(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)、(b)及び(c)の工程を含む、多能性幹細胞からの色素幹細胞の製造方法。
(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程
(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程
(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程
【請求項２】
工程(b)が、多能性幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニスト、幹細胞因子（SCF）、エンドセリン-3（ET-3）、cAMP誘導剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含有する培地中で培養することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法により得られる色素幹細胞。
【請求項６】
下記の特徴(A)〜(H)を有する色素幹細胞。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Fzd4、Fzd7及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H)チロシナーゼの発現は有さない
【請求項７】
請求項５又は６に記載の色素幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニストの存在下で培養する工程を含む、メラノサイトの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から色素幹細胞を製造する方法、及び色素幹細胞からメラノサイトを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノサイトは、発生過程において神経堤に由来し、メラニンを産生する細胞である。メラノサイトは、皮膚においては表皮の基底層及び毛球に存在し、皮膚や毛髪にメラニンを供給する。メラノサイトによるメラニン合成が低下又は消失することや、メラノサイトが消失することにより、眼皮膚白皮症（アルビニズム）や尋常性白斑など、先天性又は後天性の色素異常症が発症することが知られている。しかし、メラノサイトは分化の過程や機能において、未知の部分が多い。
【０００３】
従ってメラノサイトは、眼皮膚白皮症や尋常性白斑などの色素異常症の病態解析若しくは治療法開発研究、又は化粧品開発などの分野で高いニーズがある。しかし、メラノサイトの単離培養には高度な技術を要し、また成人から単離されたメラノサイトでは増殖能が低いなどの問題がある。そのため、メラノサイトを単離及び培養維持する技術が求められている。
【０００４】
近年、Fzd4、Fzd7及びCD34をマーカータンパク質とすることで、C57BL/6マウスの皮膚組織から、メラノサイトに分化可能な幹細胞を分離する方法が報告された（特許文献１）。しかし、皮膚組織由来の幹細胞は、供給元に限りがあるため、大量調製の点で問題がある。またヒト生体内において、色素幹細胞が同定されたとの報告はなく、マウスと同じように皮膚組織から色素幹細胞を分離できるかについては、不明である。
【０００５】
一方で、人工多能性幹細胞（iPS細胞）や胚性幹細胞（ES細胞）などの多能性幹細胞から、メラノサイトを製造する方法が報告されている（特許文献２、非特許文献１、２）。しかし、多能性幹細胞からメラノサイトを製造するには２０〜４０日程度の日数を要し、効率も低い。また多能性幹細胞から色素幹細胞に分化誘導する方法については、報告がされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１３−５２０１６３号公報
【特許文献２】特開２０１５−１４６８０３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ohta S et al., PLos One, 6: 1-10 (2011)
【非特許文献２】Nishimura EK et al., Nature, 416: 854-860 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、多能性幹細胞から色素幹細胞を製造する方法を提供すること、及び多能性幹細から誘導可能な色素幹細胞を提供することを課題とする。また、色素幹細胞からメラノサイトを製造する方法を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、多能性幹細胞から胚様体を形成させ、胚様体をメラノサイトへの分化誘導をする条件下で一定期間培養し、その後分化誘導を中止してメラノサイト維持培養条件下で培養することで、メラノサイトへ分化可能な細胞を製造できることを発見した。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は以下の通りのものである。
[１]  以下の(a)、(b)及び(c)の工程を含む、多能性幹細胞からの色素幹細胞の製造方法。
(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程
(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程
(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程
[２]  工程(b)が、多能性幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニスト、幹細胞因子（SCF）、エンドセリン-3（ET-3）、cAMP誘導剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を含有する培地中で培養することにより行われる、[１]に記載の方法。
[３]  培地中にさらにBMP4を含有する、[２]に記載の方法。
[４]  Wntシグナル経路アゴニストがCHIR99021又はWnt 3Aである、[２]又は[３]に記載の方法。
[５]  工程(b)の培養を２〜４週間行う、[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。
[６]  多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。
[７]  多能性幹細胞がヒト由来である、[１]〜[６]のいずれかに記載の方法。
[８]  [１]〜[７]のいずれかに記載の方法により得られる色素幹細胞。
[９]  下記の特徴(A)〜(H)を有する色素幹細胞。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Fzd4、Fzd7及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H) チロシナーゼの発現は有さない
[１０]  [８]または[９]に記載の色素幹細胞を、Wntシグナル経路アゴニストの存在下で培養する工程を含む、メラノサイトの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の色素幹細胞は、メラノサイトへと分化させる効率が非常に高く、活発な増殖力を有し、長期の継代培養や凍結解凍を繰り返して培養することが可能で、質的にも同様に安定して維持されるものである。この色素幹細胞を用いることで、メラノサイトを容易かつ安定に量的制限なく得ることができる。
【００１２】
本発明の色素幹細胞やメラノサイトは、眼皮膚白皮症、尋常性白斑、老人性色素斑などの色素異常症の病態解析に用いることができ、またこれらの色素異常症の治療用医薬品又は美白用化粧品の開発において、スクリーニングに用いることができる。
【００１３】
特に、色素異常症の患者由来のヒトiPS細胞から製造した色素幹細胞は、メラノサイトの表現型についての病態解析や治療薬開発にとって有用である。iPS細胞の段階、又は色素幹細胞の段階で遺伝子操作を容易に行うことが可能であるため、このような色素幹細胞を製造する方法は、再生医療にとっても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、色素幹細胞を製造するためのスキームを示す。
【図２】図２は、工程（ｂ）による分化誘導後１４日目の細胞の代表的な形態を示す。
【図３】図３は、本発明の方法により製造された色素幹細胞の代表的な形態を示す。
【図４】図４は、本発明の方法により製造された色素幹細胞の代表的な形態を示す。
【図５】図５は、色素幹細胞の増殖曲線を示す。
【図６】図６は、色素幹細胞の遺伝子発現を示す。図中、直接分化させたメラノサイトとは、工程(c)を経ずに工程(b)から直接メラノサイトに分化させたメラノサイトを意味する（以下同様）。縦軸は、相対的な遺伝子の発現レベルを示す。FZD4、FZD7遺伝子における４つの棒グラフは、左から順に色素幹細胞１、色素幹細胞２、直接分化させたメラノサイト、正常黄色人種メラノサイトから得られた結果を、CD34遺伝子における５つの棒グラフは、左から順にiPS細胞、色素幹細胞１、色素幹細胞２、直接分化させたメラノサイト、正常黄色人種メラノサイトから得られた結果を示す。
【図７】図７は、凍結解凍後の色素幹細胞の生存率グラフを示す。
【図８】図８は、色素幹細胞から製造されたメラノサイトの形態を示す。
【図９】図９は、未分化マーカーの遺伝子の発現の結果を示す。縦軸は、相対的な遺伝子の発現レベルを示す。各遺伝子における６つの棒グラフは、左から順にiPS細胞、色素幹細胞１、色素幹細胞２、直接分化させたメラノサイト、本発明のメラノサイト、正常黄色人種メラノサイトから得られた結果を示す。
【図１０】図１０は、メラノサイト特異的マーカーの遺伝子発現の結果を示す。縦軸は、相対的な遺伝子の発現レベルを示す。各遺伝子における６つの棒グラフは、左から順にiPS細胞、色素幹細胞１、色素幹細胞２、直接分化させたメラノサイト、本発明のメラノサイト、正常黄色人種メラノサイトから得られた結果を示す。
【図１１】図１１は、色素幹細胞、本発明のメラノサイト、正常黄色人種メラノサイトの電子顕微鏡によるメラニン産生評価の結果を示す。
【図１２】図１２は、色素幹細胞をケラチノサイト分化培地又はメラノサイト分化培地で２週間培養した細胞の蛍光免疫染色の結果を示す。PAM細胞（マウス由来培養表皮細胞株）を、ケラチノサイトのマーカーであるサイトケラチン14(CK14)に対する免疫染色の陽性コントロールとして用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、多能性幹細胞からの色素幹細胞の製造方法（以下、「本発明の製法」ともいう。）を提供する。本発明の製法は、以下の(a)ないし(c)の工程を含む。
(a) 多能性幹細胞から浮遊培養により胚様体を形成させる工程
(b) 工程(a)により得られた細胞を、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで、メラノサイトへの分化を誘導する条件下で培養する工程
(c) 工程(b)により得られた細胞を、メラノサイトの維持培養条件下で培養する工程
【００１６】
幹細胞とは、自己複製能と分化した細胞をつくる能力を併せもった細胞を意味する。
多能性幹細胞とは、in vitroで培養することが可能で、かつ三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖幹細胞（EG細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、iPS細胞またはES細胞である。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能であり、人工多能性幹細胞の作製方法としては、例えばCell, 131(5): 861-872 (2007)やCell, 126(4): 663-676 (2006)に記載の方法が挙げられる。
【００１７】
多能性幹細胞としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類由来の細胞、及びヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の色素幹細胞やメラノサイトが、ヒトの色素異常症の病態解析又は治療法開発などの目的で用いられる場合には、ヒト由来の多能性幹細胞が好ましい。
【００１８】
本発明の色素幹細胞やメラノサイトがヒトの再生医療用途に用いられる場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人又はHLAの型が同一若しくは実質的に同一である他人由来のiPS細胞が好ましい。
【００１９】
多能性幹細胞としてiPS細胞を用いる場合には、iPS細胞は自体公知の方法により体細胞から製造してもよいし、既に樹立されているiPS細胞を用いてもよい。
【００２０】
あるいは、多能性幹細胞は、ヒトの遺伝子疾患の原因となる突然変異、特に皮膚の遺伝子疾患の原因となる突然変異を有していてもよい。
【００２１】
本明細書において「色素幹細胞」とは、メラノサイトへ分化可能な幹細胞を意味し、以下の性質(A)〜(H)により特徴付けられる。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Frizzled-4(Fzd4)、Frizzled-7(Fzd7)及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H)チロシナーゼの発現は有さない
【００２２】
メラノサイト（色素細胞やメラニン細胞とも呼ばれる）とは、チロシナーゼ活性があり、メラニンを産生する細胞であって、メラニン合成のための細胞内小器官（メラノソーム）を有する、形態学的には樹枝状の細胞でその樹状突起の形状は環境によって変化する細胞を意味する。
【００２３】
工程(a)の多能性幹細胞から胚様体を形成する工程は、自体公知の方法により行うことができ、例えば、多能性幹細胞を、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)などの増殖因子を添加していない非接着培養皿上に播種して、浮遊培養する方法により行うことができるが、これに限定されない。これらの方法は、例えば上記特許文献２、非特許文献１などに開示されている。
【００２４】
浮遊培養とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味する。本発明の浮遊培養に用いることができる培地として、例えば霊長類ES/iPS細胞用培地（REPROCELL社製）が挙げられるが、多能性幹細胞を培養することが可能な培地であれば、浮遊培養に用いることができる。
【００２５】
工程(a)で使用される培地としては、例えば、ダルベッコ改変最小必須培地（DMEM）、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが挙げらるが、これらに限定されない。多能性幹細胞の生存率を上昇させるため、Rho結合キナーゼ（ROCK）の阻害剤（例えば、Y-27632、Fasudil）又はミオシンの阻害剤（例えば、ブレビスタチン）を添加してもよい。
【００２６】
培養開始時の多能性幹細胞の培地中の密度は、特に限定されないが、例えば約8000〜9000細胞/mlとすることができる。
【００２７】
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。培養は、胚様体が形成されるのに十分な期間行えばよいが、通常、約２週間程度で胚様体が形成される。
【００２８】
工程（ｂ）の培養は、培養皿上に播種し、接着培養により行うことができる。基礎培地には、工程(a)と同様の培地を用いることができる。培養皿は、細胞接着因子等でコートされていてもよい（例えば、フィブロネクチンコート、ラミニンコート）。
【００２９】
一実施態様において、工程(b)の培養は、胚様体を分散してフィブロネクチンでコートした培養皿に播種し、接着培養することで行うことができる。
【００３０】
工程(b)のメラノサイトへの分化誘導は、自体公知の方法により行うことができ、例えばメラノサイトへの分化に必要な因子を胚様体に接触させることにより行うことができる。
【００３１】
メラノサイトへの分化に必要な因子としては、Wntシグナル経路アゴニスト、幹細胞因子（SCF）、エンドセリン-3（ET-3)、cAMP誘導剤及び塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)などを挙げることができるが、これらに限定されない。好適なWntシグナル経路アゴニストとしては、Wntファミリーに属するタンパク質（例えば、Wnt 1、Wnt 3A、Wnt 7A）や、グリコーゲン合成酵素-3β（GSK-3β）の阻害剤であるCHIR99021、ケンパウロンなどが挙げられる。また、コレラ毒素のようにcAMPの合成を誘導する因子、又はdbcAMPのようにcAMPと同様の機能を有する因子などを、cAMP誘導剤として用いることができる。さらにBMPシグナル経路アゴニスト（例えばBMP2、BMP4、BMP7）を培地に添加してもよい。
【００３２】
好適な実施態様において、工程(b)は、Wntシグナル経路アゴニスト、SCF、ET-3、cAMP誘導剤及びbFGFを含む培地中で胚様体を培養することにより行うことができる。
【００３３】
別の好適な実施態様において、工程(b)は、CHIR99021、SCF、ET-3、BMP4、dbcAMP及びbFGFを含む培地中で胚様体を培養することにより行うことができる。
【００３４】
これらの因子の濃度は、組み合わせ等により変化する場合があるが、メラノサイトへの分化誘導可能な濃度であればよい。典型的には、CHIR99021の濃度は3μM、SCFの濃度は50ng/mL、ET-3の濃度は100nM、bFGFの濃度は4ng/mL、dbcAMPの濃度は500μM、BMP4の濃度は25ng/mLである。
【００３５】
これらの因子がタンパク質である場合には、当該因子の細胞との接触は、当該因子を細胞の培養培地に直接添加する他、当該因子を産生する細胞をフィーダー細胞として用いて共培養することもできる。
【００３６】
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。工程（b）の培養は、図２で示されるような紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が出現し始めるまで行われるが、典型的な期間としては、約２〜４週間であり、好ましくは１４〜２１日間である。また、工程(c)で用いる「工程(b)により得られた細胞」には、黒褐色の顆粒を含有する細胞、及び／又は培地中に存在する他の種類の細胞が含まれ得る。
【００３７】
工程(c)で用いられるメラノサイトの維持培養培地は、メラノサイトの成長、増殖および生存に必要な栄養素を含む培地であり、例えば成長因子を添加したMedium 254培地（Invitrogen社）、又はダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）とMCDB-201を混合した培地が挙げられるが、メラノサイトを維持培養できる培地であれば、これらに限定されない。
【００３８】
培養温度は、特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。工程（c）の培養は、７〜２８日間、好ましくは７〜１４日間行う。
【００３９】
工程(c)により得られた細胞が色素幹細胞であることの確認は、目視による形態観察により行うことができる。より正確を期すために、Fzd4、Fzd7又はCD34などの色素幹細胞マーカーのmRNAやタンパク質の発現レベルを、自体公知の方法により測定することで確認してもよい。
【００４０】
このようにして得られる色素幹細胞は、以下の性質(A)〜(H)を有することを特徴とする。
(A) 多能性幹細胞由来である
(B) メラノサイトへの分化能を有する
(C) 自己複製能を有する
(D) Frizzled-4(Fzd4)、Frizzled-7(Fzd7)及びCD34を発現している
(E) 細胞形態は類円形ないし多角形であり、細胞質が豊富で核はほぼ中央部に位置する
(F) ケラチノサイト増殖因子の存在下で培養しても、ケラチノサイトへ分化しない
(G) 凍結保存可能である
(H)チロシナーゼの発現は有さない
従って、本発明はまた、上記(A)ないし(H)の特徴を有する色素幹細胞（以下、「本発明の色素幹細胞」という。）を提供する。前記特許文献１に開示されるような、皮膚組織から単離された従来公知の色素幹細胞は、メラノサイトだけでなく、ケラチノサイト（角化細胞とも呼ばれ、ケラチンを産生し、皮膚組織においては表皮細胞の大部分を占める細胞）を含む多様な細胞種に分化可能なより未分化なステージの細胞であるのに対し、本発明の色素幹細胞は、少なくとも既知の分化誘導条件下においてケラチノサイトへの分化能力を有さず、よりメラノサイト方向へ分化ステージが進んだ細胞である点で、新規な細胞であり、なおかつ自己複製能を保持しているため、大量増幅させた後、分化誘導を行うことにより、より迅速に大量のメラノサイトを供給することが可能である。しかも、多能性幹細胞から分化誘導可能であるため、皮膚組織からの煩雑な単離工程を経ることなく、迅速かつ簡便に作製することができる。
【００４１】
本明細書において「自己複製能を有する」とは、少なくとも9継代、上記(A)ないし(H)の特徴を保持しつつ、増殖速度が維持されていることを意味する。
【００４２】
「類円形」とは、円形に類する形状を意味する。類円形には、円形の形状は元より、楕円形状や、円形と近似できる形状も含まれる。また、多角形には、特に四角形〜八角形と近似できる形状が含まれるが、角がとれている場合もある。
【００４３】
「細胞質が豊富」であるとは、例えば、核／細胞質比（Ｎ／Ｃ比）が１／３以下、好ましくは１／３〜１／４程度であることを意味する。Ｎ／Ｃ比は、細胞の核の容積を細胞質容積で割った値として算出することができる。また、本発明の色素幹細胞は、核がほぼ中央部に位置することでも特徴づけられる。
【００４４】
「凍結保存可能である」とは、凍結解凍後もメラノサイト分化能及び自己複製能が維持されることを意味する。
【００４５】
本発明の色素幹細胞は、自体公知の方法により凍結することが可能である。凍結方法としては、例えば凍結保存液にジメチルスルホキシド、グリセロールなどの凍結保護剤を添加し、細胞を急速に凍結する方法が挙げられるが、これに限定されない。凍結保存は、市販品、例えばセルバンカー１プラス(タカラバイオ)を用いて行うこともできる。
【００４６】
本発明はまた、色素幹細胞からのメラノサイトの製造方法を提供する。
【００４７】
色素幹細胞からメラノサイトへの分化誘導は、特に限定されないが、例えば工程(b)について上述した方法と同様の方法により行うことができる。
【００４８】
典型的には、色素幹細胞からメラノサイトへの分化誘導は、色素幹細胞をWntシグナル経路アゴニストの存在下で１週間以上培養することにより行う。
【００４９】
色素幹細胞から誘導された細胞がメラノサイトであることの確認は、目視による形態観察により行うことができる。より正確を期すために、チロシナーゼ活性の測定、遠心分離によるペレットの観察、透過電子顕微鏡による観察、又はSRY(sex-determining region Y)-box 10（SOX10）、小眼球症関連転写因子（MITF）若しくはチロシナーゼ（TYR）などのメラノサイトマーカーの発現レベルを測定する方法、などの自体公知の方法により行うことができる。これらの方法は、例えば特許文献２、非特許文献１などに開示されている。
【００５０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
実施例１  色素幹細胞の製造
ヒトiPS細胞を非接着培養皿上に播種し（50〜200細胞/ml）、霊長類ES/iPS細胞用培地中で２週間培養することで、胚様体を形成させた。その後胚様体をフィブロネクチンでコートした接着培養皿上に播種し、3μM  CHIR99021（Stemgent）、50 ng/ml   SCF（R＆D）、100 nM  ET-3（American Peptide Company）、500μM  dbcAMP（Sigma）、50 nM TPA(12-テトラデカノイルホルボール 13-アセタート（Sigma）、4 ng/ml  bFGF（Wako）、100 μM  L-アスコルビン酸（Sigma）、0.05 μM  デキサメタゾン（Sigma）、1 mg/ml リノール酸-ウシ血清（Sigma）、及び1Xインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム（Sigma）を加えたメラノサイト維持培地（Medium 254培地（Invitrogen社製）にHuman Melanocyte Growth Supplement（HMGS）（Invitrogen社製）を添加した培地）で培養し、メラノサイトへの分化を誘導した。この間、２〜３日に一度培地を交換した。分化誘導をしてから１４日後に、紡錘形で黒褐色の顆粒を含有する細胞が顕微鏡観察により認められたため分化誘導を中止し、分化誘導因子を含んでいないメラノサイト維持培地に切り替えて細胞を培養した。分化誘導を中止してから７日後に、培地中に色素幹細胞が認められた。
【００５２】
実施例１における、メラノサイトへの分化誘導をしてから１４日後の細胞の形態を図２に示す。また、実施例１で製造した色素幹細胞の代表的な形態を、図３〜図４に示す。図３の細胞では、類円形の形態が、図４の細胞では角がとれている形態も観察されたが、六角形〜八角形の形態が観察された。
【００５３】
実施例２  色素幹細胞の遺伝子解析
培養色素幹細胞からトライゾール、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNAを 回収し、Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) にてcDNAへ 逆転写した。生成したcDNAを用いてLightCycler 480 Probe (Roche) および各遺伝子プライマー(lifetechnology) を使用し、Light cycler 480II(Roche) にてリアルタイム RT-PCRを実施した。結果を図６、９、１０に示す。
【００５４】
図６より、色素幹細胞はFzd4、Fzd7 及びCD34を発現していることが認められた。また、図９より未分化マーカーであるNANOG及びOCT4、並びに図１０よりメラノサイト特異的マーカーであるSOX10、MITF及びTYRはほとんど認められなかった。
【００５５】
実施例３  色素幹細胞の継代培養
100%コンフルエントに達した色素幹細胞を0.5×TrypLE Select(Gibco)にて剥がしたあと血清を含む培地で失活させ、800rpm 22℃ 5分遠心分離で沈殿させた。上清を吸引後メラノサイト維持培地で懸濁し、ファイブロネクチンコートディッシュに播種した。培養は、37℃  5% CO2環境下で行った。 
【００５６】
図５は、実施例３による色素幹細胞の増殖曲線を示す。
【００５７】
実施例１で製造した色素幹細胞は、少なくとも、分化能については9継代、増殖については9継代維持されることが認められた。
【００５８】
実施例４  色素幹細胞の凍結保存
実施例１で製造した色素幹細胞を、セルバンカー１プラス(タカラバイオ)を用いて凍結した。凍結した細胞を急速解凍後、実施例３の継代培養と同様にメラノサイト維持培地中で培養することで、色素幹細胞が増殖することを確認した。また、この細胞を実施例５と同様に培養することで、メラノサイトへ分化することを確認した。凍結解凍後の色素幹細胞の生存率を図７に示す。
【００５９】
実施例５  メラノサイトへの分化誘導
実施例１で製造した色素幹細胞を、3μM CHIR99021(stemgent)を添加したメラノサイト維持培地（メラノサイト分化培地）中で培養することで、メラノサイトへ分化させた。得られたメラノサイトの形態を図８に示す。
【００６０】
実施例６  メラノサイトの遺伝子解析、評価
培養メラノサイトからトライゾール、クロロホルム、イソプロパノールを用いてRNAを回収し、Transcriptor 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) にてcDNAへ逆転写した。生成したcDNAを用いてLightCycler 480 Probe (Roche) および各遺伝子プライマー(lifetechnology) を使用し、Light cycler 480II(Roche) にてリアルタイム RT-PCRを実施した。結果を図９、１０に示す。
【００６１】
実施例７  ケラチノサイトへの分化誘導
色素幹細胞を特許文献１を倣い、表皮角化細胞培地（HumediaKG2 クラボウ社）に増殖用添加剤（HumediaKG クラボウ社）を添加した培地（ケラチノサイト分化培地）にて、３７℃、５％CO2の条件で２週間培養した。培養液は２〜３日毎に新鮮な培地に交換した。２週間培養後、細胞を4％パラホルムアルデヒド溶液にて固定し、CK14抗体にて蛍光免疫染色を実施したところ染色されなかった。結果を図１２に示す。
【００６２】
本発明の色素幹細胞は、ケラチノサイトへの分化が誘導されないことから、特許文献１のメラノサイトやケラチノサイトへの高い分化能をもつ幹細胞と比べ、分化が進んだ細胞であることが示唆された。
【００６３】
以上により、多能性幹細胞を分化誘導することでメラノサイトへの分化能、自己複製能を有し、凍結保存可能な新規の色素幹細胞が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明の色素幹細胞やメラノサイトは、眼皮膚白皮症、尋常性白斑などの色素異常症の病態解析に用いることが可能であり、またこれらの色素異常症の治療用医薬品又は美白用化粧品の開発において、スクリーニングに用いることが可能である。また本発明の製法、色素幹細胞やメラノサイトは、再生医療へ応用されることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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