(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
PEEDGTRFHRRASK（配列番号：17）、PEEDGTRFHRKASK（配列番号：18）、PEEDGTRFHRTASK（配列番号：36）、PEEDGSRFHKQASK（配列番号：41）、およびPEEDGSRFHRQATK（配列番号：44）からなる群から選択される、少なくとも1つのペプチドを含む、ワクチン。
【請求項２】
少なくとも1つの前記ペプチドが、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、哺乳動物において、総コレステロールのレベルを減少させる増強された能力を有する、請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】
少なくとも1つの前記ペプチドが、医薬的に許容しうる担体に結合または融合している、請求項1または2に記載のワクチン。
【請求項４】
少なくとも1つのペプチドが、そのN末端および／またはC末端に、それに直接結合するか、またはスペーサー配列を介して結合する少なくとも1つのシステイン残基をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項５】
少なくとも1つの前記ペプチドが、医薬的に許容しうる担体に結合または融合しており、医薬的に許容しうる担体が、タンパク質担体である、請求項3または4に記載のワクチン。
【請求項６】
タンパク質担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、破傷風トキソイド（TT）、CRM197、プロテインD、およびジフテリア毒素（DT）からなる群から選択される、請求項5に記載のワクチン。
【請求項７】
タンパク質担体が、突然変異ジフテリア毒素、CRM197、およびKLHからなる群から選択される、請求項5または6に記載のワクチン。
【請求項８】
ワクチンが、アジュバントとともに製剤される、請求項1〜7のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項９】
ワクチンが、Al（OH）3（アルヒドロゲル）とともに製剤される、請求項1〜8のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項１０】
血漿LDLコレステロールレベルの減少に使用される、請求項1〜9のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項１１】
高脂血症、高コレステロール血症および/またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる障害、あるいはPCSK9に関連する腫瘍性疾患の治療および／または予防のための、請求項1〜10のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項１２】
心血管疾患、脳卒中、末梢血管疾患、黒色腫または肝癌転移の治療および／または予防のための、請求項1〜11のいずれか1つに記載のワクチン。
【請求項１３】
PEEDGTRFHRRASK（配列番号：17）、PEEDGTRFHRKASK（配列番号：18）、PEEDGTRFHRTASK（配列番号：36）、PEEDGSRFHKQASK（配列番号：41）、およびPEEDGSRFHRQATK（配列番号：44）からなる群から選択される、ペプチド。
【請求項１４】
ペプチドが、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、哺乳動物において、総コレステロールのレベルを減少させる増強された能力を有する、請求項13に記載のペプチド。
【請求項１５】
血漿LDLコレステロールレベルの減少の誘導のための、請求項13または14に記載のペプチドを含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
高脂血症、高コレステロール血症および／またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる障害を患っているか、または発症するリスクのある患者の治療用の請求項13または14に記載のペプチドを含有する、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロタンパク質転換サブチリシン/ケキシンタイプ9（PCSK9）に対する抗体の形成を誘導することができる免疫原性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心臓病や脳卒中などの血管障害は、世界的な死亡の主な原因の一つであり、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL）のレベルの上昇は、それらの病因において重要な役割を果たしている。したがって、LDLcの維持は、脂質異常症およびアテローム性動脈硬化症の治療を成功させるために非常に重要である。
【０００３】
常染色体優性高コレステロール血症（ADH）の発症に関与する、2003年のPCSK9の発見およびLDLRとApoB-100の間の第3因子としてのその同定は、ADHの疾患発症のメカニズムに新しい洞察をもたらした。したがって、ヒトにおける遺伝学的研究は、LDLcレベル、PCSK9および冠状動脈性心臓病発症の間の関連を確認した。別の動物モデルにおいて、PCSK9とLDLcの上昇との間の関連も観察されている。
【０００４】
PCSK9は、主として肝臓、腸および腎臓において発現され、血流中に分泌されていることも見出されている。それは低密度リポたんぱく質（LDL）受容体と直接反応し、形成された錯体は、実質的に取り込まれる。LDLRを結合することによって、PCSK9は、受容体分解を促進し、血漿LDLcの上昇をもたらす。PCSK9遺伝子における「機能突然変異の獲得（GOF）」は、LDLRとのその相互作用を増進し、著しく高いLDLcレベルと、それに続く高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症への素因をもたらす。一方、PCSK9の「機能突然変異の喪失（LOF）」突然変異は、冠状動脈性心臓病に対するリスクの減少に関連付けられる。興味深いことに、機能的PCSK9を喪失し、非常に低いLDLc（〜14mg/dL）を有する健康な女性の2つの症例は、血流中のLDLcレベルを低下させるための非本質的かつ有望な標的としてPCSK9に脚光を当てた。
【０００５】
野生型マウスにおけるPCSK9の過剰発現は、安定したmRNAレベルにもかかわらず、肝臓LDLRタンパク質を有意に低下させ、循環LDLcの増加をもたらす。比較すると、-/-マウスのLDLRにおけるPCSK9の過剰発現は、LDLcのレベルに影響を及ぼさず、LDL異化において役割を演じるためのLDLR上のPCSK9の依存性が確認される。そして、予測されるように、PCSK9-/-マウスは、野生型動物と比較して、LDLRのレベルおよびLDLcの減少において2.8倍の増加を示した。最終的に、循環中でのPCSK9分泌は、肝臓組織におけるPCSK9の不活性化において抑止され、主要臓器としての肝臓がPCSK9分泌の原因であることが確認された。
【０００６】
したがって、PCSK9は、LDLRにおける直接作用を介してLDL異化において重要な役割を演じる。PCSK9の阻害は、LDLcレベルにとって有利なものになる。したがって、抗-PCSK9療法は、LDLcレベルの有利な調節という観点から、有望なアプローチである。
【０００７】
神経アポトーシス調節転換酵素1（NARC-1）としても知られるPCSK9は、分泌性プロテイナーゼK様サブチラーゼであり、哺乳動物前駆タンパク質変換酵素（PC）ファミリーのメンバーである。それは、〜72kDaの前駆タンパク質として合成され、前駆体（プロ-PCSK9）は、機能的であるために、自己触媒のために処理される。これは、この成熟体（〜60-63kDa）において、CSK9フラグメント（aa153-692）との1：1錯体形成において強く非共有的に結合する生成物（aa31-152）の形成をもたらし、PCSK9は、分泌経路に向かって処理される。
【０００８】
このPCSK9成熟体に加えて、PCSK9のもう1つの先端切断（フーリン切断）体が、多くの細胞株および血漿において観察されている。ヒトおよびマウス血漿は、2つの形態のPCSK9、すなわち、成熟体（aa153-692）およびその先端切断体（aa218-692）を含み、マウス血漿において、先端切断体は、総血漿PCSK9の〜50%でありうる。このフーリン切断先端切断PCSK9は、成熟PCSK9（aa153-692）の部位aa218-219における切断の産物であり、したがって、フーリン/PC5/6A切断部位と呼ばれる。このような切断の後、次のPCSK9先端切断フラグメント（aa219-692）（いわゆるフーリン切断PCSK9）が形成される。
【０００９】
近年のデータは、両方の形態：成熟PCSK9（aa153-692）およびフーリン切断PCSK9（aa219-aa692）の、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）を結合し、そのレベルおよびLDLcレベルを調節する能力を確認した。
【００１０】
LDLRに結合する過程において、PCSK9触媒ドメインは、異なる部位を介してLDLRと相互作用する。この結合の結果として、PCSK9は、フーリン/PC5/6A切断部位（aa218-219）が位置する領域として知られる第2部位を介するこの相互作用を再度強化し、最適化する高次構造中に、LDLRのEGF（B）ドメインを用いてその位置づけを行なう。
【００１１】
このように、LDLRに向かうPCSK9の適切な位置決めを廃除する能力のうち、フーリン/PC5/6A切断PCSK9部位（aa218-219）を標的とする治療剤は、PCSK9におけるフーリンの作用を遮断することができる。このような治療剤は、間接的なPCSK9/LDLR相互作用（位置決め）を同時に排除し、PCSK9の先端切断されたLDLR結合活性体（aa219-692）の生成を阻害する。これは、LDLRの有利な増加をもたらし、したがって、血漿LDLcの有利な低下をもたらす。
【００１２】
過去25年間を通しての臨床試験は、3-ヒドロキシ-3 メチル-グルタリルコエンザイムAレダクターゼ阻害剤（スタチン）を用いることによって、心血管疾患の治療および循環LDLcレベルの低下における明らかな利点を確認した。スタチンは、ステロール調節エレメント結合タンパク質（以降、SREBPと称する）におけるその後の増加をもたらす肝臓コレステロール生合成を阻害することによって作用している。SREBPは、LDLRなどの脂質ホメオスタシスに関与する遺伝子の調節因子である。そして、上昇したSREBPは、LDLRタンパク質レベルの増加および後続する循環からのLDLc取り込みの増加をもたらす。
【００１３】
スタチンは、脂質異常症に対する最も一般的に用いられる療法である。しかし、それらの効能にもかかわらず、スタチンを用いる治療は、肝酵素の上昇、筋肉痛および筋炎などの副作用をもたらすことが多い。さらに、スタチンで治療された患者の有意な数が、有利なLDLc管理という点での目標を達成することができず、さらにスタチン不耐容になる患者も存在する。興味深いことには、SREBPにおいて作用することによって、スタチンは、LDLRを増加させるのみならず、PCSK9発現も上昇させ、その結果として、薬理効果を打ち消す。
【００１４】
このように、スタチンと抗PCSK9療法の組合せは、単独治療と比較して、相乗/相加効果の効力を有するLDLc管理のための有望なアプローチであるとみなされていた。
【００１５】
そして、抗PCSK9療法は、著しくより魅力的な効力のある将来的LDLc調節因子になった。抗PCSK9療法は、単剤療法として適しているのみならず、スタチン、またはフィブレートもしくはニコチン酸などのその他の物質などの、推奨かつ使用されている現行の療法のための新規な補助療法としても適している。一方、PCSK9の合成または機能を抑制するためのいくつかの異なる方策が確立されている。最後の十年間、アンチセンス-オリゴヌクレオチド（ASO）、ロックド核酸−核酸アンチセンス-オリゴヌクレオチド（LNO-ASO）およびsiRNAを用いる遺伝子サイレンシングによる合成を阻害するためのアプローチが、非常に積極的に開発されている。さらに、ASO技術は、アポリポタンパク質Bの阻害のために成功裏に適用されており、食品医薬品局（FDA）によって近年承認されている。事実、サル（Macaca fascicularis：カニクイザル）におけるPCSK9に対するsiRNAの適用は、総コレステロールの有意な減少をもたらした。一般に、PCSK9遺伝子サイレンシングのためのさまざまな方法からの結果は、議論の的となっており、アプローチの選択性に明らかに従属している。siRNAおよびLNAオリゴヌクレオチドを用いる2つの臨床試験第I相は、いくつかの課題に直面し、不確かな理由のために早期終了した。しかしながら、一方で、siRNAによってPCSK9を阻害する第三の臨床試験第I相は、成功裏に終了した。
【００１６】
模倣ペプチドおよびアドネクチンによるPCSK9-LDLR相互作用の阻害のための他の有望な治療的アプローチが設計されている。しかしながら、阻害のための可能性がさまざまであるのにもかかわらず、PCSK9を調節することによってLDLcを減少させるための最も進化したアプローチの1つは、抗PCSK9モノクローナル抗体である。今日までに、抗PCSK9モノクローナル抗体を評価する多くの臨床研究が、現在進行中である。健常者に対して行なわれる第I相臨床試験において、静脈内または皮下に導入された抗PCSK9モノクローナル抗体の単回用量は、LDLcレベルを67%まで引き下げることができた。さらに、スタチン処置において被験者に隔週または4週間隔で皮下適用された同じモノクローナル抗体は、81%までのLDLcの低減化に成功した。さらに、スタチン不耐容患者における同じモノクローナル抗体（隔週処置）による第二相臨床試験は、41-66%の範囲でLDLcを低下させた。これらの研究は、抗PCSK9療法が健常者において有効であるのみならず、スタチン処置およびスタチン不耐容集団においても有用であることを確認した。さらに、該モノクローナル抗体の効果を評価するための最終臨床試験である第III相臨床試験からの肯定的な結果に基づいて、前心筋梗塞または脳卒中の既往、冠動脈危険因子および冠動脈症候群を有する患者における抗PCSK9療法が行われ、共同主要評価項目を満たしていると近年報告された。しかしながら、PCSK9モノクローナル抗体の1つの大きな問題は、長期持続性のLDLc管理の欠如である。
【００１７】
WO 2009/055783 A2、WO 2009/100297 A1、WO 2010/057242 A2、WO 2011/02757 A2、WO 2011/117401 A1、WO 2012/59573 A1、WO 2013/037889 A2およびWO 2013/148284 A1は、抗原性PCSK9ペプチドを有するワクチンを開示する。Luoら （J. Lipid Res. 50（2009）: 1581-1588）は、トランスジェニックマウスにおいて肝外で発現された循環ヒトPCSK9を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、個人においてLDLcを減少させる手段および方法を提供することである；改善された抗原性能力を有し、ワクチン接種されたた個体におけるコレステロールの減少のために有効なワクチンとしての新規な抗原性PCSK9ペプチドを提供することが、本発明の特別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、配列番号：1のアミノ酸残基209〜222からなるPCSK9フラグメントの、特異的免疫増強変異体（アミノ酸交換および任意の先端切断）に関する。
【００２０】
本発明のペプチドは、いわゆるVARIOTOPE（登録商標）、すなわち、ペプチドPEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）である元の天然配列のアミノ酸変異体である。VARIOTOPE（登録商標）は、誘導される元のタンパク質／ペプチド配列とは異なるアミノ酸配列を有する。本発明のVARIOTOPE（登録商標）は、免疫系によって異物とみなされ、したがって、自己寛容を破壊する必要がない。
【００２１】
本発明は、アミノ酸残基209〜222（配列番号：1）からなるPCSK9フラグメントから誘導された、ワクチン、ワクチン組成物、またはVARIOTOPE（登録商標）ペプチドもしくはそのフラグメントからなる少なくとも1つのペプチドを含む組成物に関する。
【００２２】
したがって、本発明は、9〜25個のアミノ酸残基からなる少なくとも1つのペプチドであって、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、哺乳動物、特にヒトにおいて増強された免疫原性を有する、ペプチドPEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）の変異体であり、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して少なくとも1つ、多くとも4つのアミノ酸交換を特徴とする変異体であるペプチドを含むワクチンを提供する。
【００２３】
好ましくは、本発明のワクチンは、9〜25個のアミノ酸残基からなる少なくとも1つのペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
X1X2EDGX6RFX9X10X11X12X13X14    （配列番号：46）
[ここで、
X1は、リシン、トレオニン、アラニン、およびプロリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはプロリンであり、
X2は、グルタミンまたはアスパラギン酸、好ましくはアスパラギン酸であり、
X6は、トレオニンまたはセリンであり、
X9は、ヒスチジン、アラニン、およびセリンから選ばれるアミノ酸残基であり、
X10は、アルギニン、アラニン、グルタミン、リシン、メチオニン、プロリン、およびセリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアルギニン、セリンまたはアラニンであり、
X11は、グルタミン、アラニン、グルタミン酸、リシン、トレオニン、およびアルギニンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン、リシン、アルギニン、およびトレオニンであり、
X12は、アラニン、セリン、およびトレオニンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンであり、
X13は、セリン、アラニン、およびアスパラギンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはセリンであり、
X14は、リシン、アラニン、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、およびバリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはリシンまたはセリンであるか、または
少なくとも9つの連続したアミノ酸残基を有する、配列番号：46のフラグメントであり、および
ここで、配列番号：46は、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）またはそのNもしくはC末端先端切断フラグメントではない]
を有するか、または含むペプチドを含む。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンは、以下の配列から選ばれるアミノ酸配列からなるか、または該配列を含むペプチドを含む：
AEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFARQASK、PEEDGTRFHAQASK、PEEDGTRFHRAASK、PEEDGTRFHRQAAK、PEEDGTRFHRQASA、TEEDGTRFHRQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGSRFHRQASK、PEEDGTRFHQQASK、PEEDGTRFHKQASK、PEEDGTRFHMQASK、PEEDGTRFHREASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、 PEEDGTRFHRQANK、PEEDGTRFHRQASR、PEEDGTRFHRQASL、KEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFHPQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGTRFHRQAST、PEEDGTRFHRQASV、PEEDGSRFHKQASK、PEEDGSRFHMQASK、PEEDGSRFHRRASK、およびPEEDGSRFHRQATK；好ましくはAEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFARQASK、PEEDGTRFHAQASK、PEEDGTRFHRAASK、PEEDGTRFHRQASA、TEEDGTRFHRQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFHPQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGTRFHRQASV、PEEDGSRFHKQASK、PEEDGSRFHRRASK、およびPEEDGSRFHRQATK；特にAEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHAQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGSRFHKQASKおよびPEEDGSRFHRRASK。
【００２５】
本発明によって提供されるペプチドは、天然のPCSK9アミノ酸配列PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）の免疫増強変異体である。本発明のペプチドは、天然のPCSK9配列に基づくワクチンが通例引き起こす自己寛容の問題を注意深く考慮した上での、PCSK9に対する改善された免疫反応を提供するように、しっかりと設計され、選択されている。
【００２６】
本発明のペプチドは、天然の配列PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と対比して、アミノ酸変異を有する。好ましい実施態様によれば、変異（交換されたアミノ酸残基）の数は、3アミノ酸残基を超えない。本発明のペプチドが、1つだけ、または2つのアミノ酸交換を有するのが好ましい。このような少数のアミノ酸交換によって、特に免疫増強ペプチドの他の有利な特性に関して、それらが提供され得たこと、すなわち、これらの新規なペプチドが、自己寛容を破壊する必要がないことは驚くべきことである。
【００２７】
本発明の好ましいペプチドは、たとえば、後記実施例によって血清ELISAで証明されるように、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、少なくとも50 %、好ましくは少なくとも100 %、特に少なくとも200%の増強された免疫原性を有する。
【００２８】
好ましい実施態様によれば、本発明のワクチン中のペプチドは、たとえば、後記実施例によって血清コレステロール試験（絶対値において、未処置比較は100%である）で証明されるように、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、少なくとも3 %、好ましくは少なくとも5 %、特に少なくとも10%の総コレステロールレベルを減少させる増強された能力を有する。本発明のペプチドの少なくともいくつかについて、天然配列との比較における、このような増強された総コレステロール低下レベルは、科学的に承認されたコレステロールモデルにおいて実験的に確認されている。したがって、本発明の変異体は、AEEDGTRFHRQASK（配列番号：2）、TEEDGTRFHRQASK（配列番号：9）、PQEDGTRFHRQASK（配列番号：10）、PEEDGTRFHRRASK（配列番号：17）、PEEDGTRFHRKASK（配列番号：18）、PEEDGTRFHRQASR（配列番号：23）、およびPEEDGTRFHRTASK（配列番号：36）から選ばれるのが好ましい。天然配列の変異体ペプチドが、天然配列ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、増強された免疫原性を有することはすでに驚くべきことであるが、このようなペプチドが、対応する天然配列よりも効率的に総コレステロールも減少させうることは、さらにおどろくべきことであった。
【００２９】
本発明のワクチンに含まれるペプチドが、医薬的に許容しうる担体、好ましくは担体タンパク質、特に少なくとも1つのT細胞エピトープを含むタンパク質に結合または融合するのが好ましい。
【００３０】
本発明のワクチンの投与は、脂質異常症、高脂血症、高コレステロール血症および／またはアテローム性動脈硬化症などの、PCSK9および疾患におけるその役割に関連する病的状態を治療または予防することを可能にする。
【００３１】
本発明のペプチドは、アミノ酸配列 PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）を有し、9〜25個のアミノ酸残基、好ましくは9〜20個のアミノ酸残基、特に9〜15個のアミノ酸残基からなるPCSK9フラグメントの変異体（アミノ酸交換および任意の先端切断）である。本発明の特に好ましいペプチドは、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸残基、好ましくは13または14個のアミノ酸残基、特に14個のアミノ酸残基からなる。本発明のPCSK9 VARIOTOPE（登録商標）ペプチドは、所定の配列（たとえば、配列番号：2-46；そのNまたはC末端、特にC末端に結合したリンカーを任意に有し；該リンカーは、好ましくはシステイン残基であるか、またはシステイン残基を含み、特にC末端のシステイン残基である）からなるペプチドの形態で用いられるのが好ましいが、より短いか、または長い配列を用いることもできる（たとえば、WO 2013/037889 A1を参照）。たとえば、NまたはC末端から単一のアミノ酸を欠失させ、免疫原性またはTC減少に関して、事実上同等のペプチドワクチンを達成することが可能である。このような欠失が、C末端で行われうるのが好ましい。いくつかの場合、より長い（すなわち、2つ以上のアミノ酸）欠失も、可能である（特に、WO 2013/037889 A1、IPRPに挙げられた追加実験（図5/6）を参照）。一方、これらの本発明ペプチドの特性を有意に変化させることなく、NまたはC末端（好ましくはC末端）にアミノ酸残基を付加することも可能である（たとえば、Amarら、AHA presentation 18960（2014）を参照）。NまたはC末端におけるアミノ酸残基の付加は、この（付加）部位における天然のアミノ酸残基のさらなる付加、すなわち、このようなVARIOTOPE（登録商標）における天然配列伸長を提供する付加であるのが好ましい。
【００３２】
本発明のワクチンは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または少なくとも3つの本明細書に定義されるペプチドを含み、哺乳動物、特にヒト個体の能動免疫化を可能にし、ここで、特に、本発明ワクチンが、T細胞エピトープを含む分子としてペプチドまたはポリペプチドまたは担体タンパク質に結合または融合する場合、PCSK9に対する抗体の中和は、誘導されたフラグメントを用いるワクチン接種によって誘導される。
【００３３】
本発明のペプチドは、結合しないで注射された場合、通常、該当する量の抗体を誘導する能力を有さないので、ペプチド/担体の組合せが、主に重要である。
【００３４】
したがって、ワクチンは、本明細書に開示される2つ以上のペプチドの組合せを含んでもよい。しかしながら、本発明ワクチンが、配列番号：1に結合した1つ以上の次のペプチド、および本明細書に定義されるミモトープなどの他のペプチド（すなわち、PCSK9フラグメントの突然変異体；EP12182241）またはPCSK9のフラグメント（たとえば、WO 2013/037889を参照）を含むことも可能である。
【００３５】
本発明のペプチドは、当技術分野で周知の方法によって化学的に合成されうる。もちろん、組換え法を用いて本発明のペプチドを産生することも可能である。ペプチドは、細菌、酵母または真菌などの微生物内、哺乳動物または昆虫細胞などの真核細胞内、またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルス、センダイウイルスなどの組換えウイルスベクター内で産生することもできる。ペプチドを産生するための適当な細菌として、大腸菌、枯草菌またはこのようなペプチドを発現する能力をもつその他の細菌が挙げられる。本発明のペプチドを発現するための適当な酵母細胞として、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、カンジダ、ピチア・パストリスまたはペプチドを発現する能力をもつその他の酵母が挙げられる。対応する手段および方法は、当技術分野で周知である。組換え的に産生されたペプチドを単離し、精製する方法もまた、当技術分野で周知であり、たとえば、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００３６】
本発明のペプチドは、ヒトPCSK9に特異的に結合する抗体を誘導することができ、LDLRのPCSK9媒介性分解を阻害することができる。
【００３７】
本発明のペプチドの単離を促進するために、ペプチドが、アフィニティークロマトグラフィーによる単離を可能にする異種ポリペプチドに翻訳的に融合（共役的に結合）される融合ポリペプチドを作成してもよい。典型的な異種は、His-Tag（たとえば、His6；6 ヒスチジン残基）、GST-Tag（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）などである。融合ポリペプチドは、ペプチドの精製を促進するばかりでなく、精製ステップ中のペプチドの分解を防止することもできる。もし精製後に異種ポリペプチドを除去することが望ましいならば、融合ポリペプチドは、ペプチドと異種ポリペプチドとの結合部に切断部位を含むことができる。切断部位は、そのアミノ酸配列に特異的な酵素（たとえば、プロテアーゼ）で切断されるアミノ酸配列からなる。
【００３８】
本発明のワクチンおよびペプチドは、ヒトを含む任意の種類の哺乳動物に投与することができる。しかしながら、本発明のワクチンおよびペプチドをヒトに投与するのが好ましい。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンに含まれる少なくとも1つのペプチドは、以下の配列から選ばれる：
配列番号（Seq）：2: AEEDGTRFHRQASK、配列番号：4: PEEDGTRFARQASK、配列番号：5: PEEDGTRFHAQASK、配列番号：6: PEEDGTRFHRAASK、配列番号：7: PEEDGTRFHRQAAK、配列番号：8: PEEDGTRFHRQASA、配列番号：9: TEEDGTRFHRQASK、配列番号：10: PQEDGTRFHRQASK、配列番号：12: PEEDGSRFHRQASK、配列番号：13: PEEDGTRFHQQASK、配列番号：14: PEEDGTRFHKQASK、配列番号：15: PEEDGTRFHMQASK、配列番号：16: PEEDGTRFHREASK、配列番号：17: PEEDGTRFHRRASK、配列番号：18: PEEDGTRFHRKASK、配列番号：19: PEEDGTRFHRQSSK、配列番号：21: PEEDGTRFHRQANK、配列番号：23: PEEDGTRFHRQASR、配列番号：24: PEEDGTRFHRQASL、配列番号：25: KEEDGTRFHRQASK、配列番号：29: PEEDGTRFSRQASK、 配列番号：34: PEEDGTRFHPQASK、配列番号：35: PEEDGTRFHSQASK、配列番号：36: PEEDGTRFHRTASK、配列番号：37: PEEDGTRFHRQTSK、配列番号：38: PEEDGTRFHRQASS、配列番号：39: PEEDGTRFHRQAST、配列番号：40: PEEDGTRFHRQASV、配列番号：41: PEEDGSRFHKQASK、配列番号：42: PEEDGSRFHMQASK、配列番号：43: PEEDGSRFHRRASK、配列番号：44: PEEDGSRFHRQATK;
および少なくとも9アミノ酸長を有するそのフラグメント。
【００４０】
PCSK9を標的とする液性免疫反応を引き起こす能力をもたない以下のペプチドは、アミノ酸交換が、PCSK9機能を効率的に遮断する抗体などの免疫原性ペプチドをもたらすように正確に選ばれなければならないことを強調する：
配列番号：26: PEWDGTRFHRQASK、配列番号：28: PEEDGTGFHRQASK、配列番号：32: PEEDGTRFGRQASK。
【００４１】
本発明の特に好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンに含まれる少なくとも1つのペプチドは、以下の配列から選ばれる：
配列番号：2: AEEDGTRFHRQASK、配列番号：4: PEEDGTRFARQASK、配列番号：5: PEEDGTRFHAQASK、配列番号：6: PEEDGTRFHRAASK、配列番号：7: PEEDGTRFHRQAAK、配列番号：8: PEEDGTRFHRQASA、配列番号：9: TEEDGTRFHRQASK、配列番号：10: PQEDGTRFHRQASK、配列番号：12: PEEDGSRFHRQASK、配列番号：13: PEEDGTRFHQQASK、配列番号：14: PEEDGTRFHKQASK、配列番号：15: PEEDGTRFHMQASK、配列番号：16: PEEDGTRFHREASK、配列番号：17: PEEDGTRFHRRASK、配列番号：18: PEEDGTRFHRKASK、配列番号：19: PEEDGTRFHRQSSK、配列番号：21: PEEDGTRFHRQANK、配列番号：23: PEEDGTRFHRQASR、配列番号：24: PEEDGTRFHRQASL、配列番号：25: KEEDGTRFHRQASK、配列番号：29: PEEDGTRFSRQASK、配列番号：34: PEEDGTRFHPQASK、配列番号：35: PEEDGTRFHSQASK、配列番号：36: PEEDGTRFHRTASK、配列番号：37: PEEDGTRFHRQTSK、配列番号：38: PEEDGTRFHRQASS、配列番号：39: PEEDGTRFHRQAST、配列番号：40: PEEDGTRFHRQASV、配列番号：41: PEEDGSRFHKQASK、配列番号：42: PEEDGSRFHMQASK、配列番号：43: PEEDGSRFHRRASK、配列番号：44: PEEDGSRFHRQATK。
【００４２】
表A: アミノ酸残基
0006494667.tif 000002
【００４３】
特に好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンに含まれる少なくとも1つのペプチドは、そのNおよび／またはC末端に、それに直接結合するか、またはスペーサー配列を介して結合する少なくとも1つのシステイン残基を含む。
【００４４】
このシステイン残基は、ペプチドをもう1つの分子または担体に結合させるための反応基として機能することができる。たとえば、ペプチドを担体タンパク質に結合させるために、この基を用いてもよい。システイン残基は、本発明のペプチドに直接結合されるか、またはスペーサー配列を介して結合されうる。スペーサー配列は、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらにより好ましくは少なくとも4つ、および任意に多くとも10個、好ましくは最小で5個の、グリシンなどの小さい非極性アミノ酸残基を含むのが好ましい。
【００４５】
しかしながら、このようなシステイン残基または他のアミノ酸リンカー（たとえば、CG-、CGG-、-GC、-GGCなど）は、天然PCSK9ペプチドエピトープ PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）もしくはそのフラグメントの（NまたはC末端）交換もしくは変異であるとみなされるべきではなくて、ワクチン接種された固体において特異的抗体反応を引き起こすエピトープ配列への付加であることは明らかである。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のワクチンは、タンパク質担体、好ましくは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、CRM（好ましくはCRM197）、破傷風トキソイド（TT）、ジフテリア毒素（DT）、プロテインD、またはヘルパーT細胞エピトープを含む任意のその他のタンパク質またはペプチドから選ばれるタンパク質担体を含む。
【００４７】
本発明によれば、ペプチドは、医薬的に許容しうる担体、好ましくは、KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）、CRM、破傷風トキソイド、アルブミン結合タンパク質、ウシ血清アルブミン、デンドリマー、ペプチドリンカー（またはフランキング領域）ならびに、Singhら （Singhら、Nat. Biotech. 17、（1999）: 1075-1081（in particular those in Table 1 of that document））、およびO'Haganら （O'Hagan and Valiante, Nature Reviews, Drug Discovery 2（9）;（2003）: 727-735（特に、内因性免疫増強化合物および文献に記載のデリバリーシステム））に記載のアジュバント物質またはその混合物に結合するか、または融合するのが好ましい。この文脈において、共役化学（たとえば、GMBSなどのヘテロ二官能性化合物、あるいはもちろん“Bioconjugate Techniques”、Greg T. Hermansonに記載の他の化合物を介して）は、当業者に公知の反応から選択されうる。
【００４８】
あるいは、当技術分野で公知の方法によって、本発明の少なくとも1つのペプチドをタンパク質担体に融合することも可能である。このようなタンパク質は、非関連免疫原性タンパク質とともに本明細書に記載のペプチドを含む。免疫原性タンパク質は、リコール反応を引き起こす能力があるのが好ましい。このようなタンパク質の例として、破傷風、結核、肝炎タンパク質およびプロテインD、グラム陰性菌であるインフルエンザ菌の表面タンパク質が挙げられる（WO 91/18926）。タンパク質の約1/3（たとえば、最初のN末端100-110アミノ酸）を含み、脂質化されてもよいタンパク質D誘導体が用いられるのが好ましい。融合タンパク質を提供するために用いることができるもう1つの担体は、LYTAとして知られるタンパク質またはその一部（好ましくはC末端タンパク質）であってもよい。LYTAは、アミダーゼLYTAとして知られるN-アセチル-L-アラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌から誘導される（LytA遺伝子によってコードされる；Gene 43;（1986）:265-292）。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。好ましい実施態様の範囲内で、LYTAの反復部分が、融合タンパク質内に組み込まれてもよい。反復部分は、残基178から始まるC末端領域に見い出される。特に好ましい反復部分は、残基188-305を含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様によれば、ペプチドは、アジュバントとともに製剤され、水酸化アルミニウム（アルヒドロゲル、Al（OH）3）に吸着されるのが好ましい。
【００５０】
本発明のワクチンは、アジュバント、好ましくは低可溶性アルミニウム組成物、特に水酸化アルミニウムとともに製剤されてもよい。もちろん、MF59、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン（たとえば、IL-2、IL-12、GM-CSF）、サポニン（たとえば、QS21）、MDP誘導体、CpGオリゴヌクレオチド、LPS、MPL、ポリホスファゼン、エマルション（たとえば、フロイントアジュバント、SAF）、リポソーム、ビロソーム、イスコム、コクリエート（cochleate）、PLGA微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、易熱性エンテロトキシン（LT）、コレラ毒素（CT）、変異毒素（たとえば、LTK63およびLTR72）、微粒子および/または重合リポソームなどのアジュバントを用いることもできる。
【００５１】
適当なアジュバントは、たとえば、AS01B、AS02A、AS15、AS-2およびその誘導体（GlaxoSmithKline、フィラデルフィア、ペンシルベニア）；CWS、TDM、Leif、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；カチオン的またはアニオン的に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリル脂質AおよびキルAとして市販されている。GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7もしくは-12などのサイトカインをアジュバントとして用いてもよい。
【００５２】
主としてTh1型応答を誘発することにおいて用いるための好ましいアジュバントとして、たとえば、モノホスホリル脂質A、好ましくは3-O-脱アシル化モノホスホリル脂質Aと、任意に、アルミニウム塩の組合せが挙げられる（たとえば、Ribiら、Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins、Plenum Publ. Corp.、NY、（1986）： 407-419；GB 2122204B；GB 2220211；およびUS 4,912,094を参照）。3D-MPLの好ましい形態は、直径0.2 mm未満の小さい粒径を有するエマルションであり、その製造方法は、WO 94/21292に開示される。モノホスホリル脂質Aおよび界面活性剤を含む水性製剤は、WO 98/43670に記載されている。例示された好ましいアジュバントとして、AS01B（リポソーム製剤中のMPLおよびQS21）、リポソーム製剤中の3D-MPLおよびQS21、AS02A（MPLおよびQS21および水中油型エマルション）、水中油型エマルション中の3D-MPLおよびQS21およびならびにAS 15が挙げられる。MPLアジュバントは、たとえば、米国特許第4,436,727号；米国特許第4,877,611号；米国特許第4,866,034号および米国特許第4,912,094号に開示される。
【００５３】
CpG含有オリゴヌクレオチド（ここで、CpGジヌクレオチドは、メチル化されていない）もまた、主としてTh1型応答を誘発する。CpGは、DNA中に存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。このようなオリゴヌクレオチドは公知であり、たとえば、WO 96/02555、WO 99/33488、米国特許6,008,200号および米国特許US 5,856,462号に記載されている。免疫活性化DNA配列もまた、Satoら、Science 273;（1996）：352に記載されている。ワクチンに製剤される場合のCpGは、一般に、遊離抗原とともに自由溶液において（WO 96/02555；McCluskieおよびDavis、上記）、または抗原に共有的に結合して（WO 98/16247）、または水酸化アルミニウムなどの担体とともに製剤されて（（肝炎表面抗原） Davisら、上記；Brazolot-Millanら、PNAS USA、95（26）、（1998）：15553-8）投与される。CpGは、全身経路および粘膜経路の両方によって投与することができるアジュバントであるとして当技術分野で知られている（WO 96/02555、EP 0 468 520、Davisら、J.lmmunol、160（2）、（1998）：870-876；McCluskieおよびDavis、J.Immunol.、161（9）、（1998）：4463-6）。
【００５４】
もう１つの好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニン模倣体もしくは誘導体であり、QS21（Aquila Biopharmaceuticals Inc.）が好ましく、単独または他のアジュバントとの併用で用いられてよい。たとえば、強化された系は、WO 94/00153に記載のQS21と3D-MPLの組合せなどのモノホスホリル脂質Aとサポニン誘導体の組合せ、あるいはWO 96/33739に記載の、QS21がコレステロールでクエンチされる反応原性がより少ない組成物を含む。他の好ましい製剤は、水中油型エマルションおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルション中の3D-MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤は、WO 95/17210に記載されている。本発明のさらなるサポニンアジュバントとして、QS7（WO 96/33739およびWO 96/11711に記載）およびQS17（米国特許第5,057,540号および欧州特許明細書0 362 279 B1に記載）が挙げられる。
【００５５】
他の好ましいアジュバントとして、モンタニドISA720（Seppic、フランス）、SAF（Chiron、カリフォルニア、米国）、ISCOMS（CSL）、MF-59（Chiron）、アジュバントのSBASシリーズ（たとえば、SBAS-2、AS2'、AS2、SBAS-4またはSBAS6、GlaxoSmithKlineから市販されている）、デトックス（Corixa）、RC-529（Corixa、ハミルトン、モンタナ）およびその他のアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート（AGPs）が挙げられる。さらなる例示のアジュバントとして、合成MPLおよびに志賀毒素Bサブユニットに基づくアジュバント（WO 2005/112991参照）が挙げられる。アジュバントとして水酸化アルミニウムを用いるのが特に好ましい。
【００５６】
本発明のワクチンは、ワクチンのための公知の適当な投与経路、好ましくは、皮下、筋肉内、皮内または静脈内投与されてよい。投与経路に応じて、薬剤は、それぞれの担体、アジュバント、および/または賦形剤を含んでよい。
【００５７】
本発明のペプチドおよび医薬的に許容しうる担体を含むワクチンは、皮内（i.d.）、腹腔内（i.p.）、筋肉内（i.m.）、鼻腔内、経口、皮下（s.c.）などの任意の適当な投与様式によって、任意の適当なデリバリーデバイスで投与することができる（O'Haganら、Nature Reviews、Drug Discovery 2（9）、(2003）、727-735）。本発明のペプチドは、比内、皮下または筋肉内投与用に製剤されるのが好ましい。それぞれの製剤を得るための手段および方法は、当業者に周知である。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様によれば、ワクチンは、特に哺乳動物、好ましくはヒトにおける、高脂血症、高コレステロール血症および/またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる障害、好ましくは心血管疾患、脳卒中または末梢血管疾患およびPCSK9に関連するその他の疾患、たとえば、黒色腫および肝癌転移などの腫瘍性疾患の治療および／または予防において用いられる（Sun et al、Neoplasia、14（12） 2012、1122-1131）。
【００５９】
概説したように、本発明のペプチドは、PCSK9に特異的に結合することができる抗体の形成を誘導することができる。抗体とPCSK9との相互作用は、インビボにおける肝細胞中の低密度リポタンパク質受容体の増加、血漿コレステロール取り込みの増加、およびそれに続く血漿LDLコレステロールレベルの低下、それによる総コレステロールレベルの低下をもたらす。
【００６０】
特に、本発明は、aa209-222 PCSK9領域を結合して、PCSK9/LDLR相互作用に負の影響を及ぼし、その結果、血漿コレステロールを有利に減少させることができる抗体に関する。これらの抗体は、フーリンによる成熟PCSK9（aa153-692）タンパク質の切断も遮断し、その結果、LDLR結合先端切断型のPCSK9（aa219-692）の産生を阻害する。さらに、本発明のペプチドは、209-222領域においてPCSK9を結合し、成熟PCSK9のフーリン切断のプロセスを阻害することができる抗体の形成を誘導することができる。
【００６１】
アテローム性動脈硬化症に関連する疾患は、好ましくは動脈閉塞性疾患、冠状動脈性心臓病、卒中性脳発作（apoplectic cerebral insultus）および脳卒中（stroke）から選ばれる。
【００６２】
用語「高脂血症、高コレステロール血症および/またはアテローム性動脈硬化症に関連する疾患」および「高脂血症、高コレステロール血症および/またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる障害」は、高脂血症、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化症の結果である疾患を意味する。これらの疾患は、特に、末梢動脈閉塞性疾患、、冠状動脈性心臓病および卒中性脳発作を包含する（たとえば、Steinberg、D. J Lipid Res 46(2005）：179-190およびSteinberg、D. J Lipid Res 47(2006）：1339-1351を参照）。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、哺乳動物または個人に、免疫化当り0.1 ng〜10 mg、好ましくは0.5〜500 μg、より好ましくは1〜100 μgの量で投与される。好ましい実施態様において、これらの量は、（もし１つ以上のペプチドがワクチンに用いられるならば）ワクチン中に存在する全ペプチドを意味する。もう１つの実施態様において、これらの量は、ワクチン中に存在する各単一のフラグメントを意味する。もちろん、ペプチドが、異なる量であるかまたは等しい量で存在するワクチンを提供することが可能である。しかしながら、別法として、本発明のペプチドは、哺乳動物または個人に、0.1 ng〜10 mg、好ましくは10 ng〜1 mg、特に100 ng〜300 μg/体重kgの量で投与されてもよい。
【００６４】
単一投与剤形を作成するために担体材料と合せるペプチドの量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変わる。ワクチンの用量は、哺乳動物または個人の疾患の状態、年齢、性別および体重；ならびに個人において所望の応答を引き起こすための抗体の能力などの因子に応じて変わる。投与計画は、最適治療応答を提供するように調節されてよい。たとえば、数回の分割用量が、毎日投与されてもよく、あるいは治療状況の緊急性によって指示されるように用量を比例的に減少させてもよい。ワクチンの用量は、状況に応じて最適予防用量応答を提供するように変更されてもよい。たとえば、本発明のペプチドおよびワクチンは、常に、PCSK9に対する抗体のレベルに応じて、数日、１もしくは２週または月または年の間隔で個人に投与されてもよい。
【００６５】
本発明の好ましい実施態様において、ペプチド／ワクチンは、2〜10回、好ましくは2〜7回、そして最も好ましくは5回まで適用される。この免疫化の数は、基礎免疫化をもたらすことができる。特に好ましい実施態様において、ワクチン接種の時間間隔は、２週間〜5年、好ましくは1ヶ月〜3年まで、より好ましくは2ヶ月〜1.5年であるように選ばれる。例示されたワクチン接種スケジュールは、6〜8週間にわたり、6ヶ月までの、3〜4回の初回ワクチン接種を含み、好ましくはこのような初回ワクチン接種の後のさらなる投与を含む。その後、ワクチン接種は、2〜10年毎に繰り返されてもよい。本発明のペプチド／ワクチンの反復投与は、治療的ワクチン接種の最終的効果を最大化することができる。
【００６６】
本発明のワクチンは、ヒトの体内におけるLDLおよび／またはHDLレベルの調節にも関与する他のタンパク質に由来する抗原を含んでもよい。たとえば、本発明のPCSK9フラグメントを、ヒトCETPタンパク質に由来するエピトープと組み合わせてもよい。本発明のワクチンはまた、PCSK9タンパク質の異なるエピトープに由来する抗原を含んでもよい。
【００６７】
本発明のワクチンは、高脂血症、高コレステロール血症および/またはアテローム性動脈硬化症、好ましくは心血管疾患、脳卒中または末梢血管疾患の治療に適した他のタンパク質に由来する抗原を含んでもよい。
【００６８】
典型的には、ワクチンは、0.5〜500 μg、好ましくは1〜100 μg、および、あるいは、0.1 ng〜10 mg、好ましくは10 ng〜1 mg、特に100 ng〜100 μg、または、あるいは、たとえば、100 fmol〜10 μmol、好ましくは10 pmol〜1 μmol、特に100 pmol〜100 nmolの量で本発明のペプチドを含む。典型的には、ワクチンはまた、緩衝剤、安定化剤などの補助物質を含んでもよい。
【００６９】
本発明のさらにもう１つの態様は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症に関連する疾患を患っているか、または患うリスクのある個人を治療するための方法に関し、その過程において本発明のペプチドまたはワクチンが該個人に投与される。
【００７０】
本発明のワクチンの次に、治療される個人は、スタチン、フィブラート、ニコチン酸、コレステロール取り込み阻害剤（エゼチミブなど）、アポA1ミラノ、脱脂HDL、植物ステロールなどの、ヒトおよび哺乳動物においてLDLおよび／またはHDLレベルに影響を及ぼすことが知られている他の活性成分を投与されてもよい。スタチンとともに（すなわち、同時、順次などで）本発明のワクチンを個人に投与するのが特に好ましい。本発明のワクチンは、LDLアフェレーシスのような方法と組み合わせることもできる。LDLアフェレーシスは、血流からコレステロール含有粒子である低密度リポタンパク質（LDL）を除去するためのアフェレーシスの１つの形態である。典型的には、LDLアフェレーシスは、アポリポタンパク質B（LDL粒子の主要タンパク質）に対する抗体、硫酸デキストランまたはポリアクリレートでコーティングされたカラムを通して静脈血を導くことによるか、または低pHにてヘパリンでLDLを沈殿させることによって作動する。それぞれの方法は、当業者には知られている。
【００７１】
本明細書で用いる用語「予防する」は、リスク因子低減化などの疾患の発生を予防することのみならず、その進行を阻止し、一旦確立されたその結果を低減化させるための措置を含む。
【００７２】
本明細書で用いる用語「治療」またはは文法的等価語は、疾患の症状の改善および／または逆転を含む。本発明のスクリーニング法で用いる場合に疾患に関連する任意のパラメーターにおいて改善を引き起こす化合物は、そのことによって治療化合物として同定される。用語「治療」は、治療的処置および予防的または防止的措置の両方を意味する。たとえば、本発明の組成物および方法による治療から恩恵を受ける患者として、すでに疾患および／または障害を有するもの、ならびに疾患および／または障害が予防されるべきであるもの（たとえば、本発明の予防的処置を用いて）が挙げられる。
【００７３】
本発明は、さらに以下の実施例および図面によって説明されるが、これらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】タンパク質ELISA：  示された配列によって誘導されたヒトPCSK9タンパク質に対する平均力価（n=5 マウス/グループ）の比較を示す。  データは、天然配列（配列番号：1 PEEDGTRFHRQASK）との比較における、選択されたVARIOTOPE（登録商標）の、ヒトPCSK9タンパク質に対する、より高い抗体力価を誘導する能力を表す。
【図１Ｂ】タンパク質ELISA：  示された配列によって誘導されたヒトPCSK9タンパク質に対する平均力価（n=5 マウス/グループ）の比較を示す。  データは、天然配列（配列番号：1 PEEDGTRFHRQASK）との比較における、選択されたVARIOTOPE（登録商標）の、ヒトPCSK9タンパク質に対する、より高い抗体力価を誘導する能力を表す。
【図２Ａ】100%として設定したネガティブコントロールグループとの比較における総コレステロール％：  図2Aは、非関連ペプチドで免疫化したネガティブコントロールグループ、ならびに天然の元のPCSK9配列（配列番号：1: PEEDGTRFHRQASK）との比較における、選択された免疫原性VARIOTOPE（登録商標）（配列番号：10: PQEDGTRFHRQASK、配列番号：17: PEEDGTRFHRRASK、配列番号：18: PEEDGTRFHRKASK、配列番号：23: PEEDGTRFHRQASR）で免疫化したマウスの総コレステロールレベルの平均％（n=3 マウス/グループ）を示す。VARIOTOPE（登録商標）の、天然配列と比較して同等またはより低いレベルまで総コレステロールレベルを減少させる能力に留意。
【図２Ｂ】100%として設定したネガティブコントロールグループとの比較における総コレステロール％：  図2Bは、非関連ペプチドで免疫化したネガティブコントロールグループ、ならびに天然の元のPCSK9配列（配列番号：1: PEEDGTRFHRQASK）との比較における、選択された免疫原性VARIOTOPE（登録商標）（配列番号：36: PEEDGTRFHRTASK）で免疫化したマウスの総コレステロールレベルの平均％（n=5 マウス/グループ）を示す。VARIOTOPE（登録商標）の、天然配列と比較してより強力に総コレステロールレベルを減少させる能力に留意。
【図２Ｃ】100%として設定したネガティブコントロールグループとの比較における総コレステロール％：  図2Cは、非関連ペプチドで免疫化したネガティブコントロールグループ、ならびに天然の元のPCSK9配列（配列番号：1: PEEDGTRFHRQASK）との比較における、選択された多重aa交換を有する免疫原性VARIOTOPE（登録商標）（配列番号：41: PEEDGSRFHKQASK and 配列番号：44: PEEDGSRFHRQATK）で免疫化したマウスの総コレステロールレベルの平均％（n=5 マウス/グループ）を示す。VARIOTOPE（登録商標）の、天然配列と比較してより強力に総コレステロールレベルを減少させる能力に留意。
【図３】フーリン切断および先端切断型フーリン切断PCSK9の生成の阻害：  図3は、選択された高免疫原性 VARIOTOPE（登録商標）（配列番号：10: PQEDGTRFHRQASK、配列番号：17: PEEDGTRFHRRASK、配列番号：18: PEEDGTRFHRKASK、配列番号：23: PEEDGTRFHRQASR）の、成熟PCSK9（aa153-692）のフーリン切断を阻害することによって先端切断型PCSK9（~50kDa産物）（aa219-692）の生成を抑止することができる抗体を誘導する能力を表す。切断プロセスを、ネガティブコントロール（非関連ペプチドを注射されたマウス由来の血漿の存在下でインキュベートしたPCSK9）およびポジティブコントロール（フーリンの存在または不在下でインキュベートしたhuPCSK9）と比較する。
【図４】100%として設定したネガティブコントロールグループとの比較における総コレステロール％（TC）を示す。
【図５】0として設定した元の配列で処置したグループとの比較におけるVARITOPE（登録商標）処置グループのTCの差異％を示す。
【図６】0として設定した元の配列で処置したグループとの比較におけるVARITOPE（登録商標）処置グループのTCの差異％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
材料および方法
ワクチン：
ヘテロ二官能性リンカーGMBS（4-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）を介して、KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）にペプチドを結合させた。
【００７６】
動物実験：
5匹のBalb/cマウスを皮下免疫した。マウスは、食餌および水を自由摂取することができ、12時間の明暗周期下に保持された。実験開始時のマウスの週齢は、8〜10週齢であった。 
【００７７】
総体積1 mlのアジュバントとしてKLHに結合させ、アルヒドロゲルに吸着させた正味15 μgのペプチドを、マウスに、2週間隔で4回注射した。
最後の注射の約2週間後に血液を採取した。
【００７８】
タンパク質ELISA：
ワクチンの免疫原性を決定し、免疫化動物の血漿中のPCSK9特異的抗体の量を特定するために、ELISA免疫測定を行なった。ELISA免疫測定は、容易に定量することができ、ワクチンが誘導したPCSK9特異的抗体の量の定量的測定を表すシグナルをもたらす。したがって、ELISAによって測定された力価は、処置された動物の血漿サンプル中の標的特異的抗体の量と直接相関する。最後の免疫化の２週間後に、すべての血漿サンプルを採取し、等しく処置した。直接的な比較を得るために、すべてのサンプルに対して同時に、ワクチン誘導PCSK9特異的抗体のPCSK9タンパク質ELISA免疫測定による定量的評価およびそれらの相対的コントロール（元の配列およびネガティブコントロール）に対する比較を行なった。この目的のために、ELISAプレートを、組換え的に発現されたヒトPCSK9タンパク質でコーティングした。遮断緩衝液（PBS中の1%BSA）とともにインキュベーションを行うことによって、非特異的結合を遮断した。適切な血清希釈物（出発希釈は、1:100）をウエルに加え、1：2倍に連続的に希釈し（12希釈ステップ）、約1時間インキュベートした。抗マウスIgG抗体とともにインキュベーションすることによって、結合した抗体を検出し、基質としてABTSを加え、405 nmにてODを測定した。非関連ペプチドを注射されたコントロールグループからのネガティブコントロール血清を分析した。アッセイにおいてODmaxの50%が達成される血清希釈として力価を決定した。
【００７９】
総コレステロールアッセイ：
最後の免疫化の２週間後に、すべての血漿サンプルを採取し、等しく処置した。すべてのサンプルについて同時に、総コレステロール（TC）測定を行ない、それらの相対的コントロール（元の配列およびネガティブコントロール）に対して対照比較を行なった。LabAssay（商標）コレステロールキット（Wako）によって、血漿TCレベル（mg/dL）の同時定量的測定値を測定した。詳しくは、コレステロールエステラーゼを含む色原体とともにインキュベーションした後、サンプル中のコレステロールエステルを、コレステロールと脂肪酸に分解した。続いて、コレステロールオキシダーゼによって遊離コレステロールを酸化し、過酸化水素の同時放出を導いた。生成された過酸化水素は、ペルオキシダーゼ（HRP）によって、DAOSと4-アミノアンチピリンを酸化し、定量的に凝縮させ、青色色素が得られた。600nmにて、光学密度を測定し、標準曲線にしたがって、TCの量を算出した。
【００８０】
フーリン切断の阻害：
100 mM Hepes緩衝液、pH 7.5、5% Triton-Xおよび1mM CaClを含む緩衝液中の2単位のフーリン（〜110ng）（New England Biolabs）を用いて、フーリン切断反応を行なった。詳しくは、VARIOTOPE（登録商標）をワクチン接種したマウス由来のマウス血漿4 μlを、PCSK9緩衝液中、250 ngのビオチン化huPCSK9（BPS Bioscience）とともに室温にて１時間インキュベートした。次いで、2単位のフーリン（〜110ng）（New England Biolabs）を反応溶液に加え、室温にて一夜インキュベートした。還元条件下、SDS-PAGEによって、反応生成物を分析した。
【００８１】
結果：
1．配列情報およびhuPCSK9に対する力価（ODmax/2）：
0006494667.tif 000003
【００８２】
0006494667.tif 000004
【００８３】
これらの結果を図１にも示す。本発明によれば、huPCSK9に対するより高い力価（たとえば、本実施例にしたがって、ODmax/2として測定）を惹起する潜在能力を有するVARIOPTOPE（登録商標）は、天然配列であるPEEDGTRFHRQASKの免疫増強変異体とみなされる。本発明の好ましいVARIOPTOPE（登録商標）は、顕著な免疫増強特性を有する（たとえば、本実施例にしたがって、ODmax/2として測定した値は、20000を超えるか、または天然配列と比較して、150%、好ましくは2倍までに効果を上昇させる）。本発明のより好ましいVARIOPTOPE（登録商標）は、より顕著な免疫増強特性を有する（たとえば、本実施例にしたがって、ODmax/2として測定した値は、25000、好ましくは30000を超えるか、または天然配列と比較して、3倍までに効果を上昇させる）。
【００８４】
2．単一AA交換配列番号：10、17、18および23；図2Aおよび配列番号：36；図2B）および多重交換（配列番号：41、44；図2C）を有するVARIOTOPE（登録商標）で免疫化したマウスにおける100％として設定したコントロールグループとの比較における総コレステロール％：
図2Aに対応
0006494667.tif 000005
図2Bに対応
0006494667.tif 000006
図2Cに対応
0006494667.tif 000007
【００８５】
これらの結果を図２にも示す。本発明によれば、天然配列であるPEEDGTRFHRQASKと比較して、同等のTC減少を惹起する潜在能力を有するVARIOPTOPE（登録商標）が好ましい。もちろん、本発明のより好ましいVARIOPTOPE（登録商標）は、天然配列よりもさらに高い量までTCを減少させる能力を有する（たとえば、本実施例において測定されたTC％における減少は、天然配列と比較して(絶対値は、すなわち、ネガティブコントロールと比較して)、5 %、特に10 %を超える）。
【００８６】
3．ウエスタンブロット分析は、配列番号：10、17、18および23を用いる免疫化において誘導された抗体の、先端切断型フーリン切断PCSK9（a219-692；〜50kDa）の形成を阻害する能力を示す（図3を参照）。
【００８７】
処置動物における総コレステロール（TC）の減少
選択されたVARIOTOPE（登録商標）ワクチン候補の能力が、処置された動物の総コレステロール（TC）を、対応する天然(元の)配列を含むワクチンよりも高い程度まで減少させる能力を有することを示すさらなる実験的証拠を届けるために、さらなる実験を行った。
以下の実験において免疫化のために用いたペプチド：
配列番号：1  PEEDGTRFHRQASK（元の天然配列）
配列番号：2  AEEDGTRFHRQASK
配列番号：9  TEEDGTRFHRQASK
配列番号：10  PQEDGTRFHRQASK
配列番号：17  PEEDGTRFHRRASK
配列番号：18  PEEDGTRFHRKASK
配列番号：23  PEEDGTRFHRQASR
配列番号：36  PEEDGTRFHRTASK
配列番号：24  PEEDGTRFHRQASL
【００８８】
選択されたVARIOTOPE（登録商標）ワクチン候補のTCを減少させる能力を評価し、VARIOTOPE（登録商標）処置動物におけるTC減少の程度を、元の配列を含むワクチン処置動物における減少と比較するために、グループ当り5〜10匹のマウスに、正味1 μgのペプチドを含むワクチンを2週間隔で5回注射した。通常どおり、抗原性ペプチドを、総体積1 mlのアジュバントとしてKLHに結合させ、0.2%アルヒドロゲルに吸着させた。記載した実験用に、GMP様物質を用いた。最後の注射から約2週間後に血液サンプルを採取した。
最初の実験において、元の配列および以下のVARIOTOPE（登録商標）を含むワクチンを試験した：
配列番号：1  PEEDGTRFHRQASK
配列番号：9  TEEDGTRFHRQASK
配列番号：17  PEEDGTRFHRRASK
配列番号：18  PEEDGTRFHRKASK
配列番号：23  PEEDGTRFHRQASR
【００８９】
処置マウスにおいてTCレベルを減少させることができることが知られているが、元の配列を含むワクチンと比較してTCレベルを減少させることにおいて劣っているワクチンを包含するために、以下のペプチドワクチンをこの実験に含めた：
配列番号：24  PEEDGTRFHRQASL
【００９０】
すでに上記で概説したように（図1A）、すべてのワクチン候補は高い免疫原性を有し、huPCSK9ならびにマウスPCSK9に効果的に結合する抗体反応を誘導する能力がある。誘導された抗体の有効性を証明するために、個々のマウス由来の血液サンプルのTC測定を行なった。図4は、100%として設定したコントロールグループとの比較における、相対的グループTC平均値（%）を示す。この実験において、グループ当り5匹の動物を免疫化した。図に示すように、すべてのワクチン処置グループにおいて、TC値は、コントロールグループとの比較において、有意に減少した。
【００９１】
この実験の目的は、VARIOTOPE（登録商標）処置グループと、元の配列で処置されたグループとを比較することであったので、図5では、0%に設定した元の配列で処置されたグループとの比較における、ワクチン処置グループのTC値の減少％を示した。
図5に示すように、以下の配列：
配列番号：9  TEEDGTRFHRQASK
配列番号：17  PEEDGTRFHRRASK
配列番号：18  PEEDGTRFHRKASK
配列番号：23  PEEDGTRFHRQASR
を含むワクチンは、元の配列を含むワクチンとの比較において、TCレベルをより強力に3〜10%減少させる。これとは対照的に、配列番号：24   PEEDGTRFHRQASLを含むワクチンは、ネガティブコントロール（図4）との比較において、TCレベルを減少させる能力を有するが、元のペプチドを含むワクチンとの比較では、TCレベルは高かった（+9%）。
【００９２】
さらなる実験において、以下のVARIOTOPE（登録商標）を試験し、配列番号：1と再度比較した。
配列番号：2  AEEDGTRFHRQASK
配列番号：10  PQEDGTRFHRQASK
配列番号：36  PEEDGTRFHRTASK
【００９３】
この実験において、グループ当り10匹の動物に、正味1 μgのペプチドを含むワクチンを、2週間隔で５回注射した。最後の注射から約2週間後に、血液サンプルを再び採取した。これらの動物におけるTC減少を、元の配列で処置された動物におけるTC値と直接比較するために、0%に設定した元の配列で処置されたグループと比較した、VARITOPE（登録商標）ワクチン処置グループのTC値の減少％を図６に示す。
図６に示されるように、この実験で試験された3つのワクチン候補のすべてが、元の配列を含むワクチンと比較して、TCレベルを強力に減少させた（-7%〜-13%）。
【００９４】
開示に基づいて、以下の好ましい実施態様が特に強調されうる：
1．PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、哺乳動物、特にヒトにおいて増強された免疫原性を有する、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）の変異体であり、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して少なくとも1つ、多くとも4つのアミノ酸交換を特徴とする変異体である、9〜25個のアミノ酸残基からなる少なくとも1つのペプチドを含むワクチンであって、該変異体が、AEEDGTRFHRQASK（配列番号：2）、TEEDGTRFHRQASK（配列番号：9）、PQEDGTRFHRQASK（配列番号：10）、PEEDGTRFHRRASK（配列番号：17）、PEEDGTRFHRKASK（配列番号：18）、PEEDGTRFHRQASR（配列番号：23）、およびPEEDGTRFHRTASK（配列番号：36）から選択されるのが好ましい、ワクチン。
2．9〜25個のアミノ酸残基からなる少なくとも1つのペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
X1X2EDGX6RFX9X10X11X12X13X14    （配列番号：46）
[ここで、
X1は、リシン、トレオニン、アラニン、およびプロリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはプロリンであり、
X2は、グルタミンまたはアスパラギン酸、好ましくはアスパラギン酸であり、
X6は、トレオニンまたはセリンであり、
X9は、ヒスチジン、アラニン、およびセリンから選ばれるアミノ酸残基であり、
X10は、アルギニン、アラニン、グルタミン、リシン、メチオニン、プロリン、およびセリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアルギニン、セリンまたはアラニンであり、
X11は、グルタミン、アラニン、グルタミン酸、リシン、トレオニン、およびアルギニンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン、リシン、アルギニン、およびトレオニンであり、
X12は、アラニン、セリン、およびトレオニンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンであり、
X13は、セリン、アラニン、およびアスパラギンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはセリンであり、
X14は、リシン、アラニン、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、およびバリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはリシンまたはセリンであるか、または
少なくとも9つの連続したアミノ酸残基を有する、配列番号：46のフラグメントであり、および
ここで、配列番号：46は、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）またはそのNもしくはC末端先端切断フラグメントではない]
を有するか、または含むペプチドを含む、実施態様1に記載のワクチン。
3．ペプチドが、以下の配列：
AEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFARQASK、PEEDGTRFHAQASK、PEEDGTRFHRAASK、PEEDGTRFHRQAAK、PEEDGTRFHRQASA、TEEDGTRFHRQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGSRFHRQASK、PEEDGTRFHQQASK、PEEDGTRFHKQASK、PEEDGTRFHMQASK、PEEDGTRFHREASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFHRQANK、PEEDGTRFHRQASR、PEEDGTRFHRQASL、KEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFMRQASK、PEEDGTRFHPQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGTRFHRQAST、PEEDGTRFHRQASV、PEEDGSRFHKQASK、PEEDGSRFHMQASK、PEEDGSRFHRRASK、およびPEEDGSRFHRQATK；好ましくはAEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFARQASK、PEEDGTRFHAQASK、PEEDGTRFHRAASK、PEEDGTRFHRQASA、TEEDGTRFHRQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFSRQASK、 PEEDGTRFHPQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGTRFHRQASV、PEEDGSRFHKQASK、PEEDGSRFHRRASK、およびPEEDGSRFHRQATK；特にAEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHAQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHRRASK PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGSRFHKQASKおよびPEEDGSRFHRRASKから選ばれるアミノ酸配列からなるか、または該配列を含む、実施態様1または2に記載のワクチン。
4．少なくとも1つのペプチドが、医薬的に許容しうる担体に結合または融合する、実施態様1〜3のいずれか１つに記載のワクチン。
5．少なくとも1つのペプチドが、そのNおよび／またはC末端に、それに直接結合するか、またはスペーサー配列を介して結合する少なくとも1つのシステイン残基を含む、実施態様1〜4のいずれか1つに記載のワクチン。
6．医薬的に許容しうる担体が、タンパク質担体である、実施態様4または5に記載のワクチン。
7．タンパク質担体が、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、破傷風トキソイド（TT）、CRM197、プロテインD、またはジフテリア毒素（DT）、好ましくは突然変異ジフテリア毒素、CRM197、またはKLH、特にKLHから選ばれる、実施態様6に記載のワクチン。
8．ワクチンが、アジュバントとともに、好ましくはAl（OH）3（アルヒドロゲル）とともに、製剤される、実施態様1〜7のいずれか1つに記載のワクチン。
9．少なくとも1つのペプチドが、9〜20個のアミノ酸残基、特に9〜15個のアミノ酸残基からなる、実施態様1〜8のいずれか1つに記載のワクチン。
10．少なくとも1つのペプチドが、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸残基、好ましくは13または14個のアミノ酸残基、特に14個のアミノ酸残基からなる、実施態様1〜9のいずれか1つに記載のワクチン。
11．9〜25個のアミノ酸残基からなる少なくとも2、少なくとも3、または少なくとも4個のペプチドを含む、実施態様1〜10のいずれか1つに記載のワクチン。
12．少なくとも1つのペプチドを0.1 ng〜10 mg、好ましくは0.5〜500 μg、より好ましくは1〜100 μgの量で含む、実施態様1〜11のいずれか1つに記載のワクチン。
13．ペプチドが、血清ELISAで証明されるように、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、少なくとも50 %、好ましくは少なくとも100 %、特に少なくとも200%の増強された免疫原性を有する、実施態様1〜12のいずれか1つに記載のワクチン。
14．ペプチドが、血清コレステロール試験で証明されるように、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、少なくとも3 %、好ましくは少なくとも5 %、特に少なくとも10%の総コレステロールレベルを減少させる増強された能力を有する、実施態様1〜13のいずれか1つに記載のワクチン。
15．高脂血症、高コレステロール血症および/またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる障害、好ましくは心血管疾患、脳卒中または末梢血管疾患、あるいはPCSK9に関連する腫瘍性疾患、好ましくは黒色腫および肝癌転移の治療および／または予防において用いるための、実施態様1〜14のいずれか1つに記載のワクチン。
16．PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、哺乳動物、特にヒトにおいて増強された免疫原性を有する、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）の変異体であり、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して少なくとも1つ、多くとも4つのアミノ酸交換を特徴とする変異体である、9〜25個のアミノ酸残基からなるペプチド。
17．9〜25個のアミノ酸残基からなるペプチドであって、以下のアミノ酸配列：
X1X2EDGX6RFX9X10X11X12X13X14    （配列番号：46）
[ここで、
X1は、リシン、トレオニン、アラニン、およびプロリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはプロリンであり、
X2は、グルタミンまたはアスパラギン酸、好ましくはアスパラギン酸であり、
X6は、トレオニンまたはセリンであり、
X9は、ヒスチジン、アラニン、およびセリンから選ばれるアミノ酸残基であり、
X10は、アルギニン、アラニン、グルタミン、リシン、メチオニン、プロリン、およびセリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアルギニン、セリンまたはアラニンであり、
X11は、グルタミン、アラニン、グルタミン酸、リシン、トレオニン、およびアルギニンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはグルタミン、リシン、アルギニン、およびトレオニンであり、
X12は、アラニン、セリン、およびトレオニンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはアラニンまたはセリンであり、
X13は、セリン、アラニン、およびアスパラギンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはセリンであり、
X14は、リシン、アラニン、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、およびバリンから選ばれるアミノ酸残基、好ましくはリシンまたはセリンであるか、または
少なくとも9つの連続したアミノ酸残基を有する、配列番号：46のフラグメントであり、および
ここで、配列番号：46は、PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）またはそのNもしくはC末端先端切断フラグメントではない]
を有するか、または含む、実施態様16に記載のペプチド。
18．ペプチドが、以下の配列：
AEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFARQASK、PEEDGTRFHAQASK、PEEDGTRFHRAASK、PEEDGTRFHRQAAK、PEEDGTRFHRQASA、TEEDGTRFHRQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGSRFHRQASK、PEEDGTRFHQQASK、PEEDGTRFHKQASK、PEEDGTRFHMQASK、PEEDGTRFHREASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFHRQANK、PEEDGTRFHRQASR、PEEDGTRFHRQASL、KEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFMRQASK、PEEDGTRFHPQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGTRFHRQAST、PEEDGTRFHRQASV、PEEDGSRFHKQASK、PEEDGSRFHMQASK、PEEDGSRFHRRASK、およびPEEDGSRFHRQATK；好ましくはAEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFARQASK、PEEDGTRFHAQASK、PEEDGTRFHRAASK、PEEDGTRFHRQASA、TEEDGTRFHRQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHRRASK、PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFSRQASK、 PEEDGTRFHPQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGTRFHRQASV、PEEDGSRFHKQASK、PEEDGSRFHRRASK、およびPEEDGSRFHRQATK；特にAEEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHAQASK、PQEDGTRFHRQASK、PEEDGTRFHRRASK PEEDGTRFHRKASK、PEEDGTRFHRQSSK、PEEDGTRFSRQASK、PEEDGTRFHSQASK、PEEDGTRFHRTASK、PEEDGTRFHRQTSK、PEEDGTRFHRQASS、PEEDGSRFHKQASKおよびPEEDGSRFHRRASKから選ばれるアミノ酸配列からなるか、または該配列を含む、実施態様16または17に記載のペプチド。
19．ペプチドが、9〜20個のアミノ酸残基、特に9〜15個のアミノ酸残基からなる、実施態様16〜18のいずれか1つに記載のペプチド。
20．ペプチドが、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸残基、好ましくは13または14個のアミノ酸残基、特に14個のアミノ酸残基からなる、実施態様16〜19のいずれか1つに記載のペプチド。
21．ペプチドが、血清ELISAで証明されるように、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、少なくとも50 %、好ましくは少なくとも100 %、特に少なくとも200%の増強された免疫原性を有する、実施態様16〜20のいずれか1つに記載のペプチド。
22．ペプチドが、血清コレステロール試験で証明されるように、ペプチド PEEDGTRFHRQASK（配列番号：1）と比較して、少なくとも3 %、好ましくは少なくとも5 %、特に少なくとも10%の総コレステロールレベルを減少させる増強された能力を有する、実施態様16〜21のいずれか1つに記載のペプチド。
23．高脂血症、高コレステロール血症および／またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる障害を患っているか、または発症するリスクのある患者の治療方法であって、有効量の実施態様1〜15のいずれか1つに記載のワクチンを該患者に投与することを含む、方法。
24．障害が、心血管疾患、脳卒中または末梢血管疾患から選ばれる、実施態様23に記載の方法。
25．好ましくは皮下、筋肉内、皮内または静脈内投与である、実施態様23または24に記載の方法。
26．投与されるワクチンが、少なくとも1つのペプチドを0.1 ng〜10 mg、好ましくは0.5〜500 μg、特に1〜100 μgの量で含む、実施態様23〜25のいずれか1つに記載の方法。
27．ワクチンが、2〜10回、好ましくは2〜7回、および最も好ましくは5回まで患者に適用される、実施態様23〜26のいずれか1つに記載の方法。
28．ワクチンが、少なくとも2回投与され、投与の間隔が、2週間〜5年、好ましくは1ヶ月〜3年まで、より好ましくは2ヶ月〜1.5年である、実施態様23〜27のいずれか1つに記載の方法。
29．ワクチンが、6〜8週間にわたり、6ヶ月までの、3〜4回の初回ワクチン接種のために投与され、好ましくはこのような初回ワクチン接種の後のさらなる投与を含む
、実施態様23〜28のいずれか1つに記載の方法。
【図１Ａ】
0006494667.tif 000008
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006494667.tif 000015
【図６】
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【配列表】
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