(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を含有し、血管新生阻害剤と併用投与するために用いられ、前記血管新生阻害剤が抗VEGF抗体を含む、放射性抗腫瘍剤。
【化１】
0006494400.tif 000007
〔式中R1、R2、R3、R4はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はアルコキシ基を示す。Cuは銅の放射性同位体を示す。〕
【請求項２】
前記銅の放射性同位体が、６４Ｃｕ又は６７Ｃｕである、請求項１に記載の放射性抗腫瘍剤。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦ抗体が、ベバシズマブ又はその塩を含む、請求項１又は２に記載の放射性抗腫瘍剤。
【請求項４】
前記放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体が、
放射性グリオキザール−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性グリオキザール−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性エチルグリオキザール−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性エチルグリオキザール−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体、又は、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン）銅錯体である、請求項１乃至３いずれか一項に記載の放射性抗腫瘍剤。
【請求項５】
前記放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体が、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ又は６７Ｃｕ−ＡＴＳ
Ｍである、請求項１乃至４いずれか一項に記載の放射性抗腫瘍剤。
【請求項６】
前記血管新生阻害剤の投与後に用いられる、請求項１乃至５いずれか一項に記載の放射性抗腫瘍剤。
【請求項７】
前記血管新生阻害剤の投与量が、前記抗血管新生阻害剤を単独投与したとき該血管新生阻害剤の投与後の体重減少率が１０％以下となるように設定されている、請求項１乃至６いずれか一項に記載の放射性抗腫瘍剤。
【請求項８】
下記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と併用投与するために用いられ、抗VEGF抗体を含む、血管新生阻害剤。
【化２】
0006494400.tif 000008
〔式中R1、R2、R3、R4はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はアルコキシ基を示す。Cuは銅の放射性同位体を示す。〕
【請求項９】
抗VEGF抗体を含む血管新生阻害剤と、
下記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と、
を有する抗腫瘍用キット。
【化３】
0006494400.tif 000009
〔式中R1、R2、R3、R4はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はアルコキシ基を示す。Cuは銅の放射性同位体を示す。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性抗腫瘍剤、及び、抗腫瘍用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、低酸素部位やミトコンドリア機能障害の診断剤として知られている（例えば、特許文献１）。また、非特許文献１には、放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体（以下、「放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭ」ともいう。）は、低酸素領域を標的とした腫瘍の放射線治療剤として有用であることが記載されている。
【０００３】
また、近年、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭは、ＣＤ１３３陽性細胞に集積することが明らかとなった（非特許文献２）。非特許文献３には、腫瘍中のＣＤ１３３陽性細胞の量を低減し、腫瘍が縮小できたことが報告されている。このため、放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭは、がん幹細胞の検出剤、及び、がん幹細胞を標的化したがんの予防・治療剤としての有用性も期待されている（特許文献２）。
【０００４】
しかしながら、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、生体内に投与すると正常な肝臓に対しても放射能が大量に集積してしまう。かかる課題を解決する手法として、特許文献３、非特許文献４には、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとＤ−ペニシラミンとを併用投与することで、肝臓への放射能集積を減少させた例が記載されている。
【０００５】
また、特許文献４には、放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭを代謝阻害剤と併用することにより、抗腫瘍効果を高めたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平８−２４５４２５号公報
【特許文献２】特開２０１０−１３３８０号公報
【特許文献３】特開２０１４−１２９３１６号公報
【特許文献４】特開２０１４−１４１４５７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊａｓｏｎ  Ｓ．  Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ（２００１），Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ｖｏｌ．９８，１２０６−１２１１
【非特許文献２】Ｙｕｋｉｅ  Ｙｏｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１０），Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．３７，３９５−４０４
【非特許文献３】Ｙｕｋｉｅ  Ｙｏｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１１），Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．３８，１５１−１５７
【非特許文献４】Ｙｕｋｉｅ  Ｙｏｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１４），ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，９（１），ｅ８６９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、低酸素化した腫瘍増殖を抑制できるものとして有用である一方、生体内に投与すると正常な肝臓に対しても放射能が大量に集積してしまう。このため、特許文献３、非特許文献４に示すような技術を使用しない場合、肝臓等の正常組織への被曝線量が制限となり、抗腫瘍効果を得るために十分な量を投与することができない。
【０００９】
血管新生阻害剤は、副作用が少なく腫瘍増殖を抑制できるものとして、腫瘍の治療に汎用されているが、腫瘍への血液供給が減少するため、低酸素化した耐性腫瘍ができることが問題になっている。こうした耐性腫瘍では、血管新生阻害剤と他の薬剤とを併用した場合、単独投与時と比較して、取りこみ量が減少するおそれがある。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体及び血管新生阻害剤の各々の抗腫瘍効果を高める技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と血管新生阻害剤とを併用することにより、腫瘍細胞に対する相乗的な殺傷効果が得られることを新たに知見し、本発明を完成させた。
【００１２】
本発明の一態様は、下記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を含有し、血管新生阻害と併用投与するために用いられ、前記血管新生阻害剤が抗VEGF抗体を含む、放射性抗腫瘍剤を提供するものである。
【００１３】
【化１】
0006494400.tif 000002
【００１４】
上記一般式（１）中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ独立して、水素原子、アルキル基又はアルコキシ基を示す。Ｃｕは銅の放射性同位体を示す。
【００１５】
また、本発明の他の態様は、上記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン
銅錯体と併用投与するために用いられ、抗VEGF抗体を含む、血管新生阻害剤を提供するものである。
【００１６】
また、本発明の他の態様は、
抗VEGF抗体を含む血管新生阻害剤と、
上記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と、
を有する抗腫瘍用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と血管新生阻害剤とを併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】［６４Ｃｕ］ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ）及びベバシズマブを併用投与し又は単独投与したＨＴ２９担がんマウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図２】ＨＴ２９担がんマウスについて、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとベバシズマブとの併用前後の白血球の数を比較した図である。
【図３】ＨＴ２９担がんマウスにおける６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの体内分布を示す図である。
【図４】ＨＴ２９担がんマウスの腫瘍移植部位の画像を示す図であり、破線で囲んだ部位が腫瘍移植部位である。Ａが対照群の６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ（ＰＥＴ）画像であり、Ｂが対照群の９９ｍＴｃ−ヒト血清アルブミン（９９ｍＴｃ−ＨＳＡ）（ＳＰＥＣＴ）画像であり、ＣがＡとＢとの重ね合わせ画像であり、Ｄがベバシズマブ投与群の６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ（ＰＥＴ）画像であり、Ｅがベバシズマブ投与群の９９ｍＴｃ−ＨＳＡ（ＳＰＥＣＴ）画像であり、ＦがＤとＥとの重ね合わせ画像である。
【図５】ベバシズマブ投与の有無による腫瘍細胞への６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ取り込み比較を示す図である。
【図６】６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ及びベバシズマブを併用投与し又は単独投与したＡ５４９担がんマウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図７】６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ及びレゴラフェニブを併用投与し又は単独投与したＨＴ２９担がんマウスの腫瘍体積の経時変化を示す図である。
【図８】ＨＴ２９担がんマウスについて、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとレゴラフェニブとの併用前後の白血球数を比較した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［放射性抗腫瘍剤］
本発明において、「抗腫瘍」とは、腫瘍の増加を抑制すること、更には、腫瘍を減少若しくは消滅することをいい、本発明の「抗腫瘍剤」は、腫瘍細胞を殺傷し、腫瘍の増殖を抑制し、更には、腫瘍を減少若しくは消滅できるものを有効成分として含有する剤をいう。
【００２０】
本発明の放射性抗腫瘍剤は、各種の腫瘍に対し適用することができる。本発明の放射性抗腫瘍剤が適用される腫瘍としては、例えば、乳癌、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、小腸癌、食道癌、十二指腸癌、舌癌、咽頭癌、唾液腺癌、神経鞘腫、肝臓癌、腎臓癌、胆管癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、皮膚癌、血管腫、悪性リンパ腫、悪性黒色腫、甲状腺癌、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍、血管線維腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形癌、肉腫、白血病などが挙げられる。これらの腫瘍は、原発性であっても転移性であってもよい。
【００２１】
本発明の放射性抗腫瘍剤は、上記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体をそのまま、あるいは薬理学的に許容され得る担体、希釈剤、若しくは賦形剤とともに製剤化されていればよい。剤形は、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよいが、例えば注射剤などの非経口投与の剤形が好ましい。
【００２２】
本発明において、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のアルキル基及びアルコキシ基の炭素数は、好ましくは１〜５の整数であり、より好ましくは炭素数１〜３の整数である。本発明において、上記一般式（１）中の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、同一又は異なって水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることが好ましく、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４が炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましく、Ｒ１及びＲ２が同一又は異なって水素原子又はメチル基であり、Ｒ３が水素原子であり、Ｒ４がメチル基であることが更に好ましい。
【００２３】
上記一般式（１）中の銅の放射性同位体は、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ又は６７Ｃｕであることが好ましく、６４Ｃｕ、６７Ｃｕがより好ましい。６４Ｃｕ、６７Ｃｕは飛程の短いβ線も放出し、細胞を破壊するため、抗腫瘍効果を更に高めることができる。
【００２４】
上記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、具体的には、
放射性グリオキザール−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性グリオキザール−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性エチルグリオキザール−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性エチルグリオキザール−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体、
放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−エチルチオセミカルバゾン）銅錯体
等が示される。中でも、下記式（２）で表される放射性ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）銅錯体（以下、放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭともいう。）又は放射性ピルブアルデヒド−ビス（Ｎ４−ジメチルチオセミカルバゾン）銅錯体（以下、放射性Ｃｕ−ＰＴＳＭともいう。）が好ましく、放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭがより好ましい。
【００２５】
【化２】
0006494400.tif 000003
【００２６】
式（２）中、Ｃｕは銅の放射性同位体を示し、好ましくは６４Ｃｕ、６７Ｃｕである。
【００２７】
本発明の放射性抗腫瘍剤は、例えば、以下の方法により製造することができる。
【００２８】
まず、Ｐｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２４，３６７−３７２，１９６４）に記載の方法によりジチオセミカルバゾン誘導体を合成する。すなわち、α−ケトアルデヒドの１ｍｏｌ水溶液又は５０体積％エタノール溶液を３０〜４０分かけてチオセミカルバジド、Ｎ４−メチルチオセミカルバジド、Ｎ４−ジメチルチオセミカルバジド等の２．２ｍｏｌ含有５％氷酢酸溶液に５０〜６０℃で滴下する。滴下中は反応液を撹拌する。滴下終了後室温で数時間放置した後、冷却して結晶を分離する。結晶はメタノールに溶解して再結晶を行い精製する。
【００２９】
つづいて、放射性銅イオンを製造する。放射性銅イオンは、公知の方法により製造することができるが、６４Ｃｕイオンは例えば、ＭｃＣａｒｔｈｙらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４（１），１９９７，ｐｐ．３５‐４３）、又は、Ｏｂａｔａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０（５），２００３，ｐｐ．５３５‐５３９）により得ることができる。６７Ｃｕイオンは例えば、６８Ｚｎ（ｐ，２ｐ）６７Ｃｕ反応から６７Ｃｕを生成した後、イオンクロマトグラフィー等を用いてターゲットから化学的に分離することにより得ることができる。
【００３０】
その後、上記ジチオセミカルバゾン誘導体をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液として、上記放射性銅イオンを含む溶液と接触させることにより、上記一般式（１）で表される放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を得ることができる。放射性Ｃｕ−ＡＴＳＭは、例えば、Ｊａｌｉｌｉａｎらの方法（Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，５９（１），２００９，ｐｐ．４５−５５）、「ＰＥＴ用放射性薬剤の製造および品質管理―合成と臨床使用へのてびき」（ＰＥＴ化学ワークショップ編）第４版（平成２３年改定版）記載の方法、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３，２００６，ｐｐ．７４３‐５０）、Ｌｅｗｉｓらの方法（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２００１，４２，６５５‐６６１）等により製造することができる。
【００３１】
本発明の放射性抗腫瘍剤は、後述する血管新生阻害剤と併用投与するために用いられる。本発明において「併用投与」とは、同一の投与レジメンで用いられることをいい、同一の腫瘍領域に対し、同一の治療効果（腫瘍の増殖抑制、更には、縮小又は消滅の効果）を発揮できるようにそれぞれの剤が投与されればよい。放射性抗腫瘍剤の投与前に血管新生阻害剤が投与されてもよいし、放射性抗腫瘍剤の投与後に血管新生阻害剤が投与されてもよいし、放射性抗腫瘍剤と血管新生阻害剤とが同時に投与されてもよい。
【００３２】
好ましくは、血管新生阻害剤の投与後に本発明の放射性抗腫瘍剤を投与することができ、血管新生阻害剤を単回投与（好ましくは持続投与）又は反復投与した後に、本発明の放射性抗腫瘍剤が投与されることがより好ましい。本発明において「反復投与」とは、一定の時間を空けて複数回投与することであり、例えば、１日１回又は複数回ずつ、２日〜１ヶ月間投与することができる。また、「持続投与」とは、一定の時間連続して投与することであり、例えば、数時間〜１週間、連続して投与することができる。血管新生阻害剤の前投与で腫瘍内の血管は低減するが、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は、組織浸透性が高いため、腫瘍内に浸透し抗腫瘍効果を発現することができる。したがって、本発明の放射性抗腫瘍剤によれば、血管新生阻害剤との間で相乗的な抗腫瘍効果をより一層高めることができる。
【００３３】
血管新生阻害剤の投与後に本発明の放射性抗腫瘍剤を投与する場合、血管新生阻害剤と放射性抗腫瘍剤との投与間隔は、特に限定されないが、例えば、生体内における血管新生阻害剤の有効成分（例えば、ベバシズマブ、レゴラフェニブなど）の血中濃度が最高血中濃度に到達した後に、本発明の放射性抗腫瘍剤を投与することができる。
【００３４】
本発明の放射性抗腫瘍剤の投与対象は、例えば哺乳動物であり、好ましくはヒトである。本発明の放射性抗腫瘍剤の投与量は、投与対象となる患者の種別、年齢、性別、体重、症状、投与法などによって異なり特に限定されないが、一般の放射性医薬品において通常採用されている範囲を採用することができる。また、本発明の放射性抗腫瘍剤は、単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよい。
【００３５】
［血管新生阻害剤］
本発明において血管新生阻害剤とは、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と受容体（ＶＥＧＦＲ）を主な標的とした薬剤であって、血管新生阻害により、癌細胞への増殖因子や酸素の供給を抑制し、腫瘍の増殖を抑制する抗がん剤である。血管新生阻害剤には、抗体医薬と低分子阻害剤とに分類できる。
【００３６】
抗体医薬の有効成分としては、モノクローナル抗体が挙げられる。モノクローナル抗体としては、マウス型モノクローナル抗体、６６％がヒト抗体のキメラ型モノクローナル抗体、９０％がヒト抗体のヒト化モノクローナル抗体、１００％ヒト抗体からなるヒト型モノクローナル抗体の４種類が挙げられるが、本発明の放射性抗腫瘍剤と併用効果の観点からは、ヒト化モノクローナル抗体が好ましい。中でも、抗ＶＥＧＦ抗体がより好ましく、ベバシズマブ又はその塩が特に好ましい。
【００３７】
低分子阻害剤としては、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤が挙げられるが、チロシンキナーゼ阻害剤が好ましい。チロシンキナーゼ阻害剤としては、受容体型チロシンキナーゼ阻害剤が好ましく、ＶＥＧＦＲを標的とした、スニチニブ、ソラフェニブ及びレゴラフェニブ並びにこれらの塩から選択される１種又は２種以上を有効成分として含有するものがより好ましい。
【００３８】
本発明の血管新生阻害剤の有効成分（例えば、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ及びレゴラフェニブ）が塩を形成するときは、その塩は薬理学的に許容される塩であればよい。
【００３９】
本発明において血管新生阻害剤は、有効成分をそのまま、あるいは、有効成分とともに、薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、徐放剤、バッファ、コーティング剤及び着色剤等を適宜含ませて製剤化されていればよく、経口投与又は非経口投与のいずれに適する剤形であってもよい。例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口剤、注射剤、外用剤、坐剤、ペレット、点滴剤、徐放性製剤等の非経口剤が挙げられる。また、２種以上の剤形を組み合わせてもよい。
【００４０】
本発明の血管新生阻害剤としては、種々の市販品を用いてもよい。抗体医薬としては、例えば、アバスチン（商品名）が挙げられる。また、低分子阻害剤としては、スーテント（商品名）、ネクサバール（商品名）、スチバーガ（商品名）が挙げられる。
【００４１】
この血管新生阻害剤は、前述の放射性抗腫瘍剤と併用投与して用いられればよく、放射性抗腫瘍剤の投与前若しくは投与後に単回投与（好ましくは持続投与）されてもよいし、反復投与されてもよい。また、放射性抗腫瘍剤の投与前後の両方において投与されてもよいし、放射性抗腫瘍剤と同時に投与されてもよいが、本発明の放射性抗腫瘍剤の投与前に投与されることが好ましい。血管新生阻害剤の前投与で腫瘍内の血管は低減するが、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は組織浸透性が高いため、腫瘍内に浸透し抗腫瘍効果を発現することができる。したがって、本発明の血管新生阻害剤によれば、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の間で相乗的な抗腫瘍効果をよりいっそう高めることができる。
【００４２】
本発明の放射性抗腫瘍剤と併用投与される血管新生阻害剤の投与量は、特に限定されないが、好ましくは、血管新生阻害剤が単独で抗腫瘍薬として用いられる際の投与量を超えない範囲で使用することができ、血管新生阻害剤を単独投与したとき体重減少が認められない量を投与することがより好ましい。具体的には、血管新生阻害剤を単独で投与したとき血管新生阻害剤の投与後の体重減少率が１０％以下となるように投与量を設定することができる。これにより、血管新生阻害剤の副作用を低減しつつ放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体の腫瘍細胞の殺傷効果を高めることができる。ここでいう単独投与とは、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を含む他の医薬を併用しない投与レジメンをいう。体重減少率は、「体重減少率（％）＝｛（血管新生阻害剤の投与開始前の体重−血管新生阻害剤の投与開始後の体重）／血管新生阻害剤の投与開始前の体重｝×１００」で表すことができ、「血管新生阻害剤の投与開始後の体重」は、好ましくは、血管新生阻害剤の投与開始から５日〜２週間後の体重にすることができる。
【００４３】
［抗腫瘍用キット］
本発明の抗腫瘍用キットは、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を含有する前述の放射性抗腫瘍剤と、前述の血管新生阻害剤とを有するものである。
【００４４】
また、本発明の抗腫瘍用キットは、前述の血管新生阻害剤を投与した後に前述の放射性抗腫瘍剤を投与することを記載した添付文書を含むことが好ましい。この添付文書には、後述する本発明の抗腫瘍用キットの使用方法を記載することができる。
【００４５】
本発明の抗腫瘍用キットは、好ましくは、上記の放射性抗腫瘍剤、及び、前述の血管新生阻害剤を哺乳動物に投与して用いられる。投与対象となる哺乳動物としては、ヒトがより好ましい。
【００４６】
[放射性抗腫瘍剤、血管新生阻害剤、及び、抗腫瘍用キットの使用方法]
本発明の放射性抗腫瘍剤、血管新生阻害剤、抗腫瘍用キットの使用方法の一例について以下に説明する。
【００４７】
まず、腫瘍を発現した被検体又は患者に血管新生阻害剤を投与する。このとき、血管新生阻害剤を単独投与したとき該血管新生阻害剤の投与後の体重減少率が１０％以下となるように、血管新生阻害剤の投与量を設定することができる。
【００４８】
その後、前述の放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を含有する放射性抗腫瘍剤を投与する。血管新生阻害剤の前投与で腫瘍内の血管は低減するが、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体は組織浸透性が高いため、腫瘍内に浸透し抗腫瘍効果を発現することができる。したがって、本発明の抗腫瘍用キットによれば、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と血管新生阻害剤とが相乗的な抗腫瘍効果をよりいっそう高めることができる。この放射性抗腫瘍剤は、血管新生阻害剤の投与後、生体内における、血管新生阻害剤の有効成分（例えば、ベバシズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ）の血中濃度が最高血中濃度に到達した後に、投与することが好ましい。
【００４９】
また、血管新生阻害剤の反復投与と、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体を含有する放射性抗腫瘍剤の単回投与とからなる投与計画を複数回繰り返してもよい。この繰り返しは、連続して行ってもよいし、当該放射性抗腫瘍剤の投与後１〜３０日間、好ましくは、１０〜２５日間の間隔をおいて行ってもよい。
【００５０】
これにより、放射性ジチオセミカルバゾン銅錯体と血管新生阻害剤とが相乗的に作用して、腫瘍細胞を殺傷する。そして、本発明の抗腫瘍用キットによれば、腫瘍細胞の殺傷効果と放射線増感効果とを併せ持つため、高い腫瘍増殖抑制効果を得ることができる。また、投与する放射能量に対する抗腫瘍効果が高いため、正常組織に対する被曝を抑えることができる。また、血管新生阻害剤の投与量は体重減少させない程度に少ないため、血管新生阻害剤の副作用も低減することができる。
【００５１】
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず種々の変更を行うことができる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を記載して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
【００５３】
（製造例１）６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ、及び、血管新生阻害剤の調製
（ＡＴＳＭの合成）
ジアセチル‐ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン）（ＡＴＳＭ）の合成は、Ｔａｎａｋａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３３，２００６，ｐｐ．７４３−５０）に準じた。
【００５４】
（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの合成）
６４ＣｕはＭｃＣａｒｔｈｙらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４，１９９７，ｐｐ．３５−４３）及びＯｂａｔａらの方法（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３０，２００３，ｐｐ．５３５−５３９）に準じて製造・精製した。ＡＴＳＭと６４Ｃｕを用い、Ｔａｎａｋａらの方法（上掲）に準じて６４Ｃｕ−ＡＴＳＭを合成した。また、製造後の薬剤は、薄層クロマトグラフ法（ＴＬＣ法）を用いて検定し、放射化学的純度９５％以上のものを以下の実験に使用した。なお、ＴＬＣを用いた６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの分析条件は下記のとおりである。
ＴＬＣプレート：シリカゲルプレート（製品名：Ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ６０、メルク）
展開相：酢酸エチル
検出：フルオロイメージアナライザー（形式：ＦＬＡ−７０００，富士フイルム）
【００５５】
（ベバシズマブ溶液の調製）
ベバシズマブ（アバスチン（登録商標）点滴静注用１００ｍｇ／４ｍＬ、中外製薬）を生理食塩液に溶解し、マウス１匹あたり１００μＬになるように調製して、以下の実験に使用した。
（レゴラフェニブ溶液の調製）
レゴラフェニブ（スチバーガ（登録商標）錠４０ｍｇ２８錠、バイエル）を生理食塩液に溶解し、マウス１匹あたり１００μＬになるように調製して、以下の実験に使用した。
【００５６】
（実施例１）ＨＴ２９担がんマウスへの６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ及びベバシズマブの投与による抗腫瘍効果
ヒト大腸がん由来のＨＴ２９細胞は、ＡＴＣＣより購入したものを増殖させて利用した。ＨＴ２９担がんモデルは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，６週齢，体重約２０−２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）の大腿部皮下にＨＴ２９細胞１×１０7個を移植して作製した。ＨＴ２９細胞の移植後、腫瘍径が６ｍｍ前後に到達した時点で、ベバシズマブを１回５ｍｇ／ｋｇずつ、週２回腹腔内に反復投与した。ベバシズマブ投与開始（試験開始）から２１日目に、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）含有の生理食塩液溶液を尾静脈より投与した。なお、対照群にはベバシズマブ及び６４Ｃｕ−ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。試験開始後、経時的に週２回、マウスの腫瘍径を計測した。
【００５７】
（比較例１）ＨＴ２９担がんマウスへのベバシズマブの単独投与による抗腫瘍効果
６４Ｃｕ−ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例１と同様にした。
【００５８】
（比較例２）ＨＴ２９担がんマウスへの６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単独投与による抗腫瘍効果
ベバシズマブを投与する代わりに生理食塩液を投与した以外は、実施例１と同様に行った。
【００５９】
［評価１−１］腫瘍成長
実施例１、及び、比較例１、２において測定した腫瘍径から腫瘍体積を算出し、その経時変化を、図１に示す。図１中、異なるアルファベットのグループは、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を行った結果、有意差（Ｐ＜０．０５）があったものを示す。図１では、試験開始前日の腫瘍体積を１００％とし、これに対する比率を腫瘍体積率（％）として示した。また、図１は、各マウス群５匹の平均及び標準偏差で示した。腫瘍体積が１０００％に達した時点を本試験でのエンドポイントに設定した（以下「エンドポイント」の定義も同じである。）。図１で示すように、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単独投与では、腫瘍の増殖をほとんど抑制できず、試験開始から３１日目でエンドポイントに達した。また、ベバシズマブの単独投与により腫瘍の増殖を抑制できたが、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとベバシズマブとの併用投与により、腫瘍増殖抑制効果の更なる向上が認められた。
【００６０】
表１には、実施例１、比較例１，２及び対照群について、試験開始前日における腫瘍体積が５倍になるまでの日数（５倍腫瘍成長日数）を、各マウス群５匹の平均値±標準偏差で示す。また、実施例１、比較例１，２について、対照群を基準として、基準日から対照群の腫瘍体積と同等の体積に成長するまでの日数を、対照群に対する成長遅延日数として示す。表１で示すとおり、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとベバシズマブとの併用投与により、相乗的な腫瘍成長遅延が認められた。
【００６１】
【表１】
0006494400.tif 000004
【００６２】
なお、実施例１、比較例１，２及び対照群の全ての腫瘍径測定時期において、試験開始前日からの体重に対して体重減少率が１０％未満であった。
以上の結果から、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭと体重減少のない量のベバシズマブとの併用により、有意な抗腫瘍効果が認められ、かつ体重減少も観察されないことが示された。
【００６３】
［評価１−２］白血球数
実施例１、比較例１，２のＨＴ２９担がんマウスについて、それぞれ６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの投与前後の白血球の数を調べた。試験開始から２１日目（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ投与開始前）、試験開始から２３日目（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ投与開始２日後）及び各例のエンドポイント日で、血液１０μＬを採取し、チュルク液（メルク）で１０体積倍に希釈した。白血球の数は、血球計算盤で計測した。
【００６４】
結果を図２に示す。図２には、各マウス群５匹の平均±標準偏差を示す。併用投与と単独投与との違いにより、白血球数に有意差はなかった。
【００６５】
［評価１−３］６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの体内分布
実施例１と同様にしてＨＴ２９担がんモデルを作製し、ＨＴ２９細胞の移植後、腫瘍径が６ｍｍ前後に到達した時点で、ベバシズマブを５ｍｇ／ｋｇ腹腔内に投与し、投与後２１日目に６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８５ｋＢｑ（５μＣｉ）含有の生理食塩溶液を尾静脈投与した。１時間後、イソフルラン麻酔下で、心臓からの脱血によって屠殺した。血液及び臓器（肝臓、腎臓、小腸、大腸及び筋肉）を摘出して、重量を計量後、血液及び各摘出臓器の放射能を測定した。血液及び各摘出臓器の放射能分布（％ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ（ＩＤ）／ｇ）を図３に示す。また、対照群は、ベバシズマブに代えて生理食塩液を投与する以外は同様に処理したマウス群とした。図３は、各マウス群５匹の平均と標準偏差を示す。
【００６６】
図３で示すように、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単剤投与は、肝臓への集積が多く認められたが、ベバシズマブを前投与することで、肝臓への集積の低減することが示された。これにより、ベバシズマブと６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとの併用により、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの肝臓への被曝を低減できることが示唆された。
【００６７】
［評価１−４］ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ評価
実施例１と同様にしてＨＴ２９担がんモデルを作製し、ＨＴ２９細胞の移植後、腫瘍径が６ｍｍ前後に到達した時点で、ベバシズマブを５ｍｇ／ｋｇ腹腔内に投与し、投与後２１日目に、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）の生理食塩液溶液をＰＥＴ／ＳＰＥＣＴスキャン開始６０分前に、テクネチウム−９９ｍヒト血清アルブミン（９９ｍＴｃ−ＨＳＡ；プールシンチ注、日本メジフィジックス）１８．５ＭＢｑ（０．５ｍＣｉ）をＰＥＴ／ＳＰＥＣＴスキャン開始１０分前にそれぞれ尾静脈投与し、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴカメラ（製品名：ＶＥＣＴｏｒ  ＳＰＥＣＴ／ＰＥＴ／ＣＴ  ｓｙｓｔｅｍ、ＭＩＬａｂｓ）で撮像した。また、ベバシズマブに代えて生理食塩液を投与し、ベバシズマブ投与後２１日目の腫瘍とほぼ同じ大きさになるまで（具体的には、ＨＴ２９植え付け後２週間まで）生育したものを対照群として同様な処置を行った。
結果を図４に示す。
【００６８】
図４Ａ〜Ｆは、各ＨＴ２９担がんマウスの腫瘍移植部位の画像であり、破線で囲んだ部位が腫瘍移植部位である。図４中、Ａは対照群の６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ（ＰＥＴ）画像であり、Ｂは対照群の９９ｍＴｃ−ＨＳＡ（ＳＰＥＣＴ）画像であり、ＣはＡとＢとの重ねあわせである。Ｄはベバシズマブ投与群の６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ（ＰＥＴ）画像であり、Ｅはベバシズマブ投与群の９９ｍＴｃ−ＨＳＡ（ＳＰＥＣＴ）画像であり、ＦはＤとＥとの重ねあわせである。図４Ｂ、Ｅで示すように、ベバシズマブ投与により血管の描出が減少したが、図４Ａ、Ｄで示すように、ベバシズマブ投与後も６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの取り込みは維持されていた。この結果から、血管新生抑制剤により血液取りこみが減少した腫瘍に対しても６４Ｃｕ−ＡＴＳＭは取りこまれ、血管新生抑制剤とともに抗腫瘍効果を発揮することが示唆された。
【００６９】
［評価１−５］６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ取りこみ評価
実施例１と同様に作製したＨＴ２９担がんマウスに、ベバシズマブを５ｍｇ／ｋｇ腹腔内に投与し、投与後２１日目に、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ１８５ｋＢｑ（５μＣｉ）含有の生理食塩液溶液を投与した後、１時間後、イソフルラン麻酔下で、心臓からの脱血によって屠殺した。腫瘍を摘出して、重量及び放射能を測定した。また、対照群として、ベバシズマブに代えて生理食塩液を投与し、ベバシズマブ投与群の投与後２１日目の腫瘍と同じ大きさになるまで（具体的にはＨＴ２９植え付け後２週間まで）生育したものを対照群として同様な処置を行った。得られた腫瘍の放射能分布（％ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ（ＩＤ）／ｇ）を図５に示す。
【００７０】
図５は、各マウス群５匹の平均値と標準偏差を示す。図５に示すように、ベバシズマブを前投与したＨＴ２９担がんマウス群は、対照群に対して、ｔ検定による有意差（Ｐ＜０．０５）をもって、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの取りこみが増加することが確認された。
【００７１】
（実施例２）Ａ５４９担がんマウスへの６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ及びのベバシズマブ投与による抗腫瘍効果
ヒト肺がん由来のＡ５４９細胞は、ＡＴＣＣより購入したものを増殖させて利用した。Ａ５４９担がんモデルは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（オス，６週齢，体重約２０−２５ｇ，日本エス・エル・シーから入手）の大腿部皮下にＡ５４９細胞１×１０7個を移植して作製した。Ａ５４９細胞の移植後、腫瘍径が６ｍｍ前後に到達した時点で、ベバシズマブを１回５ｍｇ／ｋｇずつ、週２回腹腔内に反復投与した。ベバシズマブ投与開始（試験開始）から２１日目に、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）含有の生理食塩液溶液を尾静脈より投与した。なお、対照群にはベバシズマブ及び６４Ｃｕ−ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。試験開始後、経時的に週２回、マウスの腫瘍径を計測した。
【００７２】
（比較例３）Ａ５４９担がんマウスへのベバシズマブの単独投与による抗腫瘍効果
６４Ｃｕ−ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例２と同様にした。
【００７３】
（比較例４）Ａ５４９担がんマウスへの６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単独投与による抗腫瘍効果
ベバシズマブに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例２と同様にした。
【００７４】
［評価２−１］腫瘍成長
実施例２、及び、比較例３、４において測定した腫瘍径から腫瘍体積を算出し、その経時変化を、図６に示す。図６中、異なるアルファベットのグループは、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を行った結果、有意差（Ｐ＜０．０５）があったものを示す。図６では、試験開始前日の腫瘍体積を１００％とし、これに対する比率を腫瘍体積率（％）として示した。また、図６は、各マウス群５匹の平均及び標準偏差で示した。図６で示すように、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単独投与により、腫瘍の増殖はやや抑制されたが、試験開始から３５日目でエンドポイントに達した。また、ベバシズマブの単独投与により腫瘍の増殖を抑制できたが、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとベバシズマブとの併用投与により、腫瘍増殖抑制効果の更なる向上が認められた。
【００７５】
表２には、実施例２、比較例３，４及び対照群について、試験開始前日における腫瘍体積が５倍になるまでの日数（５倍腫瘍成長日数）を、各マウス群５匹の平均値±標準偏差で示す。また、実施例２、比較例３，４について、対照群を基準として、基準日から対照群の腫瘍体積と同等の体積に成長するまでの日数を、対照群に対する成長遅延日数として示す。表２で示すとおり、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとベバシズマブとの併用投与により、相乗的な腫瘍成長遅延が認められた。
【００７６】
【表２】
0006494400.tif 000005
【００７７】
なお、実施例２、比較例３，４及び対照群の全ての腫瘍径測定時期において、試験開始前日からの体重減少率が１０％未満であった。
以上の結果から、がん種を変更した場合においても６４Ｃｕ−ＡＴＳＭと体重減少のない量のベバシズマブとの併用により、有意な抗腫瘍効果が認められ、かつ体重減少も観察されないことが示された。
【００７８】
（実施例３）ＨＴ２９担がんマウスへの６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ及びレゴラフェニブの投与による抗腫瘍効果
実施例１と同様な方法でＨＴ２９担がんモデルを作製し、ＨＴ２９細胞の移植後、腫瘍径が６ｍｍ前後に到達した時点で、レゴラフェニブを１日１回３０ｍｇ／ｋｇずつ、１０日間、中２日間の休薬を挟んで（４日目・５日目を休薬日とした）、腹腔内に反復投与した。レゴラフェニブ投与（試験開始）から７日目に、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ３７ＭＢｑ（１ｍＣｉ）含有の生理食塩液溶液を尾静脈より投与した。なお、対照群にはレゴラフェニブ及び６４Ｃｕ−ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した。試験開始後、経時的に週２回、マウスの腫瘍径を計測した。
【００７９】
（比較例５）ＨＴ２９担がんマウスへのレゴラフェニブの単独投与による抗腫瘍効果
６４Ｃｕ−ＡＴＳＭに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例３と同様にした。
【００８０】
（比較例６）ＨＴ２９担がんマウスへの６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単独投与による抗腫瘍効果
レゴラフェニブに代えて生理食塩液を投与した以外は、実施例３と同様にした。
【００８１】
［評価３−１］腫瘍成長
実施例３、及び、比較例５、６において測定した腫瘍径から腫瘍体積を算出し、その経時変化を、図７に示す。図７中、異なるアルファベットのグループは、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定を行った結果、有意差（図示したもの以外は、Ｐ＜０．０５）があったものを示す。図７では、試験開始前日の腫瘍体積を１００％とし、これに対する比率を腫瘍体積率（％）として示した。また、図７は、各マウス群５匹の平均及び標準偏差で示した。図７で示すように、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの単独投与により、腫瘍の増殖はやや抑制されたが、試験開始から３４日目でエンドポイントに達した。また、レゴラフェニブの単独投与により腫瘍の増殖を抑制できたが、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとレゴラフェニブとの併用投与により、腫瘍増殖抑制効果の更なる向上が認められた。
【００８２】
表３には、実施例３、比較例５，６及び対照群について、試験開始前日における腫瘍体積が５倍になるまでの日数（５倍腫瘍成長日数）を、各マウス群５匹の平均値±標準偏差で示す。また、実施例３、比較例５，６について、対照群を基準として、基準日から対照群の腫瘍体積と同等の体積に成長するまでの日数を、対照群に対する成長遅延日数として示す。表３で示すとおり、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとレゴラフェニブとの併用投与により、相乗的な腫瘍成長遅延が認められた。
【００８３】
【表３】
0006494400.tif 000006
【００８４】
なお、実施例３、比較例５，６及び対照群については、試験開始１３日目以降の腫瘍径測定時期において、試験開始前日からの体重減少率が１０％未満であった。
以上の結果から、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭとレゴラフェニブとの併用により、有意な抗腫瘍効果が認められ、かつ体重減少も観察されないことが示された。
【００８５】
［評価３−２］白血球数
実施例３、比較例５、６のＨＴ２９担がんマウスについて、それぞれ６４Ｃｕ−ＡＴＳＭの投与前後の白血球の数を調べた。試験開始から６日目（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ投与開始前）、試験開始から９日目（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ投与開始２日後）及び各群エンドポイント日で、血液１０μＬを採取し、チュルク液（メルク）で１０体積倍に希釈した。白血球の数は、血球計算盤で計測した。  
【００８６】
結果を図８に示す。図８には、各マウス群５匹の平均値±標準偏差を示す。併用投与と単独投与との違いにより、白血球数に有意差はなかった。
【００８７】
以上の結果から、６４Ｃｕ−ＡＴＳＭと血管新生阻害剤との併用により、相乗的な抗腫瘍効果が認められた。
【図１】
0006494400.tif 000010
【図２】
0006494400.tif 000011
【図３】
0006494400.tif 000012
【図４】
0006494400.tif 000013
【図５】
0006494400.tif 000014
【図６】
0006494400.tif 000015
【図７】
0006494400.tif 000016
【図８】
0006494400.tif 000017