(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体またはその薬学的に許容可能な塩：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
（Ｉ）
［式中、
Ａｂは、［標的］抗体もしくは抗原抗体、またはその［標的］結合フラグメントもしくはその抗原結合フラグメントであり、
Ｌは、下記式（ＩＩＩ）のリンカーであり:
【化１】
0006567551.tif 000270
（式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、または（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニルであり、
Ｗは、アミノ酸単位であり、ｗは、０〜５の間を含む整数であり、
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
【化２】
0006567551.tif 000271
であり、ｙは、０または１であり、
アスタリスクは、Ｄとの結合点を示し、かつ、
波線は、Ａｂとの結合点を示す）、
Ｄは、下記式（ＩＩ）の薬物部分であり：
【化３】
0006567551.tif 000272
（式中、
Ｒ１は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ２は、基：（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）またはチアゾリルであり、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
Ａは、下記であり：
式−Ｈｅｔ−Ａｌｋ−の基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基であり、かつ、ＮＲ３に連結され、Ｈｅｔは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、かつ、少なくとも１つの窒素原子を含有する複素環であり、前記窒素原子はＬに連結されている、または
式−Ａａ−Ａｂ−の基、ここで、ＡａはＬに連結され、かつ、ＯまたはＮＲ９であり、ここで、Ｒ９はＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＡｂはＮＲ３に連結され、かつ、
・（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ａ１（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２）ａ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ３）ａ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ４）ａ４ＣＨ２ＣＨ２−基、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ互いに独立してＯまたはＮＲ８を表し、ａ１、ａ２、ａ３およびａ４はそれぞれ互いに独立して０または１を表し、かつ、Ｒ８はＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表す、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイルまたは複素環−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、前記基は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、アリールまたは複素環部分はＡａに連結され、かつ、（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル部分はＮＲ３に連結され、
波線は、Ｌとの結合点を示す）、かつ
ｎは、１〜１２である］。
【請求項２】
本発明による前記［標的］抗体もしくは抗原抗体の［標的］もしくは抗原、またはその［標的］もしくは抗原結合フラグメントがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、Ａｘｌおよびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項３】
本発明による前記［標的］抗体もしくは抗原抗体の前記［標的］もしくは抗原、またはその［標的］もしくは抗原結合フラグメントが、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒおよびタンパク質Ａｘｌ、およびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項４】
前記Ａｂが、
ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択される、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項５】
前記Ａｂが、
ｉ）配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項６】
Ａｂが、
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ここで、該配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、ならびに
ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ここで、該配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、
を含んでなる、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項７】
前記Ａｂが、
ｉ）配列番号５９、６０および６１の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号５６、５７および５８の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）Ａｘｌとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＡｘｌのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトタンパク質Ａｘｌと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項８】
前記ＡｂがトラスツズマブからなるヒトＨＥＲ２と結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗体−薬物複合体。    
【請求項９】
Ｌ２が下記式である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体：
【化４】
0006567551.tif 000273
（式中、
アスタリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し、かつ、
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す）。
【請求項１０】
ｗ＝０、またはｗ＝２、かつ（Ｗ）ｗが下記から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体：
【化５】
0006567551.tif 000274
（式中、
アスタリスクは（Ｙ）ｙとの結合点を示し、かつ、
波線は、Ｌ２との結合点を示す）。
【請求項１１】
Ｌが下記から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体：
【化６】
0006567551.tif 000275
（式中、アスタリスクはＤとの結合点を示し、かつ、波線はＡｂとの結合点を示す）。
【請求項１２】
Ａが式−Ａａ−Ａｂ−の基であり、ここでＡａは請求項１に定義される通りであり、かつＡｂは下記基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体：
−フェニル−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、または
−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、該複素環は、１または２個の窒素原子を含んでなる５または６員を有する飽和、不飽和または芳香環である。
【請求項１３】
Ａが下記式の基である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体：
【化７】
0006567551.tif 000276
（式中、
Ｒ９は請求項１に定義される通りであり、ｍは１〜８の間を含む整数であり、
波線は、Ｌとの結合点を示し、かつ、
アスタリスクは、ＮＲ３との結合点を示す）。
【請求項１４】
（Ｌ−Ｄ）が下記から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体：
【化８】
0006567551.tif 000277
0006567551.tif 000278
0006567551.tif 000279
0006567551.tif 000280
（式中、波線は、Ａｂとの結合点を示す）。
【請求項１５】
下記から選択される式およびその薬学的に許容可能な塩を有する、請求項１に記載の抗体−薬物複合体：
【化９】
0006567551.tif 000281
0006567551.tif 000282
0006567551.tif 000283
0006567551.tif 000284
（式中、Ａｂは、［標的］抗体もしくは抗原抗体、またはその［標的］結合フラグメントもしくはその抗原結合フラグメントである）。
【請求項１６】
前記［標的］抗体の［標的］もしくは前記抗原抗体の抗原、またはその前記［標的］結合フラグメントもしくはその抗原結合フラグメントが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、Ａｘｌおよびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される、請求項１５に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項１７】
前記［標的］抗体の［標的］または前記抗原抗体の抗原がＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒおよびタンパク質Ａｘｌから選択される、請求項１５に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項１８】
前記Ａｂが抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、かつ下記から選択される、請求項１５に記載の抗体−薬物複合体：
ａ）下記から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント：
ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体、
ｂ）下記から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント：
ｉ）配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体、
ｃ）下記を含んでなるＡｂ：
ｉ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、ここで、該配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、ならびに
ｉｉ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、ここで、該配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、
ｄ）下記から選択されるヒトタンパク質Ａｘｌと結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント：
ｉ）配列番号５９、６０および６１の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号５６、５７および５８の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）Ａｘｌとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＡｘｌのエピトープと結合する抗体、ならびに
ｅ）トラスツズマブまたはペルツズマブからなるヒトＨＥＲ２と結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
ｎが２である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項２０】
ｎが４である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体−薬物複合体。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体−薬物複合体を含んでなる、組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでなる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
［標的］または抗原発現癌の処置において使用するための、該［標的］または抗原が、好ましくはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、Ａｘｌおよびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＨＥＲ２−、ＩＧＦ−１Ｒ−またはＡｘｌ−発現癌の処置において使用するための、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記［標的］または抗原発現癌が、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、中皮腫、口腔扁平上皮癌、カポジ肉腫、急性白血病、結腸直腸癌、黒色腫、膵管腺癌および任意の薬剤耐性癌から選択される癌である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、抗体−薬物複合体に関する。１つの側面から、本発明は、標的と結合し得る抗体を含んでなる抗体−薬物複合体に関し、前記抗体は、ドラスタチン１０の誘導体およびアウリスタチンから選択される少なくとも１種類の薬物とコンジュゲートされている。本発明はまた、癌の処置のための処置方法および前記抗体−薬物複合体の使用も含んでなる。
【０００２】
背景技術
本発明は、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）または複合体および癌の処置のためのその使用に関する。
【０００３】
ＡＤＣは、抗体の結合特異性と例えば細胞傷害性薬剤などの薬物の効力を組み合わせたものである。モノクローナル抗体の開発、より有効な薬物の使用およびこれらの成分と共有結合する化学リンカーの設計に関連する技術が、近年、急速に進んできた。
【０００４】
ＡＤＣの使用は、複合体を形成してない薬物として投与された際に、正常な細胞に許容されないレベルの毒性をもたらし得る薬物の局所送達を可能とする。
【０００５】
すなわち、それにより最小の毒性で最大の有効性が求められる。ＡＤＣを設計および精密化するための努力は、抗体の選択性ならびに薬物の作用機序、薬物の架橋、薬物／抗体比（負荷量またはＤＡＲ）、および薬物放出特性に焦点が当てられてきた。薬物部分は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、プロテアソーム、リボソーム機能の障害、タンパク質合成および／またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によってそれらの細胞傷害性および細胞増殖抑制作用を付与し得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体とコンジュゲートされると不活性または低活性となる傾向がある。
【０００６】
各抗体は別々に特性決定されなければならず、適当なリンカーが設計されなければならず、また腫瘍細胞へ送達された際にその効力を保持する好適な細胞傷害性薬剤が同定されなければならない。癌標的上の抗原の濃度および正常組織がその標的抗原を発現するかどうかを考慮しなければならない。他の考慮すべき点としては、標的と結合した際にＡＤＣ全体が内部移行されるかどうか、正常組織暴露の可能性ならびに／または処置される癌のタイプおよびステージを考慮する場合に細胞増殖抑制薬剤または細胞傷害性薬剤が好ましいかどうか、ならびに抗体と薬物弾頭を接続するリンカーが切断可能な結合か切断不能な結合かが含まれる。さらに、抗体と薬物成分とのコンジュゲーション比は、抗体の結合活性および／または薬物の効力を損なわず、かつ、ＡＤＣの物理化学的特性を変化させて凝集またはその化合物の以降の開発工程に関して有害な特性を生じることのない十分なものでなければならない。
【０００７】
ＡＤＣは複雑な生体分子であり、有効なＡＤＣを開発する挑戦には大きな問題が残っている。
【発明の概要】
【０００８】
第１の側面において、本発明は、下記式（Ｉ）の抗体−薬物複合体またはその薬学的に許容可能な塩を対象とする：
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｎ
（Ｉ）
［式中、
Ａｂは、［標的］抗体もしくは抗原抗体、またはその［標的］結合フラグメントもしくはその抗原結合フラグメントであり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、下記式（ＩＩ）の薬物部分であり：
【化１】
0006567551.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ２は、基：（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）またはチアゾリルであり、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
Ａは、下記であり：
式−Ｈｅｔ−Ａｌｋ−の基、ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基であり、かつ、ＮＲ３に連結され、Ｈｅｔは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、かつ、少なくとも１つの窒素原子を含有する複素環であり、前記窒素原子はＬに連結されている）、または
式−Ａａ−Ａｂ−の基、ここで、ＡａはＬに連結され、かつ、ＯまたはＮＲ９であり、ここで、Ｒ９はＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであり、ＡｂはＮＲ３に連結され、かつ、
・（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ａ１（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２）ａ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ３）ａ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ４）ａ４ＣＨ２ＣＨ２−基、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ互いに独立してＯまたはＮＲ８を表し、ａ１、ａ２、ａ３およびａ４はそれぞれ互いに独立して０または１を表し、かつ、Ｒ８はＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基を表す、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイルまたは複素環−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、前記基は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、アリールまたは複素環部分はＡａに連結され、かつ、（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル部分はＮＲ３に連結され、
波線は、Ｌとの結合点を示す）、かつ、
ｎは、１〜１２である］。
【０００９】
１つの実施態様では、本発明は、本発明による前記［標的］抗体もしくは抗原抗体の［標的］もしくは抗原、またはその［標的］もしくは抗原結合フラグメントがＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、Ａｘｌおよびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１０】
１つの実施態様では、本発明は、本発明による前記［標的］抗体もしくは抗原抗体の前記［標的］もしくは抗原、またはその［標的］もしくは抗原結合フラグメントが、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒおよびタンパク質Ａｘｌ、好ましくは、ヒトＨＥＲ２、ヒトＩＧＦ−１Ｒおよびヒトタンパク質Ａｘｌ、およびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１１】
１つの実施態様では、本発明は、前記Ａｂが、
ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択される、ヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１２】
１つの実施態様では、本発明は、前記Ａｂが、
ｉ）配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１３】
１つの実施態様では、本発明は、前記Ａｂが、
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、ならびに
ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、
を含んでなる抗体である、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１４】
１つの実施態様では、本発明は、前記Ａｂが、
ｉ）配列番号５９、６０および６１の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号５６、５７および５８の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）Ａｘｌとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＡｘｌのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトタンパク質Ａｘｌと結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、本発明による抗体−薬物複合体関する。
【００１５】
１つの実施態様では、本発明は、前記Ａｂが特にトラスツズマブからなるヒトＨＥＲ２と結合し得る抗体、またはその抗原結合フラグメントである、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１６】
１つの実施態様では、本発明は、Ｌが下記式（ＩＩＩ）：
【化２】
0006567551.tif 000003
のリンカーであり、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニルであり、
Ｗは、アミノ酸単位であり、ｗは、０〜５の間を含んでなる整数であり、
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
【化３】
0006567551.tif 000004
であり、ｙは、０または１であり、
アスタリスクは、Ｄとの結合点を示し、かつ、
波線は、Ａｂとの結合点を示す、
本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１７】
１つの実施態様では、本発明は、Ｌ２が下記式：
【化４】
0006567551.tif 000005
のものであり、式中、
アスタリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し、かつ、
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す、
本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１８】
１つの実施態様では、本発明は、
ｗ＝０、またはｗ＝２そしてかつ、（Ｗ）ｗが
【化５】
0006567551.tif 000006
から選択され、式中、
アスタリスクは（Ｙ）ｙとの結合点を示し、かつ、
波線は、Ｌ２との結合点を示す、
本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００１９】
１つの実施態様では、本発明は、Ｌが
【化６】
0006567551.tif 000007
から選択され、式中、アスタリスクはＤとの結合点を示し、かつ、波線はＡｂとの結合点を示す、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００２０】
１つの実施態様では、本発明は、Ａが式−Ａａ−Ａｂ−の基であり、式中、Ａａは請求項１に定義される通りであり、かつ、Ａｂは基：
フェニル−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、または
（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、前記複素環は、１または２個の窒素原子を含んでなる５または６員を有する飽和、不飽和または芳香環であり、特に、ピリジン、ピペリジンおよびイミダゾールの中から選択され、好ましくはピリジンである、本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明は、Ａが下記式：
【化７】
0006567551.tif 000008
の基であり、式中、
Ｒ９は請求項１に定義される通りであり、ｍは１〜８の間を含んでなる整数であり、好ましくは、Ｒ９＝ＨまたはＭｅおよびｍ＝１または２であり、
波線は、Ｌとの結合点を示し、かつ、
アスタリスクは、ＮＲ３との結合点を示す、
本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００２２】
１つの実施態様では、本発明は、（Ｌ−Ｄ）が
【化８】
0006567551.tif 000009
0006567551.tif 000010
0006567551.tif 000011
から選択され、式中、
波線は、Ａｂとの結合点を示す、
本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００２３】
別の実施態様では、本発明は、
【化９】
0006567551.tif 000012
0006567551.tif 000013
0006567551.tif 000014
0006567551.tif 000015
およびその薬学的に許容可能な塩から選択される式を有し、
式中、Ａｂは、［標的］抗体もしくは抗原抗体、またはその［標的］結合フラグメントもしくはその抗原結合フラグメントである、
本発明による抗体−薬物複合体に関する。
【００２４】
１つの実施態様において、本発明によれば、前記Ａｂは、［標的］抗体もしくは抗原抗体、またはその［標的］結合フラグメントもしくはその抗原結合フラグメントであり、前記［標的］または抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、Ａｘｌおよびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される。
【００２５】
１つの実施態様において、本発明によれば、前記Ａｂは、［標的］抗体もしくは抗原抗体、またはその［標的］もしくは抗原結合フラグメントであり、前記［標的］または抗原は、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒおよびタンパク質Ａｘｌ、好ましくは、ヒトＨＥＲ２、ヒトＩＧＦ−１Ｒおよびヒトタンパク質Ａｘｌ、およびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントから選択される。
【００２６】
１つの実施態様において、本発明によれば、前記Ａｂは抗体、またはその抗原結合フラグメントであり、
ａ）
ｉ）抗体２０８Ｆ２、２１２Ａ１１、２１４Ｆ８、２１９Ｄ６および２１３Ｂ１０、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント、
ｂ）
ｉ）配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトＩＧＦ−１Ｒと結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント、
ｃ）
ｉ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、ならびに
ｉｉ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、
を含んでなるＡｂ、
ｄ）
ｉ）配列番号５９、６０および６１の配列の３つの重鎖ＣＤＲと配列番号５６、５７および５８の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｉｉ）Ａｘｌとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、ならびに
ｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＡｘｌのエピトープと結合する抗体
から選択されるヒトタンパク質Ａｘｌと結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント、ならびに
ｅ）好ましくはトラスツズマブまたはペルツズマブからなるヒトＨＥＲ２と結合し得るＡｂ、またはその抗原結合フラグメント
から選択される。
【００２７】
１つの実施態様において、本発明によれば、ｎは２であるか、またはｎは４である。
【００２８】
別の実施態様では、本発明は、薬剤として使用するための本発明による抗体−薬物複合体を対象とする。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つの抗体−薬物複合体を含んでなる組成物を対象とする。
【００３０】
１つの実施態様では、本発明による組成物は、薬学的に許容可能なビヒクルをさらに含んでなる。
【００３１】
別の実施態様では、本発明は、［標的］発現癌または抗原発現癌の処置において使用するための、前記標的］または抗原が好ましくはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ、Ａｘｌおよびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）から、より好ましくは、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒおよびタンパク質、またより好ましくは、ヒトＨＥＲ２、ヒトＩＧＦ−１Ｒおよびヒトタンパク質Ａｘｌ、およびそれらの細胞膜外（ＥＣＤ）フラグメントからから選択される、本発明による組成物を対象とする。
【００３２】
１つの実施態様では、前記［標的］発現癌または前記抗原発現癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、中皮腫、口腔扁平上皮癌、カポジ肉腫、急性白血病、結腸直腸癌、黒色腫、膵管腺癌および任意の薬剤耐性癌から選択される癌である。
【００３３】
１つの実施態様では、本発明は、必要とする対象における［標的］発現癌または抗原発現癌の処置のための方法であって、前記対象に有効量の少なくとも１つの本発明による抗体−薬物複合体または本発明による組成物を投与することを含んでなる方法に関する。
【発明の具体的説明】
【００３４】
Ｉ−抗体(Ａｂ)
用語「抗体(antibody)」、「抗体（複数）(antibodies)」、「ａｂ」、「ＭＡｂ」または「免疫グロブリン」は、最も広義で互換的に使用され、それらが所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、単離された、操作された、または組換え型の抗体（例えば、全長または完全モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多価抗体または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）およびまたその抗体フラグメントが含まれる。
【００３５】
１つの実施態様では、本発明の抗体は組換え抗体からなる。用語「組換え抗体」は、生細胞内での組換えＤＮＡの発現から生じる抗体を意味する。本発明の組換え抗体は、生物学的有機体では見られないＤＮＡ配列を作り出す、当業者に周知の遺伝子組換えの実験法を使用することにより得られる。
【００３６】
別の実施態様では、本発明の抗体は、化学的に合成された抗体からなる。
【００３７】
より詳しくは、このような分子は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含んでなる糖タンパク質からなる。各重鎖は、重鎖可変領域（またはドメイン）（本発明ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含んでなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含んでなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本発明ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含んでなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含んでなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在した相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分できる。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００３８】
本発明による抗体の「抗原結合フラグメント」または「標的結合フラグメント」とは、抗体の標的（一般には抗原とも呼ばれる）と結合する能力を保持し、抗体のアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなる、いずれのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も示すものとする。
【００３９】
１つの実施態様では、このような「抗原結合フラグメント」は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃは一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメントもしくはダイアボディ、またはポリ（エチレン）グリコール（「ペグ化」）（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧまたはＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれるペグ化フラグメント）（「ＰＥＧ」はポリ（エチレン）グリコール）などのポリ（アルキレン）グリコールの添加などの化学修飾により、または本発明による抗体の特徴的ＣＤＲのうち少なくとも１つを有する前記フラグメントをリポソーム内に組み込むことによりその半減期が延長されている任意のフラグメントからなる群において選択される。好ましくは、前記「抗原結合フラグメント」は、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列から構成されるか、または含んでなり、前記部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性、および標的に対して十分な、好ましくは、それが由来する抗体の親和性の少なくとも１／１００、より好ましい様式では少なくとも１／１０に相当する親和性を保持するのに十分なものである。
【００４０】
「結合」、または「結合する」などとは、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定な、抗原との複合体を形成することが意図される。特異的結合は、少なくとも約１．１０−６Ｍの平衡解離定数を特徴とし得る。２分子が結合するかどうかを決定するための方法は当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、および放射性標識アッセイなどが挙げられる。疑念を避けるため、それは前記抗体が別の抗原と、低レベルで結合または干渉できないことを意味するものではない。しかしながら、１つの好ましい実施態様として、前記抗体は前記抗原のみと結合する。
【００４１】
本明細書において使用する場合、「［標的］抗体」という表現は、「抗［標的］抗体」と同様に解釈されるべきであり、［標的］と結合し得る抗体を意味する。
【００４２】
「標的」または［標的］という表現は、細胞、好ましくは、腫瘍細胞、より好ましくは、哺乳動物(mamals)およびヒト細胞の表面に存在し、かつ、薬物送達のために使用可能な任意の分子と解釈されるべきである。好ましくは、標的は、正常細胞と比較して腫瘍細胞の表面で特異的に発現するか、または過剰発現する。
【００４３】
より詳しくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１ＲまたはＡｘｌ(B.A. Teicher, Current Cancer Drug Targets, 2009, 9, 982-1004)から選択することができる。
【００４４】
好ましい標的としては、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１ＲおよびＡｘｌ、好ましくは、ヒトＨＥＲ２、ＩＧＦ−１ＲおよびＡｘｌを挙げることができる。
【００４５】
非限定例として、「ＨＥＲ２抗体」、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」または「Ａｘｌ抗体」という表現は、「抗ＨＥＲ２抗体」、「抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体」または「抗Ａｘｌ抗体」と同様に解釈されるべきであり、それぞれＨＥＲ２、ＩＧＦ−１ＲまたはＡｘｌと結合し得る抗体を意味する。
【００４６】
本出願では、抗体のエピトープは、優先的には、標的の細胞外ドメインに位置する。
【００４７】
特定の実施態様では、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、１０．１０−１０〜１×１０−１０の間、より優先的には８×１０−１０〜２×１０−１０の間を含むＥＣ５０で標的と結合し得る。
【００４８】
用語５０％有効濃度（ＥＣ５０）は、ベースラインと明示されたある暴露時間後の最大値の半分の応答を誘導する薬物、抗体または毒物の濃度に対応する。それは薬物の効力の尺度として慣用されている。従って、漸増用量反応曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が見られる化合物の濃度を表す。素量的用量反応曲線のＥＣ５０は、明示された暴露期間の後に集団の５０％が応答を示す化合物の濃度を表す。濃度尺度は一般に、比較的小さな濃度変化で急激に増加するシグモイド曲線を描く。これはベストフィットラインの導出により数学的に決定できる。
【００４９】
好ましい実施態様として、本発明で決定されたＥＣ５０は、ヒト腫瘍細胞上に露出している標的ＥＣＤに結合する抗体の効力を特徴付ける。ＥＣ５０パラメーターは、ＦＡＣＳ分析を用いて決定される。ＥＣ５０パラメーターは、ヒト腫瘍細胞上で発現されるヒト標的上で最大結合の５０％が得られる抗体濃度を表す。各ＥＣ５０値は、４パラメーター回帰曲線フィッティングプログラム（Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて用量反応曲線の中点として計算された。このパラメーターは生理学的／病理学的状態を代表するように選択された。
【００５０】
用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域である。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまたコンフォメーション的でもあり得、すなわち、非直鎖アミノ酸から構成される。特定の実施態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの化学的に活性な表面分子群である決定基を含み得、特定の実施態様では、特定の三次元構造特徴、および／または特定の変化特徴を有し得る。
【００５１】
標的との結合に関する競合は、限定されるものではないが、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれの方法または技術によっても決定可能である。「標的との結合に関して競合する」とは、少なくとも２０％、優先的には少なくとも５０％、より優先的には少なくとも７０％の競合を意味する。
【００５２】
同じエピトープへの結合の決定は、限定されるものではないが、例では、放射能、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーなどの当業者に公知のいずれの方法または技術によっても決定可能である。「標的の同じエピトープに結合する」とは、少なくとも２０％、優先的には少なくとも５０％、より優先的には少なくとも７０％に競合を意味する。
【００５３】
上述のように、一般的知識に反して、本発明は、それらの標的との結合後に高い内部移行能を示す特定の抗体に着目する。本明細書で使用される場合、「内部移行される」または「内部移行された」抗体（これらの２つの表現は同様である）は、哺乳動物細胞上の標的に結合した際に細胞により取り込まれる（それが入ることを意味する）ものである。このような抗体はＡＤＣの一部として着目され、従って、それは連結された細胞傷害剤を標的癌細胞にアドレス指定する。ひと度、内部移行されると、細胞傷害剤は癌細胞の死滅を誘導する。
【００５４】
ＡＤＣ療法で成功するための重要な鍵は、標的抗原の特異性と抗原−抗体複合体の癌細胞への内部移行であると思われる。明らかに内部移行しない抗原は内部移行する抗原よりも細胞傷害性薬剤送達効果が低い。内部移行プロセスは抗原によって異なり、抗体により影響を受け得る複数のパラメーターに依存する。
【００５５】
ＡＤＣでは、細胞傷害剤が細胞傷害活性を付与し、使用する抗体が癌細胞に対する特異性、ならびに細胞傷害剤を適正にアドレス指定するよう細胞内に入れるためのベクターを担う。従って、ＡＤＣを改善するために、抗体は標的癌細胞への高い内部移行能を示さなければならない。抗体により媒介される内部移行の効率は、標的とされるエピトープによって有意に異なる。強力な内部移行性抗体の選択には、標的のダウンレギュレーションだけではなく、抗体の細胞への浸透を研究する様々な実験データが必要である。
【００５６】
好ましい実施態様では、本発明による抗体の内部移行は、免疫蛍光もしくはＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）（本出願の下記に例示される通り）または内部移行機構に特異的な当業者に知られている任意の方法もしくはプロセスによって評価することができる。好ましい実施態様では、本発明による抗体は、標的との結合後に少なくとも３０％、優先的には５０％およびより優先的には８０％の内部移行を誘導し得る。
【００５７】
複合体標的／抗体は、前記標的のＥＣＤへの抗体の結合の後に内部移行され、細胞表面の標的量の減少が誘導される。この減少は当業者に公知のいずれかの方法（ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫蛍光など）によって定量することができる。
【００５８】
複合体ＩＧＦ−１Ｒ／抗体は、前記ＩＧＦ−１ＲのＥＣＤへの抗体の結合の後に内部移行され、細胞表面のＩＧＦ−１Ｒ量の減少が誘導される。この減少は、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、および免疫蛍光などの当業者に公知のいずれかの方法によって定量することができる。
【００５９】
非限定例として、このΔは、ｉ）本明細書に記載の抗体との４時間のインキュベーション後の癌細胞、例えばＭＣＦ７などと、ｉｉ）Ａｌｅｘａ４８８で標識された二次抗体を用い、非処理細胞および抗体で処理した細胞で得られたＭＦＩに基づいて決定される。このパラメーターは、下記式：Δ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）で算出される通りに定義される。他の実施態様は、下記の例で詳説する。
【００６０】
ＭＦＩは細胞表面で発現されるＩＧＦ−１Ｒに比例するので、このＭＦＩ間の差異は、ＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションを反映する。
【００６１】
有利な側面において、本抗体は、一例として、ＭＣＦ−７などの癌細胞上でΔ（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）を惹起する少なくとも２８０、好ましくは少なくとも４００の抗体からなる。
【００６２】
より詳細には、上述のΔは下記の過程に従って測定することができ、それは例示的な非限定例と見なされるべきである：
ａ）対象とする腫瘍細胞を低温（４℃）または温かい（３７℃）完全培養培地中、本発明の抗体で処理し、インキュベートすること、
ｂ）工程ａ）の処理細胞および並行して非処理細胞を二次抗体で処理すること、
ｃ）本発明の抗体と結合し得る二次標的抗体で処理した細胞および非処理の細胞のＭＦＩを測定すること（表面に存在するＩＧＦ−１Ｒの量を代表する）、および
ｄ）Δを非処理細胞で得られたＭＦＩから処理細胞で得られたＭＦＩの減算として計算すること。
【００６３】
このΔＭＦＩから、内部移行パーセンテージ：
１００×（ＭＦＩ４℃−ＭＦＩ３７℃）／ＭＦＩ  ４℃
を求めることができる。
【００６４】
本発明による抗体は、好ましくは、５０％〜９９％、７０％〜９０％、優先的には７５％〜８７％の間を含む内部移行パーセンテージで存在する。
【００６５】
本明細書に記載の抗体の特定の利点は、それらの内部移行速度に頼る。
【００６６】
ＡＤＣの場合、使用する抗体は急速な、好ましくは、抗体の投与から２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、一層より好ましくは６時間以内の内部移行速度を示すことが望ましいことが一般に知られている。
【００６７】
本発明では、細胞表面結合抗体減少または細胞表面抗体減衰とも呼ばれる内部移行率はｔ１／２（半減期）として表され、ΔＭＦＩの５０％の低下を得るために必要な時間に相当する（この側面は、下記の例に関して明確に理解される）。
【００６８】
特定の利点は、本発明の抗体は、５〜２５分の間、優先的には１０〜２０分の間を含むｔ１／２を有する。
【００６９】
以下の明細書では、２つの好ましい標的を例示する。
【００７０】
これらの２つの好ましい標的については、「本発明による抗体」、または「本発明の抗体」とは、それぞれ「本発明によるＡＤＣの抗体」または「本発明のＡＤＣの抗体」と理解されなければならない。
【００７１】
Ｉ．１：ＩＧＦ−１Ｒ抗体
本発明の特定の実施態様は、抗体Ａｂが配列番号２の配列のＣＤＲ−Ｈ２を有する３つの重鎖ＣＤＲおよび配列番号３の配列のＣＤＲ−Ｈ３と、配列番号５の配列のＣＤＲ−Ｌ２を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなるＡＤＣに関する。
【００７２】
本発明の特定の実施態様は、抗体Ａｂが配列番号１、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲと、配列番号４、５および６の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなるＡＤＣに関する。
【００７３】
ＡＤＣの実施態様は、配列番号１、２および３の配列、または配列番号１、２および３と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列とを含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４、５および６の配列、または配列番号４、５および６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる抗体を含んでなる。
【００７４】
別の実施態様では、抗体、またはその任意の抗原結合フラグメントは、配列番号１、２および３の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲ、ならびに配列番号４、５および６の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる。
【００７５】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体であれ、鎖型であれ、または種であれ、可変ドメインを比較するために定義されている[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol, 27, 55-77 (2003)]。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は、常に同じ位置を持ち、例えば、システイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）などである。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域の標準的な画定（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域の標準的な画定：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８番、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５番およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７番を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（括弧内に示され、ドットで仕切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓ[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]と呼ばれる２Ｄグラフ、およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)]における３Ｄ構造において使用される。
【００７６】
本明細書に相反する記載がなければ、相補性決定領域またはＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義される免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。
【００７７】
ＣＤＲもやはりＫａｂａｔナンバリングシステム(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 第5版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,および後続版)に従って定義することができる。３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。ここで、用語ＣＤＲ（単数または複数）は、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対するその抗体の親和性を担うアミノ酸残基の大多数を含むこれらの領域の１以上もしくはさらには全体を示すために使用される。本出願の通読を簡単にするために、ＫａｂａｔによるＣＤＲは定義しない。しかしながら、ＩＭＧＴによるＣＤＲの定義を用いてＫａｂａｔによるＣＤＲを定義することは当業者には自明であろう。
【００７８】
本発明の意味において、核酸またはアミノ酸の２配列間の「同一性」または「同一性パーセンテージ」は、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは、純粋に統計学的なものであり、２配列間の差異はそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の比較は、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって慣例的に行われ、前記比較はセグメントにより、または「アラインメントウインドウ」を使用することによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカルホモロジーアルゴリズムの手段によるか、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法の手段によるか、またはこれらのアルゴリズムを用いるコンピューターソフトウエア（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または比較ソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）の手段によって行うことができる。
【００７９】
同一性パーセンテージは、２配列間、好ましくは２つの全配列の間でアミノ酸ヌクレオチドまたは残基 (the amino acid nucleotide or residue)が同一である位置の数を決定し、その同一の位置の数をアラインメントウインドウ内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて２配列間の同一性パーセンテージを得ることによって計算される。
【００８０】
例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlのサイトで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム、「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」(Tatusova et al, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol, 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特に、パラメーター「オープンギャップペナルティー」：５、および「エクステンションギャップペナルティー」：２に関して、選択されるマトリックスは、このプログラムによって提案される例えば「ＢＬＯＳＵＭ  ６２」マトリックスである）とともに使用し、比較する２配列間の同一性パーセンテージはこのプログラムによって直接計算される。
【００８１】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列に関して、好ましい例としては、参照配列、特定の改変、特に、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または延長を含有するものが含まれる。１以上の連続または非連続アミノ酸の置換の場合、置換アミノ酸が「等価な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「等価なアミノ酸」は、構造アミノ酸の１つに関しておそらく置換されるが、対応する抗体の、また、以下に定義される具体例の、生物活性を変更しないいずれのアミノ酸も示すものとする。
【００８２】
等価なアミノ酸は、それらが置換されるアミノ酸との構造的相同性か、または生成される可能性のある種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果かのいずれかに基づいて決定され得る。
【００８３】
限定されない例として、下記表１は、対応する改変抗体の生物活性に有意な改変をもたらさずに行えると思われる潜在的置換をまとめたものであり、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。
【００８４】
【表１】
0006567551.tif 000016
【００８５】
本発明の特定の側面は、抗体がインスリン受容体（ＩＲ）に結合しないというものである。この側面は、本明細書に記載の抗体はＩＲ、すなわち、インスリン代謝に悪影響を持たないので注目される。
【００８６】
本発明のＡＤＣの抗体のさらに別の有利な側面は、ヒトＩＧＦ−１Ｒにだけでなく、サルＩＧＦ−１Ｒにも、より詳しくはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒにも結合できるということである。この側面もまた、それが臨床試験に要される毒性評価を助けるので注目される。
【００８７】
さらに別の実施態様では、本発明のＡＤＣの抗体は、モノクローナル抗体からなる。
【００８８】
用語「モノクローナル抗体」または「Ｍａｂ」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質の抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、その集団の個々の抗体は、わずかな量で見られ得る潜在的な自然突然変異以外は同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられている。このようなモノクローナル抗体は、Ｂ細胞の単一のクローンまたはハイブリドーマにより生産され得る。モノクローナル抗体はまた、組換え型であってもよく、すなわち、タンパク質工学または化学合成によっても生産され得る。モノクローナル抗体はまた、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。加えて、一般に種々の決定基またはエピトープに対する種々の抗体を含むポリクローナル抗体の作製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対するものである。
【００８９】
モノクローナル抗体は、本明細書において、以降に記載されるものなどのマウス、キメラおよびヒト化抗体を含む。
【００９０】
抗体は好ましくは、微生物培養物の仏国コレクション（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、２５  Ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、フランス）に提出されたマウス起源のハイブリドーマに由来し、前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫マウス脾細胞／リンパ球と骨髄腫Ｓｐ  ２／Ｏ−Ａｇ  １４細胞株の細胞の融合βにより得られたものである。
【００９１】
１つの実施態様では、本発明のＡＤＣのＩＧＦ−１Ｒ抗体はマウス抗体からなり、従って、ｍ［抗体の名称］と呼ばれる。
【００９２】
１つの実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はキメラ抗体からなり、従って、ｃ［抗体の名称］と呼ばれる。
【００９３】
１つの実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体はヒト化抗体からなり、従って、ｈｚ［抗体の名称］と呼ばれる。
【００９４】
疑念を避けるため、以下の明細書において、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」および「［抗体の名称］という表現は同等であり、前記ＩＧＦ−１Ｒ抗体または前記「［抗体の名称］」のマウス型、キメラ型およびヒト化型を含む（相反する記載がない限り）。必要であれば、接頭辞ｍ−  （マウス）、ｃ−（キメラ）またはｈｚ−（ヒト化）が使用される。
【００９５】
より明確にするために、下記表２に好ましい抗体に関してＩＭＧＴに従って定義されるＣＤＲ配列を示す。
【００９６】
【表２】
0006567551.tif 000017
【００９７】
上記のような６つのＣＤＲのいずれの組合せも本発明の一部と見なされるべきであることは当業者には自明であろう。
【００９８】
この表２から見て取ることができるように、本明細書に記載の抗体は総て、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ２に関して同じ配列を有し、この特性は上記のように特に注目される。
【００９９】
特定の側面は、マウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とするマウス抗体に関する。
【０１００】
別の特定の側面は、マウスとは異種の、特にヒトの抗体に由来する軽鎖および重鎖定常領域も含んでなることを特徴とするキメラ（ｃ）抗体に関する。
【０１０１】
キメラ抗体は、所与の種の抗体に由来する天然可変領域（軽鎖および重鎖）を前記の所与の種とは異種の抗体の軽鎖および重鎖の定常領域と組み合わせて含有するものである。
【０１０２】
キメラ抗体は、組換え遺伝子の技術を使用することにより製造され得る。例えば、キメラ抗体は、プロモーターおよび非ヒト、特にマウスの本発明のＡＤＣのモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列および異種、好ましくは、ヒトの抗体定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることにより製造することができる。１つのこのような組換え遺伝子によりコードされている本発明によるＡＤＣのキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであり得、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域により決定され、そのアイソタイプは、ヒトＤＮＡに由来する定常領域により決定される。
【０１０３】
限定されるものではないが、好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１０、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１２の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１０４】
「配列番号１３〜１７と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの重鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）外の配列番号１３〜１７の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１０５】
限定されるものではないが、別の好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｂ）配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｃ）配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、
ｄ）配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、ならびに
ｅ）配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１０６】
「配列番号１８〜２２と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの軽鎖ＣＤＲを示す、および加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）外の配列番号１８〜２２の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１０７】
本発明の実施態様は、Ａｂが、
ａ）配列番号１３の配列または配列番号１３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１８の配列または配列番号１８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体、
ｂ）配列番号１４の配列または配列番号１４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号１９の配列または配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体、
ｃ）配列番号１５の配列または配列番号１５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２０の配列または配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体、
ｄ）配列番号１６の配列または配列番号１６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２１の配列または配列番号２１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体、ならびに
ｅ）配列番号１７の配列または配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号２２の配列または配列番号２２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗体
から選択される抗体であるＡＤＣに関する。
【０１０８】
本明細書に記載のキメラ抗体はまた定常ドメインによっても特徴付けることができ、より詳しくは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの前記キメラ抗体が選択または設計され得る。より好ましくは、本発明に関して、前記キメラ抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【０１０９】
本発明の実施態様は、Ａｂが、形式ＩｇＧ１において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるキメラ抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記キメラ抗体は、配列番号４３の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１１０】
本発明の実施態様は、Ａｂが、形式ＩｇＧ４において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるキメラ抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記キメラ抗体は、配列番号４４の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１１１】
限定されるものではないが、別の好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号２３の配列または配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２８の配列または配列番号２８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体、
ｂ）配列番号２４の配列または配列番号２４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号２９の配列または配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体、
ｃ）配列番号２５の配列または配列番号２５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３０の配列または配列番号３０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体、
ｄ）配列番号２６の配列または配列番号２６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３１の配列または配列番号３１と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体、ならびに
ｅ）配列番号２７の配列または配列番号２７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３２の配列または配列番号３２と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなるまたはからなる抗体
から選択される。
【０１１２】
より明確にするために、下記表３に好ましいキメラ抗体に関してそれぞれＶＨおよびＶＬの配列を示す。
【０１１３】
【表３】
0006567551.tif 000018
【０１１４】
本発明のさらに別の特定の側面は、Ａｂが、ヒト抗体に由来する軽鎖および重鎖の定常領域がそれぞれλまたはκ領域およびγ−１、γ−２またはγ−４領域であることを特徴とするヒト化抗体である、ＡＤＣに関する。
【０１１５】
「ヒト化抗体」は、非ヒト起源の抗体に由来するＣＤＲ領域を含み、抗体分子の他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体に由来する抗体を意味する。加えて、骨格セグメント残基（ＦＲと呼ばれる）の一部を、結合親和性を保持するように改変することができる。
【０１１６】
ヒト化抗体またはそのフラグメントは、当業者に公知の技術によって作製することができる。このようなヒト化抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける予防的および／または治療的処置を含む方法におけるそれらの使用に好ましい。ＰＤＬにより特許ＥＰ０４５１２１６、ＥＰ０６８２０４０、ＥＰ０９３９１２７、ＥＰ０５６６６４７またはＵＳ５，５３０，１０１、ＵＳ６，１８０，３７０、ＵＳ５，５８５，０８９およびＵＳ５，６９３，７６１に記載されている例えば、「ＣＤＲグラフト」技術などの他のヒト化技術もまた当業者に公知である。米国特許第５，６３９，６４１号または同第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号および同第５，８７７，２９３号も引用することができる。
【０１１７】
本発明の特定の実施態様として、以下の実施例においてより詳しく解説されるように、本明細書ではｈｚ２０８Ｆ２からなる抗体が記載される。このようなヒト化は、本発明の他の抗体部分にも当てはまり得る。
【０１１８】
好ましい実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、
ｉｉ）ヒト生殖系列ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖系列ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４
を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。
【０１１９】
好ましい実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、
ｉ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、
ｉｉ）ヒト生殖系列ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３と、
ｉｉｉ）ヒト生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４
を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなる。
【０１２０】
限定されるものではないが、本発明の好ましい実施態様では、ＡＤＣの抗体は、
ａ）それぞれ配列番号７、２および３の配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３と、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号４６）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖系列ＩＧＨＪ４＊０１（配列番号４８）に由来するＦＲ４とを有する重鎖と、
ｂ）それぞれ配列番号９、５および１１の配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３と、ヒト生殖系列ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号４７）に由来するＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、ならびにヒト生殖系列ＩＧＫＪ４＊０１（配列番号４９）に由来するＦＲ４とを有する軽鎖
を含んでなる。
【０１２１】
１つの実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる。前記ヒト化抗体は、以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体１」または「Ｖａｒ．１」）と呼ぶ。
【０１２２】
別の実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる。
【０１２３】
「復帰突然変異（”back-mutation” or “back mutation”)」という表現は、生殖系列中に存在するヒト残基の突然変異またはマウス配列に元々存在する対応する残基のよる置換を意味する。
【０１２４】
別の実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなり、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の復帰突然変異を含んでなる。
【０１２５】
より明確にするために、下記表４に好ましい復帰突然変示す。
【０１２６】
【表４】
0006567551.tif 000019
【０１２７】
１つの実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる。
【０１２８】
１つの実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される２、３、４、５、６、７または８の復帰突然変異を含んでなる。
【０１２９】
別の実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号３３の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、前記配列番号３３の配列は、残基２０、３４、３５、３８、４８、５０、５９、６１、６２、７０、７２、７４、７６、７７、７９、８２または９５から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる、と、
ｂ）配列番号３５の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、前記配列番号３５の配列は、残基２２、５３、５５、６５、７１、７２、７７または８７から選択される少なくとも１つの復帰突然変異を含んでなる
とを含んでなる。
【０１３０】
より明確にするために、下記表５に好ましい復帰突然変示す。
【０１３１】
【表５】
0006567551.tif 000020
【０１３２】
このような実施態様では、本発明によるＡＤＣの抗体は、上述の復帰突然変異の総てを含んでなり、配列番号３４の配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号３６の配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる抗体に相当する。前記ヒト化抗体を以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体３」または「Ｖａｒ．３」）と呼ぶ。
【０１３３】
別の実施態様では、変異体１〜変異体３の間を含むヒト化型もまた本発明により包含される。言い換えれば、本発明によるＡＤＣの抗体は、配列番号４１の「コンセンサス」配列の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号４２の「コンセンサス」配列の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなる抗体に相当する。前記ヒト化抗体を以下、ｈｚ２０８Ｆ２（「変異体２」または「Ｖａｒ．２」）と呼ぶ。
【０１３４】
限定されるものではないが、好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号３３の配列または配列番号３３と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、または
ｂ）配列番号３４の配列または配列番号３４と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号９、５および１１の配列の３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１３５】
「配列番号３３または３４と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号１、２および３の３つの重鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号１、２および３）外の配列番号３３または３４の全長配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１３６】
限定されるものではないが、好ましい実施態様では、本発明のＡＤＣの抗体は、
ａ）配列番号３５の配列または配列番号３５と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体、ならびに
ｂ）配列番号３６の配列または配列番号３６と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号７、２および３の配列の３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる抗体
から選択される。
【０１３７】
「配列番号３５または３６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」とは、配列番号４、５および６の３つの軽鎖ＣＤＲを示し、加えて、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号４、５および６）外の全長配列番号３５の配列または３６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１３８】
本明細書に記載のヒト化抗体はまた定常ドメインによっても特徴付けることができ、より詳しくは、限定されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥなどの前記ヒト化抗体が選択または設計され得る。より好ましくは、本発明に関して、前記ヒト化抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【０１３９】
本発明の実施態様は、Ａｂが、形式ＩｇＧ１において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるヒト化抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、配列番号４３の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１４０】
本発明の実施態様は、Ａｂが、形式ＩｇＧ４において上記されているような可変ドメインＶＨおよびＶＬを含んでなるヒト化抗体であるＡＤＣに関する。より好ましくは、前記ヒト化抗体は、配列番号４４の配列のＶＨの定常ドメインと、配列番号４５の配列のＶＬのＫａｐｐａドメインとを含んでなる。
【０１４１】
本発明のさら別の実施態様は、Ａｂが、
ａ）配列番号３７の配列または配列番号３７と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号３９の配列または配列番号３９と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列軽鎖とを含んでなる抗体、ならびに
ｂ）配列番号３８の配列または配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の重鎖と、配列番号４０の配列または配列番号４０と少なくとも８０％の同一性を示す任意の配列の軽鎖とを含んでなる抗体
から選択される抗体であるＡＤＣに関する。
【０１４２】
より明確にするために、下記表６にヒト化抗体ｈｚ２０８Ｆ２の変異体１（Ｖａｒ．１）および変異体３（Ｖａｒ．３）に関するＶＨおよびＶＬの配列の非限定例を示す。それはまた、変異体２（Ｖａｒ．２）のコンセンサス配列も含んでなる。
【０１４３】
【表６】
0006567551.tif 000021
【０１４４】
本発明の別の側面は、Ａｂが、ｉ）それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６もしくはＩ−４７７４により産生された抗体、ｉｉ）ＩＧＦ−１Ｒとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープと結合する抗体から選択される抗体であるＡＤＣである。
【０１４５】
それぞれ２０１３年５月３０日、２０１３年６月２６日、２０１３年６月２６日、２０１３年４月２４日および２０１３年６月２６日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４７５７、Ｉ−４７７３、Ｉ−４７７５、Ｉ−４７３６およびＩ−４７７４から選択されるマウスハイブリドーマが本明細書に記載される。
【０１４６】
また、本発明による、抗体をコードする単離された核酸、またはその抗原結合フラグメントも記載される。
【０１４７】
本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核配列」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有するまたは含有しない核酸のフラグメントまたは領域を定義し、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドの厳密な配列を意味する。
【０１４８】
本発明のＡＤＣの抗体の核酸配列は単離および／または精製されており、すなわち、それらは例えば複製により直接的または間接的にサンプリングされたものであり、それらの環境は少なくとも部分的に改変されている。組換え遺伝学により、例えば宿主細胞の手段により得られた、または化学合成により得られた単離された核酸もまた本明細書に記載されるべきである。
【０１４９】
また、本発明による、本発明のＡＤＣの抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含んでなるベクターも記載される。
【０１５０】
特に、このようなヌクレオチド配列を得る標的クローニングおよび／または発現ベクターも記載される。
【０１５１】
ベクターは好ましくは、所与の宿主細胞においてヌクレオチド配列の発現および／または分泌を可能とするエレメントを含む。従って、ベクターは、プロモーター、翻訳開始および終結シグナル、ならびに好適な転写調節領域を含み得る。ベクターは宿主細胞内で安定に維持可能でなければならず、場合により、翻訳されたタンパク質の分泌を指定する特異的シグナルを有してよい。これらの種々のエレメントは使用する宿主細胞に応じて当業者により選択および最適化される。この目的で、ヌクレオチド配列は、選択された宿主内でまたは自己複製するベクターに挿入できるか、または選択された宿主の組み込みベクターであり得る。
【０１５２】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルス起源のベクターである。ベクターは本発明のヌクレオチド配列をクローニングまたは発現するよう宿主細胞を形質転換させるために使用される。
【０１５３】
このようなベクターは当業者により一般に使用される方法によって作製され、得られたクローンは、リポフェクション、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、熱ショックまたは化学法などの標準的方法により好適な宿主に導入することができる。
【０１５４】
また、上記のベクターによりされた、または上記のベクターを含んでなる単離された宿主細胞も開示される。
【０１５５】
宿主細胞は、細菌細胞などの原核生物系または真核生物系、例えば、また、酵母細胞または動物細胞、特に哺乳動物細胞（ヒトを除く）などの中から選択され得る。昆虫または植物細胞も使用可能である。
【０１５６】
また、本発明による抗体またはその抗原結合フラグメントの製造のための方法も開示され、前記方法は、以下の工程：
ａ）培地中、上記に開示されるような宿主細胞に好適な培養条件での培養、および
ｂ）このようにして産生された抗体の、培養培地からまたは前記培養細胞からの回収
を含んでなることを特徴とする。
【０１５７】
形質転換細胞は、組換え抗体の生産方法で使用される。ベクターおよび／またはベクターにより形質転換された細胞を用いて組換え型の抗体を生産するための方法もまた本明細書に含まれる。好ましくは、上記のようなベクターにより形質転換された細胞は、前記抗体の発現および前記抗体の回収を可能とする条件下で培養される。
【０１５８】
既述のように、宿主細胞は、原核生物系または真核生物系の中から選択することができる。特に、このような原核生物系または真核生物系において分泌を促進するヌクレオチド配列を特定することができる。よって、このような配列を有する本発明によるベクターは、分泌される組換えタンパク質の製造に遊離に使用できる。実際に、対象とするこれらの組換えタンパク質の精製は、それらのタンパク質が宿主細胞内部ではなく細胞培養の上清中に存在するという事実により容易となる。
【０１５９】
本発明のＡＤＣの抗体はまた、化学合成によって作製することもできる。このような１つの作製方法もまた、本発明の目的である。当業者は、固相技術または部分的固相技術、フラグメントの縮合による、または溶液中での従来合成によるなどの化学合成のための方法を知っている。化学合成により得られた、また対応する非天然アミノ酸を含有し得るポリペプチドも本発明に含まれる。
【０１６０】
上記の方法により得られる可能性のある抗体を含んでなるＡＤＣもまた、本発明に含まれる。
【０１６１】
特定の側面によれば、本発明は、Ａｂが、宿主標的部位に細胞傷害性薬剤を送達するためのアドレッシングビヒクルとして使用するための上記の抗体またはその抗原結合フラグメントである、ＡＤＣに関し、前記宿主標的部位は、ＩＧＦ−１Ｒ、好ましくは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン、より好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（配列番号５０）、いっそうより好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（配列番号５１）に、いっそうより好ましくは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインのＮ末端（配列番号５２）、またはその任意の天然変異体配列に局在するエピトープからなる。
【０１６２】
好ましい実施態様では、前記宿主標的部位は、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞、より好ましくは、天然にまたは遺伝子組換えの方法によりＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞の標的部位である。
【０１６３】
Ｉ．２：Ａｘｌ抗体
相反することが示されない限り、段落「Ｉ．１、ＩＧＦ−１Ｒ抗体」で使用および定義される定義または表現は、本段落でも同じであり、本発明のＡＤＣの総てに適用できる。
【０１６４】
Ａｘｌ抗体は、ヒトタンパク質Ａｘｌと結合し得る。より詳しくは、前記標的は、Ａｘｌの細胞外ドメイン（「Ａｘｌ細胞外ドメイン」を表すＡｘｌ  ＥＣＤと呼称される）に位置するエピトープである。
【０１６５】
Ａｘｌ  ＥＣＤは、配列番号１０３の配列のアミノ酸１〜４５１に相当する４５１アミノ酸のフラグメントであり、その配列は配列番号１０５として配列表に表される。アミノ酸１〜２５はシグナルペプチドに相当し、シグナルペプチドを含まないヒトタンパク質ＡｘｌのＥＣＤは、配列番号１０６の配列により表される配列番号１０４の配列のアミノ酸２６〜４５１に相当する。
【０１６６】
本発明のＡＤＣ(yhe ADC)のＡｘｌ抗体は、配列番号５６、５７および５８の配列、または配列番号５６、５７および５８と少なくとも９０％、好ましくは、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号５９、６０および６１の配列、または配列番号５９、６０および６１と少なくとも９０％、好ましくは、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１６７】
１つの実施態様では、Ａｘｌ抗体は、配列番号５６、５７および５８の配列をそれぞれ含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号５９、６０および６１の配列をそれぞれ含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１６８】
１つの実施態様では、Ａｘｌ抗体は、ｉ）配列番号６２の配列、または配列番号６２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン、および／またはｉｉ）配列番号６３の配列、または配列番号６３と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなるｍ１６１３Ｆ１２からなる。
【０１６９】
より明確にするために、下記表７ａにＡｘｌ抗体に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる。
【０１７０】
【表７】
0006567551.tif 000022
【０１７１】
１つの実施態様では、Ａｘｌ抗体は、配列番号５６、５７および５８の配列、または配列番号５６、５７および５８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号５９、６０および６１の配列、または配列番号５９、６０および６１と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなるｃ１６１３Ｆ１２からなる。
【０１７２】
１つの実施態様では、ｃ１６１３Ｆ１２は、配列番号５６、５７および５８の配列をそれぞれ含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号５９、６０および６１の配列をそれぞれ含んでなる３つの重鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１７３】
１つの実施態様では、Ａｘｌ抗体は、ｉ）配列番号６２の配列、または配列番号６２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメイン、および／またはｉｉ）配列番号６３の配列、または配列番号６３と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインを含んでなるｃ１６１３Ｆ１２からなる。
【０１７４】
１つの実施態様では、Ａｘｌ抗体は、配列番号５６、５７および５８の配列、または配列番号５６、５７および５８と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲ、および配列番号５９、６０および６１の配列を含んでなる３つの重鎖ＣＤＲ、または配列番号５９、６０および６１と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列を含んでなるｈｚ１６１３Ｆ１２からなる。
【０１７５】
１つの実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号５６、５７および５８の配列をそれぞれ含んでなる３つの軽鎖ＣＤＲと、配列番号５９、６０および６１の配列をそれぞれ含んでなる３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる。
【０１７６】
１つの実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号７０の配列、または配列番号７０と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列からなる軽鎖可変ドメインと、配列番号５９、６０および６１の配列からなる３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる。
【０１７７】
本発明の別の実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号７１〜８１からなる群において選択される配列、または配列番号７１〜８１と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号５９、６０および６１からなる３つの重鎖ＣＤＲを含んでなる。
【０１７８】
以上に定義された同一性パーセンテージを示すために、「配列番号７０〜８１と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」により、３つの軽鎖ＣＤＲ配列番号５６、５７および５８を示し、および加えて配列番号７０〜８１の全長配列と、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号５６、５７および５８）外で少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１７９】
より明確にするために、下記表７ｂに本発明のＡＤＣのヒト化Ａｘｌ抗体軽鎖（ＶＬ）に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（ここで、ｈｚ．＝ヒト化）。
【０１８０】
【表８】
0006567551.tif 000023
【０１８１】
１つの実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号８２の配列、または配列番号８２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列からなる重鎖可変ドメインと、配列番号５６、５７および５８の配列からなる３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでなる。
【０１８２】
別の実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号８３〜１０２からなる群において選択される配列、または配列番号８３〜１０２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインと、配列番号５６、５７および５８からなる３つの軽鎖ＣＤＲを含んでなる。
【０１８３】
以上に定義された同一性パーセンテージを示すために、「配列番号８２〜１０２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列」により、３つの重鎖ＣＤＲ配列番号５９、６０および６１を示し、および加えて配列番号８２〜１０２の全長配列と、ＣＤＲに相当する配列（すなわち、配列番号５９、６０および６１）外で少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す配列を表すものとする。
【０１８４】
より明確にするために、下記表７ｃに本発明のヒト化抗原結合タンパク質重鎖（ＶＨ）に相当する種々のアミノ酸配列をまとめる（ここで、ｈｚ．＝ヒト化）。
【０１８５】
【表９】
0006567551.tif 000024
【０１８６】
１つの実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号７０からなる群において選択される配列および配列番号７０と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８２からなる群において選択される配列および配列番号８２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【０１８７】
１つの実施態様では、ｈｚ１６１３Ｆ１２は、配列番号７１〜８１からなる群において選択される配列、または配列番号７１〜８１と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の軽鎖可変ドメインと、配列番号８３〜１０２からなる群において選択される配列、または配列番号８３〜１０２と少なくとも８０％、好ましくは、８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示す任意の配列の重鎖可変ドメインとを含んでなる。
【０１８８】
本発明の別の側面は、Ａｂが、ｉ）２０１１年７月２８日にＣＮＣＭ、パスツール研究所、フランスに寄託されたハイブリドーマＩ−４５０５により産生された抗体、ｉｉ）Ａｘｌとの結合に関してｉ）の抗体と競合する抗体、またはｉｉｉ）ｉ）の抗体と同じＡｘｌのエピトープと結合する抗体から選択される抗体であるＡＤＣである。
【０１８９】
別の側面によれば、ハイブリドーマＩ−４５０５から選択されるマウスハイブリドーマが開示される。
【０１９０】
下記表８に１６１３Ｆ１２のＣＤＲに関するヌクレオチド配列をまとめる。
【０１９１】
【表１０】
0006567551.tif 000025
【０１９２】
１つの実施態様では、ＣＤＲの核酸配列は、配列番号６４〜６９の配列から選択され得る。
【０１９３】
非限定的実施態様では、抗体をコードする単離された核酸またはその組合せが本明細書で開示され、前記核酸またはその組合せは配列番号６４〜６９の配列の６つのＣＤＲを含んでなることを特徴とする。
【０１９４】
Ｉ．３：ＨＥＲ２抗体
ＨＥＲ２抗体は、限定されるものではないが、ＴｒａｓＧＥＸ（グリコトープ）、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはその任意のバイオシミラーなどの、ＨＥＲ２と結合し得るいずれの抗体からなってもよい。
【０１９５】
好ましい実施態様では、ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標）、４Ｄ５、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、サンフランシスコ、ＣＡ）である。
【０１９６】
ＩＩ−薬物（Ｄ）
本発明による薬物部分は下記式（ＩＩ）
【化１０】
0006567551.tif 000026
を有し、式中、
Ｒ１は、ＨまたはＯＨであり、
Ｒ２は、基：（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、メチル）、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）（例えば、ＣＯＯＭｅ）またはチアゾリル（例えば、チアゾール−２−イル）であり、
Ｒ３は、Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基（例えば、メチル）、特に、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
Ａは、
式−Ｈｅｔ−Ａｌｋ−の基（ここで、Ａｌｋは（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基であり、かつ、ＮＲ３に連結され、Ｈｅｔは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、かつ、少なくとも１つの窒素原子を含有する複素環であり、前記窒素原子はＬに連結されている）、または
式−Ａａ−Ａｂ−の基（ここで、ＡａはＬに連結され、かつ、ＯまたはＮＲ９であり、ここで、Ｒ９はＨまたは（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、メチル）であり、ＡｂはＮＲ３に連結され、かつ、
・（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基（例えば、−（ＣＨ２）ｍ−、ここで、ｍは１〜８の間を含んでなる）、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ａ１（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２）ａ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ３）ａ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ４）ａ４ＣＨ２ＣＨ２−基、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ互いに独立してＯまたはＮＲ８を表し、ａ１、ａ２、ａ３およびａ４はそれぞれ互いに独立して０または１（特に、ここで、ａ１＋ａ２＋ａ３＋ａ４＝１または２、特に、１）を表し、かつ、Ｒ８はＨまたはａ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基（例えば、メチル）を表す、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイルまたは複素環−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、前記基は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、アリールまたは複素環部分はＡａに連結され、かつ、（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル部分はＮＲ３に連結されている
であり、
波線は、Ｌとの結合点を示す。
【０１９７】
ラジカルＲ２、Ｒ３およびＡはキラル基であり得、それらの異なる立体異性体の形態であってよく、場合により、立体異性体の混合物の形態であってよい。
【０１９８】
≪立体異性体≫は、本発明の意味において、幾何異性体または光学異性体を意味する。
【０１９９】
幾何異性体は二重結合上の置換基の位置の違いから生じ、従って、Ｚ配置またはＥ配置を有する。
【０２００】
光学異性体は、特に、４つの異なる置換基を含んでなる炭素原子上の置換基の空間の位置の違いから生じる。よって、この炭素原子はキラルまたは不斉中心を形成する。光学異性体は、ジアステレオ異性体および鏡像異性体を含んでなる。互いに鏡像であるが、重ね合わせることができない光学異性体は、≪鏡像異性体≫と呼ばれる。互いに重ね合わせることができる鏡像ではない光学異性体は、≪ジアステレオ異性体≫と呼ばれる。
【０２０１】
反対のキラリティーの２つの個々の鏡像異性体形態を等量含有する混合物は≪ラセミ混合物≫と呼ばれる。
【０２０２】
≪アルキル≫とは、本発明において、一価の直鎖または分岐型の飽和炭化水素鎖を意味する。例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシル基が挙げられる。
【０２０３】
≪Ｃｘ−Ｃｙ）アルキル≫とは、本発明の意味において、ｘ〜ｙ個の炭素原子を含んでなる、上記で定義されるものなどのアルキル鎖を意味する。よって、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有するアルキル鎖である。（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは有利には（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、好ましくは（Ｃ１−Ｃ２）アルキルである。
【０２０４】
≪アルカンジイル≫とは、本発明において、二価直鎖または分岐型の飽和炭化水素鎖を意味する。例えば、メタンジイル、エタンジイル、プロパンジイル、ブタンジイル、ペンタンジイル、およびヘキサンジイルなどが挙げられる。
【０２０５】
≪（Ｃｘ−Ｃｙ）アルカンジイル≫とは、本発明の意味において、ｘ〜ｙ個の炭素原子を含んでなる、上記で定義されるものなどのアルカンジイル鎖を意味する。従って、（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基は、１〜８個の炭素原子を有するアルカンジイル鎖である。
【０２０６】
≪アリール≫とは、本発明の意味において、好ましくは、６〜１０個の炭素原子を有し、かつ、１または２個の縮合環を含んでなり得る芳香族炭化水素基を意味する。例えば、フェニルまたはナフチルが挙げられる。有利には、それはフェニルである。
【０２０７】
≪複素環≫とは、本発明の意味において、１または２個の縮合環を有し、そこで、１以上、有利には１〜４個、より有利には１または２個の炭素原子がそれぞれ、酸素、窒素および硫黄の中から選択されるヘテロ原子で置換されている、飽和、不飽和または芳香族炭化水素基を意味する。有利には、複素環は、５〜１０個の炭素原子とヘテロ原子を含んでなる。例えば、フラン、ピロール、チオフェン、チアゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピリミジン、ピペラジン、ピペリジン、キナゾリン、キノリン、キノキサリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドリン、インドリジン、ベンゾチアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾピラン、ベンズオキサゾール、ベンゾ［１，３］ジオキソール、ベンゾイソキサゾール、ベンズイミダゾール、クロマン、クロメン、ジヒドロベンゾフラン、ジヒドロベンゾチオフェン、ジヒドロイソキサゾール、イソキノリン、ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジン、フロ［２，３−ｃ］ピリジン、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インデン、［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピリジン、ピロロ［１，２−ｃ］ピリミジン、ピロロ［１，２−ａ］ピリミジン、テトラヒドロナフタレンおよびベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジンが挙げられる。
【０２０８】
本発明において、複素環は、より詳しくは、１または２個の窒素原子を含んでなる５〜６員を有する飽和、不飽和または芳香環である。例えば、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピペラジンおよびピペリジン環が挙げられる。好ましくは、それはピリジン、ピペリジン、またはイミダゾールである。
【０２０９】
本発明の薬物部分のうち、１つの特に有価なクラスの薬物部分は、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２が（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基、例えば、メチルを表す式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
【０２１０】
別の特に有価なクラスの薬物部分は、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がチアゾリル（特に、チアゾール−２−イル基）である、式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
【０２１１】
別のクラスの特に有価な薬物部分は、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がＣＯＯ−（（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）基、例えば、ＣＯＯＭｅである、式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
【０２１２】
別のクラスの特に有価な薬物部分は、Ｒ１が水素であり、Ｒ２がＣＯＯＨ基である、式（ＩＩ）の薬物部分に相当する。
【０２１３】
本発明の１つの特定の実施態様によれば、Ｒ２はメチル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅまたはチアゾール−２−イル基である。
【０２１４】
よって、本発明の薬物部分は有利には、
・Ｒ１＝ＯＨおよびＲ２＝Ｍｅ（メチル）、または
・Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅまたはチアゾール−２−イル
である式（ＩＩ）の薬物部分である。
【０２１５】
好ましい実施態様によれば、Ｒ１＝ＨおよびＲ２＝ＣＯＯＨ、ＣＯＯＭｅまたはチアゾール−２−イル、好ましくは、Ｒ２＝ＣＯＯＨまたはＣＯＯＭｅ、より好ましくは、Ｒ２＝ＣＯＯＨである。
【０２１６】
Ｒ３は特に、Ｈまたはメチル基、有利にはメチル基を表す。
【０２１７】
好ましい実施態様では、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＣＯＯＨであり、Ｒ３はメチル基である。
【０２１８】
Ａの定義において、
・（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基は、有利には、（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル基、好ましくは、（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル基、より好ましくは、（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル基であり、特に、それは式−（ＣＨ２）ｍ−を有する直鎖であり、式中、ｍは１〜８の間、有利には１〜６の間、好ましくは１〜４の間を含んでなる整数であり、より好ましくは、ｍは１または２である、
・アリール基は、有利には、フェニル基である、かつ
・複素環は、有利には、１または２個の窒素原子を有する５または６員の飽和、不飽和または芳香環、例えば、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピペラジン、またはピペリジン環、好ましくは、ピリジン、ピペリジンまたはイミダゾール、より好ましくは、ピリジンである。
【０２１９】
Ａが式−Ｈｅｔ−Ａｌｋ−の基である場合、Ｈｅｔはより詳しくは、ピペリジンおよびイミダゾールの中から選択される複素環である。
【０２２０】
Ａは式−Ａａ−Ａｂ−の基であり、式中、Ａｂは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい複素環−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基であり、複素環はより詳しくはピリジンである。
【０２２１】
好ましい実施態様によれば、Ａは、上記で定義された式−Ａａ−Ａｂ−の基である。
【０２２２】
ＡａはＯまたはＮＲ９、好ましくはＮＲ９であり、ここで、Ｒ９は上記で定義された通りであり、好ましくは、Ｒ９＝ＨまたはＭｅである。
【０２２３】
本発明の特定の実施態様によれば、Ａｂは基：
・（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル、特に、（Ｃ２−Ｃ６）アルカンジイル（例えば、−（ＣＨ２）ｍ−、ここで、ｍは１〜６の間、好ましくは２〜６の間を含んでなる）、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ａ１（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２）ａ２ＣＨ２ＣＨ２−、ここで、ａ１＋ａ２は有利には１または２、特に１を表す、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル、または
・（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル
を表す。
【０２２４】
本発明の別の特定の実施態様によれば、Ａｂは基：
・（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル、特に、（Ｃ２−Ｃ４）アルカンジイル（例えば、−（ＣＨ２）ｍ−、ここで、ｍは１〜４の間を含んでなり、好ましくは２、３または４である）、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ＣＨ２ＣＨ２−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２）ＣＨ２ＣＨ２−、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル、または
・（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル
を表す。
【０２２５】
本発明の別の特定の実施態様によれば、Ａｂは基：
・（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル、特に、（Ｃ２−Ｃ４）アルカンジイル（例えば、−（ＣＨ２）ｍ−、ここで、ｍは１〜４の間を含んでなり、好ましくは２、３または４である）、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ＣＨ２ＣＨ２−、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、または
・（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル
を表す。
【０２２６】
別の特定の実施態様によれば、Ａｂは、
アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、
特に、アリール−（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル基、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル基、
有利には、アリール−（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル基、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル基、
好ましくは、アリール−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル基、または（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル
を表す。
【０２２７】
さらに別の特定の実施態様によれば、Ａｂは、アリール−（Ｃ１−Ｃ８）アルカンジイル基、特に、アリール−（Ｃ１−Ｃ６）アルカンジイル基、有利には、アリール−（Ｃ１−Ｃ４）アルカンジイル基、好ましくは、アリール−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル基である。
【０２２８】
Ａｂに関する上記の特定の実施態様では、アリール基は有利にはフェニル基である。
【０２２９】
Ａｂに関する上記の特定の実施態様では、複素環は有利には１または２個の窒素原子を有する５または６員の飽和、不飽和または芳香環である。例えば、ピロール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピペラジン、またはピペリジン環が挙げられる。好ましくは、それはピリジン、ピペリジンまたはイミダゾール、より好ましくは、それはピリジンである。
【０２３０】
有利には、Ａｂは基：
・フェニル−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、または
・（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよい（特に非置換型の）複素環−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル、前記複素環は、１または２個の窒素原子を含んでなる５または６員の飽和、不飽和または芳香環であり、特に、ピリジン、ピペリジンおよびイミダゾールの中から選択され、好ましくはピリジンである、
を表す。
【０２３１】
好ましい実施態様では、Ａｂは、フェニル−（Ｃ１−Ｃ２）アルカンジイル基である。
【０２３２】
好ましい実施態様によれば、Ａは、下記式：
【化１１】
0006567551.tif 000027
好ましくは下記式：
【化１２】
0006567551.tif 000028
を有し、式中、
Ｒ９およびｍは、従前に定義された通りであり、好ましくは、Ｒ９＝ＨまたはＭｅおよびｍ＝１または２であり、
波線は、Ｌとの結合点を示し、かつ、
アスタリスクは、ＮＲ３との結合点を示す。
【０２３３】
有利には、薬物部分は、下記の部分：
【化１３】
0006567551.tif 000029
0006567551.tif 000030
0006567551.tif 000031
0006567551.tif 000032
0006567551.tif 000033
0006567551.tif 000034
0006567551.tif 000035
0006567551.tif 000036
0006567551.tif 000037
0006567551.tif 000038
0006567551.tif 000039
0006567551.tif 000040
の中から選択される。
【０２３４】
（式ＤＨの）薬物の製造：
薬物は、必要であれば場合により、文献に記載のまたは当業者に周知の、または本明細書の実験の部の例に記載される任意の標準的操作を補って、下記の合成スキームに記載の一般法を用いて製造することができる。
【０２３５】
【化１４】
0006567551.tif 000041
スキーム１は、薬物を製造するために使用可能な第１の一般法を示す。上記一般式において、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は従前に定義されたものなどであり、Ｒ４は−ＡＨを表し、Ｒ４ａは、場合により保護型の、従前に定義されたものなどのＲ４基を表し、かつ、Ｇは保護基である。
【０２３６】
第１の工程は、そのアミン官能基上で保護基Ｇにより保護された化合物（ＩＩ）と化合物（ＩＩＩ）の縮合からなる。Ｘは、塩素などの脱離基を表し得る。この場合、この第１の工程は、酸塩化物とアミンの間の反応からなる。この反応は、当業者に周知の方法および技術を用いて行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの溶媒中、有機または無機塩基、例えば、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ピリジン、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３の存在下で反応させる。Ｘはまたヒドロキシル（ＯＨ）であってもよい。この場合、第１の工程は、カルボン酸（ＩＩ）とアミン（ＩＩＩ）の間の縮合反応である。この反応は、当業者に周知の方法および技術に従って行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンなどのカップリング剤、ジイソプロピルエチルアミンなどの第３級アミンの存在下で反応させる。別の特に有価な方法では、これら２つの実体を−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、トリエチルアミンなどの第３級アミンの存在下で反応させる。別の特に有価な方法は、−１５℃〜１００℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、第３級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下でこれら２つの実体を反応させることからなる。
【０２３７】
当業者に周知の技術(<< Protective Groups in Organic Synthesis >>, T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 and << Protecting Groups >>, P.J. Kocienski, Thieme Verlag, 1994)を用いた中間体の脱保護後に、化合物（ＩＶ）を上記の方法および技術に従って化合物（Ｖ）と縮合させると、脱保護工程後に化合物（ＶＩ）が得られる。この化合物を次に、中間体（ＶＩＩ）と縮合させ、任意選択の脱保護の後に薬物の形成に至り得る。化合物（ＶＩ）はまた、Ｒ’３がＲ３の前駆体、特に、保護基により保護されたＲ３基である化合物（ＶＩＩ’）とカップリングさせることもできる。カップリングおよびその後のＲ３を得るための基Ｒ’３の脱保護は従前に記載されたものと同じ手順に従って行うことができる。
【０２３８】
【化１５】
0006567551.tif 000042
スキーム２は、薬物を製造するために使用可能な第２の一般法を示す。上記一般式において、Ｇは保護基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４ａは従前に定義されたものなどであり、かつ、Ｒ４ｂは−Ａｃ−ＡａＨを表し、ここで、Ａａは従前に定義された通りであり、かつ、Ａｃは、を表し
・（Ｃ１−Ｃ７）アルカンジイル基、
・−（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ１）ａ１（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２）ａ２（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ３）ａ３（ＣＨ２ＣＨ２Ｘ４）ａ４ＣＨ２＊−基、ここで、アスタリスクでマークされたＣＨ２基はＲ４ｂＣＨＯのＣＨＯ基に連結されている、または
・アリールまたは複素環基、
・アリール−（Ｃ１−Ｃ７）アルカンジイルまたは複素環−（Ｃ１−Ｃ７）アルカンジイル基、前記基は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基で置換されていてもよく、（Ｃ１−Ｃ７）アルカンジイル部分はＲ４ｂＣＨＯのＣＨＯ基に連結されている。
【０２３９】
第１の工程において、そのアミン官能基上で保護基Ｇにより保護された化合物（ＩＸ）を化合物（ＶＩ）と縮合させる。Ｘは、脱離基、例えば、塩素を表し得る。この場合、第１の工程は、酸塩化物とアミンの間の反応からなる。この反応は、当業者に周知の方法および技術を用いて行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ＴＨＦ、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの溶媒中、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ピリジン、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３などの有機または無機塩基の存在下で反応させる。Ｘはまたヒドロキシルを表してもよい。この場合、第１の工程は、カルボン酸（ＩＸ）とアミン（ＶＩ）の間の縮合反応である。この反応は当業者に周知の方法および技術に従って行うことができる。１つの特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド（ＥＤＣ）、３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オン、第３級アミン、例えばジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させる。別の特に有価な方法では、これら２つの実体を、特に−１５℃〜４０℃の間の温度で、ジクロロメタンまたはＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中、ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ）、第３級アミン、例えばトリエチルアミンの存在下で反応させる。
【０２４０】
当業者に周知の技術を用いた中間体の脱保護の後、得られた化合物（ＶＩＩＩ）はＲ４Ｙとの反応の後に薬物となり得る。この場合、Ｙは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＳＯ２ＣＨ３、ＯＳＯ２ＣＦ３またはＯ−トシルなどの脱離基である。この反応は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの極性無水溶媒中、Ｅｔ３Ｎ、ｉＰｒ２ＮＥｔ、ＮａＨ、Ｃｓ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３などの有機または無機塩基の存在下で行われる。別の特に有価な方法では、化合物（ＶＩＩＩ）を、Ｒ４ｂがＲ４の前駆体に相当する式Ｒ４ｂ−ＣＨＯのアルデヒドと反応させる。この場合、この反応は、特に−２０℃〜１００℃の間の温度で、酢酸などの酸の添加により制御可能なｐＨにて、任意選択のチタンイソプロポキシド（ＩＶ）の存在下、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨなどの極性溶媒中、ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３などの還元剤の存在下での還元的アミノ化である。
【０２４１】
以上の合成スキームでは、薬物は、例えば、当業者に周知の方法を用いた鹸化などの付加的反応工程後に別の薬物となり得、それにより、エステル（ＣＯＯＭｅ）を表すＲ２基がカルボン酸（ＣＯＯＨ）を表すＲ２基に変化する。
【０２４２】
少なくとも１つの塩基官能基を含有する薬物を酸付加塩の状態で単離することが望まれる場合には、これは薬物の遊離塩基（少なくとも１つの塩基官能基を含有する）を好ましくは等量の好適な酸で処理することにより可能となる。好適な酸は特にトリフルオロ酢酸であり得る。
【０２４３】
ＩＩＩ−リンカー（Ｌ）
「リンカー」、「リンカー単位」、「Ｌ」または「連結」は、本発明において、共有結合を含んでなる化学部分または抗体を少なくとも１つの薬物に共有結合させる原子の鎖を意味する。
【０２４４】
リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、２，６−ジイソシアン酸トルエン）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）などの種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製され得る。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が、細胞傷害性薬剤とアドレス指定系のコンジュゲーションのための例示的キレート剤である。他の架橋試薬は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、およびスルホ−ＳＭＰＢ、ならびに（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ロックフォード、Ｉｌｌ．、Ｕ．Ｓ．Ａから）市販されているＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）であり得る。
【０２４５】
リンカーは、「切断不能」であっても、または「切断可能」であってもよい。
【０２４６】
好ましい実施態様では、リンカーは、細胞内での薬物の放出を助ける「切断可能なリンカー」からなる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが使用可能である。リンカーは、好ましい実施態様では、リンカーの切断が細胞内環境において抗体から薬物を放出するように、細胞内条件下で切断可能である。
【０２４７】
例えば、いくつかの実施態様では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断因子により切断可能である。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素（限定されるものではないが、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含む）により切断されるペプチジルリンカーであり得る。一般に、ペプチジルリンカーは、少なくとも２つの連続するアミノ酸もしくは少なくとも３つの連続するアミノ酸を含んでなるか、または少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断因子はカテプシンＢおよびＤおよびプラスミンを含むことができ、これらは総て、ジペプチド薬誘導体を加水分解して標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが知られている。例えば、癌組織で発現の高いチオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断可能なペプチジルリンカーが使用可能である（例えば、Ｐｈｅ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含んでなる、またはそのものであるリンカー）。特定の実施態様では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−ＣｉｔまたはＰｈｅ−Ｌｙｓを含んでなる、またはそのものである。薬物の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの１つの利点は、薬物がコンジュゲートされた場合には一般に減弱され、かつ、その複合体の血清安定性が一般に高いことである。
【０２４８】
他の実施態様では、切断可能なリンカーはｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性である。一般に、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、またはケタールなど）が使用できる。このようなリンカーは、血中などの中性ｐＨ条件下で比較的安定であるが、リソソームのおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０以下では不安定である。特定の実施態様では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して薬物と結合されているチオエーテル）である。
【０２４９】
さらに他の実施態様では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を用いて形成可能なものが含まれる。
【０２５０】
特定の好ましい実施態様では、リンカー単位は、下記一般式：
−（Ｔ）ａ−（Ｗ）ｗ−（Ｙ）ｙ−
を有してよく、式中、
Ｔは、延伸単位であり、
ａは、０または１であり、
Ｗは、アミノ酸単位であり、
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり、
Ｙは、スペーサー単位であり、
ｙは、０、１または２である。
【０２５１】
延伸単位（Ｔ）は、存在する場合、抗体を、存在する場合にアミノ酸単位（Ｗ）と、または存在する場合にスペーサー単位と、または直接的に薬物と連結する。天然にまたは化学的操作を介して抗体上に存在し得る有用な官能基としては、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマーヒドロキシル基、およびカルボキシルが含まれる。好適な官能基はスルフヒドリルおよびアミノである。スルフヒドリル基は、存在する場合、抗体の分子内ジスルフィド結合の還元により作製することができる。あるいは、スルフヒドリル基は、抗体のリシン部分のアミノ基と２−イミノチオランまたは他のスルフヒドリル生成試薬との反応により生成することもできる。特定の実施態様では、抗体は、１以上のリシンを有するように操作される。より好ましくは、抗体は、１以上のシステインを有するように操作することができる（ＴｈｉｏＭａｂｓ参照）。
【０２５２】
ある特定の実施態様では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と結合を形成する。硫黄原子は、還元型の抗体のスルフヒドリル（−ＳＨ）基に由来し得る。
【０２５３】
他のある特定の実施態様では、延伸単位は、抗体の硫黄原子と延伸単位の硫黄原子の間のジスルフィド結合を介して抗体に連結される。
【０２５４】
他の特定の実施態様では、延伸部の反応性基は、抗体のアミノ基に反応し得る反応性部位を含む。このアミノ基は、アルギニンまたはリシンのものであり得る。好適なアミン反応性部位としては、限定されるものではないが、活性化エステル（例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル）、無水物、酸塩化物、塩化スルホニル、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられる。
【０２５５】
さらに別の側面では、延伸部の反応性官能基は、抗体上に存在し得る修飾炭水化物基に反応性のある反応性部位を含む。特定の実施態様では、抗体は、炭水化物部分を提供するように酵素的にグリコシル化されているか、または天然にグリコシル化されている。炭水化物は過ヨウ素酸ナトリウムなどの試薬で温和に酸化されてもよく、結果として得られる酸化炭水化物のカルボニル単位は、ヒドラジド、オキシム、反応性アミン、ヒドラジン、チオセミカルバジド、カルボン酸ヒドラジン、またはアリールヒドラジドなどの官能基を含む延伸部と縮合させることができる。
【０２５６】
特定の実施態様によれば、延伸単位は下記式：
【化１６】
0006567551.tif 000043
を有し、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル（前記シクロアルキルまたはアルキル部分は、マレイミド部分の窒素原子に献血される）であり、
アスタリスクは、存在する場合にアミノ酸単位との、存在する場合にスペーサー単位との、または薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、抗体Ａｂとの結合点を示す。
【０２５７】
「（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル」は、本発明において、４〜１０個の炭素原子を有する炭化水素環を意味し、限定されるものではないが、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどが含まれる。
【０２５８】
Ｌ２は、有利には（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル、例えば、下記式：
【化１７】
0006567551.tif 000044
のペンチル−カルボニルであり得、式中、
アスタリスクは、存在する場合にアミノ酸単位、存在する場合にスペーサー単位、または薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す。
【０２５９】
アミノ酸単位（Ｗ）は、存在する場合、存在する場合に延伸単位（Ｔ）を連結し、またはそうでなければ、抗体を、スペーサー単位が存在する場合にスペーサー単位（Ｙ）に、もしくはスペーサー単位が存在しない場合には薬物に連結する。
【０２６０】
上述のように、（Ｗ）ｗは存在しないか（ｗ＝０）、またはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドもしくはドデカペプチド単位であり得、ここで、ペプチドを形成するアミノ酸は互いに異なり得る。
【０２６１】
よって、（Ｗ）ｗは、下記式：（Ｗ１）ｗ１（Ｗ２）ｗ２（Ｗ３）ｗ３（Ｗ４）ｗ４（Ｗ５）ｗ５により表すことができ、式中、各Ｗ１〜Ｗ５は互いに独立してアミノ酸単位を表し、各ｗ１〜ｗ５は０または１である。
【０２６２】
いくつかの実施態様では、アミノ酸単位（Ｗ）ｗは、天然に存在するものなどのアミノ酸残基、ならびにシトルリンなどの希少アミノ酸および非天然アミノ酸類似体を含んでなり得る。
【０２６３】
アミノ酸単位（Ｗ）ｗのアミノ酸残基としては、限定されるものではないが、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリン、アセチルまたはホルミルで保護されたまたは保護されていないリシン、アルギニン、トシルまたはニトロ基で保護されたまたは保護されていないアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチルまたはホルミルで保護されたオルニチン、およびシトルリンが挙げられる。例示的アミノ酸リンカー成分としては、好ましくは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドまたはペンタペプチド、特に、ジペプチドまたはトリペプチドが挙げられる。
【０２６４】
例示的ジペプチドとしては、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇが挙げられる。
【０２６５】
例示的トリペプチドとしては、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓが挙げられる。
【０２６６】
例示的テトラペプチドとしては、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号５３）、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号５４）が挙げられる。
【０２６７】
例示的ペンタペプチドとしては、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（配列番号５５）が挙げられる。
【０２６８】
特定の実施態様によれば、（Ｗ）ｗは、Ｖａｌ−Ｃｉｔなどのジペプチド（すなわち、ｗ＝２）であり得、またはリンカーはアミノ酸単位を欠いている（ｗ＝０）。リンカーがアミノ酸単位を欠く場合、好ましくは、それはスペーサー単位も欠く。
【０２６９】
好ましい実施態様によれば、ｗ＝０（すなわち、（Ｗ）ｗは一重結合である）またはｗ＝２（すなわち、（Ｗ）ｗはジペプチドである）および従って、（Ｗ）ｗは
【化１８】
0006567551.tif 000045
から選択することができ、特に、Ｖａｌ−Ｃｉｔであり、式中、
アスタリスクは、存在する場合にスペーサー単位との、または薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、Ｌ２との結合点を示す。
【０２７０】
アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。
【０２７１】
リンカーのアミノ酸単位は、限定されるものではないが、腫瘍関連プロテアーゼを含む酵素により酵素的に切断されて薬物を遊離し得る。
【０２７２】
アミノ酸単位は、特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に関するそれらの選択性において設計および最適化することができる。好適な単位は、その切断がプロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、ならびにプラスミンにより触媒されるものである。
【０２７３】
スペーサー単位（Ｙ）は、存在する場合、存在する場合にアミノ酸単位を、または存在する場合に延伸単位を、またはそうでなければ、抗体を薬物に連結する。スペーサー単位は、自壊的および非自壊的の２つの一般的タイプのものである。非自壊的スペーサー単位は、抗体−薬物複合体からのアミノ酸単位の酵素的切断後にそのスペーサー単位の一部または全部が薬物に結合して残るものである。非自壊的スペーサー単位の例としては、限定されるものではないが、（グリシン−グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が挙げられる。薬物を遊離させるためには、非依存的加水分解反応がグリシン−薬物単位の結合を切断するように標的細胞内で起こるべきである。
【０２７４】
特定の実施態様では、非自壊的スペーサー単位（Ｙ）はＧｌｙである。
【０２７５】
あるいは、自壊的スペーサー単位を含有する抗体−薬物複合体は、独立した加水分解工程の必要なく薬物を放出することができる。これらの実施態様では、（Ｙ）は、ＰＡＢ基の窒素原子を介して（Ｗ）ｗに連結され、かつ、エステル基、炭酸基、カルバミン酸基またはエーテル基を介して薬物に直接接続されたｐ−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）単位の残基である。
【０２７６】
自壊的スペーサーの他の例としては、限定されるものではないが、ＰＡＢ基と電気的に等価な芳香族化合物、例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体およびオルトまたはパラ−アミノベンジルアセタールの残基が挙げられる。スペーサーは、アミド結合の加水分解時に容易に環化を受けるもの、例えば、置換および非置換４−アミノ酪酸アミド、適宜置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミドが使用可能である。
【０２７７】
別の実施態様では、スペーサー単位は、分岐型のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）単位であり、これは付加的薬物を組み込むために使用可能である。
【０２７８】
特定の実施態様では、スペーサー単位（Ｙ）はＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは
【化１９】
0006567551.tif 000046
（ＰＡＢ単位の酸素は、カルボニルに連結されている）であり、かつ、ｙ＝１またはリンカーはスペーサー単位を欠いている（ｙ＝０）。
【０２７９】
特定の実施態様では、リンカーは下記式（ＩＩＩ）：
【化２０】
0006567551.tif 000047
を有し、式中、
Ｌ２は、（Ｃ４−Ｃ１０）シクロアルキル−カルボニル、（Ｃ２−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル（これらの部分のカルボニルは、存在する場合、（Ｗ）ｗに連結されている）であり、
Ｗは、アミノ酸単位を表し、ここで、ｗは、０〜５の間を含む整数を表し、
Ｙは、ＰＡＢ−カルボニルであり、ここで、ＰＡＢは、
【化２１】
0006567551.tif 000048
（ＰＡＢ単位の酸素は、カルボニルに連結されている）であり、かつ、ｙは０または１であり（好ましくは、ｗが０である場合、ｙは０であり、ｗが１〜５の間を含む場合、ｙは０または１である）、
アスタリスクは、薬物Ｄとの結合点を示し、かつ
波線は、抗体Ａｂとの結合点を示す。
【０２８０】
有利には、Ｌ２は、（Ｃ２−Ｃ６）アルキル−カルボニル、例えば、下記式：
【化２２】
0006567551.tif 000049
のペンチル−カルボニルであり、式中、
アスタリスクは、（Ｗ）ｗとの結合点を示し、かつ
波線は、マレイミド部分の窒素原子との結合点を示す。
【０２８１】
好ましい実施態様によれば、リンカーＬは、
【化２３】
0006567551.tif 000050
から選択され、式中、
アスタリスクは、薬物Ｄとの結合点を示し、かつ、波線は、抗体Ａｂとの結合点を示す。
【０２８２】
ＩＶ−抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）
好ましい実施態様では、本発明の抗体−薬物複合体は、例えば、限定されるものではないが、ｉ）抗体の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の薬物の求核基との反応、またはｉｉ）薬物の求核基と二価リンカー試薬との反応およびその後の抗体の求核基との反応など、当業者に公知のいずれの方法によって作製されてもよい。
【０２８３】
抗体上の求核基としては、限定されるものではないが、Ｎ末端アミン基、側鎖アミン基（例えば、リシン）、側鎖チオール基、および抗体がグリコシル化されている場合には糖のヒドロキシル基またはアミノ基が挙げられる。
【０２８４】
薬物上の求核基としては、限定されるものではないが、アミン、チオール、およびヒドロキシル基、好ましくは、アミン基が挙げられる。
【０２８５】
アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができ、限定されるものではないが、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハリド、アルキルおよびベンジルハリド、例えば、ハロアセトアミド、アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基が挙げられる。抗体は、還元可能な鎖内ジスルフィド、すなわち、システイン架橋を有してもよい。抗体は、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）などの還元剤での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性とすることができる。従って、各システイン架橋は理論上２つの反応性チオール求核部分を形成する。当業者に公知の任意の反応を介して抗体に付加的求核基を導入することができる。非限定例として、反応性チオール基は、１以上のシステイン残基を導入することにより抗体に導入され得る。
【０２８６】
抗体−薬物複合体はまた、リンカー試薬上の求核置換基と反応し得る求電子部分を導入するための抗体の修飾によっても作製され得る。グリコシル化抗体の糖を酸化してアルデヒドまたはケトン基を形成させてもよく、これはリンカー試薬または薬物のアミン基と反応し得る。生じたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成し得るか、または還元して安定なアミン結合を形成させてもよい。一実施態様では、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応はタンパク質中に、薬物上の適当な基と反応し得るカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基を生じ得る。別の実施態様では、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含有するタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応して、その結果、最初のアミノ酸に代わってアルデヒドの生成をもたらし得る。
【０２８７】
好ましい実施態様では、本発明の抗体−薬物複合体は、薬物−リンカー部分の形成とその後の抗体の求核基（例えば、システイン部分のＳＨ基）と薬物−リンカー部分の求電子基（例えば、マレイミド）との間のカップリングにより作製される。
【０２８８】
１．薬物−リンカー
薬物−リンカー部分は、
リンカーと薬物、
リンカーの合成が完了する前のリンカーの一部と薬物、
薬物の合成が完了する前のリンカーと薬物の一部または前駆体、または
リンカーおよび薬物の合成が完了する前のリンカーの一部と薬物の一部または前駆体
をカップリングすることにより作製され得る。
【０２８９】
カップリング反応は、求核基と求電子基の間の当業者に周知の反応である。
【０２９０】
求核基は特に、アミン、チオールまたはヒドロキシル基、特にアミンまたはヒドロキシル基であり得る。好ましい実施態様では、求核基は第１級または第２級アミン基である。
【０２９１】
求電子基は、場合により活性化形態のカルボン酸基（ＣＯＯＨ）、または活性化された炭酸エステル部分であり得る。
【０２９２】
カルボン酸の「活性化形態」とは、ＣＯＯＨ官能基のＯＨ部分が、アミド結合を形成して化合物ＬＧ−Ｈを放出するために活性化カルボン酸基とアミノ基のカップリングを可能とする活性化脱離基（ＬＧ）で置換されている、カルボン酸を意味する。活性化形態は、活性化エステル、活性化アミド、無水物またはアシルハリド、例えば、塩化アシルであり得る。活性化エステルとしては、カルボン酸基とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドの反応により形成される誘導体が含まれる。
【０２９３】
「活性化炭酸エステル」は、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ部分を含んでなる炭酸エステルを意味し、ここで、ＯＲは、カルバミン酸部分を形成して化合物ＲＯＨを放出するために活性化炭酸エステルとアミノ基のカップリングを可能とする良好な脱離基を表す。活性化炭酸エステルのＲ基としては、限定されるものではないが、ｐ−ニトロ−フェニル、ペンタフルオロフェニル、２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イルおよびベンジル基、好ましくはｐ−ニトロ−フェニルおよびペンタフルオロフェニル基が挙げられる。
【０２９４】
リンカーが下記式（ＩＩＩ）：
【化２４】
0006567551.tif 000051
を有する場合、薬物−リンカー部分は下記式（ＩＶ）：
【化２５】
0006567551.tif 000052
を有し、薬物−リンカー部分の合成の最終工程は一般に、下記式（Ｖ）：
【化２６】
0006567551.tif 000053
（式中、Ｌ２は従前に定義された通りであり、ＬＧは、脱離基、特に、ハリド、例えば、クロリドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドに由来する基を表す）
の化合物と下記式（ＶＩ）：
Ｈ−（Ｗ）ｗ−（Ｙ）ｙ−Ｄ    （ＶＩ）
（式中、ｙ＝１およびＹ＝ＰＡＢ−カルボニル）
の化合物の間のカップリングであり、式（ＶＩ）の化合物は、薬物（ＤＨ）と下記式（ＶＩＩ）の化合物、またはその保護形態：
Ｈ−（Ｗ）ｗ−ＰＡＢ−ＣＯ−ＯＲ    （ＶＩＩ）
（式中、Ｗおよびｗは従前に定義された通りであり、Ｒは、「活性化炭酸エステル」の定義に定義された通りである）
の間のカップリングにより作製され得る。
【０２９５】
式（ＶＩＩ）の化合物が保護形態である場合、脱保護の最終工程が必要である。
【０２９６】
ｙ＝０である場合、化合物（ＶＩ）は式Ｈ−（Ｗ）ｗ−Ｄを有し、式中、（Ｗ）ｗおよびＤはアミノ酸単位から構成される。結果として、化合物（ＶＩ）はこの場合、当業者に周知の従来のペプチド合成方法により作製され得る。
【０２９７】
２．Ａｂ−リンカー−薬物
本発明による好ましい実施態様は、抗体上に存在するシステインと薬物−リンカー部分の求電子基、好ましくは、薬物−リンカー部分上に存在するマレイミド部分との間のカップリングからなる。
【０２９８】
マレイミド−システインのカップリングは、当業者に周知の方法により行うことができる。
【０２９９】
一般に、抗体は、たとえあるとしても、薬物成分に連結可能な多くの遊離の反応性システインチオール基を含まない。抗体中のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在し、部分的または完全な還元条件下でジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤を用いて還元しなければならない。ＡＤＣの負荷量（薬物／抗体比）は、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）または抗体に対するリンカー試薬のモル過剰率の制限、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度の制限、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾に対する部分的還元条件または還元条件の制限を含む、いくつかの異なる方法で制御可能である。
【０３００】
ヒトＩｇＧのジスルフィド結合構造は、現在、非常に確立されている（Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23に総説）。実際に、４つのヒトＩｇＧサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のジスルフィド結合構造に関して、多くの類似性といつくかの相違がある。総てのＩｇＧサブクラスが常に１２の鎖内ジスルフィド架橋と、重鎖と軽鎖の間で形成されるそれらの鎖内ジスルフィド結合内に存在する相違を含む。各鎖内ジスルフィド結合は、個々のＩｇＧドメイン、すなわち、可変（ＶＬおよびＶＨ）および定常（ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）ドメインに関連する。２本の重鎖はそれらのヒンジ領域で様々な数：ＩｇＧ１およびＩｇＧ４では２つ、ＩｇＧ２では４つ、ＩｇＧ３では１１のジスルフィド架橋により連結されている。ＩｇＧ１の重鎖と軽鎖は軽鎖の最後のシステイン残基と重鎖の５番目の残基の間のジスルフィド結合により接続されているが、他のサブクラスＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４では、軽鎖は、軽鎖の最後のシステイン残基とＶＨドメインとＣＨ１ドメインの境界に存在する、重鎖の３番目のシステイン残基の間のジスルフィド結合により重鎖に連結されている。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４では、これらの古典的構造以外のジスルフィド結合構造が記載されている（Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23に総説）。鎖内ジスルフィド結合は溶媒露出性が高く、結果として、各ドメイン内で逆平行β−シート構造に埋もれて溶媒に曝されていない鎖内ジスルフィド結合よりもはるかに反応性が高い。これらの理由で、抗体のアイソタイプによらず、カップリングは、軽い還元の後に露出した鎖内システイン残基で起こる。従って、各鎖内ジスルフィド架橋は、理論上、２つのコンジュゲーション部位を形成し得る。
【０３０１】
付加的な求核基は、リシンと２−イミノチオラン（トロート試薬）との反応によるアミンのチオールへの変換を介して抗体に導入することができる。反応性チオール基はまた、１、２、３、４、またはそれを越えるシステイン残基を操作すること（例えば、１以上の非天然システインアミノ酸残基を含んでなる変異型抗体を作製すること）によって抗体（またはそのフラグメント）に導入してもよい。米国特許第７５２１５４１号は、反応性システインアミノ酸の導入による抗体の操作を教示している。
【０３０２】
システインアミノ酸は、抗体中の、鎖内または分子間ジスルフィド結合を形成しない反応性部位で操作し得る（Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932、 Dornan et al (2009) Blood 114(13):2721-2729、米国特許第７５２１５４１号、米国特許第７７２３４８５号、ＷＯ２００９／０５２２４９)。操作されたシステインチオールは、マレイミドまたはα−ハロアミドなどのチオール反応性求電子基を有する本発明のリンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応させて、システイン操作抗体と薬物部分を有するＡＤＣを形成することができる。従って、薬物成分の位置は設計、制御可能であり、既知である。操作されたシステインチオール基は一般に高収率でチオール反応性リンカー試薬または薬物−リンカー試薬と反応するので、薬物負荷量は制御可能である。重鎖または軽鎖上の単一部位における置換によるシステインアミノ酸の導入のためのＩｇＧ抗体の操作から、対称抗体上に２つの新たなシステインが得られる。ほぼ均質なコンジュゲーション産物ＡＤＣで、２に近い薬物負荷量が達成できる。
【０３０３】
抗体の２以上の求核基または求電子基が薬物−リンカー中間体、またはリンカー試薬次いで薬物成分試薬と反応する場合、得られる産物は、抗体と結合した一定の分布、例えば、１、２、３などの薬物部分を持ったＡＤＣ化合物の混合物である。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法で、混合物中の化合物を薬物負荷値によって分離することができる。単一薬物負荷値（ｐ）を有するＡＤＣの調製物は単離可能であるが、薬物部分はリンカーを介して抗体の異なる部位に結合されている可能性があるので、これらの単一薬物負荷値のＡＤＣはなお異質な混合物であり得る。
【０３０４】
一部の抗体−薬物複合体では、薬物比は抗体上の結合部位の数によって制限を受け得る。高い薬物負荷、例えば、薬物比＞５は、特定の抗体−薬物複合体の凝集、不溶性、毒性、または細胞透過性の低下を招く場合がある。一般には、コンジュゲーション反応では、理論的最大値より少ない薬物部分が抗体にコンジュゲートされる。
【０３０５】
薬物負荷量はまた薬物−抗体比（ＤＡＲ）とも呼ばれ、細胞結合剤当たりの薬物の平均数である。
【０３０６】
抗体ＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜８薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、および８つの薬物部分が抗体と共有結合される。
【０３０７】
抗体ＩｇＧ２アイソタイプの場合、部分的抗体還元の後に薬物がシステインに結合される場合、薬物負荷量は抗体当たり１〜１２薬物（Ｄ）の範囲であり得、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２の薬物部分が抗体と共有結合される。
【０３０８】
ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８または１〜１２の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
【０３０９】
コンジュゲーション反応からのＡＤＣの調製における抗体当たりの薬物の平均数は、ＵＶ、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、および電気泳動などの従来の手段によって特徴付けることができる。
【０３１０】
非限定実施態様として、本明細書では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｃ２０８Ｆ２とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号２８の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号２３の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される少なくとも１つのシステインとカップリングされる。
【０３１１】
非限定実施態様として、本明細書では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｃ２０８Ｆ２とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号２８の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号２３の配列の重鎖では、２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される２、３または４つのシステインとカップリングされる。
【０３１２】
非限定実施態様として、本明細書では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２（ａｒ．１）とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号３９の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号３７の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される少なくとも１つのシステインとカップリングされる。
【０３１３】
非限定実施態様として、本明細書では、ＩＧＦ−１Ｒ抗体ｈｚ２０８Ｆ２（ｖａｒ．３）とのコンジュゲーションが提供される。この場合、薬物は、ｉ）配列番号４０の配列の軽鎖では２１４番の残基Ｃｙｓ、およびｉｉ）配列番号３８の配列の重鎖では２２３、２２９および２３２番の残基Ｃｙｓから選択される２、３または４つのシステインとカップリングされる。
【０３１４】
同じアプローチが例えばＡｘｌ抗体などの他の抗体にも容易に適合できる。
【０３１５】
別の例はリシンカップリングからなる。抗体は、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬と反応しない、例えば、多数のリシン残基を含み得る。最も反応性の高いリシン基だけがアミン反応性リンカー試薬と反応し得る。また、最も反応性の高いシステインチオール基だけがチオール反応性リンカー試薬と反応し得る。
【０３１６】
本発明の化合物がリシンと結合される場合、薬物負荷量は細胞抗体当たり１〜８０薬物（Ｄ）の範囲であり得るが、上限は４０、２０、１０または８が好ましいものであり得る。ＡＤＣの組成物は、一定範囲の、１〜８０、１〜４０、１〜２０、１〜１０または１〜の薬物とコンジュゲートされた細胞結合剤、例えば抗体の集合体を含む。
【０３１７】
本発明による式（Ｉ）のＡＤＣは、薬学的に許容可能な塩の形態であり得る。
【０３１８】
本発明において、「薬学的に許容可能な」とは、一般に、安全、無毒で、生物学的もその他の点でも望ましくないものではなく、かつ、獣医学的使用ならびにヒト医薬的使用に許容可能な医薬組成物の作製に使用できるものを意味する。
【０３１９】
化合物の「薬学的に許容可能な塩」とは、本明細書で定義されるように薬学上許容可能であり、かつ、親化合物の所望の薬理活性を有する塩を意味する。
【０３２０】
薬学的に許容可能な塩は特に、下記を含んでなる：
（１）塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および類似の酸などの薬学的に許容可能な無機酸を伴って形成される、または酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ステアリン酸、乳酸および類似の酸などの薬学的に許容可能な有機酸を伴って形成される、薬学的に許容可能な酸の付加塩、ならびに
（２）親化合物中に存在する酸プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたはアルミニウムイオンのいずれかにより置換されている、またはリシン、アルギニンおよび類似のものなどの薬学的に許容可能な有機塩基、もしくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムおよび類似のものなどの薬学的に許容可能な無機塩基とともに配位している場合に形成される薬学的に許容可能な塩基の付加塩。
【０３２１】
これらの塩は、塩基または酸官能基を含有する本発明の化合物および対応する酸または塩基から、従来の化学法を用いて作製することができる。
【０３２２】
Ｖ−処置
最後に、本発明は、特に、癌の処置における薬剤として使用するための上記のＡＤＣに関する。
【０３２３】
本発明のさらなる主題は、特に、癌の処置のために医薬品として使用するための、上記で定義されるものなどの式（Ｉ）の化合物である。
【０３２４】
本発明はまた、特に癌の処置のために意図される医薬品を製造するための、上記で定義されるものなどの式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
【０３２５】
本発明はまた、癌を処置するための方法であって、それを必要とする人に有効量の上記で定義されるものなどの式（Ｉ）の化合物を投与することを含んでなる方法に関する。
【０３２６】
癌は好ましくは、それらの表面で標的の全部または一部を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含む標的関連癌から選択することができる。
【０３２７】
より詳しくは、前記癌は、乳癌、結腸癌、食道癌、肝細胞癌、胃癌、神経膠腫、肺癌、黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、横紋筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、神経鞘腫、神経芽腫、口腔扁平上皮癌、中皮腫、平滑筋肉腫、カポジ肉腫、急性白血病、結腸直腸癌、黒色腫、膵管腺癌および任意の薬物耐性現象または癌である。
【０３２８】
疑念を避けるため、薬物耐性抗体発現癌とは、元々抗体を発現する耐性癌だけなく、元々は抗体を発現または過剰発現しないが、それらがひと度従前の処置に対して耐性となった場合に抗体を発現する癌もそうであると理解されるべきである。
【０３２９】
本発明のもう１つの目的は、本明細書に記載のようなＡＤＣを含んでなる医薬組成物である。
【０３３０】
より詳しくは、本発明は、本発明のＡＤＣを少なくとも賦形剤および／または薬学的に許容可能なビヒクルを含んでなる医薬組成物に関する。
【０３３１】
本明細書において、「薬学的に許容可能なビヒクル」または「賦形剤」は、二次反応を誘発せずに医薬組成物中に入り、かつ、１または複数の有効化合物の投与の助長、内体でのその寿命および／またはその有効性の増強、溶液中でのその溶解度の増大またはその保存の改善を可能とする化合物または化合物の組合せを表すものとする。これらの薬学的に許容可能なビヒクルおよび賦形剤は周知であり、選択された１または複数の化合物の性質および投与様式の関数として当業者により適合される。
【０３３２】
有効成分は、従来の医薬担体との混合物として単位投与形で動物またはヒトに投与することができる。好適な単位投与形は、経口経路を介する形態および非経口経路（皮下、皮内の、筋肉内または静脈内）を介する投与形態を含んでなる。
【０３３３】
経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチン硬または軟カプセル）または顆粒の使用が可能である。これらの組成物では、本発明の有効成分は、アルゴン流中でデンプン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカなどの１以上の不活性希釈剤と混合する。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの１以上の滑沢剤、着色剤、コーティング剤（コーティング錠）またはワニスも含んでなり得る。
【０３３４】
非経口投与用の無菌組成物は、好ましくは、水性または非水性溶液、懸濁液またはエマルションであり得る。溶媒またはビヒクルとして、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、特に、オリーブ油、注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルまたは他の好適な有機溶媒の使用が可能である。これらの組成物は、アジュバント、特に、湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤および安定剤も含有してよい。滅菌は、例えば、除菌濾過、組成物への滅菌剤の配合、照射または加熱によるなどのいくつかの方法で行うことができる。それらはまた、使用時に無菌水または他の任意の注射用無菌媒体に溶かすことができる固体無菌組成物の形態で調製することもできる。
【０３３５】
好ましくは、これらのＡＤＣは、全身経路により、特に、静脈内経路により、筋肉内、皮内、腹腔内または皮下経路により、または経口経路により投与される。より好ましい様式では、本発明によるＡＤＣを含んでなる組成物は、連続的に数回投与される。
【０３３６】
本発明は、従って、また、少なくともｉ）本発明による抗体−薬物複合体、および／または本発明による医薬組成物と、ｉｉ）前記抗体−薬物複合体および／または医薬組成物が配分されているシリンジまたはバイアルまたはアンプルとを含んでなるキットにも関する。
【０３３７】
それらの投与様式、用量および最適な剤形は、例えば、患者の年齢または体重、患者の健康状態の重篤度、処置に対する忍容性および示される二次的影響など、患者に適合された処置の確立において一般に考慮される基準に従って決定することができる。
【０３３８】
本発明の他の特徴および利点は、実施例および判例が以下に表される図面とともに本明細書の続きで明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０３３９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合。図１Ａは、ＭＣＦ−７細胞株での力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図１Ｂは、ＭＣＦ−７細胞株でのマウスおよびキメラ両方の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図１Ｃは、ＭＣＦ−７細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＢｍａｘを表す。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ：トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞を用いたｈＩＧＦ−１Ｒ認識の評価。図２Ａ）は、ＩＧＦ−１Ｒ＋細胞株での１つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図２Ｂは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ−細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂ：トランスフェクト細胞を用いたＩＧＦ−１ＲとｈＩＲのＡｂの特異性の評価。図３Ａは、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株でのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。図３Ｂは、ＩＲ＋細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ  Ｍａｂ（Calbiochem）は陽性対照として導入された。
【図４】図４：ＩＭ−９細胞株でのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの結合。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。ＧＲＯ５抗ｈＩＲ  Ｍａｂは陽性対照として導入された。
【図５】図５Ａ〜５Ｃ：サルＩＧＦ−１Ｒの認識の評価。図５Ａは、ＣＯＳ−７細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの力価測定曲線を表す。ＭＦＩは、蛍光強度の平均を表す。図５Ｂは、ＣＯＳ−７細胞株でのマウスおよびキメラ両抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。図５Ｃは、ＮＩＨ  ３Ｔ３トランスフェクト細胞ｈＩＧＦ１Ｒ＋およびＣＯＳ−７の両細胞株でのキメラ抗ＩＧＦ１Ｒ抗体のＥＣ５０を表す。
【図６】図６：カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトされたマウス抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体１１０００ＲＵ超で活性化したＣＭ５センサーチップを用いたＳＰＲ技術に基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００で得られたセンサーグラム。実験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、２５℃にて３０μｌ／分の流速で行った。図は、分析の最初の注入の開始時にｘ軸上に、また、この最初の注入直前に定義されたベースラインによりｙ軸上に並べた４つの独立したセンサーグラムの重畳を示した。組換え可溶性ＩＧＦ１Ｒのヒトに基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを菱形で示す。組換え可溶性ＩＧＦ１Ｒのカニクイザル(cynomolgus)に基づく配列のキャプチャーで得られたセンサーグラムを三角で示す。白い記号はブランクサイクル（ランニングバッファーの５回の注入）に相当し、黒い記号は漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２（５、１０、２０、４０および８０ｎＭ）の注入に相当する。
【図７】図７：ＩＧＦ１と比較した場合の受容体リン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の固有の効果の評価。
【図８】図８：マウス抗ｈＩＧＦ−１ＲによるＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害。
【図９】図９：抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞表面シグナル強度は、３７℃での細胞インキュベーション後にダウンレギュレートされる。ＭＣＦ−７細胞を４℃または３７℃で４時間、１０μｇ／ｍｌのＡｂとともにインキュベートした。図は、をΔＭＦＩ表す。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂ：抗体表面減衰。細胞表面結合抗体を３７℃で１０、２０、３０、６０および１２０分後に評価した。図１０Ａは、４℃で測定したシグナル強度と比較した残留ＩＧＦ−１Ｒ％を表す。図１０Ｂは、Ｐｒｉｍｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用い、指数減衰フィッティングを用いた半減期計算を表す。
【図１１】図１１：抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂは内部移行される。細胞を１０μｇ／ｍｌのマウスＡｂとともに３７℃で０、３０または６０分間インキュベートした。細胞に透過処理を施し、または施さず、二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８とともにインキュベートした。膜は、シグナル強度ｗ／ｏ透過処理に相当する。全体は、細胞透過処理後のシグナル強度に相当し、細胞質は、内部移行したＡｂに相当する。各評価抗体の名称を各グラフの上に示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂ：Ａｂ内部移行の画像。図１２Ａ：ｍ２０８Ｆ２とともに４℃で２０分間インキュベートし、インキュベーション前（Ｗ）、３７℃で１５分（Ｘ）、３０分（Ｙ）および６０分（Ｚ）洗浄したＭＣＦ−７細胞。細胞を固定し透過処理を施した。ｍ２０８Ｆ２  Ａｂは抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ４８８を用いて、Ｌａｍｐ−１はウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体を二次抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ５５５とともに用いて可視化した。図１２Ｂ：ＭＣＦ−７細胞を３７℃で３０分間抗ｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体とともにインキュベートし、上記のように染色した。共局在化はＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在化ハイリター(highliter)プラグインを用いて確認した。
【図１３】図１３：抗体分解におけるリソソーム経路の関与。
【図１４】図１４：酸性ｐＨは５種類のマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合能を低下させる。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄ：ｃ２０８Ｆ２  Ｍａｂの第１のヒト化型の結合特徴。ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３  ｍＡｂの結合特性をヒト細胞株ＭＣＦ−７（Ａ）、サル細胞株ＣＯＳ−７（Ｂ）およびヒトインスリン受容体を発現するトランスフェクトマウス細胞株（Ｃ）で評価した。マウスおよびキメラの両２０８Ｆ２  ｍＡｂの結合を並行して評価した。トランスフェクト細胞株（Ｄ）でのｈＩＲの発現を確認するために抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用いた。
【図１６】図１６：ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３抗体表面減衰。
【図１７】図１７：両フローセルにて、流速３０μｌ／分でランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、カルボキシメチルデキストランマトリックスに化学的にグラフトした１２．０００ＲＵ前後のマウス抗ＴａｇＨｉｓモノクローナル抗体で活性化したＣＭ５センサーチップを用い、２５℃の温度でＳＰＲに基づくＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置で得られたセンサーグラムの重畳。各センサーグラム（第１のものを三角で示し、第２のものを菱形で示す）は全サイクルに相当する。  １−第２のフローセルでの組換えｈ−ＩＧＦ１Ｒ（１０μｇ／ｍｌ）の溶液の１分間の注入  ２−第１のセンサーグラムでは：各９０秒で５回のランニングバッファーの注入。  第２のセンサーグラムでは：各９０秒で漸増濃度範囲での抗ＩＧＦ１Ｒ  ｃ２０８Ｆ２抗体溶液の５回の注入  ３−解離動態速度の決定のための３００秒の減衰  ４−１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーの４５秒の注入による表面の再生
【図１８】図１８：漸増濃度範囲の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｃ２０８Ｆ２溶液で得られたセンサーグラムに対するブランクセンサーグラム（ＨＢＳ−ＥＰ＋の５回の注入）の減算に相当するセンサーグラムを灰色で示す。下記パラメーター：ｋｏｎ＝（１．２０６±０．０３６）×１０６Ｍ−１．ｓ−１、ｋｏｆｆ＝（７．８１±０．１８）×１０−５ｓ−１、Ｒｍａｘ＝３０７．６±０．３ＲＵを用いた１：１モデルに相当する理論的センサーグラムを細い黒線で示す。ｃ２０８Ｆ２の算出濃度をグラフに示す：最高濃度（２４ｎＭ）のみを定数と見なす）。
【図１９】図１９：解離定数は各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、ｐＭ単位で表される比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎ×１０１２に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【図２０】図２０：半減期は、各抗体に関して行った４回の実験の平均に相当し、時間の単位で表される比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆ／３６００に相当する。エラーバーは標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【図２１】図２１：３つの異なる化合物とカップリングされた抗ＩＧＦ−１Ｒの細胞傷害性。５種類のキメラ抗体、抗ＩＧＦ−１ＲをＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた。無関連抗体ｃ９Ｇ４もまた同じ化合物とカップリングさせた。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（図２２Ａ）、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２２Ｂ）およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３（図２２Ｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂ：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＡＤＣ対照（ｃ９Ｇ４−Ｅ１３およびｃ９Ｇ４−Ｇ−１３）と比較したｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３（図２３Ａ）およびｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２３Ｂ）の両方のｉｎ  ｖｉｖｏ評価。
【図２４】図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃ：ＥＬＩＳＡによる、固定化したｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（２４Ａ）、ｒｈＤｔｋ−Ｆｃ（２４Ｂ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（２４Ｃ）タンパク質に対する１６１３Ｆ１２の結合特異性。
【図２５】図２５：ヒト腫瘍細胞に対する１６１３Ｆ１２結合のＦＡＣＳ分析。
【図２６】図２６：ｍ１６１３Ｆ１２およびｈｚ１６１３Ｆ１２両方のｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対する結合を検討するＥＬＩＳＡ試験。
【図２７】図２７Ａ、２７Ｂおよび２７Ｃ：１６１３Ｆ１２とのインキュベーション後のＳＮ１２Ｃ細胞の免疫蛍光顕微鏡。図２７Ａ−膜および細胞内の両染色に関するｍＩｇＧ１アイソタイプ対照条件の写真。図２７Ｂ−膜染色。図２７Ｃ−１６１３Ｆ１２を用いたＡｘｌ受容体および初期エンドソームマーカーＥＥＡ１の両方の細胞内染色。画像の重畳を下に示し、可視化された共局在化を矢印で示す。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂ：図２８Ａは、ＳＮ１２ｃ（Ａｘｌ＋）およびＭＣＦ−７（Ａｘｌ−）の両細胞株に対するｈｚ１６１３Ｆ１２−Ｅ−１３の細胞傷害活性を表す。図２８Ｂは、ＳＮ１２ｃ（Ａｘｌ＋）およびＭＣＦ−７（Ａｘｌ−）の両細胞株に対するｈｚ１６１３Ｆ１２−Ｇ−１３の細胞傷害活性を表す。
【図２９】図２９ＡおよびＢ：Ｃａｌｕ−３異種移植モデルにおけるＥ−１３（２９Ａ）またはＧ−１３（２９Ｂ）いずれかの化合物とコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｃ：ＪＩＭＴ−１異種移植モデルにおける、Ｅ−１３（図３０Ａ）またはＧ−１３（図３０Ｂ）いずれかの化合物とコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体または単独（図３０Ｃ）のｉｎ  ｖｉｖｏ活性。
【実施例】
【０３４０】
実施例１：ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤに対するマウス抗体の作製
ヒトＩＧＦ−１受容体（ｈＩＧＦ１Ｒ）のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対して生成したマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作製するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）で３回皮下免疫した。別途、一部の動物で、１０μｇのＩＧＦ−１Ｒマウス細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）での３回の付加的免疫誘導も行った。初回の免疫誘導はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。以降の免疫誘導にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。融合３日前に、免疫マウスに１０μｇのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質で追加免疫を行った。次に、脾細胞およびリンパ球をそれぞれ脾臓の灌流および近位リンパ節の細断により調製し、５個体の免疫マウスのうち１個体（総てのマウスの血清力価測定の後に選択）から採取し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合させた。融合プロトコールはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。融合細胞に対してＨＡＴ選択を行う。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングとして、ハイブリドーマの上清を、ヒト乳房ＭＣＦ７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）および／または細胞表面にサルＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＯＳ７細胞（アフリカミドリザル腎臓ＳＶ４０形質転換）を用いたＦＡＣＳ分析によって、ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤタンパク質に対して生成したＭａｂの分泌に関して評価した。より厳密には、フローサイトメトリーによる選択のために、１０５細胞（ＭＣＦ７またはＣＯＳ７のいずれか）を９６ウェルプレートの各ウェルの１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｒｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｓ  Ｉｎｃ．、ユージーン、ＵＳＡ）で１／５００°希釈したＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄後、各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌでヨウ化プロピジウムを加えた後に、ＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により細胞を分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート二次抗体ともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。アイソタイプ対照を各実験で使用した（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆ  Ｍ９０３５１ＭＧ）。蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を算出するために少なくとも５０００細胞を評価した。
【０３４１】
加えて、内部移行する抗体のみを選択するために内部移行アッセイを行った。このアッセイでは、ＭＣＦ７腫瘍細胞株を試験前にフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％のＦＡＣＳを含むＲＭＰＩ  １６４０中で３日間培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を解離させ、１００μｌの細胞懸濁液を４．１０５細胞／ｍｌで、９６マルチウェルプレートのフェノールレッド不含の、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離後に、細胞を５０μｌのハイブリドーマ上清または対照抗体溶液（１μｇ／ｍｌの陽性対照およびアイソタイプ対照）のいずれかに再懸濁させた。４℃で２０分のインキュベーション時間の後、細胞を２０００ｒｐｍで２分遠心分離し、冷（４℃）または温（３７℃）いずれかの完全培養培地に再懸濁させた。次に、細胞を３７℃または４℃のいずれかで２時間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した。Ａｌｅｘａ  ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を２０分間インキュベートし、細胞を３回洗浄した後、ヨウ化プロピジウム陰性細胞集団でのＦＡＣＳ分析を行った。
【０３４２】
ＦＡＣＳ分析の後、（ｉ）イブリドーマ上清とともに、４℃でインキュベートした細胞の表面上で検出された蛍光シグナルと、３７℃でインキュベートした細胞で得られたものとの差異と、（ｉｉ）細胞表面上に残留するＩＧＦ１Ｒのパーセンテージの、２つのパラメーターを決定した。
【０３４３】
残留ｈＩＧＦ  １Ｒのパーセンテージは、下記のように算出される：％残留ＩＧＦ−１Ｒ＝（ＭＦＩＡｂ  ３７℃／ＭＦＩＡｂ  ４℃）×１００。
【０３４４】
加えて、組換えヒト（ｈＩＧＦ−１Ｒ）およびマウス（ｍＩＧＦ−１Ｒ）タンパク質、ならびに組換えヒトインスリン受容体（ｈＩＲ）タンパク質への抗体結合を検討するために、３種類のＥＬＩＳＡを行った（クローニング前または後のいずれか）。ｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒおよび／またはｒｍ−ＩＧＦ−１Ｒへの結合を示し、ｒｈＩＲには結合しない抗体を分泌するハイブリドーマを保持した。簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を４℃にて一晩、ＰＢＳ中０．６μｇ／ｍｌのｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３９１−ＧＲ）または１μｇ／ｍｌのｒｍＩＧＦ−１Ｒタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６６３０−ＧＲ／Ｆｃ）または１μｇ／ｍｌのｒｈＩＲタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４４−ＩＲ／ＣＦ）１００μｌ／ウェルでコーティングした。次に、これらのプレートを３７℃にて２時間、０．５％ゼラチンを含有するＰＢＳ（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）でブロッキングした。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出したところで、各ウェルに１００μｌの各上清希釈液（無希釈ハイブリドーマ上清も上清連続希釈液も）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、１００μｌセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中１／５０００希釈で３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加える。室温で１０分のインキュベーション時間後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの光学密度を測定する。
【０３４５】
対象とする抗体を分泌するハイブリドーマを拡大培養し、限界希釈によりクローニングした。アイソタイプ分類を行ったところで、各コードの１クローンを拡大培養し、凍結させた。さらなる特性決定のため、対象とする各抗体をＣｅｌｌＬｉｎｅ（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産系で生産した。
【０３４６】
結合特異性ＦＡＣＳ分析に取り組むためのさらなるアッセイを、ＩＭ９細胞（ヒトＩＲ発現Ｂリンパ芽球）ならびにｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞に対して行った。
【０３４７】
選択された抗体に対応するデータを総て表９にまとめ、５つの選択抗体がＭＣＦ−７乳癌細胞またはトランスフェクト細胞のいずれかで発現された天然ヒトＩＧＦ−１Ｒを強く認識することを示した。それらの抗体はまたＣＯＳ−７細胞でサルＩＧＦ−１Ｒも認識する。これらの抗体は、ＩＭ９細胞で発現の高いヒトインスリン受容体とは交差反応しない。これらの抗体はＥＬＩＳＡプレートに直接コーティングされた場合のｒｈＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤタンパク質をあまり認識しないことを述べておかなければならない。
【０３４８】
【表１１】
0006567551.tif 000054
【０３４９】
実施例２：ＦＡＣＳ分析によるヒト天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合
５つのマウスＩＧＦ−１Ｒ抗体をキメラ化した。マウスおよびキメラ両方のＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合特性をヒトＭＣＦ−７乳腺癌細胞株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）にて漸増抗体濃度を用い、ＦＡＣＳ分析により評価した。この目的で、細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）を４℃にてＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともに２０分間インキュベートした。次に、それらの細胞を３回洗浄し、暗所、４℃にてさらに２０分間、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。各抗体で得られたシグナル強度の最大値をＢｍａｘと呼び、蛍光強度の平均（ＭＦＩ）で表した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３５０】
各マウスまたはキメラＡｂの力価測定曲線は、生成した総ての抗体が典型的な飽和特性で天然ＩＧＦ−１Ｒ型を認識できることを示した（図１Ａ）。抗体のランク付けを行い、マウスおよびキメラの両Ａｂの結合特性を比較するために、各化合物の結合ＥＣ５０を、非直線回帰分析を用いて決定した。各マウスＡｂとその対応するキメラ型のＥＣ５０の比較は、これら２つの形態が同じ結合特性を示し、Ａｂのキメラ化がＩＧＦ−１Ｒ認識に影響を及ぼさなかったことを示した（図１Ｂ−Ｃ）。キメラ抗体のＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表１０にまとめた。
【０３５１】
【表１２】
0006567551.tif 000055
【０３５２】
実施例３：有意なレベルのＩＲを発現するＩＧＦ−１ＲまたはＩＲトランスフェクト細胞またはＩＭ９細胞のいずれかを使用することによる抗体特異性の確認
生成された抗体のＩＧＦ−１ＲとＩＲに対する特異性を確認するために、ｈＩＧＦ−１ＲまたはｈＩＲのいずれかを発現する安定なトランスフェクト体を、ＦＡＣＳ分析により評価した。簡単に述べれば、漸増濃度のキメラｍＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、細胞とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３５３】
ｈＩＧＦ−１Ｒトランスフェクト細胞株（図２Ａ）と非トランスフェクト細胞で得られた力価測定曲線（図２Ｂ）から、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するキメラＡｂの結合特異性が確認された。ＥＣ５０値およびＢｍａｘ値を表１１にまとめた。
【０３５４】
【表１３】
0006567551.tif 000056
【０３５５】
ｈＩＲへのマウスおよびキメラの両抗体の結合の不在を確認するために、ヒトＩＲ（ｈＩＲ）を発現する安定な細胞株を用いた。マウスおよびキメラの両Ａｂによるヒト細胞表面ｈＩＲの認識は、ＦＡＣＳ分析により行った。漸増濃度のマウスまたはキメラいずれのｍＡｂをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃にて２０分間、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞株上でインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、その後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を陽性対照として用いた。マウスおよびキメラ９Ｇ４抗体を無関連抗体として導入した。
【０３５６】
トランスフェクト細胞の細胞表面での高レベルのｈＩＲ発現は、市販の抗ｈＩＲ抗体ＧＲＯ５を用いて確認した（図３Ａおよび３Ｂ）。高濃度のマウス（図３Ａ）またはキメラ（図３Ｂ）いずれかのｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂを用いても、ｈＩＲ＋トランスフェクト細胞の細胞表面での結合は見られなかった。これらの結果は、マウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂもキメラ抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  ＡｂもｈＩＲを認識しなかったことを示した。
【０３５７】
ｈＩＧＦ−１ＲとＩＲの認識のこの特異性はまた、ｈＩＲを発現するＢリンパ腫細胞株であるＩＭ９細胞を用いたＦＡＣＳ分析によっても示された（図４）。このＦＡＣＳ分析では、プロトコールは上記のものと同じであり、抗ヒト二次Ａｂの交差反応性を避けるためにマウス抗体を用いた（ＩＭ９細胞はそれらの細胞表面にヒトＩｇを発現する）。図４に示す結果は、ここでも、ＧＲＯ５抗ｈＩＲ抗体を用いた場合にも予想されたシグナルが見られたが、評価したマウス抗体にこの細胞株上で有意な結合シグナルを示したものはなかったことを示した。
【０３５８】
実施例４：ＦＡＣＳ分析およびＢｉａｃｏｒｅ分析によるサル天然ＩＧＦ−１Ｒへの抗体結合
規制毒性試験の第１の前提条件の１つは、選択された化合物を評価するために適切な動物種を見つけることである。本明細書に記載の抗体系列はマウスＩＧＦ−１Ｒを認識できないので、毒性評価に最も可能性のある種は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。
【０３５９】
サルＩＧＦ−１Ｒに対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合を評価するために、マウスおよびキメラの両抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合をまず、漸増抗体濃度を用い、ＣＯＳ−７細胞株でＦＡＣＳ分析により評価した。細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、０．１％、ＢＳＡ、０．０１％ＮａＮ３）中、４℃で２０分間、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした後、暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートし、最後にＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認される生細胞に対する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合をすぐに評価した。モル濃度（Ｍ）で表される結合ＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。
【０３６０】
ＣＯＳ−７サル細胞株で得られた力価測定曲線は、総ての抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂがサル細胞株の表面で発現されたＩＧＦ−１Ｒを特異的に認識したことを示した（図５Ａ）。マウスおよびキメラの各Ａｂに関するＥＣ５０の決定は、これらの２形態はサルＩＧＦ−１Ｒに対するそれらの結合特性に関して十分匹敵したことを示した（図５Ｂ）。これらの結果は、生成された総ての抗ｈＩＧＦ−１ＲがサルＩＧＦ−１Ｒを認識したことを示した。
【０３６１】
ヒトとサルのＩＧＦ−１Ｒに対するキメラ抗体認識の大きさを確認するために、ＣＯＳ−７細胞とトランスフェクトＩＧＦ−１Ｒ細胞での結合ＥＣ５０の比較を行った。図５Ｃに示される結果は、総ての抗体によるヒトおよびサルＩＧＦ−１Ｒの同等の認識を示した。
【０３６２】
別の種類のサルにおける認識を確認するために、細胞をＩＧＦ−１Ｒ型カニクイザルでトランスフェクトして可溶性サルＩＧＦ−１Ｒ  ＥＣＤを作製し、ｈＩＧＦ−１ＲまたはカニクイザルＩＧＦ−１Ｒのいずれかに対するその結合特性を比較するためにキメラ抗体の１つ（ｃ２０８Ｆ２）を用いてＢｉａｃｏｒｅ試験を行った。
【０３６３】
認識試験は、Ｘ１００装置にて、抗Ｔａｇ  Ｈｉｓ抗体（ＨｉｓキャプチャーキットＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  カタログ番号２８−９９５０−５６）により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。アミンキット化学を用い、１１０００ＲＵを越える抗体をカルボキシメチルデキストラン(carboxymethyldextan)マトリックスに化学的にグラフトした。これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。マカク属ＩＧＦ−１Ｒと比較してｈＩＧＦ−１Ｒに対する２０８Ｆ２抗体のキメラ型（ｃ２０８Ｆ２）の結合の速度パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
【０３６４】
ヒト（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）またはカニクイザル（自家作製）のうち１つのいずれかの配列に基づく、２本のα鎖と、付加的なＣ末端１０Ｈｉｓタグとともに発現される２本のβ鎖の細胞外ドメインから構成されるＩＧＦ１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型の溶液を、１６０ＲＵ前後の抗原を捕捉するために定義された希釈で第２のフローセルに１分注入した。捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲のｃ２０８Ｆ２を注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを通した。
【０３６５】
次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５バッファーを３０秒間注入して表面を再生した。
【０３６６】
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ−１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する（図６）。
【０３６７】
各ＩＧＦ１Ｒ分子（ヒトまたはカニクイザル）に関して、漸増濃度範囲のｃ２０８Ｆ２の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した。得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。動態速度は独立に（各ＩＧＦ−１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の２つの動態速度）または一般に（ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ１Ｒに対するｃ２０８Ｆ２の結合の同じ動態速度）評価する。フィッティングの質は、０．０５ＲＵ未満のＣｈｉ２／Ｒｍａｘ比により評価した。
【０３６８】
各ＩＧＦ−１Ｒに関して個別に定義された結合の動態速度（表１２参照）は近く、同じ動態速度を有する両センサーグラムのフィッティングは良好な質である。
【０３６９】
ｃ２０８Ｆ２抗体は、組換えヒトＩＧＦ−１ＲとカニクイザルＩＧＦ−１Ｒを約０．２ｎＭの解離定数（ＫＤ）で同様に認識する。この研究で(in tis study)定義された親和性は、１６０ＲＵ前後の捕捉ヒトおよびカニクイザルＩＧＦ−１Ｒレベルに関しての抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。
【０３７０】
【表１４】
0006567551.tif 000057
実施例５：ＩＧＦ−１Ｒリン酸化に対する生成抗体の固有の効果
抗体チロシンキナーゼ受容体と結合した際に促進作用を誘導し得ることはよく知られている。本発明者らはこのようなアゴニスト抗体を選択したくはなかったので、キメラ抗体を用いてｈＩＧＦ−１Ｒリン酸化の評価を検討した。
【０３７１】
この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、ＩＧＦ−１（１００ｎＭ）または供試Ａｂのいずれかを３７℃で１０分間加えた（１０μｇ／ｍｌ）。培地を排出し、細胞を４℃にて９０分間、ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中で崩壊させた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
【０３７２】
図７に記載される結果は、ＩＧＦ−１と比較した場合の３回の独立した実験のキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂに応答したｐＩＧＦ−１Ｒの％の平均＋／−Ｓ．Ｄ．を表す。示されたように、ＭＣＦ−７細胞が１０μｇの抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂとともにインキュベートされた場合に、ｈＩＧＦ−１Ｒの有意なリン酸化は検出されなかったか、または低い（＜１０％）しか検出されなかった。
【０３７３】
実施例６：マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体による、ＩＧＦ−１に応答したＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害
選択された抗体の特性決定を行うために、ＩＧＦ１により誘導されたリン酸化を阻害するそれらの能力を検討した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を無血清培地で一晩インキュベートした。次に、細胞をマウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂとともに５分間インキュベートした後、３７℃で２分間ＩＧＦ−１を添加した。培地を排出し、細胞を４℃で９０分間、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５％ＮａＣｌ（１Ｍ）、１０％洗剤混合物（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％Ｉｇｅｐａｌ溶解バッファー）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、５％デオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、１個のプロテアーゼ阻害剤カクテルコンプリートＴＭ錠（Ｒｏｃｈｅ）、１％ホスファターゼ阻害剤カクテルＳｅｔ  ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を含有する溶解バッファー（ｐＨ７．５）中で崩壊させた。これらの溶解液を４℃での遠心分離により明澄化し、１００℃で５分間加熱し、−２０℃で維持するか、またはそのまま４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。一次抗体のインキュベーションを室温で２時間行った後、ＨＲＰ結合二次抗体とのインキュベーションを室温で１時間行った。メンブランをＴＢＳＴ中で洗浄した後、タンパク質をＥＣＬで可視化した。ブロットを、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウエアを用いて定量した。ＧＡＰＤＨを用いてホスホタンパク質値を正規化した。ＩＧＦ−１に応答したｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を１００％の刺激と見なした。ｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化に対する抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂの効果を、ＩＧＦ−１により誘導されたリン酸化の％として求めた。
【０３７４】
総ての抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＡｂがＩＧＦ−１に応答してｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を強く阻害した（８０％を越える低下）（図８）。ＩＧＦ１により誘導されたｈＩＧＦ−１Ｒのリン酸化の最良の阻害剤は、ｍ２０８Ｆ２、ｍ２１２Ａ１１およびｍ２１４Ｆ８  Ｍａｂである。
【０３７５】
実施例７：ＦＡＣＳ分析による生成ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒ内部移行の研究
ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのキメラ抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩとの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図９および表１１に示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂの内部移行パーセンテージは、次のように算出され１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩ、表１３に示した。
【０３７６】
【表１５】
0006567551.tif 000058
【０３７７】
サルＩＧＦ−１Ｒも認識した抗体がこの受容体を内部移行することができたかどうかを決定するために、同じ内部移行試験を行った。表１４にまとめた結果は、総ての供試抗体がサルＩＧＦ−１Ｒ内部移行を媒介できたことを示した。
【０３７８】
【表１６】
0006567551.tif 000059
【０３７９】
細胞表面結合抗体減少の動態をさらに評価した。この目的で、ＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートに播種し、４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌのマウスとともにインキュベートした。次に、３７℃にて１０、２０、３０、６０または１２０分間、培地中で細胞を洗浄して結合してない抗体を除去した。各時点で、細胞を遠心分離した後、氷上にて二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８で表面標識して、細胞表面に残留する抗体の量を決定した。各マウスＡｂおよび各時点の蛍光強度を４℃でのシグナル（残留ＩＧＦ−１Ｒ％）により正規化し、指数減衰に当てはめて半減期（ｔ１／２）を求めた。ｔ１／２は、シグナルの５０％の低下を得るために必要な時間と考えた。図１０に示されるように、総てのマウスＡｂの表面レベルは最初の３０分で急速に低下し、低下は６０分のインキュベーション後にほぼ最大となった（図１０Ａ）。算出された半減期はマウスＡｂに応じて１０〜１８分の間を含んだ（図１０Ｂ）。
【０３８０】
細胞表面シグナルの低下がＡｂの内部移行によるものであって、受容体の脱落によるものではなかったことを確認するために、細胞を３７℃で０、３０および６０分間、マウスＡｂとともにインキュベートした（図１１）。次に、細胞結合抗体（ｗ／ｏ透過処理）および細胞表面結合＋内部移行Ａｂ（透過処理有り）に相当する全抗体シグナルを決定するために、細胞を固定し、透過処理を施すか、または施さなかった。内部移行Ａｂ（細胞質）の量は次のように決定した：透過処理後のＭＦＩ−ＭＦＩ  ｗ／ｏ透過処理。この試験は、細胞表面結合Ａｂの減少は細胞質Ａｂの増加によるものであり、Ａｂが内部移行したことを示すということを示した（図１１）。加えて、透過処理後のシグナル（全体）の低下により示されるように、Ａｂの分解は１時間のインキュベーション後に始まった。
【０３８１】
実施例８：共焦点分析による生成ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合後のＩＧＦ−１Ｒ内部移行の研究
抗体の内部移行をさらに確認するため、細胞輸送後の抗体の細胞下分布を評価するために共焦点顕微鏡観察を行った。細胞を抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ａｂ  ３７℃とともにインキュベートし、固定し、透過処理を施した。従って、細胞を、二次抗体Ａｌｅｘａ−４８８をウサギ抗Ｌａｍｐ−１抗体（二次抗ウサギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ５５５を用いて可視化した）を用いて染色した。３７℃でのインキュベーション前に、マウス２０８Ｆ２  ＡｂはＭＣＦ−７細胞の膜上に局在した（図１２Ａ）。ＩｍａｇｅＪソフトウエアの共局在化ハイリター(highliter)プラグインを用いてリソソームマーカーｌａｍｐ−１との共局在化は見られなかった。細胞表面結合抗体は、３７℃で１５分のインキュベーション後に劇的に減少した。細胞表面結合抗体の減少と同時に、細胞内抗体が小胞に検出された。ｌａｍｐ−１との共局在化はまれにしか見られなかった。３０分のインキュベーション後に、細胞表面結合抗体はほとんど検出されなかった。しかしながら、リソソームでのＡｂの共局在化は増加した。１時間のインキュベーション後には、細胞内Ａｂ染色ならびにｌａｍｐ−１との共局在化数は低下した。細胞表面結合抗体のこの動態およびその細胞内蓄積は、ＦＡＣＳによる抗体表面減衰尺度の動態と相関していた。加えて、ＦＡＣＳ試験ですでに記載したように、マウスＡｂの分解は、共焦点顕微鏡によれば、１時間のインキュベーション後に始まった。
【０３８２】
他の総てのｈＩＧＦ−１Ｒマウス抗体の内部移行およびそれらのＬａｍｐ−１との共局在化もまた評価した（図１２Ｂ）。３７℃で３０分のインキュベーション後に、細胞内抗体が検出され、ｌａｍｐ−１との共局在化が見られ、このことは選択された総ての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体がリソソームに効果的に内部移行されたことを示す。
【０３８３】
実施例９：リソソーム阻害剤バフィロマイシンＡ１を用いたＡｂ分解の阻害
抗体がリソソームに到達してそこで分解されることを確認するために、細胞をリソソーム機能の強力な阻害剤であるバフィロマイシンＡ１で処理したか、または非処理とした。次に、細胞を４℃で１０μｇ／ｍｌの供試Ａｂとともにインキュベートし、洗浄し、３７℃で２時間インキュベートした。内部移行したＡｂは細胞透過処理後に二次抗マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ４８８  Ａｂを用いて検出された。バフィロマイシンＡ１の添加は細胞内Ａｂの分解を防ぎ（図１３）、このことはＡｂが効果的に内部移行され、リソソームで分解されたことを示す。
【０３８４】
実施例１０：抗体−ＩＧＦ−１Ｒ結合に対するｐＨの影響
抗体はそれらの内部移行能に基づいて選択され、リソソームコンパートメントに入る前に初期エンドソームと共局在化することが上記で示されたので、対象とするアプローチは、Ａｂ／ｈＩＧＦ−１Ｒ結合の安定性がｐＨ環境によって調節された抗体、優先的には、ｐＨ環境が酸性となった場合にＩＧＦ−１Ｒから優先的に解離される抗体を選択することからなった。実際に、初期エンドソームとリソソームの間の主要な違いはそれらの管腔ｐＨであり、エンドソームコンパートメントではｐＨはおよそ６であり、リソソームコンパートメントではｐＨは約４．５である。
【０３８５】
リガンド結合（ＩＧＦ１）後にひと度、内部移行されると、ｈＩＧＦ−１Ｒは再循環経路を介して細胞表面に戻ることがよく知られている。
【０３８６】
特定の理論に関連付けるものではないが、本明細書の仮説は、酸性ｐＨで早期にそれらの標的からより放出されやすい抗体はおそらく膜への標的再循環に有利であり、結果として、ＡＤＣアプローチのより良い候補と考えられるはずであるというものである。本発明者らの抗体にこのような特性を示すものがあるか、また、この特性が細胞傷害活性と相関するかどうかを検討するために、ＭＣＦ−７細胞株でのマウス抗ｈＩＧＦ−１Ｒ  Ｍａｂの結合を、種々のｐＨのバッファー中で行った。漸増濃度のマウスｍＡｂをＭＣＦ−７細胞株上で４℃にて２０分間、５〜８の範囲の種々のｐＨでインキュベートした。次に、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中で、Ａｌｅｘａ  ４８８とカップリングした適当な二次抗体とともにインキュベートした。細胞を暗所、４℃にてさらに２０分間インキュベートした後、ＦＡＣＳバッファー中で３回洗浄した。すぐに生細胞に抗ｈＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合がなされ、これを、ヨウ化プロピジウム（死細胞を染色する）を用いて確認した。モル濃度（Ｍ）で表される結合のＥＣ５０は、非直線回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｍｓ  ４．０）を用いて算出した。図１４に示されるように、選択された総てのマウス抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体が酸性ｐＨでより低い結合能を示した。
【０３８７】
実施例１１：２０８Ｆ２  Ｍａｂのヒト化型の評価
ｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂの第１のヒト化型の結合をＭＣＦ−７、ＣＯＳ−７およびＮＩＨ  ３Ｔ３  ＩＲ＋細胞株で評価した。漸増濃度のｍ２０８Ｆ２、ｃ２０８Ｆ２またはｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３ＶＬ３を各細胞株に４℃で２０分間加えた。次に、細胞を洗浄し、供試ｍＡｂの結合を、対応する二次抗体を用いて可視化した。トランスフェクト細胞株上でのヒトＩＲの発現を確認するために、市販の抗ｈＩＲ抗体クローンＧＲＯ５を用い、その認識特性を例示した（図１５Ｄ）。
【０３８８】
ＭＣＦ−７細胞（図１５Ａ）またはサルＣＯＳ−７（図１５Ｂ）細胞でヒト化型とマウス型またはキメラ型のいずれかと比較したところ、供試したこれら３つの型に近似した特性が示された。ヒト化のプロセスは、ヒトインスリン受容体に対する交差反応性に関してマウス型およびキメラ型に完全に匹敵する抗体の認識特異性を改変しなかった（図１５Ｃ）。
【０３８９】
ヒト細胞株ＭＣＦ−７およびサル細胞株ＣＯＳ−７に対する２０８Ｆ２の第１のヒト化型の算出されたＥＣ５０は、ｍＡｂ  ２０８Ｆ２のマウス型またはキメラ型のいずれで決定されたものとも同等であった。
【０３９０】
ｍＡｂ  ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３の内部移行能をフローサイトメトリーにより評価した。ＭＣＦ−７細胞を４℃で２０分間、１０μｇ／ｍｌの抗体とともにインキュベートした。次に、細胞を洗浄し、４℃または３７℃で４時間インキュベートした。細胞表面結合抗体の量を、二次抗体を用いて決定した。４時間のインキュベーション時間後に４℃で測定されたＭＦＩと３７℃で測定されたＭＦＩの間の差異として定義されるΔＭＦＩは、内部移行されたＡｂの量に相当した。ΔＭＦＩを図１６および表１３に示した。１０μｇ／ｍｌのＡｂにおける内部移行のパーセンテージは、次のように算出され：１００＊（４℃でのＭＦＩ−３７℃でのＭＦＩ）／４℃でのＭＦＩ、表１５に示す。よって、ヒト化ｈｚ２０８Ｆ２  ＶＨ３／ＶＬ３は、対応するマウスおよびキメラ２０８Ｆ２抗体で測定されたものと同等の結合および内部移行特性を有していた。
【０３９１】
【表１７】
0006567551.tif 000060
【０３９２】
実施例１２：可溶性組換えヒトＩＧＦ１Ｒに対する２０８Ｆ２抗体の５つのキメラ抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（ｃ２０８Ｆ２、ｃ２１３Ｂ１０、ｃ２１２Ａ１１、ｃ２１４Ｆ８およびｃ２１９Ｄ６）およびヒト化型（ＶＨ３／ＶＬ３）の結合の解離定数（ＫＤ）の定義
組換え可溶性ヒト−ＩＧＦ１Ｒに対する抗体の結合の解離定数（ＫＤ）は、解離速度（ｋｏｆｆ）と会合速度（ｋｏｎ）の間の比により定義した。動態試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００装置にて、マウス抗Ｔａｇ  Ｈｉｓモノクローナル抗体により活性化したＣＭ５センサーチップを用いて行った。１２０００ＲＵ前後の抗体を、アミンキット化学を用いてカルボキシメチルデキストラン(carboxymethyldextan)マトリックスに化学的にグラフトする。
【０３９３】
これらの試験は、ランニングおよびサンプル希釈バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ＋バッファー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、２５℃にて流速３０μｌ／分で行った。
【０３９４】
その２つのＣ末端１０ヒスチジンタグにより捕捉された可溶性組換えヒトＩＧＦ１Ｒへの抗ＩＧＦ１Ｒ抗体の結合の動態パラメーターを定義するためにシングルサイクル動態スキームを用いた。
【０３９５】
１−２本のα鎖と付加的Ｃ末端１０−Ｈｉｓタグとともに発現される２本β鎖の細胞外ドメインのヒトＩＧＦ１Ｒヘテロ四量体の可溶性組換え型（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号３０５−ＧＲ−５０）の溶液を第２のフローセルに１０μｇ／ｍｌの濃度で１分間注入した。本試験で実現した２４サイクルのそれぞれにおいて平均５８７ＲＵ（標準偏差２４ＲＵ）の可溶性受容体が捕捉された。
【０３９６】
２−この捕捉相の後、両フローセルにランニングバッファーを５回注入するか（各９０秒注入）、または漸増する５種類の濃度範囲の、６種類の抗体のうちの１つを注入した（各９０秒注入）。５回目の注入の終了時に、解離速度を定義するためにランニングバッファーを５分間通した。
【０３９７】
３−次に、１０ｍＭグリシン、ＨＣｌ  ｐＨ１．５のバッファーを４５秒間注入して表面を再生した。
【０３９８】
コンピューターで計算されたシグナルは、フローセル２（捕捉されたＩＧＦ１Ｒを含む）の応答とフローセル１（ＩＧＦ１Ｒ分子を含まない）の応答の間の差異に相当する。
【０３９９】
各ＩＧＦ−１Ｒ分子に関して、漸増濃度範囲の１つの抗体の注入によるシグナルを、５回のバッファー注入で得られたシグナル（二重参照）の減算により補正した（図１７参照）。
【０４００】
得られたセンサーグラムを、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアを１：１モデルとともに用いて分析した。
【０４０１】
各抗体について、２つの異なる濃度範囲、すなわち、各抗体について実施した最初の２回の試験では４０、２０、１０、５および２．５ｎＭおよびあとの２回の試験では２４、１２、６、３および１．５ｎＭを用いて４回の試験を行った。
【０４０２】
本試験で供試した６つの抗体について、試験データは、より高い濃度が定数と定義された場合に有意なｋｏｆｆ値を有する１：１モデルによく適合し、他の４つの濃度が計算される（図１８参照）。
【０４０３】
比：ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される解離定数（ＫＤ）および比：Ｌｎ（２）／ｋｏｆｆとして算出されるそれらの複合体の半減期を図１９および２０に示す。これらは各抗体について行った４回の独立した試験の平均に相当する。エラーバーは値の標準誤差（ｎ＝４）に相当する。
【０４０４】
解離定数は１０〜１００ｐＭの範囲である。ｃ２０８Ｆ２抗体は、ｈ−ＩＧＦ１Ｒに対してより弱い親和性（より高い解離定数値）を示し（ＫＤ  ７５ｐＭ前後）、そのヒト化型は少なくともキメラ型と同等に良好である（ＫＤ  ６０ｐＭ前後）。他の４つの抗ＩＧＦ１Ｒキメラ抗体は、ｈＩＧＦ１−Ｒに対して全く同等の親和性を示す（ＫＤ  ３０ｐＭ前後）。この親和性の違いは主として解離速度または結果としての複合体の半減期に関連している。２０８Ｆ２では、キメラ型およびヒト化型（ＶＨ３／ＶＬ３）の場合、複合体の半減期は２〜３時間の間である。他の４つのキメラ抗体では、平均半減期は７．０〜９．４時間の間である。
【０４０５】
これらの極めて緩慢な解離速度は、それらの両Ｆａｂアームにより２つの隣接するｈ−ＩＧＦ１Ｒ分子に同時に結合できる抗体の二価構造に明らかに関連している。この場合、捕捉されたＩＧＦ１Ｒ分子のレベルは解離速度に影響を持ち得る。本試験で定義された親和性は、捕捉された６００ＲＵ前後のｈ−ＩＧＦ１Ｒのレベルに対する抗体の機能的親和性（アビディティー）に相当する。上記に示されるデータ（表１０）と実施例１３に示される値の間に見られるＫＤの３倍の違いは、ｈＩＧＦ−１Ｒの捕捉レベルの違い（実施例４では６００ＲＵと１６０ＲＵ）に関連している。
【０４０６】
実施例１３：１６１３Ｆ１２の作出
Ａｘｌ受容体のヒト細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を作出するために、５個体のＢＡＬＢ／ｃマウスを皮下（ｓ．ｃ．）、１５〜２０．１０６のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞で５回、および２０μｇのｒｈ  Ａｘｌ  ＥＣＤで２回免疫した。初回の免疫誘導はフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）の存在下で行った。以降の免疫誘導にはフロイントの不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を加えた。
【０４０７】
融合３日前に、免疫マウスに２０．１０６のＣＨＯ−Ａｘｌ細胞と２０μｇのｒｈＡｘｌ  ＥＣＤの両方でＩＦＡを伴って追加免疫を行った。
【０４０８】
ハイブリドーマを作製するために、脾細胞およびリンパ球をそれぞれ脾臓の灌流および近位リンパ節の細断により調製し、５個体の免疫マウスのうち１個体（血清力価測定後に選択）から採取し、ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ロックヴィル、ＭＤ、ＵＳＡ）と融合させた。融合プロトコールはKohler and Milstein (Nature, 256:495-497, 1975)に記載されている。融合細胞に対してＨＡＴ選択を行う。一般に、特にマウス起源のモノクローナル抗体またはそれらの機能的フラグメントの調製には、特に手引き書“Antibodies” (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988)に記載されている技術を参照することができる。
【０４０９】
融合のおよそ１０日後に、ハイブリッド細胞のコロニーをスクリーニングした。一次スクリーニングとして、ハイブリドーマの上清を、ＥＬＩＳＡを用い、Ａｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対して生成したＭａｂの分泌に関して評価した。並行して、ＣＨＯとＡｘｌ発現ＣＨＯ細胞の両方を用い、細胞表面に存在する細胞型のＡｘｌに結合し得るＭａｂを選択するためにＦＡＣＳ分析を行った。
【０４１０】
できるだけ速やかに選択されたハイブリドーマを限界希釈によりクローニングした後、それらのＡｘｌ  ＥＣＤタンパク質に対する反応性に関してスクリーニングした。次に、クローニングしたＭａｂを、アイソタイピングキット（カタログ番号５３００．０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミンガム、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いてアイソタイプを同定した。各ハイブリドーマから得られた１つのクローンを選択し、拡大培養した。
【０４１１】
ＥＬＩＳＡアッセイは、次のように、純粋なハイブリドーマ上清を用いて行うか、または上清中のＩｇＧ含量が決定された場合には、５μｇ／ｍｌで始めて力価測定を実行した。次に、以下の１１列で１／２連続希釈を行った。簡単に述べれば、９６ウェルＥＬＩＳＡ  プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３６９０、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）を４℃にて一晩、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのｒｈ  Ａｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４−ＡＬ）またはｒｈＡｘｌ  ＥＣＤ  ５０μｌ／ウェルでコーティングした。次に、これらのプレートを３７℃にて２時間、０．５％ゼラチン（＃２２１５１、Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ、ハイデルベルク、ドイツ）を含有するＰＢＳでブロッキングした。プレートを軽く打ち付けることで飽和バッファーを排出したところで、ＥＬＩＳＡプレートに５０μｌの純粋なハイブリドーマ上清または５０μｌの５μｇ／ｍｌ溶液を加え、３７℃で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、５０μｌセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナルヤギ抗マウスＩｇＧ（＃１１５−０３５−１６４、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ウェストグローブ、ＰＡ、ＵＳＡ）を、０．１％ゼラチンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ｗ：ｗ）を含有するＰＢＳ中１／５０００希釈で３７℃にて１時間加えた。次に、ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄し、ＴＭＢ（＃ＵＰ６６４７８２、Ｕｐｔｉｍａ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ、フランス）基質を加えた。室温で１０分のインキュベーション時間後、１Ｍ硫酸を用いて反応を停止させ、４５０ｎｍでの光学密度を測定した。
【０４１２】
フローサイトメトリーによる選択のために、１０５細胞（ＣＨＯ  ｗｔまたはＣＨＯ−Ａｘｌ）を９６ウェルプレートの各ウェルの、１％ＢＳＡおよび０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中に４℃で播種した。２０００ｒｐｍで２分の遠心分離の後、バッファーを除去し、供試するハイブリドーマ上清または精製Ｍａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加えた。４℃で２０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファー（＃Ａ１１０１７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳＡ）で１／５００°希釈したＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス抗体を加え、４℃で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳバッファーでの最終洗浄の後、各試験管に終濃度４０μｇ／ｍｌでヨウ化プロピジウムを加えた後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。細胞単独およびＡｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした細胞を含有するウェルを陰性対照として含めた。各試験でアイソタイプ対照を使用した（Ｓｉｇｍａ、参照Ｍ９０３５１ＭＧ）。少なくとも５０００細胞を評価して、蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を算出した。
【０４１３】
１６１３Ｆ１２を産生するハイブリドーマを候補として選択した。
【０４１４】
実施例１４：１６１３Ｆ１２のヒト化
ヒトにおける治療適用のためのマウス抗体（Ｍａｂ）の使用は一般に大きな有害作用をもたらし、患者はヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を生じ、それにより、治療および予防の継続的投与の有効性が低下する。この問題を克服するための１つのアプローチが、抗原結合活性を改変することなくマウス配列をそれらのヒト対応物で置換することによりマウスＭａｂをヒト化することである。これは、（ｉ）マウス可変領域がヒト定常領域に連結されるマウス／ヒトキメラ抗体の構築(Boulianne et al., 1984)および（ｉｉ）マウス可変領域由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を慎重に選択したヒト可変領域にグラフトした後、これらの「再形成ヒト」可変領域をヒト定常領域に連結すること(Riechmann et al., 1988)による２つの主要な方法で達成することができる。
【０４１５】
１４．１  軽鎖可変ドメインＶＬのヒト化
予備工程として、１６１３Ｆ１２  ＶＬのヌクレオチド配列をＩＭＧＴデータベース(http://www.imgt.org)のマウス生殖系列遺伝子配列部分と比較した。マウスＩＧＫＶ１６−１０４＊０１およびＩＧＫＪ５＊０１生殖系列遺伝子を同定した。ＣＤＲグラフトの最良のヒト候補を特定するために、１６１３Ｆ１２  ＶＬマウス配列と最も同一性を示すヒト生殖系列遺伝子を検索した。ＩＭＧＴデータベース分析ツールの助けで、マウス１６１３Ｆ１２  ＶＬ  ＣＤＲの可能性のあるアクセプターヒトＶ領域を特定した：ＩＧＫＶ１−２７＊０１およびＩＧＫＪ４＊０２。軽鎖可変ドメインに対してヒト化を行うために、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基に優先順位を付けた。これらの優先度（１〜４）を用い、最大１４の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域の１１の異なるヒト化変異体を作出した。
【０４１６】
【表１８】
0006567551.tif 000061
１４．２  重鎖可変ドメインＶＨのヒト化
ＣＤＲグラフトのための最良のヒト候補を特定するために、１６１３Ｆ１２  ＶＨと最も同一性を示すマウスおよびヒト生殖系列遺伝子を検索した。ＩＭＧＴデータベースの一部である配列アラインメントソフトウエア「ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ」を用い、１６１３Ｆ１２  ＶＨのヌクレオチド配列をマウスおよびヒトの両方の生殖系列遺伝子配列とアラインした。また、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩパッケージの「Ａｌｉｇｎ  Ｘ」ソフトウエアを用いてヌクレオチド配列アラインメントの結果を確認するためのアミノ酸配列アラインメントも実行した。マウス生殖系列遺伝子とのアラインメントは、マウス生殖系列Ｖ−遺伝子ＩＧＨＶ１４−３＊０２およびＪ−遺伝子ＩＧＨＪ２＊０１が最も相同なマウス生殖系列遺伝子であることを示した。ＩＭＧＴデータベースを用い、マウスＤ遺伝子生殖系列ＩＧＨＤ１−１＊０１を相同配列として特定した。ＣＤＲグラフトに適当なヒト生殖系列を選択するために、１６１３Ｆ１２  ＶＨマウス配列と最高の相同性を有するヒト生殖系列遺伝子を特定した。ＩＭＧＴデータベースおよびツールの補助で、ヒトＩＧＨＶ１−２＊０２生殖系列遺伝子およびヒトＩＧＨＪ５＊０１  Ｊ生殖系列遺伝子をマウス１６１３Ｆ１２  ＶＨ  ＣＤＲのヒトアクセプター配列として選択した。重鎖可変ドメインに対するヒト化を行うために、ヒト配列とマウス配列の間で異なる各残基に優先順位（１〜４）を付けた。これらの優先度を用い、最大１８の復帰突然変異を有する軽鎖可変領域の２０の異なるヒト化変異体を作出した。
【０４１７】
【表１９】
0006567551.tif 000062
【０４１８】
実施例１５：Ａｘｌ結合特異性
この例では、１６１３Ｆ１２の結合が、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質に対する最初の試験であった。次に、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋ−ＦｃおよびｒｈＭｅｒ−Ｆｃに対するその結合を試験した。
【０４１９】
簡単に述べれば、組換えヒトＡｘｌ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１５４ＡＬ／ＣＦ）、ｒｈＤｔｋ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８５９−ＤＫ）またはｒｈＭｅｒ−Ｆｃ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号８９１−ＭＲ）タンパク質を４℃で一晩Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ９６ウェルプレートにコーティングし、０．５％ゼラチン溶液で１時間のブロッキング工程の後、１６１３Ｆ１２を５μｇ／ｍｌ（３．３３  １０−８Ｍ）の濃度で始め、３７℃でさらに１時間加えた。次に、１／２連続希釈を１２列に行った。プレートを洗浄し、ヤギ抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）特異的ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で１時間加えた。ＴＭＢ基質溶液を用いて反応を進行させた。アイソタイプ対照抗体ｍＩｇＧ１および市販の抗Ａｘｌ  Ｍａｂ  １５４抗体も並行して用いた。コーティング対照はＨＲＰで標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル血清（Ｊａｃｋｓｏｎ、参照１０９−０３５−０９８）の存在下および／またはＨＲＰ結合抗ヒスチジン抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、参照：ＭＡＢ０５０Ｈ）の存在下で行った。
【０４２０】
結果をそれぞれ図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃに表す。
【０４２１】
この実施例は、１６１３Ｆ１２はｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質とのみ結合し、ＴＡＭファミリーの他の２つのメンバーｒｈＤｔｋまたはｒｈＭｅｒには結合しないことを示す。１６１３Ｆ１２の結合の交差特異性はＴＡＭメンバー間では見られない。一次抗体の不在下（希釈剤）で、非特異的結合は見られなかった。アイソタイプ対照抗体の存在下で結合は見られなかった。
【０４２２】
実施例１６：１６１３Ｆ１２はヒト腫瘍細胞上で発現される細胞型のＡｘｌを認識する
まず、ヒト腫瘍細胞上での細胞表面Ａｘｌ発現レベルを、Ａｘｌ発現レベルの定量を可能とするため較正ビーズと並行して市販のＡｘｌ抗体（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、参照：ＭＡＢ１５４）を用いて確認した。次に、細胞表面Ａｘｌの結合を、１６１３Ｆ１２を用いて試験した。
【０４２３】
細胞表面結合試験については、１０μｇ／ｍｌ（６．６６  １０−８Ｍ）一次抗体溶液（１６１３Ｆ１２、ＭＡＢ１５４またはｍＩｇＧ１アイソタイプ対照９Ｇ４  Ｍａｂ）の２倍連続希釈系を作製し、２．１０５の細胞に４℃で２０分間適用する。１％ＢＳＡおよび０．０１％ＮａＮ３を添加したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、細胞を二次抗体ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ４８８（１／５００°希釈）とともに４℃で２０分間インキュベートした。１％ＢＳＡおよび０．１％ＮａＮ３を添加したＰＢＳ中でさらに３回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ（Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。少なくとも５０００細胞を評価して、蛍光強度の平均値を算出した。
【０４２４】
ＭＡＢ１５４を用いた定量的ＡＢＣの決定については、ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）較正ビーズを用いる。次に、これらの細胞をＱＩＦＩＫＩＴ（商標）ビーズと並行して、飽和濃度のポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン／ＦＩＴＣ、ヤギＦ（ａｂ’）２とともにインキュベートする。次に、検体細胞上の抗原部位の数を検量線（ビーズ上のＭａｂ分子の数に対する個々のビーズ集団の蛍光強度）の補間によって決定する。
【０４２５】
１６．１．細胞表面Ａｘｌ発現レベルの定量
ヒト腫瘍細胞の表面でのＡｘｌ発現レベルを、細胞表面抗原を評価するための定量的フローサイトメトリーキットである間接的免疫蛍光アッセイ（ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）法（Ｄａｋｏ、デンマーク）を用いたフローサイトメトリーで決定した。較正グラフによるビーズの既知の抗原レベルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較から、細胞株の抗体結合能（ＡＢＣ）の決定を可能となる。
【０４２６】
表１６は、ＭＡＢ１５４（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、  ＱＩＦＩＫＩＴ（商標）を用いて決定した際の、種々のヒト腫瘍細胞株（ＳＮ１２Ｃ、Ｃａｌｕ−１、ＭＤＡ−ＭＢ４３５Ｓ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＮＣＩ−Ｈ１２５、ＭＣＦ７、Ｐａｎｃ１）の表面で検出されたＡｘｌ発現レベルを示す。値は抗原結合複合体（ＡＢＣ）として示される。
【０４２７】
【表２０】
0006567551.tif 000063
【０４２８】
ＭＡＢ１５４で得られた結果は、Ａｘｌ受容体は考慮するヒト腫瘍細胞によって様々なレベルで発現されことを示した。
【０４２９】
１６．２．  ヒト腫瘍細胞での１６１３Ｆ１２によるＡｘｌ検出
より具体的に、１６１３Ｆ１２を用いて結合を試験した。
【０４３０】
１６１３Ｆ１２用量反応曲線を作成した。次に、種々のヒト腫瘍細胞を用いて得られたＭＦＩを、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて分析した。データを図２５に示す。
【０４３１】
データは、飽和曲線特性により証明されるように、１６１３Ｆ１２が膜Ａｘｌ受容体と特異的に結合することを示す。しかしながら、異なる強度の標識が見られ、ヒト腫瘍細胞上の細胞表面Ａｘｌ受容体の様々なレベルが明らかになった。ＭＣＦ７ヒト乳房腫瘍細胞株を用いた場合には、Ａｘｌ受容体の結合は見られなかった。
【０４３２】
実施例１７：ｈｚ１６１３Ｆ１２とｍ１６１３Ｆ１２のバリデーション
ｈｚ１６１３Ｆ１２がそのマウス型に匹敵したかどうかを確認するために、ｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質アッセイを用いたＥＬＩＳＡにより結合試験を行った。
【０４３３】
このアッセイでは、９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を４℃で一晩、１×ＰＢＳ中の１６１３Ｆ１２溶液５μｇ／ｍｌでコーティングした。飽和工程の後、一定範囲のＡｘｌ−Ｆｃタンパク質（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、参照：１５４−ＡＬ）を前記コーティングプレート上で３７℃にて１時間インキュベートする。可視化工程については、ビオチン化−Ａｘｌ抗体（自家製品）を加え０．８５μｇ／ｍｌで３７℃にて１時間加えた。このＡｘｌ抗体は異なるエピトープ基に属す。次に、希釈バッファー中１／２０００°のアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ溶液をこれらのウェルに加える。その後、ＴＭＢ基質溶液を５分間加える。ペルオキシダーゼ停止溶液の添加後、マイクロプレートリーダーを用い、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０４３４】
図２６は、１６１３Ｆ１２のマウス型およびヒト化型の両方が同様にｒｈＡｘｌ−Ｆｃタンパク質と結合することを示す。
【０４３５】
実施例１８：蛍光免疫細胞化学標識を用いた１６１３Ｆ１２内部移行試験
相補的内部移行結果は、間接的蛍光標識法を用いた共焦点顕微鏡を用いて得られる。
【０４３６】
簡単に述べれば、ＳＮ１２Ｃ腫瘍細胞株を試験前３日間、１％Ｌ−グルタミンおよび１０％のＦＣＳを含むＲＭＰＩ１６４０で培養した。次に、トリプシンを用いて細胞を剥離し、カバーガラスを含む６マルチウェルプレートの、１％Ｌ−グルタミンおよび５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０中に播種した。翌日、１０μｇ／ｍｌの１６１３Ｆ１２を加えた。無関連抗体で処理した細胞も含めた。次に、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で１時間および２時間インキュベートした。Ｔ０時間では、細胞を４℃で３０分間インキュベートして細胞表面での抗体結合を決定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞をすすぎ、４℃で６０分間、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８抗体とともにインキュベートし、細胞表面に残留する抗体を同定した。細胞内への抗体の浸透を追跡するために、細胞を固定し、サポニンで透過処理を施した。ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８(Invitrogen)を用いて、膜および細胞内の両方の抗体を染色した。初期エンドソームは、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  ５５５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化されるＥＥＡ１に対するウサギポリクローナル抗体を用いて同定した。細胞を３回洗浄し、Ｄｒａｑ５を用いて核を染色した。染色後、細胞をＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ封入剤(Invitrogen)中に封入し、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦顕微鏡を用いて分析した。
【０４３７】
写真を図２７２７−４Ｃに示す。
【０４３８】
共焦点顕微鏡により画像を得た。ｍＩｇＧ１アイソタイプ対照（９Ｇ４）の存在下では、膜染色も細胞内標識も見られない（図２７Ａ）。ＳＮ１２Ｃ細胞を１６１３Ｆ１２とともに１時間インキュベートした後に間もなく、段階的な膜抗Ａｘｌ標識の低下が見られる（図２７Ｂ）。１時間および２時間の時点で１６１３Ｆ１２抗体の細胞内蓄積が明らかに見られる（図２７Ｃ）。細胞内抗体は、初期エンドソームマーカーであるＥＥＡ１と共局在化する。これらの写真により１６１３Ｆ１２のＳＮ１２Ｃ細胞への内部移行が確認される。
【０４３９】
実施例１９：本発明の薬物の合成
以下の実施例では下記の略号を使用する。
ａｑ．      水性
ｅｅ        鏡像体過剰率
ｅｑｕｉｖ  当量
ＥＳＩ    エレクトロスプレーイオン化
ＬＣ／ＭＳ  液体クロマトグラフィーと質量分析の組み合わせ
ＨＰＬＣ    高速液体クロマトグラフィー
ＮＭＲ      核磁気共鳴
ｓａｔ．    飽和
ＵＶ        紫外線
【０４４０】
化合物１
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，ビストリフルオロ酢酸
【化２７】
0006567551.tif 000064
化合物１Ａ：（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−５−フェニル−３−プロパノイル−１，３−オキサゾリジン−２−オン
【化２８】
0006567551.tif 000065
（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−２−オン（５．８ｇ、３２．７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１２０ｍＬ）に溶かした。この混合物を−７８℃に冷却し、ｎ−ブチルリチウム（１４．４ｍＬ）を滴下した。−７８℃で３０分間振盪した後、塩化プロパノイル（５．７ｍＬ）を加えた。−７８℃で３０分間、次いで、周囲温度で一晩振盪を続けた。この反応混合物を濃縮した後、２００ｍＬの水に再溶解させた。溶液のｐＨを重炭酸ナトリウム飽和水溶液で７に調整した。この水相を１００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、６．８ｇ（８９％）の化合物１Ａを黄色油状物の形態で得た。
【０４４１】
化合物１Ｂ：（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−２−メチル−３−［（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−５−フェニル−１，３−オキサゾリジン−３−イル］−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化２９】
0006567551.tif 000066
化合物１Ａ（１７．６ｇ、７５．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ジクロロメタン（ＤＣＭ、２８６ｍＬ）に溶かした。この溶液を氷浴で冷却した。トリエチルアミン（ＴＥＡ、１２．１ｍＬ、１．１５当量）およびＢｕ２ＢＯＴｆ（７８．３ｍＬ、１．０４当量）を、反応混合物の温度を２℃より低く保持しながら滴下した。０℃で４５分分間振盪を続け、その後、この反応物を−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（４２ｍＬ）中、（２Ｓ）−２−ホルミルピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８．５ｇ、４２．６６ｍｍｏｌ、０．５７当量）の溶液を滴下した。−７８℃で２時間、次いで０℃で１時間、最後に周囲温度で１時間振盪を続けた。この反応物を７２ｍＬのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．２〜７．４）および２１４ｍＬのメタノールで中和し、０℃に冷却した。メタノール中３０％過酸化水素の溶液（２５７ｍＬ）を、温度を１０℃より低く維持しながら滴下した。０℃で１時間振盪を続けた。この反応物を１４２ｍＬの水で中和した後、減圧下で濃縮した。得られた水溶液を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を、シリカカラムにてＥｔＯＡｃおよび石油エーテルの混合物（ＥｔＯＡｃ：ＰＥ＝１：８）を用いて精製し、１３．１６ｇ（４０％）の化合物１Ｂを無色の油状物の形態で得た。
【０４４２】
化合物１Ｃ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］ピロリジン−２−イル］−３−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸
【化３０】
0006567551.tif 000067
化合物１Ｂ（１３．１６ｇ、３０．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を過酸化水素（水中３０％、１５．７ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（４６０ｍＬ）に溶かした後、氷浴で冷却した。水酸化リチウム水溶液（０．４ｍｏｌ／Ｌ、１５２．１ｍＬ）を、反応温度を４℃より低く保持しながら滴下した。この反応混合物を０℃で２．５時間振盪した。Ｎａ２ＳＯ３水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ、１６７．３ｍＬ）を、温度を０℃に保持しながら滴下した。この反応混合物を周囲温度で１４時間振盪した後、１５０ｍＬの冷重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和し、５０ｍＬのＤＣＭで３回洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍ  ＫＨＳＯ４水溶液で２〜３に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、７．３１ｇ（８８％）の化合物１Ｃを無色の油状物の形態で得た。
【０４４３】
化合物１Ｄ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−［（２Ｓ）−１−［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カ
ルボニル］ピロリジン−２−イル］−３−メトキシ−２−メチルプロパン酸
【化３１】
0006567551.tif 000068
化合物１Ｃ（７．３１ｇ、２６．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ヨードメタン（２５．３ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（１３５ｍＬ）に溶かした。この反応媒体を氷浴で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、４．２８ｇ）を少量ずつ加えた。この反応物を０℃で３日、振盪下で放置した後、１００ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和水溶液で中和し、５０ｍＬのエーテルで３回洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｍ  ＫＨＳＯ４水溶液で３に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＮａ２Ｓ２Ｏ３（水中５％）で１回、ＮａＣｌ飽和溶液で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、５．５ｇ（７２％）の化合物１Ｄを無色の油状物の形態で得た。
【０４４４】
化合物１Ｅ：Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチル−２−フェニルアセトアミド
【化３２】
0006567551.tif 000069
２−フェニル酢酸（１６．２ｇ、１１８．９９ｍｍｏｌ、１．００当量）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１３０ｍＬ）に溶かした後、−１０℃に冷却した。ジエチルホスホロシアニデート（ＤＥＰＣ、１９．２ｍＬ）、メトキシ（メチル）アミン塩酸塩（１２．９２ｇ、１３３．２０ｍｍｏｌ、１．１２当量）およびトリエチルアミン（３３．６ｍＬ）を加えた。この反応混合物を−１０℃で３０分、次いで、周囲温度で２．５時間振盪した。次に、これを１リットルのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で２回、４００ｍＬの水で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３）を用いて精製し、２０．２ｇ（９５％）の化合物１Ｅを黄色油状物の形態で得た。
【０４４５】
化合物１Ｆ：２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−オン
【化３３】
0006567551.tif 000070
テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ、２７．２ｍＬ）を不活性雰囲気中、ＴＨＦ  ３００ｍＬに溶かした後、−７８℃に冷却し、その後、ｎ−ＢｕＬｉ（６７．６ｍＬ、２．５Ｍ）を滴下した。２−ブロモ−１，３−チアゾール（１５．２ｍＬ）を滴下し、−７８℃で３０分振盪を続けた。ＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かした化合物１Ｅ（２５ｇ、１３９．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）を滴下した。−７８℃で３０分間、次いで、−１０℃で２時間振盪を続けた。この反応物を５００ｍＬのＫＨＳＯ４（飽和）で中和した後、１リットルのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、４００ｍＬの水で２回および７００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：１０）を用いて精製し、２５ｇ（８８％）の化合物１Ｆを黄色油状物の形態で得た。
【０４４６】
化合物１Ｇ：（１Ｒ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−オール
【化３４】
0006567551.tif 000071
不活性雰囲気中、（＋）−Ｂ−クロロジイソピノカンフェイルボラン(chlorodiisopinocampheylborane)（（＋）−Ｉｐｃ２ＢＣｌ、１１０．８ｍＬ）に、エーテル（３００ｍＬ）中、化合物１Ｆ（１５ｇ、７３．８ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を滴下した。この反応混合物を０℃で２４時間振盪した後、ＮａＯＨ（水中１０％）とＨ２Ｏ２（水中３０％）の（１：１）混合物３００ｍＬで中和し、最後に５００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、３００ｍＬのＫ２ＣＯ３（飽和）で２回および５００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２０から１：２）を用いて精製し、６．３ｇ（４２％）の化合物１Ｇを白色固体の形態で得た。
【０４４７】
化合物１Ｈ：２−［（１Ｓ）−１−アジド−２−フェニルエチル］−１，３−チアゾール
【化３５】
0006567551.tif 000072
化合物１Ｇ（６ｇ、２９．２３ｍｍｏｌ、１．００当量）を、不活性雰囲気中、トリフェニルホスフィン（１３ｇ、４９．５６ｍｍｏｌ、１．７０当量）の存在下でＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。アゾジカルボン酸ジエチル（ＤＥＡＤ、７．６ｍＬ）、次いで、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ、１１ｍＬ）を滴下した後、冷却浴を外し、溶液を振盪下、周囲温度で４８時間放置した。この媒体を減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３０）を用いて精製し、８ｇの部分的に精製された化合物１Ｈを黄色油状物の形態で得た。化合物１Ｈはそのまま次の工程で使用した。
【０４４８】
化合物１Ｉ：Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化３６】
0006567551.tif 000073
化合物１Ｈ（６．５ｇ、２８．２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、トリフェニルホスフィン（６．５ｇ、３３．９ｍｍｏｌ、１．２０当量）の存在下でＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かし、２時間５０℃に加熱した。次に、アンモニア（７０ｍＬ）を加え、３時間加熱を続けた。この反応物を冷却し、５００ｍＬの水で中和した後、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌで２回抽出した、水相を合わせ、水酸化ナトリウム溶液（水中１０％）を加えることによりｐＨ８〜９とした後、５００ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４．８ｇ（８３％）の（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−アミンを黄色油状物の形態で得た。次に、この化合物を、それが精製可能となるように、Ｂｏｃ基（（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル）で保護した。これを不活性雰囲気中、１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。２０ｍＬの１，４−ジオキサンに希釈した（Ｂｏｃ）２Ｏ（１０．２６ｇ、４７．０１ｍｍｏｌ、２．００当量）を滴下した。冷却浴を外し、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、３００ｍＬの水で中和し、５００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：２０、ｅｅ＝９３％）を用いて精製した。次に、これをヘキサン／アセトン混合物（約５〜１０／１、１ｇ／１０ｍＬ）中で再結晶させ、６ｇ（８４％）の化合物１Ｉを白色固体の形態で得た（ｅｅ＞９９％）．
【０４４９】
化合物１Ｊ：（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化３７】
0006567551.tif 000074
化合物１Ｉ（３ｇ、９．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、１０ｍＬのＤＣＭに溶かした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮し、２．０ｇ（６４％）の（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エタン−１−アミン、トリフルオロ酢酸を黄色油状物の形態で得た。この中間体を２０ｍＬのＤＣＭに再溶解させ、その後、化合物１Ｄ（１．８ｇ、６．２６ｍｍｏｌ、１．０５当量）、ＤＥＰＣ（１．１ｇ、６．７５ｍｍｏｌ、１．１３当量）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１．６４ｇ、１２．７１ｍｍｏｌ、２．１３当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：３）を用いて精製し、２．３ｇ（８１％）の化合物１Ｊを淡黄色固体の形態で得た。
【０４５０】
化合物１Ｋ：（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］−３−［（２Ｓ）−ピロリジン−２−イル］プロパンアミド、トリフルオロ酢酸
【化３８】
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化合物１Ｊ（２．２５ｇ、４．７５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、１０ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（１０ｍＬ）を加え、溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮し、２．１８ｇ（９４％）の化合物１Ｋを黄色油状物の形態で得た。
【０４５１】
化合物１Ｌ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−（ベンジルアミノ）−３−メチルペンタン酸
【化３９】
0006567551.tif 000076
２Ｎ水酸化ナトリウム溶液（３７５ｍＬ）に、（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−メチルペンタン酸（９８．４ｇ、７５０ｍｍｏｌ、１．００当量）を周囲温度で少量ずつ加えた。ベンズアルデヒド（７９．７ｇ、７５１．０２ｍｍｏｌ、１．００当量）を手早く加え、得られた溶液を３０分振盪した。水素化ホウ素ナトリウム（１０．９ｇ、２８８．１７ｍｍｏｌ、０．３８当量）を、温度を５〜１５℃の間に保持しながら少量ずつ加えた。周囲温度で４時間振盪を続けた。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈した後、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回洗浄した。水溶液のｐＨを２Ｎ塩酸溶液で７に調整した。生じた沈澱を濾取し、１４９．２ｇ（９０％）の化合物１Ｌを白色固体の形態で得た。
【０４５２】
化合物１Ｍ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタン酸
【化４０】
0006567551.tif 000077
化合物１Ｌ（２５ｇ、１１２．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ホルムアルデヒド（水中３６．５％、２２．３ｇ）の存在下でギ酸（３１．２ｇ）に溶かした。溶液を９０℃で３時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を２５０ｍＬのアセトン中で摩砕した後、濃縮した。この摩砕／蒸発操作を、５００ｍＬのアセトンを用いて２回繰り返し、２１．６ｇ（８１％）の化合物１Ｍを白色固体の形態で得た。
【０４５３】
化合物１Ｎ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタン−１−オール
【化４１】
0006567551.tif 000078
ＬｉＡｌＨ４（０．３６ｇ）を不活性雰囲気中、０℃で１０ｍＬのＴＨＦに懸濁させた。化合物１Ｍ（１．５ｇ、６．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）を、温度を０〜１０℃の間に保持しながら少量ずつ加えた。この反応混合物を６５℃で２時間振盪した後、再び０℃に冷却し、その後、３６０μｌの水、１ｍＬの１５％水酸化ナトリウムおよび３６０μｌの水を順次加えて中和した。沈澱したアルミニウム塩を濾去した。濾液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：５０）を用いて精製し、８２０ｍｇ（５８％）の化合物１Ｎを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４５４】
化合物１Ｏ：（２Ｓ，３Ｓ）−２−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メチルペンタナール
【化４２】
0006567551.tif 000079
塩化オキサリル（０．４ｍＬ）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶かした。溶液を−７０℃に冷却し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）の溶液を１５分間滴下した。この反応混合物を３０分振盪し、その後、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中、化合物１Ｎ（８２０ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を１５分間滴下した。この反応混合物をさらに３０分、低温で振盪した後、トリエチルアミン（２．５ｍＬ）をゆっくり加えた。この反応混合物を−５０℃で１時間振盪した後、冷却浴を外し、温度を常温に戻しながら、反応物を２５ｍＬの水で中和した。この溶液を３０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２００）を用いて精製し、０．４２ｇ（５２％）の化合物１Ｏを黄色油状物の形態で得た。
【０４５５】
化合物１Ｐ：（２Ｓ，３Ｓ）−Ｎ−ベンジル−１，１−ジメトキシ−Ｎ，３−ジメチルペンタン−２−アミン
【化４３】
0006567551.tif 000080
化合物１Ｏ（４．７ｇ、２１．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を０℃で２０ｍＬのメタノールに溶かした。濃硫酸（４．３ｍＬ）を滴下し、０℃で３０分間振盪を続けた。オルトギ酸トリメチル（２１．４ｍＬ）を加え、冷却浴を外し、反応媒体を周囲温度で３時間、振盪下で放置した。この反応媒体を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１００ｍＬの１０％Ｎａ２ＣＯ３および２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで順次洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．４ｇ（６０％）の化合物１Ｐを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４５６】
化合物１Ｑ：［［１−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）エテニル］オキシ］（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラン
【化４４】
0006567551.tif 000081
ジイソプロピルアミン（２０ｇ、１８６．７１ｍｍｏｌ、１．０８当量）を不活性雰囲気中、１７０ｍＬのＴＨＦに溶かし、−７８℃に冷却した。ｎＢｕＬｉ（２．４Ｍ、７８．８ｍＬ）を滴下し、溶液を低温で３０分振盪し（ＬＤＡ−リチウムジイソプロピルアミドを得るため）、その後、酢酸ｔｅｒｔ−ブチル（２０ｇ、１７２．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。この反応混合物を−７８℃で２０分振盪した後、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ、２５．８ｍＬ）および３５ｍＬのＴＨＦ中、ｔｅｒｔブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＤＭＳＣｌ、２８ｇ、１８５．８０ｍｍｏｌ、１．０８当量）の溶液を加えた。低温でさらに２０分間振盪を続けた後、冷却浴を外した。この溶液を減圧下で濃縮した。残渣を１００ｍＬの水に再溶解させ、１００ｍＬのＰＥで３回抽出した。有機相を合わせ、５００ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣を蒸留により精製し、１６．６ｇ（８３％）の化合物１Ｑを無色の油状物の形態で得た。
【０４５７】
化合物１Ｒ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［ベンジル（メチル）アミノ］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４５】
0006567551.tif 000082
化合物１Ｐ（２．０ｇ、７．５４ｍｍｏｌ、１．００当量）および化合物１Ｑ（２．６ｇ、１１．２８ｍｍｏｌ、１．５０当量）を不活性雰囲気中、３３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を０℃に冷却した。ＤＭＦ（１．２ｇ）を７．５ｍＬのＤＣＭ中、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（２．１ｇ）の溶液とともに滴下した。０℃で２４時間振盪を続けた。この反応媒体を３０ｍＬの炭酸ナトリウム（１０％）で１回および５０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００）を用いて精製し、１．８２ｇ（９１％）の化合物１Ｒを黄色油状物の形態で得た。
【０４５８】
化合物１Ｓ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタン酸塩酸塩
【化４６】
0006567551.tif 000083
化合物１Ｒ（２．４ｇ、６．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、Ｐｄ／Ｃ（０．１２ｇ）および濃塩酸（０．６３ｍＬ）の存在下で３５ｍＬのエタノールに溶かした。窒素雰囲気を水素雰囲気に置き換え、反応媒体を周囲温度で１８時間、振盪下で放置した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を５０ｍＬのヘキサン中で摩砕し、上清を取り出し、減圧下で乾燥させた後、１．６６ｇ（８２％）の化合物１Ｓを白色固体の形態で得た。
【０４５９】
化合物１Ｔ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ(mthoxy)−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４７】
0006567551.tif 000084
（２Ｓ）−２−［［（ベンジルオキシ）カルボニル］アミノ］−３−メチルブタン酸（１５ｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＩＥＡ（３８．３ｍＬ）およびブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ、３２．３ｇ）の存在下で３００ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を周囲温度で３０分振盪した後、化合物１Ｓ（１５．９９ｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０７当量）を加えた。この反応媒体を２時間振盪した後、濃縮した。残渣をアセトニトリル（ＡＣＮ）と水の混合物（４０分で３０：７０から１００：０）を用いて逆相（Ｃ１８）で精製し、１７ｇ（５８％）の化合物１Ｔを無色の油状物の形態で得た。
【０４６０】
化合物１Ｕ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化４８】
0006567551.tif 000085
化合物１Ｔ（７６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、Ｐｄ／Ｃ（０．０５ｇ）の存在下で１０ｍＬのエタノールに溶かした。窒素雰囲気を水素雰囲気に置き換え、この反応物を周囲温度で２時間振盪した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６４ｍｇの化合物１Ｕを無色の油状物の形態で得た。
【０４６１】
化合物１Ｖ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノエート
【化４９】
0006567551.tif 000086
化合物１Ｕ（１８．１９ｇ、５０．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）を重炭酸ナトリウム（１２．７８ｇ、１５２ｍｍｏｌ、３．００当量）およびクロロギ酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ、１９．６９ｇ、７６ｍｍｏｌ、１．５０当量）の存在下で４００ｍＬの１，４−ジオキサン／水混合物（１：１）に溶かした後、周囲温度で２時間振盪した。次に、この反応媒体を５００ｍＬの水で希釈し、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、２００ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、４０ｇの部分的に精製された化合物１Ｖを淡黄色油状物の形態で得た。
【０４６２】
化合物１Ｗ：（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］アミノ］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタン酸
【化５０】
0006567551.tif 000087
化合物１Ｖ（４０ｇ、６８．８８ｍｍｏｌ、１．００当量）を中性雰囲気中、６００ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（３００ｍＬ）を加えた。この溶液を周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：１０）を用いて精製し、２３．６ｇ（６５％）の化合物１Ｗを無色の油状物の形態で得た。
【０４６３】
化合物１Ｘ：Ｎ−［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバミン酸９Ｈ−フルオレン−９−イルメチル
【化５１】
0006567551.tif 000088
化合物１Ｗ（２．５３ｇ、４．８２ｍｍｏｌ、１．０８当量）を化合物１Ｋ（２．１８ｇ、４．４７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＥＰＣ（８７５ｍｇ、５．３７ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（１．２５ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、２．１６当量）の存在下で２０ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、５０ｍＬの飽和ＫＨＳＯ４および１００ｍＬの水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：２００から１：４０）を用いて精製し、２．８ｇ（７１％）の化合物１Ｘを淡黄色固体の形態で得た。
【０４６４】
化合物１Ｙ：（２Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−［（３Ｒ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
【化５２】
0006567551.tif 000089
化合物１Ｘ（２．８ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）をピペリジン（３ｍＬ）の存在下でアセトニトリル（ＡＣＮ、１２ｍＬ）に溶かし、周囲温度で１８時間、振盪シアで放置した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、１００ｍＬのＤＣＭで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてメタノールとＤＣＭの混合物（１：１００から１：４０）を用いて精製し、１．２ｇ（５７％）の化合物１Ｙを黄色固体の形態で得た。
【０４６５】
化合物１ＺＡ：（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化５３】
0006567551.tif 000090
（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］−３−メチルブタン酸（６３ｇ、２８９．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ヨードメタン（１８１ｍＬ）の存在下でＴＨＦ（１０００ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、水素化ナトリウム（１１６ｇ、４．８３ｍｏｌ、１６．６７当量）を少量ずつ加えた。この反応混合物を０℃で１．５時間振盪した後、冷却浴を外し、１８時間振盪を続けた。この反応物を２００ｍＬの水で中和した後、減圧下で濃縮した。残った水相を４リットルの水で希釈し、２００ｍＬのＥｔＯＡｃで１回洗浄し、そのｐＨを１Ｎ塩酸溶液で３〜４の間に調整した。得られた混合物を１．２ＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、６０ｇ（８９％）の化合物１ＺＡを黄色油状物の形態で得た。
【０４６６】
化合物１ＺＢ：（２Ｓ）−２−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸ベンジル
【化５４】
0006567551.tif 000091
化合物１ＺＡ（４７ｇ、２０３．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＬｉ２ＣＯ３（１５．８ｇ、２１３．８３ｍｍｏｌ、１．０５当量）の存在下でＤＭＦ（６００ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、臭化ベンジル（ＢｎＢｒ  ５７．９ｇ、３３８．５３ｍｍｏｌ、１．６７当量）を滴下した。この反応混合物を一晩振盪下で放置した後、４００ｍＬの水で中和し、濾過した。得られた溶液を５００ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１００から１：２０）を用いて精製し、２２．５ｇ（３４％）の化合物１ＺＢを黄色油状物の形態で得た。
【０４６７】
化合物１ＺＣ：（２Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）ブタン酸ベンジル塩酸塩
【化５５】
0006567551.tif 000092
化合物１ＺＢ（２２．５ｇ、７０．００ｍｍｏｌ、１．００当量）を１５０ｍＬのＤＣＭに溶かした。気体塩酸をバブリングさせた。この反応物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮し、１７ｇ（９４％）の化合物１ＺＣを黄色固体の形態で得た。
【０４６８】
化合物１ＺＤ：Ｎ−（３，３−ジエトキシプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５６】
0006567551.tif 000093
３，３−ジエトキシプロパン−１−アミン（６ｇ、４０．７６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＥＡ（４．４５ｇ、４３．９８ｍｍｏｌ、１．０８当量）の存在下で１，４−ジオキサン（３０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。２０ｍＬの１，４−ジオキサンに希釈した（Ｂｏｃ）２Ｏ（９．６ｇ、４３．９９ｍｍｏｌ、１．０８当量）を滴下した。この溶液を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した後、１０ｍＬの水で中和した。ｐＨをＨＣｌ（１％）で５に調整した。この溶液を５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、８．２１ｇ（８１％）の化合物１ＺＤ淡黄色油状物の形態で得た。
【０４６９】
化合物１ＺＥ：Ｎ−（３−オキソプロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５７】
0006567551.tif 000094
化合物１ＺＤ（８．２０ｇ、３３．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）を１８．７５ｍＬの酢酸に溶かし、周囲温度で一晩、振盪下で放置した。次に、この反応媒体を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、３０ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、５ｇ（８７％）の化合物１ＺＥを暗赤色油状物の形態で得た。
【０４７０】
化合物１ＺＦ：（２Ｓ）−２−［（３−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］プロピル）（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化５８】
0006567551.tif 000095
化合物１ＺＥ（２．４ｇ、１３．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（３．５６ｇ、１３．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＤＩＥＡ（９．１６ｍＬ、４．００当量）の存在下で５０ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で３０分振盪した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．８７ｇ、２７．７０ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。一晩振盪を続けた後、反応物を１００ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：４）を用いて部分的に精製した。得られた粗生成物をＰｄ／Ｃ（１．２ｇ）の存在下で２０ｍＬのメタノールに再溶解させ、常温および常圧で２０分間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、２００ｍｇ（５％）の化合物１ＺＦを白色固体の形態で得た。
【０４７１】
化合物１ＺＧ：Ｎ−（３−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］チル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバモイル］−２−メチルプロピル］（メチル）アミノ］プロピル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化５９】
0006567551.tif 000096
化合物１Ｙ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＦ（２６．２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．２０当量）、ＤＩＥＡ（３７．７ｍＬ）およびＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ、４３．３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．５０当量）の存在下で２ｍＬのＤＭＦに溶かした。この反応物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、１０ｍＬの水で希釈し、５ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、１００ｍｇの化合物１ＺＧを部分的に精製された無色の油状物の形態で得た。
【０４７２】
化合物１ＺＧ（９０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を中性雰囲気中、２ｍＬのＤＣＭに溶かし、この溶液を氷浴で冷却した。ＴＦＡ（１ｍＬ）を加え、この反応物を周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％のＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、７分で１８％から３１％ＡＣＮへ、次いで、２分で３１％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１を２５％（２３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４７３】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３カラム、３μｍ、４．６×１００ｍｍ、３５℃、  １ｍＬ／分、水中３０％から６０％ＡＣＮへ（６分で２０ｍＭ酢酸アンモニウム）、ＥＳＩ（Ｃ４４Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８２７．５３）ｍ／ｚ：８２９（ＭＨ＋）、５．８４分（９３．７％、２５４ｎｍ）。
1H NMR(300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.85 - 7.80 (m, 1H)、 7.69 - 7.66 (m, 1H), 7.40 - 7.10 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.22 -4.00 (m, 1H), 3.89 - 0.74 (m, 58H)。
【０４７４】
化合物２
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−アミノピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化６０】
0006567551.tif 000097
【０４７５】
化合物２Ａ：（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６１】
0006567551.tif 000098
化合物１Ｄ（２．５ｇ、８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）および（１Ｓ，２Ｒ）−２−アミノ−１−フェニルプロパン−１−オール（１．３１５ｇ、８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（３５ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．３９ｍＬ）およびＴＥＡ（１．８２ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で４時間振盪した。この反応混合物を２００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．６ｇ（９８％）の化合物２Ａを黄色固体の形態で得た。
【０４７６】
化合物２Ｂ：（２Ｒ，３Ｒ）−Ｎ−（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパンアミド２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化６２】
0006567551.tif 000099
化合物２Ａ（２．７ｇ、６．４２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かした後、０℃に冷却した。ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加え、この溶液を０℃で２時間振盪した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、４．４ｇの化合物２Ｂを黄色油状物の形態で得た。
【０４７７】
化合物２Ｃ：（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル
【化６３】
0006567551.tif 000100
化合物２Ｂ（４．４ｇ、１０．１３ｍｍｏｌ、１．００当量）および１Ｗ（５．３１ｇ、１０．１２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４５ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．６２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（８．４ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、圧力下で濃縮し、３．３ｇ（３９％）の化合物２Ｃを黄色固体の形態で得た。
【０４７８】
化合物２Ｄ：（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
【化６４】
0006567551.tif 000101
化合物２Ｃ（３００ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＡＣＮ（２ｍＬ）およびピペリジン（０．５ｍＬ）に溶かした。この溶液を周囲温度一晩、振盪下で放置した後、減圧下で蒸発乾固した。残渣をシリカカラムにてＤＣＭとＭｅＯＨの混合物（１：１００）を用いて精製し、１５０ｍｇ（６８％）の化合物２Ｄを白色固体の形態で得た。
【０４７９】
化合物２Ｅ：２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）イソニコチン酸メチル
【化６５】
0006567551.tif 000102
２−アミノピリジン−４−カルボン酸メチル（２ｇ、１３．１４ｍｍｏｌ、１．００当量）をｔｅｒｔ−ブタノール（２０ｍＬ）に溶かし、その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４．０２ｇ、１８．４２ｍｍｏｌ、１．４０当量）を加えた。この反応混合物を６０℃で一晩振盪した後、この反応を１Ｍ  ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）の添加により停止させた。固体を濾別し、５０ｍＬのＥｔＯＨで洗浄した後、真空乾燥させ、２．５ｇ（７５％）の化合物２Ｅを白色固体の形態で得た。
【０４８０】
化合物２Ｆ：（４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６６】
0006567551.tif 000103
化合物２Ｅ（２．５ｇ、９．９１ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＣａＣｌ２（１．６５ｇ）をＥｔＯＨ（３０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＮａＢＨ４（１．１３ｇ、２９．８７ｍｍｏｌ、３．０１当量）を徐々に加えた。この溶液を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、この反応を水（５０ｍＬ）の添加により停止させた。この混合物を２０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、２０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２．０ｇ（９０％）の化合物２Ｆを無色の固体の形態で得た。
【０４８１】
化合物２Ｇ：（４−ホルミルピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化６７】
0006567551.tif 000104
化合物２Ｆ（２．５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＥ（２５ｍＬ）に溶かした後、１９．４ｇ（２２３．１４ｍｍｏｌ、２０．０２当量）のＭｎＯ２を加えた。この混合物を７０℃で一晩、振盪下で放置した後、固体を濾去した。濾液を蒸発乾固させ、１．４ｇ（５７％）の化合物２Ｇを白色固体の形態で得た。
【０４８２】
化合物２Ｈ：（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化６８】
0006567551.tif 000105
化合物２Ｇ（２．３ｇ、１０．３５ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（２．９３ｇ、１１．３７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＩＥＡ（５．３９ｇ、４１．７１ｍｍｏｌ、４．０３当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（４．３９ｇ、２０．７１ｍｍｏｌ、２．００当量）の存在下で２５ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で６時間振盪した後、６０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で中和し、２０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、２０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１５）を用いて精製し、２．７ｇ（６１％）の化合物２Ｈを白色固体の形態で得た。
【０４８３】
化合物２Ｉ：（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化６９】
0006567551.tif 000106
化合物２Ｈ（５００ｍｇ、１．１７ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）の存在下でに１０ｍＬのＡｃＯＥｔおよび２ｍＬのメタノール溶かし、周囲温度および大気圧で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、２５４ｍｇ（６４％）の化合物２Ｉを無色の固体の形態で得た。
【０４８４】
化合物２Ｊ：（４−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−３，６−ジイソプロピル−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化７０】
0006567551.tif 000107
化合物２Ｊは、ＤＭＦ（３ｍＬ）中、アミン２Ｄ（８５．２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．５０当量）、酸２Ｉ（３１．７ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＨＡＴＵ（４２．９ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（３６．７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、３．０２当量）から、化合物１ＺＧと同様にして製造された。蒸発乾固の後、１００ｍｇの粗生成物を白色固体の形態で得た。
【０４８５】
化合物２Ｊ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を２ｍＬのＤＣＭおよび１ｍＬのＴＦＡに溶かした。この反応物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物２を６％（６．３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４８６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．８ｍＬ／分、６分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮへ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７３Ｎ７Ｏ７、正確な質量８２３．５６）ｍ／ｚ：８２４．５（ＭＨ＋）および４１２．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、３．２１分（９９．２％、２１０ｎｍ）
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.81 - 7.79 (m, 1H)、 7.39 - 7.29 (m, 5H)、 6.61 - 6.59 (m, 2H)、 4.84 - 4.52 (m, 1H)、 4.32 - 4.02 (m, 1H)、 3.90 - 2.98 (m, 10H)、 2.90 - 2.78 (m, 1H)、 2.55 - 0.81 (m, 39H)。
【０４８７】
参照化合物３
（（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
【化７１】
0006567551.tif 000108
化合物３Ａ：（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−（（（Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化７２】
0006567551.tif 000109
化合物１Ｄ（３ｇ、１０．４４ｍｍｏｌ、１．００当量）および（Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロパン酸メチル（２．２５ｇ、１２．５５ｍｍｏｌ、１．２０当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（１．６７ｍＬ、１．０５当量）およびＴＥＡ（３．６４ｍＬ、２．５０当量）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応混合物を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、１００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、１００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、圧力下で濃縮し、４ｇ（８５％）の化合物３Ａを無色の油状物の形態で得た。
【０４８８】
化合物３Ｂ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−メトキシ−２−メチル−３−（（Ｓ）−ピロリジン−２−イル）プロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチルの２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化７３】
0006567551.tif 000110
化合物３Ａ（５ｇ、１１．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）は、不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かした。ＴＦＡ（２５ｍＬ）を加え、溶液を２時間振盪した。この反応混合物を減圧下で濃縮し、８ｇの化合物３Ｂを黄色油状物の形態で得た。
【０４８９】
化合物３Ｃ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化７４】
0006567551.tif 000111
化合物３Ｂ（８．０３ｇ、１７．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）および１Ｗ（９．１ｇ、１７．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（８０ｍＬ）に溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、ＤＥＰＣ（２．８ｍＬ）およびＤＩＥＡ（１２ｍＬ）を滴下した。この反応混合物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。反応混合物を２００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＫＨＳＯ４（１ｍｏｌ／Ｌ）で１回、５０ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で１回、５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、５ｇ（３４％）の化合物３Ｃを黄色固体の形態で得た。
【０４９０】
化合物３Ｄ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−アミノ−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化７５】
0006567551.tif 000112
化合物３Ｃ（５．５ｇ、６．４３ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＤＭＦ（１００ｍＬ）中、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ、２．６１ｇ、９．９８ｍｍｏｌ、１．５５当量）の溶液に溶かした。この溶液を周囲温度で２時間振盪した後、１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせた後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、３．３ｇ（８１％）の化合物３Ｄを黄色固体の形態で得た。
【０４９１】
化合物３Ｅ：（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタン酸ベンジル
【化７６】
0006567551.tif 000113
ピリジン−４−カルバルデヒド（１ｇ、９．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（２．９ｇ、１１．２５ｍｍｏｌ、１．２１当量）およびチタンイソプロポキシド（ＩＶ）（４．１９ｍＬ、１．４０当量）の存在下で１０ｍＬの１，２−ジクロロエタン（ＤＣＥ）に溶かした。この混合物を周囲温度で３０分間振盪した後、２．７７ｇのＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１３．０７ｍｍｏｌ、１．４０当量）を加えた。この反応媒体を振盪下で一晩放置した後、１００ｍＬの水で中和し、この混合物を５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾固させた。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：２０）を用いて精製し、１．３ｇ（４５％）の化合物３Ｅを無色の油状物の形態で得た。
【０４９２】
化合物３Ｆ：（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタン酸
【化７７】
0006567551.tif 000114
化合物３Ｅ（８００ｍｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（３００ｍｇ）の存在下で３０ｍＬのＡｃＯＥｔに溶かし、周囲温度および大気圧下で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカカラムにてＤＣＭとＭｅＯＨの混合物（１００：１から５：１）を用いて精製し、１００ｍｇ（１８％）の化合物３Ｆを白色固体の形態で得た。
【０４９３】
化合物３Ｄ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）および３Ｆ（２６．３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、１．５０当量）を３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この溶液を０℃に冷却した後、０．０１８ｍＬのＤＥＰＣおよび０．０３９２ｍＬのＤＩＥＡを加えた。この反応物を０℃で２時間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応媒体を減圧下で濃縮し、残基（７０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％のＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物３を２７％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０４９４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３６．５）ｍ／ｚ：８３７．５（ＭＨ＋）および４１９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２（１００％））、７．０４分（９０．０％、２１０ｎｍ）
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.76 - 8.74 (m, 2H)、 8.53 - 8.48 (m, 0.4H, NHCO不完全交換)、 8.29 - 8.15 (m, 0.8H, NHCO不完全交換)、 8.01 (s, 2H), 7.31 - 7.22 (m, 5H), 4.88 - 4.68 (m, 3H)、 4.31 - 4.07 (m, 2H)、 3.94 - 2.90 (m, 18H)、 2.55 - 0.86 (m, 38H)。
【０４９５】
参照化合物４
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（ピリジン−４−イルメチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸、トリフルオロ酢酸
【化７８】
0006567551.tif 000115
化合物３（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）およびピペリジン（２．５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を振盪下で一晩放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、２０ｍｇ（２０％）の化合物４を白色固体の形態で得た。
【０４９６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＡＣＮへ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７０Ｎ６Ｏ８、正確な質量８２２．５）ｍ／ｚ：８２３．５（ＭＨ＋）および４１２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．８４分（８９．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.79 - 8.78 (m, 2H)、 8.09 (m, 2H)、 7.30 - 7.21 (m, 5H)、 4.80 - 4.80 (m, 1H), 4.36 - 0.87 (m, 58H)。
【０４９７】
化合物６
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
【化７９】
0006567551.tif 000116
化合物６Ａ：（２Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−［（Ｒ）−［（２Ｓ）−１−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−［（２Ｓ）−２−［（２Ｓ）−２−［（３−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］プロピル）（メチル）アミノ］−３−メチルブタンアミド］−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド］−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル］ピロリジン−２−イル］（メトキシ）メチル］プロパンアミド］−３−フェニルプロパン酸メチル
【化８０】
0006567551.tif 000117
化合物３Ｄ（１５７．５ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．００当量）を０℃で不活性雰囲気中、カルボン酸１ＺＦ（７８．７ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＥＰＣ（４６μｌ）およびＤＩＥＡ（１２４μｌ）の存在下で３ｍＬのＤＣＭに溶かした。この反応混合物を低温で２時間振盪した後、冷却浴を外し、４時間振盪を続けた。次に、これを減圧下で濃縮し、２００ｍｇの化合物６Ａを粗黄色油状物の形態で得た。これはそのまま次の工程で使用した。
【０４９８】
化合物６Ａ（２００ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、０℃で、２ｍＬのＤＣＭに溶かした。ＴＦＡ（１ｍＬ）を滴下し、冷却浴を外した。この反応混合物を周囲温度で１時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、６０ｍｇ（２工程の収率２６％）の化合物６を白色固体の形態で得た。
【０４９９】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．１％Ｈ３ＰＯ４）中３０から８０％メタノール）、ＥＳＩ（Ｃ４３Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８０２．５６）ｍ／ｚ：８０４（ＭＨ＋）、１１．５０分（９１．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.52 (d, 0.3H, NHCO不完全交換)、 8.25 (d, 0.5H, NHCO不完全交換)、 7.30-7.22 (m, 5H)、 4.9-4.6 (m, 3H)、 4.2-4.0 (m, 1H)、 4.0-0.86 (m, 61H)。
【０５００】
化合物７
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノプロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，ビストリフルオロ酢酸
【化８１】
0006567551.tif 000118
化合物６（７０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（２．５ｍＬ）とピペリジン（５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：で緩衝させた０．０５％ＦＡ水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、ＵＶ  Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、１４．６ｍｇ（２１％）の化合物７を白色固体の形態で得た。
【０５０１】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、１．５ｍＬ／分、４０℃、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中０から８０％メタノール、ＥＳＩ（Ｃ４２Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量７８８．５４）ｍ／ｚ：７９０（ＭＨ＋）、５．７１分（９６．８３％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.42 (d, 0.3H, NHCO不完全交換)、 8.15 (d, 0.2H, NHCO不完全交換)、 7.31-7.21 (m, 5H)、 4.9-4.6 (m, 3H)、 4.25-4.0 (m, 1H)、 4.0-0.86 (m, 59H)。
【０５０２】
化合物８
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−アミノピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化８２】
0006567551.tif 000119
化合物８Ａ：（４−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−３，６−ジイソプロピル−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）ピリジン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８３】
0006567551.tif 000120
化合物８Ａは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（３９ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸２Ｉ（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＨＡＴＵ（２７ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、１．２０当量）およびＤＩＥＡ（２３．２ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、３．０１当量）から、化合物２Ｊと同様にして合成された。粗生成物を精製しなかった。
【０５０３】
化合物８：化合物８は、中間体８Ａ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物（１００ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、７分で１８％から３１％ＡＣＮへ、次いで、２分で３１％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物８を８％（８ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５０４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３カラム、３μｍ、４．６×１００ｍｍ、３５℃、  １．８ｍＬ／分、７分で水（０．０５％ＴＦＡ）中２５％から８０％ＡＣＮへ）、ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７２Ｎ８Ｏ６Ｓ、正確な質量８７６．５）ｍ／ｚ：８７７．５（ＭＨ＋）および４３９．５（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、４．８７分（９５．１％、２５４ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.83 - 7.78 (m, 2H)、 7.56 - 7.52 (m, 1H)、 7.34 - 7.17 (m, 5H)、 6.64 - 6.62 (m, 2H)、 5.77 - 5.61 (m, 1H)、 4.86 - 4.68 (m, 2H)、 4.25 - 4.05 (m, 1H)、 3.87 - 2.83 (m, 17H)、 2.56 - 0.84 (m, 37H)。
【０５０５】
化合物９
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−アミノピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
【化８４】
0006567551.tif 000121
【０５０６】
化合物９Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化８５】
0006567551.tif 000122
化合物９Ａは、ＤＣＭ（５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（１７０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸２Ｉ（９９．７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１．１０当量）、ＤＥＰＣ（０．０４９ｍＬ、１．０５当量）およびＤＩＥＡ（０．１３３ｍＬ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥ（１：１）の混合物を用いて精製し、２００ｍｇ（７８％）の化合物９Ａを淡黄色固体の形態で得た。
【０５０７】
化合物９：化合物９は、ＤＣＭ（４ｍＬ）およびＴＦＡ（２ｍＬ）中、中間体９Ａ（２００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物９を１０％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５０８】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７３Ｎ７Ｏ８、正確な質量８５１．６）ｍ／ｚ：８５２．５（ＭＨ＋）および４２６．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．９２分（９２．７％、２５４ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.51 - 8.45 (m, 0.5H, NH不完全交換)、 8.30 - 8.24 (m, 0.3H, NH不完全交換)、 8.17 - 8.07 (m, 0.8H, NH不完全交換)、 7.79 - 7.77 (m, 1H)、 7.36 - 7.18 (m, 5H)、 7.21 - 7.16 (m, 1H)、 6.94 - 6.89 (m,1H)、 4.85 - 4.65 (m, 3H)、 4.20 - 3.10 (m, 20H)、 3.00 - 2.85 (m, 2H)、 2.55 - 0.80 (m, 36H)。
【０５０９】
化合物１０
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（２−アミノピリジン−４−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリフルオロ酢酸
【化８６】
0006567551.tif 000123
化合物１０：化合物９（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）およびピペリジン（２．５ｍＬ）の混合物に溶かした。この反応混合物を振盪下、周囲温度で一晩放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、３２．２ｍｇ（３３％）の化合物１０を白色固体の形態で得た。
【０５１０】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％〜９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７１Ｎ７Ｏ６、正確な質量８３７．５）ｍ／ｚ：８３８．５（ＭＨ＋）および４１９．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．８１分（９７．７％、２２０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.41 - 8.32 (m, 0.3H, NH不完全交換)、 8.20 - 8.07 (m, 0.8H, NH不完全交換)、 7.82 - 7.75 (m, 1H)、 7.36 - 7.158 (m, 5H)、 7.12 - 7.03 (m, 1H)、 6.94 - 6.88 (m,1H)、 4.85 - 4.66 (m, 3H)、 4.20 - 3.10 (m, 16H)、 3.00 - 2.85 (m, 2H)、 2.57 - 0.80 (m, 37H)。
【０５１１】
化合物１１
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化８７】
0006567551.tif 000124
化合物１１Ａ：Ｎ−［４−（２−ヒドロキシエチル）フェニル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８８】
0006567551.tif 000125
ＴＨＦ（２００ｍＬ）中、２−（４−アミノフェニル）エタノール（１０ｇ、７２．９ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１６．７ｇ、７７ｍｍｏｌ、１．０５当量）を加え、この反応物を周囲温度で一晩撹拌した。この混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水（２００ｍＬ）、次いで、ＨＣｌ  １Ｍ（１００ｍＬ）、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、次いで、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させた後、減圧下で蒸発乾固させた。粗生成物をヘプタン（１５０ｍＬ）で２回摩砕し、真空下で乾燥させ、化合物１１Ａを白色固体として得た（１４．７ｇ、８４％）。
【０５１２】
化合物１１Ｂ：Ｎ−［４−（２−オキソエチル）フェニル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化８９】
0006567551.tif 000126
化合物１１Ａ（２．５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ、１．００当量）を２５ｍＬのＤＣＭに溶かした後、−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（１０ｍＬ）中デス・マーチン・ペルヨージナン溶液（ＤＭＰ、６．７１ｇ、１５．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を滴下した。冷却浴を外し、周囲温度で１時間振盪を続けた。この反応物を重炭酸ナトリウム飽和水溶液とＮａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液の５０／５０混合物６０ｍＬで中和した。得られた溶液を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、ＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １／１５）で精製し、１．０ｇ（４０％）の化合物１１Ｂを淡黄色固体の形態で得た。
【０５１３】
化合物１１Ｃ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸ベンジル
【化９０】
0006567551.tif 000127
化合物１ＺＣ（３．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ、１．１当量）をＤＩＥＡ（６．４ｇ、４９．７ｍｍｏｌ、４．０当量）、アルデヒド１１Ｂ（２．９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５．２３ｇ、４９．７ｍｍｏｌ、２．０当量）の存在下でＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、６０ｍＬの重炭酸ナトリウム飽和溶液で中和した。得られた溶液を３０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、ＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １：２０）で精製し、３．７ｇ（６８％）の化合物１１Ｃを黄色油状物の形態で得た。
【０５１４】
化合物１１Ｄ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化９１】
0006567551.tif 000128
化合物１１Ｃ（２ｇ、４．５ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ（２ｇ）の存在下で１０ｍＬのメタノールに溶かし、常温および常圧で２時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１．２ｇ（７５％）の化合物１１Ｄを黄色油状物の形態で得た。
【０５１５】
化合物１１Ｅ：（２Ｓ）−２−［［２−（４−［［（ｔｅｒｔ−ブトキシ）カルボニル］（メチル）アミノ］フェニル）エチル］（メチル）アミノ］−３−メチルブタン酸
【化９２】
0006567551.tif 000129
化合物１１Ｄ（１．２ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶かした。反応媒体を氷浴で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、５４９ｍｇ、１３．７ｍｍｏｌ、４．０当量）を少量ずつ加えた後、ヨードメタン（４．９ｇ、３４ｍｍｏｌ、１０当量）を加えた。この反応物を周囲温度で(at ambient teperature)一晩、振盪下で放置した後、水で中和し、１００ｍＬのＥｔＯＡｃで洗浄した。水溶液のｐＨを１Ｎ  ＨＣｌで６〜７に調整した。この水溶液を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、８００ｍｇ（６４％）の化合物１１Ｅを黄色固体の形態で得た。
【０５１６】
化合物１１Ｆ：Ｎ−［４−（２−［［（１Ｓ）−１−［［（１Ｓ）−１−［［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−２−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］カルバモイル］エチル］ピロリジン−１−イル］−５−メチル−１−オキソヘプタン−４イル］（メチル）カルバモイル］−２−メチルプロピル］カルバモイル］−２−メチルプロピル］（メチル）アミノ］エチル）フェニル］−Ｎ−メチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化９３】
0006567551.tif 000130
化合物１１Ｆは、アミン１Ｙ（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．２当量）および酸１１Ｅ（７０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１．０当量）から、化合物６Ａと同様にして製造された。シリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １：１）での精製後、１００ｍｇ（５２％）の目的生成物を淡黄色固体の形態で得た。
【０５１７】
化合物１１は、中間体１１Ｆ（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）から、化合物１と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１１を３９％（３９．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５１８】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中５０から９５％メタノール）、ＥＳＩ（Ｃ５０Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量９０３．５７）ｍ／ｚ：９０４．５（ＭＨ＋）、７．５３分（９３．６８％、２５４ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.84 (d, 0.5H, NHCO不完全交換)、 8.7-8.5 (m, 0.9H, NHCO不完全交換)、 7.76-7.73 (m, 1H)、 7.55 - 7.4 (m, 1H)、 7.28-7.22 (m, 7H)、 7.08-7.05 (m, 2H)、 5.51-5.72 (m, 1H)、 4.9-4.80 (m, 2H)、 4.3-0.7 (m, 60H)。
【０５１９】
化合物１２
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
【化９４】
0006567551.tif 000131
化合物１の合成の最終段階と同様にして、化合物１２をアミン３Ｄ（１１８ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）および酸１１Ｅ（８２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）から２段階で製造した。最終残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１２を７％（１３．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５２０】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０から９５％メタノール）、ＥＳＩ（Ｃ４９Ｈ７８Ｎ６Ｏ８、正確な質量８７８．５９）ｍ／ｚ：８７９．７（ＭＨ＋）、１０．０７分（９０．６％、２５４ｎｍ）。
1H:NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.40 (se, 2H)、 7.38-7.22 (m, 7H)、 4.95-4.7 (m, 3H)、 4.2-4.0 (m, 1H)、 3.9-0.86 (m, 62H)。
【０５２１】
化合物１３
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）フェネチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリフルオロ酢酸
【化９５】
0006567551.tif 000132
化合物１３は、化合物１２（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）から、化合物７と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１３を２０％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５２２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、１．５ｍＬ／分、４０℃、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０から９５％メタノール）、ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７６Ｎ６Ｏ８、正確な質量８６４．５７）ｍ／ｚ：８６５．６（ＭＨ＋）、６．０５分（９０．９％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.32-7.19 (m, 9H)、 4.9-4.65 (m, 3H)、 4.2-4.0 (m, 1H)、 3.9-0.86 (m, 59H)。
【０５２３】
化合物１４
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化９６】
0006567551.tif 000133
化合物１４Ａ：（３−（ヒドロキシメチル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化９７】
0006567551.tif 000134
（３−アミノフェニル）メタノール（３ｇ、２４．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＨＦ（６０ｍＬ）に溶かし、その後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（６．３８ｇ、２９．２３ｍｍｏｌ、１．２０当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、この反応物を２００ｍＬの水を加えて希釈した。生成物を１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した後、有機相を再び合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、粗生成物（１３．８５ｇの化合物１４Ａ）を黄色油状物の形態で得た。
【０５２４】
化合物１４Ｂ：（３−ホルミルフェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化９８】
0006567551.tif 000135
化合物１４Ａ（１３．８ｇ、６１．８１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＥ（４００ｍＬ）に溶かした後、ＭｎＯ２（５４ｇ、６２１．１４ｍｍｏｌ、１０．０５当量）を加えた。この混合物を周囲温度で３日間、振盪下で放置し、その後、これらの固体を濾去した。濾液を蒸発乾固させ、残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：３０）を用いて精製し、３ｇ（２２％）の化合物１４Ｂを白色固体の形態で得た。
【０５２５】
化合物１４Ｃ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化９９】
0006567551.tif 000136
化合物１４Ｂ（１ｇ、４．５２ｍｍｏｌ、１．００当量）を化合物１ＺＣ（１．１６ｇ、４．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＥＡ（３ｍＬ）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１．９２ｇ、９．０６ｍｍｏｌ、２．０１当量）の存在下で２０ｍＬのＴＨＦに溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、１００ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：５０）を用いて精製し、１．９ｇ（９９％）の化合物１４Ｃを白色固体の形態で得た。
【０５２６】
化合物１４Ｄ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１００】
0006567551.tif 000137
化合物１４Ｃ（１ｇ、２．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（４００ｍｇ）の存在下で３０ｍＬのＡｃＯＥｔおよび４ｍＬのメタノールに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６８０ｍｇ（８６％）の化合物１４Ｄを白色固体の形態で得た。
【０５２７】
化合物１４Ｅ：（３−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−３，６−ジイソプロピル−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）フェニル）  カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１０１】
0006567551.tif 000138
化合物１４Ｅは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（１０２．２７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０５３ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０４６ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１）を用いて精製し、１００ｍｇ（６７％）の化合物１４Ｅを淡黄色固体の形態で得た。
【０５２８】
化合物１４は、中間体１４Ｅ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１４を１０％（１０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５２９】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、４０℃、１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０％から９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８７５．５）ｍ／ｚ：８７６．５（ＭＨ＋）および４３８．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１１．３５分（９５．６％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.92 - 8.86 (m, 0.4H, NH不完全交換)、 8.70 - 8.54 (m, 0.6H, NH不完全交換)、 7.88 - 7.78 (m, 1H)、 7.60 - 7.50 (m, 1H)、 7.45 - 6.97 (m, 9H)、 5.80 - 5.65 (m, 1H)、 4.85 - 4.70 (m, 1H)、 4.40 - 0.80 (m, 56H)。
【０５３０】
化合物１５
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
【化１０２】
0006567551.tif 000139
化合物１５Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化１０３】
0006567551.tif 000140
化合物１５Ａは、ＤＣＭ（５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（２００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（２１２．６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．１１０３ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．１５７ｍＬ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物をシリカカラムにてＥｔＯＡｃとＰＥの混合物（１：１）を用いて精製し、２００ｍｇ（６７％）の化合物１５Ａを黄色固体の形態で得た。
【０５３１】
化合物１５は、中間体１５Ａ（２００ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ＵＶ検出器  ２５４５  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物１５を１９％（３８．６ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５３２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８５０．５）ｍ／ｚ：８５１．５（ＭＨ＋）および４２６．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．６１分（９１．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.53 - 7.42 (m, 1H)、 7.35 - 7.18 (m, 8H)、 4.88 - 4.79 (m, 2H)、 4.42 - 4.00 (m, 3H)、 3.93 - 2.71 (m, 22H)、 2.61 - 0.81 (m, 33H)。
【０５３３】
化合物１６〜２０
【化１０４】
0006567551.tif 000141
化合物１６〜２０は、アミン１Ｙおよび１ＺＣおよび対応するアルデヒドから、化合物１と同様にして製造された。
【０５３４】
化合物１６の製造に関与する（４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルは、４，４−ジエトキシブタン−１−アミンから、化合物１ＺＥと同様に２工程で製造された。
【０５３５】
化合物１７の製造に関与するｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−メチル−Ｎ−（２−オキソエチル）カルバメートは市販品であった。
【０５３６】
化合物１８の製造に関与する２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エトキシ）アセトアルデヒドは、次のように２工程で製造した：
２−（２−ヒドロキシエトキシ）エタン−１−オール（７ｇ、６６ｍｍｏｌ、９．９当量）を不活性雰囲気中、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ、０．１当量）の存在下でピリジン（１０ｍＬ）に溶かした。溶液を０℃に冷却した後、ＴＢＤＭＳＣｌ（１ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を少量ずつ加えた。この反応混合物を振盪下、周囲温度で一晩放置し、１００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１００ｍＬの１Ｎ  ＨＣｌで２回およびＮａＣｌ飽和水溶液で２回順次洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、１．３ｇ（８８％）の２−［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］エトキシ］エタン−１−オールを無色の油状物の形態で得た。
【０５３７】
塩化オキサリル（７６０ｍｇ、６ｍｍｏｌ、１．３当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶かし、−７８℃に冷却した。ＤＣＭ（５ｍＬ）に希釈したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１．０７ｇ、１３．７ｍｍｏｌ、３当量）を滴下した。低温度で３０分の振盪時間の後、５ｍＬのＤＣＭに溶かした２−［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］エトキシ］エタン−１−オール（１ｇ、４．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。低温度で１時間振盪を続けた後、ＴＥＡ（２．７８ｇ、２７ｍｍｏｌ、６当量）を添加した。この反応混合物を−７８℃で１５分および周囲温度で一晩振盪した後、１００ｍＬの水で中和した。次に、これを１００ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １：２０）で精製し、０．８ｇ（８０％）の２−［２−［（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ］エトキシ］アセトアルデヒドを無色の油状物の形態で得た。
【０５３８】
化合物１９の製造に関与する４−ホルミルフェニル炭酸ｔｅｒｔ−ブチルは、次のように一工程で製造した：４−ヒドロキシベンズアルデヒド（２．５ｇ、２０．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を不活性雰囲気中、１８−クラウン−６（０．２５ｇ）および炭酸カリウム（５ｇ）の存在下でＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を０℃に冷却した後、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５．８ｇ、２６．５８ｍｍｏｌ、１．３０当量）を加えた。低温で１時間振盪を続け、その後、この反応物を３０ｍＬの水で中和した。得られた溶液を２００ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ  １：１０）で精製し、４．２ｇ（９２％）の４−ホルミルフェニル炭酸ｔｅｒｔ−ブチルを淡黄色固体の形態で得た。
【０５３９】
化合物２０の製造に関与する４−ニトロベンズアルデヒド市販品であった。
【０５４０】
化合物１８の合成は、シリル化アルコールの脱保護により完了した。これは次に用に行った：（Ｓ）−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）（メチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−１１−イソプロピル−２，２，３，３，１０−ペンタメチル−４，７−ジオキサ−１０−アザ−３−シラノデカン−１２−アミド（４０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、１．０当量）を不活性雰囲気中、ＴＢＡＦ（２ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、２当量）の存在下でＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶かし、周囲温度で４時間振盪した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、５０ｍＬのＥｔＯＡで３回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、化合物１８を粗状態で得た。
【０５４１】
化合物２０の合成は、ニトロ基を還元することにより完了した。これは次のように行った：（２Ｓ）−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−２−［［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］カルバモイル］−１−メトキシ−２−メチルエチル］ピロリジン−１−イル］−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ，３−ジメチル−２−［（２Ｓ）−３−メチル−２−［メチル［（４−ニトロフェニル）メチル］アミノ］ブタンアミド］ブタンアミド（４０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ、１．０当量）を１５ｍＬのエタノールに溶かした。二水和塩化スズ（ＩＩ）（３１７ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ、３０当量）を加え、この溶液を振盪下、周囲温度で３日間放置した。この反応物を５０ｍＬの水で中和した後、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、化合物２０を粗状態で得た。
【０５４２】
【表２１】
0006567551.tif 000142
0006567551.tif 000143
【０５４３】
＊これらの化合物は、分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、対応するＴＦＡ塩を白色固体の形態で得た。
【０５４４】
最終生成物の同定：化合物１６  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、１ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中５から９５％メタノールへ）、ＥＳＩ：（Ｃ４５Ｈ７５Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８４１．５５）ｍ／ｚ８４２．５（ＭＨ＋）、４２１．９（１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２）、ＵＶ：１４．０２分（９４．９％、２１０ｎｍ）。1HMNR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.55-8.2 (m, 0.8H, NHCO不完全交換)、 8.0 (0.55H, NHCO不完全交換)、 7.70 (d, 1H)、 7.44 (d, 1H)、 7.21-7.15 (m, 5H)、 5.65-5.45 (m, 1H)、 4.8-4.5 (m, 2H)、 4.15-3.9 (m, 2H)、 3.8-0.6 (m, 59H)。化合物１７  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ  ＥＳＩ：（Ｃ４４Ｈ７３Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８２７．５３）ｍ／ｚ８２８（ＭＨ＋）、４１５［１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２］、  ＵＶ：ＲＴ＝６．７２分（９９．６％、２５４ｎｍ）。1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.82-7.80 (m, 1H)、 7.56-7.54 (m, 1H)、 7.35-7.20 (m, 5H)、 5.8-5.55 (m, 1H)、 4.85-4.6 (m, 1H)、 4.25-4.05 (m, 1H)、 3.95-0.8 (m, 60H)。化合物１８  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３、３μｍ、４．６×１００ｍｍ、１．２ｍＬ／分、４０℃、７分で水（０．０５％ＴＦＡ）中５から９５％メタノールへ）ｉ、ＥＳＩ：（Ｃ４５Ｈ７４Ｎ６Ｏ８Ｓ、正確な質量８５８．５３）ｍ／ｚ８５９（ＭＨ＋）、８８１（ＭＮａ＋）、４３０（１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２）、ＵＶ：４．８５分（９６．８％、２２０ｎｍ）。  1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.75-8.55 (m, 0.5H, NHCO不完全交換)、 7.85-7.80 (m, 1H)、 7.6-7.5 (m, 1H)、 7.40-7.15 (m, 5H)、 5.8-5.6 (m, 1H)、 4.8-4.55 (m, 2H)、 4.15-4.0 (m, 1H)、 4.0-0.8 (m, 60H)。化合物１９  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ  ＥＳＩ：（Ｃ４８Ｈ７２Ｎ６Ｏ７Ｓ、正確な質量８７６．５２）ｍ／ｚ８７７（ＭＨ＋）、４３９［１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２］、ＵＶ：ＲＴ＝１．７６分（９３．２％、２２０ｎｍ）。化合物２０  1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.85-7.80 (m, 1H)、 7.6-7.5 (m, 1H)、 7.4-7.15 (m, 5H)、 7.1-7.05 (m, 2H)、 6.73-6.70 (m, 2H)、 5.8-5.55 (m, 1H)、 5.0-4.7 (m, 2H)、 4.25-4.05 (m, 1H)、 4.0-0.8 (m, 54H)。ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ  ＥＳＩ：（Ｃ４８Ｈ７３Ｎ７Ｏ７Ｓ、正確な質量８７５．５３）ｍ／ｚ８７６（ＭＨ＋）、４３９［７５％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２］、ＵＶ：ＲＴ＝４．８３分（９６．８％、２５４ｎｍ）。1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.85-7.80 (m, 1H)、 7.6-7.5 (m, 1H)、 7.4-7.1 (m, 7H)、 6.76-6.72 (m, 2H)、 5.8-5.55 (m, 1H)、 4.9-4.65 (m, 2H)、 4.25-4.05 (m, 1H)、 4.0-0.8 (m, 54H)。
【０５４５】
化合物２１〜２４
【化１０５】
0006567551.tif 000144
化合物２１〜２４は、アミン１Ｙをアミン２Ｄに置き換え、化合物１７〜２０と同様にして製造された。
【０５４６】
【表２２】
0006567551.tif 000145
0006567551.tif 000146
【０５４７】
＊これらの化合物は、分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、対応するＴＦＡ塩を白色固体の形態で得た。
【０５４８】
最終生成物の同定：化合物２１  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（ＥＳＩ）（Ｃ４２Ｈ７４Ｎ６Ｏ７、正確な質量７７４．５６）ｍ／ｚ７７５（ＭＨ＋）、７９７（ＭＮａ＋）、３８８（１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２）、ＵＶ：３．１４分（９７．６％、２１５ｎｍ）。1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.05-7.7 (m, 0.8H, NHCO不完全交換)、 7.45-7.15 (m, 5H)、 4.9-4.45 (m, 2H)、 4.35-4.00 (m, 2H)、 3.95-0.8 (m, 61H)。化合物２２  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ  ＥＳＩ）（Ｃ４３Ｈ７５Ｎ５Ｏ９、正確な質量８０５．５６）ｍ／ｚ８０６（ＭＨ＋）、８２８（ＭＮａ＋）、４０４（１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２）、ＵＶ：４．４７分（９５．６％、２１５ｎｍ）。1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.1-7.7 (m, 0.4H, NHCO不完全交換)、 7.45-7.15 (m, 5H)、 4.9-4.5 (m, 3H)、 4.4-4.05 (m, 2H)、 4.05-0.8 (m, 61H)。化合物２３  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（ＥＳＩ）（Ｃ４６Ｈ７３Ｎ５Ｏ８、正確な質量８２３．５５）ｍ／ｚ８２４（ＭＨ＋）、８４６（ＭＮａ＋）、４１３（１００％、（Ｍ．２Ｈ＋）／２）、ＵＶ：４．７６分（９８．５％、２１５ｎｍ）。1H NMR (400MHz, CDCl3, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.5-7.2 (m, 5H)、 7.9-7.75 (m, 2H)、 5.5-5.3 (m, 1H)、 4.9-4.6 (m, 2H)、 4.55-4.15 (m, 4H)、 4.0-0.8 (m, 55H)。化合物２４  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（ＥＳＩ）（Ｃ４６Ｈ７４Ｎ６Ｏ７、正確な質量８２２．５６）ｍ／ｚ８２３（ＭＨ＋）、８４５（ＭＮａ＋）、８６１（ＭＫ＋）、ＵＶ：３．６８分（９９．１５％、２５４ｎｍ）。1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.0-7.7 (m, 0.5H, NHCO不完全交換)、 7.5-7.0 (m, 7H)、 6.75-6.65 (m, 2H)、 4.85-4.5 (m, 2H)、 4.4-4.05 (m, 2H)、 4.0-0.8 (m, 56H)。
【０５４９】
化合物２６
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド、ビストリフルオロ酢酸
【化１０６】
0006567551.tif 000147
化合物２６Ａ：（Ｓ）−２−（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化１０７】
0006567551.tif 000148
化合物２６Ａは、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中、アミン１ＺＣ（１．３ｇ、５．０４ｍｍｏｌ、１．００当量）、（２−オキソエチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（８００ｍｇ、５．０３ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＩＥＡ（３．５２ｇ、２７．２４ｍｍｏｌ、５．４２当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２．２５ｇ、１０．６２ｍｍｏｌ、２．１１当量）から、化合物２Ｈと同様にして製造された。混合物を振盪下で一晩放置し、５０ｍＬの水で中和した。残渣をＥｔＯＡｃとＰＥ（１０：１）の混合物を用いてシリカカラムで精製し、０．６ｇ（３３％）の化合物２６Ａを無色の油状物の形態で得た。
【０５５０】
化合物２６Ｂ：（Ｓ）−２−（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１０８】
0006567551.tif 000149
化合物２６Ａ（６００ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（３００ｍｇ）の存在下で４０ｍＬのＴＨＦに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃとＭｅＯＨの混合物を用いてシリカカラムで精製し、０．４ｇ（８９％）の化合物２６Ｂを無色の油状物の形態で得た。
【０５５１】
化合物２６Ｃ：（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１０９】
0006567551.tif 000150
化合物２６Ｃを、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸２６Ｂ（５８．４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０３２ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０５３ｍＬ）から、化合物３と同様にして製造された。蒸発乾固の後、化合物２６Ｃを黄色油状物の形態で得た（１００ｍｇ）。
【０５５２】
化合物２６：化合物２６をＤＣＭ（３ｍＬ）およびＴＦＡ（１．５ｍＬ）中、中間体２６Ｃ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％〜４５％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物２６を３８％（３８．１ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５５３】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中５％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４３Ｈ７１Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８１３．５２）ｍ／ｚ：８１４．５（ＭＨ＋）および４０７．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１５．７８分（９１．２％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.90 - 8.82 (m, 0.5 H, NH不完全交換)、 8.71 - 8.65 (m, 0.3H, NH不完全交換)、 (7.85 - 7.77 (m, 1H)、 7.60 - 7.49 (m, 1H)、 7.37 - 7.15 (m, 5H)、 5.78 - 5.55 (m, 1H)、 4.82 - 4.62 (m, 1.6H)、 4.32 - 3.83 (m, 3.6H)、 3.75 - 3.35 (m, 7.4H)、 3.30 - 2.60 (m, 13H)、 2.58 - 0.80 (m, 42H)。
【０５５４】
化合物２７
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−ヒドロキシフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
【化１１０】
0006567551.tif 000151
【０５５５】
化合物２７：化合物２７は、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン３Ｄ（７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４９Ｃ（５５．５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０３４ｍＬ、２．００当量）およびＤＩＥＡ（０．０５５ｍＬ、３．００当量）から、化合物３と同様にして得た。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４５％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへのの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物２７を３％（２．９ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５５６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７５Ｎ５Ｏ９、正確な質量８６６．５６）ｍ／ｚ：８６６．５（ＭＨ＋）および４３３．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．６１分（８９．１％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.70 - 8.49 (m, 0.9 H, NH/OH不完全交換)、 8.30 - 8.22 (m, 0.3H, NH不完全交換)、 7.36 - 7.02 (m, 7H)、 6.86 - 6.62 (m, 2H)、 4.82 - 4.69 (m, 2H)、 4.20 - 4.03 (m, 1H)、 3.91 - 3.33 (m, 12H)、 3.30 - 2.90 (m, 17H)、 2.55 - 0.80 (m, 35H)。
【０５５７】
化合物２８
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化１１１】
0006567551.tif 000152
【０５５８】
化合物２８Ａ：（３−（（３Ｓ，６Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ）−９−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１０−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−３−（（（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−３，６−ジイソプロピル−２，８−ジメチル−４，７−ジオキソ−１１−オキサ−２，５，８−トリアザドデシル）フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１１２】
0006567551.tif 000153
化合物２８Ａは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン２Ｄ（１００ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸１４Ｄ（１１１．２５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０５８ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ）から、化合物３と同様にして製造された。残渣をＥｔＯＡｃとびヘキサン（１：１）の混合物を用いてシリカカラムで精製し、１００ｍｇ（６６％）の化合物２８Ａを白色固体の形態で得た。
【０５５９】
化合物２８：化合物２８は、中間体２８Ａ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物（８０ｍｇ）を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物２８を２０％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５６０】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７４Ｎ６Ｏ７、正確な質量８２２．５６）ｍ／ｚ：８２３．５（ＭＨ＋）および４１２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１２．４５分（８７．２％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.47 - 7.20 (m, 5H)、 7.10 - 7.01 (m, 1H)、 6.80 - 6.56 (m, 3H)、 4.82 - 4.52 (m, 3H)、 4.33 - 4.03 (m, 2H)、 3.91 - 3.82 (m, 0.5H)、 3.75 - 3.35 (m, 9.5H)、 3.28 - 3.10 (m, 2H)、 2.79 - 2.90 (m, 1H)、 2.60 - 2.40 (m, 2H)、 2.30 - 0.80 (m, 40H)。
【０５６１】
化合物２９
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−アミノベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリフルオロ酢酸
【化１１３】
0006567551.tif 000154
化合物１５（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を水（５ｍＬ）、ＡＣＮ（５ｍＬ）とピペリジンの混合物（２．５ｍＬ）に溶かした。この反応混合物を周囲温度で一晩、振盪下で放置した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、２０ｍｇ（２０％）の化合物２９を白色固体の形態で得た。
【０５６２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、４０℃、１．０ｍＬ／分、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中４０％から９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３６．５４）ｍ／ｚ：８３７．５（ＭＨ＋）および４１９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１０．６１分（９２．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.38 - 7.15 (m, 6H)、 7.00 - 6.99 (m, 3H)、 4.85 - 4.68 (m, 2H)、 4.37 - 3.38 (m, 11H)、 3.31 - 2.70 (m, 8H)、 2.60 - 0.82 (m, 35H)。
【０５６３】
化合物３０
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノブチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
【化１１４】
0006567551.tif 000155
化合物３０は、アミン３Ｄおよび対応するカルボン酸から、化合物１６と同様にして製造された。
【０５６４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、１．５ｍＬ／分、４０℃、１５分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０〜９５％メエタノール）、ＥＳＩ（Ｃ４４Ｈ７６Ｎ６Ｏ８、正確な質量８１６．５７）ｍ／ｚ：８１７．６（ＭＨ＋）、４０９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２）、１２．０分（９０％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.7-8.2 (m, 1H, NHCOs,不完全交換)、 7.4-7.1 (m, 5H)、 4.95-4.7 (m, 3H)、 4.2-4.0 (m, 1H)、 3.9-0.8 (m, 63H)。
【０５６５】
化合物３１
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノブチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，ビストリフルオロ酢酸
【化１１５】
0006567551.tif 000156
化合物３１は、メチルエステル３０から化合物４と同様にして製造された。
【０５６６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、１．５ｍＬ／分、４０℃、１８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０から９５％メタノールへ）、ＥＳＩ（Ｃ４３Ｈ７４Ｎ６Ｏ８、正確な質量８０２．５６）ｍ／ｚ：８０３．６（ＭＨ＋）、４０２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２）、１３．６８分（９８．９％、２１０ｎｍ）。
1H NMR (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.4-7.1 (m, 5H)、 4.95-4.7 (m, 3H)、 4.2-4.0 (m, 1H)、 3.9-0.8 (m, 61H)。
【０５６７】
化合物３２
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（３−（メチルアミノ）プロピル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド，ビストリフルオロ酢酸
【化１１６】
0006567551.tif 000157
化合物３２Ａ：（３，３−ジエトキシプロピル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１１７】
0006567551.tif 000158
化合物１ＺＤ（２４７ｍｇ、１ｍｍｏｌ、１．００当量）を不活性雰囲気中、ＴＨＦとＤＭＦの１：１混合物３０ｍＬに溶かした。反応媒体を氷浴上で冷却し、その後、ＮａＨ（油中６０％、６０ｍｇ、１．５当量）を少量ずつ加えた後、ＭｅＩ（０．２８ｍＬ）を滴下した。この反応物を振盪下、周囲温度で２日間放置した後、５ｍＬのＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で中和し、１５ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、２００ｍｇ（７７％）の化合物３２Ａを黄色固体の形態で得た。
【０５６８】
化合物３２Ｂ：（Ｓ）−２−（（３−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）プロピル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１１８】
0006567551.tif 000159
化合物３２Ｂを、化合物１ＺＤを化合物３２Ａに置き換え、化合物１ＺＦの製造に関して記載したものと同じプロトコールに従って製造した。
【０５６９】
化合物３２：化合物３２を、アミン１Ｙおよびカルボン酸３２Ｂから、化合物１の製造に関して記載したものと同じプロトコールに従って２工程で製造した。
【０５７０】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑ、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１３分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０から９５％メタノールへ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７５Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８４２．１９）ｍ／ｚ：８４３（ＭＨ＋）、４２１．９（Ｍ．２Ｈ＋／２）、１１．９１分（８８％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 8.5 - 9.0 (m, 0.5H,不完全交換 NHCOs), 7.85 - 7.80 (m, 1H)、 7.60 - 7.50 (m, 1H), 7.35 - 7.15 (m, 5H), 5.80 - 5.63 (m, 1H), 4.80 - 4.65 (m, 2H), 4.30 - 4.00 (m, 1H), 3.95 - 0.80 (m, 61H)。
【０５７１】
化合物３３および３４
【化１１９】
0006567551.tif 000160
化合物３３および３４は、カルボン酸１ＺＦを化合物３２Ｂに置き換え、化合物６および７と同様にして製造された。
【０５７２】
【表２３】
0006567551.tif 000161
【０５７３】
＊これらの化合物は、分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、対応するＴＦＡ塩を白色固体の形態で得た。
【０５７４】
最終生成物の同定：化合物３３  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（ＥＳＩ）（Ｃ４４Ｈ７６Ｎ６Ｏ８，正確な質量８１６．５７）ｍ／ｚ８１７．６（ＭＨ＋）、４０９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２）、ＵＶ：５．９４分（９５％、２１０ｎｍ）。1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) δ 8.6 - 8.2 (m, 0.8H, NHCO不完全交換) 7.30 - 7.22 (m, 5H), 4.80 (m, 2H), 4.23 - 0.86 (m, 66H)。化合物３４  ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（ＥＳＩ）（Ｃ４３Ｈ７４Ｎ６Ｏ８，正確な質量８０２．５６）ｍ／ｚ８０３．６（ＭＨ＋）、４０２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２）、ＵＶ：５．９４分（９７．５％、２１０ｎｍ）。1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ(回転異性体の存在) 7.30 - 7.20 (m, 5H), 4.80 (m, 2H), 4.25 - 0.86 (m, 63H)。
【０５７５】
化合物３５
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（２−（２−アミノエトキシ）エチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，ビストリフルオロ酢酸
【化１２０】
0006567551.tif 000162
化合物３５Ａ：（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１２１】
0006567551.tif 000163
０℃にて、２−（２−アミノエトキシ）エタノール（５ｇ、４７．５６ｍｍｏｌ、１．００当量）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶かした後、水酸化ナトリウム（２ｇ、５０．００ｍｍｏｌ、１．０５当量）（２５ｍＬの水中の溶液）を加えた。ＴＨＦ（２０ｍＬ）中、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１０．３８ｇ、４７．５６ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を滴下した後、反応物を振盪下、周囲温度で一晩放置した。この反応物を５０ｍＬの水を加えることにより希釈し、生成物を７５ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、１００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で１回洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、９ｇ（９２％）の化合物３５Ａを黄色油状物の形態で得た。
【０５７６】
化合物３５Ｂ：（２−（２−オキソエトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１２２】
0006567551.tif 000164
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、ＤＭＳＯ（３．４６ｍＬ、５．００当量）の溶液を、−７８℃、窒素下で、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、塩化オキサリル（１．９ｍＬ、２．３０当量）の溶液に滴下した。添加（３０分）後、この溶液を３０分間振盪し、２０ｍＬのＤＣＭ中、化合物３５Ａ（２ｇ、９．７４ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を添加した。ＴＥＡ（１２．２ｍＬ）の添加後、この反応物を−７８℃で３０分間、次いで、周囲温度で一晩振盪した。この反応物を１００ｍＬの水を加えることで希釈し、生成物を５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、１．９ｇの化合物３５Ｂを黄色油状物の形態で得た。
【０５７７】
化合物３５Ｃ：ベンジル（Ｓ）−１２−イソプロピル−２，２，１１−トリメチル−４−オキソ−３，８−ジオキサ−５，１１−ジアザトリデカン−１３−オエート
【化１２３】
0006567551.tif 000165
化合物３５Ｃは、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中、アミン１ＺＣ（２．４ｇ、９．３１ｍｍｏｌ、１．００当量）、アルデヒド３５Ｂ（１．９ｇ、９．３５ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３．９６ｇ、１８．６８ｍｍｏｌ、２．００当量）およびＤＩＥＡ（６．２ｍＬ）から、化合物１４Ｃと同様にして合成された。この反応混合物を２００ｍＬの水で中和し、１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、２．３ｇの化合物３５Ｃを黄色油状物の形態で得た。
【０５７８】
化合物３５Ｄ：（Ｓ）−１２−イソプロピル−２，２，１１−トリメチル−４−オキソ−３，８−ジオキサ−５，１１−ジアザトリデカン−１３−酸
【化１２４】
0006567551.tif 000166
化合物３５Ｃ（２００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ、１．００当量）を、Ｐｄ／Ｃ（２００ｍｇ）の存在下で１０ｍＬのＥｔＯＨに溶かし、一晩水素化した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１５０ｍｇ（９６％）の化合物３５Ｄを白色固体の形態で得た。
【０５７９】
化合物３５Ｅ：（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２，１４−ジオキサ−５，８，１１−トリアザヘキサデカン−１６−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１２５】
0006567551.tif 000167
化合物３５Ｅを、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００等量）、酸３５Ｄ（４０．６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．２０当量）、ＤＥＰＣ（０．０３２４ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０５２７ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（１００ｍｇ、９８％）を黄色油状物の形態で単離し、続いてそのまま使用した。
【０５８０】
化合物３５：化合物３５は、中間体３５Ｅ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−０１０）、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへ勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物３５を２３％（２２．９ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５８１】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７５Ｎ７Ｏ７Ｓ、正確な質量８５７．５４）ｍ／ｚ：８５８．５（ＭＨ＋）および４２９．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、５．８９分（８９．７％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) δ 8.9 - 8.5 (m, 0.5H, NHCO不完全交換), 7.8 - 7.7 (m, 1H), 7.55 - 7.45 (m, 1H), 7.35 - 7.1 (m, 5H), 5.45 - 5.5 (m, 1H), 4.9 -4.6 (m, 1H), 4.3 - 0.75 (m, 62H)。
【０５８２】
化合物３６
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１４Ｒ）−１−アミノ−１３−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−１４−メトキシ−６，１２−ジメチル−８，１１−ジオキソ−３−オキサ−６，９，１２−トリアザヘキサデカン−１６−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
【化１２６】
0006567551.tif 000168
化合物３６Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（１２Ｓ，１５Ｓ，１８Ｓ，１９Ｒ）−１８−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１２，１５−ジイソプロピル−１９−メトキシ−２，２，１１，１７−テトラメチル−４，１３，１６−トリオキソ−３，８−ジオキサ−５，１１，１４，１７−テトラアザヘニコサン−２１−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化１２７】
0006567551.tif 000169
化合物３６Ａは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン３Ｄ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸３５Ｄ（２５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．４８当量）、ＤＥＰＣ（０．０３３７ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０５４８ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（１００ｍｇ）を黄色油状物の形態で単離し、続いてそのまま使用した。
【０５８３】
化合物３６：化合物３６は、中間体３６Ａ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物３６を１３％（１２．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５８４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ａｑカラム、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、１分間、水（０．０５％ＴＦＡ）中２％ＭｅＯＨ、次いで、１３分で水中２％から９５％ＭｅＯＨへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４４Ｈ７６Ｎ６Ｏ９、正確な質量８３２．５７）ｍ／ｚ：８３３．５（ＭＨ＋）および４１７．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１１．５８分（９８．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.1 - 8.5 (m, 0.8H, NHCO不完全交換), 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 64H)。
【０５８５】
化合物３７
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（７Ｓ，１０Ｓ，１３Ｓ，１４Ｒ）−１−アミノ−１３−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−１４−メトキシ−６，１２−ジメチル−８，１１−ジオキソ−３−オキサ−６，９，１２−トリアザヘキサデカン−１６−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，ビストリフルオロ酢酸
【化１２８】
0006567551.tif 000170
化合物３７は、化合物３６（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物４と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｔ３カラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、１８．４ｍｇ（１９％）の化合物３７を白色固体の形態で得た。
【０５８６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４３Ｈ７４Ｎ６Ｏ９、正確な質量８１８．６）ｍ／ｚ：８１９．６（ＭＨ＋）および４１０．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、５．４８分（９６．７％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.35 - 7.2 (m, 5H), 5.0 - 4.65 (m, 3H), 4.3 - 0.8 (m, 61H)。
【０５８７】
化合物３８
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
【化１２９】
0006567551.tif 000171
化合物３８Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，１６Ｒ）−１５−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−９，１２−ジイソプロピル−１６−メトキシ−２，２，８，１４−テトラメチル−４，１０，１３−トリオキソ−３−オキサ−５，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化１３０】
0006567551.tif 000172
化合物３８Ａは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン３Ｄ（７０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸２６Ｂ（６０．７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０３３７ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０５４８ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（１００ｍｇ）を黄色油状物の形態で単離した。
【０５８８】
化合物３８：化合物３８は、中間体３８Ａ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣＰｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物３８を１０％（１０．３ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５８９】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ａｑカラム、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、１分間、水（０．０５％ＴＦＡ）中２％ＭｅＯＨ、次いで、１３分で水中２％から９５％ＭｅＯＨへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４２Ｈ７２Ｎ６Ｏ８、正確な質量７８８．５）ｍ／ｚ：７８９．５（ＭＨ＋）および３９５．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１２．９７分（９１．０％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 60H)。
【０５９０】
化合物３９
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，ビストリフルオロ酢酸
【化１３１】
0006567551.tif 000173
化合物３９は、化合物３８（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物４と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）より精製し、８．２ｍｇ（８％）の化合物３９を白色固体の形態で得た。
【０５９１】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム、３．５μｍ、４．６×１５０ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４１Ｈ７０Ｎ６Ｏ８、正確な質量７７４．５）ｍ／ｚ：７７５．５（ＭＨ＋）および３８８．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．４７分（９３．６％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.35 - 7.15 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 57H)。
【０５９２】
化合物４０
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（４−（メチルアミノ）ブチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド，ビストリフルオロ酢酸
【化１３２】
0006567551.tif 000174
化合物４０Ａ：（４，４−ジエトキシブチル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１３３】
0006567551.tif 000175
化合物４０Ａは、ＴＨＦ／ＤＭＦ（４０／２０ｍＬ）中、（４，４−ジエトキシブチル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル（５．５ｇ、１９．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＨ（油中６０％、３．２ｇ、８０．００ｍｍｏｌ、４．０１当量）およびヨードメタン（１４ｍＬ）から、化合物１１Ｅと同様にして製造された。反応物を５０ｍＬのＮＨ４Ｃｌ（水溶液）で中和した。化合物４０Ａを黄色油状物の形態で単離した５．５ｇ（９５％）。
【０５９３】
化合物４０Ｂ：メチル（４−オキソブチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１３４】
0006567551.tif 000176
化合物４０Ａ（３ｇ、１０．８９ｍｍｏｌ、１．００当量）をＡｃＯＨと水（１５／４ｍＬ）の混合物に溶かし、この溶液を振盪下で一晩放置した。ｐＨをＮａＨＣＯ３飽和水溶液で７〜８とした後、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を合わせ、５０ｍＬのＮａＣｌ飽和水溶液で２回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。化合物４０Ｂを黄色油状物の形態で単離した２．１ｇ（９６％）。
【０５９４】
化合物４０Ｃ：（Ｓ）−２−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）ブチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化１３５】
0006567551.tif 000177
化合物４０Ｃは、ＴＨＦ（１５ｍＬ）中、アミン１ＺＣ（２．４５ｇ、９．５３ｍｍｏｌ、０．８０当量）、アルデヒド４０Ｂ（２．４ｇ、１１．９２ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（５．０６ｇ、２３．８７ｍｍｏｌ、２．００当量）およびＤＩＥＡ（６．１６ｇ、４７．６６ｍｍｏｌ、４．００当量）から、化合物１４Ｃと同様にして合成された。この反応混合物を１００ｍＬの水で中和し、１００ｍＬのＡｃＯＥｔで２回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（１：１００−１：２０））で精製し、１．２ｇ（２５％）の化合物４０Ｃを黄色油状物の形態で得た。
【０５９５】
化合物４０Ｄ：（Ｓ）−２−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）ブチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１３６】
0006567551.tif 000178
化合物４０Ｃ（５００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ、１．００当量）を、Ｐｄ／Ｃ（５５０ｍｇ）の存在下、２０ｍＬのＥｔＯＨに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、３５０ｍｇ（９０％）の化合物４０Ｄを無色の油状物の形態で得た。
【０５９６】
化合物４０Ｅ：（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザペンタデカン−１５−イル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１３７】
0006567551.tif 000179
化合物４０Ｅは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４０Ｄ（５７．８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０２７８ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０４５２ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（１００ｍｇ）を続いてそのまま使用した。
【０５９７】
化合物４０：化合物４０は、中間体４０Ｅ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ  溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物４０を２４％（２４．６ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０５９８】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ、正確な質量８５５．６）ｍ／ｚ：８５６．６（ＭＨ＋）および４２８．８（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、５．８９分（９７．０％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.9 - 8.5 (0.7H, NHCO不完全交換), 7.8 - 7.7 (m, 1H), 7.55 - 4.45 (m, 1H), 7.35 - 7.1 (m, 5H), 5.5 - 5.75 (m, 1H), 4.9 - 4.6 (m, 2H), 4.2 - 0.8 (m, 64H)。
【０５９９】
化合物４１
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ）−１４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−８，１１−ジイソプロピル−１５−メトキシ−７，１３−ジメチル−９，１２−ジオキソ−２，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１７−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
【化１３８】
0006567551.tif 000180
化合物４１Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（１１Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ，１８Ｒ）−１７−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１１，１４−ジイソプロピル−１８−メトキシ−２，２，５，１０，１６−ペンタメチル−４，１２，１５−トリオキソ−３−オキサ−５，１０，１３，１６−テトラアザイコサン−２０−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化１３９】
0006567551.tif 000181
化合物４１Ａは、ＤＣＭ（５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（１７０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４０Ｄ（１７０ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、２．０９当量）、ＤＥＰＣ（０．０８１９ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．１３３ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（２００ｍｇ）を続いてそのまま使用した。
【０６００】
化合物４１：化合物４１は、中間体４１Ａ（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）のより精製した。化合物４１を２５％（２５ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０６０１】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、１分間、水（０．０５％ＴＦＡ）中２％ＭｅＯＨ、次いで、１３分で水中２％から９５％ＭｅＯＨへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７８Ｎ６Ｏ８、正確な質量８３０．６）ｍ／ｚ：８３１．６（ＭＨ＋）および４１６．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１１．５８分（９７．２％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.55 - 8.15 (0.75H, NHCO不完全交換), 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 67H)。
【０６０２】
化合物４２
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（８Ｓ，１１Ｓ，１４Ｓ，１５Ｒ）−１４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−８，１１−ジイソプロピル−１５−メトキシ−７，１３−ジメチル−９，１２−ジオキソ−２，７，１０，１３−テトラアザヘプタデカン−１７−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，ビストリフルオロ酢酸
【化１４０】
0006567551.tif 000182
化合物４２は、化合物４１（１００ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、１．００当量）から化合物４と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｔ３カラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、３０．６ｍｇ（３１％）の化合物４２を白色固体の形態で得た。
【０６０３】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４４Ｈ７６Ｎ６Ｏ８、正確な質量８１６．６）ｍ／ｚ：８１７．６（ＭＨ＋）および４０９．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、５．７５分（１００％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.5 - 8.1 (0.3H, NHCO不完全交換), 7.30 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 64H)。
【０６０４】
化合物４３
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｒ）−３−メチル−２−（メチル（２−（２−（メチルアミノ）エトキシ）エチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド，ビストリフルオロ酢酸
【化１４１】
0006567551.tif 000183
化合物４３Ａ：（２−（２−（（ｔｅｒｔブチルジメチルシリル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１４２】
0006567551.tif 000184
化合物３５Ａ（（（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル）（８．２１ｇ、４０．００ｍｍｏｌ、１．００当量）およびイミダゾール（６ｇ、８８．１４ｍｍｏｌ、２．２０当量）を不活性雰囲気中、ＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶かした。ｔｅｒｔブチルジメチルシランクロリド（ＴＢＤＭＳＣｌ、６．６２ｇ、４３．９２ｍｍｏｌ、１．１０当量）を滴下し、反応媒体を振盪下、周囲温度で一晩放置した。反応混合物を１００ｍＬのＤＣＭで希釈した後、２００ｍＬの０．５Ｍ  ＨＣｌで２回、２００ｍＬのＮａＨＣＯ３（飽和）で２回、次いで、３００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（１：３）で精製し、１０ｇ（７８％）の化合物４３Ａを白色固体の形態で得た。
【０６０５】
化合物４３Ｂ：（２−（２−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）エトキシ）エチル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１４３】
0006567551.tif 000185
化合物４３Ｂは、ＤＭＦ（２００ｍＬ）中、化合物４３Ａ（１０ｇ、３１．３０ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＨ（油中６０％、５ｇ、２０８．３３ｍｍｏｌ、４．００当量）およびヨードメタン（２２ｇ、５．００当量）から、化合物１１Ｅと同様にして製造された。反応媒体を２００ｍＬの水で中和し、１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回、次いで、３００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、１０ｇ（９６％）の化合物４３Ｂを白色固体の形態で得た。
【０６０６】
化合物４３Ｃ：（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エチル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１４４】
0006567551.tif 000186
化合物４３Ｂ（１０ｇ、２９．８９ｍｍｏｌ、１．００当量）およびＴＢＡＦ．３Ｈ２Ｏ（２０．８ｇ、６５．９３ｍｍｏｌ、２．２０当量）をＴＨＦ（２００ｍＬ）に溶かした。この混合物を周囲温度で２時間振盪した後、１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、３００ｍＬの水で２回、次いで、３００ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（１：３−１：１）で精製し、６．６ｇの化合物４３Ｃを無色の油状物の形態で得た。
【０６０７】
化合物４３Ｄ：メチル（２−（２−オキソエトキシ）エチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１４５】
0006567551.tif 000187
化合物４３Ｄは、化合物４３Ｃ（２ｇ、９．１２ｍｍｏｌ、１．００当量）、塩化オキサリル（１．９ｍＬ）、ＴＥＡ（１１．３ｍＬ）およびＤＭＳＯ（３．３ｍＬ）から、化合物３５Ｂと同様にして製造された。化合物４３Ｄ（２ｇ）を黄色油状物の形態で単離した。
【０６０８】
化合物４３Ｅ：ベンジル（Ｓ）−１２−イソプロピル−２，２，５，１１−テトラメチル−４−オキソ−３，８−ジオキサ−５，１１−ジアザトリデカン−１３−オエート
【化１４６】
0006567551.tif 000188
化合物４３Ｅは、ＴＨＦ（１００ｍＬ）中、アミン１ＺＣ（２．４ｇ、９．３１ｍｍｏｌ、１．００当量）、アルデヒド４３Ｄ（２ｇ、９．１６ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（４ｇ、１８．８７ｍｍｏｌ、２．０６当量）およびＤＩＥＡ（６ｍＬ）から、化合物１４Ｃと同様にして合成された。この反応混合物を１００ｍＬの水で中和し、１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（４：１）で精製し、１ｇ（３７％）の化合物４３Ｅを白色固体の形態で得た。
【０６０９】
化合物４３Ｆ：（Ｓ）−１２−イソプロピル−２，２，５，１１−テトラメチル−４−オキソ−３，８−ジオキサ−５，１１−ジアザトリデカン−１３−酸
【化１４７】
0006567551.tif 000189
化合物４３Ｅ（１ｇ、２．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（１ｇ）の存在下で４０ｍＬのＭｅＯＨに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、６００ｍｇ（７６％）の化合物４３Ｆを白色固体の形態で得た。
【０６１０】
化合物４３Ｇ：（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｒ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２，１４−ジオキサ−５，８，１１−トリアザヘキサデカン−１６−イル）（メチル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１４８】
0006567551.tif 000190
化合物４３Ｇは、ＤＣＭ（１ｍＬ）中、アミン１Ｙ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４３Ｆ（５０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＥＰＣ（２４．７９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、２．００当量）およびＤＩＥＡ（２９．４６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成した。粗生成物（５９ｍｇ）を続いてそのまま使用した。
【０６１１】
化合物４３：化合物４３は、中間体４３Ｇ（８１ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物４３を６４％（５２．６ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０６１２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分間、水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＣＮへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＣＮ）、ＥＳＩ（Ｃ４８Ｈ７７Ｎ７Ｏ７Ｓ、正確な質量８７１．６）ｍ／ｚ：８７２．５（ＭＨ＋）および４３６．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、３．９０分（１００％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.8 - 7.7 (m, 1H), 7.55 - 4.45 (m, 1H), 7.35 - 7.1 (m, 5H), 5.5 - 5.75 (m, 1H), 4.9 - 4.6 (m, 2H), 4.2 - 0.8 (m, 64H)。
【０６１３】
化合物４４
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｓ，１６Ｒ）−１５−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−９，１２−ジイソプロピル−１６−メトキシ−８，１４−ジメチル−１０，１３−ジオキソ−５−オキサ−２，８，１１，１４−テトラアザオクタデカン−１８−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，ビストリフルオロ酢酸
【化１４９】
0006567551.tif 000191
化合物４４Ａ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（１２Ｓ，１５Ｓ，１８Ｓ，１９Ｒ）−１８−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−１２，１５−ジイソプロピル−１９−メトキシ−２，２，５，１１，１７−ペンタメチル−４，１３，１６−トリオキソ−３，８−ジオキサ−５，１１，１４，１７−テトラアザヘニコサン−２１−オイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化１５０】
0006567551.tif 000192
化合物４４ＡはＤＣＭ（１．５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４３Ｆ（４７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．５０当量）、ＤＥＰＣ（３１ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、２．００当量）およびＤＩＥＡ（３７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（５８ｍｇ）を続いてそのまま使用した。
【０６１４】
化合物４４：化合物４４は、中間体４４Ａ（５８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物４４を４０％（２３．７ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０６１５】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分間で、水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＣＮへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＣＮ）、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７８Ｎ６Ｏ９、正確な質量８４６．６）ｍ／ｚ：８４７．６（ＭＨ＋）および４２４．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、３．２０分（１００％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.3 - 7.1 (m, 5H), 4.9 - 4.6 (m, 3H), 4.2 - 0.8 (m, 67H)。
【０６１６】
化合物４５
（Ｓ）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（２−（ピペラジン−１−イル）エチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド，トリストリフルオロ酢酸
【化１５１】
0006567551.tif 000193
化合物４５Ａ：４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１５２】
0006567551.tif 000194
２−（ピペラジン−１−イル）エタン−１−オール（５ｇ、３８．４１ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶かし、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中、二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８．３８ｇ、３８．４０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液を滴下した。この反応物を振盪下、周囲温度で一晩放置した。反応物を蒸発乾固させ、残渣を２００ｍＬのＡｃＯＥｔに溶かし、ＮａＣｌ（飽和）で５回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、８．５ｇ（９６％）の化合物４５Ａを白色固体の形態で得た。
【０６１７】
化合物４５Ｂ：４−（２−オキソエチル）ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１５３】
0006567551.tif 000195
化合物４５Ｂは、化合物４５Ａ（１ｇ、４．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）、塩化オキサリル（６１０ｍｇ、４．８０ｍｍｏｌ、１．１２当量）、ＴＥＡ（２．１３ｇ、２１．０９ｍｍｏｌ、４．９０当量）およびＤＭＳＯ（０．８２ｇ、２．４０当量）から、化合物３５Ｂと同様にして製造した。化合物４５Ｂ（０．８ｇ、８１％）を無色の油状物の形態で単離した。
【０６１８】
化合物４５Ｃ：（Ｓ）−４−（２−（（１−（ベンジルオキシ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）（メチル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１５４】
0006567551.tif 000196
化合物４５Ｃは、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中、アミン１ＺＣ（７２０ｍｇ、２．７９ｍｍｏｌ、０．８０当量）、アルデヒド４５Ｂ（８００ｍｇ、３．５０ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（１．６ｇ、７．５５ｍｍｏｌ、２．１５当量）およびＤＩＥＡ（２．５ｍＬ）から、化合物１４Ｃと同様にして合成された。反応混合物を５ｍＬの水で中和し、５ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（３：１）で精製し、４００ｍｇ（３３％）の化合物４５Ｃを無色の油状物の形態で得た。
【０６１９】
化合物４５Ｄ：（Ｓ）−２−（（２−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピペラジン−１−イル）エチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１５５】
0006567551.tif 000197
化合物４５Ｃ（４００ｍｇ、０．９２ｍｍｏｌ、１．００当量）をＰｄ／Ｃ（４００ｍｇ）の存在下、３０ｍＬのＭｅＯＨに溶かし、周囲温度および大気圧で１時間水素化した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、３００ｍｇ（９５％）の化合物４５Ｄを白色固体の形態で得た。
【０６２０】
化合物４５Ｅ：４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１５６】
0006567551.tif 000198
化合物４５Ｅは、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（６０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４５Ｄ（６２．７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０２７８ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０４５２ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成した。粗生成物（１００ｍｇ）を続いてそのまま使用した。
【０６２１】
化合物４５：化合物４５は、中間体４５Ｅ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物４５を１９％（１９．４ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０６２２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ａｑカラム、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．０ｍＬ／分、１分間、水（０．０５％ＴＦＡ）中２％ＭｅＯＨ、次いで、１３分で水中２％から９５％ＭｅＯＨへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７８Ｎ８Ｏ６Ｓ、正確な質量８８２．６）ｍ／ｚ：８８３．５（ＭＨ＋）および４４２．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、１０．９５分（９８．８％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在), 7.80 - 7.70 (m, 1H), 7.52 - 7.43 (m, 1H), 7.31 - 7.09 (m, 5H), 5.70 - 5.51 (m, 1H), 4.80 - 4.60 (m, 1H), 4.20 - 0.75 (m, 66H)。
【０６２３】
化合物４６
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（２−（ピペラジン−１−イル）エチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−  フェニルプロパン酸メチル，トリストリフルオロ酢酸
【化１５７】
0006567551.tif 000199
化合物４６Ａ：４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−（（（Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）アミノ）−２−メチル−３−オキソプロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）ピペラジン−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１５８】
0006567551.tif 000200
化合物４６Ａは、ＤＣＭ（５ｍＬ）中、アミン３Ｄ（１７０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、１．００当量）、酸４５Ｄ（１８４．６ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ、２．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０８１９ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．１３３ｍＬ）から、化合物３と同様にして合成された。粗生成物（２００ｍｇ）を続いてそのまま使用した。
【０６２４】
化合物４６：化合物４６は、中間体４６Ａ（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物２と同様にして合成された。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物４６を１９％（１９．１ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０６２５】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分間で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＣＮへ、次いで、２分間、水中９５％ＭｅＣＮ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７９Ｎ７Ｏ８、正確な質量８５７．６）ｍ／ｚ：８５８．６（ＭＨ＋）および４２９．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、５．９３分（１００％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.58 - 8.50 (m, 0.5 H, NHCO,不完全交換), 8.29 - 8.22 (m, 0.4 H, NHCO,不完全交換), 7.35 - 7.15 (m, 5H), 4.87 - 4.69 (m, 3H), 4.22 - 0.82 (m, 68H)。
【０６２６】
化合物４７
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−Ｎ，３−ジメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチル（２−（ピペラジン−１−イル）エチル）アミノ）ブタンアミド）ブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリストリフルオロ酢酸
【化１５９】
0006567551.tif 000201
化合物４７は、化合物４６（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物４と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｔ３カラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、３２．６ｍｇ（３３％）の化合物４７を白色固体の形態で得た。
【０６２７】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４６Ｈ７７Ｎ７Ｏ８、正確な質量８４３．６）ｍ／ｚ：８４４．６（ＭＨ＋）および４２２．９（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、５．７３分（１００％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.66 - 8.57 (m, 0.3 H, NHCO,不完全交換), 8.41 - 8.32 (m, 0.3 H, NHCO,不完全交換), 8.13 - 8.06 (m, 0.2 H, NHCO,不完全交換), 7.30 - 7.10 (m, 5H), 4.80 - 4.61 (m, 3H), 4.19 - 0.78 (m, 65H)。
【０６２８】
化合物４８
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化１６０】
0006567551.tif 000202
化合物４８は、アミン１Ｙおよび１ＺＣおよび１Ｈ−イミダゾール−２−カルバルデヒドから、化合物１と同様にして製造された。最終生成物を以下の条件下の分取ＨＰＬＣにより精製した：ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、０．０５％ＴＦＡで緩衝させた移動相、１０分で水中１５．０から３０％ＡＣＮへ、次いで、２分で９５．０％ＡＣＮまでの勾配、ＵＶ検出  ＵＶ２２０ｎｍ。
【０６２９】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ８、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、１ｍＬ／分、４０℃、１分間水中２％メタノール（０．０５％ＴＦＡで緩衝させた溶離相）、次いで、１２分間で２％から９５％メタノールへ、ＥＳＩ（Ｃ４５Ｈ７０Ｎ８Ｏ６Ｓ、正確な質量８５０．５１）ｍ／ｚ：８５１．２（ＭＨ＋）、８７３．５（ＭＮａ＋）、４２６．３（Ｍ．２Ｈ＋／２）、１２．７５分（９０．５％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.83 - 7.81 (m, 1H), 7.80 - 7.53 (m, 3H), 7.53 - 7.22 (m, 5H), 5.6 -5.8 (m, 1H), 5.0 - 4.6 (m, 2H)、 4.6 - 0.85 (m, 55H)。
【０６３０】
化合物４９
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−ヒドロキシフェネチル）（メチル(mthyl)アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ(mthoxy)−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド，トリフルオロ酢酸
【化１６１】
0006567551.tif 000203
化合物４９Ａ：２−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアルデヒド
【化１６２】
0006567551.tif 000204
４−（２−ヒドロキシエチル）フェノール（４ｇ、２８．９５ｍｍｏｌ、１．００当量）をＤＭＳＯ（３２ｍＬ）に溶かした後、ＴＥＡ（８．８ｍＬ、２．２０当量）を滴下した。ＤＭＳＯ（３６ｍＬ）中、ＳＯ３．Ｐｙ（１０ｇ、２．２０当量）の溶液を加え、この混合物を振盪下、周囲温度で一晩放置した。この反応混合物を２５０ｍＬの水で中和し、１００ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、水（１００ｍＬ）で５回、次いで、１５０ｍＬのＮａＣｌ（飽和）で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（１：１０）で精製し、１ｇ（２５％）の化合物４９Ａを無色の油状物の形態で得た。
【０６３１】
化合物４９Ｂ：（Ｓ）−２−（（４−ヒドロキシフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化１６３】
0006567551.tif 000205
化合物４９Ｂは、ＴＨＦ（２５ｍＬ）中、アミン１ＺＣ（１．５ｇ、５．８２ｍｍｏｌ、０．９９当量）、アルデヒド４９Ａ（８００ｍｇ、５．８８ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２．７ｇ、１２．７４ｍｍｏｌ、２．１７当量）およびＤＩＥＡ（４．２３ｍＬ）から、化合物１４Ｃと同様にして合成された。反応混合物を５０ｍＬの水で中和し、５０ｍＬのＡｃＯＥｔで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル（ＥｔＯＡｃ／ＰＥ（１：１０）で精製し、６００ｍｇ（３７％）の化合物４９Ｂを白色固体の形態で得た。
【０６３２】
化合物４９Ｃ：（Ｓ）−２−（（４−ヒドロキシフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１６４】
0006567551.tif 000206
化合物４９Ｂ（０．５ｇ、１．４６ｍｍｏｌ、１．００当量）を、Ｐｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）の存在下で４０ｍＬのＭｅＯＨに溶かし、周囲温度および大気圧で３時間水素化した。反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、０．４ｇの化合物４９Ｃを白色固体の形態で得た。
【０６３３】
化合物４９：化合物４９は、ＤＣＭ（３ｍＬ）中、アミン１Ｙ（５３．４ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ、２．００当量）、酸４９Ｃ（７０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＤＥＰＣ（０．０３２ｍＬ、２．００当量）およびＤＩＥＡ（０．０５３ｍＬ、３．００当量）から、化合物３と同様にして合成された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｔ３カラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４５％ＡＣＮへ、次いで、２分で％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、３ｍｇ（１％）の化合物４９を白色固体の形態で得た。
【０６３４】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨ）、ＥＳＩ（Ｃ４９Ｈ７４Ｎ６Ｏ７Ｓ、正確な質量８９０．５）ｍ／ｚ：８９１．５（ＭＨ＋）および４４６．４（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．６９分（１００％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.92 - 8.87 (m, 0.5 H, NHCO,不完全交換), 8.70 - 8.63 (m, 0.4 H, NHCO,不完全交換), 8.85 - 8.77 (m, 1H), 7.59 - 7.51 (m, 1H), 7.35 - 7.03 (m, 7H), 6.82 - 6.71 (m, 2H), 5.77 - 5.58 (m, 1H), 5,81 - 5.70 (m, 1H), 4.21 - 0.80 (m, 58H)。
【０６３５】
化合物５０
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−ヒドロキシフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸，トリフルオロ酢酸
【化１６５】
0006567551.tif 000207
化合物５０は、化合物２７（１００ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）から、化合物４と同様にして製造された。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−００１  ＳＨＩＭＡＤＺＵ、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｐｒｅｐ  ＯＢＤ  Ｔ３カラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２０％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製し、１０．７ｍｇ（１１％）の化合物５０を白色固体の形態で得た。
【０６３６】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃ１８カラム、２．７μｍ、４．６×１００ｍｍ、４０℃、１．５ｍＬ／分、８分で水（０．０５％ＴＦＡ）中１０％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７３Ｎ５Ｏ９、正確な質量８５１．５）ｍ／ｚ：８５２．５（ＭＨ＋）および４２６．８（Ｍ．２Ｈ＋／２、１００％）、６．４６分（９１．７％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (400MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 7.34 - 7.15 (m, 5H)、 7.15 - 7.04 (se, 2H), 6.82 - 6.83 (m, 2H), 4.83 - 4.70 (m, 1H), 4.21 - 4.00 (m, 1H), 3.90 - 3.80 (m, 1H), 3.74 - 3.62 (m, 1H), 3.57 - 2.86 (m, 20H), 2.56 - 0.80 (m, 36H)。
【０６３７】
化合物５１
（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−ヒドロキシベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル，トリフルオロ酢酸
【化１６６】
0006567551.tif 000208
化合物５１Ａ：（４−ホルミルフェニル）炭酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１６７】
0006567551.tif 000209
４−ヒドロキシベンズアルデヒド（３．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を、４−ＤＭＡＰ（３００ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ、０．１当量）および二炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（５．３５ｇ、２４ｍｍｏｌ、１．０当量）の存在下で３０ｍＬのＤＣＭに溶かし、周囲温度で１時間振盪した。次に、この溶液を２００ｍＬの水で希釈し、１００ｍＬのＤＣＭで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、５ｇ（９２％）の化合物５１Ａを白色固体の形態で得た。
【０６３８】
化合物５１Ｂ：（Ｓ）−２−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸ベンジル
【化１６８】
0006567551.tif 000210
化合物５１Ａ（２２０ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）を、化合物１ＺＣ（２５５ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ、１．０当量）、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（４２０ｍｇ、２ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＤＩＥＡ（６５４μｌ）の存在下で５ｍＬのＴＨＦに溶かし、周囲温度で一晩振盪した。次に、この溶液を１００ｍＬの水で希釈し、５０ｍＬのＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃとＰＥ（１：１００）の混合物を用いてシリカカラムで精製し、２００ｍｇ（４７％）の化合物５１Ｂを白色固体の形態で得た。
【０６３９】
化合物５１Ｃ：（Ｓ）−２−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタン酸
【化１６９】
0006567551.tif 000211
化合物５１Ｃは、化合物３Ｆの製造に使用したプロトコールに従い、化合物５１Ｂ（２００ｍｇ）の水素化により製造された。
【０６４０】
化合物５１Ｄ：（Ｓ）−２−（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）オキシ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパンアミド）−３−フェニルプロパン酸メチル
【化１７０】
0006567551.tif 000212
化合物５１Ｄは、化合物３の製造に使用したプロトコールに従い、化合物５１Ｃとアミン３Ｄのカップリングにより製造し、目的生成物を６０％の収率で黄色油状物の形態で得た。
【０６４１】
化合物５１：化合物５１Ｄ（８０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）を０．５ｍＬのＴＦＡの存在下で１ｍＬのＤＣＭに溶かし、周囲温度で２時間振盪した後、減圧下で濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｐｒｅ−ＨＰＬＣ−０１０、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、溶出相：０．０５％ＴＦＡで緩衝させた水／ＡＣＮ、１０分で２３％から４０％ＡＣＮへ、次いで、２分で４０％から９５％ＡＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８９  ＵＶ検出器  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物５１を２４％（２０ｍｇ）の収率で白色固体の形態で得た。
【０６４２】
ＬＣ／ＭＳ／ＵＶ（Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑ、１．８μｍ、４．６×１００ｍｍ、１分間、水（０．０５％ＴＦＡ）中２％ＭｅＯＨ、次いで、１３分で２％から９５％ＭｅＯＨへ）、ＥＳＩ（Ｃ４７Ｈ７３Ｎ５Ｏ９、正確な質量８５１．５４）ｍ／ｚ：８７４．５（ＭＮａ＋）、４２６．９（Ｍ．２Ｈ＋／２）、１２．４８分（９６％、２１０ｎｍ）。
1H NMR: (300MHz, CD3OD, ppm): δ (回転異性体の存在) 8.1 - 8.6 (m, 0.9H, NHCO不完全交換)、 7.29 - 7.27 (m, 2H), 7.25 - 6.86 (m, 5H), 6.84 - 6.83 (m, 2H), 4.83 - 4.72 (m, 3H), 4.26 - 0.82 (m, 58H)。
【０６４３】
化合物６１
（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド
【化１７１】
0006567551.tif 000213
【０６４４】
化合物６１Ａ：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン二塩酸塩
【化１７２】
0006567551.tif 000214
化合物１１Ｄ（９６２ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をプロパン−２−オール中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）１０ｍｌに溶かし、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた黄色固体をＥｔ２Ｏ（２×１０ｍｌ）で摩砕した。生成物を真空下で乾燥させ、化合物６１Ａを黄色固体として得た（３２２ｍｇ、４７％）。
【０６４５】
化合物６１：カルボン酸６１Ａ（７３ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）およびアミン１Ｙ（１５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かした。ＤＩＥＡ（１５８μｌ、０．９０ｍｍｏｌ、４当量）およびＤＥＣＰ（５１μｌ、０．３４ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、この反応物を室温で４時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳによる分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物６１を淡黄色固体として得た（８３ｍｇ、４０％）。
【０６４６】
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ(回転異性体の存在), 8.86 (d, 0.5H, NHCO)、 8.65 (d, 0.5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0.5H, チアゾール), 7.78 (d, 0.5H, チアゾール), 7.65 (d, 0.5H, チアゾール), 7.63 (d, 0.5H, チアゾール), 7.32 - 7.12  (m, 5H), 6.83 (d, J=8.3 Hz, 2H), 6.45 (d, J=8.3 Hz, 2H), 5.56 - 5.49 (m, 0.5 H), 5.42 - 5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.46 (m, 2H), 4.01 - 0.66 (m, 57H)。
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ、  ３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．３１分（９６．５％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＥＳＩ＋）８９０．５５５８（２％、ＭＨ＋、Ｃ４９Ｈ７６Ｎ７Ｏ６Ｓ理論値８９０．５５７２）、４４５．７８３４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４９Ｈ７７Ｎ７Ｏ６Ｓ理論値４４５．７８２３）。
【０６４７】
化合物６２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル
【化１７３】
0006567551.tif 000215
化合物６２は、カルボン酸６１Ａ（６９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、アミン３Ｄ（１３５ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＩＥＡ（７５μｌ、０．４３ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＥＣＰ（４９μｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１．５当量）を用い、化合物６１と同様にして製造された。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製し、化合物６２を帯黄色固体として得た（８２ｍｇ、４５％）。
【０６４８】
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ(回転異性体の存在), 8.50 (d, J=8.3, 0.5H, NHCO)、 8.27 (d, J=8.0, 0.5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27 - 7.13  (m, 5H), 6.86 - 6.79 (m, 2H), 6.48 - 6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH2), 4.74 - 4.44 (m, 3H), 4.01 - 3.72 (m, 1.5H), 3.66 (s, 1.5H, CO2Me), 3.63 (s, 1.5H, CO2Me), 3.57 - 0.65 (m, 55.5H)。
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ１８、３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ、３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．２９分（９５．３％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＥＳＩ＋）８６５．５８００（２％、ＭＨ＋、Ｃ４８Ｈ７７Ｎ６Ｏ８理論値８６５．５７９７）、４３３．２９３７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４８Ｈ７８Ｎ６Ｏ８理論値４３３．２９３５）。
【０６４９】
化合物６３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−アミノフェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１７４】
0006567551.tif 000216
化合物６２（２３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を水（１ｍｌ）とアセトニトリル（１ｍｌ）の混合物に溶かした。ピペリジン（０．７５ｍｌ）を加え、この混合物を室温で５時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発材料の完全な消費を示した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐカラム  Ｃ１８  ＯＢＤ、５μｍ、１９×１５０ｍｍ、移動相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１０分で２０％から４０％ＭｅＣＮへ、次いで、２分で４０％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、検出器  ＵＶ  Ｗａｔｅｒｓ  ２５４５  ２５４ｎｍおよび２２０ｎｍ）により精製した。化合物６３を白色固体として得た（１４ｍｇ、６６％）。
【０６５０】
1H NMR: (500MHz, DMSO-d6, ppm): δ(回転異性体の存在), 12.7 (s(br), 1H, CO2H), 9.58 (m(br), 1H)、 9.04 - 8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0.6H, NHCO), 8.15 (d, 0.4H, NHCO), 7.27 - 7.13  (m, 5H), 7.13 - 6.99 (m(br), 2H), 6.90 - 6.64 (s(br), 2H), 4.77 - 3.40 (m, 10H), 3.34 - 2.75 (m, 20H), 2.34 - 1.94 (m, 4H), 1.90 - 0.7 (m, 25H)。
ＨＰＬＣ（Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｃ１８，  ３．５μｍ、４．６×５０ｍｍ、３．５ｍｌ／分、４０℃、２．２５分で水（０．１％ＴＦＡ）中０から９５％ＭｅＣＮへ、次いで、０．５分間９５％ＭｅＣＮ、Ｔｒ＝１．２４分（１００％、２２０ｎｍ）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＥＳＩ＋）８５１．５６４１（６％、ＭＨ＋、Ｃ４７Ｈ７５Ｎ６Ｏ８理論値８５１．５６４１）、４２６．２８５４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ４７Ｈ７６Ｎ６Ｏ８理論値４２６．２８５７）。
【０６５１】
実施例２０：薬物の抗増殖性の活性
方法：
細胞培養    Ａ５４９（非小細胞肺癌−ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳腺癌−ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）細胞をそれぞれ、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）および１０％ＦＣＳを含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＭＣＦ７（乳管癌−ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）細胞およびＳＮ−１２Ｃ（腎臓癌−ＡＴＣＣ）細胞は、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＣＦ７細胞の場合にはフェノールレッド不含）で維持した。総ての培地にファンギゾン（１．２５μｇ／ｍＬ）およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００Ｕ／１００μｇ／ｍＬ）を添加した。細胞を３７℃のインキュベーターにて、５％ＣＯ２および９５％大気湿度の標準条件下で培養した。
【０６５２】
４つの腫瘍細胞株での抗増殖性活性  選択された薬物を、４細胞株の包括的パネルでＡＴＰｌｉｔｅ増殖アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｌｌｅｂｏｎ  ｓｕｒ  Ｙｖｅｔｔｅ、フランス）を用い、それらの抗増殖性の活性に関して調べた。０日目に、細胞を９６ウェルプレートに、細胞が７２時間の薬物処理期間に対数細胞増殖期に留まることを保証する濃度で播種した（Ａ５４９では１０３細胞／ウェル、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＮ１２Ｃでは２．１０３）。２４時間のインキュベーション期間の後、総ての細胞を供試化合物の希釈系で処理した（１％ＤＭＳＯ中１０倍溶液１１μＬ−６ウェル／条件）。チップ上への化合物の接着を避けるため、２つの連続する希釈の間でチップを交換した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。４日目に、細胞の生存率を、生細胞により放出されるＡＴＰを定量することにより評価した。生細胞の数を溶媒処理細胞の数と比較して分析した。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＣＡ、ＵＳＡ）により提供されているアルゴリズムを用いて実行される曲線フィッティング分析（シグモイド用量反応、可変ヒル傾き係数を用いる非線形回帰モデル）で評価した。
【０６５３】
結果：
種々の薬物：
上記の方法に従いＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株でのそれらの抗増殖活性を決定するために種々の薬物を試験した。測定された活性はＥＣ５０＜０．１μＭの値を示した。
【０６５４】
上記で例示した薬物の中から選択された少数の下記の例は、それらの十分に顕著な抗増殖活性を示す：
実施例１２：ＥＣ５０＝５．８０×１０−１０Ｍ、実施例１３：ＥＣ５０＝７．９５×１０−８Ｍ、実施例１５：ＥＣ５０＝１．７０×１０−１０Ｍ、実施例２７：ＥＣ５０＝１．２０×１０−１０  Ｍ。
【０６５５】
種々の細胞株：
化合物１５を、上記の方法に従い種々の細胞株（Ａ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ−７、ＳＮ１２Ｃ）で試験した。測定された活性は、総ての供試細胞株でＥＣ５０ ＜ ０．１μＭの値を示した。
【０６５６】
【表２４】
0006567551.tif 000217
【０６５７】
比較例：
以下の比較例でフェニル環上での置換（アミノ／ヒドロキシル対カルボキシル）を検討したところ、アミノまたはヒドロキシル置換基を含んでなる本発明による薬物の抗増殖活性の向上が示された。
【０６５８】
【表２５】
0006567551.tif 000218
【０６５９】
実施例２１：薬物−リンカー部分の合成
化合物Ｅ−１１
（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）（メチル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１７５】
0006567551.tif 000219
化合物Ｅ−１１−１：（Ｓ）−２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸メチル塩酸塩
【化１７６】
0006567551.tif 000220
塩化アセチル（１０ｍＬ）を、０℃で撹拌しながらＭｅＯＨ（１２０ｍＬ）に滴下した。２０分後、Ｌ−シトルリン（１０ｇ、５７ｍｍｏｌ、１．００当量）を加え、この混合物を一晩還流下で加熱した。溶媒を減圧下で蒸発させ、１５ｇ（１１６％）の化合物Ｅ−１１−１を白色固体として得た。この生成物をそれ以上乾燥させずに次の工程で使用した。
【０６６０】
化合物Ｅ−１１−２：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸メチル
【化１７７】
0006567551.tif 000221
化合物Ｅ−１１−１（１３ｇ、５７．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で不活性雰囲気下、ＤＭＦ（１４０ｍＬ）に溶かした。ＤＩＥＡ（３０ｍＬ、１７３ｍｍｏｌ、３．０当量）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ−１０．５９ｇ、６９．１ｍｍｏｌ、１．２当量）およびＢｏｃ−Ｌ−バリンヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ−１８．１ｇ、５７．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を加えた。この反応混合物を周囲温度で一晩振盪した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を水（１００ｍＬ）に溶かしＤＣＭ（１５０ｍＬ）で２回抽出した。有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１８．８ｇ（８４％）の化合物Ｅ−１１−２を白色固体として得た。
【０６６１】
化合物Ｅ−１１−３：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタン酸
【化１７８】
0006567551.tif 000222
化合物Ｅ−１１−２（１８．８ｇ、４８．４ｍｍｏｌ、１当量）を０℃でＭｅＯＨ（２００ｍＬ）に溶かした。ＮａＯＨ  １Ｍ溶液（７２ｍＬ、７２ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、この混合物を室温で２時間撹拌した。ＭｅＯＨを減圧下で除去し、残った水溶液をＨＣｌ  １Ｍで酸性化した。水相を蒸発乾固させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１８ｇ（９９％）の化合物Ｅ−１１−３を白色固体として得た。
【０６６２】
化合物Ｅ−１１−４：（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）  アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１７９】
0006567551.tif 000223
化合物Ｅ−１１−３（５ｇ、１３．４ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＣＭ（６５ｍｌ）と乾燥ＭｅＯＨ（３５ｍｌ）の混合物に溶かした。（４−アミノフェニル）メタノール（１．８１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ、１．１当量）およびＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ−６．６０ｇ、２６．７ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を暗所で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、５．２ｇ（７３％）の化合物Ｅ−１１−４を灰白色固体として得た。
【０６６３】
化合物Ｅ−１１−５：（（Ｓ）−３−メチル−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１８０】
0006567551.tif 000224
化合物Ｅ−１１−４（１．１ｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１当量）を不活性雰囲気下、周囲温度で乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かした。炭酸ビス（４−ニトロフェニル）（１．４０ｇ、４．５９ｍｍｏｌ、２当量）、次いで、ＤＩＥＡ（６００μｌ、３．４４ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、得られた黄色溶液を一晩撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、１．２７ｇ（８４％）の化合物Ｅ−１１−５を灰白色固体として得た。
【０６６４】
化合物Ｅ−１１−６：（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）（メチル）カルバミン酸４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１８１】
0006567551.tif 000225
カーボネートＥ−１１−５（１１４ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、１．２当量）およびアニリン１１Ｆ（１５０ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かした。ＨＯＢｔ（３８ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＥＡ（５４μＬ、０．２９５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を週末にわたって室温で撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣を、ＤＣＭで溶出するシリカでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により再精製した。選択された画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１１−６を白色固体として得た（８９ｍｇ、３９％）。
【０６６５】
化合物Ｅ−１１：
【化１８２】
0006567551.tif 000226
化合物Ｅ−１１−６（２１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＤＣＭ（０．２５ｍＬ）に溶かし、ＴＦＡ（４０μＬ）を加えた。この溶液を室温で２時間撹拌し、その後、ＬＣ−ＭＳ分析は出発材料の完全な消費を示した。この混合物を軽く冷却（液体窒素浴）すると同時にＤＭＦ（０．５ｍＬ）、次いで、ＴＦＡを中和するためのＤＩＥＡ（１００μＬ）を加えた。その後、冷却浴を外し、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物を室温で４８時間撹拌し、生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１１を白色固体として得た（１１ｍｇ、５４％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１５２４．８２８２（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７９Ｈ１１５Ｎ１３ＮａＯ１４Ｓ理論値１５２４．８２９９）、７５１．９２８３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７９Ｈ１１７Ｎ１３Ｏ１４Ｓ理論値７５１．９２７６）。
【０６６６】
化合物Ｅ−１２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１８３】
0006567551.tif 000227
化合物Ｅ−１２−１：（（Ｓ）−３−メチル−１−オキソ−１−（（（Ｓ）−１−オキソ−１−（（４−（（（（ペルフルオロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）ブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル
【化１８４】
0006567551.tif 000228
化合物Ｅ−１１−４（６７０ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で不活性雰囲気下、乾燥ＤＭＦ（６ｍｌ）に溶かした。炭酸ビス（ペルフルオロフェニル）（９９１ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ、２当量）、次いで、ＤＩＥＡ（３２９μｌ、１．８９ｍｍｏｌ、１．５当量）を加え、得られた無色の溶液を室温で３０分間撹拌した。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、８３６ｍｇ（９６％）の化合物Ｅ−１２−１を灰白色固体として得た。
【０６６７】
化合物Ｅ−１２−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１８５】
0006567551.tif 000229
アニリン１２（１６５ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ、１．０当量）を０℃で不活性雰囲気下、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かした。カーボネートＥ−１２−１（１９４ｍｇ、０．２８２ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＨＯＢｔ（５１ｍｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、２当量）およびＤＩＥＡ（６６μＬ、０．３７５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、この混合物を室温で８時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ１２−７を白色固体として得た（２４７ｍｇ、７７％）。
【０６６８】
化合物Ｅ−１２−３：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１８６】
0006567551.tif 000230
化合物Ｅ−１２−２（５．６ｍｇ、４．０４μｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（１００μＬ）に溶かした。５分後、２ｍｌの水を加え、この混合物を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１２−３を灰白色固体として得た（５．６ｍｇ、９８％）。
【０６６９】
化合物Ｅ−１２：
【化１８７】
0006567551.tif 000231
化合物Ｅ−１２−３（５．６ｍｇ、４μｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（５μＬ、７当量）、次いで、６−（２,５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２．５ｍｇ、８μｍｏｌ、２当量）を加えた。この混合物を室温で６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより反応を管理した後、２００μｌの水を加え、得られた溶液を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１２を白色固体として得た（４．６ｍｇ、７０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）７３９．４３８９（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７８Ｈ１１８Ｎ１２Ｏ１６理論値７３９．４３８９）。
【０６７０】
化合物Ｅ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１８８】
0006567551.tif 000232
化合物Ｅ−１３−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン
【化１８９】
0006567551.tif 000233
化合物Ｅ−１２−２（１８５ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を室温で水（５ｍＬ）とアセトニトリル（５ｍＬ）の混合物に溶かした。ピペリジン（３．６７ｍＬ、３００当量）を加え、この混合物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発乾固させ、残渣をＥｔ２Ｏ（６０ｍＬ）で摩砕した。この固体をＥｔ２Ｏ（２０ｍｌ）で２回すすぎ、真空下で乾燥させ、化合物Ｅ−１３−１を灰白色固体として得た（１７５ｍｇ、９５％）。
【０６７１】
化合物Ｅ−１３−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１９０】
0006567551.tif 000234
化合物Ｅ−１３−１（１７５ｍｇ、０．１２８ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（１ｍＬ）およびアセトニトリル（１ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１３−２を灰白色固体として得た（１８０ｍｇ、８７％）。
【０６７２】
化合物Ｅ−１３：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１９１】
0006567551.tif 000235
化合物Ｅ−１３−２（８０ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ、１．０当量）をアセトニトリル（１．５ｍＬ）とＤＭＦ（０．４ｍＬ）の混合物に溶かした。ＤＩＥＡ（５０μＬ、０．２８９ｍｍｏｌ、５当量）、次いで、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３６ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。この混合物を室温で３時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳにより反応を管理した後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１３を白色固体として得た（３２ｍｇ、３５％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ−）１４６１．８３３６（１００％、（Ｍ−Ｈ）−、Ｃ７７Ｈ１１３Ｎ１２Ｏ１６理論値１４６１．８４０３）。ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１４６３．８５６５（２％、ＭＨ＋、Ｃ７７Ｈ１１５Ｎ１２Ｏ１６理論値１４６３．８５４９）、７３２．４３１７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７７Ｈ１１６Ｎ１２Ｏ１６理論値７３２．４３１１）。
【０６７３】
化合物Ｅ−１５
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１９２】
0006567551.tif 000236
化合物Ｅ−１５−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化１９３】
0006567551.tif 000237
化合物Ｅ−１５−１は、ＤＭＦ（２ｍＬ）中、カーボネートＥ−１１−５（２８ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）、アニリン１５（４２ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ、１当量）、ＨＯＢｔ（３ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ、０．５当量）、およびＤＩＥＡ（１５μＬ、０．０８７ｍｍｏｌ、２当量）を用い、化合物Ｅ−１１−６と同じ方法に従って製造された。化合物Ｅ−１５−１を白色固体として単離した（８．２ｍｇ、１３％）。
【０６７４】
化合物Ｅ−１５−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（（（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化１９４】
0006567551.tif 000238
化合物Ｅ−１５−１（８．２ｍｇ、５．５８μｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かしたた。５分後、水（１ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｅ−１５−８を白色固体として得た（７．６ｍｇ、９９％）。
【０６７５】
化合物Ｅ−１５：
【化１９５】
0006567551.tif 000239
化合物Ｅ−１５は、アセトニトリル（０．５ｍＬ）中、アミンＥ−１５−２（７．６ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、１当量）、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．２当量）およびＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ、５当量）を用い、化合物Ｅ−１２と同じ方法に従って製造された。化合物Ｅ−１５を白色固体として単離した（４．２ｍｇ、４８％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１４７１．８１６９（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７６Ｈ１１２Ｎ１２ＮａＯ１６理論値１４７１．８２１１）、７２５．４２２３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７６Ｈ１１４Ｎ１２Ｏ１６理論値７２５．４２３２）、４８３．９４８２（１０％、（ＭＨ３）３＋、Ｃ７６Ｈ１１５Ｎ１２Ｏ１６理論値４８３．９５１３）。
【０６７６】
化合物Ｆ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸酸
【化１９６】
0006567551.tif 000240
化合物Ｆ−１３−１：Ｎ−（４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）  フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１９７】
0006567551.tif 000241
化合物１１Ｃ（２５０ｍｇ、０．５６７ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶かした後、ＮａＨ（鉱油中６０％懸濁液、６８ｍｇ、１．７０２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この混合物を５分間撹拌した後、ヨードメタン（１０６μＬ、１．７０２ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この反応物を室温で２時間撹拌した後、水で急冷し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）と水（５０ｍＬ）とで分離した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、化合物Ｆ−１３−１を黄色油状物として得（２５０ｍｇ、９７％）、これをそれ以上精製せずに用いた。
【０６７７】
化合物Ｆ−１３−２：Ｎ−メチル−Ｎ−（４−（メチルアミノ）フェネチル）−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１９８】
0006567551.tif 000242
Ｂｏｃ保護アニリンＦ−１３−１（２５０ｍｇ、０．５５０ｍｍｏｌ、１当量）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶かした後、ｉＰｒＯＨ中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）１ｍＬを加えた。この溶液を室温で２時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。得られた黄色油状物をＥｔ２Ｏで摩砕し、化合物Ｆ−１３−２を黄色固体として得た（２０２ｍｇ、９４％）。
【０６７８】
化合物Ｆ−１３−３：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化１９９】
0006567551.tif 000243
酸Ｅ−１１−３（１９０ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（１ｍｌ）に溶かした後、ＤＩＥＡ（１１８μＬ、０．６７７ｍｍｏｌ、２当量）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ−２６４ｍｇ、０．５０８ｍｍｏｌ、１．５当量）およびアニリンＦ−１３−２（１２０ｍｇ、０．３３９ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。この混合物を室温で一晩撹拌し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−３を白色固体として得た（１４０ｍｇ、４５％）。
【０６７９】
化合物Ｆ−１３−４：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
【化２００】
0006567551.tif 000244
化合物Ｆ−１３−３（１１６ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ１０％（３０ｍｇ）の存在下でＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶かし、周囲温度および大気圧下で２時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、１１０ｍｇ（９９％）の化合物Ｆ−１３−４をベージュの固体として得た。
【０６８０】
化合物Ｆ−１３−５：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２０１】
0006567551.tif 000245
アミン３Ｄ（８９ｍｇ、０．１４０ｍｍｏｌ、１当量）および酸Ｆ−１３−４（１４５ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）に溶かし、ＰｙＢＯＰ（１０９ｍｇ、０．２１０ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（７３μＬ、０．４２０ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。この混合物を室温で１時間撹拌し、溶媒を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃと水とで分離し、有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−５を白色固体として得た（１４０ｍｇ、７３％）。
【０６８１】
化合物Ｆ−１３−６：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−メチル−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２０２】
0006567551.tif 000246
化合物Ｆ−１３−５（１４０ｍｇ、０．１０４ｍｍｏｌ、１当量）を水（４ｍＬ）、アセトニトリル（４ｍＬ）およびピペリジン（２ｍＬ）の混合物に溶かし、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−１３−６を白色固体として得た（１１５ｍｇ、８３％）。
【０６８２】
化合物Ｆ−１３：
【化２０３】
0006567551.tif 000247
化合物Ｆ−１３は、化合物Ｅ−１１と同じ方法に従い、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）およびＴＦＡ（１００μＬ、３０当量）中、Ｂｏｃ保護アミンＦ−１３−６（５５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ、１．０当量）を用い、次いで、ＤＭＦ（１ｍＬ）で希釈し、ＤＩＥＡ（３２０μＬ、４５当量）で急冷した後、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１５ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、１．２当量）と反応させて製造された。分取ＨＰＬＣによる精製および凍結乾燥の後に、化合物Ｆ−１３を白色固体として得た（１４ｍｇ、２４％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３１４．８０６７（２％、ＭＨ＋、Ｃ６９Ｈ１０８Ｎ１１Ｏ１４理論値１３１４．８０７２）、６５７．９０６７（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６９Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１４理論値６５７．９０７２）。
【０６８３】
化合物Ｆ−６１
Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）−６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２０４】
0006567551.tif 000248
化合物Ｆ−６１−１：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル二塩酸塩
【化２０５】
0006567551.tif 000249
化合物１１Ｃ（１．０ｇ、２．２７ｍｍｏｌ、１当量）をｉＰｒＯＨ中ＨＣｌの市販溶液（５〜６Ｍ）８ｍＬに溶かした。この混合物を室温で２時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。残渣をＥｔ２Ｏ（３０ｍＬ）で２回摩砕し、真空下で乾燥させ、化合物Ｆ−６１−１を白色固体として得た（９１６ｍｇ、９８％）。
【０６８４】
化合物Ｆ−６１−２：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル
【化２０６】
0006567551.tif 000250
酸Ｅ−１１−３（７６９ｍｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２．５ｍｌ）に溶かした後、ＤＩＥＡ（９５７μＬ、５．４８ｍｍｏｌ、４当量）およびＰｙＢＯＰ（１．０７ｇ、２．０５ｍｍｏｌ、１．５当量）を加えた。アニリンＦ−６１−１（５６６ｍｇ、１．３６９ｍｍｏｌ、１当量）を加え、この混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）で精製し、９６９ｍｇ（１０２％）の化合物Ｆ−６１−２を白色固体として得た。
【０６８５】
化合物Ｆ−６１−３：Ｎ−（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン
【化２０７】
0006567551.tif 000251
化合物Ｆ−６１−２（９６９ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、１当量）をＰｄ／Ｃ１０％（２７０ｍｇ）の存在下でＭｅＯＨ（２０ｍｌ）に溶かし、周囲温度および大気圧下で３時間水素化した。この反応媒体を濾過し、減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲル（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＡｃＯＨ）で精製し、５２０ｍｇ（６７％）の化合物Ｆ−６１−３を白色固体として得た。
【０６８６】
化合物Ｆ−６１−４：（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）アミノ）−１−オキソ−５−ウレイドペンタン−２−イル）アミノ）−３−メチル−１−オキソブタン−２−イル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２０８】
0006567551.tif 000252
酸Ｆ−６１−３（６７．５ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．５当量）を乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）およびＤＥＣＰ（１７μＬ、０．１１１ｍｍｏｌ、１．５当量）に溶かし、ＤＩＥＡ（３９μＬ、０．２２３ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。室温で１５分間撹拌した後、アミン１Ｙ（５０ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ、１当量）を加え、この溶液を一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ６１−４を白色固体として得た（２８ｍｇ、２８％）。
【０６８７】
化合物Ｆ−６１−５：（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−Ｎ−（４−（（３Ｒ，４Ｓ，７Ｓ，１０Ｓ）−４−（（Ｓ）−ｓｅｃ−ブチル）−７，１０−ジイソプロピル−３−（２−（（Ｓ）−２−（（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−（（（Ｓ）−２−フェニル−１−（チアゾール−２−イル）エチル）アミノ）プロピル）ピロリジン−１−イル）−２−オキソエチル）−５，１１−ジメチル−６，９−ジオキソ−２−オキサ−５，８，１１−トリアザトリデカン−１３−イル）フェニル）−５−ウレイドペンタンアミド  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化２０９】
0006567551.tif 000253
化合物Ｆ−６１−４（２８ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。５分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６１−５を無色の油状物として得た（３８ｍｇ、１３４％）。
【０６８８】
化合物Ｆ−６１：
【化２１０】
0006567551.tif 000254
化合物Ｆ−６１−５（２８．３ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（０．５ｍＬ）、次いで、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（９ｍｇ、０．０２９μｍｏｌ、１．４当量）およびＤＩＥＡ（２５μＬ、０．１４３ｍｍｏｌ、７当量）に溶かした。この混合物を４．５時間撹拌し、その後、ＨＰＬＣ分析は出発材料の存在、スクシンイミドの完全な消費を示した。従って、補助的に６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（３ｍｇ、０．０１μｍｏｌ、０．５当量）を加え、この反応物を１．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析は出発材料の完全な消費を示した。溶媒を蒸発させて乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（８０／２０）の混合物で２回摩砕し、化合物Ｆ−６１を灰白色固体として得た（１９．４ｍｇ、７０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３６１．７７２５（２％、ＭＮａ＋、Ｃ７０Ｈ１０６Ｎ１２ＮａＯ１２Ｓ理論値１３６１．７６６６）、６７０．３９６１（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ７０Ｈ１０８Ｎ１２Ｏ１２Ｓ理論値６７０．３９６０）。
【０６８９】
化合物Ｆ−６２：
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２１１】
0006567551.tif 000255
化合物Ｆ−６２−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２１２】
0006567551.tif 000256
化合物Ｆ−６２−１は、ＤＭＦ（２ｍＬ）  中、アミン３Ｄ（１００ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ、０．９当量）、酸Ｆ−６１−３（１０８ｍｇ、０．１７８ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＥＣＰ（４１μＬ、０．２６７ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＤＩＥＡ（９３μＬ、０．５３４ｍｍｏｌ、３当量）から、化合物Ｆ−６１−４と同様にして製造された。分取ＨＰＬＣによる精製の後、化合物Ｆ−６２−１を白色固体として得た（９３ｍｇ、３９％）。
【０６９０】
化合物Ｆ−６２−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ビス（２，２，２−トリフルオロ酢酸塩）
【化２１３】
0006567551.tif 000257
化合物Ｆ−６２−１（３５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。１０分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６２−２を白色固体として得た（３４ｍｇ、１０５％）。
【０６９１】
化合物Ｆ−６２：
【化２１４】
0006567551.tif 000258
アミンＦ−６２−２（３４ｍｇ、５．５５μｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（３ｍＬ）に溶かした。ＤＩＥＡ（５μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ、５当量）および６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．２当量）を加えた。ＨＰＬＣ  分析は出発材料の完全な消費を示した。溶媒を蒸発させて乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ／Ｅｔ２Ｏ（８０／２０）の混合物で摩砕した。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６２を白色固体として得た（５．５ｍｇ、１３％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３３６．７８５９（２％、ＭＮａ＋、Ｃ６９Ｈ１０７Ｎ１１ＮａＯ１４理論値１３３６．７８９１）、６５７．９０７３（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６９Ｈ１０９Ｎ１１Ｏ１４理論値６５７．９０７２）。
【０６９２】
化合物Ｆ−６３：
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２１５】
0006567551.tif 000259
化合物Ｆ−６３−１：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン
【化２１６】
0006567551.tif 000260
化合物Ｆ−６２−１（１５７ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ、１当量）を水（４．５ｍＬ）、アセトニトリル（４．５ｍＬ）およびピペリジン（３．５ｍＬ）の混合物に溶かし、室温で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をＥｔ２Ｏ（６０ｍＬ）で摩砕した。固体を濾取し、Ｅｔ２Ｏ（１０ｍＬ）で２回すすぎ、化合物Ｆ−６３−１を灰白色固体として得た（１５３ｍｇ、１００％）。
【０６９３】
化合物Ｆ−６３−２：（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−アミノ−３−メチルブタンアミド）−５−ウレイドペンタンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ビス２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２１７】
0006567551.tif 000261
化合物Ｆ−６３−１（１５３ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ、１．０当量）をＴＦＡ（２００μＬ）に溶かした。１０分後、水（２ｍＬ）およびアセトニトリル（０．５ｍＬ）を加え、この溶液を一晩凍結乾燥させ、化合物Ｆ−６３−２を白色固体として得た（３４ｍｇ、１０５％）。
【０６９４】
化合物Ｆ−６３：
【化２１８】
0006567551.tif 000262
アミンＦ−６３−２（１００ｍｇ、０．０８２ｍｍｏｌ、１当量）をアセトニトリル（２ｍＬ）とＤＭＦ（０．５ｍＬ）の混合物に溶かし、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（４５ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ、１．８当量）およびＤＩＥＡ（７１μＬ、０．４０９ｍｍｏｌ、５当量）を加えた。室温で４．５時間撹拌した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、その後、化合物Ｆ−６３を白色固体として得た（４２ｍｇ、３６％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１３００．７９０１（２％、ＭＨ＋、Ｃ６８Ｈ１０６Ｎ１１Ｏ１４理論値１３００．７９１５）、６５０．８９９０（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ６８Ｈ１０７Ｎ１１Ｏ１４理論値６５０．８９９４）。
【０６９５】
化合物Ｇ−１２
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２１９】
0006567551.tif 000263
化合物Ｇ−１２−１：Ｎ−（４−アミノフェネチル）−Ｎ−メチル−Ｌ−バリン酸ベンジル二塩酸塩
【化２２０】
0006567551.tif 000264
塩化オキサリル（３ｍＬ）に６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（２００ｍｇ、０．９４７ｍｍｏｌ、１当量）を溶かした。この溶液を室温で５時間撹拌した後、減圧下で蒸発乾固させた。化合物Ｇ−１２−１をベージュの固体として得（２１７ｍｇ、１００％）、精製せずに次の工程で用いた。
【０６９６】
化合物Ｇ−１２：
【化２２１】
0006567551.tif 000265
アニリン１２（４０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（８μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。３０分間撹拌した後、乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（１０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ（２５ｍｌ）で希釈し、水（２０ｍＬ）で２回、ブライン（１０ｍＬ）で１回洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗生成物を淡褐色固体として得た（５４ｍｇ）。これをシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）、次いで、分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。単離された生成物を凍結乾燥させ、白色固体を得（２３ｍｇ）、これを分取ＨＰＬＣにより再精製し、選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ−１２を白色固体として得た（９ｍｇ、１６％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１０９４．６５４３（２０％、ＭＮａ＋、Ｃ５９Ｈ８９Ｎ７ＮａＯ１１理論値１０９４．６５１２）、１０７２．６７２２（１６％、ＭＨ＋、Ｃ５９Ｈ９０Ｎ７Ｏ１１理論値１０７２．６６９３）、５３６．８３５８（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５９Ｈ９１Ｎ７Ｏ１１理論値５３６．８３８３）。
【０６９７】
化合物Ｇ−１３
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（４−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−Ｎ−メチルヘキサンアミド）フェネチル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン  ２，２，２−トリフルオロ酢酸酸
【化２２２】
0006567551.tif 000266
化合物Ｇ−１３：
【化２２３】
0006567551.tif 000267
アニリン１３（１５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶かし、ＤＩＥＡ（８μＬ、０．０４６ｍｍｏｌ、３当量）を加えた。乾燥ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（３．５ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗生成物を分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ−１３を白色固体として得た（１１．４ｍｇ、６２％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１０５８．６５１０（３０％、ＭＨ＋、Ｃ５８Ｈ８８Ｎ７Ｏ１１理論値１０５８．６５３６）、５２９．８２８５（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５８Ｈ８９Ｎ７Ｏ１１理論値５２９．８３０５）。
【０６９８】
化合物Ｇ−１５
（（２Ｒ，３Ｒ）−３−（（Ｓ）−１−（（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−４−（（Ｓ）−２−（（Ｓ）−２−（（３−（６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）ベンジル）（メチル）アミノ）−３−メチルブタンアミド）−Ｎ，３−ジメチルブタンアミド）−３−メトキシ−５−メチルヘプタノイル）ピロリジン−２−イル）−３−メトキシ−２−メチルプロパノイル）−Ｌ−フェニルアラニン酸メチル  ２，２，２−トリフルオロ酢酸塩
【化２２４】
0006567551.tif 000268
化合物Ｇ−１５：
【化２２５】
0006567551.tif 000269
アニリン１５（４０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、１当量）を０℃で乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）  に溶かし、ＤＩＥＡ（１０μＬ、０．０５６ｍｍｏｌ、１．２当量）を加えた。乾燥ＤＣＭ（１ｍＬ）中、化合物Ｇ−１２−１（１０８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ、１０当量）の溶液を導入し、この反応物を０℃で１．５時間撹拌した。この混合物をＤＣＭ（１０ｍｌ）で希釈し、水（５ｍＬ）で２回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させ、粗生成物をベージュの固体として得た。これを分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ６００Ｅ、ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８  ＯＢＤカラム、５μｍ、１９×１００ｍｍ、溶出相：０．１％ＴＦＡで緩衝させた水／ＭｅＣＮ、１５分で５％から１００％ＭｅＣＮへの勾配、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  ＵＶ検出器  ２２０ｎｍ）により精製した。選択した画分を合わせ、凍結乾燥させ、化合物Ｇ１５を白色固体として得た（２７ｍｇ、５０％）。
ｍ／ｚ（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ＋）１０６６．６５１７（２％、ＭＮａ＋、Ｃ５７Ｈ８５Ｎ７ＮａＯ１１理論値１０６６．６１９９）、５２２．８２２４（１００％、（ＭＨ２）２＋、Ｃ５７Ｈ８７Ｎ７Ｏ１１理論値５２２．８２２６）。
【０６９９】
実施例２２：ＡＤＣの合成、精製および特性決定
下記の手順はキメラおよびヒト化ＩｇＧ１形態に当てはまる。ＩｇＧ２、ＩｇＧ４などの他の形態については、当業者ならば一般知識を用いてこの手順を適合させることができると理解されなければならない。
【０７００】
抗体（１〜５ｍｇ／ｍｌ）を、３７℃にて２時間、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファー  ｐＨ８．４中、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で部分的に還元した。一般に、それぞれ４前後の薬物−抗体比（ＤＡＲ）を目標とするために２．５〜３ｍｏｌ当量のＴＣＥＰを使用した。部分的抗体還元は、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した。遊離した鎖内システイン残基へのリンカー−薬物のカップリングの前に、還元混合物を室温まで放冷した。次に、抗体濃度を１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭホウ酸バッファー  ｐＨ８．４で１ｍｇ／ｍｌに調整し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中１０ｍＭ溶液から、抗体に対して５モル過剰の薬物を加えた。カップリング中に水性媒体での薬物の溶解度を維持するために、最終ＤＭＳＯ濃度は１０％に調整した。反応は室温で１時間行った。薬物過剰分は、薬物１モル当たり１．５モルのＮ−アセチルシステインを加えて室温で１時間インキュベートすることによって急冷した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  Ｈｉｓバッファー  ｐＨ６．５に対して４℃で一晩透析した後、抗体−薬物複合体を、市販のクロマトグラフィーカラムおよび限外濾過装置に基づく当業者に公知の方法を使用することにより精製した。まず、非結合薬物とＡＤＣ凝集物をＳ２００（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により除去した。次に、精製されたＡＤＣモノマーを３０または５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ濾過装置での限外濾過またはプロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーにより２〜３ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。精製されたＡＤＣを０．２μｍフィルターで濾過除菌した後に４℃で保存した。それらをさらに、薬物コンジュゲーションを確認するために還元条件および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、また、モノマーおよび凝集形態の含量を決定するために分析的Ｓ２００またはＴＳＫ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬカラムでのＳＥＣにより分析した。タンパク質濃度は、標品としてＩｇＧを用いたビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを使用することにより決定した。ＤＡＲは各精製ＡＤＣに関してＨＩＣおよびＬＣ−ＭＳにより評価した。一般に、凝集形態の含量は５％未満であり、ＤＡＲは３．５〜５の間を含んだ。
【０７０１】
実施例２３：種々の薬物とカップリングされたＩＧＦ−１Ｒ抗体の細胞傷害性評価
５つのＩＧＦ−１Ｒ抗体は急速にリソソームへ内部移行されること、および酸性環境になると低結合能を有することが示された。この点で、これらのＡｂはＡＤＣとして使用されるべき総ての特性を備えていた。従って、これら５つのキメラ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を３つの異なる化合物（Ｇ−１３、Ｅ−１３およびＦ−６３）とカップリングさせた。これらのＡＤＣの薬物抗体比は約４であった。非特異的細胞傷害性を評価するために、無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４も同じＤＡＲでこれらの化合物とカップリングさせた。ＭＣＦ−７細胞を完全培養培地で、３７℃にて６日間、漸増濃度の各ＡＤＣとともにインキュベートした。細胞生存率は、発光細胞生存率アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。発光シグナルはＭｉｔｈｒａｓプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて読み取った。Ｅ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた無関連キメラ抗体ｃ９Ｇ４は、ＭＣＦ−７細胞で細胞傷害活性を全く示さなかったかまたは低活性であった（図２１）。これに対して、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３のいずれかとカップリングさせた後に得られた他の総てのＡＤＣを加えると、ＭＣＦ−７細胞の生存率は劇的に低下した。
【０７０２】
実施例２４：ＭＣＦ−７異種移植モデルにおけるＥ−１３、Ｇ−１３またはＦ−６３化合物のいずれかとコンジュゲートされたｃ２０８Ｆ２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
Ｇ−１３、Ｅ−１３またはＦ−６３化合物とカップリングされたｃ２０８Ｆ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性がｉｎ  ｖｉｖｏで翻訳可能であったことを確認するために、それらがＭＣＦ−７異種移植モデルで試験された。
【０７０３】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。５００万のＭＣＦ−７細胞を７週齢のスイス／ヌードマウスに皮下注射した。細胞注入前に、ＭＣＦ−７腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ成長に必要なエストロゲンを放出させるために、マウスの左側腹部にエストロゲンペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を移植した。
【０７０４】
ＭＣＦ−７細胞移植の２０日後、腫瘍が１２０〜１５０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を５個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は式：π／６×長さ×幅×高さで計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹膜内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｅ−１３、Ｆ−１３またはＦ−６３のいずれかと約ＤＡＲ４でカップリングされたｃ２０８Ｆ２  ｍＡｂの抗腫瘍活性は、Ｄ２０およびＤ２７に７ｍｇ／ｋｇ用量の２回の注射の後に評価した（図２２Ａ、２２Ｂおよび２２Ｃ）。並行して、キャップされた薬物部分Ｅ−１３、Ｆ−１３およびＦ−６３を、７ｍｇ／ｋｇのｃ２０８Ｆ２−Ｅ−１３、ｃ２０８Ｆ２−Ｆ−１３およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３  ＤＡＲ  約４に相当するものと同等の用量で注射した。
【０７０５】
ｃ２０８−Ｅ−１３（図２２Ａ）、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３（図２２Ｂ）またはｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３（図２２Ｃ）のいずれかの注射は、腫瘍成長を有意に阻害し、完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえした（対応するキャップ薬物に対してｐ＜０．０５）。ｃ２０８−Ｅ−１３、ｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３およびｃ２０８Ｆ２−Ｆ−６３の間に統計的な活性の違いは認めることができなかった。キャップ薬物はＭＣＦ−７腫瘍の成長に影響を及ぼさなかった（対照群に対してｐ＞０．０５）。
【０７０６】
従前に記載したＭＣＦ−７異種移植モデルにおいて、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされたｃ２０８Ｆ２およびＥ−１３またはＧ−１３のいずれかとカップリングされた無関連抗体ｃ９Ｇ４を用いて第２の試験セットを実施した。Ｄ２０およびＤ２７に、マウスに７ｍｇ／ｋｇの各ＡＤＣをｉ．ｐ．注射した（図２３Ａおよび２３Ｂ）。
【０７０７】
ｃ９Ｇ４−Ｅ−１３とｃ９Ｇ４−Ｆ−１３の両方の注射は、ＭＣＦ−７異種移植腫瘍の成長にあまり大きくない一時的な影響を及ぼすだけであった。しかしながら、この第２の試験により、Ｄ４３にＡＤＣの高い抗腫瘍活性が示されたことから、ｃ２０８−Ｅ−１３またはｃ２０８Ｆ２−Ｇ−１３のいずれの注射も完全な腫瘍退縮を誘導したことが確認された。
【０７０８】
実施例２５：種々の薬物とカップリングしたＡｘｌ  ＡＤＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効な細胞傷害性
腫瘍細胞成長の阻害に関するＡＤＣの細胞傷害活性を、ＳＮ１２Ｃ（Ａｘｌ＋ヒト腎細胞癌）およびＭＣＦ−７（Ａｘｌ−ヒト乳腺癌）を用いた細胞増殖アッセイで試験した。簡単に述べれば、薬物処理の前日に細胞を９６ウェルマルチウェルプレートに２５００細胞／ウェルで播種した。ＡＤＣおよび対照を連続希釈した後、ｍｗ−９６プレートに加えた。次に、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号＃Ｇ７５７１）を用いてウェル中のＡＴＰのレベルを測定することにより定量した。細胞生存率のパーセンテージを、無処理細胞を１００％として計算した。非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０）を用い、無処理細胞（対照＝１００％）と比較して生存率に５０％の低下をもたらすのに必要な化合物の濃度であるＩＣ５０を求め、モル濃度で表した（図２８）。
【０７０９】
図２８Ａおよび２８Ｂのデータは、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかとコンジュゲートしたｈｚ１６１３Ｆ１２はそれぞれ１．０４８  １０−１０Ｍ、１．４１３  １０−１０ＭのＩＣ５０値を示すことを示した。よって、Ｅ−１３およびＧ−１３は、１６１３Ｆ１２などのＡｘｌ抗体とカップリングした際に強い細胞傷害性を誘発し得る。ＭＣＦ７細胞（Ａｘｌ−）では細胞傷害性は見られない。
【０７１０】
実施例２６：Ｃａｌｕ−３異種移植モデルにおいてＥ−１３またはＧ−１３いずれかの化合物とコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
Ｇ−１３またはＥ−１３化合物とカップリングした抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を確認するために、それらをトラスツズマブとカップリングし、ＨＥＲ２増幅および（３＋）発現に関して既知のＨＥＲ２感受性異種移植モデルＣａｌｕ−３で試験した。抗体トラスツズマブ(Tratuzumab)は、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、２４  Ｒｕｅ  ｄｅｓ  Ｔｕｉｌｅｒｉｅｓ  ６７４６０  ＳＯＵＦＦＥＬＷＥＹＥＲＳＨＥＩＭ／フランスから購入した。
【０７１１】
総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。７００万のＣａｌｕ−３細胞を７週齢のＳＣＩＤマウスに皮下注射した。
【０７１２】
Ｃａｌｕ−３細胞移植の６日後、腫瘍が２５０〜２６０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を６個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：（長さ×幅２）／２で計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹膜内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかと約ＤＡＲ４でカップリングされたトラスツズマブ(Tratuzumab)  ｍＡｂの抗腫瘍活性は、Ｄ６に３ｍｇ／ｋｇ用量の１回の注射の後に評価した。並行して、トラスツズマブ単独を、３ｍｇ／ｋｇ用量の裸の抗体に相当するものと同等の用量で注射した。
【０７１３】
トラスツズマブ−Ｅ−１３（図２９Ａ）またはトラスツズマブ−Ｇ−１３（図２９Ｂ）のいずれかの注射は、腫瘍成長を有意に阻害し、総ての処置マウスで完全な腫瘍成長の退縮を誘導しさえした（対応する裸の抗体に対してｐ＜０．０５）。トラスツズマブ−Ｅ−１３群とトラスツズマブ−Ｇ−１３群の間に統計的な活性の違いは見られなかった。このＣａｌｕ−３モデルにおいて公開されているデータ(Cretella et al. Molecular Cancer 2014, 13:143)、ＴＤＭ−１は、その用量がトラスツズマブ−Ｅ−１３またはトラスツズマブ−Ｇ−１３のいずれに関して使用したものよりも高い場合であっても（６日ごとに各１回の注射３ｍｇ／ｋｇに対して１５ｍｇ／ｋｇ）、完全な退縮を誘導しなかった。
【０７１４】
実施例２７：ＪＩＭＴ−１異種移植モデルにおけるＥ−１３またはＧ−１３いずれかの化合物とコンジュゲートしたトラスツズマブ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
【０７１５】
トラスツズマブ抗体複合体がトラスツズマブに対して耐性であることが知られるモデルに対しても活性を示すかどうかを知るために、ＨＥＲ２発現が高いがトラスツズマブ療法に耐性であったＪＩＭＴ−１異種移植モデルを評価した。総ての動物手順は、科学目的で使用される動物の保護に関する２０１０／６３／ＵＥ指令のガイドラインに従って実施した。プロトコールはピエール・ファーブル研究所の動物倫理委員会により承認されたものである。７００万のＪＩＭＴ−１細胞を７週齢のＳＣＩＤマウスに皮下注射した。
【０７１６】
ＪＩＭＴ−１細胞移植の４日後、腫瘍が２２０〜２３０ｍｍ３の平均サイズに達した際に、腫瘍のサイズと外観に従って動物を５個体ずつの群に分けた。種々の処置剤を腹腔内注射により接種した。動物の健康状態を毎日監視した。腫瘍体積を電子カリパスで週に２回、試験の終了まで測定した。腫瘍体積は下記式：（長さ×幅２）／２で計算する。毒性は週に３回、動物の体重に従って評価した。統計分析は各尺度においてマン・ホイットニー検定を用いて行った。総ての化合物を腹膜内に（ｉ．ｐ．）注射した。この実施例では、Ｅ−１３またはＧ−１３のいずれかと約ＤＡＲ４でカップリングされたトラスツズマブ  ｍＡｂの抗腫瘍活性は、Ｄ６に３ｍｇ／ｋｇ用量の１回の注射の後に評価した（図３０Ａおよび３０Ｂ）。最初の試験では、本発明者らは、トラスツズマブ単独では抗腫瘍効果を持たなかったことを示した（図３０Ｃ）。この結果は、公開されているデータと一致する。
【０７１７】
トラスツズマブ−Ｅ−１３（図３０Ａ）またはトラスツズマブ−Ｇ−１３（図３０Ｂ）のいずれかの注射は腫瘍成長を有意に阻害し、３４日目にそれぞれ７３％および７０％の成長阻害まで低下させた。トラスツズマブ−Ｅ−１３とトラスツズマブ−Ｇ−１３の間に統計的な活性の違いは認めることができなかった。このＣａｌｕ−３モデルにおいてすでに見られているように、また、このＪＩＭＴ−１モデルにおいて公開されているデータ(Barok et al. Breast Cancer Research 2011, 13:R46)に比べて、ＴＤＭ−１は、その用量がトラスツズマブ−Ｅ−１３またはトラスツズマブ−Ｇ−１３のいずれに関して使用したものよりも高い場合であっても（６日ごとに各１回の注射３ｍｇ／ｋｇに対して１５ｍｇ／ｋｇ）、効力が低いと思われる。
【図１】
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【図２Ａ−２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ−１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ−Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ−Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【配列表】
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