(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１２）のアミノ酸残基配列；または
配列番号１２と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸残基配列を含む、１０〜３０アミノ酸残基長の単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩であって、前記ペプチドは、低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ）の１つ以上の生物活性を阻害する、単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
前記単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩は、ＭＤ２細胞表面受容体に結合するＣＩＲＰを阻害する、請求項１に記載の単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩。
【請求項３】
前記単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に結合するＣＩＲＰを阻害する、請求項１または２に記載の単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩。
【請求項４】
前記単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩は、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１３）のアミノ酸残基配列
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩。
【請求項５】
前記単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩は、
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）のアミノ酸残基配列
を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩；および
医薬上許容される担体または希釈剤
を含む医薬組成物。
【請求項７】
炎症性状態に罹患している被験者を治療するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項８】
前記炎症性状態は、急性炎症性状態である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記炎症性状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血−再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、腐敗症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、肺炎、珪性肺塵、肺胞炎、気管支梢炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈洞炎、インフルエンザ、ＲＳウイルス感染症、ヘルペス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心嚢炎、心筋炎、虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、髄膜炎、脳炎、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、ページェット病、痛風、歯周病、関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、ベルガ−病、ライター症候群、ホジキン病、乾癬、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎、出血性ショックおよび外傷性出血からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記炎症性状態は、出血性ショックおよび敗血症性ショックからなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記被験者はヒトである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩は、炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩は、ＴＮＦ−αの放出を阻害する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ＣＩＲＰの１つ以上の生物活性を阻害するための組成物であって：
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩を含む、組成物。
【請求項１５】
ＣＩＲＰの前記生物活性は、ＣＩＲＰ媒介性シグナル伝達である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ＣＩＲＰの前記生物活性は、ＣＩＲＰ媒介性炎症である、請求項１４または１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＣＩＲＰの前記生物活性は、炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介性放出である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ＣＩＲＰの前記生物活性は、ＴＮＦ−αのＣＩＲＰ媒介性放出である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
皮膚創傷に罹患している被験者を治療するための医薬組成物であって：
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの単離ペプチドまたはその医薬上許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
前記皮膚創傷は、慢性皮膚創傷である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記皮膚創傷は、糖尿病性潰瘍である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記皮膚創傷は、褥瘡である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／８８１７９８号明細書の利益を主張するものである。上記の出願の全教示は、参照して本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイル内の資料の参照による組み込み
本出願は、本明細書と同時に提出される下記のＡＳＣＩＩテキストファイル内に含まれる配列表を参照により組み込んでいる：
ファイル名：３２６８１０２３００１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ；作成日：２０１４年９月２３日、サイズ：１１ＫＢ。
【０００３】
政府による支援
本発明は、国立衛生研究所により授与された補助金番号ＲＯ１ＨＬ０７６１７９およびＧＭ０５３００８の下で政府による支援を受けて実施された。米政府は、本発明の所定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００４】
炎症は、病原体、損傷した細胞または刺激原などの有害な刺激に対する血管組織の複雑な生物反応である。炎症は、有害な刺激を除去して組織のための治癒工程を開始する、生体による防御の試みである。炎症が起こらなければ、よくても創傷や感染がはるかに緩徐に治癒することになり、組織の進行性破壊は生体の生存を危うくさせることになる。しかし炎症が抑制されずに進行すると、多数の疾患も引き起こす可能性がある。
【０００５】
炎症は、急性または慢性のいずれかに分類できる。急性炎症は有害な刺激に対する身体の初期反応であり、血液から損傷組織への血漿や白血球の移動が増加することによって発生する。生化学的事象のカスケードは伝播して、局所血管系、免疫系および損傷組織内の様々な細胞に関係する炎症反応を成熟させる。慢性炎症として公知である長期炎症は、炎症部位に存在する細胞のタイプの進行性変化をもたらし、炎症過程からの組織の破壊と治癒が同時に起こることを特徴とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血液量減少および多臓器不全を原因とする出血性ショックは、依然として内科および外科集中治療室において主要な死因であり続けており、容認しがたいほど高い死亡率を伴っている。循環虚脱を予防するため、および死亡率を低下させるために極めて多数の理学療法や物質が研究されてはきたが、完全に満足できるものは一つもない。
【０００７】
同様に、創傷治癒は、止血、炎症、修復および再形成を含む動的で複雑な過程である。数多くの細胞タイプ、酵素、タンパク質およびシグナル伝達分子は、治癒過程中に協調した方法で機能することが必要とされる。創傷ケアのためには、銀処置、陰圧閉鎖療法、高圧酸素、代用皮膚、先進ドレッシングならびに成長因子および生物学的創傷製品を含む多数の治療選択肢が存在する。多数の臨床ツールが利用可能であるにもかかわらず、依然として慢性創傷は効果的に治療および管理することができない。非治癒性創傷は、依然として重大な臨床問題であり、四肢切断術を招くことが多い。皮膚創傷は、特に、創傷ケア管理における進歩にもかかわらず重大な罹患率および死亡率を誘発し続けている。外傷によって誘発された急性皮膚創傷は、患者がさらに糖尿病または心血管疾患などの疾病に罹患している場合は、慢性（非治癒性）創傷になる可能性がある。患者は、例えば創傷感染、敗血症および敗血症性ショックならびに長期固定化からの血栓塞栓事象などの慢性創傷の合併症が原因で死亡することがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの態様では、本発明は、低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ）の阻害が炎症反応を軽減するという発見に基づいている。より詳細には、本出願人は、ＣＩＲＰの阻害が未処置コントロール群と比して出血性ショックの動物モデルにおいてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、肝ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、乳酸塩、ＴＮＦ、血清ＴＮＦおよび血清、肺および肝ＩＬ−６の濃度を減少させることを発見した（図７〜８）。さらに、ＣＩＲＰの阻害は出血誘導性死亡率を低下させる（図６）。この発見に基づいて、炎症性状態を治療するための医薬組成物および方法が開示される。
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１２）の１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩；または配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有する１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む単離ポリペプチドであり、このときペプチドの長さは１０〜３０アミノ酸残基である。
【００１０】
また別の実施形態では、本発明は、医薬上許容される担体もしくは希釈剤ならびに配列番号１２の１つのアミノ酸残基配列または配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有する１つのアミノ酸残基配列を含む単離ペプチドを含む医薬組成物である。
【００１１】
また別の実施形態では、本発明は、炎症性状態を有する被験者を治療する方法であって、被験者に配列番号１２の１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩、または配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有する１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む有効量の単離ポリペプチドを投与する工程を含む方法である。
【００１２】
また別の実施形態では、本発明は、ＣＩＲＰの１つ以上の生物活性を阻害する方法であって、ＣＩＲＰを配列番号１２の１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩、または配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有する１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む単離ポリペプチドと接触させる工程を含む方法に関する。特に、本出願人は、本発明のペプチド、詳細には配列番号１２の配列もしくは配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有する１つの残基配列を含む単離ペプチドが炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介性放出を効果的に阻害するが、他方他のペプチドはＣＩＲＰの生物活性にそのような阻害作用を有していないことを発見した。
【００１３】
また別の態様では、本発明は、ＣＩＲＰの発現が治癒過程を妨害するという発見に基づいている。ＣＩＲＰ発現および／または生物活性を調節する工程は、創傷治療薬にとっての新規な標的を提供する。
【００１４】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、皮膚創傷を患っている被験者を治療する方法であって、被験者に配列番号１２の１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む、または配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有する１つのアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む有効量の単離ポリペプチドを投与する工程を含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒトＣＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】疑似（非出血）コントロール群と比較した出血の動物モデルにおける肝臓、心臓および血液中のＣＩＲＰ遺伝子の過剰発現を示す図である。図２Ａおよび２Ｂは、動物出血モデルにおける肝臓および心臓組織各々におけるＣＩＲＰ発現の倍率増加を示す棒グラフである。図２Ｃおよび２Ｄは、ウェスタンブロッティング法により検出された、クロマトグラフィーにより分離されたＣＩＲＰの写真である。
【図３】負傷した動物への組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）の投与後のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ、図３Ａ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ、図３Ｂ）の血中濃度の上昇を示している棒グラフである。
【図４】健常ラットへのｒＣＩＲＰの投与後の血液、肝臓および腸組織中の炎症性サイトカインＴＮＦおよびＨＭＧＢ１の上昇を示す図である。
【図５】培養マクロファージからのサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＨＭＧＢ１）放出の刺激にｒＣＩＲＰが及ぼす時間経過および作用を示す図である。
【図６】未処置コントロール群と比して出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体の添加による生存率の増加を示すグラフである。
【図７】未処置コントロール群と比較した出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体組成物の投与後の血清ＡＳＴ、ＡＬＴおよび乳酸塩の減少を示すグラフである。
【図８】未処置コントロール群と比較した、抗ＣＩＲＰ抗体の投与後の出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体による血清、肺および肝臓中ＩＬ−６の減少を示すグラフである。図８Ｇでは、肝ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性が実験的出血によって増加し、この増加は抗ＣＩＲＰ抗体の投与によって逆転されるが、コントロール抗体によっては逆転されない。
【図９】健常志願者またはショックに罹患している外科集中治療室（ＳＩＣＵ）患者いずれかから採取された血清サンプル中のＣＩＲＰの濃度を検出しているウェスタンブロッティング法を示す写真である。出血後のラットから採取された血清および組織サンプル中のＣＩＲＰ濃度を検出しているウェスタンブロッティング法を示す写真である。出血２４０分間後の出血した動物の組織中でのＣＩＲＰ転写のアップレギュレーションを示す棒グラフである。低酸素症が細胞系に及ぼす作用を示す図である。図９Ｄは、正常酸素性および低酸素性ＲＡＷ２６４．７細胞由来の細胞抽出物の核および細胞質成分のウェスタンブロッティング法を示す写真である。図９Ｅは、ＧＦＰ−ＣＩＲＰ発現プラスミドを用いてトランスフェクトされたＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡写真である。図９Ｆは、ＲＡＷ２６４．７細胞が低酸素性ショック後０、７および２４時間増殖させられた馴化培地中でＣＩＲＰを検出しているウェスタンブロットの写真である。図９Ｇは、低酸素性ショックの０、７および２４時間後のＲＡＷ２６４．７細胞由来の細胞溶解物中のＣＩＲＰを検出しているウェスタンブロットの写真である。図９Ｈは、正常酸素性または低酸素性状態下で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞抽出液のウェスタンブロッティング法の写真である。溶解物を核（Ｎ）およびリソソーム（Ｌ）成分に分画化した。図９Ａ、９Ｂおよび９Ｆでは、「ＰＳレッド」は、タンパク質負荷を示すためにウェスタンブロット膜のためのＰｏｎｃｅａｕ（ポンソー）Ｓレッド染色である。
【図１０】ある細胞系におけるサイトカイン放出にｒＣＩＲＰが及ぼす作用を示すグラフである。図１０Ａおよび図１０Ｂ−ＲＡＷ２６４．７細胞。ラットへのｒｍＣＩＲＰの投与後のＨＭＧＢ１の血清中濃度の誘導を示す棒グラフである。図１０Ｄ−１０Ｆ、様々な細胞系におけるサイトカイン放出にｒＣＩＲＰが及ぼす作用を示すグラフである。図１０Ｄ−ＲＡＷ２６４．７細胞；図１０Ｅ−ヒトＴＨＰ−１細胞；図１０Ｆ−ヒトＰＢＭＣ細胞系。図１０Ｇ、ＣＩＲＰをＴＮＦαの放出に曝露させる前に抗ＣＩＲＰ抗体とのヒトＴＨＰ−１細胞のプレインキュベーションの作用を示している棒グラフである。
【図１１】動物出血モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体によるサイトカイン産生および肝損傷の減弱および抗ＣＩＲＰ抗体による致死性の阻止を示す図である。
【図１２】敗血症性動物モデルにおける敗血症中のＣＩＲＰの発現および放出ならびに抗ＣＩＲＰ抗体の作用を示す図（図１２Ｇ）である。
【図１３】ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体が細胞外ＣＩＲＰ活性を媒介することを証明する図である。
【図１４】ヒトＣＩＲＰのｒｈＭＤ２への結合領域を示す図である。
【図１５】核から細胞質への低酸素症／再酸素化誘導性ＣＩＲＰ転位を証明しているＲＡＷ２６４．７細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図１６】ＣＩＲＰおよびＨＭＧＢ１がＴＮＦ−α放出の刺激に及ぼす相加作用を証明する図である。
【図１７】組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）が健常ラットにおいて炎症反応を誘導したことを証明する図である。
【図１８】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって測定されたパターン認識受容体を含むｒｈＣＩＲＰの結合動態を示す図である。
【図１９】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるｒｈＭＤ２を用いたヒトＣＩＲＰ由来の１５マーオリゴペプチドの結合動態を示す図である。
【図２０】ヒトＴＨＰ−１細胞によるＴＮＦ−αの産生にオリゴペプチドＣ２２およびＣ２３が及ぼす（しかしＣ２１は及ぼさない）阻害作用を示す図である。
【図２１】治癒所要日数の関数としての野生型マウスに比較したＣＩＲＰ−ヌルマウスにおける皮膚創傷のより小さな相対面積を示すプロット図である。
【図２２】ＣＩＲＰ刺激後のＴＨＰ−１細胞によるＴＮＡ−α分泌への複数のＣＩＲＰ由来ペプチドが及ぼす作用を示すグラフである。
【図２３】ＣＩＲＰ刺激後のＭＬＶＥＣ中のＩＣＡＭ−１の発現レベルにオリゴペプチドＣ２３が及ぼす作用を示すウェスタンブロッティング法の写真である。図２３Ｂ、ＣＩＲＰ刺激後のＭＬＶＥＣ中のＩＬ−１βの分泌濃度にオリゴペプチドＣ２３が及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図２４】敗血症性マウスの肺におけるＥ−セレクチン（上）およびＩＣＡＭ−１（下）の発現レベルにオリゴペプチドＣ２３が及ぼす作用を示す棒グラフである。図２４Ｂ、敗血症性マウスの肺におけるＴＮＦ−α（上）およびＩＬ−１β（下）の発現レベルにオリゴペプチドＣ２３が及ぼす作用を示す棒グラフである。図２４Ｃ、敗血症性マウスの血清におけるＴＮＦ−α（上）およびＩＬ−１β（下）の発現レベルにオリゴペプチドＣ２３が及ぼす作用を示す棒グラフである。
【図２５】オリゴペプチドＣ２３の作用を証明している、ＣＬＰ手技後の時間関数としての敗血症性マウスの生存率を示すプロット図である。図２５Ｂ、敗血症性マウスの生存率にオリゴペプチドＣ２３が及ぼす作用を示す散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願人は、驚くべきことに、炎症反応中にＣＩＲＰ発現がアップレギュレートされ、循環中に放出されることを発見した。本出願人はさらに、ＣＩＲＰがいったん血流に進入すると、強力な炎症促進性メディエーターもしくはサイトカインとして機能し、組織損傷および死さえ誘発することも発見した。
【００１７】
したがって、本発明は、新規な炎症メディエーターとしてのＣＩＲＰの発見に基づく。この発見は、炎症を誘導する代替機序の解明を可能にし、さらに本出願人が炎症を治療するためのＣＩＲＰを標的とする治療戦略を発見することを可能にした。
【００１８】
ＣＩＲＰは、軽度の低温ストレス（３２℃）によって培養細胞中で誘導される哺乳動物タンパク質である。マウスおよびヒトＣＩＲＰは、Ｎ末端ＲＮＡ結合ドメインおよびＣ末端グリシンリッチドメインを含む１７２−ａａ（９５％同一）核タンパク質であり、転位を促進するＲＮＡシャペロンとして機能する。ヒトＣＩＲＰのアミノ酸配列は、図１、配列番号１に提供されている（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３７，１９９７を参照されたい）。「哺乳動物ＣＩＲＰ」には、天然型または内因性の対応する哺乳動物ＣＩＲＰ（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質（即ち、合成有機化学の方法を使用して生成した））のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。この用語にはさらに、ＣＲＩＰの多型もしくは対立遺伝子変異体および他のイソ型（例えば、選択的スプライシングもしくは他の細胞過程）および上記（例えば、脂質化、グリコシル化および非グリコシル化）の修飾形もしくは未修飾形が含まれる。そのようなタンパク質は、自然に哺乳動物ＣＩＲＰを産生する供給源から回収または単離できる。ＣＩＲＰは、低温誘導性の細胞増殖抑制において本質的な役割を果たす。本発明は、細胞外ＣＩＲＰは出血性および敗血症性ショック中に有害な作用を誘発する内因性炎症促進性メディエーターであるという驚くべき発見に基づいている。そこで本発明は、以前には認識されていなかった治療標的としてのＣＩＲＰ拮抗作用に向けられる。
【００１９】
細胞内ＣＩＲＰは、細胞がストレス条件下に置かれたときに特異的ｍＲＮＡｓを安定化させて延命効果のための転位を促進する公知の機能を有する（Ｙａｎｇ，Ｃ．＆  Ｃａｒｒｉｅｒ，Ｆ．Ｔｈｅ  ＵＶ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ１８（Ａ１８  ｈｎＲＮＰ）ｐｌａｙｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４７２７７−４７２８４（２００１）；Ｃａｍｍａｓ，Ａ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｓ．Ｍ．，Ｖａｇｎｅｒ，Ｓ．＆  Ｈｏｌｃｉｋ，Ｍ．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７６，１３９５−１４０３（２００８））。本出願人は、細胞外ＣＩＲＰが新規な損傷関連性分子パターン（ＤＡＭＰ）分子であることを発見しており、この所見を実験上の証拠により実証する（実施例１）。第一に、本出願人は、外科ＩＣＵ患者ならびに出血した動物および敗血症性動物の血清中でＣＩＲＰを検出した。第二に、低酸素性ストレス下またはリポ多糖（ＬＰＳ）への曝露下では、マクロファージ中のＣＩＲＰは核から細胞質へ転位し、細胞外マトリックス内に能動的に放出される。第三に、組換えＣＩＲＰタンパク質はインビトロではマクロファージからのＴＮＦ−αおよびＨＭＧＢ１の放出を誘導し、健常動物においては炎症反応を刺激して組織損傷を誘発する。第四に、抗ＣＩＲＰ抗体を中和することによる細胞外ＣＩＲＰ活性の阻害は、ショック誘導性の炎症、組織損傷および致死性の減弱により出血した動物および敗血症性動物の生存率を有意に改善する。最後に、ＣＩＲＰは、炎症反応を始動させるためにＤＡＭＰｓによって一般に利用されるパターン認識受容体（ＰＲＲ）の１つであるＴＬＲ４と相互作用する。そこで、細胞外ＣＩＲＰは、真正の炎症促進性メディエーターである。
【００２０】
ＣＩＲＰは、低酸素状態への曝露後にＲＡＷ２６４．７細胞中で核から細胞質へ転位する。そのようなＣＩＲＰ転位は、さらに線維芽細胞および上皮細胞を含む他の細胞タイプにおいても、ＵＶ曝露、浸透圧ショック、熱ショックおよび小胞体ストレス下で観察されている（Ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｇｒａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｔｏ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｂｙ  ａ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１３，４１３０−４１４４（２００７）；Ｙａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ１８  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ＲＮＡ  ｍｏｔｉｆ  ｉｎ  ｔｈｅ  ３’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ  ａｎｄ  Ｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ（ＡＴＲ）ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，８８８７−８８９３（２０１０））。環境ストレス下でのＲＧＧドメイン中のアルギニン残基のメチル化（Ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１３，４１３０−４１４４（２００７））およびＵＶ線に反応したＣ末端領域でのリン酸化（Ｙａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，８８８７−８８９３（２０１０））は核からのＣＩＲＰ退出に対して仮説が立てられている。ＣＩＲＰは、低酸素状態もしくはＬＰＳに反応してＣＭ中に放出させられる。「リーダーレス」タンパク質を放出させるために、微小胞脱落、分泌リソソームのエキソサイトーシスおよび能動輸送を含む多数の非標準的経路が提案されている（Ｑｕ，Ｙ．＆  Ｄｕｂｙａｋ，Ｇ．Ｒ．Ｐ２Ｘ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ  Ｓｉｇｎａｌ．５，１６３−１７３（２００９））。さらに、リーダーレスＩＬ−１β分泌の代替モデルは、取り込まれたＩＬ−１βとともにエキソソームを含有する多小胞体の形成およびエキソソームを放出させるためのこれらの多小胞体と血漿膜の後の融合によって完了できる（Ｑｕ，Ｙ．，Ｆｒａｎｃｈｉ，Ｌ．，Ｎｕｎｅｚ，Ｇ．＆  Ｄｕｂｙａｋ，Ｇ．Ｒ．Ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ  ＩＬ−１  ｂｅｔａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐ２Ｘ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｘｏｓｏｍｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９，１９１３−１９２５（２００７）を参照されたい）。理論によって拘束されなくても、ＣＩＲＰ放出についての１つの方法はリ���ソーム分泌による。
【００２１】
細胞外ＣＩＲＰの活性は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を通して媒介される（実施例９）。表面プラズモン共鳴分析は、ＣＩＲＰがＴＬＲ４／ＭＤ２複合体ならびに個々のＴＬＲ４およびＭＤ２に結合することを示した。この発見を通して、本出願人は、本明細書に記載したように、典型的には長さが１０〜３０アミノ酸残基である、アミノ酸残基１０６〜１２５の間にあるｈＣＩＲＰタンパク質の一部分と少なくとも８０％相同性の配列を有する、ヒトＣＩＲＰ由来ペプチドを含むＣＩＲＰ活性の新規な阻害剤を開発した。このペプチドは、高親和性でＭＤ２に結合する。
【００２２】
ＣＩＲＰのＴＬＲ４媒介性炎症促進活性の同定は、ＴＬＲ４が出血した動物における炎症および臓器障害（Ｂｅｎｈａｍｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ４  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．３７，１７２４−１７２８（２００９））ならびに敗血症性動物（Ｗｉｔｔｅｂｏｌｅ，Ｘ．，Ｃａｓｔａｎａｒｅｓ−Ｚａｐａｔｅｒｏ，Ｄ．＆  Ｌａｔｅｒｒｅ，Ｐ．Ｆ．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｓｅｐｓｉｓ．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１０，５６８３９６（２０１０））において重大な役割を果たすことを証明した以前の研究と一致している。ＴＬＲ４はさらに、それらがストレスを受けた、損傷した、または瀕死の細胞から、または細胞外マトリックスの分解から放出されたときに、ＨＭＧＢ１、熱ショックタンパク質、ヒアルロン酸およびフィブロネクチンを含む数種の内因性分子を認識できる（（ａ）Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ２  ａｎｄ  ４  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，７３７０−７３７７（２００４）；（ｂ）Ｏｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｂｕｒｋａｒｔ，Ｖ．，Ｆｌｏｈｅ，Ｓ．＆  Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６０  ｉｓ  ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，５５８−５６１（２０００）；（ｃ）Ｔｅｒｍｅｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９５，９９−１１１（２００２）；（ｄ）Ｏｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ  Ａ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１０２２９−１０２３３（２００１）を参照されたい）。多数のＤＡＭＰｓはＴＬＲ４／ＭＤ２複合体のリガンドとして機能するが、一部の分子は、ＣＩＲＰとＨＭＧＢ１の関係によって本明細書で証明されたように、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体の様々な部位に結合してマクロファージにおける炎症促進性サイトカイン産生を刺激することに追加して作用する可能性がある。ＳＰＲ分析によって示されたように、ＨＭＧＢ１は１．５×１０−６ＭのＫＤでＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に結合したが（Ｙａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＨＭＧＢ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈ��ｇｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７，１１９４２−１１９４７（２０１０））、これはＣＩＲＰに匹敵する（ＫＤ＝２．３９×１０−７Ｍ）。また別の分析は、ＨＭＧＢ１が８×１０−９ＭのＫＤでＭＤ２に結合するがＴＬＲ４には結合しないことを示したが（Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ａｎｔｏｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．＆  Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．Ｔｈｅ  ｍａｎｙ  ｆａｃｅｓ  ｏｆ  ＨＭＧＢ１：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．９３，８６５−８７３（２０１３））、他方ＣＩＲＰは個々のＭＤ２およびＴＬＲ４に結合することができる。ＴＬＲ４、ＭＤ２およびＴＬＲ４／ＭＤ２複合体と相互作用するＣＩＲＰのサブドメインのマッピングは、これらの受容体に結合することに関係するので、ＣＩＲＰの全分子構造に関するより多くの情報を入手するために調査されている。注目すべきことに、ＬＰＳからＴＬＲ４およびＭＤ２へのＫＤは、各々１．４１×１０−５および２．３３×１０−６Ｍである（Ｓｈｉｎ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ＬＰＳ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＣＤ１４，ＴＬＲ４，ａｎｄ  ＭＤ−２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２４，１１９−１２４（２００７））。
【００２３】
ＣＩＲＰは、「リーダーレス」タンパク質が例えば壊死などの受動的様式によって漏出され得るという事実にもかかわらず、能動的に放出され得る（Ｓｃａｆｆｉｄｉ，Ｐ．，Ｍｉｓｔｅｌｉ，Ｔ．＆  Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｍ．Ｅ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＭＧＢ１  ｂｙ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，１９１−１９５（２００２））。近年の研究は、抗ＣＩＲＰ抗体の中和が出血した動物および敗血症性動物の生存率の改善における治療として利用される、培養線維芽細胞中でのＩＬ−１β発現を調節するためのＮＦ−κＢ経路を活性することにＣＩＲＰが関与することを報告している（Ｂｒｏｃｈｕ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｃｏｌｄ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １ｂｅｔａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ５７４２６（２０１３）を参照されたい）。そこで、ＣＩＲＰを標的とすることは、出血および敗血症を犠牲にして罹病率および死亡率を改善するための治療可能性を提供する可能性がある。
【００２４】
ＣＩＲＰの阻害は、未処置コントロール群と比して敗血症の動物モデルにおいてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、肝ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、乳酸塩、ＴＮＦ、血清ＴＮＦならびに血清、肺および肝臓中ＩＬ−６を含むがそれらに限定されない炎症メディエーターおよびマーカーの濃度の減少をもたらす（実施例７および８）。これらは反射を減少させ、一部の場合には炎症性疾患および状態の治療においてＣＩＲＰを標的とする有益な作用の原因となる。さらに、これらの減少は、そのような疾患および状態の治療におけるＣＩＲＰ阻害剤およびアンタゴニストの治療有益性を例示している。
【００２５】
本明細書に規定するように、「ＣＩＲＰ阻害剤」は、ＣＩＲＰに結合してＣＩＲＰの１つ以上の生物活性を阻害する作用物質（例えば、分子、天然もしくは合成核酸もしくは核酸アナログ、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原性断片、化合物など）；またはＣＩＲＰ遺伝子および／またはタンパク質の発現または生物活性ＣＩＲＰの放出を阻害する（例えば、減少させる、防止する、低下させる、中和する）作用物質である。用語「ＣＩＲＰの生物活性」は、ＣＩＲＰ受容体結合、ＣＩＲＰシグナル伝達、炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介性放出、ＣＩＲＰ媒介性炎症および／または他のＣＩＲＰ媒介性活性を意味する。用語「アンタゴニスト」は、用語「阻害剤」と互換的に使用できる。
【００２６】
ＣＩＲＰ阻害剤は、ＣＩＲＰの１つ以上の生物活性または機能に結合して阻害する（例えば、減少させる、防止する、または中和する）抗体であってよい。
【００２７】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよく、用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体両方を含むことが意図されている。用語の「ポリクローナル」および「モノクローナル」は抗体調製物の均質度に関しており、特定の製造方法に限定することは意図していない。本明細書で使用する用語「抗体」は、さらにキメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ベニヤ化抗体または一本鎖抗体の断片を含む抗体の機能的断片もまた含んでいる。機能的断片には、哺乳動物ＣＩＲＰに結合する抗原結合断片が含まれる。そのような断片は、酵素的開裂または組換え技術によって製造できる。例えば、必要な基質特異性を備えるパパイン、ペプシンまたは他のプロテアーゼもまた断片を生成するために使用できる。抗体はさらに、その中で１つ以上の終止コドンが天然停止部位の上流で導入されている抗体遺伝子を使用して様々な切断型で製造することもできる。
【００２８】
様々な種に由来する断片を含む、一本鎖抗体およびキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは霊長類化（ＣＤＲグラフト化）抗体、またはベニヤ化抗体ならびにキメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体もしくはベニヤ化一本鎖抗体なども、さらに本発明および用語「抗体」によって含まれる。これらの抗体の様々な断片は従来型技術によって化学的に一緒に結合することができる、または遺伝子工学技術を使用して隣接タンパク質として調製できる。例えば、隣接タンパク質を生成するために、キメラ鎖もしくはヒト化鎖をコードする核酸を発現させることができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４８１６５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０１２５０２３Ｂ１号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４８１６３９７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０１２０６９４Ｂ１号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０１９４２７６Ｂ１号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５２２５５３９号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０２３９４００Ｂ１号明細書；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号明細書；およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．、欧州特許出願公開第０５１９５９６Ａ１号明細書を参照されたい。さらに、霊長類化抗体に関してはＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）、および一本鎖抗体に関してはＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４９４６７７８号明細書およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）を参照されたい。
【００２９】
ヒト化抗体は、標準方法を使用する合成もしくは組換えＤＮＡテクノロジーまたは他の好適な技術を使用して生成できる。ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）配列は、さらにまたヒトもしくはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列、例えば以前にヒト化された可変領域からのＤＮＡ鋳型などを変化させるためのＰＣＲ突然変異誘発方法を使用して構築することもできる（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９））；Ｓａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；およびＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照されたい）。これらやその他の好適な方法を使用すると、変異体もまた容易に生成できる。１つの実施形態では、クローン化可変領域を変異させることができ、所望の特異性を備える変異体をコードする配列を選択できる（例えば、ファージライブラリーから；例えばＫｒｅｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５５１４５４８号明細書；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３年４月１日公開の国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照されたい）。
【００３０】
哺乳動物（例えば、ヒト）ＣＩＲＰに対して特異的である抗体は、例えば配列番号１の単離および／または組換えヒトタンパク質またはそれらの断片（例えば合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原に対して作製することができる。抗体は、ＣＩＲＰを発現する細胞で好適な宿主（例えば、マウス）を免疫することによって作製することもできる。さらに、ＣＩＲＰを発現する細胞は、免疫原として、またはＣＩＲＰに結合する抗体に対するスクリーンにおいて使用できる。
【００３１】
免疫抗原の調製ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成は、任意の好適な技術を使用して実施できる。様々な方法が記載されている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）  ａｎｄ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５５２（１９７７），Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４１７２１２４号明細書；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２７，Ｓｕｍｍｅｒ  ‘９４），Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．），Ｃｈａｐｔｅｒ  １１，（１９９１）を参照されたい）。一般に、ハイブリドーマは好適な不死細胞系（例えば、骨髄腫細胞系、例えばＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３または異種骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｌｏｍａ））を抗体産生細胞と融合させることによって生成される。抗体産生細胞は、当該の抗原で免疫されたヒトまたは他の好適な動物の末梢血、脾臓またはリンパ節から入手できる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的培養条件を使用して単離し、限界希釈法によってクローン化することができる。所望の特異性を備える抗体を産生する細胞は好適なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択できる。
【００３２】
例えば、ライブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）から組換え抗体を選択する、または広範囲のヒト抗体を産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫に依存する方法を含む、必要な特異性を備える抗体（例えば、ヒト抗体または抗原結合断片）を作製または単離するその他の好適な方法を使用できる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５５４５８０６号明細書；Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５５４５８０７号明細書；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、国際公開第９７／１３８５２号パンフレットを参照されたい）。そのような免疫および単離手順は、当業者には周知である。
【００３３】
抗原性断片は、身体内に導入されると抗体の産生を刺激する物質である。抗原には、毒素、細菌、異質な血球および／または移植臓器の細胞が含まれよう。
【００３４】
ＣＩＲＰ阻害剤は、ＣＩＲＰに特異的に結合してＣＩＲＰの活性を阻害する（減少させる、防止する、低下させる、中和する）ペプチド（例えば、合成、組換え、融合もしくは誘導体化）であってよい。ペプチドは、直鎖状、分枝状または環状、例えば数個のアミド結合を含むヘテロ原子環状構造を有するペプチドであってよい。特定の実施形態では、ペプチドは、環状ペプチドである。ペプチドは、約２〜約１００個のアミノ酸残基からなる化合物であって、１つのアミノ酸のアミノ基がペプチド結合によってまた別のアミノ酸のカルボキシル基に結合している化合物を意味する。そのようなペプチドは、典型的には長さが約１００個アミノ酸残基未満であり、一部の実施形態では約１０、約２０、約３０、約４０または約５０残基である。
【００３５】
ＣＩＲＰの特定ドメイン（例えば、独特のドメイン）に結合するために選択的であるペプチドを作製できる。ペプチドは、例えば、酵素的もしくは化学的開裂により天然タンパク質から抽出する、もしくは取り出すことができる、または例えば固相ペプチド合成法（メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）型合成）などの好適な方法によって合成することができる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９７６を参照されたい）。ＣＩＲＰ阻害剤であるペプチドはさらに、例えば組換えＤＮＡ法または他の好適な方法を使用して作製することもできる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照されたい）。
【００３６】
ＣＩＲＰ阻害剤は、例えば担体タンパク質（例えば、ｍｙｃ、ｈｉｓ、グルタチオンスルフヒドリルトランスフェラーゼ）に融合された、および／または標識（例えば、放射標識、蛍光標識）された融合ペプチドであってもよい。
【００３７】
ペプチドは、任意の好適なＬ−および／またはＤ−アミノ酸、一般α−アミノ酸（例えば、アラニン、グリシン、バリン）、非−α−アミノ酸（例えば、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン）、および異常アミノ酸（例えば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン）を含むことができる。ペプチド上のアミノ基、カルボキシル基および／または他の官能基はフリー（例えば、未修飾）であってよい、または好適な保護基で保護されていてもよい。アミノ基およびカルボキシル基のために好適な保護基ならびに保護基を付加または除去するための方法は当分野において公知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９１に開示されている。ペプチドの官能基は、さらにまた当分野において公知の方法を使用して誘導体化（例えば、アルキル化）することができる。
【００３８】
ペプチドは合成して小数から多数の別個の分子種を含むライブラリーに組み込むことができる。そのようなライブラリーは、コンビナトリアル・ケミストリーの方法を使用して調製することができ、任意の好適な方法を使用してスクリーニングすることによりこのライブラリーが所望の生物活性を備えるペプチドを含むかどうかを決定することができる。そのようなペプチド阻害剤は、次に好適な方法を使用して単離できる。
【００３９】
ポリペプチドは、所望であれば、修飾（例えば、アミノ酸リンカー、アシル化、アセチル化、アミド化、メチル化、末端修飾（例えば、環化修飾））を含むことができる。ポリペプチドは、さらに化学修飾（例えば、Ｎ−メチル−α−アミノ基置換）もまた含有することができる。さらに、ペプチド阻害剤は、公知および／または天然型ペプチドのアナログ、例えば、保存アミノ酸残基置換を有するペプチドアナログであってよい。これらの修飾は、そのＣＩＲＰ阻害活性を含むペプチドの様々な特性（例えば、溶解度、結合）を改良することができる。本明細書に記載したペプチド阻害剤には、さらに下記の投与方法のセクションに記載したようにその医薬上許容される塩が含まれる。
【００４０】
本発明の特定の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１２）を含む、および約１０〜約３０アミノ酸残基の長さを有する単離ペプチドである。本発明の特定の他の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１３）またはＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）のアミノ酸残基配列を含む単離ペプチドである。本発明の他の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、配列番号１２、配列番号１３または配列番号１４のいずれかと少なくとも８０％、または少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の相同性を有するアミノ酸残基配列を含む単離ペプチドである。
【００４１】
配列同一性は、典型的には配列分析ソフトウエアを使用して測定される（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐの配列分析ソフトウエアパッケージ、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＧＡＰ，ＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸ，ＡＬＩＧＮ，ＡＤＶＡＮＣＥ，ＡＤＡＭまたはＦＡＳＴＡプログラム）。そのようなソフトウエアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾との相同性度を指定することにより同一もしくは類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、下記の群；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン内の置換が含まれる。同一性度を決定するための典型的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されてよい。確率スコアは、密接に関連する配列の相同性が偶然のみよる確率を示している。特定の実施形態では、低確率スコアは、１×１０−３〜１×１０−１００である。
【００４２】
２つのアミノ酸配列の相同性率は、最適な比較のために配列をアラインメントすることにより決定できる（例えば、第１配列の配列内にギャップを導入することができる）。次に対応する位置でのアミノ酸配列を比較し、２つの配列間の同一性率はこれらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（即ち、同一性率（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つのアミノ酸配列間の同一性率は、さらにまたＢｌｏｓｓｏｍ  ６３マトリックスもしくはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１２、１０、８、６または４のギャップ重量および２、３または４の長さ重量を使用して、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）内のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。タンパク質コード化の長さは、比較目的のために、参照配列、例えば配列番号１２、１３または１４のいずれかのアミノ酸残基配列を含むＣＩＲＰ阻害剤の長さの少なくとも８０％、または８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％でアラインメントすることができる。
【００４３】
ペプチドミメティックは、ポリペプチドではないが、それらの構造の態様を模倣している分子を意味する。ペプチドミメティックアンタゴニストは、従来の化学的方法によって調製できる（例えば、Ｄａｍｅｗｏｏｄ  Ｊ．Ｒ．“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｉｄ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”ｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１−８０，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ  Ｗ．Ｋ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９９）。例えば、ペプチドと同一官能基を有する多糖類を調製できる。ペプチドミメティックは、例えば、それが標的分子に結合している、または結合するであろう環境においてペプチド作用物質の三次元構造を確立することによって設計できる。ペプチドミメティックは、少なくとも２つの構成要素、結合部分もしくは成分および骨格もしくは支持構造を含んでいる。
【００４４】
結合部分は、リガンド結合部位もしくはその近くで標的分子と、例えばアミノ酸と反応する、または複合体を（例えば、疎水性もしくはイオン性相互反応を通して）形成するであろう化学原子または基である。例えば、ペプチドミメティック内の結合部分は、ペプチドもしくはタンパク質阻害剤の結合部分と同一であってよい。結合部分は、ペプチド阻害剤の結合部分はペプチド阻害剤内の結合部分と同一もしくは類似の方法で受容体と反応する原子または化学基であってよい。例えば、計算化学を使用すると、ＣＩＲＰの活性を阻害するためにＣＩＲＰ結合のペプチドミメティックを設計することができる。ペプチド中の塩基性アミノ酸のためのペプチドミメティックを設計する際に使用するために好適な結合成分の例には、窒素含有基、例えばアミン、アンモニウム、グアニジンおよびアミドまたはホスホニウムが含まれる。酸性アミノ酸のためのペプチドミメティックを設計する際に使用するために好適な結合成分の例には、例えば、カルボキシル、低級アルキルカルボン酸エステル、スルホン酸、低級アルキルスルホン酸エステルまたはリン酸もしくはそれのエステルが含まれる。
【００４５】
支持構造は、結合部分に結合した場合に、ペプチドミメティックの三次元配置を提供する化学実体である。支持構造は、有機または無機であってよい。有機支持構造の例には、多糖類、有機合成ポリマーのポリマーまたはオリゴマーが含まれる（例えば、ポリビニルアルコールまたはポリラクチド）。支持構造は、実質的にペプチド骨格もしくは支持構造と同一のサイズおよび寸法を有するのが好ましい。これは、ペプチドおよびペプチドミメティックの原子のサイズおよび結合を計算または測定することによって決定できる。１つの実施形態では、ペプチド結合の窒素は、例えばポリエステル骨格を形成する酸素または硫黄と置換することができる。また別の実施形態では、カルボニルはスルホニル基もしくはスルフィニル基と置換することができ、それによりポリアミド（例えば、ポリスルホンアミド）が形成される。ペプチドの逆アミドを作成できる（例えば、１つ以上の−ＣＯＮＨ−基を１つの−ＮＨＣＯ−基と置換する）。さらに別の実施形態では、ペプチド骨格はポリシラン骨格と置換することができる。
【００４６】
これらの化合物は、公知の方法によって製造できる。例えば、ポリエステルペプチドミメティックは、ヒドロキシル基を対応するα−アミノ基もしくはアミノ酸と置換する工程、それによりヒドロキシ酸を調製し、連続してそのヒドロキシ酸をエステル化する工程、側鎖反応を最小限に抑えるために任意選択的に塩基性および酸性側鎖を遮断する工程によって調製できる。適切な化学合成経路を決定することは、一般に化学構造を決定すれば容易に同定できる。
【００４７】
ペプチドミメティックは、合成して小数から多数の別個の分子種を含むライブラリーに組み込むことができる。そのようなライブラリーは、コンビナトリアル・ケミストリーの周知の方法を用いて調製することができ、スクリーニングを実施することによりライブラリーが所望の活性を有する１つ以上のペプチドミメティックを含むかどうかを決定することができる。そのようなペプチドミメティック阻害剤は、次に好適な方法によって単離できる。
【００４８】
例えば、非ペプチド化合物もしくは低分子などのその他のＣＩＲＰ阻害剤は、実際に見つける（例えば、同定する、単離する、精製する）および／または作製する（例えば、合成する）ことができる。作用物質は、スクリーンにおいて、例えば化合物および／またはライブラリー（例えば、化学、ペプチド、核酸ライブラリー）の高スループットスクリーン内でＣＩＲＰ結合特異性について試験できる。化合物もしくは低分子は、例えば、国立癌研究所の化学薬品貯蔵所、分子ライブラリー低分子貯蔵所（ＰｕｂＣｈｅｍ）および商業的に利用できる他のライブラリーからの化合物の数多くの利用可能なライブラリーから同定できる。そのような分子のライブラリーまたはコレクションは、さらにまた周知のコンビナトリアル・ケミストリーなどの周知の化学的方法を使用して調製することもできる。ライブラリーは、ＣＩＲＰに結合して阻害する化合物を同定するためにスクリーニングできる。同定された化合物は、医薬品化学の周知の方法を使用してさらに多様化するためのリード化合物として機能できる。例えば、リード化合物の構造変異体である化合物のコレクションは、ＣＩＲＰ結合および／または阻害活性について調製およびスクリーニングできる。これは、化合物の構造を生物活性に連結させる構造活性関係の開発を生じさせることができる。好適な結合および阻害活性を有する化合物は、さらにインビボ使用のために開発できる。１つの実施例では、低分子のＮａＮ３は、Ｓ．Ｗｅｌｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．による“Ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＲＢＭ３  ａｎｄ  ＣＩＲＰ  ｂｙ  ＨＩＦ−１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１７，１７８５−１７９４，２００４に開示されたようにＣＩＲＰ転写を阻害する。
【００４９】
本発明の一部の実施形態では、ＣＩＲＰ阻害剤は、１，０００ダルトン未満の分子量を有する。
【００５０】
ＣＩＲＰ阻害剤は、さらにＣＩＲＰの発現を阻害する（減少させる、低下させる、中和する、防止する）作用物質である。ＣＩＲＰ遺伝子発現（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング、翻訳）を阻害する作用物質（分子、化合物、核酸、オリゴヌクレオチド）は効果的なＣＩＲＰ阻害剤である。アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、リボプローブ）はさらにＣＩＲＰサブユニット発現を阻害するためのＣＩＲＰ阻害剤としても使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズして標的核酸の分解（例えば、ＲＮａｓｅ  Ｈ−依存性機序を通してのＲＮＡの分解）を誘導する、またはスプライシングもしくは翻訳機構の進行を立体的に妨害する、一般に短鎖（約１３〜約２５ヌクレオチド）の一本鎖核酸である（例えば、Ｄｉａｓ  Ｎ．ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ  Ｃ．Ａ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎ．Ｔｈｅｒ．１：３４７−３５５，２００２を参照されたい）。ＣＩＲＰ阻害剤として使用できる、メチルホスホン酸オリゴヌクレオチド、ホスホロチオ酸オリゴヌクレオチド、Ｏ−アルキル基（例えば、メチル）によって置換されたリボースの２’−位で水素を有するオリゴヌクレオチド、ポリアミド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（デオキシリボース部分はモルホリン環によって置換されている）、ＰＮ（アミン基によるリボース上の３’位での酸素のＮ３’→Ｐ５’置換）およびキメラオリゴヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ−メチル／ホスホロチオエート）を含む多数の様々なタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。
【００５１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予測アルゴリズムを使用してＣＩＲＰに対して特異的であるように設計できる。（例えば、Ｄｉｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：１０３４−１０４６，２００１；Ｓｃｚａｋｉｅｌ，Ｇ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．，５：Ｄ１９４−Ｄ２０１，２０００；Ｓｃｈｅｒｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２４５５−２４６１，２０００；Ｐａｔｚｅｌ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：４３２８−４３３４，１９９９；Ｃｈｉａｎｇ，Ｍ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８１６２−１８１７１，１９９１；Ｓｔｕｌｌ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３５０１−３５０８，１９９２；Ｄｉｎｇ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｅ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．，２３：３８７−４００，１９９９；Ｌｌｏｙｄ，Ｂ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：３６６４−３６７３，２００１；Ｍｉｒ，Ｋ．Ｕ．，ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：７８８−７９２，１９９９；Ｓｏｈａｉｌ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２０４１−２０５１，２００１；Ａｌｔｍａｎ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．，１：４９３−５０８，１９９９を参照されたい）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好適な方法、例えば、自動核酸合成装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用する核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）合成によって生成できる（さらに、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７８：４８６−５０４，１９９５も参照されたい）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに適切な発現ベクターを含有する細胞中で安定性で発現させることができる。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、吸着性エンドサイトーシスの方法を介して標的細胞により取り上げることができる。そこで、被験者（例えば、哺乳動物）の治療において、アンチセンスＣＩＲＰは、標的細胞へ、例えば注射または注入によって送達できる。例えば、精製オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡは、単独で、または好適な薬物送達ビヒクル（例えば、リポソーム、カチオン性ポリマー、（例えば、ポリ−Ｌ−リシン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子およびポリエチレンイミン）を含む製剤で投与できる、または好適な担体ペプチド（例えば、ホメオティック転写因子、アンテナペディアペプチド、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質、Ｅ５ＣＡペプチド）に結合させることができる。
【００５３】
以下では、ＣＩＲＰに対するアンタゴニスト作用物質（例えば、抗体）を同定する方法について記載する。
【００５４】
ＣＩＲＰを含む組成物は、本発明の抗体を含むＣＩＲＰに結合できる作用物質を検出および／または同定するための結合アッセイにおいて使用できる。
【００５５】
結合アッセイにおいて使用するために好適な組成物には、例えば、哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を自然に発現する細胞および哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を発現する組換え細胞が含まれる。結合アッセイにおいて使用するために好適な組成物には、哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を含む膜調製物もまた含まれる。そのような膜調製物は、天然（例えば、血漿膜）または合成膜を含有することができる。一部の実施形態では、膜調製物は、哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を含有する細胞の膜分画である。
【００５６】
１つの実施形態では、哺乳動物ＣＩＲＰに結合する作用物質（例えば、抗体）を検出または同定する方法は、試験物質（例えば、抗体）が参照物質（例えば、リガンドまたは公知の特異性のまた別の抗体）の結合を阻害する能力が評価される競合結合アッセイである。例えば、参照物質は、以下に記載する好適な標識を用いて標識することができ、アッセイ中に存在するＣＩＲＰを飽和させるために必要とされる標識参照物質の量を決定できる。飽和量の標識参照物質および様々な量の試験物質は、哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を含む組成物と結合のために好適な条件下で接触させることができ、複合体形成を決定することができる。ＣＩＲＰと試験物質との間の複合体形成の特異性は、好適なコントロール群（例えば、未標識物質、標識単独）を使用して決定できる。
【００５７】
参照物質もしくは試験物質いずれかとＣＩＲＰもしくは上述した免疫原性ペプチドを含むその断片との間の複合体の形成は、好適な方法を使用して直接的または間接的に検出または測定することができる。例えば、作用物質は好適な標識を用いて標識することができ、複合体の形成は標識の検出によって決定できる。複合体の特異性は、例えば未標識物質または標識単独などの好適なコントロールを使用して検出できる。作用物質と哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体との間の複合体の検出に使用するために好適な標識には、例えば、放射性同位体、エピトープ、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、蛍光基または化学発光基が含まれる。
【００５８】
例えば抗体などの試験物質がＣＩＲＰに結合する能力を決定するために使用される競合結合アッセイに関しては、そのような能力は、標識参照物質の特異的結合を５０％阻害する試験物質の濃度（ＩＣ５０値）として報告することができる。特異的結合は、好ましくは全結合（例えば、複合体中の全標識）−非特異的結合であると規定される。非特異的結合は、好ましくは、過剰な非標識参照物質の存在下で形成される複合体中で依然として検出される標識の量であると規定される。本方法において使用するために好適な参照物質には、哺乳動物ＣＩＲＰまたはその機能的変異体、例えばＣＩＲＰのリガンドまたは抗体に特異的に結合する分子および化合物が含まれる。好ましい参照物質は、ヒトＣＩＲＰ（配列番号１）の断片に対して公知の特異性を有する抗体である。
【００５９】
また別の態様では、本発明は、ＣＩＲＰの１つ以上の生物活性を阻害するための方法にさらに関する。一部の実施形態では、ＣＩＲＰ阻害剤は、ＣＩＲＰ媒介性シグナル伝達を阻害する。本明細書で使用する「ＣＩＲＰ媒介性シグナル伝達」は、細胞外シグナル伝達分子ＣＩＲＰによる細胞表面受容体の活性化を意味する。細胞表面受容体の活性化は、細胞からの生理学的反応を生成する。活性化は、例えば、細胞表面受容体へのＣＩＲＰ結合を通して発生する。本発明の一部の実施形態では、ＣＩＲＰ阻害剤は、細胞表面受容体、例えばＭＤ２へのＣＩＲＰ結合を阻害する。本発明の他の実施形態では、ＣＩＲＰ阻害剤は、細胞表面受容体複合体、例えばＭＤ２／ＴＬＲ４へのＣＩＲＰ結合を阻害する。本発明の他の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、ＣＩＲＰ媒介性炎症を阻害する。本発明のさらに他の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、炎症促進性サイトカイン、例えばＴＮＦ−αのＣＩＲＰ媒介性放出を阻害する。
【００６０】
ＣＩＲＰに結合する作用物質が１つ以上の「ＣＩＲＰの生物活性」を阻害する（例えば、減少させる、防止する、中和する）能力を調査することができる。上記で規定された用語「ＣＩＲＰの生物活性」は、ＣＩＲＰ受容体結合、ＣＩＲＰシグナル伝達、炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介性放出、ＣＩＲＰ媒介性炎症および／または他のＣＩＲＰ媒介性活性を意味する。そこで、これらのＣＩＲＰ媒介性機能を検出するアッセイを使用すると、試験物質の阻害活性（例えば、試験物質がＣＩＲＰの１つ以上の機能を阻害する能力）を評価できる。
【００６１】
作用物質（例えば、抗体）がＣＩＲＰの生物活性を阻害するかどうかの評価は、例えば、抗体が哺乳動物細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を阻害するかどうかを決定する工程によって実施できる。好適なサイトカインの例には、ＴＮＦ、ＩＬ−６またはＨＭＧＢ１が含まれる。
【００６２】
これらの方法のために、細胞は、炎症促進性サイトカインを生成するために誘導できる任意の細胞であってよい。細胞は、免疫細胞、例えば、マクロファージ、単球または好中球である。
【００６３】
サイトカイン産生の阻害の評価は、サイトカインの定量（例えば、ＥＬＩＳＡを用いる）またはバイオアッセイ（例えば、炎症促進性サイトカイン活性が減少するかどうかを決定する）、または炎症促進性サイトカインｍＲＮＡの測定を含む公知の任意の手段によってでよい。当業者であれば、無用な実験を行わずにこれらのアッセイのいずれかを利用できよう。ＣＩＲＰ阻害剤による炎症促進性サイトカインの放出の阻害についての非限定的実施例については、図４〜８を参照されたい。図８Ａは、未処置コントロール群と比して出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体を用いた治療による血清ＴＮＦの減少を示している。未処置コントロール群と比較した出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体を用いた処置による組織ＴＮＦの減少を図８Ｂ〜Ｃに示した。図８Ｄ〜Ｆは、未処置コントロール群と比較した出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体を用いた処置によるＩＬ−６（例えば、血清、肺および肝ＩＬ−６）の減少を示している。
【００６４】
炎症促進性サイトカイン放出を測定するまた別の方法には、炎症促進性サイトカインカスケードを刺激する物質とともに抗体を用いて哺乳動物細胞を処置する工程を含んでいる。一部の実施形態では、１つの作用物質は細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）である。化合物は、作用物質の前、作用物質と同時または作用物質の後のいずれかに哺乳動物細胞に投与できる。特定の実施形態では、化合物は、作用物質の前に投与される。例えば、その関連教示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６６１０７１３号明細書を参照されたい。
【００６５】
ＣＩＲＰ阻害を評価するために測定できるＣＩＲＰの他の生物活性には、動物モデルにおけるＡＳＴ濃度、動物モデルにおける肝ＭＰＯ濃度および動物モデルにおける乳酸塩濃度が含まれる。それらのマーカーの濃度は、一般に炎症反応中には上昇する。ＣＩＲＰの生物活性の阻害剤は、未処置コントロール群に比して炎症反応を経験している動物モデルにおけるこれらのマーカーの１つ以上の濃度を減少させることができる。ＣＩＲＰ阻害剤によるこれらのマーカーの放出の阻害を評価するための方法は、実験のセクションにおける図７Ａ〜Ｃに提供した。未処置コントロール群と比較した出血の動物モデルにおけるＡＳＴ濃度に抗ＣＩＲＰ抗体が及ぼす阻害作用は図７Ａに示した。図８Ｇは、未処置コントロール群と比して出血の動物モデルにおける抗ＣＩＲＰ抗体を用いた治療による肝ＭＰＯ濃度の減少を示している。図７Ｂ〜Ｃでは、抗ＣＩＲＰ抗体による血清ＡＬＴおよび乳酸塩の減少が示されている。
【００６６】
これらの方法はインビボで実施できるが、この場合は動物、例えばラットが炎症促進性サイトカインカスケードを刺激する作用物質と一緒に化合物を用いて治療され、その後に作用物質が炎症促進性サイトカインカスケードの誘導に及ぼす作用が例えば血清ＴＮＦ濃度を測定する工程によって測定される。しかし、動物全体を用いるより細胞培養を用いるタイプのアッセイを実施する方が比較的に容易であるために、特定の態様では、本方法は例えばマクロファージ培養を使用してインビトロで実施される。
【００６７】
本発明は、被験者にＣＩＲＰ阻害剤を投与する工程を含む、皮膚創傷に罹患している患者を治療する方法にさらに関する。本発明の特定の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、配列番号１２のアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩または配列番号１２と少なくとも８０％、または８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の相同性を有するアミノ酸残基配列を含む単離ペプチドである。本発明の特定の態様では、ＣＩＲＰ阻害剤は、配列番号１３または１４のアミノ酸残基配列を含むペプチドである。
【００６８】
治療方法
本明細書で使用する「炎症性疾患または状態」は、個体における炎症の増加を特徴とする疾患または状態を意味する。本明細書で使用する「炎症性疾患または状態」を典型とする感染性疾患または状態も意味する。炎症性疾患または状態は、「慢性炎症性疾患または状態」であってよい。慢性炎症性疾患または状態は、数週間、数カ月間またはそれ以上の後に消散しない炎症性状態である。慢性炎症性状態は、急性炎症性状態に続くことがある、または一部の疾患または状態については、急性炎症性疾患または状態の非存在下で発生することがある。または、炎症性状態は、急性炎症性エピソードの結果の場合がある。本明細書で使用する「急性炎症性エピソード」は、亢進した先天性免疫反応を意味する。急性炎症の症状には、発赤、発熱、腫脹、疼痛および機能喪失、例えば関節運動の喪失が含まれる。例えば、急性炎症性疾患または状態の急性炎症性エピソードは、下記のように慢性炎症性疾患または状態の典型的な症状とは異なる。頻回に、急性炎症反応中には、肝臓は血流中で検出可能な急性期タンパク質または急性期反応物質を合成する。急性期反応物質には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）；α１−アンチトリプシン；α１−アンチキモトリプシン；α２−マクログロブリン；凝固因子、例えばフィブリノゲン、フィブリン、プロトロンビン、トロンビン、第ＶＩＩＩ因子およびプラスミノゲン；補体タンパク質および血清アミロイドタンパク質が含まれる。さらに、急性炎症性エピソード中、局所炎症細胞、例えば好中球およびマクロファージは、多数のサイトカイン、最も顕著には、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＨＭＧＢ１およびＴＮＦ−αを血流中に分泌する（「サイトカインカスケード」）。ＣＩＲＰ阻害剤は、炎症性状態のこれらの作用物質およびマーカーの一部または全部を阻害する、減少させる、またはさもなければ軽減するために投与されてよい。
【００６９】
本発明を使用して役立つように治療できる炎症性状態の非限定的例は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、喉頭蓋炎、アカラシア（無弛緩症）、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血−再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、腐敗症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、肺炎、塵肺症、肺胞炎、気管支梢炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈洞炎、インフルエンザ、ＲＳウイルス感染症、ヘルペス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心嚢炎、心筋炎、虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、髄膜炎、脳炎、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、ページェット病、痛風、歯周病、関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、ベルガ−病、ライター症候群、ホジキン病、乾癬、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎および外傷性出血からなる群から選択される。
【００７０】
また別の実施形態では、炎症性状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、肝炎、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、腐敗症、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、セリアック病、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、関節炎、全身性エリテマトーデス、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、脊髄損傷、麻痺、乾癬、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳および四肢の虚血−再潅流、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎および外傷性出血からなる群から選択される。
【００７１】
また別の実施形態では、炎症性状態は、腹膜炎、膵炎、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳および四肢の虚血−再潅流、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎、喘息および外傷性出血からなる群から選択される。
【００７２】
または、炎症性状態は、外傷性出血、敗血症−敗血症性ショック、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳および四肢の虚血−再潅流、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患および壊死性腸炎からなる群から選択される。
【００７３】
また別の実施形態では、本発明は、皮膚創傷に罹患している患者を治療する方法であって、被験者に有効量のＣＩＲＰ阻害剤を投与する工程を含む方法に関する。本明細書で使用する「皮膚創傷」は、皮膚の一部分が鈍力、化学物質または細菌感染を含む任意の作用物質により裂かれて、切られて、刺されて、またはさもなければ破壊されている少なくとも皮膚真皮への損傷である。皮膚創傷の例には、糖尿病、褥瘡および細菌性もしくはウイルス性感染症に関連する慢性（非治癒性）創傷を含む皮膚創傷（皮膚潰瘍）が含まれる。
【００７４】
投与方法
ＣＩＲＰ阻害剤の投与経路は、治療対象の状態に左右される。例えば、静脈内注射は、敗血症性ショックなどの全身性障害の治療のために好ましいことがある、および例えば胃潰瘍などの消化器障害を治療するためには経口投与が好ましいことがある。
【００７５】
本方法によると、本発明の１つ以上のＣＩＲＰ阻害剤は、単独またはまた別の薬物と組み合わせてのいずれかで、適切な経路により被験者に投与できる。有効量の作用物質（即ち、ＣＩＲＰ阻害剤）が投与される。「有効量」は、例えば、炎症反応を阻害するため、および炎症性状態を緩和もしくは治癒させるために十分な量などの、投与条件下で所望の治療効果または予防効果を達成するための十分な量である。これらの作用物質は、単回投与または複数回投与で投与することができる。用量は、当分野において公知の方法によって決定することができ、例えば、選択された特定の作用物質、被験者の年齢、薬物への感受性および忍容性ならびに全身の健康状態に左右される。抗体についての好適な用量は、治療１回毎に約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であってよい。
【００７６】
作用物質および治療対象の疾患または状態に依存して、例えば、経口、食事、局所、経皮、経直腸、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射、腸内注射）ならびに吸入（例えば、気管支内、鼻腔内もしくは経口吸入、点鼻）の投与経路を含む、様々な投与経路が可能である。投与は、適応があれば局所または全身性であってよい。好ましい投与経路は、選択された特定の作用物質（ＣＩＲＰ阻害剤）および治療される特定の状態（例えば、疾患）に依存して変動してよい。静脈内、経口または非経口投与が好ましい。
【００７７】
作用物質は、中性化合物または医薬上許容される塩として投与できる。アミンまたはその他の塩基性基を含有する化合物の塩は、例えば、好適な有機もしくは無機酸、例えば塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などと反応させることによって入手できる。第４級アンモニウム基を含む化合物は、さらに例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などの対アニオンも含有している。カルボン酸または他の酸性官能基を含有する化合物の塩は、好適な塩基、例えば水酸化物塩基と反応させる工程によって調製できる。酸性官能基の例は、対カチオン、例えばナトリウム、カリウムなどを含有している。
【００７８】
本明細書で使用する本明細書で開示した化合物の「医薬上許容される塩」は、本発明の化合物を被験者に投与するために好適な酸または塩基いずれかと反応させる工程のイオン結合含有生成物である。例えば、アミンまたはその他の塩基性基を含有する化合物の酸性塩は、その化合物を好適な有機もしくは無機酸、例えば塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などと反応させることによって入手できる。そのような塩の他の例には、塩酸塩、臭化水素酸、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（例えば、（＋）−酒石酸塩、（−）−酒石酸塩またはラセミ混合物を含むそれらの混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩および例えばグルタミン酸などのアミノ酸との塩が含まれる。塩は、化合物が例えば−ＣＯＯＨもしくは−ＳＯ３Ｈなどの酸性官能基を含む場合は好適な有機塩基を用いて形成することもできる。本発明の化合物を用いた医薬上許容される塩基付加塩の形成に好適なそのような塩基には、酸性官能基と反応させるために十分な非毒性および強力である有機塩基が含まれる。そのような有機塩基は当分野において周知であり、アミノ酸、例えばアルギニンおよびリシン、モノ−、ジ−およびトリエタノールアミン、塩素、モノ−、ジ−およびトリアルキルアミン、例えばメチルアミン、ジメチルアミンおよびトリメチルアミン、グアニジン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどが含まれる。
【００７９】
作用物質は、ＣＩＲＰ阻害剤および医薬上許容される担体を含む医薬組成物の一部として個体に投与することができる。
【００８０】
本明細書で使用する「医薬組成物」は、被験者に投与するために好適な形態にある、本明細書で開示したＣＩＲＰアンタゴニスト（例えば、抗ＣＩＲＰ抗体）および医薬上許容される希釈剤もしくは担体を含む製剤である。好適な医薬上許容される担体には、不活性固体充填剤もしくは希釈剤および無菌水溶液もしくは有機溶液が含まれる。製剤は、選択された投与経路にしたがって変動することになる（例えば、液剤、エマルジョン剤、カプセル剤）。好適な医薬担体は、ＣＩＲＰのプロモーター（アゴニスト）または阻害剤（アンタゴニスト）と相互作用しない不活性成分を含有することができる。標準的な製剤処方技術、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）に記載された技術を使用できる。非経口投与のために好適な医薬担体には、例えば、無菌水、生理食塩液、静菌食塩液（約０．９％ｍｇ／ｍＬのベンジルアルコールを含有する食塩液）、リン酸緩衝食塩液、ハンクス液、乳酸リンゲル液などが含まれる。組成物を（例えば、硬質ゼラチンもしくはシクロデキストランのコーティング中などに）カプセル封入するための方法は、当分野において公知である（Ｂａｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９８６）。吸入のためには、作用物質は可溶化して投与のために好適なディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エーロゾルディスペンサー）内に装填することができる。
【００８１】
医薬組成物は、バルク形または単位剤形にあってよい。単位剤形は、例えば、カプセル剤、ＩＶバッグ、錠剤、エーロゾルインヘラー上のシングルポンプまたはバイアルを含む様々な形態のいずれかであってよい。単位用量の組成物中の有効成分（即ち、本明細書に開示した化合物またはその塩の製剤）の量は、有効量であり、関係する特定治療にしたがって変動してよい。患者の年齢および状態に依存して用量を定期的に変動させることが必要な場合があることを理解されたい。用量は、さらに投与経路にも左右されるであろう。
【００８２】
本明細書で使用する「被験者」には、哺乳動物、例えばヒト、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ、鳥類など）、農耕動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、家禽類など）ならびに実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）が含まれる。本明細書に開示した方法の特定の実施形態では、被験者はヒトである。
【００８３】
本発明の一部の実施形態では、ＣＩＲＰ阻害剤は、被験者の急速輸液中に投与される。本明細書で使用する「急速輸液」もしくは「補液」は、出血、発汗、体液移動または病的過程を通しての体液損失の補充を意味する。急速輸液は、静脈内投与、または経口もしくは直腸投与を通して、またはさらに皮下組織中への液体の注射によって行われる。
【００８４】
本発明の実践は、他に特に指示しない限り、当業者の技量の明確な範囲内にある細胞培養、分子生物学、微生物学、細胞生物学および免疫学の従来型技術を使用することになる。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｓｅｖｅｒａｌ  ｖｏｌｕｍｅｓ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｅｖｅｒａｌ  ｖｏｌｕｍｅｓ），ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｓｅｖｅｒａｌ  ｖｏｌｕｍｅｓ）を参照されたい。
【００８５】
本発明の特定の実施形態を以下の実施例において説明する。本明細書の特許請求の範囲内に含まれる他の実施形態は、当業者には、本明細書に開示した本発明の明細書の考察または実施から明白になるであろう。本明細書は、実施例とともに典型であると見なされ、本発明の範囲および精神は実施例の項に続く特許請求項によって指示されることが意図されている。
【実施例】
【００８６】
実施例１：天然ＣＩＲＰは動物モデルにおいて出血性ショックにより誘導される炎症反応を媒介する
出血性ショックモデルにおける動物の組織中および血清中で高濃度のＣＩＲＰが検出された。
【００８７】
材料および方法
実験動物：雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラット（体重、２７５〜３２５ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入し、１２時間明暗周期で温度調節した室内に収容し、標準Ｐｕｒｉｎａラット用飼料を摂取させた。出血性ショックを誘導する前に、ラットは一晩絶食させたが、水は随意に摂取させた。全ての実験は国立衛生研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）による実験動物使用ガイドラインを順守して実施し、フェインスタイン医学研究所の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された。
【００８８】
出血性ショックの動物モデル：本実験において使用した出血性ショックのモデルについては、以前にわずかな修正を伴って詳細に記載した（Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｈａｕｐｔｍａｎ  ＪＧ，Ｃｈａｕｄｒｙ  ＩＨ：Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｗｈｉｃｈ  ｐｅｒｓｉｓｔｓ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｆｌｕｉｄ  ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ｓｈｏｃｋ  ３２：３０７−３１８，１９９０．；Ｗｕ  Ｒ，Ｄｏｎｇ  Ｗ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｃｕｉ  Ｘ，Ｓｉｍｍｓ  ＨＨ，Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ：ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  １３７：２００５）。手短には、ラットにイソフルラン吸入により麻酔をかけた。大腿神経および血管を注意深く分離した後に、カテーテル（ＰＥ−５０チューブ）を大腿静脈および動脈内に留置した。反対側の大腿動脈にもカテーテルを留置した。１本の動脈カテーテルは血圧分析装置（Ｄｉｇｉ−Ｍｅｄ社、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）を介して平均動脈圧（ＭＡＰ）および心拍数（ＨＲ）を監視するために使用し、もう１本は血液抜去のために使用し、静脈カテーテルは急速輸液のために使用した。ラットは１０分間以内に２５〜３０ｍｍＨｇのＭＡＰへ出血させた。この圧力をその後の少量の血液の抜去または少量の乳酸リンゲル液の供給によって９０分間維持した。低血圧期間の終了時に、ラットに乳酸リンゲル液（計算血液量のおよそ６０％であった最高出血量の２倍等量）を６０分間かけて輸液した。流出した血液は輸液のためには使用せず、動物は出血の前、中または後にヘパリン化しなかった。４時間後、血液サンプルを採取し、凝血させるための氷上に置いた。サンプルを次に１，２００ｇで１０分間、４℃で遠心し、血清サンプルはアッセイ時まで−８０℃で貯蔵した。培養皿の組織サンプルも採取し、直ちに液体窒素に曝露させ、次にアッセイ時まで−８０℃で貯蔵した。疑似手術動物は同一外科手順を受けたが、出血も輸液もされなかった。
【００８９】
ＣＩＲＰ遺伝子発現の決定：ＣＩＲＰ遺伝子の発現が出血において変化したかどうかを試験するために、出血性組織を決定し、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量した。Ｑ−ＰＣＲは、マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して４μｇのＲＮＡから逆転写させたｃＤＮＡサンプル上で実施した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、反応は２ｐｍｏｌのフォワードおよびリバースプライマー、１２μＬのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘならびに１μＬのｃＤＮＡを含有する２４μＬの最終量中で実施した。増幅は、Ｑｉａｇｅｎ社の勧告にしたがってＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００リアルタイムＰＣＲを用いて実施した。各サンプルの正規化のためにはラットＧ３ＰＤＨ  ｍＲＮＡの発現量を使用し、各特異的ｍＲＮＡの分析を２回ずつ実施した。ｍＲＮＡの相対発現は、ΔΔＣｔ法によって計算し、結果は対応する実験コントロール群に比した倍率変化として表示した。下記のラットプライマーを使用した：ＣＩＲＰ（ＮＭ＿０３１１４７）：５’−ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＧＡ−３’（フォワード）、（配列番号４）、５’−ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡ−３’（リバース）、（配列番号５）；Ｇ３ＰＤＨ（ＸＭ＿５７９３８６）：５’−ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧ−３’（フォワード）、（配列番号６）、５’−ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＴＴ−３’（リバース）、（配列番号７）。ＴＮＦ−αの遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して評価した。ＴＮＦ−αのためのプライマーおよびハウスキーピング遺伝子は、以前に記載されたように（Ｗｕ  Ｒ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  １１２：１９−２６，２００３）、以下の通りであった：ラットＴＮＦ−α、５’−ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＡ−３’（配列番号８）、５’−ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＣＧ−３’（配列番号９）およびＧ３ＰＤＨ、５’−ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ  ＧＣ−３’（配列番号１０）、５’−ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ−３’（配列番号１１）。
【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲアッセイ：全ＲＮＡｓは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によって抽出した。ｃＤＮＡは、ＭＬＶ逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して合成した。ＰＣＲ反応は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ混合物（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で実施し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍによって分析した。ＧＡＰＤＨを正規化のための内部コントロールとして使用し、分析した遺伝子の相対発現レベルはΔΔＣｔ法によって計算した。各サンプルを２回ずつ測定した。ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマーはＯｐｅｒｏｎ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）から合成した。プライマーを以下のように列挙する：ラットＣＩＲＰ（ＮＭ＿０３１１４７）、５’−ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＧＡ−３’（フォワード）、（配列番号４）および５’−ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡ−３’（リバース）、（配列番号５）；ＴＮＦ−α（ＮＭ＿０１２６７５）、５’−ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＡ−  ３’（フォワード）、（配列番号８）、５’−ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＣＧ−３’（リバース）、（配列番号９）；ならびにＧＡＰＤＨ（ＮＭ＿０１７００８）、５’−ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧ−３’（フォワード）、（配列番号６）、５’−ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＴＴ−３’（リバース）、（配列番号７）。
【００９１】
ウェスタンブロット分析：血清および組織中のＣＩＲＰタンパク質の発現は、ウェスタンブロット分析によってＣＩＲＰ（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ社、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）に対するウサギポリクローナル抗体を使用して決定した。手短には、等量の血清（体積）および組織ホモジネート（タンパク質ｍｇ／レーン）は４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上で分画化し、ニトロセルロース膜へ移し、次に５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０）中で１時間、室温でインキュベーションすることにより遮断した。膜をウサギポリクローナル抗体とともに一晩、４℃でインキュベートした。ＴＢＳＴバッファー中で数回洗浄してホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）とともにインキュベートし、化学発光ペルオキシダーゼ（ＥＣＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を製造業者の取扱説明書にしたがって適用し、膜をＸ線フィルムに曝露させた。ウェスタンブロットの結果をスキャンし、相対バンド強度は、ＧＳ８００較正密度計、Ｂｉｏ−Ｒａｄ画像分析装置システム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して定量した。同等の負荷を保証するために抗β−アクチン抗体（細胞質タンパク質に対して、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を使用した。ラット血清中のＨＭＧＢ１の濃度は、以前に報告されたようにウサギポリクローナル抗ＨＭＧＢ１抗体を使用して測定した（Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｂｌｏｏｍ  Ｏ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｖｉｓｈｎｕｂｈａｋａｔ  ＪＭ，Ｏｍｂｒｅｌｌｉｎｏ  Ｍ，Ｃｈｅ  Ｊ，Ｆｒａｚｉｅｒ  Ａ，Ｙａｎｇ  Ｈ，Ｉｖａｎｏｖａ  Ｓ，Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ  Ｌ，Ｍａｎｏｇｕｅ  ＫＲ，Ｆａｉｓｔ  Ｅ，Ａｂｒａｈａｍ  Ｅ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｊ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｕ，Ｍｏｌｉｎａ  ＰＥ，Ａｂｕｍｒａｄ  ＮＮ，Ｓａｍａ  Ａ，Ｔｒａｃｅｙ  ＫＪ：ＨＭＧ−１  ａｓ  ａ  ｌａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：２４８−２５１，１９９９）。
【００９２】
または、組織サンプルは、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）を含有するＲＩＰＡバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、１％のデオキシコール酸ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳ）中でホモジナイズした。タンパク質濃度は、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって決定した。等量の血清もしくは組織ホモジネートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画化し、ニトロセルロース膜に移した。膜をＣＩＲＰに対する抗体（＃１０２０９−２−ＡＰ；ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ社、Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、ＧＡＰＤＨ（＃ｓｃ−２５７７８；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ヒストン（＃９７１５；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｂａｘ（＃ｓｃ−５２６；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、アクチン（＃Ａ５４４１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、カテプシンＤ（＃ｓｃ−１０７２５；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）またはＨＭＧＢ１（＃ａｂ１８２５６；Ａｂｃａｍ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、次に二次抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａｂａｍａ）とともにインキュベートし、化学発光検出キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて顕色させた。
【００９３】
統計的分析：全データは平均値±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）として表示し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびスチューデント・ニューマン・クールズ法によって比較した。２群分析のためにはスチューデントのｔ検定を使用した。大多数のデータセットは正規性検定に合格した。一部のデータセットは、群間変動において統計上の差を有していた。生存率は、カプラン・マイヤー法によって推定し、ログ・ランク検定を比較した。数値の差は、Ｐ＜０．０５であれば有意と見なされた。
【００９４】
結果
出血した動物における組織中および循環中のＣＩＲＰのアップレギュレーションおよび放出：実験的失血（出血）を受けたラットは、様々な組織中でＣＩＲＰ  ｍＲＮＡの有意に増加した発現を示した。ＣＩＲＰ発現は、疑似手術コントロール群に比して肝臓中では約５倍（図２Ａ）および心臓内では約３倍（図２Ｂ）増加した。出血ラットにおいてウェスタンブロット分析によりＣＩＲＰタンパク質の高循環中濃度が検出された。出血群は、疑似群（図２Ｃ）では見いだされなかった明白な免疫反応性ＣＩＲＰバンドを示した。ＣＩＲＰタンパク質の発現はさらに、疑似手術ラット群（同等の負荷を保証するためにβ−アクチンが投与された）と比して、出血した動物の心臓においても増加した（図２Ｄ）。出血性ショックのラットモデルは、２５〜３０ｍｍＨｇの平均動脈圧（ＭＡＰ）まで動物に出血され、９０分間にわたりＭＡＰを維持し、その後に急速輸液を行うことにより使用した。血清ＣＩＲＰは２４０分後に検出可能であり、出血したラットにおけるショックの３３０分後に有意に上昇することが見いだされた。ＣＩＲＰタンパク質濃度は、肝臓および心臓内で各々１５０および２４０分後に増加し始めた。血清ＣＩＲＰ濃度は、標準物質として精製ＣＩＲＰの連続希釈液を使用して推定した。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝４〜６／時点、＊Ｐ  時点０群に比して＜０．０５（図９Ｂおよび２Ｃ）。それに対応して、ＣＩＲＰ  ｍＲＮＡ濃度は、肝臓および心臓内ではショック２４０分後に各々４．１および２．８倍まで有意に誘導された。これらの濃度は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝６／群、＊Ｐ  疑似群に比して＜０．０５（図９Ｃならびに図２ＡおよびＢ）。
【００９５】
実施例２：天然ＣＩＲＰはヒトにおいて出血性ショックにより誘導される炎症反応を媒介する
出血性ショックに罹患しているヒトにおいてＣＩＲＰの上昇した血清中濃度が検出された。
【００９６】
材料および方法
ヒト血液検体：血液サンプルは、出血性ショックのために外科集中治療室（ＩＣＵ）に入院した患者から入手した。血清を分離し、−８０℃でアリコートにして貯蔵した。インフォームドコンセントおよびヒト被験者プロトコルは、米ノースショア・ロングアイランド・ユダヤ人ヘルスシステム（Ｎｏｒｔｈ  Ｓｈｏｒｅ−Ｌｏｎｇ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｊｅｗｉｓｈ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ）の施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された。
【００９７】
結果
ショックを有する外科ＩＣＵ患者における血清ＣＩＲＰの検出：臨床状態におけるＣＩＲＰの役割を探索するために、外科ＩＣＵ患者１０例由来の血清ＣＩＲＰ濃度（表１）を検査した。５例の女性および５例の男性がいて、平均年齢は７１歳であった。集中治療における急性期患者の重症度評価ＩＩ（ＡＰＡＣＨＥ  ＩＩ）は１３〜２５に及び、平均は１９であった。平均血液サンプル採取時間は、能動的出血中または外傷性損傷後いずれかでの臨床的に証明された収縮期血圧＜９０ｍｍＨｇにより規定されたショック開始４３時間後であった。血清ＣＩＲＰは、臨床パラメータの差とは無関係に、健常志願者においてはほとんど観察されなかったが、患者全１０例において著明に検出された（図９Ａ）。
【００９８】
【表１】
0006615100.tif 000002
【００９９】
実施例３：ＣＩＲＰは、低酸素状態に曝露された細胞系から分泌される
ＣＩＲＰは、低酸素状態に曝露された細胞から分泌された。再酸素化後、ＣＩＲＰは核から細胞質に、次に細胞質から細胞外マトリックスに転位した。
【０１００】
材料および方法
細胞培養：マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％（体積／体積）のＦＢＳ（５６℃で３０分間にわたり熱不活性化した）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で増殖させた。細胞を培地中に再懸濁させ、６もしくは４８ウエル組織培養皿内に入れて一晩、加湿培養器（３７℃、５％のＣＯ２）中でインキュベートした。実験では、細胞単層を様々な指示濃度および様々な指示時間にわたり組換えＣＩＲＰを用いて、または用いずに刺激した。無細胞上清をＴＮＦ−αについてはＥＬＩＳＡによって、またはＨＭＧＢ１についてはウェスタンブロット分析によってアッセイした。
【０１０１】
インビトロ低酸素状態：低酸素状態は、３７℃の培養器内に配置された１％のＯ２、５％のＣＯ２および９４％のＮ２を含有する密閉チャンバを使用して作り出した。培養培地は、低酸素状態の影響下に置く前にＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に変更した。低酸素チャンバ内での２０時間のインキュベーション後、細胞を様々な期間にわたり標準培養状態で回収し、その後の分析のために収集した。
【０１０２】
細胞分画法：細胞質分画および核分画を単離するために、ＲＡＷ２６４．７細胞ペレットは、氷上で１５分間、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのジチオトレイトールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するバッファー中に再懸濁させた。遠心分離後、上清を細胞質分画として収集し、ペレットは、氷上で２０分間、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、２５％のグリセロール、４２０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのジチオトレイトールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するバッファー中に再懸濁させた。遠心分離後、上清を核分画として収集した。リソソームの単離は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって指示されたようにキットを用いて実施した。
【０１０３】
ＧＦＰ−ＣＩＲＰ融合タンパク質の発現：ＧＦＰ−ＣＩＲＰ発現プラスミドの構築は、Ｎｉｓｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３７，８９９−９０８（１９９７））に記載されている。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してプラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞はさらに、比較のためのコントロール群としてＧＦＰ発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。培養細胞中へのＣＩＲＰの放出を調査した。正常酸素性もしくは低酸素性／再酸素化ＲＡＷ２６４．７細胞からの馴化培地は０．０２％デオキシコール酸および１０％のトリクロロ酢酸とともに４℃で一晩タンパク質沈降のためにインキュベートし、これを次にウェスタンブロッティング法にかけた。ＬＤＨ活性は、Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のアッセイキットによって決定した。
【０１０４】
結果
低酸素状態に曝露させたマクロファージからのＣＩＲＰの転位および放出：ＣＩＲＰはショック後のヒトおよびラットの両方の血清中で検出可能であったので、ＣＩＲＰ放出について調査した。マクロファージは、様々な炎症メディエーターの放出の原因となる主要な細胞集団である。マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞は、出血性ショック中に発生する方法と同様の方法で２０時間にわたり正常酸素状態（ＮＭ）または低酸素状態（１％のＯ２）で培養し、ＣＩＲＰの細胞部位を試験した。低酸素状態に曝露させた細胞を０、２、４、７または２４時間にわたり再酸素化した（Ｈ／Ｒ０、Ｈ／Ｒ２、Ｈ／Ｒ４、Ｈ／Ｒ７またはＨ／Ｒ２４）。細胞抽出物を核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）成分に分画化し、次にウェスタンブロッティング法にかけた。各分画の完全性は、抗ＧＡＰＤＨおよび抗ヒストン抗体を使用して検証した。ＣＩＲＰは正常酸素状態中には主として核内に位置したが、他方細胞質ＣＩＲＰは生化学分画化によって決定した２０時間の低酸素状態からの再酸素化７時間後に検出され、２４時間後には顕著に増加した（図９Ｄ）。遺伝的アプローチは、さらにＣＩＲＰの転位を確証するためにも使用した。ＲＡＷ２６４．７細胞を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現プラスミドでトランスフェクトしたコントロール実験では、緑色蛍光は正常酸素性および低酸素性状態の両方において細胞全体にわたって観察された（図１５）。対照的に、ＲＡＷ２６４．７細胞をＧＦＰ−ＣＩＲＰ発現プラスミドを用いてトランスフェクトした場合は、正常酸素状態下でのヘキスト核染色からの青色蛍光によってオーバーラップされながら緑色蛍光は細胞の中心でしか観察されなかった（図９Ｅ）。しかし、低酸素状態からの再酸素化４時間後には、緑色蛍光は核および細胞質両方に分布していた（図９Ｅ）。これらをまとめると、低酸素／再酸素化は、マクロファージ内での核から細胞質へのＣＩＲＰ転位を誘導した。
【０１０５】
トリクロロ酢酸によって沈降させたＲＡＷ２６４．７細胞の馴化培地（ＣＭ）中において細胞質ＣＩＲＰを細胞外空間内へ放出させることができたかどうかを試験するために、ＣＩＲＰは低酸素状態後の２４時間の再酸素化で明確に検出されたが、ウェスタンブロッティング法によって正常酸素状態ではＣＩＲＰは検出できなかった（図９Ｆ）。さらに、細胞内ＣＩＲＰタンパク質濃度は低酸素状態直後に２．８倍および再酸素化の７時間後に４．３倍増加したが、その濃度は細胞外空間内への放出のために細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｃｙｓａｔｅ）中での２４時間の再酸素化時には減少した（図９Ｆおよび９Ｇ）。図９Ｇでは、中央の画像における倍率変化は相対強度を示している。乳酸デヒドロゲナーゼ活性における変化は見られず、低酸素状態後にＣＭ中で検出可能な細胞内Ｂａｘタンパク質は存在しなかったために、ＣＩＲＰ放出の原因を壊死に帰せることはできなかった。
【０１０６】
ＣＩＲＰタンパク質配列は分泌リーダーシグナルを含有していない；このため、その分泌が伝統的（小胞体−ゴルジ依存性）経路を通して行われるはずはない（Ｑｕ，Ｙ．＆  Ｄｕｂｙａｋ，Ｇ．Ｒ．Ｐ２Ｘ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ  Ｓｉｇｎａｌ．５，１６３−１７３（２００９））。能動性ＣＩＲＰ放出の潜在的機序は、低酸素状態／再酸素化を受けているＲＡＷ２６４．７細胞のリソソーム区画を単離するために生化学的分画化を実施することによって同定した。ＲＡＷ２６４．７細胞由来の細胞抽出物のウェスタンブロットにおいて証明されたように、ＣＩＲＰタンパク質は正常酸素状態（ＮＭ）で培養された細胞のリソソーム内では検出されなかったが、低酸素状態からの２４時間の再酸素化（Ｈ／Ｒ２４）時には、リソソームの１つのタンパク質マーカーであるカテプシンＤと共局在化した（図９Ｈ；Ｎ＝核；Ｌ＝細胞抽出物のリソソーム分画成分）。この結果は、ＣＩＲＰをリソソーム分泌によって放出させることができることを示した。図９Ｄ〜９Ｈにおける画像は３つの独立実験を示している。
【０１０７】
実施例４：細胞系および動物の外因性組換えＣＩＲＰによる処置は炎症反応を誘導する
炎症性サイトカインおよび臓器障害マーカーの放出によって測定されるように、ｒＣＩＲＰの投与後にはマウスおよびヒト細胞系ならびに健常動物において炎症反応の増加が観察された。
【０１０８】
材料および方法
組換えタンパク質（ｒＣＩＲＰ）：細菌発現系由来のヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を用いた組換えタンパク質の発現および精製のための連続法を使用した。ｃＤＮＡは、以前に記載されたように５０ＵのＭｕＬＶ逆転写酵素を備える改変オリゴｄ（Ｔ１６）プライマーを使用してラット心臓の４μｇの全組織ＲＮＡを逆転写させることによって調製した（Ｄｗｉｖｅｄｉ  ＡＪ，Ｗｕ  Ｒ，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｅ，Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｋｒｉｓｈｎａｓａｓｔｒｙ  Ｋ，Ｍａｒｉｎｉ  ＣＰ，Ｒａｖｉｋｕｍａｒ  ＴＳ，Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｇｕｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ  ２０５：２８４−２９３，２００７）。ＣＩＲＰタンパク質を入手するために、ＣＩＲＰコーディング配列は、ＰＣＲによってＣＩＲＰ  ｃＤＮＡからプライマーセット：センス５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＧ−３’（配列番号２）およびアンチセンス５’−ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＣ−３’（配列番号３）を用いて増幅させ、合成し（ＧｅｎＢａｎｋによる設計：ＮＭ＿０３１１４７、ＮＣＢＩ）、ラットＣＩＲＰクローンを単離するために使用した。次にＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで消化し、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって記載されている）でｐＥＮＴＲベクター内にクローン化し、次に結果として生じる発現プラスミドとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換させた。ＣＩＲＰの誘導発現を数リットルのＢＬ２１（ＤＥ３）細胞培養中で実施し、次にＣＩＲＰを単離し、製造業者によって記載されたように精製した（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。以前に報告されたように（Ｅｒｔｅｌ  Ｗ，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＭＨ，Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｂａ  ＺＦ，Ａｙａｌａ  Ａ，Ｃｈａｕｄｒｙ  ＩＨ：Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，ｃａｃｈｅｃｔｉｎ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２１４：１４１−１４８，１９９１）、故意ではないリポ多糖（ＬＰＳ）汚染を回避するために、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４抽出を使用して可能性のある内毒素汚染を除去し、最終ＬＰＳ含量はアメリカカブトガニ溶解物（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ：ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して決定した。
【０１０９】
ＣＩＲＰ発現プラスミドの構築：ラットＣＩＲＰ  ｃＤＮＡ（ＮＭ＿０３１１４７）は、ｏｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ１６）プライマーとともにＭＬＶ逆転写酵素を使用することによりラット心臓から単離した全ＲＮＡから合成した。ｃＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライマーであるセンス５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＧ−３’およびアンチセンス５’−ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＣ−３’を用いて増幅させた。生じたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩで消化し、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）でｐＥＮＴＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内へクローン化し、次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）へ形質転換させた。個々のクローンは、カナマイシン耐性によって選択した。
【０１１０】
ｒｍＣＩＲＰの精製：ラットＨｉｓ−ＣＩＲＰ発現プラスミドを有する形質転換大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、カナマイシンを含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中に一晩接種し、さらに６時間かけて１．０ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。細菌を遠心分離によって収穫し、ペレットは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）を用いて１回洗浄した。細菌パレットは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダザールを含有するバッファー中に再懸濁させ、４℃での超音波処理により溶解させた。可溶性抽出物は、１時間にわたり４℃で２０，０００ｇでの遠心分離により浄化した。透明溶解物をＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）上に装填した。結合タンパク質を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５００ｍＭのＮａＣｌおよび１００ｍＭのイミダゾールで洗浄し、１．０Ｍイミダゾールを補給した同一バッファー中に溶出させた。全タンパク質をＰＢＳで透析し、その後の分析のために−８０℃で貯蔵した。
【０１１１】
精製ｒｍＣＩＲＰ製剤からのＬＰＳの除去：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）は、最終濃度が５％となるように精製タンパク質溶液に加えた。混合液は、均質溶液を保証するために室温で１５分間回転させた。次に、この混合物を１４，０００ｇで１２分間遠心した。ｒｍＣＩＲＰを含有する上方水相（ＬＰＳ非含有）を注意深く除去した。除去した溶液中のＬＰＳの濃度をアメリカカブトガニ溶解物（ＬＡＬ）アッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ社、Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）によって測定した。
【０１１２】
精製ｒｍＣＩＲＰの妥当性確認：発現および精製後、１μｇのタンパク質調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルをクマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）により染色した。レーン１、タンパク質マーカー；レーン２、バッチＡ；レーン３、バッチＢ。ｒｍＣＩＲＰ調製物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験したが、２４ｋＤａで主要バンドおよび他の位置では極めて小さなバンドが証明された（図１６Ａ）。ｒｍＣＩＲＰの同一性は、１つは実験室内で生成され、もう一つはＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈから生成された２つの異なる起源由来の抗ＣＩＲＰ抗体に対するウェスタンブロッティング法によりさらに確証された（図１６Ｂ）。精製ｒｍＣＩＲＰはさらに、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋでＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用するアミノ酸配列分析によって妥当性確認した。組換えタンパク質は、ＭＡＳＣＯＴデータベース検索アルゴリズムを使用して９５％を超える信頼性でＣＩＲＰであると同定された。
【０１１３】
細胞培養：ＲＡＷ２６４．７細胞は、実施例３に記載したように培養した。
【０１１４】
炎症性サイトカインアッセイ：炎症性サイトカインカスケードおよび急性炎症反応の指標として、市販で入手できる酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して、組換えＣＩＲＰとともにインキュベートした細胞由来の上清を血清、組織ホモジネートならびにマクロファージとともに増殖させた培養培地中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６濃度について測定した。血清および組織中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６タンパク質濃度を定量するために、血清サンプルを出血４時間後または動物由来の組換えＣＩＲＰを用いた処置４時間後に、ラットを犠死させた時点に心穿刺により採取し、組織サンプルを収集し、上記と同一方法によって実施した。ＨＭＧＢ１濃度は、ウェスタンブロッティング法により決定した。
【０１１５】
トランスアミナーゼ類および乳酸塩の血清中濃度の決定：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）および乳酸塩の血清中濃度は、アッセイキットを製造業者（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＭＩ）の取扱説明書にしたがって使用して決定した。
【０１１６】
ヒトＰＢＭＣの単離：ヒトＰＢＭＣｓは、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋの健常ドナーから入手した血液から、標準プロトコルにしたがってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）密度勾配での遠心分離により単離した。単離細胞はＲＰＭＩ１６４０完全培地を用いて洗浄し、培養皿上で培養した。２時間後、非付着性細胞を取り出し、付着性培養を使用前に一晩培養した。
【０１１７】
結果
マウス細胞系における組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）誘導性炎症反応：細胞外ＣＩＲＰが炎症メディエーターとして機能できるかどうかを解決するために、組換えマウスＣＩＲＰ（ｒｍＣＩＲＰ）は９７％を超える純度を備える細菌発現系を用いて発現させて精製し、ウェスタンブロッティング法により確証した（図１６ＡおよびＢ）。アメリカカブトガニ溶解物アッセイにより測定して約１０ｐｇのＬＰＳ／μｇ（ＣＩＲＰ）の残留物を含む精製ｒｍＣＩＲＰからリポ多糖（ＬＰＳ）を取り出すためにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４抽出法を適用したが（例えば、Ａｉｄａ，Ｙ．＆  Ｐａｂｓｔ，Ｍ．Ｊ．Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２，１９１−１９５（１９９０）を参照されたい）、これは他の同定された内因性ＤＡＭＰｓにおいて記載されたものに匹敵している（例えば、Ｗａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７０  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４，３３０６−３３１６（２００５）；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  １５，１２３−１４１（２０１０）を参照されたい）。ＲＡＷ２６４．７細胞へのｒｍＣＩＲＰの添加は用量および時間依存法でＴＮＦ−α放出を増加させた（例えば、図１０Ａおよび１０Ｂを参照されたい）。ＲＡＷ２６４．７細胞は指示濃度のｒｍＣＩＲＰと４時間（図１０Ａ）、または１００ｎｇ／ｍＬのｒｍＣＩＲＰと指示時間（図１０Ｂ）にわたりインキュベートしたが、このとき＊ＰはｒｍＣＩＲＰなしまたは時点０群に比して＜０．０５であった。
【０１１８】
健常ラットにおける組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）誘導性炎症反応：
健常ラットにｒｍＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）または生理食塩水（ビヒクル）を静脈内投与した。コントロールとしてのｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）またはバッファー溶液（同一容積）の注射後、ＴＮＦ−αの血清中濃度はｒＣＩＲＰ群ではバッファー（疑似）群より約５倍高く、顕著に増加した（図４Ａ）。ＴＮＦ−α遺伝子およびタンパク質発現は、ｒＣＩＲＰ投与後に肝臓（図４ＣおよびＤ）ならびに腸（図４ＥおよびＦ）中で増加した。ｒｍＣＩＲＰはさらに、また別の炎症促進性サイトカインＨＭＧＢ１の放出を用量依存性で誘導した（図１０Ｃ）。ＲＡＷ２６４．７細胞を指示濃度のｒｍＣＩＲＰとともに２０時間にわたりインキュベートした。馴化培地（ＣＭ）中のＨＭＧＢ１濃度は、ウェスタンブロッティング法により決定した。バンド強度は、デンシトメトリーにより定量した。図４Ｂは、ｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）の投与後の炎症促進性サイトカインであるＨＭＧＢ１の循環中濃度の増加を示している。ｒＣＩＲＰ処置ラットは、疑似群における弱いバンド（２回ずつ）に比して、強度の免疫反応性ＨＭＧＢ１バンド（３回ずつ）を示した。インビトロ作用に加えて、健常ラットへのｒｍＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈内投与は、生理食塩水（ビヒクル）が投与された場合に比して血清中ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＨＭＧＢ１濃度ならびに臓器障害マーカーであるＡＳＴおよびＡＬＴ（図１７Ａ〜Ｃ）を有意に増加させた。４時間後、血液および組織を分析のために収集した。図１７Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定した血清中ＴＮＦ−α濃度およびウェスタンブロッティング法により測定したＨＭＧＢ１濃度を示している。図１７Ｂは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡ各々によって測定された肝臓中のＴＮＦ−α  ｍＲＮＡおよびタンパク質濃度を示している。血清中ＡＳＴおよびＡＬＴをｒｍＣＩＲＰ投与の４時間後に測定し、濃度を図１７Ｃに示した。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝６〜９／群、＊Ｐ  ビヒクル群に比して＜０．０５。
【０１１９】
ＬＰＳ−結合抗生物質であるポリミキシンＢは、ｒｍＣＩＲＰ誘導性ＴＮＦ−α産生を妨害しなかったが、これはｒｍＣＩＲＰ中のＬＰＳ残留物がサイトカイン放出の原因ではなかったが、熱処理はｒｍＣＩＲＰの活性を不活性化することを証明した。これとは対照的に、ポリミキシンＢはＬＰＳ−誘導性ＴＮＦ−α放出を８４％阻害したが、他方熱処理はＬＰＳの活性化をほんのわずかしか低下させなかった（図１０Ｄ）。この実験を実施するために、ｒｍＣＩＲＰ（１．５μｇ／ｍＬ）またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）をポリミキシンＢ（ＰＭＢ、１２０Ｕ／ｍＬ）で処置した、または８時間にわたりＲＡＷ２６４．７細胞に加える前の３０分間にわたり８０℃で加熱した。＊Ｐ  ｒｍＣＩＲＰ群に比して＜０．０５；＃Ｐ  ＬＰＳ群に比して＜０．０５。
【０１２０】
ヒト細胞系における組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）誘導性炎症反応：マウスモデルと同様に、ヒトモデルにおけるｒＣＩＲＰによるＴＮＦ−α放出の刺激について試験した。組換えタンパク質の調製におけるＬＰＳ汚染を回避するために、ヒトＨＥＫ２９３細胞から発現させて精製した組換えヒトＣＩＲＰ（ｒｈＣＩＲＰ）を利用した。ｒｈＣＩＲＰは分化ヒトＴＨＰ−１細胞（図１０Ｅ）ならびに一次ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（図１０Ｆ）由来のＴＮＦ−α放出を用量依存性方法で刺激する際にｒｍＣＩＲＰに匹敵する活性を有していた。これらの実験は、分化ヒトＴＨＰ−１細胞を指示濃度で４時間にわたりｒｈＣＩＲＰまたはｒｍＣＩＲＰとともにインキュベートすることにより実施した。＊Ｐ  ＣＩＲＰなし群に比して＜０．０５。同様に、ヒトＰＢＭＣを８時間にわたり指示濃度のｒｈＣＩＲＰとともにインキュベートした。＊Ｐ  ｒｈＣＩＲＰなし群に比して＜０．０５。そこで、ＣＩＲＰによるサイトカイン放出の刺激はＬＰＳ汚染に帰せることはできなかった。さらに、ＣＩＲＰ誘導性サイトカイン活性化は、齧歯類とヒトの間で保存された。
【０１２１】
ｒＣＩＲＰを用いたマクロファージの刺激後の炎症性サイトカインの放出の増加：平行実験では、ｒＣＩＲＰとともにインキュベートした培養ＲＡＷ細胞の上清中のサイトカインを測定した。組換えＣＩＲＰとともにインキュベートした培養ＲＡＷ細胞の上清中の上昇したＴＮＦ−αおよびＩＬ−６濃度は用量および時間依存性であった。図５Ａに指示したように、１００ｎｇ／ｍＬの用量でのｒＣＩＲＰ（４時間のインキュベーション）はＴＮＦ−α放出を有意に増加させた。時間的経過に関して、１００ｎｇ／ｍＬの用量でのｒＣＩＲＰはインキュベーションの４時間後および２時間後という早期に、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６産生を各々顕著に増加させた（図５Ｃ〜Ｄ）。上清中ＨＭＧＢ１濃度は、ｒＣＩＲＰ刺激に続いて用量依存性方法で増加した。ウェスタンブロット法による定量は、培養ＲＡＷ細胞からのＨＭＧＢ１放出が５００ｎｇ／ｍＬの用量でのｒＣＩＲＰとのインキュベーション２０時間後に約６倍に増加することを証明した（図５Ｂ）。
【０１２２】
実施例５：ＣＩＲＰ欠損性マウスへの外因性組換えＣＩＲＰの投与は炎症反応を誘導する
材料および方法
実験動物：Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドを備えるＣｉｒｐ−／−マウスは日本の熊本大学により提供された（Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｉｒｐ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｖｉａ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１７６３，２９０−２９５（２００６））。Ｒａｇｅ−／−、Ｔｌｒ２−／−およびＴｌｒ４−／−マウスは、Ｄｒ．Ｈｅｌｅｎａ  Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎ−Ｈａｒｒｉｓから入手し、Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈで飼養された（Ｙａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＨＭＧＢ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７，１１９４２−１１９４７（２０１０））。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。実験では雄性の年齢を適応させた（１０〜１２週齢）のマウスを使用した。動物は疑似群、ビヒクルコントロール群または処置群に無作為割り付けした。各群に使用した動物の数は、出血および敗血症の動物モデルに関する以前の刊行物に基づいた。全動物試験は、完全遮蔽法では実施しなかった。動物は、外科手術中に死亡した場合は、分析から除外した。
【０１２３】
ｒＣＩＲＰの投与：追加の正常健常動物群では、ｒＣＩＲＰ、例えばｒｍＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）またはバッファー（同一容積、１ｍＬ）を投与した。処置の完了４時間後、血液サンプルを採取し、凝固させるために氷上に配置し、次に１，２００ｇで１０分間、４℃で遠心し、血清サンプルをアッセイ時まで−８０℃で貯蔵した。さらに組織サンプルも採取し、直ちに液体窒素に曝露させ、次にアッセイ時まで−８０℃で貯蔵した。また別の出血性動物群では、抗ＣＩＲＰ抗体（３ｍｇ／ｋｇ体重）、ウサギＩｇＧまたはビヒクルもしくはバッファー（同一容積、１ｍＬ）を、４５分間にわたり大腿静脈カテーテルを介して急速輸液の開始１５分後に出血したラットに投与した。処置の完了１．５時間後に、血液サンプルを上記と同様に採取した。
【０１２４】
結果
健常ラットにおける組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）誘導性組織損傷：正常動物におけるｒＣＩＲＰの作用を調査するために、細菌発現系から精製した組換えタンパク質であるｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）を正常健常ラットに投与し、ＡＳＴおよびＡＬＴ（肝障害の指標）の血清中濃度を測定した。ｒＣＩＲＰを用いて処置したラットは、ＡＳＴ（図３Ａ）およびＡＬＴ（図３Ｂ）の有意に上昇した濃度を示した。これらの結果は、ｒＣＩＲＰが炎症性組織損傷を直接的に誘発することを示している。
【０１２５】
実施例６：組換えＣＩＲＰは炎症促進性サイトカインＨＭＧＢ１と協調してＴＮＦ−αの放出を刺激する
材料および方法
組換えタンパク質：ｒｍＨＭＧＢ１は以前に記載されたように生成した（Ｙａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｓｅｐｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，２９６−３０１（２００４））。組換えラットＴＮＦ−αは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社から入手した。Ｃ末端ＤＤＫタグを備える組換えヒト（ｒｈ）ＣＩＲＰ（アクセッション番号ＮＰ＿００１２７１；全長）は、ヒトＨＥＫ２９３細胞からトランスフェクトして発現させ、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手した。ｒｈＴＬＲ２（アクセッション番号ＮＰ＿００３２５５；Ｇｌｕ２１−Ｌｅｕ５９０）およびｒｈＴＬＲ４（アクセッション番号Ｏ００２０６；Ｇｌｕ２４−Ｌｙｓ６３１）は、マウス骨髄腫ＮＳ０細胞系からトランスフェクトして発現させた。ｒｈＭＤ２（アクセッション番号ＢＡＡ７８７１７；Ｇｌｕ１７−Ａｓｎ１６０）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から形質転換させて発現させた。ｒｈＴＬＲ４／ＭＤ２複合体は、ＮＳ０細胞である、各タンパク質にＨｉｓタグを備える共発現したｒｈＴＬＲ４（アクセッション番号Ｏ００２０６；Ｇｌｕ２４−Ｌｙｓ６３１）およびｒｈＭＤ２（アクセッション番号Ｑ９Ｙ６Ｙ９；Ｇｌｕ１７−Ａｓｎ１６０）から精製した。ｒｈＴＬＲ２、ｒｈＴＬＲ４およびｒｈＭＤ２全部をそれらのＣ末端で１０−Ｈｉｓタグと融合させ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）から入手した。Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを備えるｒｈＲＡＧＥ（アクセッション番号Ｑ１５１０９；Ａｌａ２３−Ａｌａ３４４）は、ヒトＨＥＫ２９３細胞からトランスフェクトして発現させ、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社（Ｍｉｌｐｉｔａｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手した。
【０１２６】
結果
ＣＩＲＰおよびＨＭＧＢ１がＴＮＦ−α放出の刺激に及ぼす相加作用：ｒｍＣＩＲＰは、マクロファージ中でのＴＮＦ−αおよびＨＭＧＢ１放出を誘導した（図１０ａ、ｂおよびｃ）。ＨＭＧＢ１もまたＴＮＦ−α放出を刺激できると報告された（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＭＧ−１）ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２，５６５−５７０（２０００））。ＴＮＦ−α放出を刺激することにＣＩＲＰおよびＨＭＧＢ１が影響を及ぼす関係は、各中和抗体を適用することにより分析した。ＲＡＷ２６４．７細胞内でのｍＣＩＲＰによるＴＮＦ−α産生を用量依存性方法で効果的に阻害する抗ＣＩＲＰポリクローナル抗体を生成した。図１６Ｃに示したように、ＲＡＷ２６４．７細胞は２０μｇ／ｍＬの抗ＣＩＲＰ抗体またはウサギコントロール（非免疫）ＩｇＧを用いて２０分間プレインキュベートし、その後に指示濃度でｒｍＣＩＲＰを添加した。４時間後に、馴化培地（ＣＭ）中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡによってアッセイした。データは、３回の独立実験からの平均値±標準誤差である。＊Ｐ  ｒｍＣＩＲＰ＋コントロールＩｇＧ群に比してＩｇＧ群に比して０．０５。図１６Ｄでは、ＲＡＷ２６４．７細胞を２０分間にわたり１ｍｇ／ｍＬの指示希釈濃度でウサギコントロールＩｇＧまたは抗ＣＩＲＰ抗体を用いてプレインキュベートし、その後に１．０μｇ／ｍＬのｒｍＣＩＲＰを添加した。４時間後に、ＣＭ中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡによってアッセイした。データは、３回の独立実験からの平均値±標準誤差である。＊Ｐ  ｒｍＣＩＲＰ＋コントロールＩｇＧ群に比して＜０．０５。ＴＨＰ−１細胞は、４μｇ／ｍＬの抗ＣＩＲＰ抗体、抗ＨＭＧＢ１抗体または非免疫コントロールＩｇＧとともに１時間インキュベートし、その後に８時間にわたりｒｍＣＩＲＰ（０．３μｇ／ｍＬ）、ｒｍＨＭＧＢ１（０．３μｇ／ｍＬ）またはｒｍＣＩＲＰ／ｒｍＨＭＧＢ１（０．３μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ）を添加した。＊Ｐ  ｒｍＣＩＲＰ群に比して＜０．０５；＃Ｐ  ｒｍＨＭＧＢ１群に比して＜０．０５。抗ＨＭＧＢ１抗体とのプレインキュベーション（Ｙａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｓｅｐｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１，２９６−３０１（２００４））は、ＴＨＰ−１細胞中でのｒｍＣＩＲＰにより誘導されたＴＮＦ−α放出の３１％減少を生じさせたが（Ｐ＝０．２９２）、他方抗ＣＩＲＰ抗体とのプレインキュベーションは有意な７０％減少を生じさせた（Ｐ＜０．０５、図１０Ｇ）。これとは逆に、抗ＣＩＲＰ抗体とのプレインキュベーションは、ｒｍＨＭＧＢ１により誘導されたＴＮＦ−α放出の１７％減少しか生じさせなかった（Ｐ＝０．１８２、図１０Ｇ）。さらに、ｒｍＣＩＲＰ、ｒｍＨＭＧＢ１およびｒｍＣＩＲＰ＋ｒｍＨＭＧＢ１は、各々０．８、０．６および１．６ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α濃度を誘導した。これらをまとめると、これらの結果は、ＣＩＲＰおよびＨＭＧＢ１がマクロファージからのＴＮＦ−α放出を刺激することに相加的に機能したことを示している。全収集ＣＭ中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡによってアッセイした。データは、３または４回の独立実験からの平均値±標準誤差である。
【０１２７】
実施例７：抗ＣＩＲＰ抗体は動物モデルにおけるＣＩＲＰの生物活性を阻害するために有効である
抗ＣＩＲＰ抗体の投与は、出血の生存率を改善して動物モデルにおける炎症反応を減弱させた。
【０１２８】
材料および方法
抗ＣＩＲＰ抗体産生：ＣＩＲＰに対するポリクローナル抗血清は、標準手順にしたがって、ウサギに精製組換えＣＩＲＰを３週間以上の間隔をあけて注射することによって生成した（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡ）。抗ＣＩＲＰ抗体のＩｇＧは、供給業者の取扱説明書（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）にしたがって固定化免疫精製タンパク質Ａ／Ｇカラムを使用することにより血清から親和性精製した。抗体力価は、９６ウエルフォーマットの直接ＥＬＩＳＡによって（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、Ｄｅｎｖｅｒ，ＰＡに記載されているように）決定した。ＬＰＳは、アメリカカブトガニ溶解物アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）によって測定された精製抗体調製物中では検出できなかった。
【０１２９】
抗ＣＩＲＰポリクローナル抗体の産生：精製ｒｍＣＩＲＰに対する抗体は、Ｃｏｖａｎｃｅ社（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）で標準手順にしたがって、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギにおいて生成した。ＩｇＧ分画は抗血清から固定化免疫精製ＩＡ／Ｇクロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ社）によって単離した。抗ＣＩＲＰ抗体の特異性は、その精製タンパク質に対してウェスタンブロッティング法によって試験した。ＬＰＳは、ＬＡＬアッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ社）によって測定したが抗体調製物中で検出できなかった。同一方法を実施してウサギ血清コントロールＩｇＧを精製した。
【０１３０】
生存率試験：出血したラットに抗ＣＩＲＰ抗体、ウサギコントロールＩｇＧまたは生理食塩水（ビヒクル）を連続３日間にわたり投与し、それらの死亡率を１０日間にわたり監視した。Ｃｉｒｐ−／−および野生型マウスに出血を受けさせ、生存率を７２時間記録した。敗血症性ラットにＣＬＰ５時間後に抗ＣＩＲＰ抗体またはウサギコントロールＩｇＧを投与した。壊死性盲腸をＣＬＰの２０時間後に切除し、死亡率を１０日間監視した。
【０１３１】
顆粒球ミエロペルオキシダーゼの評価：肺および肝組織内での好中球蓄積は、以前に報告されたようにミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性アッセイを使用して推定した（Ｄｗｉｖｅｄｉ  ＡＪ，Ｗｕ  Ｒ，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｅ，Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｓ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｋｒｉｓｈｎａｓａｓｔｒｙ  Ｋ，Ｍａｒｉｎｉ  ＣＰ，Ｒａｖｉｋｕｍａｒ  ＴＳ，Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｇｕｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ  ２０５：２８４−２９３，２００７）。ＭＰＯ活性を決定するために、肝組織は、０．５％のヘキサ−デシル−トリメチル−アンモニウムブロミドを含有する５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で均質化した。遠心分離後、上清を反応溶液（リン酸バッファー中の０．２ｍｇ／ｍＬのＯ−ジアニシジンジヒドロクロライドおよび０．２ｍＭのＨ２Ｏ２）に加え、活性を計算するために４６０ｎｍでのＯＤの時間変化を記録した。
【０１３２】
結果
抗ＣＩＲＰ抗体は出血後の有意な延命効果を提供した：ＣＩＲＰが例えば出血などの様々な課題に対する炎症反応における新規なメディエーターであることをさらに確証するために、出血性ラットにＣＩＲＰに対する特異的抗体（３ｍｇ／ｋｇ体重）を投与した。結果は、ＣＩＲＰ遮断が急性失血において有意な延命効果を提供することを証明した。図６に示したように、抗ＣＩＲＰ抗体処置は実験的に出血させた動物の生存率を４３％から８５％へ増加させた（Ｐ＜０．０５）。
【０１３３】
抗ＣＩＲＰ抗体は出血後に組織損傷を減弱させた：出血に応答したｒＣＩＲＰの病理生理学的結果の調査を継続するために、ＣＩＲＰに対する特異的抗体（３ｍｇ／ｋｇ体重）を出血性ラットに投与した。結果は、出血後のＡＳＴ、ＡＬＴおよび乳酸塩の増加した濃度は抗ＣＩＲＰ抗体により有意に減弱されたことを示している（３０〜４０％の減少、Ｐ＜０．０５）（図７Ａ〜Ｃ）。
【０１３４】
抗ＣＩＲＰ抗体は炎症促進性サイトカインにおける出血誘導性増加を減弱させた：細胞外ＣＩＲＰが出血中の炎症反応を媒介することに果たす役割を調査した。出血したラットは、急速輸液中にウサギコントロール（非免疫）ＩｇＧまたは中和抗ＣＩＲＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈内投与を受けた。４時間後、ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ−αおよびＩＬ−６ならびに血清ＡＳＴ、ＡＬＴおよび肝ＭＰＯ活性を測定するために血清ならびに肝サンプルを採取した。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝６／群、＊Ｐ  疑似群に比して＜０．０５；＃Ｐ  出血単独群に比して＜０．０５である。中和抗ＣＩＲＰ抗体は、非免疫コントロールＩｇＧによっては変化しないままであった（図１１Ａ）。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の血清中および肝臓中濃度を有意に減少させた。ＴＮＦ−α（図８Ａ）およびＩＬ−６（図８Ｄ）の出血誘導性アップレギュレーションは、血清中において有意に低下した。実験的血液枯渇（出血）後の動物の肺および肝臓各々におけるＴＮＦ−α（図８ＢおよびＣ）ならびにＩＬ−６（図８ＥおよびＦ）の組織中濃度においても極めて類似の結果が観察された。好中球蓄積の指標である血清中ＡＳＴおよびＡＬＴならびに肝ミエロペルオキシダーゼ活性は、抗ＣＩＲＰ抗体群では有意に減少した（図１１Ｂ）。出血したラットに抗ＣＩＲＰ抗体（１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、ｎ＝１３）、コントロールＩｇＧ（ｎ＝１３）または生理食塩水（ビヒクル；ｎ＝１４）を連続３日間にわたり静脈内投与し、１０日間にわたり死亡率を監視した。＊Ｐ  食塩水群に比して＜０．０５。抗ＣＩＲＰ抗体群の生存率は、出血１０日後にコントロールＩｇＧ群およびビヒクル群の生存率に比して有意に高かった（８５％対３８％および４３％；図１１Ｃ）。Ｃｉｒｐ−／−マウス（ｎ＝９）および同一遺伝的背景の野生型（ＷＴ）マウス（ｎ＝９）を出血させ、７２時間にわたり観察した。＊Ｐ  ＷＴ群に比して＜０．０５。これらと一致して、Ｃｉｒｐ−／−マウスの生存率は、出血７２時間後に野生型マウスの生存率より有意に高かった（５６％対１１％；図１１Ｄ）。ＷＴおよびＣｉｒｐ−／−マウスを出血させた。４時間後、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−α濃度およびウェスタンブロッティング法によるＨＭＧＢ１濃度を測定するために血清サンプルを採取した。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝６／群、＊Ｐ  ＷＴ疑似群に比して＜０．０５；＃Ｐ  ＷＴ出血群に比して＜０．０５である。出血４時間後の野生型マウスにおける血清ＴＮＦ−αの７．３倍の増加が観察された；そのようなＴＮＦ−α上昇はＣｉｒｐ−／−マウスでは発生しなかった（図１１Ｅ）。類似の現象は血清中ＨＭＧＢ１濃度において観察されたが（図１１Ｆ）、これはＣＩＲＰおよびＨＭＧＢ１の両方がショック後の動物の死亡率に寄与して作用することを示唆している。
【０１３５】
抗ＣＩＲＰ抗体は出血後に増加したＭＰＯ活性を減少させた：ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）は、炎症の一般的指標であると考えられ、増加した組織中ＭＰＯ活性は好中球浸出を反映した。実験的出血は肝臓中のＭＰＯ活性の増加を誘導した。増加したＭＰＯは、抗ＣＩＲＰ抗体の投与後に有意に減少した（図８Ｇ）。
【０１３６】
実施例８：抗ＣＩＲＰ抗体は敗血症性動物における生存率を増加させるために有効である
材料および方法
複数菌性敗血症の動物モデル：動物にイソフルラン吸入により麻酔をかけた。正中開腹術を通して盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）を実施した。手短には、２ｃｍの正中腹壁切開術を実施した。盲腸を露出させ、腸閉塞を回避するために回盲弁のすぐ遠位で結紮し、１８ゲージのニードルを用いて２回穿刺し、少量の糞便を穴に通して流動させるためにわずかに圧搾し、次に腹腔へ戻した。腹部は縫合糸を用いて層状に閉鎖した。疑似手術動物は、盲腸を結紮も穿刺もしなかったことを除き、同一手順を受けさせた。動物には手術直後に３ｍＬ／１００ｇ体重の生理食塩水を皮下に輸液した。
【０１３７】
腹膜マクロファージの細胞培養および単離：マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞およびヒト単球ＴＨＰ−１細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した。一次腹膜マクロファージは以前に記載されたように４％チオグリコール酸塩を腹腔内注射した３日後にＣ５７ＢＬ／６野生型、Ｒａｇｅ−／−、Ｔｌｒ２−／−およびＴｌｒ４−／−マウスから単離した（Ｙａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ＨＭＧＢ１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７，１１９４２−１１９４７（２０１０））。ラット一次腹膜マクロファージは、プレインキュベーションを行わずに雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの腹腔内から直接的に単離した。ＲＡＷ２６４．７細胞および腹膜マクロファージをＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）各々の中で培養した。ＴＨＰ−１細胞は０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールとともにＲＰＭＩ１６４０中で培養し、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（２０ｎｇ／ｍＬ）とともに４８時間インキュベートすることによってマクロファージ様細胞内へ分化させた。全培養培地に１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを補給した。細胞は、５％のＣＯ２を含む３７℃の培養装置内で維持した。
【０１３８】
結果
敗血症性動物中のＣＩＲＰのアップレギュレーションおよび放出：高炎症によって誘発されるまた別の臨床状態である敗血症におけるＣＩＲＰの炎症促進活性を調査した。複数菌性敗血症の確立された動物モデルである、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）を受けたラットにおけるＣＩＲＰ発現について調査した（Ｙａｎｇ，Ｓ．，Ｚｈｏｕ，Ｍ．，Ｃｈａｕｄｒｙ，Ｉ．Ｈ．＆  Ｗａｎｇ，Ｐ．Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｄｙｎａｍｉｃ  ｐｈａｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ：ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２３６，６２５−６３３（２００２）を参照されたい）。２０時間後、血液および肝組織を分析のために収集した。血清中ＣＩＲＰ濃度は、ウェスタンブロッティング法により決定した。バンド強度は、デンシトメトリーにより定量した。ＣＬＰの２０時間後、ＣＩＲＰの血清中濃度は疑似群に比して３．４倍増加した（図１２Ａ）。肝臓中のＣＩＲＰのｍＲＮＡおよびタンパク質濃度をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法およびウェスタンブロッティング法各々によって評価した。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝４〜６／群、＊Ｐ  疑似群に比して＜０．０５である。肝臓中のＣＩＲＰのｍＲＮＡおよびタンパク質濃度もまた、各々２．４および４．０倍増加した（図１２Ｂおよび１２Ｃ）。マクロファージ内のＣＩＲＰの発現および放出にＬＰＳが及ぼす作用を評価した。ラットから単離した腹膜マクロファージを平板培養し、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に曝露させた、または処置しなかった（Ｎｏｎ）。６時間後、マクロファージ中のＣＩＲＰ  ｍＲＮＡ濃度をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＣＩＲＰ発現濃度をＧＡＰＤＨへ正規化した。非処置細胞における数値を比較のために１と指定する。データは、３回の独立実験からの平均値±標準誤差である。＊Ｐ  Ｎｏｎ群に比して＜０．０５。ラット一次腹膜マクロファージ中のＣＩＲＰのｍＲＮＡおよびタンパク質濃度は、ＬＰＳへの各々６および２４時間にわたる曝露後に有意に増加した（図１２Ｄ）。全細胞溶解物および培養培地は、ＬＰＳへの曝露の各々２４時間後および６時間後に採取し、ウェスタンブロッティング法にかけた。データは、３回の独立実験を表す。ＣＩＲＰタンパク質はＬＰＳへの６時間の曝露後にさらにＣＭで検出されたが、非処置細胞からは検出できなかった（図１２Ｅ）。ＣＩＲＰ放出を誘導する他の炎症メディエーターを調査した。ＲＡＷ２６４．７細胞のｒｍＨＭＧＢ１（１μｇ／ｍＬ）またはｒｍＴＮＦ−α（３０ｎｇ／ｍＬ）との２４時間にわたるインキュベーションはＣＭ中へのＣＩＲＰ放出を誘発しなかったが、他方ＣＩＲＰタンパク質はＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）へ曝露した細胞から検出することができた。馴化培地をウェスタンブロッティング法にかけ、データｑは３回の独立実験を表す（図１２Ｆ）。細胞外ＣＩＲＰの有害な活性の妥当性を確認するために、中和抗ＣＩＲＰ抗体を敗血症性動物に投与した。ＣＬＰラットに抗ＣＩＲＰ抗体（１０ｍｇ／ｋ��体重、ｎ＝１８）または非免疫コントロールＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ体重、ｎ＝１８）をＣＬＰの５時間後に投与した。死亡率を１０日間監視した。＊Ｐ  コントロールＩｇＧ群に比して＜０．０５。ＰＳ  レッド、ポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓレッド染色。敗血症性ラットの１０日間の生存率は、抗ＣＩＲＰ抗体を用いた治療後に３９％から７８％へ有意に増加した（図１２Ｇ）。そこで、ＣＩＲＰはさらに敗血症性ショックにおける有害因子でもあった。
【０１３９】
実施例９：ＣＩＲＰはＴＬＲ４／ＭＤ２細胞表面受容体複合体に結合する
材料および方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析：タンパク質−タンパク質およびペプチド−タンパク質相互作用の分析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して実施した。結合反応は、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１×ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中で実施した。ＣＭ５デキストラン・チップ（フローセル−２）は最初に、８９μＬの０．１ＭのＮ−エチル−Ｎ’−［３−ジエチルアミノ−プロピル］−カルボジイミドおよび０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの注射によって活性化した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中に希釈した２００μＬの５μｇ／ｍＬのリガンドのアリコートを固定化のためのＣＭ５チップのフローセル−２内に注入した。次に、１３５μＬの１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．２）を次に残りの活性部位を遮断するために注入した。非特異的結合を評価するために、リガンドを用いたコーティングを施していないフローセル−１をコントロールとして使用した。結合分析は、２５℃で３０μＬ／分の流速で実施した。結合を評価するために、分析物（動態分析のためには６２．５ｎＭ〜１．０μＭの範囲内または合格／不合格結合分析のためには０．５μＭ）をフローセル−１および−２内に注入し、分析物とリガンドの関連を表面プラズモン共鳴法により各々記録した。ブランクチャネル（フローセル−１）からのシグナルをリガンドでコーティングしたチャネル（フローセル−２）から減じた。データは、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウエアによって分析した。全サンプルについて、バッファー単独を用いたブランク注射を結果として生じた反応表面データから減じた。データは、１：１結合についてのＬａｇｍｕｉｒモデルに全体的に当てはめた。
【０１４０】
結果
ＣＩＲＰはＴＬＲ４を通しての炎症反応を誘導した：細胞外ＣＩＲＰシグナル伝達を伝播することの原因となる細胞表面受容体を同定した。炎症を媒介することが公知の３つの主要ＰＲＲ：ＲＡＧＥ、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を試験した（（ａ）Ｚｈａｎｇ，Ｘ．＆  Ｍｏｓｓｅｒ，Ｄ．Ｍ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｄａｎｇｅｒ  ｓｉｇｎａｌｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２１４，１６１−１７８（２００８）；（ｂ）Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．Ａ．ＴＬＲｓ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１３，１３９９−１４０７（２００９）；（ｃ）Ｗａｒｄ，Ｐ．Ａ．Ｔｈｅ  ｓｅｐｓｉｓ  ｓｅｅｓａｗ：ｓｅｅｋｉｎｇ  ａ  ｈｅａｒｔ  ｓａｌｖｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，４９７−４９８（２００９））。ＷＴ、Ｒａｇｅ−／−、Ｔｌｒ２−／−またはＴｌｒ４−／−マウスから単離した腹膜マクロファージを１．５μｇ／ｍＬのｒｍＣＩＲＰと４時間インキュベートした。馴化培地ＣＭ中のＴＮＦ−α濃度をＥＬＩＳＡによってアッセイした。データは、３回の独立実験からの平均値±標準誤差である。＊Ｐ  ＷＴ群に比して＜０．０５。野生型マウスとｒｍＣＩＲＰに反応した各受容体を標的とするノックアウトマウスとを比較すると、ＴＬＲ４−欠損性マクロファージだけがＴＮＦ−α誘導に対する反応を消失したが、ＲＡＧＥ−およびＴＬＲ２−欠損性マクロファージは野生型マクロファージへの類似の反応を維持した（図１３Ａ）。ＣＩＲＰ活性を媒介する際にＴＬＲ４の要件を確証するために、野生型およびＴＬＲ４ノックアウトマウスにｒｍＣＩＲＰ（１または５ｍｇ／ｋｇ体重）または生理食塩水（ビヒクル）を注射した。４時間後、血清サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６およびウェスタンブロッティング法によるＨＭＧＢ１ならびに血清中ＡＳＴおよびＡＬＴについてアッセイした。データは、平均値±標準誤差、ｎ＝６〜９／群、＊Ｐ  ＷＴ  ｒｍＣＩＲＰなし群に比して＜０．０５；＃Ｐ  ５ｍｇ／ｋｇでｒｍＣＩＲＰを用いたＷＴ群に比して＜０．０５である。ラットに類似して、野生型マウスは血清中炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＨＭＧＢ１）ならびに臓器障害マーカー（ＡＳＴおよびＡＬＴ）の増加をｒｍＣＩＲＰ注射へ用量依存性方法で示した（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。これとは対照的に、ｒｍＣＩＲＰが野生型マウスに及ぼすこれらの有害な作用がＴｌｒ４−／−マウスでは減少した。
【０１４１】
ＣＩＲＰはＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に直接的に結合した：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を利用して、ｒｈＣＩＲＰおよびパターン認識受容体およびＭＤ２の間の物理的相互作用および結合親和性を決定した。ＴＬＲ４は、頻回にコ受容体としてＭＤ２に付随してＴＬＲ４／ＭＤ２複合体を形成する（Ｎａｇａｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＭＤ−２  ｉｎ  ＬＰＳ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ＴＬＲ４  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，６６７−６７２（２００２））。全組換えタンパク質はＳＰＲ分析のためにヒトコーディング配列から引き出した。見かけのＫＤは、一連の濃度の分析物を用いた動態分析によって決定した。ｒｈＣＩＲＰは、ｒｈＴＬＲ４、ｒｈＭＤ２およびｒｈＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に、各々６．１７×１０−７、３．０２×１０−７および２．３９×１０−７Ｍの見かけのＫＤで結合した（図１３ｄおよび図１８）。分析物分析の代表的なセンサーグラムは、２〜３回の独立実験から図１８に示した。センサーグラムは、各図の上部に分析物／リガンドとして示した、センサーチップ上に固定化されたリガンドへ通過した指示濃度での分析物の会合および解離を示している。ｒｈＭＤ２のｒｈＴＬＲ４への結合は、陽性コントロールとして試験し、５．３７×１０−８Ｍの見かけのＫＤを入手したが、これは以前に報告された６．２９×１０−８ＭのＫＤと極めて近い（Ｈｙａｋｕｓｈｉｍａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ＴＬＲ４  ｄｏｍａｉｎ  ｗｉｔｈ  ＭＤ−２  ｅｎａｂｌｅｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ＴＬＲ４−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３，６９４９−６９５４（２００４））。興味深いことに、ｒｈＣＩＲＰはＲＡＧＥおよびＴＬＲ２とともにｎＭ範囲内のＫＤを有する（図１３Ｄおよび１８）；しかし、これらの所見の生物学的有意性は未だ決定されていない。これらのＳＰＲの結果は、ＣＩＲＰがシャペロンタンパク質としてのその特性に適合する様々なタイプのタンパク質と相互作用できることを明白に指示した。ＭＤ２に結合するＣＩＲＰの領域は、全ヒトＣＩＲＰ配列をカバーする３２オリゴペプチド（１５マー）の合成によって決定した。オリゴペプチドはＢＩＡｃｏｒｅ機器上に固定化されたｒｈＭＤ２を通過させられ、その後に一連のＳＰＲ分析が実施された。高結合親和性を備える３つのオリゴペプチドを指示した。各図の上部に分析物／ｒｈＭＤ２として示した、センサーチップ上に固定化されたｒｈＭＤ２に通過した指示濃度での分析物の会合および解離を示しているオリゴペプチド分析の２回の独立実験からの代表的なセンサーグラムは、図１９に示した。３つのオリゴペプチド、ａａ１０１〜１１５、１０６〜１２０（Ｃ２２）および１１１〜１２５（Ｃ２３）は、ｒｈＭＤ２に高親和性で結合した（図１４および図１９）。
【０１４２】
実施例１０：オリゴペプチドＣ２２およびＣ２３は細胞系におけるＴＮＦ−αのｒｍＣＩＲＰ誘導性産生を阻害する
材料および方法
オリゴペプチドの合成：一団の３２個の１５マーオリゴペプチドを合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）での高性能液体クロマトグラフィーによって精製した。各１５マーオリゴペプチド配列（配列番号１３〜４４）はｈＣＩＲＰに由来する（図１）。
【０１４３】
細胞培養：ヒト単球ＴＨＰ−１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を懸濁液中でＴ７５組織培養フラスコ内に１．５×１０６ｃｅｌｌｓの密度で播種し、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿培養装置内で１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンおよび追加の０．０５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地とともに培養した。
【０１４４】
細胞の分化および処置：細胞を９６ウエル組織培養皿に１ウエル当たり５×１０４の密度で平板培養し、４８時間にわたりホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（２０ｎｇ／ｍＬ）とともにインキュベートすると、実験前に分化マクロファージ様細胞になった。細胞は第５〜１２継代の間で使用した。細胞を指示濃度のＣＩＲＰ由来ペプチドＣ２２（配列番号１３）またはＣ２３（配列番号１２）を用いて１時間にわたり前処置し、次にｒｍＣＩＲＰまたはＬＰＳ（大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来、Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の非存在下または存在下でＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地とともに６時間にわたりインキュベートした。無細胞上清をＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−αについてアッセイした。
【０１４５】
サイトカインアッセイ：上清は、市販で入手可能な酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）キット−ヒトＴＮＦ−αセット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用してＴＮＦ−α濃度について測定した。
【０１４６】
結果
Ｃ２２およびＣ２３が分化ＴＨＰ−１細胞内のｒｍＣＩＲＰ誘導性ＴＮＦ−α産生に及ぼす作用：図２０Ａに示したように、ＣＩＲＰ−ペプチド単独ではＴＮＦ−α産生、培地に類似する検出可能な量に影響を及ぼさなかった。しかし、用量５０ｎｇ／ｍＬでのＣ２２（配列番号１３）またはＣ２３（配列番号１４）を用いた前処置は、ｒｍＣＩＲＰ  ３００ｎｇ／ｍＬ誘導性ＴＮＦ−α産生を有意に減弱させた。阻害濃度は６７〜７２％の範囲に及ぶ。２つの分子間のサイズの差を考慮に入れるために、分子濃度に変換した場合はｒｍＣＩＲＰより２倍高い用量のペプチドを使用した。
【０１４７】
Ｃ２２およびＣ２３が分化ＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生に及ぼす作用：ＣＩＲＰ由来ペプチドもまた分化ＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α放出を調節することが見いだされた。図２０Ｂに示したように、Ｃ２２（配列番号１３）またはＣ２３（配列番号１４）はＬＰＳ誘導性ＴＮＦ放出を６１〜６３％抑制した。細胞を処置するために、１．３ｐｍｏｌ／ｍＬに等価の２ｎｇ／ｍＬでのＣ２２またはＣ２３および０．６７ｐｍｏｌ／ｍＬに等価の１０ｎｇ／ｍＬでのＬＰＳの用量、２：１にあるペプチドおよびＬＰＳモル比を使用した。
【０１４８】
実施例１１：オリゴペプチドＣ１〜Ｃ２１およびＣ２４〜Ｃ３２は細胞系におけるＴＮＦ−αのｒＣＩＲＰ誘導性産生に阻害作用をほとんどまたは全く示さない
以下の結果は、ペプチドＣ２２およびＣ２３がＴＮＦ−αのｒＣＩＲＰ誘導性分泌に及ぼす驚くべき阻害作用を証明している。
【０１４９】
材料および方法
オリゴペプチドＣ１〜Ｃ２１およびＣ２４〜Ｃ３２の合成についての実験プロトコル、ＴＨＰ−１細胞を使用する細胞培養、細胞の処置ならびにサイトカインアッセイは実施例１０に記載した。細胞は、刺激のためにＣＩＲＰ（１０００ｎｇ／ｍＬ）を用いて処置した。ペプチドは刺激前の１時間にわたり１０×モル濃度のＣＩＲＰとともにインキュベートした。ＴＮＦ−α濃度は、刺激４時間後にＥＬＩＳＡにより細胞培地中でアッセイした。
【０１５０】
下記のペプチドは、分化ＴＨＰ−１細胞中のｒｍＣＩＲＰ誘導性ＴＮＦ−α産生に及ぼすそれらの阻害活性についてアッセイした：
Ｃ１：ＭＡＳＤＥＧＫＬＦＶＧＧＬＳＦ（配列番号１５）；
Ｃ２：ＧＫＬＦＶＧＧＬＳＦＤＴＮＥＱ（配列番号１６）；
Ｃ３：ＧＧＬＳＦＤＴＮＥＱＳＬＥＱＶ（配列番号１７）；
Ｃ４：ＤＴＮＥＱＳＬＥＱＶＦＳＫＹＧ（配列番号１８）；
Ｃ５：ＳＬＥＱＶＦＳＫＹＧＱＩＳＥＶ（配列番号１９）；
Ｃ６：ＦＳＫＹＧＱＩＳＥＶＶＶＶＫＤ（配列番号２０）；
Ｃ７：ＱＩＳＥＶＶＶＶＫＤＲＥＴＱＲ（配列番号２１）；
Ｃ８：ＶＶＶＫＤＲＥＴＱＲＳＲＧＦＧＦ（配列番号２２）；
Ｃ９：ＲＥＴＱＲＳＲＧＦＧＦＶＴＦＥ（配列番号２３）；
Ｃ１０：ＳＲＧＦＧＦＶＴＦＥＮＩＤＤＡ（配列番号２４）；
Ｃ１１：ＦＶＴＦＥＮＩＤＤＡＫＤＡＭＭ（配列番号２５）；
Ｃ１２：ＮＩＤＤＡＫＤＡＭＭＡＭＮＧＫ（配列番号２６）；
Ｃ１３：ＫＤＡＭＭＡＭＮＧＫＳＶＤＧＲ（配列番号２７）；
Ｃ１４：ＡＭＮＧＫＳＶＤＧＲＱＩＲＶＤ（配列番号２８）；
Ｃ１５：ＳＶＤＧＲＱＩＲＶＤＱＡＧＫＳ（配列番号２９）；
Ｃ１６：ＱＩＲＶＤＱＡＧＫＳＳＤＮＲＳ（配列番号３０）；
Ｃ１７：ＱＡＧＫＳＳＤＮＲＳＲＧＹＲＧ（配列番号３１）；
Ｃ１８：ＳＤＮＲＳＲＧＹＲＧＧＳＡＧＧ（配列番号３２）；
Ｃ１９：ＲＧＹＲＧＧＳＡＧＧＲＧＦＦＲ（配列番号３３）；
Ｃ２０：ＧＳＡＧＧＲＧＦＦＲＧＧＲＧＲ（配列番号３４）；
Ｃ２１：ＲＧＦＦＲＧＧＲＧＲＧＲＧＦＳ（配列番号３５）；
Ｃ２２：ＧＧＲＧＲＧＲＧＦＳＲＧＧＧＤ（配列番号１３）；
Ｃ２３：ＧＲＧＦＳＲＧＧＧＤＲＧＹＧＧ（配列番号１４）；
Ｃ２４：ＲＧＧＧＤＲＧＹＧＧＮＲＦＥＳ（配列番号３６）；
Ｃ２５：ＲＧＹＧＧＮＲＦＥＳＲＳＧＧＹ（配列番号３７）；
Ｃ２６：ＮＲＦＥＳＲＳＧＧＹＧＧＳＲＤ（配列番号３８）；
Ｃ２７：ＲＳＧＧＹＧＧＳＲＤＹＹＳＳＲ（配列番号３９）；
Ｃ２８：ＧＧＳＲＤＹＹＳＳＲＳＱＳＧＧ（配列番号４０）；
Ｃ２９：ＹＹＳＳＲＳＱＳＧＧＹＳＤＲＳ（配列番号４１）；
Ｃ３０：ＳＱＳＧＧＹＳＤＲＳＳＧＧＳＹ（配列番号４２）；
Ｃ３１：ＹＳＤＲＳＳＧＧＳＹＲＤＳＹＤ（配列番号４３）；
Ｃ３２：ＳＧＧＳＹＲＤＳＹＤＳＹＡＴＨ（配列番号４４）。
【０１５１】
ＣＩＲＰ由来ペプチドＣ１〜Ｃ２１およびＣ２４〜Ｃ３２が分化ＴＨＰ−１細胞におけるｒｍＣＩＲＰ誘導性ＴＮＦ−α産生に及ぼす作用：図２２に示したように、ＣＩＲＰ由来ペプチドＣ１〜Ｃ２１およびＣ２４〜Ｃ３２は、ＴＨＰ−１細胞によるｒｍＣＩＲＰ誘導性ＴＮＦ−α分泌を有意には減弱させなかった。
【０１５２】
Ｃ２１が分化ＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α産生に及ぼす作用：ＣＩＲＰ由来ペプチドＣ２２およびＣ２３は、実施例１０において証明し、図２０Ｂに例示したように、分化したＴＨＰ−１細胞中でのＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α放出を阻害する。しかし図２０Ｃに示したように、ペプチドＣ２１は、ＴＨＰ−１細胞中でのＬＰＳ誘導性ＴＮＦ−α放出を抑制しない。
【０１５３】
実施例１２：ＣＩＲＰ−ヌルマウスは野生型マウスより迅速な創傷閉鎖率を有する
創傷治癒におけるＣＩＲＰの改善を同定するために、皮膚創傷の動物モデルを使用して野生型（ＷＴ）とＣＩＲＰ−ヌルマウスとの間の創傷閉鎖率を比較した。詳細な手順および測定は以下のとおりであった。全層２．０ｃｍ径の円形切開創を外科的に、３月齢の雄性ＣＩＲＰ−ヌルおよびＷＴマウス両方の背部上に作製した。創傷のサイズを創傷作製後第１４日まで測定し、ＮＩＨ画像ソフトウエアによって定量した。また別の２組の動物に第３および第７日に麻酔をかけ、全層皮膚サンプルを組織学的評価およびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる様々な遺伝子の発現の測定のために採取した。
【０１５４】
図２１に示したように、ＣＩＲＰ−ヌルマウスにおける皮膚創傷の治癒率は、１４日間の時間経過にわたってＷＴマウスにおけるより有意に迅速であった。
【０１５５】
Ｈ＆Ｅおよびマッソン・トリクロム（Ｍａｓｓｏｎ−Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色は、ＣＩＲＰ−ヌル創傷がＷＴ創傷よりも良好な品質の創傷閉鎖およびコラーゲン沈着を有することを示した。早期創傷治癒では、ＣＩＲＰ−ヌル創傷における細胞増殖マーカーＫｉ６７を用いて染色が陽性の細胞数はＷＴにおけるより数が多かった。ＣＩＲＰ−ヌル創傷内の炎症メディエーターＴＮＦ−αおよびＩＬ−６は、第３日のＷＴ創傷におけるより、各々、２．６倍および２．８倍高かったが、ＣＩＲＰ−ヌル創傷におけるそれらの濃度は第７日にはＷＴ創傷におけるより各々６０％および６８％低くなった。これに対応して、好中球浸潤を指示しているミエロペルオキシダーゼ染色に対して陽性である細胞数は、ＷＴ創傷におけるよりＣＩＲＰ−ヌルにおける方が高かった。第３日および第７日でのＣＩＲＰ−ヌルとＷＴ創傷との間のＶＥＧＦ発現およびＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１染色における差は見られなかった。ＣＩＲＰ−ヌル創傷におけるＭＭＰ−９  ｍＲＮＡ濃度は第３日にはＷＴ創傷より２．２倍高かった。
【０１５６】
これらの結果は、ＣＩＲＰ−ヌルマウスが皮膚創傷のより迅速な治癒を示したことを示している。この加速された治癒には細胞増殖の促進、炎症のより早期の活性化および寛解ならびに基質リモデリングの加速と結び付いていた。これらの結果は、ＣＩＲＰ発現が治癒過程を妨害する可能性があること、皮膚創傷の状況におけるＣＩＲＰの阻害が創傷閉鎖および治癒の速度および質を改善するであろうことを示している。
【０１５７】
実施例１３：オリゴペプチドＣ２３はインビボおよびインビトロで内皮細胞のＣＩＲＰ誘導性活性化を無効化する
オリゴペプチドＣ２３は、ＴＬＲ４共受容体ＭＤ２に対する最高親和性を備えるオリゴペプチドであると同定された（選択された断片のＫＤについての匹敵するデータを列挙している図１４を参照されたい）。
【０１５８】
下記に記載した実験では、Ｃ２３は、ｒｍＣＩＲＰを用いて刺激したマウス胚血管内皮細胞（ＭＬＶＥＣｓ）中でＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）の発現の誘導ならびにＭＬＶＥＣからの炎症促進性サイトカインであるＩＬ−１βの放出の防止を妨害することが証明された。
【０１５９】
図２３Ａは、ＩＣＡＭ−１の発現濃度を証明しているＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットの写真である。ＭＬＶＥＣは、４時間にわたりＣ２３または非特異的オリゴペプチドＰ５（陰性コントロール）の存在下でｒｍＣＩＲＰにより処置した。細胞を収穫し、溶解させ、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびウェスタンブロッティング法により分析した（免疫検出）。図２３Ａを参照すると、ＩＣＡＭ−１発現は、２００ｎｇ／ｍＬのオリゴペプチドＣ２３の存在下では無効にされる。
【０１６０】
同様に、ｒｍＣＩＲＰにより刺激されたＭＬＶＥＣによるＩＬ−１βの放出は、図２３Ｂに示したように、２００ｎｇ／ｍＬのオリゴペプチドＣ２３が培地に加えられると（ＥＬＩＳＡによって決定されたように）遮断された（図２３Ａおよび２３Ｂについて：平均値±ＳＤ、ｎ＝３、＊Ｐ  Ｃ２３なし群に比して＜０．０５）。
【０１６１】
また別の実験では、オリゴペプチドＣ２３は、肺内での内皮細胞活性化マーカーおよび炎症促進性サイトカインの盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）誘導性発現を減少させることが証明された。ＣＬＰを受けたマウスを２時間後にオリゴペプチドＣ２３（８ｍｇ／ｋｇ）または食塩水で処置した。肺における内皮細胞活性化マーカーであるＥ−セレクチンおよびＩＣＡＭ−１ならびに同様に肺における炎症促進性サイトカインであるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの発現における有意な増加はＣＬＰ２４時間後に観察された。結果は下記の図２４Ａおよび図２４Ｂに示した。これらの結果は、Ｃ２３がＣＩＲＰ活性を遮断できることを示している。
【０１６２】
最後に、図２３Ｃに示したように、Ｃ２３で処置したマウスはさらに、敗血症の重症度および予後の指標であるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の低い血清中濃度を有していた。肺内だけではなく全身性でもＣＩＲＰの有害な作用のＣ２３抑制は、Ｃ２３が内皮細胞損傷の減弱を介して敗血症に対する新規な治療に開発される可能性を有することを示唆している。
【０１６３】
図２３Ａ〜２３Ｃでは：平均値±ＳＤ；ｎ＝４〜８／群；＊Ｐ  疑似群に比して＜０．０５、＃Ｐ  ビヒクル群に比して＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡ。ｍＲＮＡ量はｑＰＣＲによって測定する；タンパク質濃度はＥＬＩＳＡによって測定する。
【０１６４】
実施例１４：オリゴペプチドＣ２３を用いた処置は敗血症性マウスの生存期間を延長する
下記の実験は、オリゴペプチドＣ２３の全体的な有益な作用を証明している敗血症性マウスの生存試験の結果を提供している。
【０１６５】
マウスにＣＬＰを受けさせ、抗生物質イミペネム（０．５μｇ／ｋｇ体重）および蘇生液を用いて手術直後に処置した。ＣＬＰの２時間後、マウスにＣ２３（８ｍｇ／ｋｇ体重）または等量の生理食塩水（ビヒクル）を内頸静脈を介して投与した。次に１２時間毎に生存率を評価した。この重症敗血症モデルにおいて、全ビヒクル群マウスはＣＬＰ後４８時間以内に死亡したが、Ｃ２３処置マウス群の一部はより長く生存した（図２５Ａ、対数順位検定を使用してカプラン・マイヤー推定量により生存率を分析すると、Ｐ＜０．０５であった）。平均生存時間は、ビヒクル群では３７．８時間およびＣ２３処置マウス群では４４．２時間であった（図２５Ｂ、各群について個々の生存時間および平均生存時間（水平線））。これらの結果は、Ｃ２３が有益であり、重症敗血症性マウスの生存時間を延長することを示している。
【０１６６】
本発明を典型的な実施例を参照しながら詳細に示して記載してきたが、当業者であれば、形態および詳細には添付の特許請求項に含まれる本発明の範囲から逸脱せずにその中で様々な変更を加えられてよいことを理解するであろう。
【０１６７】
本明細書で言及した全ての参考文献は、これにより参照して本明細書に組み込まれる。
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１２）のアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩；または
配列番号１２と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む単離ペプチドであって、
前記ペプチドの長さは１０〜３０アミノ酸残基であるペプチド。
［２］前記ペプチドは、ＣＩＲＰの１つ以上の生物活性を阻害する、［１］に記載のペプチド。
［３］前記ペプチドは、ＭＤ２細胞表面受容体に結合するＣＩＲＰを阻害する、［１］または［２］に記載のペプチド。
［４］前記ペプチドは、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に結合するＣＩＲＰを阻害する、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のペプチド。
［５］前記ペプチドの長さは１０〜２０アミノ酸残基である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のペプチド。
［６］前記ペプチドは、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１３）のアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のペプチド。
［７］前記ペプチドは、
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１３）のアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩からなる、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のペプチド。
［８］前記ペプチドは、
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）のアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のペプチド。
［９］前記ペプチドは、
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１４）のアミノ酸残基配列もしくはその医薬上許容される塩からなる、［１］〜［５］または［８］のいずれか一項に記載のペプチド。
［１０］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチド；および
医薬上許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物。
［１１］炎症状態に罹患している被験者を治療する方法であって、それを必要とする前記被験者に有効量の［１］〜［９］のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドを投与する工程を含む方法。
［１２］前記炎症性状態は、急性炎症性状態である、［１１］に記載の方法。
［１３］前記炎症性状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、喉頭蓋炎、アカラシア（無弛緩症）、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血−再潅流障害、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、腐敗症、内毒素性ショック、悪液質、異常高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、肺炎、珪性肺塵、肺胞炎、気管支梢炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈洞炎、インフルエンザ、ＲＳウイルス感染症、ヘルペス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心嚢炎、心筋炎、虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、セリアック病、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、髄膜炎、脳炎、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、ページェット病、痛風、歯周病、関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、ベルガ−病、ライター症候群、ホジキン病、乾癬、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎、出血性ショックおよび外傷性出血からなる群から選択される、［１１］に記載の方法。
［１４］前記炎症性状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、肝炎、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器壊死、枯草熱、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、腐敗症、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、セリアック病、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、関節炎、全身性エリテマトーデス、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病、脊髄損傷、麻痺、乾癬、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳および四肢の虚血−再潅流、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎および外傷性出血からなる群から選択される、［１３］に記載の方法。
［１５］前記炎症性状態は、腹膜炎、膵炎、敗血症、敗血症−敗血症性ショック、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、イレウス、成人呼吸窮迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳および四肢の虚血−再潅流、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性腸炎、喘息および外傷性出血からなる群から選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］前記炎症性状態は、外傷性出血、敗血症−敗血症性ショック、腸、肝臓、腎臓、心臓、脳および四肢の虚血−再潅流、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患および壊死性腸炎からなる群から選択される、［１５］に記載の方法。
［１７］前記炎症性状態は、出血性ショックおよび敗血症性ショックからなる群から選択される、［１１］に記載の方法。
［１８］前記被験者はヒトである、［１１］〜［１７］のいずれか一項に記載の方法。
［１９］前記少なくとも１つのペプチドは、炎症促進性サイトカインの放出を阻害する、［１１］〜［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２０］前記少なくとも１つのペプチドは、ＴＮＦ−αの放出を阻害する、［１１］〜［１８］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］ＣＩＲＰの１つ以上の生物活性を阻害する方法であって：
ＣＩＲＰを［１］〜［９］のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドと接触させる工程を含む方法。
［２２］ＣＩＲＰの前記生物活性は、ＣＩＲＰ媒介性シグナル伝達である、［２１］に記載の方法。
［２３］ＣＩＲＰの前記生物活性は、ＣＩＲＰ媒介性炎症である、［２１］または［２２］に記載の方法。
［２４］ＣＩＲＰの前記生物活性は、炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介性放出である、［２１］〜［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］ＣＩＲＰの前記生物活性は、ＴＮＦ−αのＣＩＲＰ媒介性放出である、［２１］〜［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］皮膚創傷に罹患している被験者を治療する方法であって：
それを必要とする前記被験者に有効量の［１］〜［９］のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドを投与する工程を含む方法。
［２７］前記皮膚創傷は、慢性皮膚創傷である、［２６］に記載の方法。
［２８］前記皮膚創傷は、糖尿病性潰瘍である、［２６］に記載の方法。
［２９］前記皮膚創傷は、褥瘡である、［２６］に記載の方法。
【図１】
0006615100.tif 000003
【図２】
0006615100.tif 000004
【図３】
0006615100.tif 000005
【図４】
0006615100.tif 000006
【図５】
0006615100.tif 000007
【図６】
0006615100.tif 000008
【図７】
0006615100.tif 000009
【図８】
0006615100.tif 000010
【図９】
0006615100.tif 000011
【図１０】
0006615100.tif 000012
【図１１】
0006615100.tif 000013
【図１２】
0006615100.tif 000014
【図１３】
0006615100.tif 000015
【図１４】
0006615100.tif 000016
【図１５】
0006615100.tif 000017
【図１６】
0006615100.tif 000018
【図１７】
0006615100.tif 000019
【図１８】
0006615100.tif 000020
【図１９】
0006615100.tif 000021
【図２０】
0006615100.tif 000022
【図２１】
0006615100.tif 000023
【図２２】
0006615100.tif 000024
【図２３】
0006615100.tif 000025
【図２４】
0006615100.tif 000026
【図２５】
0006615100.tif 000027
【配列表】
0006615100000001.app