(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低酸素蛍光プローブを有効成分として含有し、前記低酸素蛍光プローブが下記式（２）で表される化合物であり、硝子体注射により０．１〜５０μｇ投与するように用いられる、硝子体注射用の低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬。
【化１】
0006505408.tif 000009
【請求項２】
請求項１に記載の診断薬と、血管新生阻害剤とを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患の治療用組成物。
【請求項３】
前記血管新生阻害剤が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）捕捉物質である、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦ捕捉物質が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項３に記載の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織中の低酸素領域の存在は、各種の眼疾患、癌の悪性化等に関わっていることが知られている。
【０００３】
生体組織中の低酸素領域の検出用試薬としては、２−ニトロイミダゾール系の化合物であるピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）が広く利用されている。ピモニダゾールを用いた低酸素領域の検出は、ピモニダゾールが低酸素状態の細胞に結合することを利用して行う。より具体的には、まず、ピモニダゾールを生体に投与する。すると、ピモニダゾールが低酸素状態の細胞に結合する。続いて、対象組織をホルマリン固定等により固定した標本を作製し、抗ピモニダゾール抗体で染色し、低酸素状態の細胞に結合したピモニダゾールを検出する。これにより、低酸素領域を観察することが可能になる。しかしながら、ピモニダゾールを用いて低酸素領域を検出するためには、対象組織を固定する必要があり、インビボで低酸素領域を検出することはできない。
【０００４】
そこで、インビボで低酸素領域を検出することができる蛍光プローブの開発が行われている。例えば、特許文献１には、近赤外蛍光色素と、低酸素領域で還元的代謝により活性化されて求核性の生体分子と結合する低酸素結合部位と、リンカー結合とからなることを特徴とする低酸素領域イメージング用近赤外蛍光プローブが記載されている。
【０００５】
低酸素関連眼疾患における低酸素状態を推測する方法として、現在、蛍光眼底造影による間接的な評価が行われている。蛍光眼底造影は、蛍光物質であるフルオレセインを点滴で患者に投与して、眼底カメラで眼底の血管を撮影する方法である。この方法は、５０年以上の歴史のある古い検査方法であるが、その有用性により眼科診療において欠かすことのできないものとなっている。
【０００６】
同様の蛍光眼底造影方法として、蛍光物質であるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）を点滴で患者に投与して、眼底カメラで眼底の血管を撮影する方法が知られている。インドシアニングリーンは近赤外領域の蛍光を発する蛍光物質であることから、インドシアニングリーンの蛍光と生体が発する自家蛍光との区別が容易である。また、近赤外光は生体組織透過性が高いことから、インドシアニングリーンにより、脈絡膜等の組織のより深い領域を観察することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２０３９６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、蛍光眼底造影では、低酸素関連眼疾患が末期にまで進行し、毛細血管の閉塞が発生して初めて無血管野や新生血管が観察され、低酸素領域の存在を推測評価することが可能となる。このため、低酸素関連眼疾患の初期〜中期の低酸素領域を直接評価することはできない。また、蛍光眼底造影では、約２０万人に１人の割合でアナフィラキシーショックにより死亡するという重篤な副作用が存在することが大きな問題となっている。
【０００９】
また、特許文献１に記載された低酸素領域イメージング用近赤外蛍光プローブは、蛍光のｏｎ−ｏｆｆ機能を持たず常に発光していることから、バックグランドが高く、シグナル検出までに時間がかかる場合があった。
【００１０】
このような背景のもと、本発明は、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能な診断薬を提供することを目的とする。本発明はまた、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することが可能な治療用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は以下の通りである。
［１］低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬。
［２］硝子体注射用である、［１］に記載の診断薬。
［３］前記低酸素蛍光プローブが下記式（１）で表される化合物である、請求項１又は２に記載の診断薬。
【化１】
0006505408.tif 000002
［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立にＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３−、又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表し、Ｒ２は存在しないか又は炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、Ｒ３は電子吸引性置換基を表し、Ｒ４はアルキル基、−（ＣＨ２）ＡＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ＡＳＯ３−、又は−（ＣＨ２）ＡＯ−を表し、Ｘ−は存在しないか又はＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、若しくはＰＦ６−を表し、ｎは１〜４の整数を表し、Ａは１〜６の整数を表す。］
［４］前記低酸素蛍光プローブが下記式（２）で表される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断薬。
【化２】
0006505408.tif 000003
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載の診断薬と、血管新生阻害剤とを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患の治療用組成物。
［６］前記血管新生阻害剤が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）捕捉物質である、［５］に記載の治療用組成物。
［７］前記ＶＥＧＦ捕捉物質が抗ＶＥＧＦ抗体である、［６］に記載の治療用組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能な診断薬を提供することができる。また、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することが可能な治療用組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】（ａ）は、終濃度０．５、１．０及び１．５μＭの低酸素蛍光プローブ（ＧＰＵ−３２７）の存在下、及び酸素濃度１％、５％及び２０％の環境下で培養した血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）における蛍光を検出した写真である。（ｂ）〜（ｄ）は、（ａ）の蛍光強度をグラフにしたものである。（ｅ）は、終濃度０．５、１．０及び１．５μＭのＧＰＵ−３２７の存在下、及び酸素濃度１％、５％及び２０％の環境下で培養した臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の蛍光を検出した写真である。（ｆ）〜（ｈ）は、（ｅ）の蛍光強度をグラフにしたものである。
【図２】（ａ）は、ＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。（ｂ）は、ＨＩＦ−１αタンパク質及びラミンＢタンパク質の発現を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ｃ）は、（ｂ）のタンパク質発現量をグラフにしたものである。
【図３】（ａ）及び（ｂ）は、皮弁虚血マウスモデルを示す写真である。（ｃ）は、蛍光観察の結果を示す写真である。
【図４】（ａ）は、インビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）で観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ｂ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｄ）は、（ｂ）及び（ｃ）の蛍光像を統合した写真である。（ｅ）は、（ａ）〜（ｄ）と同一の実験方法で作製したモデルの眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。（ｆ）は、（ｅ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｇ）は、（ｅ）及び（ｆ）の蛍光像を統合した写真である。
【図５】（ａ）は、インビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）で観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ｂ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｄ）は、（ｂ）及び（ｃ）の蛍光像を統合した写真である。
【図６】（ａ）は、眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の蛍光像を統合した写真である。
【図７】（ａ）及び（ｂ）は、蛍光観察の結果を示す写真である。（ｃ）は、（ｂ）において検出された蛍光強度をグラフにしたものである。
【図８】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影した写真である。（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）は、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。
【図９】蛍光眼底造影の結果を示す写真である。
【図１０】（ａ）は、インビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を検出した写真である。（ｂ）は（ａ）で観察した眼の眼底を撮影した写真である。（ｃ）は、（ａ）で観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。（ｄ）は、（ｃ）と同一のサンプルにおける、ピモニダゾールによる染色の結果を示す写真である。（ｅ）は、（ｃ）及び（ｄ）の蛍光像を統合した写真である。（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）における矢印は、網膜静脈の閉塞部位を示す。
【図１１】（ａ）はＰＢＳ又はＧＰＵ−３２７の投与から６０日後の網膜電図を示すグラフである。（ｂ）は、各刺激輝度において測定されたａ波について、左眼の振幅に対する右眼の振幅の比を示すグラフである。（ｃ）は、各刺激輝度において測定されたｂ波について、左眼の振幅に対する右眼の振幅の比を示すグラフである。（ｄ）はＧＰＵ−３２７投与群の眼の光学顕微鏡写真である。（ｅ）はＰＢＳ投与群の眼の光学顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
［低酸素関連眼疾患の診断薬］
１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患のインビボ用診断薬を提供する。
【００１５】
従来、インビボで眼の低酸素領域を可視化する手法は存在しなかった。これに対し、発明者らは、低酸素蛍光プローブを眼に適用することにより、インビトロ及びインビボの双方において、眼の低酸素領域を検出し、低酸素関連眼疾患の診断を行うことが可能であることを初めて明らかにした。
【００１６】
本実施形態の診断薬によれば、インビトロだけでなく、インビボにおいても眼の低酸素領域を直接検出することができる。これにより、従来できなかった、低酸素関連眼疾患の初期〜中期の低酸素領域の直接評価を実現することができる。
【００１７】
例えば若年者糖尿病網膜症の場合、網膜症の活動性が高く、進行も早いため、治療のタイミングを逃すと新生血管緑内障等の重篤な合併症を生じ、視力予後が非常に不良となる。このような疾患においては、適切な活動性評価、つまり低酸素状態の評価が非常に重要である。疾患の初期〜中期の低酸素領域の状態を直接評価することにより、より低侵襲の早期治療を行うことができる。
【００１８】
また、近年、失明の主要な原因である緑内障や強度近視による黄斑変性症等の疾患と、血流の低下との関連が指摘されている。本実施形態の診断薬を使用して眼の低酸素領域をインビボで観察することにより、これらの疾患の原因究明にも寄与できることが期待される。
【００１９】
（低酸素蛍光プローブ）
低酸素蛍光プローブとは、常酸素環境下と低酸素環境下において蛍光特性が変化する化合物である。低酸素蛍光プローブとしては、ヒトや動物に対する毒性が許容範囲内であれば特に限定されず、例えば、低酸素条件下の生体内における還元代謝によって蛍光特性が大きく変化する化合物が挙げられる。
【００２０】
低酸素蛍光プローブが発する蛍光の波長は特に限定されないが、近赤外領域（波長６５０〜１０００ｎｍ）の蛍光であることが好ましい。近赤外蛍光は、生体が発する自家蛍光との区別が容易である。また、近赤外光は、生体組織への透過性が高く、生体内物質による吸収も限られている。
【００２１】
近赤外蛍光を発する低酸素蛍光プローブとしては、例えば、シアニン系色素誘導体、ＢＯＤＩＰＹ系色素誘導体等が挙げられる。
【００２２】
低酸素蛍光プローブの低酸素条件下における蛍光特性の変化は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。低酸素蛍光プローブの蛍光特性の変化が可逆的である場合には、低酸素環境が改善され、常酸素環境に近づくと蛍光特性が変化することから、酸素濃度の経時的な変化をモニターすることも可能になる。
【００２３】
より具体的な低酸素蛍光プローブとしては、例えば、下記式（１）で表される化合物が挙げられる。
【化３】
0006505408.tif 000004
［式（１）中、Ｒ１はそれぞれ独立にＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３−、又は炭素数１〜３のアルコキシ基を表し、Ｒ２は存在しないか又は炭素数１〜１０の直鎖若しくは分岐鎖状のアルキル基を表し、Ｒ３は電子吸引性置換基を表し、Ｒ４はアルキル基、−（ＣＨ２）ＡＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ＡＳＯ３−、又は−（ＣＨ２）ＡＯ−を表し、Ｘ−は存在しないか又はＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、若しくはＰＦ６−を表し、ｎは１〜４の整数を表し、Ａは１〜６の整数を表す。］
【００２４】
上記の電子吸引性置換基としては、ニトロ基、シアノ基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化アリール基、ハロゲン化ヘテロアリール基、含窒素ヘテロアリール基、カルボニル基、スルホニル基、ホスホリル基、アルキニル基等が挙げられる。
【００２５】
低酸素蛍光プローブは、例えば、下記式（２）で表される化合物（以下、「ＧＰＵ−３２７」という場合がある。）であってもよい。
【化４】
0006505408.tif 000005
【００２６】
ＧＰＵ−３２７は蛍光をほとんど示さないが、生体に投与すると、低酸素領域において還元的代謝を受けて下記式（３）に示す化合物に変化して活性化され、近赤外領域の蛍光を発するようになる。また、下記式（３）に示す化合物は、タンパク質等の求核性の生体分子と結合し、低酸素領域にしばらく留まるため、低酸素領域を可視化することができる。下記式（３）に示す化合物は、一定期間経過後、代謝により体外に排泄される。
【００２７】
【化５】
0006505408.tif 000006
［式（３）中、Ｒ５はそれぞれ独立にＮＯ２、ＮＨ２、ＮＯ又はＮＨＯＨを表す。但し、Ｒ５の全てが同時にＮＯ２になることはない。］
【００２８】
後述するように、発明者らは、ＧＰＵ−３２７により、眼の低酸素領域をインビボで可視化することができることを明らかにした。また、ＧＰＵ−３２７を生体に投与しても安全であることを確認した。
【００２９】
ＧＰＵ−３２７を局所投与する場合の投与量は、例えば０．１〜１０００μｇであってよい。特に、ＧＰＵ−３２７を硝子体注射により投与する場合の投与量は、例えば０．１〜５０μｇであってよく、例えば０．１〜１０μｇであってよい。また、ＧＰＵ−３２７を全身投与する場合の投与量は、例えば１〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重であってよく、例えば１〜２００ｍｇ／６０ｋｇであってよい。
【００３０】
（常酸素領域及び低酸素領域）
本明細書において、常酸素領域とは、酸素濃度約２０％の通常の大気中において、培地中で培養中の細胞が接している酸素の濃度に相当する濃度の酸素が存在する領域を意味する。そして、低酸素領域とは、常酸素領域よりも酸素の濃度が少ない領域を意味する。いいかえると、「低酸素領域」とは、酸素の存在量が、細胞の生存又は細胞の健全な機能に必要な量よりも少ない領域を意味する。
【００３１】
（低酸素関連眼疾患）
本実施形態の診断薬で診断可能な低酸素関連眼疾患としては、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、黄斑変性症、緑内障等が挙げられる。
【００３２】
（剤型及び投与方法）
本実施形態の診断薬は、全身投与してもよく、局所投与してもよい。局所投与の場合には、必要な診断薬の量がわずかで済み、アナフィラキシーショック等の副作用の危険性も低減することができる。局所投与の例としては、例えば硝子体注射が挙げられる。すなわち、本実施形態の診断薬は、硝子体注射用であってもよい。後述するように発明者らは、診断薬を硝子体注射で投与することにより、眼の低酸素領域を検出できることを明らかにした。
【００３３】
本実施形態の診断薬は、薬学的に許容される担体を混合した診断用組成物であってもよい。診断薬又は診断用組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。
【００３４】
薬学的に許容される担体（添加剤）としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、増粘剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤、注射剤用溶剤等が挙げられる。
【００３５】
賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００３６】
結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００３７】
崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００３８】
滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００３９】
乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤；ステアリン酸ポリグリセリル−１０、ジステアリン酸ポリグリセリル−１０、トリステアリン酸ポリグリセリル−１０、ペンタステアリン酸ポリグリセリル−１０等の（ポリ）グリセリル脂肪酸エステル界面活性剤等が挙げられる。
【００４０】
安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。
【００４１】
希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００４２】
増粘剤としては、キサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、カラギナン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００４３】
湿潤剤としては、ソルビット、グリセリン、濃グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
【００４４】
ｐＨ調整剤としては、フタル酸、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、フマル酸、リンゴ酸、炭酸やそれらのカリウム塩、ナトリウム塩又はアンモニウム塩、水酸化ナトリウム等が挙げられる。
【００４５】
注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００４６】
本実施形態の診断薬又は診断用組成物は、低酸素蛍光プローブを有効成分として含有する。ここで、「有効成分として含有する」とは、本実施形態の診断薬又は診断用組成物が、本願発明の効果を奏する程度に低酸素蛍光プローブを含有していれば特に限定されないが、例えば、診断薬又は診断用組成物中に含まれる低酸素蛍光プローブの含有量が、０．００１〜２０質量％であることを意味し、例えば０．０１〜１０質量％であることを意味する。
【００４７】
診断薬又は診断用組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内又は硝子体投与される。坐剤は直腸内投与される。皮膚外用剤は、患部に塗布、貼付又はスプレーされる。
【００４８】
診断薬又は診断用組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、投与単位形態あたり１〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分（低酸素蛍光プローブ）を投与すればよい。また、注射剤で全身投与する場合には、例えば、投与単位形態あたり１〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。また、硝子体注射により投与する場合には、投与単位形態あたり、例えば１〜５０μｇの有効成分を投与すればよく、例えば１〜１０μｇの有効成分を投与すればよい。また、坐剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり１〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。また、皮膚外用剤の場合には、例えば、投与単位形態あたり１〜５００ｍｇ／６０ｋｇ体重の有効成分を投与すればよい。
【００４９】
［低酸素関連眼疾患の治療用組成物］
１実施形態において、本発明は、上記の診断薬又は診断用組成物と、血管新生阻害剤とを有効成分として含有する、低酸素関連眼疾患の治療用組成物を提供する。
【００５０】
本実施形態の治療用組成物を患者に投与することにより、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することができる。
【００５１】
また、上述したように、本実施形態の治療用組成物が含有する低酸素蛍光プローブの低酸素条件下における蛍光特性の変化は、可逆的であっても不可逆的であってもよい。低酸素蛍光プローブの蛍光特性の変化が可逆的である場合には、低酸素環境が改善され、常酸素環境に近づくと蛍光特性が変化することから、酸素濃度の経時的な変化をモニターすることができる。したがって、当該低酸素蛍光プローブの蛍光を観察することにより、患者の眼の低酸素環境が改善したか否か、すなわち、治療効果が奏されたか否かを評価することもできる。
【００５２】
（血管新生阻害剤）
血管新生阻害剤としては、ＶＥＧＦ捕捉物質、ＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、ＶＥＧＦ受容体キナーゼ阻害剤、アンジオスタチン、エンドスタチン、フマギリン、フマギロール誘導体、血管新生抑制ステロイド等が挙げられる。
【００５３】
ＶＥＧＦ捕捉物質としては、例えば、ルセンティス（ラニビズマブ）、アバスチン（ベバシズマブ）等の抗ＶＥＧＦ抗体；マクジェン（ペガプタニブナトリウム）等のアプタマー；アイリーア等の融合タンパク質等が挙げられる。
【００５４】
フマギロール誘導体としては、例えば、Ｏ−モノクロロアセチルカルバモイルフマギロール、Ｏ−ジクロロアセチルカルバモイルフマギロール等が挙げられる。
【００５５】
（剤型及び投与方法）
本実施形態の治療用組成物は、全身投与してもよく、局所投与してもよい。局所投与の場合には、必要な治療用組成物の量がわずかで済み、アナフィラキシーショック等の副作用の危険性も低減することができる。局所投与の例としては、例えば硝子体注射が挙げられる。すなわち、本実施形態の治療用組成物は、硝子体注射用であってもよい。
【００５６】
本実施形態の治療用組成物の剤型及び投与方法としては、上記実施形態の診断薬又は診断用組成物と同様のものが挙げられる。また、本実施形態の治療用組成物の投与量は、含有する低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤の効果が奏される範囲において適宜設定することができる。
【００５７】
１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブを眼に投与する工程を備える、眼の低酸素領域をインビボで検出する方法を提供する。本実施形態の方法において、低酸素蛍光プローブの投与は、硝子体注射により行われてもよい。また、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
【００５８】
１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブを眼に投与する工程を備える、低酸素関連眼疾患をインビボで診断する方法を提供する。本実施形態の方法において、低酸素蛍光プローブの投与は、硝子体注射により行われてもよい。また、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
【００５９】
１実施形態において、本発明は、低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤を眼に投与する工程を備える、低酸素関連眼疾患の治療方法を提供する。本実施形態の治療方法において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。また、血管新生阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００６０】
１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の診断のための低酸素蛍光プローブを提供する。本実施形態において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
【００６１】
１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の治療のための組成物であって、低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤を有効成分として含有する組成物を提供する。本実施形態の組成物において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。また、血管新生阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００６２】
１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の診断薬を製造するための低酸素蛍光プローブの使用を提供する。本実施形態において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。
【００６３】
１実施形態において、本発明は、低酸素関連眼疾患の治療用組成物を製造するための、低酸素蛍光プローブ及び血管新生阻害剤の使用を提供する。本実施形態において、低酸素蛍光プローブとしては、上述したものと同様の化合物を使用することができる。また、血管新生阻害剤としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００６５】
［実験例１］
（低酸素蛍光プローブの合成）
下記式（２）で表される低酸素蛍光プローブ（以下、「ＧＰＵ−３２７」という場合がある。）を合成した。
【００６６】
【化６】
0006505408.tif 000007
【００６７】
ＧＰＵ−３２７は、下記反応スキーム（Ｉ）にしたがって合成した。以下に各合成ステップの詳細を説明する。なお、下記の説明において１〜９の数字が付された各化合物は、反応スキーム（Ｉ）において１〜９の数字が付された各化合物に対応する。
【００６８】
（３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ（２）の合成）
窒素雰囲気下に３，５−ジニトロ安息香酸（１，３．１９ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液（２５ｍＬ）に氷冷下撹拌しつつ０．９５Ｍボラン−ＴＨＦ錯体のＴＨＦ溶液（２０．０ｍＬ，１９．０ｍｍｏｌ）を２０分かけて注意深く滴下した。氷冷下更に９０分撹拌後、室温にて更に２２時間撹拌した。水：酢酸（１：１，１．０ｍＬ）を注意深く反応混合物に滴下して反応を停止させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）を更に加えたのちにクロロホルム（３０ｍＬ×３）で抽出を行った。溶媒を減圧溜去後、オレンジ色の固体が得られ、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝３：７）にて精製し、淡黄色固体の化合物２（２．４７ｇ，８３％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．９７（ｓ，１Ｈ），８．５９（ｓ，２Ｈ），４．９７（ｄ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．１８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，１Ｈ）．
【００６９】
（３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｂｒｏｍｉｄｅ（３）の合成）
３，５−ジニトロベンジルアルコール（２，１．９７ｇ，９．９４ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２０ｍＬ）溶液に、三臭化リン（１．７ｍＬ，１７．９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（７．３ｍＬ）溶液を１５分間かけて滴下し、その後塩化カルシウムによる防湿下に２時間加熱還流を行った。更に１６．５時間室温で撹拌後、水（３０ｍＬ）を反応混合物に注意深く加え、クロロホルム（３５ｍＬ×６）で抽出を行った。有機層をまとめて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ｍＬ）及び飽和食塩水（２００ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し溶媒を減圧溜去した。得られた黄色固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝５：９５〜２０：８０）にて精製し、淡黄色結晶の化合物３（２．２５ｇ，８７％）を得た。ｍ．ｐ．９４．０−９５．５°Ｃ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．９９（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．５９（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，２Ｈ），４．６１（ｓ，２Ｈ）．
【００７０】
（３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｉｏｄｉｄｅ（４）の合成）
３，５−ジニトロベンジルブロミド（３，２．９２ｇ，１１．２ｍｍｏｌ）のアセトン（７５ｍＬ）溶液に１０％（ｗ／ｗ）ヨウ化ナトリウムのアセトン溶液（４３．９ｍｍｏｌ，７５．０ｍＬ）を撹拌しながら７５分かけて加え、更に４時間室温にて撹拌した。水（８０ｍＬ）を反応混合物に加え、更にクロロホルム（８０ｍＬ×３）にて抽出を行った。まとめた有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）にて洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。更に溶媒を減圧溜去して淡黄色固体の化合物４（３．３９ｇ，９８％）を得た。ｍ．ｐ．９０．０−９３．０°Ｃ；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．９３（ｔ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，２Ｈ），４．５７（ｓ，２Ｈ）．
【００７１】
（５−Ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｅ（６）の合成）
イソプロピルメチルケトン（０．６４ｍＬ，５．９７ｍｍｏｌ）と４−メトキシフェニルヒドラジン塩酸塩（５，１．０５ｇ，６．０１ｍｍｏｌ）のエタノール（２５．７ｍＬ）溶液を３時間加熱還流した。室温まで放冷後、溶媒を減圧溜去した。残渣をクロロホルム（４０ｍＬ）に溶解し、水（３０ｍＬ×２）で洗浄後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧溜去した。茶色半固体の化合物６（１．０５ｇ，９３％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ，）δ：７．４３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８５−６．８０（ｍ，２Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），１．２９（６Ｈ，ｓ）．
【００７２】
（１−（３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（７）の合成）
５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（６，１８９．３ｍｇ，１．００ｍｍｏｌ）と３，５−ジニトロベンジルヨージド（４，４６２．０ｍｇ，１．５０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（６．０ｍＬ）溶液を窒素雰囲気下に２２時間加熱還流した。室温まで放冷後、生じた沈殿を濾取し、得られた固体をアセトン（３ｍＬ×３）及びジエチルエーテル（３ｍＬ）にて洗浄した。オレンジ色固体の化合物７（３７５．４ｍｇ，７５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００ＭＨｚ）δ：８．９２（ｔ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５４（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．０５（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．７Ｈｚ，１Ｈ），５．８４（ｓ，２Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），１．６２（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ：ＣＤ３ＯＤ：ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ，）δ：１９６．１，１６０．９，１４８．０，１４３．２，１３４．５，１３２．９，１２６．８，１１８．２，１１５．７，１１４．２，１０８．４，５５．０，５４．２，４９．０，２１．２；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１９Ｈ２０Ｎ３Ｏ５［Ｍ−Ｉ］＋＝３７０．１４０３，Ｆｏｕｎｄ，３７０．１３８４．
【００７３】
（５−Ｍｅｔｈｏｘｙ−１，２，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（８）の合成）
５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール（６，１９３．２ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）をヨウ化メチル（４．０ｍＬ）に溶解し、２時間加熱還流を行った後室温まで放冷した。生じた沈殿をｎ−ヘキサンにて処理して濾取し、得られた固体をｎ−ヘキサン（３ｍＬ×２）にて洗浄し、減圧乾燥を行って茶色粉末８（３１９．０ｍｇ，９４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：７．５９（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６−７．０２（ｍ，２Ｈ），４．２３（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．０４（ｓ，３Ｈ），１．６５（ｓ，６Ｈ）．
【００７４】
（５−Ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−２−｛６−（Ｎ−ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｈｅｘａ−１，３，５−ｔｒｉｅｎｙｌ｝−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（９）の合成）
グルタコンアルデヒド・ジアニール塩酸塩（５７．１ｍｇ，０．２０１ｍｍｏｌ）、塩化アセチル（５６．６μＬ，０．７９７ｍｍｏｌ）及び無水酢酸（０．２ｍＬ）の混合物を１１０℃にて加熱し、ここに５−メトキシ−１，２，３，３−テトラメチル−３Ｈ−インドリウムヨージド（８，３０．１ｍｇ，０．０９０９ｍｍｏｌ）の無水酢酸（２．０ｍＬ）溶液を滴下し、さらに３０分撹拌した。溶媒を５０℃以下にて減圧溜去し、得られた残渣を塩化メチレン（０．４ｍＬ）に溶解し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）に激しく撹拌しつつ加えた。生じた沈殿を濾取し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（塩化メチレン：ｎ−ヘキサン：メタノール＝２０：４：０．５〜２０：４：４）により精製し、赤色個体として化合物９（１０９．２ｍｇ）を定量的に得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ：８．１４（ｄ，Ｊ＝１３．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｄｄ，Ｊ＝１５．１，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６３−７．５０（ｍ，３Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｄｄ，Ｊ＝１４．５，１１．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１８（ｓ，３Ｈ），３．８９（ｓ，３Ｈ），１．９７（ｓ，３Ｈ），１．７１（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１７８．４，１６９．２，１６０．９，１５３．７，１４９．８，１４４．６，１４０．１，１３７．９，１３４．８，１３０．６，１２９．９，１２９．７，１２８．１，１１５．２，１１４．５，１１３．５，１１３．４，１０８．６，５６．１，５１．４，３５．６，２７．０，２３．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ２９Ｎ２Ｏ２［Ｍ−Ｉ］＋＝４０１．２２２９，Ｆｏｕｎｄ，４０１．２２４８．
【００７５】
（２−［７−｛１−（３，５−Ｄｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ）−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｌｉｎ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ｝ｈｅｐｔａ−１，３，５−ｔｒｉｅｎｙｌ］−５−ｍｅｔｈｏｘｙ−１，３，３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（ＧＰＵ−３２７）の合成）
化合物９（６９．６ｍｇ，０．１３２ｍｍｏｌ），無水酢酸ナトリウム（１６．４ｍｇ，０．２００ｍｍｏｌ）及び１−（３，５−ジニトロベンジル）−５−メトキシ−２，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドレニウムヨージド（７，４９．７ｍｇ，０．０９９９ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に加え、アルゴン雰囲気下で４５分間加熱還流した。溶媒を減圧溜去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（塩化メチレン：ｎ−ヘキサン：メタノール＝２０：４：０．３〜２０：４：０．８）及びＯＤＳフラッシュクロマトグラフィ（水：アセトニトリル＝６０：４０〜３６：６４）により精製し、青色粉末としてＧＰＵ−３２７（１３．８ｍｇ，１８％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）δ：８．９２（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．４４（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，２Ｈ），７．９７（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．６６（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．４２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），７．３９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．５１（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，２Ｈ），６．３１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．８７（ｄ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），１．７６（ｓ，６Ｈ），１．７０（ｓ，６Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）δ：１７７．１，１６７．０，１６１．２，１５８．５，１５５．６，１５４．６，１５０．３，１４６．９，１４５．３，１４２．５，１４２．０，１３７．６，１３７．１，１２８．０，１２７．７，１２６．８，１１８．９，１１５．３，１１４．４，１１４．３，１１０．６，１１０．２，１０９．７，１０８．９，１０１．６，７９．５，５６．５，５６．４，５１．８，４６．１，３２．６，２８．６，２７．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３７Ｈ３９Ｎ４Ｏ６［Ｍ−Ｉ］＋＝６３５．２８６４  Ｆｏｕｎｄ，６３５．２８７５．
【００７６】
【化７】
0006505408.tif 000008
【００７７】
［実験例２］
（ＧＰＵ−３２７によるＥＰＣ及びＨＵＶＥＣの低酸素領域の可視化）
ＧＰＵ−３２７の存在下で血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培養し、ＧＰＵ−３２７の低酸素選択性を検討した。
【００７８】
ＥＰＣは、臍帯血から単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）中で培養した。ＨＵＶＥＣはキャンブレックス社より購入し、説明書にしたがって培養した。
【００７９】
ＥＰＣ及びＨＵＶＥＣの培地に、終濃度０．５、１．０及び１．５μＭのＧＰＵ−３２７を添加し、酸素濃度１％、５％及び２０％の環境下で６時間培養した。続いて、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で各細胞を洗浄し、結合しなかったＧＰＵ−３２７を除去した。
【００８０】
続いて、ＣＣＤカメラ（型式「Ｈ６７４１ＣＥ」、Ｔｕｃｓｅｎ社）及びＩＣＧ用蛍光フィルター（オメガオプティカル社）を取り付けた蛍光顕微鏡（型式「ＢＸ５１」、オリンパス社）を用いてＧＰＵ−３２７の蛍光を検出した。
【００８１】
結果を図１に示す。図１（ａ）は、各条件下のＥＰＣにおける蛍光を検出した写真である。図１（ｂ）〜（ｄ）は、図１（ａ）の蛍光強度をグラフにしたものである。図１（ｅ）は、各条件下のＨＵＶＥＣにおける蛍光を検出した写真である。図１（ｆ）〜（ｈ）は、図１（ｅ）の蛍光強度をグラフにしたものである。図１（ｂ）〜（ｄ）及び（ｆ）〜（ｈ）中の「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。データは、スチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）及び対応のあるｔ検定（Ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）を用いて解析した。複数の群を比較する場合、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較を使用した。以下、全ての実験例において、統計学的解析は、ソフトウエア（商品名「ＳｔａｔＶｉｅｗ  ｖｅｒ．５．０」、ＳＡＳ社）を使用して行った。グラフにおいて、ｙ軸のエラーバーは標準偏差を示す。
【００８２】
その結果、常酸素条件下（酸素濃度２０％）と低酸素条件下（酸素濃度５％又は１％）におけるＧＰＵ−３２７の蛍光強度に有意差があることが確認された。この結果は、ＧＰＵ−３２７が低酸素領域を検出可能であることを示す。
【００８３】
［実験例３］
（ＥＰＣ及びＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦ及びＨＩＦ−１αの発現レベルの測定）
実験例２の各酸素条件下で培養したＥＰＣ及びＨＵＶＥＣにおける血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１αの発現レベルを測定した。ＶＥＧＦの発現量は定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。より具体的には、まず、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて各細胞から全ＲＮＡを抽出した。続いて、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ（商標）（東洋紡社）を用いて全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、定量的ＲＴ−ＰＣＲの鋳型に使用した。ＶＥＧＦ遺伝子増幅用プライマーとして、センスプライマー（５’−ＡＧＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＡＣＡＧＣＡＣＡＡＣ−３’、配列番号１）及びアンチセンスプライマー（５’−ＡＧＧＡＣＴＴＡＴＡＣＣＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＧ−３’、配列番号２）を使用した。ＨＩＦ−１αの発現量は、ウエスタンブロッティングにより測定した。
【００８４】
各細胞の核抽出物各３０μｇをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。続いて、１次抗体にウサギ抗ＨＩＦ−１α抗体（Ｎｏｖｕｓ社）を使用し、２次抗体にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（インビトロジェン社）を使用して転写膜を染色し、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）システム（ＧＥヘルスケア社）で検出した。対照として、ラミンＢタンパク質を検出した。ラミンＢタンパク質の検出は、１次抗体にヤギ抗ラミンＢ抗体（サンタクルーズ社）を使用し、２次抗体にＨＲＰ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ（インビトロジェン社）を使用して行った。
【００８５】
結果を図２に示す。図２（ａ）は、各細胞におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。図２（ｂ）は、各細胞におけるＨＩＦ−１αタンパク質及びラミンＢタンパク質の発現を検出したウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。図２（ｃ）は、図２（ｂ）のタンパク質発現量をグラフにしたものである。図２（ａ）、図２（ｃ）中の「＊」は、危険率５％未満で有意差があることを示す。
【００８６】
その結果、ＨＵＶＥＣと比較して、ＥＰＣは低酸素条件に強く応答し、低酸素条件下でＶＥＧＦ遺伝子発現量及びＨＩＦ−１αタンパク質発現量が有意に増加したことが明らかとなった。
【００８７】
一方、ＨＵＶＥＣは、低酸素条件に対する応答が弱かったにもかかわらず、実験例２においては、低酸素条件でＧＰＵ−３２７の蛍光強度の有意な増加が認められた。この結果は、ＧＰＵ−３２７が、ＶＥＧＦやＨＩＦ−１αの発現を直接検出するものではなく、低酸素条件を検出するものであることを示す。
【００８８】
［実験例４］
（ＧＰＵ−３２７の皮弁虚血マウスモデルへの適用）
ＧＰＵ−３２７が、低酸素領域を正確に検出できることを確認し、ＧＰＵ−３２７を眼以外の領域への適用可能性を検討することを目的として、皮弁虚血マウスモデルを用いた検討を行った。
【００８９】
図３（ａ）及び（ｂ）は、皮弁虚血マウスモデルを示す写真である。図３（ａ）に示すように、半島形の切り込み（３ｃｍ×２ｃｍ）をマウスの背表面に作製した。これにより、切り込みの１方側のみに血液循環が存在し、虚血勾配が生じる。切り込み作製の２日後のマウスに、尾静脈投与によりＧＰＵ−３２７を投与し、ヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ−２」、コーワ社）を用いてＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。
【００９０】
このモデルでは、虚血組織において酸素圧の勾配が生じる。皮弁の尾側の領域は、皮弁の頭側の領域の１／５の酸素圧となる。したがって、皮弁の尾側の縁の領域は最も酸素圧が低いため、ＧＰＵ−３２７の蛍光が最も強くなると予想された。
【００９１】
図３（ｂ）は、蛍光フィルター無しで撮影した写真であり、図３（ｃ）は、蛍光フィルターを使用した蛍光像を示す写真である。その結果、ＧＰＵ−３２７が、低酸素領域を正確に検出できることが確認された。しかしながら、上記の予想に反し、ＧＰＵ−３２７の蛍光が最も強かったのは、皮弁の中央部分であった。この結果は、ＧＰＵ−３２７が皮弁の尾側の縁の領域まで到達できていないことによると考えられた。
【００９２】
［実験例５］
（ＧＰＵ−３２７の網膜動脈閉塞マウスモデルへの適用）
ＧＰＵ−３２７を網膜動脈閉塞マウスモデルに適用し、低酸素領域を正確に検出できるか否かを検討した。
【００９３】
マウス尾静脈にローズベンガルを投与し、レーザー光を網膜動脈に照射することにより、網膜動脈を閉塞させて網膜内に局所的な低酸素状態を作製することができる。この方法により、網膜動脈閉塞マウスモデルを作製した。
【００９４】
より具体的には、まず、マウスを麻酔し、瞳を拡張させた。続いて、４０ｍｇ／ｋｇのローズベンガル（ナカライテスク社）を尾静脈内投与した後に、角膜にガラスカバーを載せ、スリットランプ  クリプトンレーザー  デリバリーシステム（型式「ＭＣ−７０００」、ニデック社）を用いて、レーザー光を照射し、網膜動脈を閉塞させた。ローズベンガルの最大ピーク吸収波長は５５０ｎｍである。レーザースポットのサイズは約５０μｍであった。レーザーパワーは約５０ｍＷであった。レーザーパルスの間隔は３秒間であった。血流を止めるために、２〜３回のレーザー光の照射が必要であった。各眼において、１本の動脈を閉塞させた。
【００９５】
網膜動脈閉塞マウスモデル作製の直後に、硝子体注射により０．２μｇ／μＬの濃度のＧＰＵ−３２７を１μＬ投与した。２日後、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ−２」、コーワ社）を用いてインビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。その後、眼を摘出してインビトロで観察した。より具体的には、摘出した眼の網膜の血管構造を、蛍光標識されたイソレクチンＢ４で染色し、フラットマウントして蛍光顕微鏡で観察した。また、摘出した眼の細胞の核を４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、横断切片を蛍光顕微鏡（ＢＺＸ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）で観察した。また、蛍光顕微鏡（ＢＺＸ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用いてＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。
【００９６】
図４（ａ）は、インビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。閉塞した動脈周囲のみで蛍光の増強を認めており、本方法により、眼の低酸素領域をインビボで直接検出することができることが明らかとなった。
【００９７】
図４（ｂ）は、図４（ａ）で観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。図４（ｃ）は、図４（ｂ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図４（ｄ）は、図４（ｂ）及び図４（ｃ）の蛍光像を統合した写真である。図４（ｅ）は、（ａ）〜（ｄ）と同一の実験方法で作製したモデル眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。図４（ｆ）は、図４（ｅ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図４（ｇ）は、図４（ｅ）及び図４（ｆ）の蛍光像を統合した写真である。この結果から、眼の低酸素領域をインビボで検出した結果は、インビトロで検出した結果と一致することが確認された。
【００９８】
以上の結果から、ＧＰＵ−３２７により、網膜動脈閉塞マウスモデルの眼における低酸素領域を正確に検出できることが示された。
【００９９】
［実験例６］
（ＧＰＵ−３２７の網膜静脈閉塞マウスモデルへの適用）
ＧＰＵ−３２７を網膜静脈閉塞マウスモデルに適用し、低酸素領域を正確に検出できるか否かを検討した。
【０１００】
まず、実験例５と同様にしてマウスの網膜静脈にレーザー光を照射して網膜静脈を閉塞させ、網膜静脈閉塞マウスモデルを作製した。各眼において、３〜５個の静脈を閉塞させた。網膜静脈閉塞マウスモデル作製の直後に、硝子体注射によりＧＰＵ−３２７を投与した。２日後、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ−２」、コーワ社）を用いてインビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。その後、眼を摘出してインビトロで観察した。より具体的には、摘出した眼の網膜の血管構造を、蛍光標識されたイソレクチンＢ４で染色し、フラットマウントして蛍光顕微鏡で観察した。
【０１０１】
図５（ａ）は、インビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。１本の動脈のみを閉塞させた動脈閉塞症モデルと比べ、各眼３〜５個の静脈を閉塞させた静脈閉塞症モデルではより広範囲の低酸素領域が認められた。本方法により、眼の低酸素領域をインビボで直接検出することができることが明らかとなった。
【０１０２】
図５（ｂ）は、図５（ａ）で観察した眼の網膜の血管構造をインビトロで観察した結果を示す写真である。図５（ｃ）は、図５（ｂ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。図５（ｄ）は、図５（ｂ）及び図５（ｃ）の蛍光像を統合した写真である。この結果から、眼の低酸素領域をインビボで検出した結果は、インビトロで検出した結果と一致することが確認された。
【０１０３】
以上の結果から、ＧＰＵ−３２７により、網膜静脈閉塞マウスモデルの眼における低酸素領域を正確に検出できることが示された。
【０１０４】
［実験例７］
（ＧＰＵ−３２７の脈絡膜虚血マウスモデルへの適用）
ＧＰＵ−３２７を脈絡膜虚血マウスモデルに適用し、硝子体注射により投与したＧＰＵ−３２７が網膜を通過して脈絡膜まで到達することができるか否かを検討した。脈絡膜虚血マウスモデルでは、マウスの内頸動脈を結紮して脈絡膜のみならず眼球全体を虚血にする。
【０１０５】
マウスを麻酔した後、片方の頸動脈を露出し内頸動脈を８−０シルク糸で２か所結紮した。内頸動脈からは眼動脈が分岐しており、結紮することにより眼球全体が虚血に陥る。臨床的には眼虚血症候群モデルであり、このモデルでは眼球全体が虚血となるため、網膜の表層のみならず脈絡膜という深層まで虚血になる。内頸動脈結紮直後に、硝子体注射により０．２μｇ／μＬの濃度のＧＰＵ−３２７を１μＬ両眼に投与した。２日後、眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。
【０１０６】
図６（ａ）は、眼の横断切片をインビトロで観察した結果を示す写真である。（ｂ）は、（ａ）と同一のサンプルにおける、ＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の蛍光像を統合した写真である。
【０１０７】
内頸動脈を結紮した側の眼球では蛍光強度の増強を認めたが、結紮していない側の眼球では蛍光の増強は認めなかった。横断切片では眼球全体が淡く蛍光が増強していた。特に視神経で強い蛍光の増強が認められた。硝子体注射されたＧＰＵ−３２７は脈絡膜や視神経等の眼球の深層部分まで到達することが明らかとなった。
【０１０８】
［実験例８］
（ＧＰＵ−３２７の未熟児網膜症マウスモデルへの適用）
ＧＰＵ−３２７を未熟児網膜症マウスモデルに適用した。未熟児網膜症マウスモデルとは、まだ網膜血管が完成していない生後７日目の幼弱マウスを酸素濃度７５％の条件下で生後１２日目まで飼育することにより網膜血管の成長が停止し、生後１２日目以降に再度常酸素条件下に戻すことにより、相対的虚血が起こり、その後網膜新生血管を認めるモデルである。
【０１０９】
ＧＰＵ−３２７の最適濃度を検討するために、生後１２日目に常酸素条件下に戻してから６時間後の未熟児網膜症マウスモデルに、０．８３２、１．６６４、３．３２８μｇ／ｇ体重のＧＰＵ−３２７を尾静脈注射した。０．８３２μｇ／ｇ体重の投与量は、ヒトの蛍光眼底造影方法におけるＩＣＧの投与量である、２５ｍｇ／６０ｋｇ体重の２倍量に相当する。同様に、１．６６４及び３．３２８μｇ／ｇ体重の投与量は、それぞれ、ヒトの蛍光眼底造影方法におけるＩＣＧの投与量の４倍量及び８倍量に相当する。
【０１１０】
ＧＰＵ−３２７の投与から１時間後に、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ−２」、コーワ社）を用いて眼におけるＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。
【０１１１】
図７（ａ）は、蛍光観察の結果を示す写真である。その結果、ＧＰＵ−３２７の投与量依存的に蛍光強度の上昇が認められた。
【０１１２】
また、生後１２日目に常酸素条件下に戻してから２時間後、６時間後、１日後及び５日後の未熟児網膜症マウスモデルに、１．６６４μｇ／ｇ体重のＧＰＵ−３２７を尾静脈注射し、経時変化を観察した（ｎ＝６）。ＧＰＵ−３２７の投与から１時間後に、眼底レンズ（型式「２８Ｄ」、ｖｏｌｋ社）及びヒト用の眼底カメラ（型式「ＲＣ−２」、コーワ社）を用いて眼におけるＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。対照として、生後１２日目の通常のマウスに１．６６４μｇ／ｇ体重のＧＰＵ−３２７を尾静脈注射したマウスの眼におけるＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。
【０１１３】
図７（ｂ）は、蛍光観察の結果を示す写真である。図７（ｃ）は、図７（ｂ）において検出された蛍光強度をグラフにしたものである。図７（ｃ）中の「＊」は、危険率１％未満で有意差があることを示す。
【０１１４】
その結果、常酸素条件下に戻してから２時間後及び６時間後の未熟児網膜症マウスモデルにおいて、強い蛍光が観察された。
【０１１５】
以上の結果から、ＧＰＵ−３２７により、未熟児網膜症マウスモデルの眼における低酸素領域を正確に検出できることが示された。
【０１１６】
［実験例９］
（ＧＰＵ−３２７の網膜静脈閉塞ウサギモデルへの適用）
未熟児網膜症マウスモデルでは、網膜全体が低酸素状態になるため、網膜内の局所的な低酸素領域の検出には向いていない可能性が考えられた。そこで、ＧＰＵ−３２７を網膜静脈閉塞ウサギモデルに適用し、低酸素領域を正確に検出できるか否かを検討した。
【０１１７】
より具体的には、カバーガラスの代わりにコンタクトレンズ（商品名「ｔｒａｎｓｅｑｕａｔｏｒ  ｌｅｎｓ」、ｖｏｌｋ社）を使用し、レーザースポットのサイズを約１２５μｍとし、レーザーパワーを１５０〜３００ｍＷとし、レーザーパルスの間隔を０．５秒間とし、１個の主要な静脈のみを閉塞させた点以外は、上述した網膜動脈閉塞マウスモデルと同様にして網膜静脈閉塞ウサギモデルを作製した。
【０１１８】
網膜静脈閉塞ウサギモデル作製の直後に、硝子体注射により０．２μｇ／μＬの濃度のＧＰＵ−３２７を５０μＬ投与した。続いて、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影し、また、眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した。
【０１１９】
図８（ａ）、図８（ｂ）及び図８（ｃ）は、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いて眼底を撮影した写真である。また、図８（ｄ）、図８（ｅ）及び図８（ｆ）は、網膜静脈閉塞から２日後、１週間後及び２週間後に眼底カメラを用いてインビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を観察した結果を示す写真である。
【０１２０】
レーザー照射直後に網膜静脈の怒張が生じ、また図８（ａ）に示すように、ヒトの網膜静脈閉塞症と同様に網膜静脈閉塞から２日後に軽度の網膜出血が認められたことから、モデル作製が成功したものと考えられた。また、図８（ｂ）に示すように、網膜静脈閉塞から１週間後に、視神経の周囲におけるレーザーを照射した側の網膜の白色化が認められた。ＧＰＵ−３２７の蛍光の増加は、眼のレーザー照射した側のみで観察され、ＧＰＵ−３２７の蛍光は、網膜静脈閉塞から２週間後まで観察可能であった。また、硝子体腔では、ＧＰＵ−３２７の蛍光の増加は観察されなかった。ウサギでは、ヒトと異なり大半の網膜が脈絡膜血流から還流されており、視神経乳頭周囲の一部の網膜のみが網膜血流から還流されている。今回の網膜静脈を閉塞されたモデルにおいても、脈絡膜血流還流領域は低酸素になっておらず、ＧＰＵ−３２７の蛍光の増加も認められていない。ＧＰＵ−３２７の蛍光の増加は、網膜動脈からの還流の領域でのみ認められた。
【０１２１】
以上の結果は、ＧＰＵ−３２７が十分な低酸素領域の検出性能を有していることを示す。また、ＧＰＵ−３２７は、網膜に取り込まれた後に蛍光を発する形態に変化することが示された。
【０１２２】
［実験例１０］
（網膜静脈閉塞ウサギモデルの蛍光眼底造影）
フルオレセインを用いて、実験例９の網膜静脈閉塞から２週間後の網膜静脈閉塞ウサギモデルの蛍光眼底造影を行った。図９は、蛍光眼底造影の結果を示す写真である。その結果、新生血管、蛍光の漏れ、及び無血管野が観察された。
【０１２３】
［実験例１１］
（網膜静脈閉塞ウサギモデルの網膜の低酸素領域の検出におけるＧＰＵ−３２７とピモニダゾールとの比較）
実験例９の網膜静脈閉塞から２日後の網膜静脈閉塞ウサギモデルの眼における低酸素領域をＧＰＵ−３２７及びピモニダゾールで染色して比較した。
【０１２４】
ピモニダゾールによる染色は次のようにして行った。まず、と殺の９０分前のウサギに、４００μＭのピモニダゾール塩酸塩（ミリポア社）５０μＬ（６０ｍｇ／ｋｇ体重）を硝子体注射した。続いて、ウサギをと殺後、眼球を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、ブロッキング溶液で５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗ピモニダゾール抗体を用いて、眼球のホールマウントを室温で１時間染色した。また、ＴＲＩＴＣ標識イソレクチンＢ４を用いて対比染色も行った。
【０１２５】
図１０（ａ）は、インビボでＧＰＵ−３２７の蛍光を検出した写真である。図１０（ｂ）は図１０（ａ）で観察した眼の眼底を撮影した写真である。図１０（ｃ）は、図１０（ａ）で観察した眼の網膜の血管構造を、イソレクチンＢ４を用いた染色によりインビトロで観察した結果を示す蛍光像の写真である。図１０（ｄ）は、図１０（ｃ）と同一のサンプルにおける、ピモニダゾールによる染色の結果を示す蛍光像の写真である。図１０（ｅ）は、図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）の蛍光像を統合した写真である。図１０（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）における矢印は、網膜静脈の閉塞部位を示す。
【０１２６】
図１０（ａ）に示すように、ＧＰＵ−３２７の蛍光は、網膜静脈閉塞部位の周辺のみではなく、より広い範囲で観察された。これに対し、図１０（ｄ）に示すように、ピモニダゾールによる染色では、網膜静脈閉塞部位の周辺のみが染色された。
【０１２７】
ピモニダゾールは、酸素濃度１％程度の低酸素領域を検出できるといわれている。酸素濃度５％においてＧＰＵ−３２７の蛍光が有意に上昇した実験例２の結果と合わせて解釈すると、本実験例の結果は、ＧＰＵ−３２７が、ピモニダゾールよりも軽度の低酸素領域を検出可能であることを示す。
【０１２８】
［実験例１２］
（ＧＰＵ−３２７の安全性の検討）
ウサギの眼に、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）又はＧＰＵ−３２７を投与して、網膜電図の測定及び網膜病理学的評価を行い、ＧＰＵ−３２７の安全性を検討した。
【０１２９】
まず、ＰＢＳ又はＧＰＵ−３２７の投与前に、瞳孔を拡張させ、全身麻酔及び局所麻酔を行った状態で少なくとも１時間の暗順応を行い、暗室にてウサギの網膜電図を測定した。網膜電図の測定は、次のようにして行った。まず、白色光発光ダイオード内蔵コンタクトレンズ電極（型式「ＬＷ−１０２」、メイヨー社）を両眼の角膜に装着し、接地電極を耳に取り付けた。続いて、網膜電図測定装置（型式「ＬＥ−３０００」、トーメー社）を使用して、両眼の網膜電図を同時に測定した。周波数バンドは０．３〜３００Ｈｚに設定した。刺激輝度は３６０、３０００及び２００００ｃｄ／ｍ２に設定し、持続時間は１ミリ秒に設定した。網膜電図の測定は、少なくとも１時間の暗順応の後に、最も弱い刺激から始めた。バックグラウンド光は使用しなかった。各光強度において、４回の刺激を行い、平均値を算出した。
【０１３０】
その結果、ＰＢＳ又はＧＰＵ−３２７の投与前の網膜電図における振幅と潜時には、ウサギの右眼及び左眼で有意な差は認められなかった。
【０１３１】
続いて、ＰＢＳ又はＧＰＵ−３２７を、硝子体注射によりウサギの片方の眼のみに投与した。ＰＢＳの投与量は５０μＬとした。また、ＧＰＵ−３２７の投与量は０．２μｇ／μＬの溶液を５０μＬとした。もう片方の眼には何も投与せず、対照とした。
【０１３２】
ＰＢＳ又はＧＰＵ−３２７の投与から６０日後に、上記と同様にして網膜電図を測定し、ウサギの右眼及び左眼（ＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ−３２７投与対対照）について振幅及び潜時を算出した。また、ＰＢＳ及びＧＰＵ−３２７の硝子体投与による影響の関連性を調べるために、独立ｔ検定（Ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）を行った。
【０１３３】
図１１（ａ）はＰＢＳ又はＧＰＵ−３２７の投与から６０日後の網膜電図を示すグラフである。その結果、ＰＢＳ投与群、ＧＰＵ−３２７投与群共に、ａ波及びｂ波等の正常な網膜電図のパターンが観察された。また、図１１（ｂ）は、各刺激輝度において測定されたａ波について、ＰＢＳ投与対対照、又はＧＰＵ−３２７投与対対照の比を示すグラフである。また、図１１（ｃ）は、各刺激輝度において測定されたｂ波について、左眼の振幅に対する右眼の振幅の比を示すグラフである。ＰＢＳ投与群とＧＰＵ−３２７投与群との間で網膜電図に有意な差は認められなかった。
【０１３４】
続いて、光学顕微鏡を用いて、ＰＢＳ投与群とＧＰＵ−３２７投与群の眼の網膜病理学的評価を行った。図１１（ｄ）はＧＰＵ−３２７投与群の眼の光学顕微鏡写真であり、図１１（ｅ）はＰＢＳ投与群の眼の光学顕微鏡写真である。
【０１３５】
その結果、いずれの群においても視細胞層の萎縮等の異常は認められず、また、網膜、色素上皮層、視神経の炎症も認められなかった。
【０１３６】
以上の結果から、ＧＰＵ−３２７が安全であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明により、インビボで眼の低酸素領域を直接検出することが可能な診断薬を提供することができる。また、低酸素関連眼疾患の診断と治療を同時に実施することが可能な治療用組成物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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