(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブと、を含み、
前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を内包する両親媒性粒子である、
前記生体分子は、タンパク質分解酵素である、
前記ウイルスは、細胞膜に吸着及び／又は融合する表面タンパク質を含む、ウイルス検出用キット。
【請求項２】
前記標識子は、自己消光された染料（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）、蛍光染料、電気化学発光物質、消光剤、発光染料及び燐光染料よりなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項３】
前記プローブは、両親媒性高分子と結合された染料及び両親媒性高分子と結合された消光剤よりなる群から選択された一つ以上を含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項４】
前記両親媒性高分子は、親水性高分子Ａ及び疎水性高分子Ｂを含むＡ−Ｂタイプのブロック共重合体、Ｂ−Ａ−Ｂタイプの三重ブロック共重合体、脂質高分子及びこれらの組合よりなる群から選択される、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項５】
前記プローブは、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、コロイドソーム（ｃｏｌｌｏｉｄｓｏｍｅ）、ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）又は液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）の形態である、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項６】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス又はパラミクソウイルスである、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項７】
前記酵素は、フーリン、トリプシン、セリン、エンドプロテアーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）及びカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）よりなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項８】
前記キットは、ｐＨ６以下の酸性物質をさらに含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項９】
前記キットは、反応補助剤をさらに含む、請求項１に記載のウイルス検出用キット。
【請求項１０】
ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブと、を含み、
前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を内包する両親媒性粒子である、
前記生体分子は、タンパク質分解酵素である、
前記ウイルスは、細胞膜に吸着及び／又は融合する表面タンパク質を含む、ウイルス検出用組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、ｐＨ６以下の酸性物質をさらに含む、請求項１０に記載のウイルス検出用組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルス又はパラミクソウイルスである、請求項１０に記載のウイルス検出用組成物。
【請求項１３】
個体から収得した試料を、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子に接触させる段階と、
前記生体分子に接触した試料を、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブに接触させる段階と、を含み、
前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を内包する両親媒性粒子である、
前記生体分子は、タンパク質分解酵素である、
前記ウイルスは、細胞膜に吸着及び／又は融合する表面タンパク質を含む、
前記接触は、ｐＨ６以下の条件下で行われる、ウイルス検出方法。
【請求項１４】
前記検出方法は、試料に接触したプローブの変化を測定する段階をさらに含む、請求項１３に記載のウイルス検出方法。
【請求項１５】
前記プローブの変化は、蛍光強度、発光強度、燐光強度、吸光強度、電気的信号、表面増強ラマン分光（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＲＳ）信号、色及びプローブの分散度よりなる群から一つ以上の変化を測定するものである、請求項１４に記載のウイルス検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス検出用キット、ウイルス検出方法、ウイルス検出用組成物及びウイルス検出用キットの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、細菌よりサイズが小さい伝染性病原体である。遺伝物質であるＲＮＡ又はＤＮＡと、該遺伝物質を取り囲んでいるタンパク質とで構成される。ウイルスは、宿主の種類によって、植物ウイルス、動物ウイルス及び細菌ウイルス（ファージ）に区分できる。しかし、大部分の場合、核酸の種類によって、ＤＮＡウイルス亜門とＲＮＡウイルス亜門とに分けられ、これらは、さらに、綱、目、科に細分化される。
【０００３】
このようなウイルスのうち、 鳥インフルエンザは、ニワトリ、アヒル、又は野生鳥類において鳥インフルエンザウイルス（Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）に感染して起きる急性ウイルス性伝染病であり、珍しいことに、ヒトにも感染症を起こす。鳥インフルエンザウイルスは、病原性によって、高病原性、低病原性及び非病原性の３種類に区分され、２００３年末から２００８年２月までヒトに伝染されることもできる高病原性鳥インフルエンザウイルス（ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ、Ｈ５Ｎ１）の人体感染事例が６４０件以上報告された。鳥インフルエンザは、鳥類の高い斃死率と産卵率の低下により莫大な経済的被害を引き起こし、人体感染可能性が高いものではないが、人体に感染される場合、高い死亡率を示す。根本的なワクチン開発が難しくて、拡散速度が非常に速いため、早期診断を通じて疾病の拡散及び経済的損失を最小化することが必要である。
【０００４】
このようなウイルスの診断方法としては、酵素結合免疫吸収検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）及び免疫蛍光検定法（ＩＦＡ）などの免疫学的検出方法と、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ検出方法などが知られたが、このような方法は、ウイルス診断に過度な時間がかかるか、高価の検査費用を必要とするか、非特異的な反応による特異度及び敏感度が低下するなどの問題がある。
【０００５】
したがって、低費用で短時間内に効率的にウイルスを検出する方法の開発が求められことが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、短時間内に効率的にウイルスの検出が可能なウイルス検出用キット、ウイルスの検出方法及びウイルス検出用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブと、を含み、前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を含むウイルス検出用キットを提供する。
【０００８】
本発明は、また、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含み、前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を含むウイルス検出用組成物を提供する。
【０００９】
本発明は、また、個体から収得した試料をウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子に接触させる段階と、前記生体分子に接触した試料を、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブに接触させる段階と、を含み、前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を含むウイルス検出方法を提供する。
【００１０】
本発明は、また、両親媒性高分子と標識子を結合させる段階を含むウイルス検出用プローブ又は検出用キットの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、低費用でウイルスを短時間内に高効率で検出することができ、従来のウイルス検出キットと比べて標識子の初期放出が抑制され、検出敏感度及び正確度を高め、製造過程で透析（洗浄）する段階を実施しなくてもよいため、製造効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の一例によるプローブの構造を示す図である。
【図２】図２は、本発明の一例によるプローブのイメージを示す図であり、スレールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図３】図３は、本発明の一例によるプローブのイメージを示す図であり、スレールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図４】図４は、本発明の一例によるプローブのイメージを示す図であり、スレールバー（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ）は、１００ｎｍを示す。
【図５】図５は、本発明の一例によるプローブの平均サイズの比較を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
インフルエンザウイルス、エボラウイルスを含んですべてのウイルスは、宿主細胞侵入のために宿主細胞に結合する表面タンパク質であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ、ＨＡ）、成熟したビリオン（ｖｉｒｉｏｎ）が宿主細胞から放出されるのに関与するノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）、水素イオン濃度の均衡を調節するＭ２イオンチャネル、ウイルスの遺伝情報を持っているＲＮＰ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）などよりなる。
【００１４】
本発明者らは、前述したウイルスの共通された特性に基づいて、ウイルスを早期に検出できる方法を開発するために研究した。その結果、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子を通じてウイルスを活性化し、かくして活性化されたウイルスと反応し、前記ウイルスの存在有無を検出できるプローブを利用して、簡単な方法でウイルスを検出できることを知見し、本発明を完成した。
【００１５】
したがって、本発明は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含み、前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を含むウイルス検出用キットを提供する。
【００１６】
本発明のプローブは、「両親媒性高分子と結合された標識子」を含む。前記「両親媒性高分子と結合された標識子」は、「標識子が結合された両親媒性高分子」であることができる。
【００１７】
本発明において使用された用語「プローブ」は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子により活性化されたウイルスと反応し、前記ウイルス又は活性型ウイルスの存在有無を検出できる物質を意味する。プローブは、ウイルス以外の物質又は不活性型ウイルスと比較して活性型ウイルスとの反応能力が格別に優れているか、又は、活性型ウイルスと特異的に反応し、活性型ウイルスの存在有無を有意に検出できる物質であれば、すべて含まれ、その種類及び形態は、特に制限されない。本明細書で前記プローブは、「検出因子」と混用して使用される。
【００１８】
「両親媒性高分子と結合された標識子」を含む本発明のプローブの場合、膜を形成し、カプセルの役目又は担体の役目をする高分子と標識子が直接結合されているので、検出過程で標識子が初期に放出されることを制御でき、検出敏感度及び正確度を向上させることができ、製造段階で透析する過程を省略でき、製造効率に優れているという効果がある。
【００１９】
本発明において使用された用語「結合」は、原子やイオンが会って分子を形成することを意味する。前記両親媒性高分子と標識子との間の原子又はイオンが会って形成し得る形態の結合であれば、共有結合、イオン結合、金属結合及び配位結合などを含む結合の種類に制限されない。
【００２０】
例えば、前記結合は、エステル結合、アミド結合、イミン結合、ヒドラゾン結合又はアセタール結合であることができる。
【００２１】
本発明において「標識子」は、プローブと活性型ウイルスの反応可否を判別できる、又は判別できるようにする物質を意味する。標識子の種類は、特に制限されず、プローブの反応の前後の変化によってプローブの変化又は信号を確認できる標識子であれば、制限なしに利用可能である。
【００２２】
本発明の具体例において、前記標識子は、両親媒性高分子に結合された標識子（第１標識子）と異なる種類の標識子（第２標識子）をさらに含むことができる。
【００２３】
前記第２標識子は、高分子と結合又は担持された形態であることができる。すなわち、本発明のプローブは、両親媒性高分子と結合された第１標識子と、前記プローブの内部に担持された第２標識子をさらに含むか、又は第１標識子が結合された親水性高分子及び第２標識子が結合された親水性高分子をそれぞれ含むことができる。
【００２４】
本発明の一具体例において、前記標識子は、自己消光された染料（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）、蛍光染料、電気化学発光物質、消光剤、発光染料及び燐光染料よりなる群から選択された一つ以上を含むことができる。
【００２５】
前記両親媒性高分子に結合された標識子は、１種以上であることができる。また、同じ種類の標識子の中でも１つ以上の互いに異なる物質がそれぞれ両親媒性高分子と結合された形態であることができる。一具体例において第１標識子が蛍光染料である場合、第２標識子は、消光剤であることができ、他の具体例において、第１標識子が消光剤である場合、第２標識子が蛍光染料であることができる。
【００２６】
本発明の一具体例において、前記プローブは、両親媒性高分子と結合された染料及び／又は両親媒性高分子と結合された消光剤を含むことができる。
【００２７】
本発明において染料は、特定波長の光を選択的に吸収又は放出する物質を意味する。前記特定波長の光は、紫外線光、赤外線光又は可視光であることができる。
【００２８】
本発明において自己消光された染料は、染料（ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ  ｄｙｅ）が互いに隣接する位置にある場合には、消光作用が起こり、結合している染料が放出され、広がると、脱消光作用によって蛍光が現われる物質を意味する。
【００２９】
一具体例において、自己消光された染料は、３、３−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペルクロラート（３、３−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ；Ｄｉｏ；Ｄｉｏｃ）、３、３−ジオクタデシル−５、５−ジ（４−スルホフェニル）オキサカルボシアニンソジウム塩（３、３−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−５、５−ｄｉ（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）ｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、４−（４−（ジヘキサデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド（４−（４−（ｄｉｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｎｏ）ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ；ＤｉＡ；４−Ｄｉ−１６−ＡＳＰ）、４−（４−（ジデシルアミノ）スチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド（４−（４−（Ｄｉｄｅｃｙｌａｍｉｎｏ）Ｓｔｙｒｙｌ）−Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ；４−Ｄｉ−１０−ＡＳＰ）、１、１−ジオクタデシル−３、３、３、３−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート（１、１−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｐｅｒｃｈｌｏｒａｔｅ；Ｄｉｌ）、１、１−ジオクタデシル−６、６−ジ（４−スルホフェニル）−３、３、３、３−テトラメチルインドカルボシアニン（１、１−Ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−６、６−Ｄｉ（４−Ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）、４、４−ジイソチオシアナトスチルベン−２、２−ジスルホン酸ジソジウム塩（４、４−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｓｔｉｌｂｅｎｅ−２、２−ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ；ＤＩＤＳ）、１、１−ジオクタデシル−３、３、３、３−テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド（１、１−ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌ−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｔｒｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ；ＤｉＲ）、１、１−ジオレイル−３、３、３、３−テトラメチルインドカルボシアニン（１、１−ｄｉｏｌｅｙｌ−３、３、３、３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）、フルオレシン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）、テトラメチルローダミン （Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、オクタデシルローダミンＢクロリド（Ｒ１８）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）及びアロピコシアニン（ａｌｌｏｐｉｃｏｃｙａｎｉｎｅ）よりなる群から選択される一つ以上であることができる。前記蛍光染料の平均粒径は、２００ｎｍ以下、又は５０ｎｍ〜１００００ｎｍであることができる。
【００３０】
一具体例において、電気化学発光物質は、これに制限されるものではないが、トリス（２、２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］を含む。
【００３１】
一具体例において蛍光染料（ｄｙｅ）は、光に含まれた波長を吸収し、色光を替えて再放射する性質を有する物質を意味する。蛍光染料は、発光染料とも言い、当業界によく知られている蛍光染料を制限なしに利用できる。一具体例において、蛍光染料は、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、４−クロロ−７−ニトロベンゾフラザン（４−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎ；ＮＢＤ−Ｃｌ）、ルミノール（ｌｕｍｉｎｏｌ）、フラーレン（ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ）及び芳香族基を含む化合物よりなる群から選択される一つ以上であることができる。
【００３２】
一具体例において、消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）は、分子の浮き上がりエネルギーを除去し、発光又は蛍光を阻害する物質を意味する。前記消光剤は、本発明の属する分野において通常的に知られており、その種類に制限なしに使用できる。一具体例において、消光剤は、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、及びＢＨＱ−３よりなる群から選択される一つ以上のものであることができる。
【００３３】
一具体例において、燐光染料は、照明光中で吸収した波長を替えて再放射することによって、光輝性効果を示す物質を意味する。一例として、硫化鉱物（ＸｍＺｎＸは、金属原素、Ｚは、非金属元素）又はアルカリ土金属の硫化物であることができるが、その種類に制限されない。
【００３４】
本発明において使用された用語「両親媒性」というのは、親水性と疎水性の性質を共に有することを意味する。また、両親媒性粒子は、親水性を示す領域と疎水性を示す領域を有する粒子を意味する。前記両親媒性高分子は、親水性高分子Ａ及び疎水性高分子Ｂを含むＡ−Ｂタイプのブロック共重合体、Ｂ−Ａ−Ｂタイプの三重ブロック共重合体、脂質高分子及びこれらの組合よりなる群から選択され得る。
【００３５】
一具体例において、親水性高分子は、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリアクリックアッシド（ＰＡＡ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び親水性ポリアミノ酸よりなる群から選択される一つ以上であることができる。好ましくは、親水性高分子は、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリグルタミン、ポリグルタミン酸、ポリスレオニン、ポリアスパラギン、ポリアルギニン及びポリセリンよりなる群から選択される一つ以上であることができる。親水性Ａブロックは、２００〜５０，０００ダルトン又は１，０００〜２０，０００ダルトンの数平均分子量を有することができる。
【００３６】
一具体例において、疎水性高分子は、親水性高分子とともに両親媒性高分子を形成できる物質であれば、制限なしに利用可能である。一具体例において、疎水性高分子Ｂブロックは、ポリエステル、ポリアンヒドリド、疎水性ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファジンよりなる群から選択される一つ以上であることができる。好ましくは、疎水性高分子Ｂブロックは、ポリロイシン、ポリイソロイシン、ポリバリン、ポリフェニルアラニン、ポリフロリン、ポリグリシン、ポリメチオニン、ポリトリプトファン、ポリアラニン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ポリラクチドとグリコリドの共重合体、ポリラクチドとジオキサン−２−オンの共重合体、ポリラクチドとカプロラクトンの共重合体、及びポリグリコリドとカプロラクトンの共重合体よりなる群から選択される一つ以上であることができる。また、前記疎水性高分子は、その誘導体を含む。疎水性Ｂブロックは、５０〜５０，０００ダルトン、又は２００〜２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する。
【００３７】
本明細書で使用した用語「脂質高分子」は、「脂質」とも言う。二重層の膜構造を形成できるものであれば、リン脂質、脂質タンパク質、糖脂質、陽イオン性脂質などをすべて含み、その種類に制限されない。また、前記脂質は、自然的に誘導されて得られたもの及び合成された脂質誘導体をすべて含む。前記リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）は、グリセロリン脂質（ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓ  ｐｈｏｌｉｐｉｄｓ）及びスフィンゴリン脂質（ｓｐｈｉｎｇｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）を含む。前記グリセロリン脂質は、ジアクリルグリセリド構造を有するものであることができ、具体的に、ホスファチジン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄａｔｅ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ、ＰＡ）、レシチン（ｌｅｃｉｔｈｉｎ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、ＰＣ）、セファリン（ｃｅｐｈａｌｉｎ）及びホスホイノシタイド類（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ）を含む。前記セファリンリン脂質は、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）及びホスファチジルエタノールアミン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、ＰＥ）を含む。また、前記ホスホイノシタイド類リン脂質は、ホスファチジルイノシトール（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールフォスフェート（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ）、ホスファチジルイノシトール二リン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ２）及びホスファチジルイノシトール三リン酸（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ３）を含む。前記スフィンゴリン脂質は、セラミドホスホリルコリン（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ、ＳＰＨ）、セラミドホスホリルエタノールアミン（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ、Ｃｅｒ−ＰＥ）及びセラミドフォスフォリルリピッド（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｌｉｐｉｄ）を含む。
【００３８】
前記合成リン脂質誘導体は、その種類に制限されないが、一具体例として、１、２−ジドデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＥＰＣ、１、２−ｄｉｄｏｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１、２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ、１、２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ、１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＰＯＰＳ、１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｌ−ｓｅｒｉｎｅ）及びこれらの組合よりなる群から選択され得る。
【００３９】
本発明の一例によるプローブは、公知された方法を自由に利用して製造し得る。例えば、親水性領域と疎水性領域を含む両親媒性ブロック共重合体を水溶液に分散させた後、超音波を加える方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、過量の水で有機溶媒を抽出又は蒸発させる方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、過量の水で透析する方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、均質器又は高圧乳化器を利用して強く溶媒を蒸発させる方法、又は薄膜水和法（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）などを使用して製造し得る。
【００４０】
本発明の一例によるプローブは、親水性領域と疎水性領域を含む両親媒性ブロック又は高分子が自己組織化して粒子化されたものであることができる。
【００４１】
本発明のプローブは、検出対象ウイルス又はウイルスの表面タンパク質の種類、使用される高分子の種類、製造方法によって多様な構造又は形態を示すことができる。
【００４２】
本発明の一具体例において、プローブは、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造を示すことができる。
【００４３】
本発明において使用した用語「膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造」とは、膜又はシェル（ｓｈｅｌｌ）によって内部が取り囲まれている構造を意味する。ベシクル（ｖｅｓｉｃｅｌ）、人工細胞（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｅｌｌ）又はマイクロカプセルのようなカプセル形態の粒子（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、その種類を制限せず、すべて含む。本明細書で前記膜構造は、シェル（ｓｈｅｌｌ）構造と混用して使用する。前記膜構造は、前記内部には、流体又は別途の構成を含む構造まで含む。
【００４４】
前記膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）又は二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）構造を含む。前記単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）は、「疎水性領域−親水性領域」を含む膜構造であって、一具体例において、水溶性溶液内で疎水性コアと親水性シェルを含む構造であることができる。前記二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、「親水性領域−疎水性領域−疎水性領域−親水性領域」を含む膜構造である。一具体例において、前記二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、前記２個の単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）が結合された形態であることができる。また、前記二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）は、親水性コアと前記親水性コアを取り囲んでいる疎水性領域及び前記疎水性領域を取り囲んでいる親水性シェルを含む構造であることができる。
【００４５】
前記膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）構造は、単一膜（ｓｉｎｇｌｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）及び単一膜を２つ以上有する多重膜（ｍｕｌｔｉｍｅｍｂｒａｎｅ）をすべて含む。一例として、単一膜を有する粒子がさらに一つの単一膜で取り囲まれた場合、多重膜を有する粒子になり得る。前記単一膜及び多重膜は、単一層及び二重層と区別される概念である。具体的に、二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）構造の膜を一つだけ含む粒子は、単一膜を有するものであり、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）構造の膜を含む粒子をさらに単一層構造の膜が取り囲んでいる粒子は、多重膜構造の粒子を意味する。
【００４６】
前記膜構造を有するプローブは、本発明の属する通常の方法によって製造され得、一具体例において、微細溶液化装備を利用した微細流動化方法（ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｚａｔｉｏｎ）、超高圧均質法（Ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）、乳液法（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）又は超音波などを利用して製造できるが、これに制限されるものではない。
【００４７】
前記膜構造を有する粒子は、その種類に制限されず、すべて本発明のプローブに含まれることができる。一具体例において、ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、コロイドソーム（ｃｏｌｌｏｉｄｓｏｍｅ）、ベシクル（ｖｅｓｉｃｌｅ）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）であることができるが、前記例に制限されるものではない。本発明のキットは、互いに異なる膜構造を有する１種以上のプローブを含むことができる。
【００４８】
前記「ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）」は、疎水性コアと親水性シェルを有する粒子を意味する。一具体例において、前記ミセルは、界面活性剤のミセル又は高分子自己組織化ミセルであることができる。自己組織化によるミセルの場合、共重合体を形成する高分子の種類によって多様な形態を有することができ、その形態に制限を受けるものではない。前記ミセルは、単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を２つ以上含む多重膜形態をも含む。前記ミセルは、その形態の制限はないが、一例によって、球形、楕円形（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ）又はシリンダー形（ｃｙｌｉｎｄｅｒ）を含む。前記ミセル構造のプローブは、疎水性コア領域に標識子及び無機粒子のような構成をさらに含むことができる。
【００４９】
前記「ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）」は、「親水性領域−疎水性領域−疎水性領域−親水性領域」を有する２重層膜構造を持って、前記疎水性及び親水性領域に高分子又は共重合体を含む粒子を意味する。前記高分子又は共重合体は、人為的に合成されたものと脂質（ｌｉｐｉｄ）を一緒に含むか、人為的に合成されたものを含むことができる。前記人為的に合成されたものは、自然的に発生する脂質（ｌｉｐｉｄ）を除いたすべての高分子及び共重合体を含む意味である。前記ポリマーソームは、二重層膜構造の単一膜及び単一膜を２つ以上含む多重膜をすべて含む。
【００５０】
前記ポリマーソームは、リポソームと区分して人為的に合成された高分子又は共重合体を含むことができる。前記ポリマーソームは、二重層形態の膜だけよりなる単一膜及び前記２重層の単一膜を２つ以上含む多重膜形態をも含む。
【００５１】
前記「リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）」は、少なくとも一つの脂質二重層を有する粒子を意味する。両親媒性の生体膜を模倣した脂質膜を有するものであれば、単一膜及び多重膜をすべて含む。リポソームを形成する方法は、当業界によく知られており、通常、リン脂質を塩類水溶液中に懸濁するか、リン脂質を含む水溶液を超音波処理などを行うことによって収得することができるが、製造方法によって本発明が制限されない。
【００５２】
前記「コロイドソーム」は、１ｎｍ〜１０００ｎｍサイズのコロイド状粒子又は前記粒子が緻密にパッキングされた構造物を意味する。膜を形成する親水性及び疎水性領域の高分子の種類によって、単一層及び二重層を含むことができる。また、単一膜及び多重膜をすべて含む。
【００５３】
前記「液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ）」は、前記膜構造粒子中において水玉の形態を示すものを意味する。単一層及び二重層を含み、単一膜及び多重膜をすべて含む。
【００５４】
本発明のプローブは、形態（ｓｈａｐｅ）によって区分できるが、前記形態に制限されない。一具体例において、前記プローブの形態（ｓｈａｐｅ）は、ロッド（ｒｏｄ）、球、リング（ｒｉｎｇ）、板（ｆｌａｔ）、シリンダー、楕円形、膜で取り囲まれた形態及びこれらの組合を含む。
【００５５】
前記ロッド（ｒｏｄ）形態は、ロッド、棒又は竿のような一直線形態を総称する意味である。前記球形態は、丸い形の形態を意味するもので、完全球形と不完全球形をすべて含む。前記リング（ｒｉｎｇ）形態は、一般的に、球又は円形の形態において中央が空いている形態を意味する。前記板（ｆｌａｔ）形態は、薄くて、平たい形態の平板、板状の形態を意味する。一具体例において、板形態のプローブは、基材又は担体の上部又は外部に板状のプローブがコーティングされた形態であることができる。
【００５６】
本発明の一具体例において、両親媒性粒子が下記式１によって計算された質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）が０．２５〜０．４０を満足するとき、両親媒性粒子は、ポリマーソーム形態を示し、質量分率が０．４０超過且つ０．７０以下であるとき、両親媒性粒子は、ミセル構造を示す。
【００５７】
［式１］
質量分率（ｍａｓｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝親水性高分子の質量／（親水性高分子の質量＋疎水性高分子の質量）
【００５８】
また、前記質量分率を質量％（ｐｅｒｃｅｎｔ）で示す場合、質量％が２５％〜４０％を満足するとき、両親媒性粒子は、ポリマーソーム形態を示し、質量％が４０％超過且つ７０％以下であるとき、両親媒性粒子は、ミセル構造を示す。
【００５９】
一具体例において、プローブのサイズは、制限されない。プローブは、ナノ又はマイクロ粒子であることができ、例えば平均粒径は、５０〜１００００ｎｍであることができる。
【００６０】
本発明の他の一例によれば、プローブは、ウイルスとの反応可否をさらに明確に判断するために、金、銀及びこれらの組合から選択された無機粒子をさらに含むことができる。
【００６１】
本発明のキット又は組成物は、前記プローブを単一種類だけ含むか、２種類以上のプローブを一緒に含むことができる。
【００６２】
本発明において使用した用語「ウイルス」は、偏性細胞内寄生体（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｒａｓｉｔｅ）であって、核酸としてＤＮＡ又はＲＮＡを有し、増殖は、核酸から始まり、二分裂増殖されず、ＡＴＰ生産に必要な酵素系を持っていないことを意味する。
【００６３】
本発明のウイルスは、露出ウイルス（ｎａｋｅｄ  ｖｉｒｕｓ）と外膜ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）を含み、具体的に、本発明の一例によるウイルスは、外膜ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｕｓ）であることができる。
【００６４】
前記外膜ウイルスは、具体的に、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）及びヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）を含むＤＮＡウイルスと、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ヘパタイティスＤ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｄ）、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、ブニヤウイルス（ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、フィロウイルス（ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）及びレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）を含むＲＮＡウイルスに属するものであれば、すべて含む。
【００６５】
前記オルトミクソウイルスは、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス（ｉｓａｖｉｒｕｓ）、トゴトウイルス（ｔｈｏｇｏｔｏｖｉｒｕｓ）及びクアランジャウイルス（ｑｕａｒａｎｊａｖｉｒｕｓ）属に含まれるすべてのウイルスを含む。
【００６６】
前記コロナウイルスは、アルファコロナウイルス（ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ベータコロナウイルス（ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ガンマコロナウイルス（ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）及びデルタコロナウイルス（ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）属に含まれるすべてのウイルスを含む。
【００６７】
前記パラミクソウイルスは、パラミクソウイルス、ルブラウイルス、モルビリウイルス及びニューモウイルス属に含まれるすべてのウイルスを含む。
【００６８】
前記ウイルスは、核酸と、これを取り囲んでいるタンパク質を含む。このようなウイルスのタンパク質は、ウイルス遺伝物質を保護し、ウイルス粒子が細胞に吸着及び／又は融合するのに関与し、ウイルスの抗原性を決定し、ウイルスの形態を維持する構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と、タンパク質と核酸などを合成するのに関連するタンパク質である非構造タンパク質（ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。
【００６９】
本発明において使用した用語「ウイルスの表面タンパク質」は、前記構造タンパク質を意味する。具体的に、本発明の「表面タンパク質」は、ウイルスの特異抗原性を持って、ウイルスが細胞に吸着及び／又は融合するのに関与する糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよく、細胞への融合（ｆｕｓｉｏｎ）に関与する融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよい。
【００７０】
本発明の一例によれば、前記ウイルスの表面タンパク質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）、スパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）又はＦタンパク質（Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であってもよい。
【００７１】
本発明の一例によれば、本発明のウイルスは、宿主細胞の細胞膜に吸着し、膜融合を起こす表面タンパク質を含むものであることができる。具体的に、本発明のウイルスは、不活性型状態に存在する表面タンパク質が生体分子により活性型に変わると、宿主細胞の細胞膜と吸着及び／又は膜融合を起こす性質を有する表面タンパク質を含むものであることができる。
【００７２】
本発明の一例によれば、「ウイルス」は、インフルエンザウイルス又は高病原性インフルエンザウイルスであることができる。インフルエンザウイルスは、「ウイルスの表面タンパク質」として、糖タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）を含む。ヘマグルチニンは、一つのポリペプチド（前駆体ＨＡ０）で発現された後、タンパク質の加水分解によってＨＡＯの切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ）がＨＡ１及びＨＡ２に分けられると、酸性条件の下で疎水性アミノ酸残基で構成された融合ペプチド（ｆｕｓｉｏｎｐ  ｅｐｔｉｄｅ）が活性化される。ＨＡは、インフルエンザウイルスの病原性の程度によって切断部位のアミノ酸と融合ペプチドのアミノ酸の構成が異なる。
【００７３】
本発明の他の一例によれば、「ウイルス」は、コロナウイルスであることができる。コロナウイルスは、表面タンパク質としてスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含み、前記スパイクタンパク質は、Ｓ１とＳ２部位を含む。スパイクタンパク質のＳ１部位が宿主細胞に結合すると、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によってＳ１とＳ２に切断され、Ｓ２の終端部分にある疎水性部位が露出され、活性化される。
【００７４】
本発明のさらに他の一例によれば、「ウイルス」は、パラミクソウイルスであることができる。パラミクソウイルスは、表面タンパク質としてＨＮタンパク質（ＨＮ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。ＨＮタンパク質は、ウイルスを宿主細胞に付着又は吸着させる付着（又は吸着）タンパク質であって、ウイルス不活性状態では、前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）ＨＮ０として存在するが、加水分解によってＣ−末端でアミノ酸残基が除去されると、活性化される。また、パラミクソウイルスは、表面タンパク質としてＦタンパク質（Ｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。Ｆタンパク質は、ウイルス不活性状態で前駆体Ｆ０として存在するが、生体分子によりＦ１とＦ２に切断された後、新しいＮ−末端形態のＦ１として活性化される。前記Ｆタンパク質は、切断部位に多塩基性残基を有するものと、単一塩基性残基を有するものをすべて含む。好ましくは、多塩基性残基を有するＦタンパク質であることができる。
【００７５】
本発明において使用した用語「反応」は、或る物質が他の物質と接触し、状態、色、形状又は化学結合などの物理及び／又は化学的状態の変化が起こること、又はその現象を意味する。一具体例において、ウイルスの表面タンパク質が生体分子と反応する場合、ウイルスの表面タンパク質が変化し、融合ペプチドなどを形成するなどの活性化されたウイルスに状態変化が起こる。他の具体例において、活性化されたウイルスとプローブの反応は、融合反応又は凝集反応であることができる。前記融合反応は、一具体例において、活性型ウイルスと本発明のプローブの一部が結合される現象であることができる。融合反応は、融合によってプローブ内部の物質などが外部に排出される現象まで含むものと理解され得る。一例として、活性型ウイルスの表面タンパク質に存在する融合ペプチドがエンドソームの細胞膜を融合する原理を利用して、活性型ウイルスとプローブの融合可否を確認することによって、活性型ウイルスを検出できる。前記凝集反応は、溶液内で分子又は粒子などが互いにくっついて結合する現象を意味する。本発明の一具体例において、凝集反応は、検出対象であるウイルスによって本発明のプローブの安定性が低くなって、プローブ同士が互いに結合し、凝集及び／又は沈殿される現象を意味する。
【００７６】
本発明において使用した用語「生体分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、生物の構造、機能、情報伝達などに必要な分子を意味する。前記生体分子は、機能、情報伝達などを行うための特異的構造及び／又は部位を含むことができる。このような生体分子の特異的構造は、分子間の結合反応を通じて反応を起こす原動力である。生体分子は、アミノ酸とタンパク質、糖と炭水化物、脂肪酸と脂質、及びヌクレオチドと核酸などを含み、生体内で作われたもの及び／又は人為的に合成されたものをすべて含む。本発明の一例によれば、「生体分子」は、約６２個〜２５００個のアミノ酸残基よりなるタンパク質である酵素であることができる。
【００７７】
一つの具体例において、前記酵素は、タンパク質分解酵素であることができる。一例として、最初合成された形態では不活性化されているが、特定部位が除去（又は切断）されると、活性を示すタンパク質において、タンパク質分解酵素は、前記特定の部位を切断（ｃｌｅａｖｅ）し、不活性化タンパク質を活性化させる。タンパク質分解酵素は、特定の部位を切断すできるものであれば、種類に制限なしに使用できる。
【００７８】
一具体例において、タンパク質分解酵素は、フーリン（ｆｕｒｉｎ）、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ）、エンドプロテアーゼ（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）及びカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）よりなる群から選択された一つ以上であるこどができる。前記タンパク質分解酵素は、誘導体又は改質された形態をすべて含む。例えば、タンパク質分解酵素は、組換えヒトフーリン、組換えマウスフーリン、トリプシン−ＥＤＴＡ、アセチル化されたトリプシン、ＴＰＣＫ−トリプシン（Ｎ−ｔｏｓｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ−ｔｒｙｐｓｉｎ）、アクリリックトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ−ａｃｒｙｌｉｃ）、フーリン型プロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、Ｋｅｘ２プロテアーゼ（Ｋｅｘ２  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）、膜貫通セリンプロテアーゼ（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｓｅｒｉｎｅ）、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ４、トリプターゼクララ（Ｔｒｙｐｔａｓｅ  ｃｌａｒａ）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ）、セリン系プロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）、サブチリシン型エンドプロテアーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ  ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）、カルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ）及びこれらの組合を含むことができる。
【００７９】
一具体例において、トリプシンがインフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）と反応する場合、トリプシンの酵素分解作用は、Ｈｉｓ５７−Ａｓｐ１０２−Ｓｅｒ１９５位置で起こり、フーリンの酵素分解作用は、Ｈｉｓ１９４−Ａｓｐ１５３−Ｓｅｒ３６８位置で起こる。トリプシンは、高病原性及び低病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを全部分解できるため、トリプシンを利用して高／低病原性インフルエンザウイルスを検出できる。また、フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのみを分解できるため、フーリンを利用して高病原性インフルエンザウイルスを検出できる。
【００８０】
他の一具体例において、タンパク質分解酵素とコロナウイルスの表面タンパク質が反応する場合、加水分解酵素の作用は、Ｓ１とＳ２の部位の境界で起こる。したがって、前記加水分解酵素の作用によって切断後、Ｓ２の疎水性部位が露出されることによって、コロナウイルスが活性化され、本発明のプローブを利用して検出できる。
【００８１】
さらに他の具体例において、パラミクソウイルスの表面タンパク質と反応する生体分子は、Ｃ−末端（Ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｓｉｄｅ）のアルギニン残基で切断が可能なタンパク質分解酵素又はカルボキシペプチダーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ）であることができる。前記タンパク質分解酵素は、Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ配列を含むＦタンパク質を認識して切断し得る。具体的な例として、フーリン又はサブチリシン型エンドプロテアーゼ（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ）であることができる。
【００８２】
本発明において使用した用語「活性型ウイルス」又は「活性化されたウイルス」は、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子によりウイルスの表面タンパク質が活性化されたウイルスを意味する。ここで、ウイルスの表面タンパク質が活性化されたというのは、ウイルスの表面タンパク質が宿主細胞及び／又はプローブと反応、例えば特異的に反応し得る状態に変化したことを意味する。ここで、「ウイルスの活性化」は、不活性型ウイルスが前記活性型ウイルスに変換される過程を意味する。ウイルスが感染を起こすためには、ウイルスの活性化過程が必須に要求されるので、前記活性型ウイルスの存在有無を検出することによって、ウイルスによる感染可否を判別できる。
【００８３】
一つの具体例において、ウイルス表面タンパク質が活性化されたものというのは、ウイルスの表面タンパク質に存在する融合タンパク質又は融合ペプチドが宿主細胞の膜又は本発明のプローブの表面と融合反応を起こすことができる状態であることを意味する。
【００８４】
一つの具体例において、インフルエンザウイルスの場合、活性化されたウイルスとは、表面タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）が酵素により分解され、不活性形態からヘマグルチニンの内部に存在する融合ペプチドが露出した形態に変換されたことを意味する。
【００８５】
すなわち、前記ＨＡの切断部位を特異的に分解する酵素には、フーリン及び／又はトリプシンが含まれる。フーリンは、高病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのみを分解できるため、インフルエンザウイルスのＨＡがフーリンにより分解される場合、前記インフルエンザウイルスは、高病原性を示す。また、トリプシンは、高病原性及び低病原性インフルエンザウイルスのヘマグルチニンを全部分解できるため、トリプシンにより分解される場合には、高病原性又は低病原性を示す。低病原性インフルエンザウイルスの切断部位は、Ｃ−末端が−Ｒ−よりなり、高病原性インフルエンザウイルスの切断部位は、Ｒ／Ｋ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒよりなる。
【００８６】
ＨＡの切断部位を特異的に分解する酵素によってＨＡが活性化されると、ＨＡの再配列が起こり、ＨＡ内の融合ペプチドが外側に露出し、活性型ウイルスになる。このように、酸性条件の下で活性化されたインフルエンザウイルスが本発明の一例によるプローブに会うと、インフルエンザウイルスの融合ペプチドによってインフルエンザウイルスとプローブの反応が起こる。プローブの反応によって変わる信号を測定することによって、ウイルス感染可否を検出できる。
【００８７】
他の具体例において、コロナウイルスの場合、活性化されたウイルスというのは、表面タンパク質であるスパイクタンパク質（Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が生体分子により不活性形態からスパイクタンパク質の内部に存在した疎水性部位が露出した形態に変換されたことを意味する。具体的に、スパイクタンパク質のＳ１部分が宿主細胞と結合すると、タンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によりＳ１とＳ２に切断され、Ｓ２の終端部にある疎水性部位が露出し、ウイルスが活性化される。前記Ｓ２で露出した疎水性部位が宿主細胞の細胞膜内疎水性領域に付着され、他の一方は、ウイルス外膜と結合された状態でＳ２部位の中間が折れる構造変形（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅ）が起こり、膜融合が起こる。したがって、本発明のプローブと活性化されたコロナウイルスが会って反応すると、プローブの安定性に変化が起こり、多様な信号を発生し、前記変化を測定することによって、ウイルス感染可否を検出できる。
【００８８】
さらに他の具体例において、パラミクソウイルスで活性化されたウイルスというのは、ＨＮタンパク質が生体分子によりＣ−末端の残基が除去された状態を意味する。具体的に、ＨＮタンパク質は、不活性化状態（ＨＮ０）を維持しつつ、Ｃ−末端の約９０個の残基が除去されると、ＨＮタンパク質が活性化され、宿主細胞又は標的の膜にパラミクソウイルスが付着される。また、活性型パラミクソウイルスは、Ｆタンパク質が生体分子によりＦ１とＦ２に切断された状態を意味する。不活性型パラミクソウイルスにおいてＦタンパク質は、前駆体Ｆ０状態で、生体分子に会うと、Ｆ１とＦ２に切断され、宿主細胞の細胞膜と融合できる活性型ウイルスになる。すなわち、ＳＳ−結合鎖Ｆ１とＦ２を含有する活性表面タンパク質を形成し、広範囲な疎水性を示すＦ１のＮ−末端残基を宿主細胞の細胞膜又はターゲットの細胞膜に固定しながら膜融合が始まる。したがって、パラミクソウイルスは、本発明の生体分子が表面タンパク質と反応して活性化され、さらに活性化されたウイルスが本発明のプローブと反応し、プローブの変化を起こす。したがって、前記変化を測定することによって、ウイルスを検出できる。
【００８９】
本発明の一具体例において、キット又は組成物は、ｐＨ６以下の酸性物質をさらに含むことができる。例えば、ｐＨ６以下の酸性物質は、酸性溶液であることができ、前記ｐＨ範囲の酸性溶液をキットに含むこともでき、使用時、直接製造して使用することもできる。ｐＨ６以下の酸性溶液は、前記ｐＨ条件を満足する溶液であれば、制限なしに使用できる。市販される保存溶液を利用することもでき、直接製造して使用することもできる。例えば、濃い酸性溶液である保存溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をｐＨ６以下になるように水に希釈して使用できる。例えば、前記酸性溶液は、ｐＨ４〜６又はｐＨ５〜ｐＨ５．７であることができる。前記範囲が、宿主細胞内のｐＨ範囲と同様なので、検出効率を高めることができる。
【００９０】
一具体例において、本発明のキット及び組成物は、反応補助剤をさらに含むことができる。
【００９１】
前記反応補助剤は、生体分子とウイルスの反応を補助する生体分子の反応補助剤であることができ、又はプローブと標的分子の反応を補助する反応補助剤であることができる。具体的な一例として、タンパク質分解酵素と表面タンパク質の反応を補助する補助剤、又はプローブと活性型ウイルス活性化された表面タンパク質、活性型ウイルスの抗原性タンパク質を含む標的分子との反応を補助する補助剤であることができる。
【００９２】
本発明において使用した用語「補助剤」は、前記などの作用を通じてウイルスの検出敏感度及び／又は特異度を高めることができるものであれば、すべてを含む意味である。前記ウイルスの検出敏感度及び／又は特異度を高めるものの例として、反応の速度を速くするか、反応が起こる最小値を低める作用又は表面タンパク質と生体分子の反応外に、他の反応を抑制する作用があるが、前記メカニズムに制限されない。補助剤は、生体分子及びこれと反応する表面タンパク質の種類によって検出敏感度及び／又は特異度を高めることができるものであれば、種類に制限なしにすべてを含む。
【００９３】
前記補助剤は、ケトンであることができる。
【００９４】
前記ケトン化合物の例は、フェニルエチルクロロメチルケトン、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ、Ｔｏｓｙｌ  ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｋｅｔｏｎｅ）及びこれらの組合を含むが、これに制限されない。
【００９５】
本発明の一具体例において、インフルエンザウイルスの検出時、補助剤としてケトンをさらに含むことができる。この場合、他の酵素の活性を低め、ヘマグルチニン（ＨＡ）分解酵素、特にトリプシンの活性を高め、キットの敏感度をさらに高めることができる。
【００９６】
本発明は、ウイルス検出方法に関する。
【００９７】
本発明の検出方法は、試料を生体分子に接触させる段階と、前記生体分子に接触した試料をプローブに接触させる段階とを含む。具体的に、個体から収得した試料を、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子に接触させる段階と、前記生体分子に接触した試料を、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブに接触させる段階とを含む。前記プローブは、両親媒性高分子と結合された標識子を含む。
【００９８】
本発明の検出方法は、前記接触によって起こる反応の可否を確認することによって、ウイルスを検出できる。一例として、活性型ウイルスの表面タンパク質に存在する融合ペプチドがエンドソームの細胞膜を融合する原理を利用して、活性型ウイルスとプローブの融合反応可否を確認することによって、活性型ウイルスを検出できる。他の例として、活性型ウイルスの表面タンパク質に存在する融合ペプチドがプローブの安定性を低める原理を利用して、プローブの凝集反応可否を確認することによって、活性型ウイルスを検出できる。
【００９９】
本発明において反応の可否を確認する方法で、反応によるプローブの信号又は変化を測定できる。一例として、活性型ウイルスとプローブが反応する場合に現われる変化又は信号は、蛍光強度、発光強度、燐光強度、吸光強度、電気的信号、表面増強ラマン分光（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＲＳ）信号、ＦＥＴ（ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）、色及びプローブの分散度よりなる群から選択された一つ以上の変化であることができるが、これに制限されない。
【０１００】
例えば、プローブの反応可否を判別できる標識子として、自己消光された染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブとの反応が起こり、プローブの高分子に結合された自己消光された染料のような標識子が放出又はプローブの外部に露出される。標識子が露出又は放出されたプローブでは、脱消光作用によって蛍光が現われる。したがって、蛍光強度の変化を測定することによって、ウイルスの存在有無を検出できる。
【０１０１】
また、プローブの反応可否を判別できる標識子として蛍光染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブとの反応が起こると、プローブ粒子の高分子膜の崩壊によってプローブの高分子と結合された蛍光染料が膜外部に露出又はプローブの内部に担持された蛍光染料が高分子膜の外部に溶出されるので、この際の蛍光強度を測定することによって、ウイルスの感染可否を検出できる。発光強度、燐光強度、吸光強度も、蛍光強度と同様に、波長によって変わるため、これらを測定し、ウイルスの感染可否を検出できる。 特に、蛍光染料のうち、ルミノールやフラーレンなどは、特別な機器により蛍光強度を測定することなく、目視でも色の変化を感知できる。
【０１０２】
また、標識子として、蛍光染料及び消光剤の各々を一つのプローブに含む場合、活性型ウイルスとプローブの反応が起こると、高分子膜が崩壊されない場合、膜内部に消光剤と蛍光染料が一緒に存在しながら発光しないが、膜崩壊によって染料が露出又は溶出される場合、プローブの蛍光強度が変化するので、前記変化を測定し、ウイルスの存在有無を検出できる。
【０１０３】
蛍光染料以外にも、トリス（２、２’−ビピリジル）ルテニウム（ＩＩ）［Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋］）のような電気化学発光物質を含むことができ、この場合、目視で色の変化観察が可能である。
【０１０４】
また、ナノギャップセンサーを利用して電気的信号を測定することによって、ウイルスを検出できる。電気的信号は、電流変化を測定するか、又はＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ−ｅｆｆｅｃｔ  ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）を利用して測定することもできる。ナノギャップセンサーとは、ギャップの間隔が約１００ｎｍ以下の電極が含まれたセンサーを意味する。例えば、プローブの反応可否を判別できる標識子として蛍光染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブの融合が起こると、プローブ内部の蛍光染料が放出され、ナノギャップセンサーのナノギャップに位置する。この際、ナノギャップセンサーにあらかじめ位置させた金、銀、クロム、チタン、白金、銅、パラジウム、ＩＴＯ（ｉｎｄｉｕｍ  ｔｉｎ  ｏｘｉｄｅ）、又はアルミニウムなどの金属粒子の電流変化を測定することによっで、ウイルスの感染可否を検出できる。金属粒子の平均粒径は、数ナノメートルであることができ、例えば、２〜４ｎｍであることができる。
【０１０５】
また、表面増強ラマン分光信号を測定し、ウイルスを検出できる。表面増強ラマン分光信号を測定するために、試料と結合可能な基材を利用できる。基材は、ナノ粒子、コロイド、液状であることができるが、これに制限されない。例えば、プローブの融合可否を判別できる標識子として蛍光染料を利用する場合、活性型ウイルスによってプローブの融合が起こると、プローブ内部の蛍光染料が放出される。放出された蛍光染料を基材と結合させた後、前記基材と結合された蛍光染料にさらに金属粒子を導入する。金、銀などの金属粒子を導入することによって、ラマン分光を増幅させることができる。その後、ラマン分光器で前記蛍光染料のラマンスペクトルを測定することによって、ウイルスの感染可否を検出できる。
【０１０６】
他の例として、活性型ウイルスによってプローブの凝集が起こることによって、プローブの凝集可否、すなわち分散度の変化を確認することによって、ウイルスを検出できる。例えば、プローブとして有機・無機粒子を利用する場合、活性型ウイルスによって有機・無機粒子の安定性が低くなるにつれて、前記粒子の凝集が起こる。
【０１０７】
一具体例において、少なくとも一つ以上の段階は、ｐＨ６以下の条件の下で行われることができる。例えば、ｐＨ４〜ｐＨ６、ｐＨ５〜ｐＨ５．５の酸性条件の下で行われることができる。本発明の一具体例において、インフルエンザウイルスを検出する場合、酸性条件で行うことが、宿主細胞内環境と非常に類似の条件を提供でき、検出正確度を高めることができる利点がある。
【０１０８】
要約するに、ｐＨ６以下、ｐＨ４〜ｐＨ６、又はｐＨ５〜ｐＨ５．５の下で、フーリン及び／又はトリプシンが存在するウェルに個体から収得した試料を入れ、前記試料内に存在するインフルエンザウイルスを活性化した後、本発明の一例によるプローブを処理する。インフルエンザウイルスが存在する場合、融合ペプチドによって活性型インフルエンザウイルスとプローブの反応が起こり、反応可否によって変わる信号を測定することによって、インフルエンザウイルスの存在有無が分かる。前記で記述したように、活性型インフルエンザウイルスとプローブの反応は、融合又は凝集であることができる。前記活性型インフルエンザウイルスとプローブの反応及びこれによって変わる信号について、前述した通りである。
【０１０９】
本発明において使用した用語「試料」は、ウイルスの検出のために母体を代表するように採取されたものを意味する。一具体例において、試料は、唾液、口腔粘膜又は糞尿試料であることができる。
【０１１０】
本発明は、また、ウイルスの表面タンパク質と特異的に反応する生体分子と、前記生体分子により活性化されたウイルスと反応するプローブとを含むウイルス検出用組成物に関する。前記でウイルス検出キット及びウイルス検出方法について記述したすべての内容がウイルス検出用組成物にも適用又は準用され得る。
【０１１１】
本発明は、また、両親媒性高分子と標識子を結合させる段階を含むウイルス検出用プローブ又は検出用キットの製造方法に関する。
【０１１２】
一具体例において、両親媒性高分子と第１標識子を結合させる段階と、前記両親媒性高分子と結合された標識子で膜構造の粒子を形成する段階とを含む。
【０１１３】
他の具体例において、前記粒子形成段階前に、第１標識子が結合された両親媒性高分子及び第２標識子を溶媒に分散させる段階をさらに含むことができる。前記第２標識子が一緒に分散された溶液から膜構造の粒子を形成すると、第２標識子が担持されたプローブを製造し得る。
【０１１４】
さらに他の一具体例において、両親媒性高分子と第１標識子を結合させる段階と、両親媒性高分子と第２標識子を結合させる段階と、前記第１標識子が結合された両親媒性高分子及び第２標識子が結合された両親媒性高分子を溶媒に分散させて、膜構造の粒子を形成する段階とを含むことができる。
【０１１５】
前記膜構造の粒子を形成する段階は、本発明の属する分野において通常的に使用されるコロイド、リポソーム、ミセル又はポリマーソームを形成する方法によって行うことができ、一例として、親水性領域と疎水性領域を含む両親媒性ブロック共重合体を水溶液に分散させた後、超音波を加える方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、過量の水で有機溶媒を抽出又は蒸発させる方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、過量の水で透析する方法、有機溶媒に分散又は溶解させた後、均質器又は高圧乳化器を利用して強く溶媒を蒸発させる方法、又は薄膜水和法（Ｔｈｉｎ  ｆｉｌｍ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）などを使用して膜構造の粒子を製造し得る。
【０１１６】
前記膜構造の粒子を形成する段階で、標識子が結合されない両親媒性高分子と標識子が結合された両親媒性高分子は、高分子の比率が１：１〜１０の重量比の範囲で混合して使用され得る。
【０１１７】
本発明の製造方法によるプローブは、膜を形成し、カプセルの役目又は担体の役目をする高分子と標識子が直接結合されているので、検出過程で初期に標識子が放出されることを制御でき、標識子の放出が制御されるので、製造段階で透析段階を進行しなくてもよいため、ウイルス検出用キットの製造効率に優れているという長所がある。
【０１１８】
前記でウイルス検出キット及びウイルス検出方法について記述したすべての内容がウイルス検出用プローブ製造方法にも適用又は準用され得る。
【０１１９】
以下、本発明を実施例を通じて詳しく説明する。下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【０１２０】
［実施例］
【０１２１】
［製造例１］親水性高分子−疎水性高分子−蛍光染料が結合された高分子を含む粒子内部に消光剤を担持したプローブの製造
【０１２２】
両親媒性共重合体を利用して、標識子で蛍光染料を結合させ、その内部に消光剤を担持しているミセル（Ｍｉｃｅｌｌｅ）又はポリマーソーム（Ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）形態のプローブを製造した。ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、Ｌａｙｓａｎ  ｂｉｏ、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステルは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＨＱ３−ＮＨＳエステルは、ｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びジメチルスルホキシドは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈで購入して使用した。
【０１２３】
具体的に、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕ１０ｍｇにＣｙ５．５−ＮＨＳエステル２．５ｍｇ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド８．９ｍｇをジメチルスルホキシド２ｍＬにとかした後、１２時間常温で反応させた。反応済みの溶液を冷たいエチルエーテル４ｍＬで沈殿させ、遠心分離し、上澄み液を除去した。凍結乾燥後、親水性高分子−疎水性高分子−蛍光染料結合体を得た。
【０１２４】
ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕとｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕ−蛍光染料結合体を高分子１：１比率で１０ｍｇを用意し、ＢＨＱ３−ＮＨＳエステル０．０４ｍｇと混合し、透析し、粒子を形成する方法で、プローブを製造した。透析段階後、洗浄段階は省略した。
【０１２５】
製造されたプローブの形状をＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）イメージで確認して図２に示し、製造されたプローブ粒子のサイズをＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法を利用して測定し、平均直径を図５に示した。
【０１２６】
図２及び図５に示されたように、不完全球形又は楕円形の形態を有し、平均直径は、６２．５±３．６ｎｍであるプローブが製造されたことを確認することができた。
【０１２７】
また、前記プローブのうちポリマーソーム形態のプローブは、分子量が６５００ｇ／ｍｏｌであり、ミセル形態のプローブは、分子量が３３００ｇ／ｍｏｌであった。
【０１２８】
［製造例２］親水性高分子−疎水性高分子−消光剤が結合された高分子を含む粒子内部に蛍光染料を担持したプローブの製造
【０１２９】
両親媒性高分子に消光剤を結合させ、蛍光染料を担持させたこと以外に、製造例１と同一の方法でプローブを製造した。
【０１３０】
ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、Ｌａｙｓａｎ  ｂｉｏ、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステルは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＨＱ３−ＮＨＳエステルは、ｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びジメチルスルホキシドは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈで購入して使用した。
【０１３１】
具体的に、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕ１０ｍｇ、ＢＨＱ３−ＮＨＳエステル１．８ｍｇ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド８．９ｍｇをジメチルスルホキシド２ｍＬにとかした後、１２時間常温で反応させた。反応済みの溶液を冷たいエチルエーテル４ｍＬで沈殿させ、遠心分離し、上澄み液を除去した。凍結乾燥後、親水性高分子−疎水性高分子−消光剤結合体を得た。
【０１３２】
ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕとｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕ−消光剤結合体を高分子基準で１：１比率で１０ｍｇ用意し、ｃｙ５．５−ＮＨＳエステル０．０４ｍｇと混合し、透析し、粒子を形成する方法で、プローブを製造した。
【０１３３】
製造されたプローブの形状をＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）イメージで確認して図３に示し、製造されたプローブ粒子のサイズをＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法を利用して測定し、平均直径を図５に示した。
【０１３４】
図３及び図５に示されたように、不完全球形又は楕円形の形態を有し、平均直径は、４８．４±４．５ｎｍであるプローブが製造されたことを確認することができた。
【０１３５】
［製造例３］親水性高分子−疎水性高分子−消光剤が結合された高分子及び親水性高分子−疎水性高分子−蛍光染料が結合された高分子を含むプローブの製造
【０１３６】
蛍光染料が結合された高分子及び消光剤が結合された高分子を利用してプローブを製造したこと以外に、製造例１と同一の方法でプローブを製造した。
【０１３７】
ｍＰＥＧ−ＮＨ２は、Ｌａｙｓａｎ  ｂｉｏ、Ｃｙ５．５−ＮＨＳエステルは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＨＱ３−ＮＨＳエステルは、ｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及びジメチルスルホキシドは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈで購入して使用した。
【０１３８】
具体的に、ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕ１０ｍｇにＣｙ５．５−ＮＨＳエステル２．５ｍｇ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド８．９ｍｇをジメチルスルホキシド２ｍＬにとかした後、１２時間常温で反応させた。反応済みの溶液を冷たいエチルエーテル４ｍＬで沈殿させ、遠心分離し、上澄み液を除去した。凍結乾燥後、親水性高分子−疎水性高分子−蛍光染料結合体を得た。
【０１３９】
ｍＰＥＧ−ｂ−ＰＬｅｕ１０ｍｇにＢＨＱ３−ＮＨＳエステル１．８ｍｇ及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド８．９ｍｇをジメチルスルホキシド２ｍＬにとかした後、１２時間常温で反応させた。反応済みの溶液を冷たいエチルエーテル４ｍＬで沈殿させ、遠心分離し、上澄み液を除去した。凍結乾燥後、親水性高分子−疎水性高分子−消光剤結合体を得た。
【０１４０】
前記それぞれ得られた結合体を高分子を基準で１：１比率で１０ｍｇを用意し、透析し、両親媒性粒子プローブを製造した。
【０１４１】
製造されたプローブの形状をＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）イメージで確認して図４に示し、製造されたプローブ粒子のサイズをＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）法を利用して測定し、平均直径を図５に示した。
【０１４２】
図４及び図５に示されたように、不完全球形又は楕円形の形態を有し、平均直径は、５２．７±２．２ｎｍであるプローブが製造されたことを確認することができた。
【０１４３】
［実験例１］プローブのウイルス検出効果確認
【０１４４】
製造例１の方法によって製造されたプローブによるウイルス検出効果を確認した。
【０１４５】
具体的に、検出対象ウイルスとしては、３つのタイプの高病原性インフルエンザウイルスとして、Ｈ５Ｎ１＿０１、Ｈ５Ｎ１＿０２及びＨ５Ｎ６、１１個のタイプの低病原性インフルエンザウイルスとして、Ｈ１Ｎ１＿０１、Ｈ１Ｎ１＿０２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ４、Ｈ３Ｎ８、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ７Ｎ９、Ｈ７Ｎ７、Ｈ９Ｎ２＿０１及びＨ９Ｎ２＿０２に対して実験を行った。ウイルスと反応する生体分子として、インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニンを特異的に分解できるフーリン（ｆｕｒｉｎ）とトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）を利用した。低病原性インフルエンザウイルスは、緑十字社の医薬品から、高病原性ウイルスは、Ｈａｎｏｉ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅから提供されて使用した。ｐＨ条件は、酸性保存溶液（ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を利用して適正ｐＨに合わせて実施した。
【０１４６】
９６−ウェルプレートにおいて一つのウェルに各処理群に適当な酵素を入れ、酵素が担持されたウェルに検出対象ウイルスを入れて接触させた。次に、本発明のプローブを入れて接触させた後、前記プローブの蛍光強度の変化を測定した（Ｅｘ：６７５ｎｍ、Ｅｍ：６９４ｎｍ）。
【０１４７】
インフルエンザウイルス総１４種に対して、検出環境（ウェルのｐＨ条件）をｐＨ５．５及びｐＨ７．４に区分し、各ｐＨ条件によって（１）フーリン単独処理群、（２）トリプシン単独処理群、（３）フーリン及びトリプシン処理群に分けて実験を行った。その結果を下記表１に示した。
【０１４８】
【表１】
0006494794.tif 000002
【０１４９】
表１に示されたように、酵素未処理群、非酸性条件実験群では、プロープの蛍光変化が観察されなかった。しかし、高病原性インフルエンザウイルス実験群において酸性条件が満足された場合、プローブとトリプシンを一緒に処理した場合、高病原性及び低病原性インフルエンザ実験群の両方において蛍光変化が確認され、フーリンを処理した場合には、高病原性インフルエンザ実験群だけにおいて蛍光変化が確認された。トリプシンを通じて高病原性及び低病原性インフルエンザを共に検出でき、フーリンを利用する場合、高病原性インフルエンザを検出できることが分かる。
【０１５０】
［実験例２］プローブのウイルス検出効果確認
【０１５１】
製造例２の方法によって製造されたプローブによるウイルス検出効果を確認した。
【０１５２】
具体的な実験方法は、製造例１のプローブの代わりに、製造例２のプローブを使用したこと以外には、前記実験例１と同一の条件で実験を実施した。蛍光強度の測定結果を下記表２に示した。
【０１５３】
【表２】
0006494794.tif 000003
【０１５４】
表２に示されたように、フーリンを処理した場合、酵素未処理群、非酸性条件実験群では、プローブの蛍光変化が観察されなかった。しかし、高病原性インフルエンザウイルス実験群において酸性条件が満足された場合、プローブとトリプシンを一緒に処理した場合、高病原性及び低病原性インフルエンザ実験群の両方で蛍光変化が確認され、フーリンを処理した場合には、高病原性インフルエンザ実験群だけにおいて蛍光変化が確認された。トリプシンを通じて高病原性及び低病原性インフルエンザを共に検出でき、フーリンを利用する場合、高病原性インフルエンザを検出できることが分かる。
【０１５５】
［実験例３］プローブのウイルス検出効果確認
【０１５６】
製造例３の方法によって製造されたプローブによるウイルス検出効果を確認した。
【０１５７】
具体的な実験方法は、製造例１のプローブの代わりに、製造例３のプローブを使用したこと以外には、前記実験例１と同一の条件で実験を実施した。蛍光強度の測定結果を下記表３に示した。
【０１５８】
【表３】
0006494794.tif 000004
【０１５９】
表３に示されたように、フーリンを処理した場合、酵素未処理群、非酸性条件実験群では、プローブの蛍光変化が観察されなかった。しかし、高病原性インフルエンザウイルス実験群において酸性条件が満足された場合、プローブとトリプシンを一緒に処理した場合、高病原性及び低病原性インフルエンザ実験群の両方において蛍光変化が確認され、フーリンを処理した場合には、高病原性インフルエンザ実験群だけにおいて蛍光変化が確認された。トリプシンを通じて高病原性及び低病原性インフルエンザを共に検出でき、フーリンを利用する場合、高病原性インフルエンザを検出できることが分かる。
【図１】
0006494794.tif 000005
【図２】
0006494794.tif 000006
【図３】
0006494794.tif 000007
【図４】
0006494794.tif 000008
【図５】
0006494794.tif 000009