(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ソーティング用の粒子操作システムにおいて、
レーザ光を、基板に形成されたマイクロ流路（１）の第１部分に設けられた第１レーザ検出領域（１０１）および前記基板に形成されたマイクロ流路（２、３）の第２部分のソート流路および廃棄流路の一方に設けられた１つの付加的なレーザ検出領域（２０１、３０１）に向けて案内する１つのレーザ光源と、
前記基板に形成された少なくとも１つの粒子操作ステージ（４）と、
が設けられており、
前記第１レーザ検出領域（１０１）と前記１つの付加的なレーザ検出領域（２０１、３０１）とは、等価なレーザスポットとして別々に照射され、
前記マイクロ流路の第１部分は、前記粒子操作ステージ（４）の上流に配置されており、
前記マイクロ流路の第２部分は、前記粒子操作ステージ（４）の下流に配置されており、
前記粒子操作ステージ（４）は、前記マイクロ流路を含む前記基板上に微細加工製造されたＭＥＭＳ可動構造を有し、前記ＭＥＭＳ可動構造は、５００μｍよりも小さい特性寸法を有し、
前記ＭＥＭＳ可動構造は、ターゲット粒子を前記廃棄流路ではなく前記ソート流路へ向けて案内し、
前記第１レーザ検出領域（１０１）からの信号および前記１つの付加的なレーザ検出領域（２０１、３０１）からの信号は、前者が前記ＭＥＭＳ可動構造を作動させるため、かつ、後者が前記ＭＥＭＳ可動構造の品質を評価するために、ロジック回路に供給され、前記ロジック回路は、前記信号のパルス幅によって、前記第１レーザ検出領域（１０１）からの信号と、前記１つの付加的なレーザ検出領域（２０１、３０１）からの信号と、を分離するために、前記粒子操作ステージ（４）と接続されている、
粒子操作システム。
【請求項２】
前記１つの付加的なレーザ検出領域から集光された光が、前記第１レーザ検出領域からの光も集光する光学系によって集光される、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項３】
前記ＭＥＭＳ可動構造は、前記第１レーザ検出領域からの信号に基づき、ターゲット粒子を残りのサンプル流から分離するフラップ型流体バルブを含む、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項４】
音響光学変調器が設けられており、前記音響光学変調器は、前記１つの付加的なレーザ検出領域に向けて案内されるレーザ光の振幅を、少なくとも約２ＭＨｚの周波数において変調する、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項５】
光学操作手段が設けられており、前記光学操作手段は、前記１つの付加的なレーザ検出領域に向けて案内される光の軌跡、スペクトル成分、タイミング、または期間のうち、少なくとも１つを変更する、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項６】
前記第１レーザ検出領域に向けて案内される光は、前記光の光学経路の少なくとも一部分を、前記１つの付加的なレーザ検出領域に向けて案内される光と共用する、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項７】
前記粒子操作ステージは、粒子に対しソーティングを実行する、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項８】
前記光学操作手段は以下のデバイス即ち、
ミラー、ビームスプリッタ、プリズム、高調波水晶、音響光学変調器、Ｑスイッチ、飽和性吸収体、フィルタ
のうち、少なくとも１つのデバイスを含む、
請求項５に記載の粒子操作システム。
【請求項９】
前記第１レーザ検出領域から集光された光は、前記光の光学経路の少なくとも一部分を、前記１つの付加的なレーザ検出領域から集光された光と共用する、
請求項１に記載の粒子操作システム。
【請求項１０】
前記第１レーザ検出領域からの信号に応じて、ロジック回路により前記フラップ型流体バルブが制御され、前記１つの付加的なレーザ検出領域からの信号に基づき、ロジック回路によりソートの品質が判定される、
請求項３に記載の粒子操作システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
該当なし
連邦政府による資金提供を受けた研究開発に関する記載
該当なし
マイクロフィッシュ添付書類に関する記載
該当なし
【背景技術】
【０００２】
本発明は、微細加工流路内の小粒子を操作するための装置及び方法に関する。
【０００３】
マイクロエレクトロメカニカルシステム（MEMS）は、半導体デバイスの製造に用いられるような表面又はバルクに対するリソグラフィ処理技術を利用して、基板上に製造された著しく小さくかつ多くの場合には可動の構造である。ＭＥＭＳデバイスとして挙げられるのは例えば、可動のアクチュエータ、センサ、バルブ、ピストン、又はスイッチなどであり、これらは数μｍ〜数１００μｍという特徴的な寸法を有する。可動のＭＥＭＳスイッチを例えば、すべてが基板上で微細加工製造された１つ又は複数の入力端子を１つ又は複数の出力端子に接続するために、使用することができる。この場合、可動スイッチのアクチュエータ手段を例えば、熱による手段、圧電による手段、静電的な手段、又は磁気的な手段とすることができる。１つの半導体基板上に複数のＭＥＭＳデバイスを製造することができ、その基板が、ＭＥＭＳデバイスにより流路中を通過する粒子を操作できるように構成することができる。
【０００４】
例えば可動バルブのようなＭＥＭＳデバイスを、液流から種々の粒子をソーティングするためのソーティング機構、例えば血液から細胞をソーティングするためのソーティング機構として、利用することができる。マイクロ流路内に封入され圧力を受けて流れる液流の中に設けられたソーティングデバイスへ向けて、粒子を搬送することができる。粒子がＭＥＭＳソーティングデバイスに到達すると、ソーティングデバイスは、血液幹細胞など着目対象粒子を隔離されたレセプタクルへ案内し、残りの液流を廃棄レセプタクルへ案内する。
【０００５】
ＭＥＭＳベースの細胞分類システムは、フローサイトメーターとして知られる既存の蛍光活性化細胞ソーティングシステム（ＦＡＣＳ）よりも実質的に有利であるといえる。フローサイトメーターは一般的に大きく高価なシステムであり、このシステムは、着目対象細胞に付着された標識からの蛍光信号に基づき、細胞をソーティングする。それらの細胞は希釈されてシース液中に懸濁され、ついでノズルを通過して急速に減圧されることで、個々の液滴として分離される。それらの液滴は、ノズルから噴射された後、標識からの蛍光信号に基づき、それぞれ異なる容器に静電的に分離される。このようなシステムによる主だった問題点とは、減圧に起因する細胞損傷又は機能喪失、難しくコストのかかるサンプル間の滅菌処置、それぞれ異なるパラメータによる部分母集団ソーティングが不可能なこと、このような大きく高価な施設の部品を所有し、操作し、かつ維持するためにはかなりのトレーニングが必要なこと、などである。少なくともこれらの理由のために、フローサイトメーターの利用は、これまで大きな病院や研究所に限られており、その技術を小規模な企業や事業所が利用することはできなかった。
【０００６】
この種のＭＥＭＳベースの粒子ソーティングデバイスに関して、多数の特許が付与されている。例えば、アメリカ合衆国特許第6,838,056号は、ＭＥＭＳベースの細胞ソーティングデバイスに関するものであり、アメリカ合衆国特許第7,264,972 B1号は、ＭＥＭＳベースの細胞ソーティングデバイスのためのマイクロメカニカルアクチュエータに関する。さらにアメリカ合衆国特許第7,220,594号は、ＭＥＭＳ細胞ソーティング機器とともに製造された光学的な構造に関するものであり、アメリカ合衆国特許第7,229,838号は、ＭＥＭＳベースの粒子ソーティングシステムを動作させるためのアクチュエータ機構に関する。これらに加え、アメリカ合衆国特許出願第13/374,899号及び第13/374,898号によれば、他のＭＥＭＳ設計が詳述されている。これらの特許及び特許出願公開のいずれも、ここで参照したことによりそれらの開示内容が本願に組み込まれるものであり、それらはInnovative Micro Technology及び本願の譲受人であるOwl biomedicalに譲受されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＭＥＭＳベースの粒子ソーティングシステムの１つの特徴は、ソーティングプロセス全体を通して、半導体基板に形成された小さい微細加工流路に流体を密閉しておくことができる点にある。ＭＥＭＳデバイスを、ターゲット粒子をサンプル流の他の成分から分離するバルブとすることができる。ＭＥＭＳデバイスは、ターゲット粒子の存在が信号により表されたとき、粒子の流れを一方の流路から他方の流路へ向かわせることができる。この信号を、蛍光標識からの光子とすることができ、この標識は、ターゲット粒子に付着され、ＭＥＭＳデバイス上流のインタロゲーション領域におけるレーザ照射により励起される。このためＭＥＭＳデバイスを、液体サンプルにおいて動作する粒子ソータ又はセルソータとすることができる。
【０００８】
ただしもっと一般的にいえば、液流中の粒子を、ソートというよりはむしろ操作することができ、このような操作を、液流中を流れるターゲット粒子の加熱、標識付着、帯電、変造、又は破壊を含む何らかの操作によって、行うことができる。このような枠組みにおいて、上述のＦＡＣＳフローサイトメーターにおいて用いられているような蛍光励起による検出によって、ターゲット粒子を非ターゲット粒子と区別することができる。この場合、識別された細胞を、粒子操作ステージによって操作することができる。この操作を、基板上に微細加工製造されたデバイスによって実現することができ、このデバイスによってターゲット粒子が加熱、標識付着、帯電、変造又は破壊される。製造基板には、粒子操作ステージまで導かれる及び粒子操作ステージから導かれる微細加工流路も含めることができる。
【０００９】
ここでは、上述の特許において開示されているような粒子操作システムに特有のこのようなアーキテクチャを利用するシステム及び方法について説明する。以下で説明するようにこれらの技術によって、サイトメトリー機能を備えた粒子操作システムを形成することができる。微細加工製造された流路に封入された液流中の粒子を操作するために、微細加工により作成されたデバイスを使用することができる。本発明によるシステム及び方法によれば、微細加工製造された流路の経路内に複数のインタロゲーション領域が設けられており、この場合、ＭＥＭＳデバイスの上流に１つのレーザインタロゲーション領域が設けられ、ＭＥＭＳデバイスの下流に少なくとも１つの付加的なレーザインタロゲーション領域が設けられる。付加的なレーザインタロゲーション領域を、微細加工製造された操作デバイスのパフォーマンスの確認に利用することができる。
【００１０】
よって、サイトメトリー機能を備えた粒子操作システムを、以下のように構成することができる。即ち、基板に形成されたマイクロ流路の第１部分に設けられた第１レーザインタロゲーション領域に向けて案内されるレーザ光と、基板に形成された少なくとも１つの粒子操作ステージと、基板に形成されたマイクロ流路の第２部分に設けられた少なくとも１つの付加的なレーザインタロゲーション領域に向けて案内されるレーザ光とが設けられている。この場合、マイクロ流路の第１部分は、粒子操作ステージの上流に配置されており、マイクロ流路の第２部分は、粒子操作ステージの下流に配置されており、粒子操作ステージは、マイクロ流路を含む基板上に微細加工製造された可動構造を有する。
【００１１】
１つの実施形態によれば、ＭＥＭＳデバイスはフラップ型セルソータであり、これによってターゲット細胞（例えば癌細胞、精細胞、幹細胞など）を液流における他の細分から選り分けられる。ＭＥＭＳソータを、フラップ又はダイバータとすることができる。この場合、流路内におけるターゲット粒子の検出に応答して流れの向きを変えるために、フラップ又はダイバータが流路中に引き下げられる。このフラップによって、廃棄流路ではなくソート流路へ向けて流れが案内される。
【００１２】
１つの実施形態によれば、ターゲット粒子がＭＥＭＳソータによって案内されるソート流路中に、付加的なインタロゲーション領域を配置することができる。ターゲット粒子と非ターゲット粒子との比率を計数することによって、ソータの有効性を確認することができ、ソーティングプロセス進行中に属性又はパラメータを調節することができる。
【００１３】
これらの特徴及び利点並びにその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明に記載されており、或いはそれらの記載から読み取ることができる。
【００１４】
次に、以下の図面を参照しながら種々の実施形態の詳細について説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】微細加工製造された粒子操作システムを示す概略図
【図１ｂ】本発明による微細加工製造された粒子操作システムを示す概略図
【図２ａ】交差路を有する微細加工製造された粒子操作システムを示す概略図
【図２ｂ】本発明の１つの実施形態による交差路を有する、微細加工製造された粒子操作システムを示す概略図
【図２ｃ】本発明の別の実施形態よる交差路を有する、微細加工製造された粒子操作システムを示す概略図
【図３ａ】本発明の１つの実施形態による微細加工製造された粒子ソーティングシステムを、閉鎖ポジションのソーティングバルブとともに示す概略図
【図３ｂ】本発明の１つの実施形態による微細加工製造された粒子ソーティングシステムを、開放ポジションのソーティングバルブとともに示す概略図
【図４ａ】本発明の別の実施形態による微細加工製造された粒子ソーティングシステムを、閉鎖ポジションのソーティングバルブとともに示す概略図
【図４ｂ】本発明の別の実施形態による微細加工製造された粒子ソーティングシステムを、開放ポジションのソーティングバルブとともに示す概略図
【図５】微細加工製造により作成された本発明の１つの実施形態による粒子ソーティングシステムを、インタロゲーション領域と対比させた検出器の視野とともに示す概略図
【図６】本発明による微細加工製造された粒子ソーティングシステムの１つの実施形態の詳細を示す概略図
【図７】本発明による微細加工製造された粒子ソーティングシステムを、種々の光学コンポーネントの配置とともにシステムレベルで示す概略図
【図８】微細加工製造された粒子ソーティングシステムの光学検出システムにおける１つのコンポーネントを示す詳細図
【図９】微細加工製造された粒子ソーティングシステムの光学検出システムにおけるさらに別のコンポーネントを示す詳細図
【図１０】１０ａは、光学検出器から発生する信号波形を、領域１のパルス形状と領域２のパルス形状との差異とともに示す図、１０ｂは、光学検出器から発生する信号波形を、ハイパスフィルタリング処理後の領域１のパルス形状と領域２のパルス形状との差異とともに示す図、１０ｃは、光学検出器から発生する信号波形を、ハイパスフィルタリング処理後の領域１のパルス形状と領域２のパルス形状との差異とともに示す図
【図１１】光学検出器から発生する信号波形を、領域１のパルス幅と領域２のパルス幅との差異とともに示す図
【図１２】複数のレーザ光源を有し、複数のレーザインタロゲーション領域を備えた粒子操作システムのさらに別の実施形態を示す概略図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ここで述べるシステムは、先に挙げた特許に開示されているような粒子操作システムのマイクロ流路アーキテクチャを利用可能な粒子ソーティングシステムである。より一般的には、ここで述べるシステム及び方法によって説明されるのは、複数のレーザインタロゲーション領域を備えた粒子操作システムであって、このシステムはサイトメトリー機能を備えた粒子操作システムを成している。複数のレーザインタロゲーション領域によって、粒子操作精度の有効性に関する情報を提供することができ、これによってプロセス中に操作を調整又は制御できるようになる。
【００１７】
以下で説明する図面において、同等の構造には同じ参照符号を付すようにしており、本発明による装置の重要な特徴を明確に示す目的で、それらの構造を様々なレベルで描いている。
【００１８】
図１ａは、リソグラフィにより形成されたマイクロ流路を利用したＭＥＭＳベースの粒子操作システムを示す概略図である。一方のマイクロ流路１を、液流を案内する入力流路とすることができる。マイクロ流路１内の液流は、第１レーザインタロゲーション領域１０１を通過する。この領域に向けて、１つまたは複数のレーザからの光が照射される。この光を集束させて、液流中を流れる粒子上にスポットを形成することができ、この場合、レーザインタロゲーション領域１０１は、微細加工製造された操作ステージ４の下流に配置されている。粒子に適切な標識が付着されていれば、標識を励起して固有の蛍光光子を発生させることができる。この光子を光学検出器によって検出し、適切なロジック回路によって評価することができる。ロジック回路は操作ステージ４を制御可能であり、操作ステージ４はロジック回路に制御されながら、標識された粒子を操作することができる。
【００１９】
１つの実施形態によれば、ＭＥＭＳデバイスはターゲット粒子に電荷を加えることができる。あとで説明する別の実施形態によれば、操作ステージ４を、ターゲット粒子を非ターゲット粒子とは異なる流路へ転流させるアクチュエータとすることができる。
【００２０】
図１ｂは、サイトメトリー機能を備えた本発明による粒子操作システム１０を示す概略図であり、このシステムは、リソグラフィにより形成されたマイクロ流路を利用する。１つのマイクロ流路１を、液流を操作ステージ４へ案内する入力流路とすることができる。微細加工製造されたデバイス４によって、粒子の軌跡、モルフォロジー、形状、電荷、又は他の特性を変化させることができる。他方のマイクロ流路２は、液流を操作ステージ４から出力流路へと案内する。第２レーザインタロゲーション領域２０１を、このマイクロ流路２内に配置することができる。レーザインタロゲーション領域２０１を利用して通過粒子を検査することにより、ＭＥＭＳ操作ステージ４の有効性、精度および／または効率について評価することができる。蛍光と操作された特性とを同時に検出することによって、操作ステージの正確なパフォーマンスが表される。
【００２１】
例えば操作ステージ４は、通過粒子に対し電荷を加えることができる。レーザインタロゲーションステージ２０１において、流路２内に設置された平行平板コンデンサ（図示せず）における電圧を測定することにより、電荷と蛍光標識の両方の存在を確認することができる。このようにすることで、蛍光と電圧信号の両方の同時発生が、標識された粒子に電荷が正しく加えられていることの証拠となる。粒子ソータ又はセルソータの場合、付加的なレーザインタロゲーションステージ２０１が配置されているソーティング経路に、ソーティングされたターゲット粒子が存在する、ということによって、適正かつ有効なソーティングであることを表すことができる。
【００２２】
図２ａは、サイトメトリー機能を備えた別の粒子操作システムを示す概略図であり、このシステムは、リソグラフィにより形成されたマイクロ流路を利用する。図２ａによれば、交差点を成す２つ又はそれよりも多くの流路が、操作ステージ４の出力側に形成されている。一方の流路２を、操作ステージ４から一方の経路へ向かって流れ出るようにすることができるのに対し、他方の流路３を、操作ステージ４から他方の経路へ向かって流れ出るようにすることができる。図２ｂには、サイトメトリー機能を備えた粒子操作システムが示されている。図２ｂに示されているように、流路２は付加的なレーザインタロゲーションステージ２０１を備えることができ、このステージにより、レーザ光の照射に対する応答に従い様々な粒子を識別することができる。照射に応答して粒子が光子を発生するならば、このことは、その粒子が標識されたターゲット粒子であることの指標である。照射に応答して粒子が光子を発生しなければ、おそらくその粒子は標識されていない非ターゲット粒子である。
【００２３】
図２ｃに示されているように、両方の流路２及び３は、付加的なレーザインタロゲーションステージ２０１及びレーザインタロゲーション領域３０１を備えることができ、これらのステージにより、レーザ光の照射に対する応答に従い様々な粒子を識別することができる。実際には、任意の個数の付加的なレーザインタロゲーション領域を、任意の個数のマイクロ流路内に配置することができる。とはいえ、このような領域を多数設けると、あとで詳しく説明するように、分離が難しくなる可能性がある。前述のとおり、照射に応答して粒子が光子を発生するならば、このことは、その粒子が標識されたターゲット粒子であることの指標である。照射に応答して粒子が光子を発生しなければ、おそらくその粒子は標識されていない非ターゲット粒子である。これら２つのレーザインタロゲーションステージによって、一方の流路２と他方の流路３との対比又は入力流路１との対比において、ターゲット粒子の密度における差異を測定することができる。
【００２４】
図３ａは、サイトメトリー機能を備えた粒子操作システム１０を示す概略図であって、この場合、粒子操作システムは、リソグラフィにより形成されたマイクロ流路内に配置された複数のレーザインタロゲーション領域を利用する。ここでは操作ステージ４を、フラップ型ＭＥＭＳアクチュエータ又はソータとすることができる。フラップ型ＭＥＭＳアクチュエータについては、図５に略示するにとどめておくが、このアクチュエータを、第１レーザインタロゲーション領域からの信号に基づき、ターゲット粒子を残りのサンプル流から分離するフラップ型流体バルブとすることができる。フラップ状のＭＥＭＳアクチュエータを、ヒンジで取り付けられた単純な可動部材とすることができ、これはそこに作用する力に応じて引き下げ可能な部材である。この部材に作用する力を例えば、静電的、磁気的、又は電磁的なものとすることができる。可動部材を、シリコン基板上にリソグラフィにより形成することができ、冒頭で参照したことで本明細書に組み込んだ上述の特許及び特許出願には、この種のデバイスの製造方法が記載されている。
【００２５】
ＭＥＭＳアクチュエータは、到来する液流を複数の出口流路のうちの１つへ向かわせることができ、例えば流路２又は流路３へ向かわせることができる。例えば、レーザインタロゲーション領域１０１からの信号が、ターゲット粒子が存在していることを表しているならば、レーザインタロゲーション領域１０１に結合されたロジック回路は、ＭＥＭＳアクチュエータ４に信号を送信して、フラップを作動させることができる。フラップを引き下げることによって、検出されたターゲット粒子は廃棄流路３へ流されてしまうのではなく、ソート流路２へ向かうことになる。
【００２６】
前述のとおり、廃棄流路３には、付加的なレーザインタロゲーション領域３０１を設けることができる。図４ａ及び図４ｂには、そのような構成が示されている。これらの図面は、図３ａ及び図３ｂと類似しているが、２つのレーザインタロゲーション領域２０１及び３０１が、それぞれソート流路２及び廃棄流路３に設けられている点で異なっている。２つの付加的なインタロゲーション領域２０１及び３０１によって、ソート流路２内のターゲット細胞の増加した密度を廃棄流路３と対比して測定することができ、したがってＭＥＭＳソータ４及びレーザインタロゲーション領域１０１の有効性及び精度の証拠を提供することができる。
【００２７】
このように上述の図面からわかるように、付加的なレーザインタロゲーション領域２０１及び３０１（或いはもっと多くのインタロゲーション領域）を、サイトメータとして、又は品質制御測定器として動作させることができる。システム１０は、ソーティングアルゴリズムにおける調整可能な任意のパラメータの適正な設定について、フィードバックを行うことができる。この種のパラメータとして挙げられるのは例えば、蛍光パルスの形状、幅、大きさ、又は期間、レーザ強度、光学アライメント又はフォーカシングである。そしてこれらのパラメータをソート中に調整することができ、サンプル全体の処理を待ってからソーティングの問題に気づく前に、調整を行うことができる。付加的なレーザインタロゲーション領域２０１及び／又は３０１を設けることで、ソータにサイトメータの機能を装備させることができ、つまりソーティングプロセスを実行しながら、ソートされたサンプルの計数、列挙、或いは密度又は純度の定量化を行うことができる。この機能によって、ソートプロセスをリアルタイムに調整できるようになり、つまりソートプロセス実行中に調整が可能となる。さらにこの機能によって、サンプルにおいて多くのソーティングオペレーションを実施することなく、ソートパラメータを最適化することができ、したがって時間及びサンプルボリュームを節約することができる。
【００２８】
さらに図５には、レーザインタロゲーション領域１０１並びに付加的なレーザインタロゲーション領域２０１及び３０１をモニタリングする検出器の視野も描かれている。図５に示されているように、すべてのレーザインタロゲーション領域を、検出器の視野内に収めることができ、このため光学的及び電子的なデータの検出経路の少なくとも一部分を共用することができる。したがって、少なくとも１つの付加的なレーザインタロゲーション領域から集められた光が、第１レーザインタロゲーション領域からの光も集める光学系によって集光される。この特徴をどのようにして利用又は実装するのかについては、残りの図面を参照しながら以下で説明する。
【００２９】
図６には、サイトメトリー機能を備えた粒子操作システム４０の別の実施形態が示されている。図６には、粒子操作システム４０のＭＥＭＳアクチュエータにおける複数のレーザインタロゲーション領域の実装に関する詳細が示されている。この図によれば、ソート流路４８がダイバータの上流を流れ、廃棄流路４６はその下流を流れ、ダイバータは垂直流路４４（図平面に対して垂直）の底部に配置されている。このアクチュエータを磁気的に作動されるダイバータ４２とすることができ、これは垂直流路４４から流れ出る液流を、下方の廃棄流路４６から上方のソート流路４８へシフトする。蛍光マーカによって標識されたターゲット細胞から放射する蛍光信号に応じて、ダイバータを作動させることができる。この「蛍光励起細胞ソーティング（fluorescence activated cell sorting, FACS）」技術は、フローサイトメーターで用いられる検出方法論と同様のものである。図６に示されているようにこの検出は、垂直流路４４内に配置された第１レーザインタロゲーション領域１０１において行われる。付加的なレーザインタロゲーション領域２０１及び／又は３０１をそれぞれソート流路４８及び廃棄流路４６の一方又は両方に配置することによって、ソーティングの成功又は失敗を確認することができる。微細加工技術により作成された電磁式ダイバータの設計及び製造に関するその他の詳細は、前述のとおり本願に組み込まれた特許を参照されたい。
【００３０】
図５及び図６に示されているように、検出光学系の接近した視野によって、すべてのレーザインタロゲーション領域１０１，２０１，３０１をカバーすることができ、これについてはあとで詳しく説明する。図５及び図６において注目すべきは、レーザインタロゲーション領域１０１もレーザインタロゲーション領域２０１も、さらにはレーザインタロゲーション領域３０１或いはそれよりも多くのレーザインタロゲーション領域も含むほど、検出光学系の視野が十分に大きいことから、複数のレーザインタロゲーション領域が、光学検出経路の少なくとも一部分を共用できることである。これは、微細加工製造されたセルソータ及びこれに対応して設けられたマイクロ流路のスケールが小さいことによるものである。流路１，２，３の各々の幅は、２０μｍのオーダである。レーザインタロゲーション領域１とＭＥＭＳセルソータ４との間の距離を、おおよそ５００μｍよりも小さく保つようにする。その目的は、ターゲット粒子の通過とＭＥＭＳセルソーティングバルブ４の開放との間で生じるタイミングの不確定性を低減するためである。この距離が長くなると、余分な不確定性ゆえに、非ターゲット粒子がソート流路２に流れ込んでしまうことになり、或いはターゲット粒子が廃棄流路３に流れ込んでしまうことになる。このような事態のいずれが発生しても、ソートされたサンプルの純度又は発生量が低減してしまう。したがって、ソートパフォーマンスを最適化するためには、検出領域とソータとの間の距離をできるかぎり短く保つようにする。
【００３１】
この実施形態による粒子操作はセルソータであるが、自明のとおり、ソーティングだけでなく標識付着、帯電、加熱、変造、破壊など、数多くの粒子操作を実施することができる。
【００３２】
一般に、ここで用いられるバルブ、アクチュエータ又はマニピュレータ４を、ＭＥＭＳ製造において周知のリソグラフィ技術を利用して、半導体基板に形成することができる。このような製造技術の詳細については、上述の特許を参照されたい。したがってこの場合の構造上の特有のサイズ例えばその全幅又は全長を、約５００μｍ又はそれ以下とすることができ、流路を約１０μｍ〜２０μｍの特性寸法で同一基板に形成することができる。
【００３３】
同じ理由から、レーザインタロゲーション領域２及び３も、理想的にはやはり操作ステージ４の近くに配置されるようにする。これらの考察の結果として、構造のサイズが小さくなり、そのサイズは本願発明に組み込まれた前出の特許及び特許公報に記載されているようなリソグラフィプロセス方式にうまく適したものでもある。
【００３４】
とはいえ、このようなサイズとした結果、付加的なレーザスポットが同じ視野内に収まることになり、それゆえ同じ光学経路によって処理できるようになる。したがって、同じ光学経路に収まっているが異なるレーザインタロゲーション領域から放射するデータを分離する措置がとられることになる。そのような措置として挙げられるのは、これらの付加的なレーザインタロゲーション領域に配向されるレーザエネルギー軌跡、スペクトル成分、タイミング及び／又は期間の変更である。別の選択肢として、別個のレーザ光源及び検出光学系を設けることもできる。このような分離を達成するための種々の実施形態について、以下で詳しく説明する。
【００３５】
図７は、上述のように複数のレーザインタロゲーション領域を用いた粒子操作システム１０００の概略図である。詳しくは図７には、インタロゲーションレーザ及び検出光学系の光学経路が描かれている。
【００３６】
システム１０００の１つの実施形態によれば、ターゲット粒子を、蛍光マーカで標識されたある特定の細胞例えば幹細胞又は癌細胞とすることができる。このマーカは、予め定められた波長で動作するレーザ１４００により照射されると、特定のエネルギーを有する光子を発生する。したがってこの細胞ソーティングシステムの場合、レーザ光源１４００を、偏向ミラー１５００により検出光学系１１００を介して、図１に示した検出領域１６０内のＭＥＭＳチップ１００へ配向することができる。検出光学系１１００及びレーザ光源１４００の光軸を、光学経路の少なくとも一部分にわたり共線とすることができる。したがって、この光軸に沿ったレーザの照射及び光学的検出の配向を、基板製造平面に対し垂直にすることができ、又は基板製造平面に直交させることができ、ソータフラップ可動構造４の運動平面に直交させて、検出領域を通過するサンプル液流に直交させることができる。これにより、光が表面と直交する入射角で交差するときに、重要な結果を生じさせることができ、このようにすることで鏡面反射を低減させることができ、したがって検出パターンにおけるノイズ源を低減又は排除することができる。
【００３７】
照射された粒子から発する蛍光を、検出光学系１１００により成形し、ダイクロイックミラー１２００により分離して、複数の光検出器１３００から成るバンクへ向かわせることができる。複数の光検出器によって、放射光の複数の波長をマルチパラメトリック検出のために適合させることができる。光検出器１３００により出力された信号は、検出領域１０１にターゲット粒子が存在しているか否かを表す。この信号をコントローラ１９００に供給することができ、コントローラ１９００は、粒子ソーティングシステム１におけるコンポーネント相互間のタイミングを管理し、データを収集する。コントローラ１９００を、汎用コンピュータ又は専用回路又はＡＳＩＣとすることができる。ターゲット粒子の検出に応じてコントローラ１９００は、力発生器又は磁束発生器を励起する信号を発生する。力発生器は、可動構造４自体に力を生じさせるデバイスであり、これによって可動構造の運動が生じる。この力発生器は、可動構造４と直接機械的に結合されていなくてもよい。例えば力発生器を磁束源とすることができ、これによれば磁束によって、可動構造４に組み込まれた透磁性材料に磁力が引き起こされる。この力によって、フラップ又は可動構造を力発生器の方向へ引き寄せることができ、これによりソート流路２が開放され、廃棄流路３が閉鎖される。ここで重要であるのは、力発生器をアクチュエータ構造４内ではなく、粒子ソーティングシステム１０００内に設けることができることである。前述のとおり、これによってアクチュエータ構造４のコスト及び構成の複雑さを低減することができる。また、第２の光学経路を設けるために、オプションとしてさらに別のレーザ１４１０が含まれるようにしてもよい。
【００３８】
検出領域１０１において、ターゲット粒子を液体サンプルの他の成分と区別することができる。必須ではないけれども、検出手段をレーザ１４００及びそれに対応して設けられた光学系とすることができ、この光学系によりレーザの光が可動ダイバータ４２上流のスポットに配向され、一般には検出領域１０１に向けて案内される。検出手段は、ターゲット粒子を液流中の他のものと区別する任意の個数の特性又は属性をベースとすることができる。例えばいくつかの例を挙げるとすれば、粒子の電気的属性、流体力学的属性、磁気的属性、光学的属性、熱的属性、質量、機械的属性などにおける差異によって、粒子の区別を行うことができる。ここで列挙したものは、すべてを網羅することを意図したものではなく、ここで説明するアクチュエータとともに使用することのできる検出システムを例示する代わりに挙げたものである。
【００３９】
１つの実施形態によればターゲット粒子を、蛍光標識で標識された特定の細胞とすることができ、これは特定の波長のレーザによって照射されると特定の色の光を発生する。この種の標識はこの分野ではよく知られており、これには例えば、フルオレセイン、Texas Red（登録商標）、フィコビリ蛋白質、シアニン誘導体、及びローダミンなどが含まれる。この開示の大半の部分はこの用途に向けられたものであるが、自明のとおりここで説明するシステム及び方法は、粒子を他のものと区別するために利用される別の検出メカニズムも適用可能である。このようなメカニズムは周知のものであってもよいし、或いはいずれ発明されるものであってもよい。
【００４０】
検出領域１０１の通過に応答して、第１インタロゲーション領域１０１内にターゲット粒子が存在していることを表す信号が、検出器（図示せず）によって発せられる。既知の遅延時間後、検出されたターゲット粒子を液流中の他の成分と区別する目的で、ソーティングゲート即ち可動ダイバータ４２またはフラップ状アクチュエータ１０の開放を指示する信号が、コントローラによって発せられる。可動ダイバータ４２又はフラップ状アクチュエータ１０が透磁性材料を含むようにすることができ、これによって磁界が存在するときにそれらの間に磁力を発生させることができる。信号がコントローラによって発せられると、ダイバータ４２又はフラップ状アクチュエータ１０内に埋め込まれた透磁性材料間に力が発生し、この力によってダイバータ４２又はアクチュエータ１０が引き下ろされる。この動きにより廃棄チャネル３又は４８が閉鎖され、ターゲット粒子がソート流路２又は４６へと向きを変えるようになる。ソートされたサンプルは、その後、ソートチャネル２又は４６の終端に配置されたソート容器によって収集され、ソートされたサンプルはこの容器内に保持される。
【００４１】
微細加工製造された粒子操作デバイス１０又は４０を、図５に示したコンポーネントを含む１つのハウジング内に収容することができる。収容領域を、粒子操作デバイス１０又は４０及び１つ又は複数の基準に対応づけられたマイクロ流路の精密なポジショニングのために利用可能なメカニズムを備えた可動ステージとすることができる。これによれば、検査領域及び粒子操作デバイス１０又は４０が、収集光学系１１００に対して配向及びポジショニングされる。いっそう精密なポジショニングが必要であるならば、入力ステージを並進ステージとすることもでき、これによれば、基準に対し相対的な可動ダイバータ４２又はフラップ状アクチュエータ４のロケーションの観測に基づき、ポジショニングが調節される。
【００４２】
図７に示されているＭＥＭＳ粒子操作システム１０００には、付加的なインタロゲーション領域２０１及び３０１の実装、或いはそれよりも多くのインタロゲーション領域の実装に役立たせることのできる複数の複数の部材を含めることができる。まず第一に、操作手段１６００によって、レーザ１４００から第２又は第３のインタロゲーションスポットへのレーザ照射の軌跡、スペクトル成分、タイミング、又は期間を、変化させることができる。光学操作手段１６００内に含めることのできる部材の例を挙げると、例えば複屈折水晶、スピニングプリズム、ミラー、飽和性吸収体、音響光学変調器、高調波水晶、Ｑスイッチなどである。もっと一般的にいえば、光学操作手段１６００には、レーザ周波数、振幅、タイミング、又は１つの光学経路の１つ分岐から付加的なインタロゲーション領域へ向かう軌跡を変化させる１つ又は複数の部材を含めることができる。
【００４３】
例えば光学操作手段１６００には、ビームスプリッタ１６２０及び音響光学変調器１６４０を含めることができる。ビームスプリッタ１６２０は、到来するレーザビームの一部分を、変調器を通る第２分岐又は第２アームに向けて分離することができ、第２ビームの振幅がこの変調器によって高い周波数で変調される。変調周波数を、例えば約２ＭＨｚ又はそれよりも高い周波数とすることができる。これに対し第１レーザインタロゲーション領域１０１に当射される光を、（変調されない）連続波とすることができる。この場合、第２分岐又は第２アームは、付加的なレーザインタロゲーション領域２０１又は３０１に配向される。この励起によって、適切に標識された細胞から相応の蛍光パターンが生成されることになる。
【００４４】
次に、このようにして変調された蛍光パターンを、検出光学系１６００によってピックアップすることができ、検出光学系１６００は、インタロゲーション領域２０１及び／又は３０１から検出された蛍光を、レーザインタロゲーション領域１０１からの蛍光と結合することができる。ついで、結合された放射を、１つ又は複数の検出器１３００に照射することができる。
【００４５】
付加的な光学コンポーネント１７００によって、第２ビーム経路の周波数、振幅、タイミング又は軌跡を変化させることができるが、この動作は、光学コンポーネント１６００のように対物レンズ１１００の上流（サンプル側）ではなく、下流（検出器側）で行うことができる。
【００４６】
検出器１３００の出力を分析して、レーザインタロゲーション領域２０１及び／又は３０１に対応する内容と、レーザインタロゲーション領域１０１に対応する内容とを区別することができる。このことは、検出器１３００からの信号に対し、いくつかの電子的な弁別手段を適用することによって実施することができる。図９に示されているように、電子弁別手段１８００に、レーザインタロゲーション領域１０１から到来する信号を、レーザインタロゲーション領域２０１及び／又は３０１から到来する信号と区別する電子回路を含めることができる。電子弁別手段１８００の詳細な構成は、光学操作手段１６００の選択に左右されることになる。例えばフィルタ１８２０には、ハイパスステージとローパスステージを含めることができ、これは音響光学変調器１６４０と整合されたものである。
【００４７】
図８、図９及び図１０には、複数のレーザインタロゲーション領域１０００を備えた粒子操作システムの１つの実施形態が、さらに詳細に示されている。図８には、光学操作手段１６００の特定の選択が描かれている。既述のように光学操作手段１６００には、ビームスプリッタ１６２０及び音響光学変調器を含めることができる。この実施形態によれば、電子弁別手段を図９に示されているような設計とすることができ、これは光学操作手段１６００の選択と整合されたものである。図１０には、複数の光学検出器１３００からの信号が電子弁別手段１８００により分析される様子が示されている。電子弁別手段１８００には、フィルタ１８２０（ハイパス及び／又はローパス）と包絡線検出器１８４０とが含まれている。
【００４８】
図１０ａには、検出器１３００から出力されたフィルタリングされていない信号が示されている。図１０ａ〜図１０ｃに示されているデータは、システム１０００によって生成可能なデータを表しており、これらの図面には、検出器出力信号の振幅が時間軸上に示されている。これらの信号には、連続波の部分と変調された部分とが含まれる可能性がある。ハイパスフィルタステージによるフィルタリング後には、図１０ｂに示されているような信号が出現する可能性があり、ローパスステージによるフィルタリング後には、図１０ｃに示されているような信号が出現する可能性がある。これらの信号は、コンピュータ１９００のロジック回路において簡単に分離することができる。別の選択肢としてハイパスフィルタを、高周波パルスの振幅の包絡線に対応する信号を送出する包絡線検出器１８４０とすることができる。
【００４９】
他の種類のコンポーネントとして、信号を分離するための電子弁別手段１８００を挙げることができる。これらのコンポーネントには例えば、信号フィルタ、ミキサ、位相ロックループ、マルチプレクサ、トリガ、又は信号を分離又は弁別可能な他の何らかの類似のデバイスを含めることができる。既述のとおりコンポーネント１８００にも、電子的なハイパスフィルタ及び／又はローパスフィルタ、或いは包絡線検出器を含めることができる。電子弁別手段１８００からの２つの信号セットは、以下で述べるようにロジック回路によって別個に処理されることになる。
【００５０】
ローパスフィルタの出力は、レーザインタロゲーション領域１０１と対応づけられた低周波成分を通過することになり、ハイパスフィルタは、レーザインタロゲーション領域２０１及び／又は３０１に対応するいっそう高い周波数の振幅変調された成分を通過することになる。ローパス成分は、コンピュータ又はＡＳＩＣ １９００のソートロジック回路１９２０を通過することになり、高周波成分は、コンピュータ又はＡＳＩＣ １９００の品質評価回路１９４０を通過することになる。コンピュータ又はＡＳＩＣ １９００はソートロジック回路１９２０によって、フラップ状可動構造１０又はダイバータ４２の開閉を制御することができ、品質評価回路１９４０は、ソーティングプロセスの品質、有効性又は精度を表す出力を発生させることができる。品質評価回路１９４０からの指示に基づき、品質評価回路１９４０において特定の結果が得られるように、ソーティングのパラメータを調整することができる。したがって粒子操作システム１０００において、少なくとも１つの付加的なレーザインタロゲーション領域からの信号がロジック回路に供給され、ロジック回路は、セルソーティングプロセスを制御、監視又は調整するために、粒子操作ステージと接続されている。
【００５１】
別の実施形態によれば、領域２０１及び／又は３０１からの信号を、パルス幅によって分離することができる。インタロゲーションレーザスポットが等価であったとしても、下流の粒子からのパルス幅が上流の粒子からのパルス幅よりも広くなることが知られている。これは、ソーティングポイントにおける流れの分岐に起因して、下流の流路において流れがゆっくりになった結果として生じる。速度（したがってパルス幅）を制御するためにも、ジオメトリ（例えばチャネル幅）を利用することができる。図１１に例示されている信号は、所定のパルス幅を有する複数の信号イベントのヒストグラムの例を表している。図１１には、それぞれ異なるパルス幅の２つの母集団が示されている。このため、これらのパルス幅に基づき信号を弁別する検出器を使用することができ、この場合、いっそう広いパルス幅は、液流のいっそう下流の部分に対応し、したがって第１インタロゲーション領域１０１ではなく、インタロゲーション領域２０１及び／又は３０１に対応する。
【００５２】
図１２は、複数のレーザ光源１４００及び１４１０を使用する粒子ソーティングシステム２０００の概略図である。レーザ光源の一方１４１０は、対応する光学系１１５０及び１７００とともに、少なくとも１つの付加的なレーザインタロゲーション領域２０１及び／又は３０１を照射するために用いられる。この構成を準備するためには、システム１０００よりもいくらか複雑になりコストがかかる可能性があるけれども、光学経路及び検出経路を、それぞれ異なるレーザインタロゲーション領域のために別個に設けることができる、という利点が得られるようになる。この実施形態のために、レーザ１４１０の光の軌跡、スペクトル成分、タイミングまたは期間を変更する必要はない。図１２に明示的には描かれていないけれども、自明のとおり、付加的なレーザ１４１０のための検出経路を、レーザ１４００のための検出経路とは別個にしてもよい。したがって実施形態２０００には、複数のレーザ光源と、これら複数のレーザ光源を各インタロゲーション領域に向けてフォーカシングする複数のレンズとを含めることができる。
【００５３】
このため、ＭＥＭＳ粒子操作システムを、１つ又は複数の付加的なレーザインタロゲーション領域と共に使用することができ、この場合、付加的なレーザインタロゲーション領域は、粒子流の操作における操作ステージの有効性又は精度を確認するために利用される。操作ステージの確認、制御又は調整のために、１つ又は複数の付加的なレーザインタロゲーションステージを利用することができる。付加的なレーザインタロゲーションステージからの信号は、検出経路及び／又は光学経路の一部分を、第１レーザインタロゲーションステージと共用することができ、各々の領域からの信号を、システムを制御するロジック回路によって、電子的に分離し別個に処理することができる。
【００５４】
サイトメトリー機能を備えた粒子操作システムを利用することによって、オペレータは個々の粒子タイプに対し、ある事象数（例えばソート後に捕捉された事象率）を別の事象数（例えばソート前の初期事象率）によって除算したものを計量し、この比に基づき、初期のインタロゲーションパラメータ（例えばｘ，ｙ，ｚポジション、及び「オープンウィンドウ」の時間長なども）を調整するためにフィードバックを行うことができる。システム１０００又は２０００の効率を最適化するために、この手法を利用することができる。さらに別の選択肢としてオペレータは、ソーティングシステム１０００又は２０００の純度を最適化する目的で、ターゲット細胞のソート後の事象率を、ソート後の全事象率で除算したものを測定し、ｘ，ｙ，ｚポジション及び「オープンウィンドウ」の時間長などのような初期レーザインタロゲーションパラメータを調整するために、フィードバックを行うことができる。
【００５５】
以上、これまで概要を示したとおりの実施例を参照しながら、種々の詳細な点について説明してきたけれども、種々の代替案、修正、変形、改善、及び／又は、実質的に同等の内容を、それらが既に知られているにことであろうが、又は現時点では予見できないこと或いは予見できないであろうが、既述の開示内容を参酌することで見出すことができる。よって、これまで述べてきた実施形態は、例示を意図したものであって、それらに限定されるものではない。
【図１ａ】
0006605327.tif 000002
【図１ｂ】
0006605327.tif 000003
【図２ａ】
0006605327.tif 000004
【図２ｂ】
0006605327.tif 000005
【図２ｃ】
0006605327.tif 000006
【図３ａ】
0006605327.tif 000007
【図３ｂ】
0006605327.tif 000008
【図４ａ】
0006605327.tif 000009
【図４ｂ】
0006605327.tif 000010
【図５】
0006605327.tif 000011
【図６】
0006605327.tif 000012
【図７】
0006605327.tif 000013
【図８】
0006605327.tif 000014
【図９】
0006605327.tif 000015
【図１０】
0006605327.tif 000016
【図１１】
0006605327.tif 000017
【図１２】
0006605327.tif 000018