(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）で示される４−アルコキシケイヒ酸と式（II）で示される１，３−ジアルコキシベンゼンとをフリーデルクラフト反応（A）でカップリングして式（III）で示されるトリアルコキシイソリキリチゲニンを合成して晶出させ、反応（Ｂ）で保護基を外して式（IV）で示されるイソリキリチゲニンを得、反応（Ｃ）でｐＨ３．５から４．５の範囲にある有機酸水溶液中で、式（IV）で示されるイソリキリチゲニンからリキリチゲニン（  V）を得ることを特徴とするリキリチゲニン組成物の製造方法。但し、式（I）、式（II）及び式（III）中、ＲはＣＨ3，Ｃ2Ｈ5，Ｂｎを示す。
【数１】
0006615455.tif 000005
【請求項２】
請求項１において、式（I）、式（II）及び式（III）中、ＲはＣＨ3を示すリキリチゲニン組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は甘草素リキリチゲニンの前駆物質イソリキリチゲニンと有機酸を主成分とするリキリチゲニン薬理効果を有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
甘草素リキリチゲニンは広く薬効が認められる優れた漢方薬であって、一般に甘草から抽出される。しかし、その抽出方法は甘草根を熱抽出した後、加水分解後の糖類部（グルコースやアビオース）を除去し、得られるリキリチゲニンの逆相クロマトグラフによる精製を必要とする。そのため、甘草素の甘草からの抽出はコスト高で、貴重ではあり、1ｇ1万元以上で販売されている。その上甘草の栽培が困難なことから甘草が減少傾向にあって、入手困難に伴い、ますます高騰しつつある。
【０００３】
そこで、甘草素リキリチゲニンを人工的に合成しようとする試みがある。第１の方法は図２に示すように、p−ヒドロキシベンズアルデヒドを出発原料とする方法で、４−カルボキシケイヒ酸を合成し、これを経由して１，３−ジヒドロキシベンゼンを付加してイソリキリチゲニンを得る方法である（非特許文献１）が、収率が低いという欠点がある。そこで、第２の方法として、図３に示すように、p−ヒドロキシベンズアルデヒドを出発原料とし、p位の水酸基をMOM試薬で保護する一方、１，３−ジヒドロキシベンゼンの水酸基をMOM試薬で保護し、両者を付加する方法が提案される（非特許文献２）。しかしながら、実際に検証してみると、ほぼ全段階（収率や生成物がオイル状など）でカラムクロマトによる精製工程が必要となる。しかも、我々の追試実験ではスケールアップした場合のカップリング工程の収率が42%まで低下し、その上最終工程のイソリキリチゲニンからリキリチゲニンへの閉環反応で，原料と目的物が平衡状態にあって，収率が上がらないという結果を得た。また、閉環段階での原料と目的物の分離が，困難で、最終クロマト精製条件でリキリチゲニンはテーリングし，大幅に回収率が低下した。しかもMOM保護試薬の発がん性，さらに保護，脱保護で２段階の余分な工程が必要であり、第２法は実験室レベルでは有効であるものの、量産には適しないとの知見を得た。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】薬学学報  Acta Pharmaceutica Sinica 1994,29(11):877-880
【非特許文献２】Hu etc. European Journal of Medical Chemistry, 2010,45,3453-3458
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、リキリチゲニンの量産のため、クロマトグラフを使用せず、晶出させる方法を選択し、しかも発がん性のあるMOM保護試薬を使用せず、量産する方法が提案される。さらに人工的にイソリキリチゲニンをリキリチゲニンに変換する場合、平衡反応に伴って収率が向上しないという知見を得た。さらにまた、有機合成したリキリチゲニンは天然物と違って（＋）体と（−）体が共存し、そのまま使用することが懸念され、（＋）体は新たに毒性試験を必要とするとの知見をも得られた。そこで、本発明はリキリチゲニンの前駆物質であるイソリキリチゲニンを有効利用してリキリチゲニンの薬理効果を得る組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、有機合成的にイソリキリチゲニンをリキリチゲニンに変換すると天然物と違って（＋）体と（−）体が共存するが、人体に有用な有機酸、特にクエン酸を主成分とする有機酸水溶液中で培養すると、（−）体のリキリチゲニンに変換されることに着目し、リキリチゲニンを有機合成せず、その前駆体であるイソリキリチゲニンを合成し、これを酸性の有機酸水溶液、特にクエン酸を主成分とする有機酸水溶液中で培養し、目的のリキリチゲニンに変換することを要旨とするもので、p−アルコキシ桂皮酸を出発原料とし、これにフィーデルクラフト反応を利用してp−アルコキシベンゼンをカップリングさせ、高収率でトリアルコキシイソリキリチゲニンが形成されて晶出し、これを脱保護してイソリキリチゲニンを得、このイソリキリチゲニンを有機酸、好ましくはクエン酸を主成分とする酸性、好ましくはｐＨ３．５から４．５の有機酸水溶液中で培養してリキリチゲニン組成物とし、リキリチゲニン（−）体の薬理効果を得るものである。
【発明の効果】
【０００７】
リキリチゲニン（−）体の薬理効果は特許公報第５６１１３９４号によれば、リキリチゲニン１０μｇ／ｍｌで、人肝臓がん細胞ＳＭＭＣ７７２１に対し９６．０８、人低分化胃線がんＢＯＣ−８２３に対し７３．７６、人早幼粒細胞白血病細胞ＨＬ−６０に対し、６４．４０、人肺がん細胞Ａ５４９に対しやや低いが３５．０６を示し、アドリアマイシンのがん細胞に対する抑制効果を上回っている（同公報第２表および第３表）。本発明によれば、最終的に有機合成による場合のようにリキリチゲニン（＋）体と（−）体が共存しないので、収率の高いイソリキリチゲニンを有効利用することができる。また、人体に有用な有機酸、特にクエン酸を主成分とする有機酸水溶液中で培養するだけで上記薬理効果の高いリキリチゲニン（−）体を得ることができ、有機合成による場合よりも、リキリチゲニン（−）体の収率に優れる。また、有機合成による場合のように、リキリチゲニン（＋）が共存しないから、毒性試験の必要もない。
【０００８】
本発明にかかるイソリキリチゲニンは図１で示すようにして製造することができる。
第１にカップリング反応（Ａ）で、式（I）で示されるpーアルコキシ桂皮酸と式（II）で示される１，３−ジアルコキシベンゼンとから式（III）で示されるトリアルコキシイソリキリチゲニンを合成し、保護基を離脱してイソリキリチゲニンを合成する。式（I）、（II）、（III）はその一般式において、Rはメチル、エチルまたはブチルであるアルコキシ基であるのが望ましく、通常入手が容易なRがメチルであるメトキシ基が用いられる。反応は式（I）で示されるp−アルコキシ桂皮酸にハロゲン化剤を添加してハロゲン化し、そこに式（II）で示されるp−アルコキシベンゼンを添加し、次いで、触媒（金属ハロゲン化物、例えば塩化アルミニウム等）存在下に所定の芳香環の水素に求電子置換し、式（IIIａ）で示されるトリアルコキシ桂皮酸が得られる。
【０００９】
第２に反応式（B）では、この保護機を脱離すると、式（IV）で示される目的のイソリキリチゲニンが得られる。イソリキリチゲニンは閉環反応（Ｃ）により、式（IV）で示されるイソリキリチゲニンが式（V）で示されるリキリチゲニンに変換されるが、（＋）体と（−)体が得られ、甘草から得られるリキリチゲニンは（−）体であるため、キラル分割により両者を分離する必要があり、製法が複雑となる。また、（＋）体の毒性試験が必要であるので、イソリキリチゲニンのイソメラーゼ酵素を使って、リキリチゲニン（−）体を得るようにする必要がある。本発明ではイソメラーゼを使用することなく、クエン酸を主成分とする有機酸水溶液をｐＨ３．５から４．５に調整し、これにイソリキリチゲニンを添加するとリキリチゲニンの（−）体を得ることができることを見出した。p−アルコキシ桂皮酸としてはp−メトキシ桂皮酸が好ましいが、p−エトキシ桂皮酸、p−ブトキシ桂皮酸を使用しても良い。以下の実施例では、具体的には式（iａ）で示されるp−メトキシ桂皮酸と式（IIa)で示される１，３−ジメトキシベンゼンとから式（IIIa)で示されるトリメトキシイソリキリチゲニンを合成し、保護基を離脱してイソリキリチゲニンを合成する。
【００１０】
イソリキリチゲニンを培養する有機酸水溶液はクエン酸を主成分として構成される。クエン酸以外の有機酸としてはアスコルビン酸、アミノ酸、酢酸等の種々の有機酸を使用することができる。また、ｐＨ３．５から４．５とすることが重要であり、培養時間は短くてもよいが、１０時間以上有機酸中で培養するのがよく、イソリキリチゲニンのリキリチゲニンへの変換を阻害しない限り、その他の付形剤を添加してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明にかかるイソリキリチゲニンの製造例を示す第１反応（A）、第２反応（B）および第３反応（C）を示す反応図。
【図２】従来第１法のリキリチゲニンの製造例を示す反応図。
【図３】従来第１法のリキリチゲニンの製造例を示す反応図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好ましい具体例を実施例に基づいて説明する。
（実施例１）
【００１３】
【化１】
0006615455.tif 000002
式(Ia)                                   式（IIIa)
4-メトキシケイヒ酸  式(Ia）10ｇをジメチルホルムアミド0.25 mLを含む無水塩化メチレン50 mLに溶解し，室温にてオキザリルクロリド9.6 mLを発泡に注意しながら10分かけて滴下した。そのまま，室温にて2時間撹拌の後，溶媒を減圧下で除去した。得られた残渣に，1，3-ジメトキシベンゼン7.4 mL（式IIa）と無水エーテル200 mLを加え，氷浴中で，粉末にした触媒無水三塩化アルミニウム22.4 gを15分かけてゆっくりと加えた。そのまま室温にて一晩放置した後，内容物を氷上(500 g)にあけ，６M  塩酸を10 mL加え，氷が溶解した後，酢酸エチル(300 mL)で4回抽出した。抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，減圧下で濃縮し，残渣をエーテル-ヘキサン混液で結晶化することにより，14.2 gの目的物(式IIIa)の結晶を得た。収率85%  1H-NMR (CDCl3) δ 7.73 (1H, d, J=8.1 Hz), 7.64 (1H, d, J=15.1 Hz), 7.54 (2H, d, J=7.7 Hz), 7.38 (1H, d, J=15.1 Hz), 6.90 (2H, d, J=7.7 Hz), 6.55 (1H, brd, J=8.1 Hz), 6.49 (1H, brs), 3.89 (3H, s), 3.85 (3H, s), 3.83 (3H, s).
【００１４】
【化２】
0006615455.tif 000003
式（IIIa）                                   式（III)
上記生成物3 gを塩化メチレン60 mLに溶解し0 ℃にて1 M BBr3塩化メチレン溶液を滴下した。室温まで昇温し，そのまま2日間撹拌した。セニエット塩34 gを含む氷冷水700 mLとメタノール350 mLを加え，室温で一晩撹拌した。得られた黄色溶液を酢酸エチルで2回抽出し，1 Mセニエット塩-飽和食塩水で洗浄後，無水硫酸ナトリウムで乾燥，濃縮した。残渣をエーテル-ヘキサンで結晶化し，目的物1.95 g（式IV）を得た。またその母液を濃縮後再度エーテル-ヘキサンで結晶化することにより0.59 gの目的物第２晶を得た。合計収率98%1H-NMR (acetone-d6) δ 13.5 (1H, s), 8.10 (1H, d, J=8.3 Hz), 7.82 (1H, d, J=15.4 Hz), 7.74 (1H, d, J=15.4 Hz), 7.72 (2H, d, J=8.2 Hz), 6.90 (2H, d, J=8.2 Hz), 6.44 (1H, dd, J=8.3 and 1.7 Hz), 6.34 (1H, d, J=1.7 Hz).
（実施例２）
【００１５】
【化３】
0006615455.tif 000004
式（IV）                                      式（V）
原料200 mg（式IV）をｐＨ４前後に調整したクエン酸水溶液に加え，撹拌し，よく分散した後に，１昼夜常温で放置した。その懸濁液を，常法で結晶化することにより粗結晶を得る（式V）。その分析値は以下の通りであり、リキリチゲニンへ変換されている。
1H-NMR (DMSO-d6) δ 9.65 (1H, brs), 7.58 (1H, m), 7.27 (2H, m), 6.74 (2H, m), 6.45 (1H, m), 6.28 (1H, m), 5.39 (1H, brd, J=11.6 Hz), 3.65 (1H, brt, J=15.0 Hz), 2.58 (1H, brd, J=15.7 Hz).
（実施例３）
【００１６】
難消化デキストリン、Ｎ−アセチルグルコサミン、デキストリン、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖、乳酸、アスコルビン酸（ビタミンＣ）を主成分とする清涼飲料水５０ｍｌ「長寿挑戦」：株式会社国際メディカル研究所販売は、ｐＨ３．９である。そこで、リキリチゲニンとしてイソリキリチゲニンを下記特許第５６１１３９４号明細書に記載の表２「リキリチゲニンのがん細胞に対する抑制作用」に示す用量（マウスに対する有効量）の約１００〜２０００倍のイソリキリチゲニンを添加し、免疫増強のためのサプリメントを形成した。
特許公報第５６１１３９４号の表２によれば、リキリチゲニン（−）体の薬理効果はリキリチゲニン１０μｇ／ｍｌで、人肝臓がん細胞ＳＭＭＣ７７２１に対し９６．０８、人低分化胃線がんＢＯＣ−８２３に対し７３．７６、人早幼粒細胞白血病細胞ＨＬ−６０に対し、６４．４０、人肺がん細胞Ａ５４９に対しやや低いが３５．０６を示すことが明らかにされている。
【図１】
0006615455.tif 000006
【図２】
0006615455.tif 000007
【図３】
0006615455.tif 000008