(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、酸化ケイ素に特異的に結合させる結合工程と、
上記複合体を、上記酸化ケイ素から解離させる解離工程と、を含み、
上記解離工程は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程であり、
上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、
上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴とする、複合体の精製方法。
【請求項２】
上記結合用溶液は、ｐＨ緩衝液および溶媒からなる溶液、または、ｐＨ緩衝液、界面活性剤および溶媒からなる溶液であることを特徴とする請求項１に記載の複合体の精製方法。
【請求項３】
上記物質は、タンパク質であることを特徴とする請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
上記解離工程は、酸化ケイ素に結合している上記複合体を、アルギニンを含有する溶出液に接触させる工程であり、
上記溶出液は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有しているものであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の精製方法。
【請求項５】
上記酸化ケイ素は、シラスに含まれているものであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の精製方法。
【請求項６】
上記ポリペプチドは、１４個以下のアミノ酸からなるものであることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の精製方法。
【請求項７】
上記ポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の精製方法；
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
【請求項８】
７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、
上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上４／７以下が、アルギニンであることを特徴とする酸化ケイ素結合タグ。
【請求項９】
上記ポリペプチドは、以下の（ｃ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであることを特徴とする請求項８に記載の酸化ケイ素結合タグ；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１０】
酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を精製するためのキットであって、
分離用の固定相として酸化ケイ素を備えているカラムと、
上記酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグと、
上記複合体を上記酸化ケイ素に特異的に結合させるための、塩が添加されていない結合用溶液と、
上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を解離させるための、アルギニンを含む解離用溶液と、を備え、
上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、
上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴とするキット。
【請求項１１】
上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上４／７以下が、アルギニンであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の精製方法。
【請求項１２】
上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上４／７以下が、アルギニンであることを特徴とする請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製方法、精製キット、および、これらに用いられる酸化ケイ素結合タグに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酸化ケイ素に関連するタンパク質が数多く発見され、当該タンパク質を、様々な用途（例えば、酸化ケイ素を重合させる技術、所望の物質を酸化ケイ素上に固定化させる技術、および、酸化ケイ素上に固定化された所望の物質を精製する技術）に利用しようとする試みがなされている。【０００３】
例えば、特許文献１には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌に由来する特定のタンパク質（ＣｏｔＧタンパク質）、および、その断片のポリペプチドが開示されている。特許文献１に記載の技術では、上述したタンパク質、および、当該タンパク質の断片を用いて、シリカを重合させている。【０００４】
特許文献２には、酸化ケイ素（例えば、シリカ）に結合することができる特定のタンパク質（ＳＢＰ：silica material binding protein）、および、当該タンパク質に由来するタグが開示されている。特許文献２に記載の技術では、タグと所望のタンパク質との融合タンパク質を用いて、タグを介して、所望のタンパク質を酸化ケイ素上に固定化している。【０００５】
特許文献３には、酸化ケイ素（例えば、シリカ）に結合することができる特定のタンパク質（ＳＢＰ：silica material binding protein）、および、当該タンパク質に由来するタグが開示されている。特許文献３に記載の技術では、タグと所望のタンパク質との融合タンパク質を用いて、タグを介して、所望のタンパク質を酸化ケイ素上に固定化し、更に、２価カチオン含有溶液を用いて、所望のタンパク質を酸化ケイ素から解離させている。【０００６】
特許文献４には、二酸化ケイ素に結合することができるペプチドが開示されている。特許文献４に記載の技術では、ペプチドと所望のタンパク質との融合タンパク質を用いて、ペプチドを介して、所望のタンパク質を二酸化ケイ素上に固定化し、更に、アルギニン含有溶液を用いて、所望のタンパク質を二酸化ケイ素から解離させている。【０００７】
なお、従来の技術では、目的の融合タンパク質以外のタンパク質が非特異的に酸化ケイ素または二酸化ケイ素に吸着することを防ぐために、高濃度の塩を含む溶液中で、融合タンパク質を酸化ケイ素または二酸化ケイ素上に固定化している。そして、従来の技術では、高濃度の塩を含む溶液を用いることによって、純度の高い融合タンパク質を精製することを実現している。【０００８】
以上のように、酸化ケイ素に関連するタンパク質を様々な用途に利用しようとする試みがなされているが、これらの中でも、特に酸化ケイ素上に固定化された所望の物質を精製する技術に注目が集まっており、当該技術の開発が急がれている。当該技術にとって、酸化ケイ素に結合し得るタグを見出すことは重要であるが、それと同様に、酸化ケイ素に結合したタグを、酸化ケイ素から特異的に解離させる方法を見出すことも重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２０１２−３１１００号公報」（２０１２年２月１６日公開）
【特許文献２】ＷＯ２００７／０５５２８８（２００７年５月１８日公開）
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２０１０−３７２２２号公報」（２０１０年２月１８日公開）
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開２００９−１３６２８０号公報」（２００９年６月２５日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述したように、特許文献３に記載の技術では、２価カチオン含有溶液を用いて、酸化ケイ素に結合した特定のタグを酸化ケイ素から解離させている。【００１１】
しかしながら、当該技術は、２価カチオンによって精製目的の物質（特に、タンパク質）が変性する虞があるという問題点を有している。【００１２】
それ故に、タグと、酸化ケイ素に結合した当該タグを酸化ケイ素から特異的に解離させ得る方法と、の新たな組み合わせを見出すことが、当該分野において強く望まれている。【００１３】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、酸化ケイ素結合タグと、当該酸化ケイ素結合タグを酸化ケイ素から特異的に解離させる方法と、を利用した目的物質の精製方法、および、当該精製方法に用いる酸化ケイ素結合タグを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、原核生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）が体内にケイ酸を取り込む機構を研究する過程において、（ｉ）酸化ケイ素に対する結合能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ由来のタンパク質と酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させ得ること、および、（ｉｉ）塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を酸化ケイ素に特異的に結合されば、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に結合することを防ぐことができ、その結果、複合体を収率高く、かつ、純度高く精製できること、を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
本発明の複合体の精製方法は、上記課題を解決するために、塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、酸化ケイ素に特異的に結合させる結合工程と、上記複合体を、上記酸化ケイ素から解離させる解離工程と、を含み、上記解離工程は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程であることを特徴としている。【００１６】
本発明の複合体の精製方法では、上記結合用溶液は、ｐＨ緩衝液および溶媒からなる溶液、または、ｐＨ緩衝液、界面活性剤および溶媒からなる溶液であることが好ましい。【００１７】
本発明の複合体の精製方法では、上記物質は、タンパク質であることが好ましい。【００１８】
本発明の複合体の精製方法では、上記解離工程は、酸化ケイ素に結合している上記複合体を、アルギニンを含有する溶出液に接触させる工程であり、上記溶出液は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有しているものであることが好ましい。【００１９】
本発明の複合体の精製方法では、上記酸化ケイ素は、シラスに含まれているものであることが好ましい。【００２０】
本発明の複合体の精製方法では、上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることが好ましい。【００２１】
本発明の複合体の精製方法では、上記ポリペプチドは、１４個以下のアミノ酸からなるものであることが好ましい。【００２２】
本発明の複合体の精製方法では、上記ポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであることが好ましい；
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。【００２３】
本発明の酸化ケイ素結合タグは、上記課題を解決するために、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴としている。【００２４】
本発明の酸化ケイ素結合タグでは、上記ポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであることが好ましい；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。【００２５】
本発明のキットは、上記課題を解決するために、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を精製するためのキットであって、分離用の固定相として酸化ケイ素を備えているカラムと、上記酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグと、上記複合体を上記酸化ケイ素に特異的に結合させるための、塩が添加されていない結合用溶液と、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を解離させるための、アルギニンを含む解離用溶液と、を備えることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、目的の物質を純度高く精製することができる。【００２７】
本発明は、目的の物質を回収率高く精製することができる。【００２８】
本発明であれば、小さなサイズの酸化ケイ素結合タグを設計することができるので、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させれば、所望の物質の構造を大きく変化させることを防ぐことができる。換言すれば、本発明であれば、酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させたときに、所望の物質が機能（例えば、酵素活性）を失うことを防ぐことができる。【００２９】
本発明であれば、安価なシリカ粒子を精製用の担体として用いることができるので、低コストの精製方法を実現することができる。【００３０】
アルギニンは、目的の物質（例えば、タンパク質）の構造を安定化させる効果（換言すれば、凝集抑制効果）を有している。それ故に、本発明は、目的の物質を、機能（例えば、酵素活性）を失うこと無く精製することができる。【００３１】
アルギニンは、分子量が小さいので、透析などによって容易に除去することができる。それ故に、本発明は、精製物から容易にアルギニンを除去することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図２】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図３】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図４】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図５】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図６】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図７】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図８】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図９】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【図１０】本発明の実施例の試験結果を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルの像である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
【００３４】
〔１．精製方法〕
従来から、タンパク質をカラムから溶出させるときに用いる溶出液にアルギニンを添加する技術が用いられている（例えば、（ｉ）Tsutomu Arakawa et al., Protein Expression and Purification, 36 (2004) 244-248、（ｉｉ）Daisuke Ejima et al., Analytical Biochemistry 345 (2005) 250-257、（ｉｉｉ）Tsutomu Arakawa et al., Protein Expression and Purification, 54 (2007) 110-116）。しかしながら、このような従来技術と本発明とは、技術思想（具体的には、アルギニンの役割）が全く異なっている。この点について、まず説明する。
【００３５】
本発明では、酸化ケイ素結合体を介して、複合体が酸化ケイ素に対して特異的に結合している。そして、本発明では、当該特異的な結合をアルギニンによって解離することによって、カラムから複合体を溶出させる。つまり、本発明では、カラムから複合体を溶出させるために用いる解離剤として、アルギニンが用いられる。
【００３６】
一方、従来から、アルギニンがタンパク質の構造を安定化させることが知られている。それ故に、上述した従来技術では、単に溶出時のタンパク質の変性等を防ぐ安定化剤として、アルギニンが併用される。
【００３７】
具体的に、上記（ｉ）および（ｉｉ）に記載の従来技術では、解離剤としてクエン酸（換言すれば、酸性溶液）が用いられ、タンパク質の安定化剤としてアルギニンが用いられている。上記（ｉｉｉ）に記載の技術では、解離剤として硫酸アンモニウムが用いられ、タンパク質の安定化剤としてアルギニンが用いられている。
【００３８】
以上のように、本発明と従来技術とでは、アルギニンが担っている役割が全く異なっている。従来技術に関して、アルギニンに、酸化ケイ素結合体を酸化ケイ素から解離する能力があるという報告はなく、このような技術思想もない。
【００３９】
更に、従来から、精製対象である物質をカラムに結合させるときには、不要な物質がカラムに結合することを防止するために、意図的に塩を添加した結合用溶液の中で精製対象である物質を担体に結合させ、これによって、精製対象である物質の精製純度を高めている。
【００４０】
ところが、後述する実施例に示すように、カラムの分離用の固定相として酸化ケイ素を用いる場合には、結合用溶液に含まれる塩の濃度が高いほど、不要な物質がカラムに結合してしまい、かえって、精製対象である物質の精製純度が低下する。このことは、本発明者らが独自に見出した、新たな知見である。
【００４１】
本発明では、塩が添加されていない結合用溶液を用いることによって、精製対象である物質を、純度高く、かつ、回収率高く精製することができる。
【００４２】
以下に、本発明の精製方法の実施形態の一例について詳細に説明する。
【００４３】
本実施の形態の複合体の精製方法は、塩が添加されていない結合用溶液の中で、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、酸化ケイ素に特異的に結合させる結合工程と、複合体を、酸化ケイ素から解離させる解離工程と、を含み、解離工程は、酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程である。
【００４４】
本明細書において「塩が添加されていない結合溶液（換言すれば、塩を含まない結合溶液）」とは、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に非特異的に結合することを防止することを目的とした塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、または、硫酸アンモニウム）が、意図的に添加されていない溶液を意図する。
【００４５】
例えば、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に非特異的に結合することを防止することを目的としていない物質であって、結合溶液の性質を所望の性質に調節するための物質（例えば、ｐＨ緩衝液、界面活性剤、還元剤、または、キレート剤）が、塩を含んでおり、これらの物質を結合溶液に加えた結果、結果的に結合溶液が塩を含むものになる場合がある。このような結合溶液は、本発明の「塩が添加されていない結合溶液」の範疇に含まれる。
【００４６】
また、生体を用いて複合体を作製する場合（例えば、大腸菌または酵母などの微生物に、複合体をコードするポリヌクレオチドが挿入された発現用ベクターを導入し、これによって、微生物内で複合体を発現させる場合）には、生体の破砕液を結合溶液として用いることが可能である。この場合、当該結合溶液には生体に由来する塩が含まれるが、当該結合溶液も、本発明の「塩が添加されていない結合溶液」の範疇に含まれる。
【００４７】
塩が添加されていない結合溶液の具体例としては、ｐＨ緩衝液および溶媒からなる溶液、または、ｐＨ緩衝液、界面活性剤および溶媒からなる溶液を挙げることができる。
【００４８】
ｐＨ緩衝液の更に具体的な例としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、および、クエン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤の更に具体的な例としては、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、ｎ−オクチルグルコシド、および、ＣＨＡＰＳが挙げられ、溶媒の更に具体的な例としては、水、アセトニトリル、ＤＭＳＯ、グリセロール、および、これらの混合物が挙げられるが、本発明は、これらに限定されない。
【００４９】
上述したように、結合溶液には、複合体以外の不要な物質が酸化ケイ素に非特異的に結合することを防止することを目的としていない物質であって、結合溶液の性質を所望の性質に調節するための物質に由来する塩が含まれ得る。この場合であっても、複合体の精製純度を上げるという観点からは、結合溶液に含まれる塩の濃度は、低ければ低いほど好ましい。
【００５０】
結合溶液に含まれる塩の濃度は、例えば、０ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、０ｍＭ〜８０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭ〜６０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭ〜４０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭ〜２０ｍＭであることが更に好ましく、０ｍＭであることが最も好ましい。
【００５１】
酸化ケイ素結合タグは、酸化ケイ素（例えば、二酸化ケイ素（シリカ）、石英、クリストバライト、シリカゲルなど）に対する結合能を有するタグである。それ故に、酸化ケイ素結合タグと所望の物質とを連結させることにより（酸化ケイ素結合タグと物質とを連結させたものを、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体とも呼ぶ）、酸化ケイ素結合タグを介して、所望の物質を酸化ケイ素に結合させることができる。そして、本実施の形態の精製方法では、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させる。
【００５２】
酸化ケイ素結合タグが結合する酸化ケイ素の具体的な構成は、特に限定されないが、シラス（換言すれば、火山灰と軽石との混合物）に含まれている酸化ケイ素であることが好ましい。換言すれば、本実施の形態の精製方法では、酸化ケイ素の代わりにシラスを用いてもよい。当該構成によれば、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、精製純度高く、かつ、回収率高く精製することができる。また、当該構成によれば、低コストの精製法を実現することができる。なお、「シラス」とは、九州南部一帯に地層として分布する、軽石および火山灰の粒子のことであって、成分として酸化ケイ素を含んでいる粒子である。
【００５３】
上述した「酸化ケイ素に対する結合能」は、過剰量の酸化ケイ素（例えば、酸化ケイ素結合タグの１０００倍の質量の酸化ケイ素）と酸化ケイ素結合タグとを、所望の水溶液中で室温にて３０分間接触させて、酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグの量を測定することによって測定することができる。
【００５４】
例えば、酸化ケイ素結合タグの好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、最も好ましくは５０％以上が酸化ケイ素に結合することができれば、当該ペプチドは、酸化ケイ素に対する結合能を有すると判定することができる。
【００５５】
酸化ケイ素結合タグの何％が酸化ケイ素に結合したかは、例えば、酸化ケイ素と酸化ケイ素結合タグとを接触させた後、遠心分離処理によって上清と沈殿物とに分画し、当該上清と沈殿物とをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、所望の方法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥに用いたゲルを染色し、ゲル中に観察される酸化ケイ素結合タグに相当するバンドを比較することによって決定することができる。
【００５６】
過剰量の酸化ケイ素と酸化ケイ素結合タグとの接触に用いられる水溶液としては、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を挙げることができる。また、過剰量の酸化ケイ素と酸化ケイ素結合タグとの接触に用いられる水溶液は、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（より具体的には、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）））を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）であってもよい。
【００５７】
本明細書では、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）中で維持される、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、「特異的な結合」と定義する。更に、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（より具体的には、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）））を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）中で維持される、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、「特異的な結合」の中でも、「より特異性が高い結合」と定義する。
【００５８】
水溶液中の界面活性剤の濃度としては、０．０５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．１％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは１．０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１．５％（ｖ／ｖ）を挙げることができる。
【００５９】
酸化ケイ素結合タグは、酸化ケイ素に対する結合能を有し、かつ、アルギニンによって酸化ケイ素との特異的な結合を解離させるものであればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。
【００６０】
例えば、酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであることが好ましい。
【００６１】
酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満がアルギニンであることが好ましく、全アミノ酸の５／１４以上６／７以下がアルギニンであることがより好ましく、全アミノ酸の５／１４以上５／７以下がアルギニンであることがより好ましく、全アミノ酸の５／１４以上４／７以下がアルギニンであることがより好ましく、全アミノ酸の５／１４以上３／７以下がアルギニンであることが最も好ましい。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できるのみならず、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、効率よくアルギニンによって解離させることができる。一方、酸化ケイ素結合タグを構成する全アミノ酸の５／１４未満がアルギニンである場合、および、酸化ケイ素結合タグを構成する全アミノ酸がアルギニンである場合には、酸化ケイ素結合タグの酸化ケイ素に対する結合効率が低下する傾向を示す。
【００６２】
酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１００個以下、更に好ましくは９０個以下、更に好ましくは８０個以下、更に好ましくは７０個以下、更に好ましくは６０個以下、更に好ましくは５０個以下、更に好ましくは４０個以下、更に好ましくは３０個以下、更に好ましくは２０個以下、更に好ましくは１４個以下、更に好ましくは１０個以下、最も好ましくは７個以下である。
【００６３】
酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、所望の物質の構造を大きく変化させることを防ぐことができる。換言すれば、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させたときに、所望の物質が機能（例えば、酵素活性）を失うことを防ぐことができる。また、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体の、水溶液に対する溶解性を増すことができる。これらの観点から、酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は、１４個以下であることが好ましく、７個以下であることが更に好ましい。
【００６４】
酸化ケイ素結合タグを構成するポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むもの、または、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドからなるもの、であってもよい。つまり、
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
【００６５】
ここで、配列番号１、３および５に記載のアミノ酸からなるポリペプチドは、原核生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９）に由来するＣｏｔＢ１タンパク質の部分ペプチドである。
【００６６】
配列番号２０および２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド（配列番号２０のアミノ酸配列：GRKKRRQRRRPPQ、配列番号２１のアミノ酸配列：YGRKKRRQRRR）は、ヒト免疫不全ウイルスの転写制御にかかわるＴＡＴ（Transactivator of transcription）タンパク質の部分ペプチドである。当該部分ペプチドは、ＴＡＴタンパク質を細胞内へ移行させる機能を有する、細胞内移行ペプチドとして同定されている。
【００６７】
上記（ｂ）に記載のポリペプチドは、配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列中のアルギニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであることが好ましい。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できるのみならず、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よくアルギニンによって解離させることができる。
【００６８】
上記（ｂ）に記載のペプチドにおいて、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは９個以下、より好ましくは８個以下、より好ましくは７個以下、より好ましくは６個以下、より好ましくは５個以下、より好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
【００６９】
上記（ｂ）に記載のペプチドは、配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列と、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであってもよい。
【００７０】
アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
【００７１】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、当該ポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけでなく、天然のポリペプチドにおいて、当該ポリペプチドの構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００７２】
好ましい変異としては、アミノ酸の置換、欠失、または付加を挙げることができる。上述した変異の中では、アミノ酸の置換が更に好ましい。
【００７３】
アミノ酸の置換としては特に限定されないが、例えば、任意のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることができる。更に具体的に、アミノ酸の置換として、セリン、グリシン、アラニンまたはグルタミンが、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることもできる。勿論、本発明は、上述した置換に限定されない。
【００７４】
酸化ケイ素結合タグは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得る。例えば、酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものである場合、当該ポリペプチドは、化学合成されても、遺伝子工学によって作製されてもよい。化学合成の方法としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Model MultiPep RS（Intavis AG）など）を利用することができる。遺伝子工学によって作製する場合、原核生物（例えば、大腸菌など）または真核生物（例えば、酵母など）を用いた強制発現システムを用いることができる。
【００７５】
上述した酸化ケイ素結合タグが連結される物質（換言すれば、精製対象の物質）は、特に限定されず、所望の物質であり得る。当該物質として、例えば、ポリペプチド（換言すれば、タンパク質）、核酸、糖、低分子化合物、または、高分子化合物などを挙げることができ、これらの中ではポリペプチド（換言すれば、タンパク質）が好ましい。
【００７６】
酸化ケイ素結合タグを物質に連結させる方法は、特に限定されず、適宜、所望の方法を用いることができる。例えば、周知の架橋剤（換言すれば、リンカー）を用いて、酸化ケイ素結合タグを物質に連結させることができる。
【００７７】
酸化ケイ素結合タグがポリペプチドを備えるものであり、かつ、当該酸化ケイ素結合タグが連結される物質がポリペプチドである場合には、酸化ケイ素結合タグと物質（ポリペプチド）とを１つの融合タンパク質として作製してもよい。なお、この場合には、酸化ケイ素結合タグを、物質（ポリペプチド）のアミノ末端に配置させてもよいし、物質（ポリペプチド）の内部に配置させてもよいし、物質（ポリペプチド）のカルボキシル末端に配置させてもよい。物質（ポリペプチド）の構造を安定に保つという観点からは、アミノ末端、または、カルボキシル末端に配置することが好ましい。
【００７８】
本実施の形態の精製方法は、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させる解離工程を有している。酸化ケイ素結合タグが連結されている物質は、酸化ケイ素結合タグを介して、酸化ケイ素に特異的に結合する。そして、上記解離工程では、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合を、アルギニンによって解離させることになる。
【００７９】
上記解離工程は、例えば、酸化ケイ素に結合している複合体（具体的には、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体）を、アルギニンを含有する溶出液に接触させることで行い得る。
【００８０】
上記解離工程では、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の特異的な結合をアルギニンによって解離させるので、上記溶出液は、酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有していればよい。
【００８１】
具体的に、上記溶出液は、アルギニンを含有し、かつ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、または、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標））、アセトニトリル、または、クエン酸を含まない溶媒（例えば、水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または、リン酸緩衝液）であってもよい。
【００８２】
上記溶出液は、アルギニンを含有し、かつ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、または、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標））、アセトニトリル、および、クエン酸からなる群より選択される少なくとも１つを含まない溶媒（例えば、水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または、リン酸緩衝液）であってもよい。
【００８３】
上記溶出液は、アルギニンを含有し、かつ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、硫酸アンモニウム、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、または、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標））、アセトニトリル、および、クエン酸を含まない溶媒（例えば、水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、または、リン酸緩衝液）であってもよい。
【００８４】
上記溶出液は、アルギニンのみを含有する溶媒（例えば、水、または、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）であってもよい。
【００８５】
溶出液に含まれるアルギニンの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１Ｍ以上であり、より好ましくは０．０５Ｍ以上であり、より好ましくは１．０Ｍ以上であり、より好ましくは１．５Ｍ以上であり、最も好ましくは２．０Ｍ以上である。このとき、アルギニンの濃度の上限値は、特に限定されず、１０Ｍ、９．０Ｍ、８．０Ｍ、７．０Ｍ、６．０Ｍ、５．０Ｍ、４．０Ｍ、または、３．０Ｍであり得る。上記構成によれば、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よく解離させることができる。
【００８６】
溶出液のｐＨは、特に限定されないが、好ましくはｐＨ６．０以上ｐＨ９．０以下であり、更に好ましくはｐＨ７．０以上８．０以下である。上記構成によれば、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よく解離させることができる。
【００８７】
本実施の形態の精製方法は、解離工程以外の工程を含み得る。例えば、解離工程にて酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させると、精製目的である複合体とアルギニンとの混合物が得られる。そこで、本実施の形態の精製方法は、上記混合物からアルギニンを除去する除去工程を含んでいてもよい。除去工程の具体的な構成は、特に限定されないが、例えば、市販の透析膜を用いた透析によって混合物からアルギニンを除去してもよい。上記構成であれば、より純度の高い複合体を得ることができる。
【００８８】
〔２．酸化ケイ素結合タグ〕
本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、酸化ケイ素に対する結合能を有するものである。本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、上記結合能に加えて、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合がアルギニンによって解離されるものであってもよい。
【００８９】
更に具体的に、本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであり得る。
【００９０】
酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、所望の物質の構造を大きく変化させることを防ぐことができる。換言すれば、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、酸化ケイ素結合タグを所望の物質（例えば、タンパク質などの高分子）に連結させたときに、所望の物質が機能（例えば、酵素活性）を失うことを防ぐことができる。また、酸化ケイ素結合タグが小さければ小さいほど、当該酸化ケイ素結合タグを所望の物質に連結させたときに、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体の、水溶液に対する溶解性を増すことができる。本実施の形態の酸化ケイ素結合タグは、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであるので、これらの効果が非常に高い。
【００９１】
上記ポリペプチドを構成するアミノ酸の数は、７個以下であればよいが、更に好ましくは６個以下、更に好ましくは５個以下、最も好ましくは４個以下である。アミノ酸の数の下限値は、特に限定されないが、７個、６個、５個、４個または３個であり得る。
【００９２】
上記ポリペプチドを構成するアミノ酸の種類は特に限定されないが、ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満がアルギニンであることが好ましく、より好ましくは全アミノ酸の３／７以上６／７以下がアルギニンであり、より好ましくは全アミノ酸の３／７以上５／７以下がアルギニンであり、より好ましくは全アミノ酸の３／７以上４／７以下がアルギニンであり、最も好ましくは全アミノ酸の３／７がアルギニンである。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できる。更に、上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よくアルギニンによって解離させることができる。一方、酸化ケイ素結合タグを構成する全アミノ酸がアルギニンである場合には、酸化ケイ素結合タグの酸化ケイ素に対する結合効率が低下する傾向を示す。
【００９３】
本実施の形態の酸化ケイ素結合タグを構成するポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいてもよい。
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
【００９４】
配列番号３に記載のアミノ酸からなるポリペプチドは、原核生物であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  １４５７９）に由来するＣｏｔＢ１タンパク質の部分ペプチドである。
【００９５】
上記（ｄ）に記載のポリペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中のアルギニン以外の１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであることが好ましい。上記構成であれば、酸化ケイ素結合タグが効率よく酸化ケイ素に結合できるのみならず、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を効率よくアルギニンによって解離させることができる。
【００９６】
上記（ｄ）に記載のペプチドにおいて、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、最も好ましくは１個以下）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。
【００９７】
上記（ｄ）に記載のペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と、好ましくは３０％以上、より好ましくは３５％以上、より好ましくは４０％以上、より好ましくは４５％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチドであってもよい。
【００９８】
好ましい変異としては、アミノ酸の置換、欠失、または付加を挙げることができる。上述した変異の中では、アミノ酸の置換が更に好ましい。
【００９９】
アミノ酸の置換としては特に限定されないが、例えば、任意のアミノ酸が、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることができる。更に具体的に、アミノ酸の置換として、セリン、グリシン、アラニンまたはグルタミンが、グリシンまたはアラニンへ置換されるような置換を挙げることもできる。勿論、本発明は、上述した置換に限定されない。
【０１００】
〔３．キット〕
本実施の形態のキットは、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を精製するためのキットであって、分離用の固定相として酸化ケイ素を備えているカラムと、酸化ケイ素に結合する酸化ケイ素結合タグと、複合体を酸化ケイ素に特異的に結合させるための、塩が添加されていない結合用溶液と、酸化ケイ素結合タグと酸化ケイ素との間の結合を解離させるための、アルギニンを含む解離用溶液と、を備えるものである。
【０１０１】
上記カラムは、分離用の固定相として酸化ケイ素を備えたものであればよく、具体的な構成は限定されない。当該カラムは、市販のカラムであってもよい。
【０１０２】
酸化ケイ素結合タグについては既に説明したので、その詳細な説明は省略するが、本実施の形態のキットは、酸化ケイ素結合タグ自体を備えていてもよいし、酸化ケイ素結合タグ、または、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を製造し得る構成を備えていてもよい。例えば、本実施の形態のキットは、酸化ケイ素結合タグをコードするポリヌクレオチドが挿入された、組み換えタンパク質発現用のベクターを備えていてもよい。この場合、キットの使用者が、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを当該ベクターへ挿入することによって、当該ベクターを、複合体発現用のベクターとすればよい。
【０１０３】
上記結合用溶液および解離用溶液については既に説明したので、その説明は省略する。
【０１０４】
本発明は、以下のように構成することも可能である。
【０１０５】
本発明の精製方法は、上記課題を解決するために、酸化ケイ素結合タグと物質との複合体を、当該複合体が特異的に結合している酸化ケイ素から解離させる解離工程を含む、複合体の精製方法であって、上記解離工程は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の結合を、アルギニンによって解離させる工程であることを特徴としている。
【０１０６】
本発明の精製方法では、上記物質は、タンパク質であることが好ましい。
【０１０７】
本発明の精製方法では、上記解離工程は、酸化ケイ素に結合している上記複合体を、アルギニンを含有する溶出液に接触させる工程であり、上記溶出液は、上記酸化ケイ素結合タグと上記酸化ケイ素との間の特異的な結合を解離させる解離剤として、アルギニンのみを含有しているものであることが好ましい。
【０１０８】
本発明の精製方法では、上記酸化ケイ素は、シラスに含まれているものであることが好ましい。
【０１０９】
本発明の精製方法では、上記酸化ケイ素結合タグは、ポリペプチドを備えるものであり、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の５／１４以上７／７未満が、アルギニンであることが好ましい。
【０１１０】
本発明の精製方法では、上記ポリペプチドは、１４個以下のアミノ酸からなるものであることが好ましい。
【０１１１】
本発明の精製方法では、上記ポリペプチドは、以下の（ａ）または（ｂ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含むものであることが好ましい；
（ａ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１、３、５、２０または２１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
【０１１２】
本発明の酸化ケイ素結合タグは、上記課題を解決するために、７個以下のアミノ酸によって構成されているポリペプチドを備える酸化ケイ素結合タグであって、上記ポリペプチドを構成する全アミノ酸の３／７以上７／７未満が、アルギニンであることを特徴としている。
【０１１３】
本発明の酸化ケイ素結合タグでは、上記ポリペプチドは、以下の（ｃ）または（ｄ）に記載のポリペプチドを少なくとも一部分として含んでいるものであることが好ましい；
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸化ケイ素に対する結合能を有するポリペプチド。
【実施例】
【０１１４】
＜１．タグとＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミドの作製＞
ＣｏｔＢ１ペプチド内の酸化ケイ素結合ドメインを特定するために、１４個のアミノ酸からなるＣｏｔＢ１ペプチドの一部分を欠失した変異ペプチドと、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）との融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。【０１１５】
まず、表１に示す野生型のＣｏｔＢ１ペプチドとＧＦＰとの融合タンパク質（ＣｏｔＢ１ｐ−ＧＦＰ）の発現プラスミド（ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ：Abdelhamid et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 98(12), 5677-5684, 2014）を鋳型として用いたインバースＰＣＲ法によって、表１に示す３種類の変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの各々（♯９〜♯１１）とＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミド（ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１０）、および、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１１））を構築した。【０１１６】
具体的には、インバースＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Takara Bio）を用いてリン酸化し、リン酸化されたＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（TOYOBO）を用いて環状化した後、環状化されたＤＮＡ断片を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミドが導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。【０１１７】
【表１】
0006505741.tif 000002
【０１１８】
＜２．酸化ケイ素に対する融合タンパク質の結合力評価＞
＜１＞にて精製した各プラスミドを、周知の方法にしたがってタンパク質発現用の宿主である大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）に導入して、形質転換体を取得した。【０１１９】
当該形質転換体を、１％グルコースを含む２×ＹＴ培地中でＯＤ６００が０．５になるまで３７℃で培養した後、培地中に０．２ｍＭ  ＩＰＴＧ（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）を添加し、更に３７℃で４時間培養することで、各融合タンパク質を大量に発現した菌体を得た。【０１２０】
各菌体を反応バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、０．５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））に懸濁し、超音波処理によって菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離処理（２０，０００×ｇ、３０分間、４℃）し、その上清を融合タンパク質抽出液として回収した。当該融合タンパク質抽出液を菌体抽出画分とした。【０１２１】
１０ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を含む０．１ｍＬの反応バッファーに、適宜希釈した融合タンパク質抽出液を添加し、室温で３０分間混合した。その後、遠心分離処理（５，０００×ｇ、２分間、２５℃）によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を未結合画分として、沈殿物を酸化ケイ素結合画分として回収した。【０１２２】
得られた各サンプル（菌体抽出画分、および、未結合画分）のＧＦＰに由来する蛍光値を測定し、菌体抽出画分の蛍光値から未結合画分の蛍光値を差し引いたものを、酸化ケイ素結合画分の蛍光値とした。【０１２３】
菌体抽出画分中の融合タンパク質のうち、酸化ケイ素に結合した融合タンパク質の割合（酸化ケイ素結合画分の蛍光値／菌体抽出画分の蛍光値）を指標として、各変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの結合力を比較した。【０１２４】
なお、ポジティブコントロールとして、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドとＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミド（ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）、ネガティブコントロールとして、ＧＦＰのみを発現するためのプラスミド（ｐＥＴ−ＧＦＰ）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）についても、同様の試験を行った。【０１２５】
試験結果を表１に示す。変異型のＣｏｔＢ１ペプチドは、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドの７０％以上もの結合力を保持していることが明らかになった。【０１２６】
変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（特に、♯９）は、非常に少ないアミノ酸（７個のアミノ酸）からなる小さなペプチドでありながら、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドに匹敵する高い結合力を示すことが明らかになった。【０１２７】
変異型のＣｏｔＢ１ペプチドのサイズは、組換えタンパク質の精製に汎用されるＨｉｓ−ｔａｇ（６個のアミノ酸からなり、Ｎｉ２＋などに親和性を示すタグ）と略同じサイズであり、所望のタンパク質に融合させるタグとしては、非常に小さいものである。それ故に、所望のタンパク質に融合させた場合、所望のタンパク質に与える影響が非常に小さいと考えられる。なお、表２に、代表的な周知のタグを記載する。【０１２８】
【表２】
0006505741.tif 000003
【０１２９】
＜３．タグの結合力にとって重要な、タグ内のアミノ酸の同定＞
変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）について、７個のアミノ酸のうち、どのアミノ酸が酸化ケイ素に対する結合に重要であるかを解析した。【０１３０】
まず、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）と、ＧＦＰとの融合タンパク質の発現プラスミド（ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９））を鋳型として用いたインバースＰＣＲ法によって、表３に示す７種類の変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの各々（♯１２〜♯１８）またはＲ９−ｔａｇと、ＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミド（ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１２）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１３）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１４）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１５）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１６）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１７）、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯１８）、または、ｐＥＴ−ＧＦＰ−（Ｒ９−ｔａｇ））を構築した。なお、表３に示す７種類の変異型のＣｏｔＢ１ペプチドは、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）を構成する７個のアミノ酸の各々をアラニンに置換したペプチドである。【０１３１】
具体的には、インバースＰＣＲ法によって得られたＤＮＡ断片の末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Takara Bio）を用いてリン酸化し、リン酸化されたＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（TOYOBO）を用いて環状化した後、環状化されたＤＮＡ断片を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、所望のプラスミドが導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。【０１３２】
各融合タンパク質の結合力評価は、＜２＞に記載の方法にしたがって行った。また、Ｒ９−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質の発現は、Taniguchi等の文献（Koji Taniguchi et al., Biotechnology and Bioengineering Vol.96, No.6, April 15, p1023-1029, 2007）に記載の方法にしたがって行った。【０１３３】
試験結果を表３に示す。【０１３４】
解析の結果、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）を構成する７個のアミノ酸中、３個のアルギニンの何れかをアラニンに置換した場合、顕著に結合力が低下することが明らかになった（表３の♯１２、♯１６、♯１８参照）。【０１３５】
一方、アルギニン以外のアミノ酸（例えば、グルタミン、セリン、グリシン）をアラニンに置換した場合は、結合力の低下は、ほとんど観察されなかった。【０１３６】
更に、比較として用いたＲ９−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質は、本試験の条件下では、酸化ケイ素にほとんど結合しなかった。Ｒ９−ｔａｇは、酸化ケイ素に結合することが既に報告されているが（S.M. Fuchs & R.T. Raines [2005] Polyarginine as a multifunctional fusion tag, Protein Sci. 14, 1538-1544）、本試験の条件下では、反応バッファー中に含まれる界面活性剤（具体的には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（更に具体的には。０．５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）））によって、酸化ケイ素への結合が阻害されたと考えられる。【０１３７】
以上の結果から、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）と酸化ケイ素との結合にはアルギニンが最も重要であるが、アルギニンのみで構成されるＲ９−ｔａｇの結合力が低かったことから、アルギニンだけでなくその他のアミノ酸の寄与も大きいと考えられる。但し、アルギニン以外のアミノ酸をアラニンに置換しても結合力の低下がほとんど見られなかったことから、アルギニン以外のアミノ酸は、アルギニンとアルギニンとの間のスペーサーとして働いていると考えられる。【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
＜４．酸化ケイ素に対する変異型のＣｏｔＢ１ペプチドの結合力と、酸化ケイ素に対するＲ９−ｔａｇの結合力との比較＞
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）、および、ｐＥＴ−ＧＦＰ−（Ｒ９−ｔａｇ）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。【０１４０】
各大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、各大腸菌を、様々な濃度（０％（ｖ／ｖ）、０．０５％（ｖ／ｖ）、０．１％（ｖ／ｖ）、または、０．５％（ｖ／ｖ））のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１４１】
１ｍＬの菌体抽出画分に対して２５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で１５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を５回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した後、当該酸化ケイ素粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに懸濁し、９５℃で５分間加熱することによって、酸化ケイ素粒子の表面に結合した融合タンパク質を酸化ケイ素粒子から解離させた。そして、解離した融合タンパク質を含むサンプルバッファーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。【０１４２】
試験結果を図１に示す。なお、図１中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」および「２」は、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含まないＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示し、レーン「３」は、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示し、レーン「４」は、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示し、レーン「５」は、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液の試験結果を示している。【０１４３】
図１から明らかなように、変異型のＣｏｔＢ１ペプチド（♯９）とＧＦＰとの融合タンパク質は、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）の有無に関わらず、酸化ケイ素に結合するのに対し、Ｒ９−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質は、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）の存在下では、酸化ケイ素に結合できなかった。【０１４４】
Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）は、所望のタンパク質以外のタンパク質が精製用のカラム等に非特異的に吸着することを防止するため、換言すれば、精製される所望のタンパク質の純度を高めるため、に広く用いられている。【０１４５】
変異型のＣｏｔＢ１ペプチドは、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）の存在下であっても酸化ケイ素に結合できるので、Ｒ９−ｔａｇよりも、汎用性に優れているとともに、より高純度で所望のタンパク質を固定・精製することを可能にする。【０１４６】
＜５．酸化ケイ素からの、融合タンパク質の特異的な溶出−１＞
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。【０１４７】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．５）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１４８】
１ｍＬの菌体抽出画分に対して２５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で１５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を４回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１４９】
当該酸化ケイ素粒子を０．２Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０によって染色したゲルの画像を撮影し、画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅＪによって所望の融合タンパク質の純度・収率を解析した。【０１５０】
試験結果を図２に示す。なお、図２中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、「Ｂ」は、４回の洗浄の後に酸化ケイ素粒子に結合していたタンパク質の試験結果を示し、レーン「１」は、アルギニンによる溶出の後も酸化ケイ素粒子に結合していたタンパク質の試験結果を示し、レーン「２」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。【０１５１】
図２から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は９０％であり、所望の融合タンパク質の収率は７０％であった。【０１５２】
＜６．酸化ケイ素からの、融合タンパク質の特異的な溶出−２＞
Ｓｉ−ｔａｇ（アミノ酸配列：配列番号１８、ＤＮＡ配列：配列番号１９）、Ｒ９−ｔａｇ（アミノ酸配列：配列番号１６、ＤＮＡ配列：配列番号１７）、および、ＴＡＴタンパク質の部分ペプチド（ＴＡＴ−ｔａｇ、アミノ酸配列：配列番号２０）について、アルギニンによる溶出が可能であるか確認した。【０１５３】
＜６−１．Ｓｉ−ｔａｇ＞
Ｓｉ−ｔａｇを融合した抗体タンパク質ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｓｉ−ｔａｇ融合ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ：発現方法および精製方法は、Ikeda等の文献（Analytical Biochemistry, Vol.385, p132-137（2009年））を参照）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に、５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、１５分間混合して、Ｓｉ−ｔａｇ融合ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを酸化ケイ素粒子に吸着させた。酸化ケイ素粒子を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で３回洗浄した後、遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１５４】
当該酸化ケイ素粒子を１Ｍまたは２Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。所望の融合タンパク質の純度および収率は＜５＞に記載の方法にしたがって行った。【０１５５】
試験結果を図３に示す。図３に示すように、アルギニンによって、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から解離できることが明らかになった。なお、１Ｍのアルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の回収率は６０％であり、２Ｍのアルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の回収率は８５％であった。【０１５６】
＜６−２．Ｒ９−ｔａｇ＞
Ｒ９−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質（発現方法および精製方法は、Taniguchi等の文献（Koji Taniguchi et al., Biotechnology and Bioengineering Vol.96, No.6, April 15, p1023-1029, 2007）を参照）を含む、５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に、５ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、１５分間混合して、Ｒ９−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質を酸化ケイ素粒子に吸着させた。酸化ケイ素粒子を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で３回洗浄した後、遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１５７】
当該酸化ケイ素粒子を１Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。【０１５８】
試験結果を図４に示す。図４に示すように、酸化ケイ素に結合したＲ９−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質は、１Ｍのアルギニン溶液によって略１００％溶出された。このことから、アルギニンによる溶出は、様々な酸化ケイ素結合性タンパク質および酸化ケイ素結合性ペプチドに対しても利用できる手法だと考えられる。【０１５９】
＜６−３．ＴＡＴ−ｔａｇ＞
ＴＡＴ−ｔａｇとＧＦＰとの融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。【０１６０】
具体的には、ＴＡＴタンパク質の部分ペプチド（配列番号２０）のＣ末端側にＧＦＰが付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを合成した。なお、当該ＤＮＡの５’末端にはＮｄｅＩ認識配列を、３’末端にはＥｃｏＲＩ認識配列を付加した。【０１６１】
合成したＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した後、当該消化物と、同様に制限酵素ＮｄｅＩおよび制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したｐＥＴ−４７ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃にて２時間の間、ライゲーションさせた。その後、ライゲーション産物を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミド（ｐＥＴ−ＴＡＴ−ＧＦＰ）が導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。【０１６２】
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＴＡＴ−ＧＦＰが導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。【０１６３】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。１ｍＬの菌体抽出画分に対して１００ｍｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で１５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を４回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１６４】
当該酸化ケイ素粒子を１．０Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。【０１６５】
試験結果を図６に示す。なお、図６中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。【０１６６】
図６から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は８０％であり、所望の融合タンパク質の収率は７０％であった。このことから、アルギニンによる溶出は、様々な酸化ケイ素結合性タンパク質および酸化ケイ素結合性ペプチドに対しても利用できる手法だと考えられる。【０１６７】
＜７．酸化ケイ素（シラス粒子）からの、融合タンパク質の特異的な溶出−３＞
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）を作製した。【０１６８】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１６９】
酸化ケイ素を主要な成分として含む火砕流堆積物であるシラス粒子（鹿児島県産）１０ｍｇを１ｍＬの菌体抽出画分に対して添加し、室温で５秒間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１７０】
当該酸化ケイ素粒子を０．３Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によってシラス粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。純度・収率は、＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。【０１７１】
試験結果を図５に示す。なお、図５中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」は、アルギニンによる溶出によってシラス粒子から解離したタンパク質の試験結果を示している。【０１７２】
図５から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質をシラス粒子から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は９５％であり、所望の融合タンパク質の収率は８０％であった。【０１７３】
＜７．ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合したｍＣｈｅｒｒｙの精製＞
ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）と蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号２２）との融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。【０１７４】
具体的には、まず、野生型のＣｏｔＢ１ペプチドとＳＵＭＯとｍＣｈｅｒｒｙとの融合タンパク質（ＣｏｔＢ１ｐ−ＧＦＰ）の発現プラスミド（ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ−ＳＣ：Abdelhamid et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 98(12), 5677-5684, 2014）を鋳型として用いたインバースＰＣＲ法によって、ＳＵＭＯをコードする領域を除いたプラスミドを構築した。得られたプラスミドを鋳型として再度インバースＰＣＲ法を行い、野生型のＣｏｔＢ１領域の一部を欠失させることで、所望のプラスミド（ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）−ｍＣｈｅｒｒｙ）を構築した。【０１７５】
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）−ｍＣｈｅｒｒｙが導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。【０１７６】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１７７】
２ｍＬの菌体抽出画分に対して０．４ｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１７８】
当該酸化ケイ素粒子を０．５Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。【０１７９】
試験結果を図７に示す。なお、図７中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、レーン「１」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「２」は、酸化ケイ素粒子との混合後に上清に残存していたタンパク質の試験結果を示し、レーン「３」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。【０１８０】
図７から明らかなように、アルギニンを用いれば、所望の融合タンパク質を酸化ケイ素から特異的に解離できることが明らかになった。なお、アルギニンを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は８９％であり、所望の融合タンパク質の収率は８８％であった。【０１８１】
＜８．シリカメンブレンを備えたスピンカラムによる、ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）とＧＦＰとの融合タンパク質の精製＞
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。【０１８２】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌（湿重量約１０ｍｇ）を、５００μＬの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１８３】
Ｑｉａｇｅｎ社Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍに付属のシリカメンブレンを備えたスピンカラムに対して、菌体抽出画分５００μＬを加え、室温で１分間静置した。その後、スピンカラムを遠心分離（１６，０００×ｇ、１分間、４℃）に供することで、菌体抽出画分にシリカメンブレン内を通過させた。スピンカラムに０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を５００μＬ加え、同様に遠心分離に供することで、シリカメンブレンを洗浄した。洗浄操作をさらに２回繰り返した後、スピンカラムを新しい１．５ｍＬ容マイクロチューブ内に移した。スピンカラムに０．５Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を１ｍＬ加え、同様に遠心分離に供し、シリカメンブレンを通過した溶液を回収した。そして、当該溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。【０１８４】
試験結果を図８に示す。なお、図８中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、レーン「１」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「２」は、シリカメンブレンを通過した菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「３」は、アルギニンによる溶出によってシリカメンブレンから解離したタンパク質の試験結果を示している。【０１８５】
図８から明らかなように、シリカメンブレンを備えたスピンカラムを用いれば、遠心分離操作によって所望の融合タンパク質をシリカメンブレンに吸着させることができ、かつ、アルギニン溶液によってシリカメンブレンから所望の融合タンパク質を解離できることが明らかになった。なお、シリカメンブレンを備えたスピンカラムを用いた場合、所望の融合タンパク質の精製純度は８９％であり、所望の融合タンパク質の収率は８８％であった。【０１８６】
＜９．ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）とＧＦＰとの融合タンパク質の、酸化ケイ素粒子への結合条件の検討＞
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＧＦＰ−ＣｏｔＢ１ｐ（♯９）が導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。【０１８７】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、（ｉ）０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）、または、（ｉｉ）０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）と、０．１５Ｍ若しくは０．５ＭのＮａＣｌと、を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１８８】
２ｍＬの菌体抽出画分に対して０．４ｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した後、当該酸化ケイ素粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用のサンプルバッファーに懸濁し、９５℃で５分間加熱することによって、酸化ケイ素粒子の表面に結合した融合タンパク質を酸化ケイ素粒子から解離させた。そして、解離した融合タンパク質を含むサンプルバッファーをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。【０１８９】
試験結果を図９に示す。なお、図９中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、レーン「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、レーン「１」は、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を用いた場合の精製タンパク質の試験結果を示し、レーン「２」は、０．１５ＭのＮａＣｌと、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）と、を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を用いた場合の精製タンパク質の試験結果を示し、レーン「３」は、０．５ＭのＮａＣｌと、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）と、を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）を用いた場合の精製タンパク質の試験結果を示している。【０１９０】
図９から明らかなように、ＮａＣｌを含む緩衝液を用いた場合は多くの大腸菌由来タンパク質も酸化ケイ素粒子に結合するのに対し、ＮａＣｌを含まない緩衝液を用いた場合は、所望の融合タンパク質を特異的に酸化ケイ素粒子に結合できることが明らかとなった。【０１９１】
＜１０．ＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）、または、ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）の融合が、融合対象であるタンパク質へ及ぼす影響の比較＞
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）にＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）またはＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合した融合タンパク質を発現するためのプラスミドを作製した。【０１９２】
具体的には、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株のＤＨＦＲ（配列番号２３）のカルボキシル末端側にＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）またはＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）が付加されている融合タンパク質をコードするＤＮＡを合成した。なお、当該ＤＮＡの５’末端にはＳａｃＩＩ認識配列を、３’末端にはＸｈｏＩ認識配列を付加した。【０１９３】
合成したＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩＩおよび制限酵素ＸｈｏＩで消化した後、当該消化物と、同様に制限酵素ＳａｃＩＩおよび制限酵素ＸｈｏＩで消化したｐＥＴ−４７ｂプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）とを、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて１６℃にて２時間の間、ライゲーションさせた。その後、ライゲーション産物を用いてクローニング用宿主である大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、所望のプラスミド（ｐＥＴ−ＤＨＦＲ−ＧＦＰ）が導入された大腸菌を選抜した。そして、周知の方法にしたがって、大腸菌から所望のプラスミドを精製した。【０１９４】
上述した方法にしたがって、ｐＥＴ−ＤＨＦＲ−ＧＦＰが導入された大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を作製した。【０１９５】
上述した大腸菌にて所望の融合タンパク質を発現させた後、当該大腸菌を、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁し、＜２＞に記載の方法にしたがって、菌体抽出画分を調製した。【０１９６】
２ｍＬの菌体抽出画分に対して０．４ｇの酸化ケイ素粒子（Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｆｉｎｅ  ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．０．８μｍ、添川理化学）を添加し、室温で５分間混合した。その後、菌体を懸濁したものと同じ組成のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて、酸化ケイ素粒子を３回洗浄した。遠心分離処理によって、洗浄後の酸化ケイ素粒子を回収した。【０１９７】
当該酸化ケイ素粒子を０．５Ｍのアルギニンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ８．０）に懸濁した。その後、遠心分離処理によって酸化ケイ素粒子を沈殿させ、上清を回収した。このアルギニンによる溶出操作を計２回行った。そして、当該上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。純度・収率は＜５＞に記載の方法にしたがって解析した。【０１９８】
試験結果を図１０に示す。なお、図１０中、「Ｍ」は、分子量マーカーを示し、「Ｓ」は、菌体抽出画分の試験結果を示し、「Ｕ」は、菌体抽出画分と酸化ケイ素粒子とを混合した際に酸化ケイ素粒子に結合しなかったタンパク質（未結合画分）の試験結果を示し、レーン「１」およびレーン「２」は、アルギニンによる溶出によって酸化ケイ素から解離したタンパク質の試験結果を示している。【０１９９】
図１０から明らかなように、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合させた場合は、当該融合タンパク質は、可溶性タンパク質として発現され、純度高く、かつ、高収率で回収できることが明らかになった。一方、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）を融合させた場合は、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合させた場合と比較して、当該融合タンパク質は、可溶性タンパク質として発現し難いことが明らかとなった。【０２００】
すなわち、より小さなペプチド（例えば、ＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９））を用いた方が、融合タンパク質が可溶性を示すことが明らかになった。なお、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（♯９）を融合させた場合は、菌体抽出画分に含まれる全タンパク質のうちの約７％が所望の融合タンパク質であったのに対し、ＤＨＦＲにＣｏｔＢ１ｐペプチド（野生型）を融合させた場合は、菌体抽出画分に含まれる全タンパク質のうちの１％未満が所望の融合タンパク質であった。
【産業上の利用可能性】
【０２０１】
本発明は、様々な物質の精製に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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