(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬的に許容される賦形剤内に、腫瘍細胞の免疫原性ストレスタンパク質及び不活性化された腫瘍細胞を含む医薬組成物または治療用ワクチンを調製するための、以下の工程i）〜v）：
i）培養培地中に腫瘍細胞を培養する工程；
ii）工程i）の腫瘍細胞をインビトロでストレスに曝し、これらの細胞がこのストレスに応答してストレスタンパク質を生成することを確認する工程、ここで、ストレスタンパク質は、ストレスを与えてから工程iv）又は工程v）までの数時間の時間間隔において得られる；
iii）ストレスを受けた腫瘍細胞およびストレスタンパク質を含む工程ii）の生成物を得るまたは回収する工程；
iv）ストレスを受けた腫瘍細胞およびストレスタンパク質を含む工程iii）で得た又は回収された生成物を、これらのストレスタンパク質を免疫原性にすることが可能なハプテン化をする工程；
v）工程ii）、iii）、またはiv）の工程の生成物における腫瘍細胞が非増殖性腫瘍細胞であるように、工程ii）、iii）、またはiv）の後に前記腫瘍細胞を不活性化する工程；並びに、
vi）ハプテン化されたストレスタンパク質および不活性化された腫瘍細胞を含む工程i）〜v）で得た生成物を、医薬的に許容される賦形剤と混合することによって、医薬組成物または治療用ワクチンを調製する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
前記工程ii）において、前記腫瘍細胞は増殖期またはプラトー期にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ii）の時間間隔は、5時間〜24時間の間である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程iv）において、前記生成物は、ジニトロフェニル、2,4-ジニトロフルオロベンゼン(DNFB)、スルファニル酸、N-ヨードアセチル-N'(5-スルホンナフチル)エチレンジアミン(EDA)、アニリン、及びp-アミノ安息香酸からなる群から選択される分子の存在下においてインビトロでインキュベートされる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ストレスは、放射線照射、熱ショック、化学的ショック、および代謝ストレスからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程i）における腫瘍細胞は、あらかじめ確立された細胞株由来の同種細胞、患者の細胞株由来の細胞、あらかじめ確立された同種株由来の細胞および／または患者由来の細胞の組み合わせ、患者の細胞、または同種細胞株由来の細胞および患者の細胞の組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ストレスは、1分〜20分にわたる0.25 gray〜25 grayの放射線照射、又は、20分〜100分にわたる38℃〜45℃の熱ショックを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記工程i）における腫瘍細胞は、同種細胞の細胞株由来であり、これらの細胞は、前記工程ii）によってストレスに曝されており、その後工程ii）から得た生成物全体が免疫原性にされている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程ii）において、培養した腫瘍細胞に、放射線照射、熱ショック、化学的ショック、および代謝ストレスからなる群から選択される少なくとも２つの異なるストレスが、これらのストレス間で遅滞期を置いて与えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は２つの細胞集団に適用され、ここで、一方の細胞集団に１種のストレスを施し他方の細胞集団に他の１種のストレスを施す、そして、得られた２種の生成物を同じ組成物に混合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程v）において、前記組成物に補助剤を添加する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ii）の時間間隔の間、細胞の培養物を３７℃に維持する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
免疫原性のハプテン化された腫瘍細胞ストレスタンパク質およびストレスタンパク質を生成した非増殖性腫瘍細胞、ここで、前記ストレスタンパク質は、放射線照射、熱、化学的、および代謝ストレスからなる群から選択されるストレスにより腫瘍細胞においてインビトロで誘導されたものである；並びに、
医薬的に許容される賦形剤；
を含む医薬組成物。
【請求項１４】
細胞株細胞、同種細胞株由来の細胞の組み合わせ、患者由来の細胞、および同種細胞株由来の細胞および患者由来の細胞の組み合わせからなる群から選択される細胞を含む組成物であって、
これらの細胞は、ハプテン化されたストレスタンパク質を有するかまたは含む非増殖性腫瘍細胞である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
熱ショックタンパク質、放射線耐性タンパク質、化学療法耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質からなる群から選択されるストレスタンパク質を含む、請求項１３又は１４に記載の組成物。
【請求項１６】
補助剤を更に含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
抗癌剤を調製するための、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
癌患者を治療するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記患者は、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される従来の抗癌治療プロトコルを用いて治療される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記患者は、化学療法および化学的ストレスにより誘導されたストレスタンパク質を用いて治療される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記患者は化学療法剤を用いる化学療法で治療され、且つ、前記ストレスタンパク質は同じ化学療法剤を用いる化学的ストレスにより誘導されたものである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記患者は放射線療法で治療され、且つ、前記ストレスタンパク質は放射線照射ストレスにより誘導されたものである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
免疫原性腫瘍細胞ストレスタンパク質および／または免疫原性ストレスタンパク質を含む非増殖性の腫瘍細胞を含む前記組成物の投与は、外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される従来の抗癌治療プロトコルに先立って実施される、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
105〜107個の腫瘍細胞の投与を少なくとも１回することを含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
各投与の間に1〜10日の間隔をあけて2、3、4、5、6、7、8、9、または10回投与することを含む、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HSPおよび／またはGRPといった種類のストレスタンパク質である「シャペロンタンパク質」その他の耐性メカニズムに関与するタンパク質（LRP、CTL4、PD-L1等）ベースの、癌治療に対する新規な治療アプローチに関する。本発明は、特に、医薬組成物または治療用ワクチンを調製する方法、かかる医薬組成物または治療用ワクチン、および癌の治療的処置に対する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、２つの防御メカニズム：迅速だが非特異的な自然免疫；および、遅いが特異的でかつ免疫記憶を有する獲得免疫、に基づく。これら２つの相補的なメカニズムは、細胞が媒介する免疫応答において直接的に細胞を動員する、または体液性免疫応答において（免疫グロブリン、サイトカインなどの種類の）活性分子を分泌することを介して細胞を動員することによって、体内への「侵略」に対し戦う能力を付与する。
【０００３】
免疫は、癌の発生および進行に大きく関与する。三相理論（three phases theory、3E）によると、癌発生のプロセスは、二重免疫機能、つまり、腫瘍細胞を破壊する目的の保護的免疫監視プロセス、排除メカニズムに応じた耐性癌細胞の「選択」に基づく。三相理論の最初の相である排除相では、免疫系が腫瘍増殖に対して戦い、腫瘍に関連する組織や環境の変化（非特異的な細胞（マクロファージ、NK、DC）の動員）、抗増殖、アポトーシス、血管新生抑制分子の分泌、サイトカインの産生、CD4およびCD8の動員および活性化を伴う。平衡相と呼ばれる第二相では、免疫系に応答して、「感受性」腫瘍細胞を排除し、最も耐性な細胞の免疫選択が起こる。発生する耐性のメカニズムは、アポトーシス、阻害サイトカイン（TGF-β、IL-10、PGE2、IDO）の分泌、抗原提示の変化（主要組織適合性複合体（MHC）クラスIの発現の部分的または完全な損失）、中和分子の分泌、およびMICAとMICBの発現、Tリンパ球の死を引き起こすFas-L、PD-L1の発現による細胞が介在する免疫系の「カウンター攻撃」に対する耐性である。この相において、破壊される腫瘍細胞の数と耐性細胞の数が平衡する。この平衡相は、治療中に観察される寛解相に対応する。これは、免疫防御系や治療に対抗する能力により最も毒性の強いクローンを選択するための選択相でもある。逃避相と呼ばれる第三相では、１つ又は複数の逃避手段が発達し、免疫系の様々な保護メカニズムに耐性の細胞が、いかなる制御も受けずに増殖する。そうして、癌細胞が生理的なエスケープ現象の臨床症状である腫瘍塊を進行させる。関連するエスケープ現象が、治療耐性現象における癌の進行ステージおよび転移ステージで見られる。
【０００４】
抗癌治療として、腫瘍を排除または減少することを主な目的とした外科手術があるが、この「物理的な」処置は、実際の癌発生のプロセスを阻害する効果はないので、癌の源を「排除する」目的の様々な異なる治療法によって補完するのが通常である。放射線療法は、腫瘍細胞の場合、急速に増殖する細胞のDNAを変化させることを意図する。放射線療法の副作用は二重にある、つまり、健康な細胞にも放射線照射されるので、それらの破壊または遺伝的変化が起こり、「癌化」につながる可能性があり、さらにシャペロンタンパク質またはシャペロン（HSP、GRP、等）の産生により、腫瘍細胞が放射線誘導性アポトーシスに対する耐性を獲得してエスケープ現象が起こることがある。化学療法は、細胞自体に作用する、あるいは、特定の代謝経路を阻害することのいずれかによって、腫瘍細胞を除去することを意図する。例として、DNAとの直接的な相互作用（求電子薬、インターカレーター剤、開裂剤）、DNAとの間接的な相互作用（代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤等のDNA合成阻害剤、紡錘体形成阻害剤）、血管新生阻害剤、プロテアソーム阻害剤が挙げられる。ここでも、腫瘍細胞による耐性メカニズムが進行し、多くの化学療法戦略にもかかわらず、再発現象が大きな腫瘍の増殖と共に観察される。これは、免疫系が関与する3E理論で説明したような、自然におこるエスケープ現象に類似すると考えられる適応性および細胞選択の証明となる。
【０００５】
免疫療法には、大量のエフェクターを与える受動免疫療法と、特異的免疫応答を誘導することを目的とする能動免疫療法がある。受動免疫療法は、受容体を遮断するため、細胞溶解を誘導するため、細胞毒性を刺激するため、アポトーシスの阻害を増強するために抗体を注入することをベースとする（セツキシマブ-アービタックス（登録商標）、アバスチン-ベバシズマブ（登録商標）、リツキシマブ-マブセラ（登録商標）等）。別の戦略として、サイトカイン（IL2、Infγ等）を使用して腫瘍に対する防御免疫応答を刺激することがある。能動免疫療法またはワクチン接種免疫の目的は、樹状細胞、TLRアゴニスト、腫瘍細胞溶解物、非増殖性腫瘍細胞（改変されているまたはされていない）の活性化による免疫系の活性化という異なる戦略により癌に対する免疫力を患者に付与することである。これらのアプローチは、新しく高度な治療的医療製品（advanced-therapy medicinal products：ATMP）を構成する。これらは有望で良好な結果をもたらすが、特に他の治療と組み合わせるとより有望で良好な結果をもたらす。米国食品医薬品局（FDA）により承認された最初の能動免疫療法的治療は、特異的腫瘍抗原の存在下での培養による患者のTリンパ球(TL)の活性化をベースとするSipuleucel-T Provenge（登録商標）である。しかし、これらの治療とともに用いると、免疫系が関与する3E理論的に説明されているような自然エスケープ現象に類似するエスケープ現象が見られる。
【０００６】
特異的かつ固有の効果をもたらすことができる、および／または併用治療戦略に寄与することができる、癌を治療するための新規な治療戦略を提供する必要性が依然として存在する。
【０００７】
複数の様々な異なる抗腫瘍メカニズムは全て、最終的には細胞溶解またはアポトーシスを起こすように、腫瘍細胞を直接的または間接的に攻撃するという基本的な戦略に基づく。よって、アポトーシス耐性因子が鍵になると思われる。というのは、アポトーシス耐性因子が逃避を直接的に誘導する（アポトーシス誘導の阻害）または腫瘍細胞を中間的な破壊メカニズムから保護することにより逃避を間接的に誘導するからである。
【０００８】
耐性現象、特に、アポトーシスに対する耐性における、「シャペロンタンパク質」またはストレスタンパク質の特定の役割をより良く理解するための手段を提供する多くの研究がある。特に、熱ショックタンパク質（HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP20、およびユビキチン）、GRP（グルコース調節タンパク質）、GRP94、GRP78（BiP）、およびGRP58（主に小胞体に局在する）の保護効果が知られている（これらは、ストレスタンパク質のファミリーに分類される）。また、GP170、VMP1、およびLRPなどの多剤耐性タンパク質（MRP）を含む様々な治療に対しより特異性の高い耐性（多剤耐性）因子が注目される。
【０００９】
特に熱ショックに対するストレス耐性のメカニズムは普遍的であり、全ての生物（細菌、植物、動物）が有する。HSPの機能は、「代謝攻撃」（低酸素、低炭水化物濃度、等）、積極的な物理的攻撃（熱、放射線）、または化学的／医薬的な攻撃の結果としての変性および「不適切な結合」の形成を阻害する分子複合体を形成することによって、特定のタンパク質および酵素を保護したり修復する作用を有するという特徴がある。
【００１０】
今日、治療標的としてHSPを使用するという新しい戦略がある。特にHSP90を阻害することを試みるためにいくつかの分子が開発されたが、結果は複合的であり毒性も高い。より高度な治療法の一つに、小分子17-AAG(タネスピマイシンまたは17-アリルアミノ-17-デメトキシゲルダナマイシン)を使用することが挙げられる（Len Neckers, Heatshock Protein 90: the cancer chaperone J Biosci 32(3) April. 2007, 517-530, Indian Academiy of Sciences）。これは、HSP90のシャペロン機能を阻害するもので、その臨床作用も有望であるが、副作用が多い。同様に、HSP90のATP部位の阻害剤である小分子Ganetespid（STA-9090）が、現在メラノーマで研究されており、HSP90の当該部位の機能や作用に対する他の分子も研究されている（ノボビオシン、シェフェルジン、アイソフォームの阻害剤、等）。HSP70に作用することにより、アポトーシスの阻害の増強について研究するという別の目的もある。検討中の物質として、ADD70（アミノ酸分子）、PES（2-フェニルエチレンスルホンアミド）、VER-155 008（アデノシン誘導体）MKT077（小分子）がある。最後に、HSP27およびクラステリンに対する「OGX-427アンチセンス」の使用も、いくつかの臨床研究の対象となっている。
【００１１】
マウスにおける腫瘍細胞に対する免疫因子としてのHSP70またはその誘導体の自家使用について更に参照する。A. Menoret and J. Le Pendu (Proteines de choc thermique et antigenes tumoraux/Heat Shock Proteins and Tumour Antigens, Medecine/Sciences 1994; 10: 665-71)には、精製HSP70調製物に対するマウスの免疫化について記載されており、HSP70が腫瘍ペプチド関連性の状態において免疫原性であることが明らかにされた。Wirth Detal (Ann. Med Vet. 2002, 146, 201-216)は、HSP調製物によるマウスのワクチン接種、あるいは腫瘍から誘導されたHSP70遺伝子の導入により、投与された自己腫瘍細胞に対する免疫化が起こり、既に発生している腫瘍の退縮が誘導されたことを示す研究について言及している。
【００１２】
しかし、現状では、これらのアプローチは、腫瘍細胞によって進行する保護メカニズムの「包括的なセット」を阻害することに焦点を当てた組み合わせ的戦略は提供しておらず、ストレスタンパク質の１つまたは複数のいずれかのみに焦点を当て特定の標的としているようだ。HSP90を阻害することにより、HSP27およびHSP70のような他のHSP（熱ショック応答）の分泌が刺激されること及び化学的保護が誘導されることによって、防御シグナルが生じる結果となり、これによりアポトーシスに対する耐性が増強されることがすでに言及されている（上記A. Menoret and J. Le Pendu 1994を参照）。
【００１３】
本発明の目的は、包括的かつ全体的なアプローチ、つまり、複数の耐性メカニズム、好ましくは腫瘍細胞によって進行するこれらのメカニズムの包括的なセット、に対し同時に作用することができるアプローチを提供することである。
【００１４】
本発明の目的は、このアプローチが、特に患者に適用される治療プロトコルの過程において、腫瘍細胞が生体内で受ける１つまたは複数のストレスに適合できるようにすることでもある。
【００１５】
本発明の目的は、細胞株の使用に関する標準化へのアプローチを提案することでもある。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、このアプローチが確実に、腫瘍細胞の種類および／また悪性度、特に、治療対象の患者の腫瘍細胞の種類および／また悪性度、を考慮に入れたものにすることでもある。
【００１７】
本発明の目的は、それ自体が治療プロトコルを構成してもよく、または別の治療プロトコルの補助的なプロトコルであってもよいアプローチを提案することでもある。
【００１８】
本発明の更なる目的は、患者特異的なアプローチを提案することでもある。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の目的は、前述の耐性因子（ストレスタンパク質）を発現する細胞を排除するために、特にハプテン化により、免疫原性にされたストレスタンパク質により免疫系を刺激することである。この免疫学的治療は、これらの耐性因子を発現し得る細胞を排除または制御することを目指す。提案される治療アプローチは、以下の点に基づき癌に対して使用することを特に意図する。
・腫瘍細胞は、自然に（免疫系により）または治療プロトコル（放射線、化学療法、免疫療法、等）により「ストレス」を受けたときに耐性を獲得するまたは逃避をするためのメカニズムを発展させること。
・この耐性メカニズムは、HSPやGRPのようなストレスタンパク質又は他の種類のタンパク質/糖タンパク質の関与を引き起こすこと。
・これらのストレスタンパク質は、ワクチン接種によって「免疫化」させる特定の条件下では免疫原性を有するものの、それ自体は元々生体内で免疫原性ではないこと。
・特異的な抗HSP（抗耐性因子）によるアプローチも、エスケープ現象を受けるようであること。
・タンパク質環境（補因子、基質、等）が、ワクチン接種による抗腫瘍防御効果を生じさせるために考慮すべき要素であるらしいこと。
【００２０】
従って、本発明は、特に、腫瘍細胞の培養物にインビトロでストレスを与えることによって誘導されたストレスタンパク質を含む組成物を製造するための方法に関する。より具体的には、前記方法は、このようなストレスタンパク質を免疫原性の形態で生成する、つまり、患者の免疫系により認識可能で、かつ、これらのタンパク質およびこのようなタンパク質を提示する腫瘍細胞に対する免疫応答を生ずるように誘導可能な形態で生成する。この方法は、好ましくは、腫瘍細胞を非増殖性にさせるための、腫瘍細胞の不活性化工程を含むことが有利である。また、本発明は、このようなタンパク質を含む組成物、特に医薬組成物または治療用ワクチンに関する。また、本発明は、主な治療として、または別の治療プロトコルとの組み合わせによる治療（特に、補助療法）として、このような組成物を投与することによる、癌に対する治療方法にも関する。
【００２１】
本発明は、腫瘍細胞にストレスを与える条件下に置くとこれらの腫瘍細胞が発現する複数または全てまたは大部分のストレスタンパク質を含む医薬組成物を調製可能にする方法に関する。この方法は、複数のストレスタンパク質を代表する生成物を得られるという利点があり、患者の免疫系が反応し得る更なる免疫原性因子を含む全範囲のストレスタンパク質を免疫原性にして医薬組成物に含めることを可能にし、そして、腫瘍細胞の全範囲を標的とし、免疫系および／または適用される治療による圧力下でこれらの腫瘍細胞によって種々に進行した耐性メカニズムに対抗するものである。
【００２２】
一般的に、これらのストレスタンパク質は、本発明にかかる組成物において、遊離状態、腫瘍細胞の膜（内膜を含む）と結合する状態、腫瘍細胞の表面に提示される状態、腫瘍細胞の内部に存在する状態、腫瘍細胞の断片または腫瘍ペプチドと結合する状態、のうちの１つまたは複数の形態で見られる。
【００２３】
従って、本発明にかかる組成物は、好ましくは、現時点またはある任意の時点までに開示される１つまたは複数の同定されたストレスタンパク質を含む。以下に、当業者に公知のファミリーをいくつか示す。
【００２４】
HSPは、その分子量により6つのファミリーに分類されるが、同じファミリー内であってもそれらの構造及び特性は、その起源により様々であるようだ。このように、（とりわけHSP72およびHSP73を含む）HSP70のうち、熱ショックに応答するもの（HSP70）と、熱ストレスによる影響が極めて弱いもの（HSP70）との間で区別ができる。
【００２５】
HSP25/HSP27は、正常細胞における発現は弱いが、腫瘍細胞において過剰に発現され、特定の治療に対する耐性獲得におけるある役割をし、増殖性腫瘍細胞の増殖及び発達を促進するだろうと思われる。別の働きとしては、カスパーゼ3に関与する経路、TNF-α等の生成における調節に相互作用することによるアポトーシスの阻害が考えられる。
【００２６】
HSP47のファミリーは近年に同定され、その役割は未だにあまり明らかでないが、特にコラーゲンの生成における結合組織の発達に主に関与するだろう。「熱ショックタンパク質」として、HSP47ファミリーは、腫瘍細胞の耐性に関与する、特に腫瘍の新生血管形成に関与する可能性がある。HSP40は、HSP70に関する「コシャペロン」の役割も有しているだろう。
【００２７】
HSP60（シャペロニン）は細菌で同定され（GroEL：Ｇrowth E. Coli large protein）、植物も見られる。これらのシャペロンタンパク質は、タンパク質構造の立体配座に関与する。HSPのこのファミリーは、免疫、特に自己免疫疾患における役割を有しているだろう。
【００２８】
HSP70のファミリーが最もよく研究されているファミリーの一つであり、HSP90と同様に最も一般的なファミリーである。「正常」状態の細胞によって発現されるか、またはストレス後に直接誘導されるかのいずれかによりいくつかのサブクラスが存在する。これらのHSPの特徴として、翻訳（折りたたみ）の間に、他のタンパク質と相互作用する能力、膜輸送への関与、シャペロンタンパク質としてのアポトーシスの阻害が挙げられる。HSP70のシャペロン活性は複雑であり、例えば、HSP40、Hip (Hsc Interactive Protein)、Hop (Hsc-HSP90 Organizing Protein)のようないくつかの因子が関与し、「シャペロン-基質」複合体の形成に必要なATPアーゼ活性を可能にする。HSP70の抗アポトーシス作用は、多面的であり、プロカスパーゼ9,8,3経路(阻害)、p53経路との相互作用（抗P53タンパク質の安定化)、プロアポトーシス因子（Bax）の阻害、チトクロームCの制御等における多くの阻害/活性化メカニズムが関与しているようだ。
【００２９】
HSP90は、最も構成的に発現し、全ての真核生物に存在する。また、それらは、ストレス下で過剰発現し、タンパク質の安定化および復元を標的とする。いくつかのアイソフォームが、場所、起源、および機能に応じて同定されている。二量化したHSP90は、コシャペロンと相互作用する能力を有し、これにより、細胞の腫瘍形質転換に関与する分子の変異および保護を可能にするタンパク質複合体を形成（特定のタンパク質を安定化）する、つまり、P90は、タンパク質を変性してから安定化させることによって、アポトーシスの調節（Bcl-2およびApaf-1の阻害）に関与し、細胞の増殖及び転移に関与し（hTERT,MMP2）、p53を阻害し、突然変異に関与する。
【００３０】
HSP110（または105）は、主にストレスの結果として誘導される。これらは、熱ショックに特に敏感なリボソームの保護に関与するだろう。それらの保護効果は、主にタンパク質凝集体の解離、つまりこれらのタンパク質の再活性化を可能にする再可溶化、である。HSP110は、同一の結合ドメインを有する、したがって、いくつか類似する特性を有するHSP70のサブグループであるようだ。
【００３１】
GRP（Glucose Regulated Protein、グルコース調節タンパク質）は、他のストレスタンパク質の主なグループである。通常、HSPに結合する。耐性のメカニズムにおけるGRPの主な役割は、タンパク質構造の保護に関する。従って、GRP78（BiP）は、通常、破壊対象のミスフォールドタンパク質に対するシャペロン的役割を有するだろう。このことにより癌細胞の耐性が説明される。「モータリン」という名で知られるGRP75は、変性後、正常細胞における抗増殖作用を有し、細胞の癌化に関与しつつ、一方で、アポトーシスの調節に関与するp53を不活性化させて反対の作用を引き起こすと考えられる。また、GPR94は、不完全にアセンブルされてその三次元的立体構造が不完全なタンパク質の保護にも関与する。HSP70と関連し、GPR94は特定の抗癌剤に対する耐性に関与する。
【００３２】
GP170、MPR（異なる7種がある）、LRP、そしてより最近ではVMP1など、「多剤耐性」として表記される他のタンパク質耐性因子も治療エスケープに関与する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、熱ストレスによるHSP70の発現の誘導を示すウェスタンブロットである。読みやすくするために、メインキャリブレーションスポットおよびHSP70スポットを線で囲み、HSP70スポットに参照番号1と付した。
【００３４】
【図２】図２は、熱ストレスによるHSP70の誘導およびHSP70のハプテン化を示すウェスタンブロットである。対照としてβアクチンのウェスタンブロットも並行して示す。読みやすくするために、メインスポットを線で囲んだ。参照番号は以下の通りである：HSP70（２）；ハプテン化HSP70 （３）；β-アクチン（４）；ハプテン化β-アクチン（５）；分子量マーカー（６）；37℃で1時間処理したCT26WT細胞（７）；42℃で1時間処理したCT26WT（８）；ストレスを与えハプテン化および放射線照射したワクチン剤（９）；分子量マーカー（１０）；37℃で1時間+37℃で14時間処理したCT26WT細胞（１１）；42℃で1時間+42℃で14時間処理したCT26WT細胞（１２）；ストレスを与えハプテン化および放射線照射したワクチン剤（１３）。
【００３５】
【図３】図３は、マウスで誘導した腫瘍の体積の経時的な変化を表すグラフであり、それぞれ、賦形剤を注射した対照マウス（「ビヒクル」を「Veh」と記載する）および本発明にかかるワクチン剤で処置したマウス（「「治療薬」を「The」と記載する）を示す。
【００３６】
【図４】図４は、マウスで誘導した腫瘍の体積の経時的な変化を表すグラフであり、それぞれ、賦形剤を注射した対照マウス（「ビヒクル」を「Veh」と記載する）および本発明にかかるワクチン剤で処置したマウス（「「治療薬」を「The」と記載する）を示す。
【００３７】
【図５】図５は、図１および図２に示す群と同じ群についての、切除時の誘導マウスの腫瘍の重量（ｇ）を表すグラフである（「ビヒクル」を「Veh」と記載し、「治療薬」を「The」と記載する）。
【００３８】
【図６】図６は、図１および図２に示す群と同じ群についての、切除時の誘導マウスの腫瘍の重量（ｇ）を表すグラフである（「ビヒクル」を「Veh」と記載し、「治療薬」を「The」と記載する）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
１．調製方法
本発明の目的は、以下の工程を含む、腫瘍細胞のストレスタンパク質を含む組成物を調製するための方法に関する：
i）培養培地中に腫瘍細胞を提供する（設ける）工程；
ii）工程i）の腫瘍細胞をストレスに曝し、これらの細胞がこのストレスに応答してストレスタンパク質を生成することを確認する工程；
iii）ストレスを受けた腫瘍細胞および／またはストレスタンパク質を得るまたは回収する工程；
iv）工程iii）で得たストレスを受けた腫瘍細胞および／またはストレスタンパク質を、これらのストレスタンパク質を免疫原性にすることが可能な分子またはプロセス、好ましくはハプテン化プロセスで処理する工程。
【００４０】
培養培地は、細胞の生存および／または成長または増殖を維持可能にする培地であってもよい。当業者に周知の培地を使用し得る。これらの培地は、一般に、ベースの培養培地「最小必須培地」を含む。「最小必須培地」は、血清または既定の成長因子を用いることにより１つまたは複数のマイトジェン因子を追加可能なら（「合成無血清」培地）、細胞の生存が可能なものである。例示目的で、従来の培地を以下に記載する：DMEM、EMEM、HBSS、EBSS、PBS、RPMI、および無血清細胞培養に使用される他の培地、PANSERIN、EX-CELL（登録商標）培地、等（グルタミン、インスリン、HAM等の栄養素を添加してもしなくてもよく、必要に応じて、血清および／または成長因子を追加してもよい）。
【００４１】
工程ii）は、好ましくは、増殖期またはプラトー期における腫瘍細胞を含む培養培地に適用される。当業者は、細胞がこれらの期のいずれかにあることを容易に判断できる。まず、一定期間後にこれらの期に達することができる培養条件を事前に決定できる。また、細胞増殖曲線、生存率、倍増期間、代謝産物アッセイ、または栄養消費等の手段によりこれらの期に達したことを決定することもできる。
【００４２】
ストレスは、インビトロで加える。ストレスは、腫瘍細胞が本発明に適切なレベルのストレスタンパク質を確実に産生するようにするために、例えば、患者に適用する抗癌プロトコルを考慮して、化学的または物理的かという意味で任意の種類であってもよく、ストレスを与える時間は与えるストレスの種類や性質に応じて変えてもよい。以下の方法を用いることができる。
・特に、約0.25 gray〜約25 grayの放射線照射、好ましくは低量、つまり、約1 gray〜約5 gray、例えば、約2 grayの放射線照射。照射時間は、約1分〜約20分、好ましくは、約1分〜約5分であってもよい。
・例えば、37℃超で、ストレスを誘導するのに十分な温度を緩やかにまたは急激に与える、熱ストレスタンパク質を生成する目的の熱ショック。この温度は、約38℃〜約45℃、好ましくは約40℃〜約43℃であってもよい。この温度を持続する時間は、約20分〜約100分、好ましくは約30分〜約60分であってもよい。温度上昇を約1分〜約5分、例えば、約3分持続させてもよい。
・ストレスを誘導するのに使用される物質による、化学的なストレスタンパク質を生産する目的の化学的ショック。使用可能な物質のなかでも、エタノール等のアルコール類（一般的に約10%〜約50%v/vの濃度で使用される）、化学療法で使用される抗腫瘍物質、特にアルキル化剤やインターカレート剤等の種類の、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、DNAを破壊するための薬剤、例えば、シスプラチン、が挙げられる。一実施形態では、想定される癌の種類または患者に適用されるプロトコルに標準的な化学療法プロトコルに使用される１つまたは複数のまたは全ての薬剤を使用する。接触時間は、約1時間〜約48時間、好ましくは約20時間〜約26時間の範囲であってもよい。また、これらの化学的ストレスの少なくとも２つを適用してもよい。
・例えば、低酸素、pH（特に、6.5を超えるpHへの酸性化）、腫瘍細胞の増殖または生存のために有用な物質、例えば、グルコースの欠乏、腫瘍細胞の増殖または生存のために不可決な物質、例えば、電解質（ナトリウム、カリウム、カルシウムのバランス、等）の欠乏といった代謝ストレス。また、これらの代謝ストレスの少なくとも２つを適用してもよい。
・上記各種のストレスの少なくとも２つの組み合わせ。
【００４３】
腫瘍細胞のアポトーシスまたは死を誘導せずストレスタンパク質を産生させるようにこれらの生細胞にストレスを与えることを目的として、上述のように各種ストレス条件を容易に決定することができる。特に、これらのタンパク質に対する抗体を用いて、例えば、ウェスタンブロットおよびFACSフローサイトメトリーの方法により、特定のストレスタンパク質、例えばHSPの産生をモニターすることが可能である。いくつかの例示HSPに結合する抗体についてさらに後述するように、このような抗体は入手可能である。ストレス条件が腫瘍細胞の死を引き起こすほどに過酷であるか否かについては、ルーチンのインビトロ試験（例えば、用量効果試験）によって確認することも可能である。
【００４４】
一の特徴によれば、複数のストレスを加える場合、それらを順番に与えることが好ましい。好ましくは、第１のストレスを与え、その後に、遅滞期（lag phase）を置いてから、その次のストレスを与えるといったことを、ストレスの数に応じて行う。第１のストレスを与えた後に遠心分離を行い、その後に、洗浄、遠心分離を行い、それに続いて、新鮮な培地を添加し、遅滞期を置いてから、次のストレスを与えるのが有利である。
【００４５】
本発明の方法の一の特徴によれば、耐性またはストレスタンパク質の因子の発現または産生を確認し、さらにはこれを定量化することができる。当業者は、フローサイトメトリーによる解析、例えば、FACS、ELISA、ウェスタンブロット等を任意に適用することで可能である。当業者は、特定のファミリーのメンバーから、各種のストレスタンパク質の発現または産生を確認し、さらには特定の種類を同定および定量化できる。
【００４６】
本発明の方法の一つの特徴によれば、工程iii）の後に工程iii-i）を行ってもよい。工程iii-i）は、以下に記載する処理の一つ以上により、前工程から得られた結果物を処理する工程である：ストレスタンパク質、腫瘍細胞およびその断片を含む固形タンパク性物質の濃縮；ストレスタンパク質または腫瘍細胞の分離または精製；腫瘍細胞およびストレスタンパク質の分離または精製；ストレスタンパク質の抽出。
【００４７】
本発明によれば、ストレスタンパク質は、細胞内のタンパク質、細胞外の遊離タンパク質、（細胞または細胞断片の）膜内のタンパク質、および細胞または細胞断片の表面におけるタンパク質に分けることができる。一般的に、ストレスを受けた癌細胞は、細胞内のストレスタンパク質および細胞表面のストレスタンパク質を含む。
【００４８】
本方法の一つの重要な特徴によれば、工程iv）において、治療方法は、ストレスタンパク質を免疫原性または免疫応答性にすることを可能にする、つまり、インビボでこれらに対する免疫応答を生じさせることができるように行われる。
【００４９】
ストレスを与える工程の終了から次の工程の開始までの間の時間間隔は、腫瘍細胞がストレスタンパク質を産生するのに十分なものである。この間隔は、前記時間間隔を変えて、ストレスタンパク質発現の変化を決定または測定することによって決定できる。例えば、モニターする対象のタンパク質に特異的な抗体を用いるウェスタンブロットおよびFACS等のフローサイトメトリーの方法（下記参照）を採用できる。この間隔は、好ましくは数時間であり、特に、約5時間〜約24時間の間で調整してもよい。この間隔は5時間未満であってもよく、本明細書に記載の方法、ウェスタンブロットおよびFACSフローサイトメトリーを用いて、ストレスタンパク質の産生をモニターすることによって、決定することも可能である。また、24時間を超えてもよいが、このような長時間である必要はないことがある。かかる必要性も、上記の方法を用いて容易に決定できる。
【００５０】
本発明によれば、工程iii）またはiii-i）から得られた生成物に、ストレスタンパク質を免疫原性にするための分子を導入する。この工程iv）により、インビトロで、例えば、前記分子が、遊離状態で存在する、あるいは、例えば腫瘍細胞または腫瘍細胞の断片といった細胞の表面に存在するまたは細胞膜の内部に存在するまたは細胞構造に存在するタンパク質と化学的結合できる。典型的には、例えば、ハプテン化分子などの分子は、腫瘍細胞またはその環境内に自然に存在しない分子（「非天然分子」）である。
【００５１】
当業者は、（特に、ハプテン化した）タンパク質に免疫原性を与える手順を知っているので、難なくこの工程を実施できる。これは、免疫原性分子（「キャリア」）とハプテン（すなわちストレスタンパク質）を共有結合により結合することにより、ハプテンに免疫原性を与えるための方法である。
【００５２】
任意のキャリア分子または公知のキャリア分子の混合物を使用できる。例として、ジニトロフェニル、2,4-ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）、スルファニル酸、N-ヨードアセチル-N'-(5-スルホンナフチル)エチレンジアミン（EDA）、アニリン、p-アミノ安息香酸、及びこれらの混合物が挙げられる。当業者は、K Landsteiner (Specificity of Serological Reactions, 1945, Chap. V, Harvard University Press）の作業を参照し得る。「キャリア分子」は、細胞膜を貫通し、細胞質ゾルに到達できる。本発明において、遊離ストレスタンパク質、細胞内ストレスタンパク質、および細胞膜に結合しているストレスタンパク質は、ハプテン化される。
【００５３】
ハプテン化工程は、ストレスを受けた細胞およびキャリア分子をインビトロでインキュベーションすることを含む。典型的には、インキュベーションは、約15分〜約1時間、特に、約20分〜約40分持続し得る。
【００５４】
この工程は、好ましくは、懸濁液中で細胞を維持可能にするために、穏やかな攪拌下で、またはある撹拌条件下で行われる。
【００５５】
本発明の方法の一の特徴によれば、タンパク質を免疫原性にする(例えば、ハプテン化する)工程iv）の後に、工程iv-i）を行ってもよい。工程iｖ-i）は、以下に記載するの処理の一つ以上により、前工程から得られた結果物を処理する工程である：ストレスタンパク質、腫瘍細胞およびその断片を含む固形タンパク性物質の濃縮；ストレスタンパク質または腫瘍細胞の分離または精製；腫瘍細胞およびストレスタンパク質の分離または精製；ストレスタンパク質の抽出。
【００５６】
ストレスの性質とその程度に依存して、腫瘍細胞を多かれ少なかれ分解または断片化してもよい。本発明の主な目的は、これらの細胞を分解または断片化することではなく、一群のストレスタンパク質を発現させるようにすることである。これは、ある腫瘍細胞の集団は、生存したままであるということを意味する。
【００５７】
従って、本発明の別の特徴によれば、生細胞を不活性化することを目的とする工程を設けてもよい。不活性化工程と称するこの工程は、ストレスを与えた後に、細胞がストレスタンパク質を発現するのに十分な時間を置いて実施される。
【００５８】
第一の実施形態によれば、タンパク質を免疫原性にするのに使用される工程、工程iv）または工程iv-i）、から得た生成物は、腫瘍細胞が非増殖性で存在するのを可能にするために、特に、不活性化(工程v）処理をしてもよい。
【００５９】
第二の実施形態によれば、ストレス工程から得た生成物は、腫瘍細胞が非増殖性で存在するのを可能にするために、特に、不活性化（工程v）処理をしてもよい。この場合、不活性化は、工程ii）と工程iv）の間に行う。
【００６０】
当業者の公知の任意の不活性化処理は、組成物が患者に投与されたら、腫瘍細胞が生体内で増殖する能力を失うことが確実であるように使用してもよい。この不活性化は、特に、化学的処理（エタノール固定）又は物理的処理、例えば、高線量の放射線放射（例えば、約25 gray）によって実現できる。生存能力を完全に欠如させる条件を決定するための細胞培養試験を実施することにより、不活性化に適切な条件を決定することができる。また、当業者に知られているように、生細胞と死細胞の区別を可能にするヨウ化プロピジウムを使用してもよい。例えば、ヨウ化プロピジウムを用いる試験の後に、以下に記載のような培養を行ってもよい。
【００６１】
本発明の別の特徴によれば、免疫原性にされた生成物（ハプテン化タンパク質材料および／またはハプテン化細胞および／またはハプテン化細胞断片）を、医薬的に許容されるビヒクルまたは賦形剤および必要に応じて補助剤と混合することによって、工程iv）または工程v）から得た生成物を製剤化してもよい。好ましくは、本工程は、医薬的に許容されるビヒクルまたは賦形剤および補助剤と混合することを含む。
【００６２】
本方法は、腫瘍細胞にストレスを与える条件下において腫瘍細胞により発現されるストレスタンパク質の複数または全部または大部分を含む医薬組成物を調製することができる。複数のストレスタンパク質を代表する生成物が得られるという利点があり、患者の免疫系が反応し得る更なる免疫原性因子を含む全範囲のストレスタンパク質を免疫原性にして医薬組成物に含めることを可能にし、そして、腫瘍細胞の全範囲を標的とし、免疫系および／または適用される治療による圧力下でこれらの腫瘍細胞によって種々に進行した耐性メカニズムに対抗するものである。
【００６３】
様々なストレスへの応答を可能にし、タンパク質の環境を維持するために、ストレスを与える対象の生成物は、好ましくは、腫瘍細胞全体から成る。工程i）で用いられる腫瘍細胞は、生検、必要に応じて培養または生存を維持した生検由来の患者細胞であってもよく、必要に応じて様々な異なる患者、特に同種細胞（同じ細胞型）由来のプールした細胞であってもよく、または同じ患者由来(自家細胞)であってもよく、あらかじめ確立された細胞株由来の同種細胞であってもよく、または患者細胞から生成されたものであってもよく、またはこのような細胞の混合物であってもよく、異なる種類の細胞の混合物であってもよい。
【００６４】
特に適切な一実施形態では、これらの細胞は、全部が、細胞株、特に治療対象の患者の腫瘍と同じ種類の細胞株由来（同種細胞）であるのが有利である。これらの細胞は、ストレス因子の１つにより「刺激」されることにより、耐性因子の過剰発現を可能する。例えば、培養中の細胞株に、熱ショック、化学物質、放射線照射、代謝ストレス、またはこれらのストレスのいくつかを与えてもよい。「刺激」株またはストレスプロトコル処理していない生の生成物または処理後の生成物を、その後、免疫系によるストレスタンパク質の認識を可能にするために、免疫原性にする。耐性因子を最適化するために、複数の株、特に同種株を用いてもよい。
【００６５】
一実施形態では、同じ腫瘍細胞の集団由来の各細胞群を様々なストレスにさらす。例えば、細胞の一部に上記から選択された１種のストレスプロトコルタイプを施し、細胞の別の一部に他の１種のストレスプロトコルを施す（ストレスの性質は、異なる条件下で異なっていてもよく同じであってもよい）などが可能である。その後、同時、個別、または経時的に交互に投与するためのキットの一部として使用してもよい。これらは混合してもよい。ストレスの種類および／または加えるストレス条件（例えば、放射線照射、熱的、化学的、代謝的、等）に応じ各耐性メカニズムに特異的であり得るストレスタンパク質を含有する医薬組成物が利用可能になる。
【００６６】
一実施形態では、本方法は、同種腫瘍細胞、つまり同じ種類の腫瘍またはその由来株、の混合物に適用される、つまり、本方法を、少なくとも２つの同種腫瘍細胞の集団に別々に適用し、得られた免疫原性にした生成物をその後混合して医薬組成物を形成する。従って、本発明は、腫瘍細胞の型に基づく標的化アプローチにおける解決策を提供することを可能にする、つまり、異なる細胞型だが、全て同じ種類の癌由来の細胞を使用して、ある同種の腫瘍（同種細胞）またある腫瘍細胞により特異的に発現されるこれらの細胞のすべてによって発現される耐性因子に対し共通する免疫反応を増強させることを可能にする。
【００６７】
別の実施形態では、患者の腫瘍細胞の特異的なタンパク質環境を維持するために、この腫瘍由来の細胞（自家細胞）をそれらの生存および／または増殖を可能にする培地中に保持し、その後１つまたは複数の前述のストレスを与える。よって、自家細胞は、ストレスタンパク質を発現するように刺激され、このストレスタンパク質は、例えば、その後のハプテン化の間に、免疫応答性にされる。
【００６８】
この実施形態では、本方法を、自家腫瘍細胞の混合物に適用する、つまり、治療対象の患者由来の腫瘍細胞に適用するか、または、本方法を少なくとも２つの自家腫瘍細胞の集団に別々に適用する。その後、同時、個別、または経時的に交互に投与するためのキットの一部として使用してもよい。これらは混合してもよい。本発明は、自家細胞を用いて、患者の腫瘍に特異的な耐性因子およびタンパク質環境を維持するような腫瘍が進行した個人ごとに固有のパーソナライズされた治療アプローチを提供することを可能にする。
【００６９】
別の実施形態では、前述の解決策を、自家細胞と同種細胞の混合物、自家でありかつ同種細胞であるもの、好ましくは互いに同種であるもの、あるいは本発明の方法により免疫原性が付されたそれらの生成物の混合物またはキットの一部として組み合わせてもよい。
【００７０】
患者の腫瘍細胞から製造する場合、生検または切除から単離された細胞から始めるのが好ましい。
【００７１】
好ましくは、免疫原性ストレスタンパク質および／または、好ましくは、および、不活性化腫瘍細胞を含む組成物は、凍結または凍結乾燥される。
【００７２】
２．本発明にかかる組成物
従って、本発明の目的は、本発明の方法により得られるまたは製造される組成物にも関する。
【００７３】
本発明の組成物は、本発明に従って免疫原性にされたストレスタンパク質、特にハプテン化されたストレスタンパク質を含むことを特徴する。また、この組成物は、工程ii）によるストレスに応答してストレスタンパク質を産生した腫瘍細胞、特に、腫瘍細胞および／または前記方法により産生されたかかる細胞の破片または断片を含むことを特徴とすることもある。この組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、特に、ハプテン化された遊離および／または免疫原性ストレスタンパク質、特にハプテンされ、腫瘍細胞またはその断片の表面上または内部に提示されたストレスタンパク質を含むこともある。好ましくは、本発明の組成物は、不活性化された腫瘍細胞および免疫原性ストレスタンパク質、特にハプテン化されたもの、を含む。
【００７４】
これらの組成物は、腫瘍細胞にストレスを与えた結果としてこれらの腫瘍細胞によりインビトロで発現されたストレスタンパク質の複数または全てまたは大部分を含み、これらのストレスタンパク質は免疫原性であり、特に、ハプテン化されている。特に、「複数のストレスタンパク質」について記述するときは、少なくとも２つの異なるストレスタンパク質、好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、または10、さらにはそれ以上のストレスタンパク質を指す。この数は、細胞の種類およびインビトロで与えられた１つまたは複数のストレスにより異なる。
【００７５】
様々な実施形態において、本組成物は、１つまたは複数の熱ショックタンパク質、特に上述の熱ショックタンパク質、例えば、HSP27、HSP70、またはHSP90；HSP27、HSP70およびHSP90；HSP27およびHSP70；HSP90およびHSP27；HSP90およびHSP70から選択される。これらの組成物において、これら１つまたは複数のHSPは、免疫原性にされている、特にハプテン化されている。
【００７６】
他の実施形態において、本組成物は、１つまたは複数の多剤耐性タンパク質、特に、化学療法に耐性なタンパク質（MRP、多剤耐性関連タンパク質)、例えば、GP170、MPR（異なる７種のタンパク質）、LRPおよび／またはVMP1を含む。
【００７７】
他の実施形態において、本組成物は、放射線照射に耐性なタンパク質または代謝ストレスに耐性なタンパク質を含む。
【００７８】
他の実施形態において、本組成物は、GRP78（BiP）、GRP75、および／またはGPR94等のGRPを含む。
【００７９】
本発明の教示によれば、本組成物は、これらのカテゴリのいくつかのストレスタンパク質を含み得る。
【００８０】
本発明は、特に、免疫原性にされたストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質を含む医薬組成物または治療用ワクチンまたは免疫原性組成物に関する。
【００８１】
これらのストレスタンパク質は、遊離状態であってもよく、腫瘍細胞の膜（内膜を含む）に結合した状態であってもよく、腫瘍細胞の表面に提示されていてもよく、腫瘍細胞の内部に提示されていてもよく、および／または腫瘍細胞の断片または腫瘍ペプチドの断片に結合した状態であってもよい。
【００８２】
一つの特徴によれば、本組成物は、免疫原性にされたストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質を含む。
【００８３】
別の特徴によれば、本組成物は、工程ii）によるストレスに応答してストレスタンパク質を産生した腫瘍細胞（不活性化された腫瘍細胞を含む）を含む。これらの細胞は、有利には、ハプテン化されたかあるいは本発明による方法で免疫原性にされた細胞内ストレスタンパク質を含み得る。特に、これらの細胞内免疫原性ストレスタンパク質は、生体内で抗原提示細胞によって免疫系に提示される。
【００８４】
特に、本組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質を含むかおよび／または有する腫瘍細胞および／またはこれらの細胞の断片を含む。
【００８５】
一つの特徴によれば、本組成物は、遊離状態で好ましくはハプテン化された免疫原性ストレスタンパク質、並びに、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質を含むおよび／または有する腫瘍細胞および／またはこれらの細胞の断片の両方を含む。
【００８６】
患者に投与可能な生成物として使用するために、これらの細胞を増殖不能にする。このことを不活性化と称する。
【００８７】
また、本組成物は、医薬的に許容されるビヒクルまたは賦形剤を含んでもよい。
【００８８】
一実施形態では、本組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質、および／または第１のストレスプロトコルを与えたかかるタンパク質を含む細胞、の集団、並びに、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質、および／または他のストレスプロトコルを与えたかかるタンパク質を含む細胞、の別の集団、を含む。
【００８９】
一実施形態では、本組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質、および／またはかかるタンパク質を含む細胞、の集団、並びに、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質、および／またはかかるタンパク質を含む細胞、の少なくとも１つの別の集団、を含み、これらの集団は、初代同種腫瘍細胞およびストレスプロトコルを受けたこれらの細胞由来であり、混合されていても別個に設けられていてもよい。
【００９０】
一実施形態では、本組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質および／またはかかるタンパク質を含む細胞であって、初代自家腫瘍細胞由来の細胞を含む。
【００９１】
一実施形態では、本組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質および／またはかかるタンパク質を含む細胞であって、同種および自家の細胞を含む。
【００９２】
一実施形態では、本組成物は、免疫原性ストレスタンパク質、好ましくはハプテン化されたストレスタンパク質および／またはかかるタンパク質を含む細胞であって、同種および自家の細胞を、同時、個別、または経時的に交互に投与するために含む。本組成物は、疫原性にされた複数のストレスタンパク質および／または免疫原性にされた複数のストレスタンパク質を含む同種細胞、特に、異なる株由来のもの(1、2、3個の株、等)、並びに、免疫原性にされた複数のストレスタンパク質および／または免疫原性にされた複数のストレスタンパク質を含む自家細胞を含む。
【００９３】
本発明の組成物は、抗癌剤として有用である。
【００９４】
一つの特徴によれば、本発明の組成物は、以前に癌治療を受けた患者への投与のための抗癌剤として有用である。上述したように、この治療は、ストレス、したがって、ストレスタンパク質の産生をもたらすだろう。よって、患者は、ストレスタンパク質を提示する腫瘍細胞を保有する。
【００９５】
別の特徴によれば、本組成物は、現在抗癌治療を受けているまたは将来受ける予定の患者への投与のための抗癌剤として有用である。上述したように、この治療は、ストレス、したがって、ストレスタンパク質の産生をもたらす可能性が高い。現在抗癌治療を受けている患者は、すでにストレスタンパク質を提示する腫瘍細胞を保有しているか、またはそうであることが疑われる。
【００９６】
一つの特徴によれば、本組成物は更に補助剤を含む。
【００９７】
補助剤は、ワクチンの有効性を増加させることで作用する物質である。この物質は、特定の免疫原と組み合わせて使用すると、当該免疫原に対する特異的な免疫応答を加速、遅延、および／または増大することによって作用し得る。当業者は、特に、Recent Advances in Vaccine Adjuvants, Singh M & O' Hagan DT, Pharmaceutical Research 2002, Volume 19, issue 6, pp715-728を参照することができる。使用可能な補助剤の中でも、サイトカインおよび他の免疫調節分子（すなわち、ケモカインおよび共刺激因子）、微生物および植物由来の、または化学的に合成された補助剤が挙げられる。それらの性質に応じて、補助剤は、免疫刺激補助剤としてのみならず、ワクチン送達系としても作用し得る。これらの送達系は、一般的に粒子状であり、特に、エマルジョン、微粒子（例えば、ポリラクチドグリコリドPLGベースのもの）、ISCOM、リポソーム（主に免疫原を抗原提示細胞に方向づけるまたはガイドする目的のもの）が挙げられる。免疫刺激補助剤は、主に、微生物学的起源の分子、例えば、リポ多糖、モノホスホリル脂質A、CpG DNA（免疫系を活性化するもの）である。補助剤は、例えば、細菌エンテロトキシン、特にE. coli由来の熱不安定性エンテロトキシンK63やR72などの無毒化変異体を粘膜経由で送達するために使用してもよい。
【００９８】
使用可能な補助剤の中でもとりわけ、水酸化アルミニウム、サポニン（例えばキラヤサポニンまたはキルA； Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, edited by Michael F. Powell and Mark J Newman, Plennum Press, NY and London, p210を参照）、Avridine（登録商標）（Vaccine Design p148)、DDA(ジメチルドデカデシルアンモニウムブロミド、Vaccine Design p157)、ポリホスファゼン（Vaccine Design p204）、水中油型エマルション、特に、ネラルオイルを含むもの、スクワラン（例えば、SPTエマルション、Vaccine Design p147）またはスクワレン（例えば、MF59、Vaccine Design p183）、油中水型エマルション特に、代謝可能な油を含むもの（特にWO9420071参照）、US5,422,109に記載のエマルション、または三重エマルション、例えば、水中油中水型エマルションが挙げられる。
【００９９】
用語「医薬的に許容される」は、アレルギー反応または他の副作用のリスクなく、患者に免疫原を投与するのに使用可能で、かつ、保管中に製品の特性が維持されるビヒクルまたは賦形剤を指すのに使用される。例えば、単独でまたは混合物中における、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、タンパク質化合物、デキストロース、スクロース、グリセロール、DMSO、エタノール等が挙げられる。例えば、0.9％NaClの生理食塩水、リン酸緩衝液、市販の保存溶液ベースの混合物を指すこともある。
【０１００】
一実施形態では、本発明に係る組成物は、特に-20℃〜-80℃で凍結されることを意図する。よって、本組成物に少なくとも一つの凍結保護剤を添加する、および／または、その構成要素、特に腫瘍細胞に損傷を与えることなく凍結に耐えうるようにするための通常の方法で本組成物を調製する。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明に係る組成物は、凍結乾燥（lyophilized, freeze-dried）されることを意図する。よって、必要に応じて、少なくとも一つの凍結乾燥用の通常の賦形剤を添加する。
【０１０２】
当業者に知られているように、ビヒクルまたは賦形剤および／または補助剤の選択による組成は、投与経路によって異なることがある。
【０１０３】
３．使用および治療法
本発明によって開発された製品は、保持可能といった特性を有する限り、様々な組成を有し得るが、生腫瘍細胞を１つまたは複数の制御されたストレスにさらすことによってインビトロで誘導されたストレスタンパク質を含み、これらのストレスタンパク質は、これらの腫瘍細胞がストレスに応答して過剰発現するため高レベルの濃度で見られ、一般的にこれらのストレスタンパク質は様々な種類でがあり、患者に投与可能な最終製品におけるこれらのストレスタンパク質はハプテン化されている、さもなくば免疫応答性（免疫原性）になるように処理されている。
【０１０４】
本発明の原理は、例えばハプテン化等により免疫応答性（免疫原性）にされたストレスタンパク質の存在により刺激を与えた後の腫瘍細胞の耐性因子（ストレスタンパク質）に対する特異的応答を発展させる免疫系の許容量及び能力に基づく。この腫瘍細胞を排除する免疫反応は、治療前に開始した作用（本発明の組成物の補助的作用）を完了する、あるいは、主治療としての免疫応答の活性化を可能にする。
【０１０５】
また、本発明は、治療的処置の方法にも関する。この方法は、免疫応答を誘導するために、本発明の組成物の有効量を投与することを含む。
【０１０６】
投与量は、例えば、1用量あたり105〜107個、特に、少なくとも106±0.5個の細胞を含み得る。細胞の量は、全腫瘍細胞、腫瘍誘発性炭素（TOC）またはタンパク質定量によって表記できる。
【０１０７】
投与計画は、経時的に1回または複数回の別個の投与を含んでもよい。例えば、投与計画は、各投与の間に1〜10日の間隔をあけて2、3、4、5、6、7、8、9、または10回投与するものであってもよい。
【０１０８】
任意の投与経路を採用し得る。よって、投与として、経口、経鼻、直腸、非経口投与が挙げられる。非経口経路は、特に、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下、皮内注入などが好ましい。特に皮内注入が選択される。
【０１０９】
治療を増強させるような任意の種類の免疫刺激剤（サイトカイン、成長因子、免疫調節物質、補助剤、等）の投与により治療を補助してもよく、当該治療用組成物がすでに補助されていてもいなくてもよい。
【０１１０】
本治療方法は、本発明にかかる治療と、従来の抗癌治療プロトコル、つまり、外科手術、放射線療法、化学療法および／または免疫療法との組み合わせを含み得る。本発明の組成物は、１つ以上のこれらのプロトコルの前、間、後に患者に投与される。しかし、免疫応答の誘導に関し、従来のプロトコルの前または間、好ましくは前、に本発明の組成物を投与することが有利である。
【０１１１】
前もって、生体内で発現される可能性のあるストレスタンパク質に対する応答を取得し、従来の治療に対する耐性を抑制するための免疫系を刺激するために、将来受けるであろう従来治療に関連するストレスタンパク質を発現した同種細胞株によって患者を治療することが可能になる。例えば、放射線治療の前に、放射線によって誘発されるストレスタンパク質および／または放射線によって誘発されるストレスタンパク質を発現する細胞を含む本発明の組成物を投与する、および／または好ましくはストレスの開始剤として抗癌治療分子を用いる化学療法の前に、当該抗癌治療分子により化学的に誘発されるストレスタンパク質および／または化学的に誘発されるストレスタンパク質を発現する細胞を含む本発明の組成物を投与する。
【０１１２】
非限定的な例としての実施例とともに図を参照しつつ本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：同種剤を製造するための方法
・細胞株
細胞株は、市販の予め確立された株（ATCC種）由来、または検査対象の患者試料由来の株である。例として、使用される株は、Caov、OVCAR-3、ES-2、およびOV-3（卵巣癌の治癒標的）が挙げられる。これらは、それぞれ推奨される条件下で別々に培養される。
【０１１４】
・患者細胞
患者細胞は、患者から単離され、培地内で適切な条件下にて培養される。
【０１１５】
細胞株および患者由来の細胞を、それらの増殖期またはプラトー期にストレスに曝し、耐性因子（ストレスタンパク質）を過剰発現させる。
【０１１６】
与えたストレスの種類：
・2 grayの放射線照射
・熱ショック：温度を40°C〜43°Cに上げ、30〜60分維持する。
・化学的ショック：エタノール、シクロホスファミド、ドキソルビシンまたはシスプラチンによる
【０１１７】
１つまたは複数の耐性因子の発現は、フローサイトメトリー、ELISA、またはウェスタンブロット、特に、抗HSP抗体(抗ヒトHSP27-FITC、抗ヒトHSP60-PE、抗ヒトHSP72-FITC、抗ヒトHSP90-PE)を用いるサイトメトリーによって確認する。
【０１１８】
同種細胞によって発現される耐性因子（ストレスタンパク質）は、ジニトロフェニルによって化学的に標識またタグ付する。別の方法としては、スルファニル酸、N-ヨードアセチル-N'-(5-スルホンナフチル)エチレンジアミン（EDA）、アニリン、またはp-アミノ安息香酸を使用することができる。
【０１１９】
ハプテン化ストレスタンパク質を含む同種細胞は、高線量の放射線照射（25 gray）によって、非増殖性にされる。別の方法としては、10％〜50％v/vのエタノール固定、あるいは細胞構造を無傷のままにしつつ細胞分裂を阻害する他の任意の方法が挙げられる。
【０１２０】
同種由来のハプテン化細胞ストレスタンパク質は、治療用途に適切でかつ低温（-20℃、-80℃）での貯蔵を可能にする製剤培地に含まれる細胞懸濁液の形態で流通され、その後、「HSP陽性」タンパク質の量および／または有機物の量で表記される治療用量に相当する用量あたり1〜5×106個の不活性化ハプテン化細胞を含む用量にて流通される。免疫補助剤として、例えば、BCG、GM-CSF、IL2を含めてもよい。
【０１２１】
実施例２：自家剤を製造するための方法
細胞は、切除した患者腫瘍に由来する。この生物学的材料は、細胞の保存および最適生存を可能にする特定のキットにて搬送される。
【０１２２】
生検細胞は、適切な機械的方法によって分離させ、次いで、それらの成長または生存だけを許容する栄養培地に懸濁する。
【０１２３】
腫瘍細胞はそのまま使用するか、あるいは細胞選別によって選択してから使用する。
【０１２４】
同種細胞剤の製造にて規定したように、腫瘍細胞は増殖期またはプラトー期にストレスに曝す。
【０１２５】
１つまたは複数の耐性因子の発現は、実施例１と同様に、適切な分析方法によって確認する。
【０１２６】
自家細胞によって発現される耐性因子（ストレスタンパク質）は、実施例1の同種細胞剤について記載したのと同様の方法により化学的にタグ付する。
【０１２７】
ハプテン化ストレスタンパク質を含む自家細胞を、実施例１の同種細胞で使用するものと同様の方法で非増殖性にする。
【０１２８】
自家細胞のハプテン化ストレスタンパク質は、治療用途に適切でかつ保存を可能にする配合培地に含まれる細胞懸濁液の形で流通させ、その後、治療用量にて流通される。
【０１２９】
実施例３：治療方法
治療レジメンは、以下の投与を含む:
・１つまたは複数の同種剤または自家剤;あるいは、
・一緒にまたは連続的に投与される１つまたは複数の同種剤および自家剤。
【０１３０】
生成物の投与は、皮内注入による。また、別の投与経路、特に、経口投与、を採用することもできる。
【０１３１】
生成物は、単独でまたは治療を増強するための他の療法と相乗的に投与される。
【０１３２】
実施例４：ＨＳＰの生成
CT26-WT株は、ATCC（登録商標）CRL-2638（商標）の名で入手可能なマウス結腸癌株である。細胞は容易かつ迅速（22時間で倍増）に成長する。
【０１３３】
HL60株はSigma-Aldrich（登録商標）から入手可能なヒト細胞株（白人前骨髄球性白血病）である。細胞は、増殖後に凍結される。
【０１３４】
元々の細胞は凍結状態で受け取った。細胞を解凍しその後、フラスコ内に入れ適切な培養培地中で培養した。培養培地は、１日目に変えた。増殖後、生細胞をカウントし、その後培養培地あたり約2×106個の細胞/mlに濃度を調整した。200×106個の細胞を回収し、細胞が約50％コンフルエントであったことを確認した後に洗浄した。懸濁液をチューブにつき25 mlずつ、50 mlのチューブに分けた。チューブを42℃に加熱した水浴中に浸漬した。チューブは、水浴中で約1時間置いた。その後、細胞を、2×106個の細胞でフラスコに移した。次いで、細胞を37℃で14時間インキュベートした。その後5×106個の生細胞/mlに細胞濃度を調整した。
【０１３５】
その後細胞を、2,4-ジニトロフルオロベンゼン（DNFB）0.07％の溶液でハプテン化した。ハプテン化は、FACSで標識することによって確認する。FACSフローサイトメトリーを分析手法として選択した。これは、細胞の総数に対するハプテン化細胞の割合を示すことが可能である。
【０１３６】
細胞懸濁液は、凍結培地当たり2〜5×106個の細胞/mlの濃度に調整し、-80±3℃の冷凍庫に最低24時間保存してから試験した。
【０１３７】
次いで、腫瘍細胞を不活性化するために凍結細胞を、25 grayのX線放射線照射に曝した。
【０１３８】
HSPまたはハプテン化HSPの発現を検出するために二つの標準的な技術を採用した。これらの技術は、検出対象のタンパク質に特異的な抗体を用いて任意のストレスタンパク質を検出するのに使用できる。
・検出対象のHSPに特異的な抗体を用いるウェスタンブロット
・特異的抗体を用いて細胞内HSPをタグ付した後のフローサイトメトリー（FACS、蛍光活性細胞選別）
【０１３９】
特異的抗体は、市販の抗HSP27抗体、抗HSP70抗体、抗HSP90α/β抗体を使用した。当該技術には、良く知られているように、追加抗体、マウスIgG1、FITC結合ヒツジ抗マウスIgG、対照抗体（抗KLH-FITC）、抗体（抗TNP FITC）、特異的DNFBも使用した。有用な市販の抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc.およびBD Biosciencesから入手可能である。
【０１４０】
サイトメトリーには、ハプテン化細胞を解凍し、その後洗浄し、1〜2×106個の細胞/mlに濃度調製した。底面がV字型の96ウェルプレートに以下を分注した。
・２つのウェルに5μlの対照抗体（抗KLH FITC）
・２つのウェルに5μlの抗体（抗TNP FITC）
【０１４１】
続いて、100μlのハプテン化細胞懸濁液を各ウェルに添加し、プレートを5℃±3℃で15分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、細胞懸濁液を「FACSキャリバー」を通過させるためのチューブに移した。前もって固定したパラメータに従って「DNP-FITC」チューブに通過させた。対照についても同様に行った。
【０１４２】
結果：
１．CT26-WT株：
ウェスタンブロットにおいて37℃で1時間保持した同じ株と比較して、上記プロトコルに従い42℃でストレスを与えた細胞内ではHSP70に対応する約70 kDにバンドが見られた（図１）。
【０１４３】
２．HL60株：
対照細胞（37℃で1時間+37℃で14時間の回復時間）およびストレスを与えた細胞（42℃で1時間+42℃で14時間の回復時間）を上記のように特異的抗体によるHSP27、70、および90で細胞内標識した後、フローサイトメトリーにより分析した。
【０１４４】
【表１】
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【０１４５】
ストレスを受けた細胞におけるHSP、より具体的にはHSP27およびHSP70の過剰発現に注目されたい。
【０１４６】
実施例４：動物実験
腫瘍剤の製造は、CT26WT細胞を増殖させ、その後、5%DMSOを補充した培養培地中で凍結し、250μl中6.25×104個の最終濃度に調整することを含んだ。
【０１４７】
ワクチン剤の製造は、CT26WT細胞を増殖させ、その後、2回継代し、42℃で1時間の熱ストレスに細胞を曝し、その後37℃で14時間の回復時間を設けることを含んだ。続いて、細胞をハプテン化し（DNFB、ジニトロフルオロベンゼンによる）、その後250μl中6.25×105個の最終濃度で-80℃にて凍結し、最後にワクチン剤を放射線照射した(25 gray)。
【０１４８】
腫瘍剤およびワクチン剤の対照は以下のように製造した。
腫瘍剤(動物における腫瘍の生成):
・血液培養物の滅菌物→陰性血液培養物
・内毒素の対照→内毒素＜200IU/ml
・腫瘍剤の細胞数および生存率の対照→5.5〜6.95×105個の細胞量、生存率＞95%
【０１４９】
ワクチン剤：
・血液培養物の滅菌物→陰性血液培養物
・内毒素の対照→内毒素＜200IU/ml
・抗KLH-TNP抗体を用いたFACS標識によるハプテン化の対照→ハプテン化%＞96%
・腫瘍剤の細胞量の対照→5.96〜6.10×105個の細胞量
・上記特異的抗体用いたサイトメトリーによるHSPの発現の対照→HSP27、70、および90の発現を検出
・上記特異的抗体を用いたウェスタンブロットによるHSPの検出対照→図２に熱ストレス後のHSP70スポットおよびハプテン化HSP70スポットを示す。
・ワクチン組成物の細胞が増殖性でないことを確認するための生存試験：ヨウ化プロピジウムを添加し、培養した；ワクチン剤を構成する細胞は増殖能を欠くことを確認した。
【０１５０】
実施例５：マウスにおけるin vivo試験
Charles Riverから入手した6〜8週間齢のBALB/c雄と雌のマウスを使用した。16×19×35 cmのケージあたり5匹のマウスを収容し、制御温度下（22±2℃）、交互の光条件（12時間の明期と12時間の暗期の周期）にて、水と食料を自由に摂取させた。マウスは、実験を開始する前に、少なくとも1週間順化させた。
【０１５１】
腫瘍モデルは、皮下CT26癌モデル（CT26WT、ATCC（登録商標）CRL-2638（商標））である。これは、一般的に動物の癌に対する治療用途、特に免疫療法プロトコルを検査し免疫応答を調べるのに使用される同系腫瘍モデルである。
【０１５２】
50匹の雌マウスを10匹ずつから成る5つの群に分けた。各マウスは、0日目（D0）に5×104個のCT26WT腫瘍細胞を皮下（SC）注射した。治療プロトコルは以下の通りであった
第１群：賦形剤
第２群：治療的処置１
第３群：治療的処置２
第2日目（D2）に第2群および第3群に15mg/kgのシクロホスファミドを腹腔内（IP）注入により投与した。
【０１５３】
第２群に対する治療１（BCGIL-2/ワクチン）：
・BCG：2×106CFU（コロニー形成単位）をSC注入
・組換えマウスIL-2：4000IUをSC注入
・ワクチン:5×105個のCT26WT細胞（放射線照射およびハプテン化）をSC注入
【０１５４】
第３群に対する治療２（BCG/GM-CSF/ワクチン）：
・BCG：2×106CFUをSC注入
・組換えマウスGM-CSF：25000IU（国際単位）をSC投与
・ワクチン：5×105個のCT26WT細胞（放射線照射およびハプテン化）をSC注入
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
試験中に測定されたパラメータ、およびその他の特性は以下の通りである。
・マウスの行動を毎日モニターした。
・体重及び腫瘍体積を週に3回モニターした。腫瘍体積は、mm3単位であり、以下の式を用いて計算した。体積=[(幅)2×長さ]/2。キャリパーを用いて寸法を測定した。
・マウスは、予想外の損傷があった場合は、屠殺した。
・腫瘍移植後遅くとも40日後までに腫瘍が1000 m3に達した場合マウスを屠殺した。腫瘍を切除し、測定した。
【０１５７】
経時的にmm3単位で腫瘍体積を測定した結果から、治療用ワクチンT1およびT2の両方で対照マウスよりも好ましい影響が見られた。図３および図４を参照。
【０１５８】
腫瘍の重量を測定した結果からも、ワクチンT1およびT2の両方で対照マウスよりも好ましい影響が見られた。図５および図６を参照。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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