(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容可能な塩の形態であってもよいオクトレオチド酢酸のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーミクロスフェアの調製方法であって、
ａ．水に混和性であり、水をまた含んでいてもよい少なくとも一種の有機溶媒にオクトレオチド酢酸又はその塩を溶解させて、水相を形成する工程と；
ｂ．ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーの有機溶液を含む適切な油相中に水中油又は水中油中水エマルジョンを形成し、該溶液が水相と非混和性であり、該ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーの有機溶液が５℃以下まで冷却される工程と；
ｃ．蒸発工程中の温度を制御し、蒸発工程中の温度を０．１℃／分〜１℃／分の温度増加速度で上昇させることによって、ａで使用された少なくとも一種の有機溶媒をエマルジョンから蒸発させてミクロスフェアを形成する工程であって、
蒸発工程中の温度増加速度によって、オクトレオチド酢酸のインビボ及びインビトロの放出特性が制御される工程
とを含む方法。
【請求項２】
有機溶媒がメタノールであり、水が添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーがジクロロメタンに溶解される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃの蒸発が１５℃を超えて開始され、蒸発工程中にエマルジョンの温度が３５℃より高い温度まで上げられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
温度が２０分から３時間の時間にわたって上げられる、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
更なる乾燥が昇温期間後の延長時間の間継続する、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド医薬品有効成分を含む生分解性ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）「ＰＬＧＡ」ミクロスフェアの調製と徐放特性を達成する方法に関する。特に、本発明は、高分子マトリックスからのペプチドの放出が溶媒蒸発工程中の温度プロファイルによって制御されるエマルジョン溶媒抽出／蒸発法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド薬は、その不十分な経口吸収性と胃液中での高度な不安定性のため、通常は全身的、例えば非経口的に投与される。しかしながら、非経口投与は痛みがあり、特に毎日の繰り返し投与の場合、不快感を生じさせうる。患者に対する注射回数を最小にするためには、原薬をデポー製剤として投与するのが有利である。生分解性高分子のデポー製剤として、例えばミクロスフェア又はインプラントとして、ペプチド薬を非経口投与することが提案されており、生体媒質の酵素及び加水分解の影響からペプチドを保護するポリマー中でのある滞留時間後にその徐放が可能になる。注射可能なデポー製剤の一般的な欠点は、全放出期間中ゼロに近い血漿中濃度と共に、望まれない薬理学的副反応を生じさせる高ピーク濃度のような血漿中濃度の変動である。長期間にわたる治療的に適切な血中濃度を達成することは難しく、満足できるペプチド放出特性は実際には非常に少ない症例で得られているに過ぎない。
【０００３】
ＰＬＧＡミクロスフェアの形態の非経口デポーのペプチド放出特性を制御する特定された因子には、ペプチド形態（すなわち、遊離ペプチド、塩形態）、高分子タイプ（すなわち、分子量、グリコリドに対するラクチドの比率、直鎖状又は分岐状構造、末端基）、薬物負荷、粒径及び粒子多孔度及び高分子マトリックス中への薬剤の分布が含まれる（米国特許第５５３８７３９号）。
【０００４】
ミクロスフェアの数種の市販の長時間作用型放出薬製剤が市場で入手可能である。サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）は、オクトレオチド酢酸塩活性ペプチドを含有する市販の非経口デポー製剤である。それは、とりわけ、末端肥大症患者における長期の維持療法と、悪性カルチノイド腫瘍及び血管作動性小腸ペプチド腫瘍（ＶＩＰ産生腫瘍）に関連した重度の下痢及びフラッシングの治療に適用される。１０、２０及び３０ｍｇ（そして米国や日本のようなある国では末端肥大症の患者に対して４０ｍｇまで）の用量で承認されて、サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）は月一回の臀部内注射が可能である。サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）の注射後のオクトレオチドの薬物動態プロファイルは高分子マトリックスからの放出プロファイルとその生分解を反映する。ヒトにおける一回の筋肉内注射後に、オクトレオチド濃度は投与後１時間以内に過渡的な初期ピークに到達し、続いて２４時間以内に検出できない低レベルまで徐々に減少する。１日目のこの初期放出後、オクトレオチドは、次の７日間、大部分の患者において治療レベル以下のままである。その後、オクトレオチド濃度は再び増加し、およそ１４日目（注射後約２−３週）にプラトーレベルに達し、これが次の３から４週間、維持され、ついで６週間の減少期間が続く（Summary of product characteristics for Sandstatin LAR(R) 10 mg, 20 mg or 30 mg powder and solvent for suspension for intramuscular injection, 2013）。上記と一致し、入手できる文献データによれば、ラットにおけるサンドスタチンＬＡＲの予想される放出プロファイルは同じパターンに従う（AAPS PharmSciTech, Vol. 12, No 4 (2011)）。
【０００５】
ＰＬＧＡミクロスフェア中へのペプチドのマイクロカプセル化には多くの技術がある。研究室規模と商業生産の双方において最も広く使用されている技術には、相分離／コアセルベーション技術、噴霧乾燥及びシングル（単一）又はダブル（二重）エマルジョン／溶媒蒸発技術が含まれる（PDA J Pharm Sci and Tech 2008, 62 125-154; Microencapsulation Methods and Industrial Applications Second Edition）。
【０００６】
１．相分離又はコアセルベーション技術では、ペプチド／タンパク質の水溶液が乳化されるか又は別法ではペプチド／タンパク質がジクロロメタンとＰＬＧＡを含む溶液中に固形形態で分散される。シリコーン油がこの分散系に定まった割合で加えられ、その溶媒中のポリマーの溶解度を減少させる。ポリマーリッチの液相（コアセルベート）が分散したペプチド／タンパク質分子を被包し、初期のミクロスフェアが硬化とヘプタンを使用する洗浄に供せられる。該プロセスはポリマー特性に非常に影響を及ぼしやすく、残留溶媒がまた重要な課題である。
【０００７】
２．噴霧乾燥技術では、ポリマーがジクロロメタン又はアセトンのような揮発性有機溶媒に溶解される。タンパク質は均質化によりこの有機溶液中に固体として懸濁され又は水溶液として乳化される。その後、得られた分散系は（加熱された）ノズルを通して加熱された空気流中に噴霧される。有機溶媒が蒸発して、典型的には１−１００ｍの寸法のミクロスフェアを生じる。ミクロスフェアはサイクロンセパレーターに集められる。有機溶媒を完全に除去するために、真空乾燥又は凍結乾燥工程が下流段階に続く場合がある。得られるポリマーミクロスフェアの内部構造は、噴霧乾燥される前のポリマー中におけるペプチド／タンパク質の溶解度に依存し、リザーバー又はマトリックス型の生成物の形成に至る。初期分散系が溶液である場合、噴霧乾燥後に得られる最終生成物はマトリックス又はモノリス型、つまり有効成分が溶解又は分散した性質を持つポリマー粒子（ミクロスフェアと定義）である。逆に、初期分散系が懸濁液である場合、得られる生成物はリザーバー型、つまり溶解した有効成分の液体コアを封入する区別できる高分子エンベロープ／シェル（マイクロカプセルと定義）である。
【０００８】
３．水中油（ｏ／ｗ）及び水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）は、ミクロスフェア調製中のシングル及びダブルエマルジョン形成をそれぞれ表す二つの水和技術である。これらのプロセスにおいて、ペプチド／タンパク質は、有機溶媒（例えばアルコール）又は水溶液に溶解され、ついでポリマーの有機溶液（水と非混和性）と混合され又は乳化されて、溶液又は油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンをそれぞれ生じる。ジクロロメタンはＰＬＧＡに対する有機溶媒となり、高せん断ホモジナイズ又は超音波処理の何れかを使用してＯ／Ｗ型一次エマルジョンが形成される。ついで、この一次エマルジョンは、通常はポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を使用して、安定剤を含む過剰の水性媒体に急速に移される。最初にｗ／ｏ／ｗ型のダブルエマルジョンを形成するためにはホモジナイズ又は集中的な撹拌が再び必要である。熱、真空、又は双方による続く有機溶媒の除去（蒸発による）はポリマーとコアの相分離を生じさせてミクロスフェアをつくり出す。溶媒の蒸発の代わりに、安定剤を伴うか伴わない多量の水での溶媒抽出もまたペプチド／タンパク質を含むミクロスフェアを得るために採用することができる。ｗ／ｏ／ｗマイクロカプセル化技術は概念的には実施するのが簡単であるように思われるが、粒子形成プロセスはかなり複雑であり、多くのプロセスパラメーターがペプチド／タンパク質充填ＰＬＧＡミクロスフェアの性質に対して影響を持っているか又は性質に影響を及ぼす。
【０００９】
今までのところ、エマルジョン／溶媒蒸発技術における蒸発工程中に適用される温度プロファイルが、高分子マトリックスからのペプチドの放出特性に影響を及ぼす重要なプロセスパラメーターとして特定されたことはない。それどころか、有機溶媒の沸点を僅かに超える（あるいは溶媒の蒸発を加速させるために減圧／真空が適用される場合は溶媒の蒸気圧を僅かに超える）一定温度での処理が一般的に適用されている。
【００１０】
これらのタイプの製剤の典型的な放出機構は、一般に初期放出相（相１）、水和相（相２）、及び制御されるが高分子マトリックスの浸食によって促進される拡散である一次放出相（相３）として一般的に表すことができる三相を含む。薬物放出はポリマー分子量が臨界値を下回ったときの遅延時間後に始まり、よって質量損失が生じうる（Faisant N, Siepmann J, Benoit JP. PLGA-based microspheres: elucidation of mechanisms and a new, simple mathematical model quantifying drug release. Eur J Pharm Sci. 2002 May; 15(4):355-66; Korber M. PLGA erosion: solubility-or diffusion-controlled? Pharm Res. 2010 Nov; 27(11):2414-20）。ミクロスフェアの高分子マトリックスからのペプチド原薬の放出プロファイルを制御するための改良された製造方法に対する必要性が当該分野には存在している。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ペプチド薬、特にオクトレオチドを含有する徐放性ＰＬＧＡミクロスフェアの調製のためのシングル又はダブルエマルジョン／溶媒蒸発技術に関し、ここで、高分子マトリックスからのペプチドの放出は溶媒蒸発工程中に適用される温度プロファイルによって制御される。他のペプチドには、エキセナチド、リューポレリン（leuporelin）、ゴセレリン、リラグルチド及びテデュグルチドが含まれる。
【００１２】
一態様では、本発明は、溶媒蒸発工程が、蒸発工程中に温度が上昇してミクロスフェアの凝固が生じる制御された温度下で実施される方法に関する。生じるミクロスフェアは、篩によって集められ、洗浄され、最後にフィルタドライヤーにおいて真空下で乾燥されて流動性粉末が得られる。
【００１３】
我々は本発明の特徴として、薬学的に許容可能な塩の形態であってもよいペプチドのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーミクロスフェアの調製方法において、
ａ．水に混和性であり、水をまた含んでいてもよい少なくとも一種の有機溶媒にペプチド又はその塩を溶解させて、水相を形成する工程；
ｂ．ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーの有機溶液を含む適切な油相中に水中油又は水中油中水エマルジョンを形成し、該溶液が水相と非混和性である工程；
ｃ．蒸発工程中の温度を制御し、蒸発工程中の温度を増加させることによって、ａで使用された少なくとも一種の有機溶媒をエマルジョンから蒸発させて、ミクロスフェアを形成する工程
を含む方法を提供する。
【００１４】
更なる態様では、インビトロ及びインビボデータによって証明される通り、ミクロスフェアの放出特性は、溶媒蒸発工程中に増加する温度の度合いによって制御される。より特定的には、溶媒蒸発中の温度は、温度を１５から２５℃、好ましくは約２０℃の開始温度から増加させる。好ましくは、達成される最高温度は３８℃又は３８度までである。温度は２０分から３時間の時間にわたって上げられる。乾燥は、昇温期間後の延長時間の間、継続されてもよい。好ましくは、昇温速度は０．１℃／分−１℃／分である。昇温は期間にわたって一定であるか又は段階的でありうる。段階的とは、各変化が温度のステップ変化であり、それで温度が次の変化までの期間の間、保たれることを我々は意味する。また蒸発段階中の段階的温度変化と一定温度変化の混合である場合もある。
【００１５】
「放出特性」なる用語によって、我々は、一回の筋肉内注射後のラット中の製剤のインビボＰＫプロファイルと相関する方法における製剤の溶解プロファイルを意味する。一態様では、Ａ型のインビトロインビボ相関が、１コンパートメントモデルを適用することによってラットの血漿中濃度曲線のデコンボリューションから計算して、インビトロ溶解プロファイルとインビボ放出プロファイルの間で樹立された。
【００１６】
より特定的には、「溶解プロファイル」は、３７℃でアセテートバッファー１ｍＭ、ｐＨ４．０中に時間の関数としてミクロスフェアから放出されるオクトレオチドの分量又は量を意味する。
【００１７】
放出特性は、初期バースト（相１）、遅延時間（相２）及び一次放出相の期間と傾き（相３）によって表される。より特定的には、溶解プロファイルは、定数ｙｏが初期バーストを反映し、定数ｘｏが遅延時間を反映し、定数ａ及びｂが一次放出相を記述する次の式によって近似される。
0006494657.tif 000002
【００１８】
本発明は、溶媒蒸発工程中の温度増加速度が封入ペプチドの放出特性を制御するために使用される、医薬品有効ペプチドを含有するＰＬＧＡミクロスフェアの調製のためのエマルジョン（シングル又はダブル）／溶媒蒸発法に関する。より特定的には、溶媒蒸発相中の温度増加速度が、ミクロスフェアの溶解プロファイルの計算されたｘｏ定数によって表されるペプチド放出プロファイルの遅延時間を制御するために使用される。得られるミクロスフェアの放出プロファイルの遅延時間は３７℃で１ｍＭのアセテートバッファー、ｐＨ４．０中で試験される。
【００１９】
より特定的には、シングルエマルジョン／溶媒蒸発技術は次の工程を含む（図１）：
ｉ．オクトレオチドが適切な量の適切な溶媒、好ましくはメタノールに溶解される。
ｉｉ．ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーがジクロロメタンに溶解させられ、溶液が１０℃以下、好ましくは５℃以下まで冷却される。
ｉｉｉ．二つの溶液が激しい撹拌下で一緒に混合されて、分散した上記油相が形成される。
ｉｖ．水性の上記連続相が、ＰＶＡ溶液中にリン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムを溶解させることによって作製され、１０℃以下、好ましくは５℃以下まで冷却される。
ｖ．分散された相と連続相が、好ましくはインライン高剪断分散機を使用して、一緒に混合され、所望の粒径分布の半固体ミクロスフェアが形成される。連続相の流れは蠕動ポンプによって達成される一方、連続の比の流れはシリンジポンプによって達成される。
ｖｉ．形成されたミクロスフェアは、撹拌下、１５から２５℃の間、好ましくは約２０℃に制御された適切な容器に排出口から移される。
ｖｉｉ．ミクロスフェアの硬化は、ここに記載のものを徐々に増加させることによって達成される。
ｖｉｉｉ．数時間の全乾燥後に、乾燥されたミクロスフェアはフィルタドライヤーに移される。
ｉｘ．粒子は、好ましくは室温で、フィルタドライヤー中において水で洗浄され、排水後、ミクロスフェアは少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、好ましくは１０ｍｂａｒの真空下、静かに撹拌しながら乾燥させる。
【００２０】
従って、ダブルエマルジョン／溶媒蒸発技術は次の工程を含む（図２）：
ｉ．オクトレオチドが適切な量の水に溶解される。
ｉｉ．ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）ポリマーがジクロロメタンに溶解させられ、溶液が１０℃以下、好ましくは５℃以下まで冷却される。
ｉｉｉ．二つの溶液が、デジタルＴ２５ ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ上部取付け分散機を使用して、好ましくは１分間に２００００ｒｐｍで、乳化させられ、分散した上記油相が形成され、１０℃以下、好ましくは５℃以下まで冷却される。
ｉｖ．水性連続相が、ＰＶＡ溶液中にリン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムを溶解させることによって作製され、１０℃以下、好ましくは５℃以下まで冷却される。
ｖ．分散された相と連続相が、好ましくはインライン高剪断分散機を使用して、一緒に混合され、所望の粒径分布の半固体ミクロスフェアが形成される。連続相の流れは蠕動ポンプによって達成される一方、連続の比の流れはシリンジポンプによって達成される。
ｖｉ．形成されたミクロスフェアは、撹拌下、１５から２５℃の間、好ましくは約２０℃に制御された反応容器に排出口から移される。
ｖｉｉ．ミクロスフェアの硬化は、ここに記載のものを徐々に増加させることによって達成される。
ｖｉｉｉ．数時間の全乾燥後に、乾燥されたミクロスフェアはフィルタドライヤーに移される。
ｉｘ．粒子は、好ましくは室温で、フィルタドライヤー中において水で洗浄され、排水後、ミクロスフェアは少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、好ましくは１０ｍｂａｒの真空下、静かに撹拌しながら乾燥させる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１ａ】ダブル乳化プロセスの概略図
【図１ｂ】シングル乳化プロセスの概略図
【図２ａ】製剤１ａ−１ｃの粒径分布グラフ
【図２ｂ】製剤２ａ−２ｃの粒径分布グラフ
【図３ａ】製剤１ａ−１ｃのＳＥＭ及び断面ＳＥＭ画像
【図３ｂ】製剤２ａ−２ｃのＳＥＭ及び断面ＳＥＭ画像
【図４ａ】サンドスタチンＬＡＲと製剤１ａ−１ｃの比較溶解プロファイル
【図４ａ】サンドスタチンＬＡＲと製剤２ａ−２ｃの比較溶解プロファイル
【図５】サンドスタチンＬＡＲと製剤１ａ及び２ｃのラット中における血漿中濃度プロファイル
【図６ａ】サンドスタチンＬＡＲのインビボでの観察血漿中濃度と逆算血漿中濃度の比較
【図６ｂ】製剤１ａのインビボでの観察血漿中濃度と逆算血漿中濃度の比較
【図６ｃ】製剤２ｃの観察血漿中濃度と予測血漿中濃度の比較
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、製造プロセスの溶媒蒸発工程中に温度を制御し増加させることによって制御される放出特性を有するオクトレオチド酢酸塩の徐放製剤を提供する。
【００２３】
オクトレオチド（好ましくは酢酸塩（又は任意の他の薬学的に許容可能な塩）の形態の、（４Ｒ，７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｒ，１６Ｓ，１９Ｒ）−１９−［（２Ｒ）−２−アミノ−３−フェニルプロパンアミド］−１０−（４−アミノブチル）−１６−ベンジル−Ｎ−［（２Ｒ，３Ｒ）−１，３−ジヒドロキシブタン−２−イル］−７−（１−ヒドロキシエチル）−１３−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−６，９，１２，１５，１８−ペンタオキソ−１，２−ジチア−５，８，１１，１４，１７−ペンタアザシクロイコサン−４−カルボキサミドとしても知られ、あるいは４Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−トリプトフィル−Ｌ−リシル−Ｌ−スレオニル−Ｎ−（（１Ｒ，２Ｒ）−２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）プロピル）−Ｌ−システインアミド環状（２−７）−ジスルフィド酢酸塩（塩）又はＬ−システインアミド−Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−システイニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｄ−トリプトフィル−Ｌ−リシル−Ｌ−スレオニル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）プロピル）−環状（２−７）−ジスルフィド（Ｒ−（Ｒ*，Ｒ*）），酢酸塩（塩）としても知られる）は、天然に生じるホルモンのソマトスタチンの合成オクタペプチド（ＤＰｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−オール）アナログであり、末端肥大症及び消化管・膵神経内分泌腫瘍のような神経内分泌疾患における腫瘍制御での使用が承認されている。オクトレオチド酢酸塩の化学構造は以下に示される：
0006494657.tif 000003
【００２４】
本発明に係るＰＬＧＡミクロスフェアの調製に使用するために適切な商業的に得ることができるポリマーには、限定されないが、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧのＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）及びＬＡＫＥＳＨＯＲＥ ＢＩＯＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、ＰＣＡＳのＥｘｐａｎｓｏｒｂ（登録商標）、ＰＵＲＡＣ Ｂｉｏｃｈｅｍ ＢＶのＰＵＲＡＳＯＲＢ（登録商標）が含まれる。本発明において使用されるＰＬＧＡポリマーは、約５０：５０から約６５：３５の範囲の乳酸とグリコール酸の比と、１００００から７００００の範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有しうる。好ましくは、本発明は、５０：５０のモノマー比と３００００−５００００の範囲の重量平均分子量を有するＰＬＧＡを使用する。
【００２５】
本発明において使用することができるＰＬＧＡ用の有機溶媒には、限定されないが、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジクロロメタン、ヘキサフルオロイソプロパノール、クロロホルム及びアセトンが含まれる。より好ましくは、本発明では、ジクロロメタンが使用される。有機溶媒中のポリマー濃度は１０−４０重量％、最も好ましくは２０−３０重量％である。
【００２６】
本発明において、オクトレオチド酢酸塩は注射用水に溶解されて、１０−４０重量％、より好ましくは２５−３５重量％の濃度を生じる。別法では、オクトレオチド酢酸塩は、水に混和性の適切な有機溶媒、好ましくはメタノールに溶解されて、５−２０重量％。より好ましくは１０重量％の濃度を生じる。場合によっては、水と共に水に混和性の有機溶媒が使用される。
【００２７】
分散相の調製では、１５０００−３００００ｓ−１の剪断速度で操作されるバッチモードの高剪断分散機を使用することによってオクトレオチド酢酸塩がポリマー溶液に分散させられる。より好ましくは、２００００−２５０００ｓ−１の剪断速度が適用される。別法では、メタノール中のオクトレオチド酢酸塩の溶液が撹拌下でポリマー溶液に加えられる。分散相は２０℃より低い温度、より好ましくは５−１０℃に制御される。
【００２８】
本発明において、連続相は、界面活性剤、好ましくはポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を伴う水溶液からなる。場合によっては用いることができる他の界面活性剤の例には、独立して又は組み合わせて使用される、一又は複数のアニオン性界面活性剤（例えばオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、非イオン性界面活性剤（例えばポロキサマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ）、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びゼラチンが含まれる。ＰＶＡは好ましくは、２０℃で４％水溶液として測定した場合３−９ｃＰの粘度範囲に対応する約１００００から約１５００００Ｄａの重量平均分子量と、８５−８９％の加水分解度と、１３０−１５０のエステル数を有する。本発明において使用される選択されたＰＶＡ等級には、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡから入手可能な、Ｅｍｐｒｏｖｅ ＰＶＡ ４−８８（Ｍｗ２５０００−３００００；水中４％粘度：３．４−４．６ｃＰｓ）、ＰＶＡ ８−８８（Ｍｗ約６５０００；水中４％粘度６．８−９．２ｃＰｓ）及びＰＶＡ １８−８８（Ｍｗ約１３００００；水中４％粘度）が含まれる。水性相に加えられる界面活性剤の量は好ましくは水溶液の質量に対して５．０％（ｗ／ｗ）までである。より好ましくは、界面活性剤の量（最適にはＰＶＡ量）は約０．５から約２．５％ｗ／ｗである。連続相は、２０℃より低い温度、より好ましくは５−１０℃で温度が自動調節される。
【００２９】
本発明において、連続油相中の水相の乳化は次の手段の一つで実施される：ｉ）機械的撹拌、ｉｉ）バッチ分散機、ｉｉｉ）インライン分散機。好ましくは、乳化プロセスは、５０００−２００００ｓ−１、最も好ましくは１００００−１５０００ｓ−１の範囲の剪断速度で操作されるＫｉｎｅｍａｔｉｃａより入手可能なインライン分散機ＭＴ−３０００によって行われ、１０−２５０μｍ、最も好ましくは２０−１００μｍのミクロスフェアの形成がなされる。分散相と連続相の間の重量比は１：２０−１：１５０、より好ましくは１：７５−１：１００である。
【００３０】
形成されたミクロスフェア懸濁液は、（インライン分散機の排出口から）１５℃より上、好ましくは約２０℃に最初に制御された（好ましくは温度制御を助けるように断熱された）適切な容器中に移される。溶媒蒸発中の温度は１５から２５℃、好ましくは約２０℃の開始温度から増加させられる。好ましくは、達成される最高温度は３５℃又は３８℃までである。温度は２０分から３時間の時間にわたって上げられる。乾燥は温度上昇期間後の延長期間の間、継続しうる。好ましくは、昇温速度は０．１℃／分−１℃／分である。昇温は期間にわたって一定であるか又は段階的でありうる。段階的とは、各変化が温度のステップ変化であり、それで温度が次の変化までの期間の間、保たれることを我々は意味する。また蒸発段階中の段階的温度変化と一定温度変化の混合である場合もある。
【００３１】
ミクロスフェアからの溶媒の蒸発は撹拌及び部分的真空下で適用される温度プロファイルに従って起こり、好ましくは部分的真空はジクロロメタンの蒸気圧より僅かに低い。
【００３２】
溶媒の蒸発後、硬化した粒子が低撹拌下のフィルタドライヤー中の懸濁液から収集される。好ましくは、ＰＳＬ（Ｐｏｗｄｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ）製のフィルタドライヤーが使用される。収集された粒子は水で洗浄され、ついで、約１０ｍｂａｒの真空をかけることによってフィルタドライヤー中で乾燥される。
【００３３】
最終のミクロスフェアは、以下に記載の通り、粒径、薬物負荷、ポリマー分子量、残留溶媒及びインビトロ放出について分析される。結果は表１及び２、また図３−４にまとめる。参照製品サンドスタチンＬＡＲと共に、選択された製剤（すなわち、１ａ及び２ｃ）をラットにおいて試験して、インビトロインビボ相関モデルを樹立した。ＰＫ研究及び適用された開発及び外部の方法論の詳細は以下に提供される。インビボ結果は図５−６に提供される。
【００３４】
粒径分布（ＰＳＤ）分析
粒径分布は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｉｚｅｒ２０００ Ｈｙｄｒｏ２０００Ｓを使用してレーザー回折によって測定した。平均粒径はミクロンでの体積平均径として表される。
【００３５】
薬物負荷の決定
約５０ｍｇのミクロスフェアを１０ｍｌの塩化メチレンに完全に溶解させた（３０分の超音波処理）。２０ｍｌの０．１Ｍアセテートバッファー（ｐＨ４．０）を、オクトレオチドを水性相中に抽出するために溶液に加えた。５分間ボルテックスすることによって二相を徹底して混合した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離して分離した。オクトレオチドの含有量を測定すべく水性相をＨＰＬＣ分析のためにサンプリングした。分析前にサンプルを、０．４５μｍのシリンジフィルタを通して濾過した。ＨＰＬＣ条件は次の通りであった：勾配分離をＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３カラム（４．６×２５０ｍｍ，粒径５μｍ）で実施した；移動相は蒸留水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶出剤Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶出剤Ｂ）からなり、１８分間の２０％から３５％までの溶出剤Ｂの線形勾配で実施した。流量は１．０ｍｌ／分、注入体積は１０μｌ、検出波長は２１０ｎｍであった。
【００３６】
平均分子量の測定
ミクロスフェアの分子量は、直列に連結された２つのカラムＰＬｇｅ ｌ５μｍ Ｍｉｘｅｄ−Ｄ３００Ｘ７．５ｍｍと屈折率（ＲＩ）検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ Ｍｏｄｅｌ ＧＰＣ５０Ｐｌｕｓシステムを使用してゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって決定した。移動相は１ｍｌ／分の流量のＴＨＦであり、カラムの温度は３０℃である。サンプルの分析のために、１０−１５ｍｇのミクロスフェアを５ｍＬのＴＨＦに溶解させ、溶液を撹拌下に一晩放置する。２ｍｌを抜き取り、４０μｍのＰＴＦＥフィルタを通して濾過し、分析する。注入体積は１００μＬである。データ収集及び解析は、Ｃｉｒｒｕｓソフトウェアを使用して実施した。１６２と３７１１００の間のＭＷ範囲のポリスチレン標準を校正のために使用した。
【００３７】
インビトロ放出方法
約１５０ｍｇの製剤化ミクロスフェアを１００ｍｌのビンに入れ、振盪浴（８５ｒｐｍ）において３７℃で３０ｍｌのアセテートバッファー（１ｍＭ，ｐＨ４．０）中でインキュベートした。放出媒体を様々な時点でサンプリングし、０．４５μｍのシリンジフィルタで濾過し、ＨＰＬＣによって分析した。ＨＰＬＣ条件は次の通りであった：勾配分離をＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３カラム（４．６×２５０ｍｍ，粒径５μｍ）で実施した；移動相は蒸留水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶出剤Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶出剤Ｂ）からなり、２５分間の２５％から３５％までの溶出剤Ｂの線形勾配で実施した。流量は１．０ｍｌ／分、注入体積は１０μｌ、検出波長は２１０ｎｍであった。
【００３８】
残留溶媒（ジクロロメタン）
エタノール及び／又は塩化メチレンがオクトレオチド微小粒子から除去されているかどうかを調査した。微小粒子はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に完全に溶解している。従って、有機溶液中のエタノール及び塩化メチレンの濃度はガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって定量された。ヘッドスペースＧＣ分析前にＧＣバイアルにおいて５ｍＬのジメチルスルホキシドに９０ｍｇの量の新鮮な微小粒子を溶解させた。残留溶媒の蒸発は、ＧＣオーブン中１００℃、３０分のサンプルのインキュベーションによって達成された。ＧＣ分析はＧＣ−２０１０プラス（島津，日本）で実施された。固定相としてＣｒｏｓｓｂｏｎｄ ５％ジフェニル／９５％ジメチルポリシロキサンを使用するＲＴＸ−５（ＲＥＳＴＥＫ，ＵＳＡ）分析カラムを使用した。溶媒の量は、校正曲線標準を使用して測定した。ジクロロメタンの保持時間は５．７５分である。
【００３９】
動物試験
雄のスプラーグドーリーラットにおける薬物動態試験に使用するために、結晶性マンニトールと混合した後のミクロスフェア製剤（すなわち、全重量に対して１７％のマンニトール）に６ワットのＵＶ光源を使用する１８０分間３６５ｎｍのＵＶ照射による滅菌を施した。約２４０−２５０グラムの体重で８−１２週齢のラット（一群当たり６匹）に試験製剤を注射した。注射の前に、乾燥粉末サンプルを、注射用水、カルボキシメチルセルロースナトリウム０．５重量％、及びマンニトール０．６重量％からなる滅菌溶媒（ビヒクル）に懸濁させた。０．２５ｍｌ／ラットの体積のビヒクル中３ｍｇオクトレオチド有効成分／ラットに対応する約６０ｍｇのオクトレオチド製剤（ミクロスフェア）／ラットの固定用量で動物の単一の部位に一回の筋肉内注射を施した。懸濁液は、大腿骨の頭側面上に位置するラットの四頭筋中に２６Ｇの皮下針によって筋肉内投与した。ラットの血液サンプルを、薬剤投与前とその後、投与後０．５時間、１時間、２時間、６時間、２４時間、３日目、７日目、１４日目、１８日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、４９日目、５６日目及び７０日目を含む予め定めた時点で集めた。各時点で、およそ０．５ｍｌの血液を軽いイソフルラン麻酔下で後眼窩神経叢から抜き取り、抗凝固薬として２００ｍＭのＫ２ＥＤＴＡを含む標識管中に移し、手で４−５回逆さにして混合した。血液サンプルは常にウエットアイス上に保ち、血漿はサンプル採集の１時間以内に遠心分離により分離させた。血漿サンプルは、検証されたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を使用する生物分析まで−６０℃未満で保存した。
【００４０】
インビトロインビボ相関
ＩＶＩＶＣモデルの作製は、以下の手順に従った：（１）サンドスタチンＬＡＲ、製剤１ａ及び製剤２ｃを含む異なった放出速度を持つ製剤の選択、（２）様々な溶解法によるインビトロ溶解プロファイルの測定、（３）ラットにおける単一の筋肉内注射後の製剤（すなわち、サンドスタチンＬＡＲ、製剤１ａ及び製剤２ｃ）のＰＫインビボ血漿中濃度プロファイルの測定、（４）Ｗａｇｎｅｒ−Ｎｅｌｓｏｎ（１コンパートメントモデル）デコンボリューション法を使用する測定血漿中濃度プロファイルによるインビボ放出プロファイルの推定、（５）サンドスタチンＬＡＲ及び製剤１ａのプールデータを使用するデコンボリューションされたインビボ放出プロファイルとインビトロ溶解プロファイル間の相関の計算、（６）インビボデータとより高度の相関を持つ適切な溶解法の選択と線形回帰分析の適用によるＩＶＩＶＣの確立、（６）サンドスタチンＬＡＲ製剤及び製剤１ａに対してＷａｇｎｅｒ−Ｎｅｌｓｏｎコンボリューションモデルを使用して逆算血漿中濃度プロファイルを比較することによる確立されたモデルの内部検証及び（７）製剤２ｃのインビトロ溶解プロファイルによって計算された予想血漿中濃度と製剤２ｃの観察されたインビボ血漿中濃度プロファイルを比較することによる確立されたモデルの外部検証。
【００４１】
実施例１ａ−ｃ（シングルエマルジョン）
５０：５０のモル比（Ｍｗ＝４１０００及び多分散度約１．６５）を持ち、ＰＵＲＡＳＯＲＢ５００４Ａとの名称でＰＵＲＡＣから商業的に入手可能なポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を４ｇ、磁気撹拌しながら３０ｇのジクロロメタンに溶解させた。そのポリマー溶液を５℃まで冷却させる。０．２９４１ｇのオクトレオチド酢酸塩を０．５８８２ｇの注射用水に混合しながら溶解させた。オクトレオチド酢酸塩溶液をポリマー溶液に加え、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ（登録商標）によって２００００ｒｐｍで１分間、乳化させ、第一エマルジョン（ＤＰ分散相）を形成した。１１．５ｇのＭｅｒｃｋのポリ（ビニルアルコール）ＥＭＲＯＶＥ（登録商標）１８−８８を８０℃で２３０７ｇの注射用水に溶解させ、続いて１７．４６ｇのリン酸水素二ナトリウムと４．１８ｇのリン酸二水素カリウムを添加した。溶液を５℃まで冷却させ、連続相（ＣＰ）を形成した。所望の粒径分布のミクロスフェアを、ＣＰを２．３Ｌ／分で、ＤＰを１５．６ｍＬ／分でインラインＫｉｎｅｍａｔｉｃａ ＭＴ３０００分散機中に送り込むことによって調製した。ミクロスフェア懸濁液は、溶媒を除去するために、２０℃に制御され激しく撹拌される二重ジャケットのガラス製反応容器に受け入れた。容器中の温度を、次表（表１）に示された予め定められた時間間隔に従って３８℃まで上昇させた。４時間後、ミクロスフェアをガラス製フィルタドライヤーに移し、室温で過剰の水で洗浄し、２４時間静かに撹拌しながら１０ｍｂａｒの真空下に置き、乾燥させた。
【００４２】
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【００４３】
実施例２ａ−ｃ（ダブルエマルジョン）
５０：５０のモル比（Ｍｗ＝４１０００及び多分散度約１．６５）を持ち、ＰＵＲＡＳＯＲＢ ５００４Ａとの名称でＰＵＲＡＣから商業的に入手可能なポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を４ｇ、磁気撹拌しながら３０ｇのジクロロメタンに溶解させた。そのポリマー溶液を５℃まで冷却させる。ポリマー溶液はシリンジフィルタに通す濾過によって滅菌され、５℃まで冷却される。０．２９４１ｇのオクトレオチド酢酸塩を混合しながら２．９４１ｇのメタノールに溶解させた。オクトレオチド酢酸塩溶液をポリマー溶液に加え、撹拌して混合して油相（ＤＰ分散相）を形成した。１１．５ｇのＭｅｒｃｋのポリ（ビニルアルコール）ＥＭＲＯＶＥ（登録商標）１８−８８を８０℃で２３０７ｇの注射用水に溶解させ、続いて１７．４６ｇのリン酸水素二ナトリウムと４．１８ｇのリン酸二水素カリウムを添加した。溶液を５℃まで冷却させ、連続相（ＣＰ）を形成した。所望の粒径分布のミクロスフェアを、ＣＰを２．３Ｌ／分で、ＤＰを１８．７ｍＬ／分でインラインＫｉｎｅｍａｔｉｃａ ＭＴ３０００分散機中に送り込むことによって調製した。ミクロスフェア懸濁液は、溶媒を除去するために、２０℃に制御され激しく撹拌される二重ジャケットのガラス製反応容器に受け入れた。容器中の温度を、次表（表３）に示された予め定められた時間間隔に従って３８℃まで上昇させた。４時間後、ミクロスフェアをガラス製フィルタドライヤーに移し、室温で過剰の水で洗浄し、２４時間静かに撹拌しながら１０ｍｂａｒの真空下に置き、乾燥させた。
【００４４】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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