(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質懸濁液の滅菌方法であって、
（ｉ）リン脂質をジャケット付き容器中でプロピレングリコールを含む水性生体適合性担体と混合して、水性リン脂質懸濁液を得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た水性リン脂質懸濁液をオートクレーブ処理する工程であって、オートクレーブ処理が、滅菌システムのすべての部分でＦ0値＞１５を達成することができ、加熱が、容器のジャケットの加熱による顕熱に加えて、
（ａ）工程（ｉ）の容器のヘッドスペース、又は
（ｂ）工程（ｉ）の水性リン脂質懸濁液、又は
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ
への蒸気の添加を含んでいる、工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た高温懸濁液を１５〜３０℃に冷却して無菌リン脂質懸濁液を得る工程と
を含んでおり、リン脂質が水素化卵ホスファチジルセリンである、方法。
【請求項２】
蒸気の添加が工程（ｉ）の容器のヘッドスペースに対して行われる、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】
ヘッドスペースに対する蒸気の添加がオートクレーブサイクル中に複数回実施される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ヘッドスペースに対する蒸気の添加の前に、工程（ｉ）の容器のヘッドスペースに対す
る真空の適用をさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
反応したＦ0値が１５〜２５である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の方
法。
【請求項６】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）の含量が、工程（ｉｉｉ）の無菌リン脂質懸濁液中で、
ＰＳと関連物質の合計に対して、少なくとも６８％である、請求項１乃至請求項５のいず
れか１項に記載の方法。
【請求項７】
ホスファチジン酸（ＰＡ）の濃度が、工程（ｉｉｉ）の無菌リン脂質懸濁液中で、ＰＳ
と関連物質の合計に対して１５％未満である、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項８】
ホスファチジルセリン（ＰＳ）及びホスファチジン酸（ＰＡ）の合計濃度が、工程（ｉ
ｉｉ）の無菌リン脂質懸濁液中で、５ｍｇ／ｍＬである、請求項１乃至請求項７のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項９】
リン脂質対プロピレングリコールの質量比が１：２である、請求項１乃至請求項８のい
ずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）においてクリーンスチームが使用される、請求項１乃至請求項９のいずれ
か１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉ）の水性リン脂質懸濁液の体積が２０〜８０Ｌの範囲内にある、請求項１乃至
請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
スクロース内の水素化卵ホスファチジルセリンで安定化されたペルフルオロブタンマイ
クロバブルの凍結乾燥組成物を含む超音波造影剤前駆体の調製方法であって、
（ｉ）請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の方法を実施して、水素化卵ホスフ
ァチジルセリンの無菌水性懸濁液を得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た懸濁液中にペルフルオロブタンのマイクロバブルを形成し、水
素化卵ホスファチジルセリンで安定化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの水性懸
濁液を得る工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た懸濁液を無菌スクロース水溶液で希釈し、５〜２０％ｗ／
ｖの最終スクロース濃度を得る工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得た組成物の一定分量をバイアルに分注し、充填バイアルを得
る工程と、
（ｖ）工程（ｉｖ）で得た充填バイアルを凍結乾燥する工程と、
（ｖｉ）工程（ｖ）で得た凍結乾燥バイアル内のヘッドスペースガスをペルフルオロブタ
ンでバックフィルする工程と、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得たバイアルのそれぞれをクロージャで封止する工程と
を含む方法。
【請求項１３】
超音波造影剤の調製用キットの調製方法であって、
（ｉ）請求項１２に記載の方法を実施し、請求項１２で定義した造影剤前駆体を含有する
バイアルを得る工程と、
（ｉｉ）前記造影剤を得るために、工程（ｉ）で得た前駆体のバイアルの再構成に適した無菌水性媒体の容器を提供する工程と
を含んでおり、超音波造影剤が、無菌水性媒体中に水素化卵ホスファチジルセリンで安定
化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの懸濁液を含む、方法。
【請求項１４】
無菌水溶液が、アルミニウム、バリウム、マグネシウム、カルシウム及び亜鉛の遊離イ
オンの合計濃度１００μＭ未満の注射用水である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
超音波造影剤の調製方法であって、
（ｉ）請求項１２に記載の方法を実施し、請求項１２で定義した造影剤前駆体を含有する
バイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た前駆体のバイアルを無菌水溶液で再構成する工程と
を含んでおり、超音波造影剤が、無菌水性媒体中に水素化卵ホスファチジルセリンで安定
化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの懸濁液を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１３で定義したキットを使用して実施される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質安定化ペルフルオロブタンマイクロバブルを含む超音波造影剤前駆体の調製に有用な、リン脂質懸濁液の滅菌法に関する。方法は、リン脂質の過度の熱分解を伴うことなく、無菌性保証を提供する。方法は、商業スケールの製造にも適している。さらに、本発明の滅菌法を組み込んだキット及び超音波造影剤の調製法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ペルフルオロカーボン（例えば、ペルフルオロプロパン又はペルフルオロブタン）のリン脂質安定化マイクロバブルを利用した超音波造影剤は、当該技術分野において周知である［例えば、Ｗｈｅａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２３（１），５７−７２（２０１３）参照］。
【０００３】
国際公開第９７／１１６８３号パンフレットは、リン脂質が加水分解を受ける物質であり、そのような組成物をオートクレーブ処理中に安定化する必要性に対処する方法を開示している（第６頁、第１段落全文）。国際公開第９７／１１６８３号パンフレットは、オートクレーブ処理中のリン脂質の分解を防止するために、ｐＨ９．５以下の安定化緩衝液の使用を教示している。
【０００４】
国際公開第９７／２９７８２号パンフレットは、室温で安定な超音波造影剤前駆体が、スクロース、マルトース、トレハロース、ラフィノース又はスタキオース、好ましくはスクロースから選択した凍結乾燥安定剤の存在下においてペルフルオロカーボンマイクロバブルの凍結乾燥により調製可能であることを教示している。国際公開第９７／２９７８２号パンフレットは、さらに、そのような造影剤の安定化に使用したホスファチジルセリンリン脂質の含量が熱滅菌中に減少し得ることを教示している。
【０００５】
国際公開第９９／０８７１５号パンフレットは、両親媒性膜形成物質を含む膜を有するガス含有小胞の水性分散体を含む医薬組成物の調製プロセスを開示しており、このプロセスは、
（ｉ）両親媒性膜形成物質を含む混合物からガス含有小胞の液体分散体を生成する工程と、
（ｉｉ）このガス含有小胞の液体分散体を凍結乾燥する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の凍結乾燥生成物を無菌水溶液で再構成してガス含有小胞の水性分散体を生成する工程と、
（ｉｖ）工程（ｉ）又は工程（ｉｉｉ）の水性分散体生成物又は工程（ｉｉ）の凍結乾燥生成物を処理して、実質的に凝集体を含まない、ガス含有小胞の無菌水性分散体を生成する工程とを含む。
【０００６】
欧州特許出願公開第１２２８７７０号明細書は、凍結乾燥前駆体のバイアルをヘッドスペースガスの減圧下で封止した、ガスマイクロバブルを含む凍結乾燥超音波造影剤の調製プロセスを教示している。減圧は、前駆体バイアルの再構成後に形成される水性マイクロバブル組成物において粒子サイズの制御に役立つと言われている。
【０００７】
Ｆｅｓｈｉｔａｎら［Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．，３２９，３１６−３２４（２００９）］は、界面活性剤被覆されたマイクロバブルとは対照的に、脂質被覆されたマイクロバブルは遠心分離後に安定であり、脂質シェルはガスに対して粘性が高く、比較的不透過性であることを報告している。Ｆｅｓｈｉｔａｎらは、４〜５μｍサイズ範囲のペルフルオロブタンマイクロバブルは少なくとも２日間は安定であったが、２週間後にはより小さなサイズのマイクロバブル（１〜２μｍ）に縮小する傾向があったことを報告している。
【０００８】
製品の無菌性を制御するリン脂質を組み込んだ超音波造影剤の凍結乾燥前駆体調製法が依然として必要とされている。そのようなリン脂質滅菌法は商業スケールの製造に適用可能である必要があり、規制要件（例えば、米国薬局方及びＩＣＨガイドライン）を満たすバイアル含量の均一性及び安全性プロファイルを有する前駆体製品を供給する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／０８２４６２号パンフレット
【発明の概要】
【００１０】
哺乳動物への非経口投与を意図したリン脂質安定化ガスマイクロバブル超音波造影剤は、無菌形態で調製される必要がある。最終滅菌法はこのような造影剤に適した技術ではないため、無菌製造を可能にするために無菌形態のリン脂質懸濁液が必要である。商業スケールの造影剤の製造は、大量（マルチリットル）の滅菌処理を必要とする。
【００１１】
本発明者らは、水素化卵ホスファチジルセリンのリン脂質の熱分解がオートクレーブ滅菌時に生じ得ることを見出した。従って、リン脂質は熱感受性であり、高温での長時間加熱時に分解を受ける可能性がある。さらに、滅菌を試みる間に過度の分解が生じた場合、ガスマイクロバブルの望ましい超音波特性が損なわれる可能性がある。従って、リン脂質の過度の熱分解を伴うことなく、完全な滅菌を実現することには問題がある。
【００１２】
この問題は、マルチリットルスケールではさらに困難なものとなるが、これは体積が大きくなるとシステム全体の均一な熱分布の確保がより困難になり、局所的な過熱又は長時間の曝露がより高レベルのリン脂質の分解を引き起こすリスクを伴うことによる。
【００１３】
典型的にはジャケット付きスチール製容器内で実施される標準的なオートクレーブプロセスの間、熱は滅菌システムの内部から隔離された容器外側の外部ジャケットを通る熱媒体（通常は蒸気）の通過によってバルク材料に供給される。従ってこのようなシステムは、顕熱を利用して許容される無菌性を得るために必要なエネルギーを供給する。ただし、この場合、入口ポート、通気用滅菌フィルタ及びタンク上部のような滅菌システム端部は、熱源により近い材料の大部分よりも遅い時点で熱を受ける。閉システムのすべての部分が滅菌されなければならいが、これは通常、端部で滅菌障壁が許容される最低限のレベルに達する前に、材料の大部分に非常に大きい熱負荷（及びＦ0値）をもたらす。
【００１４】
従って、標準的な加熱レジメンでは、総熱負荷、ひいてはリン脂質の化学分解は許容できないほど増大する可能性がある。従って、滅菌システム全体（すなわち、滅菌障壁間に含まれている体積）の迅速で均一な加熱／冷却が必要である。
【００１５】
本発明は、この問題に対する解決策を提供する。本発明の方法は、リン脂質懸濁液自体及び／又はこの懸濁液の上方のヘッドスペースへの蒸気注入を含む。熱伝達への潜熱（蒸気加熱）の利用は、より短時間に非常に高いエネルギー量が放出されることから、例えば外部ジャケットからの顕熱よりもはるかに効果的である。さらに、ヘッドスペースへの蒸気注入は、具体的には入口ポート、滅菌フィルタ及びタンク上部のような端部の迅速な加熱を可能にし、それによりバルク材料にかかる総熱負荷を低減させる。ヘッドスペース蒸気加熱の利用には、以下の利点がある。
【００１６】
【表１】
0006591460.tif 000002
発明の詳細な説明
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
第１の態様において、本発明は、リン脂質懸濁液の滅菌法であって、
（ｉ）リン脂質をジャケット付き容器中でプロピレングリコールを含む水性生体適合性担体と混合して、水性リン脂質懸濁液を得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た水性リン脂質懸濁液をオートクレーブ処理する工程であって、オートクレーブ処理が、滅菌システムのすべての部分でＦ0値＞１５を達成することができ、加熱が、容器のジャケットの加熱による顕熱に加えて、
（ａ）工程（ｉ）の容器のヘッドスペース、又は
（ｂ）工程（ｉ）の水性リン脂質懸濁液、又は
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ
への蒸気の添加を含んでいる、工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た高温懸濁液を１５〜３０℃に冷却して無菌リン脂質懸濁液を得る工程と
を含み、リン脂質が水素化卵ホスファチジルセリン（Ｈ−ＥＰＳ）である、方法を提供する。
【００１８】
用語「滅菌」は、その従来の意味を有し、微生物を殺滅して、無菌の、発熱物質を含まない組成物を得るプロセスを指す。用語「オートクレーブ処理」は、その従来の意味を有し、過熱蒸気を使用して滅菌する、１つの特定の滅菌法を指す。オートクレーブ処理及び他の滅菌法は、Ｎ．Ｈａｌｌｓ著、Ａｃｈｉｅｖｉｎｇ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）に述べられている。
【００１９】
用語「滅菌システム」は、バルクオートクレーブユニットの滅菌障壁（すなわち、入口及び出口）内に含まれる体積を意味する。
【００２０】
無菌性保証は、通常、「滅菌プロセスによって製品に供給された、１２１℃での相当時間（分）」と定義される用語Ｆ0により説明される（ＦＤＡ「Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ｒｕｌｅｓ」ｏｆ  Ｊｕｎｅ  １ｓｔ，１９７６（ｂ），ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１２．３）。オートクレーブサイクル中のＦ0値は次の式で算出される。
【００２１】
Ｆ0＝ΔｔΣ１０(T-Tb)/Z
式中、
Δｔは測定間隔、
Ｔは加熱温度（センサで測定された温度）、
Ｔｂは１２１．１℃（蒸気滅菌に定義された温度）、
Ｚは通常１０℃に設定される、対数で表される滅菌力の変化に対する温度定数である。
【００２２】
オートクレーブサイクル中、Ｆ0は従って低温でも時間の経過とともに上昇するが、増加率は温度に著しく依存する。米国薬局方／欧州薬局方によれば、無菌性保証として容認されるＦ0の最低要件はＦ0＞１５である。
【００２３】
用語「ヘッドスペース」は、その従来の意味を有し、容器内の、かつ、容器の液体及び／又は固体内容物、この場合では水性リン脂質懸濁液の上方の気相を指す。
【００２４】
用語「水性リン脂質懸濁液」は、水及び／又は水混和性溶媒を含む水性溶媒中のリン脂質の懸濁液を指す。水性溶媒は、好適には生体適合性担体である。用語「生体適合性担体」は、その組成物が生理学的に許容し得る、すなわち毒性又は過度の不快感なく哺乳動物の体内に投与することができるような流体、特に液体を意味する。生体適合性担体は、好適には注射可能な担体液であり、例えば無菌の、発熱物質を含まない注射用水、生理食塩水（注射用の最終生成物が等張であるように有利に平衡化し得る）のような水溶液、生体適合性緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤）を含む水性緩衝液、１種以上の浸透圧調整物質（例えば、血漿カチオンと生体適合性対イオンとの塩）、糖類（例えば、グルコース又はスクロース）、糖アルコール類（例えば、ソルビトール又はマンニトール）、グリコール類（例えば、グリセロール）、又は他の非イオン性ポリオール物質（例えば、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコール類等）の水溶液である。好ましくは生体適合性担体は、発熱物質を含まない注射用水（ＷＦＩ）、等張食塩水又はリン酸緩衝液である。従って水性懸濁液は、好適には水不混和有機溶媒を除外する。
【００２５】
用語「含む」は、本願を通じてその従来の意味を有し、薬剤又は組成物が記載された本質的特性又は成分を有していなければならないが、それ以外がさらに存在していてもよいことを意味する。用語「含む」は、組成物が記載された成分を有し、それ以外の特性又は成分が存在していないことを意味する「本質的に〜からなる」を好ましい下位概念として包含する。
【００２６】
好ましい実施形態
第１の態様の方法において、蒸気の添加は、好ましくは工程（ｉ）の容器のヘッドスペースに対して行われる。例えば、液体懸濁液への直接的な蒸気注入は可能であるが、液体への注入は局所的に顕著な分解を引き起こす可能性があり、ヘッドスペースへの添加ははるかに制御された加熱効果を与える。
【００２７】
第１の態様の方法は、好ましくは、Ｆ0値が１５以上２５以下となるように実施される。例えば、本発明者らは、Ｆ0値が３０に達する、より長いオートクレーブ加熱時間がリン脂質の過度の分解を引き起こすことを立証した。これはさらに、そこから調製したＰＦＢマイクロバブルの安定性に悪影響を及ぼす。
【００２８】
ホスファチジルセリンの熱分解は、スキーム１に示すように起きると考えられている。
【００２９】
スキーム１
【００３０】
【化１】
0006591460.tif 000003
式中、
ＰＳ＝ホスファチジルセリン、
ＰＡ＝ホスファチジン酸、
Ｓ＝セリン、
ＦＦＡ＝遊離脂肪酸、
ＬＡ＝リゾ−ＰＡ、
ＬＳ＝リゾ−ＰＳである。
【００３１】
主な反応は、スキーム２に示すようにＰＡ及びＳへのＰＳの加水分解である。
【００３２】
スキーム２
【００３３】
【化２】
0006591460.tif 000004
式中、各Ｒ＝ｎ−Ｃ16鎖である。
【００３４】
理論によって束縛されることを望むものではないが、分解の増加は、酸であるＰＡのレベルの上昇を意味すると考えられる。すなわちＰＳ（親リン脂質）よりも負に帯電しており、従ってマイクロバブルを安定化するリン脂質の「シェル」の電荷平衡及び場合によっては静電反発力が影響を受ける。
【００３５】
スキーム１から、ＰＳ及び関連物質の総量（すなわちＰＳ、ＰＡ、Ｓ、ＦＦＡ、リゾＰＡ及びリゾＰＳの和）に対するオートクレーブ処理後の懸濁液中のＰＳの量が分解の直接の尺度となることは明らかである。実施例４から明らかなように、ＰＡ及び関連物質の総量中のＰＳの量の割合は好ましくは少なくとも６８％、より好ましくは少なくとも７３％、最も好ましくは少なくとも７５％でなければならない。ＰＳレベルが低いと、マイクロバブル特性の低下をもたらすことが示されている。
【００３６】
第１の態様の方法において、リン脂質対プロピレングリコールの質量比は、好ましくは１：１．５〜１：２．５、より好ましくは１：２である。
【００３７】
第１の態様の方法において、工程（ｉ）の水性リン脂質懸濁液の体積は、好ましくは２０〜８０Ｌの範囲内、より好ましくは３０〜７０Ｌ、最も好ましくは４０〜６０Ｌである。
【００３８】
リン脂質混合物の滅菌は、特に商業製造に適したマルチリットルスケールに関して課題となっている。前述の熱分解が無菌性を確保するために必要な加熱と競合するからである。脂質懸濁液の濾過滅菌は、その後の製造工程で生成されたマイクロバブルの収率及び品質を低下させることが証明されており、ガンマ線照射は適切なインプロセス滅菌技術ではない。従って、許容される無菌性保証は達成困難であるが、これは体積が大きくなると、要求されるＦ0＞１５の無菌性保証を得るために、より長い加熱時間を必要とすることによる。
【００３９】
これを達成するために、本発明は容器のヘッドスペースに直接供給される蒸気を使用する。第１の態様の方法において、好ましくはクリーンスチーム（ＣＦＲ  Ｔｉｔｌｅ２１，Ｐａｒｔ２１１のＧＭＰガイドラインの定義に従う）を工程（ｉｉ）において使用する。第１の態様の方法は、好ましくは、工程（ｉ）の容器のヘッドスペースに真空パルス１回又は真空パルス複数回の適用をさらに含み、ヘッドスペースへの蒸気の添加前にヘッドスペースガスを除去する。ヘッドスペースガスは、大部分が良好な絶縁体である空気であり、蒸気注入前にこれを除去することにより、その後の熱伝達が大幅に向上する。
【００４０】
第１の態様の方法において、工程（ｉ）の容器は、工程（ｉｉ）の加熱が容器ジャケットへの加熱蒸気の添加をさらに含むように、好適にはジャケット付き容器（図１に例示する）であり、すなわち、熱伝達を最大化するために、本発明の加熱法を従来の加熱法により補助することを意味する。媒体入口ポート（図１、Ａ）を介して、容器のヘッドスペースを周期的に真空に引く。第１の真空パルスにより、ヘッドスペース内の空気の大部分が引き出され、その後、タンク内の液体の気化により再び圧力が上昇する。新たな真空サイクルを適用し、残っている空気と水蒸気との混合物を引き出す。最も好ましくは、蒸気の注入前に３回の真空パルスを適用する。これらのパルスは、容器のヘッドスペース、並びにエアフィルタ（図１、Ｂ）及び媒体入口のようなシステム端部のすべての空気を除去する。
【００４１】
クリーンスチームの注入は、好ましくはサイクル中に複数回、例えばオートクレーブサイクルの開始時及び終了時に実施する。第１の注入は、通常は高熱容量鋼構造の容器上部（図１、Ｃ）の加熱に役立ち、これが蒸気により加熱されない場合、オートクレーブサイクルを著しく長引かせる原因となり、実施例１に示すように、その後のバルク脂質懸濁液の過度の分解を引き起こす。
【００４２】
典型的には、滅菌システムに３つの温度センサ、バルク脂質懸濁液に１つ（図１、Ｄ）と、媒体入口の滅菌障壁（バルブ）のすぐ外側に１つ（図１、Ｅ）と、滅菌通気フィルタの滅菌障壁のすぐ外側に１つ（図１、Ｆ）、が含まれる。許容される滅菌サイクルの要件は、すべてのセンサについてＦ0＞１５である。
【００４３】
その後のクリーンスチーム注入は、好ましくは液相がＦ0＞１５（通常は不確実性を考慮して設定点としてＦ0＞１６が適用される）に達した時点で行う。この注入は、実施例２に示すように、容器上部、エアフィルタ及び媒体入口の表面を迅速に滅菌し、容器ジャケットからの顕熱への長時間の曝露及びバルク材料中の脂質のさらなる分解を防止する。エアフィルタ及び媒体入口でＦ0＞１６に達した時点で、生成物は容器ジャケットへの冷却水の適用により急速に冷却される。
【００４４】
オートクレーブサイクルの最初の部分の間に添加されるクリーンスチームからの凝縮液は、さらに、オートクレーブサイクル中にＨ−ＥＰＳ懸濁液から蒸発する水の一部を補う。
【００４５】
Ｈ−ＥＰＳは、日本の兵庫県尼崎市の日油株式会社から市販されている。卵ホスファチジルセリン及び超音波造影剤Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）のリン脂質成分の分析及び定量化の技術は、Ｈｖａｔｔｕｍら［Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，４２，５０６−５１２（２００６）］により述べられている。このような分析は、本発明の方法での使用にも適している。
【００４６】
第２の態様において、本発明は、スクロース内の水素化卵ホスファチジルセリンで安定化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの凍結乾燥組成物を含む超音波造影剤前駆体の調製法を提供し、この方法は、
（ｉ）第１の態様の方法を実施し、水素化卵ホスファチジルセリンの無菌水性懸濁液を得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た懸濁液中にペルフルオロブタンのマイクロバブルを形成し、水素化卵ホスファチジルセリンで安定化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの水性懸濁液を得る工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た懸濁液を無菌スクロース水溶液で希釈し、５〜２０％ｗ／ｖの最終スクロース濃度を得る工程と、
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で得た組成物の一定分量をバイアルに分注し、充填バイアルを得る工程と、
（ｖ）工程（ｉｖ）で得た充填バイアルを凍結乾燥する工程と、
（ｖｉ）工程（ｖ）で得た凍結乾燥バイアル内のヘッドスペースガスをペルフルオロブタンでバックフィルする工程と、
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）で得たバイアルのそれぞれをクロージャで封止する工程とを含む。
【００４７】
第２の態様の工程（ｉ）の方法の好ましい実施形態は、第１の態様（前述）で説明した通りである。
【００４８】
用語「前駆体」は、再構成すると所望の超音波造影剤を容易に形成するように設計された、簡便な、又はキット形態の造影剤を指す。
【００４９】
用語「造影剤」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ医用イメージングの分野におけるその従来の意味を有し、哺乳動物被検体のみの撮像で得ることができる以上に、関心の領域又は器官の鮮明な画像の提供を補助する、哺乳動物への投与に適した形態の薬剤を指す。用語「被検体」は、哺乳動物ｉｎ  ｖｉｖｏ、好ましくは無傷の哺乳動物体ｉｎ  ｖｉｖｏ、より好ましくはヒト生体対象を意味する。語句「哺乳動物への投与に適した形態」は、無菌で、発熱物質を含まず、毒性又は有害作用を引き起こす化合物を有さない組成物を意味し、生体適合性ｐＨ（約ｐＨ４．０〜１０．５）で製剤化される。このような組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで塞栓を引き起こすリスクのある粒子状物質を有さず、体液（例えば血液）と接触しても沈殿が生じないように製剤化される。このような組成物はさらに、生物学的に適合性の賦形剤のみを含み、好ましくは等張性である。
【００５０】
他のｉｎ  ｖｉｖｏイメージング剤と同様に、造影剤は、画像化される哺乳動物被検体の受ける薬理作用が最小になるように設計される。好ましくは、造影剤は低侵襲の方法で、すなわち、専門職の医療専門知識の下で実施される際、哺乳動物被検体に対する実質的な健康上のリスクを伴うことなく、哺乳動物の体内に投与することができる。このような低侵襲投与は、好ましくは被検体の末梢静脈内への静脈内投与であり、局所又は全身麻酔を必要としない。
【００５１】
用語「マイクロバブル」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ超音波イメージングの分野におけるその従来の意味を有し、直径が通常０．５〜１０μｍのガスマイクロバブルを指す。７μｍ以上のサイズでは、肺毛細血管におけるうっ滞（塞栓形成）の重大なリスクがある。適切なマイクロバブルは、赤血球とサイズにおいて同等であり、哺乳動物の全身の微小血管及び毛細血管において同等の特性を示すことが許容される［Ｓｉｒｓｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｕｂｂｌｅ  Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１（１−２），３−１７（２００９）］。
【００５２】
本発明の適切なマイクロバブルは、水素化卵ホスファチジルセリン（Ｈ−ＥＰＳ）中に存在するリン脂質によって安定化される。Ｈ−ＥＰＳに存在するリン脂質は、主にホスファチジルセリン及びホスファチジン酸である［Ｈｖａｔｔｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，４２，５０６−５１２（２００６）］。
【００５３】
ペルフルオロブタン（「ＰＦＢ」）は、その標準的な化学的意味を有し、医療用途の関連においてペルフルブタンとも呼ばれる。ペルフルオロ−ｎ−ブタンの化学式はＣＦ3ＣＦ2ＣＦ2ＣＦ3又はＣ4Ｆ10であり、沸点は−２．２℃である。市販のペルフルオロ−ｎ−ブタンは、少量（通常２〜４％）のペルフルオロイソブタン異性体、すなわちＣＦ3ＣＦ（ＣＦ3）ＣＦ3を含む。
【００５４】
第２の態様の方法において、工程（ｉｉｉ）のスクロース濃度は、好ましくは８〜１２％ｗ／ｖ、より好ましくは約１０％ｗ／ｖ、最も好ましくは９２ｍｇ／ｍＬである。スクロースは凍結乾燥保護物質／凍結保護物質として作用し、マトリックスを形成することが示されており、脂質安定化ＰＦＢマイクロバブルが前駆体の凍結乾燥スクロース内に捕捉されることにより、マイクロバブルのサイズ及び濃度はあらかじめ規定され、エンドユーザが採用した再構成手順に影響されない。例えば、適切な水性媒体で前駆体バイアルを再構成すると、スクロースはリン脂質安定化ＰＦＢマイクロバブルを放出して溶解する［Ｓｏｎｔｕｍ，Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４（５），８２４−８３３（２００８）］。凍結乾燥保護物質又は凍結保護物質としての糖類の使用は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓｏｌｉｓら［Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．，３９６，３０−３８（２０１０）］、及びその参考文献に述べられている。
【００５５】
用語「充填バイアル」は、充填済みのバイアル、組成物の一定分量が分注されたバイアル、すなわち分注済みのバイアルを指す。バイアルは物理的に満量ではなく、これはバイアルの容量が典型的には１０ｍＬであり、分注量が約２ｍＬで、残りは組成物の上方のヘッドスペースガスであることによる。用語「ヘッドスペースガス」は、その従来の意味を有し、バイアル内の凍結乾燥組成物の上方のガスを指す。
【００５６】
第２の態様の方法において、凍結乾燥された前駆体組成物は無菌である。
【００５７】
第２の態様の方法において、造影剤前駆体を充填するためのバッチサイズは、好ましくは５００〜８０，０００の範囲内、より好ましくは１，０００〜５０，０００、最も好ましくは５，０００〜４５，０００バイアルである。約３５，０００〜４０，０００バイアルのバッチサイズが理想的である。
【００５８】
第２の態様の方法の工程（ｉｉ）のマイクロバブルの調製は、
超音波処理、
高剪断乳化、
膜乳化、
（ｉｖ）同軸電気流体力学的噴霧（ＣＥＨＤＡ）、及び
（ｖ）マイクロ流体デバイス、
（ｖｉ）インクジェット印刷を含む、当該技術分野で既知の様々な方法により行うことができる。
【００５９】
これらの方法は、Ｓｔｒｉｄｅら［Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，４，２３５０−２３５９（２００８）］により、及びその参考文献に述べられている。マイクロバブル調製法のさらなる詳細は、Ｕｎｎｉｋｒｉｓｈｎａｎら［Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．，１９９（２），２９２−２９９（２０１２）］により提供されている。
【００６０】
インクジェット印刷は、Ｓｔｒｉｄｅら（前掲）により液体充填粒子により適していることが報告されており、本発明のＰＦＢマイクロバブルにはあまり適していない。超音波処理はバブルサイズが広範囲にばらつく傾向にあることからあまり好ましくなく、マイクロ流体技術は製造速度が遅く、商業製造に適さないという問題がある［Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３９（５），８８２−８９２（２０１３）］。
【００６１】
本発明の好ましい製造方法は高剪断乳化であり、好ましくは、サイズ制御の範囲が広く、大規模バッチ製造に適しており、静的サイズ分布が得られることから、ロータステータミキサを使用する。マイクロバブルは、無菌の、発熱物質を含まない脂質懸濁液をペルフルオロカーボン（ここではＰＦＢ）の存在下で数秒間攪拌することにより形成される。実施例３は、ロータステータマイクロバブル調製法を提供する。ロータステータミキサは、Ｒｏｄｇｅｒｓら［Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，９０（３），３２３−３２７（２０１２）］及びＥｍｕｌｓｉｏｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｔ．Ｆ．Ｔａｄｒｏｓ（Ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ（２０１３）］に述べられており、後者では特にＰａｃｅｋらによるＣｈａｐｔｅｒ  ５  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｏｔｏｒ−Ｓｔａｔｏｒ  Ｍｉｘｅｒｓ、１２７〜１６７頁を参照されたい。
【００６２】
本発明の方法は、商業スケール、例えば、製造バッチ単位で造影剤前駆体のバイアル数１００，０００以下、典型的には３５，０００〜４０，０００程度の製造における使用に特に適している。そのような大規模の商業製造においては、バイアル間の一貫性、すなわちバイアル間のばらつきを最小化することが重要である。そのようなバッチサイズは、第１の態様（前述）で説明したように、マルチリットル量のリン脂質懸濁液を必要とする。
【００６３】
本発明の好ましい超音波造影剤及び前駆体は、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＳ）であり、Ｓｏｎｔｕｍ［Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４（５），８２４−８３３（２００８）」により述べられているように、以前はＮＣ１００１００として知られていた。
【００６４】
第１の態様の方法において使用に適したバイアル及びクロージャは、医薬品グレードで、凍結乾燥に適した、入手が容易な市販品である。平底バイアルの使用が好ましく、これはバイアルと凍結乾燥機の棚との間の熱伝達を高めることによる。クロージャは、好ましくは、凍結乾燥に適し、凍結乾燥機を開けて取り出す前にバイアルに栓をすることが可能な、バイアルから蒸気を逃がすように設計されたものを選択する。
【００６５】
スクロースも市販されており、医薬品グレードを使用しなければならない。医薬品ＧＭＰグレードのペルフルオロブタンは、Ｆ２  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄから入手することができる。
【００６６】
第３の態様において、本発明は、
（ｉ）第２の態様の方法を実施し、その定義に従う造影剤前駆体を含有するバイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た前駆体のバイアルの再構成に適した無菌水性媒体の容器を提供し、造影剤を得る工程とを含み、
この超音波造影剤が、無菌水性媒体中に水素化卵ホスファチジルセリンで安定化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの懸濁液を含む、超音波造影剤の調製用キットの調製法を提供する。
【００６７】
第２の態様の方法の好ましい実施形態、第３の態様のキット調製法における前駆体及び造影剤は、第１及び第２の態様（前述）で説明した通りである。
【００６８】
用語「キット」はここでは、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングの分野におけるその従来の意味を有し、哺乳動物への投与（前述の定義に従う）に適した形態で、関心の造影剤を調製するために必要な構成要素すべてとともに供給されるイメージング剤自体、又はその前駆体を指す。このようなキットは、数週間又は数ヶ月間の使用可能な保管寿命を有するように設計され、臨床医は、関心の哺乳動物被検体の撮像に適した局面及び時点でイメージング剤を調製できる。これは、一度調製した造影剤自体の使用可能な保管寿命がはるかに短いことから、概して臨床医の利便性向上となる。キットの供給を得ることは、必要なときにはいつでも、臨床医が２４時間、週７日間造影剤を使用できることを意味する。キットには、キット及びその構成要素を明示し、患者の安全性情報とともにキットの詳細な使用法、及び商業的供給者の詳細を提供する「添付文書」を適切に同梱する。このようなキットは、典型的には、超音波造影剤を提供するために設計された市販品の好ましいフォーマットを示す。
【００６９】
第３の態様の工程（ｉｉ）の無菌水溶液は、好ましくは前述の定義に従う「生体適合性担体」である。より好ましくは、無菌注射用水である。最も好ましくは、無菌水溶液は、アルミニウム、バリウム、マグネシウム、カルシウム及び亜鉛の遊離（すなわち、キレート化されていない）イオンの合計濃度が１００μＭ未満、理想的には５０μＭ未満である。
【００７０】
第２の態様のキットは、好ましくは、ケモプロテクト（登録商標）スパイク（Ｃｏｄａｎ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ，ドイツ）のようなベント付きフィルタ（５μｍ）スパイクをさらに含む。キットは、スパイクを介して水溶液で再構成し、約１分間手動混合して乳白色の均質な分散液を得る。その後、被検体を撮像するための造影剤の投与量を、フィルタスパイクを介してシリンジ内に吸い取る。「スパイク」の役割は、目視による検出が困難な異物又は凝集体を除去することであり、これはバイアル内の分散液が不透明であることによる。
【００７１】
第４の態様において、本発明は、
（ｉ）第２の態様の方法を実施し、その定義に従う造影剤前駆体を含有するバイアルを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た前駆体のバイアルを無菌水溶液で再構成する工程とを含み、
この超音波造影剤が、無菌水性媒体中に水素化卵ホスファチジルセリンで安定化されたペルフルオロブタンマイクロバブルの懸濁液を含む、超音波造影剤の調製用キットの調製法を提供する。
【００７２】
第２の態様の方法の好ましい実施形態、第４の態様の造影剤調製法における前駆体及び造影剤は、第１及び第２の態様（前述）で説明した通りである。第４の態様の方法は、好ましくは、第３の態様で説明したキットを使用して実施される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】脂質懸濁液のような液体生成物のオートクレーブ処理用の典型的なシステムである、５０Ｌのジャケット付き鋼製容器の概略図である。Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ及びＧは、それぞれ、媒体入口ポート、滅菌エアフィルタ、容器上部、加熱ジャケット、バルク製品用温度センサ、入口ポート用温度センサ、及びエアフィルタ用温度センサを示す。
【図２】蒸気注入及び加熱ジャケットを使用したオートクレーブサイクル（上段）、又は加熱ジャケットのみを使用したオートクレーブサイクル（下段）について、バルク製品センサから得た温度と時間の関係を示すグラフである。矢印は加熱／蒸気注入の開始及びＦ0＞１６の時点を示す。両矢印は、バルク製品の温度が＞８０℃に達している期間を示す。
【図３ａ】温度と、開始時蒸気注入／加熱ジャケットに加えてバルク製品がＦ0＞１６に達した時点で第２の蒸気注入を行わなかった場合のオートクレーブサイクルの時間との関係を示すグラフである。
【図３ｂ】温度と、開始時蒸気注入／加熱ジャケットに加えてバルク製品がＦ0＞１６に達した時点で第２の蒸気注入を行った場合のオートクレーブサイクルの時間との関係を示すグラフである。
【図３ｃ】Ｆ0値と、開始時蒸気注入／加熱ジャケットに加えてバルク製品がＦ0＞１６に達した時点で第２の蒸気注入を行わなかった場合のオートクレーブサイクルの時間との関係を示すグラフである。
【図３ｄ】Ｆ0値と、開始時蒸気注入／加熱ジャケットに加えてバルク製品がＦ0＞１６に達した時点で第２の蒸気注入を行った場合のオートクレーブサイクルの時間との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
以下に詳述する非限定的な実施例によって本発明を説明する。実施例１は、急速な温度上昇を達成し、それによりリン脂質懸濁液の長時間加熱を回避することに対する本発明の蒸気注入技術の有効性を示す（図２）。蒸気注入を適用しない古典的方法では、Ｆ0＞１６に達するまでの＞８０℃の時間として表した総熱負荷は、サイクル開始時に蒸気注入を適用した場合の約３５分間と比較して＞８５分間である。表１は、この差の影響をオートクレーブ処理後のＰＳのレベルに関して示す。蒸気注入を伴ってオートクレーブ処理した場合、オートクレーブ処理後のＰＳ含量は８３％であったが、蒸気注入を伴わずにオートクレーブ処理した場合は７５％に減少した。
【００７５】
実施例２は、オートクレーブサイクル終了時の蒸気注入の有効性を示し（図３ａ〜ｄ）、滅菌障壁（入口ポート及びエアフィルタ）のＦ0値がほぼ瞬時に＞１６に上昇することにより、総熱負荷（＞８０℃の時間）を約３５分間から約３０分間にさらに低減させる（図３ａ〜ｄ）。実施例３は、ロータステータ混合を使用し、Ｈ−ＥＰＳで安定化されたＰＦＢマイクロバブル（造影剤Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標））の調製を提供する。
【００７６】
実施例４は、造影剤Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）の脂質成分に関し、オートクレーブサイクルの加熱時間の影響を示す。表２に見られるように、ＰＳのレベルは加熱により低下し、ＰＡ濃度の上昇を伴う。表３は、超音波造影剤の特性が２３分間（Ｆ0＝２５）のオートクレーブサイクルと３０分間（Ｆ0＝３０）のオートクレーブサイクルとの間でかなり顕著に劣化し、後者はいくつかの基準で規格を満たさなかったことを示す。この結果は、加熱サイクルの慎重な制御の必要性及び本発明による方法論を実証している。
【００７７】
略語
ＦＤ：凍結乾燥
ＧＭＰ：適正製造規範
Ｈ−ＥＰＳ：水素化卵ホスファチジルセリン
ＩＣＨ：日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議
ｉ．ｖ．：静脈内
Ｍｉｎ：分
ＰＡ：ホスファチジン酸
ＰＦＢ：ペルフルオロブタン
ＰＳ：ホスファチジルセリン
Ｒｐｍ：１分間あたりの回転数
ＷＦＩ：注射用水
実施例１：ヘッドスペース蒸気注入を使用した加熱：方法Ｉ
リン脂質に加えられる熱負荷に関する蒸気注入の影響及びその後の脂質分解の影響を調査するため、オートクレーブサイクルを４回実施し、ジャケット加熱のみによる標準サイクルと、滅菌プログラム開始時に容器のヘッドスペースに蒸気を注入したサイクルとを比較した。
【００７８】
Ｎｏｖａｆｅｒｍのジャケット付きステンレス鋼圧力容器（バルクオートクレーブ）（５０Ｌ）を使用した。Ｈ−ＥＰＳ１２５ｇを、プロピレングリコール１０ｍｇ／ｍＬを含むＷＦＩ２５Ｌに添加し、６０℃で２０分間攪拌しながら水和させた後、オートクレーブサイクルを開始した。バルク脂質懸濁液内の温度をセンサでモニタし、Ｆ0を連続的に算出した。蒸気注入サイクルでは、容器のヘッドスペースを３回の周期で真空に引き、その後蒸気注入を行った。クリーンスチームの注入はオートクレーブサイクルの開始時に実施した。Ｆ0値が＞１６になった時点で、水（周囲温度）による冷却を開始した。同じＨ−ＥＰＳ原料を使用して、蒸気注入手順を含む場合又は含まない場合の両方について、オートクレーブサイクルを２回繰り返した。
【００７９】
バルク製品の温度と時間との関係について、結果を図２に示す。
【００８０】
オートクレーブ処理した懸濁液調製物のリン脂質組成は、Ｈｖａｔｔｕｍら［Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，４２，５０６−５１２（２００６）］に従って分析した。結果を表１にまとめる。
【００８１】
【表２】
0006591460.tif 000005
図２及び表１は、急速な温度上昇を達成し、それによりリン脂質懸濁液の長時間加熱を回避することに対する本発明の蒸気注入技術の有効性を示す。蒸気注入を適用しない古典的方法では、Ｆ0＞１６に達するまでの＞８０℃の時間として表した総熱負荷は、サイクル開始時に蒸気注入を適用した場合の約３５分間と比較して＞８５分間である。実際、従来のジャケットの加熱のみでは、滅菌温度域の平坦期間は全く確立されなかった。
【００８２】
表１は、この差の影響をオートクレーブ処理後のＰＳ及びＰＡのレベルに関して示す。特に、ＰＳ含量は熱負荷の増大により顕著に減少するが、ＰＡ含量は増加する。オートクレーブ処理後のＰＳ含量（ＰＳ＋ＰＡの％）は、蒸気注入を伴ってオートクレーブ処理した場合は８３％であったが、蒸気注入を伴わないオートクレーブ処理の場合は７５％に減少した。
【００８３】
実施例２：ヘッドスペース蒸気注入を使用した加熱：方法ＩＩ
リン脂質に加えられた熱負荷に関する蒸気注入の影響を調査するため、オートクレーブサイクルを実施し、ジャケット加熱及び滅菌プログラム開始時に蒸気注入を行ったサイクルと、バルク材料のＦ0値が１６に達した時点でヘッドスペースに蒸気をさらに注入したサイクルとを比較した。
【００８４】
Ｄｉｅｓｅｌのジャケット付きステンレス鋼圧力容器（バルクオートクレーブ）（７７Ｌ）を使用した。Ｈ−ＥＰＳ２５０ｇを、プロピレングリコール１０ｍｇ／ｍＬを含むＷＦＩ５０Ｌに添加し、６０℃で２０分間攪拌しながら水和させた後、オートクレーブサイクルを開始した。図１に示すように、温度プローブを使用してリン脂質懸濁液内の温度、並びに媒体入口及びエアフィルタにおいて滅菌障壁の温度をモニタした。Ｆ0値は各センサについて連続的に算出した。
【００８５】
加熱は、ジャケットへの通常の家屋用蒸気（１．２５ｂａｒＧ、１２４℃）の添加により開始した。４０秒間の真空パルスを３回適用し、４５秒間の蒸気注入を２．３５ｂａｒＧ、１３７℃で、媒体入口ポートを介して適用した。バルク懸濁液のＦ0値が＞１６となった時点で、真空パルス／蒸気注入の手順を繰り返した。両方の滅菌障壁で算出されたＦ0値が＞１６に達した時点で、ジャケットへの水（周囲温度）による冷却を開始した。
【００８６】
３箇所のセンサにおける温度又はＦ0値と時間との関係について、結果を図３ａ〜ｄに示す。
【００８７】
これらの結果はオートクレーブサイクル終了時の蒸気注入の有効性を示し、滅菌障壁（入口ポート及びエアフィルタ）のＦ0値がほぼ瞬時に＞１６に上昇することにより、リン脂質懸濁液に加えられた総熱負荷（＞８０℃の時間として表す）を約３５分間から約３０分間にさらに低減させる。
【００８８】
実施例３：ロータステータ混合及び凍結乾燥によるＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）製剤の調製
無菌Ｈ−ＥＰＳ懸濁液は、実施例４に詳述するように調製した。各バッチ（Ａ，Ｂ及びＣ）について、Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）製剤は、以下に詳述するように製造した。懸濁液の一部（５００ｍＬ）を円錐状の首部を備える丸底フラスコに移した。フラスコは、２５℃に維持した水浴に接続した温度制御用の入口及び出口を有するガラスジャケットに取り付けた。
【００８９】
ロータステータ攪拌軸を溶液中に導入し、ガスの漏出を回避するため、首部の壁と攪拌軸との間の空間は、ガス含量の調節及び圧力制御のためのガス入口／出口接続部を取り付けた特別設計の金属プラグで封止した。ガス出口を真空ポンプに接続し、溶液を１分間脱気した。その後、ガス入口を介してペルフルオロ−ｎ−ブタンガスの雰囲気に置換した。開口部が液体表面よりわずかに上になるようにロータ−ステータ攪拌軸を保持し、溶液を２３，０００ｒｐｍで１０分間均質化した。
【００９０】
得られた白色のクリーム状分散体は、密閉容器に移し、ペルフルオロ−ｎ−ブタンでフラッシュした。その後、分散体４４０ｇを、サイズ及び濃度の多段階調整のため、浮上分離槽（直径８５ｍｍ）に移した。分散体を４００分間沈降させた後、底部バルブから２５０ｍＬ排出した。この手順を４回繰り返した。その後コールターカウンター法によりマイクロバブル濃度のインプロセス定量を行った。このインプロセス分析で得た結果に基づいて、凍結乾燥用の最終分散体を固定標的マイクロバブル濃度１．７％ｖ／ｖに調整した。濃度の調整はスクロース１８４ｍｇ／ｍＬを含むＷＦＩで行い、ＷＦＩはスクロース９２ｍｇ／ｍＬを含む最終分散体に希釈する。各バッチＡ、Ｂ及びＣについて、最終分散体２ｍＬを凍結乾燥用ストッパ付きの１０ｍＬ無菌ガラスバイアル（Ｎ＝３０）に移した。凍結乾燥は、以下で詳述するサイクルにより、Ａｍｓｃｏ  Ｆｉｎｎ  Ａｑｕａ  Ｌｙｏｖａｃ  ＧＴ６パイロット凍結乾燥機を使用して実施した。
【００９１】
【表３】
0006591460.tif 000006
実施例４：Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）のリン脂質含量に関するオートクレーブ処理時間の影響
Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）製品における分解のレベル、及び分解のレベルの重要品質特性に関する影響を明らかにするため、水和リン脂質懸濁液のバルクオートクレーブにおける１５分間、２３分間、及び３０分間の滅菌を調べた。
【００９２】
ジャケット付きＢｕｃｈｉｇｌａｓｕｓｔｅｒ  Ｍｉｎｉａｕｔｏｃｌａｖｅ（１Ｌ）を使用した。Ｈ−ＥＰＳナトリウム４ｇを、プロピレングリコール１０ｍｇ／ｍＬを含むＷＦＩ８００ｍＬに添加し、２００ｒｐｍ、６０℃で２０分間混合した後、オートクレーブサイクルを開始した。温度センサを懸濁液のバルクに配置し、懸濁液の温度を連続的にモニタするために使用した。ジャケットは、加熱したシリコーン油浴から給熱され、加熱期間中１６０℃を維持し、懸濁液が設定温度１２１℃に達した時点で１４５℃に調整した。懸濁液は、バッチＡ、Ｂ及びＣについてそれぞれ、１５分間、２３分間及び３０分間、この温度に維持した（測定された温度は１２１〜１２４℃の間で変動した）。サイクルの終了時に、２０℃の冷却水をジャケットに適用した。室温に戻ってから、実施例３に詳述されているように滅菌したＨ−ＥＰＳ懸濁液をＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）の製造に使用した。
【００９３】
製剤Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）は、リン脂質懸濁液の滅菌に使用したオートクレーブ処理時間（１２１℃での分）が異なる３つのバッチＡ、Ｂ及びＣにおいて、実施例３に従って調製した。懸濁液Ａ，Ｂ及びＣのリン脂質組成は、Ｈｖａｔｔｕｍら［Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，４２，５０６−５１２（２００６）］に従ってＴＬＣにより分析した。マイクロバブルの濃度及びサイズ、３．５ＭＨｚでの音響減衰効果及び１２０ｍｍＨｇで６０秒間の加圧後の３．５ＭＨｚでの％減衰効果で示した圧力安定性を、Ｓｏｎｔｕｍ［Ｕｌｔｒａｓｏ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，３４（５），８２４−８３３（２００８）］により述べられているように測定した。結果を以下の表２及び表３にまとめる。
【００９４】
これらの結果は、造影剤Ｓｏｎａｚｏｉｄ（商標）の脂質組成物に関するオートクレーブ滅菌における加熱時間の影響を実証する。表１に見られるように、ＰＳのレベルは加熱により低下し、ＰＡ及び他の関連物質の濃度の上昇を伴う。表２は、超音波造影剤の特性が２３分間（Ｆ0＝２５）のオートクレーブサイクルと３０分間（Ｆ0＝３０）のオートクレーブサイクルとの間でかなり顕著に低下し、後者はいくつかの基準で規格を満たさなかったことを示す。この結果は、本発明による加熱サイクルの慎重な制御の必要性を実証する。
【００９５】
これらのデータから明らかなように、許容される特性を備えたＳｏｎａｚｏｉｄ（商標）を製造するために、ＰＳ及び関連物質の総量の割合において、ＰＳの量は少なくとも６８％でなければならない。ＰＳ及び関連物質の総量に対するＰＡの含量は、１５％未満でなければならない。ＰＳレベルが低いと、収率の低下及びマイクロバブル特性の低下をもたらす。
【００９６】
【表４】
0006591460.tif 000007
【００９７】
【表５】
0006591460.tif 000008
【符号の説明】
【００９８】
Ａ  媒体入口ポート
Ｂ  滅菌エアフィルタ
Ｃ  容器上部
Ｄ  加熱ジャケット
Ｅ  バルク製品用温度センサ
Ｆ  入口ポート用温度センサ
Ｇ  エアフィルタ用温度センサ
【図１】
0006591460.tif 000009
【図２】
0006591460.tif 000010
【図３ａ】
0006591460.tif 000011
【図３ｂ】
0006591460.tif 000012
【図３ｃ】
0006591460.tif 000013
【図３ｄ】
0006591460.tif 000014