(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第９染色体の８４８５８３４番目の塩基における一塩基多型を検出する工程、並びに検出された一塩基多型における塩基がアデニンである場合に非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクが高いと判定することを補助する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定を補助する方法。
【請求項２】
以下のａ）又はｂ）のオリゴヌクレオチドの一種以上を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定用キット。
ａ）ヒト第９染色体の８４８５８３４番目の塩基における一塩基多型を含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマーセット用オリゴヌクレオチド
ｂ）ヒト第９染色体の８４８５８３４番目の塩基における一塩基多型を含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子多型の検出を含む非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定方法、並びに該判定用のオリゴヌクレオチドキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎、脂肪肝又は肝硬変などは、最終的には肝がんに至る肝障害の代表例であり、その早期発見と早期治癒は医療上重要な意義を有する。従来、前記肝障害は、肝炎ウイルスへの感染の他、アルコールの多飲による肝組織における脂肪蓄積を原因とする場合が多かった。しかし近年、アルコールの多飲以外の、肥満、糖尿病、高血圧などの生活習慣病が起因となって肝障害が生じ、さらに肝がんに至る症例の増加が問題となっている。
【０００３】
アルコールの多飲を原因としない脂肪性肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（Ｎｏｎ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＡＦＬＤ）と呼ばれており、ＮＡＦＬＤはさらに、肝細胞での脂肪沈着のみを特徴とする単純性脂肪肝と、脂肪沈着に加えて炎症や線維化が起こる非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎ  ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）に分けられる。以下、これらを纏めてＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと表す。
【０００４】
食生活の欧米化及び慢性的な運動不足によってＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと診断される患者数、さらには肝がん全体に占めるＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ等の肝障害が原因となる肝がんの割合も増加してきており、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの早期発見及び治療への介入は、重要な課題となってきている。
【０００５】
ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症には、食生活、運動習慣などの環境要因の他に、患者本人の遺伝的要因が関与すると考えられており、これまでにもＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症と関連のある遺伝子多型、特に一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）がいくつか報告されている（例えば非特許文献１及び非特許文献２）。
【０００６】
しかし、人種によりＳＮＰの頻度は異なることもあり、日本において遺伝子多型の検出を利用したＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの診断技術は確立していない。また、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症に関わる詳細な分子機構も未だ明らかにされていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄｏｍｅｎｉｃｉら、Ｇｅｎｅ、２０１３年、第５２９巻、第２号、第３２６−３３１ページ
【非特許文献２】Ｈｅｒｎａｅｚら、Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．、２０１３年、第１１巻、第９号、第１１８３−１１９０ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの早期発見を可能にする遺伝子多型の検出を利用したＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスクの判定技術の確立を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと臨床的に診断された複数の患者について遺伝子多型の存在を解析することで、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症と関連性のある複数のＳＮＰを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【００１０】
（１）米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示されるＳＮＰであって、ヒト第１番染色体上のＥＸＯ１遺伝子におけるｒｓ１０４７８４０、ヒト第２染色体上のＨＫ２遺伝子におけるｒｓ２２２９６２９、ヒト第９染色体上のＰＴＰＲＤ遺伝子におけるｒｓ３５９２９４２８、ヒト第２１染色体上のＩＦＮＡＲ２遺伝子におけるｒｓ２２２９２０７及びヒト第２１染色体上のＦＡＭ３Ｂ遺伝子におけるｒｓ１１１９８８４３７よりなる群から選択される一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定方法。
（２）ｒｓ１０４７８４０、ｒｓ２２２９６２９、ｒｓ３５９２９４２８、ｒｓ２２２９２０７及び／若しくはｒｓ１１１９８８４３７の塩基がアデニンの場合に、並びに／又はｒｓ２２２９２０７の塩基がシトシンの場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクが高いと判定する工程をさらに含む、（１）に記載の判定方法。
（３）前記ＳＮＰがｒｓ３５９２９４２８である、（１）又は（２）に記載の判定方法。
（４）以下のａ）又はｂ）のオリゴヌクレオチドの一種以上を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定用キット。
ａ）（１）から（３）のいずれかに記載のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド
ｂ）（１）から（３）のいずれかに記載のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチド
【発明の効果】
【００１１】
本発明におけるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスク及び／又は重症化リスクを判定するためのマーカーとして利用可能である。これにより、早期にＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスク、及び発症したときの重症化リスクを判定することが可能となり、リスクが高い人に関しては、より頻繁に検診を受ける及び／又は生活習慣を改善するなどの指導を与えるなどによって、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症及び／重症化を抑制することができるものと期待される。また、前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを有する各遺伝子は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ感受性遺伝子としてこれらの疾患の検出用マーカー遺伝子として利用可能である他、各遺伝子にコードされるタンパク質、特にＰＴＰＲＤを分子標的としたＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの治療法・予防方法への実用化も期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ患者におけるｒｓ３５９２９４２８及びｒｓ７３８４０９の各アレルの検出頻度を示すグラフである。
【図２】ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ患者におけるｒｓ３５９２９４２８及びｒｓ７３８４０９の各アレルの検出頻度とＦＩＢ−４  ｉｎｄｅｘとの関係を示すグラフである。
【図３】ヘマトキシリンエオジン染色（上）又は抗ＰＴＰＲＤ抗体で免疫組織化学染色（下）したＮＡＳＨ患者肝組織の顕微鏡観察像である。
【図４】抗ＰＴＰＲＤ抗体で免疫組織化学染色した正常マウス（上）及び高脂肪食負荷マウス（下）の肝組織の顕微鏡観察像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明における一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）は、ヒトのゲノム配列において、国際標準配列（ＧＲＣｈ３７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ｇｒｃ／、又はｈｇ１９、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｄｂ＝ｈｇ１９）と比較して母集団中１％以上の頻度で存在する、一塩基の多様性をいう。本明細書では、ＳＮＰは、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ）のリファレンス番号であるｒｓ番号によって特定される。また、連鎖不均衡とは２つの密に連鎖した遺伝子座における特定の対立遺伝子の組み合わせ出現頻度が、それぞれの遺伝子頻度から推定される期待値と異なる場合をいい、本発明において連鎖不平衡にあるＳＮＰとは、本発明においてｒｓ番号で特定されるいずれかのＳＮＰとの間の連鎖不平衡係数（ｒ２）が０．８以上であるＳＮＰをいう。
【００１４】
本発明は、ヒト第１番染色体上のＥＸＯ１遺伝子におけるｒｓ１０４７８４０、ヒト第２染色体上のＨＫ２遺伝子におけるｒｓ２２２９６２９、ヒト第９染色体上のＰＴＰＲＤ遺伝子におけるｒｓ３５９２９４２８、ヒト第２１染色体上のＩＦＮＡＲ２遺伝子におけるｒｓ２２２９２０７及びヒト第２１染色体上のＦＡＭ３Ｂ遺伝子におけるｒｓ１１１９８８４３７よりなる群から選択される一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクの判定方法に関する。
【００１５】
ヒト第１番染色体上のＥＸＯ１遺伝子はｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ１を、ヒト第２染色体上のＨＫ２遺伝子はｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ２を、ヒト第９染色体上のＰＴＰＲＤ遺伝子はｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｄを、ヒト第２１染色体上のＩＦＮＡＲ２遺伝子はｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α  ｒｅｃｅｐｔｏｒ２を、ヒト第２１染色体上のＦＡＭ３Ｂ遺伝子ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ３，ｍｅｍｂｅｒ  Ｂを、それぞれコードする遺伝子である。
【００１６】
後の実施例に詳細に説明するように、上記ＳＮＰは、健常人と比較して臨床的にＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと診断された患者において高い頻度で存在することが確認されたＳＮＰである。各ＳＮＰの染色体上の位置、ｒｓ番号、塩基置換、アミノ酸置換、患者又は健常人における頻度及びＰ−ｖａｌｕｅを表１に示す。
【００１７】
【表１】
0006494356.tif 000002
【００１８】
本発明の判定方法は、具体的にはｒｓ１０４７８４０、ｒｓ２２２９６２９、ｒｓ３５９２９４２８、ｒｓ２２２９２０７及び／若しくはｒｓ１１１９８８４３７の塩基がアデニンの場合に、並びに／又はｒｓ２２２９２０７の塩基がシトシンの場合に、非アルコール性脂肪性肝疾患及び／又は非アルコール性脂肪肝炎の発症リスク及び／又は重症化リスクが高いと判定するものである。
【００１９】
本発明で特定されるＳＮＰは、いずれもそれを含む各遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸置換を伴うものであることから、かかるタンパク質の何らかの機能変化がＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスク若しくは重症化リスク、又は発症若しくは重症化そのものに関与すると推察される。
【００２０】
特に、ＰＴＰＲＤの９９５番目のアルギニン（Ｒ）をシステインに変異させる（Ｒ９９５Ｃ）ＳＮＰであるｒｓ３５９２９４５８は、タンパク質におけるアミノ酸置換の影響を予測するプログラムであるＰＲＯＶＥＡＮ  Ｓｃｏｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｖｅａｎ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）によると、ＰＴＰＲＤの機能に影響を与え得る変異であると推測される。
【００２１】
ＰＴＰＲＤは、免疫グロブリンドメイン及びフィブロネクチンドメインを含む細胞外ドメインと、タンパク質のチロシン残基における脱リン酸化に関与する細胞質ドメインとを有する、一回膜貫通型のレセプタータンパク質である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／５７８９）ことから、ＰＴＰＲＤは、細胞質内タンパク質の脱リン酸化を介してＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症又は症状の進行に関与していると推定される。したがって、ＰＴＰＲＤ又はその脱リン酸化によって機能が制御されている細胞質内タンパク質は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの予防又は治療に用いることのできる医薬の標的分子となり得る。
【００２２】
また、ＰＴＰＲＤはレセプタータンパク質であることから、その活性制御を指標とすることでＰＴＰＲＤに対するアゴニスト、アンタゴニスト又は活性調節物質を検出することができ、それらはＰＴＰＲＤの機能制御を介したＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの予防用又は治療用の医薬となり得る。このように、本発明はＰＴＰＲＤの活性制御を指標とした、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの予防又は治療に用いることのできる化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００２３】
本発明の方法による判定対象は、ヒト、特にアジア人種とりわけ日本人である。また、ＳＮＰの検出は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡのいずれの核酸について行ってもよい。また、かかる核酸は、被験者から採取される任意の生物学的試料、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、精液、腹腔液等の体液、又はバイオプシー等によって得られる組織細胞等から、常法にしたがって抽出、精製、調製することができる。
【００２４】
本発明により特定されるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、当業者に知られた従来の方法にしたがって検出することができる。そのような方法としては、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ等の、ＰＣＲによってＳＮＰを含む増幅断片を利用する方法、ＤＮＡシーケンサーなどを用いたＳＮＰを含む塩基配列を直接決定する方法、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含むマイクロアレイによる検出方法、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）又はインベーダー法などを挙げることができるが、これらには限定されない。
【００２５】
増幅断片を利用する方法の一つは、目的となるＳＮＰを有する場合にのみ増幅断片が生じるよう、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方がそのＳＮＰにハイブリダイズするように設計されたプライマーセットを用いた方法を挙げることができる。かかるプライマーセットを使用することにより、増幅断片が生じたかどうかで目的とするＳＮＰを検出することが可能となる。
【００２６】
また、増幅断片を利用する別の方法は、目的とするＳＮＰを含む領域が増幅されるように設計されたプライマーセットを用いた方法である。かかるプライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅断片のサイズ、塩基配列、高次構造などの差異に基づいて、ＳＮＰを検出することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などを用いたときの増幅断片の移動度の違いから、目的とするＳＮＰを検出することができる。
【００２７】
また、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。例えば、適当なプライマーセットを用いてＳＮＰを含む増幅断片を調製し、目的とするＳＮＰに応じて独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で増幅断片を切断し、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などを用いたときの切断物の移動度の違いから、目的とするＳＮＰを検出することができる。
【００２８】
なお、上記の増幅断片又は切断物の塩基配列を直接決定することによって、目的とするＳＮＰを検出してもよい。また、増幅断片又は切断物を熱変性によって一本鎖ＤＮＡとした後、これをゲル電気泳動によって分離し、塩基配列の変化による移動度の変化を解析する、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）によって目的とするＳＮＰを検出してもよい。
【００２９】
ＳＮＰは、一のＳＮＰに特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって検出することもできる。プローブは、前記のＳＮＰを含み、生物学的試料から調製したＤＮＡ等とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り、いかなるものでもよい。
【００３０】
プローブとしては、例えば前記ＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、ＳＮＰがプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の遺伝子多型の配列とハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。
【００３１】
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、遺伝子多型を区別するのに十分な条件である。例えば、生物学的試料から調製したＤＮＡ等が遺伝子多型の一のアレルである場合にはハイブリダイズするが、他のアレルである場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
【００３２】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、遺伝子多型の一のアレルに対応するプローブのみが固定されていても、遺伝子多型の複数のアレルに対応するプローブが固定されていてもよい。
【００３３】
本発明において好ましい方法は、ＰＣＲによる遺伝子増幅を用いた方法、特に操作が簡便で且つ信頼性の高いＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲである。具体的には、目的とするＳＮＰを含む領域を増幅できるプライマーオリゴヌクレオチドセットと、各アレルに相補的な配列を有する、ＳＮＰの塩基変異に対応するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ２種類を用いて、ＰＣＲを行なう。
【００３４】
上記のＳＮＰを検出する方法の多くは、それぞれの原理に応じたオリゴヌクレオチド、例えば遺伝子増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチド、またはハイブリダイゼーション用のプローブオリゴヌクレオチドを必要とする。これらは、各方法の原理及び検出対象となるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。本発明にかかる特定のＳＮＰの検出のためのオリゴヌクレオチドもまた、採用される検出方法の原理及び本発明で特定されるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。
【００３５】
本発明は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスク及び／又は重症化リスクの判定用キットを提供し、該キットは、ａ）前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド、又はｂ）前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチドを含む。
【００３６】
本発明のキットに含まれるオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰの検出方法において説明したように、採用される検出方法の原理及び本発明で特定されるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。
【００３７】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドの他に、遺伝子多型を検出する各方法に適した試薬、反応成分その他を含んでいてもよい。例えば、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また、上記オリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されたマイクロアレイとしてキットに含まれてもよい。
【００３８】
本発明のＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスク及び／又は重症化リスクの判定用キットにより、被験者の発症リスク又は重症化のリスクを簡便かつ迅速に診断することが可能となり、その診断結果に応じて適切な処置を施すことができる。
【００３９】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
血液検査、超音波、ＭＲＩ及び／又はＣＴなどの画像検査、並びに肝生検組織の病理診断（確定診断）によってＮＡＳＨと診断された患者３４名、及び健常人３１名からそれぞれから末梢血８ｍＬを採取し、Ｆｉｃｏｌｌ比重遠心法により単核球を分離後、シリカゲルカラムを用いてＤＮＡを抽出、精製した。なお、上記患者及び健常人はいずれも、ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針を準拠し、旭川医科大学の倫理委員会で審査され承認された本研究の内容を理解し、研究協力に同意した者である。
【００４１】
炎症性腸疾患、膵疾患、肝疾患症、血液疾患及び金属代謝疾患の各疾患との関連性が報告されている遺伝子、ならびに前記各疾患に関連する代謝、免疫又はシグナル伝達に関連する遺伝子を選出し、ここから重複する遺伝子及びアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の設定が不可能な遺伝子を削除した計１０３１遺伝子を、ＳＮＰを解析する対象遺伝子として決定した。対象遺伝子の全エクソン領域をカバーするように、計１２６０９個のアンプリコンに分割し、それぞれに対するプライマーセットを作成した。
【００４２】
５０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとし、５つのプライマープールを用いてＰＣＲを行ってアンプリコンを作成した後、製造者のプロトコルに従って高出力シークエンサーＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用してＤＮＡ配列を解析し、上記１０３１遺伝子に関するＳＮＰ解析を行った。解析にあたって、予備的シークエンスを２回施行し、各アンプリコンの解析長と被覆率が検討に十分なことを確認した。
【００４３】
全サンプルで国際標準配列（リファレンス）とシークエンス配列とを比較し、患者群と健常人群において計４０４３のリファレンスとの相違を検出した。この相違から、患者と健常人との遺伝子異常の出現頻度の差をフィッシャー検定におけるｐ値＜０．０５を有意として、かつアミノ酸置換を伴う遺伝子多型を候補遺伝子として、表１に示す１１種類のＳＮＰが候補として抽出された。
【００４４】
【表２】
0006494356.tif 000003
【００４５】
表２に示されるＳＮＰについて、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｓｓａｙ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）により検証を行った。その結果、前記表１に示すＳＮＰが高出力シークエンサーで得られた結果と一致することが確認された。
【００４６】
さらに、ＰＲＯＶＥＡＮ  Ｓｃｏｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｖｅａｎ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を利用して、各ＳＮＰによるアミノ酸置換が各遺伝子にコードされるタンパク質の機能に影響を予測した結果、ｒｓ３５９２９４２８におけるグアニンからアデニンへの塩基置換により生じるＰＴＰＲＤ  Ｒ９９５Ｃ、すなわち９９５番目のアルギニンがシステインに置換されたＰＴＰＲＤは、機能異常を引き起こすと判定された。
【００４７】
さらに、検体数をＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨと診断された患者５１名及び健常人ボランティア４５名へと増やし、ＴａｑＭａｎ  ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ａｓｓａｙを用いてｒｓ３５９２９４２８について検証を行った。また、これまでにＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤ関連ＳＮＰとして報告されている多型ＰＮＰＬＡ３  ｒｓ７３８４０９（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  Ｔら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（６）：ｅ３８３２２）の頻度と比較した。
【００４８】
その結果、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨと診断された患者の２９．４％が、ｒｓ３５９２９４２８がＡであるアレル（図１左におけるＳＮＰ（＋））を有することが確認された。また、ｒｓ３５９２９４２８は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤと健常人ボランティアの比較によりＰ＝０．０１０６、オッズ比４．２７１（９５％  ＣＩ  １．３０−１４．０５）と、疾患そのものの発症に強く関連していることが確認された。一方、既報のｒｓ７３８４０９がＧであるアレル（図１右におけるＳＮＰ（＋））は、Ｐ＝０．２３２８、オッズ比０．６４７（９５％  ＣＩ  ０．２６−１．５８）であり、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症には関連していないものと考えられる。
【００４９】
また、臨床的にＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの線維化進展度の指標として用いられるＦＩＢ−４  ｉｎｄｅｘと、ｒｓ３５９２９４２８及びｒｓ７３８４０９の各アレルの検出頻度との関係を解析した。その結果、ｒｓ３５９２９４２８がＡであるアレル（図２左におけるＳＮＰ（＋））の検出頻度は、ＦＩＢ−４  ｉｎｄｅｘ低値群と比較して高値群では４倍程度高くなった。一方、ｒｓ７３８４０９がＧであるアレル（図２右におけるＳＮＰ（＋））の検出頻度は、ＦＩＢ−４  ｉｎｄｅｘ低値群と比較して高値群で１．４倍程度高くなった。以上から、ｒｓ３５９２９４２８はＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの病態進行にも関連していることが明らかとなった。
【００５０】
＜試験例１＞
肝臓におけるＰＴＰＲＤタンパク質の発現がＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの病態に関連があるかどうかを解析するために、ＮＡＳＨ患者及び高脂肪食負荷マウスの肝組織を用いて抗ＰＴＰＲＤ抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。その結果、ＮＡＳＨ患者、高脂肪食負荷マウスいずれの肝組織においても、脂肪沈着の伴う肝細胞においてＰＴＰＲＤ蛋白質の陽性像が認められた（図３、図４）。この結果から、ＰＴＰＲＤ蛋白質は肝細胞への脂肪沈着に関与することが示唆された
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症リスク及び重症化リスクの判定方法としての利用可能性を有し、これにより、リスクが高い人に関しては、より頻繁に検診を受ける及び／又は生活習慣を改善するなどの指導を与えるなどによって、ＮＡＳＨ／ＮＡＦＬＤの発症及び／重症化を抑制することができるものと期待される。
【図１】
0006494356.tif 000004
【図２】
0006494356.tif 000005
【図３】
0006494356.tif 000006
【図４】
0006494356.tif 000007