(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ（ボレリアの細胞表層タンパク質Ａ）断片を含むポリペプチドであって、前記ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片が、Ｎ末端からＣ末端に向かう方向で、
（ｉ）配列番号８を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの対応断片ではない、ボレリア株に由来するＯｓｐＡのアミノ酸１２５〜１７６またはアミノ酸１２６〜１７５からなる第１のＯｓｐＡ部分、および
（ｉｉ）Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡ（配列番号８）のアミノ酸１７６〜２７４またはアミノ酸１７７〜２７４からなる第２のＯｓｐＡ部分
からなり、前記第２のＯｓｐＡ部分が、対応する野生型配列とは少なくとも配列番号８の位置１８３＋/−３の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号８の位置２７０＋/−３の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに前記第２のＯｓｐＡ部分の位置１８３＋/−３のシステインと位置２７０＋/−３のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されている、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号５１のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項４】
第２のＣ末端ＯｓｐＡ断片をさらに含み、前記ＯｓｐＡ断片が、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインからなり、前記ＯｓｐＡ断片が、対応する野生型ＯｓｐＡ配列とは少なくとも一つのジスルフィド結合が導入されている点で少なくとも異なる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）脂質付加されているか、もしくは、脂質化シグナル、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｌｐｐ脂質化シグナルMKATKLVLGAVILGSTLLAG (配列番号 15)
を含むか、且つ／または
（ｉｉ）脂質化のための部位としてのＮ末端システイン残基によって生じる脂質化部位ペプチド、好ましくはＣＳＳを含むか、且つ／または
（ｉｉｉ）前記ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片と前記第２のＣ末端ＯｓｐＡ断片との間にリンカーを含み、特に、前記リンカーが
GTSDKNNGSGSKEKNKDGKYS (配列番号 16)
を含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）からなる、請求項４または５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２７のアミノ酸配列（ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）を含むか、または配列番号２７のアミノ酸配列（ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）からなる、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子であって、特に、配列番号２６の核酸配列を含むか、または配列番号２６の核酸配列からなる、前記核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生するための方法であって、請求項８に記載の核酸分子を発現させる工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
以下の工程によって特徴づけられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを産生するための方法：
（ａ）前記ポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｂ）前記ポリペプチドを発現させることができる条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程、
（ｃ）前記宿主細胞をホモジナイズする工程、および
（ｄ）前記宿主細胞ホモジネートを精製工程に供する工程。
【請求項１１】
請求項１に記載のハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片に選択的に結合するが、単独の前記第１のＯｓｐＡ部分および前記第２のＯｓｐＡ部分には結合しない、抗体または少なくともその有効な部分であって、前記有効な部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）Ｎ断片、Ｆ（ａｂ）２断片またはＦｖ断片を含む、前記抗体または少なくともその有効な部分。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載の核酸分子および／または請求項１１に記載の抗体、並びに
（ｉｉ）任意に、薬学的に許容可能な賦形剤
を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
前記薬学的に許容される賦形剤はＬ−メチオニンを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）以外の病原体由来の少なくとも１つのさらなる抗原をさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物を含み、前記少なくとも１つのさらなる抗原が第２の組成物中に含まれる、キット。
【請求項１７】
前記第２の組成物がワクチン、好ましくはダニ媒介性脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチンまたはロッキー山紅斑熱ワクチンである、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ポリカチオン性重合体、ポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、オリゴ（ｄＩｄＣ）１３（配列番号６３）、少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチド、ペプチドKLKLLLLLKLK (配列番号 61)、神経刺激性の化合物、ヒト成長ホルモン、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、フロイントの完全アジュバントもしくはフロイントの不完全アジュバントまたはこれらの組み合わせ
からなる群から好ましくは選択される免疫賦活性物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
医薬としての使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載の核酸分子、請求項１１に記載の抗体または請求項１２〜１５もしくは１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症を治療または予防する方法における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項８に記載の核酸分子、請求項１１に記載の抗体または請求項１２〜１５もしくは１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ボレリア感染症の予防および治療のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）のハイブリッドＣ末端断片を含むポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体、該ポリペプチドおよび／または該核酸および／または該抗体を含む医薬組成物（特に、ボレリア感染症を治療または予防するための医薬としてまたは方法にて使用するため）、ボレリア感染症を治療または予防するための方法並びに対象を免疫化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ライムボレリア症またはライム病は、欧州および北アメリカにおいて最も一般的に報告されるダニ媒介性疾患である。該疾患は、節足動物媒介性グラム陰性様スピロヘータ、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｅｎｓｕ  ｌａｔｏ；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｌ．）の感染により引き起こされ、多器官または多組織が含まれ得、皮膚、心臓、筋骨格および神経の障害を生じる。大部分の国において、ライムボレリア症は届出疾患でなく、したがって、年間発生率に関する正確なデータは入手できない。米国では、原因菌はボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ；Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）であり、ライムボレリア症は北東部、中部大西洋および上方中北部の州に局在化している。２０１０年には、米国については合計約３０，０００例のライムボレリア症の症例が、疾病管理予防センター（ＣＤＣ）に報告されていた。他の情報源からの診断データも考慮に入れた、ＣＤＣによる２０１３年の最新報告では、米国における新規症例の実際の年間数は、３００，０００件に近いと推定されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２０１３／ｐ０８１９−ｌｙｍｅ−ｄｉｓｅａｓｅ．ｈｔｍｌ（非特許文献１））。欧州においては、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）およびボレリア・ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）と同様に、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）がライムボレリア症の主な原因菌であり、それらは地理的位置に依存して寄与程度はより小さい。ライムボレリア症の流行は、欧州の異なる国々においてかなり変化し、全体の有病率は西から東へと増加する。欧州の多くの国において、ライムボレリア症の報告された症例数は１９９０年代初期から増加し（たとえば、チェコ共和国、エストニア、リトアニア；欧州におけるライムボレリア症、ＷＨＯ報告、２００６参照）、また症例の地理的分布も拡大した。
【０００３】
ボレリア属はスピロヘータ科に属し、それは医学的に重要な属であるトレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびボレリア属に細分化される。ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｌ．）は螺旋形の勢いよく運動するグラム陰性菌であり、長さが約１０〜２０μｍ、幅は０．２〜０．５μｍで、微好気性条件下で増殖する。スピロヘータ細胞壁は、ペプチドグリカンおよび幾つかの鞭毛に囲まれた原形質膜と、次いでゆるく結合された外膜とからなっている。
【０００４】
ライムボレリア症は、一般に、緩解および悪化を伴った、異なる臨床的徴候を特徴とする複数の段階で生じる。初期の感染であるステージ１は皮膚の局部的感染からなり、数日または数週間以内の播種性感染であるステージ２が続き、また数ヶ月から数年後の持続的な感染であるステージ３が続く。しかし、感染は変化し易い；幾人かの患者は皮膚の局部的感染だけを有する一方で、他の患者は関節炎のような疾病後期の徴候だけを示す。ライムボレリア症の別の臨床的症候群もまた、多様なボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｌ．）種による感染症によって生じる。ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）は、より多くの場合に、関節症状（関節炎）および心臓疾患を生じ、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）は主に真皮性の症候（遊走性紅斑；ＥＭおよび慢性萎縮性先端皮膚炎；ＡＣＡ）を生じさるのに対して、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）は、殆どの神経ボレリア症の症例に関係する。
【０００５】
限局性感染−感染のステージ１で最も共通の症候は遊走性紅斑であり、それは感染した人々の７０〜８０％において生じる。この皮膚病変の後には、筋痛、関節痛、頭痛および発熱のようなインフルエンザ様症候が続く。これらの非特異的症候は、遊走性紅斑の患者の５０％において生じる。
【０００６】
播種性感染−ステージ２の間、細菌は感染の部位から遠位の組織および器官へと血流の中に移動する。この段階において生じる、神経性、心血管系および関節炎の症候には、髄膜炎、脳神経障害および断続的な炎症性関節炎が含まれる。
【０００７】
持続的感染−ステージ３の感染は慢性的であり、およびダニ咬創の後に数月から数年に亘って生じる。北アメリカにおいて最も共通の症候は慢性関節リウマチであり、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）の感染によって生じる。Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）での中枢神経系の持続的感染は、ステージ３の際により重篤な神経性の症候を生じさせ、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）での皮膚の持続的感染は慢性萎縮性先端皮膚炎を生じる。
【０００８】
農民、林業労働者、ハイカー、ランナーまたは休暇中の人のような幾つかのリスク群では、１５歳以下の子供および３９歳から５９歳の成人において同様に、血清有病率および疾患発病率が性別を問わず増加した。ライムボレリア症のこの発病率増加は、森林生息地並びに社会的因子における変化と関連している。森林の断片化のような環境の変化は、キツネおよび猛禽などの齧歯類肉食動物の急激な減少を導き、これは次にマウス集団の増大と、その後のダニ集団の増大をもたらした。最近では、不調和な再植林によって鹿の数、したがってダニの数が増加した。郊外のスプロール現象、並びにキャンピングおよびハイキング等のレクリエーションのための森林領域の使用の増加は、ヒトを、より莫大な数のボレリア媒介ダニとより広範に接触させることになった。これら全ての因子が共に、ボレリアのより広い分布およびライムボレリア症のより高い発病率の一因となった。
【０００９】
抗菌物質は、ボレリア感染症の主要な治療方法である。使用する抗生物質は、疾患のステージ、症候および薬物療法に対する患者のアレルギーに依存する。抗生物質コースの長さは、疾患のステージおよび症状の重篤度にも依存する。初期のライムボレリア症は、典型的にはドキシサイクリンのような経口テトラサイクリンおよびアモキシリンまたはペニシリンＶのような半合成ペニシリンで治療される。関節炎および神経性障害は、高用量の静脈内ペニシリンＧまたはセフトリアキソンで治療される。３０％以下のライムボレリア症患者は、ボレリア属感染の初期の特徴症候を示さず、診断および治療を困難にする。特に後期の疾患ステージの際には、抗生物質の治療コースは長くなり（数か月まで）、時には効果がなくなる可能性があり、したがってボレリアの分野において議論されている。ボレリアの有効な治療の場合においてさえ、その後何年もの間、患者には治療後ライム病症候群と称される衰弱性の疲労、疼痛または神経性の症候が残る可能性がある。一般に、抗生物質の使用は、標的微生物に耐性が生じる等のような望ましくない結果を有する可能性がある。最後に、抗生物質療法は、ライムボレリア症を効率的に治療し得るが、その後の感染症に対しては保護を提供しない。
【００１０】
ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）により生じるライム病の予防のために、一価の抗原型１−ＯｓｐＡに基づくワクチン（ＬＹＭＥｒｉｘ（商標））が米国において承認され、市場に出されたが、このワクチンは今では入手できない。さらに、欧州および他の地域に亘るＯｓｐＡ配列の不均一性は、単一の抗原型だけからのＯｓｐＡに基づくワクチンを用いた効率的な保護を妨げる。
【００１１】
１つのＯｓｐＡ抗原型由来の近位部分およびもう１つのＯｓｐＡ抗原型由来の遠位部分を含むキメラＯｓｐＡ分子は、親ポリペプチドの両方の抗原特性を保持するが、ライム病またはボレリア症の予防および治療に使用される可能性がある（ＷＯ２０１１／１４３６１７（特許文献１）、ＷＯ２０１１／１４３６２３（特許文献２））。
【００１２】
現在では、市販されているライムボレリア症のための予防医薬はなく、したがって、当該技術分野においては、米国、欧州等に存在するボレリアに対して有効な保護を提供できる医薬の開発が必要とされており、特に、幾つかのボレリア抗原型に対して、同時に有効な保護を提供できる医薬の開発が必要とされている。本発明の抗原型３  ＯｓｐＡ含有ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１は、抗原型３ボレリアスピロヘータへの抗体表面結合にて評価した場合、特定の抗体の産生および刺激がともに向上した点で、本発明者らが先に開示したヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１（ＷＯ２０１４／００６２２６（特許文献３）参照）を改善するものである。加えて、新規のヘテロ二量体に対する免疫応答の特異性の向上は、その有効性が、以前開示したヘテロ二量体と比較して優れていることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１４３６１７
【特許文献２】ＷＯ２０１１／１４３６２３
【特許文献３】ＷＯ２０１４／００６２２６
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２０１３／ｐ０８１９−ｌｙｍｅ−ｄｉｓｅａｓｅ．ｈｔｍｌ
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ボレリア属細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）のハイブリッド断片を含むポリペプチド、これをコードする核酸、このような核酸分子を含むベクターおよびこのようなベクターを含む宿主細胞に関する。さらに、本発明は、このようなポリペプチドを製造する方法およびこのようなポリペプチドを発現する細胞を製造する方法を提供する。さらにまた、本発明は、このようなポリペプチドに特異的に結合する抗体、このような抗体を産生するハイブリドーマ細胞、このような抗体を製造する方法、このようなポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは抗体を含む医薬組成物、医薬もしくは医薬組成物（特にワクチンとして、またはボレリア感染症を治療もしくは予防する方法において使用するためのもの）の調製のための、このようなポリペプチド、核酸分子、ベクターまたは抗体の使用、感染症を診断する方法、ボレリア感染症を治療または予防する方法、および対象を免疫化する方法を提供する。特に、本発明は、抗原型３のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）に対する免疫化のための改善されたポリペプチドに関し、このポリペプチドは、本発明者らの先の出願であるＷＯ２０１４／００６２２６にて開示した抗原型３  ＯｓｐＡ含有構築物と比較したとき、精製に関してより有利であり、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）への表面結合により評価した場合、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）に対するより特異的な免疫応答が誘発される。
【００１６】
ライムボレリア症の予防のためのサブユニットワクチンを開発する努力は、大部分が、ボレリア細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）の抗原としての使用に集中された。ＯｓｐＡタンパク質は、それが媒介ダニの腸にある場合にだけ、ボレリア属によって発現される。したがって、ワクチン接種によって産生されたＯｓｐＡ抗体は、体内で感染と戦うのではなく、むしろダニが吸血するときにその腸の中に入る。そこで、抗体がスピロヘータを中和し、ボレリアが脊椎動物宿主に入る経路であるダニの中腸から唾液腺までの細菌の移動を遮断する。したがって、ＯｓｐＡ特異的抗体は、媒介ダニからヒト宿主へのボレリア属の感染を予防する。
【００１７】
水酸化アルミニウムを伴ったボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）株ＺＳ７由来のＯｓｐＡ脂質付加体が、スミスクラインビーチャム社［ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ；現在はグラクソスミスクライン社（Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（ＧＳＫ）］によって、ボレリアに対するワクチン（ＬＹＭＥｒｉｘ（商標））として米国市場のために開発された。最適な保護のためには、１年超の期間に亘ってＬＹＭＥｒｉｘ（商標）の３用量が必要であった。最初の２用量の後、ライムボレリア症に対するワクチンの有効性は４９％であり、３回目の用量の後には７６％であった。しかし、ＬＹＭＥｒｉｘ（商標）は、市販されて暫くした後の２００２年に市場から回収された。挙げられた理由は、ワクチンの実用化の問題であった。たとえば、ワクチンは毎年または１年置きにブースター注射をする必要があり、また初期感染の抗生物質療法と比較して、この予防アプローチは相対的に高コストである。加えて、証明はされなかったが、ＬＹＭＥｒｉｘ（商標）はヒトタンパク質との配列相同性のために、集団のサブグループにおいて自己免疫反応をトリガーする可能性があるとの懸念があった。加えて、他の臨床的に重要なボレリア種に対する交差防御は、このワクチンでは提供されなかった。
【００１８】
したがって、一つの態様において、例えばライムボレリア症の予防のための改善されたワクチンを提供することが本発明の目的であった。好ましくは、該ワクチンは容易に製造される一方、保護的で安全であり、また既存療法よりもさらに効果的であり、および／または複数のボレリア種に対して保護を提供する。加えて、患者が異なれば、種々のワクチン組成物に異なる応答を示すことは、当該技術分野にてよく知られている。したがって、いかなる場合においても、ボレリアに対するワクチン接種のさらなる選択肢として利用できる代替ワクチンがあることは、傑出した利点である。
【００１９】
本発明の基礎となる問題は、ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を含むポリペプチドによって解決され、このハイブリッド断片は、Ｂ．ガリニ株ＰＢｒとは異なるボレリア株のＯｓｐＡタンパク質に由来する断片およびＢ．ガリニ株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡの第２の断片からなるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインからなり、且つ少なくとも１つのジスルフィド結合を少なくとも導入することによって、対応する野生型配列と異なっている。
【００２０】
驚くべきことに、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６由来の配列を、ジスルフィド結合を導入した抗原型３  ＯｓｐＡ（Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ）由来の配列に融合させて含む、該ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を導入すると、本発明者らの先の発明であるヘテロ二量体Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１（ＷＯ２０１４／００６２２６）よりも、より簡単に精製でき、且つ抗原型３  ＯｓｐＡに対するより特異的な免疫応答を刺激するヘテロ二量体タンパク質（Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）が得られた。実施例で示す通り、本発明の抗原型３ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片は、抗原型３  ＯｓｐＡ断片よりも、他の抗原型に由来する他のＯｓｐＡ断片により類似した静電ポテンシャル予想等値面を有している。さらに、抗原型３ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片含有ヘテロ二量体（Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）は、先の発明であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体よりもより簡単に精製でき、より少ない工程でより高い収率が得られた。加えて、観察された抗体力価は同等であったが、改善されたヘテロ二量体混合ワクチンによって刺激された抗体は、先の発明のヘテロ二量体混合ワクチンと比較して、抗原型３  ＯｓｐＡを発現するボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）により特異的に結合した。最後に、試験した４つのボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原型に対する、改善されたヘテロ二量体混合ワクチンのインビボでの保護能力は、高かった。
[本発明1001]
ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ（ボレリアの細胞表層タンパク質Ａ）断片を含むポリペプチドであって、前記ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片が、Ｎ末端からＣ末端に向かう方向で、
（ｉ）配列番号8を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの対応断片ではない、ボレリア株に由来するＯｓｐＡのアミノ酸125〜176またはアミノ酸126〜175からなる第1のＯｓｐＡ部分、および
（ｉｉ）Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡ（配列番号8）のアミノ酸176〜274または最も好ましくはアミノ酸177〜274からなる第2のＯｓｐＡ部分
からなり、前記第2のＯｓｐＡ断片が、対応する野生型配列とは少なくとも配列番号8の位置182の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号8の位置269の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに前記第2のＯｓｐＡ断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、
前記アミノ酸および前記システイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ31の完全長ＯｓｐＡ（配列番号5）の対応するアミノ酸の番号付けに従う、ポリペプチド。
[本発明1002]
前記ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片が、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ116に由来するアミノ酸125〜176およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274からなる（配列番号1）、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1003]
前記ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片が、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）に由来するアミノ酸126〜175およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274からなる（配列番号51）、本発明1001のポリペプチド。
[本発明1004]
前記第2のＯｓｐＡ部分が、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸177〜274と同一であるが、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの野生型ＯｓｐＡのアミノ酸233のスレオニン残基がプロリン残基で置換されている点でそれとは異なっている、本発明1001〜1003のいずれかのポリペプチド。
[本発明1005]
配列番号1のアミノ酸配列を含むか、または配列番号1のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
[本発明1006]
配列番号51のアミノ酸配列を含むか、または配列番号51のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
[本発明1007]
配列番号31に記載のＬｉｐ−Ｓ4Ｄ1−Ｓ3Ｄ1ヘテロ二量体タンパク質に対して産生された抗体によって誘発された蛍光強度と比較して、前記ポリペプチドを用いたマウスでの3回の免疫化後に産生された抗体によって抗原型3ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）表面への結合により誘発されかつフローサイトメトリーで測定した蛍光強度において、少なくとも1．5倍増加、好ましくは少なくとも2倍増加、より好ましくは少なくとも3倍増加、さらにより好ましくは少なくとも4倍増加、さらにより好ましくは少なくとも5倍増加、最も好ましくは少なくとも10倍増加をもたらし、特に、前記増加は、実施例3に記載するように決定することができる、本発明1001〜1006のいずれかのポリペプチド。
[本発明1008]
前記ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを含む構築物が、配列番号31に記載のＬｉｐ−Ｓ4Ｄ1−Ｓ3Ｄ1ヘテロ二量体タンパク質と比較して、生物量1グラム当たりのミリグラムで測定した作製収率において、少なくとも1．5倍増加、好ましくは少なくとも2倍増加、より好ましくは少なくとも3倍増加、さらにより好ましくは少なくとも4倍増加、さらにより好ましくは少なくとも5倍増加、最も好ましくは少なくとも10倍増加を示し、特に、前記増加は、実施例2に記載するように決定することができる、本発明1001〜1007のいずれかのポリペプチド。
[本発明1009]
第2のＣ末端ＯｓｐＡ断片をさらに含み、前記ＯｓｐＡ断片が、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインからなり、前記ＯｓｐＡ断片が、対応する野生型ＯｓｐＡ配列とは少なくとも野生型配列の位置182のアミノ酸のシステインでの置換および野生型配列の位置269のアミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに前記ＯｓｐＡ断片の位置182のシステインと位置269のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、さらに、前記ＯｓｐＡ断片が、位置123、124または125から始まり、位置273または274で終わり、さらに、前記アミノ酸および前記システイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ31の完全長ＯｓｐＡ（配列番号5）の対応するアミノ酸の番号付けに従う、本発明1001〜1008のいずれかのポリペプチド。
[本発明1010]
（ｉ）脂質付加されているか、もしくは、脂質化シグナル、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｌｐｐ脂質化シグナル
0006505110.tif 000002
を含むか、且つ／または
（ｉｉ）脂質化のための部位としてのＮ末端システイン残基によって生じる脂質化部位ペプチド、好ましくはＣＳＳを含むか、且つ／または
（ｉｉｉ）前記ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片と前記第2のＣ末端ＯｓｐＡ断片との間にリンカーを含み、特に、前記リンカーが
0006505110.tif 000003
を含む
、本発明1001〜1009のいずれかのポリペプチド。
[本発明1011]
前記第2のＣ末端ＯｓｐＡ断片が、本発明1001〜1008のいずれかのＯｓｐＡのハイブリッドＣ末端断片である、本発明1009または1010のポリペプチド。
[本発明1012]
ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ4Ｄ1−Ｓ3ｈｙｂＤ1（配列番号27）からなる、本発明1009〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
配列番号27のアミノ酸配列（ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ4Ｄ1−Ｓ3ｈｙｂＤ1）を含むか、または配列番号27のアミノ酸配列（ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ4Ｄ1−Ｓ3ｈｙｂＤ1）からなる、ポリペプチド。
[本発明1014]
本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチドをコードする核酸であって、特に、配列番号26の核酸配列を含むか、または配列番号26の核酸配列からなる、前記核酸。
[本発明1015]
本発明1014の核酸分子を含むベクター。
[本発明1016]
本発明1014の核酸または本発明1015のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、前記宿主細胞。
[本発明1017]
本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチドを発現する細胞を産生するための方法であって、本発明1015のベクターで適切な宿主細胞を形質転換するかまたはトランスフェクトする工程を含む、方法。
[本発明1018]
本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチドを産生するための方法であって、本発明1014の核酸分子を発現させる工程を含む、前記方法。
[本発明1019]
以下の工程によって特徴づけられる、本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチドを産生するための方法：
（ａ）前記ポリペプチドをコードするベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｂ）前記ポリペプチドを発現させることができる条件下で前記宿主細胞を増殖させる工程、
（ｃ）前記宿主細胞をホモジナイズする工程、および
（ｄ）前記宿主細胞ホモジネートを精製工程に供する工程。
[本発明1020]
本発明1001のハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片に選択的に結合するが、単独の前記第1のＯｓｐＡ部分および前記第2のＯｓｐＡ部分には結合しない、抗体または少なくともその有効な部分。
[本発明1021]
モノクローナル抗体である、本発明1020の抗体。
[本発明1022]
前記有効な部分が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）Ｎ断片、Ｆ（ａｂ）2断片またはＦｖ断片を含む、本発明1020または1021の抗体。
[本発明1023]
キメラ抗体である、本発明1020〜1022のいずれかの抗体。
[本発明1024]
ヒト化抗体である、本発明1020〜1023のいずれかの抗体。
[本発明1025]
本発明1020〜1024のいずれかの抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
[本発明1026]
以下の工程によって特徴づけられる、本発明1020〜1024のいずれかの抗体を産生するための方法：
（ａ）非ヒト動物に本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
（ｂ）前記動物から抗体を含む体液を取り出す工程、および、
（ｃ）前記抗体を含む体液をさらなる精製工程に供することによって抗体を産生する工程。
[本発明1027]
以下の工程によって特徴づけられる、本発明1020〜1024のいずれかの抗体を産生するための方法：
（ａ）非ヒト動物に本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
（ｂ）前記動物から脾臓または脾細胞を取り出す工程、
（ｃ）前記脾臓または脾細胞のハイブリドーマ細胞を産生する工程、
（ｄ）前記ポリペプチドについて特異的なハイブリドーマ細胞を選択してクローン化する工程、
（ｅ）前記クローン化されたハイブリドーマ細胞の培養によって抗体を産生する工程、および、
（ｆ）任意に、さらなる精製工程を行う工程。
[本発明1028]
（ｉ）本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸および／または本発明1020〜1024のいずれかの抗体、並びに
（ｉｉ）任意に、薬学的に許容可能な賦形剤
を含む、医薬組成物。
[本発明1029]
Ｌｉｐ−Ｓ1Ｄ1−Ｓ2Ｄ1（配列番号29）およびＬｉｐ−Ｓ5Ｄ1−Ｓ6Ｄ1（配列番号33）をさらに含む、本発明1028の医薬組成物。
[本発明1030]
Ｌｉｐ−Ｓ1Ｄ1−Ｓ2Ｄ1（配列番号29）をさらに含む、本発明1028の医薬組成物。
[本発明1031]
Ｌｉｐ−Ｓ5Ｄ1−Ｓ6Ｄ1（配列番号33）をさらに含む、本発明1028の医薬組成物。
[本発明1032]
Ｌｉｐ−Ｓ1Ｄ1−Ｓ2Ｄ1（配列番号29）、Ｌｉｐ−Ｓ4Ｄ1−Ｓ3ｈｙｂＤ1（配列番号27）およびＬｉｐ−Ｓ5Ｄ1−Ｓ6Ｄ1（配列番号33）を含む、医薬組成物。
[本発明1033]
前記薬学的に許容される賦形剤はＬ−メチオニンを含む、本発明1028〜1032のいずれかの医薬組成物。
[本発明1034]
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）以外の病原体由来の少なくとも1つのさらなる抗原をさらに含む、本発明1028〜1033のいずれかの医薬組成物。
[本発明1035]
前記さらなる抗原は、ダニ媒介の病原体に由来する、本発明1034の医薬組成物。
[本発明1036]
前記ダニ媒介の病原体は、ボレリア・ヘルムシイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｈｅｒｍｓｉｉ）、ボレリア・パルケリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｐａｒｋｅｒｉ）、ボレリア・ヅットニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｄｕｔｔｏｎｉ）、ボレリア・ミヤモトイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｍｉｙａｍｏｔｏｉ）、ボレリア・ツリカタエ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｔｕｒｉｃａｔａｅ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッチア・アウストラリス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、リケッチア・コノリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉｉ）、リケッチア・ヘルベチカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｈｅｌｖｅｔｉｃａ）、リケッチア・パルケリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐａｒｋｅｒｉ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、エーリキア・センネツ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、ネオエーリキア・ミクレンシス（Ｎｅｏｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｍｉｋｕｒｅｎｓｉｓ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）およびボレリア・ロネスタリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｌｏｎｅｓｔａｒｉ）、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、コロラドダニ熱ウイルス（ＣＴＦＶ）、クリミアコンゴ出血熱ウイルス（ＣＣＨＦＶ）、キャサヌール森林病ウイルス（ＫＦＤＶ）、ポワッサンウイルス、ハートランドウイルス、オムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）およびバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属種を含む群から選択される、本発明1035の医薬組成物。
[本発明1037]
本発明1034〜1036のいずれかの医薬組成物を含み、前記少なくとも1つのさらなる抗原が第2の組成物中に含まれる、キット。
[本発明1038]
前記第2の組成物がワクチン、好ましくはダニ媒介性脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチンまたはロッキー山紅斑熱ワクチンである、本発明1037のキット。
[本発明1039]
ポリカチオン性重合体、特にポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、特にオリゴ（ｄＩｄＣ）13（配列番号63）、少なくとも2つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチド、特にペプチド
0006505110.tif 000004
、神経刺激性の化合物、特にヒト成長ホルモン、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム、フロイントの完全アジュバントもしくはフロイントの不完全アジュバントまたはこれらの組み合わせ
からなる群から好ましくは選択される免疫賦活性物質をさらに含むことを特徴とする、本発明1028〜1036のいずれかの医薬組成物。
[本発明1040]
前記免疫賦活性物質は、ポリカチオン性重合体および免疫賦活性デオキシヌクレオチドの、または、少なくとも2つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドのいずれかの組み合わせ、好ましくは
0006505110.tif 000005
およびオリゴ（ｄＩｄＣ）13（配列番号63）の組み合わせである、本発明1039の医薬組成物。
[本発明1041]
前記ポリカチオン性ペプチドは、ポリアルギニンである、本発明1040の医薬組成物。
[本発明1042]
ワクチンである、本発明1028〜1036または1039〜1041のいずれかの医薬組成物。
[本発明1043]
医薬としての、特にワクチンとしての使用のための、本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸、本発明1020〜1024のいずれかの抗体または本発明1028〜1036もしくは1039〜1041のいずれかの医薬組成物。
[本発明1044]
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．ヴァライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）感染症、好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）感染症を治療または予防する方法における使用のための、本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸、本発明1020〜1024のいずれかの抗体または本発明1028〜1036もしくは本発明1039〜1041のいずれかの医薬組成物。
[本発明1045]
本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸、本発明1020〜1024のいずれかの抗体または本発明1028〜1036もしくは本発明1039〜1041のいずれかの医薬組成物の治療上有効な量をその必要のある対象に投与する工程を含む、該対象におけるボレリア感染症を治療または予防するための方法。
[本発明1046]
本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸、本発明1020〜1024のいずれかの抗体または本発明1028〜1036もしくは本発明1039〜1041のいずれかの医薬組成物の治療上有効な量をその必要のある対象に投与する工程を含む、該対象を免疫化する方法。
[本発明1047]
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化するための方法であって、前記動物またはヒトに、本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸、本発明1020〜1024のいずれかの抗体または本発明1028〜1036もしくは本発明1039〜1041のいずれかの医薬組成物の有効な量を投与する工程を含み、前記有効な量が、前記動物またはヒトにおける免疫応答を誘発するために適切である、方法。
[本発明1048]
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）生物に対する動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するための方法であって、前記動物またはヒトに本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド、本発明1014の核酸、本発明1020〜1024のいずれかの抗体または本発明1028〜1036もしくは本発明1039〜1041のいずれかの医薬組成物の有効な量を投与する工程を含み、前記有効な量が、前記動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するために適切である、方法。
[本発明1049]
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）生物は、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．ヴァライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）を、好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）を含む群から選択される、本発明1047または1048の方法。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
したがって、第１の側面において、本発明は、細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）のハイブリッドＣ末端断片を含むポリペプチドに関し、当該ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片は、ボレリア株の２つの異なるＯｓｐＡのＣ末端ドメイン融合体からなり、且つ少なくとも１つのジスルフィド結合、例えばシスチンを少なくとも導入することによって、対応する野生型断片とは異なる。特に、ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片は、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒとは異なる株、例えば、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６またはＢ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）のＯｓｐＡタンパク質に由来するアミノ酸と、少なくとも１つのジスルフィド結合（シスチン）の導入を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒのＯｓｐＡタンパク質に由来するアミノ酸との融合体からなる。具体的には、ポリペプチドは、ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ（ボレリアの細胞表層タンパク質Ａ）断片を含み、当該ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、（ｉ）配列番号８を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの対応断片ではない、ボレリア株に由来するＯｓｐＡのアミノ酸１２５〜１７６またはアミノ酸１２６〜１７５からなる第１のＯｓｐＡ部分、および（ｉｉ）Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡ（配列番号８）のアミノ酸１７７〜２７４またはアミノ酸１７６〜２７４（しかし最も好ましくはアミノ酸１７７〜２７４）からなる第２のＯｓｐＡ部分からなり、第２のＯｓｐＡ部分は、対応する野生型配列とは少なくとも配列番号８の位置１８２の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号８の位置２６９の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに当該第２のＯｓｐＡ断片の位置１８２のシステインと位置２６９のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、アミノ酸およびシステイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１の完全長ＯｓｐＡ（配列番号５）の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。
【００２２】
あるいは、ポリペプチドは、ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を含み、当該ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、
（ｉ）配列番号８を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの対応断片ではない、ボレリア株に由来するＯｓｐＡのアミノ酸１２５〜１７６またはアミノ酸１２６〜１７５からなる第１のＯｓｐＡ断片（第１のＯｓｐＡ部分ともいう）、および
（ｉｉ）Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡ（配列番号８）のアミノ酸１７７〜２７４からなる第２のＯｓｐＡ断片（第２のＯｓｐＡ部分ともいう）からなり、第２のＯｓｐＡ断片は、配列番号８の位置１８２の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号８の位置２６９の野生型アミノ酸の置換によって、対応する野生型配列とは異なり、また当該第２のＯｓｐＡ断片の位置１８２のシステインと位置２６９のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、システイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１の完全長ＯｓｐＡ（配列番号５）の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。
【００２３】
本発明によるポリペプチドは、容易に且つ効率的に作製できることが見出された（実施例２を参照）。この作製法により、既知の作製物と比較して収率が増大した（実施例２を参照）。本発明によるポリペプチドで免疫化すると、天然型のＯｓｐＡタンパク質に特異的な抗体が高レベルで産生された。したがって、これは改善されたワクチンである（実施例３を参照）。さらに、インビボでのボレリア曝露に対する保護ももたらした（実施例４を参照）。
【００２４】
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）は、スピロヘータ門のバクテリア属である。種に応じて、主としてダニおよび一部はノミから伝播して、人獣共通感染症であり生物媒介性疾患であるボレリア症を引き起こす。現在、３６種のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）が知られている。このボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の３６の既存種のうち、１３種がライム病またはボレリア症を引き起こすことが知られており、ダニから伝播する。ライム病を引き起こす主なボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ）およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）である。ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｌ．）という用語は、少なくとも１３のボレリア種（表Ａ−１）を包含する。これらの種は、異なる地理的領域において生じ、およびマダニ種群（シュルツェマダニ種群とも呼ばれる）のダニおよび広範囲の動物宿主が関与する地方病サイクルで天然に生きている。次の４つのボレリア種は、ヒトにおける感染症の大多数の原因である：ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクト（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）。その他の３つの種、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、およびＢ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）がヒトにおいて時折検出されたが、ライムボレリア症におけるこれらの役割は現時点では不明確である。ボレリアの新たな種は、いまだに特定中である。
【００２５】
（表Ａ−１）
0006505110.tif 000006
【００２６】
上記のように、ボレリアの細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）は、ワクチンの候補としての潜在的能力のために特に興味深い、ボレリアの豊富な免疫原性リポタンパク質である。Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｌ．のＯｓｐＡは、約３０ｋＤａの分子量を有する塩基性のリポタンパク質であり、直鎖状プラスミド上に暗号化される。ＯｓｐＡタンパク質の重要な側面は、そのＮ末端脂質化である；即ち、二重結合の有無にかかわらず、Ｃ１４〜Ｃ１９の鎖長をもった脂肪酸がＮ末端システイン残基に結合しており、ＯｓｐＡタンパク質の免疫原性を増強する特徴となっていることである。免疫原性の不十分な合成ペプチドは、脂質付加されたとき、たとえば、脂質付着を特定するシグナル配列を用いて合成される多くの細菌リポタンパク質のアミノ末端に見られる脂肪酸置換であるＰａｍ３Ｃｙｓ（Ｂｅｓｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１４３：５４８−５５２）に共有結合されたときに、より強力な抗体反応を誘導することが示された。加えて、Ｐａｍ３Ｃｙｓ部分は、一部はＴＬＲ−２／１との相互作用を介して、マウスにおいてＯｓｐＡに対する免疫応答を増強することが示された（Ｙｏｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７１：３８９４−３９００）。したがって、ＯｓｐＡのＣ末端断片の脂質化は、該断片の免疫原性および保護能力を増強すると予測される。
【００２７】
北アメリカおよび欧州において得られたＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｌ．単離物の解析によって、ＯｓｐＡが抗原可変性を有すること、および幾つかの異なる基が血清学に基づいて定義できることが明らかになった。特定のＮ末端およびＣ末端の抗原決定基に結合する抗ＯｓｐＡ  ｍＡｂが報告されている。Ｘ線結晶学およびＮＭＲ解析を用いて、ＯｓｐＡにおいて免疫学的に重要な超可変ドメインが同定され、またＬＡ−２エピトープがＣ末端アミノ酸２０３〜２５７にマッピングされた（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：１１５３−６４，２０００）。以前の研究では、Ｃ末端エピトープＬＡ−２に対する抗体産生がＯｓｐＡでワクチン接種後の防御免疫と相関することが示されている（Ｖａｎ  Ｈｏｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４（１７−１８）：１６２０−６、およびＳｔｅｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（１９９８）３３９：２０９−２１５）。ＬＡ−２に対する抗体は、ダニから宿主までのボレリア属の伝達を遮断することが示された（Ｇｏｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ（１９９７）６５（３）：８８２−８８９）。これらの研究は、ＯｓｐＡタンパク質のＣ末端部分が、防御免疫を誘導するために十分であり得ることを示唆した。なお、ＯｓｐＡのＣ末端部分の配列は、Ｎ末端部分がそうであるよりも、ボレリア抗原型間において高度に保存されていないことに注意すべきである（図１参照）。
【００２８】
他の研究と共に、上記で概説した研究からの情報に基づいて、先の発明（ＷＯ２０１４／００６２２６）では、Ｃ末端部分を含むＯｓｐＡの短縮型（本明細書では、「ＯｓｐＡ断片」または「単量体」とも称する）を使用した。このＯｓｐＡの短縮型は、全長ＯｓｐＡタンパク質より保護性が低いことが判明した。しかしながら、驚くべきことに、先の発明の経過において、この短縮型の中にジスルフィド結合を導入することによって（本明細書では「突然変異体ＯｓｐＡ断片」、「シスチン安定化ＯｓｐＡ断片」、または「変異体断片」または「シスチン安定化断片」とも称する）、この不都合を克服できることが見出された。特定の機構に限定されるものではないが、この改善された保護は、熱的安定度を測定するアッセイ法に示すように、ＯｓｐＡ断片の増加した安定性によるものと考えられる。
【００２９】
先の発明に従えば、突然変異体ＯｓｐＡ断片（本発明において第２のＯｓｐＡ断片とも称する）は、任意のボレリア種由来であってよい。しかし、医学分野における罹病率から、特にヒトについては、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ、Ｂ．ババリエンシスおよびＢ．ガリニが好ましい。本発明によれば、第１のＯｓｐＡ部分はＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ以外の任意のボレリア株に由来し、第２の部分はＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来する。したがって、ハイブリッドＯｓｐＡ断片は、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒのＯｓｐＡに由来するアミノ酸と、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ以外の任意のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）およびＢ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、特にＢ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６のＯｓｐＡに由来するアミノ酸（したがって、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒのＯｓｐＡに由来するアミノ酸とは異なるアミノ酸配列）との融合体に由来する。第１のＯｓｐＡ部分は、配列番号８を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの対応断片ではない、ボレリア株に由来するＯｓｐＡのアミノ酸１２５〜１７６またはアミノ酸１２６〜１７５からなり、第２のＯｓｐＡ部分は、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡ（配列番号８）のアミノ酸１７６〜２７４または最も好ましくはアミノ酸１７７〜２７４からなり、第２のＯｓｐＡ部分は、対応する野生型配列とは少なくとも配列番号８の位置１８２の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号８の位置２６９の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点、ならびに当該第２のＯｓｐＡ断片の位置１８２のシステインと位置２６９のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており、アミノ酸およびシステイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１の完全長ＯｓｐＡ（配列番号５）の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。ただし、本発明に係る第１および第２の部分には、野生型部分と比較してさらなる突然変異が存在してよい（以下参照）。好ましい態様では、位置１８２および２６９でのシステインによる上記置換が野生型に対する唯一の変異である。あるいは、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４は、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの野生型ＯｓｐＡのアミノ酸２３３のスレオニン残基がプロリン残基で置換されている点のみで異なっている。
【００３０】
ポリペプチドの好ましい例には、
Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６に由来するアミノ酸１２５〜１７６およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４からなるハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片（配列番号１）、または
Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）に由来するアミノ酸１２６〜１７５およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４からなるハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片（配列番号５１）
が挙げられる。
【００３１】
したがって、本発明の好ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または当該配列からなる。あるいは、ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、または当該配列からなる。
【００３２】
本発明の一態様では、第２のＯｓｐＡ部分は、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４と同一であるが、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの野生型ＯｓｐＡのアミノ酸２３３のスレオニン残基がプロリン残基で置換されている点で異なっている（配列番号７）。
【００３３】
これら４つのボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、Ｂ．ブルドフェルリ（Ｂ．ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）は、これらのＯｓｐＡの抗原型に従ってさらに分類することができ、これはそれぞれのＯｓｐＡタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用いた解析によって決定された。抗原型１〜７（これらはヒトボレリア感染症の大部分を説明する）を、これらの罹患率と共に下記の表Ａ−２に示す。
【００３４】
（表Ａ−２）Ｂ．ブルドフェルリ（Ｂ．ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ  ｓ．ｓ．）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）の抗体型指定および罹病率。ヒト脳脊髄液または皮膚から、または媒介ダニから単離されたボレリアの抗原型は、各々がＯｓｐＡの特定のエピトープに特異的なマウスモノクローナル抗体で全細胞溶解物をプロービングすることにより決定された［Ｗｉｌｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （１９９３）３１（２）：３４０−３５０に記載され、また「Ｃｌｉｍａｔｅｃｈａｎｇｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｉｃｋｓ  ａｎｄ  ｔｉｃｋ−ｂｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，０６  Ｆｅｂ  ２００９においてバクスター・バイオサイエンス社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により呈示された］。
0006505110.tif 000007
【００３５】
ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１由来のＯｓｐＡタンパク質の構造は、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．によって決定された（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  ｓｃｉ（１９９７）９４：３５８４−３５８９）。それは、Ｎ末端（α鎖１〜４）および中央βシート（α鎖５〜１４ｎ［Ｎ末端部分］）、バレルシート１（α鎖１４ｃ［Ｃ末端部分］〜１６）、バレルシート２（α鎖１７〜２１）およびＣ末端αヘリックスで構成される。「Ｃ末端ＯｓｐＡ断片」もしくは「ＯｓｐＡのＣ末端ドメイン」もしくは「Ｃ末端ドメイン」という用語、または「野生型断片」もしくは本明細書の全体にわたって使われるＯｓｐＡに関する「Ｃ末端部分」は、ＯｓｐＡのＣ末端アミノ酸配列、即ち、少なくともＮ末端βシート（α鎖１〜４を含む）を欠失したＯｓｐＡを意味するものとする。ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１由来のＯｓｐＡにおいて、Ｎ末端シートは、アミノ酸１７〜７０からなっている（１６アミノ酸長脂質化シグナルペプチドの翻訳後切断の後）。
【００３６】
本発明のＣ末端ＯｓｐＡ断片は、Ｎ末端における脂質化シグナル配列、たとえば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１由来の、ＯｓｐＡ（配列番号１３）またはＯｓｐＢ（配列番号１４）のアミノ酸１〜１６の脂質化シグナル配列、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の脂質化シグナル配列（ここでは「ｌｐｐ脂質化シグナル」（配列番号１５）と称する）、またはたとえば以下で定義するような任意の他のシグナル配列を含んでよい。
【００３７】
発生期のＯｓｐＡポリペプチド上に存在するようなＮ末端脂質化シグナル配列でのタンパク質の脂質化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターにおいて、それぞれ酵素ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ、シグナルペプチダーゼＩＩおよびトランスアシラーゼの段階的作用によって生じる。第１の工程は、修飾されていないプロリポタンパク質のシステインスルフヒドリル基への、ジアシルグリセリドの移動、続いてシグナルペプチダーゼＩＩによるシグナルペプチドの切断、および最後に、アポリポタンパク質のＮ末端システインにおける□−アミノ基のアシル化である。その結果は、ポリペプチドのＮ末端システイン残基に結合した、１つの脂質と、さらに２つの脂質を有するグリセロール基の配置である。脂質化の際に切断除去される脂質化シグナル配列は、最終的なポリペプチド配列には存在しない。
【００３８】
ポリペプチドは、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸モノマーの鎖である生物学的分子である。この共有化学結合は、１つのアミノ酸のカルボキシル基がもう１つのアミノ酸のアミノ基と反応して形成される。本発明のポリペプチドは、連続的且つ非分岐のアミノ酸鎖である。本発明のポリペプチドは、シスチン結合を含む。本発明によれば、突然変異体ＯｓｐＡ断片は、脂質付加されたタンパク質（リポプロテインとも称する）であってよく、ここでの脂質部分はグリセロール基と共に「Ｌｉｐ」とも称する。本発明によれば、Ｌｉｐは１〜３つの脂質、たとえば、グリセロールおよび本発明のポリペプチドのＮ末端システインのアミノ基に結合されたＣ１４−２０アルキルおよび／またはＣ１４−２０アルケニルを含んでおり、あるいは、好ましくは、Ｌｉｐは下記の式（Ｉ）の部分である。
0006505110.tif 000008
式中、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３の１つはＣ１４−Ｃ２０アルキルまたはアルケニルであり、他の各々は独立してＣ１４−Ｃ２０アルキルまたはＣ１４−Ｃ２０アルケニルであり、Ｘは式（Ｉ）に示されるシステイン残基に結合されたアミノ酸配列である。より好ましくは、ＬｉｐとポリペプチドのＮ末端システインを加えたものは、Ｎ−パルミトイル−Ｓ−（２ＲＳ）−２，３−ビス−（パルミトイロキシ）プロピルシステイン（ここでは「Ｐａｍ３Ｃｙｓ」と称する）であり、システインのカルボニルＣを介して本発明の前記アミノ酸配列に結合される。式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２またはＲ３はパルミトイル部分であろうし、またＸはシステイン残基に結合されたアミノ酸配列である。
【００３９】
本発明に従えば、ＯｓｐＡのＣ末端ドメインは、少なくともＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１に由来するＯｓｐＡのアミノ酸１７〜７０に対して相同性のＮ末端ドメインが欠失してよい。加えて、本発明に従うＯｓｐＡのＣ末端ドメインは、リー（Ｌｉ）およびその共同研究者（前出のＬｉ  ｅｔ  ａｌ．）によって定義される中央シートのさらなる部分、特に、任意のボレリア属（特にＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株Ｂ３１）のアミノ酸１７〜８２、９３、１０５、１１８または１１９、好ましくは１７〜１２９、より好ましくは１〜１２４、１〜１２５、１〜１２９または１〜１３０からのアミノ酸部分のようなさらなる鎖、またはＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株Ｂ３１以外のボレリア種に由来するＯｓｐＡタンパク質の相同部分を欠失してもよい。
【００４０】
本発明に関して、ＯｓｐＡ  Ｃ末端ドメインは、「ＯｓｐＡ断片」または「ＯｓｐＡの断片」とも称する。
【００４１】
本発明のポリペプチドに関して、また本明細書の全体を通して使用されるときに、「変異体Ｃ末端ＯｓｐＡ断片」または「突然変異体断片」または「変異体ＯｓｐＡ断片」とは、上記および本明細書で定義したＯｓｐＡのＣ末端断片を意味するものであり、これは、少なくともジスルフィド結合（すなわち、シスチン）を形成できる少なくとも２つの導入されたシステインによって、野生型断片とは異なっている。理論に拘束されるものではないが、このジスルフィド結合は、当該断片を、抗体結合の誘導に貢献するコンホメーションに安定化させると仮定される。ＯｓｐＡの野生型Ｃ末端断片の折畳みは、全長タンパク質に比較して低下した温度安定性を示す（Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｌｙｍｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  ＯｓｐＡ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３５０：２９０−２９９）。本発明について、このＣ末端ドメインの折畳みの安定性を向上し得る導入されたジスルフィドブリッジの位置を決定するために、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．株Ｂ３１のＯｓｐＡのＣ末端ドメインの配列がコンピュータで解析された。この解析の結果は、この折畳みが複数の種に亘って保存されると仮定して、他のボレリア種の相同的なＯｓｐＡ断片にも適用された。
【００４２】
本発明のポリペプチドに関して、また本明細書の全体を通して使用されるときに、「ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片」または「ハイブリッド断片」または「ハイブリッドＯｓｐＡ断片」とは、上記および本明細書で定義したＯｓｐＡ  Ｃ末端断片を意味するものであり、これは、
（ａ）ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片が、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒとは異なる株、例えば、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６またはＢ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）に由来する第１のＯｓｐＡタンパク質のアミノ酸（第１のＯｓｐＡ部分という）と、少なくとも１つのジスルフィド結合（シスチン）の導入および任意に１つ以上のさらなる変異を伴うＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来する第２のＯｓｐＡタンパク質のアミノ酸（第２のＯｓｐＡ部分という）との融合体からなる、および
（ｂ）ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片中の少なくとも２つの導入されたシステインがジスルフィド結合（すなわち、シスチン）を形成し、当該導入されたシステインが本明細書に記載の通りに、またＷＯ２０１４／００６２２６の教示に従って導入される
という点で、野生型断片とは異なっており、
当該ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片は、自然に折り畳まれた断片となり、これは、例えばこのハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片によるワクチン接種からもたらされる抗体の、例えばマウスにおけるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原型３抗原に対する結合効率によって、例えば本実施例にて記載するように、例えば当該抗体（３回の免疫化後に取得したもの）の抗原型３ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）表面への結合をフローサイトメトリーで試験することによって評価される通りである。
【００４３】
典型的には、このジスルフィド結合は、１以上、好ましくは２つのシステイン残基の導入によって持ち込まれてよく、ここでのジスルフィド結合（Ｓ−Ｓブリッジ）は、２つのシステイン残基のチオール基間に形成され、アミノ酸シスチンがもたらされる。ジスルフィド結合が、野生型ＯｓｐＡ断片中に存在するシステイン残基と形成される場合、１つのシステイン残基だけの導入が必要とされる。２つのシステインは、アミノ酸置換によって導入される。置換は、（ａ）該当する野生型ＯｓｐＡアミノ酸配列の位置１８２のアミノ酸のシステインによるものおよび（ｂ）該当する野生型ＯｓｐＡアミノ酸配列の位置２６９のアミノ酸のシステインによるものであり、当該ＯｓｐＡ断片の位置１８２のシステインと位置２６９のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、これによりシスチンが形成される。システイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１の完全長ＯｓｐＡ（配列番号５）の対応するアミノ酸の番号付けに従う。
【００４４】
また、突然変異体またはハイブリッドＯｓｐＡ断片は、野生型と比較してさらなる変異を含んでいてよい。上記のように、ＯｓｐＡの構造および表面ドメインは当該技術分野において知られている。したがって、突然変異体断片は、特に当該タンパク質の表面上になく、および／または免疫応答に関与しない部位、したがって、抗原性能力に影響を与えない部位にさらなる突然変異を含んでいてもよい。これらは、１以上のアミノ酸欠失、特に小さな欠失（たとえば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下のアミノ酸）、１以上のアミノ酸付加（特にＣ末端またはＮ末端に）、または１以上のアミノ酸置換（特に１以上の保存的アミノ酸置換）を含むことができる。好ましくは、該当する野生型と比較した第１および第２の部分のさらなる突然変異の数は、多くて１０、９、８、７、６、５、４、より好ましくは３または２、特に１である。より好ましくは、さらなる突然変異は、第２のＯｓｐＡ部分のみにある。好ましい突然変異は、置換であり、特に保存的置換である。保存的アミノ酸置換の例には下記に列挙したものが含まれるが、これらに限定されない。
0006505110.tif 000009
【００４５】
好ましい突然変異には、断片の選択された部分における変化が含まれ、たとえば、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．に存在するヒト白血球機能関連抗原（ｈＬＦＡ−１）に対する配列類似性をもった配列が修飾され、たとえば他のボレリア種由来のＯｓｐＡタンパク質からの相同配列で置換される。この修飾のための理論的根拠は、ヒトタンパク質で免疫交差反応を誘導することについてのリスクを減少させることである。別の好ましい変異は、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するＯｓｐＡポリペプチド配列（配列番号８）の位置２３３にあるスレオニンのプロリンの置換である。また、最終断片または中間断片における、脂質化のためのシグナル配列の付加、またはマーカータンパク質（たとえば、同定または精製のためのもの）の付加も可能である。
【００４６】
幾つかの態様において、突然変異体またはハイブリッドＯｓｐＡ断片は、野生型断片に対して６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性をもったアミノ酸配列を有する。もう一つの態様では、配列の付加、欠失または置換に起因して、該配列は最大で１０％、最大で９％、最大で８％、最大で７％、最大で６％、５％、４％、３％、２％、最も好ましくは最大で１％だけ異なる。
【００４７】
当該技術分野で知られているように、また本明細書で使用するように、同一性とは、配列を比較することによって定まる２以上のポリペプチド配列間の関係である。また、当該技術において同一性とは、場合によっては、このような一続きの配列の間の一致性によって定まる、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度を意味する。同一性は、容易に算出することができる。２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の間の同一性を測定するために多くの方法が存在するが、この用語は当業者に周知である（たとえば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄ  ｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７）。同一性を決定する好ましい方法は、試験すべき配列の間に最も大きな一致性を与えるように設計されている。同一性を決定する方法は、コンピュータプログラムにおいて体系化される。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム方法にはＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９８４），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０）が含まれるが、限定されない。
【００４８】
突然変異体またはハイブリッドＯｓｐＡ断片とは対照的に、本発明の関係での「野生型断片」または「野生型ＯｓｐＡ断片」とは、天然に存在するボレリア属のＯｓｐＡ断片に関する。この野生型断片はＮ末端欠失により得られるが、それは内部欠失（ここで詳述するシグナル配列からは除く）または内部突然変異を含まない。ハイブリッドおよび変異体ＯｓｐＡ断片に関して、野生型断片は、ＯｓｐＡの同一部分（ＯｓｐＡの同一長さおよび同じ株など）からなり、また上記で詳述した改変においてのみ異なる。
【００４９】
本発明のポリペプチド
ポリペプチドは、ペプチド結合によって連結され、また幾つかの場合にはジスルフィド結合によって連結されたアミノ酸の単一の直鎖状重合体である。本発明によれば、ポリペプチドは、１以上の翻訳後修飾を含んでいてもよい；即ち、結合された酢酸、リン酸、脂質または糖鎖、好ましくは脂質、またはグリセロールと共にＮ末端システインに結合された脂質、より好ましくは１〜３つのＣ１４−Ｃ２０アルキルまたはアルケニル部分、より好ましくは１〜３つのパルミトイル基、最も好ましくは３つのパルミトイル基（Ｐａｍ３）のような結合された生化学的官能基を含んでよい。
【００５０】
本発明のポリペプチドは上記で定義する通りであり、ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を含むか、または当該断片からなり、当該ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、
（ｉ）配列番号８を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの対応断片ではなく、位置１２５または１２６から始まり、位置１７５または１７６で終わる、ボレリア株に由来するＯｓｐＡの第１のＣ末端部分のアミノ酸からなる第１のＯｓｐＡ部分、および
（ｉｉ）第１のＣ末端部分に連続的に続くＯｓｐＡの第２のＣ末端部分からなり（例えば、第１のＣ末端部分が位置１７５で終わる場合、第２のＣ末端部が位置１７６から継続し、または第１のＣ末端部分が位置１７６で終わる場合、第２のＣ末端部分が位置１７７から継続する等である。ただし、１つもしくは２つ以上または最大１０のアミノ酸が２つのＣ末端部分の融合領域にて欠失している場合があってもよく、例えば、最も好ましくは、第１のＣ末端部分が位置１７５で終わる場合、第２のＣ末端部分が位置１７７から継続する）、第２のＯｓｐＡ断片は、配列番号８の位置１８２の野生型アミノ酸のシステインでの置換および配列番号８の位置２６９の野生型アミノ酸のシステインでの置換によって、対応する野生型配列とは異なり、当該第２のＯｓｐＡ断片の位置１８２のシステインと位置２６９のシステインとの間にジスルフィド結合が存在し、これによりシステイン（「シスチン安定化ＯｓｐＡ断片」ともいう）が形成される、第２のＯｓｐＡ部分
からなり、
アミノ酸およびシステイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１の完全長ＯｓｐＡ（配列番号５）の対応するアミノ酸の番号付けに従うものである。
【００５１】
本発明のさらなる態様において、ポリペプチドは、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６に由来するアミノ酸１２５〜１７６およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４からなるハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片（配列番号１）を含むか、または当該断片からなる。
【００５２】
本発明のさらなる態様において、ポリペプチドは、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）に由来するアミノ酸１２６〜１７５およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４からなるハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片（配列番号５１）を含むか、または当該断片からなる。
【００５３】
本発明のさらなる態様において、ポリペプチドは、本明細書にて定義する通りであり、第２のＯｓｐＡ部分は、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒに由来するシスチン安定化アミノ酸１７７〜２７４と同一であるが、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒの野生型ＯｓｐＡのアミノ酸２３３のスレオニン残基がプロリン残基で置換されている点のみで異なっている。
【００５４】
上記で定義し、本明細書にてさらに定義する本発明のポリペプチドは、免疫化した動物にて抗体力価をもたらし、関連する先行技術のポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１４／００６２２６に記載のもの）と比較したとき、当該抗体は、ｉｎ  ｓｉｔｕで、対応する抗原への結合の改善を示す。好ましくは、本発明のハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を含むポリペプチドは、少なくとも１つのシステイン結合を少なくとも付加することによって対応する野生型ＯｓｐＡ配列とは異なるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインを含むポリペプチド（より好ましくは配列番号３１で定義されるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体タンパク質）に対して産生された抗体によって誘発された蛍光強度と比較して、本ポリペプチドを用いたマウスでの３回の免疫化後に産生された抗体によって抗原型３ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）表面への結合により誘発されかつフローサイトメトリーで測定した蛍光強度において、少なくとも１．５倍増加、好ましくは少なくとも２倍増加、より好ましくは少なくとも３倍増加、さらにより好ましくは少なくとも４倍増加、さらにより好ましくは少なくとも５倍増加、最も好ましくは少なくとも１０倍増加をもたらす。特に、この増加は、実施例３に記載するように決定することができる。
【００５５】
さらに、本発明のさらなる態様において、上記および本明細書にて定義する本発明のポリペプチドは、標準的プロセスでの収率よりも高い収率で作製でき、該当する先行技術のポリペプチド（例えば、ＷＯ２０１４／００６２２６に記載のもの）と比較して、必要とする精製工程がより少ない。好ましくは、本発明のハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を含むポリペプチドは、少なくとも１つのシステイン結合を少なくとも付加することによって対応する野生型ＯｓｐＡ配列とは異なるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインを含むポリペプチド、より好ましくは配列番号３１に定めるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体タンパク質と比較して、生物量１グラム当たりのミリグラムで測定した作製収率において、少なくとも１．５倍増加、好ましくは少なくとも２倍増加、より好ましくは少なくとも３倍増加、さらにより好ましくは少なくとも４倍増加、さらにより好ましくは少なくとも５倍増加、最も好ましくは少なくとも１０倍増加を示す。特に、当該増加は、実施例２に記載するように決定し得る。
【００５６】
好ましくは、本発明のハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片を含むポリペプチドは、少なくとも１つのシステイン結合を少なくとも付加することによって対応する野生型ＯｓｐＡ配列とは異なるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインを含むポリペプチド、より好ましくは配列番号３１に定めるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体タンパク質と比べて、精製のための工程が少なくて済み、より具体的には、必要とするクロマトグラフィー工程が少なくとも１つ少なくなる。
【００５７】
本発明のさらなる態様において、ポリペプチドは、（ａ）上記および本明細書に定義するハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片、および（ｂ）変異体ＯｓｐＡ断片を含む。
【００５８】
本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチドは、（ａ）本明細書に定義するハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片、および（ｂ）第２のＯｓｐＡ断片を含み、当該ＯｓｐＡ断片は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＯｓｐＡタンパク質のＣ末端ドメインからなるという点で、Ｃ末端であり、対応する野生型ＯｓｐＡ配列とは少なくとも野生型配列の位置１８２のアミノ酸のシステインでの置換および野生型配列の位置２６９のアミノ酸のシステインでの置換によって異なるという点ならびに当該ＯｓｐＡ断片の位置１８２のシステインと位置２６９のシステインとの間にジスルフィド結合が存在するという点で、変異体であり且つシスチン安定化されており；かつさらに、当該変異体ＯｓｐＡ断片は、位置１２３、１２４または１２５から始まり位置２７３または２７４で終わり；かつさらに、アミノ酸およびシステイン置換の番号付けは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１の完全長ＯｓｐＡ（配列番号５）の対応するアミノ酸の番号付けに従う。本発明の一態様において、第２のＯｓｐＡ断片は、例えば、先の発明（ＷＯ２０１４／００６２２６）との関係で上記で定義したＯｓｐＡの変異体Ｃ末端断片のいずれかであってよい。
【００５９】
本発明によれば、本発明の変異体ＯｓｐＡ断片およびハイブリッド断片は、（ｉ）上記で定義したＮ末端シートと、（ｉｉ）任意に、上記で定義した中央シートの１以上のさらなる鎖とを含まない。しかし、当該ポリペプチドは、シグナル配列のような１以上の官能配列、たとえば脂質化シグナル配列または脂質化のような翻訳後修飾を含んでいてよい。
【００６０】
本発明のさらなる態様において、本発明のポリペプチドは、（ｉ）１以上の変異体ＯｓｐＡ断片（少なくとも１つが、例えば以下に定義するリンカーにより任意に連結された本発明に係るハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片である）、または、１以上の変異体ＯｓｐＡ断片および抗原型３ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片、ならびに、（ｉｉ）任意に、ＯｓｐＡに対して異種の１以上のアミノ酸、特にシグナル配列、ならびに、（ｉｉｉ）任意に、脂質化のような翻訳後修飾からなる。
【００６１】
したがって、本発明のさらなる態様において、上記および本明細書にて定義する本発明のポリペプチドは、追加で、
（ｉ）脂質付加されているか、もしくは脂質化シグナル、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のｌｐｐ脂質化シグナル
0006505110.tif 000010
を含むポリペプチド、および／または
（ｉｉ）脂質化のための部位としてのＮ末端システイン残基によって生じる脂質化部位ペプチド、好ましくはＣＳＳを含むポリペプチド、および／または
（ｉｉｉ）ハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片と第２のシステイン安定化ＯｓｐＡ断片との間に、特に、例えば
0006505110.tif 000011
を含むリンカーを含むポリペプチド
を含んでよい。
【００６２】
本発明の一態様において、第２のＣ末端ＯｓｐＡ断片は、本発明に係るＯｓｐＡのハイブリッドＣ末端断片である。
【００６３】
本発明のさらなる態様において、ポリペプチドは、ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）を含むか、当該ヘテロ二量体からなる。したがって、さらなる側面において、本発明は、配列番号２７のアミノ酸配列（ヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）を有するか、当該配列からなるポリペプチドに関する。
【００６４】
本発明のポリペプチドは、保護能力を有している。上記のように、ハイブリッドおよびハイブリッド／変異体のＯｓｐＡ断片だけでなく、本発明のＯｓｐＡ断片のハイブリッド種へのジスルフィド結合の導入は、該ポリペプチドの保護能力を、ジスルフィド結合のないそれぞれの断片およびＯｓｐＡ断片のハイブリッド種を含むポリペプチドに比較して増大させる。幾つかの態様において、この保護能力は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、ジスルフィド結合のないそれぞれの断片およびＯｓｐＡ断片のハイブリッド種を含むポリペプチドに対して増大される。
【００６５】
保護能力という用語は、対象をボレリア感染症から保護するための能力を記述する。本発明のポリペプチドに関して、保護能力とは、対象をボレリア感染症から保護する免疫応答を誘導するための、ポリペプチドの能力に関する。保護能力は、ポリペプチドに対する免疫反応を誘導するように、対象にポリペプチドを投与することによって試験することができる。その後、対象をボレリアに曝露すればよい。感染に対する対象の反応がモニターされる。特に、対象におけるボレリアの存在を決定することができる。たとえば、ボレリアが対象において検出できない場合、ポリペプチドは保護的である。対象におけるボレリアの存在は、ボレリア特異的な核酸を検出することによって（たとえば、ＰＣＲによって）、またはボレリア特異的抗体を検出することによって（たとえば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによって）、またはボレリア自体を検出することによって（たとえば、増殖培地中で器官または組織を培養し、顕微鏡分析によってボレリアの存在を検証する）、決定することができる。特に、特定の投与量について、パーセンテージで報告される保護能力（「ｐｃ」）は、次のように定義される。
ｐｃ（％）＝［（試験された対象の総数−ボレリアに感染した対象の数）／試験された対象の総数］×１００
【００６６】
保護能力の差（Δｐｃ）は、たとえば、ジスルフィド結合（ｐｃ［結合あり］）を備えた突然変異体ＯｓｐＡ断片の保護能力（ｐｃ）を、ジスルフィド結合のない突然変異体ＯｓｐＡ断片の保護能力（ｐｃ［結合なし］）と比較することによって決定されてよい。本発明によれば、比較されるポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合の導入においてだけ異なる。ジスルフィド結合の導入による保護能力の変化（Δｐｃ）は、以下のようにして決定される。
Δｐｃ＝（ｐｃ［試料］−ｐｃ［対照］）
たとえば、Δｐｃ＝（ｐｃ［結合あり］−ｐｃ［結合なし］）
【００６７】
Δｐｃがゼロより大きければ（＞０）、全ての他のパラメーター（たとえば、用量およびアッセイ）が同じである場合には、試料（たとえばジスルフィド結合を備えた突然変異体ＯｓｐＡ断片）の保護能力が、対照（たとえばジスルフィド結合のないＯｓｐＡ断片）の保護能力よりも優れている。逆に、Δｐｃがゼロ未満（＜０）で、且つ他のすべてのパラメーター（たとえば、用量およびアッセイ）が同じであると仮定すれば、試料（たとえばジスルフィド結合を備えた突然変異体ＯｓｐＡ断片）の保護能力が、比較例（たとえば、ジスルフィド結合のないＯｓｐＡ断片）の保護能力よりも小さい。
【００６８】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、インビボ曝露アッセイによってその保護能力を評価され、ここでは本発明のポリペプチドまたはプラセボ対照薬で免疫化されたマウスが、皮下針（針曝露法）で、または媒介ダニによる導入（ダニ曝露法）によって免疫化された対象に導入されたボレリアに曝露される。
【００６９】
針曝露法は、望ましいボレリア株（たとえば、ボレリア・ブルグドルフェリ株ＺＳ７）については、本発明の第一の側面の前記第一のポリペプチドまたは適切なプラセボ（ネガティブ）対照、たとえばバッファーもしくはアジュバント単独で免疫化されたマウスに対して、感染用量（ＩＤ）５０の２０倍から５０倍のボレリアを皮下に導入し、該曝露マウスにおける感染率を比較することにより実施される。ＩＤ５０は、曝露マウスの５０％が感染する用量として定義される。ボレリアの用量は細菌の数で測定される。曝露用量は広範に変化することができ、株依存性である；したがって、株の病原性は、まずＩＤ５０の決定のための曝露実験によって評価されなければならない。針曝露の４週間後に、感染状態を決定する読み取り方法のために、血液および組織を採取する。これらの読み取り方法は、たとえば、ここに記載した血清に対するＶｌｓＥ  ＥＬＩＳＡまたはボレリアの同定のための採取された組織に対するｑＰＣＲ、またはその他の方法であることができる。
【００７０】
ダニ曝露法は、第１の側面の前記第１のポリペプチドで免疫化されたマウスに、ボレリア（たとえば、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株ＩＳ１）に感染した少なくとも１匹のダニ若虫（たとえばマダニ）を適用すること；およびｂ）第１の側面の前記第２のポリペプチドで免疫化された第２のマウスに、少なくとも１匹の感染ダニ若虫を適用すること；およびｃ）一般に曝露後の６週間、前記２つのマウスにおける感染の割合を比較することによって実施される。好ましくは、前記アッセイまたは試験は、試験されるべきポリペプチド当たり一群のマウスを用いて行われる。適切な試験は、実施例において記述および例示される。感染状態の評価は、血清に対するＶｌｓＥ  ＥＬＩＳＡ、または採取された組織から単離されたＤＮＡに対するｑＰＣＲを使用して、または他の適切な方法を使用して行うことができる。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、たとえば対象に対して３回、３０μｇ、好ましくは１０μｇ、好ましくは５．０μｇ、好ましくは１．０μｇ、好ましくは０．３μｇ以下の投与量で対象に投与される、ハイブリッドＯｓｐＡ断片および好ましくは変異体ＯｓｐＡ  Ｃ末端断片を含む本発明のポリペプチドなどの本発明の生成物は、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の保護能力を有する。一つの態様において、保護能力は、たとえば実施例で説明するようにインビボ曝露法で評価され、より好ましくはダニ曝露法で、より好ましくは針曝露法で評価される。
【００７２】
好ましい態様において、ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片を含む本発明のポリペプチドと、プラセボ（ネガティブ）対照との間の保護能力の差（Δｐｃ）は、３０μｇの投与量、好ましくは１０μｇ、好ましくは５．０μｇ、好ましくは１．０μｇ、好ましくは０．３μｇ以下の投与量で対象に３回投与されたとき、少なくとも５０％、特に少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％である。
【００７３】
本発明に従えば、ハイブリッドＯｓｐＡの第１の部分は、配列番号８を有するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ以外の如何なるボレリア株のものでもよく、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＢｒでないもの）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）のような本明細書で特定されたもの、好ましくは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）に由来してよく、これらの種の２以上に由来するＯｓｐＡタンパク質断片の融合体であってもよい。好ましくは、ＯｓｐＡは、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、特に株ＶＳ１１６（配列番号４）であるが、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、特に株Ｋ７８、ＯｓｐＡ抗原型２（配列番号６）；Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、特に株Ｂ３１、ＯｓｐＡ抗原型１（配列番号５）；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株ＰＢｒ、ＯｓｐＡ抗原型３（配列番号８）；Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、特に株ＰＢｉ、ＯｓｐＡ抗原型４（配列番号９）；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株ＰＨｅｉ、ＯｓｐＡ抗原型５（配列番号１０）；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株ＤＫ２９、ＯｓｐＡ抗原型６（配列番号１１）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株Ｔ２５、ＯｓｐＡ抗原型７（配列番号１２）に由来するものであってもよい。これらのＯｓｐＡタンパク質（全長）のアミノ酸配列は、下記に与えられる。
【００７４】
本発明に従えば、ジスルフィド結合はまた、断片の適切な折り重ねを可能にし、またはサポートするＯｓｐＡ断片の任意の位置に導入されたシステイン間に形成されてもよい。この位置は、上記のように、ＯｓｐＡの公知の構造に基づいて選択してよい。好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、Ｂ．アフゼリ、特にＢ．アフゼリＫ７８抗原型２  ＯｓｐＡ、またはＢ．アフゼリ以外のボレリア、たとえばＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．、特に株Ｂ３１、抗原型１；Ｂ．ガリニ、特に株ＰＢｒ、抗原型３；Ｂ．ババリエンシス、特に株ＰＢｉ、抗原型４；Ｂ．ガリニ、特に株ＰＨｅｉ、抗原型５；Ｂ．ガリニ、特に株ＤＫ２９、抗原型６；もしくはＢ．ガリニ、特に株Ｔ２５、抗原型７に由来するＯｓｐＡの相同性アミノ酸、またはＢ．バライシアナ株ＶＳ１１６のＯｓｐＡのアミノ酸１２５〜１７６もしくはＢ．スピエルマニイのＯｓｐＡのアミノ酸１２６〜１７５とＢ．ガリニ株ＰＢｒ（配列番号８）のアミノ酸１７７〜２７４との融合体の残基１８２＋／−３のうちの１つおよび残基２６９＋／−３のうちの１つにシステイン残基を挿入することで導入された少なくとも１つのジスルフィド結合（ジスルフィド結合型１「Ｄ１」）を含む。
【００７５】
なお、以下に注意されたい：
位置１８２＋／−３とは、位置１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４または１８５（好ましくは１８２）の略語である。
位置２６９＋／−３とは、位置２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１または２７２（好ましくは２６９）の略語である。
【００７６】
好ましい態様において、追加の変異体断片は、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株Ｋ７８、抗原型２のＯｓｐＡの野生型配列（配列番号６）の位置１２５、１２６、１３０または１３１から位置２７３のアミノ酸に由来すると共に、少なくとも１つのジスルフィド結合の導入だけが異なるものであり、特に、この少なくとも１つのジスルフィド結合は、位置１８２と２６９の間（ジスルフィド結合型１）にあるか、あるいは、Ｂ．アフゼリ以外のボレリア種、たとえばＢ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．、特に株Ｂ３１、抗原型１；Ｂ．ガリニ、特に株ＰＢｒ、抗原型３；Ｂ．ババリエンシス、特に株ＰＢｉ、抗原型４；Ｂ．ガリニ、特に株ＰＨｅｉ、抗原型５；Ｂ．ガリニ、特に株ＤＫ２９、抗原型６；またはＢ．ガリニ、特に株Ｔ２５、抗原型７に由来するＯｓｐＡの相同性断片および位置である。
【００７７】
さらなる態様において、変異体断片は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、最も好ましくは配列番号４６および配列番号１９〜２５の少なくとも１つの配列に対して少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列（ここでのシステインは置換されない）からなる群から選択されるアミノ酸配列であってよい。突然変異および配列同一性についてのさらなる詳細は上記で与えられている。
【００７８】
上記で詳述したように、本発明のポリペプチドは、シグナル配列を含んでいてよい。脂質化がＯｓｐＡに対してアジュバント特性を与えることについては既に示した。したがって、本発明のポリペプチドの脂質付加された形態、または脂質化シグナルを含むポリペプチドが好ましい。好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、脂質化シグナル、好ましくはボレリア外部表面タンパク質の脂質化シグナル、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＢ（それぞれ配列番号１３および１４）、またはさらに好ましくは、大腸菌ｌｐｐ脂質化シグナル配列（配列番号１５）を含んでいる。脂質化シグナルを含む本発明のＯｓｐＡ断片は、プロセシングの間に脂質付加され、また脂質化されたシグナルペプチドは切断される。したがって、シグナルペプチドは、成熟した脂質付加タンパク質にはもはや存在しない。
【００７９】
本発明による脂質付加されたタンパク質は、ポリペプチドへの３つの脂肪酸基およびグリセロールの付加を示すために、Ｎ末端が「Ｌｉｐ」で標識されている。上記の適切な脂質化シグナルは、
0006505110.tif 000012
が含まれる。脂質部分およびグリセロールは全長の野生型ＯｓｐＡタンパク質に存在するＮ末端システイン残基に結合されるので、脂質化のためのＯｓｐＡ  Ｃ末端断片はさらに、システイン残基に続く追加のアミノ酸を含むペプチドを含んでいてよい。たとえば、脂質化シグナル配列に対して直ぐＣ末端にあるＣＳＳまたはＣＫＱＮ（配列番号６２）のような配列は、脂質化シグナルペプチドの切断の際に、脂質化のためのＮ末端システイン残基を提供する。この脂質付加されたシステイン含有ペプチドが、本発明の最終的な脂質付加されたポリペプチドに存在する。
【００８０】
Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．のＯｓｐＡタンパク質は、Ｔ細胞受容体に結合する能力をもった配列を含んでおり、これはヒト白血球機能関連抗原（ｈＬＦＡ−１）（本明細書では「ｈＬＦＡ−１様配列」とも称する）に結合する能力をも有することが推測されている。このＯｓｐＡ領域のｈＬＦＡ−１に対する類似性は、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．の投与に際して、交差反応性を伴って免疫応答を生じる可能性がある。ヒト対象に対するＯｓｐＡは、感受性のある個体において自己免疫疾患（特に自己免疫関節炎）を誘導する可能性がある。したがって、好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、ヒト白血球機能関連抗原（ｈＬＦＡ−１）に対する結合能力を有するＴ細胞受容体への結合能力を有する配列を含まず、特に、アミノ酸配列
0006505110.tif 000013
を含まない。この目的で、ｈＬＦＡ−１様配列、特にアミノ酸配列
0006505110.tif 000014
は、もう一つのボレリアｓｐ．のＯｓｐＡタンパク質由来の相同配列、特に
0006505110.tif 000015
で置換されてよい。
【００８１】
好ましい態様において、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む本発明のポリペプチドは、少なくとも一つのボレリア株、特にＢ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）Ｋ７８、ＯｓｐＡ抗原型２（配列番号６）；Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．、特に株Ｂ３１、抗原型１（配列番号５）；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株ＰＢｒ、抗原型３（配列番号７および８）；Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、特に株ＰＢｉ、抗原型４（配列番号９）；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株ＰＨｅｉ、抗原型５（配列番号１０）；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株ＤＫ２９、抗原型６（配列番号１１）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、特に株Ｔ２５、抗原型７（配列番号１２）に由来する野生型全長ＯｓｐＡタンパク質の少なくとも１つに関し、ボレリア感染に対して前記ポリペプチドと同じ保護能力を本質的に樹立する。
【００８２】
なお、突然変異および配列同一性についてのさらなる詳細が、上記に与えられていることに留意すべきである。
【００８３】
（表Ａ−３）本発明に記載された、脂質化された突然変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体の名称および配列番号
0006505110.tif 000016
＊Ｓ＝抗原型（１〜６）（表Ａ−２参照）；
Ｓ３ｈｙｂ＝Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）のアミノ酸１２５〜１７６とＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒのアミノ酸１７７〜２７４との融合体
Ｄ１＝ジスルフィド結合型１（位置１８３＋／−３および２７０＋／−３に挿入されたシステイン残基）；
Ｌｉｐ＝脂質化：グリセロールおよび脂肪酸残基のＮ末端付加
【００８４】
もう一つの好ましい態様において、本発明の第一の側面に従うポリペプチドは、１以上のリンカーを介して連結される少なくとも２つまたは３つの突然変異体断片を含んでいる。リンカーは２つの断片を結合させるために用いられる幾分短いアミノ酸配列である。それは、前記断片、治療またはワクチン接種すべき対象中でのそれらの相互作用、またはそれらの保護能力に対する負の影響を回避するために設計されるべきである。好ましいのは、最大でも２１アミノ酸、特に最大でも１５アミノ酸、とりわけ最大でも１２または８アミノ酸の短いリンカーである。より好ましくは、１以上のリンカーは、断片との相互作用を低減または最小化するために、グリシン、セリンおよびアラニンのような短いアミノ酸で構成される。好ましいリンカーは、「ＬＮ１」ペプチドリンカー、即ち、次の配列を有した、Ｂ．ブルグドルフェリｓ．ｓ．、株Ｂ３１に由来するＯｓｐＡのＮ末端半分の２つの別々のループ領域（Ｄ５３Ｓの位置５３のアミノ酸交換を伴ったａａ６５〜７４およびａａ４２〜５３）の融合体である：
0006505110.tif 000017
。リンカーは脂質化部位を含んでもよい。
【００８５】
もう一つの好ましい態様において、第１の側面に従うポリペプチドは、第１の側面の好ましい態様において定義した２つもしくは３つの異なる突然変異体断片を含む、全体のサイズが５００アミノ酸以下のポリペプチド；または、本質的に２つもしくは３つの異なる突然変異体断片、１つもしくは２つのリンカー、および任意にＮ末端システインからなる、ポリペプチドを含むか；ならびに／または、本質的に２つもしくは３つの異なる突然変異体断片、最大で２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２もしくは１１アミノ酸、好ましくは最大で１０、９、８、７もしくは６アミノ酸、さらにより好ましくは最大で５、４、３、２もしくは１アミノ酸からなる前記断片のＮ末端伸長部（該Ｎ末端伸長部はそれぞれのボレリアＯｓｐＡにおける断片のＮ末端に直接位置する）、および任意にＮ末端システインからなるポリペプチドを含む。該Ｎ末端システインの後には、任意に、１〜１０アミノ酸長の短いペプチドリンカーが続いてよく、好ましくはＮ末端ＣＳＳペプチドの形態を取る。
【００８６】
本発明の核酸および関連する側面
さらなる側面では、本発明は、本明細書および本発明に関して上記で定義したポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸は、ベクターおよび／または細胞に含まれていてよい。
【００８７】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明の目的にとって、一般に「核酸」という用語は、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいい、それは一本鎖および二本鎖の領域／形態を含む未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡでよい。
【００８８】
本明細書に使用される「ポリペプチドをコードする核酸」という用語は、本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含んだポリヌクレオチドを包含する。この用語はまた、ペプチドまたはポリペプチドをコードする単一の連続領域または複数の不連続領域（たとえば、組み込まれたファージ、組み込まれた挿入配列、組み込まれたベクター配列、組み込まれたトランスポゾンによって、またはＲＮＡエディティングもしくはゲノムＤＮＡ再編成により中断された、ポリヌクレオチド）と追加の領域（コード化配列および／または非コード化配列を含んでもよい）とを含むポリヌクレオチドも包含する。
【００８９】
遺伝子コードの縮重の結果として、ここに記載したポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者に理解されるであろう。これらポリヌクレオチドの幾つかは、何れか天然の（即ち、天然に存在する）遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の類似性を有する。にもかかわらず、本発明では、コドン使用の相違によって変化するポリヌクレオチド、たとえば、ヒトおよび／または霊長類および／または大腸菌のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドが個別的に想定される。
【００９０】
所望のポリペプチドをコードする配列は、当該技術において周知の化学的方法を使用して（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．  ｐｐ．２１５−２２３（１９８０），Ｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．ｐｐ．２２５−２３２（１９８０）参照）、全体的または部分的に合成されてもよい。あるいは、タンパク質自身を、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成する化学的方法によって製造してもよい。たとえば、ペプチド合成は種々の固相法（Ｒｏｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２−２０４（１９９５））を使用して行うことができ、また、たとえばＡＳＩ  ４３１  Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して自動合成が達成されてもよい。
【００９１】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセッシングおよび／または発現を修飾する変化を含むが、これに限定されない）でポリペプチドをコードする配列を変化させるために、当該技術で一般に知られた方法を使用して加工することができる。たとえば、遺伝子断片のランダムな断片化、およびＰＣＲ再編成、および合成オリゴヌクレオチドによるＤＮＡシャッフリングを使用して、ヌクレオチド配列を加工してよい。加えて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変化させ、コドン優先性を変え、スプライス変異体を作製し、または突然変異を導入する等のために、部位特異的突然変異誘発を使用してよい。
【００９２】
本発明のさらなる側面において、本発明は、例えばプロモーターが誘導されたら核酸によりコードされたポリペプチドが発現されるように誘導性プロモーターに連結された本発明の核酸を含む、ベクターに関する。好ましい態様において、該ベクターはｐＥＴ２８ｂ（＋）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｖｅｃｔｏｒ−ｄａｔａｂａｓｅ／２５６６／）である。
【００９３】
本発明のさらなる側面は、前記ベクターを含んでなり、ここで前記誘導性プロモーターは、好ましくは増殖培地への十分量のＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシド）の添加によって活性化される。任意に、これは０．１〜１０ｍＭ、０．１〜５ｍＭ、０．１〜２．５ｍＭ、０．２〜１０ｍＭ、０．２〜５ｍＭ、０．２〜２．５ｍＭ、０．４〜１０ｍＭ、１〜１０ｍＭ、１〜５ｍＭ、２．５〜１０ｍＭ、２．５〜５ｍＭ、５〜１０ｍＭの濃度においてである。あるいは、プロモーターは、温度またはｐＨの変化によって誘導されてもよい。
【００９４】
本明細書で使用される核酸分子とは、一般には、任意のリボ核酸分子またはデオキシリボ核酸分子を言うものであり、これは未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。したがって、たとえば、ここで使用される核酸分子は、少なくとも一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を言い、該ハイブリッド分子のＤＮＡおよびＲＮＡは一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖の領域の混合物であってよい。本明細書で使用する核酸分子という用語には、１以上の修飾塩基を含む上記で述べたＤＮＡまたはＲＮＡ分子が含まれる。したがって、安定性またはその他の理由のために修飾された骨格をもったＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、該用語が本明細書で意図した通りの「核酸分子」である。さらに、２例だけ挙げるならば、イノシンのような特殊な塩基またはトリチル化された塩基のような修飾塩基を含んだＤＮＡまたはＲＮＡ種もまた、本明細書で定義される核酸分子である。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に対して、当業者に既知の多くの有用な目的で、多様な修飾がなされてきたことが理解されるであろう。本明細書に使用される核酸分子という用語は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された核酸分子の形態、並びにウイルスおよび細胞（特に単純型細胞および複合型細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。また、核酸分子という用語は、しばしばオリゴヌクレオチドと称される短い核酸分子をも包含する。「ポリヌクレオチド」および「核酸」または「核酸分子」は、本明細書では互換可能に使用される。
【００９５】
本発明に従う核酸は、化学的に合成されてよい。あるいは、当該核酸をボレリアから単離して、当業者に周知の方法により修飾することができる。同じことが、本発明に従うポリペプチドにも適用される。
【００９６】
さらにまた、本発明の核酸は、クローニングなどの標準的な技術を用いて、それがボレリアの制御配列もしくは異種の制御配列、異種のリーダー配列、異種のマーカー配列、または異種のコード配列であっても、何れかの望ましい配列に機能的に連結して、融合遺伝子を作製することができる。
【００９７】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡもしくはｃＲＮＡのようなＲＮＡの形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であってよく、これらはクローニングによって得られ、あるいは化学合成技術によって製造され、またはそれらの組合せによって製造される。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖、または一本鎖でよい。一本鎖ＤＮＡは、コーディング鎖（別名センス鎖）でもよく、またはそれは非コーディング鎖（またアンチセンス鎖として称する）でもよい。
【００９８】
本発明の核酸は、ベクターまたは宿主細胞に含まれていてよい。したがって、本発明はまた、本発明に係る核酸分子を含む、ベクターまたは宿主細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に関する。ベクターは、ベクターが宿主細胞中で複製可能であるように、且つヌクレオチド配列でコードされるタンパク質を発現できるように、上述した核酸を含んでいてもよい。
【００９９】
本発明のポリペプチドの組換え製造のために、宿主細胞は、本発明の核酸の発現システムまたはその一部を組み込むように遺伝子的に操作することができる。宿主細胞への核酸の導入は、多くの標準的な研究室マニュアル［たとえば、Ｄａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（１９８６）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）］に記述される方法、たとえばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、カチオン脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲート、形質導入、スクレープローディング、弾道導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染によって行うことができる。
【０１００】
適切な宿主の代表的な例には、グラム陰性菌細胞、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アクチノバチルス、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、シアノバクテリア、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、フランシスセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、ヘモフィルス（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、トレポネーマ、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）の細胞などが含まれる。一つの態様において、宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である。好ましい態様において、宿主細胞は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞、または大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）（ＤＥ３）細胞である。
【０１０１】
あるいは、グラム陽性細菌細胞を使用してもよい。本発明のポリペプチドを産生するために、極めて多様な発現システムが使用できる。一つの態様において、ベクターは細菌プラスミドから誘導される。一般に、宿主内でポリヌクレオチドを維持する、増大させる、もしくは発現させる、かつ／またはポリペプチドを発現させるのに適した任意のシステムもしくはベクターを、この点に関する発現のために使用してよい。適切なＤＮＡ配列は、たとえば「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前出のＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）」に記載のような周知かつルーチンの種々の技術の何れかによって、発現系の中に挿入されてよい。
【０１０２】
本発明の一つの態様において、細胞を、抗生物質、好ましくはカナマイシンの存在下のような選択圧下で増殖させる。もう一つの態様において、細胞を抗生物質の非存在下で増殖させる。
【０１０３】
本発明に従うポリペプチドを発現させるために、非常に多種多様な発現ベクターを使用することができる。一般に、宿主内で核酸を維持し、増大させ、または発現させ、ポリペプチドを発現させるのに適した任意のベクターが、この点に関して発現のために使用されてよい。本発明のこの側面に従えば、ベクターは、たとえばプラスミドベクター、一本鎖もしくは二本鎖のファージベクター、または一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスのベクターであってよい。ここに開示した出発プラスミドは、商業的に入手可能であるか、または公的に入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから周知もしくは公開された方法のルーチンの応用によって、構築することができる。ある点に関して、ベクターの中でも、本発明による核酸分子およびポリペプチドの発現のためのベクターが好ましい。宿主細胞中の核酸構築物は、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生するために、従来の方法で使用することができる。あるいは、本発明に従うポリペプチドは、従来のペプチド合成機によって合成的に製造することができる。
【０１０４】
加えて、本発明は、該ベクターを含む宿主細胞に関する。適切な宿主細胞の代表例には、細菌、たとえば連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；真菌、たとえば酵母およびコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）；昆虫細胞、たとえばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；哺乳動物細胞、たとえばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞またはボウズ（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞；および植物細胞が含まれる。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを使用してこのようなタンパク質を産生するために、無細胞翻訳系もまた用いることができる。
【０１０５】
実際に本発明によるベクターを宿主細胞に導入することによって所望のアミノ酸配列を発現させるために、ベクターは、本発明による核酸配列に加えて、発現を制御するための他の配列（たとえば、プロモーター配列、ターミネータ配列およびエンハンサー配列）、および微生物、昆虫細胞、動物培養細胞等を選別するための遺伝子マーカー（たとえば、ネオマイシン耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子）を含んでいてもよい。さらにまた、該ベクターは、反復形態（たとえばタンデム）で、本発明による核酸配列を含んでいてよい。該ベクターは、遺伝子工学の分野で慣用的に用いられる手順に基づいて構築してよい。
【０１０６】
宿主細胞は適切な培地で培養してよく、また本発明によるタンパク質は培養産物から得ることができる。また、本発明に従うタンパク質は培地から回収し、従来の方法で精製してよい。
【０１０７】
したがって、本発明はまた、本発明に係るベクターで適切な宿主細胞を形質転換する、もしくはトランスフェクトする工程を含む、本発明に係るポリペプチドを発現する細胞を作製するための方法、または本発明に係る核酸分子を発現させる工程を含む、本発明に係るポリペプチドを製造するための方法に関する。
【０１０８】
あるいは、上記で定義したポリペプチドを製造する方法は、以下の工程によって特徴づけられ得る：
（ａ）宿主細胞にポリペプチドをコードするベクターを導入する工程、
（ｂ）前記宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で増殖させる工程、
（ｃ）前記宿主細胞をホモジナイズする工程、および
（ｄ）前記宿主細胞ホモジネートを精製工程に供する工程。
【０１０９】
本発明はさらに、以下の工程によって特徴づけられる、上記で定義したポリペプチドを製造する方法に関する：
（ａ）ポリペプチドをコードする核酸をベクターに導入する工程、
（ｂ）前記ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｃ）前記宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で増殖させる工程、
（ｄ）前記宿主細胞をホモジナイズする工程、
（ｅ）相分離によって、脂質相におけるポリペプチドを濃縮する工程、および
（ｆ）ゲル濾過カラムでさらに精製する工程。
【０１１０】
本発明はさらに、次の工程を特徴とする、上記で定義したポリペプチドを製造する方法に関する：
（ａ）ポリペプチドをコードする核酸をベクターに導入する工程、
（ｂ）前記ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（ｃ）前記宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で増殖させる工程、
（ｄ）前記宿主細胞をホモジナイズする工程、
（ｅ）相分離によって、脂質相におけるポリペプチドを濃縮する工程、
（ｇ）ゲル濾過カラムでさらに精製する工程、および
（ｈ）任意に、バッファー交換カラムでさらに処理する工程。
【０１１１】
本発明の抗体および関連する側面
さらなる側面において、本発明の基礎をなす問題は、本発明に関して定義したハイブリッドＣ末端ＯｓｐＡ断片に選択的に結合し、単独の第１のＯｓｐＡ部分および第２のＯｓｐＡ部分に（すなわち他の部分と融合していない場合に）は結合しない抗体またはその少なくとも有効な部分によって解決される。
【０１１２】
好ましい態様において、前記抗体はモノクローナル抗体である。
【０１１３】
もう一つの好ましい態様において、当該有効な部分は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）Ｎ断片、Ｆ（ａｂ）２断片もしくはＦｖ断片または単一ドメイン抗体を含む。
【０１１４】
本発明のさらにもう一つの態様において、前記抗体はキメラ抗体である。
【０１１５】
さらにもう一つの態様において、前記抗体はヒト化抗体である。
【０１１６】
好ましい側面において、本発明の抗体は、本発明のハイブリッドＯｓｐＡ断片ポリペプチドに特異的に結合し、単独の第１のＯｓｐＡ部分および第２のＯｓｐＡ部分には結合せず、また対応する野生型ＯｓｐＡ断片ポリペプチドにも結合しない。より好ましい側面において、抗体は、特異的に本発明の変異体ＯｓｐＡ断片のジスルフィド結合に結合する。
【０１１７】
「特異性」という用語は、特定の抗原結合性分子または抗原結合性タンパク質（ナノボディまたは本発明のポリペプチドなど）が結合することができる、異なるタイプの抗原または抗原決定基の数を指す。抗原結合性タンパク質の特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて決定することができる。親和性は、抗原結合性タンパク質（ＫＤ）との抗原の解離のための平衡定数によって表され、抗原決定基と抗原結合性タンパク質上の抗原結合部位間の結合強度に関する尺度である：ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合性分子間の結合強度は強力である（あるいは、親和性は、親和定数（ＫＡ）として表現することもでき、これは１／ＫＤである）。
【０１１８】
当業者に明らかであろうように（たとえば、本明細書におけるさらなる開示に基づいて）、親和性は、それ自体公知の様式において決定することができ、関心対象の特異的抗原に依存する。結合活性は、抗原結合性分子（本発明の抗体またはその有効な部分など）と関連する抗原間の結合の強度の尺度である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合性分子上のその抗原結合部位間の親和性および抗原結合性分子上に存在する関連する結合部位の数の両方に関連がある。典型的には、抗原結合性タンパク質（本発明の抗体またはその有効な部分などの）が、その抗原に、１０−５〜１０−１２Ｍまたはそれ未満、好ましくは、１０−７〜１０−１２Ｍまたはそれ未満、より好ましくは、１０−８〜１０−１２Ｍの解離定数（ＫＤ）（すなわち、１０５〜１０１２Ｍ−１またはそれ以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モルまたはそれ以上、より好ましくは１０８〜１０１２Ｍ−１の会合定数（ＫＡ））で、結合し得る。一般に、１０４Ｍより大きい任意のＫＤ値（または１０４Ｍ−１未満の任意のＫＡ値）は、非特異的結合を示すと考慮される。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは、１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で所望の抗原に結合し得る。抗原または抗原決定基への抗原結合性タンパク質の特異的結合は、それ自体公知の任意の適切な様式において決定することができ、たとえば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイおよび当技術分野においてそれ自体公知のその異なる変異体、並びに本明細書において言及したその他の技術などの、スキャッチャード解析および／または競合結合アッセイを含む。
【０１１９】
解離定数は、当業者に明らかであろう、実際のまたは見かけ上の解離定数であり得る。解離定数を決定するための方法は当業者に明らかであり、たとえば、本明細書において言及した技術を含み得る。この点において、１０−４Ｍまたは１０−３Ｍ（たとえば、１０−２Ｍ）を超える解離定数を測定することができない可能性があることも明らかであろう。任意に、また、当業者に明らかであろうように、（実際のまたは見かけ上の）解離定数を、関係［ＫＤ＝１／ＫＡ］を用いて、（実際のまたは見かけ上の）会合定数（ＫＡ）に基づいて算出してもよい。
【０１２０】
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を意味する。一般に、親和性は、ＫＤまたは解離定数によって与えられ、モル／リットル（またはＭ）の単位を有する。また、親和性を、会合定数ＫＡとして表すこともでき、これは１／ＫＤと同等であり、（リットル／モル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、主に、２つの分子（アミノ酸配列、ナノボディまたは本発明のポリペプチドおよびその意図された標的など）の間の相互作用の安定性は、これらの相互作用のＫＤ値によって表され；関係ＫＡ＝１／ＫＤを考慮すれば、そのＫＤ値によって分子相互作用の強度を特定することは、対応するＫＡ値を算出するためにも使用できることが、当業者に明らかである。ＫＤ値は、周知の関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（換言すればＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））により結合の自由エネルギー（ＤＧ）に関連するので、熱力学的な意味における分子相互作用の強度も特徴づけ、式中Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、およびｌｎは自然対数を意味する。
【０１２１】
意味があると考えられる（たとえば特異的な）生物学的相互作用のためのＫＤは、典型的には１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用がより強力であるほど、そのＫＤはより低い。
【０１２２】
好ましい態様において、本発明の抗体のＫＤは、１０−１２Ｍと１０−５Ｍの間であり、好ましくは、１０−６未満、好ましくは１０−７未満、好ましくは１０−８Ｍ未満、好ましくは１０−９Ｍ未満、より好ましくは１０−１０Ｍ未満、さらにより好ましくは１０−１１Ｍ未満、最も好ましくは１０−１２Ｍ未満である。
【０１２３】
また、ＫＤは、ｋｏｆｆとして表示される複合体の解離速度定数の、ｋｏｎと表示されるその会合の速度に対する比として（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆとなるよう）表すこともできる。解離の速度（off-rate）ｋｏｆｆは、単位ｓ−１（ｓは、秒の国際単位表示法である）を有する。会合の速度ｋｏｎは、単位Ｍ−１ｓ−１を有する。会合の速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し得、二分子相互作用に関する拡散律速の会合速度定数に近づく。解離の速度は、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによって、与えられた分子相互作用の半減期に関連する。解離の速度は、１０−６ｓ−１（複数の日のｔ１／２でほぼ不可逆な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
【０１２４】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、１つの分子をバイオセンサーチップ上に固定し、もう一方の分子に、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値およびしたがってＫＤ（またはＫＡ）値を生じる流動条件下で固定化分子上を通過させる、周知の表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術（たとえば、Ｏｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３，１５５１−１５５９，２００１を参照されたい）などの、それ自体で公知の別の技術を介して測定することができる。たとえば、これは、周知のＢＩＡＣＯＲＥ機器を使用して行うことができる。
【０１２５】
また、たとえば、測定するプロセスが、１つの分子のバイオセンサー上のコーティングに関連した人工産物によって推定される分子の固有の結合親和性に何らかの形で影響する場合、測定されたＫＤが見かけ上のＫＤに対応し得ることは、当業者に明らかであろう。また、１つの分子がもう一方の分子のための複数の認識部位を含む場合、見かけ上のＫＤを測定してもよい。このような状況において、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合活性によって影響を受け得る。
【０１２６】
親和性を評価するために使用してもよいもう一つのアプローチは、Ｆｒｉｇｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）手順である（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７７，３０５−１９，１９８５）。この方法は、溶液相結合平衡測定を確立し、およびプラスチックなどの支持体上の分子の１つの吸着に関する潜在的人工産物を回避する。
【０１２７】
しかし、ＫＤの正確な測定は、かなり労働集約型であり得るし；したがって、時々、見かけ上のＫＤ値が、２つの分子の結合強度を評価するために決定される。全ての測定が一貫した方法で行われる（たとえば、アッセイ条件を変更しないまま保持する）限り、見かけ上のＫＤ測定を真のＫＤの近似値として使用することができることに留意すべきであり、およびそれ故、本文書において、ＫＤと見かけ上のＫＤは、同等の重要性または関連性で扱われるべきである。
【０１２８】
最後に、多くの状況において、経験豊かな科学者は、いくつかの参照分子に関連する結合親和性を決定することが便利であると判断し得ることに留意すべきである。たとえば、分子ＡとＢの間の結合強度を評価するために、たとえば、Ｂに結合することが公知であり、かつＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーまたはその他の形式における簡単な検出のためのビオチンなどの、蛍光体または発色団またはその他の化学的部分（蛍光検出のための蛍光体、光吸収検出のための発色団、ストレプトアビジン媒介されたＥＬＩＳＡ検出のためのビオチン）で適切にラベルされた、参照分子Ｃを使用してもよい。典型的には、参照分子Ｃを固定濃度にて保持し、およびＡの濃度を、Ｂの与えられた濃度または量に対して変動させる。結果として、Ａの非存在下においてＣについて測定されたシグナルが半分になる濃度のＡに対応する、阻害濃度（ＩＣ）５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ並びに参照分子の総濃度ｃｒｅｆが公知であれば、相互作用Ａ−Ｂについての見かけ上のＫＤは、以下の式から得ることができる：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆならば
0006505110.tif 000018
であることに注目されたい。ＩＣ５０の測定が、比較される結合剤に関して、一貫した方法（たとえば、固定されたｃｒｅｆを保持する）において行われるならば、分子相互作用の強度または安定性は、ＩＣ５０によって評価することができ、およびこの測定は、このテキストの全体にわたってＫＤまたは見かけ上のＫＤと同等と判断される。
【０１２９】
本発明のもう一つの側面は、ハイブリドーマ細胞系に関し、これは上記で定義した抗体を産生する。
【０１３０】
さらに、本発明の根底にある問題は、以下の工程によって特徴づけられる、上記で定義した抗体を産生するための方法によって解決される：
（ａ）非ヒト動物に上記で定義したポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
（ｂ）前記動物から抗体を含む体液を取り出す工程、および、
（ｃ）前記抗体を含む体液をさらなる精製工程に供することによって抗体を産生する工程。
【０１３１】
さらに、本発明は、以下の工程によって特徴づけられる、上記で定義した抗体を産生するための方法に関する：
（ａ）非ヒト動物に上記で定義したポリペプチドを投与することによって前記動物における免疫応答を開始させる工程、
（ｂ）前記動物から脾臓または脾細胞を取り出す工程、
（ｃ）前記脾臓または脾細胞のハイブリドーマ細胞を産生する工程、
（ｄ）前記ポリペプチドに特異的なハイブリドーマ細胞を選択してクローン化する工程、
（ｅ）前記クローン化されたハイブリドーマ細胞の培養によって抗体を産生する工程、および、
（ｆ）任意に、さらなる精製工程を行う工程。
【０１３２】
医薬組成物および関連する医学的側面
本発明のもう一つの側面は、
（ｉ）本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸および／または本発明に係る抗体、並びに
（ｉｉ）任意に、薬学的に許容可能な賦形剤
を含む医薬組成物に関する。
【０１３３】
したがって、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係る抗体または本発明に係る医薬組成物は、
−医薬、特にワクチンとして使用するため、または
−ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．ヴァライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）感染症、好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）感染症を治療または予防するための方法にて使用するため
のものであってよい。
【０１３４】
好ましくは、組成物は、Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）をさらに含み、組成物は、Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）をさらに含み、組成物は、Ｌｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）をさらに含み、あるいは組成物は、Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）をさらに含む。
【０１３５】
さらにもう一つの側面は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、より好ましくは本明細書において開示した病原性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、例えばより好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）による感染症の治療または予防にて使用するための、上記で定義した医薬組成物に関する。
【０１３６】
本発明の根底にある問題は、もう一つの側面において、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、より好ましくは本明細書において開示した病原性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、例えばより好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）による感染症を治療または予防するための医薬組成物の調製のための、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸および／または本発明に係る抗体の使用によって解決される。
【０１３７】
医薬組成物は、緩衝物質、安定剤またはさらなる活性成分、特に医薬組成物および／またはワクチン製造と関連して公知である成分などの任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を任意に含んでいてもよい。好ましくは、薬学的に許容可能な賦形剤は、Ｌ−メチオニンを含む。好ましくは、医薬組成物は、特にワクチンとしてまたは、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、より好ましくは本明細書において開示した病原性ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、例えばより好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、ならびに／または抗原が含まれているワクチンに対するその他の病原体によって生じる感染症を予防または治療するために、医薬として使用されるものである。好ましくは、医薬組成物は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．ヴァライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）感染症、好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）感染症を治療または予防するための方法にて使用するためのものである。
【０１３８】
さらに一つの態様において、医薬組成物は、アジュバントを含む。細菌毒素または本発明のプロセスを使用して作製されたコンジュゲートと混合された適切なアジュバントの選択は、当業者の知識の範囲内である。適切なアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩を含み、しかしまた、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛のものなどのその他の金属塩でもよく、またはアシル化されたチロシンの不溶性懸濁液またはアシル化された糖、陽イオンまたは陰イオンで誘導体化されたサッカライドまたはポリホスファゼンでもよい。好ましい態様において、医薬組成物は、水酸化アルミニウムで補助される。
【０１３９】
さらなる態様において、医薬組成物は、ポリカチオン性重合体、特にポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、特にオリゴ（ｄＩｄＣ）１３（配列番号６３）、少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチド、特にペプチド
0006505110.tif 000019
、神経刺激性化合物、特にヒト成長ホルモン、水酸化アルミニウム、アルミニウムホスフェート、フロイントの完全アジュバントもしくはフロイントの不完全アジュバントまたはこれらの組み合わせからなる群より好ましくは選択される免疫賦活性物質をさらに含む。好ましくは、免疫賦活性物質は、ポリカチオン性重合体および免疫賦活性デオキシヌクレオチドの、または、少なくとも２つのＬｙｓＬｅｕＬｙｓモチーフを含むペプチドおよび免疫賦活性デオキシヌクレオチドのいずれかの組み合わせ、好ましくは、
0006505110.tif 000020
およびオリゴ（ｄＩｄＣ）１３（配列番号６３）の組み合わせである。より好ましくは、前記ポリカチオン性ペプチドは、ポリアルギニンである。
【０１４０】
さらなる態様において、医薬組成物は、６．７＋／−０．２のｐＨにて、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、Ｌ−メチオニン、スクロースおよびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含む。好ましくは、また、医薬組成物は、好ましくは、０．１５％の濃度にて、水酸化アルミニウムを含む。
【０１４１】
一つの態様において、製剤は、５ｍＭと５０ｍＭの間のリン酸ナトリウム、１００と２００ｍＭの間の塩化ナトリウム、５ｍＭと２５ｍＭの間のＬ−メチオニン、２．５％と１０％の間のスクロース、０．０１％と０．１％の間のＴｗｅｅｎ２０および０．１％と０．２％（ｗ／ｖ）の間の水酸化アルミニウムを含む。より好ましくは、製剤は、ｐＨ６．７±０．２にて、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ  Ｌ−メチオニン、５％スクロース、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１５％（ｗ／ｖ）水酸化アルミニウムを含む。さらにより好ましくは、製剤は、本発明にしたがって、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体を含む。
【０１４２】
一つの態様において、医薬組成物は、３つのヘテロ二量体、好ましくはＬｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）を含む。好ましくは、３つのヘテロ二量体は、１：２：１、１：３：１、１：１：２、１：１：３、１：２：２、１：２：３、１：３：２、１：３：３、２：１：１、２：１：２、２：１：３、２：２：３、２：２：１、２：３：１、２：３：２、２：３：３、３：１：１、３：１：２、３：１：３、３：２：１、３：２：２、３：２：３、３：３：１、３：３：２、最も好ましくは１：１：１のモル比にて混合される。
【０１４３】
さらなる態様において、医薬組成物は、２つのヘテロ二量体、好ましくはＬｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）、Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）およびＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）またはＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）を、１：２、１：３、２：１、３：１、２：３、３：２、好ましくは１：１のモル比にて含む。
【０１４４】
一つの態様において、本発明の医薬組成物またはワクチンは、ボレリアまたはボレリア以外の病原体に由来する少なくとも１つのさらなる抗原をさらに含む（本明細書において、一般的に、「混合医薬組成物またはワクチン」と称する）。好ましい態様において、少なくとも１つのさらなる抗原は、ライムボレリア症を生じるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種から由来する。種々の側面において、少なくとも１つのさらなる抗原は、もう一つの病原体、好ましくはダニ媒介の病原体から由来する。さらなる側面において、病原体は、ロッキー山紅斑熱、ヒト顆粒球エールリヒア症（ＨＧＥ）、腺熱、ヒト単核球エールリヒア症（ＨＭＥ）、アナプラズマ症、ボタン熱、リケッチア・パルケリリケッチア症、サザンマダニ関連発疹疾病（ＳＴＡＲＩ）、ヘルベチカ斑点熱、３６４Ｄリケッチア症、アフリカ斑点熱、回帰熱、野兎病、コロラドダニ熱、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ、別名ＦＳＭＥ）、クリミアコンゴ出血熱、Ｑ熱、オムスク出血熱、キャサヌール森林病、ポワッサン脳炎、ハートランドウイルス疾患またはバベシア症を生じる。さらなる側面において、疾患は、日本脳炎である。
【０１４５】
さらなる態様において、少なくとも１つのさらなる抗原は、生物媒介の、好ましくはダニ媒介の、ボレリア・ヘルムシイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｈｅｒｍｓｉｉ）、ボレリア・パルケリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｐａｒｋｅｒｉ）、ボレリア・ヅットニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｄｕｔｔｏｎｉ）、ボレリア・ミヤモトイ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｍｉｙａｍｏｔｏｉ）、ボレリア・ツリカタエ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｔｕｒｉｃａｔａｅ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、リケッチア・アウストラリス（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、リケッチア・コノリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉ）、リケッチア・ヘルベチカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｈｅｌｖｅｔｉｃａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、エーリキア・センネツ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｅｎｎｅｔｓｕ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、ネオエーリキア・ミクレンシス（Ｎｅｏｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｍｉｋｕｒｅｎｓｉｓ）、コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）およびボレリア・ロネスタリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｌｏｎｅｓｔａｒｉ）を含む群から選択した病原体、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ  ａｋａ  ＦＳＭＥウイルス）、コロラドダニ熱ウイルス（ＣＴＦＶ）、クリミアコンゴ出血熱ウイルス（ＣＣＨＦＶ）、オムスク出血熱ウイルス（ＯＨＦＶ）、日本脳炎（ｅｎｃｅｐａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＪＥＶ）およびバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属種に由来する。
【０１４６】
もう一つの側面において、本発明は、本発明の医薬組成物および上記で定義した追加の抗原を含むキットに関し、少なくとも１つの追加抗原が第２の組成物中に含まれ、特に、第２の組成物がワクチン、好ましくはダニ媒介性脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチンまたはロッキー山紅斑熱ワクチンである。第１の組成物も同様にワクチンであってもよい。本発明の混合医薬組成物またはワクチンは、少なくとも第２の（ワクチン）組成物と組み合わせて本明細書において考察した任意の組成物を含む。いくつかの側面において、第２のワクチン組成物は、生物媒介性疾患、好ましくはダニ媒介性疾患に対して保護する。種々の側面において、第２のワクチン組成物は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症またはライムボレリア症に対して免疫化と適合する季節的な免疫化予定を有する。その他の側面において、混合ワクチンは、これらの疾患が流行する地理的な位置における使用のために、複数の疾患の予防において有用である。
【０１４７】
一つの側面において、第２の組成物は、ダニ媒介性脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチンおよびロッキー山紅斑熱ワクチンからなる群より選択されるワクチンである。好ましい側面において、ワクチン組成物は、ＦＳＭＥ−ＩＭＭＵＮ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ）、Ｅｎｃｅｐｕｒ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、ＥｎｃｅＶｉｒ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｇｅｎ  ＮＰＯ）、またはＴＢＥ  Ｍｏｓｃｏｗ  Ｖａｃｃｉｎｅ（登録商標）（Ｃｈｕｍａｋｏｖ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。もう一つの好ましい側面において、ワクチン組成物は、ＩＸＩＡＲＯ（登録商標）／ＪＥＳＰＥＣＴ（登録商標）（Ｖａｌｎｅｖａ  ＳＥ）、ＪＥＥＶ（登録商標）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅ，Ｌｔｄ．）またはＩＭＯＪＥＶ（登録商標）（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）である。
【０１４８】
さらに、ワクチンである医薬組成物が提供され、このワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。好ましい態様において、賦形剤は、Ｌ−メチオニンである。
【０１４９】
また、本発明は、免疫原性組成物を含む。いくつかの側面において、本発明の免疫原性組成物は、本明細書において考察した組成物および薬学的に許容される担体のいずれかを含む。種々の側面において、免疫原性組成物は、細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）タンパク質を特異的に結合させる抗体の産生を誘導する特性を有する。一定の側面において、免疫原性組成物は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）を特異的に結合させる抗体の産生を誘導する特性を有する。特定の側面において、免疫原性組成物は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）を中和する抗体の産生を誘導する特性を有する。いくつかの側面において、抗体は、動物によって産生される。さらなる側面において、動物は、哺乳動物である。さらにさらなる側面において、哺乳動物は、ヒトである。
【０１５０】
本発明の医薬組成物を含むワクチン調製物を、全身性または粘膜経路を介して前記ワクチンを投与することによって、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染に感受性である哺乳動物を保護するため、またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症を有する哺乳動物を治療するために使用してもよい。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する；または経口／食物、呼吸器または尿生殖路に対する粘膜投与を介する注射を含んでいてもよい。本発明のワクチンは、一回の用量として投与してもよいが、その成分を、同じ時点にて一緒に、または異なる時点にて同時投与してもよい。
【０１５１】
本発明の一つの側面において、任意に凍結乾燥された形態で本発明の医薬組成物を含むバイアルを含み、および本明細書において記述されたとおりのアジュバントを含むバイアルをさらに含むワクチンキットが提供される。本発明の本側面において、アジュバントは、凍結乾燥された免疫原性組成物を再構成するために使用され得ると想像される。さらなる側面において、本発明の医薬組成物は、バイアルにおいて、好ましくは注射器において使用前に混合してもよい。
【０１５２】
本発明のさらなる側面は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明の抗体または本発明の医薬組成物の治療上有効な量をその必要のある対象に投与する工程を含む、該対象においてボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症を治療または予防するための方法に関する。
【０１５３】
本発明のさらなる側面は、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明の抗体または本発明の医薬組成物の治療上有効な量をその必要のある対象に投与する工程を含む、該対象を免疫化するための方法に関する。
【０１５４】
またさらなる側面は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）生物による感染症に対して動物またはヒトを免疫化するための方法であって、当該動物またはヒトに、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明の抗体または本発明の医薬組成物の有効な量を投与する工程を含み、有効な量は、当該動物またはヒトにおける免疫応答を誘発するために適切である、方法に関する。
【０１５５】
また別の側面は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）生物に対する動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するための方法であって、当該動物またはヒトに、本発明のポリペプチド、本発明の核酸、本発明の抗体または本発明の医薬組成物の有効な量を投与する工程を含み、有効な量は、当該動物またはヒトにおける免疫応答を刺激するために適切である、方法に関する。
【０１５６】
好ましくは、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）生物は、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．ヴァライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）を、好ましくはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）を含む群から選択される。
【０１５７】
一つの態様において、宿主に本発明の医薬組成物またはワクチンまたはキットの免疫保護用量を投与する工程を含む、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染の初発エピソードおよび／または再発エピソードを予防または治療する方法を提供する。
【０１５８】
本発明のさらなる側面は、ボレリア疾患の治療または予防における使用のための本発明の医薬組成物である。一つの態様において、ボレリア感染症の治療または予防における使用のための医薬組成物を提供する。
【０１５９】
本発明のさらなる側面は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症の治療または予防のための医薬の製造における本発明の医薬組成物またはワクチンまたはキットの使用である。一つの態様において、ボレリア感染症の治療または予防のための医薬の製造における使用のための本発明の医薬組成物を提供する。
【０１６０】
また、本発明は、対象における免疫学的応答を誘導するための方法を含む。種々の側面において、このような方法は、免疫学的応答を誘導するのに有効な量で対象に本明細書において考察した免疫原性組成物またはワクチン組成物のいずれかを投与する工程を含む。一定の側面において、免疫学的応答は、抗ＯｓｐＡ抗体の産生を含む。
【０１６１】
本発明は、対象におけるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症またはライム病（Ｌｙｍｅｂｏｒｅｌｉｏｓｉｓ）を予防または治療するための方法を含む。種々の側面において、このような方法は、本明細書において考察したワクチン組成物のいずれか、またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症またはライムボレリア症を予防または治療するのに有効な量において対象に本明細書において考察した混合ワクチンのいずれかを投与する工程を含む。
【０１６２】
本発明は、医薬の調製のための、本発明のポリペプチド、核酸、抗体、医薬組成物またはワクチンの使用を含む。また、その他の関係する側面を、本発明において提供する。
【０１６３】
本明細書における用語「含むこと」、「含む」および「含む」は、あらゆる例において、それぞれ用語「からなっている」、「からなる」および「からなる」で任意に代用可能なことが発明者によって意図される。用語「含む」は、「含む」を意味する。したがって、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、語「含む」および「含む」および「含むこと」などの変化は、明示された化合物または組成物（たとえば、核酸、ポリペプチド、抗体）または工程または化合物または工程の群を含むことを暗示すると理解されるだろう、しかし任意のその他の化合物、組成物、工程またはその群を除外しない。略語「たとえば」は、ラテン語のたとえばから由来し、および非限定的な例を示すために本明細書に使用される。したがって、略語「たとえば」は、用語「たとえば」と同義である。
【０１６４】
また、本発明の「ワクチン組成物」に関する本明細書における態様は、本発明の「医薬組成物」に関する態様に適用でき、および逆もまた同じである。
【０１６５】
説明されない限り、本明細書に使用された全ての専門的および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、オックスフォード大学出版部によって刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，１９９４（ＩＳＢＮ０−１９−８５４２８７−９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．によって刊行されたＴｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（ＩＳＢＮ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって刊行されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）において見つけることができる。
【０１６６】
単一の用語「１つの」、「ある」および「該」は、状況が別途明らかに示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、語「または」は、状況が別途明らかに示さない限り、「および」を含むことを意図する。用語「複数」は、２つ以上をいう。さらに、核酸またはポリペプチドに与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズおよび全ての分子重量または分子質量値は、概算であり、および記述のために提供されることが理解される。加えて、抗原などの、物質の濃度またはレベルに関して与えられた数の限界は、概算でもよい。
【０１６７】
これらの多様な態様において、本発明に従ったポリペプチドのための好ましい担体または賦形剤または本発明に従った核酸分子は、本発明に従ったポリペプチドまたはそのコードする核酸分子への免疫応答をさらに刺激するためのアジュバントなどの免疫賦活性化合物である。
【０１６８】
本発明の組成物において、アジュバントまたは免疫賦活性化合物を使用してもよい。好ましくは、本発明に従った医薬組成物における免疫賦活性化合物は、ポリカチオン性物質、特にポリカチオン性ペプチド、免疫賦活性核酸分子、好ましくは免疫賦活性デオキシヌクレオチド、水中油型または油中水型乳剤、ＭＦ５９、アルミニウム塩、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、神経刺激性化合物、特にヒト成長ホルモンまたはこれらの組み合わせの群から選択される。
【０１６９】
水酸化アルミニウムおよび／またはアルミニウムホスフェートアジュバントの使用は、特に好ましく、抗原は一般に、これらの塩に吸着される。好ましくは、水酸化アルミニウムは、０．１５％の終濃度で存在する。有用なアルミニウムホスフェートアジュバントは、０．８４と０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比の非晶質のアルミニウムヒドロキシホスフェートである。本発明にて有用な別のアジュバントは、水性組成物の重量を基準にして３５０ｐｐｂ未満の重金属を有する水性組成物をもたらすことができるアルミニウム塩である。さらに有用なアルミニウムに基づいたアジュバントは、ＡＳ０４、水酸化アルミニウムとモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）の組み合わせである。
【０１７０】
また、本発明に従った医薬組成物は、以下の化合物またはこれらの組み合わせの少なくともいずれかを含む医薬組成物である：本発明に従った核酸分子、これらの多様な態様において本発明に従ったポリペプチド、本発明に従ったベクター、本発明に従った細胞および本発明に従った抗体。これに関連して、これらの化合物のいずれかを、細胞、組織または生物との使用のための非滅菌または滅菌の担体または複数の担体、例えば対象に対する投与に適切な医薬品担体と組み合わせて使用してもよい。このような担体は、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせを含むが、限定されない。製剤は、投与の様式に適するべきである。
【０１７１】
一つの態様において、医薬組成物は、安定剤を含む。用語「安定剤」は、ワクチンの免疫原性組成物を、加熱もしくは凍結の間に生じるものなどの有害な状態から保護し、かつ／または、安定で免疫原性の条件もしくは状態における免疫原性組成物の安定性もしくは保存寿命を延長する物質またはワクチンの賦形剤をいう。安定剤の例は、限定されないが、スクロース、ラクトースおよびマンノースなどの糖；マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）などの糖アルコール；グリシンまたはグルタミン酸などのアミノ酸；およびヒト血清アルブミンまたはゼラチンなどのタンパク質を含む。
【０１７２】
本発明の医薬組成物を、任意の有効な便利な様式において投与してもよく、たとえば、とりわけ局所的、経口、肛門内、膣内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、気管内または皮内経路による投与を含む。好ましい態様において、医薬組成物は、皮下または筋肉内、最も好ましくは筋肉内に投与される。
【０１７３】
療法において、または予防として、本発明の医薬組成物の活性薬剤を、注射可能な組成物として、好ましくは等張性のたとえば無菌の水性分散液として個体に投与してもよい。
【０１７４】
あるいは、組成物、好ましくは、医薬組成物は、たとえば軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼、点耳液、含嗽薬、浸透性包帯および縫合およびエアロゾルの形態で局所的な施用のために製剤化してもよく、およびたとえば、保存剤、薬物透過を助ける溶媒、および軟膏における軟化薬およびクリームを含む適切な従来の添加剤を含んでいてもよい。また、このような局所的な製剤は、適合性の従来の担体、たとえばクリームまたは軟膏基剤およびエタノールまたはローションのためのオレイルアルコールを含んでもよい。このような担体は、製剤の重量で約１％〜約９８％で構成してもよい；より通常は、これらは、製剤の約８０重量％までを構成し得る。
【０１７５】
上記の療法に加えて、本発明の組成物は一般に、傷害組織における露出したマトリックスタンパク質への細菌の付着を予防する損傷治療薬剤として、および、抗生物質予防投与に代わるものとしてのまたはそれと組み合わせた歯科治療における予防的使用のために、使用されうる。
【０１７６】
好ましい態様において、医薬組成物は、ワクチン組成物である。好ましくは、このようなワクチン組成物は、都合よく注射可能な形態である。従来のアジュバントは、免疫応答を増強するために使用されてもよい。タンパク質抗原でのワクチン接種のための適切な単位投与量は、成人については体重ｋｇあたり０．０２μｇ〜３μｇの間および子供については体重ｋｇあたり抗原０．２μｇ〜１０μｇの間であり、および好ましくは、このような用量は、２〜２４週の間隔にて１〜３回投与される。
【０１７７】
示された用量範囲にて、本発明の化合物による、適切な個体へのこれらの投与を妨げるような有害な毒性効果は予想されていない。
【０１７８】
さらなる側面として、本発明は、対象への投与のためのこれらの使用を容易にする様式でパッケージされた、対象への投与のための１つまたは複数の薬学的製剤を含むキットを含む。好ましい態様において、キットは、最終容積２ｍＬの、より好ましくは、最終容積１ｍＬの製剤を含む。
【０１７９】
特定の態様において、本発明は、１回用量投与ユニットを産生するためのキットを含む。キットは、種々の側面において、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器両方をそれぞれ含む。また、本発明の範囲内に含まれるものは、単一の、および多数の室を備えたあらかじめ満たされた注射器（たとえば、液体注射器およびリオシリンジ）を含むキットである。
【０１８０】
もう一つの態様において、このようなキットは、容器に添付されたかまたは方法を実践する際の化合物または組成物の使用を説明するパッケージ中に含まれたラベルを有する、封をした瓶または器などの容器内にパッケージされた、本明細書において記載された医薬製剤（たとえば、治療的タンパク質またはペプチドを含む組成物）を含む。一つの態様において、医薬製剤は、容器におけるヘッドスペースの量（たとえば、液体製剤と容器上部間の空気の量）が非常に小さいように、容器中にパッケージされる。好ましくは、ヘッドスペースの量は、ごくわずかである（すなわち、ほとんどない）。
【０１８１】
一つの側面において、キットは、治療的タンパク質またはペプチドの組成物を有する第１の容器および該組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第２の容器を含む。一つの側面において、医薬製剤は、単位剤形においてパッケージされる。さらに、キットは任意に、投与の特定経路にしたがって、医薬製剤を投与するために適切な装置を含む。いくつかの側面において、キットは、医薬製剤の使用を記述するラベルを含む。
【０１８２】
医薬組成物は、様々な異なる抗原を含むことができる。抗原の例は、完全に死滅した、または減弱された生物、これらの生物の亜分画、タンパク質、またはこれらの最も単純な形態のペプチドである。また、抗原は、グリコシル化されたタンパク質またはペプチドの形態で免疫系によって認識されてもよく、かつまた、多糖または脂質であってもよくそれを含んでいてもよい。細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）とコンジュゲートして、通常８〜１１アミノ酸の長さの短いペプチドの形態で抗原を認識するため、短いペプチドを使用することができる。Ｂ細胞は、４〜５アミノ酸程度の短い直鎖状エピトープ、並びに三次元構造（高次構造的なエピトープ）を認識することができる。
【０１８３】
好ましい態様において、別の側面の医薬組成物は、抗原、断片およびＷＯ２００８／０３１１３３に記載されたような変異体などの、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）タンパク質または活性断片またはその変異体に対する、高度免疫血清反応性抗原をさらに含む。
【０１８４】
本発明にしたがって、別の側面に従った医薬組成物は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）によって生じるか、それに結びついているか、またはそれに付随する疾患または疾患状態と特に関連する医薬として、特にワクチンとして使用されうる。
【０１８５】
本発明の医薬組成物は、医薬として、特にワクチンとして、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）によって生じるか、それに結びついているか、またはそれに付随する疾患または疾患状態と特に関連して、より好ましくは、任意の病原性のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、およびさらに好ましくは、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症、特にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、Ｂ．アンデルソニ（Ｂ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ）、Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ビセッティ（Ｂ．ｂｉｓｓｅｔｔｉｉ）、Ｂ．ヴァライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）、Ｂ．ルシタニエ（Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、Ｂ．スピエルマニイ（Ｂ．ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ）、Ｂ．ジャポニカ（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｂ．タヌキイ（Ｂ．ｔａｎｕｋｉｉ）、Ｂ．ツルディ（Ｂ．ｔｕｒｄｉ）またはＢ．シニカ（Ｂ．ｓｉｎｉｃａ）感染症、好ましくは、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）感染症を治療または予防するための方法において使用してもよい。
【０１８６】
それに関連して、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｌ．を含む、種々のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種が本明細書において開示したものを含むいくつかの種および株を含むことに留意すべきである。本発明にしたがって予防されおよび／または治療されるべき、細菌感染に関連するか、それにより生じるか、またはそれに付随する疾患は、ライムボレリア症（ライム病）を含む。ライムボレリア症および、導入部を含む本明細書においても開示されているような、このような疾患に罹患している患者の特定群のさらなる側面、症候、段階およびサブグループは、参照により本明細書に援用される。より具体的には、一般にライムボレリア症は、それぞれの段階にて臨床的徴候が異なる緩解および悪化を伴い、段階的に生じる。初期の感染ステージ１は、皮膚の限局性感染から成り、数日あるいは数週間以内にステージ２の播種性感染となり、数ヶ月から数年後、ステージ３の持続的感染となる。しかし、感染は一様ではなく；皮膚の限局性感染のみを有する患者もいれば、その一方で、関節炎などの、該疾病の後期の徴候だけを示す患者もいる。
【０１８７】
第４の側面において、本発明は、第３の側面にしたがって対象に医薬組成物の治療上有効な量を投与する工程を含む、その必要のある対象においてボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症を治療または予防する方法に関する。
【０１８８】
用語「対象」は、本発明に従った治療または方法を提供する動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは、ヒトを記述するために、本明細書の全体にわたって使用される。ヒト患者などの特定動物に対して特異的であるこれらの感染症、状態または疾患状態の治療については、患者という用語は、その特定動物をいう。好ましくは、対象は、ヒトである；しかし、また、組成物の医学的使用は、ニワトリ、シチメンチョウ、カモまたはガチョウなどの家禽、ウマ、ウシまたはヒツジなどの家畜またはイヌまたはネコなどのコンパニオン・アニマルを含む動物を含み得る。
【０１８９】
用語「有効な量」は、本医薬組成物の量を記述するために、明細書の全体にわたって使用され、本発明の方法において使用されるとき、意図された結果を誘導するために使用され得る。多数の本発明の側面において、有効な量という用語は、治療または予防と併せて使用される。その他の側面において、単に、有効な量という用語は、有益な、または有用であると見られた結果をもたらす薬剤の量をいい、本発明に従った方法においてボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染症の治療または予防が探求されることを含む。
【０１９０】
現在記述された化合物および組成物についての有効な量という用語は、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）感染を減少させるまたは阻害するために、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）関連疾患に罹患している哺乳動物患者、例えば特にヒト患者に投与される本発明に従った化合物の量を記述するために、本明細書の全体にわたって使用される。
【０１９１】
好ましい態様において、上記側面にしたがって対象を免疫化する方法は、対象に本発明の第３の側面の医薬組成物の治療上有効な量を投与する工程を含む。
【０１９２】
本方法は、前記個体を疾患から保護するために、その疾患が個体の中ですでに確立されているか否かに関わらず、遺伝子療法を介してまたは別途、抗体または細胞媒介Ｔ細胞反応、サイトカイン産生Ｔ細胞または細胞障害性Ｔ細胞のいずれかを産生するための免疫学的応答を刺激するために、インビボで本発明に従ったポリペプチドまたは核酸を投与することによって個体における免疫学的応答を誘導する工程を含む。
【０１９３】
本発明の産物、特にポリペプチドおよび核酸は、好ましくは、単離された形態で提供され、および均一に精製してもよい。本明細書に使用された用語「単離された」は、その天然状態から「人の手によって」分離されたことを意味する；すなわち、天然において存在する場合、それは本来の環境から変えられた、または取り除かれた、またはその両方である。たとえば、その天然状態において生存する生物において天然に存在する核酸分子またはポリペプチドは、「単離され」ておらず、しかし、その天然状態の共存する材料から分離された同じ核酸分子またはポリペプチドは、本用語が本明細書において使用されるように、「単離され」ている。単離の一部として、またはその後、このような核酸分子は、突然変異誘発のため、融合遺伝子を形成するため、およびたとえば、宿主における増大または発現のために、ＤＮＡ分子などのその他の核酸分子に連結することができる。単独またはベクターなどのその他の核酸分子に連結された単離された核酸分子は、培養中または生物体内の宿主細胞に導入することができる。培養中または生物体内の宿主細胞に導入されても、このようなＤＮＡ分子は、これらが天然に存在する形態または環境にはないため、なおも本用語が本明細書において使用されるように、単離されたということができる。同様に、核酸分子およびポリペプチドは、培地製剤、核酸分子またはポリペプチドの導入のための溶液などの組成物において、たとえば細胞、組成物または化学薬品または酵素反応のための溶液中に存在してもよく、たとえば、天然に存在する組成物でなく、および単離された核酸分子または本明細書において使用されたように、その用語の意味の範囲内のポリペプチドのままである。
【０１９４】
本発明は本明細書において記述した特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これは変化してもよい。さらにまた、本明細書に使用される用語法は、詳細な態様のみを記述する目的のためにあり、および本発明の範囲を限定することを意図しない。本明細書および添付の請求項において使用されるように、単数形「１つの」、「ある」および「該」は、状況を別途明確に指示しない限り、複数の言及を含む。同様に、語「含む」、「含む」、および「包含する」は、排他的よりもむしろ、包括的な解釈である。
【０１９５】
別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門的用語、科学用語および任意の頭字語は、本発明の技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記述したものに対する任意の方法および類似のまたは等価の材料を本発明の実施に際して使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書において記述した。
【０１９６】
さらに、本発明は、以下の図、表、実施例および配列表によって図示され、これらからさらなる特徴、態様および利点を取ってもよい。したがって、考察した具体的改変は、本発明の範囲の限定として解釈するべきでない。種々の等価物、変化および改変を本発明の範囲から逸脱せずに行ってもよいことは、当業者にとって明らかであり、したがって、このような等価物態様が本明細書に含まれるべきことは理解されるであろう。
【０１９７】
本発明に関連して、
図１は、抗原型１〜抗原型６およびＢ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）ＯｓｐＡ（Ｓ１Ｄ１〜Ｓ６Ｄ１およびＢｖａＤ１）のジスルフィド結合安定化断片、並びにＢ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６のアミノ酸１２５〜１７６およびジスルフィド結合が導入されたＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒのアミノ酸１７７〜２７４からなる本発明の変異融合体ＯｓｐＡ断片（Ｓ３ｈｙｂＤ１）についての静電ポテンシャル等値面を示す。
【０１９８】
図２は、本発明の変異体抗原型３  ＯｓｐＡ融合体断片含有ヘテロ二量体タンパク質であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１と、ヘテロ二量体タンパク質であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１とのアミノ酸配列比較である。
【０１９９】
図３は、本発明にしたがった変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体の産生を模式的に示す。
【０２００】
図４は、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１を含む、３つの異なる変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体を含む「改善された混合ワクチン」である、本発明の医薬組成物のポリペプチド成分を模式的に表す。
【０２０１】
図５は、本発明の脂質付加されたポリペプチドのＮ末端にて見いだされ得る、脂肪酸置換システインの一例であるＰａｍ３Ｃｙｓの化学構造を示す。
【０２０２】
図６は、本発明の改善されたヘテロ二量体混合ワクチンでの免疫化に対応してマウスにおいて産生された抗原型１〜６のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ＯｓｐＡタンパク質に対するＩｇＧ抗体力価を示す。
【０２０３】
図７は、ＯｓｐＡ抗原型１〜６のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）スピロヘータの細胞表面への、本発明の改善されたヘテロ二量体混合ワクチンで免疫化されたマウスからの抗体の結合を示す。
【０２０４】
表１は、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１ヘテロ二量体およびＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体の精製収率を比較するものである。
【０２０５】
表２は、ＯｓｐＡ抗原型１、２、５および６のボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）を用いたインビボ曝露に対する本発明の改善されたヘテロ二量体混合ワクチンの保護能力を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
本明細書において参照され得る図および表を、さらに詳細に下で記述してある。
【図１】抗原型１〜６（Ｓ１Ｄ１〜Ｓ６Ｄ１）およびＢ．バライシアナ（ＢｖａＤ１）のジスルフィド結合安定化ＯｓｐＡ断片、並びにジスルフィド結合安定化融合体ＯｓｐＡ断片（Ｓ３ｈｙｂＤ１）の静電ポテンシャルシミュレーション。等値面（＋／−１ｋＴ／ｅ）は、立体面として、負電荷を明色で正電荷を暗色で示した。溶媒露出面をワイヤーフレームとした。白い矢印は、抗原型３断片の同一平面上で静電的極性を生じさせる広範な２つのクラスターの位置を示す。ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片の表面がＳ３Ｄ１単量体のように広範な静電的極性クラスターを有しないことがわかる。
【図２】Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１およびＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体ポリペプチドのアミノ酸配列比較。コンセンサス配列も示す。Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１ヘテロ二量体は、合計で３１のアミノ酸のみがＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１ヘテロ二量体と異なる。
【図３】ボレリア種の異なるＯｓｐＡ抗原型から選択された２つの変異体ＯｓｐＡ  Ｃ末端断片を含む本発明の変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体、すなわちハイブリッド変異体ＯｓｐＡ  Ｃ末端断片の産生。（Ａ）脂質付加された変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体をコードする核酸の概略図。成分は、５'から３'まで、脂質化シグナル配列（Ｌｉｐシグナル）、Ｎ末端脂質化のためのＣＳＳペプチド、２つの非天然システインを伴うＯｓｐＡの変異Ｃ末端断片、短いリンカーペプチド（ＬＮ１）のコード配列を含み、２つの非天然のシステインを伴う第２の変異体ＯｓｐＡ  Ｃ末端断片のコード配列が続く。（Ｂ）中間の変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体ポリペプチドは、核酸構築物の翻訳後に直接、発生期の産物を含む。Ｎ末端からＣ末端まで、このポリペプチドは、脂質化シグナル配列（Ｌｉｐシグナル）、脂質化のためのＣＳＳペプチド、非天然ジスルフィド結合を伴う変異体ＯｓｐＡ断片、短いリンカーペプチド（ＬＮ１）からなり、非天然ジスルフィド結合を伴う第２の変異体ＯｓｐＡ断片が続く。（Ｃ）翻訳後修飾の後の最終的な脂質付加された変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体ポリペプチド。ヘテロ二量体は、Ｎ末端からＣ末端まで、脂質付加されたＮ末端システインを伴うＣＳＳ含有ペプチド、ジスルフィド結合によって安定化された変異体ＯｓｐＡ断片、リンカーペプチド（ＬＮ１）、およびジスルフィド結合によって安定化された第２の変異体ＯｓｐＡ断片からなる。脂質化シグナル配列は、示したようにポリペプチドの翻訳後修飾の間に切断される。
【図４】本発明に従った好ましい医薬組成物の例。３つの変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体は、異なるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ＯｓｐＡ抗原型またはハイブリッド変異体ＯｓｐＡ  Ｃ末端断片（Ｓ３ｈｙｂＤ１）から選択した２つの変異したＯｓｐＡ断片をそれぞれ含み、組成物において存在し、共に６つの異なるボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ＯｓｐＡ抗原型からＯｓｐＡ抗原を提供する。このような医薬組成物は、６つのボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原型に対して同時の免疫化を可能にする。
【図５】全長野生型ＯｓｐＡタンパク質並びに本発明の脂質付加された変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体のＮ末端システインの脂肪酸置換の一例である、Ｐａｍ３Ｃｙｓの化学構造の図解。本発明の全長ＯｓｐＡタンパク質またはポリペプチドの翻訳後修飾の間、Ｎ末端脂質化シグナル配列を切断し、脂肪酸、最も一般的には３つのパルミトイル部分（「Ｐａｍ３」）を酵素的にＮ末端システイン残基に共有結合させる（硫黄原子「Ｓ」を、矢印によって示す）。ポリペプチド鎖の残りの残基は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ残基からＣ末端に位置し、「Ｘｎ」によって表される。（Ｂｏｕｃｈｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４６：５２−６１から変更。）
【図６】完全長ＯｓｐＡタンパク質の６つの全ての抗原型に対して生じた抗体力価。Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１を共に１：１：１の比で含むもの（「ｈｅｔの組み合わせ」）；Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１を共に１：１：１の比で含むもの（「改善されたｈｅｔの組み合わせ」）またはＬｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ１／ＳＴ２−Ｈｉｓ、Ｌｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ５／ＳＴ３−ＨｉｓおよびＬｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ６／ＳＴ４−Ｈｉｓを共に１：１：１の比で含むもの（「キメラの組み合わせ」）の記載した各混合ワクチン３μｇでマウスを２週間間隔で３回免疫化した。最終投与から１週間後に血清を採取した。完全長ＯｓｐＡタンパク質の６つの異なる抗原型に対するＩｇＧ抗体の力価は、ＥＬＩＳＡによって決定した。
【図７】ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）スピロヘータの細胞表面への免疫化されたマウスからの抗体の結合。上述の通りにマウスを免疫化し、最終投与から１週間後に血清を採取し、プールした。血清の連続希釈を、細胞染色およびフローサイトメトリーを介してボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）スピロヘータの細胞表面への結合について試験した。Ａｌ（ＯＨ）３アジュバント単独で免疫化された対照マウスから収集された血清で染色するときに観察された蛍光強度値を、非特異的結合を説明するために減算した。（結合アッセイにて使用したボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）は、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ＯｓｐＡ抗原型１、株Ｎ４０；Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）、ＯｓｐＡ抗原型２、株ＰＫｏ；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、ＯｓｐＡ抗原型３、株Ｆｒ；Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）、ＯｓｐＡ抗原型４、株Ｆｉｎ；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、ＯｓｐＡ抗原型５、株ＰＨｅｉ；Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）、ＯｓｐＡ抗原型６、株ＫＬ１１であった。）
【実施例】
【０２０７】
実施例１  ハイブリッド抗原型３  ＯｓｐＡ  Ｃ末端断片の分子モデリング
ハイブリッドＯｓｐＡ  ＳＴ３  Ｃ末端断片を構築する目的
本発明者らの先の出願（ＷＯ２０１４／００６２２６）にて記載したライムボレリア症混合ワクチンは、３つの変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体からなった。Ｃ末端ドメインに由来する、２つの異なるＯｓｐＡ抗原型（ＳＴ）の短い安定化断片を短いリンカーと融合させてヘテロ二量体を形成する。３つのヘテロ二量体は、ＯｓｐＡ  ＳＴ１−ＳＴ２、ＳＴ４−ＳＴ３およびＳＴ５−ＳＴ６からなる。ヘテロ二量体の免疫原性を改善するために、脂質化のためのシグナル配列が、リポタンパク質である成熟した完全長ＯｓｐＡの類似体に付加される。
【０２０８】
ＯｓｐＡ  ＳＴ４−ＳＴ３（Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１；配列番号３１）からなる脂質付加されたヘテロ二量体は、他の２つのヘテロ二量体よりも可溶性が低いことが示され、これにより精製の回収率は低くなる。この問題は、ほとんどの場合、短い安定化ＯｓｐＡ  ＳＴ３部分に起因すると考えられる。これは、このタンパク質が、脂質付加された単量体では発現も精製もできないためである。
【０２０９】
分子モデリング
安定化させた単量体の比較構造調査をインシリコで行い、ＯｓｐＡ結晶構造と比較した単量体モデル間の折り畳みの適合性を明らかにし（ＰＤＢ：１ＯＳＰ；ＬｉＨ，Ｄｕｎｎ  ＪＪ，Ｌｕｆｔ  ＢＪ，Ｌａｗｓｏｎ  ＣＬ（１９９７）Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｕｔｅｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｆａｂ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４：３５８４−３５８９）、その表面特性をＳＴ３型単量体と比較した。結晶構造は、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）Ｂ３１の抗原型１を表し、そのＮ末端がネズミ抗体Ｆａｂ１８４．１に結合したＯｓｐＡを示す。６つの短い安定化ＯｓｐＡ単量体の相同性構造モデルを、ＳＴ１  ＯｓｐＡ結晶構造および入手可能なホモロジーモデルから始めて構築し（ＳｗｉｓｓＭｏｄｅｌ；  Ｋｉｅｆｅｒ  Ｆ，Ａｒｎｏｌｄ  Ｋ，Ｋｕｎｚｌｉ  Ｍ，Ｂｏｒｄｏｌｉ  Ｌ，Ｓｃｈｗｅｄｅ  Ｔ（２００９）Ｔｈｅ  ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３７：Ｄ３８７−３９２）、次いで、修正を加えて安定化ジスルフィド結合および必要に応じて配列変化を組み込んだ。（Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｏｐｅｎ−Ｓｏｕｒｃｅ，Ｓｃｈｒoｄｉｎｇｅｒ  ＬＬＣ）。
【０２１０】
６つ全ての短い安定化ＯｓｐＡ単量体の静電ポテンシャル等値面をアダプティブポアソンボルツマン解法でシミュレーションし（ＡＰＢＳ；Ｂａｋｅｒ  ＮＡ，Ｓｅｐｔ  Ｄ，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ，Ｈｏｌｓｔ  ＭＪ，ＭｃＣａｍｍｏｎ  ＪＡ（２００１）Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９８：１００３７−１００４１，ｐｄｂ２ｐｑｒ；Ｄｏｌｉｎｓｋｙ  ＴＪ，Ｃｚｏｄｒｏｗｓｋｉ  Ｐ，Ｌｉ  Ｈ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＪＥ，Ｊｅｎｓｅｎ  ＪＨ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＰＤＢ２ＰＱＲ：ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｐｇｒａｄｉｎｇ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５：Ｗ５２２−５２５）、短い安定化ＯｓｐＡ  ＳＴ３タンパク質が他のＯｓｐＡ  ＳＴとは異なる表面静電特性パターンを有するかどうかを明確にした。これにより、短い安定化ＯｓｐＡ  ＳＴ３（「Ｓ３Ｄ１」、図１）の溶解性の問題を説明することができる。電荷分布における著しい極性は、Ｓ３Ｄ１の片面上に観察され（矢印を参照）、他の短い安定化ＯｓｐＡ  ＳＴのいずれでも観察されなかった。
【０２１１】
また、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）由来の短い安定化ＯｓｐＡ（「ＢｖａＤ１」、図１）でも静電ポテンシャルシミュレーションを行った。ＢｖａＤ１  ＯｓｐＡ断片は、表面上で他とは異なる静電ポテンシャル等値面の極性を示し、このことにより、Ｓ３Ｄ１に認められたような増大した静電的極性をもつ極めて広範囲なクラスターを示すことのないように表面全体を改変するための部分的なセグメント交換の基本構成要素の潜在的候補となった。ハイブリッド単量体中の抗原型３部分とＢ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）に由来する交換部分との間の好ましい連結は、全体的な折り畳みを保持しつつ、単量体のＮ末端のβシートを置き換え、且つ天然の抗原型３部分の２つのβシートおよびＣ末端ヘリックスを残すように選択した。後者の条件は、当該分子の中心にある高密度の疎水性残基の立体適合性に大きく依存する。ハイブリッド安定化単量体Ｓ３ｈｙｂＤ１のモデルに関する折り畳み適合性を分子力学シミュレーションで確認した（Ｇｒｏｍａｃｓ；Ｐｒｏｎｋ  Ｓ，Ｐａｌｌ  Ｓ，Ｓｃｈｕｌｚ  Ｒ，Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｐ，Ｂｊｅｌｋｍａｒ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＧＲＯＭＡＣＳ  ４．５：ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｏｐｅｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌｋｉｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２９：８４５−８５４）。
【０２１２】
ハイブリッドＯｓｐＡ断片を含むヘテロ二量体の形態での適用
静電ポテンシャルシミュレーションの結果を受けて、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）に由来する断片ＯｓｐＡタンパク質の実験的融合体（Ｓ３ｈｙｂＤ１、図１）を含む新しいヘテロ二量体をクローニングした（Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）。ＬｉｐＳ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１と比較して、ヘテロ二量体中（Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）の抗原型３  ＯｓｐＡ断片の始めの１／３を変更したことに加えて、ＯｓｐＡ  ＳＴ３の位置２３３にアミノ酸置換（Ｐ２３３Ｔ、未成熟の完全長ＯｓｐＡ；配列番号８に従ったアミノ酸命名法）を導入した。
【０２１３】
以下でさらに詳細に示すように、この新しいヘテロ二量体は、実質的に改善された溶解性のみならず、精製し、マウスを免疫化するために使用したとき、抗原型３  ＯｓｐＡを発現するボレリアに対する免疫原性を示す。
【０２１４】
実施例２  脂質付加された変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体の精製および製剤化
脂質付加されたＨｉｓタグなし変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体のクローニングおよび発現
融合体ＯｓｐＡ単量体であるＢ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）／Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＶＳ１１６／ＰＢｒ）を、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）により大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のためにコドン最適化した。Ｎ末端終点に付加された脂質化シグナル配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の主要外膜リポタンパク質Ｌｐｐに由来し、Ｃ末端側に、Ｎ末端システインを脂質化させるためのＣＳＳペプチドを隣接させた。変異抗原型４  ＯｓｐＡ断片およびハイブリッド抗原型３  ＯｓｐＡ断片をリンカー配列「ＬＮ１」を介して融合させることにより、改善されたヘテロ二量体構築物を作製した。遺伝子断片を、ｐＥＴ２８ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＵＳＡ）中にクローニングし、安定化したヘテロ二量体をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で発現させた。細胞を４時間後、遠心分離により収集し、およびペレットを、さらなるプロセシングの前に最大１２ヶ月間−７０℃にて貯蔵した。
【０２１５】
脂質付加された変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体の精製
細胞を高圧ホモジナイゼーションによって機械的に破壊し、脂質付加された変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体（Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１およびＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１）を、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を使用して相分離によって脂質相中に濃縮した。その後、希釈された界面活性剤相を非結合様式において作動された陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に供した。生じる通過画分をヒドロキシアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）にロードし、脂質付加されたタンパク質を直線状の塩勾配によってカラムから溶出した。溶出液を、緩衝液交換のために、非結合様式においてＤＥＡＥ−セファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に続いてゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのさらなる精製に供した。脂質付加された変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体ピークを解析サイズ排除カラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいてプールした。濾過滅菌後、精製されたヘテロ二量体を製剤化するまで−２０℃にて貯蔵した。
【０２１６】
混合ワクチンの製剤化
本発明の混合ワクチンの製剤化に関する研究を、安定性を最適化するために実施した。本発明者らの先の出願ＷＯ２０１４／００６２２６に記載されている通り、異なるタイプの緩衝液および安定剤を、水酸化アルミニウムと抗原の組み合わせの種々の濃度にて試験した。ｐＨ６．７±０．２にて３つのヘテロ二量体（全タンパク質１２０μｇ）のそれぞれ４０μｇ／ｍＬ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ  Ｌ−メチオニン、５％スクロース、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）および０．１５％（ｗ／ｖ）水酸化アルミニウムの最適の製剤を決定した。
【０２１７】
結果
改善されたヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１は、ｍｇ／ｇ生物量を基準にして約４倍高い収率を示し、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１と比べて著しく改善した。さらに、１工程少ないクロマトグラフィーの工程で、同等の純度の改善されたヘテロ二量体作製物が得られた（表１を参照）。
【０２１８】
（表１）Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１と比較したヘテロ二量体ＬｉｐＳ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１の改善された収率
0006505110.tif 000021
【０２１９】
実施例３  異なる抗原型の脂質付加された変異体ＯｓｐＡ断片ヘテロ二量体の免疫原性
マウスの免疫化
雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスを全ての研究について使用した。免疫化の前に、１０匹のマウス群から顔面静脈を介して採血し、免疫前血清を調製し、プールした。それぞれ１００μＬの３回のｓ．ｃ．免疫化を、２週間の間隔にて施した。各投与量には、１μｇの対応するヘテロ二量体タンパク質が含まれた。改善されたヘテロ二量体混合ワクチンについて：Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１（配列番号２７）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）；先の発明のヘテロ二量体混合ワクチンについて：Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１（配列番号２９）、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１（配列番号３１）およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１（配列番号３３）、ならびにキメラ混合ワクチンについて：Ｌｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ１／ＳＴ２−Ｈｉｓ（配列番号４０）、Ｌｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ５／ＳＴ３−Ｈｉｓ（配列番号４１）およびＬｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ６／ＳＴ４−Ｈｉｓ（配列番号４２）。全ての混合ワクチンは、０．１５％の終濃度にて水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）で製剤化した。第３の免疫化の１週間後、血液を顔面静脈から回収し、免疫血清を調製した。それぞれの実験において、Ａｌ（ＯＨ）３で調製したＰＢＳを用いて免疫化した１つの群を負の対照として含んだ（プラセボ群）。全ての動物実験は、オーストリアの法律（ＢＧＢ１  Ｎｒ．５０１／１９８９）にしたがって行われ、および「Ｍａｇｉｓｔｒａｔｓａｂｔｅｉｌｕｎｇ  ５８」によって承認された。
【０２２０】
ＯｓｐＡ  ＥＬＩＳＡ
コーティングバッファー（ＰＢＳ）で希釈したタンパク質５０ｎｇ（１μｇ／ｍＬ）で、ＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ，Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をウェルごとにコーティングし、４℃で１６〜７２時間インキュベートした。コーティング抗原は、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き完全長の脂質付加されたＯｓｐＡ  ＳＴ１〜６であった。コーティングバッファーを捨て、ブロッキングバッファー１００μＬ（１％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ）を加え、周囲温度にて１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ）３００μＬ（オーバーフロー）で３回洗浄した。５倍希釈の血清をブロッキングバッファーで作製し、５０μＬを各ウェルに加え、周囲温度にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ  ３００μＬ（オーバーフロー）で３回洗浄した。二次抗体（セイヨウワサビペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］結合ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）をブロッキングバッファーで１：２０００に希釈し、５０μＬを各ウェルに加え、周囲温度にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ  ３００μＬ（オーバーフロー）で３回洗浄した。ＡＢＴＳ（２，２'−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）をＨＲＰ基質として使用し、ＡＢＴＳ  ５０μＬを各ウェルに加え、暗所で周囲温度にて１５分間インキュベートした。１％ＳＤＳ  ５０μＬの添加により反応を停止させ、吸光度を４０５ｎｍで読み取った。ブランクの吸光度が０．１未満だったプレートを有効とした。最小希釈が１．０を越える吸光度を有し、最大希釈が０．１を下回るサンプルを有効とした。これらの基準を満たしたとき、最大半値力価を求めた。最大半値力価は、最大希釈と最小希釈の間の平均吸光度に対応する希釈の逆数である。
【０２２１】
フローサイトメトリー
スピロヘータ（１×１０６）を同等の容積の４％パラホルムアルデヒドと混合し、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ  ９６Ｕ，Ｎｕｎｃ）中で室温にて２時間インキュベートした。プレートを２，０００ｇにて５分間遠心分離し、および上清を廃棄した。細胞を、２％  ＢＳＡ（ＨＢＳＳ−Ｂ）を伴うＨＢＳＳ  １５０μＬで洗浄し、上のように遠心分離し、および上清を廃棄した。マウス血清を、３５分間５６℃にてインキュベートすることによって熱不活性化した。熱不活化血清をＨＢＳＳ−Ｂ中で希釈し、Ｃｏｓｔａｒ  ｓｐｉｎ−Ｘ遠心管フィルター（０．２２μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）を使用して、４，０００ｇにて３分間、遠心分離することによって滅菌濾過した。スピロヘータを血清１００μＬに溶解し、および室温にて４５分間インキュベートした。プレートを１５分間、２，０００ｇにて遠心分離し、および上清を廃棄した。細胞をＨＢＳＳ−Ｂ  １５０μＬで一度洗浄し、次いで、ＨＢＳＳ−Ｂ  １００μＬ中に再懸濁した。二次抗体（ＰＥとコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＵＳＡ）１マイクロリットルを、細胞に添加し、および暗所において４５分間、室温にてインキュベートした。スピロヘータをＨＢＳＳ−Ｂ  １５０μＬで一度洗浄し、次いで、２．５μＭ  ＳＹＴＯ−１７  ＤＮＡ色素を含むＨＢＳＳ  ２００μＬ中に再懸濁し、暗所で１０分間、室温にてインキュベートした。染色されたスピロヘータを２，０００ｇにて５分間、遠心分離することによって沈渣させ、その後、ＨＢＳＳ  ２００μＬ中に再懸濁した。標識されたスピロヘータを、ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターで測定し、ＳＹＴＯ−１７陽性イベントについてゲートした。
【０２２２】
結果
２つの異なるＯｓｐＡヘテロ二量体製剤（「ｈｅｔの組み合わせ」および「改善されたｈｅｔの組み合わせ」）並びにＯｓｐＡキメラ組み合わせ（「キメラの組み合わせ」）のマウスでの免疫原性について試験した。完全長ＯｓｐＡ（コーティング抗原）に対する反応性及び異なるＯｓｐＡ抗原型（ＳＴ１〜ＳＴ６）を発現するボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）株への表面結合について、高度免疫血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡの結果により、全てのワクチン組み合わせが、６つ全てのＯｓｐＡ抗原型に対する抗体反応を刺激したことが示された（図６を参照）。先の発明のＯｓｐＡヘテロ二量体混合ワクチンと比較して、改善されたＯｓｐＡヘテロ二量体混合ワクチンは、抗原型３  ＯｓｐＡに特異的な抗体のレベルがより高かった一方で、他のＯｓｐＡ抗原型に対する抗体レベルは、両方のワクチンで同程度に刺激されたことが、本発明に関して特に注目に値する。
【０２２４】
高度免疫マウス血清からの抗体のボレリアスピロヘータへの直接的結合は、６つ全てのＯｓｐＡ抗原型を発現するボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の場合において観察され（図７を参照）、全ての抗原への反応において産生された抗体が機能的に活性であり、ｉｎ  ｓｉｔｕでの天然のＯｓｐＡを結合できることを示した。蛍光強度は、広い範囲にわたる血清希釈に対して直線状であった。スピロヘータに対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチンに対応して観察された蛍光強度は、ヘテロ二量体混合ワクチンおよびキメラ混合ワクチンに対応して観察されたものと同等であった。とりわけ、抗原型３  ＯｓｐＡボレリアへの結合に関して、改善されたワクチンでの免疫化によって産生された抗体が、他の２つの混合ワクチンに応じた抗体産生を上回った。
【０２２５】
実施例４  インビボでのボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）曝露に対する、改善されたヘテロ二量体混合ワクチンの保護能力
マウスの免疫化
雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（Ｈ−２ｋ）マウスを全ての研究について使用した（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）。それぞれの曝露の前に、８週齢のマウス５匹の群を尾静脈を介して血を取り、免疫前血清を調製し、およびプールした。３回の１００μＬの皮下（ｓ．ｃ．）免疫化を、表２に示す用量で２週間の間隔にて施した。改善されたヘテロ二量体混合ワクチンとキメラ混合ワクチンの両方は、実施例３に記載するように、３つのタンパク質を１：１：１の比で含んだ。全ての製剤は、０．１５％の終濃度にて水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）を含んだ。第３の免疫化の１週間後、血液を収集し、および高度免疫血清を調製した。それぞれの実験において、Ａｌ（ＯＨ）３単独（製剤バッファーまたはＰＢＳ）を注入した１つの群を陰性対照として含み、マウスの１つの群を適切なＯｓｐＡ抗原型に由来する野生型完全長脂質付加ＯｓｐＡタンパク質（Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｂ３１（ＯｓｐＡ抗原型１、配列番号３４）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株Ｋ７８（ＯｓｐＡ抗原型２、配列番号３５）、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＨｅｉ（ＯｓｐＡ抗原型５、配列番号３８）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＤＫ２９（ＯｓｐＡ抗原型６、配列番号３９））で免疫化し、陽性対照群とした。全ての動物実験は、オーストリアの法律（ＢＧＢ１  Ｎｒ．５０１／１９８９）にしたがって行われ、および「Ｍａｇｉｓｔｒａｔｓａｂｔｅｉｌｕｎｇ  ５８」によって承認された。
【０２２６】
免疫化されたマウスのインビトロで増殖させたボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）を用いた針曝露
最後の免疫化の２週後に、マウスを増殖培地（ＢＳＫＩＩ）１００μＬ中で希釈したスピロヘータにｓ．ｃ．にて曝露した。曝露には、ＯｓｐＡ抗原型１（実験１および２）を発現するＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株ＺＳ７、ＯｓｐＡ抗原型５（実験１０〜１３）を発現するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＨｅｉ、またはＯｓｐＡ抗原型６（実験１４〜１７）を発現するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株Ｍａを用いた。曝露用量は、株依存的であり、ＩＤ５０の決定のための曝露実験によって評価した個々の株の病原性に依存した。針曝露実験のために使用された用量は、ＩＤ５０の２０〜５０倍の範囲であった。各曝露の前に、ＯｓｐＡ発現をフローサイトメトリーにより確認した（実施例３を参照）。マウスの曝露は、８０％を越える細胞がＯｓｐＡ発現について陽性であった培地でのみ行った。
【０２２７】
免疫化されたマウスのＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）またはＢ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）に感染したダニを用いた曝露（「ダニ曝露」）
最後の免疫化の２週後に、ＯｓｐＡ抗原型１を発現するＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｐｒａ４（実験３）、ＯｓｐＡ抗原型１を発現するＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｐｒａ１（実験４および５）またはＯｓｐＡ抗原型２を発現するＢ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）（実験６〜９）を宿すダニにマウスを曝露した。免疫化されたマウスのダニ感染を容易にするために、それぞれのマウスの背中の毛を、Ｖｅｅｔ（登録商標）クリーム（Ｒｅｃｋｉｔｔ  Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）で取り除き、および小さな換気された容器をスーパーグルー（Ｐａｔｔｅｘ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で皮膚に接着した。その後、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｐｒａ１もしくはＰｒａ４またはＢ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株ＩＳ１に感染した２〜３匹のＩ．リシヌス（Ｉ．ｒｉｃｉｎｕｓ）の若虫をマウスごとに付け、これらが完全に充血し外れるまで、付着し吸血できるようにした。吸血状態は、それぞれの個々のダニについて毎日モニターした。少なくとも１つの完全にまたはほぼ完全に吸血したダニを収集したマウスのみを最終的な読み出しに含んだ。
【０２２８】
マウスの屠殺および材料の収集
針曝露またはダニ曝露の４週後または６週後それぞれで、マウスを頚椎脱臼によって屠殺した。血液を眼窩出血によって収集し、最終血清を調製し、感染状態を決定するためにＶｌｓＥ  ＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロットを使用した。加えて、それぞれのマウスから膀胱を収集し、ＤＮＡを抽出し、およびボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の同定のために定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に供した。
【０２２９】
ＶｌｓＥの不変領域６（ＩＲ６）でのＥＬＩＳＡ
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＩＰ９０の配列から由来するビオチン化された２５アミノ酸長ペプチド
0006505110.tif 000022
を、解析に使用した（Ｌｉａｎｇ  ＦＴ，Ａｌｖａｒｅｚ  ＡＬ，Ｇｕ  Ｙ，Ｎｏｗｌｉｎｇ  ＪＭ，Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈｙ  Ｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ＭＴ．Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＶｌｓＥ，  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９９；１６３：５５６６−７３）。ストレプトアビジンでプレコートされた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ／０．１Ｔ）で補充されたＰＢＳ中のペプチド１００μＬ／ウェル（１μｇ／ｍＬ）で被覆した。プレートを４℃にて一晩インキュベートした。ペプチドでコーティング後、プレートをＰＢＳ／０．１Ｔで一度洗浄した。次いで、ＰＢＳ／０．１Ｔで再び洗浄される前に、プレートをＰＢＳ＋２％ＢＳＡ１００μＬ／ウェルで室温（ＲＴ）にて１時間ブロックした。ペプチドに対する曝露後血清（最終血清）の反応性をＰＢＳ＋１％のＢＳＡ中の１：２００および１：４００の希釈にて試験した。プレートをＰＢＳ／０．１Ｔで３回洗浄する前にＲＴにて９０分間インキュベートした。次いで、それぞれのウェルに、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中のＨＲＰ（Ｄａｋｏ）にコンジュゲートされた５０μＬのポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ１．３μｇ／ｍＬを入れた。次いで、プレートをＲＴにて１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．１Ｔで３回洗浄後、ＡＢＴＳ（５０μＬ／ウェル）を基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）として添加し、および３０分間発色できるようにした。吸光度を、４０５ｎｍにて測定した。全ての血清を二つ組で試験した。負の対照は、血清の代わりにＰＢＳ、並びにペプチドで被覆されていないプレートを含んだ。ボレリア感染陽性培養であることを示したマウスからの血清を正の対照として使用した。
【０２３０】
ＤＮＡ抽出および精製
それぞれのマウスの膀胱を、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を以下の変更を加えて製造業者の説明書に従って使用し、ＤＮＡ抽出および精製に供した。１００μＬの組換えプロテイナーゼＫ（ＰＣＲ等級、１４〜２２ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて、各膀胱を一晩６０℃にて消化した。ＤＮＡを５０μＬ脱イオン滅菌水中で溶出し、−２０℃にて貯蔵した。それぞれのＤＮＡ抽出および精製において、陰性対照として、各１０番目のサンプルの後に１つの空の精製カラムを続けた。
【０２３１】
ｒｅｃＡをターゲットするｑＰＣＲ
オリゴヌクレオチドプライマーは、ライムボレリア症を生じさせる全ての関連したボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種の同定のためのｑＰＣＲにおいて使用することができる形で、ｒｅｃＡ遺伝子に対して設計した
0006505110.tif 000023
。ｒｅｃＡ断片をそれぞれの反応における標準として使用するために、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｎ４０からｐＥＴ２８ｂ（＋）へクローニングした。マウスの膀胱から抽出された染色体ＤＮＡを、希釈されていないＤＮＡで観察されるマトリックス効果を減少させるために水中に１：４に希釈した。ＳＳｏＡｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘからなるマスター混合物１０μＬ、それぞれのプライマー（１０μＭ）０．３μＬおよび水７．４μＬをそれぞれの実験のために調製した。マスター混合物１８μＬをマイクロタイタープレート中で、膀胱から抽出された希釈ＤＮＡ  ２μＬと混合し、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してＤＮＡを増幅した。ＤＮＡを９５℃にて３分間変性させ、続いて９５℃にて１５秒間および５５℃にて３０秒間の５０サイクルを行った。増幅後、ＤＮＡを、９５℃にて３０秒間、続いて５５℃にて２分間の変質によって融解曲線解析のために調製した。融解曲線解析は、５５℃にて５秒間、サイクルあたり０．５℃増大、および９５℃にて５秒間のインキュベーションによって、行った。それぞれのプレートにおいて、４つのノーテンプレート対照（ＮＴＣ）を含め、２つ組の標準曲線に１０〜１０，０００の範囲であるテンプレートコピー数を含めだ。
【０２３２】
ウェスタンブロット
対応するＯｓｐＡ抗原型に属するボレリアの全細胞溶解物に対する最終血清の結合をウェスタンブロットにより分析した。簡潔に述べれば、分析するマウス血清当たり２．５μｇのスピロヘータ溶解物を、４〜１２％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＺＯＯＭゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。ｉＢｌｏｔ（登録商標）ドライブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。５％ミルクで１時間ブロッキングした後、最終血清を１：２０００の希釈で添加し、＋４℃で一晩インキュベートした。次いで、膜をＰＢＳ／０．１Ｔで３回洗浄し、１：１０，０００に希釈したＨＲＰ結合ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で１時間インキュベーションした。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ（商標）ウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＫｏｄａｋ  ＢｉｏＭａｘフィルム（Ｋｏｄａｋ）を用いて免疫ブロットを可視化した。
【０２３３】
感染読み出し
最終感染読み出しは、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）特異性抗体の存在（ウェスタンブロットおよびＶｌｓＥ  ＥＬＩＳＡ）並びにボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ＤＮＡの存在（ｒｅｃＡをターゲットするｑＰＣＲ）を検出する２つの異なる方法に基づいた。曝露にＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株ＺＳ７を用いた実験（実験１および２）では、ウェスタンブロットとｑＰＣＲとを実施した。他の全ての実験では、ＶｌｓＥ  ＥＬＩＳＡおよびｑＰＣＲを用いた。２つの方法の間には高い一致性があり（＞９５％）、したがって、２つの方法のうちの少なくとも１つが陽性であったとき、マウスが感染したとみなした。フィッシャーの正確確率検定（両側）により統計的有意性を求めた。
【０２３４】
結果
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）曝露に対する保護能力について、改善されたヘテロ二量体混合ワクチンを試験した。これらの実験の結果を表２に要約する。免疫化されたマウスを、Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．（ＯｓｐＡ抗原型１、株ＺＳ７、針曝露、実験１および２または株Ｐｒａ１もしくはＰｒａ４、ダニ曝露、それぞれ実験３もしくは４および５）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）（ＯｓｐＡ抗原型２、株ＩＳ１、ダニ曝露、実験６〜９）、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（ＯｓｐＡ抗原型５、株ＰＨｅｉ、針曝露、実験１０〜１３）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（ＯｓｐＡ抗原型６、株Ｍａ、針曝露、実験１４〜１７）に曝露した。いくつかの実験では、キメラ混合ワクチンまたは脂質付加された完全長ＯｓｐＡタンパク質などの他のＯｓｐＡ系抗原を含めた。各実験にて、Ａｌ（ＯＨ）３を混合したＰＢＳまたは製剤バッファーで免疫化した一群のマウスをプラセボ（アジュバント単独）対照群とした。
【０２３５】
１７件の実験からの保護データを表２に要約する。全ての実験にて、全てのプラセボ群で高い感染レベルが認められた。さらに、部分的な保護のみが観察された完全長ＯｓｐＡ抗原型６を除き、対応する完全長ＯｓｐＡタンパク質を施した群で、低い感染率が認められた（実験１４〜１７）。これらの結果は、実験構成および読み出し方法を実証するものである。
【０２３６】
改善されたヘテロ二量体混合ワクチンは、インビトロで増殖させたＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．もしくはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（ＯｓｐＡ抗原型５または６）またはＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）もしくはＢ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）を宿したダニにマウスを曝露した場合、用量３μｇで有意な保護（ｐ値＜０．０５）をもたらした。さらに、異なる免疫化用量についてワクチン有効性を評価すると、０．０３μｇの改善されたヘテロ二量体混合ワクチンを投与し、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）またはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（ＯｓｐＡ抗原型５または６）にマウスを曝露したとき（実験８、９、１２、１３および１６）、高度に有意な保護（ｐ値＜０．０１）が認められた。要約すると、曝露にインビトロで増殖させたスピロヘータまたは感染ダニのいずれかを用いたマウスモデルで示されたように、改善されたヘテロ二量体混合ワクチンは、４つの臨床的に関連するＯｓｐＡ抗原型（１、２、５および６）を含む３つのボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種（Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ））に対する防御免疫を誘導した。
【０２３７】
改善されたヘテロ二量体混合ワクチンにより付与された抗原型５および６に対する保護と同様の保護が、キメラ混合ワクチンで免疫化したマウスでも観察された（データは示さず）。
【０２３８】
（表２）ＯｓｐＡ抗原型１、抗原型２、抗原型５および抗原型６ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）曝露に対する本発明の改善された変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体混合ワクチンの保護能力。
マウス群を３回、２週間の間隔にて、示した用量の免疫原またはＡｌ（ＯＨ）３アジュバント単独で免疫化した。使用した免疫原は、変異体ＯｓｐＡヘテロ二量体であるＬｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１、Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１およびＬｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１の１：１：１の組み合わせ（「改善されたヘテロ二量体混合ワクチン」）、Ｌｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ１／ＳＴ２−Ｈｉｓ、Ｌｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ５／ＳＴ３−ＨｉｓおよびＬｉｐ−キメラＯｓｐＡ  ＳＴ６／ＳＴ４−Ｈｉｓの１：１：１の組み合わせ（「キメラ混合ワクチン」）、並びにＬｉｐ−ＯｓｐＡ１−Ｈｉｓ（Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｂ３１由来の脂質付加された完全長ＯｓｐＡタンパク質）、Ｌｉｐ−ＯｓｐＡ２−Ｈｉｓ（Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株Ｋ７８由来の脂質付加された完全長ＯｓｐＡタンパク質）、Ｌｉｐ−ＯｓｐＡ５−Ｈｉｓ（Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＨｅｉ由来の脂質付加された完全長ＯｓｐＡタンパク質）またはＬｉｐ−ＯｓｐＡ６−Ｈｉｓ（Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＤＫ２９由来の脂質付加された完全長ＯｓｐＡタンパク質）とした。最後の免疫化の２週後、シリンジを用いて（Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株ＺＳ７、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＨｅｉまたはＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株Ｍａ）またはダニを用いて（Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）株Ｐｒａ１もしくはＰｒａ４またはＢ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株ＩＳ１）、免疫化マウスを記載のボレリア種にｓ．ｃ．にて曝露した。
【０２３９】
Ａ  抗原型１  ＯｓｐＡボレリアを用いた針曝露に対するキメラ混合ワクチンおよび改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（一回用量：３μｇ）による保護
0006505110.tif 000024
【０２４０】
Ｂ  抗原型１  ＯｓｐＡボレリアを用いたダニ曝露に対するキメラ混合ワクチンおよび改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（一回用量：３μｇ）による保護
0006505110.tif 000025
【０２４１】
Ｃ  抗原型１  ＯｓｐＡボレリアを用いたダニ曝露に対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（減少用量：３μｇおよび０．３μｇ）による保護
0006505110.tif 000026
【０２４２】
Ｄ  抗原型２  ＯｓｐＡボレリアを用いたダニ曝露に対するキメラ混合ワクチンおよび改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（一回用量：３μｇ）による保護
0006505110.tif 000027
【０２４３】
Ｅ  抗原型２  ＯｓｐＡボレリアを用いたダニ曝露に対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（減少用量：０．０３μｇおよび０．００３μｇ）による保護
0006505110.tif 000028
【０２４４】
Ｆ  抗原型５  ＯｓｐＡボレリアを用いた針曝露に対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（一回用量：３μｇ）による保護
0006505110.tif 000029
【０２４５】
Ｇ  抗原型５  ＯｓｐＡボレリアを用いた針曝露に対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（減少用量：３μｇ、０．３μｇおよび０．０３μｇ）による保護
0006505110.tif 000030
【０２４６】
Ｈ  抗原型６  ＯｓｐＡボレリアを用いた針曝露に対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（一回用量：３μｇ）による保護
0006505110.tif 000031
【０２４７】
Ｉ  抗原型６  ＯｓｐＡボレリアを用いた針曝露に対する改善されたヘテロ二量体混合ワクチン（減少用量：３μｇ、０．３μｇおよび０．０３μｇ）による保護
0006505110.tif 000032
アジュバント単独群と比較した、Ｐ値、フィッシャーの正確確率検定（両側）を括弧内に示す。（ｎ．ｓ．）は有意差なし。
【０２４８】
配列
配列番号１
Ｓ３ｈｙｂＤ１：ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片；ジスルフィド結合型１および位置２３３にＴを伴う、ボレリア・バライシアナ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６由来のアミノ酸の位置１２５〜１７６およびボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ由来のアミノ酸１７７〜２７４
0006505110.tif 000033
【０２４９】
配列番号２
Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）（株ＶＳ１１６）、ＯｓｐＡ  ａａ１２５〜１７６
0006505110.tif 000034
【０２５０】
配列番号３
位置２３３にＴを伴う、完全長ＯｓｐＡ（配列番号８）に由来するＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＢｒ、抗原型３）、ＯｓｐＡ  ａａ１７７〜２７４
0006505110.tif 000035
【０２５１】
配列番号４
Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）（株ＶＳ１１６）、ＯｓｐＡ
0006505110.tif 000036
【０２５２】
配列番号５
Ｂ．  ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．（株Ｂ３１、ＯｓｐＡ抗原型１）
0006505110.tif 000037
【０２５３】
配列番号６
Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）（株Ｋ７８；ＯｓｐＡ抗原型２）
0006505110.tif 000038
【０２５４】
配列番号７
位置２３３にＰを伴う、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＢｒ、ＯｓｐＡ抗原型３）（ＥＭＢＬ受託番号Ｘ８０２５６．１）
0006505110.tif 000039
【０２５５】
配列番号８
位置２３３にＴを伴う、Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＢｒ、ＯｓｐＡ抗原型３）（ＥＭＢＬ受託番号ＡＣＬ３４８２７．１）
0006505110.tif 000040
【０２５６】
配列番号９
Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）（株ＰＢｉ、ＯｓｐＡ抗原型４）
0006505110.tif 000041
【０２５７】
配列番号１０
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＨｅｉ、ＯｓｐＡ抗原型５）
0006505110.tif 000042
【０２５８】
配列番号１１
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＤＫ２９、ＯｓｐＡ抗原型６）
0006505110.tif 000043
【０２５９】
配列番号１２
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株Ｔ２５、ＯｓｐＡ抗原型７）
0006505110.tif 000044
【０２６０】
配列番号１３
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ＯｓｐＡ脂質化シグナル
0006505110.tif 000045
【０２６１】
配列番号１４
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）ＯｓｐＢ脂質化シグナル
0006505110.tif 000046
【０２６２】
配列番号１５
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌｐｐ脂質化シグナル
0006505110.tif 000047
【０２６３】
配列番号１６
Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１に由来するＯｓｐＡのＮ末端半分の２つの別々のループ領域（ａａ６５〜７４およびａａ４２〜５３、位置５３でのアミノ酸交換：Ｄ５３Ｓ）から構築したＬＮ１ペプチドリンカー
0006505110.tif 000048
【０２６４】
配列番号１７
Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．株Ｂ３１（ＯｓｐＡ抗原型１）に由来するｈＬＦＡ−１様配列
0006505110.tif 000049
【０２６５】
配列番号１８
Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）株Ｋ７８（ＯｓｐＡ抗原型２）に由来する非ｈＬＦＡ−１様配列
0006505110.tif 000050
【０２６６】
配列番号１９
抗原型１  ＯｓｐＡに由来するｈＬＦＡ様配列で置換されたＢ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）ｓ．ｓ．（株Ｂ３１、抗原型１）、ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７３
0006505110.tif 000051
【０２６７】
配列番号２０
Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）（株Ｋ７８、抗原型２）、ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７３
0006505110.tif 000052
【０２６８】
配列番号２１
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＢｒ、抗原型３）、ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７４
0006505110.tif 000053
【０２６９】
配列番号２２
Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）（株ＰＢｉ、抗原型４）、ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７３
0006505110.tif 000054
【０２７０】
配列番号２３
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＨｅｉ、抗原型５）、ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７３
0006505110.tif 000055
【０２７１】
配列番号２４
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＤＫ２９、抗原型６）、ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７４
0006505110.tif 000056
【０２７２】
配列番号２５
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株Ｔ２５、抗原型７）ＯｓｐＡ  ａａ１２６〜２７４
0006505110.tif 000057
【０２７３】
配列番号２６
Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１−ｎｔ：ジスルフィド結合型１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌｐｐ脂質化シグナル、ＬＮ１リンカー配列、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６のアミノ酸１２５〜１７６（配列番号２）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ、抗原型３のアミノ酸１７７〜２７４（配列番号３）を含む抗原型３  ＯｓｐＡ断片を伴う、ＯｓｐＡ抗原型４およびＯｓｐＡ抗原型３の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
0006505110.tif 000058
【０２７４】
配列番号２７
Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３ｈｙｂＤ１−ａａ：ジスルフィド結合型１、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳ、ＬＮ１リンカー配列、Ｎ末端脂質化を伴う、Ｂ．バライシアナ（Ｂ．ｖａｌａｉｓｉａｎａ）株ＶＳ１１６のアミノ酸１２５〜１７６（配列番号２）およびＢ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）株ＰＢｒ、抗原型３のアミノ酸１７７〜２７４（配列番号３）を含む、ＯｓｐＡ抗原型４およびＯｓｐＡ抗原型３のヘテロ二量体融合タンパク質
0006505110.tif 000059
【０２７５】
配列番号２８
Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１−ｎｔ：ジスルフィド結合型１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌｐｐ脂質化シグナル、ＬＮ１リンカー配列、非ｈＬＦＡ−１様配列ＮＦＴＬＥＧＫＶＡＮＤによって置換されたＯｓｐＡ抗原型１のａａ１６４−１７４を伴うＯｓｐＡ抗原型１およびＯｓｐＡ抗原型２の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
0006505110.tif 000060
【０２７６】
配列番号２９
Ｌｉｐ−Ｓ１Ｄ１−Ｓ２Ｄ１−ａａ：ジスルフィド結合型１、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳ、ＬＮ１リンカー配列、非ｈＬＦＡ−１様配列ＮＦＴＬＥＧＫＶＡＮＤによって置換されたＯｓｐＡ抗原型１のａａ１６４〜１７４、Ｎ末端脂質化を伴う、ＯｓｐＡ抗原型１およびＯｓｐＡ抗原型２のヘテロ二量体融合タンパク質
0006505110.tif 000061
【０２７７】
配列番号３０
Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１−ｎｔ：どちらもジスルフィド結合型１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌｐｐ脂質化シグナル、脂質の付加のためのＮ末端ＣＳＳ、ＬＮ１リンカー配列を伴う、ＯｓｐＡ抗原型４および３の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
0006505110.tif 000062
【０２７８】
配列番号３１
Ｌｉｐ−Ｓ４Ｄ１−Ｓ３Ｄ１−ａａ：どちらもジスルフィド結合型１、脂質の付加のためのＮ末端ＣＳＳ、ＬＮ１リンカー配列、Ｎ末端脂質化を伴う、ＯｓｐＡ抗原型４および３のヘテロ二量体融合タンパク質
0006505110.tif 000063
【０２７９】
配列番号３２
Ｌｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１−ｎｔ：どちらもジスルフィド結合型１、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌｐｐ脂質化シグナル、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳ、ＬＮ１リンカー配列を伴う、ＯｓｐＡ抗原型６の中間体および最終ヘテロ二量体融合タンパク質のコード配列
0006505110.tif 000064
【０２８０】
配列番号３３
Ｌｉｐ−Ｓ５Ｄ１−Ｓ６Ｄ１−ａａ：どちらもジスルフィド結合型１、脂質の付加のためのＮ末端ＣＳＳ、ＬＮ１リンカー配列、Ｎ末端脂質化を伴う、ＯｓｐＡ抗原型６のヘテロ二量体融合タンパク質
0006505110.tif 000065
【０２８１】
配列番号３４
Ｂ．ブルグドルフェリ（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（株Ｂ３１、ＯｓｐＡ抗原型１）ａａ１８〜２７３、ｌｐｐ脂質化シグナル配列
0006505110.tif 000066
除去、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳＦ
0006505110.tif 000067
【０２８２】
配列番号３５
Ｂ．アフゼリ（Ｂ．ａｆｚｅｌｉｉ）（株Ｋ７８、ＯｓｐＡ抗原型２）ａａ１８〜２７３、ｌｐｐ脂質化シグナル配列
0006505110.tif 000068
除去、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳＦ
0006505110.tif 000069
【０２８３】
配列番号３６
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＢｒ、ＯｓｐＡ抗原型３）ａａ１８〜２７４、ｌｐｐ脂質化シグナル配列
0006505110.tif 000070
除去、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳＦ
0006505110.tif 000071
【０２８４】
配列番号３７
Ｂ．ババリエンシス（Ｂ．ｂａｖａｒｉｅｎｓｉｓ）（株ＰＢｉ、ＯｓｐＡ抗原型４）ａａ１８〜２７３、ｌｐｐ脂質化シグナル配列
0006505110.tif 000072
除去、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳＦ
0006505110.tif 000073
【０２８５】
配列番号３８
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＰＨｅｉ、ＯｓｐＡ抗原型５）ａａ１８〜２７３、ｌｐｐ脂質化シグナル配列
0006505110.tif 000074
除去、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳＦ
0006505110.tif 000075
【０２８６】
配列番号３９
Ｂ．ガリニ（Ｂ．ｇａｒｉｎｉｉ）（株ＤＫ２９、ＯｓｐＡ抗原型６）ａａ１８〜２７４、ｌｐｐ脂質化シグナル配列
0006505110.tif 000076
除去、Ｃ末端Ｈｉｓタグ（ＬＥＨＨＨＨＨＨ）、脂質付加のためのＮ末端ＣＳＳＦ
0006505110.tif 000077
【０２８７】
配列番号４０
処理中に切断されるＯｓｐＢ脂質化シグナル配列：
0006505110.tif 000078
を含む、キメラＯｓｐＡ抗原型１／抗原型２、Ｎ末端脂質化、Ｈｉｓタグ
0006505110.tif 000079
【０２８８】
配列番号４１
処理中に切断されるＯｓｐＢ脂質化シグナル配列：
0006505110.tif 000080
を含む、キメラＯｓｐＡ抗原型５／抗原型３、Ｎ末端脂質化、Ｈｉｓタグ
0006505110.tif 000081
【０２８９】
配列番号４２
処理中に切断されるＯｓｐＢ脂質化シグナル配列：
0006505110.tif 000082
を含む、キメラＯｓｐＡ抗原型６／抗原型４、Ｎ末端脂質化、Ｈｉｓタグ
0006505110.tif 000083
【０２９０】
配列番号４３
Ｓ１Ｄ１
0006505110.tif 000084
【０２９１】
配列番号４４
Ｓ２Ｄ１
0006505110.tif 000085
【０２９２】
配列番号４５
Ｓ３Ｄ１
0006505110.tif 000086
【０２９３】
配列番号４６
Ｓ４Ｄ１
0006505110.tif 000087
【０２９４】
配列番号４７
Ｓ５Ｄ１
0006505110.tif 000088
【０２９５】
配列番号４８
Ｓ６Ｄ１
0006505110.tif 000089
【０２９６】
配列番号４９
Ｓ３ＨＹＢＤ１（ＢＶＡ）
0006505110.tif 000090
【０２９７】
配列番号５０
ＢＶＡＤ１
0006505110.tif 000091
【０２９８】
配列番号５１
Ｓ３ｈｙｂＤ１（Ｂｓｐ）：ハイブリッドＯｓｐＡ  Ｃ末端断片、ボレリア・スピエルマニイ由来のアミノ酸１２６〜１７５およびジスルフィド結合１型および位置２３３にＴを伴うボレリア・ガリニ株ＰＢｒ由来のアミノ酸１７７〜２７４
0006505110.tif 000092
【０２９９】
配列番号５２
ＭＳＰＤ１
0006505110.tif 000093
【０３００】
配列番号５３
１６Ｓ−２３Ｓの遺伝子間スペーサーのためのフォワードプライマー
0006505110.tif 000094
【０３０１】
配列番号５４
１６Ｓ−２３Ｓの遺伝子間スペーサーのためのリバースプライマー
0006505110.tif 000095
【０３０２】
配列番号５５
１６Ｓ−２３Ｓの遺伝子間スペーサーのためのフォワードネステッドプライマー
0006505110.tif 000096
【０３０３】
配列番号５６
１６Ｓ−２３Ｓの遺伝子間スペーサーのためのリバースネステッドプライマー
0006505110.tif 000097
【０３０４】
配列番号５７
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＲｅｃＡ遺伝子のためのフォワードプライマー
0006505110.tif 000098
【０３０５】
配列番号５８
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）のＲｅｃＡ遺伝子のためのリバースプライマー
0006505110.tif 000099
【０３０６】
配列番号５９
ＶｌｓＥの不変領域６（ＩＲ６）に由来する２５アミノ酸長ペプチド
0006505110.tif 000100
【０３０７】
配列番号６０
マウスカテリン
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【０３０８】
配列番号６１
ＫＬＫペプチド
0006505110.tif 000102
【０３０９】
配列番号６２
脂質化のためのＮ末端ペプチド
ＣＫＱＮ
【０３１０】
配列番号６３
0006505110.tif 000103
【０３１１】
この出願の全体にわたって引用した全ての参照の全ての内容は（文献参照、発行された特許、公開された特許出願および同時係属特許出願を含む）、ここに明白に参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
0006505110000001.app