(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの組み合わせを含むリンパ浮腫の治療用医薬であって、
ＣＣＢＥ１が、
（ａ）（ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列、（ii）配列番号１記載のアミノ酸３５〜４０６、または、（iii）（ｉ）または（ii）と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、全長ＣＣＢＥ１の生物活性を保持しているポリペプチドの形態、または
（ｂ）（ｉ）配列番号２記載の核酸配列、または（ii）（ｉ）と少なくとも９０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含み、全長ＣＣＢＥ１の生物活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態
であり、
ＶＥＧＦ−Ｃが、
（ｃ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸３２〜４１９、（ii）配列番号３のアミノ酸２２８〜４１９に共有結合されているアミノ酸３２〜２２７、（iii）配列番号３のアミノ酸１１２〜２２７、（iv）配列番号３のアミノ酸１０３〜２２７、および（ｖ）（ｉ）〜（iv）のいずれかと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ−Ｃの生物活性を保持しているポリペプチドの形態、または
（ｄ）（ｉ）配列番号４の核酸５２４〜１６８７、（ii）配列番号４の核酸７３７〜１６８７、（iii）配列番号４の核酸７６４〜１６８７、（iv）配列番号４の核酸７３７〜１１１１、（ｖ）配列番号４の核酸７６４〜１１１１、および（vi）（ｉ）〜（vi）のいずれかと少なくとも９０％の核酸配列同一性を有する核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含み、ＶＥＧＦ−Ｃの生物活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態
である医薬。
【請求項２】
リンパ浮腫が、原発性リンパ浮腫、ミルロイ症候群、メージュリンパ浮腫、遅発型リンパ浮腫、続発性リンパ浮腫および脂肪性浮腫からなる群より選択される請求項１記載の医薬。
【請求項３】
ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの組み合わせ、ならびに医薬的に許容され得るビヒクルを含むリンパ系障害に関連した疾患または症状を治療するための医薬組成物であって、
ＣＣＢＥ１が、
（ａ）（ｉ）配列番号１記載のアミノ酸配列、（ii）配列番号１記載のアミノ酸３５〜４０６、または、（iii）（ｉ）または（ii）と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、全長ＣＣＢＥ１の生物活性を保持しているポリペプチドの形態、または
（ｂ）（ｉ）配列番号２記載の核酸配列、または（ii）（ｉ）と少なくとも９０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含み、全長ＣＣＢＥ１の生物活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態
であり、
ＶＥＧＦ−Ｃが、
（ｃ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸３２〜４１９、（ii）配列番号３のアミノ酸２２８〜４１９に共有結合されているアミノ酸３２〜２２７、（iii）配列番号３のアミノ酸１１２〜２２７、（iv）配列番号３のアミノ酸１０３〜２２７、および（ｖ）（ｉ）〜（iv）のいずれかと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＥＧＦ−Ｃの生物活性を保持しているポリペプチドの形態、または
（ｄ）（ｉ）配列番号４の核酸５２４〜１６８７、（ii）配列番号４の核酸７３７〜１６８７、（iii）配列番号４の核酸７６４〜１６８７、（iv）配列番号４の核酸７３７〜１１１１、（ｖ）配列番号４の核酸７６４〜１１１１、および（vi）（ｉ）〜（vi）のいずれかと少なくとも９０％の核酸配列同一性を有する核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含み、ＶＥＧＦ−Ｃの生物活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態
である医薬組成物。
【請求項４】
リンパ浮腫が、原発性リンパ浮腫、ミルロイ症候群、メージュリンパ浮腫、遅発型リンパ浮腫、続発性リンパ浮腫および脂肪性浮腫からなる群より選択される請求項３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ系障害に関連した疾患および症状、特にリンパ浮腫を治療するための、治療方法、治療的使用および治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ浮腫は、リンパ系機能障害により引き起こされる、限局性のリンパ液の滞留および進行性の腫脹の、慢性的な身体機能および外見を損なう疾患である。リンパ浮腫は一生続く症状であり、世界中で約１億４千万人の患者の生活の質に深刻な影響を与えている。
【０００３】
稀な遺伝性疾患である原発性リンパ浮腫は、一般的にリンパ管の異常発育に起因する。原発性リンパ浮腫の症状は、出生時または後年において現れ得る。
【０００４】
後天性または続発性リンパ浮腫はリンパ系への損傷によって生じる。西洋諸国においては、続発性リンパ浮腫は、がん、特に乳がんの治療中に、リンパ系への損傷がもたらされる、リンパ節郭清、手術および／または放射線治療によって最も多く引き起こされる。米国では、約１１万人の乳がん患者が腋窩リンパ節郭清および／または放射線によってリンパ浮腫を患っており、毎年、新しく１５０００人近くの患者が乳がんに関連したリンパ浮腫を発症していると推定されている。
【０００５】
治療によるリンパ脈管新生（リンパ管の再生）はリンパ浮腫の治療の将来において魅力的な展望である。近年の、リンパ脈管新生を支配している分子機序に関する知識の急増にもかかわらず、初期のリンパ脈管新生の正確な形態発生機序は、いまだ完全には理解されていない。
【０００６】
血管内皮細胞増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）は、胎児発育期におけるリンパ脈管新生および成人における様々なリンパ脈管新生過程の主要な動因である（非特許文献１）。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を活性化させることにより作用し、そしてタンパク質分解的にプロセシングされた成熟形態で、ＶＥＧＦＲ−２を活性化させることによっても作用する。マウスにおけるＶｅｇｆｃ遺伝子の欠失は、新たに分化したリンパ管内皮細胞が中心静脈から最初のリンパ管構造が形成される場所に遊走できないために、リンパ系の発達不全をもたらす（非特許文献２、非特許文献３）。この表現型は、組み換えＶＥＧＦ−Ｃを適用することによって回復され得る（非特許文献３）。その回復には、Ｎ末端およびＣ末端プロペプチドを欠く、ＶＥＧＦ−Ｃの「成熟」組み換え型が使用された。内在性のＶＥＧＦ−Ｃを分泌する細胞において、ＶＥＧＦ−Ｃがそのシグナル伝達の全潜在能力を発揮するために、これらのプロペプチドは中心のＶＥＧＦ相同ドメイン（ＶＨＤ）からタンパク質分解的に切断される必要がある（非特許文献４）。ＶＥＧＦ−Ｃは、両方のプロペプチドが切断された場合のみ、主要な血管新生の受容体ＶＥＧＦＲ−２を有意に活性化させることができ（非特許文献４）、よって、成熟型ＶＥＧＦ−Ｃは血管新生も刺激する。
【０００７】
ＶＥＧＦ−Ｃ受容体ＶＥＧＦＲ−３における突然変異は、ミルロイ病として知られる遺伝性のリンパ浮腫をもたらすことが明らかにされている（非特許文献５）。一方で、Ｈａｎｎｅｋａｍリンパ管拡張症−リンパ浮腫症候群は、コラーゲンおよびカルシウム結合ＥＧＦドメイン１（ＣＣＢＥ１）遺伝子における突然変異と関連している（非特許文献６）が、変異ＣＣＢＥ１がどのようにそのリンパ管の表現型を生じさせているかは不明である。いずれにせよ、ダブルヘテロ接合ＣＣＢＥ１＋／；ＶＥＧＦ−Ｃ＋／−マウスの表現型により、ＣＣＢＥ１とＶＥＧＦ−Ｃとの遺伝的相互作用が示唆されている（非特許文献３）。
【０００８】
ＣＣＢＥ１は、角膜マイクロポケットアッセイにおいて、ＶＥＧＦ−Ｃの前リンパ脈管新生活性を増加させると示唆されている（非特許文献７）が、リンパ脈管新生におけるその真の役割は不明瞭なままである。その理由の１つは、天然の全長ＣＣＢＥ１の製造が不可能であったため、実験に使用されたＣＣＢＥ１タンパク質が、ヒトＩｇＧのＦｃドメインと融合された人工のトランケート型ＣＣＢＥ１タンパク質であったことによる。
【０００９】
近年、リンパ管上に特異的に発現される分子の同定は著しく進歩したが、リンパ浮腫の根治的治療は存在していない。現在行われているのは緩和治療のみであるため、リンパ浮腫の治療法は改善が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Alitalo, 2011, Nature Medicine 17: p.1371-1380
【非特許文献２】Karkkainen et al, 2003, Nature Immunology 5: p.74-80
【非特許文献３】Haegerling et al, 2013, EMBO J 32: p.629-644
【非特許文献４】Joukov et al, 1997, EMBO J 16: p.3898-3911
【非特許文献５】Karkkainen et al, 2000, Nature Genetics 25: p.153-159
【非特許文献６】Alders et al, 2009, Nature Genetics 41: p.1272-1274
【非特許文献７】Bos et al, 2011, Circulation Research 109: p.486-491
【発明の概要】
【００１１】
ある実施態様において、本発明は、リンパ浮腫の治療における使用のための全長ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの組み合わせに関する。
【００１２】
別の実施態様においては、本発明は、リンパ浮腫の治療方法であって、その治療を必要とする患者に全長ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの組み合わせを、同時に、別々にまたは連続的に投与することによる方法に関する。
【００１３】
上記実施態様のいくつかの実施形態では、その組み合わせは、ＣＣＢＥ１を、配列番号１記載のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３５〜４０６、またはそれらと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの形態で含む。
【００１４】
いくつかの他の実施形態では、その組み合わせは、ＣＣＢＥ１を、配列番号２記載の核酸配列、配列番号２のヌクレオチド７１〜１２９１、またはそれらと少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドの形態で含む。
【００１５】
いくつかのさらなる実施形態では、その組み合わせは、ＶＥＧＦ−Ｃを、配列番号３のアミノ酸３２〜４１９、配列番号３のアミノ酸２２８〜４１９に共有結合されているアミノ酸３２〜２２７、配列番号３のアミノ酸１１２〜２２７、配列番号３のアミノ酸１０３〜２２７、およびそれらと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの形態で含む。
【００１６】
いくつかのまたさらなる実施形態では、その組み合わせは、ＶＥＧＦ−Ｃを、配列番号４の核酸５２４〜１６８７、配列番号４の核酸７３７〜１６８７、配列番号４の核酸７６４〜１６８７、配列番号４の核酸７３７〜１１１１、配列番号４の核酸７６４〜１１１１、およびそれらと少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含むポリヌクレオチドの形態で含む。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様は、上述の実施形態のいずれかに記載された、全長ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの組み合わせを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明の他の実施態様、具体的な実施形態、目的、詳細、および利点は、以下の図面、詳細な説明および実施例に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
以下において、本発明は、好ましい実施形態を用い、添付の図面を参照してより詳細に説明される。
【００２０】
【図１】ＣＣＢＥ１の同時発現が、ＶＥＧＦ−Ｃの、成熟型つまり完全活性ＶＥＧＦ−Ｃへのタンパク質分解的プロセシングを増加させることを示す図である。２９３Ｔ細胞をＣＣＢＥ１のみ（Ａ）またはＶＥＧＦ−Ｃ＋／−ＣＣＢＥ１（Ｄ）でトランスフェクトし、放射性アミノ酸とインキュベートし、培地上清（ｓｕｐ）および細胞ライセートをＶ５抗体（ＩＰ：Ｖ５）および可溶性ＶＥＧＦ−Ｃ受容体（ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｃ）との沈降と続くオートラジオグラフィーにより分析した。留意すべきは、細胞内および細胞外ＣＣＢＥ１の両方が検出され、ＣＣＢＥ１の分泌は、コラーゲンとは異なり、細胞培養培地へのアスコルビン酸塩の添加に依存しないということである。Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｃの生合成およびプロセシングの概略図である。ＶＥＧＦ−Ｃの前駆体、および様々なプロセシングされた形態の概略的構造が示されている（Karpanen & Alitalo, 2008, Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease 3: 367-397）。矢印はパネルＤの対応するバンドを指している。Ｄは、ＶＥＧＦＲ−３／ＦｃとのＶＥＧＦ−Ｃ沈降物が、切断されていない、部分的に切断された、および切断されたＶＥＧＦ−Ｃを含むことを示している。ＣＣＢＥ１との同時発現は、切断されていないＶＥＧＦ−Ｃの量を減少させ、活性化されたＶＥＧＦ−Ｃの量を増加させる。Ｃは、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの両方を発現する培養物由来の上清が、ＶＥＧＦ−Ｃのみを発現する培養物由来の上清よりも、Ｂａ／Ｆ３−ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ細胞の増殖の促進において高い活性を示すことを示している。統計学上の有意差Ｐ＜０．０５は＊で、そしてＰ＜０．００１は＊＊＊で記し、ｎ．ｓ．は統計学的有意差がないことを示している（ｎ＝４）。
【図２Ａ】ＣＣＢＥ１がＶＥＧＦ−Ｃの分泌を促進させることを示す図である。示されるように、ＶＥＧＦ−Ｃを用いて、ＣＣＢＥ１と共に、またはＣＣＢＥ１なしで、トランスフェクトされた細胞の上清およびライセートからのＶＥＧＦ−Ｃ免疫沈降反応を示す。左の分子量は、主要なＶＥＧＦ−Ｃの形態の移動度を示す。留意すべきは、成熟２１ｋＤａ型ＶＥＧＦ−Ｃの量は上清中で増加し（８倍）、切断されていないＶＥＧＦ−Ｃおよび２９／３１ｋＤａポリペプチドの量は、ＣＣＢＥ１同時トランスフェクションの場合に（それぞれ、７４％および５１％）減少する（レーン１、２とレーン３、４とを比較）ということである。ＶＥＧＦ−ＣのＮ末端切断から生じる１４ｋＤａ断片は、同時トランスフェクトされた細胞の上清のみで検出される。ＣＣＢＥ１−同時トランスフェクションした細胞の細胞ライセートにおいて、細胞内ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドが８０％減少するので、ＣＣＢＥ１との同時トランスフェクションはＶＥＧＦ−Ｃの分泌を促進させる（レーン５、６とレーン７、８とを比較）。
【図２Ｂ】ＣＣＢＥ１がＶＥＧＦ−Ｃの分泌を促進させることを示す図である。ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの両方を発現する培養物由来の馴化培地が、ＶＥＧＦ−Ｃのみを発現する培養物由来の上清よりも、マウス（ｍ）またはヒト（ｈ）ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲキメラを発現するＢａ／Ｆ３細胞の増殖の促進において、より高い活性を有することを示している。
【図３Ａ】コラーゲンドメイントランケート型Ｆｃ融合ＣＣＢＥ１は、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３刺激活性に影響を与えないことを示す図である。ｈＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ−Ｂａ／Ｆ３細胞は、一定用量（５μｇ／ｍｌ）のトランケート型ＣＣＢＥ１−Ｆｃ（「Ａ」）またはＦｃ部分のみからなる陰性対照タンパク質（「Ｂ」）の存在下で、ヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣ（成熟型ＶＥＧＦ−Ｃ）の濃度の増加と共に刺激された。細胞は、刺激条件で合計３日間インキュベートされた。この期間の最後に、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、シグマ−アルドリッチ）が細胞培養物に添加され、各培養物中の生細胞数（細胞増殖の直接的なスコア）が、ＯＤ５４０光学濃度によって測定された（濃青色の物質を生産する生細胞のミトコンドリア酵素によって、黄色のＭＴＴは減少される）。
【図３Ｂ】コラーゲンドメイントランケート型Ｆｃ融合ＣＣＢＥ１は、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦＲ−３刺激活性に影響を与えないことを示す図である。ｈＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ−Ｂａ／３細胞は、一定用量（５μｇ／ｍｌ）のトランケート型ＣＣＢＥ１−Ｆｃ（「Ａ」）またはＦｃ部分のみからなる陰性対照タンパク質（「Ｂ」）の存在下で、全長ＶＥＧＦ−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ前駆体）の濃度の増加と共に刺激された。細胞は、刺激条件で合計３日間インキュベートされた。この期間の最後に、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、シグマ−アルドリッチ）が細胞培養物に添加され、各培養物中の生細胞数（細胞増殖の直接的なスコア）が、ＯＤ５４０光学濃度によって測定された（濃青色の物質を生産する生細胞のミトコンドリア酵素によって、黄色のＭＴＴは減少される）。
【図４】ＶＥＧＦ−Ｃ切断が、トランスでＣＣＢＥ１を発現する細胞によって増進されることを示す図である。別々の細胞集団が、ＶＥＧＦ−ＣまたはＣＣＢＥ１を用いてトランスフェクトされ、そして、示されたように、代謝標識期間の間混合された。留意すべきは、ＣＣＢＥ１が（同時）トランスフェクトされると、上清中の、成熟型ＶＥＧＦ−Ｃ（２１ｋＤａ）の量は増加し、全長（５８ｋＤａ）または部分的に切断された（２９／３１ｋＤａ）ＶＥＧＦ−Ｃの量は減少する一方、細胞ライセートにおけるそれらの量は変化しないということである。また、安定的にトランスフェクトされた２９３Ｓ  ＧｎＴＩ細胞によって生産されたＶＥＧＦ−Ｃの異なるグリコシル化パターンから、安定的にトランスフェクトされた細胞と一過的にトランスフェクトされた細胞間でのＶＥＧＦ−Ｃの遊走にわずかな差異が生じることにも留意すべきである（Chaudhary et al, 2012, Nature Protocols 7: 453-466）。
【図５】ＣＣＢＥ１のＶＥＧＦ−Ｃ切断増進活性が、培地、すなわちＣＣＢＥ１産生２９３Ｔ細胞の馴化上清の可溶性成分に分泌されることを示す図である。これは、活性が、細胞表面または細胞外基質に限定されず、たとえば、可溶性タンパク質として治療的に投与され得ることを示している。さらに、切断増進活性は、１０％ＦＣＳの添加によって阻害されないかまたは有意に阻害されない。しかし、全ての形態のＣＣＢＥ１が、ＶＥＧＦ−Ｃの切断を増進するわけではなく、たとえば、ＤＵ−４４７５によって生産されたＣＣＢＥ１は、ＶＥＧＦ−Ｃの切断を増進しない。
【図６】ＣＣＢＥ１が、インビボでリンパ脈管新生を促進させることを示す図である。示された因子をコードするＡＡＶ９により形質導入され、示された抗原について染色されたマウス前脛骨筋の免疫染色である。全長ＶＥＧＦ−Ｃのみでは、軽度のリンパ脈管新生反応のみを誘導するが、ＣＣＢＥ１との同時形質導入では、リンパ管のＬＹＶＥ−１およびＰｒｏｘ−１染色によって検出されるように、強い反応を生じる。陽性対照としてΔＮΔＣ−ＶＥＧＦ−Ｃ（完全にプロセシングされた、成熟型ＶＥＧＦ−Ｃの等価物）をコードするＡＡＶ９を使用した。血清アルブミンへの反応は、ＣＣＢＥ１単独のものと同等であった。統計学上の有意差Ｐ＜０．０５を＊で、Ｐ＜０．０１を＊＊で、そしてＰ＜０．００１を＊＊＊で記し、ｎ．ｓ．は、差が統計学的に有意でないことを示す（ｎ≧５）。
【図７】ＶＥＧＦ−ＣとのＣＣＢＥ１同時形質導入が血管新生を刺激することを示す図である。前脛骨筋における内皮マーカー（ＰＥＣＡＭ−１）および平滑筋細胞マーカー（ＳＭＡ）の免疫組織化学的検査である。右に、染色領域の定量化が表示されている。統計学上の有意差Ｐ＜０．０５を＊で、Ｐ＜０．０１を＊＊で、そしてＰ＜０．００１を＊＊＊で記す（ｎ≧５）。
【図８】ＣＣＢＥ１／ＶＥＧＦ−Ｃ同時形質導入による、ＣＤ４５＋白血球の動員を説明する図である。Ｐｒｏｘ１転写因子を、リンパ管内皮細胞のマーカーとして使用した。分析は、図７におけるように行なった。
【図９】示されたＡＡＶ９ベクターが前脛骨筋に注入されたマウスにおけるＶＥＧＦＲ−３−ルシフェラーゼレポーターシグナルを説明する図である。ＶＥＧＦ−ＣおよびＣＣＢＥ１での同時形質導入は、大きなリンパ脈管新生反応を示す強いルシフェラーゼシグナルを生じるが、全長ＶＥＧＦ−ＣおよびＣＣＢＥ１は小さなルシフェラーゼ活性を生じるのみである。
【図１０】パルス−チェイスにおいて、野生型ＶＥＧＦ−Ｃの分泌は、２時間でピークに達するのに対して、Ｃ末端プロペプチドを欠くＶＥＧＦ−Ｃ突然変異体（ΔＣ−ＶＥＧＦ−Ｃ）は、１５〜４５分の間ですでにピークに達していることを示す図である。
【図１１Ａ】ＶＥＧＦ−ＣのＮ末端およびＣ末端プロペプチドの、成長因子プロセシングへの効果を示す図である。成熟２１ｋＤａ型ＶＥＧＦ−Ｃのおよび１４ｋＤａのＮ末端プロペプチドの量の両方が、Ｃ末端およびＮ末端プロペプチドとの競合によって減少する。
【図１１Ｂ】ＶＥＧＦ−ＣのＮ末端およびＣ末端プロペプチドの、成長因子プロセシングへの効果を示す図である。ＣＣＢＥ１同時トランスフェクションが存在する場合、および存在しない場合における、ＶＥＧＦ−ＤおよびＶＥＧＦ−Ｄ／ＶＥＧＦ−Ｃキメラ（ＣＤＣ）のタンパク質分解的プロセシングを説明する。Ｃ−ｐｐ、Ｃ末端プロペプチド；Ｎ−ｐｐ、Ｎ末端プロペプチド；ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；ΔＮΔＣ、成熟型ＶＥＧＦ−Ｃに相当するＣ末端およびＮ末端トランケート型ＶＥＧＦ−Ｃ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、全長コラーゲンおよびカルシウム結合ＥＧＦドメイン１（ＣＣＢＥ１）タンパク質が、血管内皮細胞増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）の分泌、および主として不活性のＶＥＧＦ−Ｃ前駆体のタンパク質切断を促進し、その結果、ＶＥＧＦ−Ｃを完全に活性化させ、ＶＥＧＦ−Ｃ受容体、ＶＥＧＦＲ−３およびＶＥＧＦＲ−２のシグナル伝達、ならびにインビボでのリンパ脈管新生および血管新生の増加につながるという知見に基づく。したがって、本発明は、リンパ浮腫などの、リンパ系機能障害と関連する様々な疾患におけるリンパ脈管新生および血管新生の調節のための治療手段である、ＣＣＢＥ１とＶＥＧＦ−Ｃとの組み合わせを提供する。
【００２２】
ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの治療的使用は、様々な方法で実行することができる。たとえば、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの併用（co-administration）は、遺伝子療法、タンパク質療法またはそれらの任意の所望の組み合わせによって達成されてもよい。つまり、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの投与の経路および手段は、独立して選択されてもよい。さらに、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの併用は、同時、別々または連続的であってもよい。
【００２３】
本明細書において使用されるように、「または」という用語は、包括的な「または」の演算子であり、文脈上特断の指示がない限り、用語「および／または」と同意義である。また、明細書全体において、複数であることを明記していない、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は複数への言及を含む。
【００２４】
本明細書において使用されるように、「遺伝子療法」という用語は、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドを、その発現を治療的に有効な量で可能にするように、選択された標的細胞または標的組織に移すことをいう。本発明に従って、遺伝子療法は、欠陥遺伝子を取り換えるため、またはリンパ系障害を有する哺乳動物、特にヒトにおいて、治療的に有効な量を、または治療的に有益な時に生産されない遺伝子産物を補うために使用されてもよい。
【００２５】
本明細書において使用されるように、「タンパク質療法」という用語は、治療を必要とするリンパ系障害を有する哺乳動物、特にヒトに、治療的に有効な量でＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを投与することをいう。本明細書において、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーに言及するために互換的に用いられる。
【００２６】
本明細書において使用されるように、「治療的に有効な量」という用語は、最低限、リンパ系障害の有害な作用が改善されるＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃの量のことをいう。
【００２７】
本明細書において使用されるように、「ＣＣＢＥ１」という用語は、特段の断りがない限り、全長ＣＣＢＥ１ポリペプチドまたはその全長ＣＣＢＥ１をコードするポリヌクレオチドのことをいう。好ましくは、ＣＣＢＥ１は哺乳類のＣＣＢＥ１、好ましくはヒトのＣＣＢＥ１である。いくつかの実施形態では、全長ＣＣＢＥ１ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、シグナルペプチドを含まないものが好ましい。おそらくは、ヒトＣＣＢＥ１のシグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１〜３４からなるが、哺乳動物の細胞内で生産された場合、シグナルペプチドは自動的に正確に切断される。ＢｏｓらによってClinical Research 2011, 109: 486-491に開示されたＣＣＢＥ１ポリペプチド、ＣＣＢＥ１Δコラーゲン−Ｆｃが、配列番号１のアミノ酸１〜１９１とヒトＩｇＧ1のＦｃ部分とをコードするｃＤＮＡから生産されるトランケート型ＣＣＢＥ１であることは、注目すべきことである。そのようなトランケート型ＣＣＢＥ１は、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合したＣＣＢＥ１のＥＧＦおよびカルシウム結合ＥＧＦドメインからなるが、コラーゲン反復ドメインを欠く。
【００２８】
本発明に従って使用されるＣＣＢＥ１のポリペプチドは、その生物活性を保持している限り、配列番号１に示されるポリペプチドから変化し得ることは当業者にとって明らかである。ＣＣＢＥ１の変異型が生物活性を維持しているかどうかを判定する典型的な方法は、全長ＶＥＧＦ−Ｃを切断する能力を判定することである。これは、たとえば、全長ＶＥＧＦ−Ｃを発現している細胞を問題とするＣＣＢＥ１変異体とインキュベートし、ＶＥＧＦ−Ｃ切断が増進された場合に、そのＣＣＢＥ１変異型は生物活性を保持している、と結論付けることによって行うことができる。このＶＥＧＦ−Ｃ切断は、たとえば、当該技術分野で周知の方法に従い、代謝標識法、および免疫沈降反応などのタンパク質特異的沈降反応によって判定されてもよい。必要であれば、陽性対照として、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＣＢＥ１を使用してもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＣＣＢＥ１ポリペプチドは、配列番号１の保存的配列変異であるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドに関連して、「保存的配列変異」という用語は、当該技術分野で周知の類似のアミノ酸（たとえば、類似のサイズおよび類似の電荷的性質のアミノ酸）とのアミノ酸置換から生じ、当該ポリペプチドの生物学的性質を有意に変化させないアミノ酸配列改変をいう。アミノ酸の欠失および付加もまた考慮される。他のいくつかの実施形態では、ＣＣＢＥ１ポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本明細書において使用されるように、２つの配列の間の％同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した上で、両配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）。配列の比較、および２つの配列間の同一性の割合の決定は、当該技術分野において利用できる数学的アルゴリズムを使用して達成可能である。これは、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適合する。
【００３１】
本明細書において使用されるように、「ＣＣＢＥ１ポリヌクレオチド」という用語は、ＣＣＢＥ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡなどの任意のポリヌクレオチドを意味する。いくつかの実施形態では、ＣＣＢＥ１ポリヌクレオチドは、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が付いた配列番号２に示される核酸配列またはその保存的配列変異体を含む。いくつかの好ましい実施形態では、ＣＣＢＥ１ポリヌクレオチドは、全長ＣＣＢＥ１のコード配列（ＣＤＳ）、すなわち配列番号２の核酸７１〜１２９１、またはその保存的配列変異体を含む。
【００３２】
ポリヌクレオチドに関して、「保存的配列変異」という用語は、コードされたポリペプチドの生物学的性質を有意に変化させないヌクレオチド配列改変を意味する。保存的ヌクレオチド配列変異は、遺伝暗号の縮重から生じる変異およびサイレント突然変異から生じる変異を含む。ヌクレオチドの置換、欠失および付加もまた考慮される。したがって、複数のＣＣＢＥ１コードポリヌクレオチドが任意のＣＣＢＥ１ポリペプチドに対して存在し、そのいずれもが本発明に従って治療に使用されてもよい。いくつかのさらなる実施形態において、ＣＣＢＥ１ポリヌクレオチドは、生物活性を保持しているＣＣＢＥ１をコードする限り、配列番号２に示される核酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であり得る。
【００３３】
本明細書において使用されるように、「ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチド」という用語は、プレプロＶＥＧＦ−Ｃ、部分的にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｃ、および完全にプロセシングされた成熟型ＶＥＧＦ−Ｃを含む、既知のあらゆる形態のＶＥＧＦ−Ｃを意味する。生合成の間、全長形態のＶＥＧＦ−Ｃ（５８ｋＤａ）は、最初にＣ末端部分においてタンパク質分解により切断され、ジスルフィド結合によって結合された２９／３１ｋＤａ中間体を生じ、そしてその後Ｎ末端の２つの代替部位で切断され、ＶＥＧＦ−Ｃの成熟した、完全に活性な２１ｋＤａまたは２３ｋＤａ型を生じる。大部分のＶＥＧＦ−Ｃタンパク質は活性化されないため、このプロセスは非効率的であることが知られている。しかし、成熟型と２９／３１ｋＤａ中間体型との間の、リンパ脈管新生潜在能力の差は顕著である（Anisimov et al, 2009, Circulation Research 104: 1302-1312）。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明に従って治療に使用されるＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｃの全長型またはプレプロ型である。いくつかのさらなる非限定的な実施形態では、プレプロＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドはシグナル配列を欠き、したがって、たとえば、配列番号３に示される配列のアミノ酸３２〜４１９を含んでもよい。当業者は、シグナルペプチダーゼのための代替の切断部位が存在すること、および他のプロテアーゼがＶＥＧＦ−ＣのＮ末端を、その活性に影響を及ぼすことなくプロセシングし得ることを理解する。その結果、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸３２〜４１９を含むもの、またはアミノ酸３２〜４１９からなるものと異なっていてもよい。
【００３５】
代わりに、またはそれに加えて、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、配列番号３に示されたアミノ酸配列のアミノ酸２２８〜４１９に共有結合されたアミノ酸３２〜２２７を含むものなどの、部分的にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｃの形態であってもよい。また、シグナルペプチダーゼおよび他のプロテアーゼに対する代替的切断部位により、部分的にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、本発明およびその実施形態から逸脱することなく、上記の非限定的な例のものとは異なるアミノ酸組成を有してもよい。
【００３６】
いくつかのさらなる実施形態では、リンパ脈管新生障害を患う被験者に投与されるＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１１２〜２２７または１０３〜２２７を含むものなどの、その完全にプロセシングされた、つまり成熟型である。さらに、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、他の任意の天然または人工型であってもよい。必要であれば、異なる型のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを任意に組み合わせて使用してもよい。好ましくは、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、哺乳類のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドであり、より好ましくはヒトのＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドである。
【００３７】
本明細書に記載されるＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドのいずれも、その生物学的活性、特にＶＥＧＦＲ−２および／またはＶＥＧＦＲ−３を結合および活性化させるその能力を保持する限り、アミノ酸配列において変化してもよい、ということも考慮される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドは、本明細書に記載のいずれのＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの保存的配列変異体であってもよく、または配列番号３に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に関連のある任意の断片を含んでもよい。
【００３８】
本明細書において使用されるように、「ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチド」という用語は、任意のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする核酸配列を含む、一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡなどのあらゆるポリヌクレオチドを意味する。たとえば、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは全長ＶＥＧＦ−Ｃをコードしてもよく、配列番号４に示される核酸配列の核酸５２４〜１６８７を含んでもよく、また核酸５２４〜１６８７からなっていてもよい。他のいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−Ｃの中間体型をコードしてもよく、配列番号４に示される核酸配列の核酸７３７〜１６８７または７６４〜１６８７のいずれかを含んでもよく、またはそのいずれかからなっていてもよい。他のさらなるいくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−Ｃの成熟型をコードしてもよく、配列番号４に示される核酸配列の核酸７３７〜１１１１または７６４〜１１１１のいずれかを含んでもよく、またはそのいずれかからなっていてもよい。上記実施形態のいずれもシグナルペプチドをコードする配列または終止コドンを含まないが、他の実施形態ではそのような配列を含んでもよい。いくつかのなおさらなる実施形態では、成熟型のＣ末端は、受容体活性化の潜在能力を失うことなく短縮され得る。
【００３９】
前記核酸配列の保存的配列変異体もまた考慮される。したがって、任意の所定のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドに対して複数のＶＥＧＦ−Ｃコードポリヌクレオチド配列が存在し、それらのいずれも、本明細書に記載されるように治療に使用されてもよい。
【００４０】
いくつかのさらなる実施形態では、ＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、その生物活性、特にＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３を結合および活性化させるその能力を保持するＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドをコードする限り、上述のＶＥＧＦ−Ｃ核酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一の核酸配列を含んでもよい。
【００４１】
好ましくは、本明細書に記載のいずれのＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドも、ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された分泌シグナルペプチドをコードする追加のＮ末端ヌクレオチド配列モチーフを含む。分泌シグナルペプチドは、典型的には約５〜３０アミノ酸の鎖から構成され、小胞体による細胞外へのポリペプチドの輸送を指示し、そして分泌されたポリペプチドから切断される。適切なシグナルペプチド配列には、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃに本来備わったもの、ＣＤ３３、Ｉｇ  κ、またはＩＬ−３などの、別の分泌タンパク質由来のもの、および合成シグナル配列などが挙げられる。
【００４２】
ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、標的細胞における発現のための適切なプロモーター配列および／またはエンハンサー配列も含んでもよく、その配列はコード配列の上流に作動可能に連結されている。必要であれば、プロモーターは、誘導性プロモーター、または内皮細胞特異的プロモーターなどの細胞型特異的プロモーターであってもよい。適切なプロモーター配列および／またはエンハンサー配列は、当該技術分野において容易に利用可能であり、制限されるものではないが、ＥＦ１、ＣＭＶおよびＣＡＧを含む。
【００４３】
さらに、本明細書に記載の、いずれのＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドも、コード配列の下流に作動可能に連結されている適切なポリアデニル化配列を含んでもよい。
【００４４】
遺伝子療法のために、上記の「裸の」ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、組換ＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターの形態で適用されてもよい。裸のポリヌクレオチドの送達は、細胞膜を物理的または化学的に透過させるどのような方法で行われてもよい。そのような方法は、当該技術分野において利用可能であり、制限されるものではないが、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、リポフェクション、リポソーム介在核酸送達、およびそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４５】
他のいくつかの実施形態では、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドは、適切な発現制御配列下で、ウイルスベクターに組み込まれてもよい。そのような遺伝子療法に適切なウイルスベクターとしては、制限されるものではないが、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターなどが挙げられる。好ましくは、ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスベクター、すなわち哺乳類の被験体内で複製することができないベクターである。そのような複製欠損ベクターの非限定的な好ましい例は、複製欠損アデノウイルスである。適切なウイルスベクターは、当該技術分野において容易に入手可能である。
【００４６】
治療用のＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃポリヌクレオチドの、哺乳類の被験体、好ましくはヒト被験者への送達は、当該技術分野において周知の様々な方法で達成され得る。たとえば、ポリヌクレオチドをコードするＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃを含むウイルスベクターは、たとえば損傷したリンパ管を有する標的組織への注入によって、治療を受ける被験体の体内に直接投与されてもよい。そのような送達によって、インビボでのポリペプチドの発現が生じるため、多くの場合、インビボ遺伝子療法と呼ばれる。代わりに、またはそれに加えて、本治療用ポリペプチドの送達は、ウイルスベクターまたは裸のポリペプチドの使用により、エクソビボでもたらされてもよい。エクソビボ遺伝子療法とは、標的細胞、好ましくは治療を受ける被験者から得られたものを、エクソビボで本発明のポリヌクレオチドでトランスフェクト（またはウイルスを用いて形質導入）し、そして治療目的のために被験者に投与することを意味する。エクソビボ遺伝子療法に適切な標的細胞の非限定的な例としては、内皮細胞、内皮前駆細胞、平滑筋細胞、白血球、そして特に、様々な種類の幹細胞が挙げられる。
【００４７】
遺伝子療法において、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃの発現は、安定的または一過性のいずれであってもよい。多くの場合、一過性の発現が好ましい。当業者は、いつ、どのように安定的または一過性の遺伝子治療のどちらを使用するのかを理解している。
【００４８】
本発明に係る、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの治療的な投与量および処方計画は、リンパ管系障害に関連する疾患または症状を治療する臨床分野における当業者によって容易に決定することができる。一般的に、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃ治療の投薬量は、治療を受ける患者の年齢、性別および総合的な健康状態；もしあれば、併用療法の種類；治療の頻度および所望の効果の特徴；組織の損傷の程度；症状の持続期間；ならびに個別の医師によって調整される他の変数などの検討事項に応じて変化する。たとえば、遺伝子送達のためにウイルスベクターが使用される場合、典型的にはベクターは、任意には薬学的に許容され得る担体で、１０7〜１０13のウイルス粒子の量、好ましくは少なくとも１０9のウイルス粒子の量で投与される。一方で、タンパク質療法が使用される場合、典型的な用量は、０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、最も好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇである。所望の結果を得るために、所望の投薬量は、１回用量でまたは適切な間隔での複数回用量で投与され得る。典型的かつ非限定的な一日の用量は、約５０ｍｇ／日〜約３００ｍｇ／日の間で変化してもよい。
【００４９】
タンパク質療法用に、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃは標準的な組換え法により得ることができる。所望のポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターにクローン化され、当該技術において周知の方法に係る適合性宿主において発現され得る。適切な宿主の例は、制限されるものではないが、（大腸菌などの）細菌、（サッカロマイセス  セレビシエなどの）酵母菌、（Ｓｆ９細胞などの）昆虫細胞、そして好ましくは哺乳類の細胞株を含む。Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンエピトープ（ＨＡタグ）またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼエピトープ（ＧＳＴタグ）などの発現タグを、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃの精製を促進するために使用してもよい。発現タグを利用する場合、投与を必要とする被験者への投与の前に、発現タグを切除しなければならない。
【００５０】
上記のように、本発明の治療方法および治療的使用は、リンパ管系障害に関連する疾患および症状の治療に関する。そのような疾患および症状の非限定的な例は、原発性リンパ浮腫（たとえば、ミルロイ症候群、メージュリンパ浮腫および遅発性リンパ浮腫）、続発性リンパ浮腫および脂肪性浮腫などのリンパ浮腫を含む。
【００５１】
本明細書において使用されるように、「治療（treatment）」または「治療する（treating）」という用語は、リンパ系障害に関連した疾患または兆候の根治だけでなく、予防、改善、緩和を含む目的のための、哺乳類の被験体、好ましくはヒト被験者へのＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの併用をいう。ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃの併用の治療効果は、腫脹、痛み、不快感、重苦しさ、患部組織の緊張などの症状をモニタリングすることにより評価することができる。
【００５２】
本発明は、リンパ管系障害に関連する疾患および症状を治療するための、治療方法および治療的使用のみならず、前記方法における使用および治療的使用のための医薬組成物も提供する。そのような医薬組成物は、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃを、別々に、または組み合わせてのいずれかで含み、ならびに薬学的に許容され得る溶媒、希釈剤、補助剤、賦形剤または担体などの薬学的に許容され得るビヒクルを含む。たとえば、薬学的に許容され得るビヒクルは、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、または注射可能な有機エステルなどの、無菌の非水性担体であってもよい。適切な水性担体は、制限されるものではないが、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水およびリンガーデキストロース溶液を含む。
【００５３】
当該技術において周知のように、所望の作用部位への有効薬物量を達成するために、多様な投与経路を使用することができる。したがって、適切な投与経路は、制限されるものではないが、当業者に知られているように、非経口送達（たとえば静脈内注射）、経腸送達（たとえば経口）、局所投与、局所適用（たとえば、皮膚投与または経皮投与）などを含む。
【００５４】
医薬組成物は、必要に応じて再構成される濃縮形態または粉末形態で提供されてもよい。凍結乾燥の場合、ポリマー（ポビドン、ポリエチレングリコール、デキストラン）、糖類（ショ糖、ブドウ糖、乳糖）、アミノ酸（グリシン、アルギニン、グルタミン酸）およびアルブミンなどの凍結保護物質が好ましい。再構成のための溶液がパッケージングに加えられる場合、たとえば、滅菌水、塩化ナトリウム水溶液、またはデキストロースもしくはブドウ糖溶液からなっていてもよい。
【００５５】
本医薬製剤を処方するための手段および方法は当業者に知られており、本来知られている方法で、たとえば、従来の混合、造粒、溶解、凍結乾燥または同様の処理によって製造されてもよい。
【００５６】
上記いずれの実施形態および特徴も、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃに独立して適用してもよく、所望の組み合わせで使用されてもよい。したがって、ＣＣＢＥ１およびＶＥＧＦ−Ｃのいずれか一方または両方が、遺伝子療法またはタンパク質療法によって送達されてもよい。また、ＣＣＢＥ１またはＶＥＧＦ−Ｃが、遺伝子療法およびタンパク質療法の両方を使用して投与されることも考慮される。
【００５７】
当業者にとって、技術の進歩に伴い、発明思想が様々な方法で実行され得るということは明白である。本発明およびその実施形態は、以下の実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲の範囲内で変更され得る。
【実施例】
【００５８】
材料および方法
クローニング
組換えアデノ随伴ウィルス（ｒＡＡＶ９）ベクターを介して発現される遺伝子は、ＣＭＶプロモーターがニワトリβ−アクチンプロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサーおよびβ−アクチンイントロンからなる混成ＣＡＧプロモーター（Okabe et al, 1997, FEBS Letters 407: 313-319）に置き換えられた、ｐｓｕｂＣＭＶ−ＷＰＲＥの誘導体であるｐｓｕｂＣＡＧ−ＷＰＲＥプラスミド（Paterna et al, 2000, Gene Therapy 7: 1304-1311）にクローニングされた。全長ｍＶＥＧＦ−Ｃ、ΔＮΔＣ−ｍＶＥＧＦ−ＣおよびＨＳＡのＡＡＶ−ベクター（ｐｓｕｂＣＡＧ−ＷＰＲＥ）へのクローニングは以前に説明されている（Anisimov et al, 2009, ibid）。Ｖ５タグに融合されたｍＣＣＢＥ１（ｍＣＣＢＥ１−Ｖ５）は以下の通りクローニングされた。部分ＣＣＢＥ１コードＤＮＡ配列（ＣＤＳ；Ｇｅｎｅｂａｎｋ ♯ＢＣ１５２３２２、Ｉｍａｇｅ ｃｌｏｎｅ ＩＤ ４０１４０６３１）を、Ｓａｃｌ／Ｘｂａｌ断片としてｐＶＫ１（ｐＵＣ１９由来ベクター（Anisimov et al, 2007, Molecular Breeding 19: 241-253））にクローニングした。欠けているヌクレオチドを、プライマー５’−ＧＣＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴ−３’（配列番号５）および５’−ＧＧＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＣＡＡＡＴＧＴＣ−３’（配列番号６）を用いて、褐色脂肪組織ｍＲＮＡから増幅し、上記ＣＤＳを、Ｎｈｅｌ／Ｓａｃｌ断片を挿入することにより完成し、ベクターｐＶＫ１−ＣＣＢＥ１を生じた。ＰＣＲ増幅Ｖ５タグ（プライマー５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号７）および５’−ＧＣＣＴＣＴＡＧＡＡＣＧＣＧＴＣＴＡＧＧＴＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧ− ＣＡＧＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＡＴＡＧＧＣＴＴＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＧＧＧＧ−３’（配列番号８）によって得られた）を、Ｅｃｏ８１Ｉ／Ｘｂａｌ断片としてＣＤＳに加えた。生じたベクターから、完全ＣＤＳはＭｌｕＩ断片として切り出され、ｐｓｕｂＣＡＧ−ＷＰＲＥにクローニングされた。
【００５９】
インビトロ試験用に、マウスＣＣＢＥ１  ＣＤＳがヒトＣＣＢＥ１  ＣＤＳ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ ♯ＮＭ＿１３３４５９）に置換された同一ベクターが構築され、免疫共沈降試験用に、ＳｔｒｅｐＩＩＩ−タグ（Junttila et al, 2005, PROTEOMICS 5: 1199-1203）がＣＣＢＥ１ ＣＤＳに直接続いて挿入された。ＶＥＧＦ−Ｃのための哺乳類発現構築物およびΔＣ−ＶＥＧＦ−Ｃ構築物は以前に説明されている（Joukov et al, 1997, ibid）。キメラ型ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−Ｄ（ＣＤＣ）発現構築物を、オーバーラッピングＰＣＲによりｐＭｏｓａｉｃベクターに組み立てた（Jeltsch et al, 2006, J. Biol. Chem. 281: 12187-12195）。インサートは、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ由来のアミノ酸残基Ｐｈｅ３２−Ａｌａ１１１およびＳｅｒ２２８−Ｓｅｒ４１９、およびヒトＶＥＧＦ−Ｄ由来の介在性の残基Ｔｈｒ９２−Ａｒｇ２０６をコードする配列を含んだ。
【００６０】
Ｓ２細胞における組換えタンパク質発現のための構築物には、ｐＭＴ−Ｅｘベクター（ｐＭＴ−ＢｉＰ−Ｖ５Ｈｉｓ−Ｃの改変型（Kaerpaenen et al, 2006, The FASEB Journal 20: 1462-1472））を使用し、ＶＥＧＦ−ＣのＮ末端プロペプチドに対するアミノ酸残基Ｐｈｅ３２−Ａｌａ１１１、Ｃ末端プロペプチドに対するＳｅｒ２２８−Ｓｅｒ４１９、およびΔＮΔＣ型に対するＴｈｒ１１２−Ａｒｇ２２７をコードする配列、続いてヘキサヒスチジンタグをコードする配列を含んだ。
【００６１】
ｒＡＡＶ生産
ｒＡＡＶ９ウイルスを、説明されているように、３プラスミドトランスフェンクション法によって作製し、非連続イオジキサノールグラジエントを使用する超遠心分離法によって精製した（Anisimov et al, 2009, ibid.）。ＡＡＶ９血清型を作出するために、血清型決定ヘルパープラスミドｐ５Ｅ１８−ＶＰ２／９をｐ５Ｅ１８−ＶＰ２／８の代わりに使用した（Michelfelder et al, 2011, PLoS ONE 6: e23101）。
【００６２】
タンパク質の発現および精製
Ｓ２細胞をＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（キアゲン（Qiagen）、フェンロー、オランダ）を用いてトランスフェクトした。安定な細胞プールを、トランスフェクションの２日後に開始して、４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンで３週間選択した。タンパク質生産のために、細胞を浮遊培養に適合させ、１ｍＭのＣｕＳＯ4で４日間誘導した。ｐＨ調整した馴化上清からＮｉ2+ＮＴＡセファロースへのバッチ結合の後、Ｎｉ2+ＮＴＡセファロースをカラムに装填し、２０ｍＭのイミダゾールで洗浄し、２５０ｍＭのイミダゾールのステップグラジエントを用いて溶出した。タンパク質をさらに、ＰＢＳをランニングバッファとして用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムでサイズ分離した。
【００６３】
細胞培養
２９３Ｔ、２９３Ｓ  ＧｎＴＩ−およびＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１０％ＦＣＳのＤ−ＭＥＭ中で増殖させた。ＰＣ３細胞を１０％ＦＣＳのＨａｍ’ｓＦ−１２中で、ＤＵ−４４７５細胞を２０％ＦＣＳのＲＰＭＩ １６４０中で、およびＳ２細胞をＨｙＣｌｏｎｅ  ＳＦＸ−Ｉｎｓｅｃｔ（サーモサイエンティフィック、ロックフォード、イリノイ）またはＩｎｓｅｃｔ−Ｘｐｒｅｓｓ（ロンザ  グループ、バーゼル、スイス）中で増殖させた。
【００６４】
トランスフェクション、代謝標識法およびタンパク質分析
２９３Ｔ細胞および２９３Ｓ  ＧｎＴＩ細胞を、示されたタンパク質をコードする発現構築物を用いて（同時）トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を［35Ｓ］−システイン／［35Ｓ］−メチオニン（パーキンエルマー、ウェルハム、マサチューセッツ）で代謝標識し、４８時間後、馴化細胞培養培地および細胞ライセートを採取した。短期の標識法実験については２４時間後にすでに採取がなされた。あるいは、ウエスタンブロッティング用の標識されていないタンパク質を生産するために、細胞の培養培地を０．２％ＢＳＡのＤ−ＭＥＭに対して交換し、上清および細胞ライセートを４８時間後に採取した。
【００６５】
免疫沈降反応の前に、試料を、タンパク質Ａセファロース（ポリクローナル抗体およびウサギ抗血清）またはタンパク質Ｇセファロース（モノクローナル抗体）を用いて任意にプレ洗浄した。抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗血清（Baluk et al, 2005, J. Clin Invest. 115: 247-257）、抗Ｖ５抗体（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア、♯４６−０７０５）、抗ｈＣＣＢＥ１抗体（アトラスアンチボディーズＡＢ（Atlas Antibodies AB）、ストックホルム、スウェーデン、♯ＨＰＡ０４１３７４）、抗ＶＥＧＦ−Ｄ抗体ＶＤ１（Achen et al, 2000, Eur. J. Biochem. 267: 2505-2515）またはキメラ型ＶＥＧＦＲ−３/ｌｇＧＦｃ（Maekinen et al, 2001, Nature Medicine 7: 199-205）を免疫沈降反応に用いた。
【００６６】
試料を洗浄し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。オートラジオグラフィーのためにゲルを乾燥し、ホスホイメージャープレートまたはＸ線フィルムに感光した。免疫検出のため、タンパク質をニトロセルロースに転写した。特異的シグナルは、ＥＣＬとの併用で、抗ＶＥＧＦ−Ｃ抗血清、抗Ｖ５抗体または抗ｈＣＣＢＥ１抗体により検出した。オートラジオグラフィーおよびウエスタンブロッティングの定量化を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ベセスダ、メリーランド）を使用して、レーザースキャナの読み出しまたはスキャンされたＸ線フィルムから行った。
【００６７】
Ｂａ/Ｆ３−ＶＥＧＦＲ/ＥｐｏＲアッセイ
Ｂａ/Ｆ３−ｈＶＥＧＦＲ−３/ＥｐｏＲ（Achen et al, 2000, ibid.）およびＢａ/Ｆ３−ｍＶＥＧＦＲ−２/ＥｐｏＲ（Stacker et al, 1999b）バイオアッセイを、馴化細胞培養培地を用い、基本的には説明されているように行った（Maekinen et al, 2001, ibid.）。Ｂａ/Ｆ３−ｈＶＥＧＦＲ−２/ＥｐｏＲ細胞株は、上述の細胞株と同様に、しかしｐＥＦ−ＢＯＳの代わりにｐＣＩ−ｎｅｏを使用して作出した。キメラ型の結合部アミノ酸配列は、〜ＦＦＩＩＥＧＡＱＥＫＴＮＬＥＧＳ（ＶＥＧＦＲ−２部分の終端部）−（ｍＥｐｏＲ部分の始端部）ＬＩＬＴＬＳＬＩＬＶＬＩＳＬＬＬＴＶＬＡＬＬＳＨＲＲＴＬＱＱＫＩＷＰＧＩＰＳＰＥＳＥＦＥ〜（それぞれ、配列番号９および１０）であった。このキメラ型構築物を、３０ｍｓ１４００Ｖの１パルス（ネオントランスフェクション装置、インビトロジェン）でＢａ／Ｆ３細胞にエレクトロポレーションした。細胞を２ｎｇ／ｍｌのｍＩＬ−３を含む培地で３６時間増殖し、その後分割し、１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて３週間選択を開始した。細胞を、最適以下のｍＩＬ−３濃度（０．４ｎｇ／ｍｌ）、ならびに最適のＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ濃度（それぞれ２００および３００ｎｇ／ｍｌ）で維持した。
【００６８】
パルスチェイス
２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、６ｃｍシャーレ上で、３６時間、コンフルエント近くまで増殖させた。細胞をメチオニン／システイン欠乏Ｄ−ＭＥＭ、５％透析ＦＣＳで、３０分間飢餓培養し、その後、細胞を［35Ｓ］−システイン／［35Ｓ］−メチオニンを用いて２時間代謝標識した。その後、細胞を温ＰＢＳで洗浄し、５ｍｌのチェイス培地を添加した（Ｄ−ＭＥＭ、１０％ＦＣＳ＋２ｍＭの冷Ｌ−メチオニン＋２ｍＭの冷Ｌ−システイン）。示した時点でシャーレを氷上に配置し、培地を解析のために取り除いた。
【００６９】
ＶＥＧＦ−ＣプロペプチドによるＶＥＧＦ−Ｃ切断の競合
精製されたヒスチジンタグタンパク質を、２５μｇ／ｍｌの濃度で、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＣＣＢＥ１−同時トランスフェクト２９３Ｔ細胞の標識培地に含めた。標識培地を、トランスフェクション後３０〜７２時間馴化し、Ｎｉ2+ＮＴＡセファロースでヒスチジンタグタンパク質を枯渇し、そしてＶＥＧＦ−Ｃを免疫沈降し、ＰＡＧＥにより分離し、Ｘ線フィルムに感光することにより視覚化した。ＶＥＧＦ−ＣのＮ末端切断の阻害は、レーザースキャナの読み出しから１４ｋＤａのＮ末端切断産物を定量化することにより測定した。
【００７０】
ＳｔｒｅｐタグＣＣＢＥ１の共免疫沈降分析
２９３Ｔ細胞を、ＣＣＢＥ１−ｓｔｒｅｐＩＩＩまたは全長ＶＥＧＦ−Ｃ構築物のいずれかでトランスフェクトした。馴化培地を、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（キアゲン）プルダウン法において、個別に、またはＣＣＢＥ１と全長ＶＥＧＦ−Ｃの混合物として使用した。プルダウンに適用する前に、混合培地をＲＴで１０分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングの後に、沈殿物を抗−ＣＣＢＥ１抗体および抗−ＶＥＧＦ−Ｃの抗血清を用いて分析した。情報は、陽性対照として充填した２５μｌの全長ＶＥＧＦ−Ｃ馴化培地を表す。
【００７１】
インビボ実験
ＦＶＢ／Ｎ雄性マウスの前脛骨筋に、ｍ（マウス）ＣＣＢＥ１−Ｖ５、全長ｍＶＥＧＦ−ＣまたはＨＳＡをコードするｒＡＡＶ９ｓの１対１の混合溶液を注入した。ＡＡＶ９−ＨＳＡおよびＡＡＶ９−ΔＮΔＣ−ｍＶＥＧＦ−Ｃの単一ベクターを、それぞれ陰性および陽性対照として使用した。単回注入用量中のベクター粒子の総濃度は６×１０10であった。形質導入の３週間後、マウスをＣＯ2の過剰投与により犠牲死させた。前脛骨筋を単離し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．（サクラファインテックヨーロッパ（Sakura Finetek Europe）、アルフェン  アン  デン  ライン、オランダ）に包埋し、薄片とし（厚さ１０μｍ）、そしてリンパ管マーカー（ＬＹＶＥ−１、Ｐｒｏｘ−１）および血管マーカー（ＰＥＣＡＭ−１）、ならびに平滑筋細胞／周皮細胞マーカー（平滑筋アクチン、ＳＭＡ）および白血球マーカー（ＣＤ４５）、続くＡｌｅｘａ  結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、インビトロジェン）について染色した。蛍光画像を、Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡（カール  ツァイスＡＧ（Carl Zeiss AG）、オーバーコッヘン、ドイツ）で得た（対物レンズは１０×、ＮＡ＝０．３、ＷＤ５．６および２０×、ＮＡ＝０．５、ＷＤ２．０；カメラはＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ−ＨＲｍ  １４ビット グレースケールＣＣＤ；取得用ソフトウェアはＺｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ ４．６）。染色された領域の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して行った。Ｐｒｏｘ−１陽性の核は手動で計数した。ＥＧＦＰ/Ｌｕｃ Ｖｅｇｆｒ３ＥＧＦＰ/Ｌｕｃマウスにおける、ルシフェラーゼ活性の検出を前述のように実行した（Martinez-Corral et al, 2012, PNAS 109: 6223-6228）。南フィンランド州庁動物実験委員会によって、本研究において行われた動物実験は許可された。
【００７２】
統計分析
一元配置分散分析を使用して有意差が検定された。等分散を仮定した場合、ポストホック検定としてチューキー法が使用された。等分散を仮定しなかった場合、ポストホック検定としてゲイムス  ハウエル法が使用された。ロジスティック回帰を使用してＢａ／Ｆ３アッセイのＥＣ５０が計算された。図中のエラーバーは標準偏差を示す。
【００７３】
結果
ＣＣＢＥ１はＶＥＧＦ−Ｃプロセシングおよび分泌を増進させ、その結果、ＶＥＧＦＲ−３の活性化が増加する。
ＣＣＢＥ１は、ＣＣＢＥ１発現ベクターでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の、細胞ライセートおよび馴化培地の両方において、４０〜５５ｋＤａの分子量のタンパク質として検出された（図１Ａ）。上清において、ＣＣＢＥ１の一部は、推定ＣＣＢＥ１二量体に対応する拡散したグリコシル化バンドとして移動した。トランスフェクトされたＶＥＧＦ−Ｃは、未切断５８ｋＤａ前駆体、Ｃ末端でプロセシングされた２９／３１ｋＤａ、および完全にプロセシングされた２１ｋＤａの成熟型として発現された（図１Ｄ、レーン１）。しかし、ＶＥＧＦ−ＣおよびＣＣＢＥ１が同時トランスフェクトされた場合、未切断ＶＥＧＦ−Ｃおよび２９／３１ｋＤａのポリペプチドの量は劇的に減少し、そして成熟、つまり完全に活性化したＶＥＧＦ−Ｃが主要なものとなった（図１Ｄ、レーン１と３を比較）これらの結果は、ＣＣＢＥ１が、ＶＥＧＦ−ＣのＮ末端およびＣ末端のタンパク質分解的プロセシングの両方を促進することを示した。
【００７４】
ＣＣＢＥ１同時トランスフェクションの、細胞内ＶＥＧＦ−Ｃ形態への効果を分析可能とするために、より短い標識期間を使用した。ＣＣＢＥ１による同時トランスフェクションは、同時トランスフェクトされた細胞のライセートにおける細胞内の量が８０％減少したように、ＶＥＧＦ−Ｃの分泌を促した（図２Ａ、レーン５、６とレーン７、８とを比較）。
【００７５】
ＣＣＢＥ１／ＶＥＧＦ−Ｃの同時トランスフェクトがされた培養物由来の馴化培地は、ＶＥＧＦ−Ｃのみがトランスフェクトされた細胞の上清よりも、Ｂａ／Ｆ３−ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲおよびＢａ／Ｆ３−ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲ細胞の増殖および生存を良好に刺激したが、ＣＣＢＥ１のみの場合はごくわずかしか活性を示さなかった。これにより、分泌および切断の増進が培養物中の活性ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質レベルの増大に結びつくことが確認された（図１Ｃおよび図２Ｂ）。とりわけまた、ＣＣＢＥ１のみを発現する細胞の上清が、Ｂａ／Ｆ３−ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ細胞の生存をわずかに増加したのは、おそらく細胞による内在性ＶＥＧＦ−Ｃのプロセシングおよび活性化の増大によるものである。
【００７６】
トランケート型ＣＣＢＥ１は、ＶＥＧＦ−Ｃ刺激ＶＥＧＦＲ−３活性を増強しない。
ＣＣＢＥ１は、Ｂｏｓら（2011，ibid．）により開示されたように、すなわちコラーゲン結合ドメインが取り除かれ、良好なタンパク質安定性のために残りのＣＣＢＥ１分子がヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合されるようにトランケートされた。トランケート型ＣＣＥＢ１は、同質性を有するまで精製され、精製された全長または成熟型ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質と共に、確立されたインビトロ系において試験された。以下のように実験を行なった。ｈＶＥＧＦＲ−３/ＥｐｏＲ−Ｂａ/Ｆ３細胞を、トランケート型ＣＣＢＥ１−ＦｃまたはＦｃ部分である陰性対照タンパク質の一定用量（５μｇ／ｍｌ）の存在下、ヒトＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣ（成熟型ＶＥＧＦ−Ｃ）（図３Ａ）または全長ＶＥＧＦ−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ前駆体）（図３Ｂ）の濃度を上昇させることによって刺激した。細胞を、合計で３日間、刺激条件下でインキュベートした。この期間の最後に、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、シグマ−アルドリッチ）を細胞培養物に添加し、各培養物における生細胞数（細胞増殖の直接的なスコア）をＯＤ５４０光学濃度によって測定した（濃青色の物質を生産する生細胞のミトコンドリア酵素によって、黄色のＭＴＴは減少する）。結果は、トランケート型ＣＣＢＥ１はＶＥＧＦ−ＣのＦＧＦＲ−３刺激活性を増強できないということを明示している。
【００７７】
ＣＣＢＥ１はトランスでＶＥＧＦ−Ｃプロセシングを増進できる。
発育中のマウスの胚およびゼブラフィッシュにおいて、ＣＣＢＥ１は発達中のリンパ管構造体近傍で発現されるが、内皮自体によっては発現されない（Hogan et al, 2009, Nature Genetics 41: 396-398）。したがって、本発明者らは、他の細胞によるトランスでのＣＣＢＥ１生産もまた、ＶＥＧＦ−Ｃプロセシングを増進することができるかどうかを決定することを必要とした。２９３Ｔ細胞の別々の培養物をＶＥＧＦ−ＣまたはＣＣＢＥ１でトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後、細胞集団を混合した。あるいは、ＣＣＢＥ１トランスフェクト細胞を、安定的にＶＥＧＦ−Ｃを発現する細胞と混合した。同時トランスフェクション実験でのように、ＣＣＢＥ１はＶＥＧＦ−Ｃの細胞外プロセシングの効率を増加させた（図４）。対して、隣接する細胞が過剰なＣＣＢＥ１を生産した場合、ＶＥＧＦ−Ｃの細胞内プロセシングおよび分泌は影響を受けなかった（図４Ｂ）。
【００７８】
ＣＣＢＥ１は、インビボでＶＥＧＦ−Ｃのリンパ脈管新生活性を増強する。
ＣＣＢＥ１がインビボでリンパ脈管新生活性を増強するかどうかを調査するために、マウス前脛骨筋を、ＣＣＢＥ１を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ＡＡＶ９−ＣＣＢＥ１）の単独、ＡＡＶ９−ＶＥＧＦ−Ｃとの１対１比で一緒に、または陰性対照としてＡＡＶ９−ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用いて、形質導入した。活性型のＶＥＧＦ−Ｃ（ΔＮΔＣ−ＶＥＧＦ−Ｃ）をコードするＡＡＶ９を、陽性対照として、完全にタンパク質分解的にプロセシングされた（成熟）型ＶＥＧＦ−Ｃを模倣するために使用した。
【００７９】
ＡＡＶ形質導入の２週間後、骨格筋を、内皮細胞のマーカー（ＰＥＣＡＭ−１）、リンパ管内皮細胞のマーカー（ＬＹＶＥ−１、Ｐｒｏｘ１）および白血球のマーカー（ＣＤ４５）を用いて免疫組織化学的検査によって分析した。このアッセイにおいて、全長ＶＥＧＦ−ＣおよびΔＮΔＣ−ＶＥＧＦ−Ｃの両方がリンパ脈管新生を刺激したが、後者（「成熟」型））は、同じウイルス投与量で、著しく強い反応を示し、一方、ΔＮΔＣ−ＶＥＧＦ−Ｃのみが血管新生を刺激した（図６および図７、最下段）。これは、全長ＶＥＧＦ−Ｃのタンパク質分解的プロセシングが、ＡＡＶ９形質導入筋組織においては効率的でないということを示唆している。
【００８０】
しかし、全長ＶＥＧＦ−ＣがＣＣＢＥ１と同時導入された場合、ＬＹＶＥ−１およびＰｒｏｘ−１染色によって示されるように、リンパ脈管新生は有意に増進された（図６）。また、有意に増加した血管新生も観察され（図７）、ＣＣＢＥ１はインビボにおいてもＶＥＧＦ−Ｃのタンパク質分解的プロセシングを増進することを示した。全長ＶＥＧＦ−Ｃ／ＣＣＢＥ１の同時導入の後、ＣＤ４５＋白血球の数の増加が観察され（図８）、ＶＥＧＦ−Ｃの活性化が、ＶＥＧＦＲ−３を介して白血球動員も増加させることを示唆した。
【００８１】
これらの知見を実証するために、ＡＡＶ９形質導入ヘテロ接合Ｖｅｇｆｒ３ＥＧＦＰ／Ｌｕｃマウス（Martinez-Corral et al, 2012, ibid.）を使用し、インビボでの光学生物発光イメージングによってリンパ脈管新生をモニタリングした。ＶＥＧＦ−ＣおよびＣＣＢＥ１をコードするＡＡＶを用いて同時導入されたマウスにおいては、強いルシフェラーゼシグナルが検出されたが、ＶＥＧＦ−ＣまたはＣＣＢＥ１のみで形質導入されたマウスにおいては、より弱いシグナルが検出され、そして、ＨＳＡで形質導入されたマウスにおいては、生物発光シグナルは検出されなかった（図９）。
【００８２】
ＶＥＧＦ−Ｃプロペプチドは、ＣＣＢＥ１媒介タンパク質分解に関与している。
ＶＥＧＦ−ＣおよびＣＣＢＥ１の物理的相互作用を証明するという試みは不成功に終わった。したがって、ＣＣＢＥ１−ＶＥＧＦ−Ｃ相互作用は弱く、一時的で、かつ、おそらく間接的であると推測される。ＣＣＢＥ１に媒介される促進された分泌および切断の原因となる、ＶＥＧＦ−Ｃの構造的要素の同定が試みられた。パルスチェイス実験において、野生型ＶＥＧＦ−ＣとＣ末端プロペプチドを欠くＶＥＧＦ−Ｃ突然変異体とを分泌速度で比較すると、標識されたＶＥＧＦ−Ｃ突然変異体は、１５〜４５分の間ですでに分泌のピークに達するのに対して、野生型ＶＥＧＦ−Ｃは、２時間たってからのみ、分泌のピークに達する（図１０）。これは、Ｃ末端プロペプチドが分泌効率を調節していることを示唆している。高濃度の精製されたＶＥＧＦ−ＣのＮ末端もしくはＣ末端プロペプチド、またはＶＨＤを添加することにより、ＶＥＧＦ−ＣのＣＣＢＥ１増進プロセシングの阻害を試みた。Ｃ末端プロペプチドでＶＥＧＦ−Ｃプロセシングの約７９％の阻害が、Ｎ末端プロペプチドで約４３％の阻害が観察されたが、ＶＨＤまたはＢＳＡ対照は、トランスフェクト細胞によって生産されたタンパク質分解断片の比率を変えなかった（図１１Ａ）。これは、ＶＥＧＦ−ＣプロペプチドがＣＣＢＥ１媒介切断に関わっていることを裏付けている。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃに構造およびタンパク質分解的プロセシングが非常に類似しているが（Leppaenen et al, 2011, Blood 117: 1507-1515; Stacker et al, 1999a, J. Biol. Chem. 274: 32127-32136）、ＣＣＢＥ１同時トランスフェクションは、ヒト全長ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄ  ＶＨＤがＶＥＧＦ−ＣのＮおよびＣ末端プロペプチドに隣接するキメラ因子のタンパク質分解的プロセシングを促進しなかった（図１１Ｂ、レーン３〜６）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0006605467.tif 000009
【図７】
0006605467.tif 000010
【図８】
0006605467.tif 000011
【図９】
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【図１０】
0006605467.tif 000013
【図１１Ａ】
0006605467.tif 000014
【図１１Ｂ】
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【配列表】
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