(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
A-443654およびGSK690693からなる群より選択されるATP競合性Akt阻害剤の治療有効量を含む、脂漏性角化症治療組成物。
【請求項２】
局所投与または全身投与のために製剤化される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
ATP競合性Akt阻害剤の治療有効量が正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
A-443654およびGSK690693からなる群より選択されるATP競合性Akt阻害剤の有効量を含む、脂漏性角化症細胞におけるアポトーシス誘導組成物。
【請求項６】
ATP競合性Akt阻害剤の有効量が正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、2012年4月26日に出願された米国特許仮出願第61/638,684号の恩典を主張するものであり、この出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトの皮膚は、環境ストレスの猛攻に絶えずさらされており、そのうち最も重大なのは紫外線(UV)である1-3。UV放射線への慢性曝露は、細胞の酸化的過負荷および修復不可能なDNA損傷につながり、その結果、表皮細胞における代謝の変化および多数のゲノム異常をもたらす。これらのプロセスの生物学的結果は、加齢を加速させ、かつ良性のみならず悪性の腫瘍形成をも加速させる4。悪性への転換は、癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子のゲノム変化が蓄積した結果であることが広く認められているものの、良性腫瘍におけるエソロジー(ethology)および遺伝的変化についてはほとんど知られていない。
【０００３】
臨床および実験のいずれの状況においても、良性腫瘍の大多数は、よく理解されていない理由により悪性に進行することがない。皮膚は、熱心に研究されている自己複製上皮組織のモデルを提供し、ここでは別個の幹細胞集団が異なる挙動の腫瘍を生じさせる。これらの中でも、皮膚の扁平上皮細胞癌は最も頻度の高いヒト癌の一つである。悪性腫瘍のほかに、ケラチノサイト亜集団は、脂漏性角化症(SK)のような良性の皮膚腫瘍を生じさせることがある。これらは、ヒト集団の大多数が加齢に伴って発症するきわめて一般的な病変である。共通する組織学的特徴は、さまざまな程度の色素沈着を伴う表皮肥厚、乳頭腫症および過角化である。SKは尋常性疣贅(common wart)と臨床的類似性を有する。ヒトパピローマウイルス(HPV)がこれらの病変の起源に関与してきたが、最近の分析では、一般的に、このウイルスの役割はほとんどの場合考慮に入れない。患者はしばしば複数のSKを有することがあり、家族単位でこうした病変を多数（＞50個）発症している個人が記載されている。さらに、SKは起源がクローン性であるようであり、それらは反応性表皮過形成に起因するのではなく、体細胞変異した細胞のクローン増殖から生じることが示されている。実際、最近の研究は、散発性SKの大部分において特定の膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である線維芽細胞増殖因子受容体-3(FGFR3)の活性化突然変異の存在を示している。原因であるFGFR3突然変異の役割は、該受容体の活性化形態のケラチノサイト特異的発現を有するトランスジェニックマウスがSKに組織学的に類似する皮膚病変を生じるという事実によって示唆される。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で提供される方法およびアッセイは、一部には、脂漏性角化症細胞を単離してエクスビボで培養するための新規な方法の発見に基づいており、これは、培養下でのこれらの細胞の研究を可能にする技術である。この発見以前には、初代脂漏性角化症細胞を培養するためのこのような方法は当技術分野において利用可能ではなかった。また、本明細書では、培養した脂漏性角化症細胞を用いるスクリーニングアッセイ、および対象において脂漏性角化症を治療するための方法が提供される。
【０００５】
本明細書では、一局面において、対象において脂漏性角化症を治療するための方法が提供され、この方法は、脂漏性角化症を有する対象にAktシグナル伝達経路を阻害する組成物の治療有効量を投与する段階を含む。
【０００６】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の一態様では、前記組成物は局所的に適用されるか、または全身的に投与される。
【０００７】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記方法はさらに、対象を脂漏性角化症と診断する段階を含む。
【０００８】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記組成物の治療有効量は、正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない。
【０００９】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記組成物は小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子を含む。
【００１０】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記組成物はAkt-1および/またはAkt-2阻害剤(例えば、C8)である。
【００１１】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００１２】
本明細書で提供される別の局面は、脂漏性角化症細胞においてアポトーシスを誘導するための方法に関し、この方法は、脂漏性角化症細胞を、Aktシグナル伝達を阻害する組成物の有効量と接触させ、それによって、該細胞においてアポトーシスを誘導する段階を含む。
【００１３】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の一態様では、前記組成物の有効量は、正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない。
【００１４】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記組成物は小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子を含む。
【００１５】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記組成物はAkt-1および/もしくはAkt-2阻害剤、ならびに/またはpan-Akt阻害剤である。
【００１６】
本明細書で提供される別の局面は、脂漏性角化症細胞をエクスビボで培養するための方法に関し、この方法は、(a)対象から得られた脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを、ディスパーゼ酵素を含む溶液と、生物学的サンプルからの脂漏性角化症細胞の解離を開始させるのに十分な温度および時間で接触させる段階、ならびに(b)解離した脂漏性角化症細胞を培養する段階、を含む。
【００１７】
この局面の一態様では、前記方法は脂漏性角化症細胞をエクスビボで培養する段階を含み、この方法は、(a)対象から得られた脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを、最初はディスパーゼ酵素を、その後はトリプシン酵素を含む溶液と、生物学的サンプルから脂漏性角化症細胞を解離させるのに十分な温度および時間で接触させる段階、ならびに(b)解離した脂漏性角化症細胞を培養する段階、を含む。
【００１８】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の一態様では、前記温度は21℃の標準室温を下回る。
【００１９】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、脂漏性角化症細胞の消化を開始させるのに十分な時間は、少なくとも15時間である。別の態様では、脂漏性角化症細胞のディスパーゼによる消化を開始させるのに十分な時間は、少なくとも15時間である。
【００２０】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記方法はさらに、脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを追加のプロテアーゼと接触させる段階を含む。
【００２１】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、追加のプロテアーゼはトリプシンである。
【００２２】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記方法はさらに、段階(b)の培養の前に、培地を添加して、前記解離した細胞からより大きな小片をろ過する段階を含む。
【００２３】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、前記解離した細胞は、コーティングしたプレート上で培養される。
【００２４】
また、本明細書では、本明細書に記載の方法を用いて得られる培養した脂漏性角化症細胞を含むスクリーニングアッセイが提供される。
【００２５】
また、本明細書では、アポトーシスを誘導するための候補薬剤をスクリーニングするための方法が提供され、この方法は、(a)脂漏性角化症細胞または脂漏性角化症細胞の集団を候補薬剤と接触させる段階、および(b)該細胞または細胞の集団におけるアポトーシスを測定する段階、を含み、ここで、該細胞または細胞の集団におけるアポトーシスの増加によって、該候補薬剤がアポトーシスを誘導することが示される。
【００２６】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の一態様では、候補薬剤はAktシグナル伝達経路の阻害剤を含む。
【００２７】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、脂漏性角化症細胞または脂漏性角化症細胞の集団は、本明細書に記載の方法を用いて培養される。
【００２８】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、アポトーシスは、スルホローダミンB(SRB)アッセイ、MTTテトラゾリウム色素、TUNEL染色、アネキシンV染色、ヨウ化プロピジウム染色、DNAラダリング、PARP切断、カスパーゼ活性化、ならびに/または細胞および核の形態の評価を用いて測定される。
【００２９】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の別の態様では、候補薬剤は小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子である。
【００３０】
また、本明細書では、以下の段階を含むアッセイが提供される：(a)解離した脂漏性角化症細胞の集団を候補薬剤と接触させる段階、(b)段階(a)の細胞を、アポトーシスタンパク質に特異的な検出可能抗体と接触させる段階、(c)結合した検出可能抗体からのシグナルの強度を測定する段階、(d)測定されたシグナル強度を基準値と比較する段階、および測定された強度が基準値と比べて増加している場合は、(e)該候補薬剤を該細胞におけるアポトーシスの誘導物質として同定する段階。
【００３１】
この局面および本明細書に記載の他のすべての局面の一態様では、候補薬剤はAktシグナル伝達経路の阻害剤(例えば、Akt-1および/もしくはAkt-2阻害剤、ならびに/またはpan-Akt阻害剤)を含む。
[本発明1001]
脂漏性角化症を有する対象に、Aktシグナル伝達経路を阻害する組成物の治療有効量を投与する段階を含む、対象において脂漏性角化症を治療するための方法。
[本発明1002]
前記組成物が局所的に適用されるか、または全身的に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
対象を脂漏性角化症と診断する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記組成物の治療有効量が正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記組成物が小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記組成物がAkt-1および/もしくはAkt-2阻害剤、ならびに/またはpan-Akt阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
脂漏性角化症細胞を、Aktシグナル伝達を阻害する組成物の有効量と接触させ、それによって、該細胞においてアポトーシスを誘導する段階を含む、脂漏性角化症細胞においてアポトーシスを誘導するための方法。
[本発明1009]
前記組成物の有効量が正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記組成物が小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子を含む、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記組成物がAkt-1および/もしくはAkt-2阻害剤、ならびに/またはpan-Akt阻害剤である、本発明1008の方法。
[本発明1012]
(a)対象から得られた脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを、ディスパーゼ酵素を含む溶液と、生物学的サンプルからの脂漏性角化症細胞の解離を開始させるのに十分な温度および時間で接触させる段階、ならびに
(b)解離した脂漏性角化症細胞を培養する段階
を含む、脂漏性角化症細胞をエクスビボで培養するための方法。
[本発明1013]
前記温度が21℃の標準室温を下回る、本発明1012の方法。
[本発明1014]
脂漏性角化症細胞の消化を開始させるのに十分な時間が少なくとも15時間である、本発明1012の方法。
[本発明1015]
脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを追加のプロテアーゼと接触させる段階をさらに含む、本発明1012の方法。
[本発明1016]
追加のプロテアーゼがトリプシンである、本発明1015の方法。
[本発明1017]
段階(b)の培養の前に、培地を添加して、前記解離した細胞からより大きな小片をろ過する段階をさらに含む、本発明1010の方法。
[本発明1018]
前記解離した細胞が、コーティングされたプレート上で培養される、本発明1010の方法。
[本発明1019]
本発明1010の方法を用いて得られる培養した脂漏性角化症細胞を含む、スクリーニングアッセイ。
[本発明1020]
(a)脂漏性角化症細胞または脂漏性角化症細胞の集団を候補薬剤と接触させる段階、および
(b)該細胞または細胞の集団におけるアポトーシスを測定する段階
を含む、アポトーシスを誘導するための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、該細胞または細胞の集団におけるアポトーシスの増加によって、該候補薬剤がアポトーシスを誘導することが示される、方法。
[本発明1021]
候補薬剤がAktシグナル伝達経路の阻害剤を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
脂漏性角化症細胞または脂漏性角化症細胞の集団が本発明1010の方法を用いて培養される、本発明1020の方法。
[本発明1023]
アポトーシスがスルホローダミンB(SRB)アッセイ、MTTテトラゾリウム色素、TUNEL染色、アネキシンV染色、ヨウ化プロピジウム染色、DNAラダリング、PARP切断、カスパーゼ活性化、ならびに/または細胞および核の形態の評価を用いて測定される、本発明1020の方法。
[本発明1024]
候補薬剤が小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子である、本発明1020の方法。
[本発明1025]
(a)解離した脂漏性角化症細胞の集団を候補薬剤と接触させる段階、
(b)段階(a)の細胞を、アポトーシスタンパク質に特異的な検出可能抗体と接触させる段階、
(c)結合した検出可能抗体からのシグナルの強度を測定する段階、
(d)測定されたシグナル強度を基準値と比較する段階、および測定された強度が基準値と比べて増加している場合は、
(e)該候補薬剤を該細胞におけるアポトーシスの誘導物質として同定する段階
を含むアッセイ。
[本発明1026]
候補薬剤がAktシグナル伝達経路の阻害剤を含む、本発明1025のアッセイ。
[本発明1027]
脂漏性角化症細胞の集団が本発明1010の方法を用いて培養される、本発明1025のアッセイ。
[本発明1028]
アポトーシスタンパク質がカスパーゼタンパク質、PARPタンパク質、またはその切断産物である、本発明1025のアッセイ。
[本発明1029]
(a)対象から得られた脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを、最初はディスパーゼ酵素を、その後はトリプシン酵素を含む溶液と、生物学的サンプルから脂漏性角化症細胞を解離させるのに十分な温度および時間で接触させる段階、ならびに
(b)解離した脂漏性角化症細胞を培養する段階
を含む、脂漏性角化症細胞をエクスビボで培養するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】脂漏性角化症(SK)細胞の初代培養物からのデータを示す。(図1A) 病変を掻爬により取り出し、ケラチノサイト増殖培地(INVITROGEN)に入れた；サンプルの一部は、直接配列決定のために、または(図1B)に示すようにFOXN1 mRNAレベルの検出のために、RNAを単離すべく処理した。組織は、最初に物理的に解離させ、ディスパーゼと共に24時間インキュベートして、3分間トリプシン処理した。
【図２】初代SK細胞における細胞死の小分子誘導物質のスクリーニングに関するデータを示す。(図2A) MAPK-RafおよびPIK3/Akt経路内のキナーゼ類の20種の小分子阻害剤(500nM)を用いて、FGFR3変異および/もしくはPIK3CA変異を保有するか、変異を保有しない初代SK細胞を(12ウェルプレートにおいて)処理した。処理後24時間でSRBアッセイを用いて細胞死を検出した。(図2B) 化合物処理後の細胞の代表的画像。(図2C) 同じ分子を2つの異なる濃度で正常なヒトケラチノサイトに対して使用した。
【図３】初代SK細胞におけるAktシグナル伝達の小分子媒介性阻害に関するデータを示す。(図3A) SKおよび正常なケラチノサイトをC8で24時間処理して、SRB染色した。(図3B)および(図3C) SK細胞をC8で4時間処理し、対応するタンパク質についてウェスタンブロッティングに供した。
【図４】初代SK細胞におけるAktシグナル伝達の阻害および細胞死の誘導に関するデータを示す。(図4A) SK細胞を2つの異なるAkt阻害剤で処理し、処理後24時間でSRBアッセイを用いて細胞死を測定した。(図4B) Akt阻害剤をヒトキノームに対してプロファイリングし、共有する標的を同定した。(図4C) PKC阻害後のSK細胞における細胞死。(図4D) 細胞死は、SK細胞において、対照RNAiまたはAkt1および/もしくはAkt2に対するRNAiでトランスフェクションしてから72時間後に測定した。
【図５】ヒトSK外植片の局所的処理が組織破壊および細胞死を誘導することを示す。ヒトSK外植片を空気と接触したフィルターインサート上で増殖させ、DMSOまたは1mM C8で局所的に48時間処理した。H＆E染色(左)および活性化カスパーゼ3の標識化は、化合物処理した外植片における細胞死の誘導を示す。
【図６】Aktの阻害がSK細胞においてアポトーシスを誘導することを示す。(図6A) SK細胞を、ウェスタンブロッティングにより切断PARPのレベルを測定するために24時間、または(図6B) TUNEL染色を検出するために48時間、Akt阻害剤で処理した。(図6C) 処理の24時間後、プロアポトーシスAkt標的をWBで分析した。
【図７】FoxO3およびp53がAkt阻害時にSK細胞において細胞死を媒介することを示す。(図7A) 細胞を対照またはFoxO3もしくはp53 siRNAでトランスフェクトし、48時間後C8で処理した。処理の48時間後にSRBアッセイを用いて細胞死を測定した。(図7B)では細胞を画像化し、(図7C)ではタンパク質レベルをWBで分析した。
【図８】ヒトSKサンプルのプロファイリングを示す：10人の異なる患者から単一のSKおよび対応する正常皮膚サンプルを掻爬によって取り出し、活性化Aktおよびp53のレベルについてウェスタンブロット分析に供した。赤の矢印はS473でリン酸化されたAktの増加を示し、青の矢印はp53レベルの減少を示す。SK組織の一部は、FGFR3および/またはPIK3CAの突然変異についてのPCRベースの直接配列決定のために処理した。
【図９】Akt阻害時の初代SK細胞における細胞死(図9A)がウェスタンブロット分析で測定されたホスホGSK-3βレベルの減少と相関することを示す。
【図１０】エリプチシンおよびケンペロールがSK細胞においてAktシグナル伝達をブロックし、かつ、48時間以内でSK細胞の細胞死をも誘導することを示す。
【図１１】ピューロマイシンがSK細胞における細胞死の誘導物質であることを示す。
【図１２】p53活性化剤のヌトリン-3がSK細胞において細胞死を誘導することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
本明細書では、脂漏性角化症細胞を単離してエクスビボで培養するための方法およびアッセイが提供され、この技術は培養下でのこれらの細胞の研究を可能にするものである。また、本明細書では、培養した脂漏性角化症細胞を用いるスクリーニングアッセイ、および対象において脂漏性角化症を治療するための方法が提供される。
【００３４】
定義
便宜上、本出願全体(明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む)で使用される特定の用語がここに集められる。別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を持つ。
【００３５】
Aktシグナル伝達経路の阻害剤と細胞を接触させることに関連して、細胞において「アポトーシスを誘導する」または「細胞死を増加させる」とは、細胞集団におけるアポトーシス経路を介した細胞死が、Aktシグナル伝達経路の阻害剤が存在しない相当する対照集団においてよりも、Aktシグナル伝達経路阻害剤で処理した集団において少なくとも5％高いことを示している。Aktシグナル伝達経路阻害剤で処理した集団における細胞死の割合は、相当するサイズおよび培養条件の対照処理集団よりも少なくとも10％高い、少なくとも20％高い、少なくとも30％高い、少なくとも40％高い、少なくとも50％高い、少なくとも60％高い、少なくとも70％高い、少なくとも80％高い、少なくとも90％高い、少なくとも1倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも5倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1000倍高い、またはそれ以上であることが好ましい。「対照処理集団」なる用語は、Aktシグナル伝達経路阻害剤の添加を除いて、同一の培地、ウイルス誘導、核酸配列、温度、培養密度、フラスコサイズ、pHなどで処理された細胞の集団を説明するために本明細書で使用される。
【００３６】
「アポトーシス」とは、死にゆく細胞が細胞質膜ブレッビング(blebbing)、細胞体収縮、クロマチン凝縮、核の崩壊、およびDNAラダリングを含む十分に特徴づけられた生化学的特徴のセットを示す細胞死経路を意味する。細胞のアポトーシス状態を判断するための多くの周知のアッセイが存在しており、限定するものではないが、以下が挙げられる：MTTテトラゾリウム色素の還元、TUNEL染色、アネキシンV染色、ヨウ化プロピジウム染色、DNAラダリング、PARP切断、カスパーゼ活性化、ならびに細胞および核の形態の評価。これらのまたは他の公知のアッセイのいずれも、細胞がアポトーシスを起こしているかどうかを判断するために、本発明の方法で用いることができる。
【００３７】
本明細書で使用されるAktシグナル伝達経路の「阻害剤」は、競合的または非競合的に機能することができ、一態様では、Aktタンパク質(例えば、Akt-1および/またはAkt-2)および/またはAkt経路における下流タンパク質(例えば、FoxO3、GSK3、MDM2など)の発現を妨害することによって、機能することができる。Aktタンパク質の発現または活性を阻害するために多くの異なるアプローチのいずれかを取ることができる。Akt経路の阻害剤には、細胞の処理時に、細胞シグナルに対するAktの活性化によって引き起こされる生物学的活性の阻害をもたらす、任意の化学的または生物学的物質が含まれる。Akt経路阻害剤としては、限定するものではないが、小分子、抗体または抗原結合抗体フラグメント、細胞内抗体、アプタマー、アンチセンス構築物、RNA干渉物質、およびリボザイムが挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用される「候補薬剤」なる用語は、脂漏性角化症の少なくとも1つの症状を少なくとも10％軽減すると予想される組成物を意味し、例えば、候補薬剤はAkt経路を介するシグナル伝達を阻害するか、さもなければ脂漏性角化症成長の大きさまたは外観を縮小させることができる。候補薬剤は、次いで、初代脂漏性角化症細胞を用いる本明細書に記載のスクリーニングアッセイを使用して試験され、候補薬剤が再現性よく所望の結果を生じさせることができ、そのためAktシグナル伝達経路の阻害剤としてまたは対象における脂漏性角化症の治療薬として有用であり得るかどうかが判断され得る。
【００３９】
本明細書に記載される「核酸」は、RNAまたはDNAであってよく、一本鎖または二本鎖であり得、例えば、以下を含む群から選択され得る：対象となるタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えばペプチド核酸(PNA)、擬似相補的PNA(pc-PNA)、ロックド核酸(LNA)など。このような核酸配列には、例えば、限定するものではないが、以下が含まれる：例えば転写リプレッサーとして作用する、タンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子抑制性核酸配列、例えば、限定するものではないが、RNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi(mRNAi)、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど。
【００４０】
本明細書で使用される「治療有効量」なる用語は、脂漏性角化症を治療する、脂漏性角化症の出現を少なくする、または脂漏性角化症の発症を遅延させるのに十分でかつ安全な量を指す。したがって、この量は、脂漏性角化症の症状を治癒するもしくはその改善をもたらす、脂漏性角化症の成長もしくは進行の経過を遅らせる、および/または脂漏性角化症の症状を遅らせるもしくは抑制することが可能である。脂漏性角化症の治療に有効な量は、治療される脂漏性角化症のタイプ、症状の重症度、治療される対象、対象の年齢および全身状態、投与方法などによって異なる。したがって、正確な「有効量」を特定することは可能でないか、または賢明ではない。しかし、どのような所与の場合でも、適切な「有効量」は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００４１】
本明細書で使用される「対象」なる用語は、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ、またはアカゲザルを含むが、これらに限定されない。一態様では、対象は哺乳動物である。別の態様では、対象はヒトである。
【００４２】
「哺乳動物」なる用語は、単数形の「哺乳動物」と複数形の「哺乳動物」を包含することを意図しており、限定するものではないが、以下が挙げられる：ヒト；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー；イヌ科、例えばイヌ、およびオオカミ；ネコ科、例えばネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科、例えばウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えばウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄動物、例えばシカ、およびキリン；げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、およびモルモット；ならびにクマ。いくつかの好ましい態様では、哺乳動物はヒトである。
【００４３】
本明細書で使用される「ベクター」なる用語は、それに連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、これは追加の核酸セグメントを連結することができる環状二本鎖DNAループを指す。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、ここでは追加の核酸セグメントがウイルスゲノムに連結され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらに機能的に連結している遺伝子の発現を指令することが可能である。そのようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」と呼ばれ、より簡単には「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。プラスミドはベクターの最もよく使用される形態であるので、本明細書では「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす発現ベクターの他の形態、例えばウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)を含むことが意図される。一態様では、レンチウイルスは、本発明の1つ以上のsiRNA分子を細胞に送達するために使用される。
【００４４】
発現ベクターにおいて、「機能的に連結される」とは、対象となるヌクレオチド配列が、(例えば、インビトロ転写/翻訳系において、またはベクターが標的細胞に導入される場合は標的細胞において)そのヌクレオチド配列の発現を可能にする形で調節配列に連結されることを意味することが意図される。「調節配列」なる用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、および特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例えば、組織特異的調節配列)が含まれる。さらに、RNA干渉物質は、本発明のsiRNAの合成を特定の間隔でまたは特定の期間にわたって指令する調節配列を含むベクターを介して送達することができる。発現ベクターの設計は、標的細胞の選択、所望のsiRNAの発現レベルなどの要因に依存し得ることが当業者には理解されるであろう。
【００４５】
本発明の発現ベクターは、標的細胞に導入され、それによって、本発明のsiRNA分子を生成することができる。一態様では、DNAテンプレート、例えば変異対立遺伝子に対するsiRNA分子をコードするDNAテンプレートは、RNAポリメラーゼIII(Pol III)の制御下で発現ベクターに連結されて、標的細胞に送達され得る。Pol IIIは、4〜5個のチミジンのストレッチ内で終結することによって3'末端が規定される、小さい非コード転写産物の合成を指令する。したがって、DNAテンプレートを用いて、RNAiをもたらすsiRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方をインビボで合成することができる(Sui, et al. (2002) PNAS 99(8):5515)。
【００４６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈によってそうでないことが明確に示されない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」(the method)の言及には、本明細書に記載されるおよび/または本開示などを読むことによって当業者には明らかになる種類の1つ以上の方法および/または段階が含まれる。前述の詳細な説明および以下の実施例は単なる例示であり、本発明の範囲の限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。開示された態様に対するさまざまな変更および修正は、当業者には明らかであり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。さらに、示されたすべての特許、特許出願、および刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載の方法論を、説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。こうした刊行物は、本出願の出願日以前のそれらの開示のためだけに提供される。これに関連して何ごとも、先行発明であるという理由でまたはその他の理由で、そのような開示に先行する権利が本発明者らにはないことを承認するものとして解釈されるべきでない。これらの文書の日付に関する記述または内容に関する表明はすべて、本出願人らが入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認をも構成しない。
【００４７】
脂漏性角化症の診断
脂漏性角化症(SK)はヒトにおいて最も一般的な良性の上皮腫瘍である。SKの病因は不明であるが、それらはケラチノサイトの増殖増加という組織学的兆候を示す。これらの病変は増加したアポトーシス速度を有し、複数の研究はその発生率が加齢とともに増加することを示している。いくつかの研究から、64歳以上の88％は少なくとも1つのSKを有することが見出されている。
【００４８】
SKは、丘疹結節性病変に発達するくすんだ過角化性斑として特徴づけられる。それらは薄茶色、ピンク、黄褐色または茶色に見えることがあり、表面はいぼ状または疣状になり得る。その大きさは5mmから数センチと様々であり、古典的な「貼り付いた(stuck on)」外観が観察される。SKが悪性腫瘍に進行することはない。
【００４９】
SKは共通してFGFR3、PIK3CA、KRAS、HRAS、EGFR、およびAKTl癌遺伝子に複数の発癌性変異を保有しているが、腫瘍抑制遺伝子p53、TSCl、およびPTENにはそうした変異がない。老化のプログラムがSKで活性化されていることを示す証拠は存在しない。SKの発現プロファイルは、SKが活性化受容体チロシンキナーゼシグナル伝達(例えば、FGFR3)と転写因子FOXN1との間のフィードバックループによって支配された分化促進プログラムの強力な活性化を保有することを除いて、扁平上皮癌などの悪性皮膚腫瘍に非常に類似している。
【００５０】
脂漏性角化症は、医学、特に皮膚科学の当業者が肉眼で容易に診断することができる。脂漏性角化症は通常、背中、肩、顔または胸に見られる茶色、黒色または薄い色の腫瘍である。一般的に、脂漏性角化症は皮膚表面よりわずかに隆起しており、ろう状またはうろこ状に見えることがある。いくつかのケースでは、脂漏性角化症は、いぼ、日光角化症、または皮膚癌に似ている。医師が皮膚癌を疑う場合には、腫瘍が脂漏性角化症であることを確認するために生検が行われる。こうした方法は当業者には日常的な作業である。
【００５１】
脂漏性角化症およびAktシグナル伝達
SKで検出された突然変異は、悪性腫瘍において観察されており、より重要なことには、細胞またはトランスジェニック動物で発現させた場合、形質転換を誘導しかつ癌を生じさせるのに十分である。同様に、SKの重要な特定の分子決定因子を同定するための本発明者らの試みにより、上皮性腫瘍の形成またはケラチノサイトの分化に関与すると考えられる増殖因子と他の遺伝子の増加した発現の検出がもたらされた8。したがって、SKがめったに悪性化しないという観察は理解しにくいことである。類似しているが、極めて異なる状況が良性のメラノサイト系母斑において起こっており、こうした母斑はしばしばシグナル伝達分子b-Rafに活性化突然変異を有しており、多くの悪性メラノーマに見られるのと同じ突然変異である9。しかし、メラノサイト系母斑には、依然として悪性転換のリスクがある。したがって、SKは、良性腫瘍において耐性のあるゲノム異常を研究するため、および癌遺伝子によって駆動される分子シグナル伝達が非形質転換細胞でどのように機能するかを調べるための、またとない機会を提供する。
【００５２】
SKにおいて最も頻繁に変異した遺伝子は、FGFR3と、ホットスポット変異が構成的活性化およびPI3K-Akt経路を介したシグナル伝達をもたらすPI3Kのp110αサブユニット(PIK3CA)である7。分子レベルでは、Akt(PI3Kの下流のセリン-トレオニンキナーゼ、PKBの別名でも知られる)活性化の上流のPI3Kシグナル伝達は、腫瘍抑制因子PTENによって負に調節される10。活性化されたAktシグナル伝達は、増殖因子、癌遺伝子、および細胞ストレスの下流の細胞生存を促進するのに重要である11。Aktは、例えばp53-MDM2経路ならびにFOXO媒介性プロアポトーシスカスケードなどの、プロアポトーシス経路の機能をブロックすることによって細胞の生存を高めている12。
【００５３】
Aktは、ホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸(PIP3)により調節されるセリン-トレオニンプロテインキナーゼであり、線維芽細胞、上皮細胞、および神経細胞を含む多種多様な細胞において生存のシグナル伝達に関与している(Franke et al. Cell 1997; 1; 88:435-7; Hemmings et al. Science 1997; 275:628-30)。Aktは、インスリン様成長因子-1(IGF-1)によるシグナル伝達の解析の際に抗アポトーシス因子として最初に認識されたものであり、小脳ニューロンの生存を促進する(Dudek et al. Science 1997; 275:661-5)。IGF-1は、セリン-トレオニンキナーゼであるAktのPI3キナーゼ誘発活性化を活性化することが示された。
【００５４】
PI3キナーゼ/Aktシグナル伝達経路のさらなる定義および詳細は、当技術分野において、例えば、Downward, J. Curr. Opin. Cell Biol. 10, 262-267(1988); Jimenez, C. et al, J. Biol. Chem. 277(44):41556-41562 (2002); Kitamura, T. et al, Mol. Cell Biol. 19, 6286-6296 (1999); Ruggero D. and Sonenberg N. Oncogene. 24, 7426-34 (2005); Testa J. R. and Tsichlis P. N. Oncogene. 7391-7393 (2005); およびZhou X. M. et al, J. Biol. Chem. 275, 25046-25051 (2000)に開示されている。
【００５５】
アポトーシス
アポトーシスは、通常、胚形成の間、発生の間に、および老化に対する正常な生理学的応答の間に起こる、プログラムされた細胞死のメカニズムである。アポトーシスはまた、熱、放射線、栄養欠乏、ウイルス感染、低酸素症、細胞内カルシウム濃度の増加などの細胞ストレス要因に応答して、および特定のグルココルチコイド受容体の活性化に応答して、誘発され得る。アポトーシスは、一部には、1つ以上のカスパーゼシグナル伝達経路の活性化を開始させる。カスパーゼは、アスパラギン酸残基の後ろで切断する強力なプロテアーゼであり、一旦活性化されると、最終的に細胞死へと導く広範囲の細胞標的のタンパク質分解的切断に関与する。欠陥のあるアポトーシス調節は、さまざまな疾患につながることがある。例えば、アポトーシス活性の低下は、不適切な細胞生存を導くことがあり、腫瘍増殖、癌、自己免疫疾患および炎症性疾患と関連している。逆に、アポトーシスの病理学的に高いレベルは、例えば、神経変性疾患(例えば、とりわけ、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、および大脳虚血)、および感染症(例えば、AIDS)に観察されるような、細胞死経路の異常な開始につながることがある。
【００５６】
アポトーシスの調節に関与するタンパク質としては、例えば、とりわけ、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、カスパーゼ-9、およびPARPが挙げられる。このようなタンパク質は、細胞または組織におけるアポトーシスを検出するためのイムノアッセイで使用することができる。
【００５７】
サンプルにおけるアポトーシスの存在および/またはレベルを測定するための他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる；アポトーシスは、スルホローダミンB(SRB)アッセイ、MTTテトラゾリウム色素、TUNEL染色、アネキシンV染色、ヨウ化プロピジウム染色、DNAラダリング、PARP切断、カスパーゼ活性化、ならびに/または細胞および核の形態の評価を用いて測定される。
【００５８】
Aktの阻害
「Akt-1および/またはAkt-2発現を阻害する」とは、Akt-1および/またはAkt-2の発現量が、Aktシグナル伝達経路の阻害剤が存在しない相当する対照集団と比べて、そうした阻害剤で処理した集団において少なくとも5％低いことを意味する。阻害剤処理集団におけるAkt発現(例えば、Akt-1および/またはAkt-2)の割合は、阻害剤が添加されない相当する対照処理集団と比べて、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれ以上であることが好ましい。
【００５９】
「Akt活性を阻害する」とは、Akt-1および/またはAkt-2の機能的活性の量が、AktまたはAktシグナル伝達経路の阻害剤が存在しない相当する対照集団と比べて、そうした阻害剤で処理した集団において少なくとも5％低いことを意味する。阻害剤処理集団におけるAkt活性(例えば、Akt-1および/またはAkt-2活性)の割合は、AktまたはAktシグナル伝達経路の阻害剤が添加されない相当する対照処理集団と比べて、少なくとも10％低い、少なくとも20％低い、少なくとも30％低い、少なくとも40％低い、少なくとも50％低い、少なくとも60％低い、少なくとも70％低い、少なくとも80％低い、少なくとも90％低い、少なくとも1倍低い、少なくとも2倍低い、少なくとも5倍低い、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低い、少なくとも1000倍低い、またはそれ以上であることが好ましい。少なくとも、Akt活性は、当技術分野において標準的な技術を用いて、タンパク質またはmRNAレベルでのAktの発現量を測定することによって、アッセイすることができる。あるいは、またはさらに、Akt活性は、Akt活性に感受性であるレポーター構築物を使用して測定することができる。
【００６０】
一態様において、Akt活性の阻害剤は、Akt-1および/またはAkt-2に対する抗体(pan-Akt阻害剤として作用する抗体を含む)またはその抗原結合フラグメント、小分子、および核酸からなる群より選択される。一態様では、核酸はAkt-1および/またはAkt-2特異的RNA干渉物質、RNA干渉物質をコードするベクター、あるいはAkt-1および/またはAkt-2に結合するアプタマーである。
【００６１】
一態様において、Akt活性の阻害剤は、Aktとその下流のメディエーターとの相互作用を妨げる。一態様では、下流のメディエーターは、とりわけ、GSK3、FoxO3、MDM2である。
【００６２】
Aktシグナル伝達経路の抗体阻害剤
AktまたはAktの下流メディエーターに特異的に結合する抗体は、Aktシグナル伝達経路をインビボ、インビトロ、またはエクスビボで阻害するために使用することができる。Aktに対する抗体は市販されており、かつ/または周知の方法を用いて当業者により産生され得る。所与の抗体、またはより詳しく言うなら、任意のAkt阻害剤、のAkt阻害活性は、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の方法を用いて評価することができる−誤解を避けるために述べると、Aktを阻害する抗体は、細胞死の増加を引き起こすであろう。Aktの抗体阻害剤には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ならびにそれらの抗原結合性誘導体またはフラグメントが含まれる。よく知られている抗原結合フラグメントとしては、例えば、単一ドメイン抗体(dAb；本質的に単一のVLまたはVH抗体ドメインからなる)、単鎖Fvフラグメント(scFv)を含むFvフラグメント、Fabフラグメント、およびF(ab')2フラグメントが挙げられる。このような抗体分子を構築する方法は当技術分野で周知である。
【００６３】
本明細書に記載の方法に従って使用することができる「抗体」には、完全な免疫グロブリン、免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、ならびに免疫グロブリンの抗原結合ドメインを含む抗原結合タンパク質が含まれる。免疫グロブリンの抗原結合フラグメントとしては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、scFvおよびdAbが挙げられる。改変された抗体フォーマットが開発されており、これらは結合特異性を保持するが、おそらく望ましいであろう他の特性、例えば二重特異性、多価性(3つ以上の結合部位)、およびコンパクトなサイズ(例えば、結合ドメイン単独)などを備えている。単鎖抗体は、それらが由来する全抗体の定常ドメインの一部または全部を欠いている。したがって、それらは全抗体の使用に関連する問題のいくつかを克服することができる。例えば、単鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子間の特定の望ましくない相互作用がない傾向がある。さらに、単鎖抗体は全抗体よりもかなり小さく、全抗体よりも大きな透過性を有して、単鎖抗体の局在化および標的抗原結合部位へのより効率的な結合を可能にする。さらに、単鎖抗体の比較的小さいサイズは、全抗体と比べて、それらがレシピエントにおいて望ましくない免疫応答を誘発する可能性を少なくする。各単鎖抗体が第1のペプチドリンカーによって共有結合で連結された1つのVHドメインと1つのVLドメインを有する、複数の単鎖抗体を、少なくとも1つ以上のペプチドリンカーによって共有結合で連結して、単一特異性または多重特異性であり得る多価単鎖抗体を形成することができる。多価単鎖抗体の各鎖は、可変軽鎖フラグメントと可変重鎖フラグメントを含み、少なくとも1つの他の鎖にペプチドリンカーによって連結されている。ペプチドリンカーは少なくとも15個のアミノ酸残基から構成される。リンカーアミノ酸残基の最大数は約100である。2つの単鎖抗体を組み合わせてダイアボディ(diabody)を形成することができ、これは二価ダイマーの別名でも知られている。ダイアボディは2つの鎖と2つの結合部位を有し、単一特異性または二重特異性であり得る。ダイアボディの各鎖はVLドメインに連結されたVHドメインを含む。これらのドメインは、同一鎖上のドメイン間の対形成を防ぐのに十分に短いリンカーで連結されており、そのため異なる鎖上の相補的ドメイン間の対形成が起こって、2つの抗原結合部位を再形成させる。3つの単鎖抗体を組み合わせてトリアボディ(triabody)を形成することができ、これは三価トリマーの別名でも知られている。トリアボディは、VLまたはVHドメインのアミノ酸末端をVLまたはVHドメインのカルボキシル末端に直接融合させて、すなわちリンカー配列なしで、構築されている。トリアボディは3つのFv頭部を有し、ポリペプチドが環状に頭-尾結合様式で配列されている。トリアボディの可能な立体配座は平面的であり、3つの結合部位が互いに120度の角度で平面に位置づけられる。トリアボディは単一特異性、二重特異性または三重特異性であり得る。したがって、本明細書に記載の方法において有用な抗体には、限定するものではないが、天然に存在する抗体、(Fab')2などの二価フラグメント、Fabなどの一価フラグメント、単鎖抗体、単鎖Fv(scFv)、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディなどの、抗原と特異的に結合するものが含まれる。
【００６４】
抗体はまた、当業者に公知の方法により、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部に対して産生することができる。抗体は、遺伝子産物またはその断片を用いた免疫化によってウサギまたはマウスなどの動物において容易に産生される。免疫したマウスは、ハイブリドーマを作製するためのB細胞の供給源を提供するために特に有用であり、次にハイブリドーマは大量のモノクローナル抗体を生成するために培養される。抗体の製造方法は、例えばHarlow et al., 1988に、詳細に記載されている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はいずれも本明細書に記載の方法で使用することができるが、諸条件が特定のタンパク質に対する特異性の向上を必要とする場合には、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００６５】
Akt発現の核酸阻害剤
選択された標的ポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチは、RNA干渉物質の使用によるものである。RNA干渉(RNAi)では、選択的分解のために標的ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的とする低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖が使用される。遺伝子発現のsiRNA依存性転写後サイレンシングは、siRNAによって導かれた部位で標的メッセンジャーRNA分子を切断することを含む。「RNA干渉(RNAi)」は、進化的に保存されたプロセスであり、このプロセスでは、標的遺伝子と同一であるか非常に類似する配列のRNAの発現または導入が、その標的遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA(mRNA)の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)をもたらし(Coburn, G. and Cullen, B. (2002) J. of Virology 76(18):9225参照)、それによって標的遺伝子の発現を阻害する。一態様では、そのRNAは二本鎖RNA(dsRNA)である。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記載されている。自然界では、RNAiはdsRNA特異的エンドヌクレアーゼであるダイサー(Dicer)によって開始され、このダイサーは、siRNAと呼ばれる二本鎖断片への長いdsRNAのプロセッシブな切断(processive cleavage)を促進する。siRNAは、標的mRNAを認識して切断するタンパク質複合体(「RNA誘導サイレンシング複合体」または「RISC」と呼ばれる)に組み込まれる。RNAiはまた、標的遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするために、核酸分子、例えば合成siRNAまたはRNA干渉物質を導入することによって開始することができる。本明細書で使用される「標的遺伝子発現の阻害」は、RNA干渉が誘導されていない状況と比較して、標的遺伝子または標的遺伝子によりコードされたタンパク質の発現またはタンパク質活性もしくはレベルの減少を含む。こうした減少は、RNA干渉物質による標的とされていない標的遺伝子の発現または標的遺伝子によりコードされたタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、もしくは99％またはそれ以上のものであろう。
【００６６】
本明細書で使用される「RNA干渉物質」および「RNA干渉」なる用語は、RNA干渉物質がsiRNA、miRNA、shRNAまたは他の二本鎖RNA分子を含むかどうかに関係なく、二本鎖RNAによって媒介される遺伝子サイレンシングの形態を包含することが意図される。「短い干渉RNA」(short interfering RNA：siRNA)は、本明細書では「低分子干渉RNA」(small interfering RNA)とも呼ばれており、例えばRNAiによって、標的遺伝子の発現を阻害するように機能するRNA作用物質として定義される。siRNAは、化学的に合成するか、インビトロ転写により生成するか、または宿主細胞内で産生させることが可能である。一態様では、siRNAは、長さが約15〜約40ヌクレオチド、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは約19〜約25ヌクレオチド長、より好ましくは約19、20、21、22または23ヌクレオチド長の二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、各鎖上に約0、1、2、3、4または5ヌクレオチドの長さを有する3'および/または5'オーバーハングを含むことができる。オーバーハングの長さは2本の鎖間で独立しており、すなわち、一方の鎖上のオーバーハングの長さは、他方の鎖上のオーバーハングの長さに依存しない。好ましくは、siRNAは、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を介してRNA干渉を促進することができる。
【００６７】
また、siRNAには、低分子ヘアピン(ステムループとも呼ばれる)RNA(shRNA)も含まれる。一態様では、これらのshRNAは、短い(例えば、約19〜約25ヌクレオチド)アンチセンス鎖と、これに続く約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行してもよく、アンチセンス鎖があとに続いてもよい。これらのshRNAをプラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス中に含めて、例えば、pol III U6プロモーターまたは別のプロモーターから発現させることができる(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Stewart, et al. (2003) RNA Apr;9(4):493-501を参照されたい)。RNA干渉物質の標的遺伝子または配列は、細胞遺伝子またはゲノム配列、例えばAktlまたはAkt2配列とすることができる。siRNAは、標的遺伝子もしくはゲノム配列、またはその断片に実質的に相同であり得る。これに関連して使用される「相同」なる用語は、標的のRNA干渉を達成するために、標的mRNAまたはその断片と、実質的に同一である、十分に相補的である、または類似していると定義される。標的配列の発現を阻害または干渉するのに適したRNAには、天然のRNA分子に加えて、RNA誘導体および類似体が含まれる。好ましくは、siRNAはその標的と同一である。siRNAはただ1つの配列を標的とすることが好ましい。siRNAなどのRNA干渉物質の各々は、例えば発現プロファイリングによって、潜在的なオフターゲット効果についてスクリーニングすることができる。こうした方法は当業者に知られており、例えば、Jackson et al. Nature Biotechnology 6:635-637, 2003に記載されている。発現プロファイリングに加えて、オフターゲット効果を持ち得る潜在的な配列を同定するために、配列データベース中の類似配列について潜在的な標的配列をスクリーニングすることもできる。例えば、Jacksonら(同上)によれば、配列同一性の15個連続するヌクレオチド、またはおそらく、わずか11個連続するヌクレオチドは、非標的転写産物のサイレンシングを指令するのに十分である。したがって、BLASTなどの公知の配列比較法による配列同一性解析を用いて、潜在的なオフターゲットサイレンシングを回避するために、提案されたsiRNAを最初にスクリーニングすることができる。siRNA配列は、siRNAのアンチセンス(ガイド)鎖のRISCへの取り込みを最大にし、それによって分解のためにヒトGGT mRNAを標的とするRISCの能力を最大にするように選択される。これは、アンチセンス鎖の5'末端で最小の結合自由エネルギーを有する配列を精査することによって達成することができる。より低い自由エネルギーはsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖の5'末端の巻き戻しの向上につながり、それにより、アンチセンス鎖がRISCに取り込まれて、ヒトAktlまたはAkt2 mRNAの配列特異的切断を指令することを確実にする。siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、例えば、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに含み、また、リボース糖分子が別の糖分子または同様の機能を果たす分子で置換されている分子を包含する。さらに、ヌクレオチド残基間の非天然の結合、例えば、ホスホロチオエート結合を用いることができる。RNA鎖は、フルオロフォアなどのレポーター基の反応性官能基で誘導体化し得る。特に有用な誘導��は、RNA鎖の一端または両端で、典型的にはセンス鎖の3'末端で修飾される。例えば、3'末端の2'-ヒドロキシルは種々の基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。他の有用なRNA誘導体は、2'O-アルキル化残基または2'-O-メチルリボシル誘導体および2'-O-フルオロリボシル誘導体などの、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを取り込んでいる。RNA塩基もまた、修飾され得る。標的配列の発現を阻害するまたは妨げるのに有用な修飾塩基はどれも使用することができる。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルなどのハロゲン化塩基を組み込むことができる。また、塩基はアルキル化されていてもよく、例えば、7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み込むことができる。阻害を成功させる非天然塩基を組み込んでもよい。最も好ましいsiRNAの修飾には、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンまたはロックド核酸(LAN)ヌクレオチド、およびホスホジエステルもしくはさまざまな数のホスホロチオエート結合のいずれかを含むRNA二重鎖が含まれる。こうした修飾は当業者に知られており、例えば、Braasch et al, Biochemistry, 42: 7967-7975, 2003に記載されている。siRNA分子に役立つ修飾のほとんどは、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術のために確立された化学を用いて導入することができる。好ましくは、修飾は最小限の2'-O-メチル修飾を含み、好ましくは、そうした修飾を除外する。修飾はまた、好ましくは、siRNAの遊離5'-ヒドロキシル基の修飾を除外する。
【００６８】
好ましい態様では、RNA干渉物質は薬学的に許容される担体で送達されるか、または投与される。リポソームなどの追加の担体物質を薬学的に許容される担体に加えることができる。別の態様では、RNA干渉物質は、薬学的に許容される担体中の低分子ヘアピンRNA(shRNA)をコードするベクターによって、個体の器官の細胞に送達される。shRNAは、転写後に細胞によって、例えばAkt-1またはAkt-2を標的とすることができる、siRNAに変換される。
【００６９】
一態様では、ベクターは、テトラサイクリン誘導性ベクターなどの、調節可能なベクターである。例えば、pTet-Onベクター(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)を使用する、Wang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5103-5106に記載の方法を用いることができる。一態様では、本明細書に記載の方法において使用されるRNA干渉物質は、ベクターを使用せずに、RNA干渉物質の効率のよいインビボ送達を示す、静脈内注入、例えば水圧注入(hydrodynamic injection)の後、インビボで細胞によって能動的に取り込まれる。siRNAを送達するための1つの方法は、標的器官に血液を供給する血管のカテーテル挿入である。RNA干渉物質、例えば本発明の方法で使用されるsiRNAまたはshRNA、を送達するための他の戦略はまた、例えばベクターによる送達を採用することができ、例えば、プラスミド、またはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターによる送達である。このようなベクターは、例えば、Xiao-Feng Qin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100: 183-188に記載されるように、使用され得る。その他の送達方法には、RNA干渉物質を塩基性ペプチド、例えばTATペプチドの断片、と結合もしくは混合することにより塩基性ペプチドを使用して、陽イオン性脂質と混合して、または粒子に製剤化して、本発明のsiRNAまたはshRNAなどのRNA干渉物質を送達することが含まれる。RNA干渉物質、例えばAkt-1またはAkt-2 mRNAを標的とするsiRNAは、単独で送達されてもよいし、他のRNA干渉物質、例えば他の細胞遺伝子に対するsiRNAなどのsiRNAと組み合わせて送達されてもよい。Akt siRNAはまた、酸化的ストレスと関連した疾患または障害、特に呼吸器疾患、さらに特定すると喘息、を治療または予防するために使用される他の薬剤と併用して投与することができる。shRNA分子をはじめとする合成siRNA分子は、当業者に知られた多くの技術を用いて得ることができる。例えば、siRNA分子は、当技術分野で知られた方法を用いて、例えば、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホロアミダイトおよび従来のDNA/RNA合成装置を用いて、化学的に合成されるか、または組換え的に製造され得る(例えば、Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Elbashir, S.M., W. Lendeckel and T. Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200; Harborth, J. et al . (2001) J. Cell Science 114:4557-4565; Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017; およびTuschl, T. et al . (1999) Genes & Development 13:3191-3197を参照されたい)。あるいは、いくつかの商業的RNA合成サプライヤーが利用可能であり、例えば、限定するものではないが、以下が挙げられる：Proligo(ハンブルク, ドイツ)、Dharmacon Research(ラファイエット, コロラド州, 米国)、Pierce Chemical(Perbio Scienceの一部, ロックフォード, イリノイ州, 米国)、Glen Research(スターリング, バージニア州, 米国)、ChemGenes(アッシュランド, マサチューセッツ州, 米国)、およびCruachem(グラスゴー, 英国)。このように、siRNA分子は合成することが過度に困難ではなく、容易にRNAiに適した品質で提供される。さらに、dsRNAは、プラスミドベクター、レトロウイルスおよびレンチウイルスによってコードされたステムループ構造として発現させることができる(Paddison, P.J. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958; McManus, M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850; Paul, C.P. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508; Miyagishi, M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500; Sui, G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520; Brummelkamp, T. et al. (2002) Cancer Cell 2:243; Lee, N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505; Yu, J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:6047-6052; Zeng, Y., et al. (2002) Mol. Cell 9:1327-1333; Rubinson, D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406; Stewart, S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501)。これらのベクターは一般に、dsRNAの上流にpol IIIプロモーターを有し、センスおよびアンチセンスRNA鎖を別々におよび/またはヘアピン構造として発現することができる。細胞内では、ダイサーが短いヘアピンRNA(shRNA)を有効なsiRNAにプロセッシングする。本発明のsiRNA分子の標的領域は、所与の標的遺伝子配列、例えば、開始コドンの約25〜50ヌクレオチド、約50〜75ヌクレオチド、または約75〜100ヌクレオチド下流から始まる、Akt-1またはAkt-2コード配列、から選択することができる。ヌクレオチド配列は5'または3' UTRおよび開始コドンのすぐ近くの領域を含んでもよい。本発明のsiRNA分子を設計する1つの方法は、23ヌクレオチドの配列モチーフAA(N19)TT(配列番号21)(ここでNは任意のヌクレオチドであり得る)を同定し、少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％または75％のG/C含量を有するヒットを選択することを含む。前記配列の「TT」部分は任意である。あるいは、このような配列が見つからない場合は、モチーフNA(N21)(ここでNは任意のヌクレオチドであり得る)を用いて検索を拡張することができる。この場合、センスsiRNAの3'末端は、センスおよびアンチセンス3'オーバーハングの配列組成に関して対称的な二重鎖の生成を可能にするために、TTに変換することができる。その後、アンチセンスsiRNA分子は、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド位置1〜21に対する相補鎖として合成され得る。対称3' TTオーバーハングの使用は、低分子干渉リボ核タンパク質粒子(siRNP)がセンスおよびアンチセンス標的RNA切断siRNPのほぼ等しい比率で形成されることを保証するために有利であり得る(Elbashir et al., (2001)前掲およびElbashir et al, 2001 前掲)。また、NCBI、BLAST、DerwentおよびGenSeqを含むがこれらに限定されない配列データベースの解析、ならびにOligoengine(登録商標)などの商業的に利用可能なオリゴ合成会社を使用して、唯一つの遺伝子が標的となるのを確実にするためにESTライブラリーに対してsiRNA配列を選択することが可能である。
【００７０】
siRNA配列、とりわけ、Akt-1、Akt-2、Akt-3、FOX03、およびp53を標的とするsiRNA配列はまた、例えば、中でも、INVITROGEN(商標)、THERMO SCIENTIFIC(商標)、ORIGENE(商標)から、商業的に入手することができる。例えば、Validated Stealth siRNAは、INVITROGEN(商標)からAkt-1(カタログ番号VHS40082)、Akt-2(カタログ番号VHS41339)、およびAkt-3(カタログ番号HSS115178)に対して取得することができる。さらに、ON-TARGETplus SMARTpool siRNAS(商標)は、THERMO SCIENTIFIC(商標)からFOX03(ヒトFOXO3A(2309); カタログ番号L-003007-00-0005)およびp53(ヒトTP53(7157); カタログ番号L-003329-00-0005)に対して取得可能である。
【００７１】
RNA干渉物質の送達
RNA干渉物質、例えばsiRNA、またはRNA干渉物質を含むベクターを、取り込みのために標的細胞、例えば脂漏性角化症細胞、皮膚細胞、または他の所望の標的細胞に送達する方法には、RNA干渉物質、例えばsiRNA、を含む組成物の注入、または細胞、例えば脂漏性角化症細胞と、RNA干渉物質、例えばsiRNA、を含む組成物との直接接触が含まれる。別の態様では、RNA干渉物質、例えばsiRNAは、静脈、動脈、細静脈または細動脈などの血管に、例えば水圧注入またはカテーテル挿入によって、直接注入することができる。投与は1回の注入によっても、2回以上の注入によってもよい。RNA干渉物質は薬学的に許容される担体で送達される。1種以上のRNA干渉物質を同時に使用することができる。一態様では、ヒトAktを標的とする単一のsiRNAが使用される。一態様では、特定の細胞がRNA干渉の標的とされ、RNA干渉の非特異的標的化によって引き起こされるRNA干渉の潜在的な副作用を制限する。この方法では、例えば、RNA干渉を細胞に効率よく送達するために使用される、細胞標的化成分とRNA干渉結合成分を含む複合体または融合分子を使用することができる。例えば、抗体-プロタミン融合タンパク質は、siRNAと混合したとき、siRNAに結合して、該抗体により認識される抗原を発現している細胞にsiRNAを選択的に送達し、結果的に、該抗原を発現する細胞においてのみ遺伝子発現のサイレンシングを引き起こす。siRNAまたはRNA干渉誘導分子に結合する成分は、タンパク質またはタンパク質の核酸結合ドメインもしくは断片であり、その結合成分は標的化成分の一部に融合される。標的化成分の位置は、構築物のカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれか、または融合タンパク質の中央であり得る。ウイルス媒介性送達機構もまた、Xia, H. et al. (2002) Nat Biotechnol 20(10): 1006に記載されるように、インビトロおよびインビボで細胞にsiRNAを送達するために使用することができる。shRNAのプラスミド-またはウイルス-媒介性送達機構もまた、Rubinson, D.A., et al. ((2003) Nat. Genet. 33:401-406)およびStewart, S.A., et al. ((2003) RNA 9:493-501)に記載されるように、インビトロおよびインビボで細胞にshRNAを送達するために使用することができる。RNA干渉物質、例えばsiRNAまたはshRNAは、以下の活性の1つ以上を果たす成分と共に導入することができる：細胞、例えばリンパ球または他の細胞による、RNA干渉物質、例えばsiRNAの取り込みを増強する；一本鎖のアニーリングを阻害する；一本鎖を安定化する；または別の方法で標的細胞への送達を促進して、標的遺伝子、例えばAkt-1またはAkt-2の阻害を増加させる。特定のRNA干渉物質の用量は、特定の標的遺伝子のRNA干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング(PTGS)を達成し、それによって、標的遺伝子発現の阻害または標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性もしくはレベルの阻害をもたらすのに必要な量であろう。
【００７２】
一態様では、脂漏性角化症細胞をエクスビボまたはインビトロで接触させる。一態様では、前記組成物はAkt-1および/またはAkt-2発現を阻害する。
【００７３】
Aktシグナル伝達経路の小分子阻害
本明細書で使用する「小分子」なる用語は、以下を含むがこれらに限定されない化学物質を指す：ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モルあたり約10,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物(すなわち、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含む)、モルあたり約5,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モルあたり約1,000グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、モルあたり約500グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物、ならびにこれらの化合物の塩、エステル、および他の薬学的に許容される形態。
【００７４】
本質的にAktシグナル伝達経路の小分子阻害剤はいずれも、本明細書に記載の方法を用いる脂漏性角化症の治療に使用することができる。一態様では、Aktシグナル伝達経路の小分子阻害剤は、Akt-1、Akt-2、Akt-3またはこれらの組み合わせの阻害剤である。別の態様では、Aktシグナル伝達経路の小分子阻害剤は、ATP競合性のAkt阻害剤である。別の態様では、ATP競合性Akt阻害剤は、GSK-3βのリン酸化を減少させる。
【００７５】
本明細書に記載される脂漏性角化症の治療に有用な小分子化合物のいくつかの非限定的な例としては、ケンペロール、エリプチシン(Akt阻害あり)、ヌトリン-3およびピューロマイシンが挙げられる。
【００７６】
薬学的に許容される担体
本明細書で使用される「薬学的に許容される」なる用語およびその文法的変形は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指すとき、互換的に使用され、これらの物質を、悪心、めまい、胃の不調などの望ましくない生理学的作用を生じることなく哺乳動物に投与できることを表す。各担体はまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容される」必要がある。薬学的に許容される担体は、所望しない限り、それと混合される薬剤に対する免疫応答の惹起を促進しないであろう。活性成分が溶解または分散されている薬理学的組成物の調製は当技術分野でよく理解されており、製剤化に基づいて限定される必要はない。薬学的製剤は、本明細書に記載の化合物を、1種以上の薬学的に許容される成分と組み合わせて含有する。担体は、固体、半固体または液体の希釈剤、クリームまたはカプセルの形態であり得る。一般的に、このような組成物は溶液または懸濁液のような注入可能な液体として調製されるが、使用前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態も調製され得る。調製物はまた、乳化したり、リポソーム組成物として提示したりすることもできる。活性成分は、薬学的に許容されかつ活性成分と適合する賦形剤と、本明細書に記載の治療方法で使用するのに適した量で混合することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、組成物は、活性成分の有効性を増強する、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤などの、少量の補助物質を含んでもよい。本発明の治療用組成物は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。薬学的に許容される塩は、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸により形成される(ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される)酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄の水酸化物などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することができる。生理学的に許容される担体は当技術分野において周知である。代表的な液状担体は、活性成分と水のほかに何の物質も含まないか、生理的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水または両方、例えばリン酸緩衝生理食塩水、などの緩衝剤を含む、滅菌水溶液である。さらに、水性担体は、2種以上の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含むことができる。液体組成物はまた、水に加えてまたは水を除いて液相を含むことができる。このような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油エマルジョンである。特定の障害または状態の治療に有効である本発明で使用される活性薬剤の量は、その障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。「薬学的に許容される担体または希釈剤」なる語句は、身体のある器官または部分から身体の別の器官または部分への対象薬剤の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤���賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクルを意味する。
【００７７】
投与量、投与および有効性
本明細書で使用される「投与する」とは、アポトーシスを誘導する薬剤(例えば、Aktシグナル伝達経路の阻害剤)を、所望の部位での該阻害剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路で対象に配置することを指す。アポトーシスを誘導する薬剤は、対象において有効な治療を生じさせる任意の適切な経路によって投与することができ、すなわち、投与は対象の所望の位置への送達をもたらし、送達された組成物の少なくとも一部、すなわちAktを阻害する少なくとも1種の薬剤は、その所望の部位で一時期活性である。阻害剤が活性である期間は、対象への投与後のインビボでの半減期に依存し、数時間、例えば24時間のように短いことも、数日、数年のように長いこともある。投与経路には、注射、注入、点滴、局所または経口摂取が含まれる。「注射」としては、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射および注入が挙げられる。一態様では、投与経路は局所的である。
【００７８】
脂漏性角化症(SK)を治療する方法では、アポトーシスを誘導する薬剤の有効量が1つ以上のSKを有すると診断された患者に投与される。一態様では、対象は哺乳動物(例えば、霊長類または霊長類以外の哺乳動物)であり得る。別の態様では、哺乳動物をヒトとすることができるが、このアプローチはすべての哺乳動物に関して有効である。一態様では、この方法は、霊長類の対象(例えば、ヒト)に、アポトーシスを誘導する薬剤を含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む。「有効量」とは、治療を受けている対象において所望の治療効果または予防効果をもたらすのに一般的に十分な量または用量を意味する。本明細書に記載される治療のための、アポトーシスを誘導する薬剤の有効量または用量は、モデリング、用量漸増試験または臨床試験などの通常の方法によって、例えば、薬剤送達の投与方法または経路、組成物の薬物動態、障害または状態の重症度および経過、対象の以前のまたは進行中の治療、対象の健康状態および薬物に対する応答、治療する医師の判断などの、通常の要因を考慮に入れて、確認することができる。ヒトへの例示的な用量は、1日あたり対象の体重の約0.001〜約1gの範囲である。
【００７９】
アポトーシスを誘導する薬剤を含む組成物の用量範囲は、その組成物の効力に依存し、かつ所望の効果(例えば、細胞死の増加)を生じるのに十分多い量を含む一方で、投与量は、容認できない有害な副作用を引き起こすほど多くてはならない。一般的に、投与量は、製剤(例えば、経口、局所、静脈内または皮下製剤)によって、さらに患者の年齢、状態および性別によって異なるだろう。投与量は当業者によって決定され、また、合併症の場合には各医師によって調整され得る。典型的には、投与量は0.001mg/日〜500mg/日の範囲である。いくつかの態様では、投与量範囲は、0.001mg/日〜400mg/日、0.001mg/日〜300mg/日、0.001mg/日〜200mg/日、0.001mg/日〜100mg/日、0.001mg/日〜50mg/日、0.001mg/日〜25mg/日、0.001mg/日〜10mg/日、0.001mg/日〜5mg/日、0.001mg/日〜1mg/日、0.001mg/日〜0.1mg/日、0.001mg/日〜0.005mg/日である。あるいは、用量範囲は、5μg/mL〜30μg/mLの血清レベルを維持するように設定される。上に列挙した用量の投与は、限られた期間または必要に応じて繰り返すことができる。いくつかの態様では、用量は1日1回、または1日複数回、例えば限定するものではないが、1日3回、与えられるか、適用される。一態様では、上に列挙した用量は、数週間または数ヶ月にわたって毎日投与される。治療期間は、対象の臨床経過と治療に対する応答性に依存する。継続する比較的低い維持用量は、初期のより高い治療用量の後に企図される。本明細書に記載される方法および組成物において有用な薬剤は、局所的に、静脈内に(ボーラスまたは連続注入による)、経口的に、吸入により、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、体腔内に投与することができ、必要に応じて、蠕動手段により、または当業者に公知の他の手段により送達することができる。SKの治療にはまれであるが、薬剤を全身投与することが可能である。少なくとも1種の薬剤を含む治療用組成物は、慣例的に単位用量で投与することができる。治療用組成物に関して使用される「単位用量」なる用語は、対象に対する単位投与量として適する物理的に別個の単位量を指し、各単位量は、必要な生理学的に許容される希釈剤、すなわち担体、またはビヒクルと共に所望の治療効果を生じるように計算された、活性物質の所定量を含有する。
【００８０】
SKの治療における、アポトーシスを誘導する薬剤を含む治療の有効性は、熟練した臨床医によって判断され得る。しかし、SKの兆候もしくは症状のいずれかまたはすべて、一例として、SKの外観、が好都合に変更され、疾患の臨床的に認められた他の症状またはマーカーが、例えば、阻害剤による治療後に少なくとも10％だけ、改善もしくは軽減される場合、治療は、本明細書で使用される用語である「有効な治療」とみなされる。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、かつ/または本明細書に記載されている。
【００８１】
基準または基準サンプル
「基準レベル」、「基準サンプル」、および「基準」なる用語は、本明細書では互換的に使用され、既知のサンプルにおけるAktシグナル伝達経路のタンパク質(例えば、Akt-1および/またはAkt-2)の発現または活性のレベルを指す。この既知サンプルに対して別のサンプルが比較される(すなわち、脂漏性角化症を有する対象から取得された皮膚サンプル)。標準は、生物学的サンプルにおけるアポトーシスまたは細胞死の量もしくは相対的な増加/減少を測定するために有用である。標準は比較のための基準レベルとして役立ち、対象におけるアポトーシスの存在、非存在または程度を推定するために、サンプルを適切な標準に対して正規化することができる。一態様では、生物学的な標準は、本明細書に記載されるように試験または治療される同じ個体から、治療の開始前に得られる。あるいは、標準は、脂漏性角化症の発症または診断後の時点で採取された、同じ個体からのものであり得る。このような場合には、標準は治療の有効性の尺度を提供することができる。標準レベルは、例えば、脂漏性角化症を実質的に患っていない異なる個体(例えば、試験される個体ではない個体)からの既知の生物学的サンプルから、得ることができる。既知のサンプルはまた、複数の個体からのサンプルをプールすることによって得られ、平均化集団に対する標準を出すことができ、この場合に、標準は個体の集団(例えば、脂漏性角化症(SK)を有する個体の集団)におけるアポトーシスの平均レベルを表す。したがって、このようにして得られた標準のアポトーシスのレベルは、SKを有する個体の一般集団における細胞死の平均レベルの代表的なものである。個々のサンプルは、サンプルからのアポトーシスのレベルを母集団の標準に対して比較することによって、この母集団の標準と比較される。一般的に、標準に対して細胞死の量の増加は、組成物による治療の有効性を示す一方で、アポトーシスの量の減少は、治療がその個体においてSKの症状を低減させるのに有効ではないことを示すであろう。集団内の個体間にはしばしばばらつきがあり、一部の個体はアポトーシスのより高いレベルを有するが、他の個体はより低いレベルを有することに留意すべきである。しかし、当業者は、本明細書に記載されるSKの検出と治療に関して個別的に論理的推論を行うことができる。標準または一連の標準はまた、合成することも可能である。アポトーシスマーカーの既知量(または一連の既知量)を、一般集団で観察される該マーカーの典型的な発現範囲内で調製することができる。この方法は、混合集団内の1以上の個体における疾患の程度を比較することができるという利点を有する。この方法はまた、標準となる事前のサンプルを欠いている対象のために、または診断後の通常の追跡調査のために有用であり得る。この種の方法はまた、いくつかの診療所、機関、または国などの間で標準試験を実施するのを可能にすることができる。
【００８２】
スクリーニングアッセイ
本明細書で想定されるスクリーニングアッセイは、アポトーシスまたはAktシグナル伝達経路活性を調節するモジュレーター、すなわち、候補化合物もしくは試験化合物または候補薬剤もしくは試験薬剤（例えば、ペプチド、抗体、ペプチドミメティック、小分子(有機または無機)、または他の薬物）を同定するために用いることができる。こうしたアッセイは、例えば、細胞死を特にアポトーシスを介して誘導する化合物、例えばAktシグナル伝達経路のモジュレーター、を同定するために設計される。
【００８３】
別の態様では、アッセイは、培養下の脂漏性角化症細胞を候補薬剤と接触させる段階、ならびにアポトーシスおよび/またはAktシグナル伝達経路活性を調節する(例えば、誘導するまたは阻害する)候補薬剤の能力を測定する段階を含む、細胞ベースのアッセイである。
【００８４】
試験化合物または候補薬剤は、当技術分野で知られたコンビナトリアルライブラリー法において、以下を含む、多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「1ビーズ1化合物」(one-bead one-compound)ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である(Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
【００８５】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野で、例えば以下に、見出すことができる：DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233。
【００８６】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、またはビーズ(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌(Ladner 米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner 米国特許第'409号)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)、もしくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner 前掲)上に提示させることができる。
【００８７】
本明細書に記載の方法はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤に関係する。治療介入に関して、アポトーシスおよび/またはAktシグナル伝達経路の活性を調節する治療薬はいずれも、ヒトの治療的介入のための候補として考慮されるべきである。
【００８８】
本発明は、以下の番号を付した項目のいずれかにおいて定義され得る：
1.  脂漏性角化症を有する対象に、Aktシグナル伝達経路を阻害する組成物の治療有効量を投与する段階を含む、対象において脂漏性角化症を治療するための方法。
2.  前記組成物が局所的に適用されるか、または全身的に投与される、第1項の方法。
3.  対象を脂漏性角化症と診断する段階をさらに含む、第1項の方法。
4.  前記組成物の治療有効量が正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない、第1項の方法。
5.  前記組成物が小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子を含む、第1項の方法。
6.  前記組成物がAkt-1および/またはAkt-2阻害剤である、第1項の方法。
7.  前記組成物が薬学的に許容される担体をさらに含む、第1項の方法。
8.  脂漏性角化症細胞を、Aktシグナル伝達を阻害する組成物の有効量と接触させ、それによって、該細胞においてアポトーシスを誘導する段階を含む、脂漏性角化症細胞においてアポトーシスを誘導するための方法。
9.  前記組成物の有効量が正常なケラチノサイトの生存に実質的に影響を及ぼさない、第8項の方法。
10.  前記組成物が小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子を含む、第8項の方法。
11.  前記組成物がAkt-1および/またはAkt-2阻害剤である、第8項の方法。
12.
(a)対象から得られた脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを、ディスパーゼ酵素を含む溶液と、生物学的サンプルからの脂漏性角化症細胞の解離を開始させるのに十分な温度および時間で接触させる段階、ならびに
(b)解離した脂漏性角化症細胞を培養する段階
を含む、脂漏性角化症細胞をエクスビボで培養するための方法。
13.  前記温度が21℃の標準室温を下回る、第12項の方法。
14.  脂漏性角化症細胞の消化を開始させるのに十分な時間が少なくとも15時間である、第12項の方法。
15.  脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを追加のプロテアーゼと接触させる段階をさらに含む、第12項の方法。
16.  追加のプロテアーゼがトリプシンである、第15項の方法。
17.  段階(b)の培養の前に、培地を添加して、前記解離した細胞からより大きな小片をろ過する段階をさらに含む、第10項の方法。
18.  前記解離した細胞が、コーティングされたプレート上で培養される、第10項の方法。
19.  第10項の方法を用いて得られる培養した脂漏性角化症細胞を含む、スクリーニングアッセイ。
20.
(a)脂漏性角化症細胞または脂漏性角化症細胞の集団を候補薬剤と接触させる段階、および
(b)該細胞または細胞の集団におけるアポトーシスを測定する段階
を含む、アポトーシスを誘導するための候補薬剤をスクリーニングするための方法であって、該細胞または細胞の集団におけるアポトーシスの増加によって、該候補薬剤がアポトーシスを誘導することが示される、方法。
21.  候補薬剤がAktシグナル伝達経路の阻害剤を含む、第20項の方法。
22.  脂漏性角化症細胞または脂漏性角化症細胞の集団が第10項の方法を用いて培養される、第20項の方法。
23.  アポトーシスがスルホローダミンB(SRB)アッセイ、MTTテトラゾリウム色素、TUNEL染色、アネキシンV染色、ヨウ化プロピジウム染色、DNAラダリング、PARP切断、カスパーゼ活性化、ならびに/または細胞および核の形態の評価を用いて測定される、第20項の方法。
24.  候補薬剤が小分子、ペプチド阻害剤、またはRNAi分子である、第20項の方法。
25.
(a)解離した脂漏性角化症細胞の集団を候補薬剤と接触させる段階、
(b)段階(a)の細胞を、アポトーシスタンパク質に特異的な検出可能抗体と接触させる段階、
(c)結合した検出可能抗体からのシグナルの強度を測定する段階、
(d)測定されたシグナル強度を基準値と比較する段階、および測定された強度が基準値と比べて増加している場合は、
(e)該候補薬剤を該細胞におけるアポトーシスの誘導物質として同定する段階
を含むアッセイ。
26.  候補薬剤がAktシグナル伝達経路の阻害剤を含む、第25項のアッセイ。
27.  脂漏性角化症細胞の集団が第10項の方法を用いて培養される、第25項のアッセイ。
28.  アポトーシスタンパク質がカスパーゼタンパク質、PARPタンパク質、またはその切断産物である、第25項のアッセイ。
29.
(a)対象から得られた脂漏性角化症細胞を含む生物学的サンプルを、最初はディスパーゼ酵素を、その後はトリプシン酵素を含む溶液と、生物学的サンプルから脂漏性角化症細胞を解離させるのに十分な温度および時間で接触させる段階、ならびに
(b)解離した脂漏性角化症細胞を培養する段階
を含む、脂漏性角化症細胞をエクスビボで培養するための方法。
【００８９】
本発明はさらに、以下の実施例により説明されるが、これらは限定するものとして解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用された全ての参考文献の内容、ならびに図面および表は、参照により本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００９０】
最近の報告は、正常な皮膚と比較したとき、SKがリン酸化Aktの有意に高いレベルを示したことを示しているが、これらの知見の生物学的意義についてはほとんど知られていない。それは、一部には、SKを研究するための努力が、多くの良性腫瘍に共通する問題として、これらの病変からの細胞をインビトロで培養することができないことによって妨げられてきた、という事実に起因する。本発明者らは、この障害を克服し、さらに患者由来の生検SK標本全体を研究室で数日間研究することを可能にする外植技術を開発した。特定のシグナル伝達キナーゼ阻害剤のパネルを用いて、SK細胞の生存に不可欠な分子経路を策定した。具体的には、シグナル伝達キナーゼAktは、SK細胞がプログラムされた細胞死を受けるのを防ぐために極めて重要である。小分子阻害剤とAkt siRNAノックダウンはどちらも、FoxO3活性化を介してカスパーゼ依存性細胞死を誘導する。内因性の野生型p53もまた、良性腫瘍状態を維持する上で、かつAkt阻害後にアポトーシスプログラムを導く上で、重要であるようである。これらの知見に基づいて、本発明者らは、SK細胞のゲノム変化がAktとその下流標的、例えばFoxO3A経路、の構成的活性化をもたらし、これがインビボのみならずインビトロでのこれらSK病変の増殖と生存に不可欠である、と仮定した。
【００９１】
現在のところ、SKの承認された薬理学的治療は存在しない。この良性-悪性スイッチの理解と、おそらくその薬理学的コントロールは、SKならびに良性表皮病変の他の多くのタイプの治療に影響を与えることになるだろう。
【００９２】
実施例1：患者サンプル由来の初代培養物はSKを研究するための新規アプローチである
本明細書に提示されたデータならびに最近発表されたレポート5,7からの証拠は、SK病変における腫瘍形成性ゲノム異常のユニークな組み合わせを指摘している。しかし、これらの変化の分子的結果は、採取された組織における組織学的レベルでの限られた範囲でのみ、または正常な培養ヒトケラチノサイトにおける同様の変化との相関を通してのみ、研究することができる。したがって、本発明者らは、問題に対処する能力を拡張させて、明確に定義されたインビトロ細胞培養系における良性表皮腫瘍の発生の決定因子についての仮説を立てようとした。これは、酵素による消化と物理的組織解離の適切な組み合わせに到達するために、何ヶ月もの苛立たしい試みを必要とする困難な作業になった。注目すべきことに、SKは外科技術によって取り除くことができ、この技術は、全層組織を採取しないが、真皮の保存を目指しており、そのため、ディスパーゼによるインキュベーションの後の表皮の通常の「剥離」をほぼ不可能にする。
【００９３】
本発明者らは、正常ヒトケラチノサイトの初代培養について以前に記載された技術23,24を変更することができ、単一SK細胞懸濁液の単離とその後の培養下での増殖が成功するようにそれを適合させた(図3A)。SK初代細胞の3つの主要なゲノム型が同定された：1)FGFR3に変異あり；2)PIK3CAに変異あり；および3)変異検出されず。図6に示されるようにホットスポット異常について標的遺伝子を配列決定した後で細胞を培養した。この時点で3回までの継代に成功したが、本発明者らは、継代1または2の細胞を用いてすべての実験を実施することを選択した。重要なことは、初代SK細胞のすべてのタイプが培養下でFOXN1の過剰発現を示したことである(図3B)。
【００９４】
実施例2：初代SK細胞は生存のために活性化Aktシグナル伝達に依存する
SK病変の顕著な特徴は生存の増強とアポトーシス速度の低下であることを、かなりの証拠が示唆している25。本発明者らは、この特徴に関与する主要な経路を同定しようとした。SKにおいて以前に特徴づけられたゲノム変化は、受容体チロシンキナーゼシグナル伝達経路の病理学的活性化が、これらのタイプの腫瘍の生存を推進することができる、という事実を指摘している。したがって、キナーゼシグナル伝達の阻害はSK細胞の細胞死を誘導するであろうという仮説を立てた。
【００９５】
初代培養物の脆弱性のために、ハイスループット様式でのRNAiトランスフェクションは困難であることが判明し、このことは、どのキナーゼがSK細胞の生存に必須であって、正常なヒトケラチノサイトの生存には必須でないかを調べるために、特定の小分子キナーゼ阻害剤のコレクションの使用を促した。ゲノム変化(突然変異と過剰発現の両方)に起因する依存性を特異的に標的化するために、このレベルの選択性が導入された。実験は、初代SK細胞の3つのタイプすべて(FGFR3変異あり；PIK3CA変異あり；これらの遺伝子のいずれにも変異なし)を用いて実施したが、驚いたことに、結果は一貫して類似していた(図4)。試験した全20種のキナーゼ阻害剤のうち、3種が60％を上回る死滅効果を有し、唯一の化合物が80％を上回る得点を得た(図4A)。重要なことに、本発明者らは、対応するおよび対応しない正常初代ケラチノサイトにおいて、これらの化合物による多数の細胞死を観察しなかった。このアッセイでSK細胞死誘導物質として評価された化合物は、同じシグナル伝達経路のモジュレーターであった：PI3K/mTORの阻害剤(より弱い活性：化合物11(C11)および12(C12))、および非常に強い活性を有するATP競合性のAkt阻害剤(化合物8(C8)、A-443654 26としても知られる)。
【００９６】
興味深いことに、スクリーニングに含まれていたアロステリックなAkt阻害剤である化合物9(C9、AT7867としても知られる)は、SK細胞の生存に影響を及ぼさなかった。この効果は確認された。SK細胞におけるC8の用量-応答死滅効果は観察されたが、正常なケラチノサイトはより高い用量でさえも影響を受けないままであった。本アッセイでのC8の活性を検証するために、Aktのリン酸化状態をSK細胞において試験したところ、こうしたタイプの分子に特徴的な、AktのT308およびS473での奇異な過剰リン酸化が観察された27,28。最近報告されたように、この過剰リン酸化はATP結合部位における該化合物のドッキングによるものであり、これはAktとその下流標的との相互作用を妨げる27。図5Bに示したように、C8で処理されたSK細胞は確かに、過剰リン酸化されたAktを有するが、重要なことは、Aktの下流のシグナル伝達が中断されたことである(図5C)。ATP競合性阻害剤に対する該細胞の感受性は、アロステリック阻害剤が何の効果も示さなかったことからも再度確認された(図5A)。
【００９７】
SK細胞を別のATP競合性Akt阻害剤(GSK690693, 29)で処理したところ、同様の細胞死の誘導が観察された(図5A)。小分子キナーゼ阻害剤は、通常、一般的なキナーゼに対して高度の特異性を有するが、多くの場合、これらの阻害効果は、異なる用量ではあるが、数種のキナーゼ間で共有されている。このことは、ほとんどの場合に、このアプローチの弱点であると考えられるが、それはまた、対象となるプロセスに関与する他の可能性のある標的に関していくつかの証拠を与えることができる。そこで本発明者らは、(DFCIのN. Gray博士と共同で)それらの標的に対して2つの有効な化合物をプロファイリングして、他のキナーゼがSK細胞の生存に関与している可能性があるかどうかを調べた。驚くべきことに、C8およびGSK690693は数種のオフターゲットのキナーゼに影響を与えるが、AktおよびPKCファミリーのメンバーだけが共有の標的であった(図6B)。したがって、pan-PKC阻害剤をSK細胞で試験したが、死滅効果はまったく観察されなかった(図6C)。このことは、Akt活性の阻害がSK細胞における細胞死にとって確かに不可欠であったことを示している。さらに、本発明者らは、RNAiアプローチを用いたAktファミリーメンバーのダウンモジュレーションによって、これを確認することができた。RNAiを介するAkt 1および2の枯渇(別個にまたは一緒に)は、SK細胞に対する大きな死滅効果を有していた(図6)。
【００９８】
培養下のケラチノサイトの増殖、分化および死は、無傷の皮膚のそれとは重要な側面で相違していることが、今では広く受け入れられている。そこで、SK腫瘍のインビボ状況を厳密に再現するために、本発明者らは、新たに切除したSK病変を最大7日間培養するためのエクスビボ外植システム16を利用した。SK外植片は、1mMのC8の局所適用により48時間処理し、細胞死を検出するために活性化カスパーゼ3について染色した。図7に示したように、エクスビボモデルにおいて、最も効果的なAKT阻害剤C8によるAkt活性の阻害は、SK細胞の顕著な細胞死をもたらした。
【００９９】
したがって、本明細書に記載したデータは、SK細胞が生存のためにAkt経路の構成的活性化に依存しており、そのため小分子またはRNAiに基づく該キナーゼの阻害はこれらの良性腫瘍において急速な細胞死を誘導することができる、ことを示している。
【０１００】
また、ATP競合性Akt阻害剤は、下流のAktシグナル伝達を抑制して、SK細胞においてFoxO3A媒介性細胞死を誘導することができるが、正常なケラチノサイトでは誘導することができない。したがって、本質的にAktシグナル伝達の小分子阻害剤はどれも、SKの薬理学的治療に使用することができる。
【０１０１】
実施例3：Aktシグナル伝達の阻害はFoxO3/p53介在機構を通してSK細胞において細胞死を引き起こす
細胞におけるAktの活性化が、さまざまな標的経路の活性化/抑制を通して、生存促進効果を誘発することが知られていることは、十分に確立されている。Akt阻害時の細胞死に共通するメカニズムの1つは、アポトーシスの誘導であり、これはまた、切断PARPレベルと陽性TUNEL染色によって検出されるように、C8によるSK細胞の処理の際にも観察された(図8A, 8B)。
【０１０２】
したがって、Aktの代表的なプロアポトーシス標的のどれかがこのプロセスに関与するのかどうかを検討した。FoxOl/3のリン酸化レベルならびにリン酸化MDM2の減少が観察され、これはAkt阻害剤で処理した時のp53レベルの増加と相関していた(図8C)。重要なこととして、初代SK細胞においてsiRNAを介してFoxO3発現(直接的なAkt標的30)および/またはp53(間接的なAkt標的31,32)を枯渇させたとき、本発明者らは、初代SK細胞におけるAkt阻害剤の死滅効果をレスキューすることができた。これらのデータは、Aktの阻害がFoxO3リン酸化の減少、および同時に起こるp53レベルの、おそらくMDM2からの放出を介した、増加を媒介し31,32、最終的にアポトーシスを促進する、ことを示している(図9)。
【０１０３】
実施例4：脂漏性角化症細胞を培養するための例示的なプロトコル
ここでは、生物学的サンプルからのSK細胞を培養するための以下の例示的な方法が提供される。この方法は、本発明を以下のプロトコルに限定するものとして解釈されるべきでない。
【０１０４】
SK細胞の培養：
1.  ペニシリン-ストレプトマイシン(GIBCO, 15140-122)を含む、滅菌DPBS中にSK標本を収集する。40で保管する。
2.  プレディスパーゼ溶液を調製する：
250mlのハンクス平衡塩溶液-HBSS (Gibco 14170-088)
2.5mlのろ過された1.0M HEPES (GIBCO, 15630)
2.5mlのろ過された7.5％重炭酸ナトリウム
3.  ディスパーゼ溶液を作る：
プレディスパーゼ溶液中10mg/mlのディスパーゼ、および
0.2ミクロンのフィルターでろ過する
4.  SK片を上に向けて適切な容器(通常は12ウェルプレート)に入れる。SKが浮くまでSKのまわりに約0.5mlのディスパーゼ溶液を加える。
5.  少なくとも18時間(最大24時間)4Cに置く。これが非常に重要である
翌日：
6.  50mlファルコンチューブに5mlのトリプシン-EDTAを加えて、それを27Cに温める。ディスパーゼからSK片を取り出し、それらをトリプシン-EDTA中に置く。チューブをインキュベーター内に配置して、37Cで5〜7分間維持する。その期間中、数回、チューブを慎重にボルテックスする。
7.  10mlのDMEM+10％FBSをチューブに加え、混合し、セルストレーナーを使って、残されたより大きな小片を取り除く。
8.  1000rpmで10分間遠心分離する。
9.  細胞をHKC培地中に再懸濁し、コラーゲンをコーティングしたプレート上に播く。
10.  培地を1日おきに変える。
【０１０５】
これらの研究は、良性表皮腫瘍が生存のためにAktシグナル伝達の活性化に依存することを示している。本明細書に記載した実験は、以前に記載されたSKのゲノム変化がこの経路の活性化に寄与し得るかを明らかにするために、さらに生存促進効果の伝達に関与しているその下流標的を同定するために、設計されたものである。
【０１０６】
最近の報告では、表皮SKは一般的に、FGFR3、PIK3CA、HRAS、EGFRおよびAKT1などのキー癌遺伝子に体細胞変異を保有することが示されている5,7,33。これらの変化は、ケラチノサイトにおける2つの必須の分子経路の直接制御を表している：ERK/MAPKおよびPI3Kシグナル伝達カスケード。同様に、SKの病因に関する本発明者らの以前の研究はまた、種々の受容体チロシンキナーゼ、成長ホルモンおよび転写因子の過剰発現を含めて、同じシグナル伝達経路の上流の異常を同定した8。まとめると、これらのデータは、ERK/MAPKおよびPI3K経路が、成長の促進、アポトーシス応答の抑制/生存の増加を特徴とする、これらの病変の良性腫瘍表現型に関与している、ことを示している7。本明細書に記載したデータは、SKにおけるゲノム変化の多様性にもかかわらず、SK細胞の増殖依存性が活性化されたAktシグナル伝達に収束することを示している。この仮説は、異なる変異を保有するSK患者サンプルにおいて、それらの隣接する健康な表皮と比較したとき、Aktのリン酸化が増加しているという証拠によって、さらに支持される(図10)。また、p53の変異はSKにおいて検出されなかったが7、これらの病変の抑制されたアポトーシス応答は、一部には、同じ患者サンプルにおける間接的Aktエフェクター、p53のレベルの低下に起因する可能性がある(図10)。
【０１０７】
さらに、本明細書に記載したデータは、初代SK細胞におけるGSK3βのリン酸化の阻害がAkt阻害剤の有効性を予測するための強力な判断材料になることを示している(図11)。
【０１０８】
引用文献：
以下の参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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