(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドを有する固相支持体を含み、試料から抗Ａ抗体を除去するための媒体が装填されたクロマトグラフィーカラムであって、前記血液型Ａ抗原リガンドが固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着され、酸性条件下および／またはアルカリ性条件下で安定であり、血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドが、還元的アミノ化化学またはｐＡＡテンタクル化学を介して固相支持体に付着される、クロマトグラフィーカラム。
【請求項２】
固相支持体に付着された血液型Ｂ抗原リガンドを有する固相支持体を含み、試料から抗Ｂ抗体を除去するための媒体が装填されたクロマトグラフィーカラムであって、前記血液型Ｂ抗原リガンドが固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着され、酸性条件下および／またはアルカリ性条件下で安定であり、血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドが、還元的アミノ化化学またはｐＡＡテンタクル化学を介して固相支持体に付着される、クロマトグラフィーカラム。
【請求項３】
リガンド充填量が、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１ｍｇ、または固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．５ｍｇ、または固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．６５ｍｇである、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項４】
リガンド充填量が、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１ｍｇまたは固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．２ｍｇである、請求項２に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項５】
試料から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去するための媒体が装填されたクロマトグラフィーカラムであって、前記媒体が、
（ａ）各々、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で、固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドおよび血液型Ｂ抗原リガンドの両方を有する固相支持体；または
（ｂ）固相支持体に対する血液型Ａ抗原リガンドを含む１つの固相支持体および血液型Ｂ抗原リガンドを含む別の固相支持体の２つの固相支持体の混合物を含み、各々の媒体は固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量を有し、前記媒体が酸性条件下および／またはアルカリ性条件下で安定である、クロマトグラフィーカラム。
【請求項６】
固相支持体が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項７】
固相支持体が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項２に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項８】
固相支持体が、ポリビニルエーテル系ビーズである、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項９】
固相支持体が、ポリビニルエーテル系ビーズである、請求項２に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１０】
血液型Ａ抗原リガンドが、以下の構造：
【化１】
0006494572.tif 000014
を有する、請求項１に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１１】
血液型Ｂ抗原リガンドが、以下の構造：
【化２】
0006494572.tif 000015
を有する、請求項２に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１２】
（ａ）モノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体を含有する清澄化された細胞培地原料を用意するステップ；
（ｂ）固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドを有する固相支持体を含み、試料から抗Ａ抗体を除去するための媒体への抗Ａ  ＩｇＭ抗体の結合を促進するために、当該媒体とともに細胞培地原料をインキュベートするステップであって、前記血液型Ａ抗原リガンドが固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着され、酸性条件下および／またはアルカリ性条件下で安定である、ステップ；
（ｃ）ｐＨが３．５から９．０の範囲である水性緩衝液を用いて前記媒体を洗浄するステップ；
（ｄ）ｐＨが２．０から３．０の範囲である緩衝液を用いて前記媒体から抗Ａ  ＩｇＭ抗体を溶出し、それにより溶出物を得るステップ；および
（ｅ）前記溶出物中の精製された抗Ａ  ＩｇＭ抗体を回収するステップ
を含む、清澄化された細胞培地原料からモノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体を精製するための方法。
【請求項１３】
（ａ）モノクローナル抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を含有する清澄化された細胞培地原料を用意するステップ；
（ｂ）固相支持体に付着された血液型Ｂ抗原リガンドを有する固相支持体を含み、試料から抗Ｂ抗体を除去するための媒体への抗Ｂ  ＩｇＭ抗体の結合を促進するために、当該媒体とともに細胞培地原料をインキュベートするステップであって、前記血液型Ｂ抗原リガンドが固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着され、酸性条件下および／またはアルカリ性条件下で安定である、ステップ；
（ｃ）ｐＨが３．５から９．０の範囲である水性緩衝液を用いて前記媒体を洗浄するステップ；
（ｄ）ｐＨが２．０から３．０の範囲である緩衝液を用いて前記媒体から抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を溶出し、それにより溶出物を得るステップ；および
（ｅ）前記溶出物中の精製された抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を回収するステップ
を含む、清澄化された細胞培地原料からモノクローナル抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を精製するための方法。
【請求項１４】
媒体がクロマトグラフィーカラムに装填される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
媒体がクロマトグラフィーカラムに装填される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
清澄化された細胞培地原料がカラムを流れる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５，４０１号の優先権の利益を主張するものであり、この仮出願の全内容を全体として本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンに富んだヒト血漿は、多数の疾患の治療のためならびに特定の先天性欠損症を治療するために使用される。典型的には、ヒト血漿は、異なる血液型を有する、複数のドナーからの血漿をプールすることにより得られる。血液型は、４つの主要な型に分けることができる。血液型Ａは赤血球上にＡ抗原のみを有する（および血漿中にＢ抗体が存在する）；血液型Ｂは赤血球上にＢ抗原のみを有する（および血漿中にＡ抗体が存在する）；血液型ＡＢは赤血球上にＡ抗原とＢ抗原の両方を有する（しかし、血漿中にＡ抗体もＢ抗体も存在しない。）；血液型Ｏ型は赤血球上にＡ抗原もＢ抗原も有していない（しかし、血漿中にＡ抗体とＢ抗体の両方が存在する。）。
【０００３】
Ａなどの特定の血液型抗原を有するヒトの赤血球は、抗Ａ抗原抗体などのこの抗原に結合する抗体と接触することがないことは重要であり、その理由は、このような抗体との接触が死に至る可能性がある赤血球細胞の凝集および／または溶血をもたらすであろうからである。したがって、血液型Ａを有するレシピエントは、血液型Ａまたは血液型ＡＢを有するドナーから血漿を受け入れることができるだけであり；血液型Ｂを有するレシピエントは、血液型Ｂまたは血液型ＡＢを有するドナーから血漿を受け入れることができるだけであり；血液型ＡＢを有するレシピエントは、血液型ＡＢを有するドナーから血漿を受け入れることができるだけであり；血液型Ｏを有するレシピエントは、ユニバーサルレシピエントと見なされる。異なる血液型の適合性は、安全な輸血および臓器移植の普及に重要である。しかしながら、一貫して平均したタンパク質成分を得るために、多くの人々からの血漿プールに依存する血液由来の治療薬の場合、レシピエントが不適合性の血漿を受け入れないことを確実にすることは特に困難となる。
【０００４】
血漿由来の血液型抗体を選択的に除くために多数のアプローチが開発されており、ホルマリン化され、熱処理された赤血球（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．、１９６７年、１２、７５−７７頁）、ＡおよびＢ抗原を有する熱処理されたエシェリヒア・コリ  Ｏ８６：Ｂ７（Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、１９７２年、１２巻、９８−１０２頁）、赤血球間質粉末、赤血球間質抗原由来の免疫吸着剤（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、１９７８年、７巻、４２３−４５２頁）、および合成の血液型ＡおよびＢの免疫吸着剤（Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌ．、１９８１年、２４巻、３号、２８１−２８７頁）が挙げられる。
【０００５】
固相クロマトグラフィー免疫吸着剤は、血液由来製剤を処置するための商業的なクロマトグラフィー媒体として、さらに、ＡＢＯ不適合性レシピエントへ移植する前のドナーの準備のために開発されてきた。合成の免疫吸着剤を用いることの重要な利点の１つは、天然供給源に由来する代わりに合成的に構築されること、したがって、バッチごとにより一貫した特性を有することである。
【０００６】
現在、血液型Ａ抗原（Ａ−抗原）リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原（Ｂ−抗原）リガンドを有する市販のクロマトグラフィー媒体の中には、Ｇｌｙｃｏｓｏｒｂ−ＡＢＯデバイス（Ｇｌｙｃｏｒｅｘ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ＡＢ）が含まれる。このＧｌｙｃｏｓｏｒｂデバイスは、不適合な血液型を有する患者に移植するための臓器ドナーを準備するために使用される。Ｇｌｙｃｏｓｏｒｂ−ＡＢＯデバイスにおける血液型抗原リガンドは、臓器ドナーの血液から血液型Ａ抗原抗体（抗Ａ）および血液型Ｂ抗原抗体（抗Ｂ）を結合し、除去し、したがって、臓器拒絶の危険性を低減させる。
【０００７】
さらに、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１５／００１２７７号は、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体に結合するアフィニティークロマトグラフィーマトリクスを論じている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１５／００１２７７号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．、１９６７年、１２、７５−７７頁
【非特許文献２】Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、１９７２年、１２、９８−１０２頁
【非特許文献３】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、１９７８年、７巻、４２３−４５２頁
【非特許文献４】Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍａｔｏｌ．、１９８１年、２４巻、３号、２８１−２８７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書に記載される実施形態は、試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ）から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するための新規なクロマトグラフィー媒体に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、その媒体が長期間にわたって酸性条件および／またはアルカリ性条件下で安定であるという点において、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するための以前に報告されたクロマトグラフィー媒体と比較していくつかの利点を有する。さらに、このような媒体は、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去する能力を失うことなく、リン酸、酢酸およびベンジルアルコールを含む溶液を用いて消毒することができる。
【００１２】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、試料から抗Ａ抗体を除去するためのクロマトグラフィー媒体が提供され、この場合、クロマトグラフィー媒体は、固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドを有する固相支持体を含み、リガンドは、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着され、クロマトグラフィー媒体は酸性条件およびアルカリ性条件下で安定である。特定の実施形態において、リガンド充填量は、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１ｍｇ、または固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．５ｍｇ、または固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．６５ｍｇであり、この場合、クロマトグラフィー媒体は酸性条件およびアルカリ性条件下で安定である。
【００１３】
別の実施形態において、試料から抗Ｂ抗体を除去するためのクロマトグラフィー媒体が提供され、この場合、クロマトグラフィー媒体は、固相支持体に付着された血液型Ｂ抗原リガンドを有する固相支持体を含み、リガンドは、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着され、クロマトグラフィー媒体は酸性条件および／またはアルカリ性条件下で安定である。特定の実施形態において、リガンド充填量は、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．０ｍｇ、または固相支持体１ｍｌあたり少なくとも１．２０ｍｇであり、この場合、クロマトグラフィー媒体は酸性条件およびアルカリ性条件下で安定である。
【００１４】
さらに別の実施形態では、試料から抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体の両方を除去するためのクロマトグラフィー媒体が提供され、この場合、クロマトグラフィー媒体は、各々、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で、固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドと血液型Ｂ抗原リガンドの両方を有する固相支持体を含む。
【００１５】
本明細書に記載される様々な実施形態において、固相支持体は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む。特定の実施形態において、固相支持体は、ポリビニルエーテル系固相支持体である。いくつかの実施形態において、固相支持体はビーズ形態である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、血液型Ａ抗原リガンドは、以下の構造：
【００１７】
【化１】
0006494572.tif 000002
を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、血液型Ｂ抗原リガンドは、以下の構造：
【００１９】
【化２】
0006494572.tif 000003
を含む。
【００２０】
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、クロマトグラフィー媒体は、還元的アミノ化化学を用いて固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドを含む。
【００２１】
本明細書に記載される他の実施形態において、クロマトグラフィー媒体は、ポリマーのテンタクル化学を用いて固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィー媒体は、デバイス、例えば、クロマトグラフィーカラムに装填される。
【００２３】
クロマトグラフィー媒体に加えて、本明細書に記載される実施形態はまた、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を用いて、試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料（ｆｅｅｄ））から抗抗体Ａおよび／または抗Ｂ抗体を除去するための方法に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、試料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するための方法が提供され、ここで、本方法は、開始既知量の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を含む試料を用意するステップ；媒体が抗体に結合するのに適した条件下で、上記試料と、該試料が抗Ａ抗体を含有する場合に、血液型Ａ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させ、該試料が抗Ｂ抗体を含有する場合に、血液型Ｂ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させるステップ；クロマトグラフィー媒体に結合していない試料の部分を回収するステップ；およびクロマトグラフィー媒体に結合していない試料の部分における抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量を測定するステップを含み、ここで、クロマトグラフィー媒体に結合していない試料の部分における抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量は、試料中の出発既知量の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体と比較して、少なくとも５０％に減少される。
【００２５】
本明細書に記載される実施形態はまた、抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を、それらの両方を含有する試料から除去するための方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体の連続使用を採用する。換言すると、試料を最初に、本明細書に記載される血液型Ａ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させ、続いて、本明細書に記載される血液型Ｂ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させる；または代替的に、試料は最初に、本明細書に記載される血液型Ｂ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させ、続いて、本明細書に記載される血液型Ａ抗原リガンドを含有する媒体と接触させる。他の実施形態において、試料は、両方の媒体の混合物と接触され、ここで、混合物は、単一のステップにおいて抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体の両方を除去する。さらに他の実施形態において、本明細書に記載される方法は、少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌのリガンド充填量で同一の固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドと血液型Ｂ抗原リガンドの両方を含むクロマトグラフィー媒体の使用に関する。
【００２６】
本明細書には、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を含有するクロマトグラフィーカラムを使用後に消毒するための方法も記載され、この場合、本方法は、少なくとも３時間、カラムをリン酸、酢酸およびベンジルアルコール（ＰＡＢ）を含む溶液と接触させる方法を含み、クロマトグラフィー媒体は、固相支持体上に固定化された血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドを含み、さらに、クロマトグラフィー媒体は、ＰＡＢへの曝露後に抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を除去する能力を維持する。
【００２７】
さらに、本明細書に記載される実施形態は、酸性溶液またはアルカリ性溶液を用いて、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を含有するクロマトグラフィーカラムを洗浄する方法に関する。いくつかの実施形態において、固相支持体に固定化された血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドを含有する媒体を含むクロマトグラフィーカラムを洗浄する方法が提供され、本方法は、精製サイクルの間に、クロマトグラフィー媒体を含有するクロマトグラフィーカラムを酸性溶液またはアルカリ性溶液に接触させることを採用し、クロマトグラフィー媒体は、酸性溶液またはアルカリ性溶液への長期（例えば、５０時間以上）の曝露後でさえ、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去する能力を維持する。いくつかの実施形態において、媒体は、２精製サイクル後、もしくは５精製サイクル後、もしくは１０精製サイクル後、もしくは１５精製サイクル後、もしくは２０精製サイクル後、もしくは２５精製サイクル後、もしくは３０精製サイクル後、もしくは３５精製サイクル後、もしくは４０精製サイクル後、もしくは４５精製サイクル後、もしくは５０精製サイクル後、もしくは５０超の精製サイクル後、またはさらには１００を超えるサイクル後に、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去する能力を維持し、ここで、クロマトグラフィーカラムは、精製サイクル間に酸性溶液またはアルカリ性溶液を用いて洗浄され、典型的なサイクルは、洗浄剤への３０分間の曝露からなっていてもよい。
【００２８】
本明細書に記載される媒体はまた、清澄化された細胞培養原料からモノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体またはモノクローナル抗Ｂ抗体の精製に使用することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態において、清澄化された細胞培養原料からモノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体を精製するための方法が提供され、この場合、本方法は、（ａ）モノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体を含有する清澄化された細胞培養原料を用意するステップ；（ｂ）媒体への抗Ａ  ＩｇＭ抗体の結合を促進するために、少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌのリガンド充填量で固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドを有する媒体とともに原料をインキュベートするステップ；（ｃ）３．５から９．０の範囲のｐＨを有する水性緩衝液で媒体を洗浄するステップ；（ｄ）２．０から３．０の範囲のｐＨを有する緩衝液を用いて媒体から抗Ａ  ＩｇＭ抗体を溶出し、それにより溶出物を得るステップ；および（ｅ）溶出物中の精製された抗Ａ  ＩｇＭ抗体を回収するステップを含む。
【００３０】
他の実施形態において、清澄化された細胞培養原料からモノクローナル抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を精製するための方法が提供され、この場合、本方法は、（ａ）モノクローナル抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を含有する清澄化された細胞培養原料を用意するステップ；（ｂ）媒体への抗Ｂ  ＩｇＭ抗体の結合を促進するために、少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌのリガンド充填量で固相支持体に付着された血液型Ｂ抗原リガンドを有する媒体とともに原料をインキュベートするステップ；（ｃ）３．５から９．０の範囲のｐＨを有する水性緩衝液で媒体を洗浄するステップ；（ｄ）２．０から３．０の範囲のｐＨを有する緩衝液を用いて媒体から抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を溶出し、それにより溶出物を得るステップ；および（ｅ）溶出物中の精製された抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を回収するステップを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、媒体をクロマトグラフィーカラムに装填し、抗Ａ  ＩｇＭモノクローナル抗体または抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を含有する清澄化された細胞培養原料がカラムを流れる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】抗Ａ抗原抗体に結合する代表的なオリゴ糖リガンドを示す図である。
【図２】抗Ｂ抗原抗体に結合する代表的なオリゴ糖を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
最近、幾人かの血液ドナー、時として数千以上の血液ドナーから得られた、プールされた血漿から抽出された濃縮多価ＩｇＧ抗体からなる静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）から抗Ａおよび抗Ｂ  ＩｇＧ抗体を除去するための合成免疫吸着クロマトグラフィー媒体の用途における関心が高まっている。しかしながら、ほとんどの市販のクロマトグラフィー媒体は、それらが使用されえる操作条件によって制限される。
【００３４】
本明細書に記載される実施形態は、試料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するための新規なクロマトグラフィー媒体に関する。
【００３５】
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、従来報告されているクロマトグラフィー媒体と比較して、いくつかの利点を有する。例えば、クロマトグラフィー媒体は、大規模操作に有用であり、この場合、媒体は、試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料）から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去する能力を損なうことなしに、広範囲のｐＨ条件下で複数回、容易に溶出され、定置洗浄され得る。
【００３６】
さらに、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体とともに使用される充填条件は、ｐＨ範囲が３．５から９に及ぶことができ、溶出条件は、ｐＨが２から４に及ぶことができる。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、広範囲のｐＨ条件下で使用され、定置洗浄され、および消毒され得るため、媒体とともに使用するための操作条件において多大な柔軟性をオペレーターに提供する。
【００３７】
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の除去に有用な媒体を定置洗浄するために従来報告されていないリン酸−酢酸−ベンジルアルコール（ＰＡＢ）緩衝液を用いて消毒され得る。本明細書の実施例により証明されるように、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、ＰＡＢへの曝露の１５０時間後でさえ、その性能を維持することが見出された。
【００３８】
本発明は、少なくとも、試料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するのに有用なクロマトグラフィー媒体が、酸性溶液とアルカリ性溶液の両方で洗浄され得るという驚くべき予想外の発見に基づいている。
【００３９】
本明細書に開示される実施形態がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
【００４０】
Ｉ．定義
用語「結合能力」とは、追って適切な条件の下で実行される、カラムに装填された所定量の媒体に結合する分子の量を意味する。いずれもの媒体に関する結合能力は、基礎となる条件に大きく依存する。一般に、試料の流量が低くなれば、結合能力が高まる。流量がゼロに近づくと、結合能力は利用可能な最大能力に近づく。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体の結合能力は抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量に基づき、クロマトグラフィー媒体は設定された流量で媒体の体積あたり結合することができる。
【００４１】
適切な洗浄および消毒なしでは、アフィニティークロマトグラフィー媒体を含むクロマトグラフィー媒体の結合能力は、典型的には、初期値を下回る。さらに、クロマトグラフィー媒体は、一般的に、酸性溶液またはアルカリ性溶液への曝露後、結合能力を喪失する傾向がある。結合能力が所望の値よりも低い場合、媒体に結合されることが意図されたかなりの量の分子が「突破」し得、またはほとんどが望ましくないフロースルー画分とともに共溶出され得る。本明細書に記載される実施形態は、試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体およびＩＶＩＧ原料）から抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を除くためのアフィニティークロマトグラフィー媒体を提供し、酸性条件もしくはアルカリ性条件下での洗浄後、またはＰＡＢを用いた消毒後でさえ媒体の結合能力を維持する。
【００４２】
用語「静的結合能力」は、使用されるクロマトグラフィー媒体の体積で割った、クロマトグラフィー媒体（例えば、本明細書に記載されるアフィニティークロマトグラフィー媒体）によって吸着されたタンパク質（例えば、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）の量として定義される。クロマトグラフィー媒体の静的結合能力を測定するための例示的な方法は以下の通りである。既知濃度のタンパク質溶液にクロマトグラフィー媒体を接触させた後、クロマトグラフィー媒体へのタンパク質（例えば、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）の結合を促進させるために、クロマトグラフィー媒体とともに溶液をインキュベートさせる。インキュベーション時間を（例えば、５分から７２時間）変化させることができ、当業者によって、例えば、上清中のタンパク質の濃度変化が測定できなくなるまで、定期的に上清中のタンパク質の濃度を測定することによって（例えば、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって）容易に決定され得る。クロマトグラフィー媒体に結合したタンパク質と溶液中のタンパク質の間が平衡に達すると、再度、タンパク質溶液の濃度を上清において測定する。次に、静的結合能力は、使用されるクロマトグラフィー媒体の体積で割った、タンパク質の初期量（インキュベーション前）−上清中のタンパク質の量（インキュベーション後）によって測定される。
【００４３】
特定のクロマトグラフィー媒体の静的結合能力は、一般的に、１つ以上の以下の因子、例えば、タンパク質の濃度、使用されるクロマトグラフィー媒体の量、溶液中の他の成分（塩、有機分子、緩衝液）の濃度、溶液ｐＨ、および導電率を含むタンパク質溶液の組成によって影響される。タンパク質溶液の温度によっても影響され得る。これらの変数の全ては、一般的に、２つの異なるクロマトグラフィー媒体間の静的結合能力の比較を可能にするために一定に保持される。用語「静的結合能力」はまた、「飽和結合能力」または「最大結合能力」と呼ばれることがある。
【００４４】
クロマトグラフィー媒体と接触させた試料の上清は、スラリーのクロマトグラフィー媒体を容器またはカラムの底に沈降させることによって得ることができる。沈降プロセスは、クロマトグラフィー媒体のスラリーを遠心分離に供することによって、または振動によって促進することができる。次に、ピペット、注射器、またはポンプを介して上清液を別の容器に移すことにより、クロマトグラフィー媒体から分離することができる。いくつかの実施形態において、上清は、試料とのインキュベーション後、メンブレンまたは多孔性材料を介してクロマトグラフィー媒体のスラリーを濾過することにより得られる。
【００４５】
用語「動的結合能力」は、クロマトグラフィーカラムから出たタンパク質溶液の濃度が特定の濃度、典型的には、開始濃度の所定の割合に達した時点で、フロー条件下で本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を含有するクロマトグラフィーカラムにより結合されたタンパク質（例えば、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）の量として定義される。実際には、これは、開始濃度の約１０％になる傾向がある。次に、タンパク質のこの集団は、クロマトグラフィーカラムにおいてクロマトグラフィー媒体の体積で除される。
【００４６】
クロマトグラフィー媒体の動的結合能力は、一般的に、１つ以上の以下の因子、例えば、タンパク質の濃度、溶液中の他の成分（塩、有機分子、緩衝液）の濃度、溶液ｐＨ、および導電率を含む、使用されるタンパク質溶液の組成によって影響される。動的結合能力は、カラムが充填される温度により、およびタンパク質溶液がカラムに充填される流量により影響され得る。クロマトグラフィーカラムへのタンパク質溶液の流量の減少は、測定される動的結合能力を増加させる。逆に、クロマトグラフィーカラムへのタンパク質溶液の流量の増加は、測定される動的結合容量を減少させる。クロマトグラフィー媒体の動的能力は、物質移動の全体的な速度によって制限されるため、動的結合能力は、静的結合能力を超えてはならない。
【００４７】
用語「試料」は、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体に結合されることが意図される、少なくとも１つの標的タンパク質（例えば、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）を含有する溶液と定義される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、抗体または免疫グロブリンである。いくつかの実施形態において、免疫グロブリンは、血液型Ａ抗原抗体（すなわち、抗Ａ抗体）である。他の実施形態において、免疫グロブリンは、血液型Ｂ抗原抗体（すなわち、抗Ｂ抗体）である。試料の例としては、限定されないが、血液、血漿、血漿誘導体、血液製剤、静脈内免疫グロブリン原料（ＩＶＩＧまたはＩＶＩＧ原料）が挙げられる。
【００４８】
用語「除去する」、「除去」または「除去された」は、本明細書で使用するとき、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体に試料を接触させた後、試料中に存在する抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量のかなりの減少を意味する。いくつかの実施形態において、抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量は、開始量と比較して、少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または９５％を超えて減少される。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体との接触前後の抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体の量は、当該技術分野において公知であるおよび本明細書に記載される１つ以上の方法を用いて測定することができる。例えば、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体とのインキュベーション前後の、試料中の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量は、凝集アッセイ、例えば、欧州薬局方（２．６．２０）に記載される直接クームス試験（ＤＣＴ）および間接クームス試験（ＩＣＴ）を用いて測定することができる。しかしながら、ＤＣＴとＩＣＴの両方は、高い可変性を有し、標準化することが困難である（Ｔｈｏｒｐｅ  ＳＪら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、２００９年、９７巻、１６０−１６８頁）。
【００４９】
本明細書に記載されるように、フローサイトメトリーは、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を用いた精製後、試料（例えば、ＩＶＩＧ原料）から除去された抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量を測定するために使用される。血液型抗体を捕捉するために赤血球を用いたフローサイトメトリー法は、文献において十分に文書化されている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、１９９６年；３６巻：５０−５０５頁；Ｄｈａｉｎａｕｔら、２０１３年；１０４巻：１１５−１２６頁）。本明細書に記載されるように、ＩＶＩＧ試料は、所定時間、Ａ型またはＢ型赤血球のいずれかとともにインキュベートされ、十分に洗浄され、蛍光標識した二次抗体（Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて染色される。試料をフローサイトメトリー測定に最適な濃度に希釈する。試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメーター（Ｇｕａｖａ  ５ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により評価する。正味のＭＦＩを用いて、本明細書に記載される血液型Ａ抗原リガンドまたは血液型Ｂ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体との接触前後、試料（例えば、ＩＶＩＧ原料）中の抗Ａまたは抗Ｂを比較し、さらに、酸性条件またはアルカリ性条件への曝露の有無により比較する。抗Ａまたは抗Ｂ抗体の除去率は、試料中の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体レベルに対して、フロースルー（または上清）中の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体レベルを比較することにより算出される。
【００５０】
用語「酸安定性」は、低ｐＨ、典型的にはｐＨ４未満である溶液への５０時間曝露後でさえ、試料から不純物のかなりの割合（例えば、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体の５０％超もしくは６０％超もしくは７０％超もしくは８０％超もしくは９０％超のまたはより高い除去率）を除去するクロマトグラフィー媒体の能力として定義される。酸安定性であるクロマトグラフィー媒体は、酸性条件下で溶出され、洗浄されおよび／または消毒され得る。酸安定性でないクロマトグラフィー媒体は、一般的に、酸性条件への曝露後、不純物（すなわち、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）のかなりの割合を除去する能力の低下を示す。
【００５１】
クロマトグラフィー媒体は、一般的に、酸溶液を用いて溶出され、洗浄される。例えば、０．１５Ｍリン酸または０．３％  ｖ／ｖ塩酸は、一般的に使用される洗浄剤である。典型的な溶出溶液としては、例えば、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０；０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．２；０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５；０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７；および０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０が含まれる。しかしながら、多くの市販の媒体は、このような条件への曝露後、試料から不純物を除去する能力を喪失する傾向がある。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、酸性条件への長期の曝露後でさえ（すなわち、５０時間以上後でさえ）、試料から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する能力を維持し、すなわち、媒体は酸安定性である。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体の酸安定性は、特定の時間にわたって酸性溶液に媒体を曝露させ、次に、酸性溶液に曝露されていない対照と比較して、媒体の性能を評価することによって評価され得る。媒体性能の評価としては、結合能力の測定、望ましい種および望ましくない種の分解能、不純物の除去、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５２】
用語「アルカリ安定性」は、高ｐＨ、典型的にはｐＨ９より上である溶液への５０時間曝露後でさえ、試料から不純物のかなりの割合（例えば、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体の５０％超もしくは６０％超もしくは７０％超もしくは８０％超もしくは９０％超のまたはより高い除去）を除去するクロマトグラフィー媒体の能力を維持する能力として定義される。アルカリ安定性であるクロマトグラフィー媒体は、塩基性条件下で溶出され、洗浄されおよび／または消毒され得る。アルカリ安定性でないクロマトグラフィー媒体は、一般的に、アルカリ性条件へ延長曝露した後、不純物（すなわち、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）のかなりの割合を除去する能力の低下を示す。
【００５３】
クロマトグラフィー媒体は、一般的に、アルカリ性溶液（例えば、０．１Ｍまたは０．５Ｍ水酸化ナトリウム）を用いて消毒される。しかしながら、ほとんどの市販のクロマトグラフィー媒体は、このような条件への曝露後の試料から不純物を除去する能力を喪失する傾向がある。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、アルカリ性条件への長期の曝露後でさえ（例えば、約５０時間以上）、試料から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する能力、または試料からかなりの量の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体（例えば、少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％またはそれ以上）を除去する能力を維持し、すなわち、媒体はアルカリ安定性である。媒体のアルカリ安定性は、特定の時間にわたってアルカリ性溶液に媒体を曝露し、次に、アルカリ性溶液に曝露されていない対照と比較して媒体の性能（例えば、結合能力、または抗Ａ抗体もしくは抗Ｂ抗体のかなり量を除去する能力）を評価することによって評価され得る。媒体性能の評価としては、結合能力の測定、望ましい種および望ましくない種の分解能、不純物の除去、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、アルカリ安定性または酸安定性とは、それぞれ、アルカリ性溶液または酸性溶液の曝露の５時間後、または１０時間後、または１５時間後、または２０時間後、または２５時間後、または３０時間後、または４０時間後、または５０時間後、または６０時間後、または７０時間後、または８０時間後、または９０時間後、または１００時間後に、初期の結合能力の少なくとも６５％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％保持する、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体の能力を意味する。別の実施形態において、アルカリまたは酸安定性とは、それぞれ、アルカリ性溶液または酸性溶液への５時間もしくは１０時間もしくは１５時間もしくは２０時間もしくは２５時間もしくは３０時間もしくは４０時間もしくは５０時間もしくは６０時間もしくは７０時間もしくは８０時間もしくは９０時間もしくは１００時間またはそれより長い曝露後でさえ、７０％未満、または６０％未満、または５０％未満、または４０％未満、または３０％未満にリガンドの初期結合能力の低下を意味する。
【００５５】
用語「初期結合能力」とは、本明細書で使用するとき、酸性条件またはアルカリ性条件への媒体の曝露前に、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体の単位体積により捕捉され得る抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量を意味する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は長時間にわたって酸洗浄またはアルカリ洗浄および／または消毒に耐えることができ、これにより、特に、試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料）からの抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体の費用効率が高い除去に関して、このクロマトグラフィー媒体を魅力的な候補にする。
【００５７】
用語「リガンド充填量」とは、本明細書で使用するとき、固相支持体上にリガンドを固定化するために、カップリング反応中に固相支持体の単位体積あたりに使用されるリガンドの量を意味する。リガンド充填量は、固相支持体の沈降体積のｍｇ／ｍｌまたはグラム／リットルで測定される。いくつかの実施形態において、リガンド充填量は、少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌもしくは少なくとも１ｍｇ／ｍｌもしくは少なくとも１．１ｍｇ／ｍｌもしくは少なくとも１．２ｍｇ／ｍｌもしくは少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌもしくは１．６５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上である。特定の実施形態において、リガンド充填量は、血液型Ａ抗原リガンドの場合には少なくとも１．６５ｍｇ／ｍｌであり、血液型Ｂ抗原リガンドの場合には少なくとも１．２ｍｇ／ｍｌである。固相支持体の沈降体積は、固定時間、保存緩衝液または水を含有するスラリーにおいて重力によって固相支持体を沈降させることによって決定することができる。
【００５８】
用語「媒体」または「クロマトグラフィー媒体」は、本明細書において互換的に使用され、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に固定化された血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドを有する固相支持体を意味する。いくつかの実施形態において、リンカーは、固定化のために使用され、リガンド自体または別の実体の一部であってもよい。
【００５９】
用語「リンカー」は、固相支持体上に固定化のために使用される官能基に、血液型オリゴ糖抗原リガンドを化学的に接続する種として定義される。このようなリンカーの非制限的な例としては、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ、（ＣＨ２）ｍ−ＮＲ−（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ、および（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＳ、（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｍ−Ｓ−ＣＯ−Ｓ−（ＣＨ２）ｎ、および（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＳ−（ＣＨ２）ｎが挙げられ、この場合、ｍおよびｎは１から２２の範囲であり得る。
【００６０】
用語「クロマトグラフィー」とは、本明細書で使用するとき、試料中の分子（例えば、この場合は抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）を他の分子から分離しまたは除去する動的分離技術を意味する。典型的には、クロマトグラフィー法において、移動相（液体または気体）は、固定相（通常は固体）媒体（例えば、クロマトグラフィー媒体）を介して分離されまたは除去されるべき分子を含有する試料を移動させる。固定相に対してのパーティションまたはアフィニティーの違いは、試料の他の成分から分子を分離する。
【００６１】
用語「アフィニティークロマトグラフィー」とは、本明細書で使用するとき、分離または除去されるべき分子（例えば、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体）が、分離または除去されるべき分子と特異的に相互作用する別の分子（例えば、固相支持体に固定化された血液型Ａ抗原リガンドまたは血液型Ｂ抗原リガンド）との相互作用により単離されるというクロマトグラフィーの様式を意味する。
【００６２】
用語「ＩｇＧ」、「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」（本明細書において互換的に使用される。）とは、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる基本的な４つのポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味し、これらの鎖は、抗原に特異的に結合する能力を有する、例えば、鎖間のジスルフィド結合によって安定化される。用語「単一鎖免疫グロブリン」または「単一鎖抗体」（本明細書において互換的に使用される。）とは、重鎖および軽鎖からなる２つのポリペプチド鎖構造を有するタンパク質を意味し、これらの鎖は、抗原に特異的に結合する能力を有する、例えば、鎖間のペプチドリンカーによって安定化される。用語「ドメイン」とは、例えば、βプリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合によって、安定化されるペプチドループを含む（例えば、３から４つのペプチドループを含む。）重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を意味する。ドメインは、本明細書において、「定常」ドメインの場合は多様なクラスのメンバーのドメイン内の配列の変動の相対的欠如に基づき、または「可変」ドメインの場合には多様なクラスのメンバーのドメイン内の有意の変動に基づき、「定常」または「可変」とさらに称される。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、多くの場合、抗体またはポリペプチド「領域」として当該技術分野において互換的に称される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと互換的に称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと互換的に称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと互換的に称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと互換的に称される。
【００６３】
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、単量体または多量体形態で存在してもよい。
【００６４】
用語「ＩｇＭ」または「免疫グロブリンＭ」とは、五量体構造を有する抗体を意味し、例えば、血清中に見出されるＩｇＭ抗体である。約９７０ｋＤａの分子量を有するＩｇＭ抗体は、単量体構造であって約１５０ｋＤａの分子量を有するＩｇＧよりもかなり大きい。２つの抗原結合部位を有するＩｇＧ抗体とは異なり、ＩｇＭ抗体は１０個の抗原結合部位を有する。ＩｇＭ抗体は、レシピエントが不適合性ドナーから輸血を受けた場合の赤血球の凝集に主に関与する。例えば、血液型がＡであり、抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を有する者は、血液型Ｂドナーから輸血時に凝集を経験する。大きなＩｇＭ抗体は、一般的に、分別により血漿中のより小さなＩｇＧ抗体から分離することができる。
【００６５】
試料からの抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体の除去に加えて、本明細書に記載される組成物はまた、精製された抗Ａ  ＩｇＭ抗体または精製された抗Ｂ抗体を得るために使用することができる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、抗Ａ  ＩｇＭ抗体または抗Ｂ  ＩｇＭ抗体は、それぞれ、本明細書に記載される血液型Ａ抗原リガンド媒体または血液型Ｂ抗原リガンド媒体を用いて、このような抗体を発現する清澄化された細胞培養物から単離される。ＩｇＭ抗体を精製するための例示的なプロセスは、以下の通りである。１０ｍＭのＰＢＳ中にＩｇＭ抗体を発現する清澄化された細胞培養物は、血液型Ａ抗原リガンド媒体または血液型Ｂ抗原リガンド媒体を含有するカラムに流される。その後、カラムは、ｐＨ範囲が３．０から９．０の範囲にあるｐＨで水性緩衝液を用いて洗浄される。カラムに結合した抗Ａ  ＩｇＭ抗体もしくは抗Ｂ抗体は、ｐＨが２．０から３．０の範囲にある酸性緩衝液を用いてカラムから溶出される。
【００６７】
本明細書に記載される媒体は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合、純度が少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％であり、または９５％を超える抗Ａ  ＩｇＭ抗体または抗Ｂ  ＩｇＭ抗体を得るために用いることができる。いくつかの実施形態において、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合、ＩｇＭ抗体の純度は少なくとも９５％である。
【００６８】
いくつかの実施形態において、精製された抗Ａ  ＩｇＭ抗体または抗Ｂ  ＩｇＭ抗体は、モデル分子として用いて、これと同日に出願された同時係属中の特許国内出願第Ｐ１５／１７６号（２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５４２３号）に記載されるように、血液型Ａ抗原リガンドまたは血液型Ｂ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体の質を評価する。
【００６９】
用語「精製する」または「精製すること」または「精製された」または「純度」とは、本明細書で使用するとき、標的分子と１つ以上の不純物を含む試料中の標的分子の濃度を増加させることを意味する。典型的には、標的分子の純度は、試料から（完全にまたは部分的に）少なくとも１つの不純物を除去することによって増加される。いくつかの実施形態において、標的分子（例えば、この場合はＩｇＭ抗体）の純度は、「百万分の一」または「ｐｐｍ」で測定される。いくつかの実施形態において、単位ｐｐｍとは、標的分子とＨＣＰが溶液中にある場合、標的分子（例えば、モノクローナルＩｇＭ）あたりナノグラム／ミリグラムの不純物（例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ））のミリグラム／ミリリットルの量を意味する。いくつかの実施形態において、モノクローナルＩｇＭ抗体−Ａ抗体またはＩｇＭ−Ｂ抗体の純度は、本明細書に記載される組成物を用いて、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、もしくは少なくとも９６％、もしくは少なくとも９７％、もしくは少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％以上、またはそれ以上に増加される。
【００７０】
用語「清澄化する」または「清澄化」または「清澄化された」とは、本明細書で使用されるとき、細胞培養原料中の懸濁された粒子および／またはコロイドを除去し、それにより、典型的にはＮＴＵ（比濁計濁度単位）で測定した場合、標的分子を含有する溶液（例えば、ＩｇＭ抗体を含有する細胞培養原料）の濁りを減少させるプロセスを意味する。清澄化は、様々な手段によって達成することができ、例えば、遠心分離または濾過が挙げられる。遠心分離はバッチまたは連続モードで行うことができ、一方、濾過は、正常流（例えば、深層濾過）または接線流モードで行うことができる。今日の産業で使用されるプロセスにおいて、遠心分離は、典型的には深層濾過が続き、これは、遠心分離によって除去されていなかった可能性がある不溶性不純物を除去することが意図される。さらに、清澄化効率を高めるための方法を使用することができ、例えば、沈殿が挙げられる。不純物の沈殿は、様々な手段によって行うことができ、例えば、凝集、ｐＨ調整（酸沈殿）、温度変化、刺激応答性ポリマーまたは小さい分子による相変化、またはこれらの方法の任意の組み合わせが挙げられる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、清澄化は、遠心分離、濾過、深層濾過および沈殿のいずれか１つ以上を伴う。
【００７１】
用語「充填ｐＨ」とは、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体とともにインキュベートされる、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を含有する試料のｐＨを意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体とともにインキュベートされた試料のｐＨは、抗Ａ抗体除去に適した媒体について約４．５から約９．０の範囲であり、抗Ｂ抗体除去に適した媒体について約４．０から約９．０の範囲である。これらの条件下で、試料中の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の量は、媒体に試料を接触させる前と比較して少なくとも５０％減少することが期待される。
【００７２】
本明細書中で使用するとき、用途「洗浄」とは、カラムおよびそこに含有される媒体の性能および完全性を保持するため、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を除去するのに使用した後のアフィニティークロマトグラフィーカラム、例えば、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体を含有するカラム上に残存した微量レベルの不純物を除去することを必要とするクロマトグラフィープロセス中のステップを意味する。洗浄ステップはカラムから不純物を除去する一方、クロマトグラフィー媒体の結合能力を用いて測定した場合、理想的には、カラムの性能における影響は最小限であるべきである。ほとんどの市販のクロマトグラフィー媒体は、酸性溶液またはアルカリ性溶液のいずれかを用いて洗浄される。しかしながら、ほとんどの市販のクロマトグラフィー媒体は、ｐＨの両極端で不安定であり、したがって、酸性条件とアルカリ性条件の両方を用いて洗浄することができない。本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、酸性溶液とアルカリ性溶液の両方を用いて洗浄することができる。洗浄溶液の例としては、例えば、０．１５Ｍリン酸または０．３％  ｖ／ｖ塩酸などの酸性溶液が挙げられる。
【００７３】
本明細書で使用するとき、用語「定置洗浄」または「ＣＩＰ」は、分解することなしに、パイプ、容器、プロセス装置、フィルターおよび関連付属品の内面を洗浄する方法である。ＣＩＰを使用する利点は、洗浄がより速く、労働集約性をより少なくし、より再現性よく、ヒトへの化学物質の曝露リスクが低いことである。クロマトグラフィーカラムについて、ＣＩＰは、カラムから中身を出さずに、クロマトグラフィー媒体、ならびにカラム本体および末端付属品を洗浄することを意味する。通常、実施後に洗浄されたクロマトグラフィーカラムは、次の実施のために即座に再平衡化される。
【００７４】
本明細書で使用するとき、用語「活動（ｃａｍｐａｉｇｎ）」とは、所望の量の試料を処理するために次々に実行される、いくつかのラウンドの個々の精製プロセスを意味する。試料から抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を除去する場合、活動は、典型的には、１つ以上の下流ステップと一緒に、抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を除去するためにアフィニティークロマトグラフィーステップの使用を伴い、これは、例えば、患者に注入するための治療組成物、またはある種の所望の成分を有する組成物に到達させるために使用されてもよい。このような下流ステップは、活動の目的に応じて、エンドユーザーによって異なってもよい。活動内の実施間で洗浄は日常的に行われるが、活動が完了した場合、クロマトグラフィーカラムは保存のためにさらに消毒され、これは、典型的には、カラムが、数日後または数週間後または数カ月後であり得る次の活動で再度使用されるためである。
【００７５】
用語「溶出」とは、精製プロセス中のステップを意味し、それにより、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、媒体に結合した不純物（即ち、抗Ａおよび／または抗Ｂ）を除去するために溶出緩衝液と接触させられる。溶出緩衝液の例としては、０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０；０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．２；０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．５；０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７；０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０が挙げられる。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「消毒」または「消毒すること」または「消毒する」とは、活動の完了後に使用されるステップであり、ＦＤＡまたは他の規制機関によって決定される場合、安全とみなされるまたは許容できるレベルまで微生物集団を減少させるように設計される。消毒は、典型的には、熱または化学薬品を用いて達成される。次の活動まで保存されなければならないクロマトグラフィーカラムは、一般的に、熱による消毒の非実用性に起因して化学的手段によって消毒される。ほとんどのアフィニティークロマトグラフィーカラムは、最大０．５ＭのＮａＯＨを用いて消毒される。しかしながら、０．５ＭのＮａＯＨはまた、クロマトグラフィー媒体の性能を低下させることが知られている。本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、リン酸、酢酸およびベンジルアルコール（ＰＡＢ）を含有する溶液を消毒のために使用する。驚くべきことに、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、それらの結合能力、またはＰＡＢによる消毒後でさえ、かなりの量の抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体を除去する能力を維持する。
【００７７】
用語「抗Ａ」または「抗Ａ抗体」とは、Ａの血液型またはＡＢの血液型を有する個体において細胞の表面に見出される血液型Ａ抗原に結合する抗体を意味する。したがって、血液由来の試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料）においてこのような抗体を除去することが望ましい。
【００７８】
用語「抗Ｂ」または「抗Ｂ抗体」とは、Ｂの血液型またはＡＢの血液型を有する個体において細胞の表面に見出される血液型Ｂ抗原に結合する抗体を意味する。したがって、血液由来の試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料）においてこのような抗体を除去することが望ましい。
【００７９】
ＩＩ．例示的なリガンド
本明細書に記載される組成物は、試料、例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去に有用である。
【００８０】
本明細書に記載される組成物は、適切な固相支持体に付着されたオリゴ糖系リガンドを含む。
【００８１】
例示的なオリゴ糖系リガンドを以下に示す。構造において使用される略語は、以下のように定義される：Ｇａｌ＝Ｄ−ガラクトース；Ｆｕｃ＝Ｌ−フコース；ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン；ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン；Ｒ＝リガンドから固相支持体までの連結であるが、リガンド構造上の他の位置での連結もまた使用されてもよい。
【００８２】
血液型Ａ抗原リガンドの例としては、限定されないが、以下の構造を有する分子が含まれる：三糖抗原Ａ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ−Ｒ）、１型三糖抗原Ａ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）、２型三糖抗原Ａ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）、３型三糖抗原Ａ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα１−Ｒ）、および４型三糖抗原Ａ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ）。特定の実施形態において、リガンドは、固相支持体に付着された三糖抗原Ａ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ−Ｒ）である。
【００８３】
血液型Ｂ抗原リガンドの例としては、以下の構造を有する分子が含まれる：三糖抗原Ｂ（Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ−Ｒ）、１型三糖抗原Ｂ（ＧａｌＮＡｃα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）、２型三糖抗原Ｂ（Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）、３型三糖抗原Ｂ（Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃα１−Ｒ）、および４型三糖抗原Ｂ（Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１−Ｒ）。特定の実施形態において、リガンドは、固相支持体に付着された三糖抗原Ｂ（Ｇａｌα１，３［Ｆｕｃα１，２］Ｇａｌβ−Ｒ）である。
【００８４】
ＩＩＩ．例示的な固相支持体
上述したリガンドの１つ以上は、固相支持体１ｍｌあたり少なくとも０．８ｍｇのリガンド充填量で固相支持体に付着されてもよく、それにより、血液型Ａ抗原抗体および／または血液型Ｂ抗原抗体の除去に適したクロマトグラフィー媒体が生じる。
【００８５】
固相支持体の例としては、限定されないが、アルミナ、シリカ、セライト、セラミックス、金属酸化物、多孔質ガラス、孔制御ガラス、炭水化物ポリマー、多糖、アガロース、セファロース、セファデックス、デキストラン、セルロース、デンプン、キチン、ゼオライト、合成ポリマー、ポリビニルエーテル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリマレイン酸無水物、メンブレン、中空糸および繊維が挙げられる。いくつかの実施形態において、固相支持体は、多孔質または非多孔質のポリマーの固相支持体であり、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含む。特定の実施形態において、固相支持体は、ポリビニルエーテル系固相支持体である。いくつかの実施形態において、固相支持体は、ビーズ形態（例えば、ポリビニルエーテル系多孔質ビーズ）である。
【００８６】
ＩＶ．固相支持体にリガンドを付着させる方法
固相支持体へのリガンドの付着を容易にするために、無数の官能基を使用することが可能である。このような官能基の非限定的な例としては、アミン、チオール、フラン、マレイミド、エポキシ、アルデヒド、アルケン、アルキン、アジド、アズラクトン、カルボキシル、活性化エステル、トリアジン、および塩化スルホニルが挙げられる。特定の実施形態において、アミン基を官能基として使用する。
【００８７】
固相支持体はまた、リガンドへの適切なリガンドまたは複数のリガンドの固定化を促進する、上記の１つ以上の官能基を含むように修飾されおよび／または活性化され得る。
【００８８】
特定の実施形態において、固相支持体は、還元的アミノ化化学を用いて修飾され、ここで、固相支持体は、リガンド固定化のためにアルデヒド基を提供するように誘導化される。
【００８９】
このような誘導化は、最初に、エポキシド基を含むように固相支持体（例えば、ポリビニルエーテル系ビーズ）を修飾し、さらに、加水分解してジオール基を生成させることによって達成される。その後、ジオール基はアルデヒド基に還元される。次に、アルデヒド含有固相支持体（例えば、固相支持体１ｍｌあたり約１μｍｏｌまたはそれを超えるアルデヒド密度の固相支持体）は、アルデヒド基とアミン基の間で還元的アミノ化反応を介して、所望のリガンド充填量（例えば、少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌ）で固定化ステップに供される。
【００９０】
特定の実施形態において、固相支持体は、ポリマーテンタクル化学を用いて修飾され、ここで、固相支持体は、リガンド固定化ステップのためにカルボン酸基を含むように誘導化される。このような誘導化は、セリウム開始重合法を用いて、固相支持体（例えば、ポリビニルエーテル系ビーズ）の表面から適切なモノマー（例えば、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート、ｔｅｒｔ−ブチルメタクリレート）を最初に重合することによって達成される。次に、カルボン酸を含有する固相支持体（例えば、固相支持体１ｍｌあたり約１μｍｏｌまたはそれを超えるカルボン酸密度の固相支持体）は、カルボン酸とアミン基の間の標準的な酸−アミンカップリング化学を介して、所望のリガンド充填量（例えば、少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌ）で固定化ステップに供される。活性化されたカルボン酸基を介したリガンド固定化はまた、テンタクル形成なしに固相支持体表面から直接適用されてもよい。
【００９１】
Ｖ．抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の除去率を測定するためのアッセイ
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、試料（例えば、血液、血液製剤、血漿、血漿誘導体またはＩＶＩＧ原料）からの抗Ａ抗体および／または抗Ｂ抗体の除去に有用である。
【００９２】
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、固相支持体の少なくとも０．８ｍｇ／ｍｌのリガンド充填量で固相支持体に付着された血液型Ａ抗原リガンドおよび／または血液型Ｂ抗原リガンドを含み、該媒体が使用され、洗浄されおよび／または消毒され得る操作条件の範囲の観点からより大きな柔軟性を提供する。具体的には、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、長時間、このような条件に曝露された後でさえ、酸性条件およびアルカリ性条件下で安定性を示す。したがって、本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、酸性条件またはアルカリ性条件への曝露後、試料から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する能力を維持する。
【００９３】
一般的に、試料からの抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去率は、以下のように測定することができる。分子を含む試料を適切な条件下で、媒体への分子の結合を促進するのに適切した時間、適切な媒体と接触させる。その後、媒体に結合している分子は、残りの試料溶液から分離され、残りの試料溶液中の分子の濃度（即ち、結合していない分子の濃度）を測定する。溶液中の分子の濃度は、当該技術分野において公知のいくつかの異なる方法によって決定することができる。抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の濃度は、赤血球を使用する凝集アッセイ、赤血球の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）に基づくものなどのフローサイトメトリーアッセイ、および抗原に基づく材料を用いる酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっても決定することができる。
【００９４】
本明細書に記載される方法において、試料から抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去するクロマトグラフィー媒体の能力は、酸性条件またはアルカリ性条件への曝露の有無により測定される。
【００９５】
実施形態は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに例証される。本出願全体で引用されている全ての参考文献、特許および公開された特許出願、並びに図面を参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【００９６】
［実施例１］
還元的アミノ化（ＲＡ）化学を用いた三糖Ａリガンド含有媒体の合成
血液型Ａ抗原の三糖（ＴｒｉＡ）リガンド媒体は、還元的アミノ化化学を用いて、独自のポリビニルエーテル系多孔質固相支持体（ビーズの形態で）上にＴｒｉＡリガンドを固定化することによって合成された。ＴｒｉＡリガンドとＴｒｉＢリガンドの具体的な構造をそれぞれ図１および２に示す。
【００９７】
固相支持体上のヒドロキシル基にリガンドを連結させた。１０ｍｌの沈降したビーズをイソプロピルアルコールを用いて調整し、反応容器に移した。反応容器に１０ｍｌのイソプロピルアルコールと０．２７３ｍｌの３２％ＮａＯＨ溶液を添加した。懸濁液を３０分間、室温で撹拌し、続いて、懸濁液に１．２２ｍｌの１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）を添加した。懸濁液を５時間、室温で撹拌した。懸濁液を水で３回、フィルターアセンブリを用いて洗浄した。湿潤ビーズを反応容器に移した。１１．８ｍｌの水と０．２６ｍｌの氷酢酸を添加し、懸濁液をさらに３０分間、室温で撹拌した。次に、ビーズを水で３回洗浄し、反応容器に戻した。
【００９８】
１７ｍｌの０．５Ｍ硫酸をビーズに添加し、懸濁液を２時間、７５℃で撹拌した。ビーズを数回洗浄し、懸濁液のｐＨを４から５の間に調整した。フィルターアセンブリを用いて溶液を吸引し、湿潤ビーズを反応容器に戻した。反応容器に１０ｍｌの２．５％メタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、懸濁液を２．５時間、室温で撹拌した。最後に、ビーズを水で５回洗浄し、リガンドＡまたはＢとカップリングするのに適したアルデヒド修飾ポリビニルエーテル系ビーズを生じさせた。
【００９９】
１０ｍｌのアルデヒド修飾した湿潤系ビーズを反応容器に移した。この容器に、１６．５ｍｇの三糖Ａ、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３および１５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。懸濁液を室温で１６時間撹拌した。４００ｍｇのグリシンを反応容器に添加し、さらに、懸濁液を少なくとも２時間、室温で撹拌した。得られたＴｒｉＡリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体は、水で５回、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ＝８で３回洗浄した。さらに、媒体を０．０５Ｍ酢酸溶液で３回、水で３回洗浄し、最後に２０％エタノール溶液中に保存した。
【０１００】
続いて、続く実施例において以下に説明されるように、媒体は、酸性条件またはアルカリ性条件への曝露の有無による、ＩＶＩＧ原料から抗Ａ抗体を除去する能力について評価された。
【０１０１】
［実施例２］
還元アミノ化（ＲＡ）化学による三糖Ｂリガンド含有クロマトグラフィー媒体の合成
上述したように、三糖Ｂリガンド含有媒体は、三糖Ａリガンド含有媒体と同様に調製された。上記で調製された１０ｍｌのアルデヒド修飾した湿潤系ビーズを反応容器に移した。この容器に、１２．０ｍｇの三糖Ｂ、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３および１５０ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。懸濁液を室温で１６時間撹拌した。４００ｍｇのグリシンを反応容器に添加し、さらに、懸濁液を少なくとも２時間、室温で撹拌した。得られたＴｒｉ  Ｂリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体は、水で５回、Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ＝８で３回洗浄した。さらに、媒体を０．０５Ｍ酢酸溶液で３回、水で３回洗浄し、最後に２０％エタノール溶液中に保存した。
【０１０２】
続いて、続く実施例において以下に説明されるように、媒体は、酸性条件またはアルカリ性条件への曝露の有無による、ＩＶＩＧ原料から抗Ｂ抗体を除去する能力について評価された。
【０１０３】
［実施例３］
ポリアクリル酸（ｐＡＡ）テンタクル化学を用いた三糖Ａまたは三糖Ｂ含有媒体の合成
この代表的な実施例において、異なる化学、すなわち、ｐＡＡテンタクルアプローチは、ポリビニルエーテル系ビーズへの三糖Ａまたは三糖Ｂリガンドの付着のために使用された。
【０１０４】
図１および２に示される血液型Ａおよび血液型Ｂ抗原リガンド（三糖ＡおよびＢ）は、ビーズに三糖Ａリガンドを付着させるための１つの反応とビーズに三糖Ｂリガンドを付着させるための別の反応である２つの別々の反応において、ヒドロキシル基を有するポリビニルエーテル系ビーズに連結させた。合成の最初のステップにおいて、ビーズは、図１および２に示されるリガンドのアミン基と反応するためにカルボキシル基を含むように修飾された。
【０１０５】
１０ｍｌの沈降したビーズを水で調整し、反応容器に移した。２つの溶液、すなわち、「モノマー溶液」と「開始剤溶液」を以下のように調製した。１０ｍｌのモノマー溶液は、０．１３７ｍｌのアクリル酸、０．１ｍｌの６５％硝酸溶液および９．７６３ｍｌの水を混合することによって調製され、１０ｍｌの開始剤溶液は、０．３３ｇの硝酸セリウムアンモニウム、０．１ｍｌの６５％硝酸溶液および９．１ｍｌの水を混合することによって調製された。湿潤ビーズを含有する反応容器にモノマー溶液を添加した。懸濁液および開始剤溶液に約１５分間、窒素ガスをパージした。次に、開始剤溶液を反応容器に移し、懸濁液を窒素雰囲気下、４時間、４０℃で撹拌した。ビーズを水で７回、０．２Ｍアスコルビン酸溶液と１Ｍ硫酸で１０回、水で５回、ＰＢＳ緩衝液で２回、最終的に水で３回洗浄した。
【０１０６】
１０ｍｌのｐＡＡ修飾させた湿潤ビーズを２つの別々の反応容器に移した。１つの容器に、１６．５ｍｇの三糖Ａ、１０ｍｌの０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、および０．１ｇの１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を添加した。他の容器に、１２．０ｍｇの三糖Ｂ、１０ｍｌの０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、および０．１ｇのＥＤＣを添加した。両方の懸濁液を、３２℃で１６時間撹拌した。得られたクロマトグラフィー媒体を０．０１Ｍ  ＮａＨＣＯ３で３回、および水で３回洗浄し、フィルターアセンブリを用いて洗浄溶液を吸引した。媒体を再び反応容器に戻し、０．０１ＭのＮａＨＣＯ３中のエタノールアミンの５％  ｖ／ｖの溶液を各容器に添加した。懸濁液を１６時間、室温で撹拌し、媒体を水で５回洗浄した。最後に、媒体を２０％エタノール中で保存した。
【０１０７】
続いて、続く実施例において以下に説明されるように、上述されるｐＡＡテンタクルアプローチを用いて作製された三糖Ａリガンドまたは三糖Ｂリガンドのいずれかを含有する媒体は、酸性条件またはアルカリ性条件への曝露の有無による、ＩＶＩＧ原料からのそれぞれ抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去について評価された。
【０１０８】
［実施例４］
抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去における原料充填ｐＨの効果
本明細書に記載される媒体を用いた抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去は、ｐＨ３．５からｐＨ９．０の範囲の試料条件で実証された。抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を含有する試料（代表的なＩＶＩＧ原料）を３．５から９．０の範囲の様々なｐＨ値を有する緩衝液中で透析した。その後、異なる結合化学を用いて作製された媒体試料を様々なｐＨ値を有する原料材料と接触させた。
【０１０９】
続いて、上述されるＲＡアプローチまたはｐＡＡテンタクルアプローチのいずれかを用いて作製されたクロマトグラフィー媒体は、後述される様々な原料材料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去について評価された。
【０１１０】
血液型Ａ抗原抗体または血液型Ｂ抗原抗体（抗Ａ／Ｂ）レベルは、確立されたフローサイトメトリー法（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ｍ．ら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、１９９６年；３６巻：５００−５０５頁）を用いて決定された。Ａ型またはＢ型の赤血球を所定時間、代表的なＩＶＩＧ原料とともにインキュベートし、続いて、過剰に洗浄した。次に、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧで細胞を染色し、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ５ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。正味の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を用いて、三糖Ａリガンドまたは三糖Ｂリガンドのいずれかを含有する媒体の接触前後とのＩＶＩＧ原料における抗Ａポリクローナル抗体または抗Ｂポリクローナル抗体のレベルを比較した。抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去率は、得られたフロースルー（または上清）中のこのような抗体のレベルを出発原料中のレベルと比較することによって算出された。
【０１１１】
以下の表は、２つの異なるＩＶＩＧ原料材料について、各々の原料充填ｐＨ条件での抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去率を要約する。
【０１１２】
両方の原料材料について、より高いｐＨレベルが、抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体のより高い除去を提供するという傾向が観察された。４．５以上のｐＨレベルは、６５パーセントより高い抗Ａ除去レベルを提供することが観察された。４．０以上のｐＨレベルは、抗Ｂ除去レベルが６５パーセントを超えた。さらにより高いｐＨレベル、ｐＨ５．０から９．０で、除去率は、抗Ａおよび抗Ｂ除去についてほぼ９０パーセントであり、それにより、このような媒体は、充填ｐＨの幅広い範囲で効果的であり、より高い充填ｐＨ（例えば、ｐＨ５から９）で最良に作用することを実証した。
【０１１３】
【表１】
0006494572.tif 000004
【０１１４】
［実施例５］
ＰＡＢへの曝露後の媒体の安定性の評価
本実施例において、本明細書において調製された様々なクロマトグラフィー媒体の安定性は、典型的には、クロマトグラフィー材料を消毒するために使用されるＰＡＢ（１２０ｍＭリン酸、１６７ｍＭ酢酸、２．２％ベンジルアルコール）への曝露後に評価された。
【０１１５】
表２に示されるように、２つの異なるリガンド充填量レベルを有する媒体は、２つの異なるＩＶＩＧ原料試料からの抗Ａおよび抗Ｂの除去について評価された。
【０１１６】
クロマトグラフィー媒体の安定性は、後述されるように、三糖Ａリガンドまたは三糖Ｂリガンドを含有する媒体を長期間、すなわち、少なくとも５０時間または少なくとも１５０時間、ＰＡＢに曝露させ、次に、ＩＶＩＧ原料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するそれらの能力を評価することによって実証された。
【０１１７】
観察されるように、ＲＡアプローチまたはｐＡＡテンタクルアプローチのいずれかを用いて作製された両方の三糖Ａおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、ＰＡＢへの曝露後の安定性、すなわち、ＩＶＩＧ原料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去する能力を示した。
【０１１８】
媒体の安定性は、後述されるように、ＩＶＩＧ原料から抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去する能力を評価することによって測定された。
【０１１９】
具体的には、血液型Ａ抗原抗体または血液型Ｂ抗原抗体（抗Ａ／Ｂ）レベルは、確立されたフローサイトメトリー法（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ｍ．ら、ＴＲＡＮＳＦＵＳＩＯＮ、１９９６年；３６巻：５００−５０５頁）を用いて決定された。Ａ型またはＢ型の赤血球を所定時間、原料材料とともにインキュベートし、続いて、過剰に洗浄した。次に、蛍光標識された抗ヒトＩｇＧで細胞を染色し、フローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ５ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に供した。正味の平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を用いて、三糖Ａリガンドまたは三糖Ｂリガンドのいずれかを含有する媒体のインキュベーション前後との原料材料における抗Ａポリクローナル抗体または抗Ｂポリクローナル抗体のレベルを比較した。抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体の除去率は、得られたフロースルー（または上清）中のこのような抗体のレベルを原料材料の開始レベルと比較することによって算出された。
【０１２０】
本明細書中で観察されるように、三糖Ａリガンドまたは三糖Ｂリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体は、ＰＡＢに曝露された後、それぞれ抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する能力を維持する。ＰＡＢに曝露されなかった対照試料（下記の表のＰＡＢ曝露の「０時間」によって示される。）と比較して、抗Ａまたは抗Ｂ除去能力における有意な変化は観察されなかった。原料１について、約８０％以上の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体が、対照の場合とＰＡＢへの曝露後の両方において除去された。原料２について、約９０％の抗Ａまたは抗Ｂは、対照の場合とＰＡＢへの曝露後の両方において除去された。
【０１２１】
【表２】
0006494572.tif 000005
【０１２２】
［実施例６］
三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は酸性条件下で安定である。
本明細書に記載される三糖類Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、様々な酸および低ｐＨ緩衝溶液、例えば、０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．０；０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．２；０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．５；０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ２．７；および０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ３．０に曝露後、化学的安定性を示すことが実証された。
【０１２３】
酸安定性は、特定の時間、例えば、少なくとも５０時間、酸性条件に異なる媒体を曝露し、次に、２つの原料材料から抗Ａおよび抗Ｂを除去する媒体の能力について媒体を評価することによって実証された。いずれの酸にも曝露されなかった対照試料も抗Ａおよび抗Ｂ除去能力について評価した。
【０１２４】
本明細書中で観察されるように、三糖類Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンド含有媒体は、酸性条件への長時間の曝露後でさえ、それぞれ抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体を除去するそれらの能力を維持した。酸溶液に曝露された試料は、両方の原料材料から約８０％以上の抗Ａおよび抗Ｂを除去する能力を維持した。
【０１２５】
【表３】
0006494572.tif 000006
【０１２６】
さらに、三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、酸性条件下での消毒後、それぞれ、ＩｇＭ−Ａ抗体およびＩｇＭ−Ｂ抗体に結合し、精製する能力を維持することが実証された。
【０１２７】
本明細書に記載される三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、例えば、ＰＡＢなどの酸性または低ｐＨ条件下でのそれらの安定について評価された。これは、特定の時間、例えば、少なくとも５０時間または１５０時間、媒体をＰＡＢに曝露させ、次に、ＩｇＭ−ＡおよびＩｇＭ−Ｂ結合能力を評価することによって実証された。ＰＡＢに曝露されていない対照試料は、以下の式を基本として用いて、保持された結合能力を計算した。
【０１２８】
【数１】
0006494572.tif 000007
【０１２９】
以下の表４は、酸性条件への曝露後の三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体の保持されたＩｇＭ−ＡおよびＩｇＭ−Ｂ結合能力を実証する。
【０１３０】
【表４】
0006494572.tif 000008
【０１３１】
［実施例７］
三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体はアルカリ性条件下で安定である。
本明細書に記載される三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、例えば、０．５ＭのＮａＯＨなどのアルカリ性またはより高いｐＨ条件下で媒体の安定性について評価された。これは、特定の時間、例えば、少なくとも５０時間または１５０時間、０．５ＭのＮａＯＨに媒体を曝露し、次に、２つの異なるＩＶＩＧ原料材料からの媒体の抗Ａおよび抗Ｂ除去能力を評価することによって実証された。ＮａＯＨに曝露されていない対照試料も、抗Ａおよび抗Ｂ除去能力について評価された。
【０１３２】
本明細書で観察されるように、三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、アルカリ性条件に長期曝露された後でさえ、それぞれ、抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体を除去する能力を維持した。ＮａＯＨへの１５０時間の曝露後でさえ、媒体は、抗Ａの約７５パーセントおよび抗Ｂの約８８パーセントを除去することができた。
【０１３３】
【表５】
0006494572.tif 000009
【０１３４】
さらなる実験において、三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、アルカリ条件下で消毒後、それぞれＩｇＭ−Ａ抗体およびＩｇＭ−Ｂ抗体を結合し、精製する能力を維持することが示された。
【０１３５】
本明細書に記載される三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体は、例えば、０．５ＭのＮａＯＨなどのアルカリ性または高いｐＨ条件下でそれらの安定性について評価された。これは、特定の時間、例えば、少なくとも５０時間または１５０時間、媒体を０．５ＭのＮａＯＨに曝露させ、次に、ＩｇＭ−ＡおよびＩｇＭ−Ｂ結合能力を評価することによって実証された。ＮａＯＨに曝露されていない対照試料は、上記の実施例において示された式を基本として用いて、保持された結合能力を計算した。
【０１３６】
アルカリ性条件に曝露後の三糖Ａリガンドおよび三糖Ｂリガンドを含有する媒体の保持されたＩｇＭ−ＡおよびＩｇＭ−Ｂ結合能力を以下の表６に示す。
【０１３７】
【表６】
0006494572.tif 000010
【０１３８】
［実施例８］
抗Ａ抗体の除去におけるリガンド充填量の効果
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体による抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の除去率におけるリガンド充填量の効果は、以下のように決定された。
【０１３９】
異なるリガンド充填量を有する三糖Ａまたは三糖Ｂ媒体は、本明細書において先に記載されるように、代表的なＩＶＩＧ原料とともにインキュベートされ、抗Ａ抗体除去は、フローサイトメトリーアッセイを用いて決定された。
【０１４０】
結果を以下の表に示す。三糖Ａリガンド充填量が増加すると、抗Ａ抗体の除去率％が試験されたリガンド充填量の範囲で増加することが見出された。ｐＡＡテンタクル化学について、抗Ａ抗体の７０％を超える除去率は、１．６５ｍｇ／ｍｌ以上のリガンド充填量で得られ、８０％を超える除去率は、２．１ｍｇ／ｍｌのリガンド充填量で得られた。比較として、ＲＡ化学について、抗Ａ抗体の８０％を超える除去率は、１．２ｍｇ／ｍｌ以上のリガンド充填量で得られた。
【０１４１】
この結果は、以前にはむしろ期待されず、（より低いリガンド充填量を意味するであろう）より低いリガンド密度を有することが、このような媒体が効果的に作用する必要があるために望ましいであろうことが報告されている（国際公開番号ＷＯ２０１５／００１２７７参照）。
【０１４２】
【表７】
0006494572.tif 000011
【０１４３】
［実施例９］
抗Ｂ抗体の除去におけるリガンド充填量の効果
代表的なＩＶＩＧ原料から抗Ｂ抗体を除去する、本明細書に記載されるＴｒｉＢリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体の能力におけるリガンド充填量の効果を調べた。
【０１４４】
このリガンド充填量の効果は、本明細書において先に記載されるように、様々なリガンド充填量を含有する媒体試料とともに原料をインキュベートし、次に、フローサイトメトリーアッセイを用いて抗Ｂ除去を測定することによって実証された。結果を以下の表に示す。三糖Ｂリガンド充填量が増加すると、抗Ｂ抗体の除去率％は試験されたリガンド充填量の範囲で増加することが観察された。
【０１４５】
ｐＡＡテンタクル化学アプローチについて、抗Ｂ抗体の７０％を超える除去率は、１．２ｍｇ／ｍｌ以上のリガンド充填量で得られ、８０％を超える除去率は、１．６５ｍｇ／ｍｌのリガンド充填量で得られ、９０％を超える除去率は、２．８ｍｇ／ｍｌ以上のリガンド充填量で得られた。比較として、ＲＡ化学について、抗Ｂ抗体の９０％を超える除去率は、１．２ｍｇ／ｍｌ以上のリガンド充填量で得られた。
【０１４６】
上述したように、この結果は、以前にはむしろ期待されず、（より低いリガンド充填量を意味するであろう）より低いリガンド密度を有することが、このような媒体が効果的に作用する必要があるために望ましいであろうことが報告されている（国際公開番号ＷＯ２０１５／００１２７７参照）。
【０１４７】
【表８】
0006494572.tif 000012
【０１４８】
［実施例１０］
試料からの抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の連続除去
本明細書に記載されるクロマトグラフィー媒体は、試料から抗Ａ抗体と抗Ｂ抗体の両方を除去するために連続して用いることができる。換言すると、抗Ａ抗体を除去するためのクロマトグラフィー媒体を最初に使用し、続いて、抗Ｂ抗体を除去するためのクロマトグラフィー媒体を使用することができる。代替的に、抗Ｂ抗体を除去するためのクロマトグラフィー媒体を最初に使用し、続いて、抗Ａ抗体を除去するためのクロマトグラフィー媒体を使用することができる。
【０１４９】
この実験において、ＩＶＩＧ原料材料を、最初に三糖Ａリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体を含有するカラムに通過させ、続いて、三糖Ｂリガンドのクロマトグラフィー媒体を含有する別のカラムに通過させた。抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体の除去は、フローサイトメトリーを用いて測定された。逆の順番も実証され、この場合、原料は、最初に三糖Ｂリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させられ、次に、三糖Ａリガンドを含有するクロマトグラフィー媒体と接触させられた。
【０１５０】
以下の表は、これらのアプローチを用いて原料から除去された抗Ａ抗体および抗Ｂ抗体のパーセント全体を示す。少なくとも８７パーセントの抗Ａ抗体が、両方の媒体に原料材料を通過させた後に除去された。少なくとも９２パーセントの抗Ｂ抗体が、両方の媒体に原料材料を通過させた後に除去された。
【０１５１】
【表９】
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【０１５２】
［実施例１１］
マウスのモノクローナルＩｇＭ−Ａ抗体の精製
本明細書に記載される組成物は、ＩｇＭ抗体を発現する清澄化された細胞培養原料からモノクローナルＩｇＭ抗体を精製するために使用することができる。この実験は、清澄化された細胞培養原料からのＩｇＭ−Ａ抗体の精製を記載する。いくつかの実施例において、２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５４２３号に記載されるように、精製されたＩｇＭ−Ａ分子をモデル分子として用いて、血液型Ａ抗原リガンドを含有するクロマトグラフィー媒体の質を評価した。
【０１５３】
１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（製品番号：ＪＨ−１Ｌ−ＢＫ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で透析された、クローンＢＩＲＭＡ−１（Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ．、１９９１年、６１巻：５３−５８頁）から産生された抗Ａ  ＩｇＭを含有する市販の清澄化された細胞培養原料から血液型Ａ抗原マウスモノクローナルＩｇＭ抗体（抗Ａ）を精製した。本明細書に記載されるように、抗Ａ細胞培養原料を０．２２μｍのメンブレンを通して濾過し、媒体に付着された血液型Ａ抗原三糖（ＴｒｉＡ）リガンドを有する媒体において結合／溶出クロマトグラフィーするように供された。
【０１５４】
直径１０ｍｍのカラムにＴｒｉ−Ａリガンド媒体を６４ｍｍに装填した。カラムを１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分で１０カラム容積（ＣＶ））を用いて平衡化し、その後、１０ｍＭのＰＢＳ中（４０ＣＶ、２２９．１８ｃｍ／時、３．０ｍＬ／分）に抗Ａを含有する清澄化された細胞培養原料を充填した。カラムを１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（５ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍｌ／分）、続いて、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（１０ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍｌ／分）中の０．５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。次に、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン（９ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分）を用いてカラムから抗Ａ  ＩｇＭ抗体を溶出させた。その後、さらに実施する前に、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（１０ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分）を用いてカラムを洗浄し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム（１０ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分）でストリップ処理した。
【０１５５】
１ｍＬの２．０Ｍトリス塩基を４５ｍＬの抗Ａ  ＩｇＭ溶出液に添加し、その溶液のｐＨを６から７に上昇させた。その後、溶出液を透析チューブ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＣ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒｉａｌ  Ｋｉｔｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ  ＦＬＡＴ  ＷＩＤＴＨ、シリアル番号：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）を用いて１０ｍＭのＰＢＳ中で透析した。１０ｍＭのＰＢＳ中で透析後、モノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体の得られた溶液は、ＩｇＭ抗体のアミノ酸組成に基づいて測定すると、２８０ｎｍで１．５０の吸光係数に基づいて、約１．１ｍｇ／ｍＬの濃度を有することが判明した。モノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより測定すると、純度９７％であることが判明した。
【０１５６】
［実施例１２］
モノクローナルマウスＩｇＭ−Ｂ抗体の精製
１０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（製品番号：ＪＨ−１Ｌ−ＢＫ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）中で透析された、クローンＬＢ−２から産生された抗Ｂ  ＩｇＭを含有する市販の清澄化された細胞培養原料から血液型Ｂ抗原マウスモノクローナルＩｇＭ抗体（抗Ｂ）を精製した。本明細書に記載されるように、抗Ｂ細胞培養原料を０．２２μｍのメンブレンを通して濾過し、媒体に付着された血液型抗原三糖（ＴｒｉＢ）リガンドを有する媒体において結合／溶出クロマトグラフィーするように供された。
【０１５７】
直径１０ｍｍのカラムにＴｒｉ−Ｂリガンド媒体を６４ｍｍに装填した。カラムを１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分で１０ＣＶ）を用いて平衡化し、その後、１０ｍＭのＰＢＳ中（４０ＣＶ、２２９．１８ｃｍ／時、３．０ｍＬ／分）にモノクローナル抗Ｂを含有する清澄化された細胞培養原料を充填した。カラムを１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（５ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍｌ／分）、続いて、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（１０ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍｌ／分）中の０．５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。次に、ｐＨ２．７の０．１Ｍグリシン（９ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分）を用いてカラムから抗Ｂ抗体を溶出させた。その後、さらに実施する前に、１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液（１０ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分）を用いてカラムを洗浄し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム（１０ＣＶ、３０５．５８ｃｍ／時、４．０ｍＬ／分）でストリップ処理した。
【０１５８】
１ｍＬの２．０Ｍトリス塩基を４５ｍＬの抗Ｂ溶出液に添加し、その溶液のｐＨを６から７に上昇させた。溶出液を透析チューブ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＣ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｔｒｉａｌ  Ｋｉｔｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）１−３、３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、５４ｍｍ  ＦＬＡＴ  ＷＩＤＴＨ、シリアル番号：１３２７２５、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、９０２２０  ＵＳＡ）を用いて１０ｍＭのＰＢＳ中で透析した。１０ｍＭのＰＢＳ中で透析後、モノクローナル抗ＢマウスＩｇＭの得られた溶液は、タンパク質のアミノ酸組成に基づいて測定すると、２８０ｎｍで１．４４の吸光係数に基づいて、約１．３ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。モノクローナル抗Ａ  ＩｇＭ抗体は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより測定すると、純度９８％であることが判明した。
【０１５９】
本明細書は、参照により本明細書に組み込む、本明細書中で引用される参考文献の教示を考慮することによって最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、実施形態の例証を提供するものであり、範囲を限定するものと解釈すべきでない。当業者（熟練者）は、他の多くの実施形態が本明細書に包含されることを容易に認識する。全ての刊行物および参考資料を、参照によりその全体を組み込む。参照により組み込む材料が本明細書と矛盾するまたは相反する範囲まで、本明細書は任意のこのような材料に取って代わる。本明細書の任意の文献の引用は、このような文献が先行技術であると認めるものではない。
【０１６０】
特記しない限り、成分量、細胞培養、処理条件などを表している、特許請求の範囲を含んだ本明細書中で使用される全ての数字は、すべての場合に用語「約」により修飾されているものと解釈すべきである。したがって、反対のことを特記しない限り、数値パラメーターは、近似値であり、本明細書に開示される実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変動することができる。特記しない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連のあらゆる要素を指すと解釈すべきである。当業者は、通常の実験を超えない実験を使用して、本明細書に記載される特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されると解釈される。
【０１６１】
本明細書に開示されている実施形態の多数の修飾および変更は、当業者に明らかであるように、その精神および範囲から逸脱することなしに行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は、例としてのみ提供され、いかなる方法でも限定するものでない。明細書および実施例は、以下の特許請求の範囲によって示される開示の真の範囲および精神とともに、単なる例示としてみなされることが意図される。
【図１】
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【図２】
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