(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
ａ）一般式Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３を有するインスリン受容体アゴニストと
［式中、
ｉ）Ｚ１が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンＢ鎖類似体であり、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
（式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり；Ｘ２が、ＶまたはＧであり；Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり；Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり；Ｘ５が、ＨまたはＦであり；Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず；Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず；但し、前記インスリンＢ鎖類似体が、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む）（配列番号１）、
ｉｉ）Ｚ２が、５〜１０個のアミノ酸を含む第１のペプチドリンカーであり（ここで、前記アミノ酸のうちの少なくとも５個が、Ｇ残基である）、
ｉｉｉ）Ｚ３が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンＡ鎖類似体である
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１ＣＳＬＸ２ＱＬＥＮＹＣＸ３Ｘ４
（式中、Ｘ１が、ＴまたはＩであり；Ｘ２が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり；Ｘ３が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；Ｘ４が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず；但し、Ｘ３がＮである場合には、Ｘ４がＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない）（配列番号２）］、
ｂ）１０〜２５個のアミノ酸を有する第２のペプチドリンカーであって、前記アミノ酸の少なくとも５０％がＧ残基であるペプチドリンカーと、
ｃ）ヒトＩｇＧのＦｃ領域と、を含み、
前記インスリン受容体アゴニストのＣ末端残基が、前記第２のペプチドリンカーのＮ末端残基に直接融合し、前記第２のペプチドリンカーのＣ末端残基が、前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端残基に直接融合している、融合タンパク質。
【請求項２】
前記インスリンＢ鎖類似体が、配列番号１のＸ４またはＸ５に、前記ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、
前記インスリンＡ鎖類似体が、配列番号２のＸ１またはＸ２に、前記ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記インスリンＢ鎖類似体が、配列番号１の配列を含み（式中、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ３がＮまたはＤであり、Ｘ４がＥであり、Ｘ５がＨである）、
前記インスリンＡ鎖類似体が、配列番号２の配列を含む（式中、Ｘ１がＩまたはＴであり、Ｘ２がＤであり、Ｘ３がＧであり、Ｘ４が存在しない）、請求項１または２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記インスリンＢ鎖類似体が、配列番号１の配列を含む（式中、Ｘ６〜Ｘ９が、各々Ｇである）、請求項１〜３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記第１のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質：
Ｘ１ＧＸ２ＧＧＧＧ
（式中、Ｘ１がＧであるか、または存在せず；Ｘ２が、ＧもしくはＳであるか、または存在しない）（配列番号３）。
【請求項６】
配列番号３のＸ１及びＸ２が、それぞれ、Ｇ及びＳである、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記インスリン受容体アゴニストが、以下のアミノ酸配列を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号５）。
【請求項８】
前記第２のペプチドリンカーが、配列［ＧＧＧＧＸ］ｎを有するペプチドを含む（式中、Ｘが、Ｑ、Ｅ、またはＳであり；ｎが、２〜５である）、請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記第２のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の融合タンパク質：
ＧＧＧＧＸ１ＧＧＧＧＸ２ＧＧＧＧＸ３ＧＧＧＧＸ４Ｘ５Ｘ６
Ｘ１が、ＱまたはＥであり、
Ｘ２が、ＱまたはＥであり、
Ｘ３が、ＱまたはＥであり、
Ｘ４が、Ｇ、Ｅ、Ｑであるか、または存在せず、
Ｘ５が、Ｇであるか、または存在せず、
Ｘ６が、Ｇであるか、または存在しない
（配列番号６）。
【請求項１０】
前記第２のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の融合タンパク質：
ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号７）。
【請求項１１】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４からのＦｃ領域である、請求項１〜１０のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
配列番号１２のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の２つの融合タンパク質のホモ二量体。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項１４に記載のホモ二量体のいずれか、及び少なくとも１つの賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の界面活性剤、及び１つ以上の等張剤を更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
クエン酸塩、クエン酸、ポリソルベート８０、及びマンニトールを更に含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ｐＨが約５．５〜約８．０の範囲である、請求項１５〜１７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ｐＨが約６．０〜約６．７５の範囲である、請求項１５〜１８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０】
付加的な活性成分を更に含む、請求項１５〜１９のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記インクレチン系療法剤がＧＬＰ−１Ｒアゴニストである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ＧＬＰ−１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１４に記載のホモ二量体及びデュラグルチドを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
療法に使用するための、請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
真性糖尿病の治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
付加的な活性成分と、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための請求項１４に記載のホモ二量体。
【請求項３０】
請求項１〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療に使用するための融合タンパク質に関する。より具体的には、本発明は、ペプチドリンカーによってヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合したインスリン受容体アゴニストを含む融合タンパク質、及びかかる融合タンパク質の糖尿病の治療における使用に関する。本発明の融合タンパク質は、長期作用プロファイルを有し、持続的な基礎グルコース制御及び肝臓でのグルコース生産の抑制を提供するのに有用である。
【０００２】
真性糖尿病は、インスリン分泌、インスリン作用、またはそれらの両方における欠陥に起因する高血糖を特徴とする慢性疾患である。１型真性糖尿病はインスリン分泌能力がほとんどまたは全くないことを特徴とし、１型真性糖尿病を患う患者は生きるためにインスリンを必要とする。２型真性糖尿病は、インスリン分泌不全、インスリン抵抗性、過剰な肝臓でのグルコース生産、及び／または上記の全ての寄与に起因する血糖値の上昇を特徴とする。２型真性糖尿病を患う患者の少なくとも３分の１において、本疾患は、進行してインスリン療法を不可欠とするようになる。
【０００３】
正常な血糖を達成するためには、正常な個人における内因性インスリン分泌のパターンと可能な限り類似するインスリン補充療法が所望される。毎日のインスリンへの生理的必要性は変動し、（ａ）食事に関連する血糖の急上昇を処理するためにインスリンのパルス（ボーラス）を必要とする食事時の段階と、（ｂ）最適な空腹時血糖を維持するように肝臓でのグルコース生産を調節するために持続（基礎）量のインスリンを必要とする食間段階との２つの段階に分けることができる。
【０００４】
１型糖尿病患者はインスリンをほとんどまたは全く生産しないため、１型糖尿病に有効なインスリン療法は、一般に、ボーラス注射によって提供される即効型の食事時用インスリン、及び食間に血糖値を制御するために１日１回または２回投与される長時間作用型の基礎インスリンという、２種類の体外投与インスリンの使用を伴う。２型糖尿病を患う患者の治療は、典型的には、規定された体重減少、運動、及び糖尿病食から始まるが、これらの対策が上昇した血糖の制御に失敗する場合には、経口薬及びインクレチン系療法、例えば、インクレチン値を増加させるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニスト及び／またはジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）阻害剤の投与が必要となり得る。これらの薬剤が依然として不十分である場合、インスリンによる治療が検討される。疾患がインスリン療法を必要とするところまで進行している２型糖尿病患者は、一般的に、長期作用型の基礎インスリンの１日１回の注射を始めるが、一部の場合には、即効型インスリンの食事時の注射を適宜含めてもよい。
【０００５】
数種類の基礎インスリンが現在利用可能である。ＬＡＮＴＵＳ（登録商標）という商品名で販売されているインスリングラルギンは、インスリンＡ鎖における位置２１のアスパラギンがグリシンで代置され、２つのアルギニンがＢ鎖のＣ末端に加えられている、修飾されたインスリン構造を含む。ＬＥＶＥＭＩＲ（登録商標）という商品名で販売されているインスリンデテミルは、Ｂ鎖の位置３０のトレオニンが欠失し、Ｂ鎖の位置２９のリジンが、１４炭素のミリストイル脂肪酸とＢ２９のリジンのεアミン基との共有結合を通して誘導体化されている、修飾されたインスリン構造を含む。ＴＲＥＳＩＢＡ（登録商標）の商品名で欧州及び日本で入手可能なインスリンデグルデクは、Ｂ鎖の位置３０のトレオニンが欠失し、Ｂ鎖の位置２９のリジンのε−アミノ基がγ−Ｌ−グルタミン酸リンカーを介してヘキサデカン二酸と共有的に誘導体化されている修飾されたインスリン構造を含む。これらのインスリンの全ては、１日１回の投与に適応される。
【０００６】
既存のインスリン療法の毎日の注射を伴う治療レジメンは、複雑かつ投与に痛みを伴い得、低血糖及び体重増加などの望ましくない副作用をもたらし得る。したがって、多くの糖尿病患者は、血糖値の厳密な管理を維持するために必要なインスリン療法に従うことを望まないかまたはそうすることができない、あるいは従う能力がない。不良な血糖管理は、心臓疾患、脳卒中、神経損傷、下肢切断、失明、及び腎臓疾患を含む深刻な糖尿病関連合併症を患者が発症するリスクを増加させる。作用期間がより長く、故に必要な注射頻度が現在利用可能なインスリン製品よりも少なく、忍従及び順守を改善するインスリン製品を特定するための研究が実施されている。
【０００７】
ＣＮ１０３５０９１１８は、ヒトインスリンＢ鎖及びヒトインスリンＡ鎖が４〜５０のアミノ酸Ｃ−ペプチド接続配列によって接合し、インスリンＡ鎖が一切の更なるリンカーを用いずに直接免疫グロブリンＦｃ断片に結合するタンパク質を説明しており、マウスにおける試験が、かかるタンパク質が３日という長さのインビボの半減期を有することを示したと述べている。ＫＲ１０１３２４８２８は、非ペプチジルリンカーの使用によって免疫グロブリンＦｃ領域に結合したプロインスリン類似体を説明しており、かかるタンパク質が、既存の療法剤と比べて増大した血清半減期を提供すると述べている。本出版物は、非ペプチジルリンカーがペプチドリンカーと比べて改善を示したと述べ、ペプチドリンカーを使用した融合タンパク質は、ペプチドリンカーが体内の酵素によって容易に切断されるため、血中の活性薬剤の半減期を増加させることができないと主張している。
【０００８】
上記の開示及び／またはいずれの他の出版物にも反し、本発明者らは、多くの困難を克服して、１週間に１回という低頻度での投薬を含む現在利用可能なインスリン製品よりも低い頻度での投薬に十分な、作用期間が増大した血糖低下製品に対する継続的な必要性を満たす、インスリン受容体アゴニスト、ペプチドリンカー、及びヒトＩｇＧのＦｃ領域を含む融合タンパク質を発見した。例えば、所望の長期間作用プロファイルを達成するためには、インスリンクリアランスの主要経路である急速な受容体媒介性クリアランスを回避するために減衰した効力を持つが、十分な血糖低下を提供するのに足りる効力を依然として有する融合タンパク質を操作することが必要であった。更に、インスリンクリアランスのもう１つの主要経路である腎クリアランスを最低限に抑えるため、及び流体力学的なサイズが限定された傍細胞拡散による周辺露出を調節するためには、融合タンパク質を、十分に大きく、かつ投与後にインスリン受容体アゴニストがヒトＩｇＧのＦｃ領域からタンパク質分解的に切断されないように操作する必要があり、これは、かかる切断が、例えヒトＩｇＧのＦｃ領域が循環中に留まったとしても所望よりも早いインスリン受容体アゴニストの腎クリアランスをもたらし得るためであった。加えて、ＩｇＧのＦｃドメインは、自己会合して安定した二量体を形成するように進化しており、かかる二量体が、各々ＩｇＧのＦｃ領域と融合したインスリン部分を含む２つの融合タンパク質から形成される場合、２つのインスリン部分が互いに近位にもたらされて、インスリンＢ鎖自己会合領域を通して媒介されるインスリン部分の自己会合または二量体化を可能にする。かかるインスリン二量体は不活性であるため、インスリン受容体アゴニスト部分の自己会合が低減した融合タンパク質を作製する必要があった。複数の更なる困難を克服して、商業的製造及び治療薬としての製剤化に好適な融合タンパク質を創出した。本発明は、既存のインスリン治療と比較して延長した期間の作用を有することで、最大で週に１回を含む既存のインスリン製品よりも低い頻度の注射を可能にするため、より高い頻度の注射を伴う既存の治療レジメンの複雑さ及びそれに関連する痛みを低減する融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、平坦な薬物動態プロファイル及び限定された周辺露出を有することで、インクレチン系療法剤などの付加的な糖尿病薬剤と組み合わせて提供される場合を含めて、低い日常的変動性及び低血糖の最小限の発生率をもたらす。本発明の融合タンパク質はまた、体重増加を引き起こすことなく長期間の作用を提供し得る。
【０００９】
本発明は、
ａ）一般式Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３を有するインスリン受容体アゴニストと
［式中、
ｉ）Ｚ１が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンＢ鎖類似体であり、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
（式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり；Ｘ２が、ＶまたはＧであり；Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり；Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり；Ｘ５が、ＨまたはＦであり；Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず；Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず；但し、インスリンＢ鎖類似体が、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む）（配列番号１）、
ｉｉ）Ｚ２が、５〜１０個のアミノ酸を含む第１のペプチドリンカーであり（ここで、アミノ酸のうちの少なくとも５個が、Ｇ残基である）、
ｉｉｉ）Ｚ３が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンＡ鎖類似体である
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１ＣＳＬＸ２ＱＬＥＮＹＣＸ３Ｘ４
（式中、Ｘ１が、ＴまたはＩであり；Ｘ２が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり；Ｘ３が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；Ｘ４が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず；但し、Ｘ３がＮである場合には、Ｘ４はＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない）（配列番号２）］、
ｂ）第２のペプチドリンカーと、
ｃ）ヒトＩｇＧのＦｃ領域と、を含み、
インスリン受容体アゴニストのＣ末端残基が、第２のペプチドリンカーのＮ末端残基に直接融合し、第２のペプチドリンカーのＣ末端残基が、ＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端残基に直接融合している、融合タンパク質を提供する。
【００１０】
本発明はまた、
ａ）一般式Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３を有するインスリン受容体アゴニストと、
［式中、
ｉ）Ｚ１が、以下のアミノ酸配列を有するインスリンＢ鎖類似体であり、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
（式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり；Ｘ２が、ＶまたはＧであり；Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり；Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり；Ｘ５が、ＨまたはＦであり；Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず；Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず；但し、インスリンＢ鎖類似体が、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む）（配列番号１）、
ｉｉ）Ｚ２が、５〜１０個のアミノ酸を含む第１のペプチドリンカーであり（ここで、アミノ酸のうちの少なくとも５個が、Ｇ残基である）、
ｉｉｉ）Ｚ３が、以下のアミノ酸配列を有するインスリンＡ鎖類似体である
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１ＣＳＬＸ２ＱＬＥＮＹＣＸ３Ｘ４
（式中、Ｘ１が、ＴまたはＩであり；Ｘ２が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり；Ｘ３が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；Ｘ４が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず；但し、Ｘ３がＮである場合には、Ｘ４はＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない）（配列番号２）］、
ｂ）第２のペプチドリンカーと、
ｃ）ヒトＩｇＧのＦｃ領域と、からなり、
インスリン受容体アゴニストのＣ末端残基が、第２のペプチドリンカーのＮ末端残基に直接融合し、第２のペプチドリンカーのＣ末端残基が、ＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端残基に直接融合している、融合タンパク質を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質及び少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明はまた、治療有効量の本発明の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病、肥満、脂質異常症、またはメタボリック症候群を患う患者を治療する方法を提供する。本発明はまた、治療有効量の本発明の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、心臓疾患、脳卒中、腎症、網膜症、及び腎疾患からなる群から選択される糖尿病関連状態を治療または防止する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、療法に使用するための本発明の融合タンパク質も提供する。
【００１４】
本発明は、医薬品の製造における本発明の融合タンパク質の使用も提供する。
【００１５】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００１６】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を産生させるためのプロセスを提供し、該プロセスは、
１．本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物宿主細胞を、該融合タンパク質が発現されるような条件下で培養するステップと、
２．融合タンパク質を該宿主細胞から回収するステップと、を含む。
【００１７】
本発明は、上記のプロセスによって産生させた融合タンパク質も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理ラット糖尿病モデルにおける例示的な本発明の融合タンパク質についての薬力学データを提供する。
【図２】本明細書に記載のタンパク質の構成の模式図を提供する。図２中の略図において使用する特定の形状（例えば、楕円形、半円形など）は、本発明の融合タンパク質の個々の構成要素の意味または構造を説明するかまたは特徴付けるようには意図されず、そのように解釈するように使用されるべきではないことに留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４またはＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリンの分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも２つの修飾を含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のアミノ酸配列を有し、式中、Ｘ６〜Ｘ９は、各々Ｇである。
【００２３】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４及びＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を有し、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨである。
【００２５】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の位置Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９の各々に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇである。
【００２７】
ある特定の実施形態では、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００３０】
ある特定の実施形態では、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ３はＮであり、Ｘ４は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、またはＰ以外のアミノ酸である。
【００３１】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４またはＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも２つの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３３】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のアミノ酸を有し、式中、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４及びＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の位置Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９の各々に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を有し、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【００３９】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４またはＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも２つの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４１】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４２】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のアミノ酸を有し、式中、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４３】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４及びＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方にヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４４】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１またはＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４５】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の位置Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９の各々に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２の両方に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２のＸ１及びＸ２に、ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含む。
【００４７】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４またはＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を含み、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００４８】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも２つの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００４９】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００５０】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のアミノ酸を有し、式中、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇであり、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００５１】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１のＸ４及びＸ５に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００５２】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を含み、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００５３】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の位置Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、及びＸ９の各々に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの修飾を含み、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００５４】
ある特定の実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の配列を有し、式中、Ｘ１はＦであり、Ｘ２はＶであり、Ｘ３はＮまたはＤであり、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、Ｘ６〜Ｘ９は各々Ｇであり、インスリンＡ鎖類似体は、配列番号２の配列を有し、式中、Ｘ１はＩまたはＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４は存在しない。
【００５５】
ある特定の実施形態では、第１のペプチドリンカー（Ｚ２）は、アミノ酸配列Ｘ１ＧＸ２ＧＧＧＧを含み、式中、Ｘ１は、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２は、Ｇ、Ｓであるか、または存在しない（配列番号３）。
【００５６】
ある特定の実施形態では、インスリン受容体アゴニスト、即ち、上記の融合タンパク質中のＺ１−Ｚ２−Ｚ３は、以下のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＧＸ１１ＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１２ＣＳＬＸ１３ＱＬＥＮＹＣＸ１４Ｘ１５
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ２が、ＶまたはＧであり、Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり、Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ５が、ＨまたはＦであり、Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず、Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず、Ｘ１０が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ１１が、Ｇ、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ１２が、ＴまたはＩであり、Ｘ１３が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ１４が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１５が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９のうちの少なくとも１つが、それぞれ、ヒトインスリン分子のＢ鎖の位置Ｂ１６、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、またはＢ３０に見出されるものとは異なるアミノ酸でなければならず、更に、Ｘ１４がＮである場合には、Ｘ１５が、ＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない（配列番号４）。
【００５７】
ある特定の好ましい実施形態では、インスリン受容体アゴニスト、即ち、上記の融合タンパク質中のＺ１−Ｚ２−Ｚ３は、以下のアミノ酸配列を有する。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号５）
【００５８】
ある特定の実施形態では、第２のペプチドリンカーは、１０〜２５個のアミノ酸を有するペプチドであり、該アミノ酸の少なくとも５０％がＧ残基である。ある特定の実施形態では、第２のペプチドリンカーは、アミノ酸配列［ＧＧＧＧＸ］ｎを含むペプチドであり、式中、Ｘが、Ｑ、Ｅ、またはＳであり、ｎが、２〜５である。ある特定の実施形態では、第２のペプチドリンカーは、以下のアミノ酸配列を含み、
ＧＧＧＧＸ１ＧＧＧＧＸ２ＧＧＧＧＸ３ＧＧＧＧＸ４Ｘ５Ｘ６
式中、Ｘ１が、ＱまたはＥであり、Ｘ２が、ＱまたはＥであり、Ｘ３が、ＱまたはＥであり、Ｘ４が、Ｇ、Ｅ、Ｑであるか、または存在せず、Ｘ５が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ６が、Ｇであるか、または存在しない（配列番号６）。
【００５９】
ある特定の好ましい実施形態では、第２のペプチドリンカーは、以下のアミノ酸配列を有する。
ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号７）
【００６０】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体の１つの重鎖からの断片を含む。かかるＩｇＧ領域を含む融合タンパク質の模式図を図２の略図（Ａ）で提供する。他の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体の２つの重鎖からの断片を含む。かかるＩｇＧ領域を含む融合タンパク質の模式図を図２の略図（Ｂ）で提供する。
【００６１】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４抗体からのＦｃ領域である。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、以下のアミノ酸配列を含むＩｇＧ１抗体からのＦｃ領域であり、
ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＸ１ＬＸ２ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＸ３ＶＸ４ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＸ５ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＸ６
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ２が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、ＶまたはＴであり、Ｘ４が、ＶまたはＴであり、Ｘ５が、Ｎ、Ｄ、またはＱであり、
Ｘ６が、Ｋであるか、または存在しない。（配列番号８）
【００６３】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号８のアミノ酸配列を含み、配列番号８中の位置１でのＣ残基のＮ末端側に対して、野生型ＩｇＧ１のＦｃ配列中に見出され得るアミノ酸の一部または全てを更に含む。
【００６４】
好ましくは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ４抗体のいずれかに由来する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、以下のアミノ酸配列を含むＩｇＧ４抗体からのＦｃ領域であり、
ＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＸ１ＬＸ２ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＸ３ＶＸ４ＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＸ５ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＸ６ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＸ７
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ２が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、ＶまたはＴであり、Ｘ４が、ＶまたはＴであり、Ｘ５が、Ｎ、Ｄ、またはＱであり、Ｘ６が、ＲまたはＫであり、Ｘ７が、Ｋであるか、または存在しない。（配列番号９）
【００６６】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、配列番号９中の位置１でのＣ残基のＮ末端側に対して、野生型ＩｇＧ４のＦｃ配列中に見出され得るアミノ酸の一部または全てを更に含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号９のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＦであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＶであり、Ｘ５がＮであり、Ｘ６がＲであり、Ｘ７が存在しない。
【００６７】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、以下のアミノ酸配列を有するＩｇＧ２抗体からのＦｃ領域であり、
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＸ１ＬＸ２ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＸ３ＶＸ４ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＸ５ＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＸ６
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ２が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、ＶまたはＴであり、Ｘ４が、ＶまたはＴであり、Ｘ５が、Ｎ、Ｄ、またはＱであり、Ｘ６が、Ｋであるか、または存在しない。（配列番号１０）
【００６８】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、配列番号１０中の位置１でのＥ残基のＮ末端側に対して、野生型ＩｇＧ２のＦｃ配列中に見出され得るアミノ酸の一部または全てを更に含む。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、配列番号１０のアミノ酸を含み、式中、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＦであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＶであり、Ｘ５がＮであり、Ｘ６が存在しない。
【００６９】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含み、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＧＸ１１ＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１２ＣＳＬＸ１３ＱＬＥＮＹＣＸ１４Ｘ１５ＧＧＧＧＸ１６ＧＧＧＧＸ１７ＧＧＧＧＸ１８ＧＧＧＧＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２ＣＰＰＣＰＡＰＸ２３Ｘ２４ＡＧＸ２５ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＸ２６ＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＸ２７ＲＶＶＳＶＬＴＶＸ２８ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＸ２９Ｘ３０ＩＥＫＴＩＳＫＸ３１ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＸ３２ＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＸ３３ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＸ３４ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＸ３５ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＸ３６Ｇ
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ２が、ＶまたはＧであり、Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり、Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ５が、ＨまたはＦであり、Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず、Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず、但し、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９のうちの少なくとも１つが、それぞれ、ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１６、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、またはＢ３０に存在するもの以外のアミノ酸であり、Ｘ１０が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ１１が、Ｇ、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ１２が、ＴまたはＩであり、Ｘ１３が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ１４が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１５が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、Ｘ１４がＮである場合には、Ｘ１５がＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならず、Ｘ１６が、ＱまたはＥであり、Ｘ１７が、ＱまたはＥであり、Ｘ１８が、ＱまたはＥであり、Ｘ１９が、Ｇ、Ｅ、Ｑであるか、または存在せず、Ｘ２０が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２１が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２２が、ＥまたはＰであり、Ｘ２３が、ＥまたはＰであり、Ｘ２４が、ＡまたはＶであり、Ｘ２５が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２６が、ＱまたはＨであり、Ｘ２７が、ＹまたはＦ、Ｘ２８が、ＬまたはＶであり、Ｘ２９が、ＳまたはＡであり、Ｘ３０が、ＳまたはＰであり、Ｘ３１が、ＡまたはＴであり、Ｘ３２が、ＱまたはＲであり、Ｘ３３が、ＶまたはＭであり、Ｘ３４が、ＲまたはＫであり、Ｘ３５が、ＥまたはＱであり、Ｘ３６が、ＬまたはＰである（配列番号１１）。
【００７０】
ある特定の実施形態では、本発明は、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群から選択される融合タンパク質を提供する。
【００７１】
好ましい実施形態では、融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を有する。
【表１】
0006591562.tif 000002
（配列番号１２）。
【００７２】
ある特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、二量体の形態で存在する。かかる二量体の模式図を図２の略図（Ｃ）で提供する。ある特定の実施形態では、二量体はホモ二量体であり、この二量体を作る２つの融合タンパク質のアミノ酸配列は同じである。ある特定の実施形態では、二量体はヘテロ二量体であり、この二量体を構成する２つの融合タンパク質のアミノ酸配列は異なる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の融合タンパク質、緩衝剤、界面活性剤、及び等張剤を含む。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、クエン酸及び／またはクエン酸塩であり、界面活性剤はポリソルベート８０であり、等張剤はマンニトールである。ある特定の実施形態では、組成物のｐＨは、約５．５〜約８．０の範囲である。ある特定の実施形態では、ｐＨは、約６．０〜約７．４の範囲である。ある特定の実施形態では、ｐＨは、約６．０〜６．７５の範囲である。
【００７４】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、付加的な活性成分を更に含む。ある特定の実施形態では、付加的な活性成分はインクレチン系療法剤である。ある特定の好ましい実施形態では、インクレチン系療法剤はＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。好ましくは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストはデュラグルチドである。
【００７５】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、１日１回の治療有効量の融合タンパク質の投与を含む。好ましい実施形態では、治療有効量の融合タンパク質は、週に１回投与される。ある特定の実施形態では、治療有効量の融合タンパク質は、月に１回投与される。ある特定の実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の融合タンパク質を患者に投与することを含む、低血糖及び／または体重増加のリスクを低減しながら真性糖尿病を患う患者を治療する方法を提供する。
【００７６】
本発明はまた、治療有効量の本発明の融合タンパク質を付加的な活性成分と組み合わせて投与することを含む、真性糖尿病、肥満、脂質異常症、またはメタボリック症候群を患う患者を治療する方法を提供する。かかる実施形態における融合タンパク質及び付加的な活性成分は、同時に、逐次に、または単一の組み合わせた製剤として投与され得るある特定の実施形態では、付加的な活性成分はインクレチン系療法剤である。ある特定の好ましい実施形態では、インクレチン系療法剤はＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。好ましくは、ＧＬＰ−１Ｒアゴニストはデュラグルチドである。ある特定の実施形態では、本組み合わせは１日１回投与される。ある特定の好ましい実施形態では、本組み合わせは、週に１回投与される。ある特定の実施形態では、本組み合わせは月１回投与される。
【００７７】
ある特定の実施形態では、本発明は、真性糖尿病、肥満、脂質異常症、またはメタボリック症候群の治療に使用するための本発明の融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、心臓疾患、脳卒中、腎症、網膜症、及び腎疾患からなる群から選択される糖尿病関連状態の治療または防止に使用するための本発明の融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の融合タンパク質を患者に投与することを含む、低血糖及び／または体重増加のリスクを低減しながら真性糖尿病を患う患者を治療することにおいて使用するための本発明の融合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、別の活性成分と同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するために提供される。ある特定の実施形態では、付加的な活性成分はインクレチン系療法剤である。ある特定の好ましい実施形態では、インクレチン系療法剤はＧＬＰ−１Ｒアゴニストである。
【００７８】
ある特定の実施形態では、本発明は、真性糖尿病、肥満、脂質異常症、またはメタボリック症候群の治療用医薬品の製造における本発明の融合タンパク質の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、心臓疾患、脳卒中、腎症、網膜症、及び腎疾患からなる群から選択される糖尿病関連状態の治療または防止用医薬品の製造における本発明の融合タンパク質の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、本発明の融合タンパク質を患者に投与することを含む、低血糖及び／または体重増加のリスクを低減しながら真性糖尿病を治療するための医薬品の製造における本発明の融合タンパク質の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、真性糖尿病、肥満、脂質異常症、またはメタボリック症候群の治療用医薬品の製造における本発明の融合タンパク質の使用を提供し、本医薬品は、別の活性成分と組み合わせて、同時、別々、または逐次に投与されることになる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「インスリン受容体アゴニスト」という用語は、インスリン受容体に結合し、それを活性化することで、下記の研究で示されるものなどの既知の技法を使用して試験及び測定することができる特徴である血糖値の低下及び／または肝臓でのグルコース生産の抑制をもたらすタンパク質を指す。
【００８０】
本発明の融合タンパク質のインスリン受容体アゴニスト部分は、インスリンＢ鎖の類似体及びインスリンＡ鎖の類似体を含む。本明細書で使用する場合、「インスリンＡ鎖」及び「インスリンＢ鎖」という用語は、天然の野生型配列が周知であるヒトインスリン分子（ＣＡＳ番号１１０６１−６８−０）のＡ及びＢ鎖を指す。ヒトインスリンＡ鎖は、以下の配列を有する当該技術分野ではＡ１〜Ａ２１と称される２１個のアミノ酸で構成される。
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１３）
【００８１】
ヒトインスリンＢ鎖は、以下の配列を有する当該技術分野ではＢ１〜Ｂ３０と称される３０個のアミノ酸で構成される。
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号１４）
【００８２】
ヒトインスリン分子中、Ａ及びＢ鎖は、ＣｙｓＡ７−ＣｙｓＢ７及びＣｙｓＡ２０−ＣｙｓＢ１９という２つのジスルフィド結合によって接合される。Ａ鎖はＣｙｓＡ６−ＣｙｓＡ１１に鎖内ジスルフィド結合を有する。
【００８３】
所望の長期間作用プロファイルを達成するために、本発明の融合タンパク質のインスリン受容体アゴニストは、長時間にわたって循環中に留まり、インスリン受容体と相互作用することが可能でなければならない。本発明の融合タンパク質が所望の期間循環中に留まるためには、融合タンパク質の排除を減衰させる必要がある。インスリン排除の２つの主要経路は、腎クリアランス及びインスリン受容体媒介性クリアランスである。Ｉｇｌｅｓｉａｓ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．２００８；１０：８１１−８２３を参照されたい。腎クリアランスを最低限に抑えるためには、流体力学的サイズが少なくともヒト血清アルブミン程度のサイズである分子が必要とされ、かかる流体力学的サイズは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域によって本発明の融合タンパク質に提供される。受容体媒介性クリアランスについては、融合タンパク質は、所望よりも急速な受容体媒介性クリアランスをもたらす程にインスリン受容体に対して強力であることはできないが、しかし、融合タンパク質は、商業的に適した用量で十分なグルコース制御を提供するのに足りる程には強力でなければならない。そのため、融合タンパク質の効力は慎重にバランスを取る必要があり、本発明の融合タンパク質の構造により、かかるバランスを達成することが可能となる。
【００８４】
インスリン分子は、二量体及び六量体へと自己会合する傾向にある。多数の役割がインスリンの進化的に保存された自己会合傾向について提案されており、これらには、（１）細胞内空胞貯蔵中の分子の化学的及び熱的安定化、（２）インビボでの単量体インスリンのフィブリル化からの保護、（３）細胞内発現中のシャペロン支援型安定化及び折り畳みの代用、ならびに／または（４）分泌輸送への不可欠性が含まれる。しかしながら、インスリンの活性形態は単量体である。
【００８５】
インスリン分子の自己会合傾向及びかかる自己会合した分子の不活性は本発明に関係しており、これは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域も、自己会合して二量体を形成する傾向にあり、典型的には、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合を通して共有的に会合し、かかる二量体は本発明の融合タンパク質中のヒトＩｇＧのＦｃ領域から形成される。ヒトＩｇＧのＦｃ領域の二量体化の結果として、２つのインスリン受容体アゴニスト「アーム」は互いに近位にあるため、比較的高い局所濃度で存在する。ヒトインスリンの場合、かかる近位は、インスリン部分の自己会合または二量体化に有利に働いて、分子の活性に影響し得る。インスリン部分アームが自己会合または二量体化状態となったＦｃ融合タンパク質二量体の模式図を、図２の略図（Ｄ）で提供する。インスリン分子が自己会合する傾向は、１つ超のＦｃ融合タンパク質二量体からのインスリン部分の自己会合または二量体化にも繋がり得る。２つのＦｃ融合タンパク質二量体の自己会合または二量体化したインスリン部分との二量体の模式図を図２の略図（Ｅ）で提供する。更に、２つ超のＦｃ融合タンパク質二量体におけるインスリン部分も、例えば、３つの二量体で構成される三量体、または３つ超の二量体で構成される更により高次の集合体を形成するような様式で自己会合し得る。
【００８６】
しかしながら、本発明の融合タンパク質のインスリン受容体アゴニスト部分は自己会合または二量体化する傾向が減少しているため、本発明の融合タンパク質で構成される融合タンパク質二量体は、図２の略図（Ｄ）及び（Ｅ）に示す構造とは対照的に、図２の略図（Ｃ）に示す構造に有利に働く傾向にある。このため、本発明は２つの融合タンパク質の二量体を提供するが、二量体中の各融合タンパク質のインスリン受容体アゴニスト「アーム」は、例えば図１の略図（Ｃ）に示すように、主に単量体である状態を維持するため、インスリン受容体と相互作用することが更に可能である。
【００８７】
本発明の融合タンパク質において、インスリン受容体アゴニスト中のインスリンＢ鎖の類似体は、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列に対する１つ以上の修飾を含む。具体的には、インスリン受容体アゴニスト部分が自己会合または二量体化する性向を低減するために、インスリンＢ鎖類似体は、それぞれ位置Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６〜９として配列番号１中で表される位置Ｂ１６、Ｂ２５、またはＢ２７〜３０，に、ヒトインスリン分子のＢ鎖からの１つ以上の修飾を含む。例えば、Ｘ４（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ１６と対応する）は、Ｅ、Ｑ、またはＨに修飾され得、Ｘ５（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ２５と対応する）は、Ｈに修飾され得、Ｘ６（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ２７と対応する）は、欠失するか、またはＧ、Ｓ、Ｈ、もしくはＶに修飾され得、Ｘ７（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ２８と対応し）は、欠失するか、またはＧ、Ｅ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、もしくはＨであり得、Ｘ８（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ２９と対応する）は、欠失するか、またはＧ、Ｅ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、もしくはＨに修飾され得、Ｘ９（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ３０と対応する）は、欠失するか、またはＧ、Ｓ、Ｅ、またはＫに修飾され得る。インスリン受容体アゴニスト部分が自己会合する性向の低減に加えて、インスリンＢ鎖類似体上の位置Ｂ１６及びＢ２５（それぞれ、配列番号１のＸ４及びＸ５）に修飾を行って、効力を調整し、発現を改善し、化学的及び／または物理的安定性を改善し、融合タンパク質を他の一般に使用される賦形剤と共に製剤化し得る容易性を改善し、かつ／あるいは脱アミド化を排除してもよい。インスリンＢ鎖類似体も、これらの理由で更なる修飾を含み得る。配列番号１中の変数を参照して、かかる更なる修飾には、Ｘ１（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ１と対応する）のＱもしくはＡへの修飾、Ｘ２（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ２と対応する）のＧへの修飾、及び／またはＸ３（ヒトインスリン分子のＢ鎖中のＢ３と対応する）のＫ、Ｄ、またはＧへの修飾が含まれる。
【００８８】
ある特定の好ましい実施形態では、インスリンＢ鎖類似体は、配列番号１の位置Ｘ４、Ｘ５、及びＸ６〜９に、ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列への１つ超の修飾を含む。好ましい実施形態では、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨである。ある特定の実施形態では、配列番号１のＸ６〜Ｘ９のアミノ酸配列は、ＧＧＥＳ、ＧＧＧＳ、ＧＧＤＳ、ＧＧＥＧ、ＧＧＧＧ、ＳＳＥＳ、ＳＳＧＳ、ＧＧＥＥ、ＧＧＧＥ、ＧＧＥＫ、ＧＧＧＫ、ＴＰＧＳ、ＴＧＧＳ、ＨＧＥＳ、ＧＨＥＳ、ＧＧＨＳ、ＧＧＥＨ、ＨＧＧＳ、ＧＨＧＳ、ＧＧＧＨ、ＧＧＤＤ、ＶＧＥＳ、ＴＥＥＴ、ＴＫＰＴ、ＧＧＧＧ、ＴＧＧＧ、ＴＰＧＧ、ＥＰＫＴ、ＴＤＫＴ、ＴＰＧＳ、ＥＧＧＳ、ＥＧＥＳ、ＥＥＥＳ、ＥＰＥＳ、ＥＰＥＰ、及びＧＧＤＤからなる群から選択される。好ましい実施形態では、これら４つのアミノ酸の配列は、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧ、またはＴＥＥＴである。特に好ましい実施形態では、Ｘ４はＥであり、Ｘ５はＨであり、Ｘ６〜９はＧＧＧＧである。
【００８９】
配列番号１のＸ６〜Ｘ９はインスリンＢ鎖類似体（Ｚ１）のＣ末端部を含むと上に記載したが、これらのアミノ酸は、インスリン受容体での融合タンパク質の活性に不可欠ではないため、代替的に第１のペプチドリンカー（Ｚ２）の延長と見なしてもよいことに留意されたい。例えば、配列番号４の文脈では、Ｘ６〜Ｘ９は、そのインスリン受容体アゴニストにおけるインスリンＢ鎖類似体の一部または第１のペプチドリンカーのいずれかと見なし得る。
【００９０】
本発明の融合タンパク質において、インスリン受容体アゴニスト部分中のインスリンＡ鎖の類似体は、化学的及び物理的安定性を改善し、効力を調整し、かつ／または発現を強化することを意図した１つ以上のヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列への１つ以上の修飾を含んでもよい。配列番号２中の変数を参照して、これらの修飾には、Ｘ１（ヒトインスリン分子のＡ鎖中のＡ１０と対応する）のＴへの修飾、Ｘ２（ヒトインスリン分子のＡ鎖中のＡ１４と対応する）のＤ、Ｑ、もしくはＥへの修飾、及び／またはＸ３（ヒトインスリン分子のＡ鎖中のＡ２１と対応する）のＧ、Ｓ、もしくはＡへの修飾が含まれる。好ましい実施形態では、Ｘ１はＴであり、Ｘ２はＤであり、Ｘ３はＧである。
【００９１】
更に、脱アミド化ならびに化学的及び／またはタンパク質分解的切断を回避するために、インスリン受容体アゴニスト中のインスリンＡ鎖の類似体における位置２１のアミノ酸、即ち、配列番号２におけるＸ３がＮである場合（ヒトインスリン分子における対応する位置に存在するアミノ酸）、その直後にＣ末端側で、ＧもしくはＮ、またはある特定の実施形態では、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＬなどのある特定のアミノ酸が続いてはならない。例えば、Ｖｌａｓａｋ  Ｊ，Ｉｏｎｅｓｃｕ  Ｒ．，ＭＡｂｓ．２０１１  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：２５３−６３．Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照されたい。この要件はインスリンＡ鎖の類似体に関する配列番号２における位置Ｘ４及びＸ５についての選択肢の文脈で上に記載した第１の融合タンパク質において列挙されるが、インスリンＡ鎖の類似体における位置２１でのアスパラギン残基に続く非グリシン残基が、第２のペプチドリンカーとは対照的に、必ずしもインスリン受容体アゴニストの一部と見なされる必要はないことに留意されたい。例えば、配列番号１１の文脈では、Ａ鎖類似体部分における位置２１と対応する残基はＸ１４によって表され、続くアミノ酸Ｘ１５は、インスリン受容体アゴニストの一部または第２のペプチドリンカーのいずれかと見なされ得る。
【００９２】
上記のように、本発明の融合タンパク質においては、インスリンＢ鎖類似体のＣ末端残基は、第１のペプチドリンカーのＮ末端残基に直接融合し、第１のペプチドリンカーのＣ末端残基は、インスリンＢ鎖類似体のＮ末端残基に直接融合している。第１のペプチドリンカーは、インスリン受容体への結合に必要な構造を達成するためにインスリンＡ鎖及びＢ鎖の類似体に十分な柔軟性を提供する必要があるが、それが長すぎてその結合に過度に干渉するようではならない。融合タンパク質の効力及び／または発現を調整するために、第１のペプチドリンカーの長さ及び組成を調整してもよい。一部の実施形態では、第１のペプチドリンカーは、アミノ酸長が５〜１０個であり、そのうちの少なくとも５個がＧ残基である。ある特定の実施形態では、第１のペプチドリンカーのアミノ酸配列は、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＥＧＧＧＧＧ、ＧＥＧＧＧＧ、ＧＧＥＧＧＧ、ＧＧＧＥＧＧ、ＧＧＧＧＥＧ、ＧＧＧＧＧＥ、ＫＧＧＧＧＧ、ＧＫＧＧＧＧ、ＧＧＫＧＧＧ、ＧＧＧＫＧＧ、ＧＧＧＧＫＧ、ＧＧＧＧＧＫ、ＨＧＧＧＧＧ、ＧＨＧＧＧＧ、ＧＧＨＧＧＧ、ＧＧＧＨＧＧ、ＧＧＧＧＨＧ、ＧＧＧＧＧＨ、ＧＧＧＧＧＡ、ＧＧＧＧＧＲ、ＳＧＧＧＧＧ、ＧＳＧＧＧＧ、ＧＧＳＧＧＧ、ＧＧＳＧＧＧＫ、ＧＧＳＧＧＧＧ、及びＧＧＳＧＧＧからなる群から選択される。ある特定の好ましい実施形態では、第１のペプチドリンカーの配列は、配列番号３を含む。最も好ましくは、第１のペプチドリンカーの配列は、ＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５）である。本発明の融合タンパク質のインスリン受容体アゴニスト部分はまた、上記のヒトインスリン分子中に見出されるジスルフィド結合、つまり、ＣｙｓＡ７−ＣｙｓＢ７及びＣｙｓＡ２０−ＣｙｓＢ１９に、インスリンＡ鎖及びＢ鎖の類似を接合する２つのジスルフィド結合、ならびにＣｙｓＡ６−ＣｙｓＡ１１でのインスリンＡ鎖の類似体中の鎖内ジスルフィド結合を含む。
【００９３】
上記のように、本発明の融合タンパク質のインスリン受容体アゴニスト部分のＣ末端残基は、第２のペプチドリンカーのＮ末端残基に融合し、第２のペプチドリンカーのＣ末端残基は、Ｆｃ部分のＮ末端残基に直接融合している。十分な配座柔軟性を提供するために、第２のペプチドリンカーがグリシン豊富であることが好ましい。好ましくは、第２のペプチドリンカーは、アミノ酸長が３０個未満である。ある特定の好ましい実施形態では、第２のペプチドリンカーは、アミノ酸長が１０〜２５個であり、これらのアミノ酸の少なくとも５０％がグリシン残基である。好ましい第２のペプチドリンカーは、配列（ＧＧＧＧＸ１５）ｎを含み、式中、Ｘ１５は、Ｑ、Ｅ、またはＳであり、ｎ＝２〜５である。より好ましい第２のペプチドリンカーは、配列番号６のアミノ酸配列である。最も好ましい第２のペプチドリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号７）を有する。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「ヒトＩｇＧのＦｃ領域」という用語は、免疫学の分野で一般的に付与される意味を有する。具体的には、本用語は、抗体から２つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を除去することによって得られるヒトＩｇＧ抗体断片を指す。特に、Ｆｃ領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３定常領域ドメインを含み、またヒンジ領域の一部または全てを含んでもよい。
【００９５】
上記のように、本発明の融合タンパク質のある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体の１つの重鎖からの定常領域の断片を含み（この模式図は図２の略図（Ａ）で提供する）、他の実施形態では、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ抗体の２つの重鎖からの定常領域の断片を含む（この模式図は図２の略図（Ｂ）で提供する）。この実施形態では、２つの重鎖の定常領域は、非共有的相互作用及びジスルフィド結合を通して互いに会合する。
【００９６】
４つのＩｇＧサブクラス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、及びＧ４）が存在し、その各々が、異なる構造、及びエフェクター機能として知られる生物学的機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用を通して、または相補因子Ｃ１ｑの結合によって媒介される。ＦｃγＲへの結合は抗体依存性細胞媒介性細胞溶解をもたらし得る一方、相補因子への結合は補体媒介性細胞溶解をもたらし得る。ＩｇＧサブクラスのＦｃ領域の構造及び特性は当該技術分野で既知である。本発明の融合タンパク質は、ＩｇＧサブクラスのうちのいずれからのＦｃ領域を含んでもよいが、Ｇ２及びＧ４は、Ｇ１及びＧ３抗体よりも低い受容体結合及びエフェクター機能活性を有するため、好ましい。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「ヒトＩｇＧのＦｃ領域」という用語はまた、例えば、補体及び／もしくはＦｃ受容体結合機能、エフェクター機能、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、製造可能性、ならびに／または安定性などの特性または特徴を改変するために、修飾された、伸長された、ならびに／または短縮されたバージョンのかかる抗体断片を含む。例えば、本発明の融合タンパク質のヒトＩｇＧのＦｃ領域は、Ｎ結合グリコシル化部位を低減または除去するように修飾されてもよく、これが、Ｃ１ｑ結合親和性及び細胞毒性を低減することになり、免疫原性を補助し、配座安定性及びインビボのクリアランス速度に影響し、かつ／またはエフェクター機能を修飾し得る。本発明の融合タンパク質のヒトＩｇＧのＦｃ領域はまた、ジスルフィド媒介性Ｆｃ二量体化を簡素化するために、ヒンジ領域の一部または全てが除去されていてもよい。改変の他の例としては、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、及び／またはヘテロ二量体分子の産生を可能にする修飾が挙げられる。ＩｇＧサブクラスのヒトＩｇＧのＦｃ領域の構造及び特性を修飾するための技法は、当該技術分野で既知である。
【００９８】
融合タンパク質の最終構造にかかわらず、ヒトＩｇＧのＦｃ領域は、インスリン受容体アゴニストのインビボの血漿半減期を延長するように作用する必要がある。半減期を延長する能力のためにＦｃ部分を利用する場合の異種Ｆｃ融合タンパク質の調製においては、いずれのエフェクター機能も最低限に抑えることが重要である。更に、融合インスリン受容体アゴニストは、下記の研究で示されるものなどの既知の技法を使用して試験及び測定することができる特徴である血糖値の低下及び／または肝臓でのグルコース生産の抑制をもたらすために、依然としてインスリン受容体に結合し、それを活性化することが可能でなければならない。本発明の融合タンパク質中の長い半減期は、例えば、下記の方法を使用して示すことができる。
【００９９】
１つの好ましいヒトＩｇＧのＦｃ領域は、エフェクター機能を更に低減し、ホモ二量体形成を促進し、式中、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＦであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＶであり、Ｘ５がＮであり、Ｘ６がＲであり、Ｘ７が存在しない、配列番号９においてのように、ヒンジの一部が欠失するように修飾されたＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【０１００】
別の好ましいヒトＩｇＧのＦｃ領域は、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＦであり、Ｘ３がＶであり、Ｘ４がＶであり、Ｘ５がＮであり、Ｘ６が存在しない、配列番号１０のように、ヒンジの一部が欠失したＩｇＧ２のＦｃ領域である。
【０１０１】
上に挙げた好ましいヒトＩｇＧのＦｃ領域のアミノ酸配列は、ジスルフィド媒介性二量体化を簡素化するためにヒンジ領域の一部が除去されているが、これらのヒンジ領域は、ある特定の実施形態では存在してもよいことに留意されたい。例えば、野生型ＩｇＧ２のＦｃ領域は、そのＮ末端部に６つのアミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶを含み、これらのアミノ酸は配列番号１０において示すＩｇＧ２のＦｃ領域配列中では挙げられていないものの、配列番号１０において示すアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧのＦｃ領域は、そのＮ末端部に６個のアミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶの一部または全てを更に含み得ることが企図される。同様に、配列番号９において示すアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ４のＦｃ領域のＮ末端部に見出される６個のアミノ酸、即ち、ＥＳＫＹＧＰの一部または全てを更に含んでもよい。同じく、配列番号８において示すアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ１のＦｃ領域のＮ末端部に見出される１０個のアミノ酸、即ち、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴの一部または全てを更に含んでもよい。更に、第２のペプチドリンカーのＣ末端部を構成するアミノ酸と、ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端部を構成するアミノ酸との間の厳密な描写は、本発明の融合タンパク質の構造または機能に必須ではない。例えば、配列番号１１の文脈では、位置Ｘ１９〜Ｘ２２と対応する残基は、第２のペプチドリンカーのＣ末端部またはヒトＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端伸長部のいずれかとして記載され得る。
【０１０２】
上記のように、本発明は、本発明の融合タンパク質のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドにも関する。上記の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含み、かつ二本鎖または一本鎖であってもよい、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。本発明のタンパク質をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複または縮退の結果として変化し得る。
本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る：タンパク質に対するコード配列のみ、タンパク質に対するコード配列及び更なるコード配列、例えば、リーダーもしくは分泌配列または前駆タンパク質配列、タンパク質に対するコード配列及び非コード配列、例えば、タンパク質に対するコード配列のイントロンまたは非コード配列５’及び／もしくは３’。このため、「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」という用語は、タンパク質に対するコード配列だけでなく、更なるコード及び／または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含み得るポリヌクレオチドを包含する。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に動作可能に結合した後で宿主細胞において発現されることになる。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分のいずれかとして宿主生物中で複製可能である。一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列によって転換された細胞の検出を可能にするための選択マーカーを含有することになる。
【０１０４】
本発明の融合タンパク質は、当該技術分野で既知の技法を使用して培養される、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞において、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、もしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅなどの細菌細胞において、昆虫細胞において、または真菌もしくは酵母菌細胞において容易に産生され得る。しかしながら、昆虫及び酵母菌または他の真菌細胞は非ヒトＮ−グリカンを産生するため、かかる細胞中で産生されたＮ結合グリコシル化を有するタンパク質は、患者に投与すると免疫原性反応を引き起こし得る。かかる細胞における産生は、このため、当該技術分野で既知の技法を使用する、Ｎ結合グリコシル化部位の除去及び／またはヒトＮ−グリカンを産生させるための細胞の遺伝子操作を必要とする。例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ，３０１Ｓｃｉｅｎｃｅ（５６３７）：１２４４−６（Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）を参照されたい。哺乳動物細胞における産生が好ましく、好ましい哺乳動物宿主細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）発現系を含有するＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株である（米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）。
【０１０５】
関心のポリヌクレオチド配列（例えば、融合タンパク質及び発現制御配列）を含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて異なる周知の方法によって宿主細胞中に移入することができる。例えば、原核細胞には塩化カルシウム転換が一般的に利用される一方、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る。
【０１０６】
タンパク質精製の種々の方法を用いてもよく、かかる方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−８９（１９９０）及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されている。
【０１０７】
上記のように、ある特定の実施形態における本発明の融合タンパク質は、二量体として産生される。かかる二量体において、融合タンパク質のヒトＩｇＧのＦｃ領域は、非共有的相互作用及びジスルフィド結合を通して互いに会合する。かかる二量体の模式図を図２の略図（Ｃ）で提供する。かかる二量体を構成する２つの融合タンパク質（例えば、図２の略図（Ｃ）で示す二量体における融合タンパク質Ａ及び融合タンパク質Ｂ）のアミノ酸配列が同じである場合、この二量体を本明細書では「ホモ二量体」と称する。上述のように、哺乳動物細胞における本発明の融合タンパク質の発現が好ましく、かかる細胞中の発現がホモ二量体をもたらす。かかるホモ二量体中の融合タンパク質は、Ｆｃ部分における非共有的相互作用及び分子間ジスルフィド結合を通して会合する。例えば、配列番号１２の融合タンパク質をコードする遺伝子によって産生されるタンパク質は、鎖間ジスルフィド結合、即ち、Ｃ８０からＣ８０及びＣ８３からＣ８３を通して共有結合するホモ二量体であり得る。
【０１０８】
二量体を構成する２つの融合タンパク質（例えば、図２の略図（Ｃ）中の融合タンパク質Ａ及び融合タンパク質Ｂ）のアミノ酸配列が異なる場合、この二量体を本明細書では「ヘテロ二量体」と称する。かかるヘテロ二量体は、当該技術分野で既知の技法によって調製され得る。例えば、Ｌｅｗｉｓ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（２）：１９１−８（２０１４）、Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８（１−２）：７−１５（２００１）、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９（７）：６１７−２（１９９６）を参照されたい。
【０１０９】
融合タンパク質を含む医薬組成物への本明細書における言及は、その融合タンパク質のホモ二量体を含有し、かつ／またはヘテロ二量体の一員がその融合タンパク質であるヘテロ二量体を含有する、医薬組成物を含む。同様に、融合タンパク質の投与を含む方法への本明細書における言及は、その融合タンパク質のホモ二量体の投与、及び／またはヘテロ二量体の一員がその融合タンパク質であるヘテロ二量体の投与を含む。同じく、療法に使用するための融合タンパク質及び／または医薬品の製造に使用するための融合タンパク質への言及は、療法及び／または医薬品の製造に使用するための、その融合タンパク質のホモ二量体、及び／またはヘテロ二量体の一員がその融合タンパク質であるヘテロ二量体を含む。
【０１１０】
「治療」または「治療すること」という用語は、本明細書で使用する場合、糖尿病もしくは高血糖、または他の状態（インスリン投与がこれらの状態の症状及び合併症に対抗するかまたはそれらを緩和する目的に適応されるもの）を有する患者の管理及び看護を指す。治療することは、本発明の融合タンパク質を投与して症状もしくは合併症の発症を防止するかもしくは遅延させること、症状もしくは合併症を緩和すること、または疾患、状態、もしくは障害を排除することを含む。治療される患者は、哺乳動物、好ましくは、人間である。
【０１１１】
「防止する」または「防止すること」という用語は、本明細書で使用する場合、１つ以上の状態、症状、合併症、もしくは疾患のリスクもしくは発生率の低減、またはそれらの進行の排除もしくは遅延を指す。
【０１１２】
本発明の融合タンパク質を使用して、多岐にわたる疾患及び状態を患う対象を治療することができる。未治療対象及び経口薬剤による治療を受けている対象を含む、高血糖、インスリン依存性糖尿病を患う対象、及び非インスリン依存性糖尿病を患う対象が含まれ、経口薬剤とは、スルホニル尿素、メトホルミン、ピオグリタゾンなどのチアゾリジンジオン、アカルボースなどのα−グルコシダーゼ阻害剤、ならびに／またはＤＰＰ−４阻害剤及びＧＬＰ−１Ｒアゴニストなどのインクレチン系療法剤を含む非インスリン注射剤などである。本発明の融合タンパク質は、かかる患者において血糖を調節するために使用してもよく、網膜症、神経障害、または腎疾患などの不十分な血糖管理から生じる状態または合併症を治療し得る。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、毎日、隔日、週に２回、週に３回、週に１回、月に２回、または月に１回投与される。好ましい実施形態では、作用期間が著しく延長されて、週に１回の投薬が可能である。しかしながら、かかる長時間作用型分子であっても、有効なグルコース制御は、１日１回などのより頻繁の高い治療レジメンを使用して、長期の薬物動態プロファイルを有する薬物を徐々に投薬蓄積することによっても提供され得ることが、当業者によって認識されるであろう。例えば、Ｈｅｉｓｅ  Ｔ  ａｎｄ  Ｍｅｎｅｇｈｉｎｉ  ＬＦ，２０  Ｅｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．ｐ７５−８３（２０１４）を参照されたい。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、インスリンもしくはインスリン類似体、インクレチン系療法剤、または経口糖尿病薬、例えば、スルホニル尿素、メトホルミン、ピオグリタゾンなどのチアゾリジンジオン、もしくはアカルボースなどのα−グルコシダーゼ阻害剤といった、付加的な活性成分と組み合わせて投与される。
【０１１５】
「インクレチン系療法剤」は、インクレチンとして知られる代謝ホルモンの、ＧＬＰ−１及び胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）を含む群の投与を含むか、またはその効果を促進し、可能にし、強化し、かつ／もしくは刺激する、任意の治療を含む。現在利用可能なインクレチン系療法剤としては、ＤＰＰ−４阻害剤及びＧＬＰ−１Ｒアゴニストが挙げられる。
「ＤＰＰ−４阻害剤」は、インクレチン分解に関与するＤＰＰ−４酵素を妨害する化合物である。現在利用可能なＤＰＰ−４阻害剤としては、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ（登録商標））及びリナグリプチン（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ（登録商標））が挙げられる。
【０１１６】
「ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト」は、ＧＬＰ−１受容体に対して活性を維持する、天然ヒトＧＬＰ−１のアミノ酸配列（配列番号２５）、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、またはＧＬＰ−１融合タンパク質を含む化合物として定義される。ＧＬＰ−１Ｒ活性は、当該技術分野で既知の方法によって測定してもよく、これには、それぞれＥＰ  ６１９，３２２及び米国特許第５，１２０，７１２号に記載されているように、ＧＬＰ−１受容体結合活性または受容体活性化を測定するインビボ実験及びインビトロアッセイ、例えば、膵島細胞またはインスリノーマ細胞を用いるアッセイの使用が含まれる。ＧＬＰ−１類似体は、天然ヒトＧＬＰ−１のアミノ酸配列（配列番号２５）と比較したときに、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、反転、または付加を含む修飾を有する分子である。ＧＬＰ−１誘導体は、天然ヒトＧＬＰ−１（配列番号２５）またはＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列を有するが、そのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基のうちの１つ以上の少なくとも１つの化学的修飾を更に有する分子である。ＧＬＰ−１融合タンパク質は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、またはＧＬＰ−１誘導体部分、及び第２のポリペプチドを含む異種タンパク質である。現在利用可能なＧＬＰ−１Ｒアゴニストとしては、（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標）及びＢｙｄｕｒｅｏｎ（登録商標））、リラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））、アルビグルチド（Ｔａｎｚｅｕｍ（登録商標））、及びデュラグルチド（Ｔｒｕｌｉｃｉｔｙ（登録商標））が挙げられ、これらの構造は当該技術分野で既知である。例えば、ＵＳ  ５，４２４，２８６（エキセナチド）、ＵＳ  ６，２６８，３４３（リラグルチド）、ＵＳ  ２０１４０４４７１７（アルビグルチド）、及びＵＳ  ７，４５２，９６６（デュラグルチド）を参照されたい。
【０１１７】
本発明の融合タンパク質が付加的な活性成分と組み合わせて提供される実施形態では、融合タンパク質及び付加的な活性成分は、同時に、逐次に、または単一の組み合わせた製剤として投与され得る。
【０１１８】
本発明の融合タンパク質は、治療有効量の本発明の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することによって、かかる疾患及び状態を治療することにおいて有効である。本明細書で使用する場合、「治療有効量」という語は、許容されない副作用を引き起こすことなく患者における血糖を調節するのに十分な本発明の融合タンパク質の量を指す。対象に投与される治療有効量の融合タンパク質は、疾患の種類及び重症度、ならびに全般的な健康、年齢、性別、体重、及び薬物耐性などの対象の特徴に応じることになる。当業者であれば、これら及び他の因子に応じて適切な用量を決定することができるであろう。ある特定の実施形態では、週に１回投与される場合の本発明の融合タンパク質の治療有効量は、約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲である。より好ましくは、週に１回投与される場合の本発明の融合タンパク質の治療有効量は、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲である。より好ましくは、週に１回投与される場合の本発明の融合タンパク質の治療有効量は、約１６ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２５ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲である。ある特定の実施形態では、週に１回投与される場合の本発明の融合タンパク質の治療有効量は、約１ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲である。より好ましくは、週に１回投与される場合の本発明の融合タンパク質の治療有効量は、約２５ｍｇ〜約１７５ｍｇの範囲である。より好ましくは、週に１回投与される場合の本発明の融合タンパク質の治療有効量は、約１００ｍｇ〜約１６０ｍｇの範囲である。
【０１１９】
当業者であれば、本発明の融合タンパク質をＧＬＰ−１Ｒアゴニストなどの別の活性成分と組み合わせて投与する場合、組み合わせた２つの治療の活性が患者において血糖を調節するのに十分であるように、用量を調整してもよいことを理解することになる。このため、かかる組み合わせで血糖値を調節するために投与する必要がある融合タンパク質の量は、融合タンパク質を単剤療法として投与した場合に必要とされるものより少なくてもよい。例えば、本発明の融合タンパク質をＧＬＰ−１Ｒアゴニストと組み合わせて提供する場合、週１回の投薬で提供すべき融合タンパク質の量は、前段落で記載した用量などの単剤療法として使用するための同じ融合タンパク質の量と比較して、最大で５０％低減し得る。
【０１２０】
好ましくは、一部の実施形態における治療有効量の本発明の融合タンパク質の投与は、既存の治療と比較して、低血糖及び／または体重増加のリスクを低減しながら効果的なグルコース制御を提供することになる。インスリン受容体を刺激する糖尿病療法によって引き起こされる低血糖の発生率は、投与後に治療薬の濃度が急上昇するのを回避することによって最低限に抑え得る。本発明の融合タンパク質は、投与後に濃度が急上昇しない長期間作用プロファイルを有する。
【０１２１】
更に、本発明の融合タンパク質を、別の活性成分、特にＧＬＰ−１Ｒアゴニストと組み合わせて提供する実施形態では、本発明の融合タンパク質の肝臓選択的活性は、血糖値を制御しながら低血糖のリスクも低減し得る。本発明の融合タンパク質は有窓類洞内皮を通して肝臓に容易にアクセスできるため、分子は、周辺での活性がほぼないに等しく肝臓でのグルコース生産を制御することができ、同時にＧＬＰ−１Ｒアゴニストが、周辺に容易に分散することができる膵臓からの内因性インスリンのグルコース依存性分泌を促進して、筋肉及び脂肪中のグルコース取り込みを制御する。
【０１２２】
本発明の融合タンパク質は、非経口、経鼻投与、または肺吸入によって投与される。非経口投与が好ましく、これには、例えば、全身投与、筋肉内、静脈内、皮下、または腹腔内注射によるものなどの全身投与が含まれ得る。
【０１２３】
融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質及び少なくとも１つの  薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物で対象に投与することができる。かかる医薬組成物は、必ずではないが典型的に、本来非経口であり、当該技術分野で周知である非経口製品用の従来の賦形剤を使用して種々の技法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照されたい。上記のように、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現される場合、ホモ二量体である。このため、本明細書で使用する場合、「融合タンパク質を含む組成物」という用語は、融合タンパク質のホモ二量体を含有する組成物を含む。ある特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の融合タンパク質が、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上の濃度で存在する組成物を含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、１０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。より好ましい実施形態では、融合タンパク質は、１５〜７５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在し、最も好ましい実施形態では、融合タンパク質は、２０〜６５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【０１２４】
「賦形剤」という用語は、融合タンパク質または任意の他の付加的な活性成分（複数可）以外の、組成物に添加される任意の物質を意味する。本発明の組成物中で使用され得るかかる賦形剤の例としては、緩衝剤、界面活性剤、等張剤、及び防腐剤が挙げられる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、組成物のｐＨを制御するために１つ以上の緩衝剤を含む。「緩衝剤」は、その酸塩基共役体構成要素の作用によってｐＨの変化に抵抗する物質である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、約５．５〜約８．０、好ましくは約６．０〜約７．４、より好ましくは約６．０〜約６．７５のｐＨを有する。所望の範囲にある本発明の組成物のｐＨを制御するのに好適な緩衝剤としては、リン酸塩、済酸塩、クエン酸塩、またはこれらの酸、アルギニン、ＴＲＩＳ、及びヒスチジン緩衝液、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。「ＴＲＩＳ」は、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３，−プロパンジオール、及びその任意の薬理学的に許容される塩を指す。遊離塩基及び塩酸塩形態（即ち、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）は、２つの一般的なＴＲＩＳの形態である。ＴＲＩＳは、当該技術分野では、トリメチロールアミノメタン、トロメタミン、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとしても知られる。本発明の組成物中で好ましい緩衝剤は、クエン酸塩またはクエン酸、及びリン酸である。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、細胞腫脹または細胞破裂による注射時の痛みを最低限に抑えるために１つ以上の等張剤を含む。「等張剤」は、生理学的に認められ、投与される医薬組成物と接触している細胞膜にわたる水の流入を防止するために製剤に好適な等張性を授ける化合物である。既知の等張剤としては、グリセロール、塩化ナトリウムなどの塩、ならびにマンニトール、ブドウ糖、及び乳糖を含むがこれらに限定されない単糖が挙げられる。好ましい等張剤（複数可）は、マンニトール及び塩化ナトリウムである。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は界面活性剤を含む。「界面活性剤」は、液体の表面張力を低下させる物質である。医薬組成物中で使用され、本発明のある特定の組成物中で使用されてもよい界面活性剤の例としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ３０００、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）、ポリエチレングリコールアルキルエーテル（例えば、ＢＲＩＪ）、ポリプロピレングリコールコポリマー（例えば、ポロキサマー、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８；ポロキサマー４０７、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ１２７；ＴＥＴＲＯＮＩＣＳ）、ソルビタンアルキルエステル（例えば、ＳＰＡＮ）、ポリエトキシル化ヒマシ油（例えば、ＫＯＬＬＩＰＨＯＲ、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ）、及びトレハロースが挙げられる。
【０１２８】
本発明の医薬組成物はまた、防腐剤を含有してもよい。「防腐剤」という用語は、多回使用型及び／または滴定型組成物中で抗菌剤として作用するように薬学的製剤に添加される化合物を指す。非経口製剤中で効果的かつ許容可能であるとして当該技術分野で既知である防腐剤は、中でも、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン（ｃｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ）、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチル−またはプロピル−パラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、及びこれらの種々の混合物である。フェノール系防腐剤としては、化合物であるフェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、メチルパラベン、及びこれらの混合物が挙げられる。防腐剤が必要な場合、本発明の組成物中で使用される防腐剤は、ｍ−クレゾールまたはフェノールのいずれかであることが好ましい。
【０１２９】
フェノール及びｍ−クレゾールなどのある特定のフェノール系防腐剤は、インスリン及びインスリン六量体に結合することで配座変化を安定させ、これが物理的安定性もしくは化学的安定性のいずれか、またはそれらの両方を増加させることが知られている。しかしながら、他のタンパク質を含む組成物中では、かかる防腐剤は、タンパク質集合体または高分子ポリマー（ＨＭＷＰ）の形成に寄与し得る。例えば、Ｍａａ  ＹＦ  ａｎｄ  Ｈｓｕ  ＣＣ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １４０：１５５−１６８（１９９６）、Ｆｒａｎｓｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：６０６−６１２（１９９７）、Ｌａｍ  ＸＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：  ７２５−７２９（１９９７）、Ｒｅｍｍｅｌｅ  ＲＬ  Ｊｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５：２００−２０８．（１９９８）、Ｔｈｉｒｕｍａｎｇａｌａｔｈｕ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９５：１４８０−１４９７（２００６）を参照されたい。治療用製剤中のかかるタンパク質集合体は、免疫応答を誘導するその傾向に起因して望ましくない。
【０１３０】
ある特定の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列は、同じくフェノール系防腐剤を含有する組成物中の融合タンパク質の物理的安定性を強化するように最適化される。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、インスリンＡ鎖の類似体における位置１０でのアミノ酸突然変異の存在（配列番号２中で挙げるインスリンＡ鎖の類似体における可変のＸ１）が、以下の安定性研究で示すように、フェノール保存性物質の存在下で融合タンパク質の集合体の蓄積を低減することを発見した。
【０１３１】
本発明は、限定的であると解釈されるべきではない以下の実施例によって更に例解される。
【０１３２】
融合タンパク質の発現及び精製
本発明の融合タンパク質は、ＣＨＯグルタミン合成酵素（ＧＳ）ノックアウト（ＧＳＫＯ）細胞株を使用して、哺乳動物細胞発現系において産生させる。ＧＳ遺伝子ノックアウトは、分泌条件下で低生産性または非生産性の細胞の生存を許容し得る内因性ＧＳ背景活性を排除することによって、厳しい選択厳密性を可能にする。融合タンパク質をコードする遺伝子を、発現プラスミドを含有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）にサブクローニングする。融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、細胞培地への融合タンパク質の分泌を強化するシグナルペプチドのコード配列とインフレームで融合させる。発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される。ＣＨＯ  ＧＳＫＯ細胞を、エレクトロポレーション及び適量の組み換え発現プラスミドを使用して安定してトランスフェクトする。
【０１３３】
トランスフェクトした細胞を、グルタミンを含まない培地中でのバルクセレクションに供する。トランスフェクトしたプールを、安定した発現細胞のクローン伸長に近づけるようにするために、低密度でプレーティングする。マスターウェルを融合タンパク質発現についてスクリーニングし、次いで無血清懸濁培養においてスケールアップして、産生に使用する。
【０１３４】
培地に分泌された融合タンパク質は、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー、続いて標準的なクロマトグラフィー技法によって精製し得る。端的には、澄まし培地からの融合タンパク質を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ）によって捕捉する。ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水による洗浄ステップの後、結合した融合タンパク質をｐＨ３．０の１０ｍＭのクエン酸で溶出させる。融合タンパク質を含有する画分をプールし、ｐＨ８．０の１ＭのＴｒｉｓの１／１０容積を添加することによって中和する。可溶性集合体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、またはイオン交換クロマトグラフィーを含む一般的な技法によって効率的に除去し得る。サイズ排除クロマトグラフィーによって決定して単量体融合タンパク質（共有結合したホモ二量体）を含有する画分をプールし、滅菌濾過し、貯蔵した。
【０１３５】
例示的な本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す。
【実施例】
【０１３６】
実施例１
【表２】
0006591562.tif 000003
（配列番号１２）
【０１３７】
実施例２
【表３】
0006591562.tif 000004
（配列番号１６）
【０１３８】
実施例３
【表４】
0006591562.tif 000005
（配列番号１７）
【０１３９】
実施例４
【表５】
0006591562.tif 000006
（配列番号１８）
【０１４０】
実施例５
【表６】
0006591562.tif 000007
（配列番号１９）
【０１４１】
実施例６
【表７】
0006591562.tif 000008
（配列番号２０）
【０１４２】
実施例７
【表８】
0006591562.tif 000009
（配列番号２１）
【０１４３】
実施例８
【表９】
0006591562.tif 000010
（配列番号２２）
【０１４４】
実施例９
【表１０】
0006591562.tif 000011
（配列番号２３）
【０１４５】
実施例１０
【表１１】
0006591562.tif 000012
（配列番号２４）
【０１４６】
インビトロ活性
実施例１〜３、５、及び９の試験ロットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）または１０ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５）中で調製し、４℃で貯蔵する。生合成ヒトインスリン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を０．０１ＮのＨＣｌ中で調製し、凍結したアリコートとして貯蔵するか、または１００単位／ｍＬでｍ−クレゾール、亜鉛、塩化ナトリウム、及びＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．３）を含有する配合混合物中で調製し、４℃で貯蔵する。
【０１４７】
Ｃ末端にＣ９エピトープ標識を含むヒトインスリン受容体アイソフォームＡ（ｈＩＲ−Ａ）またはヒトインスリン受容体アイソフォームＢ（ｈＩＲ−Ｂ）のいずれかを過剰発現している安定してトランスフェクトした２９３ＥＢＮＡ細胞（ＥＢＮＡ−１を発現している２９３ＨＥＫヒト胎児腎細胞）から調製したＰ１膜に行った受容体結合アッセイにおいて融合タンパク質の親和性を決定する。結合親和性を、ヒト組み換え（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル−Ａ１４）−インスリンを使用して定常状態で行う競合的放射性リガンド結合アッセイから決定する。試験試料についての値は、非標識ヒトインスリンの活性に対するパーセントとして計算する。ＩＣ５０値は、４パラメータロジスティック非線形回帰分析（ＸＬＦｉｔバージョン４．０、ＩＤＢＳ）から決定する。必要であれば、曲線上部または底部パラメータを、それぞれ１００または０に設定する。
【０１４８】
親和性定数（Ｋｉ）を方程式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋Ｄ／Ｋｄ）に基づいてＩＣ５０値から計算し、式中、Ｄは、実験に使用する放射性リガンドの濃度と等しく、Ｋｄは、飽和結合分析から決定したその同起源受容体に対する放射性リガンドの平衡結合親和性定数と等しい（ｈＩＲ−Ａ＝０．２０５ｎＭ、ｈＩＲ−Ｂ＝０．２５１ｎＭ）。Ｋｉについての報告値を幾何平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示し、反復測定の数を「ｎ」で示す（表１）。
【０１４９】
例示する融合タンパク質は、ｈＩＲ−Ａ及びｈＩＲ−Ｂの両方で親和性を有する。ヒトインスリンと比較して、例示する融合タンパク質は、ｈＩＲ−Ａ及びｈＩＲ−Ｂに対して低減した結合親和性を示す（表１）。
【表１２】
0006591562.tif 000013
【０１５０】
インビボ研究
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理したラット糖尿病モデルにおける研究
融合タンパク質の効果をＳＴＺ処理したラット糖尿病モデルにおいて調査する。体重４００〜４２５グラムの雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットをイソフルランで麻酔し、Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標）（ＳＴＺ品番８９２５６、Ｔｅｖａ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、４０ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）の単回注射を与える。ラットをＺａｎｏｓａｒ（登録商標）の注射から３日後に研究に使用する。非空腹時の血糖が４００〜５５０ｍｇ／ｄＬである動物のみをこれらの研究に使用する。
【０１５１】
ラットを、血糖及び体重における同等の分散をもたらすようにグループ分けした後、ランダム化する。血糖を、Ａｃｃｕｃｈｅｃｋ  Ａｖｉｖａ血糖計（Ｒｏｃｈｅ）を使用して測定する。ＳＴＺ処理したラットに、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量の単回皮下（ＳＣ）注射を与える。
【０１５２】
グルコース測定のための血液試料を、尾の断切りによって収集する。動物は実験中ずっと自由摂餌摂水させる。血糖データを図１に提供する。図１に示すデータは平均±ＳＥＭである（実施例１及び８についてｎ＝６、残りの実施例についてｎ＝３）。初期の給餌期間中の時点（０〜２４時間）についての血糖データを収集するが、視覚表示の簡便性のため図１には含めない。図１に示すように、実施例１〜１０は、各々、長期間のグルコース低下を提供する。
【０１５３】
実施例１、３〜６、及び９〜１０の薬物動態特性も、上記のＳＴＺ処理したラットにおける皮下（ＳＣ）投薬後に特性評価する。インスリン受容体と結合することができるインスリンの存在を必要とするインスリン受容体ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、データを生成する。インスリン受容体ＥＬＩＳＡは、ヒトインスリン受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ＃１５４４−ＩＲ／ＣＦ  ａａ２８−９４４）を捕捉として利用する。ヒトインスリン受容体は、マウス抗６ｘ  ＨｉｓＴａｇ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ  ７０７９６）によってＩｍｍｕｎｌｏｎ  ４  ＨＢＸプレートに結合させる。融合タンパク質標準曲線及び試料を、１００％のラットＫ３  ＥＤＴＡ血漿中で希釈し、マウス抗ヒトＩｇＧのＦｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  ９０４０−０５）によって検出する。３３６時間の時点での実施例３〜６及び９〜１０の濃度は全て、２２．１±９．８ｍｇ／ｍＬ〜１４９８±６９０ｍｇ／ｍＬである。表３は経時的な実施例１の濃度を示し、表４は実施例１についてのデータの非コンパートメント分析後の薬物動態パラメータを示す。データは、本発明の融合タンパク質についてのバイオアベイラビリティの延長した期間を支持する。
【表１３】
0006591562.tif 000014
【表１４】
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【０１５４】
正常なラットにおける正常血糖クランプ
実施例１のグルコース利用に対する全体的なインビボ活性を理解するため、及び肝臓対周辺組織における実施例１の活性を決定するために、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットにおける正常血糖クランプ研究を行った。３−３Ｈ−グルコースのボーラス／持続注入を、慢性的にカテーテル処置した一晩絶食させたラットにおいて開始して、基礎条件下での内因性グルコース産生（ＥＧＰ）を決定した。次に、試験物品のボーラス／持続静脈内注入（７ｎｍｏｌ／ｋｇ［ボーラス］及び１ｎｍｏｌ／ｋｇ／時間［持続速度］）またはインスリンリスプロコンパレーター（［ボーラスなし］及び０．７５ｍＵ／ｋｇ／分［持続速度］）を投与し、２０％のグルコースの変動する静脈内注入を開始し、血糖濃度を１００〜１１０ｍｇ／ｄＬに維持するように定期的に調整する。ボーラス／注入速度は、各群において正常血糖クランプ条件下で同等のグルコース注入速度（ＧＩＲ）及びＥＧＰの同等の抑制を達成するように選択する。ソマトスタチンを投与して、内因性インスリン分泌を阻害する。実験中に動脈血試料を得て、ヘマトクリット、血漿インスリン、及び遊離脂肪酸、Ｃ−ペプチド、ならびに基礎及びクランプＥＧＰを監視する。実験終了時、２−［１−１４Ｃ］−デオキシグルコースを投与して、定常状態グルコース濃度下の組織グルコース取り込みを測定する。これらの一致条件下で、試験物品及びコンパレーターの周辺活性を、ヒラメ筋におけるグルコース取り込み及び血漿遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の抑制として分析する。全てのデータを、インスリンリスプロ群を対照コンパレーターとして使用するダネットのポストホック検定による一方向性の分散分析を使用して分析する。
【０１５５】
実施例１のボーラス及び注入により、クランプ実験にわたって２７４±５７ｎＭの一定の血漿濃度を得る。表５に示すように、両群の動物が実験のクランプ相中に同等のＧＩＲを達成する。実施例１群における平均血糖は、インスリンリスプロ群よりもわずかに高い。両群は、同様の基礎及びクランプＥＧＰ速度を有する（表５）。更に、実施例１群における基礎ＥＧＰからの変化率は、インスリンリスプロ対照群と同等である（表５）。等しくクランプした条件下の周辺活性を評定するために、血漿ＦＦＡ及び筋グルコース取り込みの抑制を測定する。インスリンリスプロがクランプ実験にわたって血漿ＦＦＡレベルの低減をもたらした一方、実施例１はもたらさなかった。（表５）。加えて、実施例１の注入は、インスリンリスプロと比較して、ヒラメ筋におけるグルコース取り込みの３３％の減少をもたらした。（表５）。総合すると、これらのデータは、実施例１がインスリンリスプロと比較して低減した周辺活性を呈することを示す。
【表１５】
0006591562.tif 000016
【０１５６】
カニクイザルにおけるインビボ有効性
実施例１の薬物動態（ＰＫ）パラメータを、カニクイザルにおいて１．５ｎｍｏｌ／ｋｇの単回静脈内投薬及び３ｎｍｏｌ／ｋｇの単回皮下投薬後に評価する。ＰＫ分析のための血漿試料を、３週かけて群／経路当たり３匹の動物から収集する。インスリン受容体ＥＬＩＳＡ及び総ＩｇＧ  Ｆｃ  ＥＬＩＳＡという２つのアッセイをＰＫ分析に利用する。インスリン受容体ＥＬＩＳＡは、ヒトインスリン受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ１５４４−ＩＲ／ＣＦ）を捕捉として利用する。ヒトインスリン受容体をマウス抗ＨｉｓＴａｇ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ  ７０７９６）によってＩｍｍｕｎｌｏｎ  ４  ＨＢＸプレートに結合させる。実施例１の標準曲線及び試料を１００％のカニクイザル血漿中で希釈し（抗凝血剤はＫ３  ＥＤＴＡであった）、マウス抗ヒトＩｇＧのＦｃ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ  ９０４０−０５）によって検出する。総ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡは、抗ヒトＩｇＧ２（Ａｂｃａｍ  ａｂ１９３３）を捕捉試薬として利用する。実施例１を１００％のカニクイザル血漿中で希釈し、検出抗体はインスリン受容体ＥＬＩＳＡのものと同じである。両アッセイからの結果を表６に示し、関連するＰＫパラメータを表７に示す。実施例１はサルにおいて完全なバイオアベイラビリティを示し、活性インスリンアッセイ及び総Ｆｃアッセイは同様の結果を出す。
【表１６】
0006591562.tif 000017
【表１７】
0006591562.tif 000018
【０１５７】
安定性
実施例１の非保存６５ｍｇ／ｍＬ製剤化
実施例１は、ｐＨ６．５の１０ｍＭのクエン酸塩、４６．４ｍｇ／ｍＬのマンニトール、０．０２％のポリソルベート８０中で６５ｍｇ／ｍＬで製剤化し、３０℃で貯蔵する。試料を、１μＬの６５ｍｇ／ｍＬ試料を注射することによって、０、２、及び４週目に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって高分子量パーセントについて分析する。ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを装備し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０の移動相を１５分間０．４ｍＬ／分で流すＡｇｉｌｅｎｔ  １１００システム上で分析ＳＥＣを行う。ピークを２８０ｎｍの吸光度で検出し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析する。ゼロ時点での高分子量パーセントは１．１３％であり、２週時点では１．６８％であり、４週時点では１．７４％である。これらの結果は、３０℃での４週後の可溶性集合体の成長が最小限で、６５ｍｇ／ｍＬの濃度での実施例１の安定性を支持する。
【０１５８】
実施例１及び３の保存及び非保存１ｍｇ／ｍＬ製剤化
実施例１及び３を、３０ｍＭのｍ−クレゾールの存在下または非存在下で、ｐＨ６．５の１０ｍＭのクエン酸塩中１ｍｇ／ｍＬで製剤化し、３０℃で貯蔵する。試料を、１０μＬの１ｍｇ／ｍＬ試料を注射することによって、ゼロ時点及び２週目に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって高分子量パーセントについて分析する。ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを装備し、ＰＢＳ＋３５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４の移動相を、それぞれｍ−クレゾールの存在下または非存在下の試料について３５分間または４５分間０．５ｍＬ／分で流すＡｇｉｌｅｎｔ  １１００システム上で分析ＳＥＣを行う。ピークを２１４ｎｍの吸光度で検出し、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して分析する。実施例３については、ｍ−クレゾールなし及びありで、ゼロ時点の高分子量パーセントは、それぞれ、０．２％及び３．０６％である。ｍ−クレゾールなし及びありでの２週目の高分子量パーセントは、それぞれ、０．２％及び１．７３％であった。これらの結果は、ゼロ時点での実施例３へのｍ−クレゾール添加後の可溶性集合体の即時の増加を示す。実施例１については、ｍ−クレゾールの非存在下及び存在下で、ゼロ時点での高分子量パーセントは、それぞれ、０．１６％及び０．１５％であった。ｍ−クレゾールの非存在下及び存在下での２週目の高分子量パーセントは、それぞれ、０．１８％及び０．３１％であった。これらの結果は、防腐剤の存在下での実施例１の安定性を示し、この実施例１は、インスリンＡ鎖の類似体における位置１０でのアミノ酸（配列番号２中の変数Ｘ１、上記の最初の融合タンパク質中のＺ３）のＴ残基への修飾を、その位置に天然のＩ残基を含むがそれ以外は実施例１と同じインスリン受容体アゴニストアミノ酸配列を含む実施例３と比較して、含む。
配列
【０１５９】
配列番号１−インスリンＢ鎖の類似体
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ２が、ＶまたはＧであり、Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり、Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ５が、ＨまたはＦであり、Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず、Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず、但し、前記インスリンＢ鎖類似体が、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む。
【０１６０】
配列番号２−インスリンＡ鎖の類似体
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１ＣＳＬＸ２ＱＬＥＮＹＣＸ３Ｘ４
式中、Ｘ１が、ＴまたはＩであり、Ｘ２が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ４が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、Ｘ３がＮである場合には、Ｘ４はＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない。
【０１６１】
配列番号３−第１のペプチドリンカー
Ｘ１ＧＸ２ＧＧＧＧ、式中、Ｘ１が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２が、Ｇ、Ｓであるか、または存在しない。
【０１６２】
配列番号４−インスリン受容体アゴニスト
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＧＸ１１ＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１２ＣＳＬＸ１３ＱＬＥＮＹＣＸ１４Ｘ１５
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ２が、ＶまたはＧであり、Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり、Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ５が、ＨまたはＦであり、Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず、Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず、Ｘ１０が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ１１が、Ｇ、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ１２が、ＴまたはＩであり、Ｘ１３が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ１４が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１５が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９のうちの少なくとも１つが、それぞれ、ヒトインスリン分子のＢ鎖の位置Ｂ１６、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、またはＢ３０に見出されるものとは異なるアミノ酸でなければならず、更に、Ｘ１４がＮである場合には、Ｘ１５が、ＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない。
【０１６３】
配列番号５−インスリン受容体アゴニスト
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧ
【０１６４】
配列番号６−第２のペプチドリンカー
ＧＧＧＧＸ１ＧＧＧＧＸ２ＧＧＧＧＸ３ＧＧＧＧＸ４Ｘ５Ｘ６
式中、Ｘ１が、ＱまたはＥであり、Ｘ２が、ＱまたはＥであり、Ｘ３が、ＱまたはＥであり、Ｘ４が、Ｇ、Ｅ、Ｑであるか、または存在せず、Ｘ５が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ６が、Ｇであるか、または存在しない。
【０１６５】
配列番号７−第２のペプチドリンカー
ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ
【０１６６】
配列番号８−ヒトＩｇＧのＦｃ領域
ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＸ１ＬＸ２ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＸ３ＶＸ４ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＸ５ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＸ６
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ２が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、ＶまたはＴであり、Ｘ４が、ＶまたはＴであり、Ｘ５が、Ｎ、Ｄ、またはＱであり、  
Ｘ６が、Ｋであるか、または存在しない。
【０１６７】
配列番号９−ヒトＩｇＧのＦｃ領域
ＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＸ１ＬＸ２ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＸ３ＶＸ４ＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＸ５ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＸ６ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＸ７
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ２が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、ＶまたはＴであり、Ｘ４が、ＶまたはＴであり、Ｘ５が、Ｎ、Ｄ、またはＱであり、Ｘ６が、ＲまたはＫであり、Ｘ７が、Ｋであるか、または存在しない。
【０１６８】
配列番号１０−ヒトＩｇＧのＦｃ領域
ＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＸ１ＬＸ２ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＸ３ＶＸ４ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＸ５ＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＸ６
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ２が、Ｆ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ３が、ＶまたはＴであり、Ｘ４が、ＶまたはＴであり、Ｘ５が、Ｎ、Ｄ、またはＱであり、Ｘ６が、Ｋであるか、または存在しない。
【０１６９】
配列番号１１−融合タンパク質
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０ＧＸ１１ＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１２ＣＳＬＸ１３ＱＬＥＮＹＣＸ１４Ｘ１５ＧＧＧＧＸ１６ＧＧＧＧＸ１７ＧＧＧＧＸ１８ＧＧＧＧＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２ＣＰＰＣＰＡＰＸ２３Ｘ２４ＡＧＸ２５ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＸ２６ＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＸ２７ＲＶＶＳＶＬＴＶＸ２８ＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＸ２９Ｘ３０ＩＥＫＴＩＳＫＸ３１ＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＸ３２ＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＸ３３ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＸ３４ＬＴＶＤＫＳＲＷＱＸ３５ＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＸ３６Ｇ
式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり、Ｘ２が、ＶまたはＧであり、Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり、Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ５が、ＨまたはＦであり、Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず、Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず、Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず、但し、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９のうちの少なくとも１つが、それぞれ、ヒトインスリンＢ鎖の位置Ｂ１６、Ｂ２５、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、またはＢ３０に存在するもの以外のアミノ酸であり、Ｘ１０が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ１１が、Ｇ、Ｓであるか、または存在せず、Ｘ１２が、ＴまたはＩであり、Ｘ１３が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり、Ｘ１４が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１５が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず、但し、Ｘ１４がＮである場合には、Ｘ１５がＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならず、Ｘ１６が、ＱまたはＥであり、Ｘ１７が、ＱまたはＥであり、Ｘ１８が、ＱまたはＥであり、Ｘ１９が、Ｇ、Ｅ、Ｑであるか、または存在せず、Ｘ２０が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２１が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２２が、ＥまたはＰであり、Ｘ２３が、ＥまたはＰであり、Ｘ２４が、ＡまたはＶであり、Ｘ２５が、Ｇであるか、または存在せず、Ｘ２６が、ＱまたはＨであり、Ｘ２７が、ＹまたはＦ、Ｘ２８が、ＬまたはＶであり、Ｘ２９が、ＳまたはＡであり、Ｘ３０が、ＳまたはＰであり、Ｘ３１が、ＡまたはＴであり、Ｘ３２が、ＱまたはＲであり、Ｘ３３が、ＶまたはＭであり、Ｘ３４が、ＲまたはＫであり、Ｘ３５が、ＥまたはＱであり、Ｘ３６が、ＬまたはＰである。
【０１７０】
配列番号１２−融合タンパク質
【表１８】
0006591562.tif 000019
【０１７１】
配列番号１３−ヒトインスリンＡ鎖
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ
【０１７２】
配列番号１４−ヒトインスリンＢ鎖
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ
【０１７３】
配列番号１５−第１のペプチドリンカー
ＧＧＳＧＧＧＧ
【０１７４】
配列番号１６−融合タンパク質
【表１９】
0006591562.tif 000020
【０１７５】
配列番号１７−融合タンパク質
【表２０】
0006591562.tif 000021
【０１７６】
配列番号１８−融合タンパク質
【表２１】
0006591562.tif 000022
【０１７７】
配列番号１９−融合タンパク質
【表２２】
0006591562.tif 000023
【０１７８】
配列番号２０−融合タンパク質
【表２３】
0006591562.tif 000024
【０１７９】
配列番号２１−融合タンパク質
【表２４】
0006591562.tif 000025
【０１８０】
配列番号２２−融合タンパク質
【表２５】
0006591562.tif 000026
【０１８１】
配列番号２３−融合タンパク質
【表２６】
0006591562.tif 000027
【０１８２】
配列番号２４−融合タンパク質
【表２７】
0006591562.tif 000028
【０１８３】
配列番号２５−ＧＬＰ−１
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ 
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  融合タンパク質であって、
ａ）一般式Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３を有するインスリン受容体アゴニストと
［式中、
ｉ）Ｚ１が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンＢ鎖類似体であり、
Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＸ４ＬＶＣＧＥＲＧＦＸ５ＹＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９
（式中、Ｘ１が、Ｆ、Ｑ、またはＡであり；Ｘ２が、ＶまたはＧであり；Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ａ、またはＥであり；Ｘ４が、Ｅ、Ｙ、Ｑ、またはＨであり；Ｘ５が、ＨまたはＦであり；Ｘ６が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｈ、Ｖであるか、または存在せず；Ｘ７が、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｋ、Ｄ、Ｓ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ８が、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｐ、Ｑ、Ｄ、Ｈであるか、または存在せず；Ｘ９が、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ａであるか、または存在せず；但し、前記インスリンＢ鎖類似体が、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、またはＸ９に、ヒトインスリン分子のＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む）（配列番号１）、
ｉｉ）Ｚ２が、５〜１０個のアミノ酸を含む第１のペプチドリンカーであり（ここで、前記アミノ酸のうちの少なくとも５個が、Ｇ残基である）、
ｉｉｉ）Ｚ３が、以下のアミノ酸配列を含むインスリンＡ鎖類似体である
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＸ１ＣＳＬＸ２ＱＬＥＮＹＣＸ３Ｘ４
（式中、Ｘ１が、ＴまたはＩであり；Ｘ２が、Ｄ、Ｙ、Ｑ、またはＥであり；Ｘ３が、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；Ｘ４が、任意の天然に存在するアミノ酸であるか、または存在せず；但し、Ｘ３がＮである場合には、Ｘ４がＧまたはＮ以外のアミノ酸でなければならない）（配列番号２）］、
ｂ）第２のペプチドリンカーと、
ｃ）ヒトＩｇＧのＦｃ領域と、を含み、
前記インスリン受容体アゴニストのＣ末端残基が、前記第２のペプチドリンカーのＮ末端残基に直接融合し、前記第２のペプチドリンカーのＣ末端残基が、前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端残基に直接融合している、融合タンパク質。
［２］  前記インスリンＢ鎖類似体が、配列番号１のＸ４またはＸ５に、前記ヒトインスリンＢ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含み、
前記インスリンＡ鎖類似体が、配列番号２のＸ１またはＸ２に、前記ヒトインスリンＡ鎖のアミノ酸配列からの少なくとも１つの修飾を含む、［１］に記載の融合タンパク質。
［３］  前記インスリンＢ鎖類似体が、配列番号１の配列を含み（式中、Ｘ１がＦであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ３がＮまたはＤであり、Ｘ４がＥであり、Ｘ５がＨである）、
前記インスリンＡ鎖類似体が、配列番号２の配列を含む（式中、Ｘ１がＩまたはＴであり、Ｘ２がＤであり、Ｘ３がＧであり、Ｘ４が存在しない）、［１］または［２］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［４］  前記インスリンＢ鎖類似体が、配列番号１の配列を含む（式中、Ｘ６〜Ｘ９が、各々Ｇである）、［１］〜［３］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［５］  前記第１のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の融合タンパク質：
Ｘ１ＧＸ２ＧＧＧＧ
（式中、Ｘ１がＧであるか、または存在せず；Ｘ２が、ＧもしくはＳであるか、または存在しない）（配列番号３）。
［６］  配列番号３のＸ１及びＸ２が、それぞれ、Ｇ及びＳである、［５］に記載の融合タンパク質。
［７］  前記インスリン受容体アゴニストが、以下のアミノ酸配列を有する、［１］〜［６］のいずれかに記載の融合タンパク質：
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＥＬＶＣＧＥＲＧＦＨＹＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＧＩＶＥＱＣＣＴＳＴＣＳＬＤＱＬＥＮＹＣＧ（配列番号５）。
［８］  前記第２のペプチドリンカーが、１０〜２５個のアミノ酸を有するペプチドであり、前記アミノ酸の少なくとも５０％がＧ残基である、［１］〜［７］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［９］  前記第２のペプチドリンカーが、配列［ＧＧＧＧＸ］ｎを有するペプチドを含む（式中、Ｘが、Ｑ、Ｅ、またはＳであり；ｎが、２〜５である）、［１］〜［８］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１０］  前記第２のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を含む、［１］〜［９］のいずれかに記載の融合タンパク質：
ＧＧＧＧＸ１ＧＧＧＧＸ２ＧＧＧＧＸ３ＧＧＧＧＸ４Ｘ５Ｘ６
Ｘ１が、ＱまたはＥであり、
Ｘ２が、ＱまたはＥであり、
Ｘ３が、ＱまたはＥであり、
Ｘ４が、Ｇ、Ｅ、Ｑであるか、または存在せず、
Ｘ５が、Ｇであるか、または存在せず、
Ｘ６が、Ｇであるか、または存在しない
（配列番号６）。
［１１］  前記第２のペプチドリンカーが、以下のアミノ酸配列を有する、［１］〜［１０］のいずれかに記載の融合タンパク質：
ＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＱＧＧＧＧＧ（配列番号７）。
［１２］  前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４からのＦｃ領域である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１３］  前記ヒトＩｇＧのＦｃ領域が、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［１］〜［１２］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１４］  配列番号１２のアミノ酸配列を有する、融合タンパク質。
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれかに記載の２つの融合タンパク質のホモ二量体。
［１６］  ［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質または［１５］に記載のホモ二量体のいずれか、及び少なくとも１つの賦形剤を含む、医薬組成物。
［１７］  前記組成物が、１つ以上の緩衝剤、１つ以上の界面活性剤、及び１つ以上の等張剤を更に含む、［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］  クエン酸塩、クエン酸、ポリソルベート８０、及びマンニトールを更に含む、［１６］に記載の医薬組成物。
［１９］  ｐＨが約５．５〜約８．０の範囲である、［１６］〜［１８］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２０］  ｐＨが約６．０〜約６．７５の範囲である、［１６］〜［１９］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２１］  付加的な活性成分を更に含む、［１６］〜［２０］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２２］  前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］  前記インクレチン系療法剤がＧＬＰ−１Ｒアゴニストである、［２３］に記載の医薬組成物。
［２４］  前記ＧＬＰ−１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、［２３］に記載の医薬組成物。
［２５］  ［１５］に記載のホモ二量体及びデュラグルチドを含む、医薬組成物。
［２６］  治療有効量の［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病を患う患者を治療する方法。
［２７］  ［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質が、付加的な活性成分と組み合わせて投与される、［２６］に記載の方法。
［２８］  前記付加的な活性成分がインクレチン系療法剤である、［２７］に記載の方法。
［２９］  前記インクレチン系療法剤がＧＬＰ−１Ｒアゴニストである、［２８］に記載の方法。
［３０］  前記ＧＬＰ−１Ｒアゴニストがデュラグルチドである、［２９］に記載の方法。
［３１］  ［１５］に記載のホモ二量体をデュラグルチドと組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む、真性糖尿病を患う患者を治療する方法。
［３２］  療法に使用するための、［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［３３］  真性糖尿病の治療に使用するための、［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［３４］  付加的な活性成分と、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［３５］  デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［３６］  デュラグルチドと、同時、別々、または逐次の組み合わせで使用するための［１５］に記載のホモ二量体。
［３７］
［１］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【図１】
0006591562.tif 000029
【図２】
0006591562.tif 000030
【配列表】
0006591562000001.app