(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボでエラスチンをプロテイナーゼにより切断部位で切断することによって前記部位に形成されたネオエピトープを含むペプチドフラグメントの定量化のためのバイオアッセイ方法であって、前記ペプチドフラグメントを含むサンプルを、前記ネオエピトープに対して特異的な結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記サンプル中のペプチドフラグメントへの、前記免疫学的結合パートナーの結合のレベルを判定するステップとを含み、前記免疫学的結合パートナーが、末端配列
【化１】
0006505749.tif 000008
の１つに対して特異的な結合親和性を有し、
前記免疫学的結合パートナーが、配列………ＦＧＰＧＶＶと反応するならば、………ＦＧＰＧＶＶＧ（配列番号５）と特異的に反応せず、………ＶＰＧＬＧＶと反応するならば、………ＶＰＧＬＧＶＧ（配列番号６）と特異的に反応せず、ＩＫＡＰＫＬ……と反応するならば、ＰＩＫＡＰＫＬ……（配列番号７）と特異的に反応しない、方法。
【請求項２】
前記免疫学的結合パートナーが、特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫学的結合パートナーおよび競合剤が前記サンプルの存在下でインキュベートされて、前記競合剤が前記サンプル中の前記ペプチドフラグメントと競合して前記免疫学的結合パートナーに結合する競合免疫アッセイとして行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記競合剤が、前記ネオエピトープを明らかにするような、合成ペプチドであるか、またはエラスチンの切断によって形成される精製された天然ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーが結合するペプチドフラグメント中に含有されるペプチド配列に対して特異的な結合親和性を有する更なる免疫学的結合パートナーとを前記サンプルの存在下でインキュベートして、その両方を前記サンプル中の前記ペプチドフラグメントに一緒に結合させるサンドイッチ免疫アッセイとして行われる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、尿、血清、血液、血漿、または唾液のサンプルである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、患者由来のサンプルであり、前記ペプチドフラグメントの前記結合の前記判定レベルを、（ａ）比較可能な健常な個体および／または（ｂ）病的状態に特有の値と比較することをさらに含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
エラスチンから誘導された末端配列
【化２】
0006505749.tif 000009
の１つと特異的に反応する免疫学的結合パートナーであって、
配列………ＦＧＰＧＶＶと反応するならば、………ＦＧＰＧＶＶＧ（配列番号５）と特異的に反応せず、………ＶＰＧＬＧＶと反応するならば、………ＶＰＧＬＧＶＧ（配列番号６）と特異的に反応せず、ＩＫＡＰＫＬ……と反応するならば、ＰＩＫＡＰＫＬ……（配列番号７）と特異的に反応しない、免疫学的結合パートナー。
【請求項９】
モノクローナル抗体またはその結合フラグメントである、請求項８に記載の免疫学的結合パートナー。
【請求項１０】
請求項９に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
【請求項１１】
請求項８または９のいずれか１項に記載の免疫学的結合パートナーと、
前記免疫学的結合パートナーと結合する競合剤と
を含む免疫アッセイキットであって、場合によっては、洗浄試薬、バッファ、反応停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、較正標準、抗マウス抗体、および前記キットを用いてアッセイを行うための説明書の１つまたは複数を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスチンのフラグメントの検出または定量のための免疫学的方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
エラスチンは、細胞外マトリックスの構造および機能に必須のタンパク質である。ヒトエラスチンのアミノ酸配列は、配列番号１である。これは、多くの器官および組織に回復力および弾性を提供する。多くの器官は、肺、皮膚、大動脈、靭帯、腱、および軟骨組織を含む。エラスチンは、前駆体トロポエラスチンから形成され、ピリジニウム構造、デスモシン構造、およびイソデスモシン構造によって形成される架橋結合を含む。エラスチンは非常に安定しているが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）およびセリンプロテアーゼ、例えばヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）が、エラスチン線維を分解させて、弾性および機能を喪失させることができる。肺において、この弾性の喪失は、病理学的特徴、例えば肺気腫が共存する慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を引き起こす可能性がある（Ｍａｃｌａｙら  ２０１２）。さらに、肺中のエラスチン由来ペプチドの「莫大な」堆積が、間質性疾患、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）を引き起こす可能性がある。あるエラスチン由来フラグメントが、肺線維性障害に罹った患者由来の血清中でアップレギュレートされるという調査が示された（Ｓｋｊｏｔ−Ａｒｋｉｌら  ２０１２）。
【０００３】
驚くべきことに、発明者らは、種々の肺疾患の診断および予後について信頼性が高いバイオマーカーとして役立ち得る、エラスチンの特定のＨＮＥ−またはＭＭＰ７−誘導フラグメントを同定することができた。
【０００４】
他のＭＭＰによって分解したエラスチンに対するＥＬＩＳＡが記載されてきた（Ｓｋｊｏｔ−Ａｒｋｉｌ、Ｃｌａｕｓｅｎ、Ｎｇｕｙｅｎ、Ｗａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ、Ｈｏｇａｂｏａｍ、Ｈａｎ、Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎ、Ｌａｒｓｅｎ、Ｎａｗｒｏｃｋｉ、ＬｅｅｍｉｎｇおよびＫａｒｓｄａｌ  ２０１２；Ｓｋｊｏｔ−Ａｒｋｉｌら  ２０１３）。これは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２による切断によって誘導されるエラスチンのフラグメントを標的とするモノクローナル抗体を利用する。このアッセイはまた、肺障害にも適用される。本明細書中に記載されるバイオマーカーは、ＨＮＥおよび／またはＭＭＰ７によって誘導された、選択されたエラスチンフラグメントに基づくので、異なっている。当該バイオマーカーは、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２プロテアーゼと比較して、肺障害により特異的である（Ｆｉｎｌａｙら  １９９７；Ｒｏｓａｓら  ２００８；Ｓｔａｒｃｈｅｒら  １９９６；Ｚｈａｎｇら  ２００５）。
【０００５】
無傷のＭＭＰ７およびＨＮＥを定量化するＥＬＩＳＡキットが知られているが、これらはプロテアーゼの濃度を測定するのみであり、標的分子に及ぼす影響、すなわちエラスチンのネオエピトープの発生を測定するものでない。
【０００６】
無傷のエラスチンを定量化するＥＬＩＳＡキットも入手可能である。これは、無傷のエラスチンを検出するのではなくエラスチンの分解中に生じるネオエピトープを検出する本発明と異なる。
【０００７】
多くのＨＮＥ由来のエラスチンフラグメントが、消化エラスチンの質量分析によって検出されてきた。例えば、Ｈｅ、ＴｕｒｉｎｏおよびＬｉｎ  ２０１０参照。そこでは、少数のエラスチンフラグメントもまた、血漿および／または痰において検出かつ定量化されている。しかしながら、検出かつ定量化されたこれらのペプチドは、本発明で用いられるフラグメントと異なる。
【０００８】
ＣＯＰＤ患者中の成熟エラスチン（デスモシン架橋結合）が、質量分析によって定量化された（Ｍａ、ＬｉｎおよびＴｕｒｉｎｏ  ２００７）。著者らは、無傷のエラスチンの産生を定量化しただけであり、プロテアーゼ誘導フラグメントを定量化しなかった。
【０００９】
種々のプロテアーゼによるエラスチンの切断部位が既に決定され、公開されている。これはまた、ＨＮＥ切断エラスチン（Ｂａｒｒｏｓｏ、ＡｂｅｌｌｏおよびＢｉｓｃｈｏｆｆ  ２００６；Ｈｅ、ＴｕｒｉｎｏおよびＬｉｎ  ２０１０ａ）およびＭＭＰ７（Ｈｅｉｎｚら  ２０１１）切断エラスチンを含む。しかしながら、これらの開示は、エラスチンのタンパク質分解中に生じたネオエピトープに特異的な抗体を用いた、エラスチンフラグメントの検出を記載していない。これらは、インビトロで形成されたエラスチンのどのフラグメントが診断に関連するのか、インビボで形成されるのか、生物学的流体サンプルにおいて検出が可能なのかさえも開示していない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、インビボでエラスチンをプロテイナーゼにより切断部位で切断することによって前記部位に形成されたネオエピトープを含むペプチドフラグメントの定量化のためのバイオアッセイ方法であって、前記ペプチドフラグメントを含むサンプルを、前記ネオエピトープに対して特異的な結合親和性を有する免疫学的結合パートナーと接触させるステップと、前記サンプル中のペプチドフラグメントへの、前記免疫学的結合パートナーの結合のレベルを判定するステップとを含み、前記免疫学的結合パートナーが、末端配列
【００１１】
【化１】
0006505749.tif 000002
の１つに対して特異的な結合親和性を有する、方法を提供する。
【００１２】
記号
【化２】
0006505749.tif 000003
は、配列番号１の番号付けされた点と、Ｃ末端切断フラグメントの場合には次のアミノ酸と、そしてＮ末端切断の場合には前のアミノ酸との間での、エラスチン配列の切断を示す。
【００１３】
免疫学的結合パートナーは、配列………ＦＧＰＧＶＶと反応するならば、好ましくは………ＦＧＰＧＶＶＧ（配列番号５）と特異的に反応せず、………ＶＰＧＬＧＶと反応するならば、………ＶＰＧＬＧＶＧ（配列番号６）と特異的に反応せず、ＩＫＡＰＫＬ……と反応するならば、ＰＩＫＡＰＫＬ……（配列番号７）と特異的に反応しない。
【００１４】
好ましくは、免疫学的結合パートナーはまた、エラスチンアミノ酸配列の関連部分が付いて切断部位を越えてさらに拡張したペプチドと特異的に反応しない。
【００１５】
前記免疫学的結合パートナーは、特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体であってもモノクローナル抗体のフラグメントであってもよい。
【００１６】
本発明は、エラスチンから誘導された末端配列
【００１７】
【化３】
0006505749.tif 000004
の１つと特異的に反応する免疫学的結合パートナーを含む。
【００１８】
好ましくは、免疫学的結合パートナーは、配列………ＦＧＰＧＶＶと反応するならば、………ＦＧＰＧＶＶＧと特異的に反応せず、………ＶＰＧＬＧＶと反応するならば、………ＶＰＧＬＧＶＧと特異的に反応せず、ＩＫＡＰＫＬ……と反応するならば、ＰＩＫＡＰＫＬ……と特異的に反応しない。
【００１９】
免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体であってもその結合フラグメントであってもよい。
【００２０】
本発明は、記載される免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーと結合する競合剤とを含む免疫アッセイキットであって、場合によっては、洗浄試薬、バッファ、反応停止試薬（ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）、酵素標識、酵素標識基質、較正標準、抗マウス抗体、および前記キットを用いてアッセイを行うための説明書の１つまたは複数を含む、キットを含む。
【００２１】
前記アッセイの結果は、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、もしくはＳＣＣの存在の、特定の患者におけるリスクの程度、またはそのような状態の程度もしくは重篤度を示す指標をもたらし得る。前記測定の値が閾値レベルを上回る患者は、更なる調査が、またはその治療のための医薬品の処方が推奨されてよく、そしてそのような追跡調査または治療が、本発明の方法の一部を形成してよい。
【００２２】
先に記載される複数のペプチドのアッセイが、別々に行われてよく、そしてそれらの、先に記載される複数のペプチドについて組み合わされた結果が、一緒に測定されてよい。
【００２３】
本発明に従うアッセイの結果は、診断または予後の値の複合指数を形成するために、１つまたは複数の他の測定されたバイオマーカーと組み合わされてよい。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「免疫学的結合パートナー」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、そしてまたＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２等の抗体の特異的結合フラグメントを含む。ゆえに、前記免疫学的結合パートナーは、結合親和性が特異的であるモノクローナル抗体であってもモノクローナル抗体のフラグメントであってもよい。
【００２５】
通常、以前に知られている全ての免疫測定フォーマットが、本発明に従って用いられてよく、異質フォーマットおよび均質フォーマット、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、酵素結合アッセイ、および放射免疫アッセイ等を含む。ゆえに、場合によっては、前記方法は、前記免疫学的結合パートナーおよび競合剤が前記サンプルの存在下でインキュベートされて、競合剤がサンプル中のペプチドフラグメントと競合して免疫学的結合パートナーに結合する競合免疫アッセイとして行われる。
【００２６】
前記競合剤は、合成ペプチドであってもよいし、エラスチンの切断によって形成される精製された天然ペプチドであってもよい。
【００２７】
あるいはその代わりに、前記方法は、前記免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーが結合するペプチドフラグメント中に含有されるペプチド配列に対して特異的な結合親和性を有する更なる免疫学的結合パートナーとを前記サンプルの存在下でインキュベートして、その両方をサンプル中の前記ペプチドフラグメントに一緒に結合させるサンドイッチ免疫アッセイとして行われる。適切な一方法が、エラスチンのフラグメントのネオエピトープに結合するモノクローナル抗体または抗体結合フラグメントを用いる競合免疫アッセイであり得る。
【００２８】
マイクロタイタープレートの固体表面上にコーティングされた、適切に選択された合成ペプチドが、モノクローナル抗体または結合フラグメントへの結合についてサンプルと競合し得る。あるいはその代わりに、モノクローナル抗体または結合フラグメントによって認識されるネオエピトープを有するこれらのタンパク質の１つまたは複数から精製された天然のフラグメントが、固体表面上に用いられてよい。さらに別の代替物は、モノクローナル抗体または結合フラグメントを固体表面上に固定してから、サンプルを、シグナル分子、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはビオチンに適切に結合した合成ペプチドと共インキュベートするものである。
【００２９】
ある好ましい方法において、サンプルは患者由来のサンプルであり、本方法はさらに、前記ペプチドフラグメントの前記結合の判定レベルを、（ａ）比較可能な健常な個体および／または（ｂ）関連する病的状態に特有の値と比較するステップと、場合によっては、より高いレベルの測定ペプチド（通常、より高いレベルの結合によって示される）を、より重度の前記状態と関連させるステップとを含む。サンプルは、一例として、尿、血清、血液、血漿、または唾液のサンプルであってよい。
【００３０】
本発明の態様は、先に記載されるように、ネオエピトープを認識するモノクローナル抗体の開発に関する。これは、エラスチンのアミノ酸配列（特に、先に記載される配列、またはその中で終結する配列）に由来する合成ペプチドでマウスを免疫化し、選択されたマウス由来の脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合し、かつ関連する合成ペプチド上のネオエピトープへの結合についてモノクローナル抗体を試験することによって、達成され得る。ネオエピトープに対する特異性は、合成ペプチドとの反応性、および（Ｃ末端ネオエピトープについて）免疫化ペプチドのＣ末端延長形態（ｐｒｏｌｏｎｇａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）または（Ｎ末端ネオエピトープについて）免疫化ペプチドのＮ末端延長形態との反応性の欠如を要求することによって、確実にされ得る。ネオエピトープ用抗体はまた、無傷のエラスチンへの結合能力の欠如を確立したことが評価され得る。あるいはその代わりに、ネオエピトープに対する特異性は、抗体の反応性が、末端アミノ酸の１つに共有結合したビオチンまたは他の官能基の存在にネガティブに依存することを要求することによって、確実にされ得る。
【００３１】
本発明は、先に記載される部分配列のいずれか１つにおける、プロテアーゼによるエラスチンの終端での切断によって形成されるネオエピトープと特異的に免疫反応性を示す免疫学的結合パートナーを含み、例えば、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントであってよい。
【００３２】
本発明は、先に記載される部分配列のいずれか１つにおける配列の、エラスチンの終端での切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープに対するモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。
【００３３】
本発明はさらに、先に記載される部分配列のいずれか１つにおけるエラスチンの切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドを提供する。そのようなペプチドは、前記ペプチドに対する免疫応答をもたらすためにキャリアにハプテンとして結合してもよいし、固体表面に固定されてもよいし、免疫アッセイに用いられる検出可能マーカーに結合してもよい。
【００３４】
本発明はさらに、先に記載される部分配列のいずれか１つにおけるエラスチンの切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。
【００３５】
本発明はさらに、先に記載される部分配列のいずれか１つにおけるエラスチンの切断によって形成されるＣ末端ネオエピトープまたはＮ末端ネオエピトープを含むペプチドの発現をコードする発現シグナルおよびコード配列を含む核酸配列を含むベクターを含み、そしてさらに、そのようなベクターで形質転換され、かつ前記ペプチドを発現する宿主細胞を含む。
【００３６】
本発明のさらに別の態様は、先に記載される方法を実行するのに好都合に用いられ得るキットに関する。そのようなキットは、（１）ネオエピトープの配列を有する合成ペプチドでコーティングされたマイクロタイタープレート；（２）前記合成ペプチドと反応性の本発明のモノクローナル抗体または抗体結合フラグメント；および（３）標識付き抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンを含んでよい。あるいはその代わりに、そのようなキットは、（１）精製された天然のタンパク質フラグメントでコーティングされたマイクロタイタープレート；（２）前記タンパク質のいずれか１つのフラグメント上のネオエピトープを認識し、かつ前記精製されたフラグメントと反応性のモノクローナル抗体；および（３）標識付き抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンを含んでよい。あるいはその代わりに、そのようなキットは、（１）ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート；（２）ビオチンに結合した合成ペプチドであって、ネオエピトープの配列を有する合成ペプチド；（３）前記タンパク質フラグメント上のネオエピトープを認識し、かつ前記合成ペプチドと反応性のモノクローナル抗体；および（４）標識付き抗マウスＩｇＧ免疫グロブリンを含んでよい。さらに別の代替物は、（１）ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレート；（２）ビオチンに結合した合成ペプチドであって、ネオエピトープの配列を有するペプチド；（３）前記タンパク質フラグメント上のネオエピトープを認識し（かつ前記合成ペプチドと反応性の）、かつセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合するモノクローナル抗体を含むキットであってよい。さらに別の代替物は、（１）前記タンパク質フラグメント上のネオエピトープを認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントで（直接的に、または間接的に）コーティングされたマイクロタイタープレート；（２）ネオエピトープの配列を有するＨＲＰ標識付き合成ペプチドを含むキット、あるいは（１）前記タンパク質フラグメント上のネオエピトープを認識するモノクローナル抗体またはそのフラグメントで（直接的に、または間接的に）コーティングされたマイクロタイタープレート；（２）ネオエピトープの配列を有するビオチン標識付き合成ペプチド；（３）ＨＲＰ標識付きストレプトアビジンを含むキットであってよい。
【００３７】
ゆえに、本発明は、本明細書中に記載される免疫学的結合パートナーと、前記免疫学的結合パートナーと結合する競合剤とを含む免疫アッセイキットであって、場合によっては、洗浄試薬、バッファ、反応停止試薬、酵素標識、酵素標識基質、較正標準、抗マウス抗体、および前記免疫アッセイを行うための説明書の１つまたは複数を含む、キットを含む。
【００３８】
本明細書中に記載されるアッセイは、記載される疾患、および一般に患者におけるエラスチン関連病状の診断に有用である。また、試験は、疾患進行の評価、および治療に対する反応の監視に有用である。本発明の免疫学的結合パートナーはまた、本明細書中に記載されるエラスチンの切断産物の存在または位置を示すための免疫染色に用いられてもよい。
【００３９】
本発明はさらに、好ましい実施形態の原理および実施を示す以下の実施例を参照して記載かつ例示されることとなる。実施例は、添付の図面に示される結果を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】実施例３において得られたＥＬＩＳＡの結果を示しており、遊離ペプチドおよび伸長ペプチド（ＮＢ５９０）の、ＮＢ５９０モノクローナル抗体とのインキュベーション後の濃度と比較した、測定Ｂ／Ｂ０比を示す。伸長ペプチドに対する反応性はほとんどない。
【図２】実施例３において得られた、ＮＢ５９０モノクローナル抗体を特徴付ける結果を示す。
【図３】実施例３において得られた、患者および対照のＣＯＰＤ、ＩＰＦ、および扁平上皮癌（ＳＣＣ）由来の血清中のＮＢ５９０遊離ペプチドの濃度を示す。＊はｐ値≦０．０５を表し、＊＊はｐ値≦０．０５を表す。平均値の標準誤差も示される。
【図４】実施例４において得られたＥＬＩＳＡの結果を示しており、遊離ペプチドおよび伸長ペプチド（ＮＢ５９２）の、ＮＢ５９２モノクローナル抗体とのインキュベーション後の濃度と比較した、測定Ｂ／Ｂ０比を示す。伸長ペプチドに対する反応性はほとんどない。
【図５】実施例４において得られた、ＮＢ５９２モノクローナル抗体を特徴付ける結果を示す。
【図６】実施例４において得られた、患者および対照のＣＯＰＤ、ＩＰＦ、および扁平上皮癌（ＳＣＣ）由来の血清中のＮＢ５９２遊離ペプチドの濃度を示す。平均値の標準誤差が示される。遊離ペプチド濃度が基準として適用された。
【図７】実施例５において得られたＥＬＩＳＡの結果を示しており、遊離ペプチド（ＮＢ５９３）（配列番号１１）および伸長ペプチド（配列番号１３）の、ＮＢ５９３モノクローナル抗体とのインキュベーション後の濃度と比較した、測定Ｂ／Ｂ０比を示す。伸長ペプチドに対する反応性はほとんどない。
【図８】実施例５において得られた、ＮＢ５９３モノクローナル抗体を特徴付ける結果を示す。
【図９】患者および健常な対照由来の種々の疾患サンプルにＮＢ５９３抗体を試験した結果を示す。ＮＢ５９３フラグメントは、血清中で検出不可能であった。
【図１０】実施例６において行われたＥＬＩＳＡの結果を示しており、ＮＢ５９５モノクローナル抗体の、遊離ペプチド（ＮＢ５９５）（配列番号１２）および伸長ペプチド（配列番号１４）による、シグナルのパーセント阻害を示す。伸長ペプチドによる阻害はほとんどない。
【図１１】実施例６において得られた、ＮＢ５９５モノクローナル抗体を特徴付ける結果を示す。
【図１２】ＣＯＰＤ患者および健常な対照由来の血清中のＮＢ５９５フラグメントの濃度を示す。ＮＢ５９５フラグメントは、ＣＯＰＤにおいて高められていない。
【図１３】実施例７において行われたＥＬＩＳＡの結果を示しており、ＮＢ５９９モノクローナル抗体の、遊離ペプチド（ＮＢ５９９）（配列番号１０）および伸長ペプチド（配列番号１５）による、シグナルのパーセント阻害を示す。遊離ペプチドと比較して、伸長ペプチドに対する抗体との反応性が低い。
【図１４】実施例７において得られた、ＮＢ５９９モノクローナル抗体を特徴付ける結果を示す。
【図１５】対照、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、ＣＯＰＤ、およびＩＰＦの患者由来の血清中のＮＢ５９９エラスチンフラグメントの濃度を示す。対照とＳＣＣとの間に、そしてＣＯＰＤと対照との間に、有意差がある。ＩＰＦと対照との間にも、統計的差異がある。
【実施例１】
【００４１】
免疫化用のペプチドの選択
免疫化用に以下のペプチドを選択した。
【００４２】
【表１】
0006505749.tif 000005
【００４３】
含まれる切断部位は、他者によって以前に決定された切断部位である（Ｈｅ、ＴｕｒｉｎｏおよびＬｉｎ  ２０１０ｄ；Ｈｅｉｎｚら  ２０１１ａ）。発明者らは、切断部位の下流または上流の最初の１０のアミノ酸について、免疫化ペプチドを選択した。
【実施例２】
【００４４】
モノクローナル抗体の開発
標準的な手順に従って、Ｃ末端エピトープの場合はＮ末端で、Ｎ末端エピトープの場合はＣ末端でＫＬＨに結合する言及した免疫原ペプチドを用いて、２００μＬの乳化抗原（免疫化１回あたり５０μｇ）で腹部中に皮下接種して６頭の４〜６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫化した。安定した力価レベルが得られるまで、免疫化を続けた。
【００４５】
力価が最も高いマウスを融合用に選択して、細胞融合用の脾臓の単離の３日前に、１００μＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中の５０μｇの免疫原によって静脈内にブーストした。
【００４６】
融合手順に続いて、既知の手順を行った（Ｇｅｆｔｅｒ、ＭａｒｇｕｌｉｅｓおよびＳｃｈａｒｆｆ  １９７７）。上澄みを収集し、プロテインＧカラムを用いて製造者（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の説明書に従ってモノクローナル抗体を精製した。
【００４７】
ネオエピトープ特異的モノクローナル抗体の選択：
抗体は、免疫化に用いた非結合形態の相同ペプチド（選択ペプチド）を用いて、ペプチド特異性に基づいて選択することによって、さらにエラスチン配列の１アミノ酸だけ切断部位を越えて拡張したペプチドの伸長バージョンを除外することによって、ネオエピトープ特異性を有する抗体のみを確実に更なる分析のために選択した。
【００４８】
その後、無傷の、天然の、および切断されたエラスチンに対する抗体の反応性を試験した。
【００４９】
最終的に、健常な対象および罹患対象由来の血清サンプルを、上述のアッセイプロトコルにおいて試験した。
【００５０】
アッセイプロトコル：
９６ウェルストレプトアビジンプレートを、コーターバッファ中に溶解したスクリーニングペプチドでコーティングし、２０℃にて３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを洗浄バッファ（２０ｍＭトリス、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で５回洗浄した。２０μＬのペプチド（選択、除外、またはナンセンス）またはヒトサンプルを適切なウェルに２連で加えた後に、１００μＬのＰＯＤ結合モノクローナル抗体を加えてから、プレートをシェーカー上で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μＬテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ）を加え、プレートを暗所で２０℃にて１５分間インキュベートした。
【００５１】
全ての上記インキュベーション工程は、３００ｒｐｍでの振盪を含んだ。
【００５２】
ＴＭＢ反応は、１００μＬの反応停止溶液（１％  Ｈ２ＳＯ４）を加えることによって止めた。吸光度は、６５０ｎｍを基準として、４５０ｎｍで測定した。選択ペプチドから作成したマスターキャリブレータを較正曲線として用い、４パラメトリック数理フィットモデルを用いてプロットした。
【００５３】
全ての血清サンプルは、測定前にインキュベーションバッファ中で１：２に希釈した。
【実施例３】
【００５４】
モノクローナル抗体ＮＢ５９０
図１は、ＮＢ５９０抗体に対する、遊離および伸長ペプチドの反応性を示す。吸光度の低下が、遊離ペプチド濃度の上昇と共に見られる。これは、ウェル内でスクリーニングペプチドの代わりに遊離ペプチドとの反応が増大したことによる。これは、伸長ペプチドには見られなかった。というのも、安定したＢ／Ｂ０レベルにより、ＮＢ５９０−０１抗体と伸長ペプチドとの間で反応が非常に低かった、または反応がなかったことが示されたためである。
【００５５】
その後、ＮＢ５９０抗体を、エラスチン（ＥＬＮ）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＨＮＥでインビトロ切断したエラスチン、ならびにそれらの各バッファ中のプロテアーゼに対して試験した（図２）。それらのバッファ中の選択されたプロテアーゼのみの反応性も含めている。ＮＢ５９０モノクローナル抗体は、明らかに、ＨＮＥによって誘導されたエラスチンフラグメントを区画している。遊離ペプチド濃度を基準として適用した。ＮＢ５９０抗体は、ＨＮＥで切断したエラスチンに対する反応性が非常に高い。ＮＢ５９０抗体および無傷のエラスチンまたは他のプロテアーゼで切断したエラスチンの反応性は、アッセイの検出下限に近い。
【００５６】
最後に、ＮＢ５９０抗体を、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、または扁平上皮癌の患者由来の血清サンプル中で試験し、健常な対照と比較した（図３）。健常な対照と比較して、ＣＯＰＤおよび扁平上皮癌の患者において、ＮＢ５９０フラグメントの濃度に有意差がある。より高いレベルの傾向が観察されたが、対照とＩＰＦ患者との間に統計的有意差はなかった。このことは、これが横断研究であったという事実によって説明されるかもしれない。一方、ＩＰＦ患者の長期的な研究によって、より有意な差異が示されるかもしれない。
【実施例４】
【００５７】
モノクローナル抗体ＮＢ５９２
図４は、ＮＢ５９２抗体に対する、遊離および伸長ペプチドの反応性を示す。吸光度の低下が、遊離ペプチド濃度の上昇と共に見られる。これは、ウェル内でスクリーニングペプチドの代わりに遊離ペプチドとの反応が増大したことによる。これは、伸長ペプチドには見られなかった。というのも、安定したＢ／Ｂ０レベルにより、伸長ペプチドとＮＢ５９２抗体との間で反応が非常に低かった、または反応がなかったことが示されたためである。
【００５８】
その後、ＮＢ５９２抗体の反応性を、エラスチン、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＨＮＥでインビトロ切断したエラスチン、ならびにそれらの各バッファ中のプロテアーゼに対して試験した（図５）。それらのバッファ中の選択されたプロテアーゼのみの反応性も含めている。ＮＢ５９２モノクローナル抗体は、明らかに、ＨＮＥによって誘導されたエラスチンフラグメントを区画している。遊離ペプチド濃度を基準として適用した。ＮＢ５９２抗体は、ＨＮＥで切断したエラスチンに対する反応性が非常に高い。ＮＢ５９２抗体および無傷のエラスチンまたは他のプロテアーゼで切断したエラスチンの反応性は、アッセイの検出下限に近い。微量のシグナルが、ＨＮＥおよびそのバッファについてのみ示されるが、シグナルは、ＨＮＥで切断されたエラスチンについてのシグナルよりも１００倍以上小さい。
【００５９】
最後に、ＮＢ５９２抗体を、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、または扁平上皮癌の患者由来の血清サンプル中で試験し、健常な対照と比較した（図６）。レベル増大の高い傾向が観察されたが、健常な対照と比較して、ＣＯＰＤおよび扁平上皮癌の患者において、ＮＢ５９２フラグメントの濃度に有意差はなかった（ｐ＜０．０５）。対照とＩＰＦ患者との間に差はなかった。このことは、これが横断研究であったという事実によって説明されるかもしれない。一方、ＩＰＦ患者の長期的な研究によって、差異が示されるかもしれない。
【実施例５】
【００６０】
（比較）モノクローナル抗体ＮＢ５９３
図７は、ＮＢ５９３抗体に対する、遊離および伸長ペプチドの反応性を示す。吸光度の低下が、遊離ペプチド濃度の上昇と共に見られる。これは、ウェル内でスクリーニングペプチドの代わりに遊離ペプチドとの反応が増大したことによる。これは、伸長ペプチドには見られなかった。というのも、安定したＢ／Ｂ０レベルにより、ＮＢ５９３抗体間で反応が非常に低かった、または反応がなかったことが示されたためである。
【００６１】
その後、ＮＢ５９３抗体の反応性を、エラスチン、ＨＮＥでインビトロ切断したエラスチン、およびＨＮＥバッファに対して試験した。５９３モノクローナル抗体は、明らかに、無傷のエラスチンと比較して、ＨＮＥによって誘導されたエラスチンフラグメントに対する反応性が非常に高く、そのようなフラグメントを区画している。遊離ペプチド濃度を基準として適用した。無傷のエラスチンまたはＨＮＥバッファに対するＮＢ５９３抗体の反応性は、非常に低い。
【００６２】
最後に、図９は、ＮＢ５９３抗体の反応性、ならびにＣＯＰＤ患者および健常な対照由来のヒト血清サンプルを示す。データは、健常な対照および罹患者の血清中で、抗体ＮＢ５９３によって認識されるフラグメントが不在であること、または検出不可能な量で存在するのみであることを示す。
【実施例６】
【００６３】
（比較）モノクローナル抗体ＮＢ５９５
図１０は、ＮＢ５９５抗体に対する、遊離および伸長ペプチドの反応性を示す。吸光度の低下が、遊離ペプチド濃度の上昇と共に見られる。これは、ウェル内でスクリーニングペプチドの代わりに遊離ペプチドとの反応が増大したことによる。これは、伸長ペプチドには見られなかった。というのも、安定したＢ／Ｂ０レベルにより、ＮＢ５９５抗体との反応が非常に低かった、または反応がなかったことが示されたためである。
【００６４】
その後（図１１）、ＮＢ５９５抗体の反応性を、エラスチン、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＨＮＥでインビトロ切断したエラスチン、ならびにそれらの各バッファ中のプロテアーゼに対して試験した。５９５モノクローナル抗体は、明らかに、ＭＭＰ７によって誘導されたエラスチンフラグメントを区画し、ＭＭＰ７で切断したエラスチンに対する反応性が高い。遊離ペプチド濃度を基準として適用した。無傷のエラスチンまたは他のプロテアーゼで切断したエラスチンに対するＮＢ５９５抗体の反応性は、アッセイの検出下限に近い。
【００６５】
最後に、図１２はＮＢ５９５抗体の反応性、ならびにＣＯＰＤ患者および健常な対照由来のプールしたヒト血清サンプルを示す。データは、ＮＢ５９５フラグメントが、ＣＯＰＤ患者において高められていないことを示す。したがって、この抗体についての生物学的妥当性は限られている。
【実施例７】
【００６６】
ＮＢ５９９
図１３は、ＮＢ５９９抗体に対する、遊離した伸長ペプチドの反応性を示す。吸光度の低下が、遊離ペプチド濃度の上昇と共に見られる。これは、ウェル内でスクリーニングペプチドの代わりに遊離ペプチドとの反応が増大したことによる。吸光度の低下は、伸長ペプチドについて、有意により低かった。というのも、Ｂ／Ｂ０レベルにより、ペプチドとＮＢ５９９抗体との反応が弱いことが示されたためである。
【００６７】
その後、ＮＢ５９９抗体の、エラスチン、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＨＮＥでインビトロ切断したエラスチン、ならびにそれらの各バッファ中のプロテアーゼに対する反応性（図１４）を判定した。ＮＢ５９９モノクローナル抗体は、明らかに、ＭＭＰ７によって誘導されたエラスチンフラグメントを区画している。ＮＢ５９９抗体は、ＭＭＰ７で切断したエラスチンに対する反応性が、他のプロテアーゼで切断したエラスチンよりもかなり高い。ＨＮＥ＋ＨＮＥバッファに対する反応性が多少存在したが、これは、ＨＮＥで切断したエラスチンよりもかなり低い。
【００６８】
最後に、ＮＢ５９９試験を用いて、エラスチンフラグメントの存在を、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、または扁平上皮癌の患者由来の血清サンプル中で試験し、健常な対照と比較した（図１５）。健常な対照と比較して、ＣＯＰＤ、ＩＰＦ、および扁平上皮癌の患者において、ＮＢ５９９フラグメントの濃度に有意差がある。とりわけ、扁平上皮癌およびＣＯＰＤの患者は、ＮＢ５９９エラスチンフラグメントのレベルが増大していた。
【００６９】
本明細書において、特に明示的に示されない限り、用語「または」は、述べられる条件の一方または双方が満たされる場合に真の値を返す演算子の意味で用いられ、条件の１つのみが満たされることを要求する演算子「排他的離接（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｒ）」とは対照的である。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる」を意味するのではなく「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で用いられる。上述された先の教示は全て、参照により本明細書中に組み込まれる。本明細書中における全ての先に公開された文書の記載が、その当時の豪州他における共通の一般的知識であったという承認または陳述であるとは認められないものとする。
【００７０】
【表２Ａ】
0006505749.tif 000006
【表２Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0006505749.tif 000024
【配列表】
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