(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）の化合物を含み、嗅覚受容体であるＯＲ２ＡＴ４を活性化することにより創傷治癒を促進するための薬剤。
【化３】
0006615793.tif 000004
Ｒ１は、水素またはメチルである。
【請求項２】
前記薬剤はサンダロール（登録商標）である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記薬剤はブラマノール（登録商標）である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記薬剤は、細胞の増殖及び移動を促すことにより創傷治癒を促進する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記薬剤は、ＭＡＰキナーゼのリン酸化を促すことにより創傷治癒を促進する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
前記薬剤は、インターロイキンＩＬ−１αの発現および分泌を促すことにより創傷治癒を促進する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記薬剤は局所的に使用される、請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項８】
前記薬剤はローション、クリーム、エマルジョン、ゲル、軟膏またはスプレーの形態、または対応するドレッシング物質に添加またはコートされる、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項９】
前記薬剤は、前記化学式（Ｉ）の有効成分を、０．００１から２重量％で含むことを特徴とする、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項１０】
（ａ）嗅覚受容体であるＯＲ２ＡＴ４を含有するケラチノサイト培養物を準備する手順と、
（ｂ）試験する有効成分が前記培養物に追加される手順と
（ｃ）細胞内カルシウム濃度の変化を特定する手順と、を含む、創傷治癒を促進する有効成分を特定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は調剤の分野に関し、また、白檀香を含む特別な化合物を有する創傷治癒を促進する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
創傷治癒とは、傷口を塞ぎ、損傷した組織を最大限治癒するための、身体の内在的プロセスに関する。これは、傷が発生すると直後に起こる、生物上自然なプロセスであり、酵素組織化学方法によって実行される。傷口を閉じるために、傷口には血小板が送られる。時折、滲出（液体の流出）によって痂皮形成が起こり、創傷治癒に伴いかゆみが生じる。
【０００３】
創傷治癒は複数のフェーズに分割できる。最初に、破損した血管が血栓により閉じた後、巨視的または微視的に目視できる反応が無い。この第１潜伏期から滲出期に移動し、異質の物体および細菌が傷口から染み出る創傷分泌物によって洗い流される。この滲出期では、免疫系の細胞及びホルモンは重要な役割を果たし、傷口に侵入した細菌またはウイルスを殺菌するだけではなく、治癒プロセスそのものを促進する。血栓の形成において、フィブリンネットワークが形成され、傷口の隣接する端部を閉じる接着部としての役割を果たす。血清によって構成される透明な創傷分泌物は、炎症細胞と共に浸透する。この滲出期では、創傷部の有糸分裂が増加する。創傷部では、単球がマクロファージになり、細胞片及び栓を取り除く。傷口に浸透した結合組織細胞から発現し、傷の端部に存在し細胞分裂によって増殖する繊維芽細胞は、次のフェーズで実際の再構築を実行する。
【０００４】
次の造粒期において、傷口は新しい結合組織の増殖により次第に満たされる。傷口に修復のための細胞が流入すると同時に、フィブリンネットワークはプラスミンによって分解（線溶）される。毛細血管の成長によって、血管の数の増加などの血管新生化が行われる。繊維芽細胞はヘキソサミン含有の酸性ムコ多糖を生成し、これは結合組織の細胞外基礎物質としての機能を果たし、細胞内の準備段階を経由して、最終的な細胞外のコラーゲン結合組織繊維を形成する。これらの工程は非常に複雑であり、複数の増殖因子（サイトカイン）の影響を受ける。
【０００５】
再生期では、表面の上皮化によって傷口が閉じる。十分に肉芽組織が形成された傷口の１／３は収縮によって傷口が閉じ、残りの２／３は新生物形成又は上皮細胞の細胞分裂及び傷口の端部から中心部への線維素の移動によって傷口が閉じる。全ての表皮層の修復が事実上完了した後に、傷口の下の肉芽組織は次第にコラーゲン線維を形成する。瘢痕組織の強度の更なる増加は、保湿、固化及びコラーゲン繊維の配向性に依存する。組織の水分は減少し、初めに皮膚からわずかに突き出た傷口は、一般的には皮膚の下で収縮する。瘢痕組織の血管分布も同様に減少する。当初は赤い傷口も白色に変色する。
【０００６】
先行技術では、創傷治癒を促進する複数の薬学的な有効成分が開示されている。例としては、アミノチアゾール（欧州特許第０９６７９８０号）、アリールスルホアミノピランカルボン酸ヒドロキシミド（欧州特許第１０７００５８号）、シアノアントラニルアミド（欧州特許第１３８７８３８号、特表２００４−５３２２８１号公報）、アンチキモトリプシンポリペプチド（欧州特許第１３９２３５４号、特表２００５−５０８１３７号公報）及びジピリジルジヒドロピラゾール（欧州特許第１８７７３９６号公報）である。上記の物質の反応メカニズムは全く異なる：薬効範囲は、増殖因子の分泌または特別なインターロイキン及びＨＩＦプロリル４−ヒドロキシラーゼの抑止からインテグリン受容体拮抗薬の準備に及ぶ。
【０００７】
以下の文献も参照される。
【０００８】
０．００１〜１０％のレチノール、０．０００１〜５０％の環状脂肪族不飽和化合物（例えばBrahmanol）及び化粧品的に適切なキャリアを含むスキンケア製剤は、米国特許第５，７５９，５５６号に記載された事項である。これらの準備物は、乾癬の治癒に使用される。
【０００９】
国際公開第２００８／０６８６８３号（特表２０１０−５１１０３７号）（フイルメニツヒ）は、抗菌キー成分、及び、場合により現在使用されている少なくとも１つのフレーバー付与成分（サンダロールまたはブラマノール）を含有するフレーバー付与組成物であって、抗菌キー成分は３，４−ジメチルフェノールと共に、１つ以上の抗菌フレーバー成分を含有し、以下から選択される２つ以上の菌種に対してそれぞれ１０００ｐｐｍ以下の最小抑制濃度を有する：フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium Nucleatum）、フソバクテリウムｓｐ．（Fusobacteriumsp.）、プロフィロモナス・ギンギバリス（Porphyromonas Gingivalis）、プレボテラ・インターメディア（Prevotella Intermedia）、クレブシエラ・ニューモニエ（KlebsiellaPneumoniae）、ベイヨネラ・アルカレセンス（Veillonella Alcalescens）、バクテロイデス・メラニノゲニカス／ホルシタス（Bacteroides Melaninogenicus/forsythus）、セレノモナス・スプタゲナ（Selenomonas Sputagena）、プロフィロモナス・エンドドンタリス（PorphyromonasEndodontalis）、プレボテラ・メラニノゲニカ（Prevotella Melaninogenica）及びストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus Mutans）。これらの準備物は歯周炎の治療に使用される。
【００１０】
国際公開第２００９／１５３５７２号（Aberystwith大学）では、白檀抽出物またはサンダルウッドアナログ（サンダロールなど）を動物用飼料の添加物として使用し、反芻動物及び馬の消化器系における病原菌の増加を防ぐための使用が開示されている。
【００１１】
長きに渡り、白檀油は創傷治癒を助長する自然由来物質の１つと考えられてきた。この熱帯性白檀の木から蒸気蒸留によって抽出される製油は、多数の亜種があり、現在においてもその詳細は明らかにされていない。特に、製油の成分のうちのどれが、抗炎症性特性を有するのか、判明していない。ここで、製油が香水の原料として幅広く使用されていることにより、天然白檀油は非常に高価な供給原料となった。
【００１２】
従って、本発明の目的は白檀油の抗炎症性成分を特定し、特に創傷治癒を促進する薬剤を提供し、また創傷治癒と併せて細胞増殖を促すことにより、インターロイキンＩＬ−１αの発現および分泌を促進する。活性種を特定することにより、これらの物質を合成する手法を提供し、天然資源の保護、多様性の保護に貢献に繋がる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許第０９６７９８０号
【特許文献２】欧州特許第１０７００５８号
【特許文献３】特表２００４−５３２２８１号公報
【特許文献４】特表２００５−５０８１３７号公報
【特許文献５】欧州特許第１８７７３９６号
【特許文献６】米国特許第５，７５９，５５６号
【特許文献７】特表２０１０−５１１０３７号公報
【特許文献８】国際公開第２００９／１５３５７２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の式（Ｉ）の誘導体を含む薬剤に関する
【化１】
0006615793.tif 000002
ここで、Ｒ１は、創傷治癒を促進させるための水素またはメチルである。
【００１５】
化学式（Ｉ）の誘導体は、好ましくは、サンダロール（Sandalore）（登録商標）（Ｒ１はメチル）またはブラマノール（Brahmanol）（登録商標）（Ｒ１は水素）など、白檀香を有する香料である。いずれの物質も市場で入手可能であり、これまで白檀香を有する香料としてのみ使用されている。
【００１６】
驚くべきことに、試験環境において、白檀油のいずれの既知の成分も、抗炎症性または創傷治癒を促進するとは認められなかった。代わりに、２つの合成物質であるサンダロール（登録商標）及びブラマノール（登録商標）は、白檀油の成分に構造的に非常に似ており、白檀のような香りであり、皮膚及び他の組織で発見されるＯＲ２ＡＴ４の嗅覚受容体の唯一の拮抗薬として特定され、当該受容体を活性化する唯一のアゴニストである。カルシウムイメージング実験では、ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトのサンプルの８０〜９０％は、上記２つの物質に刺激され、カルシウム信号は顕著な刺激を示しており、例えば添加の都度、信号振幅の増加を示す。
【００１７】
受容体の活性化及びシグナルカスケードの惹起は、ＨａＣａＴ細胞の増殖及び移動の増加を伴う。これは、リン酸化によって刺激されたＭＡＰキナーゼｐ３８及びＥＲＫ１／２の２つの物質が、皮膚の創傷治癒に関連していたことを示す。生体外の傷口評価では、細胞が５００μＭのサンダロール（登録商標）またはブラマノール（登録商標）で治療された場合、傷口は、ＨａＣａＴ細胞によって２６％早く治癒し、ケラチノサイトによって３４％早く治癒することが分かる。
【００１８】
最後に、２つの合成白檀香料を使用した結果、ＩＬ−１αの発現および分泌が増加し、ヒトケラチン細胞株の細胞分化におけるプロテインキナーゼＡｋｔが活性化することが確認された。
【００１９】
この発見で驚くべき点は、白檀油の成分を構成しない２つの合成物質が、本来は参考目的で試験されたことである。
【００２０】
しかし、現在の結果を元に、サンダロール（登録商標）及び／またはブラマノール（登録商標）の投与、好ましくは皮膚への局所投与は、主にＯＲ２ＡＴ４受容体の活性及び細胞の増殖及び移動による創傷治癒を促進し、その後のＭＡＰキナーゼのリン酸化を刺激し、ＩＬ−１αの分泌を増加する。
【００２１】
＜薬剤＞
本発明の薬剤は、通常は局所的に投与される。薬剤は、例えばローション、クリーム、エマルジョン、ゲル、軟膏またはスプレーの形態である。または、これらの調合物をパッチなどの対応するドレッシング物質に添加またはコートすることも可能である。
【００２２】
最終的な薬剤の組成に対する有効成分の濃度（例えば、有効成分と、薬剤的に信頼性が高いキャリア、任意の添加材）は、約０．００１〜２重量％、好ましくは約０．０１〜１重量％、好ましくは約０．１〜０．５重量％である。
【００２３】
薬剤はさらに典型的な助剤及び添加剤、刺激性の弱い界面活性剤、油成分、乳化剤、真珠光沢ワックス、増粘剤、過脂肪剤、安定剤、ポリマー、シリコーン化合物、脂質、ワックス、レシチン、リン脂質、紫外線予防因子、軟化剤、生体活性成分、酸化防止剤、ヒドロトロープ、溶剤、防腐剤、香油、染料などを含んでもよい。
【００２４】
＜界面活性剤＞
界面活性剤、例えば、アニオン性、非イオン性、カチオン性および／または両性もしくは双性イオン性の界面活性剤を含んでもよく、通常平均すると約１〜７０重量％、好ましくは５〜５０重量％、特に好ましくは１０〜３０重量％の界面活性剤の含有してもよい。アニオン性界面活性剤の典型的な例は、石鹸、アルキルベンゼンスルホネート、アルカンスルホネート、オレフィンスルホネート、アルキルエーテルスルホネート、グリセロールエーテルスルホネート、α−メチルエステルスルホネート、スルホ脂肪酸、アルキルスルフェート、アルキルエーテルスルフェート、グリセロールエーテルスルフェート、脂肪酸エーテルスルフェート、ヒドロキシ混合エーテルスルフェート、モノグリセリド（エーテル）スルフェート、脂肪酸アミド（エーテル）スルフェート、モノ−およびジアルキルスルホサクシネート、モノ−およびジアルキルスルホスクシナメート、スルホトリグリセリド、アミド石鹸、エーテルカルボン酸およびそれらの塩、脂肪酸イセチオネート、脂肪酸サルコシネート、脂肪酸タウリド、Ｎ−アシルアミノ酸、例えばアシルラクチレート、アシルタルタラート、アシルグルタマートおよびアシルアスパルテート、アルキルオリゴグルコシドスルフェート、タンパク質脂肪酸濃縮物（特に、小麦に基づく植物生成物）およびアルキル（エーテル）ホスファートである。アニオン性界面活性剤がポリグリコールエーテル鎖を含む場合、これらは従来型を示してもよいが、好ましくは狭い同族体分布を示しうる。非イオン性界面活性剤の代表例は、脂肪族アルコールポリグリコールエーテル、アルキルフェノールポリグリコールエーテル、脂肪酸ポリグリコールエステル、脂肪酸アミドポリグリコールエーテル、脂肪族アミンポリグリコールエーテル、アルコキシル化トリグリセリド、混合エーテルまたは混合ホルマール、任意に部分的に酸化されたアルキル（アルケニル）オリゴグリコシドまたはグルクロン酸誘導体、脂肪酸Ｎ−アルキルグルカミド、タンパク質加水分解物（特に、小麦に基づく植物生成物）、ポリオール脂肪酸エステル、糖エステル、ソルビタンエステル、ポリソルベート、およびアミンオキシドである。非イオン性界面活性剤がポリグリコールエーテル鎖を含む場合、これらは従来型を示しうるが、好ましくは狭い同族体分布を示しうる。カチオン性界面活性剤の典型例は、第四級アンモニウム化合物、例えば、ジメチルジステアリルアンモニウムクロリドおよびエステル化第四級アンモニウム化合物、とりわけ第四級化脂肪酸トリアルカノアミンエステル塩などである。両性または双性イオン性界面活性剤の典型的な例は、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アミノプロピオネート、アミノグリシネート、イミダゾリウムベタインおよびスルホベタインである。前述の界面活性剤の全ては既知の化合物である。特に好適な緩和界面活性剤、即ち、特に皮膚に適合する界面活性剤は、脂肪族アルコールポリグリコールエーテルスルフェート、モノグリセリドスルフェート、モノ−および／またはジアルキルスルホサクシネート、脂肪酸イセチオネート、脂肪酸サルコシネート、脂肪酸タウリド、脂肪酸グルタマート、α−オレフィンスルホネート、エーテルカルボン酸、アルキルオ��ゴグルコシド、脂肪酸グルカミド、アルキルアミドベタイン、両性アセタールおよび／またはタンパク質脂肪酸縮合物、後者は好ましくは小麦タンパク質に基づくタンパク質脂肪酸縮合物である。
【００２５】
＜油成分＞
適した油成分例は、６〜１８個、好ましくは８〜１０個の炭素原子を有する脂肪族アルコールに基づくゲルベアルコール、直鎖または分岐Ｃ６〜Ｃ２２の脂肪族アルコールとの直鎖Ｃ６〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、または直鎖または分岐Ｃ６〜Ｃ２２の脂肪族アルコールとの分岐Ｃ６〜Ｃ１３のカルボン酸のエステル、例えば、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸ミリスチル、ステアリン酸ミリスチル、イソステアリン酸ミリスチル、オレイン酸ミリスチル、ベヘン酸ミリスチル、エルカ酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、パルミチン酸セチル、ステアリン酸セチル、イソステアリン酸セチル、オレイン酸セチル、ベヘン酸セチル、エルカ酸セチル、ミリスチン酸ステアリル、パルミチン酸ステアリル、ステアリン酸ステアリル、イソステアリン酸ステアリル、オレイン酸ステアリル、ベヘン酸ステアリル、エルカ酸ステアリル、ミリスチン酸イソステアリル、パルミチン酸イソステアリル、ステアリン酸イソステアリル、イソステアリン酸イソステアリル、オレイン酸イソステアリル、ベヘン酸イソステアリル、オレイン酸イソステアリル、ミリスチン酸オレイル、パルミチン酸オレイル、ステアリン酸オレイル、イソステアリン酸オレイル、オレイン酸オレイル、ベヘン酸オレイル、エルカ酸オレイル、ミリスチン酸ベヘニル、パルミチン酸ベヘニル、ステアリン酸ベヘニル、イソステアリン酸ベヘニル、オレイン酸ベヘニル、ベヘン酸ベヘニル、エルカ酸ベヘニル、ミリスチン酸エルシル、パルミチン酸エルシル、ステアリン酸エルシル、イソステアリン酸エルシル、オレイン酸エルシル、ベヘン酸エルシル、およびエルカ酸エルシルなどが含まれる。他の適した物質には、分枝アルコール、特に２−エチルヘキサノールとの直鎖のＣ６〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、直鎖または分岐のＣ６〜Ｃ２２の脂肪族アルコール、特にマレイン酸ジオクチルとのＣ１８〜Ｃ３８のアルキルヒドロキシカルボン酸のエステル、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ダイマージオールまたはトリマートリオールなど）および／またはゲルベアルコールとの直鎖および／または分岐の脂肪酸のエステル、Ｃ６〜Ｃ１０の脂肪酸に基づくトリグリセリド、Ｃ６〜Ｃ１８の脂肪酸に基づく液状モノ−／ジ−／トリグリセリド混合物、芳香族カルボン酸、特に安息香酸とのＣ６〜Ｃ２２の脂肪族アルコールおよび／またはゲルベアルコールのエステル、直鎖または分岐の１〜２２個の炭素原子を有するアルコールまたは２〜１０個の炭素原子および２〜６個のヒドロキシル基を有するポリオールとのＣ２〜Ｃ１２のジカルボン酸のエステル、植物油、分岐した第一級アルコール、置換シクロヘキサン、直鎖および分枝のＣ６〜Ｃ２２の脂肪族アルコールカーボネート、例えば、炭酸ジカプリリル（Ｃｅｔｉｏｌ（登録商標）ＣＣ）など、６〜１８個、好ましくは８〜１０個のＣ原子を有する脂肪族アルコールに基づくゲルベカーボネート、直鎖および／または分岐のＣ６〜Ｃ２２のアルコールとの安息香酸のエステル（例えば、Ｆｉｎｓｏｌｖ（登録商標）ＴＮ）、アルキル基当たり６〜２２個の炭素原子を有する直鎖または分枝の、対称または非対称のジアルキルエーテル、例えば、ジカプリリルエーテル等（Ｃｅｔｉｏｌ（登録商標）ＯＥ）など、ポリオールとのエポキシド化された脂肪酸エステルの開環生成物、シリコーン油（シクロメチコーン、シリコーン・メチコーン生成物など）および／または脂肪族またはナフテン系炭化水素、例えば、スクアラン、スクアレンまたはジアルキルシクロヘキサンなどが含まれる。
【００２６】
＜乳化剤＞
適した乳化剤は、例えば、以下の群から選択される非イオン性界面活性剤である。
・２〜３０ｍｏｌの酸化エチレンおよび／または０〜５ｍｏｌの酸化プロピレンを８〜２２個の炭素分子を有する直鎖脂肪族アルコールへ付加する生成物、１２〜２２個の炭素分子を有する脂肪酸へ付加する生成物、アルキル基において８〜１５個の炭素原子を有するアルキルフェノールへの付加生成物、およびアルキル基において８〜２２個の炭素原子を有するアルキルアミン；
・アルキル（アルケニル）基に８〜２２個の炭素原子を有するアルキルおよび／またはアルケニルオリゴグリコシドおよびそのエトキシ化類似体；
・１５〜６０ｍｏｌの酸化エチレンのヒマシ油および／または水素化ヒマシ油への付加生成物；
・１５〜６０ｍｏｌの酸化エチレンのヒマシ油および／または硬化ヒマシ油への付加生成物；
・グリセロールおよび／またはソルビタンと、１２〜２２個の炭素原子を有する不飽和、直鎖または飽和、分枝状脂肪酸との、および／または、３〜１８個の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸との部分エステル、およびそれらのエチレンオキシド１〜３０モル付加物；
・ポリグリセロール（平均自己縮合度２〜８）、ポリエチレングリコール（分子量４００〜５，０００）、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、糖アルコール（例えばソルビトール）、アルキルグルコシド（例えばメチルグルコシド、ブチルグルコシド、ラウリルグルコシド）、およびポリグルコシド（例えばセルロース）と、１２〜２２個の炭素原子を有する飽和および／または不飽和、直鎖または分枝状脂肪酸および／または３〜１８個の炭素原子を有するヒドロキシカルボン酸との部分エステル、およびそのエチレンオキシド１〜３０モル付加物；
・ペンタエリスリトール、脂肪酸、クエン酸および脂肪アルコールの混合エステルおよび／または６〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸、メチルグルコースおよびポリオール（好ましくはグリセロールまたはポリグリセロール）との混合エステル；
・リン酸モノ−、ジ−およびトリアルキル−リン酸およびＰＥＧ−モノ−、ジ−およびトリアルキル−リン酸エステルおよびその塩）；
・羊毛脂アルコール；
・ポリシロキサン／ポリアルキルポリエーテルコポリマーおよび相当する誘導体；
・ブロックコポリマー、例えばポリエチレングリコール−３０ジポリヒドロキシステアレート；
・ポリマー乳化剤、例えばGoodrichのPemulenグレード（ＴＲ−１、ＴＲ−２）またはCognisのCosmedia（登録商標）SP；
・ポリアルキレングリコール、および；
・グリセロールカーボネート。
【００２７】
以下、好適な乳化剤の更なる詳細を示す：
【００２８】
＜アルコキシル化＞
脂肪族アルコール、脂肪酸、アルキルフェノール、またはヒマシ油に、酸化エチレンおよび／または酸化プロピレンが添加された製品は周知であり、市販品で入手可能である。これらは、アルコキシル化度の平均が酸化エチレンの数および／または酸化プロピレンの数と添加反応との間の比率に対応する、添加反応に用いるホモログ混合物および基板である。酸化エチレンのグリセロールへの付加生成物のＣ１２／１８脂肪酸モノエステル及びジエステルは、化粧品調整物の脂質層増強剤として知られている。
【００２９】
＜アルキルおよび／またはアルケニルオリゴグリコシド＞
アルキルおよび／またはアルケニルオリゴグリコシド、その製造および使用は、先行技術である。これらは、特に、グルコースまたはオリゴ糖と８〜１８個の炭素原子を有する第一級アルコールとを反応させることによって製造される。グリコシド成分に関しては、環状糖単位がグリコシド結合によって脂肪アルコールに結合しているモノグリコシドならびに好ましくは約８以下のオリゴマー化度を有するオリゴマーグリコシドの両方が適当である。オリゴマー化度は統計学的平均値を意味し、この値は、上記のような工業用製品に通常の同族体分布に基づく。
【００３０】
＜部分グリセリド＞
適した部分グリセリドの典型例は、ヒドロキシステアリン酸モノグリセリド、ヒドロキシステアリン酸ジグリセリド、イソステアリン酸モノグリセリド、イソステアリン酸ジグリセリド、オレイン酸モノグリセリド、オレイン酸ジグリセリド、リシノール酸モノグリセリド、リシノール酸ジグリセリド、リノール酸モノグリセリド、リノール酸ジグリセリド、リノレン酸モノグリセリド、リノレン酸ジグリセリド、エルカ酸モノグリセリド、エルカ酸ジグリセリド、酒石酸モノグリセリド、酒石酸ジグリセリド、クエン酸モノグリセリド、クエン酸ジグリセリド、リンゴ酸モノグリセリド、リンゴ酸ジグリセリド及びこれらの技術的混合物であり、少量のトリグリセリドを依然として含み得る。前述の部分グリセリドに、１〜３０、好ましくは５〜１０モルのエチレンオキサイドの添加も好適である。
【００３１】
＜ソルビタンエステル＞
適したソルビタンエステルの例は、モノイソステアリン酸ソルビタン、セスキイソステアリン酸ソルビタン、ジイソステアリン酸ソルビタン、トリイソステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、ジオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、モノエルカ酸ソルビタン、セスキエルカ酸ソルビタン、ジエルカ酸ソルビタン、トリエルカ酸ソルビタン、モノリシノール酸ソルビタン、セスキリシノール酸ソルビタン、ジリシノール酸ソルビタン、トリリシノール酸ソルビタン、モノヒドロキシステアリン酸ソルビタン、セスキヒドロキシステアリン酸、ジヒドロキシステアリン酸ソルビタン、トリヒドロキシステアリン酸ソルビタン、モノ酒石酸ソルビタン、セスキ酒石酸ソルビタン、ジ酒石酸ソルビタン、トリ酒石酸ソルビタン、モノクエン酸ソルビタン、セスキクエン酸ソルビタン、ジクエン酸ソルビタン、トリクエン酸ソルビタン、モノマレイン酸ソルビタン、セスキマレイン酸ソルビタン、ジマレイン酸ソルビタン、トリマレイン酸ソルビタン、およびこれらの混合物である。前述のソルビタンエステルに、１〜３０、好ましくは５〜１０モルのエチレンオキサイドの添加も好適である。
【００３２】
＜ポリグリセロールエステル＞
適したなポリグリセロールエステルの典型例は、ポリグリセリル−２−ジポリヒドロキシステアレートＤｅｈｙｍｕｌｓ（登録商標）ＰＧＰＨ）、ポリグリセロール−３−ジイソステアレート（Ｌａｍｅｆｏｒｍ（登録商標）ＴＧＩ）、ポリグリセリル−４−イソステアレート（Ｉｓｏｌａｎ（登録商標）ＧＩ３４）、ポリグリセリル−３−オレート、ジイソステアロイルポリグリセリル−３−ジイソステアレート（Ｉｓｏｌａｎ（登録商標）ＰＤＩ）、ポリグリセリル−３−メチルグルコースジステアレート（ＴｅｇｏＣａｒｅ（登録商標）４５０）、ポリグリセリル−３−ミツロウ（Ｃｅｒａ Ｂｅｌｌｉｎａ（登録商標））、ポリグリセリル−４−カプレート（Ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｏｌ ＣａｐｒａｔｅＴ２０１０／９０）、ポリグリセリル−３−セチルエーテル（Ｃｈｉｍｅｘａｎｅ（登録商標）ＮＬ）、ポリグリセリル−３−ジステアレート（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＧＳ３２）およびポリグリセリルポリリシノレート（Ａｄｍｕｌ（登録商標）ＷＯＬ１４０３）、ポリグリセリルジメレートイソステアレートおよびこれらの混合物である。その他の好適なポリオールエステルの例は、トリメチルオールプロパンまたはペンタエリスリトールとラウリン酸、ヤシ脂肪酸、獣脂脂肪酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、ベヘン酸その他とのモノ−、ジ−およびトリエステルであって、任意に１〜３０モルのエチレンオキサイドと反応させたものである。
【００３３】
＜アニオン性乳化剤＞
典型的なアニオン性乳化剤は、例えばパルミチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸等の脂肪族Ｃ１２〜２２脂肪酸、並びにアゼライン酸、セバシン酸などのＣ１２〜２２ジカルボン酸である。
【００３４】
＜両性およびカチオン性乳化剤＞
さらに、両性または両イオン性界面活性剤は、乳化剤としても使用され得る。両イオン性界面活性剤は、少なくとも１つの４級アンモニウム基と、少なくとも１つのカルボキシレートと、１つのスルホン酸基とを分子中に含む界面活性化合物である。特に適した両イオン性界面活性剤は、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシネート等、例えば、ココアルキルジメチルアンモニウムグリシネート、Ｎ−アシルアミノプロピルーＮ，Ｎ−ジメチルアンモニウムグリシネート、例えば、ココアシルアミノプロピルジメチルアンモニウムグリシネート、ならびにアルキル基およびアシル基中に８〜１８個の炭素原子を含む２−アルキル−３−カルボキシメチル−３−ヒドロキシエチルイミダゾリン、ココアシルアミノエチルヒドロキシエチルカルボキシメチルグリシネート等の、いわゆるベタインである。特に好ましくは、ＣＴＦＡ名ではコカミドプロピルベタインとして知られている脂肪酸アミド誘導体である。両性界面活性剤もまた好適な乳化剤である。両性界面活性剤は、Ｃ８／１８アルキルまたはアシル基に加えて少なくとも１つの遊離アミノ基と少なくとも１つの−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ３Ｈ基を分子中に含み内塩を形成可能な界面活性化合物である。好適な両性界面活性剤の例は、Ｎ−アルキルグリシン、Ｎ−アルキルプロピオン酸、Ｎ−アルキルアミノ酪酸、Ｎ−アルキルイミノジプロピオン酸、Ｎ−ヒドロシキエチル−Ｎ−アルキルアミドプロピルグリシン、Ｎ−アルキルタウリン、Ｎ−アルキルサルコシン、２−アルキルアミノプロピオン酸およびアルキル基中に８〜１８個の炭素原子を含むアルキルアミノ酢酸である。特に好ましい両性界面活性剤は、Ｎ−ココアルキルアミノプロピオネート、ココアシルアミノエチルアミノプロピオネート及びＣ１２／１８アシルサルコシンである。最後に、エステルクワット系、好ましくはメチル−四級化ジ脂肪酸トリエタノールアミンエステル塩のカチオン系界面活性剤も乳化剤として使用できる。
【００３５】
＜脂肪およびワックス＞
脂肪の典型例はグリセリドであり、例えば、高級脂肪酸の混合グリセロールエステルから本質的になる、固体または液体の植物または動物産物であり、適したワックスは、例えば、キャンデリラ蝋、カルナバワックス、和蝋、エスパルトワックス、コルクワックス、グアルマワックス、コメ胚芽油ワックス、サトウキビワックス、オウリキュリーワックス、モンタンワックス、蜜蝋、セラックワックス、鯨蝋、ラノリン（羊毛蝋）、尾脂、セレシン、オゾケライト（地蝋）、ワセリン、パラフィンワックス、マイクロワックスなどの天然ワックス、例えば、モンタンエステルワックス、サソールワックス、水素化ホホバワックスなどの化学的に修飾されたワックス（ハードワックス）；例えば、ポリアルキレンワックスおよびポリエチレングリコールワックスなどの合成ワックスが含まれる。脂肪に加えて、例えば、レシチンおよびリン脂質などの脂肪様物質も添加剤として好適である。レシチンという用語は、当業者には、脂肪酸、グリセロール、リン酸およびコリンからエステル化によって形成されるグリセロリン脂質として理解される。従って、レシチンは専門家の間でホスファチジルコリン（ＰＣ）とも呼ばれる。天然レシチンの例には、ホスファチジン酸とも呼ばれ、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸の誘導体を構成するケファリンが含まれる。一方、一般的に脂肪として分類されるグリセロール（グリセロールホスフェート）とのリン酸のモノ−および好ましくはジエステルを意味すると通常理解される。さらに、スフィンゴシンまたはスフィンゴ脂質も適している。
【００３６】
＜真珠光沢ワックス＞
真珠光沢ワックスの例には、アルキレングリコールエステル、特にエチレングリコールジステアレート；脂肪酸アルカノールアミド、特にヤシ脂肪酸ジエタノールアミド；部分グリセリド、特にステアリン酸モノグリセリド；多価の、任意にヒドロキシ置換したカルボン酸の６〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコールとのエステル、特に酒石酸の長鎖エステル；脂肪性物質、例えば、脂肪族アルコール、脂肪族ケトン、脂肪族アルデヒド、脂肪族エーテルおよび脂肪族カーボネート（合計２４以上の炭素原子数を有する）、特にラウロンおよびジステアリルエーテル；脂肪酸、例えば、ステアリン酸、ヒドロキシステアリン酸またはベヘン酸、１２〜２２個の炭素原子を有するオレフィンエポキシドの、１２〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコールおよび／または２〜１５個の炭素原子を有し２〜１０個のヒドロキシル基を有するポリオールとの開環生成物；ならびにそれらの混合物が含まれる。
【００３７】
＜冷却材＞
冷却材は、皮膚に冷却を与える化合物である。ルールとして、これらはメントール化合物であり、−基本物質のメントール自体に加えて−、メントール化合物は、例えば、メントールメチルエーテル、メントングリセリルアセタール（ＦＥＭＡＧＲＡＳ１ ３８０７）、メントングリセリルケタール（ＦＥＭＡ ＧＲＡＳ ３８０８）、乳酸メンチル（ＦＥＭＡ ＧＲＡＳ ３７４８）、メントールエチレングリコールカーボネート（ＦＥＭＡＧＲＡＳ ３８０５）、メントールプロピレングリコールカーボネート（ＦＥＭＡ ＧＲＡＳ ３８０６）、メンチル−Ｎ−エチルオキサメート、モノメチルサクシネート（ＦＥＭＡＧＲＡＳ ３８１０）、モノメンチルグルタマート（ＦＥＭＡ ＧＲＡＳ ４００６）、メントキシ−１，２−プロパンジオール（ＦＥＭＡ ＧＲＡＳ ３７８４）、メントキシ−２−メチル−１，２−プロパンジオール（ＦＥＭＡＧＲＡＳ ３８４９）、メンタンカルボン酸エステルおよびアミドＷＳ−３、ＷＳ−４、ＷＳ−５、ＷＳ−１２、ＷＳ−１４およびＷＳ−３０、及び上記の混合物から成る群より選択される。
【００３８】
１ＦＥＭＡは「Ｆｌａｖｏｒ ａｎｄ  ＥｘｔｒａｃｔｓＭａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ」の略であり、ＧＲＡＳは「一般的に安全とみなされている（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ Ｒｅｇａｒｄｅｄ Ａｓ Ｓａｆｅ）」と定義される。ＦＥＭＡＧＲＡＳ評価は、そのように示された物質は標準的な方法で試験され、毒性学的に安全とみなされていることを意味する。
【００３９】
物質の第１の重要な例は、コハク酸モノメンチル（ＦＥＭＡ ＧＲＡＳ ３８１０）である。コハク酸ならびに類似のグルタル酸モノメンチル（ＦＥＭＡＧＲＡＳ ４００６）のいずれも、ジカルボン酸およびポリカルボン酸に基づくモノメンチルエステルの重要な例である
【００４０】
【化２】
0006615793.tif 000003
これらの物質の適用例は、例えば、国際公開第２００３／０４３４３１号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）または欧州特許公開第１３３２７７２号（ＩＦＦ）の文献中に記載されている。
【００４１】
本発明の意味する範囲内で好適なメントール化合物の次に重要な群は、メントールの炭酸エステルおよびポリオールを含み、例えば、グリコール、グリセロールまたは炭水化物、例えばメントールエチレングリコールカーボネート（FEMA GRAS 3805＝Frescolat（登録商標）MGC）、メントールプロピレングリコールカーボネート（FEMA GRAS 3784＝Frescolat（登録商標）MPC）、メントール２−メチル−１,２−プロパンジオールカーボネート（FEMA GRAS 3849）または対応する糖誘導体である。メントール化合物乳酸メンチル（FEMA GRAS 3748＝Frescolat（登録商標）ML）および、特にメントングリセリルアセタール（FEMA GRAS 3807）または、Frescolat（登録商標）MAGの商品名で販売されているメントングリセリルケタール（FEMA GRAS 3808）は、それぞれ、本発明の意味する範囲内で好ましい。これらの物質の中で、メントングリセリルアセタール／ケタールおよび乳酸メンチル、ならびにメントールエチレングリコールカーボネートまたはメントールプロピレングリコールカーボネートが特に有用であり、それぞれ、Frescolat（登録商標）MGA、Frescolat（登録商標）ML、Frescolat（登録商標）MGCおよびFrescolat（登録商標）MPCの商品名で販売されている。
【００４２】
１９７０年代には、Ｃ−Ｃ結合を３位に有するメントール化合物が初めて開発されており、これらの中のいくつかの例も、本発明の意味する範囲内で使用してよい。これらの物質は、一般に、ＷＳタイプと称される。基本体はメントール誘導体であり、ここで、ヒドロキシル基がカルボキシル基に置き換えられる（ＷＳ−１）。他の全てのＷＳタイプがこの構造から誘導され、例えば本発明の意味する範囲内で好ましい種類は、ＷＳ−３、ＷＳ−４、ＷＳ−５、ＷＳ−１２、ＷＳ−１４およびＷＳ−３０である。
【００４３】
＜コンシ染色シー調整剤及び増粘剤＞
好適なコンシ染色シー調整剤の例としては、主に１２〜２２個、好ましくは１６〜１８個の炭素原子を含む脂肪族アルコールまたは部分グリセリド、脂肪酸またはヒドロキシ脂肪酸が挙げられる。これらの物質と、アルキルオリゴグルコシドおよび／または同じ鎖長の脂肪酸Ｎ−メチルグルカミドおよび／またはポリグリセロールポリ−１２−ヒドロキシステアレートとの組合せが好ましい。好適な増粘剤は、例えば、アエロジルグレード（親水性シリカ）、多糖、特にキサンタンガム、グアー、寒天、アルギン酸塩およびチロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、更に比較的高分子量の脂肪酸ポリエチレングリコールモノエステルおよびジエステル、ポリアクリレート（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）；Ｓｙｎｔｈａｌｅｎｓ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）；Ｋｅｌｔｏｌグレード（Ｋｅｌｃｏ）、Ｓｅｐｉｇｅｌグレード（Ｓｅｐｐｉｃ）、Ｓａｌｃａｒｅ（ＡｌｌｉｅｄＣｏｌｌｏｉｄｓ）、ポリアクリルアミド、ポリマー、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドン。例えばＢｅｎｔｏｎｅ（登録商標）、Ｇｅｌ ＶＳ−５ＰＣ（Ｒｈｅｏｘ）等のシクロペンタシロキサンの混合物、字ステアディオニウムヘクトライト及びプロピレンカーボネート等のベントナイトも有効である。コンシ染色シー調整剤は同様に、エトキシル化脂肪酸グリセリドなどの界面活性剤、脂肪酸とペンタエリトリトールまたはトリメチロールプロパンなどのポリオールとのエステル、狭い同族体分布を有する脂肪アルコールエトキシレートならびに塩化ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの電解質も適している。
【００４４】
＜過脂肪剤および安定剤＞
過脂肪剤は、例えば、ラノリンおよびレシチン、更にポリエトキシル化またはアシル化したラノリンおよびレシチン誘導体、ポリオール脂肪酸エステル、モノグリセリドおよび脂肪酸アルカノールアミド（後者は、発泡安定剤としても働く）等から選択されて良い。脂肪酸の金属塩、例えばマグネシウム、アルミニウム及び／または亜鉛ステアレート及びリシノリエートも、安定剤として使用し得る。
【００４５】
＜ポリマー＞
適したカチオン性ポリマーは、具体的には、カチオン性セルロース誘導体、例えば、ＪＲ ４００（登録商標）の商品名でＡｍｅｒｃｈｏｌより入手可能な第四級化ヒドロキシエチルセルロース、カチオン性デンプン、ジアリルアンモニウム塩とアクリルアミドのコポリマー、第四級化ビニルピロリドン／ビニルイミダゾールポリマー、例えばＬｕｖｉｑｕａｔ（登録商標）（ＢＡＳＦ）など、ポリグリコールおよびアミンの縮合製品、第四級化コラーゲンポリペプチド、例えば、ラウリルジモニウムヒドロキシプロピル加水分解コラーゲン（Ｌａｍｅｑｕａｔ（登録商標）Ｌ／Ｇｒｕｅｎａｕ）、第四級化小麦ポリペプチド、ポリエチレンイミン、カチオン性シリコーンポリマー、例えば、アモジメチコンなど、アジピン酸とジメチルアミノヒドロキシプロピルジエチレントリアミンのコポリマー（Ｃａｒｔａｒｅｔｉｎｅ（登録商標）／Ｓａｎｄｏｚ）、アクリル酸のジメチルジアリルアンモニウムクロリドとのコポリマー（Ｍｅｒｑｕａｔ（登録商標）５５０／Ｃｈｅｍｖｉｒｏｎ）、ポリアミノポリアミドおよびその架橋水溶性ポリマー、カチオン性キチン誘導体、例えば、第四級化キトサンであり、任意に微結晶分散した形態、ジハロゲンアルキレン縮合生成物、例えば、ジブロモブタンのビス−ジアルキルアミン、例えば、ビス−ジメチルアミノ−１，３−プロパンなど、カチオン性グアーガム、例えば、Ｃｅｌａｎｅｓｅ製のＪａｇｕａｒ（登録商標）ＣＢＳ、Ｊａｇｕａｒ（登録商標）Ｃ−１７またはＪａｇｕａｒ（登録商標）Ｃ−１６など、第四級化アンモニウム塩ポリマー、例えば、Ｍｉｒａｎｏｌ製のＭｉｒａｐｏｌ（登録商標）Ａ−１５、Ｍｉｒａｐｏｌ（登録商標）ＡＤ−１、Ｍｉｒａｐｏｌ（登録商標）ＡＺ−１などである。
【００４６】
適したアニオン性、双性イオン性、両性および非イオン性ポリマーの例には、酢酸ビニル／クロトン酸コポリマー、ビニルピロリドン／アクリル酸ビニルコポリマー、酢酸ビニル／マレイン酸ブチル／アクリル酸イソボルニルコポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマーおよびそれらのエステル、未架橋ポリアクリル酸およびポリオールとの架橋ポリアクリル酸、アクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド／アクリレートコポリマー、オクチルアクリルアミド／メチルメタクリルレート／tert−ブチルアミノエチルメタクリレート／２−ヒドロキシプロピルメタクリレートコポリマー、ポリビニルピロリドン、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、ビニルピロリドン／ジメチルアミノエチルメタクリレート／ビニルカプロラクタムターポリマー、ならびに任意に誘導体化したセルロースエーテルおよびシリコーンが含まれる。
【００４７】
＜シリコーン化合物＞
適したシリコーン化合物は、例えば、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、環状シリコーン、ならびに室温で液状または樹脂状のいずれかであってもよい、アミノ、脂肪（ｆａｔｔｙ）−酸、アルコール、ポリエーテル、エポキシ、フッ素、グリコシドおよび／またはアルキル修飾シリコーン化合物である。他の適したシリコーン化合物は、２００〜３００のジメチルシロキサン単位の平均鎖長と水素化ケイ酸塩を有するジメチコーンの混合物であるシメチコンである。
【００４８】
＜紫外線予防因子＞
紫外線予防因子とは、例えば、室温で液体または結晶である有機物質（光保護フィルター）であり、紫外線を吸収でき、その後、熱などのより長い波長の放射の形で吸収したエネルギーを放出できる因子をいう。一般的に、紫外線防御因子は０．１〜５重量％、好ましくは０．２〜１重量％の量で含まれる。ＵＶＢフィルタは油溶性または水溶性であってもよい。油溶性物質の例は以下のように具体的に示すことができる。
・３−ベンジリデンカンファまたは３−ベンジリデンノルカンファおよびそれらの誘導体、例えば、３−（４−メチルベンジリデン）カンファ；
・４−アミノ安息香酸誘導体、好ましくは４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−エチルヘキシルエステル、４−（ジメチルアミノ）安息香酸−２−オクチルエステル、および４−（ジメチルアミノ）安息香酸アミルエステル；
・桂皮酸のエステル、好ましくは４−メトキシ桂皮酸２−エチルヘキシルエステル、４−メトキシ桂皮酸プロピルエステル、４−メトキシ桂皮酸イソアミルエステル、および２−シアノ−３，３−フェニル桂皮酸−２−エチルヘキシルエステル（オクトクリレン）；
・サリチル酸のエステル、好ましくはサリチル酸−２−エチルヘキシルエステル、サリチル酸−４−イソプロピルベンジルエステル、およびサリチル酸ホモメンチルエステル；
・ベンゾフェノン誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−４’−メチルベンゾフェノン、および２，２’−ジヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン；
・ベンザルマロン酸のエステル、好ましくは４−メトキシベンザルマロン酸ジ−２−エチルヘキシルエステル；
・トリアジン誘導体、例えば、２，４，６−トリアニリノ−（ｐ−カルボ−２’−エチル−１’−ヘキシルオキシ）−１，３，５−トリアジンおよびオクチルトリアゾンまたはジオクチルブタミドトリアゾン（Ｕｖａｓｏｒｂ（登録商標）ＨＥＢ）など；
・プロパン−１，３−ジオン、例えば、１−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオン；
・ケトトリシクロ（５．２．１．０）デカン誘導体。
【００４９】
適切な水溶性物質には、以下の物質が含まれる：
・２−フェニルベンズイミダゾール−５−スルホン酸およびそのアルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、アルカリアンモニウム、アルカノールアンモニウム、およびそのグルコアンモニウム塩；
・１Ｈ−ベンズイミダゾール−４，６−ジスルホン酸、２，２’−（１，４−フェニレン）ビス−二ナトリウム塩（ＮｅｏＨｅｌｉｏｐａｎ（登録商標） ＡＰ）
・ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸およびその塩；
・３−ベンジリデンカンファのスルホン酸誘導体、例えば、４−（２−オキソ−３−ボルニリデンメチル）ベンゼンスルホン酸および２−メチル−５−（２−オキソ−３−ボルニリデン）スルホン酸およびそれらの塩。
【００５０】
ＵＶ−Ａフィルタの典型例のうち、特に適しているのはベンゾイルメタンの誘導体、具体的には、１−（４’−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−３−（４’−メトキシフェニル）プロパン−１，３−ジオン、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン（Ｐａｒｓｏｌ（登録商標）１７８９）、２−（４−ジエチルアミノ−２−ヒドロキシベンゾイル）−安息香酸ヘキシルエステル（Ｕｖｉｎｕｌ（登録商標）Ａ Ｐｌｕｓ）、１−フェニル−３−（４’−イソプロピルフェニル）プロパン−１，３−ジオン、およびエナミン化合物などである。ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂフィルタは混合物中でも使用しうる。特に好ましい組合せは、ベンゾイルメタンの誘導体、例えば、４−ｔｅｒｔ−ブチル−４’−メトキシジベンゾイルメタン（Ｐａｒｓｏｌ（登録商標）１７８９）および２−シアノ−３，３−フェニル桂皮酸−２−エチル−ヘキシルエステル（オクトクリレン）と、桂皮酸のエステル、好ましくは４−メトキシ桂皮酸−２−エチルヘキシルエステルおよび／または４−メトキシ桂皮酸プロピルエステルおよび／または４−メトキシ桂皮酸イソアミルエステルとの組み合わせである。これらの組合せは、水溶性フィルタ、例えば、２−フェニルベンズイミダゾール−５−スルホン酸およびそのアルカリ、アルカリ金属、アンモニウム、アルキルアンモニウム、アルカノールアンモニウムおよびグルコアンモニウム塩などとも有利に組み合わされる。
【００５１】
前述した可溶性物質に加えて、不溶性の光防御顔料、つまり、微細分散した金属酸化物またはそれらの塩もこの目的に適している。適した金属酸化物の例には、特に、酸化亜鉛および二酸化チタン、および鉄酸化物、ジルコニウムオキシド、ケイ素、マンガン、アルミニウムおよびセリウムの酸化物、ならびにそれらの混合物が含まれる。ケイ酸塩（タルク）、硫酸バリウムまたはステアリン酸亜鉛は塩として使用できる。酸化物および塩は、スキンケアの形態におけるスキンケアおよび皮膚保護エマルジョンならびに美容化粧品のための顔料の形態で使用される。この場合の平均粒径は１００ｎｍ未満、好ましくは５〜５０ｎｍの間、特に好ましくは１５〜３０ｎｍの間である。これらの粒子は球形の形態を有しうるが、楕円形または球形の形態から外れた粒子も使用できる。顔料は、親水化または疎水化などの表面処理がされていてもよい。典型的な例は、被覆された二酸化チタン、例えば、二酸化チタンＴ ８０５（Ｄｅｇｕｓｓａ）またはＥｕｓｏｌｅｘ （登録商標） Ｔ２０００、Ｅｕｓｏｌｅｘ （登録商標） Ｔ、Ｅｕｓｏｌｅｘ （登録商標） Ｔ−ＥＣＯ、Ｅｕｓｏｌｅｘ（登録商標） Ｔ−Ｓ、Ｅｕｓｏｌｅｘ （登録商標） Ｔ−Ａｑｕａ、Ｅｕｓｏｌｅｘ （登録商標） Ｔ−４５Ｄ（すべてメルク社）、Ｕｖｉｎｕｌ Ｔｉ０２（ＢＡＳＦ社）などである。疎水性コーティング材料としては、シリコーンが好ましく、トリアルコキシオクチルシランまたはシメチコンが特に好ましい。日焼け止め剤において、ミクロまたはナノ顔料と呼ばれる物質が好適に使用される。微粉化した酸化亜鉛、例えば、Ｚ−ＣＯＴＥ（登録商標）またはＺ−ＣＯＴＥＨＰ１（登録商標）などが最も好適に使用される。
【００５２】
＜湿潤剤＞
湿潤剤は、組成物の官能特性をさらに最適化し、皮膚の水分を調節するために使用される。同時に、本発明による調製物の冷却安定性は、特にエマルジョンの場合に、増加する。湿潤剤は通常０．１〜１５重量％、好ましくは１〜１０重量％、特に好ましくは５〜１０重量％の量で含まれる。
【００５３】
本発明による好適な湿潤剤の例は、アミノ酸、ピロリドンカルボン酸、乳酸およびその塩、ラクチトール、尿素および尿素誘導体、尿酸、グルコサミン、クレアチニン、コラーゲン分解産物、キトサンまたはキトサン塩／誘導体、および特にポリオールおよびポリオール誘導体（例えば、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、エリスリトール、１，２，６−ヘキサントリオール、ポリエチレングリコール、例えば、ＰＥＧ−４、ＰＥＧ−６、ＰＥＧ−７、ＰＥＧ−８、ＰＥＧ−９、ＰＥＧ−１０、ＰＥＧ−１２、ＰＥＧ−１４、ＰＥＧ−１６、ＰＥＧ−１８、ＰＥＧ−２０など）、糖および糖誘導体（フルクトース、グルコース、マルトース、マルチトール、マンニトール、イノシトール、ソルビトール、ソルビチルシランジオール、スクロース、トレハロース、キシロース、キシリトール、グルクロン酸、およびそれらの塩を含む）、エトキシ化ソルビトール（Ｓｏｒｂｅｔｈ−６、Ｓｏｒｂｅｔｈ−２０、Ｓｏｒｂｅｔｈ−３０、Ｓｏｒｂｅｔｈ−４０）、蜂蜜および水素化蜂蜜、水素化デンプン加水分解物、ならびに水素化小麦タンパク質とＰＥＧ−２０アセテートコポリマーの混合物である。本発明に従い湿潤剤として好ましいのは、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロールおよびブチレングリコールである。
【００５４】
＜生体活性成分および酸化防止剤＞
生体活性成分とは、例えば、トコフェロール、トコフェロールアセテート、トコフェロールパルミテート、アスコルビン酸、(デオキシ）リボ核酸およびその断片化生成物、β−グルカン、レチノール、ビサボロール、アラントイン、フィタントリオール、パンテノール、ＡＨＡ酸、アミノ酸、セラミド、擬似セラミド、精油、植物抽出物、例えば、サクラ属抽出物およびバンバラナッツ抽出物など、ならびにビタミン複合体を意味すると理解される。
【００５５】
酸化防止剤は、ＵＶ放射が皮膚を貫通するときに引き起こされる光化学反応連鎖を分断する。酸化防止剤の代表的な例としては、アミノ酸（例えば、グリシン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファン）およびそれらの誘導体、イミダゾール（例えば、ウロカニン酸）およびその誘導体、ペプチド、例えば、Ｄ，Ｌ−カルノシン、Ｄ−カルノシン、Ｌ−カルノシンおよびそれらの誘導体（例えば、アンセリン）、カロテノイド、カロテン（例えば、α−カロテン、β−カロテン、リコピン）およびそれらの誘導体、クロロゲン酸およびその誘導体、リポ酸およびその誘導体（例えば、ジヒドロリポ酸）、アウロチオグルコース、プロピルチオウラシルおよび他のチオール（例えば、チオレドキシン、グルタチオン、シ染色、シスチン、シスタミンおよびそれらのグリコシル、Ｎ−アセチル、メチル、エチル、プロピル、アミル、ブチルおよびラウリル、パルミトイル、オレイル、γ−リノレイル、コレステリル及びこれらのグリセリルエステル）並びにそれらの塩、ジラウリルチオジプロピオネート、ジステアリルチオジプロピオネート、チオジプロピオン酸およびそれらの誘導体（エステル、エーテル、ペプチド、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび塩）、ならびに非常に少ない耐容可能用量（例えば、ｐｍｏｌ〜μｍｏｌ／ｋｇ）のスルホキシイミン化合物（例えば、ブチオニンスルホキシイミン、ホモシ染色スルホキシイミン、ブチオニンスルホン、ペンタ−、ヘキサ−、ヘプタチオニンスルホキシイミン）、さらに（金属）キレート剤（例えば、α−ヒドロキシ脂肪酸、パルミチン酸、フィチン酸、ラクトフェリン）、α−ヒドロキシ酸（例えば、クエン酸、乳酸、リンゴ酸）、フミン酸、胆汁酸、胆汁抽出物、ビリルビン、ビリベルジン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡおよびそれらの誘導体、不飽和脂肪酸およびそれらの誘導体（例えば、γ−リノレン酸、リノール酸、オレイン酸）、葉酸およびその誘導体、ユビキノンおよびユビキノールおよびそれらの誘導体、ビタミンＣおよび誘導体（例えば、パルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルＭｇ、酢酸アスコルビル）、トコフェロールおよび誘導体（例えば、ビタミンＥアセテート）、ビタミンＡおよび誘導体（ビタミンＡパルミテート）、ならびにベンゾイン由来のコニフェリルベンゾアート、ルチン酸およびその誘導体、α−グリコシルルチン、フェルラ酸、フルフリリデングルシトール、カルノシン、ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、ノルジヒドログアヤク樹脂酸、ノルジヒドログアイアレチン酸、トリヒドロキシブチロフェノン、尿酸およびその誘導体、マンノースおよびその誘導体、スーパーオキシドジスムターゼ、亜鉛およびその誘導体（例えば、ＺｎＯ、ＺｎＳ０４）、セレンおよびその誘導体（例えば、セレンメチオニン）、スチルベンおよびそれらの誘導体（例えば、スチルベンオキシド、ｔｒａｎｓ−スチルベンオキシド）ならびに前記活性成分の本発明に適した誘導体（塩、エステル、エーテル、糖、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ペプチドおよび脂質）が挙げられる。
【００５６】
＜ヒドロトロープ＞
流動性状の向上のため、ヒドロトロープ剤、例えばエタノール、イソプロピルアルコールまたはポリオールを用いてもよい。これらの物質は当初説明したキャリアに概ね対応する。好適なポリオールは、好ましくは２〜１５個の炭素原子および少なくとも２個のヒドロキシ基を含有する。これらポリオールは、他の官能基、特にアミノ基を含有することができ、また、窒素で修飾することもできる。典型例は次の通りである：
・グリセロール；
・アルキレングリコール、例えばエチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、および、ポリエチレングリコール（１００〜１０００ダルトンの平均分子量を有する）；
・１.５〜１０の内的縮合度を有する工業用オリゴグリセロール混合物、例えば４０〜５０ｗｔ．％のジグリセロール含量を有する工業用ジグリセロール混合物；
・メチロール化合物、例えば特にトリメチロールエタン、トリメチロールプロパン、トリメチロールブタン、ペンタエリスリトールおよびジペンタエリスリトール；
・低級アルキルグルコシド、特にアルキル基に１〜８個の炭素原子を含むもの、例えばメチルおよびブチルグルコシド；
・５〜１２個の炭素原子を含む糖アルコール、例えばソルビトールまたはマンニトール；
・５〜１２個の炭素原子を含む糖、例えばグルコースまたはサッカロース；
・アミノ糖、例えばグルカミン；
・ジアルコールアミン、例えばジエタノールアミンまたは２−アミノ−１,３−プロパンジオール。
【００５７】
＜防腐剤＞
好ましい防腐剤は、例えば、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド溶液、バラベン、ペンタンジオールまたはソルビン酸、およびＫｏｓｍｅｔｉｋｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇ（”ＣｏｓｍｅｔｉｃｓＤｉｒｅｃｔｉｖｅ”）のパートＡおよびＢの付録６に記載の銀錯体である。香油、香料物質、香料およびフラグランス
香油としては、天然および合成香料の混合物が挙げられる。天然香料としては、例えば、花（例、ユリ、ラベンダー、バラ、ジャスミン、ネロリ、イラン−イラン等）、茎および葉（例、ゼラニウム、パチョリ、プチグレン等）、果実（例、アニス、コリアンダー、キャラウェー、ビャクシン等）、果皮（例、ベルガモット、レモン、オレンジ等）、根（例、ナツメグ、アンゼリカ、セロリ、カルダモン、コスタス、アヤメ、ショウブ等）、木（例、マツ、白檀、グアヤク、シーダー、シタン等）、ハーブおよび草（例、タラゴン、レモングラス、セージ、タイム等）、針葉および枝（例、トウヒ、モミ、マツ、低木マツ等）、樹脂およびバルサム（例、ガルバヌム、エレミ、ベンゾイン、ミルラ、乳香、オポパナクス等）などの抽出物が挙げられる。動物性原料、例えばシベットおよびカストリウムを使用してもよい。典型的な合成香料化合物は、エステル、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルコールおよび炭化水素型の生成物である。エステル型フラグランス化合物の例は、ベンジルアセテート、フェノキシエチルイソブチレート、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシルアセテート、リナリルアセテート、ジメチルベンジルカルボニルアセテート、フェニルエチルアセテート、リナリルベンゾエート、ベンジルホルメート、エチルメチルフェニルグリシネート、アリルシクロヘキシルプロピオネート、スチラリルプロピオネート、およびベンジルサリチレートである。エーテルは例えば、ベンジルエチルエーテルを包含し、アルデヒドは例えば、８〜１８個の炭素原子を有する直鎖アルカナール、シトラール、シトロネラル、シトロネリルオキシアセトアルデヒド、シクラメンアルデヒド、ヒドロキシシトロネラル、リリアールおよびブルゲオナールを包含し、好適なケトンは例えば、イオノン類、α−イソメチルイオノンおよびメチルセドリルケトンであり、好適なアルコールは、アネトール、シトロネロール、オイゲノール、イソオルゲノール、ゲラニオール、リナロール、フェニルエチルアルコールおよびテルピネオールであり、炭化水素は主として、テルペン類およびバルサム類を包含する。しかしながら、共同で快い香を発する種々の香料化合物の混合物を使用することが好ましい。別の好適な鉱油としては、芳香成分として用いられることの多い比較的揮発性の低い精油が挙げられる。好適な鉱油の例としては、セージ油、カモミール油、丁子油、メリッサ油、ミント油、シナモン葉油、ライム花油、ジュニパーベリー油、ベチベル油、乳香油、ガルバヌム油、ラブダヌム油およびラバンジン油が挙げられる。好ましくは以下を単独であるいは混合物として用いても良い：ベルガモット油、ジヒドロミルセノール、リリアール、ライラール、シトロネロール、フェニルエチルアルコール、ヘキシルシンナムアルデヒド、ゲラニオール、ベンジルアセトン、シクラメンアルデヒド、リナロール、ボイサムブレンフォルテ、アンブロキサン、インドール、ヘジオン、サンデリス、シトラス油、マンダリン油、オレンジ油、アリルペンチルグリコレート、シクロバータル、ラバンジン油、クラリー油、ダマスコン、ゼラニウム油バーボン、シクロヘキシルサリチレート、バートフィックスクール、イソ−イー−スーパー、���ィクソリドＮＰ、エベルニル、イラルデインガンマ、フェニル酢酸、ゲラニルアセテート、ベンジルアセテート、ローズオキシド、ロミレート、イロチルおよびフロラメートなどの単独または混合物が挙げられる。
【００５８】
好ましい香料物質は、例えばペパーミント油、スペアミント油、アニシード油、スターアニス油、クミン油、ユーカリ油、フェネル油、レモン油、冬緑油、クローブ油、メントール等が挙げられる。
【００５９】
＜染料＞
好適な染料は、例えば刊行物“Ｋｏｓｍｅｔｉｓｃｈｅ Ｆａｅｒｂｅｍｉｔｔｅｌ”， Ｆａｒｂｓｔｏｆｆｋｏｍｍｉｓｓｉｏｎｄｅｒ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｇｅｍｅｉｎｓｃｈａｆｔ， Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， １９８４，８１〜１０６ページに記載のような、化粧用に適当で承認された物質である。その例は、コチニールレッドＡ（Ｃ．Ｉ．１６２５５）、パテントブルーＶ（Ｃ．Ｉ．４２０５１）、インジゴチン（Ｃ．Ｉ．７３０１５）、クロロフィリン（Ｃ．Ｉ．７５８１０）、キノリンイエロー（Ｃ．Ｉ．４７００５）、二酸化チタン（Ｃ．Ｉ．７７８９１）、インダントレンブルーＲＳ（Ｃ．Ｉ．６９８００）、およびマダーレーキ（Ｃ．Ｉ．５８０００）を包含する。蛍光染料としてルミノールも使用し得る。これらの染料は、全体の重量のうちの０．００１〜０．１重量％の濃度である。
【００６０】
助剤及び添加剤は、組成物の全体量に対して１〜５０重量％、好ましくは５〜４０重量％である。組成物は一般的な冷却及び加熱過程によって生成され、転相温度法に従って生成されることが好適である。
【００６１】
＜スクリーニング方法＞
本発明の更なる目的は、創傷治癒を促進する有効成分を特定する方法に関し
（ａ）嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４を含むケラチノサイト培養物を準備し
（ｂ）試験する有効成分を培養物に追加し
（ｃ）細胞内カルシウム濃度の変化を特定する。
【００６２】
受容体が有効成分によって活性されると、有効成分は創傷治癒を助長または促進し、細胞内、好ましくはＨａＣａＴ細胞でのカルシウム分泌が増加する。これまでの投与と比較して、各有効成分の投与がカルシウム濃度の振幅を増加させる場合は、特にそうである。
【００６３】
＜実施例＞
＜＜異種発現システムにおけるＯＲ２ＡＴ４の特徴＞＞
組織内での受容体の機能を明瞭にするために、リガンドを特定することが重要であり、受容体が神経システムで活性することを確認するべきである。殆どのＯＲは、デオーファンされていない。この理由によって、ヒトケラチノサイトで発見されるＯＲ２ＡＴ４は、最初に異種発現システムで明確に特徴化され、受容域が特定される。
【００６４】
＜Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の異種発現＞
安定した内因性の嗅覚伝達ファクターを発現するＨａｎａ３Ａ細胞は、異種発現として使用され、特に細胞膜へのＯＲの導入をターゲットにし、活性容積を改善させる。さらに、ロドプシン（Ｒｈｏ−Ｔａｇ）の２０の最初のＮ末端アミノ酸が、ＯＲのコーディングシーケンスのＮ末端の前に追加され、異種発現をサポートする。
【００６５】
Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の異種発現を検出するために、これらの細胞はリン酸カルシウム法で、受容体プラスミド（pcDNA3-OR2AT4）と４８時間トランスフェクトされ、免疫細胞化学的染色はＯＲ２ＡＴ４特性抗体（α−ＯＲ２ＡＴ４抗体）及びロドプシン特性抗体（α−Ｒｈｏ抗体）によって実現される。２つの抗体の明瞭な共染色は、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体が特に受容体と結合し、Ｈａｎａ３Ａ細胞での受容体の異種発現が可能となる。ＯＲのコーディングシーケンスのＮ末端は、異種発現を支えるために付与される。Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の異種発現を特定するためには、これらの細胞はリン酸カルシウム法で、受容体プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＯＲ２ＡＴ４）で４８時間トランスフェクトされ、免疫細胞化学的な染色はＯＲ２ＡＴ４特性抗体（α−ＯＲ２ＡＴ４抗体）及びロドプシン特性抗体（α−Ｒｈｏ抗体）によって実現される。２つの抗体の明瞭な共染色は、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体が特に受容体と結合し、Ｈａｎａ３Ａ細胞での受容体の異種発現が可能となる（図１、上部）。
【００６６】
これまで、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体の非特異的結合は、他の異種発現できるＯＲ、ＯＲ１Ａ２で染色を制御することにより、排除することが可能であった。ＯＲ１Ａ２でトランスフェクトされたＨａｎａ３Ａ細胞では、明らかなロドプシンの染色が受容体発現を表すが、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体は特定できなかった（図１、下図）。更なる制御として、第２抗体の非特異的結合を排除するために、第１抗体を排除してＨａｎａ３Ａ細胞がインキュベーションされた。
【００６７】
＜Ｈａｎａ３Ａ細胞でのＯＲ２ＡＴ４の膜発現＞
細胞外リガンドがＨａｎａ３Ａ細胞で異種発現したＯＲ２ＡＴ４に結合することを保証するために、前記の受容体は細胞膜に取り込まれる必要がある。異種系では、ＯＲは非常に難しい発現しかできず、多くの場合、受容体を小胞体から細胞表面へ移動する際に欠陥を生じる。従って、デオーファンを実施する前に、受容体を膜に結合し、トランスフェクト率を決めることが重要である。この目的において、Zhang及びMatsunamiによる生細胞の染色（２００８）が実施され、表面のタンパク質のみを選択的に着色し、細胞膜が透過されない。
【００６８】
組換えで発現するＯＲのＲｈｏタグのＮ末端を検知するα−Ｒｈｏ抗体は、染色に再度使用される。染色は、リン酸カルシウム法で４８時間トランスフェクトした後、ＯＲ２ＡＴ４が膜に成功的に導入されたことを示す（図２ａ）。染色されたＨａｎａ３Ａ細胞（１２細胞）の数と全体のセルカウント（１０５０細胞）とを比較すると、トランスフェクト率は約１．３％である（図２ｂ）。
【００６９】
要約すると、現在の結果は、ＯＲ２ＡＴ４がＨａｎａ３Ａ細胞で膜結合型で発現し、受容体の受容野の特徴の要件が満たされる。
【００７０】
＜組換発現したＯＲ２ＡＴ４の受容野＞
ルール大学ボーフムでの細胞生理学部によって確立されたデオーファン方法は、カルシウムイメージングであり、匂い物質によるＯＲの活性化は、蛍光染料を使用してトランスフェクト細胞の細胞内カルシウム濃度の変化によって可視化される。（参考：Wetzel et al. in: J. Neurosci. 19, pp. 7426-7433 (1999); Spehr etal. in: Science 299, pp. 2054-2058 (2003); Neuhaus et al. in: J. Biol. Chem.284, pp. 16218-16225 (2009)]. この方法では、Ｈａｎａ３Ａ細胞は匂い物質によって短時間（２０秒）刺激され、Ｈａｎａ３Ａ細胞で弱く発現したＯＲの活性を確認するために、高濃度（最大１ｍＭ）の匂い物質スクリーニングに選択される。
【００７１】
＜組換発現したＯＲ２ＡＴ４の潜在的なアゴニストの調査＞
サンダロール（登録商標）によるＯＲ２ＡＴ４の活性は、まずはカルシウムイメージング方法で調査される。１ｍＭのサンダロール（登録商標）の刺激により、ＯＲ２ＡＴ４で一過的にトランスフェクトされたＨａｎａ３Ａ細胞は特定のカルシウム信号を発信し、細胞は白檀香によって１度のみ活性される（図３ａ）。定量化において、Ｒｉｎｇｅｒ制御に対するＨａｎａ３Ａ細胞の反応率の顕著な増加が見られ、白檀香による受容体の活性化が確認される。受容体は複数構造に関連する分子によって活性化されることが大半であり、ＯＲ２ＡＴ４は６種類の更なる合成白檀香（Brahmanol、Ebanol、isobornylcyclohexanol、Javanol、PolysantolおよびSandranol）及び天然の白檀油で刺激され、受容体の活性が確認される。この場合、Brahmanolのみがカルシウムイメージングに対する反応率の増加を示すが、増加は顕著ではない（図３ｂ）。
【００７２】
トランスフェクトされていないＨａｎａ３Ａ細胞の制御計測を行うことにより、Ｈａｎａ３Ａ細胞の直接活性による２つの白檀香の反応率が増加する可能性が排除された（図３ｂ、右側）。
【００７３】
カルシウムイメージングの結果を精査し、ＯＲ２ＡＴ４の活性の容量依存を調査するために、二重ルシフェラーゼシステムによるデオーファンの更なる方法が使用された。この方法では、ＯＲに追加して、２種類のルシフェラーゼがＨａｎａ３Ａ細胞に導入された。発現したＯＲが芳香剤で活性化され、シグナルカスケードの更なる手順でｃＡＭＰが生成されると、ＣＲＥ（ｃＡＭＰ反応要素）によって蛍ルシフェラーゼの発現が起こる。第２ルシフェラーゼであるRenillaルシフェラーゼは、トランスフェクションの制御及び細胞の存続の役割を果たす。２つのルシフェラーゼ値を計算することにより、芳香剤によるＯＲの活性キャパシティが特定される。ＣＲＥルシフェラーゼアッセイでは、ルシフェラーゼの発現を確保するために、芳香剤が細胞に４時間とどまる。芳香剤の長時間のインキュベーション時間及び９６ウェルフォーマットで更に受容体を活性できる可能性により、この方法はカルシウムイメージングよりも繊細であり、用量反応関係の確立に適している。
【００７４】
ＣＲＥルシフェラーゼアッセイでは、サンダロール（登録商標）及びブラマノール（登録商標）は、Ｈａｎａ３Ａ細胞で発現した組換え受容体における、投与依存の活性を表す。しかし、受容体で顕著な効果を生成するために、ブラマノール（登録商標）の濃度（７５μΜ以上）はサンダロール（登録商標）の濃度（２５μΜ以上）よりも高いことを要した（図３ｃ）。一方、白檀香としてSandranol（登録商標）を使用した場合において、調査した濃度（５０μΜ以下）では反応を示さなかった（図３ｃ）。
【００７５】
芳香剤によるルシフェラーゼアッセイでの４時間のインキュベーションは、一定の濃度からＨａｎａ３Ａ細胞に毒性効果を与えるため、高くない芳香剤濃度（サンダロール（登録商標）は５０μＭ以下、ブラマノール（登録商標）は１００μＭ以下、Sandranol（登録商標）は50μＭ以下）が用いられ、完全な用量反応曲線を作ることはできない。この毒性は、特にコントロールリポーターであるRenillaルシフェラーゼの値の減少により顕在化した。この理由により、評価においては、均一に高いRenillaシグナルの値のみがが使用された（Zhuang and Matsunami,2008）。Javanolの白檀香、Polysantol、イソボロニルシクロヘキサノール及びビャクダン油では、使用し得る最も高い濃度は１０〜２５μＭであった。しかし、この濃度ではＯＲ２ＡＴ４の活性の増加は確認されなかった。
【００７６】
＜組換え発現したＯＲ２ＡＴ４の潜在的な拮抗薬の調査＞
芳香剤は受容体を活性するのみならず、ＯＲの拮抗薬としての働きも有する。カルシウムイメージング技術を使用し、サンダロール（登録商標）との同時適用において、オキシフェニロン（登録商標）及びPheniratの芳香剤は、サンダロール（登録商標）誘発されたカルシウムシグナルを顕著に低下させる拮抗薬として特定された（割合は１：１、１ｍＭである）。同時適用において、サンダロール（登録商標）誘発されたカルシウムシグナルに影響を与えないジメトール芳香剤は、コントロールのために使用された。ジメトール、フェニラト（Phenirat）（登録商標）及びオキシフェニロン（Oxyphenylon）（登録商標）単独では、Ｈａｎａ３Ａ細胞に影響を与えない。
【００７７】
総括すると、異種性で発現したＯＲ２ＡＴ４に対し、サンダロール（登録商標）及びブラマノール（登録商標）はアゴニストであり、オキシフェニロン（登録商標）及びフェニラト（登録商標）は拮抗薬であった。ＯＲ２ＡＴ４の受容野及び調査された芳香剤の構造式は、図５でグラフ的に表示されている。
【００７８】
＜ヒトケラチン細胞株でのＯＲ２ＡＴ４の発現の特定＞
ＲＴ−ＰＣＴ分析は、様々な人体の皮膚の細胞型及び組織でのＯＲ２ＡＴ４の異所的発現を特定するために実行された。追加して、ヒトケラチン細胞株でのＯＲ２ＡＴ４の発現分析は、免疫細胞化学的染色で補足された。
【００７９】
＜ＲＴ−ＰＣＲによるヒト皮膚細胞及び組織内でのＯＲ２ＡＴ４の発現＞
トランスクリプトレベルでＯＲ２ＡＴ４を検知するために、様々な皮膚の細胞型及び皮膚の生体組織のＲＮＡが分離され、ＲＴ−ＰＣＲが実行された。ＯＲ２ＡＴ４のトランスクリプトは、様々な分離ステージの人体の初代ケラチノサイト、ＨａＣａＴ細胞及び皮膚の生体組織（全層皮膚）で検出された（図６）。人体皮膚はケラチノサイトの主な成分に加え、結合組織、ピグメント及び免疫細胞等の細胞を含むので、これらの細胞型は受容体の発現を確認するためにＲＴ−ＰＣＲで個別に調査された。樹状細胞およびメラノサイトもＯＲ２ＡＴ４を発現した。一方、脂肪細胞または繊維芽細胞では、受容体の発現は確認されなかった（図６、中央図）。
【００８０】
受容体が皮膚で独占的に発現しているかを確認するために、様々な人体組織のＲＮＡサンプル（脳、胸、結腸、肝臓、肺、卵巣）がさらなるＲＴ−ＰＣＡ分析に使用された。結果としては、ＯＲ２ＡＴ４は皮膚で独占的に発現しておらず、脳、肝臓、卵巣でも発現することが判明した。一方、胸、大腸、肺では、トランスクリプトは検出されなかった（図６、下図）。十分に分離または分解されていないＲＮＡによってＰＣＲ生成物が検出されない可能性を排除するために、全てのサンプルにβ−アクチン制御を実行してＲＮＡの質を確認し、この制御が全てのＲＮＡサンプルで確かであることが判明した（図６）。
【００８１】
＜免疫細胞化学でのヒトケラチン細胞株におけるＯＲ２ＡＴ４発現の検出＞
タンパク質のレベルでＯＲ２ＡＴ４の発現を検出するために、自己生成したα−ＯＲ２ＡＴ４抗体で免疫細胞化学的染色が実行された。抗体の特定性は、Ｈａｎａ３Ａ細胞で一過的にトランスフェクトされたＯＲ２ＡＴ４で調査された。α−ＯＲ２ＡＴ４抗体の使用において、ＨａＣａＴ細胞及びケラチノサイトのクリアな染色は共焦点免疫蛍光画像で目視された（図７ａ）。
【００８２】
抗体から皮膚細胞への非特異的結合を排除するために、遮断ペプチドが使用された。このペプチドはα−ＯＲ２ＡＴ４抗体を遮断し、結合サイトへの付着が不可能となる。遮断ペプチドを使用することにより、細胞核及び細胞核の周辺でのわずかな染色が目視された（図７ｂ）。さらなる制御として、第２抗体の非特異的結合を排除するために、第１抗体を除いて細胞をインキュベーションした（データは表示されていない）。従って、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体の培養は特定的であり、ヒトケラチノサイトにて、タンパク質レベルでの受容体の発現が確認された。
【００８３】
培養されたケラチノサイトに加えて、人体皮膚におけるＯＲ２ＡＴ４のタンパク質の発現が調査された。この目的において、皮膚の一部がα−ＯＲ２ＡＴ４抗体で染色された。上皮ケラチノサイトでの受容体の明確な発現は染色で確認でき（図８ａ、上部）、基礎的なケラチノサイトは最も強い抗体結合を示している（図８ａ、断面図）。上皮の下の真皮では、特定の染色を示していなかった。また、第１抗体がウサギ血清と置換されたコントロール染色でも、特定の染色が確認されなかった（図８ｂ）。
【００８４】
＜ヒトケラチノサイトでサンダロール（登録商標）誘発されたカルシウムシグナルの特徴＞
皮膚細胞でのＯＲ２ＡＴ４の生理学的機能を特徴化するために、人体で培養されたケラチノサイトで、リガンドで特定されたサンダロール（登録商標）及びブラマノール（登録商標）の受容体の活性容量を調査することが重要である。この調査では、リガンドサンダロール（登録商標）に焦点を置いた。
【００８５】
カルシウムイメージング試験では、８０〜９０％のＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトがサンダロール（登録商標）で繰り返し刺激され、サンダロール誘発カルシウムシグナルは顕著な感作を有し、例えば適用時にシグナル振幅の増加が見られた（図９ａ、９ｂ）。
【００８６】
最初の適用時の振幅の更なる詳細な調査では、サンダロール（登録商標）によるＨａＣａＴ細胞の投与依存活性を示し、１００μΜから約２ｍＭで飽和を示した（図９ｃ）。４番目の適用時では、飽和は約５００μΜで起こった（図９ｄ）。最初の適用時でのサンダロール（登録商標）のＥＣＲ５０Ｒ値は４３０μΜであり、４番目の適用時では１１２μΜであった。
【００８７】
＜サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの増感の調査＞
サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルでは、刺激の繰り返しによる振幅の増加が特徴的である（図９）。ケラチノサイトがＡＴＰ又はＣａ２＋のような分子をやり取りする細胞−細胞チャネル（ギャップ結合）の役割を調査するために、この感作メカニズムでは、２つのギャップ結合ブロッカーである１−オクタノール及びカルベノキソロンが使用された。
【００８８】
ケラチノサイト又はＨａＣａＴ細胞と１−オクタノールのブロッカとによるプレインキュベーションの後、カルシウムイメージングにおいて、サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの向上が特定された（図１０ａ）。結果を数値化すると、１−オクタノールと併せてサンダロール（登録商標）誘発された最初の振幅は、ＨａＣａＴでは約４００％の割合で増加し（図１０ｂ）、ケラチノサイトでは約１０００％の割合で増加した（図１０ｃ）。コントロール計測と比較して、繰り返されるサンダロール（登録商標）の刺激では、その後のカルシウムシグナルが継続して低下した。第２ギャップ結合ブロッカーとしてカルベノオキソロンを使用した場合も、同様の結果であった（図１０ｂ）。
【００８９】
ギャップ結合のブロッキングによって非特異的影響が生じた可能性を排除するために、カルベノオキソロンでのプレインキュベーションの後、皮膚細胞でのカルシウムシグナルを誘発する芳香剤であるリラールによって活性化された。リラールで誘発された反応パターンの効果は見られなかった（図１０ｂ）。
【００９０】
＜サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの薬理的特徴＞
ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトでのサンダロール（登録商標）誘発シグナルカスケードは、カルシウムイメージング技術及び特定のシグナルカスケードタンパク質のブロッカーによって薬理的に特徴化された。まず、カルシウムシグナルが、細胞外空間でのカルシウム流動によって発生しているかを確認するための調査を行った。この目的において、カルシウムを含まない細胞外の溶液は、カルシウムキレート剤（ＥＧＴＡ）を添加した状態で使用された。カルシウムを含まない溶液の存在において、サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルが顕著に低下した（図１１ａ、１１ｅ）。アデニリルシクラーゼの役割を調査するために、特定のブロッカーであるＳＱ−２２５３６及びＭＤＬ−１２３３０Ａが使用された。この場合においても、対応するブロッカーの存在の下、サンダロール誘発カルシウムシグナルの顕著な低下が確認された（図１１ｂ、１１ｅ）。一方、ＰＬＣブロッカーＵ−７３１２２は、サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルに対する影響を示さないため、ホスフォリパーゼＣの使用が排除された（図１１ｃ、１１ｅ）。この場合、ブロッカーの効能はＰＬＣシグナル通路を活性させたヒスタミンで試験された（図１１ｃ）。
【００９１】
外部から皮膚細胞のサイトゾルに流れるカルシウムイオンのカルシウムチャンネルを特定するために、ＣＮＧチャネルブロッカのＬ−シス−ジルチアゼムが使用された。この物質も、サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルを著しく低下させた（図１１ｄ、１１ｅ）。カルシウムイメージング技術によって薬理的特徴のデータを確認するために、追加的なｃＡＭＰアッセイが実行された。この目的において、様々なサンダロール（登録商標）濃度によりＨａＣａＴ細胞が刺激され、ｃＡＭＰの含有量が特定された。結果としては、ＥＣ５０値が１９７μΜであるサンダロール（登録商標）において、投与依存のｃＡＭＰが増加した（図１１ｆ）。
【００９２】
総括すると、ＣＮＧチャネルの関与を伴うｃＡＭＰ依存のシグナル通路は、ＨａＣａＴ細胞のサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナル及び初代ケラチノサイトによって達成された。
【００９３】
＜嗅覚のシグナルカスケード成分と構造的に関連するタンパク質の発現＞
精細胞及び腎臓では、ＯＲの機能的な異所性発現に加え、嗅覚的Ｇタンパク質（Ｇαｏｌｆ）及びアデニリルシクラーゼ３（ＡＣ３）のサブユニット等の嗅覚的シグナルカスケードが検出された。ＯＲの異所性発現に加え、研究では様々な組織における嗅覚的なシグナルカスケードの成分の分布が広範囲で確認された。この調査では、ケラチノサイトで発現し、嗅覚的シグナルカスケードに関与したシグナルカスケードタンパクの概観が、トランスクリプトーム解析（次世代シーケンス、ＮＧＳ）で取得された。
【００９４】
＜トランスクリプト水準での嗅覚的なシグナルカスケード成分と構造的に関連するタンパクの発現＞
シグナルカスケードタンパクを調査するために、初代ケラチノサイトのＮＧＳデータが評価された。Ｇαｏｌｆ、ＡＣ３、ＣＮＧＡ２及びＴＭＥＭ１６Ｂ等の、嗅覚シグナルカスケードで発生する成分に加え、さらに構造的に関連するシグナルカスケードタンパクが調査された。初代ケラチノサイトのトランスクリプトームデータを評価することにより、Ｇαｏｌｆ（ＦＰＫＭ＝３．６）及びＡＣ３（ＦＰＫＭ＝２．１）のサブユニットの発現が確認され得る。発現の範囲は、刺激性のＧ−タンパクＧαｓ（ＦＰＫＭ＝６９．２）またはＡＣ６（ＦＰＫＭ＝１４．１）のサブユニット等の関連するタンパクに比べると小さい。
【００９５】
さらにケラチノサイトでは、ＣＮＧチャネルのサブユニットＣＮＧＡ１（ＦＰＫＭ＝２．２）のトランスクリプト及び塩素チャネル族のＴＭＥＭ１６の１０のうち７が検出された（図１２ａ）。ＮＧＳデータを確認するために、初代ケラチノサイト及びＨａＣａＴ細胞を使用してＲＴ−ＰＣＲ実験が行われた（図１２ｂ）。Ｇαｏｌｆ及びＡＣ３の発現は両方の細胞型で確認された。さらに、初代ケラチノサイト及びＨａＣａＴ細胞の双方において、塩素チャネルＴＭＥＭ１６Ｈ、ＴＭＥＭ１６Ｊ、ＴＭＥＭ１６Ｆ、ＴＭＥＭ１６Ｋ及びＣＮＧＡ１サブユニットの発現が検出された。ここで使用されるＮＧＳデータは低いシーケンス深さを示しており（＝18 million reads）、この方法では発現が低い遺伝子は検出されない。この理由により、ＮＧＳデータに基づいて発現しない遺伝子も、ＲＴ−ＰＣＲで調査された。この場合、ＣＮＧＡ１のサブユニットに加えて、ＣＮＧＢ１のサブユニットがＨａＣａＴ細胞及びケラチノサイトで発現した。
【００９６】
＜タンパク質レベルにおける構造的に関連するタンパクの成分及び嗅覚的なシグナルカスケードの発現＞
ＲＴ−ＰＣＲ実験に加えて、嗅覚的シグナルカスケードＧαｏｌｆ、ＲＡＣ３及びＣＮＧＡ１の成分を検出するための免疫細胞化学的染色が、ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトで用意された。両方の細胞型において、免疫細胞化学的染色でＧαｏｌｆ、ＡＣ３及びＣＮＧＡ１の明確な発現が目視できた（図１３ａ）。Ｇαｏｌｆ及びＡＣ３染色では、サイトゾルがある場所に加えて、細胞核の明確な染色が認められた。第１抗体を有しないタンパクは、第２抗体の非特異的結合を示さないコントロールとして使用された。
【００９７】
培養されたケラチノサイトに加え、Ｇαｏｌｆの検出は、皮膚の一部に対する免疫細胞化学的染色によって事前に行われた。上記のデータを揃えるために、人体の皮膚部はα−ＡＣ３抗体で染色された。これによって、上皮ケラチノサイトではＡＣ３の強い発現が認められた。第１抗体がウサギ血清と置換されたコントロール染色は、特定の染色が確認されなかった（図１３ｂ）。
【００９８】
＜ヒトケラチノサイトにおけるサンダロール誘発カルシウムシグナルでのＯＲ２ＡＴ４の役割＞
ヒトケラチノサイトはＯＲ２ＡＴ４受容体を発現し、リガンド サンダロール（登録商標）で刺激することにより、カルシウムシグナルを示した。
サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルが他の受容体またはメカニズムではなく、ＯＲ２ＡＴ４で移動したことを調査するために、上述の拮抗薬のＯＲ２ＡＴ４を試験し、ＲＮＡ干渉試験を実施した。
【００９９】
＜ＲＮＡ干渉試験＞
ＲＮＡ干渉試験では、干渉が小さいＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が細胞に導入され、ｓｉＲＮＡの補足的な１Ｔ２Ｔ、１Ｔ２Ｔヌクレオチドシーケンスを有するｍＲＮＡが分解され、対応するコード化された１Ｔ２Ｔ、１Ｔたんぱく１Ｔ，例えば１Ｔ２Ｔがその後合成されない。ここで実行されるＲＮＡ干渉試験では、ＯＲ２ＡＴ４に対抗する２つの自己生成したｓｉＲＮＡが使用された。この手法が成功した場合、ＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡが分解し、機能性の受容体たんぱくが転写されず、結果としてはサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルが減少した。
【０１００】
非特異的影響を排除するために、細胞に対する影響が無いと考えられる、２つのコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）が使用された。まず、２つの自己生成したｓｉＲＮＡがＯＲ２ＡＴ４のトランスクリプトの劣化を成功的に引き起こすかどうかを判定するために、Ｈａｎａ３Ａ細胞を使用した対照実験が行われた。この目的において、Ｈａｎａ３Ａ細胞には、特別なルシフェラーゼ−及びＯＲ２ＡＴ４発現したレポータープラスミド（ｐｍｉｒＧＬＯ−ＯＲ２ＡＴ４）及び対応するｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡが同時導入された。ｓｉＲＮＡによってＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡが劣化すると、ルシフェラーゼ及びＯＲ２ＡＴ４のｍＲＮＡの溶解によって破壊され、結果として蛍光シグナルが低下した。
【０１０１】
結果では、発光シグナルの著しい低下が明確に表すように、２つのｓｉＲＮＡ異性体は、ＯＲ２ＡＴ４のトランスクリプトの劣化を引き起こしたことを示した。２つのｓｃＲＮＡは全く影響を与えなかった（図１４ａ）。成功的なノックダウン試験の要件は満たされ、ＨａＣａＴの機能試験を行うことが可能となった。まず、ＯＲ２ＡＴ４の発現が、ＨａＣａＴ細胞のｓｉＲＮＡでも低下するかどうかが調査された。この目的において、ＨａＣａＴ細胞は２つのｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡの混合物で２日間トランスフェクトされ、ＯＲ２ＡＴ４抗体が使用された免疫細胞化学的染色が行われた。ｓｃＲＮＡのｓｉＲＮＡを成功的に使用したＨａＣａＴ細胞はＧＦＰで特定され、これはpGeneClipベクターでも発現した。α−ＯＲ２ＡＴ４抗体の比較によれば、ｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡ発現細胞は抗体の染色を表し、ｓｉＲＮＡの使用においてＯＲ２ＡＴ４の発現は著しく低下するため、ｓｉＲＮＡはＨａＣａＴ細胞でも機能することが判明した（図１４ｂ）。
【０１０２】
ＯＲ２ＡＴ４がサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルでの役割を果たすかを特定するにあたり、ＨａＣａＴ細胞は、カルシウムイメージング実験で使用される、２種類のＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡの混合物（図１４ｃ）で２日間トランスフェクトされた。測定において、ＧＦＰの同時発現により、ｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡと非発現細胞とを区別することが可能であった（図１４ｄ）。トランスフェクトされた細胞はサンダロール（登録商標）で繰り返し刺激され、カルシウムシグナルの振幅が計算された。ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞は、サンダロール（登録商標）を適用する３つ全ての使用において、ｓｃＲＮＡ発現細胞と比較して、顕著なサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの低下を示した（図１４ｅ、１４ｆ）。
【０１０３】
＜ヒトケラチノサイトにおけるサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルへの拮抗薬の効能＞
拮抗薬としては、特定のリガンドによる受容体の活性も確認でき、異種システム及び在来細胞でのリガンド誘発されたカルシウムシグナルは、同じ受容体の活性を示すように認識できる。上述の通り、フェニラト（登録商標）及びオキシフェニロン（登録商標）は、同時適用における異種系においてサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルを阻害するＯＲ２ＡＴ４の拮抗薬として特定される。ジメトールは、サンダロール（登録商標）との同時使用において阻害効果を示さず、コントロールとして使用された。従って、２つの拮抗薬は、ＯＲ２ＡＴ４の関与を調査するために、ＨａＣａＴ細胞でのサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの潜在的な阻害を確認するために試験された。
【０１０４】
拮抗薬を特徴化するために、最初にＨａＣａＴ細胞をサンダロール（登録商標）（１ｍＭ）で繰り返し刺激した。第３適用時には、サンダロール（登録商標）と拮抗薬の１つとによる共同刺激（１：１）を行った。フェニラト（登録商標）又はオキシフェニロン（登録商標）との同時適用においては、サンダロール誘発カルシウムシグナルの顕著な低下が認識でき、ジメトールとの同時適用では、カルシウムシグナルはわずかに低下した（図１５ａ、１５ｂ）。この結果に基づき、抑制の用量依存的な特性化が実行された。この目的において、サンダロール（登録商標）及び拮抗薬は、異なる濃度で同時刺激された。サンダロール（登録商標）（５００μＭ）と、オキシフェニロン（登録商標）（５００μＭ）又はフェニラト（登録商標）（５００μＭ）との共同適用において、カルシウムシグナルは、コントロール振幅（拮抗薬を含まないサンダロール（登録商標））の８〜９％に低下した。拮抗薬の濃度を２５０μΜに低下させた場合、サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナル及び振幅の抑制は、制御振幅の３９〜４５％であった。拮抗薬の濃度をさらに１００μΜに低下させた場合、２つの拮抗薬の阻害は完全に消滅した（図１５ｃ）。特定されたＩＣ５０値（抑制濃度の平均）は、フェニラト（登録商標）では１７８μΜ、Oxyphenylonでは１７４μΜであった（図１５ｄ）。
【０１０５】
一定的な拮抗薬の濃度（５００μΜ）及びサンダロール（登録商標）濃度の継続的な増加（７５０μΜ）によって、拮抗薬によるブロッキングが減少した。サンダロール（登録商標）が１ｍＭに増加することにより、拮抗薬の抑制が完全に取り除かれた（図１５ｃ）。拮抗薬によるサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの投与依存の抑制により、オキシフェニロン（登録商標）及びフェニラト（登録商標）が目視された。これは、siRNA実験結果を裏付け、ＨａＣａＴ細胞におけるリガンドサンダロール（登録商標）によるＯＲ２ＡＴ４の活性を確認させる。
【０１０６】
＜ヒトケラチノサイトにおけるＯＲ２ＡＴ４の生理学的機能＞
カルシウムイメージング実験では、細胞内カルシウム濃度の変化は、皮膚細胞でサンダロール（登録商標）を使用した短時間シミュレーション（２０秒）によって誘発された。しかし、クリームまたは香水の定期的使用によって、芳香剤は皮膚に長時間（数時間から数日）滞在する。そのような場合、皮膚細胞でＯＲ２ＡＴ４を活性させることにより、サンダロール（登録商標）が引き起こす生理学的効果は、長時間刺激試験によって調査された。
【０１０７】
＜増殖及び移動におけるサンダロール（登録商標）の刺激に対する効果＞
ＯＲ２ＡＴ４の活性によって起こる可能性がある生理学的効果のイニシャルデータを入手するために、ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトがサンダロール（登録商標）によって５日間刺激された。この方法では、透過光顕微鏡を使用して、ネクローシス性又はアポトーシス性の微細穴膜のみが通過する、細胞の形態学及びその後のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を観察することにより、潜在的に起こるアポトーシス性又はネクローシス性効果が明らかになった。５００μΜのサンダロール（登録商標）を使用した５日間のインキュベーションの後、ＨａＣａＴ細胞及びケラチノサイトのいずれも形態的な変化又はＰＩ染色が認められなかった。従って、芳香剤の致死効果は排除された（図１６ａ）。
【０１０８】
次に、サンダロール（登録商標）が皮膚細胞の成長に影響を与えるかが調査された。この目的において、ＨａＣａＴ細胞はサンダロール（登録商標）によって５日間刺激され、増殖分析によって細胞数の決定が行われた。この結果、コントロール（０．１％ＤＭＳＯ）と比較して、サンダロール（登録商標）はＨａＣａＴ細胞を３３％増殖させた（図１６ｂ）。この増殖がＯＲ２ＡＴ４の活性によって誘発されたものであることを確認するために、ＨａＣａＴ細胞はｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡでそれぞれトランスフェクトされ、増殖分析が繰り返された。ｓｃＲＮＡでトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞は、トランスフェクトされていない細胞と同様の増殖を示した。しかし、ｓｉＲＮＡのトランスフェクトは、サンダロール（登録商標）によって誘発された効果を著しく減少させた（図１６ｂ）。
【０１０９】
加えて、細胞数はサンダロール（登録商標）（５００μΜ）とオキシフェニロン（登録商標）（５００μΜ）又はフェニラト（登録商標）（５００μΜ）の拮抗薬との同時刺激（１：１）の後に特定された。対応する拮抗薬の存在により、増殖が減少した。この効果は、オキシフェニロン（登録商標）で顕著であった。オキシフェニロン（登録商標）及びフェニラト（登録商標）単独では、ＨａＣａＴ細胞の増殖に対する顕著な効果は現れなかった。
【０１１０】
全体的には、ｓｉＲＮＡ及び拮抗薬の試験結果は、サンダロール（登録商標）の増殖増進効果は、ＯＲ２ＡＴ４の活性により媒介されることを示した。例えば、再上皮化過程では、ケラチノサイトのわずかな増殖が見られた。増殖に加えて、この過程において、皮膚細胞の移動がわずかに増加した。この理由により、細胞増殖の増加が走化を伴うかを特定するにあたり、アガロース移動アッセイが実行された。このアッセイでは、ＨａＣａＴ細胞は、アガロース溶媒混合物に接種され、５００μΜのサンダロール（登録商標）又は０．１%のＤＭＳＯにおける細胞の増殖が５日間観察された。細胞が横断した通路、又は細胞が過剰成長した面積の測定は、サンダロール（登録商標）の方向におけるＨａＣａＴ細胞の著しい走化性移動を示した（図１６ｃ）。
【０１１１】
総括すると、サンダロール（登録商標）は、ＯＲ２ＡＴ４によって、ＨａＣａＴ細胞の増殖及び移動の増加に繋がるシグナルカスケードを誘発した。
【０１１２】
＜ＭＡＰキナーゼのリン酸化におけるサンダロール（登録商標）刺激の効果＞
分裂促進因子活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼは、細胞外刺激の伝搬及び細胞内のシグナルへの変換において重要な役割を果たし、細胞分化、細胞増加、ストレスなどの様々なプロセスを規制する。シグナル経路は、リン酸化によって連続的に活性された少なくとも３つのキナーゼを有する：上流ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）、下流ＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）及び末端ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）。ＭＡＰＫシグナル経路は末端ＭＡＰＫによって特定されており、最も重要なものは、ＥＲＫ１／２（細胞外のシグナル規制キナーゼ）ＭＡＰＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫ／ＳＡＰＫ（ｃ−ＪｕｎＮＨ２末端キナーゼ／ストレス活性ホスフォキナーゼ）である。
【０１１３】
次に、ＭＡＰＫシグナル経路は皮膚細胞でのサンダロール（登録商標）刺激によって活性されたか否かを特定し、そうであれば、その経路が関連することを特定する調査が行われた。特定するにあたり、ＨａＣａＴ細胞は５００μΜのサンダロール（登録商標）で０〜３０分間刺激し、タンパクが分離され、ウェスタンブロットアッセイが使用された。ウェスタンブロットの結果は、５〜３０分において、ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ及びｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の増加を示したが、細胞ストレスによってはＪＮＫ／ＳＡＰＫのリン酸化は誘発されなかった（図１７ａ）。ＨａＣａＴ細胞のウェスタンブロットアッセイの数値化によって、３０分間のサンダロール（登録商標）刺激がＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ及びｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化の著しい増加を示した。ｐ３８ＭＡＰＫに対してはＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０、ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫに対してはＵ０１２６の更なるインキュベーションにおいて、リン酸化は著しく低下した（図１７ｂ）。
【０１１４】
２つのＭＡＰＫシグナル経路の相互作用の可能性を明らかにするために、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の影響を受けたＥＲＫ１／２リン酸化、並びにＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ阻害剤Ｕ０１２６の影響を受けたｐ３８ＭＡＰＫリン酸化が調査された。サンダロール（登録商標）のみで刺激された細胞と比較して、対応する阻害剤の影響を受けたキナーゼのリン酸化が促進されたことが判明した。この影響は、ｐ３８ＭＡＰＫで顕著であった（図１７ｃ）。
【０１１５】
総括すると、結果は、ｐ３８及びＥＲＫ１／２ＭＡＰＫはサンダロール（登録商標）刺激によりリン酸化され、信号経路の相互調節があることを示した。
【０１１６】
＜体外での創傷治癒アッセイにおけるヒトケラチノサイトに対するサンダロール（登録商標）刺激の効果＞
ＭＡＰキナーゼｐ３８及びＥＲＫ１／２は、多くの場合、上皮性の創傷治癒における増殖及び移動に関連する。この理由によって、更なる生理学的検査では、ＨａＣａＴ細胞の合流する細胞層又は初代ケラチノサイトにおける「創傷治癒」に対するサンダロール（登録商標）の効果が調査された。この目的において、引っ掻き傷アッセイが使用され、これはケラチノサイトにおいて、創傷治癒での第１調査での生体外での方法として確立されていた。引っ掻き傷アッセイでは、傷はＨａＣａＴ細胞の合流する細胞層又は初代ケラチノサイトにおいて、ピペットの先端を使用して形成され、この「傷」は２日間観察された。この結果、５００μΜのサンダロール（登録商標）で治療された細胞は、ＨａＣａＴ細胞においては２６％、ケラチノサイトにおいては３４％早く、傷が閉じることが分かった（図１８ａ、１８ｂ）。
【０１１７】
この効果においてＯＲ２ＡＴ４受容体の役割を調査するために、２つの拮抗薬、オキシフェニロン（登録商標）及びフェニラト（登録商標）がサンダロール（登録商標）によって増加した「創傷治癒」を減少できるかの試験を実施した。この目的において、サンダロール（登録商標）と各拮抗薬とは同様の割合で混合され、ＨａＣａＴ細胞の「創傷治癒」効果が４８時間観察された。ここで、コインキュベーションが「創傷治癒」を通常のレベルに下げることが判明した（図１８ｃ）。２つの拮抗薬は、単独では、「創傷治癒」に全く効果が無かった（図１８ｄ）。ＭＡＰキナーゼｐ３８及びＥＲＫ１／２の役割が、キナーゼの特定の抑制剤の方法により調査された。ｐ３８ＭＡＰＫでは、ＥＲＫ１／２阻害剤ＳＢ２０３５８０が使用され、ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫでは、ｐ３８阻害剤Ｕ０１２６が使用された。
対応する阻害剤の存在の下、「創傷治癒」は再度、通常のレベルに低下し（図１８ｃ）、サンダロール（登録商標）誘発された「創傷治癒」にｐ３８ＭＡＰＫ及びＥＲＫ１／２ＭＡＰＫの役割の確認ができた。２つの阻害剤単独では、創傷治癒に全く効果が無かった（図１８ｄ）。
【０１１８】
＜インタールーキンの分泌およびタンパクキナーゼＡｋｔのリン酸化の調査＞
上記の通り、生体外の傷アッセイにおいて、サンダロール（登録商標）は、培養されたケラチノサイトの「創傷治癒」に対して有効な効果を持つ。創傷治癒は、様々な生理学的機能が関連する、複雑なプロセスである。ＯＲ２ＡＴ４活性されたシグナルカスケードが皮膚細胞の創傷治癒の改善にどのように貢献しているかの情報を得るにあたり、サンダロール（登録商標）刺激後のインターロイキンの生成及び分泌を、定量リアルタイムＰＣＲ及びＥＬＩＳＡアッセイの手法を用いて、ＨａＣａＴ細胞に対して調査をするべきである。さらに、ウェスタンブロット分析を用いて、ケラチノサイトの分離化に関連するプロテインキナーゼＡｋｔが、サンダロール（登録商標）刺激によってリン酸化するかを調査するべきである。
【０１１９】
インターロイキンの分泌を調査するにあたり、定量リアルタイムＰＣＲが実行された。この目的において、サンダロール（登録商標）によって、６〜２４時間、事前に刺激されたＨａＣａＴ細胞のＲＮＡが使用された。特定は、様々なインターロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の特異的プライマーによって行われた。２４時間の経過後、コントロール（０．１％ＤＭＳＯ）に対し、ＩＬ−１αの発現は約１０，０００％増加し、インターロイキンＩＬ−１βの発現は約１，７００％増加した。他のインターロイキンについては、発現率の増加が見られなかった（図１９ａ）。結果を確信するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実行し、細胞の表面に分泌したインターロイキンは、免疫反応によって検知された。使用されたアッセイによって、インターロイキン（ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２及びＩＬ−１７α）、ＴＮＦα、γ−インターフェロン（ＩＦＮγ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の分泌が調査された。サンダロール（登録商標）で２４時間刺激した後、コントロール（０．１％ＤＭＳＯ）に対し、ＩＬ−１αについてのみ、分泌の著しい増加が目視された。ＨａＣａＴ細胞はＩＬ−８の高い分泌を示したが、これはコントロール（０．１％ＤＭＳＯ）の増加と比較すると著しく高いものではない。
【０１２０】
検出されたリン酸化キナーゼに加え、プロテインキナーゼＡｋｔのリン酸化も調査された。この目的において、ＨａＣａＴ細胞はサンダロール（登録商標）によって、０、５、１５及び３０分間刺激され、リン酸化はウェスタンブロットアッセイ及びリン酸化された、またはリン酸化されていないＡｋｔタンパクに対する特別な抗体によって、調査された。サンダロール（登録商標）刺激によって、Ａｋｔキナーゼは５分以内にリン酸化し、その効果は長時間の刺激（１５又は３０分）で増加した（図１９ｃ）。
【０１２１】
総括すると、この結果はＩＬ−１αの発現及び分泌は、サンダロール（登録商標）によって増加し、ヒトケラチノサイトの分離化を伴うプロテインキナーゼＡｋｔが活性されることを示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
以下、図面を参照し、本願の発明について詳細に説明をする。
【図１】Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の異種発現
【図２】Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の膜発現
【図３】組換え発現したＯＲ２ＡＴ４の受容野の特定
【図４】組換え発現したＯＲ２ＡＴ４の拮抗薬
【図５】ＯＲ２ＡＴ４の受容野及び芳香剤の構造式
【図６】様々な人体皮膚細胞型及び組織におけるＯＲ２ＡＴ４の発現
【図７】タンパクレベルにおける、ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトのＯＲ２ＡＴ４の発現
【図８】人体皮膚でのＯＲ２ＡＴ４の発現
【図９】培養されたケラチノサイトの細胞内カルシウム濃度におけるＯＲ２ＡＴ４リガンドサンダロール（登録商標）の効果
【図１０】サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの刺激によるギャップ結合ブロッカーの効果
【図１１】ヒトケラチン細胞株におけるサンダロール（登録商標）誘発シグナルカスケードの薬理的特徴
【図１２】ＮＧＳデータ及びＲＴ−ＰＣＲを使用したシグナルカスケード成分及び構造的に関連するタンパクの発現分析
【図１３】免疫細胞化学的染色による、ＡＣ３及びＣＮＧＡ１の発現分析
【図１４】ＨａＣａＴ細胞におけるサンダロール誘発カルシウムシグナルでのＯＲ２ＡＴ４の役割を確認するためのＲＮＡ干渉試験
【図１５】ＨａＣａＴ細胞におけるサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルのＯＲ２ＡＴ４拮抗薬の活動
【図１６】長時間のサンダロール（登録商標）刺激による、ケラチノサイトにおける形態、増殖及び移動の効果
【図１７】皮膚細胞におけるサンダロール（登録商標）刺激によるＭＡＰキナーゼのリン酸化の効果
【図１８】体外での創傷治癒アッセイにおけるヒトケラチノサイトに対するサンダロール（登録商標）刺激の効果
【図１９】サンダロール（登録商標）刺激後のインターロイキン分泌とＡｋｔプロテインキナーゼのリン酸化の調査。
【０１２３】
図面の説明
＜図１＞
Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の異種発現
ＯＲ２ＡＴ４で一過的にトランスフェクトされたＨａｎａ３Ａ細胞は（上段）、α−Ｒｈｏ抗体（赤色）及びα−ＯＲ２ＡＴ４抗体（緑色）によって、免疫細胞化学的染色において明確な重ね合わせを示した。一方、ＯＲ１ＡＴ２で一過的にトランスフェクトＨａｎａ３Ａ細胞の染色のコントロールにおいて（下段）、ロドプシン染色のみが特定できた。細胞の位置及び数を特定するために、細胞染色（ＤＡＰＩ、青）を同時進行した。
蛍光画像は、共焦点顕微鏡で撮影した。
スケールは２０μｍである。
＜図２＞
Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるＯＲ２ＡＴ４の膜発現
図２ａは、α−Ｒｈｏ抗体を有するＨａｎａ３Ａ細胞の生細胞染色を示す。左図：ＯＲ２ＡＴ４で一過的にトランスフェクトされたＨａｎａ３Ａ細胞は、膜染色を示した。右図：トランスフェクトされていないＨａｎａ３Ａ細胞は、ロドプシン染色を示していない。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で撮影された。スケール：２０μＭ。
図２ｂは、生細胞染色の定量化を示す。トランスフェクト率を特定するために、全体の細胞数（ｔｏｔａｌで示す）及びトランスフェクトされた細胞（ｔｒａｎｓｆ．で示す）が、蛍光顕微鏡を使用してカウントされた。３つの独立したトランスフェクションの平均細胞数及び標準誤差を示した。
＜図３＞
組換え発現したＯＲ２ＡＴ４の受容野の特定
図３ａは、サンダロール（登録商標）（１ｍＭ）で２回刺激（各２０秒、鉄棒を使用）された、一過性のＯＲ２ＡＴ４発現Ｈａｎａ３Ａ細胞のカルシウムイメージングトレースの代表例である。コントロールとして、トランスフェクトされていないＨａｎａ３Ａ細胞は、サンダロール（登録商標）で刺激された。有効コントロール刺激として、各測定において、１００μΜのＡＴＰが使用された。
図３ｂは、カルシウムイメージング測定の評価を示しており、一過性のＯＲ２ＡＴ４を発現するＨａｎａ３Ａ細胞が、様々な白檀香で刺激された（１ｍＭ）。Ｒｉｎｇｅｒ制御に関して、細胞の標準誤差を含めた平均反応率が示されている。測定数：Ringer（２３）、サンダロール（登録商標）（２２）、ブラマノール（登録商標）（１４）、Javanol（１５）、Sandranol（１８）、Polysantol（１４）、isobornyl cyclohexanol （１４）、ビャクダン油（１４）。Isobornyl.: isobornyl cyclohexanol; S. ol: ビャクダン油。複数の比較を含むクラスカル・ウォリス試験（Kruskal-Wallis test）*: p<0.05。
図３ｃは二重ルシフェラーゼアッセイの評価を示す。その意義は、ＯＲ２ＡＴ４−ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトされたＨａｎａ３Ａ細胞と、インサートを有しないｐｃＤＮＡ３との間で特定された。ドット（点）は、標準誤差を含む、通常化されたルシフェラーゼ活動を示す。マン・ホイットニーのＵ検定（Mann-Whitney U test）；ｎ＝３試験。
*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001.
＜図４＞
組換え発現したＯＲ２ＡＴ４の拮抗薬
図４ａは、サンダロール（登録商標）（青色）、サンダロール（登録商標）＋ジメトール（薄青色）、サンダロール（登録商標）＋フェニラト（登録商標）（灰色）、サンダロール（登録商標）＋オキシフェニロン（登録商標）（黒色）で２回刺激（各２０秒、鉄棒を使用）された、一過性のＯＲ２ＡＴ４発現Ｈａｎａ３Ａ細胞のカルシウムイメージングのトレースである。有効コントロール刺激として、各測定の最後に、１００μΜのＡＴＰが使用された。
図４ｂは、カルシウムイメージング測定の評価を示し、一過性のＯＲ２ＡＴ４を発現するＨａｎａ３Ａ細胞が、様々な芳香剤で刺激された（１ｍＭ）。Ｒｉｎｇｅｒ制御に関して、細胞の標準誤差を含めた平均反応率示されている。測定数：Ringer（２３）、サンダロール（登録商標）（２２）、サンダロール（登録商標）＋ジメトール（１１）、ジメトール（１１）、フェニラト（登録商標）（１４）、サンダロール（登録商標）＋フェニラト（登録商標）（２２）、オキシフェニロン（登録商標）（１２）及びサンダロール（登録商標）＋オキシフェニロン（登録商標）（２０）。
S: サンダロール（登録商標）。複数の比較を含むクラスカル・ウォリス試験を実施。*: p<0.05。
＜図５＞
ＯＲ２ＡＴ４の受容野及び芳香剤の構造式
受容野は、アゴニスト（円の中央部に図示）、不活性物質（円の灰色部に図示）、拮抗薬（図の右上の長方形に図示）を含む。検査された白檀油では、２つの主な成分、すなわちα−サンタロール及びβ−サンタロールが例示されている。
＜図６＞
様々な人体皮膚細胞型及び組織におけるＯＲ２ＡＴ４の発現
ＯＲ２ＡＴ４を検知するために、様々な人体皮膚ＲＮＡサンプル（＋サンプル）のｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ分析が実施された。ゲノムＤＮＡによる汚染は、−ＲＴサンプルに基づいて除外された。フラグメントの大きさ：ＯＲ２ＡＴ４（４００ｂｐ）、β−アクチン（２５０ｂｐ）。Ｍ：マーカー、Ｐ：細胞培養経路。
＜図７＞
タンパクレベルにおける、ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトのＯＲ２ＡＴ４の発現
図７ａはＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトを表し、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体（赤色）を使用することにより、明確な免疫細胞化学的染色を示した。
図７ｂでは、遮断ペプチド（ブロック、ペプチド、ＯＲ２ＡＴ４抗体と遮断ペプチドとの比率は１：２）を使用した染色の制御においては、染色が著しく減少したことを示した。細胞の位置及び数を特定するにあたり、核染色（ＤＡＰＩ、青色）が同時に行われた。共焦点顕微鏡を使用し、蛍光像を撮影した。スケール：２０μｍ。
＜図８＞
人体皮膚でのＯＲ２ＡＴ４の発現
図８ａで示される通り、上皮ケラチノサイトは、α−ＯＲ２ＡＴ４抗体（緑色）による明確な免疫細胞化学的染色を表した。
図８ｂでは、第１抗体がウサギ血清と置換された場合の制御染色を示し、この場合、染色が顕著に減少したことを示した。
上図：４００倍に拡大した図、下図：断面図、Ｅ：表皮、Ｄ：真皮、Ｂ：基底層
＜図９＞
培養されたケラチノサイトの細胞内カルシウム濃度におけるＯＲ２ＡＴ４リガンドサンダロール（登録商標）の効果
Ａ）初代ケラチノサイト（細胞の数ｎ＝１７５）及びＢ）ＨａＣａＴ細胞（細胞の数ｎ＝１８６）の両方において、サンダロール（登録商標）（５００μΜ）は、反復刺激（横棒）を伴うカルシウムイメージング試験において、カルシウムシグナルを誘発した。
左側：サンダロール誘発カルシウムシグナルの代表的なカルシウムイメージングトレース。有効コントロール刺激として、各測定後に１００μＭのＡＴＰを使用した。
右側：サンダロール（登録商標）（５００μΜ）を４回適用した場合におけるカルシウムシグナルの定量評価。表では、標準誤差を含んだ、各適用時の平均値を示す。マン・ホイットニーのＵ検定*: p<0.05。
Ｃ）及びＤ）：カルシウムイメージング試験におけるＨａＣａＴ細胞の容量依存活性。
表では、第１〜第４のサンダロール（登録商標）の使用時における、様々な濃度での標準誤差を含めた平均振幅を示す。測定された細胞数：０．０１２５ｍＭ（３９）、０．０２５ｍＭ（３０）、０．１ｍＭ（４６）、０．５ｍＭ（３４）、１ｍＭ（６３）、２ｍＭ（４１）、１０ｍＭ（３６）。
＜図１０＞
サンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの刺激によるギャップ結合ブロッカーの効果
Ａ）ＨａＣａＴ細胞（左側）及び初代ケラチノサイト（右側）のカルシウムイメージングトレースの代表図であり、ギャップ結合ブロッカーである１−オクタノール（５００μΜ）でインキュベーションされた後、サンダロール（登録商標）（５００μΜ、横棒）（青色）で繰り返し刺激された。黒色のトレースは、ブロッカー（コントロール）によるプレインキュベーションを伴わない、サンダロール（登録商標）の反復刺激を示す。有効コントロール刺激として、各測定後に１００μＭのＡＴＰを使用した。カルシウムイメージング試験では、ギャップ結合ブロッカーである１−オクタノール（５００μΜ）又はカルベノオキソロン（１０μΜ）で培養されたＨａＣａＴ細胞（Ｂ）及び初代ケラチノサイト（Ｃ）の定量評価の後、サンダロール（登録商標）（５００μΜ）又はリラール（Lyral）（１ｍＭ）で反復刺激された。
表は、コントロール測定（ブロッカーを含まないサンダロール（登録商標）の適用）と比較した、標準誤差を含んだ各適用の平均値である。マン・ホイットニーのＵ検定。測定された細胞の数：サンダロール（登録商標）＋１−オクタノール（ＨａＣａＴ（１１０）、ケラチノサイト（２６））；サンダロール（登録商標）＋カルベノオキソロン：ＨａＣａＴ（７４）；リラール＋カルベノオキソロン：ＨａＣａＴ（４３）。
***: p<0.001.
＜図１１＞
ヒトケラチン細胞株におけるサンダロール（登録商標）誘発シグナルカスケードの薬理的特徴
表Ａ）〜Ｄ）は、ブロッカー（青色）が存在する状態における、初代ケラチノサイトの代表的なカルシウムイメージングトレースである。横棒は、適用回数を表す。有効コントロール刺激として、各測定後に１００μＭのＡＴＰを使用した。
Ａ）カルシウムを含まない細胞外の溶液（＋１０ｍＭＥＧＴＡ）を使用した測定。
Ｂ）アデニリルシクラーゼブロッカーＳＱ−２２５３６（１００μＭ）を使用した測定。
Ｃ）ホスフォリパーゼ−ＣブロッカーであるＵ−７３１２２（１０μＭ）の使用。有効コントロールとして、１００μΜのヒスタミンを使用。
Ｄ）ＣＮＧチャネルブロッカ―であるＬ−シス−ジルチアゼム（１５０μΜ）を使用した測定。
Ｅ）ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイト（Ｋｅｒａ）の薬理的測定の概要。制御測定（１点鎖線）に対する平均振幅が示されている。ＭＤＬ−１２３３０Ａ（４０μＭ）。ＥＧＴＡ：カルシウムを含まないRinger (HaCaT n = 46, Kera n = 52)、SQ：SQ-22536 (HaCaT n = 60, Kera n = 26)、MDL:MDL-12330A (HaCaT n = 69, Kera n = 24)、U-73122 (HaCaT n= 41, Kera n = 25)、L-cis-D.：L-cis-diltiazem(HaCaT n = 41, Kera n = 25)。マン・ホイットニーのＵ検定***:p<0.001。
Ｆ）ｃＡＭＰ−ＧｌｏＴＭアッセイによるサンダロール（登録商標）刺激後、ＨａＣａＴ細胞のｃＡＭＰ内容の特定。ドットは、１０分間のサンダロール（登録商標）刺激（１μΜ−１０,０００μΜ）の後の標準誤差を含む平均ｃＡＭＰ内容を示す。顕著性は、サンダロール（登録商標）で刺激されたＨａＣａＴ細胞と、同量で刺激されたＤＭＳＯ（０．２％）との間で特定される。複数の比較を含むクラスカル・ウォリス試験を実施。ｎ＝３回の試験、*: p<0.05。
＜図１２＞
ＮＧＳデータ及びＲＴ−ＰＣＲを使用したシグナルカスケード成分及び構造的に関連するタンパクの発現分析
Ａ）ＮＧＳ及びＲＴ−ＰＣＲの結果の概要。ＮＧＳデータの結果は、ＦＰＫＭ値で表示される。ＲＴ−ＰＣＲ試験のトランスクリプトの検知は（チェックマーク）で示され、検知なしは（ｘ）で示されている。ｎ．ｄ．は、データなし（ｎｏ  ｄａｔａ）の意味である。芳香性があるシグナルカスケードの成分は、（*）で示される。
Ｂ）様々なシグナルカスケード成分のＲＴ−ＰＣＲ。フラグメントの大きさ：AC3 (311 bp), ANO1 (288 bp), ANO6 (432 bp), ANO8 (427 bp), ANO9 (416bp), ANO10 (373 bp), CNGA1 (2790 bp), CNGB1 (288 bp), GNAL (485 bp). Ｍ：マーカー、Ｋ：コントロール、ＧＮＡＬ：ＧαｏｌｆＲサブユニット、ＧＮＡＳ：ＧαＳＲサブユニット、ＡＤＣＹ：アデニリルシクラーゼ、ＡＮＯ：アノクタミン（膜貫通タンパク質１６）。
＜図１３＞
免疫細胞化学的染色による、ＡＣ３及びＣＮＧＡ１の発現分析
Ａ）ＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトは、特定の抗体（α−Ｇαｏｌｆ、α−ＣＮＧＡ１及びα−ＡＣ３）によって、明確な免疫細胞化学的染色を示した。第２抗体のみを使用した場合の染色が、コントロールとして使用された。細胞の位置及び数を特定するにあたり、核染色（ＤＡＰＩ、青色）が同時に実施された。蛍光画像は、共焦点顕微鏡で撮影した。スケール：２０μｍ。
Ｂ）免疫細胞化学的染色による人体皮膚へのＡＣ３発現の検知。上皮ケラチノサイトは、α−ＡＣ３抗体（緑色）を使用した際、明確な免疫細胞化学的染色を示した。コントロール染色において、第１抗体がウサギ血清と置換された場合、特定の染色は目視されなかった。拡大倍率は４００倍。Ｅ：表皮、Ｄ：真皮、Ｂ：基底層。
＜図１４＞
ＨａＣａＴ細胞におけるサンダロール誘発カルシウムシグナルでのＯＲ２ＡＴ４の役割を確認するためのＲＮＡ干渉試験
Ａ）Ｈａｎａ３Ａ細胞におけるｓｉＲＮＡ活動を特定するための二重ルシフェラーゼアッセイ。表は、ｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡで同時導入されたＨａｎａ３Ａ細胞の標準化された発光シグナル（firefly/Renilla）及びｐｍｉｒＧＬＯ−ＯＲ２ＡＴ４のみで導入された細胞と比較した場合における、レポーターベクターであるｐｍｉｒＧＬＯ−ＯＲ２ＡＴ４を示す。マン・ホイットニーのＵ検定；ｎ＝３、***：p<0.001。
Ｂ）左図：ｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡ−発現プラスミド及びα−ＯＲ２ＡＴ４抗体（赤色）でトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞の免疫細胞化学的染色を示す。ｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡ発現細胞は、ＧＦＰ発現に基づき特定される（緑色）。右図：定量評価では、ｓｃＲＮＡ−発現細胞（ｎ＝１７細胞）に比べ、ｓｃＲＮＡ−発現細胞（ｎ＝１７細胞）のα−ＯＲ２ＡＴ４染色が著しく減少したことを示した。表示では、ｓｃＲＮＡ−発現細胞と比較した、ｓｉＲＮＡの標準誤差を含めた平均蛍光強度を示している。マン・ホイットニーのＵ検定**: p<0.01。
Ｃ）２つのｓｉＲＮＡの混合物でトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞の透過光及び蛍光画像。大きさ：５０μＭ。
Ｄ）カルシウムイメージング測定の蛍光画像。ｓｉＲＮＡ発現細胞（円で示す）はＧＰＦの同時発現により特定され、サンダロールによる刺激では、細胞内カルシウム濃度に増加は見られなかった。
Ｅ）サンダロール（登録商標）で繰り返し刺激されたｓｉＲＮＡ（青色トレース）又はｓｃＲＮＡ（黒色トレース）でトランスフェクトされた、ＨａＣａＴ細胞のカルシウムイメージングトレースの代表例である（５００μΜ、水平の棒）。コントロール刺激として、測定の最後に、１００μΜのＡＴＰが使用された。
Ｆ）ｓｉＲＮＡ及びｓｃＲＮＡ発現細胞における、サンダロール誘発カルシウムシグナルの定量評価。まず、カルシウムシグナルの振幅がＡＴＰに標準化され、ｓｉＲＮＡ発現細胞がｓｃＲＮＡ発現ＨａＣａＴ細胞に応じて発現した。表では、標準誤差を含む、各適用の平均値を示す。マン・ホイットニーのＵ検定；ｎ＝１８細胞（ｓｉＲＮＡ）、ｎ＝１７細胞（ｓｃＲＮＡ）。 *: p<0.05; **: p<0.01。
＜図１５＞
ＨａＣａＴ細胞におけるサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルのＯＲ２ＡＴ４拮抗薬の活動
Ａ）サンダロール（登録商標）（１ｍＭ）で繰り返し刺激されたＨａＣａＴ細胞の代表的なカルシウムイメージングトレース。第３適用時において、サンダロール（登録商標）（青色トレース）による刺激、又はサンダロール（登録商標）＋ジメトール（薄青色トレース）、サンダロール（登録商標）＋オキシフェニロン（登録商標）（黒色トレース）、又はサンダロール（登録商標）＋フェニラト（登録商標）（灰色トレース）による同時刺激が加えられた。コントロール刺激として、各測定の最後に、１００μΜのＡＴＰが使用された。水平棒は、適用の数に対応する。芳香剤：１ｍＭ
Ｂ）サンダロール（登録商標）単独またはジメトール、フェニラト（登録商標）、又はオキシフェニロン（登録商標）による同時刺激のカルシウムイメージングの定量評価。Ｓ：サンダロール（登録商標）を表す。表示では、標準誤差を含む第３適用の平均値を示す。マン・ホイットニーのＵ検定***: p<0.001。測定された細胞数：サンダロール（登録商標）（１２１）、サンダロール（登録商標）＋オキシフェニロン（登録商標）（４３）、サンダロール（登録商標）＋フェニラト（登録商標）（６７）、サンダロール（登録商標）＋ジメトール（１２０）。
Ｃ）拮抗薬、オキシフェニロン（登録商標）及びフェニラト（登録商標）によるサンダロール（登録商標）誘発カルシウムシグナルの容量依存による阻害の調査。第３適用において、ＨａＣａＴ細胞は異なる濃度のサンダロール（登録商標）（５００〜１０００μΜ）及び１つの拮抗薬（１００〜５００μＭ）によって同時刺激された。芳香剤誘発カルシウムシグナルとの適合性について、第３適用時の振幅は前回の適用において標準化された。表では、標準的な芳香剤誘発されたカルシウムシグナルの標準誤差を含む平均値とコントロール細胞（拮抗薬を含まないサンダロール（登録商標）適用）との比較を示す。マン・ホイットニーのＵ検定、***: p<0.001。
Ｄ）前記Ｃ）において拮抗薬が５００μΜである場合のＩＣ５０値の計算。
＜図１６＞
長時間のサンダロール（登録商標）刺激による、ケラチノサイトにおける形態、増殖及び移動の効果
Ａ）サンダロール（登録商標）（５００μΜ）又は０．１％のＤＭＳＯ（コントロール）で５日間刺激した後のＨａＣａＴ細胞及び初代ケラチノサイトの位相コントラスト画像及びＰＩ染色を示す。有効なＰＩ染色では、細胞核は赤色で染色された。スケール：１００μＭ。
Ｂ）サンダロール（登録商標）（５００μΜ）又は０．１％のＤＭＳＯ（コントロール）で５日間刺激した後、ＨａＣａＴ細胞のCyQuant細胞増殖キットを使用した増殖アッセイの評価。ＲＮＡ干渉試験において、サンダロール（登録商標）刺激を行う日の前に、細胞はｓｉＲＮＡ又はｓｃＲＮＡでトランスフェクトされた。表では、治療されていない細胞と比較した場合における、標準誤差を含めた平均細胞数を表す。マン・ホイットニーのＵ検定；ｎ＝３試験、*: p<0.05; **: p<0.01。 S：サンダロール。
Ｃ）ＨａＣａＴ細胞の増殖を特定するためのアガロースアッセイ。上部：サンダロール（登録商標）（５００μΜ）又は０．１％のＤＭＳＯの方向に増殖したＨａＣａＴ細胞の透過光画像。細胞の増殖マージンは、黒色で囲われている。スケール：２５０μＭ。下図：増殖アッセイの評価。細胞及び過剰成長した面積の最も長い通路が測定され、コントロール（０．１％のＤＭＳＯ）と比較された。ペア両側Ｔ検定（Paired two-sided T test）標準誤差を含む平均値：ｎ＝４回の試験。**:p<0.01; ***: p<0.001。
＜図１７＞
皮膚細胞におけるサンダロール（登録商標）刺激によるＭＡＰキナーゼのリン酸化の効果
Ａ）サンダロール（登録商標）（５００μＭ）で刺激されたＨａＣａＴ細胞におけるＭＡＰキナーゼのリン酸化を調査するための０分、５分、１５分及び３０分のウェスタンブロットである。タンパクの容積を均一とするために、コントロールとしてα−チューブリンが使用された。ＥＲＫ１／２：４２／４４ｋＤａ；ｐ３８：４３ｋＤａ；ＪＮＫ／ＳＡＰＫ：４６／５４ｋＤＡ;α−チューブリン：５２ｋＤａ。
Ｂ）サンダロール（登録商標）（５００μΜ）による３０分間の刺激または追加してｐ３８阻害剤ＳＢ２０３５８０（１０μΜ）又はＥＲＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６（１０μΜ）によってｐ３８及びＥＲＫ１／２リン酸化されたＨａＣａＴ細胞の定量評価を示す。評価において、リン酸化（ｐ）及びリン酸化されていないタンパクが特定され、治療されていない細胞との比較を行った。平均値には標準誤差が含まれる。マン・ホイットニーのＵ検定  *: p<0.05；***：p<0.001。
Ｃ）では、他のＭＡＰキナーゼの抑制剤が使用され、サンダロールのみ（登録商標）（５００μΜ）で刺激された細胞のリン酸化が比較された。平均値には標準誤差が含まれる。マン・ホイットニーのＵ検定*: p<0.05。ウェスタンブロット分析は、３つの異なるタンパク分離によって実施された。
＜図１８＞
体外での創傷治癒アッセイにおけるヒトケラチノサイトに対するサンダロール（登録商標）刺激の効果
Ａ）初代ケラチノサイト及びＢ）ＨａＣａＴ細胞の「創傷治癒率」の調査は、サンダロール（登録商標）（５００μΜ）又は０．１％のＤＭＳＯがコントロールとして存在している条件において、引っ掻き傷アッセイによって行われた。左図：「傷」が複数回観察された透過光画像。細胞の増殖部は黒色で囲われている。スケール：２００μＭ。右図：引っ掻き傷アッセイの定量評価。傷の領域を測定し、当初の傷の範囲（０時間）と比較した。平均値は標準誤差を含む。マン・ホイットニーのＵ検定；ｎ＝４試験。*: p<0.05; ***: p<0.001。
Ｃ）サンダロール（登録商標）（５００μΜ）及び拮抗薬であるオキシフェニロン（登録商標）（５００μΜ）又はフェニラト（登録商標）（５００μΜ）、ｐ３８のＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０（１０μΜ）又はＥＲＫ１／２ＭＡＰＫ阻害剤Ｕ０１２６（１０μΜ）が存在する引っ掻き傷アッセイ。治療された傷の測定領域（４８時間の刺激）と、コントロール（０．１％のＤＭＳＯ）とを比較した。平均値は標準誤差を含む。複数の比較を含むクラスカル・ウォリス試験を実施。ｎ＝３回の試験。*: p<0.05.
Ｄ）Ｃで実行されたオキシフェニロン（登録商標）（５００μΜ）、フェニラト（登録商標）（５００μΜ）、ＳＢ２０３５８０（１０μΜ）Ｕ０１２６（１０μΜ）を含む引っ掻き傷アッセイのコントロール。治療された傷の測定領域と、コントロール（０．１％のＤＭＳＯ）とを比較した。平均値を含む。
＜図１９＞
サンダロール（登録商標）刺激後のインターロイキン分泌とＡｋｔプロテインキナーゼのリン酸化の調査。
Ａ）サンダロール（登録商標）（５００μＭ）刺激を６〜２４時間行った後、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＨａＣａＴ細胞のインターロイキン制御を行った調査結果である。コントロールとして、０．１％のＤＭＳＯが使用された。対照遺伝子としてＧＡＰＤＨが使用され、治療された及び治療されていない細胞の相対発現が特定された。平均値は標準誤差を含む。ｎ＝３回の試験。
Ｂ）サンダロール（登録商標）（５００μＭ）刺激を２４時間行ったＨａＣａＴ細胞の表面で検知されるインターロイキンのＥＬＩＳＡアッセイ。コントロールとして、０．１％のＤＭＳＯが使用された。治療された細胞の測定光学密度は、背景と比較して表現した。３つの独立した刺激の上澄みを使用した。平均値は標準誤差を含む。マン・ホイットニーのＵ検定、*: p<0.05。
Ｃ）サンダロール（登録商標）（５００μＭ）刺激を０分、５分、１５分、３０分行ったＨａＣａＴ細胞によるＡｋｔプロテインキナーゼのリン酸化調査のウェスタンブロット分析。Ａｋｔ（６０ｋＤＡ）；ｐ−Ａｋｔ：リン酸化Ａｋｔタンパク（６０ｋＤＡ）。
【図１】
0006615793.tif 000005
【図２】
0006615793.tif 000006
【図３】
0006615793.tif 000007
【図４】
0006615793.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【図７】
0006615793.tif 000011
【図８】
0006615793.tif 000012
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006615793.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
0006615793.tif 000017
【図１４】
0006615793.tif 000018
【図１５】
0006615793.tif 000019
【図１６】
0006615793.tif 000020
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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