(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株でリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるとともに、リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子（ｃａｄＢ）を発現させ、
前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現することは、改変されたリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の全部または一部のヌクレオチド配列を外因発現プラスミドのプロモーターおよびＲＢＳの後に置いて発現させ、
前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子は改変されたリジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）であり、前記改変は、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）の第２のコドンを大腸菌の使用頻度の高い第２のコドンに突然変異してから、希少コドンの数を増加するように、前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）の＋７〜＋３３位塩基に対して同義コドン置換を行い、転写により発生したｍＲＮＡの二次構造の最小自由エネルギーが−６．００ｋｃａｌ／ｍｏｌを下回り、翻訳開始効率が７０００より大きい配列を選択し、
前記リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子を発現させることは、ＲＢＳ配列を含んでもよいリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子の全部または一部のヌクレオチド配列を外来発現プラスミドのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の後に置いて発現させ、または、大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株染色体におけるリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子自身のプロモーターを大腸菌に適用する、ｃａｄＢ転写抑制を解除できるプロモーターに置換し、
前記改変されたリジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）の＋１〜＋３５位塩基は以下のものを含むことを特徴とする工学菌。
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’。
【請求項２】
アンチポーター誘導アンチポーター解除前記大腸菌に適用する、ｃａｄＢ転写抑制を解除できるプロモーターは、Ｌプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ５プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターまたはＴ７プロモーターであることを特徴とする請求項１に記載の工学菌。
【請求項３】
前記大腸菌Ｂ株は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であることを特徴とする請求項１または２に記載の工学菌。
【請求項４】
１，５−ペンタンジアミンの製造方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の工学菌をカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養して、種子液を得るステップと、種子液を富栄養培地に接入し、発酵培養するステップと、誘導剤を添加して発現誘導し、発酵液を除去した菌体細胞を直接に培養液に添加や収集してから、基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒を開始するステップとを含み、
前記誘導剤は具体的にＩＰＴＧや乳糖であり、
前記基質リジンは具体的にリジン生産菌を含むリジン発酵液、菌体を除去したリジン発酵液、菌体を除去し脱色したリジン発酵液、リジン発酵液のイオン交換溶離液、遊離リジン、リジン塩粉末またはその溶液であり、
前記ビタミンＢ６はピリドキサール、ピリドキサールリン酸および／またはピリドキサール塩酸であり、
前記富栄養培地は１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのトリプトン、０．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１．１４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＬ／Ｌの微量元素リザーバー、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有し、殘りは水であり、
前記微量元素リザーバーは６ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．８ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏと１０ｍＬ／Ｌの濃塩酸を含有し、殘りは水であることを特徴とする方法。
【請求項５】
前記ＬＢ液体培地のカナマイシンの濃度は５〜２００ｍｇ／Ｌであり、
前記種子液のＯＤ６００は２〜２５であり、好ましくは３〜５であり、
前記種子液を富栄養培地に接入する割合は０．５〜３０％であり、
前記発酵培養の温度は２５℃〜４５℃であり、
前記発酵培養のＤＯは５０％以上であり、
前記発酵培養のｐＨは４．０〜９．０であり、
前記ＩＰＴＧの最終濃度は０．０１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．０５〜０．４ｍＭであり、
前記ＩＰＴＧ添加の時間は発酵培養後の２〜１０ｈであり、好ましくは２〜６ｈであり、
前記ＩＰＴＧ誘導時は０．５〜１０ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加するステップをさらに含み、前記速度は具体的に３ｇ／Ｌであり、
前記リジン塩はＬ−リジン塩酸塩であり、
前記基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒を開始する時間は誘導開始後の０．５〜１０ｈ、好ましくは１〜５ｈであり、
前記触媒過程でのｐＨを４．０〜１０．０の間に維持し、
前記触媒は、０〜５ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加するステップをさらに含み、通気量は０〜１０ｖｖｍであり、温度を２５〜６０℃に制御し、攪拌回転速度は０〜１２００ｒｐｍであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１，５−ペンタンジアミンの製造方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の工学菌をカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養して、種子液を得るステップと、種子液を無機塩培地に接入し、発酵培養するステップと、誘導剤を添加して発現誘導し、発酵液を除去した菌体細胞を直接に培養液に加入や収集してから、基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒を開始するステップとを含み、
前記誘導剤はＩＰＴＧや乳糖であり、
前記基質リジンはリジン生産菌を含むリジン発酵液、菌体を除去したリジン発酵液、菌体を除去し脱色したリジン発酵液、リジン発酵液のイオン交換溶離液、遊離リジン、リジン塩粉末またはその溶液であり、
前記ビタミンＢ６はピリドキサール、ピリドキサールリン酸およびピリドキサール塩酸であることを特徴とする方法。
【請求項７】
前記ＬＢ液体培地のカナマイシンの濃度は５〜２００ｍｇ／Ｌであり、
前記種子液のＯＤ６００は２〜２５であり、好ましくは３〜５であり、
前記種子液を無機塩培地に接入する割合は０．５〜３０％であり、
前記発酵培養の温度は２５℃〜４５℃であり、
前記発酵培養のＤＯは５０％以上であり、
前記発酵培養時のグルコースの濃度を５ｇ／Ｌ以下に維持し、具体的には、補足材料液を流加することにより実現し、前記補足材料液は７００ｇ／Ｌグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有し、殘りは水であり、
前記ＩＰＴＧの最終濃度は０．０１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．０５〜０．４ｍＭであり、
前記ＩＰＴＧ添加の時間は発酵培養後の３〜２０ｈであり、好ましくは４〜１２ｈであり、
前記リジン塩はＬ−リジン塩酸塩であり、
前記基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒を開始する時間は誘導開始後の０．５〜２４ｈ、好ましくは１〜５ｈであり、
前記触媒過程のｐＨを４．０〜１０．０の間に維持し、
前記触媒は、０〜５０ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加するステップをさらに含み、通気量は０〜１０ｖｖｍであり、温度を２５〜６０℃に制御し、攪拌回転速度は０〜１２００ｒｐｍであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の工学菌の１，５−ペンタンジアミンの製造への応用。
【請求項９】
前記基質リジンは具体的にリジン生産菌を含むリジン発酵液、菌体を除去したリジン発酵液、菌体を除去し脱色したリジン発酵液、リジン発酵液のイオン交換溶離液、遊離リジン、リジン塩粉末またはその溶液であり、リジン塩粉末はＬ−リジン塩酸塩およびリジン硫酸塩を含み、
前記ビタミンＢ６は具体的にピリドキサール、ピリドキサールリン酸および／またはピリドキサール塩酸であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の工学菌の基質リジンとビタミンＢ６を触媒して１，５−ペンタンジアミンを生成することへの応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は全細胞触媒による１，５−ペンタンジアミン生産用の大腸菌の工学菌およびその応用に関し、バイオテクノロジー分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−ペンタンジアミン（１，５−Ｐｅｎｔａｎｅｄｉａｍｉｎｅ）は、別名カダベリン（Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、１，５−ジアミノペンタン（１，５−Ｄｉａｍｉｎｏｐｅｎｔａｎｅ）と呼ばれ、は２元酸と重合して高分子ポリアミド材料（即ち、ナイロン）を合成可能である。全世界では毎年約７００万トンのポリアミド材料を生産し、大量な石油化学資源を消費するため、バイオロジーでポリアミドの重要な構成単量体−１，５−ペンタンジアミンを合成することは、経済学とエコロジーに重要な意義を有する。
【０００３】
バイオロジーで１，５−ペンタンジアミンを生産することは、主に微生物発酵と触媒の２つの方法を採用している。ここで、発酵法はグルコースを炭素源として、菌種の一連の代謝経路を介してペンタジアミンを合成し、その最高の生産量は８８ｇ／Ｌであり、生産強度は２．２ｇ／Ｌ／ｈ（Ｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１４，２５：１１３−１２３）である。全細胞触媒法はリジンを基質として、菌体細胞のリジンデカルボキシラーゼによりペンタンジアミンを触媒発生する。現在では、リジンは大口のアミノ酸の種類の１つとして、その生産能力は厳重に過剰で、利益率が極めて低い。そのため、リジンを基質としての効率的なペンタンジアミンの生体触媒の生産方法を開発することは、新しいバイオ基材市場を開発するだけでなく、アミノ酸発酵産業のモデルチェンジとアップグレードを推進することもできる。
【０００４】
従来の技術では、全細胞触媒による１，５−ペンタンジアミンの生産は、日本の味の素株式会社（特許ＵＳ７１８９５４３、ＥＰ１４８２０５５）のｐＵＣ１８をベクターとしてリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡを過剰発現し、この組換えプラスミドを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅ．  Ｃｏｌｉと略称）Ｋ１２の誘導菌株ＪＭ１０９に転換し、全細胞触媒による１，５−ペンタンジアミン生産用の工学菌を得る。この工学菌を応用して全細胞触媒作用を行い、１１ｈ後のペンタンジアミン生産量は６９ｇ／Ｌに達し、生産強度は約６．２ｇ／Ｌ／ｈである。工学菌の触媒性能を向上させるために、熱処理、凍結溶融や超音波などの細胞処理工程（特許ＣＮ１０２７８２１４６）を採用するが、これらの処理工程が実際の生産工程の難度と生産コストを増加させてしまう。
【０００５】
現在、ペンタジアミン生体触媒の従来技術は工学菌細胞の触媒機能が低く、触媒工程が複雑であることを有し、１，５−ペンタンジアミン生体触媒の実際的な工業化生産応用を厳重に制限している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は全細胞触媒による１，５−ペンタンジアミン生産用の大腸菌の工学菌およびその応用を提供しているものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る工学菌は、大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株において、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるとともに、リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子ｃａｄＢを適量発現させるものである。
【０００８】
上記の工学菌において、前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させる方法は、前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の全部または一部のヌクレオチド配列を外来発現プラスミドのプロモーターの後に置いて発現させ、
前記リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子（ｃａｄＢ）を適量発現させることは、ＲＢＳ配列を含んでもよいリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子の全部または一部のヌクレオチド配列を外来発現プラスミドのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の後に置いて発現させ、または、大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株染色体におけるリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子自身のプロモーターを大腸菌に適用するの、ｃａｄＢ転写抑制を解除できるプロモーターに置換し、
前記大腸菌に適用するの、ｃａｄＢ転写抑制を解除できるプロモーターは、具体的に、Ｌプロモーター、ｔｒｃプロモーター、Ｔ５プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーターまたはＴ７プロモーターである。
【０００９】
上記の何れかに記載の工学菌において、前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子は改変されたリジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）であり、前記改変は、前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）の２番目のコドンをＧＣＡに突然変異してから、希少コドンの数を増加するように、前記リジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）の＋７〜＋３３位の塩基に対して同義コドン置換を行い、転写により発生したｍＲＮＡの二次構造の最小自由エネルギーが低く、翻訳開始効率が高い配列を選択し、
好ましくは、前記改変されたリジンデカルボキシラーゼ遺伝子（ｃａｄＡ）の＋１〜＋３５位塩基は以下のものを含む。
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’
５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ−３’。
【００１０】
上記の何れかに記載の工学菌において、前記大腸菌Ｂ株は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００１１】
上記の何れかに記載の工学菌において、前記大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株でリジンデカルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させるとともに、リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子（ｃａｄＢ）を適量発現させる方法は下記の（１）または（２）に示す。
【００１２】
（１）リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子を含む断片およびＲＢＳＢＣＤ２２のリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質コード遺伝子を含む断片を前記大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株に導入し、
前記断片は組換え発現ベクターにより導入するものであり、
前記組換え発現ベクターは具体的に前記断片をｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイトの間に挿入して得られたものであり、
前記組換え発現ベクターの具体的な構築過程は以下の通りであり、リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子を含む断片をｐＥＴ２８ａ（＋）のＮｃｏ  Ｉ  とＳａｌ  Ｉの切断部位の間に挿入し、組換え発現ベクター１を得てから、ＲＢＳＢＣＤ２２リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質コード遺伝子を含む断片を組換え発現ベクター１のＮｏｔ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩの部位の間に挿入し、
前記リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質コード遺伝子のヌクレオチド配列は具体的にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示し、
前記ＲＢＳＢＣＤ２２のヌクレオチド配列は具体的にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示し、
（２）前記大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株のｃａｄＢＡオペロンのプロモーターを大腸菌に適用するの、ｃａｄＢ転写抑制を解除できるプロモーターに置換してから、リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子を含む断片を前記大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株に導入し、または上記１つ又は複数のプロモーターが置換されたｃａｄＢ遺伝子を染色体のその他の部位に挿入する。
【００１３】
前記大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株のｃａｄＢＡオペロンのプロモーターをＴ７プロモーターに置換する過程は以下の通りであり、Ｔ７プロモーター配列を有するリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質コード遺伝子のプラスミドを前記大腸菌Ｂ株またはその誘導菌株に導入して相同組換えにより得られたものであり、
Ｔ７プロモーター配列を有するリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質コード遺伝子のプラスミドは、Ｔ７プロモーター配列を有するリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質コード遺伝子をｐＫＯＶプラスミドのＢａｍＨＩとＮｏｔ  Ｉの部位の間に挿入して得られたものであり、
前記リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子を含む断片は組換え発現ベクターにより導入するものであり、
前記組換え発現ベクターは具体的に前記断片をｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイトの間に挿入して得られたものであり、
前記組換え発現ベクターの具体的な構築過程は以下の通りであり、リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子を含む断片をｐＥＴ２８ａ（＋）のＮｃｏ  Ｉ  とＳａｌ  Ｉの切断部位の間に挿入し、
前記リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子のヌクレオチド配列は具体的にＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示し、
前記リジンデカルボキシラーゼタンパク質コード遺伝子を含む断片はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に示す。
【００１４】
１，５−ペンタンジアミンの製造方法も本発明の保護範囲に属し、上記のいずれか１項に記載の工学菌をカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養して、種子液を得るステップと、種子液を富栄養培地に接種し、発酵培養するステップと、誘導剤を添加して発現誘導し、基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒作用を開始するステップとを含み、
前記誘導剤は具体的にＩＰＴＧや乳糖であり、
前記基質リジンは具体的にリジン生産菌を含むのリジン発酵液、菌体を除去したリジン発酵液、菌体を除去し脱色したリジン発酵液、リジン発酵液のイオン交換溶離液、遊離リジン、リジン塩粉末またはその溶液であり、
前記ビタミンＢ６はピリドキサール、ピリドキサールリン酸および／またはピリドキサール塩酸であり、
前記富栄養培地は１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのトリプトン、０．９ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１．１４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍＬ／Ｌの微量元素リザーバー、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有し、殘りは水であり、
前記微量元素リザーバーは６ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１.３５ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．８ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏと１０ｍＬ／Ｌの濃塩酸を含有し、殘りは水であることを特徴とする方法。
【００１５】
上記の方法において、前記ＬＢ液体培地のカナマイシンの濃度は５〜２００ｍｇ／Ｌであり、具体的には５０ｍｇ／Ｌであり、
前記種子液のＯＤ６００は２〜２５であり、好ましくは３〜５であり、
前記種子液を富栄養培地に接種する割合は０．５〜３０％であり、具体的には５％であり、
前記発酵培養の温度は２５℃〜４５℃であり、具体的には３７℃であり、
前記発酵培養のＤＯは５０％以上であり、
前記発酵培養のｐＨは４．０〜９．０であり、
前記ＩＰＴＧの最終濃度は０．０１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．０５〜０．４ｍＭであり、
前記ＩＰＴＧ添加の時間は発酵培養後の２〜１０ｈであり、好ましくは２〜６ｈであり、
前記ＩＰＴＧ誘導時は０．５〜１０ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加するステップをさらに含み、前記速度は具体的に３ｇ／Ｌであり、
前記リジン塩はＬ−リジン塩酸塩またはリジン硫酸塩を含み、
前記基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒作用を開始する時間は誘導開始後の０．５〜１０ｈ、好ましくは１〜５ｈであり、
前記触媒過程でのｐＨを４．０〜１０．０の間に維持し、
ｐＨ調節用の酸は、無機酸または有機酸であってよく、無機酸は塩酸、硫酸、リン酸、硝酸であってよく、有機酸はアジピン酸、コハク酸、セバシン酸、酢酸、乳酸などであってよい。
前記触媒は、０〜５ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加するステップをさらに含み、通気量は０〜１０ｖｖｍであり、温度を２５〜６０℃に制御し、攪拌回転速度は０〜１２００ｒｐｍであり、
前記触媒過程で、前記グルコースを追加する速度は具体的に０〜２ｇ／Ｌであり、
前記触媒過程で、前記通気量は具体的に０．５〜５ｖｖｍであり、
前記触媒過程で、前記温度は具体的に３０〜５０℃であり、
前記触媒過程で、前記攪拌回転速度は具体的に２００〜１０００ｒｐｍである。
【００１６】
１，５−ペンタンジアミンの製造方法も本発明の保護範囲に属し、上記のいずれか１項に記載の工学菌をカナマイシンを含むＬＢ液体培地で培養して、種子液を得るステップと、種子液を無機塩培地中に接種し、発酵培養するステップと、誘導剤を添加して発現誘導し、基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒作用を開始するステップとを含み、
前記誘導剤はＩＰＴＧや乳糖であり、
前記基質リジンはリジン生産菌を含むリジン発酵液、菌体を除去したリジン発酵液、菌体を除去し脱色したリジン発酵液、リジン発酵液のイオン交換溶離液、遊離リジン、リジン塩粉末またはその溶液であり、
前記ビタミンＢ６はピリドキサール、ピリドキサールリン酸およびピリドキサール塩酸であり、
前記無機塩培地は２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇ／Ｌのクエン酸、０．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｍｇ／ＬのＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２．０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ＬのＮＨ４Ｍｏ７Ｏ２４、０．１５ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏを含有し、殘りは水である。
上記の方法において、前記ＬＢ液体培地のカナマイシンの濃度は５〜２００ｍｇ／Ｌであり、具体的には５０ｍｇ／Ｌであり、
前記種子液のＯＤ６００は２〜２５であり、好ましくは３〜５であり、
前記種子液を無機塩培地に接種する割合は０．５〜３０％であり、具体的には２％であり、
前記発酵培養の温度は２５℃〜４５℃であり、具体的には３７℃であり、
前記発酵培養のＤＯは５０％以上であり、
前記発酵培養時のグルコースの濃度を５ｇ／Ｌ以下に維持し、具体的には、補足材料液を流加することにより実現し、前記補足材料液は７００ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有し、殘りは水であり、
前記ＩＰＴＧの最終濃度は０．０１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．０５〜０．４ｍＭであり、
前記ＩＰＴＧ添加の時間は発酵培養後の３〜２０ｈであり、好ましくは４〜１２ｈであり、
前記リジン塩はＬ−リジン塩酸塩またはリジン硫酸塩を含み、
前記基質リジンとビタミンＢ６を添加して全細胞触媒作用を開始する時間は誘導開始後の０．５〜２４ｈ、好ましくは１〜５ｈであり、
前記触媒過程のｐＨを４．０〜１０．０の間に維持し、具体的には６．５であり、
ｐＨ調節用の酸は、無機酸または有機酸であってよく、無機酸は塩酸、硫酸、リン酸、硝酸であってよく、有機酸はアジピン酸、コハク酸、セバシン酸、酢酸、乳酸などであってよい。
前記触媒は、０〜５ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加するステップをさらに含み、通気量は０〜１０ｖｖｍであり、温度を２５〜６０℃に制御し、攪拌回転速度は０〜１２００ｒｐｍであり、
前記触媒過程で、前記グルコースを追加する速度は具体的に０〜２ｇ／Ｌであり、
前記触媒過程で、前記通気量は具体的に０．５〜５ｖｖｍであり、
前記触媒過程で、前記温度は具体的に３０〜５０℃であり、
前記攪拌回転速度は具体的に２００〜１０００ｒｐｍである。
上記のいずれか１項に記載の工学菌の１，５−ペンタンジアミンの製造への応用も本発明の保護範囲に属する。
上記のいずれか１項に記載の工学菌の基質リジンとビタミンＢ６を触媒作用をして１、５−ペンタンジアミンを生成することへの応用も本発明の保護範囲に属し、
前記基質リジンは具体的にリジン生産菌を含むリジン発酵液、菌体を除去したリジン発酵液、菌体を除去し脱色したリジン発酵液、リジン発酵液のイオン交換溶離液、遊離リジンおよびリジン塩粉末またはその溶液であり、さらに具体的にはＬ−リジン塩酸塩であり、
前記ビタミンＢ６は具体的にピリドキサール、ピリドキサールリン酸および／またはピリドキサール塩酸である。
【発明の効果】
【００１７】
大腸菌での１，５−ペンタンジアミンオペロンは順次に誘導型のプロモーターＰｃａｄＢ、リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子ｃａｄＢとリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡを含む。低ｐＨ値、高リジン濃度条件の下で、１，５−ペンタンジアミンオペロンの上流調節遺伝子ｃａｄＣが活性化され、その産物はＰｃａｄＢプロモーターに作用し、リジンデカルボキシラーゼＣａｄＡとリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質ＣａｄＢの発現を活性化する。ＣａｄＡは細胞内のリジンを触媒して１，５−ペンタンジアミンを合成し、ＣａｄＢは合成した１，５−ペンタンジアミンを細胞外に輸送し（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９２，１７４（８）：２６５９−２６６９．）、大腸菌Ｋ１２の誘導株を出発としてペンタンジアミン全細胞触媒工学菌を構築する従来の技術とは異なり、本発明はタンパク質の効率的発現に適用する大腸菌Ｂシリーズの誘導菌株から出発しペンタンジアミン全細胞触媒工学菌を構築する。本発明によれば、大腸菌Ｂシリーズの誘導菌株でリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡを過剰発現させるとともに、リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子ｃａｄＢを適量発現させることにより、菌体生長抑制の問題を解決し、工学菌の１，５−ペンタンジアミン触媒性能を著しく向上させる。本発明は、この工学菌を利用して１，５−ペンタンジアミンを全細胞触媒作用をして生産する方法をさらに提供し、１，５−ペンタンジアミンの生産量は１００〜３００ｇ／Ｌに達して、１，５−ペンタンジアミンの生産強度は５０〜３００ｇ／Ｌ／ｈに達して、１，５−ペンタンジアミンの高生産強度や高生産量的な触媒生産を実現する。従来技術に比べて、本発明に係るペンタンジアミンの生産量や生産率を倍に向上させ、１，５−ペンタンジアミンの生産コストを低減させることにより、実際に１，５−ペンタンジアミンの量産に応用でき、普及応用しやすい。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡプラスミドプロファイルである。
【図２】ｃａｄオペロン遺伝子の異なる過剰発現組合せ工学菌の生長曲線である。
【図３】ｃａｄＢ遺伝子の逆転写ＰＣＲ核酸電気泳動図である。
【図４】ＩＰＴＧと乳糖誘導ｃａｄＡ遺伝子発現のタンパク質の電気泳動図である。
【図５】基質リジン塩酸塩濃度が３００ｇ／Ｌであるときの１，５−ペンタンジアミン全細胞触媒過程の生産量図である。
【図６】基質リジン塩酸塩濃度が４００ｇ／Ｌであるときの１，５−ペンタンジアミン全細胞触媒過程の生産量図である。
【図７】基質リジン塩酸塩濃度が４５０ｇ／Ｌであるときの１，５−ペンタンジアミン全細胞触媒過程の生産量図である。
【図８】基質リジン塩酸塩濃度が５００ｇ／Ｌであるときの１，５−ペンタンジアミン全細胞触媒過程の生産量図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
下記の実施例で使う実験方法について特別な説明がない限り、いずれも通常の方法である。
【００２０】
下記の実施例で使う材料、試薬等について特別な説明がない限り、いずれもビジネスルートから入手可能である。
【００２１】
ハイフィデリティポリメラーゼＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＨｏｔＳｔａｒは北京閲微遺伝子技術有限会社から購入したものである。
【００２２】
野生型大腸菌Ｋ１２  Ｗ３１１０菌株は製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＢＲＣ）から購入したものである。
【００２３】
ｐＫＯＶプラスミドはＡｄｄｇｅｎｅから購入したものであり、カタログ番号は２５７６９である。
【実施例】
【００２４】
（実施例１）１，５−ペンタンジアミンの測定方法
１０μＬのサンプルを取り１００μＬの４．２ｇ／１００ｍＬの炭酸水素ナトリウム水溶液を含む２ｍＬの遠心チューブに添加して混ぜた後、体積パーセント含有量は１％の２，４−ジニトロフルオロベンゼンを含む２００μＬのアセトニトリル溶液を添加して混ぜて、６０℃で６０分間誘導体化反応する（厳しく計時し、３０分間で取り出して軽振動して混ぜて引き続き誘導体化反応する）。これを取り出して遮光して室温まで低下し、１６００μＬのアセトニトリルを添加して、３０秒渦振動して混ぜて、有機濾過膜で濾過した後に、１５μＬを取り注入する。
【００２５】
流動相ＡはｐＨ７．２の５．４ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液であり、流動相Ｂは体積パーセント含有量８０％のアセトニトリル水溶液であり、ＡとＢを体積比５：９５の割合で、１ｍＬ／ｍｉｎの流速で流動相にポンプ入り、使用するクロマトグラフ用カラムはＣ１８カラム（ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６＊１５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）であり、カラム温度：３５℃で、検出波長：３６０ｎｍである。
【００２６】
１，５−ペンタンジアミン塩酸塩（ｓｉｇｍａ会社から購入）を標準品として、１，５−ペンタンジアミン塩酸塩の濃度は１〜５ｇ／Ｌの間で線形の関係が良好である。標準品の濃度を横軸として、標準品積分ピーク面積を縦軸として、標準曲線を作成し、標準曲線公式（Ｘ＝０．０００６４９＊Ｙ＋０．０１７６（Ｒ２＝０．９９９９））を得る。
【００２７】
以下、実施例中の１，５−ペンタンジアミン濃度はいずれも標準曲線公式で計算した１，５−ペンタンジアミン塩酸塩の測定値を１，５−ペンタンジアミン濃度値に換算したものである。
【００２８】
（実施例２）リジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡ配列の最適化、ならびに発現ベクターと工学菌の構築
（一）ｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクターのＴ７プロモーターとＲＢＳの後に最適化のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡのＯＲＦを挿入する。まず、ｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクターＲＢＳ後の制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ  Ｉにより塩基配列の特徴を識別し、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡの２番目のコドンを高含有量タンパク質の使用頻度の高い２番目のコドンＧＣＡに突然変異する。次に、希少コドンを使用して後続の＋３３位塩基前の配列に対して同義コドン交換を行い、この領域の配列の希少コドンの数を増加することにより、遺伝子発現レベルを向上させる。さらに、ＲＮＡｆｏｌｄソフトウエア（ｈｔｔｐ／／ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用してリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡの−４〜＋３７位の塩基希少コドン置換後のＲＮＡの二次構造の最小自由エネルギーを予測し、自由エネルギーが−６．００ｋｃａｌ／ｍｏｌを下回る突然変異配列が好ましい。さらにソフトウエア（Ｓａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９、２７（１０）：９４６−９５０）を応用して上記突然変異配列の翻訳開始効率（−３３〜＋３３位塩基で計算）を計算し、自由エネルギーが小さい突然変異配列から翻訳開始効率が７０００より大きい突然変異配列がより好ましい。上記の設計により、＋４〜＋３３塩基配列の最適化のｃａｄＡ遺伝子を得る。
【００２９】
上記の最適化設計の配列に基づいてプライマーを設計し、野生型大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ハイフィデリティポリメラーゼＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＨｏｔＳｔａｒを使用し、Ｐ１とＰ２をプライマーとして、ｃａｄＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、この遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示す。ＰＣＲ手順は、９８℃で３０秒変性し、６５℃で１５秒焼鈍し、７２℃で１５０秒伸長、２６の循環を通じて、プライマーＰ１により突然変異の部位Ｎを導入することにより、改変されたリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡ＊の断片を得る。
Ｐ１：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＮＡＴＮＧＣＡＡＴＡＴＴＮＡＡＴＣＡＮＡＴＧＧＧＮＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）
（下線に示す配列はＮｃｏ  Ｉダイジェスト識別部位である）
Ｐ２：５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＣＴＴＡＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）  
（下線に示す配列はＳａｌ  Ｉダイジェスト識別部位である）
（二）上記のＰＣＲ電気泳動バンドをゲル抽出し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ  Ｉ  とＳａｌ  Ｉを使用してリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡ＊のＤＮＡ断片およびｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドをダブルダイジェストして、ダイジェスト後のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡ＊遺伝子断片とベクター大断片を得る。ダイジェスト後のリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡ＊遺伝子断片とベクター大断片を接続し、大腸菌ＥＣ１３５（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０１２年、８（９）：ｅ１００２９８７）コンピタンスに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、組換えプラスミドを含む転換体を得、プラスミドを抽出してシークエンシングし、その結果正しいプラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊プラスミドと名付けて、図１は模式図である。
【００３０】
（三）対照菌１の構築：図１に示すように、自身ＲＢＳ付きのリジンデカルボキシラーゼ遺伝子ｃａｄＡをｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターのＴ７プロモーターの後に挿入してから対照工学菌を構築し、Ｐ２とＰ３をプライマーとして、野生型大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ハイフィデリティポリメラーゼＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＨｏｔＳｔａｒを使用して、ＰＣＲで増幅し、条件は同上である。
Ｐ３：５’−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡＣＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）
（下線に示す配列はＸｂａ  Ｉダイジェスト識別部位である）
上記のＰＣＲ電気泳動バンドをゲル抽出し、制限エンドヌクレアーゼＸｂａ  Ｉ  とＳａｌ  Ｉを使用してこの回収されたＤＮＡ断片とｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドをダブルダイジェストし、ベクター大断片を得る。回収された遺伝子断片とベクター大断片を接続し、組換えプラスミドを得、ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ１と名付けて、それをシークエンシングし、結果は正しい。
【００３１】
対照菌２の構築：図１に示すように、ｃａｄＡ遺伝子の２番目のコドンを欠損させ、４番目の塩基をＧにして、Ｎｃｏ  Ｉエンドヌクレアーゼ識別部位として、ｃａｄＡを過剰発現させたベクターを構築する。Ｐ４とＰ２をプライマーとして、ＰＣＲで増幅し、条件は同上である。上記のＰＣＲ電気泳動バンドをゲル抽出し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ  ＩとＳａｌ  Ｉを使用してこの回収されたＤＮＡ断片とｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドをダブルダイジェストし、ベクター大断片を得る。回収された遺伝子断片とベクター大断片を接続し、ＥＣ１３５コンピタンスに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むロスＬＢ平板でスクリーニングし、組換えプラスミドを含む転換体を得、プラスミドを抽出してシークエンシングし、その結果正しいプラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ２と名付ける。
Ｐ４：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）
上記のプラスミドｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊、ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ１およびｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ２およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊を得、さらに、振盪を使って工学菌の１，５−ペンタンジアミン触媒性能を触媒検証する。
【００３２】
（実施例３）工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊の全細胞触媒性能スクリーニング
−８０℃凍結保存管に保存している上記構築の工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊と対照工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ１およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ２をそれぞれ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地平板にストリーク接種し、３７℃培養器に置いて１２ｈ培養し、平板で培養済みの菌ローンをこすり取り、３ｍＬの液体ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）を含む試験管に転入し、３７℃に置いて振盪２００ｒｐｍで１０ｈ培養する。培養済みの菌液を取り２％の接種量（体積比）で５０ｍＬの液体ＬＢ培地を含む（５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）５００ｍＬの振盪に転入し、３７℃に置いて振盪２００ｒｐｍで培養し、２．５ｈ培養して終濃度は０．２ｍＭの誘導剤ＩＰＴＧを添加し、引き続き同じ条件で振盪にて２ｈ誘導培養し、菌体吸光値ＯＤ６００を測定し、ＯＤ６００値を０．４２を掛けて乾燥細胞重量を計算する。同じ体積の４００ｇ／Ｌの市販飼育用の９８．５％リジン塩酸塩と０．１ｇ／Ｌのピリドキサル酸水溶液を添加し、同じ条件で振盪で１ｈ全細胞触媒し、サンプリングした後に遠心し、上澄み液を出して−２０℃で保存され、１，５−ペンタンジアミン濃度測定に用いて、測定方法は実施例１に示す。
【００３３】
振盪触媒スクリーニングにより、単位細胞量の１，５−ペンタンジアミン生産量を比較し、すなわち比生産速度であり、計算公式は、比生産速度＝毎時間の１，５−ペンタンジアミン生産量／乾燥細胞重量である。一連の触媒性能が著しく向上した工学菌を得、表１に示すように、５１＃、５５＃、５９＃工学菌のペンタンジアミンの比生産速度はそれぞれ３３．９４±１．９６ｇ／ｇ／ｈ、３３．３１±３．２３ｇ／ｇ／ｈおよび３１．２１±１．４２ｇ／ｇ／ｈに達し、対照菌株より著しい上回る。
【００３４】
【表１】
0006616777.tif 000002
【００３５】
工学菌４８＃、５０＃、５１＃、５３＃、５５＃、５７＃、５８＃および５９＃に対応するＰ１プライマー（実施例２を参照）の配列は以下の通りである。
Ｐ１−４８：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）
Ｐ１−５０：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）
Ｐ１−５１：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２）
Ｐ１−５３：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３）
Ｐ１−５５：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）
Ｐ１−５７：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５）
Ｐ１−５８：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６）
Ｐ１−５９：５−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７）
【００３６】
（実施例４）リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子ｃａｄＢ発現の最適化
一、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５の取得
Ｐ１−５５とＰ２をプライマーとしてＰＣＲで増幅し、実施例２（一）の部分の方法によりｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５を構築し、プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピタンスに転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５工学菌を得、工学菌ｐＡと略称する。
【００３７】
二、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＢＡの取得
（一）野生型大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ハイフィデリティポリメラーゼＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＨｏｔＳｔａｒを使用し、Ｐ５とＰ６をプライマーとしてＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ手順は、９８℃で３０秒変性し、６５℃で１５秒焼鈍し、７２℃で１５０秒伸長、２６の循環を通じて、長さが３６０４ｂｐのｃａｄＢＡ断片を得（ｃａｄＢとｃａｄＡの２つの遺伝子が同一のオペロンにあるため、この産物に２つの遺伝子の産物が含める）、その中、ｃａｄＢ遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２に示す。
Ｐ５：５’−  ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＧＧＣＴ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１８）
（下線に示す配列はＮｃｏ  Ｉダイジェスト識別部位である）
Ｐ６：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＣＡＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＡＣＧＡＧＣＴＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１９）
（下線に示す配列はＨｉｎｄ  ＩＩＩダイジェスト識別部位である）
（二）上記ＰＣＲで得たＤＮＡ分子をＮｃｏ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩでダブルダイジェストし、遺伝子断片を得、ｐＥＴ２８ａ（＋）をＮｃｏ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩでダブルダイジェストし、ベクター大断片を得、遺伝子断片とベクター大断片を接続し、ＥＣ１３５コンピタンスに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、組換えプラスミドを含む転換体を得、プラスミドを抽出してシークエンシングし、その結果正しいプラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＢＡと名付ける。
【００３８】
（三）組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＢＡをＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＢＡを得、工学菌ｐＢＡと略称する。
【００３９】
二、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳｎａｔｉｖｅ−ｃａｄＢの取得
（一）野生型大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ハイフィデリティポリメラーゼＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＨｏｔＳｔａｒを使用し、Ｐ７とＰ９をプライマーとして、ＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ手順は、９８℃で３０秒変性し、６５℃で１５秒焼鈍し、７２℃で１５０秒伸長、２６の循環を通じて、自身ＲＢＳを含むリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子配列ＲＢＳｎａｔｉｖｅ−ｃａｄＢを得る。
Ｐ７：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＴＴＡＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０）
（下線に示す配列はＨｉｎｄ  ＩＩＩダイジェスト識別部位である）
Ｐ８：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＧＡＡＧＴＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧＴＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡ  −３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１）
（下線に示す配列はＨｉｎｄ  ＩＩＩダイジェスト識別部位である）
Ｐ９：５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＴＧＴＧＣＧＴＴＡＧＡＣＧＣＧＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２２）
（下線に示す配列はＮｏｔ  Ｉダイジェスト識別部位である）
（二）上記ＰＣＲで得たＤＮＡ分子をＮｏｔ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩでダブルダイジェストし、遺伝子断片を得、ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５をＮｏｔ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩでダブルダイジェストし、ベクター大断片を得、遺伝子断片とベクター大断片を接続し、ＥＣ１３５コンピタンスに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、組換えプラスミドを含む転換体を得、プラスミドを抽出してシークエンシングし、その結果正しいプラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳｎａｔｉｖｅ−ｃａｄＢと名付ける。
【００４０】
（三）ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳｎａｔｉｖｅ−ｃａｄＢをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳｎａｔｉｖｅ−ｃａｄＢを得、工学菌ｐＡ−Ｂと略称する。
【００４１】
三、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢの取得
（一）野生型大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ハイフィデリティポリメラーゼＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＴＭ  ＨｏｔＳｔａｒを使用し、Ｐ８とＰ９をプライマーとして、ＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ手順は、９８℃で３０秒変性し、６５℃で１５秒焼鈍し、７２℃で１５０秒伸長、２６の循環を通じて、弱ＲＢＳの一部の配列（Ｍｕｔａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１３．１０（４）：３５４−３６０．）を含むリジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子配列ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢを得、その中、ＲＢＳＢＣＤ２２断片のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３に示す。
【００４２】
（二）上記ＰＣＲで得たＤＮＡ分子をＮｏｔ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩでダブルダイジェストし、遺伝子断片を得、ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５をＮｏｔ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩでダブルダイジェストし、ベクター大断片を得、遺伝子断片とベクター大断片を接続し、ＥＣ１３５コンピタンスに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、組換えプラスミドを含む転換体を得、プラスミドを抽出してシークエンシングし、その結果正しいプラスミドをｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢと名付ける。
【００４３】
（三）ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに転換し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板でスクリーニングし、工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢを得、工学菌ｐＡ−ＲＢＳＢＣＤ２２−Ｂと略称する。
【００４４】
四、大腸菌染色体でｃａｄＢ遺伝子のプロモーターの置換
（一）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーＰ１０とＰ１１、Ｐ１２とＰ１３をもってそれぞれＰＣＲで増幅し、長さがそれぞれ５１０ｂｐと６１０ｂｐの２つのＤＮＡ断片を得、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示す。ここで、Ｔ７プロモーター配列とｌａｃコントロール配列はプライマーＰ９とＰ１０から導入する。ＰＣＲは以下のような方式で行い、９４℃で３０ｓ変性し、５２℃で３０ｓ焼鈍し、７２℃で３０ｓ伸長（３０の循環）。ここで、プライマー配列は以下の通りである。
Ｐ１０：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２３）
（下線に示す配列はＢａｍＨＩダイジェスト識別部位である）
Ｐ１１：５’−ＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＧＣＣＧＣＡ  ＡＣＡＴＡＴＴ  ＡＴＡＣＣＡＡＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２４）
Ｐ１２：５’−ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＧＡＡＡＴＴＡＧ  ＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＴＧＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２５）
Ｐ１３：５’−ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＴＣＣＡＧＴＴＡＧＣＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２６）
（下線に示す配列はＮｏｔ  Ｉダイジェスト識別部位である）
（二）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５に示すＤＮＡ分子の混合物をテンプレートとして、Ｐ１０とＰ１３をプライマーとして、ＯｖｅｒｌａｐＰＣＲにより長さが約１．１ｋｂのＯｖｅｒｌａｐ断片を増幅し、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９に示す。ここで、ＰＣＲ手順は、９４℃で３０秒変性し、５２℃で３０秒焼鈍し、７２℃で６０秒伸長、２６の循環である。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９の５’末端の第４７７位から第４９５位のヌクレオチドに示す配列はＴ７プロモーター配列であり、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９の５’末端の第４９６位から第５２０位のヌクレオチドに示す配列はｌａｃコントロール配列である。
【００４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２９に示すＤＮＡ分子をＢａｍ  ＨＩとＮｏｔ  Ｉでダブルダイジェストし、遺伝子断片を得、ｐＫＯＶプラスミドをＢａｍ  ＨＩとＮｏｔ  Ｉでダブルダイジェストし、ベクター大断片を得、遺伝子断片とベクター大断片を接続し、組換えプラスミドを得、ｐＫＯＶ−ＰＴ７−ｃａｄＢと名付けて、それをシークエンシングし、正確なＴ７プロモーターとｌａｃコントロール遺伝子配列を含むことを検証し、予備のために保存する。
【００４７】
（三）構築したｐＫＯＶ−ＰＴ７−ｃａｄＢプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に電気的形質転換し、３０℃、１５０ｒｐｍでＬＢ培地で２ｈ回復した後、Ａｄｄｇｅｎｅ会社のｐＫＯＶプラスミドの商品ガイドにより、相同組換えの陽性のモノクローナルを選び、シークエンシングを経て、その染色体でのｃａｄＢ遺伝子の自身のプロモーターがＴ７プロモーターに置換されることを確認し、その菌株をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＰｃａｄＢ：：ＰＴ７と名付け、さらにプラスミドｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５を同菌に転換して、工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ＰｃａｄＢ：：ＰＴ７／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５を得、Ｃｈｒ−Ｔ７−Ｂと略称する。
【００４８】
（実施例５）逆転写ＰＣＲによるｃａｄＢ誘導発現の検証
実施例３の菌体培養や誘導の方法に基づき、誘導剤を添加した２ｈ後の工学菌ｐＡと工学菌Ｃｈｒ−Ｔ７−Ｂを収集し、ＲＮＡを抽出して逆転写ＰＣＲによりｃａｄＢ遺伝子の誘導発現状況を検証する。天根生物化学科学技術有限会社の細菌総ＲＮＡ抽出キットを使用して、その説明によりＲＮＡを抽出し、具体的なステップは、新しく培養された菌液を収集し、ＯＤ６００が約０．８まで希釈し、１ｍＬの希釈液を取って、４℃低温で１３，４００×ｇで２ｍｉｎ遠心し、脱イオン水を用いて再懸濁し、２ｍｉｎ遠心する。０．４０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含むＴＥ緩衝液１００μＬを用いて徹底的に菌体を再懸濁し、８ｍｉｎ孵化する。３５０μＬのライセートＲＬを添加し渦発振器を使って混ぜて、不溶性沈殿物があると、１３，４００×ｇで２ｍｉｎ遠心し、上澄みを別の遠心チューブに転送する。２５０μＬの無水エタノールを添加して混ぜる。得た溶液と沈殿を一緒に吸着カラムＣＲ３に転入し、吸着カラムを収集管に置いて、１３，４００×ｇで１ｍｉｎ遠心し、廃液を捨てて、吸着カラムＣＲ３を収集管に戻す。吸着カラムＣＲ３へ３５０μＬの除タンパク液ＲＷ１を入れて、１３，４００×ｇで１ｍｉｎ遠心し、廃液を捨てて、吸着カラムを収集管に戻す。吸着カラムカラムＣＲ３へ８０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ溶液を入れて、室温で３０ｍｉｎ放置し、吸着カラムＣＲ３へ３５０μＬの除タンパク液ＲＷ１を入れて、１３，４００×ｇで１ｍｉｎ遠心し、廃液を捨てて、吸着カラムＣＲ３を収集管に戻す。吸着カラムＣＲ３へ５００μＬの洗浄液ＲＷを入れて、室温で２ｍｉｎ放置し、１３，４００×ｇで１ｍｉｎ遠心し、廃液を捨てて、吸着カラムを収集管に戻す。一回繰り返し洗浄した後、１３，４００×ｇで２ｍｉｎ遠心し、廃液を捨てて、吸着カラムＣＲ３を室温で８ｍｉｎ放置し、吸着材料に残された洗浄液を徹底的に干す。吸着カラムＣＲ３を新たなＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ遠心チューブに転入し、吸着膜の中央部へ６０μＬのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｄｄＨ２Ｏを滴下し、室温で２ｍｉｎ放置し、１３，４００×ｇで２ｍｉｎ遠心し、ＲＮＡ溶液を得る。１．５μｇの総ＲＮＡを取って２μＬのｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒを添加し、ゲル電気泳動で検出し、検出合格後に抽出したＲＮＡを−８０℃で予備のために保存する。
【００４９】
天根生物化学科学技術有限会社のＦａｓｔＱｕａｎｔ  ｃＤＮＡ第一鎖合成キットを用いて、テンプレートＲＮＡを氷の上で解凍し、５×ｇＤＮＡ  ｂｕｆｆｅｒ、ＦＱ−ＲＴ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ、１０×Ｆａｓｔ  ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｄｄＨ２Ｏを室温で解凍し、解凍後に迅速に氷の上に置いて、使用前に各種類の溶液を均一にうず振動し、短く遠心して、試験管壁に残った液体を収集する。表２のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の除去システムにより混合液を調製して、徹底的に混ぜて、短く遠心し、４２℃で放置し、３０ｍｉｎで孵化してから、氷の上に置ける。
【００５０】
【表２】
0006616777.tif 000003
【００５１】
表３に示すように、同じ反応システム（１０．００μＬ）により逆転写反応システムを調製する。
【００５２】
【表３】
0006616777.tif 000004
【００５３】
逆転写システムでのＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＭｉｘをｇＤＮＡ除去ステップの反応液に添加し、十分に混ぜて、４２℃で３０ｍｉｎ孵化した後に９５℃まで加熱し５ｍｉｎ維持してから、氷の上に置いて、得たｃＤＮＡを−２０℃に予備のために保存する。ここで、リバースプライマーはＰ１４であり、フォワードプライマーはＰ１５である。
Ｐ１４：５’−ＴＡＣＣＧＴＴＧＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２７）
Ｐ１５：５’−ＣＴＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＴＣＡＧＴＧＣＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２８）
誘導後の工学菌ｐＡと工学菌Ｃｈｒ−Ｔ７−ＢのｃＤＮＡをテンプレートとして、ＢＬ２１染色体ゲノムを陽性対照テンプレート（＋）として、逆転写前にｇＤＮＡを除去したＲＮＡを陰性対照テンプレート（Ａ−とＴＢ−）として、ｇａｐＡ遺伝子を参照遺伝子（ＧＰＡとＧＰＢ）として、Ｐ１４とＰ１５をプライマーとして、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物の核酸電気泳動図（図３を参照）によると、参照遺伝子レーンＧＰＡとＧＰＢで目的バンドを観察でき、逆転写の成功を表明し、陰性対照（Ａ−とＴＢ−）と工学菌ｐＡ（Ａ）のｃＤＮＡはいずれも標的バンドを増幅できないが、陽性対照（＋）と工学菌Ｃｈｒ−Ｔ７−ＢのｃＤＮＡはいずれも目的バンド（１８６ｂｐ）を増幅でき、工学菌Ｃｈｒ−Ｔ７−ＢのｃａｄＢ遺伝子の誘導発現の成功を表明する。
【００５４】
（実施例６）リジン−ペンタンジアミンアンチポータータンパク質遺伝子ｃａｄＢの発現誘導が工学菌の生長とペンタンジアミンの触媒作用に及ぼす影響
一、−８０℃凍結保存管に保存している工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５（図２でｐＡと略称）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＢＡ（図２でｐＢＡと略称）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳｎａｔｉｖｅ−ｃａｄＢ（図２でｐＡ−Ｂと略称）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５−ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢ（図２でｐＡ−ＲＢＳＢＣＤ２２−Ｂと略称）およびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｃａｄＢ：：ＰＴ７／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５（図２でＣｈｒ−Ｔ７−Ｂと略称）をそれぞれ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地平板にストリーク接種し、３７℃培養器に置いて１２ｈ培養し、平板で培養済みの菌ローンをこすり取り、３ｍＬの液体ＬＢ培地（５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）を含む試験管に転入し、３７℃に置いて振盪２００ｒｐｍで１０ｈ培養する。培養済みの菌液を取り３％接種量（体積比）で５０ｍＬの液体ＬＢ培地を含む（５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）５００ｍＬ振盪に転入し、３７℃に置いて振盪２００ｒｐｍで１０ｈ培養し、２ｈごとにサンプリングして６００ｎｍ波長の吸光値（ＯＤ６００）を測定する。２．５ｈ後にそれぞれ最終濃度０．２ｍＭの誘導剤ＩＰＴＧを添加し、誘導後の菌体の成長傾向は図２に示す。誘導剤を添加した後に固有の遺伝子配列順序でプラスミドにｃａｄＢＡオペロンを過剰発現した工学菌ｐＢＡはもうほとんど成長しないが、プラスミドに遺伝子発現の順序を調整した工学菌ｐＡ−ＢとｐＡ−ＲＢＳＢＣＤ２２−Ｂや染色体に強プロモーターＴ７を組み込む工学菌は成長を続け、対照菌ｐＡとの異なりがあまりない。さらに、工学菌ｐＡ−Ｂと比べ、プラスミドに活性の弱いＲＢＳＢＣＤ２２を使用することあるいは染色体に強プロモーターを使用して置換する方法によりｃａｄＢ遺伝子を過剰発現させることは、ｃａｄＢの発現誘導後の工学菌の成長速度を向上させることを発見した。
【００５５】
実施例３の方法により、振盪の全細胞触媒を通じて工学菌の触媒性能を比較すると、工学菌Ｃｈｒ−Ｔ７−Ｂの触媒によるペンタンジアミンの生産性能が最も高くて、対照工学菌ｐＡより１３．９％も向上したことを発見した。
【００５６】
（実施例７）異なる誘導剤ＩＰＴＧと乳糖による標的たんぱく質の発現誘導
−８０℃凍結保存管に保存している工学菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）／  ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ２−ＲＢＳＢＣＤ２２−ｃａｄＢを５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地平板にストリークし、３７℃培養器に置いて１２ｈ培養し、平板で培養済みの菌ローンをこすり取り、３ｍＬのＬＢ液体培地（５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）を含む試験管に転入し、３７℃に置いて振盪２００ｒｐｍで１０ｈ培養する。培養済みの菌液を取り３％接種量（体積比）で５０ｍＬの液体ＬＢ培地を含む（５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）５００ｍＬの振盪に転入し、３７℃に置いて振盪２００ｒｐｍで培養し、３．５ｈ後に最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧ、２ｍＭと１００ｍＭの乳糖をそれぞれ添加して４ｈ引き続き培養する。誘導剤を添加する前後の培養液を遠心した後に、ｐＨ７．５の０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を添加して菌体を再懸濁し、ＯＤ６００＝４．０に調整し、懸濁液を得、それぞれ１６μＬの懸濁液を取り６μＬの５倍濃度のＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに添加して、９５℃で１０分間処理する。５μＬの処理後のサンプルを取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥたんぱく質の電気泳動を行い、染色し脱色した後の電気泳動結果は図４に示す。
【００５７】
図４によると、誘導剤を添加する前の対照０番レーンに比べて、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加した１番レーン、２ｍＭと１００ｍＭ乳糖を添加した２番と３番レーンはいずれも８１ｋＤの標的たんぱく質（ＣａｄＡたんぱく質）バンドがあり、ＩＰＴＧと乳糖を使用することはいずれも標的たんぱく質の発現を誘導することができる。
【００５８】
（実施例８）富栄養培地を使用する菌体培養と１，５−ペンタンジアミンにより触媒作用を行った連続の生産工程
工学菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰｃａｄＢ：：ＰＴ７／ｐＥＴ２８ａ−ｃａｄＡ＊５５（Ｃｈｒ−Ｔ７−Ｂと略称）菌ローンをこすり取り、５０ｍＬのＬＢ（５０ｍｇ／Ｌ（５〜２００ｍｇ／Ｌ可）のカナマイシンを含む）培地を含む５００ｍＬの三角瓶に接種し、３７℃に置いて２２０ｒｐｍ振盪で４ｈ培養し、種子液を得、ＯＤ６００は４〜５であり、培養して得られた種子液を５％の接種量で２Ｌの富栄養培地を含む７．５Ｌの発酵缶に接種し、培養温度は３７℃で、ＤＯを５０％以上に制御し、ｐＨ４．０〜９．０で、必要な時に増圧や純酸素を通すことができる。３ｈに０．４ｍＭのＩＰＴＧを添加して誘導させ、３ｇ／Ｌの速度でグルコースを追加する。６ｈ培養した後に、ＯＤ６００は２５．１であり、３００ｇ／ＬのＬ−リジン塩酸塩と０．０８ｇ／Ｌのピリドキサル酸を添加して、全細胞触媒を開始する。触媒過程でｐＨが迅速に上昇し、硫酸を追加してｐＨを６．５に維持するように調節する。触媒過程で通気量は１ｖｖｍであり、温度を３７℃に制御し、撹拌パドルの回転速度は５００ｒｐｍである。
【００５９】
富栄養培地の成分は以下の通りであり、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、トリプトン２０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ０．９ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４１．１４ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４１０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．３ｇ／Ｌ、微量元素リザーバー５ｍＬ／Ｌ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌで、殘りは水である。
微量元素リザーバー：６ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．３５ｇ／ＬのＣａＣｌ２、０．８ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏおよび１０ｍＬ／Ｌの濃塩酸で、殘りは水である。
【００６０】
それぞれ触媒時間が０．５、１．０と１．５ｈで、発酵缶から２ｍＬの触媒産物を取り、１２０００×ｇで５分間遠心し、上澄み液を出して、上澄み液での１，５−ペンタンジアミン含有量を検出する。実施例１の１，５−ペンタンジアミン検出方法により、全細胞触媒過程での１，５−ペンタンジアミン生産量を検出した結果は表４に示すように、この工程で工学菌は１．５ｈで１５１．５ｇ／Ｌ（１．４８ｍｏｌ／Ｌ）１，５−ペンタンジアミンを触媒生産することができる。
【００６１】
【表４】
0006616777.tif 000005
【００６２】
（実施例９）無機塩培地を使用する菌体培養と１，５−ペンタンジアミン触媒の生産工程
種子液培養条件は実施例６と同じで、培養した種子液を２％の接種量で２Ｌの無機塩培地を含む７．５Ｌの発酵缶に接種し、培養の温度は３７℃で、ＤＯを５０％以上に制御し、必要な時に増圧や純酸素を通すことができる。補足材料液を流動追加することにより、培養液中のグルコースの濃度を５ｇ／Ｌ以下に維持させる。７ｈごろ培養し、菌体ＯＤ６００が４０〜５０に達する時に０．１ｍＭの誘導剤ＩＰＴＧを添加し、２ｈ後に菌体培養液ＯＤ６００が８０以上に達する。遠心して湿菌体を得、２０ｇ湿菌体を量って、それぞれ２Ｌ（大まかに予備の追加菌体懸濁液とリン酸の体積に計上）の６００ｇ、８００ｇ、９００ｇと１０００ｇリジン塩酸塩と０．１６ｇピリドキサル酸を含む全細胞触媒水溶液システムに添加し、１，５−ペンタンジアミンの触媒生産を開始する。触媒過程でリン酸を流動添加し、ｐＨを６．５に維持するように調節し、通気量は１ｖｖｍであり、温度を３７℃に制御し、撹拌パドルの回転速度は５００ｒｐｍである。
【００６３】
無機塩培地成分と補足材料液成分は以下の通りである。
【００６４】
無機塩培地：２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇ／ＬのＣｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ（クエン酸）、０．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｍｇ／ＬのＮａＢ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２．０ｍｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ＬのＮＨ４Ｍｏ７Ｏ２４、０．１５ｍｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、殘りは水である。
補足材料液は７００ｇ／Ｌのグルコースと２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含み、殘りは水である。
【００６５】
０．５ｈごとに発酵缶から触媒液を取り出して、１２０００×ｇで５分間遠心し、上澄み液を出して、上澄み液での１，５−ペンタンジアミン含有量を検出する。実施例１の１，５−ペンタンジアミン検出方法により、全細胞解媒過程での１，５−ペンタンジアミン生産量を検出した結果は図５〜図８に示すように、図５〜図８からわかるように、ペンタンジアミンの最終生産量は基質リジン塩酸塩濃度の向上につれて向上し、基質濃度が５００ｇ／Ｌである場合、１０ｈ触媒作用すると、ペンタンジアミン生産量は２８２．８５ｇ／Ｌに達することができ、基質リジン塩酸塩濃度が３００〜４５０ｇ／Ｌであるとき、触媒作用されたペンタンジアミンの生産量は皆２．５ｈで最高値に達して、それぞれ１７０．４９ｇ／Ｌ、２２９．０８ｇ／Ｌと２５６．６０ｇ／Ｌである。基質リジン塩酸塩の添加量は３００ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、４５０ｇ／Ｌおよび５００ｇ／Ｌの開始０．５ｈのペンタンジアミンの全細胞触媒合成速度（即ち生産強度）はそれぞれ１５４．５０ｇ／Ｌ／ｈ、２０６．０１ｇ／Ｌ／ｈ、２６５．０４ｇ／Ｌ／ｈおよび２９６．９７ｇ／Ｌ／ｈに達するが、全体の生産強度はそれぞれ６８．２０ｇ／Ｌ／ｈ、９１．６３ｇ／Ｌ／ｈ、１０２．６４ｇ／Ｌ／ｈおよび２８．２９ｇ／Ｌ／ｈである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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