(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非エンベロープウイルス粒子の製造方法であって、
（ａ）非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質を添加する工程、
（ｂ）前記物質を添加した試料を酸性にする工程、及び
（ｃ）前記（ｂ）工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程、
を含み、非エンベロープウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス粒子であり、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質がカルボン酸型アニオン界面活性剤である、方法。
【請求項２】
（ｃ）工程の後にさらに、（ｄ）非エンベロープウイルス粒子を精製する工程、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸性にする工程が、酸性の溶液を添加する工程である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞の溶解物もしくは破砕物、非エンベロープウイルス粒子を含有する非エンベロープウイルス産生細胞の培養液上清、または非エンベロープウイルス産生細胞から得られる抽出物である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液で処理して得られる抽出物の中和物である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、ヌクレアーゼ処理を施された試料である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の非エンベロープウイルスの製造方法に用いるためのキットであって、
（１）カルボン酸型アニオン界面活性剤、及び
（２）酸性の溶液、
を含有することを特徴とするキット。
【請求項８】
さらに、中和液を含有することを特徴とする請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非エンベロープウイルス粒子を煩雑な操作なく高純度に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子組換え分野や医療分野においては、ヒトを含む哺乳動物細胞に遺伝子を導入する方法として、電気穿孔や金属微粒子を用いる物理的方法、核酸、ポリカチオン、もしくはリポソームを用いる化学的方法等に加えて、生物学的方法としてウイルス由来の遺伝子導入用のベクター（以下、ウイルスベクター）を用いる方法がある。ウイルスベクターとは、天然由来のウイルスを改変し、所望の遺伝子等を標的に移入することができるようにしたベクターのことで、近年技術開発が進んでいる。一般に、遺伝子組換え技術を用いて作製したウイルスベクターは、遺伝子組換えウイルスベクターと呼ばれるが、そういった遺伝子組換えウイルスベクターの由来となるウイルスとしては、レトロウイルスやレンチウイルス、センダイウイルス、ならびにヘルペスウイルス等のエンベロープを持つウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（以下、ＡＡＶ）等のエンベロープを持たないウイルス（以下、非エンベロープウイルス）がよく知られている。【０００３】
特にＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞等の分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること等から、先天性遺伝子疾患の治療の他、癌や感染症の治療を目的とした遺伝子治療法に用いる遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が、近年注目されている。【０００４】
遺伝子組換えウイルスの製造方法としては、通常、ウイルス粒子形成に必須な要素を核酸構築物の形で細胞に導入し、ウイルスを産生する能力を有する細胞（以下、ウイルス産生細胞）を作製し、当該細胞を培養してウイルス粒子形成に必須な要素を発現させることで行われる。一般的には、前記ウイルス粒子形成に必須な要素のうち、シス供給を要するものとトランス供給可能なものを分離してウイルス産生用の細胞に導入することで、野生型ウイルスの産生、及び遺伝子組換えウイルスの感染先での自立複製を防ぐ方法が取られる（特許文献１）。【０００５】
以下、ＡＡＶを由来とした遺伝子組換えウイルス（以下、ｒＡＡＶ）ベクターを例に挙げて具体的に説明すると、１）野生型ＡＡＶゲノムの両端のＩＴＲを残し、ｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子を除いた核酸をプラスミドに搭載したｒＡＡＶプラスミドの導入、２）Ｒｅｐ、Ｃａｐタンパク質をトランスに供給するためのｒｅｐ、ｃａｐ遺伝子発現プラスミドの導入、加えてＡＡＶはその感染性ウイルス粒子形成にヘルパーウイルスと呼ばれる、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス等のいずれかのウイルスからの補助要素の供給を要することから、３）アデノウイルス感染、を用いる方法が確立されている。更に、上記方法を用いると、理論上、製造されたベクター液中にアデノウイルスが混入するが、それを回避するため、上記３）に代わって３’）アデノウイルス由来要素のうち、ＡＡＶのウイルス粒子形成に必須な要素のみを発現するヘルパープラスミドの導入、を用いる製造方法（ヘルパーフリー系）が開発された。【０００６】
ウイルス産生が達成されたウイルス産生細胞は、その後、回収、破砕され、得られたｒＡＡＶ粒子を含む細胞破砕液を適宜フィルターろ過、超遠心、クロマトグラフィー、又は限外ろ過等の工程に供することによってｒＡＡＶ粒子が精製され、最終製造物となる。【０００７】
現在、遺伝子組換えウイルスベクターの利用が遺伝子治療の基礎研究、又は臨床応用の分野に広がるにつれ、より高力価、高純度のｒＡＡＶ粒子を取得する方法が必要とされ、各種の改良方法が開示されている。例えば、培養液のｐＨを上昇させたストレス条件下でウイルス産生細胞を培養することで、ｒＡＡＶ粒子の産生と当該粒子の培養上清への放出割合を促す方法（特許文献１）が知られているが、それ以外は産生されたｒＡＡＶ粒子の精製以降の工程についての工夫である。また、ｒＡＡＶ粒子の精製においては、超遠心やクロマトグラフィーを用いずにさまざまなセロタイプ（以下、血清型ともいう）のｒＡＡＶ粒子を精製する方法が提案されている（非特許文献１及び非特許文献２）。しかし、当該方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）相と水相の二相分割方法、ＰＥＧ沈殿、クロロホルム処理、及び透析の四種類の処理工程を含む複雑な精製方法であることに加え、純度の上でもＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて不純物と思われるバンドが多数認められており、純度及び簡便さという観点からみると十分ではない。以上のように、ｒＡＡＶ粒子を精製に供する前に実施されるウイルス産生細胞の処理方法、及びｒＡＡ粒子の精製方法については、依然改善の余地が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０００／１４２０５号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  ヴィロロジカル  メソッズ（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１８３巻、第２号、１３９〜１４６頁（２０１２年）
【非特許文献２】バイオエンジニアード（Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、第４巻、第２号、１０３〜１０６頁（２０１３年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得るための製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得るための製造方法を提供することを目的に鋭意研究した結果、非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質を添加し、当該物質を添加後の試料を酸性にする工程で生じた沈殿物を除去することにより、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を得ることができることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は、
［１］  非エンベロープウイルス粒子の製造方法であって、
（ａ）非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質を添加する工程、
（ｂ）前記物質を添加した試料を酸性にする工程、及び
（ｃ）前記（ｂ）工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程、
を含む方法、
［２］（ｃ）工程の後にさらに、（ｄ）非エンベロープウイルス粒子を精製する工程、を含むことを特徴とする［１］に記載の方法、
［３］  酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質が、界面活性剤である［１］に記載の方法、
［４］  酸性にする工程が、酸性の溶液を添加する工程である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法、
［５］  非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞の溶解物もしくは破砕物、非エンベロープウイルス粒子を含有する非エンベロープウイルス産生細胞の培養液上清、または非エンベロープウイルス産生細胞から得られる抽出物である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法、
［６］  非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液で処理して得られる抽出物の中和物である［５］に記載の方法、
［７］  非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料が、さらにヌクレアーゼ処理を施された試料である［１］〜［６］のいずれかに記載の方法、
［８］  非エンベロープウイルス粒子がアデノ随伴ウイルス粒子である［１］〜［７］のいずれかに記載の方法、
［９］  ［１］〜［８］のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、
（１）酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質、及び
（２）酸性の溶液、
を含有することを特徴とするキット、
［１０］  さらに、中和液を含有することを特徴とする［９］に記載のキット、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得るための製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１で調製したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図２】実施例１で調製したサンプルの回収率を示す図である。
【図３】実施例２で調製したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】実施例３で調製したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図５】実施例６で調製したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において非エンベロープウイルスとは、エンベロープウイルス以外のウイルスを指す。ここでエンベロープウイルスとは、ウイルス表面に脂質層もしくは脂質２重層を持つウイルスを指す。非エンベロープウイルスの代表的なものとしては、ＤＮＡをゲノムとするウイルスについては、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス等、ＲＮＡをゲノムとするウイルスについては、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス等が例示される。
【００１６】
本発明の製造方法が適用される非エンベロープウイルスに特に限定はなく、既に産生方法が知られた非エンベロープウイルスでも、天然から新たに取得された非エンベロープウイルス、又はそれらを由来とする遺伝子組換えウイルスベクターでもよい。本発明の製造方法で製造される非エンベロープウイルスには、好適にはアデノウイルス、又はパルボウイルス科のＡＡＶが例示される。本発明の製造方法は、公知のいずれの血清型のＡＡＶにも適用可能であり、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群より選択された少なくとも１種のＡＡＶの製造に利用することができる。なお、本明細書においてｒＡＡＶの血清型について述べる場合、カプシド（ｃａｐｓｉｄ）の由来となる血清型を基準とする。すなわち、ｒＡＡＶ調製時に使用されるｃａｐ遺伝子の由来に応じてそのｒＡＡＶの血清型を決定するものとし、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノムの血清型の由来には依存しないものとする。例えば、カプシドがＡＡＶ６由来で、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノム中のＩＴＲがＡＡＶ２由来の場合は、本明細書中では当該ｒＡＡＶは血清型６とする。さらに、前記の各血清型のＡＡＶのカプシドの変異体を含むＡＡＶの製造にも、本発明の製造方法を適用することができる。
【００１７】
本明細書において、「ウイルス粒子」とはカプシドと呼ばれるタンパク質の殻から構成された粒子を意味する。また「ウイルスベクター」とは、前記のウイルス粒子に包含されているウイルスゲノム（核酸形状）を意味する。例えば、ＡＡＶの場合、ｒＡＡＶ粒子は、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻から構成された粒子であって、ｒＡＡＶベクターを含む。また、ｒＡＡＶベクターはｒＡＡＶ粒子内に存在するウイルスゲノムＤＮＡを含むものである。さらに本明細書では、「ウイルス粒子」には、ウイルスゲノムを含んでいないウイルス様粒子（例えばＡＡＶ中空粒子：国際公開第２０１２／１４４４４６号パンフレット）の場合も含む。特に限定はされないが、ｒＡＡＶベクター由来のウイルス様粒子、又はＡＡＶ中空粒子は、ｒＡＡＶ粒子の範疇である。
【００１８】
本明細書において、酸性とはｐＨ６．５未満であることをいい、中性とはｐＨ６．５〜７．５であることをいい、塩基性とはｐＨ７．５超であることをいう。
【００１９】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００２０】
（１）本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法
本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法は、
（ａ）非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質を添加する工程、
（ｂ）前記物質を添加した試料を酸性にする工程、及び
（ｃ）前記（ｂ）工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程、
を含むことを特徴とする。
【００２１】
具体的には、非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に、まず酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質が添加される。当該物質の添加は、固形物を添加して実施することもできるが、好ましくはあらかじめ調製しておいた溶液を所望の終濃度となるように添加することで実施される。当該物質の添加後は、すぐに次工程（ｂ）に進んでもよいが、好ましくは当該物質の添加後しばらく静置する。静置温度および静置時間は適宜決定すればよく、特に限定されないが、静置温度としては例えば０〜４０℃、好ましくは４〜３７℃、静置時間としては例えば１分〜２４時間、好ましくは５分〜１時間が挙げられ、例えば３７℃で３０分間静置する。
【００２２】
本発明の方法で使用する「酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質」とは、中性又は塩基性条件と比較して、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる性質を有する物質のことをいう。当該物質としては、特に本発明を限定するものではないが、試料中のタンパク質との相互作用によって酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させて、沈殿させる性質を有するものが本発明に好適である。
【００２３】
また、本発明の方法で使用する「酸性条件で沈殿する物質」とは、中性又は塩基性条件から酸性条件に変化することにより、自身が沈殿する性質をもつ物質のことをいう。当該物質としては、特に本発明を限定するものではないが、酸性条件で沈殿する際に試料中のタンパク質をともに沈殿させる性質を有するものが本発明に好適である。
【００２４】
本発明の方法で使用する酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質と酸性条件で沈殿する物質は、別物質であってもよいし、同一物質であってもよい。当該酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質は、特に限定はされないが界面活性剤であってもよい。当該界面活性剤は、アニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン界面活性剤及び両性界面活性剤に大別される。
【００２５】
アニオン界面活性剤とは、陰イオン界面活性剤とも称されるものであって、水中で電離して有機陰イオンとなるものである。当該アニオン界面活性剤は、カルボン酸型、スルホン酸型、硫酸エステル型及びリン酸エステル型に分類される。当該カルボン酸型に分類されるものとしては、デオキシコール酸塩、コール酸塩又はラウロイルサルコシン塩が例示される。また、スルホン酸型としてはドデシル硫酸塩が例示される。前記塩は、ナトリウム塩、リチウム塩が好適である。
【００２６】
非イオン性界面活性剤とは、水中でイオンにならないものをいう。当該非イオン性界面活性剤は、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型、アルカノールアミド型、糖型及びメチルグルカミン型に分類される。前記エステル型としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ６０）又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０）等が例示される。また、エーテル型としては、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ―４０）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＢｒｉＪ（登録商標）  Ｌ２３、ＢｒｉＪ（登録商標）  Ｌ５８）が例示される。エステルエーテル型としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヘキシタン脂肪酸エステル又はソルビタン脂肪酸エステルポリエチレングリコールが例示される。さらにアルカノールアミドとしては、Ｎ，Ｎ-ビス［３−（Ｄ−グルコンアミド）プロピル］デオキシコールアミドが例示される。糖型としては、アルキルマルトシド、アルキルグルコピラノシドが例示される。メチルグルカミン型としては、アルキル−Ｎ−メチルグルカミンが例示される。
【００２７】
カチオン界面活性剤は、陽イオン界面活性剤とも称され、これは、水中で、電離して有機陽イオンとなるものである。カチオン界面活性剤は、アルキルアミン塩型及び第四級アンモニウム塩型に分類され、当該アルキルアミン塩型としては、モノメチルアミン塩酸塩、ジメチルアミン塩酸塩又はトリメチルアミン塩酸塩が例示される。また、第四級アンモニウム塩型としては、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド又はミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド等が例示される。
【００２８】
両性界面活性剤とは、分子内にアニオン基とカチオン基の両者を併せ持っている界面活性剤である。水溶液中での電離状態はアミノ酸に類似しており、両性界面活性剤には、アミノ酸誘導体が多く存在する。従って、アミノ酸と同様に等電点を有し、等電点よりアルカリ性側にある場合にはアニオン界面活性剤として、酸性側にある場合にはカチオン界面活性剤として作用する。前記両性界面活性剤としては、スルホベタインが例示される。特に限定はされないが、ラウリルスルホベタイン、カプリリルスルホベタイン、オクチルスルホベタイン、パルミチルスルホベタイン又はミリスチルスルホベタインが挙げられる。
【００２９】
本発明の方法においては、好ましくは、酸性ｐＨで不溶化するアニオン界面活性剤が例示される。さらに好ましくは、カルボン酸型アニオン界面活性剤である、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウムが好適に使用される。特に好適には、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウムが使用される。
【００３０】
本発明の方法の工程（ａ）においては、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質を固形物として添加してもよく、または、あらかじめ調製しておいた当該物質の溶液を添加してもよい。当該物質の溶液の濃度は、特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。また、当該物質の溶液の調製に用いる溶媒には特に限定はなく、水、緩衝液、細胞培養用培地等、適宜選択可能である。酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質は、所望の終濃度となるように、非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料に添加される。当該物質の所望の終濃度は、酸性条件下で試料中の夾雑タンパク質を沈澱させる濃度であればよく、特に限定されない。試料に含有される非エンベロープウイルスの種類や当該物質の種類にもよるが、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸ナトリウム、またはコール酸ナトリウムを用いる場合の終濃度としては、０．１〜２％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．２〜１％（ｖ／ｖ）が挙げられる。また、個々の非エンベロープウイルスによって酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質の最適濃度が異なる場合は、適切な濃度を決定するのは当然のことである。
【００３１】
次に、本発明の方法では、前記物質が添加された試料のｐＨを酸性にする。この工程において、中性又は塩基性の試料を酸性にすることができれば、その方法に特に限定はない。酸性にする手段としては、気体の酸をバブリングしてもよいし固体の酸を添加してもよい。特に好ましくは、あらかじめ調製しておいた酸性の溶液を所望の終濃度となるように添加することである。本発明に使用される酸としては、例えば、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、またはそれらの塩、更に、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ等の緩衝域がｐＨ６．５未満のグッドバッファーから選択される化合物が例示される。酸性の溶液としては、例えば、前記化合物を含有する溶液が使用される。酸性の溶液の調製に用いる溶媒には特に限定はなく、水、緩衝液、細胞培養用培地等、適宜選択可能である。特に好適には、クエン酸、及びそれらの塩を含有する水溶液が使用される。前記の酸または酸性の溶液は、所望の終濃度となるように前記試料に添加される。当該所望の終濃度は、前記試料のｐＨが酸性になるような濃度であればよく、特に限定されない。また、当該酸性にした後の最終ｐＨは、好ましくはｐＨ６．５未満であり、さらに好ましくはｐＨ４〜６の範囲である。また、個々の非エンベロープウイルスによって最適ｐＨが異なる場合は、適切なｐＨを決定するのは当然のことである。
【００３２】
本発明の方法で用いる非エンベロープウイルス粒子を含有する試料は、非エンベロープウイルス産生細胞由来の試料であってもよい。当該ウイルス産生細胞は特に限定はなく、環境中や、感染症の患者の臨床検体等から得られたウイルス産生細胞でもよく、人為的に作製したウイルス産生細胞でもよい。
【００３３】
前記非エンベロープウイルス産生細胞製造用の細胞としては、特に限定はなく、ヒト、サル、げっ歯類等の哺乳動物細胞、好適にはトランスフェクション効率が高い２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）や２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）、２９３Ｆ細胞、２９３ＦＴ細胞（いずれもライフテクノロジーズ社製）、Ｇ３Ｔ−ｈｉ細胞（国際公開第２００６／０３５８２９号パンフレット）、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７１１）、市販のウイルス産生用細胞株、ＡＡＶ２９３細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）が例示される。また、例えば、前記２９３細胞等はアデノウイルスＥ１タンパク質を恒常的に発現するが、このような、ｒＡＡＶ産生に必要なタンパク質の１つ、又はいくつかを一過的もしくは恒常的に発現するように改変した細胞であってもよい。これらの種々の細胞に対して、公知の方法や市販のキットを用いて非エンベロープウイルスベクターを導入し、非エンベロープウイルス産生細胞とすることができる。また、当該細胞の培養は、公知の培養条件で行うことができる。例えば温度３０〜３７℃、湿度９５％ＲＨ、ＣＯ２濃度５〜１０％（ｖ／ｖ）での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。所望の非エンベロープウイルス産生細胞の増殖や非エンベロープウイルスの産生が達成できるのであれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。また、培養期間は特に限定はなく、例えば１２〜１５０時間、好適には４８〜１２０時間である。
【００３４】
非エンベロープウイルス産生細胞として例えば、ｒＡＡＶ産生細胞を例に挙げて説明すると、ｒＡＡＶ粒子形成に必須な要素として、（Ａ）ＡＡＶ由来Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸及びＣａｐタンパク質をコードする核酸、（Ｂ）アデノウイルス由来要素、例えばＥ１ａタンパク質、Ｅ１ｂタンパク質、Ｅ２タンパク質、Ｅ４タンパク質及びＶＡＲＮＡを供給する核酸、並びに（Ｃ）ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸を任意の細胞に導入することにより、ｒＡＡＶ産生細胞を作製することができる。なお、前記の（Ｂ）に記載された核酸に換えてアデノウイルス等をヘルパーウイルスとして使用する方法も知られている。
【００３５】
前記のＡＡＶ由来Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸及びＣａｐタンパク質をコードする核酸、ならびに前記のアデノウイルス由来要素を供給する核酸の形態には限定はなく、それぞれの要素を供給可能な１又は複数の核酸構築物として、プラスミドやウイルスベクターに搭載して、細胞に導入することができる。これらの核酸の細胞への導入は、例えば、市販又は公知のプラスミド又はウイルスベクターを用いて公知の方法により行うことができる。
【００３６】
前記のｒＡＡＶ粒子に封入される核酸は、ＡＡＶ由来のＩＴＲ配列とｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸で構成される。ｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる核酸としては、任意の外来遺伝子、例えばポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ等を供給する核酸が例示される。加えて外来遺伝子の発現の制御のため、適当なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターやその他の転写調節要素が前記の核酸に挿入されていてもよい。例えば、ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸は、２つのＩＴＲ配列の間にｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる任意の外来遺伝子を含んでいてもよく、又は、２つのＩＴＲ配列の間に、ｒＡＡＶベクターに搭載することが望まれる任意の外来遺伝子及び該外来遺伝子の発現の制御のための１以上の要素を含んでいてもよい。ｒＡＡＶ粒子に封入される核酸は核酸構築物として、プラスミドの形態で細胞に導入することができる。前記のプラスミドは、例えば市販のｒＡＡＶベクタープラスミドであるｐＡＡＶ−ＣＭＶ  Ｖｅｃｔｏｒ等（タカラバイオ社製）を使用して構築することができる。
【００３７】
本発明の方法に使用される非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料は、例えば、上記のように培養された非エンベロープウイルス産生細胞を破砕もしくは溶解して調製することができる。非エンベロープウイルス産生細胞の培養中に培養液に非エンベロープウイルス粒子が漏出するような場合には、当該非エンベロープウイルス粒子を含有する培養液の上清を試料としてもよい。さらに、前記非エンベロープウイルス産生細胞の破砕または溶解は、超音波処理、凍結融解処理、酵素処理、浸透圧処理等の公知の方法で実施することができる。こうして得られた非エンベロープウイルス産生細胞の破砕物もしくは溶解物または非エンベロープウイルス粒子を含有する培養液上清のｐＨが中性又は塩基性であれば、前記非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料としてそのまま使用できるし、そうでない場合は、中和することによって、本発明の方法で用いる非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料とすることができる。なお、本明細書において中和とは、特に限定はされないが、酸性の溶液に塩基性の溶液やｐＨ緩衝液を加えることを意味し、中和後の溶液（中和物）は中性であってもよいし、塩基性であってもよい。塩基性の溶液としては、特に限定はされないが、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム溶液などが挙げられる。また、ｐＨ緩衝液としては、特に限定はされないが、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液などが挙げられる。
【００３８】
さらに、本発明の方法で用いる非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料は、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液で処理して得られる抽出物の中和物であってもよい。即ち、非エンベロープウイルス産生細胞を酸性の溶液と接触させることにより得られた試料を中和したものも好適に使用できる。この工程は、培養後に遠心分離やろ過によって培養液を除去して回収された非エンベロープウイルス産生細胞のペレットを酸性の溶液に懸濁する操作、もしくは非エンベロープウイルス産生細胞の培養液に培養液を酸性とし得る成分を添加する操作、により実施される。前記酸性の溶液としては、非エンベロープウイルス産生細胞の培養時のｐＨより低いｐＨを示し、かつウイルス産生が達成された非エンベロープウイルス産生細胞から非エンベロープウイルス粒子を含む抽出物を取得できる溶液であれば限定はない。例えば、本発明の方法の工程（ｂ）で用いられる酸性の溶液として例示されたのと同様の溶液が使用できる。前記培養液を酸性とし得る成分としては、非エンベロープウイルス産生細胞の培養液のｐＨを非エンベロープウイルス産生細胞の培養時のｐＨより低いｐＨにする成分であり、かつ、ウイルス産生が達成された非エンベロープウイルス産生細胞から非エンベロープウイルス粒子を含む抽出物を取得できる成分であれば限定はない。例えば、本発明の方法の工程（ｂ）で用いられる酸として例示されたのと同様の化合物が使用できる。前記酸性の溶液または酸性とし得る成分と接触している際の温度と時間は特に限定はなく、温度としては例えば０〜４０℃、好適には４〜３７℃、時間としては例えば１分〜４８時間、好適には５分〜２４時間が例示される。更に酸性の溶液または酸性とし得る成分と接触させた状態あるいは中和した後の状態で、−８０℃等の超低温フリーザーにおいて長期に保存することも可能である。この接触操作により非エンベロープウイルスはウイルス産生細胞外に放出される。
【００３９】
さらに本発明の方法で用いる非エンベロープウイルス粒子を含有する中性又は塩基性の試料は、あらかじめヌクレアーゼ処理を施された試料であってもよい。例えば、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質を添加する前にヌクレアーゼ処理を行ってもよい。当該工程で使うヌクレアーゼは、抽出物中のＤＮＡに作用するものが好ましく、例えばベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  登録商標  メルクミリポア社製）、Ｃｒｙｏｎａｓｅ  Ｃｏｌｄ-ａｃｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（タカラバイオ社製）等が例示される。該ヌクレアーゼ処理の温度及び時間、ヌクレアーゼの量等の条件は、使用する酵素の種類に応じて適宜決定すればよく、特に限定はされない。
【００４０】
本発明の方法において生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程とは、酸性にする工程で生じた沈殿物を除去し、非エンベロープウイルス粒子を含む画分を取得する工程を指す。沈殿の除去はろ過のような公知の固液分離方法で実施すればよい。好適には遠心分離により実施される。
【００４１】
上記の、沈殿物の除去の工程を経て得られた、非エンベロープウイルス粒子を含む画分は、さらに精製する工程に付してもよい。また、当該精製工程により、非エンベロープウイルス粒子が濃縮されてもよい。当該精製方法としては、超遠心、クロマトグラフィー、限外ろ過、その他公知の方法が例示される。
【００４２】
前記限外ろ過とは、限外ろ過膜を使用するろ過のことである。限外ろ過膜は、物理的に明瞭な多数の微細な孔を有する分離膜である。限外ろ過膜の分画分子量は、非エンベロープウイルス精製の点及び夾雑物除去の点から、５０〜３００ｋＤａであることが好ましく、７０〜１５０ｋＤａであることがより好ましく、１００ｋＤａであることがさらに好ましい。例えば、分画分子量が１００ｋＤａの限外ろ過膜Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ−１５（メルクミリポア社製、以下、１００ｋＤａの限外ろ過膜と記載する）によって実施することができる。このとき、非エンベロープウイルス粒子を含む画分にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することにより、非エンベロープウイルス粒子の回収率を改善することができる。添加するＰＥＧには特に限定はなく、種々の平均分子量のものを使用することができる。例えば平均分子量２００〜１０，０００のＰＥＧ、好ましくは平均分子量４，０００〜８，０００のＰＥＧが本発明では使用される。さらに好ましくは、平均分子量６，０００のＰＥＧが使用できる。
【００４３】
また、前記クロマトグラフィーによる非エンベロープウイルス粒子の精製は、イオン交換カラム（例えば、ムスタングＱ（ｐａｌｌ社製））やアフィニティカラム（例えば、ＡＶＢ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＧＥ社製）やヘパリンカラム等）、ハイドロキシルアパタイトカラム等によって実施することができる。
【００４４】
本発明の方法において、非エンベロープウイルス粒子は、好ましくはアデノ随伴ウイルス粒子である。
【００４５】
本発明の方法では非エンベロープウイルス粒子の取得の程度は、評価方法として非エンベロープウイルスの力価等を用いて示される。前記非エンベロープウイルスの力価は、特に限定はないが、一定量の試料中の（ａ）非エンベロープウイルスのゲノムの個数（ゲノム力価）、（ｂ）実験的に測定される非エンベロープウイルスの細胞への感染能力（感染力価）、又は（ｃ）非エンベロープウイルスを構成するタンパク質の純度を測定する方法が挙げられる。
【００４６】
上記（ａ）の方法としては、試料中のウイルスゲノムのコピー数をＰＣＲ法で測定する方法が例示される。特に限定はされないが、例えば、ゲノム力価測定には、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を使用し、取扱説明書に記載された方法でゲノム力価を算出することができる。
【００４７】
また、（ｂ）の方法としては、例えば試料の系列希釈液を適当な標的細胞に感染させ、細胞の形状変化（細胞変性）を検出する方法、導入遺伝子の発現を検出する方法、細胞に導入されたウイルスゲノムのコピー数を測定する方法等が例示される。
【００４８】
さらに（ｃ）の方法としては、例えば当該タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する方法あるいは免疫的手法で定量する方法等が例示される。
【００４９】
（２）本発明の製造方法のためのキット
本発明のキットは、上記（１）記載の非ウイルスエンベロープウイルス粒子を製造する方法を実施するためのキットであって、（１）酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質、及び（２）酸性の溶液、を含有することを特徴とする。当該酸性条件で沈殿する物質は、上記（１）本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法で説明した、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質が好適に使用できる。また、当該酸性の溶液は、上記（１）本発明の非エンベロープウイルス粒子の製造方法で説明した、酸性条件でのタンパク質の溶解度を低下させる物質及び／又は酸性条件で沈殿する物質が添加された試料のｐＨを酸性にする工程で使用できるものであれば特に限定はされない。本発明のキットについては、さらに中和液を含んでいてもよい。当該中和液は、好適には塩基性の溶液やｐＨ緩衝液である。塩基性の溶液としては、特に限定はされないが、例えば水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム溶液などが挙げられる。また、ｐＨ緩衝液としては、特に限定はされないが、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液などが挙げられる。さらに、非エンベロープウイルス産生細胞からの抽出物の調製に使用される試薬や、非エンベロープウイルス粒子の形成に必須な要素を供給する核酸を含むプラスミド、非エンベロープウイルス粒子に封入される核酸を含むプラスミド等を含むキットとしてもよい。
【００５０】
本発明により、非エンベロープウイルス粒子の製造方法の他、当該製造方法に使用されるキット、及び当該製造方法で製造した非エンベロープウイルス粒子も提供される。本発明の製造方法を用いて取得した非エンベロープウイルス粒子は、医薬組成物の有効成分として使用することができる。当該医薬組成物は、患者由来の細胞に体外で使用するか、もしくは患者へ直接投与することができる。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００５２】
実施例１  デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加によるｒＡＡＶ５の精製
（１）ｒＡＡＶ製造用細胞の播種
組織培養処理Ｔ２２５フラスコ（コーニング社製）に、１０％ＦＢＳ（ギブコ社製）を含むＤＭＥＭ（シグマ社製）に懸濁した２９３Ｔ／１７細胞を播種した。その後、３７℃、ＣＯ２濃度５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。【００５３】
（２）ｒＡＡＶ５製造用プラスミドのトランスフェクション
実施例１−（１）で得られた細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質及びＡＡＶ５のＣａｐタンパク質をコードする配列を含むｐＲＣ５  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、アデノウイルスのＥ２Ａ、ＶＡ、Ｖ４をコードする配列を含むｐＨｅｌｐｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、ＡＡＶ２ゲノムの２つのＩＴＲの間に蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１の発現カセットを含むｐＡＡＶ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）をそれぞれ２５μｇずつトランスフェクションした。トランスフェクション６時間後、培地を完全に除去し、２％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭをフラスコ１枚当たり４０ｍＬ添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。【００５４】
（３）クエン酸バッファー処理による抽出液の取得
実施例１−（２）で得られた各フラスコに、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（和光純薬社製）０．５ｍＬを添加し、室温で数分間静置することで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、１，７５０×ｇ、４℃、１０分間遠心後、上清を除去した。細胞ペレットを２ｍＬのクエン酸バッファー（３８．１ｍＭ  クエン酸、７４．８ｍＭ  クエン酸ナトリウム、７５ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  塩化マグネシウム、ｐＨ５）で再懸濁し、１５秒間ボルテックスミキサーで混和を行い、室温で５分間静置、再び１５秒間ボルテックスミキサーで混和を行った。その後、４，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心を行い、上清を回収した。得られた上清に１／１０量の２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を添加した溶液を抽出液とした。【００５５】
（４）デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加による沈殿物生成とその除去
実施例１−（３）で得られた抽出液に、１／１００量の２０Ｕ／μＬ  Ｃｒｙｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｃｏｌｄ−ａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（タカラバイオ社製）を添加後（終濃度０．２Ｕ／μＬ）、３７℃で１時間反応させた。サンプルを５等分し、サンプル１には１／１０量の１Ｍ  クエン酸のみを添加した。サンプル２には、１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムのみを添加した。サンプル３には１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間静置後、さらに１／４０量の１Ｍ  クエン酸を添加した。サンプル４には１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間静置後、さらに１／２０量の１Ｍ  クエン酸を添加した。サンプル５には１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間静置後、さらに１／１０量の１Ｍ  クエン酸を添加した。それぞれのサンプルについて、ｐＨを測定した結果を表１に示す。【００５６】
【表１】
0006616329.tif 000002
【００５７】
すべてのサンプルで沈殿物が生じたので、サンプルを５，０００×ｇ、４℃、５分間遠心を行い、上清を回収することにより、沈殿物を除去した。回収した上清を孔径０．４５μｍのＰＶＤＦ製の加圧式フィルターユニットＭｉｌｌｅｘ（登録商標）（メルクミリポア社製、以下、孔径０．４５μｍのフィルターと記載する）でろ過した溶液を濃縮前ｒＡＡＶ５（サンプル１〜５）とした。【００５８】
（５）濃縮前ｒＡＡＶ５の純度確認
実施例１−（３）で得られた抽出液及び実施例１−（４）で得られた５種の濃縮前ｒＡＡＶ５に、それぞれ等量の５×サンプルバッファー（タカラバイオ社製）を加えて混合し、９５℃、１０分間処理を行った。各処理液４μＬを４−１２％ポリアクリルアミドゲルにアプライし電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルを適当量のＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステイン溶液（バイオラッド社製）に浸し、遮光して９０分間振とうした。振とう後のゲルをＬｕｍｉｎｏｓｈｏｔ４００（タカラバイオ社製）にて撮影した。その結果を図１に示す。図１中、レーンＣは抽出液、レーン１〜５は濃縮前ｒＡＡＶ５（サンプル１〜５）である。【００５９】
図１中のバンドはすべて夾雑タンパク質のバンドである。濃縮前の段階ではｒＡＡＶ５の濃度が薄いため、ｒＡＡＶ５のバンドは確認できない。図１に示されるように、レーン１とレーン２はレーンＣに比べて夾雑タンパク質のバンドが少なかった。このことは、ｒＡＡＶ５と夾雑タンパク質の混合物にクエン酸を添加することやデオキシコール酸ナトリウムを添加することにより、夾雑タンパク質を沈殿させ、除去することができることを示す。また、図１に示されるように、レーン３〜５はレーン１やレーン２に比べて夾雑タンパク質のバンドがさらに少なかった。このことは、デオキシコール酸ナトリウム添加とクエン酸添加を組み合わせることにより、さらに効率的に、夾雑タンパク質を沈殿させ、除去することができることを示す。さらに、夾雑タンパク質の除去効率はデオキシコール酸ナトリウム及びクエン酸の添加量に依存して変化することが示された。すなわち、レーン４とレーン５の夾雑タンパク質のバンドが非常に少ないことより、デオキシコール酸ナトリウムの終濃度を０．５％（ｖ／ｖ）とし、ｐＨ４〜６となるようにクエン酸を添加すると、夾雑タンパク質が効率的に除去された。【００６０】
（６）濃縮前ｒＡＡＶ５の回収率測定
実施例１−（３）で得られた抽出液及び実施例１−（４）で得られた５種の濃縮前ｒＡＡＶ５のゲノム力価を測定した。ゲノム力価測定には、ＡＡＶｐｒｏ（登録商標）  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｆｏｒ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を使用し、反応液の調製等の操作はキット添付の説明書に従った。得られたゲノム力価のデータを用いて、下記式に従って総ゲノム力価を算出した。【００６１】
式：  総ゲノム力価（ＶＧ）＝ゲノム力価（ＶＧ／ｍＬ）×総液量（ｍＬ）【００６２】
抽出液の総ゲノム力価を１００とした時の相対値（回収率）を図２に示す。図２中、縦軸は回収率（％）、横軸のレーンＣは抽出液、レーン１〜５は濃縮前ｒＡＡＶ５（サンプル１〜５）である。【００６３】
図２に示されるように、サンプル１〜５の回収率は９９％〜１１３％であり、１００％に近かった。このことは、デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加によるｒＡＡＶ５の精製において、ｒＡＡＶ５の回収率が非常に高いことを示す。【００６４】
図１と図２の結果により、デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加によるｒＡＡＶ５の精製は非常に効率の良い精製方法であることが明らかになった。すなわち、デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加により、夾雑タンパク質を沈殿させ、除去することができる。特に、デオキシコール酸ナトリウムの終濃度を０．５％（ｖ／ｖ）とし、ｐＨ４〜６となるようにクエン酸を添加することにより、ｒＡＡＶ５を高い回収率で精製できることが明らかになった。【００６５】
実施例２  ｒＡＡＶ５の精製と濃縮
（１）デオキシコール酸ナトリウム及びクエン酸の添加量の検討
実施例１−（１）〜（３）と同様の方法で抽出液を取得した。得られた抽出液に、１／１００量の２０Ｕ／μＬ  Ｃｒｙｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｃｏｌｄ−ａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを添加後（終濃度０．２Ｕ／μＬ）、３７℃で１時間反応させた。サンプルを４等分し、１／１０量又は１／２０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間静置後、さらに１／２０量又は１／３０量の１Ｍ  クエン酸を添加した。それぞれのサンプルについて、ｐＨを測定した結果を表２に示す。【００６６】
【表２】
0006616329.tif 000003
【００６７】
すべてのサンプルで沈殿物が生じたので、サンプルを５，０００×ｇ、４℃、５分間遠心を行い、上清を回収することにより、沈殿物を除去した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過したものを濃縮前ｒＡＡＶ５とした。【００６８】
（２）限外ろ過膜によるｒＡＡＶ５の精製と濃縮
実施例２−（２）で得られた濃縮前ｒＡＡＶ５を１００ｋＤａＫの限外ろ過膜（メルクミリポア社製）に入れ、２，０００×ｇ、４℃、１０分間遠心し、そのろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜に１０ｍＬのＤ−ＰＢＳを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作（洗浄操作）」を５回繰り返し、最終濃縮液を精製ｒＡＡＶ５（サンプルａ〜ｄ）とした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにｒＡＡＶ５を１０倍に濃縮した。【００６９】
（３）ｒＡＡＶ５の純度確認
実施例１−（５）と同様の方法で実施例２−（２）で得られた精製ｒＡＡＶ５の純度を確認した。その結果を図３に示す。図３中、レーンＭはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｒｋｅｒ  （Ｂｒｏａｄ）（タカラバイオ社製、上から２００、１１６、９７、６６、４４、２９、２０ｋＤａ）、レーンａ〜ｄは精製ｒＡＡＶ５（サンプルａ〜ｄ）である。【００７０】
図３中、３本の太いバンドはｒＡＡＶ５の構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２，ＶＰ３）のバンド、その他のバンドは夾雑タンパク質のバンドである。図３に示されるように、レーンａは夾雑タンパク質のバンドが少なかった。このことは、デオキシコール酸ナトリウム添加（終濃度０．５％（ｖ／ｖ））とクエン酸添加（ｐＨ５）によって生じた沈殿物を除去後、さらに１００ｋＤａＫの限外ろ過膜処理することによりｒＡＡＶ５を精製及び濃縮することができることを示す。【００７１】
実施例３  様々なセロタイプのｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ６）の精製
（１）ｒＡＡＶ製造用細胞の播種
実施例１−（１）と同様の方法でｒＡＡＶ製造用細胞を播種した。【００７２】
（２）ｒＡＡＶ製造用プラスミドのトランスフェクション
実施例１−（２）と同様の方法でｒＡＡＶ製造用プラスミドを実施例３−（１）で得られた細胞にトランスフェクションした。ただし、調製するｒＡＡＶのセロタイプに合わせて、ｐＲＣ５  Ｖｅｃｔｏｒの代わりに、ｐＲｅｐ−Ｃａｐ１  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ社製）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）、ｐＲｅｐ−Ｃａｐ３  ＡＡＶ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ社製）、ｐＲＣ６  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）を使用した。【００７３】
（３）クエン酸バッファー処理による抽出液の取得
実施例１−（３）と同様の方法で各セロタイプのｒＡＡＶの抽出液を取得した。【００７４】
（４）デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加による沈殿物の生成とその除去
実施例３−（３）で得られた各抽出液に、１／１００量の２０Ｕ／μＬ  Ｃｒｙｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｃｏｌｄ−ａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを添加後（終濃度０．２Ｕ／μＬ）、３７℃で１時間反応させた。その後、各サンプルに１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間以上静置後、さらに１／２０量の１Ｍ  クエン酸を各サンプルに添加した。それぞれのサンプルについて、ｐＨを測定したところ、ｐＨ４〜６であった。【００７５】
すべてのサンプルで沈殿物が生じたので、サンプルを５，０００×ｇ、４℃、５分間遠心を行い、上清を回収することにより、沈殿物を除去した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過したものを、濃縮前ｒＡＡＶとした。【００７６】
（５）限外ろ過膜によるｒＡＡＶの精製と濃縮
実施例３−（４）で得られた濃縮前ｒＡＡＶを１００ｋＤａＫの限外ろ過膜に入れ、２，０００×ｇ、４℃、５分間以上遠心し、そのろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜に１４ｍＬのＤ−ＰＢＳを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作（洗浄操作）」を５回繰り返し、最終濃縮液を精製ｒＡＡＶとした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにｒＡＡＶを３〜５倍に濃縮した。【００７７】
（６）ｒＡＡＶの純度確認
実施例１−（５）と同様の方法で各セロタイプのｒＡＡＶの抽出液（レーンＣ）、濃縮前ｒＡＡＶ（レーンＰｒｅ）及び精製ｒＡＡＶ（レーンＦ）の純度を確認した。その結果を図４に示す。【００７８】
図４中、レーンＣとレーンＰｒｅのバンドはすべて夾雑タンパク質のバンドである。ｒＡＡＶはこの段階では濃度が薄いため、ｒＡＡＶのバンドは確認できない。一方、レーンＦの３本の太いバンドはｒＡＡＶの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２，ＶＰ３）のバンドである。図４に示されるように、各セロタイプのｒＡＡＶにおいて、レーンＰｒｅはレーンＣに比べて夾雑タンパク質のバンドが少なかった。このことは、ｒＡＡＶのセロタイプに関係なく、デオキシコール酸ナトリウム添加とクエン酸添加により、夾雑物タンパク質を沈殿させ、除去することができることを示す。また、各セロタイプのｒＡＡＶにおいて、レーンＦはｒＡＡＶの構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のバンド以外に、夾雑タンパク質のバンドは殆どなかった。このことは、ｒＡＡＶのセロタイプに関係なく、１００ｋＤａＫの限外ろ過膜処理により、ｒＡＡＶを濃縮するとともに低分子量の夾雑タンパク質を除去することができることを示す。【００７９】
（７）ｒＡＡＶの回収率測定
実施例１−（６）と同様の方法で各セロタイプのｒＡＡＶのゲノム力価を測定し、各工程のｒＡＡＶの総ゲノム力価を算出した。抽出液の総ゲノム力価を１００とした時の相対値（回収率）を表３に示す。【００８０】
【表３】
0006616329.tif 000004
【００８１】
表３に示されるように、濃縮前ｒＡＡＶ（Ｐｒｅ）の回収率は８９％〜１２０％であり、１００％に近かった。このことは、デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加によるｒＡＡＶの精製において、ｒＡＡＶのセロタイプに関係なく、ｒＡＡＶの回収率が非常に高いことを示す。【００８２】
図４と表３の結果により、ｒＡＡＶのセロタイプに関係なく、デオキシコール酸ナトリウム添加及びクエン酸添加によるｒＡＡＶの精製は非常に効率の良い精製方法であることが明らかになった。すなわち、デオキシコール酸ナトリウムの終濃度を０．５％（ｖ／ｖ）とし、ｐＨ４〜６となるようにクエン酸を添加することにより、夾雑タンパク質を沈殿させ、除去することができる。また、１００ｋＤａＫの限外ろ過膜処理を追加することにより、さらに高純度のｒＡＡＶを得られることが明らかとなった。【００８３】
実施例４  ポリエチレングリコール添加によるｒＡＡＶ６の回収率の改善
（１）濃縮前ｒＡＡＶ６の取得
実施例３−（１）〜（４）と同様の方法で濃縮前ｒＡＡＶ６を取得した。【００８４】
（２）限外ろ過膜によるｒＡＡＶ６の精製と濃縮（ポリエチレングリコール添加）
濃縮前ｒＡＡＶ６を３等分し、サンプル１はポリエチレングリコール添加無しサンプルとした。サンプル２には終濃度０．４％（ｗ／ｖ）になるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−６０００（ＳＩＧＭＡ社製）溶液を添加した。サンプル３に終濃度０．８％（ｗ／ｖ）になるように、ＰＥＧ−６０００溶液を添加した。それぞれのサンプルを１００ｋＤａＫの限外ろ過膜に入れ、２，３８０×ｇ、室温、１０分間以上遠心し、ろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜にそれぞれの終濃度のポリエチレングリコールを含有した１０〜１４ｍＬのＰＢＳを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作（洗浄操作）」を３回繰り返した。サンプル２とサンプル３だけＰＢＳによる洗浄操作を追加で行い、最終濃縮液を精製ｒＡＡＶ６とした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにｒＡＡＶ６を６〜１２倍に濃縮した。【００８５】
（３）ｒＡＡＶ６の回収率測定
実施例１−（６）と同様の方法で各ｒＡＡＶ６のゲノム力価を測定し、各工程のｒＡＡＶ６の総ゲノム力価を算出した。抽出液の総ゲノム力価を１００とした時の相対値（回収率）を表４に示す。【００８６】
【表４】
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【００８７】
表４に示されるように、限外ろ過膜を用いてｒＡＡＶ６を精製及び濃縮する際に、ポリエチレングリコールを添加することによりｒＡＡＶ６の回収率を向上させることができた。その他のセロタイプのｒＡＡＶにおいても、限外ろ過をする際にポリエチレングリコールを添加すると、ｒＡＡＶの回収率を向上させることができると考えられる。【００８８】
実施例５  様々な種類の酸性の溶液の検討
（１）ｒＡＡＶ６抽出液の取得
実施例３−（１）〜（３）と同様の方法でｒＡＡＶ６抽出液を取得した。【００８９】
（２）デオキシコール酸ナトリウム添加及び様々な種類の酸性の溶液添加による沈殿物の生成とその除去
実施例５−（１）で得られたｒＡＡＶ６抽出液に、１／１００量の２０Ｕ／μＬ  Ｃｒｙｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｃｏｌｄ−ａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを添加後（終濃度０．２Ｕ／μＬ）、３７℃で１時間反応させた。サンプルの一部を３等分した後、各サンプルに１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間以上静置後、さらに１／２０量の１Ｍ  クエン酸、１／２０量の１Ｍ  塩酸、又は１／２０量の１Ｍ  酢酸をそれぞれ添加した。それぞれのサンプルのｐＨを測定し、酸性であることを確認した。それぞれのサンプルの条件を表５に示す。【００９０】
【表５】
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【００９１】
すべてのサンプルで沈殿物が生じたので、サンプルを５，０００×ｇ、４℃、５分間遠心を行い、上清を回収することにより、沈殿物を除去した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過したものを、濃縮前ｒＡＡＶ６とした。【００９２】
（３）濃縮前ｒＡＡＶ６の純度確認、及び回収率測定
実施例１−（５）と同様の方法で、濃縮前ｒＡＡＶ６の純度を確認したところ、酸性の溶液の種類に関わらず同等の純度を示した。また、実施例１−（６）と同様の方法で濃縮前ｒＡＡＶ６のゲノム力価を測定し、回収率を算出したところ、酸性の溶液の種類に関わらず同等の回収率を示した。これらのことは、ｒＡＡＶと夾雑タンパク質の混合物にデオキシコール酸ナトリウム及び酸性の溶液を添加する際に、どのような種類の酸性の溶液を使用しても、夾雑タンパク質を沈殿させ、除去できることを示す。【００９３】
実施例６  様々な種類の界面活性剤の検討
（１）ｒＡＡＶ２抽出液の取得
実施例３−（１）〜（３）と同様の方法でｒＡＡＶ２抽出液を取得した。【００９４】
（２）様々な界面活性剤添加及びクエン酸添加による沈殿物の生成とその除去
実施例６−（１）で得られたｒＡＡＶ２抽出液に、１／１００量の２０Ｕ／μＬ  Ｃｒｙｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｃｏｌｄ−ａｃｔｉｖｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを添加後（終濃度０．２Ｕ／μＬ）、３７℃で１時間反応させた。サンプルの一部を３等分した後、各サンプルに１／１０量の５％（ｖ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウム、５％  （ｖ／ｖ）ケノデオキシコール酸ナトリウム、又は５％（ｖ／ｖ）  コール酸ナトリウムを添加し、３７℃で３０分間以上静置後、さらに１／２０量の１Ｍ  クエン酸をそれぞれ添加した。それぞれのサンプルのｐＨを測定し、酸性であることを確認した。それぞれのサンプルの条件を表６に示す。【００９５】
【表６】
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【００９６】
すべてのサンプルで沈殿物が生じたので、サンプルを５，０００×ｇ、４℃、５分間遠心を行い、上清を回収することにより、沈殿物を除去した。回収した上清を孔径０．４５μｍのフィルターでろ過したものを、濃縮前ｒＡＡＶ２とした。【００９７】
（３）限外ろ過膜によるｒＡＡＶ２の精製と濃縮
実施例６−（２）で得られた濃縮前ｒＡＡＶ２を１００ｋＤａの限外ろ過膜に入れ、２，０００×ｇ、４℃、５分間以上遠心し、そのろ過液を廃棄した。さらに「限外ろ過膜に１４ｍＬのＤ−ＰＢＳを添加後、懸濁し、上記の条件で遠心し、そのろ過液を廃棄する操作（洗浄操作）」を５回繰り返し、最終濃縮液を精製ｒＡＡＶ２とした。これら一連の操作により、低分子量の夾雑物を除去するとともにｒＡＡＶ２を濃縮した。【００９８】
（４）ｒＡＡＶ２の純度確認
実施例１−（５）と同様の方法でｒＡＡＶ２抽出液（レーンＣ）、濃縮前ｒＡＡＶ２（レーンＰｒｅ）及び精製ｒＡＡＶ２（レーンＦ）の純度を確認した。その結果を図５に示す。【００９９】
図５中、レーンＣとレーンＰｒｅのバンドはすべて夾雑タンパク質のバンドである。ｒＡＡＶ２はこの段階では濃度が薄いため、ｒＡＡＶ２のバンドは確認できない。一方、レーンＦの３本の太いバンドはｒＡＡＶ２の構造タンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）のバンドである。図５に示されるように、すべての界面活性剤において、レーンＰｒｅはレーンＣに比べて夾雑タンパク質のバンドが少なかった。このことは、界面活性剤の種類に関係なく、界面活性剤添加とクエン酸添加により、夾雑物タンパク質を沈殿させ、除去することができることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明の非エンベロープウイルスの製造方法により、煩雑な操作なく高純度の非エンベロープウイルス粒子を得ることができる。本発明の製造方法で調製された非エンベロープウイルス粒子や当該粒子を有効成分とする組成物は、遺伝子治療の基礎研究、又は臨床応用の分野における遺伝子導入方法として非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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