(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入され、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するイソアミラーゼにおいて、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ｄ２６８Ａ、Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ及びＡ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔから選ばれるアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。
【請求項２】
前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入され、配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するイソアミラーゼが、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入され、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するイソアミラーゼである、請求項１記載のイソアミラーゼ。
【請求項３】
アミノ酸変異が、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ及びＡ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔから選ばれる変異を含む変異である請求項１又は２記載のイソアミラーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項４記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項記載のイソアミラーゼを含有するデンプン糖化用酵素組成物。
【請求項９】
さらに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる酵素を含有する請求項８記載のデンプン糖化用酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性が向上した変異イソアミラーゼ、及びその変異イソアミラーゼの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化工業において、デンプンやアミロペクチン中のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵素として、Klebsiella pneumoniaeなどが生産するプルラナーゼ及びイソアミラーゼが知られている。このうち、イソアミラーゼは、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン中のα−１，６−グルコピラノシド結合を加水分解する酵素であり、可逆的な反応が見られないため、他のアミラーゼやグルコアミラーゼなどを使用することで高純度のグルコースやマルトースが生産できることが知られている。イソアミラーゼ生産菌としては、Pseudomonas amyloderamosa（非特許文献１）などが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｓｔａｒｃｈ(１９９６),４８：２９５−３００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、Pseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼの至適温度は他のアミラーゼの至適温度よりも低く、産業的に使用するレベルの反応温度帯では併用が困難であった。
従って、本発明の課題は、より至適温度が向上した、すなわち耐熱性が向上した新たなイソアミラーゼ、及びその製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、前記のPseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼのアミノ酸配列の一部を改変したタンパク質を製造し、その耐熱性を検討したところ、特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸に変異させることにより耐熱性が５℃〜１０℃向上した変異イソアミラーゼが得られることを見出し、本発明を完成した。【０００６】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［10］を提供するものである。【０００７】
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼ。
［２］アミノ酸変異が、Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる２〜５重変異を含む変異である［１］記載のイソアミラーゼ。
［３］アミノ酸変異が、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ｄ２６８Ａ、Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ及びＡ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔから選ばれる変異を含む変異である［１］又は［２］記載のイソアミラーゼ。
［４］アミノ酸変異が、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ及びＡ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔから選ばれる変異を含む変異である［１］〜［３］のいずれかに記載のイソアミラーゼ。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のイソアミラーゼをコードする遺伝子。
［６］［５］記載の遺伝子を有する組み換えベクター。
［７］［６］記載の組み換えベクターで形質転換した形質転換体。
［８］［７］記載の形質転換体を培養して、該培養物からイソアミラーゼを採取することを特徴とするイソアミラーゼの製造法。
［９］請求項１〜４のいずれかに記載のイソアミラーゼを含有するデンプン糖化用酵素組成物。
［10］さらに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる酵素を含有する［９］記載のデンプン糖化用酵素組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のイソアミラーゼは、耐熱性が５℃以上向上しており、他の各種アミラーゼの至適温度と重複する。従って、本発明のイソアミラーゼは、各種アミラーゼと併用してデンプン等に作用させることにより、高純度のグルコースやマルトース等を工業的に有利に生産することができる。本発明において「併用」とは、本発明のイソアミラーゼと、それ以外の１種以上の酵素を混合した状態において、少なくとも２種以上の酵素が活性を示す状態にあることをいう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ネイティブおよび各変異体酵素の熱安定性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のイソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有するイソアミラーゼである。
【００１１】
ここで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼは、非特許文献１に記載された、Pseudomonas amyloderamosaが産生するイソアミラーゼである。このイソアミラーゼには、同一のアミノ酸配列を有する限り、Pseudomonas amyloderamosa由来でないイソアミラーゼが含まれる。また、同一アミノ酸配列を有する限り、ポリペプチドだけでなく、糖ペプチドも含まれる。なお、配列番号１は、成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおける、アミノ酸残基の欠失、置換又は挿入の数は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼと同等の酵素活性を示すものであれば限定されないが、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がさらに好ましく、１〜８個がさらに好ましい。また、当該欠失、置換又は挿入されたイソアミラーゼと配列番号１のアミノ酸配列との同一性は、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上がさらに好ましい。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）などを用いることができる。
【００１３】
本発明のイソアミラーゼは、Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上のアミノ酸変異を有する。より好ましいアミノ酸変異は、Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる２〜５重変異を含む変異である。
【００１４】
具体的なアミノ酸変異としては、Ａ５５４Ｐ、Ｍ２７７Ｉ、Ｄ２６８Ａ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ５５４Ｐ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ、Ｄ２６８Ａ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ、Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５８０Ｔ、Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５８０Ｔ、Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ等が挙げられる。
さらに好ましいアミノ酸変異としては、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔが挙げられる。
【００１５】
本発明の変異イソアミラーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるイソアミラーゼ、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は挿入されているイソアミラーゼにおいて、Ｄ２６８Ａ、Ｍ２７７Ｉ、Ａ５４９Ｐ、Ａ５５４Ｐ及びＡ５８０Ｔから選ばれる１又は２以上をアミノ酸変異することにより構築した遺伝子を用いて製造することができる。
【００１６】
本発明の変異イソアミラーゼを製造するための遺伝子は、前記の変異イソアミラーゼをコードする塩基配列を有する遺伝子であり、例えば前記の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子において、置換すべきアミノ酸配列をコードする塩基配列を、所望のアミノ酸残基をコードする塩基に置換することにより構築することができる。このような部位特異的塩基配列置換のための種々の方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば適切に設計されたプライマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。あるいは、改変型のアミノ酸配列をコードする遺伝子を全合成してもよい。
【００１７】
このようにして得た遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主（例えば大腸菌）に形質転換する。外来性蛋白質を発現させるための多くのベクター・宿主系が当該技術分野において知られている。変異イソアミラーゼ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられ、例えば大腸菌用としてはｐＥＴ−１４ｂ、ｐＢＲ３２２等が挙げられる。枯草菌用としては、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。糸状菌用としては、ｐＰＴＲＩ等が挙げられる。また、酵母用としては、ｐＲＳ４０３等が挙げられる。
【００１８】
得られた組み換えプラスミドは、大腸菌、枯草菌、カビ、酵母、放線菌、酢酸菌、シュードモナス属菌等の微生物に形質転換し、当該形質転換体を培養すれば、本発明変異イソアミラーゼが得られる。当該形質転換体は、変異イソアミラーゼ遺伝子をプラスミドのまま保持しても良いし、ゲノム内に取り込んでも良い。
【００１９】
本発明のイソアミラーゼは、Pseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼに比べて耐熱性が５℃〜１０℃向上しており、かつ至適ｐＨ、イソアミラーゼ活性等はPseudomonas amyloderamosaなどが生産するイソアミラーゼと同等である。従って、デンプンに、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどから選ばれる酵素と、本発明イソアミラーゼとを作用させれば、高純度のグルコースやマルトースが容易に得られる。ここでβ−アミラーゼとしては、ＧＯＤＯ−ＧＢＡ２（合同酒精株式会社）、オプチマルトＢＢＡ（ダニスコジャパン株式会社）、β−アミラーゼＬ／Ｒ（ナガセケムテックス株式会社）、ハイマルトシンＧＬ（エイチビィアイ株式会社）等を用いることができる。また、α−アミラーゼとしては、例えばクライスターゼＴ１０（大和化成株式会社）を用いることができる。グルコアミラーゼとしては、例えばグルクザイム（天野エンザイム株式会社）、ＧＯＤＯ−ＡＮＧＨ（合同酒精株式会社）を用いることができる。
【００２０】
本発明のイソアミラーゼは、糖化用のイソアミラーゼとして使用することが好ましく、デンプン糖化用のイソアミラーゼとして使用することがさらに好ましい。
本発明のイソアミラーゼは、必要により他の１種以上の酵素と混合したデンプン糖化用酵素組成物とすることも好ましい。他の１種以上の酵素は、上述したβ−アミラーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼから選択することができる。
【００２１】
反応は、例えばデンプンおよびアミラーゼ等のデンプン糖化酵素に前記酵素を添加し、当該酵素が作用するｐＨ、温度条件にて混合撹拌することにより行なわれる。本発明方法によれば、高純度のグルコースやマルトースを工業的に有利に製造することができる。
【実施例】
【００２２】
次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２３】
実施例１（イソアミラーゼの部位特異的変異導入）
Pseudomonas amyloderamosaゲノムを鋳型としてプライマーＰＳＴＰＩＡ−Ｆ（AAACTGCAGATGAAGTGCCCAAAGATTCTC（配列番号２））およびＨＩＮＤＰＩＡ−Ｒ（CCCAAGCTTCTACTTGGAGATCAACAGCAG（配列番号３））を用いて耐酸性イソアミラーゼ遺伝子配列を含む約２．３ｋｂの断片を取得した。この断片を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ及びＨｉｎｄ  IIIで消化し、ｐＨＳＧ３９８（タカラバイオ株式会社）を制限酵素Ｐｓｔ  Ｉ及びＨｉｎｄ  IIIで消化した約２．２ｋｂの断片と連結することにより、ｐ−ＰＩを取得した。ネイティブの耐酸性イソアミラーゼの発現プラスミドであるプラスミドｐ−ＰＩに部位特異的変異導入を行い、一重変異体（Ａ５５４Ｐ）発現プラスミドｐ−ＰＩＡ５５４Ｐを取得した。同様に一重変異体（Ｍ２７７Ｉ）発現プラスミドｐ−ＰＩＭ２７７Ｉ、一重変異体（Ｄ２６８Ａ）発現プラスミドｐ−ＰＩＤ２６８Ａ、一重変異体（Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩＡ５８０Ｔを取得した。また、ｐ−ＰＩＡ５５４Ｐに部位特異的変異導入を行い、二重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ）発現プラスミドｐ−ＰＩ２Ｍ、三重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ）発現プラスミドｐ−ＰＩ３Ｍ、四重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ）発現プラスミドｐ−ＰＩ４Ｍ、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ５Ｍを取得した。【００２４】
実施例２（酵素の生成）
ネイティブ耐酸性イソアミラーゼ発現プラスミドｐ−ＰＩ、一重変異体（Ａ５５４Ｐ）発現プラスミドｐ−ＰＩＡ５５４Ｐ、一重変異体（Ｍ２７７Ｉ）発現プラスミドｐ−ＰＩＭ２７７Ｉ、一重変異体（Ｄ２６８Ａ）発現プラスミドｐ−ＰＩＤ２６８Ａ、一重変異体（Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩＡ５８０Ｔ、二重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ）発現プラスミドｐ−ＰＩ２Ｍ、三重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ）発現プラスミドｐ−ＰＩ３Ｍ、四重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ）発現プラスミドｐ−ＰＩ４Ｍ、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）発現プラスミドｐ−ＰＩ５Ｍにより大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、それぞれのイソアミラーゼを生産する大腸菌株を取得した。これらの大腸菌を３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（酵母エキス  ０．５％、トリプトン１．０％、塩化ナトリウム  ０．５％、ＩＰＴＧ  ０．１ｍＭ  ｐＨ７．２）で、３０℃３日培養し、培養液１Ｌを得た。超音波により菌体を破砕後、遠心分離（１０，０００ｇ、１０分間）を行い、上清をＵＦ濃縮（旭化成社製  ＡＩＰモジュール）により、１，０００Ｕ／ｍＬとなるように濃縮した。これらを０．２μｍのポアサイズの膜で除菌することにより、ネイティブ耐酸性イソアミラーゼ、一重変異体（Ａ５５４Ｐ）イソアミラーゼ、一重変異体（Ｍ２７７Ｉ）イソアミラーゼ、一重変異体（Ｄ２６８Ａ）イソアミラーゼ、一重変異体（Ａ５８０Ｔ）イソアミラーゼ、二重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ）イソアミラーゼ、三重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ）イソアミラーゼ、四重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ）イソアミラーゼ、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）イソアミラーゼの酵素溶液とした。【００２５】
実施例３（各変異体の熱安定性向上）
これらを４０℃、５０℃、５５℃、５７．５℃、６０℃、６２．５℃、６５℃に１０分間保ったのちに氷冷し、残存活性を測定した。各温度における残存活性のプロットより作成された近似式を用いて残存活性が５０％になる温度を算出し、この温度をネイティブ耐酸性イソアミラーゼと比較した場合に、増加する度合いを耐熱化度とした。四重変異体のアミノ酸配列を配列番号４に示す。五重変異体のアミノ酸配列を配列番号５に示す。【００２６】
＜活性測定方法＞
イソアミラーゼの活性測定法は、以下のとおりである。
０．５％ワキシーコーンスターチ溶液０．３５ｍＬに、０．５Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）０．１ｍＬを混合し、適時希釈した酵素液を０．１ｍＬ加え、４５℃で１５分間反応させる。その後、０．１Ｎ  ＨＣｌにて５倍希釈したヨード溶液（０．０５Ｍヨウ素を含む０．５Ｍヨウ化カリウム溶液）０．５ｍＬを加えて酵素反応を止め、１０ｍＬの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定する。酵素活性の単位は、上記条件下で１分間に０．０１吸光度を増加する酵素量を１単位とした。
その結果、図１及び表１に示すように、一重変異体（Ａ５５４Ｐ）で約１．２℃、一重変異体（Ｍ２７７Ｉ）で約１．１℃、一重変異体（Ｄ２６８Ａ）で約１．３℃、一重変異体（Ａ５８０Ｔ）で約４．５℃、二重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ）で約３．２℃、三重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ）で約４．３℃、四重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ）で約５．１℃、五重変異体（Ａ５５４Ｐ／Ｍ２７７Ｉ／Ｄ２６８Ａ／Ａ５４９Ｐ／Ａ５８０Ｔ）で約６℃の耐熱化度の向上が確認された。【００２７】
実施例４（デンプンの糖化）
デンプンの糖化として、還元糖遊離試験を行った。１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶性デンプンを３０％（重量/重量）となるように加温溶解し、（１）０．０５ｍｇ/ｍＬに溶解したグルコアミラーゼ（和光純薬株式会社製）を３０％溶性デンプン１ｇあたり２０ｍｇおよびネイティブ耐酸性イソアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり１２５Ｕ添加したもの、（２）グルコアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり２０ｍｇおよび四重変異体イソアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり１２５Ｕ添加したもの、（３）グルコアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり２０ｍｇおよび五重変異体イソアミラーゼを３０％溶性デンプン１ｇあたり１２５Ｕ添加したものそれぞれを５５℃、６０℃、６２．５℃で１６時間反応させた。
１００℃、５分間加熱し反応を停止させ、生成した還元糖量について、ＤＮＳ法にて測定した。【００２８】
＜測定方法＞
還元糖量の測定法は、以下のとおりである。
ＤＮＳ溶液１．５ｍＬに、適時希釈したサンプル液を０．５ｍＬ加えた後に撹拌し、沸騰水中で５分間反応させる。水冷後、４ｍＬの水を加えて十分に撹拌した後、分光光度計を用いて５４０ｎｍで測定する。還元糖量はグルコース溶液を用いて作製した検量線より算出した。ＤＮＳ（３，５−ジニトロサリチル酸）溶液は、１％ＤＮＳ溶液４４００ｍＬに４．５％水酸化ナトリウム溶液を１５００ｍＬとロッセル塩１２７５ｇ溶解した後、別に調製したフェノール溶液（１％フェノール、２．４４％水酸化ナトリウム）を３４５ｍＬと、炭酸水素ナトリウムを３４．５ｇ加えて撹拌溶解し、２日間暗所保存後、ろ紙にて濾過したものを使用した。
その結果を表２に示した。ネイティブ耐酸性イソアミラーゼを用いた５５℃反応において得られた還元糖量を１００％としたとき、四重変異体イソアミラーゼを用いた際は１０３％に、五重変異体イソアミラーゼを用いた際は１０４％に向上した。また、６０℃反応においては、ネイティブ耐酸性イソアミラーゼでは９８％に低下したにもかかわらず、四重変異体イソアミラーゼでは１０２％、五重変異体イソアミラーゼでは１０４％であった。さらに、６２．５℃反応においては、ネイティブ耐酸性イソアミラーゼでは９７％に低下したにもかかわらず、四重変異体イソアミラーゼでは１０２％、五重変異体イソアミラーゼでは１０３％であった。したがって、ネイティブ耐酸性イソアミラーゼに比べて、四重変異体イソアミラーゼを使用した場合の方が明らかに還元糖生成量の向上が認められた。また、四重変異体イソアミラーゼに比べて、五重変異体イソアミラーゼを使用した場合の方が還元糖生成量の向上が認められた。さらに、温度上昇に伴ってネイティブ耐酸性イソアミラーゼは枝切り効果が低下するのに対し、四重変異体イソアミラーゼ、または五重変異体イソアミラーゼは枝切り効果が低下せず、歩留まりの向上が認められたことから、変異による熱安定性効果が確認された。【００２９】
【表１】
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【００３０】
【表２】
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【図１】
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【配列表】
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