(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)測定対象である試料に光を照射する、半導体発光素子を光源とした光照射部と、
b)前記光照射部から前記試料に対して照射された光に対し該試料を透過した光を検出可能な位置に配置された光検出部と、
c)点灯及び消灯を繰り返すように前記光源を駆動する光源駆動部と、
d)前記光源が点灯及び消灯を繰り返しているときに前記光検出部で連続的に得られる検出信号の中で、前記光源が点灯するように駆動されている期間中の少なくとも一部の期間に得られた検出信号を前記試料による吸収を反映した吸光データとして抽出する動作と、前記光源が点灯するように駆動されている状態から消灯するように駆動された直後に得られた検出信号を前記試料からの蛍光を反映した蛍光データとして抽出する動作と、を繰り返し行うことで、同一の前記試料に対する吸光データと蛍光データとを取得する信号処理部と、
を備えることを特徴とする光学分析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の光学分析装置であって、
前記光源として発光波長の相違する複数の半導体発光素子を用い、前記光源駆動部は、複数の光源を同時に点滅させるように又は複数の光源の一つを選択的に点滅させるようにそれら複数の光源を駆動することを特徴とする光学分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に対する吸光度測定と蛍光測定とを並行して行う光学分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフ（ＬＣ）により成分分離された液体試料中の成分を検出するために、紫外可視分光光度計やフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器などを用いた吸光度測定がしばしば行われる。また、蛍光特性を有する成分や蛍光標識可能な成分については、蛍光分光光度計を用いた蛍光測定が行われることがある。蛍光測定が可能である成分は限られるものの、一般に、蛍光測定は吸光度測定に比べて格段に高感度である。そのため、特に、ライフサイエンス、医薬品開発、環境測定といった微量分析の必要性が高い分野では、同じ試料に対して吸光度測定と蛍光測定とを並行して行いたいという要望も強い。
【０００３】
ＬＣにより成分分離された液体試料に対し吸光度測定と蛍光測定とを並行して行うために、一般的には、ＬＣのカラム出口に、ＰＤＡ検出器等の吸光検出器と蛍光検出器とを直列に又は並列に接続する構成が採られている。吸光検出器と蛍光検出器とを直列に接続した構成では、前段の検出器を通過した液体試料が配管を通して後段の検出器に導入される。このため、前段の検出器に比べて後段の検出器では、試料中の成分の時間方向への拡散の影響が大きくなり、例えばクロマトグラムのピークの幅が広がる、ピークトップの強度が低下する、といった問題がある。一方、吸光検出器と蛍光検出器とを並列に接続した構成では、ＬＣのカラム出口から溶出した液体試料を二つに分けて各検出器に導入する必要があるため、全く同一の液体試料を測定しているのではない（つまりは測定対象の液体試料中の成分の濃度が微妙に異なる）、また信号強度が低くなる、という問題がある。
【０００４】
上記のような問題を避けるために、一つの容器中に収容されている液体試料に対し吸光度測定と蛍光測定とを共に行うことができる装置も開発されている。例えば非特許文献１に記載の装置は、試料を透過した光を検出する吸光度測定用の光検出器と、試料から発せられた蛍光を検出するための、透過光が入射しない位置に設けられた蛍光測定用の光検出器と、の二つの光検出器を備え、吸光スペクトルと蛍光スペクトルとを同時に測定することができるようになっている。また、特許文献１にも、非特許文献１と同様の構成で蛍光測定と吸光度測定とを同時に実行可能であることが記載されている。しかしながら、こうした構成では、光検出器が複数必要であり、光学系の構成が複雑になりコストが高くなる。
【０００５】
一方、特許文献２には、試料と一つの光検出器との間にシャッタ機構を設けるとともに、試料から入射光に直交する方向に放出される光を上記光検出器まで案内する光ガイドを設け、吸光度測定を行うときにはシャッタを開放して試料を透過した光を光検出器に到達させ、蛍光測定を行うときにはシャッタを閉鎖して光ガイドを通した蛍光を光検出器に到達させることで、吸光度測定と蛍光測定とを共に行えるようにした装置が開示されている。この構成によれば、完全に同時ではないものの、シャッタによる光路の切替えを高速で行うことで、同一試料に対する吸光度測定と蛍光測定とを実質的に同時に行うようにすることができる。しかしながら、こうした構成でも光学系やシャッタ機構などの構成が複雑になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１４７８２６号公報（段落［００５１］、図５）
【特許文献２】特表２００６−５０３２６７号公報（段落［００２５］−［００２７］、図２）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】山内  進、「環境技術紹介  ３次元蛍光測定装置による蛍光性溶存有機物の評価」、かんぎきょう、公益社団法人日本環境技術協会、2014年7月、p.18-19
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、その目的とするところは、同一の光検出器を使用し光学系を簡素にすることで、低コスト且つ小形で同一試料に対する吸光度測定と蛍光測定とを実質的に同時に行うことができる光学分析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するためになされた本発明に係る光学分析装置は、
a)測定対象である試料に光を照射する、半導体発光素子を光源とした光照射部と、
b)前記光照射部から前記試料に対して照射された光に対し該試料を透過した光を検出可能な位置に配置された光検出部と、
c)点灯及び消灯を繰り返すように前記光源を駆動する光源駆動部と、
d)前記光源が点灯及び消灯を繰り返しているときに前記光検出部で連続的に得られる検出信号の中で、前記光源が点灯するように駆動されている期間中の少なくとも一部の期間に得られた検出信号を前記試料による吸収を反映した吸光データとして抽出する動作と、前記光源が点灯するように駆動されている状態から消灯するように駆動された直後に得られた検出信号を前記試料からの蛍光を反映した蛍光データとして抽出する動作と、を繰り返し行うことで、前記試料に対する吸光データと蛍光データとを取得する信号処理部と、
を備えることを特徴としている。
【００１０】
本発明に係る光学分析装置では、光源として、従来一般的に用いられている重水素ランプやキセノンフラッシュランプではなく、半導体発光素子が用いられる。ここでいう半導体発光素子は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセンスダイオード（ＳＬＤ）、レーザダイオード（ＬＤ）などである。こうした半導体発光素子の発光スペクトルのピーク幅は一般的に狭いため、高価な分光器による単色光化を行うことなく、そのまま測定光として利用することができる。
【００１１】
半導体発光素子は供給された電気エネルギーが直接光エネルギーに変換されて発光するため、駆動電流のオン・オフに対する発光の立ち上がり・立ち下がりの追従がきわめて速い。そのため、μsecオーダーでの高速なオン・オフ動作、つまりは点灯・消灯の繰り返し動作が可能である。そこで、本発明に係る光学分析装置において、光源駆動部は、所定の周波数で光源を点滅させるように該光源を駆動する。光源が点灯しているとき、該光源から発せられた光は測定光として試料に照射され、試料中を通過する間に該試料による吸収を受ける。そして、吸収を受けつつ透過して来た光が光検出部に到達する。そこで、信号処理部は、光源が点灯駆動されている期間中の少なくとも一部に光検出部で得られた検出信号を試料による吸収を反映した信号として所定の処理を行うことで、例えば試料による吸光度を算出する。
【００１２】
試料が蛍光特性を有する成分を含み、光源からの照射光の波長が励起光として作用する波長を含む場合、照射光を受けた試料からは蛍光が様々な方向に発せられる。光源が消灯し励起光が無くなっても試料からの蛍光の放出は、短時間ではあるが、或る程度の時間持続する。そこで、信号処理部は、光源が点灯状態から消灯された直後の期間に光検出部で得られた検出信号を試料からの蛍光を反映した信号として所定の処理を行うことで、例えば試料からの蛍光の強度を算出する。
なお、光源が点灯しているときの検出信号にも試料から発せられた蛍光の成分が含まれる可能性があるが、通常、蛍光の強度は透過光の強度に比べると十分に小さいので、吸光度を算出する際に問題となることはない。
【００１３】
半導体発光素子の発光の波長帯域は狭いため、通常、光照射部と試料との間の光路上には波長帯域を制限するフィルタなどの光学素子を設ける必要はないが、必要に応じて、光学フィルタを設置して照射光の波長帯域を制限してもよい。また、試料と光検出部との間の光路上にも同様に、適宜の光学フィルタや偏光素子などを設置してもよい。
【００１４】
また、蛍光標識された成分を励起する励起光の波長は蛍光物質などによって異なるから、複数の異なる蛍光物質でそれぞれ蛍光標識された様々な成分を検出するには、異なる波長の励起光を試料に照射する必要がある場合があり、一つの半導体発光素子ではそうした複数の波長をカバーできないことがある。
そこで、本発明に係る光学分析装置では、前記光源として発光波長の相違する複数の半導体発光素子を用い、前記光源駆動部は、複数の光源を同時に点滅させるように又は複数の光源の一つを選択的に点滅させるようにそれら複数の光源を駆動する構成としてもよい。
【００１５】
この構成によれば、異なる波長の励起光を同時に又は選択的に試料に照射し、その光が消えた直後に、試料から発せられる蛍光を光検出部で検出することにより、異なる蛍光物質で標識された成分による蛍光をともに検出することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る光学分析装置によれば、一つの光検出部を使用し、且つ光ガイドなどの特別な光学部品や光学素子を用いることなく、一つの試料容器中に収容されている試料に対する吸光度測定と蛍光測定とを実質的に同時に実行することができる。それにより、吸光度と蛍光の同時測定が、低コストで且つ小形である装置を用いて行える。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施例である吸光・蛍光検出器の概略構成図。
【図２】本実施例の吸光・蛍光検出器における動作タイミング図。
【図３】本発明の他の実施例である吸光・蛍光検出器の光学測定部の概略構成図。
【図４】本発明の他の実施例である吸光・蛍光検出器の概略構成図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の一実施例である吸光・蛍光検出器について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例の吸光・蛍光検出器の概略構成図、図２は本実施例の吸光・蛍光検出器における動作タイミング図である。測定対象である試料溶液が流通する試料セル２は、例えばＬＣのカラムの出口に接続され、カラムで時間的に分離された各種成分を含む試料溶液が試料セル２中に略一定流速で流れる。
【００１９】
図１において、単一のＬＥＤを光源とする光照射部１はＬＥＤ駆動部５から供給される駆動電流により駆動され発光する。この光照射部１から出射された光は、測定光及び励起光として試料セル２に照射される。測定光に対し試料セル２中を透過した光や励起光により試料セル２中の試料溶液から発せられた蛍光が光検出器３に到達する。光検出器３は光照射部１の発光波長及び試料から発せられる蛍光の波長に対して感度を有していさえすれば、その素子の種類は特に限定されない。また、光照射部１におけるＬＥＤは、測定対象である試料溶液中の蛍光特性を有する成分（蛍光標識されている場合にはその蛍光物質）に対する励起光の波長を含む発光スペクトルを示すものであればよい。
【００２０】
透過光や蛍光が光検出器３に入射することで該光検出器３で生成される検出信号は、アナログデジタル変換器（ＡＤＣ）６により所定のサンプリング間隔でデジタルデータに変換されてデータ処理部７に入力される。データ処理部７は、データ抽出部７１、吸光演算部７２、蛍光演算部７３などの機能ブロックを含む。制御部４は後述する吸光度・蛍光同時測定を行うためにＬＥＤ駆動部５を制御するとともに、データ処理部７にタイミング制御信号を送る。
なお、制御部４及びデータ処理部７はマイクロコンピュータを含むハードウエア回路によって構成することも可能であるが、一般的には、汎用のパーソナルコンピュータにイントールされた専用の制御・処理用のソフトウエアを該コンピュータ上で動作させることで、制御部４及びデータ処理部７の機能の全て又は一部を達成するようにすることができる。
【００２１】
次に、本実施例の吸光・蛍光検出器における典型的な動作の一例を説明する。
制御部４は図２（ａ）に示すような矩形波状の制御信号をＬＥＤ駆動部５及びデータ処理部７に送る。この矩形波状制御信号の周波数は例えば数Hz〜数kHz程度とすればよい。ＬＥＤ駆動部５は、制御信号がＨレベルであるときに光照射部１に所定の駆動電流を供給し、制御信号がＬレベルであるときに該駆動電流の供給を停止する。ＬＥＤ駆動部５は定電流回路を含み、駆動電流の電流値は常に一定に維持される。光照射部１においてＬＥＤの点灯・消灯は高速に行われるため、制御信号がＨレベルであるときにＬＥＤは点灯し、該制御信号がＬレベルであるときにＬＥＤは消灯する。つまり、上記矩形波状制御信号の周期で光照射部１におけるＬＥＤは点滅する。
【００２２】
ＬＥＤが点灯しているとき、光照射部１から発した光は試料セル２に照射され、該試料セル２中を通過する。そのとき、試料セル２中の試料溶液による吸収を受けるから、その光量が減衰して光検出器３に到達する。光検出器３は入射した光の強度（光量）に応じた検出信号を出力するから、上記制御信号がＨレベルであるときに光検出器３から出力される検出信号は、試料セル２中の試料溶液による吸収の度合を反映した信号となる。なお、試料溶液中に蛍光特性を有する成分が存在する場合、該成分は光を受けて蛍光を放出する。蛍光はあらゆる方向に発せられるため、一部は光検出器３に到達するが、通常、蛍光の強度は透過光の強度に比べると低いため、この蛍光の影響は殆ど問題とならない。
【００２３】
点灯しているＬＥＤが消灯すると、当然のことながら、測定光に対して試料溶液中を透過して来る光は無くなるが、消灯直前に試料溶液に照射されていた光を励起光として該試料溶液中の成分から発せられる蛍光は、短い時間（通常、サブナノ秒〜100ナノ秒程度）ではあるものの、励起光が無くなったあとも暫く放出され続ける。そのため、上記制御信号がＨレベルからＬレベルに変化した直後の所定時間の間に光検出器３から出力される検出信号は、試料溶液に含まれる成分から放出される蛍光のみを反映した信号となる。
【００２４】
そこで、データ処理部７においてデータ抽出部７１は、制御部４から与えられる制御信号に基づいて、時系列的に連続するデータから、試料溶液による吸光を反映したデータと試料溶液からの蛍光のみを反映したデータとをそれぞれ抽出する。
具体的には、データ抽出部７１は、図２（ｂ）に示すように、制御信号がＨレベルである期間中に得られたデータを試料溶液による吸光を反映したデータ（吸光データ）として抽出する。一方、図２（ｃ）に示すように、制御信号がＨレベルからＬレベルに変化した直後の所定期間中に得られたデータを蛍光を反映したデータ（蛍光データ）として抽出する。これにより、一つの光検出器３により得られた検出信号をデジタル化したデータから、実質的に同一の試料溶液に対する吸光データと蛍光データとを取得することができる。
なお、蛍光測定時に発生した長い寿命の蛍光が次の吸光測定の際に透過光として誤って検出されることを避けるために、制御信号のＨレベルとＬレベルとの切り替えの前又は後の一方又は両方に、データを検出しない不検出期間を設けてもよい。
【００２５】
吸光演算部７２は上記吸光データを受け取り、従来と同様の既知のアルゴリズムに従って試料溶液による吸光度を算出する。一方、蛍光演算部７３は上記蛍光データを受け取り、試料溶液中の成分から発せられた蛍光の強度値を算出する。光照射部１におけるＬＥＤの点滅の周期に比べて試料セル２中の試料溶液の流れは遙かに遅い。したがって、ＬＥＤが複数回点灯・消灯する期間中に試料セル２中の試料溶液は同じである（つまりは成分が変化しない）とみなすことができる。そこで、吸光演算部７２及び蛍光演算部７３は、時間的に連続する多数回のＬＥＤの点滅に対応して得られた吸光データ、蛍光データをそれぞれ積算したうえで、吸光度や蛍光強度を求めるようにすればよい。それによって、吸光度や蛍光強度の算出精度や感度を上げることができる。
【００２６】
以上のようにして、本実施例の吸光・蛍光検出器では、一つの光検出器を使用し光学系の構成を簡素にしながら、一つの試料に対する吸光度測定と蛍光測定とを実質的に同時に行うことができる。これによって、例えばＬＣで分離された様々な成分に対する吸光度及び蛍光強度を、低コストで小形の検出器を用いて求めることができる。
【００２７】
なお、蛍光の寿命は蛍光物質にも依存するから、目的成分を蛍光物質で標識する場合には、蛍光寿命ができるだけ長い物質を利用するほうが都合がよいことは言うまでもない。
【００２８】
上記実施例では、光照射部１から発した光をそのまま試料セル２に照射し、該試料セル２を透過した及び該試料セル２から発した光をそのまま光検出器３に導入していたが、光照射部１と試料セル２との間の光路上、試料セル２と光検出器３との間の光路上のいずれか一方又は両方に、所定の透過特性を有する光学フィルタなどの別の光学素子を設置してもよい。図３は、それら両光路上にそれぞれ光学フィルタ８Ａ、８Ｂを設けた場合の吸光・蛍光検出器の光路構成図である。
【００２９】
光照射部１と試料セル２との間の光路上には、励起光として有効な波長λ1を選択可能な透過特性を有する光学フィルタ８Ａを設ける。また、試料セル２と光検出器３との間の光路上には、励起光として有効な波長λ1と該励起光によって励起されて試料成分から発せられる蛍光の波長λ2とを選択可能な透過特性を有する光学フィルタ８Ｂを設ける。ＬＥＤの発光スペクトルのピーク幅は一般的に狭いが、測定に使用する波長以外の波長の光がノイズとなって測定精度の低下の原因となることもある。これに対し、図３に示した構成によれば、測定に不要である波長の光が光検出器３に入射することを防止して、測定精度を向上させることができる。
【００３０】
また、上記実施例では、或る特定の波長の光を測定光及び励起光として使用しているが、異なる蛍光特性を有する又は異なる蛍光物質で標識された複数の成分が含まれる試料をＬＣで分離して検出する場合、励起光として複数の波長の光を用いる必要がある場合がある。
こうした場合には、図４に示すように、発光スペクトルが相違する複数のＬＥＤを光照射部１Ｂに用い、制御部４は複数のＬＥＤを同時に点灯・消灯するようにＬＥＤ駆動部５を制御するか、或いは、複数のＬＥＤのうちの一つを選択的に点灯・消灯するようにＬＥＤ駆動部５を制御する構成とするとよい。ＬＥＤを選択的に点灯・消灯する場合には、複数のＬＥＤのそれぞれの点灯・消灯を順番に繰り返し行うという時分割的な動作としてもよい。
【００３１】
複数のＬＥＤを選択的に点滅させる場合には、例えば目的成分のＬＣでの保持時間に応じて点滅駆動するＬＥＤを切り替えてもよいが、ＬＥＤの発光波長が相違すると吸光度の比較が困難になる。そこで、例えばＬＥＤの発光波長の相違による同一成分の吸光度の相違を予め調べておき、それに基づいて異なるＬＥＤの下で得られた吸光度測定結果を校正して比較可能であるようにするとよい。
【００３２】
また、図１、図３、図４では記載を省略しているが、一般にＬＥＤは発光光量の温度依存性を有するため、これを軽減するために、光照射部１、１ＢにおいてはＬＥＤの温度が略一定に維持されるように温度制御を行ったり、ＬＥＤから出射した光の一部をモニタしてそのモニタ光量が略一定になるようにＬＥＤの駆動電流を制御するフィードバック制御を行ったりすることが望ましい。本実施例の吸光・蛍光検出器をＬＣの検出器として使用する場合には、カラムを略一定温度に維持するカラムオーブンの内部に本検出器を設置することで、そのカラムオーブンによって光照射部１、１Ｂの温度調整も行うことができる。
【００３３】
また、上記各実施例では光源としてＬＥＤを用いていたが、スーパールミネッセンスダイオード（ＳＬＤ）やレーザダイオード（ＬＤ）などのＬＥＤ以外の半導体発光素子を光源として用いた光学分析装置でも同様の構成とすることができる。
【００３４】
さらにまた、上記各実施例や上述した各種変形例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００３５】
１、１Ｂ…光照射部
２…試料セル
３…光検出器
４…制御部
５…ＬＥＤ駆動部
７…データ処理部
７１…データ抽出部
７２…吸光演算部
７３…蛍光演算部
８Ａ、８Ｂ…光学フィルタ
【図１】
0006595204.tif 000002
【図２】
0006595204.tif 000003
【図３】
0006595204.tif 000004
【図４】
0006595204.tif 000005