(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性物質の分離に使用される液体クロマトグラフィーシステムであって、少なくとも中空カラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィーシステムであって、中空カラムが充填剤を充填していない無処理の中空の石英シリカ又は天然クオーツ製のキャピラリーカラムであり、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御し、
カラム長、カラム内径及び移動相のイオン強度を変化させることにより生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する、液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２】
生理活性物質の分離に使用される液体クロマトグラフィーシステムであって、少なくとも中空カラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィーシステムであって、中空カラムが充填剤を充填していない無処理の中空の石英シリカ又は天然クオーツ製のキャピラリーカラムであり、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御し、
さらに、流速、移動相の粘度及びカラム温度からなる群から選択される条件を変化させることにより、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する、液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項３】
中空カラムがフューズド石英シリカ又はドープ石英シリカである、請求項１又は２に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項４】
中空カラムの長さが、３〜１００ｍであり、請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーシステム。 
【請求項５】
移動相として、水又はリン酸緩衝生理食塩水が用いられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項６】
カラムを通過する移動相の流速が１．３〜８９ｍｍ／秒（０．０３９〜２．６μＬ／分）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項７】
移動相として、リン酸緩衝生理食塩水を用い、タンパク質を分離する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項８】
移動相として水を用い、高分子物質を分離する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィーシステムを用いて生理活性物質を分離分析する方法。 
【請求項１０】
少なくとも中空カラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィーシステムを用いて生理活性物質を分離分析する方法であって、中空カラムが充填剤を充填していない無処理の中空の石英シリカ又は天然クオーツ製のキャピラリーカラムであり、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御し、
カラム長、カラム内径及び移動相のイオン強度を変化させることにより生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する、生理活性物質を分離分析する方法。
【請求項１１】
少なくとも中空カラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィーシステムを用いて生理活性物質を分離分析する方法であって、中空カラムが充填剤を充填していない無処理の中空の石英シリカ又は天然クオーツ製のキャピラリーカラムであり、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御し、
さらに、流速、移動相の粘度及びカラム温度からなる群から選択される条件を変化させることにより、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する、生理活性物質を分離分析する方法。
【請求項１２】
中空カラムがフューズド石英シリカ又はドープ石英シリカである、請求項１０又は１１に記載の生理活性物質を分離分析する方法。
【請求項１３】
中空カラムの長さが、３〜１００ｍであり、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の生理活性物質を分離分析する方法。
【請求項１４】
移動相として、水、リン酸緩衝生理食塩水又はＮａＣｌ溶液が用いられる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の生理活性物質を分離分析する方法。
【請求項１５】
カラムを通過する移動相の流速が１．３〜８９ｍｍ／秒（０．０３９〜２．６μＬ／分）である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の生理活性物質を分離分析する方法。
【請求項１６】
移動相として水を用い、高分子物質を分離する、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の生理活性物質を分離分析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空カラムを用いた液体クロマトグラフィーによる物質の分離分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、分離分析手段として今や医・工・農・薬等のほとんどすべての分野で汎用されており、現在の科学研究や社会生活を支える基盤となる技術の１つであるといっても過言ではない。社会と科学の進展とともに、より高感度、高選択性、高分解性、高速性、自動化、小型化が達成されてきたが、生命科学やナノテクノロジーの研究領域では、より一層優れた分離分析法が渇望されている。例えば、環境試料や生体試料の分析に、近年環境負荷の低減や分離能の向上、特に分子量の小さい化合物に対して、高分子化合物やナノ粒子の効率的な分離精製方法が望まれている。【０００３】
（１）環境に優しい化学という理念が提案されており、この理念に沿った環境に優しいクロマトグラフィーも望まれている。【０００４】
（２）タンパク質は、アミノ酸残基からなるポリマーで、ひも状構造を有しており、そのひもが折りたたまれることで特定の構造を形成し、生体内で重要な役割を果たしている。一方で、折りたたみが正確に行われない、又は形成された構造が変形することが原因で病気が引き起こされる例が多く見つかっている。また最近の新薬は、タンパク質製剤と呼ばれるタンパク質を用いた医薬品の割合が急速に増えており、その割合は今後も一層、増加することが予想されている。タンパク質製剤は、タンパク質が本来の構造を維持している場合には目的の薬効を示すが、構造が変化することで、薬効を示さないばかりか、疾患を悪化させる可能性もある。タンパク質の構造は機能と密接に関連しているが、従来の液体クロマトグラフィーで用いていたカラム内に充填する充填剤に、タンパク質が吸着してしまう問題があった（非特許文献１及び非特許文献２を参照）。従来の液体クロマトグラフィーでは、タンパク質の構造を維持した状態で分離分析することはできなかった。【０００５】
（３）アルツハイマー病、プリオン病等のいわゆるフォールデイング病はその組織に含まれるタンパク質の構造が変化した結果、異常凝集が生じることが原因であることがわかっている。例えば、アルツハイマー病の発症と密接な関与が疑われているβアミロイドは、異なった構造を形成し、それぞれが毒性等の物性が異なることが知られている。タンパク質の凝集過程で生じる中間体のサイズは数nm から十数μmと大きいため、汎用カラムでは充填剤間の隙間を通ることができないため分析することができない。さらに、タンパク質がカラム内にある充填剤に吸着することで、構造の変化が起こってしまうと予想された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Goda, R. et al., Biomedical Chromatography 2007,21 (10), 1005-1015.
【非特許文献２】Goda, R. et al., Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 2012, 895, 137-145.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、充填剤を充填していない長いカラムを用い、弱い作用力を利用した液体クロマトグラフィーシステムであって、従来の液体クロマトグラフィーシステムを用いても分離作用力が小さく分離できない物質の分離を可能とする液体クロマトグラフィーシステムの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
液体クロマトグラフィーは移動相によって固定相内に移動する際に、各物質の移動速度差を利用した分離法である。通常、固定相は充填剤としてカラム内に充填される。分離を達成するためには、主な固定相と移動相に様々な工夫が必要になる。例えば、固定相については、素材、表面修飾、サイズ、形、表面積などが分離性能に影響を与える。特に充填剤として何を使用するかは重要な問題である。一方、移動相について、移動相の組成、成分の分配比率は分離影響因子になる。良好な物質の分離を達成するためには、固定相及び移動相の上記の因子を適切に調整する必要がある。【０００９】
本発明者は充填剤をなくし、かつ移動相が大きな分離影響因子にならない液体クロマトグラフィーによる分離方法について鋭意検討を行った。その結果、分析条件を考慮しなくても物質の分離が可能になる分離法を開発することができた。【００１０】
充填剤や移動相の分離因子を考慮しない場合、分離のためのカラムと移動相と分離する物質の間の相互作用が弱くなり過ぎて分離が不可能になることも考えられた。【００１１】
しかし、本発明者は、分離しようとする物質とカラム内壁との弱い相互作用や流体力学的流動の影響を利用して物質を分離することを可能にするシステムを見出した。本発明の方法によれば、いかなる移動相も利用することができると予測される。また、分離のための相互作用が弱いという問題は、カラムの長さを長くすることで解消し、物質の分離能を向上させることができる。カラムの長さを長くすることで、分離のための相互作用が起こる頻度を増やすことができる。互いに分離しようとする物質の移動速度差が小さい場合でも、理論段数が高くなり、従来の方法では分離が困難であった物質の検出ピークを分けられるとも可能になる。【００１２】
また、本発明の分析システムは微小化の結果、使用する溶媒を減じることができ、さらに、有機溶媒ではなく、純水のみやリン酸緩衝生理食塩水（PBS）等を移動相として用いることができ、環境への負担が少ない分析を可能にする。【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  生理活性物質の分離に使用される液体クロマトグラフィーシステムであって、少なくとも中空カラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィーシステムであって、中空カラムが充填剤を充填していない無処理の中空の石英シリカ又は天然クオーツ製のキャピラリーカラムであり、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する液体クロマトグラフィーシステム。
[２]  カラム長、カラム内径及び移動相のイオン強度を変化させることにより生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する、[１]の液体クロマトグラフィーシステム。
[３]  さらに、流速、移動相の粘度及びカラム温度からなる群から選択される条件を変化させることにより、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御する、[１]又は[２]の液体クロマトグラフィーシステム。
[４]  中空カラムがフューズド石英シリカ又はドープ石英シリカである、[１]〜[３]のいずれかの液体クロマトグラフィーシステム。
[５]  中空カラムの長さが、３〜100ｍである、[１]〜[４]のいずれかの液体クロマトグラフィーシステム。
[６]  移動相として、水又はリン酸緩衝生理食塩水が用いられる、[１]〜[５]のいずれかの液体クロマトグラフィーシステム。
[７]  カラムを通過する移動相の流速が1.3〜89mm/秒(0.039〜2.6μＬ/分)である、[１]〜[６]のいずれかの液体クロマトグラフィーシステム。
[８]  移動相として、リン酸緩衝生理食塩水を用い、タンパク質を分離する、[１]〜[７]のいずれかの液体クロマトグラフィーシステム。
[９]  移動相として水を用い、高分子物質を分離する、[１]〜[８]のいずれかの液体クロマトグラフィーシステム。
[１０]  [１]〜[９]のいずれの液体クロマトグラフィーシステムを用いて生理活性物質を分離する方法。
[１１]  少なくとも中空カラムを備えることを特徴とする液体クロマトグラフィーシステムを用いて生理活性物質を分離分析する方法であって、中空カラムが充填剤を充填していない無処理の中空の石英シリカ又は天然クオーツ製のキャピラリーカラムであり、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御することにより、生理活性物質を分離分析する方法。
[１２]  カラム長、カラム内径及び移動相のイオン強度を変化させることにより生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御することにより、[１１]の生理活性物質を分離分析する方法。
[１３]  さらに、流速、移動相の粘度及びカラム温度からなる群から選択される条件を変化させることにより、生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御することにより、[１１]又は[１２]の生理活性物質を分離分析する方法。
[１４]  中空カラムがフューズド石英シリカ又はドープ石英シリカである、[１１]〜[１３]のいずれかの生理活性物質を分離分析する方法。
[１５]  中空カラムの長さが、３〜100ｍであり、[１１]〜[１４]のいずれかの生理活性物質を分離分析する方法。
[１６]  移動相として、水、リン酸緩衝生理食塩水又はＮａＣｌ溶液が用いられる、[１１]〜[１５]のいずれかの生理活性物質を分離分析する方法。
[１７]  カラムを通過する移動相の流速が1.3〜89mm/秒(0.039〜2.6μＬ/分)である、[１１]〜[１６]のいずれかの生理活性物質を分離分析する方法。
[１８]  移動相として水を用い、高分子物質を分離する、[１１]〜[１７]のいずれかの生理活性物質を分離分析する方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の中空カラムを有する液体クロマトグラフィーシステムを用いることにより、弱い作用力を利用し、従来のシステムでは分離できない物質同士を分離することができる。【００１５】
また、移動相として、純水又はリン酸生理緩衝食塩水を用いた場合、分離しようとする物質を変性させることなくインタクトのまま分離精製するころができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】用いたスプリッターの構造を示す図である。
【図２】用いた液体クロマトグラフィーシステムの概要を示す図である。
【図３】スプリッターによる分流効果を示す図である。
【図４】中空カラムの長さによるカラム内の送達流速とカラムへの試料の注入量の影響を示す図である。
【図５】カラムの理論段数、カラムの長さ、及び線流速との関係を示す図である。
【図６】液体クロマトグラフィーシステム１とシステム２を用いて分析して得られたクロマトグラムの比較を示す図である。
【図７】液体クロマトグラフィーシステム２とシステム３を用いて分析して得られたクロマトグラムの比較を示す図である。
【図８】液体クロマトグラフィーシステム２で異なる内径の中空カラムを利用して分析したクロマトグラムの比較を示す図である。
【図９】液体クロマトグラフィーシステム２で異なる長さの中空カラムを利用して分析したクロマトグラムの比較を示す図である。
【図１０】カラムの内径及び長さの検討結果のまとめを示す図である。
【図１１−１】中性低分子であるチオウレアと低分子荷電物質の分離の結果を示す図である。
【図１１−２】低分子荷電物質の相対保持時間を示す図である。
【図１２−１】チオウレアと分子量及び荷電数の異なるFITC-デキストランの分離の結果を示す図である。
【図１２−２】各分子量のFITC-デキストランのチオウレアに対する相対保持時間を示す図である。
【図１３】用いたフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランの特性を示す図である。
【図１４】DNA、ローダミンB及び分子量マーカーの分離の結果を示す図である。
【図１５】低分子物質と高分子物質の同時分離の結果を示す図である。
【図１６】移動相の塩濃度の分離に対する影響を示す図である。
【図１７】塩濃度の相対保持時間への影響を示す図である。
【図１８】中空カラムの内壁と分離しようとする物質の相互作用を示す図である。
【図１９】移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いたときのタンパク質の分離の結果を示す図である。
【図２０】タンパク質の相対保持時間、理論段数及び等電点（pI）との関連を示す図である。
【図２１】４種類の試料の同時分析の結果を示す図である。
【図２２】電気二重層の厚さと負電荷物質が管内に内壁から排除される距離との比較を示す図である。
【図２３】層流特性に基づいた溶出時間モデルの図である。カラム内の流れの状態をレイノルズ数で評価している。
【図２４】負電荷物質のカラム内での分布を示す図である。
【図２５】検討物質の特性を示す図である。
【図２６】分子量による計算された粒径（図２５）と相対保持時間の理論的な関係を示す図である。
【図２７】管内内壁から排除される距離Ｘとカラム長との関係を示す図である。
【図２８】カラム内径と相対保持時間の関係を示す図である。
【図２９】管内内部から排除される距離Ｘとカラム内径の関係を示す図である。
【図３０−１】移動相のNaCl濃度による4kDaのFITC-デキストランとチオウレアの分離クロマトグラムを占めず図である。
【図３０−２】移動相のNaCl濃度による40kDaのFITC-デキストランとチオウレアの分離クロマトグラムを占めず図である。
【図３０−３】移動相のNaCl濃度による500kDaのFITC-デキストランとチオウレアの分離クロマトグラムを占めず図である。
【図３０−４】移動相のNaCl濃度による2000kDaのFITC-デキストランとチオウレアの分離クロマトグラムを占めず図である。
【図３１】塩濃度と相対保持時間の関係を示す図である。
【図３２】管内内壁から排除される距離Ｘと移動相NaCl濃度の関係を示す図である。
【図３３】高濃度のNaClの分析条件におけるFITC-デキストランの粒子径と相対保持時間の関係を示す図である。
【図３４】温度と相対保持時間の関係を示す図である。
【図３５】管内内壁から排除される距離Ｘとカラム温度との関係を示す図である。
【図３６】コンカナバリンAとローダミンBの混合試料を分析したクロマトグラムを示す図である。
【図３７】カタラーゼとローダミンBの混合試料を分析したクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、生理活性物質の精製工程に使用される液体クロマトグラフィーシステムである。本発明の液体クロマトグラフィーシステムは、少なくとも中空カラムを備えており、さらにマイクロポンプ、スプリッター（splitter)、検出部及び接続部等を備えていてもよい。
【００１８】
本発明で用いる中空カラムは、充填剤を充填していないカラムであり、内壁への固定相の担持等の修飾処理がなされていない無処理の中空カラムである。中空カラムをや中空キャピラリーカラムと呼ぶこともできる。
【００１９】
該カラムは、石英シリカ又は天然クオーツ製であり、好ましくは石英シリカ製である。さらに、好ましくはフューズドシリカ（石英ガラス）又はドープ石英シリカ製のカラムである。
【００２０】
中空カラムは市販のフューズドシリカ（石英ガラス）又はドープ石英シリカ製の毛細管を用いることができ、例えば、Polymicro Technologies(商標）毛細管(キャピラリー）(Phoenix,AZ,USA)を用いることができる。
【００２１】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムで用いる中空カラムは充填剤を充填しないため、分離しようとする物質の充填剤の吸着等、分離しようとする物質と充填剤との相互作用を生じさせずに分離することができる。充填剤を充填したカラムを用いる場合、タンパク質等の高分子物質を分離しようとする場合、分離しようとする物質が充填剤に吸着することがあり、分離がうまくできないことがあるが、本発明の液体クロマトグラフィーシステムではそのような問題はない。
【００２２】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムで用いる中空カラムの長さは３〜100mであり、好ましくは３〜72mであり、さらに好ましくは８〜72mである。カラムは直線状でもよいが、長い場合設置スペースを節約するためにコイル状に巻いた形状のカラムを用いることもできる。カラムの長さが長くなるとより分離能が向上する。また、カラムは連続した１本のカラムを用いることが好ましく、途中に接続部がないほうがよい。通常、長いカラムでは背圧（back pressure)が大きくなってしまう。本発明では、未充填の中空カラムを用いることにより背圧を小さくすることができる。
【００２３】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムで用いる中空カラムについて、背圧の観点から、内径が大きくなると、送液しやすくなる。しかしながら、本発明の液体クロマトグラフィーシステムで用いる中空カラムの分離作用力は、内壁の薄い層と関与しているので、カラムの内径は重要ではなく、いかなる内径のものも用い得る。ただし、カラムの内径が1μm以下になると、薄い層の厚さが無視できず、内径の影響が出やすいと考えられる。従って、好ましくは、１μm以上、好ましくは５μm以上、さらに好ましくは25μm以上である。カラムの内径の上限は、50μm、好ましくは40μm、さらに好ましくは30μmである。カラムの内径が小さくなるとより分離能が向上する。
【００２４】
石英シリカ製の中空カラムを用いる場合、中空カラム内壁には石英ガラスの負電荷のシラノール基（SiH3OH-)が存在し、分離しようとする物質と中空カラム内壁のシラノール基との間に弱い静電的相互作用が生じる。この弱い相互作用により、荷電を有する物質の溶出に役立たち、結果として中空カラムの分離能が向上する。
【００２５】
マイクロポンプとは、低流速で送液するポンプであり、脈波を最小限に抑えることができる。マイクロポンプは市販のものを使用することができる。
【００２６】
スプリッターは移動相の流れを２つに分ける部品である。スプリッターにより移動相は分離用カラムを通る流れとドレイン用カラムを通る流れの２つの流れに分けられる。２つの流れに向かう移動相の比率は適宜調整することができる。スプリッターを用いることにより低い流速で安定した高圧の流れを達成することができる。スプリッターは市販の液体クロマトグラフィーシステム用のものを用いることができる。スプリッター中の流量を制御する部分をリストリクター(restrictor）と呼ぶ。
【００２７】
検出部には、中空カラムを通って分離された物質が通る検出セルがあり、セル内を通る物質の吸光度、蛍光等を吸光光度計検出器や蛍光検出器により測定し、定量する。検出セルの内径は好ましくは中空カラムの内径より小さい。
【００２８】
接続部は、パーツ同士を接続する部分をいう。
【００２９】
また、本発明の液体クロマトグラフィーシステムは、オートサンプラーを含んでいてもよい。市販オートサンプラーの精密な注入量は1μL以上であり、nLオーダーの試料をカラム内に導入する前に、スプリッターの前にオートサンプラーを配置することが好ましい。
【００３０】
中空カラムを用いる場合、上記のマイクロポンプやスプリッター等を用いて、微小な送液速度（nL/min）、微小な試料注入(nL/injection)、死体積の最小化、及び試料拡散の最小化等を達成し得る。
【００３１】
移動相としては、液体クロマトグラフィーに用い得る移動相ならばいずれの移動相も用いることができる。分析目的に合わせて、自由に使用できる。例えば、純水又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）が挙げられる。また、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化カリウム（KCl)、過塩素酸ナトリウム（NaClO4)溶液等の塩溶液も用いることができる。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）又は塩溶液を用いる場合、塩の種類や塩濃度を変化させることにより移動相のイオン強度を変化させ、電気二重層の厚さが変化し、分離条件を変えることができる。移動相中に有機溶媒や界面活性剤が含まれていないため、分離しようとする物質が有機溶媒や界面活性剤による変性作用を受けることがない。
【００３２】
本発明の、中空カラムは水酸化ナトリウムで流すだけで洗浄することができ、また長期間の使用も可能である。
【００３３】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムによる物質の分離は、分離しようとする物質と中空カラムの内壁との間で生じる作用、すなわち中空カラムの内部表面との静電的相互作用と及び流体力学的流動の作用による。中空カラムの内部表面との相互作用は、中空カラム内壁のシラノール基との間に弱い静電的相互作用による。流体力学的流動については、移動相が層流となって流れ、層流により物質の分離が影響を受ける。層流とは、流れの中で、液体の各部分が互いに混ざりあうことなくカラムの管軸と平行に流れるものをいう。層流はカラムに近づくほど流速は小さくなり、カラムの中心で最も流速が大きくなる。カラム内での拡散の程度が互いに異なる物質同士は層流により分離される。カラムの内径、流速、移動相の粘度等の条件が一定の場合に、層流が形成される。上記の内径のカラムを用いる限り、層流は形成される。
【００３４】
層流特性に基づいて作成した溶出時間（Okada T, 2010. J. Liq, Chromatogr. Rel. Technol. 33: 1116-29)を図２３に示す。カラム内の流れの状態をレイノルズ数で評価している。レイノルズ数は0.04〜0.9の範囲であったため、カラム内の流れは層流であると考えられる。次いで、層流特性に基づいて溶出時間モデルを評価した。内壁付近の流速が０であると考えられるので、中性低分子であるチオウレアの溶出は水の平均流速になる。中心の最大線流速が平均流速の2倍となる。図において、カラムの内径をaで、カラム内に注入した試料体積がの断面半径はrで表す。試料の溶出体積は積分で求められる。負電荷化合物の溶出と平均流速の比率から、ｒが求められる。また、a-rで表される距離は、試料が内壁から排除された距離になる。
【００３５】
本発明の中空カラムを有する液体クロマトグラフィーシステムを用いた場合、低圧で物質を分離可能であり、かつ低流速で分離可能である。このため、分離の理論段数を向上させることができ、分離能の向上が期待できる。本発明のシステムを用いて物質を分離するときの流速は1.3〜89mm/秒(0.039〜2.6μＬ/分)で、カラム内にスプリッターによる分流した試料の注入量は0.20〜4.9×103nLである。
【００３６】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムを用いた場合、低分子物質からタンパク質等の高分子物質まで広く分離し解析することができる。特に分離しようとする物質を変性させないという点で生理活性物質の分離に適しており、生理活性物質の分離工程で本発明の液体クロマトグラフィーシステムを用いることができる。ここで、生理活性物質とは、生体に作用し、種々の生体反応を制御する化学物質をいい、低分子物質から高分子物質まで含まれる。生理活性物質には、タンパク質、DNAやRNA等の核酸、糖、脂質等も含まれる。
【００３７】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムのカラムは、充填剤を有しない中空カラムであるため、カラム内に大きな空隙を有し、高分子物質も通過させることができる。
【００３８】
特にタンパク質の凝集体の分析も可能になり、タンパク質の重合体や凝集体と単量体を分離することが可能である。例えば、本発明の液体クロマトグラフィーシステムによれば、アルツハイマー病、プリオン病等のいわゆるフォールデイング病における構造が変化して生じた異常凝集タンパク質を分離検出することができる。このようなタンパク質として、アルツハイマー病に関わるアミロイドβ(Aβ)が例示される。Aβは健常人にも存在し、日常的に体内で合成・分泌されている。健常人では、Aβが蓄積せず、アルツハイマー病患者では蓄積し、アルツハイマー病の発症につながる。本発明の液体クロマトグラフィーシステムを利用して、Aβの重合と蓄積の機構を詳細に解析することで、アルツハイマー病発症の機構が明らかになると考えられる。重合過程が詳細に明らかになり、その反応を阻害することができれば、アルツハイマー病の発症を抑えることができる。さらには重合体を分解することができれば、アルツハイマー病の治療も可能になると考えられる。
【００３９】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムを用いた場合、電荷を有する物質は中空カラムの内壁との静電的相互作用により分離されやすくなる。
【００４０】
例えば、フューズド石英シリカでできたカラム等内壁に負に荷電した基が存在するカラムを用い、移動相として純水を用いた場合、負電荷を有する物質にはイオン排除効果が作用し、正電荷を有する物質にはイオン交換効果が作用し、分離される。すなわち、中空カラム内の電気二重層が厚くなり、負に荷電している物質はカラムの内壁から排除され、カラム内の中心に分布するようになる。ここで、電気二重層とは、表面にイオン濃度勾配で表面から充分に離れた溶液のバルク部分との電位差が生じる層である。図２４Ａは負電荷が小さい物質の分布を示し、図２４Ｂは負電荷が大きい物質の分布を示す。図に示すように負電荷が大きい物質ほど早く溶出する。図２４Ｃは流れ方向から観察した様子を示す。図２４中、外側の太い線はカラムの管壁を示し、カラムの内壁には、シラノール基（SiH3OH-)が存在している。カラム内壁の負電荷のシラノール基（SiH3OH-)の影響で電気二重層が形成され、負電荷物質はカラムの内壁から排除されて遠くなり中心近辺を通って流れる。また、矢印は移動相の流れを示す。カラムの管壁に平行な細い実線はその部分で電気二重層が形成されていることを示す。さらに、点線で囲んだ部分は分離しようとする物質が集まっているサンプルゾーンを示し、サンプルゾーン中の矩形のものは分離しようとする物質を示す。塩濃度が小さくなると、電気二重層が厚くなり、カラム内壁にシラノール基のような負に荷電した基が存在する場合、負に荷電している物質はカラムの内壁から排除され、カラム内の中心に分布するようになる。その結果、相対保持時間が小さくなる。カラムの管内流体は層流であり、中心流体の線流速は内壁付近の線流速より速いため、中心に分布している物質は受ける線流速の影響で早く溶出される。すなわち、塩の濃度が小さいと、負電荷物質の分離向上能が上がる。移動相と接触したキャピラリー内壁が移動相の移動に連動して相対的に移動しているとき、移動相と内壁が接触している接触相の表面からある厚さの層にある溶液は粘性のために接触相とともに移動する。内壁に存在している電気二重層（〜1000nm）は無視できず、静的な二重層というより、動的二重層ということができる。
【００４１】
また、例えば、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水を用いた場合、タンパク質等の正電荷物質にイオン交換効果が作用し、等電点の大きさの順で溶出され得る。本発明は、本発明の液体クロマトグラフィーシステムを利用し、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いタンパク質を分離する方法を包含する。
【００４２】
移動相としてリン酸緩衝生理食塩水又はNaCl溶液等の塩溶液を用いて本発明の液体クロマトグラフィーシステムを用いて物質を分離するときにイオン強度を変更することにより、分離条件を変えることができる。移動相のイオン強度を変えることにより、電気二重層の厚さが変わり、物質がカラム内壁から排除される距離が変わる。すなわち、塩濃度が大きくなると電気二重層が薄くなり、内壁との相互作用が弱くなり、内壁から排除される距離が小さくなる。その結果、相対保持時間は小さくなり早く溶出する。さらに、塩濃度が大きくなると、例えば、延伸した形状の物質を球状に変化させるように、分子量が大きい物質の形状（構造）を変化させる。球状構造を有する物質は、粒子径が小さくなり、相対保持時間比率が低下する。従って、移動相の塩濃度を変えることにより、あるいはカラム温度を変えることにより、分離しようとする物質とカラム内壁との相互作用を制御することができ、複数の物質の分離を制御することができる。
【００４３】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムを用いたタンパク質を分離する場合の理論段数は10,000以上であり、通常の液体クロマトグラフィーシステムを用いて分離するときよりも大きい。
【００４４】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムを用いて物質を分離するときのカラム温度は、分離し温度が変わると、影響されるものが多くて、例えば、ブラウン運動、物質自身の構造、物質の表面電荷、物質と内壁との相互作用などに影響される。一般的に、試料に対して、低温条件で分析するのは望ましく、0℃で分析可能である。温度が高すぎると、カラムの品質にも影響されるので、だいたい70℃以下での条件が好ましい。すなわち、カラム温度を変えることにより、分離しようとする物質とカラム内壁との相互作用を制御することができる。
【００４５】
タンパク質等の高分子物質を分離する場合、ローダミンB等の低分子物質を共存させることにより、低分子物質が高分子物質に吸着し、保持時間が遅くなり、溶出が遅くなる。これは、低分子物質が吸着することより、高分子物質の表面の電荷が変化するか、あるいは、高分子物質の構造が変化し、保持時間が変化するためであると考えられる。すなわち、高分子物質と低分子物質を共存させることにより、高分子物質の保持時間を制御することができる。共存物質の分析の目的は、共存物質を吸着することにより、タンパク質の表面や構造を微少変化させ分離能を変化させることにある。
【００４６】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムにおいては、カラム長、カラムの内径、移動相のイオン強度、流速、移動相の粘度、カラム温度等を変化させ調整することにより、分離しようとする物質を中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御することができる。
【００４７】
本発明の液体クロマトグラフィーシステムは、弱い相互作用を利用して物質を分離するクロマトグラフィーであり、タンパク質の構造や生理効果を維持して分離することができる。
【００４８】
本発明は、液体クロマトグラフィーにより生理活性物質を分離分析する方法であって、カラム長、カラム内径、移動相のイオン強度及びカラム温度からなる群から選択される条件を変化させ調整することにより生理活性物質の中空カラムの内部表面との静電的相互作用を制御して、生理活性物質を分離分析する方法を包含する。
【００４９】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５０】
実施例１  中空カラムを有する液体クロマトグラフィーシステムの構築
実施例において、以下の液体クロマトグラフィーシステムを用いた。
システム１：
MP711ポンプ(GL Science,Tokyo, Japan)
MI709オートサンプラー(GL Science)
ポンプからオートサンプラーへの接続L：中空キャピラリー（内径30μm,0.73m）
amicro 21 UV-02 UVアレイディテクター(Jasco, Tokyo, Japan)
HPLC system organizer (EZChrom Elite v.3.1.7J)
キャピラリー: Polymicro technology (Phoenix,AZ,USA)
接続部： GL Science
【００５１】
システム２： 
MP711ポンプ(GL Science,Tokyo, Japan)
C4マニュアルインジェクター(VICI AG, Schenkon, Switzerland)
ポンプからマニュアルインジェクターへの接続部はなく、直接に接続した。
電気泳動システム（Agilent 7100 キャピラリー電気泳動システム）
接続部： GL Science PTFE チューブ、
【００５２】
システム３：
構成： ポンプNCP-3200RS Nano/Cap Pump, WPS-3000PL(RS) (Thermo
Fisher Scientific, Japan)
注入部：WPS-3000FCオートサンプラー(ThermoFisher Scientific, Japan)
ポンプからオートサンプラーへの接続L：中空キャピラリー（内径20μm,1.5m）
検出部： VWD-3100 and VWD-3400RS （(ThermoFisher Scientific, Japan.１回のクロマトグラフィーで複数の吸収スペクトルを記録できる可変波長検出器であり、検出セルは内径20μm、長さ50cmのキャピラリーである）
スプッリター：T-shaped splitter (LCap splitter, GL Sciences, Japan)
接続部：PTFE Tubing, Thermo Fisher Scientific
キャピラリー: Polymicro technology (Phoenix,AZ,USA)
【００５３】
システム１と２で用いたスプリッター１を図１Ａに示し、システム３で用いたスプリッター２を図１Ｂに示す。また、各システムの概要を図２に示す。図２Ａはシステム１を、図２Ｂはシステム２を、図２Ｃはシステム３を示す。
【００５４】
カラムはフューズドシリカ製で、充填剤のない中空キャピラリーカラムを用いた。
（１）微小な送液（nL/min)と試料注入（nL/injection)
微少な送液（nL/min）と試料注入(nL/injection)を行うため、システム１の液体クロマトグラフィーシステムを用いてスプリッターの分流性能を検討した。スプリッターによる分流効果を図３に示す。図３に示すように、スプリッターの分流比率はカラムの圧力と分流スプリットの圧力により決定した。カラムとスプリッターのスプリットの内径を両方とも25μmとし、カラムの長さを10mとした。ポンプの送液は1μL/minで一定とし、スプリッターのスプリット長さを0.5から2.3mに調整することで、スプリッターの分流比率を81％から26％に調製することができ、さらに、キャピラリーカラム内を通過する移動相の流速を0.81μL/minから0.26μL/minに調整できることを確認した（図３Ａ）。次に、スプリッターのスプリット長さをさらに短く0.1mまで減らしたところ、ポンプの送液を7から13μL/minに調整することで、ポンプからの送液を17％から11％まで調整することができ、さらに、カラム内を通過する流速を0.1μL/minまで調整できることを確認した。このように、ポンプの送液が9μL/min 以上にすると、再現性がよく、分流比率も一定になり、安定していた（図３Ｂ）。
【００５５】
システム３においては、カラムの長さが9〜72ｍの範囲で、スプリットを完全に外しても、ポンプの送液を1000μL/minに設定することにより、スプリッターによる微少送液（0.04μL/min〜、1.3mm/s）及びカラム内を通過する移動相の微少注入量（0.8nL）を達成することができた。キャピラリーカラムの長さによるカラム内の送達流速とカラムへの試料の注入量の影響を図４に示す。
【００５６】
この検討で得られたカラムの理論段数、カラムの長さ、及び線流速との関係を図５に示す。
【００５７】
（２）  システムの死容積（デッド・ボリューム）の最小化及び試料拡散の抑制
システムの死容積を最小化するため、また試料拡散を最大限に抑えるため、カラムは複数のカラムを接続したものではなく、一本の長いキャピラリーカラムを用いた。また、システムの流路のカラム以外の部分の容積を最小化した。すなわち、システム３に示すように、キャピラリーカラムをスプリッター内部に通し（図１Ｂのスプリッター２）、キャピラリーカラムとオートサンプラーの送液出口とを直接接続した。また、検出部の検出セルの内径はカラムの内径25μmより細い、20μmのキャピラリーセルを有する検出器を用いた。
【００５８】
（３）  フルオレセイン及びFITC-デキストランの分離
システム１及びシステム２の液体クロマトグラフィーシステムを用いて分離実験を行った。分離する試料として、フルオレセイン（fluorescein）及びフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン（fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran)）を用いた。平均分子量は、それぞれ、20kDa及び70kDaであった。
【００５９】
中空キャピラリーカラムは、システム１と２においては、内径25μm、長さ10mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用いた。移動相としては、純水を用いた。
【００６０】
結果を図６に示す。図６Ａはシステム１による分離の結果を示し、図６Ｂはシステム２による分離の結果を示す。最後のピークがフルオレセインのピークであり、その前のピークがフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランのピークである。
【００６１】
システム１の検出部のキャピラリーセルの内径75μmはカラムの内径より大きく、注入した試料がカラムを通過した後、検出部に到達したときに拡散してしまい、その結果、検出されたピークの幅が広くなった。一方、システム２においては、中空キャピラリーカラムに検出窓を作ることにより検出部を設けているため検出部の内径と中空キャピラリーカラムの内径は同じであった。このため、検出されたピークの幅が小さくなり、よりよい分離が可能となった。
【００６２】
（４）DNA及びフルオレセインの分離
システム２及びシステム３の液体クロマトグラフィーシステムを用いて分離実験を行った。分離する試料として、システム２を用いた分離実験ではDNA（サケ由来DNA、90〜270bp）及びフルオレセインを用いた。システム３を用いた分離実験ではDNA（サケ由来DNA、90〜270bp）及びローダミンB（rhodamine B）を用いた。
【００６３】
中空キャピラリーカラムは、システム２、システム３共に、内径25μm、長さ９mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用いた。移動相としては、純水を用いた。
【００６４】
結果を図７に示す。図７Ａはシステム２による分離の結果を示し、図７Ｂはシステム３による分離の結果を示す。最初のピークがDNAのピークであり、後のピークがローダミンBのピークである。
【００６５】
システム３では中空キャピラリーカラムをスプリッター内部に通して、オートサンプラーの送液出口と直接に接続した（図１Ｂのスプリッター２を使用）。検出部の検出セルとしては、カラムの内径25μmより細い内径20μmのキャピラリーセルを用いた。その結果、DNAの検出ピークの精度を上げることが可能であった。
【００６６】
実施例２  カラムの内径及び長さの分離能への影響の検討
（１）カラムの内径の分離能への影響の検討
システム２の液体クロマトグラフィーシステムを用いて分離実験を行った。分離する試料として、DNA（サケ由来DNA、90〜270bp）及びフルオレセインを用いた。
【００６７】
中空キャピラリーカラムは、内径50μm、長さ17.8mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラム、内径25μm、長さ47.6mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラム及び内径５μm、長さ5.0mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用いた。移動相としては、純水を用いた。
【００６８】
結果を図８に示す。図８Ａが内径50μm、長さ17.8mのカラムを用いた結果、図８Ｂが内径25μm、長さ47.6mのカラムを用いた結果、図８Ｃが内径５μm、長さ5.0mのカラムを用いた結果を示す。
【００６９】
図８に示すように、カラムの内径が小さいほど分離能が向上した。流速は内径50μm、長さ17.8mのカラムを用いたときは0.43μl/min、内径25μm、長さ47.6mのカラムを用いたときは0.33μl/min、内径５μm、長さ5.0mのカラムを用いたときは0.0015μl/minであった。
【００７０】
（２）  カラムの長さの分離能への影響の検討
システム２の液体クロマトグラフィーシステムを用いて分離実験を行った。分離する試料として、DNA（サケ由来DNA、90〜270bp）及びフルオレセインを用いた。
【００７１】
中空キャピラリーカラムは内径25μm、長さ3.1m、6.0m、9.0m又は47.6mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用いた。移動相としては、純水を用いた。
【００７２】
結果を図９に示す。図９Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれ長さ3.1m、6.0m、9.0m又は47.6mのカラムを用いた結果を示す。
【００７３】
図９に示すように、カラムの長さが長いほど分離能が向上した。流速は長さ3.1mのカラムを用いたときは0.61μl/min、長さ6.0mのカラムを用いたときは0.46μl/min、長さ9.0mのカラムを用いたときは0.22μl/min、長さ47.6mのカラムを用いたときは0.33μl/minであった。
【００７４】
図１０にカラムの内径及び長さの検討結果のまとめを示す。
【００７５】
実施例３  液体クロマトグラフィーシステムを用いた分離
１．  移動相として純水を用いての分析
（１）低分子物質の分離
中性低分子物質であるチオウレア（チオ尿素）(0)は電荷とサイズの効果を無視でき、移動相の溶出を現れることができるので、標準物質として用い、電荷低分子物質であるBCECF（2',7'-Bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein）(-4)、フルオレセイン(-2)、ローダミン(0)及びローダミン 6G(+1)と標準物質の分離を行った。かっこ内の数値は、電荷数を示す。カラムとして、内径25μm、長さ9.0mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相としては、純水を用いた。直線速度（流速）は、1.8±0.1mm/sであり、UV254nmで検出を行った。
【００７６】
分離の結果を図１１−１に示す。
【００７７】
チオウレアと電荷低分子物質であるBCECF(-4)、フルオレセイン(-2)、ローダミン(0)又はローダミン6G(+1)の分離の結果を、それぞれ図１１−１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。また、図１１−２には、それぞれの低分子電荷物質の相対保持時間を示す。
【００７８】
（２）高分子物質の分離
負の電荷高分子であるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン（分子量4kDa(-0.2)、40kDa(-4.8)、500kDa(-83.4)及び2000kDa(-444.4）、かっこ内の数値は電荷数を示す）とチオウレアを用いて分離を行った。図１３に用いたフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランの特性（分子量、置換度、電荷数、流体力学半径等）を示す。カラムとして、内径25μm、長さ9.0mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相としては、純水を用いた。直線速度（流速）は、2.6±0.3mm/sであり、UV254nmで検出を行った。
【００７９】
チオウレアとフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン 4kDa(-0.2)、40kDa(-4.8)、500kDa(-83.4)及び2000kDa(-444.4）の分離の結果を、それぞれ図１２−１Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤに示す。FITC-デキストランの検出ピークは分子量に依存し、プロードの形になり、チオウレアに対して相対保持時間比も電荷数との関連が認められた。表面電荷密度や構造にも関与していると予想されている。また、図１２−２には、それぞれの分子量のFITC-デキストランのチオウレアに対する相対保持時間を示す。
【００８０】
（３）DNAとローダミンBの分離
同様に内径25μm、長さ9.0mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相としては純水を用いて、DNA(10bp)又はDNA(90〜270bp)とローダミンBと分子量マーカー(12〜225kDa)の分離を行った。
【００８１】
結果を図１４に示す。図１４Ａは10bpのDNAとローダミンBの分離の結果、図１４Ｂは90〜270bpのDNAとローダミンBの分離の結果、図１４Ｃは90〜270bpのDNAとローダミンBと分子量マーカーの分離の結果を示す。
【００８２】
(４)低分子物質と高分子物質の同時分析
同様に内径25μm、長さ72mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相としては純水を用いて、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン、フルオレセイン、チオウレア及びローダミンBの同時分離を行った。
【００８３】
結果を図１５に示す。図１５に示すように低分子物質と高分子物質を同時に分離することができた。
【００８４】
実施例４  移動相の塩濃度のFITC-デキストランの相対保持時間比率に対する影響
内径25μm、長さ60mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相としてNaCl溶液を用いて、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランとチオウレアの分離を行った。NaCl濃度は5×10-3M、5×10-4M、5×10-5M、5×10-6M及び0Mであった。
【００８５】
結果を図１６に示す。図１６に示すように、NaCl濃度が小さいほど、分離がよくなった。図１６A、B、C、D及びEは、それぞれNaCl濃度が5×10-3M、5×10-4M、5×10-5M、5×10-6M及び0Mのときの結果を示す。
【００８６】
塩濃度の相対保持時間への影響を調べるため、内径25μm、長さ60mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相として種々の濃度のNaCl溶液を用い、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン（荷電-83）の相対的保持時間を測定した。結果を図１７に示す。図１７に示すように、塩濃度が小さいほど、相対保持時間も小さくなった。
【００８７】
分離が塩の影響を受けていることは、中空キャピラリーカラム内に、電気二重層が存在していることを示している。塩の濃度が小さくなり、電気二重層が厚くなり、相対保持時間が小さくなる（図１７）。この結果は、塩の濃度を小さくすることにより、負電荷物質の分離向上能が上がることを示している。
【００８８】
実施例５  pHによるカラムの内壁による相互作用の検討
カラムの内壁による相互作用が存在しているか確認するため、内径25μm、長さ９mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相として緩衝液を用いてローダミンBとギ酸（pKa 3.77)との分離を行った。緩衝液はA溶液0.2Mクエン酸とB溶液0.05Mリン酸ナトリウム二塩基性・十二水和物を調製した。176mLのA溶液と24mLのB溶液を混ぜることで、pH3の緩衝液が得られた。また、17mLのA溶液と183mLのB溶液を混ぜることで、pH12の緩衝液が得られた。pHの値はpHメーター(HM-30R, GST-5741C electrode, DKK-TOA Corporation)で確認した。移動相の直線速度（流速）は、1.8±0.1mm/sであり、UV254nmで検出を行った。
【００８９】
結果を図１８に示す。pHを３（図１８A)から１２（図１８B)へ変化させることにより、ギ酸とローダミンBの分離が可能になった。pHを３から１２へ変更した場合でも、中空キャピラリー内壁は負電荷を維持しており、カルボキシ基を解離し負電荷を持っているので分離できたと予測される。この結果は、中空キャピラリーカラムの内壁と分離しようとする物質の相互作用が存在していることを示す。
【００９０】
実施例６  移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いたときのタンパク質の分析
内径25μm、長さ60mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相としてNaCl溶液を用いて、アルブミン（pI4.5、分子量9.9×104）、カタラーゼ（pI5.6、分子量4.9×104）及びαキモトリプシン（pI8.8、分子量2.3×104）の分離を行った。
【００９１】
結果を図１９に示す。図１９に示すように３種類のたんぱく質を分離することができた。
【００９２】
さらに、同様のシステムを用いて種々のpIを有するタンパク質（サイログロブリンpI4.5、アルブミンpI4.7、カタラーゼpI5.6、コンカナバリンA pI8.4、αキモトリプシンpI8.8、リゾチームpI11）の相対保持時間とpIの関係を調べた。結果を図２０に示す。図２０に示すように、タンパク質の相対保持時間と等電点（pI）と理論段数との関連が認められた。タンパク質のpIが高いと、相対保持時間とピークの幅は大きくなった。この結果は、タンパク質がカラム内壁と相互作用していることを示している。
【００９３】
実施例７  分析時間効率の改善
内径25μm、長さ60mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、移動相として純水を用いた。分析時間を長くし、分離しようとする物質を連続注入した結果、１回の分析での複数試料の分析が可能になった。図２１に結果を示す。図２１に結果を示す検討では、１回の分析時間は約650分で、60分で、１回試料を注入し、その後４回試料を連続注入して分析した。650分の分析時間で、４種類の試料を同時に分析することができ、分析時間を短くし、分析の効率化を達成することができた。
【００９４】
実施例８  電気二重層の厚さと負電荷物質が管内に内壁から排除される距離の検討
長さ60mのフューズドシリカ製の中空キャピラリーカラムを用い、試料としてFITC-デキストラン（平均分子量５×10−5 M、電荷 -83）を用い、電気二重層の厚さと負電荷物質が管内に内壁から排除される距離を比較検討した。図２２に、電気二重層の厚さと負電荷物質が管内に内壁から排除される距離との比較を示す。塩NaClの濃度を変化させ、注入した試料が内壁から排除された距離と電気二重層の厚さを比較した。電気二重層の厚さは２種類の方法で計算した。比較の結果、塩の濃度が５×10−5 M以下の場合、試料が内壁からの距離が電気二重層より小さくなることがわかった。塩の濃度が低い場合、電気二重層が厚くなり、電気二重層内に物質が分布していることが示唆された。電気二重層が薄くなり、分離しようとする物質の粒径より小さくなると、物質の内壁からの距離は分離しようとする物質の粒径の影響が大きくなると考えられた。
【００９５】
実施例９  長い中空キャピラリーカラム及び超純水を用いた分析条件におけるFTIC-デキストランの溶出挙動
長い中空キャピラリーカラム及び水移動相を用いた分析条件では、キャピラリー内壁付近に薄い電気二重層が存在し、分離に大きな役割を果たしていると推測される。以下の４つの条件を変化させて検証した。
１）カラム長、２）カラム内径、３）移動相のイオン強度、及び４）カラム温度
【００９６】
評価のためのパラメータ：
a. 平均流速に対する相対保持時間比率Rf
本実施例で用いる分析システムは精密な流速制御が難しいため、平均流速を基準とし、物質の平均流速に対する相対保持時間比率Rf（Rf =t(analte)t(ave)）で物質の溶出を評価している。中性低分子物質は電荷を持たず、内壁との相互作用がないとしている。また、低分子物質はサイズ効果を無視することができ、さらに、拡散が速いため、拡散の影響も無視できると考えられる。本実施例では低分子物質であるチオウレア（チオ尿素）を選択し、チオ尿素を用いて得られた流速を平均流速とし、各物質のチオ尿素の平均流速に対する相対保持時間比率Rfにより、各物質の溶出挙動を評価した。
【００９７】
b. 層流溶出体積による管内内壁から排除される距離X
中空キャピラリーカラムは内壁との相互作用より、管内層流プロファイルが異なる線流速が分布しているという特徴がある。物質が層流プロファイル断面で受ける線流速で溶出時間を求められると考えられる。
【００９８】
物質はキャピラリー内壁から排除され、内壁から排除される距離により、受ける線流速を求めることができる。その排除距離は物質のサイズ、電荷などの影響因子があると考えられる。中空キャピラリー管内の層流であり、物理的な層流モデルで溶出体積を積分により正確に理論的に計算することができ、その結果、内壁から排除された距離を求めることができる。本実施例では負電荷を持つ異なる分子量のフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを実験対象とした。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランの理論上の計算値で、中空キャピラリーカラム内の物質の溶出挙動の解析を試みた。
【００９９】
１）カラム長の影響
分析条件
キャピラリーカラム： I.D. 25μm, 9, 16, 60m
移動相：超純水
温度: 室温(25℃)
可変波長UV 検出：200, 254, 460 nm
カラムの内壁に存在する薄い電気二重層を利用し、キャピラリー長を増加することで分離を向上することが検証できた。カラム長9、16及び60mで分析した結果、相対保持時間はカラムが長いほど小さくなることが判明した。相対保持時間が１より小さいときは、物質の移動が移動相の流速より速く、先に溶出されたと考えられる。FITC-デキストランは分子量が4、40、500、2000kDaと大きくなると共に負電荷数も-0.1、-2.0、-16.7、-66.7と増える。分子量、粒径又は負電荷数が大きいほど、溶出が早くなった。図２６は分子量による計算された粒子径（図２５）と相対保持時間の理論的な関係を示す。実験で得られた相対保持時間は理論値より低くなっている。このことは、粒子径による分離よりよかったことと意味している。
【０１００】
図２７には、管内内壁から排除される距離Ｘとカラム長との関係を示し、相対保持時間から計算される管内内壁から排除された距離Ｘを分子量ごとに流速2.5mm/s 附近の流速ごとに示した。分子量又は負電荷数が大きいほど、内壁からの距離が大きくなる。そのため、受ける線流速が速くなり、溶出が早くなったと考えられる。内壁から排除された距離はFITC-デキストランの粒径1.6、6.3、27.6、62.4nmより大きかった。このことは、内壁から排除される現象は分子量の違いだけで説明できず、電荷の排除効果にもよることを示している。
【０１０１】
実施例１において、キャピラリーが長くなるとDNAの分離が向上したことを示した。カラムが長いほど、分離が向上したのは、図２７に示すように、物質が管内の内壁から排除される距離が大きくなるからであると考えられる。また、物質が管内の内壁から排除され、内壁から遠くなることで、受ける線流速が大きくなることもその理由であると考えられる。
【０１０２】
２）カラム内径の影響
分析条件:
キャピラリーカラム：ID 25, 50, 75μm, 60m
移動相：超純水
温度: 室温(25℃)
可変波長UV 検出：200、254, 460 nm
キャピラリー内径が25μmの場合、内壁の層が大きな分離役割果たしていることに基づいて、内径 25、50及び75μmのカラムを用いて検討した。
【０１０３】
内径が大きくなると、相対保持時間が大きくなり、4 種の異なる分子量のFITC-デキストランの移動速度差が生じ、良好な分離が達成できた。
【０１０４】
図２８は、FITC-デキストランの粒子径とカラム内径の比率から、粒子径によるサイズ排除による理論上の相対保持時間との関係を示している。また、内径25、50、75μmのカラムで実験により得られた相対保持時間比率はサイズ排除効果の結果より良好であった。
【０１０５】
図２９は、管内内部から排除される距離Ｘとカラム内径の関係を示す。図２９より、内径25、 50、75μmのカラム内において、内壁から排除された距離は分子量が40kDaの場合に、内径の影響が多少あると考えられる。しかしながら、500kDa、2000kDaのFITC-デキストランの場合はあまり変化せず、内壁の層の厚さはカラム内径に依存しないことがわかった。ただし、カラムの内径が大きくなると、内壁の層の厚さが一定になり、図２３に示すように、試料分布領域とカラムの断面比率r/aが大きくなるため、相対保持時間も大きくなると予想できる。
【０１０６】
３）移動相のイオン強度の影響
分析条件
キャピラリーカラム： ID 25,50μm, 60m
移動相：超純水、0.000005, 0.00005, 0.0005, 0.001, 0.005, 0.05, 0.25 mol/L NaCl
5.0×10-6 mol/L、5.0×10-5 mol/L、5.0×10-4 mol/L、5.0×10-3 mol/L、5.0×10-2 mol/L、2.5×10-1 mol/L
流速：2.5 mm/s附近
温度: 室温(25℃)
可変波長UV 検出：200、254, 460 nm
塩（NaCl）の濃度の影響について、内径25μmのキャピラリーカラムを用いて検討を行った。移動相中のNaClの濃度は0.000005、0.00005、0.0005、0.001、0.005、0.05又は0.25mol/Lであった(図３０−１〜３０−４)。図３０−１、３０−２、３０−３及び３０−４は、それぞれ4kDa、40kDa、500kDa及び2000kDaのFITC-デキストランを異なる塩濃度で分析したときのクロマトグラムを示し、A〜Hは、それぞれH2O（超純水）、0.000005、0.00005、0.0005、0.001、0.005、0.05及び0.25 mol/L NaClの結果を示す。図中の右側（後方）のシャープなピークは標準物質であるチオウレアのピークで、移動相の平均流速で表している。図中の左側（前方）のブロード（幅広）なピークがFITC-デキストランのピークである。NaClの濃度が増加すると共に、FITC-デキストランのピークが標準物質であるチオウレアのピークへ近づいてきた。また、FITC-デキストランのピーク形状がシャープになってきた。
【０１０７】
この２つの変化について検討する。
1. 塩濃度が高くなるにつれてのFITC-デキストランのピークの標準物質であるチオウレアのピークへの接近
相対保持時間比率に基づきその現象を評価した結果を図３１に示す。図に示すように、NaCl濃度が高くなると相対保持時間比率が小さくなった。この理由として以下の３つが考えられる。
（１）キャピラリーカラム内壁にある電気二重層が薄くなった。
（２）FITC-デキストランの構造又は保持電荷が変化した。
（３）FITC-デキストランに対するキャピラリーカラム内壁の排除効果が弱くなった。
【０１０８】
2. FITC-デキストランのピーク形状のシャープ化
一般的に、ピーク形状は物質の分子量の分布であると考えられる。しかし、NaCl濃度が高くなったときに物質の分子量の分布が変化することは考えにくい。最近、塩濃度により核酸の折り畳み状態が変化し、クロマトグラムのピーク形状が変化したという報告があった（Friedrich, S. M. et al., Journal of the American Chemical Society 2016, 138 (1), 319-327）。本実施例においてもFITC-デキストランがNaCl濃度の違いにより、長い延伸した構造から球状構造へ変化していることが推測される。すなわち、長い延伸した構造を有する物質は、球状構造よりキャピラリーカラム内で移動しやすく、早く溶出し得ることが示唆される。
EDL(電気二重層）計算式:
0006476386.tif 000002
【０１０９】
カラム内壁にある薄い層による排除が電気二重層による排除であるかを検証するため、電気二重層の厚さに強く関与する移動相のイオン強度と管内内壁から排除される距離Ｘとの関係を調べることが有効である。超純水のイオン強度を1.0×10-7 mol/Lとし、NaCl濃度は0.0000017 mol/L〜 0.25 mol/Lの範囲で検討した結果（図３１）に基づいて、内壁から排除された距離を求めた(図３２)。図に示すように、内壁から排除された距離は電気二重層の厚さと相関していた。従って、電気二重層による電荷排除効果が物質の分離に影響していることが考えられた。
【０１１０】
内径50μmのカラムにおいて、相対保持時間と塩濃度との関連が認められた。
【０１１１】
内径25μmのカラムと同様に、塩の濃度が高くなり、電気二重層の厚さが小さくなり、その結果、試料分布領域とカラムの断面比率r/aが大きくなるため、相対保持時間が大きくなると考えられる。同じNaCl濃度の場合、内径50μmのカラムを用いた場合の相対保持時間は、すべて内径25μmのカラムを用いた場合より高くなった。この結果は、内径の影響を検討した結果(図２８)と一致している。
【０１１２】
一方、NaCl濃度が0.0005mol/L以上になると、電気二重層が非常に薄くなり、内壁から排除された距離はFITC-デキストランの粒子径より小さくなることも観測された。この現象は電荷排除ではなく、サイズ排除であると考えられる。図３３は、0.005、0.05及び0.25 mol/Lの濃度のNaClにおけるFITC-デキストランの粒子径と相対保持時間比率との関係と理論曲線を示す。
【０１１３】
NaCl濃度が0.005mol/Lの場合、理論値より小さかったため、電荷排除効果が影響していることが考えられた。それに対して、NaCl濃度0.05、0.25mol/Lの場合、相対保持時間比率は理論値より小さくなった。この結果は、塩濃度によるFITC-デキストランの構造が変化し、粒子径が小さくなり、相対保持時間比率が小さくなったためと考えられる。すなわち、分子量よる移動速度差が生じることが確認できた。
【０１１４】
４）カラム温度の影響
分析条件
キャピラリーカラム： ID 25μm, 60m
移動相：超純水
温度: 氷水(0℃),室温(25℃), 40, 50, 60℃
可変波長UV 検出：200、254, 460 nm
温度の影響について、ナノカラムを利用した分析では流速に影響があり、相対移動には影響がなかったと報告されている（Li, R. et al.,; Chemistry Letters 2012, 41 (11), 1506-1508）。本実施例では、０〜60℃の温度範囲で検討した。その結果、流速を一定とした場合、相対保持時間に影響が見られた（図３４）。温度が25℃以上と高い場合は物質のブラウン運動が強くなり、カラム内でカラム内壁へ近づく拡散運動が強くなり、内壁から排除される距離が小さくなった（図３５）。また、0℃での相対保持時間が高くなる現象が認められた。０℃における現象は、ブラウン運動ではなく、温度による層流の流速分布の変化等に影響されることを示している。
【０１１５】
結論
長い中空キャピラリーカラムと水移動相の分析条件で、１）カラム長、２）カラム径、３）移動相のイオン強度、及び４）カラム温度の４つの条件を検証した。その結果、キャピラリー内壁付近に薄い層が存在し、分離に大きな役割を果たしていることがわかった。層流計算モデルにより、カラム内の物質の分布情報を得られることがわかった。
【０１１６】
実施例１０  長い中空キャピラリーカラム及びリン酸生理緩衝食塩水を利用した分析条件でのタンパク質の溶出挙動
中空キャピラリーカラム及びリン酸緩衝生理食塩水を利用したタンパク質分析により、タンパク質の等電点が増加すると共に、相対保持時間は大きくなり、理論段数は小さくなることが示された（実施例６）。本実施例では、コンカナバリンAとカタラーゼの2種類のタンパク質がローダミンBの共存している場合に、ローダミンＢの濃度によって表面電荷が変化し、溶出挙動が変化するか否かを検討した。
分析条件
キャピラリーカラム： I.D. 25μm, 60m
移動相：リン酸緩衝生理食塩水
温度: 室温(25℃)
可変波長UV 検出：220, 280, 546 nm
【０１１７】
図３６及び３７はコンカナバリンA又はカタラーゼを0.05(A)、0.1(B)、0.5()及び2.5 mg/mL(D)のローダミンBとを混合し分離した結果を示す。コンカナバリンAを用いた場合のクロマトグラムを図３６に、カタラーゼを用いたクロマトグラムを図３７に示す。クロマトグラムの左側のシャープのピークはローダミンBのピークであり、右側のブロードなピークはコンカナバリンA又はカタラーゼのピークである。コンカナバリンA及びカタラーゼはそれぞれ２つのピークとして検出され、ローダミンBの濃度が増加することにより、２つ目のピークが大きくなる現象が認められた。これは、ローダミンBの濃度が高くなると、タンパク質に吸着されたローダミンBが多くなり、表面電荷が大きくなったためか、あるいは構造に変化が生じ、内壁との相互作用が強くなったためと考えられた。
【０１１８】
中空キャピラリーカラムとリン酸緩衝生理食塩水を利用したタンパク質分析において、コンカナバリンAとカタラーゼ の2種類のタンパク質がローダミンBの共存下でローダミンBの濃度によりピーク形状が変化し、保持時間が遅くなったと考えられる。
【図１】
0006476386.tif 000003
【図２】
0006476386.tif 000004
【図３】
0006476386.tif 000005
【図４】
0006476386.tif 000006
【図５】
0006476386.tif 000007
【図６】
0006476386.tif 000008
【図７】
0006476386.tif 000009
【図８】
0006476386.tif 000010
【図９】
0006476386.tif 000011
【図１０】
0006476386.tif 000012
【図１１−１】
0006476386.tif 000013
【図１１−２】
0006476386.tif 000014
【図１２−１】
0006476386.tif 000015
【図１２−２】
0006476386.tif 000016
【図１３】
0006476386.tif 000017
【図１４】
0006476386.tif 000018
【図１５】
0006476386.tif 000019
【図１６】
0006476386.tif 000020
【図１７】
0006476386.tif 000021
【図１８】
0006476386.tif 000022
【図１９】
0006476386.tif 000023
【図２０】
0006476386.tif 000024
【図２１】
0006476386.tif 000025
【図２２】
0006476386.tif 000026
【図２３】
0006476386.tif 000027
【図２４】
0006476386.tif 000028
【図２５】
0006476386.tif 000029
【図２６】
0006476386.tif 000030
【図２７】
0006476386.tif 000031
【図２８】
0006476386.tif 000032
【図２９】
0006476386.tif 000033
【図３０−１】
0006476386.tif 000034
【図３０−２】
0006476386.tif 000035
【図３０−３】
0006476386.tif 000036
【図３０−４】
0006476386.tif 000037
【図３１】
0006476386.tif 000038
【図３２】
0006476386.tif 000039
【図３３】
0006476386.tif 000040
【図３４】
0006476386.tif 000041
【図３５】
0006476386.tif 000042
【図３６】
0006476386.tif 000043
【図３７】
0006476386.tif 000044