(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）：
【化１】
0006605477.tif 000023
（式中、Ｘ１〜Ｘ６は、そのいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基を示し、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基を示す。）で表されるカチオン性脂質。
【化２】
0006605477.tif 000024
（式中、Ｒ１は、炭素数８〜２２の脂肪族炭化水素基または炭素数８〜２２のアシル基を示し；Ｙ１は、−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。）
【化３】
0006605477.tif 000025
（式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ３とＲ４は互いに結合して環を形成していてもよく；Ｚ２は、炭素数１〜６のアルキレン基を示し；Ｙ３は、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示し；ｎは、０または１である。）
【請求項２】
Ｒ１が、炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基または炭素数１０〜２０のアシル基である、請求項１記載のカチオン性脂質。
【請求項３】
Ｒ１が、不飽和結合を含む炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基または炭素数１０〜２０のアシル基である、請求項１記載のカチオン性脂質。
【請求項４】
Ｙ１が、−Ｏ−である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項５】
核酸送達用である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体であって、当該脂質膜構造体の形態が、リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、またはひも状ミセルである、脂質膜構造体。
【請求項７】
請求項６記載の脂質膜構造体および核酸を含む核酸導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸送達のためのカチオン性脂質、これを含む脂質膜構造体、及びこれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬品は、機能性核酸を細胞質内に送達して病原タンパク質の発現を抑制するものであり、次世代の医薬品として注目され、多くの研究が行われてきた。機能性核酸は血中での安定性が低く速やかに分解される問題点があるためキャリアが不可欠となっている。核酸を送達するキャリアとしては、ウィルス、ポリマーミセル、リポソーム等の脂質膜構造体が挙げられる。【０００３】
ウィルスキャリアは発現効率の高さから最も汎用されているが、病原性や抗原性を有し、さらに機能性の付与が難しいといった問題点がある。そのため、より安全性の高い非ウィルスキャリアの開発が求められており、ポリマーミセル、脂質膜構造体等の研究が進められている。ポリマーミセルはポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」と称する）やポリアミノ酸等から構成されるキャリアであるが、臨床開発例は未だ少ない。【０００４】
脂質膜構造体は、カチオン性脂質やリン脂質等で構成されるキャリアである。キャリアを構成する成分の組成変更や、構造改変による機能性付与が容易であることが利点である。これまでに複数の臨床開発が行われており、最も一般的に用いられている非ウィルスキャリアである。【０００５】
脂質膜構造体をキャリアとして用い、効果的に機能性核酸を細胞内に送達するには、脂質膜構造体の血中安定性や腫瘍集積性等、体内動態を改善する他に、細胞への取り込みや、エンドソーム脱出能等、細胞内動態を向上させることが必要となる。【０００６】
脂質膜構造体の構成成分の１つであるカチオン性脂質は、脂質膜構造体にｐＨ応答性を付与する目的で使用される。カチオン性脂質の使用により、血中等の生理的環境下においては脂質膜構造体を安定に存在させる一方で、細胞内のような酸性環境下においては脂質膜構造体を崩壊させることで、薬物の細胞質内への放出が可能になる。【０００７】
カチオン性脂質は、大別して疎水性部と親水性部から構成されており、疎水性部は脂肪酸残基やステロール残基等の疎水性基、親水性部はアミノ基またはアンモニウム基等のカチオン性基である。特に、疎水性部に疎水性基を２つ、親水性部にアミノ基またはアンモニウム基等のカチオン性基を１つ含む構造（２鎖型カチオン性脂質）が多く知られている。【０００８】
脂質膜構造体に用いられるカチオン性脂質としては、公知化合物である１，２−Ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ（以下、「ＤＯＤＡＰ」と称する）や、１，２−Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ（以下、「ＤＬｉｎＤＡＰ」と称する）等が挙げられる。【０００９】
カチオン性脂質に含まれるアミノ基が周辺のｐＨの低下に伴ってプロトン化されカチオン性に変化することで、脂質膜構造体にｐＨ応答性が付与される。【００１０】
生体に投与された脂質膜構造体はエンドソームに取り込まれる。初期エンドソームはゴルジ体近傍へ移動していくに従い、多数の小胞体を内部に含んだ後期エンドソームへと成熟し、リソソームと結合することが知られている。後期エンドソームとリソソームが結合すると、リソソーム内の分解酵素により機能性核酸が分解されるため、機能性核酸を効率的に細胞内に送達するには、初期エンドソームから、後期エンドソームとリソソームが結合するまでの間に機能性核酸を細胞質内へ放出する必要がある。【００１１】
しかし非特許文献１では、機能性核酸を封入した脂質膜構造体が細胞質内へ機能性核酸を放出するのは初期エンドソームの段階のみであり、その上放出量は数％であることが主張されている。【００１２】
このように、当該分野での技術進歩にも関わらず、従来のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体により達成される細胞内への核酸送達能は十分に満足できるものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３１，  ６３８−６４６  （１  Ｊｕｌｙ  ２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、機能性核酸を送達するためのキャリアである脂質膜構造体として用いた場合に、従来のカチオン性脂質よりも、高い細胞内送達効率を達成できるカチオン性脂質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一般的に、親水性部が小さく疎水性部の大きい円錐型構造を有した脂質は、ラメラ相から逆ヘキサゴナル相へ転移し易いことが知られている。これに対し、従来の２鎖型カチオン性脂質は、生体内でアミノ基がプロトン化されて正に帯電し、アミノ基同士が反発しあうことで親水性部が広がり、脂質膜がラメラ相から逆ヘキサゴナル相へ相転移しにくくなっていると考えられる。よって、従来の２鎖型カチオン性脂質を含む脂質膜構造体では、脂質膜が相転移しにくく脂質膜構造体とエンドソーム膜との膜融合能に乏しいために、該脂質膜構造体を含む核酸導入剤は、細胞質内への機能性核酸送達能が低くなる。【００１６】
本発明者らは上記課題について鋭意研究した結果、静電的反発による親水性部の広がりを抑えるために、１つ又は２つのカチオン性基を有し、さらに疎水性部を大きくするために、疎水性基を１つ乃至４つ導入したカチオン性脂質を開発した。本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体は、生体内のような酸性条件下での膜融合能が高く、該脂質膜構造体を用いた核酸導入剤は、従来の２鎖型カチオン性脂質を含む脂質膜構造体を用いた核酸導入剤よりも、細胞質内への機能性核酸の送達能が顕著に高いことを見出し、本発明を完成するに至った。【００１７】
即ち本発明は、以下の内容を包含する。
［１］式（１）：【００１８】
【化１】
0006605477.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｘ１〜Ｘ６は、そのいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基、式（Ｘｂ）で表される基または水酸基を示し（但し、該４個の全てが水酸基である場合を除く）、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基または水酸基を示す（但し、該２個の全てが水酸基である場合を除く）。）で表されるカチオン性脂質。【００２０】
【化２】
0006605477.tif 000003
【００２１】
（式中、Ｒ１は、炭素数８〜２２の脂肪族炭化水素基または炭素数８〜２２のアシル基を示し；Ｙ１は、−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。）【００２２】
【化３】
0006605477.tif 000004
【００２３】
（式中、Ｒ２は、ステロール残基または脂溶性ビタミン残基を示し；Ｚ１は、炭素数２または３のアルキレン基を示し；Ｙ２は、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示す。）【００２４】
【化４】
0006605477.tif 000005
【００２５】
（式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ３とＲ４は互いに結合して環を形成していてもよく；Ｚ２は、炭素数１〜６のアルキレン基を示し；Ｙ３は、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示し；ｎは、０または１である。）
［２］Ｘ１〜Ｘ６のいずれか４個が独立して式（Ｘａ）で表される基または式（Ｘｂ）で表される基であり、残り２個が独立して式（Ｘｃ）で表される基である、［１］記載のカチオン性脂質。
［３］Ｘ１〜Ｘ６のいずれか４個が独立して式（Ｘａ）で表される基であり、残り２個が独立して式（Ｘｃ）で表される基である、［１］記載のカチオン性脂質。
［４］Ｒ１が、炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基または炭素数１０〜２０のアシル基である、［１］〜［３］のいずれかに記載のカチオン性脂質。
［５］Ｒ１が、不飽和結合を含む炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基または炭素数１０〜２０のアシル基である、［１］〜［３］のいずれかに記載のカチオン性脂質。
［６］Ｙ１が、−Ｏ−である、［１］〜［５］のいずれかに記載のカチオン性脂質。
［７］Ｘ１〜Ｘ６のいずれか４個が独立して式（Ｘｂ）で表される基であり、残り２個が独立して式（Ｘｃ）で表される基である、［１］記載のカチオン性脂質。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体。
［９］［８］記載の脂質膜構造体および核酸を含む核酸導入剤。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、１つ乃至４つの疎水性基を含む疎水性部と、１つ又は２つのカチオン性基を含む親水性部からなるカチオン性脂質、当該カチオン性脂質を含む脂質膜構造体、当該脂質膜構造体および核酸を含む核酸導入剤に関するものである。本発明のカチオン性脂質は、安定な脂質膜構造体を形成でき、脂質膜構造体としての酸解離定数（以下、「ｐＫａ」と称する）を中性付近に調整できる。さらに、本発明のカチオン性脂質を用いた核酸導入剤によって機能性核酸の導入を行うと、エンドソーム内のような弱酸性環境下においてのみエンドソーム膜との高い膜融合能を示し、効率的に機能性核酸を細胞質内に放出させることができる。即ち、本発明のカチオン性脂質を用いた核酸導入剤によって機能性核酸の導入を行うことにより、細胞質内に送達した機能性核酸を介した効率的な遺伝子ノックダウンを達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＤＬｉｎＤＡＰ  ＭＥＮＤ、ＤＯＤＡＰ  ＭＥＮＤのヘモライシス活性を示したグラフである。
【図２】第１〜第４ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤのヘモライシス活性を示したグラフである。
【図３】ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＤＬｉｎＤＡＰ  ＭＥＮＤ、ＤＯＤＡＰ  ＭＥＮＤによる、ＦＶＩＩノックダウン活性を示したグラフである。
【図４】ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤによる、ＦＶＩＩノックダウン活性を示したグラフである。
【図５】第１〜第４ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤによる、ＦＶＩＩノックダウン活性を示したグラフである。
【図６】ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤによる、ｍＲＮＡ発現活性を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態を説明する。
１．本発明のカチオン性脂質
本発明は、式（１）で表されるカチオン性脂質を提供する。
【００２９】
【化５】
0006605477.tif 000006
【００３０】
（式中、Ｘ１〜Ｘ６は、そのいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基、式（Ｘｂ）で表される基または水酸基を示し（但し、該４個の全てが水酸基である場合を除く）、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基または水酸基を示す（但し、該２個の全てが水酸基である場合を除く）。）
【００３１】
【化６】
0006605477.tif 000007
【００３２】
（式中、Ｒ１は、炭素数８〜２２の脂肪族炭化水素基または炭素数８〜２２のアシル基を示し；Ｙ１は、−Ｏ−または−ＮＨ−を示す。）
【００３３】
【化７】
0006605477.tif 000008
【００３４】
（式中、Ｒ２は、ステロール残基または脂溶性ビタミン残基を示し；Ｚ１は、炭素数２または３のアルキレン基を示し；Ｙ２は、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示す。）
【００３５】
【化８】
0006605477.tif 000009
【００３６】
（式中、Ｒ３およびＲ４は、独立して、炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ３とＲ４は互いに結合して環を形成していてもよく；Ｚ２は、炭素数１〜６のアルキレン基を示し；Ｙ３は、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示し；ｎは、０または１である。）
【００３７】
式（１）において、Ｘ１〜Ｘ６は、そのいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基、式（Ｘｂ）で表される基または水酸基であり（但し、該４個の全てが水酸基である場合を除く）、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基または水酸基であればよい（但し、該２個の全てが水酸基である場合を除く）が、好ましくは、Ｘ１〜Ｘ６は、そのいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基または式（Ｘｂ）で表される基であり、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基または水酸基であり（但し、該２個の全てが水酸基である場合を除く）、より好ましくは、Ｘ１〜Ｘ６は、そのいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基または式（Ｘｂ）で表される基であり、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
【００３８】
式（１）の一態様として、Ｘ１〜Ｘ６のいずれか４つが、独立して、式（Ｘａ）で表される基または式（Ｘｂ）で表される基であり、残り２個が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である場合、そのＸ１〜Ｘ６における式（Ｘａ）で表される基、式（Ｘｂ）で表される基および式（Ｘｃ）で表される基の組合せは任意であるが、当該組合せの具体例としては、以下（１）〜（８）の組合せが挙げられる。
（１）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６が、独立して、式（Ｘａ）で表される基であり、且つＸ３およびＸ４が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（２）Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ６が、独立して、式（Ｘａ）で表される基であり、且つＸ２およびＸ５が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（３）Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が、独立して、式（Ｘａ）で表される基であり、且つＸ１およびＸ６が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（４）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が、独立して、式（Ｘａ）で表される基であり、且つＸ５およびＸ６が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（５）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６が、独立して、式（Ｘｂ）で表される基であり、且つＸ３およびＸ４が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（６）Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ６が、独立して、式（Ｘｂ）で表される基であり、且つＸ２およびＸ５が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（７）Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が、独立して、式（Ｘｂ）で表される基であり、且つＸ１およびＸ６が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
（８）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４が、独立して、式（Ｘｂ）で表される基であり、且つＸ５およびＸ６が、独立して、式（Ｘｃ）で表される基である。
中でも原料調達や製造のしやすさの観点から、（１）の組合せが好ましく、特に、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６の式（Ｘａ）で表される基が全て同一であり、且つＸ３およびＸ４の式（Ｘｃ）で表される基が同一である（１）の組合せが好ましい。
また、原料調達や製造のしやすさの観点から、（３）の組合せが好ましく、特に、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の式（Ｘａ）で表される基が全て同一であり、且つＸ１およびＸ６の式（Ｘｃ）で表される基が同一である（３）の組合せが好ましい。
【００３９】
式（１）の一態様として、Ｘ１〜Ｘ６のいずれか４個が、独立して、式（Ｘａ）で表される基または式（Ｘｂ）で表される基である場合、残り２個は、例えば、一方が式（Ｘｃ）で表される基であり、他方が水酸基であってよく、あるいは残り２個がいずれも式（Ｘｃ）で表される基であってもよい。
【００４０】
式（１）において、水酸基を示すＸ１〜Ｘ６の数は、好ましくは３以下であり、より好ましくは１以下であり、特に好ましくは０である。
【００４１】
式（Ｘａ）、式（Ｘｂ）および式（Ｘｃ）における各基の定義について、以下に詳述する。
【００４２】
［式（Ｘａ）］
式（Ｘａ）は−Ｙ１−Ｒ１の構造を呈する。
Ｒ１は、炭素数８〜２２の脂肪族炭化水素基または炭素数８〜２２のアシル基を表す。当該脂肪族炭化水素基およびアシル基に含まれる炭素数は、好ましくは１０〜２０である。当該脂肪族炭化水素基およびアシル基は、直鎖状であっても分岐または環を有していてもよいが、好ましくは直鎖状である。当該脂肪族炭化水素基およびアシル基は、飽和であっても不飽和結合を含んでいてもよいが、好ましくは不飽和結合を含む。当該脂肪族炭化水素基およびアシル基が不飽和結合を含む場合、これらに含まれる不飽和結合の数は通常１〜６個であり、好ましくは１〜３個であり、より好ましくは１〜２個である。これらに含まれる不飽和結合は炭素−炭素二重結合が好ましい。
【００４３】
炭素数８〜２２の脂肪族炭化水素基としては、例えば、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、オクテニル基、ノネニル基、デセニル基、ウンデセニル基、ドデセニル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、オクタジエニル基、ノナジエニル基、デカジエニル基、ウンデカジエニル基、ドデカジエニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、イソステアリル基、テトラメチルヘキサデセニル基（フィチル基）等が挙げられ、好ましくはデシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、イコシル基、デセニル基、ドデセニル基、テトラデセニル基、ヘキサデセニル基、オクタデセニル基、イコセニル基、デカジエニル基、ドデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、オクタデカジエニル基、イコサジエニル基等の飽和又は不飽和結合を含む炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基であり、より好ましくはデセニル基、ドデセニル基、テトラデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、オクタデカジエニル基等の不飽和結合を含む炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基である。
【００４４】
炭素数８〜２２のアシル基としては、例えば、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、ヘプタデカノイル基、オクタデカノイル基、ノナデカノイル基、イコサノイル基、ヘンイコサノイル基、ドコサノイル基、オクタエノイル基、ノナエノイル基、デカエノイル基、ウンデカエノイル基、ドデカエノイル基、トリデカエノイル基、テトラデカエノイル基、ペンタデカエノイル基、ヘキサデカエノイル基、ヘプタデカエノイル基、オクタデカエノイル基、ノナデカエノイル基、イコサエノイル基、ヘンイコサエノイル基、ドコサエノイル基、オクタジエノイル基、ノナジエノイル基、デカジエノイル基、ウンデカジエノイル基、ドデカジエノイル基、トリデカジエノイル基、テトラデカジエノイル基、ペンタデカジエノイル基、ヘキサデカジエノイル基、ヘプタデカジエノイル基、オクタデカジエノイル基、ノナデカジエノイル基、イコサジエノイル基、ヘンイコサジエノイル基、ドコサジエノイル基、オクタデカトリエノイル基、イコサトリエノイル基、イコサテトラエノイル基、イコサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、イソステアロイル基、テトラメチルヘキサデカノイル基（フィタノイル基）、レチノイル基等が挙げられ、好ましくはデカノイル基、ドデカノイル基、テトラデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、イコサノイル基、デカエノイル基、ドデカエノイル基、テトラデカエノイル基、ヘキサデカエノイル基、オクタデカエノイル基、イコサエノイル基、デカジエノイル基、ドデカジエノイル基、テトラデカジエノイル基、ヘキサデカジエノイル基、オクタデカジエノイル基、イコサジエノイル基等の飽和又は不飽和結合を含む炭素数１０〜２０のアシル基であり、より好ましくはデカエノイル基、ドデカエノイル基、テトラデカジエノイル基、ヘキサデカジエノイル基、オクタデカジエノイル基等の不飽和結合を含む炭素数１０〜２０のアシル基である。
【００４５】
式（１）が式（Ｘａ）で表される基を２個以上含む場合、各Ｒ１は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００４６】
Ｙ１は、−Ｏ−または−ＮＨ−であり、好ましくは−Ｏ−である。式（１）が式（Ｘａ）で表される基を２個以上含む場合、各Ｙ１は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００４７】
好適な式（Ｘａ）で表される基としては、Ｒ１が、不飽和結合を含む炭素数１０〜２０の脂肪族炭化水素基またはアシル基であり、Ｙ１が、−Ｏ−である式（Ｘａ）で表される基である。
【００４８】
式（１）が式（Ｘａ）で表される基を２個以上含む場合、各式（Ｘａ）で表される基は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００４９】
［式（Ｘｂ）］
式（Ｘｂ）は−Ｙ２−Ｚ１−ＣＯ−Ｒ２の構造を呈する。
Ｒ２は、ステロール残基または脂溶性ビタミン残基を示し、好ましくは脂溶性ビタミン残基である。
【００５０】
ステロール残基としては、例えば、コレステリル基（コレステロール残基）、コレスタリル基（コレスタノール残基）、スチグマステリル基（スチグマステロール残基）、β−シトステリル基（β−シトステロール残基）、ラノステリル基（ラノステロール残基）、およびエルゴステリル基（エルゴステロール残基）等が挙げられる。ステロール残基は、好ましくはコレステリル基またはコレスタリル基である。
【００５１】
脂溶性ビタミン残基としては、例えば、レチノール残基、レチナール残基、エルゴステロール残基、７−ヒドロキシコレステロール残基、７−デヒドロコレステロール残基、カルシフェロール残基、コルカルシフェロール残基、ジヒドロエルゴカルシフェロール残基、ジヒドロタキステロ−ル残基、トコフェロール残基、トコトリエノール残基等を挙げることができる。脂溶性ビタミン残基は、好ましくはレチノール残基またはトコフェロール残基である。
【００５２】
式（１）が式（Ｘｂ）で表される基を２個以上含む場合、各Ｒ２は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００５３】
Ｚ１は、炭素数２または３のアルキレン基を示し、該アルキレン基は直鎖状であっても分岐を有していてもよいが、好ましくは直鎖状である。炭素数２または３のアルキレン基としては、例えばエチレン基、トリメチレン基等が挙げられ、好ましくはトリメチレン基である。
【００５４】
式（１）が式（Ｘｂ）で表される基を２個以上含む場合、各Ｚ１は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００５５】
Ｙ２は、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−であり、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−である。Ｙ２の結合の向きは制限されないが、例えばＹ２が−Ｏ−ＣＯ−である場合、式（Ｘｂ）は好ましくは−Ｏ−ＣＯ−Ｚ１−ＣＯ−Ｒ２の構造を呈する。また、例えばＹ２が−ＮＨ−ＣＯ−である場合、式（Ｘｂ）は好ましくは−ＮＨ−ＣＯ−Ｚ１−ＣＯ−Ｒ２の構造を呈する。
【００５６】
式（１）が式（Ｘｂ）で表される基を２個以上含む場合、各Ｙ２は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００５７】
好適な式（Ｘｂ）で表される基としては、Ｒ２が、ステロール残基（好ましくはコレステリル基またはコレスタリル基）または脂溶性ビタミン残基（好ましくはレチノール残基またはトコフェロール残基）であり、Ｚ１が、炭素数２または３のアルキレン基（好ましくはエチレン基またはトリメチレン基、より好ましくはトリメチレン基）であり、Ｙ２が、−Ｏ−ＣＯ−である式（Ｘｂ）で表される基である。
【００５８】
式（１）が式（Ｘｂ）で表される基を２個以上含む場合、各式（Ｘｂ）で表される基は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは全て同一である。
【００５９】
［式（Ｘｃ）］
式（Ｘｃ）は−（Ｙ３−Ｚ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４の構造を呈する。
Ｒ３およびＲ４は、独立して、炭素数１〜６のアルキル基を示す。Ｒ３およびＲ４は、直鎖状、分岐鎖状および環状のいずれであってもよく、さらにＲ３とＲ４は互いに結合して環を形成してもよい。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３である。直鎖状または分岐鎖状の、炭素数１〜６のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、２−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。Ｒ３とＲ４が互いに結合して環を形成する場合における−ＮＲ３Ｒ４の例としては、具体的にはアジリジル基、アゼチジル基、アゾリジル基、ピペリジル基等が挙げられる。Ｒ３およびＲ４は好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基であり、より好ましくはメチル基である。
【００６０】
Ｒ３とＲ４とは同一であっても異なっていてもよいが、好ましくはＲ３とＲ４とは同一である。
【００６１】
式（１）が式（Ｘｃ）で表される基を２個含む場合、各Ｒ３は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
【００６２】
式（１）が式（Ｘｃ）で表される基を２個含む場合、各Ｒ４は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
【００６３】
Ｚ２は、炭素数１〜６のアルキレン基を示す。Ｚ２は、直鎖状であっても分岐を有していてもよいが、好ましくは直鎖状である。炭素数１〜６のアルキレン基としては、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピリデン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基、ヘキサメチレン基等が挙げられる。Ｚ２は好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピリデン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基であり、より好ましくはエチレン基、トリメチレン基である。
【００６４】
式（１）が式（Ｘｃ）で表される基を２個含む場合、各Ｚ２は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
【００６５】
Ｙ３は、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示し、好ましくは−Ｏ−ＣＯ−である。Ｙ３の結合の向きは制限されないが、例えばＹ３が−Ｏ−ＣＯ−である場合、式（Ｘｃ）は好ましくは−（Ｏ−ＣＯ−Ｚ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４の構造を呈する。また、例えばＹ３が−Ｏ−である場合、式（Ｘｃ）は好ましくは−（Ｏ−Ｚ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４の構造を呈し、Ｙ３が−ＮＨ−ＣＯ−である場合、式（Ｘｃ）は好ましくは−（ＮＨ−ＣＯ−Ｚ２）ｎ−ＮＲ３Ｒ４の構造を呈する。
【００６６】
式（１）が式（Ｘｃ）で表される基を２個含む場合、各Ｙ３は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
【００６７】
ｎは、０または１であり、好ましくは１である。ｎが１である場合、式（Ｘｃ）は、−Ｙ３−Ｚ２−ＮＲ３Ｒ４の構造を呈し、ｎが０である場合、式（Ｘｃ）は、−ＮＲ３Ｒ４の構造を呈する。
【００６８】
式（１）が式（Ｘｃ）で表される基を２個含む場合、各ｎは、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
【００６９】
好適な式（Ｘｃ）で表される基としては、Ｒ３およびＲ４が、独立して、炭素数１〜３のアルキル基（好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基またはイソプロピル基、より好ましくはメチル基）であり、Ｚ２が、炭素数１〜６のアルキレン基（好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピリデン基、テトラメチレン基、ヘキサメチレン基、より好ましくはエチレン基、トリメチレン基）であり、Ｙ３が、−Ｏ−ＣＯ−であり、ｎが１である、式（Ｘｃ）で表される基である。
【００７０】
式（１）が式（Ｘｃ）で表される基を２個含む場合、各式（Ｘｃ）で表される基は同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
【００７１】
本発明のカチオン性脂質の具体例として、表１記載のＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ（１，２，５，６−テトラリノレイル−３，４−ジ（ジメチルアミノアセチル）−Ｄ−マンニトール）、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（１，２，５，６−テトラリノレイル−３，４−ジ（３−ジメチルアミノプロパノイル）−Ｄ−マンニトール）、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ（１，２，５，６−テトラリノレイル−３，４−ジ（４−ジメチルアミノブタノイル）−Ｄ−マンニトール）、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（１，２，５，６−テトラキス（デセニル）−３，４−ジ（３−ジメチルアミノプロパノイル）−Ｄ−マンニトール）、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ（テトラリノレオイル−ジ（３−ジメチルアミノプロパノイル）−Ｄ−マンニトール）等が挙げられる。
【００７２】
【表１】
0006605477.tif 000010
【００７３】
次に本発明のカチオン性脂質の製造方法について説明する。
【００７４】
本発明のカチオン性脂質の製造方法としては、例えば、水酸基を６つ有する式（１’）で表される化合物に、式（Ｘａ）で表される基および／または式（Ｘｂ）で表される基、並びに式（Ｘｃ）で表される基を、（i）Ｘａおよび／またはＸｂを導入した後にＸｃを導入する方法、（ii）Ｘｃを導入した後にＸａおよび／またはＸｂを導入する方法、（iii）Ｘａおよび／またはＸｂとＸｃとを同時に導入する方法、またはこれらに準ずる方法等が挙げられる。
【００７５】
【化９】
0006605477.tif 000011
【００７６】
本発明のカチオン性脂質の製造方法は特に制限されないが、好ましくは上記（i）の方法である。当該（i）の方法の具体例を以下に挙げるが、本発明のカチオン性脂質の製造方法は、この方法に特に限定されない。
【００７７】
出発化合物としては、例えば、水酸基を６個有する式（１’）で表される化合物において、２個の水酸基を保護基によって保護した化合物、または式（１’）で表される化合物において、４個の水酸基を保護基によって保護した化合物等が挙げられる。
尚、これらの出発化合物は、市販されているものを容易に入手でき、あるいは自体公知の方法またはそれに準ずる方法に従って製造することもできる。
【００７８】
式（１’）に導入する保護基としては、例えばイソプロピリデン基、ベンジリデン基、ベンゾイル基、ベンジル基、トリチル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、トリアルキルシリル基（例、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等）等が挙げられる。該保護基の導入方法は特に制限されず、自体公知の方法またはこれに準じた方法により行うことができる。
【００７９】
本発明のカチオン性脂質として、例えば、式（１）におけるＸ１、Ｘ２、Ｘ５およびＸ６が、式（Ｘａ）で表される基（Ｒ１：脂肪族炭化水素基、Ｙ１：−Ｏ−、それ以外の記号は式（Ｘｃ）で定義されるとおり）であり、Ｘ３およびＸ４が、式（Ｘｃ）で表される基（Ｙ３：−ＣＯ−Ｏ−、ｎ：１）である式（５）で表される化合物を製造する場合、該式（５）で表される化合物は、出発化合物として式（１ａ）で表される化合物を用い、以下の工程１（エーテル化）、工程２（脱保護）、工程３（エステル化）、あるいは工程１（エーテル化）、工程２（脱保護）、工程４（エステル化）、工程５（アミノ化）を経て製造することができる。
【００８０】
【化１０】
0006605477.tif 000012
【００８１】
式中、Ａは保護基（例えばイソプロピリデン基、ベンジリデン基、ベンゾイル基、ベンジル基、トリチル基、４-メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、トリアルキルシリル基など）を示し、Ｂは脱離基（例えば、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、メタンスルホニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基等）を示し、Ｄは水酸基、またはハロゲン原子（例えば、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子など）を示し、Ｅは、式（Ｅ）で表される基またはビニル基を示す。
【００８２】
【化１１】
0006605477.tif 000013
【００８３】
（式中、Ｚ２は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｂは、脱離基（例えば、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、メタンスルホニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基など）を示す。）
【００８４】
工程１（エーテル化）
式（１ａ）で表される化合物とＲ１−Ｂ（式中、Ｒ１およびＢは前記と同義である。）で表される化合物とを反応させることにより、式（２）で表される化合物を得る。
【００８５】
反応には水酸化カリウム、水素化ナトリウム、ｔ−ブトキシカリウム等の塩基触媒を使用してもよく、無触媒で行ってもよい。好ましくは水酸化カリウムが触媒として用いられる。使用する触媒量としては、式（１ａ）で表される化合物に対して通常６〜２０モル当量であり、好ましくは８〜１２モル当量である。
【００８６】
反応は溶媒を使用しても、無溶媒で行ってもよいが、式（１ａ）で表される化合物は高極性の固体であり、反応系中で分散させる必要があるため、溶媒の使用が好ましい。溶媒としては、反応を阻害せず、式（１ａ）で表される化合物が分散するものが使用でき、例えばヘキサン、トルエン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」と称する）等が挙げられる。これらの中ではトルエンが好ましい。
【００８７】
反応温度は通常２０〜１５０℃であり、好ましくは４０〜１００℃である。反応時間は通常１〜５０時間であり、好ましくは１０〜３０時間である。
【００８８】
得られた式（２）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等の手段によって、適宜精製することができる。
【００８９】
工程２（脱保護）
式（２）で表される化合物の保護基を脱保護し、２つの遊離の水酸基を含む式（３）で表される化合物を得る。
【００９０】
反応には酸触媒を使用する。酸触媒としては、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物等が挙げられるが、好ましくは塩酸である。
【００９１】
使用する触媒量としては式（２）で表される化合物に対して通常１〜５０モル当量であり、好ましくは５〜２０モル当量である。
【００９２】
反応には溶媒を使用する。溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、水等が挙げられるが、好ましくは、メタノール、エタノールである。
【００９３】
反応温度は通常２０〜７０℃であり、好ましくは４０〜６０℃である。反応時間は通常１〜１２時間であり、好ましくは４〜８時間である。
【００９４】
得られた式（３）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等の手段によって、適宜精製することができる。
【００９５】
工程３（エステル化）
式（３）で表される化合物と式（ｐ）（式中、Ｒ３、Ｒ４及びＺ２は前記と同義である。）で表される化合物とを反応させることにより、本発明の式（５）で表される化合物を得ることができる。
【００９６】
反応には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」と称する）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＣ」と称する）、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」と称する）等の縮合剤を使用する。
【００９７】
反応には塩基触媒を加える。塩基触媒としては４−ジメチルアミノピリジン（以下、「ＤＭＡＰ」と称する）、ピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられるが、好ましくは、ＤＭＡＰである。
【００９８】
式（ｐ）で表される化合物の仕込み量は、式（３）で表される化合物に対して通常２〜１０モル当量であり、好ましくは４〜８モル当量である。
【００９９】
反応は溶媒を使用しても、無溶媒で行ってもよいが、式（ｐ）で表される化合物は高極性の固体であり、反応系中で溶解または分散させる必要があることから、溶媒の使用が好ましい。式（ｐ）で表される化合物を溶解または分散させ得る溶媒としては、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、酢酸エチル等が挙げられ、これらの中ではクロロホルムが好ましい。
【０１００】
反応温度は通常１０〜６０℃であり、好ましくは２０〜４０℃である。反応時間は通常１〜２０時間であり、好ましくは２〜１０時間である。
【０１０１】
得られた式（５）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等の手段によって、適宜精製することができる。
【０１０２】
工程４（エステル化）
式（３）で表される化合物と式（ｑ）（式中のＤ、Ｅは前記と同義である。）で表される化合物とを反応させることにより、式（４）で表される化合物を得ることができる。
【０１０３】
式（ｑ）で表される化合物中のＤが水酸基の場合、反応には、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣ等の縮合剤を使用する。式（３）で表される化合物と式（ｑ）で表される化合物とを直接反応させてもよく、又は式（ｑ）で表される化合物の酸無水物を形成後に式（３）で表される化合物と反応させてもよい。
【０１０４】
式（ｑ）で表される化合物中のＤがハロゲン原子の場合、副生するハロゲン化水素を中和するために塩基を加える。塩基としては、トリエチルアミン、ピリジンなどが挙げられる。
【０１０５】
反応は溶媒を使用する。溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、酢酸エチル等が挙げられるが、好ましくはトルエンである。
【０１０６】
式（ｑ）で表される化合物の仕込み量は、式（３）で表される化合物に対して通常２〜１０モル当量であり、好ましくは２〜５モル当量である。
【０１０７】
反応温度は通常０〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃であり、反応時間は通常１〜１０時間であり、好ましくは１〜５時間である。
【０１０８】
得られた式（４）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等の手段によって、適宜精製することができる。
【０１０９】
工程５（アミノ化）
Ｒ３およびＲ４を含む２級アミンと式（４）で表される化合物とを反応させることにより、本発明の式（５）で表される化合物を得ることができる。
【０１１０】
反応は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、ｔ−ブトキシカリウム等の塩基触媒を使用しても、無触媒で行ってもよい。
【０１１１】
反応は溶媒を使用しても、無溶媒で行ってもよい。溶媒には、例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン（以下、「ＴＨＦ」と称する）等が使用でき、これらの中ではトルエンが好ましい。
【０１１２】
Ｒ３およびＲ４を含む２級アミンの仕込み量は、式（４）で表される化合物に対して通常１〜２０モル当量であり、好ましくは５〜１０モル当量である。
【０１１３】
反応温度は通常１０〜１００℃であり、好ましくは６０〜８０℃である。反応時間は通常１〜１０時間であり、好ましくは２〜６時間である。
【０１１４】
得られた式（５）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等の手段によって適宜精製することができる。
【０１１５】
当業者であれば、適宜原料を選択し、本明細書の実施例の方法に準じて反応を行うことにより、所望の本発明のカチオン性脂質を製造することができる。
【０１１６】
また、例えば、式（１）におけるＸ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５が、式（Ｘａ）で表される基（Ｒ１：アシル基、Ｙ１：−Ｏ−）であり、Ｘ１およびＸ６が、式（Ｘｃ）で表される基（ｎ：１、Ｙ３：−ＣＯ−Ｏ−、それ以外の記号は式（Ｘｃ）で定義されるとおり）である式（９）で表される化合物を製造する場合、該式（９）で表される化合物は、出発化合物として式（１ｂ）で表される化合物を用い、以下の工程６（エステル化）、工程７（脱保護）、工程８（エステル化）、あるいは工程６（エステル化）、工程７（脱保護）、工程９（エステル化）、工程１０（アミノ化）を経て製造することができる。
【０１１７】
【化１２】
0006605477.tif 000014
【０１１８】
式中、Ａは保護基（例えばイソプロピリデン基、ベンジリデン基、ベンゾイル基、ベンジル基、トリチル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、トリアルキルシリル基など）を示し、Ｄは水酸基、またはハロゲン原子（例えば、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子など）を示し、Ｅは、式（Ｅ）で表される基またはビニル基を示す。
【０１１９】
【化１３】
0006605477.tif 000015
【０１２０】
（式中、Ｚ２は炭素数１〜６のアルキレン基を示し、Ｂは脱離基（例えば、ヨウ素原子、臭素原子、塩素原子、メタンスルホニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基など）を示す。）
【０１２１】
工程６（エステル化）
式（１ｂ）で表される化合物とＲ１−Ｄ（式中、Ｒ１およびＤは前記と同義である。）で表される化合物とを反応させることにより、式（６）で表される化合物を得る。
【０１２２】
Ｒ１−ＤのＤが水酸基の場合、反応には、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用する。使用量は、式（１ｂ）で表される化合物に対して通常４〜１０モル当量であり、好ましくは５〜８モル当量である。
【０１２３】
反応には塩基触媒を加える。塩基触媒としてはＤＭＡＰ、ピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられるが、好ましくは、ＤＭＡＰである。
【０１２４】
反応には溶媒を使用する。溶媒としては、反応を阻害せず、基質が溶解するものであれば特に限定されない。具体的にはクロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、酢酸エチルなどが挙げられるが、好ましくはクロロホルムである。
【０１２５】
反応温度は通常０〜６０℃であり、好ましくは１０〜４０℃である。反応時間は通常１〜５０時間であり、好ましくは１０〜３０時間である。
【０１２６】
得られた式（６）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって、適宜精製することができる。
【０１２７】
工程７（脱保護）
式（６）で表される化合物の保護基を脱保護し、２つの遊離の水酸基を含む式（７）で表される化合物を得る。
【０１２８】
Ａがトリアルキルシリル基である場合、反応にはフッ化物を使用する。フッ化物としては、テトラブチルアンモニウムフルオリド、テトラプロピルアンモニウムフルオリド、テトラエチルアンモニウムフルオリド、テトラメチルアンモニウムフルオリド、フッ化水素酸、フッ化セシウムなどが挙げられるが、好ましくはテトラブチルアンモニウムフルオリドである。
【０１２９】
フッ化物の使用量としては、式（６）で表される化合物に対して通常２〜１０モル当量であるが、好ましくは４〜８モル当量である。
【０１３０】
トリアルキルシリル基の脱保護の過程では、強塩基であるアルコキシドが生成する。アルコキシドが存在すると、エステルの分解や転位が起きるため、速やかに中和する必要がある。よって反応系中にはプロトン源となる酸を加えた方が好ましい。酸は強すぎるとエステルを分解してしまうため弱酸である方が好ましい。具体的には酢酸、シュウ酸、クエン酸、リン酸、安息香酸、ホウ酸、トリエチルアミン塩酸塩などが挙げられるが、好ましくは酢酸である。
【０１３１】
酸の使用量としては、式（６）で表される化合物に対して通常２〜１０モル当量であるが、好ましくは４〜８当量である。
【０１３２】
反応には溶媒を使用する。溶媒としては、テトラヒドロフラン、クロロホルム、酢酸エチル、エタノール、メタノールなどが挙げられるが、好ましくは、テトラヒドロフランである。
【０１３３】
反応温度は通常０〜７０℃であり、好ましくは１０〜６０℃である。反応時間は通常１〜１２時間であり、好ましくは４〜８時間である。
【０１３４】
得られた式（７）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって、適宜精製することができる。
【０１３５】
工程８（エステル化）
式（７）で表される化合物と式（ｐ）（式中、Ｒ３、Ｒ４及びＺ２は前記と同義である。）で表される化合物とを反応させることにより、本発明の式（９）で表される化合物を得ることができる。
【０１３６】
反応には、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用する。反応時は、式（７）で表される化合物と式（ｐ）で表される化合物とを直接反応させてもよく、又は式（ｐ）で表される化合物の酸無水物を形成後に式（７）で表される化合物と反応させてもよい。
【０１３７】
反応には塩基触媒を加える。塩基触媒としてはＤＭＡＰ、ピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられるが、好ましくは、ＤＭＡＰである。
【０１３８】
式（ｐ）で表される化合物の仕込み量は、式（７）で表される化合物に対して通常２〜１０モル当量であり、好ましくは４〜８モル当量である。
【０１３９】
反応は溶媒を使用しても、無溶媒で行ってもよいが、式（ｐ）で表される化合物は高極性の固体であり、反応系中で分散させる必要があることから、溶媒の使用が好ましい。式（ｐ）で表される化合物を分散させ得る溶媒としては、例えばクロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、酢酸エチルなどが挙げられ、これらの中ではクロロホルムが好ましい。
【０１４０】
反応温度は通常１０〜６０℃であり、好ましくは２０〜４０℃である。反応時間は通常１〜２０時間であり、好ましくは２〜１０時間である。
【０１４１】
得られた式（９）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって、適宜精製することができる。
【０１４２】
工程９（エステル化）
式（７）で表される化合物と式（ｑ）（式中のＤ、Ｅは前記と同義である。）で表される化合物とを反応させることにより、式（８）で表される化合物を得ることができる。
【０１４３】
式（ｑ）で表される化合物中のＤが水酸基の場合、反応には、ＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤＣなどの縮合剤を使用する。式（７）で表される化合物と式（ｑ）で表される化合物とを直接反応させてもよく、又は式（ｑ）で表される化合物の酸無水物を形成後に式（７）で表される化合物と反応させてもよい。
【０１４４】
反応には塩基触媒を加える。塩基触媒としてはＤＭＡＰ、ピリジン、トリエチルアミンなどが挙げられるが、好ましくは、ＤＭＡＰである。
【０１４５】
式（ｑ）で表される化合物中のＤがハロゲン原子の場合、副生するハロゲン化水素を中和するために塩基を加える。塩基としては、トリエチルアミン、ピリジンなどが挙げられる。
【０１４６】
反応は溶媒を使用する。溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、酢酸エチルなどが挙げられるが、好ましくはトルエンである。
【０１４７】
式（ｑ）で表される化合物の仕込み量は、式（７）で表される化合物に対して通常２〜１０モル当量であり、好ましくは２〜５モル当量である。
【０１４８】
反応温度は通常０〜６０℃、好ましくは１０〜４０℃であり、反応時間は通常１〜１０時間、好ましくは１〜５時間である。
【０１４９】
得られた式（８）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって、適宜精製することができる。
【０１５０】
工程１０（アミノ化）
Ｒ３およびＲ４を含む２級アミンと式（８）で表される化合物とを反応させることにより、本発明の式（９）で表される化合物を得ることができる。
【０１５１】
反応は炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、ｔ−ブトキシカリウムなどの塩基触媒を使用しても、無触媒で行ってもよい。
【０１５２】
反応は溶媒を使用しても、無溶媒で行ってもよい。溶媒には、例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦなどが使用でき、これらの中ではトルエンの使用が好ましい。
【０１５３】
Ｒ３およびＲ４を含む２級アミンの仕込み量は、式（８）で表される化合物に対して通常１〜２０モル当量であり、好ましくは５〜１０モル当量である。
【０１５４】
反応温度は通常１０〜１００℃であり、好ましくは６０〜８０℃である。反応時間は通常１〜１０時間であり、好ましくは２〜６時間である。
【０１５５】
得られた式（９）で表される化合物は、抽出、再結晶、吸着処理、再沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの手段によって適宜精製することができる。
【０１５６】
当業者であれば、適宜原料を選択し、本明細書の実施例の方法に準じて反応を行うことにより、所望の本発明のカチオン性脂質を製造することができる。
【０１５７】
２．本発明の脂質膜構造体
次に本発明の脂質膜構造体について説明する。本発明の脂質膜構造体は、上記式（１）で表されるカチオン性脂質（即ち、本発明のカチオン性脂質）を膜の構成脂質として含有するものである。ここで、本発明における「脂質膜構造体」とは、膜の構成脂質の親水基が界面の水相側に向かって配列した脂質膜構造体を意味する。
【０１５８】
本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、水系溶媒に本発明のカチオン性脂質が分散した形態として、リポソーム（例えば、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム等）、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、または不特定の層状構造物等を挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の形態は、好ましくはリポソームである。
【０１５９】
本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質に加え、それ以外のその他の構成成分をさらに含有してよい。当該その他の構成成分としては、例えば、脂質（例えば、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン等）、糖脂質、ペプチド脂質、コレステロール、本発明のカチオン性脂質以外のカチオン性脂質、ＰＥＧ脂質等）、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム塩、オクチルグリコシド、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミド類、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ類、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等）、ＰＥＧ、タンパク質等が挙げられる。本発明の脂質膜構造体における当該その他の構成成分の含有量は、通常５〜９０重量％であり、好ましくは１０〜３０重量％である。
【０１６０】
本発明の脂質膜構造体に含まれる本発明のカチオン性脂質は１種類のみであっても、２種類以上を併用してもよい。本発明のカチオン性脂質を２種類以上併用することで、本発明の脂質膜構造体のｐＫａを４〜７の範囲において任意に調整することができる。本発明の脂質膜構造体のｐＫａを目的に適した値に調整することで、機能性核酸を高効率に細胞内に送達することが可能である。
【０１６１】
本発明の脂質膜構造体に含まれる本発明のカチオン性脂質の含有量は特に限定されないが、例えば、本発明の脂質膜構造体を後述の核酸導入剤において用いた場合、本発明の脂質膜構造体は、核酸を導入するのに十分な量の本発明のカチオン性脂質を含むことが好ましい。本発明の脂質膜構造体に含まれる本発明のカチオン性脂質の含有量は、通常、本発明の脂質膜構造体に含まれる総脂質量の５〜１００ｍｏｌ％、好ましくは３０〜９０ｍｏｌ％、より好ましくは５０〜７０ｍｏｌ％である。
【０１６２】
本発明の脂質膜構造体は、本発明のカチオン性脂質及びその他の構成成分（脂質等）を適当な溶媒または分散媒、例えば、水性溶媒やアルコール性溶媒中に溶解または分散させ、必要に応じて組織化を誘導する操作を行うことにより調製することができる。
【０１６３】
「組織化を誘導する操作」としては、例えば、エタノール希釈法、単純水和法、超音波処理、加熱、ボルテックス、エーテル注入法、フレンチ・プレス法、コール酸法、Ｃａ２＋融合法、凍結−融解法、逆相蒸発法等の自体公知の方法が挙げられる。
【０１６４】
３．本発明の核酸導入剤
本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体に核酸を導入させ、それを生体内および／又は生体外の細胞に接触させることにより、該細胞内へ核酸を導入することができる。従って、本発明は、核酸導入剤（以下、「本発明の剤」と称する）も提供する。
【０１６５】
本発明の剤は、上述の本発明のカチオン性脂質を含む脂質膜構造体および核酸を含むことを主たる特徴とする。
【０１６６】
本発明の剤は、一態様として、本発明の脂質膜構造体及び核酸を含むものであってよく、その場合、当該核酸は、本発明の脂質膜構造体に導入されていることが好ましい。ここで、核酸を本発明の脂質膜構造体に「導入する」とは、脂質二重膜から形成される空間に核酸を封入することを意味する。
【０１６７】
本発明の脂質膜構造体に導入し得る核酸は特に制限されず、任意の核酸を使用できる。核酸の種類としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、核酸は１〜３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、例えば、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）または特殊な結合を含有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）等であってもよい。さらに該核酸は、例えば、公知の修飾の付加された核酸、当該分野で知られた標識のある核酸、キャップの付いた核酸、メチル化された核酸、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換した核酸、分子内ヌクレオチド修飾のされた核酸、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）を持つ核酸、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を持つ核酸、例えば蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）や糖（例えば、モノサッカライド等）等の側鎖基を有している核酸、インターカレント化合物（例えば、アクリジン、プソラレン等）を持つ核酸、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属等）を含有する核酸、アルキル化剤を含有する核酸、修飾された結合を持つ核酸（例えば、αアノマー型の核酸等）等であってもよい。
【０１６８】
本発明において使用できるＤＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができ、例えばプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＰＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられ、好ましくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡであり、より好ましくはプラスミドＤＮＡである。プラスミドＤＮＡ等の環状ＤＮＡは適宜制限酵素等により消化され、線形ＤＮＡとして用いることもできる。
【０１６９】
本発明において使用できるＲＮＡの種類は特に制限されず、使用の目的に応じて適宜選択することができ、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡゲノム、二本鎖ＲＮＡゲノム、ＲＮＡレプリコン、トランスファーＲＮＡ、リボゾーマルＲＮＡ等が挙げられ、好ましくはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡレプリコンである。
【０１７０】
本発明において用いられる核酸は、当業者が通常用いる方法により精製されていることが好ましい。
【０１７１】
本発明の剤は、例えば、疾患の予防および／または治療を目的として、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与することができる。従って、本発明において用いられる核酸は、ある所定の疾患に対して予防および／又は治療活性を有するもの（予防・治療用核酸）が好ましい。そのような核酸としては、例えば、いわゆる遺伝子治療に用いられる核酸等が挙げられる。
【０１７２】
本発明の脂質膜構造体に核酸を導入する方法は特に制限されないが、例えば、本発明の脂質膜構造体を形成する際に、本発明の脂質膜構造体の構成成分と所望の核酸とを共存させることにより、本発明の脂質構造体に核酸を導入できる。例えば、エタノール希釈法により本発明の脂質膜構造体を形成する場合は、核酸の水溶液と、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）のエタノール溶液とをボルテックス等で激しく混合した後で、混合物を適切な緩衝液で希釈することにより、核酸が導入された本発明の脂質膜構造体の懸濁液が得られる。単純水和法により本発明の脂質膜構造体を形成する場合は、本発明の脂質膜構造体の構成成分（脂質等）を適切な有機溶媒に溶解し、該溶液をガラス容器に入れ、減圧乾燥することにより溶媒を留去し、脂質薄膜を得た後、ここに、核酸の水溶液を加え、水和させた後に、ソニケーターで超音波処理することにより、核酸が導入された本発明の脂質膜構造体の懸濁液が得られる。
【０１７３】
本発明の剤の一形態として、例えば、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ  ｎａｎｏ  ｄｅｖｉｃｅ、以下、「ＭＥＮＤ」と称する）が挙げられる。該ＭＥＮＤは、例えば、核酸とポリカチオン（例えば、プロタミン等）との間の静電的複合体を本発明の脂質膜構造体に導入すること等により調製できる（Ｋｏｇｕｒｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ  ｎａｎｏ  ｄｅｖｉｃｅ  （ＭＥＮＤ）  ａｓ  ａ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．，  ６０，  ５５９−５７１（１  Ｍａｒｃｈ  ２００８）。この構造体（ＭＥＮＤ）は、核酸等を特定の細胞内に選択的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして用いることができ、例えば、樹状細胞への抗原遺伝子導入によるＤＮＡワクチンや腫瘍の遺伝子治療等に有用である。
【０１７４】
核酸が導入された本発明の脂質膜構造体の表面電荷（ゼータ電位）は、好ましくは−１０〜＋１０ｍＶであり、さらに好ましくは−１０〜＋５ｍＶである。従前の遺伝子導入においては、表面電荷が正に荷電された粒子が主に用いられてきた。これは、負電荷を有する細胞表面のヘパリン硫酸との静電的相互作用を促進し、細胞への取り込みを促進するための方法としては有用であるが、正の表面電荷は、細胞内において導入遺伝子との相互作用による転写抑制やｍＲＮＡとの相互作用による翻訳抑制を生み出す可能性がある。表面電荷を上記の範囲内に調整することによりこの問題を解決し得る。表面電荷の測定は、Ｍｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を用いて行うことができる。表面電荷は、本発明の脂質膜構造体の構成成分の組成を、本発明の目的を損なわない範囲内で適宜調整することにより、所望の値に調整することができる。
【０１７５】
本発明の剤と細胞とを接触させることで、本発明の剤に含まれる核酸を細胞内へ導入することができる。当該「細胞」の種類は、特に限定されず、原核生物及び真核生物の細胞を用いることができるが、好ましくは真核生物の細胞である。当該真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物；昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の非脊椎動物；植物；微生物（例えば、酵母等）等が挙げられる。より好ましくは、本発明で対象とされる細胞は、好ましくは動物細胞（例えば、脊椎動物細胞等）もしくは植物細胞であり、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や組織より単離された細胞、あるいは組織もしくは組織片の細胞であってもよい。また、当該細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。
【０１７６】
生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において本発明の剤と細胞とを接触させる方法を以下において具体的に説明する。
【０１７７】
細胞は本発明の剤との接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。本発明の剤との接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
【０１７８】
当該接触時の培養液は、血清含培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は３０重量％以下が好ましく、２０重量％以下であることがより好ましい。培地中に過剰な血清等の蛋白質が含まれていると、本発明の剤と細胞との接触が阻害される可能性がある。
【０１７９】
当該接触時の細胞密度は、特に限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４〜１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
【０１８０】
このように調製された細胞に、例えば、上述の核酸が導入された本発明の脂質膜構造体の懸濁液を添加する。該懸濁液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際の、該懸濁液における本発明の脂質膜構造体の濃度は、目的とする核酸の細胞内への導入が達成可能な限り特に限定されないが、脂質濃度として、通常１〜１００ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０〜５０ｎｍｏｌ／ｍＬであり、核酸の濃度として、通常０．０１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１０μｇ／ｍＬである。
【０１８１】
上述の懸濁液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定できる。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１〜２４時間の範囲であり、好ましくは０．２５〜４時間の範囲であり、より好ましくは０．５〜２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、核酸が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
【０１８２】
上記培養により、核酸が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、または培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は血清又は栄養因子を含むことが好ましい。
【０１８３】
また、上記の通り、本発明の剤を用いることで、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においても核酸を細胞内へ導入することが可能である。即ち、本発明の剤を対象に投与することにより、例えば、核酸が導入された本発明の脂質膜構造体が標的細胞へ到達・接触し、生体内で該脂質膜構造体に導入された核酸が細胞内へ導入される。本発明の剤を投与可能な対象は、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例、カエル等）、魚類（例、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることが出来る。本発明の剤の投与対象は、好ましくはヒトまたは他の哺乳動物である。
【０１８４】
標的細胞の種類は特に限定されず、本発明の剤を用いることで、種々の組織（例、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組織等）中の細胞へ、核酸を導入することが可能である。
【０１８５】
また、本発明の剤に含まれる脂質膜構造体は、核酸以外の化合物が導入されたものであってよい。本発明の剤が、核酸以外の化合物が導入された脂質膜構造体を含む場合、本発明の剤の対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物等）への投与方法は、標的細胞へ該脂質膜構造体が到達・接触し、該脂質膜構造体に導入された化合物を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。本発明の剤の投与量は、化合物の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、導入化合物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。本発明の脂質膜構造体に化合物を導入する方法は特に制限されず、例えば、上述の本発明の脂質膜構造体に核酸を導入する方法と同様の方法またはこれに準じた方法により製造できる。
【０１８６】
本発明の剤の剤形は特に制限されないが、例えば、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、点滴剤等）等が挙げられる。
【０１８７】
本発明の剤は、本発明の脂質膜構造体を、用途（例えば、研究用試薬、医薬等）に応じた常套手段に従って製剤化することにより製造できる。
【０１８８】
本発明の剤が研究用試薬として提供される場合、当該本発明の剤は、本発明の脂質膜構造体をそのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、水溶性溶媒（例えば、リンゴ酸緩衝液等）、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ等）もしくは水溶性溶媒と有機溶媒との混合液等）との無菌性溶液もしくは懸濁液を用いて提供され得る。本発明の剤は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことが出来る。
【０１８９】
また、本発明の剤が医薬として提供される場合、当該本発明の剤は、本発明の脂質膜構造体をそのままで用いて、あるいは医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とともに用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として、好ましくは非経口剤（より好ましくは、注射剤）として製造することができる。
【０１９０】
本発明の剤は、成人用に加えて、小児用の製剤とすることもできる。
【０１９１】
本発明の剤はキットの態様で提供することも可能である。当該キットには、本発明の脂質膜構造体および核酸に加えて、細胞への核酸導入の際に使用する試薬を含むことができる。一態様において、本発明の剤（又はキット）は、ポリカチオン（例えば、プロタミン等）を更に含むことができる。本発明の剤（又はキット）は、ポリカチオン（例えば、プロタミン等）を更に含むことにより、容易に核酸とポリカチオン（例えば、プロタミン等）との間の静電的複合体を、本発明の脂質膜構造体に導入し、ＭＥＮＤを調製できる。当該ＭＥＮＤは、核酸の細胞内導入に利用できる。
【実施例】
【０１９２】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されない。【０１９３】
実施例の説明において使用している略語の意味は、それぞれ以下のとおりである。
Ｌｉｎ−Ｍｓ：リノレイルメタンスルホネート
ＭＩＭ：３，４−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−マンニトール
ＴＬＭＩＭ：１，２，５，６−テトラリノレイル−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−マンニトール
ＴＬＭ：１，２，５，６−テトラリノレイル−Ｄ−マンニトール
ＴＬＭ−Ｃ２−Ｂｒ：１，２，５，６−テトラリノレイル−３，４−ジ（ブロモアセチル）−Ｄ−マンニトール
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
Ｃｈｏｌ：コレステロール
ＰＥＧ２０００−ＤＭＧ：１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール，メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ  分子量：２０００）
Ｄｅｃｅｎｙｌ−Ｍｓ：デセニルメタンスルホネート
ＴＤＭＩＭ：１，２，５，６−テトラキス（デセニル）−３，４−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−マンニトール
ＴＤＭ：１，２，５，６−テトラキス（デセニル）−Ｄ−マンニトール
ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＴＢＤＰＳ−Ｍ：１，６−ジ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−Ｄ−マンニトール
ＤＴＢＤＰＳ−ＴＬＭＥＳ：１，６−ジ−（ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル）−２，３，４，５−テトラリノレオイル−Ｄ−マンニトール
ＴＬＭＥＳ：テトラリノレオイル−Ｄ−マンニトール
ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド【０１９４】
表２及び表３に、以下の実施例及び比較例において製造したカチオン性脂質の名称と構造を示した。【０１９５】
【表２】
0006605477.tif 000016
【０１９６】
【表３】
0006605477.tif 000017
【０１９７】
［製造例１］
＜シリル基保護＞  ＤＴＢＤＰＳ−Ｍの合成
Ｄ−マンニトール（東京化成工業株式会社製）３．０ｇ（１６．５ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド４８ｍＬ、およびＤＩＰＥＡ（関東化学株式会社製）６．４ｇ（４９．４ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら０〜１０℃まで冷却した。そこへＴＢＤＰＳ−Ｃｌ（東京化成工業株式会社製）１３．６ｇ（４９．４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１６ｍＬに溶解させた溶液を、１０℃を超えないように滴下により加えた。滴下終了後、２０℃まで昇温し、２．５時間攪拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９／１（ｖ／ｖ）、過マンガン酸カリウムで発色）により、Ｄ−マンニトールおよびモノシリル体が消失していることを確認し、反応を終了した。反応溶液にイオン交換水１２０ｍＬおよびトルエン６０ｍＬを加えて、１０分間攪拌子した後、１０分間静置し、分層させた。得られたトルエン層をイオン交換水４０ｍＬで再度水洗した後、トルエン層を濃縮した。得られた濃縮物をアセトニトリル１７０ｍＬに溶解させた後、ヘキサン１７０ｍＬで５回抽出精製を行った。得られたアセトニトリル層の溶媒を留去し、ＤＴＢＤＰＳ−Ｍ９．２ｇを得た。
得られたＤＴＢＤＰＳ−Ｍを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ１．０３ｐｐｍ（ｓ，  １８Ｈ，  （ＣＨ３−）３Ｃ−）、δ３．７９−３．８９ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ（−ＯＨ）−ＣＨ（−ＯＨ）−）、δ７．２５−７．７２ｐｐｍ（ｍ，  ２０Ｈ，  ｔＢｕ−Ｓｉ（−Ｐｈ)２−）【０１９８】
［実施例１］（ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡの合成）
＜メシル化＞  Ｌｉｎ−Ｍｓの合成
リノレイルアルコール１００ｇ（日油株式会社製、純度≧９９％）（０．３８ｍｏｌ）、トリエチルアミン（関東化学株式会社製）４６ｇ（０．４５ｍｏｌ）を脱水トルエン５００ｇに加えて溶解させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら１０℃に冷却した。温度が３０℃以下になるように塩化メタンスルホニル（関東化学株式会社製）４７ｇ（０．４１ｍｏｌ）を２時間かけて滴下した。滴下終了後、ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム、リン酸硫酸銅発色）によりリノレイルアルコールのスポットが消失したことを確認した。エタノール５．２ｇ（０．１１ｍｏｌ）を加え、ろ紙にて不溶物をろ別除去した。ろ液をイオン交換水１５０ｇで洗浄し、水層を廃棄した。水洗を再度行った後、得られた有機層に無水硫酸マグネシウム２０ｇを加えて脱水処理を行った。ろ紙にて不溶物をろ別除去し、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去してＬｉｎ−Ｍｓを１２０ｇ得た。
得られたＬｉｎ−Ｍｓを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−  ）、δ１．４１−１．２６ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．７５ｐｐｍ（ｑｕｉｎｔ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０５ｐｐｍ（ｑ，  ４Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ２Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ３．００ｐｐｍ（ｓ，  ３Ｈ，  −ＳＯ２−ＣＨ３）、δ４．２２ｐｐｍ（ｔ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２−Ｏ−）、δ５．４１−５．３１ｐｐｍ（ｍ，  ４Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）【０１９９】
＜エーテル化＞  ＴＬＭＩＭの合成
ＭＩＭ（東京化成工業株式会社製）２．０ｇ（９．００ｍｍｏｌ）にトルエン４０ｇを加え、さらに水酸化カリウム(関東化学株式会社製)４．２ｇ（７４．５０ｍｍｏｌ）、Ｌｉｎ−Ｍｓ１８．６ｇ（５４．００ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で５分間撹拌した。その後８０℃に昇温し、１４時間撹拌した。１Ｈ−ＮＭＲ分析により、反応生成物由来のピークが出現したこと、Ｌｉｎ−Ｍｓ由来のピークの積分値の減少が止まったことを確認し反応を停止した。反応溶液にトルエン６０ｍＬとイオン交換水１００ｍＬを加え２０℃で１０分間撹拌した後に１０分間静置し分層させた。水層を除去後、水洗を再度行った。次に２５ｗｔ％食塩水１００ｍＬを加え１０分間撹拌した後に１０分間静置して分層させ、水層を除去した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウム２．０ｇを加え脱水処理を行った。ろ紙にて不溶分をろ別除去しエバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去して褐色液体１１．５ｇを得た。
得られた褐色液体１０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０〜９８／２（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭＩＭを３．０ｇ得た。  得られたＴＬＭＩＭを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．３８−１．２９ｐｐｍ（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．３８ｐｐｍ（ｓ，  ６Ｈ，  −Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｏ−）、δ１．５６ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０５ｐｐｍ（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ３．５４−３．４１ｐｐｍ（ｍ，  １０Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−）、δ３．６７ｐｐｍ（ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−）、δ４．０６ｐｐｍ（ｄ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−）、δ５．４０−５．３１ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）【０２００】
＜脱保護＞  ＴＬＭの合成
ＴＬＭＩＭ６．７ｇ（５．５１ｍｍｏｌ）にエタノール６７ｍＬ、イオン交換水４．０ｇ（２２０．４０ｍｍｏｌ）、塩酸（４．０Ｍ  ジオキサン溶液）（東京化成工業株式会社製）１３．８ｍＬ（塩酸として５５．１０ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で６ｈ撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９９．５／０．５（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、ＴＬＭＩＭのスポットが消失したことを確認し反応を終了した。反応液を５℃に冷却しながら１３ｈ静置して分層させ、有機層を回収した。回収した有機層は窒素バブリングにより溶媒を留去し、微褐色液体５．１ｇを得た。
得られた微褐色液体４．６ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９８／２〜９／１（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭを３．５ｇ得た。
得られたＴＬＭを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．３８−１．２８ｐｐｍ（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．５６ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、２．０５ｐｐｍ（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、３．３０ｐｐｍ（ｄ，  ２Ｈ，  −ＯＨ）、３．５１−３．４２ｐｐｍ（ｍ，  ６Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−ＯＨ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−ＯＨ）、３．６８−３．５２ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．８２ｐｐｍ（ｄ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−ＯＨ）、５．３９−５．３１ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）【０２０１】
＜エステル化＞  ＴＬＭ−Ｃ２−Ｂｒの合成
ＴＬＭ１．０ｇ（０．８５ｍｍｏｌ）とブロモ酢酸（東京化成工業株式会社製）３５４．５ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）をクロロホルム１０ｍＬに溶解させた後、ＤＭＡＰ（広栄化学工業株式会社製）５１．９ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ（東京化成工業株式会社製）３２１．８ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて１時間撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルムのみ、リン酸硫酸銅発色）により、ＴＬＭのスポットが消失したことを確認した。その後、反応液をイオン交換水１０ｍＬ、２５ｗｔ％食塩水１０ｍＬで洗浄し、有機層を回収した。回収した有機層に無水硫酸マグネシウム１．０ｇを加え脱水処理を行い、ろ紙にて不溶分を濾別した。エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、微褐色液体を１．６ｇ得た。
得られた微褐色液体をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０〜９７／３（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭ−Ｃ２−Ｂｒを９８０ｍｇ得た。
得られたＴＬＭ−Ｃ２−Ｂｒを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−  ）、１．３８−１．２７  ｐｐｍ  （ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．５２  ｐｐｍ  （ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、２．０５  ｐｐｍ  （ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、２．７７  ｐｐｍ  （ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、３．５１−３．３７  ｐｐｍ  （ｍ，  １０Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）、３．６０  ｐｐｍ  （ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）、３．８４  ｐｐｍ  （ｓ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−）、５．４０−５．３１  ｐｐｍ  （ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、５．５１  ｐｐｍ  （ｄ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）【０２０２】
＜アミノ化＞  ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡの合成
ＴＬＭ−Ｃ２−Ｂｒ３００ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ２．２ｍＬに溶解させた後、ジメチルアミン（２．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）（東京化成工業株式会社製）８４６μＬ（ジメチルアミンとして１．６８ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃にて４時間撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９６／４（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、反応生成物のスポットが出現したこと、並びに原料であるＴＬＭ−Ｃ２−Ｂｒのスポットが消失したことを確認した。反応溶液にクロロホルム８ｍＬ、イオン交換水１０ｍＬを加えて１０分間撹拌を行った後に１０分間静置して分層させ、水層を除去した。その後、イオン交換水１０ｍＬによる水洗を計３回、２５ｗｔ％食塩水１０ｍＬによる水洗を一回行い、有機層を回収した。回収した有機層に無水硫酸マグネシウム０．５ｇを加え脱水処理を行った。ろ紙にて不溶分をろ別し除去し、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去してＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡを２６０ｍｇ得た。
得られたＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、１．３８−１．２７ｐｐｍ（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、１．５２ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、２．０５ｐｐｍ（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、２．３５ｐｐｍ（ｓ，  １２Ｈ，  −Ｎ−（ＣＨ３）２）、２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、３．１６ｐｐｍ（ｑ，  ４Ｈ、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−）、３．４９−３．３５ｐｐｍ（ｍ，  １０Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）、３．５５ｐｐｍ（ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）、５．４０−５．３１ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、５．４７ｐｐｍ（ｄ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）【０２０３】
［実施例２］（ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡの合成）
＜エステル化＞
ＴＬＭ１．０ｇ（０．８５ｍｍｏｌ）とジメチルアミノプロピオン酸塩酸塩（東京化成工業株式会社製）７８３．８ｍｇ（５．１０ｍｍｏｌ）をクロロホルム１０ｍＬに溶解させた後、ＤＭＡＰ５１．９ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（タマ化学工業株式会社製）１．１ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）を加え、２５±５℃にて１時間撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝８５／１５（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、ＴＬＭのスポットが消失したことを確認した。ろ紙にて反応液中の不溶物をろ別除去し、得られたろ液にクロロホルム１０ｍＬ、イオン交換水２０ｍＬ、メタノール３０ｍＬを加えて洗浄し有機層を回収した。さらに有機層にイオン交換水２０ｍＬ、メタノール４０ｍＬを加えて洗浄し、有機層を回収した。回収した有機層に無水硫酸マグネシウム１．０ｇを加え脱水処理を行った。ろ紙にて不溶分をろ別除去し、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、微褐色液体を１．６ｇ得た。
得られた微褐色液体をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９８／２〜９６／４（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡを１０２ｍｇ得た。
得られたＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．３８−１．２７（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．５２（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０５（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、δ２．２３（ｓ，  １２Ｈ，  −Ｎ−（ＣＨ３）２）、δ２．４９（ｔ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．６０（ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．７７（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ３．４３（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ３．５３（ｍ，  ６Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）、δ５．３９−５．３０（ｍ，  １８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）【０２０４】
［実施例３］（ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡの合成）
＜エステル化＞
ＴＬＭ０．５ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）とジメチルアミノ酪酸塩酸塩（ＡＣＲＯＳ  ＯＲＧＡＮＩＣＳ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）４２７．６ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）をクロロホルム５ｍＬに溶解させた後、ＤＭＡＰ５１．９ｍｇ（０．４３ｍｍｏｌ）、ＤＩＣ３２１．８ｍｇ（２．５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃にて４時間撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝８５／１５（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、ＴＬＭのスポットが消失したことを確認した。その後、反応液をイオン交換水５ｍＬ、エタノール５ｍＬを加えて洗浄し、有機層を回収した。同様の洗浄を再度行い、回収した有機層に硫酸マグネシウム０．５ｇを加えることで脱水処理を行った。ろ紙にて不溶分をろ別除去し、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、微褐色液体を５１５．８ｍｇ得た。
得られた微褐色液体のうち４００ｍｇをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９６／４〜８／２（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡを２４４ｍｇ得た。
得られたＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９  ｐｐｍ  （ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．３８−１．２７  ｐｐｍ  （ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．５３  ｐｐｍ  （ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ１．７７  ｐｐｍ  （ｑｕｉｎｔ，  ４Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）、δ２．０５  ｐｐｍ  （ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−）、δ２．２１  ｐｐｍ  （ｓ，  １２Ｈ，  −Ｎ−（ＣＨ３）２）、δ２．２８  ｐｐｍ  （ｔ，  ４Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）、δ２．３４  ｐｐｍ  （ｍ，  ４Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２）、δ２．７７  ｐｐｍ  （ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ３．５４−３．３８  ｐｐｍ  （ｍ，  １４Ｈ，  ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  −ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−，  −ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−  ），  δ５．４０−５．３２  ｐｐｍ  （ｍ，  １８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−，  −ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）【０２０５】
［実施例４］（ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡの合成）
＜メシル化＞  Ｄｅｃｅｎｙｌ−Ｍｓの合成
デセニルアルコール（ＡＬＤＲＩＣＨ社製）１０．０ｇ（６４．０ｍｏｌ）、トリエチルアミン７．８ｇ（７６．８ｍｏｌ）を脱水トルエン５０ｇに加えて溶解させ、窒素雰囲気下で撹拌しながら１０℃に冷却した。温度が３０℃以下になるように塩化メタンスルホニル８．１ｇ（７０．４ｍｏｌ）を３０分かけて滴下した。滴下終了後、ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム、リン酸硫酸銅発色）によりデセニルアルコールのスポットが消失していることを確認した。エタノール０．９ｇ（１９．２ｍｏｌ）を加え、ろ紙にて不溶物をろ別除去した。ろ液をイオン交換水２０ｇで洗浄し、水層を廃棄した。水洗を再度行った後、得られた有機層に無水硫酸マグネシウム５ｇを加えて脱水処理を行った。ろ紙にて不溶物をろ別除去し、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去してＤｅｃｅｎｙｌ−Ｍｓを１４．５ｇ得た。
得られたＤｅｃｅｎｙｌ−Ｍｓを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  ３Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．２６−１．３６ｐｐｍ（ｍ，  ６Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．８１ｐｐｍ（ｑｕｉｎｔ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０２ｐｐｍ（ｑ，  ２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝）、δ２．１６ｐｐｍ（ｑ，  ２Ｈ，＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ３．００ｐｐｍ（ｓ，  ３Ｈ，  −ＳＯ２−ＣＨ３）、δ４．２３ｐｐｍ（ｔ，  ２Ｈ，  −ＣＨ２−Ｏ−）、δ５．３２ｐｐｍ、δ５．４５ｐｐｍ（ｑ，  ２Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−）【０２０６】
＜エーテル化＞  ＴＤＭＩＭの合成
ＭＩＭ１．８ｇ（８．１ｍｍｏｌ）にトルエン３６ｇを加え、さらに水酸化カリウム３．６ｇ（６４．８ｍｍｏｌ）、Ｄｅｃｅｎｙｌ−Ｍｓ１１．４ｇ（４８．６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で５分間撹拌した。その後８０℃に昇温し、１４時間撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム、リン酸硫酸銅発色）により、Ｄｅｃｅｎｙｌ−Ｍｓの残存量が１０％未満となったことを確認し、反応を終了した。反応溶液にトルエン４２ｍＬとイオン交換水７２ｍＬを加え２０℃で１０分間撹拌した後に１０分間静置し分層させた。水層を除去後、水洗を再度行った。次に２０ｗｔ％食塩水７２ｍＬを加え１０分間撹拌した後に１０分間静置して分層させ、水層を除去した。得られた有機層に無水硫酸マグネシウム３．６ｇを加え脱水処理を行った。ろ紙にて不溶分をろ別除去しエバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去して褐色液体７．５ｇを得た。
得られた褐色液体７．５ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝１００／０〜９８．５／１．５（ｖ／ｖ））し、ＴＤＭＩＭを５．３ｇ得た。
得られたＴＤＭＩＭを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．２６−１．３８ｐｐｍ（ｍ，  ２４Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．３８ｐｐｍ（ｓ，  ６Ｈ，  −Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−Ｏ−）、δ１．６３ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０２ｐｐｍ（ｑ，  ８Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ３．５４−３．４１ｐｐｍ（ｍ，  １０Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−）、δ３．６７ｐｐｍ（ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−）、δ４．０６ｐｐｍ（ｄ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ３）２−）、δ５．４０−５．３１ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）【０２０７】
＜脱保護＞  ＴＤＭの合成
ＴＤＭＩＭ５．０ｇ（６．５ｍｍｏｌ）にエタノール５０ｍＬ、イオン交換水４．６ｇ（２５８．０ｍｍｏｌ）、塩酸（４Ｍジオキサン溶液）１６．１ｍＬ（６４．５ｍｍｏｌ）を加え、６０℃で３時間撹拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム／メタノール＝９９．５／０．５（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、ＴＤＭＩＭと中間体であるモノイソプロピリデン体が消失していることを確認し、反応を終了した。反応液にヘキサン５０ｍＬを加えて、２５℃で１０分攪拌した後、１０分間静置し分層させた。上層（ヘキサン層）を回収し、そこへアセトニトリル５０ｍＬを加えた。２５℃で１０分攪拌した後、１０分間静置し分層させた。アセトニトリル層を除去した後、再度アセトニトリル洗浄を行った。得られたヘキサン層の溶媒を留去し、微褐色液体４．１ｇを得た。
得られた微褐色液体４．０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９８／２〜９５／５（ｖ／ｖ））し、ＴＤＭを２．６ｇ得た。
得られたＴＤＭを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．２５−１．３５ｐｐｍ（ｍ，  ２４Ｈ，  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−）、δ１．６３ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、２．０１ｐｐｍ（ｑ，  ８Ｈ,  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、３．２６−３．８４ｐｐｍ（ｍ，  １８Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−ＯＨ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、５．３３−５．３８ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−）【０２０８】
＜エステル化＞  ＴＤＭジアクリレート体の合成
ＴＤＭ５００ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン２７５ｍｇ（２．７２ｍｍｏｌ）を脱水トルエン５．０ｇに加え、攪拌した。そこに、脱水トルエン１．０ｇに溶解したアクリロイルクロリド２４６ｍｇ（２．７２ｍｍｏｌ）を滴下した。２５℃で１ｈ攪拌した後、析出物をろ過し、ＴＤＭジアクリレート体のトルエン溶液を得た。【０２０９】
＜アミノ化＞
ＴＤＭジアクリレート体のトルエン溶液に、２．０Ｍジメチルアミン／テトラヒドロフラン溶液１．７ｍｌ（ジメチルアミン３．４０ｍｍｏｌ）を加え７０℃で１ｈ攪拌した。反応溶液を２５℃まで冷却し、１０ｗｔ％食塩水５．０ｇを加えて１０分間攪拌した後、１０分間静置し分層させた。下層（水層）を除去し、上層（トルエン層）に、２５ｗｔ％食塩水５．０ｇを加えて１０分間攪拌した後、１０分間静置し分層させた。下層（水層）を除去し、上層（トルエン層）を無水硫酸マグネシウム５００ｍｇで脱水、ろ過した後、ろ液を濃縮し、微黄色液体４０６ｍｇを得た。
得られた微黄色液体のうち３００ｍｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９９／１〜９５／５（ｖ／ｖ））し、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡを２４１ｍｇ得た。
得られたＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．２７−１．３８ｐｐｍ（ｍ，  ２４Ｈ，  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−）、δ１．６３ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ２．０１ｐｐｍ（ｑ，  ８Ｈ，  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−）、δ２．２３ｐｐｍ（ｓ，  １２Ｈ，  −Ｎ−（ＣＨ３）２）、δ２．４９ｐｐｍ（ｔ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．６０ｐｐｍ（ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ３．４３（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）、δ３．５３ｐｐｍ（ｍ，  ６Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）、δ５．３９−５．３０ｐｐｍ（ｍ，  １０Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−Ｏ−ＣＯ−）【０２１０】
［実施例５］（ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡの合成）
＜エステル化＞  ＤＴＢＤＰＳ−ＴＬＭＥＳの合成
ＤＴＢＤＰＳ−Ｍ４．０ｇ（６．１ｍｍｏｌ）、リノール酸（日油社製、純度≧９９％）９．４ｇ（３３．４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ０．７ｇ（６．１ｍｍｏｌ）をクロロホルム４５ｍＬに加え、溶解させた。そこへＥＤＣ７．６ｇ（３９．５ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で５時間攪拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム、過リン酸硫酸銅発色）により、ＤＴＢＤＰＳ−Ｍおよび中間体のモノ〜トリエステル体が消失していることを確認し、反応を終了した。反応溶液から溶媒を留去した後、ヘキサン６０ｍＬに溶解させた。ヘキサン溶液にアセトニトリル３０ｍＬを加え、２５℃で１０分間攪拌した後、１０分間静置し、分層させた。ヘキサン層を回収し、溶媒を留去することで、微黄色液体１１．１ｇを得た。
得られた微黄色液体１０．０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９９．５／０．５〜９９／１（ｖ／ｖ））し、ＤＴＢＤＰＳ−ＴＬＭＥＳを６．８ｇ得た。
得られたＤＴＢＤＰＳ−ＴＬＭＥＳを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．０３ｐｐｍ（ｓ，  １８Ｈ，  （ＣＨ３−）３Ｃ−）、δ１．２５−１．３７ｐｐｍ（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−，  ＝ＣＨ−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．４７−１．５４ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−）、δ２．０４ｐｐｍ（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ２．１１−２．３２（ｍ，  ８Ｈ，  ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝）、δ３．６２−３．７４ｐｐｍ（ｍ，  ４Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−）、δ４．９９ｐｐｍ（ｍ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−）、δ５．３２−５．３９ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ５．５７ｐｐｍ（ｍ，  ２Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−）、δ７．３３−７．６３ｐｐｍ（ｍ，  ２０Ｈ，  ｔＢｕ−Ｓｉ（−Ｐｈ)２−）【０２１１】
＜脱保護＞  ＴＬＭＥＳの合成
ＤＴＢＤＰＳ−ＴＬＭＥＳ３．００ｇ（１．８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランに溶解させ、攪拌しながら５℃まで冷却した。酢酸（関東化学株式会社製）０．７ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）、およびＴＢＡＦ（１Ｍ  テトラヒドロフラン溶液）（東京化成工業株式会社製）１０．５ｍＬ（１０．５ｍｍｏｌ）を１０℃を超えないように滴下により順次加えた。滴下後、２５℃で７時間攪拌した。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム、リン酸硫酸銅発色）により、ＤＴＢＤＰＳ−ＴＬＭＥＳおよび中間体であるモノシリル体が消失したことを確認し、反応を終了した。反応溶液をクロロホルム３０ｍＬで希釈した後、５ｗｔ％炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍＬを加え、２５℃で１０分間攪拌した。攪拌後、１０分間静置し、分層させ、有機層を回収した。得られた有機層をさらにイオン交換水３０ｍＬで水洗した後、溶媒を留去し、微黄色液体３．０ｇを得た。
得られた微黄色液体２．８ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９７／３〜８０／２０（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭＥＳを１．９ｇ得た。
得られたＴＬＭＥＳを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．２５−１．３７ｐｐｍ（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−，  ＝ＣＨ−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．６１ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−）、δ２．０４ｐｐｍ（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ２．２６−２．３７（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−）、δ２．７７ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝）、δ２．９０−５．２３ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−）、δ５．３２−５．３９ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）【０２１２】
＜エステル化＞  ＴＬＭＥＳジアクリレート体の合成
ＴＬＭＥＳ１．７ｇ（１．４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．６ｇ（５．５ｍｍｏｌ）を脱水トルエン１７ｇに加え、２５℃で攪拌した。そこに脱水トルエン３．４ｇに溶解したアクリロイルクロリド０．５ｇ（５．５ｍｍｏｌ）を滴下した。２５℃で１ｈ攪拌した後、析出物をろ過し、ＴＬＭＥＳジアクリレート体のトルエン溶液を得た。【０２１３】
＜アミノ化＞  ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡの合成
ＴＬＭＥＳジアクリレート体のトルエン溶液に、２．０Ｍジメチルアミン／テトラヒドロフラン溶液６．９ｍＬ（１３．８ｍｍｏｌ）を加え、７０℃で１ｈ攪拌した。反応溶液を２５℃まで冷却し、１０ｗｔ％食塩水１７ｇを加えて１０分間攪拌した後、１０分間静置し分層させた。下層（水層）を除去し、上層（トルエン層）に、２５ｗｔ％食塩水１７ｇを加えて１０分間攪拌した後、１０分間静置し分層させた。下層（水層）を除去し、上層（トルエン層）を無水硫酸マグネシウム１．０ｇで脱水、ろ過した後、ろ液を濃縮し、微黄色液体１．４ｇを得た。
得られた微黄色液体１．４ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル＝９９／１〜９７／３（ｖ／ｖ））し、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡを０．５ｇ得た。
得られたＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡを１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）にて分析し、目的物であることを確認した。
δ０．８９ｐｐｍ（ｔ，  １２Ｈ，  ＣＨ３−ＣＨ２−）、δ１．２５−１．３７ｐｐｍ（ｍ，  ６４Ｈ，  ＣＨ３−（ＣＨ２）３−，  ＝ＣＨ−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−）、δ１．６１ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−）、δ２．０６ｐｐｍ（ｑ，  １６Ｈ，  −ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）、δ２．２２−２．３６（ｍ，  ２０Ｈ，  −（ＣＨ２）６−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−，  （ＣＨ３）２−Ｎ−）、δ２．４７−２．６４ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  （ＣＨ３）２−Ｎ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−Ｏ−）、δ２．７８ｐｐｍ（ｔ，  ８Ｈ，  ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝）、δ４．０４ｐｐｍ，δ４．３０ｐｐｍ，δ５．１１ｐｐｍ，δ５．４７ｐｐｍ（ｍ，  ８Ｈ，  −Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ−）、δ５．３２−５．３９ｐｐｍ（ｍ，  １６Ｈ，  −ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）【０２１４】
［実施例６］  各種ＭＥＮＤの調製
（１）ｓｉＲＮＡとプロタミンからなる核酸静電的複合体の形成
Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に、ｓｉＲＮＡ（北海道システム・サイエンス株式会社）を２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させ、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。
ベクターのコアとして、当該ｓｉＲＮＡ溶液、プロタミン溶液（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ；Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液でそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．３ｍｇ／ｍＬ  ｓｉＲＮＡ  ２５０μＬを攪拌しながら０．２ｍｇ／ｍＬ  プロタミン  ２５０μＬを少量ずつ滴下して、ｓｉＲＮＡとプロタミンの静電的複合体（以下、「ｓｉＲＮＡ複合体」と称する）を調製した（Ｎ／Ｐ比＝１．０）。【０２１５】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ（以下、「ＦＶＩＩ」と称する）に対するｓｉＲＮＡの配列としては、Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １７（５），  ８７２−８７９（Ｍａｙ  ２００９）に記載のもの（但し化学修飾のないもの）を用いた。【０２１６】
（２）ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤの調製（カチオン性脂質としてＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＯＤＡＰを単独で使用）
カチオン性脂質（ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ（実施例１）、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（実施例２）、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ（実施例３）、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（実施例４）、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ（実施例５）、ＤＬｉｎＤＡＰ（比較例１）、ＤＯＤＡＰ（比較例２））の９０％ブタノール溶液とＣｈｏｌ溶液を、カチオン性脂質：Ｃｈｏｌ＝７：３のモル比で、総脂質３０００ｎｍｏｌとなるように１．７ｍＬチューブに混合した。さらに、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００−ＤＭＧ溶液を総脂質に対して３ｍｏｌ％相当添加し、それぞれ全量で４００μＬとなるように９０％ブタノールを加え脂質溶液とした。これとは別の１．７ｍＬチューブに、ｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ含量：１６０μｇ）と、１３０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ４）とを混合して計１１４μＬとし、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。脂質溶液をボルテックスミキサーによって撹拌しながら、ｓｉＲＮＡ溶液を加えて混合した。この混合溶液全量を１ｍＬシリンジ（２７Ｇ）にとり、クエン酸緩衝液２ｍＬを激しく攪拌しているところ（５ｍＬチューブ）へゆっくり注入した。リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」と称する）で希釈し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １００Ｋ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、限外濾過（１０００ｇ、１５分、３０℃）を行い濃縮した。その後、ＰＢＳで希釈し、再び限外濾過を行い濃縮した。最後に、ＰＢＳで目的の脂質濃度となるよう調整し、ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤを得た。この操作により調製したＭＥＮＤは、用いたカチオン性脂質により、以下「ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ」、「ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ」、「ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ」、「ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ」、「ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ」、「ＤＬｉｎＤＡＰ  ＭＥＮＤ」、「ＤＯＤＡＰ  ＭＥＮＤ」と呼称する。【０２１７】
（３）ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤの調製（カチオン性脂質としてＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡのうち２種類を混合して使用）
ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ（実施例１）、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（実施例２）、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ（実施例３）を、表４記載のモル比で混合した脂質の９０％ブタノール溶液（ＴＬＭ−ＣＸ−ＤＭＡ  ｍｉｘ）を、それぞれＴＬＭ−ＣＸ−ＤＭＡ  ｍｉｘ：Ｃｈｏｌ＝７：３のモル比で、総脂質３０００ｎｍｏｌとなるように１．７ｍＬチューブに混合した。さらに、ＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００−ＤＭＧを総脂質に対して３ｍｏｌ％相当量添加し、それぞれ全量で４００μＬとなるように９０％ブタノールを加え、脂質溶液とした。これとは別の１．７ｍＬチューブに、ｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ含量：１６０μｇ）と１０ｍＭ  リンゴ酸緩衝液（ｐＨ７．４）とを混合して計５０μＬとし、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。脂質溶液を、ボルテックスミキサーを用いて撹拌しながら、ｓｉＲＮＡ溶液を加えて混合した。この混合溶液全量を１ｍＬシリンジ（２７Ｇ）にとり、リンゴ酸緩衝液２ｍＬを激しく攪拌しているところ（５ｍＬチューブ）へゆっくり注入した。ＰＢＳで希釈し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １００Ｋ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、限外濾過（１０００ｇ、１０分、３０℃）を行い濃縮した。その後、ＰＢＳで希釈し、再び限外濾過を行い濃縮した。最後に、溶液をＰＢＳで目的の脂質濃度となるよう調整し、ｓｉＲＮＡ封入ＭＥＮＤを得た。この操作により調製したＭＥＮＤは、表４に記載するとおりに、使用したカチオン性脂質の比率に応じて、以下「第１ＭＥＮＤ」、「第２ＭＥＮＤ」、「第３ＭＥＮＤ」、「第４ＭＥＮＤ」と呼称する。【０２１８】
【表４】
0006605477.tif 000018
【０２１９】
（４）エタノール希釈法によるｍＲＮＡ封入ＭＥＮＤの調製（ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡを単独で使用）
カチオン性脂質（ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（実施例２）、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ（実施例４））の９９．５％エタノール溶液をカチオン性脂質：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ＝３：３：４の比率で総脂質量１３１ｎｍｏｌとなるように５ｍｌチューブに混合した。またＰＥＧ脂質としてＰＥＧ２０００−ＤＭＧを総脂質量に対して３ｍｏｌ％相当添加し、全量で３０ｍＬとした。これを４本分用意した。またこれとは別に用意した１．５ｍｌチューブに、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをコードしたｍＲＮＡ（ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ  Ｔ７  Ｕｌｔｒａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて調製）を３ｍｇ分加え、ここに３０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ３．０）を全量が４５ｍｌとなるように加え、これも脂質溶液同様４本分用意した。
脂質溶液をボルテックスしながらｍＲＮＡ溶液を混合し、続けて９２５ｍｌの１００ｍＭ  ２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」と称する）緩衝液（ｐＨ５．５）を加えて混合し、あらかじめ２ｍｌのＭＥＳ緩衝液を加えておいたＶｉｖａｓｐｉｎ  ｔｕｒｂｏ  １５（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製。以下、「Ｖｉｖａｓｐｉｎ」と称する。）にデカントで加えた。さらにこの５ｍｌチューブに２ｍｌのＭＥＳ緩衝液を加えてボルテックスして洗いこみ、同様にＶｉｖａｓｐｉｎにデカントで加えた。この操作を４回繰り返し、最後にＶｉｖａｓｐｉｎに直接２ｍｌのＭＥＳ緩衝液を加え、２５℃、１０００ｇで遠心し限外濾過した。さらにＰＢＳを加えて十分希釈し、同条件で限外濾過した。この溶液をＰＢＳで目的の濃度になるように調整し、ｍＲＮＡ封入ＭＥＮＤを得た。この操作により調製したＭＥＮＤは、用いたカチオン性脂質により、以下「ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤ」、「ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤ」と呼称する。【０２２０】
ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅをコードしたｍＲＮＡの配列としては、Ｍｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４３（３），  １３１７−１３３１  （２０１５）の“ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹ  ＤＡＴＡ”に記載のものを用いた。【０２２１】
［実施例７］  各種ＭＥＮＤの粒子径、多分散度、表面電位、ｓｉＲＮＡ封入率、ｓｉＲＮＡ回収率の測定
各種ＭＥＮＤの粒子径、多分散度並びに表面電位は、動的光散乱法（ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を用いて測定した。
ｓｉＲＮＡ封入率およびｓｉＲＮＡ回収率は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定した。実施例６（２）または（３）で調製した各種ＭＥＮＤを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、これをサンプル溶液とした。また、ＭＥＮＤの調製に用いたｓｉＲＮＡ複合体を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で０〜２０００ｎｇ／ｍＬに段階希釈し、これを検量線溶液とした。これら溶液とは別に、デキストラン硫酸、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎをそれぞれ０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．４％、５μＬ／ｍＬとなるように１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈した測定溶液を用意した。また、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で置き換えたものも用意した。９６ウェルプレートに検量線溶液またはサンプル溶液を５０μＬ加え、さらにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むもしくは含まない測定溶液をそれぞれ５０μＬ混合し、７００ｒｐｍで５分間撹拌した後、励起波長５００ｎｍおよび観測波長５２５ｎｍで蛍光強度を測定した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだ条件で測定した時のｓｉＲＮＡ量を１０００ｎｇ／ｍＬで除することによりｓｉＲＮＡ回収率を算出した。またＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだ条件で測定したときのｓｉＲＮＡ量からＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含まない条件で測定したときのｓｉＲＮＡ量を引き、この値を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含んだ条件で測定したときのｓｉＲＮＡ量で徐することによりｓｉＲＮＡ封入率を算出した。
結果を表５および表６に示した。【０２２２】
【表５】
0006605477.tif 000019
【０２２３】
【表６】
0006605477.tif 000020
【０２２４】
［実施例８］  ＭＥＮＤのｐＫａ評価
ｐＨ３．０〜１０．０の範囲で種々のｐＨに合わせた、終濃度１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液およびトリスＨＣｌ緩衝液を用意した。これらの緩衝液に、実施例６（２）または（３）で調製したＭＥＮＤを脂質濃度が３０μＭとなるよう加え、さらに６−（ｐ−トルイジノ）−２−ナフタレンスルホン酸ナトリウム塩を６μＭとなるよう加えて、最終容量を１００μＬとした。その後、３７℃において励起波長３２１ｎｍおよび観測波長４４７ｎｍで蛍光強度を測定した。各ＭＥＮＤにおける蛍光強度の最大値を１００％、最小値を０％として、相対蛍光強度を百分率で算出した。また、相対蛍光強度が５０％であるｐＨをｐＫａとした。結果を表７および表８に示した。【０２２５】
【表７】
0006605477.tif 000021
【０２２６】
【表８】
0006605477.tif 000022
【０２２７】
［実施例９］  ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤの膜融合能試験
雄性ＩＣＲマウスより血液を採取して赤血球を回収し、生理食塩水に懸濁した。一定量の赤血球を含む生理食塩水を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）または１０ｍＭリン酸−１０ｍＭリンゴ酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．５、５．５）に添加した。続いて、実施例６（２）で調製したＭＥＮＤ含むＰＢＳ溶液を、脂質終濃度が３００μｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。また、ＭＥＮＤを含まない同量のＰＢＳを添加したものをネガティブコントロール（ＮＣ）とし、ＭＥＮＤを含まない同量のＰＢＳを添加した後、終濃度０．０２％（ｗ／ｖ）となるようＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して赤血球を溶解させたものをポジティブコントロール（ＰＣ）とした。これらを３７℃で４５分間インキュベートした後、４℃、４００×ｇの条件で５分間遠心分離を行い、上清を回収して、５４５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、赤血球からのヘモグロビン漏出量を定量した。続いて、ＰＣの測定値を１００％として各サンプルの測定値を百分率で表した（ヘモライシス活性）。当該百分率が高い程、膜融合能が高いことを示している。【０２２８】
結果を図１に示した。ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤは、ＤＯＤＡＰ  ＭＥＮＤ、ＤＬｉｎＤＡＰ  ＭＥＮＤと比較して高い膜融合能を示した。特にＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤはｐＨ５．５のみで高い膜融合能を示した。【０２２９】
［実施例１０］  第１ＭＥＮＤ、第２ＭＥＮＤ、第３ＭＥＮＤ、第４ＭＥＮＤによる膜融合能試験
雄性ＩＣＲマウスより血液を採取して赤血球を回収し、生理食塩水に懸濁した。ＰＢＳをｐＨ７．４、６．５、５．５に調整した後、一定量の赤血球を含む生理食塩水を添加した。続いて、実施例６（２）で調製したＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤおよびＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤと、実施例６（３）で調製したＭＥＮＤを含むＰＢＳとを、３．３μＬ、１０μＬおよび３０μＬ添加した。また、ＭＥＮＤを含まない同量のＰＢＳを添加したものをネガティブコントロール（ＮＣ）とし、ＭＥＮＤを含まない同量のＰＢＳを添加した後、０．５％（ｗ／ｖ）となるようＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加して赤血球を溶解させたものをポジティブコントロール（ＰＣ）とした。これらを３７℃で３０分間インキュベートした後、４℃、４００×ｇの条件で５分間遠心分離を行い、上清を回収して、５４５ｎｍにおける吸光度を測定することにより、ヘモグロビンの量を測定した。続いて、ＰＣの測定値を１００％として各測定値を百分率で表した（ヘモライシス活性）。当該百分率が高い程、膜融合能が高いことを示している。【０２３０】
結果を図２に示した。第２ＭＥＮＤ、第３ＭＥＮＤ、第４ＭＥＮＤにおいて、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤよりも高い膜融合能を示した。特に第２ＭＥＮＤは、第３ＭＥＮＤ、第４ＭＥＮＤと比較し、ｐＨ５．５のみで高い膜融合能を示した。【０２３１】
［実施例１１］  ＴＬＭ−Ｃ２−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＤＬｉｎＤＡＰ  ＭＥＮＤ、ＤＯＤＡＰ  ＭＥＮＤのｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン活性試験
実施例６（２）で示した方法で調製したＭＥＮＤを含む溶液を、４週齢の雄性マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与した。２４時間後に血液を採取し、本血液サンプルを１０００ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を回収することで血漿を得た。血漿中のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）量を、ＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩ  ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＣ  ＡＳＳＡＹ（Ｓｙｓｍｅｘ  ＢｉｏＭｅｄ社）を用いて定量し、未処理群（ＮＴ）のＦＶＩＩ発現量を１として、ＭＥＮＤ投与群のＦＶＩＩ発現量を相対値（相対血漿中ＦＶＩＩ量）で示した。【０２３２】
結果を図３に示した。ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤは、ＤＬｉｎＤＡＰ  ＭＥＮＤ、ＤＯＤＡＰ  ＭＥＮＤと比較し、ＦＶＩＩ発現量の低下が見られた。特にＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤが最も高いノックダウン活性を示した。【０２３３】
［実施例１２］  ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤのｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン活性試験
実施例６（２）で示した方法で調製したＭＥＮＤを含む溶液を、４週齢の雄性マウスに、０．１ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与した。２４時間後に血液を採取し、本血液サンプルを１０００ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を回収することで血漿を得た。血漿中のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）量を、ＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩ  ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＣ  ＡＳＳＡＹ（ＨＹＰＨＥＮ  ＢｉｏＭｅｄ社）を用いて定量し、未処理群（ＮＴ）のＦＶＩＩ発現量を１として、ＭＥＮＤ投与群のＦＶＩＩ発現量を相対値（相対血漿中ＦＶＩＩ量）で示した。【０２３４】
結果を図４に示した。ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭＥＳ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤについてもＦＶＩＩ発現量の低下がみられ、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤと比較し、ほぼ同等のノックダウン活性を示した。【０２３５】
［実施例１３］  ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、ＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ、および第１ＭＥＮＤ、第２ＭＥＮＤ、第３ＭＥＮＤ、第４ＭＥＮＤの、ｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン活性試験
実施例６（２）で示した方法で調製したＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ溶液およびＴＬＭ−Ｃ４−ＤＭＡ  ＭＥＮＤ溶液と、実施例６（３）で示した方法で調製したＭＥＮＤ溶液とを、４週齢の雄性マウスに、０．１ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与した。２４時間後に血液を採取し、本血液サンプルを１０００ｇ、１０分、４℃で遠心し、上清を回収することで血漿を得た。血漿中のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）量を、ＢＩＯＰＨＥＮ  ＦＶＩＩ  ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＣ  ＡＳＳＡＹ（Ｓｙｓｍｅｘ  ＢｉｏＭｅｄ社）を用いて定量し、未処理群（ＮＴ）のＦＶＩＩ発現量を１として、ＭＥＮＤ投与群のＦＶＩＩ発現量を相対値（相対血漿中ＦＶＩＩ量）で示した。【０２３６】
結果を図５に示した。第１ＭＥＮＤ、第２ＭＥＮＤにおいて、ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ＭＥＮＤよりも高いノックダウン活性を示し、第２ＭＥＮＤが高い大きいノックダウン活性を示した。【０２３７】
［実施例１４］ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍＲＮＡ発現試験
実施例６（４）で示した方法で調製したＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤ溶液、ＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤ溶液をｍＲＮＡが１ｍｇ／１００ｍｌとなるようにＰＢＳで希釈し、これを６週齢の雌性ＩＣＲマウスの頸部に皮下投与した。５．５時間後にあらかじめ３ｍｇ／２００ｍｌ／匹となるように調製しておいたルシフェリン（ＶｉｖｏＧｌｏＴＭ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ，  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｒａｄｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の生理食塩水溶液を各マウスに腹腔内投与し、この３０分後、ＩＶＩＳＴＭ  ＬｕｍｉｎａＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によりｍＲＮＡ投与部位の発光を観察、定量した。【０２３８】
結果を図６に示した。ＴＬＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤ及びＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤのいずれにおいても発光が確認され、ｍＲＮＡ発現活性を示した。中でもＴＤＭ−Ｃ３−ＤＭＡ  ｍＭＥＮＤにおいて最も強い発光量を示し、ｍＲＮＡ発現活性が高いことを示した。
【産業上の利用可能性】
【０２３９】
本発明の剤は、高効率で機能性核酸を細胞質内へ送達することが可能であるので、核酸医薬品開発や生化学実験に有用である。【０２４０】
本出願は、日本で出願された特願2014-166041（出願日：2014年8月18日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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