(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電層と；
該導電層の上方に配された窒化チタン（TiN）作用電極と；
該TiN作用電極の上方に配された絶縁壁であって、該絶縁壁と該TiN作用電極とが、中に電解質を含有してもよいウェルを形成する、絶縁壁と
を含む、ナノポアセルであって、
該TiN作用電極が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を導電層の上方に付着させるよう調整された条件を伴う付着技法によって付着させた、海綿状かつ多孔質のTiN作用電極であり、かつ
該絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、該ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、該TiN作用電極のベース表面積が、該TiN作用電極の該非被覆部分の上方の該開口部のベース表面積より大きい、
ナノポアセル。
【請求項２】
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の比表面積の10〜1000倍の比表面積を有する、請求項1記載のナノポアセル。
【請求項３】
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の電気化学キャパシタンスの10〜1000倍の電気化学キャパシタンスを有する、請求項1または2記載のナノポアセル。
【請求項４】
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、10ピコファラド〜1ナノファラドの電気化学キャパシタンスを有する、請求項1〜3のいずれか一項記載のナノポアセル。
【請求項５】
付着技法が、チタンターゲットからの直流（DC）反応性スパッタリングを含み、かつ、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を導電層の上方に付着させるよう調整された条件が、低温と、低い基板バイアス電圧と、高圧とをスパッタリングのために用いることを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のナノポアセル。
【請求項６】
TiN作用電極のベース表面積、および該TiN作用電極の非被覆部分の上方の開口部のベース表面積が、該TiN作用電極に関連するキャパシタンスと該開口部にまたがるメンブレンに関連するキャパシタンスとの比に基づいて選択される、請求項1記載のナノポアセル。
【請求項７】
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、電解質が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶柱の間の空間を通って拡散でき、該TiN作用電極の該非被覆部分を垂直方向下向きに拡散し次いで該TiN作用電極の該被覆部分へと水平方向に拡散できる、請求項1〜5のいずれか一項記載のナノポアセル。
【請求項８】
導電層を構築する段階；
該導電層の上方に配された窒化チタン（TiN）作用電極を構築する段階；および
該TiN作用電極の上方に配された絶縁壁を構築する段階であって、該絶縁壁と該TiN作用電極とが、中に電解質を含有してもよいウェルを形成する、段階
を含む、ナノポアセルを構築する方法であって、
TiN作用電極を構築する段階が、海綿状かつ多孔質のTiN作用電極を構築する段階であり、該海綿状かつ多孔質のTiN作用電極を構築する段階が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を導電層の上方に付着させるよう調整された条件を伴う付着技法によって付着させることを含み、かつ
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、該TiN作用電極のベース表面積が、該TiN作用電極の該非被覆部分の上方の該開口部のベース表面積より大きい、
方法。
【請求項９】
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の比表面積の10〜1000倍の比表面積を有する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の電気化学キャパシタンスの10〜1000倍の電気化学キャパシタンスを有する、請求項8または9記載の方法。
【請求項１１】
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、電解質が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶柱の間の空間を通って拡散でき、該TiN作用電極の該非被覆部分を垂直方向下向きに拡散し次いで該TiN作用電極の該被覆部分へと水平方向に拡散できる、請求項8〜10いずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
近年の半導体産業における超小型化の進歩は、従来かさばっていた検出ツールをいわゆるバイオチップ上に詰め込み、フォームファクタをますます小さくすることを、生物工学者らにとって可能にしつつある。バイオチップの頑健性、効率性、および費用対効果をより高めるための技法を開発することが望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【０００２】
[本発明1001]
導電層と；
該導電層の上方に配された硝酸チタン（TiN）作用電極と；
該TiN作用電極の上方に配された絶縁壁であって、該絶縁壁と該TiN作用電極とが、中に電解質を含有してもよいウェルを形成する、絶縁壁と
を含む、ナノポアセル。
[本発明1002]
TiN作用電極が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を導電層の上方に付着させるよう調整された条件を伴う付着技法によって付着させた、海綿状かつ多孔質のTiN作用電極を含む、本発明1001のナノポアセル。
[本発明1003]
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の比表面積の10〜1000倍の比表面積を有する、本発明1002のナノポアセル。
[本発明1004]
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の電気化学キャパシタンスの10〜1000倍の電気化学キャパシタンスを有する、本発明1002または1003のナノポアセル。
[本発明1005]
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、10ピコファラド〜1ナノファラドの電気化学キャパシタンスを有する、本発明1002〜1004のいずれかのナノポアセル。
[本発明1006]
付着技法が、チタンターゲットからの直流（DC）反応性スパッタリングを含み、かつ、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を導電層の上方に付着させるよう調整された条件が、低温と、低い基板バイアス電圧と、高圧とをスパッタリングのために用いることを含む、本発明1002〜1005のいずれかのナノポアセル。
[本発明1007]
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、該TiN作用電極のベース表面積が、該TiN作用電極の該非被覆部分の上方の該開口部のベース表面積より大きい、本発明1002〜1006のいずれかのナノポアセル。
[本発明1008]
TiN作用電極のベース表面積、および該TiN作用電極の非被覆部分の上方の開口部のベース表面積が、該TiN作用電極に関連するキャパシタンスと該開口部にまたがるメンブレンに関連するキャパシタンスとの比に基づいて選択される、本発明1007のナノポアセル。
[本発明1009]
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、電解質が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶柱の間の空間を通って拡散でき、該TiN作用電極の該非被覆部分を垂直方向下向きに拡散し次いで該TiN作用電極の該被覆部分へと水平方向に拡散できる、本発明1002〜1006のいずれかのナノポアセル。
[本発明1010]
導電層を構築する段階；
該導電層の上方に配された硝酸チタン（TiN）作用電極を構築する段階；および
該TiN作用電極の上方に配された絶縁壁を構築する段階であって、該絶縁壁と該TiN作用電極とが、中に電解質を含有してもよいウェルを形成する、段階
を含む、ナノポアセルを構築する方法。
[本発明1011]
TiN作用電極を構築する段階が、海綿状かつ多孔質のTiN作用電極を構築する段階を含み、該海綿状かつ多孔質のTiN作用電極を構築する段階が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を導電層の上方に付着させるよう調整された条件を伴う付着技法によって付着させることを含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の比表面積の10〜1000倍の比表面積を有する、本発明1011の方法。
[本発明1013]
海綿状かつ多孔質のTiN作用電極が、実質的に同一の寸法を備えた平面TiN作用電極の電気化学キャパシタンスの10〜1000倍の電気化学キャパシタンスを有する、本発明1011の方法。
[本発明1014]
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、該TiN作用電極のベース表面積が、該TiN作用電極の該非被覆部分の上方の該開口部のベース表面積より大きい、本発明1011の方法。
[本発明1015]
絶縁壁の一部分がTiN作用電極の一部分を被覆し、ウェルが、該TiN作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有し、かつ、電解質が、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶柱の間の空間を通って拡散でき、該TiN作用電極の該非被覆部分を垂直方向下向きに拡散し次いで該TiN作用電極の該被覆部分へと水平方向に拡散できる、本発明1011の方法。
以下の詳細な説明および添付の図面において、本発明のさまざまな態様が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】ナノポアベースのシーケンシングチップ内のセル100の態様を図示した図である。
【図２】Nano-SBS技法でヌクレオチドシーケンシングを行っているセル200の態様を図示した図である。
【図３】あらかじめ装填されるタグを用いたヌクレオチドシーケンシングを今から行うところのセルの態様を図示した図である。
【図４】あらかじめ装填されるタグを用いた核酸シーケンシングのためのプロセス400の態様を図示した図である。
【図５】ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網500の態様を図示した図である。
【図６】ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網600の態様を図示した図であり、ナノポアをまたいで印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能状態にある期間にわたって変化するように構成することができる。
【図７Ａ】ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網700の追加的態様を図示した図であり、ナノポアをまたいで印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能状態にある期間にわたって変化するように構成することができる。
【図７Ｂ】ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網701の追加的態様を図示した図であり、ナノポアをまたいで印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能状態にある期間にわたって変化するように構成することができる。
【図７Ｃ】導電性電極と、隣接する液体電解質との間の任意の境界部に形成される二重層を図示した図である。示されている例において、電極表面は負に帯電され、その結果、正の荷電種が電解質中に蓄積する。別の例において、示されたすべての電荷の極性が、図示されている例と逆であってもよい。
【図７Ｄ】導電性電極と、隣接する液体電解質との間の境界部において、図7Cのような二重層の形成と同時に形成されてもよい擬似キャパシタンス効果を図示した図である。
【図８】ナノポア内部の分子を分析するためのプロセス800の態様を図示した図であり、ナノポアはメンブレンの中に挿入されている。
【図９】プロセス800が行われ、3回繰り返されたときに、ナノポアをまたいで印加される電圧を時間に対してプロットした態様を図示した図である。
【図１０】ナノポアがさまざまな状態にあるときに、ナノポアをまたいで印加される電圧を時間に対してプロットした態様を図示した図である。
【図１１】電気化学キャパシタンスが増大したTiN作用電極を含む、ナノポアベースのシーケンシングチップの非ファラデー性電気化学セル1100の態様を図示した図である。
【図１２】ナノポアベースのシーケンシングチップにおける複数のウェルの複数の円形開口部1202の上面図である。
【図１３】図13A〜13Eは、電気化学キャパシタンスが増大したTiN作用電極を含む、ナノポアベースのシーケンシングチップの非ファラデー性電気化学セルを構築するためのプロセスの態様を図示した図である。
【図１４】海綿状かつ多孔質のTiN層の断面図である。
【図１５】海綿状かつ多孔質のTiN層の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
詳細な説明
本発明は、プロセス；装置；システム；組成物；コンピュータ可読記憶媒体上で具現化されたコンピュータプログラム製品；ならびに／または、例えばプロセッサに連結されたメモリ上に保存されている命令および／もしくはそのメモリによって提供される命令を実行するように構成されたプロセッサなどのプロセッサを含む、多数の方式で実施することができる。本明細書において、これらの実施形態、または本発明が取りうる他の任意の形態を技法という場合がある。概して、開示されるプロセスの段階の順序は、本発明の範囲内で変更されてもよい。特に断りがない限り、タスクを行うよう構成されるものとして説明されているプロセッサまたはメモリなどの構成要素は、所与の時間にタスクを行うよう一時的に構成された一般的な構成要素として実施されてもよく、または、タスクを行うよう製造された特定的な構成要素として実装されてもよい。本明細書において用いられる「プロセッサ」という用語は、コンピュータプログラム命令などのデータを処理するように構成された1つまたは複数のデバイス、回路、および／または処理コアを指す。
【０００５】
以下に、本発明の1つまたは複数の態様の詳細な説明が、本発明の原理を図示した添付の図面とともに提供される。本発明は、そのような態様との関連において説明されるが、本発明はいかなる態様にも限定されない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定され、本発明は多数の代替物、変更、および均等物を包含する。本発明の充分な理解を提供するため、以下の説明において、多数の具体的詳細が提示される。これらの詳細は例示の目的で提供されるのであり、本発明は、これら具体的詳細の一部または全部を伴わずに、特許請求の範囲に従って実施されてもよい。明瞭性という目的を達するため、本発明が不必要に不明瞭になることがないよう、本発明に関連する技術分野において公知の技術的事項は、詳しくは説明されていない。
【０００６】
内径が1ナノメートルのオーダーである孔径を有するナノポアメンブレンデバイスは、高速のヌクレオチドシーケンシングに有望であることが示されている。導電性の流体中に浸漬されたナノポアをまたぐように電位が印加されると、ナノポアをまたぐイオンの伝導に起因する小さなイオン電流が観察されうる。その電流の大きさは孔径に影響される。
【０００７】
ナノポアベースのシーケンシングチップは、DNAシーケンシングに用いられてもよい。ナノポアベースのシーケンシングチップは、アレイとして構成された多数のセンサーセルを組み込んでいる。例えば、100万個のセルのアレイが、1000行×1000列のセルを含んでいてもよい。
【０００８】
図1はナノポアベースのシーケンシングチップ内のセル100の一態様を図示している。セルの表面上にメンブレン102が形成されている。いくつかの態様において、メンブレン102は脂質二重層である。タンパク質ナノポアメンブレン貫通分子複合体（protein nanopore transmembrane molecular complex）（PNTMC）と関心対象の分析物とを含有するバルク電解質114が、セルの表面上に直接置かれる。単一のPNTMC 104が、エレクトロポレーションによってメンブレン102に挿入される。アレイ内の個々のメンブレンは、化学的にも電気的にも互いに接続されていない。ゆえに、アレイ内の各セルは、PNTMCと結合した単一のポリマー分子に特有のデータを生成する、独立したシーケンシング機械である。PNTMC 104は分析物に対して作動し、そうでなければ不透過性である二重層を通るイオン電流を変調させる。
【０００９】
引き続き図1を参照すると、電解質の薄膜108によって被覆された電極110にアナログ測定回路網112が接続される。電解質の薄膜108は、イオン不透過性メンブレン102によってバルク電解質114から隔離されている。PNTMC 104は、メンブレン102を横切り、イオン電流がバルク液体から作用電極110へと流れるための唯一の経路を提供する。セルはまた対電極（CE）116も含む。セルはまた、電気化学的な電位センサーとして作用する参照電極117も含む。
【００１０】
いくつかの態様において、ナノポアアレイは、合成による単一分子のナノポアベースシーケンシング（Nano-SBS）技法を用いた並列シーケンシングを可能にする。図2は、Nano-SBS技法によるヌクレオチドシーケンシングを行っているセル200の態様を図示している。Nano-SBS技法では、シーケンス対象のテンプレート202とプライマーとがセル200に導入される。このテンプレート-プライマー複合体に対し、4種類の異なるようにタグ付けされたヌクレオチド208が、バルク水相に添加される。正しくタグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼ204と複合体化する際に、タグの尾部がナノポア206のバレル内に位置付けられる。ナノポア206のバレル内に保持されたタグは、特有のイオン性遮断信号210を生成し、これにより、そのタグ独特の化学構造によって、追加された塩基が電子的に同定される。
【００１１】
図3は、あらかじめ装填されるタグを用いたヌクレオチドシーケンシングを今から行うところのセルの態様を図示している。メンブレン302内にナノポア301が形成されている。酵素303（例えば、DNAポリメラーゼなどのポリメラーゼ）がナノポアと結合している。いくつかの場合において、ポリメラーゼ303は共有結合的にナノポア301に取り付けられる。ポリメラーゼ303は、シーケンス対象の核酸分子304と結合する。いくつかの態様において、核酸分子304は環状である。いくつかの場合において、核酸分子304は線状である。いくつかの態様において、核酸分子304の一部分に核酸プライマー305がハイブリダイズされる。ポリメラーゼ303は、一本鎖の核酸分子304をテンプレートとして用いて、プライマー305へのヌクレオチド306の組み込みを触媒する。ヌクレオチド306はタグ種（「タグ」）307を含む。
【００１２】
図4は、あらかじめ装填されるタグを用いた核酸シーケンシングのためのプロセス400の態様を図示している。ステージAにおいて、タグ付きヌクレオチド（A、T、G、またはCの異なる4種類のうち1つ）は、ポリメラーゼと結合していない。ステージBにおいて、タグ付きヌクレオチドはポリメラーゼと結合している。ステージCにおいて、ポリメラーゼはナノポアときわめて近接している。メンブレンおよび／またはナノポアをまたいで印加される電圧によって生成される電場により、タグがナノポア内に引き込まれる。
【００１３】
結合したタグ付きヌクレオチドのいくつかは、核酸分子と塩基対になっていない。塩基対になっていないこれらのヌクレオチドは、正しく塩基対になったヌクレオチドがポリメラーゼと結合したままになっている時間スケールより短い時間スケールの間に、ポリメラーゼによって拒絶されるのが典型的である。塩基対になっていないヌクレオチドがポリメラーゼと結合するのは一時的にすぎないので、図4に示されているプロセス400は、典型的に、ステージBより先には進まない。
【００１４】
ポリメラーゼがナノポアにドッキングする前は、ナノポアのコンダクタンスは約300ピコジーメンス（300 pS）である。ステージCにおいて、ナノポアのコンダクタンスは、4種類のタグ付きヌクレオチドの各1種類に対応して、約60 pS、80 pS、100 pS、または120 pSである。ポリメラーゼは、異性化およびトランスリン酸化反応を経て、成長している核酸分子中にヌクレオチドを組み込むとともに、タグ分子を放出する。具体的には、タグがナノポア内に保持されると、そのタグ独特の化学構造によって特有のコンダクタンス信号（例えば図2の信号210を参照）が生成され、これにより、追加された塩基が電子的に同定される。そのサイクル（すなわち、ステージA〜EまたはステージA〜F）を繰り返すことにより、核酸分子のシーケンシングが可能となる。ステージDにおいて、放出されたタグはナノポアを通過する。
【００１５】
いくつかの場合において、成長している核酸分子に組み込まれなかったタグ付きヌクレオチドもまた、図4のステージFに見られるように、ナノポアを通過する。組み込まれなかったヌクレオチドは、いくつかの場合においてナノポアによって検出されてもよいが、本方法は、ヌクレオチドがナノポア内で検出される時間に少なくとも部分的に基づいて、組み込まれたヌクレオチドと組み込まれなかったヌクレオチドとを区別するための手段を提供する。組み込まれなかったヌクレオチドに結合しているタグはナノポアを速やかに通過し、短時間（例えば10 ms未満）の間検出されるが、一方、組み込まれたヌクレオチドに結合しているタグはナノポア内に装填され、長時間（例えば、少なくとも10 ms）の間検出される。
【００１６】
図5は、ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網500の態様を図示している。上述したように、タグがナノポア502内に保持されているときは、そのタグ独特の化学構造によって特有のコンダクタンス信号（例えば図2の信号210を参照）が生成され、これにより、追加された塩基が電子的に同定される。図5の回路網は、電流の測定時に、ナノポア502をまたぐ電圧を一定に維持する。具体的には、回路網は、ナノポア502をまたぐ電圧をVaまたはVbに等しい一定電圧に維持する、オペアンプ504とパスデバイス506とを含む。ナノポア502を通る電流は、キャパシタ ncap 508において積分されて、アナログ-デジタル変換器（ADC）510によって測定される。
【００１７】
しかし、回路網500にはいくつもの欠点がある。欠点の1つは、回路網500が一方向の電流しか測定しないことである。別の欠点は、回路網500内のオペアンプ504が、いくつもの性能上の問題をもたらす可能性があることである。例えば、オペアンプ504のオフセット電圧および温度ドリフトは、ナノポア502をまたいで印加される実際の電圧に、セルごとのばらつきをもたらす可能性がある。ナノポア502をまたいで印加される実際の電圧は、望ましい値より数十ミリボルト上または下にドリフトする可能性があり、これにより、測定にかなりの不正確さをもたらす可能性がある。加えて、オペアンプノイズがさらなる検出誤差をもたらす可能性もある。別の欠点は、電流測定中にナノポアをまたぐ電圧を一定に保つための回路網の一部が、大きな面積を要することである。例えば、オペアンプ504は、セル内で占める空間が他の構成要素よりかなり大きい。ナノポアベースのシーケンシングチップを、より多くのセルを含むようにスケール変更する際に、オペアンプが占める面積は、実現不可能なサイズまで増大する可能性がある。残念ながら、大型アレイを有するナノポアベースのシーケンシングチップ内でオペアンプのサイズを低減すると、他の性能上の問題が生じる可能性がある。例えば、セル内のオフセットおよびノイズの問題をさらに悪化させる可能性がある。
【００１８】
図6は、ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網600の態様を図示しており、ナノポアをまたいで印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能状態にある期間にわたって変化するように構成することができる。ナノポアに生じうる状態の1つは、タグが取り付けられたポリホスフェートがナノポアのバレルに存在しない、チャネル開状態である。ナノポアに生じうる別の4つの状態は、タグが取り付けられた異なる4種類のポリホスフェート（A、T、G、またはC）がナノポアのバレル内に保持されている、各状態に対応する。ナノポアに生じうるさらに別の状態は、メンブレンが断裂した場合である。図7Aおよび7Bは、ナノポアベースのシーケンシングチップのセル内の回路網（700および701）の追加的態様を図示しており、ナノポアをまたいで印加される電圧は、ナノポアが特定の検出可能状態にある期間にわたって変化するように構成することができる。上述の回路において、オペアンプはもはや必要でない。
【００１９】
図6は、メンブレン612に挿入されたナノポア602を示しており、ナノポア602とメンブレン612とは、ナノポア602をまたいで電圧が印加されるように、セル作用電極614と対電極616との間に位置を定められている。ナノポア602はまた、バルク液体／電解質618と接触もしている。ナノポア602およびメンブレン612は、図1のナノポアおよびメンブレンと比較して上下逆さに描かれていることに注意されたい。これ以降、セルは、メンブレンと、ナノポアと、セル作用電極と、関連する回路網とを少なくとも含むとの意図で記述される。いくつかの態様において、対電極は複数のセル間で共用され、したがって共通電極とも呼ばれる。共通電極は、測定セル内でナノポアと接触しているバルク液体に、共通の電位を印加するように構成することができる。共通電位および共通電極は、すべての測定セルに共通である。各測定セル内にセル作用電極がある。共通電極と対照的に、セル作用電極614は、他の測定セル内のセル作用電極とは独立した別個の電位を印加するように構成可能である。
【００２０】
図7Aおよび7Bにおいて、メンブレンに挿入されたナノポア、およびナノポアを囲む液体を示す代わりに、ナノポアおよびメンブレンの電気特性を表す電気モデル702と、作用電極の電気特性を表す電気モデル714とが示されている。図7Aおよび7Bにおいて、それぞれの回路網は、余分のキャパシタ（例えば図5のncap 508）がオンチップで作製されることを必要とせず、したがって、ナノポアベースのシーケンシングチップのサイズ低減を容易にすることに注意されたい。
【００２１】
電気モデル702は、異なる状態（例えば、チャネル開状態、または、ナノポア内部で異なる種類のタグもしくは分子を有することに対応した各状態）における、メンブレンに関連するキャパシタンスをモデル化したキャパシタ706（Cメンブレン）と、ナノポアに関連する抵抗をモデル化した抵抗器704とを含む。電気モデル714は、作用電極に関連するキャパシタンスをモデル化したキャパシタ716を含む。作用電極に関連するキャパシタンスは、電気化学キャパシタンス（C電気化学）とも呼ばれる。作用電極に関連する電気化学キャパシタンスC電気化学は二重層キャパシタンスを含んでおり、擬似キャパシタンスをさらに含んでいてもよい。
【００２２】
図7Cは、導電性電極と、隣接する液体電解質との間の任意の境界部に形成される二重層を図示している。電圧が印加されると、導電性電極と、隣接する液体電解質との間の境界部の電極内に、電子電荷（正または負）が蓄積する。電極内の電荷は、双極子の再配向と、境界部付近の電解質中における反対電荷のイオンの蓄積とによって、バランスが取られる。電解質中の荷電種および溶媒分子のサイズが有限であることに起因するわずかな距離によって分離される、電極と電解質との間の境界部のいずれかの側における電荷の蓄積は、従来のキャパシタにおける誘電体のように作用する。「二重層」という用語は、電極と電解質との間の境界部の近傍における電子およびイオンの電荷分布の集合体を指す。
【００２３】
図7Dは、導電性電極と、隣接する液体電解質との間の境界部において、図7Cのような二重層の形成と同時に形成されてもよい擬似キャパシタンス効果を図示している。擬似キャパシタは、電極と電解質との間の電子電荷移動によって、ファラデー的に電気エネルギーを蓄える。このことは、電気吸着（electrosorption）、酸化還元反応、またはインターカレーションのプロセスを通して実現される。
【００２４】
図8は、ナノポア内部の分子を分析するためのプロセス800の態様を図示しており、ナノポアはメンブレンの中に挿入されている。プロセス800は、図6、7A、または7Bに示されている回路網を用いて行われてもよい。図9は、プロセス800が行われ、3回繰り返されたときに、ナノポアをまたいで印加される電圧を時間に対してプロットした態様を図示している。ナノポアをまたぐ電圧は経時的に変化する。電圧減衰率（すなわち、ナノポアをまたぐ電圧の、時間に対するプロットの傾きの急峻さ）は、セル抵抗（例えば、図7Aの抵抗器704の抵抗）に依存する。より具体的には、異なる状態（例えば、ナノポア内部に異なる種類の分子を有することに対応した各状態）において、ナノポアに関連する抵抗は、その分子独特の化学構造ゆえに異なるので、それに対応して異なる電圧減衰率が観察される可能性があり、ゆえに、ナノポア内の分子の同定に用いられてもよい。
【００２５】
図10は、ナノポアが複数の異なる状態にあるときに、ナノポアをまたいで印加される電圧を時間に対してプロットしたものを図示している。曲線1002は、チャネル開状態の間の電圧減衰率を示している。いくつかの態様において、チャネル開状態におけるナノポアに関連する抵抗は、100 Mohm〜20 Gohmの範囲である。曲線1004、1006、1008、および1010は、タグが取り付けられた異なる4種類のポリホスフェート（A、T、G、またはC）がナノポアのバレル内に保持されているときの4つの捕捉状態に対応する、異なる電圧減衰率を示している。いくつかの態様において、捕捉状態におけるナノポアに関連する抵抗は、200 Mohm〜40 Gohmの範囲内である。各プロットの傾きが互いに区別可能であることに注意されたい。
【００２６】
ナノポアをまたいで印加される電圧が、ナノポアが特定の検出可能状態にある期間にわたって減衰することを可能にすると、多数の利点がある。利点の1つは、そうでなければセル回路網内にオンチップで作製されるオペアンプ、パスデバイス、およびキャパシタ（例えば図5の ncap 508）がなくなることにより、ナノポアベースのシーケンシングチップ内の単一セルのフットプリントが大幅に低減することであり、したがって、より多くのセルを含むようにナノポアベースのシーケンシングチップをスケール変更すること（例えば、ナノポアベースのシーケンシングチップ内に数百万個のセルを組み込むこと）が容易になることである。ナノポアと並列するキャパシタンスは、2つの部分、すなわち、メンブレンに関連するキャパシタンスと、集積チップ（IC）に関連するキャパシタンスを含む。薄いというメンブレンの性質により、メンブレンに関連するキャパシタンスのみで、追加的なオンチップキャパシタンスの必要なく、要求されるRC時定数を生み出すのに充分であることができ、したがって、セルサイズおよびチップサイズの大幅な低減が可能となる。
【００２７】
別の利点は、何らかの回路網の介入なく、Vプレが作用電極に直接印加されるので、セルの回路網がオフセットの不正確さによる悪影響を受けないことである。別の利点は、測定インターバルの間に開閉されるスイッチがないので、電荷注入量が最小になることである。
【００２８】
さらに、上述の技法は、正電圧を用いてもまたは負電圧を用いても、等しく良好に作動する。二方向測定は分子複合体の特徴決定に役立つことが示されている。例えば、二方向測定は、ACによる非ファラデー性の作動によって生じるベースラインドリフトの補正に用いることができる。
【００２９】
作用電極に関連する電気化学キャパシタンス（図7Aおよび7BのC電気化学 716を参照）を最大にすることによって、ナノポアベースのシーケンシングチップのセル性能の増大が実現されてもよい。C電気化学を最大にすることにより、図6、7A、または7Bに示された回路網によって測定される情報信号がより安定し、そして、情報信号の上に畳み込まれる擬似信号が最小になる。C電気化学の最大化は、C電気化学に関連するインピーダンスが、Cメンブレン（図7Aおよび7BのCメンブレン 706を参照）に関連するインピーダンスと比較して、AC（交流）短絡に近くなるように行われる。
【００３０】
本出願において、電気化学キャパシタンスが増大した窒化チタン（TiN）作用電極を含む、核酸シーケンシング用の非ファラデー性電気化学セルが開示される。以下により詳しく説明されるように、TiN作用電極は、まばらに間隔の空いたTiNの柱状構造物を有する、粗く、海綿状で、多孔質の電極が形成されるような様式で、成長および付着させる。
【００３１】
図11は、電気化学キャパシタンスが増大したTiN作用電極を含む、ナノポアベースのシーケンシングチップの非ファラデー性電気化学セル1100の態様を図示している。セル1100は導電性または金属の層1101を含む。金属層1101は、セル1100を、ナノポアベースのシーケンシングチップの残りの部分に接続する。いくつかの態様において、金属層1101はメタル6層（M6）である。セル1100は、金属層1101の上方に作用電極1102と誘電体層1103とをさらに含む。いくつかの態様において、作用電極1102は円形または八角形の形状であり、誘電体層1103は作用電極1102を囲む壁を形成する。セル1100は、作用電極1102および誘電体層1103の上方に誘電体層1104をさらに含む。誘電体層1104はウェル1105を囲む絶縁壁を形成する。いくつかの態様において、誘電体層1103と誘電体層1104は一緒になって、単一ピースの誘電体を形成する。誘電体層1103は作用電極1102に隣接して水平方向に配された部分であり、誘電体層1104は作用電極の一部分を被覆してその上方に配された部分である。いくつかの態様において、誘電体層1103と誘電体層1104とは、別個のピースの誘電体であり、別個に成長させてもよい。ウェル1105は作用電極の非被覆部分の上方に開口部を有する。いくつかの態様において、作用電極の非被覆部分の上方の開口部は、円形または八角形の形状である。図12は、ナノポアベースのシーケンシングチップにおける複数のウェルの複数の円形開口部1202の上面図を図示している。
【００３２】
ウェル1105の内部において、塩類溶液／電解質1106の膜が作用電極1102の上方に付着している。塩類溶液1106は、塩化リチウム（LiCl）、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化カリウム（KCl）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（CaCl2）、塩化ストロンチウム（SrCl2）、塩化マンガン（MnCl2）、および塩化マグネシウム（MgCl2）のうち1つを含んでいてもよい。いくつかの態様において、塩類溶液1106の膜は約3ミクロン（μm）の厚さを有する。塩類溶液1106の膜の厚さは0〜5ミクロンの範囲であってもよい。
【００３３】
誘電体層1103および1104を形成するのに用いられる誘電材料として、ガラス、酸化物、および一窒化ケイ素（SiN）などが挙げられる。誘電体層1104の上面はシラン処理されてもよい。シラン処理は、誘電体層1104の上面の上方に疎水層1120を形成する。いくつかの態様において、疎水層1120は約1.5ナノメートル（nm）の厚さを有する。あるいは、酸化ハフニウムなど疎水性の誘電材料が誘電体層1104の形成に用いられてもよい。
【００３４】
図11に示されているように、メンブレンが誘電体層1104の上に形成され、メンブレンはウェル1105にまたがる。例えば、メンブレンは疎水層1120の上に形成された脂質単層1118を含み、メンブレンがウェル1105の開口部に達すると、脂質単層は、ウェルの開口部にまたがる脂質二重層1114に移行する。疎水層1120は、誘電体層1104の上方の脂質単層1118の形成と、脂質単層から脂質二重層への移行とを容易にする。タンパク質ナノポアメンブレン貫通分子複合体（PNTMC）と関心対象の分析物とを含有するバルク電解質1108が、ウェルの上方に直接置かれる。単一のPNTMC／ナノポア1116がエレクトロポレーションによって脂質二重層1114に挿入される。ナノポア1116は脂質二重層1114を横切り、バルク電解質1108から作用電極1102へのイオン流のための唯一の経路を提供する。バルク電解質1108は、塩化リチウム（LiCl）、塩化ナトリウム（NaCl）、塩化カリウム（KCl）、グルタミン酸リチウム、グルタミン酸ナトリウム、グルタミン酸カリウム、酢酸リチウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、塩化カルシウム（CaCl2）、塩化ストロンチウム（SrCl2）、塩化マンガン（MnCl2）、および塩化マグネシウム（MgCl2）のうち1つをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
セル1100は対電極（CE）1110を含む。セル1100はまた、電気化学電位センサーとして作用する参照電極1112も含む。いくつかの態様において、対電極1110は複数のセル間で共用され、したがって共通電極とも呼ばれる。共通電極は、測定セル内でナノポアと接触しているバルク液体に、共通の電位を印加するように構成することができる。共通電位および共通電極は、すべての測定セルに共通である。
【００３６】
作用電極1102は、電気化学キャパシタンスが増大した窒化チタン（TiN）作用電極である。作用電極1102に関連する電気化学キャパシタンスは、電極の比表面積を最大にすることによって増大されてもよい。作用電極1102の比表面積は、単位質量あたりの総表面積（例えばm2/kg）、単位体積あたりの総表面積（例えばm2/m3もしくはm-1）、または単位ベース面積あたりの総表面積（例えばm2/m2）である。表面積が増大するほど、作用電極の電気化学キャパシタンスが増大し、そして、キャパシタが荷電される前の同じ印加電位で、より大量のイオンが動かされうる。作用電極1102の表面積は、TiN電極を「海綿状」または多孔質にすることによって増大されてもよい。TiNの海綿が電解質を吸いこみ、電解質と接触する大きな有効表面積を生み出す。
【００３７】
メンブレンに関連するキャパシタンス（図7Aおよび7BのCメンブレン 706を参照）と、作用電極に関連するキャパシタンス（図7Aおよび7BのC電気化学 716を参照）との比は、全体的なシステム性能を最適化するように調節されてもよい。システム性能の増大は、Cメンブレンを低減させ、かつ一方でC電気化学を最大にすることによって実現されてもよい。Cメンブレンは、追加的なオンチップキャパシタンスの必要なく、要求されるRC時定数を生み出すように調節され、したがって、セルサイズおよびチップサイズの大幅な低減が可能となる。
【００３８】
セル1100において、ウェル1105の開口部のベース表面積（これは脂質二重層1114のベース表面積と同じである）、および作用電極1102のベース表面積は、それぞれ、誘電体層1104および誘電体層1103の寸法によって決定される。作用電極1102のベース表面積は、ウェル1105の開口部のベース表面積より大きいかまたはこれと等しい。したがって、これら2つのベース表面積は、CメンブレンとC電気化学との間に望ましい比を提供するように、独立に最適化されてもよい。図11に示されているように、作用電極1102の一部分は誘電体1104によって被覆されており、したがって、被覆部分は塩類溶液／電解質1106との直接接触を有さない。海綿状かつ多孔質のTiN作用電極を用いることにより、電解質は、柱状TiN構造物の間の空間を通って拡散し、作用電極の非被覆部分を垂直方向下向きに拡散し、次いで誘電体層1104の下にある作用電極1102の被覆部分へと水平方向に拡散することができる。その結果、電解質と接触するTiNの有効表面積が最大となり、そしてC電気化学が最大となる。
【００３９】
図13A〜13Eは、電気化学キャパシタンスが増大したTiN作用電極を含む、ナノポアベースのシーケンシングチップの非ファラデー性電気化学セルを構築するためのプロセスの態様を図示している。
【００４０】
図13Aはプロセスの段階Aを図示している。段階Aにおいて、誘電体の層1304（例えばSiO2）が、導電層1302（例えばM6）の上に配される。導電層は、セルからチップの残りの部分に信号を送達する回路網を含む。例えば、回路網は、セルから積分キャパシタに信号を送達する。いくつかの態様において、誘電体の層1304は、約400 nmの厚さを有する。
【００４１】
図13Bはプロセスの段階Bを図示している。段階Bにおいて、穴1306を作り出すため、誘電体の層1304がエッチングされる。穴1306は、海綿状かつ多孔質のTiN電極を成長させるための空間を提供する。
【００４２】
図13Cはプロセスの段階Cを図示している。段階Cにおいて、段階Bで作り出された穴1306を満たすように海綿状かつ多孔質のTiN層1308を付着させる。海綿状かつ多孔質のTiN層1308は、電解質と接触できる大きな比表面積を提供する、粗く、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を作り出すような様式で、成長および付着させる。海綿状かつ多孔質のTiN層1308は、原子層堆積、化学蒸着、および物理蒸着（PVD）スパッタリング堆積などを含む、さまざまな付着技法を用いて付着させることができる。例えば、層1308は、窒素を含有する前駆体（例えばNH3またはN2）と組み合わせてTiCl4を用いる化学蒸着によって付着させてもよい。層1308はまた、チタンと窒素とを含有する前駆体（例えば、テトラキス(ジメチルアミド)チタン（TDMAT）またはテトラキス(ジエチルアミド)チタン（TDEAT））と組み合わせてTiCl4を用いる化学蒸着によって付着させてもよい。層1308はまた、PVDスパッタリング堆積によって付着させてもよい。例えば、チタンがN2環境中で反応的にスパッタリングされてもよく、またはTiNターゲットから直接スパッタリングされてもよい。各々の付着方法の条件は、まばらに間隔の空いたTiN柱状構造物またはTiN結晶の柱を付着させるようなやり方に調整されてもよい。例えば、層1308が、DC（直流）反応性マグネトロンスパッタリング法によってチタン（Ti）ターゲットから付着される場合、付着システムは、TiNがより緩徐かつより穏やかに付着されてTiN結晶の柱が形成されることができるように、低温と、低い基板バイアス電圧（シリコン基板とTiターゲットとの間のDC電圧）と、高圧（例えば25 mT）とを用いるように調整されてもよい。いくつかの態様において、付着層1308の深さは、穴1306の深さの約1.5倍である。付着層1308の深さは500オングストローム〜3ミクロンである。付着層1308の直径または幅は20 nm〜100ミクロンである。
【００４３】
図14は、金属層1404の上方に付着された海綿状かつ多孔質のTiN層1402の断面図を図示している。図14に示されているように、海綿状かつ多孔質のTiN層1402は、芝状の柱状構造物を含む。図15は、穴の表面から成長したTiN柱状構造物を有する、海綿状かつ多孔質のTiN層1502の別の断面図を図示している。
【００４４】
図13Dはプロセスの段階Dを図示している。段階Dにおいて、余分なTiN層が除去される。例えば、余分なTiN層は、化学機械研磨（CMP）技法を用いて除去されてもよい。穴1306内に付着した、残りのTiNが、海綿状かつ多孔質のTiN作用電極1310を形成する。作用電極1310が形成された後、誘電体の層1312（例えばSiO2）を、誘電体1304および作用電極1310の上に付着させる。いくつかの態様において、誘電体1312の深さは100 nm〜5ミクロンである。
【００４５】
図13Eはプロセスの段階Eを図示している。段階Eにおいて、作用電極の上部ベース表面積の一部分のみを露出させるウェル1314を作り出すため、誘電体の層1312がエッチングされる。例えば、ウェルは、反応性イオンエッチング（RIE）によってエッチングされてもよい。ウェルの開口部のベース表面積（例えば、π x (d1/2) 2）は、作用電極のベース表面積（例えば、π x (d2/2) 2）とは独立しているので、CメンブレンとC電気化学との望ましい比を得るようにセル内のCメンブレンおよびC電気化学を微調整することが可能である。いくつかの態様において、ウェル1314の直径（d2）は20 nm〜100ミクロンである。
【００４６】
海綿状のTiN作用電極を有する、ナノポアベースのシーケンシングチップの非ファラデー性電気化学セル1100を造ることには、多数の利点がある。TiN電極の厚さ（例えば、厚さ500オングストローム〜3ミクロン）に依存するが、海綿状のTiN作用電極の比表面積およびその電気化学キャパシタンス（例えば、ベース面積1平方ミクロンあたり5ピコファラド〜500ピコファラド）は、実質的に同一の寸法（例えば、実質的に同一の厚さおよびベース表面積）を備えた平面TiN作用電極に対し、10〜1000倍の向上を有する。海綿状のTiN作用電極は、電解質が容易に拡散することを可能にするので、システム性能の向上のためにCメンブレンとC電気化学との望ましい比を提供するようにウェルおよび作用電極のベース表面積を独立に最適化できるよう、海綿状TiN作用電極の直径／幅がウェルの直径／幅を超えて伸びていてもよい。TiNを用いることの他の利点として、コストが低いこと、ならびに、白金など他の電極材料と比較してパターン形成およびエッチングが容易であることなどがある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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