(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼのうち１以上の活性が除去されるか、あるいは低下された組換え微生物であって、前記組換え微生物は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼ及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼの活性が除去又は低下されていない親菌株と比較してＬ−アミノ酸生産能が向上されたものであり、前記組換え微生物は、大腸菌であり、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンを生産する能力を有し、前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンであり、配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼをコードする遺伝子のうち１以上が欠失されるか、あるいは破壊されている、前記組換え微生物。
【請求項２】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼの活性、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼの活性が除去されるか、あるいは低下された、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼをコードする遺伝子が欠失されるか、あるいは破壊された、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項４】
大腸菌ＣＡ０３−８２５４Ｐ（ＫＣＣＭ１１４９４Ｐ）である、請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項５】
請求項１に記載の組換え微生物を培養する段階と、
前記培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階と、
を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法であって、前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニン又はＬ−トリプトファンである、前記方法。
【請求項６】
前記組換え微生物において、配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼの活性、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼの活性が除去されるか、あるいは低下された、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換え微生物において、配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼをコードする遺伝子が欠失されるか、あるいは破壊された、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え微生物が大腸菌ＣＡ０３−８２５４Ｐ（ＫＣＣＭ１１４９４Ｐ）である、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上された微生物、及びそれを利用してＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ：adenosine-5’-triphosphate）は、高エネルギーリン酸結合を有し、ＡＤＰとリン酸とに加水分解されるとき、エネルギーが生産される。ＡＴＰは、全ての生きている生物体において、主要エネルギー源として使用される。ＡＴＰは、微生物内部において電子伝達系を利用する方法と、基質レベルリン酸化反応（substrate level phosphorylation）を介して主に作られる。作られたＡＴＰは、分解されながら、細胞で必要とするエネルギーを供給し、解糖経路（glycolysis）や酸化的リン酸化反応（oxidative phosphorylation）を介して再び再生される過程を経て再使用される。発酵を介して有用産物を生産する微生物は、生合成経路を強化させることにより、ＡＴＰのようなエネルギーの要求性が非常に大きくなると知られている。
【０００３】
そのために、本発明者らは、Ｌ−アミノ酸を生産するのに最大のエネルギー源として使用されるＡＴＰの細胞内比重を向上させ、Ｌ−アミノ酸生産に効果があることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明が解決しようとする課題は、微生物内ＡＴＰレベルを上昇させることにより、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上された組換え微生物を提供することである。
【０００５】
本発明が解決しようとする課題はまた、前記微生物を利用して、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一様相は、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）及びＡＭＰヌクレオシダーゼ（ＡＭＰ nucleosidase）のうち１以上の活性が除去されるか、あるいは低下された、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上された組換え微生物を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一様相による、アデノシンデアミナーゼ及びＡＭＰヌクレオシダーゼのうち１以上の活性が除去されるか、あるいは低下された微生物は、Ｌ−アミノ酸生産のために利用される。
【０００８】
本発明の他の様相による、Ｌ−アミノ酸生産用組成物、またはＬ−アミノ酸を生産する方法によれば、Ｌ−アミノ酸を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｌ−トレオニン生産菌株において、本発明による遺伝子欠損が及ぼすＡＴＰレベルに対する効果を示すグラフである。
【図２】Ｌ−トリプトファン生産菌株において、本発明による遺伝子欠損が及ぼすＡＴＰレベルに対する効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の一様相は、アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase）及びＡＭＰヌクレオシダーゼ（ＡＭＰ nucleosidase）のうち１以上の活性が除去されるか、あるいは低下された、Ｌ−アミノ酸の生産能が向上された組換え微生物を提供する。
【００１１】
本明細書で使用された用語「アデノシンデアミナーゼ（Ａｄｄ）」は、細胞質に存在する酵素であり、プリン代謝の一部を担当することができる。アデノシンデアミナーゼは、アデノシンの６番炭素に結合されたアミノ基を脱アミノさせ、イノシンとアンモニアとを生成するアデノシン＋Ｈ２Ｏ→イノシン＋ＮＨ３反応を触媒するものでもある。
【００１２】
前記アデノシンデアミナーゼのアミノ酸配列は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、それに制限されるものではない。前記アデノシンデアミナーゼは、具体的には、配列番号１４のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上のアミノ酸配列を含むものでもある。また、そのような相同性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列も、本発明の範囲内に含まれるということは、自明である。前記アデノシンデアミナーゼの配列は、前記配列番号１４のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記アデノシンデアミナーゼタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド配列は、ａｄｄ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３１２５７）と呼ばれ、例えば、配列番号１３のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が８０％以上、９０％以上または９５％以上のポリヌクレオチド配列を有することができる。また、そのような相同性を有する塩基配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれるということは、自明である。
【００１３】
用語「ＡＭＰヌクレオシダーゼ（Ａｍｎ：ＡＭＰnucleosidase）」は、加水分解酵素（hydrolase）に属する酵素にあり、特に、Ｎ−グリコシル化合物を加水分解するグリコシラーゼに属して、アデニレートヌクレオシダーゼ（adenylate nucleosidase）とも呼ばれる。前記ＡＭＰヌクレオシダーゼは、プリン代謝の一部を担当することができ、例えば、ＡＭＰ＋Ｈ２Ｏ⇔Ｄ−ribose ５−phosphate＋adenineの反応を触媒することができる。また、ＡＭＰヌクレオシダーゼを暗号化するａｍｎ遺伝子を不活性させれば、細胞内のＡＴＰレベルを上昇させることができる。
【００１４】
前記ＡＭＰヌクレオシダーゼのアミノ酸配列も、公知のデータベースから得ることができ、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、それに制限されるものではない。前記アデノシンデアミナーゼは、具体的には、配列番号１６のアミノ酸配列、またはそれと相同性が、例えば、８０％以上、９０％以上または９５％以上のアミノ酸配列を含むものでもある。また、そのような相同性を有するアミノ酸配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列も、本発明の範囲内に含まれるということは、自明である。前記ＡＭＰヌクレオシダーゼの配列は、前記配列番号１６のアミノ酸を暗号化するポリヌクレオチド配列を含んでもよい。前記ＡＭＰヌクレオシダーゼタンパク質を暗号化するポリヌクレオチド配列は、ａｍｎ遺伝子（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１２９３１４０７）と呼ばれ、例えば、配列番号１５のポリヌクレオチド配列、またはそれと相同性が８０％以上、９０％以上または９５％以上のポリヌクレオチド配列を有することができる。また、そのような相同性を有する塩基配列であるならば、一部配列が欠失、変形、置換または付加された塩基配列も、本発明の範囲内に含まれるということは、自明である。
【００１５】
本発明において、前記相同性は、タンパク質をコーディングする遺伝子の塩基配列やアミノ酸配列の類似程度を意味するが、相同性が十分に高い場合、当該遺伝子の発現産物は、同一であるか、あるいは類似した活性を有することができる。
【００１６】
本発明において、前記アデノシンデアミナーゼまたは前記ＡＭＰヌクレオシダーゼの活性が除去されるか、あるいは低下された微生物は、Ｌ−アミノ酸生産用途に使用される。本発明のＬ−アミノ酸の生産能が向上された組換え微生物は、アデノシンデアミナーゼまたはＡＭＰヌクレオシダーゼの活性が、それぞれのうち一つ、またはいずれも除去または低下され、例えば、それら２つのタンパク質活性がいずれも除去されるか、あるいは低下されたものでもある。前記微生物は、アデノシンデアミナーゼまたは前記ＡＭＰヌクレオシダーゼの活性が除去または低下されることにより、活性の除去または低下の前より、Ｌ−アミノ酸の生産能にさらにすぐれる。
【００１７】
用語「Ｌ−アミノ酸」は、一般的に、アミノ基とカルボン酸基とが同一炭素原子に結合されている生物の本体を構成するタンパク質の基本構成単位を意味する。例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンでもある。
【００１８】
用語「組換え微生物（recombinant microorganism）」は、遺伝的に操作された微生物でもある。遺伝工学によって製造された微生物、例えば、遺伝工学方法によって微生物内に外因性（exogenous）核酸が導入されるか、あるいは、微生物の内因性（endogenous）遺伝子の配列または位置が変形されたものでもある。
【００１９】
本明細書で使用された用語である、酵素またはポリペプチドの「活性の除去」は、微生物中の言及されたタンパク質が全く発現されないか、あるいは発現されたとしても、全く活性を有さないということを意味する。用語「活性の低下」は、言及されたタンパク質の活性が、内在的活性に比べて弱化されたということを意味する。前記活性の除去または低下は、「不活性」または「活性の弱化」の用語で代替して使用することができる。用語「内在的活性」とは、微生物が天然の状態、すなわち、微生物が本来有していた、遺伝子組み換えを経ないタンパク質の活性を意味する。
【００２０】
前記アデノシンデアミナーゼまたは前記ＡＭＰヌクレオシダーゼの活性の除去または低下は、前記タンパク質を暗号化する各遺伝子の除去または変形によるものでもある。前記「遺伝子の除去または変形」は、遺伝子が発現されないか、または発現量が減少されるか、あるいは発現されたとしても、酵素活性を示さないか、または活性が低下されるように、遺伝子の一部または全部が、またはそのプローモーター領域、そのターミネーター領域などの調節因子の一部または全部が、変異、置換、削除されるか、あるいは遺伝子に１以上の塩基が挿入されることをいう。前記遺伝子の除去または破壊は、相同組換えのような遺伝子組み換え、突然変異誘発、分子進化を介して達成される。細胞が複数個の同じ遺伝子を含むか、あるいは２個以上の異なるポリペプチド同種相同遺伝子（paralog）を含む場合、１またはそれ以上の遺伝子が除去または破壊される。一具体例においては、アデノシンデアミナーゼを暗号化するａｄｄ遺伝子、またはＡＭＰヌクレオシダーゼを暗号化するａｍｎ遺伝子を相同性組換え（homologous recombination）によって、微生物の遺伝体から除去するか、あるいは開始コドンを変形させることができる。
【００２１】
本発明の「Ｌ−アミノ酸の生産能が向上された組換え微生物」は、培地中の炭素源からＬ−アミノ酸を生産して蓄積させることができる微生物でもある。前記微生物は、アデノシンデアミナーゼ活性またはＡＭＰヌクレオシダーゼ活性をそれぞれのうち一つ、またはいずれも低下させるか、あるいは除去することにより、それら酵素の活性変形以前よりも高い生産性でもってＬ−アミノ酸を生産することができる。本発明の一具体例では、前記酵素を不活性化させたトレオニン生産菌株及びトリプトファン菌株のいずれもが、親菌株対比で、それぞれトレオニン及びトリプトファンの生産能が向上された。
【００２２】
前記組換え微生物は、エシェリキア（escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、オウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物でもある。例えば、エシェリキア属に属する微生物でもある。前記エシェリキア属微生物は、大腸菌（Escherichia coli）でもあり、例えば、大腸菌ＫＣＣＭ００００Ｐでもある。前記大腸菌ＫＣＣＭ００００Ｐは、トレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０９１０Ｐを親菌株にして、ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子をいずれも欠損させた菌株（ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔａｄｄΔａｍｎ）であり、親菌株よりトレオニンの生産が増加するということを確認した。
【００２３】
前記菌株を「ＣＡ０３−８２５４Ｐ」と命名した後、ブダペスト条約下で、２０１３年１２月９日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、寄託番号ＫＣＣＭ１１４９４Ｐを受けた。
【００２４】
他の様相は、前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物を含むＬ−アミノ酸生産用組成物を提供する。用語「Ｌ−アミノ酸生産用組成物」は、前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物またはその培養物を利用して、代謝産物としてＬ−アミノ酸を生産することができる組成物を意味する。前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物については、前述の通りである。前記Ｌ−アミノ酸は、例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンでもある。用語「培養物」は、前記組換え微生物を含んだ培養原液でもあり、菌体を除去した培養上澄み液、または培養物の希釈液でもある。前記組成物は、Ｌ−アミノ酸の生産性を向上させるための成分を追加して含んでもよい。例えば、炭素源、窒素源、または微量の元素成分を含んでもよい。前記炭素源は、例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培養は、例えば、グルコースを炭素源にして行われる。前記窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆ミールのような有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記組成物は、リンの供給源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム含有塩、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが培地に含まれてもよい。
【００２５】
他の様相は、前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物を培養する段階と、培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階と、を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法を提供する。
【００２６】
前記Ｌ−アミノ酸を生産する組換え微生物については、前述の通りである。
【００２７】
前記Ｌ−アミノ酸は、例えば、例えば、Ｌ−ロイシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニンから構成された群から選択され、例えば、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンでもある。前記培養は、当業界に知られた適当な培地及び培養条件によっても行われる。当業者であるならば、選択される微生物によって、培地及び培養条件を容易に調整して使用することができるであろう。培養方法は、回分式、連続式、流加式、またはそれらの組み合わせ培養を含んでもよい。
【００２８】
前記培地は、多様な炭素源、窒素源及び微量元素成分を含んでもよい。
【００２９】
前記炭素源は、例えば、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖、マルトース、澱粉、セルロースのような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ココナッツ油のような脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール及びエタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸；またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培養は、グルコースを炭素源にして行われる。前記窒素源は、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液（ＣＳＬ）及び大豆ミールのような有機窒素源；及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムのような無機窒素源；またはそれらの組み合わせを含んでもよい。前記培地は、リンの供給源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、及び相応するナトリウム含有塩、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、アミノ酸、ビタミン及び適切な前駆体などが培地に含まれてもよい。前記培地または個別成分は、培養液に回分式または連続式によって添加される。
【００３０】
また、培養中に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用し、気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に、酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）を注入することができる。培養液の温度は、一般的に、２０℃ないし４５℃、例えば、２５℃ないし４０℃でもある。培養期間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで持続され、例えば、１０ないし１６０時間でもある。
【００３１】
前記培養物からＬ−アミノ酸を回収する方法は、培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式の培養方法などにより、当該分野に公知の適する方法を利用して、培養物から生産されたＬ−アミノ酸を収集または回収することができる。
【００３２】
本発明は例えば以下の実施形態を包含する：
１．配列番号１４のアミノ酸配列を含むアデノシンデアミナーゼ、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＭＰヌクレオシダーゼのうち１以上の活性が除去されるか、あるいは低下された、Ｌ−アミノ酸生産能が向上された組換え微生物。
２．前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
３．前記組換え微生物は、エシェリキア属微生物であることを特徴とする、請求項１に記載の組換え微生物。
４．前記組換え微生物は、大腸菌であることを特徴とする、請求項３に記載の組換え微生物。
５．請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養する段階と、
前記培養物からＬ−アミノ酸を回収する段階と、
を含む、Ｌ−アミノ酸を生産する方法。
６．前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−トリプトファンであることを特徴とする、請求項５に記載のＬ−アミノ酸を生産する方法。
以下、本発明について、実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００３３】
実施例１．ａｄｄ遺伝子またはａｍｎ遺伝子によってコーディングされるタンパク質の活性が弱化されたＬ−トレオニン生産菌株、及びＬ−トリプトファン生産菌株の作製
Ｌ−トレオニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０９１０Ｐ（韓国公開特許公報第２００９−００７６３８９号）及びＫＣＣＭ−１０１３２（韓国公開特許公報第２０００−００１３８５３号）と、Ｌ−トリプトファン生産菌株であるＫＣＣＭ１０８１２Ｐ（大韓民国登録特許第１０−０７９２０９５号）菌株とのＡｄｄ、Ａｍｎを暗号化する各遺伝子を、相同組換えによってそれぞれ欠損させた。欠損対象遺伝子であるａｄｄ及びａｍｎは、それぞれ配列番号１３，１５の塩基配列を示す。
【００３４】
具体的には、Datsenko ＫＡらが開発したラムダレッド組換え酵素（lambda Red recombinase）を利用した突然変異作製技法である１段階欠損（one step inactivation）方法を使用した（Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645）。遺伝子内部への挿入を確認するためのマーカーとしては、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣのクロラムフェニコール遺伝子を使用した（韓国公開特許公報第２００９−００７５５４号）。前記２遺伝子の一部分、及びｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣ遺伝子のクロラムフェニコール（chloramphenicol）耐性遺伝子の一部の塩基配列を有する配列番号１及び２、配列番号７及び８のプライマーをそれぞれ利用して、ｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＣをテンプレートにして、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間重合する条件を３０回反復する重合酵素連鎖反応法（以下、「ＰＣＲ」法）によって、約１，２００塩基対の遺伝子断片を増幅した。
【００３５】
ＰＣＲ増幅を介して得られたＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲル電気泳動後に溶離し、二次ＰＣＲのテンプレートとして使用した。二次ＰＣＲは、一次ＤＮＡ断片の５’領域及び３’領域の２０対の相補的塩基配列を有するようにし、前記遺伝子の５’領域及び３’領域を加えた配列番号３及び４、配列番号９及び１０のプライマーをそれぞれ利用して溶離された一次ＰＣＲ産物をテンプレートとして、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間重合する条件を３０回反復するＰＣＲ方法によって、約１，３００塩基対の遺伝子断片４種を増幅した。前記過程を経て得られたＤＮＡ断片は、０．８％アガロースゲル電気泳動後に溶離し、組換えに使用した。
【００３６】
Datsenko ＫＡらが開発した方法（Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97: 6640-6645）によって、ｐＫＤ４６で形質転換された対象大腸菌を、コンピテントな状態に製造した後、ＰＣＲ法で得られた前記１，３００塩基対サイズの遺伝子断片を流入させて形質転換を行った。得られた菌株は、クロラムフェニコール耐性を有しているＬＢで選別した。それは、配列番号５及び６、配列番号１１及び１２のプライマーを利用したＰＣＲを介して増幅された大きさが、それぞれ約１，４４０と２，１０４との塩基対を確認し、前記遺伝子が欠損されたということを確認した。
【００３７】
クロラムフェニコール耐性を有した一次組換え菌株は、ｐＫＤ４６を除去した後、ｐＪＷ１６８を導入し、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を菌体から除去する（Gene, (2000) 247, 255-264）。最終的に得られた菌体は、配列番号５及び６のプライマーと、配列番号１１及び１２のプライマーとを利用したＰＣＲを介して得られた約３４０と１，００４との塩基対の増幅産物であり、意図通りにそれぞれの遺伝子欠損がなされていることをを確認した。
【００３８】
前記と同一方法で、ａｄｄ遺伝子が欠損された菌株において、ａｍｎ遺伝子欠損を進め、前述の配列番号５及び６プライマーと、配列番号１１及び１２のプライマーとを利用して、２種類の遺伝子が重複欠損されたということを確認した。
【００３９】
前記方法で、Ｌ−トレオニン生産菌株ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔａｄｄ，ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔａｍｎ，ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔａｄｄΔａｍｎ，ＫＣＣＭ−１０１３２Δａｄｄ，ＫＣＣＭ−１０１３２Δａｍｎ，ＫＣＣＭ−１０１３２ΔａｄｄΔａｍｎの菌株を含んだ６種の菌株を作製した。また、Ｌ−トリプトファン生産菌株ＫＣＣＭ１０８１２ＰΔａｄｄ，ＫＣＣＭ１０８１２ＰΔａｍｎ，ＫＣＣＭ１０８１２ＰΔａｄｄΔａｍｎ菌株３種を作製した。
【００４０】
実施例２．作製されたＬ−トレオニン生産菌株及びＬ−トリプトファン生産菌株のＡＴＰレベル測定
前記実施例１で作製された菌株を利用して、実際ＡＴＰを定量するために、Kiyotaka Ｙらか開発したルシフェラーゼ（luciferase）を利用した「細胞ＡＴＰ合成能の定量測定方法（An Efficient Method for Quantitative Determination of Cellular ATP Synthetic Activity）を利用した（J Biom Scre, (2006) V11: No. 3: pp. 310-17）。グルコースが含まれたＬＢ液体培地で、実施例１で作製された、それぞれ異なる遺伝的形質を有した菌株を一晩培養した。遠心分離で上澄み液を除去した後、１００ｍＭ Tris−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を利用して菌体を洗浄した後、ＰＢ緩衝液（permeable buffer：４０％［ｖ／ｖ］glucose、０．８％［ｖ／ｖ］Triton Ｘ−１００）を３０分間処理し、細胞内のＡＴＰを外に染み出させた。再び遠心分離し、上澄み液を分離し、それを、ルシフェラーゼの基質に利用されるルシフェリン（luciferin）と混合した。１０分間反応させた後、ルミノメータを利用して、ルシフェラーゼの発色程度を測定し、ＡＴＰを定量した。結果は、図１及び図２に示されている。全ての結果は、３回反復実験の平均値を使用した。
【００４１】
図１及び図２から分かるように、欠損前の親菌株であるＬ−トレオニン生産菌株及びＬ−トリプトファン生産菌株と比較するとき、実施例１によって作製された菌株は、いずれもＡＴＰレベルが上昇したということを確認した。また、単独欠損より、ａｄｄ遺伝子とａｍｎ遺伝子との欠損組み合わせのＡＴＰレベルがさらに上昇するという結果を得た。
【００４２】
実施例３．グルコース含有培地での、大腸菌ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子によって暗号化されるタンパク質の活性弱化されたＬ−トレオニン生産菌株の効果確認
実施例１で作製したＬ−トレオニン生産菌であるＫＣＣＭ１０９１０Ｐに、ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子をそれぞれ単独欠損及び重複欠損を介して、細胞内のＡＴＰを増加させた菌株を対象に、グルコースを炭素源として使用して力価評価を進めた。
【００４３】
それぞれ異なる遺伝的形質を有した菌株を、３３℃培養基で、ＬＢ固体培地で一晩培養した後、表１の組成のようにグルコースが含有された２５ｍＬの力価培地に、１白金耳ずつ接種した後、それを３３℃、２００ｒｐｍの培養基で５０時間培養し、その結果を表２に示した。全ての結果は、３個のフラスコ結果の平均値を使用した。
【００４４】
【表１】
0006494643.tif 000002
【００４５】
【表２】
0006494643.tif 000003
【００４６】
表２から分かるように、本発明による遺伝子の欠損時、グルコース利用度が、親菌株対比で約１８．８％まで上昇し、トレオニンの生産量は、親菌株対比で約６．６％まで上昇するということを確認することができた。そのような結果は、図１で確認したＡＴＰレベルを考慮するとき、増加されたＡＴＰを介して菌株の活性が上昇し、（glucose consumption）速度やアミノ酸生産能も上昇したといえる。
【００４７】
そのように、糖消費速度及びトレオニン生産能が上昇した前記形質転換された大腸菌ＫＣＣＭ１０９１０ＰΔａｄｄΔａｍｎを、「ＣＡ０３−８２５４Ｐ」と命名した（寄託番号ＫＣＣＭ１１４９４Ｐで、２０１３年１２月９日に、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託）。
【００４８】
実施例４．グルコース含有培地での、大腸菌ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子によって暗号化されるタンパク質の活性が弱化されたＬ−トレオニン生産菌株の効果確認
実施例１で作製したＬ−トレオニン生産菌である親菌株ＫＣＣＭ−１０１３２に、ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子をそれぞれ単独欠損及び重複欠損を介して、細胞内のＡＴＰを増加させた菌株を対象に、グルコースを炭素源として使用して力価評価を進めた。
【００４９】
それぞれ異なる遺伝的形質を有した菌株を、３３℃培養器で、ＬＢ固体培地で、一晩培養した後、表１の組成のように、グルコースが含有された２５ｍＬの力価培地に、一白金耳ずつ接種した後、それを３３℃、２００ｒｐｍの培養器で５０時間培養し、その結果を表３に示した。全ての結果は、３個のフラスコ結果の平均値を使用した。
【００５０】
【表３】
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【００５１】
表３から分かるように、本発明で提示した遺伝子の欠損時、グルコース利用度が親菌株対比で約１３％まで上昇し、トレオニンの生産量は、親菌株対比で約６．４％まで上昇するということを確認することができた。
【００５２】
実施例５．グルコース含有培地での、大腸菌ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子によって暗号化されるタンパク質の活性が弱化されたＬ−トリプトファン生産菌株の効果確認
実施例１で作製されたトリプトファン生産菌であるＫＣＣＭ１０８１２Ｐに、ａｄｄ遺伝子及びａｍｎ遺伝子をそれぞれ単独欠損または組み合わせでもって、欠損を介して細胞内のＡＴＰを増加させた菌株を対象に、グルコースを炭素源として力価評価を進めた。
【００５３】
力価評価のために、菌体を白金耳で接種した後、ＬＢ固体培地で一晩培養し、表４でのような組成を有する２５ｍｌのフラスコ力価培地に１白金耳ずつ接種した。菌株接種後、３７℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、そこから得られた結果を表５に示した。全ての結果は、３個のフラスコ結果の平均値を使用した。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
【表５】
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【００５６】
表５に示されているように、本発明で提示した遺伝子の欠損時、糖消費速度が親菌株対比で１０％まで改善するということを確認し、トリプトファン生産量は、親菌株対比で２６．６％まで上昇するという結果を得た。その結果は、図２で確認したＡＴＰレベルを考慮するとき、増加されたＡＴＰを介して菌株の活性が上昇し、糖消費速度やアミノ酸生産能も上昇したといえる。
【００５７】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であるならば、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更せずとも、他の具体的な形態でもって実施されるということを理解することができるであろう。それと係わって、以上で記述された実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないということを理解しなければならない。本発明の範囲は、前述の詳細な説明よりは、特許請求の範囲の意味、範囲及びその等価概念から導き出される全ての変更、または変形された形態が、本発明の範囲に含まれるものであると解釈されなければならない。
【受託番号】
【００５８】
寄託機関人：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１４９４Ｐ
受託日付け：２０１３１２０９
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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