(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−Ｌ１の発現を増強するために免疫調節細胞をＩＬ−２５で処理することを含む、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて免疫調節細胞を上方調節する方法であって、前記免疫調節細胞は、単球または間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である、方法。
【請求項２】
前記免疫調節細胞はヒト単球またはヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｈＭＳＣは骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤から単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト単球は末梢血白血球由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫調節細胞をＪＮＫおよび／またはＳＴＡＴ３アクチベーターで処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／０５２，０８３号の優先権を主張するものであり、その開示はその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
１．発明の分野
本出願は、免疫調節細胞を上方調節および抑制するための方法に関する。特に、本発明は、ＩＬ−２５を介して免疫調節細胞を上方調節および抑制するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
多能性ヒト間葉系間質細胞（ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）（ｈＭＳＣ）は、骨髄（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ）（ＢＭ）（非特許文献１、非特許文献２）ならびに脂肪組織、臍帯血、および胎盤などの他の多くの部位から（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）単離可能な体細胞前駆細胞である。
従前の研究では、ｈＭＳＣは骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞の沿軸中胚葉系譜に分化できるとともに、適切な環境の合図が与えられれば他の非中胚葉系譜にも分化できることが示されている（非特許文献６、非特許文献７）。従って、ｈＭＳＣは、再生医療に関する多くの臨床試験で広く適用されてきた（非特許文献８、非特許文献９）。さらに、ｈＭＳＣは、これらの万能前駆細胞を用いた免疫関連疾患に関する多くの臨床試験によりエビデンスが得られているように、圧倒的な治療能を有する強い免疫調節特性を備えていることが分かっている（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
ｈＭＳＣは多様な白血球集団を調節し、最もよく研究されているのは、Ｔエフェクター機能を抑制するＴリンパ球に対するものである（非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。この分子基盤は、特にヒトのシステムでは、腫瘍増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、およびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を含むパラ分泌因子と白血球表面受容体と結合する細胞表面分子の両方を含むと思われる（非特許文献１５、非特許文献１６）。ｈＭＳＣはまた、ＣＤ４  Ｔヘルパー（Ｔｈ）サブセット表現型の多様性に影響を及ぼし、おそらくＴｈ１細胞応答をＴｈ２細胞応答に傾け（非特許文献１７、非特許文献１８）、Ｔ細胞の免疫調節集団である制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導を増強する（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１）。
【０００４】
より顕著な隆起部に移動したＴリンパ球の一集団が、インターロイキン（ＩＬ）−１７Ａ分泌Ｔ細胞である（非特許文献２２）。Ｔｈ１７細胞としても知られるこのＴヘルパー細胞サブグループは、微生物感染に対する宿主応答の媒介、ならびにＴｈ１細胞により引き起こされると永らく考えられてきた多くの自己疾患および慢性炎症性疾患の病因への関与において重要である（非特許文献２３）。
ｈＭＳＣはＴｈ１７介在免疫を弱めることを示している研究もあれば（非特許文献２４、非特許文献２５、非特許文献２６）、ｈＭＳＣが実際にＴｈ１７応答を増強することを見出したという研究もある（非特許文献２７、非特許文献２８）。これらの矛盾した報告は、おそらくはｈＭＳＣとＴｈ１７リンパ球の相互作用に関与する機構の現状での理解が完全でないためであり、ヒト疾患におけるＴｈ１７細胞の役割を考えれば、この相互作用はｈＭＳＣの臨床使用に重要な意味を持っている（非特許文献２９）。よって、ｈＭＳＣとＴｈ１７の相互作用の性質の検討および関与する機構の解明が着手される。
ｈＭＳＣは、ＩＬ１７Ｅとしても知られるＩＬ−２５ならびにＰＤ−１ファミリーのリガンドであるＰＤ−Ｌ１を含む、パラ分泌機構と細胞−細胞接触の両方を介してＴｈ１７応答を抑制することが判明した。このデータは、ｈＭＳＣはＩＬ−２５を構成的に分泌して、ＪＮＫおよびＳＴＡＴ３介しＰＤ−Ｌ１の細胞表面発現を上方調節することを証明し、ここで、ＳＴＡＴ３はＰＤ−Ｌ１の転写制御に関与する。ｈＭＳＣはまた、骨髄由来抑制細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌ）（ＭＤＳＣ）の免疫調節白血球集団を増加させることも記載されている（非特許文献３０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，１９７６  Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１９７６，４７，３２７−３５９
【非特許文献２】Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８４，１４３−１４７
【非特許文献３】Ｅｒｉｃｅｓら，２０００  Ｅｒｉｃｅｓ，Ａ．ら，Ｂｒ．  Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０００，１０９，２３５−２４２
【非特許文献４】Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５，２３，３−９
【非特許文献５】Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．ら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２０００，７，２１１−２２８
【非特許文献６】Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｍ．ら，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００６，８，３１５−３１７
【非特許文献７】Ｅｎｇｌｅｒ，  Ａ．Ｊ．ら，  Ｃｅｌｌ  ２００６，  １２６，  ６７７−６８９
【非特許文献８】Ｇｉｏｒｄａｎｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００７，２１１，２７−３５
【非特許文献９】Ｈａｒｅ，Ｊ．Ｍ．ら，ＪＡＭＡ  ２０１２，３０８，２３６９−２３７９
【非特許文献１０】Ｇｅｂｌｅｒ，Ａ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２０１２，１８，１２８−１３４
【非特許文献１１】Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，Ｋ．ら，Ｌａｎｃｅｔ  ２００８，３７１，１５７９−１５８６
【非特許文献１２】Ｔａｎ，Ｊ．ら，ＪＡＭＡ  ２０１２，３０７，１１６９−１１７７
【非特許文献１３】Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ，Ａ．ら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００２，３０，４２−４８
【非特許文献１４】Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ，Ｍ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００２，９９，３８３８−３８４３
【非特許文献１５】Ｕｃｃｅｌｌｉ，Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，８，７２６−７３６
【非特許文献１６】Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．２０１１，１８，４９−５９
【非特許文献１７】Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００５，１０５，１８１５−１８２２
【非特許文献１８】Ａｋｓｕ，Ａ．Ｅ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，１２７，３４８−３５８
【非特許文献１９】Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６，２４，２４６６−２４７７
【非特許文献２０】Ｍａｃｃａｒｉｏ，Ｒ．ら，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２００５，９０，５１６−５２５
【非特許文献２１】Ｓｅｌｍａｎｉ，Ｚ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００８，２６，２１２−２２２
【非特許文献２２】Ｄｏｎｇ，Ｃ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，８，３３７−３４８
【非特許文献２３】Ｍｉｏｓｓｅｃ，Ｐ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２，１１，７６３−７７６
【非特許文献２４】Ｇｈａｎｎａｍ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０，１８５，３０２−３１２
【非特許文献２５】Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．Ａ．ら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００９，６０，１００６−１０１９
【非特許文献２６】Ｘｕ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２，１２０，３１４２−３１５１
【非特許文献２７】Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１０，６８，５４０−５４５
【非特許文献２８】Ｔｓｏ，Ｇ．Ｈ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１０，２８，９３９−９５４
【非特許文献２９】Ｋｏｒｎ，Ｔ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，２７，４８５−５１７
【非特許文献３０】Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１３，１，１３９−５１
【発明の概要】
【０００６】
概要
本出願は、ＰＤ−Ｌ１の発現を増強するために免疫調節細胞をＩＬ−２５で処理することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫調節細胞を上方調節する方法を提供する。一実施形態では、前記免疫調節細胞はヒト単球またはヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）である。本方法は、免疫調節細胞をＪＮＫおよび／またはＳＴＡＴ３アクチベーターで処理することをさらに含み得る。
【０００７】
本出願はまた、上述の方法による、限定されるものではないが、自己免疫疾患、移植、および炎症性疾患を含む免疫障害の治療方法も提供する。
【０００８】
本出願は、ＰＤ−Ｌ１の発現を抑制することを含む、免疫調節細胞を抑制するための方法を提供する。前記免疫調節細胞は、ヒト単球またはｈＭＳＣであり得る。本方法は、ＩＬ−２５の発現を抑制することならびに／またはＳＴＡＴ３阻害剤および／もしくはＪＮＫ阻害剤で処理することをさらに含み得る。
【０００９】
本出願はさらに、免疫調節細胞を抑制するために上述の方法を使用することによって免疫回避疾患を治療するための方法を提供する。前記免疫回避疾患は、限定されるものではないが、癌を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＭＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大培養されたＰＢＬおよびＣＤ４細胞においてＩＬ−１７Ａ発現を抑制し、ヒトＴ細胞においてＦＯＸＰ３発現を増強する。３ドナーのヒトＰＢＬ（Ａは代表的データ、Ｂはプールしたデータ）またはＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃは代表的データ、Ｄはプールしたデータ）を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて３日間、単独で培養する（左のパネル）かまたはｈＭＳＣ（ドナーＡおよびＢ）と共培養した（右のパネル）。ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン刺激６時間後の、活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞のＩＬ−１７Ａ生産を細胞内染色により評価した。右上の象限内の数字は、ＩＬ−１７Ａ＋細胞のパーセンテージを表す。＊はｐ＜０．０５。新たに単離したＰＢＬ（Ｅ）またはＣＤ４  Ｔ細胞（Ｆ）を単独で培養する（左のパネル）かまたはヒトＭＳＣと共培養し（右のパネル）、ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３発現を細胞内染色により評価した。３名ドナーのＰＢＬ／Ｔ細胞および２ドナーのｈＭＳＣを用いた実験に関する代表的なドットプロットを示し、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージは右上の象限に示される。
【図２】多能性ヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）はＴｈ１７応答を抑制する。ヒト末梢血ＣＤ３＋白血球（ＰＢＬ）（Ａは代表的データ、Ｂはプールしたデータ）またはＣＤ３＋ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃは代表的データ、Ｄはプールしたデータ）を、ｅｘ  ｖｉｖｏにて、ｈＭＳＣを伴わずに培養するか（左のパネル）またはｈＭＳＣとともに共培養し（右のパネル）、次いで、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激を６時間行った。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養したＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産を細胞内染色により評価した。３ドナー全てのｈＭＳＣと共培養したＰＢＬ（ｎ＝１７）またはＣＤ４  Ｔ細胞（ｎ＝１１）からプールしたデータをそれぞれ（Ｂ）および（Ｄ）に示す。ｈＭＳＣとの共培養を行わなかった場合および行った場合のＣＤ３＋  ＰＢＬ（Ｅは代表的データ、Ｆはプールしたデータ）またはＣＤ３＋ＣＤ４  Ｔ細胞（Ｇは代表的データ、Ｈはプールしたデータ）におけるＩＬ−１７ＡおよびＩＦＮ−γの生産をフローサイトメトリーにより分析した。ＩＬ−１７Ａ＋  ＩＦＮ−γ−−ＣＤ３＋Ｔ細胞（Ｒ３領域）およびＩＬ−１７Ａ＋ＩＦＮ−γ＋（Ｒ５領域）ＣＤ３＋Ｔ細胞の代表的な細胞内染色を示し、２ドナーのｈＭＳＣ（ドナーＡおよびＢ）と共培養したＰＢＬ（ｎ＝４）またはＣＤ４  Ｔ細胞（ｎ＝４）からプールしたデータをそれぞれ（Ｆ）および（Ｈ）に示す。グレーのバーはＩＬ−１７Ａ＋ＩＦＮ−γ−−ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを表し、白いバーはＩＬ−１７Ａ＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。２ドナーのｈＭＳＣ（ドナーＡおよびＢ）との共培養を行わなかった場合および行った場合の、４ドナーのＣＤ３＋ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＬ−２２の生産（Ｉは代表的データ、Ｊはプールしたデータ）を細胞内染色により評価した。細胞パーセンテージは対象とするドットプロット象限に表される。データは平均±ＳＤとして示す、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。
【図３】ｈＭＳＣは、ＩＬ−２５を構成的に発現する。胎盤由来ｈＭＳＣおよび線維芽細胞の細胞株（ＭＲＣ−５およびＷＳ−１）（Ａ）、ならびに３ドナーの各胎盤（左のパネル）および骨髄（ＢＭは右のパネル）ｈＭＳＣ（Ｂ）における遺伝子ＩＬ−２５の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＩＬ−２５のタンパク質発現は、（Ｃ）ウエスタンブロット法（陽性対照としてＫ５６２細胞株および示された量の組換えヒトＩＬ−２５（ｒｈＩＬ−２５）、内部対照としてのチューブリン）および（Ｄ）フローサイトメトリー分析のための細胞内染色（左のパネルは胎盤ｈＭＳＣドナーＡ、右のパネルはＢＭ  ｈＭＳＣドナーＡ）により決定した。黒いヒストグラムはアイソタイプ対照を表し、白いヒストグラムはＩＬ−２５抗体染色を表し、（Ｅ）ではプールしたデータ（３ドナーの各胎盤およびＢＭ  ｈＭＳＣ）を示す。対照はアイソタイプ対照、ＭＦＩは平均蛍光強度、Ａ．Ｕ．は任意単位。（Ｆ）胎盤ｈＭＳＣ（ドナーＣ、黒いバー）、ＢＭ  ｈＭＳＣ（ドナーＢ、グレーのバー）、ＭＲＣ−５（ストライプのバー）、またはＷＳ−１（白いバー）により分泌されたＩＬ−２５は、採取した各細胞種の細胞馴化培地によって評価し、ＥＬＩＳＡにより分析した。データは３反復の平均±ＳＤとして示す。
【図４】ｓｉＩＬ−２５は、ヒトＭＳＣにおけるＩＬ−２５の発現を首尾良くサイレンシングする。非特異的配列に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＣｔｒｌ）またはＩＬ−２５に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＩＬ−２５）を用いた場合のＭＳＣにおけるＩＬ−２５発現を（Ａ）代表的ゲルと濃度計による定量を示すＲＴ−ＰＣＲ（３ドナー全て）、および（Ｂ）細胞内染色によって分析した。黒いヒストグラムはアイソタイプ対照を表す。広いヒストグラムはＩＬ−２５抗体染色を示す。Ａ．Ｕ．は任意単位、ＭＦＩは平均蛍光強度、＊はｐ＜０．０５。
【図５】ｈＭＳＣにおけるＩＬ−２５サイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｈ１７応答を逆転させる。新たに単離したヒトＰＢＬ（Ａ）またはＣＤ４  Ｔ細胞（Ｃ）を、３日間、単独で培養する（左のパネル）かまたはｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣ（中央のパネル）もしくはｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣ（右のパネル）のいずれかと共培養した後、６時間、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激を行った。ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａの生産を細胞内染色により評価した。右上の象限中の数は、ＩＬ−１７Ａ生産ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。ＰＢＬ（ｎ＝３）またはＣＤ４  Ｔ細胞（ｎ＝３）および２ドナーのｈＭＳＣ（ドナーＡおよびＢ）からプールしたデータをそれぞれ（Ｂ）および（Ｄ）に示す。データは平均±ＳＤとして示す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１。（Ｅ）Ｔｈ１７細胞を拡大増殖し、ｈＭＳＣの養子免疫細胞移入を行った野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ炎症状態を確立するための実験的戦略。（Ｆ）ＬＰＳ（１００μｇ／マウス）投与後３日目に、対照マウス、ＰＢＳ処置マウス、ｓｉＣｔｒｌ−ｈＭＳＣ処置マウス、またはｓｉＩＬ−２５−ｈＭＳＣ処置マウス由来の脾細胞中の活性化ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産を細胞内染色により評価した。対照マウス、ＰＢＳ処置マウス、ｓｉＣｔｒｌ−ｈＭＳＣ処置マウス、またはｓｉＩＬ−２５−ｈＭＳＣ処置マウス（ｎ＝６）におけるＩＬ−１７Ａを発現するＣＤ４  Ｔ細胞の平均パーセンテージの計算値（Ｇ）および相対値（Ｈ）。データは平均±ＳＤとして示す。＊はｐ＜０．０５。＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００５。
【図６】外因性ＩＬ−２５だけでは、Ｔｈ１７応答を有意に抑制するには不十分であり、ｈＭＳＣが介在するＴｈ１７応答の阻害の場合と同様に細胞接触を必要とする。（Ａ）ヒトＣＤ４  Ｔ細胞を示された用量の組換えヒトＩＬ−２５（ｒｈＩＬ−２５）で１８時間処理した後、６時間、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激を行った。ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産を細胞内染色により評価した。右上の象限内の数字は、ＩＬ−１７Ａ生産ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す、（Ｂ）５ドナーのＰＢＬをプールしたデータ。（Ｃ）ヒトＣＤ４  Ｔ細胞（ｎ＝４）を、トランスウェルバリアの不在下および存在下、単独で培養するか、またはｈＭＳＣ（２ドナー：ＢおよびＣ）と共培養した。健康なドナーからプールしたデータを（Ｄ）に示す。データは平均±ＳＤとして示す。＊＊はｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意でない。
【図７】ＩＬ−２５は、ｈＭＳＣおよびヒト単球においてＰＤ−Ｌ１の表面発現を誘導する。（Ａ）ｓｉＣｔｒｌ  ＭＳＣにおけるＰＤ−Ｌ１（左のパネル）およびＬ１  ＭＳＣにおけるｓｉＰＤ−ｓ（右のパネル）を表面染色により分析した。（Ｂ）新たに単離したヒトＰＢＬを３日間、単独で培養する（左のパネル）かまたはｓｉＣｔｒｌ  ＭＳＣ（中央のパネル）もしくはｓｉＰＤ−Ｌ１  ＭＳＣ（右のパネル）と共培養した後、６時間、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激を行った。ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産を細胞内染色により評価した。右上の象限内の数字で示される代表的データは、ＩＬ−１７Ａ生産ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。ＰＢＬ（ｎ＝４）および２ドナーのｈＭＳＣ（ドナーＡおよびＢ）からプールしたデータを（Ｃ）に示す。ｓｉＩＬ−２５およびｓｉＰＤ−Ｌ１の逆転した表現型の倍率を（Ｄ）に示す。（Ｅ）ｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣ（左のパネル）およびｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣ（右のパネル）におけるＰＤ−Ｌ１発現を細胞表面染色により評価した。黒いヒストグラムはアイソタイプ対照を表す。広いヒストグラムはＰＤ−Ｌ１抗体染色を表す。ｓｉＩＬ−２５−ｈＭＳＣおよびｓｉＰＤ−Ｌ１−ｈＭＳＣ（３ドナー全て）でのＰＤ−Ｌ１発現（平均蛍光強度ＭＦＩの変化倍率により示される）のプールしたデータを（Ｆ）に示す。ＰＤ−Ｌ１発現レベルを、標的遺伝子（ＩＬ−２５またはＰＤ−Ｌ１）に関してサイレンシグされたｈＭＳＣと対応するｓｉＣｔｒｌ間で比較した。（Ｇ）ｈＭＳＣを示された用量のｒｈＩＬ−２５で１８時間処理し、細胞表面ＰＤ−Ｌ１の発現を細胞表面染色により評価した。プールしたデータ（３名全てのドナー）を右にチャートで示し、バーはＭＦＩ（任意単位、Ａ．Ｕ．）を示す。（Ｈ）ヒトＰＢＬを示された用量のｒｈＩＬ−２５で１８時間処理し、フローサイトメトリー分析により、ＦＳＣおよびＳＳＣを用いてゲート設定した単球上の表面ＰＤ−Ｌ１の発現に関して分析した。プールしたデータ（１０ドナーのＰＢＬ）を（Ｉ）に示し、バーはＭＦＩを表す。＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．は有意でない。
【図８】ＩＬ−２５Ｒサイレンシングは、ヒトＭＳＣによるＴ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産の阻害を障害する。（Ａ）ヒトＭＳＣでのＩＬ−２５Ｒ発現を免疫ブロットにより決定した。（Ｂ）ｓｉＣｔｒｌ  ＭＳＣ（左のパネル）およびｓｉＩＬ−２５Ｒ  ＭＳＣ（右のパネル）上のＩＬ−２５Ｒを表面染色により分析した。黒いヒストグラムはアイソタイプ対照を表す。白いヒストグラムはＩＬ−２５Ｒ抗体染色を表す。（Ｃ）新たに単離したヒトＰＢＬを３日間、単独で培養する（左のパネル）かまたはｓｉＣｔｒｌ  ＭＳＣ（中央のパネル）もしくはｓｉＩＬ−２５Ｒ  ＭＳＣ（右のパネル、ドナーＡおよびＢ）と共培養した後、６時間、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激を行った。ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産（３ドナー）を細胞内染色により評価した。右上の象限内の数字はＩＬ−１７Ａ生産ＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージを表す。ＰＢＬ（ｎ＝３）からプールしたデータを（Ｄ）に示す。
【図９】ヒト単球およびｈＭＳＣにおけるＩＬ−２５が介在するＰＤ−Ｌ１発現はＪＮＫおよびＳＴＡＴ３により媒介され、ＳＴＡＴ３がＰＤ−Ｌ１の転写制御に関与している。（Ａ）ヒトＰＢＬを１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−２５の前に、ＳＴＡＴ３の阻害剤（ＷＰ１０６６、２．５μＭ）、ＪＮＫの阻害剤（ＳＰ６００１２５、２５μＭ）、またはＭＥＫ１の阻害剤（ＰＤ９８０５９、２０μＭ）で１８時間前処理し、その後、ＦＳＣおよびＳＳＣを用いてゲートを設定した単球でのＰＤ−Ｌ１の表面発現に関してフローサイトメトリー分析を行った。黒いヒストグラムはアイソタイプ対照を表す。白いヒストグラムはＰＤ−Ｌ１抗体染色を表す。プールしたデータ（３ドナー）を（Ｂ）に示し、バーはＭＦＩを表す。ｈＭＳＣを６時間、（Ｃ）ＳＴＡＴ３の阻害剤（ＷＰ１０６６、２．５μＭ）および（Ｄ）ＪＮＫの阻害剤（ＳＰ６００１２５、２５μＭ）で処理した後、フローサイトメトリー分析によりＰＤ−Ｌ１表面発現を評価した。対応する各阻害剤のプールしたデータ（３ドナー全て）を示し（左のチャート）、バーはＭＦＩを表す。（Ｄ）ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子の近位プロモーター領域、すなわち、ＴＦＳｅａｒｃｈウェブに基づくソフトウエアで決定した場合、転写開始部位から上流７００ｂｐの領域にある推定ＧＡＳエレメント（ＳＴＡＴ結合部位）。（Ｅ）ｈＭＳＣにおけるＳＴＡＴ３またはＩｇＧ（陰性対照）の結合を、領域１および領域２に関するプロモーター特異的プライマーを用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）により分析した。インプットサンプル（陽性対照）は１％開始クロマチンを表す。（Ｆ）ＩＬ−２５／ＳＴＡＴ３／ＰＤ−Ｌ１軸を含むｈＭＳＣが介在するＴｈ１７応答抑制のモデルの概略図。
【図１０】ヒト末梢血単球におけるＩＬ−２５により誘導されるＰＤ−Ｌ１の発現に関するシグナル経路の関与。（Ａ）ＭＥＫ阻害後のＰＤ−Ｌ１発現（ＭＦＩとして示す）のプールしたデータ（３ドナー）。（Ｂ）ヒト末梢血単球をＰＩ３Ｋの阻害剤（ＬＹ２９４００２、１０μＭ）またはＡｋｔの阻害剤（Ａｋｔ阻害剤ＩＩＩ、１０μＭ）で前処理した後、１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−２５刺激を行った。１８時間のＩＬ−２５処理後、ＰＤ−Ｌ１の発現を細胞表面染色により評価した。ＰＤ−Ｌ１発現（ＭＦＩとして示す）のプールしたデータ（３ドナー）を（Ｃ）に示す。Ａ．Ｕ．は任意単位である。
【図１１】ＩＬ−２５は、末梢血白血球（ＰＢＬ）においてＣＤ３３−／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３３＋骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を拡大培養させる。組換えヒトＩＬ−２５によるヒトＰＢＬからのＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋細胞の拡大増殖。同種異系ＰＢＬ（２ドナー）を単独培養するか、または示されたように種々の用量のＩＬ−２５を添加して培養した。ＰＢＬに、まず、前方散乱（ＦＳＣ）／側方散乱（ＳＳＣ）でゲートをかけ（Ｒ１）、次に、ＣＤ１４−およびＣＤ１１ｂ＋に関して分析し（Ｒ２）、さらにＣＤ３３＋に関して分析した（Ｒ３、細胞パーセンテージを示す）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
実施形態の詳細な説明  本出願では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫調節細胞を上方調節する方法は、ＰＤ−Ｌ１の発現を増強するために免疫調節細胞をＩＬ−２５で処理することを含む。一実施形態では、前記免疫調節細胞は、ヒト単球またはヒト間葉系間質細胞（ｈＭＳＣ）である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記ｈＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤から単離できる。別の実施形態では、前記ヒト単球は、末梢血白血球から単離できる。一実施形態では、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいて免疫調節細胞を上方調節する方法は、免疫調節細胞をＪＮＫおよび／またはＳＴＡＴ３アクチベーターで処理することをさらに含む。
【００１３】
本出願では、免疫障害の治療のための方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて免疫調節細胞を上方調節するための上述の方法を使用することによる。いくつかの実施形態では、前記免疫障害は、自己免疫疾患、移植、および炎症性疾患であり得る。
【００１４】
本出願では、免疫調節細胞を抑制するための方法は、ＰＤ−Ｌ１の発現を抑制することを含む。一実施形態では、前記免疫調節細胞は、ヒト単球またはｈＭＳＣである。さらに、前記ｈＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯血、または胎盤の間葉系間質細胞であり得る。 
【００１５】
一実施形態では、免疫調節細胞を抑制するための方法は、ＩＬ−２５の発現を抑制することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＩＬ−２５の発現は、ＩＬ−２５とＩＬ−２５Ｒの間の相互作用を抑制することにより、または抗ＩＬ２５もしくは抗ＩＬ−２５Ｒ抗体で処理することによって抑制される。いくつかの実施形態では、前記ＩＬ−２５の発現は、ＩＬ−２５およびＩＬ−２５Ｒを標的とするｓｉＲＮＡで処理することによりＩＬ−２５およびＩＬ−２５Ｒの発現を抑制することによって抑制される。 
【００１６】
別の実施形態では、免疫調節細胞を抑制するための方法は、ＳＴＡＴ３阻害剤および／またはＪＮＫ阻害剤で処理することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＳＴＡＴ３阻害剤はＷＰ１０６６であり、前記ＪＮＫ阻害剤はＳＰ６００１２５である。 
【００１７】
本出願はさらに、免疫調節細胞を抑制するための上述の方法を使用することによる、免疫回避疾患の治療のための方法を提供する。免疫回避疾患としては、限定されるものではないが、癌を含む。
【実施例】
【００１８】
試験手順
細胞培養
ＢＭおよび胎盤由来のｈＭＳＣを、従前の公開プロトコール（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  Ｍ．Ｆ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，  ２８４，  １４３−１４７、Ｙｅｎ，  Ｂ．Ｌ．ら，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５，  ２３，  ３−９）に従って単離および拡大培養した。簡単に述べれば、治験審査委員会により承認されたインフォームド・コンセントを得たヒト満期胎盤（妊娠３８〜４０週、Ａ、Ｂ、およびＣと呼称する３ドナー）から胎盤ＭＳＣを単離した。
胎盤組織を機械的および酵素的に消化し（０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。ＢＭＭＳＣは商業的に入手した（Ｃａｍｂｒｅｘ、ＡおよびＢと呼称する２ドナー、ならびにＰｒｏｍｏｃｅｌｌ、Ｃと呼称する１ドナー）。使用した全てのｈＭＳＣは特に断りのない限り胎盤由来である。ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）は、治験審査委員会の手続きに従って承認されたインフォームド・コンセントとともに入手した健康なドナーの血液サンプル（Ｔａｉｗａｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｔａｉｐｅｉ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ、台北、台湾）のバフィーコートから単離し、従前に報告されているように培養した（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６，２４，２４６６−２４７７、Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１３，１，１３９−１５１）。ＣＤ４  Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造者のプロトコールに従って用い、ＰＢＬから精製した。純度はフローサイトメトリー分析により評価した（＞９８％ＣＤ４陽性）。ヒト線維芽細胞株ＭＲＣ−５およびＷＳ−１はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、提案されているプロトコールに従って培養した。
【００１９】
ＭＳＣ−白血球共培養実験
ｈＭＳＣを６ウェルプレートにウェル当たり３．５×１０４細胞で播種し、ヒトＰＢＬまたはＣＤ４細胞との共培養前に３７℃で２４時間インキュベートした。共培養では、１×１０５のヒトＰＢＬまたはＣＤ４細胞を、無刺激下、または製造者の説明書に従った抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングした磁気ダイナビーズ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による刺激下のｈＭＳＣ含有ウェルに加えた。３日後、細胞を、モネンシン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって６時間刺激し、その後、細胞内染色を用いてＴ細胞のＩＬ−１７Ａ発現を評価した。
トランスウェル培養では、ヒトＰＢＬまたはＣＤ４細胞をトランスウェルプレート（０．４μｍ孔径、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標））の上のコンパートメントに播種し、一方でｈＭＳＣを下のコンパートメントに播種した。単球およびｈＭＳＣの毒性プロフィールを確認した後に、ヒト組換えＩＬ−２５（ｒｈＩＬ−２５、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と種々の阻害剤（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＷＰ１０６６／ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）ＳＴＡＴ３阻害剤ＩＩＩおよびＡｋｔ阻害剤ＩＩＩ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＳＰ６００１２５  ＪＮＫ阻害剤およびＬＹ２９４００２  ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ならびにＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのＰＤ９８０５９／ＭＥＫ１／２阻害剤）を示された用量で種々の実験に加えた。
【００２０】
フローサイトメトリー
細胞を示されたように抗体で染色した：抗ヒトＩＬ−２５−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ヒトＣＤ３−ＰＥ／Ｃｙ５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＣＤ４−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＩＬ−１７Ａ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＩＦＮ−γ−ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ヒトＩＬ−２２−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＦＯＸＰ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ１−Ｈ１）−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ヒトＩＬ−２５Ｒ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗マウス  ＣＤ４−ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗マウスＣＤ３ｅ−ＰＥ／Ｃｙ５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および抗マウス／ラットＩＬ−１７Ａ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。データはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）装置で収集し、Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【００２１】
質量分析
タンデム質量（ＭＳ／ＭＳ）実験は、従前に報告されている通りに実施した（Ｃｈａｎｇ，  Ｗ．Ｃ．ら，  Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２０１０，  ７２６９６８）。簡単に述べれば、ＭＳ／ＭＳを、ナノエレクトロスプレーイオン源（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズバイナリーＨＰＬＣポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＦａｍｏｓオートサンプラー（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ）を備えたＬＴＱ−ＦＴ  ＩＣＲ  ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて実施した。ＬＴＱによるＭＳ／ＭＳ連続分離のために最小閾値１，０００カウントをカットオフとして用い、ＭＳ／ＭＳシーケンシングについては単一荷電イオンを除外した。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って用い、全ＲＮＡを細胞から調製した。このＲＮＡからＩｍｐｒｏｍ−ＩＩ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲでは、ｃＤＮＡに対して、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。ＩＬ−２５、フォワード５’−ＴＴＣＣＴＡＣＡＧＧＴＧＧＴＴＧＣＡＴＴＣ−３’、リバース５’−ＣＧＣＣＴＧＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’（Ｆｕｒｕｔａ，Ｓ．ら，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１１，３，７８ｒａ３１）、β−アクチン、フォワード５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣ−３’、リバース５’−ＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣ−３’。
【００２３】
ＥＬＩＳＡ
ヒトＩＬ−２５  ＥＬＩＳＡキットはＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手し、製造者の説明書に従って行った。検出範囲は０〜２０００ｐｇ／ｍｌである。
【００２４】
ＲＮＡ干渉
ｈＭＳＣにおけるヒトＩＬ−２５、ＩＬ−２５ＲまたはＰＤ−Ｌ１の発現のサイレンシングを、Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）二重鎖オリゴヌクレオチド（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って行い、非標的ｓｉＲＮＡ（中ＧＣ含量二重鎖）を対照として使用した。ＲＮＡｉのトランスフェクションは、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の説明書に従って行った。ノックダウン効率はフローサイトメトリーにより確認した。
【００２５】
ｈＭＳＣ養子免疫細胞
全ての動物研究は、所内動物実験委員会によって承認されたプロトコールに従って行った。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは台湾国家実験動物センター（台北、台湾）から購入した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴｈ１７細胞の誘導は従前の報告と同様に行った（Ｓｈｉ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，１９１，４１５−４２３）。簡単に述べれば、ＬＰＳ（１００μｇ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）０００４１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を８〜１２週齢のマウスの腹膜内に注射し、２時間後、非標的またはＩＬ−２５  ＲＮＡｉトランスフェクション（それぞれｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＩＬ−２５）の後にｈＭＳＣ（１×１０５細胞／マウス）を移入した。マウスを３日目に犠牲にし、ＣＤ４  Ｔ細胞におけるＩＬ−１７Ａ＋発現の評価のために脾細胞を採取した。
【００２６】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
ＣｈＩＰアッセイは、ＥＺ−Ｚｙｍｅ（登録商標）Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｅｐキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＥＺ−ＣｈＩＰ（登録商標）クロマチン免疫沈降キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をキット製造者のプロトコールに従って行った。消化したクロマチンを、抗ＳＴＡＴ３（１２４Ｈ６）マウスモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および通常のマウスＩｇＧを用いた多重免疫沈降に使用した。この反応物の１パーセントをインプットクロマチンとして取り出した。
ＰＣＲ検出は、ヒトＣＤ２７４プロモーター領域内の推定ＳＴＡＴ３結合部位に特異的なプライマーセットを用いて行った。プライマーセットの配列は、−３３７ｂｐ〜−１１８ｂｐのセグメントを増幅するフォワード５’−ＡＧＧＴＧＣＧＴＴＣＡＧＡＴＧＴＴＧＧＣ−３’およびリバース５’−ＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧ−３’、ならびに−８０３ｂｐ〜−４７７ｂｐのセグメントを増幅するフォワード５’−ＴＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＴＧＴＣＡＴＣ−３’および５’−ＧＴＣＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＣＡＴＡＴＧ−３’であった。
【００２７】
免疫ブロット分析
全細胞溶解液は、細胞を４℃で１５分間、溶解バッファー（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１０ｍＭ  ＮａＰｙｒＰＯ４、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１ｍＭ  Ｎａ４ＶＯ３）中に溶解させることによって調製した。溶解液をまず１２，０００ｘｇで２０分間の遠心分離によって明澄化した。等量のサンプルを７％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写し、抗ＩＬ−２５Ｒ抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ）でブロットした。
【００２８】
統計分析
２群間の統計分析に関してはスチューデントのｔ検定（両側）を行い、多群の統計分析に関してはＡＮＯＶＡを行った。統計的有意性はｐ＜０．０５に設定した。データは全て平均±ＳＤとして表した。
【００２９】
結果
ｈＭＳＣはＴｈ１７応答を阻害する。
ＭＳＣとＴｈ１７の相互作用については矛盾した報告があったので、まず、ｈＭＳＣがＴｈ１７細胞の拡大増殖を促進するか抑制するか答えを出すことを試みた。これを決定するために、ＢＭＭＳＣと同様に、三血球系多能性前駆細胞でありかつ免疫調節性であることがこれまでに証明されている胎盤由来ｈＭＳＣを使用した（Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５，２３，３−９、Ｃｈａｎｇ，Ｃ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６，２４，２４６６−２４７７、Ｙｅｎ，Ｂ．Ｌ．ら，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１３，１，１３９−１５１）。次に、これらのｈＭＳＣを３日間、ヒト末梢血白血球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（ＰＢＬ）または定常状態の精製ＣＤ４  Ｔ細胞と共培養した。６時間のホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン処理の後に、非プライムＴ細胞のおよそ１〜３％がＩＬ−１７Ａ生産細胞となり、ｈＭＳＣが存在した場合には、ＩＬ−１７Ａ発現Ｔ細胞の頻度が、ＰＢＬ（図２Ａは代表的データ、２Ｂはプールしたデータ）またはＣＤ４  Ｔ細胞（図２Ｃは代表的データ、図２Ｄはプールしたデータ）において６０％〜６５％と著しく低下したことが判明した。
この現象を確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズおよびイオノマイシンでＰＢＬまたはＴ細胞の刺激を行ってＴｈ１７エフェクター表現型を活性化した（Ｓａｎｔａｒｌａｓｃｉ，Ｖ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１２，３６，２０１−２１４）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大培養されたＩＬ−１７Ａ発現ＰＢＬ（図１Ｃは代表的データ、図１Ｄはプールしたデータ）およびＴ細胞（図１Ａは代表的データ、図１Ｂはプールしたデータ）の頻度は、ｈＭＳＣが存在した場合と同様に有意に減少したことが判明した。Ｔｒｅｇの系譜とＴｈ１７の系譜は関連があり、免疫恒常性を維持するためにある系譜が他の系譜から選択されることが知られている（Ｗｅａｖｅｒ，Ｃ．Ｔ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，９，８８３−８８９）。並行して、ｈＭＳＣとの共培養後に、ＰＢＬおよびＣＤ４細胞において、ＦＯＸＰ３を発現する内在性Ｔｒｅｇの頻度が増加したことも見出された（図１Ｅおよび１Ｆ）。ｈＭＳＣはＩＬ−１７Ａ細胞を抑制するだけでなく、炎症部位においてＴｈ１７細胞の優勢なサブタイプであるＩＬ−１７Ａ／ＩＦＮ−γ二重生産細胞も著しく抑制する（Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００７，２０４，１８４９−１８６１、Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，Ｃ．Ｅ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２，４８４，５１４−５１８）。
従前の報告で、ｈＭＳＣはＰＢＬおよびＴ細胞で原型Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの生産を強く抑制することが示されており（Ａｋｓｕ，Ａ．Ｅ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，１２７，３４８−３５８、Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００５，１０５，１８１５−１８２２）、これがその通りであることも判明した（それぞれ図２Ｅおよび２Ｇ）。加えて、ｈＭＳＣはＩＦＮ−γ／ＩＬ−１７Ａ発現Ｔ細胞を実質的に抑制したことも判明した（ＰＢＬについては、図２Ｅが代表的データおよび図２Ｆがプールしたデータ、ＣＤ４細胞については、図２Ｇが代表的データおよび図２Ｈがプールしたデータ）。Ｔｈ１７細胞はまた、ＩＬ−２２を生産することも知られ（Ｄｏｎｇ，Ｃ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，８，３３７−３４８）、ＣＤ４  Ｔ細胞とｈＭＳＣの共培養もまた、ＩＬ−２２生産を有意に低下させた（図２Ｉは代表的データ、図２Ｊはプールしたデータ）。従って、これらの結果は、ｈＭＳＣがＴｈ１７応答を効果的に抑制することを証明する。
【００３０】
ｈＭＳＣはＩＬ−２５を構成的に発現する
ヒトのシステムでは、ＭＳＣとＴ細胞の相互作用は主としてパラ分泌因子を含んでおり（Ｋｉｍ，Ｎ．ら，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１３，９２，１２９５−１３０８）、従って、Ｔｈ１７応答を抑制できる、可能性ある候補としての分泌型因子を同定するために、ｈＭＳＣ細胞馴化培地で質量分析（ＭＳ）分析を行った。驚くことに、ＭＳ／ＭＳ試験により、ＩＬ１７ＥとしておよびＴｈ１７応答の強力な抑制因子としても知られるＩＬ−２５（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｅｋ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００７，２０４，１６１−１７０、Ｚａｐｈ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００８，２０５，２１９１−２１９８）がｈＭＳＣにより旺盛に分泌されることが明らかになった。
ＭＳ／ＭＳ結果を再確認するために、本発明者らは、線維芽細胞などの他の間質細胞種に対して、ｈＭＳＣの様々な供給源におけるＩＬ−２５の転写産物を調べた。ＩＬ−２５メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はｈＭＳＣでは検出できたが、ヒト線維芽細胞株ＭＲＣ−５またはＷＳ−１では検出できなかった（図３Ａ）。また、胎盤由来ｈＭＳＣおよびヒトＢＭＭＳＣのそれぞれ３名の異なるドナーにおいてＩＬ−２５  ｍＲＮＡの発現も検出され（図３Ｂ）、このことは、ｈＭＳＣの種々の供給源間におけるＩＬ−２５発現の信頼性を示唆する。
ＩＬ−２５のタンパク質生産を確認するために、全タンパク質生産に関してウエスタンブロット（図３Ｃ）を、また、ＩＬ−２５を検出するために細胞内フローサイトメトリー分析（図３Ｄ）を行い、両アッセイでタンパク質発現を検出できた。さらに、ＥＬＩＳＡにより検出されたように（図３Ｅ）、ｈＭＳＣが細胞馴化培地中に分泌型で検出可能なＩＬ−２５タンパク質を発現したことも見出された。これらの所見は、ｈＭＳＣがＩＬ−２５を構成的に生産することを示す。
【００３１】
ｈＭＳＣ由来ＩＬ−２５のサイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｈ１７の応答の抑制を逆転させるが、外因性のＩＬ−２５だけではＴｈ１７応答を抑制するため十分ではなく、ｈＭＳＣにより分泌されたＩＬ−２５がＴｈ１７応答の抑制に関与するかどうかを評価するために、ｈＭＳＣにおけるＩＬ−２５（ｓｉＩＬ−２５）発現のサイレンシングをＲＮＡ干渉により行った。ノックダウンの効率を確認した後に（図４Ａおよび４Ｂ）、ｈＭＳＣにおけるこの遺伝子に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたＩＬ−２５分泌のサイレンシングは、対照サイレンシグｈＭＳＣ（ｓｉＣｔｒｌ）に比べてＴｈ１７細胞に対する抑制効果をほぼ完全に逆転させた（図５Ａ）。
ＩＬ−１７Ａ発現Ｔ細胞においてｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣと共培養した場合には３５％の平均低下が見られ、これはｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣが適用された場合には完全に無効となった（図５Ｂ）。ｓｉＣｔｒｌまたはｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣが精製ＣＤ４リンパ球と共培養された場合にも同様の傾向が見られた（図５Ｃ）。Ｔｈ１７リンパ球は、ｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣが適用された場合の８７％に比べて、ｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣが共培養で使用された場合には平均５２％のベースラインまで低下する（図５Ｄ）。さらに、リポ多糖（ＬＰＳ）で処置したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスへのｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣｓまたはｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣいずれかの養子免疫細胞移入によるｉｎ  ｖｉｖｏ炎症状態下でのＴｈ１７抑制に関するｈＭＳＣ由来ＩＬ−２５の能力が確認された（図５Ｅ）。
ｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣのｉｎ  ｖｉｖｏ移入は脾臓においてＩＬ−１７Ａ発現ＣＤ４  Ｔ細胞の集団を抑制したが、ｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣはその達成ができなかったことが判明した（図５Ｆおよび５Ｇ）。ｓｉＣｔｒｌ  ｈＭＳＣの移入では、ＩＬ−１７Ａ発現Ｔ細胞は、平均４１％のベースラインまで低下するが、ｓｉＩＬ−２５  ｈＭＳＣの移入はこれらの効果をほぼ完全に無効にし、ＩＬ−１７Ａ発現Ｔ細胞は平均９８％のレベルに戻る（図５Ｈ）。これらのデータは、ｈＭＳＣによるＩＬ−２５分泌がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴｈ１７応答の抑制に関与することを証明する。
【００３２】
Ｔｈ１７応答の抑制におけるＩＬ−２５の役割をさらに確認するために、ＰＭＡ／イオノマイシン刺激の前に、ＣＤ４  Ｔ細胞を組換えヒトＩＬ−２５（ｒｈＩＬ−２５）で１８時間処理し、ＣＤ４細胞におけるＩＬ−１７Ａのレベルを調べた。驚くことに、ＣＤ４  Ｔ細胞にＩＬ−２５だけを添加してもＴｈ１７応答は有意な程度には抑制できなかったことが判明した（図６Ａは代表的データ、図６Ｂはプールしたデータ）。さらに、ｈＭＳＣがトランスウェル膜によってＣＤ４  Ｔ細胞から分離された場合には、ＣＤ４細胞におけるＴｈ１７細胞に対する抑制効果は失われた（図６Ｃは代表的データ、図６Ｄはプールしたデータ）。これは、膜結合因子はＩＬ−２５が介在する効果に関与する可能性のあることを示す。
【００３３】
ｈＭＳＣにより分泌されるＩＬ−２５はＰＤ−Ｌ１の表面発現の上方調節によりＴｈ１７応答を抑制する
ｈＭＳＣ細胞表面で構成的に発現されるＰＤ−Ｌ１リガンド（Ｃｈａｎｇ  Ｃ．Ｊ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６，２４，２４６６−２４７７、Ｓｔａｇｇ、Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０７，２５７０−２５７７）は、ヒトＴ細胞におけるＩＬ−１７Ａ生産の強力な阻害剤であることが報告されている（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３，１７０，１２５７−１２６６、Ｈｉｒａｈａｒａ，Ｋ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１２，３６，１０１７−１０３０）。ゆえに、ｈＭＳＣにより分泌されるＩＬ−２５のＴｈ１７応答に対する効果は、このＭＳＣ細胞表面分子との相互作用により媒介される可能性が考えられた。Ｔｈ１７細胞上でのＰＤ−Ｌ１の抑制効果に関する従前の報告を確認するために、ｈＭＳＣ上でのＰＤ−Ｌ１発現のノックダウンを、ｓｉＰＤ−Ｌ１を用いて行った（図７Ａ）。従前の報告と一致して、ｈＭＳＣにおけるＰＤ−Ｌ１ノックダウンはＴｈ１７細胞の抑制を逆転させた（図７Ｂおよび７Ｃ）が、ｓｉＩＬ−２５を用いた場合によりも有意に低い程度であったことが判明した（図７Ｄ）。
ＩＬ−２５依存性のＴｈ１７応答の抑制におけるＰＤ−Ｌ１の役割を評価するためには、ＩＬ−２５がｈＭＳＣ上でのＰＤ−Ｌ１の発現に関与するかどうかが問われた。ｈＭＳＣにおいてＩＬ−２５のサイレンシングが行われた場合、ＰＤ−Ｌ１の表面発現は、それ自体に特異的なｓｉＲＮＡでのノックダウンと同様の程度まで、著しく低下したことが判明し（ｓｉＩＬ−２５対ｓｉＰＤ−Ｌ１の、図７Ｅは代表的データ、図７Ｆはプールしたデータ）、このことは、ＩＬ−２５がＰＤ−Ｌ１発現を誘導し得ることを示唆する。ＩＬ−２５の受容体はＩＬ２５Ｒであり（Ｌｅｅ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１，２７６，１６６０−１６６４）、ｈＭＳＣにおけるＩＬ２５Ｒの発現を調べたところ、ウエスタンブロット法によりｈＭＳＣがこの受容体を構成的に発現することが明らかとなった（図８Ａ）。ｈＭＳＣにおいてｓｉＩＬ−２５ＲでＩＬ−２５Ｒ発現のサイレンシングを行った場合（図８Ｂ）、ｈＭＳＣが介在するＴｈ１７応答抑制が有意に無効となったことが判明した（図８Ｃおよび８Ｄ）。よって、ｈＭＳＣにより分泌されるＩＬ−２５は、Ｔｈ１７応答の抑制に至るためにｈＭＳＣ上のその受容体ＩＬ−２５Ｒとの相互作用を必要とする。
【００３４】
ＰＤ−Ｌ１発現に対するＩＬ−２５の相互作用をさらに確認するために、ｒｈＩＬ−２５を直接ｈＭＳＣに加え、ＰＤ−Ｌ１のさらなる上方調節をアッセイした。外因性のｒｈＩＬ−２５はｈＭＳＣ上のＰＤ−Ｌ１の表面発現をさらに上方調節できるが有意な程度ではないことが判明し（図７Ｇ）、これは、ＰＤ−Ｌ１がｈＭＳＣ上で高レベルで構成的に発現され、それによりｒｈＩＬ−２５のさらなる効果をマスキングするためであり得る。よって、ＰＤ−Ｌ１発現に対するＩＬ−２５の重要性をさらに明らかにするためにＰＢＬ由来のヒト初代単球を用いる。これはこれらの細胞がＩＬ−２５に応答するとともにベースラインにおいて低レベルのＰＤ−Ｌ１を発現することが知られているからである（Ｃａｒｕｓｏ，Ｒ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００９，１１３，３５１２−３５１９）。
ヒトＰＢＬをｒｈＩＬ−２５で処理した場合、ＰＤ−Ｌ１発現は単球において用量依存的に、劇的かつ有意に増加したことが判明した（図７Ｈは代表的データ、図７Ｉはプールしたデータ）。よって、これらの所見は、ＩＬ−２５はｈＭＳＣおよびヒト単球の両方でＰＤ−Ｌ１の表面発現の調節に関与していることを証明する。
【００３５】
ＩＬ−２５により誘導されるＰＤ−Ｌ１の上方調節にはＪＮＫおよびＳＴＡＴ３が介在し、ＳＴＡＴ３はＰＤ−Ｌ１の転写制御に関与する。
次に、ＩＬ−２５がＰＤ−Ｌ１の発現に介在するシグナル伝達経路を探索することが求められる。まず、この疑問に答えるために、ＰＤ−Ｌ１の発現が構成的ではなく誘導型であるヒトＰＢＬ由来の単球を使用した。ヒト初代単球では、ＳＴＡＴ３阻害剤であるＷＰ１０６６またはＪＮＫ阻害剤であるＳＰ６００１２５は、ＩＬ−２５が介在するＰＤ−Ｌ１の誘導を実質的に無効にした（図９Ａは代表的データ、図９Ｂはプールしたデータ）。対照的に、ＭＥＫ１／２阻害剤であるＰＤ９８０５９は最小の効果を示し、一方、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２およびＡｋｔ阻害剤ＩＩＩは、ＩＬ−２５により誘導されるＰＤ−Ｌ１の発現に部分的な影響を及ぼすに過ぎなかった（図１０Ａおよび１０Ｂ）。高レベルのＰＤ−Ｌ１を構成的に発現するｈＭＳＣでは、ＷＰ１０６６によるＳＴＡＴ３の阻害（図９Ｃ）またはＳＰ６００１２５によるＪＮＫの阻害（図９Ｄ）はＰＤ−Ｌ１発現を著しく低下させたことも判明した。
【００３６】
ＳＴＡＴ３は転写因子でもあるので、ＩＬ−２５が介在するＰＤ−Ｌ１発現のシグナル経路に関与するだけでなく、ＰＤ−Ｌ１の転写制御にも役割を果たし得ると推論された。この疑問に答えるために、まず、ヌクレオチド−７００とヌクレオチド＋１の間にあるヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子のプロモーターの推定ＳＴＡＴ３結合エレメントを分析した。
ソフトウエア推定に基づき、転写開始部位の上流５９５〜１１６ｂｐの間に３つの推定ＧＡＳエレメント（ＳＴＡＴ３結合部位）が見出され（図９Ｅ）、ＳＴＡＴ３がＰＤ−Ｌ１のプロモーターに直接結合する可能性が浮上した。この可能性を検討するために、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行ってＳＴＡＴ３がｈＭＳＣのＰＤ−Ｌ１プロモーターに結合するかどうかを判定したところ、ＰＤ−Ｌ１プロモーター上のＧＡＳエレメントに構成的に動員されることが判明した（図９Ｆ）。よって、このデータは、ｈＭＳＣにおいて、ＩＬ−２５はＪＮＫおよびＳＴＡＴ３を介したＰＤ−Ｌ１の細胞表面発現を媒介し、後者はＰＤ−Ｌ１の転写制御に関与していることを証明する（図９Ｇ）。
【００３７】
ＩＬ−２５が末梢血由来のＭＤＳＣの拡大増殖を誘導できることをさらに確認するために、同種異系ＰＢＬ（２ドナー）を単独で、または示されたように種々の用量のＩＬ−２５を添加して培養した（図１１）。処理された細胞にまず、前方散乱（ＦＳＣ）／側方散乱（ＳＳＣ）でゲートをかけ（Ｒ１）、次に、ＣＤ１４−およびＣＤ１１ｂ＋に関して分析し（Ｒ２）、さらにＣＤ３３＋に関して分析した（Ｒ３、細胞パーセンテージを示す）。このデータは、ＩＬ−２５がＣＤ３３−／ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ３３＋  ＭＤＳＣ  ＰＢＬを拡大増殖させることを証明する。
【００３８】
考察
ｈＭＳＣは幅広い免疫調節性があることが知られ、これらの効果は治療上適切である（Ｃａｐｌａｎ，Ａ．Ｉ．ら，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２０１１，９，１１−１５、Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，Ｋ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１２，３８３−３９６、Ｕｃｃｅｌｌｉ，Ａ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，８，７２６−７３６）。今般、Ｔｈ１７細胞はいくつかの自己免疫疾患および慢性炎症性疾患の病因に関与していることが知られており（Ｍｉｏｓｓｅｃ，Ｐ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２，１１，７６３−７７６）、ｈＭＳＣはこの重要な白血球集団と相互作用するが、矛盾があることが示されている（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｐ．Ｊ．ら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１０，６８，５４０−５４５、Ｇｈａｎｎａｍ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０，１８５，３０２−３１２、Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｍ．Ａ．ら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００９，６０，１００６−１０１９、Ｔｓｏ，Ｇ．Ｈ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１０，２８，９３９−９５４、Ｘｕ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２０１２，１２０，３１４２−３１５１）。
このデータから、Ｔｈ１７細胞に対するｈＭＳＣの効果は抑制的であり、パラ分泌因子としてのＩＬ−２５ならびに細胞表面分子としてのＰＤ−Ｌ１の両方を必要とすることが明らかである。さらに、ｈＭＳＣにおけるＰＤ−Ｌ１の発現は、ＩＬ−２５Ｒを介してＩＬ−２５と、また、ＪＮＫおよびＳＴＡＴ３を介してさらに下流に関連し、その後者はＰＤ−Ｌ１の転写制御に関与している。Ｔｈ１７細胞は、未知の機構を介した移植拒絶への寄与因子として認識されている（Ａｎｔｏｎｙｓａｍｙ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，１６２，５７７−５８４、Ｆａｕｓｔ，Ｓ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，１８３，７２９７−７３０６）。
このデータは、関連疾患に対するｈＭＳＣ療法の強い治療効果の背後にある機構に光を投げかけ（Ｂａｓｓｉ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１２，６１，２５３４−２５４５、Ｓｕｎ，Ｌ．ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００９，２７，１４２１−１４３２、Ｚｈｏｕ，Ｂ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，１４１，３２８−３３７）、自己免疫／炎症性疾患ならびに移植拒絶におけるＩＬ−２５アゴニストの役割を含意し得る。
【００３９】
ＩＬ−２５（ＩＬ−１７Ｅ）は、ＩＬ−１７ファミリーのメンバーである（Ｉｗａｋｕｒａ，  Ｙ．ら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１１，  ３４，  １４９−１６２）。しかしながら、自己免疫疾患および慢性炎症性疾患に直接的な役割を持つ、このインターロイキンファミリーのより知られているＩＬ−１７ＡまたはＦとは異なり、ＩＬ−２５は実際にＩＬ−１７Ａ／Ｔｈ１７状態およびＴｈ１状態から保護していると思われる（Ｃａｒｕｓｏ，Ｒ．ら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００９ａ，１３６，２２７０−２２７９）。ＩＬ−２５欠損マウスは、ヒト多発性硬化症モデルであるＴｈ１７介在実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、Ｔｈ１応答の増進に加え、ＩＬ−１７Ａ発現Ｔ細胞およびＩＦＮ−γ発現Ｔ細胞の量が多い（Ｋｌｅｉｎｓｃｈｅｋ，Ｍ．Ａ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００７，２０４，１６１−１７０）。興味深いことに、蓄積しているデータは、ＩＬ−２５が、Ｔｈ２応答の促進により、蠕虫感染（Ｆａｌｌｏｎ，Ｐ．Ｇ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００６，２０３，１１０５−１１１６）ならびに好酸球性気道炎症（Ｋｉｍ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００２，１００，２３３０−２３４０）を予防するという免疫系の別の役割も持つことを証明する。
これまでに報告されているＩＬ−２５の供給源には、Ｔ細胞、マクロファージ、単球由来樹状細胞、肥満細胞、好酸球、および好塩基球などの免疫細胞、ならびに上皮細胞および内皮細胞などの非免疫細胞が含まれる（Ｍｏｎｔｅｌｅｏｎｅ，Ｇ．ら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２０１０，２１，４７１−４７５）。ＩＬ−２５はｈＭＳＣの多様な供給源によって高量で構成的に発現されるが、非線維芽細胞ではそうではないことが判明した。さらに、このデータは、ＩＬ−２５が高病原性ＩＬ−１７Ａ／ＩＦＮ−γ＋細胞を減らすことを含む、同種異系Ｔｈ１７応答のｈＭＳＣ抑制を直接的に担っていることを示し、さらに、ＩＬ−２５にＴｈ１７応答およびＴｈ１応答に対して幅広い保護力があることを証明する。その高い構成的発現を考えれば、ｈＭＳＣにおけるＩＬ−２５の他の可能性のある生物学的役割を推測することは興味深い。このサイトカインがｈＭＳＣの増殖および／または分化に役割を果たすかどうかを評価するためにさらなる研究を進めている。
【００４０】
本研究の特筆すべき発見の１つが、ＩＬ−２５は白血球集団、すなわち単球と非白血球集団、すなわちｈＭＳＣの両方において表面分子ＰＤ−Ｌ１を直接上方調節するということである。ＰＤ−Ｌ１には強い免疫抑制性があり、数種の自己免疫疾患では自己Ｔ細胞活性化の阻害剤であり（Ｋｅｉｒ，Ｍ．Ｅ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，６７７−７０４）、最近証明されたように（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２４４３−２４５４）、Ｔ細胞上のその受容体ＰＤ−１の遮断が癌の免疫抑制に対して極めて効果的である可能性がある。最近、マウスＭＳＣがこの経路を介してＴｈ１７応答を抑制することを示すという報告があった（Ｌｕｚ−Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｐ．ら，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２，７，ｅ４５２７２）。しかしながら、この報告におけるデータは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路の遮断はマウスＭＳＣのＴｈ１７応答抑制を部分的に逆転させるに過ぎず、このプロセスにおける他の因子の関与を示している。
このデータはまた、ＰＤ−Ｌ１サイレンシングはｈＭＳＣのＴｈ１７応答抑制の部分的逆転をもたらすが、ＩＬ−２５のサイレンシングはｈＭＳＣ介在性のＴｈ１７抑制の、有意に高くかつほぼ完全な逆転をもたらすことを証明する（図７Ｄ）。加えて、ＰＤ−Ｌ１発現のノックダウンの程度は、ＩＬ−２５に特異的なｓｉＲＮＡを使用した場合であれＰＤ−Ｌ１に特異的なｓｉＲＮＡを使用した場合であれ同等であった（図７Ｆ）。さらに、ＩＬ−２５は、ＳＴＡＴ３を介してｈＭＳＣとヒト白血球の両方のＰＤ−Ｌ１転写に直接影響を及ぼし得るという証拠が見出され、これはＰＤ−Ｌ１転写制御の疑問を解明する助けとなる（Ｓｕｍｐｔｅｒ，Ｔ．Ｌ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，４１，２８６−２９０、Ｗｏｌｆｌｅ，Ｓ．Ｊ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，４１，４１３−４２４）。
決定的なこととしては、マウスＭＳＣは定常状態ではＰＤ−Ｌ１を発現しないが、ｈＭＳＣは高レベルのＰＤ−Ｌ１を構成的に発現する（Ｓｔａｇｇ，Ｊ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００６，１０７，２５７０−２５７７）。マウスシステムからのデータはＭＳＣの免疫生物学において明らかに重要であるが、マウスおよびヒトシステムからの結果は、ＰＤ−Ｌ１発現の場合と同様に矛盾していた（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００５，１０６，４０５７−４０６５、Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，Ｋ．ら，Ｌａｎｃｅｔ  ２００８，３７１，１５７９−１５８６）ことに留意することが重要である。様々な免疫関連疾患でのｈＭＳＣ療法に対する臨床応答に基づけば、ｈＭＳＣは強い免疫調節効果を発揮すると思われるが（Ｌｅ  Ｂｌａｎｃ，Ｋ．ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，１２，３８３−３９６）、これはマウス研究では常に明白というわけではない（Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｎ．ら，Ｂｌｏｏｄ  ２００５，１０６，４０５７−４０６５）。よって、ｈＭＳＣの治療的適用に関与する機構を解明するために、ｈＭＳＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を遂行することがなお不可欠である。
【００４１】
要約すると、これらの所見は、ｈＭＳＣはＴｈ１７応答を抑制し、これには分泌型因子ＩＬ−２５とＩＬ−２５が介在する表面ＰＤ−Ｌ１の上方調節の両方が必要であることを証明する。ＪＮＫおよびＳＴＡＴ３の下流シグナル伝達経路は、ＰＤ−Ｌ１のＩＬ−２５調節に関与し、ＳＴＡＴ３はＰＤ−Ｌ１の転写制御に関連付けられている。
自己免疫疾患および慢性炎症性疾患におけるＴｈ１７細胞の既知の役割に加え、最近の研究ではまた、チェックポイント免疫療法の有効性の増強におけるＴｈ１７細胞の重要性も示されている（Ｌｕｔｚ，Ｅ．Ｒ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２０１４，２，６１６−６３１）。従って、ＩＬ−２５の調製は、このサイトカインがＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の相互作用およびＴｈ１７細胞を同様に調節できることから、強い臨床的重要性を持ち得る。これらの所見は、ｈＭＳＣとＴｈ１７細胞の間のクロストーク、ならびに関連疾患の候補治療標的としての際だったＩＬ−２５／ＳＴＡＴ３／ＰＤ−Ｌ１軸のより良い理解を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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