(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ医薬および生物学的巨大分子プロダクトを含有するプロダクトストリームの連続的限外ろ過のためのユニットであって、少なくとも１つのキャピラリー限外ろ過モジュールを含むユニットにおいて、
−少なくとも１つのポンプが、前記プロダクトストリーム（すなわちフィード）を前記限外ろ過モジュールのキャピラリー内に運搬し、
−容積ポンプが、前記プロダクトストリームを前記キャピラリーから運搬し、
−少なくとも１つのさらなるポンプが、洗浄流体を前記キャピラリーの外側を通過させ、
−前記ユニットが、前記プロダクトストリームおよび前記洗浄流体を前記限外ろ過モジュール内へ循環させる手段を含まず、
−前記限外ろ過のためのユニットは、準備手順によりフィード側およびジャケット側の双方に気泡がなくなり、前記準備手順では、前記フィード側および前記ジャケット側の双方に、ガス気泡が透析モジュールから出てこなくなるまでバッファー溶液を流し、
−前記バッファー溶液の流速は、血流速の１０％と１００％との間に及ぶ、
ことを特徴とするユニット。
【請求項２】
前記洗浄流体を、使用する前記限外ろ過モジュールから調節して除去する手段を含む、請求項１に記載のユニット。
【請求項３】
複数のキャピラリー限外ろ過モジュールが直列または並列で結合されることを特徴とする、請求項１または２に記載のユニット。
【請求項４】
連続的限外ろ過のためのユニットにおける、バイオ医薬および生物学的巨大分子プロダクトを含有するフィードストリームの連続的限外ろ過のための方法において、前記フィードストリームは、キャピラリー限外ろ過モジュールの少なくとも１つのキャピラリー限外ろ過膜を介して洗浄流体で洗浄され、前記フィードストリームはキャピラリー内に運搬されて前記洗浄流体は前記キャピラリーの外側にわたって運搬され、前記フィードストリームおよび前記洗浄流体は、前記限外ろ過モジュール内に連続的に供給され、かつ前記限外ろ過モジュールから連続的に除去され、前記フィードストリームおよび前記洗浄流体は、前記限外ろ過モジュール内に循環されず、濃縮水を含む前記プロダクトストリームの除去は、所望されない純流動が前記キャピラリー内部から前記キャピラリー外部へまたは前記外部から前記内部へ通過できないように制御され、前記限外ろ過モジュールは、準備手順によりフィード側およびジャケット側の双方に気泡がなくなり、前記準備手順では、前記フィード側および前記ジャケット側の双方に、ガス気泡が透析モジュールから出てこなくなるまでバッファー溶液を流し、前記バッファー溶液の流速は、血流速の１０％と１００％との間に及ぶ、ことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記連続的限外ろ過のためのユニットにおいて、前記フィードストリームのプロダクトが最大で２の係数で濃縮され、または２の係数で希釈されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄流体が、前記フィードストリームに対して横断流または向流で、好ましくは向流で通過することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
複数のキャピラリー限外ろ過モジュールが直列または並列であり、前記キャピラリー限外ろ過モジュールの膜間の最大の圧力低下が１ｂａｒを超えないことを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオ医薬および生物学的巨大分子プロダクトを含有するプロダクトストリームの連続的限外ろ過のための少なくとも１つのユニットを含む製造プラント。
【請求項９】
前記連続的限外ろ過のためのユニットに結合される少なくとも１つの濃縮ユニットをさらに含む、請求項８に記載の製造プラント。
【請求項１０】
前記濃縮ユニットが、
−透過水出口を有する１つまたは複数の膜モジュールと、濃縮ループ内の循環のためのポンプと、脱気袋と、を含む前記濃縮ループ内に前記プロダクトストリームを運搬するポンプと、
−タンパク質含有溶液を前記濃縮ループの外に運搬するポンプと、
−代替的に、単一使用で単一通過の膜モジュールを通過する流れのためのポンプと、
を含むことを特徴とする、請求項９に記載の製造プラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バッファーまたは媒体の連続的な交換のための限外ろ過ユニットと、限外ろ過ユニットにおいてバッファーまたは媒体を連続的に交換する方法と、特にバイオ医薬および生物学的巨大分子プロダクト（詳細にはタンパク質など、例えばモノクローナル抗体やワクチン）の（半）連続生産のためのプラントであって、本発明による限外ろ過ユニットを含むプラントとに関する。
【０００２】
本明細書の文脈では、連続操作とは、バイオリアクターへのフィードストリームの供給および生産プラントからのプロダクトストリームの取り出しが絶え間なく起こり、多くの工程が半連続的であり得ることを意味する。
【背景技術】
【０００３】
医薬品を厳しく制御して生産するには、清浄および滅菌したバイオリアクターの準備や、無菌製品の確保のために、多大な時間、技術的労力および人員の労力を要する。多目的プラント内でのプロダクトの交換時または２つのプロダクトロット間での相互汚染を確実に回避するため、洗浄とは別に、かなり労力の要する洗浄による検証が必要であり、この検証は、必要であればプロセスの改変の間に繰り返されなくてはいけない。
【０００４】
これは、アップストリームプロセス（ＵＳＰ）、すなわち発酵槽での生物由来プロダクトの生成、および、ダウンストリームプロセス（ＤＳＰ）、すなわち発酵産物の精製の両者にあてはまる。
【０００５】
培養の成功に無菌環境が必要なのは、まさしく発酵においてある。バッチ式発酵槽またはフェドバッチ式発酵槽の滅菌では、ＳＩＰ技術（ＳＩＰ＝定置滅菌）が原則として用いられる。
【０００６】
準備手順のためのリアクターの休止時間は、リアクター利用性の大きさの順であり得、特に、短い使用時間および頻度の高いプロダクトの交換の場合である。ＵＳＰでは、例えば媒体の準備および発酵のプロセス工程といった生物工学的な生産が影響を受け、ＤＳＰでは、溶解化、凍結、解凍、ｐＨ調節、例えばクロマトグラフィー、沈降または結晶化といった産物の分離、バッファー交換およびウイルス不活性化が影響を受ける。
【０００７】
最大限の清潔さおよび無菌性を維持しながら生産プラントに迅速かつ柔軟に再投入するための必要な条件を満たすために、好ましくは使い捨ての技術を伴った連続生産の設計に対する関心が、市場で絶えず大きくなっている。
【０００８】
ＷＯ２０１２／０７８６７７では、クロマトグラフィーによるバイオ医薬製品の連続的な調製のための方法およびプラント、ならびに、これらを生産プラント、特に使い捨てプラントへ一体化することが開示されている。ＷＯ２０１２／０７８６７７でバイオ医薬および生物由来プロダクトの連続生産に対するアプローチが提供されたものの、開示された解決策は実用性が十分ではない。バイオ医薬および生物由来プロダクトの生産のための方法には、通常、次の生産工程が含まれ、これらの工程は一緒に結び付けられる。
【０００９】
１．灌流培養
２．細胞保持システム、
および、工程１および工程２の代わりにフェドバッチ培養。
【００１０】
３．細胞分離
４．好ましくは濃縮によるバッファーまたは媒体交換
５．好ましくは除菌ろ過による生物汚染度の減少
６．回収クロマトグラフィー
通常はプロダクトストリームのさらなる精製のために追加の工程が実施され、具体的には：
７．ウイルス不活性化
８．中和
９．任意でさらに生物汚染度の減少（除菌ろ過）
バイオ医薬品の高品質基準の観点から、通常はこれらに以下の工程も続く：
１０．クロマトグラフィーによる中間および精密な精製
１１．生物汚染度の減少、例えば除菌ろ過
１２．ウイルスろ過
１３．バッファー交換および好ましくは濃縮
１４．除菌ろ過
上記の生産プロセスでは、栄養液を有する発酵槽内の細胞が生物由来プロダクトを生産する。この場合の栄養液は、細菌および胞子といった微生物にとって理想的な成長培地でもある。
【００１１】
したがって、後ろに続くプロセス工程において微生物汚染のリスクを下げることが課題の１つである。プロセスの時間がかかるほど、特に連続的プロセスでは、この課題を解決することがより重大になる。タンパク質の生産では、少なくとも１つのプロセス工程で、プロダクト溶液のバッファーまたは媒体交換（＝バッファー交換）が実施される。
【００１２】
さらに、フィードストリーム／プロダクトストリームの１つまたは複数のパラメーター、具体的には濃度、体積／流速（flow rate）、ｐＨおよび伝導率の、労力を要する調節がプロセス工程の多くで必要となる。特に、クロマトグラフィーの各種工程では、フィードストリームの１つまたは複数のパラメーターの様々な調節を新たに行う必要があり得る。さらに、連続プロセスのために、連続プロセス用の解決策を好ましくは見つけなくてはいけない。
【００１３】
ＷＯ２０１２／０７８６７７では、特にクロマトグラフィーユニットの直前でのバッファーもしくは媒体交換またはフィードストリームの調節の詳細が提供されず、その結果、開示される連続プラントの利用可能性が、特に濃度、ｐＨおよび伝導率などの具体的な調節を一切必要としない種類のクロマトグラフィーに限定される。
【００１４】
従来技術では、バッファー交換はバッチプロセスにおけるフィードのパラメーターを調節する方法として知られている。通常、限外ろ過膜（ultrafiltration membrane）を用いるバッチ式ダイアフィルトレーションを用いる。この場合、プロダクト溶液はまず始めに容器内に配置される。この溶液を、限外ろ過膜を介して回路内にポンプで送り、ここでプロダクトができる限り膜によって保持される一方で、塩／バッファーが膜を介して透過水（permeate）として除去される。プロダクト容器内の充填レベルは、透過水の体積が洗浄流体（washing fluid）によって置き換えられるため、通常一定に保たれる。次いで、生産中の残渣塩濃度が、理想的には次のように計算される：
Ｃ＝Ｃｏ＊ｅｘｐ（洗浄の体積／体積プロダクト溶液）、ここで、Ｃｏは塩の初期濃度である。このプロセスはよく、文献上で間違って連続的ダイアフィルトレーションと呼ばれるが、フィードストリームは容器に連続的に供給されず、プロダクトストリームは容器から連続的に除去されないため、バッチプロセスである。これは、バッチが完全に処理されるまでバッファーを連続的にシステム内に供給するという事実が原因である［Alois Jungbauer, "Continuous downstream processing of biopharmaceuticals", Trends in Biotech., 2013 (8), 479-492, WO2009017491］。
【００１５】
限外ろ過モジュールは血液透析、血液ろ過および血液透析ろ過でも用いられる。血液透析は、純粋に拡散性であり、圧力によって行われるプロセスではない点で、他の限外ろ過方法と異なる。しかし、プロセスの技術の観点からは、血液透析は、人体がプロダクト容器としてみなされ得、患者の血液が原則として数時間にわたって洗浄されなくてはいけないバッチ方式のプロセスでもある。さらに従来技術では、透析は、タンパク質溶液の脱塩およびバッファー交換に関して、研究所でも知られている。しかし、拡散が遅いと言われており、そのために、透析は実験の体積がより小さいもののための方法でしかない［ThermoScientific http://www. piercenet.com/browse. cfm?fld I D=5753AFD9-5056-8A 76-4E 13-5F9E9B4324DA,CN102703550］。
【００１６】
機能的透析は、透析の速度および効率を高めるために、流体力学を利用する。サンプルおよび／または透析液（dialysate）の循環によって、透析時間を著しく短くするために、可能な限り最も高い濃度勾配を得る。付随して生じる流れには、膜汚染が予防され、一方で多くの場合、圧力差が生じるこという他の利点もある。この追加的な駆動力は、半透膜を超える低浸透圧の質量移動の速度を増やし、透析手順の間のサンプルの濃縮を可能にする。適用方法によって、２つの基本的な方法があり、透析液ストリームおよびサンプルが静止状態か流れている状態のいずれかであり得る。これらの方法は、機能的透析において、様々な理由および様々な目的で使用される。サンプルが流れる場合、従来技術では、プロダクトの容器を含む循環システムで運搬される（convey）［http://de.spectrumlabs.com/dialysis/Dynamic.html］。この方法もバッチ式の方法である。
【００１７】
本明細書の文脈では、連続的ダイアフィルトレーション（diafiltration）とは、フィードストリームおよび洗浄ストリームが限外ろ過ユニット内に連続的に供給されることを意味する。本明細書の文脈では、半連続的操作とは、ロットまたはバッチ式精製として一般的に理解されることを意味し、すなわち、１つまたは複数の容器から出たタンパク質溶液の１つまたは複数のロットが限外ろ過ユニットに連続的に供給され、ここで洗浄流体も連続的に供給されることを意味する。
【００１８】
実際の連続的ダイアフィルトレーションは、従来技術では複数のダイアフィルトレーション段階を、並流または向流で結合することで効果を示す。しかし、このための装備コストはそれに応じて大きい［Alois Jungbauer, "Continuous processing of biopharmaceuticals", Trends in Biotech., 2013 (8), 479-492］。
【００１９】
フィードのパラメーターの調節、および特にプロダクトストリームのバッファー交換のための、単純で連続的な解決策は未だ知られていない。
【００２０】
ＵＳ４９６３２６４Ａは、抗体の精製に使用され得る透析ユニットおよび方法を開示している。中空繊維モジュールが使用される。プロダクトおよび洗浄溶液は向流の方法で供給され、溶液は循環されない。アフィニティ吸着材によって、ターゲットとなる種が膜の反対側に抽出され、こうして、透過水にて取り出される。具体的な実施形態では、ＵＳ４９６３２６４Ａには、いくつかの実験に関して、対圧手段を様々な圧力を設定するために用いたことを記述されているが、さらなる詳細はなかった。
【００２１】
ＵＳ３５８２４８８Ａは、透析、バッファー交換および／または生物学種（biological species）、例えばタンパク質の濃縮のためのユニットおよび方法を開示している。この場合、平膜モジュールが使用され、流動は、キャピラリーとしても見なされ得る小さなチャネルで運搬される。このユニットは、向流の方法で操作される。出口の圧力デバイスとして、ＵＳ３５８２４８８Ａは、純流動（net flow）を生じさせることでプロダクトの濃縮を達成するが、バッファー交換の改善は達成しないクランプを開示している。
【００２２】
KURNIK et al.は、純流動を調節する出口流動の制御を行わずに、直列に結合された複数の中空繊維膜モジュールを使用する向流透析を利用したタンパク質のバッファー交換を開示している。１００倍の濃縮が達成され得る（KURNIK RONALD T ET AL: "Buffer exchange using size exclusion chromatography, countercurrent dialysis, and tangential flow filtration: Models, development, and industrial application", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING - COMBINATORIAL CHEMISTRY, WILEY, NEW YORK, NY, US, Vol. 45, No. 2, 1st January 1995 (1995-01-01), pages 149-157, XP002311649）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、第１の課題は、プロダクトストリームの調節、特に連続的プロダクトストリームの濃度、ｐＨおよび／または伝導率の調節をバッファー交換によって可能にする解決策の提供にあった。特に、解決策は柔軟なものであるべきであり、プロダクトストリームを１つまたは複数の異なるクロマトグラフィーの精製工程の要件に調節するのを可能にするべきである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
この課題は、並流、向流または横断流、好ましくは向流で操作される少なくとも１つの中空繊維限外ろ過モジュール（＝キャピラリー限外ろ過モジュール）の使用、好ましくは、プロダクトストリーム（＝フィードストリーム）および洗浄流体（＝透析液）が流れており、中空繊維限外ろ過モジュール内のプロダクトストリームおよび洗浄流体の循環がなくともバッファー交換が実行される、限外ろ過ユニット内にある血液透析モジュールの使用によって解決された。
【００２５】
本明細書では、キャピラリーに運搬されるプロダクトストリームは、膜技術で従来の通り、フィードストリームまたはフィードとも呼ばれる。本明細書では、キャピラリーから外に運搬されるプロダクトストリームは、膜技術で従来の通り、濃縮水（retentate）とも呼ばれる。
【００２６】
本明細書では、キャピラリーに運搬される洗浄流体は、膜技術で従来の通り、透析液、透析バッファーまたは透過水とも呼ばれる。キャピラリーから外に運搬される洗浄流体は、本明細書では、排気ストリームとも呼ばれる。
【００２７】
市販の中空繊維限外ろ過モジュール／キャピラリー限外ろ過モジュールを通常用いる。ここで、限外ろ過膜の分画分子量（ＭＷＣＯ）は、膜が、収率損失が≦９０％、好ましくは≦３０％および特に好ましくは≦１０％を超えないように中空繊維／キャピラリー内にターゲットとなるプロダクトを維持するように選択されるべきである。同時に、より小さな分子およびイオンは、膜によって維持されない。収率損失とは、フィードストリーム中のプロダクトと比較して膜を透過したプロダクトの損失を意味し、例えばクロマトグラフィー的な方法、ＥＬＩＳＡ等といった公知の方法のうち１つを用いたサンプルの測定のよって測定または分析される。
【００２８】
キャピラリー限外ろ過モジュールは、医薬産業の要件に応じて、市販の蒸気滅菌またはガンマ滅菌されたものであることが効果的である。例えば、１つの試験用プラントでは、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のポリマー混合物の、内部直径１９０μｍおよび壁厚３５μｍであるキャピラリーを含んでなる血液透析モジュール、レバクリア３００キャピラリーダイアライザー（ガンブロ社）を用いた（http://www.gambro.com/PageFiles/21256/Revaclear%20White%20Paper.pdf?epslanguage=en）。代替的に、ＧＥヘルスケア社のプロセススケール限外ろ過中空繊維カートリッジ（Process Scale Ultrafiltration Hollow Fiber Cartridge）（ＵＦＰ−７５０−Ｅ−５５Ａ）といった中空繊維モジュールも使用可能である。
【００２９】
本発明によれば、フィードストリームは、限外ろ過モジュールの中空繊維／キャピラリー内に制御された方法で運搬され、洗浄流体はジャケット側に制御された方法で運搬される。濃縮水は、中空繊維／キャピラリーから外に制御された方法で運搬され、プラント内に移動する。驚くことに、バッファー交換が、プロダクトストリームの循環なしで上手く実施され得ることが分かった。これは、単一の限外ろ過モジュールの使用で既に起こる。しかし、複数の限外ろ過モジュールを、直列または並列で結合するのが効果的であり得る。この方法では、洗浄流体は、並流、横断流または向流、好ましくは横断流、特に好ましくは向流のいずれかでフィードストリームにポンプで送り出される。プロダクトストリーム（例えばバッファーＡ中のタンパク質溶液）が下方から限外ろ過モジュールの中空繊維／キャピラリーを通って上方に流れる一方でジャケット側の洗浄流体（バッファーＳ）は通常上方から中空繊維／キャピラリーを過ぎて下方に通過する、向流の操作は、より少ない洗浄流体でより高い純度（バッファー交換効率）を可能にする。同様に、プロダクトストリームは、血液透析モジュールのキャピラリーを通って上方から下方に流れ得る一方で、ジャケット側の洗浄流体は下方からキャピラリーを過ぎて上方に通過する。驚くことに、この単純な解決策は、連続的な操作でも、効率的なプロダクトストリームのバッファー交換を可能にすることが分かった。
【００３０】
各場合でプロダクトストリーム（＝フィードストリーム）および洗浄流体（＝透過水）を運搬するために、ポンプが１つ使用される。キャピラリー（＝濃縮水）からプロダクトストリームを調節して除去するために、さらにもう１つポンプまたは制御弁が、プロダクトストリームを調節して除去する手段として使用される。濃縮水の調節された除去のためのポンプ（＝濃縮水ポンプ）の使用によって、濃縮水の除去の調節は簡潔になる。正確には、滅菌の使い捨て技術の利用では、より低い流速（≦１００ｍｌ／分）を確実に測定する適切な流動センサー（flow sensor）がないため、低い流速で特に効果的である。特に好ましくは、ぜん動ポンプが用いられ得、使い捨てぜん動ポンプが市販されており、よって滅菌性および使い捨て技術も利用可能であるという利点を伴う。
【００３１】
ポンプが３つ、すなわち、フィードストリーム（＝フィードポンプ）および透過水（＝透過水ポンプ）を運搬するためのポンプ２つならびに濃縮水ポンプしか使用しない場合、第４のストリームは調節されない。３つのポンプのうち１つのポンプで起こりうる不具合は気づかれないままであり得る。したがって、好ましくは、洗浄流体の調節された除去のために、キャピラリーおよびジャケット側（＝外側）間の圧力比を調節する。また、これは通常、洗浄流体除去のためのポンプまたは制御弁を、洗浄流体を調節して除去する手段としてさらに使用することで達成される。キャピラリー限外ろ過モジュールを含む本発明による限外ろ過ユニットが、図１および２の例によってこれらに限定することなく示されている。
【００３２】
フィードストリームおよび洗浄流体の流れ（＝透析バッファー）は、ポンプによって作り出される。濃縮水の流れは好ましくは、ぜん動ポンプといった容積ポンプ（positive displacement pump）（図１）、または代替的に制御弁および流量調節（実施形態は示されず）によって作り出される。
【００３３】
好ましくは、入口の流量（図１、フィードおよび透析バッファー）の圧力の比は、一方の膜側からもう一方の膜側への短絡フローを避けるために、調節される。このため、図１で示すように、透過水の出口において追加された４つ目のポンプが用いられ得（図１）、または、好ましくは透過水の出口を、弁または静水圧によって絞める（図２）。
【００３４】
ポンプ４つでの実施形態では、フィードストリームおよび洗浄流体（＝透過水ポンプ）を運搬するためのポンプ２つならびに濃縮水ポンプの３つのポンプは好ましくは制御下で操作され、一方で洗浄流体を調節して除去するポンプ（＝廃棄ポンプ）は圧力センサーによって調節される。より正確には、廃棄ポンプは、血液透析モジュールでの圧力が、透過水側で測定された時に例えば２００ｍｂａｒに調節されるように、作動される。この圧力で調節される廃棄ポンプは、次いで、フィードポンプの体積流量（volume flow）／流速を正確に運搬しなくてはいけない。流速が低い時は、内向きの運搬ポンプであるフィードもしくは透過水ポンプのうち１つ、または、外向きの運搬ポンプ（濃縮水もしくは廃棄ポンプ）のうち１つに欠陥がある。この方法で、流れを測定せずに、ポンプが全て正しく動いているかをモニターすることが可能である。
【００３５】
好ましくは、弁または静水圧が透過水出口の圧力調節のために使用され得る。
【００３６】
限外ろ過ユニットのさらなる実施形態が、これに限定はされないが、図３に図式で示されている。ポンプＭ０３０３は、ある体積流量を、１つまたは複数の血液透析モジュール（ＤＦモジュール）に流す。好ましくは、１つまたは複数の血液透析モジュールが直列で結合されている。プレッシャーセンサーＰ０３０３は、好ましくは、限外ろ過ユニットのフィード圧力をモニターする。フィード圧力が最大圧力を超えた場合は、この段階は遮断される。限外ろ過ユニットのあとに、ポンプＭ０３０４は、好ましくは、血液透析モジュールのプロダクト濃度の変化および膜上のゲル層の形成を防止するために、Ｍ０３０３と全く同じ速度で送り出す。ポンプＭ０３０４は、透析された濃縮水を中間袋（intermediate bag）Ｂ０３０２内に運搬する。洗浄流体を、ポンプＭ０３０５によって、Ｍ０３０３よりも早い流速で血液透析モジュールの透過水側（＝キャピラリーのジャケット側）へ送り出す。ここで、ポンプＭ０３０３の流速は、濃縮水のバッファーが所望する濃度に到達するのに十分な高さで設定される。使用した洗浄流体は袋Ｂ０３０４で回収される。
【００３７】
本明細書の第１の主題は、バイオ医薬（biopharmaceutical）および生物学的巨大分子プロダクト（biological macromolecular product）を含有するプロダクトストリームの連続的限外ろ過のためのユニットであって、少なくとも１つのキャピラリー限外ろ過モジュールを含むユニットにおいて、
−少なくとも１つのポンプが、プロダクトストリームを限外ろ過モジュールのキャピラリー内に運搬し、
−ポンプが、プロダクトストリームをキャピラリーから運搬し、
−少なくとも１つのさらなるポンプが、洗浄流体をキャピラリーの外側を通過させ、
−限外ろ過モジュール全体でプロダクトストリームおよび洗浄流体を循環する手段（measure）を一切有さない、
ことを特徴とするユニットである。
【００３８】
好ましくは、限外ろ過モジュールから洗浄流体を調節して除去する手段を用いる。
【００３９】
本明細書のさらなる主題は、連続的限外ろ過に関する本発明によるユニットにおける、バイオ医薬および生物学的巨大分子プロダクトを含有するフィードストリームの連続的限外ろ過のための方法において、フィードストリームは、キャピラリー限外ろ過モジュールの少なくとも１つのキャピラリー限外ろ過膜を介して洗浄流体で洗浄され、フィードストリームはキャピラリーの内部に運搬されて洗浄流体はキャピラリーの外側を通過し、フィードストリームは、限外ろ過モジュール内に連続的に供給され、洗浄流体は、限外ろ過モジュールに連続的に供給および限外ろ過モジュールから連続的に除去され、フィードストリームおよび洗浄流体は、限外ろ過モジュールを介して循環されない、ことを特徴とする方法である。
【００４０】
膜の両側間での小分子およびイオンの交換を効率的に達成するために、透析方法のように移動ができる限り拡散によって起こるよう、膜を超える実体積流量を出来るだけ小さくする。拡散による移動は、非透過性物質の希釈および濃縮が、最大１〜５の係数（factor）、好ましくは１〜２の係数、特に好ましくは１の係数で起こるときに特に達成される。
【００４１】
本発明によれば、いくつかの限外ろ過モジュールは直列または並列で結合（connect）し得る。ここで、直列の限外ろ過モジュールの数は、限外ろ過モジュール全体にわたる全体の圧力の損失が１ｂａｒを超えないように選択されるべきである。並列に結合された限外ろ過モジュールの数は、キャピラリー内へのフィードストリームが、製造者が推奨する最大流速を超えないように選択されるべきであり；推奨される流速の０．１〜１５％の流速、特に、推奨される流速の０．１〜５％が好ましい。
【００４２】
例えば、試験用プラントでは、ガンブロ社の血液透析モジュール、レバクリア３００キャピラリーダイアライザー（Revaclear 300 Capillary Dialyzer）を用いた。これらのモジュールでは、フィードストリームは、モジュールごとに、５００ｍｌ／分、好ましくは７５ｍｌ／分、さらに好ましくは２５ｍｌ／分を超えるべきではない。モジュールの入口と出口の間の全体的な圧力差（＝キャピラリー限外ろ過モジュールの膜を隔てた圧力の損失）が推奨される１ｂａｒの流速を超えないように、モジュールは直列で結合され得る。
【００４３】
濃縮水中の不純物の除去を出来るだけ多く達成するために、フィードストリームに対する洗浄流体（＝透析液ストリーム）の流量の比は、通常、できるだけ高く選択される。この比の正確なレベルは、必要とされる最小除去量および分子の拡散比次第である。同時に、１つのモジュール内の透析液ストリームは、製造者が推奨する最大流量を超えるべきでない。経済的な観点からも、透析液ストリームを制限することが賢明である。バッチ方式で操作されるダイアフィルトレーションプロセスでは、洗浄流体体積のフィード液体積に対する比を３〜６、時には１０の比に設定するのが通常行われる設定である。本発明による方法では、フィードストリームに対する透析液ストリームの比が３〜６である比較可能な設定を第１のアプローチとして選択し得、原則、プロダクトの特質によって実験的に適合させる。
【００４４】
透析モジュールの準備（洗浄および脱気によるスタートアップ）が、洗浄の質に対して決定的であることが予期せず発見され、なぜなら、そうでなければキャピラリーが全て完全に使用されるわけではないからである。好ましい低流速のため、具体的な難点は、キャピラリー側およびジャケット側で透析モジュールを脱気することである。
【００４５】
本発明に従って、全ての透析モジュールをスタートアップする前に、フィード側およびジャケット側の双方に、製造者が推奨する血流速の少なくとも１０％〜１００％、好ましくは１５〜１００％、および特に好ましくは３０〜１００％で、ガス気泡が透析モジュールから出てこなくなるまで、バッファー溶液を流す。この場合、フィード側およびジャケット側の双方に気泡がないことが不可欠である。
【００４６】
本発明によれば、フィードおよび透析液ストリームは、これらの流量が明確に定義され、すなわち、所望されない純流動がフィードスペース（＝キャピラリー内部）から透析液スペース（＝キャピラリー外部／ジャケット側）に、またはその逆の方向に、一切起こり得ないように、調節される。このため、次の手法を取り得る。
【００４７】
−オフライン／オンライン信号であるＵＶ、伝導率、ｐＨ、流量測定、または、ＨＰＬＣ、Ｅｌｉｓａなどといった製品の品質を決定するオフライン測定による、プロダクトストリームのモニタリング。
【００４８】
−ジャケット側（＝透析液スペース）またはフィード側（＝フィードスペース）に圧力をかけるのも効果的であり得る。この目的で、ポンプまたは弁のいずれかである、各流体を調節して除去する手段を、関連する出口で使用し得る。
【００４９】
本発明によれば、連続限外ろ過のための本発明のユニットは、製造プラント、特に、１つまたは複数の前述した製造工程を連続的または半連続的に実行するための製造プラントに組込まれる。
【００５０】
したがって、本明細書のさらなる主題は、バイオ医薬および生物学的巨大分子プロダクトを含有するプロダクトストリームの連続限外ろ過のための、本発明による少なくとも１つのユニットを含む製造プラントである。
【００５１】
さらに、バイオ医薬および生物由来プロダクトの製造に関する前述の製造工程の多くで、プロダクトストリームの一連の希釈および濃縮が生じ、これは、連続プロセス操作に関して困難なものである。
【００５２】
好ましくは、本発明による製造プラントは、プロダクトストリームを連続的限外ろ過するユニットのうち１つのユニットの前後に、プロダクトストリームを濃縮するためのユニット（濃縮ユニットとも呼ぶ）を含む。好ましくは、製造プラントの連続限外ろ過のための本発明のユニットは、濃縮ユニットの出口のパイプに結合している。
【００５３】
本発明によれば、例として挙げる図３に示す通り、濃縮ユニットは、再循環ループ（＝濃縮ループ）を含み、かつ、濃縮ループにおいて、透過水出口を有する１つまたは複数の膜モジュールと、濃縮ループで循環の流量を調節するためのポンプＭ０３０２と、脱気袋（deaeration bag）（番号付けなし）とを含む。濃縮ループでは、プロダクトストリームは連続的に濃縮される。ポンプＭ０３０１は、プロダクトストリームを、通常、保持袋から濃縮ループ内へ運搬する。膜モジュールとして、１つまたは複数のＣＦＦ限外ろ過モジュール（クロスフローろ過）または代替的にＡＴＦ（交互タンジェンシャルフロー）限外ろ過モジュールが通常用いられるが、好ましくは１つのＣＦＦモジュールである。例えば、試験用プラントでは、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社のＣＦＦモジュール、ＲＴＰ  ＵＦＰ−３０−Ｃ−５Ｓを用いる。
【００５４】
Ｍ０３０２からの流速は少なくとも、膜の製造者が示す最小の超流速に設定する。例えば、モジュールＲＴＰ  ＵＦＰ−３０−Ｃ−５Ｓに関しては、少なくとも２ｌ／分が設定される。
【００５５】
ポンプＭ０３０３は、濃縮ループの外にプロダクトストリームを運搬する。ここで、ポンプＭ０３０３の流速は、ポンプＭ３０１の流速と関連して設定する。この比は、所望する濃縮係数に対応する。この場合、圧力をプレッシャーセンサーＰ０３０１およびＰ０３０２で設定し、これによって液体は濃縮ループから膜を介して透過するが、この間に、出来る限り多くの生物由来プロダクトが保持される。通常、生物由来プロダクトの少なくとも９０％、好ましくは９０〜９５％、特に好ましくは９５〜１００％を保持する膜が使用される。開示する設計では、膜ではなくポンプを介して液体を流さずに供給圧力も保持できるポンプを用いる。ぜん動ポンプがここで好ましくは用いられる。代替手段として、透過水の流れを調節する調節弁と流量計の組合せも使用され得る。
【００５６】
膜モジュールの膜を通過する透過水は、容器Ｂ０３０４の透過水の出口を介して回収される。ポンプＭ０３０１と濃縮ループとモニターとの間にあるプレッシャーセンサーＰ０３０１は、膜モジュールの前の圧力をモニターし、最大圧力を超える場合はＭ０３０２の遮断を導き得る。この場合、膜モジュールを交換しなければいけない。この場合では好ましくは、濃縮ループ全体を、滅菌した新しいもので取り替える。しかし、膜カセットの使用において、カセットを並列で操作することは完全に普通のことである。膜カセットは、直列または並列で配置され得、好ましくは並列で配置され得る。通常、プレッシャーセンサーＰ０３０２は、濃縮ループの後の圧力を測定し、これによって、膜間の圧力を決定し得る。通常、流量センサーＦ０３０１（図示されず）は、濃縮ループの体積流量を測定する。Ｍ０３０１の流速に対して固定された比で、ポンプＭ０３０３は、濃縮ループから限外ろ過ユニットへ体積流量を運搬する。
【００５７】
無菌性の維持は、さら（半）連続的製造プラントでは困難および問題をさらにもたらす。本発明による製造プラントでは、要素は全てチューブ、特に使い捨てチューブで一緒に結合されている。例えば、生物適合性のチューブであるＰｈａｒｍｅｄ  ＢＰＴ（登録商標）（耐熱シリコーンチューブ）を用いる。プラントの他の要素も、好ましくは使い捨て要素であり；具体的には、使い捨てリアクター、使い捨てろ過要素、使い捨て弁、使い捨てセンサー（流量、ｐＨ、伝導率、ＵＶ、圧力）、使い捨て細胞保持システム、使い捨てチューブ、使い捨て膜、使い捨てコネクター、使い捨てクロマトグラフィーカラム、使い捨て容器および使い捨てサンプリングシステムの群から選択される要素である。液体を運搬する手段、特にポンプも、好ましくは使い捨てポンプである。
【００５８】
膜モジュールおよび／または限外ろ過モジュールを交換するために、プロダクトストリームは通常遮断され、暫定袋（図３の保持袋Ｂ０３０１）が交換されている間に代わりを務める。
【００５９】
さらなる生物汚染度の減少のために除菌ろ過用のユニットを使用することで、特定のモジュールの寿命が改善され得、その結果、交換の間に暫定袋でプロダクトストリームが遮断および捕獲（＝保管）されることが正当化される。
【００６０】
濃縮ループに代わって、ポール社のＣａｄｅｎｃｅ（商標）シングルパスタンジェンシャルフロー（Single-Pass Tangential Flow）ろ過カセットを１つまたは複数で、プロダクトストリームを濃縮するユニットとして用い得る（US 7.682.511 B2, http://www.pall.com/main/biopharmaceuticals/product.page?id=52742）。
【００６１】
濃縮工程によって、体積流量は顕著に減少し、プロダクトの濃度は増大する。
【００６２】
実施例および試験用プラント：
本発明による発酵ブロスからのプロダクトストリームのバッファー交換のための解決策の有用性を調べるために、図３による試験用プラントを例として建設した。試験用プラントのチューブとして、内径が３．２ｍｍであるＰｈａｒｍｅｄ  ＢＰＴ（登録商標）チューブを用いた。図３の要素に加え、試験用プラントは、試験用プロダクトストリームとして、細胞を含まない発酵ブロスを充填した１０Ｌの容器を含んでいた。容器（図示されず）にチューブによって結合された第１のポンプ（Ｍ０３０１）は、第１に、図３で示す通り、プロダクトストリームを濃縮ユニット内へ運搬した。試験用分子として、免疫グロブリンＧ抗体（ＩｇＧ抗体）を選択した。
【００６３】
濃縮ユニットは、濃縮ループ内への循環／流れのためのポンプＭ０３０２、濃縮ループにチューブおよび手動のピンチ弁ＡＢ０３０１、ＡＢ０３０２およびＡＢ０３０３によって結合されている脱気袋（番号付けなし）、ならびに、膜モジュール（ＵＦモジュール３．１）を含んでなった。膜モジュールとして、例として、ＧＥヘルスケアライフサイエンス社のＣＦＦ限外ろ過モジュール、ＲＴＰ  ＵＦＰ−３０−Ｃ−５Ｓを用いた。
【００６４】
Ｍ０３０２の流速は、膜製造者が示す最小の超流速に設定した。例えば、モジュールＲＴＰ  ＵＦＰ−３０−Ｃ−５Ｓに関しては、少なくとも２ｌ／分を設定した。実際に濃縮する前に、ＡＢ０３０１およびＡＢ０３０３およびＡＢ０３０２を部分的に開放することで、濃縮ループをまず脱気する。濃縮ループに気泡がなくなったら、ＡＢ０３０２を完全に開放し、ＡＢ０３０１およびＡＢ０３０３を閉じる。
【００６５】
ポンプＭ０３０３は、濃縮ループからプロダクトストリームを運搬した。同時に、ポンプＭ０３０３の流速は、所望する濃縮係数に対応した、ポンプＭ０３０１の流速に対する比で設定した。プレッシャーセンサーＰ０３０１およびＰ０３０２で、液体が濃縮ループから膜を介して透過することを引き起こす圧力を確定したが、この間に、出来る限り多くの生物由来プロダクトを保持した。
【００６６】
膜モジュールの膜を通過した透過水は、容器Ｂ０３０４を介して回収された。ポンプＭ０３０１と濃縮ループとの間にあるプレッシャーセンサーＰ０３０１は、膜モジュールの前の圧力をモニターし、最大圧力を超えた場合はＭ０３０２の遮断を導き得た。この場合、膜モジュールを交換しなければいけなかった。プレッシャーセンサーＰ０３０２は、濃縮ループの後の圧力を測定し、これによって、膜間の圧力を決定し得た。流量センサーＦ０３０１（図示されず）は、濃縮ループの体積流量を測定した。
【００６７】
ポンプＭ０３０３は、Ｍ０３０１からの流速に対して固定された比で、濃縮ループから次に続く限外ろ過ユニットへ体積流量を運搬した。
【００６８】
試験用プラントでは、図３で示す通り、限外ろ過ユニットは、ポリアリールエーテルスルホン（ＰＡＥＳ）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のポリマー混合物の、内部直径１９０μｍおよび壁厚３５μｍであるキャピラリーを含有する血液透析モジュール（透析モジュール）、レバクリア３００キャピラリーダイアライザー（ガンブロ社）を含んでなった（http://www.gambro.com/PageFiles/21256/Revaclear%20White%20Paper.pdf?epslanguage=en）。
【００６９】
ポンプＭ０３０３は、ある体積流量を、血液透析モジュールに運搬した。プレッシャーセンサーＰ０３０３は、限外ろ過ユニットのフィード圧力をモニターした。
【００７０】
血液透析モジュールのスタートアップの前に、フィード側およびジャケット側の双方を、ガス気泡がモジュールから出てこなくなるまで、バッファー溶液（洗浄流体）で、８０〜１００ｍｌ／分の血流速度で洗浄した（準備）。ここで、フィード側およびジャケット側の双方に気泡がないことが不可欠であった。
【００７１】
プロダクトストリームのバッファー交換に関して、次いで、フィードストリームをモジュールごとに３ｍｌ／分に設定した。
【００７２】
ポンプＭ０３０５を用いて、フィードストリームに対して向流で、透析バッファー（洗浄流体）を、３ｍｌ／分または６ｍｌ／分の流速で、Ｍ０３０３同様に、血液透析モジュール（複数可）の透過水側へ送り出した。ここで、Ｍ０３０３の流速は、プロダクト中のバッファーが所望する濃度に到達するのに十分な高さで設定された。使用した洗浄流体は袋Ｂ０３０４で回収された。
【００７３】
フィードおよび透析液ストリームは、これらの流量が明確に定義され、すなわち、所望されない純流動がフィードスペース（キャピラリー内部）から透析スペース（キャピラリー外部）に、または透析スペースからフィードスペースに、一切起こり得ないように、調節／制御された。このため、次の手法を取った。
【００７４】
ＵＶ、伝導率、ｐＨ、流量測定といったオフライン／オンライン信号、または、ＨＰＬＣもしくはＥｌｉｓａといった製品の品質を決定するオフライン測定による、プロダクトストリームのモニタリング。
【００７５】
限外ろ過ユニットの後で、透析モジュールのプロダクト濃度の変化および膜上のゲル層の形成を防止するために、ポンプＭ０３０４は、Ｍ０３０３と全く同じ速度で、濃縮および透析されたプロダクトストリームを暫定袋Ｂ０３０２内に運搬し、その充填を、検量セルＷ０３０２でモニターした。
【００７６】
プロダクトストリームの収率損失および成功したバッファー交換を、プロダクト、グルコースおよび塩の濃度を決定して確認した。
【００７７】
第１の実験では、イオン交換を、生物由来プロダクトを一切含有しないプロダクトストリームで試験した。
【００７８】
表Ａは、フィード（フィード伝導率）および濃縮水（濃縮水伝導率）の伝導率の測定を、各ポンプのそれぞれのターゲット流速と一緒に示している。
【表１】
0006605504.tif 000002
【００７９】
さらなる実験では、イオン交換を、ＩｇＧ抗体を含有するプロダクトストリームで試験した（ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｔ  Ａで測定）。
【００８０】
表Ｂは、ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｔ  Ａで測定した、関連ポンプの様々なターゲット流速での濃縮水の伝導率（濃縮水伝導率）および濃縮水中のＩｇＧ抗体の濃度の測定を示す。
【００８１】
透過水でも、高い流速で組合せたサンプルにおけるＩｇＧの濃縮が、前述した収率損失の計算方法で決定された。これによれば、透過水の収率損失は１．４％であった。
【００８２】
イオンクロマトグラフィーによる酢酸ナトリウムの濃縮の測定は、成功したプロダクトストリームのバッファー交換を示す。
【表２】
0006605504.tif 000003
【００８３】
本明細書につながった研究は、欧州地域開発ファンド（ＥＲＤＦ）による「Bio.NRW: MoBiDiK- Modular Bioproduction - Disposable and Continuous」の経済援助の同意に従って支援された。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】キャピラリー限外ろ過モジュールを含む本発明による限外ろ過ユニットの例を示す図である。
【図２】キャピラリー限外ろ過モジュールを含む本発明による限外ろ過ユニットの例を示す図である。
【図３】限外ろ過ユニットのさらなる実施形態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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