(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、軽度認知障害を検査する方法（但し、人間に対する医師による診断行為を除く）
（ａ）被検体から分離された生体試料における、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９１の発現レベルを検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したｍｉＲＮＡの発現レベルから前記被検体が軽度認知障害を有している確率を算出し、当該確率が閾値と比較して高い場合、前記被検体が軽度認知障害を有していると判断する工程。
【請求項２】
請求項１に記載の方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、
少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１にハイブリダイズするオリゴヌクレオド、及び
少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１にハイブリダイズする、オリゴヌクレオド
を含む薬剤。
【請求項３】
前記工程（ａ）が、被検体から分離された生体試料における、下記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１のｍｉＲＮＡの発現レベルを、更に検出する工程である、請求項１に記載の軽度認知障害を検査する方法（但し、人間に対する医師による診断行為を除く）
ｍｉＲＮＡ群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２。
【請求項４】
請求項３に記載の方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、
少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１にハイブリダイズするオリゴヌクレオド、
少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有し、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１にハイブリダイズするオリゴヌクレオド、及び
少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有し、下記オリゴヌクレオチド群から選択されるいずれかのｍｉＲＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１のオリゴヌクレオチドを含む薬剤
ｍｉＲＮＡ群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽度認知障害を検査する方法、又は該方法に用いられる薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）等の認知症は、主に初老期〜老年期に生じる進行性の神経変性疾患である。その主な症状は、記憶障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化等である。そして、このような症状故、患者本人の生活の質の低下のみならず、家族等の周囲の生活にも多大な影響を与えている。さらに、その患者数は人口の高齢化に伴い増加の一途を辿っており、認知症は世界的に現代社会の抱える深刻な問題となっている。
【０００３】
かかる状況に関し、認知症の症状の進行を遅らせることは可能となりつつある。特にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤が実際に臨床の場で使用されそれなりの成果をあげ、症状の進行をある程度抑えることも可能になっている。そのため、認知症の治療においては、早期又は発症前診断法の開発が喫緊の課題となっている。
【０００４】
認知症が発症する前段階、すなわち軽度の臨床的症状が現れる段階は、軽度認知障害（ＭＣＩ）と称され、それは正常な老化（健常状態）と認知症との中間段階として定義されている。そして、軽度認知障害を検査する方法として、様々な神経心理学的検査が主に用いられており、例えば、見当識、短期及び長期の記憶、行動、言語及び理解について検査し、認知障害をスコア化する、フォルスタインのミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）が用いられている。しかしながら、このような問診法はあくまでスクリーニング目的で用いられ、確定診断に至ることはない。
【０００５】
また、認知症の検査方法としては、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ等の画像診断等の開発が進められている。しかしながら、画像診断には特殊な設備を必要とするため、実施できる医療機関が限られる。また現状の画像診断技術により、認知症が発症する前段階と健常状態等との差を捉えることは依然として難しいため、画像を見る医師によって判断が異なることがあり、客観性に欠けるという欠点も有する。
【０００６】
このように、客観的かつ精度高く軽度認知障害の患者と健常者とを判別できる方法は、確立していないのが現状である。そのため、血液のような容易に得られる被検体の試料を用い、客観的な診断を可能にするバイオマーカーの探索が、軽度認知障害の検査方法において重要視されている。
【０００７】
近年、このような容易かつ、客観的な診断を可能にするバイオマーカーとして、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、約２２塩基の蛋白質非翻訳ＲＮＡであり、ヒトには約１０００種類以上存在することが示唆されている。また、ｍｉＲＮＡは生体内で様々な遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されており、かかる機能故、ｍｉＲＮＡは疾患と広く関連していることが示唆されている。さらに、ｍｉＲＮＡは、細胞から放出される小胞等に包まれて安定に存在し、血中を循環していることも明らかになっているため、前述の通り、各種疾患のバイオマーカーとして注目されている。
【０００８】
特にがんとｍｉＲＮＡの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのｍｉＲＮＡの発現様式が異なることが明らかにされつつある。例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０及びｈｓａ−ｍｉＲ−９３等のｍｉＲＮＡから構成されるｍｉＲ−１７  ファミリーが、癌と高い相関性を示し、バイオマーカーとして有用であることが報告されている（非特許文献１）。また、アルツハイマー病に関しては、当該患者の血清中のｍｉＲ−１２５ｂ濃度が健常人よりも低く、該疾患と高い相関性が認められたため、ｍｉＲ−１２５ｂはアルツハイマー病のバイオマーカーとして有用であることが報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
しかしながら、アルツハイマー病等の前段階である軽度認知障害に関しては、未だ有用なバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡは見出されておらず、精度高く軽度認知障害を検査できる方法は未だ開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｍｏｇｉｌｙａｎｓｋｙ  Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ、２０１３年、２０巻、１６０３〜１６１４ページ
【非特許文献２】Ｔａｎ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．、２０１４年、１５巻、３３６（１−２）、５２〜５６ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することを可能とするｍｉＲＮＡを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、３０の健常体対照群及び２３の軽度認知障害（ＭＣＩ）の患者群の血漿サンプル由来のｍｉＲＮＡにて構成されたデータセット（１４３のｍｉＲＮＡ）を対象として、共発現差解析（ｍｉＲＮＡの発現レベルと健常状態との相関係数と、軽度認知障害におけるそれとの差の解析）を行った。また、このような発現差解析において、従来からよく利用されている伝統的な解析法であるｔ検定も前記データセットを対象として行った。
【００１３】
その結果、伝統的な解析法であるｔ検定によって選択された上位２２のｍｉＲＮＡは、共発現差解析によって選択されたそれらとはかなり異なっていた（後述の表５  参照）。さらに、共発現差解析によって選択された２０のｍｉＲＮＡからなる２０のペアの中から、２ペアを組み合わせて用いた場合、それらｍｉＲＮＡの発現レベルを指標として、ＡＵＣ値が０．９００以上という極めて高い精度にて健常体と軽度認知障害患者とを判別できる組み合わせを８３も得ることができた。また、共発現差解析によって選択された上位５個のｍｉＲＮＡからなる３つのペアを組み合わせて用いることによっても、０．８９９という極めて高いＡＵＣ値を達成することができた。
【００１４】
このように、伝統的な解析法であるｔ検定では得ることのできなかった、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することを可能とするｍｉＲＮＡのペアを、共発現差解析によって検出することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、軽度認知障害を検査する方法、又は該方法に用いられる薬剤に関し、より具体的には以下の通りである。
＜１＞  下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、軽度認知障害を検査する方法
（ａ）被検体から分離された生体試料における、下記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも２のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したｍｉＲＮＡの発現レベルから、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定する工程、
ｍｉＲＮＡ群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２。
＜２＞  ＜１＞に記載の方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、下記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１のｍｉＲＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオドを含む薬剤
ｍｉＲＮＡ群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２。
【００１５】
本発明において、「軽度認知障害（ＭＣＩ：Ｍｉｌｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）」とは、Ｐｅｔｅｒｓｅｎらが定義するところにより、正常な老化（健常状態）と認知症との中間段階にある症状のことであり、認知機能（記憶、決定、理由づけ、実行等）のうち１つの機能に問題が生じてはいるが、日常生活には支障がない、下記５つの条件に合う症状を意味する。
１．記憶障害の訴えが本人または家族から認められている
２．日常生活動作は正常
３．全般的認知機能は正常
４．年齢や教育レベルの影響のみでは説明できない記憶障害が存在する
５．認知症ではない
（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００１年、５８巻、１９８５〜１９９２ページ、Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．、２００５年、６２巻、１１６０〜１１６３ページ  参照）。
【００１６】
本発明の検査方法の対象となる「被検体」としては、ヒトであれば良いが、通常１８歳以上であり、好ましくは６０歳以上、より好ましくは６５歳以上、さらに好ましくは７０歳以上である。また、「被検体から分離された生体試料」としては、被検体（ヒトの生体）から摘出され、その由来の生体と完全に隔離されている状態にある、血漿、血清、血液、脳脊髄液、リンパ液、尿、唾液等の体液、脳神経組織（特に神経学的生検組織）等の組織、細胞が挙げられるが、被検体に対する侵襲性が低いという観点から、血漿が好ましい。
【００１７】
また、本発明の検査方法において、検出の対象となるｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００９９によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）のアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４４０によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００１０１によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２７９によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２２２によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２２７によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００７４によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００２８０によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００３２５８によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００７３２によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４２３によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−２４は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００８０によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００５１０によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００４５９７によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００７５によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００１０３によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００６３によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００００７２によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ０００２１７４によって規定されるｍｉＲＮＡである
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２は、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号：ＭＩＭＡＴ００００４３８によって規定されるｍｉＲＮＡである。
【００１８】
このように、本発明にかかるｍｉＲＮＡは、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号によって特定されるｍｉＲＮＡである。しかしながら、ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子のＤＮＡ配列は、その変異等により、自然界において（すなわち、非人工的に）変異し得る。したがって、本発明においては、このような天然の変異体も、対象となり得る。また、本発明にかかるｍｉＲＮＡは、上述の通り、典型的には、ｍｉＲＢａｓｅデータベースのアクセッション番号によって特定される、２０〜２５ヌクレオチド程度の成熟ｍｉＲＮＡによって特定されるものである。しかしながら、成熟ｍｉＲＮＡの発現レベルは、成熟ｍｉＲＮＡの前駆体である、ヘアピン形態をとり、かつ７０ヌクレオチド程度のｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、ひいてはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの前駆体であるＰｒｉｍａｒｙ  ｍｉＲＮＡ転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の発現レベルに依存するものである。したがって、本発明においては、上記成熟ｍｉＲＮＡに限定されず、それらのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡも、対象となり得る。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することが可能となる。例えば、上記ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１等の２０のｍｉＲＮＡからなる２０のペアの中から、２ペアを組み合わせて用いた場合、それらｍｉＲＮＡの発現レベルを指標として、ＡＵＣ値が０．９００以上という極めて高い精度にて健常体と軽度認知障害患者とを判別することができる。また、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる３つのペアを組み合わせて用いることによっても、ＡＵＣ値が０．８９９という極めて高い精度にて判別することもできる。
【００２０】
さらに、本発明の軽度認知障害の検査方法においては、ｍｉＲＮＡの発現レベルを指標とするため、医師等による判断の差異に依らず、客観的に軽度認知障害を検査することも可能となる。
【００２１】
また、本発明の検査方法の対象となるｍｉＲＮＡは、発現の相関性に基づいて（共発現差解析によって）選抜されたものである。したがって、かかる共発現差解析に基づく本発明によれば、ｔ検定のような単なる発現差解析において、しばしば発生する低発現所見による偽陰性の見落としが回避され、安定性高く軽度認知障害を検査することも可能となる。
【００２２】
さらに、本発明によれば、ＣＴやＭＲＩ等の高価な機器を必要とせず、また解析にかかる時間も短いため、費用及び時間も抑えて、軽度認知障害を検査することも可能となる。
【００２３】
また、このように、本発明によって認知症発症の前段階である軽度認知障害であることを早期に判定することにより、認知症に対する早期の医療介入が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】共発現差解析によって得られた上位２２のｍｉＲＮＡにおける、相関ネットワークの全てを示す概略図である。
【図２】共発現差解析によって得られた上位２２のｍｉＲＮＡにおける相関ネットワークにおいて、健常人とＭＣＩ患者の差異を示す概略図である。
【図３】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１及びｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。散布図は左から順に、健常人、軽度認知障害の患者、アルツハイマー病の患者に関する散布図となる（以下、図４〜７において同じ）。
【図４】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図５】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９１）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図６】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図７】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９７）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図８】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図９】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９１）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１０】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３及びｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１１】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１及びｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１２】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１３】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１４】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１０３）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１５】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２４）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１６】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１及びｈｓａ−ｍｉＲ−１９１）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１７】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２２）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１８】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７及びｈｓａ−ｍｉＲ−３７８）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図１９】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図２０】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図２１】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図２２】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られたｍｉＲＮＡペア（ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ及びｈｓａ−ｍｉＲ−４８４）に関し、それらの相関係数を示す散布図とＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを示す、図である。
【図２３】健常人と軽度認知障害の患者とにおける共発現差解析によって得られた、５つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ及びｍｉＲ−１４０−３ｐ）からなる上位３つのｍｉＲＮＡペアに基づくＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
＜軽度認知障害の検査方法＞
後述の実施例において示す通り、３０の健常体及び２３の軽度認知障害（ＭＣＩ）の患者に由来するｍｉＲＮＡにて構成されたデータセット（１４３のｍｉＲＮＡ）を対象として共発現差解析（相関係数の差の解析）を行った結果、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１等の２０のｍｉＲＮＡから構成されるｍｉＲＮＡペアの発現レベルを指標とすることによって、軽度認知障害患者と健常体とを高い精度にて判別できることが明らかになった。したがって、本発明においては、これらｍｉＲＮＡペアの発現レベルを指標とする、下記（ａ）〜（ｂ）の工程を含む、軽度認知障害を検査する方法が提供される。
（ａ）被検体から分離された生体試料における、下記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも２のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出する工程、
（ｂ）工程（ａ）で検出したｍｉＲＮＡの発現レベルから、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定する工程、
ｍｉＲＮＡ群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２。
【００２６】
被検体から分離された生体試料における、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルの検出は、当業者であれば、対象とする生体試料の種類に応じ、適宜公知の手法を採用し、実施することができる。このような公知の手法としては、ｍｉＲＮＡにハイブリダイズするプライマーを用いたＰＣＲによる検出法（ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ｑＰＣＲ等）、ｍｉＲＮＡにハイブリダイズするプローブを用いるハイブリダイゼーション技術（ノーザンブロッティング、ビーズによるフローサイトメトリー、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイ解析法を用いた検出法等）、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法が挙げられる。さらに、いわゆる次世代シークエンシング法においてリード数をカウントすることにより、ｍｉＲＮＡの発現レベルを定量的に検出することもできる。次世代シークエンシング法としては特に制限はないが、合成シークエンシング法、パイロシークエンシング法、リガーゼ反応シークエンシング法が挙げられる。
【００２７】
ｍｉＲＮＡの発現レベルの検出においては、その検出の前にｍｉＲＮＡを精製してもよい。ｍｉＲＮＡの精製は、当業者であれば、対象とする生体試料の種類に応じ、適宜公知の手法を採用して実施することができる。このような公知の手法としては、例えば、市販のキットを用いた精製法（例えば、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社製）、ｍｉＲＡＣＬＥ  ｍｉＲＮＡ単離キット（アジレント社製）、ハイピュアｍｉＲＮＡ単離キット（ロシュ社製））、トリゾール抽出法、陰イオン交換体を用いた濃縮法が挙げられる。
【００２８】
また、本発明の検査法においては、前記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも２のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出すればよいが、ＡＵＣの値が０．７０以上となる複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出することが好ましく、ＡＵＣの値が０．８０以上となる複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出することがより好ましく、ＡＵＣの値が０．９０以上となる複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出することがさらに好ましく、ＡＵＣの値が０．９５以上となる複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを検出することが特に好ましい。なお、ＡＵＣの値とは、ＲＯＣ（受信者動作特性）解析によって得られるＲＯＣ曲線下の面積の値＝０〜１を意味する。また、後述の実施例において示す通り、当業者であれば、用いる複数のｍｉＲＮＡの組み合わせに応じて適宜ＡＵＣの値を算出することができる。
【００２９】
本発明の検査方法においては、次に、このようにして検出されたｍｉＲＮＡの発現レベルから、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定する。この決定に用いられるｍｉＲＮＡの発現レベルは、上述の検出方法によって得られた発現データ（絶対値）そのものであってもよいが、正規化された又は標準化かつ正規化された発現データであってもよい。
【００３０】
また、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを指標として、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定する方法については特に制限はなく、当業者であれば適宜公知の統計学的手法を用いて行うことができる。しかしながら、複数のｍｉＲＮＡの発現レベルを同時に解析することにより、より精度高く決定することができるという観点から、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを変量とする、多変量解析に基づく判別式を用い、当該判別式により算出される値から、前記被検体が軽度認知障害を有しているか否かを決定することが好ましい。このような多変量解析としては、例えば、ロジスティック回帰分析、線形判別分析（ＬＤＡ）、二次判別分析（ＱＤＡ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）による解析、ｋ近接法（ｋ−ＮＮ）による解析、ランダムフォレストによる解析が挙げられる。また、これらの中では、複数のｍｉＲＮＡ間の任意の相関関係を付けることができ、また個々の相関関係の統計的有意性を判断できるという観点から、ロジスティック回帰分析がより好ましく、以下の式による解析であることがさらに好ましい。
【００３１】
【数１】
0006616983.tif 000002
【００３２】
ｐは被検体が軽度認知障害を有している確率を示す。Ｘ１、Ｘ２、…、Ｘｋは、検出された各ｍｉＲＮＡの発現レベルを示す。β１、β２、…、βｋは、検出された各ｍｉＲＮＡの回帰係数を示す。なお、後述の実施例において示す通り、当業者であれば用いるｍｉＲＮＡの発現レベル検出法等に合わせて適宜回帰係数を推定することができる。Ｃは、健常人とＭＣＩ患者との間で差動的に相関しているｍｉＲＮＡのペアのセットを示す交互作用項である。
【００３３】
例えば、２つのｍｉＲＮＡ（１：ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、２：ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５）の発現量Ｘ１、Ｘ２について、被検体が軽度認知障害を有している確率ｐを求める場合には、ｌｏｇｐ／（１−ｐ）＝β０＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋β１３Ｘ１Ｘ３の式を用いて行うことができる。
【００３４】
また、５つのｍｉＲＮＡ（１：ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、２：ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、３：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、４：ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、５：ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ)の発現量Ｘ１、Ｘ２、…、Ｘ５について、被検体が軽度認知障害を有している確率ｐを求める場合には、ｌｏｇｐ／（１−ｐ）＝β０＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋β３Ｘ３＋β４Ｘ４＋β５Ｘ５＋β１２Ｘ１Ｘ２＋β１３Ｘ１Ｘ３＋β４５Ｘ４Ｘ５の式かを用いて行うことができる。
【００３５】
また、このようにして得られた確率ｐに閾値を定めることにより（例えば、０．５）、ｐが０．５以上であれば、被検体が軽度認知障害を有していると決定し、ｐが０．５未満であれば、被検体が軽度認知障害を有していないと決定することができる。
【００３６】
また、かかるロジスティック回帰分析に限らず、当業者であれば用いるｍｉＲＮＡの発現レベルの検出法及び統計学的手法に合わせて、閾値を適宜設定し、当該値を基準として、健常者と軽度認知障害の患者とを判別することができる。
【００３７】
以上の通り、本発明によれば、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することができる。そして、かかる評価の結果により、認知症の治療を行うか否かを判断することもできる。
【００３８】
したがって、本発明は、本発明の検査方法により軽度認知障害を有すると判定された被検体に、認知症の治療を施す工程を含む、認知症の治療方法を提供することもできる。かかる認知症の治療としては特に制限はないが、例えば、免疫療法、認知症の病変を抑えるための薬剤を投与する方法が挙げられる。免疫療法としては、例えば、アミロイドβの凝集の抑制を対象とする、アミロイドβの部分ペプチドを用いる能動免疫療法（ワクチン療法）、アミロイドβに対する抗体を投与する受動免疫療法が挙げられる。また、認知症の病変を抑えるために投与される薬剤としては、例えば、アミロイドβの産生を抑制するための薬剤（γセクレターゼモジュレーター（ＧＳＭ）、γセクレターゼモジュレーター阻害剤（ＧＳＩ）、非ステロイド性抗炎症薬等）、アミロイドβの凝集を抑制するための薬剤（クルクミン、ポリ硫酸化合物、クリオキノール等）、ｔａｕの凝集を抑制するための薬剤（アミノチエノピリダジン、シアニン色素、メチレンブルー等）、神経保護薬（ジメボン等）、コリンエステラーゼ阻害薬（ドネぺジル等）、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬（ガランタミン等）、グルタミン酸ＮＭＤＡ受容体阻害薬（メマンチン等）が挙げられる。
【００３９】
また、被検体における軽度認知障害を有するか否かの評価は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む、以下同じ）によって行われるが、本発明の方法によって得られる、上述のｍｉＲＮＡの発現レベル等に関するデータは、医師による治療法の選択も含めた診断に役立つものである。よって、本発明の方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。
【００４０】
＜軽度認知障害の検査薬＞
上述の通り、本発明の検査方法においては、ｍｉＲＮＡの発現レベルを検出することにより、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することができる。したがって、本発明は、上述の検査方法により、軽度認知障害を検査するための薬剤であって、下記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１のｍｉＲＮＡにハイブリダイズする、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオドを含む薬剤を提供する。
【００４１】
ｍｉＲＮＡ群：ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２。
【００４２】
本発明の薬剤に含まれるオリゴヌクレオドは、上記ｍｉＲＮＡの発現レベルでの検出方法に合わせ、プライマーの態様であってもよく、プローブの態様であってもよい。
【００４３】
本発明の薬剤に含まれるプライマーは、前記ｍｉＲＮＡ群から選択される少なくとも１のｍｉＲＮＡ又はその相補的核酸（ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）にハイブリダイズし、ｍｉＲＮＡ等の増幅及び検出を可能とする限り特に限定されない。プライマーは、ＤＮＡのみであってもよく、またその一部又は全部において、架橋化核酸等の人工核酸（修飾核酸）によって置換されているものであってもよい。また、プライマーのサイズは、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５〜８０ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜７０ヌクレオチド長、さらに好ましくは１８〜３０ヌクレオチド長、特に好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長である。また、上記検出方法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、本発明の薬剤に含まれるプライマー数は特に限定されないが、本発明の薬剤は、１のｍｉＲＮＡに対して２以上のプライマーを含んでもよい。また、このようなプライマーは、上記検出方法に合わせ、当業者であれば公知の方法により設計し、作製することができる。
【００４４】
本発明の薬剤に含まれるプローブは、前記ｍｉＲＮＡ又はその相補的核酸にハイブリダイズし、該ｍｉＲＮＡ等の検出を可能とする限り特に限定されない。プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸又はそれらのキメラ分子等であり得る。プローブは、１本鎖又は２本鎖のいずれでもよい。プローブのサイズは、少なくとも約１５ヌクレオチド長以上あればよく、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは１５〜７０ヌクレオチド長、さらに好ましくは１８〜３０ヌクレオチド長、特に好ましくは２０〜２５ヌクレオチド長である。このようなプローブは、当業者であれば公知の方法により作製することができる。また、プローブは、マイクロアレイのように、基板上に固定された形態で提供されてもよい。
【００４５】
また、本発明の薬剤に含まれるオリゴヌクレオチドは、上記検出方法に合わせ、標識用物質で標識されていてもよい。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、Ｃｙ５等の蛍光物質、β−Ｄ−グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ等の酵素、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。
【００４６】
また、本発明の薬剤は、前記オリゴヌクレオチドの他、組成物として許容される他の成分を含むことができる。このような他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩、二次抗体等が挙げられる。
【００４７】
また、上記本発明の薬剤の他、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照（例えば、軽度認知障害の患者から分離された血漿や健常者から分離された血漿、又はそれらから調製されたｍｉＲＮＡ抽出溶液）あるいは試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を組み合わせることができ、軽度認知障害を検査するためのキットとすることもできる。さらに、かかるキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
軽度認知障害（ＭＣＩ）の患者と健常者とを精度高く判別するためのバイオマーカーとなり得る、ｍｉＲＮＡの探索を以下に示す方法にて行った。
【００５０】
＜被検体＞
本実施例において解析した、３０人の健常人対照群（ノーマル、男性１２人、女性１８人）、２３のＭＣＩ患者群（男性１１人、女性１２人）及び１５人のアルツハイマー病（ＡＤ）患者（男性３人、女性１２人）を、サンプル数、平均年齢及びＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査）スコアと共に、表１に示す。なお、全てのＭＣＩ患者は、上記Ｐｅｔｅｒｓｅｎらの定義により、軽度認知障害と診断された患者である。また、全てのＡＤ患者は、米国の国立神経障害・脳卒中研究所（Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ）及びアルツハイマー病・関連障害協会（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）が定めた診断基準、又は、日本に於けるアルツハイマー病脳画像診断法の先導的研究（Ｊ−ＡＤＮＩ）が定めた診断基準に基づき、ＡＤに罹患していると診断された患者である（なお、前者の診断基準については、ＭｃＫｈａｎｎ，Ｇ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９８４年、３４巻、７号、９３９〜９４４ページ  参照のこと）。さらに、全てのＡＤ患者は、アリセプト（ドネぺジル）が服薬されていない患者である。また、健常人は、前記Ｐｅｔｅｒｓｅｎらの定義及び前記ＡＤに関する診断基準に基づき、これら疾患に罹患していないことが明らかになった人である。
【００５１】
【表１】
0006616983.tif 000003
【００５２】
なお、表１において、健常人対照群の女性１８人のうち、２人のＭＭＳＥスコアは得られていないので、１６名の平均値を示している。
【００５３】
＜ＲＮＡの調製＞
上記被検体から分離された血漿からトータルＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、そのメーカー説明書に記載の方法に改良を加えて行った。すなわち先ず、血漿を氷上で融かした後、４℃に設定した微小遠心機に入れ、３０００×ｇにて５分間遠心処理した。１サンプルあたり２００μＬの血漿アリコートを新しいチューブに移し、１．２５μｇ／ｍＬ  ＭＳ２バクテリオファージＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＱｉａｚｏｌ混合液７５０μＬを加えた。チューブの中の内容物を混合し、５分間インキュベーションした後、２００μＬのクロロホルムを加ええた。さらにチューブの中の内容物を混合し、２分間インキュベーションした後、４℃に設定した微小遠心機に入れ、１２０００×ｇにて１５分間遠心処理した、。次いで、上部水層を新しい微小遠心チューブに移し、１．５倍量の１００％エタノールを添加した。そして、チューブの内容物を完全に混合した後、７５０μＬのサンプルを、回収チューブに備えたＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニスピンカラムに移し、室温下、１５０００×ｇにて３０秒間遠心した。全ての残余サンプルを載せるまで、この工程を繰り返した後、スピンカラムを７００μＬのＱｉａｇｅｎＲＷＴバッファーにてリンスし、室温下、１５０００×ｇにて１分間遠心した。次いで、５００μＬのＱｉａｇｅｎＲＰＥバッファーにてもう１回リンスし、室温下、１５０００×ｇにて１分間遠心した。この５００μＬのＱｉａｇｅｎＲＰＥバッファーによるリンス工程を２回繰り返した後、スピンカラムを新しい回収チューブに移し、室温下、１５０００×ｇにて、２分間遠心した。次いで、スピンカラムを新しい微小遠心チューブに移し、１分間蓋を開けたままにし、カラムを乾燥させた。そして、スピンカラムのメンブレンにＲＮａｓｅフリーの水５０μＬを加え、１分間インキュベーションし、次いで、室温下、１５０００×ｇにて１分間遠心することにより、トータルＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡは−８０℃に保存した。
【００５４】
＜マイクロＲＮＡ  リアルタイムｑＰＣＲ＞
先ず、前記にて調製したＲＮＡ抽出液１９．２μＬに、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）ユニバーサルＲＴｃＤＮＡ合成キット（Ｅｘｉｑｏｎ社製）を加え、計８０μＬの反応液とし、逆転写反応に供した。得られたｃＤＮＡ産物を５７．２５倍希釈し（８０μＬのｃＤＮＡ反応液に４５００μＬの水を加えて）、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ（登録商標）ユニバーサルＲＴマイクロＲＮＡ  ＰＣＲシステムのプロトコールに従って、１０μＬ  ＰＣＲ反応を行った。より具体的には、マイクロＲＮＡ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  ＰＣＲ，  ヒト  パネル１及びパネル２、Ｖ２を用い、ｑＰＣＲによって各マイクロＲＮＡについて１回解析を行った。また、逆転写反応から鋳型ＲＮＡを除去したサンプルを陰性対照として分析し、他のサンプル同様にプロファイリングした。次に、ライトサイクラー（登録商標）４８０リアルタイムＰＣシステム（Ｒｏｃｈｅ社製）及び３８４ウェルプレートを用いて、増幅反応を行った。得られた増幅曲線は、Ｒｏｃｈｅ  ＬＣソフトウェア（ｖｅｒ  １．５）を用い、第２誘導法によるＣｐの決定及び融解曲線分析によって分析した。
【００５５】
＜データのフィルタリング及び分析＞
先ず、生データを、ライトサイクラー４８０ソフトウェアから抽出した。そして、ＧｅｎＥｘソフトウェア（Ｅｘｉｑｏｎ社製）を用いて、データ分析を行った。結果、クロッシングポイント（Ｃｐ）が３７未満である、またはネガティブコントロールのＣｐよりも少なくとも３低い、検定データ値を、データ解析に含める値として全て検出した。これらの基準を満たさないデータは、いかなる解析から除外した。また、ＬｉｎＲｅｇＰＣＲソフトウェアを用いて、増幅効率を算出した。そして、増幅効率が１．６未満である反応も除外した。さらに、全てのデータは、各サンプルにおいて検出された平均分析値に正規化した（ｄＣｐ＝平均Ｃｐ［＜３７］−分析Ｃｐ）。
【００５６】
以上の解析結果に基づき、１４３のｍｉＲＮＡから、表２に示す８５のｍｉＲＮＡを重点的に解析する対象として選択した。すなわち、全６８の被検体における１４３のｍｉＲＮＡの発現量（９，７２４＝１４３×６８）から、発現量が２０％以下であり１７４の欠損値を伴うものを除外した。健常人、ＭＣＩ患者及びＡＤ患者の各群において、発現量が８０％以上であった８５のｍｉＲＮＡを、重点的に分析するための対象として選択した。
【００５７】
【表２】
0006616983.tif 000004
【００５８】
＜Ｔ検定＞
前述の通り、表２に示す８５のｍｉＲＮＡを対象として、従来からよく利用されている伝統的な解析法  ｔ検定によって、ＭＣＩ患者において発現が上方制御又は下方制御されているｍｉＲＮＡを、ＭＣＩのバイオマーカーとして探索した。ｔ検定において、各ｍｉＲＮＡにおけるｐ値をバイオマーカーとしての有効性の評価基準とした。例えば、０.０５未満の小さいｐ値をとるｍｉＲＮＡを、ＭＣＩ患者において上方制御又は下方制御されているｍｉＲＮＡとして評価した。このようにして、ｍｉＲＮＡの発現量に応じ、患者候補を予測することができる。
【００５９】
ＭＣＩマーカーとしてのｍｉＲＮＡの有効性は、ロジスティック回帰に基づくＲＯＣ（受信者動作特性）解析によって得られたＡＵＣ値（ＲＯＣ曲線下の面積の値＝０〜１）によって評価した。
【００６０】
一のｍｉＲＮＡを対象とした場合には、発現量を直接スコアのセットとして用いた。ｍｉＲＮＡの発現量の利用は、健常人及びＭＣＩ患者の全てのサンプルにおいて、ロジスティック回帰モデル  ｌｏｇ｛ｐ／１−ｐ｝＝β０＋β１Ｘ１による推定確率＾ｐ１、…＾ｐｎを伴うそれに相当する。なお、ｐは、被検体がＭＣＩ患者群に属する確率を示す。β０及びβ１は回帰係数を示す。Ｘ１はｍｉＲＮＡの発現量を示す。
【００６１】
複数のｍｉＲＮＡの性能を同時に評価するために、下記ロジスティック回帰モデルを用いた。
【００６２】
【数２】
0006616983.tif 000005
【００６３】
Ｐは被検体がＭＣＩに属する確率を示す。β０、…、βｋは回帰係数を示す。Ｘ１、…、Ｘｋは各ｍｉＲＮＡｓの発現量を示す。
【００６４】
上記ロジスティック回帰モデル（１）を推定した後、健常人対照群及びＭＣＩ患者群の全てのサンプルに関する、推定確率＾Ｐ１、…、＾Ｐｎを、上記（１）の等価式  ｐ＝ｅｘｐ（ηｋ）／｛１＋ｅｘｐ（ηｋ）｝を用いて得た。ηｋは、推定回帰係数＾β１、…、＾βｋ及び発現量Ｘ１、…Ｘｋを用いて算出した。
【００６５】
ＭＣＩマーカーとしてのｋ  ｍｉＲＮＡｓの有効性は、ＲＯＣ解析によって得られたＡＵＣ値によって評価した。もし、健常人対照群及びＭＣＩ患者群の推定確率が大きく異なっている場合、例えば、健常人の＾Ｐは＜０．５であり、ＭＣＩ患者の＾Ｐは＞０．５である場合、ＡＵＣの値は１となる（完全に分離する）。
【００６６】
＜共発現差解析＞
健常人対照群とＭＣＩ患者群との相関係数の差を調べる手法、共発現差解析によって有効なＭＣＩマーカーを検出することを、以下の方法にて試みた。
【００６７】
先ず、共発現差解析において、ｍｉＲＮＡが構成する全てのペアを相関係数の差によって順位付けた。
【００６８】
【数３】
0006616983.tif 000006
【００６９】
次に、ｒ１及びｒ２を、健常人対照群及びＭＣＩ患者群に関し、各々スピアマンの順位相関によって解析することによって算出した。そして、当該式により得られたスコアにおいてより高いｍｉＲＮＡのペアをＭＣＩマーカーの候補とした。
【００７０】
また、共発現差解析において、相関係数の統計的な有意差の参考として、ｍｉＲＮＡペアのｐ値も算出した。この目的のため、正規化された順位相関ｒｎ（Ｙａｎａｇａｗａ  Ｔ．ら、ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＴＲＩＣＳ、２００３年、１４巻、１２１〜１２８ページ、及び、Ｋａｙａｎｏ  Ｍ．ら、ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ．２０１３年、２０巻、８号、５７１〜５８２ページ  参照）を、ロバストなピアソンタイプの相関係数として用いた。
【００７１】
【数４】
0006616983.tif 000007
【００７２】
Φは、標準正規分布の分布関数を示す。Ｒｉ及びＱｉは、二つのｍｉＲＮＡの発現量ｘｉ及びｙｉの順位を各々示す。
【００７３】
なお、正規化された順位相関ｒｎは、スピアマンの順位相関とほぼ同等であった。より具体的には、全てのｍｉＲＮＡのペアにおける、正規化された相関係数と、スピアマンの順位相関との差の平均値は、用いたデータセットにおいて、たったの０．００１であった。また、かかる２つの正規化された順位相関係数が同等であるという仮説を検証するため、Ｓ．Ｒ．ＰＡＵＬ、Ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、１９８９年、１７巻、２号、２１７〜２２７ページ、及び、Ｋａｙａｎｏ  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１１年、３９巻、１１号、ｅ７４に記載の尤度比検定にそれらを供した。また、Ｐ値は、その仮説検証において算出した。
【００７４】
ｍｉＲＮＡペアのＭＣＩマーカーとしての評価を行うため、２つのｍｉＲＮＡの交互作用項を伴うロジステック回帰モデルを用いることを試みた。
【００７５】
【数５】
0006616983.tif 000008
【００７６】
ｐは被検体がＭＣＩに属する確率を示す。β０、β１、β２及びβ１２は回帰係数を示す。Ｘ１、Ｘ２は２つのｍｉＲＮＡｓの発現量を各々示す。交互作用項  β１２Ｘ１Ｘ２は、共発現差解析において２つのｍｉＲＮＡを評価するために導入した。すなわち、Ｘ１及びＸ２間における相関係数が、健常人対照群とＭＣＩ患者群との間で変化する場合は、健常人対照群とＭＣＩ患者群との区別においてかなり影響を及ぼすため、この交互作用項を導入した。
【００７７】
また、前述の複数のｍｉＲＮＡの性能を同時に評価するためのロジスティック回帰モデルにおけるηｋをη１２に置き換えることによって、ｔ検定の場合と同様の方法にて、ロジステックモデルを推定し、健常人対照群及びＭＣＩ患者群の全てのサンプルにおける、推定確率＾ｐ１…＾ｐｎを算出した。そして、その推定確率を用いてＡＵＣ値を算出した。
【００７８】
また、いくつかのｍｉＲＮＡペアのＭＣＩマーカーとしての性能を評価するため、以下に示す交互作用項を伴うロジステック回帰モデルも用いた。
【００７９】
【数６】
0006616983.tif 000009
【００８０】
なお、Ｃは、健常人対照群とＭＣＩ患者サンプル群との間で差動的に相関しているｍｉＲＮＡのペアのセットを示す。
【００８１】
また、例えば、５つのｍｉＲＮＡからなるｍｉＲＮＡのペア４つ（ｍｉＲＮＡ  １−２，１−３、３−４及び４−５）を、このロジステック回帰モデルに組み込み、
ｌｏｇｐ／（１−ｐ）＝β０＋β１Ｘ１＋β２Ｘ２＋β３Ｘ３＋β４Ｘ４＋β５Ｘ５＋β１２Ｘ１Ｘ２＋β１３Ｘ１Ｘ３＋β４５Ｘ４Ｘ５
という判別式を作成する。
【００８２】
なお、交互作用項
【００８３】
【数７】
0006616983.tif 000010
【００８４】
におけるＣは｛（１，２），（１，３），（３，４），（４，５）｝である。
【００８５】
そして、前記判別式を用いた、ＡＵＣ値を伴うＲＯＣ分析によって、５つのｍｉＲＮＡのＭＣＩマーカーとしての性能を同時に評価することができる。以上の方法によって得られた結果を以下に示す。
【００８６】
＜ｔ検定＞
年齢を合わせた３０の健常人対照群及び２３のＭＣＩ患者群由来の、８５のｍｉＲＮＡにて構成されたデータセットを対象として、従来からよく利用されている伝統的なｔ検定を行った。
【００８７】
その結果、８５の中から２２のｍｉＲＮＡを、健常人とＭＣＩ患者とを有意に判別できるバイオマーカーとして検出した（表３  参照）。なお、ＭＣＩのバイオマーカーとして各ｍｉＲＮＡの性能を調べるため、ＲＯＣ分析を行った結果、２２の各ｍｉＲＮＡにおけるＡＵＣ（曲線下面積）の値は、０．７８４±０．０１７であった。
【００８８】
【表３】
0006616983.tif 000011
【００８９】
＜共発現差解析＞
年齢を合わせた３０の健常人対照群及び２３のＭＣＩ患者群由来の、８５のｍｉＲＮＡにて構成されたデータセットを対象として、共発現差解析を行った。すなわち、８５のｍｉＲＮＡがとり得る３５７０のペアから、健常人とＭＣＩ患者とを有意に判別できるバイオマーカー（｜ｒ１−ｒ２｜が０．８以上を示すｍｉＲＮＡのペア）として、２０のｍｉＲＮＡのペアを選択した（表４  参照）。なお、これら２０のｍｉＲＮＡペアによるＡＵＣは、０．８００±０．０５１であった。
【００９０】
【表４】
0006616983.tif 000012
【００９１】
また、共発現差解析によって得られた上位２０のｍｉＲＮＡにおける相関ネットワークを図１及び２に示す。なお、これらの図において、各ボックスは個々のｍｉＲＮＡを示す（ｍｉＲＮＡの表記Ａ〜Ｖは、後述の表５を参照のこと）。各エッジは、相関係数｜ｒ｜＞０．４０であることを示す。そして、共発現差解析によって、健常人とＭＣＩ患者とにて見出された、相関ネットワーク上の差異、すなわち、表４に示す上位２０のｍｉＲＮＡ（健常人における１１エッジとＭＣＩ患者における９エッジ）を図２に示す。また、図中、実線及び破線は、正の相関及び負の相関を各々示す。
【００９２】
さらに、表４に示す上位２０のｍｉＲＮＡペアに関し、それらの相関係数を示す散布図と、ＡＵＣ値を示すＲＯＣ曲線とを、図３〜２２に示す。
【００９３】
そして、共発現差解析によって得られた上位２０のｍｉＲＮＡとｔ検定によって得られた上位２２のｍｉＲＮＡとを比較した結果、表５に示す通り、４つのｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３）においては共通していたが、残りのｍｉＲＮＡは全く異なるものであった。
【００９４】
【表５】
0006616983.tif 000013
【００９５】
過去１０年間、ｔ検定による単純なバイオマーカーの探索が行われてきた。しかしながら、生体内に潜むｍｉＲＮＡが関与する発症システムにおいては、莫大な因子（例えば、ゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム及びメタボローム）が相互に関連しあっているため、表５に示すように、ｔ検定のような単純かつ直線的なアプローチでは検出することのできないｍｉＲＮＡでも、共発現差解析を含む手法では検出できることが明らかになった。
【００９６】
次に、表４に示した２０のｍｉＲＮＡペアの中から、２ペアを組み合わせて用い、それらの診断精度を評価した。得られた結果を、表６〜１２に示す。
【００９７】
【表６】
0006616983.tif 000014
【００９８】
【表７】
0006616983.tif 000015
【００９９】
【表８】
0006616983.tif 000016
【０１００】
【表９】
0006616983.tif 000017
【０１０１】
【表１０】
0006616983.tif 000018
【０１０２】
【表１１】
0006616983.tif 000019
【０１０３】
【表１２】
0006616983.tif 000020
【０１０４】
表６〜１２に示した結果から明らかなように、表４に示した２０のｍｉＲＮＡペアの発現レベルを指標として、ＡＵＣ値が０．９００以上という極めて高い精度にて健常体と軽度認知障害患者とを判別できる組み合わせを８３も得ることができた（表６〜８  参照）。さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２４及びｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａからなる１３のｍｉＲＮＡ群から選択される２つのｍｉＲＮＡを適宜組み合わせて用いることにより、ＡＵＣ値が０．９５以上という極めて高い精度にて健常体と軽度認知障害患者とを判別できることも見出された（表６  参照）。特に表６の記載から明らかなように、これらｍｉＲＮＡのペアにおいて、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１とｈｓａ−ｍｉＲ−１９１とのペアが、ＡＵＣ値を高めるのに有効なペアであることも明らかになった。
【０１０５】
次に、表４に示した上位３つのｍｉＲＮＡペアを組み合わせて用い、その場合の診断精度を評価した。その結果、図８に示す通り、共発現差解析によって選択された上位３つのｍｉＲＮＡペアを組み合わせて用いることによっても、０．８９９という極めて高いＡＵＣ値を達成することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】
以上説明したように、本発明によれば、軽度認知障害の患者と健常者とを精度高く判別することが可能となる。さらに、本発明の軽度認知障害の検査方法においては、ｍｉＲＮＡの発現レベルを指標とするため、医師等による判断の差異に依らず、客観的に軽度認知障害を検査することも可能となる。また、本発明の検査方法の対象となるｍｉＲＮＡは、発現の相関性に基づいて（共発現差解析によって）選抜されたものである。したがって、かかる共発現差解析に基づく本発明によれば、ｔ検定のような単なる発現差解析において、しばしば発生する低発現所見による偽陰性の見落としが回避され、安定性高く軽度認知障害を検査することも可能となる。さらに、本発明によれば、ＣＴやＭＲＩ等の高価な機器を必要とせず、また解析にかかる時間も短いため、費用及び時間も抑えて、軽度認知障害を検査することも可能となる。また、このように、本発明によって認知症発症の前段階である軽度認知障害であることを早期に判定することにより、認知症に対する早期の医療介入が可能となる。
【０１０７】
したがって、本発明は、軽度認知障害を検査する方法及び該方法に用いられる軽度認知障害を検査するための薬剤等として有用である。
【図１】
0006616983.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006616983.tif 000030
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0006616983.tif 000033
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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