(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における非経口感染の治療方法用組成物であって、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとを含み、１０００ダルトン以下の分子量を有するコポリマーを含む、組成物。
【請求項２】
前記アクロレイン由来セグメントが、２個以上のアクロレイン残基を含むポリアクロレインオリゴマーである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントが、２００〜６００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記非経口感染が、血（菌血症）、髄膜、肺、尿管、洞、皮膚、創傷、膿瘍および外科的処置の感染からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記非経口感染が、抗生物質耐性感染である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記非経口感染が、敗血症および菌血症から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、経口投与、吸入、経皮送達および注射からなる群より選択される経路により投与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、静脈内治療により投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、水溶液として投与され、前記水溶液が、当該水溶液の０．０１重量％〜２０重量％の前記コポリマーを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記コポリマーが、体重１キログラム当たり１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で全身投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記感染が、細菌感染であり、細菌が、プロテウス属、セラチア属、緑膿菌、髄膜炎菌、大腸菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎球菌および腸球菌属からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとを含み、１０００ダルトン以下の分子量を有し、
前記ポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントが、２００〜６００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、コポリマー。
【請求項１３】
アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーとを含み、１０００以下の分子量を有するコポリマーの製造方法であって、アルカリ性触媒の条件下で、１２以下のｐＨで、少なくとも２０％ｗ／ｗの水とポリアルキレングリコールオリゴマーとを含む水溶液中で、少なくとも４のポリアルキレングリコール／アクロレインの重量比でアクロレインを重合して、前記コポリマーを与える工程を含む、コポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとを含むコポリマーを使用する細菌感染、特に非経口細菌感染の治療方法であって、コポリマーが１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する治療方法に関し、およびポリアルキレングリコールの水溶液中でのアクロレインの重合によるコポリマーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非経口感染（胃腸管の感染とは異なる）は、微生物が、外側保護膜または皮膚下の細胞間および細胞内成分へ侵入したときに起こる。穿刺、注射、咬傷、切傷、創傷、外科手術、皮膚と粘膜との間の裂傷は全て、非経口感染につながる例である。非経口感染は、胃腸管の管腔内の感染を含まない。
【０００３】
非経口感染、特に非経口経路を介する細菌感染は、炎症反応を伴う深刻かつ生命を脅かす疾患につながり得る。抑制されない場合、非経口感染は血圧の低下を伴う敗血症につながり、生命を脅かすレベルの感染の危険にさらすことになり得る。
【０００４】
敗血症に進展する最も一般的な原因は、血（菌血症）、髄膜、肺、尿管、洞、皮膚、創傷、膿瘍および外科的処置の感染である。敗血症に関連する一般的な原因微生物の研究は、症例の約５３％がグラム陽性菌と関連し、約４２％がグラム陰性菌と関連していることを示す。
【０００５】
敗血症の発症に関与するグラム陰性菌の例には、プロテウス属、セラチア属、緑膿菌、髄膜炎菌、大腸菌、肺炎桿菌が挙げられる。関与するグラム陽性の例には、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎球菌、腸球菌属が挙げられる。
【０００６】
日常的に、敗血症および／または相互に関連する菌血症は、予防的に（予防的に）および／または治療的に抗生物質により治療される；よく認識されている統計では、生命生存の確率は、治療の１時間の遅延毎に６％減少するとされている。しかし、問題の根底にある細菌を識別するのに数日かかる可能性がある−その後でも使用される抗生物質が常に効くわけではない。抗生物質耐性は、敗血症の危険性のさらなる増大につながり、この危険性は、多くの場合、抗生物質の使用の普及に起因して抗生物質耐性が特に高くなり得る病院で深刻化する。
【０００７】
敗血症と診断された人の約３０％が死亡し、ほとんどの病院の集中治療室での死亡の主要な原因のひとつとなっている。米国では、それで毎年約１２０，０００〜２００，０００人が死亡している。世界全体では、毎年１，３００万人が敗血症を発症し、４００万人もの人々が結果として死亡している。
【０００８】
抗生物質耐性菌の世界人口への脅威の増大が、普遍的に認められている。
【０００９】
感染が抗生物質耐性菌（「スーパーバグ」）により引き起こされたときの脅威は、より深刻である。現在使用される１つ以上の抗生物質に耐性を持つようになった細菌を含む非経口細菌感染の即時の効果的な治療をより確実に提供するために、広い範囲の細菌非経口感染の治療を可能にする抗生物質が緊急に必要とされている。
【００１０】
アクロレインは、その高い反応性に起因して、身体組織に非常に有害である。純粋なポリアクロレインは、単独では顕著な抗菌活性を示すことは知られていない。しかし、多くの特許（Ｍｅｌｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９８８；Ｍｅｌｒｏｓｅ  １９９６；Ｍｅｌｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｘｈａｍ  ２０００；Ｍｅｌｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１；Ｓｔａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｌｒｏｓｅ  ２００２；Ｍｅｌｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３；Ｔｉｌｂｒｏｏｋ  ２００５；Ｍｅｌｒｏｓｅ  ２００９）は、消化管における抗菌剤としての修飾ポリアクロレインの調製および使用を開示している。アクロレインは非常に反応性の高いモノマーであり、重合すると、高分子量の扱いにくいネットワークを速やかに形成する。通常、アニオン重合は、無水溶媒中で実施され、迅速な重合をもたらし、高分子量ポリマーを形成する。
【００１１】
先行技術は、修飾ポリアクロレインの抗菌活性を、それらの化学的反応性の高いカルボニル基によるものとし、それらは胃腸管において、微生物外膜のタンパク質と破壊的に反応すると述べられている。先行技術に記載されたポリマーの認識されている利点の１つは、それらは腸の壁を貫通することができず、そのためそれらの活性が胃腸管に制限されるということである。Ｍｅｌｒｏｓｅ  ２００９は、アクロレインおよび／またはそのアルカノールとのアセタールの塩基触媒重合により形成され得るポリアクロレインポリマーを記載している。そのポリマーは、膜を通って移行する傾向が低減されているという利点を有している。
【００１２】
米国特許第６，０６０，５７１号明細書（Ｗｅｒｌｅら）は、水系における殺菌剤としての活性を提供するのに十分なアクロレインを放出するアクロレイン放出ポリマーを記載している。そのようなポリマーは、水性媒体中に放出されるアクロレインの重大なレベルの毒性のため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に適していない。
【００１３】
本発明者らは、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとを含む低分子量コポリマーが、コポリマーの分子量が１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下に制限されるように調製され得ることを見出した。さらに、本発明者らは、低分子量コポリマーは、アクロレインモノマーを放出することなく、非経口感染の治療にとって強力な抗菌活性をもたらすことを発見した。実際に、より高分子量のアクロレインポリマーと比較して、活性が向上したことが見出されている。
【００１４】
本明細書における本発明の背景の説明は、本発明の文脈を説明するために含まれている。これは、いずれの参照資料も、いずれの特許請求の優先日時点で、公開されていた、知られていた、または技術常識の一部であったことの承認として解釈されるべきではない。
【発明の概要】
【００１５】
したがって、本発明者らは、被験体における非経口感染の治療方法であって、被験体に、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）とを含むコポリマーを投与する工程を含み、コポリマーが１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する方法を提供する。
【００１６】
一組の実施形態では、本発明者らは、被験体における非経口感染の治療方法であって、被験体に、ポリアクロレインオリゴマーセグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）とを含むコポリマーを投与する工程を含み、コポリマーが１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する方法を提供する。
【００１７】
また、被験体における非経口感染の治療用薬剤の製造における、ポリアクロレインオリゴマーセグメントなどのアクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）とを含むコポリマーの使用であって、コポリマーは被験体への経口投与用または非経口投与用であり、１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有するコポリマーの使用も提供される。
【００１８】
一組の実施形態では、アクロレイン由来セグメントは、ポリアクロレインオリゴマーである。
【００１９】
さらなる態様では、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）とを含むコポリマーであって、１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有するコポリマーが提供される。コポリマーは、通常、被験体における非経口感染の治療用である−予防的または治癒的治療のいずれかである。
【００２０】
一組の実施形態におけるアクロレイン由来セグメントは、ポリアクロレインオリゴマーである。
【００２１】
さらに別の態様では、アクロレイン由来セグメント（ポリアクロレインオリゴマーなど）とポリアルキレングリコールオリゴマーとを含むコポリマーの製造方法であって、ｐＨ１２以下のアルカリ性触媒と１２．０〜７．０．０のｐＨ範囲内の条件下、少なくとも２０％ｗ／ｗの水とポリアルキレングリコールオリゴマー（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）とを含む水溶液中で、少なくとも４、好ましくは少なくとも１０のポリアルキレングリコール／アクロレインの重量比で、アクロレインとポリアルキレングリコールオリゴマーとを共重合させる工程を含む方法が提供される。
【００２２】
（定義）
用語「体」は、ヒトおよび／または動物の身体を意味する；用語「被験体」は、被験となるそのような身体を意味する。
【００２３】
静脈内治療（略してＩＶ療法またはｉｖ療法）は、液体物質の静脈内への直接注入である。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「非経口」は、無傷の消化管を介する以外の方法で体内に取り込まれたことを意味する。つまり、通常の胃または腸内ではない；腸管ではない。
【００２５】
用語「非経口感染」は、胃腸管内ではない体内に取り込まれることによりかかる感染を意味する。そのような感染は、血管（血液／リンパ）系、生殖器−尿路を介して、肺から、外科手術、針刺しによる損傷、切傷、擦過傷などの皮膚もしくは外保護膜の破壊、または皮膚の任意の割れ目および皮膚と粘膜の間隙から起こり得る。経口投与を含む薬物投与の任意の方法により潜在的に治療され得る非経口感染（有効用量が感染部位に到達すると仮定）と−経口投与以外の投与に限定される薬物の非経口投与とが明確に区別されることが理解されるであろう。
【００２６】
細菌性病原体に言及するときに本明細書で使用する場合、用語「抗生物質耐性」または「スーパーバグ」は、細菌性病原体（すなわち、細菌病原体の非耐性株）を治療するために当技術分野で使用される抗生物質の影響に耐えることができる細菌性病原体を意味する。例えば、黄色ブドウ球菌は、メチシリンを用いて治療することができる；しかし、黄色ブドウ球菌の抗生物質耐性株である黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である。細菌株はよく見られるが、黄色ブドウ球菌：ＵＳＡ：３００は、典型的には免疫不全または感染しやすい環境にいる人に感染する。感染は、多くの場合、小さな切傷や傷から体内に入る。ＵＳＡ：３００に関連するその他の症状は、肺炎、壊死性筋膜炎、心内膜炎、および骨および関節の感染である。
【００２７】
用語「経肺投与」は、本発明の製剤の吸入による肺への投与を意味する。
【００２８】
用語「全身性」は、疾患もしくは障害、もしくは元の感染部位から離れた元の損傷部位を意味する、または生物の体全体を含む。用語「局所」は、したがって、本明細書で元の感染部位に関して使用される。したがって、全身性感染は、病原体が、器官または血液中に見出されるものであり（菌血症を含む）、敗血症などの深刻な生命を脅かす可能性のある疾患と関連し得る。局所感染は、病原体が、肺や創傷部位などの感染の局所的な組織までしか移動していないものである。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語「吸入」は、空気の肺の肺胞への取り込みを意味する。特定の実施例では、取り込みは、吸入しながらの本発明の製剤の自己投与により、または人工呼吸器を介する投与、例えば、人工呼吸器をつけている患者への投与により起こり得る。本発明の製剤に関して使用される用語「吸入」は、「経肺投与」と同義である。
【００３０】
用語「治療」および「治療する」は、予防、治療および治癒も包含することが意図される。したがって、一態様では、治療は、抗生物質耐性菌に関連する病状、疾患、もしくは障害（例えば疾患、病状、または障害に関連する症状）の発症を予防するまたは遅延させるまたは遅らせることを含む。別の態様では、治療は、抗生物質耐性菌に関連する既存の症状、疾患、または障害（例えば疾患、病状、または障害に関連する症状）を治療する（例えば発症を最小化するもしくは軽減させるもしくは遅らせるまたは改善する）ことを含む。一実施形態では、治療は、病状、疾患、または障害の治癒を提供する。
【００３１】
語句「薬学的に許容される担体」は、本明細書で使用する場合、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、もしくは溶媒封入物質などの薬学的に許容される物質、組成物または運搬体を意味し、対象コポリマーおよび／または組成物を、１つの器官もしくは身体の一部から別の器官もしくは身体の一部に運搬もしくは輸送することに関与する。各担体は、製剤の他の成分と相性がよく、患者に過度に有害でないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として働くことができる物質のいくつかの例には：ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝溶液；ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；ならびに医薬製剤において使用されるその他の非毒性で相性のよい物質。
【００３２】
コポリマーは、治療効果のある（または「薬学的に有効なもしくは活性な」）量で使用され、非経口感染の治療を提供し得る。その量は、経口、筋肉内、静脈内、吸入または経皮投与などの投与様式に依存することになる。語句「治療有効量」は、本明細書で使用する場合、コポリマーおよび／もしくは組成物、物質、または動物の細胞の少なくとも亜集団において、任意の医学的治療に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で所望の治療効果をもたらすのに有効であるコポリマー組成物を含む組成物の量を意味する。治療有効量は、細菌生存を、少なくとも細胞のサブセットにおいて阻害するのに十分な量である。したがって、治療有効量は、疾患の進行を予防または最小化する。疾患の進行は、集団研究、個人での制御観測、またはその両方の組み合わせに基づいて予想される疾患の進行と比較して監視することができる。
【００３３】
用語アクロレイン由来セグメントは、１個以上のアクロレインモノマー残基を含むコポリマーセグメントを意味する。
【００３４】
用語オリゴマー、ポリアルキレングリコールオリゴマーおよびポリアクロレインオリゴマーは、少なくとも２個のモノマー単位、好ましくは少なくとも３個のモノマー単位からなるポリマーを意味する。オリゴマーは、典型的には２〜２０個のモノマー単位を含むことになる；一実施形態では、単位数は２〜１０個である。
【００３５】
用語「モノマー単位」および「モノマー残基」は、アクロレインおよびポリアルキレングリコールなどの反応性モノマーから誘導されるコポリマー中に存在する単位を意味する。
【００３６】
多分散指数は、ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）対ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）の比である。ポリマーの重量平均分子量および数平均分子量は、高速液体クロマトグラフィーなどの分析法により決定することができる。一旦重量平均および数平均分子量が決定されると、多分散指数は、重量平均分子量を数平均分子量で割ることにより、Ｍｗ／Ｍｎにより容易に計算される。仮定上単分散のポリマーは、１．０００の多分散指数を有する。しかし、市販の樹脂などの典型的な市販のポリマーは、１０以上の多分散指数を有する。広い分子量分布のポリマーは高い多分散指数を有し、狭い分子量分布のポリマーは低い多分散指数を有する。
【００３７】
敗血症は、血液またはリンパ系内を含む循環系における感染性微生物が免疫系を圧倒し、もはや微生物を、それらが増殖するよりも速く循環血液から除去することができない場合に生じる転移性感染および炎症プロセスである。敗血症に発展する感染の最も一般的な原因は、菌血症、性器−尿路感染、肺炎、蜂巣炎、傷および膿瘍、副鼻腔炎、髄膜炎、および外科手術（胃腸管までを含む）、または感染部位である。
【００３８】
本明細書を通して、用語「含む」または「含んでいる」またはその文法的な変形の使用は、既述の特徴、整数、工程または構成要素の存在を特定すると解釈されなければならないが、特に言及されていない１つの以上の他の特徴、整数、工程もしくは構成要素またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】実施例５の実験手順に従ってバクテリアを感染させた１２〜２４時間後の２組の１０匹のマウスの血液中の化膿連鎖球菌の発生率（ｃｆｕ／ｍＬ）のパーセンテージ比のグラフである。１組のマウスを、感染の１５分後の時点で比較例１のコポリマーで処置し、もう一方の組を、処置の代わりに生理食塩水を与えて未処置（陰性対照）とした。
【図２】実施例６の実験手順に従って、それぞれ１０匹のマウスである３つの群のマウスの、８日後の淘汰率を比較する棒グラフである。黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）で感染させる１０分前に、３組のマウスに、実施例１の本発明のコポリマーＭＷ５００；マウスの１３２ｍｇ／ｋｇ、陽性対照オキサシリン、５００ｍｇ／ｋｇ、および陰性対照生理食塩水を投与した。
【図３】それぞれ１０匹のマウスからなる２つの群の、１０日間にわたる健康スコア（健康スコアの説明についてはパラグラフ１７６を参照）のグラフであって、両群ともコポリマーＭＷ５００；実施例１（Ｅｘ１）；マウスの１３２ｍｇ／ｋｇで処置した；第１の（「感染」）マウス群を黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）に感染させ、第２の（「未感染」）群は細菌に感染させなかった。グラフは、実施例７の結果を示す。
【図４】黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）に感染した各１０匹のマウスの２つの群であって、２４時間後、それぞれマウスの１３２ｍｇ／ｋｇの実施例１のコポリマーＭＷ５００、またはマウスの１６７ｍｇ／ｋｇの比較例１のコポリマーＭＷ２５００で治療的に処置した各群の罹患または死亡により淘汰されたマウスのグラフである。実験手順を実施例８に報告する。
【図５】黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）に感染した各１０匹のマウスの４つの群であって、２４時間後、それぞれマウスの１３２ｍｇ／ｋｇの実施例１（Ｅｘ１）のコポリマーＭＷ５００、またはマウスの１６７ｍｇ／ｋｇの比較例１（ＣＥ１）のコポリマーＭＷ２５００で、または５００ｍｇ／ｋｇの陽性対照オキサシリンで、または陰性対照生理食塩水で治療的に処置した各群の罹患または死亡により淘汰されたマウスの数を示す縦棒グラフである。実験手順を実施例９に報告する。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
治療方法は、アクロレイン由来セグメントとポリアルキレングリコールオリゴマーセグメント（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）とを含むコポリマーを投与する工程を含み、コポリマーは１５００ダルトン以下、好ましくは１０００ダルトン以下の分子量を有する。
【００４１】
アクロレイン由来セグメントは、１個以上のアクロレインモノマー残基を含み得る。一実施形態では、アクロレイン由来セグメントは、ポリアクロレインオリゴマーを含む。
【００４２】
ポリアルキレングリコールは、ポリ（Ｃ１〜Ｃ４アルキレングリコール）またはそれらの混合物もしくはコポリマーであってもよいが、一般にポリアルキレングリコールは、最も好ましくはポリエチレングリコールであり、好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量である。
【００４３】
用語ポリエチレングリコールは、好ましくはジエチレングリコールを含まないことは、当業者により理解されるであろう。平均分子量２００〜６００ダルトンのポリエチレングリコールには、公称平均分子量２００〜６００ダルトンのポリエチレングリコールが含まれ、その平均分子量は、所定値の１１０％以下および９０％以上（好ましくは１０５％以下および９５％以上）である。ポリエチレングリコールは、式Ｈ−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨである。ｎの平均値は少なくとも３であり、通常３〜１３である（ただし平均値は整数である必要はない）。ポリエチレングリコールは、商業供給業者から医薬品グレードで広く入手可能であり、平均分子量が所定値の１０５％以下および９５％以上であることを通常表す特定の公称分子量で販売されている。粘度および分子量測定方法は、ＵＳＰ  ＮＦ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １１１８０−１１８２  ［２００７  Ｅｄｉｔｉｏｎ］に開示されている。一組の実施形態では、ポリエチレングリコールは２００〜４００の分子量である。いくつかの実施形態では、ｎが３または４である式Ｈ−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｎ−ＯＨの化合物などの、エチレングリコールの特定の純粋なオリゴマーを使用することが好ましい。
【００４４】
一組の実施形態では、コポリマーの分子量（本明細書では、数平均分子量を常に意味する）は、少なくとも３００ダルトン、好ましくは少なくとも４００ダルトン、例えば４００〜１５００ダルトンであり、より好ましくは、分子量は４００〜１０００ダルトンである。
【００４５】
コポリマーは、非経口感染の治療に特に適しており、有効レベルのコポリマーを非経口感染部位に提供するのに適した多くの方法により投与され得る。治療は、予防的、治癒的であってもよく、または感染を制御するために、例えば、原因となる病原体の感受性の確認を可能にするために行われてもよい。一組の実施形態では、コポリマーは、皮膚病変、創傷、肺、または被験体の特定の器官もしくは組織におけるその他の感染部位などの局所感染部位に直接投与される。
【００４６】
別の実施形態では、コポリマーは、例えば、経口投与、吸入、経皮送達により、または血流などへの注射もしくは筋肉内注射により、または静脈内治療により、全身投与される。約８００ダルトン未満の分子量の分子は、ある程度自由に腹膜を通過することが一般的に認識されている。経口投与は、コポリマーが腸壁から全身循環へと吸収されることを必要とする。この実施形態では、経口投与されるコポリマーは、１０００ダルトン以下の分子量、例えば４００〜８００ダルトンの分子量であることが特に好ましい。この分子量のコポリマーは、経口投与した場合、全身循環に輸送され、非経口感染の治療を提供することを本発明者らは見出した。腸壁を通して吸収されるコポリマーの割合は、この範囲の低分子量のコポリマーにしては通常大きい。
【００４７】
一組の実施形態では、治療は、マウスモデルにおける実施例に示されるように、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（スーパーバグ）などの細菌による感染を防御する。結果は、１５００ダルトン未満、好ましくは１０００ダルトン未満、例えば４００〜１０００ダルトンなどの低分子量コポリマーの経口投与後のｉｎ  ｖｉｖｏ殺菌／予防または治療の有効性は、２５００ダルトンなどのより高分子量の高分子量コポリマーよりも高い有効性を提供することを実証する（図４を参照）。
【００４８】
さらに本発明は、血液中および／または重要な器官に拡がっている感染の治療（予防的または治癒的のいずれか）にも及ぶ。したがって、本発明は、経口投与または血液中への注射による非経口治療、特に静脈内注射または治療を含み、血液または腎臓、肝臓もしくは脳などの重要な器官に広がっている感染を治療する。そのような疾患には、敗血症、菌血症および髄膜炎が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＩＶ療法の使用は、重大な非経口感染へのばく露が疑われる場合および／または治療される被験体の状態が非経口感染のために急激に悪化している場合に特に重要となり得る。例えば、敗血症または菌血症と診断された場合、例えば水溶液または生理食塩水溶液としてのコポリマーでのＩＶ療法が好ましいとされ得る。
【００４９】
コポリマーは、薬学的有効量で投与され、感染部位に局所治療を提供することができ、そのような場合、投与量は、創傷感染の程度または重症度などの感染の程度および／または重症度に依存する。コポリマーは、エアロゾル、ゲル、局所用泡もしくは軟膏として塗布されてもよく、または創傷、火傷、手術部位等への適用のための包帯剤に含浸されてもよい。別の一組の実施形態では、コポリマーは、エアロゾル等を介して吸入として投与される。吸入を使用し、肺感染が治療され得る、または肺を経由して全身治療が提供され得る。
【００５０】
血液の肺炎球菌感染は、かなりの頻度の肺感染に続いて起こり、敗血症、菌血症および髄膜炎などに限られるものではないが、そのような重篤な合併症につながり得る。一組の実施形態では、コポリマーは、エアロゾル吸入などの吸入として投与される。
【００５１】
さらなる実施形態では、コポリマーは、ポリマーの浸透促進剤を含んでもよい組成物の経皮送達により投与される。パッチ、マイクロニードルなどの器具を使用し、経皮送達を促進してもよい。
【００５２】
さらなる実施態様では、コポリマーは、注射、例えば静脈内注射により投与される。
【００５３】
コポリマーは、それが可溶性であり、ｐＨ１〜１４の全域にわたって可溶性を保つため、水性組成物中に製剤化することができる。コポリマーは、既知の薬学的に許容される担体および賦形剤を含む組成物で投与され得る；しかし、水性製剤は、重要な利点を提供する。組成物は、治療される特定の感染および投与様式に応じて、広い範囲のコポリマー濃度を含み得る。一組の実施形態では、水性医薬組成物中のコポリマーの濃度は、組成物の０．０１重量％〜２０重量％である。したがって、好ましい一組の実施形態では、コポリマーは水溶液として投与される。
【００５４】
組成物は、錠剤、カプレット、シロップまたは液体の形態で経口投与されてもよく、その経口投与量は、感染の重症度および種類に依存するが、例えば、体重１キログラム当たり１日当たり１０ｍｇ〜５００ｍｇなど、体重１キログラム当たり１日当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇであってもよい。
【００５５】
コポリマーおよび治療方法の重要な利点の１つは、広範囲の病原体のから感染に対して使用されてもよく、特に、急速に進展し、菌血症または敗血症または肺炎または髄膜炎または蜂巣炎のような深刻な脅威を示す可能性のある細菌感染症の治療に有用となり得る。そのような細菌感染の具体例は、プロテウス属、セラチア属、緑膿菌、髄膜炎菌、大腸菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌属、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌および腸球菌属からなる細菌の群から選択され得る。
【００５６】
広範囲の病原体および特に広範囲の細菌に対する活性は、深刻なまたは生命を脅かす感染、例えば、感染の重症度が、原因となる細菌を適切に同定するための十分な時間を許さない場合の治療の第一線としてコポリマーが使用される。
【００５７】
アクロレインコポリマーが非経口感染に対して活性であるという本明細書の知見は、それらの活性に関連すると考えられる作用機序のため、予想されていなかった。Ｍｅｌｒｏｓｅ  １９９６は、追加タンパク質を使用して、アクロレインポリマーの抗菌活性を完全に抑えていた。先行技術の焦点は、それらの経腸の移動を防止するように十分に高い分子量を有するアクロレインポリマーの経口投与により、胃腸管における感染を治療することであった。実際、アクロレインモノマーの反応性は、アクロレインを重合させて約１，０００ダルトン以下の分子量を有する生成物を生成することが可能であると従来考えられていなかったものである。非経口感染に対する投与は、その潜在的な毒性（血清タンパク質との反応を含む）の理由のために、意図的に回避されてきた。
【００５８】
先行技術のポリアクロレインの調製では、重合の機構はアニオン性であり、アニオンの消失や生成物の解離を避けるために水分を最小限に抑える必要があると考えられた。本発明者らは、モノマーの比率を制御すること、アクロレインとポリエチレングリコールとの水での希釈を制御すること、ならびに先行技術と比べて、ｐＨをより低い範囲に保つこと−ｐＨを１２．０以下、１２．０〜７．０のｐＨ範囲に維持することにより、分子量が１０００ダルトン以下に制限され得ることを見出した。すなわち、新しい機構の重合を達成するために、ｐＨ範囲は、先行技術の重合でこれまで使用されていたものよりもｐＨを丸２単位、すなわち１００倍低いヒドロキシル−イオン濃度に低下させる。
【００５９】
一組の実施形態では、本発明は、非経口感染の治療用コポリマーの調製方法であって、ポリエチレングリコール（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量）を含む水溶液中でのアクロレインの塩基触媒重合を含み、ポリアルキレングリコール／アクロレインの比率が少なくとも４、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１０であり、水が組成物の少なくとも２０重量％の量で存在する方法を提供する。
【００６０】
好ましい一組の実施形態では、本方法は、アクロレインの水溶液を、好ましくは５０％ｗ／ｗ以下のアクロレイン濃度を有するアクロレインの水溶液を、少なくとも１０％ｗ／ｗの水を含み、ｐＨ１２．０以下、好ましくはｐＨ１１以下を有するポリエチレングリコールの水溶液に添加する工程を含む。
【００６１】
さらにより好ましい実施形態では、アクロレインは水溶液として、ｐＨ９〜１１のポリアルキレングリコールの水溶液に添加される。
【００６２】
概して、本発明者らは、本方法で使用される水性系において、比較的低いｐＨ、例えば１２．０以下、例えば１１．５以下（好ましくは１１以下）のｐＨが、アクロレインを重合するために用いた最大ｐＨ１４の先行技術のｐＨ範囲に比べて、重要な利点を提供することを見出した。先行技術において長期間使用されるような比較的高いｐＨは、酸化をもたらし、溶解性を改善するカルボキシル基を導入する。対照的に、本発明者らは、比較的高いｐＨでの長時間の加熱を必要とすることなく、溶解性が本発明の方法において提供され、結果としてカルボニルおよび／またはカルボキシル含有量は非常に低く、典型的にはコポリマーの０〜１０％となることを見出した。最小のカルボニルまたはカルボキシル含有量は、雑多な起源のタンパク質との望ましくない反応または細菌の酸性およびアニオン性コーティングに対する斥力の両方を最小限に抑え、それにより両方の場合において、抗生物質の作用を増強すると考えられる。
【００６３】
理論に拘束されることを望まないが、本発明の方法では、アルカリの存在下でのアクロレインの重合は、そのような大量の水の存在下で完全にアニオン性の機構により進行するのではなく、むしろ顕著なフリーラジカル重合機構を有する。
【００６４】
この結論は、以下の事実により支持される：（ａ）重合は、二重フリーラジカル、酸素の存在により促進されたこと（ｂ）溶媒の主成分である水は、アニオンクエンチングすること（ｃ）重合は、周囲温度およびそれ以上の温度で顕著であり−速く、発熱して、典型的なフリーラジカル阻害剤のヒドロキノンにより阻害されること  −  全ての観察は、イオン重合ではなくフリーラジカル重合の典型である（Ｆｌｏｒｅｙ；Ｏｄｉａｎ）。再び、理論に拘束されることを望まないが、反応機構は、酸素とヒドロキシルイオンとの間に開始剤−ラジカルの形成を伴い、ポリエチレングリコール溶媒へのラジカル転移が続き、重合を開始させる；次いで、溶媒−ヒドロキシルを含む溶媒移動停止が続き、コポリマー中のカルボニルに隣接する活性ラジカル部位で重合するアクロレイン残基の数を制限すると考えられている。
【００６５】
ポリアルキレングリコールオリゴマーは、連鎖移動および／または連鎖停止、それによる制限（水性希釈と共に）、全体のヒドロキシル含有量に直接比例する分子量を提供すると考えられる。
【００６６】
概要では、理論に拘束されることを望まないが、合成の中心戦略は−先行技術（Ｍｅｌｒｏｓｅ  ２００９）とは異なり、得られたコポリマー生成物の２つのセグメントを、求核性マイケル付加によってではなくフリーラジカル機構によって進行すると考えられる機構により結合させる。これは、増殖するフリーラジカル活性中心の形成を最大化することにより（ラジカル、酸素の存在を最大にすることにより）−およびｐＨを最小にすることにより、求核性マイケル付加のための水素イオン欠損活性中心の形成を最小にすることにより行われる。
【００６７】
活性コポリマーの抗菌性は、ＨＰＬＣにより、アミノ酸モデルシステイン（スルフヒドリル）またはスレオニン（ヒドロキシル）のいずれかとの重要でない反応を有することが示され、およびコポリマーの抗菌活性は、コポリマー内の同定された近接炭素での非共有結合的な物理的疎水性効果のみに起因し、細菌の外膜の安定性に起因し得る。先行技術における作用機構は、修飾ポリアクロレイン中のカルボニル基とタンパク質との化学反応に依存しており、したがって、本発明のコポリマーの抗菌活性の原因とは考えられていない。
【００６８】
アクロレインポリマーのタンパク質との破壊的反応性を教示する先行技術とは対照的に、本発明者らは、コポリマーの抗菌速度はタンパク質の存在により著しく低下しないことを発見した。実際、ほとんどの細菌、特にクロストリジウム・ディフィシル、黄色ブドウ球菌および緑膿菌について、純殺菌速度（総殺菌−総増殖）は向上した−タンパク質が、標的微生物の増殖を促進した培養液であった場合でも（表２を参照）。本発明者らは、コポリマーの抗菌速度は、毒性をもたらすタンパク質との血管内化学反応、またはｉｎ  ｖｉｖｏ除去プロセスと競合する以上に十分に速いことを発見した。先行技術の観点では、一貫して、これらの観察および結論は、本明細書のようにコポリマー（実施例１のコポリマーなど）を合成してその後非経口的に使用する進行に反直観的である。
【００６９】
本発明者らはさらに、コポリマーは、原核生物に対して見られる高いレベルの活性と比較して、真菌などの真核細胞に対してより遅い抗菌殺傷速度を示すことを発見した。本発明者らは、哺乳動物内の血管および胃腸細胞は真核性であり、この観察は、コポリマーによる細菌の細胞およびその他の細胞間での反応性の選択性を求める本発明の設計に内在的であることに注目した。
【００７０】
本明細書に開示されたコポリマーは、先行技術からのアクロレインポリマーよりもはるかに毒性の低い血管内ばく露を表す。本発明者らは、コポリマーは、低い多分散性で調製されてもよく、好ましくは５未満、より好ましくは２未満、最も好ましくは１．５未満、さらにより好ましくは１．２未満の低い多分散性は、特に分子量が１０００未満、例えば４００〜１０００ダルトン、より好ましくは４００〜８００ダルトン、例えば４００〜６００ダルトンである場合にコポリマーの性能を高めることを見出した。本発明のポリマーは、約１の多分散指数を有する細くて対称な単一ポリマーとして調製することができる。前述したアクロレインポリマーは、概してより高い多分散性を含み、または国際公開第０９／０５９３５０号パンフレットの実施例６のポリマーの場合には、非常に高感度のＵＶ検出においては、約１％、および広範囲の低分子量ポリマー／残基の約８倍を含み、これは屈折率検出から容易に検出することはできない。本明細書のコポリマーは、１に近い多分散性の狭い分子量分布で、定量的に形成され得る。コポリマーは、先行技術の著しく加熱され、自動酸化されたアクロレインポリマーよりはるかに少ない潜在的に有毒な混入物質（残留物、催涙性アクロレインを含む副生成物および出発物質）を含む。本発明の好ましい実施形態では、塩基性触媒による調製に使用されるカルボニル含有量およびｐＨは、いずれもこれまでにない最小限度である−両方の因子を使用して、特にカルボニルとのカニッツァーロ反応からの副生成物およびそれらの潜在的な毒性を最小化し、その先行技術はアクロレインポリマーにおいて異常に急速であることが判明している。
【００７１】
コポリマーは、部位に対して活性な抗菌活性を有することが見出されており、これは突然変異にかかわらず、全ての細菌に共通している。この結論は、表２（コポリマーが、天然または突然変異スーパーバグ形態にある細菌とは無関係に、同じ抗菌速度−活性を有することを示す）、および表３（反復使用によるアモキシシリンの不活性を引き起こした突然変異とは無関係に、抵抗性が生じないことを示す）の様々な代表的細菌からの結果から引き出される。これは、全種類のおよび抗菌剤耐性を発現する傾向を示す細菌からの、被験体における感染の治療および予防の新規で一般的なおよび成功した方法を表す。
【００７２】
アクロレインモノマーに加えて、その他のモノマー、例えば、アクリル酸、アクリルアミド、アクリロニトリル、塩化ビニル、スチレン、メタクリル酸、メタクリル酸メチル、酢酸ビニル、ビニルピリジンおよびビニルピロリドンを追加モノマーとして、ポリアルキレングリコールオリゴマーセグメントとアクロレイン由来セグメントとを含むコポリマーの製造において本明細書に記載のように使用してもよい。追加モノマーは、コポリマーの抗菌活性に有害ではない量で存在し得る。モノマーの比は、コポリマーの水溶性を維持するように選択することができ、他のモノマーの取り込みは、モノマー反応性を考慮した反応条件および相対モノマー濃度により制御され得る。概して、他のモノマーは、コポリマーのモノマー残基の１５モル％以下、好ましくは１０モル％以下を構成することが好ましく、最も好ましくは、コポリマーはポリアルキレングリコールおよびアクロレインモノマー残基のみからなる。
【００７３】
本発明のコポリマーの特徴である疎水性機構は、分子量；抗菌反応の細菌細胞との真核細胞を上回る親和性；タンパク質の存在下で増強された抗菌活性；ならびにコポリマー中のカルボニルおよびカルボキシル含有量の両方の最小化、を制御する処置工程により達成される。
【００７４】
本明細書で提供されるコポリマー抗生物質は、一般に、耐性であろうと非耐性であろうと広範囲の細菌に対する有効性を示し、確実に活性を提供する。活性は、ある特定の細菌に対する特定の抗生物質の活性を超えても超えなくてもよいが、本明細書では、細菌、特に感染性疾患の現代の重大な深刻化に関係する耐性細菌の範囲に対する抗生物質活性の確実性は、全ての種類の細菌感染の適切な治療に対して、より重要で貴重な信頼性を提供する。従来の抗生物質と同じレベルの信頼性は、第一に感染に存在する細菌に関する同一性および病状の決定を必要とし−そしてようやく、残りの活性抗生物質からの選択が必要となる。
【００７５】
好ましい一組の実施形態では、本発明のコポリマーの製造方法は、以下の工程を含む：
弱塩基性（好ましくは１２．０以下のｐＨ；より好ましくはｐＨ９〜１１）の、ポリアルキレングリコール（好ましくは２００〜６００ダルトンの分子量のポリエチレングリコール）の水溶液を供給する工程；
弱塩基性溶液を激しく撹拌し、空気を混入させる工程；（好ましくは徐々に、少なくとも２分間、より好ましくは少なくとも５分間などの時間をかけて）アクロレインを、５０％ｗ／ｗ以下の濃度のアクロレイン水溶液の水溶液として添加する工程（通常防腐剤を含有する）；
反応温度を１０℃〜４０℃に維持する工程；
アクロレインモノマーが消費された後、酸を加えてｐＨを９未満、好ましくは８以下にする工程。
【００７６】
得られたコポリマーの分子量は、ポリアルキレングリコールの分子量により制御され、またそのヒドロキシル濃度に直接比例する（重合は周囲温度で始まり、次に発熱重合としてわずかに上昇する−これは外観から明らかであり、その後、保存料から黄色の消失が進行する）。
【００７７】
反応中、好ましくは撹拌を継続し、必要な場合にのみ、ｐＨを弱塩基性（好ましくは１２．０以下のｐＨ、より好ましくはｐＨ９〜１１）に維持する。分解／副反応を低下させ、生成物中のカルボニルまたはカルボキシル形成を減少させるために、さらなる塩基の添加およびその濃度は、最小限に抑えられる。
【００７８】
最後に、溶液のｐＨを低下させてもよい。好ましい一組の実施形態では、ｐＨは、酸の添加により中性付近に調整される。アクロレインの非常に強い匂いは、少なくとも９９％の収率で形成されたコポリマー生成物においてはもはやはっきりしない。
【００７９】
得られたアクロレインコポリマーは、典型的には２５０〜１０００ダルトン（３００〜１０００ダルトン、４００〜１０００ダルトンまたは４００〜８００ダルトンなど）の分子量を有する。コポリマーは、任意の含有量のポリアクロレインから予想されるように、濁りがない。アクロレイン由来セグメントとポリエチレングリコールオリゴマーセグメントとの含有量および結合は、先に提案した方法において、全てのコポリマーのサイズ分離−ＨＰＬＣにより実証される−それぞれ１つの、単一の、細くて、対称的で、主要な、および分解不可能な質量ピークを有する−残留アクロレインモノマーまたは実質的なポリアクロレインのいずれも示すことなく；さらに、実施例２からのコポリマーＭＷ１０００は、分解可能な変化および予想に反して、セグメント間の関連性が単に物理的相互吸着であった場合、ポリエチレングリコールＭＷ２００との平衡後、全てのコポリマーの元の調製に使用されたものに匹敵する塩基性条件下で、サイズ分離−ＨＰＬＣおよび抗菌活性において変化しなかった（実施例２を参照）。
【００８０】
コポリマーの製造に使用されるアクロレイン：ポリエチレングリコールの重量比は、好ましくは１：４〜１：４０、より好ましくは１：８〜１：２０である。
【００８１】
好ましい塩基は、水酸化アルカリの水溶液であり；より好ましくは、水酸化アルカリは水酸化ナトリウムである。
【００８２】
好ましい酸は希塩酸であるが、酢酸はｐＨ緩衝目的に有用である。
【００８３】
アクロレインのポリアルキレングリコールの水溶液への添加に約１０分かけ−反応が完了するまで、および酸の添加は典型的には約４０分、好ましくは９０分以下で行われることが好ましい。
【００８４】
典型的には、本発明者らは、コポリマー生成物への実質的に完全な変換を得るのに５０分の反応時間が適切であることを見出した。
【００８５】
アクロレインは、好ましくは、水性ポリアルキレングリコールに水溶液として−より好ましくは、水性ポリアルキレングリコール溶液に添加される水性アクロレイン溶液の重量に基づいて、アクロレインモノマーの１０重量％〜３０重量％の濃度で添加される。
【００８６】
得られたコポリマーは、１０％未満、より好ましくは５％未満、さらに好ましくは０％の反応性カルボニル基含有量（加えて任意のカルボキシル含有量）を有する。
【００８７】
アクロレイン溶液は、通常、阻害剤のヒドロキノンを、０．５％以下、典型的には０．０１〜０．５％、より好ましくは０．１％ｗ／ｗで含有する。
【００８８】
本明細書のコポリマーは、様々な組成物および物理的形態に含まれ得ることは、当業者には明らかであろう。特に、組成物およびｉｎ  ｖｉｖｏでの薬学的な使用方法は、コポリマーのより遅いクリアランスをうまく利用していることは明らかであろう。また、分子量の差異の薬理学的利点を利用して、膜、組織および器官を通る浸透速度−そしてヒトまたは動物体内で得られる吸収または分布が調節され得ることは明らかであろう；この文脈において、１０００ダルトンを超える分子量のコポリマーよりも低い分子量のコポリマー、例えば４００〜８００ダルトンなど。
【００８９】
本明細書の結果を考慮すると、タンパク質、特に培養液を添加して、使用中のコポリマーの抗菌活性を高めることも考えられる。
【００９０】
本明細書の主題の生成物は、水溶性であり、ヒト／動物への投与は、医学的に知られている通常の方法により−特に、経口または注射により行われ−そして実用的な薬学的方法で、単独でもしくは組成物中で、器官および組織内で、もしくは接触で、またはヒトもしくは動物のいずれかのｉｎ  ｖｉｖｏ血管系において使用することができる。コポリマーをヒトおよび動物に投与する場合、それ自体を与えることができ、または、例えば０．１％〜９９．５％（より好ましくは０．５％〜９０％）の活性成分を含む医薬組成物として、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与することができる。
【００９１】
組成物は、薬理学的有効量のコポリマーを含む固体、溶液、ゲル、エマルジョンまたは懸濁物であってもよい。
【００９２】
コポリマーおよびそれらの組成物は、特に、細菌黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌に対して実質的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を有するが、真菌アスペルギルス・ブラジリエンシスおよびカンジダ・アルビカンスに対しては、低い活性を有する。
【００９３】
抗生物質に対する細菌耐性の世界的な問題のために特に重要であるが、コポリマーは、大腸菌、黄色ブドウ球菌または緑膿菌のいずれかへの反復ばく露に対して、アモキシシリンよりも抗菌安定性を有する。コポリマーは、連続世代の細菌からの異常な抵抗性を示すことなく、正常におよび通常通りに、大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の「スーパーバグ」を殺菌した。
【００９４】
これら３つの細菌、大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌に対する最小殺菌濃度は、コポリマーの実用範囲１〜２００ｐｐｍであった。
【実施例】
【００９５】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに説明する。
【００９６】
実施例は、本発明の例示のために提供されるものであり、それらは本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。
【００９７】
実施例１および比較例１からのコポリマーは、最小殺菌濃度、広いスペクトルの殺菌速度−タンパク質−培養液の存在下でより速い、およびそれらに対するスーパーバグの発現への抵抗性の抗菌特性を有する。（表１、２および３を参照）。肺膜を介した吸着による送達の文脈では、低ＭＷコポリマーが、マイコバクテリウム・フォーチュイタム−結核を引き起こす細菌モデルを殺菌することができることは興味深く、比較例１からのコポリマーＭＷ２５００は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗菌活性を有する（図１および４）。しかし、表２から注目すべきことは、それは実施例１からの低いＭＷ５００よりも速い／活性なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を−ｉｎ  ｖｉｖｏでは常に−予防的または治癒的に有するが（例えば、図４および５を与える実験において）、その性能は著しく鈍い−そしてより小さいコポリマーが有効であるまたは陽性対照よりも有効であるということである。すなわち、本発明による低分子量コポリマーの合成および使用は、比較例１からのコポリマーよりも顕著な特質および利点を与えていた；さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでのより小さいコポリマーのこの特質ならびに利点は、先行技術、および大きなコポリマーの優位性を示す最初に作製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に対して直観に反しており、この段落で説明される。
【００９８】
マウス体内ｉｎ  ｖｉｖｏでは、信頼水準ｐ＞０．０１で、実施例１からのＭＷ５００のコポリマーは、マウスの１３２ｍｇ／ｋｇでの単回投与後、被験体の血液および腎臓における予防的および治癒的抗菌活性の両方を含むプロトコルにおいて、スーパーバグメチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００を効果的に殺した；それは、細菌がその好ましい部位（腎臓）に感染として広がる前の初期の時期の、血液中での予防的保護の適用を示し、そこから治癒療法が行われる。（図１参照）。
【００９９】
（微生物）
本発明において実験的に使用され、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（オーストラリア）により提供された微生物は、大腸菌（ａｔｃｃ  ２５９２２）、緑膿菌（ａｔｃｃ  ２７８５３）、β−ラクタム耐性肺炎桿菌（ａｔｃｃ  ７００６０３）、黄色ブドウ球菌（ａｔｃｃ  ２５９２３）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ａｔｃｃ  ４３３００）、化膿連鎖球菌（ａｔｃｃ  １９６１５）、大便連鎖球菌（ａｔｃｃ  ２９２１２）、バンコマイシン耐性大便連鎖球菌（ａｔｃｃ  ５１２９９）、クロストリジウム・ディフィシル（ａｔｃｃ  ９６８９）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（ａｔｃｃ  ６８４１）、アスペルギルス・ブラジリエンシス（ａｔｃｃ  １６４０４）およびカンジダ・アルビカンス（ａｔｃｃ  １０２３１）であった。
【０１００】
（カルボニル含有量の推定値）
本明細書で報告されるカルボニル含有量の推定値は、確立された方法（Ｐｅｔｅｒｓ  １９６２；  Ｍｅｌｒｏｓｅ  ２００９）に基づく。二重に、コポリマー（１ｇ）の水性試料溶液を、０．０１ｇの精度で秤量した−水（９ｇ）を添加し、０．０１Ｍ塩酸または０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液のいずれかを適宜加え、溶液をｐＨ６．００にした。
【０１０１】
ヒドロキシルアミン塩酸塩の１％溶液（５０ｍＬ）を、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．００にした。
【０１０２】
上記コポリマーおよび試薬の溶液を混合し、室温で３０分間放置した；反応液を、０．０１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（ＶｍＬ）で逆滴定し、ｐＨ６．００にした。
【０１０３】
したがって、元の試料溶液（Ｗｇ）のＷ／Ｗ％カルボニル含有量は、アクロレインとして推定され、Ｖｘ０．１０ｘ５．６／Ｗに等しい。
【０１０４】
（ＨＰＬＣによるコポリマーの定量分析）
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、屈折率検出器およびＵＶ（２６８ｎｍ）検出器の両方を同時に使用して、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ装置で実施した；カラムは、サイズ排除による分離用の、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  １２０またはＷａｔｅｒｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２５０のいずれかまたは両方（直列）であった。
【０１０５】
ＭＷ較正を、平均ＭＷ範囲２００〜１０，０００ダルトンのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈポリエチレングリコールの排除時間対ｌｏｇ  ＭＷの直線プロットにより行った。したがって、決定方法からすると、この基準に基づいて常に決定され、本明細書に記載されるアクロレインポリマーの分子量は、常に数平均分子量（５００ダルトンに最も近い値に補正された）を意味することになる。
【０１０６】
溶質の水溶液（０．０２０ｍＬ；０．４％ｗ／ｗ）に対して、水溶媒（０．６ｍＬ〜１．０ｍＬ／分）で分離を行った。
【０１０７】
（質量分析によるコポリマーの定量分析）
２つの別々の技法（島津科学機器（オセアニア）株式会社の提供による）を実施した：
・事前クロマトグラフィーなしでの質量分析計への直接注入；
・事前クロマトグラフィー後の質量分析
装置；実験条件は、以下であった：Ｎｅｘｅｒａ  ＵＨＰＬＣバイナリー高圧勾配、およびＬＣＭＳ−８０６０（Ｑ３スキャンで実行され、単一四重極質量分析をシミュレートする）；水中０．０２％ギ酸、およびアセトニトリル中０．０２％ギ酸に等量の移動相、ならびにカラムＰｈｅｍｏｎｅｎｅｘ  Ａｅｒｉｓ  ＸＢ  Ｃ１８  ３００Ａ  １５０ｘ２．１ｍｍ。
【０１０８】
（ポリマー溶液の定量的ＵＶ／可視分析）
分析用溶液を、コポリマー（２５０ｍｇ）の水（２０ｇ）中での希釈により調製し、その後、適用可能ならば、化学量論的モル当量の反応液となる；その後、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶｍｉｎｉ−１２４０装置でＵＶスペクトルを取る前に、水で１：９に希釈した。
【０１０９】
（実施例１および比較例１）
この実施例は、ポリアクロレインオリゴマーセグメントと、分子量２００ダルトンのポリエチレングリコールオリゴマーセグメントとを含む、約５００ダルトンの分子量の本発明のコポリマーの製造を記載している。コポリマーは、ｐＨ１２．０の調製物から意図的に例示されており、これは確実な成功のために推奨される最も高いｐＨであるため、本明細書に記載されるような望ましくない副反応のレベルを導入することはない。コポリマーの抗菌活性を、分子量約２５００ダルトンの対応するコポリマーの抗菌活性と比較する。
【０１１０】
（実施例１−ＭＷ約５００ダルトンのコポリマーの製造）
水（２０ｇ）中の蒸留したてのアクロレインの溶液（５ｇ；ヒドロキノン０．１％ｗ／ｗで阻害）を、水（２０ｇ）と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨ１２にしたポリエチレングリコール（６０ｇ；ＭＷ２００）との溶液に１０分かけてゆっくりと添加した；その１０分の間に、酸化ヒドロキノンの黄色が速やかに現れ、その後消失した。この製造過程中、組成物を連続的かつ激しく撹拌して空気と多く接触させた。発熱および急速な重合が起こり、反応液の温度を約２５℃〜３５℃に維持した。
【０１１１】
さらに５０分後、その透明溶液を１Ｍ塩酸水溶液の添加によりｐＨ７．５に調整した；生成物は透明で、ほぼ無色（非常に淡い黄色）の溶液であった。本明細書の試料および結果について行われた全ての試験は、精製なしで４または６年間７℃で保存されていた試料で行った；これは、生成物の高純度および高安定性を示すものとみなされる。
【０１１２】
生成物のＵＶ−可視、２００〜６００ｎＭスペクトルは、２００〜３００ｎＭ領域の遠端において実質的な吸収を有するのみであった。これは、カルボニルと共役し、マイケル反応の傾向に関連し得る無視できる含量の不飽和と一致する。
【０１１３】
ＨＰＬＣは、重合収率が９９〜１００％ｗ／ｗであり、任意の残留アクロレイン−モノマーが１ｐｐｍ  ｗ／ｗ未満であることを示した；ＭＷは約５００ダルトンであった。質量分析は、塩基が３１２の基準ピークを示し、コポリマーが２つの２−プロパナール（例えばアクロレイン）残基に直線状に共有結合した５つのオキシエチレン（例えばＰＥＧ）残基を含むことを示した。
【０１１４】
ｐＨ１まで（およびｐＨ１４まで）試験したところ、コポリマーは可溶性のままであった。コポリマーは、約０〜１０％ｗ／ｗのカルボニル含有量またはカルボキシル含有量を有する。
【０１１５】
ＨＰＬＣにおける生成物の単一ピークは、ＨＰＬＣが水中で１ｍｌ／分で、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  １２０、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２５０上で、単独で、またはいずれかの連結で、交互配列で行われたかどうかにかかわらず、細く、未分解のままであった。
【０１１６】
同じ調製結果は、重合がｐＨ８またはｐＨ１０のいずれかで行われた場合に、常に大腸菌に対して全く同じｉｎ  ｖｉｔｒｏ微生物学的速度結果で、および同じＨＰＬＣ結果で生じた（ｐＨ８は、１％ｗ／ｗ未満の総量のアクロレインのダイマーまたはオリゴマーを示す物質の量を有する生成物をもたらしたことを除いて；ｉｎ  ｖｉｖｏ微生物学的速度試験は、全ての生成物で同じであった。
【０１１７】
実施例１の調製を、種々のｐＨ８〜１２、別々にｐＨ８、ｐＨ１０およびｐＨ１２などで、本出願人の実験室の他のメンバーにより独立して数回繰り返し、同一の重合結果、ＨＰＬＣおよび大腸菌に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ速度試験結果をもたらした。
【０１１８】
（比較例１−分子量約２５００ダルトンのコポリマー）
この例は、分子量２０００のポリエチレングリコールセグメントを含む、より高い分子量である２５００ダルトンの、本発明のものではないコポリマーの調製を記載する。
【０１１９】
水（２０ｇ）中の蒸留したてのアクロレインの溶液（５ｇ；ヒドロキノン０．１％ｗ／ｗで阻害）を、水（３０ｇ）と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨ１１にしたポリエチレングリコール（２０ｇ；ＭＷ２，０００）との溶液に１０分かけてゆっくりと添加した；この間に、酸化ヒドロキノンの黄色が速やかに現れ、その後消失した。その組成物を、添加前および添加中に激しく機械的に撹拌して空気と多く接触させた。発熱および急速な重合が、２５℃〜３５℃に維持した温度で起こった。
【０１２０】
さらに５０分間撹拌した後、透明溶液を１Ｍ塩酸水溶液の添加によりｐＨ７．５に調整した；生成物は透明で、ほぼ無色（非常に淡い黄色）の溶液であった。
【０１２１】
先行技術における全てのポリアクロレイン生成物と共通して、比較的高い分子量の生成物による寒天を介した拡散に対する抵抗のために、微生物学的分析の寒天拡散技術はここでは使用されないことは注目に値する。
【０１２２】
本明細書に記録された試料およびそれらの結果について行われた全ての試験は、精製なしで４〜６年間７℃で保存されていた試料で行った；これは、生成物の高純度および高安定性を示すものとみなされる。
【０１２３】
生成物のＵＶ−可視、２００〜６００ｎＭスペクトルは、２００〜３００ｎＭ領域の遠端において実質的な吸収を有するのみであった。
【０１２４】
ＨＰＬＣは、重合収率が９９〜１００％ｗ／ｗであり、任意の残留アクロレイン−モノマーが１ｐｐｍ  ｗ／ｗ未満であることを示した；ＭＷは約２，５００ダルトンであった。ｐＨ１まで（およびｐＨ１４まで）試験したところ、ポリマーは可溶性のままであった。ポリマーは、約０〜１０％ｗ／ｗのカルボニル含有量を有する。
【０１２５】
ＨＰＬＣにおける生成物の単一ピークは、ＨＰＬＣが水中で１ｍｌ／分で、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  １２０、Ｗａｔｅｒｓ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２５０上で、単独で、またはいずれかの連結で、交互配列で行われたかどうかにかかわらず、細く、未分解のままであった。
【０１２６】
本明細書に記載の重合機構に基づいて、重合に添加されたアクロレインモノマーの当量（ポリエチレングリコールの当量との関係で）は、比較例１の場合に、実施例１よりも大きいと計算することができ、したがって、不溶性ポリアクロレインを形成する傾向が前者ではより大きいが、７℃／６年間放置した後でも観察されなかった。アクロレイン−ポリマーの希釈溶液を希塩酸でｐＨ２．５に段階的に酸性化し、希釈水酸化ナトリウム溶液で逆滴定するとカルボキシル基が存在しないことが示された（ｐＫａ＝４．５）。
【０１２７】
（実施例１および比較例１からのコポリマーの最小殺菌濃度の推定）
コポリマーの連続希釈を行った。二重に、その後各希釈液に細菌を接種して約１０６ｃｆｕ／ｍＬとし、ｐＨ６．５〜７．０、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１２８】
各溶液からアリコート１ｍＬを取り出し、トリプチカーゼ大豆培養液のアリコート１ｍＬと１分間混合し、その後滅菌水８ｍＬを加えて混合した。アリコート（１ｍＬ）をその後各溶液から取り出し、フラッディングによりウマ血液寒天プレート上にローン接種し、２４時間または４８時間３７℃でインキュベーションした。プレート上の細菌増殖（コロニー形成単位；ｃｆｕ）を目視で数えた。
【０１２９】
比較例１および実施例１のコポリマーの最小殺菌濃度を様々な細菌に対して測定し、その結果を表１に示す。
【表１】
0006605602.tif 000002
【０１３０】
各組成物の微生物学的アッセイは、８０℃／４年のエイジング、または疑似胃内酸性条件へのばく露のいずれにおいても変わらなかった（実施例４を参照）。
【０１３１】
実施例１および比較例１のコポリマーのそれぞれは、細菌黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、緑膿菌に対しては実質的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を有するが、真菌アスペルギルス・ブラジリエンシスおよびカンジダ・アルビカンスに対しては低い活性を有する。
【０１３２】
両コポリマーは８℃での４年後でも依然として安定であり、疑似ｐＨ条件に対してヒトの胃に滞留する時間中は安定であった。
【０１３３】
生菌（１ｍＬあたり約１０ｘＥ６細胞を生じる）を、滅菌水（２０ｍＬ）中、ｐＨ６．５〜７．０の実施例１のコポリマー（３８３ｍｇ；アクロレインに対して５．４％ｗ／ｗ）または比較例１のコポリマー（３０３ｍｇ；アクロレインに対して６．７％ｗ／ｗ）の水溶液に添加した；対照溶液はアクロレイン生成物を全く含まなかった。必要に応じて、反応液にトリプチカーゼ大豆培養液（１ｍＬ）を直ちに添加した。
【０１３４】
時間間隔で、アリコート（１ｍＬ）を等容積のトリプチケース大豆培養液増殖培地と１分間、次いで水（８ｍＬ）と混合した後−アリコート（１ｍＬ）を寒天生育プレート上に画線またはローン接種し、３０℃または３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＦＵを数えた。
【０１３５】
結果を表２に示す。
【表２】
0006605602.tif 000003
【０１３６】
（コポリマーの抗菌活性はｐＨと共に増大したため、ｐＨ６．５〜７．０の間で全ての観察がなされた−任意のタイプの非経口敗血症で遭遇するものの約半分以下のｐＨ；また、これは非常に自然に達成され、そこでは異なる緩衝液からの様々な添加塩との相互作用の合併症を回避した。）
【０１３７】
（実施例２）
この実施例は、分子量６００ダルトンのポリエチレングリコールオリゴマーセグメントを含む約１０００ダルトンの分子量の本発明のコポリマーの調製を実証した。
【０１３８】
水（２０ｇ）中の蒸留したてのアクロレインの溶液（５ｇ；ヒドロキノン０．１％ｗ／ｗで阻害）を、水（２０ｇ）と１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液の添加によりｐＨ１０にしたポリエチレングリコール（６０ｇ；ＭＷ６００）との溶液に１０分かけてゆっくりと添加した。その組成物をアクロレインの添加前および添加中に激しく撹拌して空気を取り込み、空気と多く接触させ、発熱および急速な重合を生じさせ、温度を約２５℃〜３５℃に維持した。添加の開始後、酸化ヒドロキノンの黄色が速やかに現れ、その後消失し、透明溶液を得た。
【０１３９】
さらに５０分後、透明溶液を１Ｍ塩酸水溶液の添加によりｐＨ７〜８に調整した；生成物は透明で、ほぼ無色（非常に淡い黄色）の溶液であった。（生成物のＵＶ−可視、２００〜６００ｎＭスペクトルは、２００〜３００ｎＭ領域の遠端において実質的な吸収を有するのみであった。）
【０１４０】
ＨＰＬＣは、重合収率が９９〜１００％ｗ／ｗであり、任意の残留モノマーが１ｐｐｍ  ｗ／ｗ未満であることを示した；ＭＷは約１，０００ダルトンであった。ｐＨ１まで（およびｐＨ１４まで）試験したところ、コポリマーは可溶性のままであった。ポリマーは、約０〜１０％ｗ／ｗのカルボニル含有量を有する。
【０１４１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、コポリマーは、培養液なしで、大腸菌を３時間で殺菌した。
【０１４２】
コポリマーは、細菌黄色ブドウ球菌および大腸菌に対して実質的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗菌活性を有する。微生物学的アッセイは、８℃／４８ヶ月のエイジングにおいても変化しなかった。
【０１４３】
ポリエチレングリコールＭＷ２００（１２０ｍｇ）をコポリマー（３８３ｍｇ）に添加し、次いで１滴の１Ｍ水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１１にした；周囲温度で２時間放置した後、１滴の１Ｍ塩酸でｐＨを７．５に調整し、３日間静置した。この処置の結果として、コポリマーのＨＰＬＣも抗菌活性も変化しなかった。
【０１４４】
（実施例３）
この実施例は、細菌に対する反復活性後の実施例１および比較例１のコポリマーの活性を試験し、細菌が耐性を発現する傾向を調べる（表３を参照）。
【０１４５】
３種の試験微生物−大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌−をそれぞれ接種し、試験溶液中で約１０６ｃｆｕ／ｍＬの濃度にした；各試験溶液は、滅菌蒸留水１９ｇ、トリプチカーゼ大豆培養液１ｍＬおよびコポリマー（実施例１；３８３ｍｇ；添加のアクロレインに対して５．４％ｗ／ｗ）または比較例１；３０３ｍｇ；添加のアクロレインに対して６．７％ｗ／ｗ溶液）を含んでいた。次いで、ｐＨ６．５〜７．０の接種した試験溶液を、３７℃で、約１０２〜１０３ｃｆｕ／ｍＬ（または微生物の９９〜９９．９％）が死滅するのに充分な時間インキュベートした。
【０１４６】
各溶液からアリコート１ｍＬを取り出し、トリプチカーゼ大豆培養液のアリコート１ｍＬと１分間混合し、その後滅菌水８ｍＬを加えて混合した。アリコート（１ｍＬ）をその後各溶液から取り出し、フラッディングによりウマ血液寒天プレート上にローン接種し、２４〜４８時間３７℃でインキュベーションした。プレート上の細菌増殖を目視で数えた。
【０１４７】
大腸菌、黄色ブドウ球菌または緑膿菌の連続世代それぞれを、コポリマーまたはアモキシシリンへの反復ばく露によるそれらの選択により培養した；処置に耐えた微生物を、別の処置のサイクル用に採取した  −  このプロセスを２５回まで繰り返した。
【０１４８】
実施例１および比較例１の両コポリマーは、約１０２〜１０３ｃｆｕ／ｍＬ（または微生物の９９〜９９．９％）の正常な減少を達成し続け、大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌それぞれの２５連続世代まで殺菌し、それぞれの場合において、コポリマーの抗菌活性に対する耐性の上昇の徴候はなかった；第１世代およびそれらの由来のスーパーバグの世代の抗菌殺傷速度は、比較すると、同じであった。
【０１４９】
これは、抗生物質に対する耐性を発現する細菌の傾向を評価する特に厳しい方法であると考えられる。計数の減少が２５サイクルごとに１０３の大きさである場合−得られた細菌は１０７５で１の選択により最も耐性があると考えられる。
【０１５０】
大腸菌および黄色ブドウ球菌それぞれの同様の処置を０．３５％ｗ／ｗアモキシシリン抗生物質の溶液と比較した平行試験は、第２世代および第８世代後にそれぞれ細菌耐性を生じた。アクロレイン−コポリマー生成物は、これらの生成された「スーパーバグ」のそれぞれに対して正常な抗菌速度を有していた。
【０１５１】
結果を表３に示す。
【表３】
0006605602.tif 000004
【０１５２】
（比較例２−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の疎水性抗菌活性）
物理的疎水性機構による抗菌活性（添加のＰＥＧからのみ）を、３７℃で、水２０ｇ、ｐＨ６．５のＰＥＧ２０００の３０％ｗ／ｗ溶液０．２９９ｇ、および１０ｅ６ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌を、それぞれ０分、６０分、２４時間および４８時間の時間間隔でインキュベートすることにより実証した；４８時間後に死滅が観察された。
【０１５３】
（実施例４−胃の酸性常在−条件のｉｎ  ｖｉｔｒｏシミュレーション）
二重に、コポリマー（１．００ｇ）の水溶液を水（９ｇ）に添加し、次いで１０％塩酸の添加によりｐＨ２にした；同様に二重に、ブランクとして、コポリマー（１．００ｇ）の水溶液を同様に処置したが、塩酸の代わりに同量の水を用いた。
【０１５４】
全てを３７℃／４時間で加熱し、次いでそれらの物理的、化学的または微生物学的特性の分析の前に、ｐＨを６．５〜７．０に調整した。
【０１５５】
（実施例５〜９−ｉｎ  ｖｉｖｏ実験）
全ての実験は事前監査されており、動物の人道的治療を確保するための国際基準に準拠するよう監督されていた。全ての実験を、独立した研究室で行った。特に、実施例６、７および８の全ての実験を、敗血症および菌血症を研究するために特別に設計されたプロトコルのもとで米国で行った；プロトコルでは、監督者と助手の両方に対して、試験溶液の正体は「盲目」であった。全ての感染は１００μＬであり、約１０７ｃｆｕ／ｍＬのマウス血液感染になるように設計されていた；マウスはＢＡＬＢ／ｃ型であった−各実験において１群あたり１０匹。マウスを、殺処分後の器官（単数または複数）内細菌のｃｆｕ／ｇ計数、または（１；機敏で健康）〜（５；病気でかなり波立っている膜；安楽死）〜（７；死亡）を含む１〜７スケールの健康スコア内のいずれかにより評価した。プロトコルを集計し、それに従う。
【０１５６】
（実施例５）
この実施例は、比較例１のコポリマーのｉｎ  ｖｉｖｏ活性および２４時間にわたる血液からの細菌のクリアランスを調べる。
【０１５７】
予備実験を、コポリマーＭＷ２５００；比較例１；  マウスの１６７ｍｇ／ｋｇで行った；１０匹のマウス２組を使用した；一方の組は処置組であり、他方は未処置組である。両組のマウスに、尾部注射により化膿連鎖球菌を感染させた。感染の１５分後、処置組のマウスは、比較例１のコポリマーの尾部注射を受け、未処置組は、処置の代わりに生理食塩水を投与された。処置組および未処置組のマウスの血液中の化膿連鎖球菌の発生率（ｃｆｕ／ｍＬ）のパーセンテージ比を、感染後１２〜２４時間で観察し、結果を図１に示す。
【０１５８】
（概要）
処置経路：尾部注射
処置が感染前／後であった時間：１５分後
コポリマーによる試験処置：比較例１；１６７ｍｇ／ｋｇ
陰性対照：−
感染経路：尾部注射
感染：化膿連鎖球菌
結果参照：図１。
【０１５９】
図１は、第１に、コポリマーがｉｎ  ｖｉｖｏで抗菌活性を有すること、第２に、細菌が２４時間以内に血液から自然に消え去ることを示している（他の場所から、アッセイにより、腎臓へと判断された）。
【０１６０】
（実施例６）
この実施例は、抗生物質耐性細菌に対する実施例１の本発明のコポリマーのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を調べ、その活性を陽性対照（オキサシリン）および陰性対照（生理食塩水）と比較する。
【０１６１】
本発明のコポリマーＭＷ５００；実施例１；マウスの１３２ｍｇ／ｋｇ、陽性対照オキサシリン、５００ｍｇ／ｋｇ、および陰性対照の生理食塩水を、１０匹のマウスの３つの群に、尾部注射での黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）の感染前に、尾部注射により投与した。その後の８日間にわたり、３つの群内のマウスの淘汰率を記録した。図は、コポリマーが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、黄色ブドウ球菌スーパーバグに対して抗菌活性があることを示している。
【０１６２】
実施例の結果を、図２に示す。
【０１６３】
（概要）
処置経路：尾部注射
処置が感染前／後であった時間：１０分前
コポリマーによる試験処置：実施例１（Ｅｘ  １）；１３２ｍｇ／ｋｇ
陰性対照：生理食塩水
陽性対照：オキサシリン；５００ｍｇ／ｋｇ
感染経路：尾部注射
感染：ＭＲＳＡ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）
結果参照：図２。
【０１６４】
（実施例７）
この実施例は、抗生物質耐性細菌の感染の治療における実施例１の本発明のコポリマーの有効性および非経口投与用のコポリマーの安全性を試験する。
【０１６５】
各１０匹のマウスの２つの群は、共にコポリマーＭＷ５００；実施例１（Ｅｘ１）；  マウスの１３２ｍｇ／ｋｇで処置した；第１（「感染」）群のマウスを黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）に感染させ、第２（「未感染」）群は細菌に感染させなかった。
【０１６６】
（概要）
処置経路：尾部注射
処置が感染前／後であった時間：１０分前
コポリマーによる試験処置：実施例１；１３２ｍｇ／ｋｇ
感染経路：尾部注射
感染：ＭＲＳＡ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）
結果参照：図３。
【０１６７】
図３は、この濃度では、第１に、コポリマーが実質的に毒性ではないこと；第２に、コポリマーがｉｎ  ｖｉｖｏで黄色ブドウ球菌スーパーバグに対して抗菌活性を有することを示している。
【０１６８】
（実施例８）
この実施例は、本発明による実施例１のコポリマーの有効性を、本発明に従わない比較例１の有効性と比較する。
【０１６９】
各１０匹のマウスの２つの群を、黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）に感染させ、２４時間後、各群をマウスの１３２ｍｇ／ｋｇの実施例１のコポリマーＭＷ５００、またはマウスの１６７ｍｇ／ｋｇの比較例１のコポリマーＭＷ２５００でそれぞれ治療的に処置した。図４は、罹患または死亡による淘汰の後に生存していたマウスのグラフである。
【０１７０】
（概要）
処置経路：強制経口投与
処置が感染前／後であった時間：２４時間後
コポリマーによる試験処置：実施例１；１３２ｍｇ／ｋｇ
コポリマーによる比較処置：比較例１；１６７ｍｇ／ｋｇ
陰性対照：−
陽性対照：−
感染経路：尾部注射
感染：ＭＲＳＡ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）
結果参照：図４。
【０１７１】
図４は、第１に、本発明の低分子量コポリマーが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの非経口感染の処置においてより高い活性を示すこと、第２に、陰性対照（生理食塩水）がわずか４の比較可能な生存率を示したことから−コポリマーは肝臓における初期代謝に抵抗することを示している。
【０１７２】
（実施例９）
この実施例は、実施例１の本発明のコポリマーで処置した被験体の抗生物質耐性細菌感染後の生存率を、比較対照１のコポリマー、陽性対照（オキサシリン）および陰性対照（生理食塩水）と比較する。
【０１７３】
各１０匹のマウスの４つの群を、黄色ブドウ球菌スーパーバグ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）に感染させ、２４時間後、各群を以下でそれぞれ治療的に処置した：マウスの１３２ｍｇ／ｋｇの実施例１（Ｅｘ１）のコポリマーＭＷ５００；マウスの１６７ｍｇ／ｋｇの比較例１（ＣＥ１）のコポリマーＭＷ２５００；陽性対照オキサシリン５００ｍｇ／ｋｇおよび陰性対照生理食塩水。図５は、罹患または死亡により淘汰されたマウスの数を示すチャートである。
【０１７４】
（概要）
処置経路：尾部注射
処置が感染前／後であった時間：２４時間後
コポリマーによる試験処置：実施例１；１３２ｍｇ／ｋｇ
コポリマーによる比較処置：比較例１；１６７ｍｇ／ｋｇ
陽性対照：オキサシリン；５００ｍｇ／ｋｇ
陰性対照：生理食塩水
感染経路：尾部注射
感染：ＭＲＳＡ（黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００）
結果参照：図５。
【０１７５】
図５から、低ＭＷコポリマーがより有効であることが明らかである；また、それぞれ３．３、２．５および３．３であるのに比べて、それは最も低い（健康的な）健康スコア＝１．０の生存マウスを与えており、その群が最も効果的に健康を回復したことを示している。
【０１７６】
文献
Ｓ．Ｖ．  Ｄａｕｄｏｕｉｎ  （２００８），  “Ｓｅｐｓｉｓ”，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ
Ｐ．  Ｊ．  Ｆｌｏｒｙ  （１９５３），  “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．
Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｋｌｅｐｐｅ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｌａｎｇｌｅｙ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｖａｎ  Ｄｙｋ  （１９８８），
国際公開第  ８８／０４６７１．
Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ  （１９９６），  国際公開第９６／３８１８６．
Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｈｕｘｈａｍ  （２０００），  国際公開第００／０３７２３．
Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ，  Ｇ．  Ｄａｌｙ  ａｎｄ  Ａ．  Ｊ．  Ｈｕｘｈａｍ  （２００１），  国際公開第０１／６０８７４  Ａ１．
Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ，  Ａ．  Ｊ．  Ｈｕｘｈａｍ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｇ．  Ｔｉｌｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｌ．  Ｗｙｃｏｃｏ  （２００３），  国際公開第０３／０６１６７２  Ａ１．
Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ  （２００９），  国際公開第０９／０５９３５０．
Ｅ．  Ｄ．  Ｐｅｔｅｒｓ  （１９６２）  ｉｎ  Ｃ．  Ｗ．  Ｓｍｉｔｈ，  “Ａｃｒｏｌｅｉｎ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １６章，  ２４０頁．
Ｇ．  Ｏｄｉａｎ  （１９８１），  “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  第２版．
Ｊ．  Ａ．  Ｓｔａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇ．  Ｊ．  Ｈ．  Ｍｅｌｒｏｓｅ  （２００２），  国際公開第０２／２６２１１  Ａ１．
Ｍ．  Ｔｉｌｂｒｏｏｋ  （２００５），  国際公開第２００５／０４４８７４  Ａ１．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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