(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）からｃ）のステップを含む、ヒト多能性幹細胞からヒト内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）の単離集団を生成する方法。
ａ）多能性幹細胞を提供するステップ；
ｂ）多能性幹細胞を内皮分化へと誘導するステップであって、前記誘導は、
ｉ）アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２を含む内皮分化培地で約２４時間多能性幹細胞を培養すること、及び
ｉｉ）その後、１または２日ごとにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２を含む内皮分化培地でステップｉ）の培地を交換すること
を含み；及び
ｃ）分化誘導された細胞から、ＥＣＦＣ様細胞を単離するステップであって、前記ＥＣＦＣ様細胞はＣＤ３１＋ＮＲＰ−１＋でありコブルストーン形態を示す。
【請求項２】
前記単離したＥＣＦＣ様細胞が、さらにＣＤ１４４＋、ＫＤＲ＋、及びα−ＳＭＡ−発現、のうち１つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、及びＦＧＦ−２のうち１つ以上が、約５〜２５ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＶＥＧＦが、約５〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記誘導ステップが、共培養細胞、胚葉体形成、及び外来性ＴＧＦ−β阻害のうち、一以上の不在下で実行される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離ステップが、分化１０日目、１１日目、または１２日目に実行される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離ステップが、分化１２日目に実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の単離が、フローサイトメトリー、または磁気活性化セルソーティング（Ｎａｇｍｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）により行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記単離されたＥＣＦＣ様細胞が、哺乳動物に同時移植細胞なしに移植された場合、血管形成能力を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記単離されたＥＣＦＣ様細胞集団の少なくとも約９５％のＥＣＦＣ様細胞集団が増殖する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単離されたＥＣＦＣ様細胞集団の少なくとも約３５〜５０％のＥＣＦＣｓが、高増殖可能な（ＨＰＰ）ＥＣＦＣ様細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、開始細胞あたり少なくとも約２００１個の細胞を生成する能力を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、自己再生能力を有する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
以下のステップｄ）をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
ｄ）前記単離したＥＣＦＣｓが、内皮増殖培地を含む組成物内で増殖するステップ。
【請求項１５】
以下のステップｅ）をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
ｅ）前記増殖細胞を１８回まで継代するステップ。
【請求項１６】
前記単離した細胞が、約３か月未満のうちに少なくとも約１兆個の細胞集団へ増殖する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトＮＲＰ−１＋ＣＤ３１＋内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）の単離集団であって、前記単離ＥＣＦＣ様細胞が、哺乳動物に同時移植細胞なしに移植した場合に、血管形成能力を有し、かつ前記単離ＥＣＦＣ様細胞が、インビトロでのヒト多能性細胞由来であり、
ここで仮想的タンパク質ＬＯＣ１００１３２２８８、ＣＵＢ及びＳｕｓｈｉマルチプルドメイン１、リンパ限定膜タンパク質、アリルアセトアミドデアセチラーゼ（エステラーゼ）、フォリスタチン様５、ＥＮＳＧ０００００２１５２６２、仮想的ＬＯＣ８４８５６、グアニル酸シクラーゼ活性剤２Ｂ（ウログアニリン）、ケラチン７５、繊維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、２２番染色体オープンリーディングフレーム３４、ガスダーミンＣ、ＥＮＳＧ０００００２２２９５４、ヒドロキシステロイド（１１−ベータ）デヒドロゲナーゼ１、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ２、及びＺｉｃファミリーメンバー４の遺伝子の１つ以上が、臍帯血ＥＣＦＣｓに比べて前期単離されたＥＣＦＣ様細胞において高発現し、及び／または、
レセプター（化学感覚）トランスポータータンパク質４、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１、アシル−ＣｏＡ  シンセターゼ中鎖ファミリーメンバー２Ａ、セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＡ（アルファ−１  アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー３、ＥＮＳＧ０００００２１８０５２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３、４８含有コイルドコイルドメイン、及びＲＡＳ（ＲＡＤ及びＧＥＭ）−様ＧＴＰバインディング１の遺伝子の１つ以上が臍帯血ＥＣＦＣｓに比べて前期単離されたＥＣＦＣ様細胞において低発現している単離集団。
【請求項１８】
前記ＥＣＦＣ様細胞の少なくとも約３５％が、高増殖可能な（ＨＰＰ）ＥＣＦＣ様細胞である、請求項１７に記載の単離集団。
【請求項１９】
前記ＥＣＦＣ様細胞の少なくとも約５０％が、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞である、請求項１８に記載の単離集団。
【請求項２０】
前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、開始細胞あたり少なくとも約２００１個の細胞を生成する能力を有し、かつ自己再生能力を有する、請求項１７に記載の単離集団。
【請求項２１】
前記単離集団中のＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、さらに、ＣＤ１４４＋、ＫＤＲ＋、及びα−ＳＭＡ−のうちの１つ以上により特徴付けられる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項２２】
前記単離集団中の前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、コブルストーン形態を示す、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項２３】
前記単離集団中の前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、マトリゲルで培養した時にキャピラリー様ネットワークを形成し得る、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項２４】
前記単離集団中の前記ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、インビトロで１８回まで継代され得る、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の単離集団。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得られる、ヒトＮＲＰ−１＋ＣＤ３１＋内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）の単離集団。
【請求項２６】
前記集団の中の、少なくとも約９５％の細胞が、ＥＣＦＣ様細胞であり、かつＮＲＰ−１＋ＣＤ３１＋である、請求項２５に記載の単離集団。
【請求項２７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により得られた内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）を含む、医薬品組成物。
【請求項２８】
以下のステップを含む、被験物質の細胞活動修正能力を調べる方法。
請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の前記細胞集団の少なくとも１つを被験物質に露出するステップ、及び
細胞増殖及び細胞生存能のうち１つ以上において、前記被験物質の前記効果を観察するステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月１１日に出願された米国仮出願６１／９５１，１０３号、（これは、すべての目的のために参照により組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、細胞と組織生物学の分野に関する。より詳しくは、本発明は内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）への多能性幹細胞の細胞系列特異的な分化に関する。
【背景技術】
【０００３】
内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣｓ）は、希少循環内皮細胞であり、特に臍帯血に豊富で、クローンの増殖能及び内因性のインビボでの血管形成能力を有する1-6。ＥＣＦＣｓは、血液伸長内皮細胞（ＢＯＥＣ）とも呼ばれ7、ドナー骨髄の遺伝的標識を示す最も増殖的な循環ＢＯＥＣを含んでいる7、8ヒトの異性間骨髄移植患者で、直接移植できることが示された。ドナー骨髄中のどのタイプの細胞がＥＣＦＣｓを引き起こすかは不明である。培養されたＥＣＦＣｓを前臨床の齧歯類脈管損傷モデルで静脈内に注射すると、それらは血管遺伝子反応の開始を組織化するために、脈管損傷または組織虚血の部位にすばやく補充される9-11。ヒトＥＣＦＣｓは、脈管修復を強化し、心筋梗塞12、13、脳卒中9、虚血性網膜症14、15、虚血性肢損傷10、11、16、17、の後の血流を改善し、露出した脈管セグメントまたは移植片を生着し再内皮化することが報告されている18。末梢動脈疾患（ＰＡＤ）と重要な肢虚血（ＣＬＩ）のある高齢患者及び対象で、循環あるいは常在のＥＣＦＣｓは、反復可能な老化（すなわち、ＥＣＦＣｓは増殖能が欠如しているかもしれない）の傾向を有し得る、よって自己脈管修理を無力にする。少なくともこれらの理由により、脈管修復のために使用し得るＥＣＦＣｓの代替供給者を見つけることが望まれる。
【０００４】
ヒト多能性幹細胞（ヒト胚性幹細胞と誘導多能性幹細胞、総称してｈＰＳＣｓ）は、実質的に無制限の自己再生能力、及び動物の体でどんな細胞型にでも分化する能力を示す19-21。ヒト多能性幹細胞は、内皮系統細胞に分化することが報告されている22-31。しかし、インビトロのｈＰＳＣ由来内皮細胞は不安定で（例えば、いろいろな非内皮表現型になることが報告される24,32）、５〜７回の継代のうちに、反復可能な老化に至る傾向と低い増殖能、及び／または支えとなる細胞の同時移植がない場合インビボでの血管形成能の欠如を呈する51。臍帯血ＥＣＦＣｓ（ＣＢ−ＥＣＦＣｓ）と同じかそれ以上の増殖能、及び共培養または同時移植された細胞の不存在化で、インビボで血管を作る能力が有する、内皮細胞のｈＰＳＣｓ由来のインビトロにおける公表された（発明者らによる以外の）証拠はない。
【０００５】
上記不足の一以上を軽減する、及び／または取り除くことが望まれている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、大まかに要約すると、ｈＰＳＣｓから内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）を生成する方法に関する。ＣＢ−ＥＣＦＣｓと類似する、分子、形態、機能的特性を有するＥＣＦＣ様細胞の集団へ再現的に分化するｈＰＳＣｓのためのプロトコルを提供する。
【０００７】
本発明の一の態様において、以下のａ）からｃ）のステップを含む、ヒト多能性幹細胞からヒト内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）の単離集団を生成する方法を提供する。
ａ）多能性幹細胞を提供するステップ；
ｂ）多能性幹細胞を内皮分化へと誘導するステップであって、前記誘導は、
ｉ）アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２を含む内皮分化培地で約２４時間多能性幹細胞を培養すること；及び
ｉｉ）その後、１または２日ごとにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２を含む内皮分化培地でステップｉ）の培地を交換すること
を含み；及び
ｃ）分化誘導された細胞から、ＥＣＦＣ様細胞を単離するステップであって、前記ＥＣＦＣ様細胞はＣＤ３１+ＮＲＰ−１+でありコブルストーン形態を示す。
【０００８】
本発明の他の態様において、ヒトＮＲＰ−１+ＣＤ３１+内皮性コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ様細胞）の単離集団であって、前記単離ＥＣＦＣ様細胞が、哺乳動物に同時移植細胞なしに移植した場合に、血管形成能力を有し、かつ前記単離ＥＣＦＣ様細胞が、インビトロでのヒト多能性細胞由来である単離集団が提供される。
【０００９】
本発明の他の態様において、本明細書に記載の方法によって得られるヒトＮＲＰ-１+ＣＤ３１+内皮コロニー形成様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）の単離集団が提供される。
【００１０】
本発明の他の態様において、本願に記載の単離細胞集団を前記対象に提供するステップを含む、単離細胞集団を必要とする対象への移植方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の態様において、本願に記載の治療有効量の細胞集団を前記対象に提供するステップを含む、上皮修飾を必要とする対象の治療方法が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様において、本願に記載の方法により得られた内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）を含む、医薬品組成物が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様において、
本願に記載の前記細胞集団の少なくとも１つを被験物質に露出するステップ、及び
細胞増殖及び細胞生存能のうち１つ以上において、前記被験物質の前記効果を観察するステップを含む、被験物質の細胞活動修正能力を調べる方法が提供される。
【００１４】
特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面による本特許また特許出願公開のコピーは、要求及び必要な料金の支払いにより米国特許庁により提供される。
【００１５】
本明細書の特徴は、添付の図面により参照される、以下の詳しい説明でより明らかになる：
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−Ｅ】図１Ａ−Ｅは、ｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞由来細胞をインビトロでＯＰ９間質細胞と共培養することによって分化させた内皮細胞の、形態、内皮抗原表現、クローンの増殖能、及びインビトロ、及びインビボでの血管形成能の試験を示す。図１Ａは、ＯＰ９細胞との共培養における内皮系統分化を経た後８日目のｈＥＳ、及びｈｉＰＳ細胞の典型的な位相差顕微鏡写真を示す（上のパネル）；Ｐ１とＰ４の単離細胞の培養（中央のパネル）；ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）コントロール細胞の特徴的なコブルストーン内皮表現型。すべての実験は２連にて５回行った；スケールバーは１００μｍである。図１Ｂは、ＯＰ９細胞との共培養で得られたｈｉＰＳ及びｈＥＳ由来細胞（Ｐ４）のヒトＣＤ３１、ＣＤ１４４及びＣＤ１４６に対するモノクローナル抗体による染色を示す。一番上のパネル中での等高線プロットのパーセンテージは、ＣＤ１４４、及びＣＤ３１の二重陽性細胞を示し、一番下のパネル中での等高線プロットのパーセンテージは、ＣＤ１４４、及びＣＤ１４６の二重陽性細胞を示す。すべての実験は２連にて４回行った；典型的な等高線プロットは、グループごとに示す。図１Ｃは、ＯＰ９と共培養された、ｈｉＰＳ、及びｈＥＳ由来細胞（Ｐ４）の典型的な顕微鏡写真であり、マトリゲルTMの上で毛細管状ネットワークの２、３の大きな分岐を形成した。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図１Ｄは、ＣＢ−ＥＣＦＣコントロールと比較したｈＥＳ由来細胞（Ｐ３〜Ｐ４）の、ＯＰ９共培養でのクローン増殖解析の棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。スケールバーは１００μｍである。図１Ｅは、インビボで移植と同時に、マウス赤血球で満たされた機能的ヒト血管を形成できなかったＯＰ９共培養ｈｉＰＳ及びｈＥＳ由来細胞（Ｐ４）の典型的な顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図２Ａ−Ｅ】図２Ａ−Ｅは、ｈＥＳ、及びｈｉＰＳ細胞の胚様体（ＥＢ）によって媒介される内皮系統分化から得られる内皮細胞の形態、内皮抗原発現、クローンの増殖可能性、及びインビトロとインビボの血管形成能の試験を示す。図２Ａは、胚様体（ＥＢ）によって媒介される内皮系統分化７日目のｈＥＳ、及びｈｉＰＳ由来ＥＢ（上部のパネル）；Ｐ１、及びＰ４における単離した細胞の培養（中央のパネル）；そして、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ；一番下のパネル）の特徴的コブルストーン内皮表現型の典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図２Ｂは、ヒトＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＣＤ１４６に対するモノクローナル抗体で染色した、ＥＢベースプロトコルで得られたｈｉＰＳ及びｈＥＳ由来の細胞（Ｐ４）を表す。一番上のパネルにおける等高線プロットのパーセンテージはＣＤ１４４及びＣＤ３１に陽性な細胞を示し、一番下のパネルの等高線プロットのパーセンテージはＣＤ１４４及びＣＤ１４６に陽性な細胞を示す。すべての実験は２連にて４回行った。図２Ｃは、マトリゲルTM上で多数のより小さな不完全な枝で毛細管状ネットワークを形成した、ＥＢベースのｈｉＰＳ及びｈＥＳ由来細胞（Ｐ４）の典型的な顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図２Ｄは、ＥＢベースのｈＥＳ由来細胞（Ｐ３〜Ｐ４）の、ＣＢ−ＥＣＦＣコントロール細胞と比較したクローン増殖解析を表す棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図２Ｅは、インビボにおいて移植と同時に、マウス赤血球で満たされた機能的ヒト血管を形成することができなかった、ＥＢベースのｈｉＰＳ及びｈＥＳ由来細胞（Ｐ４）の典型的な顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図３Ａ−Ｄ】ｈＥＳ細胞のＥＢｓプラス二次元ベースの内皮系統分化で得られた内皮細胞の、形態、内皮抗原表現、クローンの増殖能、及びインビトロにおけるマトリゲルTM上でのネットワーク形成能（ＴＧＦ−β阻害剤存在下）の試験を示す。図３Ａは、ＥＢｓプラス二次元ベースの分化プロトコルのｈＥＳ細胞の内皮系統分化の略図である。前述24の通りである。図３Ｂは、ＥＢプラス二次元ベースの分化プロトコルでの異なる日における内皮系統分化を経たｈＥＳ細胞の典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図３Ｃは、ＥＢプラス二次元ベースの分化プロトコルでの異なる日における内皮系統分化を経たｈＥＳ細胞の典型的等高線プロットを表す。１４日の内皮系統分化を経ている間、細胞は異なる時点に様々なヒト内皮抗原に対するモノクローナル抗体で染色された。等高線プロットのパーセンテージは、ＮＲＰ−１及びＣＤ３１の二重陽性細胞を示す。すべての実験は２連にて５回行った。図３Ｄは、ＥＢプラス二次元ベースの分化プロトコルにおいて内皮系統分化を経た１４日目ｈＥＳ細胞からソートされた細胞の異なるサブセット（ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１-、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+、及びＣＤ１４４+ＣＤ１４６+）の典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＥＢ−二次元ベースのｈＥＳ由来の様々なサブセット（Ｐ４〜Ｐ３）を、ＣＢ−ＥＣＦＣコントロールと比較したクローン増殖解析結果を示す棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを表す。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｇは、本明細書で提供される、ＥＢ形成またはＴＧＦ−β阻害を必要とせず、ＣＢ−ＥＣＦＣｓに類似したＥＣＦＣ様細胞を生産する、ワンステップ二次元無血清内皮系統分化プロトコルを示す。図４Ａは、本明細書で提供される、１０4個のｈＥＳまたはｈｉＰＳ細胞から始まり、６１日で１兆以上のＥＣＦＣ様細胞にｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞を分化させるための内皮系統分化プロトコルの略図である。１２日間の３×１０4個のｈＰＳ細胞生成は、左で示される。典型的なフローサイトメトリー等高線プロット（下部）は分化１２日目細胞のＮＲＰ−１及びＣＤ３１の発現パーセントを示す。１２日目のＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、広範囲な拡大を経た安定したＥＣＦＣ様細胞集団を引き起こす。
【図４Ｂ】図４Ｂは、分化１２日目の細胞がＮＲＰ−１+ＣＤ３１+、及びＮＲＰ−１-ＣＤ３１+にソートされ、内皮増殖のための転換培地で培養された細胞フラクションを示す棒グラフである。すべての実験は３連にて６回行った。値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図４Ｃ−Ｅ】図４Ｃは、特徴的コブルストーン形態を示し、各々のコロニーの中で内皮細胞の同種の集団を含んだ、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションから得られたＥＣＦＣ様細胞コロニーの典型的な顕微鏡写真である。実験は２連にて８回行った。スケールバーは５０μｍである。図４Ｄは、典型的内皮マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＮＲＰ−１の細胞表面発現を示し、非内皮マーカーであるα−ＳＭＡを示さないＥＣＦＣ様細胞の、典型的な免疫蛍光顕微鏡写真である。左のパネルにおいて、ＮＲＰ−１発現は緑で表し；ＣＤ３１発現は赤で表す。右のパネルにおいて、α−ＳＭＡ発現は緑で表し；ＣＤ１４４発現は赤で表す。ＤＡＰＩは、核を青で染色するために用いた。すべての実験は２連にて３回行った。図４Ｅは、ＣＢ−ＥＣＦＣコントロールと比較したｈＥＳ、及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞のクローン増殖解析を表す棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った。値は平均±ＳＤを表す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞の特徴的コブルストーン形態を示し、かつマトリゲルTM上で完全な毛細管状のネットワークを形成する、ＣＢ−ＥＣＦＣｓが示す能力と類似する能力を示す典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＥＣＦＣ様細胞が免疫不全マウスで恒久性、及び機能的なインビボのヒト脈管を作ることを示す。典型的な顕微鏡写真の中の矢は、抗ヒトＣＤ３１+で染色した、ホストマウス赤血球の循環で灌流させた機能的なヒト血管を表す。スケールバーは５０μｍである。棒グラフ（下部）は、各々のグループでのｍｍ2あたりの機能的ｈＣＤ３１+脈管の数を表す。すべての実験は３連にて６回行った。値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：ｐ＝ｎｓ。スケールバーは５０μｍである。
【図５】ＥＣＦＣ様細胞プロトコルにおいて、ｈＥＳ、及びｈｉＰＳ細胞の分化からのＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞出現の動態解析を示す。すべての実験は２連にて４回行った；値は平均±ＳＤを表す。
【図６Ａ−Ｅ】ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞がＥＣＦＣの特性を示さないことを示す。図６Ａは、異質な形態を示すＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞から得た内皮コロニーの典型的な顕微鏡写真である。実験は２連にて８回行った。スケールバーは１００μｍである。図６Ｂは、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞の典型的な免疫蛍光顕微鏡写真であり、ほとんどの細胞が内皮表面マーカーＣＤ１４４を表さず、非内皮マーカーα−ＳＭＡの優勢発現を示している。ＣＤ１４４発現は赤で示し、α−ＳＭＡ発現は緑で示し、そしてＤＡＰＩは核を青で染色するために用いた。実験は２連にて４回行った。スケールバーは１００μｍである。図６Ｃは、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞の典型的な顕微鏡写真であり、移植と同時にインビボでマウス赤血球を満たした機能的ヒト脈管生成が不可能であることを示す。代わりに、前記ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞は、接合における欠陥を示唆するＲＢＣｓ（矢で示される）なしで、小さな管腔（ｌｕｍｅｎｓ）を形成した。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図６Ｄは、マトリゲルTM上で不完全な毛細管状ネットワーク形成を示すＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞の典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図６Ｅは、ｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+、及びＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞の、単一細胞プレートＣＢ−ＥＣＦＣコントロールと比較したクローン増殖解析の結果を示す棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７Ａ−Ｄ】安定したＥＣＦＣ様表現型を引き起こすＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞が分化９日目に現れ始め、そして、安定したＥＣＦＣ様細胞を引き起こすＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞の顕著な増加が分化１２日目に起こることを示す。図７Ａは、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞プロトコルを用いたヒトｉＰＳ細胞由来の、新生ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞の分化６日、９日、及び１２日目のパーセンテージを表した棒グラフである。すべての実験は２連にて４回行った。値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。図７Ｂは、ｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞から得た内皮コロニーの、分化６日、９日、及び１２日目における典型的な顕微鏡写真である。１２日目由来のＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、コブルストーン形態を示し、各々のコロニーの中に内皮細胞の同種の集団を含んでいた。すべての実験は２連にて８回行った。スケールバーは５０μｍである。図７Ｃは、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞プロトコルにより得たｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションの、分化６日、９日、及び１２日目の典型的な等高線プロットである。等高線プロットに示されるパーセンテージは、ＣＤ１４４、及びＣＤ３１の二重陽性細胞を示す。すべての実験は２連にて４回行った。図７Ｄは、マトリゲルTMネットワーク形成能を示す典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図８Ａ−Ｂ】本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞分化プロトコルから得られるｈＥＳ由来内皮細胞の形態、内皮抗原発現、及びインビトロでのマトリゲルTMネットワーク形成能の試験を示す。図８Ａは、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞分化プロトコルにおける内皮系統分化を経たｈｉＰＳ細胞の、異なる日における、典型的な位相差顕微鏡写真である。２Ｄ培養でのヒトｉＰＳ細胞は、内皮様の形態を持った細胞のコロニーを作るようになり（６日目と９日目に）、１２日目でコンフルエントになった。実験は２連にて８回行った。スケールバーは１００μｍである。図８Ｂは、ＥＣＦＣ様細胞分化を経ている細胞が異なる日において、典型的内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＮＲＰ−１を細胞表面に発現し、非内皮マーカーα−ＳＭＡを発現しないことを示す典型的な免疫蛍光顕微鏡写真である。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は１２日目に分化している大量の細胞中で、細胞のクラスターとなって現れ、α−ＳＭＡ発現が完全に欠如していた。ＮＲＰ−１発現は緑で表し；ＣＤ３１発現は赤で表し；α−ＳＭＡ発現は緑で表し；ＣＤ１４４発現は赤で表す；ＤＡＰＩは核を青で染色するために用いられた。実験は２連にて４回行った。スケールバーは５０μｍである。
【図８Ｃ−Ｅ】図８Ｃは、ｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションから得られる内皮コロニーの６日、９日、及び１２日目に調べられた典型的な顕微鏡写真である。１２日目由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、各々のコロニーの中で内皮細胞の同種の集団を含んでいる特徴的コブルストーン形態を示した。すべての実験は２連にて８回行った。スケールバーは５０μｍである。図８Ｄは、ＥＣＦＣ様細胞プロトコルを使って得られる６日、９日、及び１２日目のｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションの典型的な等高線プロットである。異なる日に由来するＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、内皮生育培地で培養され、コンフルエントな細胞の単層を形成した。典型的内皮遺伝子共発現の有無を試験するために、これらの細胞は、ヒトＣＤ３１、及びＣＤ１４４内皮抗原に対するモノクローナル抗体で染色した。等高線プロットで示されるパーセンテージは、ＣＤ１４４、及びＣＤ３１の二重陽性細胞を示す。ＣＤ１４４、及びＣＤ３１を共発現している細胞の最も高いパーセンテージは、１２日目由来のＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞で現れた。すべての実験は２連にて５回行った。図８Ｅは、マトリゲルTMネットワーク形成能を示す典型的な位相差顕微鏡写真である。ヒトｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションは、ＥＣＦＣ様細胞分化プロトコルの６日、９日、及び１２日目にＥＣＦＣ様細胞プロトコルを使って得られた。これらの各々の日由来のＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞を培養し増殖させた後に、マトリゲルTMをコートしたディッシュ上でインビトロでの毛細管状のネットワーク形成解析を行った。６日目由来の細胞が、マトリゲルTMにプレートしている不完全な毛細管状のネットワークを形成した間に、９日目と１２日目由来の細胞は完全な毛細管状のネットワークを形成した。すべての実験は２連にて４回行った。スケールバー１００μｍである。
【図９Ａ−Ｅ】図９Ａ−Ｅは、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞分化プロトコルから得られるｈＥＳ由来内皮細胞の形態、内皮抗原表発現、及びインビトロでのマトリゲルTMネットワーク形成能試験を示す。図９Ａは、ＥＣＦＣ様細胞分化プロトコルにおいて内皮系統分化を経ているｈＥＳ細胞の、異なる日における典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて８回行った。スケールバーは１００μｍである。図９Ｂは、典型的内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＮＲＰ−１を細胞表面に発現し、非内皮マーカーα−ＳＭＡを発現しないことを示している、異なる日においてＥＣＦＣ様細胞分化が進行している細胞典型的な免疫蛍光顕微鏡写真である。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は１２日目に分化している大量の細胞中で、細胞のクラスターとなって現れ、α−ＳＭＡ発現が完全に欠如していた。ＮＲＰ−１発現は緑で表し；ＣＤ３１発現は赤で表し；α−ＳＭＡ発現は緑で表し；ＣＤ１４４発現は赤で表す；ＤＡＰＩは核を青で染色するために用いられた。すべての実験は２連にて４回行った。スケールバーは１００μｍである。図９Ｃは、ｈＥＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションから得られる内皮コロニーの６日、９日、及び１２日目に試験された典型的な顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて８回行った。スケールバーは５０μｍである。図９Ｄは、ＥＣＦＣ様細胞プロトコルを使って得られる６日、９日、及び１２日目のｈＥＳ由来のＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションの典型的な等高線プロットである。異なる日に由来するＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、内皮生育培地で培養され、コンフルエントな細胞の単層を形成した。等高線プロットで示されるパーセンテージは、ＣＤ１４４、及びＣＤ３１の二重陽性細胞を示す。すべての実験は２連にて４回行った。図９Ｅは、マトリゲルTMネットワーク形成能を示す典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図１０Ａ−Ｃ】ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞がヒトの病気の臨床前動物モデルで虚血性網膜、及び肢の両方の脈管修復に関与する方法を表す。図１０Ａは、ビヒクル（左）またはｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞（右）を注射したＣ５７／ＢＬ６マウスの平らにマウントした典型的な網膜である。網膜脈管構造は、イソレクチンＢ４で緑に染色した。無血管エリアは白線によって示した。すべての実験は４回以上行われ、無血管エリアのパーセンテージを計算した。スケールバーは１ｍｍである。図１０Ｂは、ビヒクル（左）またはｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓ（右）を注射したＣ５７／ＢＬ６マウスの平らにマウントした典型的な網膜である。網膜脈管構造は、イソレクチンＢ４で緑に染色した。無血管エリアは白線によって示した。すべての実験４回以上行われ、無血管エリアのパーセンテージを計算した。スケールバーは１ｍｍである。図１０Ｃは、ビヒクル（左）またはｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞（右）を注射したＣ５７／ＢＬ６マウスの典型的な病理学的網膜前新血管形成を示す。網膜前新血管は、反対側のｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣｓ様細胞を注射した目と比較して、ビヒクルを注射した目では主にふさ状分岐になって見える。矢は網膜前新血管のふさ状分岐を示す。すべての実験は４回以上行った。スケールバーは２００μｍである。
【図１０Ｄ−Ｆ】図１０Ｄは、無胸腺のヌードマウスにおいてｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞によって治療的な新血管形成を示す典型的なレーザー・ドップラー灌流の画像である。ビヒクルまたはｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４＋ＥＣｓを注射したグループより、ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞またはＣＢ−ＥＣＦＣｓを移植したマウスの虚血性肢（矢印）で、肢血灌流のより大きな増加が観察された。すべての実験は１０回以上行った。図１０Ｅは、ビヒクル、ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞、ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４＋ＥＣｓ、またはＣＢ−ＥＣＦＣｓの、移植後２８日目における虚血性肢の生理的状態のパーセンテージ分布を示した積み上げ棒グラフである。すべての実験は１０回以上行った。図１０Ｆは、ビヒクル、ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞、ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４＋ＥＣｓ、またはＣＢ−ＥＣＦＣｓの、移植後２８日目における虚血性肢の生理的状態を表すテーブルである。すべての実験は１０回以上行った。値は患肢温存、壊死、また喪失のパーセンテージを示す。パラメータのカイ二乗テスト：＊Ｐ＜０．０５。
【図１１Ａ】インビボでの虚血性網膜脈管系へのｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞の統合を表す。図１１Ａは、量子ドットで赤くラベルして虚血性網膜に注射し、その後レジデント脈管系（イソレクチンＢ４で緑に染色した）に取り込まれた、ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞（右上）またはｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４＋ＥＣｓ（左上）を表す。ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４＋ＥＣｓと比較されるとき、ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞はホスト網膜でより多く、及びより広い配布において統合する。すべての実験は４回以上行った。スケールバーは５０μｍである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、単一細胞としてホスト脈管構造と緊密に存在し、さらに表層性網膜網状組織の構造のような脈管チューブを形成するように見える、赤い量子ドットでラベルしたｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞である。すべての実験は４回以上行った。スケールバーは２５μｍである。
【図１２Ａ−Ｂ】ｈｉＰＳ由来ＣＤ３１+ＮＲＰ−１+ＥＣＦＣ様細胞が広範囲な拡大を経て、安定した内皮表現型を維持し、最終的に長期培養の後、老境にかかったようになる初代細胞の特性を示す。図１２Ａは、β−ガラクトシダーゼ染色を示すＣＢ−ＥＣＦＣｓの典型的な位相差顕微鏡写真である。ＣＢ−ＥＣＦＣｓは、メーカーの指示に従ってβ−ガラクトシダーゼで染色した。ＣＢ−ＥＣＦＣｓはＰ７では、ほとんどβ−ガラクトシダーゼ陽性の青色細胞（円によって示される）を示さなかったが、Ｐ１８では、これらの細胞のほぼ全てがβ−ガラクトシダーゼにより青く染色され陽性であった。すべての実験は２連にて８回行った。スケールバーは５０μｍである。図１２Ｂは、β−ガラクトシダーゼ染色を示すｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞の典型的な位相差顕微鏡写真である。ｈｉＰＳ  ＥＣＦＣ様細胞はメーカーの指示に従ってβ−ガラクトシダーゼで染色された。ｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞はＰ７ではほとんどβ−ガラクトシダーゼ陽性の青色細胞（円によって示される）を示さなかったが、Ｐ１８ではこれらの細胞のほぼ全てがβ−ガラクトシダーゼにより青く染色され陽性であった。すべての実験は２連にて４回行った。スケールバーは５０μｍである。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ｃは、異なる継代回数におけるＣＢ−ＥＣＦＣｓ、及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞でのβ−ガラクトシダーゼ陽性のパーセンテージを示す棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを表す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。図１２Ｄは、典型的内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＮＲＰ−１を発現し、非内皮マーカーα−ＳＭＡを発現していないことを示しているｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞の典型的な免疫蛍光顕微鏡写真である。上部のパネルにおいて、ＮＲＰ−１発現は緑で表し；ＣＤ３１発現は赤で表す。下部パネルにおいて、α−ＳＭＡ発現は緑で表し；ＣＤ１４４発現は赤で表す。ＤＡＰＩは、核を青で染色するために用いられた。すべての実験は２連にて３回行った。スケールバーは１００μｍである。
【図１３Ａ】ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞がＣＢ−ＥＣＦＣｓに類似した分子サインを提示することを示す。図１３Ａは、個々の胚葉と、特定の系統を定めている遺伝子の選ばれたグループの相対的な転写レベルのヒートマップである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、前述32のように、脈管、アンジオクライン、及び非脈管遺伝子の選ばれたグループの相対的な転写レベルのヒートマップを表す。ヒトｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞、及びｈＥＳ由来ＥＣＦＣ様細胞は、多くの脈管（上のパネル）、及びアンジオクライン（中央のパネル）遺伝子で高発現プロフィールを示し、非脈管遺伝子（下のパネル）の発現は減少しており、ＣＢ−ＥＣＦＣｓによって示される発現に類似していた。
【図１４Ａ−Ｂ】ＫＤＲ、ｐ１３０Cas、及びＰｙｋリン酸化を示した全長ウエスタンブロットである。図１４Ａは、リン酸化されたＫＤＲを確認するためにリン酸ＫＤＲ抗体で最初に処理されたウエスタンブロットである。図１４Ｂは、リン酸ＫＤＲ抗体で最初に処理され、そして総ＫＤＲ抗体でのインキュベートのためにストリッピングされたウエスタンブロットである。
【図１４Ｃ−Ｄ】図１４Ｃは、リン酸ｐ１３０Casで処理されたウエスタンブロットである。図１４Ｄは、リン酸−ｐ１３０Casで最初に処理され、そしてリン酸Ｐｙｋ２抗体で再度インキュベートするためにストッリッピングされたウエスタンブロットである。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、リン酸ｐ１３０Casで最初に処理され、そして総リン酸Ｐｙｋ２抗体で再インキュベートするためにストッリッピングされたウエスタンブロットである。
【図１５Ａ−Ｃ】ＮＲＰ−１がｈｉＰＳ細胞からのＥＣＦＣ様細胞の出現のために重要であることを示す。図１５Ａは、ｈｉＰＳ細胞からのＥＣＦＣ様細胞の出現における、ＮＲＰ−１の役割を試験するために用いられる処理ストラテジーの略図である。図１５Ｂは、コントロール（青）、Ｆｃ−ＮＲＰ−１（赤）、及びＮＲＰ−ｂ（緑）による処理４日後と６日後にのＮＲＰ−１+ＣＤ３１+（二重の）陽性細胞の出現パーセンテージの定量化を表す折れ線グラフである。挿入しているフローサイトメトリー等高線プロットは、分化６日目のＫＤＲ、及びＮＲＰ−１の発現パーセントであり、大量のＫＤＲ発現とＮＲＰ−１発現の減少を示す。すべての実験は３連にて６回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１５Ｃは、ＫＤＲ、ｐ１３０Cas、及びＰｙｋ２リン酸化を示すウエスタンブロットである。すべての実験は２連にて４回行った。
【図１６Ａ−Ｅ】ＮＲＰ−１がＥＣＦＣ様細胞の増殖能の維持のために重要であることを示す。図１６Ａは、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＮＲＰ−１に対するモノクローナル抗体で染色した異なる継代回数（Ｐ４、Ｐ１４、及びＰ１８）のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞を表す。それぞれの等高線プロットのパーセンテージはＣＤ３１、及びＣＤ１４４の二重陽性細胞（左のパネル）を示し、一方右のパネルの等高線プロットのパーセンテージはＣＤ３１、及びＮＲＰ−１の二重陽性細胞を示す。すべての実験は２連にて４回行った。図１６Ｂは、異なる継代回数（Ｐ４、Ｐ１４、及びＰ１８）のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞における、培養７日後での拡大倍率を表す。すべての実験は３連にて３回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。図１６Ｃは、ＫＤＲ、及びＮＲＰ−１に対するモノクローナル抗体で染色した継代１４回のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞を表す。各々の等高線プロットのパーセンテージは、ＮＲＰ−１、及びＫＤＲに対する陽性細胞を示す。すべての実験は２連にて４回行った。図１６Ｄは、処理の３日後または７日後に拡大倍率の検査をするために、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで処理された後期の継代（Ｐ１４）のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞を表す。棒グラフはコントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂでの処理３日後（左の棒グラフ）、及び７日後（右の棒グラフ）のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞（Ｐ１４）の拡大倍率を表す。すべての実験は３連にて５回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１６Ｅは、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理された、メーカーの指示に従ってβ−ガラクトシダーゼで染色した、後期の継代（Ｐ１４）のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞を表す。円はβ−ガラクトシダーゼ陽性の染色された細胞を表す。Ｆｃ−ＮＲＰ−１処理は、コントロール処理細胞と比較してβ−ガラクトシダーゼ陽性の青色細胞（ドットで囲んだ）の数を減少させた。ＮＲＰ−１−Ｂ処理は、コントロールと比較して青色細胞の数を増加させた。すべての実験は３連にて４回行った。スケールバーは５０μｍである。
【図１６Ｆ−Ｉ】図１６Ｆは、後期の継代（Ｐ１４）におけるｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞を、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理した後の、β−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞のパーセンテージを示している棒グラフである。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図１６Ｇは、ＶＥＧＦ１６５を含む正常ＥＧＭ−２培地、及びＶＥＧＦ１２１を含むＥＧＭ−２培地で培養され、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理された、後期の継代（Ｐ１４）におけるｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞を表す。７日後に、細胞を回収、カウントし、これら各々の処理群の中で、生細胞、アポトーシス促進細胞、及び死細胞の有無を試験するためにヨウ化プロピジウムとアネキシンＶで染色した。棒グラフは、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂでの７日間処理に続き、培地を含んだＶＥＧＦ１２１、及びＶＥＧＦ１６５中でのアポトーシス促進細胞のパーセンテージを表す。ＶＥＧＦ１２１存在下で培養した細胞に比べて、培地を含んだＶＥＧＦ１６５中で培養した細胞のＦｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂ処理群においてアポトーシス促進細胞のパーセンテージはかなり減少した。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊ｐ＜０．０１。図１６Ｈは、ＶＥＧＦ165をＶＥＧＦ121と入れ替えられた正常ＥＧＭ−２培地で培養された後期の継代（Ｐ１４）におけるｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞を表す。これらの細胞は７日間、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、またはＮＲＰ−１−Ｂで処理された。棒グラフは、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂでの７日間処理に続き、ＶＥＧＦ121処理培地でのＰ１４ｈｉＰＳ由来のＥＣＦＣ様細胞の拡大倍率を表す。Ｆｃ−ＮＲＰ−１またはＮＲＰ−１−Ｂ処理はＶＥＧＦ121存在下のコントロールと比べて、これらの細胞の拡大倍率において重要な変更を起こさなかった。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。図１６Ｉは、ＶＥＧＦ165を含む正常ＥＧＭ−２培地とＶＥＧＦ121を含むＥＧＭ−２培地で培養された後期の継代（Ｐ１４）回数のｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞を表す。これらの細胞は、７日間コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、またはＮＲＰ−１−Ｂで処理された。７日後に、細胞は回収、カウントし、これら各々の処理群の中で、生細胞、アポトーシス促進細胞、及び死細胞の有無を試験するためにヨウ化プロピジウムとアネキシンＶで染色した。コントロール（左のパネル）、Ｆｃ−ＮＲＰ−１（中央のパネル）、またはＮＲＰ−Ｂ（右のパネル）で処理され、ＶＥＧＦ121（上の列のパネル）、またはＶＥＧＦ165（下の列のパネル）の存在下での、各々の等高線プロットのパーセンテージは、生細胞、アポトーシス促進細胞、及び死細胞を示す。ＶＥＧＦ121処理細胞で、Ｆｃ−ＮＲＰ−１とＮＲＰ−１−Ｂは、コントロールと比較して死細胞とアポトーシス促進細胞のパーセンテージを上昇させた。しかし、ＶＥＧＦ165処理細胞では、Ｆｃ−ＮＲＰ−１が死細胞とアポトーシス促進細胞のパーセンテージを低下させ、コントロールと���較して生細胞のパーセンテージを上昇させ、ＮＲＰ−１−Ｂは死細胞とアポトーシス促進細胞のパーセンテージを上昇させ、コントロールと比較して生細胞のパーセンテージを低下させた。すべての実験は３連にて４回行った；典型的な等高線プロットは、グループごとに示す。
【図１７Ａ−Ｆ】ＰＡＤ患者由来のＥＣｓにおいて、ＮＲＰ−１発現の低下、及び初期の細胞老化が見られ、クローン増殖能の完全な階層を示すことができず、インビボでの脈管形成能が不十分であるが、ＰＡＤ−ＥＣｓでの外性のＮＲＰ−１による処理が細胞老化を減少させ、多核細胞形成を減少し、ＰＡＤ−ＥＣの増殖能を救うことを説明する。図１７Ａは、下肢切断を受けた末梢動脈疾患患者に由来した動脈、及び末梢血ＥＣｓを表す。典型的な位相差顕微鏡写真は、ＰＡＤ、及びＣＬＩにおいて患者から得られるＰＢ（左のパネル）と動脈（右のパネル）に由来する内皮細胞の同種の特徴的コブルストーン形態を示す。すべての実験は２連にて６回行った。スケールバーは５０μｍである。図１７Ｂは、典型的内皮マーカーの発現力を決定するためにフローサイトメトリー解析を受けたＰＡＤ患者由来のＥＣｓを表す。ＰＡＤ患者動脈またはＰＢ由来の内皮細胞は、ヒトＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＫＤＲ、及びＮＲＰ−１に対するモノクローナル抗体で染色した。等高線プロットの右上四半部で示されるパーセンテージは、ＣＤ３１、及びＣＤ１４４の二重陽性細胞（左の等高線プロット）を示す。右の等高線プロットのパーセンテージは、ＮＲＰ−１とＫＤＲを共発現している細胞（右上）；ＮＲＰ−１発現（左上）；右下はＫＤＲ発現のパーセンテージを示す。これらの細胞の全てがＣＤ３１とＣＤ１４４の共発現の高水準を維持し、そして、細胞の６０％以上がＫＤＲ発現を示し、細胞の１０％未満はＮＲＰ−１発現を示した。すべての実験は３連にて５回行った。図１７Ｃは、内皮マーカーＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＮＲＰ−１、及び非内皮マーカーα−ＳＭＡの表面発現を示しているｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞、及びＰＡＤ動脈ＥＣｓの典型的な免疫蛍光顕微鏡写真である。上のパネルでは、緑でＮＲＰ−１発現を示し；赤でＣＤ３１発現を示した。下パネルでは、緑でα−ＳＭＡ発現を示し；赤でＣＤ１４４発現を示した。ＤＡＰＩは、核を青で染色するために用いられた。ｈｉＰＳ  ＥＣＦＣ様細胞は、ＮＲＰ−１、及びＣＤ３１の共発現を示し、ＣＤ１４４に対し陽性染色され、α−ＳＭＡ発現を完全に欠如していた。ＰＡＤ−動脈−ＥＣｓはＮＲＰ−１、及びＣＤ３１の共発現は示さなかったが、それらはＣＤ３１、及びＣＤ１４４に対し陽性染色され、α−ＳＭＡ発現を完全に欠如していた。すべての実験は２連にて４回行った。スケールバーは１００μｍである。図１７Ｄは、単一細胞増殖能アッセイを受けたＣＢ−ＥＣＦＣｓ、ｈｉＰＳ由来のＥＣＦＣ様細胞、及びＰＡＤ患者由来のＥＣｓを表す。これらのグループからの単一細胞は９６ウェルプレートにプレートされ、１４日後に記録された。ＰＡＤ患者由来の内皮細胞はレジデント血管壁（動脈）のおよそ７０％とＰＢ由来内皮細胞の３０％以上が、単一非分裂細胞として残り、不十分な増殖的ふるまいを示した。対照的に、プレートした単一ＣＢ−ＥＣＦＣｓ細胞、及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞グループでは、わずか２％が培養１４日間後に非分裂細胞として残った。それらのＰＡＤ誘導細胞は、大部分は内皮集団を形成し（ＰＡＤ−動脈−ＥＣｓの２８％、及びＰＡＤ−ＰＢ−ＥＣｓの６０％）、ＬＰＰ−ＥＣＦＣ形成はほとんどせず（ＰＡ���−動脈−ＥＣｓの０．５％、及びＰＡＤ−ＰＢ−ＥＣｓの４％）、ＨＰＰ−ＥＣＦＣを引き起こさなかった。しかし、ＣＢ−ＥＣＦＣｓ、及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞グループの細胞は、ほとんど内皮集団を形成せず、大部分はＬＰＰ−ＥＣＦＣｓ（ＣＢ−ＥＣＦＣｓの４４．３％、及びｈｉＰＳ  ＥＣＦＣ様細胞の４４．７％）、及びＨＰＰ−ＥＣＦＣｓ（ＣＢ−ＥＣＦＣｓの３５％、及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞の４３％）を形成した。すべての実験は３連にて４回行った。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７Ｅは、ＰＡＤ患者由来の動脈、及び末梢血からのＥＣｓのマトリゲルTM上での毛細管状ネットワーク形成能を示す典型的な位相差顕微鏡写真である。すべての実験は２連にて５回行った。スケールバーは１００μｍである。図１７Ｆは、免疫不全マウスに移植したＰＡＤ患者由来のＥＣｓである。ゲルは移植１４日後に回収、固定、及び透過し、マウスのホスト細胞に交差反応しない特異的抗ヒトＣＤ３１抗体で染色した。典型的な顕微鏡写真の中で示される矢は、ホスト赤血球の循環で灌流したいくつかの小さな抗ヒトＣＤ３１+血管を示す。すべての実験は３連にて５回行った。スケールバーは５０μｍである。
【図１７Ｇ−Ｋ】図１７Ｇは、各々のグループが示すｍｍ2あたりの機能的ｈＣＤ３１+脈管を定量化した棒グラフである。ＰＡＤ患者由来ＥＣｓが示す機能的ｈＣＤ３１+脈管は、ＣＢ−ＥＣＦＣコントロールと比較してかなり減少していた。すべての実験は３連にて５回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７Ｈは、メーカーの指示に従ってβ−ガラクトシダーゼで染色したＰＡＤ−ＥＣｓ、及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞（Ｐ７）を表す。ＰＡＤ−ＥＣグループのほとんどの細胞はβ−ガラクトシダーゼ陽性の青色細胞を示したが、ｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞グループでは、わずかな細胞（円によって示される）がβ−ガラクトシダーゼ陽性であった。すべての実験は３連にて４回行った。スケールバーは５０μｍである。図１７Ｉは、β−ガラクトシダーゼ陽性であるＰＡＤ−ＥＣｓのパーセンテージを、ｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞と比較した棒グラフである。ＰＡＤ−ＥＣｓではｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞と比較して、高いパーセンテージの細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性の青色細胞であった。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７Ｊは、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理したＰＡＤ−動脈ＥＣｓ（Ｐ７）を表す。棒グラフは、ＰＡＤ−動脈ＥＣｓをコントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理した後の拡大倍率を示す。Ｆｃ−ＮＲＰ−１処置群ではコントロールと比較してより高い拡大倍率が観察され、ＮＲＰ−１−Ｂ処置群では、コントロールと比較してかなり減少した拡大倍率が観察された。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７Ｋにおいて、ＰＡＤ−動脈ＥＣｓ（Ｐ７）は、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理し、メーカーの指示に従ってβ−ガラクトシダーゼで染色した。コントロール、及びＮＲＰ−１−Ｂ処置群ではほとんどすべての細胞がβ−ガラクトシダーゼ陽性であり染色されたが、Ｆｃ−ＮＲＰ−１処置群ではいくつかの細胞がβ−ガラクトシダーゼ染色（円によって示される）に陽性ではなかった。すべての実験は３連にて４回行った。スケールバーは５０μｍである。
【図１７Ｌ−Ｎ】図１７Ｌは、ＰＡＤ−動脈内皮細胞をコントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで７日間処理した後のβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞のパーセンテージを示した棒グラフである。Ｆｃ−ＮＲＰ−１処理細胞で、コントロール処理細胞と比較してかなり減少したβ−ガラクトシダーゼ陽性青色細胞が観察された。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊ｐ＜０．０５＊＊＊ｐ＜０．００１。図１７Ｍは、ＰＡＤ−動脈ＥＣｓ（Ｐ７）をコントロール、及びＦｃ−ＮＲＰ−１で７日間処理し、処理細胞の核の数をカウントするために得られた、細胞の顕微鏡写真である。典型的な顕微鏡写真では、コントロール（左のパネル）において矢は多核青色細胞を示し、円（右のパネル）は一つの核を有する非青色細胞を示す。すべての実験は３連にて４回行った。スケールバーは２５μｍである。図１７Ｎは、Ｆｃ−ＮＲＰ−１処理細胞の多核ＰＡＤ−ＥＣｓのパーセンテージを、コントロールを比較した棒グラフである。Ｆｃ−ＮＲＰ−１処理細胞における多核細胞のパーセンテージは、コントロール処理細胞と比較してかなり減少していた。すべての実験は３連にて４回行った；値は平均±ＳＤを示す。スチューデントｔ検定：＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１８】１０4個のｈＥＳまたはｈｉＰＳ細胞から始まり、本明細書のＥＣＦＣ様細胞分化プロトコルを使用し、８３日間で１兆細胞以上の推定された世代を表した略図である。１２日目に誘導されたＮＲＰ−１＋ＣＤ３１＋細胞は、１兆以上の細胞を引き起こす広範囲な拡大を経て、安定したＥＣＦＣ様細胞群体を生じた。この研究は、１つのｈＥＳ株と３つのｈｉＰＳ株で２回行った。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は概して、多能性細胞（例えばヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（総称してヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）））の内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）へのインビトロにおける分化方法に関する。本明細書で提供される方法のいくつかの態様において、フィーダー細胞及び／または血清の使用を必要としないと定義した条件下で、多能性細胞は維持され、拡大し、そして分化しうる。一の態様において、得られるＥＣＦＣ様細胞は、共培養及び／または同時移植細胞が不在の場合、インビボにおいてさらに血管へと成長しうる。
【００１８】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法により生成したＥＣＦＣ様細胞は、インビトロで、ＯＰ９の様な細胞、または胎様体（ＥＢ）形成との共培養によってｈＥＳまたはｈｉＰＳ細胞から派生した内皮細胞（ＥＣｓ）と関連して高い増殖能（ＨＰＰ）を有する。一の態様において、本明細書に記載の方法により生成したＥＣＦＣ様細胞は、ヒトの臍帯血から分離されたＥＣＦＣｓと同等、またはより大きな増殖能を有する。一の態様において、本明細書に記載された方法は、少なくとも１ｘ１０8個の計算されたＥＣＦＣ様細胞からの再生可能な生成のために用いうる。
【００１９】
Ｉ．定義
【００２０】
本明細書で用いられる特定の用語の定義が以下に提供される。特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的な用語は、一般に本開示が属する技術分野の通常の知識を有する者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２１】
本明細書において、「内皮コロニー形成細胞」及び「ＥＣＦＣ」は、単一細胞から内皮コロニーを増殖、形成する能力を示し、同時移植あるいは共培養された細胞が不在の場合インビボで血管形成能力を有する血液中に見られる一次内皮細胞を意味する。
【００２２】
本明細書において、「臍帯血ＥＣＦＣ」及び「ＣＢ−ＥＣＦＣ」は、臍帯血に由来する一次ＥＣＦＣｓを意味する。
【００２３】
本明細書において、「細胞様細胞を形成している内皮コロニー」及び「ＥＣＦＣ様細胞」は、インビトロにおいてヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣｓ）から生成される非一次内皮細胞を意味する。ＥＣＦＣ様細胞は、少なくとも単一細胞から内皮コロニーを増殖、形成する能力を示し、同時移植あるいは共培養された細胞が不在の場合インビボで血管形成能力を含む、ＥＣＦＣｓのいくつかの特徴を有する。
【００２４】
本明細書において、用語「増殖能」及び「増殖能」は、適切な成長促進シグナルが提供される際の、細胞を分裂する能力を意味する。
【００２５】
本明細書において、用語「高い増殖能」、「高い増殖能」、及び「ＨＰＰ」は、１４日の細胞培養において、単一細胞がおよそ２０００より多数の細胞に分裂する能力を意味する。好ましくは、ＨＰＰ細胞は、自己補充能力を有する。例えば、本明細書で提供されるＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞は自己補充能力を有する、つまりインビトロで再播種されるとき、二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様コロニーの中で、一以上のＬＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞を生じさせる能力があることを意味する。いくつかの態様において、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞は、インビトロで再播種されるとき、二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様コロニーの中で、一以上のＬＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞及びＥＣＦＣ様細胞クラスターを生じさせる能力をも有し得る。
【００２６】
本明細書において、用語「低い増殖能」、「低い増殖能」、及び「ＬＰＰ」は、１４日の細胞培養において、単一細胞がおよそ５１−２０００の細胞に分裂する能力を意味する。いくつかの態様において、ＬＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞は、ＥＣＦＣ様細胞クラスターを生じさせる能力をも有し得る。しかし、ＬＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞は、二次ＬＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞またはＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞を生じさせる能力がない。
【００２７】
本明細書において、用語「ＥＣＦＣ様クラスター」は、１４日間の細胞培養において約２〜５０の細胞に分裂する能力があるＥＣＦＣ様細胞のクラスターを意味する。
【００２８】
本明細書において、用語「多能性細胞」は、任意の細胞型（例えば、３つの胚葉のいずれか一つの細胞：内胚葉、中胚葉、または外胚葉）に分化する可能性がある細胞を意味する。
【００２９】
本明細書において、用語「胚性幹細胞」、「ＥＳ細胞」、または「ＥＳＣｓ」は、初期胚に由来する多能性幹細胞を意味する。
【００３０】
本明細書において、用語「誘導多能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」、または「ｉＰＳＣｓ」は、例えば成人の体細胞の様な非多能性細胞、または例えば線維芽細胞、造血細胞、筋細胞、ニューロン、または表皮細胞等の様な最終的に分化した細胞から、非多能性細胞に誘導すること、または一以上の再プログラミング因子を伴う非多能性細胞に接触させることにより調製される多能性幹細胞の種類を意味する。
【００３１】
本明細書において、用語「内皮分化培地」は、多能性細胞の内皮系統の細胞への分化をサポート及び／または促進する、全ての栄養培地を意味する。
【００３２】
本明細書において、用語「内皮成長培地」は、内皮系統の細胞の維持に適した全ての培地を意味する。
【００３３】
ＩＩ：多能性細胞を内皮コロニー形成細胞様細胞（ＥＣＦＣ様細胞）に分化する方法
【００３４】
一の態様において、本明細書で提供される方法は、少なくとも以下の３ステップを含む：
Ａ：多能性幹細胞を提供するステップ；
Ｂ：前記多能性幹細胞の内皮系統の細胞への分化を誘導するステップ；及び、
Ｃ：分化した内皮系統の細胞からＥＣＦＣ様細胞を単離するステップ。
【００３５】
いくつかの態様において、前記方法はさらに以下のステップを含む：
Ｄ．単離したＥＣＦＣ様細胞を拡大させるステップ。
【００３６】
前述の方法における各ステップを、以下に説明する。本明細書で提供される方法のいくつかの態様は、「ＥＣＦＣ様プロトコル」、「ＥＣＦＣ様細胞プロトコル」、「ｈＥＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞プロトコル」、または「ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞プロトコル」ということがある。
【００３７】
Ａ．多能性幹細胞培養
【００３８】
一の態様において、インビトロで多能性細胞からＥＣＦＣｓの単離集団を生成する方法を提供する。本開示の方法における使用に適した多能性細胞は、種々のソースから得られる。例えば、一種の適切な多能性細胞は、胚盤胞の内部の細胞塊由来の胚性幹（ＥＳ）細胞である。さまざまなＥＳ細胞、例えばマウス、アカゲザル、コモンマーモセット、及びヒトの細胞を得る方法は良く知られている。前記方法で使用されるＥＳ細胞のソースは、例えば、一以上の確立したＥＳ細胞株であり得る。種々のＥＳ細胞株が知られており、それらの成長及び普及の条件が定義されている。事実上、あらゆるＥＳ細胞またはＥＳ細胞株は、本明細書で開示される方法で使用可能であると考えられる。一の態様において、多能性細胞は、体細胞を再プログラムすることによって誘導される誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。誘導多能性幹細胞は、いくつかの公知の方法により得られる。事実上、あらゆるｉＰＳ細胞または細胞株が、本明細書に記載の方法で使用可能であると考えられる。他の態様において、多能性細胞は、ドナー核がスピンドルのない卵母細胞に移植される体細胞の核移動によって誘導されるＥＳ細胞である。核移動によって幹細胞を生産する種々の方法が知られている。実質的に、体細胞の核移動によって誘導される、あらゆるＥＳ細胞またはＥＳ細胞株は、本明細書で開示される方法で使用可能であると考えられる。
【００３９】
一の態様において、多能性細胞は、未分化状態の多能性細胞を維持するために適した条件下で培養される。インビトロ、すなわち未分化状態で、多能性細胞を維持する方法が知られている。一の態様において、多能性細胞は、未分化状態の多能性細胞を維持するために適した条件下で、二日間培養される。例えば、下記の実施例において、ｈＥＳとｈｉＰＳ細胞は、３７℃、５％ＣＯ2で約２日間、１０ｃｍ2の組織培養皿のマトリゲルTM上でｍＴｅＳＲ１完全培地により維持された。
【００４０】
多能性細胞を培養及び／または維持するための、さらなる及び／または代わりの方法を使用することができる。例えば、基本培地として、あらゆるＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ１、アルファ．ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、ＤＭＥＭ、イーグルＭＥＭ、フィッシャー培地、グラスゴーＭＥＭ、Ｈａｍ、ＩＭＤＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、及びＲＰＭＩ  １６４０、またはその組合せを、多能性細胞の培養及び／または維持するために使用することができる。
【００４１】
使用される多能性細胞培養培地は血清を含むか、または、無血清であり得る。無血清とは、未処理及び／または精製されていない血清を含まない培地を意味する。無血清培地は、例えば成長因子の様な、精製された血液由来の構成要素または動物の組織由来の構成要素を含んでもよい。使用される多能性細胞培地は、例えばノックアウト血清代替品（ＫＳＲ）、化学的定義済み脂質濃縮物（ギブコ）、またはグルタマックス（ギブコ）の様な、血清に代わる一以上を含んでもよい。
【００４２】
多能性細胞の分割または継代方法は、良く知られている。例えば、以下の実施例では、多能性細胞のプレーティング後、培地は２日目、３日目、及び４日目に交換され、そして５日目に細胞を継代した。通常、一旦培地容器がいっぱい（すなわち、７０〜１００％コンフルエント）ならば、容器の細胞塊は分離に適した任意の方法によって凝集細胞または単一細胞に分割し、その凝集細胞または単一細胞は、継代のために新しい培地容器に移す。細胞の「継代」または「分割」は、細胞を活かしながら長期間インビトロで成長させるための公知の技術である。
【００４３】
Ｂ．内皮系統細胞への多能性細胞の指向された分化
【００４４】
本明細書に開示される一の態様において、インビトロの多能性細胞は、内皮分化を経るよう誘導される。内皮系統細胞に多能性細胞の分化を誘導するための、培地条件を含むいくつかの方法が知られている。本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞プロトコルでは、化学的に定義された培地で多能性細胞の分化誘導をすることは、より望ましい。例えば、無血清造血拡大培地ステムラインＩＩは、基本内皮分化培地として使用することができる。本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞プロトコルにおいて、いくつかの成長因子は、ＥＣＦＣ様細胞を含む内皮系統細胞への多能性細胞の分化を促進するために用いられる。例えば、アクチビンＡ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、及び骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）は、ＥＣＦＣ様細胞を含む内皮系統の細胞への多能性細胞の分化を誘導するための化学的に定義された分化培地に含まれる。
【００４５】
本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞プロトコルの一の態様において、基本培地（例えば、ｍＴｅＳＲ１）での培養２日（−Ｄ２）後に、アクチビンＡ、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２の有効量を含む内皮分化培地で２４時間細胞と接触することによって、多能性細胞の分化は内皮系統に指向された。２４時間の分化に続いて、アクチビンＡは、有効量のＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２を含む内皮分化培地と、前記内皮分化培地を交換することによって培地から取り除かれた。「有効量」は、ＥＣＦＣ様細胞を含む内皮系統細胞への多能性細胞の分化を促進するための有効量を意味する。さらに、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ−２の有効量を含む内皮分化培地は１〜２日毎に交換することができる。
【００４６】
アクチビンＡは、複数の経路を通して細胞分化を活性化するために知られているＴＧＦ−Ｂスーパーファミリーのメンバーである。アクチビンＡは、中胚葉仕様の活性化を容易にするが、内皮形質の獲得（specification）とそれに続く内皮増幅のために重要でない。一の態様において、内皮分化培地はアクチビンＡを約５〜２５ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。一の好ましい態様において、内皮分化培地は、アクチビンＡを約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００４７】
骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ−４）は、成人のヒト骨髄（ＢＭ）で発現する中胚葉誘導物質であり、造血前駆細胞の増殖及び分化の可能性の調整に関係している（Ｂｈａｒｄｗａｊら、２００１；Ｂｈａｔｉａら、１９９９；Ｃｈａｄｗｉｃｋ２００３）。さらにＢＭＰ−４は、ヒト胎児、新生児、及び成人の造血前駆細胞において、初期造血細胞の発育を調整することができる（Ｄａｖｉｄｓｏｎ及びＺｏｎ（２０００）；Ｈｕｂｅｒら、１９９８；Ｍａｒｓｈａｌｌら、２０００）。一の態様において、前記内皮分化培地は、ＢＭＰ−４を約５〜２５ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。一の好ましい態様において、前記内皮分化培地は、ＢＭＰ−４を約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００４８】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、胚性循環系構造と血管新生に関係するシグナリング・タンパク質である。インビトロで、ＶＥＧＦは内皮細胞有糸分裂と細胞遊走を刺激することができる。一の態様において、前記内皮分化培地は、ＶＥＧＦを約５〜５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。一の好ましい態様において、内皮分化培地は、ＶＥＧＦを約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。一のより好ましい態様において、内皮分化培地は、ＶＥＧＦ165を約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００４９】
ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２とも呼ばれる塩基性線維芽細胞成長因子は、肢と神経系発達、創傷治癒、及び腫瘍の成長を含む多様な生物学的プロセスに関係する。ｂＦＧＦは、ヒト胚性幹細胞のフィーダー非依存成長を支えるのに用いられる。一の態様において、前記内皮分化培地は、ＦＧＦ−２を約５〜２５ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。一のより好ましい態様において、前記内皮分化培地は、ＦＧＦ−２を約１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００５０】
ｈＰＳＣｓからＥＣｓを生成するための従前のプロトコルとは対照的に、本明細書に記載の方法は、例えばＯＰ９間質細胞の様な支えとなる細胞との共培養を必要としない。
【００５１】
ｈＰＳＣｓからＥＣｓを生成するための従前のプロトコルとは対照的に、本明細書に記載の方法は、胎様体（ＥＢ）形成を必要としない。
【００５２】
ｈＰＳＣｓからＥＣｓを生成するための従前のプロトコルとは対照的に、本明細書に記載の方法は、外因性のＴＧＦ−β阻害を必要としない。
【００５３】
Ｃ．分化した内皮細胞からのＥＣＦＣ様細胞の分離
【００５４】
本明細書に記載された方法の一の態様において、ＣＤ３１+ＮＲＰ−１+細胞は、選択され、内皮分化を経た細胞集団から分離される。一以上の特定の分子マーカーを有する細胞を選ぶための方法は知られている。例えば細胞は、蛍光活性化セルソーティングまたは磁気活性化セルソーティングを含むフローサイトメトリーによっていくつかの転写物の発現に基づき選ばれ得る。
【００５５】
一の態様において、ＣＤ３１+ＮＲＰ−１+細胞は、本明細書に記載される内皮分化を経た分化１０日目、１１日目または１２日目の細胞集団から選択される。一の好ましい態様において、ＣＤ３１+ＮＲＰ−１+細胞は、進行中の内皮分化１２日目における細胞集団から選択される。本発明者らは、進行中の内皮分化１２日目の細胞集団が、分化の他の日に存在する細胞集団と比較してＮＲＰ−１+細胞をより高い割合で含むことを見出した。
【００５６】
以下の実施例において、接着性ＥＣｓは分化１２日目に収穫され、単一細胞懸濁液になった。細胞は数えられ、抗ヒトＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＮＲＰ−１抗体染色のために調製された。ＣＤ３１+ＣＤ１４４+ＮＲＰ−１+細胞は、フローサイトメトリーを使用してソートされ、選択された。
【００５７】
一の態様において、前記選択された細胞は、ＥＣＦＣｓを含むＥＣｓに特有である、コブルストーン形態を示す。
【００５８】
一の態様において、前記選択された細胞は、ＥＣＦＣｓを含むＥＣｓに特有である、マトリゲルTMでコートされた皿上で毛細管状ネットワークの生成能力を有する。
【００５９】
一の態様において、前記選択された細胞は、それはＥＣＦＣｓに特有である、共培養及び／または同時移植された細胞が不在の場合インビボでの血管形成の能力を有する。
【００６０】
一の態様において、前記選択された細胞は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓと同等またはそれ以上、またはインビトロでの既知のプロトコルで誘導されるＥＣｓより大きなクローン増殖能を示す。
【００６１】
一の態様において、前記選択された細胞は、高いクローン増殖能を示す。例えば、一の態様において、約９５％以上の単離した単一のＥＣＦＣ様細胞は、少なくとも約３５〜５０％の単離した単一のＥＣＦＣ様細胞は、自己補充能力があるＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞であり、それによりさらなるＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞を発生させる。
【００６２】
Ｄ．単離したＥＣＦＣ様細胞の拡大
【００６３】
いくつかの態様において、前記単離したＣＤ３１+ＮＲＰ−１+ＥＣＦＣ様細胞は、内皮成長に適した条件下で拡大する。一の態様において、前記単離したＣＤ３１+ＮＲＰ−１+ＥＣＦＣ様細胞を拡大させるために、既知の内皮細胞成長の培養条件を使用することができる。さらに以下で議論される一の態様において、培養皿は細胞のためのマトリックスアタッチメントとして、タイプ１コラーゲンでコーティングされている。フィブロネクチン、マトリゲルまたは他の細胞マトリックスは、培養皿に細胞の付加を容易にするためにも使用することができる。さらに以下で議論される一の態様において、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＥＧＦ、及びＦＧＦ２をプラスした内皮成長培地２（ＥＧＭ２）、ビタミンＣ、ヒドロコルチゾン、及び子牛胎児の血清は、前記単離したＣＤ３１+ＮＲＰ−１+ＥＣＦＣ様細胞を拡大するために使用することができる。
【００６４】
下記の実施例において、ＣＤ３１+ＮＲＰ−１+単離ＥＣＦＣ様細胞は、遠心分離され、１：１の内皮成長培地及び内皮分化培地で再懸濁された。
前記選択された細胞集団からＥＣＦＣ様細胞を生成するために、ウェルあたり約２５００の選択細胞が、コラーゲンでコーティングした１２ウェルプレート上に播かれた。２日後、培養培地は内皮成長培地と内皮分化培地の比率が３：１である培養培地と交換された。ＥＣＦＣ様コロニーはしっかりとした接着性の細胞として出現し、拡大７日目にコブルストーン形態を示した。
【００６５】
下記の実施例において、ＥＣＦＣ様細胞クラスターは、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞の実質的に純粋な集団を単離するために、クローン化された。「純粋」あるいは「実質的に純粋」は、総細胞集団を構成するＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞に対して、少なくとも約７５％（例えば、少なくとも７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上について）純粋である細胞の集団を意味する。言い換えると、用語「実質的に純粋」は、本明細書において、内皮細胞系統を得るための分化を指向するとき、約２５％、２０％、約１０％または約５％より少ない非ＥＣＦＣ用細胞を含むＥＣＦＣ様細胞集団を意味する。用語「実質的に純粋」はまた、本明細書において、あらゆる濃縮、拡大ステップ、または分化ステップの前に単離された集団における約２５％、２０％、約１０％または約５％より少ない非ＥＣＦＣ用細胞を含むＥＣＦＣ様細胞集団を意味する。いくつかのケースにおいて、本明細書で提供される方法によって生成するＥＣＦＣ様細胞の実質的に純粋な単離された集団は、総細胞集団を構成する内皮細胞に対して、少なくとも約９５％（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％について）純粋である。この分野で既知のクローン技術は、本明細書で提供される方法に使用し得る。
【００６６】
下記の実施例において、コンフルエントＥＣＦＣ様細胞は、シード密度がｃｍ2につき１０,０００細胞でプレーティングすること、及び完全内皮成長培地（コラーゲンで被覆したプレートとｃＥＧＭ−２培地）で、一日おきに培地交換をしてＥＣＦＣ様細胞を維持することにより継代された。既知の細胞継代技術は、本明細書で提供された方法において使用できる。
【００６７】
一の態様において、本明細書で提供される方法を用いて生成するＥＣＦＣ様細胞は、内皮成長培地を含む組成物で拡大することができ、安定なＥＣＦＣ様細胞表現型を維持しながら最大１８回継代される。「安定なＥＣＦＣ様細胞表現型」は、コブルストーン形態を示し、細胞表面抗原ＣＤ３１及びＣＤ１４４を発現し、かつ共培養や同時移植された細胞の不存在化でインビボで血管新生能力がある細胞を意味する。一の好ましい態様において、安定した表現型を有するＥＣＦＣ様細胞は、ＣＤ１４４及びＫＤＲを発現するが、α−ＳＭＡ（アルファ−平滑筋アクチン）を発現しない。
【００６８】
ＩＩＩ．ＥＣＦＣ様細胞の単離集団
【００６９】
一の態様において、ヒトＮＲＰ−１+／ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞の単離集団を提供する。一の態様において、本明細書で提供されるｈＰＳＣｓからＥＣＦＣ様細胞を生成するインビトロの方法により、生成されたＮＲＰ−１+／ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞の分離されたヒト細胞集団が生成される。
【００７０】
下記の実施例において、本明細書で提供される方法は、ＮＲＰ−１+とＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞の精製されたヒト細胞集団を生成するために用いられる。前記集団の単離ＥＣＦＣ様細胞は、コブルストーン形態を示し、共培養や同時移植された細胞なしにインビボで血管形成する能力を有する。一の態様において、前記集団のＥＣＦＣ様細胞は、一以上のＣＤ１４４+、ＫＤＲ+、及びα−ＳＭＡ−によってさらに特徴づけられる。
【００７１】
一の態様において、少なくとも、前記集団のＥＣＦＣ様細胞のいくつかは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓの増殖能以上、かつ他の公知のプロトコルによりインビトロで生成したＥＣｓの増殖能以上の高い増殖能を有する。一の好ましい態様において、前記ＥＣＦＣ様細胞集団は、単一の開始多能性細胞から少なくとも１兆のＥＣＦＣ様細胞を生成する増殖能を有するＨＰＰ−ＥＣＦＣｓを含む。
【００７２】
一の好ましい態様において、単離ＥＣＦＣ様細胞集団は実質的に純粋である。
【００７３】
一の好ましい態様において、本明細書で提供される単離ＥＣＦＣ様細胞集団は、
少なくとも、以下の特徴を有する約３５〜５０％のＥＣＦＣ様細胞を含む。
Ａ．特徴的ＥＣＦＣ様分子表現型、
Ｂ．インビトロにおいてマトリゲルTM上で毛細管状のネットワークを作る能力、
Ｃ．高い増殖能、
Ｄ．自己補充能、
Ｅ．インビボにおける共培養細胞非存在下での血管形成能、及び
Ｆ．増加した細胞生存能、及び／または減少した老化。
【００７４】
前記のＥＣＦＣ様の特徴の各々は、以下でさらに議論される。
【００７５】
Ａ．特徴的ＥＣＦＣ様分子表現型
【００７６】
内皮系統の細胞は、例えば、ＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＫＤＲ、及びＮＲＰ−１を含む特徴的分子マーカーを有する。臍帯血ＥＣｓがＣＤ３１、ＣＤ１４４、ＫＤＲ、及びＮＲＰ−１を含む種々の内皮マーカーを発現することが知られている。現時点では、本発明者らは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓと血管由来の他のＥＣｓとを区別する特定のマーカーを知らない。ＥＣＦＣｓを含むＥＣｓ中の分子表現パターンを測定する方法は知られている。例えば、本開示の方法を用いて生成した細胞において、種々のマーカーの発現を評価する種々の公知の免疫細胞化学技術である。
【００７７】
本明細書の実施例において、ＥＣＦＣ様細胞はＣＤ３１+／ＮＲＰ−１+である。一の好ましい態様において、本明細書で提供される方法を用いて誘導されるＥＣＦＣ様細胞はまた、ＣＤ１４４とＫＤＲを発現し、α−ＳＭＡを発現しない。これに対して、インビトロで、ＯＰ９細胞またはＥＢ発展物（development）との共培養を必要とするプロトコルを用いたｈＰＳＣｓから作り出されるＥＣｓは、しばしばα−ＳＭＡを発現する。
【００７８】
Ｂ．インビトロにおいてマトリゲルTM上で毛細管状のネットワークを作る能力
【００７９】
種々の他のＥＣｓのように、臍帯血由来のＥＣＦＣｓは、インビトロにおいてマトリゲルTM上で培養されるとき、毛細管状のネットワークを作ることができる。
【００８０】
一の態様において、本明細書で提供される方法を使用しているインビトロのｈＰＳＣｓ由来のＥＣＦＣ様細胞及び集団は、インビトロにおいてマトリゲルTM上で培養されるとき、毛細管状のネットワークを作る能力を有する。
【００８１】
Ｃ．高い増殖能
【００８２】
インビトロにおいて種々の異なるプロトコルを使用しているｈＰＳＣｓ由来の内皮細胞（ＥＣｓ）は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓと比較して異なる増殖能を有する。例えば、実施例に示すように、単一細胞ＣＢ−ＥＣＦＣｓの約４５％は低い増殖能（ＬＰＰ）を有し、単一細胞ＣＢ−ＥＣＦＣｓの約３７％は高い増殖能（ＨＰＰ）を有する。実施例に示すように、本明細書で提供される単離ＥＣＦＣ様細胞集団のＥＣＦＣ様細胞の少なくとも約３５％は、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞である。好ましい態様において、本明細書で提供される単離ＥＣＦＣ様細胞集団のＥＣＦＣ様細胞の少なくとも約５０％は、ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞である。
【００８３】
これとは対照的に、インビトロにおいてＯＰ９細胞での細胞の共培養を含むプロトコルにより生成した（例えば、Ｃｈｏｉら；Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００９）ＥＣｓは、３％未満の細胞が、ＨＰＰ−ＥＣｓを引き起こすクローンの増殖能を示す。ＥＢ形成を含むインビトロのプロトコルにより生成した（例えばＣｉｍａｔｏら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００９）内皮細胞は、３％未満の細胞がＨＰＰ−ＥＣｓを引き起こす、クローンの増殖能を示した。外生のＴＧＦ−β阻害を含むインビトロのプロトコルにより生成した内皮細胞（例えば、Ｊａｍｅｓら  ２０１０）は、約３０％の細胞がＨＰＰ−ＥＣｓを引き起こす、クローンの増殖能を示した、しかしＴＧＦ−β阻害が継続される場合のみであった（すなわち、外生のＴＧＦ−β阻害がこのプロトコルから除かれれば、ＥＣｓはその全てのＨＰＰ活性を喪失する）。
【００８４】
細胞の増殖能を測定するための種々の技術が知られており、ＥＣＦＣ様細胞の増殖能を確認するために、本明細書で提供される方法とともに利用することができる。実施例の中で、単一細胞アッセイはＣＢ−ＥＣＦＣｓ、ｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞、ＥＢ由来ＥＣｓ、及び末梢動脈疾患（ＰＡＤ）由来ＥＣｓのクローン形成増殖能を評価するのに用いられた。手短に言うと、ＣＢ−ＥＣＦＣｓ、ＥＣＦＣ様細胞、及びＥＣｓは、単一細胞懸濁液を得るために処理された。懸濁された細胞を数え、希釈して、単一細胞は、９６ウェルプレートの各々のウェルで培養された。数日培地した後、各ウェルは、細胞数を数えるために精査した。二種以上の細胞を含むウェルは増殖能陽性として特定した。ＥＣカウントが１であるウェルは分裂無しに分類し、ＥＣカウントが２〜５０のウェルは内皮細胞クラスター内皮細胞クラスター（ＥＣＣｓ）に、ＥＣカウントが５１〜５００または５０１〜２０００のウェルは低増殖能内皮細胞クラスター（ＬＰＰ）に、そしてＥＣカウントが２００１以上のウェルは高増殖能内皮細胞クラスター（ＨＰＰ）に分類した。
【００８５】
Ｄ．自己補充能
【００８６】
種々の異なるプロトコルにより生成した内皮細胞は、自己補充のための異なる能力を有する。「自己補充能」は、細胞のように分裂する能力を意味する。例えば、本明細書で提供されているＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞は、インビトロで再プレートされるとき、二次ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様コロニーの中で一以上のＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞を引き起こす能力を有する。一の態様において、自己補充ＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞は、細胞治療に適する、少なくとも治療的に十分な数のＨＰＰ−ＥＣＦＣ様細胞が、本明細書で提供される方法によりインビトロで生成されるからである。
【００８７】
Ｅ．インビボにおける共培養細胞非存在下での血管形成能
【００８８】
種々の異なるプロトコルにより誘導される内皮コロニー形成細胞は、インビボでの血管形成のための異なる能力を有する。例えば、インビボで例えばマウス等の哺乳類に移植されるとき、ＣＢ−ＥＣＦＣｓは血管を形成することができる。
【００８９】
これとは対照的に、ＥＣｓの生成のためにＯＰ９細胞で細胞の共培養を含むＣｈｏｉらのプロトコル（２００９）を用いて生成したＥＣｓは、インビボで哺乳類に移植されるとき、機能的なヒト血管で満たされたホストマウス赤血球（ＲＢＣ）を形成しない。ＥＣｓの生成のためのＥＢ形成を含むＣｉｍａｔｏらのプロトコル（２００９）により生成したＥＣｓは、インビボで哺乳類に移植されるとき、機能的なヒト血管で満たされたホストＲＢＣを形成しない。内皮細胞の生成のために外生のＴＧＦ−β阻害を含むＪａｍｅｓら（２０１０）のプロトコルを用いて生成したＥＣｓは、インビボで哺乳類に移植されるとき、極めて少ない機能的なヒト血管を形成する（すなわち、本明細書で提供されるプロトコルによる細胞より１５倍少ない）。Ｊａｍｅｓらの細胞は、インビボで哺乳類に移植されるとき、培養がＴＧＦ−βを含むように継続すれば、機能的なヒト血管を形成する；もしＴＧＦ−βが除かれれば、ヒト血管で満たされたＲＢＣを形成する能力を完全に失う。１２日目にＣＤ３１+ＮＲＰ−１+細胞を選ぶステップが欠如しているＳａｍｕｅｌらのプロトコル（Ｓａｍｕｅｌら  ＰＮＡＳ  ２０１３）を用いて生成したＥＣｓは、ＥＣｓが支えとなる細胞（すなわち、間充織前駆細胞）とともに移植されれば、インビボで哺乳類に移植されるとき、血管だけを形成できる。
【００９０】
上記の従来の方法と対照的に、実施例において、ＥＣＦＣ様細胞集団の細胞は、インビボで哺乳類に移植されるとき、支えとなる細胞がない場合でも血管を形成することができる。
【００９１】
インビボ血管形成を測定する公知の様々な技術を使用することができる。実施例において、インビボ血管形成は、本明細書に記載の方法により生成したＥＣＦＣ様細胞３次元（３Ｄ）細分化コラーゲンマトリックスを加えることにより、評価した。ＥＣＦＣ様細胞懸濁液を含むコラーゲン混合物は、組織培養皿でゲルを形成するために重合した。細分化ゲルは、６〜１２週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの横腹に移植された。移植の２週後に、ゲルは回収され、マウス赤血球が還流するヒト内皮系血管の有無を調べた。
【００９２】
外因性の支えとなる細胞の非存在下のインビボでの血管形成能は、本明細書で提供される方法を用いて生産される細胞がＥＣＦＣｓであることの１つの指標だ。
【００９３】
Ｆ．増加した細胞生存能、及び／または減少した老化
【００９４】
種々の異なるプロトコルを用いて生成される内皮細胞は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓに関連して、異なる細胞生存能力レベル、及び／または老齢のレベルを有する。例えば実施例において、生存能力のあるＣＢ−ＥＣＦＣｓは、１８回まで継代可能である。
【００９５】
対照的に、ＥＣｓの生成のためにＯＰ９細胞で細胞の共培養を含むＣｈｏｉら（２００９）のプロトコルを用いて生成したＥＣ細胞は、６回の継代の生存能力を有する。ＥＣｓの生成のためにＥＢ形成を含むＣｉｍａｔｏら（２００９）のプロトコルを用いて生成したＥＣｓは、７回の継代の生存能力がある。内皮細胞の生成のために外生のＴＧＦ−β阻害を含むＪａｍｅｓら（２０１０）のプロトコルを用いて生成したＥＣｓは９回の継代の生存能力があり、ＴＧＦ−β阻害剤の非存在下で、ＪａｍｅｓらのＥＣの間葉系細胞型に移行し、それにより内皮系の特徴を失った。１２日目にＣＤ３１+ＮＲＰ−１+細胞を選ぶステップが欠如しているＳａｍｕｅｌらのプロトコルを用いて生成したＥＣｓは、１５回までの継代へ拡大することができた。
【００９６】
インビトロでＥＣｓを生成する上記の方法と対照的に、実施例において、ＥＣＦＣ様細胞集団の生細胞は、最高１８回の継代で拡大されることができた。ＣＢ−ＥＣＦＣｓは、１５〜１８回の間で継代され得る。
【００９７】
当該分野で知られている、細胞生存能力と老齢を測る種々の技術を、本開示において使用することができる。実施例では、細胞生存能力はトリパンブルー排除によって評価し、細胞老化は老齢アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を使用して評価した。当該分野で知られている、細胞生存能力や老齢を評価する他の方法を使用することができる。
【００９８】
ＩＶ．本明細書におけるＥＣＦＣ様細胞の使用
【００９９】
一次細胞であるＥＣＦＣｓに対して、本明細書で提供される方法により生成されたＥＣＦＣ様細胞は、下記のように、種々の臨床用途に使用可能なボリュームでインビトロで生成し得る。
【０１００】
Ａ．治療
【０１０１】
一の態様において、本開示は、細胞移植、細胞補充、及び／または細胞または組織置換に適した方法、細胞、及び組成物を提供する。方法は、必要により対象に、本明細書で提供される方法により得られた治療有効量のＥＣＦＣ様細胞を提供することを含み、それにより対象にＥＣＦＣ様細胞治療提供する。本明細書において、用語「治療有効量」は、上皮の修復に必要な対象の治療に有効な量を示す。本明細書で提供される細胞及び／または組成物は、ＥＣＦＣ様細胞を意図する組織部位に移植または移動し、機能的が欠損した部位で再構築または再生成することが可能な方法で対象に投与することができる。
【０１０２】
本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞を用いた受容治療に適した対象は、種々の種類の内皮機能障害及び／または損傷がある人々を含む。例えば、心血管疾患、心筋梗塞、心臓発作、または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を有する対象は、本開示のＥＣＦＣ様細胞を用いた受容治療に適した対象であり得る。肺または腎臓の病気あるいは損傷がある対象は、本開示のＥＣＦＣ様細胞を用いた受容治療に適した対象であり得る。好ましい態様において、深刻な肢虚血（ＣＬＩ）を有するＰＡＤ患者は、本開示のＥＣＦＣ様細胞を用いた受容治療に適した対象であり得る。
【０１０３】
ある態様において、ＥＣＦＣ様細胞は、ヒトでの投与に適した医薬品組成物の形で、対象に提供することができる。例えば、組成物は、一以上の製薬上許容されるキャリア、緩衝剤、または賦形剤を含んでも良い。組成物は、さらに、一以上の移植ＥＣＦＣ様細胞の移植を促進する一以上の成分を、含む、あるいは、と共に対象に提供しても良い。例えば、医薬品組成物はまたさらに、移植細胞の生存及び／または生着を促進、血管新生を促進、細胞がいまたは間質マトリックスの組成物の調節、及び／または移植部位へ他の細胞型を補充する一以上の成長因子またはサイトカイン（例えば、血管形成サイトカイン）、を含む、あるいは、と共に対象に提供しても良い。
【０１０４】
ある態様において、医薬組成物は、適切な無菌状態と安定性を提供する標準的な方法によって、調製、生産、及び保存することができる。
【０１０５】
例えば、一の態様において、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、十分な血流が不足している組織（医者により判断）に、直接注射することができる。
一の態様において、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、コラーゲン、フィブロネクチンまたは合成材料から成るマトリックスに懸濁することができる、そしてこのゼリー状の懸濁液は、十分な血流が不足している組織（医者により判断）に、直接注射することができる。組織に注射するＥＣＦＣ様細胞の濃度は適宜調節することができ、例えば、送達ビヒクルまたはマトリックス材料に対して約１０，０００から約１００，０００細胞／マイクロリットルとすることができる。いくつかの態様において、他の組織が、適切な血流を回復するために長時間の多回及び連続的な注射を必要とする一方で、細胞は適切な血流の回復と共に一回で送達される。
【０１０６】
対象へＥＣＦＣ様細胞を投与した後、本治療効果は改良可能である、要望があれば必要または要求に応じて繰り返してもよい。治療効果は、公知の臨床的に許容される基準、例えば、瘢痕組織が占める部、瘢痕組織の血管新生、及び狭心症（ａｎｇｉｎａ）の頻度と重症度の減少；発達した圧力、収縮期圧、拡張終期圧、対象の機動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）及び／または生活の質の改善として評価することができる。
【０１０７】
ＥＣＦＣ細胞は、低酸素及び新血管形成から目を救うことができる。したがって、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、例えば早熟の網膜症、糖尿病性網膜症、中心静脈閉塞、または黄斑変性の様な、低酸素症及び心血管形成が起きる種々の眼病の治療に使用することができると考えられる。
【０１０８】
また、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、少なくとも血管ステントの内側、及び必要に応じステント設置の際に内皮細胞が露出する部位を覆うために使用することができると考えられる。この場合、静脈内に注射されたＥＣＦＣ様細胞は、血栓形成を避けるために損傷部位および血管の再内皮化部位に、及び／または再狭窄を防ぐためステントが設置された部位に、結合するであろう。
【０１０９】
狭窄領域と血液遮断を有する患者の動脈への移植片としてのヒト静脈（伏在または臍帯）の設置は、高確率で続いて起こる狭窄と血液遮断を伴う。これは、インビボでの血管のリモデリングプロセス早期における、血管内皮細胞の喪失と関係している。ここでは、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞が、移植された移植片の再内皮化及び血管の機能を保つ必要のある患者の脈管構造に静脈注射することが考えられる。
【０１１０】
Ｂ．被験物質のスクリーニング
【０１１１】
本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、ＥＣＦＣ様細胞及びそこで形成されるあらゆる組織の特徴に影響を及ぼす要因（例えば溶媒、低分子薬、ペプチド、オリゴヌクレオチドの様な）または環境条件（例えば培地条件または操作の様な）を評価するために使用することができる。一の態様において、例えば医薬品組成物のような被験物質は、内皮の健康や修復への影響を調べるために、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞を用いてスクリーニングすることができる。例えば、スクリーニングは、組成物が内皮細胞に対する薬理学的効果を有するため、または他のどこかに効果を有するようにデザインされた化合物が内皮細胞に対する予期せぬ副作用を有するため、行うことができる。種々の態様において、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、培養された多能性細胞からインビトロで分化しているので、特に被験物質のスクリーニングのために有用である。これに対して、ＣＢ−ＥＣＦＣｓは、患者の血液から得られる一次細胞である。スクリーニング被験物質の方法が当該分野で知られており、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞と共に用いることができる。
【０１１２】
例えば、被験物質の活性のスクリーニングは、ｉ）一種のまたは他の物質を含む二種以上の被験物質と、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞とを結合すること、ｉｉ）形態、分子表現型、及び／またはＥＣＦＣ様細胞の機能的活性の変化を測定すること、及びｉｉｉ）観察される変化と共に被験物資の効果を収集すること、を含む。
【０１１３】
ある態様において、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞上の被験物質の細胞毒性は、被験物質が、一以上のＥＣＦＣ様細胞の生存能力（viability）、生存（survival）、形態、及び分子表現型、及び／またはレセプターを有するという効果により測定することができる。
【０１１４】
ある態様において、ＥＣＦＣ様細胞活性は、ＥＣＦＣ様細胞の細胞表現型または活性を観察する標準的アッセイにより評価することができる。例えば、細胞培養において、または、インビボにおける一以上の分子表現または受容体結合は、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞により評価することができる。
【０１１５】
Ｃ．キット
【０１１６】
ある態様において、本明細書で提供される方法及び細胞と共に用いるキットが考えられる。ある態様において、キットは、本明細書で提供される、一以上の密封されたバイアル中の分化及び／または成長培地を含むことができる。ある態様において、キットは、本明細書で提供されるように、多能性細胞やＥＣＦＣ様細胞の様な一以上の細胞を含むことができる。ある態様において、キットは、多能性細胞からＥＣＦＣ様細胞を生成するための指示書を含むことができる。ある態様において、キットは、本開示の用途のために、適当な容器と包装材料の中に種々の試薬を含むことができる。
【０１１７】
本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮することによりに、より完全に理解される。
【０１１８】
実施例
【０１１９】
実施例１：材料及び方法
【０１２０】
ｈＥＳ、及びｈｉＰＳ細胞の培養：ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株Ｈ９47、及び線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞株（ＤＦ１９−９−１１Ｔ）48は、ＷｉＣｅｌｌ研究所（ウィスコンシン州マディソン）から購入した。いくつかの他のｈｉＰＳ細胞株（ＦＣＢ−ｉＰＳ−１、及びＦＣＢ−ｉＰＳ−２）はＢｒｏｘｍｅｙｅｒ及びＹｏｄｅｒ研究所由来であり、ＥＣＦＣｓを生成するために使われた20、21（表１）。ｍＴｅＳＲ１完全培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣｓは３７℃、５％ＣＯ2で１０ｃｍ2組織培養皿のマトリゲルTMの上で維持された。細胞のプレート後、２、３、及び４日目に培地を交換した。細胞は、５日目に継代した。培地を吸引し、４〜５ｍＬの培地を含むディスパーゼ（２ｍｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ）を各々のプレートに加え、そして３〜５分間、またはコロニーの端がプレートから浮いてくるまでの間、３７℃でインキュベートした。ディスパーゼ含有培地をプレートから吸引し、残留する酵素を除去するためにＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）で３回、細胞を穏やかに洗浄した。それから、新しい培地を用いて５ｍＬの使い捨てピペットを使い、泡を避けるように注意し力強く洗浄し削りとることで、コロニーを回収した。回収したコロニーは、５分間３００×ｇで遠心分離した。上澄みは吸引し、ペレットはｍＴｅＳＲ１完全培地で再懸濁した。継代する前に、１０ｃｍ2の組織培養皿はマトリゲルTMで３０分間コートした。付着しなかったマトリゲルTMは組織培養皿から取り除き、７ｍＬのｍＴｅＳＲ１完全培地を培養皿に添加した。コロニーは、ｍＴｅＳＲ１培地へ均一に配布され各々のプレートに加えた。細胞は渦を巻いてしまうことを避けて、複数回の横〜横の振れ動作を使いて皿内に広げられた。培養物は２日目に成長の質及び形態をチェックした。前述20のように、奇形腫形成アッセイを行った。
【０１２１】
【表１】
0006591434.tif 000002
【０１２２】
ｈＥＳＣ、及びｈｉＰＳＣｓのＥＣＦＣ様細胞を含むＥＣ系統への、誘導された分化：ｍＴｅＳＲ１培地での培養２日（−Ｄ２）後に、培養物はＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ165、及びＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）の２４時間存在下で、アクチビンＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）の追加で中胚葉系統に向かった。翌日、アクチビンＡ含有培地を取り除き、ＦＧＦ−２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＶＥＧＦ165（Ｒ＆Ｄ）、及びＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を含む８ｍｌのＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ完全培地（シグマ）と入れ替えた。培地は、３、５、７、及び８日目に８ｍｌの新しいステムラインＩＩ分化培地と交換した。９日目以降は１０ｍＬのステムラインＩＩ分化培地と交換した。
【０１２３】
フローサイトメトリー：分化後の１２日目に、接着細胞はＴｒｙｐｌｅＥを用いて回収し、ＥＧＭ−２培地で単一細胞懸濁液とした。細胞数を数え、細胞懸濁液の一定分量を抗体染色のために調製した。ＦｃＲ遮断試薬（Ｍｉｌｔｙｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ｃａｔ＃１２０−０００−４４２）を、抗体の非特異的結合を防ぐために加えた。抗ヒトＣＤ３１（ＣＤ３１−ＦＩＴＣ、ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎクローンＷＭ５９、Ｃａｔ＃５５５４４５）、ＣＤ１４４（ＣＤ１４４−ＰＥ、ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅクローン１６Ｂ１、Ｃａｔ＃１２−１４４９−８２）、及びＮＲＰ−１（ＮＲＰ−１−ＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃｈクローンＡＤ５−１７６、Ｃａｔ＃１３０−０９０−９００）抗体を、あらかじめ滴定した濃度で使用した。死細胞染色のためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を細胞懸濁液に加えた。細胞表面抗原のフローサイトメトリー検出、及び細胞ソートを、それぞれ、ＬＳＲ  ＩＩ、及びＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。臍帯血由来ＥＣＦＣｓを用いた一回の陽性コントロールによって、補正をセットした。ターゲット細胞集団のゲート制御を、蛍光色ごとに１を引いた蛍光（ＦＭＯ）コントロールに基づいて決定した。
【０１２４】
ソートされた細胞の細胞培養：ＣＤ３１+、ＣＤ１４４+またはＫＤＲ+、及びＮＲＰ−１+でソートされた細胞を、５０％のＥＧＭ−２、及び５０％の完全ステムラインＩＩ分化培地に再懸濁し、５分間３００×ｇで遠心分離した。ソートされた集団からＥＣＦＣｓを生成するために、１ウェルにつき２５００セルを、ラットテイルタイプＩコラーゲンでコートした１２ウェルプレートに播種した。２日後、培地を吸引し、ＥＧＭ−２を３部及び分化培地１部を培地に加えた。ＥＣＦＣ様細胞集団は、強固に接着する細胞として現れ、７日目にコブルストーン形態を示した。時折、クローニングシリンダーを、ＥＣＦＣ様細胞コロニーを不均一な細胞集団から分離するため用いた。前述1、2、49のように、高増殖な内皮細胞の純粋な集団を単離するために、内皮細胞クラスターのクローニングを行った。コンフルエントＥＣＦＣ様細胞は、１００００細胞／ｃｍ2の密度で継代し、ＥＣＦＣ様細胞は完全内皮成長培地（コラーゲンでコートしたプレート、及びｃＥＧＭ−２培地）で一日おきに培地交換をし、前述1、2、49のように維持した。
【０１２５】
マトリゲルTM上でのインビトロ毛細管状ネットワーク形成アッセイ：種々の異なるプロトコル由来の内皮細胞をトリプシン処理し、ＥＧＭ−２培地で再懸濁した。細胞を、増殖因子を減らしたマトリゲルTM（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）５０μＬをコートした９６ウェルプレートに１ウェルにつき１．０×１０4個の密度で３連にプレートした。ウェルプレートを３７℃で一晩インキュベーションした。
８〜１６時間のインキュベーションの後、対物レンズ１０×ＣＰ−ＡＣＨＲＯＭＡＴ／０．１２  ＮＡを装着した倒立顕微鏡ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２５ＣＦＬを用いて、各ウェルの１０倍の顕微鏡写真を撮影した。イメージは、ＳＰＯＴ  ＲＴカラーカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、メーカーのソフトウェアにより得た。位相差コントラストイメージは、乾燥系対物レンズで撮影した。
【０１２６】
免疫化学：ＥＣＦＣ様細胞は４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドで３０分間固定し、０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳで５分間透過した。１０％（ｖ／ｖ）ヤギ血清で３０分間ブロックした後、細胞を以下の一次抗体中で４℃で一晩インキュベートした：抗ＣＤ３１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ＣＤ１４４（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＮＲＰ−１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、及びα−ＳＭＡ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）。ＰＢＳで細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ−４８８またはＡｌｅｘａ−５６５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を接合した二次抗体でインキュベートして、２ｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で着色した後、共焦点顕微鏡検査によって視覚化した。共焦点イメージは、オリンパスＦＶ１０００  ｍｐＥ共焦点顕微鏡を用い、オリンパスｕｐｌａｎＳＡｐｏ  ６０ｘＷ／１．２ＮＡ／ｅｕｓ対物レンズを用いて得た。すべての画像は、室温で、イメージの個々の１０μの厚さのＺ−スタックとして撮影し、ＦＶ１０−ＡＳＷ  ３．０  Ｖｉｅｗｅｒを使って解析した。
【０１２７】
単一細胞アッセイ：クローン形成増殖能を評価するため、ＣＢ−ＥＣＦＣｓまたはｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞、またはＥＢ由来ＥＣｓ、及びＰＡＤ由来ＥＣｓを単一細胞アッセイにかけた。手短に言うと、ＥＣｓを、単一細胞懸濁液を得るために、ｔｒｙｐＬＥエキスプレス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。９６ウェル培養プレートの個々のウェルにつき０．６８細胞の濃度にするために、細胞数カウントと連続希釈を行った。プレートした翌日に単一細胞の存在を確実にするため、ウェルをテストした。培養培地は４、８、及び１２日目に交換した。培養１４日目に、細胞をＳｙｔｏｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、そして、各ウェルを細胞数量測定のために蛍光顕微鏡で検査した（１０倍拡大；対物レンズ１０×ＣＰ−ＡＣＨＲＯＭＡＴ／０．１２ＮＡを装着した、倒立顕微鏡ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２５ＣＦＬ）。二つ以上の細胞を含んでいるウェルを増殖が陽性であると特定した（１０x拡大；対物レンズ１０×ＣＰ−ＡＣＨＲＯＭＡＴ／０．１２ＮＡを装着した、倒立顕微鏡ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２５ＣＦＬ）。前述1、2、49のように、ＥＣ数が１であるウェルは分裂なしと分類し、２〜５０であるウェルは内皮細胞集クラスター（ＥＣＣ）と分類し、５１〜５００または５０１〜２０００であるウェルは低増殖可能（ＬＰＰ）細胞と分類し、≧２００１であるウェルは高増殖可能（ＨＰＰ）細胞と分類した。
【０１２８】
細胞生存能、老化、及び細胞増殖アッセイ：内皮細胞は、タイプＩコラーゲンでコートした６ウェルまたは１２ウェルプレートに、１ウェルあたり５×１０4または１×１０5の密度でプレートした。２４時間後、培養培地はＦｃ−コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１二量体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、またはＮＲＰ−１ブロッキング抗体を含有するＥＧＭ−２培地と７日間交換し、培地は一日おきに交換した。ＮＲＰ−１Ａ及びＮＲＰ−１Ｂ抗体は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈにより寄贈を受けた42。細胞生存能及び増殖は、トリパンブルー排除によって評価し、染色されない細胞数を位相差顕微鏡の下で条件ごとに３回数えた。
【０１２９】
老化アッセイキットを、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（ｃａｔ＃Ｋ３２０−２５０）から購入し、メーカーの指示に従いアッセイを行った。手短に言うと、内皮細胞は、１２ウェルプレート上にプレートして一晩培養し単分子層を形成した。翌日、細胞は室温において０．５ｍｌの市販の定着溶液で１０〜１５分間固定した。細胞を、１ｍｌの１×ＰＢＳで二回洗浄し、０．５ｍｌの市販の染色溶液により、３７℃で一晩染色した。細胞は、顕微鏡により青色の展開物として観察された。顕微鏡写真を、対物レンズ１０×ＣＰ−ＡＣＨＲＯＭＡＴ／０．１２ＮＡを装着した、倒立顕微鏡ツァイスＡｘｉｏｖｅｒｔ２５ＣＦＬを用いて、１０倍拡大で撮影した。イメージは、メーカーのソフトウェアでＳＰＯＴ  ＲＴカラーカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて得た。位相差コントラストイメージは、乾燥系対物レンズで撮影した。
【０１３０】
マウス：すべての動物の手順は、実験動物の世話と使用のための指針に従って行い、インディアナ医科大学（インディアナ州インディアナポリス）で、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ（ＩＡＣＵＣｓ）の承認を得た。雄雌両方の６〜１２週間目のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｔ細胞及びＢ細胞欠損、補足障害）をすべての動物実験で使用した。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスは、インディアナ大学実験動物資源センター（ＬＡＲＣ）において、特定の病原体のない状況の下で維持された。この動物モデルの以前の研究を、統計的に有意な結果取得に必要な最小限の動物数を測定するために用いた1、50。以前の研究は、移植した１０のマトリックス中８つが（１匹の動物は２つのマトリックスを受けた）ホスト血管構造で吻合し、そして、機能的な血管を持つ８つのマトリックス（４匹の動物）が統計有意性のためにグループごとに必要であることを示した1、50。サンプル及び動物を各々の実験群に割り当てている間、ランダム化の方法は使用しなかった。また、実験の間及び結果にアクセスする間のいずれも、実験者はグループ配分を把握していた。
【０１３１】
インビボ血管形成アッセイ：前述4、50のように、ブタ皮タイプＩコラーゲンを３次元（３Ｄ）細胞化コラーゲンマトリックスの生成に用いた。手短に言うと、タイプ１コラーゲンゲル混合物を、０．０１Ｎ  ＨＣＬ中で氷冷豚皮膚コラーゲン溶液を混合して準備し、リン酸バッファー塩、及び０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ（７．４）まで中和した。中和したゲル混合物（〜１．５ｍｇ／ｍＬ）は、５％ＣＯ2で３７℃まで暖めて重合を誘導する前に氷上に置いた。培養したＣＢ−ＥＣＦＣｓ、ＥＣＦＣ様細胞、またはＥＣｓを、最終濃度２００万細胞／ｍｌでコラーゲン混合物に加えた。細胞懸濁液含有コラーゲン混合物（２５０μＬ）を、４８ウェル組織培養皿に加え、３７℃で３０分間ＣＯ2中でインキュベーションして重合させ、ゲルを形成した。得られたゲルは、３７℃で一晩、５％ＣＯ2中で５００μｌの培養培地で重層した。
【０１３２】
１８時間の体外での培養後、前述1、49のように、細胞化ゲルを６〜１２週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの横腹（ホスト血管構造の近くの切り開いた皮下嚢）に移植した。コラーゲンゲルを移植する外科的手技は、麻酔と酸素を恒常的に供給しながら行った。切り傷を縫合し、マウスの回復を監視した。移植の２週後に、ゲルは、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルにより、人道的犠牲として捧げられた動物から削ることによって回収した。ゲルにマウス赤血球で灌流したヒト内皮系統の血管がないか調べるために、Ｈ＆Ｅ及び抗ヒトＣＤ３１染色を使用して以前記述されたように、免疫組織化学を行った。Ｓｐｏｔ−ＫＥデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＩ）を取り付けたライカＤＭ  ４０００Ｂ顕微鏡（ライカＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂａｎｎｏｃｋｂｕｒｎ、ＩＬ）を使って各々の移植片のｈＣＤ３１+血管を画像化した。機能的血管は、それらが少なくとも１つのマウス赤血球を含む場合のみカウントした。
【０１３３】
酸素誘導網膜症モデル：すべての実験は、眼科及び視野研究における動物使用のためのＡＲＶＯ宣言、及び英国内務省規定のもとで行った。前述2のように、酸素誘導網膜症はＣ５７／ＢＬ６野生タイプのマウスで誘導された。手短に言うと、出産の日（Ｐ）、７匹の新生仔マウス及びそれらに授乳をする親たちを７５％の酸素に５日間さらした（Ｐｒｏ−Ｏｘ１１０  チャンバーコントローラー；Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ、Ｒｅｄｆｉｅｌｄ、ＮＹ）。Ｐ１２で、それらを室内空気へ移した。Ｐ１３で、マウスは、前もってラベルをつけた（Ｑｔｒａｃｋｅｒ６５５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１×１０5個のｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞、ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓまたはＣＢ−ＥＣＦＣｓを含む１μｌ硝子体内注射を受けた。成長因子及び血清を含まない、フェノールレッドフリーＤＭＥＭをビヒクルとして用い、コントロールとして各々の仔マウスの左目に注射した。すべての仔マウスは、７２ｈ後にペントバルビタールナトリウムで安楽死させ、目を４％のパラホルムアルデヒドで固定した。網膜フラットマウントはイソレクチンＢ４（Ｓｉｇｍａ）及びストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、染色した網膜は共焦顕微鏡を用いて視覚化し、画像化した。領域の定量化は、前述2のように３人の独立した、盲検試験者によってＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。
【０１３４】
マウス後肢虚血モデル：後肢虚血実験は我々が前述24したようにして行った。手短に言うと、６週間目の雄胸腺欠損ヌードマウス（体重２５〜３０ｇ；Ｏｒｉｅｎｔ  ｂｉｏＡｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．Ｓｅｏｕｌ、韓国）に、ロンプン（２０ｍｇ／ｋｇ）とケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。大腿動脈及びその分枝は、皮膚切開の後、６−０絹（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で結紮した。外腸骨動脈とそれより上流の動脈の全てを更に結紮した。大腿動脈は、外腸骨動脈の分岐としての近位の起源から、それが伏在及び膝窩動脈の二叉に分岐する末梢部の先まで切除した。動脈の解剖の直後に胸腺欠損マウスは、４つの実験群のうちの１つに無作為に割付けた。虚血性手術の後、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞、またはＣＢ−ＥＣＦＣｓ、またはｈｉＰＳ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓ（１マウスにつき１．０×１０6細胞）は２００μｌのＥＧＭ−２で懸濁し、そしてこれらの細胞またはビヒクルコントロールは２９−ゲージツベルクリン注射器で、内側腿薄筋肉の６つの部位に筋内注射した。前述24のように、レーザードップラー血流画像化装置（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）は処理後０日目及び２８日後に後肢での血流を測定するために用いた。膝関節からつま先までの領域で血流を定量化するために、デジタル色分けされたイメージを解析し平均血流値を計算した。後肢虚血実験のすべての動物のケアと実験的な手続きは、ＣＨＡ大学（ＩＡＣＵＣ  Ｎｏ．１３００２４）の動物実験委員会の承認の元で行った。
【０１３５】
末梢動脈疾患（ＰＡＤ）患者からの動脈ＥＣｓの単離：告知に基づく同意の後、インディアナ大学ヒトＩＲＢパネルの承認されたプロトコルにより、下肢切断を受けた末梢動脈疾患患者の疾患動脈（ＤＡ）ＥＣｓの提供を受けた。酵母のコンタミネーションという大きな危険性のために、進行中の蜂巣炎、排膿または湿性壊疽患者は、この研究では採用しなかった。同様に、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎、及びＨＩＶ保有患者は、この研究から除外された。切断の後、切断された足は手術室で手術フィールドと離れた無菌テーブル上で、動脈の適当な標本を直ちに探った。適当であると考えられるサンプルは、ハンクス平衡塩溶液水（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で満たされる容器に入れ、処理のために研究室へ運んだ。無菌状態で、組織培養皿の長さに血管を開き、ＥＧＭ−２培養培地（Ｌｏｎｚａ）に浸した。各々の血管の内膜は、セルスクレイパー（ＴＰＰ、チューリッヒ、スイス）でこすり、ＤＭＥＭで洗浄した。洗浄物からの細胞フラクションは１６２０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ラットテイルタイプＩコラーゲンでコートした６ウェルプレート上へ設置した。数日後、成長する内皮コロニーを顕微鏡検査を通して観察され、そしてこれらコロニーはクローニングシリンダーで単離してトリプシン処理し、間葉細胞コンタミネーションを防止するために新しい６ウェルプレートの上へ再度プレートした。精製されたＥＣｓは更に１〜２回継代し、そして低温保存の前にＴ−７５組織培養フラスコ（ＴＰＰ）で拡大した。
【０１３６】
ＰＡＤ患者の末梢血からの内皮細胞の培養：各々の患者の末梢血または臍帯血から分離した単核細胞は、ラットテイルタイプＩコラーゲンでプレコートした６ウェルプレート上に播種し、１０％ＦＢＳ（２％ペニシリン・ストレプトマイシン）を添加した完全内皮成長培地（ＥＧＭ−２）で培養した。細胞は３７℃、５％ＣＯ2の加湿インキュベータ内で維持し、２〜３週間またはコブルストーンが出現する内皮コロニーが現れるまで、培地を一日おきに交換した。最初のコロニー出現の後、細胞は新しい６ウェルプレートへ移し、更に２５ｃｍ2フラスコで８５〜９５％コンフルエントで継代した。約７０％コンフルエントで３〜７回継代したＰＡＤ細胞をすべての研究において使用した。
【０１３７】
ウェスタンブロット解析：細胞可溶化物を、溶解バッファー（２０ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、１ｕｇ／ｍｌ  アプロチニン及びロイペプチン）に再懸濁し、続いて２０分間インキュベーションして準備した。不溶成分を、１２,０００×ｇ１５分間の遠心分離で除去した。タンパク質濃度をタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で測定した。タンパク質を、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシン・ミニゲル上で電気泳動によって分離し、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。非特異的結合は、ブロッキングバッファーで室温で１時間ブロックし、リン酸ＰＹＫ２（１：１,０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びリン酸ｐ１３０Cas（１：１,０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する一次抗体とともにオデッセイブロッキングバッファー中で、４℃で一晩インキュベートした。ブロットは０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで洗浄し、抗ウサギ抗体（１：１０,０００；ＬＩ−ＣＯＲ）で、室温で１時間インキュベートした。免疫反応バンドはオデッセイ赤外線画像装置（ＬＩ−ＣＯＲ）により検出した。
【０１３８】
ＲＮＡ配列ライブラリー作成、配列の決定、及び解析：全ＲＮＡを、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサンプルから分離し、そして前述32のようにＲＮＡの特性を調べた。ＲＮＡ配列ライブラリーを１μｇの高品質全ＲＮＡを用いて生成し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００シーケンサーを用いて前述32のように配列の決定を行った。ＲＮＡ配列解析を、分化０日目ｈｉＰＳＣｓ、分化３日目ｈｉＰＳＣ由来細胞、分化１２日目ｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞、ｈＥＳ由来ＥＣＦＣ様細胞、及びＣＢ−ＥＣＦＣｓから分離される全ＲＮＡで行った。結果として生じるシーケンスリードを、デフォルトパラメータでＴｏｐＨａｔを用いてヒトゲノム（ｈｇ１８）にマッピングし、ＲｅｆＳｅｑ（２０１０年６月）転写レベル（ＦＰＫＭｓ）を、ＣｕｆｆＬｉｎｋｓを用いて定量化した。個体胚葉及び系統に属する選択転写のヒートマップを、ＲＮＡＳｅｑデータからヒートマップ．２のＲ統計ソフトウェア・パッケージを用いた赤〜緑のスケールを使用してプロットすることにより解析した。
【０１３９】
ＣＢ−ＥＣＦＣｓに関連するｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞において、差別的に発現した遺伝子を検出する転写発現の更なる解析は、（１）ＳＴＡＲを用いたリードマッピング（Ｄｏｂｉｎら（２０１２）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ６３５）（２）ＨＴｓｅｑを用いた発現評価（Ａｎｄｅｒｓら（２０１４）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｕ６３８）、及び（３）ＤＥＳｅｑを使いた分化解析（Ａｎｄｅｒｓ及びＨｕｂｅｒ（２０１０）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：Ｒ１０６）を含んだ。最初に、特定の遺伝子モデル、すなわち、エクソンの位置とゲノムの交差点地域に基づく参照ゲノムに、ＲＮＡ−Ｓｅｑ読み取りデータをマップした。ＳＴＡＲは参照ゲノムを使い、ＧＴＦはファイルし、そしてＲＮＡ−Ｓｅｑはその入力として読み、既知の交差点（既知のアイソフォームの交差点）、規範的な交差点（既知のエクソンの間の交差点）の新規の探知、非正規接合と融合のような空想的なコピーを見つけシーケンスを保存するために圧縮されていない接尾辞配列を使用する。具体的には、Ｅｎｓｅｍｂｌ版７０遺伝子モデルを用いて、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＧＲＣＨ３７とともに、ＳＴＡＲ  ２．４．０が作動した。マッピング結果に基づいて、グループ２（分化３日目ｈｉＰＳＣ由来細胞）、グループ３（ｈｉＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞）、及びグループ４（ＣＢ−ＥＣＦＣｓ）の発現値として各々の遺伝子に重なったマッピングの数を数えるために、ＨＴｓｅｑ  ０．６．１を用いた。
一旦、リードカウントを得て、グループ２で発現せず、グループ３または４で少なくとも発現した遺伝子を考察した。ＤＥＳｅｑを用いて、これら候補から異なる発現遺伝子を決定した。ＤＥＳｅｑモデルにおいて、従来のポアソンモデル（すなわち、バリエーションは過小評価されるかもしれない）における過分散の問題を解決するために、負の二項分配（ＮＢ）を通して、サンプルにおけるデータを数えた。ＤＥＳｅｑはまた、反復数が高くなく（この場合３つの反復）てもデータあてはめを改善するために、他のグループからのいくつかのモデルも含み、モデル予測は、違いを決定するためには十分強固なものである。
【０１４０】
統計解析：すべての実験は３連にて３回以上行い、そしてデータは統計比較のため平均値±ＳＤとして表す。統計的に有意な結果を得ることを要求されるサンプルサイズを計算するために、９５％の信頼区間による解析の権限を用いた。使用するサンプリング番号は正規分布を得た。違いの有意性は、両側スチューデントｔ検定によって評価した。
【０１４１】
実施例２：先行技術のプロトコルにより生成したｈＥＳ、及びｈｉＰＳ由来ＥＣｓは、臍帯血ＥＣＦＣｓの特性が欠如している。
【０１４２】
ヒト内皮細胞は、ヒト多能性幹細胞から、ＯＰ９間質細胞22、25、30、31との共培養、または、胚様体（ＥＢ）形成23、24、26-29を経て誘導され、続いて種々の成長因子の投入及び／またはレセプターシグナリング経路阻害が内皮細胞の分化を促進する。
【０１４３】
現在の研究において、ｈＥＳまたはｈｉＰＳ細胞は、ＯＰ９共培養またはＥＢ条件の下で１週間分化し、続いて内皮培地で細胞を拡大する（それぞれ図１Ａ及び２Ａ）。
【０１４４】
ＯＰ９共培養による分化（図１）：８日目のＯＰ９共培養分化細胞は、内皮様形態の細胞エリアを示した（図１Ａ、上のパネル）。内皮培養培地中で単離及び培養すると、ＯＰ９共培養分化細胞は、最初に、Ｐ１で内皮コブルストーン様形態を示し（図１Ａ、上部中央のパネル）、次第に、Ｐ４まで内皮コブルストーン形態を示しているわずかな細胞とともに、細胞の大部分が線維芽細胞様の外観を呈する不均一細胞集団になった（図１Ａ、下部中央のパネル）。Ｐ４の細胞は、これらの抗原のそれぞれを発現する細胞の一塊のみを伴うＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＣＤ１４６発現の不均一なパターンを含む（図１Ｂ）。マトリゲルTM上にプレートすると、ＯＰ９共培養細胞は、いくつかの大きな枝とともに血管様のネットワークを形成した（図１Ｃ）。Ｐ３またはＰ４で、単一細胞は、クローンの増殖能解析のためにプレートし、結果を、分裂なし、あるいは分裂して２〜５０（ＥＣクラスター）、５１〜５００（低増殖可能ＥＣ；ＬＰＰ−ＥＣＦＣ）、５０１〜２０００（ＬＰＰ−ＥＣ）、または≧２０００細胞（高増殖可能ＥＣＦＣ；ＨＰＰ−ＥＣ）のコロニーを形成したと、前述1、2のように評価した。ＯＰ９共培養ｈＥＳ由来クローン細胞により形成されるＨＰＰ−ＥＣ及びＬＰＰ−ＥＣコロニーの分布パターンは、ＣＢ−ＥＣＦＣクローンで表示される分布パターンとは、有意な違いがあった（図１Ｄ）。
【０１４５】
ＯＰ９共培養細胞由来のＥＣｓの２％未満は、ＨＰＰ−ＥＣｓを生じ、実際、ＯＰ９共培養細胞由来のＥＣｓのほとんどは分裂しないか、またはＥＣクラスターを生じた（図１Ｄ）。これらのＥＣコロニー形成のパターンは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓ由来の単一ＥＣｓによって示されるパターンとは著しく異なった（図１Ｄ）。ＯＰ９共培養由来ＥＣｓの拡大は、複製老化のため、Ｐ７を越えることはできなかった（図１Ｅ）。更に、Ｐ５のＥＣｓは、移植と同時にインビボでヒト血管を生じることができなかった。
【０１４６】
ＥＢ分化細胞（図２）：ＫＤＲ+ＮＲＰ−１+細胞は、単離及び内皮培養培地中での培養の際、そこで内皮特徴を示した細胞の一塊と伴う場合にのみ、細胞形態の不均一な集団を呈した（図２Ａ、上部中央のパネル）。更に拡大（Ｐ４）をすると、これらの細胞は、内皮コブルストーン形態でなく線維芽細胞様の外観の細胞を有意に含むようになった（図２Ａ、下部の中央のパネル）。ｈｉＰＳ及びｈＥＳ両方に由来するＥＣ細胞において、これらの抗原（図２Ｂ）の各々を発現している細胞の一塊のみを伴うＣＤ３１、ＣＤ１４４、及びＣＤ１４６発現の不均一なパターンを呈し、そしてＥＢ培養細胞は、多数のより小さな不完全な芽キャベツのような枝を有する血管様のネットワークを形成した（図２Ｃ）。Ｐ３またはＰ４において、単一細胞は、クローンの増殖能解析のためにプレートし、結果を、分裂なし、あるいは分裂して２〜５０（ＥＣクラスター）、５１〜５００（低増殖可能ＥＣ；ＬＰＰ−ＥＣＦＣ）、５０１〜２０００（ＬＰＰ−ＥＣ）、または≧２０００細胞（高増殖可能ＥＣＦＣ；ＨＰＰ−ＥＣ）のコロニーを形成したと、前述1、2のように評価した。ＥＢベースのｈＥＳ由来細胞により形成されるＨＰＰ−ＥＣ及びＬＰＰ−ＥＣコロニーの分布パターンは、ＣＢ−ＥＣＦＣクローンで表示される分布パターンとは、有意な違いがあった。ＥＢベース細胞由来のＥＣｓの２％未満は、ＨＰＰ−ＥＣｓを生じ、実際、ＥＢベース細胞由来のＥＣｓのほとんどは分裂しないか、またはＥＣクラスターを生じた（図２Ｄ）。これらのＥＣコロニー形成のパターンは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓ由来の単一内皮細胞によって示されるパターンとは著しく異なった（図２Ｄ）。ＥＢベース細胞由来のＥＣｓの拡大は、複製老化のため、Ｐ７を越えることはできなかった（図２Ｅ）。更に、Ｐ５のＥＣｓは、移植と同時にインビボでヒト血管を生じることができなかった。
【０１４７】
外因性ＴＧＦ−β阻害剤存在下で分化した細胞（図３）：最初のＥＢ形成に続く２Ｄ接着細胞培養（成長因子追加とともに）を含む、別の２ステップ内皮分化プロトコルをテストし、ｈＥＳ及び／またはｈｉＰＳ細胞がＥＣＦＣ様細胞を生成するために用いることができるかどうかを決定した。発展33、34及びｈＥＳ細胞の内皮系統分化23の間、内皮細胞の出現における経路をシグナリングする血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の周知の重要性に基づいて、ＥＣＦＣ様細胞の出現を特定するマーカーとして、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）を使用したＮＲＰ−１は、ＶＥＧＦコレセプターであり、内皮細胞、血管平滑筋細胞、及びリンパ球を含む種々の組織で発現しているセマフォリン３Ａ結合多機能タンパク質である35。血管形成におけるＮＲＰ−１の役割は知られていないが、マウスにおけるＮＲＰ−１及びＮＲＰ−２のダブルノックアウトは、ＶＥＧＦＲ−２ノックアウト35、36に類似する胚性の致死表現型を導く。ｈＥＳ（Ｈ９株）及びｈｉＰＳ細胞由来ＥＢ（ＤＦ１９−９−１１Ｔ、ＦＣＢ−ｉＰＳ−１、及びＦＣＢ−ｉＰＳ−２）を、４日間の懸濁培養において生成し、マトリゲルTMコートの培養皿の上に１０日間播種した24（図３Ａ、Ｂ）。このプロトコルは、７日目にＴＧＦ−β阻害を開始するために、継続的な内皮細胞の曝露を必要とした（図３Ａ）。ＥＢｓ（図３Ｂ、左から２枚目のパネル）が、４日目にマトリゲルTMでコートされたプレートに付着したとき、２Ｄ培地中のＥＢ由来細胞は接着して、内皮様形態（６日目及び９日目に）の細胞区域を形成し、１４日目までにコンフルエントになった。
【０１４８】
ＮＲＰ−１及びＣＤ３１（ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞）を共発現している細胞は、３日目（０．１７％）に現れ継時的に増加し、１４日目（１．６％）（図３Ｃ）でピークに達した。ＴＧＦ−β阻害は、ｈＥＳまたはｈｉＰＳ細胞からの内皮系統分化を促進し、細胞が間葉系細胞に移行するのを防ぐことが報告されているので24、続いて、ソートされた細胞の異なるサブセットを、ＴＧＦ−β阻害剤（１０μＭ  ＳＢ４３１５４２）を添加した内皮成長（ＥＧＭ−２）培地で２週間培養した、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+サブセットは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓによって示された形態に類似した特徴的な内皮コブルストーン形態の細胞を生じた（図３Ｄ、上のパネル）。大部分のｈＥＳ由来細胞サブセットがマトリゲルTM上へプレートするのと同時に不完全な毛細管状ネットワークを形成したのに対し、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、ＣＢ由来ＥＣＦＣｓによって示される構造に類似した完全な構造を形成した（図３Ｄ）。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１-、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+、及びＣＤ１４４+ＣＤ１４６+サブセットによって作られるＨＰＰ−ＥＣ及びＬＰＰ−ＥＣコロニーの分布パターンは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓによって示されるパターンと著しく異なっていた（図３Ｅ）。しかし、ＣＢ−ＥＣＦＣクローンで表示されるパターンと、単一ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞によって形成されるＨＰＰ−ＥＣ及びＬＰＰ−ＥＣコロニーの分布パターンは、類似していた（図３Ｅ）。クローンのレベルで、個々の、プレートしたＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は全て分裂し、多数のクローン（３７％）はＨＰＰ−ＥＣｓを形成したが、ほとんどのＮＲＰ−１+ＣＤ３１-またはＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞は、ＨＰＰ−ＥＣｓを形成しなった（図３Ｅ）。このように、内皮分化（ＥＢプラス２Ｄプロトコル）を経たｈＥＳ由来細胞ＮＲＰ−１及びＣＤ３１の共発現は、高いクローンの増殖能及び血管形成活性を有するＥＣｓを生じる前駆体サブセットを特定したが、ＴＧＦ−β阻害の継続的な存在下で培養される場合のみであった（前述24のようにＴＧＦ−β阻害剤の除去は低下した増殖能、内皮形態の欠損、及びアルファ−平滑筋アクチン［α−ＳＭＡ］の増加した発現度と関係していた）。
【０１４９】
要約すると、上述のテストされた方法の全ては、臍帯血ＥＣＦＣｓに類似の特性を有する安定なＥＣｓの出現を促進しなかった。
【０１５０】
実施例３：ｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞の両方から安定なＮＲＰ−１+ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞を生成するプロトコル。
【０１５１】
本発明者らは、ＥＣＦＣ様の特徴を有するＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞の、臨床的に有用な細胞量への細胞の拡大をサポートするために十分な収率を促すが、ＴＧＦ−β阻害を必要としない内皮系統分化プロトコル開発をこころみた。
【０１５２】
ヒト多能性細胞は、ｍＴｅＳＲ１培地でマトリゲルTMコートのプレート上で２日間培養した37。内皮系統分化を誘導するために、分化０日目にｍＴｅＳＲ１培地を、１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ165、及びＦＧＦ−２で補われるステムラインＩＩ培地と交換した。組織培養培地は、ＣＤ３１及びＮＲＰ−１抗原を共発現している細胞を解析した１２日目まで、選択した成長因子を添加した新しいステムラインＩＩ培地で、次の日に置き換えた（図４Ａ）。このプロトコルを使って、それぞれ、ｈｉＰＳ及びｈＥＳ細胞から平均４．５％及び２％のＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞を収集することができた。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は７日間の培養においてＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞と比較して、６０％多い内皮コロニー（図４Ｂ、左のパネル）及び１５倍多い総内皮細胞（図４Ｂ、右のパネル）を生じた。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+の子孫は同種で、コブルストーン外観（図４Ｃ及び４Ｆ）を示し、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞から得られるコロニーの中で不均一な細胞集団が観察された（図６Ａ）。ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞と比較してＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞からの７日間の拡大培養で、総細胞数の重要な（１５倍の）増加が観察された（図４Ｂ）。更に、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+でソートされたフラクションから成長した細胞は、ＣＤ３１とＮＲＰ−１（図４Ｄ）の表面の共発現、及びＣＤ１４４の均一な発現を示したが、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+の子孫（図６Ｂ）とは対照的に、α−ＳＭＡ（図４Ｄ）の発現が完全に欠如していた。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞サブセットのわずか２％は分裂ができず、そして４８％は臍帯血ＥＣＦＣｓ（図４Ｅ）に酷似したが、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+サブセットと大きく異なる分布パターンでＨＰＰ−ＥＣＦＣｓ（図４Ｅ及び図６Ｅ）を形成した。更に、マトリゲルTM上にプレートした時、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞がマトリゲルTM上で形成しなかった（図６Ｄ）非常に分岐している毛細管状構造をＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は形成した（図４Ｆ）。
【０１５３】
細胞化されたコラーゲンゲルに配置されているＥＣＦＣｓ（ＣＢ−ＥＣＦＣｓ及びｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞）は、麻酔をかけた免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの皮下嚢の中に移植した。ゲルは、移植の１４日後にマウスを人道的に安楽死させた後、回収した。ゲルを、前述1、49のように、固定、透過、及びマウスホスト細胞に交差反応しない特異的抗ヒトＣＤ３１抗体で染色した。ｈＥＳ及びｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、前述1のようなＣＢ−ＥＣＦＣｓの能力に類似のホストマウス血管と吻合する強固なインビボ血管形成能を有するＥＣｓを生じた（図４Ｇ及びＦ）。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、２４匹以上の免疫不全マウスへの移植の３ヵ月以上後でも奇形腫形成を誘発しなかった（データ示さず）。しかしながら、ＮＲＰ−１-ＣＤ３１+細胞は、機能的なヒト血管（図６Ｃ）を生成しなかった。全体的に、ＥＣＦＣ様細胞プロトコル１２日目由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、実質的に純粋なコブルストーン形態（表された典型的内皮抗原）を示し、インビトロのマトリゲルTM上で毛細管状ネットワークを形成し、高いクローン増殖能を示し、及びホストマウス赤血球で満たされる強固なインビボヒト血管を生成した。よって、分化１２日目ｈＥＳ及びｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞フラクションは、ＣＢ−ＥＣＦＣｓに類似した多数の特性を備える内皮細胞を生産した。本明細書において、この様な細胞をＥＣＦＣ様細胞と言う。
【０１５４】
分化１日目のｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞は、ＣＤ３１及びＮＲＰ−１の共発現をしていなかったが（図５）、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞のパーセンテージは次第に上昇し、培養１２日目に最も高いレベルに到達したことが明らかになった（図５；図７Ａ）。ＥＣＦＣ分化を経ているｈＥＳ及びｈｉＰＳ細胞は９日目及び１２日目にコブルストーン様形態の出現を表し（図７Ｂ、図８Ａ、及び９Ａ）、そして、ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞のコロニーは他の分化細胞の間での出現が観察された（図８Ｂ、及び９Ｂ）。ＣＤ１４４及びＣＤ３１の共発現細胞の最も高いパーセンテージは、１２日目由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞から出現した（図７Ｃ；図９Ｄ）。６日目由来細胞は、マトリゲルTM上にプレートするのと同時に、不完全な毛細管状ネットワークを形成した（図９Ｅ）。９日目及び１２日目由来細胞は、完全な毛細管状ネットワーク（図９Ｅ）を形成した。結局、１２日目由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+ＥＣｓは、間葉系抗原α−ＳＭＡの発現なしに代表的な内皮抗原の最高頻度の共発現を示すＥＣＦＣ様細胞を生じさせ（図８及び９）、そして更なる研究に用いた。
【０１５５】
更に２つのモデルを、上述の皮下注入方法に加えて、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞の内皮機能を試験するために用いた。以下の３つの実験グループを比較した：（ｉ）ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞、（ｉｉ）ｈｉＰＳＣ胚様体由来ＴＧＦ−β阻害ＣＤ１４４+内皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓ）（Ｊａｍｅｓら  ２０１０）、及び（ｉｉｉ）ＣＢ−ＥＣＦＣｓ（Ｙｏｄｅｒら  ２００７；及びＩｎｇｒａｍら  ２００４）。
【０１５６】
最初のモデルでは、高濃度酸素暴露新生仔マウスにおける血管形成の救出及び血管新生ふさ状分岐の縮小を測定した（Ｍｅｄｉｎａら  ２０１０）。新生仔の酸素誘発網膜症（ＯＩＲ）は、過度に豊富な網膜低酸素反応の後の、網膜血管の低酸素によって誘発された損失から生じる。傷害後の無血管領域の重要な縮小は、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞を受けた網膜で起こり（≧３６％の縮小；＊＊Ｐ＜０．０１）、ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓを受けた網膜では起きなかった（無血管領域で≦１４％の縮小；Ｐ＝非有意（ｎｓ））（図１０Ａ、Ｂ）。さらに、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞だけは、網膜前血管新生ふさ状分岐を有意に減らした（図１０Ｃ；ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣ結果示さず）。細胞配達の７２時間後でのＱｄｏｔｓ６５５による細胞の前標識、及びイメージングは、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞がｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓと比較してより多く、及びホスト網膜組織のより広い配布で統合されることを示した（図１１Ａ）。ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓではなく、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞は、表層性網膜網状組織で血管チューブ構造を形成するように見えた（図１１Ｂ）。
【０１５７】
ヌードマウスの後肢大腿血管除去の第２のモデルがすでに研究されている24。虚血性肢と血流の救出は、ｈｉＰＳＣ−ＥＢＴ−ＣＤ１４４+ＥＣｓと比較して、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞によって大幅に向上した（Ｐ＜０．０５；図１０Ｄ〜Ｆ、及びデータ示さず）。これらのアッセイでは、ｈｉＰＳＣ−ＥＣＦＣ様細胞が、ＣＢ−ＥＣＦＣｓと同様に機能した。
【０１５８】
一次細胞は無制限には増殖せず、代わりにインビトロでの長期培養の後老化を受ける38。代表的な内皮細胞機能を失わずに、Ｐ１８までｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞及びＣＢ−ＥＣＦＣｓの両方を拡大することができた（図１２Ａ、Ｂ）。ヒトｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞は、ＣＢ−ＥＣＦＣコントロールと類似の同種のコブルストーン内皮単分子層を呈した（図１２Ａ）。ＣＢ−ＥＣＦＣｓ及びｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞は、Ｐ１８（図１２Ｂ）まで、成功裏に拡大した。ｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞の３％のみが、Ｐ７で細胞老化マーカーβ−ガラクトシダーゼ発現を示し、８０％以上の細胞は、Ｐ１８でＣＢ−ＥＣＦＣコントロール細胞によって示される老化プロフィールと類似の複製老化を示した（図１２Ｃ）。重要なことに、ｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様及びＣＢ−ＥＣＦＣｓの大多数が老化し、Ｐ１８で瀕死の一次細胞38の特徴を示したが、それらはまだ内皮コブルストーン形態を維持し、内皮抗原ＣＤ３１、ＮＲＰ−１、及びＣＤ１４４の発現、α−ＳＭＡの非発現を維持していた（α−ＳＭＡ発現は完全にこれらの細胞に欠損していた；図１２Ｄ）。このように、ｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞は、長期拡大培養を通して安定した内皮表現型を維持した。
【０１５９】
実施例４：ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓと比較して類似点と相違点を有する分子プロフィールを示す。
【０１６０】
種々のＥＣサブセットのより複雑な分子比較を実行するために、全トランスクリプトーム配列（ＲＮＡｓｅｑ）解析は、以下の分子プロフィール：ｉ）未分化ｈｉＰＳ細胞（０日目ｈｉＰＳ）；ｉｉ）分化３日目ｈｉＰＳ細胞（３日目ｈｉＰＳ）；ｉｉｉ）１２日目ｈｉＰＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞（ｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞）；ｉｖ）１２日目ｈＥＳ由来ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+ＥＣＦＣ様細胞（ｈＥＳ−ＥＣＦＣ様細胞）；及びｖ）ＣＢ−ＥＣＦＣｓを確認し比較するため、前述32のように行った。
【０１６１】
ヒトｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞、及びｈＥＳ−ＥＣＦＣ様細胞は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓによって示される、それらに類似した相対的な遺伝子発現プロフィールを呈した（図１３Ａ）。ヒト０日目のｉＰＳ細胞は、多能性細胞に特有のトランスクリプトームプロフィールを一般的に分化細胞で典型的に見られる限られた転写物の発現を示した（図１３Ａ）。しかし、３日目のｈｉＰＳ細胞は、複数の系統に特有の遺伝子発現の増加を示し（原始線条、内胚葉、中胚葉、造血性、及び軟骨−骨−脂肪生成遺伝子）、多能性細胞分化の開始を示した（図１３Ａ）。ｈｉＰＳ及びｈＥＳの両方に由来するＥＣＦＣ様細胞は、多能性で非内皮系統に特有の遺伝子転写物の減少を示したが（図１３Ａ）、内皮遺伝子転写物の発現は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓに類似して増加していた（図１３Ａ、Ｂ）。
【０１６２】
転写発現における種々の違いは、臍帯血由来ＥＣＦＣｓと比較したｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞でも確認された（表２）。例えば、以下の遺伝子は、臍帯血由来ＥＣＦＣｓと比較してｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞で過剰発現した：仮想的タンパク質ＬＯＣ１００１３２２８８、ＣＵＢ及びＳｕｓｈｉマルチプルドメイン１、リンパ限定膜タンパク質、アリルアセトアミドデアセチラーゼ（エステラーゼ）、フォリスタチン様５、ＥＮＳＧ０００００２１５２６２、仮想的ＬＯＣ８４８５６、グアニル酸シクラーゼ活性剤２Ｂ（ウログアニリン）、ケラチン７５、繊維芽細胞活性化タンパク質、アルファ（ＦＡＰ）、２２番染色体オープンリーディングフレーム３４、ガスダーミンＣ、ＥＮＳＧ０００００２２２９５４、ヒドロキシステロイド（１１−ベータ）デヒドロゲナーゼ１、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ２、及びＺｉｃファミリーメンバー４。以下の遺伝子は、臍帯血由来ＥＣＦＣｓと比較してｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞で過小発現した：レセプター（化学感覚）トランスポータータンパク質４、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１、アシル−ＣｏＡ  シンセターゼ中鎖ファミリーメンバー２Ａ、セルピンペプチダーゼインヒビター、クレードＡ（アルファ−１  アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー３、ＥＮＳＧ０００００２１８０５２、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２３、４８含有コイルドコイルドメイン、及びＲＡＳ（ＲＡＤ、及びＧＥＭ）−様ＧＴＰバインディング１。
【０１６３】
【表２】
0006591434.tif 000003
0006591434.tif 000004
【０１６４】
実施例５：ＮＲＰ−１は、ＥＣＦＣ様細胞出現の間にＫＤＲ媒介シグナリングの本質を高める。
【０１６５】
心血管発生及び血管形成におけるＮＲＰ−１の役割は確立されているが35、36、39、ＮＲＰ−１がＥＣｓで機能するメカニズムは完全には理解されていない。ＥＣ表面に存在するＮＲＰ−１がコレセプターとしてＶＥＧＦ165と結合し、ＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ）とシグナリング複合体を形成する、と提案されている40。ＮＲＰ−１は小さな細胞質ドメインを持ち、それは定義済みの固有のキナーゼ活性を持たない。ＫＤＲは固有のキナーゼ活性を有し、ＮＲＰ−１−ＶＥＧＦ165−ＫＤＲシグナリング複合体の形成は、ＶＥＧＦ−ＫＤＲによって媒介されるシグナリング活性、及び生物学的機能を高める40-43。ＮＲＰ−１はＫＤＲを通したＶＥＧＦ165シグナリングの媒介に必要ではない42-44が、しかし最大のＫＤＲ活性、及び／またはＫＤＲチロシンリン酸化35、40-43のため、及び内皮細胞でｐ１３０Cas／Ｐｙｋ２の活性化を通して選択的にＶＥＧＦ−ＫＤＲシグナリングを媒介するために必要であることが明らかに示された43、44。二量体Ｆｃ−ＮＲＰ−１、膜ＮＲＰ−１の代用45、及びＶＥＧＦ（ＮＲＰ−１−Ｂ）42と結合しているＮＲＰ−１をブロックする特定のモノクローナル抗体を、それぞれＮＲＰ−１によって媒介される活性を高め、及びブロックするために使用した。Ｆｃ−ＮＲＰ−１は本来のオリゴマー形成された膜ＮＲＰ−１の代用の働きをするが45、ＮＲＰ−１−Ｂは特にＮＲＰ−１結合ＶＥＧＦ165をブロックする42。分化６日目ｈｉＰＳ細胞がＫＤＲ発現を大量に増加させ、ＮＲＰ−１発現を（図１５Ｂから挿入）制限することを本明細書で提供されるデータが示唆したので、発明者はＮＲＰ−１活性を増やすことがＫＤＲ活性化を高めるかもしれないと仮定した。再現できる結果（データ示さず、及び図１５Ａ）を矛盾なく提供する処理のための、特定の用量（Ｆｃ−ＮＲＰ−１二量体  ３．３ｎＭ、及びＮＲＰ−１−Ｂ  ５００ｎｇ／ｍＬ）及び時間の長さ（４〜６日）を確認するために、時間及び用量反応実験を、報告42、45されているように行った。処理の４日間後に、ＦＣ−ＮＲＰ−１二量体で処理した細胞の中でＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞生成のかなりの増加（図１５Ｂ）、及びブロッキング抗体ＮＲＰ−１−ＢがＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞（図１５ｂ）の生成をかなり減少させたことが判明した。この影響は、１２日目に更に強化された。（図１５Ｂ）
【０１６６】
図１５Ｃを参照すると、上部のブロットにおいて、ＥＣＦＣ様細胞分化を経ているｈｉＰＳ細胞を、Ｆｃ−コントロール（３．３ｎＭ）、Ｆｃ−ＮＲＰ−１二量体（３．３ｎＭ）、またはＮＲＰ−１−Ｂ（５００ｎｇ／ｍＬ）で図１３Ａに記載のとおりに処理した。細胞を、５．５時間欠乏させ、そして５分間ＶＥＧＦ165（３０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。細胞可溶化物はリン酸ＫＤＲ及び総ＫＤＲに対する抗体を用いたエウスタンブロット解析を行った。矢は、ＮＲＰ−１二量体、及びＮＲＰ−１−Ｂで処理したｈｉＰＳ細胞におけるリン酸ＫＤＲの発現を示す。下部パネルにおいて、各々のレーンにおける総ＫＤＲレベルを示す。
【０１６７】
ＫＤＲリン酸化はＶＥＧＦ刺激したグループで観察され、そしてＦｃ−ＮＲＰ−１二量体処理はコントロール処理細胞と比較してＫＤＲのリン酸化を増加させた。しかし、減少したリン酸化は、ＮＲＰ−１−Ｂ処理細胞（ｎ＝３）で観察された。一番下のブロットにおいて、ＥＣＦＣ様細胞分化を経ているｈｉＰＳ細胞は示された濃度のＦｃ−コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１二量体、または、ＮＲＰ−１−Ｂで処理した。細胞を飢餓状態にし、ＶＥＧＦ165（３０ｎｇ／ｍＬ）で５分間刺激した。細胞可溶化物を、リン酸ｐ１３０Cas、リン酸Ｐｙｋ２、及び総Ｐｙｋ２に対する抗体を用いたウスタンブロット解析にかけた。上部のパネルの矢は、リン酸ｐ１３０Casの発現を示し、中央のパネルの矢はリン酸Ｐｙｋ２の発現を示し；下部のパネルは、Ｆｃ−コントロール（Ｃ；３．３ｎＭ）、Ｆｃ−ＮＲＰ−１二量体、及びＮＲＰ−１−Ｂ処理ｉＰＳ細胞における総ｐｙｋ２を示す。下部のパネルは、各々のレーンで総ＫＤＲレベルを示す。増加したＰ−１３０Cas及びＰｙｋ２リン酸化は、コントロール処理細胞と比較してＦｃ−ＮＲＰ−１二量体処理群において用量依存的に観察された。しかし、減少したＰ−１３０Cas及びＰｙｋ２リン酸化は、コントロール処理細胞と比較してＮＲＰ−１−Ｂ処理細胞において観察された。我々はまた、Ｆｃ−ＮＲＰ−１二量体処理細胞における、増加したＫＤＲの活性化、及びＫＤＲ40、44の活性化を媒介するＮＲＰ−１によって活性化される特異な下流分子として知られているｐ１３０Casの活性化を見いだした（図１５Ｃ）。これとは対照的に、ＮＲＰ−１−Ｂ処理細胞は、減少したＫＤＲリン酸化を示し、下流分子の活性化を減少させた（図１５Ｃ）。これらのデータは、ＮＲＰ−１がＫＤＲシグナリングを高めることによって、ヒト多能性幹細胞からＥＣＦＣ様細胞の生成を促進することを示唆した。
【０１６８】
次に、本発明者らは、ＮＲＰ−１が培養ＥＣＦＣ様細胞の増殖能の維持に関与してもいるかもしれないと仮定した。ＮＲＰ−１発現が、後期継代ｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞で次第に下方制御され、減少した全体の増殖能に関与したことが判明した（図１６Ａ、Ｂ）。後期継代（Ｐ１４）ＥＣｓのＫＤＲ発現の解析は、４０〜５０％のＫＤＲ発現を示した（図１６Ｃ）。しかし、Ｆｃ−ＮＲＰ−１存在下で７日間培養されるとき、Ｐ１４  ＥＣｓは有意義に増加した拡大を示したが、コントロール及びＮＲＰ−１−Ｂ処理群と比較してβ−ガラクトシダーゼ発現（老化マーカー）は減少した（図１６Ｄ〜Ｆ）。
【０１６９】
ＶＥＧＦ165含有の正常ＥＧＭ−２培地、及びＶＥＧＦ121含有ＥＧＭ−２培地で培養し、コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで7日間処理した後期継代（Ｐ１４）ｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞で見られるように（図１６Ｇ）、Ｆｃ−ＮＲＰ−１処理したＰ１４  ＥＣｓは、コントロール処理細胞と比較してアポトーシス促進細胞のパーセンテージがかなり減少した。７日後に、細胞を集めて数え、各々の処理群での、生細胞、アポトーシス促進細胞、及び死細胞を検査するためにヨウ化プロピジウム、及びアネキシンＶで染色した。コントロール、Ｆｃ−ＮＲＰ−１、及びＮＲＰ−１−Ｂで7日間処理したＶＥＧＦ165及びＶＥＧＦ121含有培地におけるアポトーシス促進細胞のパーセンテージは、ＶＥＧＦ121の存在下で培養した細胞と比較して、ＶＥＧＦ165含有培地で培養した細胞においてかなり減少した。
【０１７０】
ＶＥＧＦ121は、Ｆｃ−ＮＲＰ−１とＰ１４  ＥＣＦＣ様細胞を支えるＫＤＲとの間の相互作用を促進することができなかったため、ＫＤＲ活性化おけるＦｃ−ＮＲＰ−１の効果はＶＥＧＦ165の存在に依存していることが確認された（図１６Ｇ〜Ｉ）。よって、ＶＥＧＦ165を経たＫＤＲのＦｃ−ＮＲＰ−１活性化は、増殖を助ける役割を担い、、老化するｈｉＰＳ由来ＥＣＦＣ様細胞において、老化マーカー及びアポトーシス促進細胞の動作の発現を減少させた。
【０１７１】
予備研究において、ＰＡＤ及びＣＬＩの患者に由来する一次ＥＣｓは、低いレベルのＮＲＰ−１発現を示し、低いクローン増殖能を有し、老化マーカーを示し、そして免疫不全マウス（図１７Ａ〜Ｇ）で移植と同時に強力なインビボヒト血管を形成しないことが明らかになった。しかし、ＰＡＤ及びＣＬＩの患者から分離した、循環するレジデント動脈由来の内皮細胞において、Ｆｃ−ＮＲＰ−１処理は、増殖、生存を促進し、老化の形跡を適切に減少させた（図１７Ｈ〜Ｎ）。このように、老化していく後期継代ｈｉＰＳ−ＥＣＦＣ様細胞、及び患者由来のＰＡＤ−ＥＣｓのＦｃ−ＮＲＰ−１処理は、増殖能が増加し、アポトーシスを減少させ、ＶＥＧＦ165依存的な様式で老化マーカーを減少させる。
【０１７２】
実施例６  考察
【０１７３】
上記の実施例において、ここでＥＣＦＣ様細胞と記載する臍帯血ＥＣＦＣ様の特性を有するＥＣｓの実質的に純粋で安定したＥＣｓ集団を再生可能に分化し分離する場目の方法が、提供され、テストされた。
【０１７４】
ＥＣＦＣ様細胞は、ＣＢ−ＥＣＦＣｓに類似する特性を有する。ＮＲＰ−１+ＣＤ３１+細胞は、特徴的コブルストーン形態を有する均一な単層を形成し、高いクローンの増殖能を示し、マトリゲルTMの上で培養されるとき完全な毛細管様構造を形成することにより血管形成を示し、同時移植細胞の不存在化で免疫不全マウスに移植された際にインビボで着実に吻合した血管を形成した。これらのヒト多能性幹細胞由来ＥＣＦＣ様細胞は、安定で、長い培養（１８回の継代）を通して非内皮細胞に移行せず、単一の開始多能性細胞（図１８）から、３ヵ月未満で１兆以上のＥＣｓに拡大することができた。一次ＣＢ−ＥＣＦＣｓとは異なり、本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、安定したＥＣＦＣ特徴を示し、種々の臨床応用における使用に適する量の細胞に拡大する可能性がある。さらに本明細書で提供されるＥＣＦＣ様細胞は、例えば、患者のｉＰＳＣｓ由来ならば、患者特有とすることができる
【０１７５】
ＥＣＦＣ様細胞は、従来のプロトコルによりインビトロで発生するＥＣｓとは異なる特徴を有する。ＥＣＦＣ様細胞由来の機能的ＥＣｓの高度に効率的なアウトプット（すなわち、３ヵ月未満での１兆を超えるＥＣｓ）は、他の公知のプロトコルによるｈＰＳＣｓ由来ＥＣｓの報告された収率、０．６22、７．４24、及び１１．６46とは対照的である。さらに、他の公知のプロトコルによるｈＰＳＣｓ由来ＥＣｓは、インビボの共培養細胞非存在下で移植された場合、血管形成能を有しない。
【０１７６】
ＮＲＰ−１−ＶＥＧＦ165−ＫＤＲに媒介される活性化とその下流のシグナリング分子は、ｈＰＳＣｓ由来のＥＣＦＣ様細胞の発生と誘導のため、及び後期継代、老化したｈＰＳＣ由来ＥＣＦＣ様細胞、及び患者由来の老化したＥＣＦＣｓの生存及び分化能を強化するためのメカニズムであることが判明した。ここで提供される結果は、心血管系疾患の患者の治療法として患者由来のＥＣＦＣ様細胞の仕様を検討することは実現可能であると示唆する。
【０１７７】
本開示は、特定の態様に関して記述されたが、種々の変更は、添付した特許請求の範囲に記載した本開示の目的と範囲から逸脱することなく、修飾当業者にとって明らかであろう。本明細書で提供されるいかなる実施例も、単に本開示を表す目的において含まれ、どんな形であれ本開示を制限することを目的とするものではない。本明細書で提供されるどんな図面も、単に本開示の種々の側面を示すためであり、どんな形であれ一定の比率や本開示を制限すること目的で描かれるものではない。本明細書で引用されるすべての先行技術の開示は、参照により完全にここに組み込まれる。
【０１７８】
リファレンス
1.Yoder, M.C. et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood 109, 1801-1809 (2007).
2.Ingram, D.A. et al. Vessel wall-derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood 105, 2783-2786 (2005).
3.Ingram, D.A. et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood 104, 2752-2760 (2004).
4.Critser, P.J., Kreger, S.T., Voytik-Harbin, S.L. & Yoder, M.C. Collagen matrix physical properties modulate endothelial colony forming cell-derived vessels in vivo. Microvasc Res 80, 23-30 (2010).
5.Au, P. et al. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood 111, 1302-1305 (2008).
6.Melero-Martin, J.M. et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ Res 103, 194-202 (2008).
7.Lin, Y., Weisdorf, D.J., Solovey, A. & Hebbel, R.P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest 105, 71-77 (2000).
8.Ikpeazu, C., Davidson, M.K., Halteman, D., Browning, P.J. & Brandt, S.J. Donor origin of circulating endothelial progenitors after allogeneic bone marrow transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 6, 301-308 (2000).
9.Moubarik, C. et al. Transplanted late outgrowth endothelial progenitor cells as cell therapy product for stroke. Stem Cell Rev 7, 208-220 (2011).
10.Schwarz, T.M. et al. Vascular incorporation of endothelial colony-forming cells is essential for functional recovery of murine ischemic tissue following cell therapy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 32, e13-21 (2012).
11.Saif, J. et al. Combination of injectable multiple growth factor-releasing scaffolds and cell therapy as an advanced modality to enhance tissue neovascularization. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30, 1897-1904 (2010).
12.Dubois, C. et al. Differential effects of progenitor cell populations on left ventricular remodeling and myocardial neovascularization after myocardial infarction. J Am Coll Cardiol 55, 2232-2243 (2010).
13.Schuh, A. et al. Transplantation of endothelial progenitor cells improves neovascularization and left ventricular function after myocardial infarction in a rat model. Basic Res Cardiol 103, 69-77 (2008).
14.Stitt, A.W. et al. Vascular stem cells and ischaemic retinopathies. Prog Retin Eye Res 30, 149-166 (2011).
15.Medina, R.J., O'Neill, C.L., Humphreys, M.W., Gardiner, T.A. & Stitt, A.W. Outgrowth endothelial cells: characterization and their potential for reversing ischemic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci 51, 5906-5913 (2010).
16.Bouvard, C. et al. alpha6-integrin subunit plays a major role in the proangiogenic properties of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30, 1569-1575 (2010).
17.Lee, J.H., Lee, S.H., Yoo, S.Y., Asahara, T. & Kwon, S.M. CD34 Hybrid Cells Promote Endothelial Colony-Forming Cell Bioactivity and Therapeutic Potential for Ischemic Diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol (2013).
18.Stroncek, J.D., Ren, L.C., Klitzman, B. & Reichert, W.M. Patient-derived endothelial progenitor cells improve vascular graft patency in a rodent model. Acta Biomater 8, 201-208 (2012).
19.Robbins, R.D., Prasain, N., Maier, B.F., Yoder, M.C. & Mirmira, R.G. Inducible pluripotent stem cells: not quite ready for prime time? Curr Opin Organ Transplant 15, 61-67 (2010).
20.Broxmeyer, H.E. et al. Hematopoietic stem/progenitor cells, generation of induced pluripotent stem cells, and isolation of endothelial progenitors from 21- to 23.5-year cryopreserved cord blood. Blood 117, 4773-4777 (2011).
21.Lee, M.R. et al. Epigenetic regulation of NANOG by miR-302 cluster-MBD2 completes induced pluripotent stem cell reprogramming. Stem Cells 31, 666-681 (2012).
22.Choi, K.D. et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27, 559-567 (2009).
23.Cimato, T. et al. Neuropilin-1 identifies endothelial precursors in human and murine embryonic stem cells before CD34 expression. Circulation 119, 2170-2178 (2009).
24.James, D. et al. Expansion and maintenance of human embryonic stem cell-derived endothelial cells by TGFbeta inhibition is Id1 dependent. Nat Biotechnol (2010).
25.Taura, D. et al. Induction and isolation of vascular cells from human induced pluripotent stem cells--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol 29, 1100-1103 (2009).
26.Goldman, O. et al. A boost of BMP4 accelerates the commitment of human embryonic stem cells to the endothelial lineage. Stem Cells 27, 1750-1759 (2009).
27.Feng, Q. et al. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem Cells 28, 704-712 (2010).
28.Rufaihah, A.J. et al. Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 31, e72-79 (2011).
29.Nourse, M.B. et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol 30, 80-89 (2010).
30.Sone, M. et al. Pathway for differentiation of human embryonic stem cells to vascular cell components and their potential for vascular regeneration. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27, 2127-2134 (2007).
31.Vodyanik, M.A., Bork, J.A., Thomson, J.A. & Slukvin, II Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood 105, 617-626 (2005).
32.Ginsberg, M. et al. Efficient direct reprogramming of mature amniotic cells into endothelial cells by ETS factors and TGFbeta suppression. Cell 151, 559-575 (2012).
33.Carmeliet, P. et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGF allele. Nature 380, 435-439 (1996).
34.Gerber, H.P. et al. VEGF is required for growth and survival in neonatal mice. Development 126, 1149-1159 (1999).
35.Staton, C.A., Kumar, I., Reed, M.W. & Brown, N.J. Neuropilins in physiological and pathological angiogenesis. J Pathol 212, 237-248 (2007).
36.Takashima, S. et al. Targeting of both mouse neuropilin-1 and neuropilin-2 genes severely impairs developmental yolk sac and embryonic angiogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 3657-3662 (2002).
37.Evseenko, D. et al. Mapping the first stages of mesoderm commitment during differentiation of human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 13742-13747 (2010).
38.Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W.J. & Peeper, D.S. The essence of senescence. Genes Dev 24, 2463-2479 (2010).
39.Kitsukawa, T., Shimono, A., Kawakami, A., Kondoh, H. & Fujisawa, H. Overexpression of a membrane protein, neuropilin, in chimeric mice causes anomalies in the cardiovascular system, nervous system and limbs. Development 121, 4309-4318 (1995).
40.Zachary, I.C. How neuropilin-1 regulates receptor tyrosine kinase signalling: the knowns and known unknowns. Biochem Soc Trans 39, 1583-1591 (2011).
41.Soker, S., Miao, H.Q., Nomi, M., Takashima, S. & Klagsbrun, M. VEGF165 mediates formation of complexes containing VEGFR-2 and neuropilin-1 that enhance VEGF165-receptor binding. J Cell Biochem 85, 357-368 (2002).
42.Pan, Q. et al. Blocking neuropilin-1 function has an additive effect with anti-VEGF to inhibit tumor growth. Cancer Cell 11, 53-67 (2007).
43.Herzog, B., Pellet-Many, C., Britton, G., Hartzoulakis, B. & Zachary, I.C. VEGF binding to NRP1 is essential for VEGF stimulation of endothelial cell migration, complex formation between NRP1 and VEGFR2, and signaling via FAK Tyr407 phosphorylation. Mol Biol Cell 22, 2766-2776 (2011).
44.Evans, I.M. et al. Neuropilin-1 signaling through p130Cas tyrosine phosphorylation is essential for growth factor-dependent migration of glioma and endothelial cells. Mol Cell Biol 31, 1174-1185 (2011).
45.Uniewicz, K.A., Cross, M.J. & Fernig, D.G. Exogenous recombinant dimeric neuropilin-1 is sufficient to drive angiogenesis. J Biol Chem 286, 12-23 (2011).
46.Lippmann, E.S. et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 30, 783-791 (2012).
47.Thomson, J.A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282, 1145-1147 (1998).
48.Yu, J. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797-801 (2009).
49.Prasain, N., Meador, J.L. & Yoder, M.C. Phenotypic and functional characterization of endothelial colony forming cells derived from human umbilical cord blood. J Vis Exp (2012).
50.Bailey, J.L. et al. Collagen oligomers modulate physical and biological properties of three-dimensional self-assembled matrices. Biopolymers 95, 77-93 (2011). 
51.Samuel et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent cells. PNAS Early Edition 1310675110.
【図１Ａ−Ｅ】
0006591434.tif 000005
【図２Ａ−Ｅ】
0006591434.tif 000006
【図３Ａ−Ｄ】
0006591434.tif 000007
【図３Ｅ】
0006591434.tif 000008
【図４Ａ】
0006591434.tif 000009
【図４Ｂ】
0006591434.tif 000010
【図４Ｃ−Ｅ】
0006591434.tif 000011
【図４Ｆ】
0006591434.tif 000012
【図４Ｇ】
0006591434.tif 000013
【図５】
0006591434.tif 000014
【図６Ａ−Ｅ】
0006591434.tif 000015
【図７Ａ−Ｄ】
0006591434.tif 000016
【図８Ａ−Ｂ】
0006591434.tif 000017
【図８Ｃ−Ｅ】
0006591434.tif 000018
【図９Ａ−Ｅ】
0006591434.tif 000019
【図１０Ａ−Ｃ】
0006591434.tif 000020
【図１０Ｄ−Ｆ】
0006591434.tif 000021
【図１１Ａ】
0006591434.tif 000022
【図１１Ｂ】
0006591434.tif 000023
【図１２Ａ−Ｂ】
0006591434.tif 000024
【図１２Ｃ−Ｄ】
0006591434.tif 000025
【図１３Ａ】
0006591434.tif 000026
【図１３Ｂ】
0006591434.tif 000027
【図１４Ａ−Ｂ】
0006591434.tif 000028
【図１４Ｃ−Ｄ】
0006591434.tif 000029
【図１４Ｅ】
0006591434.tif 000030
【図１５Ａ−Ｃ】
0006591434.tif 000031
【図１６Ａ−Ｅ】
0006591434.tif 000032
【図１６Ｆ−Ｉ】
0006591434.tif 000033
【図１７Ａ−Ｆ】
0006591434.tif 000034
【図１７Ｇ−Ｋ】
0006591434.tif 000035
【図１７Ｌ−Ｎ】
0006591434.tif 000036
【図１８】
0006591434.tif 000037