(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ｉ）および（ｉｉ）をハイブリダイズさせ、目視で検出可能な状態にすることを含む遺伝子解析方法：
（ｉ）ストリップ上に固定したオリゴヌクレオチドプローブ；
（ｉｉ）下記（ａ）および（ｂ）を、核酸試料を鋳型とする２０〜４０回の熱サイクル処理を経る、１サイクルの反応時間が２分以内であるサイクリングライゲーション反応を行うライゲーション処理に供して増幅した一本鎖ライゲーション産物：
（ａ）前記核酸試料に相補的な第一の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列もしくは目視での検出を可能とする標識部分を含むクエリーオリゴ；
（ｂ）前記核酸試料に相補的であって、前記第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよびタグ配列もしくは目視での検出を可能とする標識部分を含むコモンオリゴ、
であって、クエリーオリゴおよびコモンオリゴのいずれかがタグ配列を含む、およびクエリーオリゴおよびコモンオリゴのいずれかが標識部分を含む、ものである、遺伝子解析方法。
【請求項２】
核酸試料およびオリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ストリップが、ストリップ上の異なる位置に配された複数のプローブを固定したプローブ領域と、前記プローブ領域とは異なる位置に配された位置マーカー領域とを備えたクロマトグラフィー本体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子差異を検出するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子多型を検出するためのものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドプローブを固定したストリップ、
対象とする核酸試料に相補的な配列および前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、ならびに
対象とする核酸試料に相補的であって、該一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する配列および標識物質またはタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子解析方法のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目視判定可能な遺伝子検査のために、標的遺伝子の一本鎖ＤＮＡを増幅して検出する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体の塩基配列を解析して判定を行う遺伝子検査は、基礎研究、医療、食品等の分野で広く用いられている。より具体的には、突然変異の検出、遺伝子多型（ヒトや動物では、変化の頻度が１％以上のものを言う）の判定、病原菌の検出、遺伝子組換えの有無の検査等に用いられている。例えば、遺伝子多型判定は、薬の副作用や効果をあらかじめ予測できるとして、医療現場等で活用され始めている。
【０００３】
遺伝子検査は、典型的にはリアルタイムＰＣＲ機器を用いたＴａｑＭａｎ法やＱＰ法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた手法（ＤｉｇｉＴａｇ法等）等を使用して行われる。しかしながら、これらの方法はいずれも技術習得、高額な蛍光検出機器を必要とするため、受託解析は行われているものの、医療現場等では活用されにくいのが現状である。
【０００４】
また、オリゴヌクレオチドを固定した固相上で標的核酸を検出する方法が開示されている（特許文献１、特許文献２）。ここでいう「固相」とは、ニトロセルロース膜やナイロン膜等のオリゴヌクレオチドを固定可能な膜上にライン状またはスポット状にオリゴヌクレオチドを結合させたいわゆる「ストリップ」のことであり、具体例は、ＰＡＳ（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）と称されるものである。核酸クロマトグラフィーの原理により、ＰＣＲにより調製したＤＮＡ産物をこのストリップ上に展開し、ハイブリダイゼーションにより検出が可能となる。この手法では、調製したＤＮＡ産物は二本鎖となっていて、そのＤＮＡ産物の一つの鎖の末端にシングルタグをつけることを特徴としている。しかしながら、ＰＣＲにより標的の二本鎖ＤＮＡ配列を増幅するため、感度（反応性）は高いものの、プライマーダイマー等の非特異的な増幅産物が生じやすく精度（正確性）が低いことが問題としてあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許５５０３０２１号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０７０６１８号
【特許文献３】特許３１０３８０６号
【特許文献４】特開２００６−１０１８４４号
【特許文献５】特公平６−３６７６０号
【特許文献６】特許３３３０５９９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、臨床現場等でも簡易的かつ正確に検査可能な遺伝子解析技術を提供することを目的とする。
【０００７】
従来のストリップでの技術では、標的とするＤＮＡを増幅させて、増幅したＤＮＡ産物をストリップ上で「展開」し、ストリップ上のオリゴヌクレオチドとＤＮＡ産物がハイブリダイゼーションを起こすことで判定を行うことが出来る。この技術では、標的とするＤＮＡをＰＣＲにより多量に増幅し、そのＤＮＡ産物をストリップ上で展開する。したがって、ストリップ上でＤＮＡ産物の検出を行うためにはＰＣＲによる増幅が必須とされてきた。しかしながら、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ産物では、プライマーダイマー等の非特異的なＤＮＡ産物が発生することが多々あり、本来検出されないＤＮＡがストリップ上で検出され、誤判定を生じるという問題点があった。
【０００８】
また、ストリップでＳＮＰを検出する場合、ＰＣＲに使用するプライマーの３’末端をＳＮＰに対応する塩基に合わせることで、ＳＮＰに対応する二本鎖ＤＮＡを増幅させる手法が用いられている。しかしながら、ＳＮＰのＰＣＲの増幅工程で、プライマーのハイブリダイゼーションが誤って起きることがあり、精度がさらに低くなる問題を生じた。
【０００９】
さらに、ストリップを用いた検出において、一本鎖ＤＮＡ配列を用いて検出する方法が考えられる。例えば、一本鎖ＤＮＡの一方の末端にシングルタグをつけ、もう一方の末端に標識物質をつけるものであり、ＰＣＲにより増幅した二本鎖ＤＮＡ産物を熱変性により、一本鎖ＤＮＡに分離することで取得することが考えられる。この方法の場合、ＰＣＲにおいて、上記の問題点が発生し、精度が低くなることに加え、ＤＮＡ産物を熱変性により分離するため、ストリップ上で展開させるときに、分離した一本鎖ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡに一部戻るものがあり、感度がさらに低くなる問題を生じた。
【００１０】
このため、臨床現場等で簡易的かつ高精度に検査可能なＤＮＡ検出技術の確立は重要課題の一つである。特に、大掛かりな装置等必要なく、臨床現場等で簡易的かつ高精度に検査可能なストリップを用いた遺伝子検査技術が着目されている。
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、検査に用いる試料において二本鎖ＤＮＡ産物を作製しないことで、プライマーダイマー等の非特異的二本鎖ＤＮＡ産物を増幅させないことに着目した。そこで、ライゲーションで増幅させた一本鎖ＤＮＡ産物を検出試料とすることで、より精度の高い遺伝子検出技術の開発を検討した。
【００１２】
一本鎖ＤＮＡを得る技術は従来より存在していた。有名な技術としては、Ｄｉｇｉｔａｇ法（特許文献３、特許文献４）やＬＣＲ（特許文献５、特許文献６）と言った技術があげられる。しかしながら、これらの技術では、反応に用いるオリゴヌクレオチドが非特異的に核酸試料に結合してしまい、偽陽性として誤判定してしまうことがわかった。
【００１３】
一本鎖ＤＮＡを得る技術である、Ｄｉｇｉｔａｇ法の工程を説明する。核酸試料の標的となる遺伝子配列をＰＣＲにより増幅させる。熱変性を行い得られたＰＣＲ産物を分離させた後、クエリーオリゴとコモンオリゴを用いて、ライゲーション反応を行い、一本鎖ＤＮＡのライゲーション産物を得る。得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、再度ＰＣＲにより増幅させる。得られたＰＣＲ産物を熱変性により、一本鎖として、マイクロアレイ上に分注する。マイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブと一本鎖ＤＮＡがハイブリダイズし、ハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡから発せられる蛍光を機器によって読み取り、検出を行う。このとき、得られる一本鎖ＤＮＡは、緑と赤の２種類蛍光標識のプライマーからなる。これらの蛍光により、緑と赤、そして緑と赤が混ざった黄色となる。このため、Ｄｉｇｉｔａｇ法では、単色の緑や赤の蛍光の検出においては、他方の蛍光標識のＤＮＡがハイブリダイズしていても、微量であるため検出されない。そのため、わずかなダイマーが生成されていても問題とならない。
【００１４】
しかしながら、上記のＤｉｇｉｔａｇ法で得られた一本鎖ＤＮＡをストリップ上で展開させると、わずかな遺伝子量であってもラインとして反応がでることになり、偽陽性として検出されることがある。そのため、一本鎖ＤＮＡを得る技術として優れてはいるが、精度の観点からはストリップで用いることができない。
【００１５】
次に、一本鎖ＤＮＡを得る技術である、ＬＣＲ反応の工程を説明する。核酸試料の標的となる遺伝子配列をＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲ後、クエリーオリゴとコモンオリゴ、および、クエリーオリゴとコモンオリゴに相補的なＣクエリーオリゴとＣコモンオリゴとリガーゼ等を混合する。得られたＰＣＲ産物を熱変性を行い分離させた後、クエリーオリゴとコモンオリゴを用いて、ライゲーション反応を行い、一本鎖ＤＮＡのライゲーション産物を得る。さらに、得られたライゲーション産物と相補的な、ＣクエリーオリゴとＣコモンオリゴにより、相補的なライゲーション産物を得る。得られたライゲーション産物とＦクエリーオリゴとＦコモンオリゴを用いて、ライゲーション産物を得る。この工程を繰り返し行い、多量の一本鎖ＤＮＡを得ることができる。
【００１６】
しかしながら、上記のＬＣＲで得られた一本鎖ＤＮＡをストリップ上で展開させると、偽陽性として検出されることがある。これは、大量に一本鎖ＤＮＡを生成するために、プローブと鋳型との間でミスマッチハイブリダイゼーションが起こり、偽陽性となりうる意図しない一本鎖ＤＮＡとしてライゲーション産物が生成されるためである。また、プローブ同士がミスマッチハイブリダーゼーションしてしまうことでさらなる意図しない一本鎖ＤＮＡが生成されてしまう。そのため、一本鎖ＤＮＡを得る技術として優れてはいるが、精度の観点からはストリップで用いることができない。
【００１７】
さらに、Ｄｉｇｉｔａｇ法のように、マルチプレックスＰＣＲで増幅する遺伝子の種類が増えた場合は、反応のしやすい遺伝子が優先的に増幅され、反応しにくい遺伝子の増幅効率が悪くなることがあり、本来検出されるべき核酸試料が検出されず、偽陰性として誤判定することもありえる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、これらの問題点を解決するため、ＰＣＲやＬＣＲと異なり、相補鎖ＤＮＡを用いない遺伝子増幅処理に着目し、一本鎖ＤＮＡをより簡易的に高精度に取得できる方法を見出し、本発明を完成させた。従来、一本鎖ＤＮＡを作製することは、ＤＮＡの増幅効率がＰＣＲより悪く、感度が低いという問題点が指摘されていた。しかしながら、この指摘に反し、本技術では、臨床現場等でも簡易的に検査可能な感度を実現している。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下を提供するものである：
（１）下記（ｉ）および（ｉｉ）をハイブリダイズさせ、目視で検出可能な状態にすることを含む遺伝子解析方法：
（ｉ）ストリップ上に固定したオリゴヌクレオチドプローブ； 
（ｉｉ）下記（ａ）および（ｂ）を、核酸試料を鋳型とする一回または複数回の熱サイクル処理を経るライゲーション処理に供して増幅した一本鎖ライゲーション産物：
（ａ）前記核酸試料に相補的な第一の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列または標識部分を含むクエリーオリゴ；
（ｂ）前記核酸試料に相補的であって、前記第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよびタグ配列または標識部分を含むコモンオリゴ、
（２）サイクリングライゲーション反応を行う（１）の方法、
（３）核酸試料およびオリゴヌクレオチドがＤＮＡである、（１）または（２）の方法、
（４）ストリップが、ストリップ上の異なる位置に配された複数のプローブを固定したプローブ領域と、前記プローブ領域とは異なる位置に配された位置マーカー領域とを備えたクロマトグラフィー本体である、（１）〜（３）のいずれかの方法、
（５）遺伝子差異を検出するためのものである、（１）〜（４）のいずれかの方法、
（６）遺伝子多型を検出するためのものである、（１）〜（５）のいずれかの方法、
（７）オリゴヌクレオチドプローブを固定したストリップ、
対象とする核酸試料に相補的な配列および前記プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、ならびに
対象とする核酸試料に相補的であって、該一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する一本鎖オリゴヌクレオチドおよび標識物質またはタグ配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチド、
を含む、（１）〜（６）のいずれかの遺伝子検査方法のためのキット。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、遺伝子解析をより簡易的かつ迅速に、目視で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の試料の処理を示す図である。
【図２】実施例１の試料をＰＣＲで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
【図３】実施例１で用いたＰＡＳ（Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）の模式図である。
【図４】実施例１の検出結果を示す図である。
【図５】通常のライゲーション反応の温度変化の具体例を示す図である。
【図６】サイクリングライゲーション反応の温度変化の具体例を示す図である。
【図７】本発明の試料の処理（サイクリングライゲーション）を示す図である。
【図８】実施例２の試料をＰＣＲで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
【図９】実施例２、５で用いたＰＡＳの模式図である。
【図１０】実施例２の検出結果を示す図である。
【図１１】実施例３の試料をＰＣＲで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
【図１２】実施例３、４で用いたＰＡＳの模式図である。
【図１３】実施例３の検出結果を示す図である。
【図１４】実施例４の試料をＰＣＲで増幅して得られた断片の確認結果を示す図である。
【図１５】実施例４の検出結果を示す図である。
【図１６】実施例５の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
一の態様において、本発明は核酸試料の目視による検出可能な状態での、複数の遺伝子多型の解析等の遺伝子解析方法に関する。より具体的には、固相担体に結合されたオリゴヌクレオチドプローブに、核酸試料を用いて調製された、タグ配列および標識部分を含む一本鎖ライゲーション産物をハイブリダイズさせることにより、目視にて標的核酸の検出を行うことを可能にする方法に関する。
【００２３】
本発明の遺伝子解析方法は、あらゆる遺伝子の配列の解析に用いることができる。例えば、細菌、ウイルス、植物、ヒトを含む動物、ヒト以外の動物の遺伝子解析に用いることができ、例えば、変異、遺伝子多型、突然変異等の遺伝子変異の検出等に用いることができる。より具体的には、例えば、ＨＰＶ、デング熱、インフルエンザウイルス等の検出および型判定、動植物の種の判定、遺伝子組換え作物の検出、ウイルス薬剤耐性株遺伝子、薬剤耐性菌遺伝子、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト、置換・欠損・挿入等の検出に用いられる。例えば、本発明の遺伝子解析方法は、遺伝子多型の検出に用いられる。
【００２４】
（核酸試料）
本発明の対象となる核酸試料は、ヌクレオチドが重合した分子であり、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド等を含む。また、あらゆる種類の一本鎖または二本鎖のＤＮＡ等を含む。さらに、天然のヌクレオチドのみで形成されたもの、および非天然の塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドを一部に含むもの、あるいは合成核酸も含む。典型的には、核酸試料はＤＮＡである。
【００２５】
また、本発明の対象となる核酸試料は、各種動植物由来の試料、例えば血液、尿、鼻汁、唾液、組織、細胞、種子、植物組織、植物培養物等、および微生物由来の試料を用いて、当業者に周知の方法、例えば抽出等により得ることができる。得られた核酸は処理の前に精製してもよいし、しなくてもよい。また、人工的に合成して得ることもできる。好ましくは、核酸試料は、後述のライゲーション処理の前にＰＣＲにより増幅される。この場合、ＰＣＲに用いられるプライマーは、対象となる試料に応じて、当業者が適宜選択、設計、調製できる。
【００２６】
核酸試料の特定の部位をＰＣＲにより増幅させることは、必ずしも必要な工程ではないが、後述のライゲーション処理において、より高い精度で増幅産物を得ることができる。
【００２７】
ＰＣＲは、複数の遺伝子を同時に増幅させることができるマルチプレックスＰＣＲが可能となる。増幅できる遺伝子数は２〜１５である。好ましくは、３〜１０であり、さらに好ましくは、４〜８である。遺伝子数が１６を超えて、ＰＣＲを行うと、ダイマーが多く生成してしまい、精度が低くなり、現場等で簡易に使用できなくなる。
【００２８】
ＰＣＲのＴｍ値は、６０〜８０℃が好ましい。さらに好ましくは、６５〜７５℃である。比較的高温に設定することで、核酸試料とプライマーのアニーリングが特異的になり、マルチプレックスＰＣＲのミスマッチが軽減される。
【００２９】
（固相担体）
本発明の遺伝子解析方法では、オリゴヌクレオチドプローブが固定された固相担体を用いる。好ましくは、膜上にオリゴヌクレオチドプローブを結合させたアレイである「ストリップ」を固相担体として用いる。このような固相担体は、遺伝子解析方法の実施の前に調製してもよいし、市販品を使用してもよい。固相担体は、好ましくは異なる位置に複数のプローブが固定されたプローブ領域を有することが好ましい。また、プローブ領域とは別の位置に、位置マーカー領域を有することが好ましい。本明細書において、ストリップに固定されたオリゴヌクレオチドプローブを、検出プローブとも称する。
【００３０】
用いられるストリップは、展開溶媒を移動可能なクロマトグラフィー本体であり、本発明の遺伝子解析に用いることができれば特に限定されない。例えば、ガラスまたはプラスチック等の基板上に、シリカ、膜物質等が塗布または接着等で固定されたものや、紙片にニトロセルロース等の膜物質を固定したもの等が挙げられる。好ましいストリップの市販品の例は、ＰＡＳ（ＴＢＡ社製）である。
【００３１】
検出プローブの長さは特に限定されず、対象となる核酸試料に応じて当業者が適宜設定できる。好ましい例は、２０塩基以上５０塩基以下である。検出プローブは、好ましくはＤＮＡである。
【００３２】
（クエリーオリゴおよびコモンオリゴ）
本発明の遺伝子解析方法は、クエリーオリゴおよびコモンオリゴを調製することを含む。
【００３３】
本明細書におけるクエリーオリゴとは、核酸試料に相補的な第一の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび任意に検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列、または任意に標識部分を含むものをいう。本発明において、クエリーオリゴはタグ配列または標識部分を含む。典型的には、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端側にタグ配列または標識部分が結合している。タグ配列と第一の一本鎖オリゴヌクレオチドとの間に、スペーサー配列が結合されていてもよいし、タグ配列と第一の一本鎖オリゴヌクレオチドがスペーサー配列なしに直接結合していてもよい。
【００３４】
本明細書におけるコモンオリゴとは、核酸試料に相補的であって、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドに隣接する第二の一本鎖オリゴヌクレオチド、および任意に標識部分、または任意に検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含むものをいう。本発明の一実施形態において、コモンオリゴは標識部分またはタグ配列を含む。典型的には、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’末端側に標識部分またはタグ配列が結合している。また、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの５’末端に、リン酸を付加してもよいし、しなくてもよい。ただし、リン酸を付加しない場合は、後述のライゲーション反応前に５’末端へのリン酸付加を行う工程を入れることができる。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、クエリーオリゴがタグ配列を含み、コモンオリゴが標識部分を含む。また他の好ましい実施形態において、クエリーオリゴが標識部分を含み、コモンオリゴがタグ配列を含む。さらに他の好ましい実施形態において、クエリーオリゴがタグ配列を含み、コモンオリゴがタグ配列を含む。
【００３６】
標識部分は、検出プローブとハイブリダイズした一本鎖オリゴヌクレオチドを検出できるものであれば特に限定されない。例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質などの蛍光物質、ルミノール、アクリジニウム誘導体などの発光物質；３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃおよび３２Ｐなどの放射性物質、磁気ビーズなどの磁性物質、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどの酵素；顔料および染料などの色素；ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンなどの親和性標識などが挙げられる。本発明の方法は目視による検査に使用できるものであり、蛍光物質、発光物質、色素などの標識部分を用いることが好ましい。また、標識部分をビオチンとし、着色したビーズ等を結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを該ビオチンに結合させることで検出を行うことも好ましい。また、標識部分を抗体および／またはハプテンとし、そこに標識物質として蛍光、放射能、磁性、酵素、燐光、化学発光および着色からなる群から選択される１種または２種以上を結合させて検出を実現してもよい。ハプテンとは、単独で抗体と結合するが、それ自体は免疫応答を起こす能力のない物質をいい、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびＦＩＴＣなどが含まれる。
【００３７】
第一の一本鎖オリゴヌクレオチド、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドの長さは、対象となる試料に応じて当業者が適宜設定できる。例えば、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは２０〜７０塩基である。好ましくは、第一の一本鎖オリゴヌクレオチドは１２〜４０塩基、第二の一本鎖オリゴヌクレオチドは２０〜５０塩基である。
【００３８】
本発明の遺伝子解析方法を遺伝子変異の検出に用いる場合、変異部分がクエリーオリゴ、コモンオリゴのいずれに含まれていてもよい。好ましくは、変異部分はクエリーオリゴに含まれる。より好ましくは、変異部分はクエリーオリゴの３’末端に位置する。
【００３９】
クエリーオリゴおよびコモンオリゴの好ましい濃度は、対象となる試料、検出の標的とする配列等に応じて当業者が適宜調整できる。好ましい濃度の例としては、終濃度でコモンオリゴが１００ｎＭ〜５μＭ、クエリーオリゴが１μＭ〜１０μＭ等である。
【００４０】
（ライゲーション）
上記クエリーオリゴおよびコモンオリゴを、核酸試料を鋳型とするライゲーション反応に供することで固相担体にハイブリダイズさせるライゲーション産物を得ることができる。本明細書にいうライゲーションとは、対応する核酸試料に結合したクエリーオリゴとコモンオリゴを連結する工程である。核酸試料に結合したクエリーオリゴとコモンオリゴは互いに隣接し合った状態になっているので、リガーゼ等を作用させてライゲーション反応を行うことにより、連結部を介してクエリーオリゴとコモンオリゴを連結させることができる。この際のライゲーション反応は複数の遺伝子を同時に増幅させることができるマルチプレックス反応が可能である。増幅できる遺伝子数は２〜１５である。好ましくは、３〜１０であり、さらに好ましくは、４〜８である。
【００４１】
オリゴ同士の連結に使用し得る好適な試薬には、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＴａｑＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅが含まれるが、これに限定されない。また、酵素的な手法に変えて、化学的な手法で両オリゴ群を連結してもよい。
【００４２】
より具体的には、図５に示すように、核酸試料とクエリーオリゴ、コモンオリゴを結合させた後、９０℃以上の高温（例えば９０〜１００℃）で数分間、次いで５０℃程度の温度（例えば、４０〜６０℃）で数十分間反応させることでクエリーオリゴとコモンオリゴを連結させ、ストリップ（ここではＰＡＳを使用）で遺伝子多型の判定等を行うことが可能である。より具体的には、ライゲーション処理は、９０℃以上の高温で数分間、次いで５０℃程度の温度で１０〜２０分間、さらに９０℃以上の高温で数分間置いた後、４０℃程度に下げることで実施できる。さらに好ましくは後述のサイクリングライゲーション反応を行うことで感度を高めることができる。
【００４３】
（サイクリングライゲーション反応）
多量のライゲーション産物を得るためにＬＣＲを用いると、上述の通り検査精度の問題がある。そこで本発明者らはクエリーオリゴおよびコモンオリゴの相補鎖を加えることなく、９０℃以上の熱処理と５０℃程度のライゲーション反応を組合せることで、さらに高感度かつ正確に遺伝子多型の判定等を行うことを可能とした（図６）。この温度調整方法は、単純なライゲーション反応とは異なり、また、クエリーオリゴおよびコモンオリゴの相補鎖を入れないことからＬＣＲとも異なった新しいライゲーション方法である。本発明者らは熱処理とライゲーション反応を組み合わせたこの温度調節方法をサイクリングライゲーション反応（ＣＬＲ:Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）と命名した。本明細書において、この反応を「サイクリングライゲーション反応」と称する。
【００４４】
より具体的には、図７に示すように、クエリーオリゴとコモンオリゴを核酸試料にハイブリダイズさせるライゲーションにおいて、ハイブリダイズとライゲーションの時間を１０〜３０秒程度の短時間に設定し、温度を比較的高い温度に設定する。その反応後、急速に高温にして、二本鎖となっていた核酸試料とＤＮＡ産物を乖離させ、再度温度を下げ、ライゲーションの反応を行う、といった工程を２０回以上のサイクルで行う。この反応は、１．急激に温度を上げる、２．短時間で高温処理を行う、３．急激に温度を下げる、４．短時間でライゲーション反応を行う、これら４つの工程を短時間で繰返し行うことを特徴とする。このサイクリングライゲーション反応により、短時間で正確に標的とする一本鎖ＤＮＡだけを増幅させることができ、ストリップにおいて精度の高い検出を行うことができる。
【００４５】
サイクリングライゲーション反応では、９０℃以上の高温（例えば９０〜１００℃）と、５０℃程度の温度（例えば、４０〜６０℃）を繰り返す（例えば、９０℃１５秒間および５８℃３０秒間を３０サイクル）。好ましいサイクリングライゲーション反応のサイクル数は、例えば１０回以上、２０回以上、または３０回以上である。サイクル数の下限、上限は特に限定されないが、下限は例えば２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など、上限は例えば１００回以下、９０回以下、８０回以下、７０回以下、６０回以下、５０回以下、４０回以下などが挙げられる。１サイクルの時間も特に限定されないが、下限は例えば１０秒間以上、２０秒間以上、３０秒間以上など、上限は１０分間以下、５分間以下、３分間以下、２分間以下、１分間以下などが挙げられる。ハイブリダイズとライゲーションの時間は同じであっても異なっていてもよく、調製する試料等に応じて適宜設定できる。各々の時間の上限、下限は特に限定されないが、下限は例えば１０秒間以上、１５秒間以上、３０秒間以上、４０秒間以上、５０秒間以上などが挙げられ、上限は例えば５分間以下、３分間以下、２分間以下、１分間以下、５０秒間以下、４０秒間以下、３０秒間以下などが挙げられる。
【００４６】
従来の、ストリップを用いる方法では、二本鎖ＤＮＡを検出に供するため、一本鎖のタグ配列と試料の間にスペーサー配列を使用する必要があるが、本発明の方法では、一本鎖ライゲーション産物をＰＣＲ増幅せずにハイブリダイゼーション処理に供するため、スペーサー配列は必要なく、遺伝子解析を簡便かつ短時間に行うことが可能である。
【００４７】
ライゲーション処理を行うときに、核酸試料と同時に生成できるポジティブコントロールを用意することが好ましい。ポジティブコントロールとしては、Ｇ３ＰＤＨ遺伝子等があげられる。検出をサンプルとポジティブコントロールの遺伝子産物で同時に行うことで、ストリップ上にラインが現れなくても、ライゲーション処理のミスか、該当のサンプルが含まれていないか判別できる。
【００４８】
（固相担体による検出）
ライゲーション処理によって得られたライゲーション産物は、検出プローブが固定された固相担体に供され、検出される。例えば、ストリップなどのクロマトグラフィー本体を用いる場合、ライゲーション産物を展開液に加え、必要に応じてバッファー、発色液等を加えて混合し、クロマトグラフィーによってハイブリダイゼーション反応を行う。本発明の方法を用いると、遺伝子解析の結果が目視で検出可能な状態となる。
【００４９】
ここでいう「目視で検出可能な状態」とは、目視で検出する態様を当然に含むが、実際に目視で検出を行うことを必要とするものではなく、例えばリーダー等の機械に読み取らせる態様も含む。また、追加の操作、例えば光の照射、を行うことで目視検査が可能となるような状態も含まれる。
【００５０】
本発明の方法は、上述の通り、様々な用途に用いられる。具体的な用途の例として、これらに限定されないが、医療現場における遺伝病の遺伝子診断、病原体の型の判別、税関における検疫、食品工場や食品販売店における食肉や植物の品種の検査、遺伝子組換え原料の使用有無の判定等が挙げられる。
【００５１】
本発明は他の態様において、遺伝子解析に用いることが可能なキットに関する。
【００５２】
一の実施形態において本発明のキットは、検出プローブを備えたストリップ、検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列および第一の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むクエリーオリゴ、ならびに第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび標識部分を含むコモンオリゴを含む。他の実施形態において、本発明のキットは、検出プローブを備えたストリップ、標識部分および第一の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むクエリーオリゴ、ならびに第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含むコモンオリゴを含む。さらに他の実施形態において、本発明のキットは、検出プローブを備えた固相担体、検出プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列および第一の一本鎖オリゴヌクレオチドを含むクエリーオリゴ、ならびに第二の一本鎖オリゴヌクレオチドおよび標識プローブとハイブリダイズ可能なタグ配列を含むコモンオリゴを含む。
【００５３】
また、本明細書にいう標識プローブとは、典型的に一本鎖ＤＮＡ産物の両末端がタグ配列を有するときに、検出プローブとハイブリダイズしないコモンオリゴのタグ配列とハイブリダイズする、標識部分を有するオリゴヌクレオチドプローブのことである。
【００５４】
好ましくは、本発明のキットは、さらにリガーゼを含む。ライゲーション処理に用いられる限り、いかなるリガーゼを用いてもよい。好ましいリガーゼの例は、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼである。
【００５５】
本発明のキットは、あらゆる遺伝子の配列の解析に用いることができる。例えば、細菌、ウイルス、植物、ヒトを含む動物、ヒト以外の動物の遺伝子解析に用いることができ、例えば、変異、遺伝子多型、突然変異等の遺伝子変異の検出等に用いることができる。より具体的には、例えば、ＨＰＶ、デング熱、インフルエンザウイルス等の検出および型判定、動植物の種の判定、遺伝子組換え作物の検出、ハラール認証の検査、ウイルス薬剤耐性株遺伝子、薬剤耐性菌遺伝子、一塩基多型（ＳＮＰ）、マイクロサテライト、置換・欠損・挿入等の検出に用いられる。例えば、本発明のキットは、遺伝子多型の検出や、ウシやブタなどの食品偽装の鑑定、ウイルス感染の簡易検査に用いられる。
【００５６】
以下に、本発明の利用の具体例を詳細に記載するが、本発明が必ずしもこれらに限定されるというものではない。
【００５７】
本発明にかかるヒトの遺伝子検査は、ヒトの血液から遺伝子を抽出することで、容易に検査をすることができる。遺伝子としては、例えばシトクローム遺伝子があげられ、薬の代謝能力を知ることができる。例えば、体内のニコチンの代謝のしやすさ、イリノテカンやタモキシフェンのような抗がん剤の副作用や薬の効果等を知ることができる。
【００５８】
本発明にかかる動物の遺伝子検査は、例えば、各種動物のミトコンドリアの遺伝子を用いることで、その種判別を行うことができる。そのため、動物が生きている状態で血液等を採血する必要は特に無く、食品用の食肉であっても遺伝子を取得することができる。他にも、加工品やスープの原料等でも良い。動物としては、ウシやブタ、トリに限らず、ヒツジ、ヤギ、魚等であっても良い。
【００５９】
本発明にかかる病原菌やウイルス等の検査は、例えば、感染者より直接採取することで、容易に検査をすることができる。病原菌やウイルスに特に制限は無く、また、病原菌やウイルスの感染の有無だけではなく、型判別を行うこともできる。
【００６０】
上記の検査は、特殊な装置を特に必要とすることはなく、卓上用の装置があれば可能とするものである。病院などの臨床現場での利用、食品工場での工程の検査、税関等での偽装食品混入の検査、動物の親子鑑定、農作物の品種鑑定等、多くの場面でその利用が想定できる。
【００６１】
以下に本発明を実施例を用いて詳細に説明するが、実施例は例示の目的であり、本願発明が必ずしも実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１
本発明の方法による標的遺伝子変異の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。ライゲーション反応までの手順を図１に示した。
１．プライマーの調製
２．標的遺伝子の増幅
３．ライゲーション用プローブの調製
４．ライゲーション反応
５．クロマトグラフィー本体（ＰＡＳ：Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）を用いた検出。
また、ヒト由来のゲノムＤＮＡ ４サンプル（Ａ０４、Ｂ０３、Ｃ０３、Ｄ０３）を実験に供試した。
【００６３】
１．プライマーの調製
１−１．プライマーの調製
ヒトゲノム中のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に特異的な以下の表１に示すプライマーＣ１２〜Ｃ１４（ユーロフィンジェノミクス社製）を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、１００μＭの濃度に調整された。Ｃ１２プライマーはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝子多型であるｒｓ１６９４７（ＣがＴに変異）、Ｃ１４プライマーは同遺伝子多型であるｒｓ１０６５８５２（ＣがＴに変異）を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、図面ではｒｓ１６９４７を２８５０Ｃ＞Ｔ、ｒｓ１０６５８５２を１００Ｃ＞Ｔと記載している。
【００６４】
【表１】
0006616574.tif 000002
【００６５】
２．標的遺伝子の増幅
２−１．反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムＤＮＡはヒト由来のものを用いた。ゲノムＤＮＡを表１のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔを使用した。サーマルサイクラーとして、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ｇｒａｄｉｅｎｔを使用した。表２に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
【００６６】
【表２】
0006616574.tif 000003
【００６７】
２−２．ＰＣＲ反応
調製したサンプル溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後、９５℃で３０秒、６８℃で２分を４０サイクル、その後４℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図２に示す。
【００６８】
３．ライゲーション用プローブの調製
３−１．ライゲーション用のプローブの調製
２．で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ（コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製）を準備した。プローブの塩基配列を表３に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ１種類、クエリーオリゴ２種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの（ＷＴと標記）と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの（ＭＴと標記）からなる。コモンオリゴの３’末端にはビオチン［Ｂｉｏｔｉｎ］が標識されており、クエリーオリゴの５’末端にはクロマトグラフィー本体（ＰＡＳ）に固定化されたオリゴＤＮＡと相補的なタグ配列が付加されている（配列情報非開示）。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはｓｐａｃｅｒ  Ｃ３が挿入されている。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴＤＮＡの位置は図３に記載した。
【００６９】
【表３】
0006616574.tif 000004
【００７０】
３−２．コモンオリゴの５’末端のリン酸化
ライゲーション反応を行うために、コモンオリゴの５’末端にリン酸基を付加した。リン酸基を付加する試薬として、東洋紡社のＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅを使用した。
【００７１】
３−３．反応液調製
表４に示す試薬を調製した。なお、コモンオリゴの最適濃度を調べる目的で、調製液に加えるコモンオリゴ濃度を１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭの４種類とした。
【００７２】
【表４】
0006616574.tif 000005
【００７３】
３−４．反応条件
コモンオリゴ溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、３７℃で３０分後、９５℃で３分、その後４℃に下げ、反応を終了した。
【００７４】
３−５．反応液調製
リン酸基付加反応を行ったコモンオリゴ溶液全量（２０μＬ）にクエリーオリゴ２０μＬを混合した。なお、各コモンオリゴ溶液に対して表５の組成でクエリーオリゴを混合した。
【００７５】
【表５】
0006616574.tif 000006
【００７６】
４．ライゲーション反応
４−１．反応液調製
ライゲーション反応における組成は表６のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【００７７】
【表６】
0006616574.tif 000007
【００７８】
４−２．ライゲーション反応
ライゲーション溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で５分後、５８℃で１５分、９５℃で２分、その後３７℃に下げ、反応を終了した。
【００７９】
５．クロマトグラフィー本体を用いた検出
５−１．ハイブリダイゼーション反応
４．で得られた一本鎖ＤＮＡを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
【００８０】
５−２．反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液（ＴＢＡ社製）、ラテックス液（ＴＢＡ社製）、ホルムアミドを３０％含有するＴＥバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を用いて実施した。反応液の組成を表７に示す。
【００８１】
【表７】
0006616574.tif 000008
【００８２】
５−３．ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各５０μＬを１．５ｍＬチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。反応液は約２０分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
【００８３】
５−４．検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。結果を表８および図４に示す。図４に示すように、３．ライゲーション用プローブの調製でコモンオリゴの濃度を５００ｎＭ、クエリーオリゴを２．５μＭとした場合に予想される位置で発色が見られ、本手法が効果を有することが確認できた。
【００８４】
５−５．結果
【００８５】
【表８】
0006616574.tif 000009
【００８６】
実施例２
本発明の検出方法による標的遺伝子変異の検出感度をさらに上げる方法として、次の手順で実験を行った。以下、これらの順序に従って説明する。ライゲーション反応までの手順を図７に示す。
１．プライマーの調製
２．標的遺伝子の増幅
３．ライゲーション用プローブの調製
４．サイクリングライゲーション反応
５．クロマトグラフィー本体（ＰＡＳ：Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムＤＮＡ（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ）を実験に供試した。
【００８７】
１．プライマーの調製
ヒトゲノム中のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に特異的な以下の表９に示すプライマーＣ０９、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４およびポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーコントロール（ユーロフィンジェノミクス社製）を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、１００μＭの濃度に調整された。Ｃ０９プライマーはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝子多型であるｒｓ１１３５８４０（ＧがＣに変異）、Ｃ１０プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるｒｓ５０３０８６５（ＧがＡに変異）、Ｃ１２プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるｒｓ１６９４７（ＣがＴに変異）、Ｃ１４プライマーは同遺伝子多型であるｒｓ１０６５８５２（ＣがＴに変異）を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、図面ではｒｓ１１３５８４０を４１８０Ｇ＞Ｃ、ｒｓ５０３０８６５を１７５８Ｇ＞Ａ、ｒｓ１６９４７を２８５０Ｃ＞Ｔ、ｒｓ１０６５８５２を１００Ｃ＞Ｔと記載している。
【００８８】
【表９】
0006616574.tif 000010
【００８９】
２．標的遺伝子の増幅
２−１．反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムＤＮＡはヒト由来のものを用いた。ゲノムＤＮＡを表９のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社のＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを使用した。サーマルサイクラーとして、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ｇｒａｄｉｅｎｔを使用した。表１０に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
【００９０】
【表１０】
0006616574.tif 000011
【００９１】
２−２．ＰＣＲ反応
調製したサンプル溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で３分後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を３０サイクル、その後７２℃で５分、最後に４℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図８に示す。
【００９２】
３．ライゲーション用プローブの調製
３−１．ライゲーション用のプローブの調製
２．で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ（コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製）を準備した。プローブの塩基配列を表１１に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ１種類、クエリーオリゴ２種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの（ＷＴと標記）と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの（ＭＴと標記）からなる。コモンオリゴの５’末端にはリン酸基［Ｐ］が修飾されており、３’末端にはビオチン［Ｂｉｏｔｉｎ］が標識されている。なお、実施例１ではコモンオリゴの５’末端にリン酸基を修飾する反応を行っていたが、今回は操作時間の短縮を目的とし、オリゴ合成段階で５’末端にリン酸基を修飾したコモンオリゴを用いた。クエリーオリゴの５’末端にはクロマトグラフィー本体（ＰＡＳ）に固定化されたオリゴＤＮＡと相補的なタグ配列が付加されている（配列情報非開示）。また、クエリーオリゴとタグ配列の間にはｓｐａｃｅｒ  Ｃ３が挿入されている。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴＤＮＡの位置は図９に記載した。なお、本実施例ではＴＢＡ社が販売するクロマトグラフィー本体のＥ１２シリーズを使用した。実施例１で使用したＤ６シリーズより固定化されたオリゴＤＮＡの数が増え、１２種類になっている（Ｆ−１〜Ｆ−１２）。
【００９３】
【表１１】
0006616574.tif 000012
【００９４】
４．サイクリングライゲーション反応
４−１．反応液調製
ライゲーション反応における組成は表１２のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【００９５】
【表１２】
0006616574.tif 000013
【００９６】
４−２．ライゲーション反応
ライゲーション溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で１分後、５８℃で５分、その後、９５℃で１５秒、５８℃で３０秒を３０サイクル、その後９５℃で１分加熱し、３７℃に温度を下げ反応を終了した。
【００９７】
５．クロマトグラフィー本体を用いた検出
５−１．ハイブリダイゼーション反応
４．で得られた一本鎖ＤＮＡを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
【００９８】
５−２．反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液（ＴＢＡ社製）、ラテックス液（ＴＢＡ社製）、ＴＥバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を用いて実施した。反応液の組成を表１３に示す。
【００９９】
【表１３】
0006616574.tif 000014
【０１００】
５−３．ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各２０μＬを１．５ｍＬチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は３７℃で行った。反応液は約２０分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
【０１０１】
５−４．検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図１０に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体による遺伝子多型解析結果がすべて一致した。サイクリングライゲーション反応によりクロマトグラフィー本体上のラインが実施例１よりもしっかりと目視できるようになった。これらのことから、本手法が簡便な遺伝子多型の判定法として有効であることが示された。
【０１０２】
実施例３
ヒトの遺伝子の遺伝子多型だけでなく、本発明の検出方法が動物種判定法としても利用できることを示すため、下記の手順で実験を行った。
１．プライマーの調製
２．標的遺伝子の増幅
３．ライゲーション用プローブの調製
４．サイクリングライゲーション反応
５．クロマトグラフィー本体（ＰＡＳ：Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）を用いた検出
また、ヒト由来のゲノムＤＮＡ、ウシ由来のゲノムＤＮＡ、ブタ由来のゲノムＤＮＡ、ニワトリ由来のゲノムＤＮＡ、ウシとブタとニワトリ由来のＤＮＡを１：１：１で混合したＤＮＡを実験に供試した。
【０１０３】
１．プライマーの調製
ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリのゲノム中のミトコンドリアＤＮＡの中から、これら４種に共通のＤＮＡ配列を見つけ出し、表１４に示すプライマー（ユーロフィンジェノミクス社製）を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、１００μＭの濃度に調整された。
【０１０４】
【表１４】
0006616574.tif 000015
【０１０５】
２．標的遺伝子の増幅
２−１．反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムＤＮＡはヒト、ウシ、ブタ、ニワトリ由来のものを用いた。ゲノムＤＮＡを表１４のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社のＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを使用した。サーマルサイクラーとして、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ｇｒａｄｉｅｎｔを使用した。表１５に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
【０１０６】
【表１５】
0006616574.tif 000016
【０１０７】
２−２．ＰＣＲ反応
調製したサンプル溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で３分後、９５℃で１５秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分を３０サイクル、その後７２℃で５分、最後に４℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図１１に示す。
【０１０８】
３．ライゲーション用プローブの調製
３−１．ライゲーション用のプローブの調製
２．で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ（コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製）を準備した。プローブの塩基配列を表１６に示す。ライゲーション用プローブは各動物種にコモンオリゴ１種類、クエリーオリゴ１種類を作成した。また、ポジティブコントロール用として、ヒト、ウシ、ブタ、ニワトリに共通のコモンオリゴ、クエリーオリゴを作成した。コモンオリゴの５’末端にはリン酸基［Ｐ］が修飾されており、３’末端にはビオチン［Ｂｉｏｔｉｎ］が標識されている。クエリーオリゴの５’末端にはクロマトグラフィー本体（ＰＡＳ）に固定化されたオリゴＤＮＡと相補的なタグ配列が付加されている（配列情報非開示）。また、本実施例ではクエリーオリゴとタグ配列の間にはｓｐａｃｅｒ  Ｃ３は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴＤＮＡの位置は図１２に記載した。なお、本実施例ではＴＢＡ社が販売するクロマトグラフィー本体のＦ１２シリーズを使用した。実施例２で使用したＥ１２シリーズとは固定化されたオリゴＤＮＡの位置が多少異なっている。
【０１０９】
【表１６】
0006616574.tif 000017
【０１１０】
４．サイクリングライゲーション反応
４−１．反応液調製
ライゲーション反応における組成は表１７のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【０１１１】
【表１７】
0006616574.tif 000018
【０１１２】
４−２．ライゲーション反応
ライゲーション溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で１分後、５８℃で５分、その後、９５℃で１５秒、５８℃で３０秒を３０サイクル、その後９５℃で１分加熱し、３７℃に温度を下げ反応を終了した。
【０１１３】
５．クロマトグラフィー本体を用いた検出
５−１．ハイブリダイゼーション反応
４．で得られた一本鎖ＤＮＡを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
【０１１４】
５−２．反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液（ＴＢＡ社製）、ラテックス液（ＴＢＡ社製）、ＴＥバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表１８に示す。
【０１１５】
【表１８】
0006616574.tif 000019
【０１１６】
５−３．ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各２０μＬを１．５ｍＬチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は３７℃で行った。反応液は約２０分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
【０１１７】
５−４．検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図１３に示すように、本手法によりクロマトグラフィー本体による各動物種判定が可能であった。このことから、本手法が簡便な動物種判定手法として有効であることを示した。
【０１１８】
実施例４
ヒトの遺伝子の遺伝子多型だけでなく、本発明の検出方法がウイルス等の型判定法としても利用できることを示すため、下記の手順で実験を行った。検出対象はヒトパピローマウイルスの１６型および１８型とした。
１．プライマーの調製
２．標的遺伝子の増幅
３．ライゲーション用プローブの調製
４．サイクリングライゲーション反応
５．クロマトグラフィー本体（ＰＡＳ：Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）を用いた検出
また、実験材料として、ＨＰＶ１６の遺伝子断片およびＨＰＶ１８の遺伝子断片を導入したプラスミド、および、ＨＰＶ１６に感染していることが既知の臨床検体１サンプルを用いた。
【０１１９】
１．プライマーの調製
表１９に示すＨＰＶの１６型および１８型に特異的なプライマーおよびポジティブコントロールとしてヒトのＧ３ＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマー（ユーロフィンジェノミクス社製）を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、１００μＭの濃度に調整された。
【０１２０】
【表１９】
0006616574.tif 000020
【０１２１】
２．標的遺伝子の増幅
２−１．反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したＤＮＡはＨＰＶの１６型由来のＤＮＡ配列が含まれるプラスミドおよび１８型由来のＤＮＡ配列が含まれるプラスミドを用いた。これらプラスミドには表１９で示したＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のプライマー配列が含まれている。また、ＨＰＶ型判定の性能を評価するために、ＨＰＶ１６の感染が既知のヒトゲノムＤＮＡを実験に用いた。これらＤＮＡを表１９のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社のＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを使用した。サーマルサイクラーとして、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ｇｒａｄｉｅｎｔを使用した。表２０に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
【０１２２】
【表２０】
0006616574.tif 000021
【０１２３】
２−２．ＰＣＲ反応
調製したサンプル溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で３分後、９５℃で１５秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分を３０サイクル、その後７２℃で５分、最後に４℃に下げる）を行った。そして、増幅したサンプルはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のバイオアナライザを用いて電気泳動し、目的とするサイズの増幅産物が得られたことを確認した。結果を図１４に示す。
【０１２４】
３．ライゲーション用プローブの調製
３−１．ライゲーション用のプローブの調製
２．で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ（コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製）を準備した。プローブの塩基配列を表２１に示す。ライゲーション用プローブはＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８およびポジティブコントロールのヒトＧ３ＰＤＨ遺伝子にそれぞれコモンオリゴ１種類、クエリーオリゴ１種類を作成した。コモンオリゴの５’末端にはリン酸基［Ｐ］が修飾されており、３’末端にはビオチン［Ｂｉｏｔｉｎ］が標識されている。クエリーオリゴの５’末端にはクロマトグラフィー本体（ＰＡＳ）に固定化されたオリゴＤＮＡと相補的なタグ配列が付加されている（配列情報非開示）。また、本実施例ではクエリーオリゴとタグ配列の間にはｓｐａｃｅｒ  Ｃ３は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴＤＮＡの位置は図１２に記載した。なお、本実施例ではＴＢＡ社が販売するクロマトグラフィー本体のＦ１２シリーズを使用した。実施例２で使用したＥ１２シリーズとは固定化されたオリゴＤＮＡの位置が多少異なっている。
【０１２５】
【表２１】
0006616574.tif 000022
【０１２６】
４．サイクリングライゲーション反応
４−１．反応液調製
ライゲーション反応における組成は表２２のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【０１２７】
【表２２】
0006616574.tif 000023
【０１２８】
４−２．ライゲーション反応
ライゲーション溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で１分後、５８℃で５分、その後、９５℃で１５秒、５８℃で３０秒を３０サイクル、その後９５℃で１分加熱し、３７℃に温度を下げ反応を終了した。
【０１２９】
５．クロマトグラフィー本体を用いた検出
５−１．ハイブリダイゼーション反応
４．で得られた一本鎖ＤＮＡを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
【０１３０】
５−２．反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液（ＴＢＡ社製）、ラテックス液（ＴＢＡ社製）、ＴＥバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表２３に示す。
【０１３１】
【表２３】
0006616574.tif 000024
【０１３２】
５−３．ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各２０μＬを１．５ｍＬチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は３７℃で行った。反応液は約２０分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
【０１３３】
５−４．検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図１５に示すように、本手法によりクロマトグラフィー本体によるＨＰＶの１６型、１８型判定が可能であった。このことから、本手法が簡便なＨＰＶ型判定手法として有効であることを示した。
【０１３４】
実施例５
クエリータグのスペーサーの有無が検査の結果に影響を与えるかを調べるため、次の手順で実験を行った。以下、これらの順序に従って説明する。
１．プライマーの調製
２．標的遺伝子の増幅
３．ライゲーション用プローブの調製（スペーサー無し）
４．サイクリングライゲーション反応
５．クロマトグラフィー本体（ＰＡＳ：Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ａｒｒａｙ  Ｓｔｒｉｐ）用いた検出
また、ヒト由来のゲノムＤＮＡ  ３サンプル（Ａ１２、Ｂ１２、Ｃ１２）を実験に供試した。
【０１３５】
１．プライマーの調製
ヒトゲノム中のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子に特異的な以下の表２４に示すプライマーＣ０９〜Ｃ１４およびポジティブコントロールとしてＧ３ＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーコントロール（ユーロフィンジェノミクス社製）を準備した。これらプライマーは通常のオリゴヌクレオチド合成方法に準じて合成され、１００μＭの濃度に調整された。Ｃ０９プライマーはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の遺伝子多型であるｒｓ１１３５８４０（ＧがＣに変異）、Ｃ１２プライマーは同遺伝子の遺伝子多型であるｒｓ１６９４７（ＣがＴに変異）、Ｃ１４プライマーは同遺伝子多型であるｒｓ１０６５８５２（ＣがＴに変異）を含む遺伝子領域を増幅するように設計した。なお、実施例の図ではｒｓ１１３５８４０を４１８０Ｇ＞Ｃ、ｒｓ１６９４７を２８５０Ｃ＞Ｔ、ｒｓ１０６５８５２を１００Ｃ＞Ｔと記載している。
【０１３６】
【表２４】
0006616574.tif 000025
【０１３７】
２．標的遺伝子の増幅
２−１．反応液調製
標的遺伝子の増幅に使用したゲノムＤＮＡはヒト由来のものを用いた。ゲノムＤＮＡを表２４のプライマーを用いて以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社のＫＡＰＡ２Ｇ  ＦＡＳＴ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘを使用した。サーマルサイクラーとして、ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社のＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）  ｇｒａｄｉｅｎｔを使用した。表２５に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。
【０１３８】
【表２５】
0006616574.tif 000026
【０１３９】
２−２．ＰＣＲ反応
調製したサンプル溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で３分後、９５℃で１５秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を３０サイクル、その後７２℃で５分、最後に４℃に下げる）を行った。
【０１４０】
３．ライゲーション用プローブの調製
３−１．ライゲーション用のプローブの調製
２．で得た増幅サンプルに結合させるライゲーション用プローブ（コモンオリゴはユーロフィンジェノミクス社製、クエリーオリゴはＴＢＡ社製）を準備した。プローブの塩基配列を表２６に示す。ライゲーション用プローブは各遺伝子多型にコモンオリゴ１種類、クエリーオリゴ２種類を作成した。クエリーオリゴは遺伝子変異が生じていない野生型に結合するもの（ＷＴと標記）と遺伝子変異が生じている変異型に結合するもの（ＭＴと標記）からなる。コモンオリゴの５’末端にはリン酸基［Ｐ］が修飾されており、３’末端にはビオチン［Ｂｉｏｔｉｎ］が標識されている。クエリーオリゴの５’末端にはクロマトグラフィー本体（ＰＡＳ）に固定化されたオリゴＤＮＡと相補的なタグ配列が付加されている（配列情報非開示）。クエリーオリゴとタグ配列の間にはｓｐａｃｅｒ  Ｃ３は挿入されていない。クロマトグラフィー本体に固定化されたオリゴＤＮＡの位置は図９に記載した。なお、本実施例ではＴＢＡ社が販売するクロマトグラフィー本体のＥ１２シリーズを使用した。
【０１４１】
【表２６】
0006616574.tif 000027
【０１４２】
４．サイクリングライゲーション反応
４−１．反応液調製
ライゲーション反応における組成は表２７のとおりとした。なお、ライゲーションを行うための酵素として、ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ社のＴａｑ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを使用した。
【０１４３】
【表２７】
0006616574.tif 000028
【０１４４】
４−２．ライゲーション反応
ライゲーション溶液をＰＣＲチューブに移し、サーマルサイクラーにセットした。温度条件は、９５℃で１分後、５８℃で５分、その後、９５℃で１５秒、５８℃で３０秒を３０サイクル、その後９５℃で１分加熱し、３７℃に温度を下げ反応を終了した。
【０１４５】
５．クロマトグラフィー本体を用いた検出
５−１．ハイブリダイゼーション反応
４．で得られた一本鎖ＤＮＡを用いての核酸クロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応およびその検出を行った。
【０１４６】
５−２．反応液調製
ハイブリダイゼーション反応および検出は、展開液（ＴＢＡ社製）、ラテックス液（ＴＢＡ社製）、ＴＥバッファーおよびライゲーション産物を混合して調製した反応液を使用して実施した。反応液の組成を表２８に示す。
【０１４７】
【表２８】
0006616574.tif 000029
【０１４８】
５−３．ハイブリダイゼーション工程
上記反応液各２０μＬを１．５ｍＬチューブに加え、クロマトグラフィー本体の各下端部を差込んでクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は３７℃で行った。反応液は約２０分間ですべて吸い上がり、すべて吸いあがった段階でクロマトグラフィーによるハイブリダイゼーション反応を完了とした。反応終了後、クロマトグラフィー本体を風乾させ、目視による反応箇所の確認および画像を撮影した。
【０１４９】
５−４．検出工程
クロマトグラフィー本体の乾燥後の発色の有無を目視で確認した。図１６に示すように、既知の遺伝子多型とクロマトグラフィー本体による遺伝子多型解析結果がすべて一致し、かつ、ｓｐａｃｅｒ  Ｃ３がある場合と無い場合の結果も一致した。このことから、本手法にスペーサーの有無は影響を与えないことを示した。
【図１】
0006616574.tif 000030
【図２】
0006616574.tif 000031
【図３】
0006616574.tif 000032
【図４】
0006616574.tif 000033
【図５】
0006616574.tif 000034
【図６】
0006616574.tif 000035
【図７】
0006616574.tif 000036
【図８】
0006616574.tif 000037
【図９】
0006616574.tif 000038
【図１０】
0006616574.tif 000039
【図１１】
0006616574.tif 000040
【図１２】
0006616574.tif 000041
【図１３】
0006616574.tif 000042
【図１４】
0006616574.tif 000043
【図１５】
0006616574.tif 000044
【図１６】
0006616574.tif 000045
【配列表】
0006616574000001.app