(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学発光標識からの化学発光を増強する方法であって、
式Ｉを有する加水分解条件下で分解可能なカチオン界面活性剤の存在下で酸および過酸化水素と化学発光標識とを接触させることを含む方法。
【化１】
0006494599.tif 000018
（式Ｉ中、Ｘは窒素またはリンであり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、水素および一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から選択され、
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から選択され、
Ｙは、炭酸エステル結合、アミド結合、エステル結合またはこれらのあらゆる組み合わせから選択される加水分解条件下で切断可能な結合であり、
Ａ−は、Ｘ＋に対するアニオン性対イオンである。）
【請求項２】
前記化学発光標識が、アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミド、またはこれらの誘導体もしくは複合体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化学発光標識の発光時間を短縮し、それによって、界面活性剤のない場合の標準的発光時間よりも短縮された発光時間を提供することをさらに含み、前記短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間に匹敵する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記短縮された発光時間が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間よりも短い請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記短縮された発光時間が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間よりも２０％短い請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記短縮された発光時間が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間よりも３０％短い請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記短縮された発光時間が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間よりも５０％短い請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、前記化学発光標識の総光出力を増強するうえで、塩化セチルトリメチルアンモニウムと同程度に効率的である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化学発光標識の化学発光を増加させ、それによって、界面活性剤のない場合の標準的発光よりも増加した発光を提供することをさらに含み、前記増加した発光は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光の増加に匹敵する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増加した発光が、界面活性剤のない場合の前記標準的発光と比較して、少なくとも２．５倍増強されている請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記増強が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光増強の少なくとも７０％である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記増強が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光増強の少なくとも８０％である請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記増強が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光増強の少なくとも９０％である請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記界面活性剤が、前記化学発光標識の発光時間を短縮するうえで塩化セチルトリメチルアンモニウムと少なくとも同程度に効率的である請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、各々独立して、一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいＣ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基またはＣ４−１０アラルキル基である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ４が、一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいＣ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基、Ｃ２−２０アルキニル基、Ｃ３−２０シクロアルキル基またはＣ４−２０アラルキル基である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
Ｒ５が、Ｃ１−３０アルキル基、Ｃ２−３０アルケニル基、Ｃ２−３０アルキニル基、Ｃ３−３０シクロアルキル基またはＣ４−３０アラルキル基である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
Ａ−が、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオンまたは水酸化物イオンである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記界面活性剤が、化合物１または化合物２またはこれらの混合物である請求項１に記載の方法。
【化２】
0006494599.tif 000019
【請求項２０】
免疫アッセイキットであって、
ａ）アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミド、またはこれらの誘導体もしくは複合体を有する化学発光標識、
ｂ）酸、過酸化水素および式Ｉを有する加水分解条件下で分解可能なカチオン界面活性剤を含む酸性試薬、ならびに
【化３】
0006494599.tif 000020
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、水素および一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から選択され、
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から選択され、
Ｘは窒素またはリンであり、
Ｙは、炭酸エステル結合、アミド結合、エステル結合またはこれらのあらゆる組み合わせから選択される加水分解条件下で切断可能な結合であり、
Ａ−は、Ｘ＋に対するアニオン性対イオンである。）
ｃ）アルカリ性水酸化物を含む塩基性試薬
を含むキット。
【請求項２１】
前記化学発光標識が、アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミド、またはこれらの誘導体もしくは複合体である請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、各々独立して、一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいＣ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基またはＣ４−１０アラルキル基である請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
Ｒ４が、一つ以上のヘテロ原子を有していてもよいＣ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基、Ｃ２−２０アルキニル基、Ｃ３−２０シクロアルキル基またはＣ４−２０アラルキル基である請求項２０に記載のキット。
【請求項２４】
Ｒ５が、Ｃ１−３０アルキル基、Ｃ２−３０アルケニル基、Ｃ２−３０アルキニル基、Ｃ３−３０シクロアルキル基またはＣ４−３０アラルキル基である請求項２０に記載のキット。
【請求項２５】
Ａ−が、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオンまたは水酸化物イオンである請求項２０に記載のキット。
【請求項２６】
使用するときに、前記界面活性剤が、界面活性剤のない場合の前記化学発光標識の標準的発光時間よりも短縮された発光時間を提供し、前記短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間に匹敵する請求項２０に記載のキット。
【請求項２７】
使用するときに、前記界面活性剤が、界面活性剤のない場合の前記化学発光標識の標準的発光と比較して、発光の増加を示し、前記増加した発光は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光の増加に匹敵する請求項２０に記載のキット。
【請求項２８】
前記酸が硝酸であり、前記アルカリ性水酸化物が水酸化ナトリウムである請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願に対する相互参照］
本出願は、２０１３年５月１４日に出願された米国仮特許出願整理番号６１／８２３，１６２に対する優先権を享受する権利を主張し、米国仮特許出願整理番号６１／８２３，１６２は、その全体において参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、アクリジニウム化合物の化学発光を増強するための、環境にやさしく、分解可能なカチオン界面活性剤に関する。関連する方法およびキットも提供される。
【背景技術】
【０００３】
化学発光性アクリジニウムジメチルフェニルエステルは、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ’  ＡＤＶＩＡ：Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）システムなどの自動免疫アッセイにおいて臨床的に重要な広範囲の分析対象物の測定に対して使用される感受性の高い標識（図１Ｂ）である。各エッセイの終わりに、二つの試薬の連続的な添加によって、アクリジニウムエステル標識由来の発光が引き起こされる。０．３ｍＬの０．１Ｍ硝酸（０．５％の過酸化水素も含有する）による最初の処理によって、アクリジニウムエステルの非化学発光性擬似塩基（図１Ａ）を標識の化学発光性アクリジニウム形態に変換する。その後、カチオン界面活性剤である、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）を７ｍＭ含有する０．２５Ｍ水酸化ナトリウムを０．３ｍＬ添加することによって、過酸化水素をイオン化し、発光を開始する。界面活性剤ＣＴＡＣは、アクリジニウムエステルの化学発光プロセスにおいて非常に重要な役割を果たす（Ｎａｔｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，９，５０９２−５１０３）。ＣＴＡＣは、標識の発光時間を約６０秒から５秒未満に短縮する。また、ＣＴＡＣは、アクリジニウムエステル標識およびその複合体からの総光出力を３−４倍に増加させる。より速い発光およびより強い光出力によって、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ’  ＡＤＶＩＡ：Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）システムなどの自動装置において、迅速かつ感受性の高いアッセイを可能とする。
【０００４】
ＡＤＶＩＡ：Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）システムで実施される各免疫アッセイ試験は、約０．７ｍｇのＣＴＡＣを消費する。非常に大容量の免疫アッセイ試験がＡＤＶＩＡ：Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）システムにおいて世界中で実施される（ある概算に基づいて２０１２年だけで５億回を超える試験）ことによって、このカチオン界面活性剤の相当量（３５０ｋｇを超える）の年間使用量につながる。ＣＴＡＣなどのカチオン界面活性剤は、環境中に排出されるとき、水性生物に対して強い毒性があると考えられている（
0006494599.tif 000002
Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓａｆｅｔｙ，２００３，５４，８７−９１；Ｐａｎｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｕｌｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｃｏｎｔａｍｉｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１９５５，５５，１７９−１８６；
0006494599.tif 000003
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１９９７，７７４，２８１−２８６；
0006494599.tif 000004
Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓａｆｅｔｙ，２００８，７１，４９８−５０５；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｓｔｅｌｌｏ，ＱＳＡＲ，２００３，２２，２２０−２２５；Ｌｅｅｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，１９９２，２４，６２９−６３９）。カチオン界面活性剤は、好気性条件下で微生物によって分解されるが、嫌気性条件下では分解しにくく、あまり生分解されないため、水性生物に対して深刻な環境的リスクを引き起こす（Ｙｉｎｇ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２００６，３２，４１７−４３１；Ｍａｄｅｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  Ｐａｒｔ  Ｂ：Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｐａｃｔ，Ｕ．Ｚｏｌｌｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，２００４，ｐ２１１−２４８；Ｙｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，Ｆａｔｅ  ａｎｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  Ｐａｒｔ  Ｂ：Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｐａｃｔ，Ｕ．Ｚｏｌｌｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，２００４，ｐ７７−１０９）。
【０００５】
このように、化学発光の増強効率を保持しながら、ＣＴＡＣを分解可能で環境にやさしい（“環境保護的（ｇｒｅｅｎ）”）界面活性剤で置換するニーズは、長い間存在したままである。したがって、化学発光をＣＴＡＣと少なくとも同程度に効率的に増強する環境保護的界面活性剤を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００６】
前述の目的などに従って、分解可能な界面活性剤を光誘発試薬に組み入れることによって、従来のＣＴＡＣなどの界面活性剤と少なくとも匹敵する程度に、化学発光性アクリジニウム化合物の化学発光が増強されることが意外にも見出された。広く利用されるアクリジニウム標識に対して、光誘発試薬中でこれらの環境にやさしい界面活性剤を用いることは、環境保護的であり、幾つかの実施形態においては、従来のカチオン界面活性剤ＣＴＡＣに代わるものとして、意外にも、より効率的である。
【０００７】
一態様においては、化学発光標識由来の化学発光を増強する方法は、構造式Ｉを有する分解可能なカチオン界面活性剤の存在下で、酸および過酸化水素と化学発光標識を接触させることを含むように提供される。
【化１】
0006494599.tif 000005
ここで、Ｘは、窒素またはリンであり、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素および一つ以上のヘテロ原子を任意に有するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から各々独立して選択され、
Ｒ４およびＲ５は、一つ以上のヘテロ原子を任意に有する水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から各々独立して選択され、
Ｙは、切断可能な結合であり、
Ａ−は、Ｘ＋に対するアニオン対イオンである。
【０００８】
幾つかの実施形態においては、化学発光標識は、アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミドまたはその誘導体もしくは複合体である。酸は、硝酸である可能性がある。
【０００９】
ある実施形態においては、方法は、化学発光標識の発光時間を短縮し、それによって、界面活性剤のない場合の標準発光時間よりも短縮された発光時間を提供することをさらに含み、短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間に匹敵する。例えば、短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間よりも短い（例えば、約２０％、約３０％、または約５０％短い）ことがある。一実施形態においては、本発明の界面活性剤は、化学発光標識の総光出力を増強するうえで、塩化セチルトリメチルアンモニウムと同程度に効率的である。
【００１０】
幾つかの実施形態においては、方法は、化学発光標識の化学発光を増強し、それによって、界面活性剤のない場合の標準的発光よりも発光を増加させることをさらに含み、発光の増加は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光の増加に匹敵する。例えば、発光の増加は、界面活性剤のない場合の標準的発光と比較すると、少なくとも約２．５倍増強することがある。ある実施形態においては、この増強は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光増強の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である可能性がある。一実施形態においては、本発明の界面活性剤は、化学発光標識の発光時間を短縮するうえで、塩化セチルトリメチルアンモニウムと少なくとも同程度に効率的である。
【００１１】
種々の実施形態においては、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立し、一つ以上のヘテロ原子を任意で有するＣ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基またはＣ４−１０アラルキル基である可能性がある。Ｒ４は、一つ以上のヘテロ原子を有するＣ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基、Ｃ２−２０アルキニル基、Ｃ３−２０シクロアルキル基またはＣ４−２０アラルキル基である可能性がある。Ｒ５は、Ｃ１−３０アルキル、Ｃ２−３０アルケニル基、Ｃ２−３０アルキニル基、Ｃ３−３０シクロアルキル基またはＣ４−３０アラルキル基である可能性がある。
【００１２】
ある実施形態においては、Ｙは、加水分解条件下で分解可能である可能性がある。例えば、Ｙは、炭酸エステル結合、アミド結合、エステル結合またはそのあらゆる組み合わせから選択することができる。
【００１３】
幾つかの実施形態においては、Ａ−は、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオンまたは水酸化物イオンとすることができる。
【００１４】
幾つかの例においては、本発明の界面活性剤は、以下の化合物１または化合物２またはその混合物である可能性がある。
【化２】
0006494599.tif 000006
【００１５】
本発明の別の態様においては、免疫アッセイキットが提供され、
ａ）アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミド、またはその誘導体もしくは複合体を有する化学発光標識と、
ｂ）酸、過酸化水素および構造式Ｉを有する分解可能なカチオン界面活性剤を含む酸性試薬と、
を含み、
【化３】
0006494599.tif 000007
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ＹおよびＡ−基は、本明細書で記述されるように定義され、
ｃ）アルカリ性水酸化物を含む基礎試薬を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態においては、化学発光標識は、アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミド、またはその誘導体もしくは複合体である可能性がある。
【００１７】
種々の実施形態においては、使用するときに、本発明の界面活性剤は、界面活性剤がない場合の標準的発光時間よりも短縮された化学発光標識の発光時間をもたらすことができ、短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間に匹敵する（例えば、ほぼ同一、約２０％、約３０％、または約５０％短い）。
【００１８】
ある実施形態においては、使用するときに、本発明の界面活性剤は、界面活性剤のない場合の標準的発光と比較して、化学発光標識の発光の増加を示すことができ、発光の増加は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光の増加に匹敵する（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）。
【００１９】
幾つかの例においては、酸は硝酸とすることができる。アルカリ性水酸化物は、水酸化ナトリウムでもよい。
【００２０】
本発明のこれらの態様および他の態様は、添付の請求項を含む以下の詳細な説明を参照することによってより理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】Ｎ−スルホプロピルアクリジニウムジメチルフェニルエステルのアクリジニウム・擬似塩基平衡
【図１Ｂ】Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ’  ＡＤＶＩＡ：Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）システムなどの自動免疫アッセイにおいて使用されるアクリジニウムリング内のＮ−スルホプロピル基を含む化学発光性アクリジニウムジメチルフェニルエステル標識の構造
【図２Ａ】切断可能な結合（ＣＭＣ＝限界ミセル濃度）を含む例示的なカチオン界面活性剤（１および２）の構造
【図２Ｂ】現在の研究で抗ＴＳＨ（ＴＳＨ＝チロイド刺激ホルモン）抗体複合体を製造するために利用される例示的アクリジニウムエステル（３ａ、３ｂおよび３ｃ）の構造
【図３】切断可能なアミド結合でのカチオン界面活性剤１に対する例示的合成スキーム
【図４】切断可能な炭酸エステル結合でのカチオン界面活性剤２に対する例示的合成スキーム
【図５】カチオン界面活性剤存在下、および不存在下での、アクリジニウムエステル３ａの抗ＴＳＨ抗体複合体の化学発光プロファイル（ＲＬＵ＝相対光単位）
【図６】カチオン界面活性剤存在下、および不存在下での、アクリジニウムエステル３ｂの抗ＴＳＨ抗体複合体の化学発光プロファイル
【図７】カチオン界面活性剤存在下、および不存在下での、アクリジニウムエステル３ｃの抗ＴＳＨ抗体複合体の化学発光プロファイル
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、分解可能なカチオン界面活性剤の存在下で、酸および過酸化水素と、化学発光標識を接触させることを含む、化学発光標識からの化学発光を増強する方法に関する。このような分解可能なカチオン界面活性剤を含む関連するキットも提供される。分解可能なカチオン界面活性剤は、従来の界面活性剤に匹敵するか、またはそれよりも短い程度に、化学発光標識の発光時間を短縮することができる。分解可能なカチオン界面活性剤は、化学発光標識の化学発光を増加させ、従来の界面活性剤に匹敵する発光の増加を提供する。
【００２３】
特に嫌気性条件下で、従来のカチオン界面活性剤の生分解性が悪いという問題を解決するために、本発明は、カチオン界面活性剤の第四級のグループおよびアルキル鎖の間に切断可能な結合を導入する。本発明においては、切断可能な結合（例えば、炭酸エステルまたはアミド）を含むカチオン界面活性剤は、アクリジニウムエステル由来の化学発光を増強するうえでＣＴＡＣと少なくとも同程度に効率的であることが意外にも見出された。広く利用されるアクリジニウム標識（例えば、エステルまたはスルホンアミド）のための、光誘発試薬中でのこれらの環境にやさしい界面活性剤の利用は、従来のカチオン界面活性剤ＣＴＡＣに代わるものとして、環境保護的である。
【００２４】
＜定義＞
簡便性のために、本明細書、例および添付の請求項で用いられる用語は、ここにまとめておく。特に定義されない限りは、本明細書で用いられる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般的に理解されるのと同等の意味を有する。
【００２５】
本明細書で用いられるように、以下の用語および語句は、以下の意味を有するように意図される。
【００２６】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、その冠詞の文法的目的語のうちの一つまたは二以上（即ち、少なくとも一つ）のことを称するように本明細書で用いられる。例示として、“ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ”とは、一構成要素または二以上の構成要素を意味する。
【００２７】
本明細書で用いられるように、“ａｂｏｕｔ（約）”という用語は、２０％以内、１０％以内または５％以内を意味する。
【００２８】
本明細書で用いられるように、“ｃｏｍｐｅｒａｂｌｅ（匹敵する）”という用語は、第一の化合物（例えば、第一の界面活性剤）の特性が第二の化合物（例えば、第二の界面活性剤）の特性とほぼ同一、または類似する、または等価であることを意味する。例えば、本発明の環境保護的界面活性剤の特性（例えば、短縮された発光時間、または発光の増加）が“塩化セチルトリメチルアンモニウムの特性に匹敵する（ｃｏｍｐｅｒａｂｌｅ）”であると称される場合、このような特性は塩化セチルトリメチルアンモニウムとほぼ同一であり、その差が２０％以内、１０％以内または５％以内であることを意味する。幾つかの例においては、本発明の環境保護的界面活性剤は、塩化セチルトリメチルアンモニウムよりも発光において良好な特性を示すことがある。
【００２９】
概して、“ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（界面活性剤）”という用語は、液体の表面張力、二液体間もしくは液体および固体間の界面張力を低下させる化合物のことを称する。界面活性剤とは、典型的に両親媒性化学物質であり、疎水性“頭部”および親水性“尾部”の双方を含むことを意味する。より一般的には、界面活性剤は、極性頭部に従って分類される。非イオン性界面活性剤は、その頭部中に帯電した基を有しない。イオン性界面活性剤の頭部は、正味の電荷を伝搬する。電荷が負である場合、界面活性剤はより詳細にはアニオン性と呼ばれ、電荷が正である場合、カチオン性と呼ばれる。界面活性剤は逆に帯電した二つの基を有する頭部を含む場合、双性イオン性と呼ばれる。
【００３０】
“ｍｉｃｅｌｌｅ（ミセル）”とは、液体コロイド中に分散した界面活性剤分子の凝集体である。水性溶液中の典型的なミセルは、周囲の溶媒と接触する親水性頭部領域で凝集体を形成し、ミセル中心に疎水性尾部領域を隔離する。この種類のミセルは、正相ミセル（水中油型ミセル）として知られている。逆ミセルは、尾部が外に延びる中心に頭部を有する（油中水型ミセル）。ミセルは、界面活性剤の濃度が限界ミセル濃度（ＣＭＣ）よりも大きいときに形成することがある。ミセルは、球状、円筒状、および円板状を含む様々な形状で存在する可能性がある。
【００３１】
＜環境保護的界面活性剤＞
本発明の主目的は、カチオン界面活性剤であるＣＴＡＣを排除し、化学発光アクリジニウム標識に対する光誘発試薬中でより環境にやさしいカチオン界面活性剤で置換することである。
【００３２】
幾つかの実施形態においては、アクリジニウムエステル標識の化学発光を増強するための分解可能なカチオン界面活性剤の構造は、以下の構造式（Ｉ）によって表すことができる。
【化４】
0006494599.tif 000008
ここで、Ｘは窒素またはリンであり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、水素および一つ以上のヘテロ原子を任意に有するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から各々独立して選択され、Ｒ４およびＲ５は、一つ以上のヘテロ原子を任意に有するアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基またはアラルキル基から各々独立して選択され、Ｙは、切断可能な結合であり、Ａ−は、Ｘ＋に対するアニオン対イオンである。
【００３３】
幾つかの実施形態においては、アクリジニウムエステル標識の化学発光を増強するための分解可能なカチオン界面活性剤の構造は、以下の式（ＩＩ）によって表すことができる。
【化５】
0006494599.tif 000009
ここで、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一であるか、または異なる可能性がある。例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立し、一つ以上のヘテロ原子（例えば、メチル、エチル、プロピルまたはブチル）を任意で有するＣ１−１０アルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ３−１０シクロアルキル基またはＣ４−１０アラルキル基である可能性がある。
−Ｒ４は、一つ以上のヘテロ原子を任意で有するＣ１−２０アルキル基、Ｃ２−２０アルケニル基、Ｃ２−２０アルキニル基、Ｃ３−２０シクロアルキル基またはＣ４−２０アラルキル基である可能性がある。例えば、Ｒ４は、２−４個の炭素を含むアルキル鎖である可能性がある。
−Ｒ５は、Ｃ１−３０アルキル基、Ｃ２−３０アルケニル基、Ｃ２−３０アルキニル基、Ｃ３−３０シクロアルキル基またはＣ４−３０アラルキル基である可能性がある。例えば、Ｒ５は、直鎖または分岐アルキル鎖（例えば、１０−１６炭素）である可能性がある。
−Ａ−は、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオンまたは水酸化物イオンから選択されるアニオンである可能性がある。
【００３４】
別の実施形態においては、アクリジニウムエステル標識の化学発光を増強するための分解可能なカチオン界面活性剤の構造は、以下の構造式（ＩＩＩ）によって表すことができる。
【化６】
0006494599.tif 000010
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＡ−は、上述と同一の定義を有する可能性がある。
【００３５】
従来の界面活性剤に対して、より環境保護的な代替物として、切断可能な結合を有する他の好適な界面活性剤は、他文献で記述され、参照によって本明細書に組み入れられる（例えば、Ｔａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２０００，３，１６７−１７２；Ｔａｔｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２００１，４，２７９−２８５；Ｂａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２００９，１２，２４９−２５９；Ｂａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２０１０，１３，３８７−３９８；Ｂａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１，６０，１１７−１２６；Ｂａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，５６，４９３−４９９；Ｓｔｊｅｒｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，２００５，２９１，５７０−５７６）。上述の界面活性剤の製造方法は本技術分野で既知である。
【００３６】
＜アクリジニウム化合物＞
分解可能なカチオン界面活性剤によって化学発光を増強することができるアクリジニウムエステルは、以下の構造式によって表すことができる。
【化７】
0006494599.tif 000011
ここで、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、０−２０ヘテロ原子を含むアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアラルキル基である可能性があり、Ｒ１０およびＲ１１は、水素、０−２０ヘテロ原子を含むアルキル基、アルケニル基、アルキニル基またはアラルキル基である可能性がある。
【００３７】
他の好適なアクリジニウム化合物（例えば、アクリジニウムスルホンアミド）は、米国特許番号８，２９３，９０８；８，１１９，４２２；７，８７５，４６７；７，７８５，９０４；７，６１１，９０９；７，４５９，２８４および米国特許公報２０１２／０２２５４９７，２０１０／０２５６３８０および２０１０／００９９０７７に記述された化合物を含み、その全ては、その全体において参照によって本明細書に組み入れられる。
【００３８】
＜環境保護的界面活性剤の利用＞
塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）などの従来のカチオン界面活性剤と比較すると、分解可能なカチオン界面活性剤の利用は有利である。なぜなら、それらは、好気性および嫌気性条件下の双方で迅速に分解され、それによって、環境に排出されるときにリスクを顕著に低下させるからである。これらのカチオン界面活性剤は、その発光経路がアクリジニウムエステルの経路と同一であるアクリジニウムスルホンアミドなどの他の標識の化学発光を増強するためにも有用である。
【００３９】
このように、本発明の一態様は、本明細書で記述された分解可能なカチオン界面活性剤の存在下で、酸および過酸化水素と化学発光標識を接触することを含む、化学発光標識由来の化学発光を増強するための方法に関する。ある実施形態においては、本方法は、化学発光標識の発光時間を短縮し、それによって界面活性剤がない場合の標準的発光時間よりも短縮された発光時間を提供することをさらに含む可能性がある。この短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間に匹敵する。例えば、短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間よりも（例えば、約２０％、約３０％または約５０％短い）短いことがある。一実施形態においては、本発明の界面活性剤は、化学発光標識の総光出力を増強するうえで、塩化セチルトリメチルアンモニウムと同程度に効率的である可能性がある。
【００４０】
幾つかの実施形態においては、本方法は、化学発光標識の化学発光を増強し、それによって界面活性剤のない場合の標準的発光よりも発光の増加を提供することをさらに含む可能性がある。このような発光の増加は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光に匹敵する可能性がある。例えば、発光の増加は、界面活性剤のない場合の標準的発光と比較すると少なくとも約２．５倍の増強であってもよい。ある実施形態においては、このような増強は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％である可能性がある。一実施形態においては、本発明の界面活性剤は、化学発光標識の発光時間を短縮するうえで、塩化セチルトリメチルアンモニウムと少なくとも同程度に効率的である可能性がある。
【００４１】
本発明の別の態様において、免疫アッセイキットが提供され、
ａ）アクリジニウムジメチルフェニルエステル、アクリジニウムスルホンアミド、またはその誘導体もしくは複合体を有する化学発光標識と、
ｂ）酸と、本明細書で記述された分解可能なカチオン界面活性剤とを含む酸性試薬と、
ｃ）アルカリ性過酸化水素を含む酸化剤と、
を含む。
【００４２】
種々の実施形態においては、使用されるとき、本発明の界面活性剤は、界面活性剤のない場合の標準的発光よりも、化学発光標識の発光時間の短縮をもたらすことができる。このような短縮された発光時間は、塩化セチルトリメチルアンモニウムの発光時間に匹敵する可能性がある（例えば、ほぼ同一、または約２０％、約３０％もしくは約５０％短い）。ある実施形態においては、使用されるときに、化学発光の増加が、塩化セチルトリメチルアンモニウムの化学発光に匹敵する（例えば、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）ように、本発明の界面活性剤は、界面活性剤のない場合の標準的発光と比較すると、化学発光標識の発光の増加を代替的または追加的に示すことができる。
【００４３】
要約すると、有利なことに、切断可能なアミドおよび炭酸エステル結合を含む分解可能なカチオン界面活性剤は、広く利用されるアクリジニウムエステル標識の化学発光を増強するうえで、ＣＴＡＣなどの従来のカチオン界面活性剤と少なくとも同程度に効率的であることが発見された。分解可能な界面活性剤は、ＣＴＡＣよりも発光を増強するうえで、より効率的である可能性があることも意外にも発見された。分解可能な界面活性剤は、酸性溶液中で良好な安定性を示し、ＣＴＡＣに代わるものとして環境にやさしい。これらの界面活性剤は、アクリジニウムスルホンアミドなどの他の標識の発光を増強するうえでも有用である。化学反応の摂動は、反応物質の局所濃度を増加させるため、および／または反応媒体の極性を変化させるための、界面活性剤の能力に依存するため、分解可能な界面活性剤は、このような用途に対して従来の界面活性剤の穏和な代替物として役立つ可能性がある。
【００４４】
＜例＞
例１：カチオンアミド界面活性剤１の合成（図３）
＜化合物ｉｉ＞
パルミチン酸（ｉ、２．５６４ｇ、１０．００ｍモル）、トルエン（１００ｍＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１．１４７ｍＬ、１０．５０ｍモル）が混合され、２０時間環流された。反応混合物は、乾燥物に濃縮され、わずかに黄色の固体が３．２１ｇ得られた。粗製固体は、乾燥アセトン（７５ｍＬ）から再結晶化された。所望の生成物ｉｉ（１．８３ｇ）は、白色の針状結晶として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）、０．８７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５）、１．２０−１．３５（ｍ，２４Ｈ）、１．５５−１．７０（ｍ，２Ｈ）、２．１７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５）、２．３０（ｓ，６Ｈ）、２．４９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．５）、３．３６（ｄｔ、２Ｈ，Ｊ＝５．５，５．５）、６．２５（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ３２７．４（Ｍ＋Ｈ＋）；ＨＲＭＳｍ／ｚ３２７．３３７６（Ｍ＋Ｈ＋）（３２７．３３７５が計算された）。
【００４５】
＜化合物ｉｉｉ＞
化合物ｉｉ（１．４１ｇ、４．３２ｍモル）、アセトン（５０ｍＬ）およびヨードメタン（０．３０９ｍＬ、４．９７ｍモル）は、６時間、アルゴン雰囲気下で８０℃で環流された。反応混合物は室温に冷却され、沈殿した白色固体がフィルタ処理によって収集された。フィルタケークは、ドライアセトン（１０ｍＬ×４）で洗浄され、高真空下のＰ２Ｏ５で乾燥された。所望の生成物ｉｉｉ（１．９０４ｇ）は白色固体として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５）、１．２１−１．３８（ｍ，２２Ｈ）、１．５７−１．７０（ｍ，４Ｈ）、２．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３）、３．４２（ｓ，９Ｈ）、３．７８−３．８９（ｍ、４Ｈ）、７．９６（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ２８２．３６（Ｍ−ＮＭｅ３＋）；ＨＲＭＳｍ／ｚ３４１．３５２８（Ｍ＋）（３４１．３５３２が計算された）。
【００４６】
＜化合物１＞
化合物ｉｉｉ（１．５０ｇ、３．２０ｍモル）が室温で無水エタノール（４００ｍＬ）中に溶解され、ＩＲ−９００塩化物レジン（７６．２ｇ，３．２０ｍモル）が添加され、室温で１時間撹拌された。その後、混合物は、ＩＲ−９００塩化物レジンカラム（８０ｇ、無水エタノールで予め洗浄された）を通された。カラムは、無水エタノール（６００ｍＬ）で溶離された。溶離液は減圧下で濃縮され、わずかに茶色の固体が１．５１ｇ得られた。この物質は、無水アセトン／エタノールから再結晶化された。所望の生成物、界面活性剤１（０．８９５ｇ）は、白色固体として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．３）、１．１７−１．３８（ｍ，２２Ｈ）、１．５５−１．６８（ｍ，４Ｈ）、２．２７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３）、３．４３（ｓ，９Ｈ）、３．７０−３．８５（ｍ、４Ｈ）、８．７２（ｂｒ，ｓ，１Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ２８２．３６（Ｍ−ＮＭｅ３＋）；ＨＲＭＳｍ／ｚ３４１．３５２９（Ｍ＋）（３４１．３５３２が計算された）。
【００４７】
例２：カチオン炭酸エステル界面活性剤２の合成（図４）
＜化合物Ｖ＞
ドデカノール（ｉｖ、２．２３６ｍＬ、１０．００ｍモル）、トリエチルアミン（１．３９４ｍＬ、１０．００ｍモル）および炭酸ジフェニル（２．１４２ｇ、１０．００ｍモル）の混合物が１６時間、８０℃に加熱された。その後、３−ジメチルアミノ−１−プロパノール（２．３６６ｍＬ、２０．００ｍモル）が添加され、さらに１６時間８０℃に加熱された。反応混合物は、その後、減圧下で濃縮され、暗黄色の油が３．９２ｇ得られた。それは、メタノール／エチルアセテート（１：９）を溶離液として使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製された。所望の生成物ｖ（２．６３ｇ）は黄色い油状物質として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５）、１．２０−１．４２（ｍ，１８Ｈ）、１．６１−１．７１（ｍ，２Ｈ）、１．８７−１．９８（ｍ，２Ｈ）、２．３３（ｓ，６Ｈ）、２．４９（ｂｒ  ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０）、４．１２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５）、４．１９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ３１６．３（Ｍ＋Ｈ＋）；ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ３１６．２８５５（Ｍ＋Ｈ＋）（３１６．２８５２が計算された）。
【００４８】
＜化合物  ｖｉ＞
化合物ｖ（１．５００ｇ、４．７５ｍモル）、アセトン（５０ｍＬ）およびヨードメタン（０．３４０ｍＬ、５．４７ｍモル）が混合され、６時間環流された。室温に冷却された後、所望の生成物が白色固体として沈殿した。白色固体は、フィルタ処理によって収集され、エチルアセテート（１０ｍＬ×４）で洗浄された。固体は、高真空下でＰ２Ｏ５によって乾燥された。所望の生成物ｖｉ（１．９８８ｇ）は、白色固体として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０）、１．６０−１．７２（ｍ，１８Ｈ）、２．０５−２．３４（ｍ，２Ｈ）、３．４９（ｓ，９Ｈ）、３．７６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３）、４．１２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５）、４．２９（ｍ，２Ｈ）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｍ／ｚ３１６．３（Ｍ＋Ｈ＋）；ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ３１６．２８５５（Ｍ＋Ｈ＋）（３１６．２８５２が計算された）。
【００４９】
＜化合物２＞
化合物ｖｉ（１．５０ｇ、３．２８ｍモル）が室温で無水エタノール（２００ｍＬ）中に溶解され、ＩＲ−９００塩化物レジン（７８ｇ、３２８ｍモル）が添加され、１時間室温で撹拌された。その後、混合物は、ＩＲ−９００塩化物レジンカラム（８０ｇ、無水エタノールで予め洗浄された）を通された。カラムは、無水エタノール（４００ｍＬ）で溶離された。溶離液は、減圧下で濃縮され、白色固体１．５ｇが得られた。粗製生成物は、無水アセトンから再結晶化された。所望の生成物２（０．６３７ｇ）は白色固体として得られた。１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５）、１．６０−１．７０（ｍ，１８Ｈ）、２．１８−２．３０（ｍ，２Ｈ）、３．４９（ｓ，９Ｈ）、３．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．８）、４．１１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８）、４．２５（ｍ，２Ｈ）。ＨＲＭＳ  ｍ／ｚ  ３３０．３０１３（Ｍ＋）（３３０．３００８が計算された）。
【００５０】
＜例３：化学発光測定＞
アクリジニウムエステル化学発光に対する分解可能なカチオン界面活性剤の影響を検討するため、切断可能な結合を含む二つの例示的カチオン界面活性剤（図２Ａ）が選択された。二つの界面活性剤の限界ミセル濃度（ＣＭＣ）は図２Ａに示されている。二つの界面活性剤の合成スキームは、図３−図４に示され、上記の例１および例２で記述されている。双方の界面活性剤は、水中で報告されたＣＭＣの５倍で、試薬１（０．５％過酸化水素を含む０．１Ｍ硝酸）中に溶解された。試薬２（０．２５Ｍ  ＮａＯＨ）中に溶解したＣＴＡＣは、対照の界面活性剤として使用された。二つの炭酸エステルおよびアミドカチオン界面活性剤（図２Ａ）は、特に長期間の保管中に安定性を保持するために試薬１中に溶解された（Ｓｔｊｅｒｎｄａｈｌ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｂｅｒｇ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，２００５，２９１，５７０−５７６）。３つのアクリジニウムエステル（図２Ｂ、化合物３ａ、３ｂおよび３ｃ）が文献（Ｎａｔｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，９，５０９２−５１０３；Ｎａｔｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１２，１０，３４３２−３４４７）に記述されるように、抗ＴＳＨ（ＴＳＨ＝チロイド刺激ホルモン）抗体のたんぱく質複合体を形成するために用いられた。複合体は、約５個の標識を含んでいた。複合体は、バッファ中に４℃で保管され、各複合体由来の化学発光は、界面活性剤のない場合、ならびにカチオン界面活性剤１および２と同様にＣＴＡＣの存在下で、測定された（表１−３、図５−図７）。（ａ）総光出力を増加するため、および（ｂ）発光動態を増強するための各界面活性剤の能力が、８０日間にわたって評価された。
【００５１】
アクリジニウムエステル３ａ、３ｂおよび３ｃ（図２Ｂ）の抗ＴＳＨ抗体複合体の化学発光は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙによるＡｕｔｏｌｕｍａｔ  ＬＢ９５３  Ｐｌｕｓ  ルミノメータによって測定された。約５個の標識を含む〜２ｍｇ／ｍＬの複合体は、化学発光測定のために、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、８ｍＭアジ化ナトリウム、０．０１５ｍＭウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ８．０の水性バッファ中に１０５倍に段階希釈された。０．０１０ｍＬ体積の各希釈アクリジニウムエステルサンプルがキュベットの底部に分注された。キュベットは、準備されたＬＢ９５３に配置され、試薬１（０．１Ｍ硝酸中の０．５％過酸化水素溶液）０．３ｍＬの添加、その後試薬２（０．２５Ｍ水酸化ナトリウム溶液）０．３ｍＬの連続的添加によって化学発光反応が開始した。ＣＴＡＣ存在下での測定のために、界面活性剤（７ｍＭ）が試薬２に含まれた。カチオンアミド界面活性剤１またはカチオン炭酸エステル界面活性剤２の存在下での測定のために、各界面活性剤は、試薬１中に３．２ｍＭ（界面活性剤１）および２．１５ｍＭ（界面活性剤２）溶解された。各化学発光フラッシュ曲線は、０．５秒間隔で２４０回測定された（合計１２０秒）。各化学発光反応は、最低３回実行され、平均化されて、各時間間隔まで蓄積された化学発光の割合に変換された。ルミノメータ装置からの出力はＲ．Ｌ．Ｕ．（相対光単位）として表された。
【００５２】
表１−表３における結果は、切断可能なアミドおよび炭酸エステル結合を其々含むカチオン界面活性剤１および２の双方が、アクリジニウムエステル複合体からの総光出力を増加させるのみならず、発光時間を短縮するうえでもＣＴＡＣと少なくとも同程度に効率的であることを示している。例えば、３つの全てのアクリジニウムエステル複合体に対して、相対的光出力に割り当てられた界面活性剤の対照と比較すると、総光出力は、界面活性剤１および２と同様にＣＴＡＣに対して、３ａでは約２．５−４倍、３ｂでは３−５倍、３ｃでは３−４．５倍増加した（表１ａ、表２ａおよび表３ａ）。具体的には、表１ａは、界面活性剤２が化学発光を増強するうえで、少なくとも最初の１０日以内はＣＴＡＣと同程度に効率的であることを示している（即ち、界面活性剤２によって増加した発光の倍数は、ＣＴＡＣと同一である）。８０日目でさえも、界面活性剤２を用いて増加した発光の倍数は、ＣＴＡＣの約８０％（２．８／３．５）のままである。同様に、界面活性剤１を用いて増加した発光の倍数は、ＣＴＡＣと比較すると、１日目で約８９％（３．１／３．５）、８０日目で７４％（２．６／３．５）である。このように、界面活性剤１および２の双方は、化学発光を増強するうえでＣＴＡＣに匹敵する。さらに、二つのカチオン界面活性剤１および２は、室温で８０日経過した後でさえも、アクリジニウムエステル抗体複合体からの化学発光を増強する能力にほとんど損失がないと証明されることによって、試薬１（０．１Ｍ硝酸中の０．５％過酸化水素）中できわめて安定であることを証明した。
【００５３】
さらには、界面活性剤１および２の双方は、アクリジニウムエステル抗体複合体からの発光を増強するうえで非常に効率的であった（表１ｂ、表２ｂおよび表３ｂ、図５−図７）。界面活性剤のない場合、複合体３ａ、３ｂおよび３ｃからの＞９０％の光の発光時間は、其々、５７．５秒、４９．５秒および６２．５秒であることが観察された。ＣＴＡＣまたは二つのカチオン界面活性剤１および２の存在下で、発光時間は、３つの全てのアクリジニウムエステル標識の複合体に対して、＜３秒に短縮された。意外にも、界面活性剤１および２は、発光を加速するうえでＣＴＡＣよりも効率的である。例えば、表１ｂに示されるように、界面活性剤１および２は、アクリジニウムエステル３ａの発光動態を５７．５秒から１．０秒に加速したが、ＣＴＡＣは１．５秒であった。発光を加速するための界面活性剤１および２の能力は、複合体の化学発光プロファイルに図示されるように、室温での８０日間の貯蔵後でさえも減少しなかった（図５−図７）。
【００５４】
＜均等物＞
本発明は、とりわけ環境保護的界面活性剤を提供し、化学発光を増強するうえでのその利用を提供する。本発明の主題の特定の実施形態が議論されてきたが、上記の明細書は、例示的なものであって、限定的なものではない。本発明の多くの変更は、本明細書を再考することで、当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、均等物の全範囲に沿った請求項および変更に沿った明細書を参照することによって決定されるべきである。
【００５５】
＜参照による組み入れ＞
各個々の文献または特許が、参照によって組み入れられることを具体的かつ個々に示されるように、本明細書で言及される全ての文献、特許およびシーケンスデータベースエントリは、その全体において参照によって本明細書に組み入れられる。
【表１ａ】
0006494599.tif 000012
【表１ｂ】
0006494599.tif 000013
【表２ａ】
0006494599.tif 000014
【表２ｂ】
0006494599.tif 000015
【表３ａ】
0006494599.tif 000016
【表３ｂ】
0006494599.tif 000017
【図１Ａ】
0006494599.tif 000021
【図１Ｂ】
0006494599.tif 000022
【図２Ａ】
0006494599.tif 000023
【図２Ｂ】
0006494599.tif 000024
【図３】
0006494599.tif 000025
【図４】
0006494599.tif 000026
【図５】
0006494599.tif 000027
【図６】
0006494599.tif 000028
【図７】
0006494599.tif 000029