(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変齧歯類動物であって、そのゲノムが、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を形成する、内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子のゲノムセグメントのヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むヒトゲノムセグメントでの置き換えを含み、該置き換えが内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子座にあり、該ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が該内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子座の齧歯類Ｂａｆｆプロモーターの制御下にあり、該齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子によってコードされる齧歯類Ｂａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結された該ヒトＢＡＦＦ遺伝子によってコードされるヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードし、該遺伝子改変齧歯類が該ヒト化Ｂａｆｆタンパク質を発現する、遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２】
前記齧歯類動物が全長内因性齧歯類Ｂａｆｆタンパク質を検出可能に発現しない、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３】
前記齧歯類動物がマウスまたはラットである、請求項１または請求項２に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４】
前記齧歯類動物がマウスである、請求項３に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５】
前記置き換えられる内因性マウスＢａｆｆ遺伝子のゲノムセグメントが、前記内因性マウスＢａｆｆ遺伝子のエクソン３、４、５、６と、エクソン７の一部とを含む、請求項４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項６】
前記ヒト化Ｂａｆｆタンパク質が配列番号５のアミノ酸１４２〜２８５を含む、請求項５に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項７】
前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が前記内因性マウスＢａｆｆ遺伝子のエクソン１およびエクソン２を含む、請求項６に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項８】
前記ヒト化Ｂａｆｆタンパク質が配列番号７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項９】
マウス胚性幹（ＥＳ）細胞であって、そのゲノムがヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を形成する、内因性マウスＢａｆｆ遺伝子のエクソン３〜６およびエクソン７の一部のヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むヒトゲノムセグメントでの置き換えを含み、該置き換えが内因性マウスＢａｆｆ遺伝子座にあり、該ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が該内因性マウスＢａｆｆ遺伝子座のマウスＢａｆｆプロモーターの調節下にあり、該マウスＢａｆｆ遺伝子によってコードされるマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結された該ヒトＢＡＦＦ遺伝子によってコードされるヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードする、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載のＥＳ細胞から生成されたマウス胚。
【請求項１１】
内因性Ｂａｆｆ遺伝子座からヒト化Ｂａｆｆタンパク質を発現する齧歯類動物を作製する方法であって、
（ａ）齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞中の内因性Ｂａｆｆ遺伝子座の内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子のゲノムセグメントをヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むゲノムフラグメントで置き換えて内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子座でヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を形成する工程であって、該ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が該内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子座の齧歯類Ｂａｆｆプロモーターの調節下にあり、該齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子によってコードされる齧歯類Ｂａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結された該ヒトＢＡＦＦ遺伝子によってコードされるヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードする、工程；
（ｂ）内因性齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子座に該ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む改変齧歯類ＥＳ細胞を得る工程；および
（ｃ）（ｂ）の改変ＥＳ細胞を使用して齧歯類動物を作製する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
前記齧歯類動物がマウスまたはラットである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記齧歯類動物が全長内因性齧歯類Ｂａｆｆタンパク質を検出可能に発現しない、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒト細胞をマウスに生着させる方法であって、
（ａ）そのゲノムが、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を形成する、内因性マウスＢａｆｆ遺伝子のエクソン３〜６およびエクソン７の一部のヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むヒトゲノムセグメントでの置き換えを含むマウスを提供する工程であって、該置き換えが内因性マウスＢａｆｆ遺伝子座にあり、該ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が該内因性マウスＢａｆｆ遺伝子座のマウスＢａｆｆプロモーターの調節下にあり、該マウスＢａｆｆ遺伝子によってコードされるマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結された該ヒトＢＡＦＦ遺伝子によってコードされるヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質をコードする、工程；および
（ｂ）１つまたはそれを超えるヒト細胞を該マウスに移植する工程
を含む、方法。
【請求項１５】
前記ヒト細胞がヒト造血幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年１１月１９日に出願した米国仮出願第６１／９０５，９８３号の優先権の利益を主張する。この出願の内容全体は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
配列表の参照による援用
２０１４年１１月５日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出されたファイル名が３１０１５＿６８００＿ＳＥＱ．ｔｘｔの２２ＫＢバイトのＡＳＣＩＩテキストファイル中の配列表は、本明細書中で参照によって援用される。
【背景技術】
【０００３】
背景
生物の免疫系がその生物自体の細胞および組織を攻撃するのを防止する生物の天然の機構が破壊された場合、自己免疫を生じる。この破壊によって、およびこの破壊の結果としての異常な自己指向性免疫応答によって引き起こされる疾患、障害、および容態を自己免疫疾患という。自己免疫性の疾患、障害、および容態の顕著な例には、真性糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、およびいくつかのアレルギーが含まれる。自己免疫疾患は、死亡原因の上位１０位に入ると推定される。自己免疫疾患治療の開発における投資額は、数十億ドル規模であり、候補治療薬を試験、開発、および検証するための重要なｉｎ  ｖｉｖｏ系は、処置の安全性および有効性が保証される必要がある。さらに、かかるｉｎ  ｖｉｖｏ系は、新規の処置により患者の長期的な改善を維持することができ、おそらく、依然として対処されていない多数の疾患でさえも治癒することができるかどうかを決定する際に必要である。かかるｉｎ  ｖｉｖｏ系は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトの造血系および免疫系に関連する機能におけるアッセイ、新規の治療およびワクチンの同定のための情報源も提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明は、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ自己免疫疾患系を提供して新規および既存の候補治療薬の試験、開発、および検証を可能にするために非ヒト動物を操作することが望ましいという認識を含む。本発明はまた、ヒトドナー由来のヒト造血幹細胞またはＢ細胞の免疫後および生着（engraftment）後のヒトリンパ球（例えば、Ｂ細胞）の改善された活性化および生存を可能にするために非ヒト動物を操作することが望ましいという認識を含む。本発明はまた、例えば、ヒトドナー由来のヒト造血幹細胞またはＢ細胞の生着で用いるために、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を有し、そして／または、そうでなければヒトＢａｆｆタンパク質またはヒト化Ｂａｆｆタンパク質を発現するか、含むか、もしくは産生する非ヒト動物が望ましいという認識を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、マウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むＢａｆｆポリペプチドを発現する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６によってコードされる。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と１００％同一である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、全長内因性Ｂａｆｆタンパク質を検出可能に発現しない。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は齧歯類であり、全長齧歯類Ｂａｆｆタンパク質を検出可能に発現しない。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、全長マウスＢａｆｆタンパク質（その配列を表３に表示される）を検出可能に発現しない。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明のＢａｆｆポリペプチドは、内因性非ヒトＢａｆｆ遺伝子座の遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子から発現される。いくつかのある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン１を含む。いくつかのある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン２を含む。いくつかのある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン７の全体または一部を含む。いくつかのある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン１およびエクソン２を含む。いくつかのある特定の実施形態では、遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン１、非ヒトＢａｆｆエクソン２、非ヒトＢａｆｆエクソン７の全体もしくは一部、またはその組み合わせを含む。種々の実施形態では、非ヒトＢａｆｆエクソン７の一部は、非ヒトＢａｆｆ  ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および非ヒトＢａｆｆポリアデニル化シグナルを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂａｆｆプロモーターに作動可能に連結されたヒトＢＡＦＦ遺伝子（すなわち、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子）の１つまたはそれを超えるエクソンを含む遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子を含む非ヒト動物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＢａｆｆプロモーターは、非ヒトＢａｆｆプロモーターである。いくつかの実施形態では、本発明のＢＡＦＦプロモーターは、ヒトＢａｆｆプロモーターである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む。いくつかのある特定の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン１をさらに含む。いくつかのある特定の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン２をさらに含む。いくつかのある特定の実施形態では、ヒト化ＢＡＦＦ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン７の全体または一部をさらに含む。いくつかのある特定の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、非ヒトＢａｆｆエクソン１、エクソン２、および非ヒトＢａｆｆエクソン７の全体または一部を含む。種々の実施形態では、非ヒトＢａｆｆエクソン７の一部は、非ヒトＢａｆｆ  ３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および非ヒトＢａｆｆポリアデニル化シグナルを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一である。いくつかの実施形態では、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と１００％同一である。
【００１３】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は齧歯類である。いくつかのある特定の実施形態では、本発明の齧歯類は、マウスまたはラットから選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンに作動可能に連結された非ヒトＢａｆｆ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンを含むヒト化Ｂａｆｆ遺伝子座（または遺伝子）を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子座（または遺伝子）は、ヒトＢＡＦＦエクソン３〜６に作動可能に連結された非ヒトＢａｆｆエクソン１および２を含む。いくつかのある特定の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子座（または遺伝子）は、非ヒトＢａｆｆエクソン１およびヒトＢＡＦＦエクソン６に隣接する５’非ヒト非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非ヒト非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子座（または遺伝子）によってコードされるＢａｆｆポリペプチドを提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の非ヒト動物から単離した細胞または組織を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、星状膠細胞、樹状細胞、リンパ球（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞）、単球、好中球、および間質細胞から選択される。いくつかの実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、眼、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、および／またはその組み合わせから選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、そのゲノムがヒトＢＡＦＦ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンに作動可能に連結された非ヒトＢａｆｆ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンを含むＢａｆｆ遺伝子（または遺伝子座）を含む単離された非ヒト（例えば、齧歯類）細胞または組織を提供する。いくつかのある特定の実施形態では、本発明は、そのゲノムがヒトＢＡＦＦエクソン３〜６に作動可能に連結された非ヒトＢａｆｆエクソン１および２を含むＢａｆｆ遺伝子（または遺伝子座）を含み、Ｂａｆｆ遺伝子（または遺伝子座）が、非ヒトＢａｆｆエクソン１およびヒトＢＡＦＦエクソン６に隣接する５’非ヒト非翻訳領域（ＵＴＲ）および３’非ヒト非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む、単離された非ヒト（例えば、齧歯類）の細胞または組織を提供する。いくつかの実施形態では、Ｂａｆｆ遺伝子（または遺伝子座）は、ヒトＢＡＦＦタンパク質の残基１４２〜２８５を含むＢＡＦＦポリペプチドをコードする配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、そのゲノムが本明細書中に記載のＢａｆｆ遺伝子（または遺伝子座）を含む非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を提供する。いくつかのある特定の実施形態では、ＥＳ細胞は、マウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするＢａｆｆ遺伝子を含む。いくつかのある特定の実施形態では、ＥＳ細胞は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むＢａｆｆ遺伝子を含む。いくつかのある特定の実施形態では、ＥＳ細胞は齧歯類ＥＳ細胞である。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒトＥＳ細胞は、マウスまたはラットのＥＳ細胞である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作製するための本明細書中に記載の非ヒト胚性幹細胞の使用を提供する。いくつかのある特定の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞はネズミ（murine）であり、本明細書中に記載のＢａｆｆ遺伝子を含むマウスを作製するために使用する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載のＢａｆｆ遺伝子を含む非ヒト胚性幹細胞を含むか、この非ヒト胚性幹細胞から作製されるか、得られるか、または生成される非ヒト胚を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト胚は、齧歯類胚である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の齧歯類胚はマウス胚またはラット胚である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂａｆｆタンパク質を内因性Ｂａｆｆ遺伝子座のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子から発現する非ヒト動物の作製方法であって、Ｂａｆｆタンパク質がヒト配列を含み、この方法が、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞中の内因性Ｂａｆｆ遺伝子（または遺伝子座）をヒトＢＡＦＦタンパク質の全体または一部をコードするヒトヌクレオチド配列を含むゲノムフラグメントでターゲティングする工程、前記ヒト配列を含む内因性Ｂａｆｆ遺伝子座のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む改変非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞を得る工程、および前記改変胚性幹（ＥＳ）細胞を使用して非ヒト動物を作製する工程を含む、方法を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記ヒトヌクレオチド配列は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む。いくつかの実施形態では、前記ヒトヌクレオチド配列は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む。いくつかのある特定の実施形態では、前記ヒトヌクレオチド配列は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と１００％同一であるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記ヒトヌクレオチド配列は、ヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２８５をコードする。いくつかの実施形態では、前記ヒトヌクレオチド配列は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２９５と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一であるヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２９５をコードする。いくつかのある特定の実施形態では、前記ヒトヌクレオチド配列は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２９５と１００％同一であるヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２９５をコードする。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の方法によって作製されるかまたはこの方法から得られる（または得ることができる）マウスまたはラットを提供する。いくつかのある特定の実施形態では、本明細書中に記載の方法によって作製されるかまたはこの方法から得られる（または得ることができる）マウスまたはラットは、全長内因性（例えば、マウスまたはラット）Ｂａｆｆタンパク質を検出可能に発現しない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、そのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするＢａｆｆ遺伝子を含むマウスを提供する方法であって、マウスのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするＢａｆｆ遺伝子を含むようにマウスのゲノムを改変し、それにより、前記マウスを提供する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｂａｆｆ遺伝子は、本明細書中に記載のＢａｆｆ遺伝子である。いくつかの実施形態では、Ｂａｆｆ遺伝子は、その配列が表３に表示されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質を反映するタンパク質をコードする遺伝子である。いくつかのある特定の実施形態では、Ｂａｆｆ遺伝子はヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む。
【００２７】
種々の実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３、４、５、および６を含む。種々の実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆタンパク質の細胞外部分は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦタンパク質の残基１４２〜２９５に対応するアミノ酸を含む。いくつかのある特定の実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、表３に表示されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質の配列を含む。種々の実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、マウスＢａｆｆプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト細胞をマウスに生着させる方法であって、そのゲノムが（本明細書中に記載の）マウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするＢａｆｆ遺伝子を含むマウスを提供する工程、および１つまたはそれを超えるヒト細胞をマウスに移植する工程を含む、方法を提供する。いくつかのある特定の実施形態では、本方法は、マウス中の１つまたはそれを超えるヒト細胞の生着をアッセイする工程をさらに含む。いくつかのある特定の実施形態では、アッセイする工程は、１つまたはそれを超えるヒト細胞の生着を、１匹またはそれを超える野生型マウスにおける生着またはそのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするＢａｆｆ遺伝子を含まない１匹またはそれを超えるマウスにおける生着と比較する工程を含む。
【００２９】
いくつかのある特定の実施形態では、ヒト細胞は造血幹細胞である。いくつかのある特定の実施形態では、ヒト細胞はヒトＢ細胞である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ヒト細胞を静脈内に移植する。いくつかの実施形態では、ヒト細胞を腹腔内に移植する。いくつかの実施形態では、ヒト細胞を皮下に移植する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、薬物またはワクチンを同定または確証する方法であって、薬物またはワクチンを本明細書中に記載の非ヒト動物に送達させる工程、および薬物またはワクチンに対する免疫応答、薬物またはワクチンの安全性プロフィール、または疾患もしくは容態（condition）に及ぼす影響のうちの１つまたはそれより多くをモニタリングする工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、安全性プロフィールをモニタリングする工程は、非ヒト動物が薬物またはワクチンの送達の結果として副作用または有害反応を示すかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態では、副作用または有害反応は、罹患率、死亡率、体重の変化、１つまたはそれを超える酵素レベルの変化（例えば、肝臓）、１つまたはそれを超える器官の重量の変化、機能（例えば、感覚機能、運動機能、臓器機能など）の喪失、１つまたはそれを超える疾患に対する感受性の増加、非ヒト動物のゲノムの変化、摂食量の増加または減少、および１つまたはそれを超える疾患の合併症から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、医薬で用いるための（医薬品としての使用など）薬物またはワクチンの開発における本発明の非ヒト動物の使用を提供する。
【００３３】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、齧歯類、好ましくはマウスまたはラットである。
【００３４】
本願で使用する場合、用語「約」および「およそ」を、等価物として使用する。約／およそを伴ってまたは伴わずに本願中で使用される任意の数字は、関連分野の当業者によって認識される任意の通常のゆらぎを包含することを意味する。
【００３５】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な説明で明らかである。しかし、詳細な説明が本発明の実施形態を示す一方で例示のみを目的として提供されており、本発明の限定のためではないと理解すべきである。詳細な説明から、本発明の範囲内の種々の変更形態および修正形態が当業者に明らかとなるであろう。
【００３６】
本明細書中に含まれる図面は、以下の図から構成され、本発明の例示のみを目的とし、本発明の限定のためのものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、マウスおよびヒトのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）遺伝子のゲノム編成のノンスケールの図を示す。エクソンは、各エクソンの真下に番号をつけている。
【００３８】
【図２】図２は、非ヒトＢ細胞活性化因子（Ｂａｆｆ）遺伝子の例示的なヒト化方法のノンスケールの図を示す。非ヒト配列を、黒に塗りつぶした記号で示す。ヒト配列を白抜きの斜線入りの記号で示す。ＣＭ：クロラムフェニコール選択カセット。Ｈｙｇ：ハイグロマイシン選択カセット。ＳＤＣ  ＮＥＯ：自己欠失ネオマイシン選択カセット。Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン選択カセット。Ｆｒｔ：Ｆｌｐリコンビナーゼ標的認識部位配列。ＬｏｘＰ：Ｃｒｅリコンビナーゼ標的認識部位配列。制限酵素認識部位を示す（例えば、ＡｓｉＳＩ、Ｉ−ＣｅｕＩなど）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義
本発明は、特定の方法および記載される実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は変動し得る。本発明の範囲は特許請求の範囲によって規定されるので、本明細書中で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定されることを意図しないことも理解すべきである。
【００４０】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての用語および語句は、そうでないことが明らかに示されないか、あるいは用語または語句が使用される文脈から明らかでない限り、用語および語句が当該分野で獲得している意味を含む。本明細書中に記載の方法および材料と類似するかまたは等価な任意の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができるが、特定の方法および材料をここに記載する。記述の全ての刊行物は、本明細書中で参照によって援用される。
【００４１】
本明細書中で１つまたはそれを超える目的の値に適用される用語「およそ」は、記述の基準値に類似する値をいう。ある特定の実施形態では、用語「およそ」または「約」は、他で記述されないか、またはそうでなければ文脈から自明でない限り（かかる数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）、記述の基準値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれら未満（いずれかの方向（超えるかまたは未満））内に含まれる範囲の値をいう。
【００４２】
本明細書中で使用される用語「生物学的に活性な」は、生物系、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、生物中）で活性を有する任意の薬剤の特徴をいう。例えば、生物中に存在する場合にその生物内に生物学的影響を有する薬剤を、生物学的に活性であると見なす。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するタンパク質またはポリペプチドの一部を、典型的には、「生物学的に活性な」部分という。
【００４３】
用語「匹敵する」（comparable）は、本明細書中で使用する場合、認められた差異または類似性に基づいて合理的に結論を下すことができるように相互に同一では無いかもしれないが、これらの間の比較を許容するのに十分に類似する２つまたはそれを超える薬剤、実体、状況、条件のセットなどをいう。当業者は、文脈内において、任意の所与の環境下で２つまたはそれを超えるかかる薬剤、実体、状況、条件のセットなどを匹敵すると見なすのにどの程度の同一性が必要であるのかを理解しているであろう。
【００４４】
保存的アミノ酸置換を説明するために本明細書中で使用される用語「保存的」は、あるアミノ酸残基の、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基による置換をいう。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性（例えば、受容体のリガンド結合能力）を実質的に変化させないであろう。類似の化学的性質を有する側鎖を有するアミノ酸基の例には、脂肪族側鎖（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなど）；脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリンおよびトレオニンなど）；アミド含有側鎖（アスパラギンおよびグルタミンなど）；芳香族側鎖（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンなど）；塩基性側鎖（リジン、アルギニン、およびヒスチジンなど）；酸性側鎖（アスパラギン酸およびグルタミン酸など）；および硫黄含有側鎖（システインおよびメチオニンなど）が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタメート／アスパルテート、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発で使用されるような、タンパク質中の任意の天然残基の、アラニンでの置換であり得る。いくつかの実施形態では、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５（本明細書中で参照によって援用される）に開示のＰＡＭ２５０対数尤度行列中の正の値を有する置換である。いくつかの実施形態では、置換がＰＡＭ２５０対数尤度行列中の負でない値を有する場合、置換は「中程度に保存的」であると考えられる。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「破壊」（disruption）は、（例えば、相同組換えを介して）ＤＮＡを妨害する事象の結果をいう。いくつかの実施形態では、破壊は、ＤＮＡ配列の欠失、挿入、逆位、改変、置き換え、置換、またはその任意の組み合わせを達成するかまたは示すことができる。いくつかの実施形態では、破壊は、ＤＮＡ中のコード配列内への変異（ミスセンス変異、ナンセンス変異、またはフレームシフト変異、またはその組み合わせなど）の導入を達成するかまたは示すことができる。いくつかの実施形態では、破壊は、細胞において内因性の遺伝子または遺伝子座内で起こり得る。いくつかの実施形態では、挿入には、細胞またはゲノム中の内因性部位内への遺伝子全体または遺伝子のフラグメント（例えば、エクソン）の挿入が含まれ得る。いくつかの実施形態では、挿入は、挿入先の内因性配列と起源が異なる配列を導入することができる。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の）発現および／または活性を増加させることができる。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少させることができる。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物（例えば、コードされるタンパク質）の配列を変化させることができる。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物（例えば、コードされるタンパク質）を短縮または断片化することができる。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物を伸長することができ、いくつかのかかる実施形態では、破壊は、融合タンパク質のアセンブリを達成することができる。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響を及ぼし得るが、その活性に影響を及ぼさないかもしれない。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の活性に影響を及ぼし得るが、そのレベルに影響を及ぼさないかもしれない。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルに有意に影響を及ぼさないかもしれない。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の活性に有意に影響を及ぼさないかもしれない。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれにも有意に影響を及ぼさないかもしれない。
【００４６】
本明細書中で使用される語句「内因性遺伝子座」または「内因性遺伝子」は、破壊（例えば、本明細書中に記載の欠失、挿入、逆位、改変、置き換え、置換、またはその組み合わせ）の導入前に親または基準生物で見出される遺伝学的遺伝子座をいう。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座は、天然に見出される配列を有する。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座は野生型である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の内因性遺伝子座を含む基準生物は野生型生物である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の内因性遺伝子座を含む基準生物は操作された生物である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の内因性遺伝子座を含む基準生物は、研究交配させた生物（野生型または操作型のいずれでもよい）である。
【００４７】
語句「内因性プロモーター」は、（例えば野生型生物において）内因性遺伝子と天然で会合するプロモーターをいう。
【００４８】
本明細書中で使用される用語「異種性」は、異なる供給源由来の薬剤または実体をいう。例えば、ポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関して使用するか、あるいは特定の細胞または生物中に存在する場合、本用語は、関連するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物が、１）人為的に操作されたこと；２）人為的に（例えば、遺伝子操作によって）細胞または生物（またはその前駆体）に導入されたこと；ならびに／あるいは、３）関連する細胞または生物（例えば、関連する細胞型または生物型）によって天然では産生されないかまたはこれらに存在しないことを明確にする。
【００４９】
用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用する場合、異種性（例えば、外因性）の核酸またはタンパク質が導入された細胞をいう。本開示を読んだ当業者は、かかる用語が特定の対象細胞をいうだけでなく、その細胞の子孫をいうためにも使用されると理解するであろう。変異または環境の影響のいずれかによってその後の世代では一定の改変が起こり得るので、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書中で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれることが当業者によって依然として理解される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であるか、これらを含む。一般に、宿主細胞は、細胞が指定される生物界と無関係に異種性の核酸またはタンパク質の受け入れおよび／または産生に適切な任意の細胞である。本開示にしたがって宿主細胞として利用することができる細胞の例には、原核生物および真核生物の細胞（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物（例えば、ハイブリドーマまたはクアドローマなど）が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（上皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上記細胞由来の細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つまたはそれを超えるウイルス遺伝子を含む（例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞））。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単離細胞であるか、これを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は組織の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は生物の一部である。
【００５０】
用語「ヒト化」を、当該分野で理解されている意味にしたがって、核酸またはタンパク質であって、その構造（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列）が、非ヒト動物で天然に見いだされ、且つヒトで天然に見いだされる対応するバージョンと区別可能な関連する核酸またはタンパク質のバージョンと実質的または完全に対応する部分を含み、そして、その構造が非ヒト動物バージョンに存在する構造と異なり、その代わりとしてヒトバージョンで見出される匹敵する構造とより密接に対応する部分も含む、核酸またはタンパク質をいうために使用する。いくつかの実施形態では、「ヒト化」遺伝子は、アミノ酸配列をヒトポリペプチド（例えば、ヒトタンパク質またはその部分（例えば、その特徴的な部分））のアミノ酸配列として実質的に有するポリペプチドをコードする遺伝子である。ほんの一例を挙げると、膜受容体の場合、「ヒト化」遺伝子は、アミノ酸配列がヒト細胞外部分のアミノ酸配列と同一または実質的に同一である細胞外部分を有し、且つ残りの配列が非ヒト（例えば、マウス）ポリペプチドの配列と同一または実質的に同一であるポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子のＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化遺伝子は、ヒト遺伝子で見出されるＤＮＡ配列全体を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質に出現する部分を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、その配列全体がヒトタンパク質で見いだされるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では（例えば、ヒト化タンパク質が、その配列全体がヒトタンパク質で見出されるアミノ酸配列を有するいくつかの実施形態が含まれる）、ヒト化タンパク質は、非ヒト動物の内因性遺伝子座から発現され、この内因性遺伝子座は、そのタンパク質をコードする関連ヒト遺伝子のホモログまたはオルソログに対応する。
【００５１】
配列比較に関して本明細書中で使用される用語「同一性」は、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために使用することができる当該分野で公知の多数の異なるアルゴリズムのうちのいずれかによって決定される同一性をいう。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載の同一性を、オープンギャップペナルティ１０．０、伸長ギャップペナルティ０．１を使用したＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントおよびＧｏｎｎｅｔ類似性行列（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を使用して決定する。本明細書中で使用する場合、用語「同一性」は、高分子間（例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間）の全体的関連性をいう。いくつかの実施形態では、高分子の配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、高分子を、相互に「実質的に同一である」と見なす。当業者によって理解されるように、配列の相同性の程度を決定するために配列を比較すること（どの残基が異なる配列中の残基と相互に「対応する」かを考慮した場合にある配列中の指定の長さのギャップを別の配列と比較することが含まれる）が可能な種々のアルゴリズムが利用可能である。２つの核酸配列間の同一性パーセントの計算を、例えば、最適な比較を目的として２つの配列をアラインメントすることによって行うことができる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２の核酸配列の一方および両方にギャップを導入することができ、比較するために非対応配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較のためにアラインメントされる配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチドの位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同一のヌクレオチドによって占められる場合、分子はその位置で同一である。２配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列が共有する同一の位置の数の関数である。２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントの決定で有用な代表的なアルゴリズムおよびコンピュータプログラムには、例えば、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用してＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＭｅｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１−１７）が含まれる。あるいは、例えば、２ヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列を使用したＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。
【００５２】
用語「単離された」は、本明細書中で使用する場合、（１）（天然および／または実験環境におけるかにかかわらず）最初に産生された時に会合していた成分の少なくとも一部から分離されており、そして／または（２）人為的にデザイン、産生、調製、および／または製造された物質および／または実体をいう。単離された物質および／または実体を、最初に会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離することができる。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％を超えて純粋である。本明細書中で使用する場合、他の成分を実質的に含まない場合、物質は「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者によって理解されるように、例えば、１つまたはそれを超えるキャリアまたは賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などの一定の他の成分と組み合わされた後、物質は依然として「単離された」またはさらに「純粋」と見なすことができる。かかる実施形態では、物質の単離率および純度を、かかるキャリアまたは賦形剤を含めないで計算する。ほんの一例を挙げると、いくつかの実施形態では、天然に存在する生体高分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなど）は、ａ）その生体高分子が由来する起源または供給源により、天然においてその天然状態でその生体高分子に付随する成分の一部または全てに会合していない場合；ｂ）生体高分子が、天然でその生体高分子を産生する種由来の同一の種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない場合；ｃ）天然でその生体高分子を産生する種に属さない細胞または他の発現系由来の成分によって発現されるか、またはそうでなければ当該成分と会合している場合に「単離された」と見なされる。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、化学合成されるか、または天然にそのポリペプチドが産生される細胞系と異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドと見なされる。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、ａ）天然に会合しており、そして／またはｂ）最初に産生された場合に会合していた他の成分から分離されている範囲内において、１つまたはそれを超える精製技術に供されたポリペプチドを「単離された」ポリペプチドと見なすことができる。
【００５３】
本明細書中で使用される句「非ヒト動物」は、ヒトではない脊椎動物をいう。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚類、軟骨魚類（例えば、サメまたはエイ）、両生類、爬虫類、哺乳動物、または鳥類である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【００５４】
句「核酸」は、本明細書中で使用する場合、広義で、オリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれているか、または組み込むことができる任意の化合物および／または物質をいう。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれているか、または組み込むことができる化合物および／または物質である。文脈から明らかなように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つまたはそれを超える各核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）をいい、いくつかの実施形態では、「核酸」は、各核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖をいう。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、もしくはＲＮＡを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、もしくはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたはそれを超える天然の核酸残基であるか、これを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたはそれを超える天然の核酸残基のアナログであるか、これを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、核酸アナログは、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で天然の核酸残基と異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたはそれを超える「ペプチド核酸」であるか、これを含むか、またはこれからなり、このペプチド核酸は、当該分野で公知であり、骨格内にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有し、本発明の範囲内と見なされる。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合よりもむしろ１つまたはそれを超えるホスホロチオアート連結および／または５’−Ｎ−ホスホルアミダイト連結を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたはそれを超える天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）であるか、これを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたはそれを超えるヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、インターカレーテッド（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）塩基、およびその組み合わせ）であるか、これを含むか、またはこれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然の核酸中の糖と比較して１つまたはそれを超える修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）を含む（すなわち、１つまたはそれを超える天然のヌクレオシド糖のアナログを含む）。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたはそれを超えるイントロンを含むヌクレオチド配列を有する。当業者は、核酸産生のための種々のテクノロジーが利用可能であり、且つ当該分野で公知であると認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、核酸を、天然の供給源からの単離、（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの）相補テンプレートに基づいた重合による酵素的合成、組換え細胞または組換え系における再生産、化学合成、およびその組み合わせからなる群から選択される方法によって調製する。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれを超える残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖であり、いくつかの実施形態では、核酸は部分的または完全に二本鎖である（すなわち、配列が相互にハイブリッド形成する相補エレメントを含む少なくとも２つの各核酸鎖を含む）。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つのエレメント、またはポリペプチドをコードする配列の相補物である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は酵素活性を有する。
【００５５】
語句「作動可能に連結された」は、本明細書中で使用する場合、直接または間接的に相互作用するか、またはそれ以外の方法で相互に協調して生物学的事象に関与する成分またはエレメントの（例えば、三次元空間における）物理的近位をいい、この近位により、かかる相互作用および／または協調が達成されるか可能となる。ほんの一例を挙げると、核酸中の調節配列（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（例えば、発現調節配列）は、その有無がコード配列の発現および／または活性に影響を及ぼすようにコード配列に関連して存在する場合、コード配列に「作動可能に連結された」という。多数の実施形態では、「作動可能な連結」には、関連する成分またはエレメントの相互の共有結合が含まれる。しかし、当業者は、いくつかの実施形態では、共有結合は有効な作動可能な連結を達成するのに必要ないと容易に認識するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、核酸調節配列が調節するコード配列に作動可能に連結される核酸調節配列は、目的の遺伝子に隣接する。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるかかる調節配列は、目的のコード配列を調節するためにトランスでまたは一定の距離で作用する。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される用語「発現調節配列」は、ライゲーションされるコード配列を発現およびプロセシングするのに必要および／または十分なポリヌクレオチド配列をいう。いくつかの実施形態では、発現調節配列は、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター配列、および／またはエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル（スプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルなど）；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を向上させる配列；および／または、いくつかの実施形態では、タンパク質分泌を向上させる配列であり得るか、これらを含むことができる。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超える調節配列は、特定の宿主細胞または宿主生物、またはその型で優先的または排他的に活性である。一例を挙げると、原核生物では、調節配列には、典型的には、プロモーター、リボゾーム結合部位、および転写終結配列が含まれ；真核生物では、多数の実施形態では、調節配列には、典型的には、プロモーター、エンハンサー、および／または転写終結配列が含まれる。当業者は、文脈から、多数の実施形態では、用語「調節配列」がその存在が発現およびプロセシングに必須である成分をいい、いくつかの実施形態では、その存在が発現に有利な成分（例えば、リーダー配列、ターゲティング配列、および／または融合パートナー配列が含まれる）が含まれることを認識するであろう。
【００５６】
用語「ポリペプチド」は、本明細書中で使用する場合、アミノ酸の任意の重合鎖をいう。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人為的措置によってデザインおよび／または産生されたという点で操作されたアミノ酸配列を有する。
【００５７】
用語「組換え」は、本明細書中で使用する場合、組換え手段によってデザイン、操作、調製、発現、作製、または単離されたポリペプチド（例えば、本明細書中に記載のＢ細胞活性化因子タンパク質）（宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現したポリペプチド、組換え、組み合わせヒトポリペプチドライブラリーから単離したポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．Ｒ．，（１９９７）ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ．１５：６２−７０；Ａｚｚａｚｙ  Ｈ．，およびＨｉｇｈｓｍｉｔｈ  Ｗ．Ｅ．，（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５−４４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ  Ｊ．Ｖ．，およびＬａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．（２００２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：１２８−１４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  Ｈ．，およびＣｈａｍｅｓ  Ｐ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−３７８）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックな動物（例えば、マウス）から単離した抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  Ｓ−Ａ．，およびＧｒｅｅｎ  Ｌ．Ｌ．（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７；Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍ．ら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３６４−３７０を参照のこと）、または相互に選択された配列エレメントをスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製、または単離されたポリペプチドなど）をいうことを意図する。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるかかる選択された配列エレメントは、天然に見出される。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるかかる選択された配列エレメントは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでデザインされる。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるかかる選択された配列エレメントは、公知の配列エレメント（例えば、天然供給源または合成供給源由来）の変異誘発（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ）に起因する。例えば、いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、目的の供給源となる生物（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノム中に見出される配列から構成される。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、変異誘発（例えば、非ヒト動物における、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）に起因するアミノ酸配列を有し、その結果、組換えポリペプチドのアミノ酸配列がポリペプチド配列を起源とし、且つ関連する一方で、ｉｎ  ｖｉｖｏで非ヒト動物ゲノム内に天然に存在しないかもしれない配列である。
【００５８】
用語「置き換え」を、宿主遺伝子座中（例えば、ゲノム中）に見いだされる「置き換えられる」核酸配列（例えば、遺伝子）が宿主遺伝子座から除去され、異なる「置き換え」核酸がその位置に配置される過程をいうために本明細書中で使用する。いくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列および置き換え核酸配列は、例えば、これらの核酸配列が相互に相同であり、そして／または対応するエレメント（例えば、タンパク質コードエレメント、調節エレメントなど）を含むという点で相互に匹敵する。いくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列は、１つまたはそれを超えるプロモーター、エンハンサー、スプライス供与部位、スプライス受容部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み；いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、１つまたはそれを超えるコード配列を含む。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、置き換えられる核酸配列のホモログである。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、置き換えられる配列のオルソログである。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、ヒト核酸配列であるか、またはこれを含む。置き換え核酸配列がヒト核酸配列であるかまたはこれを含むいくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列は、齧歯類配列（例えば、マウス配列）であるか、またはこれを含む。このようにして置かれる（ｓｏ  ｐｌａｃｅｄ）核酸配列は、このようにして置かれた配列を得るために使用される供給源となる核酸配列の一部である１つまたはそれを超える制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域など）を含むことができる。例えば、種々の実施形態では、置き換えは、内因性配列の異種配列との置換であり、その結果、このようにして置かれた核酸配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の産生がもたらされるが、当該内因性配列の発現はもたらされない；置き換えは、内因性ゲノム配列の、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有するタンパク質をコードする核酸配列との置き換えである（例えば、内因性ゲノム配列はＢａｆｆタンパク質をコードし、ＤＮＡフラグメントは１つまたはそれを超えるヒトＢＡＦＦタンパク質をコードする）。種々の実施形態では、内因性遺伝子またはそのフラグメントを、対応するヒト遺伝子またはそのフラグメントと置き換える。対応するヒト遺伝子またはそのフラグメントは、置き換えられる内因性遺伝子またはそのフラグメントのオルソログであるか、その構造および／または機能が実質的に類似するかもしくは同一であるヒト遺伝子またはフラグメントである。
【００５９】
本明細書中で使用される語句「Ｂ細胞活性化因子」または「ＢＡＦＦ」または「Ｂａｆｆ」は、腫瘍壊死ファミリーリガンド（例えば、ＴＮＦファミリーリガンド）をいう。ＢＡＦＦは、フューリン切断部位でのタンパク質分解プロセシングの際の可溶性リガンドとして放出され得るタイプＩＩ膜結合タンパク質である。ＢＡＦＦタンパク質は、ｐＨ条件に応じて多量体（例えば、タイマー（ｔｉｍｅｒ））を形成することができる。この特徴は、受容体結合に重要であり得る。ＢＡＦＦは、細胞表面上に発現し、免疫細胞（例えば、Ｂ細胞）上の膜表面タンパク質間の相互作用に関与する制御タンパク質としての機能を果たす。ヒト被験体および齧歯類におけるいくつかのバリアント（選択的スプライシング事象に起因するバリアントが含まれる）が、記載されている。例として、マウスおよびヒトのＢＡＦＦ遺伝子のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、表３に提供する。本開示を読んだ際に、当業者は、ゲノム中の１つまたはそれを超える内因性Ｂａｆｆ遺伝子（または全て）を１つまたはそれを超える異種Ｂａｆｆ遺伝子（例えば、多型バリアント、サブタイプまたは変異体、別の種由来の遺伝子、ヒト化形態など）に置き換えることができることを理解するであろう。
【００６０】
本明細書中で使用される「ＢＡＦＦ発現細胞」は、Ｂ細胞活性化因子リガンドを発現する細胞をいう。いくつかの実施形態では、ＢＡＦＦ発現細胞は、その表面上にＢ細胞活性化因子リガンドを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＡＦＦタンパク質は、細胞表面上に発現したＢＡＦＦタンパク質を介して細胞−細胞相互作用を媒介するのに十分な量で細胞表面上に発現する。いくつかの実施形態では、ＢＡＦＦ発現細胞は、可溶性形態（すなわち、細胞表面上にない）のＢ細胞活性化因子リガンドを発現する。例示的なＢＡＦＦ発現細胞には、星状膠細胞、樹状細胞、単球、好中球、および間質細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＢＡＦＦは、主にＢ細胞系統上に見出される受容体と相互作用し、Ｂ細胞の活性化および生存に関与する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物により、非ヒト動物の１つまたはそれを超える（ｏｎｅ  ｍｏｒｅ）細胞の表面上で発現したヒト化Ｂａｆｆリガンドを介した免疫細胞調節が実証される。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、異種造血幹細胞（例えば、ヒト）を含む非ヒト動物におけるＢ細胞の長期生存を促進する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、異種造血幹細胞（例えば、ヒト）を含む非ヒト動物における抗原特異性Ｂ細胞の長期生存を促進する。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の全てまたはほぼ全ての範囲または程度を示す定性的状況をいう。生物学分野の当業者は、生物学的現象および化学的現象が、完全に完了し、そして／または完全性へ向かうか、あるいは絶対的な結果を達成または回避することは、もしあるとしても稀であると理解するであろう。したがって、用語「実質的に」を、本明細書中で、多数の生物学的現象および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を示すために使用する。
【００６２】
本明細書中で使用される語句「実質的相同性」は、アミノ酸または核酸配列の間の比較をいう。当業者によって認識されるように、２つの配列が対応する位置に相同な残基を含む場合、２つの配列を、一般に、「実質的に相同」であると見なす。相同な残基は同一の残基であり得る。あるいは、相同な残基は、適切に類似する構造および／または機能の特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者に周知であるように、一定のアミノ酸を、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有するアミノ酸として分類する。あるアミノ酸の同タイプの別のアミノ酸との置換を、しばしば、「相同」置換と見なすことができる。典型的なアミノ酸の分類を、表１および表２にまとめている。
【００６３】
当該分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列を、種々のアルゴリズム（市販のコンピュータプログラムで利用可能なアルゴリズム（ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど）が含まれる）のうちのいずれかを使用して比較することができる。例示的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、”Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。相同配列の同定に加えて、上述のプログラムは、典型的には、相同性の程度を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える対応残基が関連範囲の残基にわたって相同である場合、２つの配列を実質的に相同であると見なす。いくつかの実施形態では、関連範囲は完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連範囲は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、またはそれを超える残基である。いくつかの実施形態では、関連範囲は、完全な配列に沿った連続残基を含む。いくつかの実施形態では、関連範囲は、完全な配列に沿った不連続残基を含む。いくつかの実施形態では、関連範囲は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超える残基である。
【表１】
0006505689.tif 000002
【表２】
0006505689.tif 000003
【００６４】
本明細書中で使用される語句「実質的な同一性」は、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較をいう。当業者によって認識されるように、２つの配列が対応する位置に同一の残基を含む場合、２つの配列を、一般に、「実質的に同一」であると見なす。当該分野で周知のように、アミノ酸配列または核酸配列を、種々のアルゴリズム（市販のコンピュータプログラムで利用可能なアルゴリズム（ヌクレオチド配列のためのＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなど）が含まれる）のうちのいずれかを使用して比較することができる。例示的なかかるプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０，１９９０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７；Ｂａｘｅｖａｎｉｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。同一配列の同定に加えて、上述のプログラムは、典型的には、同一性の程度を示す。いくつかの実施形態では、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える対応残基が関連範囲の残基にわたって同一である場合、２つの配列を実質的に同一であると見なす。いくつかの実施形態では、関連範囲は完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連範囲は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超える残基である。
【００６５】
本明細書中で使用される語句「ターゲティングベクター」または「ターゲティング構築物」は、ターゲティング領域を含むポリヌクレオチド分子をいう。ターゲティング領域は、標的となる細胞、組織、または動物中の配列に同一または実質的に同一の配列を含み、そして、相同組換えを介して当該細胞、組織、または動物のゲノム内の位置へのターゲティング構築物の組み込みを提供する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を使用してターゲティングするターゲティング領域も含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のターゲティング構築物は、特に目的とされる核酸配列または遺伝子と、選択可能マーカーと、調節配列および／または制御配列と、かかる配列が関与する組換えに役立つかこれを容易にするタンパク質の外因性の付加によって媒介される組換えを可能にする他の核酸配列とをさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のターゲティング構築物は、目的の遺伝子の全体または一部をさらに含み、ここで、目的の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有するタンパク質の全体または一部をコードする異種遺伝子である。
【００６６】
用語「バリアント」は、本明細書中で使用する場合、基準実体と有意な構造的同一性を示すが、基準実体と比較した場合に１つまたはそれを超える化学的部分の存在またはレベルが基準実体と構造的に異なる実体をいう。多数の実施形態では、バリアントはまた、その基準実体と機能的に異なる。一般に、特定の実体が基準実体の「バリアント」と適切に見なされるかどうかは、基準実体とのその構造的同一性の程度に基づく。当業者によって認識されるように、任意の生物学的または化学的な基準実体は、一定の特徴的な構造エレメントを有する。定義によれば、バリアントは、１つまたはそれを超えるかかる特徴的な構造エレメントを共有する異なる化学的実体である。ほんのいくつかの例を挙げると、小分子は、特徴的なコア構造エレメント（例えば、大環状分子コア）および／または１つまたはそれを超える特徴的な懸垂部分を有することができ、それにより当該小分子のバリアントは、当該コア構造エレメントおよび特徴的な懸垂部分を共有するが、他の懸垂部分および／またはコア内に存在する結合のタイプ（単結合対二重結合、Ｅ対Ｚなど）において異なり、ポリペプチドは、線形または三次元空間中に相互に関連した指定の位置を有し、そして／または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸からなる特徴的な配列エレメントを有することができ、核酸は、線形または三次元空間中に相互に関連した指定の位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的な配列エレメントを有することができる。例えば、バリアントポリペプチドは、アミノ酸配列の１つまたはそれを超える相違および／またはポリペプチド骨格に共有結合的に付着した化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つまたはそれを超える相違の結果として、基準ポリペプチドと異なり得る。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である基準ポリペプチドとの全配列同一性を示す。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを基準ポリペプチドと共有しない。いくつかの実施形態では、基準ポリペプチドは、１つまたはそれを超える生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、１つまたはそれを超える基準ポリペプチドの生物学的活性を共有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、１つまたはそれを超える基準ポリペプチドの生物学的活性を欠く。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、基準ポリペプチドと比較して１つまたはそれを超える生物学的活性レベルが減少している。多数の実施形態では、目的のポリペプチドが、特定の位置の少数の配列の変化を別にすれば、親のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する場合、目的のポリペプチドを、親または基準ポリペプチドの「バリアント」であると見なす。典型的には、親と比較してバリアント中の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満の残基が置換されている。いくつかの実施形態では、バリアントは、親と比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つの置換残基を有する。しばしば、バリアントは、非常に少数（例えば、５、４、３、２、または１個未満）の置換された機能残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有する。さらに、バリアントは、典型的には、親と比較して５、４、３、２、または１つ以下の付加または欠失を有し、しばしば、付加や欠失を有しない。さらに、任意の置換または欠失は、典型的には、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６未満の残基であり、一般に、約５、約４、約３、または約２個未満の残基である。いくつかの実施形態では、親または基準ポリペプチドは、天然に見いだされるポリペプチドである。当業者によって理解されるように、目的の特定のポリペプチドの複数のバリアントを、一般に、特に目的のポリペプチドが感染性因子ポリペプチドである場合に天然に見出すことができる。
【００６７】
用語「ベクター」は、本明細書中で使用する場合、会合された別の核酸を輸送することができる核酸分子をいう。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核細胞および／または原核細胞などの宿主細胞中でベクターが連結した核酸の染色体外の複製および／または発現が可能である。作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することができるベクターを、本明細書中で「発現ベクター」という。
【００６８】
用語「野生型」は、本明細書中で使用する場合、当該分野で理解されている意味を有し、「正常な」（変異、罹患、変更などと対照的）状態または状況で天然に見いだされる構造および／または活性を有する実体をいう。当業者は、野生型の遺伝子およびポリペプチドがしばしば複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することを認識するであろう。
【００６９】
ある特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、Ｂ細胞活性化因子タンパク質（例えば、Ｂａｆｆ）をコードするヒト化遺伝子材料を有する改善および／または操作された非ヒト動物を提供する。ある特定の実施形態では、かかる非ヒト動物は、例えば、移植片生着、Ｂ細胞活性化、および抗原特異的Ｂ細胞の免疫後の生存におけるアッセイに有用である。かかる非ヒト動物によりＢ細胞活性化および抗原特異的Ｂ細胞の免疫後、ヒト造血幹細胞の生着後の生存の改善が提供されることを意図する。したがって、本発明は、非ヒト動物におけるヒト造血細胞の維持に特に有用である。特に、本発明は、齧歯類Ｂａｆｆ遺伝子のヒト化を含み、その結果、当該非ヒト動物細胞の原形質膜表面上でのヒト化タンパク質の発現がもたらされる。かかるヒト化タンパク質は、生着したヒト細胞の表面上に存在するヒト化Ｂａｆｆタンパク質およびリガンド／受容体の固着を介して生着したヒト細胞を認識する能力を有する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、移植されたヒト造血細胞を受け入れることができ；いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物は、ヒト細胞を含む免疫系を生成し、そして／または有する。いくつかの実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６によってコードされる配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物および異種性の種（例えば、ヒト）由来の遺伝子材料を含む遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含み、ここで、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３、４、５、および６を含む。いくつかの実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆタンパク質の発現は、非ヒトＢａｆｆ遺伝子材料（例えば、非ヒトＢａｆｆプロモーター）の調節下にある。
【００７０】
本発明の種々の態様を、以下の節に詳述する。節の使用は、本発明を制限することを意味しない。各節は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願では、別に記載しないかぎり、「または」の使用は、「および／または」を意味する。
【００７１】
Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）遺伝子
Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦまたはＢａｆｆ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドスーパーファミリーのメンバーであり、多数の異なる細胞型（星状膠細胞、Ｂ細胞系統の細胞、樹状細胞、単球、好中球、および間質細胞が含まれるが、これらに限定されない）によって発現される。ＢＡＦＦ（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｃ、ＴＮＦＳＦ１３Ｃ、ＢＡＦＦ、ＢＬＹＳ、ＣＤ２５７、ＤＴＬ、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ２０、およびＺＴＮＦ４ともいう）は、タイプＩＩ膜貫通タンパク質として細胞表面上に発現し、タンパク質分解後に、フューリンコンセンサス部位での切断を介して可溶性形態で放出され得る。可溶性ＢＡＦＦは、ｐＨに応じて複数の形態（例えば、タイマー（ｔｉｍｅｒ）、６０量体）で存在し得る。マウスおよびヒトにおけるＢＡＦＦの遺伝子構造は、前者がさらなるエクソンを含むという点でわずかに異なる。ヒトでは、エクソン１は膜貫通ドメインをコードし、エクソン２はフューリン切断部位をコードし、エクソン３〜６は受容体結合を担うＴＮＦドメインをコードする。マウスでは、エクソン１は膜貫通ドメインをコードし、エクソン２はフューリン切断部位をコードし、エクソン３はフューリン部位とＴＮＦドメインとの間のさらなるアミノ酸をコードし、エクソン４〜７はＴＮＦドメインをコードする。マウスおよびヒトの両方について、選択的スプライスバリアントによりタンパク質内部が欠失し、「デルタ−ＢＡＦＦ」（またはΔＢＡＦＦ）と呼ばれるバリアントが得られる。ヒトでは、スキップされるのはエクソン３であるのに対して、マウスでは、スキップされるのはエクソン４である。ΔＢＡＦＦは依然として細胞表面上に発現されるが、可溶性形態の放出が阻止されることが報告されている。報告されているＢＡＦＦの受容体には、最も注目すべきは、ＢＡＦＦ受容体（ＢＡＦＦ−Ｒ）が含まれるが、膜貫通アクチベーター、カルシウムモジュレーター、シクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）も含まれる。ＢＡＦＦはＢＡＦＦ−ＲおよびＴＡＣＩの両方に強い親和性で結合するのに対して、ＢＡＦＦはＢＣＭＡに弱い親和性で結合する。
【００７２】
特に、Ｂ細胞の活性化および分化における役割に関するＢａｆｆの役割が調査されている。例えば、マウスＢａｆｆを過剰発現するトランスジェニックマウスにおけるＢａｆｆレベルの上昇は、自己抗原に親和性を示すＢ細胞の生存、耐性、およびレスキューを促進させ、それにより、自己抗体分泌を促進させることが見出された（Ｏｔａら、２０１０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８５：４１２８−４１３６）。
【００７３】
ＢＡＦＦ配列
ヒトおよびマウスのＢＡＦＦ配列の例を表３に示す。ｃＤＮＡ配列について、連続エクソンは、交互の下線を引いたテキストによって分離されている。タンパク質配列について、推定膜貫通領域に下線を引いている。
【表３−１】
0006505689.tif 000004
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【００７４】
ヒト化Ｂａｆｆ非ヒト動物
非ヒト動物であって、その細胞（例えば、樹状細胞）の表面上に遺伝子が改変された（例えば、ヒト化）Ｂａｆｆタンパク質を発現する非ヒト動物を提供する。具体的には、本発明は、その細胞表面上に遺伝子が改変された（例えば、ヒト化）Ｂａｆｆタンパク質を発現し、このタンパク質がＢａｆｆタンパク質をコードする非ヒト動物の内因性遺伝子座の遺伝子改変によってコードされ、そして／またはこの遺伝子改変から発現される非ヒト動物を提供する。本明細書中に示した適切な例は、齧歯類、特にマウスを具体的に例示する。
【００７５】
遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、いくつかの実施形態では、異種性の種（例えば、ヒト）由来の遺伝子材料を含み、ここで、遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、異種性の種由来の遺伝子材料のコードされた部分を含むＢａｆｆタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子は、細胞の原形質膜上に発現するＢａｆｆタンパク質の細胞外部分に対応する異種性の種のゲノムＤＮＡを含む。前記遺伝子改変Ｂａｆｆ遺伝子を含む非ヒト動物、非ヒト胚、および細胞を作製するための非ヒト動物、胚、細胞、およびターゲティング構築物も提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、内因性Ｂａｆｆ遺伝子を欠失させる。いくつかの実施形態では、内因性Ｂａｆｆ遺伝子の一部を異種配列（例えば、ヒトＢＡＦＦ遺伝子配列の全体または一部）に置き換えて内因性Ｂａｆｆ遺伝子を変化させる。いくつかの実施形態では、全てまたは実質的に全ての内因性Ｂａｆｆ遺伝子を異種遺伝子（例えば、ヒトＢＡＦＦ遺伝子）に置き換える。いくつかの実施形態では、異種Ｂａｆｆ遺伝子の一部を、内因性非ヒトＢａｆｆ遺伝子に挿入する。いくつかの実施形態では、異種遺伝子はヒト遺伝子である。
【００７７】
本発明の非ヒト動物は、内因性非ヒトＢａｆｆ遺伝子座にヒトＢＡＦＦ遺伝子の全体または一部を含む。したがって、かかる非ヒト動物を、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を有するものとして記載することができる。置き換えられたか、挿入されたか、改変された内因性Ｂａｆｆ遺伝子（すなわち、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子）を、種々の方法（例えば、ＰＣＲ、ウェスタンブロット、サザンブロット、制限酵素切断断片長多型（ＲＦＬＰ）、または対立遺伝子の増減のアッセイが含まれる）を使用して検出することができる。
【００７８】
種々の実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、表３のヒトＢＡＦＦ遺伝子中に存在する第３、第４、第５、および第６のエクソンと少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）同一の配列をそれぞれ有する第３、第４、第５、および第６のエクソンを有するＢａｆｆ遺伝子を含む。
【００７９】
種々の実施形態では、本発明のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子は、表３のヒトＢＡＦＦ  ｃＤＮＡ配列中に存在するヌクレオチド６９２〜２６７１と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）同一のヌクレオチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ配列）を有するＢａｆｆ遺伝子を含む。
【００８０】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）同一の配列を有する細胞外部分を有する。
【００８１】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、表３のヒトＢＡＦＦタンパク質中に存在するアミノ酸残基１４２〜２８５と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）同一の配列を有する細胞外部分を有する。
【００８２】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、表３に表示されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）同一のアミノ酸配列を有する。
【００８３】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物によって産生されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも５０％（例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）同一のアミノ酸配列を有する。
【００８４】
ヒト化Ｂａｆｆタンパク質（特異的な多型または対立遺伝子バリアント（例えば、単一のアミノ酸相違、選択的スプライスバリアントなど）が含まれる）を発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法（ヒトプロモーターおよびヒト制御配列から、または必要に応じて非ヒトプロモーターおよび非ヒト制御配列からかかるタンパク質を発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法が含まれる）を提供する。いくつかの実施形態では、内因性プロモーターおよび内因性制御配列からかかるタンパク質を発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供する。本方法は、ヒトＢＡＦＦタンパク質の全体または一部をコードする遺伝子材料を内因性Ｂａｆｆ遺伝子に対応する非ヒト動物のゲノム中の正確な位置に挿入し、それにより、ヒトであるＢＡＦＦタンパク質の全体または一部を発現するヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を作製する工程を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６に対応するゲノムＤＮＡを非ヒト動物の内因性Ｂａｆｆ遺伝子内に挿入し、それにより、挿入されたエクソンによってコードされるアミノ酸を含むヒト部分を含むＢａｆｆタンパク質をコードするヒト化遺伝子を作製する工程を含む。
【００８５】
種々の実施形態では、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子アプローチは、内因性遺伝子の比較的最小限の改変を使用し、その結果、非ヒト動物において天然のＢａｆｆ媒介性シグナル伝達が得られる。なぜなら、単一のフラグメント中のＢａｆｆ遺伝子のゲノム配列が改変され、それ故、必要な制御配列を含めることによって正常な機能性を保持しているからである。したがって、かかる実施形態では、Ｂａｆｆ遺伝子改変は、他の周囲の遺伝子または他の内因性Ｂａｆｆ遺伝子に影響を及ぼさない。さらに、種々の実施形態では、改変は、原形質膜上の機能的な膜貫通タンパク質のアセンブリに影響を及ぼさず、改変によって影響を及ぼされない所与の受容体との細胞外部分の結合および相互作用を介してその受容体との正常な会合を維持する。
【００８６】
内因性のマウスおよびヒトのＢＡＦＦ遺伝子の略図（ノンスケール）を図１に示す。ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子の略図（ノンスケール）を図２に示す。図に示すように、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むゲノムＤＮＡを、ターゲティング構築物によって内因性マウスＢａｆｆ遺伝子内に挿入する。このゲノムＤＮＡは、受容体結合を担うヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分（例えば、アミノ酸残基１４２〜２８５）をコードする遺伝子の部分を含む。
【００８７】
ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を有する非ヒト動物（例えば、マウス）を、当該分野で公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、選択可能マーカー遺伝子を有するヒトＢＡＦＦ遺伝子の全体または一部を導入するターゲティングベクターを作製することができる。図２は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が挿入されたマウスゲノムを示す。図に示すように、ターゲティング構築物は、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むヒト遺伝子材料の正確な挿入を可能にする固有の５’および３’制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。ターゲティング構築物はまた、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む遺伝子材料の３’側に配置された自己欠失薬物選択カセット（例えば、両側がＬｏｘＰ配列に隣接するネオマイシン耐性遺伝子；米国特許第８，３５４，３８９号および同第８，５１８，３９２号（その両方が本明細書中で参照によって援用される）を参照のこと）を含む。消化および再ライゲーションの際、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を、ターゲティングベクター中に含まれるヒト配列を受け入れるように特異的に操作されている内因性マウスＢａｆｆ遺伝子に挿入する。ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６によってコードされるアミノ酸を含むヒト化Ｂａｆｆタンパク質を発現する細胞または非ヒト動物が得られるヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を作製する。薬物選択カセットは、発生依存様式で（すなわち、上記のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む生殖系列細胞が発生中に分化細胞由来の選択可能マーカーを除去するマウス由来の子孫）で除去されるであろう。
【００８８】
本発明の非ヒト動物を、上記のように、または当該分野で公知の方法を使用して、しばしば意図する非ヒト動物の使用に応じてさらなるヒト遺伝子またはヒト化遺伝子を含むように調製することができる。かかるさらなるヒト遺伝子またはヒト化遺伝子の遺伝子材料を、上記の遺伝子改変を有する細胞（例えば、胚性幹細胞）のゲノムのさらなる変化または必要に応じて他の遺伝子改変株を使用した当該分野で公知の交配技術によって導入することができる。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡから選択される１つまたはそれを超えるヒト遺伝子またはヒト化遺伝子をさらに含むように調製する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトまたはヒト化された増殖誘導リガンド（Ａ ＰＲｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｌｉｇａｎｄ）（ＡＰＲＩＬ）遺伝子をさらに含むように調製する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトまたはヒト化されたＴＮＦ関連アポトーシス弱誘導因子（ＴＷＥＡＫ）（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｗｅａｋ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）をさらに含むように調製する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、本明細書中に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子および異種性の種（例えば、ヒト）由来の遺伝子材料を含み、ここで、遺伝子材料は、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、およびＴＷＥＡＫから選択される１つまたはそれを超える異種タンパク質の全体または一部をコードする。
【００８９】
本明細書中に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を有するマウスに加えて、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む他の遺伝子改変非ヒト動物も本明細書中に提供する。いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物は、内因性Ｂａｆｆプロモーター配列に作動可能に連結されたヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、かかる非ヒト動物は、内因性Ｂａｆｆ遺伝子座からヒト化ＢＡＦＦタンパク質を発現し、ここで、ヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、ヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２８５を含む。
【００９０】
かかる非ヒト動物を、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択することができる。適切な遺伝子改変可能なＥＳ細胞を容易に利用できない非ヒト動物について、本明細書中に記載の遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するための他の方法を使用する。かかる方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または誘導多能性細胞）を改変し、核移植を使用して改変されたゲノムを適切な細胞（例えば、卵母細胞）に移入する工程、および胚形成に適切な条件下にて非ヒト動物中で改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を妊娠させる工程を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、例えば、トビネズミ上科またはネズミ上科の小型哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変動物は齧歯類である。いくつかの実施形態では、本発明の齧歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。いくつかの実施形態では、本発明の齧歯類は、ネズミ上科から選択される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変動物は、カンガルーハムスター科（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、新世界ラット（Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ｒａｔ）およびマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（真のマウスおよびラット、スナネズミ、アフリカトゲネズミ（ｓｐｉｎｙ  ｍｏｕｓｅ）、タテガミネズミ（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｒａｔ））、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（カメルーンキノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、ロックマウス（ｒｏｃｋ  ｍｏｕｓｅ）、ウィズテールドラット（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔ）、マラガシーラット（Ｍａｌａｇａｓｙ  ｒａｔ）およびマウス）、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ（ｓｐｉｎｙ  ｄｏｒｍｉｃｅ））、およびメクラネズミ科（Ｓｐａｌａｃｉｄａｅ）（例えば、デバネズミ（ｍｏｌｅ  ｒａｔｅｓ）、バンブーラット（ｂａｍｂｏｏ  ｒａｔ）、およびモグラネズミ（ｚｏｋｏｒ））から選択される科に由来する。いくつかのある特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変齧歯類は、真のマウスまたはラット（ネズミ科）、スナネズミ、アフリカトゲネズミ、およびタテガミネズミから選択される。いくつかのある特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変マウスは、ネズミ科のメンバーに由来する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は齧歯類である。いくつかのある特定の実施形態では、本発明の齧歯類は、マウスおよびラットから選択される。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物はマウスである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである齧歯類である。いくつかのある特定の実施形態では、本発明のマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら、１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈら、２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照のこと）である系統からなる群から選択される１２９系統である。いくつかのある特定の実施形態では、本発明の遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統との交配種である。いくつかのある特定の実施形態では、本発明のマウスは、前述の１２９系統の交配種または前述のＢＬ／６系統の交配種である。いくつかのある特定の実施形態では、本明細書中に記載の交配種の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。いくつかの実施形態では、本発明のマウスは、ＢＡＬＢ系統（例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統）である。いくつかの実施形態では、本発明のマウスは、ＢＡＬＢ系統と別の前述の系統との交配種である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物はラットである。いくつかのある特定の実施形態では、本発明のラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。いくつかのある特定の実施形態では、本明細書中に記載のラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つまたはそれを超える系統の交配種である。
【００９４】
ヒト化ＢＡＦＦ遺伝子を有する非ヒト動物を使用した方法
Ｂａｆｆトランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス）は報告されている（Ｍａｃｋａｙら、１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（１１）：１６９７−１７１０；Ｋｈａｒｅら、２０００，ＰＮＡＳ  ９７（７）：３３７０−３３７５；Ｇａｖｉｎら、２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：３１９−３２８）。かかる動物は、ＢＡＦＦの発現、機能、および制御の分子的局面を決定するために種々のアッセイで使用されている。しかし、これらの動物に制限がないわけではない。例えば、Ｂａｆｆトランスジェニックマウスは、マウスＢａｆｆ（例えば、全長ＢａｆｆまたはΔＢａｆｆ）の過剰発現のために使用が制限されている。トランスジェニックマウスにおけるＢａｆｆの過剰発現は、とりわけ、Ｂ細胞の過剰な蓄積および活性化ならびに自己反応性Ｂ細胞の増殖による自己免疫疾患によって特徴づけられるいくつかのＢ細胞異常を誘導する。いくつかの場合、マウスＢＡＦＦを過剰発現するトランスジェニックマウスは、血清免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥなど）のレベルが増加している。さらに、マウスＢａｆｆを過剰発現するトランスジェニックマウスは、糸球体腎炎などの他の異常を示す。したがって、ＢＡＦＦ媒介性の生物学的機能およびシグナル伝達経路の分子的局面は、トランスジェニックマウスで活用されていない。
【００９５】
本発明の非ヒト動物は、種々のアッセイに有用なヒトＢＡＦＦを発現する生物材料（例えば、細胞）の改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ系および供給源を提供する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトＢＡＦＦをターゲティングし、そして／またはＢＡＦＦ媒介性シグナル伝達経路を調整する治療薬を開発するために使用する。種々の実施形態では、本発明のマウスを、ヒトＢＡＦＦに結合する候補治療薬（例えば、抗体）をスクリーニングおよび開発するために使用する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、本明細書中に記載の非ヒト動物細胞の表面上のヒト化Ｂａｆｆのアンタゴニストおよび／またはアゴニストの結合プロフィールを決定するために使用する。
【００９６】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトＢＡＦＦシグナル伝達（例えば、リン酸化）の遮断または調整の治療効果および細胞変化の結果としての遺伝子発現に及ぼす影響を測定するために使用する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトＢＡＦＦ−ＢＡＦＦＲ、ＢＡＦＦ−ＴＡＣＩ、および／またはＢＡＦＦ−ＢＣＭＡのシグナル伝達経路の遮断または調整（例えば、ＮＦ−κＢ媒介性のＤＮＡ転写の調整）の治療効果を測定するために使用する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物または非ヒト動物から単離した細胞を、非ヒト動物細胞の表面上のヒトＢＡＦＦタンパク質に結合する候補治療薬に曝露し、その後しばらくして、ＢＡＦＦ依存性過程、例えば、Ｂ活性化、種々の区画（例えば、脾臓、骨髄、リンパ節など）中の特異的Ｂ細胞サブセット数の制御、自己反応性Ｂ細胞の生存、およびＮＦ−κＢ活性化に及ぼす影響について分析する。
【００９７】
本発明の非ヒト動物は、ヒト化Ｂａｆｆタンパク質を発現し、したがって、細胞、細胞株、および細胞培養物を、結合アッセイおよび機能アッセイ（例えば、特にアンタゴニストまたはアゴニストがヒトＢＡＦＦ配列またはエピトープに特異的である場合のＢＡＦＦアンタゴニストまたはＢＡＦＦアゴニストの結合または機能についてのアッセイ）で用いるヒト化Ｂａｆｆの供給源としての機能を果たすために生成することができる。種々の実施形態では、本明細書中に記載の非ヒト動物によって発現されるヒト化Ｂａｆｆタンパク質は、バリアントアミノ酸配列を含み得る。リガンド結合残基に関連する変異を有するバリアントヒトＢＡＦＦタンパク質が報告されている。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、ヒト化Ｂａｆｆタンパク質バリアントを発現する。種々の実施形態では、バリアントは、リガンド結合に関連するアミノ酸位置で多型である。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトＢＡＦＦの多型バリアントとの相互作用によるリガンド結合の影響を決定するために使用する。いくつかのある特定の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、表３に表示されるヒトＢＡＦＦスプライスバリアントタンパク質を発現する。
【００９８】
本発明の非ヒト動物由来の細胞を単離して一時的に使用することができるか、何世代も培養によって維持することができる。例えば、本発明の非ヒト動物由来の細胞を、当該分野で公知の種々の細胞アッセイで使用することができる。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物由来の細胞を不死化し、培養で（例えば、連続培養で）無期限に維持する。
【００９９】
種々の実施形態では、本発明の細胞および／または非ヒト動物を、ヒトＢＡＦＦを調整する候補治療薬をスクリーニングおよび開発するために、（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞を使用した）生存および／または増殖アッセイで使用する。自己反応性Ｂ細胞の生存は、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）など）の慢性の病態で重要な役割を果たし、したがって、候補ＢＡＦＦモジュレーター（例えば、アンタゴニスト）を、本発明の非ヒト動物および／または本明細書中に記載の非ヒト動物の細胞を使用して同定、特徴付け、および開発することができる。いくつかの実施形態では、本発明の細胞および／または非ヒト動物を、ＢＡＦＦの存在下および非存在下での抗原特異的血漿Ｂ細胞数を決定するために生存アッセイで使用する。
【０１００】
種々の実施形態では、本発明の細胞および／または非ヒト動物を、抗原に対する免疫応答におけるＢＡＦＦ媒介性機能を決定するために種々の免疫レジメンで使用する。いくつかの実施形態では、ヒトＢＡＦＦに結合するかまたはその１つもしくはそれを超える機能を遮断する候補治療薬を、本発明の非ヒト動物で特徴づける。適切な測定には、種々の細胞アッセイ、増殖アッセイ、血清免疫グロブリン分析（例えば、抗体価）、細胞傷害性アッセイ、リガンド−受容体相互作用の特徴付け（免疫沈降アッセイ）が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物を、抗原に対する免疫応答を制御するＢＡＦＦ媒介性機能を特徴づけるために使用する。いくつかの実施形態では、抗原は、自己免疫疾患または容態に関連する。いくつかの実施形態では、抗原は試験抗原（例えば、オボアルブミンまたはＯＶＡ）である。いくつかの実施形態では、抗原は、処置を必要とする１人またはそれを超えるヒト患者が罹患する疾患または容態に関連する標的である。
【０１０１】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、ヒトＢＡＦＦをターゲティングする候補治療薬の薬物毒物学的態様を試験するための二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）自己抗体産生の力価を決定するための血清アッセイで使用する。いくつかの実施形態では、本発明の非ヒト動物における二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）自己抗体産生は、非ヒト動物で誘導される１つまたはそれを超える自己免疫疾患または容態に起因する。
【０１０２】
種々の実施形態では、本発明の細胞および／または非ヒト動物を、抗原に対する免疫応答で生成された抗体のレパートリーおよび／または特異性を特徴づけるために使用する。いくつかの実施形態では、免疫応答を、本発明の非ヒト動物の１つまたはそれを超える組織に特異的な自己抗体の生成によって特徴づける。いくつかの実施形態では、化合物または生物学的因子がＢ細胞レパートリーのＢＡＦＦ依存性制御を調整する治療能力を、本発明の非ヒト動物において特徴付け、そして／または発展させる。
【０１０３】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、化合物または生物学的因子が免疫応答（所与の抗原に対する特異的なＴ細胞依存性応答およびＢ細胞依存性応答が含まれるが、これらに限定されない）のＢＡＦＦ依存性制御を調整する治療能力を決定するための１つまたはそれを超える抗原を使用した攻撃誘発のために使用する。
【０１０４】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物を、化合物または生物学的因子が新規のリンパ球のＢＡＦＦ依存性制御およびその免疫機能を調整する治療能力を決定するための移植実験または養子移入実験で使用する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物にヒトＢ細胞を移植する。
【０１０５】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物細胞を、化合物または生物学的因子がＴ細胞依存性の応答および機能のＢＡＦＦ依存性制御を調整する治療能力を決定するためのＴ細胞アッセイで使用する。例示的なＴ細胞アッセイには、ＥＬＩＳｐｏｔ、細胞内サイトカイン染色、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束、ウイルス抑制アッセイ、細胞傷害性アッセイ、増殖アッセイ、および制御性Ｔ細胞抑制アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物細胞を、化合物または生物学的因子が腫瘍細胞成長のＢＡＦＦ依存性の制御および／または刺激を調整する治療能力を決定するための腫瘍細胞成長アッセイで使用する。
【０１０７】
種々の実施形態では、自己免疫性の疾患または容態を、化合物または生物学的因子が自己免疫性の疾患または容態の１つまたはそれを超える機能のＢＡＦＦ依存性制御を調整する治療能力を決定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供するために１つまたはそれを超える本発明の非ヒト動物で誘導する。いくつかの実施形態では、自己免疫性の容態は、炎症状態、例えば、関節炎（例えば、コラーゲン誘発関節炎、ＣＩＡ）である。
【０１０８】
本発明の非ヒト動物は、薬物またはワクチンの分析および試験のためのｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供する。種々の実施形態では、候補薬物または候補ワクチンを、１つまたはそれを超える本発明の非ヒト動物に送達後、薬物またはワクチンに対する免疫応答、薬物またはワクチンの安全性プロフィール、または疾患または容態に及ぼす影響のうちの１つまたはそれより多くを決定するために非ヒト動物をモニタリングすることができる。安全性プロフィールの決定のために使用される例示的な方法には、毒性、至適用量濃度、薬物またはワクチンの効力、および可能性のあるリスク因子の測定が含まれる。かかる薬物またはワクチンを、かかる非ヒト動物中で改良および／または開発することができる。
【０１０９】
本発明の非ヒト動物は、癌で用いる候補治療薬の開発および特徴付けのための改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物に腫瘍を移植後、候補治療薬を投与することができる。腫瘍を、非ヒト動物内の１つまたはそれを超える位置に十分な時間をかけて樹立させることができる。腫瘍細胞の増殖、成長などを、候補治療薬の投与前および投与後の両方で測定することができる。候補治療薬の細胞傷害性を、必要に応じて非ヒト動物中で測定することもできる。
【０１１０】
本発明の非ヒト動物は、養子移入によるヒトの細胞−細胞相互作用機構を解明するための改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物に腫瘍異種移植片を移植後、養子移入による非ヒト動物への腫瘍浸潤リンパ球の第２の移植を行って、固形腫瘍または他の悪性疾患の根絶効果を決定することができる。かかる実験を、非ヒト動物の内因性Ｂａｆｆとの競合が存在ないヒトＢＡＦＦの排他的存在に基づいて、ヒト細胞（例えば、Ｂ細胞リンパ腫）を使用して行うことができる。さらに、異種移植で用いる治療および医薬品を、かかる非ヒト動物において改良および／または開発することができる。
【０１１１】
本発明の非ヒト動物は、生着によるヒト造血幹細胞の維持および開発のための改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物内のヒト幹細胞の改良された開発方法および維持方法を提供する。種々の実施形態では、非ヒト動物の血液、骨髄、脾臓、および胸腺で分化したヒトのＢ細胞集団およびＴ細胞集団の増加が認められる。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、内因性非ヒトＢａｆｆおよび異種（例えば、ヒト）ＢＡＦＦの両方を発現する非ヒト動物と比較してヒト造血幹細胞の生着レベルが増加する。
【０１１２】
本発明の非ヒト動物は、生着によるヒトＢ細胞（例えば、ヒトドナー由来）の維持および開発のための改良されたｉｎ  ｖｉｖｏ系を提供する。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、非ヒト動物内のヒトＢ細胞の発生および維持が改良されている。種々の実施形態では、免疫後の分化ヒトＢ細胞集団の増加が、非ヒト動物の血液、骨髄、脾臓、またはリンパ節のうちの１つまたはそれより多くで認められる。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物は、内因性非ヒトＢａｆｆを発現する非ヒト動物と比較して、ヒトＢ細胞の生着レベルが増加する。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例を、本発明の方法および組成物の作製および使用方法を当業者に説明するために提供し、発明者が発明と見なす範囲を制限することを意図しない。他の意味を示さない限り、温度を摂氏で示し、圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０１１４】
実施例１．内因性非ヒトＢ細胞活性化因子（Ｂａｆｆ）遺伝子のヒト化
本実施例は、齧歯類（例えば、マウス）などの非ヒト動物におけるＢ細胞活性化因子（Ｂａｆｆ）をコードする内因性遺伝子のヒト化方法の例を示す。ヒトＢＡＦＦは、いくつかのバリアント（または対立遺伝子）形態で存在することが公知である。本実施例に記載の方法を、必要に応じて任意のヒトバリアント（または対立遺伝子）またはヒトバリアントの組み合わせ（または対立遺伝子もしくはそのフラグメント）を使用して非ヒト動物の内因性Ｂａｆｆ遺伝子をヒト化するために使用することができる。本実施例では、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＣＴＤ−２３５５ｎ１８中に存在するヒトＢＡＦＦ遺伝子を、マウスの内因性Ｂａｆｆ遺伝子のヒト化のために使用する。
【０１１５】
Ｂａｆｆ遺伝子の細胞外領域のヒト化のためのターゲティングベクターを、細菌相同組換えおよびＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）テクノロジーを使用して構築した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）。マウスの内因性Ｂａｆｆ遺伝子のヒト化プロセスの例を図２に示す。
【０１１６】
簡潔に述べれば、ヒト細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＣＴＤ−２３５５ｎ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のおよそ２０６ｂｐ  ３’側から開始されるヒトＢＡＦＦ遺伝子の３’隣接領域を欠失するように改変した。リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ；米国特許第８，３５４，３８９号および同第８，５１８，３９２号（その両方が本明細書中で参照によって援用される）を参照のこと）に隣接した自己欠失ネオマイシンカセットおよびこのカセットの３’側に配置された固有のＡｓｉＳＩ制限部位を含むターゲティングベクターを使用した細菌細胞における相同組換えによってこの改変を行った。得られた改変ＢＡＣクローンを、ヒトＢＡＦＦ遺伝子の５’側の配列と、エクソン１、２と、イントロン２のおよそ３１４６ｂｐとを欠失するようにスペクチノマイシンカセットを使用して細菌細胞において第２の相同組換え工程で改変した。スペクチノマイシンカセットは、スペクチノマイシンカセットの３’側の固有のＩ−ＣｅｕＩ部位を含んでいた。したがって、二重改変ヒトＢＡＣクローンは、５’→３’方向に、スペクチノマイシンカセットと、Ｉ−ＣｅｕＩ部位と、ヒトＢＡＦＦイントロン２のほとんど、ヒトＢＡＦＦエクソン３〜６、およびヒトＢＡＦＦエクソン６の３’側のおよそ２０６ｂｐのヒト配列を含むおよそ３５，３０３ｂｐのヒトゲノム配列と、ＬｏｘＰ部位に隣接した自己欠失ネオマイシンカセットと、３’ＡｓｉＳＩ部位とを含んでいた。
【０１１７】
個別に、マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−３５１Ｌ２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、上記の改変ヒトＢＡＣクローンが特異的に挿入されるように改変した。第１の工程では、部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、Ｆｒｔ）に隣接したハイグロマイシンカセットを使用して、マウスＢａｆｆ遺伝子のエクソン３〜６およびエクソン７の一部を含む配列を欠失した。３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルを保持した。ハイグロマイシンカセットは、それぞれ５’末端および３’末端に隣接する固有のＩ−ＣｅｕＩ制限部位およびＡｓｉＳＩ制限部位を含んでいた。ハイグロマイシンカセットを使用した細菌細胞における相同組換えにより、エクソン３〜７に対応するマウスＢａｆｆ遺伝子が約２５，１４８ｂｐ欠失し、インタクトな約３０６９ｂｐのマウスＢａｆｆイントロン２が残存した。ハイグロマイシンカセットの３’末端は、ＢＡＣクローンＲＰ２３−３５１Ｌ２０中のマウスＢａｆｆ遺伝子（エクソン７の）の３’ＵＴＲのおよそ中央を標的にした。ハイグロマイシンカセットを使用した相同組換え由来のマウスＢａｆｆエクソン３〜６および７（一部）が欠失した改変マウスＢＡＣクローンを、ヒトＢＡＦＦのエクソン１〜２およびイントロン２の約３１４６ｂｐが欠失した改変ヒトＢＡＣクローンを使用した第２の工程で改変した。２つの改変ＢＡＣクローン間で共通の固有の制限酵素部位によってこの改変を行った。各改変ＢＡＣクローンを、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＡｓｉＳＩで消化して適合する付着フラグメントを産生した（図２）。適合する制限フラグメントのライゲーションによって作製された最終ターゲティングベクターは、５’→３’方向に、マウスＬｉｇ４遺伝子およびマウスＡｂｄｈ１３遺伝子を含むマウスゲノム遺伝子と、約１４．５ｋｂのマウスゲノム配列と、マウスＢａｆｆ遺伝子のエクソン１および２と、約３０６９ｂｐのマウスＢａｆｆ遺伝子のイントロン２と、Ｉ−ＣｅｕＩ部位と、約３５．３ｋｂのヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含むヒトゲノム配列と、リコンビナーゼ認識部位に隣接した自己欠失ネオマイシンカセットと、ＡｓｉＳＩ部位と、３’ＵＴＲおよびポリアデニル化シグナルを含むマウスＢａｆｆエクソン７の一部と、マウスＢａｆｆ遺伝子の３’側のマウスゲノム配列とを含んでいた。
【０１１８】
最終ターゲティングベクターを使用してＢＡＬＢ−Ｒａｇ２−／−ＩＬ２Ｒγｃ−／−（ＤＫＯ）マウス胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションを行って、マウスＢａｆｆ遺伝子のイントロン２のほぼ中央（スプライス供与部位の約３０００ｂｐ  ３’側）からマウスＢａｆｆ遺伝子の３’ＵＴＲのほぼ中央に挿入したヒトＢＡＦＦ遺伝子のポリアデニル化部位のおよそ１００ｂｐ  ３’側までヒト化した内因性Ｂａｆｆ遺伝子座にＢａｆｆ遺伝子を含む改変ＥＳ細胞を作製した（図１）。ヒト化ＢＡＦＦ遺伝子を含む陽性にターゲティングされたＥＳ細胞を、ヒトＢＡＦＦ配列の存在を検出するアッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、前出）によって同定し、マウスＢａｆｆ配列の欠失を確認した。表４は、上記の内因性Ｂａｆｆ遺伝子のヒト化を確認するために使用したプライマーおよびプローブを示す。ｈＢＡＦＦ：ヒトＢＡＦＦ；ｍＢａｆｆ：マウスＢａｆｆ。
【０１１９】
次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照のこと）を使用した雌マウスの移植を行って、マウスの内因性Ｂａｆｆ遺伝子にヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を挿入した同腹仔を生成した。内因性Ｂａｆｆ遺伝子のエクソン３〜６をヒト化したマウスを、ヒトＢＡＦＦ遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、前出）の修正形態を使用して尾の切片から単離したＤＮＡの遺伝子型同定によって再度確認した。同腹仔を遺伝子型同定し、ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子構築物のヘテロ接合体動物コホートを、特徴付けのために選択する。
【表４】
0006505689.tif 000008
【０１２０】
均等物
本発明の少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様を記載しているが、当業者は、種々の変更形態、修正形態、および改良形態が当業者によって容易に想起されると認識すべきである。かかる変更形態、修正形態、および改良形態は、本開示の一部であることを意図し、本発明の精神および範囲に含まれることを意図する。したがって、前述の説明および図面はほんの一例であり、本発明は、以下の特許請求の範囲によって詳述される。
【０１２１】
クレームの要素を修飾するための特許請求の範囲中の「第１の」、「第２の」、「第３の」などの序数の使用は、序数自体があるクレーム要素と別のクレーム要素に関するいかなる優先順位、先行、または順序や方法を実施する一時的な順序を意味しないが、一定の名称を有するあるクレームの要素を、クレームの要素を区別するための（序数の使用以外の）同一の名称を有する別の要素と区別するための標識としてのみ使用する。
【０１２２】
本明細書中および特許請求の範囲中で使用される冠詞「ａ」および「ａｎ」は、それとは反対に明記されない限り、複数形を含むと理解すべきである。群の１つまたは複数のメンバーの間に「ｏｒ」を含むクレームまたは説明は、それとは反対に示されているか、そうでなければ文脈から明らかでない限り、１つ、１つを超える、または全ての群のメンバーが所与の生成物または過程中に存在するか、所与の生成物または過程中で使用されるか、あるいはそうでなければ所与の生成物または過程に関連するという場合に充足されると見なされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物または過程中に存在するか、所与の生成物または過程中で使用されるか、あるいはそうでなければ所与の生成物または過程に関連する実施形態を含む。本発明はまた、１つを超えるか全ての群のメンバーが所与の生成物または過程中に存在するか、所与の生成物または過程中で使用されるか、あるいはそうでなければ所与の生成物または過程に関連する実施形態を含む。さらに、他で示されないか、矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、１つまたは複数の列挙したクレーム由来の１つまたは複数の制限、要素、節、記述用語などが同一の基本クレーム（すなわち、関連するに任意の他のクレームとして）に従属する別のクレームに導入される全ての変更形態、組み合わせ、および並び替えを本発明が含むと理解すべきである。要素をリストとして（例えば、マーカッシュグループ形式または類似の形式で）示す場合、要素の各サブグループも開示され、任意の要素をグループから除くことができると理解すべきである。一般に、本発明または本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むことを言及する場合、本発明のある特定の実施形態または本発明の態様がかかる要素、特徴などからなるか本質的になることも理解すべきである。簡潔にすることを目的として、これらの実施形態は、あらゆる場合において、本明細書中で具体的に、そして多数の言葉によって記載されているわけではない。特定の除外が明細書中で言及されているかどうかと無関係に、本発明の任意の実施形態または態様を特許請求の範囲から明確に除外することができることも理解すべきである。
【０１２３】
当業者は、典型的な標準偏差または標準誤差が本明細書中に記載のアッセイまたは他の過程で得られた値に起因することを認識するであろう。
【０１２４】
発明の背景を記載し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書中で参照した刊行物、ウェブサイト、および他の参考資料は、本明細書中で参照によって援用される。
（項目１）  マウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分を含むＢａｆｆポリペプチドを発現する非ヒト動物。
（項目２）  前記ヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分が、ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６によってコードされる、項目１に記載の非ヒト動物。
（項目３）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも５０％同一である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目４）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも６０％同一である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目５）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも７０％同一である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目６）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも８０％同一である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目７）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも９０％同一である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目８）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と同一である、項目２に記載の非ヒト動物。
（項目９）  前記非ヒト動物が全長内因性Ｂａｆｆタンパク質を検出可能に発現しない、前記項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１０）  前記Ｂａｆｆポリペプチドが、内因性Ｂａｆｆ遺伝子座のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子から発現される、前記項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１１）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が非ヒトＢａｆｆエクソン１を含む、項目１０に記載の非ヒト動物。
（項目１２）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が非ヒトＢａｆｆエクソン２をさらに含む、項目１１に記載の非ヒト動物。
（項目１３）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が非ヒトＢａｆｆエクソン７の全体または一部をさらに含む、項目１２に記載の非ヒト動物。
（項目１４）  Ｂａｆｆプロモーターに作動可能に連結されたヒトＢＡＦＦ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンを含むヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む非ヒト動物。
（項目１５）  前記Ｂａｆｆプロモーターが非ヒトＢａｆｆプロモーターである、項目１４に記載の非ヒト動物。
（項目１６）  前記ＢａｆｆプロモーターがヒトＢＡＦＦプロモーターである、項目１４に記載の非ヒト動物。
（項目１７）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子がヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む、項目１４〜１６のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目１８）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも５０％同一である、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目１９）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも６０％同一である、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目２０）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも７０％同一である、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目２１）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも８０％同一である、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目２２）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と少なくとも９０％同一である、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目２３）  前記ヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６が表３に表示されるヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６と同一である、項目１７に記載の非ヒト動物。
（項目２４）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が非ヒトＢａｆｆエクソン１を含む、項目１４〜２３のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２５）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が非ヒトＢａｆｆエクソン２をさらに含む、項目２４に記載の非ヒト動物。
（項目２６）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が、非ヒトＢａｆｆエクソン７の全体または一部をさらに含む、項目２５に記載の非ヒト動物。
（項目２７）  前記非ヒト動物が齧歯類である、前記項目のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
（項目２８）  ヒトＢＡＦＦ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンに作動可能に連結された非ヒトＢａｆｆ遺伝子の１つまたはそれを超えるエクソンを含むヒト化Ｂａｆｆ遺伝子。
（項目２９）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が、ヒトＢＡＦＦエクソン３〜６に作動可能に連結された非ヒトＢａｆｆエクソン１および２を含む、項目２８に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子。
（項目３０）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子が、前記非ヒトＢａｆｆエクソン１および前記ヒトＢＡＦＦエクソン６に隣接する５’非ヒト非翻訳領域および３’非ヒト非翻訳領域をさらに含む、項目２９に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子。
（項目３１）  項目２８〜３０のいずれか１項に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子によってコードされるＢＡＦＦポリペプチド。
（項目３２）  項目１〜２７のいずれか１項に記載の非ヒト動物の単離された細胞または組織。
（項目３３）  項目２８〜３０のいずれか１項に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む単離された細胞。
（項目３４）  マウス胚性幹細胞であって、そのゲノムが項目２８〜３０のいずれか１項に記載のヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む、マウス胚性幹細胞。
（項目３５）  マウス胚性幹細胞であって、そのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む、マウス胚性幹細胞。
（項目３６）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子がヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む、項目３５に記載のマウス胚性幹細胞。
（項目３７）  マウスを作製するための項目３４、３５、または３６に記載のマウスＥＳ細胞の使用。
（項目３８）  項目３４、３５、または３６に記載の胚性幹細胞から生成されたマウス胚。
（項目３９）  内因性Ｂａｆｆ遺伝子座からＢａｆｆタンパク質を発現する非ヒト動物を作製する方法であって、前記Ｂａｆｆタンパク質がヒト配列を含み、
（ａ）非ヒトＥＳ細胞中の内因性Ｂａｆｆ遺伝子座の内因性Ｂａｆｆ遺伝子をヒトＢＡＦＦタンパク質の全体または一部をコードするヒトヌクレオチド配列を含むゲノムフラグメントでターゲティングする工程；
（ｂ）該内因性Ｂａｆｆ遺伝子座に（ａ）のヒト配列を含むヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含む改変非ヒトＥＳ細胞を得る工程；および
（ｃ）（ｂ）の改変ＥＳ細胞を使用して非ヒト動物を作製する工程
を含む、方法。
（項目４０）  前記ヒトヌクレオチド配列がヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）  前記ヒトヌクレオチド配列がヒトＢＡＦＦタンパク質のアミノ酸残基１４２〜２８５をコードする、項目３９に記載の方法。
（項目４２）  前記非ヒト動物がマウスまたはラットである、項目３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）  項目３９〜４２のいずれか１項に記載の方法から得ることができるマウスまたはラット。
（項目４４）  マウスのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含むマウスを提供する方法であって、
マウスがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含むように、マウスのゲノムを改変し、それにより、前記マウスを提供する、マウスのゲノムを改変する工程を含む、方法。
（項目４５）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子がヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  ヒト細胞をマウスに生着させる方法であって、
（ａ）そのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含むマウスを提供する工程；および
（ｂ）１つまたはそれを超えるヒト細胞を前記マウスに移植する工程
を含む、方法。
（項目４７）  （ｃ）前記１つまたはそれを超えるヒト細胞の前記マウスへの生着をアッセイする工程
をさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）  前記アッセイする工程が、
前記１つまたはそれを超えるヒト細胞の前記生着を、１匹またはそれを超える野生型マウスにおける生着、またはそのゲノムがマウスＢａｆｆタンパク質の細胞内部分に連結されたヒトＢＡＦＦタンパク質の細胞外部分をコードするヒト化Ｂａｆｆ遺伝子を含まない１匹またはそれを超えるマウスにおける生着と比較する工程
を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）  前記ヒト化Ｂａｆｆ遺伝子がヒトＢＡＦＦ遺伝子のエクソン３〜６を含む、項目４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５０）  ヒトＢＡＦＦタンパク質の前記細胞外部分が、表３に表示されるヒトＢＡＦＦタンパク質の残基１４２〜２８５に対応するアミノ酸を含む、項目４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）  前記ヒト細胞が造血幹細胞である、項目４６〜５０のいずれか１項に記載の方法。
（項目５２）  前記ヒト細胞が静脈内に移植される、項目４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）  前記ヒト細胞が腹腔内に移植される、項目４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）  前記ヒト細胞が皮下移植される、項目４６〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
0006505689.tif 000009
【図２】
0006505689.tif 000010
【配列表】
0006505689000001.app