(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザウイルスを検出するための方法であって、
(a)試料を、インフルエンザウイルスA型又はインフルエンザウイルスB型を検出するためのイムノアッセイに適合させたイムノアッセイ緩衝液と接触させ、それによりイムノアッセイ検査試料を得る工程;
(b)前記イムノアッセイ検査試料の第一の部分について、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査を実施し、それにより前記試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出する工程;
(c)前記イムノアッセイ検査試料の第二の部分を、イムノアッセイ検査試料をノイラミニダーゼアッセイ検査試料に変換するためのノイラミニダーゼアッセイ緩衝液を含む交換マトリックスと接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得る工程;及び
(d)前記ノイラミニダーゼ検査試料についてノイラミニダーゼアッセイを実施し、それにより前記試料中のノイラミニダーゼ活性を検出する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記イムノアッセイ緩衝液が、ノイラミニダーゼ活性のためのアッセイに適合性ではない、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記イムノアッセイ緩衝液が、ノイラミニダーゼ活性を阻害する、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
工程(c)及び(d)が、同一の容器内で実施され、前記容器が、複数のチャンバを備え、前記容器が、前記交換マトリックスを含むチャンバ、及び前記ノイラミニダーゼアッセイ用の試薬を含むチャンバを備える、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記交換マトリックスが、架橋多糖を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
インフルエンザウイルスを検出するための方法であって、
(a)試料を、ノイラミニダーゼアッセイに適合させたノイラミニダーゼアッセイ緩衝液と接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得る工程;
(b)前記ノイラミニダーゼ検査試料の第一の部分について、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査を実施する工程であって、ここで、前記ノイラミニダーゼ検査試料は、ノイラミニダーゼアッセイ検査試料をイムノアッセイ検査試料に変換するためのイムノアッセイ緩衝液を含む検査マトリックスと接触し、それによりイムノアッセイ検査試料を得て、前記試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出する、工程;並びに
(c)前記ノイラミニダーゼ検査試料の第二の部分についてノイラミニダーゼアッセイを実施し、それにより前記試料中のノイラミニダーゼ活性を検出する工程
を含む、方法。
【請求項７】
前記ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液が、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイに適合性ではない、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液が、インフルエンザA型及びインフルエンザB型からなる群から選択される抗原に対する抗体の特異的結合を阻害する、請求項6又は7に記載の方法。
【請求項９】
前記検査マトリックスが、凍結乾燥又はドライダウンされたイムノアッセイ緩衝液を含む、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程(c)が、複数のチャンバを備える容器内で実施される、請求項6から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記容器が、光電子増倍管又はマイクロ光電子増倍管を用いて読取られるように適合させたマルチウェルカートリッジ又はストリップを備え、ノイラミニダーゼ活性のレベルが、光電子増倍管を用いて測定される、請求項4または10に記載の方法。
【請求項１２】
前記ノイラミニダーゼアッセイが、試験化合物に対するノイラミニダーゼの感受性を決定する工程を含み、前記ノイラミニダーゼアッセイが、(a)阻害値比を得る工程であって、ここで、前記比は、試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、前記試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む、工程;及び、(b)前記阻害値比を阻害閾値と比較し、それにより前記試験化合物に対する前記ノイラミニダーゼ活性の感受性を決定する工程を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害閾値が、A型又はB型ウイルスの検出により決定され、第一の阻害閾値が、A型ウイルスが検出された場合に用いられ、第二の阻害閾値が、B型ウイルスが検出された場合に用いられる、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の閾値が、前記第二の閾値より低い、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害閾値が、前記試験化合物により決定され、前記試験化合物が、抗ウイルス薬である、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
インフルエンザを処置するための前記試験化合物を選択する工程をさらに含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ノイラミニダーゼアッセイが、シグナル伝達酵素を含む二重酵素アッセイを含み、ノイラミニダーゼ活性が、前記シグナル伝達酵素に対する基質又は前記シグナル伝達酵素に対する阻害剤を生成する、請求項12から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ノイラミニダーゼアッセイが、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンとのコンジュゲート、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンとのコンジュゲートの誘導体、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン、又は、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトンの誘導体から選択される試薬を含む、請求項12から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記シグナル伝達酵素が、ルシフェラーゼを含む、請求項17または18に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験化合物が、オセルタミビル、ザナミビル、ラニナミビル、及びペラミビルからなる群から選択される抗ウイルス薬である、請求項12から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
インフルエンザウイルスを検出するための診断システムであって、
試料中のノイラミニダーゼ活性を決定するためのカートリッジであって、前記カートリッジが、前記決定用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、前記決定用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている、カートリッジ;
前記試料中のインフルエンザA型又はB型を検出するための検査ストリップであって、前記検査ストリップが、前記検出用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、前記検出用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている、検査ストリップ;
前記検査ストリップからのシグナルを測定するように構成されている第一の検出器;及び
前記カートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第二の検出器
を含む、診断システム。
【請求項２２】
前記カートリッジが、前記決定用の前記適合性の緩衝液を含むカートリッジマトリックスを含むマトリックスチャンバ、及び、ノイラミニダーゼ活性の決定用の試薬を含む試薬チャンバを備え、前記カートリッジマトリックスが、架橋多糖を含み、前記マトリックスチャンバ及びカートリッジチャンバが、前記マトリックスチャンバに入れられた試料が前記マトリックスチャンバから前記試薬チャンバへ流動するように流体連結されている、請求項21に記載のシステム。
【請求項２３】
前記カートリッジが、光電子増倍管又はマイクロ光電子増倍管を用いて読取られるように適合させたマルチウェルカートリッジを備える、請求項21または22に記載のシステム。
【請求項２４】
前記検査ストリップが、イムノアッセイを実施するように構成されている、請求項21から23のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２５】
インフルエンザウイルスを検出するためのキットであって:
試料中のノイラミニダーゼ活性を決定するためのカートリッジであって、前記カートリッジが、前記決定用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、前記決定用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている、カートリッジ;及び
前記試料中のインフルエンザA型又はB型を検出するための検査ストリップであって、前記検査ストリップが、前記検出用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、前記検出用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている、検査ストリップ、
を含む、キット。
【請求項２６】
前記カートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第一の検出器;及び
前記カートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第二の検出器
をさらに含む、請求項25に記載のキット。
【請求項２７】
ノイラミニダーゼ活性アッセイ用の試薬をさらに含む、請求項25又は26に記載のキット。
【請求項２８】
前記ノイラミニダーゼ活性アッセイ試薬が、ルシフェラーゼ、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンとのコンジュゲート、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンとのコンジュゲートの誘導体、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトンの誘導体、及び抗ウイルス薬からなる群から選択される、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】
前記抗ウイルス薬が、オセルタミビル、ザナミビル、ラニナミビル、及びペラミビルからなる群から選択される、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
イムノアッセイ用の試薬をさらに含む、請求項25から29のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記イムノアッセイ試薬が、インフルエンザA型抗原に特異的である抗体、及びインフルエンザB型抗原に特異的である抗体からなる群から選択される、請求項30に記載のキット。
【請求項３２】
前記N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトンとのコンジュゲート、又は前記N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトンとのコンジュゲートの誘導体が、式(I)：
【化１】
0006591398.tif 000027
（式中:
R1、R2及びR3は、各々独立して、水素又はC1〜5アルキルであり;
nは、0、1、2、又は3であり;
R4は、-(CH2)mC(=O)CF3であり;
mは、0又は1であり;
Xは、-S(O)z-又は-CH(R5)-であり;
R5は、-S(O)zCH3であり;
zは、0、1又は2である）
の構造を有する、二重酵素インフルエンザノイラミニダーゼ感受性アッセイに使用するためのマスクされた阻害剤化合物を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記式(I)の化合物が、
【化２】
0006591398.tif 000028
【化３】
0006591398.tif 000029
及び
【化４】
0006591398.tif 000030
からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトンとのコンジュゲート、又は前記N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトンとのコンジュゲートの誘導体が、式(I)：
【化５】
0006591398.tif 000031
（式中:
R1、R2及びR3は、各々独立して、水素又はC1〜5アルキルであり;
nは、0、1、2、又は3であり;
R4は、-(CH2)mC(=O)CF3であり;
mは、0又は1であり;
Xは、-S(O)z-又は-CH(R5)-であり;
R5は、-S(O)zCH3であり;
zは、0、1又は2である）
の構造を有する、二重酵素インフルエンザノイラミニダーゼ感受性アッセイに使用するためのマスクされた阻害剤化合物を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３５】
前記式(I)の化合物が、
【化６】
0006591398.tif 000032
【化７】
0006591398.tif 000033
及び
【化８】
0006591398.tif 000034
からなる群から選択される、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、2013年4月1日に出願され、表題名「Point Of Care (POC) Influenza Antiviral Susceptibility Test」の米国仮特許出願第61/807,185号の利益を主張するものである。
【０００２】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、インフルエンザのポイントオブケア検査のための方法、組成物、装置、及びシステムに関する。いくつかの実施形態は、組み合わせたアッセイに関する。いくつかの実施形態において、インフルエンザA型又はインフルエンザB型を同定するためのアッセイは、抗ウイルス薬に対するインフルエンザノイラミニダーゼの感受性を決定するためのアッセイと組み合わされている。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザは、定期的に繰り返され、公衆衛生にとって深刻な脅威である。毎年、米国で、インフルエンザに関連する疾病がおよそ200,000件の入院及び36,000件の死亡に至っている。国の影響見通しから、2010年のインフルエンザからの総経済コストは、$290億と推定された。インフルエンザに対する抗ウイルス療法は、時宜を得た方法で、処置として施されるか又は予防として施される場合は効果的である。いくつかの研究は、ノイラミニダーゼ薬物は症状持続期間を減縮すると結論付けている。タミフル及びリレンザは、季節性インフルエンザに対する予防において、両方共80%有効である。インフルエンザに罹患している患者を処置する場合は、症状の48時間内に患者を治療し始めることが推奨され、遅延は短ければ短いほど良い。迅速な診断及び抗ウイルス療法の開始により、患者の最良の結果に至る。
【０００４】
M2チャネル遮断薬に対する広範な耐性に基づくと、ノイラミニダーゼ阻害剤の広範な使用は、最終的に季節性又は世界的流行のインフルエンザウイルスにおける耐性の出現を引き起こしうると推測することは不合理ではない。多くのノイラミニダーゼ阻害剤耐性変異が、臨床研究中に同定されている。3年間の調査期間中に、オセルタミビルに対する感性における10倍超の減少を伴う8つのウイルス変異体が単離された。これらの所見により、季節性インフルエンザへの対応のためのノイラミニダーゼ阻害剤ベースの薬物の大量流通を考慮する休止をするべきだ。2007年〜2008年冬期中の伝染性のオセルタミビル耐性インフルエンザウイルスの出現、並びにHSN1におけるオセルタミビル耐性の検出及びインフルエンザHlNlの世界的流行(2009)の後で、2010年にWHOは、抗ウイルス薬耐性に関する第1回世界協議を香港で開催した。この協議からの主要な結果は、臨床背景におけるか又は国の調査の一部としてのいずれかで、インフルエンザに対する抗ウイルス薬耐性の公式の状況報告の要請であった。さらに、オセルタミビルのようないくつかの抗ウイルス薬は、有害事象を起こし、必要な場合に処方することのみが重要となる。さまざまな抗ウイルス薬に関する適用範囲が医療提供者によって異なり、かつ患者に対して異なった費用がありうる。医師は、必要とされるものを処方することのみに責任を負う。費用は効果に次ぐ二次的なものである一方、患者がより安価な薬物で切り抜けられる場合は、医師には患者にその選択肢を知らせる義務がある。従って、有害事象を回避し、薬物耐性の進化を遅らせ、かつ患者及び米国医療制度を省力化するために特異性株の診断を提供しうる、ポイントオブケア検査に関する未だ対処されていない必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US 5,998,221
【特許文献２】US 6,194,220
【特許文献３】米国特許第4,904,583号
【特許文献４】米国特許第4,835,099号
【特許文献５】米国特許第6,267,722号
【特許文献６】米国特許第6,394,952号
【特許文献７】米国特許第6,867,051号
【特許文献８】米国特許第8,221,976号
【特許文献９】米国特許第8,163,237号
【特許文献１０】米国特許第7,947,820号
【特許文献１１】米国特許第7,642,060号
【特許文献１２】米国特許第7,291,488号
【特許文献１３】米国特許第5,736,365号
【特許文献１４】米国特許第5,639,428号
【特許文献１５】米国特許第5,561,044号
【特許文献１６】米国特許第5,518,884号
【特許文献１７】米国特許第5,470,723号
【特許文献１８】米国特許第5,457,027号
【特許文献１９】米国特許第5,314,801号
【特許文献２０】米国特許第5,017,473号
【特許文献２１】米国特許第4,810,631号
【特許文献２２】U.S. 4,590,169
【特許文献２３】米国特許第6,303,764号
【特許文献２４】米国特許第6,420,552号
【特許文献２５】米国特許第6,680,054号
【特許文献２６】米国特許第7,893,272号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Mizeら、Dual Enzyme Cascade、Analytical Chemistry、179、(1989)、229〜235頁
【非特許文献２】ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY、2008年9月、3284〜3292頁、Vol.52、No.9
【非特許文献３】ACS Nano、2009、3(10)、2859〜2869頁
【非特許文献４】Mckimm-Breschkin(2012):Influenza neuraminidase inhibitors:Antiviral action and mechanisms of resistance. Influenza and other Respiratory Viruses 7(補遺1)、25〜36頁
【非特許文献５】Wathen M、Barro M、Bright R、(2012)Antivirals in seasonal and pandemic influenza-future perspectives。Influenza and Other Respiratory Viruses 7 (補遺)、76〜80頁
【非特許文献６】Peciら、Community-acquired respiratory viruses and co-infection among patients of Ontario sentinel practices(2012)1750〜2659頁
【非特許文献７】Wangら、Influenza and Bacterial Pathogen Coinfections in the 20th Century、Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases、Volume 2011(2011)Article ID 146376
【非特許文献８】Shimasakiら、Rapid Diagnostics:the detection of neuraminidase activity as a technology for highspecificity targets、The Royal Society、(2001)356、1925〜1931頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で提供される方法、キット、システム、及び組成物のいくつかの実施形態は:(a)試料を、インフルエンザウイルスA型又はインフルエンザウイルスB型を検出するためのイムノアッセイに適合させたイムノアッセイ緩衝液と接触させ、それによりイムノアッセイ検査試料を得る工程;(b)イムノアッセイ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査と接触させ、それにより試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出する工程;(c)イムノアッセイ検査試料の第二の部分を、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液を含むマトリックスと接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得る工程;及び(d)ノイラミニダーゼ検査試料をノイラミニダーゼアッセイと接触させ、それにより試料中のノイラミニダーゼの存在を検出する工程を含む、インフルエンザウイルスを検出するための方法を含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性のためのアッセイに適合性ではない。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液はノイラミニダーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態において、工程(c)及び(d)は同一の容器内で実施される。
【０００８】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は:(a)試料を、ノイラミニダーゼアッセイに適合させたノイラミニダーゼアッセイ緩衝液と接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得る工程;(b)ノイラミニダーゼ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査と接触させる工程であって、ここで、ノイラミニダーゼ検査試料は、イムノアッセイ緩衝液を含むマトリックスと接触し、それによりイムノアッセイ検査試料の取得及び試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出する工程;並びに(c)ノイラミニダーゼ検査試料の第二部分と、ノイラミニダーゼアッセイとを接触させ、それにより試料中のノイラミニダーゼの存在を検出する工程を含む、インフルエンザウイルスを検出するための方法を含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液は、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイに適合性ではない。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液は、インフルエンザA型及びインフルエンザB型からなる群から選択される抗原に対する抗体の特異的結合を阻害する。いくつかの実施形態において、マトリックスは、凍結乾燥又はドライダウンされたイムノアッセイ緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、工程(c)は、複数のチャンバを備える容器内で実施される。
【０００９】
インフルエンザウイルスを検出するための方法のいくつかの実施形態において、容器は、複数のチャンバを備える。いくつかの実施形態において、容器は、マトリックスを含むチャンバ、及びノイラミニダーゼアッセイ用の試薬を含むチャンバを備える。いくつかの実施形態において、マトリックスは、架橋多糖を含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、セファデックス及びセファロースからなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイ検査試料及びノイラミニダーゼ検査試料は、重力、毛管作用、及び拡散から選択される1つ又は複数の力により容器内に移される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、容器は、カートリッジを備える。いくつかの実施形態において、容器は、光電子増倍管器を用いて読取られるように適合させたマルチウェルカートリッジを備える。いくつかの実施形態において、光電子増倍管器は、光電子増倍管及びマイクロ光電子増倍管からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、光電子増倍管器は、可搬式である。いくつかの実施形態において、光電子増倍管器は、プライマリケアの診療所に適する可搬式読取装置内にある。いくつかの実施形態において、光電子増倍管の表面は、円形であり直径約6mm〜9mmを有するか、又はマイクロ光電子増倍管は、長方形であり寸法約1mm〜3mmを有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、試験化合物に対するノイラミニダーゼの感受性を決定することを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは:(a)阻害値比を得る工程であって、ここで、該比は、試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む工程;及び(b)阻害値比を阻害閾値と比較し、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ活性の感受性を決定する工程を含む。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型又はB型ウイルスの検出により決定される。いくつかの実施形態において、第一の阻害閾値は、A型ウイルスが検出された場合に用いられ、第二の阻害閾値は、B型ウイルスが検出された場合に用いられる。いくつかの実施形態において、第一の閾値は、第二の閾値より低い。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、試験化合物により決定される。
【００１３】
いくつかの実施形態は、インフルエンザを処置するための試験化合物の選択も含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、シグナル伝達酵素を含む二重酵素アッセイを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する基質を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素のための阻害剤を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達酵素は、ルシフェラーゼを含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ルシフェラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性のレベルは、光電子増倍管を用いて測定される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、抗ウイルス薬である。いくつかの実施形態において、試験化合物は、オセルタミビル、ザナミビル、ラニナミビル、及びペラミビルからなる群から選択される抗ウイルス薬である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、試料は、対象から取得される。いくつかの実施形態において、対象は、インフルエンザ罹患の疑いがある。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【００１８】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は:(a)試料を、インフルエンザウイルスA型又はインフルエンザウイルスB型を検出するためのイムノアッセイに適合させたイムノアッセイ緩衝液と接触させ、それによりイムノアッセイ検査試料を得る工程;(b)イムノアッセイ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査と接触させ、それにより試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出する工程;(c)イムノアッセイ検査試料の第二部分を、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液を含むマトリックスとを接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料の得る工程;(d)ノイラミニダーゼ検査試料と、ノイラミニダーゼアッセイとを接触させ、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ検査試料のノイラミニダーゼの感受性を決定する工程であって、決定する工程は:(i)阻害値比を得る工程であって、ここで、該比は、1つ又は複数の試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、1つ又は複数の試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む工程、及び(ii)阻害値比を阻害閾値と比較し、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ活性の感受性を決定する工程を含む工程;並びに(e)ノイラミニダーゼ活性を阻害することが決定している1つ又は複数の試験化合物から試験化合物を選択する工程を含む、インフルエンザウイルスに関する処置を選択するための方法を含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性に関するアッセイに適合性ではない。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態において、工程(c)及び(d)は、同一の容器内で実施される。
【００１９】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は:(a)試料を、ノイラミニダーゼアッセイに適合させたノイラミニダーゼアッセイ緩衝液と接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得る工程;(b)ノイラミニダーゼ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査と接触させる工程であって、ここで、ノイラミニダーゼ検査試料は、イムノアッセイ緩衝液を含むマトリックスと接触し、それによりイムノアッセイ検査試料を得ること及び試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出する工程;並びに(c)ノイラミニダーゼ検査試料の第二の部分を、ノイラミニダーゼアッセイと接触させ、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ検査試料のノイラミニダーゼの感受性を決定する工程であって、決定する工程は:(i)阻害値比を得る工程であって、ここで、該比は、1つ又は複数の試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、1つ又は複数の試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む工程、及び(ii)阻害値比を阻害閾値と比較する工程であって、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ活性の感受性を決定する工程を含む工程;並びに(e)ノイラミニダーゼ活性を阻害することが決定している1つ又は複数の試験化合物から試験化合物を選択する工程を含む、インフルエンザウイルスに関する処置を選択するための方法を含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、凍結乾燥又はそうでなければドライダウンされたイムノアッセイ緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、工程(c)は、同一の容器内で実施される。いくつかの実施形態において、工程(c)は、複数のチャンバを備える容器内で実施される。
【００２０】
インフルエンザウイルスに関する処置を選択するための方法のいくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型又はB型ウイルスの検出により決定される。いくつかの実施形態において、第一の阻害閾値は、A型ウイルスが検出された場合に用いられ、第二阻害閾値は、B型ウイルスが検出された場合に用いられる。いくつかの実施形態において、第一閾値は、第二閾値より低い。
【００２１】
いくつかの実施形態において、容器は、光電子増倍管又はマイクロ光電子増倍管を用いて読取られるように適合させたマルチウェルストリップ又はカートリッジを備える。いくつかの実施形態において、光電子増倍管マイクロ光電子増倍管は、可搬式である。いくつかの実施形態において、光電子増倍管は、プライマリケアの診療所に適する可搬式読取装置内にある。いくつかの実施形態において、光電子増倍管の表面は、円形であり直径約6mm〜9mmを有するか、又はマイクロ光電子増倍管は、長方形であり寸法約1mm〜3mmを有する。
【００２２】
いくつかの方法は、インフルエンザを処置するための試験化合物を選択することも含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、シグナル伝達酵素を含む二重酵素アッセイを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する基質を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する阻害剤を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達酵素は、ルシフェラーゼを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性のレベルは、光電子増倍管を用いて測定される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、抗ウイルス薬である。いくつかの実施形態において、試験化合物は、オセルタミビル、ザナミビル、ラニナミビル、及びペラミビルからなる群から選択される抗ウイルス薬である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、試料は、対象から取得される。いくつかの実施形態において、対象は、インフルエンザ罹患の疑いがある。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象試料は、対象から取得され、対象はインフルエンザを処置するために選択された試験化合物を摂取するように勧められる。いくつかの実施形態において、対象試料は、対象から取得され、対象にはインフルエンザを処置するために選択された試験化合物が供給される。
【００２８】
いくつかの実施形態は、試料中のノイラミニダーゼ活性を決定するためのカートリッジであって、決定用の適合性緩衝液を含む試料を、決定用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されているカートリッジ;試料中のインフルエンザA型又はB型を検出するための検査であって、検出用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、検出用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている検査;検査からのシグナルを測定するように構成されている第一の検出器;及びカートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第二の検出器を含むインフルエンザウイルスを検出するための診断システムを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、カートリッジは、決定用の適合性の緩衝液を含むカートリッジマトリックスを含むマトリックスチャンバ、及びノイラミニダーゼ活性決定用の試薬を含む試薬チャンバを備える。いくつかの実施形態において、カートリッジマトリックスは、架橋多糖を含む。いくつかの実施形態において、カートリッジマトリックスは、セファデックス及びセファロースからなる群から選択される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、マトリックスチャンバ及びカートリッジチャンバは、マトリックスチャンバに入れられた試料が、マトリックスチャンバから試薬チャンバへ流動するように流体連結されている。いくつかの実施形態において、試料は、重力、毛管作用、及び拡散から選択される1つ又は複数の力によりカートリッジ内を流動する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、カートリッジは、光電子増倍管又はマイクロ光電子増倍管を用いて読取られるように適合させたマルチウェルカートリッジを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、検査は、イムノアッセイを含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイである。いくつかの実施形態において、検査は、検出用の適合性の緩衝液を含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、ニトロセルロースを含む。いくつかの実施形態において、検出用の適合性の緩衝液は、凍結乾燥又はドライダウンされている。
【００３３】
いくつかの実施形態において、第一の検出器は、ルミノメーターを備える。いくつかの実施形態において、第一の検出器は、反射率読取装置を備える。いくつかの実施形態において、第二の検出器は、光電子増倍管又はマイクロ光電子増倍管を備える。いくつかの実施形態において、装置は、第一及び第二の検出器を備える。いくつかの実施形態において、第一及び第二の検出器は、同一である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、装置は可搬式である。いくつかの実施形態において、装置は手持ち操作式である。
【００３５】
いくつかの実施形態は、試料中のノイラミニダーゼ活性を決定するためのカートリッジであって、決定用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、決定用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されているカートリッジ;及び試料中のインフルエンザA型又はB型を検出するための検査であって、検出用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、検出用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている検査を含む、インフルエンザウイルスを検出するためのキットを含む。いくつかの実施形態は、検査からのシグナルを測定するように構成されている第一の検出器;及びカートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第二の検出器を含む。いくつかの実施形態は、ノイラミニダーゼ活性アッセイ用の試薬を含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性アッセイ試薬は、ルシフェラーゼ、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリン又はその誘導体とのコンジュゲート、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン又はその誘導体とのコンジュゲート、及び抗ウイルス薬からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ウイルス薬は、オセルタミビル、ザナミビル、ラニナミビル、及びペラミビルからなる群から選択される。いくつかの実施形態は、イムノアッセイ用の試薬を含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ試薬は、インフルエンザA型抗原に特異的である抗体、及びインフルエンザB型抗原に特異的である抗体からなる群から選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態は、式(I)
【００３７】
【化１】
0006591398.tif 000002
【００３８】
(式中:R1、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素又はC1〜5アルキルであり;nは、0、1、2、又は3であり;R4は、-(CH2)mC(=O)CF3であり;mは、0又は1であり;Xは、-S(O)2-又は-CH(R5)-であり;R5は、-S(O)zCH3であり;zは、0、1又は2である)
の構造を有する、二重酵素インフルエンザノイラミニダーゼ感受性アッセイに使用するためのマスクされた阻害剤化合物を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、式(I)の化合物は、
【００４０】
【化２−１】
0006591398.tif 000003
【化２−２】
0006591398.tif 000004
【化２−３】
0006591398.tif 000005
【００４１】
からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】Veritor System(Becton Dickinson社)用のイムノアッセイ検査ストリップ及び読取装置の実施形態を示す図である。
【図２】ラテラルフローイムノアッセイ及び薬物感性アッセイを組み合わせたワークフローの実施形態を示す図である。
【図３】薬物感性アッセイにおけるシグナル比を決定するための実施形態を示す図である。
【図４】マスクされた阻害剤に関する合成の実施形態を示す図である。
【図５】動的フローノイラミニダーゼアッセイ用のカートリッジの実施形態を示す図である。
【図６】可搬式読取装置を用いて測定される蛍光性対照の発光量及び濃度のグラフである。
【図７】ノイラミニダーゼアッセイに関する発光量のグラフであり、処置のための最良のNAベースの抗ウイルス薬を選択するための二重酵素アッセイの能力を実証する。例中、リレンザがタミフルより優れている。
【図８】さまざまなA型インフルエンザウイルスのさまざまな希釈物に関する阻害値のグラフであり、インフルエンザB株に対する値と明確に異なる、インフルエンザA薬物耐性とインフルエンザA薬物感受性株とを識別するために用いられうる明確な阻害値が存在することを実証し、AST検査が、A/B分類を提供する従来のインフルエンザID検査の次に行われる場合、BDは、POC設定において判断を下す能力を有する。
【図９】さまざまなB型インフルエンザウイルスのさまざまな希釈物に関する阻害値のグラフであり、インフルエンザA株に対する値と明確に異なる、インフルエンザB薬物耐性とインフルエンザB薬物感受性株とを識別するために用いられうる明確な阻害値が存在することを実証し、AST検査が、A/B分類を提供する従来のインフルエンザID検査の次に行われる場合、BDは、POC設定において判断を下す能力を有する。
【図１０】ウイルス混合物のさまざまな希釈物に関する阻害値のグラフであり、それらが混合培養中に存在する場合、薬物耐性株の存在を報知するための、本明細書に記載される技術の能力を実証する。pH感受性NAを持つ薬物耐性インフルエンザを高度に報知することを立証された能力が、さらにより重要である。
【図１１】抗ウイルス薬感性試験のための二重酵素カスケードの実施形態において用いられる、例示的ノイラミニダーゼ基質、NANA-CF3(マスクされた阻害剤)及びトリフルオロケトン(遊離阻害剤)の化学構造を示す図である。
【図１２】マスクされた遊離阻害剤を伴う完全二重酵素カスケードの実施形態を示す図である。
【図１３】2つの異なる二重酵素アッセイのグラフであり、二重酵素検出化学物質を用いて達成されうる感受性の範囲を実証する。
【図１４】ストリップ上に事前に配置されたイムノアッセイヌクレオカプシド抽出試薬を含む、イムノアッセイラテラルフロー検査ストリップの実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本明細書で提供される方法、組成物、キット、装置及びシステムのいくつかの実施形態は、インフルエンザA型又はB型を同定し、抗ウイルス療法を指導することを可能にするポイントオブケア(POC)組み合わせ診断を含む。いくつかの実施形態において、可搬式プラットホームが、医療関係者により、制限された試験室スキルで操作可能でありうる。いくつかの実施形態は、いかなる細胞培養増幅も伴わず臨床単離物から直接の、抗ウイルス薬耐性株を検出するためのアッセイを用いたインフルエンザ検出に関するラテラルフロー技術を含む。
【００４４】
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、(1)試料中のA型又はB型インフルエンザウイルスの同定;及び(2)1つ又は複数の抗ウイルス薬に対するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの感受性に関して試料をアッセイする組み合わせアッセイを含む。通常、A型又はB型インフルエンザウイルスを同定するためのイムノアッセイにおける使用のために調製された試料は、ウイルスノイラミニダーゼ活性に関するアッセイにおける使用に適合性ではない。例えば、イムノアッセイにおける使用のための溶解緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性アッセイを阻害しうる。本明細書で提供される方法及び組成物の実施形態は、アッセイの1つに適合性の初期緩衝液中の単一試料からイムノアッセイ及びノイラミニダーゼ活性アッセイを用いるための方法を含む。そのようないくつかの実施形態は、インフルエンザの型に関する迅速な試験を提供し、処置のための抗ウイルス薬を選択するためのガイダンスを提供する。
【００４５】
さらに、本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、そのようなアッセイの感度を大いに高める。いくつかの実施形態において、試料中のインフルエンザの型を同定するためのアッセイは、アッセイの分析を有利に情報提供し、抗ウイルス薬に対するインフルエンザノイラミニダーゼの感受性又は耐性を決定する。いくつかの実施形態において、特定の抗ウイルス薬に対するA型又はB型ウイルスに関する阻害値閾値は、選択されえて、用いられて、ノイラミニダーゼが抗ウイルス薬に対して感受性であるか又は耐性であるかを決定するために用いられうる。
【００４６】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、患者にとってのより大きな利益のための、2つのアッセイの統合を含む。本明細書で提供される実施形態は、インフルエンザIDアッセイの感度を飛躍的に改善する。さらに、両方のアッセイは、同容量の検体を用いて実施されうる。いくつかの実施形態において、初期のイムノアッセイ及びそのようなアッセイに有用な抽出緩衝液は、変化せず行われ、既に商品化されたアッセイを新しい臨床試験に提示する必要を回避しうる。いくつかの実施形態において、インフルエンザの型を決定するためのインフルエンザイムノアッセイに適している緩衝液中の検体は、ノイラミニダーゼ薬物感受性アッセイに適している緩衝液中の検体と変換されうる。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ薬物感受性アッセイに適している緩衝液中の検体は、インフルエンザの型を決定するためのインフルエンザイムノアッセイに適している緩衝液中の検体と変換されうる。前述のいくつかの実施形態において、変換はポイントオブケア診断検査に適している期間に起こりうる。いくつかの実施形態において、ポイントオブケア診断検査に適している期間は、約1日未満、約12時間未満、約6時間未満、約3時間未満、約1時間未満、約30分未満、約10分未満、約5分未満、約1分未満、及び前述の任意の時間の間を含みうる。
【００４７】
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、他の従前のアッセイより著しく低いノイラミニダーゼ薬物感受性アッセイにおける特異的な薬物阻害値を提供しうる。そのような薬物阻害値により、インフルエンザ変異体が薬物耐性であるか又は薬物感受性であるかの決定が可能となる。感度の改善により、実際にはインフルエンザが薬物耐性である場合に薬物耐性ではないと同定されるという誤った結果は殆ど生じない。
【００４８】
いくつかの実施形態は、検出用にナノ粒子を利用し、インフルエンザヌクレオカプシドの存在に注目し、かつインフルエンザ分類結果(インフルエンザA対インフルエンザB)を自動的に読取装置モジュールに送り、それにより薬物感受性と薬物耐性との区別に関する次の検査で使用するための、最も適切な薬物阻害値を適用することができる読取装置を有する、ラテラルフローイムノアッセイを含むインフルエンザIDコンポーネントを含む。いくつかの実施形態において、インフルエンザIDコンポーネントは、さらなる人の介入なしに、薬物感受性成分に対するインフルエンザの型に関する情報を提供する。
【００４９】
いくつかの実施形態は、インフルエンザノイラミニダーゼの活性に影響を与え、それにより、第一の酵素(ノイラミニダーゼ)が第一の基質に作用し、それがシグナル発生に関与する第二酵素により作用されうる第二の基質を遊離する、薬物感性試験のための二重又は二酵素アッセイを含む。
【００５０】
二酵素アッセイ又は二重酵素アッセイの複数の形式は、本明細書に開示される実施形態に適合性である。いくつかの実施形態において、第一の酵素-基質反応の結果は、第二の酵素により作用される基質でありえて、シグナルはインフルエンザ抗原が多くなるにつれて増加し、効果的なインフルエンザ抗ウイルス薬が存在する場合に減少する。いくつかの実施形態において、第一の酵素-基質反応の結果は第二の酵素反応の阻害剤として機能する化合物でありうる。いくつかの実施形態において、第一の基質はマスクされた阻害剤であり、すなわち、阻害剤の前駆物質である。いくつかの実施形態において、より多くのインフルエンザ抗原が存在する場合シグナルは減り、効果的なインフルエンザ抗ウイルス薬が存在する場合シグナルは増える。本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、インフルエンザノイラミニダーゼに関する良好な感受性を送達しえて、感受性は10ピコモル〜100フェントモルの範囲に及びうる二重酵素アッセイを含む。
【００５１】
現在、インフルエンザ処置のための最も効果的な抗ウイルス薬は、ノイラミニダーゼを標的とする。2つの主要なノイラミニダーゼ阻害薬物は、ザナミビル{RELENZA(商標)}及びオセルタミビル{TAMIFLU(商標)}である。これらの薬物に対して耐性であるインフルエンザ株は、最初の診察中に検出されえず、患者にPOC抗ウイルス薬耐性検査を用いて回避できた更なるストレスをもたらす。米国及び他の工業先進国では、抗ウイルス薬感性試験は、患者から遠く離れて、かつ患者のプライマリケア医師の診察のずっと後に、調査の一要素として政府研究室により主に実施される。最近まで、そのような検査が診療所の検査室で実施されうることは考えられなかった。さらに、抗ウイルス薬感性試薬は、非培養増幅検体に関する直接試験を考えるために必要な感度が欠如していた。等しいか又はより良好な感受性及び非依存性抗原に向かう化学物質が必要とされ、反射率、蛍光、発光等の複数のシグナル出力を読み取ることが可能な可搬式読取装置が不足していた。従って、インフルエンザ薬物耐性に関して高感度で迅速な検査が、抗ウイルス療法のより合理的な使用を促進する必要が存在する。
【００５２】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、イムノアッセイを通して1組のインフルエンザエピトープを標的とする、インフルエンザA+Bの存在に関するPOC検査、及び別々のインフルエンザ抗原、ノイラミニダーゼを標的とすることによるインフルエンザ薬物耐性の評価を含む。これらの抗原の組合せにより、全般により良好なインフルエンザ検出につながり、一方、同時に治療へのガイドを提供する。
【００５３】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ヌクレオカプシドに関する高感度のイムノアッセイ及びノイラミニダーゼ活性を測定するための動的アッセイを含む。いくつかの実施形態において、動的アッセイは、二重酵素動的アッセイを含みうる。ヌクレオカプシドに関するイムノアッセイを用いたノイラミニダーゼ活性に関する二重酵素動的アッセイは、第二の酵素としてルシフェラーゼを、及び基質としてルシフェリンベースのコンジュゲートを含みうる。インフルエンザA型及びB型ウイルスは、時にNeu5Acと表される、α-ケトシド結合N-アセチルノイラミン酸を含有する基質の加水分解を可能とする、表面糖タンパク質、ノイラミニダーゼを持つ。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼベースの抗ウイルス薬感性検査に使用するための基質は、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンから成る混成分子(コンジュゲート)でありうる。ルシフェリンが、ルシフェラーゼの存在下で放出される場合、光が、検体中の残留ノイラミニダーゼ活性に直接に比例する量で生み出される。いくつかの実施形態において、N-アセチルノイラミン酸-ホタルルシフェリンのコンジュゲートは、Cellex QFlu(商標)Comboキットで用いられるものを含みうる。
【００５４】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、読取装置を含む。いくつかの実施形態において、読取装置は、ルミノメーター機能を備えるVeritor(商標)System (Beckton Dickinson社)の読取装置を含む。ルミノメーターは、Veritor(商標)System内で用いられるラテラルフローカートリッジ、及びマイクロウェルストリップを含むさまざまな検査の使い捨て部品と共に用いられうる。付加的な感度及び使い捨て部品の柔軟性が、検体から第二の結果を引き出すための有用な選択肢となりえて、現在インフルエンザA又はBの存在を同定するためにのみ用いられている。
【００５５】
現在、インフルエンザが社会に入り込んだ場合、検体が採取されプライマリケア医師によりインフルエンザA又はBの決定がなされる。残りの検体は、薬物感性検査のために調査研究室に送られえて、結果は、社会の他の医師達が見るために政府のウェブサイトで公表される。本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、医師に最良のノイラミニダーゼ阻害剤(NAI)抗ウイルス薬に導こうとする一方、そのような実施形態は、ノイラミニダーゼ及びヌクレオカプシドの両方が同一の検体に関して測定されうるため、基礎的な診療所検査室のインフルエンザ試験に、感度に関してさらなる改善をする機会も提供しうる。本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、該研究対象に関する多くの第一人者達は、ウイルスがMDCK培養、伝統的な労力を要する50%阻害濃度薬物感受性アッセイにより必要とされる工程により増幅された場合、真のノイラミニダーゼ表現型は変化しうると確信しているため、調査のためのより正確な抗ウイルス薬耐性データを収集する機会も提供する。
【００５６】
薬物を用いる及び薬物なしのノイラミニダーゼ活性測定は、インフルエンザ調査の要素として、世界中の検査室で日常的に行われる。ノイラミニダーゼ活性アッセイに基づく組織培養は、付加的な規格化から恩恵を受けることができる一方、該アッセイは、細胞培養により十分な量のウイルスが産生された後、臨床検体の薬物耐性を決定するための、容認されかつ信頼できる方法である。NA-Star(商標)(Applied Biosystems社)等の化学発光基質は、インフルエンザノイラミニダーゼ活性を測定するために日常的に用いられる。対照的に、本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、ノイラミニダーゼ反応により作られた基質に作用しうる、試薬反応混液に対する別の酵素を含む。そうすることにより、本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、自然のインフルエンザウイルス酵素により生み出されたシグナルを増幅する。第二の酵素は、より伝統的な検査室調査手順で用いられる培養増幅工程を次々に置き換えるのに役立つ。いくつかの実施形態において、Veritor(商標)Systemからのイムノアッセイシグナルは、50%阻害濃度アッセイを構成する場合に時々実施される工程である、労力を要するウイルス滴定の代わりとなる、ノイラミニダーゼアッセイ用に十分なウイルス抗原が存在することを検証しうる。特定のシグナル強度がイムノアッセイに達した場合、発光シグナル比(薬物なしの酵素活性:薬物存在下での酵素活性)は有効である。
【００５７】
本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、迅速で、使いやすく、かつ安価でありうるプラットホームを含む。いくつかの実施形態は、複数の試験シナリオを目標とし、より高い処理量を必要としているPOC診療所の検査室及び研究室のために手段を提供しうる。これらの同様の特質は、供給に限りがある環境及び世界的流行中の使用に有用である。
【００５８】
本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、可搬式、所望ならば手持ち操作式、改善された感度を有する、主に新規な特許検出粒子によるシステム、Veritor(商標)Systemを含む。図1を参照のこと。機械的な読取りにより、提出された抗ウイルス薬感性検査に必要とされるシステム属性である定量的である可能性が生まれる。
【００５９】
広域流通に有用であるVeritor(商標)Systemのいくつかの属性が含むのは:1)比較的熟練していない治療者による使用の簡便さ、及び遠隔の試験場(診療所、薬局、リハビリテーション施設及び実現可能な移動使用)へ持ち出せる十分な可搬性。2)これまでで最初のポイントオブケア(POC)インフルエンザ抗ウイルス薬感性検査への注目を含む、可能な最も広範囲の患者。3)生物学的環境における使用。4)安価な展開コスト。5)鼻拭いスワブ、鼻咽頭の洗浄液又は吸引液中に存在するインフルエンザA及びBを決定するために用いられる、インフルエンザの薬物耐性株を報知する能力も有する組み合わせシステム。結果として強化する診断、処置及び調査。6)電池式。7)小型設置サイズ-15cm(W)x15cm(H)x15cm(D)を有する軽量読取装置。
【００６０】
図1に示すラテラルフロー構成及びメンブランは、異なる化学物質を含む2つ以上のアッセイを統合するのに有用である。ラテラルフロー基質は、緩衝液が交換されえて、他の試薬が事前に配置されえて、異なる種類のシグナルがラテラルフロー基質の異なる領域内で読取られうる、2つの明確に異なる酵素を適切な順序に配置することを伴う化学反応を可能にする。
【００６１】
いくつかの実施形態において、反応パッド及び検出粒子内で用いられるニトロセルロース等の固体担体は、ラテラルフローアッセイ装置では通常の要素である。それぞれ定量的ラテラルフローに関し、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、例えば、US 5,998,221及びUS 6,194,220を参照のこと。いくつかの実施形態において、定量的ラテラルフローは、適当なウイルス抗原が抗ウイルス薬耐性検査に使用可能であることを検証する有用な工程である。いくつかの実施形態において、ラテラルフローストリップは、検体パッド用及びコンジュゲートパッド用に別々のメンブランを用いうる。いくつかの実施形態において、ラテラルフローストリップは、複数のメンブランを含みうる。いくつかの実施形態において、ラテラルフローストリップは、4つのメンブランを含みうる。いくつかの実施形態において、ラテラルフローストリップは、ラテラルフローカセット内に4つのメンブランを含みうる。別の実施形態において、1つのメンブランは、検体の受け取り及びドライダウンされたコンジュゲートの保持の両方に用いられる。
【００６２】
本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、二重酵素システムを含む。いくつかの実施形態において、Cellex基質-酵素試薬システムの要素が用いられうる。エステラーゼ二重酵素の化学物質に関するより詳細は、それぞれその記載内容全体が参照により組み込まれている、以下の出版物: Mizeら、Dual Enzyme Cascade、Analytical Chemistry、179、(1989)、229〜235頁;米国特許第4,904,583号;及び米国特許第4,835,099号に見出されうる。
【００６３】
本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、修飾ルシフェラーゼ酵素及びノイラミン酸-ルシフェリンのコンジュゲートを含むそのような酵素に対する基質を含む。いくつかの実施形態において、増幅は、異なる第二の酵素(エステラーゼ)及びフルオロケトンベースのブロックされた(マスクされた)阻害剤の導入によりさらに達成されうる。図4は、マスクされたエステラーゼ阻害剤の実施形態に関する合成を示す。図4は、ノイラミニダーゼ基質としてカルバメート又はカーボネート結合のいずれかを含む基質の実施形態を示す。
【００６４】
本明細書で提供されるいくつかの方法及び組成物は、さまざまな可能な方式の配置の範囲を含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ及び二重酵素アッセイの完全な実行は、ラテラルフロー方式を含みうる。そのようないくつかの実施形態において、同一の抽出試薬により処理された検体は、ラテラルフロー試料パッド上に載せられえて、少しするとラテラルフローカセットの末端部は、インフルエンザの存在に関して読取られえて、治療のための推奨も同様に提供されうる。いくつかの実施形態において、色の変化は、反射率読取装置を用いて測定されうる。いくつかの実施形態において、反射率測定等の測定は、インフルエンザ検出用のラテラルフローメンブランから直接に行われえて、化学発光、蛍光、又は発色団測定等の別の種類の測定は、薬物感性のために行われうる。いくつかの実施形態において、測定は、検査ストリップ上などのデータを検出及び/又は定量するための機器を表す読取装置を用いて行われうる。そのような読取装置は、その記載内容全体が参照により組み込まれている、米国特許第6,267,722号、同第6,394,952号、及び同第6,867,051号に開示され記載されている。いくつかの実施形態において、反射率読取装置は、蛍光、又は任意の波長の電磁放射線を含む反射光を用いて、検査ストリップを読み取ることに適合させた機器を表す。反射率は、光検出器又は電荷結合素子ダイオード(CCD)等の他の検出器を用いて検出されうる。
【００６５】
イムノアッセイ及び感性のシグナルの両方は、CCDカメラ等の通常の検出器を用いて観察されうる。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ及び感性アッセイは、CCD及び光電子増倍管等の異なる検出器を用いて読取られうる。いくつかの実施形態において、定量的「オンフィールド」(on field)の化学発光測定用の可搬式冷却CCDカメラが用いられうる。いくつかの実施形態において、化学発光抗ウイルス薬感性アッセイは、低ノイズ増幅器を備えたPINダイオードによっても読取られうる。
【００６６】
いくつかの実施形態において、二重酵素アッセイにおける第一酵素反応がイムノアッセイ試薬に適合性ではない場合、二重酵素アッセイの初期段階がオフラインで実施され、切断された基質を有する部分的に処理された検体は、ラテラルフローストリップを毛管作用により下方に、発光シグナルを生じるのに必要なルシフェラーゼ及び他の試薬を含有する固体担体まで移動しうる、ラテラルフロー試料パッド上に載せられる。この配置で、イムノアッセイ及び感性のシグナルは、CCDカメラ等の通常の検出器を用いて読取られうる。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ及び感性アッセイは、CCD及び光電子増倍管等の異なる検出器を用いて読取られうる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、ラテラルフローに関する二重酵素アッセイは、切断されたルシフェリンを含有する処理されたラテラルフローカセットの部分を、発光シグナルを生じるために必要とされるルシフェラーゼ及び他の試薬を有するウェル内に浸すことにより達成されうる。二重酵素アッセイから生み出された光は、次にLuminoskan TL Pus又は相当する管ルミノメーターにより測定される。
【００６８】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイが行われて、ラテラルフローカセット上で読取られ、二重酵素アッセイが行われて、ウェルストリップ上で読取られる。2つのアッセイは、通常の抽出検体を共有しうるが、異なる方式で実行され、次にラテラルフロー反射率及びウェルストリップ化学発光(又は蛍光若しくは他の光シグナル)に順応しうる通常の機器で読取られる。イムノアッセイ及び感性のシグナルの両方は、CCDカメラ等の通常の検出器を用いて観察されうるか、又はイムノアッセイ及び二重酵素アッセイは、CCD及び光電子増倍管等の異なる検出器を用いて読取られうる。
【００６９】
実施形態を決定するための一般的手法:
図2に示すように、出願人は、単一試料に関するインフルエンザ分類及び抗ウイルス薬感受性検査を行うための幾つかの選択肢を探究した。一実施形態において、検体は、分割され、2つの異なる抽出緩衝液で処置され、検体の各部分は、1つのアッセイのみで用いられた。この手法の制約は、いくつかの状況ではインフルエンザID及びASTアッセイの両方を行うのに十分な検体が得られなかった点である。一実施形態において、両方のアッセイに用いられうる通常の抽出試薬及び緩衝液が検査された。この手法の制約は、イムノアッセイ及び動的アッセイのための条件が異なり、最適ではない通常の緩衝液を利用した点である。別の実施形態において、実時間で対立するアッセイに対して緩衝液の変換を用いて、インフルエンザIDかASTアッセイのどちらかに適切な単一の抽出緩衝液が用いられた。この実施形態は、両方のアッセイに関する十分な試料量及び感受性を提供した。図2は、開発されたインフルエンザID及び感性試験の両方のアッセイ方式の複数の実施形態も示す。組み合わせたラテラルフローイムノアッセイ及び二重酵素アッセイ用の適切な読取装置及び使い捨て部品が用いられた(例えば、ASTにウェルストリップが用いられる場合は、別々のウェルストリップ読取装置が用いられえて、他方では、ラテラルフローストリップが用いられる場合は、単一ラテラルフロー読取装置が両方の検査に用いられうる)。
【００７０】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイ及び抗ウイルス薬耐性測定の両方用の通常の抽出試薬が、用いられる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、ラテラルフロー方式は、ニトロセルロースパッドを通過するノイラミニダーゼに関する抗ウイルス薬耐性測定で、イムノアッセイ及び二重酵素アッセイの両方に用いられる。いくつかの実施形態において、アッセイは、イムノアッセイラテラルフローカートリッジが載せられた後で残存していることが多い、約150μlの検体に関して実施されうる。いくつかの実施形態において、1つ又は両方の容量は、同種のアッセイとしてウェルストリップ内で測定されうる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、システムは、Tropix又はBethold等のルミノメーター、Shanghi Huguo Science Instrument社からのHG-2等の可搬式ルミノメーターを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、ウイルス源は、凍結した、インフルエンザ陽性であることが既知の、ヒト鼻腔分泌物の存在下で機能的動的及びイムノアッセイを検証するための臨床検体を含みうる。
【００７４】
二重酵素抗ウイルス薬感性アッセイ
図3に示すように、ノイラミニダーゼ活性に関する二重酵素動的アッセイのいくつかの実施形態は、第二の酵素としてルシフェラーゼを、及び基質としてルシフェリンベースのコンジュゲートを含みうる。Yolkenは、1980年にノイラミニダーゼに対する蛍光性基質に関して報告した。Buxtonは、2000年にノイラミニダーゼに対する化学発光性基質に関して報告し、Hamiltonは、2004年にインフルエンザID用に化学発光のノイラミニダーゼ基質を用いるFDA認可ZestatFlu-II Testの比較を併行して実施した。非単一酵素-単一基質システムは、診療所検査室での実施に適しているロバスト性の薬物感性試験に発展した。これは、より良好なシグナル増幅システムにより対処可能な感受性に関する問題でありうる。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ルシフェリンコンジュゲートに関わる二重酵素システムを含む。一度、インフルエンザノイラミニダーゼの作用を受けると、コンジュゲートは、遊離ルシフェリンを放出し、それは次々にルシフェラーゼによる作用を受ける。本明細書に開示される実施形態において、そのような二重酵素化学発光システムは、POC抗ウイルス薬感性診断に対して十分な増幅を提供しうる。本明細書で提供される方法及び組成物に有用な試薬の一例として、Cellex社によるQFlu(商標)Combo Testで用いられる試薬が挙げられる。
【００７５】
通常の抽出検体に関するインフルエンザA/Bイムノアッセイ及び薬物感性試験を実施するための実証能力
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、そのアッセイ反応工程/試薬が、同一の時間枠にわたり、かつ同一の空間ではないとしても極近くで実施された場合、適合性であることの実証を含む。いくつかの実施形態において、ヌクレオカプシドに関するイムノアッセイ及びノイラミニダーゼ活性に関する二重酵素アッセイは、感受性、特異性、アッセイ範囲、解明、及び結果への時間におけるいかなる損失に関しても密接にモニタされうる。2つのアッセイからの全ての工程が成功するために必ずしも適合性である必要はない。いくつかの実施形態において、Veritor(商標)イムノアッセイ試薬及びCellex QFlu(商標)アッセイ(調査目的のため現在展開中)で用いられる現在の二重酵素試薬は、開示される方法、組成物、キット、装置及びシステムにおいて利用される。評価される1つの試薬は、両方のアッセイで用いられた溶解試薬であった。いくつかの実施形態において、Veritor(商標)イムノアッセイからの溶解試薬は、インフルエンザA/B及び薬物感受性検査の両方で用いられる試料の調製に用いられる。別の実施形態において、Cellex QFlu(商標)アッセイからの溶解試薬は、インフルエンザA/B及び薬物感受性検査の両方で用いられる試料の調製に用いられる。
【００７６】
抗ウイルス薬感性/耐性アッセイに関する干渉スクリーニング
インフルエンザA型及びB型ウイルスは、時々Neu5Acと表される、アルファ-ケトシド的結合のN-アセチルノイラミン酸を含有する基質の加水分解を可能とする、表面糖タンパク質、ノイラミニダーゼを持つ。ノイラミニダーゼベースの抗ウイルス薬感性検査における使用に評価された基質は、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンから成る混成分子(コンジュゲート)を含んだ。ルシフェリンが、ルシフェラーゼの存在下で放出される場合、光が、検体中の残留ノイラミニダーゼ活性に直接に比例する量で生み出される。一実施形態において、現在、調査用途のため流通している、Cellex QFlu(商標)Comboキットで用いられるN-アセチルノイラミン酸-ホタルルシフェリンのコンジュゲートは、評価された。いくつかの実施形態において、培養ウイルスストックを用いてベンチマーク実験が実施され、それにより2つの別々の反応が各検査条件で行われ、例えば、1つの反応は抗ウイルス薬(例:オセルタミビル)を含み、別のノイラミニダーゼ活性測定は抗ウイルス阻害剤なしで実施される。対照検体は、開発下の迅速な方法により、及び推奨されるWHO50%阻害濃度方法の1つによりアッセイされうる。いくつかの実施形態において、抗ウイルス薬感性試薬のスクリーニングは、マイクロウェル、管若しくはキュベット又はプレート内で行われ、化学発光又は蛍光が読み取られうる。スクリーニングは、インフルエンザの抗ウイルス薬耐性及び感受性株で行われうる。迅速の場合は、純粋ノイラミニダーゼが、検体内に固定され、干渉スクリーニングに用いられうる。凍結した陽性であることが既知の臨床検体は、主に定期的に検査され、鼻腔分泌物の他の成分は二重酵素アッセイで干渉されないことを確認しうる。
【００７７】
イムノアッセイに関する干渉スクリーニング
いくつかの実施形態において、インフルエンザ検出(イムノアッセイ)試薬に関するスクリーニングは、現在、FDA認可CLIA Waived Veritor(商標)Productにおいて実施されているように、ラテラルフロー方式で実施され、反射率が読取られうる。BD Veritor(商標)イムノアッセイは、インフルエンザヌクレオカプシドに向かう2つのモノクローナル抗体を用いる。ラテラルフローカセット内で、1つの抗体は、特許金粒子表面に固定化され、もう1つの抗体は、ニトロセルロースに固定化される。ニトロセルロース反応ストリップ上で検出されたシグナル量は、検体中のインフルエンザウイルス量に比例している。Veritor(商標)イムノアッセイに対する可能性がある干渉に関する二重酵素試薬試験は、中等度の陽性(検出レベルの約5倍)に対応する最終濃度を得るために調製された、インフルエンザA(インフルエンザA/PR/8/34)及びインフルエンザB(インフルエンザB/Lee/40)陽性試料の存在下で実施されうる。検査干渉は、インフルエンザA又はインフルエンザBの陰性試料についての偽陽性結果、又はインフルエンザA又はインフルエンザBの陽性試料についての偽陰性結果という形態で見られうる。干渉を呈さないこれらの二重酵素試薬のみが、推進されうる。迅速の場合は、純粋ヌクレオカプシドが、検体内に固定され、スクリーニング実施に用いられうる。
【００７８】
他の二重酵素化学物質
他の二重酵素試薬システムは、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンのコンジュゲート成分を含むCellexシステムと同様の基質を含むが、異なるリンカーを利用する。いくつかの実施形態において、異なるルシフェラーゼ酵素が、用いられうる。
【００７９】
薬物感性アッセイに関する決定方式/使い捨て部品
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、結合アッセイのための適切な方式の選択を含む。いくつかの実施形態において、化学物質が適合性であると見出された場合、次にイムノアッセイ及び二重酵素アッセイの完全な実行が、ラテラルフロー方式で最良に行われうる。ラテラルフロー方式が、両方のアッセイに用いられる場合、同一の抽出試薬により処理された検体は、ラテラルフロー試料パッド上に載せられえて、少しするとラテラルフローカセットの末端部は、A/B型を含むインフルエンザの存在に関して読取られえて、薬物感性に基づいた治療のための推奨も同様に提供されうる。反射率測定は、インフルエンザ検出用のラテラルフローメンブランから直接に行われえて、化学発光測定は、薬物感性のために行われうる。いくつかの実施形態において、定量的「オンフィールド」の化学発光測定用の可搬式冷却CCDカメラが用いられうる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、二重酵素アッセイにおける第一の酵素反応が他のイムノアッセイ試薬に適合性ではない場合、二重酵素アッセイの初期段階がオフラインで実施され、切断された基質を有する部分的に処理された検体は、ラテラルフローストリップを毛管作用により下方に、発光シグナルを生じるのに必要なルシフェラーゼ及び他の試薬を含有する固体担体まで移動しうる、ラテラルフロー試料パッド上に載せられる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ラテラルフローに関する二重酵素アッセイは、切断されたルシフェリンを含有する処理されたラテラルフローカセットの部分を、発光シグナルを生み出すのに必要とされるルシフェラーゼ及び他の試薬を有するウェル内に浸すことにより達成されうる。二重酵素アッセイから生み出された光は、次にLuminoskan TL Pus又は相当するルミノメーターにより測定される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイが行われて、ラテラルフローカセット上で読取られ、合理化されたCellex Qflu(商標)Comboアッセイが行われて、ウェルストリップ上で読取られる。2つのアッセイは、通常の抽出検体を共有しうるが、異なる方式で実行され、次にラテラルフロー反射率及びウェルストリップ化学発光に順応しうる通常の機器で読取られる。いくつかの実施形態において、2つの別々の機器が用いられる。いくつかの実施形態において、単一の又は複数の装置は、小型設置サイズを有する、可搬式、電池式の装置であり、例えば、カウンター上面又は可搬式医療用スタンドに取り付ける大きさで、診療所への設置に適している。
【００８３】
システム確認
20のインフルエンザ株の検査一式は、培養されかつ列挙されえて、最終組み合わせプラットホーム(統合された使い捨て部品、読取装置及び試薬)を可能にし、10E3ウイルス粒子(TCID50/ml又はCEID50/ml単位で定義される)の濃度に依存して感受性に関してアッセイされうる。20株の検査一式は、インフルエンザA及びB株の均衡を含有しうる。インフルエンザA株は、インフルエンザHINl及びH3N2の混合でありうる。検査一式は、TamiFlu(商標)耐性及び感性株を含有しうる。検査一式は、第二のNAI薬物に対して耐性及び感性の株も含有しうる。ベンチマーク推進及び最終統合システムのために、ほぼ100の凍結した陽性であることが既知の臨床単離物が用いられうる。
【００８４】
開発及び確認のための抗ウイルス薬
TABLE1(表1)は、本明細書で提供される方法及び組成物に有用なNAI(ノイラミニダーゼ阻害剤)抗ウイルス薬の例を提供する。個体数は、オセルタミビル及びザナミビルに対して常に感受性である新しく循環しているインフルエンザ株に依存しえないため、Biota drugを用いたPOC抗ウイルス薬感性診断のデータ作成が望ましい。
【００８５】
【表１】
0006591398.tif 000006
【００８６】
インフルエンザ株、単離物、及び対照採取
TABLE2(表2)は、本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態で使用するための、特定の表現型及び遺伝子型の例を含む。ノイラミニダーゼ薬物に対して耐性及び感性の両方の、インフルエンザA及びインフルエンザB株(BSL-2)は、開発のために取得されうる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法及び組成物は、主要なインフルエンザA亜型ノイラミニダーゼ、同様にインフルエンザBノイラミニダーゼを含む。
【００８７】
【表２】
0006591398.tif 000007
【００８８】
ベンチマーク試験
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、一点QFlu(商標)Combo及びイムノアッセイに関する50%阻害濃度法の実施を含む。Veritor(商標)及びQFlu(商標)システムは、添付文書に従って用いられうる。Applied Biosystems社/Life Technologies社からのNA-Star(商標)Kit等の50%阻害濃度の調製をされたキットに対する多くの選択肢がある。TABLE3(表3)は、抗ウイルス薬試験で用いられうる供給物に関する供給源及び品番の例を提供する。
【００８９】
【表３】
0006591398.tif 000008
【００９０】
50%阻害濃度法
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、NA-Star(登録商標)緩衝液(26mM MES、4mM CaC12、pH6.0)、NA-Star(登録商標)基質、NA-Star(登録商標)促進剤、及び96-ウェル固体白色プレートを含む、市販のNA-Star(登録商標)Kit(Applied Biosystems社、Foster City、CA)を用いて行われた化学発光NAIアッセイと比較されうる。カタログ4374348及び4374349。50%阻害濃度法、調製及び分析のさらなる詳細は、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY、2008年9月、3284〜3292頁、Vol. 52、No. 9に見出されうる。
【００９１】
検体選択(スワブ対洗浄液対吸引液)及びアッセイ感受性に関する影響
いくつかの実施形態は、3つの検体選択肢(スワブからの直接試験対鼻咽頭洗浄液又は吸引液からの試験)を含む。いくつかの実施形態は、凍結した検体及び培養からの試験、及び単一採取からのヌクレオカプシドイムノアッセイ及びノイラミニダーゼ活性アッセイを実施する能力を含む。
【００９２】
スワブから直接試験
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、検体を採取するためのスワブの使用を含む。第一のVeritor(商標)イムノアッセイは、乾燥スワブ採取に基づき、それにより全部の検体は、意図的に「処理試薬」(体積400μl)に投入され、添付文書は、検体がラテラルフローストリップに1時間内に適用されるように要求している。通常、体積約80μlがラテラルフローカセット上に載せられた後、数百マイクロリットルが残り、抗ウイルス薬感性検査に送られうる大量の未使用で処理された抗原が残っている。この検体処理経路は、ウイルス培養用の試料の分は与えないが、一方、いくつかの実施形態において、イムノアッセイ及び動的アッセイの両方は、後のPCR検出用の核酸安定剤を補足されうるいくらかの残余検体を用いて、検出のピークレベルで又はその近くで実施しうる。
【００９３】
鼻咽頭洗浄液/吸引液の試験
Veritor(商標)プラットホームは、ラテラルフローカセットに載せる前に、濃縮粘液溶解試薬が採取検体に3パーツ(parts)〜1パーツで添加される方法を含む。300/マイクロリットルの各生体懸濁液が、BDで市販されている{例えば、Veritor(商標)System for Rapid Diagnostics of Flu A&B(製品番号256045)用のキット内で}RV試薬C又はRV試薬Dを含むユニット化管に添加される。10種超の保存-輸送培地が、これらの洗浄液/吸引液検体について成功裏に試験されてきた。保存-輸送培地の例として、M4RT、M4、M5、UTM、Ames Medium(液体)、Bartel Vira Trans(商標)Medium、ハンクス平衡塩溶液、生理食泉水、リン酸緩衝食塩水が挙げられる。M4RT培地は、25℃でpH7.3であり、Hankの平衡塩類:CaCl2、MgCl2-6H2O、MgSO4-7H2O、KC1、KH2PO4、NaCl、Na2HPO4-7H2O、グルコースを含む。従って、いくつかの実施形態において、ウイルス増殖用の試料は、粘液溶解剤が添加される前の鼻咽頭洗浄液/吸引液で採取されうる。鼻咽頭洗浄液/吸引液検体を用いる場合は、起こりうる抗原希釈の影響が考慮されうる。Veritor(商標)アッセイは、他の市販されているいかなる迅速アッセイより大きな感度を有する。
【００９４】
化学発光法及び感受性を評価するための測定基準
本明細書で提供される方法及び組成物に有用な化学発光法は、その各記載内容全体が参照により組み込まれている、米国特許第8,221,976号、同第8,163,237号、同第7,947,820号、同第7,642,060号、同第7,291,488号、同第5,736,365、同第5,639,428号、同第5,561,044号、同第5,518,884号、同第5,470,723号、同第5,457,027号、同第5,314,801号、同第5,017,473号、及び同第4,810,631号に開示されるものを含む。いくつかの実施形態において、二重酵素検査の測定基準は、Veritor(商標)イムノアッセイを用いて取得される、インフルエンザウイルス粒子の検出レベル等の測定基準と実質的に同様である。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼの存在を検出するための化学物質は、103 TCID50で十分なシグナルを生み出しえて、薬物及びw/o薬物を用いて実施される反応間に観察されるロバスト性5:1比も可能にする。いくつかの実施形態において、感受性及び長い直鎖上範囲の両方が評価されうる。いくつかの実施形態において、Cellexが用いられうる。
【００９５】
特定の化学物質
図12は、ノイラミニダーゼ活性をアッセイするための、本明細書で提供される組成物及び方法で用いられうるエステラーゼベースの化学物質を示す。本明細書で提供される方法及び組成物の実施形態に有用な方法は、その各記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、以下に開示されるものを含む:Mizeら、Dual Enzyme Cascade、Analytical Chemistry、179、(1989)229〜235頁;米国特許第4,904,583号;米国特許第4,835,099号。いくつかの実施形態は、修飾ノイラミン酸-ルシフェリンのコンジュゲート等の修飾ルシフェラーゼ酵素及びそれらの基質を含む。用いられうる他の阻害剤は、以下を含む。
【００９６】
【化３】
0006591398.tif 000009
【００９７】
【化４】
0006591398.tif 000010
【００９８】
図12の化合物は、パラ位のトリフルオロケトンを有する。より多くのエステラーゼ阻害剤は、l,l,l-トリフルオロ-4-(4-ヒドロキシフェニル)ブタン-2-オン(パラ);1,1,1-トリフルオロ-4-(3-ヒドロキシフェニル)ブタン-2-オン(メタ);及び1,1,1-トリフルオロ-4-(2-ヒドロキシフェニル)ブタン-2-オン(オルト)を含む。
【００９９】
本明細書に開示される実施形態に使用するための代替のマスクされた阻害剤基質は、以下に提供するメタ位及びオルト位のトリフルオロケトンを有するものを含む。
【０１００】
【化５】
0006591398.tif 000011
【０１０１】
別の実施形態において、4,7メチル化N-アセチルノイラミン酸(NANA)-トリフルオロケトンは、インフルエンザノイラミニダーゼに対してより特異性を有し、DEマスクされた阻害剤アッセイにおいて用いられうる。
【０１０２】
いくつかの実施形態は、式(1):
【０１０３】
【化６】
0006591398.tif 000012
【０１０４】
(式中:R1、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素又はC1〜5アルキルであり;nは,0、1、2又は3であり;R4は,-(CH2)mC(=O)CF3であり;mは,0又は1であり;Xは,-S(O)z-又は-CH(R5)-であり;R5は,-S(O)zCH3であり;zは,0、1又は2である)
の構造を有する、二重酵素インフルエンザノイラミニダーゼ感受性アッセイに使用するためのマスクされた阻害剤化合物を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、式(I)の化合物は、
【０１０６】
【化７−１】
0006591398.tif 000013
【化７−２】
0006591398.tif 000014
【化７−３】
0006591398.tif 000015
【０１０７】
からなる群から選択される。
【０１０８】
DNA配列決定
いくつかの実施形態において、遺伝子型データは、検体のインフルエンザウイルス粒子から取得される。いくつかの実施形態において、特別なウイルス単離物は、ベンチマーク組織培養50%阻害濃度法を用いて、迅速POC検査からのプロファイルとは異なる薬物感受性特性を生み出しうる。その異なるプロファイルは、ノイラミニダーゼ活性部位内の残基における変異、及び特異的なインフルエンザ亜型に耐性を与えると既知であるか、又は他にNAにおけるフレームワーク置換によるものでありうる。検体からの核酸の配列を決定する方法は、当技術分野で周知である。
【０１０９】
他の病原体からの干渉
いくつかの実施形態において、インフルエンザ感染を有する疑いがある患者からのいくつかの検体は、ノイラミニダーゼを生み出す他の病原体を含有しうることが予想される。TABLE4(表4)は、インフルエンザ陽性臨床検体内に最も通常に見出される病原体の例を提供する。
【０１１０】
【表４】
0006591398.tif 000016
【０１１１】
TABLE5(表5)は、検体干渉試験で検査されうる病原体の例を提供する。そのような病原体は、本明細書で提供される方法及び組成物へのいかなる影響も検査されうる。干渉は、全ウイルス又は精製ノイラミニダーゼについて検査する。これらの病原体は、臨床採取に存在すると予期される濃度でアッセイされうる。
【０１１２】
【表５】
0006591398.tif 000017
【０１１３】
いくつかの実施形態において、試料は、鼻咽頭洗浄液、吸引液、及びスワブを含みうる。
【０１１４】
インフルエンザA型又はインフルエンザB型の検出
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、検体中のインフルエンザA型ウイルス又はインフルエンザB型ウイルスの存在を検出することを含む。いくつかの実施形態は、A/B等のインフルエンザの型間を区別しうるウイルス抗原を同定するためのイムノアッセイの使用を含む。いくつかの実施形態において、抗原は、ヌクレオカプシドである。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイを含む。そのようないくつかの実施形態において、第一の抗体は、特異的に標的抗原に結合し、結合された抗原及び第一の抗体は、次にシグナルを生み出す第二の抗体に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、シグナルは、発色性、蛍光性、化学発光性、及び放射性である。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、ラテラルフローシステムを含みうる。いくつかの実施形態において、検査ストリップは、イムノアッセイを含む。本明細書で提供される方法及び組成物に有用なシステム及び組成物は、インフルエンザA+Bの迅速な検出のためのVeritor(商標)Systemを含む(Becton Dickinson社)。いくつかの例で、検査ストリップからの出力は、反射率である。いくつかの実施形態において、検査ストリップからの出力は、反射率読取装置を用いて測定されうる色変化である。ラテラルフローイムノアッセイ方式に加えて、A型又はB型インフルエンザウイルスを決定するための実施形態は、溶液相内、メンブラン、表面、及び粒子等の基質上の分子及びイムノ検出を含みうる。いくつかの実施形態において、マイクロウェルELISA法、ナノ標識-磁気分離アッセイ、及び粒子凝集。分子検出アッセイの例は、Xpert(登録商標)Flu System(Cephied社、Sunnyvale、CA)を含む。ナノ標識を含む実施形態は、表面増感ラマン分光法(SERS)ナノ標識を含む。例えば、その記載内容全体が、参照により本明細書に組み込まれている、ACS Nano、2009、3(10)、2859〜2869頁を参照のこと。分子凝集を含む実施形態は周知であり、流体中の抗原と、粒子上被覆の抗体等の抗原結合性要素との接触を含む。例えば、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている。U.S. 4,590,169を参照のこと。
【０１１５】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、検体中のインフルエンザA型ウイルス又はインフルエンザB型ウイルスの存在を検出することを含み、非イムノアッセイ法を含む。いくつかの実施形態において、インフルエンザA型ウイルス又はインフルエンザB型の存在は、PCR、核酸ハイブリッド形成法及び核酸配列決定等の、核酸に基づく方法を用いて検出されうる。
【０１１６】
ノイラミニダーゼ活性測定
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料中のノイラミニダーゼ活性の検出及び/又は測定を含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、インフルエンザA型又はB型ノイラミニダーゼ等のウイルスノイラミニダーゼである。いくつかの実施形態において、検出される酵素は、シアリダーゼである。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、二重酵素アッセイを用いて測定されうる。本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態に有用な試薬は、QFlu(商標)NI Assay(Cellex、Inc.社、Maryland)及びQFlu(商標)Combo Assayのものを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼに対する基質は、エステラーゼ等、ルシフェラーゼ等の第二の酵素に対する基質に変換される。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼに対する基質は、N-アセチルノイラミン酸(シアル酸)の誘導体とルシフェリンの誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、N-アセチルノイラミン酸又はその誘導体とルシフェリンとの間のコンジュゲートは、N-アセチルノイラミン酸の糖環上の-OH基を介して、グリコシド結合を通して互いに連結する。いくつかの実施形態において、糖環上の位置は、これはインフルエンザノイラミニダーゼにより好まれるグリコシド結合であるため、2'位である。シアル酸誘導体の例は、4-アルキル又は7-アルキル又は4,7アルキルN-アセチルノイラミン酸(例えばその記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第6,303,764号及び米国特許第6,420,552号、同第6,680,054号に記載されるもの)を含む。一例は、4,7メチル化N-アセチルノイラミン酸-ホタルルシフェリンのコンジュゲートである。そのようなコンジュゲートの実施形態は、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第7,893,272号に提供される。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ基質として用いられるコンジュゲートは、Na塩を示す以下の式:
【０１１８】
【化８】
0006591398.tif 000018
【０１１９】
により表されうる。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、Rl、R2、R3は、それぞれ互いに独立して、水素又は1〜5個の炭素原子を有するアルキルである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼに対する基質は、エステラーゼ等、ルシフェラーゼ等の第二の酵素に対する阻害剤に変換される。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼに対する基質は、N-アセチルノイラミン酸(シアル酸)の誘導体とトリフルオロメチルケトン(CF3)の誘導体とのコンジュゲートを含む。N-アセチルノイラミン酸の誘導体は、上述されている。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼに対する基質は:
【０１２２】
【化９】
0006591398.tif 000019
【０１２３】
である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、トリフルオロメチルケトン阻害剤は:
【０１２５】
【化１０】
0006591398.tif 000020
【０１２６】
を含む。
【０１２７】
ノイラミニダーゼに対する基質が、エステラーゼ等の第二の酵素に対する阻害剤に変換されるいくつかの実施形態において、基質はマスクされた阻害剤としても知られている。本明細書で提供されるいくつかの方法に有用なマスクされた阻害剤の例は、本明細書に開示される。
【０１２８】
合成例は、図4に示される。いくつかの実施形態において、試料は、インフルエンザウイルス以外の供給源からのノイラミニダーゼを含有しうる。いくつかの実施形態において、所望されないノイラミニダーゼは、特異的な抗体及び阻害剤を用いて阻害される。所望されないノイラミニダーゼ活性は、特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いて阻害される。例えば、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの検出のために、試料中の生体を汚染しそうな細菌種、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)及びアクチノミセス・ビスコーサス(Actinomyces viscosus)等からの非特異性のノイラミニダーゼ活性は、これらの供給源からのノイラミニダーゼに特異性の抗体を用いて阻害される。この手法は、異なる生体からのノイラミニダーゼは明確に異なるアミノ酸シーケンスを有し、種特異性の、又は亜種特異性のノイラミニダーゼ抗体の産生を可能にするため、可能である。例えば、特異的な抗体は、ノイラミニダーゼ中和アッセイ中で、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼ亜型を区別するために通常用いられる。
【０１２９】
組み合わせアッセイ
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料が(1)試料中のA型又はB型インフルエンザウイルスの同定、及び(2)ある種の抗ウイルス薬に対するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの感受性に関してアッセイされる組み合わせアッセイを含む。いくつかの実施形態において、試料中のA型又はB型インフルエンザウイルスの同定用のイムノアッセイは、ある種の抗ウイルス薬に対するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの感受性を測定するためのアッセイとは異なる緩衝液内で実施される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、検体は、取得される。いくつかの実施形態において、検体は、鼻咽頭洗浄液、吸引液、及びスワブを含みうる。いくつかの実施形態において、異なる緩衝液内でいくつかの初期試料を調製するためには、不十分な量の検体がありうる。いくつかの実施形態において、検体は、第一の緩衝液内に入れられ、第一のアッセイ用の第一の検査試料を得る。いくつかの実施形態において、第一の検査試料は、第二のアッセイに適合性ではない緩衝液を含む。例えば、第一の緩衝液は、第二のアッセイを阻害しうる。そのようないくつかの実施形態において、第一の検査試料は、第二のアッセイに適合性である第二の緩衝液を含む第二の検査試料に変換される。いくつかの実施形態において、第一又は第二のアッセイは、試料中のA型又はB型インフルエンザウイルスの同定用のイムノアッセイを含む。いくつかの実施形態において、第一又は第二のアッセイは、ある種の抗ウイルス薬に対するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの感受性を決定するためのアッセイである。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、検体は、イムノアッセイ検査試料を調製するために、A型又はB型インフルエンザウイルスの同定用のイムノアッセイに適合性の第一の緩衝液に添加される。イムノアッセイ検査試料の第一の部分は、A型又はB型インフルエンザウイルスの同定用のイムノアッセイに適用されうる。第二の部分は、イムノアッセイ検査試料を、ノイラミニダーゼ活性アッセイに適合性の第二の緩衝液と平衡に達している交換マトリックスと接触することにより、ノイラミニダーゼアッセイ検査試料に変換されうる。マトリックスの例として、セファデックス及びセファロース等の架橋多糖が挙げられる。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼは、マトリックスを含むチャンバを備えるカートリッジを含む。セファデックスの種類は、G25中程度、G25粗い、G25細かい、でありうる。ベッド高は、1センチメートルから15センチメートルの範囲でありうる。いくつかの実施形態において、樹脂は、インフルエンザノイラミニダーゼの放出及び次のノイラミニダーゼ活性測定を促進する緩衝液内で予備洗浄及び予備平衡化を提供されうる。そのような試薬は、NA-STAR(商標)及びNA-FLUOR(商標)Kits及びZstatFlu(商標)Productに見出されるものと同様である。これらの緩衝液は、lOOmM未満及びしばしば10mM未満等の低塩化ナトリウム含有量を通常、含有する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム含有量は、100mM〜0.1mM、100mM〜1mM、10mM〜0.1mM、及び10mM〜1mMである。これらの緩衝液は、カルシウム及び/又はマグネシウムのイオンを0.1mM〜50mM、1mM〜20mM、又は及び4mM〜10mMの範囲で通常、含有し、最も至適なノイラミニダーゼ活性測定をもたらす。樹脂を平衡化するために用いられる緩衝液のpHは、次のノイラミニダーゼ活性アッセイが致死的なインフルエンザH7N9等のpH感受性ノイラミニダーゼを含有する稀少株に取り組みうることを確認するために、5〜8の間であるべきである。樹脂カートリッジを通過するインフルエンザ検体は、インフルエンザIDイムノアッセイ用の、ヌクレオカプシドを放出するために用いられる界面活性剤と同様の少量の界面活性剤を含有しうる。界面活性剤は、NP-40、胆汁酸塩、Brij-35及びトリトンを含みうる。トリトンの一例は、トリトンX-100である。胆汁酸塩の一例は、デオキシコール酸ナトリウムである。これらの組織及びウイルス溶解剤は、液体ストックに入りえて、別の場合には固体として入手できる。トリトン及びNP40は、樹脂カートリッジを通過する試料中に0.01体積%〜10体積%、又は0.5体積%〜3体積%存在しうる。固体界面活性剤は、0.1質量体積%〜10質量体積%、又は0.5質量体積%〜2質量体積%の範囲の濃度で存在しうる。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、検体は、ノイラミニダーゼアッセイ検査試料を調製するために、ノイラミニダーゼ活性アッセイに適合性の第一の緩衝液に添加される。ノイラミニダーゼアッセイ検査試料の第一の部分は、ノイラミニダーゼ活性アッセイに適用されうる。第二の部分は、ノイラミニダーゼアッセイ検査試料を、A型又はB型インフルエンザウイルス同定用のイムノアッセイに適合性の第二の緩衝液と平衡に達している交換マトリックスと接触することにより、イムノアッセイ検査試料に変換されうる。そのようなマトリックスの例として、セファデックス、セファロース等の架橋多糖及びニトロセルロースが挙げられる。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは検査ストリップを含み、マトリックスはニトロセルロースを含む。いくつかの実施形態において、第二の緩衝液は、凍結乾燥又はそうでなければドライダウンされてマトリックス内にある。イムノアッセイ検出用に使用可能であるヌクレオカプシドを作製するように構成された抽出緩衝液は、検体パッドコンジュゲートパッド、又はその両方内に事前に配置される。これらのパッド(メンブラン)の適切な例として、ガラス繊維Millipore G041、Millipore GFDX及びセルロースMillipore C083、Millipore C048、Millipore C068、Millipore C083、Millipore C248が挙げられる。適切なMilliporeパッドの特定の系統はSureWick Product Lineである。他の適切な例は、GE Healthcare CF1、CF3、CF4 cotton linter、Whatman Fusion 5、Std 14及びStd15であり、ポリエステル検体-コンジュゲートパッドは、他の例である。図14は、イムノアッセイラテラルフロー検査ストリップ上のイムノアッセイヌクレオカプシド抽出試薬の事前配置の実施形態を説明する。
【０１３３】
試験化合物に対するノイラミニダーゼの感受性測定
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試験化合物に対するノイラミニダーゼの感受性測定を含む。試験化合物は、インフルエンザに対する抗ウイルス薬等の抗ウイルス薬を含む。実施形態において、ノイラミニダーゼの活性は、試験化合物の存在下及び非存在下で測定される。活性の比は、阻害値を決定するために用いられえて、阻害値は、ノイラミニダーゼが試験化合物に対して感受性であるか又は耐性であるかを決定するために、選択された阻害閾値と比較されうる。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、阻害値閾値は、特定の試験化合物に対して感受性又は耐性であるか既知の一団の異なるウイルスに関して阻害値を決定することにより決定されうる。各ウイルスに関する阻害値は、プロットされて、阻害閾値は、試験化合物に対して感受性であるウイルスの阻害値と、試験化合物に対して耐性であるウイルスの阻害値との間であると決定されうる。出願者は、予期しなかったことだが、インフルエンザA型とインフルエンザB型の阻害閾値が異なることを発見した。いくつかの実施形態において、ある種の試験化合物に関して、A型ウイルスは、B型ウイルスより低い阻害閾値を有する。いくつかの実施形態において、試料中のインフルエンザウイルスの型が既知である(例えば、A型又はB型)場合は、適切な阻害閾値レベルが、検査された化合物に対して適用されえて、それでアッセイの感度を有意に高めることができ、ほんの低レベルの薬物耐性を有するインフルエンザ株を、いかなる種類の薬物耐性も示さない株から分離する能力を可能にする。
【０１３５】
ノイラミニダーゼ検査カートリッジ
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、ノイラミニダーゼアッセイ用の検査カートリッジを含む。いくつかの実施形態において、試験薬及び/又は抗ウイルス薬等の試験化合物に対する感受性を決定するためのノイラミニダーゼアッセイは、マトリックスチャンバ及び試薬チャンバを備えるカートリッジ内で実施されうる。いくつかの実施形態において、カートリッジは、1つ又は複数の検査チャンバを含みうる。検査チャンバは、検体+試験化合物なしのアッセイ試薬;検体又は試験化合物なしのアッセイ試薬;検体+アッセイ試薬+試験化合物;及びアッセイ試薬+検体なしの試験化合物用のもう1つの検査チャンバを含みうる。いくつかの実施形態において、複数の試験化合物は検査され、各付加的な試験化合物(例えば第一、第二、第三、第四、等の試験化合物)のための、検体+アッセイ試薬+試験化合物、及びアッセイ試薬+検体なしの試験化合物用の付加的な検査チャンバが含まれる。検体+アッセイ試薬及び/又はアッセイ試薬用の対照検査チャンバは、カートリッジで検査される全ての試験化合物に関して利用されうる。いくつかの実施形態において、マトリックスチャンバは、検体を含有するために選択されたチャンバ等の、1つ又は複数の他のチャンバと流体連結している。いくつかの実施形態において、検査チャンバは、(1)検体、反応混合物及び試験薬を含む、薬物を用いる試験、(2)検体及び反応混合物を含む、薬物を用いない試験、(3)反応混合物を含む、反応混合物に関する対照、及び(4)反応混合物及び薬物を含む、試験薬に関する対照を含む。いくつかの実施形態において、他の対照が含まれうる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、液体試料は、マトリックスチャンバに添加される。液体試料は、マトリックスチャンバを通って、試料を含有するために選択されたチャンバへ、拡散、毛細管流動、及び重力から選択される1つ又は複数の力により流動する。チャンバ内で起きる反応からのシグナルは、光電子増倍管を用いて測定されうる。カートリッジの一例は図5に示される。
【０１３７】
インフルエンザウイルスを検出するための方法
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料と、インフルエンザウイルスA型又はインフルエンザウイルスB型を検出するためのイムノアッセイに適合させたイムノアッセイ緩衝液との接触、それによるイムノアッセイ検査試料の取得;イムノアッセイ検査試料の第一の部分の、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査ストリップへの接触、それにより試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出すること;イムノアッセイ検査試料の第二の部分と、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液を含むマトリックスとの接触、それによるノイラミニダーゼ検査試料の取得;及びノイラミニダーゼ検査試料と、ノイラミニダーゼアッセイとの接触、それにより試料中のノイラミニダーゼの存在を検出することを含む、インフルエンザウイルスを検出することを含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性のためのアッセイに適合性ではない。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性を阻害する。
【０１３８】
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、試料と、ノイラミニダーゼアッセイに適合させたノイラミニダーゼアッセイ緩衝液とを接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得ること;ノイラミニダーゼ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査ストリップへ接触させ、ここでノイラミニダーゼ検査試料は、イムノアッセイ緩衝液を含むマトリックスと接触し、それによりイムノアッセイ検査試料の取得及び試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出すること;並びにノイラミニダーゼ検査試料の第二の部分と、ノイラミニダーゼアッセイとを接触させ、それにより試料中のノイラミニダーゼの存在を検出することを含む、インフルエンザウイルスを検出するための方法を含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液は、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイに適合性ではない。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液は、インフルエンザA型及びインフルエンザB型からなる群から選択される抗原に対する抗体の特異的結合を阻害する。いくつかの実施形態において、マトリックスは、凍結乾燥したイムノアッセイ緩衝液を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液、及びノイラミニダーゼアッセイ用の試薬を含むマトリックスは、カートリッジ等の同一の容器内にある。いくつかの実施形態において、容器は、マトリックスを含むチャンバ、及びノイラミニダーゼアッセイ用の試薬を含むチャンバ等の複数のチャンバを備える。いくつかの実施形態において、マトリックスは、セファデックス及びセファロース等の架橋多糖を含む。いくつかの実施形態において、容器は、可搬式光電子増倍管等の光電子増倍管を用いて読取られることに適合させたマルチウェルカートリッジを備える。マルチウェルストリップ又はマルチウェルストリップ-樹脂のカートリッジは、次に各ウェルを検出器の真下に配置するレールを超えて動かされる。レールを超える動きは、休止してかつ各ウェルを数えることを可能にするようにプログラムされたステッピングモーターにより行われる。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイ検査試料及びノイラミニダーゼ検査試料は、重力、毛管作用、及び拡散から選択される1つ又は複数の力により容器に移される。
【０１４１】
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、(a)阻害値比を得ること、ここで該比は試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む;及び(b)阻害値比と阻害閾値とを比較し、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ活性の感受性を決定することを含む。阻害閾値を超える阻害値比は、ノイラミニダーゼ活性が試験化合物に対して感受性であり、従って、インフルエンザ株が試験化合物に対して感受性であることを意味し、閾値未満の比は、ノイラミニダーゼ活性が試験化合物に対して感受性ではなく、従って、インフルエンザ株が試験化合物に対して耐性であることを意味する。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型又はB型ウイルスの検出により決定される。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、試験化合物により決定される。いくつかの実施形態において、試験化合物は、インフルエンザを処置するために、試験化合物に対するノイラミニダーゼの感受性に従って選択されうる。いくつかの実施形態において、検査されるインフルエンザ株に罹患している患者は、ノイラミニダーゼが試験化合物に対して感受性である場合、試験化合物を摂取するように勧められうるか、又は試験化合物が患者に提供されうる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、シグナル伝達酵素を含む二重酵素アッセイを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する基質を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する阻害剤を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達酵素は、ルシフェラーゼを含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ルシフェラーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性のレベルは、光電子増倍管を用いて測定される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、抗ウイルス薬である。いくつかの実施形態において、試験化合物は、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、及びラニナミビルからなる群から選択される抗ウイルス薬である。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイを含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、試料は、ヒト等、インフルエンザ罹患の疑いがある対象等の対象から取得される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される組み合わせアッセイは、少なくとも2000 TCID50/ml、1000 TCID50/ml、500 TCID50/ml、200 TCID50/ml、100 TCID50/mlの感染量に関して、又はこれらの値の任意の2つにより定義される範囲のインフルエンザウイルスの検出限界を有する。モル基準で、開示される組み合わせ検査は、少なくとも1000fM、500fM、100fM、10fM、又はこれらの値の任意の2つにより定義される範囲のノイラミニダーゼを検出する能力を有する。
【０１４７】
処置を選択するための方法
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、(a)試料と、インフルエンザウイルスA型又はインフルエンザウイルスB型を検出するためのイムノアッセイに適合させたイムノアッセイ緩衝液とを接触させ、それによりイムノアッセイ検査試料を得ること;(b)イムノアッセイ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含むラテラルフロー検査ストリップへ接触させ、それにより試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出すること;(c)イムノアッセイ検査試料の第二部分と、ノイラミニダーゼアッセイ緩衝液を含むマトリックスとを接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得ること;(d)ノイラミニダーゼ検査試料と、ノイラミニダーゼアッセイとを接触させ、それにより試験化合物(例えばインフルエンザ抗ウイルス薬)に対するノイラミニダーゼ検査試料のノイラミニダーゼの感受性を決定すること、決定することは:(i)阻害値比の取得、ここで該比は試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む;及び(ii)阻害値比と阻害閾値とを比較し、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ活性の感受性を決定することを含む;並びに(e)ノイラミニダーゼ活性を阻害することが決定している試験化合物の選択又は同定を含む、インフルエンザウイルスに関する処置を選択するための方法を含む。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型又はB型ウイルスの検出により決定される。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性に関するアッセイに適合性ではない。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ緩衝液は、ノイラミニダーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態において、工程(c)及び(d)は、同一の容器内で実施される。いくつかの実施形態において、対象は、インフルエンザに罹患している疑いがある。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【０１４８】
本明細書で提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は:(a)試料と、ノイラミニダーゼアッセイに適合させたノイラミニダーゼアッセイ緩衝液とを接触させ、それによりノイラミニダーゼ検査試料を得ること;(b)ノイラミニダーゼ検査試料の第一の部分を、インフルエンザA型又はB型を検出するためのイムノアッセイを含む検査ストリップへ接触させ、ここでノイラミニダーゼ検査試料は、イムノアッセイ緩衝液を含むマトリックスと接触し、それによりイムノアッセイ検査試料の取得及び試料中のインフルエンザA型又はB型の有無を検出すること;並びに(c)ノイラミニダーゼ検査試料の第二の部分と、ノイラミニダーゼアッセイとを接触させ、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ検査試料のノイラミニダーゼの感受性を決定すること、決定することは:(i)阻害値比の取得、ここで該比は試験化合物の非存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルと比較した、試験化合物の存在下でのノイラミニダーゼ活性のレベルを含む、及び(ii)阻害値比と阻害閾値とを比較し、それにより試験化合物に対するノイラミニダーゼ活性の感受性を決定すること含む;並びに(e)ノイラミニダーゼ活性を阻害することが決定している試験化合物の選択を含む、インフルエンザウイルスに関する処置を選択するための方法を含む。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型又はB型ウイルスの検出により決定される。いくつかの実施形態において、マトリックスは、凍結乾燥したイムノアッセイ緩衝液を含む。いくつかの実施形態において、工程(c)は、同一の容器内で実施される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型又はB型ウイルスの検出により決定され、ここで第一の阻害閾値は、A型ウイルスが検出された場合に用いられ、第二の阻害閾値は、B型ウイルスが検出された場合に用いられる。いくつかの実施形態において、阻害閾値は、A型インフルエンザウイルスが検出された場合は、B型インフルエンザウイルスが検出された場合より低い。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、容器は、マトリックスを含むチャンバ、及びノイラミニダーゼアッセイ用の試薬を含むチャンバ等の複数のチャンバを備える。いくつかの実施形態において、マトリックスは、セファデックス及びセファロース等の架橋多糖を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、容器は、光電子増倍管を用いて読取られることに適合させたマルチウェルカートリッジ等の、カートリッジを備える。いくつかの実施形態において、光電子増倍管は可搬式である。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、シグナル伝達酵素を含む二重酵素アッセイを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する基質を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性は、シグナル伝達酵素に対する阻害剤を生成する。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼアッセイは、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン又はその誘導体とのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態において、シグナル伝達酵素は、ルシフェラーゼを含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性のレベルは、光電子増倍管を用いて測定される。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、試験化合物は、抗ウイルス薬である。いくつかの実施形態において、試験化合物は、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、及びラニナミビルからなる群から選択される抗ウイルス薬である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、試料は、対象から取得される。
【０１５６】
システム及びキット
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、インフルエンザウイルスを検出するための診断用のシステムを含む。いくつかの実施形態において、そのようなシステムは、試料中のノイラミニダーゼ活性を決定するためのカートリッジであって、決定用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、決定用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されているカートリッジ;及び試料中のインフルエンザA型又はB型を検出するための検査ストリップであって、ここで、検出用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、検出用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されているラテラルフローストリップ等の検査ストリップを含む。いくつかの実施形態において、そのようなシステムは、カートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第一の検出器;及び検査ストリップからのシグナルを測定するように構成されている第二の検出器も含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、カートリッジは、決定用の適合性の緩衝液を含むカートリッジマトリックスを含むマトリックスチャンバ、及びノイラミニダーゼ活性の決定用の試薬を含む試薬チャンバを備える。いくつかの実施形態において、カートリッジマトリックスは、架橋多糖を含む。いくつかの実施形態において、カートリッジマトリックスは、セファデックス及びセファロースからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、マトリックスチャンバ及びカートリッジチャンバは、マトリックスチャンバに入れられた試料が、マトリックスチャンバから試薬チャンバへ流動するように流体連結されている。いくつかの実施形態において、試料は、重力、毛管作用、及び拡散から選択される1つ又は複数の力によりカートリッジ内を流動する。いくつかの実施形態において、カートリッジは、光電子増倍管を用いて読取られるように適合させたマルチウェルカートリッジを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、検査ストリップは、イムノアッセイを含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイは、サンドイッチアッセイである。いくつかの実施形態において、検査ストリップは、検出用の適合性の緩衝液を含むマトリックスを含む。いくつかの実施形態において、マトリックスは、ニトロセルロースを含む。いくつかの実施形態において、検出用の適合性の緩衝液は、凍結乾燥されている。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、第一の検出器はルミノメーターを含む。いくつかの実施形態において、第一の検出器は反射率読取装置を含む。いくつかの実施形態において、第二の検出器は光電子増倍管を含む。いくつかの実施形態において、装置は、第一及び第二の検出器を含む。いくつかの実施形態において、第一及び第二の検出器は、同一である。いくつかの実施形態において、装置は可搬式である。いくつかの実施形態において、装置は手持ち操作式である。いくつかの実施形態において、ラテラルフローストリップ及びマルチウェルストリップ/樹脂カートリッジは、通常のプラットホーム上で2つの別々の検出様式で読取られるが、ID及びAST両方の結果を精査するための通常の動力源及び表示部を共有している。
【０１６０】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、インフルエンザウイルスを検出するための診断用のキットを含む。いくつかの実施形態において、そのようなキットは、試料中のノイラミニダーゼ活性を決定するためのカートリッジであって、決定用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、決定用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されているカートリッジ;及び試料中のインフルエンザA型又はB型を検出するための検査ストリップであって、検出用の適合性ではない緩衝液を含む試料を、検出用の適合性の緩衝液を含む試料に処理するように構成されている検査ストリップを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態は、カートリッジからのシグナルを測定するように構成されている第一の検出器;及び検査ストリップからのシグナルを測定するように構成されている第二の検出器も含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態は、ノイラミニダーゼ活性アッセイ用の試薬も含む。いくつかの実施形態において、ノイラミニダーゼ活性アッセイ試薬は、ルシフェラーゼ、N-アセチルノイラミン酸とルシフェリン又はその誘導体とのコンジュゲート、N-アセチルノイラミン酸とトリフルオロメチルケトン又はその誘導体とのコンジュゲート、及び抗ウイルス薬からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗ウイルス薬は、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、及びラニナミビルからなる群から選択される。
【０１６３】
いくつかの実施形態は、イムノアッセイ用の試薬も含む。いくつかの実施形態において、イムノアッセイ試薬は、インフルエンザA型抗原に特異的である抗体、及びインフルエンザB型抗原に特異的である抗体からなる群から選択される。
【実施例】
【０１６４】
(実施例1)
組み合わせアッセイ
この実施例は、インフルエンザA型又はB型検査、及びノイラミニダーゼ薬物耐性検査についてのワークフロー例を説明する。イムノアッセイ抽出緩衝液及び開口部付きの蓋を含むアプリケーター管;インフルエンザA型又はB型を同定するためのラテラルフローイムノアッセイを含む第一の検査装置;並びにノイラミニダーゼ薬物耐性を決定するための動的フローアッセイを含む第二の検査装置を備えるキットを、包装から解き、各要素に患者の個人識別についてのラベルを付ける。検体は、スワブを用いて患者の鼻から採取される。スワブを抽出緩衝液内に挿入し、内壁に当てて3回、回転する。スワブを、管壁を圧迫しながら抽出緩衝液から取り去り、次に廃棄する。アプリケーター管の蓋を管に装着する。
【０１６５】
アプリケーター管の上下を逆にし、抽出緩衝液3滴(約85μl)を蓋を通して押出し、第一の検査装置に適用する。第一の検査装置は、第一の検査用の第一の検査緩衝液を含む検出器試薬と重なり合わない検体パッドを備える。検体は、第一の検査装置の検査部位内に第一の検査緩衝液を介して拡散する。第一検査装置を、10分間インキュベートし、第一の検査の結果を、読取装置を用いて測定する。読取装置は、試料中にA型又はB型インフルエンザウイルスが存在するかどうかの表示を提供する。
【０１６６】
アプリケーター管の上下を逆にし、残りの抽出緩衝液を蓋を通して押出し、第二の検査装置に適用する。この検査において、ノイラミニダーゼの増加はルシフェラーゼシグナルの増加という結果をもたらす。第二の装置は、緩衝液交換チャンバ(別称マトリックスチャンバ)及び反応チャンバを備える。検体は、緩衝液交換チャンバを通って、ノイラミニダーゼ薬物耐性アッセイ用の反応チャンバへ拡散する。阻害値は、反応混合物及び試験薬により生み出されるシグナルのバックグラウンドレベルを考慮した、試験薬を用いたシグナルと、試験薬なしのシグナルとの比である。反応チャンバは、TABLE5A(表6)に示される。
【０１６７】
【表６】
0006591398.tif 000021
【０１６８】
第二の検査装置を、インキュベートし、各チャンバからのシグナルを光電子増倍管を用いて測定する。阻害値を、各反応チャンバからのシグナルから、以下の式:
【０１６９】
【数１】
0006591398.tif 000022
【０１７０】
を用いて決定する。
【０１７１】
各抗ウイルス試験薬に関する薬物感受性閾値レベルは、第一の検査で決定されたインフルエンザの型、及び用いられた抗ウイルス試験薬に従って選択される。阻害値が阻害値閾値より低い場合は、ノイラミニダーゼは、抗ウイルス試験薬に対して感受性であると決定される。
【０１７２】
(実施例2)
光電子増倍管装置の感度
この実施例は、Hamamatsu TO-Can光電子増倍管装置の感度、及び可搬式で手持ち操作式システムにおいて読取れる低暗ノイズを取り去る能力を実証する。発光量(RLU)は、Hamamatsu TO-Can光電子増倍管装置を用いて、さまざまな濃度の陽性化学発光シグナル発生対照試薬(Cell Titer Glo)に関して測定された。対照は、バックグラウンド対照及び暗計数対照を含んだ。結果は、図6に示される。
【０１７３】
(実施例3)
二重酵素アッセイ
この実施例は、ザナミビルに対して感受性であり、かつオセルタミビルに対して耐性であるノイラミニダーゼを含むA/ミシシッピ(Mississippi)/03/2001 A(H1N1) H275Y試験株に関する二重酵素アッセイを実証する。試験株を含む検体は、1/3000又は1/9000に希釈され、動的フロー検査装置に適用された。動的フロー検査アッセイの検査チャンバは、TABLE5A(表6)のものを含み、すなわち:(1)反応混合物+検体;(2)反応混合物+検体+抗ウイルス試験薬;(3)対照:反応混合物;及び(4)対照:反応混合物+抗ウイルス試験薬であった。各検査チャンバからのシグナルは、光電子増倍管装置を用いて測定された。結果は、図7に示される。該アッセイにより、試験株は、ザナミビルに対してオセルタミビルよりもより感受性であることが示された。
【０１７４】
(実施例4)
さまざまなインフルエンザA株の感受性
この実施例は、オセルタミビルに対して感受性又は耐性であることが既知のA型インフルエンザウイルスのパネルに関する阻害閾値レベルの決定を実証する。検体は、さまざまなインフルエンザA株のさまざまな希釈物から調製され、オセルタミビルについて動的フロー検査装置に適用された。動的フローアッセイに関する検査チャンバは、TABLE5A(表6)のものを含み、すなわち:(1)反応混合物+検体;(2)反応混合物+検体+抗ウイルス試験薬;(3)対照:反応混合物;及び(4)対照:反応混合物+抗ウイルス試験薬であった。各検査チャンバからのシグナルは、光電子増倍管を用いて測定された。各株に対する阻害値を、実施例1におけるように決定した。阻害値を、各株のさまざまな希釈物に関してグラフ上にプロットし、阻害値閾値をグラフから決定した。薬物感受性と薬物耐性とを識別するための阻害値閾値、又はカットオフ値は、約0.6であった。カットオフは、薬物感受性株からのエラーバーが、インフルエンザ耐性株と重複しない場合の値である決定された。図8を参照のこと。
【０１７５】
(実施例5)
さまざまなインフルエンザB株の感受性
この実施例は、オセルタミビルに対して感受性又は耐性であることが既知のA型インフルエンザウイルスのパネルに関する阻害閾値レベルの決定を実証する。検体を調製し、実施例4におけるように検査した。各株に関する阻害値を決定した。阻害値を、各株のさまざまな希釈物に関してグラフ上にプロットし、阻害値閾値をグラフから決定した。薬物感受性と薬物耐性とを識別するための阻害値閾値、又はカットオフ値は、約1.55である。図9を参照のこと。
【０１７６】
(実施例6)
ラテラルフローアッセイに関する緩衝液交換の影響
この実施例は、動的フローノイラミニダーゼアッセイ緩衝液からの緩衝液交換後の、検体中のインフルエンザA型又はB型を決定するためのラテラルフローイムノアッセイの感度を実証する。インフルエンザウイルス:A/PR/8/34、B/フロリダ(Florida)/4/2006、及びA/テキサス(Texas)/12/2007のさまざまな希釈物の検体を、(1)添付文書に従ってラテラルフローVeritor(商標)アッセイ、又は(2)動的フローアッセイ抽出緩衝液から、ラテラルフローパッド内に存在するイムノアッセイ抽出緩衝液に緩衝液交換した、ラテラルフローVeritor(商標)アッセイを用いて検査した。シグナルを測定し、読取装置は、各試料中のインフルエンザA型及び/又はB型の有無の決定を提供した。TABLE6(表7)は、結果の概要を示す。特に、インフルエンザA型又はB型は、添付文書に従ってVeritor(商標)アッセイより、緩衝液交換を伴うVeritor(商標)についてのプロトコルを用いたアッセイの、より希釈した検体において同定された。
【０１７７】
【表７】
0006591398.tif 000023
【０１７８】
(実施例7)
イムノアッセイ及び二重酵素(DE)アッセイの感度
オセルタミビルを用いたVeritorイムノアッセイ及び二重酵素ノイラミニダーゼ動的フローアッセイを、インフルエンザウイルス:A/パース(Perth)/211/2001 WTのさまざまな希釈物に関して実施した。TABLE7(表8)は、2つの実験の結果を要約する。これらの結果は、イムノアッセイ抽出緩衝液中の検体を、ノイラミニダーゼ活性緩衝液を用いて予備平衡化したG25Mセファデックス樹脂に適用することは、標準(Std)DEアッセイの感度に悪影響を与えないことを実証する。Std DEアッセイは、臨床的に関連がある検体濃度で、薬物感受性結果を提供することができた。
【０１７９】
【表８】
0006591398.tif 000024
【０１８０】
(実施例8)
混合インフルエンザ検体中の薬物耐性検出
検体のさまざまな希釈物は、抗ウイルス薬、オセルタミビルを用いる動的フローアッセイを用いてアッセイされた。検体は、A/ベテスダ(Bethesda)(H3N2 R);A/フクイ(Fukui)(H3N2 S);及びA/ベテスダ(Bethesda)(V)+Aフクイ(Fukui)(WT)の混合物を含んだ。シグナルを光電子増倍管を用いて測定し、阻害値を決定した。結果は、図10に要約する。これらの結果は、Std Dual Enzyme AST Detection Chemistryは、インフルエンザAとインフルエンザBとを区別するアッセイ(最も適切な阻害値が適用されることが可能)に続き、単一光子検出を伴うPMTを用いて、バックグラウンド減算を適用する場合、薬物感受性株と共に検体中に存在する場合、薬物耐性株を同定しうることを実証する。
【０１８１】
(実施例9)
二重酵素アッセイの比較
この実施例は、2つのタイプの二重酵素アッセイの感度を比較する。精製インフルエンザH3N2ノイラミニダーゼのさまざまな希釈物を、(1)ルシフェラーゼに対する前駆物質阻害剤であるノイラミニダーゼ基質(NANA-CF3;図11を参照のこと);及び(2)ルシフェラーゼに対する前駆物質基質であるノイラミニダーゼ基質(N-アセチルノイラミン酸とルシフェリンとのコンジュゲート)のいずれかを含む二重酵素アッセイを用いてアッセイした。ノイラミニダーゼ活性は、NANA-CF3をエステラーゼ阻害剤、CFCへと切断する。エステラーゼがルシフェラーゼを含むアッセイにおいて、ノイラミニダーゼ活性は、ルシフェラーゼ活性を阻害する、CFC阻害剤の存在下で、ルシフェラーゼ基質の発光生成物への変換の減少という結果となる。図12を参照のこと。アッセイの結果は、図13に示される。アッセイ(1、マスクされた阻害剤を用いた二重酵素アッセイ)に関する検出レベル(LOD)は、約10pMであった。対照的に、アッセイ(2、標準二重酵素アッセイ)に関する検出レベルは、0.1pM未満であった。
【０１８２】
(実施例10)
バックグラウンドシグナルに関する対照の影響
この実施例は、抗ウイルス薬の存在下でのノイラミニダーゼ活性の阻害値の計算における、実施例1の式に記載されたバックグラウンドレベルの減算の影響を実証する。阻害値を、実施例1のように特定の抗ウイルス薬を用いて、さまざまな濃度の特定のウイルス株に関して決定した。バックグラウンド減算なしの阻害値を、反応混合物+検体+抗ウイルス試験薬(薬物を用いた試験)、及び反応混合物+検体(薬物なしの試験)を含有するチャンバからのシグナルに関して、以下の式:
【０１８３】
【数２】
0006591398.tif 000025
【０１８４】
を用いて決定した。
【０１８５】
結果は、TABLE8(表9)に示される。TABLE8(表9)において、左から右への列は、ウイルスの濃度減少からの結果である。実施例1に示す、阻害値の計算におけるバックグラウンドレベルの減算は、アッセイの感度を高める。
【０１８６】
【表９】
0006591398.tif 000026
【０１８７】
本明細書で用いられる用語「含んでいる(comprising)」は、「含んでいる(including)」、「含有する(containing)」、又は「特徴とする(characterized by)」と同義であり、かつ包括的であり又は制約がなく、付加的な、非引用の要素又は方法工程を除外しない。
【０１８８】
上述の記載は、本発明のいくつかの方法及び物質を開示する。本発明は、方法及び物質の修正、同様に方法及び設備の製作における変更も受け入れる。そのような修正は、本開示の考察又は本明細書に開示される本発明の実践から、当業者にとって明白となりうる。従って、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び精神の内に入る、全ての修正及び代替を包含することを意図する。
【０１８９】
本明細書に引用される全ての参照は、発表済み及び未発表の出願、特許、及び文献参照を含むが、これらに限定されず、その記載内容全体が参照により本明細書に組み込まれ、それにより本明細書の一部を成す。参照により組み込まれる出版物及び特許又は特許出願が、本明細書に含まれる開示に矛盾する範囲において、本明細書は、そのようないかなる矛盾材料にも優先しかつ/又は先行することを意図する。
【図１】
0006591398.tif 000035
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006591398.tif 000041
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006591398.tif 000045
【図１２】
0006591398.tif 000046
【図１３】
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【図１４】
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