(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中のＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体を合わせて検出する方法であって、
（ａ）以下の試薬：
（ｉ）ビオチンに結合することができる固相であって、該固相は、該固相に結合する、ビオチン化された抗−ＨＣＶ抗体及び第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原を含み、
第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原は、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５及び配列番号１０６から選択されるアミノ酸配列を含む、固相、及び
（ｉｉ）第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原によって捕捉された抗−ＨＣＶ抗体に結合する、第１の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原、
を同時に提供することと、
（ｂ）
（ｉ）ビオチン化された抗−ＨＣＶ抗体が、試験サンプル中に存在するＨＣＶ抗原に特異的に結合し、前記固相の上に捕捉された、ビオチン化された抗−ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体を生成し、
（ｉｉ）第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原が、前記試験サンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合し、前記固相の上に捕捉された第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成し、及び
（ｉｉｉ）第１の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原が、前記固相の上に捕捉された第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合する、
条件下で工程（ａ）の該試薬をインキュベートすることと、
（ｃ）捕捉された抗−ＨＣＶ抗体および捕捉されたＨＣＶ抗原を含む固相を、未反応の試験サンプルおよび試薬から、単離することと、
（ｄ）該単離された固相と、抗−ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体中のＨＣＶ抗原に結合する検出可能に標識された複合抗体とを接触させることと、
（ｅ）
（ｉ）検出可能に標識された複合抗体から発生した第１のシグナルであって、第１のシグナルの存在が試験サンプル中のＨＣＶ抗原の存在を示す、第１のシグナル及び
（ｉｉ）第１の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原から発生した第２のシグナルであって、第２のシグナルの存在が試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を示す、第２のシグナル、を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）がさらに、
（ｉｉｉ）第１のビオチン化されたＨＣＶ抗原とは別個である、固相に結合した第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原であり、試験サンプル中に存在する第２の抗−ＨＣＶ抗体に結合する、第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原及び
（ｉｖ）第２の抗−ＨＣＶ抗体に結合するための第２の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原、
を提供することを含み、
工程（ｂ）がさらに、
（ｉｖ）第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原が、前記固相に結合し、前記試験サンプル中に存在する第２の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合し、前記固相の上に捕捉された第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原−第２の抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成し、及び
（ｖ）第２の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原が、前記固相の上に捕捉された第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原−第２の抗−ＨＣＶ抗体複合体中の第２の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合することを含み、及び
工程（ｅ）がさらに、
第２の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原から発生した第３のシグナルであって、第３のシグナルの存在が、試験サンプル中の第２の抗−ＨＣＶ抗体の存在を示す、第３のシグナル、を検出すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）が、さらに、
（ｖ）第１及び第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原とは別個である、固相に結合する第３のビオチン化されたＨＣＶ抗原であり、試験サンプル中に存在する第３の抗−ＨＣＶ抗体に結合する、第３のビオチン化されたＨＣＶ抗原及び
（ｖｉ）第３の抗−ＨＣＶ抗体に結合するための第３の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原、
を提供すること含み、
工程（ｂ）がさらに、
（ｖｉ）第３のビオチン化されたＨＣＶ抗原が、前記固相に結合し、前記試験サンプル中に存在する第３の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合し、前記固相の上に捕捉された第３のビオチン化されたＨＣＶ抗原−第３の抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成し、及び
（ｖｉｉ）第３の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原が、前記固相の上に捕捉された第３のビオチン化されたＨＣＶ抗原−第３の抗−ＨＣＶ抗体複合体中の第３の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合することを含み、及び
工程（ｅ）がさらに、
第３の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原から発生した第４のシグナルを検出することを含み、第４のシグナルの存在が、試験サンプル中の第３の抗−ＨＣＶ抗体の存在を示す、第４のシグナルの検出、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
試験サンプル中のＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体を両方とも同時に検出するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）試験サンプルを、
（ａ）配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５又は配列番号１０６から選択されるアミノ酸配列を含む第１の捕捉抗原、及び
第１のＨＣＶタンパク質のペプチド配列と、第１の検出可能な標識を含む、第１の検出抗原、
（ｂ）第１のＨＣＶタンパク質と異なる第２のＨＣＶタンパク質のペプチド配列を含む第２の捕捉抗原、及び
第２のＨＣＶタンパク質のペプチド配列と、第２の検出可能な標識を含む、第２の検出抗原、
（ｃ）第１及び第２のＨＣＶタンパク質と異なる第３のＨＣＶタンパク質のペプチド配列を含む第３の捕捉抗原、及び
第３のＨＣＶタンパク質のペプチド配列と、第３の検出可能な標識を含む、第３の検出抗原、
（ｄ）第１の捕捉抗体、及び第４の検出可能な標識を含む複合抗体
と接触させ、
ここで、第１の捕捉抗体及び複合抗体は、試験サンプル中の第１、第２及び第３のＨＣＶタンパク質と異なる第４のＨＣＶタンパク質に特異的に結合し、それにより、
（１）前記試験サンプル中に存在する前記第１の捕捉抗原、第１の検出抗原および第１の抗−ＨＣＶ抗体を含む、第１のサンドイッチ複合体が生成され、
（２）前記試験サンプル中に存在する前記第２の捕捉抗原、第２の検出抗原および第２の抗−ＨＣＶ抗体を含む、第２のサンドイッチ複合体が生成され、
（３）前記試験サンプル中に存在する前記第３の捕捉抗原、第３の検出抗原および第３の抗−ＨＣＶ抗体を含む、第３のサンドイッチ複合体が生成され、及び
（４）前記試験サンプル中に存在する前記捕捉抗体、前記複合抗体および第４のＨＣＶ抗原を含む、サンドイッチ複合体が生成され、及び
（ｉｉ）前記第１、第２、第３及び第４のサンドイッチ複合体の生成の結果として、前記第１、第２、第３及び第４の検出可能な標識から発生する第１、第２、第３及び第４のシグナルを測定し、
これによって、前記試験サンプル中に存在する第１、第２及び第３の抗−ＨＣＶ抗体および第４のＨＣＶ抗原を同時に検出する方法。
【請求項５】
（ｉ）第１、第２、第３および第４のＨＣＶタンパク質は、それぞれ、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５及びその部分から選択され、
（ｉｉ）第１の捕捉抗体は、２又は３個の異なる抗体を含み、及び／又は
（ｉｉｉ）捕捉抗原及び捕捉抗体は、固相に固定される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１の検出抗原が、寄託番号Ｍ６２３２１でＧｅｎＢａｎｋに寄託されたアミノ酸配列からの、アミノ酸３４、４８および１１５から１２１の欠失を含むコアペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第４のＨＣＶタンパク質が、コア抗原である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）第１の検出抗原は、寄託番号Ｍ６２３２１でＧｅｎＢａｎｋに寄託されたアミノ酸配列からの、アミノ酸３４、４８および１１５から１２１の欠失を含む、アクリジン化されたコアペプチドであり、
（ｉｉ）第２の捕捉抗原は、ビオチン化されたＮＳ３組換え抗原であり、前記第２の検出抗原は、アクリジン化されたＮＳ３組換え抗原であり、
（ｉｉｉ）第３の捕捉抗原は、ビオチン化されたＮＳ４ペプチドであり、前記第３の検出抗原は、アクリジン化されたＮＳ４ペプチドであり、
（ｉｖ）捕捉抗体は、ビオチン化されたＣ１１−７モノクローナル抗体であり、及び／又は
（ｖ）検出複合抗体は、Ｃ１１−９抗体又はＣ１１−１４抗体を含む、
請求項４に記載の方法。
【請求項９】
試験サンプル中のＨＣＶ抗原および抗体を同時に検出するためのキットであって、
（ａ）捕捉抗原と、第１のＨＣＶタンパク質に対する第１の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための検出可能に標識されている検出抗原の第１の対であって、捕捉抗原は、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５又は配列番号１０６から選択されるアミノ酸配列を含む、第１の対、
（ｂ）捕捉抗原と、第１のＨＣＶタンパク質と異なる第２のＨＣＶタンパク質に対する第２の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための検出可能に標識されている検出抗原の、第２の対、
（ｃ）捕捉抗原と、第１及び第２のＨＣＶタンパク質と異なる第３のＨＣＶタンパク質に対する第３の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための検出可能に標識されている検出抗原の、第３の対、及び
（ｄ）捕捉抗体と、第１、第２及び第３のＨＣＶタンパク質と異なる第４のＨＣＶタンパク質を検出するための検出可能に標識されている複合抗体の、第４の対、
を含むキット。
【請求項１０】
前記捕捉抗原および前記捕捉抗体は、固体支持体に結合する、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８５，１２４号および２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７８８，１３６号の優先権の利益を主張するＰＣＴ出願として出願される。上述の出願の完全な内容が、全体的に本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般的に、ＨＣＶ感染の検出および診断のためのイムノアッセイに関する。さらに具体的には、本発明は、試験サンプル中のＨＣＶ抗原および抗−ＨＣＶ抗体を同時に検出するための組み合わせイムノアッセイ、試薬およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＷＨＯ統計によれば、世界で１億７千万人程度がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している（肝臓のウイルス感染）。ＨＣＶに感染したヒトの７５％から８５％が、慢性感染に進行し、これらの症例の約２０％が、感染から２０年後の肝硬変または肝細胞癌を含め、慢性Ｃ型肝炎の合併症を発症する。ＨＣＶ感染について現在推奨されている処置は、インターフェロンとリバビリン薬の組み合わせであるが、この処置は、すべての症例に有効ではなく、Ｃ型肝炎に関連する末期段階の肝疾患には、肝臓移植が適応となる。現在、ＨＣＶ感染を予防するために利用可能なワクチンは存在せず、従って、感染を避けるためにあらゆる警戒をしなければならない。
【０００４】
従って、患者のケアおよび血液または血液産物による、または密接な個人的な接触によるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の伝染予防は、感度の高い検出アッセイを用いた極度の警戒を必要とする。これにより、ＨＣＶおよびＨＣＶが混入した血液または血液産物の担体をスクリーニングし、同定するための特定の方法の必要性が生じる。ＨＣＶ曝露の血清学的な決定は、ヒトの血漿または血清に存在するＨＣＶの検出に依存している。このことは、ウイルスによってコードされる別個の構造的タンパク質または非構造的タンパク質の検出によって、またはＨＣＶに対する抗体の検出によって達成することができる。
【０００５】
ＨＣＶ病原体への曝露の後、初期は、ウイルスが存在する証拠は存在しない（即ち、検出可能なウイルスＲＮＡまたは血清学的マーカーが存在しない。）。これは、「ウインドウピリオド」（ＷＰ）と呼ばれる。一般的に、ＨＣＶに曝露してから１０日後、ウイルスＲＮＡを検出することができ、一方、抗−ＨＣＶ抗体は、約７０日後に検出可能になる（Ｂｕｓｃｈ  Ｍ  Ｐ  ａｎｄ  Ｄｏｄｄ  Ｒ  Ｙ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０（１０）：１１５７−１１６０，２０００）。ＨＣＶ感染の広がりを予防するには、検出ウインドウを狭めるように設計された信頼性の高い血液スクリーニング試験を有することがさらに重要である。
【０００６】
患者の血清または血漿中のＨＣＶポリペプチドに対するＨＣＶコア抗原または抗体の存在を検出するための、血液の血清学的スクリーニングに基づくＨＣＶ感染を検出するための多くの方法が存在する。ＨＣＶコア抗原アッセイの検出を目的とするこのアッセイは、抗体スクリーニングアッセイに基づくＨＣＶスクリーニングよりも４０日から５０日速くＨＣＶ感染を検出することが示された。ＨＣＶコアタンパク質は、ポリタンパク質の最初の１９１アミノ酸を含み、ゲノムＲＮＡをキャプシド生成する内部ウイルスコートを生成するＨＣＶの構造的タンパク質である。血清中のＨＣＶコア抗原を検出可能な、２つの異なる種類の血清学的アッセイが開発されている。一方のアッセイフォーマットは、セロコンバージョン前の被検体のＨＣＶコア抗原を検出し、血液ドナーのスクリーニングに利用され、一方、他方のアッセイフォーマットは、ＨＣＶ抗体の状態にかかわらず、Ｃ型肝炎患者でのみコア抗原を検出し、ＨＣＶへの曝露を診断し、または抗ウイルス治療を監視するための臨床実験で利用される。
【０００７】
しかし、典型的には、ＨＣＶコア抗原の血液スクリーニングアッセイは、セロコンバージョン前の段階または初期のセロコンバージョン後の段階でのみコア抗原を検出する。さらに、ＨＣＶコア抗原アッセイは、後期セロコンバージョン段階で抗原が抗−コア抗体と免疫複合体を生成するときは、コア抗原を検出することができない。これにより、セロコンバージョン前の段階でＨＣＶコア抗体を検出することができ、セロコンバージョン段階で抗−ＨＣＶ抗体を検出することができ、ＷＰを顕著に狭める血清学アッセイの必要性が生じる。
【０００８】
このような組み合わせＨＣＶスクリーニングアッセイの有用性は、このようなアッセイが、ＷＰを狭めるという点で現行の血清学的血液スクリーニング方法よりも顕著に向上するため、顕著である。しかし、首尾良い抗原抗体組み合わせアッセイのための課題の１つは、このようなアッセイを行うための適切な抗原および抗体を選択することである。本発明は、この需要に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｕｓｃｈ  Ｍ  Ｐ  ａｎｄ  Ｄｏｄｄ  Ｒ  Ｙ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ４０（１０）：１１５７−１１６０，２０００
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、一般的に、試験サンプル中のＨＣＶ抗原および抗−ＨＣＶ抗体を同時に検出するための組み合わせイムノアッセイ、試薬およびキットに関する。さらに具体的には、本発明は、試験サンプル中のＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体を合わせて検出するためのイムノアッセイであって、
（ａ）以下の試薬：
（ｉ）ビオチンに結合することができる固相、
（ｉｉ）試験サンプル中に存在するＨＣＶ抗原を捕捉するためのビオチン化された抗−ＨＣＶ抗体、
（ｉｉｉ）試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体を捕捉するためのビオチン化されたＨＣＶ抗原、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）のビオチン化されたＨＣＶ抗原によって捕捉される抗−ＨＣＶ抗体に結合するための検出可能に標識されたＨＣＶ抗原
を同時に提供することと、
（ｂ）
（ｉ）（ａ）の（ｉｉ）のビオチン化された抗−ＨＣＶ抗体が、ビオチンを介して固相に結合し、試験サンプル中に存在するＨＣＶ抗原に特異的に結合し、固相の上に捕捉された抗−ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体を生成し、
（ｉｉ）（ａ）の（ｉｉｉ）のビオチン化された抗原が、ビオチンを介して固相に結合し、試験サンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合し、固相の上に捕捉されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成し、（ａ）の（ｉｖ）の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原が、固相の上に捕捉されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体中の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合する、反応混合物を生成する条件下で工程（ａ）の試薬をインキュベートすることと、
（ｃ）固相に結合した捕捉された抗体および捕捉されたＨＣＶ抗原を含む固相を、未反応の試験サンプルおよび試薬から、単離することと、
（ｄ）単離された固相と、（ｂ）の（ｉｉ）の抗−ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体中に捕捉されたＨＣＶ抗原に結合する検出可能に標識された複合抗体とを接触させることと、
（ｅ）検出可能な標識部分から発生したシグナルが引き金となると、シグナルを検出することと
を含み、シグナルの存在は、試験サンプル中のＨＣＶの存在を示す、イムノアッセイを記述する。
【００１１】
例示的な実施形態では、このイムノアッセイは、
（ａ）
（ｖ）工程（ａ）の（ｉｉｉ）のＨＣＶ抗原とは別個である、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体を捕捉するための第２のビオチン化されたＨＣＶ抗原、および
（ｖｉ）（ｖ）のビオチン化されたＨＣＶ抗原によって捕捉された抗−ＨＣＶ抗体に結合するための検出可能に標識されたＨＣＶ抗原
を提供することと、
（ｂ）（ｉｉｉ）（ａ）の（ｖ）のビオチン化された抗原が、ビオチンを介して固相に結合し、試験サンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合し、固相の上に捕捉されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成し、（ａ）の（ｖｉ）の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原が、固相の上に捕捉されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体中の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合することと
をさらに含んでいてもよい。
【００１２】
このようなイムノアッセイは、
（ａ）
（ｖｉｉ）工程１の（ａ）の（ｉｉｉ）または工程２の（ａ）の（ｖ）のＨＣＶ抗原とは別個である、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体を捕捉するための第３の（または複数のさらなる）ビオチン化されたＨＣＶ抗原、および
（ｖｉｉｉ）（ｖｉｉ）のビオチン化されたＨＣＶ抗原によって捕捉された抗−ＨＣＶ抗体に結合するための検出可能に標識されたＨＣＶ抗原
を提供することと、
（ｂ）（ｉｖ）（ａ）の（ｖｉｉ）のビオチン化された抗原が、ビオチンを介して固相に結合し、試験サンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合し、固相の上に捕捉されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成し、（ａ）の（ｖｉｉｉ）の検出可能に標識されたＨＣＶ抗原が、固相の上に捕捉されたＨＣＶ抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体中の抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合することと
によって、第３のＨＣＶ抗原または複数のさらなるＨＣＶ抗原も検出してもよい。
【００１３】
本発明の別の態様は、試験サンプル中のＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体を両方とも同時に検出するためのイムノアッセイであって、この組み合わせアッセイは、
（ａ）第１のＨＣＶタンパク質のペプチド配列を含む第１の捕捉抗原、
（ｂ）第１のＨＣＶタンパク質のペプチド配列を含み、さらに、検出可能な標識を含む、第１の検出抗原、
（ｃ）第２のＨＣＶタンパク質に由来する抗原性配列を含む第２の捕捉抗原、
（ｄ）第２のＨＣＶタンパク質に由来する抗原性配列を含み、検出可能な標識をさらに含む、第２の検出抗原、
（ｅ）第３のＨＣＶタンパク質に由来する抗原性配列を含む第３の捕捉抗原、
（ｆ）第３のＨＣＶタンパク質に由来する抗原性配列を含み、検出可能な標識をさらに含む、第３の検出抗原、
（ｇ）第１の捕捉抗体、
（ｈ）検出可能な標識を含む複合抗体
を含み、
捕捉抗体および複合抗体は、試験サンプルに由来する第４のＨＣＶタンパク質に特異的に結合し、組み合わせアッセイは、
（ｉ）
（ａ）試験サンプル中に存在する第１の捕捉抗原および検出抗原および第１の抗−ＨＣＶ抗体のサンドイッチ複合体の生成、
（ｂ）試験サンプル中に存在する第２のＨＣＶタンパク質に対し、第２の捕捉抗原および第２の検出抗原および抗−ＨＣＶ抗体のサンドイッチ複合体の生成、
（ｃ）試験サンプル中に存在する第３のＨＣＶタンパク質に対し、第３の捕捉抗原および第３の検出抗原および抗−ＨＣＶ抗体のサンドイッチ複合体の生成、および
（ｄ）サンプル中に存在する捕捉抗体、複合抗体およびＨＣＶ抗原の複合体の生成
を可能とする条件で、試験サンプルと、捕捉抗原、検出抗原、捕捉抗体および複合抗体とを接触させることと、
（ｉｉ）複合体の生成の結果として、検出可能な標識から発生するシグナルを測定し、これによって、サンプル中に存在するＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体を同時に検出することと
によって行われる、イムノアッセイを記載する。
【００１４】
上にまとめたいずれかのイムノアッセイにおいて、第１、第２、第３および第４のＨＣＶタンパク質は、独立して、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５、またはコア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５のいずれか１つの別個の独立した部分からなる群から選択される。
【００１５】
特定の実施形態では、第１、第２、第３および第４のＨＣＶタンパク質の２つ以上が、独立して、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５からなる群から選択される同じタンパク質の異なる部分から選択される。
【００１６】
具体的な好ましい実施形態では、本発明のイムノアッセイにおいて、第１のＨＣＶタンパク質は、試験サンプル中に存在する抗−コア抗体を検出するために設計されたコア抗原である。さらに具体的には、抗−コア抗体を捕捉するための捕捉抗原は、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含むコアペプチドである。ある実施形態では、抗−コア抗体を検出するための検出抗原も、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含むコアペプチドである。特定の実施形態では、組み合わせイムノアッセイは、試験サンプル中のコア抗原および抗−コア抗体の両方を検出するように設計される。このような検出は、捕捉抗原および検出抗原として上にまとめられたコア欠失抗原の使用によって容易になる。従って、上に概説したイムノアッセイにおいて、第１の抗原および第４のタンパク質の両方は、それぞれ、コアに関連するタンパク質であり、つまり、第１の抗原は、試験アッセイで供給され、第４のタンパク質は、サンプル中のＨＣＶの存在の結果として試験サンプル中に存在する。
【００１７】
試験サンプルに由来する抗原の捕捉を使用する特定の実施形態では、イムノアッセイは、複数の抗体を使用してもよく、複数の抗原は、それぞれ、同じＨＣＶ抗原の別個のエピトープに指向する（例えば、コア抗原を捕捉するための２つの別個の捕捉抗体として、コアの脂質結合領域に指向する抗体およびコアのＤＮＡ結合領域に指向する抗体）。
【００１８】
本発明のイムノアッセイは、捕捉抗体および複合抗体の第２の対を提供することをさらに含み、第２の捕捉／複合抗体の対が、上にまとめられたイムノアッセイの第１の捕捉／複合抗体の対と同じＨＣＶタンパク質に特異的に結合するか、または異なるＨＣＶタンパク質に特異的に結合する。
【００１９】
特定の実施形態では、捕捉抗原および捕捉抗体は、固体支持体に結合する。
【００２０】
他の実施形態では、第１の捕捉抗原は、ビオチン化されたコアペプチドであり、第１の検出抗原は、アクリジン化されたコアペプチドであり、それぞれのビオチン化された抗原および検出抗原は、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含むコアペプチドである。
【００２１】
さらなる具体的な実施形態は、第２の捕捉抗原は、ビオチン化されたＮＳ３組み換え抗原であり、第２の検出抗原は、アクリジン化されたＮＳ３組み換え抗原である。他の具体的な実施形態では、第３の捕捉抗原は、ビオチン化されたＮＳ４ペプチドであり、第３の検出抗原は、アクリジン化されたＮＳ４ペプチドである。
【００２２】
特定の実施形態では、捕捉抗体は、ビオチン化されたＣ１１−７モノクローナル抗体である。
【００２３】
他の実施形態では、検出抗体複合体は、Ｃ１１−９およびＣ１１−１４またはこれらの組み合わせからなる群から選択される抗体を含む。
【００２４】
さらに、本明細書には、試験サンプルから複数のＨＣＶ要素を検出するためのイムノアッセイであって、
（ａ）ビオチンが結合する固相を提供することと、
（ｂ）固相と、
（ｉ）ビオチン化された第１の捕捉抗原、ビオチン化された第２の捕捉抗原、ビオチン化された第３の捕捉抗原および第４のＨＣＶ抗原に特異的なビオチン化された抗体、および
（ｉｉ）検出可能に標識された第１、第２、第３の検出抗原
を含む混合物とを、
（１）それぞれ第１、第２および第３のビオチン化された抗原と独立して免疫反応性であり、これらによって捕捉される試験サンプル中の抗体と、ビオチン化された抗体と免疫反応性であるサンプル中のＨＣＶタンパク質との間に生成する免疫複合体、および
（２）捕捉抗体およびそれぞれの第１、第２および第３の検出可能に標識された抗原との間に生成する免疫複合体
のために十分な条件および時間で接触させることと、
（ｃ）未反応の試験サンプルおよび試薬から、接続した検出可能に標識された捕捉された抗体および捕捉された第４のＨＣＶ抗原を含む固相を単離することと、
（ｄ）単離された固相と、捕捉された第４のＨＣＶ抗原に結合する検出可能に標識された複合抗体とを接触させることと、
（ｅ）検出可能な標識部分から発生したシグナルが引き金となると、シグナルを検出することと
を含み、シグナルの存在は、試験サンプル中のＨＣＶの存在を示す、イムノアッセイも記載される。
【００２５】
再び、このようなアッセイでは、第１、第２、第３および第４のＨＣＶタンパク質は、独立して、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５からなる群から選択される。さらに具体的には、ある特定の実施形態では、ＨＣＶコア抗原は、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含み、第２の抗原は、ＮＳ３抗原であり、第３の抗原は、ＮＳ４抗原であり、ビオチン化された抗体が、ＨＣＶコア抗原に対するものである。具体的な実施形態では、抗−コアモノクローナル抗体は、ＨＣＶコアの脂質結合ドメインに特異的な抗体である。これに代えて、またはこれに加えて、ＮＳ３抗原は、ヘリカーゼのそれぞれのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含むＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む組み換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原であり、この抗原は、Ｃ３３抗原と比較した場合、血清由来のＨＣＶ抗体に対する免疫反応性が高まっている。
【００２６】
さらに、本明細書には、試験サンプルから複数のＨＣＶ抗体を検出するためのイムノアッセイであって、
（ａ）ビオチンが結合する固相を提供することと、
（ｂ）固相と、
（ｉ）ビオチン化された第１の捕捉抗原、ビオチン化された第２の捕捉抗原、ビオチン化された第３の捕捉抗原、および
（ｉｉ）検出可能に標識された第１、第２および第３の検出抗原
を含む混合物とを、
（１）それぞれ第１、第２および第３のビオチン化された抗原と独立して免疫反応性であり、これらによって捕捉される試験サンプル中の抗体との間に生成する免疫複合体、および
（２）捕捉抗体およびそれぞれの第１、第２および第３の検出可能に標識された抗原との間に生成する免疫複合体
のために十分な条件および時間で接触させることと、
（ｃ）未反応の試験サンプルおよび試薬から、接続した検出可能に標識された捕捉された抗体を含む固相を単離することと、
（ｄ）検出可能な標識部分から発生したシグナルが引き金となると、シグナルを検出することと
を含み、シグナルの存在は、試験サンプル中のＨＣＶの存在を示す、イムノアッセイも想定される。再び、このようなイムノアッセイでは、第１、第２および第３のＨＣＶタンパク質が、独立して、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５からなる群から選択される。ある特定の例示的なアッセイでは、第１の抗原は、ＨＣＶコア抗原であり；第２の抗原は、ＮＳ３抗原であり；第３の抗原は、ＮＳ４抗原である。さらに具体的には、捕捉コア抗原は、必要ではないが、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含む抗原であってもよい。ＮＳ３抗原は、ＮＳ３から誘導される任意のＮＳ３抗原であってもよい。特定の実施形態では、ＮＳ３抗原は、ヘリカーゼのそれぞれのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含むＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む組み換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原であり、抗原は、Ｃ３３抗原と比較した場合、血清由来のＨＣＶ抗体に対する免疫反応性が高まっている。
【００２７】
本発明は、さらに、サンプル中のＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体を同時に検出するためのキットであって、
検出抗原が検出可能に標識されている、第１のＨＣＶタンパク質に対する第１の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための捕捉抗原および検出抗原の第１の対、
検出抗原が検出可能に標識されている、第２のＨＣＶタンパク質に対する第２の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための捕捉抗原および検出抗原の第２の対、
検出抗原が検出可能に標識されている、第３のＨＣＶタンパク質に対する第３の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための捕捉抗原および検出抗原の第３の対、
複合抗体が検出可能に標識されている、第４のＨＣＶタンパク質を検出するための捕捉抗体および複合抗体の第１の対
を含む、キットを含む。
【００２８】
このキットにおいて、第１、第２、第３および第４のＨＣＶタンパク質は、独立して、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５、またはコア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５のいずれか１つの別個の独立した部分からなる群から選択される。具体的には、キットは、独立して、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５からなる群から選択される同じタンパク質の異なる部分から選択される第１、第２、第３および第４のＨＣＶタンパク質の２つ以上を検出するように設計される。好ましいキットでは、第１のＨＣＶタンパク質は、コア抗原であり、好ましくは、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含むコアペプチドである。このキットは、抗−コア抗体検出抗原を含み、検出抗原中のコアペプチドは、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含む。キットは、サンプル中のコア抗原を検出してもよく、従って、有利には、抗−コア捕捉抗体および検出抗体を含んでいてもよい。このような捕捉抗体は、２つ以上の抗体を含んでいてもよい。
【００２９】
キットは、捕捉抗体および複合抗体の第２の対も含んでいてもよく、第２の捕捉／複合抗体の対が、第１の捕捉／複合抗体の対と同じＨＣＶタンパク質に特異的に結合するか、または異なるＨＣＶタンパク質に特異的に結合する。特定の実施形態では、捕捉抗原および捕捉抗体が固体支持体に結合する。
【００３０】
本発明の抗原を使用する任意のイムノアッセイは、自動化されたシステムまたは半自動化されたシステムで使用するように簡単に調整されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明のＨＣＶ  ＮＳ３組み換え抗原の位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、従来のイムノアッセイで行われるようなＨＣＶに対する両抗体を検出することによって、さらに、ＨＣＶに対する抗体が成長する前に、感染の初期段階での個人の血液中に存在し得るＨＣＶコア抗原を検出することによって、ＨＣＶへの曝露の検出を向上させたＨＣＶ組み合わせイムノアッセイを提供する。本発明は、１つのアッセイにおいて、サンプル中のＨＣＶ抗原および抗−ＨＣＶ抗体を両方とも同時に検出するための組み合わせイムノアッセイについて、当該技術分野の必要性を満たす。抗原／抗体組み合わせアッセイ方法は、ＨＣＶセロコンバージョンの初期段階中に存在する抗原性および免疫原性のＨＣＶ抗体および抗原の同定および使用に依存し、これによって、検出の正確さを高め、ウインドウピリオド中の間違った結果の発生を減らす。
【００３３】
本発明の組み合わせアッセイを用いてＨＣＶについて試験することができる生体サンプルとしては、ＨＣＶビリオン、抗原または抗体を含むおそれがある任意のサンプルが挙げられる。「サンプル」という用語は、本明細書で使用される場合、最も広い意味で使用される。「生体サンプル」は、本明細書で使用される場合、限定されないが、生きているものまたは以前生きていたものに由来する任意の量の物質を含む。このような生きているものとしては、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよび他の動物が挙げられる。このような物質としては、限定されないが、血液（例えば、全血液またはこの要素）、血漿、血清、尿、唾液、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単核細胞、他の細胞、臓器、組織、骨髄、リンパ節および脾臓が挙げられる。
【００３４】
組み合わせアッセイの抗−ＨＣＶ抗体の検出態様では、少なくとも１つの（即ち、１つ以上の）捕捉抗原が使用され、試験サンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体に結合し、従って、抗−ＨＣＶ抗体を捕捉する。捕捉抗原は、一般的に、ＨＣＶゲノムによってコードされるＨＣＶタンパク質から誘導される抗原性ペプチド（１つ以上のエピトープを含む。）である。全ＨＣＶゲノムの配列およびコードされたＨＣＶポリタンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋに示されており（それぞれ寄託番号Ｍ６２３２１およびＡＡＡ４５６７６）、当業者にとって利用可能である。使用可能なある例示的なコア抗原としては、コアタンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１から１２５）から誘導される抗原が挙げられる。さらに他の好ましいコア抗原は、コアタンパク質のアミノ酸残基１３４から１７１に位置するコアの脂質結合ドメインから誘導される（ＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧ）（配列番号８９）。しかし、本発明において、特に好ましいコア抗原としては、特定のモノクローナル抗体のための既知のエピトープ結合領域に特定の欠失または置換を含むコアタンパク質から誘導される抗原が挙げられ、この結果、ＨＣＶコア抗原検出に使用されるモノクローナル抗体は、これらの改変されたコア抗原を検出できない一方、試験サンプルからの完全なコア抗原を検出するだろう。従って、これらの新規の改変されたコア抗原で固相支持体をコーティングすることができ、および／またはヒト血清または血漿中に存在する捕捉抗体に溶液相で使用することができ、ＨＣＶのコア領域に指向するが、同時に、ＨＣＶコンボアッセイでコアＡｇの検出に使用される複合抗体による検出をせず、同時に、試験サンプル中にあると予想され、同じＨＣＶコンボアッセイフォーマットで同定される抗−コア抗体を検出することができる。本発明のアッセイで使用するのに好ましいコア抗原は、アミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含む変異コアタンパク質を含む。
【００３５】
本明細書に記載される新規コア捕捉抗原を用いることによって、本発明は、抗−コア抗体を捕捉するために使用される現在利用可能なコア抗原を、コア抗原の血清学的検出を行うように設計された検出抗体と反応させるため、ＨＣＶ組み合わせアッセイにおいてコア抗原を検出するために使用される現在利用可能な＊Ａｃ−ＤＢＡ−ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体を用いたときにみられる顕著な問題を克服する。以前、この問題をなくすために、５アミノ酸（Ｃ１１−９結合領域のアミノ酸３２、３３および３４およびコアのＣ１１−１４結合領域に由来するアミノ酸および残基４７および４８）の欠失によって、構築物が作られたが、これらの構築物は、これらの残基は、抗−コア陽性の患者において非常に免疫原性であるため、抗−コア抗体の検出は良くなかった。捕捉抗原として本明細書に記載されるコア抗原の使用は、＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体による検出をうまく避けることができるが、抗−コア反応性標本の検出を保持するか、または高めるより最低限の欠失を包含する設計であるため、この問題を克服する。本発明の組み合わせアッセイでは、抗−ＨＣＶコア抗体を捕捉し、検出するためのコア抗原は、有利には、検出コア抗原に対する捕捉抗体の結合をなくすのに十分なコアアミノ酸の欠失を含む（例えば、アミノ酸１１５から１２１が欠失している。）。
【００３６】
定義
本発明は、試験サンプル中のＨＣＶを検出するための試薬を提供する。好ましくは、この検出は、試験サンプル中のＨＣＶ抗原および抗−ＨＣＶ抗体を両方とも同時に検出することによって達成される。明細書全体で、特定の用語が頻繁に使用され、このため、以下の章は、これらの用語のさらなる定義を与える。「抗体」（Ａｂ）および「複数の抗体」（Ａｂｓ）という用語は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ（単数形）またはｍＡｂｓ（複数形））、ポリクローナル抗体（ｐＡｂｓ（複数形））、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（完全または部分的にヒト化されたもの；ヒト抗体の改変された可変領域を含み、可変領域の一部が、非ヒト配列の対応する配列によって置換されており、改変された可変領域が、ヒト抗体の定常領域の少なくとも一部に連結しているポリペプチド）、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、マウスなど）または非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジーなど）を含む動物抗体（例えば、限定されないが、鳥（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラおよび哺乳動物、組み換え抗体、キメラ抗体（ｃＡｂ；別の宿主種に由来する抗体定常領域の少なくとも一部に連結した、ある宿主種に由来する抗体の重鎖および軽鎖可変領域のすべてまたは一部を含むポリペプチド）、一本鎖抗体、一本鎖ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（「ｓｃＦｖ」）、ジスルフィド結合したＦｖフラグメント（「ｓｄＦｖ」）、ｄＡｂフラグメント、ダイアボディ、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）および抗−イディオタイプ（「抗−Ｉｄ」）抗体、二官能または二重ドメイン抗体（例えば、二重可変ドメイン抗体、またはＤＶＤ−ＩｇＧ）、ならびに上述のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメント（または抗原的に反応性のフラグメント）を指す。特に、抗体としては、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（または抗原的に反応性の）フラグメント、つまり、本明細書で（ｎ）にさらに記載されるような検体結合部位を含む分子および本明細書で（ａｃ）にさらに記載されるような改変体が挙げられる。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。バイオディスプレイを用いて調製されたコンビナトリー抗体ライブラリのスクリーニングを介し、アフィニティが増加または向上した抗体（即ち、ＫＤ、ｋｄまたはｋａ）は、「親和性が成熟した抗体」と呼ばれる。単純化するために、検体に対する抗体は、多くは、本明細書には「抗−検体抗体」または単に「検体抗体」と呼ばれる（例えば、抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗体）。
【００３７】
本発明では、アッセイの「要素」、「複数の要素」および「少なくとも１つの要素」は、一般的に、捕捉抗体、検出抗体または複合抗体、コントロール、キャリブレーター、一連のキャリブレーター、感受性パネル、容器、バッファー、希釈剤、塩、酵素、酵素の補因子、検出試薬、前処理試薬／溶液、基質（例えば、溶液として）、停止溶液などを指し、本明細書に記載される方法および当該技術分野で既知の他の方法に従って、試験サンプル（例えば、患者の尿、血清または血漿サンプル）のアッセイのためのキットに含まれていてもよい。従って、本開示の内容において、「少なくとも１つの要素」、「要素」および「複数の要素」は、本明細書に記載されるようなポリペプチドを含んでいてもよく、場合により固体支持体に固定されている。ある要素は、溶液であってもよく、アッセイに使用するために再構築するために凍結乾燥されていてもよい。
【００３８】
本発明のアッセイを行う際に、コントロールを使用することが有用であろう。「コントロール」は、抗−ＨＣＶ抗体を含まないことが知られている組成物（「ネガティブコントロール」）または抗−ＨＣＶ抗体を含むことが知られている組成物（「ポジティブコントロール」）を指す。ポジティブコントロールは、既知の濃度の抗−ＨＣＶ抗体を含んでいてもよい。「コントロール」、「ポジティブコントロール」および「キャリブレーター」は、既知の濃度の抗−ＨＣＶ抗体を含む組成物を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられてもよい。「ポジティブコントロール」を使用し、アッセイの性能特徴を確立することができ、ポジティブコントロールは、試薬（例えば、検体）の一体性の有用な指標である。
【００３９】
本発明のＮＳ３抗原は、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体を検出するための血清学アッセイに有用である。このような抗体が、本発明のＮＳ３抗原に含まれるエピトープを認識するためである。「エピトープ」、「複数のエピトープ」および「目的のエピトープ」は、認識され、特定の結合パートナーの相補性部位（例えば、抗体またはこの抗原的に反応性のフラグメント）に結合可能な任意の分子の部位（この場合には、本明細書に記載されるＮＳ３抗原）を指す。エピトープは、特定の結合パートナーの相補性部位に結合することが知られている抗原（またはこのフラグメント）の領域の正確なアミノ酸残基からなる。抗原性フラグメントは、１個より多いエピトープを含んでいてもよい。
【００４０】
本明細書に記載されるアッセイにおいて、アッセイのある要素または他の要素は、検出可能な標識を含んでいてもよい。「標識」および「検出可能な標識」という用語は、特定の結合パートナー（例えば、抗体または検体）に接続し、検出可能な特異的な結合対（例えば、抗体および検体）のメンバーと、特定の結合パートナー（例えば、抗体または検体）との反応を行う部分を意味し、このような標識されたものは、「検出可能に標識された」と呼ばれる。標識は、視覚によって、または装置手段によって検出可能なシグナルを生成することができる。種々の標識としては、シグナルを生成する基質、例えば、色原体、蛍光化合物、化学発光化合物、放射性化合物などが挙げられる。標識の代表例としては、光を生成する部分（例えば、アクリジニウム化合物）および蛍光を生成する部分（例えば、フルオロセイン）が挙げられる。他の標識が本明細書に記載される。この観点で、この部分自体が検出可能に標識されていなくてもよいが、さらなる別の部分と反応したときに検出可能になってもよい。「検出可能に標識された」の使用は、後者の種類の検出可能な標識を包含することを意図している。
【００４１】
「連結配列」は、目的の１つ以上のポリペプチド配列（例えば、全長、フラグメントなど）に接続した天然または人工のポリペプチド配列を指す。「接続した」という用語は、目的のポリペプチド配列に対する連結配列の接続を指す。このようなポリペプチド配列は、好ましくは、１つ以上のペプチド結合によって接続する。連結配列は、約４アミノ酸から約５０アミノ酸の長さを有していてもよい。好ましくは、連結配列の長さは、約６から約３０のアミノ酸である。天然の連結配列は、人工の連結配列を作成するためにアミノ酸の置換、付加または欠失によって改変されていてもよい。例示的な連結配列としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。（ｉ）ヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、例えば、６個のヒスチジン残基を含む６ｘＨｉｓタグは、目的のポリペプチドおよび抗体の単離および精製を容易にするための連結配列として有用である。（ｉｉ）Ｈｉｓタグのようなエンテロキナーゼ開裂部位は、目的のタンパク質および抗体の単離および精製に使用される。多くは、エンテロキナーゼ開裂部位は、目的のタンパク質および抗体の単離および精製において、Ｈｉｓタグとともに使用される。種々のエンテロキナーゼ開裂部位は、当該技術分野で公知である。（ｉｉｉ）種々雑多な配列を使用し、一本鎖可変領域フラグメントの軽鎖および／または重鎖可変領域に連結または接続することができる。他の連結配列の例は、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）に見いだすことができる。連結配列は、さらなる機能（例えば、薬物の接続または固体支持体への接続）のために改変することもできる。本開示の観点で、ｍＡｂは、例えば、連結配列（例えば、Ｈｉｓタグ、エンテロキナーゼ開裂部位、またはこの両方）を含んでいてもよい。
【００４２】
「患者」および「被検体」は、動物、例えば、鳥（例えば、アヒルまたはガチョウ）、サメ、クジラ、ならびに非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジーおよびヒト）を含む哺乳動物を指すために本明細書で相互に置き換え可能に使用されてもよい。好ましくは、患者または被検体は、ヒト、例えば、ＨＣＶ感染のリスクがあるヒト、またはＨＣＶに感染したヒトである。
【００４３】
本明細書に記載されるイムノアッセイの結果の分析では、カットオフレベルとして特定の検出レベルを含むことが有用であろう。「所定のカットオフ」および「所定のレベル」は、一般的に、所定のカットオフ／レベルに対してアッセイの結果を比較することによって診断／予後／治療効果を評価するために使用されるアッセイのカットオフ値を指し、所定のカットオフ／レベルは、種々の臨床パラメーターとすでにつながりがあるか、または関係がある（例えば、疾患の重篤度、進行／進行しないこと／向上など）。本開示は、例示的な所定のレベルを与えてもよいが、カットオフ値は、イムノアッセイの性質（例えば、使用される抗体など）によって変わってもよいことがよく知られている。さらに、本開示に基づく他のイムノアッセイのためのイムノアッセイに特異的なカットオフ値を得るために、他のイムノアッセイに本明細書の本開示を応用することは、十分に当業者の通常の知識内である。所定のカットオフ／レベルの正確な値は、アッセイ間で変動し得るが、本明細書に記載されるような相関関係を一般的に適用することができる。
【００４４】
以下に記載されるように、本発明のある実施形態では、試験サンプルの前処理を行うことが望ましい場合がある。「前処理試薬」、例えば、溶解、沈殿および／または可溶化の試薬は、本明細書に記載されるような診断アッセイで用いられる場合、試験サンプル中に存在する任意の細胞を溶解したものおよび／または任意の検体を可溶化したものである。本明細書にさらに記載されるように、前処理は、すべてのサンプルに必要なわけではない。他のものの中で、検体（即ち、抗−ＨＣＶ抗体）を可溶化することは、サンプル中に存在する任意の内因性結合タンパク質からの検体の放出を伴う。前処理試薬は、均一であってもよく（分離工程を必要としない。）、または不均一であってもよい（分離工程を必要とする。）。不均一な前処理試薬を使用するとき、アッセイの次の工程に進む前に、試験サンプルから、任意の沈殿した検体に結合するタンパク質の除去が存在する。前処理試薬は、場合により、（ａ）１つ以上の溶媒および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および洗剤、（ｃ）洗剤、（ｄ）洗剤および塩、または（ｅ）細胞溶解および／または検体の可溶化に適した任意の試薬または試薬の組み合わせを含んでいてもよい。
【００４５】
アッセイは、厳格な品質制御を受けてもよい。「品質制御試薬」は、本明細書に記載されるイムノアッセイおよびキットの観点で、限定されないが、キャリブレーター、コントロールおよび感受性パネルを含む。「キャリブレーター」または「標準」は、典型的には、検体（例えば、抗体または検体）の濃度の内挿のための較正（標準）曲線を確立するために使用される（例えば、１つ以上、例えば、複数で）。または、所定のポジティブ／ネガティブカットオフに近い１つのキャリブレーターを使用することができる。複数のキャリブレーター（即ち、１つより多いキャリブレーター、または種々の量のキャリブレーター）を、「感受性パネル」を含むように組み合わせて使用することができる。
【００４６】
「サンプル」、「試験サンプル」および「患者サンプル」という用語は、本明細書で相互に置き換え可能に使用されてもよい。サンプル、例えば、尿、血清、血漿、羊水、脳脊髄液、胎盤細胞または組織、内皮細胞、白血球または単核細胞のサンプルを、患者から得られたまま直接使用してもよく、または例えば、本明細書に記載される幾つかの様式、または当該技術分野で知られるような他の様式でサンプルの特徴を変えるために、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、妨害要素の不活性化、試薬の添加などによって前処理してもよい。好ましくは、サンプルは、尿、血清または血漿である。
【００４７】
あるアッセイでは、アッセイの較正を行うことが望ましいだろう。「一連の較正組成物」は、既知の濃度の抗−ＨＣＶ抗体を含む複数の組成物を指し、それぞれの組成物は、一連の他の組成物とは抗−ＨＣＶ抗体の濃度が異なる。
【００４８】
本明細書全体で、ＮＳ３抗原および／または他の試薬が、固体支持体または固相に結合してもよく、両方の用語は、相互に置き換え可能に使用されることを注記する。「固相」という用語は、不溶性の任意の材料を指すか、またはその後の反応によって不溶性になってもよい。固相は、捕捉剤を引きつけ、固定する固有の能力について選択することができる。または、固相は、捕捉剤を引きつけ、固定する能力を有する固定された連結剤を有していてもよい。連結剤は、例えば、捕捉剤自体または捕捉剤に接合した帯電した物質と反対に帯電した、帯電した物質を含んでいてもよい。一般的に、連結剤は、固相に固定（接続）され（好ましくは特異的に）、結合反応によって捕捉剤を固定する能力を有する任意の結合パートナーであってもよい。アッセイを行う前、またはアッセイを行っている間に、連結剤によって、捕捉剤を固相材料に間接的に結合することができる。固相は、例えば、試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップおよび当業者に既知の他の構造を含め、例えば、プラスチック、誘導体化されたプラスチック、磁性または非磁性の金属、ガラスまたはケイ素であってもよい。
【００４９】
本明細書に記載されるアッセイの特定の記載では、特定の結合パートナーとして、ＮＳ３、ＮＳ４またはコア抗原、またはＨＣＶ抗体のいずれかを指すことが有用であろう。「特定の結合パートナー」は、特異的な結合対の１つである。特異的な結合対は、２つの異なる分子を含み、化学的手段または物理的手段によって互いに特異的に結合する。従って、共通のイムノアッセイの抗原および抗体に特異的な結合対に加え、他の特異的な結合対は、ビオチンおよびアビジン（またはストレプトアビジン）、炭水化物およびレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクターおよび受容体分子、補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素などを含んでいてもよい。さらに、特異的な結合対は、元々の特定の結合メンバーのアナログであるメンバーを含んでいてもよい（例えば、検体−アナログ）。免疫反応性の特定の結合メンバーとしては、単離されているか、または組み換えによって作られたかによらず、抗原、抗原フラグメントおよび抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。）およびこの複合体、フラグメントおよび改変体（改変体のフラグメントを含む。）が挙げられる。「特異的な」および「特異性」の用語は、特異的な結合対（例えば、抗原（またはこのフラグメント）および抗体（またはこの抗原的に反応性のフラグメント））のメンバー間の相互作用の観点で、相互作用の選択的な反応性を指す。「…に特異的に結合する」の句および類似の句は、抗体（またはこの抗原的に反応性のフラグメント）が所与の抗原（またはこのフラグメント）に特異的に結合し、他の部分には特異的に結合しない能力を指す。
【００５０】
本発明で使用するための抗原
本明細書に記載される場合、本発明は、アッセイされる試験サンプルのＨＣＶの感受性が高く、選択的な検出を有利に与えるために、１つのアッセイにおけるＨＣＶ抗原の組み合わせの検出を記載する。特定の好ましい実施形態では、組み合わせアッセイは、さらに、抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出する。さらに具体的には、ＨＣＶ抗原は、典型的にはＨＣＶアッセイで観察される任意の抗原であってもよい。このような抗原としては、限定されないが、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５、または、コア抗原、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５の任意のいずれかの別個の独立した部分である。このような抗原を検出するためのイムノアッセイは、個々に、当業者にとって商業的に入手可能であり、このような市販のアッセイで使用される任意の抗原は、本発明のイムノアッセイで捕捉抗原または検出抗原として容易に使用されてもよい。例えば、ＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質およびこの変異体は、主に、２つの主要なタンパク質部分を含む必要があり、第１の部分は、Ｐ２６６６４（Ｇｅｎｂａｎｋ、本明細書では、配列番号２として再現される；Ｃｈｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９１）として番号が付けられている、Ｃ３３（Ｃｈｉｒｏｎによって元々記載されている。）として、または「９ＮＢ４９Ｈ」として知られているＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２から１４５７に対応する。ＮＳ３タンパク質の第２の部分は、ＮＳ３ヘリカーゼまたは「ＮＳ３ｈ」としても知られるアミノ酸１１９２から１６５７に対応する。これら２つのタンパク質のすべてまたは一部を含む抗原は、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の検出に簡単に使用することができる。例えば、Ｃ３３は、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質から誘導されるよく知られた抗原であり、本発明の組み合わせイムノアッセイでＮＳ３抗体を検出するための捕捉抗原または検出抗原として本明細書で簡単に使用されるだろう。
【００５１】
他のＮＳ３から誘導される抗原としては、名称「ＨＣＶ  ＮＳ３  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｎｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、代理人整理番号０３９４６−２６５３０ＵＳ０１の同時に出願された米国仮出願第６１／７８４，８２２号に記載されるものが挙げられる。このような抗原は、Ｃ３３の改変体であり、Ｎ末端配列またはＣ末端配列が改変されたＮＳ３ヘリカーゼタンパク質の改変体である。ある実施形態では、システインからセリンへの突然変異を含む抗原が作られた。これらの突然変異は、抗原の酸化に対する耐性を高め、これによって、エピトープの提示を保持し、従って、免疫反応性を保持する。システインからセリンへの突然変異は、例えば、免疫反応性の維持のために重要ではないと考えられる選択されたシステイン残基のみを変異することによって、（マレイミド試薬を用いた化学接合によって）タンパク質の部位特異的な改変も可能にした。さらに、システインからセリンへの置換された変異の少なくとも一部は、全長ヘリカーゼ酵素（ＨＣＶ  ａａ１１９２−１６５７）が、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ＡＴＰ）に結合する能力を破壊する。これは、開いた構造または伸長した構造にタンパク質を維持し（Ｇｕ  ＆  Ｒｉｃｅ、ＰＮＡＳ、２０１０、１０７：５２１−５２８およびこの中の参考文献を参照）、本発明で向上した免疫反応性を生成することが示される。
【００５２】
本発明で使用可能な例示的なＮＳ３抗原を本明細書で以下の表１に示す。一般的に、これらのＮＳ３抗原は、ヘリカーゼのそれぞれのドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩを含むＮＳ３ヘリカーゼ配列を含む組み換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原として記載されてもよく、この抗原は、Ｃ３３抗原と比較した場合、血清由来のＨＣＶ抗体に対する免疫反応性が高まっており、前記組み換えＨＣＶ  ＮＳ３抗原は、野生型ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ−結合活性と比較して、ＡＴＰ−結合活性の低下；野生型ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ−結合活性と比較して、野生型ＮＳ３と比較して、ＡＴＰａｓｅ活性の低下および野生型ＮＳ３ヘリカーゼの酸化還元安定性と比較して、酸化還元安定性の増加からなる群から選択される１つ以上の特徴を有する。さらに具体的には、本発明の内容において、野生型ＨＣＶ  ＮＳ３は、配列番号８７の配列を含み、本発明の組み換え抗原は、配列番号８７の配列と比較して、少なくとも１つの突然変異を含む。これらの抗原の製造および試験の詳細な記載は、名称「ＨＣＶ  ＮＳ３  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｎｔｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、代理人整理番号０３９４６−２６５３０ＵＳ０１を有する同時に出願された米国仮出願第６１／７８４，８２２号に与えられる。
【００５３】
【表１】
0006505076.tif 000002
0006505076.tif 000003
0006505076.tif 000004
0006505076.tif 000005
0006505076.tif 000006
0006505076.tif 000007
【００５４】
他の実施形態では、組み合わせイムノアッセイの別の態様は、コア抗原に対する抗体の存在を検出する。使用可能なある例示的なコア抗原としては、コアタンパク質のＤＮＡ結合ドメインから誘導される抗原（アミノ酸１から１２５）が挙げられる。さらに他の好ましいコア抗原は、コアタンパク質のアミノ酸残基１３４から１７１に位置するコアの脂質結合ドメインから誘導される（ＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧ）（配列番号８９）。しかし、本発明では、特に好ましいコア抗原としては、ＨＣＶコア抗原の検出に使用されるモノクローナル抗体は、これらの改変されたコア抗原を検出することができないが、試験サンプルから完全なコア抗原を検出するような、特異的なモノクローナル抗体のための既知のエピトープ結合領域に特定の欠失または置換を含むコアタンパク質から誘導される抗原が挙げられる。従って、これらの新規の改変されたコア抗原で固相支持体をコーティングすることができ、および／またはヒト血清または血漿中に存在する抗体を捕捉するための溶液相で使用することができ、ＨＣＶのコア領域に指向するが、同時に、ＨＣＶ組み合わせイムノアッセイで試験サンプル中に存在するコア抗原の検出に使用される複合抗体による検出をしない。従って、試験サンプル中に存在するコア抗原を検出し、同時に、試験サンプル中に存在することが予想され、同じＨＣＶコンボアッセイフォーマットで同定される抗−コア抗体を検出する組み合わせイムノアッセイを行うことができる。試験サンプルから抗−コア抗体を検出する目的のために使用可能なコア抗原は、好ましくは、コア抗原のアミノ酸３４および４８およびアミノ酸１１５から１２１の欠失を含む。
【００５５】
本明細書に示される場合、本発明の方法全体で、典型的には、イムノアッセイ方法である。例示的な実施形態では、このような方法は、目的の分子（例えば、試験サンプル中に存在する特異的な抗体、または試験サンプル中に存在し得る特異的な抗原）を単離するための方法を含む。このような単離を容易にするために、目的の分子は、精製タグを含むか、または精製タグに接続し、この精製タグは、タグ結合パートナーと接触する。従って、精製タグとタグ結合パートナーの会合を使用し、分子の混合物から目的の分子を分離してもよい。精製タグは、同じ構造または同様の構造を有する部分を含んでいてもよい。特定の実施形態では、アフィニティタグのタグ化部分は、単結合によって直接的に、または、場合により、単結合、二重結合、三重結合、芳香族炭素−炭素結合および炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、リン−酸素結合、リン−窒素結合およびこの任意の組み合わせを含め、直鎖、分枝鎖または環状の配置で、安定な化学結合の接続によって、機能的なタグと会合することができる。特定の実施形態では、タグ化部分と機能的なタグとの会合は、エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、スルホンアミド、尿素またはウレタン部分を含む。好ましい実施形態では、接続は、ポリアルキレン鎖（即ち、炭素−炭素結合の直鎖または分枝鎖の配置）を含む。他の実施形態では、接続は、ポリエチレングリコール部分を含め、ポリアルキレンオキシド鎖を含む。アフィニティタグの例としては、限定されないが、ビオチン、ジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ジンクフィンガー、フッ素化ポリマーおよびポリペプチド配列、例えば、ポリヒスチジンモチーフが挙げられる。
【００５６】
アフィニティタグは、ある実施形態では、アフィニティタグと、アフィニティタグに引き寄せられる官能基またはアフィニティタグに結合する官能基の結合または引き寄せに依存することによって、目的の分子を単離するために有利に使用される。ある実施形態では、固体基質は、タグに対するアフィニティを有し、固体基質をタグ結合パートナーで誘導体化する。ある実施形態では、結合パートナーをアフィニティ基質に固定してもよい。「アフィニティ基質」という用語は、分子の精製タグとの強い、好ましくは可逆性の相互作用を生成することができる結合パートナーに結合する固定マトリックスまたは支持体を指すことができる。アフィニティ基質が、樹脂、ビーズ、粒子、膜、ゲルを含んでいてもよい。結合パートナーは、精製タグを特異的に認識するか、またはこれに結合する。特定の結合パートナーは、アフィニティタグに依存するが、帯電した部分および結合対の１つのメンバー、例えば、受容体−リガンド、抗体−抗原、炭水化物−レクチンおよびビオチン−ストレプトアビジン（またはアビジン、ニュートラアビジンまたは抗−ビオチン抗体）を含む。
【００５７】
具体的で好ましい実施形態では、組み合わせイムノアッセイで使用される抗原の任意またはすべてのＣ末端またはＮ末端は、ビオチン化されていてもよく、または、アフィニティタグとしてビオチン結合部分（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンまたはニュートラアビジンまたは抗−ビオチン）を含んでいてもよい。これらのペプチドは、ビオチン化されているか、またはアビジン／ストレプトアビジンが接合したペプチドであり、捕捉抗原として働くだろう。または、同様に、抗原は、検出標識で標識されてもよく、この場合には、検出抗原として働くだろう。検出抗原および捕捉抗原は、同じ基礎にあるアミノ酸配列を有していてもよく、または、異なる配列を有していてもよい。例示的な実施形態では、捕捉抗原は、ビオチン結合パートナー（即ち、アビジンまたはストレプトアビジン）を有する固体支持体への結合を容易にするために、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかでビオチン化される。例示的な製造のために、ビオチン化されたペプチドは、２５℃でＩＰＴＧ誘導システムを経て、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２Ｌ（ＤＥ３）細胞で組み換えによって発現する。Ｃ末端またはＮ末端でのビオチン化での系中のビオチン化は、望ましいペプチドを発現するＨＣＶ発現プラスミドと、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢｉｒＡ遺伝子を含む第２のプラスミドとを用いたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の同時形質変換によって達成される（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆  Ｐｕｒｉｆ，１４：７５１−７５５；Ｓｃｈａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１１３８−１１４３）。組み換えタンパク質の精製は、タンパク質の金属触媒による酸化および凝集を防ぐことが示されている二価カチオンキレート化剤を用いて行われる。タンパク質の安定性は、ＥＤＴＡまたは関連する二価のカチオンキレート化剤を、精製中に使用するバッファーに加えるとき、およびイムノアッセイに使用される１種類以上の最終的な保存バッファーに加えるとき、顕著に向上する。
【００５８】
組み合わせアッセイに使用するための抗体
本明細書で全体に記載する場合、組み合わせイムノアッセイは、有利には、試験サンプル中に存在する１つ以上のＨＣＶ抗原の存在も決定する。このような実施形態では、試験サンプルからの抗原を捕捉し、次いで、さらなる複合抗体を使用し、捕捉された抗原の存在を検出するために、モノクローナル抗−ＨＣＶ抗体を使用することが望ましいだろう。この努力で使用され得る多くの市販の抗体が存在する。具体的には、このような抗体は、好ましくは、試験サンプル中のコア抗原の存在を決定する。コア抗原に対するものである抗体は、当業者に知られており、例えば、米国特許公開第２０１２０００９１９６号に記載されるものが挙げられる。これに加え、本発明は、さらに、同時に出願された米国特許出願第６１／７８３，５２９号、名称「ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、代理人整理番号０３９４６−２６５３１ＵＳ０１に記載されるモノクローナル抗体の使用を想定し、この抗体は、ＨＣＶコア抗原の脂質結合ドメインと特異的に免疫反応性である。さらに特定的には、ＨＣＶコア抗原は、ＨＣＶのアミノ酸残基１３４から１７１である。さらに特定的な実施形態では、抗体は、アミノ酸配列ＭＧＹＩＰＬＶＧＡＰＬＧＧＡＡＲＡＬＡＨＧＶＲＶＬＥＤＧＶＮＹＡＴＧＮＬＰＧ（配列番号８９）によって作られる少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。さらに具体的な実施形態では、抗体は、ＨＣＶコア抗原のアミノ酸１４１から１６１、１３４から１５４および１５１から１７１によって作られるエピトープと免疫反応性である。
【００５９】
具体的で例示的な実施形態では、組み合わせイムノアッセイで使用される抗体は、試験サンプル中のＨＣＶコアタンパク質またはこのフラグメントを検出するように設計される。このような抗体は、ＤＮＡ結合ドメイン、脂質結合ドメイン、または実際に完全なコアタンパク質を検出してもよい。ある実施形態では、イムノアッセイで使用される検出抗体は、コアペプチドの脂質結合ドメインを指向し、例示的なこのような抗体は、名称「ＨＣＶ  Ｃｏｒｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、代理人整理番号０３９４６−２６５３１ＵＳ０１の同時に出願された米国仮出願第６１／７８３，５２９号に記載される。さらに他の実施形態では、組み合わせアッセイで使用される抗−ＨＣＶコア抗体は、例えば、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−９およびＣ１１−１４であってもよい（米国特許第６，７２７，０９２号；Ｍｏｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２００９，１５７：８−１４によって記載されるように）。
【００６０】
本発明の具体的なアッセイでは、組み合わせイムノアッセイは、試験サンプル中の少なくともコア抗原を検出し、コア抗体を検出する。このような実施形態では、抗−コア抗体、好ましくは、ＨＣＶコア抗原の検出に使用されるモノクローナル抗体は、これらの改変されたコア抗原を検出しないが、試験サンプルからの完全なコア抗原を検出するような、特異的なモノクローナル抗体に対する既知のエピトープ結合領域に特定の欠失または置換を含む抗−コア抗体を捕捉するように設計された捕捉抗原を確保することは必須ではないが、望ましくなる。捕捉抗体として使用される例示的な抗−コア抗体としては、米国特許第６，７２７，０９２号およびＭｏｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２００９，１５７：８−１４に記載されるようなＡＯＴ３、Ｃ１１−３、Ｃ１１−７、Ｃ１１−９およびＣ１１−１４抗体が挙げられる。
【００６１】
免疫診断アッセイおよび試薬
特定の実施形態では、上に記載される抗原および抗体は、ＨＣＶに感染しているおそれがある試験サンプル中に発見される複数のＨＣＶ要素の検出のために設計された組み合わせイムノアッセイにおける免疫診断試薬としての使用が想定される。限定されないが、ＨＣＶのＮＳ３領域、ＨＣＶのコア抗原、ＨＣＶのＮＳ４領域、またはこれらの組み合わせおよびこれらの１つ以上の領域に対して指向する抗−ＨＣＶ抗体を含め、ＨＣＶ抗原の検出のために設計された組み合わせイムノアッセイで使用することができるように、免疫診断試薬（抗体または抗原である。）は、上述の抗原ポリペプチドおよび抗体で構成されるだろう（典型的には、組み合わせて）。捕捉のために、免疫診断試薬が含まれる抗原および／または抗体を固体支持体（例えば、微粒子（例えば、磁気粒子）、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場となる分子、膜、濾紙、ディスクまたはチップ）でコーティングしてもよい。この観点で、免疫診断試薬が抗原の組み合わせ（例えば、異なるＨＣＶタンパク質または同じＨＣＶタンパク質の異なるフラグメントに指向する。）を含む場合、抗原で同じ固体支持体を一緒にコーティングしてもよく、または別個の固体支持体をコーティングしてもよい。同様に、免疫診断試薬が、試験サンプルから１つ以上の抗原を捕捉するために使用される１つ以上の抗体を含む場合、このような抗体で同じ固体支持体を一緒にコーティングしてもよく、または別個の固体支持体をコーティングしてもよい。
【００６２】
特に、免疫診断試薬は、抗原および抗体を含み、これらは、検出可能な標識で標識されてもよく、または捕捉または検出を可能にする特異的なパートナーで標識されてもよい。例えば、標識は、検出可能な標識、例えば、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識などであってもよい。このような標識は、以下にさらに詳細に記載される。
【００６３】
さらになお、本発明は、本明細書に記載される免疫診断試薬と、試験サンプル中の２つ以上のＨＣＶタンパク質および／または抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出することによって、試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定するための組み合わせイムノアッセイで免疫診断試薬を使用するための指示とを含む、ＨＣＶ診断キットの調製を想定する。例えば、キットは、イムノアッセイによって抗−ＨＣＶ抗体（例えば、試験サンプル中の抗−コア抗体）について試験サンプルをアッセイするための指示を含んでいてもよい。好ましい実施形態は、試験サンプルをアッセイするための化学発光微粒子イムノアッセイを使用するが、本発明の組み合わせイムノアッセイで使用される抗原および抗体を、試験サンプル中のＨＣＶの存在を決定するために、当業者に既知の任意の他のイムノアッセイフォーマットで使用してもよいことを理解すべきである。指示は、紙の形態またはコンピュータで読み取り可能な形態（例えば、ディスク、ＣＤ、ＤＶＤなど）であってもよい。これに代えて、またはこれに加えて、キットは、キャリブレーターまたはコントロール、例えば、精製された（場合により、凍結乾燥された）抗−ＨＣＶ抗体または抗原および／またはアッセイを行うための少なくとも１つの容器（例えば、組み合わせイムノアッセイの１つ以上の捕捉要素（抗原および／または抗体）ですでにコーティングされていてもよい、管、マイクロタイタープレートまたは試験片）および／またはバッファー、例えば、アッセイバッファーまたは洗浄バッファー（いずれか１つが濃縮溶液として与えられてもよい。）、検出可能な標識のための基質溶液（例えば、酵素標識）、または停止溶液を含んでいてもよい。好ましくは、キットは、アッセイを行うのに必要なすべての要素を含む（即ち、試薬、標準、バッファー、希釈剤など）。具体的な実施形態では、固体支持体を、捕捉部分（例えば、ビオチン化された抗原またはビオチン化された抗体）の結合を可能にする薬剤でコーティングするイムノアッセイがキャプチャオンザフライ（ｃａｐｔｕｒｅ−ｏｎ−ｔｈｅ−ｆｌｙ）型の組み合わせイムノアッセイとして行われてもよいように、すべての要素がキットに個々に存在することが好ましく、キットは、さらに、それぞれの個々の捕捉抗原と検出抗原の対およびビオチン化された捕捉抗体を１個の容器に含み、第２の容器は、検出抗体複合体を与える。アッセイを行うための指示は、抗−ＨＣＶ抗体を定量するための標準曲線または参照標準を作成するための指示も含んでいてもよい。
【００６４】
キットに与えられる任意の抗体（例えば、抗−ＩｇＧ抗体および抗−ＩｇＭ抗体）は、検出可能な標識、例えば、フルオロフォア、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識なども組み込んでいてもよく、または、キットは、抗体（例えば、検出抗体）を検出するための、および／または検体を標識するための抗体または試薬を標識するための試薬、または検体を検出するための試薬を含んでいてもよい。抗体、キャリブレーターおよび／またはコントロールは、別個の容器で与えられてもよく、または適切なアッセイフォーマット（例えば、マイクロタイタープレート）にあらかじめ分注してもよい。好ましい組み合わせイムノアッセイでは、２つの容器が提供される。第１の容器には、少なくとも第１、第２および第３の抗原の対が提供され、それぞれの対の第１の抗原は、ビオチン化された所与のＨＣＶタンパク質に由来する捕捉抗原であり、それぞれの対の第２の抗原は、第１の抗原と同じタンパク質に由来するが、検出可能な標識で標識された（例えば、アクリジン化された）検出抗原と、試験サンプル由来の１つ以上のＨＣＶ抗原を検出するために設計された１つ以上のビオチン化された抗体であり、第２の容器には、第１の容器からビオチン化された抗体によって捕捉される抗原を検出するための接合対を生成する抗体が与えられる。第１の容器に複数のビオチン化された抗体が存在する場合、接合パートナーを生成する複数の抗体が、１個の容器または複合抗体を検出するそれぞれの異なる抗原のための個々の容器に存在してもよいことが想定される。
【００６５】
場合により、キットは、品質制御要素（例えば、感受性パネル、キャリブレーターおよびポジティブコントロール）を含む。品質制御試薬の調製は、当該技術分野でよく知られており、種々の免疫診断製品のための添付シートに記載される。感受性パネルの膜は、場合により、アッセイ性能の特徴を確立するために使用され、さらに、場合により、イムノアッセイキット試薬の一体性およびアッセイの標準化の有用な指標である。
【００６６】
キットは、場合により、診断アッセイを行うため、または品質制御の評価を容易にするのに必要な他の試薬（例えば、バッファー、塩、酵素、酵素の補因子、基質、検出試薬など）も含んでいてもよい。他の要素（例えば、試験サンプルの単離および／または処理のためのバッファーおよび溶液（例えば、前処理試薬））もキットに含まれていてもよい。キットは、さらに、１つ以上の他のコントロールを含んでいてもよい。キットの１つ以上の要素を凍結乾燥してもよく、この場合には、キットは、さらに、凍結乾燥した要素の再構築に適した試薬を含んでいてもよい。
【００６７】
キットの種々の要素は、場合により、必要な場合、適切な容器（例えば、マイクロタイタープレート）中で与えられる。キットは、さらに、サンプルを保持または保存するための容器（例えば、サンプルのための容器またはカートリッジ）を含んでいてもよい。適切な場合、キットは、場合により、反応容器、混合容器および試薬または試験サンプルの調製を容易にする他の要素も含んでいてもよい。キットは、試験サンプルを得るのを助けるための１つ以上の装置（例えば、シリンジ、ピペット、鉗子、秤量スプーンなど）も含んでいてもよい。
【００６８】
好ましい実施形態では、検出可能な標識は、少なくとも１つのアクリジニウム化合物である。このような実施形態では、キットは、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキサミド、少なくとも１つのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステル、またはこの任意の組み合わせを含んでいてもよい。検出可能な標識が、少なくとも１つのアクリジニウム化合物である場合、キットは、過酸化水素源、例えば、バッファー、溶液および／または少なくとも１つの塩基性溶液も含んでいてもよい。免疫診断試薬において、抗体検出のための抗原が、検出可能に標識されていてもよく、このような試薬と共に使用するためのキットに与えられる任意の抗体も、検出可能に標識されていてもよいことを理解すべきである。
【００６９】
所望な場合、キットは、固体支持体相、例えば、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場となる分子、膜、濾紙、ディスクまたはチップを含んでいてもよい。
【００７０】
試験サンプル中のＨＣＶの存在、量または濃度を決定する方法
本開示は、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原の存在、量または濃度を決定するための組み合わせイムノアッセイ方法を提供する。アッセイが、試験サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するための１つ以上の抗原および／または１つ以上のＨＣＶ抗原を検出するための１つ以上の抗−ＨＣＶ抗体を使用する限り、当該技術分野で知られている任意の適切なアッセイをこのような方法で使用してもよい。このようなアッセイの例としては、限定されないが、イムノアッセイ、例えば、サンドイッチイムノアッセイ（例えば、放射性同位体検出（放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ））を含む、モノクローナル−ポリクローナルサンドイッチイムノアッセイ）および酵素検出（酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）または酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（例えば、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡアッセイ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、Ｍｉｎｎ．））、競争的阻害イムノアッセイ（例えば、順方向および逆方向）、蛍光極性イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、酵素多重イムノアッセイ技術（ＥＭＩＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）および均一化学発光アッセイなどが挙げられる。
【００７１】
組み合わせイムノアッセイの具体的な実施形態では、組み換え抗原（例えば、コア、ＮＳ３およびＮＳ４抗原）を捕捉試薬として（例えば、抗原のアミノ末端またはカルボキシ末端がビオチンタグを含む抗原を用いることによって）、または抗原がアクリジニウムで直接的または間接的に標識された検出（複合体）試薬として使用してもよい。間接的な標識は、ＳＭＣＣ型リンカーを介するタンパク質の中の対になっていないシステイン残基の遊離チオールに共有結合したアクリジン化されたＢＳＡの使用を必要とする。このような間接的な標識を容易にするために、本発明の組み合わせイムノアッセイに使用される特定の抗原は、Ｃ末端にさらなるシステイン残基を含むように、簡単にさらに改変されてもよい。
【００７２】
典型的には、イムノアッセイは、１工程または２工程のフォーマットで行われる。１工程アッセイにおいて溶液中で生成する免疫複合体を捕捉するための固相試薬としては、ビオチン化された部分を捕捉するための抗−ビオチンモノクローナル抗体、ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンが挙げられる（ＨＣＶ抗体を捕捉するためのビオチン化された抗原、または試験サンプル中のＨＣＶタンパク質／抗原を捕捉するためのビオチン化された抗体である。）。
【００７３】
ＳＥＬＤＩ系イムノアッセイでは、抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原に特異的に結合する捕捉試薬は、質量分光用プローブ（例えば、あらかじめ活性化されたタンパク質チップアレイ）の表面に接続する。次いで、抗−ＨＣＶ抗体または抗原は、バイオチップ上に特異的に捕捉され、捕捉された部分は、質量分光法によって検出される。または、抗−ＨＣＶ抗体を捕捉試薬から溶出し、従来のＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）またはＳＥＬＤＩによって検出することができる。化学発光微粒子イムノアッセイ、特に、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）自動化分析機（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アボットパーク、ＩＩＩ．）を使用するアッセイは、複数の抗原の組み合わせ（好ましくは、２つ以上のＨＣＶタンパク質に由来する抗原）および複数の抗−ＨＣＶ抗体を容易に使用し得る好ましいイムノアッセイの一例である。凝集アッセイ、例えば、受身赤血球凝集アッセイも使用することができる。凝集アッセイでは、抗原−抗体反応は、凝集またはクランピングによって検出される。受身赤血球凝集アッセイでは、赤血球は、抗原でコーティングされ、コーティングされた赤血球は、凝集アッセイで使用される。
【００７４】
尿、血液、血清および血漿ならびに他の体液を集め、取り扱い、処理するための当該技術分野でよく知られた方法は、例えば、免疫診断試薬が、複数の抗原を含む場合、および／または抗−ＨＣＶ抗体イムノアッセイキット内に含まれる場合、本開示の実施で使用される。試験サンプルは、目的のポリペプチドに加え、さらなる部分、例えば、抗体、抗原、ハプテン、ホルモン、薬物、酵素、受容体、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、サンプルは、被検体から得られる全血液サンプルであってもよい。試験サンプル、特に、全血液が、本明細書に記載されるようなイムノアッセイの前に、例えば、前処理試薬で処理されることが必要な場合があるか、または望ましい場合がある。前処理が必要ではない場合であっても（例えば、ほとんどの尿サンプル）、前処理は、場合により、単なる簡便さのために行われてもよい（例えば、商業的なプラットフォームに対する方法の一部として）。
【００７５】
前処理試薬は、本発明の組み合わせイムノアッセイおよびキットを用いる使用に適した任意の試薬であってもよい。前処理は、場合により、（ａ）１つ以上の溶媒（例えば、メタノールおよびエチレングリコール）および塩、（ｂ）１つ以上の溶媒、塩および洗剤、（ｃ）洗剤、または（ｄ）洗剤および塩を含む。前処理試薬は、当該技術分野で公知であり、例えば、文献に記載されるように（例えば、Ｙａｔｓｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓｓａｙ  Ｅｖａｌｕａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｉｎ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３６：１９６９−１９７３（１９９０）およびＷａｌｌｅｍａｃｑ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  ＡｘＳＹＭ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙ：Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＴＤｘ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａｓｓａｙｓ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４５：４３２−４３５（１９９９）を参照）、および／または市販されているものとして、Ａｂｂｏｔｔ  ＴＤｘ、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）およびＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析機（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アボットパーク、ＩＩＩ）でのアッセイのために使用されるように、このような前処理が使用されてもよい。さらに、Ａｂｂｏｔｔの米国特許第５，１３５，８７５号、欧州特許公開第０  ４７１  ２９３号、２００６年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／８７８，０１７号および米国特許出願公開第２００８／００２０４０１号（前処理に関する教示について、全体的に参照により組み込まれる。）に記載されるように、前処理が行われてもよい。前処理試薬は、不均一な薬剤または均一な薬剤であってもよい。
【００７６】
不均一な前処理試薬を使用し、前処理試薬は、検体に結合するタンパク質（例えば、抗−ＨＣＶ抗体に結合することができるタンパク質、またはサンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体形態に結合することができる抗原）を沈殿させる。このような前処理工程は、沈殿した検体を結合するタンパク質から、サンプルに前処理剤を加えることによって生成した混合物の上澄みを分離することによって、任意の検体を結合するタンパク質を除去することを含む。このようなアッセイでは、任意の結合するタンパク質が存在しない混合物の上澄みをアッセイで使用し、抗体捕捉工程に直接進む。
【００７７】
均質な前処理試薬を用いるとき、このような分離工程は存在しない。試験サンプルおよび前処理試薬の全混合物を、抗−ＨＣＶ抗体のための標識された特定の結合パートナー（即ち、抗原）またはＨＣＶ抗原のための標識された特定の結合パートナー（即ち、抗体）と接触させる。このようなアッセイに使用される前処理試薬は、典型的には、第１の特定の結合パートナーによって捕捉する前または捕捉中に、前処理した試験サンプル混合物で希釈する。このような希釈にもかかわらず、特定の量の前処理試薬（例えば、５Ｍのメタノールおよび／または０．６メチレングリコール）が、捕捉中の試験サンプル混合物中にまだ存在する（または残留する。）。
【００７８】
不均一なフォーマットでは、被検体から試験サンプルが得られた後、第１の混合物が調製される。混合物は、抗−ＨＣＶ抗体および第１の特異的な捕捉結合パートナーについて評価される試験サンプルを含み、試験サンプル中に含まれる第１の特異的な捕捉結合パートナーおよび任意の抗−ＨＣＶ抗体は、第１の特異的な捕捉結合パートナー−抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成する。第１の特異的な捕捉結合パートナーは、コア抗原、ＮＳ３抗原またはＮＳ３のいずれかであってもよい。本発明で使用される例示的なＮＳ３抗原は、本明細書の上の表１に示される任意の１つ以上の抗原であってもよい。同様に、本発明の組み合わせアッセイでは、混合物は、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナーも含み、これらの第２および第３の特異的な捕捉結合パートナーは、試験サンプル中に存在する抗−ＨＣＶ抗体と、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナー−抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成する。このような第２、第３および第４の抗原は、コア抗原、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５およびこれらの部分からなる群から選択される１つ以上の少なくとも１つのＨＣＶ抗原であってもよい。
【００７９】
これに加え、組み合わせイムノアッセイは、試験サンプル中に存在する第４の抗原との抗−ＨＣＶ抗体−第４の特定の結合パートナー複合体を生成するように、試験サンプル中にみられる第４の特定の結合パートナー（即ち、試験サンプル中にみられる抗原またはＨＣＶタンパク質）との特異的な複合体を生成する少なくとも１つの抗−ＨＣＶ捕捉抗体を含んでいてもよく、好ましくは、含む。好ましくは、第４の特異的な結合対は、試験サンプル中のコア抗原を検出するものであり、従って、この結合対は、試験サンプル中の第４の抗原（コア）を検出するための抗−コア抗体である。
【００８０】
試験サンプルおよび種々の特定の結合パートナーを加えて混合物を生成する順序は重要ではない。ある実施形態では、第１、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナー（即ち、抗原）および抗−ＨＣＶ捕捉抗体が、固相に固定される。さらに他の実施形態では、これら４種類の要素はどれも固定されないが、代わりに、固相に捕捉を行うために、すべてが同時に試験サンプルに加えられる。組み合わせイムノアッセイに使用される固相は、当該技術分野で知られている任意の固相であってもよく、例えば、限定されないが、磁気粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場となる分子、膜、濾紙、ディスクまたはチップであってもよい。
【００８１】
第１、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナーと、試験サンプル中にみられるそれぞれの抗−ＨＣＶ抗体との免疫複合体、第１の抗−ＨＣＶ捕捉抗体（例えば、抗−コア）と、試験サンプル中にみられるそれぞれのＨＣＶ抗原またはＨＣＶタンパク質との免疫複合体が生成した後、任意の結合していない抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原／タンパク質を、任意の当該技術分野で公知の技術を用い、複合体から除去する。例えば、結合していない抗−ＨＣＶ抗体または抗原を洗浄によって除去することができる。しかし、望ましくは、第１、第２および第３の特定の結合パートナーおよび抗−ＨＣＶ抗体は、過剰な任意の抗−ＨＣＶ抗体および抗原中に存在し、それぞれが試験サンプル中に存在し、この結果、試験サンプル中に存在するすべての抗−ＨＣＶ抗体および抗原は、それぞれ第１、第２および第３の特定の結合パートナーおよび抗−ＨＣＶ捕捉抗体によって結合する。
【００８２】
任意の結合していない抗−ＨＣＶ抗体および抗原が除去された後、第１の特異的な検出結合パートナーを混合物に加え、第１の特異的な捕捉結合パートナー−抗−ＨＣＶ抗体−第１の特異的な検出結合パートナー複合体を生成することによって、検出が達成される。第１の特異的な検出結合パートナーは、好ましくは、抗−ＩｇＧ抗体と抗−ＩｇＭ抗体の組み合わせである。さらに、好ましくは、第１の特異的な検出結合パートナーは、上述のような検出可能な標識で標識されるか、または検出可能な標識を含む。具体的な実施形態では、これに代えて、またはこれに加えて、第１の特異的な検出パートナーは、捕捉された抗体に結合する抗原であってもよい。同様に、本発明の組み合わせアッセイでは、混合物は、第２および第３の特異的な検出結合パートナーを含み、これらの第２および第３の特異的な検出結合パートナーは、試験サンプル中に存在する捕捉された抗−ＨＣＶ抗体と、第２または第３の特異的な捕捉結合パートナー−抗−ＨＣＶ抗体−第２または第３の特異的な検出結合パートナー複合体を生成する。再び、第２および第３の特異的な検出結合パートナーは、抗−ＩｇＧ抗体と抗−ＩｇＭ抗体の組み合わせであってもよい。具体的な実施形態では、これに代えて、またはこれに加えて、第２および第３の特異的な検出パートナーは、捕捉された抗体に結合する抗原であってもよい。さらに、好ましくは、第２および第３の特異的な検出結合パートナーは、抗−ＩｇＭまたはＩｇＧ抗体または抗原であり、上述のような検出可能な標識で標識され、または検出可能な標識を含む。これに加えて、組み合わせイムノアッセイは、試験サンプルから捕捉される第４の抗原との抗−ＨＣＶ抗体−第４の特定の結合パートナー−抗−ＨＣＶ複合抗体複合体を生成するように、試験サンプル中にみられる捕捉された抗原またはＨＣＶタンパク質との特異的な複合体を生成する少なくとも１つの抗−ＨＣＶ複合抗体を含んでいてもよく、好ましくは、含む。
【００８３】
任意の適切な検出可能な標識は、当該技術分野で知られるように、任意の１つ以上の検出可能な標識として使用されてもよい。例えば、検出可能な標識は、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース  ６−ホスフェートデヒドロゲナーゼなど）、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステル、またはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン（例えば、５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロ−フルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど））、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット（例えば、硫化亜鉛で保護されたセレン化カドミウム）、測温標識、またはイムノポリメラーゼ連鎖反応標識であってもよい。標識の導入、標識化手順および標識の検出は、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｎｅｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．によって公開されたハンドブックとカタログを合わせたものに見いだされる。蛍光標識は、ＦＰＩＡで使用することができる（例えば、全体的に本明細書に参照により組み込まれる米国特許第５，５９３，８９６号、第５，５７３，９０４号、第５，４９６，９２５号、第５，３５９，０９３号および第５，３５２，８０３号を参照）。均質な化学発光アッセイにおいて、アクリジニウム化合物を検出可能な標識として使用することができる（例えば、Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：１３２４−１３２８（２００６）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：２３１３−２３１７（２００４）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：３９１７−３９２１（２００４）；およびＡｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）を参照）。
【００８４】
好ましいアクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキサミドである。アクリジニウム  ９−カルボキサミドを調製するための方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．６：１０７−１１４（１９９１）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：５６３６−５６３９（１９９８）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５５：１０８９９−１０９１４（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１：７７９−７８１（１９９９）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：７１４−７２４（２０００）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ、Ｋ．Ｖ．Ｅｄ．；ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ｐｐ．７７−１０５（２００２）；Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．５：３７７９−３７８２（２００３）；および米国特許第５，４６８，６４６号、第５，５４３，５２４号および第５，７８３，６９９号に記載される（それぞれが、上の方法に関する教示について、全体的に本明細書に参照により組み込まれる。）。
【００８５】
別の好ましいアクリジニウム化合物は、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである。式ＩＩのアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの一例は、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネートである（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、アナーバー、Ｍｉｃｈ．から入手可能）。アクリジニウム  ９−カルボキシレートアリールエステルを調製するための方法は、ＭｃＣａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４：１１１１−２１（１９６５）；Ｒａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２４５−２４９（２０００）；Ｒａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  １５：２３９−２４４（２０００）；および米国特許第５，２４１，０７０号に記載される（それぞれが、上の方法に関する教示について、全体的に本明細書に参照により組み込まれる。）。このようなアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、シグナルの強度および／またはシグナルの迅速さの観点で、少なくとも１つのオキシダーゼによって検体の酸化で生成する過酸化水素のための有効な化学発光指示薬である。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルのための一連の化学発光は、迅速に（即ち、１秒以内に）終了し、一方、アクリジニウム−９−カルボキサミド化学発光は、２秒間続く。しかし、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、タンパク質の存在下、この化学発光特性を失う。従って、この使用は、シグナル発生および検出の間にタンパク質が存在しないことを必要とする。サンプル中のタンパク質を分離または除去するための方法は、当業者によく知られており、限定されないが、超濾過、抽出、沈殿、透析、クロマトグラフィーおよび／または消化が挙げられる（例えば、Ｗｅｌｌｓ、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（２００３）を参照）。試験サンプルから除去または分離されるタンパク質の量は、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％であってもよい。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルおよびこの使用に関するさらなる詳細は、２００７年４月９日に出願され、米国特許出願公開第２００８／０２４８４９３号として２００８年１０月９日に公開された米国特許出願第１１／６９７，８３５号に示される。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、任意の適切な溶媒、例えば、脱気した無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはコール酸ナトリウム水溶液に溶解することができる。
【００８６】
Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ５７９（１）：６１−６７（２００６）に記載される方法に従って、化学発光アッセイを行うことができる。任意の適切なアッセイフォーマットを使用することができるが、マイクロプレート化学発光計（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ−９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、ＬＬＣ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、Ｔｅｎｎ．）によって、少ない容積の複数のサンプルを迅速にアッセイすることができる。化学発光計は、９６ウェルの黒色ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３７９２番）を用い、複数の試薬注入部を備えていてもよい。それぞれのサンプルを別個のウェルに加え、その後、使用されるアッセイの種類によって決定されるように、同時／逐次に他の試薬を加えてもよい。望ましくは、例えば、酸性化によって、アクリジニウムアリールエステルを使用する中性または塩基性の溶液中の疑似塩基の生成が避けられる。次いで、化学発光応答をウェルごとに記録する。この観点で、化学発光応答を記録するための時間は、部分的に、試薬の添加と、特定の使用されるアクリジニウムの添加の遅れに依存するだろう。
【００８７】
試験サンプルおよび特定の結合パートナーを加え、化学発光アッセイのための混合物を生成する順序は、重要ではない。第１の特異的な捕捉結合パートナーが、アクリジニウム化合物で検出可能に標識されている場合、検出可能に標識された第１の特異的な捕捉結合パートナー−抗−ＨＣＶ抗体複合体が生成する。または、第１の特異的な検出結合パートナーが使用され、第１の特異的な検出結合パートナーが、アクリジニウム化合物で検出可能に標識されている場合、検出可能に標識された第１の特異的な捕捉結合パートナー−抗−ＨＣＶ抗体−第１の特異的な検出結合パートナー複合体が生成する（同様に、上述の組み合わせアッセイにおける第２および第３の複合体）。任意の結合していない特定の結合パートナーは、標識されているか、または標識されていないかにかかわらず、当該技術で公知の任意の技術（例えば、洗浄）を用いて混合物から除去することができる。
【００８８】
上述のアクリジニウム化合物の添加の前、添加と同時、または添加の後に、混合物中、過酸化水素を混合物中で系中で作成することができ、混合物に提供または供給することができる。当業者に明らかなような多くの様式で、過酸化水素を系中で作成することができる。
【００８９】
または、過酸化水素源は、混合物に単純に加えられてもよい。例えば、過酸化水素源は、過酸化水素を含んでいることが知られている１つ以上のバッファーまたは他の溶液であってもよい。この観点で、過酸化水素の溶液を単純に加えてもよい。
【００９０】
少なくとも１つの塩基性溶液をサンプルに同時または逐次に添加すると、抗−ＨＣＶ抗体（捕捉は抗原を用いる。）または抗原（捕捉は抗体を用いる。）の存在の指標である検出可能なシグナル（即ち、化学発光シグナル）が発生する。塩基性溶液は、少なくとも１つの塩基を含有し、ｐＨは、１０以上、好ましくは、１２以上である。塩基性溶液の例としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウムおよび炭酸水素カルシウムが挙げられる。サンプルに加えられる塩基性溶液の量は、塩基性溶液の濃度によって変わる。使用する塩基性溶液の濃度に基づき、当業者は、サンプルに加えるための塩基性溶液の量を簡単に決定することができる。
【００９１】
発生する化学発光シグナルは、当業者に知られている通常の技術を用いて検出することができる。発生するシグナルの強度に基づき、サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体および／または抗原の量を定量することができる。具体的には、サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体および／または抗原の量は、発生するシグナルの強度に比例する。発生した光の量を、抗−ＨＣＶ抗体および／または抗原についての標準曲線と比較することによって、または、参照標準と比較することによって、存在する抗−ＨＣＶ抗体および／または抗原の量を定量することができる。質量分光法、重量測定法および当該技術分野で既知の他の技術によって、既知の濃度の抗−ＨＣＶ抗体の順次希釈物または溶液を用い、標準曲線を作成することができる。
【００９２】
当該技術分野で知られる任意の適切なフォーマットを用い、抗−ＨＣＶ抗体および／または抗原イムノアッセイを行うことができる。一般的に言うと、抗−ＨＣＶ抗体について試験されるサンプル（例えば、抗−ＨＣＶ抗体を含むおそれがある。）を、捕捉抗原および少なくとも１つの検出抗体（第２の検出抗体または第３の検出抗体であってもよい。）、例えば、標識された抗−ＩｇＧおよび抗−ＩｇＭ抗体を同時にまたは逐次に、任意の順序で接触させてもよい。同様に、抗原の存在についての試験物を、試験サンプル中の抗原に結合する捕捉された抗体と接触させることができ、次いで、結合した抗原を検出抗体によって検出してもよい。
【００９３】
例えば、まず、試験サンプルを少なくとも１つの捕捉抗原と接触させ、次いで、（逐次に）少なくとも１つの検出抗体と接触させてもよい。または、まず、試験サンプルを少なくとも１つの検出抗体と接触させ、次いで、（逐次に）少なくとも１つの捕捉抗体と接触させてもよい。さらに別の代替例では、試験サンプルを、捕捉抗原および検出抗体と同時に接触させてもよい。
【００９４】
サンドイッチアッセイフォーマットでは、抗−ＨＣＶ抗体（またはこのフラグメント）を含むおそれがあるサンプルを、まず、第１の捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成する条件下で、少なくとも１つの第１の捕捉抗原と接触させる。組み合わせアッセイでは、同じことを第２、第３またはより多くの捕捉抗原を用いて繰り返し、または同時に行う。１種類より多い捕捉抗原を使用する場合、複数の第１の捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体複合体が生成する。サンドイッチアッセイでは、抗原、好ましくは、少なくとも１つの捕捉抗原を、試験サンプル中で予測される最大量の抗−ＨＣＶ抗体に対しモル過剰量で使用する。例えば、バッファー（例えば、微粒子コーティングバッファー）１ｍＬあたり５μｇから約１ｍｇの抗原を使用することができる。
【００９５】
競争的阻害イムノアッセイは、多くは、小さな検体を測定するために使用されるが、逐次および従来のフォーマットを含む。逐次の競争的阻害イムノアッセイでは、目的の抗体（即ち、抗−ＨＣＶ抗体）に対し、１種類以上の捕捉抗原（即ち、本明細書に記載されるようなポリペプチド、および好ましくは、ポリペプチド対）を、マイクロタイタープレートのウェルにコーティングする。目的の抗体／複数の抗体を含むサンプルをウェルに加えると、目的の抗体が捕捉抗原に結合する。洗浄した後、既知の量の標識された（例えば、ビオチンまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））抗体をウェルに加える。酵素標識のための基質は、シグナルを発生させるのに必要である。ＨＲＰのための適切な基質の一例は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である。洗浄した後、標識された抗体によって発生したシグナルを測定し、このシグナルは、サンプル中の抗体の量に反比例する。従来の競争的阻害イムノアッセイでは、目的の抗体のための抗原で、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。しかし、逐次の競争的阻害イムノアッセイとは異なり、目的の抗体（即ち、抗−ＨＣＶ抗体）を含むサンプルと標識された抗体をウェルに同時に加える。サンプル中の任意の抗体は、捕捉抗原に対する結合について、標識された抗体と競争する。洗浄した後、標識された検体によって発生したシグナルを測定し、このシグナルは、サンプル中の検体の量に反比例する。
【００９６】
場合により、試験サンプルと、少なくとも１つの捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）とを接触させる前に、少なくとも１つの捕捉抗原を固体支持体に結合してもよく、試験サンプルからの第１の抗原／抗−ＨＣＶ抗体複合体の分離が容易になる。捕捉抗原が結合する基質は、サンプルからの捕捉抗原−抗−ＨＣＶ抗体複合体の分離を容易にする任意の適切な固体支持体または固相であってもよい。例としては、プレートのウェル、例えば、マイクロタイタープレート、試験管、多孔性ゲル（例えば、シリカゲル、アガロース、デキストランまたはゼラチン）、ポリマー膜（例えば、ポリアクリルアミド）、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズまたは磁気ビーズ）、フィルタ／膜片（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）、微粒子（例えば、ラテックス粒子、磁性微粒子（例えば、酸化鉄または酸化クロムのコアおよびホモポリマーまたはヘテロポリマーのコーティングを有し、半径が約１ミクロンから１０ミクロンの微粒子）が挙げられる。基材は、抗原に結合する適切な表面アフィニティを有し、検出抗体が近づくことができる十分な多孔性を有する適切な多孔性材料を含んでいてもよい。微多孔性材料は、一般的に好ましいが、水和した状態のゼラチン状材料を使用してもよい。このような多孔性基質は、好ましくは、厚みが約０．０１ｍｍから約０．５ｍｍ、好ましくは、約０．１ｍｍのシートの形態である。孔径は、非常にさまざまであってもよいが、好ましくは、孔径は、約０．０２５ミクロンから約１５ミクロン、さらに好ましくは、約０．１５ミクロンから約１５ミクロンである。このような基質の表面は、基質に対して抗体を共有結合させる化学工程によって活性化することができる。一般的に、基材に対し、抗原の疎水性力による吸着による不可逆的な結合が起こる。または、このような結合が、抗−ＨＣＶ抗体に結合する抗原の能力を妨害しない限り、化学カップリング剤または他の手段を用い、基材に抗原を共有結合させることができる。
【００９７】
または、試験サンプルからの抗−ＨＣＶ抗体を、抗原ですでにコーティングされた微粒子に結合させてもよい。所望な場合、１つ以上の捕捉試薬、例えば、本明細書に記載されるようなポリペプチドの対は、それぞれ抗−ＨＣＶ抗体に結合することができ、異なる物理的位置または割り当て可能な位置で、これを固相に接続してもよい（例えば、バイオチップの構造（例えば、米国特許第６，２２５，０４７号、国際特許公開ＷＯ９９／５１７７３；米国特許第６，３２９，２０９号；国際特許公開ＷＯ００／５６９３４および米国特許第５，２４２，８２８号を参照）。捕捉試薬を固体支持体として質量分光用プローブに結合する場合、プローブに結合した抗−ＨＣＶ抗体の量は、レーザー脱離イオン化質量分光法によって検出することができる。または、１つのカラムを異なるビーズで充填してもよく、１つ以上の捕捉試薬で誘導体化し、これによって、１つの場所で抗−ＨＣＶ抗体を捕捉する（誘導体化された抗体、ビーズに基づく技術、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）のｘＭＡＰ技術を参照）。
【００９８】
抗−ＨＣＶ抗体についてアッセイされる試験サンプルを、少なくとも１つの捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）と接触させた後、第１の抗原（または複数の抗原）−抗−ＨＣＶ抗体（またはこのフラグメント）複合体を生成させるために、混合物をインキュベートする。インキュベーションを、約４．５から約１０．０のｐＨ、約２℃から約４５℃の温度で少なくとも約１分間から約１８時間、好ましくは、約１分から約２４分間、最も好ましくは、約４分から約１８分間行うことができる。本明細書に記載されるイムノアッセイを１工程で行うことができ（試験サンプル、少なくとも１つの捕捉抗体および少なくとも１つの検出抗体を、すべて、反応容器に逐次または同時に加えることを意味する。）、または１工程より多い工程で、例えば、２工程、３工程などで行うことができる。
【００９９】
（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体複合体の生成の後、または生成と同時に、複合体を少なくとも１つの検出抗体と接触させる（（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／第１の抗体検出複合体を生成する条件下で）。少なくとも１つの検出抗体は、イムノアッセイで使用する第２、第３、第４などの抗体であってもよい。捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体複合体を１種類より多い検出抗体と接触させると、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／（複数の）検出抗体複合体を生成する。捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）を用いる場合、少なくとも第２の（およびその後の）検出抗体を捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体複合体と接触させるとき、上述の条件と類似の条件下でインキュベーションする期間は、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体の生成のために必要である。好ましくは、少なくとも１つの検出抗体は、検出可能な標識を含む。（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体の生成の前、生成と同時、または生成の後に、検出可能な標識を少なくとも１つの検出抗体（例えば、第２の検出抗体）に結合することができる。当該技術分野で知られている任意の検出可能な標識を使用することができる（Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）およびＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）を含め、上述を参照）。
【０１００】
検出可能な標識を抗体（または検出可能な標識を含んでいてもよい抗原）に直接的に、またはカップリング剤によって結合してもよい。使用可能なカップリング剤の一例は、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）であり、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、Ｍｏから市販される。使用可能な他のカップリング剤は、当該技術分野で公知である。抗体に対して検出可能な標識を結合する方法は、当該技術分野で公知である。さらに、多くの検出可能な標識は、購入することができるか、または合成することができ、抗体に対する検出可能な標識のカップリングを容易にする末端基をすでに含んでおり、例えば、ＣＰＳＰ−アクリジニウムエステル（即ち、９−［Ｎ−トシル−Ｎ−（３−カルボキシプロピル）］−１０−（３−スルホプロピル）アクリジニウムカルボキサミド）またはＳＰＳＰ−アクリジニウムエステル（即ち、Ｎ１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（３−スルホプロピル）−アクリジニウム−９−カルボキサミド）である。
【０１０１】
（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体複合体を、必須ではないが、標識を定量する前に試験サンプルの残りから分離してもよい。例えば、少なくとも１つの捕捉抗原（例えば、第１の捕捉抗原）が固体支持体（例えば、ウェルまたはビーズ）に結合する場合、固体支持体との接触から（試験サンプルの）流体を除去することによって分離を行うことができる。または、少なくとも第１の捕捉抗原を固体支持体に結合する場合、抗−ＨＣＶ抗体を含有するサンプルおよび少なくとも１つの第２の検出抗体（または標識された検出抗原）を同時に接触させ、第１の（複数の）抗原／抗−ＨＣＶ抗体／第２の（複数の）抗体（および／または標識された検出抗原）複合体を生成し、その後、固体支持体との接触から、流体（試験サンプル）を除去してもよい。少なくとも１つの第１の捕捉抗原が固体支持体に結合しない場合、（第１のまたは複数の）捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／（第２のまたは複数の）検出抗体（および／または捕捉された抗体のための検出抗原）複合体は、標識の量を定量するために試験サンプルから除去する必要はない。
【０１０２】
標識された捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／検出抗原（および／または検出抗体）複合体（例えば、第１の捕捉抗原／抗−ＨＣＶ抗体／第１の検出抗原複合体、場合により第２の検出抗体も含む。）を生成した後、複合体中の標識の量は、当該技術分野で知られる技術を用いて定量される。例えば、酵素標識が使用される場合、標識された複合体を標識のための基質と反応させ、定量可能な反応（例えば、色の発色）を与える。標識が放射性標識である場合、シンチレーションカウンターを用いて標識を定量する。標識が蛍光標識である場合、ある色の光（「励起波長」として知られる。）で標識を刺激し、刺激に対する応答で標識によって発光する別の色（「発光波長」として知られる。）を検出することによって、標識を定量する。標識が化学発光標識である場合、発光した光を視覚的に検出する、または発光計、ｘ線フィルム、高速写真フィルム、ＣＣＤカメラなどを使用することによって標識を定量する。複合体中の標識の量を定量したら、既知の濃度の抗−ＨＣＶ抗体または抗原の順次希釈物を用いて作成した標準曲線を使用することによって、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体または抗原の濃度を決定する。抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原の順次希釈物を用いる以外に、標準曲線を重量測定で、質量分光法によって、当該技術分野で知られている他の技術によって作成することができる。
【０１０３】
ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）分析機を使用する化学発光微粒子アッセイでは、複合体希釈剤のｐＨは、約６．０±０．２であるべきであり、微粒子コーティングバッファーは、室温（即ち、約１７℃から約２７℃）に維持すべきであり、微粒子コーティングバッファーのｐＨは、約６．５±０．２であるべきであり、微粒子希釈剤のｐＨは、約６．５±０．２であるべきである。固形分は、好ましくは、約０．２％未満、例えば、約０．１５％未満、約０．１４％未満、約０．１３％未満、約０．１２％未満、または約０．１１％未満、例えば、約０．１０％である。
【０１０４】
ＦＰＩＡは、競争的結合イムノアッセイの原理に基づく。蛍光標識された化合物は、線形偏光によって励起される場合、この回転率に反比例する偏光度を有する蛍光を発するだろう。蛍光標識されたトレーサー−抗体複合体が、線形偏光した光によって励起される場合、発光した光は、フルオロフォアが、光が吸収される時間から光が発光する時間まで回転が制限されるため、高度に偏光したままである。「遊離した」トレーサー化合物（即ち、抗体に結合していない化合物）は、線形偏光した光によって励起される場合、この回転は、競争的結合イムノアッセイで作られる対応するトレーサー−抗体複合体よりもかなり速い。ＦＰＩＡは、特殊な取扱いおよび廃棄を必要とする放射性物質が存在しないという点で、ＲＩＡより有利である。これに加え、ＦＰＩＡは、簡単に迅速に行うことができる均一なアッセイである。
【０１０５】
市販の抗−ＨＣＶ抗体および抗−ＩｇＧおよび抗−ＩｇＭ抗体を、アッセイ方法およびこのキットで使用することができる。市販の抗体としては、Ａｂｎｏｖａ（ウォルナット、カリフォルニアおよび台湾）およびＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（サンディエゴ、カリフォルニア）から入手可能なものが挙げられる。また、抗−ＨＣＶ抗体の調製に関する欧州特許出願ＥＰ２０９９８２５Ａ２も参照。
【０１０６】
抗−ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原組み合わせイムノアッセイに任意の適切なコントロール組成物を使用してもよい。コントロール組成物は、一般的に、抗−ＨＣＶ抗体、既知の抗原および任意の望ましい添加剤を含む。
【０１０７】
従って、上の観点で、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体または抗原の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。この方法は、アッセイによって、抗−ＨＣＶ抗体または抗原について試験サンプルをアッセイすることを含む。
【０１０８】
（ｉ）ＨＣＶ抗原および少なくとも１つの検出可能な標識を含む単離されたポリペプチドまたは精製されたポリペプチドを少なくとも含む免疫診断試薬を使用し、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度の間接的または直接的な指標として、検出可能な標識によって発生するシグナルを、コントロールまたはキャリブレーター（場合により、それぞれのキャリブレーターが、抗−ＨＣＶ抗体の濃度という点で他のキャリブレーターと異なる一連のキャリブレーターの一部である。）中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度の間接的または直接的な指標として発生したシグナルと比較する。この方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
【０１０９】
（ｉ）試験サンプル中に存在し得るＨＣＶ抗体との第１、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成するように、試験サンプルと、１つ以上の組み換えＨＣＶ抗原を含む免疫診断試薬とを接触させること、
（ｉｉ）第１の特定の結合パートナー／第１、第２および第３の抗−ＨＣＶ抗体、それぞれ／第２の特定の結合パートナー複合体を生成するように、第１、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナー／第１、第２および第３の抗−ＨＣＶ抗体複合体と、抗−ＨＣＶ抗体（例えば、本明細書に記載されるような抗−ＩｇＧ抗体および抗−ＩｇＭ抗体またはポリペプチド）のための少なくとも１つの検出可能に標識された第２の特定の結合パートナーとを接触させることおよび
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で作られる第１の特定の結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体／第２の特定の結合パートナー複合体において検出可能な標識によって発生するシグナルを検出または測定することによって、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度を決定すること。
【０１１０】
場合により、または好ましくは、抗−ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の使用に加えて、またはこれに代えて、第２の工程は、それぞれ第１の特定の結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体／第２の特定の結合パートナー複合体を生成するように、第１、第２および第３の捕捉抗原によって特異的に捕捉された抗−ＨＣＶ抗体に特異的に結合する第１、第２および第３の検出抗原の添加を含み、第３の工程は、以下のものを含む。
【０１１１】
（ｉｉｉ）（ｉｉ）に作られる第１、第２および第３の特異的な捕捉結合パートナー／第１、第２および第３の抗−ＨＣＶ抗体／第１、第２および第３の特異的な検出結合パートナー複合体中の検出可能な標識によって発生するシグナルを検出または測定することによって、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度を決定すること。
【０１１２】
または、この方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
【０１１３】
（ｉ）試験サンプルと、１つ以上の組み換え抗原を含む免疫診断試薬とを接触させ、同時または逐次に、いずれかの順序で、試験サンプルと、第１の特定の結合パートナーの少なくとも１つの対に結合することについて、抗−ＨＣＶ抗体と競争することができ、検出可能に標識された抗−ＨＣＶ抗体を含む、少なくとも１つの検出可能に標識された第２の特定の結合パートナーとを接触させ、試験サンプル中に存在する任意の抗−ＨＣＶ抗体および少なくとも１つの検出可能に標識された第２の特定の結合パートナーが互いに競争し、それぞれ、第１の特定の結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体複合体および第１の特定の結合パートナー／第２の特定の結合パートナー複合体を生成すること、
（ｉｉ）（ｉｉ）で作られる第１の特定の結合パートナー／第２の特定の結合パートナー複合体中の検出可能な標識によって発生するシグナルを検出または測定することによって、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度を決定し、第１の特定の結合パートナー／第２の特定の結合パートナー複合体中の検出可能な標識によって発生するシグナルは、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の量または濃度に反比例する。免疫診断試薬が含まれる組み換え抗原で微粒子をコーティングしてもよい。この観点で、免疫診断試薬が含まれる抗原で、さらなるＨＣＶ抗原と同じ微粒子を一緒にコーティングしてもよい。免疫診断試薬が含まれるポリペプチドで、同じ微粒子に一緒にコーティングする場合（例えば、４％の固形分を含有する微粒子懸濁物（４％重量／体積の微粒子または４グラムの微粒子／１００ｍＬの微粒子懸濁物））、好ましくは、ポリペプチドで同じ微粒子に約１：２から約１：６の比率で一緒にコーティングし、ポリペプチドを約１：２の比率で同じ微粒子に一緒にコーティングする場合、本発明の単離された抗原または精製された抗原（例えば、表１に記載されるもの）の濃度は、少なくとも約４０μｇ／ｍＬであり、他の単離されたポリペプチドまたは精製されたポリペプチドの濃度は、少なくとも約８０μｇ／ｍＬである。試験サンプルが患者から得られる場合、この方法は、さらに、患者の治療的／予防的な処置の効力を診断し、予後を判断し、または評価することを含んでいてもよい。この方法が、さらに、患者の治療的／予防的な処置の効力を評価することを含む場合、この方法は、場合により、効力を高めるために必要な場合、患者の治療的／予防的な処置を変えることをさらに含んでいてもよい。この方法は、自動化されたシステムまたは半自動化されたシステムで使用するように調整することができる。
【０１１４】
また、上の観点で、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原またはタンパク質の存在、量または濃度を決定する方法が提供される。この方法は、アッセイによって試験サンプルをアッセイすることを含む。
【０１１５】
（ｉ）少なくとも１つのＨＣＶ抗原（および好ましくは２つ、３つ、またはより多い抗原）、少なくとも１つの検出可能な標識（好ましくはそれぞれの抗原が、検出可能に標識されている。）を含む免疫診断試薬を使用すること、
（ｉｉ）試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度の間接的または直接的な指標として、検出可能な標識によって発生するシグナルを、コントロールまたはキャリブレーター（場合により、それぞれのキャリブレーターが、抗−ＨＣＶ抗体の濃度という点で他のキャリブレーターと異なる一連のキャリブレーターの一部である。）中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度の間接的または直接的な指標として発生したシグナルと比較すること。この方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
【０１１６】
（ｉ）第１の特異的な捕捉結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体複合体を生成するように、試験サンプルと、少なくとも１つ、２つ、３つ、またはより多い本発明の組み換えＨＣＶ抗原を含む免疫診断試薬とを接触させること、
（ｉｉ）第１の特定の結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体／第２の特定の結合パートナー複合体を生成するように、第１の特異的な捕捉結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体複合体と、抗−ＨＣＶ抗体（例えば、抗−ＩｇＧ抗体および抗−ＩｇＭ抗体または抗−ＨＣＶ抗体に結合する標識された抗原）についての少なくとも１つの検出可能に標識された第２の特定の結合パートナーとを接触させること、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で作られる第１の特定の結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体／第２の特定の結合パートナー複合体中、検出可能な標識によって発生するシグナルを検出または測定することによって、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度を決定すること。または、この方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
【０１１７】
（ｉ）試験サンプルと、少なくとも１つ、２つ、３つ、またはより多くの異なるＨＣＶ抗原を含む免疫診断試薬とを接触させ、同時または逐次に、いずれかの順序で、試験サンプルと、第１の特定の結合パートナーの少なくとも１つの対に結合することについて、抗−ＨＣＶ抗体と競争することができ、検出可能に標識された抗−ＨＣＶ抗体を含む、少なくとも１つの検出可能に標識された第２の特定の結合パートナーとを接触させ、試験サンプル中に存在する任意の抗−ＨＣＶ抗体および少なくとも１つの第２の特定の結合パートナーが互いに競争し、それぞれ、第１の特定の結合パートナー／抗−ＨＣＶ抗体複合体および第１の特定の結合パートナー／第２の特定の結合パートナー複合体を生成すること、
（ｉｉ）（ｉｉ）で作られる第１の特定の結合パートナー／第２の特定の結合パートナー複合体中の検出可能な標識によって発生するシグナルを検出または測定することによって、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在、量または濃度を決定し、第１の特定の結合パートナー／第２の特定の結合パートナー複合体中の検出可能な標識によって発生するシグナルは、試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の量または濃度に反比例する。免疫診断試薬が含まれるポリペプチドで微粒子をコーティングしてもよい。この観点で、免疫診断試薬が含まれるポリペプチドで、同じ微粒子を一緒にコーティングしてもよい。免疫診断試薬が含まれるポリペプチドで、同じ微粒子に一緒にコーティングする場合（例えば、４％の固形分を含有する微粒子懸濁物（４％重量／体積の微粒子または４グラムの微粒子／１００ｍＬの微粒子懸濁物））、好ましくは、ポリペプチドで同じ微粒子に約１：２から約１：６の比率で一緒にコーティングし、ポリペプチドを約１：２の比率で同じ微粒子に一緒にコーティングする場合、組み換えＨＣＶ抗原を含む単離されたポリペプチドまたは精製されたポリペプチドの濃度は、少なくとも約４０μｇ／ｍＬであり、他の単離されたポリペプチドまたは精製されたポリペプチドの濃度は、少なくとも約８０μｇ／ｍＬである。試験サンプルが患者から得られる場合、この方法は、さらに、患者の治療的／予防的な処置の効力を診断し、予後を判断し、または評価することを含んでいてもよい。この方法が、さらに、患者の治療的／予防的な処置の効力を評価することを含む場合、この方法は、場合により、効力を高めるために必要な場合、患者の治療的／予防的な処置を変えることをさらに含んでいてもよい。この方法は、自動化されたシステムまたは半自動化されたシステムで使用するように調整することができる。
【０１１８】
一般的に、抗−ＨＣＶ抗体について試験サンプルをアッセイするときに得られる結果を評価するベンチマークとして、所定のレベルを使用してもよい。一般的に、このような比較をするときに、疾患、障害または状態（例えば、子癇前症または心血管系疾患）の特定の段階または終点、または特定の兆候を有する検体の存在、量または濃度の結合または会合を行うことができるように十分な回数、適切な条件で特定のアッセイを行うことによって、所定のレベルが得られる。典型的には、参照被検体（または被検体の集合）のアッセイを用い、所定のレベルが得られる。
【０１１９】
特に、疾患の進行および／または処置を監視するために使用されるような所定のレベルに関し、抗−ＨＣＶ抗体の量または濃度は、「変化しない」、「望ましい」（または「望ましく変更される」）または「望ましくない」（または「望ましくないように変更される」）であってもよい。「高まる」または「増加する」は、典型的または正常なレベルまたは範囲（例えば、所定のレベル）より高いか、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、初期のサンプルまたはベースラインサンプル）より高い試験サンプル中の量または濃度を指す。「低下する」または「減少する」という用語は、典型的または正常なレベルまたは範囲（例えば、所定のレベル）より低いか、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、初期のサンプルまたはベースラインサンプル）より低い試験サンプル中の量または濃度を指す。「変化した」という用語は、典型的または正常なレベルまたは範囲（例えば、所定のレベル）より変えられた（増加または減少した。）か、または別の参照レベルまたは範囲（例えば、初期のサンプルまたはベースラインサンプル）より変えられた（増加または減少した。）サンプル中の量または濃度を指す。
【０１２０】
抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原について典型的または正常なレベルまたは範囲は、標準的な実施に従って定義される。抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原のレベルは、ある場合には、非常に低いため、典型的または正常なレベルまたは範囲と比較して正規の変化が存在する場合、または実験誤差またはサンプルの変動によって説明することができない参照レベルまたは範囲の正規の変化が存在する場合、いわゆる変化したレベルまたは変更が起こったと考えることができる。従って、特定のサンプルで測定されるレベルは、いわゆる正常な被検体からの同様のサンプルで決定されるレベルまたはレベルの範囲と比較されるだろう。この観点で、「正常な被検体」は、検出可能な肝炎を有さない個人であり、例えば、「正常な」（時に「コントロール」と呼ばれる。）患者または集合は、例えば、検出可能な肝炎を示さない被検体である。さらに、抗−ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原が大部分のヒト集合において高レベルで常にみられない場合、「正常な被検体」は、抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原の量または濃度の検出可能な実質的な増加も上昇もない個人であると考えることができ、「正常な」（時に「コントロール」と呼ばれる。）患者または集合は、抗−ＨＣＶ抗体の量または濃度の検出可能な実質的な増加も上昇も示さない。「明らかに正常な被検体」は、抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原が評価されていなかったか、または評価されていない被検体である。検体が、通常は検出可能ではない（例えば、正常なレベルはゼロであるか、または正常な集合の約２５から約７５パーセントの範囲内にある。）が、試験サンプルで検出される場合、および検体が試験サンプル中に正常なレベルより多く存在する場合、検体のレベルは、「高まる」と言われる。従って、特に、本開示は、例えば、本明細書で定義されるような肝炎を有するか、または肝炎を有するリスクがある被検体をスクリーニングする方法を提供する。
【０１２１】
従って、本明細書に記載される方法を使用し、被検体が肝炎を有するか、または肝炎が進行するリスクを有するかどうかを決定することもできる。具体的には、このような方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
【０１２２】
（ａ）被検体からの試験サンプルにおける抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量を決定すること（例えば、本明細書に記載される方法、または当該技術分野で知られる方法を用いて）、および
（ｂ）工程（ａ）で決定される抗−ＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原の濃度または量と、所定のレベルとを比較し、工程（ａ）で決定される抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が、所定のレベルに関して望ましい場合、被検体は、肝炎を有していないか、または肝炎のリスクがないと決定される。しかし、工程（ａ）で決定される抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が、所定のレベルに関して望ましくない場合、被検体は、肝炎を有しているか、または肝炎のリスクがあると決定される。
【０１２３】
さらに、本明細書には、被検体における疾患の進行を監視する方法が提供される。最適には、この方法は、以下の工程を含む。
【０１２４】
（ａ）被検体からの試験サンプルにおいて、抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量を決定すること、
（ｂ）被検体からの後期の試験サンプルにおいて、抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量を決定すること、および
（ｃ）工程（ｂ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と、工程（ａ）で決定される抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量とを比較し、工程（ｂ）で決定される濃度または量が、工程（ａ）で決定される抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比較したとき、変化していないか、または望ましくない場合、被検体の疾患は、継続しており、進行しているか、または悪化していると決定される。比較によって、工程（ｂ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が、工程（ａ）で決定される抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比較したとき、望ましい場合には、被検体の疾患は、継続しておらず、回復しているか、または向上していると決定される。
【０１２５】
場合により、この方法は、さらに、工程（ｂ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量を、例えば、所定のレベルと比較することを含む。さらに、場合により、この比較が、工程（ｂ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／または抗−ＨＣＶ抗原の濃度または量が、例えば、所定レベルに対して望ましくないように変化することを示す場合、この方法は、被検体を１つ以上の医薬組成物で所定時間処置することを含む。
【０１２６】
さらになお、この方法を使用し、１つ以上の医薬組成物を用いた処置を受けている被検体において、処置を監視してもよい。具体的には、このような方法は、被検体に１つ以上の医薬組成物を投与する前に、被検体からの第１の試験サンプルを提供することを含む。次いで、被検体からの第１の試験サンプルにおける抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が決定される（例えば、本明細書に記載される方法または当該技術分野で知られている方法を用いて）。抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が決定された後、場合により、抗−ＨＣＶ抗体の濃度または量と所定のレベルとを比較する。第１の試験サンプルにおいて決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が、所定のレベルより小さい場合、被検体は、１つ以上の医薬組成物で処置されない。しかし、第１の試験サンプルにおいて決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が、所定のレベルより大きい場合、被検体は、１つ以上の医薬組成物で所定期間処置される。被検体が１つ以上の医薬組成物で処置される期間は、当業者によって決定することができる（例えば、この期間は、約７日から約２年、好ましくは、約１４日から約１年であってもよい。）。
【０１２７】
１つ以上の医薬組成物を用いた一連の処置の間、第２およびその後の試験サンプルを被検体から得る。試験サンプルの数および試験サンプルが被検体から得られる時間は重要ではない。例えば、被検体に１つ以上の医薬組成物を最初に投与してから７日後に第２の試験サンプルを得ることができ、被検体に１つ以上の医薬組成物を最初に投与してから２週間後に、第３の試験サンプルを得ることができ、被検体に１つ以上の医薬組成物を最初に投与してから３週間後に第４の試験サンプルを得ることができ、被検体に１つ以上の医薬組成物を最初に投与してから４週間後に第５の試験サンプルを得ることができた、など。
【０１２８】
それぞれの第２またはその後の試験サンプルを被検体から得た後、第２またはその後の試験サンプル中で決定される抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量を決定する（例えば、本明細書に記載される方法または当該技術分野で既知の方法を用いて）。次いで、第２またはその後のそれぞれの試験サンプル中で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量を、第１の試験サンプルで決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比較する（例えば、元々の試験サンプルを、場合により、所定のレベルと比較する。）。工程（ｃ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量が、工程（ａ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比較したときに望ましい場合、被検体の疾患は、継続しておらず、回復しているか、または向上していると決定され、被検体は、工程（ｂ）の１つ以上の医薬組成物の投与を継続すべきである。しかし、工程（ｃ）で決定されるような濃度または量が、工程（ａ）で決定されるような抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度または量と比較したときに変化していないか、または望ましくない場合、被検体の疾患は、継続しており、進行しているか、または悪化していると決定され、被検体は、工程（ｂ）でより高い濃度の１つ以上の医薬組成物を被検体に投与して処置されるべきであり、または、被検体は、工程（ｂ）で被検体に投与されるものとは異なる１つ以上の医薬組成物を被検体に投与して処置されるべきである。具体的には、被検体は、被検体の抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原のレベルを減少または低下させるために被検体がすでに受けた１つ以上の医薬組成物とは異なる１つ以上の医薬組成物を投与して処置されるべきである。
【０１２９】
一般的に、繰り返し試験を行ってもよいアッセイについて（例えば、疾患の進行および／または処置に対する応答を監視する。）、第１の試験サンプルを被検体から得てから所定期間後に、第２またはその後の試験サンプルを得る。具体的には、被検体からの第２の試験サンプルは、第１の試験サンプルを被検体から得てから数分後、数時間後、数日後、数週間後または数年後に得てもよい。例えば、第１の試験サンプルを被検体から得てから約１分後、約５分後、約１０分後、約１５分後、約３０分後、約４５分後、約６０分後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約５時間後、約６時間後、約７時間後、約８時間後、約９時間後、約１０時間後、約１１時間後、約１２時間後、約１３時間後、約１４時間後、約１５時間後、約１６時間後、約１７時間後、約１８時間後、約１９時間後、約２０時間後、約２１時間後、約２２時間後、約２３時間後、約２４時間後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、約６週間後、約７週間後、約８週間後、約９週間後、約１０週間後、約１１週間後、約１２週間後、約１３週間後、約１４週間後、約１５週間後、約１６週間後、約１７週間後、約１８週間後、約１９週間後、約２０週間後、約２１週間後、約２２週間後、約２３週間後、約２４週間後、約２５週間後、約２６週間後、約２７週間後、約２８週間後、約２９週間後、約３０週間後、約３１週間後、約３２週間後、約３３週間後、約３４週間後、約３５週間後、約３６週間後、約３７週間後、約３８週間後、約３９週間後、約４０週間後、約４１週間後、約４２週間後、約４３週間後、約４４週間後、約４５週間後、約４６週間後、約４７週間後、約４８週間後、約４９週間後、約５０週間後、約５１週間後、約５２週間後、約１．５年後、約２年後、約２．５年後、約３．０年後、約３．５年後、約４．０年後、約４．５年後、約５．０年後、約５．５年後、約６．０年後、約６．５年後、約７．０年後、約７．５年後、約８．０年後、約８．５年後、約９．０年後、約９．５年後または約１０．０年後に、第２の試験サンプルを被検体から得てもよい。疾患の進行を監視するために使用する場合、上のアッセイを使用し、急性状態を患う被検体の疾患の進行を監視することができる。急性状態（クリティカルケア状態としても知られる。）は、例えば、心血管系または排泄系を含む、急性の生命を脅かす疾患または他の重要な医学的状態を指す。典型的には、クリティカルケア状態は、病院系の施設（限定されないが、救急救命室、集中治療室、外傷センター、または他の救急ケア施設）での急性の医学的介入、または医療補助者または他の分野に基づく医学者による投与を必要とするこれらの状態を指す。クリティカルケア状態の場合、繰り返しの監視は、一般的に、短い時間フレームで、即ち、分、時間または日（例えば、約１分、約５分、約１０分、約１５分、約３０分、約４５分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、４約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日または約７日）行われ、初期のアッセイは、同様に、一般的に、より短い時間フレーム内で、例えば、疾患または状態の発生の約数分間、数時間または数日間行われる。
【０１３０】
アッセイを使用し、慢性または非急性の状態を患う被検体の疾患の進行を監視することもできる。クリティカルケアではない状態、または非急性の状態は、例えば、心血管系および／または排泄系を含む、急性の生命を脅かす疾患または他の重要な医学的状態以外の状態を指す。典型的には、非急性の状態は、長期間または慢性の期間の状態を含む。非急性の状態の場合、繰り返しの監視は、一般的に、より長い時間フレームで、例えば、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間または数年間（例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１３週間、約１４週間、約１５週間、約１６週間、約１７週間、約１８週間、約１９週間、約２０週間、約２１週間、約２２週間、約２３週間、約２４週間、約２５週間、約２６週間、約２７週間、約２８週間、約２９週間、約３０週間、約３１週間、約３２週間、約３３週間、約３４週間、約３５週間、約３６週間、約３７週間、約３８週間、約３９週間、約４０週間、約４１週間、約４２週間、約４３週間、約４４週間、約４５週間、約４６週間、約４７週間、約４８週間、約４９週間、約５０週間、約５１週間、約５２週間、約１．５年、約２年、約２．５年、約３．０年、約３．５年、約４．０年、約４．５年、約５．０年、約５．５．年、約６．０年、約６．５年、約７．０年、約７．５年、約８．０年、約８．５年、約９．０年、約９．５年または約１０．０年）で行われ、初期のアッセイは、同様に、一般的に、より長い時間フレーム内で、例えば、疾患または状態の発生の約数時間、数日間、数ヶ月間または数年間行われる。
【０１３１】
さらに、被検体から得られる第１の試験サンプルを用い、上のアッセイを行うことができ、第１の試験サンプルは、ある供給源、例えば、尿、血清または血漿から得られる。場合により、次いで、被検体から得られる第２の試験サンプルを用いて上のアッセイを繰り返してもよく、第２の試験サンプルは、別の供給源から得られる。例えば、第１の試験サンプルが尿から得られる場合、第２の試験サンプルを血清または血漿から得てもよい。第１の試験サンプルおよび第２の試験サンプルを用いたアッセイから得られた結果を比較してもよい。この比較を用い、被検体の疾患または状態の状況を評価することができる。
【０１３２】
さらに、本開示は、肝炎であると前もって診断された被検体または肝炎を患う被検体が処置から利益を得るかどうかを決定する方法にも関する。特に、本開示は、ＨＣＶを伴う診断方法および製品に関する。従って、「被検体の疾患の処置を監視する」方法は、本明細書に記載される場合、さらに、最適には、治療の候補を選択または特定することも包含していてもよい。
【０１３３】
従って、特定の実施形態では、本開示は、肝炎を有するか、または肝炎のリスクを有する患者が治療の候補であるかどうかを決定する方法も提供する。一般的に、被検体は、肝炎の幾つかの症状を経験した被検体、または肝炎を有するか、または肝炎のリスクがあると実際に診断された被検体および／または本明細書に記載されるように、望ましくない濃度または量の抗−ＨＣＶ抗体またはこのフラグメントおよび／またはＨＣＶ抗原を示す被検体が挙げられる。
【０１３４】
この方法は、場合により、本明細書に記載されるようなアッセイを含み、検体は、被検体を１つ以上の医薬組成物で処置、免疫抑制治療を用いて、または免疫吸収治療によって、抗−血管新生治療する前および後に評価され（例えば、特に、ＨＣＶを伴い作用機序に医薬的に関する。）るか、または検体がこのような処置に従って評価され、検体の濃度または量を所定のレベルに対して比較する。処置後に観察される検体の望ましくない濃度または量は、被検体が、さらなる処置または継続する処置を受けても利益を受けないことを確認し、一方、処置後に観察される検体の望ましい濃度または量は、被検体が、さらなる処置または継続する処置から利益を受けることを確認する。この確認は、臨床研究の管理を用いて補助され、改良された患者のケアを与える。
【０１３５】
キットおよび方法の適合
本明細書に記載されるようなイムノアッセイによって試験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原の濃度を決定するキット（またはこの要素）および方法を、例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号、および例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＩＩ）によってＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）として市販されているように、種々の自動化されたシステムおよび半自動化されたシステム（固相が微粒子を含むもの）での使用に適合させることができる。
【０１３６】
自動化されていないシステム（例えば、ＥＬＩＳＡ）と比較して、自動化されたシステムまたは半自動化されたシステムの幾つかの差は、第１の特定の結合パートナー（例えば、抗原）が接続する基質（サンドイッチ生成および検体の反応性に影響を与えることがある。）、ならびに捕捉、検出および／または任意の洗浄工程の長さおよび時間調整を含む。自動化されていないフォーマット（例えば、ＥＬＩＳＡ）が、サンプルおよび捕捉試薬を用いて比較的長いインキュベーションを必要とし得る（例えば、約２時間）一方、自動化されたフォーマットまたは半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的短いインキュベーション時間を有するだろう（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）について約１８分）。同様に、自動化されていないフォーマット（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、検出抗体、例えば、複合体試薬を比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）でインキュベートし得るが、自動化されたフォーマットまたは半自動化されたフォーマット（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ））は、比較的短いインキュベーション時間を有するだろう（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）について約４分）。
【０１３７】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な他のプラットフォームとしては、限定されないが、ＡｘＳＹＭ（Ｒ）、ＩＭｘ（Ｒ）（例えば、米国特許第５，２９４，４０４号を参照、全体的に本明細書に参照により組み込まれる。）、ＰＲＩＳＭ（Ｒ）、ＥＩＡ（ビーズ）、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩおよび他のプラットフォームが挙げられる。さらに、アッセイ、キットおよびキット要素を他のフォーマットで、例えば、電気化学または他の手動のアッセイシステムまたはポイントオブケアアッセイシステムで使用してもよい。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイイムノセンサを行う商業的なＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学イムノアッセイシステムに適用でき、１回型の試験デバイスでの製造および操作の方法が、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、米国特許出願公開第２００４／００１８５７７号、米国特許出願公開第２００５／００５４０７８号および米国特許出願公開第２００６／０１６０１６４号に記載され、これらに関する教示について、全体的に本明細書に参照により組み込まれる。
【０１３８】
特に、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）システムへのアッセイの適合に関し、以下の構造が例示である。微細加工されたケイ素チップを、金電流測定の作業電極と、銀−塩化銀参照電極の対を用いて製造する。作業電極の１つについて、固定された捕捉抗体を有するポリスチレンビーズ（直径が０．２ｍｍ）が、電極の上にあるパターン形成されたポリビニルアルコールのポリマーコーティングに付着する。このチップを、イムノアッセイに適した流体フォーマットで、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジに並べる。カートリッジのサンプルを保持するチャンバの壁の一部に、アルカリホスファターゼ（または他の標識）で標識された検出抗体を含む層が存在する。カートリッジの液体溜めの中は、ｐ−アミノフェノールホスフェートを含む水性試薬である。
【０１３９】
操作時に、抗−ＨＣＶ抗体および／またはＨＣＶ抗原を含むおそれがあるサンプルを、試験カートリッジの保持チャンバに加え、カートリッジをＩ−ＳＴＡＴ（Ｒ）リーダーに挿入する。検出抗体または検出可能に標識された検出抗原をサンプルに溶解させた後、カートリッジ内のポンプ要素が、サンプルを、チップを含む導路に向かわせる。ここで、捕捉抗原（または捕捉抗体）、抗−ＨＣＶ抗体（またはＨＣＶ抗原）と、標識された検出抗体（および／または検出抗原）との間のサンドイッチ生成を促進するように振動する。アッセイの２番目の工程では、流体を液体溜めから出し、導路に向かわせ、チップからサンプルを洗い流し、廃棄チャンバに送る。アッセイの最後の工程では、アルカリホスファターゼ標識がｐ−アミノフェノールホスフェートと反応し、ホスフェート基を開裂させ、遊離したｐ−アミノフェノールを、作業電極で電気化学的に酸化させる。測定された電流に基づき、この読みから、埋め込まれたアルゴリズムおよび工場で決定される較正曲線を用い、サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体またはＨＣＶ抗原の量を計算することができる。
【０１４０】
本明細書に記載される方法およびキットは、イムノアッセイを行うための他の試薬および方法を包含する。例えば、種々のバッファー（例えば、当該技術分野で公知なものおよび／または複合体希釈剤として、および／または例えばキャリブレーター希釈剤として洗浄するために使用するために、簡単に調製することができ、または最適化することができるもの）を包含する。例示的な複合体希釈剤は、特定のキットで使用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）複合体希釈剤（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＩＩ）であり、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、塩、タンパク質ブロッカー、抗菌剤および洗剤を含む。例示的なキャリブレーター希釈剤は、特定のキットで使用されるＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）ヒトキャリブレーター希釈剤であり（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＩＩ．）、ＭＥＳ、他の塩、タンパク質ブロッカーおよび抗菌剤を含むバッファーを含む。さらに、２００８年１２月３１日に出願された米国特許出願第６１／１４２，０４８号および米国特許出願第１２／６５０，２４１号に記載されるように、例えば、Ｉ−ＳＴＡＴ（Ｒ）カートリッジフォーマットで、シグナル増幅剤としてシグナル抗体に連結した核酸配列を用い、改良されたシグナル発生が得られてもよい。
【実施例】
【０１４１】
［実施例１］：ＨＣＶ  ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈのクローニングおよび発現
ＨＣＶ−１のアミノ酸１１９２から１４５７（配列番号２）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、Ｅ．Ｃｏｌｉ発現のために最適化されたコドンであり、改変したｐＥＴ３２ａベクターへとクローン化し、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列が除かれ、メチオニン（Ｍ）と置き換わっていた。これに加え、カルボキシ末端のヘキサヒスチジンタグは、固定化された金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）での精製を容易にするために含まれていた。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、精製されたプラスミドＤＮＡで形質変換し、形質変換体をスクリーニングした。得られたプラスミドは、ｐ９ＮＢ４９Ｈと命名し、このプラスミドから発現したタンパク質は、９ＮＢ４９Ｈと命名された。
【０１４２】
ｐ９ＮＢ４９Ｈで形質変換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞をテリフィックブロス（ＴＢ）培地で培養することによってタンパク質発現が達成された。振とうフラスコでＯＤ６００ｎｍが０．５０になるまで細胞を成長させ、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、ＯＤ６００ｎｍ  約３．５が得られるまで、２５から３７℃で約３時間成長させた。遠心分離によって細胞を集め、プロテアーゼ阻害剤を追加した溶解バッファー（５０ｍＭ  ＫＰＯ４、３００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）に懸濁させた。細胞懸濁物を凍結させ、解凍し、ベンゾナーゼを加え、氷の上で音波処理することによって細胞を溶解させた。遠心分離によって、溶解物を可溶性フラクションと不溶性フラクションに分けた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥから、ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈタンパク質が可溶性フラクション中に存在することがわかった。Ｎａｔｉｖｅ  ＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＫｉｔおよびＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ＩＭＡＣカートリッジ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、製造業者のプロトコルに従って、溶解可溶性フラクションに対してＩＭＡＣ精製を行った。精製されたタンパク質のバッファーのＰＢＳへの交換は、脱塩カラムによって、または透析によって達成された。精製手順全体で使用されるすべてのバッファーは、２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（βＭＥ）を含んでいた。
【０１４３】
［実施例２］：ＨＣＶ  ＮＳ３  Ｎｂｔ−９ＮＢ４９Ｈのクローニングおよび発現
実施例１に記載されるＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、改変されたｐＥＴ３２ａプラスミドへとサブクローン化し、オープンリーディングフレームは、アミノ末端ビオチン化タグ（ＭＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号９１）をコードし、ＮＳ３コード配列の上流にＧＳＧＳＮＳＭ−リンカー配列（配列番号９２）、その後、カルボキシル末端ヘキサヒスチジンタグ、その後、ストップコドンを有する。得られるプラスミドは、ｐＮｂｔ−９ＮＢ４９Ｈと命名した。Ｂｅｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，８（４）：９２１−９２９，１９９９）によって記載されるビオチン化タグによって、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢｉｒＡ遺伝子によってコードされるビオチンリガーゼ酵素を介した部位特異的なビオチン組み込みが可能になる。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの制御下、ｐＮｂｔ−９ＮＢ４９Ｈ発現プラスミドおよびビオチンリガーゼを発現する第２のプラスミド（ｐＢｉｒＡｃｍ）で同時形質変換した。振とうフラスコ中、最終濃度が０．０５０ｍＭになるまでビオチンを加えたテリフィックブロス中、３７℃でＯＤ６００ｎｍが０．５０になるまで細胞を成長させ、次いで、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、２５℃で一晩成長させた。次いで、遠心分離によって細胞を集め、溶解バッファーで再懸濁させ、音波処理によって細胞を破壊した。ある場合には、高レベルの部位特異的なビオチン化をさらに確実にするために、上の溶解した細胞にＡＴＰおよびビオチンを加え（最終濃度がそれぞれ３ｍＭおよび０．２５ｍＭ）、室温で２時間インキュベートした。次いで、組み換えタンパク質を実施例１に記載されるようにＩＭＡＣによって精製した。
【０１４４】
［実施例３］：ＨＣＶ  ＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔのクローニングおよび発現
実施例１に記載されるＮＳ３  ９ＮＢ４９Ｈタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、改変されたｐＥＴ３２ａベクターへとサブクローン化し、オープンリーディングフレームは、Ｎ末端メチオニンをコードし、その後、ＮＳ３、その後、ＧＳＧＳＧ−リンカー（配列番号９３）およびヘキサヒスチジンタグ、その後、ＧＧ−リンカーおよびビオチン化タグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号９４）、最後にストップコドンを有した。得られるプラスミドは、ｐ９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔを命名した。タンパク質発現およびビオチン化を実施例１および２に記載するように行った。
【０１４５】
［実施例４］：ＨＣＶ  ＮＳ３ｈおよびこの改変体のクローニングおよび発現
以下の表２に記載され、図１に示されるようなＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼの種々の領域に融合したｐ９ＮＢ４９Ｈによって発現される同じアミノ末端（即ち、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１１９２から１２１５）を用いることによって組み換えＨＣＶ  ＮＳ３ヘリカーゼ改変体を構築した。このヘリカーゼ構築物をコードするヌクレオチド配列は、実施例１に記載されるようなカルボキシル末端ＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジンタグ（配列番号９５）または実施例２に記載されるようなカルボキシル末端ＧＳＧＳＧ−ヘキサヒスチジン−ＧＧ−ビオチン化タグ（配列番号９６）のいずれかを用い、改変したｐＥＴ３２ａベクター（マイナスチオレドキシン融合物）へとクローン化した。ビオチン化および精製を行うか、または行わずにタンパク質発現を実施例１および２に記載されるように行った。
【０１４６】
【表２】
0006505076.tif 000008
【０１４７】
［実施例５］：発酵、タンパク質の発現および精製
ＮＳ３組み換えタンパク質（例えば、９ＮＢ４９ＨまたはＮＳ３ｈ、またはこれらの改変体）を、１０Ｌ発酵器で培養したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現させた。Ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ（ＳＢ）Ｍｅｄｉａ（炭素源としてグリセロールを豊富に含む培地）を含む振とうフラスコで成長させた１２０ｍＬの種培地を使用し、ＳＢ培地を含む１０Ｌ発酵器に接種した。６００ｎｍでの光学密度  ８−１２に達するまで、細胞を３７℃で成長させた。イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が１ｍＭになるように加えることによって、タンパク質発現を誘発させた。次いで、培地を２５から３７℃でさらに４時間成長させた。次いで、発酵器から細胞を集め、次いで、中空繊維膜フィルタを通し、最初の体積１０Ｌから１から２リットルになるまで収穫物を濃縮した。次いで、濃縮した細胞を遠心分離によってペレット化し、上澄みを除去し、タンパク質精製に使用するまで、得られたペレットを−８０℃で保存した。
【０１４８】
誘導のときに最終濃度が０．０５ｍＭになるまでビオチンを加える以外は、上に記載される発酵を行うことによって、アミノ末端またはカルボキシル末端のビオチン化タグ配列（実施例２および３を参照）を含む組み換えＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏビオチン化を達成した。次いで、培養物を２５から３７℃でさらに４時間成長させ、上の章で記載されるように処理した。
【０１４９】
発現した可溶性ＨＣＶ  ＮＳ３組み換え抗原を含む凍結したＥ．ｃｏｌｉ細胞ペレットを凍結し、次いで、冷却した溶解バッファー（４０ｍＭ  ＮａＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％  グリセロール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．２）に再懸濁させ、その後、０℃で４５分間、連続的なフロー音波処理によって溶解させた。遠心分離して不溶性物質を除去した後、ＧＥニッケルセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂を上澄みに加え、２から８℃で一晩インキュベートした（１２５ｒｐｍで振り混ぜる。）。次いで、結合した抗原を含む樹脂を、洗浄バッファー（４０ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  イミジゾール、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール）を用いて穏和な減圧下で洗浄し、結合した抗原を、４０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５００ｍＭ  イミジゾール、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．２を含むバッファーを用いて溶出させた。以下のようにアニオン交換クロマトグラフィーによって抗原をさらに精製した。２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．４中、抗原をＧＥ  Ｑ  ＨＰアニオン交換樹脂に結合させ、その後、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ８．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いた勾配溶出を行った。次いで、溶出したタンパク質を、ＧＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムを用い、１０ｍＭ  ホスフェート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２を含む最終バッファーへと脱塩した。精製したＮＳ３タンパク質を−７０℃で保存した。
【０１５０】
［実施例６］：アクリジニウム−ウシ血清アルブミン（Ａｃｒ−ＢＳＡ）の調製
０．１％ナトリウムアジドを防腐剤として含むウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の３０％溶液（３００ｍｇ／ｍＬ）を、商業的な供給源（Ｐｒｏｌｉａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｎｋｅｎｙ、ＩＡ）から購入した。１ミリリットル（３００ｍｇ）の３０％ＢＳＡ溶液を２．０ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）で希釈し、０．５から３．０ｍＬ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に移し、０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）に対し、２から８℃で一晩透析した（２回交換、６００ｍＬ／交換）。透析したＢＳＡ溶液の濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ吸収に基づき、９７．１ｍｇ／ｍＬであった。２００ミリグラム（２．０６０ｍＬ、３．０ｕｍｏｌ、１．０ｍｏｌ当量）の９７．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ溶液を、１０．１８１ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ８．０）を含む褐色ガラスバイアルに加えた。この混合物に、３９ｍｇ（１．０９２ｍＬ、４５ｕｍｏｌ、１５．０ｍｏｌ当量）のＳＰＳＰ−アクリジニウム活性エステルのＤＭＦ［Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド］を加えた。反応バイアルに封をし、３５０ｒｐｍで３０分間攪拌することによって溶液を混合し、次いで、室温に一晩置いた（２０から２６時間）。インキュベーション後、遊離アクリジニウムおよび凝集物を、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）ランニングバッファーを用いたクロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  ＨＲ  Ｓ−２００カラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰＡ）によって除去した。モノマーＡｃｒ−ＢＳＡ複合体に対応するフラクションを保存し、ＵＶ分光法によって特性決定した（２４０から６００ｎｍをスキャン）。２８０ｎｍおよび３７０ｎｍでの吸収値を使用し、タンパク質の濃度を決定し、ＢＳＡ分子あたりのアクリジニウムの組み込みを計算した。計算されたタンパク質の濃度は、６．７７９ｍｇ／ｍＬであり、平均数は、ＢＳＡ分子あたり６．２のアクリジニウムであった。
【０１５１】
［実施例７］：マレイミドで活性化されたＡｃｒ−ＢＳＡの調製
マレイミドで活性化されたＡｃｒ−ＢＳＡの調製。Ａｃｒ−ＢＳＡ（実施例８；１３．５ミリグラム、２０２ｎｍｏｌｅ、１．０ｍｏｌ当量）１．９９ｍＬのＰＢＳ／０．１％ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）を褐色ガラスバイアルに加え、０．２５４ｍＬの０．４Ｍホスフェート／８ｍＭ  ＥＤＴＡ／１．６％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．４）で処理し、反応物のｐＨを７．４に調節した。均一な溶液に、０．０４０ｍＬ（０．３５ｍｇ、４．０ｍｏｌｅ当量）のスクシンイミジル  ４−（Ｎ  マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ）の新しい０．０２Ｍ水溶液を加えた。反応バイアルに封をし、溶液を泡立たせることなく２０分間攪拌し、次いで、暗室中、室温で６０から９０分間、静かにインキュベートした。反応混合物を脱塩し、０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）であらかじめ平衡状態にしたＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ）にかけることによって、組み込まれていないスルホ−ＳＭＣＣを除去した。溶出したＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌ試薬の吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍで測定し、タンパク質濃度を概算した。計算されたタンパク質濃度は、６．２８ｍｇ／ｍＬであった。ＨＣＶ  ＮＳ３抗原の接合にＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌをすぐに使用した。
【０１５２】
Ａｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌに対する組み換え９ＮＢ４９Ｈの接合。Ａｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌ（５．６ミリグラム、８４ｎｍｏｌｅ、２．０ｍｏｌｅ当量）の０．７８９ｍＬの０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）をポリプロピレン管に加えた。これに、１．２ｍｇ（１．３ｍＬ、４２ｎｍｏｌｅ、１．０ｍｏｌ当量）の組み換え９ＮＢ４９Ｈ抗原の０．０１Ｍ  ＰＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を加えた。この溶液を泡立たせることなく３０分間攪拌し、次いで、暗室中、室温で一晩、静かにインキュベートした。この段階で、または９ＮＢ４９Ｈ遊離システインのカルボキシメチル化の後に複合体を精製した。カルボキシメチル化の場合、未精製の複合体溶液を０．２７０ｍＬの０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ１１．０）で処理し、ｐＨを８．０に調節した。混合物を５分間攪拌し、次いで、０．９４ｍｇ（０．０２０ｍＬ、１２０ｍｏｌｅ当量）の新しい１Ｎ  ＮａＯＨの０．２５Ｍヨード酢酸（ＩＡＡ）溶液または０．２５Ｍヨードアセトアミド水溶液（ＩＡＭ）を混合しながら加え、９ＮＢ４９Ｈ遊離Ｃｙｓ−カルボキシメチル化を行った。暗室中、室温で６０分間、混合物を静かに反応させ、次いで、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）で平衡状態にしたＰＤ１０カラムを通した（溶出容積３．０ｍＬ）。
【０１５３】
Ａｃｒ−ＢＳＡ−９ＮＢ４９Ｈ複合体のタンパク質濃度は、複合体の２８０ｎｍでの吸光度から、Ａｃｒ−ＢＳＡが寄与する２８０ｎｍでの吸光度を引き算した後、決定された。９ＮＢ４９Ｈの１％（ｗ／ｖ）溶液の吸光度０．５２を使用し、タンパク質濃度を計算した。上述のように計算された９ＮＢ４９Ｈ濃度は、０．４０６ｍｇ／ｍＬであった。
【０１５４】
［実施例８］：アクリジニウム−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈ複合体の調製
（ＬＣ）マレイミドで活性化されたＡｃｒ−ＢＳＡの調製。Ａｃｒ−ＢＳＡ（実施例８；３．０ｍｇ、０．４４３ｍＬ、４５ｎｍｏｌ、または１．０ｍｏｌ当量）のＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）を褐色ガラスバイアルに加え、０．０５８ｍｌの０．４Ｍ  ホスフェート／８ｍＭ  ＥＤＴＡ／１．６％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．４）バッファーで処理し、反応物のｐＨを７．４に調節した。均一な溶液に、０．０１８ｍＬ（０．０８０ｍｇ、１８０ｎｍｏｌｅ、４．０ｍｏｌ当量）のスクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（Ｌｏｎ  ＣｈａｉｎまたはＬＣ−ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の新しい０．０１Ｍ溶液を加えた。反応バイアルに封をし、溶液を泡立たせることなく２０分間攪拌し、次いで、暗室中、室温で６０分間、静かにインキュベートした。反応混合物を脱塩し、０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）であらかじめ平衡状態にしたＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ）にかけることによって、組み込まれていないＬＣ−ＳＭＣＣを除去した。溶出したＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌ試薬の吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍで測定し、タンパク質濃度を概算した。計算されたタンパク質濃度は、５．２５ｍｇ／ｍＬであった。Ａｃｒ−ＢＳＡ−（ＬＣ）Ｍａｌを次の接合工程にすぐに使用した。
【０１５５】
Ａｃｒ−ＢＳＡ−（ＬＣ）Ｍａｌに対する組み換えＮＳ３ｈの接合。１．２０ｍＬ（３．１２ｍｇ）のＮＳ３ｈの０．０２５Ｍ  ホスフェート／０．２５Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭ  β−メルカプトエタノール／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の２．６ｍｇ／ｍＬ溶液をＰＤ１０脱塩カラムに通し、β−メルカプトエタノールを除去した。ＮＳ３ｈタンパク質を、２．５ｍＬの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）で溶出させ、溶出液の濃度は、２８０ｎｍでの吸光度によって２．９ｍｇ／ｍＬであると決定された。ポリプロピレン管に、１．５６ｍｇ（０．２９７ｍＬ、２３．４ｎｍｏｌｅ、２．０ｍｏｌ当量）のＡｃｒ−ＢＳＡ−（ＬＣ）Ｍａｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）、次いで、０．６０ｍｇ（０．５１８ｍＬ、１１．７ｎｍｏｌｅ、１．０ｍｏｌ当量）の組み換えＮＳ３ｈ抗原の０．０１Ｍ  ＰＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２）を加えた。この溶液を泡立たせることなく３０分間攪拌し、次いで、暗室中、室温で一晩静かにインキュベートした。この複合体溶液に、０．０９３ｍＬの０．５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ１１．０）を加え、混合物のｐＨを８．０に調節した。混合物を５分間攪拌し、次いで、０．５６ｍｇ（０．０１２ｍＬ、１２０ｍｏｌｅ当量）の新しい０．２５Ｍ  ヨード酢酸（ＩＡＡ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を混合しつつ加え、ＮＳ３遊離Ｃｙｓ−カルボキシメチル化を行った。混合物を暗室中、室温で６０分間静かに反応させ、０．０８０ｍＬの０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）を用いて最終容積を１．０ｍｌになるように調整し、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．３）で平衡状態にしたＰＤ１０カラムを通した（溶出容積２．５ｍＬ）。脱塩した複合体を、次にＳＥＣクロマトグラフィー（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム、Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）によって精製し、望ましくない凝集物を除去した。Ａｃｒ−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈ複合体タンパク質濃度は、複合体の２８０ｎｍでの吸光度から、Ａｃｒ−ＢＳＡが寄与する２８０ｎｍでの吸光度を引き算した後、決定された。ＮＳ３ｈの１％（ｗ／ｖ）溶液の吸光度０．９５を使用し、タンパク質濃度を計算した。
【０１５６】
［実施例９］：自動化された磁気微粒子に基づくイムノアッセイ
ＨＣＶ  ＮＳ３に由来するタンパク質を、常磁性微粒子および化学発光複合体を利用する自動化された免疫分析機を用い、抗−ＨＣＶ  ＮＳ３抗体を検出する能力について試験した（ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（Ｒ）システム；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；「Ｂｕｌｋ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｒａｎｄｏｍ−Ａｃｃｅｓｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ：ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ｉ２０００」Ｆｒａｎｋ  Ａ．Ｑｕｉｎｎ、３６３から３６７ページを参照。Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第３版、Ｄａｖｉｄ  Ｗａｒｄ編集、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ；米国特許第５，７９５，７８４号および米国特許第５，８５６，１９４号）。試験されるアッセイフォーマットは、２工程フォーマットまたは１工程フォーマットを含んでいた。アッセイは、一般的に、２工程および１工程の２つのフォーマットを含むものとして記載することができる（「疑似」１工程としても記載される。）。２工程フォーマットでは、ヒトサンプル、アッセイ特異的な希釈剤バッファーおよび組み換え抗原でコーティングされた常磁性微粒子を反応容器内で混合し、ボルテックスで攪拌し、１８分間インキュベートし、組み換え抗原に指向する抗体は、微粒子によって捕捉される。このインキュベーションの後、微粒子／免疫複合体は、磁石を用いて反応容器の側面に捕捉され、反応上澄みを除去する。次いで、微粒子を水／洗剤溶液で洗浄する。第２の工程では、微粒子に結合したサンプル由来の抗体は、アクリジニウム−標識された複合体を含むバッファー中の粒子の懸濁物およびインキュベーション（４分間）によって検出される。複合体は、ヒト免疫グロブリンまたはアクリジニウム−標識された組み換え抗原に指向するアクリジニウム−標識された抗体であってもよい。複合体と共にインキュベーションし、その後、第２の洗浄工程、最後に、アクリジニウムの活性化および光出力の同時測定を行い、光出力は、微粒子に結合した複合体の量に比例している。
【０１５７】
１工程フォーマットでは、ヒトサンプル、組み換え抗原コーティングされた常磁性微粒子およびアクリジニウム−標識された組み換え抗原で構成される複合体を含むアッセイ特異的な希釈剤バッファーを反応容器内で混合した。１８分間インキュベートした後、組み換え抗原に指向する抗体は、磁気微粒子によって同時に捕捉され、アクリジニウム−標識された組み換え抗原に結合した。その後、微粒子／免疫複合体は、磁石を用いて反応容器の側面に捕捉され、水／洗剤混合物で洗浄した。次いで、粒子を容器の壁から離れさせ、希釈剤に懸濁させ、４分間インキュベートした。インキュベーションの後、第２の洗浄工程を行い、最後に、アクリジニウムの活性化および光出力の同時測定を行い、光出力は、微粒子に結合した複合体の量に比例していた。
【０１５８】
ビオチン−捕捉イムノアッセイ。Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ分析機でのビオチン捕捉が介在するイムノアッセイは、ビオチン化されたＮＳ３タンパク質（例えば、実施例２から６に記載されるようなＮｂｔまたはＣｂｔ、または非部位特異的な様式でビオチンが化学的手段によってカップリングしたＮＳ３タンパク質）およびビオチン捕捉タンパク質（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、または抗−ビオチン抗体）コーティングされた磁気粒子を使用した。このフォーマットでは、サンプル中に存在するＮＳ３抗体とビオチニル−ＮＳ３との間に作られる免疫複合体は、微粒子表面に固定されたビオチン捕捉タンパク質を介して微粒子表面に捕捉された。アクリジン化されたＮＳ３組み換え抗原からなる複合体を、第１の工程または第２の工程に加え（即ち、捕捉工程の後）、捕捉された抗−ＮＳ３を検出してもよい。または、抗−ヒト抗体アクリジニウム複合体を第２の工程に加え、捕捉された抗−ＮＳ３を検出することができる。
【０１５９】
［実施例１０］：イムノアッセイフォーマット
以下のヒト標本を使用した。
【０１６０】
ネガティブコントロールサンプルは、再石灰化された非反応性ヒト血漿（ＨＢｓＡｇについて非反応性、抗−ＨＣＶ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡまたはＨＩＶ−１  Ａｇ、抗−ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２および抗−ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩについてネガティブ）である。
【０１６１】
「パネルＢ」として知られるポジティブコントロールサンプルは、Ｃｈｉｒｏｎ  ＲＩＢＡ  ＨＣＶ  ３．０  ＳＩＡ（２＋またはより大きなｃ３３バンド強度および他のバンドについて非反応性）によって決定される場合、単一の抗−ＨＣＶマーカーについて反応性のヒトの再石灰化されたヒト血漿サンプルである。このパネルを、二ナトリウム−ＥＤＴＡおよびナトリウムアジドを含む再石灰化された非反応性ヒト血漿（ＨＢｓＡｇについて非反応性、抗−ＨＣＶ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ、またはＨＩＶ−１  Ａｇ、抗−ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２および抗−ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩについてネガティブ）で希釈する。
【０１６２】
血液サンプル：市販のヒト血液サンプルのパネル（セロコンバージョンパネルと呼ばれる。）をＳｅｒａＣａｒｅ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびＺｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＭＡ）から得た。セロコンバージョンパネルは、初期の出血日においてＨＣＶ抗体にネガティブであるが、後の出血日には抗体に反応性の個人から得た順次希釈の血液サンプルからなる。セロコンバージョンパネルを利用し、種々の抗体試験および抗原／抗体試験の感度を決定した。感度の高い試験は、感度の低い試験よりも初期にＨＣＶへの曝露を検出する。
【０１６３】
コア抗原標本ＳＴ５  １：１０は、ＨＣＶ  ＲＮＡポジティブであり、ＨＣＶ抗体ネガティブであり、二ナトリウム−ＥＤＴＡおよびナトリウムアジドを含む再石灰化された非反応性のヒト血漿（ＨＢｓＡｇについて非反応性、抗  ＨＣＶ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡまたはＨＩＶ−１  Ａｇ、抗  ＨＩＶ  １／ＨＩＶ−２および抗−ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩについてネガティブ）で１：１０に希釈したヒト血漿である。
【０１６４】
ＣＡＬは、ＨＣＶコア、ＮＳ３およびＮＳ４に対する抗体に反応性であり、二ナトリウム−ＥＤＴＡおよびナトリウムアジドを含む再石灰化された非反応性ヒト血漿（ＨＢｓＡｇについて非反応性、抗  ＨＣＶ、ＨＩＶ−１  ＲＮＡまたはＨＩＶ−１  Ａｇ、抗  ＨＩＶ  １／ＨＩＶ−２および抗−ＨＴＬＶ−Ｉ／ＨＴＬＶ−ＩＩについてネガティブ）で希釈した、再石灰化されたヒト血漿である。
【０１６５】
［実施例１１］：ＨＣＶ抗原／抗体（コンボ）アッセイフォーマット
本明細書には、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓで開発されたＡＲＣＨＩＴＥＣＴイムノアッセイプラットフォームでの１回の反応でＣ型肝炎（ＨＣＶ）のコア抗原および抗体を検出する方法が記載される。原型となる化学発光イムノアッセイは、血清および血漿中のＨＣＶに対するＨＣＶコア抗原および抗体（抗−ＨＣＶ）を同時に検出するために開発された。この原型の組み合わせアッセイは、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ装置プラットフォームでの２工程（１８’／４’）、３瓶のアッセイである。ＨＣＶコンボ試験は、ＨＣＶに感染した個人の血液中に存在し得るＨＣＶコア抗原の検出に加え、ＨＣＶのコア、ＮＳ３およびＮＳ４タンパク質に対するヒト抗体を検出する。
【０１６６】
第１の工程では、この装置は、１１０ｕｌの標本と、瓶１からの５０ｕｌの反応混合物と、瓶２からの５０ｕｌのストレプトアビジン／ニュートラアビジンまたは抗−ビオチン常磁性微粒子を、微粒子希釈剤を含む洗剤（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．６、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１３．６％  スクロース、０．１％  Ｎｉｐａｓｅｐｔ、０．０００５％  Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ、５ｍＭ  ＤＴＴ  ＆  ５ｍＭグルタチオンを含み、２４．３ｍＭ  ＳＢ３−１４（Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）で希釈したものを分注する。瓶１は、ビオチンおよびアクリジニウム標識されたＨＣＶ特異的な試薬（ペプチド、タンパク質、抗体および種々の洗剤およびバッファー）の混合物を含み、血清または血漿中に存在するＨＣＶ抗体または抗原との免疫複合体生成を可能にする。具体的には、瓶１は、以下を含む。８０ｍＭ  ビス−トリス、ｐＨ６．３、０．９２Ｍ  ＮａＣｌ、８％  スクロース、１．７％  Ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００、３％  ＢＳＡ、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．０４％  メチルセルロース、７ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０４％  ナトリウムアジド）中の、アクリジン化されたコアペプチド５（ａａ  １５−６８＾３４＾４８）、ビオチン化されたコアペプチド５（ａａ  １５−６８＾３４＾４８）、アクリジン化されたＮＳ３組み換え抗原（９ＮＢ４９ＨまたはＮＳ３ｈ）、ビオチン化されたＮＳ３組み換え抗原（９ＮＢ４９Ｈ−ＣｂｔまたはＮＳ３ｈ−Ｃｂｔ）、アクリジン化されたＮＳ４ペプチドａａ  １６９４−１７３５、ビオチン化されたＮＳ４ペプチドａａ  １６９４−１７３５およびビオチン化されたｃ１１−７モノクローナル抗体。従って、この反応の第１の工程は、１１０ｕｌの標本と、５０ｕｌの瓶１からの反応混合物と、５０ｕｌの瓶２からのストレプトアビジン／ニュートラアビジン／抗−ビオチン微粒子を含み、１８分間延長し、種々の免疫複合体の生成を可能にする。
【０１６７】
抗体検出アッセイの第１の工程は、以下のように記載される。具体的には、抗−コア検出について、１つのビオチン標識されたコアペプチドおよび１つのアクリジニウム標識されたコアペプチドが反応混合物中に存在することが必要であり、標本中に存在する抗−コア抗体によって結合することができる。次いで、この免疫複合体は、ビオチンが結合するタンパク質でコーティングされた固相に結合し、この場合はニュートラアビジンであるが、または、ストレプトアビジンまたは抗−ビオチンであってもよい。抗−ＮＳ３反応のための工程は、１つのビオチン標識されたＮＳ３タンパク質と、１つのアクリジニウム標識されたＮＳ３タンパク質が反応混合物中に存在する必要があり、標本に存在する抗−ＮＳ３抗体によって結合することができる。抗−ＮＳ４と同様に、１つのビオチン標識されたＮＳ４ペプチドおよび１つのアクリジニウムＮＳ４標識されたペプチドが反応混合物中に存在する必要があり、標本中に存在する抗−ＮＳ４抗体によって結合することができる。
【０１６８】
抗原検出アッセイの第１の工程は、以下のように記載される。コア抗原検出反応の場合、血清または血漿中のＨＣＶコア抗原に結合することができるビオチン標識されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ  ｃ１１−７）は、１つ目の反応中に存在する（瓶１）。次いで、この免疫複合体は、これもビオチン部分を介し、固相に結合する。
【０１６９】
抗体および抗原の反応の第２の工程は、以下のとおりである。１８分のインキュベーション工程の後、微粒子を洗浄し、混合物から結合していない反応剤を除去する。次いで、微粒子を、種々の洗剤およびタンパク質（８０ｍＭ  Ｂｉｓ  トリス、ｐＨ６．３、０．９２４Ｍ  ＮａＣｌ、３．０％  スクロース、５．０％  ソルビトール、７ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．７％  Ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００、０．８％  ＰＶＳＡ（２５％溶液）、３．０％  ＢＳＡ、０．０２％  塩化ベンゼトニウム、５５，０００単位／Ｌ  ヘパリンナトリウム、０．２％  フッ化ナトリウム、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．３％  グリシン、０．２％  ＳＢ３−１２、０．４％  ＳＢ３−１６、０．２％  ＳＢ３−１８、０．１５％  ＣＨＡＰＳ、０．２％  サポニン、０．３５％  ＣＴＡＢ、０．０２％  ＴＴＡＢ、０．１％  ナトリウムアジド、０．１％  Ｎｉｐａｓｅｐｔ、１％  Ａ５６６２０、０．０４％  メチルセルロース）を含む緩衝化した溶液で希釈した瓶３からの複合体＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体と共にインキュベートする。この工程では、固相の上の任意の免疫複合体化したコア抗原が接合するだろう。第２の工程の４分のインキュベーションの後、微粒子は、標識された免疫複合体そのものと競争し、これを再び洗浄し、磁石によって未反応の要素から分離する。次いで、反応の引き金を引き、免疫複合体を介して固相に結合したアクリジニウム−標識された複合体から発生する化学発光シグナルを読み取り、この量は、試験されるサンプル中に存在した検体の量と比例している。
【０１７０】
［実施例１２］：コアペプチドの設計
ＨＣＶ感染の検出は、抗体検出のための複数のＨＣＶタンパク質の使用を必要とする（ＨＣＶコア、ＮＳ３およびある場合には、ＮＳ４およびＮＳ５ペプチドまたはタンパク質を含む。）。ＨＣＶコア抗原の検出は、ＨＣＶコア抗原に結合する抗体の使用を必要とし、このような抗体は、ＨＣＶコンボ試験の抗体側で利用されるＨＣＶコアタンパク質に結合してもよい。研究者は、ＨＣＶコア抗原を捕捉するために利用されるもの（このアッセイではＣ−１１−７）およびシグナルを発生するために利用されるもの（Ｃ１１−９／Ｃ１１−１４）の両方について、コア抗原試験で使用される抗体によって標的とされるＨＣＶコア抗原についてのアミノ酸配列を特定している。抗体によって認識されるそれぞれの部位について、この認識部位を含むアミノ酸は、アミノ酸の置換またはアミノ酸の欠失によって改変されていなければならない。
【０１７１】
改変されたコアペプチドは、５アミノ酸（アミノ酸残基３２から３４および４７から４８）をコアタンパク質から除去することによって作られ、従って、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ＨＣＶコア抗原試験で使用される２つのモノクローナル（Ｃ１１−１４およびＣ１１−９）による認識を避ける。これらの５アミノ酸を除去する望ましくない結果は、コアタンパク質に対するヒト抗体の応答が、これらのアミノ酸がないことによって犠牲となったことである。
【０１７２】
従って、一連のコアペプチドを作成し、コアタンパク質に最小限の改変がなされ得るかどうかを決定し、この結果、最小限改変されたペプチドは、コア抗原試験で利用される抗体によって認識されないが、コアタンパク質に対する抗体の十分な検出を可能にする。これらの改変されたペプチドは、５アミノ酸が欠失したコアペプチドで観察される反応性の消失の一部を回復するように設計された。モノクローナル抗体ｃ１１−９（ａａ  ２９−３７）およびｃ１１−１４（ａａ  ４５−４９）についての既知のエピトープ結合領域での特定の欠失／置換を設計することができ、この複合体による検出がなくなることが仮定された。
【０１７３】
コアペプチドの設計は、ＨＣＶのコア配列の別個の領域に標的とされたアミノ酸の欠失および／または置換を含み、これによって、これらの欠失／置換は、ＨＣＶコンボアッセイでのコアＡｇの検出のために使用される＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体による検出をうまく回避する。
【０１７４】
【表３】
0006505076.tif 000009
【０１７５】
それぞれの新しく合成されたコアペプチドで、ニュートラアビジン常磁性微粒子をコーティングし、＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体でプローブ化した。以下に示すように（表４）、ペプチド１（アミノ酸１５から６８のインタクトな配列）は、＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体と反応するとき、高いシグナルノイズ（Ｓ／Ｎ）値を与える。注釈：ネガティブコントロールは、任意のＨＣＶコアエピトープ認識分子を固相または液相のいずれかに含まない微粒子を含む。これらのネガティブコントロールは、低いＳ／Ｎ（シグナルノイズ）値を生じる。ポジティブコントロール（６Ｃ３７コーティングされた微粒子）は、ＨＣＶ組み換えタンパク質（ＨＣＶコアタンパク質のアミノ酸１から１５０を含む。）を含み、＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体による認識に起因して、高いＳ／Ｎ値を生じる。
【０１７６】
【表４】
0006505076.tif 000010
【０１７７】
上のペプチド１は、ＨＣＶコアタンパク質に対する抗体を検出するためにすでに使用されたアミノ酸１５から６８のインタクトなアミノ酸配列を表す。上のペプチド２は、合計で５アミノ酸が欠失しており、これらのアミノ酸のうち３つ（３２、３３および３４）は、Ｃ１１−９モノクローナル抗体についてのエピトープ認識部位の一部を表し、これらのアミノ酸のうち２つ（４７および４８）は、Ｃ１１−１４モノクローナル抗体についてのエピトープ認識部位を表す。ペプチド１のシグナルは、ＨＣＶコア複合体＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４によって認識されるため、大きい。ペプチド４および６から１０についてのＳ／Ｎ値は、Ｓ／Ｎ値＞３．０であり、コア複合体によっても認識されるため、ＨＣＶ組み合わせアッセイでの使用の候補ではない。ペプチド２、３および５についてのＳ／Ｎ値は、非常に低く、ネガティブコントロールについて示されるＳ／Ｎ比と類似しており、従って、ＨＣＶコア抗原複合体によって認識されず、これによって、ＨＣＶコンボ試験に有用な設計を作成する。
【０１７８】
【表５】
0006505076.tif 000011
【０１７９】
表５で上に示されるように、ペプチド２、３および５は、すべて、間接的なアッセイフォーマットで抗−ＨＣＶに反応性のヒト標本を用いると、免疫反応性を示す。ＨＣＶに対する抗体を含むヒトサンプルについてのＳ／Ｎ値は、ペプチド２でみられるよりも、ペプチド３および５でわずかに高いが、ペプチド５は、これらの２つのペプチドの中で最小の欠失を含む（ａａの３４および４８のみが欠失している。）ため、ペプチド５は、ＨＣＶコンボ開発のために選択するペプチドとして選択された。従って、ペプチド５は、＊Ａｃ−ＤＢＡ  ｃ１１−９／ｃ１１−１４複合体による検出をうまく回避し、ＨＣＶに感染したヒト標本に免疫反応性であり、ＨＣＶコンボのための候補ペプチドであると考えられた。
【０１８０】
［実施例１３］：モノクローナル抗体
ＨＣＶコンボ試験は、３つのモノクローナル抗体（Ｃ１１−７、Ｃ１１−１４およびＣ１１−９）を利用する。このモノクローナル抗体のうち２つ（Ｃ１１−７、Ｃ１１−１４）は、Ａｂｂｏｔｔの米国特許「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＣＶ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ＨＣＶ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」にすでに記載されている。２００４年４月２７日に登録されたＳｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６，７２７，０９２号。しかし、これらの２つのモノクローナル抗体の元々の開示は、２００３年９月２３日に登録されたＡｏｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，６２３，９２１号に引用された。第３のモノクローナル抗体は、刊行物に開示された（Ｍｏｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ  １５７：８（２００９），Ｍｕｅｒｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．によって特許出願第２０１２０００９１９６号で議論されている（公開日２０１２−０１−１２）。
【０１８１】
［実施例１４］：微粒子の調製
ＨＣＶコンボアッセイは、ビオチン−標識されたタンパク質（ストレプトアビジン、ニュートラアビジンおよび抗−ビオチン）を捕捉することができる１種類の磁気微粒子を使用する。簡単に言うと、Ｄｙｎａｌ  Ｍ２７０カルボン酸の元々の粒子を、ＭＥＳ−Ｃｈａｐｓバッファー、ｐＨ５．５（２５ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．１％  ３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（Ｃｈａｐｓ））で２回交換して洗浄する。粒子を、０．２５ｍｇ／ｍＬのＥＤＡＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）で、固形分１％で３０分間、あらかじめ活性化する。粒子を、ＭＥＳ−Ｃｈａｐｓバッファー（ｐＨ５．５）を１回交換して洗浄する。ニュートラアビジン／ストレプトアビジン／抗−ビオチンＡｂストック溶液を、０．４０ｍｇ／ｍＬ、固形分１％で粒子に６０分間かけて加える。粒子を、ＰＢＳ−Ｃｈａｐｓバッファー、ｐＨ７．２（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．１％  Ｃｈａｐｓ）を３回交換して洗浄する。最終的な粒子濃度は、ＰＢＳ−Ｃｈａｐｓバッファー（ｐＨ７．２）中、固形分１％である。その後、これらの微粒子を、微粒子希釈剤（２０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．６、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１３．６％  スクロース、０．１％  Ｎｉｐａｓｅｐｔ、０．０００５％  Ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１．５４ｇ／Ｌ  グルタチオンと、２４ｍＭ  ＳＢ３−１４（Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）を含む。）で、固形分が０．０７５％になるまで希釈する。
【０１８２】
［実施例１５］：ＨＣＶコアペプチド
合成ペプチドをＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）によって製造した。純度＞９５％。
【０１８３】
１．
【化１】
0006505076.tif 000012
（配列番号１０１）
２．アクリジン化された標識されたＨＣＶコアペプチド５を、アッセイのための複合体として使用し、以下のように表される。
【０１８４】
【化２】
0006505076.tif 000013
（配列番号１０１）
コアペプチド５のアクリジン化工程を実施例１８に記載する。
【０１８５】
［実施例１６］：ＮＳ４ペプチド（アミノ酸１６９４から１７３５）
これらの合成ペプチドをＡｎａ  Ｓｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ  ＣＡ）によって製造した。純度＞９５％。
【０１８６】
ＨＣＶコンボ試験は、２つの形態でＨＣＶ  ＮＳ４ペプチドを利用した。
【０１８７】
１．ビオチン化されたＮＳ４ペプチドは、以下のようにストレプトアビジンでコーティングされた微粒子に捕捉された。
【０１８８】
【化３】
0006505076.tif 000014
（配列番号１０７）
２．アクリジン化された標識されたＮＳ４ペプチドを、アッセイのための複合体として使用し、以下のように表される。
【０１８９】
【化４】
0006505076.tif 000015
（配列番号１０８）
ＮＳ４のアクリジン化工程を実施例１７に記載する。
【０１９０】
［実施例１７］：Ａｃｒ−ＢＳＡ−ＮＳ４ペプチド複合体の調製
１３ミリグラム（２．０ｍＬ、０．１９６ｕｍｏｌ、１．０ｍｏｌ当量）のＡｃｒ−ＢＳＡ−Ｍａｌの０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．７）（実施例２から）をポリプロピレン管に加えた。この溶液に、０．１００ｍＬ（４．０２ｍｇ、０．７８４ｕｍｏｌ、４．０ｍｏｌ当量）のＣ末端システインＮＳ４ペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の新しい４１ｍｇ／ｍＬ溶液を加えた。反応バイアルに封をし、溶液を泡立たせることなく簡単にボルテックスで攪拌し、暗室中、室温で一晩インキュベートした。次に、未精製複合体を０．２５ＭメルカプトエチルアミンＨＣｌ（ＭＥＡ）水溶液で、最終的に１．１４ｍＭ  ＭＥＡ反応濃度になるまで約３０分間処理し、未反応のマレイミド基をクエンチした。複合体を、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｇ３０００ＳＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ．、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）で０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）を用い、ＳＥＣクロマトグラフィーによってすぐに精製した。主要な複合体ピークに対応するフラクションを保存した。複合体の保存物の吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍで測定し、これを使用し、補正した２８０ｎｍ吸光値を決定した。複合体を使用中に−２０℃で保存した。
【０１９１】
［実施例１８］：Ａｃｒ−ＢＳＡ−コアペプチド複合体の調製
６ミリグラム（１．０１ｍＬ、９０ｎｍｏｌｅ、１．０ｍｏｌ当量）のＡｃｒ−ＢＳＡの０．１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）（実施例１から）をポリプロピレン管に加えた。この溶液に、０．４３１ｍＬ（４．３１ｍｇ、２２．５ｕｍｏｌ、２５０ｍｏｌ当量）の新しい１０ｍｇ／ｍＬの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）水溶液および０．２５９ｍＬ（２．５８ｍｇ、２２．５ｕｍｏｌ、２５０ｍｏｌ当量）の新しい１０ｍｇ／ｍＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）水溶液を加えた。混合物を穏やかにボルテックスで攪拌し、次いで、暗室中、室温で１０分間、静かに反応させた。この活性化されたＡｃｒ−ＢＳＡ複合体溶液に、４．４ｍｇ（０．８８１ｍＬ、０．７２ｕｍｏｌ、８ｍｏｌ当量）の新しい５．０ｍｇ／ｍＬのコアペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）の０．０１Ｍ  ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）を加えた。この溶液を穏やかにボルテックスで攪拌し、暗室中、室温で一晩反応させた。ＳＥＣクロマトグラフィーによって、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ．、Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）で、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ６．３）を用いて複合体を精製し、凝集物を除去した。主要な複合体ピークに対応するフラクションを保存した。Ａｃｒ−ＢＳａ−ＮＳ４ペプチド複合体の保存物の吸光度を２８０ｎｍおよび３７０ｎｍで測定し、これを使用し、補正した２８０ｎｍ吸光値を決定した。複合体を使用中に−２０℃で保存した。
【０１９２】
［実施例１９］：ビオチン化されたＣ１１−７モノクローナル抗体の調製
１３ミリグラム（１．０ｍＬ、８６．６ｎｍｏｌｅ、１．０ｍｏｌ当量）のＣ１１−７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）の１３．１ｍｇ／ｍＬの溶液を、０．９１６ｍＬの０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）バッファーの入った褐色ガラスバイアルに加えた。この溶液に、０．１４４ｍＬの０．１３３Ｍホスフェート／０．３７６Ｍ  ＮａＣｌ／７．５％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ８．０）を加え、反応物のｐＨを７．４から７．５に調節し、混合物を泡立たせることなく５分間攪拌した。この攪拌したＣ１１−７  ｍＡｂ溶液に、０．３５０ｍｇ（０．１００ｍＬ、４３３ｎｍｏｌｅ、５．０ｍｏｌ当量）のＣｈｒｏｍａｌｉｎｋビオチン（ＣＬＢ、ＳｏｌｕＬｉｎｋ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）の無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の５．７１ｍｇ／ｍＬの溶液を加えた。この混合物を３０分間攪拌し、次いで、暗室中、室温で静かに一晩反応させた。未精製複合体混合物は、合格であった。反応混合物を脱塩し、０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．１％  ＣＨＡＰＳ（ｐＨ７．２）で平衡状態にしたＺｅｂａスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＩＩ）を通すことによって、組み込まれていないＣＬＢビオチンを除去した。溶出したＣ１１−７  ｍＡｂ−ＣＬＢ複合体の吸光度を２８０ｎｍおよび３５４ｎｍで測定し、タンパク質濃度を概算し、抗体分子あたりのビオチンの組み込みを計算した。計算されたタンパク質濃度は、４．０３ｍｇ／ｍＬであり、Ｃ１１−７  ｍＡｂ分子あたりのビオチンの平均数は、４．１２であった。
【０１９３】
［実施例２０］：デキストラン−ＢＳＡの調製
蒸留水で調製した１．０６８ｍＬの過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１００ｍｇ／ｍＬ溶液を、１１７．４８ｍｇのデキストラン（１５０，０００ＭＷ  ＧＰＣ  Ｇｒａｄｅ、Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ、Ｈｏｌｂａｅｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を２．１ｍＬの蒸留水に溶解し、暗室中、攪拌しつつ、２３℃の水浴で１２０分間インキュベートすることによって調製したデキストラン溶液に加えた。１２０分が終了したら、１５０ｍＭ  ＨＥＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）バッファー（ｐＨ８．９）で平衡化した５５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｂｏｏｎｅ、ＩＡ）溶液６．４０８ｍＬを、酸化したデキストラン溶液に加え、暗室中、２３℃でさらに１２０分間反応を続けた。インキュベーション終了時に、１．０６ｇのボラン−ジメチルアミン複合体（９７％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、暗室中、２３℃で６０分かけてデキストラン−ＢＳＡ溶液に加え、その後、１．３４ｍＬの０．６５Ｍ  トリス−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））（ｐＨ７．５）バッファーを２３℃で１６から２０時間かけて加えた。ＰＢＳ中、２．６ｍＬ／分で平衡化したＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、得られた溶液を精製した。未精製デキストラン−ＢＳＡをカラムに入れ、２８０ｎｍで吸光度を監視しつつ、２．６ｍＬ／分で操作した。２．６ｍＬのフラクションを集め、空のフラクションを保存した。次いで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離濃縮機（５０，０００  ＭＷＣＯ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用い、この保存されたフラクションを１０ｍＬ未満になるまで濃縮した。この濃縮したデキストラン−ＢＳＡを、ナトリウムアジドおよびＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の溶液で、最終濃度が０．１％ナトリウムアジドおよび０．５％ＣＨＡＰＳになるまで増加させた。この溶液に、４５℃のオーブンで７日間熱によるストレスを加え、さらなるＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００カラム精製の前に２から８℃で保存した。ＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、２．６ｍＬ／分の流速でＰＢＳを用いて平衡化し、熱によるストレスが加えられたデキストラン−ＢＳＡをカラムに入れた。高分子量の凝集物および低分子量の分解生成物を除去するために、フラクションを保存した。
【０１９４】
保存したフラクションを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心分離濃縮機（上述のような）を用いて５ｍｇ／ｍＬより大きくなるまで濃縮し、複合体を調製するために使用されるまで、溶液を２から８℃で保存した。
【０１９５】
［実施例２１］：Ｃ１１−９／Ｃ１１−１４  Ｄｅｘｔｒａｎ−ＢＳＡ複合体の調製
リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、０．２％  ＣＨＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含む接合バッファー（ｐＨ７．４）中、６ｍｇの精製され、熱によるストレスを与えられたデキストラン−ＢＳＡ溶液（上述）を１．６２ｍｇのアクリジニウムＳＰＳＰ（９−［［［［４−［４−オキソ−４−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノキシ）ブチル］フェニル］スルホニル］（３−スルホプロピル）アミノ］カルボニル］−１０−（３−スルホプロピル）と反応させた。暗室中、室温で反応を一晩進めた。一晩の反応が終了したら、２．７ｍｇのスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、ＳＰＳＰ−デキストラン−ＢＳＡ溶液に加え、暗室中、室温で６０分間インキュベーションを続けた。ゲル濾過によって、リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＣＨＡＰＳを含むバッファー（ｐＨ６．０）で平衡化したカラムを用い、未反応のＳＰＳＰおよびｓＳＭＣＣを除去した。最終的な溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離濃縮機（３０，０００  ＭＷＣＯ）を用い、１０ｍｇ／ｍＬより大きくなるまで濃縮し、２８０ｎｍおよび３７０ｎｍでの吸光度を決定した。
【０１９６】
リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む接合バッファー（ｐＨ６．０）中、８．７６ｍｇのＣ１１−９：Ｃ１１−１４  Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの２．５：１（ｍｇ：ｍｇ）混合物を水浴中、３７℃で平衡化した。ＥＤＴＡを含むｐＨ６．０のリン酸ナトリウムバッファーで調製した０．３９ｍＬのシステアミンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１２０ｍＭ溶液を、温度を平衡化した抗体フラグメントに加え、３７℃で９０分間インキュベートした。フラグメントを還元した後、過剰なシステアミンＨＣｌを、リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＣＨＡＰＳを含むバッファー（ｐＨ６．０）で平衡化したカラムを用いたゲル濾過によって除去し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心分離濃縮機（１０，０００  ＭＷＣＯ）を用い、溶液を８ｍｇ／ｍＬより大きくなるまで濃縮した。５ｍｇ／ｍＬのＳＰＳＰおよびｓＳＭＣＣ標識されたデキストラン−ＢＳＡおよび４ｍｇ／ｍＬの還元したフラグメントを含む最終的な接合反応物を、リン酸ナトリウム、ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＣＨＡＰＳ、ｐＨ６．０バッファー中、暗室中、２から８℃で１６から２４時間インキュベートした。
【０１９７】
任意の未反応のマレイミド基を過剰なシステアミンＨＣｌで保護した後、０．１％  ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳ（ｐＨ６．３）で平衡化したＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ４００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用い、未精製接合反応物を精製した。高分子量材料および任意の結合していない抗体フラグメントを除去するために、主要な複合体ピークからフラクションを保存した。複合体の濃度を、抗体フラグメントの量として表し、ＳＰＳＰおよびｓＳＭＣＣ標識されたデキストラン−ＢＳＡの吸光度と比較して、２８０ｎｍおよび３７０ｎｍでの複合体の吸光度を用いて決定した。
【０１９８】
［実施例２２］：アッセイ希釈配合物
ＨＣＶコンボフォーマット中でコア抗原を検出することができるようにするために、コアカプシドタンパク質の曝露が必要である。この曝露は、外側の環の瓶（瓶１）または中側の環の瓶（瓶２）のいずれかに存在する洗剤の使用を必要とし、この洗剤は、非イオン性の分類であってもよく、および／またはアミンを含むアルキル鎖基を含んでいてもよい（Ａｏｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇ０１Ｎ  ３３／５７６、ＷＯ００／０７０２３、２０００年２月１０日）。
【０１９９】
ＨＣＶコア抗原を検出するために必要な洗剤は、抗体がＨＣＶコンボアッセイに利用されるＮＳ３タンパク質に結合する能力に対し、負の影響を有する。この抗−ＮＳ３シグナルの消失は、再現可能であり、ＮＳ３に対する抗体を含むが、他のＨＣＶタンパク質を含まない抗−ＮＳ３「のみ」のサンプルを用い、アッセイ開発工程中に監視された。本願発明者らの試験で利用されるサンプルは、パネルＢと呼ばれ、反応性の高いサンプルを、ＮＳ３に対する抗体にネガティブな正常なヒト血漿で希釈することによって調製される。パネルＢは、中程度の反応性を含むように希釈され、イムノアッセイによって患者サンプル中のＮＳ３に対する抗体を検出する能力のための代用マーカーとして働く。抗−ＮＳ３反応性を監視する際に、相対的な反応性を示すためにシグナルノイズ（Ｓ／Ｎ）比を利用し、高いＳ／Ｎが望ましい。抗−ＨＣＶアッセイを用いた以前の経験は、実行可能な抗体アッセイが、２０より大きなＳ／Ｎ値を与えるべきであることを示している。
【０２００】
［実施例２３］：ＨＣＶコンボアッセイに対する洗剤の効果
実施例１１に記載されるコンボフォーマット（および本明細書に記載されるコンボアッセイのすべての捕捉試薬）を用い、表６のデータは、抗−ＮＳ３の検出（パネルＢ）およびＨＣＶコンボアッセイフォーマット中のコア抗原の検出における双性イオン性洗剤スルホベタイン（ＳＢ３）のさまざまな炭化水素鎖長の効果を示す。反応物中に洗剤が存在しない場合、パネルＢの検出は、高い（Ｓ／Ｎ＝３９．６）が、コア抗原の検出は、低い（Ｓ／Ｎ＝３．８）。炭化水素鎖の長さが８（ＳＢ３−８）を反応に使用する場合、パネルＢおよびコア抗原の検出は、両方とも低い。炭化水素鎖の長さが増えるにつれて（特に１２または１４）、コア抗原の反応性は高まる。しかし、鎖長が１６の場合、コア抗原の検出およびパネルＢの反応性が両方とも低下し、パネルＢの検出と、コア抗原の検出との適切なバランスを与えるための最適な炭化水素鎖の長さは、１２から１４のようであることを示唆している。
【０２０１】
表６：ＨＣＶコンボアッセイフォーマット（Ｓ／Ｎ：サンプルｒｌｕ／ネガティブ血漿ｒｌｕの比率）中の抗−ＮＳ３およびコア抗原の検出における異なる双性イオン性洗剤の効果
【０２０２】
【表６】
0006505076.tif 000016
【０２０３】
表７は、さまざまな洗剤の使用およびパネルＢの検出およびコア抗原の検出に対するこれらの効果を示す。洗剤を含まないコントロール希釈剤は、パネルＢの良好な検出を示す（Ｓ／Ｎ＝６３．９）が、コア抗原の検出は、実質的にできなかった（Ｓ／Ｎ＝２．２）。他の洗剤は、パネルＢおよびコア抗原の中程度の検出を示す（Ｃ７ＢｚＯ）。最良の検出は、洗剤ＳＢ３−１４を用いたときにみられ、パネルＢおよびコア抗原の検出は、それぞれＳ／Ｎが７１．７および８１．９で最も高い。
【０２０４】
【表７】
0006505076.tif 000017
【０２０５】
試験で使用される洗剤のまとめ：洗剤ＳＢ３−１４、ＣＨＡＰＳ、Ｃ７ＢｚＯ（３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホネート）、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ（ＥＭＰＩＧＥＮ（Ｒ）ＢＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびＡＳＢ−１６（アミドスルホベタイン−１６）は、双性イオン性界面活性剤と分類され、これらは、中性の電荷を有し、分子内に同数の正電荷を有する化学基と負電荷を有する化学基が存在することから得られる。この群の洗剤は、膜タンパク質を可溶化する能力を有する（Ｓｉｇｍａａｌｒｉｃｈ．ｃｏｍ）。ＴＳＰ−１６は、非イオン性界面活性剤に分類され、帯電していない親水性頭部基を含む。スルホベタインＮＤＳＢ２５６（ジメチルベンジルアンモニウムプロパンスルホネート；Ｎ−フェニル−メチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−プロパン−スルホネート）およびＮＤＳＢ２０１（３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート）は、洗剤ではないスルホベタインに分類され、凝集を減らすことができ、タンパク質の折りたたみを補助することができる双性イオン性化合物である。凝集してミセルを生成することができないため、これらは洗剤とは考えられない。
【０２０６】
表８に示されるのは、微粒子希釈剤（瓶２、中側の環）の中で０から１００ｍＭの洗剤ＳＢ３−１４の滴定である。パネルＢおよびコア抗原の両方の最適な検出のためのＳＢ３−１４洗剤の濃度は、２５から７５ｍＭであるようであり、許容範囲のパネルＢ（Ｓ／Ｎ＞２０）およびコアＡｇ（Ｓ／Ｎ＞２０）の感度を有する。
【０２０７】
【表８】
0006505076.tif 000018
【０２０８】
［実施例２４］：アッセイの性能−洗剤の配置
表９は、選択したセロコンバージョンパネルに対するＨＣＶコンボアッセイの性能を示し、コア抗原検出に使用される洗剤は、外側の環（瓶１）に配置されるか、または中側の環（瓶２）に配置される。検出される出血の合計数が１９／２３であるとされ、性能はほぼ同じまま維持されている。
【０２０９】
表９：ＳＢ３−１４が外側の環の瓶（瓶１）または中側の環の瓶（瓶２）にある場合のＨＣＶコンボアッセイ安定性
【０２１０】
【表９】
0006505076.tif 000019
0006505076.tif 000020
【０２１１】
［実施例２５］：異なる試薬瓶でのＳＢ３−１４のアッセイ安定性
上述のように、コア抗原の検出に必要な洗剤は、同等の性能を有する外側の環の瓶（瓶１）または中側の環の瓶（瓶２）のいずれかに配置されていてもよい。しかし、６２日間の安定性試験は、ＮＳ３標本（パネルＢ）のｒｌｕの保持において、洗剤が、外側の環の瓶に保持されている場合には約６７％の低下を示し、一方、洗剤が中側の環の瓶に移動した場合には、ｒｌｕ保持率の明らかな低下はなかった（表１０）。
【０２１２】
表１０：異なる試薬瓶でのＳＢ３−１４のアッセイ安定性。試薬が２℃から８℃で保存される場合、長期間にわたるＮＳ３パネルのＲＬＵ。
【０２１３】
【表１０】
0006505076.tif 000021
【０２１４】
［実施例２６］：セロコンバージョンパネルに対するＨＣＶ組み合わせアッセイの性能
合計で９のセロコンバージョンパネルＰＨＶ−９０７、ＰＨＶ−９０９、ＰＨＶ−９１２、ＰＨＶ−９１３、ＰＨＶ−９１４、ＰＨＶ−９１９（ＳｅｒａＣａｒｅから市販されている。）およびＢＣＰ  ６２１４、ＢＣＰ  ６２２９およびＢＣＰ  ９０４４（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘから市販されている。）を、抗−ＨＣＶのみのアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ  ＬＮ６Ｃ３７）およびＨＣＶコンボアッセイ（上述）によって試験した。結果は、Ｓ／ＣＯ（サンプル／カットオフ）の観点で表され、Ｓ／ＣＯが１．０以上だと反応性であると考えられる。表１１に示されるように、ＨＣＶコンボアッセイは、これらのパネルにおいて、抗体のみのアッセイによって検出されるより速く、感染の証拠を検出する（６Ｃ３７）。以下に示される（表１２）のは、最初の一連の出血に対してＲＮＡポジティブであったセロコンバージョンパネルについて、日数単位での平均的なウインドウピリオドの減少である。ＨＣＶコンボアッセイは、抗体のみのアッセイよりも平均で約１８．４日速い検出を示し、ＲＮＡによって検出されるのとほぼ同等の検出を示した。一連の集合（ＰＨＶ−９１９）中にＲＮＡポジティブになった上に示される単一のセロコンバージョンパネルは、ＲＮＡと同時にＨＣＶコンボアッセイによる検出を示し、抗体のみのアッセイによる検出より３日速い。
【０２１５】
これらのデータは、ＨＣＶへの曝露の検出において、ＨＣＶ抗原／抗体コンボ試験の値が、抗体のみの試験より速いことを示す。
【０２１６】
【表１１】
0006505076.tif 000022
0006505076.tif 000023
【０２１７】
［実施例２７］
表１２  ＨＣＶコンボアッセイによるウインドウピリオドの減少。１回目の出血で検出されたＨＣＶ  ＲＮＡを含むＨＣＶセロコンバージョンパネルのＨＣＶ  ＡｇまたはＡｂの検出までの時間（日数）。
【０２１８】
【表１２】
0006505076.tif 000024
【０２１９】
［実施例２８］
表１３は、任意のフォーマットによって検出されたセロコンバージョン出血の最も高い数が、（潜在的な２１の出血の中で）検出される出血の合計数が１７であるキャプチャオンザフライＨＣＶコンボアッセイフォーマットによることを示す。６Ｃ３７抗体のみのアッセイは、１１の出血を検出し、一方、Ｍｕｒｅｘ  ＨＣＶコンボ（ＭｉＤＡＳ  Ｒｅｐｏｒｔ、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ−Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｒｅｐｏｒｔ  ＰＥＲ０６００７、Ｆｅｂｒｕａｒｙ、２００７）は、９の出血を検出した。表１４は、表１３に示される両方のセロコンバージョンパネルについてのＳ／ＣＯ情報を示す。さらに、表１４では、Ｓ／ＣＯ値は、パネルＢについて示される（抗−ＮＳ３のみのサンプル）。キャプチャオンザフライフォーマットは、より丈夫であり、Ｓ／ＣＯが６．１９であるのに対し、６Ｃ３７ではＳ／ＣＯが３から４であり、ＨＣＶコンボのためのキャプチャオンザフライフォーマットは、ＨＣＶセロコンバージョンパネルの検出に最も適したアッセイフォーマットであることを示している。
【０２２０】
表１３：２つの鍵となるセロコンバージョンパネルのための異なるアッセイフォーマットの感度の比較
【０２２１】
【表１３】
0006505076.tif 000025
【０２２２】
【表１４】
0006505076.tif 000026
【０２２３】
［実施例２９］：９ＮＢ４９ＨおよびＮＳ３ｈのセロコンバージョン感度
ＨＣＶに感染した個人からのセロコンバージョンパネルに由来する個人血清サンプルの中で抗体を検出する能力について、ＮＳ３組み換え抗原９ＮＢ４９Ｈ（Ａｃｒ−ＢＳＡ−９ＮＢ４９Ｈおよび９ＮＢ４９Ｈ−Ｃｂｔ）およびＮＳ３ｈ（ＮＳ３ｈ−ＣｂｔおよびＡｃｒ−ＢＳＡ−ＮＳ３ｈ）を、ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂコンボフォーマットで試験した。結果は、Ｓ／ＣＯ（サンプル／カットオフ）の観点で表され、Ｓ／ＣＯ≧１．０のサンプルは、反応性であると考えられ、Ｓ／ＣＯ＜１．０のサンプルは、非反応性であると考えられる。ＮＳ３ｈを用いたアッセイは、大きなセロコンバージョン感度が得られ、即ち、９ＮＢ４９ＨおよびＭｕｒｅｘ  ＨＣＶ  Ａｇ／Ａｂコンボを用いたアッセイと比較して、最も高いＳ／ＣＯ値で最も反応性の出血が検出された。
【０２２４】
【表１５】
0006505076.tif 000027
【図１】
0006505076.tif 000028
【配列表】
0006505076000001.app