(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターフェロン-γ（以下「IFN-γ」と表記）に結合する抗体を有効成分とし、胸水を被検試料とすることを特徴とするイムノクロマト用の結核性胸膜炎診断剤であって、上記IFN-γに結合する抗体が、受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）である結核性胸膜炎診断剤。
【請求項２】
IFN-γに結合する抗体（抗IFN-γ抗体−１）が固定化された部位（反応部位）を一部に有する短冊またはスティック状の試験片、及びIFN-γに結合する標識された別の抗体（抗IFN-γ抗体−２）を含む試薬を含有する、結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットであって、
上記抗IFN-γ抗体−１が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、
上記抗IFN-γ抗体−２が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）から選択される、抗IFN-γ抗体−１とは異なるモノクローナル抗体であることを特徴とする結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
【請求項３】
上記試験片が、反応部位とは別の部位（コントロール部位）に、標識−抗IFN-γ抗体−２と結合する抗体が固定化されてなるものである請求項２に記載する結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
【請求項４】
上記抗IFN-γ抗体−２を標識する物質が発色物質または発光物質である、請求項２または３に記載する結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
【請求項５】
（1）IFN-γに結合する抗体（抗IFN-γ抗体−１）が固定化された短冊またはスティック状の試験片の当該固定化部位（反応部位）に、IFN-γを含み得る被験試料を接触させる工程、
（2）上記試験片の抗IFN-γ抗体−１固定化部位（反応部位）に、IFN-γを含み得る被験試料の存在下で、IFN-γに結合する標識された別の抗体（抗IFN-γ抗体−２）を接触させる工程、及び
（3）上記試験片の抗IFN-γ抗体−１固定化部位（反応部位）におけるシグナルを検出する工程
を有する結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法であって、
上記抗IFN-γ抗体−１が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、
上記抗IFN-γ抗体−２が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）から選択される、抗IFN-γ抗体−１とは異なるモノクローナル抗体であることを特徴とする結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法。
【請求項６】
上記試験片が、抗IFN-γ抗体−１の固定化部位（反応部位）とは別の部位に、標識−抗IFN-γ抗体−２と結合する抗体が固定化されたコントール部位を有するものであり、反応部位及びコントロール部位の両方でシグナルが検出される場合を結核陽性、反応部位でシグナルが検出されず、コントロール部位でシグナルが検出される場合を結核陰性、コントロール部位でシグナルが検出されない場合を測定不良と判断する、請求項５記載の結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法。
【請求項７】
IFN-γに結合する抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）を産生する、受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胸水中の検体から結核性の胸膜炎の診断をイムノクロマトを利用して行う方法（結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定法）、並びに当該方法に使用するイムノクロマト用結核性胸膜炎診断剤、及び結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットに関する。また、本発明は当該イムノクロマトテストに使用する抗体を特異的に産生するハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
胸水は、胸膜腔内の体液の貯留であり、漏出性胸水及び滲出性胸水の２つに分類される。漏出性胸水の原因は、静水圧の上昇と肺循環若しくは体循環におけるコロイド浸透圧の低下との併発であり、心不全が最も一般的である。滲出性胸水の原因は、体液、蛋白、細胞、およびその他の血清成分の滲出をきたす毛細管透過性の増大を引き起こす局所的変化であり、一般的には肺炎、悪性疾患、肺塞栓症、ウイルス感染および結核を挙げることができる。
【０００３】
結核が疑われる患者から採取された胸水を被験試料として結核検査をする場合、チールニルゼン染色では感度が１％と低すぎる。一方、結核菌の培養検査でよると、検査に数週間以上の時間が要する上に、検出感度は１１〜５０％程度と十分ではない。胸膜の生検は感度が高い(〜約８０％)とされているが、生検には熟練した技量が必要であることに加えて、侵襲性が高い。
【０００４】
Ogawaらは、胸水に分泌されるバイオマーカーのうち、インターフェロン-γ(以下、「IFN-γ」と称する。)を測定することで結核を原因とする胸水と癌や心臓性疾患による非結核性胸水とが鑑別できることを報告している（非特許文献１〜４）。IFN-γは、活性化されたＴリンパ球やＮＫ細胞によって産生され、免疫応答や炎症反応に関与するサイトカインである。さらに、Krenkeらの報告では、IFN-γは、結核性胸膜炎の診断マーカーとしても有用であるとしている（非特許文献５）。
【０００５】
ところで、酵素で標識した抗体を用いる酵素免疫測定法（ELISA法）は、IFN-γを高感度に測定できる方法ではあるが、操作者の熟練や機器・装置を必要とする測定方法であり、測定に数時間以上かかるという問題がある。
【０００６】
これに対して、イムノクロマト測定法は、短時間で一連の免疫反応を同時に行うことができる方法であることから、迅速で簡便という長所を有する（非特許文献５）。しかしながら、検出感度は、一般的にELISA法の感度と比較すると低いとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】K.Ogawa, H.Koga et al.. Differential diagnosis of tuberculous pleurisy by measurement of cytokine concentrations in pleural effusion. Tubercle and Lung Disease 1997, 78(1), 29-34
【非特許文献２】S.Wongtim, U.Silachamroon, et al.. Interferon gamma for diagnosing tuberculous pleural effusions. Thorax 1999, 54, 921-924
【非特許文献３】MV.Villegas, LA.Labrada,et al.. Evaluation of polymerase chain reaction, adenosine deaminase, and interferon-γ in pleural fluid for the differential diagnosis of pleural tuberculosis. CHEST 2000, 118, 1355-1364
【非特許文献４】K.Aoe, A Hiraki et al., Diagnostic Significance of Interferon-γ in Tuberculous Pleural Effusions. CHEST 2003, 123, 740-744
【非特許文献５】R. Krenke, A. Safianowska et al., Pleural fluil adenosine deaminase and interferon gamma as diagnostic tools in tuberculous pleurisy. J. of Physiology and Pharmacology 2008, 59, supp1 6, 349-360
【非特許文献５】Chou SF., Development of a manual self-assembled colloldal gold nanoparticle-immunochromatographic strip for rapid determination of human interferon-γ. Analyst, 2013 May 7;138(9) 2620-3
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、検体中のIFN-γを、迅速且つ簡便にしかもELISA法の感度と同等以上に高い感度で検出し診断することができるイムノクロマト測定方法を提供することを目的とする。また本発明は、当該イムノクロマト測定法に使用するための結核性胸膜炎診断剤、及び結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットを提供することを目的とする。さらに本発明は当該結核性胸膜炎診断剤及び結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットに使用する抗体を産生するためのハイブリドーマを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、日夜鋭意検討を重ねていたところ、特定の抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体、ANOC-1612抗体）を用いたイムノクロマト測定法によると、被験試料として胸水を用いて、試料中に含まれるIFN-γを迅速且つ簡便にしかも感度高く診断でき、上記課題が一挙に解決することを見出した。具体的には当該抗IFN-γマウスモノクローナル抗体を用いることで、感度が不足することが懸念されるイムノクロマト測定法であっても、同抗体を用いたELISA法によるIFN-γELISAテストと比較して同等の感度及び精度で、しかも迅速且つ簡便に結核の感染が検出・診断できることを確認した。また、本発明によれば、胸水が生じている患者について、その原因が結核感染であるか、またはそれ以外の疾病であるかを鑑別することができることを確認した。
【００１０】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施形態を有するものである。
【００１１】
（Ｉ）結核性胸膜炎診断剤
（Ｉ−１）IFN-γに結合する抗体を有効成分とするイムノクロマト用の結核性胸膜炎診断剤。
（Ｉ−２）上記IFN-γに結合する抗体が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）からなる群から選択される少なくとも１つのモノクローナル抗体である、（Ｉ−１）記載の結核性胸膜炎診断剤。
（Ｉ−３）胸水を被験試料とする結核診断剤である、（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）に記載する結核診断剤。
【００１２】
（ＩＩ）結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット
（ＩＩ−１）IFN-γに結合する抗体（抗IFN-γ抗体−１）が固定化された部位（反応部位）を一部に有する短冊またはスティック状の試験片、及びIFN-γに結合する標識された別の抗体（抗IFN-γ抗体−２）を含む試薬を含有する、結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットであって、
上記抗IFN-γ抗体−１が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、
上記抗IFN-γ抗体−２が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）から選択される、抗IFN-γ抗体−１とは異なるモノクローナル抗体であることを特徴とする結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
（ＩＩ−２）上記抗IFN-γ抗体−１が、受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）であり、上記抗IFN-γ抗体−２が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）であることを特徴とする、（ＩＩ−１）記載の結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
（ＩＩ−３）上記試験片が、反応部位とは別の部位（コントロール部位）に、標識抗IFN-γ抗体−２と結合する抗体が固定化されてなるものである、（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）に記載する結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
（ＩＩ−４）上記抗IFN-γ抗体−２を標識する物質が発色物質または発光物質である、（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかに記載する結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット。
【００１３】
（ＩＩＩ）結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定法
（ＩＩＩ−１）（1）IFN-γに結合する抗体（抗IFN-γ抗体−１）が固定化された試験片の当該固定化部位（反応部位）に、IFN-γを含み得る被験試料を接触させる工程、
（2）上記試験片の抗IFN-γ抗体−１固定化部位（反応部位）に、IFN-γを含み得る被験試料の存在下、IFN-γに結合する標識された別の抗体（抗IFN-γ抗体−２）を接触させる工程、及び
（3）上記試験片の抗IFN-γ抗体−１固定化部位（反応部位）におけるシグナルを検出する工程を有する、結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法であって、
上記抗IFN-γ抗体−１が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、
上記抗IFN-γ抗体−２が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、及び受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）から選択される、抗IFN-γ抗体−１とは異なるモノクローナル抗体であることを特徴とする結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法。
（ＩＩＩ−２）上記抗IFN-γ抗体−１が、受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマにより産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）であり、上記抗IFN-γ抗体−２が、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマにより産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）であることを特徴とする、（ＩＩＩ−１）記載の結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法。
（ＩＩＩ−３）上記試験片が、抗IFN-γ抗体−１の固定化部位（反応部位）とは別の部位に、標識−抗IFN-γ抗体−２と結合する抗体が固定化されたコントール部位を有するものであり、反応部位及びコントロール部位の両方でシグナルが検出される場合を結核陽性、反応部位でシグナルが検出されず、コントロール部位でシグナルが検出される場合を結核陰性、コントロール部位でシグナルが検出されない場合を測定不良と判断する、（ＩＩＩ−１）または（ＩＩＩ−２）記載の結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法。
（ＩＩＩ−４）IFN-γを含み得る被験試料が胸水、腹水、肺胞洗浄液、血液（血清、血漿）または喀痰、好ましくは胸水である、（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）のいずれかに記載する結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定方法。
【００１４】
（ＩＶ）抗IFN-γモノクローナル抗体、及びそれを産生するハイブリドーマ
（ＩＶ−１）IFN-γに結合する抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）を産生する、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマ、またはIFN-γに結合する抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）を産生する、受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマ。
（ＩＶ−２）抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）を産生する、受託番号が「NITE P-01944」であるハイブリドーマによって産生されるる抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1611抗体）、または抗IFN-γマウスモノクローナル抗体ANOC-1612を産生する、受託番号が「NITE P-01945」であるハイブリドーマによって産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（ANOC-1612抗体）。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の特定の抗IFN-γ抗体（ANOC-1611抗体、ANOC-1612抗体）を用いたイムノクロマト測定法によると、被験試料として好ましくは胸水を用いて、迅速且つ簡便にしかもELISA法と同等以上の感度及び精度で、結核感染による結核性胸膜炎の有無を診断することができる。また、本発明によれば、胸膜腔に胸水が貯留している患者について、その原因が結核感染による結核性胸膜炎であるか、またはそれ以外の疾病であるかを、迅速且つ簡便にしかもELISA法と同等以上の感度及び精度で、鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（Ａ）および（Ｂ）とも、本発明の結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット中の試験片の一態様を示す図（横から見た図）である。図（Ａ）は、判定部(3)に反応部位（テスト結果表示部）(a)だけを有する態様、図（Ｂ）は、判定部(3)に反応部位（テスト結果表示部）(a)とコントロール部位(b)の両方を含む態様である。符号１０：支持体、符号２１：試料採取部(1)を構成するシート、符号２２：標識抗体部(2)を構成するシート、符号２３：判定部(3) を構成するシート、符号２４：液吸収部(4)を構成するシート、(a)：反応部位（テスト結果表示部）、(b)：コントロール部位、(1)：試料採取部、(2)：標識抗体部、（3)：判定部、(4)：液吸収部、Ｐ：被験試料の流れる方法を示す矢印を意味する（図２も同じ）。
【図２】本発明の結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット中の試験片の一態様を示す図（斜視図）である。
【図３】IFN-γイムノクロマトテストによる被験試料の測定手順をわかりやすく示した図を示す（実施例３）。
【図４】IFN-γイムノクロマトテストによる胸水検体の測定結果を示す写真の画像を示す（実施例３）。
【図５】IFN-γイムノクロマトテストによる血漿検体の測定結果を示す写真の画像を示す（実施例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（Ｉ）抗IFN-γ抗体、及びそれを産生するハイブリドーマ
本発明のイムノクロマト用の結核性胸膜炎診断剤、及び結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットに使用する抗IFN-γ抗体は、結核を原因として生じる胸水や血漿中の生体試料中に存在するIFN-γを特異的に認識し結合することのできる抗体であり、特にイムノクロマト測定用抗体として好適に使用することができる、特異性及び検出感度を有する。
【００１８】
抗IFN-γ抗体には、一般にIFN-γを認識して結合することができる抗IFN-γポリクローナル抗体及び抗IFN-γモノクローナル抗体が含まれる。本発明において好ましくはIFN-γを特異的に認識して結合することができる抗IFN-γモノクローナル抗体である。さらに好ましくはヒトIFN-γを免疫抗原としてマウスに免疫して取得される抗ヒトIFN-γマウスモノクローナル抗体である。当該抗IFN-γ抗体は定法に従って作製することができる。
【００１９】
IFN-γを含み得る胸水や血漿などの被験試料を対象として、迅速且つ簡便に結核の感染を検出診断するためのイムノクロマト測定法において、ELISA法によるIFN-γ ELISAテストと比較して同等の感度及び精度を得ることができる点で、本発明の抗IFN-γ抗体として、最も好ましくは、ハイブリドーマ細胞株「NITE P-01944」から産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（これを本発明では「ANOC-1611抗体」と称する。）、及びハイブリドーマ細胞株「NITE P-01945」から産生される抗IFN-γマウスモノクローナル抗体（これを本発明では「ANOC-1612抗体」と称する。）を挙げることができる。なお、これらのハイブリドーマは、平成２６年９月３０日に千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター(NPMD)に、前者は「ANOC-1611」という識別の表示で「受託番号：NITE P-01944」として、また後者は「ANOC-1612」という識別の表示で「受託番号：NITE P-01945」として、それぞれ寄託されている。
【００２０】
（ＩＩ）結核性胸膜炎診断剤
本発明のイムノクロマト用結核性胸膜炎診断剤は、被験者の生体試料中に存在するIFN-γをイムノクロマト測定法により検出するための試薬であり、当該試薬によれは、IFN-γの検出の可否（陽性、陰性）を指標として結核感染による結核性胸膜炎の有無を診断することができる。
【００２１】
本発明の結核性胸膜炎診断剤で使用する抗IFN-γ抗体としては、前述するように最も好ましくはANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体を挙げることができる。なお、ANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体はどちらか一方を使用しても、また２つを組み合わせて使用することができる。これらの抗体は、任意の固体の担体に、脱着可能なようにまたは脱着不可能なように、固定化されていてもよいし、また任意の標識物質で標識されていてもよい。
【００２２】
被験者の生体試料（被験試料）としては、結核菌感染を原因としてIFN-γが産生され、IFN-γが存在している生体試料であればよく、本発明の目的から好ましくは胸水を挙げることができる。
【００２３】
抗IFN-γ抗体を固定化するために使用される固体の担体としては、この技術分野において慣用の各種の担体が利用でき、例えばガラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロース、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロース、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビーズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸共重合体等の種々の素材からなる短冊状またはスティック状の試験片、ビーズ、プレート（マイクロプレートを含む）、試験管等を広く例示することができる。
【００２４】
標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ等の酵素；フルオレセインイソシアネート、ローダミンなどの蛍光物質；32Ｐや125Ｉ等の放射性物質；金コロイドや白色コロイド等の金属コロイド、赤色や青色などの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックス及び天然ゴムラテックス等のラテックスなどの発色物質（呈色物質）；化学発光物質などを例示することができる。
【００２５】
（ＩＩＩ）結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キット
結核の診断は、前述する本発明の結核性胸膜炎診断剤を検出試薬として含む結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットを利用することによって、簡便に実施することができる。当該結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットは、被験試料中に存在するIFN-γを、抗原抗体反応を利用して検出測定するための測定キット（検出具）である。本発明が対象とする被験者は胸膜腔に胸水が貯留している患者である。また本発明が対象とする被験試料は、好ましくは当該胸膜腔に胸水が貯留している患者の胸水である。
【００２６】
当該測定キットは、IFN-γに結合する抗体（抗IFN-γ抗体−１）が固定化された部位（反応部位）を一部に有する短冊状またはスティック状の試験片、及びIFN-γに結合する抗IFN-γ抗体−１とは別の標識された抗体（抗IFN-γ抗体−２）を含む試薬を含有する。
【００２７】
上記抗IFN-γ抗体−１は、好ましくはANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体から選択されるいずれかの抗IFN-γ抗体であり、抗IFN-γ抗体−２は好ましくはANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体から選択されるいずれかの抗IFN-γ抗体のうち、抗IFN-γ抗体−１として使用されない抗IFN-γ抗体である。つまり、抗IFN-γ抗体−１としてANOC-1611抗体を使用する場合、抗IFN-γ抗体−２はANOC-1612抗体であり、抗IFN-γ抗体−１としてANOC-1612抗体を使用する場合、抗IFN-γ抗体−２はANOC-1611抗体である。好ましくは抗IFN-γ抗体−１はANOC-1612抗体であり、抗IFN-γ抗体−２はANOC-1611抗体である。
【００２８】
抗IFN-γ抗体−２は、任意の標識物質で標識した状態で使用される。ここで標識物質としては、前述するように、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ等の酵素；フルオレセインイソシアネート、ローダミンなどの蛍光物質；32Ｐや125Ｉ等の放射性物質；金コロイドや白色コロイド等の金属コロイド、赤色や青色などの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックス及び天然ゴムラテックス等のラテックスなどの発色物質（呈色物質）；化学発光物質などを例示することができる。これらの標識物質による抗IFN-γ抗体−２の標識は、各種標識物質に応じて定法に従って行うことができる。好ましくは発色物質及び発光物質であり、より好ましくは金属コロイドなどの発色物質である。
【００２９】
試験片は、毛細管作用またはクロマトグラフィー作用（本発明ではこれらを総じて「毛細管現象」という）によって被験試料を一方の端部からもう一方の端部に移送することができる材料からなる短冊状（長方形のシート状）またはスティック状（棒状）の試験片である。当該試験片は１枚のシートにより、或いは複数枚のシートを重ね合わせるかまたは連結して形成することができる。或いは当該試験片は、細長い棒状の細片とする等、液の吸収及び毛細管現象による移送が可能な種々の形態とすることができる。なお、試験片は、毛細管現象によって被験試料を移送できる材料（部材）に加えて、当該部材を支持する支持体を備えるものであってもよい。
【００３０】
この試験片のための材料としては、浸透可能な多孔構造又は毛細管構造を有し、測定成分（IFN-γ）を含む被験試料を、試験片の端部の試料採取部に適用（採取、滴下、添加、含浸）した場合に、当該被験試料が試験片のもう一方の端部方向に、多孔構造又は毛細管構造内を移動（展開）し得る材料であればよく、特に制限されない。好ましくは有機多孔質体である。なお、有機多孔質体の例としては、セルロースなどの天然繊維、セルロースアセテートなどの半合成繊維やニトロセルロースなどのセルロース誘導体、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステルなどの合成繊維などで形成された繊維集合体、多孔質ポリプロピレン、多孔質ポリスチレン、多孔質ポリメタクリル酸メチル、多孔質ナイロン、多孔質ポリスルフォン、多孔質フッ素樹脂、親水性基が導入されたフッ化ポリビニリデン等の多孔質合成樹脂などを挙げることができる。好ましくはセルロースなどの天然繊維、またはセルロースアセテートなどの半合成繊維やニトロセルロースなどのセルロース誘導体である。
【００３１】
試験片の大きさは、特に制限されない。幅（短辺の長さ）が２〜２０mm程度、好ましくは４〜１０mm程度の範囲にあり、長さ（長辺の長さ）が２０〜２００mm、好ましくは３０〜１５０mmの範囲にある大きさであることが好ましい。
【００３２】
試験片は、少なくとも
(i)被験試料を吸収採取する「試料採取部」、
(ii)下記（a）に示す、反応部位（テスト結果表示部）を備えた「判定部」
（a）被験試料に含まれ得るIFN-γと特異的に反応する抗IFN-γ抗体（抗IFN-γ抗体−１）を固定化した反応部位（テスト結果表示部）、及び
(iii)上記試料採取部及び判定部を移動してきた被験試料の残液を吸収する液吸収部
を備えている。
【００３３】
さらに、上記(ii)の「判定部」は、上記の(a)反応部位（テスト結果表示部）に加えて、それと間隔をおいて下記に示すコントロール部位を備えていてもよい：
(b)標識−抗IFN-γ抗体（標識−抗IFN-γ抗体−２）と反応する非標識抗体を固定したコントロール部。
【００３４】
また試験片は、上記（i）「試料採取部」と（ii）「判定部」の間に、被験試料中に存在し得るIFN-γと特異的に反応する標識−抗IFN-γ抗体（標識−抗IFN-γ抗体−２）を脱離可能な状態で担持した「標識抗体部」を備えていてもよい。つまり、本発明の試験キットにおいて、標識−抗IFN-γ抗体−２は、試験片と別個の状態で存在していてもよいが、当該試験片中に脱離可能な状態で担持されていてもよい。この場合、被験試料が試験片の「標識抗体部」を移動する際に標識−抗IFN-γ抗体−２は試験片（支持体）から脱離し、被験試料とともに試験片上を移動し、反応部に固定化された抗IFN-γ抗体−１にIFN-γとの結合を介して捕捉され、当該反応部に固定されることになる（標識によるシグナル呈示）。
【００３５】
試験片に対する抗IFN-γ抗体−１の固定化方法については特に制限はないが、測定中に抗体が試験片から脱離し、被験試料とともに移動しないように固定化することが好ましい。この限度において、各種固体担体に応じて、物理的結合及び化学的結合のいずれをも使用できる。例えば、共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド誘導体法、カルボキシルクロライド樹脂法、カルボジイミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカルボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アルキル化法、架橋試薬による担体結合法（例えば架橋試薬としてグルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアナート等を用いるもの）、Ｕｇｉ反応による担体結合法等の化学的反応：或いはイオン交換樹脂のような担体を用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラスを担体として用いる物理的吸着法等が例示できる。
【００３６】
当該試験片によれば、（ii）「判定部」の(a)反応部位（テスト結果表示部）のシグナル（例えば発色）の有無で、被験試料中にIFN-γが存在するか否かを判定することができ、その結果に基づいて胸水が結核性か否かを判断することができる。（ii）「判定部」に(b)コントロール部位を有する場合、(b)コントロール部位のシグナル（例えば発色）の有無で、被験試料が試験片を一端からもう一方の端に向けて正常に移動したことを確認することができる。つまり、試験片が(b)コントロール部位を有する場合、（a）反応部位及び（b）コントロール部位の両方でシグナルが検出される場合をIFN-γ陽性で被験試料が結核性胸水と判定され、（a）反応部位でシグナルが検出されず、（b）コントロール部位でシグナルが検出される場合をIFN-γ陰性で被験試料が結核性でないことが示され（a）コントロール部位でシグナルが検出されない場合を測定不良と判断することができる。
【００３７】
本発明の測定キットには、上記の短冊状またはスティック状の試験片、及び標識−抗IFN-γ抗体−２を含む試薬に加えて、測定の実施の便益のために、更に適当な反応液、希釈液、洗浄液、反応停止液、標識活性測定試薬等が含まれていてもよい。
【００３８】
以下、本発明で用いる試験片の一態様として、試験片上に標識−抗IFN-γ抗体−２を担持した「標識抗体部」を有する試験片を、図面（図１）を参照しつつ説明する。
【００３９】
図１（Ａ）および（Ｂ）は、本発明の試験片を横からみた図である。試験片は、被験試料を採取(添加)する試料採取部(1)、標識抗体部(2)、及び反応部位（テスト結果表示部）(a)を備えた判定部(3)、並びにこれらの試料採取部、標識抗体部、及び判定部を移動してきた被験試料の残液を吸収する液吸収部(4)を備える。また図１（Ｂ）は、上記判定部(3)において、反応部位（テスト結果表示部）(a)に加えてコントロール部位(b)を備える試験片を示す。
【００４０】
図１に示す例では、試験片は、複数のシート片により形成されたシート状細片とされているが、シート状細片は同一材料からなる一枚のシートからなるものであってもよいし、また同一または異なる材質からなる複数枚のシート片で全体として一つのシートを形成してなるものであってもよい。なお、シート全体が複数枚のシートからなるものであってもよいし、部分的に複数枚のシートから形成される部分を有するものであってもよい。
【００４１】
図１で示す例では、支持体１０の上に、シート状細片が接着されている。このシート状細片は、長手方向の一端側から他端側に順に、試料採取部(1)を形成するシート２１、標識抗体部(2)を形成するシート２２、判定部(3)を形成するシート２３、液吸収部(4)を形成するシート２４を備えている。また、図２に示すように、シート２１の端部がシート２２の端部と重なるように、またシート２２の端部がシート２３の端部と重なるように、さらにシート２３の端部がシート２４の端部と重なるように構成することもできる。かかる構成をとることで液の移動をよりスムーズにすることができる。
【００４２】
試料採取部(1)は、測定対象とする被験試料を吸収採取する部分（被験試料供給部）である。被験試料としては、本発明が測定対象とする被験者の生体試料を挙げることができる。
【００４３】
当該試料採取部(1)は、図１および図２に例示するように、シート状細片の端部（始端部）に位置することができる。
【００４４】
標識抗体部(2)は、前述するように試料採取部(1)の終端部と接触するか（図１）、または当該試料採取部(1)と一部を重なった状態で形成される（図２）。当該標識抗体部(2)は、被験試料に含まれるIFN-γと特異的に反応し結合する標識抗体（標識−抗IFN-γ抗体−２）を脱離可能な状態で含む。標識抗体部(2)は、シート状細片に採用される材料の中でも、標識−抗IFN-γ抗体−２を脱離可能な状態で含み、試料採取部(1)から移動してきた被験試料中の被験成分（IFN-γ）と反応して形成される抗原−抗体複合体（IFN-γと標識−抗IFN-γ抗体−２との複合体を、被験試料の判定部(3)への移動に伴って、図１中、矢印Ｐで示す方向に移動させることができる性質を備えた、親水性且つ吸水性の材料から構成されることが好ましい。
【００４５】
なお、標識抗体部(2)に、標識−抗IFN-γ抗体−２を脱離可能な状態で担持させる方法としては、制限されないが、標識−抗IFN-γ抗体−２を含む溶液を標識抗体部(2)に含浸または付着させる方法を例示することができる。また、標識抗体部(2)に被験試料中に含まれる被験成分（IFN-γ）を漏れなく結合させるために、当該標識抗体部(2)には上記の標識−抗IFN-γ抗体−２を過量に担持させておくことが好ましい。
【００４６】
判定部(3)は、上記試料採取部(1)から標識抗体部(2)を通って移動してきた被験試料をさらに液吸収部(4)まで移送する部分であって、その移送領域上に、移送する被験試料中に含まれる特定成分（IFN-γと標識−抗IFN-γ抗体−２との複合体）を捕捉して、その捕捉結果を表示する部分〔反応部位（テスト結果表示部）(a）〕を含む。この反応部位（テスト結果表示部）(a）に示される結果に基づいて、被験試料のIFN-γの存在の有無が判定可能になる。
【００４７】
本発明の試験片は、かかる判定部(3)において、反応部位（テスト結果表示部）（a）に加えて、コントロール部位(b）を備えていてもよい。なお、かかる反応部位（テスト結果表示部）（a）、及びコントロール部位(b）は、それぞれ順次間隔をおいて配置される。
【００４８】
反応部位（テスト結果表示部）(a)には、IFN-γと特異的に反応する非標識の抗体〔非標識−抗IFN-γ抗体−１〕が過量に固定されている。このため、上記標識抗体部(2)での抗原抗体反応によって標識−抗IFN-γ抗体−２と結合したIFN-γは、当該標識−抗IFN-γ抗体−２との複合体の状態で、この反応部位（テスト結果表示部）（a）に捕捉され、その捕捉量に応じた強さで、標識物質に起因するシグナル（発色など）を呈する。
【００４９】
コントロール部位(b）には、上記標識抗体部(2)に含有させた標識−抗IFN-γ抗体−２と反応する非標識−抗体（第二抗体）が所定量、固定されている。当該コントロール部位(b)は、上記するように、被験試料の移動方向（図１中、ｐの方向）に、反応部位（テスト結果表示部）（a）と間隔をおいて、反応部位（テスト結果表示部）（a）およびコントロール部位(b)の順で配置することができる。コントロール部位(b)には、先行する試験片から移動してくる被験試料中に含まれる標識−抗IFN-γ抗体−２と反応する非標識−抗体（第二抗体）が過剰量固定されている。
【００５０】
このため、かかるコントロール部位(b)には、標識抗体部(2)から脱離して被験試料中に放出された標識−抗IFN-γ抗体−２が捕捉され、コントロール部位(b)に固定された上記第二抗体の量に応じた強さで、標識−抗IFN-γ抗体−２の標識物質に起因する発色を呈する。
【００５１】
ここで非標識−抗体（第二抗体）は、標識−抗IFN-γ抗体−２と結合するものであればよい。かかる非標識−抗体（第二抗体）は、制限されないが、抗IFN-γ抗体−２が、抗IFN-γマウス抗体であることから、抗マウス抗体（例えば抗マウスポリクローナル抗体）、具体的にはヤギ抗マウスポリクローナル抗体などを用いることができる。
【００５２】
本発明の試験片を用いたIFN-γの測定は、判定部(3)における反応部位（テスト結果表示部）(a)におけるシグナル（発色など）の有無を指標として行われる。この際、必要に応じて、判定部(3)におけるコントロール部位(b)におけるシグナル（発色など）の有無も判断に使用することができる。反応部位（テスト結果表示部）(a)におけるシグナル（発色など）が認められない場合でも、上記コントロール部位(b)でシグナル（発色など）が認められる場合は、測定は正常に行われており、測定結果を陰性と判断することができる。しかし、上記コントロール部位(b)でシグナル（発色など）が認められない場合は、測定が正常に行われていないことを示し、反応部位（テスト結果表示部）(a)の結果をもって陰性と判断することはできない。
【００５３】
判定部(3)は、試験片に採用される材料の中でも、種々の成分を含む被験試料を、液吸収部(4)に毛細管現象によって移動させることができ、反応部位（テスト結果表示部）(a)に非標識−抗IFN-γ抗体−１を、またコントロール部位（b）に上記非標識−抗体（第二抗体）を安定に固定化できる性質を備えた、親水性且つ吸水性の材料から構成されることが好ましい。
【００５４】
液吸収部(4)は、上記試料採取部(1)から標識抗体部(2)、及び判定部(3)（反応部位(a)、または反応部位(a)とコントロール部位(b)）を通って、矢印Ｐの方向に移動してきた被験試料の残液を吸収する部分である。このため、液吸収部(4)は、試験片に採用される材料の中でも、親水性及び吸収性に優れていることが好ましいが、より好適には、吸収した液を離水しない性質を備えた材料または弾力性のある材料から構成されることが望ましい。かかる材料として、具体的には、濾紙や親水性繊維の不織布などを挙げることができ、濾紙と不織布との積層体も使用することができる。
【００５５】
本発明の試験片は、基本的に上記構成を備えた短冊状（シート状）またはスティック状の細片からなるが、当該細片に加えて、さらに支持体１０を備えることもできる。かかる支持体１０は、上記細片を保持し得る材質及び形態を備えるものであれば特に制限されない。例えば、シート状細片の裏面（下層面）に積層して用いられるシート状の支持体であっても、またシート状細片を収納するハウジング形態の支持体であってもよい。
【００５６】
シート状の支持体としては、例えば各種プラストリップ製のシート（プラストリップシート）、硬質紙、アルミ製等の金属（合金を含む）製シート、例えば異質又は同質の複数の紙を張り合わせた（貼り合わせた）複層紙、プラストリップシートと紙とを張り合わせ（貼り合わせ）たもの、紙と金属製シートを張り合わせ（貼り合わせ）たもの、プラストリップシートと紙と金属製シートを張り合わせ（貼り合わせ）たもの、紙に防水用等のコーティングを施したものなどを挙げることができる。好ましくは防水機能を有するものである。
【００５７】
ハウジング形態の支持体は、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、アクリル酸ポリマーなど、不透湿性の材料からなるものが好ましいが、紙製であっても撥水加工がされていれば用いることができる。ハウジングには、少なくとも、内部に収納される上記シート状細片の試料採取部(1)に対応して「採液窓」、判定部(3)の反応部（テスト結果表示部）(a)に対応して「判定表示窓」、及びコントロール部位(b)に対応して「コントロール表示窓」が形成されていることが望ましい。なお、「判定表示窓」と「コントロール表示窓」は、個々に形成されていてもよいが、一つの窓として形成されていてもよい。
【００５８】
前述する試験片を備える本発明の測定キットは、その使用に際して、まず試験片の試料採取部(1)に被験試料を含浸させる。そうすると、試料採取部(1)に吸収された被験試料が試験片中を毛細管現象により浸透し、まず標識−抗IFN-γ抗体−２が脱離可能なように担持されている標識抗体部(2)に至る。ここで、被験試料中の被験成分（IFN-γ）が上記標識−抗IFN-γ抗体−２と抗原抗体反応により特異的に結合する。次いで、被験試料は、「IFN-γと標識−抗IFN-γ−２との複合体」と、「IFN-γと結合しなかった余剰の標識−抗IFN-γ抗体−２」を伴いながら、判定部(3)の反応部位（テスト結果表示部）(a)に至る。反応部位（テスト結果表示部）(a)にはIFN-γと特異的に結合する非標識−抗IFN-γ抗体−１が安定に固定されているので、ここに被験試料中の「IFN-γと特異的に結合した標識−抗IFN-γ抗体−２」が捕捉され集積される。その結果、反応部位（テスト結果表示部）(a)は、捕捉された標識−抗IFN-γ抗体−２の標識物質に基づいて被験試料中に含まれるIFN-γの量に応じた強度で発色する。これにより、被験試料中のIFN-γの有無や量的割合が検知できる。
【００５９】
次に被験試料は、「IFN-γと結合しなかった余剰の標識−抗IFN-γ抗体−２」を伴いながら、判定部(3)のコントロール部位(b)に至る。コントロール部位(b)には標識−抗IFN-γ抗体−２と結合する第二抗体〔非標識−抗体〕が一定の量で安定に固定されているので、ここに被験試料中の上記の余剰の標識−抗IFN-γ抗体−２が捕捉され集積される。その結果、コントロール部位(b)は、コントロール部位(b)に固定化された第二抗体の量（または、第二抗体と結合した標識−抗IFN-γ抗体−２の量）に応じた強度で発色する。
【００６０】
以上、標識−抗IFN-γ抗体−２を担持させた標識抗体部(2)を有する試験片を例として、本発明の試験キットを説明したが、本発明の試験キットは、当該標識抗体部(2)を有さない試験片、及び標識−抗IFN-γ抗体−２を含有する試薬を別個に有するものであってもよい（実施例２参照）。この場合、実施例３及び４で説明するように、標識−抗IFN-γ抗体−２を被験試料とともに、試験片の試料採取部（1）に含浸または付着させることで、イムノクロマト測定を実施することができる。
【００６１】
本発明の測定キットは、これらの他、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変形態様が可能である。上記の本発明の測定キットには、他に当該測定キットの使用方法や判定方法について説明した仕様書を添付することができ、本発明はかかる仕様書がセットとなった測定キットを提供するものでもある。
【００６２】
（ＩＶ）結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定法
本発明の結核菌の診断（検出・検査）は、下記の(1)〜(3)の工程を行うことで実施することができる。
（1）抗IFN-γ抗体−１が固定化された短冊状またはスティック状の試験片の当該固定化部位（反応部位）に、被験試料を接触させる工程、
（2）上記試験片の抗IFN-γ抗体−１固定化部位（反応部位）に、IFN-γを含み得る被験試料の存在下で、標識−抗IFN-γ抗体−２を接触させる工程、及び
（3）上記ストリップの抗IFN-γ抗体−１固定化部位（反応部位）におけるシグナルを検出する工程。
【００６３】
なお、反応部位に加えてコントロール部位を有する試験片を使用する場合、工程（3）において、反応部位におけるシグナルの検出に加えて、コントロール部位におけるシグナルの検出を行うことが好ましい。
【００６４】
(1)の工程で抗IFN-γ抗体−１が固定化された試験片の反応部位に接触させる被験者の生体試料（被験試料）としては、胸水、腹水、肺胞洗浄液、血液（血清、血漿）、喀痰等を挙げることができるが、好ましくは胸水である。なお、ここで測定の対象となる被験者は好ましくはヒトであり、より好ましくは胸膜腔に胸水が貯留しているヒトである。
【００６５】
（1）の工程において、試験片の反応部位と被験試料とを接触させる条件は、抗IFN-γ抗体−１と被験試料中に含まれるIFN-γとの結合反応が損なわれない条件であれば特に制限されず、通常の免疫反応における条件が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは約４〜４０℃、より好ましくは２０〜３５℃程度の温度条件下、とりわけ室温条件下で、試験片の反応部位にIFN-γを含み得る生体試料が接触する方法を挙げることができる。なお、（2）の工程において、試験片の反応部位と標識−抗IFN-γ抗体−２を接触させる条件も上記と同じ条件を採用することができる。
【００６６】
(3)の工程は、本発明の抗IFN-γ抗体（抗IFN-γ抗体−１、抗IFN-γ抗体−２）とIFN-γとの結合反応で得られる免疫複合体（抗原抗体結合物）を検出・測定する工程である。ここで免疫複合体（抗原抗体結合物）の検出・測定方法並びにそれらの条件は、特に制限されることなく、通常の免疫測定法で用いられるものと同じか若しくはそれに準じた方法及び条件を採用することができる。具体的には、抗IFN-γ抗体−２の標識に使用した標識物質の種類に応じて、前述するように、一般の免疫化学的測定法において使用される種々の方法を利用することができる。
【００６７】
(3)の工程において、試験片における反応部位（テスト結果表示部）のシグナル（例えば発色）の有無で、被験試料中にIFN-γが存在するか否かを判定することができ、その結果に基づいて被験試料が結核性であるか否かを判断することができる。具体的には、反応部位に加えてコントロール部位を有する試験片を使用する場合、当該試験片における反応部位及びコントロール部位の両方でシグナルが検出される場合をIFN-γ陽性で被験試料が結核性、反応部位でシグナルが検出されず、コントロール部位でシグナルが検出される場合をIFN-γ陰性で被験試料が結核性ではない、コントロール部位でシグナルが検出されない場合を測定不良と判断することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。但し、本発明は当該実施例になんら制限されるものではない。
【００６９】
実施例１  ANOC-1611抗体およびANOC-1612抗体の取得
ANOC-1611抗体およびANOC-1612抗体は、ヒトIFN-γを免疫抗原としてマウスに免疫して取得した抗ヒトIFN-γマウスモノクローナル抗体である。これらの抗体は、ハイブリドーマ細胞株ANOC-1611あるいはハイブリドーマ細胞株ANOC-1612から産生される。
【００７０】
（１）抗体産生ハイブリドーマ細胞の樹立
免疫抗原として用いたヒトIFN-γは、ヒトミエロモノサイト（HBL-38）細胞株をリポポリサッカライド（LPS）で刺激培養した上清から分離精製して得た。
【００７１】
フロイントアジュバント（DIFCO社製）と共にエマルジョン化したヒトIFN-γを免疫抗原としてBalb/cマウスに皮下投与し、その後、2週間の間隔を空けて皮下投与を3回繰り返した。数回の免疫の後に部分採血を行ってヒトIFN-γに対する抗体価を確認し、抗体価の上昇が確認できたマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓の細胞はミエローマ細胞（P3U1）と細胞融合させてハイブリドーマ細胞を作製した。培養上清中の抗体価を指標としてスクリーニングを繰り返し、作製したハイブリドーマ細胞から抗ヒトIFN-γ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択を行った。さらに、限界希釈法によって最終的に単一クローン細胞株とし、複数の単一クローン細胞株のなかから２つの特定のハイブリドーマ細胞株（ANOC-1611およびANOC-1612）を得た。これらのハイブリドーマ細胞株のうち、一つは「ANOC-1611」（識別の表示）と命名し、平成２６年９月３０日に千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター(NPMD)に「受託番号：NITE P-01944」として寄託した。もう一つは、「ANOC-1612」（識別の表示）と命名し、平成２６年９月３０日に同センター(NPMD)に「受託番号：NITE P-01945」として寄託した。
【００７２】
（２）ANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体の精製
上記で取得したハイブリドーマ細胞株ANOC-1611及びANOC-1612をそれぞれ培養し、マウス腹腔内に投与してそれぞれANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体を含む腹水を得た。Protein Aカラムを用いて、各抗体を含む腹水から抗体を精製して、抗IFN-γマウスモノクローナル抗体としてそれぞれANOC-1611抗体及びANOC-1612抗体を得た。
【００７３】
実施例２  結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットの作製
本発明の一例として、結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットを作製した。当該結核性胸膜炎診断用イムノクロマト測定キットは、実施例１で調製したANOC-1612抗体をニトロセルロースメンブランに固定化したスティック状試験紙（以下、単に「テストスティック」ともいう）、実施例１で調製したANOC-1611抗体を金コロイドで標識したもの（標識ANOC-1611抗体）の凍結乾燥品の入ったテストチューブ、および洗浄液の入った洗浄チューブからなる。
【００７４】
（１）ANOC-1612抗体固相メンブランの作製
縦長さ2.5cm、横幅30cmのニトロセルロースメンブラン（HF-180、ミリポア社）の縦方向の一端側から1.0cmの付近にANOC-1612抗体を1cm幅あたり3μgの割合でライン状に塗布した。同時に、同じ一端側から1.5cm付近にヤギ抗マウスポリクローナル抗体を1cm幅あたり0.2μgの割合でライン状に塗布した。なお、ニトロセルロースメンブランへの抗体の塗布はメンブランプリンター（Bio-Dot社）を用いて行った（以下、同じ。）。ニトロセルロースメンブランにおいて、ANOC-1612抗体を塗布した部分を「テストライン部」、ヤギ抗マウスポリクローナル抗体を塗布した部分を「コントロールライン部」とし、テストラインとコントロールラインは5mmの間隔を開けて平行に塗布した。抗体を塗布したニトロセルロースメンブランは、その後乾燥して、抗体固相メンブランとした。
【００７５】
（２）テストスティックの作製
縦長さ8.2cm、横幅30cmのプラスティック製の台紙（ARcare9920、Adhesives Research社）に上記（１）で作製した抗体固相メンブラン（縦長さ2.5cm、横幅30cm）を貼付し、その縦方向の両端にそれぞれセルロース製の吸収パッド（31ET、GE社）（縦長さ5.8cm、横幅30cm）およびグラスファイバー製のサンプルパッド（F075-17、GE社）（縦長さ0.6cm、横幅30cm）を貼付けた。なお、サンプルパッドは、被験試料を吸収採取する「試料採取部」であり、吸収パッドは、試料採取部であるサンプルパッド、及びテストラインとコントロールラインを有する抗体固相メンブランを移動してきた被験試料の残液を吸収する「液吸収部」である。
【００７６】
サンプルパッドの先端部分を残すようにしてラミネートシール（ARvare7759、Adhesives Research社）を貼り付け、メンブランカッター（Bio-Dot社）を用いて幅4mmに切断して、長さ8.2cm、幅４mmのテストスティックを作製した。
【００７７】
（３）金コロイド標識ANOC-1611抗体の作製
金コロイド溶液（WRGH1、ワインレッドケミカル社）1mLにANOC-1611抗体を24μg添加して20分室温で攪拌した。これに終濃度が１重量％となるようにカゼイン溶液を添加して20分室温で攪拌した。これを4600g、4℃で20分間遠心分離し、沈渣を1％カゼインと5％スクロースを含む2mM ４ホウ酸ナトリウム緩衝液に懸濁して金コロイド標識ANOC-1611抗体の懸濁液を作製した。
【００７８】
（４）テストチューブの作製
上記（３）で作製した金コロイド標識ANOC-1611抗体の懸濁液を、65μLずつチューブに分注し、これを凍結乾燥した後、キャップで密閉してテストチューブとした。
【００７９】
（５）洗浄チューブの作製
0.05%TritonX-305を含む10mMリン酸緩衝液を50μLずつチューブに分注し、洗浄チューブとした。
【００８０】
比較例１  IFN-γELISA試験キットの作製
比較のためにIFN-γELISA試験キットを作製した。当該IFN-γELISA試験キットは、少なくともANOC-1612抗体を固相したELISAプレートと酵素標識したANOC-1611抗体を含有するサンドイッチELISA用の試験キットである。
【００８１】
（１）ANOC-1612抗体固相ELISAプレートの作製
96ウェルマイクロタイタープレート（マキシソープ、NUNC社）にANOC-1612抗体含有溶液（5.5μg/mL、10mMリン酸緩衝液）を各ウェルあたりの抗体量が0.55μgとなるように加えて4℃で一夜静置した。静置後、各ウェルから溶液を除去し、次いで、各ウェルにブロッキング剤として１％のBSAを含む緩衝液を300μL加えて4℃で一夜静置した。静置後、ブロッキング剤を取り除き、その後、各ウェルを乾燥させて、表面にANOC-1612抗体を固定化したANOC-1612抗体固相ELISAプレートを調製した。
【００８２】
（２）HRP標識ANOC-1611抗体の作製
過ヨウ素酸法によって処理した西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）をANOC-1611抗体に結合させ、HRP標識ANOC-1611抗体を作製した。
【００８３】
（３）その他の試薬
発色用基質としてテトラメチルベンチジン（TMB）、発色停止液として0.1N硫酸液を用いた。
【００８４】
実施例３  胸水（被験試料）の測定
（１）IFN-γイムノクロマトテストによる胸水検体の測定
胸水50μLを実施例２（４）で調製したテストチューブに滴下し、テストチューブ中の金コロイド標識ANOC-1611抗体の凍結乾燥品を溶解し、胸水と標識ANOC-1611抗体との混合液を調製した。当該混合液が入ったテストチューブに、実施例２（２）で作製したテストスティックの試料採取部分を差し込んで静置した（室温下）。15分後、テストスティックを実施例２（５）で調製した洗浄チューブに移し、バックグラウンドがクリアになった後に、テストラインとコントロールラインの出現を目視にて判定した。測定手順をわかりやすく示した図を図３に示す。
【００８５】
テストラインとコントロールラインの出現が共に認められる場合を陽性と判定し、テストラインが認められずコントロールライン1本のみの場合を陰性と判定した。なお、コントロールラインの出現が認められなかった場合は測定不良として、測定対象外とした。
【００８６】
さらに、測定後のテストスティックの写真撮影を行い、デンシトグラフ（アトー社）によりテストラインの信号強度を数値化した。
【００８７】
（２）IFN-γELISAテストによる胸水検体の測定
ANOC-1612固相ELISAプレートに、IFN-γ標準品（コントロール）100μL、あるいは胸水検体原液又は希釈した検体100μLをそれぞれ加えて室温で2時間反応させた。プレートウォッシャーで洗浄した後に、HRP標識ANOC-1611を加えて室温で2時間反応させた。洗浄後、反応基質液を加えて発色させ、吸光度を測定した。IFN-γ標準品の吸光度から標準濃度曲線を作成し、胸水検体中のIFN-γ量を算出した。
【００８８】
（３）測定結果
IFN-γイムノクロマトテスト及びIFN-γELISAテストによる胸水検体の測定結果を表１に示す。またIFN-γイムノクロマトテストによる胸水検体の測定結果を示す写真の画像を図４に示す。
【００８９】
結核性胸水４例、及び非結核性胸水９例の合計１３例の被験試料を測定した結果、結核性胸水４例はいずれもIFN-γイムノクロマトテストにおいてテストラインが出現してIFN-γ陽性と判定された。非結核性胸水９例は、８例でテストラインが出現せず陰性と判定されたが、１例でテストラインが出現した（No.10）。しかしながら、この被験試料はIFN-γ ELISAテストにおいてもIFN-γが検出されており、IFN-γイムノクロマトテストの非特異反応が原因ではないと思われる。また、数値化したテストラインの信号強度の強弱とIFN-γ ELISAテストの測定値は相関していることが確認された。
【００９０】
【表１】
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【００９１】
これらの結果から、本発明の抗IFN-γ抗体を用いたIFN-γイムノクロマトテストは、同抗体を用いたIFN-γ ELISAと100％一致する結果となり、ELISA法と同等以上の十分な感度と精度を有していることが確認された。
【００９２】
実施例４  QFT検体の測定
QFT検査結果が出ている血漿検体を被験試料としてIFN-γイムノクロマトテストを実施した。
【００９３】
（１）IFN-γイムノクロマトテストによるQFT血漿検体の測定
血漿検体50μLを実施例２（４）で調製したテストチューブに滴下し、テストチューブ中の金コロイド標識ANOC-1611抗体の凍結乾燥品を溶解し、血漿と標識ANOC-1611抗体との混合液を調製した。当該混合液が入ったテストチューブに、実施例２（２）で作製したテストスティックの試料採取部分を差し込んで静置した（室温下）。15分後、テストスティックを実施例２（５）で調製した洗浄チューブに移し、バックグラウンドがクリアになった後に、テストスティック上のテストラインとコントロールラインの出現を目視にて判定した。さらに、測定後のテストスティックの写真撮影を行い、デンシトグラフ（アトー社）によりテストラインの信号強度を数値化した。
【００９４】
（２）QFT検査結果判定について
QFT検査では、（a）刺激抗原無し（Ｎ：陰性コントロール）、（b）結核菌抗原入り（Ａ）、及び（c）マイトジェン入り（Ｍ:陽性コントロール）の３本の採血管に血液を入れて培養が行なわれる。培養後、遠心分離等によって血漿を分離し、QFTを構成するELISAテストによってＮ（陰性コントロール）、Ａ（結核菌抗原入り）、及びＭ（陽性コントロール）のそれぞれの血漿検体に含まれるIFN-γの測定を行う。結果の判定は、Ａの値からＮの値を引いた値が0.35を越える場合は「陽性」、0.1〜0.35の間にある場合は「判定保留」、0.1より小さい場合を「陰性」とする。なお、Ｍの値からＮの値を引いた値が0.5より小さい場合は判定不可とするが、今回測定した検体に判定不可となったものは含まれていない。
【００９５】
（３）IFN-γイムノクロマトテスト結果の判定について
IFN-γイムノクロマトテストの判定は、Ａの測定で出現するテストラインの信号強度とＮの測定で出現するテストラインの信号強度とを目視で比較し、Ａ＞Ｎの場合を陽性、Ａ≦Ｎの場合を陰性と判定した。
【００９６】
（４）測定結果
QFT（ELISA）検査及びIFN-γイムノクロマトテストによる血漿検体の測定結果を表２及び３に示す。またIFN-γイムノクロマトテストによる血漿検体の測定結果を示す写真の画像を図５に示す。
【００９７】
【表２】
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【００９８】
【表３】
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【００９９】
11例のQFT陽性血漿検体（#1-10及び12）のうち、10例（#1-2, 4-10及び12）は陽性と判定できた。QFT陽性でイムノクロマト陰性と判定された1例（#3）については、ＡとＮともにテストラインがはっきりと出現して強弱の判別が付かなかった例であってIFN-γイムノクロマトテストの感度不足によるものではない。なお、QFT検査の結果もＡの値が0.94でＮの値が0.47であり、A−N＝0.47と判定保留域に近いサンプルであった。
【０１００】
6例のQFT陰性血漿検体（#13-18）はいずれもIFN-γイムノクロマトテストでも同じく陰性と判定された。一方、QFT検査で判定保留となっていた1例（#11）については、テストライン及びコントロールラインの両方が共に出現し、その強弱を目視で判定できなかったことから、IFN-γイムノクロマトテストの目視判定結果は陰性とした。
【０１０１】
以上のことから、陰性コントロール（Ｎ）でテストラインが出現するような検体を測定した際に判定が難しくなるケースが認められたが、実際に臨床の現場で用いられているELISA法の結果とおおよそ一致しており、本発明のIFN-γイムノクロマト測定法は検出感度の面で十分な性能を有していると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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