(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
小さなサイズの粒子の試料を光学的に特徴判定する装置を較正する方法であって、
（ａ）（ｉ）実質的に単分散であり、且つ、（ｉｉ）均質であり、且つ、（ｉｉｉ）単位容積当たりの数において既知の粒子の濃度を有する粒子の較正母集団の試料を前記装置内に導入するステップと、
（ｂ）適切な条件下において前記試料を解析し、装置条件又は設定の特定の組合せについて、検出された粒子の数と、個々に検出及び計測された粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
（ｃ）前記装置を装置条件又は設定の新しい特定の組合せに調節し、且つ、同一の試料を、或いは、ステップ（ａ）における同一の較正母集団の別の試料を、解析し、且つ、ステップ（ｂ）の前記解析を反復し、装置条件又は設定の前記新しい組合せの下において、前記検出された粒子の数と、前記検出された粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
（ｄ）任意選択により、装置条件又は設定の１つ又は複数の更なる新しい特定の組合せにおいて、ステップ（ｃ）を反復するステップと、
（ｅ）その濃度の推定値を判定するべく、未知の濃度の粒子の母集団の後続の解析のために前記装置を較正するべく使用される検出された粒子の数に照らした粒子の輝度の較正プロット又はルックアップテーブルを前記解析から導出するステップと、
を有する方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）は、カメラ設定及び／又は輝度検出閾値を調節するステップを有する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調節されるカメラ設定は、カメラの利得、シャッタ速度、又はフレームレートを有する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）において導出された前記較正プロット又はルックアップテーブル、或いは、そのデジタル的な情報の観点における均等物は、前記装置と動作可能に装着された又はこれと関連付けられたデジタルメモリ装置内において保存される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
小さなサイズ粒子の母集団内の粒子の濃度を推定する方法であって、
（ｉ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を使用して適切な装置を較正するか、或いは、すでにそのように較正された装置を使用する、ステップと、
（ｉｉ）前記母集団の試料を解析し、且つ、検出された粒子の平均数と、前記粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの結果を前記較正プロット又はルックアップテーブルから予想されるものと比較し、前記試料内の実際の粒子濃度の推定値に到達するステップと、
を有する方法。
【請求項６】
前記粒子の試料は、ウイルス（バクテリオファージを含む）、弱毒化又は非活化されたウイルス又はウイルス様の粒子及びこれらに類似したものを有するワクチン製剤、タンパク質集合体、エクソソーム、メンブレイン集合体及びリポソーム、インク及び顔料、量子ドット、及び化学機械研磨／平坦化（「ＣＭＰ」）スラリのうちの１つを有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉ）において解析される前記試料は、多分散であり、且つ／又は、計測されるパラメータにおいて変化する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉ）において前記試料から取得される計測データは、異なる分解能の２つ
以上のグループに分割され、前記グループは、別個であるか、又は重複しており、且つ
、任意選択により、それぞれ、前記２つ以上のグループのそれぞれのグループの前記粒子の濃度を推定する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）は、平均数及び平均輝度に加えて、前記粒子の１つ又は複数のパラメータに関するデータを取得するステップを有する請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ又は複数の更なる計測パラメータは、偏光特性、蛍光、形状、及び、推進力の印加下における運動から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記装置は、ＮＴＡを実行するように適合及び構成されている請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記装置は、ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、及び／又は顕微鏡と、試料チャンバと、試料処理流体装置と、試料照明装置と、ナノ粒子トラッキング画像解析ソフトウェアによってプログラムされた処理手段と、デジタルメモリ装置とのコンポーネントうちの１つ又は複数を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
液体試料において懸濁する小さなサイズの粒子の試料を光学的に特徴判定するために適したナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）装置であって、前記装置は、
試料を受けるための試料チャンバと、
前記粒子からの散乱光を生成するために前記試料チャンバを照らすための光源と、
顕微鏡構成およびビデオカメラとを備え、前記顕微鏡構成は、前記粒子による前記散乱光の一部を前記ビデオカメラによって撮像することをもたらし、前記装置はさらに、
撮像および粒子トラッキング解析を用いＮＴＡ解析を実行するように構成され、検出された粒子の数に対する粒子の輝度の軟正プロットまたはルックアップテーブルで軟正されるコンピュータ処理手段を備え、前記コンピュータ処理手段は、未知の濃度の粒子の母集団において補正された粒子の濃度の推定値を決定するために前記軟正プロットまたはルックアップテーブルを使用するように構成され、補正された前記推定値は、前記軟正プロットまたはルックアップテーブルから軟正係数を適用することによって決定され、前記装置はさらに、
デジタルメモリ装置を備え、前記軟正プロットまたはルックアップテーブルは、前記デジタルメモリ装置に格納される、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、計器の、且つ、特に、粒子の光学的検出及び解析のための計器の、較正方法と、この方法によって較正される計器と、試料内の（単位容積当たりの粒子の数の観点における）粒子の濃度を推定する方法と、に関する。
【０００２】
本発明は、特に、ナノ粒子トラッキング解析（「ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ」）を実行する装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナノ粒子トラッキング解析は、液体中のナノ粒子の直接的な且つリアルタイムの視覚化及び解析のための比較的最近になって開発された方法である（例えば、国際公開第０３／０９３８０１号パンフレットを参照されたい）。レーザー照明型の顕微鏡法に基づいて、ナノ粒子のブラウン運動が、例えば、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ−ｃｏｕｐｌｅ  ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ）カメラ又はこれに類似したものによってリアルタイムで解析され、それぞれの個々の粒子が、専用の粒子トラッキング画像解析プログラムにより、同時に、但し、別個に、視覚化されると共に追跡される。粒子サイズ及び粒子散乱輝度を同時に計測するＮＴＡの能力によれば、不均質な粒子の混合物を分解することが可能であり、且つ、重要なことには、粒子濃度を直接的に推定することが可能であり、ＮＴＡによって取得される粒子サイズ分布プロファイルは、直接的な個数／頻度分布である。
【０００４】
ＮＴＡは、当業者によって認識される当技術分野の用語となっている。ＮＴＡを使用して収集されたデータを参照している９００件を上回る科学論文及びプレゼンテーションが存在している。更には、この用語は、例えば、ＡＳＴＭインターナショナル（以前の米国材料試験協会）、米国環境保護庁（Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ：ＥＰＡ）、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）、及びＮＩＨによって使用されている。
【０００５】
ＮＴＡによって解析されうる粒子サイズの範囲は、粒子タイプによって左右される。上述のように、粒子が検出及び追跡されるべく十分な光がそれぞれの粒子によって散乱されなければならないとした場合に、相対的に小さなサイズ限度が、粒子サイズ及び粒子屈折率によって定義される。コロイド状の金などの非常に大きな屈折率を有する粒子の場合には、約１０ｎｍの最大寸法を有する粒子に至るまで、サイズの正確な判定を実現することができる。生物学に由来するものなどの相対的に小さな屈折率の粒子の場合には、最小検出可能サイズは、２５〜５０ｎｍの範囲となりうるであろう。従って、ＮＴＡは、特定サイズ未満の粒子を検出するその能力が制限されている。
【０００６】
ＮＴＡによれば、そのそれぞれが個別に検出されるべく十分な光を散乱させる粒子の存在及び解析は、例えば、そのそれぞれが、個別に検出するには小さすぎるが、散乱された光のバックグラウンドヘイズを集合的に形成するべく十分に大きな濃度において存在している（タンパク質分子、１０ｎｍ未満の無機材料、ポリマー溶液、ナノエマルジョンなどのような）非常に小さな粒子の母集団を有する「バックグラウンド」物質の存在している場合にも、依然として実行することができる。このバックグラウンドは、ＮＴＡによって解析することはできないが、このバックグラウンド内において埋め込まれた別個の光散乱エンティティとして可視状態にある粒子は、ＮＴＡによって解析することができる。当然のことながら、このバックグラウンドの強度が、最小検出可能サイズの観点において、ＮＴＡの感度の限度を決定することになる。更には、ＮＴＡは、粒子が、少数の相対的に大きな粒子を含む不均質な試料内において存在している際にも、適切にサイズ設定された粒子を識別、トラッキング、及び解析することができる。
【０００７】
ＮＴＡは、適切な蛍光励起光源及び適切な蛍光フィルタを使用し、非蛍光性のバックグラウンドが存在する状態において、本質的に蛍光性の又は蛍光によってラベル付与されたナノ粒子を検出及び解析する能力を更に有する。ＮＴＡは、複数のフィルタ又はカラーカメラを使用して試料内の複数の蛍光波長を計測する能力を更に有する。
【０００８】
ＮＴＡによる個々のナノ粒子のサイズ判定は、粒子によって散乱された光が、粒子によって散乱された光の一部分のビデオカメラ（通常は、ＣＣＤ、電子倍増ＣＣＤ［ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｙｉｎｇ  ＣＣＤ：ＥＭＣＣＤ］、科学的相補型金属酸化物半導体［ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｍｅｔａｌ  ｏｘｉｄｅ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ｓＣＭＯＳ］など）による撮像を実現する顕微鏡構成によって検出されるように、適切な光源（例えば、レーザー）によって照明された際に液体中において懸濁したミクロン及びサブミクロン粒子が示すブラウン運動の解析に基づいている。
【０００９】
既知の時間インターバル（例えば、カメラのフレームレートの逆数であり、通常は、３０フレーム／秒である）において任意の所与の粒子が移動する平均距離は、周囲の液体の温度及び粘度が判明している場合には、拡散係数が粒子流体力学直径に対して外挿されうるＳｔｏｋｅｓ  Ｅｉｎｓｔｅｉｎ式を通じて関係付けることができる。
【００１０】
カメラによって調べられるレーザービームの領域は、適切なカメラがその上部に取り付けられる顕微鏡の光学トレーンによってキャプチャされる（ｘ及びｙ次元における）画像のサイズの関数である。通常の用途の場合には、ｘ２０の長作動距離の顕微鏡対物レンズが使用される。ブラウン運動は、事実上、粒子の質量とは無関係であることから、ＮＴＡは、（動的光散乱の関係する技法と同様に）、絶対的な技法であると見なされており、較正を必要とはしない。ＮＴＡは、懸濁液中において個別に（但し、同時に）粒子を調べることから、高分解能の粒子サイズ分布プロファイルを生成することができる。
【００１１】
カメラの視野は、通常、約１００×８０ミクロンであり、且つ、ビームの深さは、これまでのところ、約１０μｍであるものと仮定されている。
【００１２】
但し、任意の所与の粒子がカメラにとって可視状態であるレーザービームの（「深さ」を含む）空間的寸法（「有効散乱容積」又は観察容積）は、特に、使用されるレーザー源のしばしば不均一である強度プロファイルが付与された場合には、様々な要因によって左右される。これらは、カメラの固有感度（利得及びシャッタ設定の変更によって調節可能である）と、レーザービームのパワー及び波長と、を含み、且つ、最も重要なことには、散乱する粒子のサイズ及び屈折率の強力な関数である。
【００１３】
照明源であるレーザービームは、通常、プロファイルが、トップハット（即ち、ｘ及びｙ次元の両方の全体を通じて均一な強度を有するもの）ではなく、複合的であって、滑らかガウスプロファイル（又は、これに類似したもの）から、ビームをガラス壁を通じて小さな（臨界角に近接した）角度で散乱セル内に放出した際に断面強度における予測不能な空間的変動が光学的摂動から生じる非常に複雑なプロファイルに至るまでの多様性を有する。
【００１４】
従って、ＮＴＡによって成功裏に追跡された粒子の粒子サイズ分布をある程度の信頼度によって動的に判定することができるが、レーザービームの経路内に存在している任意の所与のサイズ又はサイズクラスの粒子の数の正確な推定には、相対的に大きな問題が存在している。
【００１５】
要するに、相対的に小さな且つ／又は相対的に低い屈折率の粒子は、多くの場合に、入射強度が最大であるビームの領域（例えば、ガウスビームの中心、或いは、例えば、筋状ビームの相対的に明るい部分）内においてのみ、（カメラにとって）可視状態であり、且つ、相対的に小さな強度領域内においては、可視状態にない。対照的に、相対的に大きな（又は、相対的に高い屈折率の）粒子は、高強度のビームの中心から相対的に大きな距離において（又は、高強度の筋の間において）、観察することが可能であり、その理由は、これらの粒子が、相対的に多くの光を散乱させるからである。従って、このような２つの粒子タイプの場合に、これらが可視状態にある容積（「有効観察容積」）は、異なることになり、且つ、その結果、これらの粒子が同一の個数濃度において実際に存在しうるにも拘らず、ＮＴＡは、同一の系において異なる数の粒子を検出することになる。
【００１６】
国際公開第２０１２／００４３２０号パンフレットは、ビーム内においてブラウン運動下において運動している粒子の平均トラック長を計測することにより、有効観察容積を判定することができる方法を開示している。既知のサイズ（又は、更に正確には、既知の拡散係数）の粒子が運動している温度及び粘度に関する知識により、そのような粒子が、平均して、存在することになる時間の長さと、従って、光の散乱検出可能量と、従って、追跡可能なものは、（すべてのその他のものが等しい場合には）調査領域の容積によって左右されることになる。任意の所与のサイズ設定された粒子の場合に、相対的に大きな有効「観察容積」は、相対的に長いトラック長を結果的にもたらす。
【００１７】
換言すれば、ビームが長いほど（又は、粒子が、散乱体として有効であるほど）、ビーム内における粒子の可視寿命が長くなる。粒子のサイズが、（例えば、較正粒子を使用していることから）判明しており、且つ、溶剤の温度及び粘度が判明している場合には、既知のサイズの粒子の単分散の母集団のトラック長の分布の判定から、ビームの容積を算出することができる。散乱容積を空間的に算出しうるこの「絶対」的な方法を使用することにより、算出された容積内において観察される粒子の数を判定することが可能であり、これにより、試料の個数濃度の絶対値の生成が可能となる。但し、この技法の制限は、連続的且つ均質な観察容積を仮定しており、且つ、高粒子濃度において、大きな画像ノイズにより、又は流動する試料により、大きく影響されうるトラック長の正確な計測を必要としているという点にある。
【００１８】
ＮＴＡ装置を較正するための別の技法は、Ｇａｒｄｉｎｅｒらによって開示されている（“Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｓｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ２０１３，２  １−１１）。これは、解析対象の粒子母集団と（粒子サイズ及び屈折率の観点において）類似した特性を有する既知の濃度の特定のナノ粒子母集団の較正試料の使用を伴っている。
【００１９】
但し、この方法は、実際的な有用性が限られており、（常に入手可能ではない場合がある）適切な特性を有する較正粒子を必要としており、且つ、いずれにしても、この装置は、異なる特性を有する粒子の母集団を解析するべく使用される場合に、毎回、再較正を必要としている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、従来技術と関連する問題のうちの１つ又は複数を低減又は克服することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
第１の態様においては、本発明は、小さなサイズ（即ち、１０００ｎｍ直径未満）の粒子の試料を光学的に特徴判定する装置を較正する方法を提供しており、方法は、
（ａ）（ｉ）実質的に単分散であり（例えば、直径Ｓ．Ｄ．が、１０％平均直径未満であり）、且つ、（ｉｉ）均質であり、且つ、（ｉｉｉ）単位容積当たりの数における既知の粒子の濃度を有する粒子の較正母集団の試料を装置内に導入するステップと、
（ｂ）適切な条件下において試料を解析し、装置条件又は設定の特定の組合せにおいて、検出された粒子の数と、検出及び計測された粒子の個別の平均輝度と、を判定するステップと、
（ｃ）装置を装置条件又は設定の新しい特定の組合せに対して調節し、且つ、同一の試料を、或いは、ステップ（ａ）におけると同一の較正母集団の別の試料を、解析し、且つ、ステップ（ｂ）の解析を反復し、装置条件又は設定の新しい組合せの下において、検出された粒子の数と、検出された粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
（ｄ）任意選択により、装置条件又は設定の１つ又は複数の更なる新しい特定の組合せにおいて、ステップ（ｃ）を反復するステップと、
（ｅ）その濃度の推定値を判定するべく、未知の濃度の粒子の母集団の後続の解析のために装置を較正するべく使用される検出された粒子の数に照らした粒子の輝度の較正プロット又はルックアップテーブルを解析から導出するステップと、
を有する。
【００２２】
これを目的として、粒子の実質的に単分散の母集団は、直径Ｓ．Ｄ．が平均粒子直径の１０％未満であるものとして見なされる。又、当業者は、対象の粒子は、完全に球形である必要はなく、好ましくは、少なくとも実質的に球形となることをも理解するであろう。較正母集団における粒子の（単位容積当たりの数における）濃度は、好ましくは、絶対的に判明しているか、或いは、規定された範囲（例えば、＋／−２０％、好ましくは、＋／−１０％、更に好ましくは、＋／−５％）内に含まれていることが判明していてもよい。
【００２３】
方法は、検出された粒子の合計数の判定を、或いは、更に好ましくは、単位時間当たりに検出された粒子の数の判定を、伴ってもよい。実際には、これは、通常、画像フレームを単位として実施される。
【００２４】
第２の態様においては、本発明は、小さなサイズの粒子の母集団における粒子の濃度を推定する方法を提供しており、方法は、
（ｉ）先程定義した本発明の第１の態様による方法を使用して適切な装置を較正するか、或いは、そのように較正された装置を使用する、ステップと、
（ｉｉ）母集団の試料を解析し、且つ、検出された粒子の平均数と、粒子の平均輝度と、を判定するステップと、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの結果を較正プロット又はルックアップテーブルから予測されるものと比較し、試料中の実際の粒子濃度の推定値に到達するステップと、
を有する。
【００２５】
本発明の第１の態様との関係において、たとえば好ましい又は望ましい本発明の特徴は、一般に、本発明の第２の態様に対しても同様に適用されることを理解されたい。
【００２６】
本発明は、特に、ＮＴＡを実行するべく利用される装置の較正との関係において、且つ、ＮＴＡを実行する装置を使用した母集団における粒子の濃度の推定との関係において、有用であるが、原則的に、その他の粒子撮像技法も、本発明から利益を享受しうるであろう。
【００２７】
本発明は、通常、粒子が、一般的に、１０〜１０００ｎｍの、更に一般的には、２０〜７５０ｎｍの範囲の平均直径又は寸法を有する試料の解析又は特徴判定のために有用であるが、上述したように、ＮＴＡによって検出可能な粒子の最小サイズは、少なくとも部分的に、粒子の屈折率によって左右され、高い屈折率の粒子ほど、検出が容易である。
【００２８】
粒子は、適切なサイズ及び屈折率を有する任意のものであってもよく、且つ、その特性が生物学的なもの又は非生物学的なものであってもよい。試料は、ナノ粒子を有する任意の技術加工された又は天然に生じた試料であってもよい。ＮＴＡによって解析されうると共に、従って、本発明の方法の対象となりうるナノ粒子状試料の具体的な例は、限定を伴うことなしに、ウイルス（バクテリオファージを含む）、弱毒化又は非活化されたウイルス又はウイルス様の粒子及びこれに類似したものを有するワクチン製剤、タンパク質集合体、エクソソーム、メンブレイン集合体及びリポソーム、インク及び顔料、量子ドット、及び化学機械研磨／平坦化（「ＣＭＰ」）スラリを含む。
【００２９】
本発明の方法は、好ましくは、先程定義した粒子の単分散の母集団を使用して実行される。
【００３０】
更には、本発明の方法は、ＮＴＡによって分解可能となるように十分な異なるサイズの粒子の２つ以上の異なる単分散母集団を含む試料中の粒子の濃度を推定するべく、使用されてもよい。
【００３１】
本発明の方法のステップ（ａ）は、その濃度が少なくとも概よそ（例えば、一桁内において）判明している粒子の標準較正試料の試料の使用を必要としている。適切な試料は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（例えば、３０００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉｚｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及びＢＢＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（例えば、金ナノ粒子）から市販されており、且つ、このような粒子は、例えば、粒子状の金ナノ粒子又はポリスチレンビードを有してもよい。市販の試料は、解析に適した範囲の粒子濃度を有する試料を提供するべく、希釈剤による希釈を必要とする場合がある。希釈剤は、明らかに、解析を妨げうる粒子を含んでいないことを要する。水、緩衝液、又はその他の水性溶液が、適宜、希釈剤として使用されてもよい。
【００３２】
方法のステップ（ｂ）は、較正対象の装置を使用した較正試料の解析を必要としている。装置は、通常、ＮＴＡを実行するように適合及び構成された装置となる。従って、装置は、一般に、通常は、必要とされる撮像及び粒子トラッキング解析を実行するためのコンピュータ処理手段及び関連するソフトウェアと共に、光源（通常は、レーザー）と、光学ステージ又は試験片チャンバ又はこれに類似したものと、ＣＣＤ又はこれに類似したものなどの光学検出器と、を有することになる。
【００３３】
装置の様々なコンポーネントは、調節可能な設定を有することになり、これらの設定は、異なる特性（基本的には、粒子サイズ、粒子屈折率、及び粒子濃度など）を有する試料の解析に装置を使用しうるように、調節することができる。例えば、（特に、ＮＴＡを実行するように適合及び構成された装置においては）手動的に、或いは、関連するソフトウェアにおける値を変更することにより、様々な設定を調節することが一般に可能であり、これらの設定は、粒子がその内部において検出及び追跡されうる有効観察容積を決定する。これらは、具体的には、（ｉ）検出器装置の感度に関係するものと、（ｉｉ）輝度検出閾値に関係するものと、を含む。光学検出器がＣＣＤ又はこれに類似したものである場合には、可変設定は、例えば、カメラの利得又はシャッタ速度を含む。輝度検出閾値は、解析及びトラッキングのために選択される観察可能な粒子の最小輝度を決定する、ユーザーによって設定される調節可能な閾値である。検出されるが、輝度検出閾値にマッチングしていない又はこれを超過している有効観察容積内の光の供給源は、無視される。
【００３４】
従って、ＮＴＡ装置を例示用の一実施形態として使用することにより、上述の設定の１つの具体的な特定の組合せ（及び、任意選択により、その他の設定をも同様に）を使用し、方法のステップ（ｂ）を実行することにより、較正試料を解析して粒子の数及びその平均輝度を判定してもよい。
【００３５】
ステップ（ｃ）においては、同一の試料を、或いは、ステップ（ａ）におけると同一の較正母集団の複製試料を、使用することにより、ステップ（ｂ）のプロセスが反復される。同一の試料が使用される場合には、粒子が、（例えば、不定期の撹拌によって）有効観察容積内において、均質化された状態で維持されることを保証することが必要となりうる。但し、ステップ（ｃ）においては、設定の新しい特定の組合せを形成する（且つ、従って、異なる有効観察容積を生成する）ように、有効観察容積を決定する上述の（例えば、カメラの）設定のうちの１つが、ステップ（ｂ）におけるその設定との関係において変更される。粒子の数及びその平均輝度が再度判定される。
【００３６】
ステップ（ｄ）においては、任意選択により（但し、好ましくは）、上述のプロセスが、有効観察容積を決定する設定の更なる特定の組合せを使用して反復される。この場合にも、同一の試料が、或いは、同一の較正母集団の複製試料が、使用されてもよい。このステップは、データセットが、異なる有効観察容積の広範な範囲にわたって、検出された粒子の数及びその平均輝度を有するように、構築されることが可能であり、これにより、装置が、広範な範囲の設定にわたって較正されることが可能であり、これにより、サイズや屈折率などの観点において広範に異なる特性を有しうる対象の多くの異なる試料を解析するために、較正済みの装置の使用が許容されるように、好ましくは、多数回にわたって、毎回、設定の異なる特定の組合せを使用することにより、反復される。
【００３７】
次いで、解析によって取得されたデータセットを使用し、検出された粒子の数に照らした粒子の輝度のプロットを、或いは、ルックアップテーブルを、生成してもよい。使用される粒子母集団の既知の（又は、仮定された）濃度を使用することにより、検出された粒子の数から、観察容積を推定することが可能であり、この結果、観察容積に照らした粒子の輝度のプロットが得られる。次いで、このプロット又はテーブルは、或いは、その情報の観点における均等物は、将来において、未知の観察容積と、従って、未知の粒子濃度と、を有する対象の実際の試験試料を解析するべく使用された際に、装置が、データを参照すると共に適切な調節を実施して粒子濃度の補正済みの推定値に到達できるように、装置と動作可能に装着された又はこれと関連付けられたデジタルメモリ内において便利に保存される。
【００３８】
第３の態様においては、本発明は、小さなサイズの粒子の（単位容積当たりの数の観点における）濃度を算出するのに適した装置を提供しており、装置は、本発明の第１の態様の方法によって較正されており、且つ、第１の態様の較正方法によって生成されたプロット又はルックアップテーブル又はその情報の観点における均等物をデジタルの形態で保存するデジタルメモリ装置を有する。
【００３９】
好ましくは、装置は、ＮＴＡを実行するように適合及び構成されている。従って、装置は、好ましくは、ＣＣＤ又はＥＭＣＣＤ及び／又は顕微鏡、試料チャンバ、試料処理流体装置（チューブやポンプなど）、試料照明装置（例えば、レーザー）、ナノ粒子トラッキング画像解析ソフトウェアなどによってプログラムされた処理手段、並びに、デジタルメモリ装置などの市販のＮＴＡ装置内において使用される種類のコンポーネントのうちの１つ又は複数、或いは、すべてを有することになる。
【００４０】
装置は、装置によって解析された試料の粒子濃度の補正済みの推定値を生成するようにプログラムされたコンピュータ処理手段を有するか、或いは、これと動作可能に関連付けられており、補正済みの推定値は、デジタルメモリ装置内において保存されているデータからの較正係数を適用することにより、判定されることが更に好ましい。
【００４１】
例示用の一例として、且つ、添付図面を参照し、本発明について更に説明することとする。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】観察容積（任意単位）に照らした平均粒子輝度（任意単位）のグラフであり、本発明による較正方法の一例において使用される１００ｎｍ直径のポリスチレンビードの単分散母集団に伴って取得されたデータを示す。
【図２】線形の関係を示す、輝度に照らした調節済みの対数観察値のグラフである。
【図３Ａ】本発明による較正の前においてＮＴＡによって解析された試料のｌｏｇ１０（観察された濃度／実際の濃度）のボックスプロットを示す。
【図３Ｂ】本発明による較正の後においてＮＴＡによって解析された試料のｌｏｇ１０（観察された濃度／実際の濃度）のボックスプロットを示す。
【図４】本発明による較正方法の実行の後の粒子の２つの異なる母集団（直径が１００又は２００ｎｍ）の観察された濃度／実際の濃度のボックスプロットを示す。
【図５】単位時間当たりに（例えば、１画像フレーム当たりに）観察される粒子の数に照らした見かけの粒子輝度の一般化された代表的なグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
例１
１００ｎｍポリスチレン標準品を使用した較正
まず、標準品が、例えば、１０８粒子／ｍｌなどの適切な濃度に希釈され、且つ、適切な計測装置（例えば、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ５００システム、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ，Ａｍｅｓｂｕｒｙ，ＵＫ）内に注入される。いくつかの計測が、異なるカメラ設定（シャッタ及び利得）及び検出設定（検出閾値）の範囲において実施される。限られた統計情報又は大きなノイズを有する点が除去されるように、データがフィルタリングされる。残りのデータを使用することにより、既知の濃度と、カウントされた粒子の数と、を使用して観察容積が算出され、これが、図１において観察されるように、いくつかの検出閾値について、平均輝度に照らしてプロットされる。
【００４４】
平均輝度を主要な説明変数として使用することにより、線形回帰がデータに対して実行される。その他の設定（検出閾値など）を処理するように、別個のモデルを生成することも可能であり、且つ、変数を変量又は係数として回帰モデルに統合することもできる（この場合には、検出閾値は、更なる説明変数である）。
【００４５】
輝度に照らして任意単位スケールにおいて観察容積をプロットした図２には、データに対するフィットが示されている（ｍｌｎｉ＿５）。
【００４６】
次いで、この線形モデルを使用することにより、（カメラ設定、サイズ、屈折率などを介して変更された）任意の輝度及び濃度の計測における観察容積を予測することができる。
【００４７】
このモデルを較正のために使用される１００ｎｍ粒子の範囲に対して適用することにより、変動が大幅に低減される。図３のボックスプロットは、較正前の変動（図３ａ）と、較正後の変動（図３ｂ）と、を示している（対数スケールに留意されたい）。
【００４８】
図は、プロセスの適用の前に、〜０．７ｌｏｇ＝（即ち、約５００％倍だけ）の変動の（主には、カメラ設定及び検出閾値に起因した）観察された四分位間の変動が存在していたが、プロセスの適用の後には、四分位間の変動が、〜３０％であったことを示している。
【００４９】
更には、このモデルを（類似の設定の範囲によってキャプチャされた）１００ｎｍ粒子及び２００ｎｍ粒子の更なる組に適用することにより、匹敵する結果が得られた（図４を観察されたい。対数スケールにおけるものではないことに留意されたい）。
【００５０】
この例は、ナノ粒子トラッキング解析（「ＮＴＡ」）を実行する方法及び装置に対して適用された本発明の原理を示している。
【００５１】
本発明者らは、国際公開第２０１２／００４３２０号パンフレットにおいて記述されている方式とは対照的に、粒子によって散乱された光の強度を計測すると共に既知の個数濃度の母集団に照らして較正することにより、有効散乱容積（個数濃度の推定値がこれから取得されうるもの）の知識を取得することができることを理解した。
【００５２】
従って、既知の個数濃度（単位容積当たりの粒子の数）の粒子の単分散（サイズ検量体）の母集団の場合には、例えば、レーザー波長及びパワー、カメラ感度、及び設定などのような）任意の所与の光学構成及びセットアップにおいて観察されるこのような粒子の数を較正を通じて実際の個数濃度に対して調節することができる。観察された粒子の輝度の責任を担うパラメータのうちの１つ又は複数が調節された場合には（例えば、レーザーパワーを増大させるか、又はカメラ感度［利得、シャッタ長さ］を増大させた場合には）、観察されるこのような粒子の数が増大することになる。従って、粒子の較正試料の場合には、任意の所与の検出効率において観察されると共にカウントされる粒子の平均数の「プライマリ」較正グラフを生成することができる。（例えば、カメラ利得を増大することによって）システムの検出感度を変更し、これにより、「粒子輝度」を変更すれば、観察される粒子の数の対応した変化が結果的に生じることになる。同様に、較正試料が希釈された場合には、（較正グラフから予想されるものとの比較における）観察される数の変化は、存在する実際の数の実際の変化を反映する。
【００５３】
異なる試料（例えば、異なるサイズ及び／又は屈折率）の場合に、試料が単分散であると共に均質である場合には、観察される粒子の輝度は、（システムの感度［例えば、カメラの利得］の変化の後にも）、較正グラフと比較することが可能であり、且つ、単位容積当たりの粒子の実際の数（その濃度）を推定することができる。従って、粒子タイプの平均輝度がその粒子タイプの有効散乱容積について報告しており、且つ、従って、その個数濃度を確実に推定しうる場合には、プライマリ較正グラフは、任意のその他の単分散の且つ均質な試料タイプに対して適用可能であると理解することができる。
【００５４】
或いは、この代わりに、較正技法においては、粒子によって散乱された光を使用して実施された計測の代わりに、蛍光粒子（本質的に蛍光性の又は蛍光によってラベル付与されたもの）を使用して得られた計測を使用してもよい。
【００５５】
繰り返しになるが、既知の個数濃度の単分散の且つ均質な試料を使用した粒子数に対する散乱容積の較正の後に、輝度がプライマリ個数較正グラフの範囲内に含まれるように（例えば、カメラの利得又はレーザーパワーを通じて）調節される限り、その他の単分散の且つ均質な試料（場合によっては、異なるサイズ及び／又はＲｉから生じる異なる散乱特性を有するもの）をカウントすることが可能であり、且つ、個数濃度を推定することができる。従って、プライマリ較正グラフから予想されるものと観察される粒子の平均数の差は、新しい試料の実際の個数濃度の実際の差を示している。
【００５６】
（サイズ及び／又は屈折率を通じた）十分に異なる散乱特性を有する２つの異なる粒子タイプを有するバイモーダル試料の場合には、それぞれの粒子母集団の十分な数が検出された場合に、２つの母集団は、そのそれぞれがプライマリ較正グラフを使用して別個にカウントされることが可能であると共にそのそれぞれの濃度が較正グラフ上におけるその位置に従って調節されうる２つのデータセットに分解されることになる。
【００５７】
複数の粒子タイプの複数の母集団を含む混合物の場合には、多分散性の増大、並びに／或いは、輝度、サイズ、偏光、蛍光、形状、推進力（電気的、磁気的、重力的なものなど）、或いは、試料を弁別する能力を有する任意のその他の尺度などの任意のその他の計測可能なパラメータの変動に伴って、それらを弁別しうる分解が益々問題となる。但し、データを増大する分解能の（別個の又はオーバーラップした）複数のビン又はグループに分割することは、観察されるそれぞれのビン又はグループ内に十分な数の粒子が存在している場合には、そのような複雑な試料におけるカウント精度の向上を支援することになる。
【００５８】
当然のことながら、サイズ判定及びカウント動作について粒子強度の計測に依存しているその他の光学的技法とは異なり、ＮＴＡは、粒子サイズを推定しうる粒子の動的ブラウン運動を（個別に）計測する能力を有する。この解析は、時間ドメインにおいて機能していることから、粒子の強度とは無関係である。この結果、更なる直交計測量を上述の輝度／濃度関係において活用することができる。
【００５９】
従って、それぞれが異なるサイズ及び／又はＲｉを有しているが、その光散乱特性が類似しており、且つ、従って、強度に基づくだけでは、相互に弁別されえない異なる粒子母集団の場合に、（それぞれの粒子が同時に検出され、ブラウン運動がサイズ判定され、且つ、輝度が計測される場合には）較正済みの個数濃度に照らして、サイズに照らしたその輝度をプロットすることにより、それらの粒子母集団を（プライマリ較正グラフを使用して）弁別及びカウントすることができる。
【００６０】
同様に、このような方法により、ＮＴＡによって提供されるその他の計測量を利用することもできよう。例えば、蛍光によってラベル付与された粒子、印加された推進場（例えば、電気的なもの、磁気的なもの、重力的なものなど）における振る舞い、粒子の形状、偏光などを、それぞれに又は様々に、有利な方式で利用することができよう。
【００６１】
例２
以下、ＮＴＡ装置に適用される本発明の較正方法の一例について説明する。
【００６２】
方法
異なる試料タイプの数を判定しうるシステムを個数較正するために必要とされるステップ
個数較正
１．任意のビームプロファイル及びパワーのＮａｎｏＳｉｇｈｔシステムの場合に、その個数濃度が正確に判明している（例えば、１０〜１０００ｎｍの、或いは、更に好ましくは、５０〜３００ｎｍの、範囲のサイズを有する）単分散の且つ均質な較正品質粒子の適切に希釈された試料を（１０７〜１０９粒子／ｍｌのいずれかになるように）追加する。
【００６３】
２．ＮＴＡ解析が有効に計測しうる強度の範囲を十分にカバーするように、所定範囲のシャッタ及び利得設定を使用して解析を実行する。
【００６４】
３．十分に安定した統計情報が、十分な時間にわたる十分な数の解析対象の粒子トラックの解析を通じて、取得される時点まで、上述の解析を実行する。少なくとも、これは、通常、＞２００個のトラックであり、且つ、３０秒超となり、且つ、更に好ましくは、＞１０００個の解析対象の粒子トラックであり、且つ、１５０秒超となろう。
【００６５】
４．選択されたカメラ設定において観察されている粒子によって表示される平均輝度を計測し、且つ、単位時間当たりの（例えば、フレーム当たりの）検出された粒子の平均数をカウントする。
【００６６】
５．結果的に得られたデータを使用し、図５に概略的に示されているように、単位時間当たりに観察される粒子の対応した増大を結果的にもたらす（利得の増大を通じた）粒子輝度差の較正グラフを生成する。
【００６７】
６．較正試料の絶対個数濃度が既知であると仮定することにより、観察されている粒子の平均数から散乱容積を推定し、これにより、輝度及び散乱容積の較正曲線を生成することができる。
【００６８】
７．結果的に得られた較正グラフを使用し、見かけの平均粒子輝度と散乱容積の間の［線形又はその他の］関係を見出す。
【００６９】
上述の較正手順を実行した後に、このようにして得られた情報を使用し、ＮＴＡを使用して解析可能である任意の粒子状試料の粒子濃度の推定値を判定することができる。
【００７０】
即ち、粒子濃度の推定は、以下のように実行される。
８．適切に希釈された、但し、それ以外においては未知である、試料を（アライメント又は倍率を変更することなしに）計器に追加し、且つ、観察されている粒子の平均輝度が、上述の較正グラフ内において使用されている粒子によって示されている強度の範囲内に位置する時点まで、設定（例えば、カメラの利得／シャッタ又はレーザーパワー）を調節する。
【００７１】
９．試料を解析し、これにより、検出された粒子の平均輝度（及び、サイズ）を記録する。
【００７２】
１０．得られた平均輝度データを使用することにより、ステップ７において見出された関係を使用し、粒子が可視状態にある散乱容積を推定する。
【００７３】
１１．散乱容積が判明したら、いまや、カウントされた粒子の数を試料内の粒子濃度と関係付けることができる。
【００７４】
未知の濃度、組成、及びサイズの多モード試料の計測
１２．異なる試料タイプ／サイズ範囲の２つ以上の別個の母集団を含む試料の場合に、上述のステップ８及び９を実行する。
【００７５】
１３．認識可能な方式で異なっている輝度グループから生じる２つ以上の別個のグループを識別し、ステップ１０及び１１に従って、それぞれの別個のグループごとに、散乱容積及び結果的に得られる濃度を算出する。
【００７６】
１４．識別されうるだけの数の異なるサブ母集団について、異なる個数調節を適用する。
【００７７】
複雑な試料タイプから更なる情報を抽出するためのＮＴＡから入手可能な更なる計測量の使用
それぞれの粒子に関する更なる情報（例えば、ブラウン運動によって判定されるサイズ、印加された電界下における電気泳動による移動性、特定のラベル（例えば、抗体媒介）などによって生成される蛍光）を追加することによって弁別されうる複数のサブ母集団を含む試料の場合に、３つの次元（輝度対濃度対サイズ／蛍光信号／移動性など）において再プロットし、且つ、較正グラフから、補正済みの個数推定値を取得する）。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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