(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株であって、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含み、前記組換えポリオウイルス株のゲノムは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株のゲノム（配列番号１）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１６３（ＡからＧ）、５９７（ＣからＵ）、および６０９（ＧからＡ）、ならびに非構造タンパク質の３４８６（ＧからＡ）、３８５２（ＡからＵ）、４１２０（ＵからＣ）、４４２８（ＡからＧ）、４５６３（ＡからＵ）、５４３６（ＧからＡ）、６２１０（ＡからＧ）、６８４８（ＧからＡ）、および７１０２（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項２】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化１型ポリオウイルス株であって、そのゲノムは、Ｍａｈｏｎｅｙ株（配列番号６）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３１（ＡからＧ）、１４０（ＵからＣ）、１６１（ＡからＧ）、５９３（ＣからＵ）、および６０５（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８２（ＧからＡ）、３８４８（ＡからＵ）、４１１６（ＵからＣ）、４４２４（ＡからＧ）、４５５９（ＡからＵ）、５４３２（ＧからＡ）、６２０６（ＡからＧ）、６８４４（ＧからＡ）および７０９８（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項３】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化２型ポリオウイルス株であって、そのゲノムは、ＭＥＦ−１株（配列番号５）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３４（ＡからＧ）、１４３（ＵからＣ）、１６４（ＡからＧ）、５９８（ＣからＵ）、および６１０（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３８４７（ＡからＵ）、４１１５（ＵからＣ）、４４２３（ＡからＧ）、４５５８（ＡからＵ）、５４３１（ＧからＡ）、６２０５（ＡからＧ）、６８４３（ＧからＡ）および７０９７（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項４】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化３型ポリオウイルス株であって、そのゲノムは、Ｓａｕｋｅｔｔ株（配列番号７）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１６３（ＡからＧ）、５９６（ＣからＵ）、および６０８（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３８３９（ＡからＵ）、４１０７（ＵからＣ）、４４１５（ＡからＧ）、４５５０（ＡからＵ）、５４２３（ＧからＡ）、６１９７（ＡからＧ）、６８３５（ＧからＡ）および７０８９（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項５】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化１型ポリオウイルス株であって、そのゲノムは、Ｓａｂｉｎ１株（配列番号９）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３１（ＡからＧ）、１４０（ＵからＣ）、１６１（ＡからＧ）、５９３（ＣからＵ）、および６０５（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８２（ＧからＡ）、３８４８（ＡからＵ）、４４２４（ＡからＧ）、４５５９（ＡからＵ）、５４３２（ＧからＡ）、６２０６（ＡからＧ）、６８４４（ＧからＡ）および７０９８（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項６】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化２型ポリオウイルス株であって、そのゲノムは、Ｓａｂｉｎ２株（配列番号１０）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３１（ＡからＧ）、１４０（ＵからＣ）、１６１（ＡからＧ）、５９４（ＣからＵ）、および６０６（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８１（ＧからＡ）、３８４７（ＡからＵ）、４１１５（ＵからＣ）、４４２３（ＡからＧ）、４５５８（ＡからＵ）、５４３１（ＧからＡ）、６２０５（ＡからＧ）、６８４３（ＧからＡ）および７０９７（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項７】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化３型ポリオウイルス株であって、そのゲノムは、Ｓａｂｉｎ３株（配列番号８）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、５９６（ＣからＵ）、および６０８（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３８３９（ＡからＵ）、４１０７（ＵからＣ）、４４１５（ＡからＧ）、４５５０（ＡからＵ）、５４２３（ＧからＡ）、６１９７（ＡからＧ）、６８３５（ＧからＡ）および７０８９（ＵからＣ）を含む組換えポリオウイルス株。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリオウイルス株を含む組成物。
【請求項９】
第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株を含む組成物であって、前記第１、第２および第３の各組換えポリオウイルス株は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリオウイルス株から選択され、前記第１の組換えポリオウイルス株はＭａｈｏｎｅｙ株のカプシドを含み、前記第２の組換えポリオウイルス株はＭＥＦ−１株のカプシドを含み、かつ前記第３の組換えポリオウイルス株はＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物を含む不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）組成物であって、前記組成物中の前記ポリオウイルスが不活化されている組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＩＰＶ  組成物を含み、さらにジフテリア、破傷風、百日咳、ヘモフィルスインフルエンザ菌（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（Ｈｉｂ）、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の１種以上の抗原を含む混合ワクチン組成物。
【請求項１３】
急性灰白髄炎のワクチン接種のための、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリオウイルス株のゲノムまたはゲノムの相補体をコードする配列を含む組換え核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリオウイルスを含む製剤の製造方法であって、ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリオウイルス株を細胞培養中の細胞に感染させる工程と、
ｂ）前記細胞培養中の前記細胞を培養して前記ポリオウイルスを増殖させる工程と
ｃ）前記細胞または前記細胞培養から前記ポリオウイルスを単離して、前記ポリオウイルスを含む製剤を得る工程と
を含む方法。
【請求項１６】
前記ポリオウイルスを不活化する工程をさらに含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＰＶを調製する方法であって、請求項１６に記載の方法、および医薬組成物に前記不活化ポリオウイルスを配合する工程を含む方法。
【請求項１８】
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株を得る方法であって、野生型ポリオウイルスゲノムに、ゲノムが以下の位置における以下のヌクレオチド：
Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）に関して、５’ＵＴＲの１３３位におけるＧ、１４２位におけるＣ、１６３位におけるＧ、５９７位におけるＵ、および６０９位におけるＡ、ならびに非構造タンパク質の３４８６位におけるＡ、３８５２位におけるＵ、４１２０位におけるＣ、４４２８位におけるＧ、４５６３位におけるＵ、５４３６位におけるＡ、６２１０位におけるＧ、６８４８位におけるＡ、および７１０２位におけるＣ、または他のポリオウイルス株の対応する位置における上記ヌクレオチド
の少なくとも１０、１１、１２、１３または１４を含むように、変異を導入すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの弱毒化の分野、およびワクチンとして使用するための新規の弱毒化ポリオウイルス株の開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリオウイルス（ＰＶ）はピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のエンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）属に属する。これらの小さなＲＮＡウイルスは一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有しエンベロープを有さない。それらは３つの血清型ＰＶ１、ＰＶ２およびＰＶ３にさらに分類される。ＰＶの感染は、通常、無症候であるが、症例の１〜２％は、運導ニューロンがウイルスによって破壊されることによる麻痺、一般に四肢の麻痺を引き起こす、急性弛緩性麻痺（ＡＦＰ）と呼ばれる麻痺性灰白髄炎を伴う。これらのＡＦＰ症例のうち５〜１０％は、ウイルスが脳幹領域に広がって呼吸停止から最終的に死をもたらすため、致死的である。（ＰＶおよび発症機序については、例えば、（Ｍｉｎｏｒ  １９９９，Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ  ２００６，Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ２０１０）を参照されたい。
【０００３】
今日、急性灰白髄炎は、世界でその症例が２０１３年および２０１４年でそれぞれ僅かに４０６例および３５９例と、今にも根絶しようとしている。入手可能なワクチンには２種類、すなわち不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）（Ｓａｌｋ  １９５３）と経口生ポリオワクチン（ＯＰＶ）（Ｓａｂｉｎ  １９５６）があり、それらがこのＰＶに対する成功裏の戦いを可能にした。ＩＰＶは、ホルマリンにより不活化（死滅）した３種類の各血清型の野生（神経毒性）ＰＶ株（典型的にはＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ（それぞれ、ＰＶ１、ＰＶ２およびＰＶ３））からなる。ＯＰＶは、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２およびＳａｂｉｎ３と呼ばれる３種類の生弱毒化株からなる。これらのＳａｂｉｎ株は、３種類の細胞培養で得た親野生型ウイルスや生物体全体をも継代培養してそれらの株を生成したＡｌｂｅｒｔ  Ｓａｂｉｎにちなんで名付けられた（Ｓａｂｉｎ  １９７３）。ＯＰＶは投与が容易でかつ安価であることから（Ｊｏｈｎ  ２００９）１９８８年の撲滅プログラムのために選択するワクチンとして、世界保健機構（ＷＨＯ）およびＧｌｏｂａｌ  Ｐｏｌｉｏ  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＧＰＥＩ）により歓迎された、（ＷＨＯ  １９８８）。しかしながら、ＯＰＶワクチン株は弱毒化した表現型が毒性および伝染性を有するポリオウイルスに転換することを示すため、その使用は根絶および終盤の戦略とは相入れない（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９６４）。このようなワクチン関連ポリオ麻痺（ＶＡＰＰ）の症例は、５００，０００のワクチン当たり１症例という頻度で起きている（Ｊｏｈｎ  ２００４）。さらに、変異したワクチンウイルスが感染しやすい個体群の中で伝染性を持つと、ワクチン由来ポリオウイルスの伝播（ｃＶＤＰＶ）が起こる。今日、ＯＰＶはＶＡＰＰやｃＶＤＰＶ現象によって急性灰白髄炎の潜在的な発症源であると認識されており、急性灰白髄炎を完全に根絶するためには、ＯＰＶの使用を除こうとする要求が生まれている。実際、この１０年間、規制当局は、急性灰白髄炎根絶のためにはＯＰＶの使用を止めなければならないと認めている（ＷＨＯ  ２００５）。ＩＰＶでは、ワクチン免疫原はホルマリンによって不活化されており、したがって、このワクチンを使用してもＶＡＰＰやｃＶＤＰＶは認められていない。しかしながら、２０倍にもなるこのワクチンのコストは、低および中所得国での使用を好ましくないものにしている（Ｈｅｉｎｓｂｒｏｅｋ  ａｎｄ  Ｒｕｉｔｅｎｂｅｒｇ  ２０１０，Ｚｅｈｒｕｎｇ  ２０１０）。そのため、ＷＨＯとその多くの協力者はＩＰＶをより安全に、かつより経済的にする戦略を展開するため、多くのプロジェクトを開始した（Ｚｅｈｒｕｎｇ  ２０１０，Ｈａｗｋｅｎ  ａｎｄ  Ｔｒｏｙ  ２０１２，Ｒｅｓｉｋ，Ｔｅｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０００４】
ＩＰＶは、実際、ＶＡＰＰおよびｃＶＤＰＶに関してはＯＰＶに代わるより安全なものであるが、ワクチンを作る野生型ウイルスは、これらのウイルスが万一製造施設から偶発的に漏出した場合に、根絶後の時代の世界の人々に脅威を引き起こすであろう。さらに、根絶の際、野生型のポリオウイルスは厳しい生物学的封じ込め規制を受けるであろう。それはこの既に高価なワクチン製品の価格をさらに上昇させるおそれがある（ＷＨＯ  ２００６，Ｖｅｒｄｉｊｋ，Ｒｏｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。実際、ＷＨＯは世界中の研究施設から野生型のＰＶ株を破壊するよう既に要求している。おそらく、根絶が近付くにつれ、これらの行動をより強く強制するようになるであろう（ＷＨＯ  ２００９）。弱毒化株に基づくＩＰＶワクチンの開発が、より安全なワクチンを製造するための方法であり、産業事故が起きた場合の潜在的な病気の発生リスクを軽減する。そのため、弱毒化株に基づくＩＰＶワクチンを製造することが、根絶後の時代の安全で経済的なＩＰＶの製造戦略として提案されている。新規のＩＰＶワクチンのベースとして多くの弱毒化株が提示されているが、それらの研究の殆どはＳａｂｉｎ株からＩＰＶを作ろうとするものであった（Ｖｅｒｄｉｊｋ，Ｒｏｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。最近、ＳａｂｉｎベースのＩＰＶの単独ワクチンとしての第ＩＩ相臨床試験が行われてよい結果が出（Ｌｉａｏ，Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、また、ジフテリア、破傷風および非細胞性百日咳（ＤＴａＰ）と組み合わせた第ＩＩおよび第ＩＩＩ相の臨床試験が行われた（Ｏｋａｄａ，Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。さらに、日本において、最近、ＳａｂｉｎベースのＩＰＶがＤＴａＰと組み合わせてライセンスされた（Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｐｅｌｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。しかしながら、これらのＳａｂｉｎウイルスのカプシドは、従来のＩＰＶ野生型ウイルスと大きく異なっており、ホルマリンによる不活化により、Ｓａｂｉｎウイルスは、ＰＶ感染に対する中和抗体の産生（および、したがって防止）に要求されるものとは異なる抗原特性を示す。実際、ＳａｂｉｎＩＰＶの免疫応答は、従来のＩＰＶに対して産生されたものと比べると変化しており、したがって、異なったワクチン投与が必要となることが観察されている（Ｗｅｓｔｄｉｊｋ，Ｂｒｕｇｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【０００５】
合理的に改変された弱毒化ＰＶ株も存在するが、ＩＰＶワクチン株のような潜在力は今のところまだ十分には検証されていない。一連のそのような候補弱毒化株は、新規のＯＰＶ開発や、新規のＩＰＶのベースとして使用するためのＳａｂｉｎ株と比べて、優れた生ワクチン株のような遺伝子的に安定なＳａｂｉｎ株に基づいている（例えば、Ｍａｃａｄａｍ  ｅｔａｌ，２００６；国際公開第２００８／０１７８７０号パンフレット；国際公開２０１２／０９００００号パンフレット）。これらの株は、生理的温度で増殖できるが、この温度では感染力が大きく低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
根絶後の時代のために、神経毒性のある形態に戻らず、かつ野生株に基づく従来のＩＰＶと類似した免疫応答を誘発する、安全な弱毒化ポリオウイルス株に基づくＩＰＶを開発するニーズが依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、組換え弱毒化ポリオウイルス株を開発する新規の方法、およびＩＰＶのベースとして使用することができる新規の組換え弱毒化ポリオウイルス株を産生する方法を提供する。現在のＩＰＶワクチンに使用されている野生株のカプシドを含むように弱毒化バックボーンを再生成し、ウイルスの産生およびワクチンを製造するために増殖中、弱毒化表現型を維持しながら、不活化後、野生型の抗原プロファイルをもたらすことができる。組換え弱毒化ポリオウイルスは、その産生条件下では遺伝子的に安定である。さらに、３７℃では複製することができないため、万一、製造施設から（非）意図的に漏れ出て誤って摂取することがあっても神経毒性のある形態に変化する可能性は極めて低い。本発明の組換え弱毒化ポリオウイルス株は、ＩＰＶワクチンとして使用するためにホルマリンで不活化することができる。
【０００８】
本発明は、それぞれ本明細書に添付した独立請求項および従属請求項に定義された一般的実施形態および好ましい実施形態に関し、簡略化のため、それらは本明細書に参照により組み込まれる。本発明の様々な態様の他の好ましい実施形態、特徴および利点は、下の詳細な説明と添付の図面とから明らかになるであろう。
【０００９】
一実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株であって、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組換えポリオウイルス株を提供する。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化１型ポリオウイルス株を提供する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化２型ポリオウイルス株を提供する。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化３型ポリオウイルス株を提供する。
【００１３】
他の実施形態において、本発明は、ポリオウイルス株および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物であって、ポリオウイルス株が、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化ポリオウイルス株で、任意選択により、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含むことができるポリオウイルス株である組成物を提供する。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株を含む組成物であって、第１、第２および第３の各組換えポリオウイルス株は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができず、かつ第１、第２および第３の各組換えポリオウイルス株は、それぞれＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組成物を提供する。
【００１５】
他の実施形態において、本発明は、第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株を含み、さらに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物であって、第１、第２および第３の各組換えポリオウイルス株は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができず、かつそれぞれＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組成物を提供する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、ＩＰＶ組成物であって、その組成物中のポリオウイルスは不活化されており、不活化される前、ポリオウイルスは、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株であり、かつ第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株はそれぞれＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組成物を提供する。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、ＩＰＶ組成物であって、そのＩＰＶ組成物は不活化された第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株を含み、不活化される前、第１、第２および第３の各組換えポリオウイルス株は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができず、かつ第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株はそれぞれＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組成物を提供する。
【００１８】
他の実施形態において、本発明は、上記ＩＰＶ組成物と、ジフテリア、破傷風、百日咳、ヘモフィルスインフルエンザ菌（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（Ｈｉｂ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの他の病原体由来の１種以上の抗原を含む混合ワクチン組成物を提供する。
【００１９】
他の実施形態において、本発明は、ポリオウイルス感染および／または急性灰白髄炎のワクチン接種方法であって、患者に、上記ＩＰＶ組成物または上記のようなＩＰＶを含む混合ワクチン組成物を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
他の実施形態において、本発明は、ポリオウイルスのゲノム、またはポリオウイルスのゲノムの相補体をコードする配列を含む核酸分子であって、ポリオウイルスが、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化ポリオウイルスであり、かつ温度感受性の組換え弱毒化ポリオウイルスが、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む核酸分子を提供する。 
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化ポリオウイルスであり、かつ任意選択により、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含むことができるポリオウイルスを含む製剤の調製方法であって、
ａ）細胞培養中の細胞にポリオウイルスを感染させる工程と、
ｂ）細胞培養中の細胞を（ポリオウイルスを複製可能な温度、例えば、約２０℃〜３３℃で）培養してポリオウイルスを増殖させる工程と、
ｃ）細胞または細胞培養からポリオウイルス株を単離して、ポリオウイルスを含む調製物を得る工程と
を含む方法を提供する。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、不活化ポリオウイルスを含み、不活化される前、ポリオウイルスは、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない温度感受性の組換え弱毒化ポリオウイルス株であり、かつ任意選択によりポリオウイルスは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株から選択されるカプシドを含む製剤を調製する方法であって、
ａ）細胞培養中の細胞にポリオウイルスを感染させる工程と、
ｂ）細胞培養中の細胞を（ポリオウイルスを複製可能な温度、例えば、約２０℃〜３３℃で）培養してポリオウイルスを増殖させる工程と、
ｃ）細胞または細胞培養からポリオウイルス株を単離して、ポリオウイルスを含む調製物を得る工程と、
ｄ）ポリオウイルスを不活化する工程と
を含む方法を提供する。
【００２３】
他の実施形態において、本発明は、医薬組成物として適した製剤中に不活化ポリオウイルスを含み、不活化される前、ポリオウイルスは、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない温度感受性の組換え弱毒化ポリオウイルス株であり、かつ任意選択によりポリオウイルスは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株から選択されるカプシドを含むＩＰＶを調製する方法であって、
ａ）細胞培養中の細胞にポリオウイルスを感染させる工程と、
ｂ）細胞培養中の細胞を（ポリオウイルスを複製可能な温度、例えば、約２０℃〜約３３℃で）培養してポリオウイルスを増殖させる工程と、
ｃ）細胞または細胞培養からポリオウイルス株を単離して、ポリオウイルスを含む調製物を得る工程と、
ｄ）ポリオウイルスを不活化する工程と、
ｅ）医薬組成物に不活化ポリオウイルスを配合する工程と
を含む方法を提供する。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株を得る方法であって、
ａ）親（または出発）ポリオウイルス株に対し≦３０℃で、３７℃で増殖障害を示すウイルスを生産するのに十分な継代（例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０または３５代）を行う工程と、
ｂ）３７℃で増殖障害を示すウイルス集団から２つ以上の異なる温度感受性クローンを単離する工程と、
ｃ）温度感受性クローンのゲノムの配列を解析する工程と、
ｄ）温度感受性クローンの配列と親ポリオウイルス株の配列とを比較して、温度感受性クローンのゲノムの配列における変異を同定する工程と、
ｅ）２つ以上の異なる温度感受性クローンの変異をポリオウイルス株（例えば、親または他のポリオウイルス株）のゲノムに導入して組換え弱毒化ポリオウイルス株を合成する工程と、
ｆ）３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株をレスキューする工程と
を含む方法を提供する。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができず、かつ任意選択により、異なるポリオウイルス株から選択されるカプシドを含むことができる組換え弱毒化ポリオウイルス株を得る方法であって、
ａ）親ポリオウイルス株に対し≦３０℃で、３７℃で増殖障害を示すウイルスを得るのに十分な数の継体を行う工程と、
ｂ）３７℃で増殖障害を示すウイルス集団から２つ以上の温度感受性クローンを単離する工程と、
ｃ）温度感受性クローンのゲノムの配列を解析する工程と、
ｄ）温度感受性クローンのゲノムの配列と親ポリオウイルス株の配列とを比較して、温度感受性クローンのゲノムの配列における変異を同定する工程と、
ｅ）２つ以上の異なる温度感受性クローンの変異をポリオウイルス株（例えば、親または他のポリオウイルス株）のゲノムに導入して組換え弱毒化ポリオウイルス株を合成する工程と、
ｆ）３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株をレスキューする工程と、
ｇ）任意選択により、レスキューされた組換え弱毒化ポリオウイルス株のカプシドをコードする配列を、異なるポリオウイルス株のカプシドをコードする配列と置換する工程と
を含む方法を提供する。
【００２６】
ある特定の実施形態においては、レスキューされた弱毒化ポリオウイルス株のカプシドをコードする配列は、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドをコードする配列と置換される。
【００２７】
ある特定の実施形態においては、レスキューされた弱毒化ポリオウイルス株のカプシドをコードする配列は、Ｓａｂｉｎ１型、Ｓａｂｉｎ２型またはＳａｂｉｎ３型株のカプシドをコードする配列と置換される。
【００２８】
他の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができず、かつ任意選択により、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株から選択されるカプシドを含むことができる組換え弱毒化ポリオウイルス株を得る方法であって、
ｈ）親ポリオウイルス株に対し≦３０℃で、３７℃で増殖障害を示すウイルスを得るのに十分な数の継体を行う工程と、
ｉ）３７℃で増殖障害を示すウイルス集団から２つ以上の温度感受性クローンを単離する工程と、
ｊ）温度感受性クローンのゲノムの配列を解析する工程と、
ｋ）温度感受性クローンのゲノムの配列と親ポリオウイルス株の配列とを比較して、温度感受性クローンのゲノムの配列における変異を同定する工程と、
ｌ）２つ以上の異なる温度感受性クローンの変異をポリオウイルス株（例えば、親または他のポリオウイルス株）のゲノムに導入して組換え弱毒化ポリオウイルス株を合成する工程と、
ｍ）３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株をレスキューする工程と、
ｎ）任意選択により、レスキューされた組換え弱毒化ポリオウイルス株のカプシドをコードする配列を、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドをコードする配列と置換する工程と
を含む方法を提供する。
【００２９】
ある特定の実施形態においては、本発明は、上記方法によって得られる組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】組換え弱毒化ポリオウイルス株（ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ）を作るための、低温適応性ウイルス弱毒化（ＣＡＶＡ）によるポリオウイルス株の弱毒化方法を示す略図。表示の折れ線グラフは、親もしくは出発ポリオウイルス株と３つの異なる温度感受性のクローンの３７℃における増殖を示す。親ウイルスを黒丸で示し、３種類の温度感受性ウイルスは、ひし形、丸および四角で示す。
【図２】４つの異なる１型ＰＶ株および代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのパネルのための浮遊ＰＥＲ．Ｃ６（ｓＰＥＲ．Ｃ６）細胞における複製動態。２Ａ：３０℃での増殖。２Ｂ：３７℃での増殖。ＣＡＶＡ−ＰＶ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓおよびＳａｂｉｎ１のデータをそれぞれ、丸、黒ひし形、四角、黒三角および黒四角で示す。
【図３】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのｓＰＥＲ．Ｃ６細胞の平均複製動態。エラーバーは平均値（Ｎ＝３）からの標準誤差を示す。図３Ａは３０℃での増殖を示し、図３Ｂは３７℃での増殖を示す。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図４】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのＨＥＫ２９３細胞における複製動態。４Ａ：３０℃での増殖、４Ｂ：３７℃での増殖、および４Ｃ：３９．５℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図５】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのＬ２０Ｂ細胞における複製動態。５Ａ：３０℃での増殖、５Ｂ：３７℃での増殖、および５Ｃ：３９．５℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図６】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのＨｅＬａ細胞における複製動態。６Ａ：３０℃での増殖、６Ｂ：３７℃での増殖、および６Ｃ：３９．５℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図７】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのベロ細胞における複製動態。７Ａ：３０℃での増殖。７Ｂ：３７℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図８】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞における複製動態。８Ａ：３０℃での増殖。８Ｂ：３７℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図９】Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶおよび代表的なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの接着ＰＥＲ．Ｃ６（ａｄＰＥＲ．Ｃ６）細胞における複製動態。９Ａ：３０℃での増殖。９Ｂ：３７℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを丸で示す。
【図１０】（Ａ）予想産生条件下、（Ａ）３０℃、および（Ｂ）３７℃、小規模での、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ（、黒丸）および８継代後（丸）の複製動態。
【図１１】予想産生条件下、（１１Ａ、Ｃ、Ｅ）３０℃および（１１Ｂ、Ｄ、Ｅ）３７℃、小規模での、（１１Ａ、Ｂ）ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、（１１Ｃ、Ｄ）ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１および（Ｅ、Ｆ）ＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ、ならびにｓＰＥＲ．Ｃ６で５継代後（Ｎ＝３）の複製動態。黒ひし形は出発ストックウイルスの増殖を示し、一方、四角、丸および三角は３種類の各継代ウイルス（それぞれ、Ｎ＝１、２および３）を示す。
【図１２】元のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株のカプシドをコードする配列を、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドをコードする配列と交換した後の、異なるＣＡＶＡ−ＰＶワクチン株の概観図。カプシド交換により得られたワクチン株をそれぞれＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔと称する。
【図１３】ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ、ならびに親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株の複製動態。１２Ａ：３０℃での増殖。１２Ｂ：３７℃での増殖。エラーバーは平均値（Ｎ＝２または３）からの標準誤差を示す。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親ＰＶを黒三角、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙを丸、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１を四角、およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔをひし形で示す。
【図１４】不活化した１４Ａ：ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、１４Ｂ：ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１または１４Ｃ：ＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔを接種したラットのウイルス中和価。
【図１５】親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ  ＰＶ、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ（Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株と比べて、表１に示す３１の変異を有する）、およびさらに実施例１０のＣＡＶＡ−ＰＶ（表４に示す１４の変異を有する親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株に相当する）の複製動態。１５Ａ：３０℃での増殖。１５Ｂ：３７℃での増殖。親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ  ＰＶのデータは黒三角で示し、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのデータは丸で示し、実施例１０のＣＡＶＡ−ＰＶのデータは黒ひし形で示す。
【図１６】親野生型ＭＥＦ−１、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ（Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓバックグラウンドにおいて、表１に示す３１の変異を有する）、およびさらに実施例１１のＣＡＶＡ−ＰＶ株（表４に示す１３の変異を有する親ＭＥＦ−１  ＰＶに相当する）の複製動態。１６Ａ：３０℃での増殖。１６Ｂ：３７℃での増殖。ＭＥＦ−１のデータは黒四角で示し、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのデータは丸で示し、１３のＣＡＶＡ変異を有するＭＥＦ−１（実施例１１のＣＡＶＡ−ＰＶ）のデータは四角で示す。
【図１７】親Ｓａｂｉｎ３、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ（Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓバックグラウンドにおいて、表１に示す３１の変異を有する）、およびさらに実施例１１のＣＡＶＡ−ＰＶ株（表４に示す１２の変異を有する親Ｓａｂｉｎ３ＰＶに相当する）の複製動態。１７Ａ：３０℃での増殖。１７Ｂ：３７℃での増殖。Ｓａｂｉｎ３のデータは黒四角で示し、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのデータは丸で示し、１２のＣＡＶＡ変異を有するＳａｂｉｎ３（実施例１１のＣＡＶＡ−ＰＶ）のデータは三角で示す。
【図１８】（Ａ）３７℃でＰＢＳ（モック）により、（Ｂ）３７℃でＭａｈｏｎｅｙにより、（Ｃ）３７℃でＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙにより、および（Ｄ）３０℃でＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙにより感染させた代表的細胞のＥＭ顕微鏡写真。
【図１９】ゲノムコピー数（右側Ｙ軸のＬｏｇ１０ＧＣ、丸）として表されるｑＰＣＲにより測定されたウイルスＲＮＡ濃度と、力価により測定される感染単位（左側Ｙ軸のＬｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、四角）で示したＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙの経時感染（３０℃（四角および丸）および３７℃（黒四角および黒丸）での感染）。
【図２０】親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ、実施例６のＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、および５’ＵＴＲにおける７つのＣＡＶＡ変異、または非構造タンパク質における１７のＣＡＶＡ変異を有する２種の中間体ウイルスの複製動態。２０Ａ：３０℃での増殖。２０Ｂ：３７℃での増殖。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株のデータは黒丸で、５’ＵＴＲにおける７つのＣＡＶＡ変異を有する中間体ウイルスのデータは黒三角で、非構造タンパク質における１７のＣＡＶＡ変異を有する中間体ウイルスのデータは黒四角で、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのデータは丸で、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙのデータは三角で示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明においては、組換え弱毒化ポリオウイルス株、低温適応性ウイルス弱毒化ポリオウイルス（ＣＡＶＡ−ＰＶ）を生産するために、新規な低温適応性ウイルス弱毒化（ＣＡＶＡ）方法が使用された。ＣＡＶＡ−ＰＶは低温（３０℃）で高力価に成長するが、生理的温度（３７℃）では実質的に成長しない。３７℃では実質的に複製できないため、ＣＡＶＡ−ＰＶ株は哺乳類宿主内では非許容温度に遭遇し、それによりＩＰＶワクチンのベースとしての使用に適した弱毒表現型を与える。ＣＡＶＡ−ＰＶゲノムバックボーンは、異なるウイルスカプシド（例えば、従来のＩＰＶに使用された３つの野生型カプシド）をコードする配列を含むように再設計するのに適しており、これにより、ＣＡＶＡ−ＰＶの弱毒化表現型を維持しながら、従来のワクチンの抗原性、およびしたがっておそらく同じ免疫原性のプロファイルを与える。さらに、本発明のホルマリン不活化組換え弱毒化ポリオウイルス株は、市販の従来のＩＰＶワクチンと類似した免疫応答をするが、ＶＡＰＰおよびｃＶＤＰＶのリスクは除かれたＩＰＶとして使用することができる。
【００３２】
本明細書で定義されるとき、「実質的に増殖しない」、「実質的に複製する能力がない」、「実質的に複製しない」および「実質的に増殖することができない」とは、ウイルスの感染単位数の増加が、理論的投入量／接種量（算出ＭＯＩに基づく）の１０％以下、好ましくは５％以下、より好ましくは１％以下、より一層好ましくはウイルスの感染単位数の増加が測定不能な量であることを意味する。ウイルス感染単位を測定／滴定するためのアッセイ（ＴＣＩＤ５０アッセイ）の検出限界は１．７Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。ある特定の実施形態においては、「実質的に増殖しない」、「実質的に複製する能力がない」、「実質的に複製しない」および「実質的に増殖することができない」は、定量逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）による測定で、理論的投入量／接種量（算出されたゲノムコピー）と比べた場合の、測定できない量のウイルスＲＮＡ（ゲノムコピー）の増加と定義される。ある特定の実施形態においては、「実質的に増殖しない」、「実質的に複製する能力がない」、「実質的に複製しない」および「実質的に増殖することができない」は、光学顕微鏡による観察で感染の視覚標識の欠如（細胞変性効果）、または、電子顕微鏡（ＥＭ）による感染の視覚標識の欠如（ウイルスによって誘導される膜小胞もしくはウイルス格子を有する死細胞もしくはアポトーシス細胞）と定義される。
【００３３】
本明細書で定義されるとき、「組換え」は、ポリオウイルスをコードする核酸分子が、２種以上の起源、例えば異種クローン、異種株または異種生命体の遺伝子成分を混合する分子生物学的操作を受けたことを意味する。本発明の組換え弱毒化ポリオウイルスは、ＤＮＡ分子のクローニングにより生産することができ、または、当業者によく知られた一般的な方法で化学的に合成することができる（デノボＤＮＡ合成）。これは、通常の技法に従ってそれらの分子を作ることができるように、委託製造業者（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＢａｓｅＣｌｅａｒなど）に目的の組換え配列の情報を提供することによっても製造できよう。ＤＮＡ技術に関する標準マニュアルは、本発明の組換えＰＶ株の生産に使用し得る詳細なプロトコル提供する。そのような組換えウイルスを構築するための方法の概略、代表的な方法は、後述の実施例で示す。
【００３４】
本明細書で定義されるとき、「弱毒化された」とは、病原性は親または出発ウイルスより低いものの、まだ生存が可能なように、ポリオウイルスの毒性が低減されていることを意味する。例えば、本発明の弱毒化ポリオウイルスは、野生型株に比べ神経毒性は非常に弱く、したがって、麻痺を引き起こす力はあったとしても非常に弱い。特に、本発明の好ましい弱毒化ウイルス株は、意図して、不活化された形態で接種されたときだけでなく、偶発的な感染および／または製造施設からの漏出が起きた場合でさえも、ワクチン株用として安全である。ある特定の好ましい実施形態では、本発明の弱毒化ウイルスは、ＣＤ１５５遺伝子導入マウスへの脳内（ｉ．ｃ．）接種で、１×１０７ＴＣＩＤ５０超の（Ｐ）ＬＤ５０を有する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれか、またはそれらから生成されたキメラを指す。したがって、「ヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、リボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジンもしくはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルの、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのポリマー形態を指す。二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスが可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次および二次構造のみを指し、特定の三次構造には限定されない。したがって、その用語は、線状もしくは環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片またはプラスミド）中に見出される二本鎖ＤＮＡ、ならびにポリオウイルスゲノムおよびそのフラグメントの一本鎖のプラス鎖ＲＮＡ分子を含む。本明細書においては、特定の二本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＲＮＡ分子の構造を論じる中で、配列は、ポリオウイルスゲノムの一本鎖のプラス鎖ＲＮＡ分子、またはＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと配列相同性を有する鎖）に沿って５’から３’の方向に配列を与える通常の方法で記載し得る。
【００３６】
ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを生産する親株としてＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓポリオウイルス株を使用した。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株は血清型１であり、もとはＢｒｕｎｈｉｌｄｅ株と呼ばれる臨床分離株に由来する。１９５６年、Ｊｏｈｎ  Ｅｎｄｅｒｓ博士がヒト起源の組織培養においてＢｒｕｎｈｉｌｄｅ株を１２代連続継代することによってＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株が得られた。この株が一部弱毒化されていることが示されている（Ｅｎｄｅｒｓ  １９５２，Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株の代表的な配列を配列番号１として示す。このＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株を本発明の親株として使用したが、ウイルス集団には自然変異がよく見られる。
【００３７】
本明細書には、ＭＥＦ−１（野生型の神経毒性を有する２型ＰＶ）または３（弱毒化３型ＰＶ）を親株Ｓａｂｉｎとして用いてもＣＡＶＡ−ＰＶ株を生産できることもまた示されており、それは、３０℃ではよく増殖するが３７℃では実質的に増殖しない表現型を有するＣＡＶＡ−ＰＶ株の生産に本発明を一般的に適用可能であることを示している。ＭＥＦ−１株の代表的な配列を配列番号５として、またＳａｂｉｎ３の代表的な配列を配列番号８として示す。当業者には、温度感受性表現型を誘発する変異が血清型に特異的でなく、したがって、例えば、ＭａｈｏｎｅｙまたはＳａｕｋｅｔｔ株などの他のポリオウイルス株もまた、本発明の表現型を有する他のＣＡＶＡ−ＰＶ株を本明細書に記載の教示内容にしたがって生産するための親株として使用することができる。
【００３８】
本明細書で定義されるとき、「親株」または「出発株」は、血中に循環している、もしくは自然から単離した野生型株、既知の標準的な実験室株、または本発明のＣＡＶＡ法をまだ供されていない他の任意の株であり得る。親株の非限定的な例としては、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株、ＭＥＦ−１株、Ｍａｈｏｎｅｙ株、Ｓａｕｋｅｔｔ株、Ｓａｂｉｎ１株、Ｓａｂｉｎ２株、またはＳａｂｉｎ３株が挙げられる。これらの株の配列の代表的な例を次のように本明細書に示す：Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ（配列番号１）、ＭＥＦ−１（配列番号５）、Ｍａｈｏｎｅｙ（配列番号６）、Ｓａｕｋｅｔｔ（配列番号７）、Ｓａｂｉｎ３（配列番号８）、Ｓａｂｉｎ１（配列番号９）およびＳａｂｉｎ２（配列番号１０）。
【００３９】
本発明はまた、３０℃の細胞培養で増殖でき、３７℃の細胞培養で実質的に増殖できない組換え弱毒化ポリオウイルス株を得る方法であって、ａ）（親）ポリオウイルス株に対し≦３２℃で、３７℃で増殖障害を示すウイルスを得るのに十分な数の継代を行う工程と、ｂ）３７℃で増殖障害を示す２つ以上（例えば、２、３、４、５もしくはそれ以上）の異なる温度感受性クローンを単離する工程と、ｃ）温度感受性クローンのゲノムの配列を解析する工程と、ｄ）温度感受性クローンの配列と親ポリオウイルス株の配列とを比較して、温度感受性クローンのゲノムの配列における変異を同定する工程と、ｅ）２つ以上の異なる温度感受性クローンの変異を親ポリオウイルス株のゲノム、または他のポリオウイルス株のゲノムに導入して組換え弱毒化ポリオウイルス株を合成する工程と、ｆ）３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株をレスキューする工程とを含む方法を提供する。工程ａ）の継代は、低い感染多重度（ＭＯＩ）、例えば、０．０００１〜１、例えば、０．００１〜０．１、例えば約０、０１のＭＯＩで感染させて行うことが好ましい。工程ａ）の継代する温度は、３２℃未満、例えば、約２０℃〜３１℃、例えば、約２４℃〜３０℃、例えば、約３０℃である。この温度でポリオウイルスの増殖を許容する細胞株、例えば、ベロ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨＥＫ２９３などは全て使用することができる。当業者であれば、必要な継代数は重要ではなく、低温適応性表現型に寄与する変異は、任意の継代で起こり得るため、分断したウイルス集団のクローンから、３７℃で増殖障害を示す表現型をスクリーニングすることによって好都合にも決定することができることは理解していよう。少しの継代で、そのような表現型が観察されるが、もし観察されないなら、さらに継代を行うことによって、この表現を有するクローンを見出す機会を増やすことができる。したがって、ある特定の実施形態では、工程ａ）における継代数は、少なくとも５代、少なくとも１０代、少なくとも１５代、少なくとも２０代、少なくとも２５代、少なくとも３０代、もしくはそれ以上であり得る。本明細書で使用されるとき、３７℃で「増殖障害を示す」とは、野生型ウイルス種と比較したとき、最大力価が少なくとも１０倍、例えば１００〜１０００倍低下することと定義される。さらに、増殖障害を示すクローンはまた、野生型または親ウイルスと比べて、増殖がより遅い、すなわち、最大力価に到達するのにより長い感染時間を要することを示し得る。ある特定の実施形態では、低温（例えば３０℃）で温度感受性を有するクローンの増殖動態は、出発（親）株に比べてより速い可能性がある。一実施形態においては、ＣＡＶＡ−ＰＶを開発するために、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株がＰＥＲ．Ｃ６細胞において低温（≦３０℃）かつ低ＭＯＩ（例えば０．０１）で３０回を超えて連続継代された。得られたウイルス集団が、その集団の中で生理的温度（３７℃）で増殖障害を示し、かつ低温（３０℃）で野生型増殖をする温度感受性ウイルスクローンを同定するために解析された。３つの感受性クローン（これらは、３７℃で増殖障害を示し、３０℃で親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株と比べてより速い増殖動態を示した）が、３７℃のウイルス集団の略１０００クローンをスクリーニングすることによって見出された。
【００４０】
３つの温度感受性クローンの配列が決定され、３つの異なるクローン全体で、合計３１の変異が見出された。各クローンは１８のヌクレオチドの変異を有し、そのうちのいくつかは異なるクローン間で共有され、各クローンに特有のものであった。これらの変異はＰＶゲノムの４つの異なる領域のうちの３領域（５’ＵＴＲ（非翻訳領域）、カプシドおよび非構造タンパク質を含む）で同定された。３’ＵＴＲでは変異は同定されなかった。５’ＵＴＲは、感染性ビリオンを形成するため、ゲノムがＶｐＧタンパク質（２Ｂ）に結合し、かつカプシドにＲＮＡのカプシドを形成するために必要なクローバー葉構造を含む。５’ＵＴＲの残り部分は、ウイルスＲＮＡの翻訳に必須のＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）である。その領域はいかなるタンパク質もコードしない（翻訳しない）ため、要素は、それと相互作用するＲＮＡ／タンパク質の相手と直接結合することによってその機能を果たす。したがって、このドメインの二次構造はその機能にとって重要である。カプシド領域はウイルス粒子の外表面をコードし、カプシドとして知られるビリオンの外側を作る４つのたんぱく質に分けることができる。これらの４つのタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４と呼ばれる。非構造タンパク質は、タンパク質２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄにさらに分けられる。これらのタンパク質は、感染がうまく行われるための、ウイルスの複製、ポリタンパク質プロセッシング、翻訳、および宿主細胞成分との相互作用に必要である。例えば、２ＡプロテアーゼはｅＩＦ４Ｇを開裂させることによって、宿主細胞のタンパク質の翻訳を遮断する（Ｓｋｅｒｎ  ａｎｄ  Ｌｉｅｂｉｇ  １９９４）。３’ＵＴＲもまた、相補鎖の合成の開始に必要な非翻訳領域である。５’ＵＴＲと同様に、要素の構造がその機能を可能にする。
【００４１】
３つのクローンで同定された３１の変異は、ＩＲＥＳにおける７つの変異、カプシドにおける７つの変異、および非構造タンパク質における１７の変異を含んだ。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ野生型バックグラウンドに３１の全変異を導入することによって、初代ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを開発した（また、したがって、開発されたこの初代ＣＡＶＡ−ＰＶは１型ポリオウイルスである）。このＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを作るために組み込まれた３１の変異については、実施例１、表１を参照されたい。また、導入されたＣＡＶＡ法の概略図およびＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの生成方法については図１を参照されたい。
【００４２】
１つのウイルスゲノムにおける３１の変異の組み込みには相乗効果があった。ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞中、３７℃では実質的に殆ど複製しないことを示すことによって、３つの個々のクローンに比べて累積した温度感受性を示した。それどころか、同細胞中、３０℃では、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株および他のＰＶ１株と類似した増殖動態、またはより速い増殖を示した（実施例２、図２および３）。その後、様々な他の哺乳類細胞株中でのＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの増殖特性が調べられ、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅが、調べた全ての哺乳類細胞型で、３７℃の生理的温度で複製する能力がないことが確認された（実施例３、図４〜９）。
【００４３】
クローンで見出された変異の人工的な組み込みがＣＡＶＡ−ＰＶ表現型（すなわち、親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株と比較したとき、同様に、３０℃では増殖し、３７℃では複製することができない）を得るのに必須であると考えられる。３７℃での複製能力が完全に欠如したウイルスは、低温で３０回を超えるＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓおよびＭＥＦ−１の連続継代を行っても選択することができなかった。実際、ＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓおよびＭＥＦ−１の継代中に得られ、スクリーニングした約１０００個のクローンの中で僅か２〜３個のクローンが、３７℃で増殖障害を示し（図１）、その一方、ＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓおよびＭＥＦ−１の継代後のクローンで、親株と比べて３０℃での増殖の増加が認められた。したがって、ここで使用された継代条件は３０℃での増殖増大のための選択的優位性を提供するが、３７℃での複製障害を有するウイルスの選択に有利に作用するものではなかった。３つの個々のクローンで見出された変異をＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓゲノムに人工的に組み込んだときのみ、ＣＡＶＡ表現が観察された。興味深いことに、ＣＡＶＡ−ＰＶ株は、３０℃では親株と比べてより良好な増殖を示さなかった（図３）。これはクローンで観察された。したがって、３０℃で継代中に生じたこれらのＣＡＶＡ変異の自然の組み込み（これは、ＣＡＶＡ表現型に必要である）は、出発クローンに比べて優位性は低く、したがって、自然に起こる可能性は低い。これは、観察された変異を人工的に組み込むことが、ＣＡＶＡ表現型を得るために必要であることを強調するものである。
【００４４】
このように、ある特定の実施形態においては、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３３（Ａ）、１４２（Ｕ）、１４６（Ｇ）、１６３（Ａ）、５７９（Ｇ）、５９７（Ｃ）および６０９（Ｇ）；カプシドの８０５（Ａ）、１７８７（Ｃ）、１９０５（Ｕ）、２７５６（Ｕ）、３２３６（Ｃ）、３３２３（Ｃ）、および３３７６（Ａ）；ならびに非構造タンパク質の３４７６（Ｃ）、３４８６（Ｇ）、３８５２（Ａ）、４１２０（Ｕ）、４２５３（Ｃ）、４３０１（Ｕ）、４４２８（Ａ）、４５６３（Ａ）、４８１１（Ａ）、５４３６（Ｇ）、５７０５（Ａ）、６０５９（Ｃ）、６２１０（Ａ）、６４８８（Ｃ）、６８４８（Ｇ）、７０７９（Ｕ）および７１０２（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１４６（ＧからＡ）、１６３（ＡからＧ）、５７９（ＧからＡ）、５９７（ＣからＵ）、および６０９（ＧからＡ）；カプシドの８０５（ＡからＣ）、１７８７（ＣからＵ）、１９０５（ＵからＣ）、２７５６（ＵからＣ）、３２３６（ＣからＵ）、３３２３（ＣからＵ）および３３７６（ＡからＧ）；ならびに非構造タンパク質の３４７６（ＣからＵ）、３４８６（ＧからＡ）、３８５２（ＡからＵ）、４１２０（ＵからＣ）、４２５３（ＣからＵ）、４３０１（ＵからＣ）、４４２８（ＡからＧ）、４５６３（ＡからＵ）、４８１１（ＡからＧ）、５４３６（ＧからＡ）、５７０５（ＡからＧ）、６０５９（ＣからＵ）、６２１０（ＡからＧ）、６４８８（ＣからＵ）、６８４８（ＧからＡ）、７０７９（ＵからＣ）および７１０２（ＵからＣ）のうちの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１の変異を含む。
【００４５】
さらに、インビボでポリオウイルスの神経毒力を評価するために使用した遺伝子組換えＣＤ１５５マウスモデル（Ｋｏｉｋｅ，Ｔａｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）では、ＣＡＶＡ−ＰＶは、大きく弱毒化されていることが示された（実施例４、表２）。実際、可能性の最も高い量のＣＡＶＡ−ＰＶを感染させたどのマウスも、麻痺またはその他の病気の兆候を示さなかった。これは、その試験に含まれたＳａｂｉｎ１、すなわち知られた弱毒化ＰＶ株の事例ではない。神経毒性マウスモデルで試験した株は、毒性の高いものから順に、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｓａｕｋｅｔｔ、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、Ｓａｂｉｎ１〜３およびＣＡＶＡ−ＰＶであった。ＣＡＶＡ−ＰＶのものは、一部弱毒化した株であるＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓの少なくとも１００倍、かつ急性灰白髄炎の経口ワクチンとして多くの国で広く使用されている、よく知られた弱毒化株のＳａｂｉｎ株と少なくとも同程度弱毒化されていると測定された。
【００４６】
さらに、異なるポリオウイルス株のカプシドを含むようにＣＡＶＡ−ＰＶバックボーンを再構築することによって、ＣＡＶＡ−ＰＶは、今日使用されている野生型ＩＰＶワクチンの抗原性プロファイルを有するが、弱毒化ＣＡＶＡ−ＰＶ表現型を有するＩＰＶを開発するための弱毒化ワクチン株として使用するのに適したものとなる。例えば、ＣＡＶＡ−ＰＶは、毒性野生型ＰＶ株（１、２および３型、例えば、１型のＭａｈｏｎｅｙ株、２型のＭＥＦ−１株、および３型Ｓａｕｋｅｔｔ株）のカプシドを含む弱毒化ポリオウイルスを生産するための弱毒化バックボーンとして使用するのに適したものとなる。これは、例えば、ＣＡＶＡ−ＰＶ株のカプシド配列を通常の分子生物学の技術を使用して所望のカプシド配列に置き換えることによって行うことができる（弱毒化ＰＶ株バックボーンのカプシドを、野生型株のカプシドに再構築する例は、例えば、国際公開第２０１２／０９００００号パンフレットを参照されたい。しかしながら、参照例では、得られた株は、本発明のＣＡＶＡ−ＰＶ株とは対照的に、３７℃でなお実質的に複製することができる）。したがって、ＣＡＶＡ−ＰＶはＩＰＶ用の組換え弱毒化ポリオウイルスの生産に使用することができる。ＣＡＶＡ−ＰＶは、１９５２年以来、世界の人々に免疫を付与するのに使用され成功を収めている野生型ＩＰＶ株と同じカプシド配列を含むように操作することが好ましい。これにより、ホルマリンによる不活化時に、Ｓａｂｉｎ株で観察されたような、他のＩＰＶ用弱毒化株による抗原性（および、したがって、推定される免疫原性）のプロファイルの変化が回避されるであろう。したがって、特に好ましい実施形態においては、ＣＡＶＡ−ＰＶがバックボーンとして使用され、カプシドをコードする配列が、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドをコードする配列と交換される。これにより、それぞれＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株が得られる。代替の好ましい実施形態においては、ＣＡＶＡ−ＰＶ表現型を引き起こす変異（例えば、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓのバックグラウンド株では、表４に示す少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異）が、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔの親株の対応する位置に挿入され、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができないＭａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株（これらは、したがって、そのような株の元のカプシドを有している）がそれぞれ生成される。本発明はまた、そのような方法、およびそれによって得られるポリオウイルス株を提供する。そのような株はまた、カプシドの交換に使用することができる。例えば、ＣＡＶＡ−ＰＶ表現型（３０℃で増殖し、３７℃で実質的に増殖しない、図１１）をもたらす変異を含むように既に変異させられたＭＥＦ−１株は、さらなる遺伝子操作によって、ＭＥＦ−１カプシドを、ＭａｈｏｎｅｙまたはＳａｕｋｅｔｔカプシドに変換するベースとして使用することができる。
【００４７】
後述の実施例６に記載するように、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔのカプシドをコードする配列が、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株のカプシドに相当する、ＣＡＶＡ−ＰＶカプシドをコードする配列を置換することによって、ＣＡＶＡ−ＰＶゲノムのバックグラウンドに挿入された（配列番号１の７４７〜３３８９のヌクレオチド）。得られたワクチン株は、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔのカプシドをそれぞれ含む、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔである。実施例７に記載するように、浮遊ＰＥＲ．Ｃ６（ｓＰＥＲ．Ｃ６）細胞、適切な生産細胞株におけるＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔの増殖動態を全て、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株の増殖と比較した。ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ株はいずれも、３０℃でＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株に類似した増殖動態を示した。それどころか、３７℃では、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ株はいずれも、実質的な複製を示さなかった。カプシド交換をしていない初代ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅで、これらと同じ増殖動態が観察され、ウイルスの温度感受性が、カプシド領域外の変異にあることが明らかとなった。
【００４８】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３３（Ａ）、１４２（Ｕ）、１４６（Ｇ）、１６３（Ａ）、５７９（Ｇ）、５９７（Ｃ）および６０９（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４７６（Ｃ）、３４８６（Ｇ）、３８５２（Ａ）、４１２０（Ｕ）、４２５３（Ｃ）、４３０１（Ｕ）、４４２８（Ａ）、４５６３（Ａ）、４８１１（Ａ）、５４３６（Ｇ）、５７０５（Ａ）、６０５９（Ｃ）、６２１０（Ａ）、６４８８（Ｃ）、６８４８（Ｇ）、７０７９（Ｕ）および７１０２（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ＰＶ株のゲノムは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１４６（ＧからＡ）、１６３（ＡからＧ）、５７９（ＧからＡ）、５９７（ＣからＵ）、および６０９（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４７６（ＣからＵ）、３４８６（ＧからＡ）、３８５２（ＡからＵ）、４１２０（ＵからＣ）、４２５３（ＣからＵ）、４３０１（ＵからＣ）、４４２８（ＡからＧ）、４５６３（ＡからＵ）、４８１１（ＡからＧ）、５４３６（ＧからＡ）、５７０５（ＡからＧ）、６０５９（ＣからＵ）、６２１０（ＡからＧ）、６４８８（ＣからＵ）、６８４８（ＧからＡ）、７０７９（ＵからＣ）および７１０２（ＵからＣ）のうちの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓカプシドと比較したとき、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換されている。代表的なカプシドのアミノ酸配列を、本明細書においては、Ｍａｈｏｎｅｙ（配列番号２）、ＭＥＦ−１（配列番号３）、およびＳａｕｋｅｔｔ（配列番号４）として示すが、当然ながら、当業者であればいくつかの自然変異がウイル集団に通常存在することを知っている。
【００４９】
様々な型のＰＶ株の多くのゲノムは比較的高い相同性を有するため、ここでＣＡＶＡ−ＰＶで同定された変異が他のポリオウイルス株に挿入することができることもまた、当業者には明らかであろう。したがって、ＣＡＶＡ−ＰＶの変異に対応する位置は、異なる株のポリオウイルスにおいて、異なる株のゲノム配列を整列させることによって同定することができる。実際、３つのポリオウイルス血清型の全ての例を含むアライメントがなされた（Ｔｏｙｏｄａ，Ｋｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。このようにして、新しい異なるバックボーンにおいてＣＡＶＡ−ＰＶの弱毒化表現型を作るため、ＣＡＶＡ−ＰＶの弱毒化表現型を他の株に移すことができる。例えば、ＣＡＶＡ−ＰＶの３１の変異のうち、１１がＣＡＶＡ−ＰＶに特有で、それらの位置の親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓのヌクレオチドは、アライメントで使用された他のＰＶ株の全てで保存される（例えば、ＣＡＶＡ−ＰＶの１４２位のヌクレオチドはＣ（シチジン）であるが、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株、ならびにＢｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔ株の、その位置のヌクレオチドはＵ（ウリジンである））。さらに、ＣＡＶＡ−ＰＶと同位置の親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓのヌクレオチドが、アライメントで使用されたＰＶ１株の全て（Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭａｈｏｎｅｙおよびＳａｂｉｎ１）で保存される変異がＣＡＶＡ−ＰＶには他に６つある。ＣＡＶＡ−ＰＶとＳａｂｉｎ１に共通の変異もまた１つあるが、その位置のヌクレオチドは他の全ての株で保存される。さらに、アライメントで使用された他の種で保存されない位置での変異がＣＡＶＡ−ＰＶに６つある。
【００５０】
ＣＡＶＡ−ＰＶ変異の全ての分析に基づき、ＣＡＶＡ−ＰＶの温度感受性（および、したがって、弱毒化）表現型に大きく寄与し得る１４の変異が同定された。それらの１４の変異を表４に示す（後述の実施例１０もまた参照されたい）。次の基準に基づき、変異が選択された：ａ）他のＰＶ株間での保存；ｂ）３７℃での継代した後のクローンでの転換に基づく実験的証拠；ｃ）３７℃でまだ増殖することができる前の中間継代集団と比較して新規なクローンにおける変異；およびｄ）アミノ酸の変化を引き起こす変異、またはＲＮＡの必須構造（すなわち、ＩＲＥＳ）における変異。１４の変異が異なるポリオウイルスバックグラウンド株に操作された。したがって、本発明のＣＡＶＡ−ＰＶは、表４に示す１４の変異を含み得る。本発明のＣＡＶＡ−ＰＶはまた、表４に示す１４の変異と、任意選択により、同定された初代のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅにおける他の１７の変異のもう１つとを含み得る。本発明のＣＡＶＡ−ＰＶはまた、表４に示す１４の変異と、任意選択により、野生型株と比較して、ゲノム中の他の変異をさらに含み得る。本発明のＣＡＶＡ−ＰＶはまた、表４に示す１４の変異を含み、任意選択によりまた、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含み得る。当業者であれば、本明細書の教示により、表４に示す１４の変異の一部のみ（例えば、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓバックグラウンド株、または他のＰＶバックグラウンド株の対応する位置での、それらの変異のうちの８、９、１０、１１、１２または１３）を有するさらなるＣＡＶＡ−ＰＶ株を作製し、それらの株のＣＡＶＡ−ＰＶ表現型を試験し、かつそのような方法で、さらなるＣＡＶＡ−ＰＶ株を得ることができる可能性があることもまた明らかであろう。
【００５１】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖でき、３７℃の細胞培養で実質的に増殖できない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３３（Ａ）、１４２（Ｕ）、１６３（Ａ）、５９７（Ｃ）および６０９（Ｇ）；非構造タンパク質の３４８６（Ｇ）、３８５２（Ａ）、４１２０（Ｕ）、４４２８（Ａ）、４５６３（Ａ）、５４３６（Ｇ）、６２１０（Ａ）、６８４８（Ｇ）および７１０２（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態においては、組換え弱毒化ＰＶ株のゲノムは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１６３（ＡからＧ）、５９７（ＣからＵ）、および６０９（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８６（ＧからＡ）、３８５２（ＡからＵ）、４１２０（ＵからＣ）、４４２８（ＡからＧ）、４５６３（ＡからＵ）、５４３６（ＧからＡ）、６２１０（ＡからＧ）、６８４８（ＧからＡ）および７１０２（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の好ましい実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換されている。
【００５２】
本発明の組換え弱毒化ポリオウイルス株はまた、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（例えば、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、ＭＥＦ−１もしくはＳａｕｋｅｔｔ株、またはこれらのいずれかから生成された株、あるいは他の株）と異なるポリオウイルス株から、ＣＡＶＡ−ＰＶの変異をそれらの他のポリオウイルス株のゲノムの相同ヌクレオチドに導入することによって作製し得る。さらに、本発明の組換え弱毒化ポリオウイルス株は、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株と異なるポリオウイルス株から作製することができ、任意選択により、異なるポリオウイルス株のカプシドを含み得る。ＰＶ株はそのゲノムの長さに変動があることから、ヌクレオチドの実際の変異位置は、様々なＰＶ配列のアライメントにより変わり得る。したがって、ＢｒｕｎｄｅｎｅｒｓバックグラウンドからＭＥＦ−１株、または他のポリオウイルス株に挿入した場合、その配列のアライメントにより、ＣＡＶＡ変異のヌクレオチドの数は僅かに異なる。Ｍａｈｏｎｅｙ（ＰＶ１）、ＭＥＦ−１（ＰＶ２）、Ｓａｕｋｅｔｔ（ＰＶ３）、Ｓａｂｉｎ１（ＰＶ１）、Ｓａｂｉｎ２（ＰＶ２）およびＳａｂｉｎ３（ＰＶ３）株のＣＡＶＡ変異の対応するヌクレオチドの位置を、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株の番号と比較して、本明細書に示す（表４）。
【００５３】
したがって、さらる非限定的な例として、ある特定の実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、ＭＥＦ−１株（配列番号５）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３４（Ａ）、１４３（Ｕ）、１６４（Ａ）、５９８（Ｃ）および６１０（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４８１（Ａ）、３８４７（Ａ）、４１１５（Ｕ）、４４２３（Ａ）、４５５８（Ａ）、５４３１（Ｇ）、６２０５（Ａ）、６８４３（Ｇ）、および７０９７（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、ＭＥＦ−１親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、ＭＥＦ−１株（配列番号５）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３４（ＡからＧ）、１４３（ＵからＣ）、１６４（ＡからＧ）、５９８（ＣからＵ）、および６１０（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８１（ＡからＡ）、３８４７（ＡからＵ）、４１１５（ＵからＣ）、４４２３（ＡからＧ）、４５５８（ＡからＵ）、５４３１（ＧからＡ）、６２０５（ＡからＧ）、６８４３（ＧからＡ）および７０９７（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｍａｈｏｎｅｙ、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換され得る。
【００５４】
さらなる非限定的な例において、ある特定の実施形態における本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｍａｈｏｎｅｙ株（配列番号６）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３１（Ａ）、１４０（Ｕ）、１６１（Ａ）、５９３（Ｃ）および６０５（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４８２（Ｇ）、３８４８（Ａ）、４１１６（Ｕ）、４４２４（Ａ）、４５５９（Ａ）、５４３２（Ｇ）、６２０６（Ａ）、６８４４（Ｇ）、および７０９８（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、Ｍａｈｏｎｅｙ親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、Ｍａｈｏｎｅｙ株（配列番号６）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３１（ＡからＧ）、１４０（ＵからＣ）、１６１（ＡからＧ）、５９３（ＣからＵ）、および６０５（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８２（ＧからＡ）、３８４８（ＡからＵ）、４１１６（ＵからＣ）、４４２４（ＡからＧ）、４５５９（ＡからＵ）、５４３２（ＧからＡ）、６２０６（ＡからＧ）、６８４４（ＧからＡ）および７０９８（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換され得る。
【００５５】
またさらなる非限定的な実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｓａｕｋｅｔｔ株（配列番号７）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３３（Ａ）、１４２（Ｕ）、１６３（Ａ）、５９６（Ｃ）および６０８（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４７２（Ａ）、３８３９（Ａ）、４１０７（Ｕ）、４４１５（Ａ）、４５５０（Ａ）、５４２３（Ｇ）、６１９７（Ａ）、６８３５（Ｇ）、および７０８９（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、Ｓａｕｋｅｔｔ親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、Ｓａｕｋｅｔｔ株（配列番号７）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１６３（ＡからＧ）、５９６（ＣからＵ）、および６０８（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４７２（ＡからＡ）、３８３９（ＡからＵ）、４１０７（ＵからＣ）、４４１５（ＡからＧ）、４５５０（ＡからＵ）、５４２３（ＧからＡ）、６１９７（ＡからＧ）、６８３５（ＧからＡ）および７０８９（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、ＭＥＦ−１、またはＭａｈｏｎｅｙ株のカプシドで置換され得る。
【００５６】
またさらなる非限定的な実施形態において、本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｓａｂｉｎ３株（配列番号８）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３３（Ａ）、１４２（Ｕ）、１６３（Ｇ）、５９６（Ｃ）および６０８（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４７３（Ａ）、３８３９（Ａ）、４１０７（Ｕ）、４４１５（Ａ）、４５５０（Ａ）、５４２３（Ｇ）、６１９７（Ａ）、６８３５（Ｇ）、および７０８９（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、Ｓａｂｉｎ３親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、Ｓａｂｉｎ３株（配列番号８）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３３（ＡからＧ）、１４２（ＵからＣ）、１６３（ＧからＧ）、５９６（ＣからＵ）、および６０８（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４７３（ＡからＡ）、３８３９（ＡからＵ）、４１０７（ＵからＣ）、４４１５（ＡからＧ）、４５５０（ＡからＵ）、５４２３（ＧからＡ）、６１９７（ＡからＧ）、６８３５（ＧからＡ）および７０８９（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換され得る。
【００５７】
さらなる非限定的な例において、ある特定の実施形態における本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｓａｂｉｎ１株（配列番号９）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３１（Ａ）、１４０（Ｕ）、１６１（Ａ）、５９３（Ｃ）および６０５（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４８２（Ｇ）、３８４８（Ａ）、４１１６（Ｕ）、４４２４（Ａ）、４５５９（Ａ）、５４３２（Ｇ）、６２０６（Ａ）、６８４４（Ｇ）、および７０９８（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、Ｓａｂｉｎ１親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、Ｓａｂｉｎ１株（配列番号９）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３１（ＡからＧ）、１４０（ＵからＣ）、１６１（ＡからＧ）、５９３（ＣからＵ）、および６０５（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８２（ＧからＡ）、３８４８（ＡからＵ）、４１１６（ＣからＣ）、４４２４（ＡからＧ）、４５５９（ＡからＵ）、５４３２（ＧからＡ）、６２０６（ＡからＧ）、６８４４（ＧからＡ）および７０９８（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換され得る。
【００５８】
またさらなる非限定的な例において、ある特定の実施形態における本発明は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、Ｓａｂｉｎ２株（配列番号１０）のゲノムと比較したとき、次の位置：５’ＵＴＲの１３１（Ａ）、１４０（Ｕ）、１６１（Ａ）、５９４（Ｃ）および６０６（Ｇ）；ならびに非構造タンパク質の３４８１（Ｇ）、３８４７（Ａ）、４１１５（Ｕ）、４４２３（Ａ）、４５５８（Ａ）、５４３１（Ｇ）、６２０５（Ａ）、６８４３（Ｇ）、および７０９７（Ｕ）（その位置の後の括弧内に、Ｓａｂｉｎ２親株のヌクレオチドを示し、したがって、この実施形態では、それが異なるヌクレオチドに変異する）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の位置での変異を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株を提供する。本発明のある特定の実施形態では、組換え弱毒化ポリオウイルス株のゲノムは、Ｓａｂｉｎ２株（配列番号１０）のゲノムと比較して、次の変異：５’ＵＴＲの１３１（ＡからＧ）、１４０（ＵからＣ）、１６１（ＡからＧ）、５９４（ＣからＵ）、および６０６（ＧからＡ）；ならびに非構造タンパク質の３４８１（ＧからＡ）、３８４７（ＡからＵ）、４１１５（ＵからＣ）、４４２３（ＡからＧ）、４５５８（ＡからＵ）、５４３１（ＧからＡ）、６２０５（ＡからＧ）、６８４３（ＧからＡ）および７０９７（ＵからＣ）のうちの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４の変異を含む。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドで置換され得る。
【００５９】
本発明はまた、３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養で実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株であって、そのゲノムが、親ポリオウイルス株のゲノムと比較したとき、次の位置、またはこれらの４つの株の配列のアライメントに基づいた他のＰＶ親株の対応する位置で、次のヌクレオチドの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４を含む組換え弱毒化ポリオウイルス株（ここで、親ポリオウイルス株は、例えば、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ／ＭＥＦ−１／Ｍａｈｏｎｅｙ／Ｓａｕｋｅｔｔ／Ｓａｂｉｎ３／Ｓａｂｉｎ２／Ｓａｂｉｎ１株（それぞれ、例えば、配列番号１／５／６／７／８／９／１０のような各ゲノム配列を有する）である）を提供する：５’ＵＴＲの１３３／１３４／１３１／１３３／１３３／１３１／１３１位でＧ、１４２／１４３／１４０／１４２／１４２／１４０／１４０位でＣ、１６３／１６４／１６１／１６３／１６３／１６１／１６１位でＧ、５９７／５９８／５９３／５９６／５９６／５９３／５９４位でＵ、および６０９／６１０／６０５／６０８／６０８／６０５／６０６位でＡ、ならびに非構造タンパク質の３４８６／３４８１／３４８２／３４７３／３４７３／３４８２／３４８１位でＡ、３８５２／３８４７／３８４８／３８３９／３８３９／３８４８／３８４７位でＵ、４１２０／４１１５／４１１６／４１０７４１４０７／４１１６／４１１５位でＣ、４４２８／４４２３／４４２４／４４１５／４４１５／４４２４／４４２３位でＧ、４５６３／４５５８／４５５９／４５５０／４５５０／４５５９／４５５８位でＵ、５４３６／５４３１／５４３２／５４２３／５４２３／５４２３／５４３１位でＡ、６２１０／６２０５／６２０６／６１９７／５１９７／６２０６／６２０５位でＧ、６８４８／６８４３／６８４４／６８３５／６８３５／６８４４／６８４３位でＡ、および７１０２／７０９７／７０９８／７０８９／７０８９／７０９８／７０９７位でＣ。ある特定の実施形態においては、そのような株のカプシドは、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシド配列を含む。
【００６０】
したがって、本発明はまた、野生型ポリオウイルスゲノム（例えば、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、Ｓａｕｋｅｔｔまたは他のＰＶ株）に、ゲノムが次の位置での次のヌクレオチドの少なくとも１０、１１、１２、１３または１４を含むように、変異を導入する（例えば、通常の遺伝子組換え技術、または完全なポリオウイルスゲノムのデノボ合成により）ことによって、ＣＡＶＡ−ＰＶ株を生成するさらなる方法を提供する：例えば、表４に示すように、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（配列番号１）に関して、５’ＵＴＲの１３３位でＧ、１４２位でＣ、１６３位でＧ、５９７位でＵ、および６０９位でＡ、ならびに非構造タンパク質の３４８６位でＡ、３８５２位でＵ、４１２０位でＣ、４４２８位でＧ、４５６３位でＵ、５４３６位でＡ、６２１０位でＧ、６８４８位でＡ、および７１０２位でＣ、または他のＰＶ種の対応する位置で。
【００６１】
本発明の組換え弱毒化ＣＡＶＡ−ＰＶ株はまた一般に、想定される生産条件下では通常安定しており、３７℃の生理的温度では複製不能であるため、事故感染および／または製造施設からの漏出の際、神経毒性形態に変化する可能性は非常に低い。３７℃でのＣＡＶＡ−ＰＶ株の連続継代は常に第１代継代後のウイルスの定量化に繋がる。これは、３７℃で再び複製が可能となるように、１０回を超える盲目継代を行った後でさえも、この温度では元に戻ることができないことを示している。これは、生理的温度で複製可能である他の弱毒化株に対する優位性をＣＡＶＡ−ＰＶにもたらすものである。したがって、ＣＡＶＡ−ＰＶは、産業事故が起きた場合の潜在的な病気発生のリスクが緩和されるため、生物学的封じ込め閾値が潜在的に低い安全なワクチン製造手順によるＩＰＶワクチンの開発を提供する。このように、ＣＡＶＡ−ＰＶに固有のＩＰＶのベースとしての安全性は、ＩＰＶの製造コストを管理するのに役立ち、また、野生型ＰＶによる製造に限られるか、または高いリスクを有している国々での製造を可能にする。さらに、ＣＡＶＡ−ＰＶ株は、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の高濃度の浮遊培養で増殖させることができ、それは高い収率をもたらし、したがって、この生産細胞株の利用もまた、他の細胞系に比べ、ＩＰＶの生産コストをより大きく低下させることに寄与する。例えば、米国特許第８，５４６，１２３号明細書、およびＳａｎｄｅｒｓ，Ｅｄｏ−Ｍａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）を参照されたい。
【００６２】
ＣＡＶＡ−ＰＶ株は当業者によく知られた方法で増殖させることができる。例えば、ＣＡＶＡ−ＰＶは、許容細胞株（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６またはベロ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ、Ｌ２０Ｂなど）中、許容温度（例えば２０〜３３℃、２６〜３３℃、２８〜３２℃、または好ましくは約３０℃で）で培養することにより増殖させることができる。そのような細胞株に適した培地は広く知られており、様々な製造会社から入手可能である。無血清培地を使用することが好ましく、ある特定の実施形態では、細胞は浮遊状態で培養される。通常、ウイルスの採集は、最大力価に到達したときに行われるが、これは、使用されるＭＯＩおよびインキュベーション温度に依存する。一般に、ＭＯＩが１では、３０℃で、感染後１２〜４８時間（ｈｐｉ）の間に、例えば１８〜３０ｈｐｉ、例えば約２４ｈｐｉで最大力価に到達するであろう。
【００６３】
ポリオウイルスまたはウイルス成分を採集し精製する方法、およびそれらからワクチンを作製する方法は、当該技術分野で数十年にわたり使用されており、したがって、よく知られており、十分に報告もされている。例えば、国際公開第２００７／００７３４４号パンフレット、米国特許第４，５２５，３４９号明細書、および（ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ，ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９７８，Ｍｏｎｔａｇｎｏｎ，Ｆａｎｇｅｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）を参照されたい。これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
一般に、各ポリオウイルス株は、別々のプロセスで培養され、例えば、３つの型のポリオウイルスを含む三価ワクチンを製造する場合、（不活化、ＩＰＶ用）ウイルスは、個別の量を調製するために、混合され、配合される。ある特定の実施形態では、例えば、一投与量当たりの最終的なワクチンは、例えば、各ＣＡＶＡ−ＰＶを異なる量で含み得る。ある特定の実施形態では、これは、１型ＣＡＶＡ（ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ）、２型ＣＡＶＡ（ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１）および３型ＣＡＶＡ（ＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ）株でなされ得る。ある特定の実施形態では、例えば、一投与量（例えば、０．５ｍｌ）当たりの最終的なワクチンは、例えば、標準製剤との比較による測定で、１型を１０〜８０、例えば４０Ｄ抗原単位（ＤＵ）、２型を２〜２０、８ＤＵ、および３型を８〜６４、例えば３２ＤＵ含み得る。
【００６５】
ＣＡＶＡ−ＰＶの不活化は、当業者によく知られた方法、例えば、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）による方法で行うことができる。例えば、（Ｊｉａｎｇ，Ｐｙｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）を参照されたい。ある特定の実施形態では、不活化はホルマリンにより、例えば、次のような方法で行うことができる：精製したウイルス浮遊液を０．２２μｍの膜で濾過し、マグネチックスターラーで２４時間一定の速度で撹拌しながら３７℃に加熱し、その後、ホルマリン溶液を加えて４０００個当たり１個の濃度を達成する。ウイルス浮遊液を３７℃に維持しながらマグネチックスターラーによる撹拌を最初の４日間継続する。６日目に、ウイルス浮遊液を０．２２ミクロンの膜で濾過し、１２日目まで、３７℃、浮遊状態で不活性化を続ける。不活性化されたウイルス浮遊液をホモジナイズし、例えば、４℃で保存し得る。この工程後、接種のための、濃縮したおよび／または最終のバッチを、例えば、所望の調合物を混合することによって調製してもよい。
【００６６】
ある特定の実施形態では、精製したＣＡＶＡ−ＰＶまたはウイルス成分を医薬組成物に配合する。これは、全て本開示を再検討後、当業者によく知られた通常の方法により、様々な方法で、様々な緩衝剤を用いて行うことができる。一般に、それにはポリオウイルスを医薬的に許容される組成物に導入する必要があり、ポリオウイルスと少なくとも医薬的に許容される賦形剤を含む。そのような組成物は当業者に知られた条件下で調製することができ、ある特定の実施形態では、ヒトへの投与に適している。ある特定の実施形態では、組成物は、緩衝培地を含み得る。その培地は任意選択的にＭ−１９９培地であってよく、ある特定の登録された従来のＩＰＶ用の製剤緩衝剤として使用されている。さらに、リン酸緩衝生理食塩水を使用することができ、最終の投与製剤は、抗菌性保存剤として、例えば、一投与量当たり、０．５％の２−フェノキシエタノールと、最大０．０２％のホルムアルデヒドを含み得る。
【００６７】
医薬的に許容される担体または賦形剤および希釈剤は当該技術分野ではよく知られており、様々な治療薬に広く使用されている。好ましくは、ワクチンに有効な担体が使用される。ある特定の実施形態では、ワクチンはさらにアジュバント、例えばミョウバンを含む。当該技術分野では、適用される抗原決定基に対する免疫応答を高めるアジュバントが知られている。
【００６８】
ヒトに投与するために、本発明は、ＣＡＶＡ−ＰＶおよび医薬的に許容される担体もしくは賦形剤を含む医薬組成物を使用してもよい。この場合、「医薬的に許容される」という用語は、担体もしくは賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない、または有害な効果を引き起こさないことを意味する。そのような医薬的に許容される担体または賦形剤は当該技術分野でよく知られている。
【００６９】
精製された不活化ＣＡＶＡ−ＰＶまたはその抗原部は滅菌溶液として処方され投与されることが好ましい。滅菌溶液は、例えば、除菌、または他の当該技術分野で知られた方法で調製することができる。その後、溶液は凍結乾燥または医薬投与容器に充填される。一般に、溶液のｐＨは、ｐＨ３．０〜９．５、例えば、ｐＨ５．０〜７．５である。ポリオウイルスまたはその免疫部は、適切な医薬的に許容される緩衝剤を含む溶液中に存在し、ポリオウイルスの溶液はまた塩を含み得る。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれる。ある特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。ある特定の実施形態では、ワクチンは、注射用製剤に製剤化され得る。これらの製剤は、有効量のポリオウイルスまたはその免疫部を含み、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥体であり、任意選択により、安定剤または賦形剤を含む。
【００７０】
本発明により得られるＣＡＶＡ−ＰＶワクチンは、１つの型のポリオウイルス（１、２もしくは３型）を含む単価ワクチン、２価ワクチン（２つの型のポリオウイルス、例えば、１型および２型、１型および３型、もしくは２型および３型）、または３価ワクチン（３つの型のポリオウイルス、例えば、１型、２型および３型）とし得る。
【００７１】
さらに、スタンドアロンＩＰＶとして使用されることに加えて、本発明により得られるＩＰＶベースのＣＡＶＡ−ＰＶを、通常の方法、例えば、従来のＩＰＶで通常行われているような、任意選択的に他のワクチン成分、例えば、ジフテリア、破傷風、百日咳、ヘモフィルス−インフルエンザ（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（Ｈｉｂ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの１種以上に対する成分を含み得る混合ワクチンの形態で、他のワクチンと組み合わせて使用することができる。（例えば、各種の成分および混合ワクチンは、“Ｖａｃｃｉｎｅｓ．”５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｗ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｏｆｆｉｔ，２００８，Ｓｅｃｔｉｏｎ２を参照されたい。例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２５にはＩＰＶワクチンが記載されている［Ｐｌｏｔｋｉｎ，ｐｐ６０５−６３０］。したがって、本発明により得られるＣＡＶＡ−ＰＶワクチンは、免疫の拡大されたプログラム（ＥＰＩ）での使用に適しており、そのプログラムのワクチンと組み合わせて使用することができる。従来のＩＰＶと同様、本発明のＣＡＶＡ−ＰＶワクチンは、単回投与として与えることができるが、適当な時間間隔でワクチンを複数回投与するプライム・ブースト法で与えることが好ましい。例えば、高い予防接種率（＞９０％）の国に対し、ＷＨＯが推奨しているように、スケジュールは生後２ヶ月で始めて３回投与する一次投与（例えば２、３および４ヶ月）を含むであろう。また、一次投与をより早く（例えば、６週、１０週および１４週のスケジュールで）始めるなら、ブースター投与は、少なくとも６ヶ月が経過した後、すなわち４回投与のスケジュールで行われるであろう。さらに、本発明によるＣＡＶＡ−ＰＶワクチンはまた、従来のＩＰＶの使用でＷＨＯが奨めているように、ＯＰＶと組み合わせて使用されるであろう。例えば、ＷＨＯは、現在ＯＰＶのみを使用している国の全てが、少なくとも１回のＩＰＶ投与をスケジュールに追加するよう奨めている。ポリオが流行している国や、ポリオが侵入し、その後拡がる恐れの高い国に対しては、誕生時、ＯＰＶを投与し（「ゼロ投与」と称する）、その後、３回のＯＰＶ投与と少なくとも１回のＩＰＶ投与を行う一次投与を行うことを奨めている。標準的な医療業務によって、最終的に最適な投与法が決定されるであろうが、一般的には、利用可能なＩＰＶのものと同じスキームに従うことになろう。
【００７２】
当業者には、本発明により得られるＣＡＶＡ−ＰＶワクチンの治療的に有効な量は、投与スケジュール、投与される組換えポリオウイルスの単位用量、組換え弱毒化ポリオウイルスが他の治療薬と組み合わせて投与されるか否か、および、患者の健康状態に依存することもまた明らかであろう。
【００７３】
本発明はまた、本発明により得られるＣＡＶＡ−ＰＶワクチンおよび医薬的に許容される担体を含む組成物を投与するためのキットを含む。キットは、本明細書に開示の組換え弱毒化ポリオウイルスを含む。キットは、任意選択により、医薬的に許容される担体、注射器などのアプリケーター、およびそれを使用するための指導材料をさらに含み得る。指導材料は、組換え弱毒化ポリオウイルスの投与の管理やウイルスの増殖に有用な情報を与えることができる。
【００７４】
明細書全体にわたって、特許、公開公報、技術論文および学術論文などの各種刊行物が括弧に入れて引用されており、それぞれの完全引用は明細書の最後に見出し得る。これらの引用刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本発明の他の実施形態、特徴および優位点を、以下の実施例を参照してさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００７６】
さらに詳しく説明せずとも、当業者であれば、ここまでの説明と、次の具体的実施例により、本発明を作成して使用し、かつ請求項に記載された方法を実施することができるであろう。したがって、次の実施例は、本発明のある特定の実施形態を具体的に示すが、本開示の残りの部分を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００７７】
実施例１：低温適応性ウイルス弱毒化（ＣＡＶＡ）の方法およびＣＡＶＡポリオウイルス（ＣＡＶＡ−ＰＶ）の作製
この実施例では、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株をＰＥＲ．Ｃ６細胞を用い、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｅｒｍｅｘｃｉｓＴＭ培地（化学的に定義された無血清培地、例えば、Ｌｏｎｚａから入手可能、ｃａｔ．＃ＢＥ０２−０３９Ｑ）において、低温（≦３０℃）、かつ低ＭＯＩ（０．０１）で３４代連続継代した。得られたウイルス集団を分析し、その集団の中で生理的温度（３７℃）で増殖障害を示し、低温（３０℃）で野生型の増殖を示す温度感受性ウイルスクローンを同定した。約１０００個のクローンをスクリーニングし、３７℃で増殖障害を示す温度感受性を示した３クローン（Ｇ１２Ｐ５、Ｆ９Ｐ４、およびＧ１１Ｐ３と命名）を見出した。増殖障害を、最大力価の親ウイルスと比べて１００〜１０００倍の低下と定義した。３クローンは、生理的温度でまだ増殖することができたが、力価は低下した。低温（３０℃）での３クローンの増殖動態は出発親株より速かった。温度感受性クローンの配列を決定し、３つの異なるクローン全体で、合計３１の変異があった。各クローンは１８のヌクレオチド変異を有し、そのうちのいくつかは、異なるクローンで共通し、いくつかは各クローンに特有であった。
【００７８】
新規の組換えポリオウイルス株（ここでは、低温適応性ウイルス弱毒化ポリオウイルス（ＣＡＶＡ−ＰＶと称する）を生成するために、３クローンで同定された３１全ての変異を、親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓの配列をバックボーンとして使用して、１つのゲノムに導入した。親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ配列を、ここでは、配列番号１として示す。ＣＡＶＡ−ＰＶ配列を合成し、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅをレスキューした。簡単に記載すると、組換え弱毒化ポリオウイルスＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株の配列を、ｃＤＮＡプラスミドの形態で合成的に作った。そこでは、ウイルスゲノム配列は、ウイルスＲＮＡの生成に必要なＴ７ファージのプロモーターの下流に直接入っている。レスキューには、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅゲノム配列を含むｃＤＮＡプラスミドを、ウイルスＲＮＡを作るＴ７ポリメラーゼを介して行われるインビトロ転写のテンプレートとして使用した。ウイルスＲＮＡは、その後、細胞のトランスフェクションおよびウイルスのレスキューに使用した。このレスキュー手順は当該技術分野でしばしば使用されており、例えば（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ，Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．１９８６）を参照されたい。  表１に、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅを作るために組み合わせた３１の変異を示す。図１はＣＡＶＡ法と、初代ＣＡＶＡ−ＰＶを作る方法を示す概観図である。
【００７９】
実施例２：他の１型ＰＶ株と比較した、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの増殖動態
浮遊ＰＥＲ．Ｃ６（ｓＰＥＲ．Ｃ６）細胞、生産細胞株、における３０および３７℃でのＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ  の増殖動態を他の１型ＰＶ（ＰＶ１）株と比較した。他のＰＶ１株はＢｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、Ｍａｈｏｎｅｙ、およびＳａｂｉｎ１であった。Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅは、次にＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの親株となるＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓの親株である。Ｍａｈｏｎｅｙは、神経毒性のある野生型ＰＶ株であり、一般にソークＩＰＶの１型成分のワクチン株として使用されている。Ｓａｂｉｎ１は弱毒化経口生ポリオウイルスワクチン（ＯＰＶ）用として使用されている弱毒化株である。浮遊ＰＥＲ．Ｃ６細胞の細胞密度は、感染時、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地において１０×１０６個／ｍｌであった。細胞をＭＯＩ２で感染させ、感染は１回行った（Ｎ＝１）。ウイルス採集物をＴＣＩＤ５０アッセイにより３０℃で滴定し、１ｍｌ当たりの組織培養感染量５０％（ＴＣＩＤ５０）である、試料の５０％が感染を示す感染量（ＣＰＥ）を得た。ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞における複製動態の折れ線グラフを図２に示す。３０℃における他のＰＶ１株との比較で、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは、野生型増殖動態、またはより速い増殖を示した。それどころか、驚いたことに、３７℃では、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは、３つの異なる温度感受性クローンの変異を組み合わせたことによる相乗累積効果を示す有意な複製は示さなかった。他のＰＶ１株は全て正常に増殖し、３７℃で、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞において同様の増殖挙動を示した。
【００８０】
ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＣＡＶＡ−ＰＶおよびＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓの増殖動態を３つの独立した実験でさらに評価し、３０℃および３７℃での平均力価の経時変化をプロットした。平均力価を図３にプロットし、エラーバーで、平均値からの標準偏差を示した。増殖曲線は３０℃では両ウイルスで似た動態を示したが、３７℃ではＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは複製しない。なお、このアッセイではインプットしたウイルスのみ測定している。親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株は３７℃では増殖障害を示さなかった。ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの３０℃での平均最大力価は、９．８２Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、これは、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞において野生型株で得られた力価と類似している（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｅｄｏ−Ｍａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【００８１】
実施例３：Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ出発ウイルスと比較した、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの各種細胞株における増殖動態
成功する感染は、ウイルスと宿主細胞との複雑な相互作用であり、したがって、温度感受性は宿主細胞の因子によって影響を受ける可能性がある。したがって、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅが生理的条件で複製する能力がないことを確認するため、様々な哺乳動物の細胞株の集団でウイルスの増殖を調べた。
【００８２】
図４、５および６は、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅおよびＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓのＨＥＫ２９３細胞、Ｌ２０Ｂ細胞およびＨｅＬａ細胞における複製動態をそれぞれ示す。各細胞株について、１×１０６個の細胞を、ＤＭＥＭ培地＋１％ＢＣＳ中、ＭＯＩ２で、３種の異なる温度（３０℃、３７℃および３９．５℃）で感染させた。３０℃でＨｅｌａＲ１９細胞によるプラークアッセイを行い、ウイルス力価を定量した。これにより、ウイルス採集物のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の数が得られる。この結果、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは３７℃または３９．５℃では３種類の細胞株の全てで複製しないことが確認された。しかしながら、３０℃では、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの増殖動態は、親ＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓＰＶ株と類似している。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株は、いかなる温度でも、全ての細胞株で増殖障害を示さないが、３９．５℃では、より低い温度と比べて、力価が僅かに低下する。
【００８３】
図７、８および９は、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅおよびＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓのベロ細胞、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞および接着性ＰＥＲ．Ｃ６（ａｄＰＥＲ．Ｃ６）細胞における複製動態をそれぞれ示す。これらの感染は、ＭＥＭ培地＋５％ＦＢＳ（ベロ細胞およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞）またはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋４．９ｍＭＭｇＣｌ２（ａｄＰＥＲ．Ｃ６）中、ＭＯＩ２で、３０℃または３７℃で行った。ウイルス採集量を３０℃でＴＣＩＤ５０アッセイにより滴定した。ベロおよびａｄＰＥＲ．Ｃ６での結果は以前観察された結果と同じであった：ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは３０℃で、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株に匹敵する複製をしただけである。再び、３７℃では、複製の欠如が観察された。
【００８４】
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞株（図８）では、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅは両温度で複製することができなかった。この細胞は、神経上皮腫由来のヒト神経細胞であり、神経毒性のインビトロモデルとして使用されている（Ｊａｈａｎ，Ｗｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。これは、ウイルス株の神経弱毒化用のインビトロでの有効な予測アッセイではないが、３０℃および３７℃の両方で、この細胞株においてＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅのウイルス増殖が阻害されたことは、神経細胞株において複製することができないことを示し、神経弱毒化を予測し得る。
【００８５】
実施例４：ＣＤ１５５遺伝子導入マウスにおける神経毒性試験
インビトロの温度感受性表現型が神経弱毒化につながるか否かを調べるために、インビボのＣＤ１５５遺伝子導入マウスモデルを使用した（Ｋｏｉｋｅ，Ｔａｙａ  ｅｔ  ａｌ．１９９１）。遺伝子導入マウスを、ＰＶ感染に対する感受性を高めるポリオウイルス受容体（ＰＶＲまたはＣＤ１５５）が発現するように、ＣＤ１５５遺伝子導入マウスを遺伝子学的に改変する。ＣＤ１５５マウスにＣＡＶＡ−ＰＶ株および他の選択したＰＶ株を感染させた。マウスの脳内（ｉ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）に量を変えて感染させ、所与の試験群のマウスの５０％が麻痺を引き起こすか、致死させるのに必要な感染単位数（ＴＣＩＤ５０で表される）に相当する、（麻痺または）致死量５０（（Ｐ）ＬＤ５０）を求めた。（Ｐ）ＬＤ５０が小さいほど、ウイルスの神経毒性はより大きい。表２は、インビボでの神経毒性試験の結果を示す。ＣＡＶＡ−ＰＶ（活性なＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ）では、マウスに投与されたウイルスの最大量でも、注入したどのマウスにも麻痺の兆候は見られず、したがって、（Ｐ）ＬＤ５０は投与し得る最大量を超える（＞）。神経毒性を示すものとして、他のＰＶウイルス株の（Ｐ）ＬＤ５０も調べられた。ＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓおよびＢｒｕｎｈｉｌｄｅはＣＡＶＡ−ＰＶの親株であり、一方、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１、ＳａｕｋｅｔｔおよびＳａｂｉｎウイルスはそれぞれＩＰＶおよびＯＰＶのワクチン株である。Ｍａｈｏｎｅｙは最も毒性が高く、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｓａｕｋｅｔｔ、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、ＭＥＦ−１およびＳａｂｉｎ株と続く。これは、これらの株の文献による神経毒性のデータと同じである。ＣＡＶＡ−ＰＶは野生型のどの株よりも神経毒性が少ない。ＣＡＶＡ−ＰＶは、脳内投与ルート（神経細胞を破壊し、麻痺を発症させるウイルスの能力を測定するために、ここで使用されている最も感受性の高いルート）のＭａｈｏｎｅｙの少なくとも１００万倍弱毒化されている。ＣＡＶＡ−ＰＶは、一部弱毒化されている株であるＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓの少なくとも１００倍弱毒化されている。このモデルはＳａｂｉｎとＣＡＶＡ株を十分に区別することができるだけの感受性を有さないため、ＣＡＶＡ株がＳａｂｉｎより弱毒化されていることを確認するためには、神経毒性を測定するためのより感受性の高いモデルを使用する必要があるであろう。しかしながら、Ｓａｂｉｎ株を最大用量投与したマウスの中に麻痺を発症したものがあり、一方、ＣＡＶＡ株ではなかった。
【００８６】
同じ神経毒性モデルで、２つの知られた弱毒化ウイルス（ＲＩＰＯおよびＳａｂｉｎ１）の（Ｐ）ＬＤ５０が、それぞれ＞１０８および５×１０７ＰＦＵであると報告されている（Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊａｈａｎ，Ｗｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。しかしながら、これらの値は、同じ実験で測定されていない。したがって、これらの（Ｐ）ＬＤ５０を直接比較するときは注意しなければならない。ＲＩＰＯ株は、悪性神経膠腫治療の臨床試験での使用が認められた弱毒化腫瘍崩壊ポリオウイルス株である（Ｊａｈａｎ，Ｗｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。ＣＡＶＡ−ＰＶ株は、これらの弱毒化株と類似の行動をする。実際、ＣＡＶＡ−ＰＶ株を可能な最大量感染させたマウスはいかなる病気の兆候も示さなかった。これは他の弱毒化ウイルス（例えば、ＯＰＶの１型成分であるＳａｂｉｎ１、毎年何百万人もの子供に投与されている認可生弱毒化ワクチン）では必ずしも当てはまらない。このように、この神経毒性モデルにおいて、ＣＡＶＡ−ＰＶが大きく弱毒化されていることが示される。
【００８７】
実施例５：生産条件下のＣＡＶＡ−ＰＶの遺伝子安定性
ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株を、想定される生産条件下、小規模で継代し（Ｐｅｒｍｅｘｃｉｓ培地中、細胞密度１０×１０６ｖｃ／ｍｌのｓＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＭＯＩ１、３０℃）、２４ｈｐｉで採集した。継代は、理論的な商業生産バッチを５代超える８回行った。これらの継代後、全ゲノムの配列を決定した。ウイルスに導入された３１の変異のどれも元に戻らなかった。継代後の全ゲノムは、３Ａ遺伝子中の５２０６位のヌクレオチドで、アミノ酸の置換を引き起こす混合集団を示した１つのヌクレオチドを除いて出発ストックと同じであった。ポリオウイルスのＲＮＡポリメラーゼのエラー率が大きいため、この変異はランダムであり、温度感受性（および弱毒化）表現型の転換を引き起こすことはないと思われる。その後、本発明者は、複製動態を行うことによって温度感受性表現型を確認し、８継代したＣＡＶＡ−ＰＶが３０℃および３７℃の両方でＣＡＶＡ−ＰＶ出発ストックと似た増殖曲線を示すことを観察した（図１０）。このように、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅの温度感受性表現型、インビトロでの神経弱毒化は、生産条件下での複数回の継代後も安定である。このことは、ＣＡＶＡ−ＰＶを商業利用のバッチ生産の製造方法における使用に適したものとするであろう。
【００８８】
想定されるワクチン株、すなわち、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔを使用して同じ遺伝子安定性試験を行った。ここでは、ウイルスを、想定される生産条件下、小規模で３回（ｎ＝３）継代した（Ｐｅｒｍｅｘｃｉｓ培地中、細胞密度１０×１０６ｖｃ／ｍｌのｓＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＭＯＩ１、３０℃、２４ｈｐｉで採集）。継代の数は５で、それは理論的な商業ロットを２代超えるものである。図１１は、出発ストックと比較した、継代ウイルス全てのインビトロでの表現型を示す。全てのウイルスが、温度感受性表現型、およびインビボでの弱毒化を保持し、ＰＬＤ５０は、拡大した継代後も３血清型でなお＞１０８であった。図１１の継代ウイルスの配列を決定したところ、僅かに数個の変異が起こっており、上記のように、これらの変異はインビボおよびインビトロでの弱毒化に影響するものではなかった。
【００８９】
実施例６：従来のＩＰＶ抗原プロファイルのＣＡＶＡ−ＰＶへの導入
従来のＩＰＶと同じ免疫プロファイルを示すことができるＣＡＶＡ−ＰＶベースのＩＰＶを生産するために、数例のウイルスのカプシドをコードする配列を、元のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅカプシドをコードする配列と置き換えることによって、ＣＡＶＡ−ＰＶゲノムのバックグラウンドに挿入した。このカプシドの交換はＣＡＶＡ−ＰＶに意図的に遺伝子操作した３１の変異のうちの７つを除くものである。カプシドの交換はまずコンピューターで設計し、その結果として、新規のゲノムを化学的に合成してＤＮＡを作る。プラスミドＤＮＡが合成されたなら（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに外部委託）、これを使用して、インビトロでの転写によりウイルスＲＮＡを作製し、その結果として、トランスフェクションにより異なる新規の組換えＣＡＶＡ−ＰＶをレスキューする。得られたワクチン株をＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔと名付けた。これらはそれぞれ、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔのカプシドを含む。ＰＶ１型株Ｍａｈｏｎｅｙ（配列番号２）、ＰＶ２型株ＭＥＦ−１（配列番号：３）およびＰＶ３型株Ｓａｕｋｅｔｔ（配列番号：４）の代表的なカプシドのアミノ酸配列を本明細書に示す。図１２にこれらの異なるＣＡＶＡ−ＰＶワクチン株の概観図を示す。
【００９０】
実施例７：親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株と比較した、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔのｓＰＥＲ．Ｃ６細胞における増殖動態
３０および３７℃の生産細胞種の浮遊ＰＥＲ．Ｃ６（ｓＰＥＲ．Ｃ６）細胞におけるＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔの増殖動態を、ＰＶ１Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓの増殖と比較した。感染時の浮遊ＰＥＲ．Ｃ６細胞の細胞密度は、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地において１０×１０６個／ｍｌであった。細胞をＭＯＩ１で感染させ、感染は、ＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔおよびＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓで２回（Ｎ＝２）、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙおよびＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１で３回（Ｎ＝３）行った。ウイルス採集物をＴＣＩＤ５０アッセイにより３０℃で滴定した。ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞中の複製動態の折れ線グラフを図１３に示す。３０℃における親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株との比較で、ＣＡＶＡ−ＰＶは野生型の増殖動態を示した。エラーバーで平均値からの標準偏差を示す。それどころか、３７℃では、ＣＡＶＡ−ＰＶは、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅでも観察されたように、実質的な複製は示さず、ウイルスの温度感受性がカプシド領域の外の変異に存在することを示した。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株は正常に複製し、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞中、３７℃で、同様の増殖挙動を示した。
【００９１】
ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔの３０℃での平均最大力価は、それぞれ９．９４、９．９１および９．７４Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、これは、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞において野生型株で得られた力価と類似している（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｅｄｏ−Ｍａｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【００９２】
実施例８：従来のＩＰＶ株Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔと比較した、ｓＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔのインビトロでの抗原量
ＩＰＶ投与は、インビトロでのＤ−抗原ＥＬＩＳＡ法（Ｂｅａｌｅ  １９６１）によって定量されるＤ−抗原単位（ＤＵ）に基づいて、ヨーロッパ薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）モノグラフ０２１４に記載されるように行われる。   野生型ＩＰＶでは、ワクチンの１回の投与量は、不活化Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔウイルスでそれぞれ４０、８および３２ＤＵを含むことになっており、それらはワクチン接種者に防御免疫反応を誘発する用量に相当する（Ｇｒａｓｓｌｙ  ２０１４）。活性なＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔウイルスのＤ−抗原量、およびしたがって間接的に免疫原性効力をＤ−抗原ＥＬＩＳＡアッセイにより測定し、従来のＩＰＶ株、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１およびＳａｕｋｅｔｔと比較した。感染は、１０×１０６個／ｍｌの細胞密度の浮遊ＰＥＲ．Ｃ６細胞で、ＭＯＩ１で行った。感染温度はＣＡＶＡ−ＰＶ株で３０℃、野生型株で３５℃とした。これは従来のＩＰＶの生産温度である。
【００９３】
表３は、それらのウイルスで得られた、感染採集物１ミリリットル当たり（ＤＵ／ｍｌ）、および１感染単位当たり（ＤＵ／ＴＣＩＤ５０）で表した、Ｄ−抗原値を示している。１ミリリットル当たりのＤ−抗原性（ＤＵ／ｍｌ）は、試料中に存在するウイルス濃度（力価またはＴＣＩＤ５０／ｍｌ）に依存するので、ＣＡＶＡ−ＰＶ株対野生型株の１感染単位当たりの特異抗原量を算出した。これは種の公正な比較に相当する。特異抗原量はＣＡＶＡ−ＰＶ株対それと対応する野生型株で似ており、ＣＡＶＡ−ＰＶとそれと対応する野生型の間に似た免疫原性プロファイルを期待し得ることを示している。ウイルスは同じカプシド配列を含むため、抗原性は似ていると予想され、これは、得られたＤ−抗原結果により裏付けられる。
【００９４】
実施例９：ラットにおける、不活化および精製されたＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔ  のインビボにおける免疫原性
ＣＡＶＡワクチン株：ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１およびＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔを精製し不活化した。精製は、想定される生産条件下（Ｐｅｒｍｅｘｃｉｓ培地中、細胞密度１０×１０６ｖｃ／ｍｌのｓＰＥＲ．Ｃ６細胞を含むローラーボトル内の２×２５０ｍｌ、ＭＯＩ１、３０℃）での感染からの浄化した粗採集物を使用し、２回の続くクロマトグラフィー工程によって行われた。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）をＳａｒｔｏｂｉｎｄ  Ｓカチオン膜を使用して行い、その後、抽出物をその結果としてサイズ排除クロマトグラフィー工程に使用し、さらなる精製（純化）と緩衝剤の交換を行った。不活化の前に、ＳＥＣ溶出液をＭ１９９およびグリシンを用いてコンディショニングした。不活化は、０．００９％ホルマリン（または３．３ｍＭホルミアルデヒド）を添加することによって行い、３７℃で１３日間インキュベートした。不活化６日目および１３日目に濾過した。不活化バルクを、ラットによるインビボでの免疫原性試験に使用した。メスのＷｉｓｔａｒラット（ｎ＝１０）からなる４つの群に、各不活化ＣＡＶＡワクチン株の１：１（ヒトの全用量）、１：２、１：４および１：１６の希釈液で免疫を付与した。ヒトの全用量は、１型、２型および３型でそれぞれ４０、８または３２Ｄ−抗原単位であり、それは従来のＩＰＶの用量である。ラットを２１日間放置し、その後、血液を採り、血清を、Ｓａｂｉｎウイルス（攻撃ウイルスとして）とＨｅｐ２Ｃ細胞を用いるウイルス中和アッセイに使用した。図１４は、不活化ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭＥＦ−１またはＣＡＶＡ−ＰＶＳａｕｋｅｔｔによる免疫付与後に、ラットで生起された中和抗体力価を示す。３種のワクチン株全てが、ワクチン総量の希釈による用量に応じて高力価の中和抗体の産生を誘発したことから、それらは免疫原性を有することを示した。
【００９５】
実施例１０：さらなるＣＡＶＡ−ＰＶ株の作製
３つの独立したクローンで生じた３１の変異（実施例１、表１を参照）を分析し、ＰＶ株の集団間での変異の保存性を調べた。本発明者は、ＣＡＶＡ−ＰＶで観察された温度感受性表現型の提示に大きな役割を果たしていると見られる１４の変異を同定した。これらを表４に示す。この表において、１つのアスタリスクはＣＡＶＡ−ＰＶに特有で、その位置のヌクレオチドがアライメントで使用されている、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、ならびにＢｒｕｎｈｉｌｄｅ、Ｍａｈｏｎｅｙ、Ｓａｂｉｎ１、Ｓａｂｉｎ２、Ｓａｂｉｎ３、ＭＥＦ−１、およびＳａｕｋｅｔｔの他のＰＶ株で保存されている変異を示している。この表において、２つのアスタリスクはＣＡＶＡ−ＰＶに特有で、その位置のヌクレオチドがアライメントで使用されている他の１型ＰＶ株、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ、Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ、ＭａｈｏｎｅｙおよびＳａｂｉｎ１の全てで保存されている変異を示している。ＣＡＶＡ−ＰＶの４１２０の位置でのヌクレオチドの変異はＳａｂｉｎ１と共通しているが、アライメントで使用されている他のＰＶ株の全てでその位置のヌクレオチドは保存されている。
【００９６】
本発明者は、温度感受性に対する効果を調べるために、表４に示す１４の変異を親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ配列に挿入した。実施例１に記載のようにしてウイルスを作製した。要約すると、１４変異を有するＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓゲノムを含む組換えｃＤＮＡプラスミドを合成した。得られたプラスミドをインビトロでの転写、およびその後のＲＮＡトランスフェクションに供した。３０℃または３７℃、ＭＯＩ１、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地において１ｍｌ当たり１０×１０６個の細胞密度で、細胞に感染させることによって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で複製動態を観察した。感染後、０、２、８、２４および４８時間で試料を採取し、滴定した。
【００９７】
図１５は、本実施例に記載するような１４の変異を有する新しいＣＡＶＡ−ＰＶ株、および実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株（３１の変異を有する）の増殖曲線を、それらの対応する野生型株（Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株）のものと比較して示す。Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株は、野生型株から予想されるように、３７℃および３０℃の両方で、感染後それぞれ１０時間および２４時間内以内に、力価がプラトーになる増殖曲線を示す。１４の変異の導入で、新しいＣＡＶＡ−ＰＶ株は、親株の２倍以上（すなわち３１）の変異を有する実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株に似た増殖表現型を示す。複製は３７℃で観察されず、一方、３０℃では、複製は野生型と同等であった。
【００９８】
これらの結果は、生理的温度における適応性の喪失が、これらの１４の変異で既に誘発され得ることを示している。さらに、上記の種々の実施形態に加えて、この実施例は、本発明のＣＡＶＡ−ＰＶ株のさらに他の実施形態、すなわち、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃で実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株を提供する。
【００９９】
実施例１１：異なる血清型を有する異なる親株からのＣＡＶＡ−ＰＶ株の生成
以上の実施例はいずれも、種々のＣＡＶＡ−ＰＶを生成するための出発株もしくは親株として、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株（一部弱毒化１型ＰＶ株）を使用することを記載している。本実施例では、２つの大きく異なる親株、すなわち、２型の神経毒性のある野生型ＭＥＦ−１株と、３型の神経毒性のあるＳａｂｉｎ３株をバックグラウンド（親）株として使用した。ＭＥＦ−１は、通常、従来のＩＰＶ製剤の２型免疫原として使用され、一方、Ｓａｂｉｎ３はＯＰＶ製剤の成分である。
【０１００】
温度感受性に対する効果を調べるために、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株の表４に示す１４の変異のうちの１３を、ＭＥＦ−１株（配列番号５；ＭＥＦ−１株は既に３４８１の位置にＡを含んでいるので、この位置は変異せず、したがって、１４変異でなく１３変異。）の対応するヌクレオチドの位置に挿入した。同様のことを、Ｓａｂｉｎ３のゲノム配列（配列番号８、Ｓａｂｉｎ３株は既に１６３および３４７３の位置にそれぞれＧおよびＡを含んでいるので、これらのヌクレオチドは変異せず、したがって、１４変異でなく１２変異。株に対するＣＡＶＡ変異の詳細な説明は表４を参照）を使用して行った。
【０１０１】
ＭＥＦ−１ウイルスおよびＳａｂｉｎ３ウイルスを実施例１に記載のようにして調製した。要約すると、１３および１２の変異を有するＭＥＦ−１およびＳａｂｉｎ３のゲノムを含む組換えｃＤＮＡプラスミドを最初に合成した。得られたプラスミドをインビトロでの転写、およびその後のＲＮＡトランスフェクションに供した。３０℃または３７℃、ＭＯＩ１、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地において１ｍｌ当たり１０×１０６個の細胞密度で、細胞に感染させることによって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で複製動態を観察した。感染後、０、２、８、２４および４８時間で試料を採取し、滴定した。
【０１０２】
図１６は、本実施例に記載するような１３の変異を有するＭＥＦ−１ベースの新しい株、および実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株（すなわち、３１の変異を有するＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株）の増殖曲線を、野生型ＭＥＦ−１株のものと比較して示す。ＭＥＦ−１親株は、野生型株から予想されるように、３７℃および３０℃の両方で、感染後それぞれ１０時間および２４時間内以内に、力価がプラトーになる増殖曲線を示す。１３の変異の導入で、新しいＭＥＦ−１ベースの株は、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓバックグラウンド株に基づき、かつ親株の２倍以上の変異を有する実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株に似た増殖表現型を示した。複製は３７℃で観察されず、一方、３０℃では、複製は野生型と同等であった。
【０１０３】
図１７は、本実施例に記載の１２の変異を有するＳａｂｉｎ３ベースの新しい株の増殖曲線を、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株（すなわち、３１の変異を有するＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株）、および弱毒化Ｓａｂｉｎ３株と比較して示す。Ｓａｂｉｎ３ＯＰＶ株は、３７℃および３０℃の両方で野生型ＰＶの増殖と同等の増殖曲線を示し、感染後それぞれ１０時間および２４時間内以内に、力価がプラトーになった。１２の変異の導入で、新しいＳａｂｉｎ３ベースの株は、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓバックグラウンド株に基づく実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株に似た増殖表現型を示した。複製は３７℃で観察されず、一方、３０℃では、複製は野生型と同等であった。
【０１０４】
データは、それぞれ１３および１２の変異を有する、新しいＭＥＦ−１およびＳａｂｉｎ３株もまた、ＣＡＶＡ−ＰＶ表現型を有し、したがって、本発明のＣＡＶＡ−ＰＶ株のさらなる実施形態、すなわち、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃で実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株であることを示す。したがって、合計で１４の変異（そのうちの１および２は既に新しいＭＥＦ−１親株およびＳａｂｉｎ３親株に存在する）は野生型ポリオウイルス株にＣＡＶＡ−ＰＶ増殖表現型を導入するのに十分である。本実施例は、さらなるＣＡＶＡ−ＰＶ株を作る代替の方法をさらに示すもので、そのような株は異なるポリオウイルス親株から調製し得ることを示している。特に、これらのデータは、本実施例の親株が２型の神経毒性があり、かつ野生型のＰＶ株、および３型弱毒化株であるので、親株が１型ＰＶ株、または野生種もしくは一部弱毒化された株である必要はないことを示している。この例の新規な株は、野生型ＭＥＦ−１カプシド配列を有し、したがって、２型ＰＶに対し安全で有効なＩＰＶの生成に直接使用することができる。また、このカプシドをＭａｈｏｎｅｙカプシドまたはＳａｕｋｅｔｔカプシドなどの他の野生型カプシドと交換する出発材料としても使用することができる。当業者もまた、この実施例が、表４に示す１４の変異（またはその一部）の、Ｍａｈｏｎｅｙ株、Ｓａｕｋｅｔｔ株、Ｓａｂｉｎ１株およびＳａｂｉｎ２株のゲノムの対応する位置への導入によって、ＩＰＶ生産用の安全で有効なワクチン株として使用することができるさらなるＣＡＶＡ−ＰＶ株が得られるであろうことを納得させるものであることを理解するであろう。
【０１０５】
実施例１２：ＥＭによるＣＡＶＡ−ＰＶ感染の定量化
３７℃でのＣＡＶＡ−ＰＶ株の滴定（ＴＣＩＤ５０）によるウイルス感染の定量化は、細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察をもたらさず、したがって、滴定は３０℃で行わなければならない。このことは、３７℃で感染中、感染単位の上昇を示さないＣＡＶＡ−ＰＶ株の複製動態曲線により裏付けられる（図２〜１１、１３、１５〜１７）。このことは、ウイルスがこの温度で複製できないことを示している。しかしながら３７℃での複製の阻害をさらに理解するため、本発明者はＰＶ感染の特性を示す代替法として、電子顕微鏡法（ＥＭ）を実施した。図１８は、１０×１０６個／ｍｌの細胞密度のｓＰＥＲ．Ｃ６細胞に、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙまたはＰＢＳ（モック感染）を使用して、ＭＯＩ１、３０および３７℃で感染させた後のＥＭの結果を示す。
【０１０６】
０．１Ｍカコジル緩衝液（ｐＨ７．４）中の１．５％グルタルアルデヒド中にＥＭ試料を固定し、１％四酸化オスミウムで染色した。試料をその後、０．１４Ｍカコジル緩衝液で洗浄し、３％寒天でペレット化し、その後、ペレットをエタノール系で徐々に脱水した。その後、試料を、酸化プロピレンおよびエポキシＬＸ−１１２樹脂（Ｌａｄｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１：１混合物に１時間、さらに、１００％エポキシＬＸ−１１２に１時間浸潤させ、その後、試料を６０℃で４８時間重合させた。厚さ５０ｎｍの細胞切片を切出し、炭素被覆したフォルムバーグリッド上に置き、７％酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で対比染色した。１２０ｋＶで動作するＴｅｃｎａｉ  １２  ＢｉｏＴｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ  ｃｏｍｐａｎｙ）を撮像に使用した。
【０１０７】
図１８のＥＭデータは、各感染の代表的な細胞を示す。３０℃でＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙを感染させた細胞は野生型Ｍａｈｏｎｅｙ株を感染させたものと酷似しており、多くの細胞が既に死滅し溶解するか、またはアポトーシスを起こしていた。アポトーシスを起こした細胞は収縮し、非常に暗い色を呈していた。これらのアポトーシスを起こした細胞はＥＲ膜の転位、およびウイルスに誘発されたベシクル形成を含んだ。細胞中のポリオウイルスの濃度が高いと、高度に構築されたウイルス格子が形成され得る。それは、ＭａｈｏｎｅｙおよびＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ（３０℃）試料で見られた。
【０１０８】
しかしながら、３７℃では、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ感染細胞は、ＰＶ感染に伴うこれらの特徴を示さなかった。実際、これらの細胞は健康であることを示し、試料中の細胞の全てで感染の兆候は認められなかった。３７℃でインキュベートされたＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ感染細胞は、ＰＢＳモック感染試料とよく似ていた。この３７℃でインキュベートした試料のＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ力価は、４．３２ＴＣＩＤ５０／ｍｌと測定され、それは、理論的インプットの値（既知の力価のインプットウイルスの添加量の計算したＭＯＩとして７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）より少なかった。しかしながら、実際、確かに、ＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙウイルスは感染の兆候を誘発せずに感染に加えられた。
【０１０９】
実施例１３：ｑＰＣＲによるＣＡＶＡ−ＰＶ感染の定量化
感染時のウイルスＲＮＡ濃度を測定するため、ＥＭに使用された試料（実施例１２）を定量ＰＣＲに供した。ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ単離キットを用いて、ウイルスＲＮＡを感染採集物から単離し、その後、ＲＴ−ｑＰＣＲのためにｐｏｗｅｒＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ  １  ｓｔｅｐ  Ｋｉｔを使用し、３Ｄポリメラーゼ遺伝子に結合するプライマーを使用した。図１９は、感染採集物の滴定によって観察されたｖＲＮＡ濃度を示す。ＣＡＶＡ−１  Ｍａｈｏｎｅｙ感染が３７℃で維持されるとウイルスＲＮＡ濃度は低下するが、これは感染温度が３０℃のときは当てはまらず、ｖＲＮＡの増加が観察される。したがって、ＲＮＡ複製に障害があり、３７℃では、複製が完全に阻害される可能性があると結論付けることができる。したがって、ＣＡＶＡ−ＰＶの複製阻害はＲＮＡ複製レベルで、または感染サイクルの早い時期に起こる。
【０１１０】
実施例１４：ＣＡＶＡ表現型を示さないＰＶの生成。
どの変異がＣＡＶＡ表現型に含まれるかをさらに理解するために、親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株のバックグラウンドの５’ＵＴＲに７つのＣＡＶＡ変異か、または非構造タンパク質に１７の変異を起こした新規の中間体ウイルスを構築した（配列番号１、これらの２つの領域のＣＡＶＡ変異は表４を参照されたい）。実施例６の−ＣＡＶＡ−ＰＶ株は、カプシドにおけるＣＡＶＡ変異がＣＡＶＡ表現型に影響を及ぼさずに除き得ることを既に示した。したがって、ここでは５’ＵＴＲ領域および非構造タンパク質領域の変異のみを調べた。中間体ウイルスの３０および３７℃における複製動態を試験し、親Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株、実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅおよび実施例６のＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙと比較した。
【０１１１】
中間体ウイルスを実施例１に記載のようにして調製した。要約すると、５’ＵＴＲに７つのＣＡＶＡ変異を有するか、非構造タンパク質に１７のＣＡＶＡ変異を有するＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓゲノムを含む組換えｃＤＮＡプラスミドをまず合成した。得られたプラスミドをインビトロでの転写、およびその後のＲＮＡトランスフェクションに供した。３０℃または３７℃、ＭＯＩ１、４ｍＭのＬ−グルタミンを添加したＰｅｒｍｅｘｃｉｓ培地において１ｍｌ当たり１０×１０６個の細胞密度で、細胞に感染させることによって、ＰＥＲ．Ｃ６細胞中で複製動態を観察した。感染後、０、２、８、２４および４８時間で試料を採取し、滴定した。
【０１１２】
図２０は、本実施例に記載するような変異を有するＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株に基づく新しい株、および実施例１のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株（すなわち、３１の変異を有するＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株）の増殖曲線を、野生型Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ株のものと比較して示す。中間体株は３７℃で障害のある増殖曲線を示し、複製はＢｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株と比べ阻止されているが、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅほどには阻止されていない。ここでは、中間体ウイルスは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株と比べて、増殖速度が遅く、最大力価も低い。３０℃では、中間体ウイルスは、Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ親株や、それぞれ実施例１および実施例６のＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株およびＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ株と同じ増殖曲線を示す。力価は感染後２４時間以内にプラトーになった。５’ＵＴＲまたは非構造変異の導入で、新しい株は、ＣＡＶＡ−ＰＶＢａｃｋｂｏｎｅ株およびＣＡＶＡ−ＰＶＭａｈｏｎｅｙ株と同じ表現を持たず、したがって、ＣＡＶＡ表現型は、両領域（５’ＵＴＲおよび非構造タンパク質）の変異が１つの親ゲノムに組み合わされた場合のみ、誘発させることができると結論付けることができる。
【０１１３】
【表１】
0006591461.tif 000002
【０１１４】
【表２】
0006591461.tif 000003
【０１１５】
【表３】
0006591461.tif 000004
【０１１６】
0006591461.tif 000005
【０１１７】
参考文献
米国特許文献：
米国特許第８，５４６，１２３号明細書（２０１３年１０月１日）．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”．Ｌｅｗｉｓ．
米国特許第４，５２５，３４９号明細書（１９８５年６月２５日）．“Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ”．ＭｏｎｔａｇｎｏｎおよびＦａｎｇｅｔ．
海外の特許文献：
国際公開第２００７／００７３４４号パンフレット（２００７年１月１８日）．“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｓａｂｉｎ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｏｆ  Ｐｏｌｉｏ  Ｖｉｒｕｓ”．Ｊａｉｎ，Ｃｈａｗｌａ，およびＫｕｍｒａｊ．
他の参考文献：
Ｂｅａｌｅ，Ａ．Ｊ．（１９６１）．“Ｔｈｅ  Ｄ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｐｏｌｉｏｖａｃｃｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｃｙ．”Ｌａｎｃｅｔ  ２（７２１３）：１１６６−１１６８．
Ｂｏｕｃｈａｒｄ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ．Ｈ．Ｌａｍ  ａｎｄ  Ｖ．Ｒ．Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ（１９９５）．“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｙｐｅ  １  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  Ｓａｂｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ．”Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９（８）：４９７２−４９７８．
Ｅｎｄｅｒｓ，Ｊ．，Ｆ．；Ｗｅｌｌｅｒ，Ｔ．，Ｈ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｆ．，Ｃ．（１９５２）．“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｏｆ  Ｂｒｕｎｈｉｌｄｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ．”Ｆｅｄ  Ｐｒｏｃ  １１：４６７．
Ｇｒａｓｓｌｙ，Ｎ．Ｃ．（２０１４）．“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  １  ｏｒ  ２  Ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．
Ｈａｗｋｅｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｔｒｏｙ（２０１２）．“Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．“Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（４９）：６９７１−６９７９．
Ｈｅｉｎｓｂｒｏｅｋ，Ｅ．ａｎｄ  Ｅ．Ｊ．Ｒｕｉｔｅｎｂｅｒｇ（２０１０）．“Ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎ  ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐａｒａｄｏｘ．”Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（２２）：３７７８−３７８３．
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．，Ｊ．Ｊ．Ｗｉｔｔｅ，Ｌ．Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｄ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９６４）．“Ｐａｒａｌｙｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｏｒａｌ  Ｐｏｌｉｏ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｊａｍａ  １９０：４１−４８．
Ｊａｈａｎ，Ｎ．，Ｅ．Ｗｉｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｓ．Ｍｕｅｌｌｅｒ（２０１１）．“Ａ  ｈｏｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ／ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｃｈｉｍｅｒａ，ＰＶ１（ＲＩＰＯ）．”Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５（１４）：７２２５−７２３５．
Ｊｉａｎｇ，Ｓ．Ｄ．，Ｄ．Ｐｙｅ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｃｏｘ（１９８６）．“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｐｉｏｌａｃｔｏｎｅ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  １４（２）：１０３−１０９．
Ｊｏｈｎ，Ｊ．（２００９）．“Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｐｏｌｉｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ．”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ８（１）：５−８．
Ｊｏｈｎ，Ｔ．Ｊ．（２００４）．“Ａ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｎｔｒｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐａｒａｌｙｔｉｃ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．”Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ  ８２（１）：５３−５７；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ５７−５８．
Ｋｏｉｋｅ，Ｓ．，Ｃ．Ｔａｙａ，Ｔ．Ｋｕｒａｔａ，Ｓ．Ａｂｅ，Ｉ．Ｉｓｅ，Ｈ．Ｙｏｎｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ａ．Ｎｏｍｏｔｏ（１９９１）．“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ  ｔｏ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８８（３）：９５１−９５５．
Ｌｉａｏ，Ｇ．，Ｒ．Ｌｉ，Ｃ．Ｌｉ，Ｍ．Ｓｕｎ，Ｙ．Ｌｉ，Ｊ．Ｃｈｕ，Ｓ．Ｊｉａｎｇ  ａｎｄ  Ｑ．Ｌｉ（２０１２）．“Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｍａｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓａｂｉｎ  ｓｔｒａｉｎｓ：ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．”Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０５（２）：２３７−２４３．
Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｋ．，Ｓ．Ｐｅｌｋｏｗｓｋｉ，Ｄ．Ａｔｈｅｒｌｙ，Ｒ．Ｓｉｔｒｉｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ（２０１３）．“Ｈｅｘａｖａｌｅｎｔ  ＩＰＶ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃ−ｓｅｃｔｏｒ  ｍａｒｋｅｔｓ  ｏｆ  ｌｏｗ−ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：Ａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｖｉｅｗ．”Ｈｕｍ  Ｖａｃｃｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ９（９）．
Ｍｉｎｏｒ，Ｐ．Ｄ．（１９９９）．“Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １９９９：１−１７．
Ｍｏｎｔａｇｎｏｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｂ．Ｆａｎｇｅｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｆａｌｑｕｅｔ（１９８４）．“Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ−ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｖｅｒｏ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ．”Ｒｅｖ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ６  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ３４１−３４４．
Ｏｋａｄａ，Ｋ．，Ｃ．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｙ．Ｋｉｎｏ，Ｔ．Ｏｚａｋｉ，Ｍ．Ｈｉｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ｕｅｄａ（２０１３）．“Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ａｎｄ  ＩＩＩ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−Ｔｅｔａｎｕｓ−Ａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｏｌｉｏ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｓａｂｉｎ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＤＴａＰ−ｓＩＰＶ）．”Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０８（２）：２７５−２８３．
Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｊ．Ｋ．（２０１０）．“Ｉｎｎａｔｅ  ｈｏｓｔ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｖｉｒａｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ：ｌｅｓｓｏｎｓ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ．”Ａｄｖ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ７７：８５−１１８．
Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ，Ｖ．Ｒ．（２００６）．“Ｏｎｅ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４４（１）：９−１６．
Ｒｅｓｉｋ，Ｓ．，Ａ．Ｔｅｊｅｄａ，Ｒ．Ｗ．Ｓｕｔｔｅｒ，Ｍ．Ｄｉａｚ，Ｌ．Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ，Ｎ．Ａｌｅｍａｎｉ，Ｇ．Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｌ．Ｈ．Ｈｕｎｇ，Ａ．Ｌ．Ｋａｈｎ，Ａ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｌａｎｄａｖｅｒｄｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｂ．Ａｙｌｗａｒｄ（２０１３）．“Ｐｒｉｍｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ａ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６８（５）：４１６−４２４．
Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．（１９５６）．“Ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｌｉｖｅ−ｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．”Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  １６２（１８）：１５８９−１５９６．
Ｓａｂｉｎ，Ａ．Ｂ．Ｂ．，Ｌ．Ｒ．（１９７３）．“Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｓａｂｉｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｏｒａｌ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １：１１５−１１８．
Ｓａｌｋ，Ｊ．Ｅ．（１９５３）．“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｏｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ．Ｉ．Ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ．”Ｊ  Ａｍ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  １５１（１３）：１０８１−１０９８．
Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｄ．Ｅｄｏ−Ｍａｔａｓ，Ｊ．Ｈ．Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｋｏｌｄｉｊｋ，Ｖ．Ｋｌａｒｅｎ，Ｍ．Ｔｕｒｋ，Ａ．Ｌｕｉｔｊｅｎｓ，Ｗ．Ａ．Ｂａｋｋｅｒ，Ｆ．Ｕｙｔｄｅｈａａｇ，Ｊ．Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．Ａ．Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｈ．Ｓｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ（２０１２）．“ＰＥＲ．Ｃ６（（Ｒ））ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｌｏｗ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｇｏｏｄｓ  ｏｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｗｏｒｌｄ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ．”Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１（５）：８５０−８５６．
Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｙ．Ｌｉｕ，Ａ．Ｂｒａｎｄｊｅｓ，Ｖ．ｖａｎ  Ｈｏｅｋ，Ｉ．ｄｅ  Ｌｏｓ  Ｒｉｏｓ  Ｏａｋｅｓ，Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ｅ．Ｗｉｍｍｅｒ，Ｊ．Ｈ．Ｃｕｓｔｅｒｓ，Ｈ．Ｓｃｈｕｉｔｅｍａｋｅｒ，Ｊ．Ｃｅｌｌｏ  ａｎｄ  Ｄ．Ｅｄｏ−Ｍａｔａｓ（２０１５）．“Ｂｒｕｎｅｎｄｅｒｓ：Ａ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｈｉｓｔｏｒｉｃ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎ．”Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．
Ｓｋｅｒｎ，Ｔ．ａｎｄ  Ｈ．Ｄ．Ｌｉｅｂｉｇ（１９９４）．“Ｐｉｃｏｒｎａｉｎｓ  ２Ａ  ａｎｄ  ３Ｃ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２４４：５８３−５９５．
Ｔｏｙｏｄａ，Ｈ．，Ｍ．Ｋｏｈａｒａ，Ｙ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｔ．Ｓｕｇａｎｕｍａ，Ｔ．Ｏｍａｔａ，Ｎ．Ｉｍｕｒａ  ａｎｄ  Ａ．Ｎｏｍｏｔｏ（１９８４）．“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ａｌｌ  ｔｈｒｅｅ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ，ｇｅｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７４（４）：５６１−５８５．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｒｆ，Ｓ．，Ｊ．Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｅ．Ｗｉｍｍｅｒ，Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ（１９８６）．“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ＲＮＡ  ｂｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８３（８）：２３３０−２３３４．
ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌ，Ａ．Ｌ．，Ｇ．ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｉｓ，Ｃ．Ａ．Ｈａｎｎｉｋ  ａｎｄ  Ｈ．Ｃｏｈｅｎ（１９７８）．“Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ａｎｄ  ｒａｂｉｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  ４１：１５９−１６８．
Ｖｅｒｄｉｊｋ，Ｐ．，Ｎ．Ｙ．Ｒｏｔｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ａ．Ｂａｋｋｅｒ（２０１１）．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｓａｂｉｎ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ．”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０（５）：６３５−６４４．
Ｗｅｓｔｄｉｊｋ，Ｊ．，Ｄ．Ｂｒｕｇｍａｎｓ，Ｊ．Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．ｖａｎ’ｔ  Ｏｅｖｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｂａｋｋｅｒ，Ｌ．Ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｋｅｒｓｔｅｎ（２０１１）．“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓａｂｉｎ  ｂａｓｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（１８）：３３９０−３３９７．
ＷＨＯ（１９８８）．Ｐｏｌｉｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００．Ｒｅｐ．Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４１．２８．Ｗ．Ｈ．Ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｇｅｎｅｖａ，ＷＨＯ．
ＷＨＯ（２００５）．Ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ｏｒａｌ  ｐｏｌｉｏ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｕｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｇｌｏｂａｌ  ｐｏｌｉｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ．Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｉｃｙ  Ｍａｋｅｒｓ  ｉｎ  ＯＰＶ−Ｕｓｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．Ｇｅｎｅｖａ，ＷＨＯ．
ＷＨＯ（２００６）．“Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｏｒａｌ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ．”Ｗｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｒｅｃ  ８１（１５）：１３７−１４４．
ＷＨＯ（２００９）．ＷＨＯ  ｇｌｏｂａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｐｌａｎ  ｔｏ  ｍｉｎｉｍｉｚｅ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｆａｃｉｌｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｉｓｋ  ａｆｔｅｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｓｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ＯＰＶ  ｕｓｅ．Ｇｅｎｅｖａ，ＷＨＯ．
Ｚｅｈｒｕｎｇ，Ｄ．（２０１０）．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｏｒｄａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅｓ（ＩＰＶ）ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｌｏｗ−  ａｎｄ  ｍｉｄｄｌｅ−ｉｎｃｏｍｅ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ．Ａｎ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｈｅ  ｃｏｓｔ  ｏｆ  ｒｏｕｔｉｎｅ  ＩＰＶ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ＰＡＴＨ．
また、本発明は以下を提供する。
［１］
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換えポリオウイルス株であって、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組換えポリオウイルス株。
［２］
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化１型ポリオウイルス株。
［３］
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化２型ポリオウイルス株。
［４］
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない、温度感受性の組換え弱毒化３型ポリオウイルス株。
［５］
［１］〜［４］のいずれか一項に記載のポリオウイルス株、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
［６］
第１、第２および第３の組換えポリオウイルス株を含む組成物であって、前記第１、第２および第３の各組換えポリオウイルス株は、３０℃の細胞培養で増殖することができ、３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができず、前記第１の組換えポリオウイルス株はＭａｈｏｎｅｙ株のカプシドを含み、前記第２の組換えポリオウイルス株はＭＥＦ−１株のカプシドを含み、かつ前記第３の組換えポリオウイルス株はＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドを含む組成物。
［７］
薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む［６に記載の組成物。
［８］
［５］〜［７］のいずれか一項に記載の組成物を含む不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）組成物であって、前記組成物中の前記ポリオウイルスが不活化されている組成物。
［９］
［８］に記載のＩＰＶ  組成物を含み、さらにジフテリア、破傷風、百日咳、ヘモフィルスインフルエンザ菌（Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（Ｈｉｂ）、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の１種以上の抗原を含む混合ワクチン組成物。
［１０］
急性灰白髄炎のワクチン接種方法であって、［８］または［９］の組成物を患者に投与することを含む方法。
［１１］
［１］〜［４］のいずれか一項に記載のポリオウイルス株のゲノムまたはゲノムの相補体をコードする配列を含む組換え核酸分子。
［１２］
［１］〜［４］のいずれか一項に記載のポリオウイルスを含む製剤の製造方法であって、ａ）［１］〜［４］のいずれか一項に記載のポリオウイルス株を細胞培養中の細胞に感染させる工程と、
ｂ）前記細胞培養中の前記細胞を培養して前記ポリオウイルスを増殖させる工程と
ｃ）前記細胞または前記細胞培養から前記ポリオウイルスを単離して、前記ポリオウイルスを含む製剤を得る工程と
を含む方法。
［１３］
前記ポリオウイルスを不活化する工程をさらに含む［１２］に記載の方法。
［１４］
ＩＰＶを調製する方法であって、［１３］に記載の方法、および医薬組成物に前記不活化ポリオウイルスを配合する工程を含む方法。
［１５］
３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない組換え弱毒化ポリオウイルス株を得る方法であって、
ａ）親ポリオウイルス株に対し３０℃以下で、３７℃で増殖障害を示すウイルスを生産するのに十分な継代を行う工程と、
ｂ）３７℃で増殖障害を示す２つ以上の異なる温度感受性クローンを単離する工程と、
ｃ）前記温度感受性クローンのゲノムの配列を解析する工程と、
ｄ）前記温度感受性クローンの配列と前記親ポリオウイルス株の配列とを比較して、前記温度感受性クローンのゲノムの配列における変異を同定する工程と、
ｅ）２つ以上の異なる温度感受性クローンの変異をポリオウイルス株のゲノムに組み合わせて前記組換え弱毒化ポリオウイルス株を合成する工程と、
ｆ）３０℃の細胞培養で増殖することができ、かつ３７℃の細胞培養では実質的に増殖することができない前記組換え弱毒化ポリオウイルス株をレスキューする工程と
を含む方法。
［１６］
ｇ）前記レスキューされた組換え弱毒化ポリオウイルス株のカプシドをコードする配列を、異なるポリオウイルス株のカプシドをコードする配列と置換する工程
をさらに含む［１５］に記載の方法。
［１７］
ｇ）前記レスキューされた組換え弱毒化ポリオウイルス株のカプシドをコードする配列を、Ｍａｈｏｎｅｙ、ＭＥＦ−１またはＳａｕｋｅｔｔ株のカプシドをコードする配列と置換する工程
をさらに含む［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
［１５］〜［１７］のいずれか一項に記載の方法によって得られる組換え弱毒化ポリオウイルス。
【図１】
0006591461.tif 000006
【図２】
0006591461.tif 000007
【図３】
0006591461.tif 000008
【図４−１】
0006591461.tif 000009
【図４−２】
0006591461.tif 000010
【図５−１】
0006591461.tif 000011
【図５−２】
0006591461.tif 000012
【図６−１】
0006591461.tif 000013
【図６−２】
0006591461.tif 000014
【図７】
0006591461.tif 000015
【図８】
0006591461.tif 000016
【図９】
0006591461.tif 000017
【図１０】
0006591461.tif 000018
【図１１】
0006591461.tif 000019
【図１２】
0006591461.tif 000020
【図１３】
0006591461.tif 000021
【図１４】
0006591461.tif 000022
【図１５】
0006591461.tif 000023
【図１６】
0006591461.tif 000024
【図１７】
0006591461.tif 000025
【図１８】
0006591461.tif 000026
【図１９】
0006591461.tif 000027
【図２０】
0006591461.tif 000028
【配列表】
0006591461000001.app