(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層とを備える分離材であって、
水銀圧入法により測定される前記分離材における細孔容積分布が多峰性であり、
細孔容積の最大値が細孔径０．０５μｍ以上０．７μｍ未満の範囲にあり、
細孔径０．７μｍ以上５μｍ以下の範囲に極大値を有する峰における細孔容積の総和が全細孔容積の３〜２０％であり、かつ
分離材の粒径の変動係数が３〜１５％である分離材。
【請求項２】
前記架橋高分子は更に疎水基を有する、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンを含有するモノマを重合させて得られるポリマを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
前記細孔容積分布における細孔容積の最大値が細孔径０．０５μｍ以上０．６μｍ以下の範囲にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
平均粒径が１０〜３００μｍである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
前記架橋高分子はアガロース又はその変性体由来の架橋高分子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項９】
前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの前記被覆層を備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分離材に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、上記のデキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も充分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
親水性天然高分子の架橋ゲルの欠点を克服するため、多孔性高分子の細孔内に天然高分子ゲル等のゲルを保持した複合体が、ペプチド合成の分野で知られている（例えば、特許文献１参照）。このような複合体を用いることにより、反応性物質の負荷係数を高め、高収率の合成が可能となる。また、硬質な合成高分子物質でゲルを包囲するため、カラムベッドの形態で使用しても、容積変化がなく、カラムを通過するフロースルーの圧力が変化しないという利点を有する。
【０００５】
また、セライト等の無機多孔質体にデキストラン、セルロースといった多糖等のキセロゲルを保持させた分離材が知られている（例えば、特許文献２、特許文献３参照）。このゲルには吸着性能を付加するために、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基等が付与されており、ヘモグロビンの除去に用いられる。このような分離材は、カラムでの通液性が良好である。
【０００６】
また、マクロネットワーク構造のコポリマの細孔を、モノマから合成した架橋共重合体ゲルで埋めた、ハイブリッドコポリマのイオン交換体が知られている（例えば、特許文献４参照）。架橋共重合体ゲルは、架橋度が低い場合、圧力損失、体積変化等の問題があるが、ハイブリッドコポリマにすることで通液特性が改善され、圧力損失が少なく、イオン交換容量が向上し、リーク挙動が改善される。
【０００７】
また、有機合成ポリマ基体の細孔内に巨大網目構造を有する親水性天然高分子の架橋ゲルを充填した複合化充填材が提案されている（例えば、特許文献５、特許文献６参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４９６５２８９号明細書
【特許文献２】米国特許第４３３５０１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４３３６１６１号明細書
【特許文献４】米国特許第３９６６４８９号明細書
【特許文献５】特開平１−２５４２４７号公報
【特許文献６】米国特許第５１１４５７７号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の分離材は、タンパク質の非特異吸着が多く、吸着量が充分でなく、また、カラムとして用いたときの通液性に劣るという問題がある。
【００１０】
そこで、本発明は、タンパク質の非特異吸着が低減され、吸着量が高く、カラムとして用いたときの通液性に優れる分離材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は下記［１］〜［１０］に記載の分離材を提供する。
［１］多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層とを備える分離材であって、水銀圧入法により測定される上記分離材における細孔容積分布が多峰性であり、細孔容積の最大値が細孔径０．０５μｍ以上０．７μｍ未満の範囲にあり、かつ細孔径０．７μｍ以上５μｍ以下の範囲に極大値を有する峰における細孔容積の総和が全細孔容積の３〜２０％である分離材。
［２］上記架橋高分子は更に疎水基を有する、［１］に記載の分離材。
［３］比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］上記多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンを含有するモノマを重合させて得られるポリマを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］上記細孔容積分布における細孔容積の最大値が細孔径０．０５μｍ以上０．６μｍ以下の範囲にある、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］上記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］平均粒径が１０〜３００μｍである、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］上記架橋高分子はアガロース又はその変性体由来の架橋高分子である、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］上記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの上記被覆層を備える、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、タンパク質の非特異吸着が低減され、吸着量が高く、カラムとして用いたときの通液性に優れる分離材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１の分離材の細孔容積分布を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な実施形態を説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層とを備え、水銀圧入法により測定される上記分離材における細孔容積分布が多峰性である。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中（メタ）アクリル酸とはアクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。
【００１６】
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態の多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤を含むモノマを重合させて得られるポリマを含む粒子であり、例えば、従来の懸濁重合、乳化重合等によって合成することができる。モノマとしては、特に限定されないが、例えば、アクリル系モノマ、スチレン系モノマを使用することができる。具体的なモノマとして以下のような多官能性モノマ、単官能性モノマ等が挙げられる。
【００１７】
多官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。これらモノマの中で、例えば、新中村化学工業社製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ）等が、商業的に入手可能である。これらの多官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、耐酸性及び耐アルカリ性の観点より、モノマがジビニルベンゼンを含有することが好ましい。
【００１８】
上記多孔質ポリマ粒子は、モノマとしてジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で６０質量％以上含むことが好ましく、７０質量％以上含むことがより好ましく、８０質量％以上含むことが更に好ましい。ジビニルベンゼンを６０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性がより良好となるため好ましい。
【００１９】
単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマ；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらの単官能性モノマは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシ基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００２０】
多孔質化剤としては、重合時に相充填を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。具体的には、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、イソアミルアルコール、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２１】
上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２２】
また、溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化させることが可能である。
【００２３】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート及びヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２４】
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン）８０、好ましくは純度約４０％、より好ましくは純度約５０％、更に好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（好ましくは純度約４０％を超える、より好ましくは純度約５０％を超える、更に好ましくは純度約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル、又はこれらの混合物が好ましい。
【００２５】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成しにくくなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持しやすくなる。
【００２６】
多孔質化剤として、重合中には溶解せず、粒子形成後に任意の方法で除去することのできる粉体を使用することもできる。例えば、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、シリカ、ポリマ、金属コロイド等を使用することができる。除去のしやすさの観点から、炭酸カルシウム、第三リン酸カルシウム等を用いることが好ましい。ポリマ粒子を形成した後に、ポリマ粒子中に含まれている粉体多孔質化剤を除去することによって、ポリマ粒子中に、当該粉体多孔質化剤に対応する大きさ及び形状の細孔を形成することができる。したがって、粉体多孔質化剤の平均粒径は、多孔質ポリマ粒子における所望の細孔径に応じて調整すればよく、例えば、０．６〜１０μｍとすることができる。除去方法としては、例えば、ポリマ粒子を酸溶液に浸すことによって粉体多孔質化剤を溶解する方法等がある。なお、粉体多孔質化剤の平均粒径は、多孔質ポリマ粒子の平均粒径測定方法と同様の方法で測定することができる。
【００２７】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２８】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩等が挙げられる。
【００２９】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３０】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００３１】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３２】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記界面活性剤の中でも、モノマ重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３３】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３４】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３５】
多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を用いてもよい。
【００３６】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３７】
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３８】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０μｍ以上であると、カラム充填後のカラム圧を抑制できる傾向がある。
【００３９】
（被覆層）
本実施形態の被覆層は、水酸基を有する架橋高分子を含む。水酸基を有する架橋高分子で多孔質ポリマ粒子を被覆することにより、カラム圧の向上を抑制することができるとともに、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる上、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上にすることが可能となる。被覆層は、例えば、多孔質ポリマ粒子の表面に、水酸基を有する高分子を吸着させた後、高分子を架橋することによって、多孔質ポリマ粒子の表面に形成することができる。
【００４０】
水酸基を有する架橋高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する架橋高分子としては、例えば、多糖類又はその変性体由来の架橋高分子、ポリビニルアルコール又はその変性体由来の架橋高分子等が挙げられる。多糖類としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロース、キトサン等が挙げられる。水酸基を有する架橋高分子としては、例えば平均分子量１万〜２０万程度のものが使用できる。水酸基を有する架橋高分子は、アガロース又はその変性体由来の架橋高分子であることが好ましい。
【００４１】
また、架橋高分子は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体であることが好ましい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基等が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。
【００４２】
（被覆層の形成方法）
水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
まず、水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。この溶液を、多孔質体の細孔内に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００４３】
次いで、架橋剤を加えて、多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。
【００４４】
架橋剤としては、例えばエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような、水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。
【００４５】
この架橋反応には通常、触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００４６】
架橋剤による架橋反応は、通常、水酸基を有する高分子の溶液等を細孔内に含浸させた多孔質ポリマ粒子を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、目的とする分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離しやすくなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向にある。
【００４７】
また、触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０.０１〜１０モル倍の範囲、より好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。
【００４８】
架橋剤と水酸基を有する高分子との架橋反応が触媒等の添加により制御可能な場合は、予め架橋剤を混合した水酸基を有する高分子の溶液を多孔質ポリマ粒子に含浸させ、当該多孔質ポリマ粒子を適当な媒体中で分散、懸濁させ、触媒等を添加して架橋反応を行わせることができる。また、触媒等を用いない場合、温度等の架橋反応条件を変化させることにより、架橋反応を生起させてもよい。水酸基を有する高分子、架橋剤及び触媒を溶解した溶液を含浸させた多孔質体を、適当な媒体に分散、懸濁させてから、架橋反応条件（例えば温度）を反応が進行する条件に調整し、架橋反応を行わせることができる。例えば、該架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度に達すれば架橋反応が生起する。
【００４９】
水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては、含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては、水、アルコール等が挙げられる。
【００５０】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００５１】
架橋反応終了後、生成した多孔質ポリマ粒子と架橋ゲルの複合体をろ別し、次いで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層により被覆された粒子が得られる。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００５２】
被覆層の量は、多孔質ポリマ粒子１ｇに対して３０〜４００ｍｇであることが好ましく、５０〜４００ｍｇであることがより好ましく、１００〜４００ｍｇであることが更に好ましい。被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して４００ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向にある。また、被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して３０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向にある。
【００５３】
（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することにより、イオン交換精製、アフィニティー精製等に使用することができる。イオン交換基を導入する方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００５４】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン及びその塩酸塩、ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する４級アンモニウム塩等が挙げられる。モノハロゲノカルボン酸としては、例えば、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等が挙げられる。ハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する３級アミンとしては、例えば、ジエチルアミノエチルクロライド等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００５５】
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いるのが有効である。有機溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００５６】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されたイオン交換基が決定される。
【００５７】
イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法、又はアルカノール基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルカノール基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミンを反応させる方法等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件としては、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００５８】
イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル基含有化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムクロライド等の４級アンモニウムハロゲナイドなどを分離材に反応させてもよい。
【００５９】
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６０】
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００６１】
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１．３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００６２】
本実施形態の分離材の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。分離材の平均粒径が１０μｍ以上であると、カラム充填後のカラム圧を抑制できる傾向がある。
【００６３】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１２％であることが更に好ましく、５〜１０％であることが特に好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（日立製作所社製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。
【００６４】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．（変動係数）を測定する。
【００６５】
分離材の細孔容積は、分離材の全体積（細孔容積を含む）基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、５０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。
【００６６】
本実施形態の分離剤は、水銀圧入法により測定される細孔容積分布が多峰性である。本明細書では、多峰性とは、細孔容積分布において細孔容積の極大値が複数存在することをいう。細孔容積分布は二峰性であることが好ましい。二峰性とは、細孔容積分布において細孔容積の極大値が２つ存在することをいう。
【００６７】
本実施形態に係る分離材の細孔容積分布は、少なくとも２つの極大値を有する。このうち、一方の極大値は細孔径０．０５μｍ以上０．７μｍ未満の範囲にあり、細孔径０．０５μｍ以上０．６μｍ未満の範囲にあることが好ましく、細孔径０．１μｍ以上０．６μｍ以下の範囲にあることがより好ましい。また、少なくとも２つある極大値のうち、他方の極大値は細孔径０．７μｍ以上５μｍ以下の範囲にあり、細孔径０．７μｍ以上３μｍ以下の範囲にあることが好ましく、細孔径０．９μｍ以上１．５μｍ以下の範囲にあることがより好ましい。分離材の細孔容積分布が二峰性である場合、２つの極大値の細孔径差は０．２５μｍ以上４．９５μｍ以下であることが好ましく、０．４μｍ以上３μｍ以下であることがより好ましく、０．６μｍ以上１．５μｍ以下であることが更に好ましい。
【００６８】
分離材の細孔容積分布において、細孔容積の最大値は細孔径０．０５μｍ以上０．７μｍ未満の範囲にあり、細孔径０．０５μｍ以上０．６μｍ以下の範囲にあることが好ましい。細孔容積の最大値がこの範囲にあると、粒子の比表面積が大きくなり、タンパク質吸着量が大きくなる点で好ましい。
【００６９】
分離材の細孔容積分布において、細孔径０．７μｍ以上５μｍ以下の範囲に極大値を有する峰における細孔容積の総和は、全細孔容積に対して３〜２０％である。上記細孔容積の総和は３〜１５％であることが好ましい。上記細孔容積の総和が２０％以下であると、分離材の弾性率が低下しにくい傾向がある。上記細孔容積の総和が３％以上であると、分離材内部への通液性がより改善され、カラム流速が早い場合の動的吸着量がより高くなる傾向がある。細孔容積分布において、全細孔容積に対する各峰における細孔容積の割合は、例えば、細孔容積分布の測定に用いる水銀圧入測定装置（オートポア：島津製作所社製）に付属の解析ソフトによって算出することができる。
【００７０】
細孔容積分布が多峰性である分離材は、例えば、多孔質ポリマ粒子の合成時に、異なる種類の多孔質化剤を併用することによって作製することができる。例えば、上述の多孔質化剤のうち、液体の多孔質化剤である有機溶媒又は水と、粉体の多孔質化剤とを併用する方法、又は異なる粒径の粉体多孔質化剤を複数種併用する方法等がある。カラムに用いたときの通液性を高める観点から、液体多孔質化剤と粉体多孔質化剤とを併用する方法が好ましい。
【００７１】
分離材の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、分離材の比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。分離材の比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。
【００７２】
本実施形態の分離材又は多孔質ポリマ粒子の細孔容積分布、平均細孔径、比表面積及び空隙率（細孔容積）は、水銀圧入測定装置（オートポア：島津製作所社製）を用いて、例えば以下のようにして測定することができる。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０  ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７３】
本実施形態の分離材の吸湿度は、次の方法で測定する。乾燥分離材１ｇを恒温恒湿度試験槽（温度６０℃、湿度９０％）に１８時間放置した後、再度分離材の質量を測定することにより、吸湿度を以下の式より算出する。
（吸湿後分離材質量−１）ｇ／１ｇ×１００＝吸湿度（％）
【００７４】
本実施形態の分離材の吸湿度は１〜３０質量％であることが好ましく、１〜２０質量％であることがより好ましく、１〜１０質量％であることが更に好ましい。分離材の吸湿度が３０質量％以下であると、被覆層の厚みによる分離材の通液性低下をより抑制することができる。
【００７５】
本実施形態の分離材は、タンパク質の静電的相互作用による分離、アフィニティー精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態のイオン交換基を導入した分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて使用することも可能である。
【００７６】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、ｐＨ条件等を選ぶ必要がある。公知の方法として、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００７７】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子の表面を被覆する、水酸基を有する架橋高分子を含む被覆層を形成した後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、水酸基を有する架橋高分子を被覆することによって非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こりやすい傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。
【００７８】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質等の分離を行う場合、カラムに通液されるタンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲である。一方、本実施形態の分離材を使用した場合は、従来のタンパク質分離用の分離材よりも速い８００ｃｍ／ｈ以上の通液速度で使用しても高吸着量を維持することができる。
【００７９】
本実施形態の分離材の平均粒径は、通常１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、１０〜３００μｍであることが好ましい。
【００８０】
さらに、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーで使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化がほとんどないという、操作性における優れた効果を発揮する。
【００８１】
なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００８３】
（実施例１）
＜多孔質ポリマ粒子１の合成＞
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学社製、商品名ＤＶＢ９６０）１２ｇ、ジエチルベンゼン４．５ｇ、イソアミルアルコール１９．５ｇ、過酸化ベンゾイル０．６４ｇ、平均粒径１μｍの炭酸カルシウム粒子３．０ｇをポリビニルアルコール水溶液（０．５質量％）に一括して加えて混合液を調製した。この混合液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後、得られた乳化液を８０℃のウォーターバスで加熱しながら、撹拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過し、アセトンで洗浄した。その後、酸水溶液で粒子中の炭酸カルシウムを溶解させ、多孔質ポリマ粒子１を得た。得られた多孔質ポリマ粒子１の平均粒径（体積基準）及び粒径のＣ．Ｖ．をレーザー回折粒度分布計（ＦＰＩＡ−３０００（シスメックス社製））にて測定した。結果を表１に示す。
【００８４】
＜被覆層の形成＞
アガロース（Ａｇａｒｏｓｅ  ＬＭＰ、（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））の水溶液（濃度２質量％）１００ｍＬに、水酸化ナトリウム４ｇ及びグリシジルフェニルエーテル０．１４ｇを投入して７０℃で１２時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。得られた変性アガロースをイソプロピルアルコールで沈殿させ、沈殿物を洗浄し、変性アガロースを得た。得られた変性アガロースを再度水に溶解して２０ｍｇ／ｍＬの変性アガロース水溶液を調製した。この水溶液７０ｍＬに多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間撹拌することによって、変性アガロースを多孔質ポリマ粒子１に吸着させた。変性アガロースを吸着させた多孔質ポリマ粒子１をろ過し、熱水で洗浄した。多孔質ポリマ粒子１への変性アガロースの吸着量は乾燥させた粒子の熱重量減少を測定し、算出した。
【００８５】
多孔質ポリマ粒子１の表面に吸着した変性アガロースを次のようにして架橋した。エチレングリコールジグリシジルエーテル及び水酸化ナトリウムの濃度がそれぞれ０．６４Ｍ、０．４Ｍである水溶液に、水溶液３５ｍＬに対して変性アガロースが吸着した多孔質ポリマ粒子１を１ｇの割合で投入し、３０℃にて撹拌し、変性アガロースを架橋させた。得られた粒子を２質量％の熱ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して分離材を得た。得られた分離材の平均粒径（体積基準）をレーザー回折粒度分布計（ＦＰＩＡ−３０００（シスメックス社製））にて測定した。結果を表１に示す。また、得られた分離材を乾燥後、熱重量分析により被覆層の質量を測定した。結果を表２に示す。
【００８６】
（タンパク質の非特異吸着性評価）
得られた分離材０．５ｇをＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｕｂｕｍｉｎ）濃度２０ｍｇ／ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０ｍＬに投入し、２４時間室温で撹拌を行った。その後、遠心分離を行って上澄み液をとった。分光光度計で上澄み液の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた上澄み液中のＢＳＡ濃度から、分離材に吸着したＢＳＡ量を算出した。結果を表３に示す。
【００８７】
（吸湿度評価）
１ｇの乾燥させた分離材を恒温恒湿度試験槽（温度６０℃、湿度９０％）内に１８時間放置し、その後、再度分離材の質量を測定した。以下の式により、分離材の吸湿度を算出した。結果を表３に示す。
（吸湿後分離材質量−１）ｇ／１ｇ×１００＝吸湿度（％）
【００８８】
＜イオン交換基の導入＞
分離材を含む水懸濁液をろ過して得られた分離材（乾燥質量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）を１６ｍＬの水に溶解し、更にイソプロピルアルコール１２８ｍ１と混合して得た溶液を、水酸化ナトリウム水溶液を含浸した状態の分離材を含む上記水酸化ナトリウム水溶液に加えた。水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、生成物をろ取して水洗し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有する（ＤＥＡＥ変性）分離材を得た。以降の細孔容積分布、比表面積、イオン交換容量、カラム特性の評価には、ＤＥＡＥ変性分離材を用いた。
【００８９】
（細孔容積分布、比表面積）
得られた分離材の細孔容積分布及び比表面積を、水銀圧入測定装置（オートポア：島津製作所社製）を用いて以下のようにして測定した。試料は、分離材のそのまま約０．０５ｇを、標準５ｃｃ粉体用セル（ステム容積０．４ｃｃ）にとり、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定した。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０ｄｅｇｒｅｅｓ、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍ（４．８５×１０−２ｍＮ／ｍ）に設定した。細孔径０．０５〜５μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出した。得られた細孔容積分布について、各峰における細孔容積の全細孔容積（細孔径０．０５〜５μｍの細孔容積）に対する割合を、水銀圧入測定装置に付属の解析ソフトによって算出した。細孔容積の最大値を示す細孔径、当該最大値を有する峰における細孔容積の全細孔容積に対する割合、最大値以外の極大値を示す細孔径、当該極大値を有する峰における細孔容積の全細孔容積に対する割合、及び比表面積を表２に示す。分離材の細孔容積分布を図１に示す。分離材の細孔容積分布は、極大値が細孔径０．３４μｍにある峰及び１．２８μｍにある峰を有する二峰性であることが確認された。図１において、細孔容積は細孔径０．３４μｍに最大値を有し、当該最大値を有する峰における細孔容積は全細孔容積に対して９１％であった。また、図１において、細孔径１．２８μｍに極大値を有する峰における細孔容積は、全細孔容積に対して９％であった。
【００９０】
（イオン交換容量評価）
１２時間以上水で膨潤させた分離材を０．２〜０．３ｇ定量し、ビーカに移し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２０ｍＬを加え、２５℃、１時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の粒子を洗浄液が中性になるまで洗浄した。その後、粒子をビーカに移し、０．１Ｎ塩酸水溶液２０ｍＬを添加し、室温で１時間撹拌した。その後、フィルタを用いて吸引ろ過を行い、フィルタ上の粒子を洗浄液が中性になるまで洗浄した。この洗浄液について自動電位差滴定装置を使用して０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で滴定を行うことによって、分離材のイオン交換容量（ｍｍｏｌ／ｍＬ）を求めた。結果を表３に示す。
【００９１】
＜カラム特性評価＞
得られた分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８ｍｍ×３００ｍｍのステンレスカラムに４ＭＰａにて１５分間かけて６５ｃｃ充填し、以下の評価に用いた。
【００９２】
（通液性評価）
分離材を充填したカラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧の関係を測定した。カラム圧が０．３ＭＰａであるときの線流速（通液速度）を求めた。結果を表３に示す。
【００９３】
（動的吸着量評価）
分離材を充填したカラムに、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１０カラム容量流した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を通し、ＵＶ吸光度測定によってカラム出口での溶出液中のＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通した。線流速は上記通液性評価にてカラム圧が０．３ＭＰａとなるときの速度と同様とした。その後、５カラム容量分の１Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋ  ｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表３に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入液のＢＳＡ濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）
【００９４】
（耐アルカリ性評価）
分離材を０．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液中で２４時間撹拌した後、リン酸緩衝液で洗浄後、上記カラム特性評価の場合と同様の方法でカラムに充填し、ＢＳＡの１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量を測定した。アルカリ処理前の１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ動的吸着量と比較し、アルカリ処理後の動的吸着量の減少割合が３％以下である場合を「○」、３％超２０％以下である場合を「△」、２０％超である場合を「×」とした。結果を表３に示す。
【００９５】
（実施例２）
ジエチルベンゼンの使用量を１０ｇに変更し、イソアミルアルコールの使用量を１４ｇに変更し、炭酸カルシウムの使用量を４．０ｇに変更した以外は多孔質ポリマ粒子１と同様にして、多孔質ポリマ粒子２を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子２を実施例１と同様の方法で処理することによって分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について実施例１と同様の評価を行った。
【００９６】
（実施例３）
イソアミルアルコールの使用量を１５ｇに変更し、更にヘキサノール４．５ｇを使用し、炭酸カルシウムの使用量を５．０ｇに変更した以外は多孔質ポリマ粒子１と同様にして、多孔質ポリマ粒子３を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子３を実施例１と同様の方法で処理することによって分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について実施例１と同様の評価を行った。
【００９７】
（比較例１）
ジビニルベンゼンの使用量を４ｇに変更し、更にジヒドロキシプロピルメタクリレート８ｇを使用し、炭酸カルシウムを使用しなかった以外は多孔質ポリマ粒子１と同様にして多孔質ポリマ粒子４を合成した。得られた多孔質ポリマ粒子４を実施例１と同様の方法でＤＥＡＥ変性処理のみを行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。実施例１におけるＤＥＡＥ変性前の分離材としては、多孔質ポリマ粒子４を用いて評価を行った。
【００９８】
（比較例２）
市販のアガロース粒子（Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ：ＧＥヘルスケア社製）を多孔質ポリマ粒子５として使用した。また、多孔質ポリマ粒子５をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に評価を行った。
【００９９】
（比較例３）
Ｓｐａｎ  ８０を追加して使用し、マイクロプロセスサーバーを使用しなかった以外は特開平１−２５４２４７号公報に記載の実施例１と同様にして、以下のように多孔質ポリマ粒子６を作製した。モノマとして２，３−ジヒドロキシプロピルメタクリレート１１．２ｇ、エチレングリコールジメタクリレート４．８ｇを用い、Ｓｐａｎ  ８０を５ｇ用いて多孔質ポリマ粒子６を合成した。洗浄後の多孔質ポリマ粒子６の４ｇをデキストラン（分子量１５万）１ｇ、水酸化ナトリウム０．６ｇ及び水素化ホウ素ナトリウム０．１５ｇを蒸留水に溶解させた溶液６ｇを加えて、多孔質ポリマ粒子６の細孔内に含浸させた。得られたデキストラン溶液含浸重合体を、１質量％エチルセルローストルエン溶液１Ｌに加えて撹拌し、分散、懸濁させた。得られた懸濁液中に、エピクロルヒドリン５ｍＬを加えて５０℃に昇温し、この温度で６時間撹拌して、重合体の細孔内に含浸されているデキストランを架橋反応させた。反応終了後、懸濁液をろ過して生成ゲル状物を液と分離し、トルエン、エタノール、蒸留水で順次洗浄し、分離材を得た。得られた多孔質ポリマ粒子６及び分離材について、実施例１と同様の評価を行った。
【０１００】
（比較例４）
炭酸カルシウムを使用しない点以外は多孔質ポリマ粒子１の粒子合成と同じ条件で多孔質ポリマ粒子７を合成し、実施例１と同様の処理を行って分離材を得た。多孔質ポリマ粒子及び分離材について実施例１と同様に評価を行った。
【０１０１】
【表１】
0006476887.tif 000002
【０１０２】
【表２】
0006476887.tif 000003
【０１０３】
【表３】
0006476887.tif 000004
【０１０４】
表２、３の結果から分かるとおり、細孔径の容積分布が多峰性であることにより、粒子内部での通液性が改善された。また、実施例の分離材では、粒子への非特異吸着が少なかった。さらに、実施例の分離材では、通液速度が８００ｃｍ／ｈでも高い動的吸着量を保つことが分かった。また、実施例の分離材では耐アルカリ性が改善され、動的吸着量がアルカリ処理前後で大きく変化しないことが分かった。
【図１】
0006476887.tif 000005