(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）修飾ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を３コピー含む単鎖ポリペプチドであって、前記修飾ヒトＴＮＦは、野生型ヒトＴＮＦと比較して、その受容体への親和性が低下しており、前記修飾ヒトＴＮＦは、次の位置：Ｙ８７、Ｉ９７、およびＹ１１５のうちの１つにおける置換変異を少なくとも１つ含み、位置Ｙ８７における置換変異は、Ｙ８７ＱおよびＹ８７Ｆから選択され、位置Ｉ９７における置換変異は、Ｉ９７ＡおよびＩ９７Ｓから選択され、位置Ｙ１１５における置換変異は、Ｙ１１５ＡおよびＹ１１５Ｇから選択される、単鎖ポリペプチドと、
（ｉｉ）リンカー配列と、
（ｉｉｉ）ターゲティング部分と、
を含む構築物であって、前記リンカー配列が前記ターゲティング部分に前記ＴＮＦポリペプチドのコピーを連結している、構築物。
【請求項２】
前記ターゲティング部分が、抗体またはラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）を含む、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
前記ターゲティング部分が、腫瘍脈管構造のマーカーに特異的にターゲティングされる、請求項１または２に記載の構築物。
【請求項４】
前記ターゲティング部分が、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、テネイシンＣ、ανβ３インテグリン、ＣＤ１３、ＣＤ３、ＣＤ４７、ＣＤ７０、Ａｘｌ、ＰＳＣＡ、およびＰＳＭＡから選択される標的に対して向けられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が、ＣＤ２０に対して向けられる、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
前記ターゲティング部分が、Ｈｅｒ２に対して向けられる、請求項４に記載の構築物。
【請求項７】
単鎖融合タンパク質を含む構築物であって、前記融合タンパク質が、
（ｉ）３コピーの修飾ヒトＴＮＦであって、前記修飾ヒトＴＮＦは、野生型ヒトＴＮＦと比較して、その受容体への親和性が低下しており、前記修飾ヒトＴＮＦは、位置Ｙ８７における置換変異を少なくとも１つ含み、位置Ｙ８７における置換変異は、Ｙ８７ＱおよびＹ８７Ｆから選択される、３コピーの修飾ヒトＴＮＦと、
（ｉｉ）リンカー配列と、
（ｉｉｉ）ＣＤ２０に向けられたラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）を含むターゲティング部分と、を含み、前記リンカー配列が前記ターゲティング部分に前記修飾ヒトＴＮＦのコピーを連結している、構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その受容体に対する減少した活性をもつＴＮＦスーパーファミリーの修飾サイトカインであって、前記修飾サイトカインは、標的細胞に特異的に送達される、修飾サイトカインに関する。好ましくは、前記修飾サイトカインは、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーの単鎖変異体であり、さらにより好ましくは、鎖の１つまたは複数は、１つまたは複数の突然変異を有し、結果として受容体への低親和性を生じ、前記突然変異体サイトカインは、標的細胞に特異的に送達される。ターゲティングは、ターゲティング部分、好ましくは抗体または抗体様分子へのＴＮＦスーパーファミリーの修飾サイトカインの融合によって現実化される。本発明は、疾患を治療するためのＴＮＦスーパーファミリーのこのようなターゲットされる修飾サイトカインの使用にさらに関する。
【０００２】
ＴＮＦスーパーファミリーは、細胞死、増殖及び分化を調節することによって、免疫系における重要な機能をもつ炎症性サイトカインからなる。加えて、ファミリーのメンバーは、骨代謝、神経系に対して、新生脈管構造及び発癌に対して機能を発揮することが記載されている。それは、１９のリガンド、ＩＩ型（細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質を含み、それは自己集合性の、非共有結合ホモ三量体として生物学的に活性である。大部分のＴＮＦスーパーファミリーリガンドが膜結合タンパク質として合成されるが、可溶型は、タンパク質切断によって生成され得る。これらの全ては、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーからの１つまたは複数の分子にこれらのＣ末端ＴＮＦ相同ドメインを介して結合し、これがファミリーメンバーの間で〜２０〜３０％の配列相同性を示す。これまで、２９のＴＮＦスーパーファミリー受容体がヒトにおいて同定された。これらは、主にリガンド結合細胞外ドメインにおいて高システインモチーフをもつＩ型（細胞外Ｎ末端、細胞内Ｃ末端）膜貫通糖タンパク質である。しかし、共有結合したＣ末端糖脂質によって膜に付着したＴＲＡＩＬ−Ｒ３のようないくつかの例外がある。可溶性受容体は、タンパク質切断（たとえばＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２）によって、または膜貫通ドメインをコードしているエクソンの選択的スプライシングによって生成され得る。このスーパーファミリーの受容体は、これらのシグナリング特性に基づいて３つの群に分けられ得る：アポトーシスを誘導する細胞質デスドメインをもつ受容体；ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＥＲＫ及びＰＩ３Ｋなどのいくつかのシグナリング経路を誘導するＴＲＡＦ相互作用モチーフをもつ受容体；及び細胞内シグナリングドメインを欠いているデコイ受容体。ＴＮＦは、ＴＮＦ−Ｒ１（ｐ５５）との相互作用を介してアポトーシスを誘導する一方で、ＴＮＦ−Ｒ２（ｐ７５、主に免疫細胞において発現される）に結合することにより、増殖を促進する。ＴＲＡＩＬシグナリングは、それが２つの細胞死受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５））に、２つのデコイ受容体（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３（ＤＣＲ１）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ４（ＤＣＲ２））に、及び可溶性オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）に結合することができるので、より複雑である。後の３つの受容体の１つに結合すると、それが細胞死受容体から離れてＴＲＡＩＬをつなぎ留めるので、ＴＲＡＩＬ媒介アポトーシスを阻害する（Ｇａｕｒ  ａｎｄ  Ａｇｇｅｒｗａｌ，  ２００３；  Ｈｅｈｌｇａｎｓ  ａｎｄ  Ｐｆｅｆｆｅｒ，  ２００５；  Ｈｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｉｋｈ，  ２００７）。
【０００３】
死を誘導するＴＮＦスーパーファミリーメンバーＴＮＦ、ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）及びＴＲＡＩＬは、これらのそれぞれの受容体ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２を発現する癌に対する有望な治療薬である。実際のところ、ＴＮＦは、インビボにおいて一定の腫瘍の出血性壊死を生じさせることによって、特別な抗腫瘍活性をもつ因子として、２５年より前に当初発見された。後に、また、ＴＮＦによって腫瘍新生脈管構造に起因した選択的な損傷は、その抗腫瘍能を定義することが明らかになった（Ｌｅｊｅｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  ｖａｎ  Ｈｏｒｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。残念なことに、癌治療におけるＴＮＦの全身使用は、そのショック誘導特性によってまだ妨げられる。現在、それは、軟部組織肉腫及び移行メラノーマを治療する化学療法と組み合わせて、単離された肢潅流の状態で臨床的に使用されるのみである（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。また、ＣＤ９５Ｌは、それが大量の肝細胞アポトーシスのために致死肝臓毒性を生じるので、全身的に投与されるときに毒性である（Ｇａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。しかし、ＴＲＡＩＬは、非形質転換細胞に対して殆どまたは全く細胞毒性をもたない癌細胞においてアポトーシスを誘導することを示し、及び種々の進行癌における臨床試験は、多くの場合において安定な疾患を報告する。なおも、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対する正常細胞の感作のために起こりうる副作用を示す、十分な全体の治療上の活性の併用治療を得ることが必要とされる（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｈｅｒｂｓｔ，  ２００８；  Ｆａｌｓｃｈｌｅｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。より低い毒性及びより高い効率をもつ突然変異体ＴＮＦ  （Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）、腫瘍特異的部分による単鎖構築物としての正常にＴＮＦまたはＴＲＡＩＬの送達（ｄｅ  Ｂｒｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｇｒｅｇｏｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｓｉｅｇｅｍｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）、キメラ可溶性ＣＤ９５Ｌ  （Ｄａｂｕｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）またはアゴニストのＴＲＡＩＬ−Ｒ１−、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２またはＣＤ９５特異的抗体（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｏｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）  などの、死を誘導するＴＮＦスーパーファミリーメンバーの全身投与の際に毒性を最小限にするための異なるアプローチが行われてきた。これらの一部は、治療指数を増加させ得るが、決してそれが臨床結果を劇的に改善するような程度でない。
【０００４】
驚くべきことに、我々は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインを含む構築物であって、サイトカインは、受容体への親和性を低下させるように修飾され、前記サイトカインは、ターゲティング部分に連結され、及び前記構築物は、強く減少した全身毒性を有し、及びターゲティング部分によって標的とされる細胞への有意な生物活性を示すのみである構築物を作製することができることを見いだした。
【０００５】
本発明の第１の態様は、（ｉ）ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカイン鎖の３つのコピーであって、生じるサイトカインは、その受容体への親和性が低下するように修飾される（「修飾サイトカイン」といわれる）コピー、（ｉｉ）リンカー配列及び（ｉｉｉ）ターゲティング部分を含む構築物であって、前記リンカー配列は、ターゲティング部分にサイトカインコピーを連結している構築物である。本明細書で使用される構築物は、化学的に修飾されたタンパク質、タンパク質複合体及び融合タンパク質を含むが、限定されない当業者に公知の任意のタンパク質の構築物であり得る。一つの好ましい実施形態において、個々の、自己三量化サイトカイン鎖が使用され、鎖の１つまたは複数は、ターゲティング部分に連結され得る。もう一つの好ましい実施形態において、３つのコピーは、単鎖サイトカインとして提示され；好ましい実施形態において、コピーは、リンカー配列によって分離されて、三量体形態でのサイトカインの提示を容易にする。また、互いに連結される１つの遊離サイトカイン鎖及び２つのサイトカインコピーをもつ混合形態が可能であることは、当業者に明らかである。生じる三量体サイトカインは、野生型サイトカインと比較して、その生物活性を低下させる修飾を保有する。このような修飾は、正常な野生型サイトカインの活性を減少させる修飾であり得る、またはそれは、相同的、非内因性ＴＮＦファミリーサイトカイン（ヒトＴＮＦファミリーサイトカイン受容体に結合していないもう一つの種のＴＮＦファミリーサイトカインなどであるが、限定されない）の活性を増加させる修飾であり得る。修飾は、ペグ化及びグリコシル化、その他のタンパク質への融合並びに突然変異などの化学的及び／または酵素修飾を含むが限定されない当業者に公知の活性を減少する、または増加する任意の修飾であり得る。サイトカインの二個以上のコピーが単鎖として提示される場合において、リンカーの長さは、正常な三量体構造を妨げるように適応されてもよく、その結果受容体に対してより低い活性を生じる。あるいは、特別なアミノ酸がリンカーに組み込まれて、構造を修飾してもよく；前記アミノ酸は、さらに修飾されてもよい。非限定的な例として、リシンは、リンカーに組み込まれてペグ化を可能にし得る。好ましくは、前記修飾は、突然変異であり、さらにより好ましくは、それは、その受容体に対するサイトカインの親和性を減少させる突然変異である。本明細書で使用される、減少した親和性及びそれに伴う減少した生物活性は、修飾サイトカインが、受容体に正常に結合する野生型サイトカインと比較して、野生型サイトカインの生物活性の７０％未満、さらにより好ましくは野生型サイトカインの生物活性の６０％未満、より好ましくは野生型サイトカインの生物活性の５０％未満、より好ましくは野生型サイトカインの生物活性の４０％未満、より好ましくは野生型サイトカインの生物活性の３０％未満、より好ましくは、野生型サイトカインの生物活性の２０％未満、最も好ましくは野生型サイトカインの生物活性の１０％未満の生物活性を有することを意味する。好ましくは、ＴＮＦスーパーファミリーの修飾サイトカインは、ＴＮＦスーパーファミリーの野生型サイトカインの突然変異体であり、及び活性は、ＴＮＦスーパーファミリーの野生型サイトカインと比較される。親和性及び／または活性は、当業者に公知の任意の方法によって測定され得る。受容体に対する突然変異体ＴＮＦの親和性は、受容体に対する野生型ＴＮＦの親和性と比較して、スキャッチャードプロット解析及び結合データのコンピュータ−フィッティングによって（たとえば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  １９４９）、またはＢｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）によって記述されるとおり、フロースルー条件下で反射型干渉分光法によって測定され得る。
【０００６】
好ましくは、前記サイトカインは、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＬ、ＬＴａｌｐｈａ、ＬＴｂｅｔａ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ２７Ｌ、４１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、ＡＰＲＩＬ、ＥＤＡ、ＶＥＧＩ及びＢＡＦＦからなる群から選択される。好ましくは、前記サイトカインは、単鎖として提示され、鎖は、リンカー配列によって結合される。
【０００７】
修飾サイトカインは、ターゲティング部分に連結される。本明細書で使用される「連結」は、共有結合によってでもよく、またはそれは、親和性結合によってであってもよい。非限定的な例において、前記ターゲティング部分は、二重特異性抗体でもよく、一方の特異性については標的細胞上の結合部位に、及び他方の特異性については修飾サイトカインに、または前記サイトカインに融合したタグに向けられる。もう一つの非限定的な例において、ターゲティング部分は、修飾サイトカインに化学的に連結されてもよく、またはそれは、組換え融合タンパク質でもよい。好ましくは、前記ターゲティング構築物は、組換え融合タンパク質である。好ましくは、前記ターゲティング部分は、腫瘍環境に、特に腫瘍脈管構造に（たとえば、腫瘍の内皮細胞、典型的には新生内皮細胞に）サイトカインをターゲティングする。さらにより好ましくは、ターゲティング部分は、ＴＮＦスーパーファミリーのサイトカインのための受容体、好ましくは結合部位と結合分子との間の特異的相互作用によって修飾サイトカインと相互作用することができる受容体を発現している細胞上の結合部位に、融合タンパク質を向けることができる結合分子である。一つの好ましい実施形態において、前記結合分子は、小さな化合物であり、細胞の外側にある分子に特異的に結合する。もう一つの好ましい実施形態において、前記結合分子は糖構造であり、細胞壁上に発現されるレクチン様分子に向けられる。もう一つの好ましい実施形態において、前記結合分子は、腫瘍環境、好ましくは腫瘍脈管構造を標的とするペプチドである。このようなペプチドは、当業者に公知であり、及びＮＧＲ（腫瘍血管において発現されるＣＤ１３イソ型をターゲティングする）及びＲＧＤペプチド（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  ＷＯ２００５０５４２９３）を含むが、限定されない。好ましくは、前記ペプチドは、ανβ３インテグリンを標的とするＲＧＤ−４Ｃペプチドである（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。さらにもう一つの好ましい実施形態において、前記結合分子は、結合ドメインを含むタンパク質である。結合ドメインは、当業者に公知である。このような結合ドメインの非限定的な例は、糖結合タンパク質（ＣＢＤ）（Ｂｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６）、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ（Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）、ラクダ科の動物重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、新たな抗原受容体の可変ドメイン（ＶＮＡＲ）、アフィボディ（Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、アルファボディ（ＷＯ２０１００６６７４０）、デザインされたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）（Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、アンチカリン（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、ノッチン（Ｋｏｌｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）及び操作されたＣＨ２ドメイン（ナノ抗体；  Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，  ２００９）である。好ましくは、前記ターゲティング部分は、ナノボディである。
【０００８】
好ましい実施形態において、ターゲティング部分は、組換え融合タンパク質における修飾サイトカインに連結される。ターゲティング部分は、突然変異体サイトカインに直接融合されてもよく、またはそれはリンカー断片の助けを借りて融合されてもよい。好ましくは、前記リンカーは、ＧＧＳリンカーである。さらにより好ましくは、前記リンカーは、少なくとも５つのＧＧＳリピート、より好ましくは少なくとも１０のＧＧＳリピート、より好ましくは少なくとも１５のＧＧＳリピートからなり、より好ましくは前記リンカーは、１７〜２３のＧＧＳリピートからなるリンカーであり、最も好ましくは前記リンカーは、２０のＧＧＳリピートからなる。ターゲティング部分は、変異したサイトカインのアミノ末端にてまたはカルボキシ末端にて融合されてもよく；好ましくは前記ターゲティング部分は、変異したサイトカイン分子のアミノ末端にて融合される。突然変異体サイトカイン及びターゲティング部分から離れて、構築物は、タグ配列、シグナル配列、もう一つのサイトカインまたは抗体などであるが限定されないその他のドメインをさらに含んでもよい。
【０００９】
好ましくは、ターゲティング部分は、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、Ａｘｌ、テネイシンＣ、ανβ３インテグリン、フィブロネクチンＥＤＡ末端ＥＤＢドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピート（Ａ１−Ｄ）、テネイシンＣ及びＣＤ１３、及びそれらの腫瘍細胞特異的スプライスバリアントからなる群から選択された標的に対して向けられる。ターゲティング部分が腫瘍脈管構造をターゲティングするとき、特に想定される標的は、ＣＤ１３、ανβ３インテグリン、フィブロネクチンＥＤＡ末端ＥＤＢドメイン、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮＩＩＩ）リピート（Ａ１−Ｄ）及びテネイシンＣを含むが、限定されない。代わりの詳細な実施形態に従って、前記ターゲティング部分は、ＣＤ２０に対して向けられる。ターゲティング部分は、これらの標的に対する抗体がすぐに利用でき、及び／または容易に生成される得るときに、抗体（または、ナノボディ）であることが特に想定される。
【００１０】
サイトカイン鎖における突然変異は、欠失、挿入または点突然変異などの当業者に公知の任意の突然変異であり得る。少なくとも１つの鎖は、少なくとも１つの突然変異を有する；しかし、いくつかの突然変異は、１つの鎖において組み合わさられてもよい。三本鎖は、同じ突然変異または異なる突然変異を保有してもよい。好ましくは、前記突然変異は、その受容体またはその複数の受容体の１つに対するサイトカインの親和性を低下させる。好ましくは、前記突然変異は、点突然変異である。
【００１１】
一つの好ましい実施形態において、サイトカインはＴＮＦであり、及び構築物は、ＴＮＦＲ１及び／またはＴＮＦＲ２を発現している細胞において発現されるマーカーをターゲティングする。もう一つの好ましい実施形態において、前記マーカーは、組織特異的マーカーであり、さらにより好ましくは、前記マーカーは、新生脈管構造組織または癌組織特異的マーカーである。最も好ましくは、前記マーカーは、ＣＤ２０、Ｈｅｒ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、テネイシンＣ、ανβ３インテグリン及びＣＤ１３からなる群から選択される。
【００１２】
好ましくは、修飾サイトカインは、突然変異体ＴＮＦであって、突然変異は、位置Ｒ３２、Ｎ３４、Ｑ６７、Ｈ７３、Ｌ７５、Ｔ７７、Ｓ８６、Ｙ８７、Ｖ９１、Ｉ９７、Ｔ１０５、Ｐ１０６、Ａ１０９、Ｐ１１３、Ｙ１１５、Ｅ１２７、Ｎ１３７、Ｄ１４３、Ａ１４５上の突然変異からなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記突然変異は、ＴＮＦ  Ｒ３２Ｇ、Ｎ３４Ｇ、Ｑ６７Ｇ、Ｈ７３Ｇ、Ｌ７５Ｇ、Ｌ７５Ａ、Ｌ７５Ｓ、Ｔ７７Ａ、Ｓ８６Ｇ、Ｙ８７Ｑ、Ｙ８７Ｌ、Ｙ８７Ａ、Ｙ８７Ｆ、Ｖ９１Ｇ、Ｖ９１Ａ、Ｉ９７Ａ、Ｉ９７Ｑ、Ｉ９７Ｓ、Ｔ１０５Ｇ、Ｐ１０６Ｇ、Ａ１０９Ｙ、Ｐ１１３Ｇ、Ｙ１１５Ｇ、Ｙ１１５Ａ、Ｅ１２７Ｇ、Ｎ１３７Ｇ、Ｄ１４３Ｎ、Ａ１４５Ｇ及びＡ１４５Ｔからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記突然変異は、Ｙ８７Ｘ、Ｉ９７Ｘ及びＹ１１５Ｘからなる群から選択される。最も好ましくは、前記突然変異は、ＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ、Ｙ８７Ｆ、Ｉ９７Ａ、Ｉ９７Ｓ、Ｙ１１５Ａ及びＹ１１５Ｇからなる群から選択される（ヒトＴＮＦ配列に従ったナンバリング、ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＢＡＧ７０３０６，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＢＡＧ７０３０６．１  Ｇｌ：１９７６９２６８５）。突然変異は、三量体ＴＮＦの１つ、２つまたは３つのコピー全てにおいて存在してもよい。三量体構築物内の異なるコピーは、異なる突然変異を保有してもよく；いくつかの突然変異は、鎖の１つまたは複数と組み合わされてもよい。言及された突然変異は別として、その他の突然変異は、１つまたは複数の鎖に存在してもよい。
【００１３】
ＴＲＡＩＬにおける突然変異に好ましい領域は、Ｔ１２７−Ｒ１３２、Ｅ１４４−Ｒ１４９、Ｅ１５５−Ｈ１６１、Ｙ１８９−Ｙ２０９、Ｔ２１４−Ｉ２２０，Ｋ２２４−Ａ２２６、Ｗ２３１、Ｅ２３６−Ｌ２３９、Ｅ２４９−Ｋ２５１、Ｔ２６１−Ｈ２６４及びＨ２７０−Ｅ２７１（ヒト配列に基づいたナンバリング、ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿００３８０１，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＰ＿００３８０１．１，  Ｇｌ：４５０７５９３）である。
【００１４】
本発明のもう一つの態様は、医薬としての使用のための本発明に従った融合タンパク質である。１つの好ましい実施形態において、本発明に従った融合タンパク質は、癌の治療における使用のためのものである。
【００１５】
これは、それを必要としている被験体における癌を治療する方法であって、本明細書において記述した融合タンパク質を前記被験体に投与することを含む方法が提供されると述べるのと同等である。癌は、これにより治療される。例えば、これは、実施例に示したように（また、図１６を参照されたい）、腫瘍サイズを評価することによって評価され得る。
【００１６】
治療に適している被験体は、典型的には哺乳類、最も典型的にはヒトである。しかし、また、非ヒト動物の治療は、本明細書において想定される。治療され得る非ヒト動物の例は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコ、イヌ及びその他家畜化された動物を含むが、限定されない。非ヒト動物が治療に想定される場合、修飾サイトカインが治療される種由来であることが特に想定される。次いで、突然変異による修飾は、ヒト配列と比較して相同位置における残基の修飾である。非限定的な例として、実施例の節に示したように、マウスＴＮＦにおいて、ヒトＴＮＦにおけるＹ８７の相同体である残基は、位置８６（Ｙ８６）にある。これは、上で詳述したように、変異され得る（たとえば、Ｙ８６ＦまたはＹ８６Ｑ）。
【００１７】
癌の異なる形態は、このストラテジーを使用して治療され得る。本質的に、ターゲティング部分でターゲットされ（直接または間接的に、腫瘍環境を介して）、これにより修飾ＴＮＦファミリーサイトカインを再活性化して、及びしたがって、腫瘍細胞死を誘導し得る任意の腫瘍が治療に適している。
【００１８】
したがって、特に想定される癌は、容易にターゲットされ得るものである。特定の実施形態に従って、ターゲティングは、腫瘍脈管構造に対してである。したがって、高度に血管化された腫瘍は、特に想定される。このような腫瘍の例は、抗ＶＥＧＦ薬物または抗アンギオポエチン／Ｔｉｅ２薬剤などの抗血管新生アプローチで治療され得るものである。これらは、乳がん、腎細胞癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肝細胞癌、膵癌、グリア芽細胞腫、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、メラノーマ、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経内分泌腫瘍、軟部組織肉腫、髄様甲状腺癌及び子宮体癌を含むが、限定されない（たとえば、Ｗｅｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３、特にその中の表１及び補足的表１を参照されたい）。
【００１９】
特定の実施形態に従って、癌は、固形腫瘍である。しかし、また、白血病などの血液癌（たとえば、ＣＭＬ、ＡＭＬ）、複数の骨髄腫及びリンパ腫が抗血管新生薬剤で治療され得ることに留意されたい（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，  ２０１１；  Ｒｏｃｃａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。したがって、代わりの実施形態に従って、癌は、造血及び／またはリンパ系組織の腫瘍である（また、実施例１２を参照されたい）。
【００２０】
血管新生は、腫瘍転移において、及び転移性病変を活性化させる際に主要な役割を果たすので、特定の実施形態に従って、癌は、転移性癌である。新生内皮細胞の増加した存在は、これらの細胞のマーカー（上記の腫瘍脈管構造マーカー）を標的にした分子に対してより感受性の高いこれらの癌を生じるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ｓｃ  ｈＴＮＦナノボディ融合タンパク質の異なるセットアップの構造要素の図。
【図２】ＨｅｋＴ細胞（パネルＡ）またはＨｅｋ−ｍＬＲ細胞（パネルＢ）において、ＷＴ  ｈＴＮＦと比較した、示したｓｃ  ｈＴＮＦ調製によって誘導されたホタルルシフェラーゼ活性。両方とも、ＮＦ−κＢルシフェラーゼリポーターを一過性にトランスフェクトした。
【図３】ＨｅｋＴ細胞（パネルＡ）またはＨｅｋ−ｍＬＲ細胞（パネルＢ）における６つのＧＧＳリピートをもつリンカーを保有している示したｓｃ  ｈＴＮＦ調製によって誘導されたホタルルシフェラーゼ活性。両方とも、ＮＦ−κΒルシフェラーゼリポーターを一過性にトランスフェクトした。
【図４】ＨｅｋＴ細胞（パネルＡ）またはＨｅｋ−ｍＬＲ細胞（パネルＢ）における１３のＧＧＳリピートをもつリンカーを保有している示したｓｃ  ｈＴＮＦ調製によって誘導されたホタルルシフェラーゼ活性。両方とも、ＮＦ−κΒルシフェラーゼリポーターを一過性にトランスフェクトした。
【図５】ＨｅｋＴ細胞（パネルＡ）またはＨｅｋ−ｍＬＲ細胞（パネルＢ）における１９のＧＧＳリピートをもつリンカーを保有している示したｓｃ  ｈＴＮＦ調製によって誘導されたホタルルシフェラーゼ活性。両方とも、ＮＦ−κΒルシフェラーゼリポーターを一過性にトランスフェクトした。
【図６】未処理の細胞及びＨｅｒ２ナノボディで刺激された細胞におけるレベルと比較した、５００ｎｇ／ｍｌの示したｓｃ  ｈＴＮＦ調製でＳＫ−ＢＲ−３細胞の処理に応じたＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルの誘導倍率。データは、２件の独立した実験（ｎ＝４）の平均±ＳＤを表す。
【図７】ＭＣＦ７細胞（乳癌株化細胞）における毒性によって測定したときのＷＴ  ｈＴＮＦと比較したｈＴＮＦ突然変異体の％活性。
【図８】ＭＣＦ７（パネルＡ）またはｍＬＲ  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＣ末端）に接続したターゲットされる修飾ＴＮＦのＭＣＦ７−ｍＬＲ（パネルＢ）細胞に対する毒性。
【図９】ＭＣＦ７（パネルＡ）またはｈＣＤ２０  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＣ末端）に接続したターゲットされる修飾ＴＮＦのＭＣＦ７−ｈＣＤ２０（パネルＢ）細胞に対する毒性。
【図１０】ＭＣＦ７（パネルＡ）またはｈＣＤ２０または対照Ｂｃｌｌ１０  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＮ−末端）に接続したターゲットされる修飾ＴＮＦのＭＣＦ７−ｈＣＤ２０（パネルＢ）細胞に対する毒性。
【図１１】ＭＣＦ７（パネルＡ）または合わせた突然変異（ＮＢ  ＴＮＦのＮ末端）をもつｓｃ  ｈＴＮＦを含むターゲットされる修飾ＴＮＦのＭＣＦ７−ｈＣＤ２０（パネルＢ）細胞に対する毒性。
【図１２】ＭＣＦ７（パネルＡ）またはｍＬＲ  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＣ末端）に接続した個々の三量化鎖をもつターゲットされる修飾ＴＮＦのＭＣＦ７−ｍＬＲ（パネルＢ）細胞に対する毒性。
【図１３】ＭＣＦ７（パネルＡ）またはｈＣＤ２０  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＮ末端）に接続した個々の三量化鎖をもつターゲットされる修飾ＴＮＦのＭＣＦ７−ｈＣＤ２０（パネルＢ）細胞に対する毒性。
【図１４】ＷＴ  ｈＴＮＦ対ターゲットされるＷＴ及びｈＣＤ２０または対照Ｂｃｌｌ１０  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＮ末端）に接続した修飾ｓｃ  ｈＴＮＦｓのインビボでの毒性の比較。（Ａ）低体温（Ｂ）死亡率。
【図１５】ＷＴまたは対照Ｂｃｌｌ１０  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＮ末端）に接続した修飾（Ｙ８６Ｆ３ｘ）ｓｃマウス（ｍ）ＴＮＦのインビボでの毒性。（Ａ）低体温（Ｂ）死亡率。
【図１６】ＷＴまたはｍＣＤ２０または対照Ｂｃｌｌ１０  ＮＢ（ＮＢ  ＴＮＦのＮ末端）に接続した修飾（Ｙ８６Ｆ３ｘ）ｓｃマウス（ｍ）ＴＮＦのインビボでの抗腫瘍効果。（Ａ）腫瘍成長（Ｂ）死亡率。
【実施例】
【００２２】
実施例に対する材料及び方法
ナノボディ
マウスのレプチン受容体（ｍＬＲ）に対して向けられたナノボディ４−１０は、Ｚａｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）に記載されている。そのコード配列をＳｌｇＫリーダーペプチド、ＨＡタグ及びアルブミンとの融合の際に哺乳動物の発現ベクターｐＭＥＴ７（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）にクローン化した。プラスミド名：ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−４．１１−Ａｌｂｕｍｉｎ。抗Ｈｅｒ２ナノボディ１Ｒ５９Ｂは、Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）において記載されている。ヒトＣＤ２０（ｈＣＤ２０）に対して向けられたＮＢ  ２ＨＣＤ２５及びマウスＣＤ２０（ｍＣＤ２０）に対する２ＭＣ５７  ＮＢは、標準的な技術を使用して作製した（Ｇｈａｒｏｕｈｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｐａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。対照ＮＢ  Ｂｃｌｌ１０は、Ｄｅ  Ｇｒｏｅｖｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）において記載されている。
【００２３】
ｓｃＴＮＦ
ＧＧＧＧＳリンカー（配列番号：１）を介して接続された３つのｈＴＮＦ単量体からなるｓｃＴＮＦは、Ｂｏｓｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）によって記載されている。ｈＴＮＦにおけるＹ８７Ｑ突然変異は、両方の受容体、ＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２との結合を完全に抑止することを示した。Ｉ９７を変異することにより、両方の受容体とのｈＴＮＦの減少した結合を生じる（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。ｈＴＮＦ内の残基の全範囲を変異し（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃａｔ＃  ２００５１８）、及びＭＣＦ７細胞におけるこれらの毒性について試験した（図７）。我々は、ターゲットされる構築物について以下の突然変異を選択した：Ｙ８７Ｑ、Ｙ８７Ｆ、Ｉ９７Ｓ、Ｉ９７Ａ、Ｙ１１５Ａ、Ｙ１１５Ｇ。ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ３ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦＩ９７Ａ３ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ１ｘ  Ｉ９７Ａ２ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ２ｘ  Ｉ９７Ａ１ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ１ｘ  Ｙ８７Ｑ２ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ２ｘ  Ｙ８７Ｑ１ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ｓ３ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ１１５Ａ３ｘ−６ｘＧＧＳ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｆ３ｘ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ１１５Ｇ３ｘ、ｓｃ  ｍＴＮＦ  ＷＴ及びｓｃ  ｍＴＮＦ  Ｙ８６Ｆ３ｘのコード配列を遺伝子合成によって作製した（ＧｅｎｅＡｒｔ）。個々の鎖は、ＧＧＧＧＳ（配列番号：１）リンカーによって分離される。
【００２４】
ｓｃＴＮＦナノボディ融合構築
１Ｒ５９Ｂ  Ｈｅｒ２ナノボディのコード配列を以下のプライマーをもつプラスミドｐＨＥＮ６−１Ｒ５９ＢからＰＣＲによって合成した：フォワード５’−ＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号：２）、リバース５’−  ＣＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＧＡＡＣＣＧＣＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣ−３’（配列番号：３）。このＰＣＲは、１Ｒ５９Ｂナノボディのアミノ末端においてＢｇｌｌｌとＮｏｔｌ部位とカルボキシ末端におけるＦＬＡＧタグとの間にＧＧＳを導入する。ＰＣＲ産物をＢｇｌｌｌ及びＸｂａｌで消化した。ｐＭＫ−ＲＱ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ、ｐＭＫ−ＲＱ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ３ｘ及びｐＭＫ−ＲＱ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａ３ｘをＮｄｅｌ及びＢｇｌｌｌで消化した。消化したＰＣＲ産物及び合成遺伝子断片をＮｄｅｌ−Ｘｂａｌ消化したｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−レプチンベクターにクローン化して、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ−６ｘＧＧＳ−１Ｒ５９Ｂ−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ３ｘ−６ｘＧＧＳ−１Ｒ５９Ｂ−ＦＬＡＧ及びｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａ３ｘ−６ｘＧＧＳ−１Ｒ５９Ｂ−ＦＬＡＧを得た。１Ｒ５９Ｂナノボディのない対照ベクターをＰＣＲ産物の代わりにＢｇｌｌｌとＸｂａｌとの間にＧＧＳ及びＦＬＡＧタグを含む以下のアニーリングされたオリゴを挿入することによって得た：フォワード：５’ＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧＴＡＡＴ３’（配列番号：４）、リバース：５’ＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡＣＣＧＣＣＡ３’（配列番号：５）。１Ｒ５９Ｂナノボディのみをもつ対照ベクターをＮｄｅｌ−ｓｃ  ｈＴＮＦ−Ｂｇｌｌｌ断片の代わりに以下のアニーリングされたオリゴを挿入することによって得た：フォワード：５’−ＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡ−３’（配列番号：６）、リバース５’−ＧＡＴＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＴＡＧＴＣＧＧＧＣＡＣＡＴＣＡ−３’（配列番号：７）。ＧＧＳリンカーの長さは、ＢｇｌｌｌとＮｏｔｌ部位との間における本来の６ｘＧＧＳに７ｘＧＧＳまたは１３ｘＧＧＳリピート（遺伝子合成によって作製した、ＧｅｎｅＡｒｔ）を付加することによって、１３のリピート及び１９のリピートのＧＧＳリンカーに適合させた。
【００２５】
類似のアプローチを使用して、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ６−ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−４．１０−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ３ｘ−６ｘＧＧＳ−４．１０−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａ３ｘ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−４．１０−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ１ｘ  Ｉ９７Ａ２ｘ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−４．１０−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ２ｘ  Ｉ９７Ａ１ｘ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−４．１０−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−２ＨＣＤ２５−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  ｌ９７Ｓ３ｘ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−２ＨＣＤ２５−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａ３ｘ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−２ＨＣＤ２５−ＦＬＡＧ及びｐＭＥＴ７  ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ１１５Ａ３ｘ−６ｘ／１３ｘ／１９ｘＧＧＳ−２ＨＣＤ２５−ＦＬＡＧを得た。
【００２６】
個々の三量化ｈＴＮＦ構築物を得るために、ｐＭｅｔ７−ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ−ＧＧＳ−４．１０−Ｆｌａｇにおけるｓｃ  ｈＴＮＦをプラスミドｐＭｅｔ７−ＳｌｇＫ−Ｈｉｓ−ｈＴＮＦ  ＷＴまたはｐＭｅｔ７−ＳｌｇＫ−Ｈｉｓ−ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａにおけるフォワードプライマー５’−ＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＧＣＣＣＧＡＣＴＡＣＧＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号：８）及びリバースプライマー５’−ＧＴＣＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＧＴ−３’（配列番号：９）で得られたＰＣＲ産物のＮｄｅｌ−Ｓａｌｌ消化によって置換した。これは、以下のベクターを生じた：ｐＭｅｔ７−ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｈＴＮＦ  ＷＴ−６ｘＧＧＳ−４．１０−Ｆｌａｇ及びｐＭｅｔ７−ＳｌｇＫ−ＨＡ−ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａ−６ｘＧＧＳ−４．１０−Ｆｌａｇ。
【００２７】
ナノボディＴＮＦ融合発現は、個々の三量化または単鎖のＮＢ  Ｎ末端で構築し、ヒトまたはマウスＴＮＦをそれぞれのサブユニットを独特の制限部位を介して交換可能であるように、ｐＭｅｔ７において作製し、及びデザインした：  Ａｇｅｌ−ナノボディ−Ｓａｌｌ−ＧＧＳリンカー−Ｎｏｔｌ−ＴＮＦ−Ｘｈｏｌ−Ｈｉｓ−Ｘｂａｌ。
【００２８】
ｐＧＬ３−（ＩＬ６−ｋＢ）３−ホタルルシフェラーゼは、Ｗ．  Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）によって快く提供された。
【００２９】
インビトロ研究のためのナノボディＴＮＦ融合タンパク質の産生
ＨｅｋＴ細胞を標準的なリン酸カルシウム沈殿法を使用してタンパク質融合構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション培養培地を収集した４８時間後、及び−２０℃にて貯蔵した。濃度を市販のｈＴＮＦ  ＥＬＩＳＡ（ＤＹ２１０、Ｒ１Ｄシステム）で決定した。
【００３０】
インビボ研究のためのナノボディｓｃＴＮＦ融合タンパク質の産生
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞を製造業者の指針に従ったＰＥＩｐｒｏ（商標）トランスフェクション試薬（ＰｏｌｙＰｌｕｓ、Ｃａｔ＃  １１５−３７５）を使用してタンパク質融合構築物でトランスフェクトした。エンドトキシン含量は、色素生産性Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ａｓｓａｙ（Ｌｏｎｚａ、Ｃａｔ＃  ５０−６４７Ｕ）によって評価したときに、全ての標品において検出限界の下であった。
【００３１】
株化細胞
Ｈｅｋ、ＨｅｋＴ、Ｈｅｋ−ｍＬＲ、ＭＣＦ７、ＭＣＦ７−ｈＣＤ２０、ＭＣＦ７−ｍＬＲ及びＢ１６ＢＩ６−ｍＣＤ２０細胞を１０％のＦＣＳを追加したＤＭＥＭにおいて生育させた。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ株化細胞をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｔ＃  Ｒ７９０−０７）から得て、及びＧｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｔ＃  １２３３８）からのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍにおいて維持した。ヒト乳がんＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３０）株化細胞をＡＴＣＣから得て、及び１０％  ＦＣＳを追加したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地において維持した。
【００３２】
Ｈｅｋ−ｍＬＲ株化細胞を以下のように作製した：Ｆｌｐ−ｌｎ−２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）には、ｍＥｃｏＲ及びネオマイシン耐性のための発現カセットを含んでいるプラスミドを、及びｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉリポーター構築物を安定して同時トランスフェクトした（Ｅｙｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。安定なトランスフェクトされたクローンをＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）含有培地において単離し、及びクローンを高ＬＩＦ（１ｎｇ／ｍｌ）誘導されたルシフェラーゼ活性で選択した。ｍＬＲを含んでいる発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴをＦｌｐ−ｌｎリコンビナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、及び選択後１０日間ハイグロマイシン（１００μｇ／ｍｌ）においてこの株化細胞に安定して組み込んだ。
【００３３】
ヒト乳癌ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−２２）株化細胞は、ＡＴＣＣから得た。ＭＣＦ７−ｈＣＤ２０及びＭＣＦ７−ｍＬＲ株化細胞を以下のように作製した：ＭＣＦ７細胞には、ｈＣＤ２０またはｍＬＲのための発現カセットを含むプラスミドを、及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを安定して同時トランスフェクトした。安定なトランスフェクト細胞をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）含有培地で選択し、続いてｈＣＤ２０またはｍＬＲ発現細胞のＦＡＣＳソーティングをした。
【００３４】
Ｂ１６ＢＩ６−ｍＣＤ２０株化細胞を以下のように作製した：Ｂ１６ＢＩ６細胞には、ｍＣＤ２０のための発現カセットを含むプラスミドを、及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドを安定して同時トランスフェクトした。安定なトランスフェクト細胞をＧ４１８（２ｍｇ／ｍｌ）含有培地で選択した。
【００３５】
ヒト乳癌ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３０）株化細胞は、ＡＴＣＣから得て、及び１０％  ＦＣＳを追加したＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地において維持した。
【００３６】
ルシフェラーゼ活性の測定
ＴＮＦ特異的活性をＮＦ−κＢプロモーターの制御下のルシフェラーゼ活性を定量化することによって測定した。標準的なリン酸カルシウム沈殿法によるＮＦ−κΒルシフェラーゼリポーター（ｐＧＬ３−（ＩＬ６−κＢ）３−ホタルルシフェラーゼ）のトランスフェクションの２日後に、細胞をターゲットされる、または対照ｓｃ  ｈＴＮＦで６時間刺激した。可溶化液を調製し（溶解緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．８、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール、１０％  グリセロール、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、及び３５μｌのルシフェラーゼ基質緩衝液（２０ｍＭトリシン、１．０７ｍＭ（ＭｇＣ０３）４Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏ、２．６７ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭジチオスレイトール、２７０μΜ補酵素Ａ、４７０μΜルシフェリン、５３０μΜ  ＡＴＰ、最終ｐＨ７．８）を５０μｌの可溶化液あたりに加えた。発光をＴｏｐＣｏｕｎｔ化学発光カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）において５秒間測定した。
【００３７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＴＮＦ誘導性遺伝子ＩＬ−６の発現を５００ｎｇ／ｍｌのターゲットされる、または対照ｓｃ  ｈＴＮＦで６時間処理されたＳＫ−ＢＲ−３細胞におけるＨＰＲＴと相対的に、ＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、及び製造業者の指針に従って、同量のＲＮＡ（０．５μｇ）をＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，  Ｓｈｉｇａ，  Ｊａｐａｎ）を使用して逆転写のために使用した。１０倍に希釈したｃＤＮＡを１ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉマスターミックス（０４  ８８７  ３５２  ００１、Ｒｏｃｈｅ）及び１ｎＭ遺伝子特異的プライマーを含むＲＴ−ＱＰＣＲ混合物に加えた。アッセイをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）において三通りで行い、及び結果を、ＡＡＣＴ法を使用して解析した。以下のプライマーを使用した：
ＨＰＲＴフォワード：５’ＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡ３’（配列番号：１０）；
ＨＰＲＴリバース：５’ＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴ３’（配列番号：１１）；
ＩＬ−６フォワード：５’ＧＡＣＡＧＣＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡ３’（配列番号：１２）；
ＩＬ−６リバース：５’ＡＧＴＧＣＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣ３’（配列番号：１３）。
【００３８】
ＭＣＦ７細胞における毒性解析
また、ＴＮＦ特異的活性を、ＭＣＦ７細胞における細胞毒性を評価することによって測定した。１０００個の細胞を黒い９６ウェルプレートに蒔き、及び２４時間後に異なるＴＮＦ構築物で刺激した。４８〜７２時間後に、生存細胞の数を製造業者の指針に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ＃  Ｇ７５７０）を使用して決定した。
【００３９】
インビボにおける毒性解析
インビボにおけるｈＴＮＦ毒性を評価するために、雌の８週間目のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，  Ｆｒａｎｃｅから購入した）には、１０ｍｇ  Ｄ−ガラクトサミン（ＬＰＳを含まないＰＢＳで希釈し、５００μｌの容積で注射した）と組み合わせた５００ｎｇ  ｒｈＴＮＦまたはｓｃ  ｈＴＮＦナノボディ融合タンパク質を腹膜内に注射した。罹患率を末梢（直腸）体温の測定によってモニターした。融合タンパク質あたりｎ＝２−４。
【００４０】
インビボにおけるｍＴＮＦ毒性を評価するために、マウスには、１０、３５、１００または２００μｇ  ｓｃ  ｍＴＮＦナノボディ融合タンパク質（容積２００μｌを注射され、ＬＰＳを含まないＰＢＳで希釈）を静脈内に注射した。罹患率を末梢（直腸）体温の測定によってモニターした。２００μｇ（ｎ＝１）を除いて、融合タンパク質あたりの用量あたりｎ＝２。
【００４１】
インビボにおける抗腫瘍研究
８週間目の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを剃り、及び背中に６ｘ１０５  Ｂ１６ＢＩ６−ｍＣＤ２０腫瘍細胞を皮下に接種した（０日目）。処理は、最も大きな垂直直径の産物がおよそ５０  ｍｍ２であったときに始めた（１０日目において）。ＰＢＳまたは３５μｇナノボディｓｃ  ｍＴＮＦ融合タンパク質を病変周辺注射（腫瘍部位の近くの皮下注射だが腫瘍瘤の外側）によって連続８日間投与した（１０〜１７日目、灰色のバーとして図１６Ａに示した）。腫瘍をノギスで毎日測定し、及び平均±ＳＥＭとして示す。罹患率を体重量及び温度の毎日の測定によってモニターした。処理あたりｎ＝５。
【００４２】
実施例１：ｓｃ  ｈＴＮＦナノボディ融合タンパク質
図１は、ｓｃ  ｈＴＮＦのナノボディＮまたはＣ末端のいずれかをもつｓｃ  ｈＴＮＦ−ナノボディ融合タンパク質の略図を示す。
【００４３】
実施例２：ｍＬＲ発現Ｈｅｋ細胞におけるターゲティングＴＮＦ活性
ＴＮＦ刺激に応じてのＮＦ−κΒルシフェラーゼリポーター活性の誘導をＨｅｋＴ細胞において、及びマウスのレプチン受容体（Ｈｅｋ−ｍＬＲ）を発現するＨｅｋ細胞において試験した。図２Ａに示したように、ＷＴ  ｓｃ  ｈＴＮＦ誘導されたＮＦ−κΒ誘導を完全に（＞１０００倍）、または部分的（１００倍）に、それぞれＹ８７Ｑ３ｘまたはＩ９７Ａ３ｘ突然変異によって抑止した。その上、ｍＬＲを発現しないＨｅｋＴ細胞において、全てのｓｃ  ｈＴＮＦ構築物（ＷＴ、Ｙ８７Ｑ３ｘ及びＩ９７Ａ３ｘ）は、ｍＬＲナノボディへの融合に非依存的に類似のＮＦ−κＢ活性を誘導する（図２Ａ）。対照的に、ｍＬＲナノボディに連結することは、ＷＴ  ｓｃ  ｈＴＮＦと類似の程度までｍＬＲを発現するＨｅｋ細胞におけるｓｃ  ｈＴＮＦＩ９７Ａ３ｘのＮＦ−κΒ誘導を回復することができる（図２Ｂ）。我々は、ｍＬＲを発現している細胞が、ナノボディ連結ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｉ９７Ａ３ｘに対する親のＨｅｋＴ細胞より１００倍感度が高いと見積もった。対照的に、３倍のＹ８７Ｑ突然変異は、ＨｅｋＴ細胞と比較してＨｅｋ−ｍＬＲ細胞におけるＴＮＦ反応性の任意のレスキュー効果を示さなかった（図２Ｂ）。
【００４４】
実施例３：異なる突然変異体の組み合わせ及び異なるリンカー長の比較
構築物を最適化するために、個々の鎖において異なる突然変異、並びにｓｃ  ｈＴＮＦとターゲティング部分との間の異なるリンカー長をもつｓｃ  ｈＴＮＦ構築物を試験した。結果を図３、４及び５に要約する。ｓｃ  ｈＴＮＦＩ９７Ａ３ｘ及びｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ１ｘ  ｌ９７Ａ２ｘは、レプチン受容体を発現しないＨｅｋ細胞における活性を示さないが、レプチン受容体を標的としたときに明らかな用量依存的活性を有する。
【００４５】
実施例４：Ｈｅｒ２発現Ｈｅｋ細胞におけるターゲティングＴＮＦ活性  
我々は、α−Ｈｅｒ２ナノボディ１Ｒ５９Ｂ及びｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ３ｘまたはｓｃ  ｈＴＮＦＩ９７Ａ３ｘを使用して融合タンパク質を作製した。ナノボディとｓｃ  ｈＴＮＦとの間のリンカーは、６ｘＧＧＳまたは１９ｘＧＧＳのいずれかであった。これらの分子を定量的ＲＴ−ＰＣＲによってＨＰＲＴと相対的に決定されるＩＬ−６  ＴＮＦ誘導性遺伝子の誘導のために、Ｈｅｒ２を過剰発現させているＳＫ−ＢＲ−３乳癌株化細胞において試験した。
【００４６】
図６は、未処理の細胞及びＨｅｒ２ナノボディで刺激される細胞におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルと比較して、ｓｃ  ｈＴＮＦ処理（５００ｎｇ／ｍｌ）に応じたＩＬ−６  ｍＲＮＡの誘導倍率を示す。ＮＦ−κΒの転写活性化に対応して、我々は、Ｙ８７Ｑ３ｘ突然変異がＴＮＦ誘導されたＩＬ−６産生を完全に妨げ、一方でｓｃ  ｈＴＮＦＩ９７Ａ３ｘがなおも、しかしＷＴ  ｓｃ  ｈＴＮＦより少ない程度にＩＬ−６産生を誘導することができることを観察する。ｓｃ  ｈＴＮＦがナノボディに融合されるとき、ＩＬ−６  ｍＲＮＡは、あまり産生されない。これは、より長い１９ｘＧＧＳリンカーと比較して効果が６ｘＧＧＳリンカーでより顕著であり、この場合より柔軟性が高い可能性があるので、立体障害のためであり得る。Ｈｅｒ２ナノボディにｓｃ  ｈＴＮＦＩ９７Ａ３ｘを連結することにより、ＩＬ−６の誘導は、対応するリンカーを介してナノボディに接続されたＷＴ  ｓｃ  ｈＴＮＦと類似のレベルに回復され得る。対照的に、Ｈｅｒ２発現している細胞に対するより重篤なＹ８７Ｑ３ｘ  ｓｃ  ｈＴＮＦ突然変異体の特異的ターゲティングは、ｓｃ  ｈＴＮＦのＩＬ−６誘導特性を回復することができない。
【００４７】
実施例５：ＭＣＦ７細胞におけるｈＴＮＦ突然変異体の毒性の比較
Ｉ９７Ａ３ｘ突然変異体ｓｃ  ｈＴＮＦの相対的に高い残効性のため、我々は、ＭＣＦ７細胞におけるルシフェラーゼ活性として異なる個々の三量化ｈＴＮＦ突然変異体の毒性を測定することによって、さらなる突然変異を捜した。ＷＴ個々の三量化ＴＮＦに対する突然変異体の活性を図７に示す。大部分の突然変異は、強烈にＴＮＦ活性に影響を及ぼさず（＞ＷＴの１％）、及びこれらのおそらく残りの実質的毒性のため、ターゲットされる構築物の開発により有望でないかもしれない。我々は、ＴＮＦ機能を（ほとんど）完全に抑止する突然変異により興味を持っている。無変異（＜ＷＴの０，１％）の使用は、副作用を有しないが、ターゲティングによる再活性化がより容易に達成されないという欠点を可能性として有するターゲットされる構築物を生じる。いくつかの残効性を有する突然変異（ＷＴの０，０２〜５％、特にＷＴの  ０，１％〜１％）は、より優れた再活性化される可能性を有し、一方で毒性がない。個々の三量化ＷＴ  ＴＮＦの０，０２〜５％の間に活性範囲をカバーしている６つの異なる突然変異をターゲットされる修飾サイトカインの開発のために選択した：Ｙ８７Ｑ（０，０２％）、Ｉ９７Ｓ及びＹ１１５Ａ（０，２％）、Ｙ８７Ｆ（０，５−１％）、Ｙ１１５Ｇ（１〜２％）及びＩ９７Ａ（２〜５％）。
【００４８】
実施例６：ｍＬＲ発現ＭＣＦ７細胞におけるターゲティングＴＮＦ活性
ｍＬＲ  ＮＢターゲットされるＴＮＦの毒性をＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｍＬＲ細胞において評価した。異なる突然変異（Ｉ９７Ａ３ｘ、Ｉ９７Ｓ３ｘ及びＹ１１５Ａ３ｘ）をｓｃ  ｈＴＮＦとｍＬＲ  ＮＢとの間の異なるリンカーと同様に試験した（６ｘＧＧＳ、１３ｘＧＧＳ、１９ｘＧＧＳ）。図８Ａに示したように、毒性はＩ９７Ａ３ｘ突然変異Ｉ９７Ｓ３ｘによって２０倍に、及びＹ１１５Ａ３ｘ突然変異によって５００倍に減少され、それは、我々が個々の三量化ＴＮＦについて観察したものと類似する（図７）。その上、ｍＬＲを発現しないＭＣＦ７細胞において、ｍＬＲ  ＮＢへの融合は、ＷＴまたは突然変異体ｓｃ  ｈＴＮＦの活性を変化させず（図８Ａ）、その一方で、この融合は、ＭＣＦ７−ｍＬＲ細胞における全てのｓｃ  ｈＴＮＦ突然変異体を再活性化する（図８Ｂ）。我々は、ｍＬＲを発現している細胞が、ＮＢ連結Ｉ９７Ｓ３ｘ及びＹ１１５Ａ３ｘ  ｓｃ  ｈＴＮＦに対する親ＭＣＦ７細胞より１００倍感度が高いと見積もった。しかし、これらのターゲットされる修飾ＴＮＦは、ＷＴ  ｓｃ  ｈＴＮＦよりなおも約２０倍活性がない。対照的に、Ｉ９７Ａ３ｘターゲットされる修飾ＴＮＦは、ＭＣＦ７−ｍＬＲ細胞におけるＷＴ活性レベルに回復され、それは２０倍の再活性化に対応する（図８Ｂ）。
【００４９】
実施例７：ｈＣＤ２０発現ＭＣＦ７細胞におけるターゲティングＴＮＦ活性
修飾ＴＮＦのターゲティングについてのその他のターゲティング部分の効果を評価するために、我々は、実施例６の構築物におけるｍＬＲ  ＮＢをｈＣＤ２０  ＮＢと置換し、及びＭＣＦ７細胞及びｈＣＤ２０（ＭＣＦ７−ｈＣＤ２０）を発現するＭＣＦ７細胞においてこれらの毒性を試験した。結果を図９に示す。予想通りに、ｍＬＲ  ＮＢ及びｈＣＤ２０  ＮＢターゲットされる修飾ＴＮＦは、親ＭＣＦ７細胞に対して同様に挙動する（図８Ａ及び９Ａ）。
【００５０】
実施例８：異なるｈＣＤ２０  ＮＢ融合セットアップをもつｈＣＤ２０発現細胞におけるターゲティングＴＮＦ活性。
我々は、ｓｃ  ｈＴＮＦ後の代わりに前にＮＢを配置することによってｈＣＤ２０  ＮＢ−ＴＮＦ構築物を改善しようとした。また、我々は、２つのさらなる、より急激でない突然変異（Ｙ８７Ｆ３ｘ及びＹ１１５Ｇ３ｘ、図７）を試験した。ＭＣＦ７及びこれらの構築物をもつＭＣＦ７−ｈＣＤ２０毒性研究を図１０に示す。ｈＣＤ２０  ＮＢに接続されたｓｃ  ｈＴＮＦは、ＭＣＦ７細胞において対照Ｂｃｌｌ１０  ＮＢに接続した対応する突然変異体と同じ毒性を及ぼし（図１０Ａ）、及び活性のレベルは、我々が個々の三量化ＴＮＦ突然変異体について観察したものと類似する（図７）。突然変異体のこの減少した毒性は、ＭＣＦ７−ｈＣＤ２０細胞におけるｈＣＤ２０ターゲティングに（部分的に）戻る：ｈＣＤ２０  ＮＢ接続された修飾ＴＮＦは、対応するＢｃｌｌ１０対照ＮＢ接続されたｓｃ  ｈＴＮＦｓと比較して、１０倍（Ｙ１１５Ｇ３ｘ）、１５倍（Ｙ８７Ｆ３ｘ）、１００倍（ｌ９７Ｓ３ｘ、Ｙ１１５Ａ３ｘ）またはさらにより高い（Ｙ８７Ｑ３ｘ）増加した活性を与える（図１０Ｂ）。この実験において、ｈＣＤ２０  ＮＢがｓｃ  ｈＴＮＦのアミノ末端の代わりにカルボキシ末端に配置するときに、再活性化はより少ない（図９Ｂ）。
【００５１】
実施例９：異なる突然変異体の組み合わせの比較
ターゲットされる修飾ＴＮＦ対ターゲットされない修飾ＴＮＦの相違は、少なくとも１００倍であるという事実にもかかわらず、いくつかの突然変異は、その抗腫瘍効果に影響を及ぼすかもしれないＷＴ活性レベル（Ｙ８７Ｑ３ｘ）より低いレスキュー活性を示す。あるいは、いくつかの突然変異は、インビボにおいて使用されるときに、いくらかの（全身）毒性を導くかもしれないいくつかの残効性（ｌ９７Ｓ３ｘ及びＹ１１５Ａ３ｘ）をなおも有する。これらの潜在的欠点を解決するために、我々は、したがって、活性レベルがさらに調節され得るかどうか確かめるために、ｓｃ  ｈＴＮＦの個々の鎖における異なる残基を変異することによってさらなる構築物を試験した。図１１に示したように、単鎖において異なる突然変異を組み合わせることは、ターゲットされない細胞における残効性及びターゲティングによる再活性化のレベルを変化させることができる。
【００５２】
実施例１０：ターゲットされる個々の三量化ＴＮＦ対単鎖修飾ｈＴＮＦの比較。
ターゲットされる個々の三量化対単鎖ＴＮＦ効率を比較するために、ＷＴまたはＩ９７Ａ  ｈＴＮＦを単量体としてｍＬＲ  ＮＢにＣ末端にて接続した。これらの毒性を、ＭＣＦ７細胞及びｍＬＲ（ＭＣＦ７−ｍＬＲ）を発現するＭＣＦ７細胞において試験し、及び図１２に示す。また、個々の三量化形態において、Ｉ９７Ａ突然変異は、ＭＣＦ７細胞において毒性であるが、ＷＴ  ｈＴＮＦより少ない範囲である（図８Ａ及び図１２Ａ）。その上、ｍＬＲナノボディにＣ末端に接続されるときに、個々の三量化する−しかし単鎖でない−ＴＮＦは、ＭＣＦ７細胞においてより毒性にならず、及びこれは、ＷＴ及びＩ９７Ａの両方についての場合である（図８Ａ及び図１２Ａ）。ほとんど確実に、個々の三量化ＴＮＦ−ｍＬＲ  ＮＢ構築物で形成されたｈＴＮＦ三量体に存在する３つのナノボディは、その受容体へのｈＴＮＦの結合を立体的に妨げている。しかし、この減少した活性は、ＭＣＦ７−ｍＬＲ細胞におけるｍＬＲへのターゲティングによって戻り得る（図１２Ｂ）。興味深いことに、これは、活性の調整のさらなるレベルを提供する：１つは、異なる突然変異を組み合わせることができ、並びに立体的妨害を使用して、残効性及びターゲティングに応じた再活性化のレベルに影響を及ぼすことができる。
【００５３】
これが一般的な現象であるかどうかに取り組むため、我々は、Ｂｃｌｌ１０またはｈＣＤ２０ナノボディに個々の三量化ＷＴ及びＹ１１５Ａ  ｈＴＮＦ  Ｎ末端に接続し、及びＭＣＦ７及びＭＣＦ７−ｈＣＤ２０細胞におけるこれらの毒性を試験した。図１３Ａに示したように、この接続は、個々の三量化ＷＴまたはＹ１１５Ａ３ｘ  ｈＴＮＦの毒性に影響を及ぼさない。その上、ターゲティングに応じて、個々の三量化Ｙ１１５Ａ３ｘ  ｈＴＮＦは、標的にされない個々の三量化ＷＴ  ｈＴＮＦと同程度活性になる（図１３Ｂ）。
【００５４】
実施例１１：ターゲットされる修飾ｈＴＮＦのインビボ毒性の評価
ＴＮＦは、マウスにおいて著しい種特異性を示すため、前臨床でｈＴＮＦ突然変異体の毒性を評価することは明らかでない。ｍＴＮＦと対照的に、ｈＴＮＦは、極めて高い用量で致死性を誘導するのみである（Ｂｒｏｕｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）。この種特異性の理由が、マウスのＴＮＦ−Ｒ２と相互作用していないｈＴＮＦによって生じると長く考えられたが、薬物動態研究は、ｈＴＮＦがマウスにおけるｍＴＮＦより非常に迅速に除去され、及び結果として生じる限られたｈＴＮＦ曝露が罹患率のその欠如の原因であることを示した（Ａｍｅｌｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）。
【００５５】
にもかかわらず、Ｄ−ガラクトサミンなどの感作物質で処理されたときに、種特異性は消失し、及びｈＴＮＦの極めて低い用量（＜５００ｎｇ）はｍＴＮＦと同程度に致命的である（Ｂｒｏｅｃｋａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）。種々のターゲットされる修飾ｈＴＮＦのインビボでの毒性を評価するために、したがって、我々は、組換え（ｒ）ｈＴＮＦ、ｓｃ  ｈＴＮＦ  ＷＴまたはｓｃ突然変異体ｈＴＮＦ（Ｙ８７Ｑ３ｘまたはＹ１１５Ａ３ｘ）のいずれか５００ｎｇを腹膜内にマウスに注射した。ｓｃ  ＷＴ及び修飾ｈＴＮＦをＢｃｌｌ１０に、またはｈＣＤ２０  ＮＢのいずれかにＮ末端にて接続した。図１４に示したように、ｓｃ  ＷＴ  ｈＴＮＦは、ｒｈＴＮＦと少なくとも同じく有毒であり、注射の後１０時間以内に重篤な低体温及び死亡を生じさせる。ターゲットされる修飾ｈＴＮＦ  Ｙ８７Ｑ３ｘ及びＹ１１５Ａ３ｘは、任意の罹患率の徴候を生じなかった（起毛、震え、嗜眠、身繕いの喪失または体温の低下；後者について図１４Ａを参照されたい）。
【００５６】
実施例１２：ターゲットされる修飾ｍＴＮＦのインビボ毒性及び抗腫瘍効果の評価。
すでに述べたように、ｈＴＮＦのインビボ毒性は、マウスにおいて容易に研究することができない。したがって、並びに免疫担当性同系マウスにおいて予想される抗腫瘍実験のため、我々がｈＴＮＦについて選択したものに相同的なｍＴＮＦの残基を変異することに決めた（実施例５を参照されたい）。図１５に図示したように、１０μｇと同じ低い用量で静脈内に注射したときに、Ｂｃｌｌ１０ＮＢ−ｓｃ  ｍＴＮＦ  ＷＴは、重篤な罹患率（図１５Ａ）及び１００％の死亡率（図１５Ｂ）を生じさせた。対照的に、２００μｇの静脈内大量瞬時投与として注射したときでさえ、Ｂｃｌｌ１０ＮＢ−ｓｃ  ｍＴＮＦ  Ｙ８６Ｆ３ｘは、死亡も誘導しなかったし（図１５Ｂ）、意の毒性の任徴候も生じさせなかった（起毛、震え、嗜眠、身繕いの喪失または体温の低下；後者について図１５Ａを参照されたい）。それにもかかわらず、Ｂ１６ＢＩ６−ｍＣＤ２０腫瘍をもつマウスに３５μｇの用量で病変周囲に毎日注射したときに、ナノボディ接続されたｓｃ  ｍＴＮＦ  Ｙ８６Ｆ３ｘは、特にｍＣＤ２０にターゲットされたときに、腫瘍成長をまだ減少させる／防ぐことができる（図１６Ａ）。より低い用量がＰＢＳ処理された動物により密接に擬態するように（データを示さず）、腫瘍成長に対するターゲットされない突然変異体ＴＮＦの効果は（図１６Ａ）、高用量（３５μｇ）が使用されたためである。ＮＢ−ｓｃ  ｍＴＮＦ  Ｙ８６Ｆ３ｘでの毎日の処理は、罹患率または死亡率の任意の徴候を生じさせなかった一方で、ＮＢ−ｓｃ  ｍＴＮＦ  ＷＴで処理された腫瘍をもつマウスは、１回または２回の注射の後に死亡した（図１６Ｂ）。
【００５７】
参照文献
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−Ｋｏｌｍａｒ，  Ｈ．  （２００８）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｋｎｏｔ  ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５，  ２６８４−２６９０．
−Ｌｅｊｅｕｎｅ，  Ｆ．Ｊ．，  Ｌｉｅｎａｒｄ，  Ｄ．，  Ｍａｔｔｅｒ，  Ｍ．  ＆  Ｒｕｅｇｇ，  Ｃ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ６，  ６  （２００６）．
−Ｌｉ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  １０３，  ２８８−２９５  （２０１２）．
−Ｌｉｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ａｎｔｉｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｃＦｖＭＥＬ／ＴＮＦ  ｓｈｏｗｓ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８，  ３８４−３９３  （２００６）．
−Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ，  Ｈ．，  Ｓｔｕｅｂｅｒ，  Ｄ．，  Ｂａｎｎｅｒ，  Ｄ．，  Ｍａｃｋａｙ，  Ｆ．  ＆  Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ，  Ｗ．  Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  （ＴＮＦ  ａｌｐｈａ）  ｍｕｔａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ５５−ｋＤａ  ｏｒ  ７５−ｋＤａ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８，  ２６３５０−２６３５７  （１９９３）．
−Ｎｙｇｒｅｎ，  Ｐ−Ａ．  （２００８）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５，  ２６６８−２６７６．
−Ｏｇａｓａｗａｒａ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｔｈａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−Ｆａｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３６４，  ８０６−８０９  （１９９３）．
−Ｐａｒｄｏｎ，Ｅ．，  Ｌａｅｒｅｍａｎｓ，  Ｔ．，  Ｔｒｉｅｓｔ，  Ｓ．，  Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ，  Ｓ．Ｇ．Ｆ．，  Ｗｏｈｌｋｏｎｉｇ，  Ａ．，  Ｒｕｆ，  Ａ．，  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，  Ｓ．，  Ｈｏｌ，  Ｗ．Ｇ．Ｊ，  Ｋｏｂｉｌｋａ，  Ｂ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｓｔｅｙａｅｒｔ，  Ｊ．  （２０１４）．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ    ９，  ６７４−６９３  
−Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｎ．Ｊ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｓ．，  Ｄｉａｚ，  Ｌ．Ａ．，  Ｊｒ．  ＆  Ｈｏｌｄｈｏｆｆ，  Ｍ．  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２，  ７３９−７５１  （２０１１）．
−Ｒｏｃｃａｒｏ  ＡＭ，  Ｈｉｄｅｓｈｉｍａ  Ｔ，  Ｒａｊｅ  Ｎ，  Ｋｕｍａｒ  Ｓ，  Ｉｓｈｉｔｓｕｋａ  Ｋ，  Ｙａｓｕｉ  Ｈ，  Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  Ｎ，  Ｒｉｂａｔｔｉ  Ｄ，  Ｎｉｃｏ  Ｂ，  Ｖａｃｃａ  Ａ，  Ｄａｍｍａｃｃｏ  Ｆ，  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＰＧ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＫＣ．  Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｖｉａ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００６；６６（１）：１８４−９１．
−Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  Ｇ．  Ａｎｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９４９；  ５１，  ６６０−７２．
−Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｔ，  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ，  ａｌｓｏ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ？Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．  ２０１１；２０１１：１−８．
−Ｓｉｅｇｅｍｕｎｄ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＴＲＡＩＬ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｎｄｅｒ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ３，  ｅ２９５  （２０１２）．
−Ｓｋｅｒｒａ，  Ａ．  （２００８）  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ  −  ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｐｏｃｋｅｔ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５，  ２６７７−２６８３．
−Ｓｔｕｍｐ，  Ｍ．Ｔ．，  Ｂｉｎｚ，  Ｈ．Ｋ．，  Ａｍｓｔｕｔｚ，  Ｐ．  （２００８）  ＤＡＲＰｉｎｓ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｄｒｕｇ  ｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  １３，  ６９５−７０１．
−Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，  Ａ．，  Ｂｉａｎｃｈｉ，  Ｅ．，  Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉ，  Ｓ．，  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｆ．，  Ｐｅｓｓｉ，  Ａ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌａｚｚｏ，  Ｍ．  （１９９４）  Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｂｏｄｙ：  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｃｏｎｆｒｏｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ７，  ９−２４．
−Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  ｐ３８  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ｐ６５  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，  ３２８５−３２９０  （１９９８）．
−Ｖａｎｅｙｃｋｅｎ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２５，  ２４３３−２４４６  （２０１１）．
−ｖａｎ  Ｈｏｒｓｓｅｎ，  Ｒ．，  Ｔｅｎ  Ｈａｇｅｎ，  Ｔ．Ｌ．  ＆  Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，  Ａ．Ｍ．  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ，  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ，  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ．  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １１，  ３９７−４０８  （２００６）．
−Ｗａｎｇ，  Ｈ．，  Ｙａｎ，  Ｚ．，  Ｓｈｉ，  Ｊ．，  Ｈａｎ，  Ｗ．  ＆  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｒｍｈＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  ４５，  ６０−６５  （２００６）．
−Ｗｅｌｔｉ  Ｊ，  Ｌｏｇｅｓ  Ｓ，  Ｄｉｍｍｅｌｅｒ  Ｓ，  Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１３；１２３（８）：３１９０−２００．
−Ｙａｎｇ，  Ｙ．Ｈ．，  Ｒａｊａｉａｈ，  Ｒ．，  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｍｏｕｄｇｉｌ，  Ｋ．Ｄ．  （２０１１）．  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｅｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｖａｓｕｌａｔｕｒｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．  ＰＢＮＡＳ  １０８，  １２８５７−１２８６２．
−Ｚａｂｅａｕ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｌｅｐｔｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒａｎｄｏｍ  ｎａｎｏｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４４１，  ４２５−４３４  （２０１２）．
【図１】
0006595988.tif 000002
【図２】
0006595988.tif 000003
【図３】
0006595988.tif 000004
【図４】
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【図５】
0006595988.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006595988.tif 000017
【配列表】
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