(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シャペロン遺伝子が導入され、かつaox1遺伝子とプロテアーゼ遺伝子が破壊されている、形質転換酵母。
【請求項２】
シャペロン遺伝子が、下記の(a)〜(d)に示される遺伝子から成る群から選択される１種または２種以上の組み合わせである、請求項１に記載の形質転換酵母。
(a) Ogataea minuta（O.minuta）由来のPDI1、ERO1、Kar2、MPD1、SCJ1、EUG1、又はHSP104をコードする遺伝子
(b) Saccharomyces cerevisiae（S.cerevisia）由来のPDI1、MPD1、SCJ1、ERO1、FKB2、JEM1、LHS1、MPD2、ERJ5、又はEUG1をコードする遺伝子
(c) ヒト由来のPDI、ERO1-Lα、ERO1-Lβ、又はGRP78をコードする遺伝子
(d) (a)〜(c)のいずれかの遺伝子の塩基配列に対して95％以上の配列相同性を有する遺伝子
【請求項３】
シャペロン遺伝子が、下記の(a)〜(g)に示される遺伝子から成る群から選択される１種または２種以上の組み合わせである、請求項１に記載の形質転換酵母。
(a) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子
(b) O.minuta由来のERO1をコードする遺伝子
(c) O.minuta由来のKar2をコードする遺伝子
(d) S.cerevisiae由来のPDI1をコードする遺伝子
(e) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子
(f) ヒト由来のERO1をコードする遺伝子
(g) (a)〜(f)のいずれかの遺伝子の塩基配列に対して95％以上の配列相同性を有する遺伝子
【請求項４】
シャペロン遺伝子が下記(a)〜(g)のいずれかのシャペロン遺伝子である、請求項１に記載の形質転換酵母。
(a) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子とERO1をコードする遺伝子とKar2をコードする遺伝子の組合せ
(b) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子とKar2をコードする遺伝子の組合せ
(c) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子とO.minuta由来のERO1をコードする遺伝子の組合せ
(d) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子とERO1をコードする遺伝子の組合せ
(e) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子とヒト由来のERO1-Lβをコードする遺伝子とヒト由来のGRP78をコードする遺伝子の組合せ
(f) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子とO.minuta由来のERO1をコードする遺伝子とヒト由来のGRP78をコードする遺伝子の組合せ
(g) (a)〜(f)のいずれかの遺伝子の塩基配列に対して95％以上の配列相同性を有する遺伝子
【請求項５】
プロテアーゼ遺伝子がprb1遺伝子である、請求項１に記載の形質転換酵母。
【請求項６】
酵母がメタノール資化性酵母である、請求項１〜５に記載の形質転換酵母。
【請求項７】
目的タンパク質をコードする遺伝子を導入した、請求項１〜６のいずれかに記載の形質転換酵母。
【請求項８】
目的タンパク質の製造のための、請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換酵母の使用。
【請求項９】
請求項７に記載の形質転換酵母を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法であって、該培地へのメタノールの添加量が０．５％（ｖ／ｖ）以下である、上記タンパク質の製造方法。
【請求項１０】
プロテアーゼ活性を抑制する条件下で培養を行うことを特徴とする、請求項９に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
pHが6.0〜7.5の培地で培養を行うことを特徴とする、請求項９又は１０に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
培地に窒素源を添加することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１３】
培地にメタノールを添加しないことを特徴とする、請求項９〜１２のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１４】
以下の(i)の工程と、(ii)の工程と、(iii)の工程を含む、形質転換酵母の製造方法。
(i) 酵母に対して、シャペロン遺伝子を導入する工程
(ii) 酵母に対して、aox1遺伝子を破壊する工程
(iii) 酵母に対して、prb1遺伝子を破壊する工程
【請求項１５】
さらに、目的タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、請求項１４に記載
の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母におけるタンパク質の高分泌生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質や抗体医薬などの蛋白質性医薬品は、遺伝子組み換え技術の発展によって急速に市場を拡大しており、これら蛋白質性医薬品を生産させる宿主としてCHOやNS0等の動物細胞や、カイコなどの昆虫あるいはSF9等の昆虫細胞、大腸菌や酵母などの微生物等が使用されている。中でも酵母は高密度培養が可能であり、比較的安価な培地で有用タンパク質を分泌生産できる系として広く用いられている。【０００３】
ところで分泌タンパク質は、N末端に存在するシグナル配列アミノ酸領域がSRP：signal recognition particleに認識され、トランスロコンを通過して小胞体に入り、トランスロコンの通過時に高次構造がほどけて小胞体内でフォールディング（folding）される。この分泌タンパク質のフォールディングは、自発的に可能であるが、様々な分子シャペロンがフォールディングを助けている。小胞体内で形成されるネイティブな立体構造の形成は、分泌に重要であり、正しくフォールディングされなかったタンパク質は、下流の分泌経路に乗ることができず、高次構造の異常なタンパク質が蓄積してしまう。このような小胞体内で起こる修飾（糖鎖、ジスルフィド結合の付加）の障害、小胞体からの輸送の低下が原因となって、「小胞体ストレス」という状態が起こる。この小胞体ストレスに対応する手段として、真核生物の細胞は、「Unfolded Protein Response（UPR)」と呼ばれるストレス応答が誘導される。UPRにおける転写誘導・翻訳調節は、蓄積した異常タンパク質を修復しようとする応答であるが、異常タンパク質を分解し、排除して小胞体内の恒常性を維持するERAD：ER-associated degradationという機構もある。また、分子シャペロンには、小胞体内でのタンパク質のフォールディングを助けるものだけなく、凝集したタンパク質をフォールディングするためにほぐすものも知られている。例えば、HSP104は、HSP70と協同して凝集体からタンパク質を可溶化する他のシャペロンでは不可能な反応を行うことができる(非特許文献１）。【０００４】
一方、タンパク質の立体構造内部を見た場合、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用など多くの相互作用がアミノ酸間で働いている。その中でもジスルフィド結合と呼ばれる二つのシステインが二電子酸化を受けることにより形成される硫黄原子間の共有結合は、その強固な性質がゆえにタンパク質の立体構造を安定化する上で非常に重要となる。実際、細胞の外に分泌される分泌タンパク質の多くは、ジスルフィド結合を有しており、これは、膜に包まれた細胞内部に比べ物理的にも化学的にもより過酷な環境である細胞外で機能するためには、タンパク質の構造をより頑強にする必要があることによるものと推定されている。酵母などの真核細胞では、タンパク質の酸化的フォールディングによるジスルフィド結合の導入は、小胞体内で酸化型PDI（Protein disulfide isomerase）によって行われる（非特許文献２）。基質となるタンパク質を酸化し、還元型となったPDIは、膜近傍に局在する酸化型ERO1によって再酸化される（非特許文献３、４）。酵母の小胞体には、５種類（PDI1、EUG1、MPD1、MPD2、EPS1）のPDIファミリーが存在する（非特許文献５）。これらのPDIファミリーの中で、ERO1との分子間ジスルフィド結合を形成することが確認されているのは、PDI1とMPD2である。また、タンパク質の酸化的フォールディングには、BiP/Kar2が、PDIと協同して効率を上げることもまた報告されている(非特許文献６）。BiP/Kar2は、前記のUPRに関連する様々な遺伝子の活性型HAC1による誘導にも関与する。活性型HAC1は、膜貫通kinase/nucleaseであるIRE1によってHAC1がスプライシングされることによって活性化される。BiP/Kar2が結合したIRE1は、小胞体内の異常構造をもつタンパク質にBiP/Kar2が作用することによって解離し、２量体を形成することによってヌクレアーゼ活性を示し、HAC1をスプライシングして活性型HAC1を生成する(非特許文献７、８)。また、Bip/Kar2は、小胞体に存在するSCJ1と協同し、小胞体内でのタンパク質のフォールディングにも関与している(非特許文献９）。【０００５】
このように、分泌タンパク質の正しいフォールディングには、様々な分子シャペロンが関与することが明らかにされているが、酵母に上記PDI1、ERO1、およびKar2などの分子シャペロンタンパクをコードする遺伝子の１種または２種以上を発現対象となる目的タンパク遺伝子と共発現させることによって複雑な立体構造を有する目的タンパク質の分泌生産性を向上させることが報告されている（特許文献１）。【０００６】
しかしながら、このようなPDI1、ERO1およびKar2などのシャペロンタンパクをコードする遺伝子を共発現させることで目的タンパク質の培地中への分泌生産能を向上させても、目的タンパク質によっては、培地中にて速やかに分解されてしまう場合がある。特に酵母のタンパク質分解オルガネラとして知られる液胞に存在しているプロテアーゼが、分泌タンパク質の分解にも関与していることが報告されている(非特許文献１０）。液胞には、プロテイナーゼAやプロテイナーゼB、カルボキシペプチダーゼYを始めとして、液胞トレハラーゼ、アミノペプチダーゼI、液胞アルカリホスファターゼ、液胞RNaseなど多くの蛋白質分解酵素が存在しているが、その活性は液胞で発揮されるように制御されており、特にプロテイナーゼAやプロテイナーゼBは、自分自身やカルボキシペプチダーゼYなどを活性化するキープロテアーゼとして機能し、蛋白質分解系において重要な役割を担っている(非特許文献１１、１２）。酸性プロテアーゼの一つであるプロテイナーゼAは、酸性条件下では強い活性を示す一方、pHが上がるにつれ活性が減少することが報告されている(非特許文献１３）。そこで、培養する培地のpHを調整することにより、プロテアーゼ活性を阻害する培養方法が検討されているが、宿主細胞の増殖に影響を与える可能性がある。【０００７】
メタノール資化性酵母において、メタノール代謝は、アルコールオキシダーゼ(AOX)によるメタノールの酸化により開始され、生じたホルムアルデヒドが、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(DAS)によりキシロース5−リン酸に固定されて、解糖系経由で細胞構成成分として利用されるとともに、細胞質にてグルタチオン依存性ホルムアルデヒド脱水素酵素(FLD)とギ酸脱水素酵素(FDH)によりCO2にまで酸化される(非特許文献１４）。メタノールにより発現が制御される遺伝子プロモーターとしては、アルコールオキシダーゼ（aox1, aox2）プロモーター、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(das1)プロモーター、ギ酸デヒドロゲナーゼ(fdh1)プロモーター、メタノールオキシダーゼ(mox)プロモーターを始めとして、pmp20-、pmp47-プロモーターなどメタノール代謝などに関連する酵素をコードする多くの遺伝子のプロモーターが知られている(非特許文献１５）。メタノール代謝に関連する酵素の発現を制御するプロモーターは、非常に強力であることから、種々の目的タンパク質を本メタノール資化性酵母で分泌生産させるのに一般的に使用されている。特にPichia pastorisのaox1プロモーターは、メタノールで誘導される非常に強力なプロモーターとして知られている。【０００８】
一方、メタノール代謝に関連する酵素の発現を制御するプロモーターの制御下で目的タンパク質を分泌生産させる場合、メタノールによる誘導が必要と考えられている。メタノールは、引火性液体区分２の劇物であり、指定数量以上の取り扱いは消防法で規制されており、防爆対応の工場・設備が必要となる。従って、できるだけ少量のメタノールで、大量のメタノールで発現誘導した場合と同程度の目的タンパク質の分泌生産性が得られれば、その工業的な価値は大きい。また、メタノール資化性酵母のメタノール代謝酵素プロモーターに利用される各種正の転写因子は、新たに導入した目的タンパク質の発現のみならず、菌本来のメタノール代謝酵素の誘導にも使用される。実際、メタノール資化性酵母であるCandida boidiniiにおいて、菌が本来有するaox1遺伝子を破壊した株を用い、aox1プロモーター制御下で菌体内のD-アミノ酸オキシダーゼや、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシソーム・アセチルスペルミジンオキシダーゼなどの各種オキシダーゼやB型肝炎表面抗原遺伝子を発現させる試みがなされ、菌が本来有するaox1遺伝子を破壊した株は元の親株より導入した目的タンパク質の発現量が上昇することが報告されている(特許文献２、非特許文献１６、１７、１８）。【０００９】
以上のように、酵母におけるタンパク質の高分泌生産については、様々な方法が提示されているが、一般的に遺伝子導入・遺伝子破壊等により宿主細胞を形質転換した場合、細胞は何らかのストレスを受けるため、単に従来の方法をいくつか組み合わせることで、必ずしも相乗または相加的な効果が得られるものではない。また、上記各種シャペロンに、上記種々の方法を組み合わせることにより、目的タンパク質を高分泌生産させた報告は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ２００９／０５７８１３
【特許文献２】特開昭６２−１０４５８５
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Glover JR, Lindquist S, Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell (1998) 94：73-82
【非特許文献２】Benjamin P. Tu and Jonathan S. Weissman, Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J. Cell Biol. (2004) 164:341-346
【非特許文献３】Mezghrani, A., Fassio, A., Benham, A., Simmen, T., Braakman, I., and Sitia, R., Manipulationof oxidative proteinfolding and PDIredox state inmammalian cells. EMBO. J.(2001) 20: 6288-6296
【非特許文献４】Frand, A. R. and C. A. Kaiser, Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell (1999) 4:469-477
【非特許文献５】Per Norgaard, Vibeke Westphal, Christine Tachibana, Lene Alsoe, Bjorn Holst, Jakob R. Winther, Functional Differences in Yeast Protein Disulfide Isomerases. J. Cell Biology (2001) 152(3): 553-562,
【非特許文献６】Marcus Mayer, Ursula Kies, Robert Kammermeier, and Johannes Buchner, BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding of Antibodies in Vitro, J. Biol. Chem. (2000) 275(38): 29421-29425.
【非特許文献７】Cox JS., Shamu CE., Walter P., Transcriptional induction of genes encoding endoplasmic reticulum resident proteins requires a transmembrane protein kinase. Cell (1993) 73:1197-1206
【非特許文献８】Sidrauski C. and Walter P., The transmembrane kinase Ire1p is a site-specific endonuclease that initiates mRNA splicing in the unfolded protein response. Cell (1997) 90(6): 1031-1039
【非特許文献９】Susana Silberstein, Gabriel Schlenstedt, Pam A. Silver, and Reid Gilmore, A Role for the DnaJ Homologue Scj1p in Protein Folding in the Yeast Endoplasmic Reticulum. J. Cell Biol. (1998) 143(4): 921-933
【非特許文献１０】Morozkina EV, Marchenko AN, Keruchenko JS, Keruchenko ID, Khotchenkov VP, Popov VO, and Benevolensky SV, Proteinase B disruption is required for high level production of human mechano-growth factor in Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2010) 18(3): 188-194
【非特許文献１１】H. Bart van den HAZEL, Morten C. KIELLAND-BRANDT, and Jakob R. WINTHER, Autoactivation of proteinase A initiates activation of yeast vacuolar zymogens. Eur. J. Biochem. (1992) 207： 277-283
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【非特許文献１３】Susanne O. SORENSEN, H. Bart VAN DEN HAZEL, Morten C. KIELLAND-BRANDT, and Jakob R. WINTHER, pH-dependent processing of yeast procarboxypeptidase Y by proteinase A in vivo and in vitro. Eur. J. Biochem. (1994) 220: 19-27
【非特許文献１４】Ida J. van der Kleia, Yurimotob H, Sakaib Y, Venhuisa M, The significance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic yeast. Biochim. Biophys. Acta. (2006) 1763: 1453-1462
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【非特許文献１６】Yurimoto H, Hasegawa T, Sakai Y, Kato N,  Characterization and High-level production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65(3), 627-633
【非特許文献１７】Sakai Y, Yoshida H, Yurimoto H, Yoshida N, Fukuya H, Takabe K, Kato N, Production of fungal fructosyl amino acid oxidase useful for diabetic diagnosis in the peroxisome of Candida boidnii. FEBS Lett. (1999) 459, 233-237
【非特許文献１８】Nishikawa M, Hagishita T, Yurimoto H, Kato N, Sakai Y, Hatanaka T, Primary structure and expression of peroxisomal acetylspermidine oxidase in the methylotrophic yeast Candida boidinii. FEBS Lett. (2000) 476, 150-154
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、酵母などの宿主細胞において、タンパク質、特にはS-S結合などの構造が複雑なタンパク質を高分泌生産し、かつ安全性が高く、防爆設備を必要としない工業生産に適した生産系を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シャペロン遺伝子が導入され、かつアルコールオキシダーゼをコードするaox1遺伝子が破壊された酵母を用いることにより、低濃度のメタノール誘導でもaox1プロモーターの制御下で目的タンパク質を高分泌生産できることを見出した。また、本発明者らは酵母で発現させた目的タンパク質の分解にプロテイナーゼ B (PRB1)およびプロテイナーゼ A (PEP4)等の酸性プロテアーゼが大きく関与していることを見出し、酵母のプロテイナーゼBをコードするprb1遺伝子を破壊し、及び／又は、プロテイナーゼA等の酸性プロテアーゼの活性が抑制されるよう培地中のpHを制御することで、目的タンパク質の分泌生産量が大きく向上することを確認した。【００１４】
これらを組み合わせたタンパク質の高分泌生産系は、添加するメタノール量を大幅に減少させることが可能であることから、安全性の高い、工業生産に適した生産系として利用できる。本発明はかかる知見により完成されたものである。【００１５】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) シャペロン遺伝子が導入され、かつaox1遺伝子が破壊されている、形質転換酵母。
(2) シャペロン遺伝子が、下記の(a)〜(d)に示される遺伝子から成る群から選択される１種または２種以上の組み合わせである、(1)に記載の形質転換酵母。
(a) Ogataea minuta（O.minuta）由来のPDI1、ERO1、Kar2、MPD1、SCJ1、EUG1、又はHSP104をコードする遺伝子
(b) Saccharomyces cerevisiae（S.cerevisia）由来のPDI1、MPD1、SCJ1、ERO1、FKB2、JEM1、LHS1、MPD2、ERJ5、又はEUG1をコードする遺伝子
(c) ヒト由来のPDI、ERO1-Lα、ERO1-Lβ、又はGRP78をコードする遺伝子  (d) (a)〜(c)のいずれかの遺伝子の塩基配列に対して95％以上の配列相同性を有する遺伝子
(3) シャペロン遺伝子が、下記の(a)〜(g)に示される遺伝子から成る群から選択される１種または２種以上の組み合わせである、(1)に記載の形質転換酵母。
(a) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子
(b) O.minuta由来のERO1をコードする遺伝子
(c) O.minuta由来のKar2をコードする遺伝子
(d) S.cerevisiae由来のPDI1をコードする遺伝子
(e)ヒト由来のPDIをコードする遺伝子
(f)ヒト由来のERO1をコードする遺伝子
(g) (a)〜(f)のいずれかの遺伝子の塩基配列に対して95％以上の配列相同性を有する遺伝子
(4) シャペロン遺伝子が下記(a)〜(g)のいずれかのシャペロン遺伝子である、(1)に記載の形質転換酵母。
(a) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子とERO1をコードする遺伝子とKar2をコードする遺伝子の組合せ
(b) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子とKar2をコードする遺伝子の組合せ
(c) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子とO.minuta由来のERO1をコードする遺伝子の組合せ
(d) O.minuta由来のPDI1をコードする遺伝子とERO1をコードする遺伝子の組合せ
(e) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子とヒト由来のERO1-Lβをコードする遺伝子とヒト由来のGRP78をコードする遺伝子の組合せ
(f) ヒト由来のPDIをコードする遺伝子とO.minuta由来のERO1をコードする遺伝子とヒト由来のGRP78をコードする遺伝子の組合せ
(g) (a)〜(f)のいずれかの遺伝子の塩基配列に対して95％以上の配列相同性を有する遺伝子
(5) プロテアーゼ遺伝子が破壊されている、(1)〜(4)のいずれかに記載の形質転換酵母。
(6) プロテアーゼ遺伝子がprb1遺伝子である、(5)に記載の形質転換酵母。
(7) シャペロン遺伝子が導入され、かつプロテアーゼ遺伝子が破壊されている、形質転換酵母。
(8) プロテアーゼ遺伝子がprb1遺伝子である、(7)に記載の形質転換酵母。
(9) 酵母がメタノール資化性酵母である、(1) 〜(8)に記載の形質転換酵母。
(10) 目的タンパク質をコードする遺伝子を導入した、(1)〜(9)のいずれかに記載の形質転換酵母。
(11) 目的タンパク質の製造のための、(1)〜(10)のいずれかに記載の形質転換酵母の使用。
(12) (10)に記載の形質転換酵母を培地に培養し、培養物から目的タンパク質を採取することを特徴とする、タンパク質の製造方法。
(13) プロテアーゼ活性を抑制する条件下で培養を行うことを特徴とする、(12)に記載のタンパク質の製造方法。
(14) pHが6.0〜7.5の培地で培養を行うことを特徴とする、(12)又は(13)に記載のタンパク質の製造方法。
(15) 培地に窒素源を添加することを特徴とする、(12)〜(14)のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
(16)培地へのメタノールの添加量が２％（ｖ／ｖ）以下であることを特徴とする、(12)〜(15)のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
(17) (12)〜(16)のいずれかに記載の方法によって製造される目的タンパク質。
(18) 以下の(i)の工程と、(ii)または(iii)の少なくとも１つの工程を含む形質転換酵母の製造方法。
(i) 酵母に対して、シャペロン遺伝子を導入する工程
(ii) 酵母に対して、aox1遺伝子を破壊する工程
(iii) 酵母に対して、prb1遺伝子を破壊する工程
(19) さらに、目的タンパク質をコードする遺伝子を導入する工程を含む、(18)に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、シャペロン遺伝子の導入、aox1遺伝子の破壊及び／又はプロテアーゼ遺伝子の破壊を行った形質転換酵母によって、通常のタンパク質のみならず、S-S結合などを有する構造が複雑なタンパク質を正しくフォールディングされた形態で酵母内において高分泌生産することが可能となる。又、前記形質転換酵母を、プロテアーゼ活性を抑制する条件下で培養することによって長期培養（大量生産）することが可能となる。本発明の形質転換酵母を用いるタンパク質生産系においては、使用するメタノール量を大幅に減少させることが可能であるので、安全性が高く、工業生産（大量生産）に適したタンパク質生産系として利用できる。【００１７】
本願は、２０１４年７月３０日に出願された日本国特許出願２０１４−１５５２７２号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ura3遺伝子破壊株の作製方法を示す図である。
【図２】aox1遺伝子破壊株の作製方法を示す図である。
【図３】シャペロン遺伝子発現ベクターの構造を示す図である（onaP11007：OmPDI1+OmERO1+OmKar2発現ベクター）。
【図４】prb1遺伝子分断株の作製方法を示す図である。
【図５】kex2発現プラスミドの作製方法を示す図である（kex2発現プラスミド：pOMEA-Z1-KEX2、kex2発現カセット）。
【図６−１】メタノール誘導によるKEX2蛋白質の分泌生産量の比較を示す図である（1: シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したNBRC10746株（NBRC10746+PEK株由来KEX2産生株）、2：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK株由来KEX2産生株）、3：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したprb1遺伝子分断株（NBRC10746+PEK dprb1株由来KEX2産生株）、4：prb1遺伝子を分断するとともにシャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK dprb1株由来KEX2産生株）)。
【図６−２】KEX2蛋白質の酵素活性を比較する図である（1: シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したNBRC10746株（NBRC10746+PEK株由来KEX2産生株）、2：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK株由来KEX2産生株）、3：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したprb1遺伝子分断株（NBRC10746+PEK dprb1株由来KEX2産生株）、4：prb1遺伝子を分断するとともにシャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK dprb1株由来KEX2産生株）、白色バー：第3四分点-中央値、黒色バー：中央値-第1四分点)。
【図７】hsa発現プラスミドの作製方法を示す図である（hsa発現プラスミド：pOMEA-Z1-HSA、hsa遺伝子発現カセット）。
【図８】メタノール誘導によるHSA蛋白質の分泌生産量（deep well plate scale）を示す図である（1: シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したNBRC10746株（NBRC10746+PEK株由来HSA産生株）、2：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK株由来HSA産生株）、3：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したprb1遺伝子分断株（NBRC10746+PEK dprb1株由来HSA産生株）、4：prb1遺伝子を分断するとともにシャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK dprb1株由来HSA産生株）)。
【図９】メタノール誘導培養によるHSA蛋白質の分泌生産量（3L Jar scale) を示す図である [Jar1: シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したNBRC10746株（NBRC10746+PEK株由来HSA産生株）、Jar2：シャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したNBRC10746株（NBRC10746+PEK株由来HSA産生株）（窒素源流加培養、pH7制御）、Jar3：prb1遺伝子を分断するとともにシャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK dprb1株由来HSA産生株）（窒素源流加培養、pH7制御)] 。
【図１０】炭素源飢餓誘導培養によるHSA蛋白質の分泌生産量（3L Jar scale) を示す図である [Jar1：prb1遺伝子を分断するとともにシャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK dprb1株由来HSA産生株）（低メタノール誘導培養)、Jar2：prb1遺伝子を分断するとともにシャペロン(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)を導入したaox1遺伝子破壊株（Δaox1+PEK dprb1株由来HSA産生株）（炭素源の飢餓誘導培養)] 。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．形質転換酵母
本発明の形質転換酵母は、シャペロン遺伝子の導入、aox1遺伝子の破壊及び／又はプロテアーゼ遺伝子の破壊を行った形質転換酵母である。すなわち、本発明の形質転換酵母は、シャペロン遺伝子が導入され、かつaox1遺伝子が破壊されている形質転換酵母、シャペロン遺伝子が導入され、かつプロテアーゼ遺伝子が破壊されている形質転換酵母、またはシャペロン遺伝子が導入され、かつaox1遺伝子とプロテアーゼ遺伝子が破壊されている形質転換酵母を包含する。
【００２０】
（宿主細胞）
形質転換させる宿主細胞としては、好ましくは酵母である。酵母としては、Ogataea minuta、Pichia lindneri、 Pichia pastoris、Hansenulla polymorpha（Pichia angusta）、Candida boidinii等のメタノール資化性酵母株、あるいはSaccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、 Yarowia lipolytica、 Shizosaccharomyces pombe等の酵母株が挙げられるが、好ましくはメタノール資化性酵母株である。より具体的には、Ogataea minuta株としてOgataea minuta YK3株（Δoch1Δpep4Δprb1Δyps1Δura3Δade1）、Saccharomyces cerevisiae としてSaccharomyces cerevisiae BY4741株（MATa Δhis3Δleu2Δmet15Δura3）等を用いることができるが、これらに限定はされない。
【００２１】
（シャペロン遺伝子の導入）
本発明に用いるシャペロン遺伝子としては、例えば、Ogataea minuta (O.minuta)に由来するPDI1[配列番号35(塩基配列)、配列番号36(アミノ酸配列)]、ERO1[配列番号43(塩基配列)、配列番号44(アミノ酸配列)]、Kar2[配列番号47(塩基配列)、配列番号48(アミノ酸配列)]、MPD1[配列番号37(塩基配列)、配列番号38(アミノ酸配列)]、SCJ1[配列番号39(塩基配列)、配列番号40(アミノ酸配列)]、EUG1[配列番号41(塩基配列)、配列番号42(アミノ酸配列)]、HSP104[配列番号45(塩基配列)、配列番号46(アミノ酸配列)]をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００２２】
また、本発明に使用するシャペロン遺伝子は、他の酵母、カビ、ヒトなど他の生物種由来のシャペロン遺伝子であってもよい。
【００２３】
他の酵母由来のシャペロン遺伝子としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae由来のシャペロン遺伝子を用いることができ、具体的には、PDI1[Primary SGDID：S000000548;配列番号49(塩基配列)、配列番号50(アミノ酸配列)]、MPD1[Primary SGDID：S000005814;配列番号51(塩基配列)、配列番号52(アミノ酸配列)]、SCJ1[Primary SGDID：S000004827;配列番号53(塩基配列)、配列番号54(アミノ酸配列)]、ERO1[Primary SGDID：S000004599；配列番号55(塩基配列)、配列番号56(アミノ酸配列)]、FKB2[Primary SGDID：S000002927;配列番号57(塩基配列)、配列番号58(アミノ酸配列)]、JEM1[Primary SGDID：S000003609；配列番号59(塩基配列)、配列番号60(アミノ酸配列)]、LHS1[Primary SGDID：S000001556;配列番号61(塩基配列)、配列番号62(アミノ酸配列)]、MPD2[Primary SGDID：S000005448;配列番号63(塩基配列)、配列番号64(アミノ酸配列)]、ERJ5[Primary SGDID：S000001937;配列番号65(塩基配列)、配列番号66(アミノ酸配列)]、EUG1[Primary SGDID：S000002926;配列番号67(塩基配列)、配列番号68(アミノ酸配列)]をコードする遺伝子等が挙げられる。Saccharomyces cerevisiae由来の上記遺伝子の配列情報は、SGD(Saccharomyces genome database：http://www.yeastgenome.org/）から入手できる。
【００２４】
また、ヒト由来のシャペロン遺伝子としては、PDI[GenBank Accession No. BC010859；配列番号69(塩基配列)、配列番号70(アミノ酸配列)]、ERO1-Lα[GenBank Accession No. AF081886；配列番号71(塩基配列)、配列番号72(アミノ酸配列)]、ERO1-Lβ[GenBank Accession No. BC044573；配列番号73(塩基配列)、配列番号74 (アミノ酸配列)]、GRP78 [GenBank Accession No. AL354710；配列番号75(塩基配列)、配列番号76(アミノ酸配列)]をコードする遺伝子等が挙げられる。
【００２５】
本発明に使用するシャペロン遺伝子は、外来タンパク質分泌促進活性を保持する限り、上記の各アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、欠失、置換、および／または付加されてもよいアミノ酸の数としては、好ましくは、１個から数個である。「数個」の数は特には限定されないが、例えば、50個以下、40個以下、30個以下、25個以下、20個以下、15個以下、12個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、5個以下、4個以下、3個以下、2個を意味する。また、ここにいう「変異」は、主には公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。なお、本明細書において「外来タンパク質」と「目的タンパク質」は同じ意味で用いている。
【００２６】
また、本発明に使用するシャペロン遺伝子は、上記の各アミノ酸配列に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。具体的には、配列番号35、37、39、41、43、45、47、49、51、53，55，57，59、61、63、65、67、69、71、73、75に示す塩基配列に対して80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子や、配列番号36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76に示すアミノ酸配列に対して80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。上記80％以上の配列同一性は、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性をいう。タンパク質のホモロジー検索は、例えば、日本DNAデータバンク（DNA Databank of JAPAN(DDBJ)等を対象に、FASTAやBLASTなどのプログラムを用いて行うことができる。
【００２７】
本発明に使用するシャペロン遺伝子は、上記の各塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列同一性が高い核酸、すなわち上記の各塩基配列と80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズし、それより配列同一性が低い塩基配列からなる核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が15〜750mM、好ましくは50〜750mM、より好ましくは300〜750mM、温度が25〜70℃、好ましくは50〜70℃、より好ましくは55〜65℃、ホルムアミド濃度が0〜50％、好ましくは20〜50％、より好ましくは35〜45％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が15〜600mM、好ましくは50〜600mM、より好ましくは300〜600mM、温度が50〜70℃、好ましくは55〜70℃、より好ましくは60〜65℃である。
【００２８】
当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、こうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記の塩基配列の配列同一性は、同様に、FASTA検索やBLAST検索により決定することができる。
【００２９】
上記アミノ酸の変異（欠失、置換、および／または付加）の導入は、Kunkel法若しくはGapped duplex法等の当該技術分野で公知の手法、またはこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-K(タカラバイオ社製）若しくはMutant-G(タカラバイオ社製）、タカラバイオ社のLA PCR in vitro Mutagenesis シリーズキットなどが利用できる。
【００３０】
また、これらの他の生物種由来のシャペロン遺伝子は、その塩基配列を、用いる宿主において使用頻度の高いコドンに置換することによって翻訳効率を高めるように改変されたコドン改変型遺伝子であってもよい。具体的にはヒト由来のPDIをコードする遺伝子のコドン改変型遺伝子が挙げられる。改変した塩基配列を有するDNAは人為的に合成することができるが、長いDNAの場合は、幾つかの断片にわけて予め合成し、最終的にそれらを結合して合成することもできる。
【００３１】
本発明においては、上記シャペロン遺伝子を１種または２種以上を組合せて用いる。２種以上を組合せる場合、同じ生物種由来のものであっても異なる生物種由来のものであってもよい。
【００３２】
本発明において使用する上記のシャペロン遺伝子の好ましい例として、O.minuta由来のpdi1遺伝子、O.minuta由来のero1遺伝子、O.minuta由来のkar2遺伝子、S. cerevisiae由来のpdi1遺伝子、ヒト由来のpdi遺伝子、ヒト由来のero1遺伝子、または前記各シャペロンのアミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。
【００３３】
また、本発明において使用する上記のシャペロン遺伝子のより好ましい例としては、O.minuta由来のpdi1遺伝子とero1遺伝子とkar2遺伝子の組合せ、O.minuta由来のpdi1遺伝子とero1遺伝子の組合せ、O.minuta由来のpdi1遺伝子とkar2遺伝子の組合せ、ヒト由来のpdi遺伝子とO.minuta由来のero1遺伝子の組合せ、ヒト由来のpdi遺伝子とero1-Lβ遺伝子とgrp78遺伝子の組み合わせ、ヒト由来のpdi遺伝子とO.minuta由来のero1遺伝子とヒト由来のgrp78遺伝子の組み合わせ、または前記各シャペロンの組合せの各アミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組合せを挙げることができる。
【００３４】
また、本発明において使用する上記のシャペロン遺伝子の最も好ましい例としては、O.minuta由来のpdi1遺伝子とero1遺伝子とkar2遺伝子の組合せ、またはPDI1 とERO1とKar2の組合せの各アミノ酸配列に対して80％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組み合わせ（例えば、配列番号35、43、47に示す塩基配列に80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組合せ、または配列番号36、44、48に示すアミノ酸配列に対して80%以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の組合せ）を挙げることができる。なお、本明細書における遺伝子の表記について、例えば「PDI1をコードする遺伝子」と「pdi1遺伝子」は同じ意味で用いている。
【００３５】
上記のシャペロン遺伝子は、発現ベクターを用いて宿主細胞である酵母に導入する。本発明において、酵母への発現ベクターの導入方法としては、導入遺伝子が酵母宿主内にて安定に存在し、かつ適宜発現させることができる方法であればいかなる方法でもよく、一般的に用いられている方法、例えば、リン酸カルシウム法（Ito et al., (1984) Agric.Biol.Chem.,48,341）、エレクトロポレーション法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194,182-187)、スフェロプラスト法（Creggh et al., Mol.Cell.Biol.,5,3376 (1985)）、酢酸リチウム法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168)、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３６】
(aox1遺伝子の破壊及び／又はプロテアーゼ遺伝子の破壊）
本発明の形質転換酵母は、上記シャペロン遺伝子の導入に加え、宿主ゲノム中に存在する内在性のaox1遺伝子を破壊するか、宿主ゲノム中に存在する内在性のプロテアーゼ遺伝子を破壊するか、あるいは、宿主ゲノム中に存在する内在性のaox1遺伝子とプロテアーゼ遺伝子の両方を破壊する。
【００３７】
aox1遺伝子としては、例えば、O.minutaのAOX1[配列番号27(塩基配列)、配列番号28(アミノ酸配列)]をコードする遺伝子、Pichia pastorisのAOX1をコードする遺伝子(GenBank登録番号；U96967)又はCandida boidiniiのAOX1 をコードする遺伝子(GenBank登録番号；Q00922)等が挙げられるが、酵母由来のAOX1をコードする遺伝子であればこれに限らない。
【００３８】
プロテアーゼ遺伝子としては、O.minutaのprb1[配列番号31(塩基配列)、配列番号32(アミノ酸配列)]遺伝子、若しくはpep4遺伝子(GenBank登録番号；AB236164)、Candida boidiniiのprb1遺伝子(GenBank登録番号；AB060541)若しくはpep4遺伝子(特開2000-078978)、Pichia pastorisのprb1遺伝子若しくはpep4遺伝子、Saccharomyces cerevisiaeのprb1遺伝子（GenBank登録番号；M18097）、又はKluyveromyces lactisのprb1遺伝子（GenBank登録番号；A75534）等が挙げられるが、酵母由来のプロテアーゼ遺伝子であればこれに限らない。
【００３９】
従って、本発明の形質転換酵母は、好ましくは、上記シャペロン遺伝子の導入に加え、宿主ゲノム中に存在する内在性のaox1遺伝子を破壊するか、宿主ゲノム中に存在する内在性のprb1遺伝子を破壊する。より好ましくは、上記シャペロン遺伝子の導入に加え、宿主ゲノム中に存在する内在性のaox1遺伝子とprb1遺伝子の両方を破壊する。最も好ましくは、上記シャペロン遺伝子としてO.minuta由来のpdi1遺伝子とero1遺伝子とkar2遺伝子の組合せ、または前記PDI1 とERO1とKar2の組合せの各アミノ酸配列に対して80％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは99％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ外来タンパク質分泌促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の導入に加え、宿主ゲノム中に存在する内在性のaox1遺伝子とprb1遺伝子の両方を破壊する。
【００４０】
本発明において、「遺伝子の破壊」とは、標的遺伝子の全部または一部が染色体から欠失されている「遺伝子の欠失」や標的遺伝子の置換のほか、標的遺伝子の分断により、標的遺伝子によりコードされる機能性タンパク質の発現が抑制されているが、遺伝子として除去されていない「遺伝子の分断」を包含する意である。あるいは、標的遺伝子の機能破壊という点において、遺伝子の破壊は、機能欠損を引き起こすための遺伝子の突然変異や遺伝子の発現抑制であってもよい。標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現や機能が抑制または欠失する限り、特に制限はない。
【００４１】
標的遺伝子の破壊は、典型的には、相同組換え法により行うことができる。まず、標的遺伝子を分断または部分欠失させ、そこに適当な選択マーカー遺伝子を挿入して標的遺伝子の上流部と下流部の間に選択マーカーが挟み込まれたDNA構造体を作製する。次にこの構造体を酵母に導入することにより、導入断片（選択マーカーを挟み込んだDNA構造体）の両端と染色体上の標的遺伝子との相同部分の間で２回の組み換えを起こし、染色体上の標的遺伝子が導入断片で置換される。この際、遺伝子破壊に用いる選択マーカーは、後記に示すような栄養要求性マーカーや薬剤耐性マーカーが用いられる。
【００４２】
選択マーカーとしてura3遺伝子を用いる場合を例にして具体的に説明する。構造遺伝子の前後に反復構造を持ったura3遺伝子を有するプラスミドを構築し、この遺伝子カセットを制限酵素で切りだし、プラスミド上の標的遺伝子に挿入し、破壊された対立遺伝子を構築する。このプラスミドを用いて染色体の標的遺伝子と置換して遺伝子破壊株を得る。染色体に挿入されたura3遺伝子は前後に反復構造を有するため、反復配列間での相同的組み換えによりura3遺伝子が染色体から脱落する。この脱落株の選択は5-フルオロオロチン酸（5-FOA）により行うことができる。ura3変異株は5-FOAに耐性であり（Boeke et al., mol. Gen. Genet., 197, 345-346（1984）；Boeke et al., Methods Enzymol., 154, 165-174 (1987)）、URA＋表現型を持つ細胞株は5-FOA培地に生育できなくなる。よって、5-FOAを加えた培地で耐性形質を持つ株を分離すれば、再びura3遺伝子マーカーを用いた操作が可能である。１つの遺伝子を破壊するためには一般的には１つの選択マーカーを要するが、ura3遺伝子を利用した場合、ura3形質を効率的に再生できる。
【００４３】
また機能欠損を引き起こすための遺伝子への突然変異の導入は、例えば部位特異的突然変異誘発法等の変異導入法を用いて改変することにより実施することができる。具体的には、部位機能欠損を引き起こすための遺伝子の突然変異とは、例えばORFへのヌクレオチド挿入又は欠失変異によるフレームシフトや活性中心のアミノ酸置換等が起きた結果、当該遺伝子が活性を喪失したタンパク質をコードするように変異した突然変異を意味する。また、遺伝子の発現抑制とは、その遺伝子の発現量が減少すること、または発現がなくなることを意味する。遺伝子の発現を抑制する方法としては、例えばアンチセンスRNAやRNAiを利用する方法、プロモーターを減弱化させる方法等が挙げられる。
【００４４】
（発現ベクター）
前記シャペロン遺伝子の酵母への導入には、発現ベクターを用いる。当該発現ベクターとしては、前記のシャペロン遺伝子の１種を含むベクター、上記のシャペロン遺伝子の１種を２以上のコピー数含むベクター、または前記のシャペロン遺伝子の２種以上の組合せを含むベクターがあげられる。シャペロン遺伝子を酵母内で発現させるために、各遺伝子を単独で含むベクターをそれぞれ用いて形質転換してもよく、また、複数の遺伝子を含む一つのベクターを用いて形質転換してもよい。また、同発現ベクターに、高発現分泌を目的とする外来タンパク質をコードする遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、外来タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを別に調製してもよく、別に調製した場合は、各ベクターを酵母にコトランスフェクト（共導入）する。
【００４５】
外来タンパク質をコードする遺伝子としては、特に限定はされないが、リゾチーム遺伝子、α-アミラーゼ遺伝子、α-ガラクトシダーゼ遺伝子等の各種酵素遺伝子、特に、エリスロポエチン（EPO）や顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）などの医薬上有用な糖タンパク質の生産に必要な糖転移酵素遺伝子、また医薬上有用な生理活性タンパク質であるインターフェロンα、インターフェロンγ等の各種インターフェロン遺伝子、IL1、IL2等の各種インターロイキン遺伝子、エリスロポエチン（EPO）遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）遺伝子等の各種サイトカイン遺伝子、成長因子遺伝子、インフルエンザ等の各種ワクチン抗原等が挙げられる。これらの遺伝子はいかなる手法によって得られるものでもよい。
【００４６】
本発明は特に疎水性の高いタンパク質、複合体を形成するような分泌生産が困難なタンパク質に対して有効であり、よって、上記の外来タンパク質には、多量体タンパク質、例えば、抗体またはその機能的断片であるヘテロ多量体が含まれる。
【００４７】
シャペロン遺伝子及び外来タンパク質をコードする遺伝子は、発現制御領域を適宜付加してタンパク質発現ユニットとして発現ベクターを構築してもよい。タンパク質発現ユニットは、転写の読み枠の方向に、少なくともプロモーター領域、上記遺伝子、転写ターミネーター領域を有するものである。ここで使用し得るプロモーターとしては、誘導発現プロモーターであっても、恒常プロモーターであってもよい。誘導発現プロモーターとしては、例えばメタノール資化性酵母におけるメタノール代謝に関わる、アルコールオキシダーゼ(AOX)をコードする遺伝子のプロモーター、ジヒドロキシアセトン・シンターゼ(DAS)をコードする遺伝子のプロモーター、ギ酸脱水素酵素（FDH）をコードする遺伝子のプロモーター等が挙げられる。また他の誘導プロモーターとしては銅誘導（cup）プロモーター等も用いることができる。恒常発現プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（TDH、GAP）、ホスホグリセロキナーゼ（PGK）、トリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、エノラーゼ（ENO）、アクチン（ACT）、シトクロムc（CYC）、トレハロース合成酵素（TPS）、アルコール脱水素酵素（ADH）等をコードする遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。また転写ターミネーターは、プロモーターからの転写に対して転写終結を起こす活性を有する配列であればよく、プロモーターの遺伝子と同じまたは異なる遺伝子のものであってもよい。
【００４８】
また、発現ベクターには、外来タンパク質をコードする遺伝子に酵母細胞で機能する分泌シグナル配列をコードするDNAを付加してもよく、これにより分泌産生が可能となり、所望の外来タンパク質を容易に単離精製することができる。分泌シグナル配列としては、S. cerevisiae由来のα−接合因子（αMF）の分泌シグナル配列、S.cerevisiae由来のインベルターゼ（SUC2）の分泌シグナル配列、ヒト由来α−ガラクトシダーゼの分泌シグナル配列などが挙げられる。
【００４９】
また、発現ベクターには、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含めることができる。例えば、酵母用発現ベクターには、his1、his2、his3、his4、his5、his6、leu2、arg1、arg2、arg3、trp1、lys2、ade1、ade2、ura3、ura5遺伝子等から選ばれる栄養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。
【００５０】
また、選択マーカーとしては、上記の栄養要求性マーカーのみならず、セルレニン、オーレオバシジン、ゼオシン、カナバニン、シクロヘキシミド、ハイグロマイシン、ブラストシジン、テトラサイクリン、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシンなどの薬剤に対して耐性を付与する薬剤耐性マーカーなどを使用することで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。また、エタノール等に対する溶剤耐性や、グリセロールや塩等に対する浸透圧耐性、銅等の金属イオン耐性等を付与する遺伝子をマーカーにすることで、形質転換体の選抜を行うことも可能である。
【００５１】
２．タンパク質の製造方法
本発明におけるタンパク質の製造は、１．の形質転換酵母を公知の方法により培養し、その培養物から採取し、精製することにより行うことができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
【００５２】
宿主細胞が酵母の場合、培養する培地としては、酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、酵母形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物；酢酸、乳酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸；メタノール、エタノール、プロパノール、グリセロール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩；尿素その他の含窒素化合物；アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物などの窒素性有機物質等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。また、栄養要求性を示す酵母の場合は、その生育に必要な栄養物質を培地に添加すればよい。該栄養物質としては、アミノ酸類、ビタミン類、核酸類、塩類等が挙げられる。また、培地には、選択マーカーの種類に応じ、オーレオバシジン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を適宜添加するか、あるいは、栄養要求性を相補する遺伝子（leu、ura、trp等）によって供給可能となるアミノ酸を除いてもよい。
【００５３】
また、プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した酵母を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、メタノール誘導性プロモーター（aox、das、moxなど）を用いた発現ベクターで形質転換した酵母を培養するときにはメタノールを、GALプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した酵母を培養するときにはガラクトースを培地に添加する。
【００５４】
また、上記培養は、酵母に特有のO型糖鎖付加を抑制するために、培地にPMT活性阻害剤を添加してもよい。PMT活性阻害剤としては、例えば、ロダニン-3-酢酸誘導体（5-[[3,4-(1-phenylmethoxy)phenyl]methylene]-4-oxo-2-thioxo-3-thiazolidineacetic acid（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004)中の化合物（1c））または{(5Z)-4-oxo-5-[3-(1-phenylethoxy)-4-(2-phenylethoxy)benzylidene]-2-thioxo-1,3-thiazolidin-3-yl}acetic acid（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, p3975, (2004)中の化合物（5a)）が挙げられる。
【００５５】
培養は、20〜30℃程度で24時間〜1000時間程度行う。培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養または連続培養等により実施することができる。
【００５６】
本発明の形質転換酵母がメタノール誘導性プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した酵母である場合、その培養はメタノールを添加した培地で行う。培地へのメタノール添加は、酵母の増殖をモニタリングしつつ、ポンプ等を用いて行えばよく、連続的又は断続的に行ってもよいが、培養の全期間にわたって行う必要はない。例えば、形質転換酵母（aox1遺伝子破壊株）を培養する場合、好ましくは０．３〜２％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．５〜１％（ｖ／ｖ）のメタノールを含有させた培地にてメタノール誘導培養を開始し、メタノール濃度が０．２〜０．３％（ｖ／ｖ）程度にまで低下した時点で一日当り、好ましくは終濃度０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは終濃度０．２〜０．４％（ｖ／ｖ）のメタノールを断続流加すればよい。
【００５７】
また、上記の形質転換酵母は、増殖に利用された培地中の炭素源が枯渇し飢餓状態におかれることによっても、メタノール誘導性プロモーターが強く活性化される。従って、炭素源枯渇後に培地中の炭素源濃度を適切に調節することによってメタノールを添加することなく、または０．２％（ｖ／ｖ）以下の低メタノール濃度でも培養を行うことができる。ここで言う「炭素源」とは、グリセリン、アラニン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、ラクトース等が挙げられ、「培地中の炭素源濃度を適切に調節する」とは、上記の炭素源を、本発明の形質転換酵母の生育、及び蛋白質発現の必要最小濃度で培地に添加することをいう。すなわち、目的菌体密度に到達すると同時に炭素源枯渇条件（炭素源飢餓条件）下で培養を行えばよい。例えば、形質転換酵母（aox遺伝子破壊株）を培養する場合、目的菌体密度に到達し炭素源の枯渇を確認すると同時に、グリセリンおよびソルビトールを好ましくは一日当り０．５〜６％（w/v）、より好ましくは一日当り１〜４％（w/v）連続流加すればよい。
【００５８】
また、上記の培養はプロテアーゼ活性を抑制する条件下で行うことが好ましい。プロテアーゼ活性を抑制する条件下で行うことにより酵母により分泌生産される目的タンパク質の分解が抑制され、その分泌生産量が大きく向上する。プロテアーゼ活性の抑制は、前述のような酵母のプロテイナーゼB遺伝子の破壊によっても達成されるが、培地のpHの制御によっても行うことができる。培地のpHは、培地中のプロテイナーゼA等の酸性プロテアーゼの活性を抑制し、かつ、酵母の生育に影響を与えないという観点から、pH6.0〜7.5が好ましい。pHの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行う。
【００５９】
さらに、上記の培養は窒素源を連続流加した条件下で行うことが好ましい。培養経時における窒素源の補給を行うことにより、蛋白質分泌生産性とその維持が大きく向上する。窒素源の一日当りの流加終濃度は、酵母エキス（Yeast extract）が0.1%〜0.75%（w/v）、L-ヒスチジン塩酸塩一水和物が0.05%〜0.15%（w/v）が好ましく、酵母エキス（Yeast extract）が0.3%〜0.5%（w/v）、L-ヒスチジン塩酸塩一水和物が0.1%〜0.13%（w/v）がより好ましい。窒素源の流加は、酵母エキス（Yeast extract）、L-ヒスチジン塩酸塩一水和物の混合液を使用することができる。
【００６０】
本発明の形質転換酵母の一態様であるシャペロン遺伝子が導入され、かつaox1遺伝子とプロテアーゼ遺伝子が破壊されている形質転換酵母を、上記のようなpH範囲の培地にて窒素源を添加して培養することにより、メタノール添加量は、シャペロン遺伝子のみを導入した形質転換酵母と比較して、メタノール添加量が4〜7％に低減できる。
【００６１】
培養後、上記の培養物（培養液、培養細胞）から外来タンパク質遺伝子の発現産物の確認は、SDS-PAGE、ウエスタン解析、ELISA等により行うことができる。生産されたタンパク質を単離精製するためには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。培養後、目的タンパク質が細胞内に生産される場合には、細胞を超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により破砕することにより、目的タンパク質を採取する。また、目的タンパク質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により目的タンパク質を採取し、必要に応じて各種クロマトグラフィー（疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー等）、分子篩を用いたゲルろ過法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法などの手法を単独あるいは組合わせて用いて単離精製すればよい。
【００６２】
上記の培養法、精製法は一例であって、これらに限定されるものではない。なお、精製された遺伝子産物が有するアミノ酸配列の確認は、公知のアミノ酸分析、例えばエドマン分解法による自動アミノ酸配列決定法等により行うことができる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明の技術的範囲をなんら限定するものではない。本発明の実施例で用いるプラスミド,制限酵素,DNA修飾酵素等は市販のものであり、常法に従って使用することができる。また、DNAのクローニング，塩基配列の決定，酵母の形質転換，形質転換酵母の培養等に用いた操作についても当業者によく知られているものであるか、文献により知ることのできるものである。【００６４】
〔実施例１〕外来遺伝子発現ベクターの構築
（１）ゼオシン耐性遺伝子を選択マーカーとしたNBRC10746（O.minuta, (Biological Resource Center, NITE)） aox1遺伝子プロモーター及びターミネーターカセットからなる外来遺伝子導入用ベクターの構築
NBRC10746のAOX1（GENBANK登録番号；AB242209）は、1992bpの塩基配列によりコードされる663のアミノ酸からなる（配列番号27、配列番号28）。Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent（PIERCE社, 78870）によって調製したNBRC10746のゲノムDNAを鋳型としてプライマーHd AOXp Fw（5’-GCAAGCTTTCTTTCGCAAACAGCTCTTTG-3’:配列番号1)とプライマーAOXp rv（5’-GAACCCGGGAACAGAATCTAGATTTTTTCGTAAGTCGTAAG-3’：配列番号2）を用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で15秒）×30サイクル]をPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社, RO45A）を使用して行ない、約2.4 kbpのaox1プロモーター領域と22 bpのスペーサー領域を含むaox1プロモーター領域含有DNA断片を増幅した。また、NBRC10746のDNAを鋳型としてプライマーAOXt fw（5’-CTGTTCCCGGGTTCCTGGATCCGAGACGGTGCCCGACTC-3’:配列番号3)とプライマーKp AOXt Rv（5’-GCGGTACCGTTAGTGGTACGGGCAG-3’:配列番号4）を用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で5秒）×30サイクル]を行ない、約0.8 kbpのaox1ターミネーター領域と22 bpのスペーサー領域を含むaox1ターミネーター領域含有DNA断片を増幅した。これらのDNA断片を鋳型としてプライマーHd AOXp FwとプライマーKp AOXt Rvを用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で15秒）×30サイクル]を行ない、約2.4 kbpのaox1プロモーター領域と約0.8 kbpのターミネーター領域を連結増幅した。連結したDNA断片についてはアガロース電気泳動後に回収し、pCR-Blunt II-TOPOにクローニングした。クローニングしたプラスミドを制限酵素HindIIIと制限酵素KpnIで二重消化して、aox1遺伝子プロモーターおよびターミネーターカセットを含むDNA断片を得た。【００６５】
WO2009/057813記載のプラスミドpOMexGP1Z(ゼオシン耐性遺伝子を選択マーカーとしたgap遺伝子プロモーターとターミネーターによる外来遺伝子発現ベクター)を制限酵素HindIIIと制限酵素KpnIで二重消化して、ゼオシン耐性遺伝子マーカーを含むDNA断片を得た。得られた断片に上記aox1遺伝子プロモーターおよびターミネーターカセットを含むDNA断片を導入し、プラスミドpOMEA-Z1を得た。【００６６】
〔実施例２〕ura3遺伝子破壊株の作製
（１）ura3遺伝子破壊用DNA断片の作製
ura3 ORFのプロモーター、及びターミネーターのDNA断片を利用した遺伝子破壊様式を図１に示す。NBRC10746のURA3（GENBANK登録番号；AB242207）は、798bpの塩基配列によりコードされる265のアミノ酸配列からなる（配列番号29、配列番号30）。Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent（PIERCE社, 78870）によって調製したNBRC10746のゲノムDNAを鋳型としてプライマーdURA Fw（5’-GGTACCAGTACTGGAAA-3’:配列番号5)とプライマーdURA rv（5’-CAGATAAACAGGCGACT TTTCGGGTCACGTGACT-3’:配列番号6）を用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で5秒）×30サイクル]をPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ社, RO45A）を使用して行ない、約0.5 kbpのura3ターミネーター領域と17 bpのura3プロモーター領域を含むura3ターミネーター領域含有DNA断片を増幅した。また、NBRC10746のDNAを鋳型としてプライマーdURA fw（5’-AGTCACGTGACCCGAAA AGTCGCCTGTTTATCTG-3’:配列番号7)とプライマーdURA Rv（5’-CCAAGGAGGAAGAAATT-3’:配列番号8）を用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で5秒）×30サイクル]を行ない、約1.2 kbpのura3プロモーター領域と17 bpのura3ターミネーター領域を含むura3プロモーター領域含有DNA断片を増幅した。これらのDNA断片を鋳型としてプライマーdURA FwとプライマーdURA Rvを用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で5秒）×30サイクル]を行ない、約1.2 kbpのura3プロモーター領域と約0.5 kbpのターミネーター領域を連結増幅した。連結したDNA断片についてはアガロース電気泳動後に回収し、ura3遺伝子破壊用断片とした。【００６７】
（２）ura3遺伝子破壊株の作製
ura3遺伝子破壊断片をNBRC10746株にエレクトロポレーション法にて導入した。YPD培地 5mlに植菌して28℃にて対数増殖期(OD600=0.5〜4程度)にまで12〜14時間培養した。1400×gで5分間の遠心分離により集菌し、菌体を10mlの氷冷した滅菌水で1回、続いて4 mlの氷冷した滅菌水で1回洗浄した。菌体を2mlのLCバッファー（100mM LiCl、50mMカリウムリン酸バッファーpH7.5）に懸濁し、28℃で45分間振盪した後、0.05mlの１M DTTを添加し、さらに15分間振盪した。1400×gで5分間の遠心分離により集菌後、氷冷したSTMバッファー（270mM sucroce，10mM Tris-HClバッファーｐH7.5、1mM MgCl2）8mlで洗浄した後、さらに1mlのSTMバッファーで洗浄し、0.05mlの氷冷したSTMバッファーに懸濁した。電気パルスによる形質転換実験は、BTX社のELECTRO  CELL MANIPULATOR ECM 600を用いて行った。0.05mlの菌体懸濁液と0.005ml（3μg）のura3遺伝子破壊断片DNA試料とを混合した後、0.2cmのディスポーザブルキュベットに入れ、適当な条件（電圧；1.5 kV，100-200Ω）の電気パルスを加えた。パルス後速やかに1 mlの氷冷した1 Mソルビトールを含むYPD培地を加え、28℃で4〜6時間振盪培養した。培養後、菌体を適当量の抗生物質を含むYPD選択培地に塗布した後、プレートを28℃で培養して、形質転換コロニーを得た。エレクトロポレーション後、終濃度0.1%(w/v)の5-FOA（5-Fluoroorotic acid）を含むYPAD寒天培地YPAD寒天培地[Yeast extract 10g/l, Peptone 20g/l, Glucose 20g/l、Adenin-HCl 40mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度0.1%(w/v)の5-FOA（5-Fluoroorotic acid）を含むYPAD寒天培地上にて増殖させた。URA3遺伝子が破壊されている形質転換体はコロニーPCR法によって選抜した。終濃度0.1%(w/v)の5-FOAを含むYPAD寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25% SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。得られた上清をDNA溶液としてura3プロモーター上流配列に設計したプライマーdURA check -1.5 kbp（5’-ATCACAGGAAAGCGCAT-3’：配列番号9）とura3ターミネーター下流配列に設計したプライマーdURA check +1kbp（5’-ATTCGAGCATCGCCGTG-3’：配列番号10）を使用して、ura3 coding regionを有さない約2.7 kbpの増幅が認められる株をura3遺伝子破壊株（Δura3株）とした。【００６８】
〔実施例３〕aox1遺伝子破壊株の作製
（１）aox1遺伝子破壊ベクターの作製
aox1 ORFのプロモーター、及びターミネーター領域のDNA断片を利用した遺伝子破壊様式を図２に示す。実施例１で構築したpOMEA-Z1をHindIIIおよびKpnIで二重消化することによりaox1遺伝子プロモーターおよびターミネーターカセットを含むDNA断片を得た。WO2009/057813記載のプラスミドonaP09007（OmKar2をコードする遺伝子の恒常発現ベクター）をHindIIIおよびKpnIで二重消化することで得られたDNA断片に上記aox1遺伝子プロモーターおよびターミネーターカセットを含むDNA断片を導入することにより、プラスミドpOMEU1を得た。【００６９】
（２）aox1遺伝子破壊株の作製
プラスミドpOMEU1を実施例２に記載のura3遺伝子破壊株（Δura3株）に実施例２に記載の条件でエレクトロポレーション法にて導入した。プラスミドpOMEU1は、制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた3μgのDNAを使用した。エレクトロポレーション後、カザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン20mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、カザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させaox1遺伝子破壊プラスミド導入株とした。【００７０】
次に、aox1遺伝子破壊プラスミド導入株を、5mlのYPAD培地[Yeast extract 10g/l, Peptone 20g/l, Glucose 20g/l, Adenin-HCl 40mg/l]が入った50ml容ポリプロピレン製遠沈管(グライナー社，227241)に接種し、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）で遠沈管上部をシールした。攪拌速度250rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間往復振盪培養後、終濃度0.1%(w/v)の5-FOAを含むYPAD寒天培地(Yeast extract 1g/l, Peptone 2g/l, Glucose 20g/l, Adenin-HCl 40mg/l, Agar 20g/l）上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度0.1%(w/v)の5-FOAを含むYPAD寒天培地上にて増殖させた。aox1遺伝子が破壊されている形質転換体はコロニーPCR法によって選抜した。終濃度0.1%(w/v)の5-FOAを含むYPAD寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25% SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。得られた上清をDNA溶液としてaox1 ORF配列内に設計したプライマーAOX ORF fw（5’-ATGGCTATTCCTGACGAATT-3’：配列番号11）とプライマーAOX ORF rv（5’-TTAGAATCTAGCCAGACCCTTC-3’：配列番号12）を使用してDNAの増幅を認めない株をaox1遺伝子破壊株（Δaox1株）とした。【００７１】
〔実施例４〕OmPDI1、OmERO1、及びOmKar2シャペロン導入株の作製
WO2009/057813記載のOmPDI1、OmERO1とOmKar2の共発現ベクターonaP11007を使用した（図３）。NBRC10746株にエレクトロポレーション法にてプラスミドonaP11007を導入した。プラスミドonaP11007は制限酵素NotIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。構築したonaP11007は制限酵素NotIで消化した後、実施例２に記載のエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション後、カザミノ酸-U-A寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7 g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン20mg/l, Agar 20g/L）上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた後、シャペロンが導入されている形質転換体をコロニーPCR法によって選抜した。カザミノ-U-A寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25% SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。得られた上清をDNA溶液として、pdi1遺伝子導入は、gapプロモーター配列内に設計したプライマーGAPpforS-F（5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：配列番号13）とプライマーOmPDI-END Rv（5’-TTACAACTCGTCGTGAGCC-3’：配列番号14）で約1.6 kbpのDNA増幅、ero1遺伝子導入は、gapプロモーター配列内に設計したプライマーGAPpforS-F（5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：配列番号13）とプライマーOmERO-END Rv（5’-TTATAGCTCCAAACGATACAG-3’：配列番号15）で約1.6 kbpのDNA増幅、kar2遺伝子導入は、pgkプロモーター配列内に設計したプライマーPGKp-END Fw（5’-TAAACACTAACGCCGCAT-3’：配列番号16）とプライマーOmKar-END Rv（5’-TCACAGCTCATCATGATCC-3’：配列番号17）で約2 kbpのDNA増幅を確認した。PCR はTaKaRa LA TaqTM with GC Buffer（タカラバイオ社, RR02AG）を使用して目的断片を増幅させた[(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で120秒）×30サイクル]。増幅を確認した形質転換体をシャペロン遺伝子導入株（ura3::pdi1/ero1/kar2, NBRC10746+PEK株）とした。【００７２】
〔実施例５〕prb1遺伝子分断株の作製
（１）prb1遺伝子分断ベクターの作製
prb1 ORFの内部配列を利用した遺伝子破壊様式を図４に示す。NBRC10746のPRB1は、1620bpの塩基配列によりコードされる539アミノ酸残基のアミノ酸配列からなる（配列番号31、配列番号32)。WO2009/057813記載のプラスミドpOMexPGHy(ハイグロマイシンB耐性遺伝子を選択マーカーとしたホスホグリセリンキナーゼ（PGK1）プロモーター及びターミネーターによる外来遺伝子発現ベクター)を制限酵素HindIIIと制限酵素KpnIで二重消化して、ハイグロマイシン耐性遺伝子マーカーを含むDNA断片を得た。Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent（PIERCE社, 78870）によって調製したNBRC10746のゲノムDNAを鋳型として、PRB1 ORF内に設計したプライマーDoprb1F（5’-CAAGCTTCGTTGGCAGCAGTGGAG-3’:配列番号18)とプライマーDoprb1R（5’-CGGTACCCGATGGAATCTCAGACA-3’:配列番号19）を用いたPCR [(98℃で10秒、55℃で5秒、72℃で5秒）×30サイクル]をPrimeStarmax Polymerase（タカラバイオ社, 12344-024）を使用して行ない、配列番号20に示す約1.4 kbpの目的DNA断片を増幅し、pCR2.1-TOPOにクローニングした。挿入DNA断片の塩基配列より、prb1内部配列を有していることを確認した。塩基配列を確認したDNA断片を保持するプラスミドから、プライマーDoprb1Fに導入した制限酵素HindIII部位とプライマーDoprb1Rに導入した制限酵素KpnＩ部位を利用して、HindIII-KpnＩ消化でprb1内部配列を含むDNA断片を回収した。prb1内部配列を含むDNA断片を、ハイグロマイシン耐性遺伝子マーカーを含むDNA断片に導入し、プラスミドpdPRB1を得た。【００７３】
（２）prb1遺伝子分断株の作製
NBRC10746株にエレクトロポレーション法にてプラスミドpdPRB1を導入した。プラスミドpdPRB1は制限酵素AgeＩで消化し、エタノール沈殿で得られた5μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン20mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ-U-A寒天培地上にて増殖させた後、プラスミドpdPRB1が導入されている形質転換体をコロニーPCR法によって選抜した。終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ-U-A寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25%(w/v) SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。得られた上清をDNA溶液として、PRB1 ORF配列内に設計したプライマーM13 RV（5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’：配列番号21）とpdPRB1配列内に設計したプライマーdprb1 check primer rv（5’-CTAATCGAACAAATCAGCAACC-3’：配列番号22）を使用して約1.5 kbpのDNAの増幅が確認された株、及びprb1 ORF配列内に設計したプライマーdprb1 check primer fw（5’-ATGAAGTTATCCCAGTCTGCTG-3’：配列番号23）とpdPRB1配列内のハイグロマイシン耐性遺伝子に設計したプライマーHyg-t（5’-CAAAGGAATAGATCCCCCAT-3’：配列番号24）を使用して約2 kbpのDNAの増幅が確認された株をprb1遺伝子分断株（prb1::hyg, dprb1株）とした。【００７４】
〔実施例６〕シャペロン遺伝子導入、及びprb1遺伝子分断株の作製
実施例４に記載のNBRC10746＋PEK株にエレクトロポレーション法にてプラスミドpdPRB1を導入した。プラスミドpdPRB1は制限酵素AgeIで消化し、エタノール沈殿で得られた5μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l、L-トリプトファン 20mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた後、プラスミドpdPRB1が導入されている形質転換体をコロニーPCR法によって選抜した。終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25%(w/v) SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。得られた上清をDNA溶液として、prb1 ORF配列内に設計したプライマーM13 RV（5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’：配列番号21）とpdPRB1配列内に設計したプライマーdprb1 check primer rv（5’-CTAATCGAACAAATCAGCAACC-3’：配列番号22）を使用して約1.5 kbpのDNAの増幅が確認された株、及びprb1 ORF配列内に設計したプライマーdprb1 check primer fw（5’-ATGAAGTTATCCCAGTCTGCTG-3’：配列番号23）とpdPRB1配列内のハイグロマイシン耐性遺伝子に設計したプライマーHyg-t（5’-CAAAGGAATAGATCCCCCAT-3’：配列番号24）を使用して約2 kbpのDNAの増幅が確認された株をシャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株（ura3::pdi1/ero1/kar2 prb1::hyg、NBRC10746+PEK dprb1株）とした。【００７５】
〔実施例７〕aox1遺伝子破壊、及びシャペロン導入株の作製
実施例３に記載のΔaox1株にエレクトロポレーション法にてプラスミドonaP11007を導入した。プラスミドonaP11007は制限酵素NotIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、カザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l、L-トリプトファン 20mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度カザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた後、シャペロン遺伝子が導入されている形質転換体をコロニーPCR法によって選抜した。カザミノ酸-U-A寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25% SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。【００７６】
得られた上清をDNA溶液として、pdi1遺伝子導入は、gapプロモーター配列内に設計したプライマーGAPpforS-F（5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：配列番号13）とプライマーOmPDI-END Rv（5’-TTACAACTCGTCGTGAGCC-3’：配列番号14）で約1.6 kbpのDNA増幅、ero1遺伝子導入は、gapプロモーター配列内に設計したプライマーGAPpforS-F（5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：配列番号13）とプライマーOmERO-END Rv（5’-TTATAGCTCCAAACGATACAG-3’：配列番号15）で約1.6 kbpのDNA増幅、kar2遺伝子導入は、pgkプロモーター配列内に設計したプライマーPGKp-END Fw（5’-TAAACACTAACGCCGCAT-3’：配列番号16）とプライマーOmKar-END Rv（5’-TCACAGCTCATCATGATCC-3’：配列番号17）で約2 kbpのDNA増幅を確認した。PCR はTaKaRa LA TaqTM with GC Buffer（タカラバイオ社, RR02AG）を使用して目的断片を増幅させた[(94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で120秒）×30サイクル]。増幅を確認した形質転換体をaox1遺伝子破壊、及びシャペロン遺伝子導入株（Δaox1, ura3::pdi1/ero1/kar2、Δaox1+PEK株）とした。【００７７】
〔実施例８〕aox1遺伝子破壊、シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株の作製
実施例７に記載のΔaox1+PEK株にエレクトロポレーション法にてプラスミドpdPRB1を導入した。プラスミドpdPRB1は制限酵素AgeＩで消化し、エタノール沈殿で得られた5μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l、L-トリプトファン 20mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200 μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた後、プラスミドpdPRB1が導入されている形質転換体をコロニーPCR法によって選抜した。終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上で増殖した酵母の一部を10μLの0.25%(w/v) SDS溶液に懸濁し、90μLの滅菌水を加えた後、遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去した。【００７８】
得られた上清をDNA溶液として、prb1 ORF配列内に設計したプライマーM13 RV（5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’：配列番号21）とpdPRB1配列内に設計したプライマーdprb1 check primer rv（5’-CTAATCGAACAAATCAGCAACC-3’：配列番号22）を使用して約1.5 kbpのDNAの増幅が確認された株、及びprb1 ORF配列内に設計したプライマーdprb1 check primer fw（5’-ATGAAGTTATCCCAGTCTGCTG-3’：配列番号23）とpdPRB1配列内のハイグロマイシン耐性遺伝子に設計したプライマーHyg-t（5’-CAAAGGAATAGATCCCCCAT-3’：配列番号24）を使用して約2 kbpのDNAの増幅が確認された株をaox1遺伝子破壊、シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株（Δaox1, ura3::pdi1/ero1/kar2, prb1::hyg、Δaox1+PEK dprb1株）とした。【００７９】
〔実施例９〕deep well plate scaleでのメタノール誘導によるKEX2蛋白質の分泌量の分泌量
（１）kex2発現プラスミドの作製
S.cerevisiaeのKEX2（GENBANK登録番号：M22870.1）蛋白質は、814アミノ酸残基からなる（配列番号33)。S.cerevisiae 由来のα Factorプレ配列、α Factorプロ配列、KEX2(配列番号33の24番〜660番)、さらに9つのHisを有するHis9タグを融合タンパク質として発現させるため、P.pastorisのコドン使用頻度で配列番号25に示す塩基配列をLife technologies社にて人工合成した。人工合成した塩基配列を含むベクターを制限酵素XbaＩと制限酵素BamHＩで消化し、実施例１で作製したpOMEA-Z1を制限酵素XbaＩと制限酵素BamHＩで消化した断片に導入した。得られたプラスミドをkex2発現プラスミド(pOMEA-Z1-KEX2)とした（図５）。【００８０】
（２）KEX2産生株の作製
（２−１）シャペロン導入株由来KEX2産生株の作製
実施例４に記載のNBRC10746+PEK株にエレクトロポレーション法にて上記のkex2発現プラスミドを導入した。kex2発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base w/o amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l、L-トリプトファン 20mg/l, Agar 20g/l]上に塗沫し、28℃で約3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200 μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００８１】
KEX2生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地[20gのYeast extractと40gのPeptoneを900mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を100ml、別滅菌した50%グルコース溶液を10ml、別滅菌した80%グリセリンを6.25ml添加して調製]を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地[20gのYeast extractと40gのPeptoneを900mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を100ml添加して調製]を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)メタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しKEX2産生試料とした。分泌生産されたKEX2の定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。SDS-PAGEバッファー（SDS/β-メルカプトエタノール）を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識penta-His 特異的抗体（Penta-His HRP Conjugate Kit )(QIAGEN社, 34460 ）で発光検出した。選抜されたKEX2産生株をシャペロン導入株（ura3::pdi1/ero1/kar2, NBRC10746+PEK株）由来KEX2産生株とした。【００８２】
（２−２）シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株由来KEX2産生株の作製
実施例６に記載のNBRC10746+PEK dprb1株にエレクトロポレーション法にて上記のkex2発現プラスミドを導入した。kex2発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００８３】
KEX2生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dpn培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)メタノール含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しKEX2産生試料とした。分泌生産されたKEX2の定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。SDS-PAGEバッファー（SDS/β-メルカプトエタノール）を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTMWestern Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識penta-His 特異的抗体（Penta-His HRP Conjugate Kit )(QIAGEN社, 34460 ）で発光検出した。選抜されたKEX2産生株をシャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株（ura3::pdi1/ero1/kar2, prb1::hyg, NBRC10746+PEK dprb1）由来KEX2産生株とした。【００８４】
（２−３）aox1遺伝子破壊、及びシャペロン導入株由来KEX2産生株の作製
実施例７に記載のΔaox1+PEK株にエレクトロポレーション法にて上記のkex2発現プラスミドを導入した。kex2発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で約2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００８５】
KEX2生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、5%(w/v)のグリセリン、及び5%(v/v)のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び5%(w/v)のグリセリンを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しKEX2産生試料とした。分泌生産されたKEX2の定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。培養上清5μlに対し、トリスSDS b-MEサンプル処理液（コスモバイオ社、423437）5μl を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識penta-His 特異的抗体（Penta-His HRP Conjugate Kit )(QIAGEN社, 34460 ）で発光検出した。選抜されたKEX2産生株をaox1遺伝子破壊、シャペロン導入株（Δaox1, ura3::pdi1/ero1/kar2、Δaox1+PEK株）由来KEX2産生株とした。【００８６】
（２−４）aox1遺伝子破壊、シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株由来KEX2産生株の作製
実施例８に記載のΔaox1+PEK dprb1株にエレクトロポレーション法にて上記のkex2発現プラスミドを導入した。kex2発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で約2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００８７】
KEX2生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、5%（w/v）のグリセリン、及び5%（v/v）のメタノール含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び5%のグリセリンを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しKEX2産生試料とした。分泌生産されたKEX2の定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。培養上清5μlに対し、トリスSDS b-MEサンプル処理液（コスモバイオ社、423437）5μl を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識penta-His 特異的抗体（Penta-His HRP Conjugate Kit )(QIAGEN社, 34460）で発光検出した。選抜されたKEX2産生株をaox1遺伝子破壊、シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株(Δaox1, ura3::pdi1/ero1/kar2, prb1::hyg、Δaox1+PEK dprb1株)由来KEX2産生株とした。【００８８】
（３）KEX2分泌生産量の比較
上記で得られた各KEX2分泌生産株を終濃度200μg/mlのゼオシン（dprb1由来株は終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンB）を含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に上記で得られた各KEX2産生株を塗沫し、28℃で約2日間増殖させた。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養した。その後、NBRC10746+PEK由来株、及びNBRC10746+PEK dprb1由来株については、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、10%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。また、Δaox1+PEK由来株、及びΔaox1+PEK dprb1由来株については、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、5%（w/v）のグリセリン、及び5%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び、5%（w/v）のグリセリンを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しKEX2産生試料とした。【００８９】
KEX2産生試料は、糖鎖切断酵素Endo H（NEW ENGLAND Bio Labs社，P0702S）により産生KEX2に付加したN結合型糖鎖を除去し、試料をSDS-PAGE/CBB染色によるバンド強度によって比較した。バンド強度は、ATTO社製Light-CaptureでSDS-PAGEゲルを撮影し、解析ソフトCool Saver2(ATTO社，Version 1.01.1058)を使用して測定した。図６−１に示すように、コントロール(NBRC10746+PEK株)がバンド強度81178を示すのに対して、NBRC10746＋PEK dprb1株はバンド強度93277とコントロールの約1.1倍の分泌生産の向上を示した。一方、Δaox1+PEK dprb1株ではNBRC10746+PEK株、及びNBRC10746+PEK dprb1株より低濃度のメタノールを添加でバンド強度143819とコントロールの約1.8倍と高い分泌生産の向上が認められた。特に、Δaox1+PEK dprb1株はコントロールより低濃度のメタノール添加で高い分泌生産性を示した。【００９０】
〔実施例１０〕KEX2蛋白質の酵素活性比較
実施例９で分泌生産されたKEX2酵素活性は図６−２に示す。 Boc-Leu-Arg-Arg-MCA (4-methylcoumaryl-7-amide) (ペプチド研究所, #3140-v) を基質としたKEX2の反応によって遊離するAMC (7-amino-4-methylcoumarin)を蛍光検出することにより評価した。培養上清から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製してKEX2産生試料とした。試料を100mM Tris (pH7.0) によって適切に希釈した後、希釈試料100μlと基質溶液[400 mM Tris (pH 7.0), 2 mM CaCl2, 0.2% lubrol, 100 μM BOC-Leu-Arg-Arg-MCA] 100μlを混合し、28℃で30分間反応させ、反応停止液(5mM EGTA (Na))50μlを加え反応を停止させた。反応停止後蛍光プレートリーダーを用いてAMCの定量を行った(励起波長355nm、測定波長460nm)。AMC(ペプチド研究所製, #3099-v) 標品を同様に希釈、検出することで検量線を作成し、試料中のKEX2プロテアーゼの活性を算出した。なおKEX2活性1 unitは、上記の反応条件下で1分間に1 pmolのAMCを遊離するKEX2含量と定義した。コントロール(NBRC10746+PEK株)に対して、Δaox1+PEK dprb1株では、・BR>・.8倍の高い酵素活性の向上が認められた。【００９１】
〔実施例１１〕deep well plate scaleでのメタノール誘導によるHSA蛋白質の分泌量
（１）hsa発現プラスミドの作製
HSA（Human serum albumin）[GENBANK登録番号；NP000468]は、609のアミノ酸配列からなる（配列番号34)。S.cerevisiae 由来のα Factorプレ配列、α Factorプロ配列、さらにHSAを融合蛋白質として発現させるため、P.pastorisのコドン使用頻度で配列番号26に示すDNAをLife technologies社にて人工合成した。人工合成したDNAを含むベクターを制限酵素XbaＩと制限酵素BamHＩで消化し、pOMEA-Z1を制限酵素XbaＩと制限酵素BamHＩで消化した断片に導入した。得られたプラスミドをhsa発現プラスミド(pOMEA-Z1-HSA)とした（図７）。【００９２】
（２）HSA産生株の作製
（２−１）シャペロン導入株由来HSA産生株の作製
実施例４に記載のNBRC10746+PEK株にエレクトロポレーション法にて上記のhsa発現プラスミドを導入した。hsa発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地[Yeast Nitrogen Base W/O amino acids 6.7g/L, Casamino acid 0.5g/L, Glucose 20g/L、L-トリプトファン 20mg/L, Agar 20g/L]上に塗沫し、28℃で約2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００９３】
HSA生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地[20gのYeast extractと40gのPeptoneを900mLの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を100ml、別滅菌した50%のグルコース溶液を10ml、別滅菌した80%のグリセリンを6.25ml添加して調製]を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地[20gのYeast extractと40gのPeptoneを900mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を100ml添加して調製]を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)メタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。分泌生産されたHSAの定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。培養上清5μlに対し、トリスSDS b-MEサンプル処理液（コスモバイオ社、423437）5μl を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識Human Albumin特異的抗体（Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated)(BETHL社, A80-129P）で発光検出した。選抜されたHSA産生株をシャペロン導入株（ura3::pdi1/ero1/kar2、NBRC10746+PEK株）由来HSA産生株とした。【００９４】
（２−２）シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株由来HSA産生株の作製
実施例６に記載のNBRC10746+PEK dprb1株にエレクトロポレーション法にて上記のhsa発現プラスミドを導入した。hsa発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００９５】
HSA生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dpn培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%(v/v)メタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。分泌生産されたHSAの定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。SDS-PAGEバッファー（SDS/β-メルカプトエタノール）を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識Human Albumin特異的抗体（Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated)(BETHL社, A80-129P）で発光検出した。選抜されたHSA産生株をシャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株（ura3::pdi1/ero1/kar2, prb1::hyg、NBRC10746+PEK dprb1）由来HSA産生株とした。【００９６】
（２−３）aox1遺伝子破壊、及びシャペロン導入株由来HSA産生株の作製
実施例７に記載のΔaox1+PEK株にエレクトロポレーション法にて上記のhsa発現プラスミドを導入した。hsa発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で約2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００９７】
HSA生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、5%(w/v)のグリセリン、及び5%(v/v)のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び5%(w/v)のグリセリンを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。分泌生産されたHSAの定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。培養上清5μlに対し、トリスSDS b-MEサンプル処理液（コスモバイオ社、423437）5μl を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識Human Albumin特異的抗体（Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated)(BETHL社, A80-129P）で発光検出した。選抜されたHSA産生株をaox1遺伝子破壊、シャペロン導入株（Δaox1, ura3::pdi1/ero1/kar2、Δaox1+PEK株）由来HSA産生株とした。【００９８】
（２−４）aox1遺伝子破壊、シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株由来HSA産生株の作製
実施例８に記載のΔaox1+PEK dprb1株にエレクトロポレーション法にて上記のhsa発現プラスミドを導入した。hsa発現プラスミドは制限酵素BglIIで消化し、エタノール沈殿で得られた1μgのDNAを使用した。エレクトロポレーションは、実施例２に記載の条件で実施し、エレクトロポレーション後、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で約2-3日間増殖させた。増殖した形質転換体は、再度、終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地上にて増殖させた。【００９９】
HSA生産株は、以下のように培養して高生産株を選抜した。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養後、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、5%（w/v）のグリセリン、及び5%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び5%のグリセリンを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。分泌生産されたHSAの定量的アッセイは、ドットブロット法により実施した。SDS-PAGEバッファー（SDS/β-メルカプトエタノール）を添加し、100℃で5分間反応させた培養上清を、ニトロセルロース膜に1μl滴下し、培養上清の蛋白質を吸着させ、ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent（GE Healthcare社，RPN2235）とペルオキシダーゼ標識Human Albumin特異的抗体（Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated)(BETHL社, A80-129P）で発光検出した。選抜されたHSA産生株をaox1遺伝子破壊、シャペロン導入、及びprb1遺伝子分断株(Δaox1, ura3::pdi1/ero1/kar2, prb1::hyg、Δaox1+PEK dprb1株)由来HSA産生株とした。【０１００】
（３）HSA分泌生産量の比較
上記で得られた各HSA分泌生産株を終濃度200μg/mlのゼオシン（dprb1由来株は終濃度200μg/mlのゼオシン終濃度と200μg/mlのハイグロマイシンB）を含むカザミノ酸-U-A寒天培地上に塗沫し、28℃で約2日間増殖させた。2xYP-P6-dp培地を使用し、96-deep well plate（グライナー社, 780271）に、800μlの2xYP-P6-dp培地を仕込み、爪楊枝で接種した後、CO2透過性プレートシール（グライナー社, 676051）でプレート上部をシールした。攪拌速度310rpm、振幅25mm、培養温度28℃で2日間培養した。その後、NBRC10746+PEK由来株、及びNBRC10746+PEK dprb1由来株については、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、10%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び10%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。また、Δaox1+PEK由来株、及びΔaox1+PEK dprb1由来株については、40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、5%（w/v）のグリセリン、及び5%（v/v）のメタノールを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加し、さらに、培養3日目に40μMのロダニン-3-酢酸誘導体1c、及び、5%（w/v）のグリセリンを含む2xYP-P6-dpn培地を100μl添加した。培養4日目の培養終了液から遠心分離（3,100×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。試料をSDS-PAGE/CBB染色によるバンド強度によって比較した。バンド強度は、ATTO社製Light-CaptureでSDS-PAGEゲルを撮影し、解析ソフトCool Saver2(ATTO社，Version 1.01.1058)を使用して測定した。図８に示すように、コントロール(NBRC10746+PEK株)がバンド強度1585061を示すのに対して、NBRC10746+PEK dprb1株ではバンド強度2882752とコントロールの1.8倍、Δaox1+PEK株では2111007とコントロールの1.3倍、Δaox1+PEK dprb1株では3041627とコントロールの1.9倍の最も高い分泌生産の向上が認められた。Δaox1+PEK株、特に、Δaox1+PEK dprb1株はコントロール（NBRC10746+PEK株）より低濃度のメタノール添加で高い分泌生産性を示した。【０１０１】
〔実施例１２〕3L通気攪拌培養スケールでのメタノール誘導によるHSA蛋白質の分泌生産量
実施例１１で得られた各HSA産生株（NBRC10746+PEK株、Δaox1+PEK dprb1株）について、3L通気攪拌培養スケールでのメタノール誘導によるHSA蛋白質の分泌生産量の比較を行った。3L通気攪拌培養については、以下のように実施した。終濃度200μg/mlのゼオシン（dprb1由来株は終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンB）を含むカザミノ酸-U-A寒天培地（Yeast Nitrogen Base W/O amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン 20mg/l, Agar 20g/l）上に実施例１１で得られた各HSA産生株（NBRC10746+PEK株、Δaox1+PEK dprb1株）を塗沫し、28℃で約2日間増殖させた。増殖した株を5mlの終濃度25μg/mlのゼオシン（dprb1由来株は終濃度25μg/mlのゼオシンと終濃度50μg/mlのハイグロマイシンB）を含むカザミノ酸-U-A培地（Yeast Nitrogen Base W/O amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン20mg/l）が入った50ml容ポリプロピレン製遠沈管(グライナー社，227241)に接種し、プレートシール（グライナー社, 676051）で上部をシールした。攪拌速度250rpm、振幅25mm、培養温度28℃で24時間往復振盪培養して得た培養終了液を第1種培養液とした。【０１０２】
次に、終濃度25μg/mlのゼオシン（dprb1由来株は終濃度25μg/mlのゼオシンと終濃度50μg/mlのハイグロマイシンB）を含む2x YP-P6 seed培地[20gのYeast extractと40gのPeptoneを900mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を100ml、別滅菌した50% グルコース溶液を12.5mL、別滅菌した80%グリセリンを62.5ml添加して調製]40mlが入った500ml容バッフルフラスコ（BD Falcon社，355123）に第1種培養液を10ml接種し、プレートシール（グライナー社, 676051）で上部をシールした。攪拌速度180rpm、振幅50mm、培養温度28℃で24時間回転振盪培養して得た培養終了液を第2種培養液とした。【０１０３】
次に、3x YP-P6 培地[36gのYeast extractと72gのPeptoneを1080mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を120ml、別滅菌した50%（w/v）のグルコース溶液を12ml、別滅菌した80%(w/v)のグリセリンを60ml、消泡剤CB-442を100μg添加して調製（dprb1由来株は50mg/mlのハイグロマイシンBを1.2ml添加）]を仕込んだ3L培養槽（エイブル社，BMS-03PI加圧型及びBMS-03PII加圧型）に第2種培養液60mlを接種した。培養温度28℃、内圧0.1MPa、DO 2ppm(攪拌による自動制御)で培養を実施した。培養8時間後に50%（w/v）のグリセリン水溶液を毎時3mlで培養24時間後まで連続流加した。培地中のグリセリンの枯渇を確認後、40mMのロダニン-3-酢酸誘導体1cを780μl添加した。【０１０４】
続いてメタノール誘導培養を以下に示す方法で実施した。コントロール（NBRC10746+PEK株：Jar1）については、前記のグリセリンの枯渇を確認した培地に、滅菌水を32ml、及び100%のメタノールを12ml添加してメタノール誘導培養を開始した。メタノール誘導培養開始から2時間目より、1日当り滅菌水20ml、及び100%のメタノール86mlを培養終了日まで連続流加した。NBRC10746+PEK株(Jar2）およびΔaox1+PEK dprb1株(Jar3)については、pH制御、及び窒素源流加によるメタノール誘導培養を以下に示す方法で実施した。BRC10746+PEK株(Jar2）については、前記のグリセリンの枯渇を確認した培地に、10%(w/v)のL-ヒスチジン塩酸塩1水和物を32ml添加後、14%（v/v）のアンモニア水でpH6.5に自動制御を開始し、100%のメタノールを12ml添加してメタノール誘導培養を開始した。Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)については、前記のグリセリン枯渇を確認した培地に、10%（w/v）のL-ヒスチジン塩酸塩1水和物を32ml、及び50mg/mlのハイグロマイシンBを1.2ml添加後、14%（v/v）のアンモニア水でpH6.5に自動制御を開始し、100%のメタノールを6.5ml添加してメタノール誘導培養を開始した。その後、NBRC10746+PEK株(Jar2）については、メタノール誘導培養3時間目にpH6.75に、6時間目以降はpH7になるように培養液のpHを制御した。さらに誘導培養開始直後から、1日当り窒素源流加液[Yeast extract 300g/l, L-ヒスチジン塩酸塩1水和物80g/l]を20ml、及び100%のメタノール86mlを培養終了日まで連続流加した。Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)については、メタノール誘導培養3時間目にpH6.75に、6時間目以降はpH7になるように培養液のpHを制御した。さらに、誘導培養開始直後から、1日当り窒素源流加液を20ml、80%(w/v)のグリセリンを30ml、滅菌水56mlを培養終了日まで連続流加し、メタノール誘導培養24時間以降に1日当り50mg/mlのハイグロマイシンBを1.2ml、及び終濃度0.2-0.5%（v/v）のメタノールを断続流加した。なお、メタノール誘導培養9日目より1日当り100mlの培養液をオーバーフローさせた。【０１０５】
各培養液を遠心分離（3000×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。分泌生産されたHSAの定量的アッセイは、試料をSDS-PAGE/CBB染色によるバンド強度によって比較した。バンド強度は、ATTO社製Light-CaptureでSDS-PAGEゲルを撮影し、解析ソフトCool Saver2(ATTO社，Version 1.01.1058)を使用して測定した。Albumin Standard （Thermo scientifi社：232209）を標品としたバンド強度の検量線からHSAを定量した。【０１０６】
HSAの分泌生産量の定量結果を図９に示す。コントロール（NBRC10746+PEK株:Jar1）は、生産性のピークがメタノール誘導培養4-5日目であった。また、pH制御、及び窒素源流加培養では、NBRC10746+PEK株(Jar2)は、生産性のピークがメタノール誘導培養2-3日目であり、4日目以降は分泌生産されたHSAの分解が顕著に認められるのに対し、Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)は、21日目まで生産性が維持され、かつ分解物の生成もほとんど認められず長期培養が可能なタンパク質生産系であることが確認された。HSAの分泌生産量については、pH制御、及び窒素源流加培養では、コントロール（NBRC10746+PEK株:Jar1）と比較し、NBRC10746+PEK株(Jar2)では約1.4倍（2486 mg/L→3594 mg/L）、Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)では約2.9倍 (2486 mg/L→7104 mg/L)の分泌生産性の向上が確認された。また、メタノール添加量について、メタノール誘導培養7日目までで比較すると、コントロール(NBRC10746+PEK株:Jar1) 及びNBRC10746+PEK株(Jar2)に対し、Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)は約1/17(5.8%)に低減した。従って、pH制御、及び窒素源流加培養のΔaox1+PEK dprb1株(Jar3)はコントロール(NBRC10746+PEK株:Jar1) 及びNBRC10746+PEK株(Jar2)と比較し、添加するメタノール量を大幅に減少させつつ高い分泌生産性を示すことが確認された。【０１０７】
〔実施例１３〕3L通気攪拌培養スケールでの炭素源飢餓誘導によるHSA蛋白質の分泌生産性
実施例１１で得られたΔaox1+PEK dprb1株由来HSA産生株について、3L通気攪拌培養スケールでの炭素源飢餓誘導とメタノール誘導によるHSA蛋白質の分泌生産量の比較を行った。3L通気攪拌培養については、以下のように実施した。終濃度200μg/mlのゼオシンと終濃度200μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A寒天培地（Yeast Nitrogen Base W/O amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン 20mg/l, Agar 20g/l）上に実施例１１で得られたΔaox1+PEK dprb1株由来HSA産生株を塗沫し、28℃で約2日間増殖させた。増殖した株を5mlの終濃度25μg/mlのゼオシンと終濃度50μg/mlのハイグロマイシンBを含むカザミノ酸-U-A培地（Yeast Nitrogen Base W/O amino acids 6.7g/l, Casamino acid 0.5g/l, Glucose 20g/l, L-トリプトファン 20mg/l）が入った50ml容ポリプロピレン製遠沈管(グライナー社，227241)に接種し、プレートシール（グライナー社, 676051）で上部をシールした。攪拌速度250rpm、振幅25mm、培養温度28℃で24時間往復振盪培養して得た培養終了液を第1種培養液とした。【０１０８】
次に、終濃度31.25μg/mlのゼオシンと終濃度62.5μg/mlのハイグロマイシンBを含む2x YP-P6 seed培地[20gのYeast extractと40gのPeptoneを900mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を100ml、別滅菌した50% グルコース溶液を12.5mL、別滅菌した80%グリセリンを62.5ml添加して調製]40mlが入った500ml容バッフルフラスコ（BD Falcon社，355123）に第1種培養液を10ml接種し、プレートシール（グライナー社, 676051）で上部をシールした。攪拌速度180rpm、振幅50mm、培養温度28℃で24時間回転振盪培養して得た培養終了液を第2種培養液とした。【０１０９】
次に、3x YP-P6 培地[45gのYeast extractと90gのPeptoneを1350mlの純水に溶解し、高圧蒸気滅菌した後、別滅菌した10xリン酸緩衝液(pH6.0)（1M KH2PO4, 0.15M (NH4)2SO4, 0.355N KOH）を150ml、別滅菌した50%（w/v）のグルコース溶液を15ml、別滅菌した80%(w/v)のグリセリンを75ml、50mg/mlのハイグロマイシンBを1.5ml、消泡剤CB-442を100μg添加して調製]を仕込んだ3L培養槽（エイブル社，BMS-03PI加圧型及びBMS-03PII加圧型）に第2種培養液75mlを接種した。培養温度28℃、内圧0.1MPa、DO 2ppm(攪拌による自動制御)で培養を実施した。培養8時間後から50%（w/v）のグリセリン水溶液を毎時4.3mlで培養22時間後まで連続流加した。【０１１０】
培地中のグリセリンの枯渇を確認した後、続いてメタノール誘導培養、または炭素源の飢餓条件下、aoxプロモーターからの誘導培養について以下に示す方法で実施した。メタノール誘導培養（コントロール）では、前記のグリセリン枯渇を確認した培地に、滅菌水を54ml、10%（w/v）のL-ヒスチジン塩酸塩1水和物を40ml、及び50mg/mlのハイグロマイシンBを1.5ml添加後、培養液を14%（v/v）のアンモニア水でpH6.5に制御し、100%のメタノールを8.5ml添加してメタノール誘導を開始した。その後、メタノール誘導培養3時間目にpH6.75に、6.5時間目以降はpH7になるよう培養液のpHを制御した。さらにメタノール誘導培養の開始直後から、1日当り窒素源流加液[Yeast extract 300g/l, L-ヒスチジン塩酸塩1水和物80g/l]を12.5ml、80%(w/v)のグリセリン37.5mlを培養終了日まで連続的に流加し、メタノール誘導培養24時間以降に1日当り5.1-5.7mlの100%のメタノール（終濃度0.25-0.35%（v/v))を断続的に流加した。さらにメタノール誘導培養48、96、及び144時間目に50mg/mlのハイグロマイシンBを1.5ml添加した。【０１１１】
一方、炭素源を枯渇させる飢餓誘導培養では、前記のグリセリン枯渇を確認した培地に、10%（w/v）のL-ヒスチジン塩酸塩1水和物を40ml、及び50mg/mlのハイグロマイシンBを1.5ml添加後、14%（v/v）のアンモニア水でpH6.5に制御し、炭素源枯渇状態による飢餓誘導培養(以下、「炭素源飢餓誘導培養」という）を開始した。炭素源飢餓誘導培養3時間目にpH6.75に、6.5時間目以降はpH7になるよう培養液のpHを制御した。さらに炭素源飢餓誘導培養の開始直後から、1日当り窒素源流加液[Yeast extract 300g/l, L-ヒスチジン塩酸塩1水和物80g/l]を12.5ml、65%（w/v）のソルビトールを92ml連続流加した。炭素源飢餓誘導培養24時間目以降は、1日当り窒素源流加液を12.5ml、80%(w/v)のグリセリン37.5mlを培養終了日まで連続流加した。さらに炭素源飢餓誘導培養48、96、及び144時間目に1日当り50mg/mlのハイグロマイシンBを1.5mlを断続流加した。【０１１２】
各培養液を遠心分離（3000×g, 4℃, 5分間）によって菌体を除去して培養上清を調製しHSA産生試料とした。分泌生産されたHSAの定量的比較は、試料をSDS-PAGE/CBB染色による染色強度により比較した。HSAの分泌生産量の定量結果を図１０に示す。炭素源飢餓誘導培養では、メタノール誘導培養と比較し、ほぼ同等の生産性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明は、抗原や抗体などの医療用タンパク質の製造分野に利用できる。【０１１４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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