(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮組織治療用細胞組成物を製造する方法であって、
（１）第一の細胞培養支持体上で上皮細胞を含む細胞群を培養し、第一の細胞層を得る工程、
（２）第二の細胞培養支持体上で間質細胞を含む細胞群を培養し、第二の細胞層を得る工程、
（３）前記第二の細胞層の上に、前記第一の細胞層を積層する工程、
を含み、ここで、前記第一細胞培養支持体及び前記第二細胞培養支持体が、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆したものである、子宮組織治療用細胞組成物の製造方法。
【請求項２】
前記第一培養支持体の細胞培養面が、多孔膜のセルインサートである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記上皮細胞が子宮組織由来である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記上皮細胞が、
（１）子宮内膜組織をミンス後、細胞分離用酵素で処理して子宮内膜組織細胞群を得る細胞分離工程、
（２）前記子宮内膜組織細胞群を細胞培養器材上に播種し、３０分〜４時間培養する培養工程、
（３）前記培養工程後に、前記細胞培養器材上に接着しない細胞を回収する工程、
により得られる細胞群に含まれる上皮細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記間質細胞が子宮内膜間質細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記間質細胞が、
（１）子宮内膜組織をミンス後、細胞分離用酵素で処理して子宮内膜組織細胞群を得る細胞分離工程、
（２）前記子宮内膜組織細胞群を細胞培養器材上に播種し、３０分〜４時間培養する培養工程、
（３）前記培養工程後に、前記細胞培養器材上に接着する細胞を回収する工程、
により得られる細胞群に含まれる子宮内膜間質細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
上皮細胞を含む細胞群からなる第一の細胞層と、間質細胞を含む細胞群からなる第二の細胞層とを有する子宮組織治療用細胞組成物であって、ここで、前記第一の細胞層は、前記第二の細胞層の上に積層され、前記第二の細胞層の最下層面が接着タンパク質を保持している子宮組織治療用細胞組成物。
【請求項８】
前記上皮細胞が子宮組織由来である、請求項７に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
【請求項９】
前記上皮細胞が子宮内膜上皮様の単層円柱上皮細胞である、請求項７または８に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
【請求項１０】
前記間質細胞が子宮組織由来である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
【請求項１１】
前記間質細胞が子宮内膜間質細胞である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
【請求項１２】
子宮組織損傷後の癒着を防止し、子宮組織を妊娠可能な状態へと治癒させることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮組織治療用細胞組成物に関する。また、子宮組織治療用細胞組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
産婦人科の各領域において、疾患はさまざまな理由により妊娠に影響を及ぼす。妊娠をした場合であっても、産科疾患の発生の可能性があり、正常から逸脱した妊娠経過をたどる場合もある。近年、女性の社会進出による晩婚化の影響で、さまざまな産科疾患を併発しやすい高齢妊娠の増加が問題視されている。一方で、妊娠年齢の上昇とともに妊娠率は低下するため、不妊症という問題も発生している。不妊症の原因は女性因子と男性因子に分けられるが、女性因子においてはさらに、排卵因子、卵管因子、子宮・頸管因子、免疫学的因子などに分けられる。これらの不妊症に対する治療としてはＡＲＴ（生殖補助医療）が有名であり、目覚ましい進歩を遂げているが、その一方で、それ以外の不妊治療についてはあまり進歩していないのが現状である。
【０００３】
子宮因子による不妊症は、子宮内腔および子宮内膜の変化が原因といわれている。子宮内腔の癒着・変性を伴う疾患として、流産後の子宮内容除去術や子宮鏡下手術、子宮内容遺残などが原因で起こる子宮腔癒着症（アッシャーマン症候群、ＩＵＡ）が知られている。この子宮腔癒着症に対する現在の治療法は、外科的に癒着を剥離したり、術後にホルモン剤の投与や子宮内避妊具（ＩＵＤ）の使用によって再癒着を防止するという方法を採用しているが、しばしば再癒着を起こしてしまうことが問題となっている。現在のところ、このような疾患に対して根本的な治療法は存在しない。
【０００４】
ＩＵＡは不妊症や無月経を含む月経異常を引き起こす。ＩＵＡと思われる患者に対して無治療で妊娠するかどうかを検討したところ４６％で妊娠が確認されたが、妊娠例の３０％しか正期産に至らず、１３％に癒着胎盤が発生したと報告されている（非特許文献１）。それ以外の報告でも５〜３１％に癒着胎盤が発生するといわれている。このようにＩＵＡは不妊症や月経異常以外にも妊娠における産科合併症にも影響を与えている。子宮内膜障害の原因となる掻爬術は、産後の胎盤遺残や流産手術に関しては掻爬を行わざるを得ない場合もあるため、癒着は一定の確率で起こると考えられる。これに対する治療法は、外科的に癒着剥離術を行うことが最も一般的である。
【０００５】
外科的剥離術としては子宮鏡下手術が標準的な方法である。剥離術後、子宮内膜の肥厚を目的としてホルモン剤（エストロゲンなど）が投与される治療が行われている。それにより、子宮内膜を刺激して創部の組織が再度上皮化するようになるといわれているが、確固たる証明はない。また、エストロゲンを使用しても反応がない患者もおり、その効果は一時的とも言われている。エストロゲン療法が失敗すれば子宮内膜の基底膜の障害や筋層の線維化が起きることで、血流障害などが起きる可能性もある。
【０００６】
一方で、術後の子宮内避妊具（ＩＵＤ）の使用に関してはその使用が支持されており、使用した場合の癒着率は約１０％であるのに対し、使用しなかった場合は約５０％で癒着が起こるとの報告がある（非特許文献２）。またＩＵＤを使用した４０５例の不妊患者のうち、妊娠率は５６％で、その内１２３例（６０％）が正常妊娠、４２例（２７％）が流産と報告されている（非特許文献１）。ＩＵＤの使用は治療効果を発揮する一方、リスクも孕んでいる。ＩＵＤはあくまで異物であり、組織と適合しない可能性や感染症を生じるリスクがある。また、ＩＵＤを使用したとしても再癒着の可能性も依然として残ったままである。
【０００７】
近年、再生医療分野の発展は著しく、さまざまな臓器を再生させる方法が模索されている。生体吸収性高分子を足場（スキャフォールド）として使用し、そこに細胞を播種することで３次元構造を保った臓器を作製する研究が行われている。生体適合性スキャフォールドはゲル状で扱いやすく、３次元構造を構築しやすいといった利点があるが、その一方で、コラーゲンやゼラチンなどの動物由来の高分子には動物成分が含まれていることなどが問題点としてあげられている。
【０００８】
近年、こうした問題解決するために、温度応答性高分子を被覆した培養皿を用いる培養法が開発されている（特許文献１〜３）。この技術により、細胞そのものをシート状の組織として移植することが可能となっている。これまでに、イヌの拡張型心筋症様モデルに対して筋芽細胞シートを移植することで心拍出量が改善することが確認されており（非特許文献３）、ヒトへの実用化を目指した治験も行われている。食道領域では、食道粘膜切除の術後合併症である切除部位の狭窄が問題となるが、切除部位に自己口腔粘膜上皮細胞（ＯＭＥＣ）を用いた細胞シートを移植することで狭窄が予防できることが証明されている（非特許文献４）。眼科領域では、角膜移植が必要となる角膜上皮の障害に対して、自己の口腔粘膜上皮細胞シート（ＯＭＥＣｓ）を移植することで視力が回復することが証明されている（非特許文献５）。
【０００９】
産婦人科の領域における再生医療研究も行われている。例えば、ＶＥＧＦを付加したコラーゲンを注射することで子宮組織の再生を促す研究（非特許文献６）やコラーゲンをスキャフォールドとして用いて子宮組織を再生させる研究（非特許文献７）、シルクのスポンジでできたスキャフォールドを用いた子宮頸管様の組織を構築する研究などが行われている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平０２−２１１８６５号公報
【特許文献２】特開平０５−１９２１３８号公報
【特許文献３】再表０２−００８３８７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Schenker, J.G. and E.J. Margalioth, Intrauterine adhesions: an updated appraisal. Fertil Steril, 1982. 37(5): p.593-610.
【非特許文献２】Polishuk, W.Z., A. Adoni, and I. Aviad, Intrauterine device in the treatment of traumatic intrauterine adhesions. Fertil Steril, 1969. 20(2): p.241-9.
【非特許文献３】Hata, H., et al., Grafted skeletal myoblast sheets attenuate myocardial remodeling in pacing-induced canine heart failure model. J Thorac Cardiovasc Surg, 2006. 132(4): p.918-24.
【非特許文献４】Ohki, T., et al., Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology, 2012. 143(3):p.582-8.e1-2.
【非特許文献５】Nishida, K., et al., Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med, 2004. 351(12): p.1187-96.
【非特許文献６】Lin, N., et al., The effect of collagen-binding vascular endothelial growth factor on the remodeling of scarred rat uterus following full-thickness injury. Biomaterials, 2012. 33(6): p. 1801-7.
【非特許文献７】Li, X., et al., Regeneration of uterine horns in rats by collagen scaffolds loaded with collagen-binding human basic fibroblast growth factor. Biomaterials, 2011. 32(32): p.8172-81.
【非特許文献８】House, M., et al., Oxygen tension and formation of cervical-like tissue in two-dimensional and three-dimensional culture. Tissue Eng Part A, 2012. 18(5-6): p.499-507.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来の子宮組織の再構築を目指した臓器再生研究は発展途上の段階であり、いずれの方法においても子宮組織を妊娠可能な状態にまで治癒させる技術として証明されていない。また、子宮腔癒着症に対する現在の治療技術では、再癒着の問題などが残っているなど、根本的な解決には至っていない。
【００１３】
そこで上記課題に鑑み、本発明は、子宮腔癒着症を含む子宮組織に起こる損傷を治癒し、妊娠可能な状態とする子宮組織治療用細胞組成物を提供することを目的とする。また、当該子宮組織治療用細胞組成物を製造する方法、及びその方法により製造される子宮組織治療用細胞組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、上皮細胞を含む第一の細胞層と、間質細胞を含む第二の細胞層とを有し、前記第二の細胞層の上に前記第一の細胞層が積層された細胞組成物が、子宮腔癒着症を含む子宮組織に起こる損傷を治癒し、性周期の変化を有しつつ妊娠可能な状態へと回復させる能力を有していることが明らかとなった。
【００１５】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１６】
［１］子宮組織治療用細胞組成物を製造する方法であって、第一の細胞培養支持体上で上皮細胞を含む細胞群を培養し、第一の細胞層を得る工程、第二の細胞培養支持体上で間質細胞を含む細胞群を培養し、第二の細胞層を得る工程、前記第二の細胞層の上に、前記第一の細胞層を積層する工程、を含む子宮組織治療用細胞組成物の製造方法。
［２］前記第一細胞培養支持体及び前記第二細胞培養支持体が、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆したものである、［１］に記載の製造方法。
［３］前記第一培養支持体の細胞培養面が、多孔膜のセルインサートである、［１］または［２］に記載の製造方法。
［４］前記上皮細胞が子宮組織由来である、［１］〜［３］に記載の製造方法。
［５］前記上皮細胞が、子宮内膜組織をミンス（ｍｉｎｃｅ）後、細胞分離用酵素で処理して子宮内膜組織細胞群を得る細胞分離工程、前記子宮内膜組織細胞群を細胞培養器材上に播種し、３０分〜４時間培養する培養工程、前記培養工程後に、前記細胞培養器材上に接着しない細胞を回収する工程、により得られる細胞群に含まれる上皮細胞である、［１］〜［４］に記載の製造方法。
［６］前記間質細胞が子宮内膜間質細胞である、［１］〜［５］に記載の製造方法。
［７］前記間質細胞が、子宮内膜組織をミンス後、細胞分離用酵素で処理して子宮内膜組織細胞群を得る細胞分離工程、前記子宮内膜組織細胞群を細胞培養器材上に播種し、３０分〜４時間培養する培養工程、前記培養工程後に、前記細胞培養器材上に接着する細胞を回収する工程、により得られる細胞群に含まれる子宮内膜間質細胞である、［１］〜［６］に記載の製造方法。
［８］［１］〜［７］に記載の製造方法により得られる子宮組織治療用細胞組成物。
［９］上皮細胞を含む細胞群からなる第一の細胞層と、間質細胞を含む細胞群からなる第二の細胞層とを有する子宮組織治療用細胞組成物であって、ここで、前記第一の細胞層は、前記第二の細胞層の上に積層され、前記第二の細胞層の最下層面が接着タンパク質を保持している子宮組織治療用細胞組成物。
［１０］前記上皮細胞が子宮組織由来である、［９］に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
［１１］前記上皮細胞が子宮内膜上皮様の単層円柱上皮細胞である、［９］または［１０］に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
［１２］前記間質細胞が子宮組織由来である、［９］〜［１１］に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
［１３］前記間質細胞が子宮内膜間質細胞である、［９］〜［１２］に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
［１４］子宮組織損傷後の癒着を防止し、妊娠可能な状態へと治癒させることを特徴とする、［９］〜［１３］に記載の子宮組織治療用細胞組成物。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に示される細胞組成物を使用することにより、産婦人科領域、特に子宮腔癒着症を含む子宮組織に起こる損傷を治癒し、なおかつ妊娠可能な状態へと回復させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の子宮内膜細胞シート作製の手順を示す図である。
【図２】実施例１で得られた子宮内膜細胞シートの組織切片を示すものである。（Ａ）組織切片をＨＥ染色したようすを示す図である。（Ｂ）組織切片を蛍光標識した抗体で免疫染色したようすを示す図である。赤はビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、緑はＣＫ１８、青は細胞核の位置を示している。
【図３】実施例２で作製した子宮内膜細胞シートを移植したヌードラットの子宮組織のようす示した図である。上段左二つは正常ヌードラットの子宮、下段と上段右側は子宮内膜全層欠損したヌードラットに子宮内膜細胞シートを移植した個体の子宮であり、組織切片をＨＥ染色とＧＦＰ染色をしたものである。矢印は再構築された子宮内膜腺構造を示す。
【図４】本発明の妊娠評価実験の流れを示す図である。
【図５】実施例３の子宮内膜細胞シート移植による妊娠能回復効果を示す図である。（Ａ）：子宮内膜細胞シートを移植したヌードラットの妊娠子宮の様子を示す。双角子宮のうち一方の子宮の内膜を全層欠損させ、子宮内膜細胞シートを移植した。ＧＦＰ陽性部分は移植した細胞シートであり、その部位に胎嚢ができているのが確認できた。（Ｂ）：エコーによる胎児の様子を示した図である。（Ｃ）：双角子宮のうち一方の子宮の内膜を全層欠損させ、細胞シートを移植していない個体の子宮の様子を示した図である。
【図６】実施例３の子宮内膜細胞シートを移植したヌードラットの妊娠子宮断面と胎仔の様子を示した図である。３つの図はそれぞれ別個体の子宮断面を示したものである。緑の蛍光を示す部分が移植した子宮内膜細胞シートである。矢印は胎仔である。
【図７】実施例３の子宮内膜細胞シートを移植したヌードラットの子宮と胎児の組織切片の様子を示した図である。（Ａ）：子宮・胎仔の組織切片をＨＥ染色したものである。（Ｂ）：ＧＦＰとα−ＳＭＡで免疫染色したものである。ＧＦＰ陽性の部位が移植した子宮内膜細胞シートである。
【図８】実施例２の子宮内膜細胞シートを移植したヌードラットの子宮組織切片を示す図である。上段はＨＥ染色による画像、下段はＧＦＰの免疫染色の画像を示している。（Ａ）：子宮の断面図を示す。（Ｂ）：（Ａ）の画像の一部拡大図である。（Ｃ）：細胞シートを移植した子宮内膜の部位であり、かつ、妊娠していない部位を拡大した図である。
【図９】実施例４の子宮内膜細胞シート移植による妊娠能回復効果を示す図である。（Ａ）：子宮内膜細胞シートを移植したＳＤラットの子宮の様子を示す。（Ｂ）：（Ａ）と同じ子宮にＧＦＰを励起する光源を照射して観察した図である。緑の蛍光を示す部位が移植した細胞シートの場所である。（Ｃ）：細胞シートを移植した側の子宮をエコー画像で観察した図である。
【図１０】比較例１の子宮内膜細胞シート（間質シート）を移植したヌードラットの子宮組織を示す図である。（Ａ）：子宮組織切片をＨＥ染色した像を示す図である。（Ｂ）：ＧＦＰの免疫染色の水平断の図である。緑が移植した細胞シートであることを示す。青は細胞核を示す。（Ｃ）：ＧＦＰの免疫染色の冠状断である。
【図１１】比較例２の子宮内膜細胞シート（間質シート）を移植したヌードラットの子宮組織を示す図である。子宮腔の癒着を防止するためにシリコンチューブを留置した。（Ａ）：移植した細胞シートの様子を示す（緑の蛍光部分）。黒円で示す部分はシリコンチューブを示している。（Ｂ）：シリコンチューブを縫合固定した図を示す（矢印）。
【図１２】比較例２の子宮内膜細胞シート（間質シート）を移植したヌードラットの子宮組織を示す図である。（Ａ）ＨＥ染色した組織切片の様子を示す。（Ｂ）緑は移植した細胞シート、赤はα−ＳＭＡ抗体で染色された平滑筋、青は細胞核をそれぞれ示す。（Ｃ）：赤はプロゲステロンレセプター、青は細胞核をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、子宮組織治療用細胞組成物に関するものである。本発明において、細胞組成物とは、細胞を含むいかなる組成物も含むものである。例えば、細胞と細胞外マトリックスを構成するタンパク質を添加した組成物であってもよく、細胞とその細胞が産生する細胞外マトリックスを構成するタンパク質を含む組成物であってもよく、特に限定されない。また、細胞外マトリックスを構成するタンパク質は、遺伝子組み換えタンパク質であってもよく、それをコードする遺伝子が組み込まれた、又はベクター等により遺伝子導入された細胞から産生されるタンパク質であってもよく、特に限定されない。
【００２０】
子宮組織とは、哺乳類のメスの生殖器のことをいい、妊娠時に体内で胎児を育てるときに胎児の入れ物になる器官のことをいう。哺乳類、特にヒトにおける子宮組織は、箱状の腔を形成した構造になっている。子宮体部において受精卵の発生、胎児の育成を行う。子宮体部は、子宮内膜、筋層、漿膜から構成されている。
【００２１】
子宮内膜は、組織構造から２つに分類でき、内膜上皮層と内膜間質層に分けることができる。内膜上皮層は、単層円柱の細胞からなり、分泌細胞と線毛細胞を含み、子宮腔にもっとも近い細胞層である。内膜間質層は、子宮内膜腺を数多く有した構造である。子宮内膜線の入り口は子宮腔に面した上皮とつながっており、一番奥は子宮内膜の深部まで伸びている。子宮内膜腺からは、粘液が分泌され子宮内膜の表面を覆い、受精卵・胚の発育を助ける。
【００２２】
子宮内膜は、機能面からも２層に分類できる。性周期で変化が起こらない子宮内膜の深部にある基底層と、性周期で厚さ及び構造を変化させ、子宮内膜腺やラセン動脈を有する機能層の２つである。
【００２３】
ヒトの子宮内膜は、女性ホルモンであるエストロゲン、プロゲステロンに依存し、性周期に応じてその厚さを変化させる。月経終了から排卵期までの期間、エストロゲンのレベルが増加し、子宮内膜、特に機能層が増殖する（増殖期）。排卵期を過ぎると一時的にエストロゲンのレベルが減少するものの、その後、再びエストロゲンのレベル、及びプロゲステロンのレベルが増加し、子宮内膜が肥厚する（分泌期）。このとき、子宮内膜の子宮腺が発達し、分泌が促進され、子宮内膜間質層の浮腫が起きる。こうして受精卵の着床に適した環境が作りだされる。その後、平均して２８日周期で月経期が訪れ、機能層の剥離が起こる。この時、エストロゲン、プロゲステロンのレベルはともに減少する。こうした性周期による子宮粘膜の肥厚、剥離は、女性において正常な妊娠を行う上で重要な役割を果たしている。
【００２４】
本発明における子宮組織治療用細胞組成物とは、上皮細胞を含む第一の細胞層と、間質細胞を含む第二の細胞層とを有し、前記第二の細胞層の上に前記第一の細胞層が積層された細胞組成物である。上皮細胞には、体表面を覆う表皮や、管腔臓器の粘膜を構成する上皮、外分泌腺を構成する腺房細胞や内分泌腺を構成する腺細胞などが含まれるが、本発明に用いられる上皮細胞としては、粘膜を構成する細胞であることが好ましい。例えば、口腔粘膜、鼻粘膜、食道粘膜、子宮粘膜（子宮内膜）などに含まれる上皮細胞である。特に、子宮組織を掻爬したために引き起こされる癒着を防止し、性周期に応じた変化を有する子宮組織へと回復させたり、妊娠可能な状態まで子宮組織を回復させることが出来るため、子宮組織由来の上皮細胞がよく、さらに好ましくは子宮内膜由来の上皮細胞を用いるのが好ましい。また、これらの上皮細胞は単一の種類の細胞であってもよく、複数の種類の細胞が混ざっていてもよく特に限定しない。また、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から誘導された上皮細胞であってもよい。第一の細胞層に含まれる上皮細胞の割合は６０％以上がよく、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）である。第一の細胞層には上皮細胞以外の細胞が含まれていてもよく、その細胞の種類は特に限定されない。
【００２５】
間質細胞とは、上皮細胞の支持組織を構成する細胞であり、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、子宮間質細胞等が含まれる。間質細胞は、炎症反応や創傷治癒反応に関連し、正常組織の維持に重要な役割を果たしている。本発明においては、子宮組織を掻爬したために引き起こされる癒着を防止し、性周期に応じた変化を有する子宮組織へと回復させたり、妊娠可能な状態まで子宮組織を回復させる効果が得られることから、間質細胞は子宮間質細胞が含まれていることが好ましい。また、間質細胞はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から誘導されたものであってもよい。第二の細胞層に含まれる間質細胞の割合は６０％以上がよく、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）である。第二の細胞層には間質細胞以外の細胞が含まれていてもよく、その細胞の種類は特に限定されない。また、これらの間質細胞は単一の種類の細胞であってもよく、複数の種類の細胞が混ざっていてもよい。
【００２６】
本発明に用いられる細胞の動物種の由来は、特に制約されるものではないが、例えば、ヒト、或いはラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等が挙げられる。本発明の細胞組成物をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタの治療に用いる場合はブタ、サルの治療に用いる場合はサル、チンパンジーの治療に用いる場合はチンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。また、治療を行うのがヒトである場合、患者本人から採取した細胞であってもよく（自家移植）、他人の細胞から採取した細胞を用いてもよく（同種移植）、市販の細胞株であってもよい。
【００２７】
本発明における細胞層とは、細胞培養器材上で培養して得られる１層、または複数層（例えば、２〜６層）からなるシート状の細胞群のことをいう。細胞層を得る方法としては特に限定されるものではないが、例えば、温度、ｐＨ、光等の刺激によって分子構造が変化する高分子を被覆した細胞培養器材上で細胞を培養し、温度、ｐＨ、光等の条件を変えて、細胞培養器材表面を変化させることで、細胞間の接着状態は維持しつつ、細胞培養器材表面から細胞層として剥離する方法、任意の細胞培養器材にて細胞を培養し、細胞培養器材の端部から、物理的にピンセット等により剥離する方法等が挙げられる。特に好ましいのが、０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、その後、培養液をポリマーの水和力が強い状態となる温度に変化させることで培養し、細胞をシート状に剥離させる方法である。その際、細胞は０〜８０℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養支持体上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度とは通常、細胞を培養する温度である３７℃が好ましい。本発明に用いる温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平２−２１１８６５号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、以下のモノマーの単独重合または共重合によって得られる。使用し得るモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−（若しくはＮ，Ｎ−ジ）アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の２種以上を使用することができる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋することも可能である。その際、培養、剥離されるものが細胞であることから、分離が５℃〜５０℃の範囲で行われるため、温度応答性ポリマーとしては、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（同３２℃）、ポリ−Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド（同４３℃）、ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド（同４５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド（同約４５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（同約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（同約３５℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド（同５６℃）、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド（同３２℃）などが挙げられる。本発明に用いられる共重合のためのモノマーとしては、ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリアクリル酸及びその塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロース、カルボキシメチルセルロースなどの含水ポリマーなどが挙げられるが、特に制約されるものではない。
【００２８】
本発明で用いられる、上述の各ポリマーの器材表面への被覆方法は、特に制限されないが、例えば、器材と上記モノマーまたはポリマーを、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、有機重合反応のいずれかにより、または塗布、混練等の物理的吸着等により行うことができる。培養器材表面への温度応答性ポリマーの被覆量は、１．１〜２．３μｇ／ｃｍ2の範囲がよく、好ましくは１．４〜１．９μｇ／ｃｍ2であり、さらに好ましくは１．５〜１．８μｇ／ｃｍ2である。１．１μｇ／ｃｍ2より少ない被覆量のとき、刺激を与えても当該ポリマー上の細胞は剥離し難く、作業効率が著しく悪くなり好ましくない。逆に２．３μｇ／ｃｍ2以上であると、その領域に細胞が付着し難く、細胞を十分に付着させることが困難となる。このような場合、温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆すれば、器材表面の温度応答性ポリマー被覆量は２．３μｇ／ｃｍ2以上であってもよく、その際の温度応答性ポリマーの被覆量は９．０μｇ／ｃｍ2以下がよく、好ましくは８．０μｇ／ｃｍ2以下がよく、７．０μｇ／ｃｍ2以下が好都合である。温度応答性ポリマーの被覆量が９．０μｇ／ｃｍ2以上であると温度応答性ポリマー被覆層の上にさらに細胞接着性タンパク質を被覆しても細胞が付着し難くなり好ましくない。そのような細胞接着性タンパク質の種類は何ら限定されるものではないが、例えば、コラーゲン、ラミニン、ラミニン５、フィブロネクチン、マトリゲル等の単独、もしくは２種以上の混合物が挙げられる。また、これらの細胞接着性タンパク質の被覆方法は常法に従えばよく、通常、細胞接着性タンパク質の水溶液を器材表面に塗布し、その後その水溶液を除去しリンスする方法がとられている。本発明は、温度応答性培養皿を利用したなるべく細胞シートそのものを利用しようとする技術である。従って、温度応答性ポリマー層上の細胞接着性タンパク質の被覆量が極度に多くなっては好ましくない。温度応答性ポリマーの被覆量、並びに細胞接着性タンパク質の被覆量の測定は常法に従えばよく、例えばＦＴ−ＩＲ−ＡＴＲを用いて細胞付着部を直接測る方法、あらかじめラベル化したポリマーを同様な方法で固定化し細胞付着部に固定化されたラベル化ポリマー量より推測する方法などが挙げられるがいずれの方法を用いてもよい。
【００２９】
本発明の方法において、培養時に播種する細胞数は使用細胞の動物種によって異なるが、一般的に０．２×１０6〜１０×１０6個／ｃｍ2がよく、好ましくは０．３×１０6〜９×１０6個／ｃｍ2がよく、さらに好ましくは０．４×１０6〜８×１０6個／ｃｍ2がよい。本発明においては、培養した細胞シートを温度応答性培養器材から剥離回収するには、培養された細胞の付着した培養器材の温度を、被覆ポリマーの上限臨界溶解温度以上若しくは下限臨界溶解温度以下にすることによって剥離させることができる。その際、培養液中において行うことも、その他の等張液中において行うことも可能であり、目的に合わせて選択することができる。細胞をより早く、より高効率に剥離、回収する目的で、培養器材を軽くたたいたり、ゆらしたりする方法、更にはピペットを用いて培地を撹拌する方法、ピンセットを用いる方法等を単独で、あるいは併用して用いてもよい。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。
【００３０】
以上のことを、温度応答性ポリマーとしてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）を例にとり説明する。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は３１℃に下限臨界溶解温度を有するポリマーとして知られ、遊離状態であれば、水中で３１℃以上の温度で脱水和を起こしポリマー鎖が凝集し、白濁する。逆に３１℃以下の温度ではポリマー鎖は水和し、水に溶解した状態となる。本発明では、このポリマーがシャーレなどの器材表面に被覆、固定されたものである。したがって、３１℃以上の温度であれば、培養器材表面のポリマーも同じように脱水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が疎水性を示すようになる。逆に、３１℃以下の温度では、培養器材表面のポリマーは水和するが、ポリマー鎖が培養器材表面に被覆、固定されているため、培養器材表面が親水性を示すようになる。このときの疎水的な表面は細胞が付着、増殖できる適度な表面であり、また、親水的な表面は細胞が付着できないほどの表面となり、培養中の細胞、もしくは細胞シートも冷却するだけで剥離させられることになる。
【００３１】
被覆を施される培養器材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外のポリマー化合物、セラミックス類など全て用いることができる。
【００３２】
本発明における細胞培養器材の形状は特に制約されるものではないが、例えばディッシュ、マルチプレート、フラスコ、多孔膜上で培養するセルインサートのような形態のもの、或いは平膜状のものなどが挙げられる。培養する細胞が上皮系の細胞である場合、セルインサートを用いると、細胞の上下に培養液が触れさせることができ、細胞が重層化し、好ましい。被覆を施される細胞培養器材としては、通常細胞培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の化合物を初めとして、一般に形態付与が可能である物質、例えば、上記以外の高分子化合物、セラミックス類などが挙げられる。
【００３３】
本発明における細胞シートは培養時にディスパーゼ、トリプシン等で代表される蛋白質分解酵素による損傷を受けていないものである。そのため、細胞培養器材から剥離された細胞シートは接着性蛋白質を有し、細胞をシート状に剥離させた際には細胞−細胞間のデスモソーム構造がある程度保持されたものとなる。このことにより、血管床上へ載せたとき良好に接着することができ、効率良く生着することができるようになる。一般に蛋白質分解酵素であるディスパーゼに関しては、細胞−細胞間のデスモソーム構造については１０〜４０％保持した状態で剥離させることができることで知られているが、細胞−器材間の基底膜様蛋白質等を殆ど破壊してしまうため、得られる細胞シートは強度の弱いものとなる。これに対して、本発明の細胞シートは、デスモソーム構造、基底膜様蛋白質共に６０％以上残存された状態のものであり、上述したような種々の効果を得ることができるものである。
【００３４】
本発明における複数の細胞層を有する細胞組成物を作製する方法については、特に限定されるものではないが、例えば、細胞を細胞培養器材に播種し、その上に細胞外マトリックスタンパクを構成するタンパク（ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、カドヘリン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、フィブリン、エラスチン、キチン、キトサン、ビトロネクチン等）を含むゲルを塗布後、さらに細胞を播種して積層した細胞組成物を得る方法や、培養細胞をシート状で剥離させ、必要に応じ培養細胞移動治具を用いて培養細胞シート同士を積層化させる方法等により得られる。その際、培地の温度は、培養器材表面に被覆された前記ポリマーが上限臨界溶解温度を有する場合はその温度以下、また前記ポリマーが下限臨界溶解温度を有する場合はその温度以上であれば特に制限されない。しかし、培養細胞が増殖しないような低温域、あるいは培養細胞が死滅するような高温域における培養が不適切であることは言うまでもない。温度以外の培養条件は、常法に従えばよく、特に制限されるものではない。例えば、使用する培地については、公知のウシ胎児血清（ＦＢＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。また、必要に応じ、細胞シートを移動させるための治具を利用してもよい。そのような治具としては、剥離した細胞シートを捕捉できるものであれば材質、形状共に何ら限定されるものではないが、それらの材質としては、通常、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、シリコン、ポリビニルアルコール、ウレタン、セルロース及びその誘導体、キチン、キトサン、コラーゲン、ゼラチン、フィブリングルー等の材料を膜状、多孔膜状、不織布状、織布状として細胞シートに接触させて使用される。
【００３５】
本発明で得られた細胞組成物を生体内の所定部位に移植することができる。その際、移植部位にあらかじめ血管誘導を施していてもよく、特に限定されるものではない。ここで、血管誘導を施す方法も特に限定されるものではないが、例えば、血管増殖因子であるＦＧＦをミクロスフィアに包埋し、このミクロスフィアの組成、大きさ、注入範囲を変えながら生体に８〜１０日間作用させる方法、ポリエチレンテレフタレートメッシュを任意の大きさに切り、袋状のものを作製し、そのバッグの内側に、高濃度アガロース溶液に溶解させたＦＧＦを入れ、８〜１０日間後、そのバッグを除去することにより、血管誘導された空間を作製する方法などが挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。なお、本実施例におけるラットを用いた実験プロトコールは、東京女子医科大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されたものであり、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって刊行された「実験動物の管理と使用に関する指針」（１９９６年改定版）に沿って実施された。
【００３７】
（動物）
細胞シート作製：３週齢ＧＦＰラット（系統名：ＳＤ−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）、日本ＳＬＣ株式会社）、ＳＤラット（系統名：Ｓｌｃ：ＳＤ、日本ＳＬＣ株式会社）を購入し、ＣＯ2にて犠牲死。
移植先動物：９週齢Ｎｕｄｅラット（系統名：Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ、日本クレア株式会社）を購入、１０週齢で移植に使用。
４％のイソフルランにて導入し、１．８％前後で維持を行った。処置の最中はホットプレートを使用して低体温を予防した。再生子宮、障害子宮ラットの犠牲死の方法は深麻酔後に失血犠牲死を行った。妊娠個体から胎仔を摘出する際に、母獣は深麻酔をすることで犠牲死とし、胎仔も母獣の犠牲死と同じ方法で行った。その際に、胎仔が低酸素状態に耐性が高いということを考慮して通常よりも長い時間を使用した。
【００３８】
（細胞シート作製）
細胞シートの作製方法は図１に示す。具体的には、３週齢ＳＤラット、またはＧＦＰラットを開腹し、子宮を確認。両側の卵巣と骨盤をつないでいる靭帯を切離し子宮広間膜を展開したのちに子宮頸部を切除して子宮を摘出した。その後、摘出した子宮を顕微鏡下に子宮筋層と子宮内膜に分離した。分離した子宮内膜組織は０．２５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡ、３７℃、振盪１５０ｂｐｍで２０分間処理した。処理したのち、５ｍＬのピペッターで７０回〜１００回程度、１０００μｍのピペットマンで２００回程度ピペッティングを行った。目安としては目視で塊が確認できなくなる程度行った。同量の１０％ＦＢＳ入り培地で反応を止めたのち、１００μｍ、４０μｍのセルストレーナーで濾過した。獲得した細胞を１００ｍｍのディッシュに全量播種し二時間静置した（以下、「細胞選別工程」という。）。二時間後上澄を回収し、ＰＢＳで三回洗浄した。洗浄時のＰＢＳも回収した。この上澄と洗浄した細胞を合わせて（１）細胞とした。洗浄後にディッシュに残った細胞は０．２５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡで５分、３７℃で反応させ回収した。この回収した細胞を（２）とした。（１）を温度応答性高分子が固定されたインサートに５．０×１０6／ｄｉｓｈ播種し、（２）の細胞を３５ｍｍの温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（登録商標）セルシード社製）、に２．５×１０6／ｄｉｓｈ播種した。（１）の培養にはＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ｉｎｓｕｌｉｎ  １０ｕｇ／ｍＬ＋ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  １０ｕｇ／ｍＬ＋ｓｅｌｅｎｉｔｅ  ０．０３８ｕＭ＋ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  １００ｕｇ／ｍＬ＋ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ２．５ｎＭ＋Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  １００ｕＭ＋ＥＧＦ  １０ｎｇ．ｍＬを使用した。（２）の培養にはＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１％Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ＋１％Ｈｅｐｅｓを使用した。播種４日後に、インサートに播種した方は２００μｍのチップを使用して、インサートのまわりを全周性になぞることによって壁面にから剥離させた。培養皿に播種した方は１０００μｍのチップで回りを全周性に６回程度なぞることで壁面から剥離させた。その後に両方とも２０℃で１時間インキュベートし細胞シートを回収した。（１）の細胞シートは剥離がしづらい場合はピンセットで剥離を行った。剥離した細胞シートは培地やＰＢＳに浮遊させた。（１）のシートに関しては通常の培養皿に移し浮遊させた。その後、まず（２）の細胞シートが浮遊している培養皿に、１ｘ１ｃｍ程度のプラスチックシートを細胞シートの下に持っていき培地を除去することによってプラスチックシートに細胞シートを伸展した。伸展した細胞シートを、プラスチックシートとともに別の細胞シートが浮遊している培養皿に入れ、浮遊している二枚目の細胞シートの下を置いた。一枚目と同様に培地を除去することでプラスチックシート上に二枚重ねた状態で進展させた。同様の方法でこの（２）の細胞シートを二枚重ねたものの上に（１）の細胞シートを重ね伸展させることで、三枚の積層化シートを作製した。（上から（１）、（２）、（２）の順番）
【実施例１】
【００３９】
（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの積層シート評価）
積層した細胞シートを通常のインサート（Ｆａｌｃｏｎ）にのせ培地を除去して伸展させた。インサートの下の６ウェルプレートのなかに２ｍＬの培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１％Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ＋１％Ｈｅｐｅ）を入れた。その状態で３７℃、５％ＣＯ2で３日間インキュベートした。その後インサートのメンブレンに接着した状態で再接着シートとして４％ＰＦＡで固定した。
【００４０】
（組織評価、免染評価）
通常の方法でパラフィン包埋、薄切、ＨＥ染色を行った。免疫染色に関しては、ｐＨ６の賦活剤を使用して圧力鍋を使用して賦活した。その後１０％ｇｏａｔ血清にて二時間ブロッキングを行った。ブロッキング後、一次抗体としてＧＦＰ、ＣＫ１８、ｖｉｍｅｎｔｉｎなどを１：１００、４℃で一晩反応させた。その後二次抗体を室温で一時間反応させ核染色を行った後に封入した。
【００４１】
図２に示す通り、（１）の細胞シートは、上方に上皮系細胞に発現するＣＫ１８陽性の細胞が均一に認められ、対側培養皿表面側にｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞が確認された。（２）の細胞シートはＣＫ１８は陰性でｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性の細胞であった。積層直後のシートは上方に一層のＣＫ１８陽性細胞が確認され、その下に層状に存在するｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性細胞が確認された。しかし、シートの間に隙間が確認された。再培養シートでも上方に一層のＣＫ１８陽性細胞が確認されその下にｖｉｍｅｎｔｉｎ陽性の層が確認されたが隙間は確認されなかった。
【実施例２】
【００４２】
（細胞シート移植）
１０週齢のヌードラットを開腹し子宮を露出した。子宮を縦に切開し開きにした。顕微鏡下で攝子を用いて子宮筋層と子宮内膜を物理的に剥離した。剥離の範囲は子宮中央の１ｃｍを対象とした。内膜を剥離し、筋層のみ残存した子宮を両側から７−０のナイロン糸を左右それぞれ５本ずつ縫合し両側に進展するようにして移植部位とした。その後に熱メスを用いて止血を行った。上記で作製した積層化細胞シートを、積層時に使用したプラスチックシートから直接移植部位へ移植した。その後、移植部位の周りに濡れたガーゼを置き、その上に１００ｍｍディッシュのフタを置くことで乾燥を予防した。その状態で１．５時間静置して生着を待った。生着を待った後に伸展しているナイロン糸を除去し、移植部位を７−０の吸収糸で連続縫合して閉創した。同時にコントロール群として子宮筋層と子宮内膜を物理的に剥離し、細胞シートを移植せずに閉創した群を作製した。
【００４３】
（再生子宮評価）
細胞シート移植４週間後に再生子宮の評価を行った。麻酔導入後小動物用超音波を用いて子宮を観察した。移植後の子宮を子宮頸管から卵管方向へ観察していき、狭窄している部位がないかどうかを確認した。また、卵管方向に水腫様の変化がないかどうかも確認した。水腫様変化が確認された場合は狭窄、閉塞が疑われた。さらに子宮内に生理食塩水を注入することで、閉塞がないかどうかを確認した。ラットの腟を耳鼻科用耳道観察器具を用いて進展し子宮頸管を露出した。子宮頸管より２２Ｇ点滴留置針の外套を超音波ガイド下に挿入した。挿入後超音波で観察をしながら生理食塩水を注入した。注入後に子宮全体が均一に進展することで閉塞なしと判断した。生理食塩水が卵管方向へ流入しなかった場合は閉塞ありと判断した。閉塞ありの場合、閉塞部位の長さを超音波上で測定した。さらに、麻酔科に開腹しＧＦＰ陽性部位が確認できるかどうかを観察した。また、水腫様の変化があるかどうかも判断した。コントロール群も水腫様変化があるかどうかを判断し、子宮内膜剥離部位が菲薄していることも確認した。確認後、子宮の縫合を行った７−０吸収糸を抜糸した。移植後４週間での再生子宮の評価として、コントロール群とともに子宮を摘出した。妊娠子宮として使用する個体は、子宮の周りの術後癒着を剥離して腹部を閉創した。
【００４４】
移植４週間後の子宮は筋層内部に正常と同等の管腔構造が認められ、周囲に内膜腺構造が認められた（図３）。またＧＦＰ陽性組織が確認され、管腔構造はＣＫ１８陽性細胞で裏打ちされている像が確認された。コントロール群においては筋層の組織内部には組織がほとんど認められず、移植群において優位に子宮組織の再生が確認された。
【実施例３】
【００４５】
（交配・妊娠評価）
図４は、交配・妊娠評価の実験の流れを示している。具体的には、再生子宮の評価後２週間経過した段階でオスのヌードラットと同居をさせた。同居二週間後に麻酔下に小動物用超音波装置にて腹部を観察した。超音波上で胎嚢、胎仔が確認された個体を妊娠個体とした。正常右子宮と移植、障害左子宮のどちらでも一個体でも胎仔が確認された場合を妊娠個体とした。胎嚢、胎仔がはっきりしないが妊娠が疑われた個体（子宮構造の変化）は数日あけて再評価を行い、上記基準で妊娠個体とした。妊娠に至らなかった場合は別の個体と同居させ再評価を行った。この方法を妊娠に至るまで継続した。妊娠個体は診断がついた段階で開腹し子宮を肉眼的、蛍光顕微鏡下で観察した。その後子宮を摘出して４％ＰＦＡで個体した。固定後３日で胎嚢を水平断として、断面を光学、蛍光顕微鏡にて観察した。観察後再度４％ＰＦＡで固定を行った。
【００４６】
（妊娠子宮の評価）
妊娠子宮において、シート移植群では胎嚢の７０〜９０％にＧＦＰ陽性が確認された（図５）。水平断においては、胎嚢の外側全周性にＧＦＰ陽性の部位が確認され、胎盤の直下に広範囲にＧＦＰ陽性の部位が確認された（図６）。組織標本においても同様に胎嚢の外側全周性にＧＦＰ陽性部位が確認され、胎盤直下に広範囲にＧＦＰ陽性部位が確認された（図７）。また、妊娠していない部位においても、ＧＦＰ陽性の子宮内膜上皮が確認され、その形態からＡｒｉａｓ−Ｓｔｅｌｌａ反応（妊娠ホルモンの影響を受けて子宮内膜が乳頭状に変化する反応）が認められた（図８）。このことから、移植後の子宮内膜細胞シートは妊娠に伴って変化していることが確認された。
【実施例４】
【００４７】
（同種他家由来子宮内膜細胞シートの評価）
移植先動物が、免疫正常動物であるＳＤラットであること以外は、実施例３と同様の実験を行い、移植動物で妊娠可能であるかどうかの評価を行った。その結果、移植先動物が免疫正常動物であるＳＤラットにおいても子宮内膜細胞シートが正着し、妊娠可能であることが確認された（図９）。
【００４８】
＜比較例１＞
（子宮間質細胞シートの子宮再生効果の評価）
子宮間質細胞シートにも上皮細胞が含まれているため、子宮間質細胞シートのみで子宮再生効果を有するかを検討した。細胞シートを作製する方法の細胞選別工程において、積層する細胞シートの全てを接着細胞由来の細胞シートを用いたこと以外は、実施例２及び３と同様の方法で実験を行った。その結果、移植した細胞シートは正着していることが確認されたが、創傷部の癒着を防ぐことはできず、子宮腔は確認されなかった（図１０）。また、妊娠も確認されなかった。
【００４９】
＜比較例２＞
（子宮間質細胞シート移植及びシリコンチューブ留置法による子宮再生効果の評価）
子宮間質細胞シートを移植すると同時にシリコンチューブを留置することで、管腔構造が維持され、上皮層が再構築されるかどうかを検討した。比較例１と同じく、子宮間質細胞シートを、子宮内膜を除去したヌードラットの子宮へ移植し、シリコンチューブ（ＡＳ  ＯＮＥ社製）を留置して、縫合した（図１１）。移植の１週間後、子宮組織切片を作製し、定法に従い、ＨＥ染色、免疫染色を行った。その結果、子宮腔の構造は維持され、細胞シート由来の細胞は確認され、子宮内膜特異的には発現するプロゲステロンレセプター陽性の細胞は確認された（図１２（Ｃ））。しかし、シリコンチューブが接する部位に炎症細胞が多数認められ、上皮細胞は認められなかった。
【００５０】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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