(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンであって、ブタサーコウイルス２型に対する循環抗体を有する動物の真皮への前記ワクチンの単回用量投与による、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対する前記動物の予防的処置における使用のためのワクチン。
【請求項２】
前記単回用量投与が、０．５ｍｌ未満のワクチンを含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ワクチンが、針なしワクチン接種デバイスにより投与されることを特徴とする、請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記動物が、投与時点において７ｌｏｇ２以上の力価で循環抗体を有することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のワクチン。
【請求項５】
前記単回用量が、５０００ＡＵ未満の下記の血清学試験に従った免疫原を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載のワクチン。
血清学：
すべての血清試料を、ＰＣＶ２に対する抗体に関して、標準ＥＬＩＳＡ手順を使用して検査する。簡潔には、段階的に希釈された血清試料を、バキュロウイルス発現ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原でコーティングされたマイクロタイタ―プレートにおいてインキュベートする。血清の除去後、すべてのウェルを、固定量のビオチン標識ＰＣＶ２特異的モノクローナル抗体と一緒にインキュベートする。その後、結合されたＭｏＡｂをペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンと一緒にインキュベートし、その後発色により検出する。力価はｌｏｇ２力価として表す。
【請求項６】
前記単回用量が、約２０００ＡＵの血清学試験に従った免疫原を含むことを特徴とする、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非生存免疫原を含み、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌による感染症に対して前記動物を処置することを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンが、ローソニア・イントラセルラリスの非生存免疫原を含み、病原性ローソニア・イントラセルラリス細菌による感染症に対して前記動物を処置することを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンが、鉱物油を含むアジュバントを含むことを特徴とし、ワクチン中の鉱物油の量が、１から１０ｖ／ｖ％の間であることを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
鉱物油の量が２．５から５ｖ／ｖ％の間であることを特徴とする、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンの単回用量を、ブタサーコウイルス２型に対する循環抗体を有する非ヒト動物の真皮へ投与することにより、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対して、前記動物を予防的に処置する方法。
【請求項１２】
組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンの単回用量を、ブタサーコウイルス２型に対する循環抗体を有する非ヒト動物の真皮へ投与することにより、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症からもたらされる疾患に対して前記動物を予防的に処置する方法。
【請求項１３】
前記ワクチンがマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非生存免疫原をさらに含み、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌による感染症に対して前記動物を処置することを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンがローソニア・イントラセルラリスの非生存免疫原をさらに含み、病原性ローソニア・イントラセルラリス細菌による感染症に対して前記動物を処置することを特徴とする、請求項１１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ブタサーコウイルス２型に対する循環抗体を有する非ヒト動物をブタサーコウイルス２型及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対して予防的に処置する方法であって、前記方法が、組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンの単回用量を前記動物の真皮に投与するステップ、及び同時にマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非生存免疫原を含むワクチンの単回用量を前記動物の真皮に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ブタサーコウイルス２型に対する循環抗体を有する非ヒト動物をブタサーコウイルス２型及びローソニア・イントラセルラリスによる感染症に対して予防的に処置する方法であって、前記方法が、組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンの単回用量を前記動物に投与するステップ、及び同時にローソニア・イントラセルラリスの非生存免疫原を含むワクチンの単回用量を前記動物の真皮に投与するステップを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）に対するワクチン及び前記ワクチンを使用してこのような感染症に対して動物を防御する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＶ−２は、若豚に観察される離乳後多臓器発育不良症候群（ｐｏｓｔ−ｗｅａｎｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰＭＷＳ）と関連がある。この疾患は、１９９１年にカナダで初めて発見された。進行性の消耗、呼吸困難、頻呼吸及び時として黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ及びｊａｕｎｄｉｃｅ）を含む、臨床兆候及び病理は１９９６年に公表された。
【０００３】
Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７は、ＰＭＷＳの臨床症状を有するブタ中にブタサーコウイルスを検出し、ＰＫ−１５細胞の常在ウイルスとみなされる公知のＰＣＶ以外のＰＣＶがＰＭＷＳに関連している可能性があると結論付けた。後の出版物（Ｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８；Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８）はこれらの発見を確認し、新たな病原性ＰＣＶをＰＣＶ−２と称し、一方、元々のＰＫ−１５細胞培養分離株（Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２）はＰＣＶ−１と称されるべきであると提唱した（Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。
【０００４】
ＰＣＶ−２は、小型（１７−２２ｎｍ）の環状単鎖ＤＮＡゲノムを含有する、二十面体非エンベロープウイルスである。ＰＣＶ−２ゲノムの長さは約１７６８ｂｐである。世界中のさまざまな地域を起源とするＰＣＶ−２分離株は互いに近い関係にあり、９５から９９％のヌクレオチド配列同一性を示す（Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００）。ＰＣＶのＯＲＦ−２はウイルスのカプシドタンパク質をコードする。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は２３３アミノ酸のタンパク質をコードする。すべてのＰＣＶ−２分離株のＯＲＦ２は９１−１００％のヌクレオチド配列同一性及び９０−１００％の推定アミノ酸配列同一性を共有する。
【０００５】
動物、特にブタを、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対して予防的に処置する従来型のワクチンは、（非複製）免疫原として全ＰＣＶ−２ウイルスに基づくことができる。しかし、ＰＣＶ−２問題の場合、ＰＣＶ−２が細胞培養において高い力価で複製しないという事実により複雑になっている。したがって、免疫原として全ウイルスに基づくワクチンは、実践的（経済的）観点からあまり理想的ではない。当分野において、ＯＲＦ２によりコードされるカプシドタンパク質は（組換え的に発現させる場合であっても）、適切なワクチンに使用するブタサーコウイルス２型のサブユニット免疫原として適切であることが示されてきた。このことは、このサブユニットは、循環系においてウイルスそれ自体と同じ方法で現れ、ＤＮＡ及び非構造タンパク質がカプシド内部に存在しないという事実と本質的に異なるので理解可能である。
【０００６】
当分野において、ＰＣＶ２に対するいくつかのワクチンが公知であり、市販されている。
【０００７】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。ツーショット（２回用量）ワクチンとして与えられた場合、免疫の持続期間（ＤＯＩ）は２２週であり、ブタの肥育期間を完全にカバーしている。ワクチン接種は、高熱及び他の全身反応をもたらすことがある。
【０００８】
Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＣｉｃｒｏＦｌｅｘ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、２週齢以上のブタに使用するための、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。ワンショット（１回用量）ワクチンとして与えられた場合、ＤＯＩは１７週である。ワクチン接種は高熱及びまれにアナフィラキシー反応をもたらすことがある。
【０００９】
Ｃｉｒｃｏｖａｃ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。ツーショットワクチンとして与えられた場合、ＤＯＩはわずか１４週である。ワクチン接種は、高熱及び食餌摂取の減少などの他の全身反応をもたらすことがある。
【００１０】
Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ（Ｚｏｅｉｔｉｓ、Ｃａｐｅｌｌｅ  ａ／ｄ  ＩＪｓｓｅｌ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタサーコウイルス２型に対してブタを防御するためのワクチンである。ワンショットワクチンとして与えられた場合、ＤＯＩは１９週である。ワクチン接種は、高熱及び嘔吐などの他の全身反応をもたらすことがある。
【００１１】
他のワクチンは、例えば国際公開番号国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号及び国際公開第２００８／０７６９１５号に記載されている。これらのうち、市販のワクチンから知られるＤＯＩより長いＤＯＩを示すものは無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２８８２３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０９４８９３号
【特許文献３】国際公開第２００８／０７６９１５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７
【非特許文献２】Ｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８
【非特許文献３】Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８
【非特許文献４】Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２
【非特許文献５】Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的
本発明の目的は、動物がワクチン接種時にブタサーコウイルス２型を対象とする循環抗体を有していたとしても、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対して少なくとも既存のワクチンと同程度の長さのＤＯＩを提供し、同時に、使用が簡便であり、動物に対して安全、特に、高熱などの全身性副作用をほとんど誘導しない、又は全く誘導しないワクチンを考案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的を達成するために、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原、特に組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含み、ブタサーコウイルス２型を対象とする循環抗体、特に、母性由来抗体を有する動物の真皮への単回用量投与による、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対する該動物の予防的処置における使用のための新規なワクチンを考案した。
【００１６】
驚くべきことに、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原を含有するワクチンの１回用量だけを動物のその真皮にワクチン接種した場合、該動物がブタサーコウイルス２型に対する中程度から高度の循環抗体を有していたとしても、全身性副作用の無い、又はきわめて少ない、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対する２３週の非常に長いＤＯＩを得ることができることが見出された。この方法により、どの既存の１回用量ワクチンのＤＯＩより実質的に長いＤＯＩを得ることができる。これらの抗体が母性由来抗体であり得ることが見出されたので、特に驚くべきである。
【００１７】
本発明はさらに、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原、特に、組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンをブタサーコウイルス２型を対象とする循環抗体を有する動物の真皮へ単回用量投与することにより、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対して該動物を予防的に処置する方法を可能にする。本発明により可能になる他の方法は：ワクチンが、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の非生存免疫原をさらに含み、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌による感染症に対して動物を処置する方法；及びワクチンが、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の非生存免疫原をさらに含み、病原性ローソニア・イントラセルラリス細菌による感染症に対して動物を処置するさらなる方法；ブタサーコウイルス２型を対象とする循環抗体を有する動物をブタサーコウイルス２型及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対して予防的に処置する方法であって、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原、特に組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンの単回用量を該動物の真皮に投与するステップ、及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非生存免疫原を含むワクチンの単回用量を該動物の真皮に同時投与するステップを含む方法；ならびにブタサーコウイルス２型を対象とする循環抗体を有する動物をブタサーコウイルス２型及びローソニア・イントラセルラリスによる感染症に対して予防的に処置する方法であって、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原、特に組換え的に発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンの単回用量を、該動物の真皮に投与するステップ、及びローソニア・イントラセルラリスの非生存免疫原を含むワクチンの単回用量を該動物の真皮に同時投与するステップを含む方法、である。
【００１８】
Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３１（２００８）１０３−１１４が、皮内と筋肉内のＰＣＶ２ワクチン接種の間に差があるかどうかの確立を目的とした調査プログラムについて報告していることに留意されたい。Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇにより引き出された結論は、「ワクチン投与の皮内と筋肉内の経路の間に差は見出されなかった」ことである。この文献を考慮して、出願者らが、皮内と筋肉内のワクチン接種の間に有意な差、特に有意に異なる抗体応答を見出したことはさらにより驚くべきであると思われる。手元の本発明の教示により、Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇが差を全く見出せなかったという事実の可能性のある説明は、知らずに両方のワクチンが単純に筋肉内に適用されたことであると思われる。このことは以下のように理解可能である：Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇは、Ｐｕｌｓｅ２５０（商標）針なし注射系（Ｐｕｌｓｅ  ＮｅｅｄｌｅＦｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ，ＵＳＡ）を使用してワクチンを適用した。このデバイスは針なしであるが、皮内適用のために特に構成されたものではない。この系の製作者は、このデバイスについてのパンフレットにおいて（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｌｓｅ−ｎｆｓ．ｃｏｍ／ｐｄｆｓ／２５０＿ｓｗｉｎｅ．ｐｄｆを参照されたい）、このデバイスが「皮膚を通して、筋肉組織内に」投与するように設計されていることを示している。Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇにより使用された注射体積、すなわち２ｍｌは非常に多く、筋肉内ワクチン接種には典型的である。世界保健機構はその２００９年８月２７日の「ワクチンの皮内送達；低所得及び中所得の国における使用のための文献の概説及び開発可能性」と称される文書で、「針なし」ワクチン接種は必ずしも「皮内」ワクチン接種を意味するとは限らないことを示している  （概説の３頁、表１を参照されたい）。針なしデバイスが「皮内ワクチン接種のために構成される」場合だけ、実際にワクチンは真皮に送達することができる。さもなければ、ワクチンは皮下又は筋肉内に送達されると思われる。Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇが、皮内ワクチン接種のために特に構成されたものではないデバイスを使用したこと、彼女が大量の注射体積を使用したこと、より重要なことには、彼女は皮内ワクチン接種と筋肉内ワクチン接種との間に差を見出せなかったが、一方で、本発明者らは（特にＩｇＭ力価に関して）実質的な差を見出したという事実を踏まえると、Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇが、「皮内送達した」と彼女の文書で報告したワクチンを単純に動物の筋肉内に適用したと結論付けることだけが可能である。
【００１９】
母性由来抗体（ＭＤＡ）のワクチン接種有効性に対する影響は十分研究されていないが、全体の影響は少ないと考えられることが近年報告されていることにさらに留意されたい（ＡＰＶＳ  Ｖｉｅｔｎａｍ，２３−２５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１３；Ｂｒａｄ  Ｔａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  ２  ａｎｄ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓを参照されたい）。さらに、同時に、中程度から高度の抗体レベルの存在下でワクチン接種した場合、母性由来抗体がＰＣＶ２ワクチン接種の有効性に影響を与えないことを確実にするために、２回のワクチン接種が使用されることが報告されている。
【００２０】
国際公開第２００８／０７６９１５号（Ｆａｃｈｉｎｇｅｒら）は、ブタサーコウイルス２型に対する能動免疫を獲得するための、ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）を使用して、ワクチンを筋肉に与える１回用量のＰＣＶ２ワクチン法を記載している。獲得免疫は、ワクチン接種の９週後検査した。国際公開第２００９／１２６３５６号（Ｒｏｏｆら）は、ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）を使用して、ワクチンを筋肉内に与える１回用量のＰＣＶ２ワクチン法を記載している。ワクチンはＭＤＡ陰性動物に与えられ、チャレンジをワクチン接種の４．５週後に行った。
【００２１】
国際公開第２００５／００９４６２号（Ｐａｒｉｓｏｔら）は、不活化ＰＣＶ２ウイルスに基づく、ＰＣＶ２に対するいくつかのワクチン接種法を記載している。まず、ＭＤＡ陰性動物へのワンショットのＩＭワクチン接種法（実施例５）。ワクチンがＭＤＡ陰性動物に筋肉内投与され、チャレンジがワクチン接種の５週後に行われるツーショットのＰＣＶ２ワクチン法（実施例６）。ＰＣＶ２に対して防御された子豚をもたらす、循環抗体を有する雌ブタにおけるワンショットのＩＭワクチン接種（実施例７）。組換え的に発現されたＯＲＦ２タンパク質を含み、ＰＣＶ２に対する循環抗体、特に母性由来抗体を有する動物における、皮内投与による単回ショット投与法のためのワクチンの開示は存在しない。ましてや、これが非常に長いＤＯＩをもたらし得ることは全く期待されない。いくつかの針なし投与デバイスが１９頁に述べられているが、これらが皮内投与に使用できることは示されていない。例えば、一般に知られているように、述べられたＢｉｏｊｅｃｔｏｒは、特にＩＭ及びＳＣ投与のために考案されている。
【００２２】
国際公開第００／０１４０９号は、実施例１７において、皮内経路により投与可能な、不活化ＰＣＶ２を含むワクチンの調製を述べている。しかし、この文献は、ＰＣＶ２に対する循環抗体、特に母性由来抗体を有する動物における、皮内投与による単回ショット投与法のための、組換え的に発現されたＯＲＦ２タンパク質を含むワクチンを示すことができない。
【００２３】
ＧａｍａｇｅはＶａｃｃｉｎｅ  ２７（２００９）６５９５−６６０４において、ファージディスプレイＰＶＣカプシドタンパク質を３回ワクチン接種されたブタの血清がＰＣＶ２ウイルスを中和できることを述べている。Ｇａｍａｇｅは、初回ワクチン接種後、防御応答が存在することを示しておらず、また使用したインジェクタ銃が実際に皮内投与可能かどうかもＧａｍａｇｅからは明確ではない。Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇに関して上に示すように、当分野において、針なし銃が真皮内に注射することが頻繁に述べられているが、ワクチンを実際に真皮内に送達できるインジェクタは数種だけである。
【００２４】
欧州特許出願公開第１９５８６４４号明細書は、その明細書を通して本発明の特色を特有の特色として述べているが、本発明のすべての特色を組み合わせて示すことはできていない。
【００２５】
ウイルスの非複製免疫原は、複製（「生存」）ウイルス全般以外の、対応する悪性ウイルス又は１もしくはそれを超えるその悪性因子が、この免疫応答の結果として宿主の免疫系により認識され、最終的に中和されるように免疫応答が誘発される、ウイルスに対応する任意の物質又は化合物である。非複製免疫原の典型的の例は、死滅全ウイルス及びこれらのウイルスのサブユニット、例えばカプシド及び例えば組換え的に発現された表面発現タンパク質である。ウイルスの非複製免疫原を含むワクチンは、「生」ウイルスワクチンとは異なるだけでなく、ＤＮＡが免疫原それ自体ではないが、宿主細胞に組み込まれた後で対応する免疫原を発現するＤＮＡワクチンとも異なる。
【００２６】
ウイルスによる感染症に対する予防的処置は、病原性ウイルスによる処置後チャレンジからもたらされる感染症を予防又は緩和する、特に、このようなチャレンジ後に宿主中のウイルス負荷を低下させる助けとなる。
【００２７】
ウイルスによる感染症からもたらされる疾患に対する予防的処置は、ウイルスによる処置後感染症からもたらされる１つ又はそれを超える臨床症状を予防又は緩和する助けとなる。
【００２８】
ワクチンの真皮への投与は、十分量のワクチンが真皮に沈着されることを意味し、これらと同じワクチンの同じ量の筋肉内投与とは有意に異なる免疫応答をもたらす（特に、実施例３に概説されるように設定された検定においてウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）順位和検定を使用する場合、ｐ値は０．１０未満、好ましくは０．０５未満のはずである）。いくつかのデバイス、例えばＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種器（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｐｕｌｓｅ  ５０  ＭｉｃｒｏＤｏｓｅ（Ｐｕｌｓｅ  Ｎｅｅｄｌｅ  Ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＶａｃｃｉｎｅ，２０１２  Ｊａｎ  １１；３０（３）：５２３−３８（特に５２５頁の表１、「液体又は固体製剤の投与のためのさまざまなデバイスの概要」を参照されたい）に記載の他のデバイスが、皮内ワクチン接種のために市販されている。
【００２９】
予防的処置おける使用のためのワクチンの単回用量投与は、防御免疫を得るために、ワクチン接種が２回目の投与によりブーストされる必要が無いことを意味している。ツーショット計画において、初回（プライム）ワクチン接種は、初回投与から通常６週間以内、一般的には初回投与から３又は２週間以内にブーストされ、２回目の（ブースト）投与後にだけ、防御免疫を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＤＯＩ研究における血清学を示す図である。
【図２】血清、排泄物及び臓器中のウイルス負荷を示す図である。
【図３】平均体温を示す図である。
【図４】平均全ＰＣＶ２  Ｉｇ  Ａｂの結果を示す図である。
【図５】平均ＰＣＶ２  ＩｇＭ  Ａｂの結果を示す図である。
【図６】持続期間研究における抗体価を示す図である。
【図７】臓器中のウイルス負荷を示す図である。
【図８】臓器中のウイルス負荷を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
第１の実施形態において、単回用量投与は、０．５ｍｌ未満のワクチン、好ましくは０．２ｍｌのワクチンを含む。０．５ｍｌ未満の投薬量は、皮内ワクチン接種に適切であると思われる。このような低投薬量で、真皮は少なくとも十分な程度に無傷で、ワクチンを受けるために利用可能なままであるが、一方で、実質的により高い投薬量では、真皮が破裂し、真皮をワクチンを受け取るために利用不可にするリスクが存在する。
【００３２】
次の実施形態において、ワクチンは、動物の皮膚を通して真皮に到達させるワクチンの噴出を使用して、針なしワクチン接種デバイスで投与される。真皮へのワクチン接種は、この実施形態において、通常０．０５から０．２ｍｌの範囲の非常に低体積のワクチンを使用する、ワクチンの液体噴出（高加圧流体の流れ）を使用して、針なしワクチン接種デバイスにより提供される。これは、ワクチン及び投与方法の安全性をさらに高くする。
【００３３】
別の実施形態において、非複製免疫原は、組換え的に発現された、例えば、当分野において公知のバキュロウイルスにより発現された、又はＰＣＶ１−ＰＣＶ２キメラウイルスにおいて発現されたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質である。この組換えタンパク質は、本発明への適用が適切であることが証明されている。特に、ＯＲＦ２タンパク質は、国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号又は国際公開第２００８／０７６９１５号に記載のようなバキュロウイルス発現系において発現させることができる。
【００３４】
さらに別の実施形態において、投与時点において動物は、７ｌｏｇ２（２ｌｏｇの７単位）以上の力価の循環抗体を有する（下記の実施例１「血清学」に記載の方法に従って確立された）。中程度から高度の抗体力価であっても、本発明はそれでも有効であることが見出されている。
【００３５】
一実施形態において、単回用量のワクチンは、５０００ＡＵ未満の免疫原を含む（最小量は、それでも有効な免疫応答をもたらす量である）。既存のワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＣＶ（ツーショットのワクチン接種計画により２２週のＤＯＩを達成することが認可されている）中の用量より低いこの用量において、１回のみのワクチン接種後に２３週超のＤＯＩが得られることが見出された。一実施形態において、単回用量のワクチンは約２０００ＡＵの免疫原を含む。この量は、本発明の有利性を得るために十分であると思われる。
【００３６】
別の実施形態において、ワクチンはマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非生存免疫原を含み、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ細菌による感染症に対して動物を処置する、及び／又はワクチンは、ローソニア・イントラセルラリスの非生存免疫原を含み、病原性ローソニア・イントラセルラリス生菌による感染症に対して動物を処置する。
【００３７】
さらに別の実施形態において、ワクチンは、鉱物油を含むアジュバントを含み、ワクチン中の鉱物油の量が、１から１０ｖ／ｖ％（油の体積／ワクチンの全体積）の間であることを特徴とする。鉱物油が免疫応答の非常に優れた増強剤（「アジュバント」とも称される）であることは一般的に知られている。しかし、ブタにおいて、特に、皮内投与の場合、鉱物油は多くの場合重症な局所反応（腫れは、平均直径５ｃｍ超を有する）をもたらす。ワクチン接種の現在の皮内経路により、このような重症な局所反応な全く起こさず、腫れの平均直径は、許容されることが見出されている３ｃｍ未満のままであり得ることが、驚くべきことに見出された。さらなる実施形態において、鉱物油の量は２．５から５ｖ／ｖ％の間である。この非常に低い濃度の鉱物油であっても、免疫応答は有効であることが見出された。
【００３８】
本発明に従った方法の実施形態において、動物は、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原を含むワクチンの真皮への単回用量投与を受け、同時に（１日以内、好ましくは数時間、数分又は数秒以内に）マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非生存免疫原（Ｍｈｙｏ）を含むワクチンの真皮への単回用量投与を受け、ブタサーコウイルス２型感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエ感染症を同時に処置される。本発明のこの実施形態又は他の実施形態のいずれかに使用されるいくつかの非生存マイコプラズマ・ハイオニューモニエ免疫原、例えば、バクテリン（Ｓｗｉｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１９９８；６（３）：１０７−１１２）、組換え的に発現されたＭｈｙｏ抗原（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｊｕｎｅ  １９９７  ｖｏｌ．６５  ｎｏ．６  ２５０２−２５０７）、Ｍｈｙｏ培養液の可溶性分画（国際公開第２０１３／１５２０８３号）などは当分野において公知である。
【００３９】
別の実施形態において、動物は、ブタサーコウイルス２型の非複製免疫原を含むワクチンの真皮への単回用量投与を受け、同時にローソニア・イントラセルラリスの非生存免疫原を含むワクチンの真皮への単回用量投与を受け、ブタサーコウイルス２型感染症及びローソニア・イントラセルラリス感染症を同時に処置される。本発明のこの実施形態又は他の実施形態のいずれかに使用されるローソニア・イントラセルラリス免疫原に関して、いくつかの型の非生存免疫原が当分野において公知であり、例えば、国際公開第２００９／１４４０８８号（死滅全細胞免疫原）、国際公開第２００５／０７０９５８号（サブユニット）及び国際公開第９７／２００５０号（死滅全細胞免疫原）に記載されている。ＰＣＶ及びＭｈｙｏ抗原との組み合わせそれ自体は、国際公開第２００９／１４４０８８号に記載されている。
【００４０】
［実施例］
実施例１は、単回用量の皮内ワクチン接種が、ブタサーコウイルス２型による感染症に対する２３週の免疫を提供できることを示す実験である。
【００４１】
実施例２は、ワクチン接種が安全であり、防御力価をもたらすことを示す、ＰＣＶ２  ＩＤの単回ワクチン接種法による別の実験である。
【００４２】
実施例３は、皮内と筋肉内とのワクチン接種の間の直接比較である。
【００４３】
実施例４は、組み合わせ皮内ワクチン接種による実験を記載する。
【００４４】
実施例５は、混合ワクチン、さまざまな抗原投薬量及びさまざまなアジュバントによる実験を記載する。
【００４５】
［実施例１］
実験計画
ＰＣＶ２に対する抗体を有する１０匹の雌ブタの子孫をこの研究に使用した。子豚を、同腹仔にわたって１５匹の動物の２群に分けた。３週齢の時点で、１群の子豚に、組換え的に発現させたブタサーコウイルス２型のＯＲＦ２タンパク質を含む０．２ｍｌのワクチン（タンパク質の供給に関しては国際公開第２００７／０２８８２３号を参照されたい）を、市販の皮内ワクチン接種デバイスＩＤＡＬ（登録商標）（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手可能）を使用して、首の右側に皮内ワクチン接種し、一方、２群はワクチン接種せずにおき、対照群として機能させた。すべての研究動物を、臨床兆候に関して毎日観察した。すべての動物の血液試料を、ワクチン接種時、ワクチン接種の９、１７、１９及び２１週後に採取した。ワクチン接種の２３週後、各動物を、鼻腔内に塗布された野生型ＰＣＶ２チャレンジウイルス株を使用してチャレンジ感染させた。
【００４６】
血清試料及びフィーカルスワブ（ｆｅｃａｌ  ｓｗａｂｓ）をチャレンジの１日前及びチャレンジの１、２及び３週間後に採取し、定量的ＰＣＲによりＰＣＶ２ウイルスの核酸に関して検査した。さらに、血清試料はＰＣＶ２抗体に関しても検査した。
【００４７】
チャレンジ３週後、すべての動物を剖検し、鼠径リンパ節、扁桃腺及び肺を、ＰＣＶ２ウイルスの抗原及び核酸の決定のためにサンプリングした。
【００４８】
使用したワクチンは、５ｖ／ｖ％の鉱物油Ｍａｒｃｏｌ（登録商標）５２（Ｅｘｘｏｎ）、０．３０ｗ／ｖ％のビタミンＥ酢酸塩及び０．３２％のポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、注射用水ならびに２０００ＡＵのＰＣＶ２タンパク質／０．２ｍｌを含む水中油エマルジョンとして与えた。ＡＵ単位は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＡｌｐｈａＬＩＳＡ試験に基づき計算した。この試験のために、ポリスチレンマイクロタイタ―プレートのウェルを、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原を含有する試験試料の段階希釈液ならびに標準試料の段階希釈液で満たした。これらの希釈液を、（ＰＣＶ２  ＯＲＦ２に対するモノクローナル抗体でコーティングされた）アクセプタービーズ及びＰＣＶ２  ＯＲＦ２を対象とするビオチン標識二次抗体と一緒にインキュベートした。その後、結合された二次抗体の量をストレプトアビジンコーティングドナービーズと一緒にインキュベートして、化学発光を検出することによって定量化した。標準試料は、５０００ＡＵ／（２ｍｌ）用量を含有するように設定された市販のワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶである。
【００４９】
実験手順
毎日の観察
すべてのブタを、疾患の臨床兆候に関して毎日観察した。観察は、食欲喪失、寝ころび傾向、気力低下又は眠気、震え、毛の逆立ち、浮腫（特に眼の周り）、嘔吐、下痢及び呼吸困難を含む全身反応から成った。
【００５０】
血液のサンプリング
血液試料をワクチン接種の前、ワクチン接種の９、１７、１９及び２１週後に収集した。血液試料を、チャレンジの１日前ならびにチャレンジの７、１３及び１９日後に収集した。これをすべてのブタから個別に行った。
【００５１】
フィーカルスワブの実施
フィーカルスワブを、１乾燥スワブ／動物を使用して、チャレンジ１日前、チャレンジ後７、１３及び１８日に採取した。スワブは標準手順を使用して、抗生物質を含有する媒体中に採取した。媒体中のスワブにより採取された検体の懸濁液を遠心分離により清澄化し、アリコートを取り、≦−１８℃においてさらなる使用まで保存した。
【００５２】
血清学
すべての血清試料を、ＰＣＶ２に対する抗体に関して、標準ＥＬＩＳＡ手順を使用して検査した。簡潔には、段階的に希釈された血清試料を、バキュロウイルス発現ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原でコーティングされたマイクロタイタ―プレートにおいてインキュベートした。血清の除去後、すべてのウェルを、固定量のビオチン標識ＰＣＶ２特異的モノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。その後、結合されたＭｏＡｂをペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジンと一緒にインキュベートし、その後発色により検出した。力価はｌｏｇ２力価として表した。
【００５３】
検死
実験終了時に、すべての動物を気絶させた後出血させることによって安楽死させた。剖検の間に、動物を切開し、内臓をその場で視診して、下記の臓器：肺、鼠径及び腸間膜のリンパ節、扁桃腺、胸腺、脾臓、肝臓及び腎臓に特に注意を注いだ。この後、扁桃腺、肺（附属葉）及び鼠径リンパ節由来の試料を急速凍結及びその後の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による分析用に摘出した。
【００５４】
定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、すべての血清及びフィーカルスワブならびに扁桃腺、肺及び鼠径リンパ節の１０％組織ホモジネートに対して実施した。簡潔には、ＤＮＡを、市販のキットを使用して試料から抽出した。各試料中のＰＣＶ２ゲノムＤＮＡを、ＰＣＶ２に特異的なプライマー及び二重標識加水分解プローブを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により定量した。特異的蛍光が閾値を超えたサイクル数を、既知の量のＰＣＶ２含有プラスミドを含有する一連の試料のサイクル数に対応させた。結果を、ｌｏｇ１０コピー／μｌ反応混合物（ｌｏｇ１０ｃ／μｌ）として表した。
【００５５】
結果
実験開始時に、すべての動物が健康であることを見出した。対照群において、ワクチン接種後（ｗｐｖ）６週において１匹の動物の死亡が見出された。２匹のワクチン接種された動物がわずかな局所問題、すなわちわずかな運動機能障害（片足の硬直）を有した。あまり問題ではないと考えて、これらの動物を処置しなかった。ワクチン接種された動物のうち、疾患の兆候又は全身反応、例えば異常高熱、食餌摂取の低下、アナフィラキシーショック又は嘔吐などを示した動物は全くいなかった。
【００５６】
血清学の結果は図１に示す。ワクチン接種された動物が、約４．０ｌｏｇ２で安定化されたと思われる抗ＰＣＶ２力価を維持し、一方、対照動物において力価は検出限界未満に低下したことが明らかである。チャレンジ後（２３ｗｐｖ、２６週齢）、力価はワクチン接種群においてわずかに上昇する。対照群において、力価は同じレベルに上昇している。
【００５７】
ｑＰＣＲの結果は、図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃに示す（「ｄｐｃ」＝チャレンジ後の日数）。ワクチン接種動物は、ワクチン接種の２３週後に血清、リンパ器官及び肺においてＰＣＶ２核酸が有意に減少することにより示されるように、ＰＣＶ２によるチャレンジ感染から防御されたと思われる。さらに、少なくとも２３週においてＰＣＶ２に対するフィーカルスワブでウイルス負荷が有意に減少することにより実証されるように、ワクチンはウイルス排出を減少させることができた。これは、中程度のレベルと考えられるおよそ７ｌｏｇ２の、ＰＣＶ２に対する循環抗体価を有する範囲の動物において実施された。
【００５８】
［実施例２］
実験計画
一腹子の群由来の合計４６匹の子豚を４種の処置群：各１３匹の子豚の２つのワクチン接種群及び１０匹の子豚の２つの対照群に分配した。１群は、子豚がおよそ２週齢の時に上記の実施例１に示したようにワクチン接種し、２群は、子豚がおよそ３週齢の時にワクチン接種した。子豚に、ワクチンの単回用量を首の右側に皮内ワクチン接種した。３群（対照群、２週齢の動物）及び４群（対照群、３週齢の動物）は処置しなかった。血清試料を、ワクチン接種当日、ワクチン接種の２、３及び４週後に、すべての動物から採取した。体温を、ワクチン接種の１日前、ワクチン接種当日及びワクチン接種の４時間後及び１、２、３、４日後に測定した。
【００５９】
実験手順
ワクチン接種前に、子豚の全体的健康を観察した。体温を、Ｔ＝−１日、Ｔ＝０日、ワクチン接種後０及び４時間ならびにワクチン接種後Ｔ＝１、２、３、４日目にすべての子豚で測定した。
【００６０】
血液試料を、ワクチン接種当日ならびにワクチン接種の２、３及び４週後に収集した。これは、標準手順に従って個別にすべてのブタから実施した。血液試料は、抗凝血剤を添加せずに収集した。血清を、血餅試料から調製し、アリコートを取り、分析まで−２０℃において保存した。
【００６１】
全ＰＣＶ２  Ｉｇ抗体及びＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体のＥＬＩＳＡを、ＩｇＭ抗体のＥＬＩＳＡの場合は、プレートをＩｇＭ抗体でコーティングして、次いでＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原と一緒にインキュベートし、その後、固定量のビオチン標識ＰＣＶ２特異的モノクローナル抗体と一緒にインキュベートしたことを除き、上記の実施例１（「血清学」）に示すように検査した。
【００６２】
結果
実験開始時に、すべての動物が健康であることを見出した。体温の平均結果を図３に示す。体温の平均上昇に、２週齢と３週齢の動物の間のいずれにおいても差は見られなかった（最大の平均上昇は、０．０−０．３℃の間である）。さらに、１群及び２群における個別の動物の体温の最大上昇は、２つの対照群における個別の動物の最大体温上昇と同等である。
【００６３】
全ＰＣＶ２  Ｉｇ抗体のＥＬＩＳＡ
全ＰＣＶ２  Ｉｇ抗体の応答の平均結果を図４に要約する。
【００６４】
ワクチン接種時に、２週齢でワクチン接種された子豚は、３週齢でワクチン接種された子豚より高い（母性由来の可能性が高い）ＰＣＶ２抗体価を有した。ワクチン接種動物は、対照動物より著しく高い力価上昇を示した。
【００６５】
ＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体のＥＬＩＳＡ
ＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体の応答の平均結果を図５に要約する。ワクチン接種時に、すべての動物はＩｇＭ抗体陰性であった。ワクチン接種後、３週齢の動物は、２週齢動物より著しく速く、高いＩｇＭ抗体応答を有した。対照動物は、本研究の間中陰性のままであった。
【００６６】
これらの結果に基づき、２及び３週齢の子豚の、単回用量皮内ワクチン接種は、許容される安全性プロファイル及び優れた血清学的応答をもたらしたと結論付けることができる。循環抗体価の開始レベルがさらにより高い、すなわち中程度範囲の上限であると考えられる９．４ｌｏｇ２まであった別の実験（データ未掲載）によっても同等の結果が得られた。
【００６７】
［実施例３］
実験計画
合計４０匹の子豚を、各１０匹の子豚の４つの処置群に分配した。１群及び２群の子豚は、上記の実施例１に示すように、単回用量のワクチンを皮内ワクチン接種した。１群と２群との間の違いは、２群のＩＤＡＬワクチン接種器がわずかに高い圧力増大（１群に使用したＩＤＡＬワクチン接種器の値の１２５％）を有したことである。３群の子豚は、単回用量の同じワクチンを、同じ量で同じ場所（首）に筋肉内ワクチン接種し、４群の子豚は未処置のままにした。血清試料をワクチン接種当日、ワクチン接種の３及び５週後にすべての動物から収集した。
【００６８】
実験手順
ワクチン接種前に、子豚の全体的健康を標準的手順に従って観察した。血液のサンプリングならびに全抗ＰＣＶ２抗体及びＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的ＩｇＭ抗体の血清学を、上記の実施例２に示す手順に従って実施した。
【００６９】
結果
研究開始時に、すべての動物が健康であることを見出した。血清学の結果を表１に要約する（力価はｌｏｇ２として表した）。ワクチン接種時において、平均抗体価は比較的高かった。ワクチン接種後、ＰＣＶ２  Ａｂ力価の上昇を示した動物は全くいなかった。ワクチン接種後３及び５週において、ＩＤ群の平均ＰＣＶ２抗体価は、ＩＭ群のそれより高いことが観察できた。
【表１】
0006605469.tif 000002
【００７０】
抗ＰＣＶ２  ＩｇＭの血清学の結果を、表２に要約する（力価はｌｏｇ２として表した）。ワクチン接種後３週において、２つのＩＤ群の抗ＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体価は、ＩＭ群及び対照群のそれより著しく高かった。
【表２】
0006605469.tif 000003
【００７１】
ウィルコクソン（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ）順位和検定を適用した場合、それぞれのＩＤ群（１及び２）対ＩＭ群（３）のＩｇＭ応答の差に関するｐ値は、０．０５未満、すなわち、それぞれ０．０００１及び０．０３２９であった。
【００７２】
［実施例４］
ＰＣＶ２に対する抗体を有する数匹の雌ブタの子孫をこの研究に使用した。子豚を、同腹仔にわたって１８匹の動物の３群に分けた。３週齢において、１群及び２群の子豚に、上記の実施例１に示すように皮内ワクチン接種した。２群の動物に、市販のＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  ＨｙｏＩＤ  Ｏｎｃｅ（Ｍｈｙｏバクテリンを含有）を製造業者の取扱説明書に従って、首の反対側に同時に皮内ワクチン接種した。３群（対照群）の動物は未処置のままにした。すべての研究動物を、毎日観察した血清試料を、ワクチン接種時及び動物を屠殺するまで（２３−２５週齢）隔週で採取した。これらの試料を、ＰＣＶ２抗体に関して検査した。
【００７３】
実験手順は、上記の実施例１に示した通りであった。得られた血清学を図６に示す。この図から、抗ＰＣＶ２力価が上記の実施例１に記載の実験により確立された４ｌｏｇ２のレベルを十分上回ったままであり、防御的であることを見出せることが明らかになっている。ワクチン間の負の干渉の兆候は存在しない。
【００７４】
この実験を反復し、悪性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する防御をチェックした。この反復実験のために６０匹の子豚を使用した。４０匹の動物にＭｈｙｏワクチンを１８−２４日齢においてワクチン接種し、これらの動物のうちの２０匹にさらにＰＣＶワクチンをワクチン接種した。２０匹の動物はワクチン接種せずに、チャレンジ対照として機能させた。ワクチン接種の３週後、すべての動物に悪性Ｍ．ハイオニューモニエ株を感染させ、チャレンジ後３週にすべての動物を、肺病変に関して検死した。肺病変スコア（ＬＬＳ）を各群の間で比較した。
【００７５】
Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅをワクチン接種した群に関するＬＬＳは、対照群のそれらより有意に低かった（ｐ＜０．０５、ダンの検定（Ｄｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔ））。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅ単独をワクチン接種した群と、ＰＣＶワクチンと併せてワクチン接種した群との間に有意差は無かった。したがって、組み合わせワクチン接種はＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅにより得られた免疫に負の影響を与えなかったと結論付けることができる。
【００７６】
［実施例５］
ＰＣＶ２（２５０から６０００ＡＵ／０．２ｍｌ）、Ｍ  ｈｙｏ（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅと同レベル）及びローソニア抗原（国際公開第２００８９／１２７６８４号、死滅全細胞抗原に関する実施例２を参照されたい：およそ１×１０９細胞／０．２ｍｌのレベル）を含有する、合計で８種のワクチンを製剤化した。これらワクチンは異なるアジュバントを含有した。いくつかのワクチンは既存のアジュバントのＤｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；「ＤＦ」と呼ばれる）を使用した。他のワクチンは、上記の実施例１に記載のアジュバント製剤（「Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２」と呼ばれる）又はＸ−ｓｏｌｖｅ１２と同じ構成を有するが、半分の濃度（「Ｘ−ｓｏｌｖｅ６」）又はＸ−ｓｏｌｖｅ１２の２．５倍濃度（「Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０」と呼ばれる）で製剤化されたアジュバントを使用した。得られたワクチンは以下の通りであった  （Ｍｈｙｏ及びローソニア抗原は列挙していない；含有量／用量）：
１群：２０００ＡＵ  ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０
２群：２５０ＡＵ  ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
３群：５００ＡＵ  ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
４群：２０００ＡＵ  ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ１２
５群：２０００ＡＵ  ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ６
６群：５００ＡＵ  ＰＣＶ２／ＤＦ
７群：２０００ＡＵ  ＰＣＶ２／ＤＦ
８群：６０００ＡＵ  ＰＣＶ２／ＤＦ
８匹の雌ブタの子孫を本研究に使用した。子豚は、中程度（中レベル）の、ＰＣＶ２に対する母性由来移行抗体（ＭＤＡ）を有した（平均：６．７ｌｏｇ２）。３／４週齢において、１群から８群の子豚に、ＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種器を使用して単回用量で皮内ワクチン接種した。９群の子豚はワクチン接種しないままであった。ワクチン接種後７週において、すべての動物をチャレンジ施設に移動させた。１日後、すべての動物を、ＰＣＶ２のチャレンジ株によりチャレンジ感染させた。すべての子豚を、臨床兆候に関して毎日観察した。
【００７７】
局所反応を触診により、ワクチン接種当日に開始して、ワクチン接種後２日おきにワクチン接種後２０日までモニターした。
【００７８】
血液試料を、ワクチン接種当日及び３週間後、チャレンジの前日、１及び２週間後ならびに剖検時にすべての動物から収集した。各動物から採取した血清試料を、ＰＣＶ２及びＭ  ｈｙｏに対する抗体に関して試験した。剖検の間、腸間膜及び鼠径のリンパ節、扁桃腺及び肺を、ＰＣＶ２核酸の定量化のためにサンプリングした。
【００７９】
実験手順は、上記の実施例２の記載と同じである。ワクチン接種時のＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体応答は、すべての群において検出レベル未満であった（２．０ｌｏｇ２未満）。ワクチン接種後３週において、ＰＶＣ抗体価は２０００ＡＵ  ＰＣＶ２／Ｘ−ｓｏｌｖｅ３０ワクチンに関して最も高く、２０ｌｏｇ２であった。２５０−、５００−及び２０００のＡＵ  ＰＣＶ２抗原／用量を含むＸ−ｓｏｌｖｅ１２群は、それぞれ、９、１６及び１９ｌｏｇ２の力価を有した。２０００ＡＵ／Ｘ−ｓｏｌｖｅ６ワクチンを与えられた群は、１５ｌｏｇ２の力価を有した。５００−、２０００−及び６０００ＡＵのＰＣＶ２抗原／用量を含むＤＦ群は、それぞれ、８、１４及び１６ｌｏｇ２の力価を有した。対照は、検出レベル未満の力価を有した。
【００８０】
この研究において、全身及び局所反応を評価した。ワクチン接種に起因する全身反応は全く観察されなかった。局所効果に関しては、（それぞれＸ−ｓｏｌｖｅ１２の５００及び２０００ＡＵ又はＤＦ６０００ＡＵ  ＰＣＶ２／用量のワクチンを与えられた）ワクチン接種された動物は３匹以下がわずかな運動性問題を有したが、これは対照群と同じ数である。したがって、これらの反応はワクチン接種とは無関係であるとみなすことが合理的と思われる。他の局所反応に関しては、Ｘ−ｓｏｌｖｅをワクチン接種された多数の動物（約６０−１００％の間）が局所反応を示し、腫れの平均サイズは３ｃｍ未満、すなわち１−２ｃｍの間であり、腫れは２−６日以内に消失した。ＤＦを使用すると、局所の腫れを示した動物はわずか約３０％であり、平均サイズは０．５ｃｍ未満であり、腫れは１日以内に消失した。
【００８１】
図７及び８において、臓器の（平均）ウイルス負荷をさまざまなワクチンに関して表す。すべてのワクチンは、関連臓器におけるウイルス負荷を実質的に低下させ得る（これらの場合少なくとも３ｌｏｇ）と思われる。
【００８２】
この研究において、使用したすべてのアジュバントは安全であり、抗ＰＣＶ２  ＩｇＭ応答を誘導し、病原性ブタサーコウイルス２型による感染症に対して動物を処置できたと思われる。異なる抗原の間に負の干渉は全く見出されなかった。
【図１】
0006605469.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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