(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）複数の核酸を含む細胞を、オリゴヌクレオチドのそれぞれが細胞中の核酸を標的とし、検出可能な部分により標識されている、第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第１の接触ステップを実施するステップであって、
前記第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の核酸を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと
を含む、ステップと、
（ｂ）第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによるそれらの核酸標的との相互作用が検出されるように第１の接触ステップの後に前記複数の核酸を含む細胞をイメージングするステップと、
（ｃ）複数の核酸を含む細胞を、第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第２の接触ステップを実施するステップであって、前記第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、前記第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドに標的とされた標的核酸と同じ標的核酸及び異なる標的核酸とハイブリダイズし、
第２の複数の検出可能に標的されたオリゴヌクレオチドが少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とする、第３のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の核酸を標的とする、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにおける同じ核酸を標的とする対応するオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているという点で、第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと異なり、このため、第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、
（ｉｉｉ）第３のオリゴヌクレオチドが、第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分又は第３の検出可能な部分により標識されており、
（ｉｖ）第４のオリゴヌクレオチドが、第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分、第３の検出可能な部分又は第４の検出可能な部分により標識されており、
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は両方である、ステップと、
（ｄ）第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによるそれらの核酸標的との相互作用が検出されるように第２の接触ステップの後に前記複数の核酸を含む細胞をイメージングするステップと、
（ｅ）第１及び第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにより標的にされる核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新たな複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを毎回用いて、接触及びイメージングステップを反復し、又は反復しないステップであって、同じ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分の標識の少なくとも１つの差のため、それぞれの用いられる複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが他の全ての用いられる複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのそれぞれと異なるステップと、
を含む、方法であって、
ステップ（ａ）〜（ｅ）により、試料中の核酸標的のそれぞれについて特異的な分子バーコードを提供する、方法
【請求項２】
細胞中の前記核酸標的は、転写物又はＤＮＡ遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
それぞれの複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、Ｆ個の検出可能な部分を含み、Ｆが少なくとも２である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｎ回の接触ステップを含み、Ｎが少なくとも２である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｎ回のうち２回の接触ステップが連続的であり、各々の利用された複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレチドが、その他すべての利用された複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレチドと異なり、そのため、核酸標的に対するオリゴヌクレオチドを標識する検出可能な部分における少なくとも一つの相違をもたらす、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
それぞれの複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、（Ｆ）Ｎ個の核酸標的を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
それぞれの複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、（Ｆ）Ｎ個未満の核酸標的を標的とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
それぞれの複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、同じ核酸標的を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
それぞれのイメージングステップの後に、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
除去するステップが、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
除去するステップが、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＤＮアーゼと接触させること、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＲＮアーゼと接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドがＨＣＲにより標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１、第２、又はそれ以降の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、細胞中の前記標的核酸にハイブリダイズする中間オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、細胞中の標的核酸を認識し、前記中間オリゴヌクレオチドが、前記核酸標的にハイブリダイズする第１の配列と、HCRにより標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする第２の配列とを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのそれぞれが、同じ核酸標的を標的とする検出可能部分を有する２つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記同じ核酸標的を標的とする検出可能な部分を有する２つ以上のオリゴヌクレオチドが、同じ色をもたらすフルオロフォアにより標識されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのそれぞれが、その他全ての複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの標的核酸とは区別される核酸を標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されており、第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと同じ検出可能な部分により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと同じ検出可能な部分により標識されており、第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されており、第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
検出可能に標識された複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的核酸へのハイブリダイズが定量化されるように、イメージングステップが接触ステップ後の複数の核酸を含む細胞をイメージングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと配列が同一であり、又は、前記第４のオリゴヌクレオチドは、前記第２のオリゴヌクレオチドと配列が同一である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１３年４月３０日に出願した米国仮特許出願第６１／８１７，６５１号及び２０１４年３月２８日に出願した第６１／９７１，９７４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
米国政府は、国立衛生研究所により授与された助成金第Ｒ０１ＨＤ０７５６０５号に基づき本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の転写プロファイリングは、多くの目的のために必須のものである。単一細胞中の複数のｍＲＮＡｓを解像し得る顕微鏡イメージングは、細胞の同定（ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ）の分子的基礎を理解し、疾患の治療法を開発するために重要である、転写物量及び局在化に関する貴重な情報を提供し得る。したがって、例えば、顕微鏡イメージングにより細胞中の転写物をプロファイリングするための新規で、改善された方法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、特に単一細胞について、細胞中の転写物又はＤＮＡ遺伝子座をプロファイリングするための既存の技術に関連する課題又は欠陥への一定の洞察を提供する。さらに、本発明は、単一細胞についてのそれを含む、有効なそのようなプロファイリングを達成するための新たな技術を提供する。提供される技術は、例えば、単離細胞、組織における細胞、臓器における細胞及び／又は生物における細胞のプロファイリングに広く有用である。
【０００５】
例えば、本発明は、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ又はｑＰＣＲのような既存の技術が単一細胞を単離し、多ウェル構成に導入することを必要とするものであり、これが法外な費用がかかり、労働集約的であり、アーチファクトを起こしやすい多段階過程であるという洞察を提供する。さらに、本発明は、最初にｍＲＮＡをＤＮＡ鋳型に変換するために酵素反応を用いる既存のｉｎ  ｓｉｔｕ配列決定技術が非常に非効率的であり（例えば、ｍＲＮＡのＤＮＡへの変換過程において）、そのため、わずかな割合のＲＮＡｓが変換され、検出されることがあり得ることを認識するものである。本発明は、ＲＴについて１％、ＰＬＡについて１０％と推定される、そのような低い効率の１つの主な不利な面は、それが遺伝子発現測定におけるかなりのノイズとバイアスを導入し得ることであるという個別的な洞察を提供する。本発明は、単一分子蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ｓｍＦＩＳＨ）を用いる既存のスペクトルｍＲＮＡバーコーディング技術が、大規模化のために異なるフルオロフォアを必要とし、発生させることができるバーコードの数が制限され得ることをさらに認識する。ｓｍＦＩＳＨは、ハイブリダイゼーション中にプローブをバーコーディングサブセットに分割することも必要とする。ｓｍＦＩＳＨでは、しばしば標的について２種以上の色を用いるため、これが画像における高密度の対象を生じさせ、これがデータ解析の複雑さを増大させ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
とりわけ、本発明は、本発明に先行する方法に関連する１つ若しくは複数又は全ての問題を克服する、例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座をプロファイリングするための新たな技術を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、異なる標的の多重化を可能にする逐次バーコーディングスキームにより細胞中の複数の標的、例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座を検出する方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本発明は、（ａ）組成物が少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の核酸を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと
を含むように、複数の核酸を含む細胞を、オリゴヌクレオチドのそれぞれが核酸を標的とし、検出可能な部分により標識されている、第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第１の接触ステップを実施するステップと、
（ｂ）第１の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との相互作用が検出されるように第１の接触ステップの後に細胞をイメージングするステップと、
（ｃ）第２の複数のオリゴヌクレオチドが少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とし、第１のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第３のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の核酸を標的とし、第２のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の複数のオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが第１の複数のオリゴヌクレオチドにおける同じ核酸を標的とする対応するオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているという点が第２の複数のオリゴヌクレオチドが第１の複数のオリゴヌクレオチドと異なるように、また第２の複数のオリゴヌクレオチドにおいて、
（ｉｉｉ）第３のオリゴヌクレオチドが第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分又は第３の検出可能な部分により標識されており、
（ｉｖ）第４のオリゴヌクレオチドが第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分、第３の検出可能な部分又は第４の検出可能な部分により標識されており、
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は両方であるように、
細胞を、第１の複数のオリゴヌクレオチドにより標的とされる重複核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを含む、第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第２の接触ステップを実施するステップと、
（ｄ）第２の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との相互作用が検出されるように第２の接触ステップの後に細胞をイメージングするステップと、
（ｅ）同じ核酸を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分の標識の少なくとも１つの差のため、それぞれの用いられる複数のオリゴヌクレオチドが他の用いられる複数のオリゴヌクレオチドとそれぞれと異なる、第１及び第２の複数のオリゴヌクレオチドにより標的にされる重複核酸を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新たな複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを毎回用いて、接触及びイメージングステップを場合によって反復するステップと
を含む方法を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明（例えば、図１に示すような）は、
（ａ）組成物が少なくとも
（ｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチド
を含むように、複数の転写物及びＤＮＡ遺伝子座を含む細胞を、それぞれが転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、検出可能な部分により標識されている、第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第１の接触ステップを実施するステップと、
（ｂ）第１の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との認識が検出されるように第１の接触ステップの後に細胞をイメージングするステップと、
（ｃ）第２の複数のオリゴヌクレオチドが少なくとも
（ｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第３のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第２のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の複数のオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが第１の複数のオリゴヌクレオチドにおける同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているという点が第２の複数のオリゴヌクレオチドが第１の複数のオリゴヌクレオチドと異なるように、また第２の複数のオリゴヌクレオチドにおいて、
（ｉｉｉ）第３のオリゴヌクレオチドが第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分又は第３の検出可能な部分により標識されており、
（ｉｖ）第４のオリゴヌクレオチドが第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分、第３の検出可能な部分又は第４の検出可能な部分により標識されており、
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は両方であるように、
細胞を、第１の複数のオリゴヌクレオチドにより標的とされる重複転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドを含む、第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第２の接触ステップを実施するステップと、
（ｄ）第２の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的との認識が検出されるように第２の接触ステップの後に細胞をイメージングするステップと、
（ｅ）同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分の標識の少なくとも１つの差のため、それぞれの用いられる複数のオリゴヌクレオチドが他の用いられる複数のオリゴヌクレオチドとそれぞれと異なる、第１及び第２の複数のオリゴヌクレオチドにより標的にされる重複転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新たな複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを毎回用いて、接触及びイメージングステップを場合によって反復するステップと
を含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにより標的とされる核酸は、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにより標的とされる核酸は、転写物であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにより標的とされる核酸は、転写物である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにより標的とされる核酸は、ＤＮＡ遺伝子座であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにより標的とされる核酸は、ＤＮＡ遺伝子座である。いくつかの実施形態において、接触ステップにおいて用いるそれぞれの複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする。
【００１０】
いくつかの実施形態において、接触ステップにおいて用いる複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、一組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと呼ばれる。いくつかの実施形態において、一組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの標的は、一組の標的と呼ばれる。いくつかの実施形態において、一組における標的は、転写物であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、一組における標的は、転写物である。いくつかの実施形態において、一組における各標的は、転写物であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、一組における各標的は、転写物である。いくつかの実施形態において、一組における標的は、ＤＮＡ遺伝子座であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、一組における標的は、ＤＮＡ遺伝子座である。いくつかの実施形態において、一組における各標的は、ＤＮＡ遺伝子座であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、一組における各標的は、ＤＮＡ遺伝子座である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、イメージングステップの後に複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するステップを場合によって含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、毎回のイメージングステップの後に複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するステップを含む。いくつかの実施形態において、除去ステップは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去ステップは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＤＮアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去ステップは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＲＮアーゼと接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去ステップは、光退色を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、各組は、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする一組における２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能なシグナルを発生させる。いくつかの実施形態において、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする一組における全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能なシグナルを発生させる。検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドがフルオロフォアにより標識されている、いくつかの実施形態において、検出可能なシグナルは、特定の色である。いくつかの実施形態において、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする一組における全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能な色をもたらすフルオロフォアにより標識されている。
【００１３】
いくつかの実施形態において、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする一組における２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態において、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする一組における全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態において、同じ転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じフルオロフォアを有する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、提供する方法を実施するために有用な組成物を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、組成物が少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の核酸を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと
を含むように、オリゴヌクレオチドのそれぞれが核酸を標的とし、検出可能な部分により標識されている、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、キットが少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の核酸を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）第１の核酸を標的とし、第１、第２又は第３の検出可能な部分により標識されており、第１のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第３のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）核酸を標的とし、第１、第２、第３又は第４の検出可能な部分により標識されており、第２のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第４オリゴヌクレオチドと
を含むように、オリゴヌクレオチドのそれぞれが核酸を標的とし、検出可能な部分により標識されていて、
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は第４オリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は両方である、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアであるか又はそれを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の核酸（「標的」）を標的とする。いくつかの実施形態において、標的は、転写物であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、標的は、転写物である。いくつかの実施形態において、標的は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ｒＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、非コーディングＲＮＡである。いくつかの実施形態において、標的は、ＤＮＡ遺伝子座であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、転写物は、ＤＮＡ遺伝子座である。いくつかの実施形態において、標的は、転写物の遺伝子座である。いくつかの実施形態において、遺伝子のスプライシング変異体のような、ＤＮＡ配列の異なる転写物は、異なる標的を構成し、１つ又は複数の変異体は、独立に標的とし、検出し、又は定量化することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、個々のスプライシング変異体を検出するための方法、組成物又はキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出するための方法、組成物又はキットを提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、標的、例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を定量化する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドは、同じ組の配列を有する。すなわち、異なるステップにおいて適用される場合、オリゴヌクレオチド間の差は、部分内にあって、配列にはない。
【００２１】
定義
動物：  本明細書で用いているように、「動物」という用語は、動物界の任意の構成員を意味する。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発育段階のヒトを意味する。いくつかの実施形態において、「動物」は、任意の発育段階の非ヒト動物を意味する。特定の実施形態において、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類及び／又はブタ）である。いくつかの実施形態において、動物は、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚及び／又は虫を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子組換え動物及び／又はクローンであり得る。
【００２２】
およそ：  本明細書で用いているように、数に関する「およそ」又は「約」という用語は、特に述べない限り又は文脈から明らかでない限り（そのような数が０％未満であるか又は可能な数の１００％を超える場合を除く）、数のいずれかの方向の５％、１０％、１５％又は２０％（より大きい又はより小さい）の範囲内に入る数を含むと一般的に解釈される。いくつかの実施形態において、用量に関する「約」という用語の使用は、±５ｍｇ／ｋｇ／日を意味する。
【００２３】
相同性：  「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、２つの核酸分子の間の配列類似性を意味する。相同性及び同一性は、比較の目的のために整列させることができる各配列における位置を比較することによってそれぞれ決定することができる。比較される配列における等価位置が同じ塩基によって専有されている場合、分子は、その位置において同一であり、等価部位が同じ又は類似の核酸残基（例えば、立体的及び／又は電子的性質が類似）によって専有されている場合、分子は、その位置において相同（類似）と呼ぶことができる。相同性／類似性又は同一性の百分率としての表現は、比較される配列によって共有される位置における同一又は類似核酸の数の関数を意味する。「非関連」又は「非相同」である配列は、本明細書で述べる配列と４０％未満の同一性、３５％未満の同一性、３０％未満の同一性又は２５％未満の同一性を共有する。２つの配列を比較するに際して、残基（アミノ酸若しくは核酸）の非存在又は余分の残基の存在も同一性及び相同性／類似性を低下させる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、「相同性」という用語は、類似の機能又はモチーフを有する遺伝子を同定するために用いられる配列の類似性の数学的比較を表す。本明細書で述べる核酸配列は、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列又は相同体を同定するための公的データベースに対する検索を行うために「問い合わせ配列」として用いることができる。いくつかの実施形態において、そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同的なヌクレオチド配列を得るためのＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、比較の目的のためのギャップ入りアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻（１７号）、３３８９〜３４０２頁に記載されているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【００２５】
同一性：  本明細書で用いているように、「同一性」は、配列対応付けを最大限にするように配列を整列させる、すなわち、ギャップ及び挿入を考慮に入れる場合に２つ以上の配列における対応する位置における同一のヌクレオチド残基の百分率を意味する。同一性は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、ＰａｒｔＩ、Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ  Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ  Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８巻１０７３頁（１９８８）に記載されているものを含むが、これらに限定されない、公知の方法により容易に計算することができる。同一性を決定する方法は、供試配列間の最大の対応をもたらすようにデザインされる。さらに、同一性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムでコード化する。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータプログラムの方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２巻（１号）、３８７頁（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０）及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻、３３８９〜３４０２頁（１９９７））を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻、４０３〜４１０頁（１９９０）から公的に入手できる。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために用いることができる。
【００２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  本明細書で用いているように、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物及び／又は微生物）体内でなく、人工的環境、例えば、試験管又は反応容器内、細胞培養中で起こる事象を意味する。
【００２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：  本明細書で用いているように、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生物（例えば、動物、植物及び／又は微生物）体内で起こる事象を意味する。
【００２８】
オリゴヌクレオチド：  「オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、修飾核酸塩基、糖、修飾糖、リン酸架橋又は修飾架橋のいずれかの組合せを含む、ヌクレオチドモノマーのポリマー又はオリゴマーを意味する。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、様々な長さのものであり得る。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが約２〜約２００ヌクレオチドの範囲にあり得る。様々な関連実施形態において、一本鎖、二本鎖及び三本鎖オリゴヌクレオチドは、長さが約４〜約１０ヌクレオチド、約１０〜約５０ヌクレオチド、約２０〜約５０ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約２０〜約３０ヌクレオチドの範囲にあり得る。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが約９〜約３９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも４ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも７ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも８ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも９ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１１ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１８ヌクレオチドの相補鎖の二重らせんである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２１ヌクレオチドの相補鎖の二重らせんである。
【００３０】
あらかじめ定められた：  あらかじめ定められたとは、例えば、ランダムに発生又は達成されることに対立するものとして、意図的に選択されたことを意味する。特定の個別のオリゴヌクレオチドを含み得る組成物は、それらが、特定のオリゴヌクレオチドを意図的に発生させるように制御することができない過程を経て期せずして発生したため、「あらかじめ定められた」組成物ではない。いくつかの実施形態において、あらかじめ定められた組成物は、意図的に再生することができるもの（例えば、制御された過程の繰り返しにより）である。
【００３１】
試料：  本明細書で用いているように、「試料」という用語は、本明細書で述べるように、対象の源から得られた又はそれに由来する生物学的試料を意味する。いくつかの実施形態において、対象の源は、動物又はヒトなどの生物を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、生物組織又は体液を含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織又は細針生検試料；細胞含有体液；浮遊性核酸；痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹膜液；胸水；糞便；リンパ液；婦人科体液；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻スワブ；管洗浄液又は気管支肺胞洗浄液などの洗液又は洗浄液；吸引物；剥離物；骨髄検体；組織生検材料；外科標本；糞便、他の体液、分泌物、及び／又は排泄物；並びに／或いはそれらからの細胞等であるか、又はこれらを含む。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、個体から得られる細胞であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態において、試料は、適切な手段により対象の源から直接得られる「一次試料」である。例えば、いくつかの実施形態において、一次生物学的試料は、生検（例えば、細針吸引又は組織生検）、手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便等）の採取等からなる群から選択される方法により得られる。いくつかの実施形態において、文脈から明らかなように、「試料」という用語は、一次試料を処理することにより（例えば、その１つ若しくは複数の成分を除去することにより、且つ／又はそれに１つ若しくは複数の物質を加えることにより）得られる調製物を意味する。例えば、半透膜を用いてろ過すること。そのような「処理試料」は、例えば、試料から抽出された或いは一次試料をｍＲＮＡの増幅又は逆転写、特定の成分の単離及び／又は精製等のような技術に供することにより得られる核酸又はタンパク質を含み得る。
【００３２】
対象：  本明細書で用いているように、「対象」又は「試験対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防及び／又は治療の目的のために提供される化合物又は組成物を本発明に従って投与する生物を意味する。一般的な対象は、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類及びヒトなどの哺乳動物；昆虫；虫；等）並びに植物を含む。いくつかの実施形態において、対象は、疾患、障害及び／又は状態に罹患し且つ／又は罹りやすいことがあり得る。
【００３３】
実質的に：  本明細書で用いているように、「実質的に」という用語は、完全又はほぼ完全な程度又は度合いの対象の特性又は性質を示す定性的な状態を意味する。生物学の技術分野における技術者は、生物学的及び化学的現象がたとえ完結まで進み且つ／又は完全になるまで進み或いは絶対的結果を達成又は回避するとしても極めてまれであることを理解する。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び／又は化学的現象に固有な完全性欠如の可能性を捕捉するために本明細書で用いられている。
【００３４】
に罹患する：  疾患、障害及び／又は状態「に罹患して」いる個人は、疾患、障害及び／又は状態と診断され、且つ／又はその１つ若しくは複数の症状を示す。
【００３５】
に罹りやすい：  疾患、障害及び／又は状態「に罹りやすい」個人は、一般公衆の構成員よりも疾患、障害及び／又は状態を発現する高いリスクを有する者である。いくつかの実施形態において、疾患、障害及び／又は状態に罹りやすい個人は、疾患、障害及び／又は状態と診断されなかったことがあり得る。いくつかの実施形態において、疾患、障害及び／又は状態に罹りやすい個人は、疾患、障害及び／又は状態の症状を示し得る。いくつかの実施形態において、疾患、障害及び／又は状態に罹りやすい個人は、疾患、障害及び／又は状態の症状を示さないことがあり得る。いくつかの実施形態において、疾患、障害及び／又は状態に罹りやすい個人は、疾患、障害及び／又は状態を発現する。いくつかの実施形態において、疾患、障害及び／又は状態に罹りやすい個人は、疾患、障害及び／又は状態を発現しない。
【００３６】
治療する：  本明細書で用いているように、「治療する」、「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患、障害及び／又は状態の１つ若しくは複数の症状若しくは特徴を部分的若しくは完全に緩和し、改善し、軽減し、抑制し、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低減し、且つ／又はその発生率を低下させるために用いられる方法を意味する。治療は、疾患、障害及び／又は状態の徴候を示さない対象に施すことができる。いくつかの実施形態において、治療は、例えば、疾患、障害及び／又は状態に関連する病変を発現するリスクを低減する目的のために疾患、障害及び／又は状態の初期の徴候のみを示す対象に施すことができる。
【００３７】
野生型：  本明細書で用いているように、「野生型」という用語は、「正常」（変異体、罹患、改変等と対比される）状態又は状況で天然に見いだされる構造及び／又は活性を有する存在物を意味する当技術分野で理解されている意味を有する。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドが複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）でしばしば存在することを十分に理解する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本開示によって提供される方法論を示す図である。
【図２】提供される方法の例示的な連続的バーコード化を示す図である。（ａ）連続的バーコード化の略図。それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションにおいて、多数のプローブ（例えば、２４個）を、それぞれの転写物上でハイブリダイズさせてイメージングした後、ＤＮアーゼＩ処置によって剥離させた。同じプローブ配列を、プローブを異なるフルオロフォアに連結させて、異なるラウンドのハイブリダイゼーションで使用することができる。（ｂ）多数の酵母細胞における３ラウンドのハイブリダイゼーションからの複合４色ＦＩＳＨデータ。１２個の遺伝子を、２ラウンドのハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイゼーション１と同じプローブを使用した第３のハイブリダイゼーションによって符号化した。枠内の領域を、それぞれの画像の右下隅で拡大した。マッチするスポットが示され、バーコードを抽出した。理論に拘束されることを意図しないが、蛍光の共局在を示さないスポットは、細胞におけるプローブの非特異的結合並びにミスハイブリダイゼーションによるものであり得る。それぞれのバーコードの数を定量して、１つの細胞における対応する転写物の量を得た。（ｃ）例示的なバーコード。ｍＲＮＡ１：黄−青−黄；ｍＲＮＡ２：緑−紫−緑；ｍＲＮＡ３：紫−青−紫；及びｍＲＮＡ４：青−紫−青。
【図３】連続的ハイブリダイゼーション及びバーコード化の略図である。（ａ）連続的ハイブリダイゼーション及びバーコード化の略図。（ｂ）細胞のＦＩＳＨ画像の略図。それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションにおいて、同じスポットが検出されたが、転写物に関連する色素は変化する。ｍＲＮＡの同一性を、ハイブリダイズした色素の時間的順序によって符号化した。
【図４】ＤＮアーゼＩが、ｍＲＮＡに結合したｓｍＦＩＳＨプローブを効率よく除去する図である。ＤＮアーゼＩは、ｍＲＮＡに結合したｓｍＦＩＳＨプローブを効率よく除去する。抗退色緩衝液中で４時間のＤＮアーゼＩ処置の前後でスポットをイメージングした。処置後の強度比の平均値、中央値、及びＳＴＤは、１１．５％、８．３％、及び１１％であった。ＤＮアーゼＩ処置の前後でのスポット強度の比を、それぞれのスポット、ｎ＝１０８４のスポットに関してプロットした。
【図５】光退色がＤＮアーゼＩ処置後の残留強度を除去する図である。光退色はＤＮアーゼＩ処置後の残留強度を除去した。スポットを、４時間のＤＮアーゼＩ処置後に１０秒間の励起によって退色させた。退色後の強度比の平均値、中央値、及びＳＴＤは、０．０３％、０．０１％、及び０．０４９％であった。ＤＮアーゼＩ処置の前後のスポット強度比を、ｎ＝１２８６スポットのそれぞれのスポットに関してプロットした。
【図６】ｍＲＮＡが複数のラウンドの再ハイブリダイゼーションにおいて安定である図である。ｍＲＮＡは複数のラウンドの再ハイブリダイゼーションにおいて安定であった。ｓｍＦＩＳＨスポットの強度分布を６回のハイブリダイゼーションに対してプロットした。２回のハイブリダイゼーションを３回繰り返して、全体で６回のハイブリダイゼーションとした。スポットを、次の同一のハイブリダイゼーションのスポットとの共局在により同定した。それぞれの四角の区画に関して、計数されたスポット数は、１９１〜１３３７個であった。
【図７】最初の２回のラウンドのハイブリダイゼーションで同定され、次のラウンドのハイブリダイゼーションで再度出現する、細胞当たりのバーコードの分画の図である。最初の２回のラウンドのハイブリダイゼーションで同定され、次のラウンドのハイブリダイゼーションで再度出現する、細胞当たりのバーコードの分画。バーコードを、３回全てのハイブリダイゼーションを通しての共局在によって同定した。バーコードの７７．９±５．６％が、ｎ＝３７の細胞において再出現する。
【図８】ハイブリダイゼーション１及び３におけるＦＩＳＨポイント間のポイント毎の変位の図である。ハイブリダイゼーション１及び３におけるＦＩＳＨポイント間のポイント毎の変位。ハイブリダイゼーション１及び３のＣｙ５画像におけるＦＩＳＨドットを抽出して、二次元ガウス分布にフィットさせた。ポイント毎の変位を３次元ヒストグラムで示す。標準偏差は１０５．８ｎｍであり、ｍＲＮＡが２ラウンドのハイブリダイゼーションにおいて、ｎ＝１１９９スポットで１００ｎｍに局在できることを示した。
【図９】同じプローブセットの繰り返しハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼーション１及び３）において同定されたバーコードの図である。同じプローブセットの繰り返しハイブリダイゼーション（ハイブリダイゼーション１及び３）において同定されたバーコード。バーコードをハイブリダイゼーションにおける共局在によって同定した。それぞれの縦列は、個々の細胞に対応する。それぞれの横行は、ハイブリダイゼーション１及び３において同定された特異的バーコードに対応する。太字の行の名称はハイブリダイゼーション１及び３において共局在するはずの反復カラーバーコードに対応する。太字でない行の名称は偽陽性バーコードに対応する。例えば、（Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５３２）では多数のバーコードが検出され、Ａｌｅｘａ  ５３２チャンネルにおけるスポットの共局在を示している。細胞数ｎ＝３７、Ａｌ５３２＝Ａｌｅｘａ  ５３２。Ａｌ５９４＝Ａｌｅｘａ  ５９４。Ａｌ６４７＝Ａｌｅｘａ  ６４７。
【図１０】バーコード抽出による１つの細胞のｍＲＮＡレベルの図である。バーコード抽出による１つの細胞のｍＲＮＡレベル。バーコードを、ハイブリダイゼーション１及び２における共局在によって同定した。それぞれの縦列は、個々の細胞、ｎ＝３７に対応する。Ａｌ５３２＝Ａｌｅｘａ  ５３２。Ａｌ５９４＝Ａｌｅｘａ  ５９４。Ａｌ６４７＝Ａｌｅｘａ  ６４７。上から下に：ＹＬＲ１９４ｃ、ＣＭＫ２、ＧＹＰ７、ＰＭＣ１、ＮＰＴ１、ＳＯＫ２、ＵＩＰ３、ＲＣＮ２、ＤＯＡ１、ＨＳＰ３０、ＰＵＮ１、及びＹＰＳ１。
【図１１】マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）におけるＮａｎｏｇ  Ａｌｅｘａ  ６４７プローブのＤＮアーゼＩによる剥離の図である。マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）におけるＮａｎｏｇ  Ａｌｅｘａ  ６４７プローブのＤＮアーゼＩによる剥離。Ｎａｎｏｇを標的とする４８個のプローブをｍＥＳＣにおいてハイブリダイズさせた。プローブを、濃度３単位／μＬのＤＮアーゼＩと共に３０分インキュベートすることによって剥離させた。
【図１２】マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）におけるＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの再ハイブリダイゼーション。マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）におけるＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの再ハイブリダイゼーション。プローブを、濃度３単位／μＬのＤＮアーゼＩと共に３０分インキュベートすることによって剥離させた。Ｎａｎｏｇ  Ａｌｅｘａ６４７プローブを、１２時間再ハイブリダイズさせて、イメージングした。画像は、１．５μｍ毎に撮影した１１の画像のｚスタックにより作製した二次元最大値投影であった。
【図１３】１００μｍ冠状切片において逆行性トレーサー（フルオロゴールド（Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ）、緑色）によって可視化した皮質におけるβ−アクチン（赤色）のＨＣＲ検出の図である。冠状切片全体を１０倍及び６０倍（拡大画像の挿入図）でイメージングした。倍率６０倍の画像では、個々の赤色のドットは、１つのβ−アクチンｍＲＮＡ分子に対応する。β−アクチンの発現は、逆行性トレーサー（緑色）によってタグ付けされたニューロンの遠位亜集団を同時に検出しながら蛍光輝点を計数することによって定量することができる。
【図１４】ＨＣＲによって標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、２０μｍの脳切片におけるＲＮＡ１分子の検出においてフルオロフォアによって直接標識されたｓｍＦＩＳＨプローブと同程度に特異的であったことを示す図である。β−アクチンを標的とするＨＣＲプローブ（左）及びｓｍＦＩＳＨプローブは、同時に共局在した。ＨＣＲの改善されたＳ／Ｎに注目されたい。
【図１５】ＨＣＲによって標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが２０μｍの脳切片に良好に再ハイブリダイズした図である。ｈｙｂ１及びｈｙｂ２におけるＨＣＲスポットは、２回のハイブリダイゼーションの間にＤＮアーゼ処置を行ったが共局在した。このことは、ＨＣＲをｓｅｑＦＩＳＨプロトコールに完全に組み込むことができることを示した。
【図１６】ニッスル染色を伴うＣＬＡＲＩＴＹの図である：Ｔｈｙ−１−ｅＹＦＰマウス脳の厚さ１ｍｍの冠状切片（前頂ＡＰ、２．３〜１．３ｍｍ）を、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ蛍光ニッスル染色液（１：１００希釈、４８時間、室温）によって透明化して染色した。左側、運動皮質の三次元冠状レンダリング。右、第Ｖ層運動野の厚さ１００μｍの切片。矢印は、錐体ニューロン（赤色−蛍光ニッスル、緑色−ｅＹＦＰ）の尖端樹状突起を示す。
【図１７】例示的な光シート顕微鏡の概略表示である。
【図１８】ＳＰＩＭがＣＬＡＲＩＴＹ処理した１００μｍの脳切片において１つのｍＲＮＡを検出する図である。切片を１００μｍにわたって走査した。画像を登録して三次元再構成を作成した。画像における回折制限点は、ＨＣＲによって検出された１つのβ−アクチンｍＲＮＡに対応した。スケールバーは１５μｍである。
【図１９】アレン脳アトラス（Ａｌｌｅｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｔｌａｓ）の連続冠状レベルにおける体性感覚運動野サブネットワークの神経結合マップである。これは体性感覚運動野の４つの主成分、すなわちＳＳｐ、ＳＳｓ、ＭＯｐ、及びＭＯｓのそれぞれが、４つの機能的ドメインに分割されることを示している。これらの機能的に相関するドメインは、他の全てと広く相互結合して、４つの主要な体性感覚運動野サブネットワークを形成する：口顔咽頭（ｏｒｆ、青色）、上肢（ｕｌ、緑色）、下肢及び体幹（ｌｌ／ｔｒ、赤色）、並びにひげ（ｂｆｄ．ｃｍ＆ｗ、黄色）。数字は、前頂に対する切片の位置を示す（ｍｍ）。提供される方法は、異なるサブネットワーク内でのこれらの別個のドメインのそれぞれにおいて投影ニューロンの結合及び分子同一性を特徴付けすることができる。
【図２０】逆行性標識ニューロンを自動的に検出及びマップするための例示的な情報ワークフロー並びに遺伝子バーコード化情報の図である。ＣＴｂ標識（ピンク色）、及びニッスル染色（青色）を有する未加工画像。枠内の領域は、ＣＴｂ標識ニューロンの拡大図を示す。Ｂ．マルチチャンネル未加工画像を領域分割するためにグレースケールに変換する。Ｃ．個々のトレーサーチャンネル画像を、標識細胞から組織バックグラウンドを明確に分離するセグメンテーションパイプラインによって処理する。白いドットは、標識された細胞体の再構成である。Ｄ．再統合したマルチピクチャーｔｉｆｆを、登録するためにＡＲＡにおける冠状断面に関連させる。Ｅ．提供された開発された登録ソフトウェアを使用して、マルチピクチャーｔｉｆｆを再投影させて、組織のシルエットと神経細胞層構築輪郭の両方を、その対応するＡＲＡレベルに整列させる。Ｆ．セグメンテーションプロセスによって抽出した細胞を、空間的に正規化してＡＲＡ内の神経層又は亜核特異的ＲＯＩに関連させることができる。Ｇ．領域分割されて登録された標識再構成画像は、その付随するｓｅｑＦＩＳＨデータと共にｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ  ＦＩＳＨビューワで公開される。解析タブは、注入部位、トレーサーのタイプ、ＲＯＩごとの標識細胞数に関する情報を提供し、これらをさらに神経層特異的細胞数、及び細胞ごとの遺伝子発現へと曖昧性を解消させることができる。
【図２１】エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）を使用したハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）の再ハイブリダイゼーションの図である。（ａ）架橋鎖及びＨＣＲポリマーのｅｘｏＩＩＩ消化の略図。ＥｘｏＩＩＩは、架橋鎖及びＨＣＲポリマーを３’から５’方向にｄＮＭＰへと消化して、標的、例えばｍＲＮＡに結合した中間プローブ鎖が後に残る。新しい架橋鎖を次に、異なる蛍光色素を有する異なるヘアピンセットの重合化を開始する異なるイニシエーター配列を有する標的結合プローブにハイブリダイズさせることができる。（ｂ）β−アクチン（Ａｃｔｂ）転写物に対するプローブを使用した、Ｔ３Ｔマウス線維芽細胞株における（ａ）に示した略図の使用を説明する未加工データ。
【図２２】ラムダエキソヌクレアーゼ（λ−ｅｘｏ）を使用するハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）の再ハイブリダイゼーションの図である。（ａ）架橋鎖のλ−ｅｘｏ消化の略図であり、λ−ｅｘｏは５’リン酸化架橋鎖を５’から３’方向に選択的に消化して、標的、例えばｍＲＮＡに結合した中間プローブ鎖からＨＣＲポリマーを放出する。放出されたポリマーを洗浄緩衝液で洗浄する。次に、新しい架橋鎖を、異なる蛍光色素を有する異なるヘアピンセットの重合化を開始する異なるイニシエーター配列を有する標的結合プローブにハイブリダイズさせることができる。（ｂ）β−アクチン（Ａｃｔｂ）転写物に対するプローブを使用したＴ３Ｔマウス線維芽細胞株における（ａ）に示した略図の使用を説明する未加工データ。
【図２３】ウラシル特異的切断試薬（ＵＳＥＲ）を使用するハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）の再ハイブリダイゼーションの図である。（ａ）架橋鎖のＵＳＥＲ消化の略図。ＵＳＥＲは、架橋鎖中のデオキシウリジンヌクレオチドを選択的に消化して、架橋鎖を断片化させる。次に、断片を中間プローブ鎖から解離させて、標的、例えばｍＲＮＡに結合したプローブからＨＣＲポリマーを放出させる。放出されたポリマーを洗浄緩衝液によって洗浄する。次に、新しい架橋鎖を、異なる蛍光色素を有する異なるヘアピンセットの重合化を開始する異なるイニシエーター配列を有する標的結合プローブにハイブリダイズさせることができる。（ｂ）β−アクチン（Ａｃｔｂ）転写物に対するプローブを使用した、Ｔ３Ｔマウス線維芽細胞株における（ａ）に示した略図の使用を説明する未加工データ。
【図２４】相補的オリゴヌクレオチド（ｃＴＯＥ）を使用した、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの例示的な除去の図である。
【図２５】例示的なオリゴヌクレオチドの調製の図である。当初のオリゴヌクレオチド（この図で例示される、プローブ）ライブラリは、いくつかのプローブサブライブラリを含む。それぞれのサブライブラリは、ＰＣＲを使用してサブライブラリを増幅するために使用することができる特異的なプライマーの組を有する。所望のサブライブラリが増幅された後、産物をニッキング酵素と共にインキュベートする。酵素は、プローブ鎖上のホスホジエステル結合をその認識部位で切断する。得られた産物を変性させて、変性ゲル上で泳動させると、所望のプローブ配列が放出される。次に、プローブのバンドをゲルから切り出して抽出することができる。抽出された産物をハイブリダイゼーションのために使用することができる。
【図２６】例示的なオリゴヌクレオチドの調製の図である。産物はゲル上の三番目のバンドであった。ライブラリは、それに関連する多くの異なるプライマーを有し、プローブのそれぞれのサブセットに関して１つのプライマーセットを有する。例示的なプライマーは、ＧＣ含有量４５〜５５％及びＴｍ約５５℃を有するランダムな２０ヌクレオチドの配列であった。ニッキングエンドヌクレアーゼ部位はＧＴＣＴＣＮＮであった；対応するニッキングエンドヌクレアーゼは、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩである。産物プローブは、４５〜５５％のＧＣ含有量を有する関心対象ｍＲＮＡと相補的な２０量体のＤＮＡ配列であった。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
とりわけ、本発明は、細胞における核酸（例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座）をプロファイリングするための新たな方法、組成物及び／又はキットを提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本発明は、細胞における核酸（例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座）をプロファイリングするための方法を提供する。いくつかの実施形態において、単一細胞における複数の標的をプロファイリングする方法を提供する。提供する方法は、とりわけ、逐次バーコーディングにより限られた数の検出可能な標識を用いて多数の標的（転写物、ＤＮＡ遺伝子座又はそれらの組合せ）をプロファイリングすることができる。
【００４１】
図１に本発明による方法を示す。示すように、本発明は、標識プローブを用いた複数のラウンドのハイブリダイゼーション（接触ステップ）により細胞中に存在する核酸（例えば、ｍＲＮＡｓ）をプロファイリングする方法を提供する。具体的には、図１に示すように、細胞中の核酸標的とハイブリダイズする複数の組のプローブを提供し、プローブ（すなわち、異なる標的とハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド）は、単一の組の中で標識されており、さらに、少なくとも１つのプローブは、異なる組において異なって標識されている。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本発明（例えば、図１に示すような）は、
（ａ）組成物が少なくとも
（ｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチド
を含むように、複数の転写物及びＤＮＡ遺伝子座を含む細胞を、それぞれが転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、検出可能な部分により標識されている、第１の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第１の接触ステップを実施するステップと、
（ｂ）第１の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的とのハイブリダイゼーションが検出されるように第１の接触ステップの後に細胞をイメージングするステップと、
（ｃ）第２の複数のオリゴヌクレオチドが少なくとも
（ｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第３のオリゴヌクレオチド、及び
（ｉｉ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第２のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の複数のオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが第１の複数のオリゴヌクレオチドにおける同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているという点が第２の複数のオリゴヌクレオチドが第１の複数のオリゴヌクレオチドと異なるように、また第２の複数のオリゴヌクレオチドにおいて、
（ｉｉｉ）第３のオリゴヌクレオチドが、第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分又は第３の検出可能な部分により標識されており、
（ｉｖ）第４のオリゴヌクレオチドが、第１の検出可能な部分、第２の検出可能な部分、第３の検出可能な部分又は第４の検出可能な部分により標識されており、
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は第４のオリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は両方であるように、
細胞を、第１の複数のオリゴヌクレオチドにより標的とされる重複転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドを含む、第２の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む第２の接触ステップを実施するステップと、
（ｄ）第２の複数のオリゴヌクレオチドによるそれらの標的とのハイブリダイゼーションが検出されるように第２の接触ステップの後に細胞をイメージングするステップと、
（ｅ）同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドの検出可能な部分の標識の少なくとも１つの差のため、それぞれの用いられる複数のオリゴヌクレオチドが他の用いられる複数のオリゴヌクレオチドとそれぞれと異なる、第１及び第２の複数のオリゴヌクレオチドにより標的にされる重複転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とするオリゴヌクレオチドを含む新たな複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを毎回用いて、接触及びイメージングステップを場合によって反復するステップと
を含む方法を提供する。
【００４３】
本明細書で用いているように、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、検出可能な部分により標識されている。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、１つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、１つの検出可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の検出可能な部分を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアであるか又はそれを含む。具体的としての、フルオロフォアにより標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）用のプローブを含むが、これらに限定されない。当業者によって広く知られ、実施されるＦＩＳＨは、とりわけ、特定のＤＮＡ配列又はＲＮＡ標的の存在又は非存在を検出し、その位置を特定するために用いられる。標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを設計し、調製する方法は、当技術分野で広く知られており、米国特許出願公開ＵＳ２０１２０１４２０１４に記載されているものを含むが、これに限定されない。しかし、フルオロフォアの入手可能性のような制約のため、ＦＩＳＨは、所定の実験における限られた数の標的をプロファイリングするために用いることができるに過ぎない。異なる標的を多重化するための逐次バーコーディングにより、本発明の提供する方法は、ＦＮまでの多数の標的をプロファイリングすることができる。ここで、Ｆは、検出可能な部分（ＦＩＳＨの場合、フルオロフォア）の種類の数であり、Ｎは、接触ステップ（ＦＩＳＨの場合、ハイブリダイゼーション）の数である。例えば、Ｆが４で、Ｎが８である場合、ほぼ全体のトランスクリプターゼ（４８＝６５５３６）をプロファイリングすることができる。いくつかの実施形態において、Ｆは、少なくとも２である。いくつかの実施形態において、Ｆは、３である。いくつかの実施形態において、Ｆは、４である。いくつかの実施形態において、Ｆは、５である。いくつかの実施形態において、Ｆは、６である。いくつかの実施形態において、Ｆは、７である。いくつかの実施形態において、Ｆは、８である。いくつかの実施形態において、Ｆは、９である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１０である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１１である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１２である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１３である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１４である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１５である。いくつかの実施形態において、Ｆは、１５より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、２である。いくつかの実施形態において、Ｎは、２より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、３である。いくつかの実施形態において、Ｎは、３より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、４である。いくつかの実施形態において、Ｎは、４より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、５である。いくつかの実施形態において、Ｎは、５より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、６である。いくつかの実施形態において、Ｎは、６より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、７である。いくつかの実施形態において、Ｎは、７より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、８である。いくつかの実施形態において、Ｎは、８より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、９である。いくつかの実施形態において、Ｎは、９より大きい。いくつかの実施形態において、Ｎは、１０である。いくつかの実施形態において、Ｎは、１０より大きい。いくつかの実施形態において、���数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００個の標的を標的とする。
【００４５】
接触ステップにおいて、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、その標的へのその結合の前に、それと同時に又はその後に標識することができる。いくつかの実施形態において、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドのような、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、その標的へのその結合の前に標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、その標的へのその結合と同時に標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、その標的へのその結合の後に標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｃｈｏｉ、ＨＭ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１０年１１月、２８巻（１１号）、１２０８〜１２頁）によるオルソゴナル増幅によるハイブリダイゼーションの後に標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、部分、例えば、核酸配列を含み、イメージングステップにおいてシグナルをもたらし得る１つ又は複数の部分は、オリゴヌクレオチドに直接的又は間接的に結合させることができる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、同じ種類の標識を、異なる標的に対する異なるプローブに結合させることができる。いくつかの実施形態において、同じ標的に対するプローブは、接触ステップで用いる複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド（一組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド）における同じ標識を有する。標的について情報、例えば、定量的及び／又は空間的情報を得ることができるように、各標的は、接触及びイメージングのラウンドの後に、それ自体の標識の固有の組合せを有する（逐次バーコーディング）。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを標識するためにフルオロフォアを用いる場合、Ｎステップの後に、標的は、Ｆ１Ｆ２．．．ＦＮの逐次バーコードを有することとなる。ここで、Ｆｎは、第ｎ番目のイメージングにおける標的について用いられるフルオロフォアの色である。１つの標的は、それらのバーコードの差異（例えば、赤赤青赤を赤赤赤青と比較した）によって他のものと区別することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明の標識は、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒｓ、ＡＴＴＯ  Ｄｙｅｓ又はそれらのいずれかの類似体若しくは誘導体を含むが、これらに限定されない、１つ又は複数の蛍光色素であるか又はそれを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本発明の標識は、フルオレセイン及びフルオレセインの化学的誘導体；エオシン；カルボキシフルオレセイン；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）；エリスロシン；ローズベンガル；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）により分泌されるフルオレセイン；メチレンブルー；レーザー色素；ローダミン色素（例えば、ローダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、オーラミンＯ、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ及びテキサスレッド）を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本発明の標識は、ＡＴＴＯ色素；アクリジン色素（例えば、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ；７−アミノアクチノマイシンＤ；８−アニリノナフタレン−１−スルホネート；オーラミン−ローダミン染色；ベンズアントロン；５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン；９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン；ブラックライトペイント；ブレインボウ；カルセイン；カルボキシフルオロセイン；カルボキシフルオロセイン二酢酸スクシンイミジルエステル；カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル；１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン；２−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン；２−クロロ−９，１０−ジフェニルアントラセン；クマリン；シアニン色素（例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５、ＤｉＯＣ６、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉなどのシアニン）；ＤＡＰＩ、Ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ、Ｆｌｕｏ−４、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ；フルオロン色素（例えば、カルセイン、カルボキシフルオロセイン、カルボキシフルオロセイン二酢酸スクシンイミジルエステル、カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル、エオシン、エオシンＢ、エオシンＹ、エリスロシン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、フルオロセインアミダイト、インディアンイエロー、メルブロミン）；フルオロジェード染色；Ｆｕｒａ−２；Ｆｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル；緑色蛍光タンパク質、ヘキスト染色、インディアンイエロー、Ｉｎｄｏ−１、ルシファーイエロー、ルシフェリン、メロシアニン、蛍光増白剤、オキサジン色素（例えば、クレシルバイオレット、ナイルブルー、ナイルレッド）；ペリレン；フェナントリジン色素（臭化エチジウム及びヨウ化プロピジウム）；フロキシン、フィコビリン、フィコエリスリン、フィコエリスロビリン、ピラニン、ローダミン、ローダミン１２３、ローダミン６Ｇ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、（Ｅ）−スチルベン、（Ｚ）−スチルベン、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ、Ｓｙｎａｐｔｏ−ｐＨｌｕｏｒｉｎ、テトラフェニルブタジエン、四ナトリウムトリス（バソフェナントロリンジスルホネート）ルテニウム（ＩＩ）、テキサスレッド、ＴＳＱ、ウンベリフェロン又は黄色蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明の標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ系列の蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｏｒｅｇｏｎ）を含むが、これらに限定されない。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、蛍光顕微鏡法及び細胞生物学において細胞及び組織標識として広く用いられている。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ系列の励起及び発光スペクトルは、可視スペクトルを対象範囲として含み、赤外に及ぶ。系列の個々のメンバーは、ほぼそれらの最大励起波長（ｎｍ単位）に従って番号付けされている。特定のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、クマリン、ローダミン、キサンテン（フルオレセインなど）及びシアニン色素のスルホン化により合成される。いくつかの実施形態において、スルホン化は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素を負に荷電させ、親水性にする。いくつかの実施形態において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、同等の励起及び発光の一般的な色素（例えば、フルオレセイン、ローダミン）よりも、またより新しいシアニン系列よりある程度、安定であり、輝度が高く、ｐＨ感受性が低い。具体的としてのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素は、Ａｌｅｘａ−３５０、Ａｌｅｘａ−４０５、Ａｌｅｘａ−４３０、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５００、Ａｌｅｘａ−５１４、Ａｌｅｘａ−５３２、Ａｌｅｘａ−５４６、Ａｌｅｘａ−５５５、Ａｌｅｘａ−５６８、Ａｌｅｘａ−５９４、Ａｌｅｘａ−６１０、Ａｌｅｘａ−６３３、Ａｌｅｘａ−６４７、Ａｌｅｘａ−６６０、Ａｌｅｘａ−６８０、Ａｌｅｘａ−７００又はＡｌｅｘａ−７５０を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本発明の標識は、１つ又は複数のＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ系列の蛍光色素（Ｄｙｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む。具体的としてのＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒ系列の色素は、ＤｙＬｉｇｈｔ−３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ−４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ−５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ−５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ−６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ−６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ−６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ−７５０又はＤｙＬｉｇｈｔ−８００を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、ナノ材料であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、ナノ粒子であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、量子ドットであるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、量子ドットである。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、量子ドットを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、金ナノ粒子であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、金ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、金ナノ粒子を含む。
【００５３】
当業者は、いくつかの実施形態において、特定のサイクルにおける特定のプローブの標識の選択は、例えば、サイズ、発生するシグナルの種類、プローブに結合する又は組み込まれる態様、細胞内のそれらの位置を含む細胞成分の特性、細胞の特性、解析される相互作用の種類などを含む様々な因子に基づいて決定することができることを理解する。
【００５４】
例えば、いくつかの実施形態において、プローブは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳ−エステル）反応性基を有するように合成されたＣｙ３又はＣｙ５で標識されている。ＮＨＳ−エステルは、脂肪族アミン基と容易に反応するので、ヌクレオチドは、アミノアルキル基で修飾することができる。これは、合成反応中にアミノアルキル修飾ヌクレオチドを組み込むことによって行うことができる。いくつかの実施形態において、消光効果を避けるために標識を６０塩基ごとに用いる。
【００５５】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的、例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座とハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態において、標的は、転写物であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、標的は、転写物である。いくつかの実施形態において、転写物は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物は、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物は、ｔＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物は、ｒＲＮＡである。いくつかの実施形態において、転写物は、ｓｎＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、非コーディングＲＮＡである。具体的としての非コーディングＲＮＡタイプは、当技術分野で広く知られており、長鎖非コーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、核小体内低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）及び他の短鎖ＲＮＡｓを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ｐｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡである。
【００５６】
いくつかの実施形態において、標的は、ＤＮＡ遺伝子座であるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、標的がＤＮＡ遺伝子座である場合、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、１つ若しくは複数のＲＮＡヌクレオチド又はＲＮＡセグメントを場合によって含む。検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を含み、これは、ＤＮＡ標的を分解せずにイメージングの後に、例えば、ＲＮＡ特異的酵素消化により、選択的に除去することができる。ＲＮＡを特異的に分解するが、ＤＮＡを分解しない具体例としての酵素は、ＲＮアーゼＡ及びＲＮアーゼＨなどの様々なＲＮアーゼを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、その標的、例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座と直接ハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的に結合している、ハイブリダイズしている又は他の仕方で特異的に結合している１つ又は複数の中間物、例えば、オリゴヌクレオチドへの結合又はハイブリダイゼーションによりその標的と特異的に相互作用する（認識する）。いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドは、相補的配列を有する第２のオリゴヌクレオチド（「架橋オリゴヌクレオチド」又は「架橋プローブ」）がそれに結合することができるようなオーバーハングによりその標的に対してハイブリダイズしている。いくつかの実施形態において、中間物は、核酸を標的とし、検出可能な部分により場合によって標識されており、標的とのハイブリダイゼーションの後にオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、中間物は、標的とハイブリダイズする配列、オーバーハング配列及び場合による検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、中間物は、標的とハイブリダイズする配列及びオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、中間物は、検出可能な部分を含まない。いくつかの実施形態において、第２のオリゴヌクレオチドは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第２の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、色素により標識される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＨＣＲポリマーにより標識される。いくつかの実施形態において、標的に結合した中間オリゴヌクレオチドは、複数の接触、除去及び／又はイメージングステップを経て保存され、接触及びイメージングステップにおいて架橋プローブを介して中間オリゴヌクレオチドに連結されている検出可能な標識の組合せにより逐次バーコードがもたらされる。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを架橋プローブとして用いる場合、バーコードは、それらのオーバーハング配列を介して中間オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによってもたらされる。イメージングステップの後に、架橋オリゴヌクレオチドは、本明細書で述べたように場合によって除去される。いくつかの実施形態において、１つの中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、３つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、４つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、５つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、６つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、７つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、８つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、９つ以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１１以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１２以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１３以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１３以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１５以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１６以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１７以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１８以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、１９以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２１以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２２以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２３以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２４以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２５以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、３０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、４０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、５０以上の中間オリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。
【００５８】
いくつかの実施形態において、各中間オリゴヌクレオチドは、標的の異なる配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、標的の各中間オリゴヌクレオチドは、同じオーバーハング配列を含む。いくつかの実施形態において、標的に対する各検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的の全ての中間オリゴヌクレオチドによって共有される同じオーバーハング配列に対して相補的な同じ配列を含む。いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドは、標的と相補的な配列及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、
（ｆ）複数の核酸を含む細胞を、それぞれが
（ｉ）核酸を標的とし、検出可能な部分により場合によって標識されており、且つ
（ｉｉ）標的とのハイブリダイゼーションの後にオーバーハング配列を含む、複数の中間オリゴヌクレオチドと接触させることを含む接触ステップを実施するステップと、
（ｇ）中間オリゴヌクレオチドとそれらの標的との間の相互作用が検出されるように細胞を場合によってイメージングするステップと
をさらに含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）及び場合によるステップ（ｇ）は、ステップ（ａ）の前に実施する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｆ）は、実施されたステップ（ａ）である。いくつかの実施形態において、除去ステップは、中間オリゴヌクレオチドを保存する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、提供する技術は、スプライシング変動、ＲＮＡエディティング、オリゴヌクレオチド修飾又はそれらの組合せの結果として形成される異なる転写物をプロファイリングするために用いる。いくつかの実施形態において、標的は、ＲＮＡスプライシング変異体である。いくつかの実施形態において、提供する技術は、遺伝子の１つ又は複数のスプライシング変異体、例えば、遺伝子の１つ又は複数のスプライシング変異体の位置及び量をプロファイリングする。いくつかの実施形態において、提供する方法又は組成物は、異なるスプライシング変異体をプロファイリングする。いくつかの実施形態において、１つ又は複数の変異体を含むエキソンは、逐次ハイブリダイゼーション及びバーコーディングにより標的にされ、バーコード化される。いくつかの実施形態において、スプライシング変異体は、スプライシングに起因する１つ又は複数の区別できる配列を含み、そのような配列が標的とされる。いくつかの実施形態において、エキソン及び／又は区別できる配列を標的とすることによって、提供する技術は、１つ又は複数の特定のスプライシング変異体又はｍＲＮＡの全スプライシングレパートリーをプロファイリングすることができる。当技術分野で広く知られているように、ｍＲＮＡスプライシングは、多くの生物学的過程及び疾患、例えば、自閉症又はダウン症候群のような神経系の疾患に対して重要である。細胞間接着及びシナプス形成に関与する分子がスプライシングされ、それらの欠陥が脳内の誤配線を生じさせ、疾患を引き起こすことが公知である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、配列エディティング、化学修飾及び／又はそれらの組合せによってもたらされた配列修飾体を標的とする。いくつかの実施形態において、修飾核酸標的は、場合によって変換過程の後に、非修飾標的と比較すると、１つ又は複数の異なる相補的配列とハイブリダイズするので、修飾核酸と選択的にハイブリダイズする１つ又は複数のオリゴヌクレオチドを用いてプロファイリングする。いくつかの実施形態において、標的は、ＲＮＡエディティングによるＲＮＡである（Ｂｒｅｎｎｉｃｋｅ  Ａ．、Ａ．  Ｍａｒｃｈｆｅｌｄｅｒら、（１９９９）「ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２３巻（３号）、２９７〜３１６頁）。いくつかの実施形態において、提供する技術は、ＲＮＡエディティングにより形成された異なるＲＮＡ変異体をプロファイリングする。いくつかの実施形態において、提供する技術は、修飾オリゴヌクレオチドをプロファイリングする。いくつかの実施形態において、提供する技術は、メチル化ＲＮＡをプロファイリングする（Ｓｏｎｇ  ＣＸ、Ｙｉ  Ｃ、Ｈｅ  Ｃ．、Ｍａｐｐｉｎｇ  ｒｅｃｅｎｔｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１２年１１月、３０巻（１１号）、１１０７〜１６頁）。いくつかの実施形態において、提供する技術は、メチル化ＤＮＡをプロファイリングする。いくつかの実施形態において、標的は、一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、標的をプロファイリングすることにより、提供する技術は、とりわけ、場合によっては、単一細胞、組織、臓器又は生物における標的の定量的及び／又は位置決め情報を提供する。いくつかの実施形態において、転写物のプロファイリングは、細胞、組織、臓器又は生物内の遺伝子発現の時空間パターンを定性的に、且つ／又は定量的に定義するために用いることができる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、一組における各検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、異なる標的、例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座を有する。いくつかの実施形態において、一組における２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を有する。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ転写物を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じＤＮＡ遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、５つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、１０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、１５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、２０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、２５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、３０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、３５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、４０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、４５以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、５０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、６０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、７０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、８０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、９０以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、１００以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約１〜１０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約５〜１５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約１０〜２０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約１５〜２５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約２０〜３０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約２５〜３５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約３０〜４０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約３５〜４５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約４０〜５０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約４５〜５５の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約５０〜７０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約６０〜８０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約７０〜９０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、約８０〜１００の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。
【００６５】
いくつかの実施形態において、とりわけ、同じ標的に対して複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを用いることにより、シグナル強度が増大する。いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とする一組における各検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、標的の異なる部分と相互作用する。
【００６６】
いくつかの実施形態において、一組における標的に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、同じ検出可能な部分を有する。いくつかの実施形態において、全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、同じ方法で標識されている。いくつかの実施形態において、標的に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが、同じフルオロフォアを有する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、標的に対する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的の標的領域内に位置決めされる。標的領域は、種々の長さを有し得る。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約２０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約３０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約４０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約５０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約６０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約８０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約１００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約１５０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約２００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約２５０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約３００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約３５０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約４００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約４５０ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約５００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約６００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約７００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約８００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約９００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的領域は、長さが約１，０００ｂｐである。いくつかの実施形態において、標的に対する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的上に互いに近接して位置決めされる。
【００６８】
当業者により理解されるように、種々の技術をイメージングステップに用いることができる。具体例としての方法は、落射蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、種々の種類の超解像顕微鏡法（ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ、ＳＳＩＭ／ＧＳＤ／ＳＴＥＤ）及び光シート顕微鏡法（ＳＰＩＭなど）を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
具体例としての超解像技術は、Ｉ５Ｍ及び４Ｐｉ−顕微鏡法、誘導放射抑制顕微鏡法（ＳＴＥＤＭ）、基底状態抑制顕微鏡法（ＧＳＤＭ）、空間構造化照明顕微鏡法（ＳＳＩＭ）、光活性化局在顕微鏡法（ＰＡＬＭ）、可逆的飽和性光学蛍光遷移（ＲＥＳＯＬＦＴ）、全反射照明蛍光顕微鏡法（ＴＩＲＦＭ）、蛍光−ＰＡＬＭ（ＦＰＡＬＭ）、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）、１ナノメートル精度の蛍光イメージング（ＦＩＯＮＡ）及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｉ、２００９、「Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌｉｍｉｔｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６巻（１号）、１５〜１８頁、Ｂｌｏｗ  ２００８、「Ｎｅｗ  ｗａｙｓ  ｔｏ  ｓｅｅ  ａ  ｓｍａｌｌｅｒ  ｗｏｒｌｄ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４５６巻、８２５〜８２８頁、Ｈｅｌｌら、２００７、「Ｆａｒ−Ｆｉｅｌｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｓｃｏｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６巻、１１５３頁、Ｒ．Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ及びＧ．Ｆｉｃｚ、２００６、「Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ  ｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５巻（４号）、２８９〜３０１頁、Ｇａｒｉｎｉら、２００５、「Ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏ  ｔｏ  ｎａｎｏ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６巻、３〜１２頁、並びにＢｅｗｅｒｓｄｏｒｆら、２００６、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｉ５Ｍ  ａｎｄ  ４Ｐｉ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、２２２巻（２号）、１０５〜１１７頁、並びにＷｅｌｌｓ、２００４、「Ｍａｎ  ｔｈｅ  Ｎａｎｏｓｃｏｐｅｓ」、ＪＣＢ  １６４巻（３号）、３３７〜３４０頁。
【００７０】
いくつかの実施形態において、電子顕微鏡（ＥＭ）を用いる。
【００７１】
いくつかの実施形態において、イメージングステップは、標的を検出する。いくつかの実施形態において、イメージングステップは、標的の位置を特定する。いくつかの実施形態において、イメージングステップは、標的の３次元空間的情報を提供する。いくつかの実施形態において、イメージングステップは、標的を定量化する。複数の接触及びイメージングステップを用いることにより、提供する方法は、驚くほどに高速大量処理で多数の標的に関する空間的及び／又は定量的情報を提供することができる。例えば、Ｆ個の検出可能に異なる種類の標識を用いる場合、Ｎ回の接触及びイメージングステップの後に最大ＦＮの標的の空間的及び／又は定量的情報を得ることができる。
【００７２】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、接触及び／又はイメージングステップの前又は後のさらなるステップを含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、各イメージングステップの後の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するステップを含む。いくつかの実施形態において、除去するステップは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを分解することを含む。いくつかの実施形態において、所望ならば標的を次の接触及び／又はイメージングステップに用いることができるように、除去するステップは、標的を大幅に分解しない。いくつかの実施形態において、除去するステップは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、除去するステップは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドをＤＮアーゼ又はＲＮアーゼと接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列を含み、ＤＮアーゼをその分解のために用いる。いくつかの他の実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を含み、ＲＮアーゼをその分解のために用いる。いくつかの実施形態において、除去するステップは、検出可能な部分を分解することを含む。いくつかの実施形態において、除去するステップは、光退色を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、１つの組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの標的は、他の組の標的でもある。いくつかの実施形態において、一組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの標的は、他の組のものと重複している。いくつかの実施形態において、重複は、１０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、２０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、３０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、４０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、５０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、６０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、７０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、８０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９１％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９２％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９３％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９４％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９０％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９５％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９６％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９７％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９８％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９９％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９９．５％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９９．６％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９９．７％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９９．８％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、９９．９％以上である。いくつかの実施形態において、重複は、１００％である。いくつかの実施形態において、一組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの標的は、他の組の標的と同じである。いくつかの実施形態において、各組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。
【００７４】
いくつかの実施形態において、第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座（第１の標的）を標的とする第２の接触ステップにおける第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする第１の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと場合によって同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、配列は、同一である。いくつかの実施形態において、配列は、異なる。同様に、いくつかの実施形態において、第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座（第１の標的）を標的とする第２の接触ステップにおける第４の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする第２の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと場合によって同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、配列は、同一である。いくつかの実施形態において、配列は、異なる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、第２の複数のオリゴヌクレオチドは、第２の複数のオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、第１の複数のオリゴヌクレオチドにおける同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されている点が第１の複数のオリゴヌクレオチドと異なる。いくつかの実施形態において、各複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、複数のオリゴヌクレオチドに存在するオリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、他の複数のオリゴヌクレオチドにおける同じ転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする対応するオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されている点が他のものと異なる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、［Ｓ］−［Ｌ］の構造を有し、［Ｓ］は、オリゴヌクレオチド配列であり、［Ｌ］は、検出可能な部分又は検出可能な部分の組合せである。いくつかの実施形態において、［Ｌ］は、それぞれが、オリゴヌクレオチド配列、例えば、［Ｓ］の１つ又は複数のヌクレオチド部分に独立に結合している検出可能な標識、例えば、フルオロフォアの複数の単位を含む。いくつかの実施形態において、同じ検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドに結合したそれぞれの検出可能な標識は、同じ検出可能なシグナルをもたらす。いくつかの実施形態において、同じオリゴヌクレオチド配列に結合した全ての検出可能な標識は、同じである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドは、２つ以上の組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのうちの同じ組の配列を有する。すなわち、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの間の差異は、たとえあったとしても、検出可能な部分内にあるのであって、配列にはない。例えば、１つの組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、第１の標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは全て、同じ検出可能な部分又は検出可能な部分の組合せ［Ｌ］１を有する：［Ｓ］１−［Ｌ］１、［Ｓ］２−［Ｌ］１、．．．、［Ｓ］ｎ−［Ｌ］１、ここで、ｎは、標的に対する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数、例えば、３〜５０の整数である。同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドが異なって標識されている、他の組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドにおいて、同じ標的を標的とするオリゴヌクレオチドは、同じ組のオリゴヌクレオチド配列（［Ｓ］１、［Ｓ］２、．．．、［Ｓ］ｎ）を有するが、異なる［Ｌ］２を有する：［Ｓ］１−［Ｌ］２、［Ｓ］２−［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］ｎ−［Ｌ］２、ここで、［Ｌ］１は、［Ｌ］２と検出可能に異なる。
【００７８】
本発明の特定の実施形態を例示するために、各組における同じ標的を標的とする全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ検出可能な部分を独立に有する、２ステップ、２標識、４標的（ＦＮ＝２２＝４）法を以下に示す。
ステップ１：標的を第１の複数（Ｐ１）の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させるステップ：
標的Ｔ１：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−３［Ｌ］１、．．．、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−Ｐ１Ｔ１［Ｌ］１、ここで、Ｐ１Ｔ１は、第１の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ１を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数であり、［Ｌ］１は、第１の検出可能な標識である；
標的Ｔ２：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−３［Ｌ］１、．．．、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ２−Ｐ１Ｔ１［Ｌ］１、ここで、Ｐ１Ｔ２は、第１の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ２を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である；
標的Ｔ３：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ３−Ｐ１Ｔ３［Ｌ］２、ここで、Ｐ１Ｔ３は、第１の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ３を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数であり、［Ｌ］２は、［Ｌ］１と検出可能に異なる標識である；
標的Ｔ４：［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ４−Ｐ１Ｔ４［Ｌ］２、ここで、Ｐ１Ｔ４は、第１の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ４を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である。
ステップ２：イメージングステップ；
ステップ３：Ｐ１を標的から除去するステップ；
ステップ４：標的を第２の複数（Ｐ２）の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと接触させるステップ：
標的Ｔ１：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−３［Ｌ］１、．．．、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−Ｐ２Ｔ１［Ｌ］１、ここで、Ｐ２Ｔ１は、第２の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ１を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である；
標的Ｔ２：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ２−Ｐ２Ｔ２［Ｌ］２、ここで、Ｐ２Ｔ２は、第２の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ２を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である；
標的Ｔ３：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−１［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−２［Ｌ］１、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−３［Ｌ］１、．．．、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ３−Ｐ２Ｔ３［Ｌ］１、ここで、Ｐ２Ｔ３は、第２の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ３を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である；
標的Ｔ４：［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−１［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−２［Ｌ］２、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−３［Ｌ］２、．．．、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ４−Ｐ２Ｔ４［Ｌ］２、ここで、Ｐ２Ｔ４は、第２の複数のオリゴヌクレオチドにおけるＴ４を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの数である。
ステップ５：イメージングステップ。
【００７９】
２つのイメージングステップの後に、各標的は、以下のようなそれ自体の固有の逐次バーコードを有する：
Ｔ１：［Ｌ］１［Ｌ］１；
Ｔ２：［Ｌ］１［Ｌ］２；
Ｔ３：［Ｌ］２［Ｌ］１；及び
Ｔ４：［Ｌ］２［Ｌ］２
いくつかの実施形態において、さらなるバーコードＴ１−−、Ｔ２−−、−−Ｔ１、−−Ｔ２も用いることができ、−−は当ステップについて無シグナルを示す。
【００８０】
上に例示した方法において、Ｐ１Ｔ１、Ｐ１Ｔ２、Ｐ１Ｔ３、Ｐ１Ｔ４、Ｐ２Ｔ１、Ｐ２Ｔ２、Ｐ２Ｔ３及びＰ２Ｔ４のそれぞれは、独立に自然数（０より大きい整数）である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ１＝Ｐ２Ｔ１である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ２＝Ｐ２Ｔ２である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ３＝Ｐ２Ｔ３である。いくつかの実施形態において、Ｐ１Ｔ４＝Ｐ２Ｔ４である。いくつかの実施形態において、１つの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを標的に対して用いる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、各複数のオリゴヌクレオチドにおける同じ組の配列を有する。例えば、上の例における標的Ｔ１について、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−Ｐ１Ｔ１のそれぞれは、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−Ｐ２Ｔ１の１つと独立に同じ配列を有し、［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ２−Ｔ１−Ｐ２Ｔ１のそれぞれは、［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−１〜［Ｓ］Ｐ１−Ｔ１−Ｐ１Ｔ１の１つと独立に同じ配列を有する。いくつかの実施形態において、同じ標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、各複数のオリゴヌクレオチドにおける異なる組の配列を有する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、イメージングステップの後に複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するステップを場合によって含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、イメージングステップの後の除去ステップを含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、最終イメージングステップを除く各イメージングステップの後の除去ステップを含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、各イメージングステップの後の除去ステップを含む。
【００８３】
提供する方法における除去ステップは、１つ又は複数の様々な目的を果たし得る。いくつかの実施形態において、除去ステップは、標的が他の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとの相互作用に利用可能であるように、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを標的から除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、１つの複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの検出可能な部分が標的に結合した他の複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの検出を妨げないように、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも８０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも８５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９１％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９２％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９３％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９４％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９６％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９７％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９８％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９．１％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９．２％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９．３％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９．４％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９．５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも８０％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも８５％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９０％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９１％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９２％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９３％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９４％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９５％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９６％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９７％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９８％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、少なくとも９９．５％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、１００％の検出可能なシグナルを除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップの後にイメージングステップによってシグナルを検出することができない。
【００８４】
除去ステップは、さらなる使用のために、例えば、さらなる接触及び／又はイメージングステップによるさらなる検出又は定量化のために標的（例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座）を場合によって保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも８０％の標的を保存する。保存された標的の百分率は、例えば、同じ接触及びイメージングプロトコールを場合によって用いて、除去ステップの前及び後に収集したデータを比較することにより測定することができる。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも８５％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９０％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９１％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９２％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９３％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９４％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９５％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９６％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９７％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９８％の標的を保存する。いくつかの実施形態において、除去ステップは少なくとも９９％の標的を保存する。
【００８５】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する方法は、当技術分野で広く知られている。いくつかの実施形態において、除去ステップは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを分解することを含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、酵素消化により除去する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを消化する酵素と接触させることを含む。
【００８６】
適切な酵素は、当技術分野で広く用いられている。例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド及び／又は標的の種類によって、ＤＮアーゼ又はＲＮアーゼのいずれかを用いることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ標的を検出／定量化するためのＤＮＡ配列を含む検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮアーゼ、例えば、ＤＮアーゼＩにより消化される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ標的を検出／定量化するためのＲＮＡ配列を含む検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼにより消化される。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ遺伝子座を標的とするために用いられる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的に結合している、ハイブリダイズしている又は他の仕方で連結しているオリゴヌクレオチドのような、１つ又は複数の中間物への結合又はハイブリダイゼーションを介してその標的と相互作用する。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズした中間オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して標的と相互作用し、中間オリゴヌクレオチドは、標的と相補的な配列及び検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列（オーバーハング）を含む。いくつかの実施形態において、除去ステップは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去し、中間オリゴヌクレオチドを場合によって完全な状態に維持する。いくつかの実施形態において、除去ステップは、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去し、中間オリゴヌクレオチドを完全な状態に維持する。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを選択的に除去することができるように、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、化学的又は酵素的観点で中間物と異なる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、中間ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を含み、相補的配列を有する架橋オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ架橋プローブ）が結合できるようなオーバーハング（例えば、２０ｎｔ）により、ＤＮＡ遺伝子座に対してハイブリダイズするために用いる。ＲＮＡ架橋プローブは、色素又はＨＣＲポリマー（ＤＮＡでもあり得る）により直接標識することができる。イメージングの後、ＤＮＡプローブがＤＮＡ遺伝子座上に完全な状態でハイブリダイズされたままにすると同時に、ＲＮアーゼを用いてＲＮＡ架橋プローブを消化除去することができる。そのような方法は、多くの利点がある。例えば、後の接触ステップは、ＲＮＡ架橋プローブがオーバーハングによりＤＮＡオリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズすることのみを含み、二本鎖ＤＮＡが融解することを回避し、困難な過程であり得る、ＤＮＡオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。さらに、ハイブリダイゼーションのラウンド当たり、遺伝子当たり、１つの種類のＲＮＡ架橋プローブのみが必要であるように、同じ遺伝子を標的とする全てのＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、２０〜４０）について同じであるようにオーバーハングを作ることができる。異なるハイブリダイゼーション（接触ステップ）における色を切り替えるために、異なる標識又は異なるＨＣＲポリマーを有するＲＮＡ架橋プローブを変更することができる。例えば、架橋又はＨＣＲヘアピン上のＥｃｏＲＩのような特異酵素制限部位により特異的に除去することができるＤＮＡ架橋プローブも用いることができる。細胞を適切なヌクレアーゼとともにインキュベートすることにより、それらにハイブリダイズしていたＤＮＡ遺伝子座及び／又はプローブに影響を与えずに全ての検出可能な部分を消化除去することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、５’リン酸化を含み、ラムダエキソヌクレアーゼにより分解することができるが、中間オリゴヌクレオチドは、５’リン酸化されず、ラムダエキソヌクレアーゼにより分解することができない。
【００９０】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ウラシルを含む。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、ウラシルを含み、ＵＳＥＲ（商標）酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＭＡ、ＵＳ）により分解することができるが、中間オリゴヌクレオチドは、ウラシルを含まず、ＵＳＥＲ（商標）酵素により分解することができない。
【００９１】
いくつかの実施形態において、中間オリゴヌクレオチドのオーバーハングに対してハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、オーバーハングに対してハイブリダイズしたとき陥凹３’末端を有する。中間オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズしたとき陥凹３’末端を有する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼＩＩＩにより選択的に消化することができる。陥凹３’末端を有さない、又はその３’末端がＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖体である中間オリゴヌクレオチドは、それらに対するエキソヌクレアーゼＩＩＩの活性がはるかに弱いため、完全なままに維持することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態において、酵素を含める場合、除去ステップは、最適な結果をもたらす温度で実施する。いくつかの実施形態において、除去ステップを約３７℃で実施する。いくつかの実施形態において、ラムダエキソヌクレアーゼによる消化を約３７℃で行う。いくつかの実施形態において、ＵＳＥＲ（商標）酵素による消化を約３７℃で行う。いくつかの実施形態において、ＵＳＥＲ（商標）酵素による消化を室温で行う。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化を約３７℃で行う。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる消化を室温で行う。
【００９３】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの結合のための中間オリゴヌクレオチド及びオーバーハング配列の使用は、様々な利点をもたらす。いくつかの実施形態において、オーバーハング配列と検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの反応速度が中間オリゴヌクレオチドと標的との間のそれより速い。いくつかの実施形態において、標的に対する全ての中間オリゴヌクレオチドは、同じオーバーハング配列を含み、標的に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じオーバーハング配列への結合のための同じ相補的配列を含む。いくつかの実施形態において、一組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと一組の中間オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションは、一組の中間オリゴヌクレオチドと一組の標的との間のそれより最大約２０〜４０倍速い。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドと中間オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションは、３０分で行わせることができるのに対して、中間オリゴヌクレオチドと標的との間のハイブリダイゼーションについては、場合によって、最大約１２時間である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去するための除去ステップに鎖置換を用いる。いくつかの実施形態において、除去ステップにおいて熱を用いて検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを解離させる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、除去ステップは、光退色を含む。いくつかの実施形態において、光退色は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのフルオロフォアのような色素を破壊する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の組の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、各標的の異なる配列を標的とし、第１のイメージングステップの後の除去ステップは、任意選択である。例えば、１つの戦略は、第１の複数のプローブがＲＮＡ上の１つの組の配列を標的とすることができ、第２の複数のプローブが同じＲＮＡ上の異なる組の配列を標的とするような、異なるＤＮＡプローブ（検出可能に標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチド）により同じＲＮＡを標的とすることである。第１のハイブリダイゼーション（接触）時に、第１の複数のプローブを用いる。それらは、次にイメージングし、場合によって光退色するか或いはＤＮアーゼにより又はオリゴ若しくは色素を破壊する他の方法により消化することができる。第１の組のプローブによる妨げなしに、第２の組のプローブをハイブリダイズさせ、イメージングすることができる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、ＨＣＲ、光シート顕微鏡法、ＣＬＡＲＩＴＹ又はそれらの組合せを場合によって含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、組織、臓器又は生物における標的の直接的なプロファイリングを可能にする。いくつかの実施形態において、臓器は、脳である。いくつかの実施形態において、提供する方法は、完全な脳又は組織における転写物の直接イメージングを可能にする。いくつかの実施形態において、提供する方法は、ＨＣＲをさらに含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、光シート顕微鏡法をさらに含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、ＣＬＡＲＩＴＹをさらに含む。
【００９８】
提供する方法は、本発明に先行する方法と比べて多くの利点がある。例えば、いくつかの実施形態において、提供する方法は、妥当な費用で大量処理を可能にする。いくつかの実施形態において、提供する方法は、標的を変換又は増幅することなく、標的の直接的プロービングを可能にする。いくつかの実施形態において、提供する方法は、多数の検出可能な標識を必要とすることなく速やかな規模の拡大を可能にする。いくつかの実施形態において、提供する方法は、同じ標的に複数の標識を加えることができ、したがって、シグナル強度を増大させることができる。いくつかの実施形態において、提供する方法は、利点の組合せをもたらす。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明は、例えば、提供する方法に使用するための複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。具体的としての組成物は、本明細書における具体的としての方法の実施形態で述べたものを含むが、それらに限定されない。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本発明は、組成物が少なくとも
（ｉ）第１の核酸を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の核酸を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと
を含むように、オリゴヌクレオチドのそれぞれが核酸を標的とし、検出可能な部分により標識されている、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明は、組成物が少なくとも
（ｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと
を含むように、オリゴヌクレオチドのそれぞれが転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、検出可能な部分により標識されている、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、本発明は、キットが少なくとも
（ｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１の検出可能な部分により標識されている第１のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第２の検出可能な部分により標識されている第２のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１、第２又は第３の検出可能な部分により標識されており、第１のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第３のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、第１、第２、第３又は第４の検出可能な部分により標識されており、第２のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同じである、第４オリゴヌクレオチドと
を含むように、オリゴヌクレオチドのそれぞれが転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とし、検出可能な部分により標識されていて、第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は第４オリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか、又は両方である、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、組成物中の同じ標的（転写物又はＤＮＡ遺伝子座）を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能なシグナル又はイメージングステップで区別することができない検出可能なシグナルをもたらす部分により標識されている。いくつかの実施形態において、組成物中の同じ標的を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ検出可能な部分により標識されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアであるか又はそれを含む。いくつかの実施形態において、検出可能な部分は、フルオロフォアである。具体的としてのフルオロフォアは、当技術分野で広く知られ、用いられているが、例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒｓ、ＡＴＴＯ  Ｄｙｅｓ又はそれらのいずれかの類似体若しくは誘導体に限定されない。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、異なる標的を標的とする。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、同じ標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の標的、例えば、転写物及び／又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上の転写物を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上のＤＮＡ遺伝子座を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも４つの標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも９つの標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１６の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２５の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも３６の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも２００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも５０，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１００，０００の標的を標的とする。いくつかの実施形態において、組成物又はキット中の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、少なくとも１，０００，０００の標的を標的とする。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、異なるオリゴヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能な部分は、異なる。いくつかの実施形態において、第１及び第２の検出可能な部分は、同じである。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、１０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、２０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、３０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、４０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、５０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、６０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、６５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、６８％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、７０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、９０％未満の配列同一性を共有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと１０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと２０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと３０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと４０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと５０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと５５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと６０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと６５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと６８％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと７０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと９０％未満の配列同一性を共有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、組成物又はキットは、同じ標的を標的とする２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５、１０、２０、３０、４０、５０又はそれ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが同じ標的を標的とする。
【０１１０】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、様々な適切な長さのものであり得る。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが１５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが１６塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが１７塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが１８塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが１９塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２１塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２２塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２３塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２４塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２６塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２７塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２８塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが２９塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが３０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１６塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１７塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１８塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも１９塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２１塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２２塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２３塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２４塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２６塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２７塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２８塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも２９塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも３５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも４０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが少なくとも５０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜２５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約２０〜３０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約２５〜３５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約３０〜４０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約３５〜４５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約４０〜５０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜３０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約２０〜３０塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約１５〜３５塩基対である。いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、長さが約２０〜３５塩基対である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが２つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが３つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが４つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが５つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが６つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが７つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが８つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが９つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが１０の検出可能な部分を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも２つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも３つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも４つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも５つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも６つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも７つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも８つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも９つの検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態において、複数の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが少なくとも１０の検出可能な部分を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、組成物は、
（ｉｉｉ）第１の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする、第１のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同一である、第３のオリゴヌクレオチドと、
（ｉｖ）第２の転写物又はＤＮＡ遺伝子座を標的とする、第２のオリゴヌクレオチドと配列が場合によって同一である、第４のオリゴヌクレオチドと
をさらに含み、
第３のオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか又は第４オリゴヌクレオチドが第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されているか又は両方である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと配列が同一である。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと重複した配列を含む。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと５０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドとの４０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドとの３０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドとの２０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドとの１０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドとの５％未満の配列同一性を有する。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと配列が同一である。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと重複した配列を含む。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドとの５０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドとの４０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドとの３０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドとの２０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドとの１０％未満の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドとの５％未満の配列同一性を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、第３のオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されている。いくつかの実施形態において、第４のオリゴヌクレオチドは、第２のオリゴヌクレオチドと異なる検出可能な部分により標識されている。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における５％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における１０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における２０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における３０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における４０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における５０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における６０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における７０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における８０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における９０％の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも５つの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも１０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも２０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも３０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも４０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも５０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも６０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも７０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも８０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくとも９０の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法における少なくともそれぞれの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの量は、あらかじめ定められている。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、２つ以上の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドが１つの標的に対して提供される。いくつかの実施形態において、標的に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの総量は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、標的に対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの総量は、あらかじめ定められており、標的に対する検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのそれぞれの量は、独立に且つ場合によってあらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数の標的のそれぞれに対する全ての検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの総量は、独立にあらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも２種の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも５種の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも１０種の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも５０種の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも１００種の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも５００種の標的を有する。いくつかの実施形態において、複数の標的は、少なくとも１０００種の標的を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法の標的は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法の少なくとも１０種の標的は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法の少なくとも５０種の標的は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法の少なくとも１００種の標的は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法の少なくとも１０００種の標的は、あらかじめ定められている。いくつかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチド、組成物、キット又は方法の最大ＦＮ種の標的は、あらかじめ定められており、Ｆは、複数のオリゴヌクレオチドにおける検出可能な部分の数であり、Ｎは、イメージングステップの数である。
【０１２１】
検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを合成する方法は、当技術分野で広く知られ、実施されている。例えば、Ｌｕｂｅｃｋ  Ｅ．＆  Ｃａｉ  Ｌ．、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９巻、７４３〜４８頁（２０１２）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、様々な供給業者から商業的に入手することもできる。いくつかの実施形態において、本発明は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを調整する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、中間オリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、架橋オリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、本発明は、
１）ニッキングエンドヌクレアーゼ部位が両端に隣接している、第１の配列を含む第１の核酸を準備するステップと、
２）第１の核酸又は第１の核酸の一部を増幅して、第１の配列及びフランキングニッキングエンドヌクレアーゼ部位を含む第２の核酸を得るステップと、
３）第２の核酸をフランキングニッキングエンドヌクレアーゼ部位に対応する１つ又は複数のニッキングエンドヌクレアーゼと接触させるステップと
を含む、第１の配列を有する標的核酸を調製する方法を提供する。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、第１の配列を有する標的核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態において、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、二本鎖の第２の核酸を変性させ、２つの鎖が一本鎖になる、変性するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、第１の配列を有する核酸を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、ニッキングエンドヌクレアーゼと接触させる前に場合によって修飾する。いくつかの実施形態において、提供する方法は、第１の配列を有する核酸を標識することをさらに含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、２つのフランキングエンドヌクレアーゼ部位は、同じである。いくつかの実施形態において、同じニッキングエンドヌクレアーゼ部位に対応する１つのニッキングエンドヌクレアーゼを用いる。いくつかの実施形態において、２つのフランキングニッキングエンドヌクレアーゼ部位は、異なる。いくつかの実施形態において、それぞれがニッキングエンドヌクレアーゼ部位に独立に対応する、２つのニッキングエンドヌクレアーゼを用いる。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、提供する技術のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプールから生成される。いくつかの実施形態において、そのようなプールは、市販されている。いくつかの実施形態における最初のＤＮＡオリゴヌクレオチドプールは、サブセットに組織化された最大１２０００以上の異なる一本鎖配列からなっている。各配列は、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位並びにフォーワード及びリバースプライマー配列が所望の配列（例えば、プローブ配列）の両端に隣接するように設計されている。フォーワード及びリバースプライマー配列が所望の配列を含むどのサブセットに属するかを指定する。プライマー対は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてサブセットを増幅するために用いることができる。ＰＣＲ反応の生成物を単離し、ニッキングエンドヌクレアーゼにより消化する。ニッキング酵素とのインキュベーション時間は、用いる酵素の量及び回収されるＤＮＡの量によって異なる。いくつかの実施形態において、約１０単位の酵素は、約１μｇのＤＮＡを約１時間で消化する。次いで試料を精製し、緩衝液、例えば、２ｘ負荷緩衝液（９６％ホルムアルデヒド／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び水で再構成して、最終負荷緩衝液（４８％ホルムアルデヒド／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を調製し、例えば、９５℃に加熱することにより変性して、ＤＮＡを完全に変性する。変性ＤＮＡを精製し、所望の生成物を単離する。いくつかの実施形態において、精製及び／又は単離は、電気泳動を含む。具体的としての方法を図２５に示す。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本発明は、
１）少なくとも１つの制限部位が両端に隣接している、第１の配列又はその相補的配列を含む第１の核酸を準備するステップと、
２）第１の核酸又は第１の核酸の一部を増幅して、第１の配列及び少なくとも１つのフランキング制限部位を含む第２の核酸を得るステップと、
３）第２の核酸を少なくとも１つのフランキング制限部位に対応する制限酵素と接触させて、陥凹末端を含む第３の核酸を得るステップと、
４）第３の核酸をヌクレアーゼと接触させて、第１の配列を含む鎖を保持しながら、もしあれば、相補的配列を含む鎖を選択的に消化するステップと
を含む、第１の配列を有する標的核酸を調製する方法を提供する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、第１の配列又はその相補的配列の両端に制限部位が独立に隣接している。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、本発明は、
１）制限部位が両端に隣接している、第１の配列又はその相補的配列を含む第１の核酸を準備するステップと、
２）第１の核酸又は第１の核酸の一部を増幅して、第１の配列及びフランキング制限部位を含む第２の核酸を得るステップと、
３）第２の核酸をフランキング制限部位に対応する制限酵素と接触させて、陥凹末端を含む第３の核酸を得るステップと、
４）第３の核酸をヌクレアーゼと接触させて、第１の配列を含む鎖を保持しながら、もしあれば、相補的配列を含む鎖を選択的に消化するステップと
を含む、第１の配列を有する標的核酸を調製する方法を提供する。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、第１の配列を含む標的核酸は、一本鎖である。いくつかの実施形態において、増幅ステップは、ＰＣＲを含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、第１の配列を有する核酸を単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の核酸は、制限酵素と接触させる前に場合によって修飾する。いくつかの実施形態において、第３の核酸は、ヌクレアーゼと接触させる前に場合によって修飾する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼは、３’陥凹末端を有する鎖を優先的に分解し、５’陥凹末端を有する鎖を保存することができる、エキソヌクレアーゼＩＩＩである。いくつかの実施形態において、制限酵素は、５’陥凹末端を生じせる。いくつかの実施形態において、制限酵素は、３’陥凹末端を生じせる。いくつかの実施形態において、相補的配列は、制限消化の後に３’陥凹末端を有する。いくつかの実施形態において、相補的配列を含む鎖は、制限消化の後に３’陥凹末端を有し、第１の配列を含む鎖は、制限消化の後に５’陥凹末端を有する。いくつかの実施形態において、提供する方法は、第１の配列を有する核酸を標識することをさらに含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｅｑＦＩＳＨに対するプローブ又は中間オリゴヌクレオチドは、ｅｘｏＩＩＩヌクレアーゼ消化のようなヌクレアーゼ消化を用いて生成させることができる。増幅（例えば、ＰＣＲ）生成物上の２つのニック部位の代わりに、プローブ及び／又はアダプター配列の両端に隣接する２つの制限部位を用いることができる。いくつかの実施形態において、１つの制限部位は、３’陥凹末端を残すが、もう一方のものは、５’陥凹末端を残す。例えば、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩは、５’陥凹末端を残すが、ＢｍｔＩ及びＰａｃＩは、３’陥凹末端を残す。そのような制限酵素は、当技術分野で広く知られ、用いられている。エキソヌクレアーゼＩＩＩは、３’陥凹末端を優先的に分解し、５’陥凹末端を有する鎖を保存する。これは、ＰＣＲ及び制限ヌクレアーゼを用いてオリゴヌクレオチドプールから一本鎖プローブを生成させる他のメカニズムを提供する。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、提供する標的核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、第１の配列と同じ配列を有する。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的、例えば、転写物又はＤＮＡ遺伝子座とハイブリダイズする第１の配列、及び第２のオリゴヌクレオチド、例えば、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする第２の配列を含む、中間オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、標的とハイブリダイズする第１の配列、及びＨＣＲにより標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする第２の配列を含む、中間オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的核酸は、架橋プローブである。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、提供する方法は、転写物又はＤＮＡ遺伝子座の異常な数に関連する、疾患の診断のために用いられる。いくつかの実施形態において、提供する方法は、治療のために対象を選択するために用いられる。いくつかの実施形態において、提供する方法は、治療計画をモニタリングするために用いられる。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、対象に由来する。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、哺乳類細胞である。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、対象に由来する。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、動物に由来する。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、ヒト対象から単離される。いくつかの実施形態において、提供する方法における細胞は、罹患組織又は疾患に罹りやすい組織に由来する。多数の標的を同時に検出し、定量化することができる、提供する方法は、診断、治療モニタリング及び患者層別化に関する意味のある利点を提供する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、提供する技術は、タンパク質、神経活動及び／又は構造配置をプロファイリングすることを場合によって含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、同じ試料中のタンパク質をプロファイリングすることを含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、同じ試料中の神経活動をプロファイリングすることを含む。いくつかの実施形態において、提供する方法は、構造配置をプロファイリングすることを含む。
【０１３４】
本明細書で例示するように、提供する技術は、多種多様な試料を対象とする。例えば、ＨＣＲ−ｓｅｑＦＩＳＨは、脳薄片で機能し、ＳＰＩＭｓは、ＣＬＡＲＩＴＹ脳薄片における単一ｍＲＮＡｓを頑健に検出することができる。いくつかの実施形態において、提供する技術は、神経変性疾患のマウスモデル又はヒト脳における標的をプロファイリングするのに有用である。本発明に先行する他の技術は、同じ質及び量のデータを提供することはできない。
【実施例】
【０１３５】
例示
前述は、本発明の特定の非制限的な実施形態の説明であった。したがって、本明細書において記述した本発明の実施形態は、本発明の原理の応用を単に説明しているに過ぎないと理解される。本明細書において説明される実施形態の詳細に言及することは、特許請求の範囲を制限しないと意図される。
【０１３６】
連続的ハイブリダイゼーション及びバーコード化による核酸のインサイチュープロファイリング
本明細書における非制限的な実施例に記述されるように、細胞中の核酸、例えばｍＲＮＡのプロファイルを、提供される方法によって接触、イメージング、及び除去ステップ（図２（ａ）及び３）の連続ラウンドを通して調べた。転写物は、細胞に固定されることから、対応する蛍光スポットは、多数のラウンドのハイブリダイゼーションの間その場に留まり、フルオロフォア配列を読み出しするために整列させることができる。この連続的バーコードは、ｍＲＮＡをユニークに同定するために設計される。
【０１３７】
それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションにおいて、それぞれの転写物は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの組、この場合１つのタイプのフルオロフォアによって標識されたＦＩＳＨプローブの標的であった。試料をイメージングした後、ＤＮアーゼＩによって処置して、ＦＩＳＨプローブを除去した。その後のラウンドにおいて、ｍＲＮＡを、同じオリゴヌクレオチド配列の組を有するが、異なる色素で標識されたＦＩＳＨプローブとハイブリダイズさせた。利用可能なバーコードの数はＦＮに比例して、式中Ｆはフルオロフォアの数であり、Ｎはハイブリダイゼーションのラウンド数である。例えば、４つの色素によって、８ラウンドのハイブリダイゼーションを行うと、ほぼ全てのトランスクリプトーム（４８＝６５，５３６）をカバーすることができる。
【０１３８】
例証として、１つの酵母細胞における１２個の遺伝子を、４つの色素と２ラウンドのハイブリダイゼーションでバーコード化した（４２＝１６、４つのバーコードが残る；それぞれのハイブリダイゼーションを３サイクル行った）。細胞をガラス表面に固定した。ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせて、イメージングした後、ＤＮアーゼＩ処置によって除去した（効率８８．５±１１．０％（ＳＥ）、図４）。残りのシグナルを光退色させた（図５）。６回のハイブリダイゼーション後であっても、ｍＲＮＡは当初の強度の７０．９±２１．８％（ＳＥ）で観察された（図６）。最初の２回のハイブリダイゼーションにおいて共局在したスポットの７７．９±５．６％（ＳＥ）が、３回目のハイブリダイゼーションでも共局在することが観察された（図７及び８）。細胞中の対応するバーコードの出現を計数することによりｍＲＮＡの量を定量した（図９及び１０、細胞ｎ＝３７）。ｍＲＮＡは、哺乳動物細胞において剥離させて、効率よく再ハイブリダイズさせることができることが示された（図１１及び１２）。本明細書において証明したように、提供される方法は、本発明より前に公知である方法と比較して多くの利点を有する。例えば、提供される方法は、たとえ２つの色素であってもコード化能が原則的に制限されないことから（２Ｎ）、速やかにスケールアップする。それぞれの接触ステップの際に、シグナルの輝度を増加させる、標的に対する検出可能に標識された利用可能な全てのオリゴヌクレオチド、この例においてＦＩＳＨプローブを使用することができる。提供される方法の読み出しもまたロバストであり、ネイティブの試料において完全なＺスタックを可能にする。提供される方法は、ＦＩＳＨプローブなどの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドの高いハイブリダイゼーション効率（ｍＲＮＡの＞９５％が検出される；Ｌｕｂｅｃｋ，  Ｅ．  ＆  Ｃａｉ，  Ｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３−４８  （２０１２））を利用することができる。本出願人は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド、例えば、ＦＩＳＨプローブをまた、１つの細胞における多数のスプライスアイソフォーム、ＳＮＰ、並びに染色体座を解像するために設計できることにも注目する（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，  Ｍ．  Ｊ．  ＆  Ｒａｊ，  Ａ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １０，  ２４６−２４８  （２０１３））。超解像法（Ｌｕｂｅｃｋ，  Ｅ．  ＆  Ｃａｉ，  Ｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３−４８  （２０１２））と組み合わせると、提供される方法により、脳などの複雑な試料中の多数の標的、例えばトランスクリプトームを、単細胞の解像度で直接イメージングすることができる。
【０１３９】
方法及び技法
試料の調製：ＭＤＮ１−ＧＦＰ酵母細胞を、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２をＯＤ０．３となるように添加したＹＰＤにおいて増殖させた。細胞を、１％ホルムアルデヒド、５％酢酸中で５分間固定した後、緩衝液Ｂで３回すすぎ、３０℃で１時間、スフェロプラストにした。細胞を、−２０℃の７０％エタノール中で最長２週間保存した。
【０１４０】
カバーガラスを、１Ｍ  ＮａＯＨ及び１００％エタノールの交互の溶液によって３回超音波処理した後、アセトン中での最後の超音波ラウンドにより調製した。（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ  ４４０１４０）の２％溶液をアセトン中で調製して、きれいにしたカバーガラスをその中に直ちに２分間沈めた。アミン修飾カバーガラスをすすいで、室温の超純水中に保存した。
【０１４１】
固定された酵母細胞を０．５Ｕ／μＬ溶液のＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  ０４７１６７２８００１）によって２３℃で３０分間前処置した。処置後、酵母の希釈溶液を２つのアミン修飾カバーガラスの間で物理的に押しつけることによって、酵母細胞を、コーティングしたカバーガラスに接着させた。次に、カバーガラスを注意深く剥がして、直ちに１％ホルムアルデヒド溶液に２．５分間沈めた。固定後、カバーガラスを乾燥させて、接着剤コーティングフローセルをカバーガラス（ＧｒａｃｅＢｉｏ  Ｌａｂｓ  ＳＡ８４−０．５−ＳｅｃｕｒｅＳｅａｌ）に接着させることによって、フローセルを構築した。フルオスフェア（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ）３６５ｎｍ蛍光ビーズをカバーガラスに添加して、多数のハイブリダイゼーションに対するドリフトを測定した（Ｌｉｆｅ  Ｆ８８０５）。フローセルをパラフィルムで覆って４℃で保存した。
【０１４２】
検出可能に標識したオリゴヌクレオチドの調製：プローブを、Ｌｕｂｅｃｋ，  Ｅ．  ＆  Ｃａｉ，  Ｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３−４８  （２０１２）の方法に従って調製した。それぞれの標的に関してプローブ２４個を使用した。それぞれの組の遺伝子に関する全ての２４のプローブを、使用される４つの色素、Ａｌｅｘａ  ５３２、５９４、Ｃｙ５、及びＣｙ７の１つに連結させた。
【０１４３】
ハイブリダイゼーション：フローセルを、１０％硫酸デキストラン（Ｓｉｇｍａ  Ｄ８９０６）、１０％ホルムアミド、及び２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液において２ｎＭ／プローブの濃度で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、試料を、室温の試料に添加する前にあらかじめ３７℃に加温した３０％ホルムアミド、０．１％トライトン−Ｘ  １００緩衝液によって１０分間洗浄した。試料を２×ＳＳＣによって数回洗浄して拡散するプローブを除去した。
【０１４４】
イメージング：試料を、抗退色緩衝液（Ｓｗｏｂｏｄａ，  Ｍ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ６，  ６３６４−６９  （２０１２））：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．８％グルコース、飽和Ｔｒｏｌｏｘ（Ｓｉｇｍａ：５３１８８−０７−１）、ＯＤ４０５ｎｍ  ０．０５のピラノースオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ４２３４）、及び１／１０００希釈のカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ：９００１−０５−２）に浸した。
【０１４５】
プローブの変位：イメージング後、細胞をＤＮアーゼＩ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）で洗浄して、０．５Ｕ／μＬ  ＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ）中で４時間放置した。ＤＮアーゼを阻害するために、細胞を３０％ホルムアミド、０．１％トライトン−Ｘ  １００、２×ＳＳＣで２回洗浄した。ＤＮアーゼ処置後、細胞を抗退色緩衝液中でもう一度イメージングして、ＤＮアーゼＩによるプローブ剥離率を決定した。残っているプローブシグナルを除去するために、試料を全てのイメージングチャンネルにおいて１０秒間の励起によって退色させて、標準的な励起時間でもう一度イメージングし、残留シグナルを記録した。
【０１４６】
再ハイブリダイゼーション：試料を、既に概要した条件に従って、顕微鏡において再ハイブリダイズさせた。顕微鏡上でのハイブリダイゼーションの間、蒸発を防止するために、試料をパラフィルムで覆った。
【０１４７】
少なくとも６ラウンドのハイブリダイゼーションを同じ試料について行った。それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションは顕微鏡上で夜間に行い、昼間の間ＤＮアーゼ処置及びイメージングを行った。この対応で適用される反復ハイブリダイゼーションスキームにおいて、２ラウンドのハイブリダイゼーションを使用して、ｍＲＮＡをバーコード化した。次に、ｈｙｂ１及びｈｙｂ３が同じプローブを使用して行われ、ｈｙｂ２及びｈｙｂ４が別のプローブの組を使用して行われるように、バーコードスキームを繰り返した。ｈｙｂ１とｈｙｂ３が共局在すれば、検出された転写物の較正を与え、ｈｙｂ１とｈｙｂ２が共局在すれば、バーコード化データを生じた。
【０１４８】
データ分析：データ分析をＩｍａｇｅＪ、Ｐｙｔｈｏｎ、及びＭａｔｌａｂによって行った。実験の間試料のドリフトが見られたことから、未加工画像を、それぞれのイメージング位置のＤＡＰＩチャンネルから決定された相互相関に基づく登録法を使用して整列させた。次に、ドリフト補正を、同じ位置に対応する他の４色チャンネルに拡大した。画像を逆畳み込みして、隣接するＦＩＳＨスポット間の重なりを減少させた。個々のチャンネルにおけるスポットの重なりは、ほとんど観察されなかったが、異なるチャンネルのスポットは、画像を重ねた場合にその点拡がり関数（ＰＳＦ）で重なり合う。未加工データを、反復ルーシー・リチャードソンアルゴリズム（Ｌｕｃｙ，  Ｌ．Ｂ．  Ｔｈｅ  Ａｓｔｒｏｎｏｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  ７９，  ７４５  （１９７４）  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，  Ｗ．Ｈ．  Ｊ．  Ｏｐｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍ．  ６２，  ５５−５９  （１９７２））に基づいて処理した。顕微鏡のＰＳＦを、顕微鏡のＤＡＰＩチャンネルにおいて測定されたビーズ画像（直径約２００ｎｍ）を平均することによって推定した。ルーシー・リチャードソンアルゴリズムによって測定されたこの点拡がり関数を使用して、本発明者らは、このプロセスを約２０回以上反復して計算した後、ＦＩＳＨ画像の蛍光放射分布の最尤推定を行った。このデコンボリューション法の結果は、解像されたＦＩＳＨデータを提供し、バーコード割付信頼度を増加させる。
【０１４９】
画像におけるＦＩＳＨシグナルに対応するドットを、極大値関数を使用して同定した。閾値より下のドットを、さらなる分析に使用しなかった。同じプローブの組にハイブリダイズしたｈｙｂ１及びｈｙｂ３画像における共局在を最適化することにより閾値の値を決定した。それぞれのＰＳＦに関する最大強度ピクセルを、そのｍＲＮＡ分子の位置のプロキシとして使用した。
【０１５０】
ｈｙｂ１及びｈｙｂ２におけるｍＲＮＡに対応するドットからバーコードを自動的に抽出した。アルゴリズムは、ｈｙｂ１において同定されたそれぞれの点とｈｙｂ２において同定された全ての点との間の対応のある距離を計算した。ｈｙｂ１におけるそれぞれの点に関して、ｈｙｂ２における最近傍を同定した。その距離が０又は１ピクセルで、ｈｙｂ２における点の最近傍もまた、ｈｙｂ１における当初の点であった場合、バーコード対であることが確認された。対称最近傍の必要条件は、バーコードの偽割付を減少させた。ｃｙ７における偽陽性を減少させるため、ｈｙｂ１  ｃｙ７において検出された点は、ｃｙ７のｈｙｂ３において再出現する必要があった。
【０１５１】
この非制限的な例において、本出願人は、その低い費用及び迅速な活性により、ＤＮアーゼＩによってプローブを除去した。本出願人は、ｍＲＮＡからプローブを除去して、それを無傷のままにする任意の方法、例えば、これらに限定されないが、鎖置換（Ｄｕｏｓｅ，  Ｄ．  Ｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４０，  ３２８９−３２９８  （２０１２））、及び高温又はホルムアミドでの洗浄を、提供されたバーコード化アプローチにおいて使用できることに注目する。本出願人はＤＮアーゼＩが、標準的なｓｍＦＩＳＨプローブからのプローブの再設計を必要とせず、過酷な洗浄によって試料を不安定にしないことに注目する。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ｄｓＤＮＡからのＤＡＰＩシグナルの数秒以内の急速な喪失が観察されたが、ｓｍＦＩＳＨプローブは、分解するためには実質的により長い時間（数十分）を要した。理論に拘束されたくはないが、ＤＮアーゼＩによるプローブ除去の効率は、ｄｓＤＮＡ切断率と比較して低くなり得る。除去プロセスはそれでもなおも短時間で観察された。
【０１５３】
特定の実験において、蛍光シグナルの１１．５％がＤＮアーゼＩ処置後にｍＲＮＡ上に残っていた。残っているシグナルは、退色によってほぼゼロまで減少した。本出願人は、シグナル及び／又はプローブのより完全な除去を、光退色の前に達成することができ、それによってより多くのｍＲＮＡをその後のラウンドのハイブリダイゼーションに利用できることに注目する。本出願人は、光退色は必ずしもバーコード化に必要ではないが、いくつかの実施形態において、光退色は、さらなるラウンドのバーコード化において偽陽性を生じ得る残留シグナルを除去することによってプロセスを単純化する。ｍＲＮＡに結合した残留プローブの１１．５％の一部は、さらなるラウンドのハイブリダイゼーションを阻害し得る。提示されるデータは、５回ハイブリダイゼーションを行ってもハイブリダイゼーション効率の軽微な減少を示したに過ぎないことから、本出願人は、残留プローブはハイブリダイゼーションの後の段階のラウンドを有意に阻害していなかったことに注目する。
【０１５４】
脳組織における核酸のプロファイリング
無傷の脳切片における細胞の転写プロファイリングは、細胞の同一性の分子的基礎を理解する上で必須である。しかし、本発明の前では、ネイティブの神経ネットワークの解剖学的状況で１つの細胞における転写物の量及び位置のプロファイルを定量的に調べることは技術的に困難であった。体性感覚野のサブネットワークを例として使用して、例えば異なる機能的ドメイン内の別個のニューロン集団、例えば一次体性感覚野（ＳＳｐ）、一次体性運動野（ＭＯｐ）、二次体性運動野（ＭＯｓ）、及び補足体性感覚野（ＳＳｓ）におけるニューロン集団、における多数の遺伝子のプロファイルを調べるために、ＦＩＳＨによるインサイチューシークエンシング（ｓｅｑＦＩＳＨ）及びコネクトミクスを使用して、例として提供される技術の実現可能性及び有用性を証明する。
【０１５５】
本明細書において広く記述されるように、いくつかの実施形態において、本発明は、例えば図１及び２に例証されるように、ＦＩＳＨによるインサイチュー「シークエンシング」により１つの細胞における遺伝子発現のプロファイルを調べる技術を提供する。個々のｍＲＮＡを検出するために、単分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）を、ｍＲＮＡ配列に対して相補的な２０量体オリゴヌクレオチドプローブと共に使用した（Ｆａｎ，  Ｙ．，  Ｂｒａｕｔ，  ＳＡ，  Ｌｉｎ，  Ｑ．，  Ｓｉｎｇｅｒ，  ＲＨ，  Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ，  ＡＩ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｌｏｃｉ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＦＩＳＨ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００１  Ｏｃｔ  ２；  ７１（１）：  ６６−９；  Ｒａｊ  Ａ，  Ｐｅｓｋｉｎ  ＣＳ，  Ｔｒａｎｃｈｉｎａ  Ｄ，  Ｖａｒｇａｓ  ＤＹ，  Ｔｙａｇｉ  Ｓ．  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  ｍＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ｏｃｔ；４（１０）：ｅ３０９）。そのようなフルオロフォア標識プローブ２４個をｍＲＮＡに結合させることにより、細胞中の１つの転写物がインサイチューで容易に検出可能となる。検出することができるほぼ全てのｍＲＮＡが、ｓｍＦＩＳＨによって観察されることが示された（Ｌｕｂｅｃｋ，  Ｅ．  Ｌ．  Ｃａｉ．  Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３−４８  （２０１２））。提供される方法は、非常に定量的であり、１つの細胞を物理的に単離することなく、又はホモジネートを使用することなく、組織試料内の空間的情報を保存する。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、異なるｍＲＮＡ種を識別するために、ｍＲＮＡを、連続ラウンドのハイブリダイゼーションを使用してＦＩＳＨプローブなどの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドによってバーコード化する。ハイブリダイゼーションのラウンドにおいて、それぞれの転写物は、１つのタイプのフルオロフォアによって標識された多数の、例えば２４個のＦＩＳＨプローブの組の標的となる。試料をイメージングして、ＦＩＳＨプローブを、酵素消化によって除去する。次に、ｍＲＮＡを、同じＦＩＳＨプローブであるが、いくつかの場合において異なる色素によって標識されたプローブによって、その後のラウンドでハイブリダイズさせる。転写物が細胞に固定されていることから、１つのｍＲＮＡに対応する蛍光スポットは、多数のラウンドのハイブリダイゼーションの間その場に留まり、色の配列を読み出しするために整列させることができる。したがって、それぞれのｍＲＮＡ種にユニークバーコードが割付される。所定の細胞におけるそれぞれの転写物の数は、対応するバーコードの数を計数することによって決定することができる。例示的なプロセスを図１、２、又は３に説明する。
【０１５７】
提供される技術はＦＩＳＨの高いハイブリダイゼーション効率（＞９５％のｍＲＮＡが検出される）を利用することができる。いくつかの実施形態において、塩基対の解像は、望ましければ行ってもよいが、転写物を同定するために必要ではない。提供される方法で利用可能なバーコードの数はＦＮに比例し、式中Ｆは別個のフルオロフォアの数であり、Ｎは、ハイブリダイゼーションのラウンド数である。別個の色素５個と３ラウンドのハイブリダイゼーションにより、１２５個のユニークな核酸のプロファイルを調べることができる。例えば、１つの細胞中の転写物の全てを解像する超解像顕微鏡を使用して、ほぼ全てのトランスクリプトームを、６ラウンドのハイブリダイゼーションによってカバーすることができる（５６＝１５，６２５）。いくつかの実施形態において、実行が単純でロバストである従来の落射蛍光顕微鏡などの従来の顕微鏡は、より少ないがなおも多数の標的、例えば１００個の遺伝子の多重処理を検出するために使用される。
【０１５８】
多数のサイクルのハイブリダイゼーションにおいて、プローブを剥離させて、同じｍＲＮＡに再ハイブリダイズさせることができる（図２）。多くの市販のフルオロフォア、例えばＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８、５３２、５９４、６４７、７００、７５０、及び７９０は、ロバストに作用して、バーコード化のために少なくとも７色を生じる。６ラウンドのハイブリダイゼーション終了時であっても、プローブは、剥離させたｍＲＮＡに、元の強度の７０．９±２１．８％で再ハイブリダイズすることができる（図６）。例証として、バーコード化される１２個の遺伝子は、１つの酵母細胞において、４つの色素と２ラウンドのハイブリダイゼーションによってバーコード化された（４２＝１６、図３ｃ）。
【０１５９】
１２個の遺伝子の多重処理画像は、それぞれの蛍光チャンネルにおける光学的空間のわずか５％を占めるに過ぎないことから、多数の、例えば１００個の遺伝子の多重処理を実施するには十分な光学的空間が細胞には存在する。図３における４つ全ての蛍光チャンネルの合成画像は、濃く見えるが、それぞれの蛍光チャンネルのスポットはまばらに分布している。それぞれのスポットを二次元ガウスプロファイルにフィットさせて、その中心位置を抽出し、他の蛍光チャンネルのスポットとの重なりをさらに減少させることができる。同じスポットが異なるラウンドのハイブリダイゼーションにおいて１００ｎｍに再整列することが示された（図８）。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、１００個の遺伝子の多重処理を、３ラウンドのハイブリダイゼーションによって迅速に行うことができる。いくつかの実施形態において、それぞれのハイブリダイゼーションサイクルは、約４時間のハイブリダイゼーション、約１時間のイメージング、及び約１時間のＤＮアーゼ処置及び洗浄を必要とし、それぞれの時間の長さは任意で及び独立して変更することができる。いくつかの実施形態において、３ラウンドのハイブリダイゼーションは、およそ１８時間を要する。いくつかの実施形態において、同じ顕微鏡上の別の切片がハイブリダイズしている間に、１つの脳切片をイメージングできることから、イメージング時間は、ハイブリダイゼーション時間より律速段階である。いくつかの実施形態において、１つの顕微鏡は、８個までの切片を同時に多重処理することができ、１８時間の３サイクルのハイブリダイゼーションの終了時に８個全ての切片において１００個の遺伝子データを得ることができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、細胞１０６個を含む１０ｍｍ×５ｍｍ×１０μｍの脳切片を、複数の顕微鏡において、３５分でイメージング及び分析することができる。いくつかの実施形態において、顕微鏡における１つの実視野（ＦＯＶ）は、２０倍の乾燥系対物レンズ及び１３ｍｍ×１３ｍｍカメラチップの場合、０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×２μｍである。いくつかの実施形態において、それぞれのＦＯＶは、１００ミリ秒露出されて読み出される。いくつかの実施形態において、ｘｙｚ及び異なるカラーチャンネルにおける試料の走査により、スナップショットの間に２００ミリ秒の遅延が導入される。いくつかの実施形態において、脳全体の切片を、２０００秒又は３５分でイメージングすることができる。遺伝子１００個の多重処理にとって必要な３ラウンドのハイブリダイゼーションでは、総イメージング時間は１０５分である。いくつかの実施形態において、マウス脳全体は、顕微鏡１つの場合３０日でイメージングすることができる。複数の顕微鏡を使用する場合、時間枠をさらに短縮することができる。いくつかの実施形態において、提供される方法は、マウス脳全体を５００個の切片にして２５，０００ドル未満の費用でイメージングすることができる。
【０１６２】
本発明より前の公知の他の技術と比較すると、提供される技術は、多様な利点を提供する。とりわけ、提供される技術は、定量的であり、空間情報を保存して、組織、臓器、及び／又は生物全体へと安価にスケールアップすることができる。
【０１６３】
本発明より前の単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑとの比較。単細胞を単離して９６ウェルフォーマットに添加することが必要な単細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ又はｑＰＣＲとは異なり、ｓｅｑＦＩＳＨなどの提供される方法は、多数の細胞を、そのネイティブの解剖学的状況で自動化された顕微鏡によって少しの追加の費用で走査することができる。流体工学装置で同レベルの処理能力を達成することは、経済学的に不可能であり、多大な労力を必要とするであろう。いくつかの実施形態において、提供される技術の主な費用は、プローブ合成の初回費用であるが、これは、一度プローブを合成すると、それらを多くの、例えば１０００〜１０，０００回又はそれ以上の反応で使用することができるという事実により相殺される。
【０１６４】
ｓｅｑＦＩＳＨなどの提供される方法は単分子ＦＩＳＨに基づき、低コピー数の転写物を絶対量の定量で測定することができる。この方法で得られるデータは、非常に定量的であり、高い品質の統計分析を可能にする。比較すると、現行の単細胞ｑＰＣＲ及びＲＮＡ−ｓｅｑ実験は、逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲ増幅エラーによるバイアスにより定量力に限界がある。
【０１６５】
本発明より前の他のインサイチューシークエンシング法との比較
ｓｍＦＩＳＨアプローチの１つの主要な利点は、標的とするほぼ全てのｍＲＮＡを観察できる点である。ｍＲＮＡに結合したそれぞれのＦＩＳＨプローブの効率は、５０〜６０％であると決定された（Ｌｕｂｅｃｋ，  Ｅ．  ＆  Ｃａｉ，  Ｌ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３−４８  （２０１２）；  Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，  Ｍ．  Ｊ．  ＆  Ｒａｊ，  Ａ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １０，  ２４６−２４８  （２０１３））。ｍＲＮＡ当たり多数の、例えば２４〜４８個のプローブを標的とすることにより、少なくとも１０個のプローブがほぼあらゆるｍＲＮＡに確実にハイブリダイズして、非特異的バックグラウンドを超える良好なシグナルを提供する。ＦＩＳＨプローブによるｍＲＮＡの直接プロービングは、非常に特異的であり、それによって全ての転写物が確実に検出される。
【０１６６】
これに対し、他の多くのインサイチューシークエンシング法は、ｍＲＮＡを直接標的とするのではなく、酵素反応を利用して、最初にｍＲＮＡをＤＮＡ鋳型へと変換した後、シークエンシング反応によりＤＮＡ鋳型を検出する。しかし、ｍＲＮＡからＤＮＡへの変換プロセスは、非常に効率が悪く、ＲＮＡのごく小さい分画が変換及び検出されるに過ぎない。他の例示的な主な欠点は、逆転写（ＲＴ）に関して１％及びパドロックライゲーション（ＰＬＡ）に関して１０％と推定される低い効率であり、これによって、遺伝子発現測定に有意なノイズ及びバイアスが導入され得る。
【０１６７】
典型的な細胞サイズが（１０〜２０μｍ３）であるとすると、細胞にはおよそ２５，０００の回折限界点が存在する。いくつかの実施形態において、これが、１つの細胞での転写物検出に利用できる現状である。ｓｅｑＦＩＳＨでは、転写因子（ＴＦ）及び細胞接着分子（ＣＡＭ）などの選択された遺伝子セットを、高い精度でイメージング及び定量することができる。遺伝子当たり転写物１００個の平均コピー数を有する標的遺伝子を選択すれば、非常に定量的な１００〜２００個の遺伝子プロファイリング実験を行うことができる。これに対し、他の多くのインサイチューシークエンシング法では、その現状のほとんどが、リボソームＲＮＡ並びにハウスキーピング遺伝子をシークエンシングするために使用される。神経細胞同一性にとって特異的な遺伝子などの関心対象遺伝子は、きわめて過小評価されて検出が不良である。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、ＦＩＳＨシグナルを増幅するためにハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｃｈｏｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２８，  １２０８−１２１２，  （２０１０））を使用し、これにより２０倍の乾燥系対物レンズで大きいＦＯＶイメージングが可能となると同時にｓｍＦＩＳＨの高い検出効率は保持される。
【０１６９】
本発明より前のＲＮＡ多重処理のための超解像バーコード化方法との比較。いくつかの実施形態において、提供される方法は、本発明より前のｓｍＦＩＳＨ（Ｆｅｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  １９９８  Ａｐｒ  ２４；２８０（５３６３）：５８５−９０；  Ｋｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００４  Ａｕｇ  ６；３０５（５６８５）：８４６；  Ｌｅｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００２  Ａｕｇ  ２；  ２９７（５５８２）：８３６−４０；  Ｌｕｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，  ７４３−４８  （２０１２）；  ａｎｄ  Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ  １０，２４６−２４８  （２０１３））によるｍＲＮＡのスペクトルバーコード化と比較して多くの利点を有し、本発明より前の方法では、特定のｍＲＮＡに対するプローブをサブセットに分割して、これを異なる色素によって標識する。とりわけ、提供される技術は、スケールアップのために多くの別個のフルオロフォアを必要としない；たった２つの色素によっても、コード化能は膨大であり、繰り返しバーコード（例えば、赤−赤−赤）を使用することができる。比較すると、本発明より前のＲＮＡのスペクトルバーコード化は、生成することができるバーコードの数に限界がある（約３０個）。提供される方法では、それぞれのラウンドのハイブリダイゼーションの間、転写物に対するＦＩＳＨプローブなどの検出可能に標識された全てのオリゴヌクレオチドを、プローブをサブセットに分割するのではなく一度に使用することができる。とりわけ、提供される技術は、それぞれのｍＲＮＡ上のシグナルがより強いことからバーコード読み出しのロバストネスの改善をもたらす。本発明より前の方法と比較すると、それぞれのｍＲＮＡが、ハイブリダイゼーションのそれぞれのラウンドでより少ない色、いくつかの実施形態において１つの色を有し得ることから、画像における対象物の密度は低いが、本発明より前のスペクトルバーコード化スキームでは少なくとも３色である。望ましければ、より低い画像密度は、データ解析を大きく単純化して、超解像顕微鏡が必要となる前により多くの遺伝子を多重処理することができる。本出願人は、特定のスペクトルバーコード化法、プローブ、及び／又は超解像顕微鏡を使用することができ、提供される実施形態において有用な実施形態であり得ることに注目する。いくつかの実施形態においてｓｅｑＦＩＳＨなどの提供される技術によってトランスクリプトームのプロファイルを調べる場合、細胞における何百万もの転写物を解像するために超解像顕微鏡が使用される。
【０１７０】
転写のプロファイリングの他に、提供される技術は、同じｍＲＮＡ分子における多数の選択的スプライシングの選択及びＲＮＡ編集を解像することができる。シークエンシングリードはたいていの場合、短すぎて同じ転写物内のエキソンの選択を相関させることができないことから、選択的スプライシングされたアイソフォームをシークエンシング法によってプロービングすることは難しい。ｓｅｑＦＩＳＨなどの提供される方法では、脳切片における個々の細胞内のスプライスアイソフォームの全レパートリーを直接可視化することができる。同様に、一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を検出するｓｍＦＩＳＨ法を、ニューロン又は他の細胞タイプにおける編集された転写物をイメージングするｓｅｑＦＩＳＨに適合させることができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、提供される技術は、連続的ＦＩＳＨ（ｓｅｑＦＩＳＨ）によるインサイチューでの遺伝子プロファイリングにとって、効率的で費用効果の高いパイプラインを提供し、細胞同一性に対応する組み合わせ分子マーカーを同定するために皮質における体性運動ニューロンのプロファイルを調べるために、ｓｅｑＦＩＳＨとコネクトミクスを統合する。
【０１７２】
脳における定量的インサイチュー遺伝子発現マッピング
ＣＬＡＲＩＴＹ透明化脳切片を直接イメージングするために光シート顕微鏡を適用する。いくつかの実施形態において、マウス脳は、１つの機器当たり１カ月でマップされる。いくつかの実施形態において、マウス脳は、４〜５個の機器であれば１週間でマップされる。
【０１７３】
増幅：ＦＩＳＨシグナルの増幅により、倍率２０倍の低開口数対物レンズによる脳切片の大きいＦＯＶイメージングが可能となる。いくつかの実施形態において、提供される方法は、シグナル対バックグラウンドを増加させるため及び／又はＦＩＳＨ法の特異性及び多重処理能力を保存するために、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）によって標識された検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを使用する。このアプローチによって、ｍＲＮＡ標的と相補的な核酸プローブは、準安定なフルオロフォア標識核酸ヘアピンが、繋がれた蛍光増幅ポリマーへと自己アセンブルする連鎖反応を誘発する。スペクトルが異なるフルオロフォアを有する直交ＨＣＲ増幅因子を使用して、インサイチュー増幅を、全てのチャンネルに関して同時に行うことができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、ＨＣＲ（ＨＣＲプローブ）により検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡと相補的な２０ヌクレオチドドメインに加えて４０ヌクレオチドのＨＣＲイニシエーターを含む。プローブのハイブリダイゼーションを、１０％ホルムアミドのストリンジェンシーで行った後、許容性の条件で増幅ステップを行う。最適な結果を得るために、ヘアピンの濃度のような条件を最適化することができる。本出願人は、特定の場合において、より高濃度のヘアピンが反応速度を増加させることに注目している。あらゆるＨＣＲプローブを回折限界点まで増幅することができる。いくつかの実施形態において、ＦＩＳＨシグナルは、回折限界点の大きさ内でおよそ１０〜２０倍増幅される。スポットの輝度は、例えばそれぞれのプローブ内に多数のＨＣＲイニシエーターを組み入れることにより、及び／又は多数のフルオロフォアによってそれぞれのＨＣＲ増幅ヘアピンを標識することにより、回折限界点の大きさを維持しながらさらに増強することができる。
【０１７５】
ＨＣＲで増幅されたシグナルを、脳切片において直接ｍＲＮＡから観察した。同じｍＲＮＡを標的とする場合、ＨＣＲプローブは、ｓｍＦＩＳＨドットと９０％の割合で共局在するが、１０〜２０倍明るい（図１４）。これによってＨＣＲプローブは、脳の自家蛍光を超えて容易に検出することができる（図１３）。高い共局在率は、ＨＣＲがｓｍＦＩＳＨと同程度に特異的であり、ほとんどの転写物が検出されることを証明している。
【０１７６】
ＨＣＲプローブは、容易に剥離して再ハイブリダイズし、本明細書において記述されるｓｅｑＦＩＳＨプロトコールに完全に組み込むことができる。図１５は、異なる２ラウンドのハイブリダイゼーションでの脳切片においてＨＣＲが標的とする同じ遺伝子を示した。２回のハイブリダイゼーションにおいて良好に共局在することは、ＨＣＲ−ｓｅｑＦＩＳＨが、脳においてｍＲＮＡをバーコード化するためにロバストに作用することを示している。
【０１７７】
ＨＣＲプロトコールは、ｓｍＦＩＳＨハイブリダイゼーションと同じ時間の尺度で作用し、アッセイのサイクル時間を増加させない。ＨＣＲにおける初回ハイブリダイゼーションステップの時間は、ｓｍＦＩＳＨと類似であるが、第２の増幅ステップは３０分から１時間で起こる。シグナルを増幅するために別のタイプのヘアピンを任意で使用して、ＲＮＡプローブを転写物にハイブリダイズさせる代替法は、サイクル時間をさらに減少させることができる。いくつかの実施形態において、ＨＣＲにより、アミン標識オリゴプローブを購入する必要がなくなる。とりわけ、ＨＣＲは、おそらく試薬の費用をおよそ半分、例えば脳１つ当たり１０，０００ドルに減少させることができる。
【０１７８】
自動化。効率よくスケールアップするために、例えば遺伝子１００個をマップするため並びに／又は人の労力及び／若しくはエラーを減少させるために、ハードウェア及びソフトウェアの両面の自動化を適用することができる。いくつかの実施形態において、技術の重要な部分を統合して、脳切片のイメージングなどの組織及び／又は臓器のイメージングのためのパイプラインを作製する及び／又はワークフローを最適化する。とりわけ、自動流体工学、画像獲得、及び／又は総合解析を、個々に及び任意で、迅速なハイブリダイゼーションサイクル時間及びイメージング時間と組み合わせることができる。
【０１７９】
ハードウェア。いくつかの実施形態において、自動システムでは、必要なユーザーの介入は最少であり、ユーザーが実験を設定した後は、画像獲得を自動で行うことができる。いくつかの実施形態において、それぞれのシークエンサーは、イメージングを行うための自動落射蛍光顕微鏡、及び連続的ハイブリダイゼーションを行うための自動流体工学系からなるか、又はそれらを含む。いくつかの実施形態において、圧縮空気を使用して、細胞及び組織が底部のカバーガラスに固定された１ｃｍ×１ｃｍのウェルに試薬を入れる。理論に拘束されたくはないが、本出願人は、いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーション緩衝液の粘度が高いことにより、圧縮空気駆動システムがデッドボリュームを放出して、同様に規定量の試薬を送達するように正確に制御することができることに注目する。いくつかの実施形態において、個別の減圧ラインを使用して、チャンバー内の空気を除去する。いくつかの実施形態において、提供されるプロトコールのワークフローは、本発明の時点で当技術分野において周知である既存のＤＮＡシークエンサーと類似である。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、それぞれのサイクルのハイブリダイゼーションにおいて、機器は、試料をプローブと自動的にハイブリダイズさせて、緩衝液によって洗浄して過剰のプローブを取り除き、及び／又はイメージングのために脳切片を走査する。いくつかの実施形態において、除去ステップにＤＮアーゼを使用する場合、イメージング後に、ＤＮアーゼを流入させてプローブを除去する。十分に洗浄した後、別のラウンドのハイブリダイゼーションをその後進行させることができる。ハイブリダイゼーション時間の間、顕微鏡は、ステージ上の異なる位置に移動して、既にハイブリダイズして洗浄されている別の脳切片をイメージングする。そのようにして、ステージ上の他の試料がハイブリダイズしている間に、カメラはほとんどの場合、画像を獲得している。
【０１８１】
ソフトウェア。いくつかの実施形態において、例えば、制御プロセス及びデータ解析を自動化するためにソフトウェアを使用する。いくつかの実施形態において、コードは、顕微鏡並びに流体工学要素を制御するために、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によってサポートされる無料のソフトウェアであるＭｉｃｒｏｍａｎａｇｅｒで書かれている。いくつかの実施形態において、バルブ、ステージ、光源、カメラ、及び／又は顕微鏡は、Ｍｉｃｒｏｍａｎａｇｅｒを通して制御される。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、密度の高い画像に関しては圧縮センシング（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｆａｓｔｅｒ  ＳＴＯＲＭ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｎｓｉｎｇ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１２，  ９（７）：７２１−３）を使用し、デコンボリューション法を使用して、密度の高いクラスタにおけるスポットを分離する。いくつかの実施形態において、画像分析の改善により、提供される方法、例えばｓｅｑＦＩＳＨの多重処理能力が増加する（例えば、１００個を超える遺伝子の多重処理では約４〜５倍）。いくつかの実施形態において、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡＩＩシークエンサーからＨｉＳｅｑ機器への改善と同様に効率は改善され、ＨｉＳｅｑ機器では、シークエンシングチップ上の密に充填されたクラスタを分析するために画像処理方法を使用することで処理能力が増加する。いくつかの実施形態において、データ獲得及び解析は使いやすいパッケージに統合される。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、提供される技術は、データ解析のためのソフトウェアパッケージを提供する。いくつかの実施形態において、提供される技術は、Ｐｙｔｈｏｎ及びＭａｔｌａｂのデータ解析のためのソフトウェアパッケージを提供する。提供される技術の画像は、多様なサイズであり得て、望ましければ任意で最適化することができる。いくつかの実施形態において、それぞれのＦＯＶは、深さ１４ビットで６メガピクセルであり、画像当たり１．５ＭＢのデータに対応する。いくつかの実施形態において、１回の解析当たり約１００ＧＢのデータが生成される。いくつかの実施形態において、提供される技術は、データを処理する方法及び／又はデータログの停止を軽減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、データログの停止は、それぞれの画像からスポットを領域分割すること、それを２次元ガウス分布にフィットさせて、フィットの中心位置を記録することによって軽減される。いくつかの実施形態において、提供される技術は、未加工データを廃棄して、処理データを保存することによってコンピュータのスペースを節約する。
【０１８４】
ＣＬＡＲＩＴＹ透明化脳切片の光シート顕微鏡検査。いくつかの実施形態において、提供される技術は、組織、臓器、及び／又は生物をイメージングするための方法を提供する。いくつかの実施形態において、提供される技術は、厚みのある組織又は臓器を測定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、厚みのある組織又は臓器は、厚さ約１００μｍであるか又はそれより厚い。いくつかの実施形態において、提供される技術は、１つの細胞内を超える長距離投影及び形態を保存する。いくつかの実施形態において、光シート顕微鏡検査は厚みのある組織又は臓器を測定するために使用される。いくつかの実施形態において、組織、臓器、及び／又は生物は、ＣＬＡＲＩＴＹ（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２０１３，  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ２１０７）によって透明化される。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、長距離投影及び形態をより良好に保存するより厚みのある脳切片（＞１００μｍ）をイメージングする場合、選択的平面照射顕微鏡検査（ＳＰＩＭ）としても知られる光シート顕微鏡検査をＣＬＡＲＩＴＹ透明化脳組織に適用する。いくつかの実施形態において、ＣＬＡＲＩＴＹ方法論は、ニューロンの成分及びその分子的同一性を可視化及び同定するために脳を透明にする。いくつかの実施形態において、ＣＬＡＲＩＴＹは、光散乱性の脂質を除去して、脳組織の形態を保存するために多孔性のハイドロゲルに置換することにより、脳組織を光学的に透明にして高分子を透過性にし、それによって脳の薄切片を作製することなく試験を行うことができ、関心対象のニューロン並びに長距離のシナプス結合を可視化することができる。本出願人は、理論に拘束されたくはないが、本発明の前までは、これまで培養又は薄切片で行われていたＦＩＳＨと比較して、提供される技術は、より厚みのある組織を使用して、個々のニューロン又は３次元ニューロンネットワークのトランスクリプトームのより正確な再構成を可能にすることに注目する。図１６は、ＦＩＳＨ染色と両立する光学的に透明な厚みのある切片を調製するための、成功したバリデートされたＣｌａｒｉｔｙに基づくプロトコールを例示する：（１）２ｍＬエッペンドルフチューブ中の１００ミクロンの冠状脳切片を、４％アクリルアミド、２％ホルムアルデヒド、０．２５％サーモイニシエーター、１×ＰＢＳを含む１．５ｍＬ中で４℃で一晩インキュベートした；（２）窒素ガスをハイドロゲル溶液の中に１０秒間通気した；（３）脱気した試料を４２℃で２時間インキュベートして重合化させた；（４）試料をＰＢＳで３回洗浄して、１０％ＳＤＳ、１×ＰＢＳ中で３７℃で４時間インキュベートして透明にして；及び（５）試料をＰＢＳ中で３回洗浄して、ｓｅｑＦＩＳＨのために使用する準備が整った。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、提供される技術は、焦点が外れたバックグラウンドを最小限にするか又は防止する方法を提供する。いくつかの実施形態において、提供される技術は、焦点が外れたバックグラウンドを最小限にするか又は防止するイメージング技術を利用する。いくつかの実施形態において、焦点の外れたバックグラウンドがより高い、より厚みのある切片に関してはＳＰＩＭを使用する。いくつかの実施形態において、共焦点顕微鏡は、このバックグラウンドを拒絶することができるが、これは走査が遅く、試料の下層をイメージングする間に試料の上層を光退色させる。いくつかの実施形態において、ＳＰＩＭではイメージング中の層のみに励起光を照射する。いくつかの実施形態において、提供される技術にとって有用なＳＰＩＭ設定において、互いに垂直に配置した２つの対物レンズを試料の上で約５５°で吊す。いくつかの実施形態において、円柱状のレンズを使用して、高さおよそ１０μｍ、及び有効幅又はＦＯＶが約２００μｍの範囲に光線の１つの軸を集中させて光シートを作製する。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本発明は、提供される方法のための顕微鏡設定を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、試料が側面から照射される光シート顕微鏡を提供する。いくつかの実施形態において、光シートは試料のステージと平行である。いくつかの実施形態において、光シートは、検出対物レンズに対して垂直である。光シート顕微鏡の例示的な設定を、図１７に例示する。２つの鏡及び円柱状のレンズを調整することによって、光シートの平面を作製し、試料を、検出対物レンズ（中央）に対して垂直である側面から照射する。底部の鏡を円柱状のレンズに接続して、対物レンズの同じ基部に直接載せる。この構成により、対物レンズは照射シートと同期して移動し、試料をｚ軸（右、上）に沿って走査することができる。右（下）の図も同様に、ハイブリダイゼーションチャンバー内部に試料を入れて、下の乾燥系対物レンズによってイメージングすることを示す。
【０１８８】
図１８に示されるように、ＣＬＡＲＩＴＹによって透明にして、β−アクチンに対するＨＣＲプローブにハイブリダイズさせた１００μｍの脳切片について、ＳＰＩＭ画像を得た。間隔０．５μｍの２００個の光学的切片を得て、再構成を行った。２０倍の水浸対物レンズによって透明なＨＣＲシグナルを観察した。β−アクチンｍＲＮＡは高度に発現され、細胞体における多数のドットを説明する。しかし、透明な回折限界点も同様に軸索に観察された。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ＣＬＡＲＩＴＹ透明化脳に対するＨＣＲ−ｓｅｑＦＩＳＨプロトコールと、ＳＰＩＭ顕微鏡とを適合させることができる。１００μｍの切片が４〜５時間で効率的にハイブリダイズし、このことは検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、厚さが１００μｍであるが透明な切片の中を容易に拡散できることを示している。加えて、ＤＮアーゼ酵素も同様に容易に拡散して、ＨＣＲシグナルを切片から剥離させた（図１５）。いくつかの実施形態において、提供される技術は、ＦＩＳＨ及びＨＣＲプローブなどの、当業者がルーチンとして厚さ１ｍｍの冠状切片に拡散させる抗体より小さい、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを提供し、組織全体又は臓器全体に関する標的のプロファイリング、例えばＣＬＡＲＩＴＹ透明化全脳におけるｓｅｑＦＩＳＨの成績を提供する。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、提供される技術は、顕微鏡の配置を提供する。いくつかの実施形態において、提供される技術は、厚みのある脳切片（＞１００μｍ）及びおそらくＣＬＡＲＩＴＹ透明化脳全体を、長作動距離対物レンズを有する落射蛍光顕微鏡に載せることができる、ＳＰＩＭの代替配置を提供する。いくつかの実施形態において、光シートは、イメージング軸に対して垂直に作製され、顕微鏡上に角度をつけて載せた試料を、２００〜３００μｍに対して幅１０μｍで切片にする。いくつかの実施形態において、提供される配置により、作製されたフローチャンバーの直接持ち越し及び自動化設計が可能となる。いくつかの実施形態において、脳切片における基準マーカーを使用して、連続的切片を登録する。いくつかの実施形態において、切片作製の前に脳の中にナノスケールの棒を注入すると、異なる切片の間を良好に位置合わせすることができる。
【０１９１】
速度。いくつかの実施形態において、イメージング速度は、最終的な処理能力を制限する。いくつかの実施形態において、提供されるＨＣＲ増幅は、イメージングに十分な数より多くの光子を提供し、より安価なカメラを使用して試料をイメージングすることができる。いくつかの実施形態において、集光対物レンズからの光を多数、例えばイメージング平面二色性及びフィルターを有する６個の別個の光路（例えば、５個の蛍光及び１つのＤＡＰＩ）に分割することができる。これは、インサイチュー「シークエンサー」の処理能力を劇的に増加させ、これにより、脳全体を１つの顕微鏡において１週間で完了することができる。
【０１９２】
標的遺伝子の選択。いくつかの実施形態において、本発明は、転写物及び／又はＤＮＡ座のセット（例えば、例示される１００個の標的セット）などの標的セットを選択及びイメージングするための技術を提供する。いくつかの実施形態において、標的遺伝子は、アレン脳アトラス（ＡＢＡ）のインサイチューデータベースから選択される。多数の基準を使用して、関心対象の遺伝子、例えば皮質領域における細胞同一性を表す可能性がある遺伝子を選択することができる。重なり合う基準によって最適な遺伝子セットをコンピュータによって選択することは周知である（２．
Ａｌｏｎ，  Ｎ；  Ｍｏｓｈｋｏｖｉｔｚ，  Ｄａｎａ；  Ｓａｆｒａ，  Ｓｈｍｕｅｌ  （２００６），  ”Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｔｓ  ｆｏｒ  ｋ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｓ”，  ＡＣＭ  Ｔｒａｎｓ．  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  （ＡＣＭ）  ２  （２）：  １５３−１７７，  ＩＳＳＮ  １５４９−６３２５；  ８．
Ｃｏｒｍｅｎ，  ＴＨ．；  Ｌｅｉｓｅｒｓｏｎ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｅ．；  Ｒｉｖｅｓｔ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ｌ．；  Ｓｔｅｉｎ，  Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  （２００１），  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．：  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ｐｐ．  １０３３−１０３８，  ＩＳＢＮ  ０−２６２−０３２９３−７；  １２．  Ｆｅｉｇｅ，  Ｕ  （１９９８），  ”Ａ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｉｎ  ｎ  ｆｏｒ  ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｎｇ  ｓｅｔ  ｃｏｖｅｒ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＣＭ  （ＡＣＭ）  ４５  （４）：  ６３４−６５２，，  ＩＳＳＮ  ０００４−５４１１）。いくつかの実施形態において、１．サブ細胞タイプを定義することが知られている；２．ＡＢＡにおいて「ごま塩」発現パターンを示す；３．転写因子、イオンチャンネル、ＧＰＣＲ、及びニューロトロピンなどの遺伝子ファミリーに属する；並びに４．皮質試料のＲＮＡ−ｓｅｑ実験から除かれた、遺伝子を選択するためにセットカバーヒューリスティクス（Ｐｅ’ｅｒ，  ２００２）を使用する。例えば、ＳＬＣ１Ａ３は、グリア細胞のマーカーであるが、ＳＬＣ６Ａ１は抑制性ニューロンのマーカーであり、ＳＬＣ１７Ａ７は興奮性ニューロンのマーカーである。いくつかの実施形態において、ＰＶＡＬＢ、ＳＳＴ、及びＣＡＬＢ２などの不均一な発現パターンを有する遺伝子は、抑制性ニューロンのサブセットのマーカーである。例示的な１００個の遺伝子セットを以下に示す：
遺伝子の名称        発現プロファイル
ＳＬＣ６Ａ１        全て抑制性（Ｉ）
ＳＬＣ１７Ａ７      全て興奮性（Ｅ）
ＳＬＣ１Ａ３        グリア
ＰＶＡＬＢ          サブセットＩ
ＳＳＴ              サブセットＩ
ＣＡＬＢ２          サブセットＩ
ＬＥＲ５            同皮質
ＴＮＮＣ１          同皮質
ＭＹＬ４            同皮質
ＳＡＴＢ２          同皮質
ＣＣＬ２７ａ        同皮質
ＢＯＣ              一次運動ニューロンＬ１
ＤＡＣＴ２          一次運動ニューロンＬ１
ＬＨＸ１            一次運動ニューロンＬ１
ＰＶＲＬ３          一次運動ニューロンＬ１
ＳＬＣ４４ａ３      一次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＫＬＫ５            一次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＴＮＮＣ１          一次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＷＮＴ６            一次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＺＭＡＴ４          一次運動ニューロンＬ５
ＳＴＡＲＤ８        一次運動ニューロンＬ５
ＴＣＦ２１          一次運動ニューロンＬ５
ＭＹＬ４            一次運動ニューロンＬ５
ＫＲＴ８０          一次運動ニューロンＬ６ａ
ＯＬＦＲ１９        一次運動ニューロンＬ６ａ
ＴＢＣｌｄ３０      一次運動ニューロンＬ６ａ
ＯＬＦ１６          一次運動ニューロンＬ６ｂ
ＥＡＲ６            一次運動ニューロンＬ６ｂ
ＣＨＩＴ１          一次運動ニューロンＬ６ｂ
ＳＬＮ              二次運動ニューロンＬ１
ＡＤＡＭＴＳ８      二次運動ニューロン  Ｌ１
ＥＰＹＣ            二次運動ニューロンＬ１
ＫＣＮＶ１          二次運動ニューロンＬ１
遺伝子の名称        発現プロファイル
ｐｃｄｈ７          二次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＧＬＴ８ｄ２        二次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＨＫＤＣ１          二次運動ニューロンＬ２／Ｌ３
ＳＲＰＸ            二次運動ニューロンＬ３
ＺＦＰ４５８        二次運動ニューロンＬ３
ＳＬＣ３０ａ８      二次運動ニューロンＬ３
ＧＫ５              二次運動ニューロンＬ５
ＴＥＸ２８          二次運動ニューロンＬ５
ＭＳ４ａｌＯ        二次運動ニューロンＬ５
ＫＲＴ１６          二次運動ニューロンＬ６ａ
ＫＲＴ４２          二次運動ニューロンＬ６ａ
ＤＯＣ２ａ          二次運動ニューロンＬ６ａ
ＫＲＴ３３ｂ        二次運動ニューロンＬ６ｂ
ＹＢＸ              二次運動ニューロンＬ６ｂ
ＰＮＰＬＡ５        二次運動ニューロンＬ６ｂ
ＴＭＥＭ２１５      一次体性感覚ニューロンＬ１
ＳＤＣ１            一次体性感覚ニューロンＬ１
ＰＲＥＸ１          一次体性感覚ニューロンＬ１
ＤＩＥＸＦ          一次体性感覚ニューロンＬ１
ＤＨＲＳ７ｃ        一次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＤＤＩＴ４１        一次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＴＤＧ              一次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＥＰＳＴＩ１        一次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＲＯＲｂ          一次体性感覚ニューロンＬ４
ＧＳＣ２            一次体性感覚ニューロンＬ４
ＫＲＴＩＯ          一次体性感覚ニューロンＬ４
ＧＣＡ              一次体性感覚ニューロンＬ４
ＤＣＢＬＤ２        一次体性感覚ニューロンＬ５
ＡＢＣＤ２          一次体性感覚ニューロンＬ５
ＧＴＤＣ１          一次体性感覚ニューロンＬ５
ＩＬ１７ＲＡ        一次体性感覚ニューロンＬ６ａ
ＴＢＲ１            一次体性感覚ニューロンＬ６ａ
ＰＰＩＤ            一次体性感覚ニューロンＬ６ａ
ＩＧＨＭ            一次体性感覚ニューロンＬ６ｂ
ＭＭＧＴ１          一次体性感覚ニューロンＬ６ｂ
ＣＰＬＸ３          一次体性感覚ニューロンＬ６ｂ
ＡＲＴ２ｂ          二次体性感覚ニューロンＬ１
ＧＮＢ４            二次体性感覚ニューロンＬ１
Ｂ３ＧＡＴ２        二次体性感覚ニューロンＬ１
ＰＤＣ              二次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＡＤＩＧ            二次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＦＰＲ１            二次体性感覚ニューロンＬ２／Ｌ３
ＩＮＨＢＣ          二次体性感覚ニューロンＬ４
ＲＵＦＹ４          二次体性感覚ニューロンＬ４
ＨＧＦＡＣ          二次体性感覚ニューロンＬ４
ＥＦＣＡＢ４ｂ      二次体性感覚ニューロンＬ５
ＳＳＴＲ２          二次体性感覚ニューロンＬ５
ＺＦＰ３９５        二次体性感覚ニューロンＬ５
ＣＣＤＣ３６        二次体性感覚ニューロンＬ６ａ
遺伝子の名称        発現プロファイル
ＳＴ１４            二次体性感覚ニューロンＬ６ａ
ＭＹＬ１２ｂ        二次体性感覚ニューロンＬ６ｂ
ＲＳＰ０２          二次体性感覚ニューロンＬ６ｂ
ＮＤＮＦ            Ｌ１（Ｉ）
ＲＡＳＧＲＦ２      Ｌ２／３（Ｉ）
ＣＵＸ２            Ｌ２／３／４
ＲＯＲＢ            Ｌ４
ＳＣＮＮ１Ａ        Ｌ４
ＥＴＶ１            Ｌ５
ＦＥＺＦ２          Ｌ５
ＢＣＬ６            Ｌ５
ＴＲＩＢ２          Ｌ５ａ
ＦＯＸＰ２          Ｌ６
ＴＬＥ４            Ｌ６／Ｌ６ｂ
ＣＴＧＦ            Ｌ６ｂ
ＣＹＬＤ            Ｌ２／３
ＣＭＴＭ３          Ｌ２／３
ＡＮＫＲＤ６        Ｌ２／３
【０１９３】
ｓｅｑＦＩＳＨとタンパク質検出、オルガネラマーカー及び活性の測定との統合。いくつかの実施形態において、提供される技術、例えばｓｅｑＦＩＳＨは、インサイチューで同じ試料中のＲＮＡ、並びにタンパク質、神経活動、及び構造的配置の単細胞解像度での多重解析を可能にする。特異的標的に対する抗体を、１つの追加のラウンドのハイブリダイゼーションにおいて試料にハイブリダイズさせることができる。いくつかの実施形態において、提供される方法は任意で、免疫染色ステップを含む。いくつかの実施形態において、連続ラウンドのハイブリダイゼーションにおいて多くのタンパク質標的を検出するために、多数の抗体を使用する（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００６）  ２４（１０）：  １２７０−１２７８）。本出願人は、細胞においてｍＲＮＡと比較してタンパク質が約１００〜１０００倍まで又はそれより多くの量で存在することに注目する。標的となるタンパク質は、ミトコンドリア、ＥＲ、輸送小胞、細胞骨格、並びにシナプス接合部などの細胞オルガネラのマーカーであり得る。例えば、ＭＡＰ２抗体を使用して、軸索と樹状突起の領域分割を助けるために細胞境界を示すことができる。
【０１９４】
脳切片の生きた状態での観察を、提供される方法（例えば、ｓｅｑＦＩＳＨ）による転写プロファイリングの前に落射蛍光顕微鏡及び光シート顕微鏡においてイメージングすることができる。カルシウム（Ｎａｋａｉ  Ｊ，  Ｏｈｋｕｒａ  Ｍ，  Ｉｍｏｔｏ  Ｋ  （Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００１）．  ”Ａ  ｈｉｇｈ  ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  Ｃａ（２＋）  ｐｒｏｂｅ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ”．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９  （２）：  １３７−４１；  Ａｋｅｒｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＧＣａＭＰ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｍａｇｉｎｇ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０１２  Ｏｃｔ  ３；３２（４０）：  １３８１９−４０；  Ｓｔｏｓｉｅｋ  ｅｔ  ａｌ，  ”Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １００  （１２）：  ７３１９）及び電位センサー（Ｃｏｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ”  ｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃａｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  ８３，  ｐｐ．  ３５−８８，  １９７８  （Ｊｕｎｅ）；  Ｍｕｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０１２  Ａｕｇｕｓｔ  １５；  ３（８）：  ５８５−５９２；  Ｐｅｔｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ．  Ｎｅｕｒｏｎ．  ２０１１  Ｊａｎｌ３；６９（ｌ）：９−２１）を、脳切片においてイメージングすることができる。ＳＰＩＭにより、脳切片におけるこれらのセンサーの効率的で迅速なイメージングが可能となる。脳切片を顕微鏡に固定して、ｓｅｑＦＩＳＨプロトコールなどの提供されるプロトコールを、自動流体工学によって行うことができる。いくつかの実施形態において、生きた状態での測定に加えて、ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅｓ（ＩＥＧｓ）のｍＲＮＡが、ニューロンにおける統合された神経活動の測定値として検出される。例えば、ＣａｍＫＩＩ及びｃＦｏｓは、ニューロンにおいて不均一な発現レベルで容易に検出された。それらを、遺伝子セット、例えば例示的な１００個の遺伝子の多重処理に組み入れることができるか、又は量に応じて追加のサイクルで個別にＦＩＳＨを行うことができる。
【０１９５】
異なる体性感覚運動ニューロンネットワークにおける別個のニューロンの分子的同一性を同定するためのコネクトミクスとｓｅｑＦＩＳＨの統合。
提供される技術を使用して、体性感覚運動ニューロンネットワーク内の別個のニューロン集団の分子的同一性を系統的に特徴付けする。いくつかの実施形態において、同じ機能的サブネットワーク内のニューロン集団は、共通のマーカー遺伝子セットを共有するが、同様に、細胞レベルで同一性を定義する他の遺伝子の不均一な発現も有する。いくつかの実施形態において、異なるサブネットワークの細胞は、その発現パターンがより異なる。それぞれが基本クラスの感覚運動機能を制御する例示的な皮質−皮質体性サブネットワークは：（１）食べたり飲んだりするための口顔咽頭、（２）手を伸ばしたりものをつかんだりするための上肢、（３）移動のための下肢、及び（４）律動的なひげの運動のためのひげ、である。いくつかの実施形態において、提供される技術は、別個のニューラルネットワークを有する皮質ニューロンの分子同一性を特徴付けするための新規で厳密なアプローチを提供し、哺乳動物の脳の配線図の基礎となる遺伝的回路を理解するための貴重な情報を提供する。
【０１９６】
神経経路の集団を使用して、デジタル皮質結合アトラスを作製して、神経線維連絡解析試験の未加工画像を表示することができる。大規模データの解析を助けるための皮質−皮質結合マップを作成するために、経路をグラフで再構築することができる。皮質内の結合に基づいて、そのそれぞれが基本クラスの感覚運動機能を制御する４つの別個の皮質−皮質体性サブネットワークを確立することができる。これらのサブネットワークのそれぞれは、一次体性感覚野（ＳＳｐ）、一次体性運動野（ＭＯｐ）、二次体性運動野（ＭＯｓ）、及び補足体性感覚野（ＳＳｓ）における４〜５個の別個の機能的ドメインを含み、それらを、体の特異的亜領域に対応する他の体性感覚運動野とのその結合強度に従ってさらに細分した。いくつかの実施形態において、口顔咽頭サブネットワークは、５つの主要なノード：（１）ＳＳｐ口及び鼻ドメイン（ＳＳｐ−ｍ／ｎ）；（２）ＭＯｐ口顔ドメイン（ＭＯｐ−ｏｒｆ）；（３）ＭＯｓ吻側背外側ドメイン（ＭＯｓ−ｒｄｌ）；（４）ＳＳｐバレル野前外側ドメイン（ＳＳｐ−ｂｆｄ．ａｌ）；及び（５）ＳＳｓ吻側尾腹側ドメイン（ＳＳｓ−ｒ＆ｃｖ）を含む。いくつかの実施形態において、上肢サブネットワークの４つの主要なノードは、（１）ＳＳｐ上肢（ＳＳｐ−ｕｌ）；（２）ＭＯｐ−ｕｌ；（３）吻背側ＭＯｓ（ＭＯｓ−ｒｄ）；及び（４）尾背側ＳＳｓ（ＳＳｓ−ｃｄ）を含む。いくつかの実施形態において下肢／体幹サブネットワークは、ＳＳｐ下肢／体幹野（ＳＳｐ−ｌｌ／ｔｒ）、ＭＯｐ−１１／ｔｒ、及び吻側背内側ＭＯｓ（ＭＯｓ−ｒｄｍ）（図１０Ｂ〜Ｄ）を含む。いくつかの実施形態において、ひげのサブネットワークは、尾内側ＳＳｐ−ｂｆｄ（ＳＳｐ−ｂｆｄ．ｃｍ）、ひげの一次運動野（ｖＭｌ）に対応するＭＯｐ−ｗ、及び尾背側ＳＳｓ（ＳＳｓ−ｃｄ；図１９を参照されたい）を含む。例示的なデータは、マウスコネクトームプロジェクト（ｗｗｗ．ｍｏｕｓｅｃｏｎｎｅｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ）によって記述される。
【０１９７】
これらの体性感覚運動サブネットワークのそれぞれにおける別個のニューロン集団の分子的同一性を決定するために、マルチ蛍光逆行性トレーサーを使用してニューロンを標識し、ｓｅｑＦＩＳＨなどの提供される技術を適用して、逆行性に標識された集団の遺伝子発現プロファイルを単細胞の解像度で決定することができる。ニューロン集団を標識するために、多数の（例えば、５個）の逆行性トレーサーを、同じ動物のそれぞれの感覚運動サブネットワークの主なノードの１つの主要な標的の５つに注入する（トレーサー情報を下記に示す）。例えば、１匹の動物において、回路トレーサーを、口顔咽頭サブネットワークの主要な皮質ノードの２つ（ＳＳｐ−ｂｆｄ．ａｌ及びＳＳｓ−ｒ＆ｃｖ）、及び皮質下ノードの３つ（尾状核被殻腹外側ドメイン、ＣＰ−ｖｌ；腹側後内側視床核、ＶＰＭ；及び腹側三叉神経脊髄路核、ＳＰＶ）に注入する。これは、口顔咽頭サブネットワークの他のノードの全てにおける５つの異なるニューロン集団を同時に逆行性に標識する。この例において、標識されたニューロンは、ＳＳｐ−ｍ／ｎドメイン及びＭＯｐ−ｏｒｏに存在する。
【０１９８】
一方、トレーサーを、そのそれぞれが、別個の体性サブネットワークに属する４つの異なるＳＳｐ体亜領域（すなわち、ＳＳｐ−ｍ／ｎ、ＳＳｐ−ｕｌ、ＳＳｐ−ｌｌ／ｔｒ、及びＳＳｐ−ｂｆｄ．ｃｍ）に注入することができる。これは、異なるサブネットワークに関連する皮質野における別個のニューロン集団を同時に標識する。この場合、例えば逆行性標識されたニューロンが、それぞれのサブネットワークに関連するＭＯｐドメイン、すなわちＭＯｐ−ｏｒｆ、ＭＯｐ−ｕｌ、ＭＯｐ−１１／ｔｒ、及びＭＯｐ−ｗで観察される。４つの体性感覚運動サブネットワークのそれぞれの主要ノード及び皮質下標的の全てに適用されるこの注入戦略は、サブネットワークのそれぞれの別個のニューロン集団を標識する。
【０１９９】
トレーサーの注入後（例えば、トレーサーの注入後１週間）、動物を屠殺して、その脳を回収して、逆行性標識ニューロンのｓｅｑＦＩＳＨ分析のために厚さ２０μｍ又は１００μｍの冠状切片を作製する。体性感覚運動野（ＳＳｐ、ＭＯｐ、ＭＯｓ、ＳＳｓ）において多量に発現される例示的なおよそ１００個の遺伝子などの遺伝子を、例えばアレン脳アトラスプロジェクトのオンラインデジタル遺伝子発現データベース（ｗｗｗ．Ｂｒｉａｎ−Ｍａｐ．ｏｒｇ）（Ｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １１；  ４４５（７１２４）：  １６８−７６）を使用してプロファイリングのためにあらかじめ選択することができる。
【０２００】
注入戦略と注入後処理。４週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／５マウス３００匹を使用する。１匹の動物において、５つの蛍光逆行性トレーサーを、同じ体性感覚運動サブネットワーク内のいずれかの異なるノードに、又は上記の異なる体性サブネットワークの異なるノードに注入する（図１９）。トレーサーは、フルオロゴールド（ＦＧ、黄色）、４８８又は６４７コンジュゲートコレラ毒素ｂ（ＣＴｂ−４８８［緑色］、ＣＴｂ−６４７［ピンク］）、赤色レトロビーズ（ＲＲ、赤色）、及び６５５コンジュゲート小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ−Ｑｄｏｔ６５５、白色）である。Ｑｄｏｔ６５５は、Ｃｔｂ６４７とは異なる励起波長を有することから、これを異なるチャンネルで捉えて、独自の色相で擬似発色させることができる。トレーサーは、定位脳手術を通して注入する（イオントフォレーシスによって、又は加圧注入のいずれかにより）。手術及び還流の詳細は、例えば、Ｈｉｎｔｉｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｉｎ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｔｌａｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ．  ２０１２  Ａｕｇ  ７；６：３０．  ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１２に記述されている。いくつかの実施形態において、対にした２匹のマウスに、正確に同じ座標で使用した同じトレーサーを注入する。動物の１匹を、標識細胞及び注入部位の位置を確認するために使用し、他の動物を、提供される、例えばｓｅｑＦＩＳＨ方法に供する。１匹をトレーサー輸送後に還流して、脳を、厚さ５０μｍの冠状切片にして、４つのシリーズで採取する。４シリーズの切片の１つを、蛍光ニッスル染色液（ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ  Ｂｌｕｅ［ＮＴＢ］）で対比染色して、スライドガラスに載せて、オリンパスＶＳ１２０バーチャル顕微鏡システムを使用してイメージングする。いくつかの実施形態において、ニッスル染色は、逆行性標識細胞の正確な解剖学的位置を可視化するための神経細胞層構築のバックグラウンドを提供する。これらの画像を、インフォマティクスパイプラインを通して処理して、あらゆる個々の画像を、アレン脳アトラス（ＡＲＡ）のその対応するレベルに忠実に登録する。このニッスル染色により、提供されたインフォマティクスツールと共に、それぞれのＲＯＩ（この場合、体性感覚運動野の異なるドメイン）におけるそれぞれのトレーサー標識ニューロン集団の概数を自動で正確に計数することができる。分布パターンは、その結合マップを作成するために対応するアトラスレベルに自動的にプロットされる。
【０２０１】
対を形成したマウスを同時に屠殺して、その脳を、ｓｅｑＦＩＳＨ分析のために厚さ２０μｍ又は１００μｍの切片にする。これらの切片を最初に、２０倍（又は１０倍）の対物レンズでイメージングして、異なるトレーサーを有する逆行性標識ニューロンを明らかにする。体性感覚運動野を含む全ての冠状レベルを通しての脳切片を使用して、例示的な１００個の遺伝子セットに関してｓｅｑＦＩＳＨを行う。この方法は、あらゆるトレーサー標識ニューロンにおける遺伝子発現を明らかにする。全ての画像を最初に、それぞれの個々のトレーサー標識ニューロンの遺伝子発現プロファイルに関して分析する。対を形成した脳からのほぼ同じ冠状レベルの切片をコネクトームビューワで並べて表示することができるように、それぞれの切片をその対を形成した脳の最も厳密にマッチする切片となるように登録し直す。それによって、異なるニューロン集団の分子プロファイルが、その最も厳密にマッチする解剖学的バックグラウンドで表示される。いくつかの実施形態において、遺伝子発現プロファイルは、それぞれの逆行性標識ニューロン集団において相関する。
【０２０２】
結果。いくつかの実施形態において、異なる体性感覚運動野内の別個の逆行性標識ニューロン集団は、異なるトランスクリプトームプロファイルを示す：異なるトレーサーで標識された同じドメイン（例えば、ＳＳｐ−ｍ）内のニューロン集団であっても、異なる結合プロファイルを有するその隣接するニューロンからの別個の遺伝子発現プロファイルを示す。いくつかの実施形態において、同じサブネットワーク内（例えば、ＳＳｐ−ｍ、ＭＯｐ−ｏｒｆ、ＳＳｐ−ｂｆｄ．ａｌ、及びＳＳｓ−ｒ）の異なる体性感覚運動ノード内の異なるニューロン集団は、共通のネットワーク特異的遺伝子を共有するが、異なるニューラルネットワーク（例えば、口顔咽頭及び下肢／体幹サブネットワーク）内のニューロン集団は、非常に異なるトランスクリプトームプロファイルを示す。いくつかの実施形態において、領域（例えば、ＳＳＰ又はＭＯｐ）、又は層（異なる層）特異的遺伝子が、異なる皮質野及び異なる層のそれらのニューロンに関して同定される。
【０２０３】
例示されるように、提供される技術は、別個の体性感覚運動ネットワーク内の結合に基づくニューロン集団（細胞タイプ）の分子的同一性を、ニューロン下の解像能及び忠実な解剖学的バックグラウンドで特徴付けするために、蛍光神経線維連絡解析とｓｅｑＦＩＳＨ技術との独自の組合せを提供する。例えば、例示的な結果に関して図３及び９を参照されたい。いくつかの実施形態において、提供される技術は、他のパラメーター（すなわち、抗体及びオルガネラの染色、並びにＩＥＧ発現レベル）を同時に測定することを含み、新皮質又は脳全体に応用することができる。
【０２０４】
データをオンラインで解析及び提示するためのハイスループットパイプライン及びインフォマティクスツール。いくつかの実施形態において、提供される技術は、例えば、ｗｗｗ．ＭｏｕｓｅＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ．ｏｒｇなどの公開されたデータベースを通してデータをオンラインで分析及び提示するためのハイスループットパイプライン及びインフォマティクスツールを提供する。いくつかの実施形態において、提供される技術は、試験の広い範囲及びマルチ蛍光イメージングの使用により、コネクトミクス領域における貴重なツールとなり、マウス脳における長距離結合を研究するために特に適している、マウスコネクトームプロジェクトとの統合を提供する。例えば、これはその自身の神経細胞層構築上のバックグラウンド及び対応するＡＲＡアトラスレベル上で、ユーザーが多数の蛍光標識経路を可視化することができるオンライン可視化ツールを提供する。いくつかの実施形態において、ｓｅｑＦＩＳＨ情報をその対応する逆行性標識体細胞に忠実に関連させるために、標識された細胞体を、組織バックグラウンドから、及び同じ切片であるが、異なるラウンド（例えば、最初は逆行性トレーサーのイメージング、次はｓｅｑＦＩＳＨにおける異なるｍＲＮＡ）で獲得した画像から個別に領域分割して、スライドガラス及び／又は組織における解剖学的指標のいずれかにおける固定された基準点と比較したその座標によって空間的なインデックスをつける。いくつかの実施形態において、ＡＲＡにおいて定義された定位固定座標にデータを関連させるために、本発明は、登録の精度を劇的に増加させる（すなわち、それぞれの走査された顕微鏡画像をＡＲＡの対応するレベルの形状に再投影させる）新規登録パイプライン、及び所定のＲＯＩ（例えば、ＳＳｐ−ｍ、ＭＯｐ−１１）における蛍光標識されたニューロンを自動で正確に計数する画像の領域分割を提供する。いくつかの実施形態において、提供される技術により、脳内の及び多数の脳の間での多数のトレーサーによる標識及びｓｅｑＦＩＳＨデータを、可視化及び注釈の目的で１つの解剖学的枠組みの中に照合することができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、画像を、アレン脳アトラス（Ｄｏｎｇ，  Ｈ．  Ｗ．  （２００８）．  Ｔｈｅ  Ａｌｌｅｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｔｌａｓ：  Ａ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｂｒａｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  Ｍａｌｅ  Ｍｏｕｓｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）の対応するアトラスレベルで登録する。登録プロセスから得られた変形マトリクスを当初の解像画像に適用して、高解像度再投影画像を得る。登録及び登録の微調整を行った後、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ（登録商標）蛍光ニッスル染色を明視野画像に変換する。次に、あらゆる画像のそれぞれのチャンネルを、輝度及びコントラストに関して調節して、ツール、例えばｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅにおける標識可視性及び品質を最大限にする。修正（すなわち、歪み、角度）及びＪＰＥＧ２０００ファイルフォーマットへの変換後、画像をｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅのビュー（ｗｗｗ．ＭｏｕｓｅＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ）に公表することができる。
【０２０６】
ＦＩＳＨ可視化ツール。いくつかの実施形態において、生成された全ての結合データを、ＭＣＰインフォマティクスパイプラインを通して処理して、新しいｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ  ＦＩＳＨビューワ（ｗｗｗ．ＭｏｕｓｅＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ）を通してオンラインで提示する。２つの順行性標識（ＰＨＡＬ及びＢＤＡ）及び２つの逆行性標識（ＦＧ及びＣＴｂ）を表示する利用可能なｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅビューワとは異なり、ｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ  ＦＩＳＨは、逆行性蛍光色素を有する５個までの異なるニューロン集団を表示することができる。先に述べたように、それぞれの注入セットをマウス対に与えることができる。１匹のマウスを通常のＭＣＰパイプラインに従って処理して、ｉＣｏｎｎｅｃｔｏｍｅ  ＦＩＳＨビューワに提示して、そのニッスル染色神経細胞層構築バックグラウンド内及びその対応するＡＲＡレベル内の多数の蛍光標識ニューロン集団を示すことができる。これらは、脳全体に及ぶ蛍光標識ニューロン集団のそれぞれに関する正確な解剖学的情報を提供することができる。ｓｅｑＦＩＳＨ後のその対形成パートナーからの脳切片を、その対形成パートナーが登録された最も近いＡＲＡレベルに登録して、異なるウィンドウで並べて表示することができる。ニューロンにおいて発現される遺伝子のリストをサイドパネルに記載することができる。遺伝子をクリックすると、この遺伝子を発現する蛍光標識ニューロンが光って、その発現位置を示すことができる。これは、全体的な結合状況及び解剖学的バックグラウンド内でのニューロン集団の分子的同一性を示すための実際的な方法を提供する。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、ユーザーがこれらのデータを解析して神経結合をその分子的同一性に相関させることができる、対応するデータベースが開発されている。このインフォマティクスツールは、遺伝子バーコード化を有するそれぞれの逆行性標識ニューロン集団に関連する情報（例えば、細胞数、解剖学的位置）を保存するデータベースの上に構築される。このデータベースは、ユーザーが、同じニューラルネットワーク又は別個のニューラルネットワーク内のニューロンの対応する遺伝子バーコードを同定するために役立ち得る。
【０２０８】
全脳のマッピング。いくつかの実施形態において、提供される技術は、１つのニューロンレベルで、全ての脳の逆行性標識ニューロンにおける遺伝子発現のハイスループット分析にとって十分な感度、選択性、自動化、及び／又は空間時間的解像度を有する。
【０２０９】
除去ステップのための追加の例示的な方法
いくつかの実施形態において、本発明は、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを標的から除去するための多様な方法を提供する。いくつかの実施形態において、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）を使用して、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。図２１は、ＥｘｏＩＩＩを使用するＨＣＲ再ハイブリダイゼーションの例示的なプロセスを示す。図２１において、ＥｘｏＩＩＩは、架橋鎖及びＨＣＲポリマーを消化するが、中間オリゴヌクレオチドを、新しい架橋鎖とのハイブリダイゼーションのために無傷のままで維持する。Ｔ３Ｔマウス線維芽細胞においてβ−アクチン（Ａｃｔｂ）転写物を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを使用する例示的なデータを、図２１（ｂ）に示した。左の画像は、Ａｌｅｘａ４８８色素を使用したＡｃｔｂ転写物の最初のハイブリダイゼーション及び増幅を示した。中央の画像は、室温でｅｘｏＩＩＩと１時間インキュベーション後にＡｌｅｘａ４８８チャンネルのシグナルが完全に失われることを示した。右の画像は、新しい架橋鎖及びＡｌｅｘａ６４７色素をタグ付けした対応するヘアピンを添加した後に限ってＡｃｔｂ転写物が再増幅されることを示した。方法の特定の特色を例証するために、画像のコントラスト比を調節した。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、ラムダエキソヌクレアーゼ（λ−ｅｘｏ）を使用して、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去する。図２２は、λ−ｅｘｏを使用したＨＣＲ再ハイブリダイゼーションの例示的なプロセスを示す。図２２においてλ−ｅｘｏは、５’リン酸化架橋鎖を消化して、標的、例えばｍＲＮＡに結合した中間体オリゴヌクレオチドからＨＣＲポリマーを放出し、放出されたポリマーを洗浄して除去した後、新しい架橋鎖とのハイブリダイゼーションのために中間体オリゴヌクレオチドを無傷のまま維持する。Ｔ３Ｔマウス線維芽細胞においてβ−アクチン（Ａｃｔｂ）転写物を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを使用する例示的なデータを、図２２（ｂ）に示した。左の画像は、Ａｌｅｘａ４８８色素を使用したＡｃｔｂ転写物の最初のハイブリダイゼーション及び増幅を示した。中央の画像は、３７℃でλ−ｅｘｏと共に１時間インキュベーション後にＡｌｅｘａ４８８チャンネルのシグナルが失われることを示した。右の画像は、洗浄緩衝液によって洗浄後で、Ａｌｅｘａ６４７色素をタグ付けした対応するヘアピンと共に新しい架橋鎖を添加した後に限ってＡｃｔｂ転写物が再増幅されることを示した。方法の特定の特色を例証するために、画像のコントラスト比を調節した。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、ウラシル特異的切除試薬（ＵＳＥＲ）を使用して、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを除去した。図２３は、ＵＳＥＲを使用したＨＣＲ再ハイブリダイゼーションの例示的なプロセスを示す。図２３において、ＵＳＥＲは、架橋鎖におけるデオキシウリジンヌクレオチドを消化して、標的、例えばｍＲＮＡに結合した中間体オリゴヌクレオチドからＨＣＲポリマーを放出させて、断片及び放出されたポリマーを洗浄して除去した後、新しい架橋鎖とのハイブリダイゼーションにとって中間体オリゴヌクレオチドを無傷のままで維持する。Ｔ３Ｔマウス線維芽細胞においてβ−アクチン（Ａｃｔｂ）転写物を標的とする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドを使用する例示的なデータを、図２３（ｂ）に提示した。左の画像は、Ａｌｅｘａ４８８色素を使用したＡｃｔｂ転写物の最初のハイブリダイゼーション及び増幅を示した。中央の画像は、３７℃でＵＳＥＲ中で１時間インキュベーション後にＡｌｅｘａ４８８チャンネルのシグナルが失われることを示した。右の画像は、洗浄緩衝液による洗浄後で、Ａｌｅｘａ６４７色素をタグ付けした対応するヘアピンと共に新しい架橋鎖を添加した後に限ってＡｃｔｂ転写物が再増幅されることを示した。方法の特定の特色を例証するために、画像のコントラスト比を調節した。
【０２１２】
いくつかの実施形態において、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドは、相補的オリゴヌクレオチド（ｃＴＯＥ）を使用する置換によって除去される。いくつかの実施形態において、置換は、デキストラン又はその誘導体、塩、及び／又は有機溶媒の使用を含む。いくつかの実施形態において、置換は、デキストラン又はその誘導体の使用を含む。いくつかの実施形態において、置換は、硫酸デキストランの使用を含む。いくつかの実施形態において、置換は塩の使用を含む。いくつかの実施形態において、塩はＭｇＣｌ２である。いくつかの実施形態において、置換は有機溶媒の使用を含む。いくつかの実施形態において、有機溶媒はホルムアミドである。多様な要因、例えばｃＴＯＥ濃度、インキュベーション時間、緩衝液の組成、並びに有機溶媒のタイプ及び／濃度など、ただしこれに限定されない要因を、個々に又は組み合わせて最適化することができる。図２４は、ｃＴＯＥを使用したｓｍＦＩＳＨプローブの置換に関する例示的なデータを示した。置換されるｓｍＦＩＳＨプローブ（Ａｌｅｘａ６４７）と、共局在するｓｍＦＩＳＨプローブ（Ａｌｅｘａ５３２）の間の蛍光強度比の平均値を示す。ｃＴＯＥ濃度、ハイブリダイゼーション緩衝液組成、及び置換時間を比較する様々な処理を行った。全ての置換プローブの条件により、細胞を１０％ＤＳ中に入れてｃＴＯＥを添加しない対照と比較して、有意により多くの置換が起こった。理論に拘束されたくはないが、本出願人は、とりわけ、ｃＴＯＥ濃度の増加、ｃＴＯＥプローブをハイブリダイズさせる時間の増加、緩衝液を１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２又は１０％＞ホルムアミドに調節することの全てにより、置換の増加が起こったことに注目する。１０％硫酸デキストラン（ＤＳ）中の２．５μＭ  ｃＴＯＥで２時間処置することにより、残留Ａｌｅｘａ６４７  ｓｍＦＩＳＨシグナルは最小となるが、ｃＴＯＥを添加せずにＡｌｅｘａ６４７の代わりにＡｌｅｘａ５９４（Ａ５９４）をハイブリダイズさせることによって決定したベースラインシグナルと比較すると軽微な増加が起こる。
【０２１３】
オリゴヌクレオチド調製の追加の実施例
１つの配列セットをＰＣＲによって増幅した（図２５）。産物を単離して、例えば５倍量の沈殿緩衝液（３０：１のＥｔＯＨ：１Ｍ  ＮａＯＡｃ）を使用することにより−２０℃で少なくとも１０分間沈殿させた。沈殿混合物を１０分間遠心分離した。上清を廃棄して、オリゴヌクレオチドペレットを、酵素約１０単位がＤＮＡ約１μｇを１時間で消化することに基づいて適切な単位の酵素を有するニッキング酵素緩衝液中に再溶解した。インキュベーション時間が経過した後、試料を再度沈殿させて２×ローディング緩衝液（９６％ホルムアミド／２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）及び水に再溶解し、最終的なローディング緩衝液（４８％ホルムアミド／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を作製した。試料を９５℃に加熱してＤＮＡを完全に変性させた。変性したＤＮＡを、変性アクリルアミドゲル（８Ｍウレア、１０〜１２％アクリルアミド）にロードした。ゲルを２５０Ｖで１時間、又は必要に応じて最適化して泳動させた。電気泳動後、ゲルを１×ｓｙｂｒゴールドを使用して１５分間染色した後、可視化した。適切なバンドを切り出して、破砕し、ＤＩ水中で２時間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度沈殿させた後、減圧カラムを使用して精製した。カラムを、ＲＮアーゼを含まない水３０μＬで溶出させると、図２６に示されるように、最終産物が得られた。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、提供される方法は、ニッキングエンドヌクレアーゼ部位の代わりに制限部位を使用する。図２５における増幅ステップと同様に５’末端に隣接するＢａｍＨＩ部位、３’末端に隣接するＡａｔＩＩ部位を有する配列セットをＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲ産物を５倍量の沈殿緩衝液（３０：１のＥｔＯＨ：１Ｍ  ＮａＯＡｃ）によって−２０℃で少なくとも１０分間沈殿させた後単離し、ＢａｍＨＩ及びＡａｔＩＩによって消化した。産物を再度精製してｅｘｏＩＩＩ消化に供する。消化した核酸を除去するとオリゴヌクレオチド産物が得られる。
【０２１５】
均等物
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明してきたが、単なる例として提示してきたことから、前述が単なる例示に過ぎず、制限するものではないことは当業者に明らかとなるはずである。多数の修飾及び他の例示的な実施形態が当業者の範囲内であり、本発明の範囲に含まれると企図される。特に、本明細書において提示した例の多くは、方法の実行又はシステムの要素の特定の組合せを必要とするが、それらの実行及びそれらの要素を、同じ目的を達成するために他の方法で組み合わせてもよいと理解されるべきであり、１つの実施形態のみに関連して考察された実行、要素、及び特徴は、他の実施形態における類似の役割から除外されないと意図される。さらに、以下の特許請求の範囲において詳述される１つ又は複数のミーンズプラスファンクションの制限に関して、手段は、本明細書において開示される、詳述された機能を行うための手段に限定されないと意図され、現在公知の又は今後開発される、詳述された機能を行うための任意の手段をその範囲に含むと意図される。
【０２１６】
特許請求の範囲において、請求項の要素を修飾するための「第１」、「第２」、「第３」等の序詞の使用は、単独で他の請求項の要素に対する１つの請求項の要素の任意の優先権、先行性、若しくは順序、又は方法の実行が行われる時間的順序を内包するものではなく、請求項の要素を区別するために、特定の名称を有する１つの請求項の要素を、同じ名称（序詞が使用されていることを除き）を有するもう１つの要素から区別するための表示として単に使用される。同様に、ａ）、ｂ）等又はｉ）、ｉｉ）等の使用は、単独で、特許請求の範囲におけるステップの任意の優先性、先行性、又は順序を内包するものではない。同様に、本明細書におけるこれらの用語の使用は、単独で、任意の必要な優先性、先行性、又は順序を内包するものではない。
【０２１７】
前述の明細書は、当業者が本発明の実践を行うことができるために十分であると考えられる。実施例は、本発明の１つの態様の１つの例示として意図され、他の機能的に同等な実施形態が本発明の範囲に含まれることから、本発明は、提供される実施例の範囲に限定されない。前述の説明から、本明細書において示され、説明された実施形態に加えて本発明の様々な変化形が当業者に明らかとなるであろうが、それらも添付の特許請求の範囲に含まれる。本発明の利点及び対象物は、本発明のそれぞれの実施形態に必ずしも包含されない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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