(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザイールエボラウイルスのギニア１４株を検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
それにより増幅されるべき鋳型配列は、３’側から５’側に向けてＦ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ３配列をこの順番で含み、
当該プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを含み、ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とをこの順番で含み、Ｆ３プライマーはＦ３配列を含み、ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とをこの順番で含み、Ｂ３プライマーはＢ３配列を含み、
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ３プライマー、前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマーおよび前記Ｂ３プライマーのためのそれぞれの当該認識配列の組み合わせは、
（１）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（２）配列番号２２、配列番号２１、配列番号１５および配列番号１０の組み合わせ；
（３）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；
（４）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；
（５）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；
（６）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；
（７）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２７おおび配列番号１０の組み合わせ；
（８）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；
（９）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；
（１０）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；
（１１）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；
（１２）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２７および配列番号９の組み合わせ；
（１３）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号９の組み合わせ；
（１４）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（１５）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１６）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；並びに
（１７）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ
からなる群より選択される
ことを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
前記組み合わせが（１）又は（１７）であり、ザイールエボラウイルスのザイール７６株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記組み合わせが（１）、（１０）〜（１６）の何れか１つであり、ザイールエボラウイルスのザイール９５株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
前記ＦＩＰプライマーが、更に前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ２配列との間にリンカーを含み、および／または前記ＢＩＰプライマーが、更に前記Ｂ１配列と前記Ｂ２ｃ配列との間にリンカーを含むことを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のプライマーセット。
【請求項５】
前記リンカーが、１〜５０塩基長を有する任意の塩基配列からなることを特徴とする請求項４に記載のプライマーセット。
【請求項６】
前記組み合わせが（１７）であり、更に、配列番号１１またはその相補配列を含むＬＦｃプライマー及び／又は配列番号２８またはその相補配列を含むＬＢｃプライマーを含むことを特徴とする請求項１、２、４又は６に記載のプライマーセット。
【請求項７】
ザイールエボラウイルスのギニア１４株を検出するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
当該プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＦｃプライマーを含み、
前記Ｆ３プライマー、前記ＦＩＰプライマー、前記ＢＩＰプライマー、前記Ｂ３プライマーおよび前記ＬＦｃプライマーのそれぞれの配列の組み合わせは、
（１８）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１０及び配列番号１１の組み合わせ
であることを特徴とするプライマーセット。
【請求項８】
請求項１又は７に記載の何れかのプライマーセットと、前記プライマーセットを収容する容器とを含むザイールエボラウイルスのギニア１４株を検出するためのアッセイキット。
【請求項９】
前記組み合わせが（１）又は（１７）であり、ザイールエボラウイルスのザイール７６株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項８に記載のアッセイキット。
【請求項１０】
前記組み合わせが（１）、（１０）〜（１６）の何れか１つであり、ザイールエボラウイルスのザイール９５株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項８に記載のアッセイキット。
【請求項１１】
３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含み、前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第３のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第４のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のダンベル構造体、および／または
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のダンベル構造体
を含む核酸構造体であって、
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
Ｆ３配列、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２配列及びＢ３配列のそれぞれの組み合わせは、
（１）配列番号１７、配列番号８５、配列番号４３、配列番号６、配列番号８及び配列番号１９の組み合わせ；
（２）配列番号２２、配列番号８４、配列番号４２、配列番号４９、配列番号９０及び配列番号１０の組み合わせ；
（３）配列番号２０、配列番号８４、配列番号４２、配列番号４８、配列番号８９及び配列番号１０の組み合わせ；
（４）配列番号２２、配列番号８４、配列番号４２、配列番号４８、配列番号８６及び配列番号１０の組み合わせ；
（５）配列番号２２、配列番号８４、配列番号４２、配列番号４７、配列番号８８及び配列番号１０の組み合わせ；
（６）配列番号２２、配列番号８４、配列番号４２、配列番号４６、配列番号８７及び配列番号１０の組み合わせ；
（７）配列番号２２、配列番号８４、配列番号４２、配列番号４６、配列番号８６及び配列番号１０の組み合わせ；
（８）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号４８、配列番号８９及び配列番号１０の組み合わせ；
（９）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号４８、配列番号８６及び配列番号１０の組み合わせ；
（１０）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号４７、配列番号８８及び配列番号１０の組み合わせ；
（１１）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号４６、配列番号８７及び配列番号１０の組み合わせ；
（１２）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号４６、配列番号８６及び配列番号１０の組み合わせ；
（１３）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０の組み合わせ；
（１４）配列番号２０、配列番号５、配列番号３、配列番号６、配列番号８及び配列番号１９の組み合わせ；
（１５）配列番号２２、配列番号５、配列番号３、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０の組み合わせ；
（１６）配列番号２２、配列番号５、配列番号３、配列番号６、配列番号８及び配列番号１９の組み合わせ；並びに
（１７）配列番号３９、配列番号５、配列番号３、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０の組み合わせ
からなる群から選択される
ことを特徴とする、ザイールエボラウイルスのギニア１４株を検出するための核酸構造体。
【請求項１２】
前記組み合わせが（１）又は（１７）であり、ザイールエボラウイルスのザイール７６株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項１１に記載の核酸構造体。
【請求項１３】
前記組み合わせが（１）、（１０）〜（１６）の何れか１つであり、ザイールエボラウイルスのザイール９５株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項１１に記載の核酸構造体。
【請求項１４】
ザイールエボラウイルスのギニア１４株を検出するための方法であって、請求項１又は７に記載の何れかのプライマーセットを用いて検体に含まれる核酸を増幅し、濁度または蛍光を指標に前記検体にザイールエボラウイルスのギニア１４株が含まれているか否かを判定する方法。
【請求項１５】
前記組み合わせが（１）又は（１７）であり、ザイールエボラウイルスのザイール７６株を更に検出することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組み合わせが（１）、（１０）〜（１６）の何れか１つであり、ザイールエボラウイルスのザイール９５株を更に検出するためのものであることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ザイールエボラウイルス検出用プライマーセット、アッセイキットおよび増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）は、ヒトまたはヒト以外の霊長動物に感染し、高い確率でそれらに死を齎すウイルスである。
【０００３】
ＥＢＯＶには、ザイールエボラウイルス（ＺＥＢＯＶ）、スーダンエボラウイルス（ＳＥＢＯＶ）、タイフォレストエボラウイルス(旧アイボリーコーストエボラウイルス)（ＩＣＥＢＯＶ）、ブンディブギョエボラウイルス（ＢＥＢＯＶ）およびレストンエボラウイルス（ＲＥＢＯＶ）の５つの種が存在する。これらのうちのＺＥＢＯＶ、ＳＥＢＯＶ、ＩＣＥＢＯＶおよびＢＥＢＯＶがヒトに対して病原性を示すことが知られている。
【０００４】
上記の種の中でも、ＺＥＢＯＶの致死率は９０％にもなり、最も病原性が高いウイルスとして知られている。
【０００５】
ＺＥＢＯＶの検出は、病理学的方法、モノクローナル抗体を使用する抗原抗体反応による方法、特異的なプライマーセットを利用するＰＣＲ法などにより行われている。
【０００６】
２０１４年現在、エボラウイルスの流行が拡大する中、ＺＥＢＯＶを精度よく検出できる手段の開発が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
実施形態は、精度よくＺＥＢＯＶを増幅または検出できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態によれば、ＺＥＢＯＶ遺伝子を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。Ｆ１配列は、配列番号３１または６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、配列番号６２または６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ３配列は、配列番号２９、３６、３８、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５または６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、６７、８２または８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】鋳型核酸とプライマーとの対応を示す模式図である。
【図１Ｂ】鋳型核酸とプライマーとの対応を示す模式図である。
【図２−１】ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。
【図２−２】ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。
【図２−３】ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。
【図３−１】ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。
【図３−２】ザイールエボラウイルスゲノムのｃＤＮＡの１例と対応するプライマー認識領域の例とを示す図である。
【図４】核酸構造物を示す模式図である。
【図５−１】実験結果を示すグラフである。
【図５−２】実験結果を示すグラフである。
【図５−３】実験結果を示すグラフである。
【図６】実験結果を示すグラフである。
【図７】実験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＺＥＢＯＶは、非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、その長さは約１９ｋｂである。その遺伝子の３’端および５’端には、それぞれ非コード配列であるリーダー領域とトレーラー領域が存在している。
【００１１】
実施形態は、トレーラー領域の特定の配列を利用してプライマー領域を設計することによって、これまで検出することができなかったＺＥＢＯＶ株を検出できることを発見したことに基づく。
【００１２】
実施形態のプライマーセットは、２０１４年型のギニア株（ギニア１４株）を検出することが可能である。２０１４年のＺＥＢＯＶの流行拡大を鎮静化するためには、ＺＥＢＯＶを精度よく、迅速に検出することが必須であるが、そのためには、このギニア１４株の検出が必須である。従来のプライマーセットでは、ギニア１４株を検出できないが、実施形態のプライマーセットによれば、過去に流行した１９７６年型のザイール株（ザイール７６株）および１９９５年型のザイール株（ザイール９５株）だけではなく、ギニア１４株についてもより検出することが可能となる。それにより、ＺＥＢＯＶを精度よく検出することが可能となる。
【００１３】
実施形態に従うプライマー領域について、図１を用いて説明する。
【００１４】
図１Ａには、鋳型としてのＺＥＢＯＶのＲＮＡ（図中、「ｖＲＮＡ」と記す）、そのｃＤＮＡ、および各プライマーを互いに対応づけて示した図である。検出されるべきＺＥＢＯＶのＲＮＡは、各プライマーが結合すべき領域（即ち、認識領域）としてＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域を含む。これらの領域は、３’側から５’側に向けて、この順番でＺＥＢＯＶのＲＮＡに含まれる。これらの領域は、それぞれＦ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ３配列を含む。このようなＺＥＢＯＶのＲＮＡが、第１の鋳型配列として使用される。
【００１５】
ｃＤＮＡは、ＺＥＢＯＶのＲＮＡの相補鎖であり、５’側から３’側に向けて、Ｆ３配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ３ｃ配列を含む。検査に供される試料中に含まれるＺＥＢＯＶのＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡが作られ、ＺＥＢＯＶのＲＮＡとｃＤＮＡとを鋳型核酸として実施形態のプライマーセットによって増幅反応が行われる。
【００１６】
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は、互いに相補配列である。
【００１７】
このような鋳型配列について、上記の６つの認識部位に対応する内部プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰプライマー）と２つの外部プライマー（Ｆ３およびＢ３プライマー）とを含むプライマーセットを１つセットとして設計した。
【００１８】
実施形態に従うプライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを含む。ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とを含む。Ｆ３プライマーは、Ｆ３配列を含む。ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とを含む。Ｂ３プライマーは、Ｂ３配列を含む。これらのプライマーのそれぞれの配列に該当する領域を図１Ａ中に矢印で示した。矢印の向きは、各領域に該当するプライマー配列の方向性を示しており、矢印の始点が５’端、矢印の終点が３’端を表す。
【００１９】
更に実施形態に従うプライマーセットは、ＬＦプライマーおよび／またはＬＢプライマーをループプライマーとして含み得る。図１Ｂは、図１Ａのプライマー設計配列に加えて、更に、ＬＦプライマーおよびＬＢプライマーの設計配列の１例を示した図である。
【００２０】
ＺＥＢＯＶのＲＮＡは、プライマー認識領域としてＦ３ｃ領域、Ｆ２ｃ領域、ＬＦｃ領域、Ｆ１ｃ領域、Ｂ１領域、ＬＢ領域、Ｂ２領域、Ｂ３領域を含む。これらの領域は、３’側から５’側に向けて、この順番でＺＥＢＯＶのＲＮＡに含まれる。ＬＦｃ領域およびＬＢ領域は、それぞれＬＦｃ配列およびＬＢ配列を含む。このようなＺＥＢＯＶのＲＮＡが、鋳型配列として使用される。
【００２１】
或いは、ループプライマーは、例えば、増幅産物のループ部分に結合するように設計されてもよい。ループ部分は、図１Ｂ中に一本鎖部分と示した領域であり得る。即ち、ループ領域は、例えば、ｖＲＮＡのＦ２ｃ領域の５’端からＦ１ｃ領域の３’端よりも３’側の塩基までの範囲、またはｖＲＮＡのＢ２領域の３’端からＢ１領域の５’端よりも５’側の塩基までの範囲であり得る。
【００２２】
各プライマーの配列は、表１に示すアクセッション番号の１３０株について配列を比較することにより決定した。
【表１】
0006605238.tif 000002
【００２３】
これらの株名を表２に示す。ここで、表および図の番号に枝番号がある場合に枝番号を省略したときには、全ての枝番号の表または図を総称する。例えば、表２−１、表２−２、表２−３、表２−４および表２−５を総称して表２と記す。
【表２−１】
0006605238.tif 000003
【００２４】
【表２−２】
0006605238.tif 000004
【００２５】
【表２−３】
0006605238.tif 000005
【００２６】
【表２−４】
0006605238.tif 000006
【００２７】
【表２−５】
0006605238.tif 000007
【００２８】
上記１３０株の比較は、アライメントを作成して行った。使用した領域は、各株のトレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８２９９番目から１８６５８番目までである。
【００２９】
プライマー認識領域の設計は、まず、ＬＡＭＰプライマー設計支援ソフトウェアプログラム(PrimerExplorer ver.3; ネット研究所、東京(日本); http://primerexplorer.jp/e/)を用いて基礎となる領域を設計し、その後、アライメントからの情報や実験結果などを考慮しながら、手動および目視などによってｃＤＮＡ上での位置や塩基の種類について改変および調整を行った。
【００３０】
設計された基礎となる領域は、Ｔｒ２系である。Ｔｒ２系のＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、それぞれ１８３３９〜１８３５８位、１８３６８〜１８３８８位、１８４０８〜１８４２７位、１８４４９〜１８４７１位、１８５０１〜１８５２２位および１８５４３〜１８５６２位の領域である。
【００３１】
更にＴｒ２系について改変および調整を行って、Ｔ２７３系および５’ＵＴＲ系を設計した。
【００３２】
Ｔ２３７系のＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、１８３３８〜１８３５７位、１８３６７〜１８３８７位、１８４０７〜１８４２６位、１８４３５〜１８４５５位、１８４９６〜１８５１３位および１８５３０〜１８５５１位の領域である。
【００３３】
５’ＵＴＲ系のＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域は、１８３２１〜１８３４３位、１８３６７〜１８３８７位、１８４０７〜１８４２６位、１８４４９〜１８４７１位、１８５０１〜１８５２２位および１８５３０〜１８５５１位であり、更に、１８３８８〜１８４０６位がＬＦ領域である。
【００３４】
図２には、５’から３’の方向で、コンセンサス配列としてのザイール７６株（H.sapiens-tc/COD/1976/Yambuku-Mayinga）のｃＤＮＡと、ギニア１４株（H.sapiens-wt/GIN/2014/Gueckedou-C05）、ザイール９５株（EBOV/H.sapiens-tc/COD/1995/13625 Kikwit）、２種類のガボン９６株（EBOV/H.sapiens-tc/GAB/1996/1Eko、EBOV/H.sapiens-tc/GAB/1996/Ilembe）およびザイール０７株（EBOV/H.sapiens-tc/COD/2007/4 Luebo）のｃＤＮＡとのアライメントとプライマー認識配列の設計例を示した。またそこに示された配列は、ザイールエボラウイルスのトレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８２９９番目から１８６５８番目までの３６０個の塩基を５’から３’の方向で示している。
【００３５】
また、図２には、ｃＤＮＡのプライマー認識領域に対応付けて、Ｔｒ２系、Ｔｒ２７３系、並びに５’ＵＴＲ系、即ち、Ｔｒ２７３ｗａ系、Ｔｒ２７３ｗａ２系、Ｔｒ２７３ｗａ３系、Ｔｒ２７３ｗａ４系およびＴｒ２７３ｗａ５系のプライマー認識配列の例を示した。
【００３６】
また、これらの系統でそれぞれ設計されるプライマーを表３に示す。この表には、それぞれのプライマー配列と、対応する配列番号、更に、図２に示されている配列との対応を示す。
【表３−１】
0006605238.tif 000008
【００３７】
【表３−２】
0006605238.tif 000009
【００３８】
図中の矢印は、プライマーとして使用される際の配列の向きを示す。下線を付した塩基は、ギニア１４株の変異に合わせた改変部位である。
【００３９】
更に、具体的な認識配列の例を図２と同様に図３に示す。括弧内に配列番号を示す。配列番号に「ｃ」の符号が付されているものは、それが配列番号で示される配列の相補配列であることを示す。図３では、図２のコンセンサス配列と同じ配列（即ち、ｃＤＮＡの領域の１８２９９番目から１８６５８番目までの配列）を１〜３６０位として示している。
【００４０】
実施形態のプライマーセットに含まれる配列は、例えば、次の通りであり得る。Ｆ３配列は、配列番号２９、３６、３８、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ２配列は、配列番号６２または６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｆ１配列は、配列番号３１または６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５または６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、６７、８２または８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む。或いは、これらの認識配列は何れも、上記配列番号に含まれる連続する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基であってもよく、例えば、１５塩基〜３０塩基であってもよい。或いはこれらの相補配列であってもよい。
【００４１】
ギニア株１４を増幅するためには、ＢＩＰプライマーの設計と、それに組み合わせるＦ３プライマーおよびＢ３プライマーの選択が重要である。このようなギニア株１４を増幅するためにＢ１ｃ領域およびＢ２ｃ領域の設計とＦ３プライマーおよびＢ３プライマーの選択が重要であるということは、本発明者によって初めて見出された知見である。
【００４２】
例えば、ギニア株１４を増幅するための好ましいＢ１ｃ領域は、トレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８４３５位〜１８４７１位である。
【００４３】
Ｂ１ｃ配列は、例えば、配列番号６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４および７５によりそれぞれ示される配列に基づいて設計されてよく、より好ましくは配列番号７５に基づいて設計される。好ましいＢ１ｃ配列は、例えば、配列番号７５に含まれる５’端から第１位〜第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基、または３’端から第１位〜第６位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基であってもよい。好ましいＢ１ｃ配列の例は、配列番号６、３２、４６、４７および４８であり、より好ましくは配列番号４６、４７および４８である。
【００４４】
例えば、ギニア株１４を増幅するための好ましいＢ２領域は、トレーラー配列に対応するｃＤＮＡの領域の１８４９３位〜１８５２２位である。
【００４５】
Ｂ２ｃ配列の例は、例えば、配列番号６５および６６によりそれぞれ示される配列に基づいて設計されてよい。好ましいＢ２ｃ配列は、例えば、配列番号６５および６６に含まれる５’端から第１位〜第７位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基である。好ましいＢ２ｃ配列の例は、配列番号３３、５０、５１、５２、５３および７８であり、より好ましくは配列番号５０、５１、５２および５３である。或いはこれらの相補配列である。
【００４６】
好ましいＦ３配列の例は、配列番号２９、５５、６０または６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基であり、より好ましくは配列番号２９、５５、６０または６１に含まれる５’端から第１位〜第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基であり、例えば、配列番号２、３９および４０、より好ましくは配列番号２または３９である。或いはこれらの相補配列である。
【００４７】
好ましいＦ２配列の例は、配列番号３、４２、４３、６２および６３であり、より好ましくは配列番号３および４２である。或いはこれらの相補配列である。
【００４８】
好ましいＦ１配列の例は、配列番号４、４４、４５および７９であり、より好ましくは配列番号４、４４および４５である。或いはこれらの相補配列である。
【００４９】
好ましいＢ３ｃ配列の例は、配列番号８２に含まれる５’端から第１位〜第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基、または配列番号３４に含まれる３’端から第１位〜第７位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基であってよい。好ましいＢ３ｃ配列は、例えば、配列番号９および１９である。或いはこれらの相補配列である。
【００５０】
ループプライマーを使用することによって増幅効率を増大することが可能である。好ましいループプライマーのための配列の例は、配列番号１１、２８および７６によりそれぞれ示される配列をそれぞれ含む配列、またはこれらの配列の連続する少なくとも１３塩基を含む配列である。配列番号１１および７６は、ＬＦｃプライマーとして好ましく使用され得る。配列番号２８および７７は、ＬＢｃプライマーとして好ましく使用され得る。また、ループプライマーのための配列は、上記配列番号に含まれる連続する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基であってもよく、例えば、１５塩基〜３０塩基であってもよい。或いはこれらの相補配列であってもよい。
【００５１】
好ましいループプライマーにおいて、例えば、ＬＦｃ配列は配列番号７６からなり、ＬＢｃ配列は配列番号７７からなる。或いはこれらのループプライマーは、これらの相補配列からなる。
【００５２】
プライマーの長さは、１３〜４０塩基、例えば、１５〜３０塩基であってもよい。認識配列に加えて鋳型へのアニーリングを阻害せず、且つプライマーの伸長を妨げない限り、何れのプライマーにおいても、認識配列に加えて更なる配列または成分を含んでもよい。
【００５３】
例えば、ＦＩＰプライマーは、Ｆ１ｃ配列とＦ２配列の間にリンカーを含む得る。また、ＢＩＰプライマーは、Ｂ１配列とＢ２ｃ配列の間にリンカーを含み得る。リンカー配列は、任意の塩基配列であればよく、好ましくは鋳型配列に特異的に結合しない配列であり得る。リンカー配列の長さは、例えば、１〜６塩基であればよい。好ましいリンカー配列の例は、ＴＴＴＴである。
【００５４】
例えば、好ましいプライマーセットの各プライマーは次の通りであり得る。Ｆ３プライマーは、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。ＦＩＰプライマーは、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。ＢＩＰプライマーは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列を含み得る。
【００５５】
或いは好ましいプライマーセットの各プライマーは例えば次の通りであり得る。Ｆ３プライマーは、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。ＦＩＰプライマーは、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。ＢＩＰプライマーは、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み得る。
【００５６】
プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーのための配列の組み合わせは、以下からなる群より選択されてもよい：
（１）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（２）配列番号２２、配列番号２１、配列番号１５および配列番号１０の組み合わせ；
（３）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；
（４）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；
（５）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；
（６）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；
（７）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２７おおび配列番号１０の組み合わせ；
（８）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；
（９）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；
（１０）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；
（１１）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；
（１２）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２７および配列番号１０の組み合わせ；
（１３）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１４）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（１５）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１６）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（１７）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１８）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１９）前記（１）〜（１８）の何れかの組み合わせに含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。
【００５７】
より好ましいプライマーセットは、上記（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）、（１７）および（１８）に示す組み合わせでプライマーを含むプライマーセットであり得る。
【００５８】
また、上記のプライマーセットに更にループプライマーを含むプライマーセットも好ましい。そのようなプライマーセットは、プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＦｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２０）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、またはプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２１）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、或いは、プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２２）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１および配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる６つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ
であってもよく、
（２３）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、またはプライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２４）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる５つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ；
であってもよく、或いは、プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマー、ＬＦｃループプライマーおよびＬＢｃループプライマーのための配列の組み合わせが、
（２５）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０、並びに配列番号１１および配列番号２８の組み合わせ、またはこのプライマーセットに含まれる６つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ
であってもよい。
【００５９】
更に、上述のプライマーセットが、配列番号７６で示されるＬＦｃプライマーを含むことは好ましい。
【００６０】
このような方法によれば、これまで増幅することができなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株の遺伝子を増幅することが可能となる。従来のプライマーセットには、ギニア１４株の遺伝子を増幅できるものはない。従って、例えば、ギニア１４株などに感染している場合には、そのような従来のプライマーセットでは得られる結果は偽陰性となってしまう。実施形態のプライマーセットによれば、ギニア１４株を増幅することができるので、増幅産物を検出することによってＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出することが可能となる。また、上述のプライマーセットによれば、ギニア１４株の遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。即ち、例えば、１０４コピーのＲＮＡが存在する場合には、２０分程度でその増幅産物を検出できるまでに増幅することが可能である。それによりＺＥＢＯＶの検出を迅速に行うことが可能である。
【００６１】
また、例えば、上述のプライマーセット（１７）、（１８）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、（２４）、（２５）、は、ギニア１４株の遺伝子を短時間で増幅できるのみならず、ザイール７６株およびザイール９５株についても短い時間で増幅することが可能となる。従って、これらのプライマーセットは、最も好ましいプライマーセットの１つである。これらによって、ＺＥＢＯＶをより精度よく、且つ迅速に検出することが可能となる。
【００６２】
更なる実施形態によれば、ＺＥＢＯＶのギニア株を検出する方法が提供される。ＺＥＢＯＶのギニア株を検出する方法は、上述の何れかのプライマーセットを用いて試料に含まれる核酸を増幅し、増幅産物を検出することにより前記試料にＺＥＢＯＶのギニア株が含まれているか否かを判定すればよい。
【００６３】
核酸の増幅は、ＬＡＭＰ法またはＬＡＭＰ法と同様の原理により核酸を増幅するそれ自身公知の何れの方法であればよい。また当該方法においては、核酸の増幅に先駆けて逆転写反応を行ってもよく、或いは逆転写反応と増幅反応とを１つの反応において行うＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いてもよい。当該方法におけるより好ましい増幅方法は、ＲＴ−ＬＡＭＰ法である。
【００６４】
また増幅産物の検出は、例えば、濁度または蛍光を指標に行い得る。濁度を指標にする増幅産物の検出は、例えば、濁度計、吸光度計、および目視などで行えばよい。蛍光を指標にする増幅産物の検出は、例えば、カルセインを含む蛍光試薬やインタカレータなど、増幅産物または増幅反応の存在に応じて蛍光を生ずる試薬を用い、生じた蛍光を検出することにより行われればよい。
【００６５】
増幅産物の検出は、例えば、増幅反応を開始した後の特定の時点で行い得る。試料に、ＺＥＢＯＶのギニア株が含まれているか否かの判定は、例えば、特定の時点で増幅産物が予め定められた閾値以上であるか否かで行われてもよい。
【００６６】
例えば、濁度を指標にする場合では、予め定めた値以上の濁度が測定されたときに、試料中にＺＥＢＯＶのギニア株が含まれていると判定すればよい。例えば、６０分間の間に０．１以上の濁度が測定されたときに検体にＺＥＢＯＶのギニア株が含まれていると判定してもよい。例えば、蛍光を指標にする場合では、
ＺＥＢＯＶのギニア株を検出する方法に供される試料は、核酸を含む、または核酸を含む可能性のある試料であればよい。試料は、生体または生体外の何れかの環境などから得られたものであってもよい。それらは、増幅反応を妨害しない状態であることが好ましく、採取された後にそれ自身公知の何れかの手段により前処理が行われてもよい。試料は、例えば、血液、血漿、血清、尿、便、精液、唾液、口腔内粘膜、それ以外の体腔粘膜、咽頭拭い液および喀痰などであり得る。
【００６７】
このような方法によれば、これまで検出することができなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能となる。即ち、当該方法により得られる増幅産物を検出することによってＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出ことが可能となる。また、上述のプライマーセットによれば、ギニア１４株の遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。それによりＺＥＢＯＶの検出を迅速に行うことが可能である。
【００６８】
当該方法では、増幅産物またはその一部分として図４に示す核酸構造体が得られる。これらの核酸構造体の存在を検出することにより、ＺＥＢＯＶのギニア１４株、所望に応じて、ザイール７６株およびザイール９５株が検出できる。このような核酸構造体も実施形態として提供される。
【００６９】
核酸構造体について、図４を参照しながら説明する。図４（ａ）、図４（ｂ）、図４（ｃ）および図４（ｄ）は、互いに相補的な配列からなる二本鎖領域であるステム部分と、この二本鎖領域により形成された一本鎖領域であるループ部分とを含むステム・ループ構造体を示す。
【００７０】
図４（ａ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含む。Ｆ１配列およびＦ１ｃ配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００７１】
図４（ｂ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含む。Ｂ１配列および前記Ｂ１ｃ配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００７２】
図４（ｃ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含む。Ｆ１ｃ配列および前記Ｆ１配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００７３】
図４（ｄ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｂ１ｃ配列および前記Ｂ１配列は、互いに結合し二本鎖を形成している。
【００７４】
図４（ｅ）および（ｆ）は、３’側と５’側にそれぞれステム・ループ構造を有するダンベル構造体を示す。
【００７５】
図４（ｅ）の核酸構造体は、３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｆ１配列とＦ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している。
【００７６】
図４（ｆ）の核酸構造体は、５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含む。Ｆ１ｃ配列とＦ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、Ｂ１ｃ配列とＢ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している。
【００７７】
これらの核酸構造体に含まれる配列は、増幅反応に使用されるプライマーセットの配列により決定される。即ち、当該核酸構造体は、上述したプライマーセットが提供されることにより初めて得られるものである。そして、このような核酸構造体を検出すれば、従来では検出できなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能となる。これにより、ＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出ことが可能となる。また、このような核酸構造体は、上述のプライマーセットを用いることによって迅速に形成できる。従って、当該核酸構造体は、ＺＥＢＯＶを迅速に検出するために使用できる。
【００７８】
また実施形態によれば、上述したＺＥＢＯＶを検出する方法において使用するためのアッセイキットが提供される。そのようなアッセイキットは、上述した何れかのプライマーセットを含めばよい。更に、当該アッセイキットは、プライマーセットを収容する容器、増幅反応を行うための酵素、基質、洗浄液、緩衝液および／または緩衝液を調製するための塩類などを含んでもよい。
【００７９】
このようなアッセイキットによれば、これまで検出することができなかったＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能となる。それによってＺＥＢＯＶを従来に比べて精度よく検出ことが可能となる。また、このようなアッセイキットによって、ギニア１４株の遺伝子を短い時間で増幅することが可能である。そのため、ＺＥＢＯＶの検出を迅速に行うことが可能である。
【００８０】
［例］
実施形態のプライマーセットを用いて、ＺＥＢＯＶを検出する試験を行った。
【００８１】
（１）ウイルスＲＮＡ合成
実験には、ザイール７６株およびザイール９５株のＺＥＢＯＶを使用した。ザイール７６株、ザイール９５株のウイルスＲＮＡは、カナダ公衆衛生局国立微生物研究所（National Microbiological Laboratory, Public Health Agency of Canada）から譲り受けた。ＲＴ−ＰＣＲにてプライマー設計領域を含むウイルスｃＤＮＡの一部を増幅し、精製した。ギニア１４株は、プライマー設計領域を含むウイルスｃＤＮＡの一部（３００塩基）を合成した（北海道システムサイエンス、日本、札幌）。ｃＤＮＡはｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ）にてクローニングし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてプライマー設計領域を含む部分的ウイルスＲＮＡを合成し、精製した。ウイルスＲＮＡは分光光度法にて定量した。
【００８２】
ザイールエボラウイルスの検出を行うために表４に示すプライマーセットを準備した。表中、「セットＩＤ」の欄にはプライマーセット番号を示した。
【表４−１】
0006605238.tif 000010
【００８３】
【表４−２】
0006605238.tif 000011
【００８４】
【表４−３】
0006605238.tif 000012
【００８５】
【表４−４】
0006605238.tif 000013
【００８６】
【表４−５】
0006605238.tif 000014
【００８７】
【表４−６】
0006605238.tif 000015
【００８８】
【表４−７】
0006605238.tif 000016
【００８９】
（２）プライマーセットの反応性の確認
上記（１）に示したそれぞれのプライマーセットを用いてＬＡＭＰ増幅を以下の方法で行った。ＬＡＭＰ法による核酸の増幅を行うためのＬＡＭＰ反応液の組成は以下の通りである。
【００９０】
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応はＬｏｏｐａｍｐＲＮＡ増幅キット（栄研化学株式会社、日本、東京）の製造者のプロトコルに従って実施した。
【００９１】
ＬＡＭＰ反応液組成（２５μＬ）
ＦＩＰ                    ４０ｐｍｏｌ
ＢＩＰ                    ４０ｐｍｏｌ
Ｆ３                      ５ｐｍｏｌ
Ｂ３                      ５ｐｍｏｌ
ＬＦ                      ２０ｐｍｏｌ
ＬＢ                      ２０ｐｍｏｌ
２×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ    １２．５μＬ
Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Bst DNA polymerase、avian myeloblastosis virus逆転写酵素）  １．０μＬ
ＲＮＡサンプル            ２．０μＬ。
【００９２】
反応に持ち込んだ合成ＲＮＡの量は、ザイール７６株が６．４ｘ１０４、ザイール９５株が３．９ｘ１０４、ギニア１４株が６．１ｘ１０４コピーであった。
【００９３】
ＲＴ−ＬＡＭＰアッセイによる増幅をリアルタイムモニタリングするために、前記ＬＡＭＰ反応液を６３℃でインキュベートし、リアルタイム濁度計（ＬＡ−２００；テラメックス、京都、日本）を用いて吸光光度分析によって観察した。
【００９４】
また、各プライマーセットを用いた増幅および濁度の測定に並行して、ＲＮＡサンプルの代わりに水を加えたこと以外は同様なプロトコルで試験を行い、その結果をネガティブコントロールとした。
【００９５】
その結果を表５に示す。
【表５】
0006605238.tif 000017
【００９６】
表５は、表４に示した各プライマーセットを使用してザイール７６株、ザイール９５株またはギニア１４株のそれぞれについて、ＲＴ−ＬＡＭＰ法で増幅し、濁度を指標にして生じた増幅産物を検出した結果を示している。結果は、濁度が０．１以上となるまでに必要とされた時間を分単位で示した。この濁度０．１以上という閾値は、複数のネガティブコントロールから得られた濁度に基づいて設定した。即ち、複数のネガティブコントロールについて得られた濁度の平均値を２倍した値である。表中の「セットＩＤ」の欄にはプライマーセット番号を示した。
【００９７】
結果は次の通りである。プライマーセット番号１、３、１０および２４では、閾値である０．１以上の濁度は観察されなかった。
【００９８】
プライマーセット番号５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１および２３では、４０分以内に０．１以上の濁度が観察された。また、プライマーセット番号５、６、７、８、９、１１、１２、２１および２３は、約２５分で０．１以上の濁度が観察された。
【００９９】
また、プライマーセット番号２０では、３５分で０．１以上の濁度が観察されたが、このプライマーセットに配列番号１１で示されるＬＦｃループプライマーとして、Ｔｒ２７３ｗａ＿ＬＦを追加した。その結果、プライマーセット番号２１では増幅効率が増大し、約２５分で０．１以上の濁度が観察された。また、プライマーセット番号２０に配列番号２８で示されるＬＢｃループプライマーと配列番号１１で示されるＬＦｃループプライマーとを追加したプライマーセット２３の場合では、増幅効率が増大し、２６．２分で０．１以上の濁度が観察された。それに対して、プライマーセット番号２０に配列番号２８で示されるＬＢｃループプライマー、即ち、Ｔｒ２＿ＬＢを追加したプライマーセット２２の場合では、増幅効率に影響はなかった。
【０１００】
これらの結果から、プライマーセット番号５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１および２３では、４０分以内に０．１以上の濁度が観察されたことから、これらは好ましいプライマーセットの例である。
【０１０１】
（３）プライマーの組み合わせによるギニア株１４の増幅への影響
上記（１）に示したプライマーセットのうち、プライマーセット番号１、２、５、２０および２２と、配列番号１１または２８の何れかのループプライマーを用いて上記（２）に記載のプロトコルと同様に試験を行った。
【０１０２】
その結果を図５に示す。図５には、各プライマーセットを用いたときの反応性を濁度を指標として経時的に測定した結果を示す。各グラフにおいて、横軸には時間を分単位で示し、縦軸には濁度を示した。グラフ中のデータは、実線がザイール７６株、破線がギニア１４株を増幅した結果を示す。また、全てのデータにおいて、各プライマーセットによる増幅に加えて、上述した通りのネガティブコントロールについても濁度を測定した。
【０１０３】
図５−１の（Ａ）は、プライマーセット番号１、（Ｂ）はプライマーセット番号１にＬＦｃプライマーを加えたプライマーセット番号１’、（Ｃ）はプライマーセット番号２、（Ｄ）はプライマーセット番号２にＬＢｃプライマーを加えたプライマーセット番号２’、図５−２の（Ｅ）はプライマーセット番号５、（Ｆ）はプライマーセット番号５にＬＦｃプライマーを加えたプライマーセット番号５’、（Ｇ）はプライマーセット番号２０、（Ｈ）はプライマーセット番号２１、（Ｉ）はプライマーセット番号２２、（Ｊ）はプライマーセット番号２３、（Ｋ）はプライマーセット番号２４、（Ｌ）はプライマーセット番号２５をそれぞれ用いて行った結果である。
【０１０４】
全てのプライマーセットの試験のために、ＲＮＡサンプルの代わりに水を添加したネガティブコントロールについて濁度を測定したが、何れのプライマーセットの場合でも測定時間０分〜６０分までの何れの時点においても濁度は大凡０であった。
【０１０５】
図５−１の（Ａ）に示す通り、プライマーセット番号１では、ザイール７６株の増幅は約３０分で立ち上がったがギニア株の増幅は観察されなかった。このプライマーセットに対してＬＦｃプライマーを追加したときの結果を図５−１の（Ｂ）に示す。ＬＦｃプライマーの追加は、ザイール７６株の増幅を早めたが、ギニア株の増幅は見られなかった。
【０１０６】
プライマーセット番号２では、約２５分でザイール７６株の増幅が観察されたが、ギニア株では約５０分近くになり漸く増幅が観察された（図５−１の（Ｃ））。このプライマーセット番号２にＬＢｃプライマーを追加した場合では、ザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間は殆ど変らなかったが、ギニア株では約５分早く増幅の立ち上がりが観察された（図５−１の（Ｄ））。
【０１０７】
プライマーセット番号５では、約２８分でギニア株の増幅が観察された（図５−１の（Ｅ））。このプライマーセット番号５にＬＦｃプライマーを追加した場合では、ギニアの増幅は約８分早い立ち上がりが観察された（図５−１の（Ｆ））。ザイール７６株についてはＬＦｃプライマーの有無には関係なく増幅の立ち上がりは観察されなかった。
【０１０８】
プライマーセット番号２０では、約３３分でギニア株の増幅が観察され、ザイール７６株の増幅は約３５分で観察された（図５−１の（Ｇ））。このプライマーセット番号２０にＬＦｃプライマーを追加したプライマーセット番号２１では、約２３分でギニア株の増幅が観察され、ザイール７６株の増幅は約２６分で観察された（図５−１の（Ｈ））。
【０１０９】
プライマーセット番号２０にＬＢｃプライマーを追加したプライマーセット番号２２では、ギニア株およびザイール７６株ともに、プライマーセット番号２０に比較して増幅効率の若干の低下が観察された（図５−１の（Ｉ））。
【０１１０】
プライマーセット番号２０にＬＦｃプライマーおよびＬＢｃプライマーを追加したプライマーセット番号２３では、約２４分でギニア株の増幅が観察され、ザイール７６株の増幅は約２６分で観察された（図５−１の（Ｊ））。
【０１１１】
プライマーセット番号２４では、ザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間は約３０分であったが、ギニア株では増幅は観察されなかった（図５−１の（Ｋ））。プライマーセット番号２５では、ザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間は約２３分であり、ギニア株での増幅の立ち上がりの時間は約３５分であった（図５−１の（Ｌ））。
【０１１２】
これらの結果から、上記のプライアーセットにおいては、ＬＢｃプライマーは増幅効率を向上せず、それを含んでいてもよいがＬＦｃプライマーの使用がより好ましいことが示唆された。
【０１１３】
また、プライマーセット番号２０では約３５分でギニア株１４の増幅の立ち上がりが観察されたのに対して、プライマーセット番号２４では、６０分以内ではギニア株の増幅の立ち上がりは観察されなかった。プライマーセット番号２０とプライマーセット番号２４とでは、これらのＦＩＰおよびＢＩＰプライマーは互いに等しく、これらのＦ３プライマーはＺＥＢＯＶのトレーラー配列上で６塩基を互いに共有し、互いに近い位置にある配列である。また、これらのＢ３プライマーについては、２つの塩基の種類が互いに異なることのみを除き、構造を共有する配列である。
【０１１４】
一方、プライマーセット番号６および８では、これらのＦ３、ＦＩＰおよびＢ３プライマーは互いに等しく、ＢＩＰプライマーのみが互いに異なる。これらのＢＩＰプライマーに含まれる変異部位のために選択された塩基の種類が互いに異なる。それにも拘わらず、プライマーセット番号６および８の場合では同様に約２０分でＺＥＢＯＶのギニア１４株の増幅が立ち上がった。
【０１１５】
また、プライマーセット番号１０とプライマーセット番号１３〜１６とを比較すると、これらはＦ３、ＦＩＰプライマーおよびＢ３プライマーが互いに等しく、ＢＩＰプライマーのみが互いに異なる。プライマーセット番号１０のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４９、Ｂ２配列として配列番号９０（配列番号５４の相補配列）を含む。他方、プライマーセット番号１３のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４７、Ｂ２配列として配列番号８８（配列番号５２の相補配列）を含む。プライマーセット番号１４のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４６、Ｂ２配列として配列番号８７（配列番号５１の相補配列）を含む。プライマーセット番号１５のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号４６、Ｂ２配列として配列番号８６（配列番号５０の相補配列）を含む。プライマーセット番号１６のＢＩＰプライマーは、Ｂ１ｃ配列として配列番号６、Ｂ２配列として配列番号８（配列番号７の相補配列）を含む。特に、プライマーセット番号１０および１６のＦ３、ＦＩＰプライマーおよびＢ３プライマーは、何れもギニア１４株の変異部位に対応するように設計されているが、共に使用されるＢＩＰプライマーに依存して迅速なギニア１４株の増幅が可能になる場合と（プライマーセット番号１３〜１６）、ギニア１４株の増幅が観察できない場合とがあった（プライマーセット番号１０）。
【０１１６】
これらの結果から、ギニア１４株を増幅するためには、ＢＩＰプライマーの設計が重要であることが明らかとなった。この結果は、単に保存された領域を選択し、増幅されるべき新株、即ち、ギニア１４株遺伝子の変異部位の塩基にプライマー配列を対応させるだけではギニア１４株の遺伝子を増幅できないことを示唆している。
【０１１７】
更に、プライマーセット番号２０および２１と、プライマーセット番号２４と２５とを比較すると、これらの４つのプライマーセットのＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーは共通している。またＦ３プライマーとＢ３プライマーは、プライマーセット番号２０と２１とで等しく、プライマーセット番号２４と２５とで等しい。更にプライマーセット番号２１と２５は、同じＬＦプライマーを含む。プライマーセット番号２０、２１、２４および２５の実験結果は、それぞれ図５−２（Ｇ）、（Ｈ）、図５−３（Ｋ）および（Ｌ）に示されている。図５−２（Ｇ）と図５−３（Ｋ）とを比べると、実線で示されているようにザイール７６株の増幅の立ち上がりの時間はそれぞれ約３４分と約３１分であり、これらに同じＬＦプライマーを追加すると、両者ともに増幅の立ち上がりは１０分弱早くなった。これに対して図中破線で示されるギニア１４株についてプライマーセット番号２０（図５−２（Ｇ））と２５（図５−３（Ｋ））と比較すると、前者ではザイール７６株よりも早く約３２分で増幅の立ち上がりが観察できたのに対して、後者では６０分以内にギニア１４株の増幅の立ち上がりは観察されなかった。これらのプライマーセットにＬＦプライマーを追加すると、プライマーセット番号２１ではギニア１４株の増幅の立ち上がりが１０分程度早くなり、ザイール７６株では８分程度早くなった。他方、プライマーセット番号２５においては、ザイール７６株では７分程度立ち上がりが早くなった。またプライマーセット番号２５においては、ＬＦプライマーを含まないセットでは６０分以内に観察されなかったギニア１４株の増幅立ち上がりが、ＬＦプライマーの使用によって３３分頃に観察することができた。これらの結果から、ＬＦプライマーがギニア１４株の増幅においては好ましいプライマーの１例であることが示される一方で、この好ましいプライマーの使用の有無に拘わらずギニア１４株を効率よく増幅でき、且つギニア１４株と同様にザイール７６株についても効率よく増幅することができたプライマーセット番号２０は、ＺＥＢＯＶの増幅およびその検出のために好ましいプライマーセットであると考えられる。また、プライマーセット番号２４とプライマーセット番号２１との違いは、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーであるが、上述した他の結果を考え合わせると、ＺＥＢＯＶの増幅、特に、ギニア１４株の増幅には、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーの設計および選択も重要であることが示唆された。
【０１１８】
（４）ループプライマーの反応性に対する影響
ＬＡＭＰ反応に持ち込んだ合成ＲＮＡの量がザイール７６株６．４ｘ１０５であることを除いて上記（２）と同様にＲＴ−ＬＡＭＰ反応を行った。プライマーセットは上述のプライマーセット番号２０〜２３を使用した。結果を図６に示す。
【０１１９】
プライマーセット番号２０では、約２５分でザイール７６株の増幅が立ち上がり、これは、ＬＦｃプライマーの追加により約５分以上短縮された（プライマーセット番号２１）。また、プライマーセット番号２０にＬＢｃプライマーを追加した場合には、増幅立ち上がりまでの時間に殆ど変化は見られなかった（プライマーセット番号２２）。プライマーセット番号２０にＬＦｃプライマーとＬＢｃプライマーとを追加した結果は、ＬＦｃプライマーのみを追加した結果と殆ど変らなかった。この結果から、ＬＢｃプライマーはギニア１４株の増幅効率に影響を与えないことが示唆された。
【０１２０】
実施形態のプライマーセットにより、ＺＥＢＯＶのギニア１４株が増幅された。ＺＥＢＯＶのギニア１４株の増幅を可能としたことにより、ＺＥＢＯＶをより精度よく検出することが可能となった。
【０１２１】
例えば、プライマーセット番号２０〜２３などは、ＺＥＢＯＶのギニア１４株の他に、ザイール７６株についても迅速に増幅することが可能であった。また、データに示さないが、プライマーセット番号２０〜２３などは、ザイール９５株についても迅速に増幅することが可能である。
【０１２２】
（５）ＺＥＢＯＶのギニア１４株の検出
ＬＡＭＰ反応に持ち込んだ合成ＲＮＡがギニア１４株６．１ｘ１０５コピーから６．１ｘ１０１コピーであることを除いて上記（２）と同様にＲＴ−ＬＡＭＰ反応を行った。使用したプライマーセットは、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６であり、これらのプライマーセットは、Ｆ３プライマーのみが互いに異なるプライマーセットである。具体的には、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６のＦ３プライマーはそれぞれ、配列番号３９および配列番号２でそれぞれ示されるヌクレオチド配列からなり、それ以外のプライマーについては互いに同じ配列からなるプライマーを用いた。使用されたこれらのプライマーセットの具体的な構成は、表４−６および表６に示す通りである。
【０１２３】
サンプル中のＺＥＢＯＶのギニア１４株の濃度は、原液を予め１０倍系列希釈することによって、１０−５倍(３．０５ｘ１０５コピー/μＬ)から１０−９倍(３．０５ｘ１０１コピー/μＬ)に調製した。
【０１２４】
試験の方法は、上記「（２）プライマーセットの反応性の確認」の項における記載と同じ方法により行った。
【表６】
0006605238.tif 000018
【０１２５】
その結果を図７に示す。図７は、２種類のＬＡＰＭプライマーによってウイルス遺伝子を増幅したときの結果を示すグラフである。縦軸に濁度を示し、横軸に分単位で時間を示した。セットＩＤ２１とセットＩＤ２６とにそれぞれ含まれるＦ３プライマーの違いは、５’端から第８位の塩基の種類のみである。即ち、５’端から第８位の塩基は、セットＩＤ２１ではチミン（ｔまたはＴ）であり、セットＩＤ２６ではシトシン（ｃまたはＣ）である。
【０１２６】
全ての合成ＲＮＡ濃度に亘り、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６共に良好にＺＥＢＯＶのギニア１４株由来の核酸を増幅することが可能であった。また、ウイルスの濃度が比較的低い場合、例えば、１０−７倍希釈（６．１ｘ１０３コピー）および１０−８倍希釈（６．１ｘ１０２コピー）の場合、セットＩＤ２６のプライマーセットの方が増幅効率が高い傾向が観察された。
【０１２７】
以上の結果から、セットＩＤ２１およびセットＩＤ２６は、ほぼ同等に良好に特異的にＺＥＢＯＶのギニア１４株由来の核酸を増幅することが可能であることが明らかになった。これにより、実施形態に従うプライマーセットにより、迅速且つ正確な検出が可能であることが示唆された。
【０１２８】
（６）臨床的なＺＥＢＯＶのギニア１４株の検出
更に、同様にギニアにおいて採取されたサンプル中のＺＥＢＯＶのギニア１４株の検出能について、実施形態に従うプライマーセットを用いたＲＴ−ＬＡＭＰ法と、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）とを比較するための試験を行った。
【０１２９】
（ａ）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、等温核酸増幅およびリアルタイム蛍光検出装置、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）III（Optigene、ウェスト・サセックス、U.K.）を用いて行った。ＤＥＰＣ処理水と、ザイール７６株の合成ＲＮＡとをそれぞれネガティブコントロールとポジティブコントロールとして使用した。
【０１３０】
ＬＡＭＰ増幅のリアルタイム蛍光検出は、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＧｅｎｉｅＩＩＩ（Optigene）の製造者のプロトコルに従って実施した。
【０１３１】
ＬＡＭＰ反応液組成（２５μＬ）
ＦＩＰ                    ２０ｐｍｏｌ
ＢＩＰ                    ２０ｐｍｏｌ
Ｆ３                      ５ｐｍｏｌ
Ｂ３                      ５ｐｍｏｌ
ＬＦ                      １０ｐｍｏｌ
Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ    １５．０μＬ
ＡＭＶ逆転写酵素（０．１５Ｕ）  １．０μＬ
ＲＮＡサンプル            ５．０μＬ。
【０１３２】
ＬＡＭＰ増幅および蛍光検出は、Ｇｅｎｉｅ（登録商標）IIIにおいて６３℃、３０分間に亘って増幅を行い、続いて９５℃〜８０℃で解離分析を行った。非特異的な増幅は、ポジティブコントロール反応の融解温度と比較することにより除外した。
【０１３３】
（ｂ）ＲＴ−ＰＣＲ法
ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔＲＴ−ＰＣＲキット（キアゲン）とＺａｉｒｅＥＢＯＶ２０１４プライマーおよびプローブキット（TIM MOLBIOL、ハンブルク、ドイツ）を用いて比較試験を行った。ＴＩＢキットは、米国食品医薬品局からＥＢＯＶ診断のための緊急使用権限（EUS）を受けたものである。
【０１３４】
５μＬのＲＮＡサンプルを２５μＬの反応混合物に添加した。各反応は、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒIIシステム（セフィード、U.S.A）において行った。
【０１３５】
上述したＲＴ−ＬＡＭＰ法およびｑＲＴ−ＰＣＲ法の試験条件を表７に示す。
【表７】
0006605238.tif 000019
【０１３６】
ＲＴ−ＬＡＭＰ試験は、ＲＴ−ＰＣＲ法による診断結果を伏せたブラインド試験により行い、試験終了後に、両試験結果を比較した。
【０１３７】
（ｃ）結果
上記試験において使用されたサンプルは、ＺＥＢＯＶのギニア１４株への感染の疑いのある対象から採取されたサンプルである。
【０１３８】
表８に示すように、ＲＴ−ＬＡＭＰ法とｑＲＴ−ＰＣＲ法とによりそれぞれ得られた結果は、全てのサンプルにおいて診断結果が一致した。即ち、ＲＴ−ＬＡＭＰ法を用いた場合であっても、ｑＲＴ−ＰＣＲ法と同様の精度でサンプル中のＺＥＢＯＶのギニア１４株を検出することが可能であった。
【表８】
0006605238.tif 000020
【０１３９】
ウイルス力価の異なる代表的な４つのサンプル（臨床検体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）について、ＲＴ−ＬＡＭＰ法およびｑＲＴ−ＰＣＲ法のそれぞれによる検出試験でウイルスＲＮＡの検出に要した時間を表９に示す。
【表９】
0006605238.tif 000021
【０１４０】
表９に示す結果から明らかであるように、臨床検体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの何れのサンプルの場合においても、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出時間の方が、ｑＲＴ−ＰＣＲ法による検出時間よりも顕著に短かった。例えば、ＲＴ−ＬＡＭＰ法による検出時間は、最短で１０．２分であり、最長でも１３．３分であった。それに比べてｑＲＴ−ＰＣＲ法による検出時間は、最短でも４０．３分であり、最長で５４．０分であった。
【０１４１】
以上のように、実施形態のプライマーセットにより、ギニア１４株を含めたＺＥＢＯＶ株を従来のＥＢＯＶ診断法として用いられるｑＲＴ−ＰＣＲ法と同様の高い精度で、より迅速に検出することが可能であることが証明された。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
ザイールエボラウイルスを特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、
それにより増幅されるべき鋳型配列は、３’側から５’側に向けてＦ３ｃ配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ３配列をこの順番で含み、
当該プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーを含み、ＦＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＦ１ｃ配列とＦ２配列とをこの順番で含み、Ｆ３プライマーはＦ３配列を含み、ＢＩＰプライマーは、５’側から３’側に向けてＢ１ｃ配列とＢ２配列とをこの順番で含み、Ｂ３プライマーはＢ３配列を含み、
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ１配列は、配列番号３１若しくは配列番号６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ２配列は、配列番号６２若しくは配列番号６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ３配列は、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０若しくは配列番号６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４若しくは配列番号７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５若しくは配列番号６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
前記Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、配列番号６７、配列番号８２若しくは配列番号８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
ことを特徴とするプライマーセット。
［２］
前記Ｆ３プライマーが配列番号２９、５５、６０若しくは６１に含まれる５’端から第１位〜第５位の何れかの塩基から続く塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列であり、
前記ＦＩＰプライマーが配列番号４、４４若しくは４５の何れかで示される配列またはその相補配列と、配列番号３若しくは４２の何れかで示される配列またはその相補配列とを含み、
前記ＢＩＰプライマーにおいて、当該Ｂ１ｃ配列が、配列番号７５に含まれる５’端から第１位〜第５位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列、または３’端から第１位〜第６位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列であり、当該Ｂ２ｃ配列が、配列番号６５若しくは６６に含まれる５’端から第１位〜第７位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列であり、
前記Ｂ３プライマーが、配列番号８２に含まれる５’端から第１位〜第５位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列、または配列番号３４に含まれる３’端から第１〜第７位の何れかの塩基を含むように連続する少なくとも１３塩基若しくはその相補配列である、
前記ＬＦｃプライマーが、配列番号１１で示される配列を含む、
ことを特徴とする［１］に記載のプライマーセット。
［３］
前記Ｆ３プライマーが、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列を含み、
前記ＦＩＰプライマーが、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列を含み、
前記ＢＩＰプライマーが、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列を含み、
前記Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列を含む、
ことを特徴とする［１］または［２］に記載のプライマーセット。
［４］
前記Ｆ３プライマーが、配列番号２、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２２または配列番号３９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み、
前記ＦＩＰプライマーが、配列番号１２、配列番号１８または配列番号２１の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み、
前記ＢＩＰプライマーが、配列番号１３、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６または配列番号２７の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含み、
前記Ｂ３プライマーが、配列番号１０または配列番号１９の何れかで示される配列またはその相補配列に含まれる連続する少なくとも１３塩基を含む、
ことを特徴とする［１］または［２］に記載のプライマーセット。
［５］
前記プライマーセットに含まれるＦ３プライマー、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマーおよびＢ３プライマーのためのそれぞれの当該認識配列の組み合わせが以下からなる群より選択される［１］〜［３］の何れか１つに記載のプライマーセット：
（１）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（２）配列番号２２、配列番号２１、配列番号１５および配列番号１０の組み合わせ；
（３）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；
（４）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；
（５）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；
（６）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；
（７）配列番号２２、配列番号２１、配列番号２７おおび配列番号１０の組み合わせ；
（８）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２３および配列番号１０の組み合わせ；
（９）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２４および配列番号１０の組み合わせ；
（１０）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２５および配列番号１０の組み合わせ；
（１１）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２６および配列番号１０の組み合わせ；
（１２）配列番号２０、配列番号１２、配列番号２７および配列番号９の組み合わせ；
（１３）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号９の組み合わせ；
（１４）配列番号２０、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（１５）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１６）配列番号２２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１９の組み合わせ；
（１７）配列番号３９、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；
（１８）配列番号２、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１０の組み合わせ；並びに
（１９）前記（１）〜（１８）の何れかの組み合わせに含まれる４つの配列のそれぞれの相補配列の組み合わせ。
［６］
前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする［１］〜［５］の何れか１つに記載のプライマーセット。
［７］前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株、ザイール７６株およびザイール９５株であることを特徴とする［１］〜［５］の何れか１つに記載のプライマーセット。
［８］
前記ＦＩＰプライマーが、更に前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ２配列との間にリンカーを含み、および／または前記ＢＩＰプライマーが、更に前記Ｂ１配列と前記Ｂ２ｃ配列との間にリンカーを含むことを特徴とする［１］〜［７］の何れか１つに記載のプライマーセット。
［９］
前記リンカーが、１〜５０塩基長を有する任意の塩基配列からなることを特徴とする［８］に記載のプライマーセット。
［１０］
更に、配列番号１１またはその相補配列を含むＬＦｃプライマーを含むことを特徴とする［１］〜［９］の何れか１つに記載のプライマーセット。
［１１］
［１］〜［５］の何れか１つに記載の何れかのプライマーセットと、前記プライマーセットを収容する容器とを含むザイールエボラウイルスを検出するためのアッセイキット。
［１２］
前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする［１１］に記載のアッセイキット。
［１３］
前記ザイールエボラウイルスが、ザイール７６株、ザイール９５株およびギニア１４株であることを特徴とする［１１］に記載のアッセイキット。
［１４］
３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列およびＦ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列およびＦ１配列をこの順番で含み、前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第３のステム・ループ構造体、
５’側から３’側に向けて、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第４のステム・ループ構造体、
３’側から５’側に向けて、Ｆ１配列、Ｆ２ｃ配列、Ｆ１ｃ配列、Ｂ１配列、Ｂ２配列およびＢ１ｃ配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１配列と前記Ｆ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１配列と前記Ｂ１ｃ配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第１のダンベル構造体、および／または
５’側から３’側に向けて、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、Ｆ１配列、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２ｃ配列およびＢ１配列をこの順番で含み、且つ前記Ｆ１ｃ配列と前記Ｆ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成し、前記Ｂ１ｃ配列と前記Ｂ１配列とが互いに結合し二本鎖を形成している第２のダンベル構造体
を含む核酸構造体であって、
ここで、Ｆ１配列とＦ１ｃ配列、Ｆ２配列とＦ２ｃ配列、Ｆ３配列とＦ３ｃ配列、Ｂ１配列とＢ１ｃ配列、Ｂ２配列とＢ２ｃ配列、Ｂ３配列とＢ３ｃ配列は互いに相補的であり、
前記Ｆ１配列は、配列番号３１若しくは配列番号６４に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ２配列は、配列番号６２若しくは配列番号６３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｆ３配列は、配列番号２９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０若しくは配列番号６１に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ１ｃ配列は、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４若しくは配列番号７５に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、
前記Ｂ２ｃ配列は、配列番号６５若しくは配列番号６６に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含み、および
前記Ｂ３ｃ配列は、配列番号３４、配列番号６７、配列番号８２若しくは配列番号８３に含まれる連続する少なくとも１３塩基またはその相補配列を含む
ことを特徴とする核酸構造体。
［１５］
前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする［１４］に記載の核酸構造体。
［１６］
前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株、ザイール７６株およびザイール９５株であることを特徴とする［１４］に記載の核酸構造体。
［１７］
ザイールエボラウイルスを検出するための方法であって、［１］〜［５］に記載の何れかのプライマーセットを用いて検体に含まれる核酸を増幅し、濁度または蛍光を指標に前記検体にザイールエボラウイルスが含まれているか否かを判定する方法。
［１８］
前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株であることを特徴とする［１７］に記載の方法。
［１９］
前記ザイールエボラウイルスが、ギニア１４株、ザイール７６株およびザイール９５株であることを特徴とする［１７］に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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