(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６の融合物または配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる融合物を含んでなるかまたはコードし、かつ以下の追加のマイコバクテリア抗原：
・Ｒｖ２６２６、および
・Ａｇ８５Ｂまたは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
をさらに含んでなるかまたは発現するか、あるいは
ｂ）ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６の融合物または配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる融合物と、ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原ＴＢ１０．４およびＴＢ９．８の融合物または配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる融合物とを含んでなるかまたはコードし、かつ追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ２６２６、Ａｇ８５Ｂまたは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｖ３４０７、およびＲｖ１８１３または配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をさらに含んでなるかまたは発現する、
免疫原性組み合わせ物。
【請求項２】
前記免疫原性組み合わせ物中に含まれるかまたはそれによってコードされる前記ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原および前記１種以上の追加のマイコバクテリア抗原が、独立に、結核菌(M. tuberculosis)（Ｍｔｂ）、ウシ型結核菌(M. bovis)、ウシ型結核菌ＢＣＧ(M. bovis BCG)、アフリカ型結核菌(M. africanum)、Ｍ．カネチ(M. canetti)、Ｍ．カプラエ(M. caprae)、およびネズミ型結核菌(M. microti)からなる群から選択される結核菌群のマイコバクテリウム属(Mycobacterium)種から得られる、請求項１に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項３】
前記追加のマイコバクテリア抗原が、別個のポリペプチドの形態または２つの融合物の形態で前記免疫原性組み合わせ物中に含まれるかまたはそれによってコードされる、請求項１〜２のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項４】
追加のマイコバクテリア抗原の前記融合ポリペプチドが、
（ｉ）Ｒｖ２６２６、およびＡｇ８５Ｂまたは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉ）ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ、または
（ｉｉｉ）Ｒｖ３４０７、およびＲｖ１８１３または配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列
を含んでなる、請求項３に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項５】
追加のマイコバクテリア抗原の前記融合ポリペプチドが、前記融合ポリペプチドの上流および下流のポリペプチドの間に挿入されたプロテアーゼ切断部位のような、前記マイコバクテリア抗原の適切なフォールディングを確保する１以上のペプチドを含んでなる、請求項３または４に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項６】
追加のマイコバクテリア抗原の前記融合ポリペプチドが、配列番号８〜配列番号１２に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項４または５に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項７】
前記免疫原性組み合わせ物が核酸分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項８】
配列番号１３〜１９のいずれかに示されるヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも９０％同一性を示す、請求項７に記載の免疫原性組み合わせ物。
【請求項９】
請求項７または８に記載の免疫原性組み合わせ物を含んでなる、ベクター。
【請求項１０】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、フォーミーウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルスからなる群から選択されるプラスミドまたはウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、鶏痘、カナリア痘およびワクシニアウイルスベクターからなる群から選択されるポックスウイルスベクター、好ましくは、コペンハーゲン株、ワイエス株、ＮＹＶＡＣ株および改変アンカラ（ＭＶＡ）株からなる群から選択されるワクシニアウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
（ｉ）ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０を含んでなる融合物をコードする核酸分子、Ａｇ８５Ｂまたは配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子、およびＲｖ２６２６をコードする核酸分子
を含んでなるベクター；ならびに
（ｉｉ）ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原ＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０を含んでなる融合物をコードする核酸分子；ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原ＴＢ１０．４およびＴＢ９．８を含んでなる融合物をコードする核酸分子、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ２６２６およびＡｇ８５Ｂ、または配列番号９もしくは配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸分子；追加のマイコバクテリア抗原ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ、または配列番号８に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸分子；および、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３、または配列番号１１もしくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸分子
を含んでなるベクター
からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３】
前記核酸分子が、哺乳類細胞内での前記コードされた融合物および追加のマイコバクテリア抗原の発現を確保するために好適なプロモーターの転写制御下、特に、好ましくは、プロモーターｐ７．５Ｋ、ｐＨ５Ｒ、ｐＢ２Ｒ、ｐＳＥ／ＬおよびｐＡ３５Ｒからなる群から選択されるワクシニアプロモーターの転写制御下に置かれる、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物、または請求項９〜１３のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物の生産方法であって、前記免疫原性組み合わせ物がマイコバクテリア抗原であり、（ｉ）ベクターを宿主細胞へ導入してトランスフェクトされたまたは感染された宿主細胞を作出する工程、（ｉｉ）前記トランスフェクトされたまたは感染された宿主細胞をその宿主細胞の増殖に好適な条件下でｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養する工程、（ｉｉｉ）その細胞培養物を回収する工程、および（ｉｖ）所望により、その細胞培養物から前記マイコバクテリア抗原（単数または複数）を精製する工程を含んでなる、方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫原性組み合わせ物、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項１４に記載の宿主細胞またはそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含んでなる、組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでなる、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
マイコバクテリウム感染症またはそのようなマイコバクテリウム感染症によって引き起こされるかまたはそれに関連する任意の疾患および病的状態の予防または治療のための医薬組成物である、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の医薬組成物であって、
ａ）  それを必要とする対象、特に、活動性疾患を発症した感染者と密接に接触していた対象において、マイコバクテリウムによる感染症を予防するため、または該感染症のリスクを遅らせるための、
ｂ）  マイコバクテリウム属種、特に結核菌に感染した対象において活動性疾患を治療するための、
ｃ）  マイコバクテリウム属種、特に結核菌に潜伏感染した対象において再活性化を予防または治療するための、
ｄ）  ＢＣＧ追加免疫としての使用のための、
ｅ）  マイコバクテリウム感染症に対して有効な１種以上の化学療法薬、特に、１種以上の抗生物質化学療法とともに使用するための、
ｆ）  投与された対象において免疫応答を誘導または増強するための、
好ましくは前記誘導または刺激された免疫応答がマイコバクテリア抗原／エピトープに対するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋を介したＴ細胞応答であり、または、
ｇ）  ａ）〜ｆ）の任意の組み合わせに使用するための
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、少なくとも２種のヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原またはそれらのようなヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原をコードする核酸分子を含んでなるかまたはコードする新規免疫原性組み合わせに関し、それらのマイコバクテリア抗原は、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)種、特に、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)（Ｍｔｂ）などの結核菌群の抗原Ｅｓｘ、ＰＥおよびＰＰＥの群から選択される。好ましい実施態様では、その免疫原性組み合わせは、少なくとも、２種のヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原を含んでなる融合ポリペプチドの形態である。本発明はまた、上記免疫原性組み合わせを含んでなるかまたはコードする、ベクター、宿主細胞および組成物、ならびにそれを発現させ、生産するための方法に関する。本発明はまた、特に、マイコバクテリウム感染症またはマイコバクテリウム感染症によって引き起こされるまたはそれに関連する任意の疾患に対する防御応答を提供することを目的として免疫応答を誘導または刺激するために、上記免疫原性組み合わせ、融合ポリペプチド、ベクター、宿主細胞、組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毎年、推定世界の人口の三分の一が結核菌（Ｍｔｂ）に感染し（すなわち、２０億人を超える）、９００万〜１０００万件の新たな症例があり、２００万人が死亡し、結核（ＴＢ）は地球規模の世界的な健康問題である。一般的には、ヒトからヒトへの伝播は、肺ＴＢ（活動性疾患）罹患者によって発生するエアゾール化飛沫によって起こる。感染者（曝露された個体の推定３０％）のうち、わずか５〜１０％が曝露後２年以内に活動性ＴＢ疾患を発症する（一次ＴＢとして知られている）。しかしながら、感染者の大部分は、疾患の臨床徴候または症状なく何十年も続くことがある潜在感染（ＬＴＢＩ）を起こす。ＬＴＢＩとは、感染した対象は、感染を制御することができるが細菌を完全には根絶することができないという平衡状態を表す。再活性化(reactivation)（遠隔感染後の活動性ＴＢ）は、後の段階で、特に、高齢者でまたはＨＩＶ感染およびＴＮＦ阻害剤による治療の場合のように免疫不全者で起こる可能性がある。ＴＢ再活性化のリスクは、生涯あたり１０％と推定され、免疫障害は１年間に１０％までリスクを高める。
【０００３】
ＴＢの原因物質である、結核菌（Ｍｔｂ）という細菌は、１９９８年に完全に配列決定された４  ４１１  ５２９塩基対（ｂｐ）の環状ゲノムを有する(Cole et al., 1998, Nature 393: 537-44)。Ｍｔｂは、およそ４０００個の遺伝子をコードするが、これらの遺伝子の大部分のＭｔｂライフサイクルおよび病因における機能および役割はまだ解明されていない。
【０００４】
密接に関連するマイコバクテリアのゲノム配列の解析と比較研究により、遺伝子ファミリーＥｓｘおよびＰＥ／ＰＰＥのメンバーを含む、複数の分泌タンパク質を同定することが可能になった。
【０００５】
ＰＥ／ＰＰＥファミリーの様々なメンバーについて、構造または正確な機能は知られていないが、それらのいくつかは、感染マイコバクテリウムの免疫回避、ビルレンスおよび宿主特異性において役割を果たし得ることが示唆されている。ゲノム解析は、遺伝子ＰＥおよびＰＰＥが頻繁にＭｔｂゲノム中で隣接して見出され、機能的に連結していることを明らかにした(Riley et al., 2008, PLoS Comput Biol, 4:e1000174)。従って、このようなＰＥ／ＰＰＥタンパク質対（例えば、Ｒｖ２４３１ｃ／Ｒｖ２４３０、Ｒｖ３４７７／Ｒｖ３４７８など）は、これらのタンパク質の機能的形態である可能性があるヘテロ二量体を形成するために互いに相互作用していると思われる。
【０００６】
ＰＥおよびＰＰＥ遺伝子ファミリーのように、Ｅｓｘ遺伝子の大部分は、協調的に調節されるタンデム対として発現される。結核菌ゲノムは、２３個のＥｓＸ遺伝子（Ｅｓｘ  Ａ〜Ｗと名付けられている）を含有し、これらは、Ｍｔｂビルレンスに関連があると推定されるタンパク質をコードする。生物物理学的研究は、Ｅｓｘ対の遺伝子産物は機能的ヘテロ二量体において互いに相互作用することを示している。例示の目的のために、ＴＢ９．８（Ｒｖ０２８７）／ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）複合体の構造解析により、ＴＢ９．８由来の１９個のアミノ酸残基およびＴＢ１０．４由来の２１個のアミノ酸残基が分子内接触に関与することが明らかにされた(Ilghari et al., 2011, J. Biol. Chem., 286: 29993-30002)。
【０００７】
大腸菌(E. coli)において結核菌のタンパク質Ｍｔｂ  ＥｓｘＡ（ＥＳＡＴ６）およびＥｓｘＢ（ＣＦＰ  １０）を個別に過剰発現させるこれまでの試みは、低タンパク質収量となる技術的な難しさによって阻まれた。いくつかの研究は、関連タンパク質対の共発現が、生産される組換えタンパク質の高収量を可能にする適切なフォールディングおよび二量化を容易にし、これにより、Ｍｔｂビルレンスに関連するこれらのタンパク質ファミリーの構造的および生化学的研究が簡素化されることを示す傾向にある(Strong et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci, 103: 8060-5; Mehra et al., 2013, PLoS, 9: e1003734)。しかしながら、このような二量体が免疫原性活性を保有することは示されていない。
【０００８】
ワクチン（カルメットとゲランの桿菌(Bacille-Calmette-Guerin)（ＢＣＧ））と抗生物質の両方が存在し、広く使用されていることを考慮すると、毎年のＭｔｂによる１００万人の死亡者数は特に劇的である。しかしながら、ＢＣＧが新生児および幼児の疾患予防に有効であるようならば、それは、成人を保護せず、潜伏感染者でのＭｔｂ再活性化を防ぐことはできない。一方で、様々な抗生物質組み合わせによる活動性ＴＢの治療は有効と思われるが異なる薬物の数ヶ月にわたる連日投与への強い患者のコンプライアンスを必要とする。さらに、主に、この長期にわたる高価な薬物療法治療の不適切な遵守による、薬剤耐性Ｍｔｂ株（例えば、「多剤耐性（ＭultiDrug Resistant)」（ＭＤＲ）株、「広範囲薬剤耐性(eXtensively Drug-Resistant)」（ＸＤＲ）株および「完全薬剤耐性（Totally Drug Resistant）」（ＴＤＲ）株）の出現には、驚くべき速さがある。
【０００９】
細胞性免疫系の刺激がＴＢ疾患の制御において役割を果たすことを示唆するいくつかの証拠がある(Rook et al., 2007, J Infect Dis, 196:191-8)。病原体を制御し、疾患への進行を防止するためのＣＤ４  Ｔリンパ球の中心的役割は十分に確立されている。例えば、低ＣＤ４＋  Ｔ細胞数のＨＩＶ／エイズ患者はＴＢ疾患への進行を受けやすい一方で、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を上昇させる抗ウイルス治療はＴＢ疾患への進行を減少させる。しかしながら、ＣＤ４  Ｔ細胞は単独では働かず、ＣＤ８  Ｔ細胞および他のＴ細胞サブセットにより支援される。
【００１０】
従って、効果的なＴＢワクチンの開発はこの懸念される状況での優先事項であり、２つの主なアプローチ：ＢＣＧ代替品およびＢＣＧ追加免疫がここ１０年間研究されている。
【００１１】
ＢＣＧの代替候補は、ＢＣＧの有効性および安全性を向上させることを目指し、主に、ＢＣＧが存在しない新しい抗原セットを発現するようにまたはＢＣＧが恐らく不十分なレベルでしか発現しないＭｔｂ抗原を過剰発現するようにまたはさらにビルレンス遺伝子およびそれらのレギュレーターを欠失させるように操作された遺伝子改変型のＢＣＧまたはＭｔｂ株などの弱毒生菌に基づく（例えば、ＷＯ２００９／０６４８２５；ＷＯ２０１２０３１７５２）。
【００１２】
ＢＣＧ追加免疫は、細胞性および／または体液性免疫応答を誘導することを目指し、一般的に、強力なＴｈ１活性化アジュバントと一般的に混合されたタンパク質組成物としてまたはウイルス発現ベクターを通じて、様々なＴＢ抗原を提供するために設計された組換えワクチンに依存する（Andersen, 2007, Nature, 5: 484; Ottenhoff and Kaufman, 2012, PLoS 8(5): e1002607; Cayabyab et al., 2012, Frontiers in Cellular and Infection Microbiology 2: 1-16; およびBrennan et al., 2012, Int J Tuberc. Lung Dis. 16(12): 1566-1573を参照）。
【００１３】
これらのワクチン候補のいくつかは、Ｍｔｂに対する強い細胞媒介性免疫応答を誘導するまたはＴＢ関連肺病変に対する保護を提供する能力を実証する前臨床試験および臨床試験で結果が得られている。例えば、Ａｇ８５Ａ、ＴＢ１０．４、ＴＢ９．８およびＡｃｒ２を発現するアデノウイルスベクター（ＡｄＴＢＦ）は、ＢＣＧの効果を高め、ワクチン接種を受けたヤギの肺内の病変体積および細菌負荷を軽減した(Perez de Val et al., 2013, PLoS, 8: e81317)。しかしながら、これらの研究は、抗原用量(例えば、Aagaard et al., 2009, PLoS One, 4: 1-8)および投与経路(Goonetilleke et al., 2003, J. Immunol., 171: 1602-9)などの、Ｔ細胞応答および防御有効性に対する様々な要因の影響を強調している。
【００１４】
また、様々なＴＢ抗原を含んでなる融合ポリペプチドの使用も記載されている。例えば、融合タンパク質Ｈｙｖａｃ  ４（Ｈ４）は、ＴＢ１０．４と融合されたＡｇ８５Ｂからなり(Aagaard et al., 2009, PLoS One, 4: 1-8)、臨床開発中である。セリンプロテアーゼＲｖ０１２５の中央に挿入されたＲｖ１１９６で作られているＧＳＫのＭ７２融合タンパク質は、異なる合成アジュバントとともに投与された場合に安全性および免疫原性の面で有利な臨床プロフィールを示した(Von Eschen et al., 2009, Hum Vaccine, 5: 475-82)。また、いわゆる「ＩＤ」の融合タンパク質（ＷＯ２００８／１２４６４７）、例えば、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ３６２０およびＲｖ２６０８で作られているＩＤ８３、ならびに３つのＩＤ８３抗原と融合されたＲｖ３６１９を含むＩＤ９３などだけでなく、Ｒｖ０１９８抗原と、Ｒｖ３８１２またはＲｖ０１１１のいずれかとの融合物（ＷＯ２０１１／１４４９５１参照）も挙げることができる。一方で、ＷＯ２０１４／００９４３８には、感染の自然経過の総ての段階を代表する数多くのマイコバクテリア抗原を含む大きな融合物が記載されている。
【００１５】
これら総ての取り組みや他の取り組みにもかかわらず、結核は制御されているとはとても言えず、特に、流行地域では、結核を診断、予防および治療するための代替ワクチン候補が依然として必要である。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、好ましくは、融合物で、抗原Ｅｓｘ、ＰＥおよびＰＰＥの群から選択される少なくともヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原を含んでなる免疫原性組み合わせを提供することによってこの必要性や他の必要性を満たす。このようなヘテロオリゴマー（例えば、ヘテロ二量体）に関与するマイコバクテリア抗原対の組み合わせ／融合物は、個別の抗原と比べたときの融合抗原の抗原フォールディングおよび溶解性の向上などの予想外の特性を提供し、これは、ワクチン候補の遺伝的安定性を増大させ、宿主細胞もしくは生物で生産した場合の潜在的な細胞毒性を低減し、ならびに／または体液性および／もしくは細胞性に関わらず、抗マイコバクテリウム免疫原性応答の質および／もしくは範囲を改善し得る。加えて、本発明の免疫原性組み合わせは、追加のマイコバクテリア抗原を用いて、マイコバクテリウム感染症の自然経過の異なる段階に合わせ得る。本発明は、マイコバクテリウム感染症分野における予防目的または治療目的、例えば、Ｍｔｂ感染症の予防および／または一次ＴＢの予防および／または潜伏感染した対象における再活性化の予防のための、独立して（stand-alone）またはＢＣＧ追加免疫として、免疫療法に関連して特に有用である。また、これは、標準的な治療（例えば、抗生物質療法）または現在開発されている任意の他の新規治療（例えば、小さな直接的または間接的阻害剤分子；抗体または免疫治療薬など）とともに使用することができる。本発明はまた、獣医学の分野で、例えば、動物におけるマイコバクテリウム感染症および／または活動性疾患のリスクを低減しまたはなくすために、特に、ウシおよびヤギの繁殖において役立つであろう。
【００１７】
この技術的な問題は、特許請求の範囲に定義される実施態様の提供によって解決される。
【００１８】
本発明の他のさらなる面、特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。これらの実施態様は開示の目的のために与えられる。
【発明の具体的説明】
【００１９】
本発明は、抗原Ｅｓｘ、ＰＥおよびＰＰＥの群から選択される、少なくとも２種のヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原、好ましくは、これらの融合ポリペプチドを含んでなるかまたはコードする免疫原性組み合わせ、または上記組み合わせ／融合物をコードする核酸分子に関する。
【００２０】
定義
本出願全体を通して本明細書で使用される場合、用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、別段の指示がない限り、それらが「少なくとも１つ」、「少なくとも最初」、「１以上」または「複数」の関連化合物または工程を意味するという意味で使用される。
【００２１】
本明細書で使用される用語「および／または」は、「および」、「または」および「上記用語に接続される要素の総てまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【００２２】
本明細書で使用される用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の１０％以内、好ましくは、８％以内、より好ましくは、５％以内を意味する。
【００２３】
用語「アミノ酸」、「残基」および「アミノ酸残基」は、同義語であり、天然アミノ酸ならびにアミノ酸類似体（例えば、Ｄ型またはＬ型光学異性体を含む、非天然アミノ酸、合成アミノ酸および修飾されたアミノ酸）を包含する。
【００２４】
本明細書で使用されるように、生成物、組成物および方法を定義するために使用される場合、用語「含んでなる(comprising）（および含んでなるの任意の形、例えば、「含んでなる(comprise)」および「含んでなる(comprises）」など）、「有する(having)」（および有するの任意の形、例えば、「有する(have)」および「有する(has)」など）、「含む(including)」（および含むの任意の形、例えば、「含む(includes)」および「含む(include)」など）または「含有する(containing)」（および含有するの任意の形、例えば、「含有する(contains)」および「含有する(contain)」など）はオープンエンドであり、追加の、列挙されていない要素または方法工程を排除するものではない。従って、アミノ酸配列がポリペプチドの最終的なアミノ酸配列の一部である可能性がある場合、ポリペプチドはアミノ酸配列を「含んでなる」。このようなポリペプチドは、最大数百個の追加のアミノ酸残基（例えば、本明細書に記載されるリンカーおよびターゲティングペプチド）を有し得る。「から本質的になる」は、本質的に重要な他の成分または工程を排除することを意味する。従って、列挙された成分から本質的になる組成物は、微量混入物および薬学的に許容可能な担体を排除しない。このようなアミノ酸配列が最終的にほんの数個の追加のアミノ酸残基とともに存在する場合、ポリペプチドは、アミノ酸配列「から本質的になる」。「からなる」は、他の成分または工程の微量を超える要素を排除することを意味する。例えば、ポリペプチドが列挙されたアミノ酸配列以外にアミノ酸を含有しない場合、ポリペプチドはアミノ酸配列「からなる」。
【００２５】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」とは、共有ペプチド結合を介して結合した少なくとも８個以上のアミノ酸のアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポリペプチドは、直鎖状または分枝状であり得、天然型(naturally occurring)および／またはアミノ酸類似体を含んでなり得る。この用語はまた、自然にまたは介入により；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分との結合またはタグ（ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｆｌａｇなど）ターゲティングペプチド（シグナルペプチド、膜貫通ドメインなど）などの機能的ペプチドの付加など、ならびに当技術分野で公知の他の修飾により、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。用語「ポリペプチド」は、タンパク質（通常、５０個以上のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドに採用される）、オリゴペプチド、およびペプチド（通常、５０個未満のアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドに採用される）を包含すると理解される。従って、各ポリペプチドは、特定のアミノ酸によって特徴付けられ、特定の核酸配列によってコードされ得る。
【００２６】
本明細書で使用される用語「組み合わせ」とは、様々な成分の可能な任意の取合せを意味する。このような取合せとしては、マイコバクテリア抗原の混合物（例えば、各抗原および／または抗原の融合物の混合物）または核酸分子（例えば、１以上のベクターによって保持される）の混合物、ならびに１または複数のポリペプチドおよび１または複数の核酸分子の混合物が挙げられる。本発明は、等モル濃度の各成分を含んでなる組み合わせだけでなく、非常に異なる濃度での組み合わせも包含する。各マイコバクテリウム成分の最適濃度は当業者によって決定され得ると理解される。
【００２７】
用語「免疫原性」とは、免疫原性を与える成分が導入された対象において測定可能な細胞性および／または体液性免疫応答を誘導または刺激する能力を意味する。例えば、本発明の組み合わせは、それが、先天性かつ／または特異的（すなわち、上記免疫原性組み合わせ中に含まれまたはそれによって発現される少なくとも１つのマイコバクテリア抗原／エピトープに対して）であり得、体液性および／または細胞性であり得る対象における免疫応答（例えば、抗体および／またはサイトカインの生産および／または細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｔリンパ球、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞などの活性化）を誘導または刺激することが可能であり、通常、投与された対象において防御応答をもたらす意味において免疫原性である。本明細書に記載されるように、成分の免疫原性をｉｎ  ｖｉｖｏ（動物またはヒト）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、生物学的サンプルで）のいずれかで評価するために、多種多様な直接的または間接的な生物学的アッセイが当技術分野で利用可能である。例えば、細胞媒介性免疫応答を刺激する特定の抗原の能力は、複数のアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作された対象において抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすることによって決定し得る。
【００２８】
本明細書で使用される用語「融合物(fusion)」または「融合ポリペプチド」とは、２つ以上のポリペプチドの単一のポリペプチド鎖での共有結合を指し、遺伝的手段により、すなわち、上記ポリペプチドのそれぞれをコードする核酸分子をインフレーム融合することにより行われる。「インフレーム融合」とは、融合されたコード配列の発現により、融合されたポリペプチドのそれぞれの間に翻訳ターミネーターが存在しない単一のポリペプチドがもたらされることを意味する。融合は、直接的（すなわち、その間に追加のアミノ酸残基が存在しない）または間接的（例えば、融合されたポリペプチドの間のリンカーを介して）であり得、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端でまたは内部で起こり得る。リンカーの存在は、融合されたポリペプチドの正確なフォールディングおよび／または機能を促進し得る。リンカーはまた、宿主細胞または生物において翻訳中（例えば、２ａペプチド）または翻訳後（例えば、プロテアーゼ部位）に融合されたポリペプチドを切断することを目的とした切断部位も含み得る。本発明は、採用されるリンカー配列の形態、大きさまたは数に限定されるものではない。例示の目的のために、典型的なリンカーは３〜３０アミノ酸長であり、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アラニンおよび／またはプロリンなどのアミノ酸残基の繰り返しからなる。リンカーはまた、特にフレキシブルであり、またはいくつかの抗原のＮ末端部分に既に存在する原核生物（例えば、Ｍｔｂなどのマイコバクテリア）由来のペプチド配列（例えば、シグナルペプチドなど）であり得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「マイコバクテリア抗原」とは、マイコバクテリウム属種中に存在する（例えば、マイコバクテリウム属種のゲノムによってコードされる）またはマイコバクテリウム属種から得られるポリペプチドを意味する。本発明の文脈において、この用語は、後述するように、天然マイコバクテリアポリペプチドだけでなく、その断片および改変型（すなわち、変異体）を包含する。好ましくは、本発明で用いられるマイコバクテリア抗原は、対象への導入によって免疫原性である（抗体またはＴ細胞受容体によって結合され得る）。典型的には、それは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）に関連して、特定の抗体またはＴ細胞受容体による認識に関与する、１以上のＢおよび／またはＴエピトープ、特に、ＣＴＬまたはＴＨエピトープまたはその両方を含有する。これらのようなエピトープを同定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞エピトープは、生物学的アッセイ（例えば、合成オーバーラッピングオリゴペプチドのライブラリーを用いたＩＦＮｇアッセイ）または利用可能な予測プログラムを実施することにより同定することができる。
【００３０】
「天然」マイコバクテリア抗原は、自然界のマイコバクテリウム源から見つけ、単離し、得ることができる。このような源としては、感染したまたはマイコバクテリウムに曝露された対象から採取した生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、血清、唾液、痰、組織切片、生検標本など）、寄託機関（例えば、ＡＴＣＣまたはＴＢ機関(institutions)）で入手可能な培養細胞ならびに組換え材料、または文献に記載されているライブラリー(libraries or described in the literature)（例えば、マイコバクテリウム分離株、マイコバクテリウムゲノム、ゲノム断片、ゲノムＲＮＡまたはｃＤＮＡならびにこのようなエレメントを含む当技術分野で公知の任意のプラスミドおよびベクター）が挙げられる。
【００３１】
マイコバクテリア抗原の「断片(fragment)」は、マイコバクテリア抗原の少なくとも８個の連続したアミノ酸、より好ましくは、少なくとも１５個の連続したアミノ酸、より好ましくは、少なくとも約２０個の連続したアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約２５個の連続したアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも約４０個の連続したアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。このような断片は、マイコバクテリア抗原として免疫応答を刺激する能力を保持すると特徴付けることができる。好適な断片は、抗体、Ｔ細胞受容体またはＨＬＡ分子によって認識される１以上のペプチドモチーフを含んでなる免疫原性ドメイン（通常、８〜３０個のアミノ酸残基のもの）であり得る。
【００３２】
「改変された」、「変異体」または「突然変異体」マイコバクテリア抗原は、典型的には、本明細書に具体的に開示されたポリペプチドまたは天然のものと１以上の位置で異なる。１個以上のアミノ酸残基の置換、挿入、付加および／または欠失、非自然配置ならびにこれらの可能性の任意の組み合わせを含む、１または複数の任意の修飾を考えることができる。アミノ酸置換は、保存的であってもなくてもよい。いくつかの修飾が意図される場合、それらは、連続残基および／または非連続残基に関係し得る。そのような修飾は、得られる変異体ポリペプチドの合成、加工、安定性、機能および／もしくは溶解性ならびに／またはその免疫原性に有益であり得る。修飾は、当業者に公知の複数の方法により、例えば、部位特異的突然変異誘発（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ（レジュリス(Les Ullis)、フランス）のスカルプター(Sculptor)（商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システムを使用して）、ＰＣＲ突然変異誘発、ＤＮＡシャッフリングおよび合成技術による（例えば、所望のポリペプチド変異体をコードする合成核酸分子をもたらす）などにより生成することができる。
【００３３】
本明細書で使用される用語「ヘテロオリゴマー」とは、複合体を形成する２つの成分の能力(ability)を意味する。会合は、特異的（結合を維持するために、結合部位での２つのパートナーのアミノ酸残基の間での構造的相補性と、静電気力、水素結合、疎水性力、および／またはファンデルワールス力の１種以上とを必要とする）または非特異的（上記の力の１種以上により相互作用するが構造的相補性を欠いている）であり得る。遺伝子ファミリーＥｓｘ、ＰＥまたはＰＰＥの複数のマイコバクテリア抗原は、自然の状況（例えば、マイコバクテリウム感染症）で会合し、複合体（ヘテロオリゴマー (heteroligomer)）、例えば、２つのパートナーの間での１：１複合体（ヘテロ二量体）または任意の他の種類の会合体（例えば、三量体、四量体など）などを形成する傾向がある。このようなヘテロオリゴマーの形成は、円偏光二色性によってまたはウェスタンブロッティングによってまたは標識技術を通じて容易に実証することができる。あるいは、それはまた、Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはＳＨＧなどの従来の構造技術によって決定することもできる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「マイコバクテリウム」、「マイコバクテリウム属種」および「マイコバクテリア」は、マイコバクテリウム科(Mycobacteriaceae)に属する放線菌門(Actinobacteria)の属の任意のメンバーを意味するために、互換的に使用される。これらの用語は、実験室株だけでなく臨床分離株を包含する。
【００３５】
「マイコバクテリウム感染症」とは、マイコバクテリウム属種への対象の曝露に続いてのその細菌による対象または対象の組織への定着を意味する。定着は、深刻な疾患（例えば、マイコバクテリウムに応じて、結核、らい病、ブルーリ潰瘍(Bureli ulcer)など）を引き起こす可能性があり、または有害な徴候にならない（無症候性感染または潜在感染）こともある。
【００３６】
本明細書で使用される用語「治療する(treating)」（および治療するの任意の形、例えば、「治療(treatment)」、「治療する(treat)」など）は、予防（例えば、マイコバクテリウムによる感染のリスクがある対象の予防）および／または療法（例えば、マイコバクテリウムに感染していると診断された対象））を包含する。治療は、活性薬剤（例えば、本明細書に記載される免疫原性組み合わせ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクターおよび／または組成物）を、最終的には、従来の治療法、特に、活動性マイコバクテリウム疾患（例えば、ＴＢ）の治療で現在使用されているものとともに、対象へ外部または内部に投与することを必要とする(requires administer)。
【００３７】
用語「対象」とは、一般的に、マイコバクテリウム属種に対する免疫応答の誘導または刺激から恩恵を受ける脊椎動物、特に、愛玩動物、家畜、競技用動物、および霊長類からなる群から選択される哺乳類を意味する。好ましくは、対象は、マイコバクテリウム、特に、Ｍｔｂに感染していると診断されたまたはそのリスクがあるヒトであり、従って、マイコバクテリウム感染症（例えば、活動性結核もしくは潜在性結核）によって引き起こされるまたはそれに関連する疾患もしくは状態を有し得るまたはそれを有するリスクがある。
【００３８】
本明細書に開示されるポリペプチド、核酸分子、ベクターなどを記載するために使用される場合、用語「単離された」とは、そのようなポリペプチド、核酸分子、ベクターなどがその自然環境から取り出されている（すなわち、それが自然に関連付けられる少なくとも１つの他の成分から分離されている）ことを意味する。例示の目的のために、単離ポリペプチドは、通常、ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、それを発現するように操作された組換え細胞内で生産される組換えポリペプチドを包含する。しかしながら、通常、単離ポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３９】
用語「から得られる」、「起こる(originating)」または「起こる(originate)」は、成分（例えば、ポリペプチド、核酸分子、ベクターなど）の起源を特定するために使用されるが、その成分が作られる方法を限定するものではなく、例えば、化学合成または組換え手段によることができる。
【００４０】
マイコバクテリウム属種
上記で定義されるように、マイコバクテリア抗原（例えば、本発明の免疫原性組み合わせに含まれまたはそれによってコードされる、ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原と、所望により、１種以上の追加のマイコバクテリア抗原など）は、独立に、現時点で同定されているマイコバクテリウム属（Ｍ．）種の任意のメンバーから得ることができる。
【００４１】
当技術分野では、本発明に関して用いられる膨大な数のマイコバクテリアが記載されている。典型的なマイコバクテリウム属種としては、限定されるものではないが、Ｍ．フレイ(M. phlei)、スメグマ菌(M. smegmatis)、アフリカ型結核菌(M. africanum)、Ｍ．カネチ(M. canetti)、Ｍ．フォルツイタム(M. fortuitum)、Ｍ．マリヌム(M. marinum)、Ｍ．ウルセランス(M. ulcerans)、結核菌(Mtb)、パラ結核菌(M. paratuberculosis)、ウシ型結核菌(M. bovis)、ネズミ型結核菌(M. microti)、Ｍ．セラタム(M. celatum)  Ｍ．アビウム(M. avium)、らい菌(M. leprae)、ネズミらい菌(M. lepraemurium)、Ｍ．イントラセルラーレ(M. intracellulare)、Ｍ．スクロフラセウム(M. scrofulaceum)、Ｍ．キセノピ(M. xenopi)、Ｍ．ゲナベンセ(M. genavense)、Ｍ．カンサシイ(M. kansasii)、Ｍ．シミエ(M. simiae)、Ｍ．スズルガイ(M. szulgai)、Ｍ．ヘモフィルム(M. haemophilum)、Ｍ．アシアチカム(M. asiaticum)、Ｍ．マルモエンセ(M. malmoense)、Ｍ．バッカエ(M. vaccae)、Ｍ．カプラエ(M. caprae)、Ｍ．ピンニペディイ(M. pinnipedii)およびＭ．シモイデイ(M. shimoidei)が挙げられる。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明で用いられるマイコバクテリア抗原は、結核という疾患を引き起こすと伝統的に考えられている種だけでなく、免疫不全の対象（例えば、ＨＩＶ感染患者）において結核および肺疾患を引き起こすマイコバクテリウム属の環境性および日和見性の種を含む結核菌群から得られる。本明細書において使用するための結核菌群の典型的な種としては、限定されるものではないが、結核菌（Ｍｔｂ）、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧ、アフリカ型結核菌、Ｍ．カネチ、Ｍ．カプラエ、およびネズミ型結核菌が挙げられる。好ましい実施態様は、Ｍｔｂに対して向けられ、Ｍｔｂ実験室株、例えば、Ｈ３７ＲｖおよびＨ３７Ｒａなど、および臨床分離株、例えば、ＫＺＮ４２０７、Ｔ８５、ＣＤＣ１５５１（米国で単離）、Ｆ１１（南アフリカで単離）、Ｃ、Ｋ８５（オランダで単離）、ＣＰＨＬ−Ａなど、ならびにＭＤＲまたはＸＤＲ分離株、例えば、ＴＮ５９０４、Ｈａａｒｌｅｍ、ＫＺＮ１４３５、ＢｅｊｉｎｇおよびＫＺＮ６０５などが挙げられる。マイコバクテリア抗原源の他の好ましい種は、特に、動物使用のための、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧおよびＭ．カプラエである。しかしながら、実際には、アミノ酸およびヌクレオチドのレベルでＭ．種の間に存在する高相同性パーセンテージを考えると交差反応が予想される。従って、本発明の免疫原性組み合わせ、Ｍｔｂ（ヒト使用）、ウシ型結核菌およびＭ．カプラエ（動物使用）の両方に感染した対象を治療するために有用である可能性が高い。
【００４３】
免疫原性組み合わせ
一実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ中に含まれまたはそれによってコードされるヘテロオリゴマーマイコバクテリアパートナーは、マイコバクテリア抗原Ｅｓｘ、ＰＥおよびＰＰＥの群から選択される。このようなマイコバクテリア遺伝子産物群は、当技術分野で周知であり、先行技術で入手可能なデータから当業者は容易に同定することができる
【００４４】
例示の目的のために、結核菌ゲノムは、２３個のＥｓｘ遺伝子（Ｅｓｘ  Ａ〜Ｗと名付けられている）を含有し、これらは、Ｍｔｂビルレンスに関連があると推定されるタンパク質をコードする。Ｅｓｘ遺伝子産物は、一般に、およそ１００個のアミノ酸残基の小さなサイズと、中央のＷＸＧモチーフの存在によって特徴付けられる。生物物理学的研究では、Ｅｓｘ対の遺伝子産物は、これらのタンパク質の機能的形態の可能性があるヘテロ二量体において相互作用することを示している。これらのようなヘテロ二量体の代表例としては、限定されるものではないが、例えば、ＥｓｘＡ（ＥＳＡＴ６）およびＥｓｘＢ（ＣＦＰ−１０）；ＥｓｘＧ（ＴＢ９．８またはＲｖ０２８７）およびＥｓｘＨ（ＴＢ１０．４またはＲｖ０２８８）；ＥｓｘＲ（Ｒｖ３０１９ｃ）およびＥｓｘＳ（Ｒｖ３０２０ｃ）；ＥｓｘＯ（Ｒｖ２３４６ｃ）およびＥｓｘＰ（Ｒｖ２３４７ｃ）ならびにＥｓｘＶおよびＥｓｘＷが挙げられる。
【００４５】
結核菌の多重遺伝子ファミリーＰＥおよびＰＰＥは、ゲノムのコーディングポテンシャルの約１０％を含んでなり、およそ１６８のメンバーを占める（総説としては、例えば、Deng and Xie, J Cell Bioch, 2013, 113: 1087-1095を参照）。このファミリーのメンバーは、保存されたＮ末端および可変のＣ末端によって特徴付けられる。これらの大きな遺伝子ファミリーによってコードされるタンパク質の機能は依然として不明であるが、それらは抗原変異および病因に関与することは提示されている。ＰＥ／ＰＰＥヘテロ二量体の代表例としては、限定されるものではないが、例えば、Ｒｖ３４７８およびＲｖ３４７７が挙げられる。
【００４６】
遺伝子ファミリーＥｓＸ、ＰＥおよびＰＰＥの好適なマイコバクテリア抗原のアミノ酸配列およびこれらのコードヌクレオチド配列は、専門データバンクおよび文献で容易に入手可能である。例えば、Ｍｔｂ配列は、Cole et al. (1998, Nature 393: 537)中でまたはウェブサイト、例えば、ｔｈｅ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、パスツール研究所など（例えば、ＴＢデータベース(@tbdb.org)およびtuberculist(@tuberculist.epfl.ch)）によって維持されているものなどで見出すことができる。しかしながら、本発明は、これらの例示的なマイコバクテリウム属種に限定されるものではない。実際には、ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は異なる分離株および菌株の間で変化し得、この自然遺伝的変異は、非自然修飾、例えば、本明細書に記載されるものなどと同様に、本発明の範囲内に含まれる。修飾されている場合、ヘテロオリゴマーパートナーは、好ましくは、全長ポリペプチドまたはその断片（例えば少なくとも４０個のアミノ酸残基）にわたって、それらのそれぞれの天然抗原ＥｓＸ、ＰＥおよびＰＰＥのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の同一性パーセンテージを示す。用語「同一性」とは、２つのポリペプチドまたは核酸配列の間でのアミノ酸とアミノ酸またはヌクレオチドとヌクレオチドの一致を意味する。２つの配列の間の同一性パーセンテージは、最適なアラインメントを得るために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である。様々なコンピュータープログラムおよび数学アルゴリズムが、アミノ酸配列間の同一性パーセンテージを決定するために、例えば、Atlas of Protein Sequence and StructureのＮＣＢＩまたはＡＬＩＧＮで利用可能なＢｌａｓｔプログラム(Dayhoffed, 1981, Suppl., 3: 482-9)など、当技術分野で利用可能である。また、ヌクレオチド配列間の同一性を決定するためのプログラムは、専門データベースで利用可能である（例えば、Genbank、Wisconsin Sequence Analysis Package、プログラムＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰ）。
【００４７】
本発明の文脈において、ヘテロオリゴマーパートナーの一方または両方を修飾することに価値がある場合がある。好適な修飾の代表例としては、限定されるものではないが、（ａ）１または複数の内部高疎水性領域の欠失、ならびに／または（ｂ）Ｎ末端シグナルペプチドの欠失（必要に応じて異種のものとの置換）、ならびに／または（ｃ）溶解性、安定性、免疫原性および組換え発現に悪い方に干渉し得るアンフォールディング領域の欠失ならびに／または（ｄ）マイコバクテリア抗原および／もしくはヘテロオリゴマーの生物学的活性の少なくとも１つをなくすための触媒ドメインの欠失もしくは突然変異、ならびに／または（ｅ）標的細胞タンパク質（例えば、Ｍｔｂ感染症に関連しては、細菌に対し、上記標的細胞タンパク質の天然機能または活性を低下させ、弱めもしくは改変し、それによって、Ｍｔｂ感染症もしくはＭｔｂ感染症に関連する疾患の発症に寄与することを可能にする、Ｍｔｂ感染症に関連しては、マイコバクテリア抗原のヘテロオリゴマーと特異的に結合することが可能である哺乳類細胞タンパク質）との相互作用を減少させもしくはなくし、それによって、細胞活性もしくは細胞機能の障害を回避するための１個以上のアミノ酸残基の欠失もしくは突然変異が挙げられる。
【００４８】
好ましい面では、ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原は、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５）、ＣＦＰ１０（Ｒｖ３８７４）、ＰＰＥ６０（Ｒｖ３４７８）、ＰＥ３１（Ｒｖ３４７７）、ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）およびＴＢ９．８（Ｒｖ０２８７）からなる群から選択される。
【００４９】
別の好ましい面では、そのようなヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原は、融合ポリペプチドを形成するために融合される。本発明の免疫原性組み合わせに含まれまたはそれによってコードされる融合物の代表的であるが限定されない例としては、（ａ）ＥｓｘＡ（ＥＳＡＴ−６またはＲｖ３８７５とも呼ばれる）とＥｓｘＢ（ＣＦＰ１０またはＲｖ３８７４とも呼ばれる）との融合物；（ｂ）ＥｓｘＧ（ＴＢ１０．４またはＲｖ０２８８とも呼ばれる）とＥｓｘＨ（ＴＢ９．８またはＲｖ０２８７とも呼ばれる）との融合物および（ｃ）ＰＥマイコバクテリア抗原Ｒｖ３４７８とそのヘテロオリゴマーパートナーＰＰＥマイコバクテリア抗原Ｒｖ３４７７との融合物が挙げられる。本発明の文脈において、免疫原性組み合わせは、ヘテロオリゴマーパートナーの２種以上の融合物（例えば、ＣＦＰ１０とＥＳＡＴ−６との融合物およびＴＢ１０．４とＴＢ９．８との融合物）を含んでなり得る。
【００５０】
本発明は、融合物のＮ末端またはＣ末端でヘテロオリゴマーパートナーの一方と、両方向での融合を包含する。融合は直接であり得るしまたはヘテロオリゴマーパートナー間にリンカーを用い得る。好ましい融合物は、Ｎ末端にＣＦＰ１０およびＣ末端にＥＳＡＴ−６を含む。別の好ましい融合物は、Ｎ末端にＴＢ１０．４およびＣ末端にＴＢ９．８を含む。
【００５１】
望ましくは、本発明の免疫原性組成物に含まれまたはそれによってコードされる融合物は、マイコバクテリア抗原の任意の他の免疫原性断片を含まない（しかし、それは、例えば、本明細書に記載されるように、リンカーまたはターゲティングペプチドなどとしての使用のための、別のマイコバクテリア抗原の非免疫原性断片を含むことができる）。
【００５２】
本発明による特に好ましい免疫原性組み合わせは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列またはその任意の変異体もしくは断片を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなるかまたはコードする。より具体的には、配列番号１は、ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６からなる融合物を提供し、ここで、ヘテロオリゴマーパートナーは、リンカーとして使用されるＭｔｂタンパク質Ｒｖ１８２７の部分１４９〜１６２に対応する１４個のアミノ酸のペプチドによって分離されている。
【００５３】
本発明による別の特に好ましい免疫原性組み合わせは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列またはその任意の変異体もしくは断片を含んでなる融合ポリペプチドを含んでなるかまたはコードする。より具体的には、配列番号２は、ＴＢ１０．４およびＲｖ０２８７からなる融合物を提供し、ここで、ヘテロオリゴマーパートナーは、リンカーとして使用されるＭｔｂタンパク質Ｒｖ１８２７の部分１４９〜１６１に対応する１３個のアミノ酸のペプチドによって分離されている。
【００５４】
本発明によるさらに別の特に好ましい免疫原性組み合わせは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列またはその任意の変異体もしくは断片を含んでなる融合物および配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％同一性を有するアミノ酸配列またはその任意の変異体もしくは断片を含んでなる融合物を含んでなるかまたはコードする。
【００５５】
ヘテロオリゴマーマイコバクテリアパートナー（例えば、これらの融合物）に加えて、本発明の免疫原性組み合わせは、１種以上の追加のマイコバクテリア抗原をさらに含んでなり得るまたはコードし得る。上記追加のマイコバクテリア抗原は、好ましくは、活動期、再燃(resuscitation)期および潜伏期の抗原からなる群から選択される。上記追加のマイコバクテリア抗原は、別個の(separate)ポリペプチドの形態でまたは１種以上の融合ポリペプチド（例えば、１または複数の追加の融合ポリペプチド）の形態でまたは独立した１または複数の抗原および融合物の両方の形態で、免疫原性組み合わせ中に含まれ得またはそれによって発現され得る。
【００５６】
有利には、本発明の免疫原性組み合わせ中に含まれまたはそれによってコードされる、ヘテロオリゴマーパートナー、最終的には、１種以上の追加のマイコバクテリア抗原は、独立に、結核菌（Ｍｔｂ）、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧ、アフリカ型結核菌、Ｍ．カネチ、Ｍ．カプラエ、およびネズミ型結核菌からなる群から選択される結核菌群から得られ、Ｍｔｂが特に好ましい。
【００５７】
好適には、本発明の免疫原性組み合わせは、少なくとも２種の追加のマイコバクテリア抗原をさらに含んでなるかまたはコードする。本明細書で使用される場合、「少なくとも２つの」は、２〜３０の範囲内に含まれる数（すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）である。好ましくは、本発明の免疫原性組み合わせは、２〜１０種の追加のマイコバクテリア抗原または対応する核酸分子を含んでなり、２〜６種が特に好ましい。
【００５８】
望ましくは、「１種以上の追加のマイコバクテリア抗原」は、相互に異なり、（融合された）ヘテロオリゴマーパートナーとは異なる。本発明の文脈において、追加のマイコバクテリア抗原のそれぞれは、免疫原性（例えば、細胞媒介性免疫応答ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋ならびに／または抗体応答を誘導する能力）を保持するという条件で、独立に、天然マイコバクテリア抗原（例えば、全長抗原）またはその改変型（断片または変異体）であり得る。
【００５９】
好ましい実施態様では、１種以上の追加のマイコバクテリア抗原は、独立に、活動期、再燃期および潜伏期の抗原からなる群から選択される。
【００６０】
「活動期の抗原」は、典型的には、マイコバクテリウムが活発に増殖し、ｉｎ  ｖｉｖｏで複製しているときに主に発現されるタンパク質のセットである。本発明において使用するための膨大な数の活動性マイコバクテリア抗原は、文献に記載されている（例えば、Bertholet et al., 2008, J. Immunol. 181: 7948-57; Bertholet and al., 2010, Sci Transl Med 2: 53ra74）。活動期のマイコバクテリア抗原の代表例としては、限定されるものではないが、Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０およびＰＰＥタンパク質Ｒｖ２６０８が挙げられる。
【００６１】
「再燃期の抗原」とは、休止状態および／もしくは持続感染状態と活発な増殖および複製（マイコバクテリウム感染症の活動状態）との間の遷移に主に発現されるまたは関与する任意の抗原を意味する。本発明において使用するための再燃抗原は、文献に記載されている（例えば、Yeremeev et al., 2003, Infection and Immunity 71: 4789-94; Kana et al., 2008, Mol Microbiol 67: 672-84;およびCommandeur et al., 2011, Clin Vaccine Immunol. 18: 676-83）。再燃期のマイコバクテリア抗原の代表例としては、限定されるものではないが、ＲｐｆＡ、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＣ、ＲｐｆＤおよびＲｐｆＥが挙げられる。
【００６２】
「潜伏期の抗原」は、マイコバクテリウム感染症の休止(dormant)（または持続感染性(persistent)）期、すなわち、マイコバクテリウムが長期間持続することができる低代謝活性の可逆的状態の間に主に発現される。本発明において使用するための膨大な数の潜伏マイコバクテリア抗原が、文献に記載されている。典型的なＭｔｂ潜伏抗原は、低酸素に対する細菌応答を媒介するＤｏｓＲ  ｒｅｇｕｌｏｎによりコードされるものおよび栄養素の枯渇時にアップレギュレートされる飢餓抗原である（Singh et al., 2013, Vaccine, 2013.11.065；ＷＯ０３／０００７２１；ＷＯ０３／００４５２０；ＷＯ０３／０３５６８１；ＷＯ２００４／００６９５２およびＷＯ２００６／１０４３８９）。潜伏期のマイコバクテリア抗原の代表例としては、限定されるものではないが、Ｒｖ００８１、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０１９８、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１７３５、Ｒｖ１７３７、Ｒｖ１８０６、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２００５ｃ、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ２６２７、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ２６６０ｃ、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３８１２が挙げられる。
【００６３】
好適には、本発明の免疫原性組み合わせは「多相性」であり、少なくとも２つの感染期（例えば、活動期および再燃期、活動期および潜在期または再燃期および潜伏期）のマイコバクテリア抗原、特に、Ｍｔｂ抗原を含んでなるかまたはコードする。特に適当な組み合わせは、活動感染期の少なくとも１つの抗原、潜在感染期の少なくとも１つの抗原および再燃感染期の少なくとも１つの抗原を含む３つの感染期のＭｔｂ抗原を含んでなるかまたはコードする。
【００６４】
有利には、本発明の免疫原性組み合わせに含まれまたはそれによってコードされる１種以上の追加のマイコバクテリア抗原は、Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、Ｒｖ３６１９、Ｒｖ３６２０、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｖ００８１、Ｒｖ０１１１、Ｒｖ０１９８、Ｒｖ０５６９、Ｒｖ１７３３ｃ、Ｒｖ１７３５、Ｒｖ１７３７、Ｒｖ１８０６、Ｒｖ１８０７、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２００５ｃ、Ｒｖ２０２９ｃ、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ２６２６、Ｒｖ２６２７、Ｒｖ２６２８、Ｒｖ２６６０ｃ、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３８１２からなる群から選択される。好ましくは、上記追加のマイコバクテリア抗原は、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６）、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｖ１８１３、Ｒｖ２６２６およびＲｖ３４０７からなる群から選択される。ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原の場合のように、本発明の免疫原性組み合わせでの使用における追加のマイコバクテリア抗原の１以上は、対応する天然マイコバクテリア抗原に対して修飾することができる。本明細書における使用のために好適なマイコバクテリア抗原の代表例としては、限定されるものではないが、Ｎ末端シグナルペプチドの欠失（最初の残基から約３１位まで）によりその天然対応物に対して修飾されている、配列番号３に示されるＲｖ１８１３抗原（Ｒｖ１８１３＊）；Ｎ末端シグナルペプチドの欠失（最初の残基から約３２位まで）によりその天然対応物に対して修飾されている、配列番号４に示されるＡｇ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ＊＊）が挙げられる。
【００６５】
より好ましい実施態様では、免疫原性組み合わせは、ヘテロオリゴマーマイコバクテリアパートナーＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６の融合物を含んでなりまたはコードし、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ２６２６およびＡｇ８５Ｂをさらに含んでなるまたはコードする。別の好ましい免疫原性組み合わせは、ヘテロオリゴマーパートナーＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６の融合物とヘテロオリゴマーパートナーＴＢ１０．４およびＴＢ９．８の融合物とを含んでなりまたはコードし、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ２６２６、Ａｇ８５Ｂ、ＲｐｆＢ、ＲｐｆＤ、Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３をさらに含んでなるまたはコードする。別の好ましい免疫原性組み合わせは、ヘテロオリゴマーパートナーＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ−６を含んでなりまたはコードし、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ２６２６、Ａｇ８５Ｂ、ＲｐｆＢ，およびＲｐｆＤをさらに含んでなるまたはコードする。さらに別の好ましい免疫原性組み合わせは、ヘテロオリゴマーパートナーＲｖ０２８７およびＴＢ１０．４ならびにＲｖ３４７８およびＲｖ３４７７とを含んでなりまたはコードし、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ３４０７をさらに含んでなるまたはコードする。
【００６６】
別の実施態様では、本発明は、免疫原性組み合わせに含まれまたはそれによってコードされるマイコバクテリア抗原の任意の取合せを包含する。この点において、追加のマイコバクテリア抗原は、別個のポリペプチド（例えば、組換え生産されたＭｔｂ抗原の混合物）の形態でまたは１種以上の融合ポリペプチド（追加のマイコバクテリア抗原の少なくとも２つの共有結合）の形態でまたは別個の抗原と融合物の両方で存在し得または発現され得る。言い換えると、このような追加のマイコバクテリア抗原は、独立に（独立した調節エレメント下で）または少なくとも２つの抗原の（例えば、コード核酸分子の共有結合による）融合物として発現され得る。さらに、コード核酸分子は、１以上のベクターによって保持し得る。これに関して、本明細書に記載される様々なマイコバクテリア抗原または融合物を発現するために、同じ種類のベクター（例えば、２つのＭＶＡ）または異なる種類のベクター（例えば、プラスミドＤＮＡとＭＶＡ）を使用し得る。
【００６７】
融合ポリペプチド
好ましい実施態様では、追加のマイコバクテリア抗原は、２つの融合物の形態で本発明の免疫原性組み合わせに含まれまたはそれによってコードされる。
【００６８】
追加のマイコバクテリア抗原の典型的な融合ポリペプチドは、Ｒｖ２６２６およびＡｇ８５Ｂ；ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤ；ならびにＲｖ３４０７およびＲｖ１８１３（またはその任意の変異体もしくは断片）を含んでなる。ヘテロオリゴマーパートナーの融合物の場合のように、本発明の文脈において、任意の取合せが考えられる。例示の目的のために、Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３を含んでなる融合物は、Ｒｖ３４０７をＮ末端に（Ｒｖ３４０７／１８１３）、内部にまたはＣ末端に（Ｒｖ１８１３／Ｒｖ３４０７）有し得る。
【００６９】
ヘテロオリゴマーマイコバクテリアパートナーの融合ポリペプチド、および／または追加のマイコバクテリア抗原の融合ポリペプチドはまた、１種以上の他の成分を含んでなり得、これらの成分は、マイコバクテリウム属種由来であり得（例えば、追加のマイコバクテリア抗原）または異種（すなわち、マイコバクテリウム属の異なる源由来のもの）であり得る。このような成分は免疫原性であり得るが、そうでないことが好ましい。このような追加成分の例としては、限定されるものではないが、リンカー、切断部位、タグペプチド、ターゲティングペプチド、膜貫通ドメイン、オリゴマー化ドメインが挙げられる。マイコバクテリア抗原に応じて、そのようなペプチドの存在は、そのようなペプチドなしで発現された抗原または融合物と比べて、得られた抗原または融合物の発現、フォールディングおよび／または免疫原性を増強するために有益であり得る。発現の増強は、ウェスタンブロッティングなどの従来の技術によって決定し得る。フォールディングの増強は、ー（可溶性タンパク質と凝集タンパク質とを識別するための）サイズ排除クロマトグラフィーなどの従来の技術によって決定し得る。免疫原性の増強は、エリスポットアッセイ(ELISpot assay)などの従来のアッセイを用いて決定し得る。
【００７０】
例えば、本明細書に記載される融合ポリペプチド（ヘテロオリゴマーパートナーの融合物および／または追加のマイコバクテリア抗原の融合物）中に含まれる上流ポリペプチドおよび下流ポリペプチドの間に切断部位を挿入することは有利であり得る。本発明における使用のために好適な切断部位としては、限定されるものではないが、自己切断活性を有する、口蹄疫ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ；配列番号５）、トセア・アシグナウイルス(Thosea asigna virus)２Ａペプチド（Ｔ２Ａ；配列番号６）およびウマ鼻炎(Equine rhinitis)Ａウイルスペプチド（Ｅ２Ａ；配列番号７）が挙げられる。これらのようなペプチド２Ａはそれら自身のＣ末端での同時翻訳切断を媒介し、リボソームを操作して特異的ペプチド結合の合成をスキップする−ペプチド主鎖での不連続をもたらす−ことが提案されている（Luke, 2012. Innovations in Biotechnology、Eddy C. Agbo博士(編)、 ISBN: 978-953-51-0096-6, In Tech、http://www.intechopen.com/books/innovation-in-biotechnology/translating-2a-research-into-practiceから入手可能）。従って、得られた融合タンパク質は、切断部位を含有するリンカーと融合された上流マイコバクテリア抗原と、下流マイコバクテリア抗原とを産生することが予想される。
【００７１】
あるいはまたは加えて、本明細書で用いられるマイコバクテリア抗原のいずれかまたはこれらの融合物は、シグナルなどのターゲティングペプチドおよび／または膜透過ペプチドを含んでなり得る。これらのようなターゲティングペプチドは、当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ９９／０３８８５参照）。簡潔には、シグナルペプチド（ＳＳ）は、一般的に、膜提示ポリペプチドまたは分泌ポリペプチドのＮ末端に存在し、小胞体（ＥＲ）へのそれらの移動を開始させる。それらは、１５個以上の本質的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、その後、それらはＥＲに存在する特異的なエンドペプチダーゼにより取り除かれて、成熟ポリペプチドがもたらされる。膜透過ペプチド（ＴＭ）は、通常、高疎水性な性質であり、ポリペプチドを細胞膜につなぎとめる役目を果たす。本発明の文脈において使用することができる膜透過ペプチドおよび／またはシグナルペプチドの選択肢は莫大である。それらは、任意の膜固定ポリペプチドおよび／または分泌ポリペプチド（例えば、細胞性またはウイルス性ポリペプチド）、例えば、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、インスリン、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質または麻疹ウイルスＦタンパク質のものなどから得られ得または合成であり得る。シグナルペプチドの好ましい挿入部位は翻訳開始コドンの下流のＮ末端であり、膜透過ペプチドのものは、例えば、停止コドンのすぐ上流の、Ｃ末端である。
【００７２】
あるいはまたは加えて、本明細書で用いられるマイコバクテリア抗原のいずれかまたはこれらの融合物は、その単離および検出を容易にするためまたはそのような抗原もしくは融合物を発現する宿主細胞の特定を容易にするために、タグペプチドを含んでなり得る。本発明の文脈において、多種多様なタグペプチドを使用することができ、限定されるものではないが、ＰＫタグ、ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ポリヒスチジンタグ（通常、５〜１０個のヒスチジン残基の範囲）が挙げられる。タグペプチドは、書き添えた実施例に記載のとおり、抗タグ抗体を用いた免疫検出アッセイにより検出することができる。タグペプチドは、独立に、マイコバクテリア抗原または融合物のＮ末端に（タグ−ポリペプチド）あるいはそのＣ末端に（ポリペプチド−タグ）あるいは内部にまたはいくつかのタグを採用する場合には、これらの位置のいずれかに位置し得る。
【００７３】
本発明において使用するための追加のマイコバクテリア抗原の典型的な融合物としては、限定されるものではないが、配列番号８〜１２に示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも７０％同一性、有利には、少なくとも８０％同一性、望ましくは、少なくとも９０％同一性、好ましくは、少なくとも９５％同一性、より好ましくは、９８％同一性、さらに好ましくは、１００％同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそれから本質的になる、あるいはそれからなるポリペプチドが挙げられる。より具体的には、配列番号８は、関連する酵素活性をなくすことに向けられた３つの突然変異（例えば、Ｅ２９２Ｋ、Ｔ３１５ＡおよびＱ３４７Ａ）を有するＲｐｆＤ抗原のいわゆるＬＤ（リゾチームドメインに関する）と融合された、シグナルペプチドの欠失によりその天然対応物に対して修飾されているＲｐｆＢ（最初の残基からおよそ２９位の残基まで、触媒ドメインの欠失により、その結果として、およそ３０位から２８３位までのＲｆｐＢを保持する）を含んでなる再燃抗原ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤの融合物を表す。配列番号９および配列番号１０は、Ｔ２Ａ切断部位を有する（配列番号９：Ｒｖ２６２６／２Ａ／Ａｇ８５Ｂ＊＊）またはＴ２Ａ切断部位を有さない（配列番号１０：Ｒｖ２６２６／Ａｇ８５Ｂ＊＊）、Ｒｖ２６２６とＡｇ８５Ｂ＊＊との融合物を表す。配列番号１１は、融合物Ｒｖ３４０７／Ｅ２Ａ／Ｒｖ１８１３＊を表し、配列番号１２は、Ｅ２Ａ切断部位を有さない融合ポリペプチドＲｖ３４０７／Ｒｖ１８１３＊を表す。
【００７４】
典型的には、本発明の免疫原性組み合わせは、標準的な技術を用いて調製することができる。例えば、マイコバクテリア抗原は、例えば、細菌培養物から、精製し得または当技術分野で利用可能な発現系のいずれかを用いて宿主細胞で組換え生産し得または本明細書に記載される方法でコード核酸分子を好適な発現ベクターにクローニングすることにより対象に提供することができる。
【００７５】
加えて、本発明の免疫原性組み合わせは、免疫原性を増強することが可能な１種以上の免疫賦活ペプチド／ポリペプチドをさらに含んでなり得る。例えば、カルレティキュリン(Cheng et al., 2001, J. Clin. Invest. 108: 669)、Ｍｔｂ熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）(Chen et al., 2000, Cancer Res. 60: 1035)、ユビキチン(Rodriguez et al., 1997, J. Virol. 71: 8497)、およびＴヘルパーエピトープ、例えば、Ｐａｎ−Ｄｒペプチドなど(Sidney et al., 1994, Immunity 1: 751)、ｐｓｔＳ１  ＧＣＧエピトープ(Vordermeier et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 2631)、破傷風トキソイドペプチドＰ２ＴＴ(Panina-Bordignon et al., 1989, Eur. J. Immunol. 19: 2237)、Ｐ３０ＴＴ(Demotz et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 425)、ヘマグルチニン(hemaglutinin)エピトープ(Rothbard et al., 1989, Int. Immunol. 1: 479)およびＣ４ｂｐオリゴマー化ドメイン(Spencer et al., 2012, PLos One 7:e33555)を挙げ得る。これらのような免疫賦活ペプチド／ポリペプチドは、独立に、存在し得もしくは発現され得またはヘテロオリゴマーパートナーの融合物および／もしくは追加のマイコバクテリア抗原の融合物中に含まれ得る
【００７６】
核酸分子および核酸組み合わせ
本発明はまた、本発明の免疫原性組み合わせ中に含まれる核酸分子組み合わせ、ならびにマイコバクテリアヘテロオリゴマーパートナーの上記融合物および／または追加のマイコバクテリア抗原の上記融合物をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００７７】
本発明の文脈内において、用語、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、ポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、ベクター、ウイルスゲノム、単離ＤＮＡ、プローブ、プライマーおよびこれらの任意の混合物）またはポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）（例えば、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）またはポリリボヌクレオチド−ポリデオキシリボヌクレオチド混合物のいずれかの任意の長さのポリマーを定義する。それらは、一本または二本鎖、線状または環状、天然または合成の核酸を包含する。
【００７８】
前に記載したように、本発明の核酸分子(the nucleic molecules)は、天然核酸（例えば、マイコバクテリウムのゲノムまたはゲノム断片から単離される）であり得または１個以上のヌクレオチドの置換、欠失、付加および／もしくは挿入を含むように人によって改変し得る。本発明は、コードされるポリペプチドおよび融合物のクローニングおよび／または発現、ならびにそのフォールディング、安定性および／または免疫原性を向上させることを目指した任意の修飾を包含する。いくつかの修飾が意図される場合、それらは、連続および／または非連続ヌクレオチド残基に関係し得る。本発明によって意図される修飾は、コードされるマイコバクテリア抗原および融合ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しないサイレント修飾だけでなく、コードされるポリペプチドへ翻訳される修飾も包含する。好ましくは、それらの修飾は、非改変のものに対して得られたポリペプチドの免疫原性を低下させない。修飾の代表例としては、限定されるものではないが、適当な制限部位の導入、配列変性（例えば、遺伝的不安定性を促進し得る、本発明の文脈においてまたは宿主細胞において使用される核酸分子の間の配列相同性を減少させるため）および／またはヌクレオチド配列の最適化（例えば、所与の宿主細胞での翻訳を最適化する）および／または潜在的に不利なエレメントの抑制（これらは発現レベルに悪い影響を及ぼすことが予想される）が挙げられる。
【００７９】
例えば、特定の宿主細胞または対象においてコードされる遺伝子産物の高レベルの発現を確保するためにコドン使用頻度を最適化する価値がある場合がある。実際に、所与のアミノ酸をコードするために２つ以上のコドンが利用可能である場合に、生物のコドン使用頻度パターンは高度に非ランダムであり、コドンの利用は異なる宿主間で著しく異なり得ることが観察されている。本発明において使用されるヌクレオチド配列は主として細菌起源のものであるため、それらは、高等真核生物細胞などの宿主細胞での効率的な発現には不適切なコドン使用頻度パターンを有し得る。典型的には、コドン最適化は、対象となる宿主細胞であまり使用されないコドンに対応する１以上の「天然」（マイコバクテリア）コドンを、より頻繁に使用される同じアミノ酸をコードする１以上のコドンに置き換えることによって行われる。発現の増加は部分的置換を用いても達成することができるため、あまり使用されないコドンに対応する総ての天然コドンを置き換える必要はない。さらに、得られた核酸分子への制限部位の導入に適応させるために、最適化されたコドン使用頻度の厳守から逸脱することもある。
【００８０】
本発明の特に好ましい実施態様は、配列番号１、２および８〜１２に記載されている融合ポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子に対して向けられ、配列番号１３〜１９に示されるヌクレオチド配列のいずれかまたはその任意の変異体および断片と少なくとも８０％同一性、有利には、少なくとも８５％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、さらに好ましくは、１００％同一性を示すヌクレオチド配列を含んでなる（あるいはそれから本質的になるあるいはそれからなる）核酸分子が特に好ましい。
【００８１】
本発明の核酸分子は、当技術分野で入手可能な配列データおよび本明細書に提供される配列情報を用いて生成することができる。例えば、それらは、当技術分野で周知の日常的な技術を用いて、例えば、特定の種のマイコバクテリウム属ゲノムもしくはそのゲノム断片、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーまたはそれを含むことが知られている任意の先行技術ベクターから従来の分子生物学によるＰＣＲ単離および／またはクローニングにより単離し得る。あるいは、本発明の核酸分子はまた、化学合成によって自動化されたプロセスで生成することができる（例えば、オーバーラッピング合成オリゴヌクレオチドから組み立てられる）。
【００８２】
本発明の別の実施態様は、本発明の核酸分子の断片、例えば、制限エンドヌクレアーゼおよびＰＣＲにより生成される断片に関する。それらのような断片は、関連する免疫原性部分をコードするプローブ、プライマーまたは断片として使用することができる。
【００８３】
ベクター
本発明はまた、（ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原の上記融合物および／または追加のマイコバクテリア抗原の上記融合ポリペプチドをコードする）本発明の１以上の核酸分子を含んでなるベクターならびにこれらのベクターを含んでなる組成物に関する。
【００８４】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、宿主細胞または対象内での、本明細書に記載される核酸分子のいずれかの送達、増殖および／または発現を可能にするのに必要なエレメントを含有するビヒクル、好ましくは、核酸分子またはウイルス粒子を意味する。この用語は、維持のためのベクター（クローニングベクター）または様々な宿主細胞もしくは対象での発現のためのベクター（発現ベクター）、染色体外ベクター（例えば、マルチコピープラスミド）または組込みベクター（例えば、宿主細胞ゲノムに組み込み、宿主細胞が複製する際に核酸分子の追加のコピーを生成するように設計されている）ならびにシャトルベクター（例えば、原核生物宿主および／または真核生物宿主の両方で機能する）およびトランスファーベクター（例えば、核酸分子をウイルスゲノムに移入するためのもの）を包含する。本発明の目的のために、ベクターは、天然に存在する遺伝源のもの、合成もしくは人工、または天然および人工の遺伝子エレメントのいくつかの組み合わせであり得る。
【００８５】
本発明の文脈において、用語「ベクター」は、プラスミドおよびウイルスベクターを含むものと広く理解されるべきである。本発明の文脈において適当なベクターとしては、限定されるものではないが、細菌（例えば、大腸菌、ＢＣＧまたはリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ））などの原核生物宿主細胞での発現のためのバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドベクター；酵母（例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)）での発現のためのベクター；昆虫細胞系（例えば、Ｓｆ９細胞）での発現のためのバキュロウイルスベクター；ならびに高等真核生物細胞または対象での発現のためのプラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。典型的には、それらのようなベクターは、（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｒｏｍｅｇａなどで）市販されておりまたはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ、ロックビル、Ｍｄ．）などの寄託機関から入手可能でありまたは当業者がそれらを適用することを可能にする、それらの配列、構成および生産方法を記載している数多くの刊行物の主題であった。本発明はまた、リポソーム、リポプレックスまたはナノ粒子などの粒子構造を形成するための脂質またはポリマーとのベクター複合体（例えば、プラスミドＤＮＡ）を包含する。
【００８６】
本明細書で使用される「プラスミドベクター」とは、複製可能なＤＮＡ構築物を意味する。通常、プラスミドベクターは、対応する選択薬の存在下でそれについてまたはそれに抵抗して、プラスミドベクターを有する宿主細胞を選択可能にする選択マーカー遺伝子を含有する。種々の正および負の選択マーカー遺伝子は当技術分野で公知である。例として、抗生物質耐性遺伝子は、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞が選択されることを可能にする正の選択マーカー遺伝子として使用され得る。好適なプラスミドベクターの代表例としては、限定されるものではないが、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＶＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＧＷｉｚ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ）が挙げられる。
【００８７】
本明細書で使用される用語「ウイルスベクター」とは、ウイルスゲノムの少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルス粒子中にまたはウイルス粒子にパッケージングされ得る核酸ベクターを意味する。用語「ウイルス」、「ビリオン」、「ウイルス粒子」および「ウイルスベクター粒子」は、ウイルス粒子の生成を可能にする好適な条件に従って核酸ベクターが適当な細胞または細胞系統に形質導入される際に形成されるウイルス粒子を意味するために、互換的に使用される。本発明の文脈において、用語「ウイルスベクター」は、核酸ベクター（例えば、ＤＮＡウイルスベクター）、ならびにその生成されたウイルス粒子を含むものと広く理解されるべきである。用語「感染性」とは、宿主細胞または対象を感染させ、それに侵入するウイルスベクターの能力を意味する。ウイルスベクターは、複製能力を有し得もしくは複製選択性であり得（例えば、特定の宿主細胞でより良好にもしくは選択的に複製するように操作されている）、または、複製欠損もしくは複製障害があるように遺伝的に無能化することができる。
【００８８】
好適なウイルスベクターの代表例は、種々の異なるウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、フォーミーウイルス、アルファウイルス、水疱性口内炎ウイルス (vesicular stomatis virus)など）から生成される。上記のとおり、用語「ウイルスベクター」は、ベクターＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびにそれらの生成されたウイルス粒子、特に、感染性ウイルス粒子を包含する。
【００８９】
一実施態様では、本発明において採用されるウイルスベクターは、複製欠損もしくは複製障害があり、これは、それが投与される正常細胞（例えば、正常ヒト細胞）または対象においてそれが任意の有意な程度まで複製することができない（複製機能の障害または欠損は、従来の手段により−例えば、非許容細胞でのＤＮＡ合成および／またはウイルス力価の測定により評価することができる）ということを意味する。そのような複製欠損または障害があるベクターは、典型的には、増殖のために、不足している／障害がある機能を引き上げるまたは補う許容細胞系統を必要とする。
【００９０】
本発明の文脈において有用であるウイルスベクターの例としては、ワクチン接種、免疫療法、遺伝子移入または組換え生産についての十分に裏付けされた複数の利点を有するアデノウイルスベクターが挙げられる（総説については、「Adenoviral vectors for gene therapy」、2002年、D. Curiel and J. Douglas編、Academic Press参照）。本発明のアデノウイルスベクターは、種々のヒトまたは動物源（例えば、イヌ、ヒツジ、サルのアデノウイルスなど）に由来し得る。任意の血清型を採用することができ、ヒトアデノウイルスが特に好ましく、亜属Ｃ、例えば、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６など、および亜属Ｂ、例えば、Ａｄ１１、Ａｄ３４およびＡｄ３５などが特に好ましい。また、動物Ａｄを使用することも有利であり得、チンパンジーＡｄ、例えば、チンパンジーＡｄ３およびＡｄ６３などが特に好ましい。列挙したアデノウイルスは、ＡＴＣＣから入手可能でありまたは当業者がそれらを適用することを可能にする、それらの配列、構成および生産方法を記載している数多くの刊行物の主題であった（例えば、ＵＳ６，１３６，５９４；ＵＳ６，１３３，０２８；ＷＯ００／５０５７３；ＷＯ００／７００７１；ＷＯ２００４／０８３４１８；ＷＯ２００４／０９７０１６およびＷＯ２００５／０７１０９３参照）。
【００９１】
好ましい複製欠損アデノウイルスベクターは、およそ４５９位から３３２８位までまたはおよそ４５９位から３５１０位まで延びるＥ１欠失を有するＥ１欠損型である（受託番号Ｍ  ７３２６０でＧｅｎｅＢａｎｋに開示されているＡｄ５の配列を参照することによる）。さらに、クローニング能力は、アデノウイルスゲノムの追加部分（ＷＯ９４／２８１５２およびLusky et al., 1998, J. Virol 72: 2022に記載されているように、非必須領域Ｅ３（例えば、およそ２７８６７位から３０７４３位までの欠失）または他の必須領域Ｅ２および／もしくはＥ４の総てまたは一部）を欠失させることにより向上させることができる。
【００９２】
本発明の核酸分子は、独立に、アデノウイルスゲノムの任意の位置に挿入することができ、領域Ｅ１および／またはＥ３の代わりに挿入することが特に好ましい。それらは、問題の領域の自然転写方向に対してセンスまたはアンチセンス配向に配置し得る。
【００９３】
本発明の文脈において特に適当なウイルスベクターの他の例としては、ポックスウイルスベクター、例えば、鶏痘ベクター（例えばＦＰ９）、カナリア痘ベクター（例えば、ＡＬＶＡＣ）などおよびワクシニアウイルスベクターが挙げられ、後者が好ましい。好適なワクシニアウイルスとしては、限定されるものではないが、コペンハーゲン株、ワイエス株、ＮＹＶＡＣ（ＵＳ５，４９４，８０７）および改変アンカラ（ＭＶＡ）株（Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365；ＷＯ０２／４２４８０）が挙げられる。組換えポックスウイルスを構築し生産するための一般的な条件は、当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ２０１０／１３０７５３；ＷＯ０３／００８５３３；ＵＳ６，９９８，２５２；ＵＳ５，９７２，５９７およびＵＳ６，４４０，４２２参照）。本発明の核酸分子は、好ましくは、ポックスウイルスゲノム内に非必須遺伝子座に挿入される。コペンハーゲンワクシニアベクターへの挿入にはチミジンキナーゼ遺伝子、ＭＶＡベクターへの挿入には欠失ＩＩまたはＩＩＩが特に適当である（ＷＯ９７／０２３５５）。
【００９４】
本発明の文脈において好適な他のウイルスベクターは、パラミクソウイルス科  (paramyxoviridae)から得ることができるモルビリウイルス属(morbillivirus)であり、麻疹ウイルスが特に好ましい。様々な弱毒株が当技術分野で入手可能であり(Brandler et al, 2008, CIMID, 31: 271; Singh et al., 1999, J. virol. 73(6): 4823)、例えば、限定されるものではないが、エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ）株ＡおよびＢ(Griffin et al., 2001, Field’s in Virology, 1401-1441)、シュワルツ(Schwarz)株(Schwarz A, 1962, Am J Dis Child, 103: 216)、Ｓ−１９１株またはＣ−４７株(Zhang et al., 2009, J Med Virol. 81 (8): 1477)がある。遺伝子ＰとＭの間または遺伝子ＨとＬの間の挿入が特に適当である。
【００９５】
また、本発明における使用に好適なベクターとしては、野生型または変異型（例えば、弱毒性）であり得る細菌細胞が挙げられる。このような細菌細胞の周知の例としては、限定されるものではないが、弱毒性マイコバクテリウム（例えば、ウシ型結核菌ＢＣＧ）、乳酸桿菌(Lactobacillus)（例えば、ラクトコッカス・ラクティス(LactococcＵＳlactis)）、リステリア属（例えば、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)）および他の微生物、例えば、サルモネラ属(Salmonella)およびシュードモナス(Pseudomona）などが挙げられる。好ましい実施態様は、そのゲノムに、上記で定義される１種以上のマイコバクテリア抗原または融合ポリペプチドをコードする核酸分子を、これらのようなエレメントをＢＣＧベクターが発現可能な方法で組み込まれているＢＣＧベクターに対して向けられる。
【００９６】
一実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ中に含まれる核酸分子は、単一のベクターにより行われる。あるいは、それらは、対象に同時にまたは逐次に投与することができる２つ以上のベクターによって保持され得る。
【００９７】
本発明に従って、本発明のベクター中に含まれる核酸分子は、宿主細胞または対象での発現に好適な形態で存在し、これは、本明細書に記載される核酸分子が適当な調節配列に機能し得る形で連結されているということを意味する。本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」または「調節配列」とは、核酸またはその誘導体（すなわち、ｍＲＮＡ）の複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送を含む、所与の宿主細胞または対象での核酸分子の発現を可能にする、与えるまたは調節する任意のエレメントを意味する。調節配列の選択が、ベクター自体、宿主細胞または対象、望ましい発現のレベルなどのような要因に依存し得ることは当業者に理解されるであろう。「機能し得る形で連結されている」とは、連結されているエレメントがそれらの意図された目的のために協力して機能するようにそれらが配置されていることを意味する。例えば、プロモーターが転写開始からターミネーターまで転写を果たし、許容宿主細胞内で核酸分子中に存在するコード配列の発現をもたらすならば、プロモーターは核酸分子に機能し得る形で連結されている。
【００９８】
具体的には、本発明の免疫原性組み合わせ中に含まれるヌクレオチド酸分子は、哺乳類細胞内でのコードされたポリペプチドおよび／または融合物の、最終的には、追加のマイコバクテリア抗原の発現を確保するために好適なプロモーターの転写制御下に置かれる。本発明の文脈において、プロモーターは、多くの種類の宿主細胞内での機能し得る形で連結されている核酸分子の発現を命令する構成的なものであり得、またはある特定の宿主細胞に特異的であり得（例えば、肺特異的な調節配列）、または特定のイベントもしくは外的要因に応答して（例えば、温度、栄養素添加物、ホルモンなどにより）もしくはウイルス周期（例えば、後期または初期）に応じて調節され得る。また、ベクター生産を最適化し、かつ、発現されるポリペプチドの潜在毒性を回避するために、特定のイベントまたは外的要因に応答して生産工程中に抑制されるプロモーターを使用し得る。
【００９９】
哺乳類細胞内での構成的発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（ＵＳ５，１６８，０６２）、ＲＳＶプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１のチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターおよびＴ７ポリメラーゼプロモーターが挙げられる。ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび糖分解酵素プロモーターなどのプロモーターは、原核生物宿主で使用され得る。有用な酵母プロモーターとしては、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼなど、マルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域が挙げられる。ワクシニアウイルスプロモーターはポックスウイルスベクターでの発現に特に適合している。代表例としては、限定されるものではないが、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、Ｂ２Ｒ、Ａ３５Ｒ、１１Ｋ７．５(Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15: 18)、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１およびＫ１Ｌプロモーター、ならびに合成プロモーター、例えば、Chakrabarti et al. (1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al., 1997, J. Virol Methods 66: 135-8;およびKumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8)に記載されているものなど、ならびに初期／後期キメラプロモーター（例えば、ｐＳＥ／Ｌ）が挙げられる。麻疹媒介発現に好適なプロモーターとしては、限定されるものではないが、麻疹転写ユニットの発現を命令する任意のプロモーターが挙げられる(Brandler and Tangy, 2008, CIMID 31: 271)。
【０１００】
当業者は、本発明の核酸分子の発現を制御する調節エレメントが、転写の適切な開始、調節および／または終結（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡ輸送（例えば、核局在化シグナル配列）、プロセッシング（例えば、スプライシングシグナル）、および安定性（例えば、イントロンおよび非コード５’配列および３’配列）、宿主細胞または対象への翻訳（例えば、イニシエーターＭｅｔ、トリパタイト（tripartite）リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列など）、および精製工程（例えば、本明細書に記載されるタグ）のための追加のエレメントをさらに含んでなり得ることを理解するであろう。
【０１０１】
本発明の特に好ましい実施態様は、以下：
（ｉ）ヘテロオリゴマーパートナーＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０を含んでなる融合物をコードする核酸分子、Ａｇ８５Ｂをコードする核酸分子、およびＲｖ２６２６をコードする核酸分子
を含んでなるベクター；
（ｉｉ）ヘテロオリゴマーパートナーＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０を含んでなる融合物をコードする核酸分子；ヘテロオリゴマーパートナーＴＢ１０．４およびＴＢ９．８を含んでなる融合物をコードする核酸分子、追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ２６２６およびＡｇ８５Ｂを含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸分子；追加のマイコバクテリア抗原ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤを含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸分子；および追加のマイコバクテリア抗原Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３を含んでなる融合ポリペプチドをコードする核酸分子
を含んでなるベクター（書き添えた実施例にＭＶＡＴＧ１８５９８で示されるとおりである）；ならびに
（ｉｉｉ）ヘテロオリゴマーパートナーＥＳＡＴ−６およびＣＦＰ１０をコードする核酸分子、ならびに追加のマイコバクテリア抗原Ａｇ８５Ｂ、Ｒｖ２６２６、ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤとの組み合わせを含んでなるベクター（書き添えた実施例にＭＶＡＴＧ１８５９７で示されるとおりである）
からなる群から選択されるベクター（またはそのウイルス粒子）に対して向けられる。
【０１０２】
より好ましくは、上述のベクターはＭＶＡベクターである。
【０１０３】
好ましい実施態様によれば、本発明のベクターは、感染性ウイルス粒子の形態で存在する。典型的には、これらのようなウイルス粒子は、（ｉ）本発明のウイルスベクターを産生細胞へ導入する工程、（ｉｉ）上記産生細胞を上記感染性ウイルス粒子の生産を可能にする好適な条件下で培養する工程、（ｉｉｉ）上記産生細胞の培養物から生産されたウイルス粒子を回収する工程、および（ｉｖ）所望により、上記回収されたウイルス粒子を精製する工程を含んでなる方法によって生産される。
【０１０４】
ウイルスベクターが複製欠損もしくは複製障害を有する場合、それらのウイルス粒子は、通常、許容産生細胞内でまたは不足している／障害がある機能をトランスに(in trans)途中で代行するヘルパーウイルスの使用を介して生産される。例えば、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターの補完に好適な産生細胞としては、２９３細胞(Graham et al., 1997, J. Gen. Virol. 36: 59-72)ならびにＨＥＲ−９６細胞およびＰＥＲ−Ｃ６細胞（例えば、Fallaux et al., 1998, Human Gene Ther. 9: 1909-17; ＷＯ９７／００３２６）またはこれらの細胞系統の任意の誘導体が挙げられる。鳥類細胞は、ポックスウイルスベクターの増殖に特に好適であり、限定されるものではないが、受精卵から得られるニワトリ胚から調製される初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、およびカモ細胞系統（例えば、ＷＯ０３／０７６６０１、ＷＯ２００９／００４０１６、ＷＯ２０１０／１３０７５６およびＷＯ２０１２／００１０７５に記載のとおりである）が挙げられる。
【０１０５】
感染性ウイルス粒子は、培養上清からおよび／または溶解後の産生細胞から回収し得る。それらは、標準的な技術（クロマトグラフィー技術、超遠心分離技術など）によりさらに精製することができる。
【０１０６】
本発明はまた、特定の宿主細胞への優先的なターゲティングを可能にするように改変されているベクターまたはウイルス粒子を包含する。ターゲティングベクターの特有の特徴は、細胞特異的なマーカー（例えば、マイコバクテリア感染細胞）、組織特異的なマーカー（例えば、肺特異的なマーカー）などのような細胞の表面に露出した成分を認識しそれと結合することが可能なリガンドがそれらの表面に存在することである。好適なリガンドの例としては、マイコバクテリア抗原性ドメインに対する抗体またはその断片が挙げられる。ターゲティングは、リガンドをウイルスの表面上に存在するポリペプチド（例えば、アデノウイルス繊維、ペントン、ｐＩＸまたはワクシニアｐ１４遺伝子産物）に遺伝的に挿入することにより行うことができる。
【０１０７】
宿主細胞および生産方法
別の面では、本発明はまた、本発明の免疫原性組み合わせ、融合ポリペプチド、核酸分子またはベクター（例えば、ウイルス粒子）を含んでなる宿主細胞、ならびにそのような宿主細胞を含んでなる組成物に関する。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は限定されるものではないが、組織、器官、または単離細胞における特定の有機体(organization)構成に関して、広く理解されるべきである。このような細胞は、唯一の細胞種または培養細胞系統、初代細胞および増殖性細胞などの異なる細胞種の群であり得る。本発明は、原核生物宿主細胞、下等真核生物宿主細胞、例えば、酵母など、および他の真核生物宿主細胞、例えば、昆虫細胞、植物細胞および哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞など、ならびに本発明のベクターを生産することが可能な産生細胞（例えば２９３細胞、ＨＥＲ９６細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、ＣＥＦ、カモ細胞系統など）を包含する。この用語はまた、本明細書に記載されるベクターのレシピエントとなり得るまたはレシピエントであった細胞ならびにこれらのような細胞の後代を含む。
【０１０９】
本発明の具体的な実施態様によれば、宿主細胞はさらに封入することができる。細胞封入技術は当技術分野で公知である。
【０１１０】
本発明のさらなる面は、本発明のベクター（または感染性ウイルス粒子）および／または宿主細胞を採用する免疫原性組み合わせ中に含まれまたはそれによってコードされるマイコバクテリア抗原（例えば、ヘテロオリゴマーパートナーおよび／または追加のマイコバクテリア抗原の融合物）の組換え生産のための方法である。典型的には、その方法は、（ｉ）ベクターを好適な宿主細胞へ導入して、トランスフェクトされたまたは感染された宿主細胞を作出する工程、（ｉｉ）上記トランスフェクトされたまたは感染された宿主細胞をその宿主細胞の増殖に好適な条件下でｉｎ−ｖｉｔｒｏ培養する工程、（ｉｉｉ）その細胞培養物を回収する工程、および（ｉｖ）所望により、その細胞培養物から回収されたマイコバクテリア抗原を精製する工程を含んでなる。
【０１１１】
当業者は、ポリペプチドを発現させるための当技術分野で利用可能な数多くの発現系およびベクターを宿主細胞へ導入するための方法を熟知していると思われる。これらのような方法としては、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション／リポソーム融合、遺伝子銃、形質導入、ウイルス感染ならびに様々な手段による宿主生物への直接投与が挙げられる。その方法はまた、宿主細胞への核酸の導入を容易にする、例えば、ポリカチオン性ポリマー（例えば、キトサン、ポリメタクリレート、ＰＥＩなど）およびカチオン性脂質（例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｌ／ＤＯＰＥ、トランスフェクタム、リポフェクチンなど）などの従来のトランスフェクション試薬とともに使用し得る。
【０１１２】
宿主細胞は、従来の発酵バイオリアクター、フラスコおよびペトリ板で培養することができる。培養は、所与の宿主細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。本明細書ではそのような目的のために当技術分野で利用可能な様々な原核生物および真核生物の発現系を詳細に記載することはしない。
【０１１３】
好ましい実施態様では、その方法は、大腸菌宿主細胞、特に、ラクトースまたはラクトースの類似体（例えば、ＩＰＴＧ：イソプロピルｂ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ  ｂ−Ｄ−１−ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ））によりＴ７ポリメラーゼの誘導性発現を可能にするために、そのゲノム中にＤ１３プロファージを保有する大腸菌株を採用する。このような菌株は，様々な製造業者（例えば、Ｌｕｃｉｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋなど）のために利用可能である。プラスミド導入後、形質転換された大腸菌細胞は、ベクター選択マーカー（例えば、抗生物質の存在）および宿主菌株（例えば、ＩＰＴＧなどのインデューサーの存在下）に適応する従来の培地で、およそ１８℃〜およそ３９℃の間に含まれる温度で（およそ３０℃またはおよそ３７℃が特に好ましい）、６時間から４８時間まで変化する期間（およそ８時間からおよそ２４時間までが特に好ましい）培養することができる。細胞培養物は回収し、溶解することができる（例えば、洗剤による化学的溶解、超音波処理など）。細胞溶解物の遠心分離後、上清およびペレットの両方を、発現のレベルならびに発現物質の溶解性を評価するさらなる分析（例えば、ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる）のために収集することができる（例えば、可溶性物質は、細胞溶解物上清において見出すことができ、不溶性物質は封入体中に捕捉され得る)。
【０１１４】
マイコバクテリア抗原および／またはこれらの融合物は、培養上清からおよび／または宿主細胞（例えば、細胞溶解による）から回収することができる。回収された物質は、所望により、周知の精製方法によって精製することができ、これらの方法としては、硫安沈殿、酸抽出、ゲル電気泳動；濾過およびクロマトグラフィー法（例えば、逆相、サイズ排除、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、ヒドロキシアパタイト、高速液体クロマトグラフィーなど）が挙げられる。使用される条件および技術は、正味電荷、分子量、疎水性、親水性などのような要因に依存し、当業者には明らかであろう。さらに、精製のレベルは、意図される用途に依存するであろう。例えば、タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ）により評価することができ、エンドトキシンレベルは、ポータブルテストシステム（Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などの技術により評価することができ、精製されたポリペプチドの質量は、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ）法またはエレクトロスプレー方法を用いて測定することができる。
【０１１５】
組成物
別の面では、本発明は、本明細書に記載される、免疫原性組み合わせ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター（例えば、感染性ウイルス粒子）、または宿主細胞またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、異なるポリペプチドまたはベクター／ウイルス粒子の組み合わせ）の少なくとも１つを含んでなる組成物（本明細書では「活性薬剤」とも呼ぶ）を提供する。好ましくは、その組成物は、治療上有効な量の活性薬剤に付け加えて、１種以上の薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる医薬組成物である
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能なビヒクル」は、対象、特に、ヒトにおける投与に適合した、任意および総ての担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、ならびに吸収遅延剤などを含むことを意図する。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」は、意図される用途のために十分な用量である。予防的使用に関係する場合、この用語は、マイコバクテリウム感染症（例えば、Ｍｔｂ感染症）を予防しまたはその発症および／もしくは確立を遅延するのに十分な用量を意味する。「治療的」使用のために、組成物は、マイコバクテリウム属種にすでに感染している対象に対し、活動性疾患を治療することまたは潜伏感染者における再活性化を予防することを目的として、最終的には、１種以上の従来の治療法と組み合わせて、投与される。具体的には、本発明の組成物の治療上有効な量は、投与された対象において免疫系の誘導または刺激を引き起こす（例えば、先天性および／または特異的な応答の発達をもたらす）のに必要な量であり得る。
【０１１８】
治療される対象は、新生児、乳児、若年成人または成人であり得る。対象は、本明細書に記載される活性薬剤で治療される前に、カルメット・ゲラン桿菌(BacillＵＳCalmette-Guerin)（ＢＣＧ）によって免疫性を与えられたことがあり得または以前にマイコバクテリウム感染症の治療を受けたことがあり得る。対象は、別の病原生物（例えば、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ）に重感染していてもまたはしていなくてもよい。
【０１１９】
具体的には、治療される対象は、薬剤耐性（例えば、ＭＤＲ、ＸＤＲまたはＴＤＲ）菌株であり得るビルレントマイコバクテリウム属種（例えばＭｔｂ）に感染している。感染マイコバクテリウムは、本発明において使用される活性薬剤に含まれるかまたはコードされる抗原を生じるマイコバクテリウムのいずれかと同じ菌株または分離株であり得、またはそれは異なる菌株または分離株に由来してもよい。
【０１２０】
本発明の組成物は、生理的ｐＨまたは弱塩基性ｐＨ（例えば、およそｐＨ７からおよそｐＨ９まで）でのヒトまたは動物使用のために適当であるように、好適に緩衝処理されている。好適なバッファーとしては、限定されるものではないが、リン酸バッファー（例えば、ＰＢＳ）、重炭酸バッファーおよび／またはトリス（Ｔｒｉｓ）バッファーが挙げられる。
【０１２１】
本発明の組成物は、ヒトまたは動物使用のために適当な希釈剤をさらに含んでなり得る。本発明の組成物は、好ましくは、等張性、低張性または弱高張性であり、比較的低いイオン強度を有する。代表例としては、滅菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス液、および他の水性の生理的緩衝塩類溶液が挙げられる（例えば、Remington : The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, Lippincott, Williams&Wilkinsの最新版を参照)。
【０１２２】
追加の薬学的に許容可能な賦形剤は、例えば、処方物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、無菌性、安定性、溶解速度の変更または維持、ヒトまたは動物生物体内への放出または吸収の変更または維持、血液関門を経た輸送または特定の器官（例えば、肺）への浸透の促進を含む、望ましい薬学的または薬力学的特性を提供するために使用し得る。
【０１２３】
加えて、本発明の組成物は、ヒトにおける全身適用または粘膜適用に好適な１種以上のアジュバントを含んでなり得る。好ましくは、アジュバントは、本発明の組成物に対する免疫性、特に、例えば、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９などを介した、Ｔ細胞性免疫を刺激することが可能である。有用なアジュバントの代表例としては、限定されるものではないが、ミョウバン、鉱油エマルジョン、例えば、フロイントの完全および不完全アジュバント（ＩＦＡ）など、リポ多糖類またはその誘導体(Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419)、サポニン、例えば、ＱＳ２１（ＷＯ  ９８／５６４１５）など、イミダゾキノリン化合物、例えば、イミキモド（ＷＯ２００７／１４７５２９）など、シトシンリン酸グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド、例えば、ＣｐＧなどおよびカチオン性ペプチド、例えば、ＩＣ−３１など(Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822: 263)またはこれらの任意の誘導体が挙げられる。
【０１２４】
本発明の組成物中に含まれる薬学的に許容可能なビヒクルはまた、製造、および冷凍温度（例えば−７０℃、−２０℃）、冷蔵温度（例えば４℃）、周囲温度での長期貯蔵（すなわち、少なくとも１ヶ月、好ましくは、少なくとも１年）の条件下でのその安定性の保持を可能としなければならない。このような「長期」処方物は当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ９８／０２５２２；ＷＯ０３／０５３４６３）。（ａ）１Ｍサッカロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５４ｍｇ／ｌツイン（Ｔｗｅｅｎ）８０、１０ｍＭトリスｐＨ８．５、（ｂ）１０ｍｇ／ｍｌマンニトール、１ｍｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、２０ｍＭ  トリス、ｐＨ７．２、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌならびに（ｃ）特に、本発明の組成物に適合されている生理食塩水を列挙し得る。
【０１２５】
本発明の組成物は、例えば、固体、液体または凍結の、様々な形態で存在し得る。固体（例えば、乾燥粉末または凍結乾燥）組成物は、真空乾燥および凍結乾燥を含む方法によって得ることができる。具体的な実施態様では、本発明の組成物は、気道への（例えば、吸入、鼻腔内または肺内経路による）送達のために、噴霧乾燥形態（例えば、ＷＯ２０１０／１３５４９５参照）または液滴形態（平均直径１００〜５０００μｍの液滴が特に好ましい）で処方される。
【０１２６】
本発明の免疫原性組み合わせ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は種々の投与様式に好適である。従来の投与経路のいずれかは、本発明の文脈において適用可能であり、全身経路、局所経路または粘膜経路を含む。
【０１２７】
全身投与としては、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、腹腔内、血管内、動脈内への注射ならびに乱切法が挙げられる。注射は、従来のシリンジおよび針、または当技術分野で利用可能な任意の他の適当な装置（例えば、エレクトロポレーション）によって行い得る。粘膜投与としては、限定されるものではないが、経口／消化、鼻腔内、気管内、肺内、膣内または直腸内経路が挙げられる。気道内投与は、適切なディスペンサーを用いて、液滴、スプレーまたは乾燥粉末組成物を噴霧化またはエアゾール化することによって行うことができる。局所投与はまた、経皮手段（例えば、パッチなど）を用いて行うことができる。筋肉内、皮内および皮下経路は、鼻腔内  気管内および肺内の投与とともに、本発明の文脈において特に好ましい。
【０１２８】
適当な用量は、様々なパラメーター、特に、組成物中に含まれる活性薬剤、投与様式；対象の年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度；併用療法の種類；処置の頻度；ならびに／または予防もしくは療法の必要性に応じて適合させることができる。治療に適当な用量を決定するために必要な計算のさらなる精密化は、関連する状況に照らして従事者によって慣例的に行われる。
【０１２９】
一般的な指針として、ウイルスベクターを含んでなる組成物に好適な用量は、使用するベクターおよび定量的技術に応じて、約１０４〜約１０１３ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）で変動する。サンプル中に存在するｖｐ、ｉｕおよびｐｆｕの量を評価するために利用可能な技術は、当技術分野で従来のものである。例えば、アデノウイルス粒子（ｖｐ）の数はＡ２６０吸光度の測定またはＨＰＬＣによって、ｉｕ力価は定量的ＤＢＰ免疫蛍光法によって、ｐｆｕは許容細胞の感染後にプラーク数を計数することによって、通常決定される。好ましくは、ｖｐ／ｉｕ比は、ＦＤＡの指針に従えば１００未満である。好ましい用量は、約１０５〜約１０１２ｖｐのアデノウイルスベクター（例えば、約５×１０８ｖｐ、約１０９ｖｐ、約５×１０９ｖｐ、約１０１０ｖｐ、約５×１０１０ｖｐまたは約１０１１ｖｐ）を含有する。ワクシニア（例えば、ＭＶＡ）に基づく組成物では、約５×１０５〜約１０９ｐｆｕの用量が好ましく、約５×１０６ｐｆｕ、約１０７ｐｆｕ、約５×１０７ｐｆｕ、約１０８ｐｆｕまたは約５×１０８ｐｆｕが特に好ましい。麻疹に基づく組成物では、約５×１０４〜約１０７ｐｆｕの用量が好ましく、約１０５ｐｆｕ、５×１０５ｐｆｕ、１０６ｐｆｕまたは５×１０６ｐｆｕが特に好ましい。プラスミドベクターに基づく組成物は、１０μｇ〜２０ｍｇの間、有利には、１００μｇ〜２ｍｇの間の用量で投与し得る。タンパク質組成物は、１０μｇ〜２０ｍｇの間の用量で投与し得、組成物中に含まれるマイコバクテリア抗原のそれぞれについて、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約２ｍｇが特に好ましい。
【０１３０】
投与は、単回投与でまたは一定の時間間隔を置いた後に反復投与で行い得る。反復投与（２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回など）は、相互に適当な期間の間隔を置くことができ、同じ投与経路または異なる投与経路によって、同じ部位または異なる部位のいずれかに行うことができる。さらに、各投与は、同じ活性薬剤または異なるものを使用することができる。例示の目的のために、ＭＶＡに基づく組成物では、相互におよそ１週間（例えば、３〜１０日）の間隔を置いた２回または３回の皮下投与が特に好適であるが、一方、Ａｄに基づく組成物、麻疹に基づく組成物およびプラスミドに基づく組成物では、１回または２回の筋肉内投与が特に好適である。また、休止期間の後に繰り返される一連の投与サイクル（例えば、週１回投与のサイクル）を介して進行することも可能である。最初の投与シリーズの後、初回抗原刺激による抗マイコバクテリウム免疫応答をリコールするために、（例えば、４ヶ月〜数年後に）１回以上の「リコール」投与を行うことができる。
【０１３１】
具体的な実施態様では、投与は、１回以上の初回刺激組成物および１回以上の追加免疫組成物の連続投与を含んでなるプライム・ブースト様式によって行うことができる。典型的には、初回刺激組成物および追加免疫組成物は、共通の、少なくとも１種のマイコバクテリア抗原、免疫原性ドメインまたはエピトープを含んでなるまたはコードする異なる活性薬剤を使用する。初回刺激組成物および追加免疫組成物は、同じ投与経路または異なる投与経路によって同じ部位または異なる部位に投与することができる。例えば、ポリペプチドに基づく組成物は粘膜経路によって投与することができ、一方、ベクターに基づく組成物は、好ましくは、、例えば、皮下または筋肉内経路によって注入される。例示の目的のために、弱毒生菌（例えば、ＢＣＧなど）での宿主の応答の初回刺激と、本明細書に記載される「活性薬剤」（例えば、本発明の免疫原性組み合わせ、融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター（例えば、感染性ウイルス粒子）、または宿主細胞またはこれらの任意の組み合わせ）の少なくとも１つでの追加免疫とを意図し得る。
【０１３２】
予防的および治療的使用
本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、好ましくは、マイコバクテリウム感染症またはそれによって引き起こされるまたはそれに関連する任意の疾患および病的状態を予防または治療するためのものである。そのような使用は、マイコバクテリア抗原／エピトープに対する防御免疫応答を誘導または刺激することを目的としている。
【０１３３】
一実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、それを必要とする対象、特に、活動性疾患を発症した感染者と密接に接触していたため、マイコバクテリウム感染症を発症するリスクがある（例えば、ＴＢを有する個体の咳から出た飛沫中の細菌の吸入による伝播）対象においてマイコバクテリウムによる感染症を予防するかまたは該感染症のリスクを遅らせる方法において使用するためのものである。
【０１３４】
別の実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、マイコバクテリウム属種、特に、Ｍｔｂに感染した対象において活動性疾患を治療する方法において使用するためのものであり、その方法は、感染マイコバクテリウム属種に対する免疫応答を誘導するために、活動性疾患を発症した感染した対象に、本明細書に記載される免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物の治療上有効な量を投与する工程を含んでなり、それによって活動性疾患を発症するリスクを遅らせまたは低減する。
【０１３５】
「活動性疾患」とは、深刻な病徴の発現を有するマイコバクテリウム感染症を意味する。例えば、ヒト対象では、ＴＢは、一般臨床徴候（例えば、体重減少、無力症、発熱、寝汗など）、臨床徴候および／または症状（例えば、咳、喀血、肺ＴＢの場合の胸部痛など）、および／または場合によって、感染部位（例えば、リンパ節、骨系、髄膜炎、泌尿系 (urologenital forms)など）に応じた肺外徴候によって特徴付けられる。
【０１３６】
さらに別の実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、マイコバクテリウム属種、特に、結核菌に潜伏感染した対象における再活性化を予防または治療する方法において使用するためのものであり、その方法は、感染マイコバクテリウム属種に対する免疫応答を誘導するために、上記潜伏感染した対象に、本明細書に記載される免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物の治療上有効な量を投与する工程を含んでなり、それによって再活性化を予防しまたは遅らせる。
【０１３７】
「潜伏感染した対象」とは、ビルレントマイコバクテリウム属種（例えば、Ｍｔｂ）にすでに感染しているが、病徴または臨床徴候の発現を示していない個体と理解される。典型的には、潜伏感染した対象は、体内にマイコバクテリウム属を保有し、臨床的に病気ではないが、特に、免疫抑制（例えば、別の病原体、例えば、ＨＩＶによる重感染などまたは免疫抑制治療、例えば、ＴＮＦａ阻害剤などを受けている）に関連して、後に臨床疾患（再活性化）に進行するリスクを有する。Ｍｔｂ潜伏感染した対象は、Ｍｔｂ感染症の診断を可能にする任意の検査（例えば、ツベルクリン試験、ＰＰＤ反応性についてのマントー試験、および／またはＩＦＮｇ放出アッセイ）によって検査した場合、陽性となると思われる。
【０１３８】
用語「再活性化」とは、マイコバクテリウム感染症の検査で陽性反応を示すが明らかな病徴を発現していなかった対象における、後の、マイコバクテリウム関連疾患の病徴の発現(manifestation)を意味する。例えば、再活性化は、活動性疾患症状を以前に発現したかどうかはわからないまたは感染を潜伏状態に至らせるために十分に治療を受けていた、感染している対象で起こり得る。例えば、Ｍｔｂ感染した対象は、ＢＣＧによって以前に免疫性を得またはＭｔｂ感染症について（例えば、１種以上の「第一選択」化学療法薬によって）以前に治療を受けた。
【０１３９】
具体的な実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、ワクチン接種を受けた対象においてＢＣＧワクチン接種の有効性を高めるためのＢＣＧ追加免疫としての使用のためのものである。
【０１４０】
化学療法との関連
本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、１種以上の従来の療法、例えば、マイコバクテリウム感染症（例えば、Ｍｔｂ感染症）に対して有効な１種以上の化学療法薬とともに採用し得る。
【０１４１】
化学療法は、典型的に、現在の慣行を用いて、治療する医師によって決定される。このような化学療法薬の例としては、限定されるものではないが、当技術分野で記載されているように、抗生物質だけでなく、小さな直接的および間接的阻害剤分子、抗体および免疫治療薬が挙げられる。典型的に、薬剤耐性のないＭｔｂ感染症を治療するために現在使用されている「第一選択(front-line)」抗生物質化学療法としては、イソニアジド、リファマイシン（すなわち、リファンピン、リファペンチンおよびリファブチン）、エタンブトール、ストレプトマイシン、ピラジナミドおよびフルオロキノロンが挙げられる。１種以上の「第一選択(first-line)」療法に対して薬剤耐性を示したＭｔｂ感染症を治療するために使用されている「第二選択の」化学療法としては、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、アミカシン、カナマイシンおよびカプレオマイシンが挙げられる。１種以上の化学療法薬は、一般的に、適当な期間にわたって、例えば、１ヶ月または数ヶ月（例えば１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、９ヶ月または１２ヶ月）またはそれ以上の間投与される。６〜１２ヶ月の範囲の期間にわたって用量２００〜６００ｍｇ（例えば、３００ｍｇまたは４００ｍｇ）の毎日の投与が適当である。
【０１４２】
一実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、マイコバクテリウム（例えば、Ｍｔｂ）感染症に対する化学療法の経時的推移を減少させるためのものである。通常、本明細書に記載される活性薬剤の投与は、化学療法の有効性を増強する（例えば、臨床徴候の持続期間および／または重篤度を減少させる、喀痰変換率(sputum conversion)を向上させるなど）ことを可能にし、特に、感染マイコバクテリアが薬剤耐性である場合には、化学療法の時間の長さおよび／または採用される化学療法薬の数を減少させる。
【０１４３】
本発明に従って、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物は、１種以上の化学療法薬の投与の前、それと同時に、またはその後に投与することができる。一実施態様では、本明細書に記載される活性薬剤は、化学療法の投与開始の少なくとも２週間後に投与される。
【０１４４】
好ましい実施態様では、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物は、投与された対象において免疫応答を誘導または増強するためのものである。従って、本発明はまた、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞および／または組成物の対象への投与による、マイコバクテリア抗原に対する免疫応答を誘導または刺激するための方法を包含する。
【０１４５】
誘導または刺激された免疫応答は、特異的（すなわち、マイコバクテリアエピトープ／抗原に対する）および／または非特異的（先天性）、体液性および／または細胞性であり得る。本発明の文脈において、免疫応答は、好ましくは、マイコバクテリア抗原／エピトープに対する、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋を介したＴ細胞応答またはその両方である。
【０１４６】
本明細書に記載される活性薬剤の、免疫応答を誘導または刺激する能力は、当技術分野で標準的な種々の直接的または間接的なアッセイを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで評価することができる。
【０１４７】
例えば、非特異的免疫の誘導は、ＮＫ／ＮＫＴ細胞（例えば、代表性および活性化のレベル）、ならびにＩＦＮ関連サイトカインおよび／またはケモカイン産生カスケード、ＴＬＲおよび他の先天性免疫マーカーの活性化（例えば、Riano et al., 2012, Tuberculosis 92: 148-59）の測定によって行うことができる。
【０１４８】
体液性応答を刺激する能力は、本明細書に記載される免疫原性組み合わせおよび融合物中に含まれまたはそれらによってコードされる抗原の少なくとも１つに特異的な抗体力価の上昇によって決定することができる。典型的な技術としては、限定されるものではないが、抗体結合、結合の競合ならびにＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットが挙げられる。
【０１４９】
細胞性免疫の評価は、例えば、本明細書に記載される免疫原性組み合わせおよび融合物中に含まれまたはそれらによってコードされるマイコバクテリア抗原の少なくとも１つに特異的なＴリンパ球などの免疫細胞の頻度の増加によって、推定することができる。また、放射性標識（例えば、［３Ｈ］チミジン取込みアッセイによるＴ細胞増殖アッセイ）により細胞増殖をモニタリングし得る。免疫応答を検出するための別の感度の高い方法は、ＩＦＮｇ産生細胞の頻度が決定されるエリスポット(ELISpot)法である。抗原特異的Ｔリンパ球の細胞傷害能はまた、感作された対象においてまたは適当な動物モデルに免疫性を与えることによって評価することができる。また、日常的なバイオアッセイ（例えば、多重パラメーターフローサイトメトリー（ＩＣＳ）、マルチプレックス技術を用いたサイトカインプロフィール分析またはＥＬＩＳＡなどによる）を用いて、活性化Ｔ細胞によって産生された関連Ｔｈ１および／またはＴｈ２サイトカインの放出を定量することにより進行することも可能である。また、ＰＣＲ技術は、関連するサイトカインをコードするｍＲＮＡの存在を判定するために使用することができる。このような関連サイトカインの量の著しい増加または減少は、本明細書に記載される活性薬剤の１以上の免疫原性活性を評価するために使用することができるということは当業者に理解されるであろう。
【０１５０】
このような免疫学的読出しは、マイコバクテリウム感染症に対して、本明細書に記載される活性薬剤により提供される防御免疫応答の許容相関である。「防御応答」とは、治療が、治療を受けない対象における応答と比較して、治療を受ける対象に利益を提供するというその通常の意味を有する；例えば、免疫応答の誘導もしくは刺激、マイコバクテリウム感染からの保護、または活動性疾患に対する抵抗力の増加もしくは潜伏マイコバクテリウム感染症の再活性化の予防あるいは活動性疾患発症後の治癒。
【０１５１】
このような防御免疫応答はまた、適当な実験動物、例えば、マウス、ラットまたはモルモットにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができ(Ashwin et al., 2008, Am J Resp, 39: 503-8; Acosta et al., 2011, Malays J Med, 18: 5-12参照)、例えば、以前に本明細書に記載される活性薬剤の１以上によって免疫付与した後、マイコバクテリウム属種（例えば、Ｍｔｂ）のビルレント菌株による攻撃感染を受けた動物から単離された脾臓、肺または他の組織のホモジネートのマイコバクテリアのコロニー形成単位（ｃｆｕ）の減少を、以前に免疫性が与えられていないが同じマイコバクテリウム属ビルレント菌株に感染した実験動物の対照群でのマイコバクテリアのｃｆｕと比較して、測定することによる。また、治療群と非治療群との比較は、動物生存について評価することもできる（治療群での生存の増加は防御免疫応答と相関する）。
【０１５２】
また、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞または組成物により提供される防御応答は、本明細書に記載される様式によるヒト対象への投与によりベースライン状態を超えるまたは治療を受けない場合には予想される状態を超えると推定することができる。防御応答は、医師または他の熟練した医療スタッフが一般に使用する任意の関連する臨床測定によって証明することができ、例えば、以下が挙げられる：
・所与の集団、例えば、中国の人口または特定の国での移民人口などでの疾患発症率および／または有病率および／または頻度の減少（例えば、本明細書に記載される活性薬剤を受けた群での、マイコバクテリウム感染症であるまたはマイコバクテリウム感染症もしくはマイコバクテリウム感染症に関連する疾患の発症のリスクがあると診断された新しい個体の割合がより低い）；
・治療を受けた対象群での喀痰変換率のパーセンテージがより高い；
・治療を受けた対象群での活動性疾患治癒のパーセンテージがより高い；
・感染した対象と密接に接触した後のマイコバクテリウム伝播の程度の低下（例えば、感染のリスクもしくは活動性疾患発症のリスクの減少もしくは遅延および／または潜伏感染した対象における再活性化のリスクの減少もしくは遅延）；
・疾患状態の改善（例えば、標的組織中もしくは生物学的サンプル中での細菌のｃｆｕの減少；病徴もしくはそれらの重篤度の軽減（例えば、標的器官における病変の数および／もしくは重篤度）または疾患状態の安定化（悪化しない））；および
・併用療法に対する治療を受けた対象の応答の改善（従来の化学療法薬の必要性、数、継続時間および／または用量の減少）。
【０１５３】
本発明の文脈において、防御応答は、一時的であり得る（投与中止後数週間）しまたは持続させることができる（数ヶ月または数年間）。臨床状態の自然経過は対象によってかなり変化し得るため、防御応答は、有意な数の対象のほかには、治療を受けた各対象で観察されることは必要とされない（例えば、２群間での統計的に有意な差は、テューキーパラメトリック検定、クラスカル・ワリス検定、マン・ホイットニーＵ検定、スチューデントｔ検定、ウイルコクソン検定などのような当技術分野で公知の任意の統計的検定によって決定することができる）。
【０１５４】
このような測定は、本明細書に記載される活性薬剤の投与前に（ベースライン）および治療中の様々な時点に、および治療中止後少なくとも数（例えば、１２）週間行うことができる。
【０１５５】
一般的な指針として、マイコバクテリウム感染症および関連疾患は、様々な手段によって検出することができる。例えば、Ｍｔｂ感染症はまた、マントーツベルクリン反応検査(Mantoux tuberculin skin test)（ＴＳＴ）、クォンティフェロン(Quantiferon)検査ならびにＨＢＨＡに対する応答のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出（ヘパリン結合血球凝集素；Hougardy et al., 2007; PLos One 2(10): e926）またはＥＳＡＴ６、ＣＦＰ１０およびＴＢ７．７でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後のＩＰ１０の検出(Ruhwald et al., 2008; Microbes Infect 9: 806-12)などの今日臨床的に使用されている複数の方法に適応させることができる。活動性疾患を発症している対象は現在の慣行により診断し得る。例示の目的のために、ＴＢの診断は、顕微鏡、培養技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびその様々な派生技術による臨床検体中の原因菌の検出に基づいている。また、ＤＮＡフィンガープリント法およびスポリゴタイピング法も実施することができる。マイコバクテリアの培養は、結核菌群の分離株の同定および薬剤感受性試験のためのゴールドスタンダード法である。また、Ｘ線技術および臨床観察も、活動性肺疾患および／または肺外疾患の発見を裏付けるために実施することができる。もう一方で、数多くの血清学的アッセイが、循環抗体を検出するための種々の抗原を用いたＭｔｂ感染症の診断のために開発されており、補体結合試験、血球凝集試験、ラジオイムノアッセイおよび酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。
【０１５６】
本発明はまた、生物学的サンプル（例えば、マイコバクテリウムに感染したまたは感染しやすい対象から採取された血漿、血清など）中のマイコバクテリウムに対する抗体の検出および／または定量のための方法であって、上記生物学的サンプルを、本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、感染性ウイルス粒子、宿主細胞のいずれかを含んでなる試薬と、抗体と上記試薬のいずれかに含まれまたはそれによってコードされるマイコバクテリア抗原／エピトープとの間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程、および任意の適当な手段により上記複合体の形成を検出しかつ／または定量する工程を含んでなる方法に関する。特異的な抗体の存在の検出はマイコバクテリウム感染症  （例えばＭｔｂ）を示す。
【０１５７】
当業者は、本発明の方法で使用される試薬の量を容易に決定するであろう。抗原／抗体複合体の検出および／または定量の手段は、日常的なものであり、当業者に周知である。例として、ブロット、ＥＬＩＳＡ、いわゆるサンドイッチ技術、競合技術、およびＰＣＲ技術、特に、いわゆる「リアルタイム」技術を挙げることができる。上に列挙した試薬の使用は、検出可能な物質とカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）により容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン、またはアビジン／ビオチン）、蛍光物質（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、またはフルオレセイン誘導体）、発光物質、生物発光物質（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、またはエクオリン）、および放射性物質（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈ）が挙げられる。
【０１５８】
本発明はまた、マイコバクテリウム（例えば、Ｍｔｂ）感染症の診断用、本発明の抗体を含んでなる抗原アッセイ用、および本発明の免疫原性組み合わせ、融合物、核酸分子、ベクター、宿主細胞、組成物を含んでなる抗体アッセイ用の試薬のキットに関する。
【０１５９】
特許、刊行物およびデータベース記載事項の上に列挙した開示の総ては、このような個別の特許、刊行物または記載事項がそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされることが具体的かつ個別に示されたのと同じ程度に、具体的に、全体として引用することにより本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】図１は、（ａ）空の(empty)ＭＶＡＴＧＮ３３．１または（ｂ）ＭＶＡＴＧ１８３７９(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 + Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807)またはＭＶＡＴＧ１８５９８(Rv2626-2a-Ag85B + CFP10-ESAT6 + TB10.4-Rv0287 + RpfB-Dhyb + Rv1813-2a-Rv3407)によるＣ５７ＢＬ／６マウスへの免疫付与後に誘導された細胞性免疫応答を示す。ＩＦＮγ産生細胞は、最後のＭＶＡ注射の１週間後、特異的ペプチドプール（Ｐ）でのｅｘ  ｖｉｖｏ刺激後にＩＦＮγエリスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイにより評価した。各無地のバーは各マウスの応答（６マウス／群）を表し、線影付きのバーは、各群の中央値を表す。実験的カットオフを示している（点線）。統計分析は、マン・ホイットニー検定を用いて行った。＊、ｐ＜０．０５。
【図２】図２は、（ａ）空のＭＶＡＴＧＮ３３．１または（ｂ）ＭＶＡＴＧ１８３７７(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 + Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807)またはＭＶＡＴＧ１８５９７(ESAT6 + CFP10 + Rv2626 + Ag85B + RpfB-Dhyb)またはＭＶＡＴＧ１８６３３(ESAT6 + Rv1813 + Rv2626 + Ag85B + RpfB-Dhyb)によるＣ５７ＢＬ／６マウスへの免疫付与後に誘導された細胞性免疫応答を示す。ＩＦＮγ産生細胞は、最後のＭＶＡ注射の１週間後、特異的ペプチドプール（Ｐ）でのｅｘ  ｖｉｖｏ刺激後にＩＦＮγエリスポットアッセイにより評価した。各無地のバーは各マウスの応答（５マウス／群）を表し、線影付きのバーは、各群の中央値を表す。実験的カットオフを示している（点線）。統計分析は、マン・ホイットニー検定を用いて行った。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【実施例】
【０１６１】
材料および方法
ワクシニアプロモーターおよび異なるＭｔｂ抗原および融合物をコードする合成遺伝子をジーンアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）（レーゲンスブルク、ドイツ）により合成した。それらの配列をヒトコドン使用頻度について最適化し、Ｋｏｚａｋ配列（ＡＣＣ）をＡＴＧ開始コドンの前に付加した。さらに、いくつかのモチーフを排除した：ポックスウイルスベクターでの発現に有害なＴＴＴＴＴＮＴ、ＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣおよびいくつかの他のベクターでの発現に有害であり得るＡＡＡＧＧＧ、ＡＡＡＡＧＧ、ＧＧＧＡＡＡ、ＧＧＧＧＡＡ、（および相補配列ＴＴＣＣＣＣ、ＴＴＴＣＣＣ、ＣＣＴＴＴＴ、ＣＣＣＣＴＴ）。
【０１６２】
ヘテロオリゴマーＭｔｂ抗原の融合物をを発現するＭＶＡＴＧ１８５９８の構築。
ＭＶＡＴＧ１８５９８は、５つの発現カセットを含有し、それぞれは、２つのＭｔｂ抗原の融合物をコードする（表１に示すとおりである）。第１の融合物Ｒｖ２６２６／２ａ／Ａｇ８５Ｂ＊＊（配列番号９）は、Ｒｖ２６２６配列の１位〜１４３位、ＧＳＧリンカーの１４４位〜１４６位、自己切断ペプチドＴ２Ａの配列の１４７位〜１６４位および改変されたＡｇ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ＊＊、Ｎ末端シグナルペプチドの最初の残基から約３２位までの部分的欠失によりその天然対応物に対して修飾されている）の配列１６５位〜４５７位で構成されている。Ｒｖ２６２６／２ａ／Ａｇ８５Ｂ＊＊をコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）をｐＢ２Ｒプロモーター（配列番号２０）の制御下に置いた。第２の融合物（配列番号１）は、２つのヘテロ二量体パートナーＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６の融合物である。それは、ＣＦＰ１０の１位〜１００位、１４個のアミノ酸のリンカー（Ｍｔｂタンパク質Ｒｖ１８２７のアミノ酸１４９〜１６２に対応する）の１０１位〜１１４位およびＥＳＡＴ６の１１５位〜２０８位で構成されている。ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６をコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）をｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号２１）の制御下に置いた。第３の融合物（配列番号２）は、２つのヘテロ二量体パートナーＴＢ１０．４およびＲｖ０２８７の融合物である。それは、ＴＢ１０．４の１位〜９６位、１３個のアミノ酸のリンカー（Ｍｔｂタンパク質Ｒｖ１８２７のアミノ酸１４９〜１６１に対応する）の９７位〜１０９位およびＲｖ０２８７の１１０位〜２０５位で構成されている。ＴＢ１０．４／Ｒｖ０２８７をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）をｐＳＥ／Ｌプロモーター（配列番号２２）の制御下に置いた。第４の融合物は、配列番号８に記載されるＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ融合物である。それは、シグナルペプチドの欠失（最初の残基からおよそ２９位の残基まで）と触媒ドメインの欠失によりその天然対応物に対して修飾されており、その結果として、ＲｆｐＢのおよそ３０位〜２８３位を保持するＲｐｆＢ抗原と、関連する酵素活性をなくすことに向けられた３つの突然変異（Ｅ２９２Ｋ、Ｔ３１５ＡおよびＱ３４７Ａ）を有するＲｐｆＤ抗原の触媒ドメインとの間の融合物である。ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂをコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）をｐ７．５Ｋプロモーター（配列番号２３）の制御下に置いた。最後の融合物Ｒｖ３４０７／２ａ／Ｒｖ１８１３＊（配列番号１１）は、Ｒｖ３４０７の１位〜９９位、ＧＳＧリンカーの１００位〜１０２位、自己切断ペプチドＥ２Ａの１０３位〜１２２位および改変されたＲｖ１８１３（Ｒｖ１８１３＊、Ｎ末端シグナルペプチドの最初の残基から約３１位までの部分的欠失によりその天然対応物に対して修飾されている）の１２３位〜２３５位で構成されている。Ｒｖ３４０７／２ａ／Ｒｖ１８１３＊をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）をｐＡ３５Ｒプロモーター（配列番号２４）の制御下に置いた。
【０１６３】
好適な制限部位によって隔てられた最初の３つの発現カセットと最後の２つの発現カセットのそれぞれに対応する２つのＤＮＡ断片を、合成手段によって生成した。第１の断片についてはＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより、第２の断片についてはＸｈｏＩおよびＰａｃＩにより制限処理した後、両方の断片を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩにより制限処理したｐＴＧ１８５９３にクローニングし、ｐＴＧ１８５９８を得た。
【０１６４】
ＭＶＡ移入プラスミド、ｐＴＧ１８５９３は、相同組換えによって移入されるヌクレオチド配列の、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩへの挿入が可能になるように設計されている。このプラスミドは、ＭＶＡ欠失ＩＩＩを囲むフランキング配列（ＢＲＧ３およびＢＲＤ３）がクローニングされているプラスミドｐＵＣ１８に由来する(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847)。
【０１６５】
ＭＶＡＴＧ１８５９８の生成は、ＭＶＡに感染させ、ヌクレオフェクション（アマクサ（Ａｍａｘａ）ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）技術による）によってｐＴＧ１８５９８でトランスフェクトした初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）での相同組換えによって行った。親のＭＶＡによる混入がないことはＰＣＲによって確認した。
【０１６６】
Ｍｔｂヘテロオリゴマーパートナーを共発現するＭＶＡベクターの構築
ＭＶＡＴＧ１８５９７の構築
ＭＶＡＴＧ１８５９７は、５つの発現カセットを含有し、それぞれは、１つのＭｔｂ抗原をコードする（表１）。ＥＳＡＴ６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２５）をｐＢ２Ｒプロモーター（配列番号２０）の制御下に置いた。ＣＦＰ１０をコードするヌクレオチド配列（配列番号２６）をｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号２１）の制御下に置いた。Ｒｖ２６２６をコードするヌクレオチド配列（配列番号２７）をｐＳＥ／Ｌプロモーター（配列番号２２）の制御下に置いた。改変されたＡｇ８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ＊、Ｎ末端シグナルペプチドの最初の残基から３９位までの欠失によりその天然対応物に対して修飾されている）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）をｐ７．５Ｋプロモーター（配列番号２３）の制御下に置いた。最後の抗原は、Ｍｔｂ抗原ＲｐｆＢおよびＲｐｆＤを含んでなる融合ポリペプチドである（例えば、配列番号８のいわゆるＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂにより示されるとおりである）。ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂをコードするヌクレオチド配列（配列番号１５）をｐＡ３５Ｒプロモーター（配列番号２４）の制御下に置いた。
【０１６７】
好適な制限部位によって隔てられ、ワクシニア移入プラスミドと相同なおよそ３０ｂｐの配列に囲まれている５つの発現カセットに対応するＤＮＡ断片を、合成手段によって生成した。ＳｎａＢ１およびＦｓｐＩにより制限処理した後、断片をインフュージョン（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ）クローニング（インフュージョンＨＤクローニングキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩにより消化したワクシニア移入プラスミドｐＴＧ１８５９３に挿入し、ｐＴＧ１８５９７を得た。
【０１６８】
ＭＶＡＴＧ１８５９７ウイルスの生成は、上記のように、ＣＥＦで相同組換えによって行った。
【０１６９】
ＭＶＡＴＧ１８６０４の構築
ＭＶＡＴＧ１８６０４は、５つの発現カセットを含有し、それぞれは、個別のＭｔｂ抗原をコードする（表１）。Ｒｖ０２８７をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）をｐＢ２Ｒプロモーター（配列番号２０）の制御下に置いた。ＴＢ１０．４をコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）をｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号２１）の制御下に置いた。Ｒｖ３４０７をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）をｐＳＥ／Ｌプロモーター（配列番号２２）の制御下に置いた。Ｒｖ３４７８をコードするヌクレオチド配列（配列番号３２）をｐ７．５Ｋプロモーター（配列番号２３）の制御下に置き、Ｒｖ３４７７のヌクレオチド配列（配列番号３３）をｐＡ３５Ｒプロモーター（配列番号２４）の制御下に置いた。
【０１７０】
好適な制限部位によって隔てられ、ワクシニア移入プラスミドと相同なおよそ３０ｂｐの配列に囲まれている５つの発現カセットに対応するＤＮＡ断片を、合成手段によって生成した。ＳｎａＢ１およびＦｓｐＩにより制限処理した後、断片をインフュージョンクローニング（インフュージョンＨＤクローニングキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＮｏｔＩおよびＰａｃＩにより消化したワクシニア移入プラスミドｐＴＧ１８５９３に挿入し、ｐＴＧ１８６０４を得た。
【０１７１】
ＭＶＡＴＧ１８６０４ウイルスの生成は、上記のように、ＣＥＦで相同組換えによって行った。
【０１７２】
Ｍｔｂ抗原に対する抗体の産生
２つの異なる抗原特異的ペプチドの混合物（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ；セラン、ベルギー）によるウサギの免疫付与後に様々なＭｔｂ抗原に対する抗体が産生された。エピトープＢ予測プログラムの実行後に、１５個または１６個のアミノ酸残基のこれらのようなペプチドを選択した。０日目の２つの特異的ペプチドによるウサギの免疫付与と７日目、１０日目および１８日目の３回の追加免疫の後に、抗原Ｒｖ１８０７、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ＊、Ｒｖ１８１３＊およびＲｖ３４０７に対する抗血清が生成された。血液サンプルは、第１回目のペプチド注射の前と２１日目に採取した。ウサギの最後の放血(bleeding)は２９日目に行った。Ｒｖ３４７８については、０日目、２２日目、４９日目および７７日目にウサギに２つの特異的１６量体ペプチドを注射した。血液サンプルは、第１回目のペプチド注射の前と３１日目および５９日目に採取した。ウサギの最後の放血は８７日目に行った。
【０１７３】
最後の血清を、特異的ペプチドを用いたＥＬＩＳＡおよび個別のＭｔｂ遺伝子発現プラスミドを用いたウエスタンブロット分析により評価した。
【０１７４】
ＭＶＡを介した発現産物に対するウエスタンブロット
４×１０６ＣＥＦ細胞を、感染の３０分後に増殖培地に添加されるプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（１０μＭ）の存在下または不在下で、Ｍｔｂ抗原融合物を生産する様々なＭＶＡによりＭＯＩ  ０．２で感染させた。ＭＶＡＴＧＮ３３．１空ベクターを陰性対照として使用した。２４時間後、培地を廃棄し、細胞を、β−メルカプトエタノール（５％ｖ：ｖ）を補給したトリス−グリシン−ＳＤＳ  ２Ｘバッファー(Tris-Glycin-SDS 2 X buffer)（照会番号：ＬＣ２６７６；ノベックス（Ｎｏｖｅｘ））３００μＬ／皿で溶解した。次いで、溶解物を超音波処理し、９５℃で５分間加熱した。細胞溶解物２０マイクロリットルを、クライテリオンプレキャストゲルシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いてプレキャストした４〜１５％クライテリオン（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）ゲル上での電気泳動に供した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写した（トランスブロット（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ）（登録商標）ターボ（Ｔｕｒｂｏ）（商標）転写システム（番号１７０−４１５５、Ｂｉｏｒａｄ））。免疫検出は、Ｍｔｂ特異的抗体を用いて行った（下記参照）。免疫複合体は、ＩｍｍｕｎＳｔａｒウエスタンＣキット（Ｂｉｏｒａｄ、照会番号１７０．５０７０）を使用して明らかにした。
【０１７５】
また、上記のように、ウサギの免疫付与後に得られた血清（１／１０００希釈）を、Ｒｐｆ−Ｂ−Ｄ、Ｒｖ１８１３＊、Ｒｖ３４０７およびＲｖ３４７８のウエスタンブロット検出にも使用した。ＥＳＡＴ６、Ａｇ８５Ｂ＊、ＴＢ１０．４およびＲｖ２６２６それぞれの検出には、市販の抗体を、ＥＳＡＴ６についてはマウスモノクローナル抗体ＨＹＢ０７６−０８（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ；番号ｓｃ−５７７３０、１／５００希釈）、Ａｇ８５Ｂ＊についてはウサギポリクローナル抗血清ＮＲ−１３８００（ＢＥＩ、１／５０００希釈）、Ｒｖ２６２６についてはマウスモノクローナル抗体２６Ａ１１（Ｌｉｆｅｓｐａｎ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；番号ＬＳ−Ｃ９１０５２  １／１０００希釈）およびＴＢ１０．４についてはポリクローナルウサギ抗体ＡＢＩＮ３６１２９２（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ、１／１０００希釈）を使用した。
【０１７６】
溶解性分析
上記のように、６ウェルプレート中で４×１０６ＣＥＦ／ウェルを培養し、ＭＧ１３２不在でＭＶＡにより０．２  ＭＯＩで感染させた。感染の２４時間後、培養培地を除去し、細胞を、ネイティブバッファー（５０ｍＭトリスｐＨ７，５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％トリトンＸ（ｔｒｉｔｏｎＸ）１００；Ｒｏｃｈｅ社の抗プロテアーゼカクテル）または０．７Ｍ  β−メルカプトエタノールを補給したノベックスバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ノベックス＋ＢＭＥ）のいずれかの２５０μＬで溶解した。
【０１７７】
細胞溶解物(Cell lysat)を室温で１６０００ｇで５分間回転させて、細胞屑と大きなタンパク質凝集体を除去した。ノベックス＋ＢＭＥバッファー２５０μＬを加えてペレットを元の容量に再懸濁した。ウエスタンブロットは、全細胞（ノベックス条件）について行い、不溶性画分または可溶性画分それぞれでの抗原の発現を検出するためにペレットおよび上清についても同様に行った。陰性対照は、いかなる導入遺伝子も有していないＭＶＡ（Ｎ３３）に感染させた細胞の溶解物(lysat)であった。対照ＭＶＡにより免疫検出によって生成された任意の非特異的バックグラウンドを識別することができた。
【０１７８】
抗原または融合物が主に可溶性画分で検出された場合には、溶解物(lysat)０．４５ｍＬを、ＰＢＳで平衡化したＳ２００  １０／３０スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分画した。８〜１０ｍＬ（ボイド(void)容量）から２３．６ｍＬ（カラムの全体積）まで０．７５ｍＬの画分を収集した。
【０１７９】
これらの画分を、特異的抗体または血清を用いたウエスタンブロットにより分析して、各抗原または融合物の溶出プロフィールを決定した。融合物または抗原がカラムのボイド容量に溶出した場合、それは塊状であると考えられた。
【０１８０】
マウスモデルでの免疫原性評価
ＭＶＡ免疫付与プロトコール
ＭＶＡ  ＴＢ候補の免疫原性をＣ５７ＢＬ／６マウスで評価した。各ＭＶＡベクターを、トリス−ＨＣｌ緩衝スクロース含有バッファー１００μＬ中１×１０７ｐｆｕの用量で尾基部に４週間間隔で２回皮下投与した。細胞性免疫応答は、最後のＭＶＡ注射の７日後に、エリスポットＩＦＮγアッセイにより評価した。
【０１８１】
ペプチドライブラリー
ペプチドライブラリーを用いて、免疫付与したマウスの脾細胞をｅｘ−ｖｉｖｏで再刺激した。より正確には、上記の構築物中に含まれる総てのＭｔｂ抗原を含むペプチド（１１個のアミノ酸がオーバーラッピングする１５量体）を合成した（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ）。ペプチドのプールを終濃度１μｍｏｌ／ＬにＤＭＳＯで調製した。各Ｍｔｂ抗原の全長を網羅するには、１〜４つのプールが必要であった。
【０１８２】
ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂは、最初の３つのプールでは２４個のペプチドが入り、４つ目のプールでは１９個のペプチドが入った４つのプールに含まれた。プール１：ＲｐｆＢ残基３０〜１２７を含む２２個のペプチド；プール２：ＲｐｆＢ残基１１７〜２１５を含む２２個のペプチド；プール３：ＲｐｆＢ残基２０５〜２８４およびＲｐｆＤ残基５３〜７１を含む２２個のペプチド；プール４：ＲｐｆＤ残基６１〜１５３を含む２１個のペプチド。
【０１８３】
Ｒｖ１８１３は、Ｒｖ１８１３残基３４〜１４３を含む２５個のペプチドが入った１つのプールに含まれた。
【０１８４】
Ｒｖ３４０７は、Ｒｖ３４０７残基１〜９９を含む２２個のペプチドが入った１つのプールに含まれた。
【０１８５】
Ｒｖ２６２６は、１７個および１６個のペプチドが入った２つのプールに含まれた。プール１：Ｒｖ２６２６残基１〜７９を含む１７個のペプチド；プール２：Ｒｖ２６２６残基６９〜１４３を含む１６個のペプチド。
【０１８６】
Ａｇ８５Ｂは、２３個のペプチドが入った３つのプールに含まれた。プール１：Ａｇ８５Ｂ残基３９〜１４１を含む２３個のペプチド；プール２：Ａｇ８５Ｂ残基１３１〜２３３を含む２３個のペプチド；プール３：Ａｇ８５Ｂ残基２２３〜３２５を含む２３個のペプチド。
【０１８７】
ＥＳＡＴ−６は、ＥＳＡＴ−６の残基１〜９５を含む２１個のペプチドが入った１つのプールに含まれた。
【０１８８】
ＣＦＰ１０は、ＣＦＰ１０の残基１〜１００を含む２３個のペプチドが入った１つのプールに含まれた。
【０１８９】
ＴＢ１０．４は、ＴＢ１０．４の残基１〜９６を含む２１個のペプチドが入った１つのプールに含まれた。
【０１９０】
Ｒｖ０２８７は、Ｒｖ０２８７の残基１〜９７を含む２２個のペプチドが入った１つのプールに含まれた。
【０１９１】
ＩＦＮγエリスポットアッセイ
免疫付与したマウスの脾細胞を採取し、赤血球を溶解した（Ｓｉｇｍａ、Ｒ７７５７）。１ウェル当たり２×１０５細胞を、１０％ＦＣＳ（ＪＲＨ、１２００３−１００Ｍ）、８０Ｕ／ｍＬペニシリン／８０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ＰＡＮ、Ｐ０６−０７−１００）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、２５０３０）、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ、１５６３０）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ、３１３５０）および５０μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、３１３５０）を補給したαＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ、２２５７１）中の抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；１０μｇ／ｍＬ、５５１２１６）でコーティングしたマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＨＡ  Ｓ４５１０）中で、かつ１０単位／ｍＬの組換えネズミＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２１２−１２）の存在下で、陰性対照として単独で、または
・終濃度１μｍｏｌ／Ｌの上記ペプチドプール
・陽性対照では、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ５２７５）
・関連性のないペプチド
とともに、４０時間、三反復で培養した。
【０１９２】
ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を、以前に記載されているエリスポット（サイトカイン特異的酵素結合免疫スポット(cytokine-specific enzyme linked immunospot)）アッセイにより定量した(Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76: 12735-46)。結果は、三反復のウェルについて得られた平均値として示している。観察された応答についての正の［ＳＥＬ１］実験閾値（またはカットオフ）は、１０６細胞に対して報告されている、培地単独で観察されたスポットの平均値＋２つの標準偏差に対応する閾値を計算することによって決定した。ＣＴＬエリスポットリーダーに関連がある技術的カットオフは、５０スポット／１０６細胞である（リーダーのＣＶ（変動係数）が体系的に２０％未満であった上記の値である）とも定義された。技術的カットオフと実験的カットオフとの間の最大のカットオフ値は、数値で表される。カットオフを上回る応答のみ（各マウス群の中央値）が陽性とみなされる。エリスポット応答の統計分析は、クラスカル・ワリス検定を用いることにより行い、有意差が得られた場合には、続いて、マン・ホイットニー検定を行った。Ｐ値が０．０５以下であることが有意であるとみなされる。
【０１９３】
結果
実施例１：ヘテロ二量体パートナーの融合物を発現する組換えＭＶＡの生成。
ＭＶＡＴＧ１８５９８  ＭＶＡを、２つのヘテロ二量体パートナー融合物ＥＳＡＴ６およびＣＦＰ１０とＴＢ１０．４およびＲｖ０２８７（ＴＢ９．８とも呼ばれる）を、潜伏性（Ｒｖ２６２６、Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３）、活動性（Ａｇ８５Ｂ）および再燃性（ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ）のＭｔｂ抗原を含む３つの追加マイコバクテリア抗原融合物とともに発現するように操作した。ヘテロ二量体のフォールディングに有利に働くように、１３個〜１４個のアミノ酸のフレキシブルリンカーを各パートナーの間に付加した。いくつかの場合には、自己切断ペプチド２Ａをコードする配列を融合物の２つの要素の間に付加して、別々に両方の要素の合成を可能にした。２つの異なるペプチド２Ａを構築物に使用した：Ｔ２Ａ（トセア・アシグナウイルス由来）およびＥ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス由来）。要するに、ＭＶＡＴＧ１８５９８は、５つの異なるプロモーターによって駆動される５つの独立した発現カセットを含有する（表１に示すとおりである）。
【０１９４】
ＭＶＡＴＧ１８５９７およびＭＶＡＴＧ１８６０４は、（非融合型構成）ヘテロ二量体パートナーＥＳＡＴ６およびＣＦＰ１０（ＭＶＡＴＧ１８５９７）と、ＴＢ１０．４およびＲｖ０２８７ならびにＲｖ３４７８およびＲｖ３４７７（ＭＶＡＴＧ１８６０４）とを、他の追加の潜伏性（Ｒｖ２６２６、Ｒｖ３４０７およびＲｖ１８１３）、活動性（Ａｇ８５Ｂ）および再燃性（ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ）のＭｔｂ抗原ＭＶＡとともに共発現する対照として生成した。
【０１９５】
より具体的には、
・ＭＶＡＴＧ１８５９８は、１０個のＭｔｂ抗原の５つの融合物、それぞれ、ｐＢ２Ｒプロモーターの制御下にＲｖ２６２６／２ａ／Ａｇ８５Ｂ＊＊、ｐＨ５Ｒプロモーターの制御下にＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６、ｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ、ｐＳＥ／Ｌプロモーターの制御下にＴＢ１０．４／ＴＢ９．８およびｐＡ３５Ｒプロモーターの制御下にＲｖ３４０７／２ａ／Ｒｖ１８１３＊を含有する。
・ＭＶＡＴＧ１８５９７は、ｐＢ２Ｒプロモーターの制御下にＥＳＡＴ６、ｐＨ５Ｒプロモーターの制御下にＣＦＰ１０、ｐＳＥ／Ｌプロモーターの制御下にＲｖ２６２６、ｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にＡｇ８５Ｂ＊およびｐＡ３５Ｒプロモーターの制御下にＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂを含有する。
・ＭＶＡＴ１８６０４は、ｐＢ２Ｒプロモーターの制御下にＲｖ０２８７、ｐＨ５Ｒプロモーターの制御下にＴＢ１０．４、ｐＳＥ／Ｌプロモーターの制御下にＲｖ３４０７、ｐ７．５Ｋプロモーターの制御下にＲｖ３４７８およびｐＡ３５Ｒプロモーターの制御下にＲｖ３４７７を含有する。
【０１９６】
【表１】
0006605480.tif 000002
【０１９７】
実施例２：ＭＶＡにより発現されるＭｔｂ抗原および融合物のウエスタンブロット分析
ＣＥＦ細胞を、ＭＧ１３２の存在下または不在下で、上記の様々なＭＶＡ候補により感染させ（ＭＯＩ  ０．２）、発現産物をウエスタンブロットにより材料および方法に記載した条件下で分析した。免疫検出は、ＣＦＰ−１０、Ｒｖ０２８７およびＲｖ３４７７を除いた、本明細書に記載される様々なＭｔｂ抗原の特異的な抗体を用いて行った。具体的には、ウサギの免疫付与後に得られた血清（材料および方法を参照）を、Ｒｖ１８０７、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ＊、Ｒｖ１８１３＊、Ｒｖ３４０７，およびＲｖ３４７８の検出に使用し、一方、市販の抗体を、ＥＳＡＴ６、Ａｇ８５Ｂ＊、ＴＢ１０．４およびＲｖ２６２６の検出に使用した。
【０１９８】
結果を表２に要約した。ＭＶＡＴＧ１８５９８に感染した細胞に由来する細胞溶解物では、抗ＥＳＡＴ６抗体および抗ＴＢ１０．４抗体による免疫検出後に、ヘテロ二量体の融合物ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６およびＴＢ１０．４／Ｒｖ０２８７に対応する強いバンドが検出された。ペプチド２Ａの切断の結果として生じるバンドは、融合物Ｒｖ２６２６／２ａ／Ａｇ８５Ｂ＊＊については抗Ｒｖ２６２６抗体および抗Ａｇ８５Ｂ＊抗体による免疫検出後に；および融合物Ｒｖ３４０７／２ａ／Ｒｖ１８１３＊については抗Ｒｖ３４０７抗体および抗Ｒｖ１８１３抗体による免疫検出後に検出された。
【０１９９】
一方で、個別の抗原（ＭＶＡＴＧ１８５９７およびＭＶＡＴＧ１８６０４）として発現された場合には、同じベクター中にそれらのそれぞれのヘテロ二量体パートナーが存在するにもかかわらず、抗ＥＳＡＴ６抗体によりかすかなバンドが検出されたが、抗ＴＢ１０．４抗体では検出された発現はなかった。しかしながら、両方の構築物において、追加のＭｔｂ抗原は対応する抗体による免疫検出により検出された。実際に、予想されるサイズに対応するバンドは、抗Ａｇ８５Ｂ、抗ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂ、抗Ｒｖ２６２６、抗Ｒｖ３４７８および抗Ｒｖ３４０７血清／抗体による免疫検出後に検出された。
【０２００】
【表２】
0006605480.tif 000003
【０２０１】
実施例３：ＭＶＡにより発現されるＭｔｂ抗原および融合物の溶解性分析
ＭＧ１３２不在で、ＭＶＡＴＧ１８５９８、ＭＶＡＴＧ１８５９７およびＭＶＡＴＧ１８６０４に感染させたＣＥＦを、抗原または融合物の溶解性について分析した。ＣＦＰ１０、Ｒｖ０２８７およびＲｖ３４７７は分析しなかった。１６０００ｇで５分間遠心分離することにより細胞屑と大きなタンパク質凝集体（不溶性画分を含んでなるペレット）を沈降させることが可能である。これに対して、フォールディングされたタンパク質と小さな凝集体は上清（可溶性画分）中に残る。ペレットを上清と同じ容量に再懸濁し、上清および再懸濁したペレットの５〜１５μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした。その結果、「ペレット」（Ｐ）および「上清」「Ｓ」で検出されたシグナルの強度は直接比較できた。表３は、上に列挙した３つのＭＶＡの発現された各抗原または融合物についての結果の要約である。
【０２０２】
【表３】
0006605480.tif 000004
【０２０３】
主に可溶性画分で発現されたいくつかの抗原について、抗原または融合物の凝集状態を評価するために、可溶性画分のＳＥＣを行った。使用したカラム（すなわち、スーパーデックス２００  １０／３０）は、球状タンパク質の場合、分画範囲１０〜６００ｋＤａを有する。質量＜６００ｋＤａの任意の球状モノマータンパク質はカラムのボイド容量の後に溶出する。従って、ボイド容量の後に溶出する任意の融合物または抗原は、凝集していないと考えられた。結果を表４に示している。
【０２０４】
【表４】
0006605480.tif 000005
【０２０５】
溶解性の結果の概要
・Ａｇ８５Ｂは、ＭＶＡＴＧ１８５９７およびＭＶＡＴＧ１８５９８に感染させたＣＥＦにおいて、予想されるサイズ（融合していない）で可溶性タンパク質として検出された。ＭＶＡＴＧ１８５９８に感染させたＣＥＦでは、Ａｇ８５Ｂ非切断融合物のサイズに対応するかすかなバンドも検出された。これらのバンドは微弱すぎてＳＥＣにより分析することができなかった。ＳＥＣ分析により、上述の２つのウイルスにより発現されたＡｇ８５Ｂがフォールディングされたタンパク質であることが実証された。
・Ｒｖ２６２６は、ＭＶＡＴＧ１８５９７およびＭＶＡＴＧ１８５９８に感染させたＣＥＦにおいて、予想されるサイズ（融合していない）でフォールディングされた可溶性タンパク質として検出された。
・ＥＳＡＴ６は、非融合発現された場合（ＭＶＡＴＧ１８５９７）にはほとんど検出されなかったが、ＣＦＰ１０と融合されている場合（ＭＶＡＴＧ１８５９８）には十分に検出された。興味深いことに、ＭＶＡＴＧ１８５９８によりコードされたＣＦＰ１０−ＥＳＡＴ６融合物のみ完全に溶解し、フォールディングされていた。
・ＴＢ１０−４は、非融合発現された場合（ＭＶＡＴＧ１８６０４）には検出されなかったが、Ｒｖ０２８７と融合されている場合（ＭＶＡＴＧ１８５９８）には十分に検出された。興味深いことに、ＭＶＡＴＧ１８５９８によりコードされたＴＢ１０−４−Ｒｖ０２８７融合物のみ完全に溶解し、フォールディングされていた。
・ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂは、ＭＶＡＴＧ１８５９８によりモノマータンパク質として発現された場合に検出された。ＭＶＡＴＧ１８５９８により発現されたＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂは可溶性であり、ＳＥＣ分析により、ＲＰＦＢ−Ｄｈｙｂタンパク質が部分的に凝集していることが実証された。
・Ｒｖ３４０７は、ＭＶＡＴＧ１８５９８に感染させたＣＥＦにおいて、ＭＧ１３２の不在下で検出することができなかった。Ｒｖ３４０７は、ＭＶＡＴＧ１８６０４に感染させたＣＥＦにおいて完全に溶解するタンパク質として発現される。可溶性画分について、分析用ＳＥＣは行わなかった。
・Ｒｖ３４７８は、融合していないタンパク質としてＭＶＡＴＧ１８６０４によりコードされる。Ｒｖ３４７８は不溶性画分でのみ検出されるかまたは可溶性画分および可溶性画分の両方で検出された。
【０２０６】
要するに、ＥＳＡＴ６およびＴＢ１０．４で示されるように、マイコバクテリア抗原とその天然ヘテロ二量体パートナーとの融合物は、得られた遺伝子産物の発現および溶解性を向上させる。
【０２０７】
実施例４：Ｍｔｂ抗原を発現するＭＶＡ候補ワクチンの免疫原性の評価
４．１  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡＴＧ１８５９８候補ワクチンの免疫原性の評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３つのタンパク質融合物を発現するＭＶＡＴＧ１８３７９（ＷＯ２０１４／００９４３８に記載されている）《 Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 + Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807 》または５つの異なるタンパク質融合物を発現するＭＶＡＴＧ１８５９８《 Rv2626-2a-Ag85B + CFP10-ESAT6 + TB10.4-Rv0287 + RpfB-Dhyb + Rv1813-2a-Rv3407 》のいずれかにより４週間間隔で２回免疫付与した。特異的な細胞性免疫応答を、最後の注射の１週間後、本明細書に記載されるペプチドプールによる刺激後にＩＦＮγエリスポットアッセイによって評価した。また、陰性対照として、空ＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧＮ３３．１）によってマウスに免疫付与した。
【０２０８】
図１ｂに示されるように、ＭＶＡＴＧ１８３７９およびＭＶＡＴＧ１８５９８の両方がＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡｇ８５Ｂ（プール３）、ＥＳＡＴ６およびＴＢ１０．４の特異的なＩＦＮγ陽性応答を誘導し、１１３〜１５４８スポット／１０６細胞の範囲であった。加えて、ＥＳＡＴ６の特異的な応答は、ＥＳＡＴ６のパートナーＣＦＰ１０を発現するＭＶＡＴＧ１８５９８（３８７スポット／１０６細胞）の場合に、ＣＦＰ１０を発現しないＭＶＡＴＧ１８３７９（１１９スポット／１０６細胞）と比べて著しく強かった。また、Ａｇ８５Ｂ特異的な応答は、マウスにＭＶＡＴＧ１８５９８を注射した場合に、ＭＶＡＴＧ１８３７９でのワクチン接種を受けた群と比べて著しく高かった（それぞれ、１５４８スポット／１０６細胞と９２８スポット／１０６細胞）。ＴＢ１０．４特異的な応答は、ＭＶＡＴＧ１８３７９またはＭＶＡＴＧ１８５９８のいずれかでのワクチン接種を受けた両方の群の間で類似していた。ＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂ特異的な応答は、ＭＶＡＴＧ１８３７９でのワクチン接種を受けたマウスでのみ検出された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて注射されたワクチンが何であっても誘導されたＲｖ２６２６、Ｒｖ１８１３またはＲｖ３４０７の特異的なシグナルはなかった。予想どおり、空ＭＶＡＴＧＮ３３．１ウイルスでのワクチン接種を受けたマウスで検出されたＩＦＮγ応答はなかった（図１ａ）。
【０２０９】
４．２  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡＴＧ１８５９７およびＭＶＡＴＧ１８６３３候補ワクチンの免疫原性の評価
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、３つのタンパク質融合物を発現するＭＶＡＴＧ１８３７７（ＷＯ２０１４／００９４３８に記載されている）《 Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111 + RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6 + Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807 》、５つの個別のＭｔｂ抗原を発現するＭＶＡＴＧ１８５９７《 Ag85B + ESAT6 + CFP10 + Rv2626 + RpfB-Dhyb 》または以下のとおりのＣＦＰ１０を除く同じ個別のＭｔｂ抗原をコードするＭＶＡＴＧ１８６３３：《 Ag85B + ESAT6 + Rv1813 + Rv2626 + RpfB-Dhyb 》のいずれかにより４週間間隔で２回免疫付与した。特異的な細胞性免疫応答を、最後の注射の１週間後、共通Ｍｔｂ抗原の、本明細書に記載されるペプチドプールによる刺激後にＩＦＮγエリスポットアッセイによって評価した。また、陰性対照として、空ＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧＮ３３．１）によってマウスに免疫付与した。
【０２１０】
図２ｂに示されるように、３つのＭＶＡ−ＴＢワクチンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＡｇ８５Ｂ（プール３）、ＥＳＡＴ６およびＲｐｆＢ−Ｄｈｙｂの特異的なＩＦＮγ陽性応答を誘導し、８５〜２１１３スポット／１０６細胞の範囲であった。加えて、ＥＳＡＴ６の特異的な応答は、ＥＳＡＴ６のパートナーＣＦＰ１０タンパク質を発現するＭＶＡＴＧ１８５９７（３７５スポット／１０６細胞）の場合に、ＣＦＰ１０タンパク質を発現しないＭＶＡＴＧ１８３７７およびＭＶＡＴＧ１８６３３（それぞれ、８５スポット／１０６細胞および１０２スポット／１０６細胞）と比べて著しく強かった。また、Ａｇ８５Ｂ特異的な応答（プール１および３）は、マウスにＭＶＡＴＧ１８５９７またはＭＶＡＴＧ１８６３３を注射した場合（２６２〜２１１３スポット／１０６細胞）に、ＭＶＡＴＧ１８３７７でのワクチン接種を受けた群（５２〜４６８スポット／１０６細胞）と比べて著しく高かった。Ｒｖ１８１３特異的な応答は、ＭＶＡＴＧ１８３７７でのワクチン接種を受けたマウスでのみ検出された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて注射されたワクチンが何であっても誘導されたＣＦＰ１０特異的なシグナルもＲｖ２６２６特異的なシグナルもなかった。予想どおり、空ＭＶＡＴＧＮ３３．１ウイルスでのワクチン接種を受けたマウスで検出されたＩＦＮγ応答はなかった（図２ａ）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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