(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流加培養においてクローン産生株細胞のパネルの相対的な産生力価を予測する、迅速でハイスループットな、コンピューターで実行される方法であって、
−各産生株細胞を、少なくとも３個の異なる化学的細胞ストレッサーとともに、静置マイクロプレート培養において４日未満のインキュベーション期間、同時にインキュベートするステップであって、各産生株細胞は、ＩＣ50の０．５から２．０倍の濃度で供給された単一の化学的細胞ストレッサーとともにインキュベートされるステップと、
−前記インキュベーション期間後に、前記少なくとも３個の化学的細胞ストレッサーの存在下および非存在下で、各細胞の産生力価応答を決定して、産生株細胞の前記パネルそれぞれに関する細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを生成するステップと、
−産生株細胞の前記パネルそれぞれに関する前記細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力するステップであって、前記計算モデルは、既知の流加産生力価を有する産生株細胞の較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、前記計算モデルは、産生株細胞の前記パネルの予測される相対的な流加産生力価を出力するように設定されるステップと
を含むことを特徴とする方法であって、
前記化学的細胞ストレッサーは、細胞培養培地中で細胞とともにインキュベートすることができ、１つまたは複数の細胞経路を介して、細胞成長の低減を引き起こすことが可能な化学物質を意味する、方法。
【請求項２】
前記産生力価応答は、正規化された産生力価応答を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記産生力価は、組換えタンパク質の産生力価であり、前記産生株細胞は、前記組換えタンパク質をコードする導入遺伝子を含むことを特徴とする請求項１および２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記組換えタンパク質は、モノクローナル抗体、またはその断片であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
クローン産生株細胞の前記パネルは、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
各産生株細胞は、静置マイクロプレート培養においてマイクロタイタープレートのウェル中で、前記異なる化学的細胞ストレッサーまたは異なる化学的細胞ストレッサーの各々とともにインキュベートされることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーは、インキュベーション中に前記クローン産生株細胞の増殖を阻害するように予め定められたＬＤ30からＬＤ80の範囲内の濃度で用いられることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記請求項１から７のいずれかに記載の流加培養においてクローン産生株細胞のパネルの相対的な産生力価を予測する、迅速でハイスループットな、コンピューターで実行される方法であって、
−各産生株細胞を、静置マイクロプレート培養において少なくとも３個のそれぞれ異なる機能的に多様な化学的細胞ストレッサーとともに、４日未満のインキュベーション期間、同時にインキュベートするステップであって、各産生株細胞は、ＩＣ50の０．５から２．０倍の濃度で供給される単一の化学的細胞ストレッサーとともにインキュベートされるステップと、
−前記インキュベーション期間後に、異なる化学的細胞ストレッサー各々の存在下で、各細胞の前記産生力価応答を決定して、クローン産生株細胞の前記パネルそれぞれに関する細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを生成するステップと、
−産生株細胞の前記パネルそれぞれに関する前記細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力するステップであって、前記計算モデルは、既知の流加産生力価を有する産生株細胞の較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、前記計算モデルは、産生株細胞の前記パネルの予測される相対的な流加産生力価を出力するように設定されるステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記計算モデルは、多重線形計算モデルであることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記多重線形計算モデルは、最小二乗解を用いて、細胞に特異的な産生力価応答のレベルを観察される流加産生力価に適合させることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
流加培養においてクローン産生株細胞のパネルの相対的な産生力価を予測する方法を実
施するための、コンピューターで実行されるシステムであって、
−ＩＣ50の０．５から２．０倍の濃度で供給された少なくとも３個の異なる化学的細胞ストレッサーの存在下および非存在下で、各クローンの産生力価をアッセイして、複数のストレスが加えられた微小環境における各クローンに関する正規化された産生力価応答値を提供するための決定システムと、
−前記ストレスが加えられた微小環境それぞれにおける各クローンに関する前記正規化された産生力価応答値を含むクローンに特異的な産生力価応答プロファイルを処理するように適応された計算モデルであって、既知の流加産生力価応答プロファイルを有するクローンの較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、各クローンに関する予測される流加産生力価値および／またはクローン細胞の前記パネルの予測される相対的な流加産生力価を出力するように設定される計算モデルと、
−（ｉ）前記パネルにおける１つまたは複数のクローンに関する前記予測される流加産生力価、または（ｉｉ）クローン細胞の前記パネルの予測される相対的な流加性能、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方を出力するための手段と
を含むことを特徴とするシステムであって、
前記化学的細胞ストレッサーは、細胞培養培地中で細胞とともにインキュベートすることができ、１つまたは複数の細胞経路を介して、細胞成長の低減を引き起こすことが可能な化学物質を意味する、システム。
【請求項１２】
前記決定システムは、ＨＰＬＣを含むことを特徴とする請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記計算モデルは、多重線形計算モデルであることを特徴とする請求項１１または１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記多重線形計算モデルは、最小二乗解を用いて、細胞に特異的な産生力価応答のレベルを観察される流加産生力価に適合させることを特徴とする請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
単一の細胞株に由来する産生株細胞クローンのパネルをスクリーニングして、流加産生力価に従って前記クローンを層別化する方法であって、各クローンの試料を、ＩＣ50の０．５から２．０倍の濃度で供給された少なくとも3個の異なる化学的細胞ストレッサーとともに、および複数の異なる化学的細胞ストレッサーを伴わずに、少なくとも２４時間かつ最大４または５日の期間、インキュベートして、前記クローンに関する複数の正規化された産生力価応答値を得るステップであって、前記産生力価応答値は、クローンに特異的な産生力価応答プロファイルを形成するクローンに特異的な産生力価応答の特定のパターンを提供するステップと、多重線形計算モデルを用いて、前記クローンに特異的な産生力価応答プロファイルを、既知の流加産生力価を有するクローンの較正セットからの複数の産生力価応答プロファイルと相関させ、クローンの前記パネルの１つまたは複数に関する流加産生力価を予測するステップとを含むことを特徴とする方法であって、
前記化学的細胞ストレッサーは、細胞培養培地中で細胞とともにインキュベートすることができ、１つまたは複数の細胞経路を介して、細胞成長の低減を引き起こすことが可能な化学物質を意味する、方法。
【請求項１６】
前記パネルからの前記クローンは、予測される流加産生力価に従ってランク付けされることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コンピューター上で実行されると、請求項１から１０、請求項１５および請求項１６のいずれかに記載の方法に従って、単一の細胞株に由来するクローン細胞のパネルの相対的な流加産生力価を予測する方法を前記コンピューターに実施させるコンピュータープログラム。
【請求項１８】
請求項１７に記載のコンピュータープログラムを保存しているコンピュータープログラム記録媒体。
【請求項１９】
流加培養においてクエリー産生株細胞の産生力価を予測する、コンピューターで実行される方法であって、
−クエリー産生株細胞を、各化学的細胞ストレッサーがＩＣ50の０．５から２．０倍の濃度で供給された、少なくとも3個の化学的細胞ストレッサーとともに個別に静置マイクロプレート培養においてインキュベートするステップと、
−各化学的細胞ストレッサーの存在下におけるクエリー産生株細胞の産生力価応答を決定して、クエリー細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを生成するステップと、
−クエリー細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力するステップであって、計算モデルは、既知の流加産生力価を有する細胞の較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、計算モデルは、細胞に関する予測される流加産生力価を出力するように設定されるステップと
を含むことを特徴とする方法であって、
前記化学的細胞ストレッサーは、細胞培養培地中で細胞とともにインキュベートすることができ、１つまたは複数の細胞経路を介して、細胞成長の低減を引き起こすことが可能な化学物質を意味する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産生株細胞の流加産生力価を予測する方法に関する。特に、本発明は、クローンに由来する産生株細胞のパネルの相対的な流加組換えタンパク質力価を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＨＯ細胞クローン分離株の、細胞株を製造するのに機能を果たす相対的な能力の初期予測は、細胞株開発プロセスの重要な構成要素である。静置培養において外見上生産的なクローンは、細胞成長および生産性の両方に関して、続く流加培養性能において実質的に多様であり得る。現在の成功事例は、５０〜１００個のクローン分離株の比較を可能にする小規模のマルチパラレルバイオリアクターシステムを使用して、細胞株開発において初期にクローン性能を測定することである。しかしながら、このアプローチは、依然としてコストも時間もかかる。
【０００３】
本発明の目的は、上述の問題のうちの少なくとも１つを克服することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ（２００４），Ｗｕｒｍ，Ｆｌｏｒｉａｎ  Ｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（２００４），Ｓ．１３９３−１３９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願人は、流加培養における産生株細胞クローンの産生力価が、静置マイクロプレート培養における１つまたは複数の機能的に多様な化学的ストレッサー（例えば、阻害剤および毒素）に対するクローンに特異的な組換えタンパク質産生応答の迅速なプロファイリングにより正確に予測することができることを発見した。マイクロプレートプロファイリングを実施するために、固定数のクローンに由来する細胞を、別々のウェルへ個別にロードされた１つまたは複数の化学的細胞ストレッサーを含有する９６ウェルマイクロプレートへ分配した。各化学物質は、細胞成長培地中に可溶性であり、マイクロプレートにおいて親ＣＨＯ細胞増殖を阻害するように予め定められたＬＤ３０からＬＤ８０の範囲内の濃度で通常利用された。成長期間（即ち、３日間）の静置成長後に、上清ＭＡｂ力価をＨＰＬＣプロテインＡアッセイにより測定した。限界希釈クローニングにより単離されるＩｇＧ１  ＭＡｂを発現する１２個のＣＨＯ−Ｓクローンをマイクロプレートプロファイリングに付して、続いて、エルレンマイヤーフラスコにおいて最適流加培養性能（ＭＡｂ力価［ＭＡｂ］、５０％細胞生存率に対する生存細胞濃度の積分［ＩＶＣＣ50］）の評価を行った。多重線形モデリングを使用して、マイクロプレートにおけるクローン性能が、クローンに特異的なＭＡｂ力価マイクロプレートプロファイルを使用してＭＡｂ力価（ｒ2＝０．８４）を予測することができることを実証した。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、流加培養においてクエリー産生株細胞の産生力価を予測する、コンピューターで実行される方法であって、
−クエリー産生株細胞を、１つまたは複数の化学的細胞ストレッサーとともにインキュベートするステップと、
−化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下で、クエリー産生株細胞の産生力価応答を決定して、クエリー細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを生成するステップと、
−クエリー細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力するステップであって、計算モデルは、既知の流加産生力価を有する細胞の較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、計算モデルは、細胞に関する予測される流加産生力価を出力するように設定されるステップと
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、流加培養において産生株細胞のパネルの相対的な産生力価を予測する、コンピューターで実行される方法であって、
−各産生株細胞を、１つまたは複数の化学的細胞ストレッサーとともにインキュベートするステップと、
−化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下で、各細胞の産生力価応答を決定して、産生株細胞のパネルそれぞれに関する細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを生成するステップと、
−産生株細胞のパネルそれぞれに関する細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力するステップであって、計算モデルは、既知の流加産生力価を有する細胞の較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、計算モデルは、産生株細胞のパネルの予測される相対的な産生力価を出力するように設定されるステップと
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０００８】
新たなクローンのバッチが、親細胞株から生成される場合、全てではなく、選ばれた少数がバイオリアクターにおいて高価でかつ時間のかかる成長研究に付されているが、本発明の方法は、多数のクローンを、迅速でかつハイスループットな様式で、予測される流加（組換えタンパク質）産生力価に関して迅速にアッセイして、それに従ってランク付けすることが可能である。これは、どのクローンを、スケールアップ／ミニバイオリアクター研究に進めるかの情報を与える（例えば以下の図Ｘに示されるような良好なクローンのみ）。
【０００９】
本発明の方法は、予め検証されたクローン（既知の産生力価のクローン）のパネルからのデータ（産生力価応答プロファイル）、およびこのデータに基づく計算モデル、理想的には多重線形計算モデルを用いて、それらの迅速に得られる化学的フィンガープリントに基づいて、クローンの新たなセットの相対的な流加組換え産生力価の予測を可能にする。
【００１０】
好ましくは、本方法は、予測される流加産生力価に従って、クローンをランク付けるさらなるステップを含む。
【００１１】
本方法は、マイクロタイタープレートを使用して通常実行され、ここで各アッセイは、マイクロタイタープレートのウェル中で実施される。適切には、各クローン細胞の成長は、マルチウェルプレートのウェル中でアッセイされる。多重の化学的細胞ストレッサーが用いられる場合、各クローンは、単一の化学的細胞ストレッサーの存在下でアッセイされる。
【００１２】
通常、アッセイは、クローンの試料を、化学的細胞ストレッサーと混合するステップと、混合物を１から４日、通常２から４日、好ましくは６０〜８０時間、理想的には約３日、インキュベートするステップと、細胞の成長のレベルをアッセイするステップとを含む。適切には、クローン試料は、混合物１ｍｌ当たり０．１から１．０ｘ１０6個の細胞の濃度で供給される。通常、バイオリアクターに関連する化学的細胞ストレッサーは、０．５から２ｘＩＣ５０、理想的には約１ｘＩＣ５０の濃度で供給される。
【００１３】
適切には、各クローンの成長は、５日未満のインキュベーション期間後にアッセイされる。理想的には、各クローンの成長は、１〜４日のインキュベーションの期間後に、理想的には２日および３日後にアッセイされる。
【００１４】
好ましくは、各クローンの成長は、同時にアッセイされる。通常、インキュベーションステップは、静置マイクロプレート培養において実行される。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明は、流加培養においてクローン産生株細胞のパネルの相対的な産生（即ち、モノクローナル抗体）力価を予測する、迅速でハイスループットな、コンピューターで実行される方法であって、
−各産生株細胞を、静置マイクロプレート培養において複数の異なる機能的に多様な化学的細胞ストレッサーとともに、４日未満のインキュベーション期間、同時にインキュベートするステップであって、化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、浸透圧ストレスの供給源、酸化的ストレスの供給源、アポトーシスの誘発剤、代謝的エフェクター、ｐＨ改質剤、解糖系の阻害剤、および毒素のうちの少なくとも２個から選択されるステップと、
−インキュベーション期間後に、異なる各化学的細胞ストレッサーの存在下で、各細胞の産生力価応答を決定して、産生株細胞のパネルそれぞれに関する細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを生成するステップと、
−産生株細胞のパネルそれぞれに関する細胞に特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力するステップであって、計算モデルは、既知の流加産生力価を有する産生株細胞の較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、計算モデルは、産生株細胞のパネルの予測される相対的な流加産生力価を出力するように設定されるステップと
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１６】
化学的細胞ストレッサーは、多重の細胞経路の１つまたは複数を介して細胞成長の低減を引き起こす化学物質である。適切には、複数の化学的細胞ストレッサーは、少なくとも２、３、４、５または６個の機能的に多様な化学的細胞ストレッサー、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の異なるストレッサーを含む。通常、複数の化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、浸透圧ストレスの供給源、酸化的ストレスの供給源、アポトーシスの誘発剤、代謝的エフェクター、ｐＨ改質剤、解糖系の阻害剤、および毒素から選択される。これらは、機能的に多様な化学的細胞ストレッサーの例である。通常、複数の化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、浸透圧ストレスの供給源、酸化的ストレスの供給源、アポトーシスの誘発剤、代謝的エフェクター、ｐＨ改質剤、解糖系の阻害剤、および毒素からなる群の少なくとも４、５、６または７個から選択されるストレッサーを含む。
【００１７】
別の態様では、本発明は、少なくとも２４、４８または９６個のウェルを含むマイクロタイタープレート、およびウェルの少なくとも幾つかの中に個々に配置される複数の化学的細胞ストレッサーを提供する。通常、プレートは、少なくとも６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の化学的細胞ストレッサーを含む。適切には、各化学的細胞ストレッサーは、プレートの少なくとも２または３個のウェル中に配置される（即ち、二重または三重で）。
【００１８】
好ましくは、複数の化学的細胞ストレッサーは、２−アミノビシクロ−（２，２，１）ヘプタン−カルボン酸（ＢＣＨ）、Ｄ−フェニルアラニン、α−（メチルアミノ）イソ酪酸（ＭｅＡＩＢ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、シクロヘキシミド、塩化アンモニウム、酢酸カドミウム二水和物、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、乳酸ナトリウム（Ｎａ  Ｌａｃ）、アミノトリアゾール（ＡＭＴ）、メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、メルカプトコハク酸（ＭＳ）、２，４−ジニトロフェノール（２４ＤＮＰ）、オキサミド酸ナトリウム、２−デオキシグルコース（２ｄｇ）、３−ブロモピルビン酸（３−ＢｒＰＡ）、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、６−ジアゾ−５−オキソ−ｌ−ノルロイシン（ｌ−ｄｏｎ）、バルプロ酸（Ｖａｌ）、オルトバナジン酸ナトリウム（ＮａＶ）、クエン酸、ＦＫ８６６、乳酸の群から選択される。
【００１９】
別の態様では、本発明は、少なくとも２４、４８または９６個のウェルを含むマイクロタイタープレート、および１つまたは複数の、一般的には複数の、ウェルの少なくとも幾つかの中に個々に配置される化学的細胞ストレッサーを提供し、ここで、複数の異なる化学的細胞ストレッサーが用いられる場合、化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、浸透圧ストレスの供給源、酸化的ストレスの供給源、アポトーシスの誘発剤、代謝的エフェクター、ｐＨ改質剤、解糖系の阻害剤、および毒素からなる群それぞれから選択される少なくとも１個の化学的細胞ストレッサーを含む。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、少なくとも９６個のウェルを含むマイクロタイタープレート、およびプレートのウェル中に個々に配置される少なくとも２３個の化学的細胞ストレッサーを提供し、ここで、化学的細胞ストレッサーは、２−アミノビシクロ−（２，２，１）ヘプタン−カルボン酸（ＢＣＨ）、Ｄ−フェニルアラニン、α−（メチルアミノ）イソ酪酸（ＭｅＡＩＢ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、シクロヘキシミド、塩化アンモニウム、酢酸カドミウム二水和物、塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、乳酸ナトリウム（Ｎａ  Ｌａｃ）、アミノトリアゾール（ＡＭＴ）、メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）、ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）、メルカプトコハク酸（ＭＳ）、２，４−ジニトロフェノール（２４ＤＮＰ）、オキサミド酸ナトリウム、２−デオキシグルコース（２ｄｇ）、３−ブロモピルビン酸（３−ＢｒＰＡ）、ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）、６−ジアゾ−５−オキソ−ｌ−ノルロイシン（ｌ−ｄｏｎ）、バルプロ酸（Ｖａｌ）、オルトバナジン酸ナトリウム（ＮａＶ）、クエン酸、ＦＫ８６６、乳酸から本質的に構成される。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するのに適しており、（ａ）本発明のマイクロタイタープレート、（ｂ）マイクロタイタープレートリーダー、および（ｃ）（ｉ）化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下および非存在下で、各クローンの産生力価値を決定システム（例えば、ＨＰＬＣ）から受信すること、（ｉｉ）化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下で、各クローンに関する正規化された産生力価値を算出すること、（ｉｉ）化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下で、各クローンに関する正規化された産生力価値を含むクローンに特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力すること（ここで、計算モデルは、既知の産生力価値を有するクローンの較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、計算モデルは、各クローンに関する予測される流加産生力価値を出力する（および任意に、クローン細胞のパネルの相対的な流加産生力価値を予測する）ように設定される）、および（ｉｉｉ）各クローンに関する予測される流加産生力価値を出力する（および任意に、クローン細胞のパネルの相対的な流加産生力価値を予測する）ことに関するプログラム指示書を含むコンピュータープログラムを含むキットを提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、単一の親宿主細胞集団に由来するクローン産生株細胞のパネルの相対的な流加産生力価を予測する方法を実施するのに適しており、（ａ）本発明のマイクロタイタープレート、（ｂ）マイクロタイタープレートリーダー、および（ｃ）（ｉ）１つまたは複数の化学的細胞ストレッサーの存在下および非存在下で成長させた各クローンの産生力価値を適切な機械から受信すること、（ｉｉ）化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下で、各クローンに関する正規化された産生力価値を算出すること、（ｉｉ）化学的細胞ストレッサーまたは各化学的細胞ストレッサーの存在下で、各クローンに関する正規化された産生力価値を含むクローンに特異的な産生力価応答プロファイルを、計算モデルに入力すること（ここで、計算プログラムは、既知の産生力価値を有するクローンの較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、計算モデルは、各クローンに関する予測される流加産生力価値を出力して、クローン細胞のパネルの相対的な流加産生力価値を予測するように設定される）、および（ｉｉｉ）クローン細胞のパネルの予測される相対的な流加産生力価値を出力することに関するプログラム指示書を含むコンピュータープログラムを含むキットを提供する。
【００２３】
クローンの産生力価を決定するのに用いられる決定システムは、任意の適切な機械、例えば、標的組換えタンパク質を定量的にアッセイするように適応されたＨＰＬＣまたは質量分析計であり得る。
【００２４】
本発明はまた、単一の細胞株に由来するクローン産生株細胞の流加産生力価を予測する方法を実施するための、コンピューターで実行されるシステムであって、
−１つまたは複数の異なる化学的細胞ストレッサー（通常、複数の異なる化学的細胞ストレッサー）の存在下および非存在下で、クローンの産生力価をアッセイして、１つまたは複数のストレスが加えられた微小環境におけるクローンに関する正規化された産生力価応答値を提供するための決定システムと、
−ストレスが加えられた微小環境または各ストレスが加えられた微小環境におけるクローンに関する正規化された産生力価応答値を含むクローンに特異的な産生力価応答プロファイルを処理するように適応された計算モデルであって、既知の流加産生力価応答プロファイルを有するクローンの較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、クローンに関する予測される流加産生力価値を出力するように設定される計算モデルと、
−クローン産生株細胞に関する予測される流加産生力価を出力するための手段と
を含むことを特徴とするシステムを提供する。
【００２５】
本発明はまた、単一の細胞株に由来するクローン産生株細胞のパネルの相対的な流加産生力価を予測する方法を実施するためのコンピューターで実行されるシステムであって、
−複数の異なる化学的細胞ストレッサーの存在下および非存在下で、各クローンの産生力価をアッセイして、複数のストレスが加えられた微小環境における各クローンに関する正規化された産生力価応答値を提供するための決定システムと、
−ストレスが加えられた微小環境それぞれにおける各クローンに関する正規化された産生力価応答値を含むクローンに特異的な産生力価応答プロファイルを処理するように適応された計算モデルであって、既知の流加産生力価応答プロファイルを有するクローンの較正セットから得られる産生力価応答プロファイルから生成され、各クローンに関する予測される流加産生力価値および／またはクローン細胞のパネルの予測される相対的な流加産生力価を出力するように設定される計算モデルと、
−（ｉ）パネルにおける１つまたは複数のクローンに関する予測される流加産生力価、または（ｉｉ）クローン細胞のパネルの予測される相対的な流加性能、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方を出力するための手段と
を含むことを特徴とするシステムを提供する。
【００２６】
通常、決定システムは、ＨＰＬＣを含むが、標的タンパク質に関して定量的にアッセイするように適応された他のシステム、例えば定量的ＥＬＩＳＡを用いてもよい。
【００２７】
適切には、計算モデルは、多重線形計算モデルである。理想的には、多重線形計算モデルは、最小二乗解を適切に用いて、パラメーター（即ち、細胞に特異的な産生力価応答のレベル）を観察される流加産生力価に適合させる。
【００２８】
本発明はまた、コンピューター上で実行されると、コンピューターに、本発明により単一の細胞株に由来するクローン細胞のパネルの相対的な流加産生力価を予測する方法を実施させるコンピュータープログラムを提供する。
【００２９】
本発明はまた、本発明によるコンピュータープログラムを保存するコンピュータープログラム読み取り媒体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】一般的な親細胞株由来の１２個のクローン細胞株のパネルからの流加培養において達成される最大モノクローナル抗体力価の図である。
【図２】１２個のクローン細胞株のパネルにより達成される特定の化学的ストレッサーの存在下での産生力価の範囲の図である。
【図３】化学的な特異的ＭＡｂ応答を使用して最大ＭＡｂ力価を予測するための多重線形モデルの適合度の視覚的な表示である。
【図４】モデルの、新たなデータを予測する能力の図である。ここで、上述のモデルパラメーターを使用して、「一個抜き」交差検証機能を使用して新たなデータを用いて最大ＭＡｂ力価を予測した。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
一態様では、本発明は、単一の細胞株に由来する産生株細胞クローンのパネルをスクリーニングして、流加産生力価に従ってクローンを層別化する方法に関する。本方法は、各クローンの試料を、１個、一般的には複数の個々の化学的細胞ストレッサーとともに、また１個、一般的には複数の異なる化学的細胞ストレッサーを伴わずに、一定期間、通常少なくとも２４時間かつ最大４または５日間インキュベートして、クローンに関する複数の正規化された産生力価応答値を得るステップを包含する。これらの産生力価応答値は、クローンに特異的な成長応答プロファイルを形成するクローンに特異的な産生力価応答の特定のパターンを提供する。多重線形計算モデルを用いて、産生力価応答プロファイルを、既知の流加産生力価を有するクローンの較正セットからの複数の産生力価応答プロファイルと相関させ、クローンのパネルの１つまたは複数に関する流加産生力価を予測する。続いて、パネルからのクローンは、予測される流加産生力価に従ってランク付けされてもよく、それにより、産生株クローンを、さらなる開発のために選択することが可能となる。
【００３２】
この明細書では、「迅速でハイスループットな」という用語は、本方法が４日またはそれ未満で実行され得ることを意味すると理解されるべきであり、ここで、インキュベーション期間中の細胞のインキュベーションは、マイクロタイタープレートのウェル中で実行され得る。
【００３３】
「産生力価」または「産生力価応答」という用語は、特異的な産生株細胞クローンに適用される場合、特異的な産生株細胞クローンが、定められた期間にわたって生成する特異的なタンパク質、一般的には組換えタンパク質、理想的には組換えモノクローナル抗体の量を指す。力価は、絶対的または相対的に定量化され得る。一般に、力価は、培養液の容量当たりの産生物の重量とみなされ、１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ）が一般的な測定基準である（最大力価）。概して、クローンは、特定の期間、例えば２〜４日間インキュベートされ、インキュベーション期間後に、上清の試料を通常採取して、産生力価に関してアッセイされる。ＨＰＬＣおよび定量的ＥＬＩＳＡを含む産生力価を測定する各種方法が、当業者に明らかである。
【００３４】
多くの場合、本発明の方法で用いられる産生力価は、正規化された産生力価応答であり、化学的細胞ストレッサーの存在下および非存在下で測定される場合の細胞に関する産生力価応答間の差を意味する。
【００３５】
「産生株細胞」という用語は、特定の所望のタンパク質を生成するのに用いられる細胞を指す。概して、細胞は、一般的に特定のプロモーターの制御下にある所望のタンパク質をコードする導入遺伝子の１つまたは多重のコピーを含むように遺伝的に改変される。したがって、特定のタンパク質は通常、組換えタンパク質である。産生株細胞は、当該技術分野で周知であり、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を含む。理想的には、産生株細胞はＣＨＯ細胞である。通常、産生株細胞は、モノクローナル抗体産生株細胞である。
【００３６】
「産生力価応答プロファイル」という用語は、１つまたは複数の化学的細胞ストレッサーに対する所定のクローンに関する産生力価応答を指す。一実施形態では、プロファイルは、所定のクローンに関する単一の産生力価応答（１個の化学的細胞ストレッサーの存在および通常非存在下での細胞に関する産生力価応答）を含み得る。他の実施形態では、産生力価応答プロファイルは、複数の産生力価応答または所定のクローン（複数の異なる化学的細胞ストレッサーの存在および任意に非存在下での細胞に関する産生力価応答）を含む。一般的に、プロファイルは、正規化された産生力価応答（ストレッサーの非存在下での産生力価から、ストレッサーの存在下での産生力価を引いたもの）を使用して生成され、その結果、正規化された産生力価応答プロファイルが得られる。しかしながら、プロファイルが１個よりも多いストレッサーを使用して生成される状況で、ストレスが加えられた微小環境からの産生力価のみを用いて（即ち、対照産生力価を用いずに）生成されるプロファイルを使用することが可能である。
【００３７】
本発明の方法は、流加培養における場合に、産生株細胞の迅速なプロファイリングを用いて、細胞の産生力価を予測する。この明細書では、「流加」または「流加培養」という用語は、さらなる栄養分が、細胞の播種後に少なくとも１回、ボーラス形式で添加される細胞の拡張培養を意味すると理解されるべきである。
【００３８】
「クローンの較正セット」という用語は、それぞれが、産生力価応答フィンガープリントおよび既知の流加性能を有する複数のクローンを指す。通常、クローンの較正セットは、最終利用者が「良好な」パフォーマーとみなすことから、最終利用者が「悪い」パフォーマーとみなすことまでの流加性能の能力の範囲を示すクローンを含む。適切には、クローンの較正セットは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４または２６個のクローンを含む。
【００３９】
「ストレスが加えられた微小環境」という用語は、化学的細胞ストレッサーを含む環境を意味すると理解されるべきである。概して、これは、クローンが、化学的細胞ストレッサーの存在下でマイクロタイタープレートのウェル中で成長に関してアッセイされることを意味する。
【００４０】
本明細書中では、「迅速な」という用語は、５日未満、理想的には４または３日未満かかる流加性能を予測する方法を意味すると理解されるべきである。
【００４１】
本明細書中では、「ハイスループット」という用語は、多数の試料、例えば２０〜５００個を同時にアッセイすることができる方法を意味すると理解されるべきである。一実施形態では、これは、マルチウェルプレート、例えば４８、９６または１９２ウェルプレートにおけるクローンの成長をアッセイすることを含む。
【００４２】
本明細書中では、「予測される流加産生力価」は、クローン産生株細胞に適用される場合、流加培養におけるクローンの予測される流加産生力価を意味すると理解されるべきである。予測される産生力価は、絶対的に定量化されてもよく、または相対的に、即ち、既知の良好な、もしくは悪い産生力価を有するクローンに対して、またはクローンのパネルに対して定量化されてもよい。
【００４３】
本明細書中では、「相対的な産生力価を予測する」という用語は、互いに対して、パネルにおけるクローンの流加産生力価を予測することを意味すると理解されるべきである。したがって、一実施形態では、クローンは、それらの予測される流加産生力価に従って層別化される。同様に、「クローン細胞のパネルの予測される相対的な流加産生力価」という用語は、互いに対するパネルにおけるクローンの予測される流加産生力価を意味すると理解されるべきである。したがって、一実施形態では、クローンは、それらの予測される流加産生力価に従って層別化される。別の実施形態では、クローンは、最良の予測される流加産生力価クローンを示す１つまたは複数のクローン、最悪の予測される流加産生力価クローンを示す１つまたは複数のクローン、またはその両方を抜き出すように層別化される。
【００４４】
本明細書では、「クローン産生株細胞のパネル」という用語は、単一の細胞株に由来し、２から５００個またはそれ以上のクローン産生株細胞集団を含むクローン産生株細胞集団のパネルを意味すると理解されるべきである。クローン産生株細胞のパネルを生成する方法は、当業者に周知であり、記載されている（例えば、非特許文献１参照）。通常、クローン産生株細胞集団のパネルは、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００または１００〜５００個のクローン細胞集団を含む。通常、クローン産生株細胞集団のパネルは、１００〜５００、１００〜４００、１５０〜４００、１５０〜３５０個のクローン細胞集団を含む。
【００４５】
本明細書中では、「計算モデル」という用語は通常、多重線形計算モデルを指す。理想的には、多重線形計算モデルは、最小二乗解を用いて、パラメーター（即ち、細胞に特異的な産生力価応答のレベル）を観察される流加産生力価に適合させる。
【００４６】
本明細書中では、「化学的細胞ストレッサー」という用語は、細胞培養培地中で細胞とともにインキュベートすることができ、１つまたは複数の細胞経路を介して、細胞成長の低減を引き起こすことが可能である化学物質を意味すると理解されるべきである。好ましくは、化学的細胞ストレッサーは、細胞培養培地中で可溶性である。化学的細胞ストレッサー（細胞ストレッサー型）として、細胞経路の阻害剤、細胞毒素（細胞、特に哺乳動物細胞に対して毒性のある化学物質）、代謝的エフェクター、および細胞にストレスを加える化学物質が挙げられる。阻害剤の例として、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤および解糖系阻害剤が挙げられる。細胞にストレスを加える化学物質の例は、浸透圧または酸化的ストレスの供給源である。通常、化学的細胞ストレッサーは、ＬＤ30からＬＤ80の範囲内の細胞増殖を阻害する量で利用される。適切には、化学的細胞ストレッサーは、０．５から２ｘＩＣ50の濃度で利用される。通常、各細胞の試料（即ち、各クローンの試料）は、少なくとも３つの異なる細胞ストレッサーとともに個別にインキュベートされる。好ましくは、各細胞の試料（即ち、各クローンの試料）は、少なくとも３個の異なる型の細胞ストレッサー（例えば、アミノ酸輸送阻害剤、解糖系阻害剤および浸透圧ストレスの供給源）とともに個別にインキュベートされる。適切には、複数の化学的細胞ストレッサーは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のストレッサーを含む。通常、複数の化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、浸透圧ストレスの供給源、酸化的ストレスの供給源、アポトーシスの誘発剤、代謝的エフェクター、ｐＨ改質剤、解糖系の阻害剤、および毒素からなる群から選択される。通常、複数の化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、浸透圧ストレスの供給源、ｐＨ改質剤、酸化的ストレスの供給源、アポトーシスの誘発剤、代謝的エフェクター、解糖系の阻害剤、および毒素からなる群の少なくとも４、５、６または７個から選択されるストレッサーを含む。化学的細胞ストレッサーの例として、以下が挙げられる：
ＢＣＨ（ＡＡ輸送阻害剤）
Ｄ−フェニルアラニン（ＡＡ輸送阻害剤）
ＭｅＡＩＢ（ＡＡ輸送阻害剤）
酪酸ナトリウム（細胞周期阻害剤）
シクロヘキシミド（毒素）
塩化アンモニウム（毒素）
塩化コバルト（アポトーシスの誘発剤）
ＮａＣＬ（浸透圧ストレスの供給源）
乳酸ナトリウム（代謝的エフェクター）
アミノトリアゾール（酸化的ストレスの供給源）
メナジオン重亜硫酸ナトリウム（酸化的ストレスの供給源）、
メルカプトコハク酸（酸化的ストレスの供給源）
２，４−ジニトロフェノール（代謝的エフェクター）
オキサミド酸ナトリウム（解糖系阻害剤）
２−デオキシグルコース（解糖系阻害剤）
３−ブロモピルビン酸（解糖系阻害剤）
ジクロロ酢酸（解糖系阻害剤）
Ｌ−ｄｏｎ（ＡＡ合成阻害剤）
バルプロ酸（細胞周期阻害剤）
オルトバナジン酸ナトリウム（細胞周期阻害剤）
ＦＫ８６６（アポトーシス誘発剤）
クエン酸／乳酸（ｐＨ改質剤）。
【００４７】
「ＩＣ５０」：阻害濃度を確立するために、「インハウス親ＣＨＯ」細胞を、９６ウェルプレートにおいて様々な濃度の目的の化学物質の存在下で、３日間（７２時間）インキュベートした。成長は、化学的生存細胞数アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫからの「Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ」）を使用して決定した。化学物質濃度の存在下での成長を、対照細胞成長（即ち、０ｍＭの阻害化学物質の存在下で）と比較して、化学物質濃度対、対照に対する成長パーセントの曲線を作った。この曲線を使用して、ＩＣ「Ｘ％」濃度を確立させた。
【００４８】
実施例
細胞培養：
使用したクローンは、Ｃｏｂｒａ  ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ（キール、ＵＫ）により供給されたモノクローナル抗体を産生する親クローン（クローン３８）由来のＣＨＯ−Ｓ由来クローンであった。これらは、これ以降、「ＰＭ−ＣＨＯ」と称される。ＰＭ−ＣＨＯ細胞は、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、ＵＫ）、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、ＵＫ）、１％ＨＴサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、ＵＫ）、１２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、ＵＫ）中で培養した。細胞は、交互の３／４日レジームで日常的に継代培養した。
【００４９】
流加研究：
流加研究は、市販のフィードおよび培地を使用して、振とうフラスコ中で、６０ｍｌ容量で実施した。フィードは、４、６、８および１０日目に６ｍｌボーラスで添加した。毎日試料を採取して、細胞成長およびモノクローナル抗体力価に関して分析した。
モノクローナル抗体力価の決定：
ＨＰＬＣ法は、「Ｂｉｏｍｏｎｏｌｉｔｈ」プロテインＡカラム（Ａｇｌｉｅｎｔ、ウォーキンガム、ＵＫ）を使用して用いた。モノクローナル抗体は、溶離液中のＵＶ吸収ピーク下の面積に従って定量化した。これは、試料中の抗体濃度に線形比例していると実証された。
【００５０】
本発明を実施する方法：
詳細な文献検索から、流加性能の情報を与えると予想された様々な化学物質を同定した。これらは、下記であった：
２−アミノビシクロ−（２，２，１）ヘプタン−カルボン酸（ＢＣＨ）
Ｄ−フェニルアラニン（Ｄ−Ｐｈｅ）
α−（メチルアミノ）イソ酪酸（ＭｅＡＩＢ）
酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）
シクロヘキシミド
塩化アンモニウム
酢酸カドミウム二水和物
塩化コバルト（ＣｏＣｌ２）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）
乳酸ナトリウム（Ｎａ  Ｌａｃ）
アミノトリアゾール（ＡＭＴ）
メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）
ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）
メルカプトコハク酸（ＭＳ）
２，４−ジニトロフェノール（２４ＤＮＰ）
オキサミド酸ナトリウム
２−デオキシグルコース（２ｄｇ）
３−ブロモピルビン酸（３−ＢｒＰＡ）
ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）
６−ジアゾ−５−オキソ−ｌ−ノルロイシン（ｌ−ｄｏｎ）
バルプロ酸（Ｖａｌ）
オルトバナジン酸ナトリウム（ＮａＶ）
クエン酸
ＦＫ８６６
乳酸。
【００５１】
「インハウス」親細胞株を使用して、上記化学物質の阻害用量５０（ＩＣ50）濃度を、成長研究を通じて同定した。ここで、ＩＣ50は、３日間にわたって正常な細胞成長を５０％阻害する、問題となっている化学物質の濃度として定義される。ＩＣ50がいったん確立されたら、ＩＣ50濃度で化学物質の上記選択を含有して、細胞成長培地のみを含有した対照ウェルを含む９６ウェルプレートをセットした。
【００５２】
モノクローナル抗体を産生するクローン細胞株のサイズ１２のパネルを、ＰＭ親細胞株を使用した限界希釈クローニング法によりインハウスで生成した。これらのクローンを流加研究に付して、それらの流加産生物産生能力を評価した。ここで、これは、流加実行中に達成される最大容量産生物力価として定義される。クローンパネルにより流加中に達成される最大力価の範囲を図１に示す。
【００５３】
各クローン細胞株を、上述の化学物質を含有する９６ウェルプレートにおいて３日間成長させた。この期間後、プレートにおける化学物質に特異的な産生物力価（即ち、上述するような化学物質の存在下および非存在下でのＭＡｂ力価−正規化された産生力価）のレベルを、上述するように「ＨＰＬＣ」アッセイを使用して測定した。これにより、化学物質に特異的な産生物産生フィンガープリントを、各クローン細胞株に関して同定することが可能となった（クローンに特異的な産生力価応答プロファイルとして上記で言及されている）。ここで、産生物産生フィンガープリントは、各化学的微小環境における複数の産生物産生レベルとして定義される。
【００５４】
クローンのパネルに関する化学物質に特異的な生産性の範囲を図２に示す。
【００５５】
これらの化学物質に特異的な産生物産生フィンガープリントからの情報を使用して、多重線形モデルは、パラメーターとして個々の化学物質に対する応答を使用して構築された。
【００５６】
多重線形モデルは、方程式を満たすものとして定義される。
【００５７】
【化１】
0006561063.tif 000002
【００５８】
式中、Ｘは、説明変数からの適切なデータを含有する行列を表し、Ｙは、従属（または応答）変数のベクトルである。これは、パラメーター（即ち、化学物質に特異的な産生物産生）を観察される流加性能（ここでは、Ｍａｘ  ＭＡｂ力価として定義される）に適合させるのに最小二乗解を本質的に見出している。
【００５９】
複数のクローン微小環境から構築される多重線形モデルの例は、
Ｍａｘ．ＭＡｂ．力価＝３７．７８*（対照プレート力価）−２２．４１５０*（ＭｅＩＡＢプレート力価）＋０．４７１１
である。
【００６０】
式中、Ｍａｘ．Ｍａｂ．力価は、流加培養において達成される最大モノクローナル抗体力価である。上記パラメーターを使用したモデル適合度を示すグラフを図３に示す。このモデルに関するＲ2値は０．８４である。これは、データの挙動の８４％をモデルにより説明することができると解釈され得る。
【００６１】
ブートストラップ交差検証技法を使用することにより、上記様式で構築されたモデルが、今後のデータ、即ちモデルで使用されていないデータを予測し得ることが示され得る。図４は、モデリングアプローチの、予測モデルを構築する予測能力を示す。このモデルを用いて、０．６８の多重Ｒ2は、新たなデータを予測するのに達成された。
【００６２】
既知の流加性能を有するクローンのセットに関して構築されたこのモデルは、新たなクローンの「フィンガープリント」を使用することができ、それらの相対的な流加性能を予測することが可能である。最初に、モデルは、既知の流加性能を有するクローンのパネルを使用して生成される（上記例では、１２個が使用されたが、どれくらいを使用することができるかに対して制限はない−しかしながら、構築されるモデルの複雑さは、使用するクローンの数により制限される）。続いて、クローンの大きなパネルが、細胞株開発のプロセスで得られる場合、これらは、多重微小環境プレートにおいて「スクリーニング」されて、既知の性能特性を有するクローンから生成されたモデルを使用して、Ｍａｘ  ＭＡｂ力価を予測するか、クローンをランク付けするか、またはそれらの今後の流加性能の能力の可能性に関して少なくとも情報を与えることが可能であり、その結果として、クローンスクリーニングの次の段階へとどのクローンを進ませるかどうかを選択するプロセスを助長する（即ち、小規模流加研究）。
【００６３】
本発明に記載する実施形態は、コンピューター装置および／またはコンピューター装置で実施されるプロセスを任意に含む。しかしながら、本発明はまた、コンピュータープログラム、特に本発明を実行させるように適応させたキャリア上または中に保存されたコンピュータープログラムにも及ぶ。プログラムは、部分的にコンパイルされた形態、または本発明による方法の実行における使用に適した任意の他の形態などのソースコード、オブジェクトコード、またはコード中間ソースおよびオブジェクトコードの形態で存在し得る。キャリアは、ＲＯＭ、例えばＣＤ  ＲＯＭなどの記憶媒体、または磁記録媒体、例えばメモリースティックまたはハードディスクを含んでもよい。キャリアは、電気もしくは光ケーブルを介して、または無線もしくは他の手段により送られ得る電気または光信号であり得る。
【００６４】
本明細書中では、「を含む、を含む（単数形）、を含んでいた、およびを含んでいる」という用語またはそれらの任意の変形、および「を包含する、を包含する（単数形）、を包含していた、およびを包含している」という用語またはそれらの任意の変形は、全体として交換可能であるとみなされ、それらは全て、最も広い考え得る解釈を提供すべきであり、その逆もまた同様である。
【００６５】
本発明は、上述の実施形態に限定されず、それらは、本発明の精神を逸脱することなく構成および詳細において多様であり得る。
【図１】
0006561063.tif 000003
【図２】
0006561063.tif 000004
【図３】
0006561063.tif 000005
【図４】
0006561063.tif 000006