(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）により表されるアミノ酸配列
【化１】
0006591964.tif 000006
Ａ−は、配列番号１、配列番号４もしくは配列番号７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列であり、
Ｘは、配列番号９５のアミノ酸配列のＣＤＲ１領域であり、
Ｂ−は、配列番号２、配列番号５もしくは配列番号８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列であり、
Ｙは、配列番号１２２のアミノ酸配列のＣＤＲ３領域であり、
Ｃ−は、配列番号３、配列番号６もしくは配列番号９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一の配列である、
を含むＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子であって、
この際、
配列番号１が、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴ、またはＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
配列番号２が、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号３が、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号４が、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴであり、
配列番号５が、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号６が、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号７が、ＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＰまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＡまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＧまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＥＳであり、
配列番号８が、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＡまたはＴＣＷＳＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＬ、ＴＣＷＴＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＡＬ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＶ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨ、またはＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＳＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨであり、
配列番号９が、ＣＧＧＧＴＶＶＴＶＮ、ＣＧＧＧＴＡＶＴＶＮ、ＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮ、またはＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮであり、
配列番号９５が、ＤＹＧＬＦＳであり、
配列番号１２２が、ＦＴＷＰＷＥＷＰＤＲＷＦＲＰＷＹである、ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
【請求項２】
ヒト化された、請求項１に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子を含む、融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子が、生物学的に活性なタンパク質へ融合している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子、または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む、核酸構築物。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸構築物を含む、宿主細胞。
【請求項８】
請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質の製造方法であって、
宿主細胞で前記分子をコードする核酸配列を発現する工程を有する、方法。
【請求項９】
請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質を含む、薬剤組成物。
【請求項１０】
薬剤に使用される、請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質の、疾患の治療を必要とする患者への前記治療のための薬剤の製造における使用。
【請求項１２】
請求項１もしくは２に記載の検出可能な標識ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質をサンプルに添加し、および前記分子の標的分析物への結合を検出することを含む、前記サンプル中の前記標的分析物の存在をアッセイする方法。
【請求項１３】
被験者の疾患の部位を画像化するために前記被験者に投与される、請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
被験者の疾患または医学的状態を診断するために前記被験者に投与される、請求項１もしくは２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または請求項３もしくは４に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫化および合成の板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ）由来ライブラリから単離された高親和性、抗原特異的天然および非天然結合分子の単離および特性に関する。特に、本発明は、特異的に結合し、免疫機能の重要なレギュレータである分子、誘発副刺激リガンド（ＩＣＯＳＬ）の活性を中和するサメ可変新規抗原レセプター（ＶＮＡＲ）ドメインに関する。中和ＶＮＡＲドメインは、２つの独立したソースから単離される；免疫化テンジクザメ（ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋ）ライブラリおよび合成アブラツノザメ（ｓｐｉｎｙ  ｄｏｇｆｉｓｈ）フレームワーク融合ライブラリ。
【背景技術】
【０００２】
生物製剤に基づくモノクローナル担体（ｍＡｂ）は、継続した臨床的成功およびそれに続くバイオテクノロジーおよびバイオ医薬品企業への経済的価値によって例示されるように、小さな分子に対して多くの利点があった。特異的に標的に結合し、疾患関連の生物学的プロセスに介入する先天的能力は、オフサイト毒性を減少させる一方、それらを有効で効能があるものとし、そして現在では証明されたクラスの治療学としている。しかし、それらの治療上の有効性には制限がある。それらのサイズおよび複雑さは、人体での特定の疾患タイプおよび疾患の位置において、それらの有用性を制限しうる。一方、免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンベースのソースに由来する、いわゆる代替骨格の多くは、いくつかのより大きなタンパク質治療薬が有する周知の制限に取り組む目的によって発展している。
【０００３】
サメ免疫グロブリンの新型または新規抗原レセプタ（ＩｇＮＡＲ）は、軟骨魚類の適応免疫システムにおいて役割を果たすとして知られている天然に生じる一本鎖結合ドメインである（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ａ．  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９５．  ３７４（６５１８）：  ｐ．  １６８−１７３；  Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００３．  ４０（１）：  ｐ．  ２５−３３；  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ｍＡｂｓ，  ２０１２．  ４（６）：  ｐ．  ６７３−６８５）。この機能の重要な側面は、可変領域（ＶＮＡＲ）での４つの領域（ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４およびＣＤＲ３）の多様性から得られる標的に対する高い親和性とともに特異的に結合する能力である（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００４．  ３０５（５６９１）：  ｐ．  １７７０−１７７３）。追加の非カノニカルシステイン残基は、より潜在性のまたは隠れたエピトープに結合可能な普通でないパラトープトポロジを有する構造的に異なるファミリーになるＶＮＡＲアイソタイプのレパートリーを作り出す（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００４．  ３０５（５６９１）：  ｐ．  １７７０−１７７３；  Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，  Ｖ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  ２００５．  １４（１１）：  ｐ．  ２９０１−２９０９；  Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，  Ｒ．  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００７．  ３６７（２）：  ｐ．  ３５８−３７２）。軽鎖パートナーおよびＣＤＲ２の欠如の組み合わせは、ＶＮＡＲを脊椎動物界での最も小さな天然に生じる結合ドメインとなる。それらの優れた標的への選択性に加え、固有の可溶性と安定性により、それらは治療薬および診断の発展の魅力的な候補となる（Ｂａｒｅｌｌｅ，  Ｃ．  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｅｘ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００９．  ６５５：  ｐ．４９−６２；  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ２０１２．  ２：  ｐ．  ６６−８１）。文献中の命名法は、ＩｇＮＡＲを免疫グロブリンアイソトープ新型（ｎｏｖｅｌ）抗原レセプターまたは免疫グロブリンアイソトープ新規（ｎｅｗ）抗原レセプターとして参照し、用語は、同義語である。
【０００４】
軟骨魚類における標的特異的ＩｇＮＡＲ応答を上昇させる能力は、最初にテンジクザメ（ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋ）で実証された（ＷＯ０３／０１４１６１）。鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）をモデル免疫原として用いると、抗原特異的な力価は、最初に、バッファーでの反復ブーストに続くアジュバントとターゲットとを免疫化することにより時間をかけて達成された。本研究に先立ち、二次免疫応答が、進化の結果、より高度な脊椎動物（例えば、鳥類および哺乳類）に限定されると一般的に認識されていた。したがって、このような応答を板鰓亜綱のような進化的に原始的な種で確かめることは予期されていなかったであろう。免疫原へのサメの応答はまた、ＩｇＮＡＲ応答がげっ歯類や他の哺乳類で見られる血清力価よりも非常に低い抗原−特異的血清力価（約二桁少ない）であるため、哺乳類で見られるものからは非常に異なっている。ナノボディとして知られるラクダ科の単一ドメイン抗体の系統とは異なり、ＩｇＮＡＲの結合ドメインは、古典的な免疫グロブリン抗体祖先から進化したとは考えられない。
【０００５】
このことは、約８０−８５％のフレームワーク領域にわたり、ナノボディでのヒトＩｇＧ重鎖に類似し、ＩｇＮＡＲとヒト軽鎖配列との間の類似がたったの２０−２５％である一次配列での違いから明らかである（Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｈ．  ａｎｄ  Ｆｌａｊｎｉｋ，Ｍ．  Ｆ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００５．  ３５（３）：  ｐ．  ９３６−９４５）。若齢のテンジクザメでの研究は、アイソタイプレパートリー、ゆえにいかなる外部チャレンジに対して上昇するＩｇＮＡＲドメインの多様性がタイプＩＩＩとしていられるＤ−領域融合アイソタイプに限定されることを示している。理論上では、これは、若い仔（ｙｏｕｎｇ  ｐｕｐｓ）がまだ子宮内にいる間に暴露されたであろう一般的な病原体への制限された応答でありうる。およそ発生の六か月後、若い成体のサメは、複数の異なるＩｇＮＡＲアイソタイプ；タイプＩ（テンジクザメでのみこれまで発見されている）、タイプＩＩ、タイプＩＩｂ、タイプＩＩＩおよびタイプＩＩＩｂを含むチャレンジへのフルレパートリおよびＩｇＮＡＲ応答を示す。アイソタイプは、結合ドメインのパラトープにわたり、異なる構造的な特徴に変換する非カノニカルシステイン残基の含有量および位置で異なる。
【０００６】
２つのプラットホームがＶＮＡＲの単離に利用できる。第１は、サメの適応免疫システムの一部としてＩｇＮＡＲの役割に基づいている（ＷＯ０３／０１４１６１）。ＩｇＮＡＲ応答が抗原チャレンジに応答して誘発しうる、現在少なくとも３つの異なる種のサメで見られている（Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００３．  ４０（１）：  ｐ．  ２５−３３；  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，  ２０１２．  ４（６）：  ｐ．  ６７３−６８５；  Ｃａｍａｃｈｏ−Ｖｉｌｌｅｇａｓ，  Ｔ．，  ｍＡｂｓ．，  ２０１３．  ５（１）：  ｐ．  ８０−８５  ＷＯ２０１１／０５６０５６）。ＶＮＡＲドメインがファージディスプレイに適するため、簡易血液サンプルは、ブースト、抽出されたＲＮＡ、このトータルメッセージから生成されたｃＤＮＡから増幅されたＶＮＡＲレパートリーに続く、免疫の反復プロセス後のこれらの動物から得られる（Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０１２．  ９０７：  ｐ．  １７７−１９４，  Ｆｌａｊｎｉｋ，  Ｍ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｈ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００９．  ５６２：  ｐ．  ７１−８２）。標準ファージミドベクターへのクローニングおよびターゲットに対する選択は、ポジティブヒットを探すために用いることができる。ＶＮＡＲドメインを単離するための第２のおよび補完的な他の手段は、ＣＤＲ領域のエンジニアリングによる重要で追加的な多様性をしばしば含む単一の天然なＶＮＡＲフレームワークに基づく未感作または半合成ファージディスプレイライブラリの構築である（Ｎｕｔｔａｌｌ，  Ｓ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００１：  ３８：  ｐ．  ３１３−３２６；  Ｎｕｔｔａｌｌ，  Ｓ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２００２．  ５１６：  ｐ．  ８０−８６；  Ｌｉｕ，  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，    ２００７．  ４４：  ｐ．  １１７５−１７８３；  Ｌｉｕ，  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２００７．  ７：  ｐ．  ７８−８８）。シングルフレームワークライブラリに対する重要な改善は、異なる種でのまたは異なる種にわたる異なるＶＮＡＲアイソタイプからの異なるフレームワークをブレンドまたは融合によって達成しうる。合成ライブラリからＶＮＡＲを生成する新規な方法は、２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）。
【０００７】
免疫化および合成ライブラリアプローチは共に、利益と課題とを有する。サメ免疫システムの進化的に離れたポジションは、多くの哺乳類タンパク質への良好な応答を促す。したがって、免疫化は、典型的には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの成熟プロセスを経て抗原ターゲットに対する高い親和性ドメインを提供する。このプロセスは、ＩｇＮＡＲレパートリーの成熟を達成するために約４〜８ヶ月であるが、動物で発生するように、哺乳類で見られる関連したプロセスよりも少し遅いものである。合成ライブラリからの選択は、このタイムフレームを短縮するが、成功のレベル（特異性および親和性）は、スクリーニングされたライブラリの質とサイズに依存し、一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟を通じてさらなる改善を得るであろうものよりも低い親和性のドメインを送達する（ｄｅｌｉｖｅｒ）であろう。合成ライブラリからのＶＮＡＲを生成する新規な方法は、２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）。
【０００８】
しかし、両方の方法は、複数のターゲットクラスに対するＶＮＡＲドメインの多くを単離するためにうまく用いられている（Ｎｕｔｔａｌｌ，  Ｓ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００１：  ３８：  ｐ．  ３１３−３２６；  Ｄｏｏｌｅｙ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００３．  ４０（１）：  ｐ．  ２５−３３；  Ｎｕｔｔａｌｌ，  Ｓ．，  Ｄ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  ２００４．  ５５：  ｐ．  １８７−１９７；  Ｌｉｕ，  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，    ２００７．  ４４：  ｐ．  １１７５−１７８３；  Ｌｉｕ，  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２００７．  ７：  ｐ．  ７８−８８；  Ｗａｌｓｈ，  Ｒ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，    ２０１１．  ４１１（１）：  ｐ．  １３２−１４１；  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，  ２０１２．  ４（６）：  ｐ．  ６７３−６８５；  Ｂｏｊａｌｉｌ，  Ｒ．，  ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１３：  １４（７）：  ｐ．１４−１７）。
【０００９】
免疫調節生物製剤は、多くの異なる治療分野での免疫関連疾患を治療するために用いることができる強力なツールである。それらは、過免疫の応答を減衰するためにデザインされ、したがってリウマチ性関節炎（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および乾癬のような慢性自己免疫および炎症症状と同じく、臓器移植での有用性を有する。逆に、それらは、癌または慢性的細菌もしくはウイルス感染での免疫応答を強化するように作用しうる（Ｙａｏ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ２０１３．  １２：  ｐ．  １３０−１４６）。Ｂ７関連タンパク質（Ｂ７ＲＰ−１）、ＣＤ２７５およびＢ７ホモログ（Ｂ７ｈ）としてもまた知られる誘発副刺激リガンド（ＩＣＯＳＬ）は、Ｂ細胞、活性化単球および樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）で構造的に発現した細胞表面抗原であり、Ｂ７ファミリーメンバー、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）のリガンドである（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｓ．，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０００．  １２（１０）：  ｐ．  １４３９−１４４７）。最初に、その作用はＴ細胞の活性化に制限されると考えられていたが、より最近では、免疫調節でのＩＣＯＳＬの中心的な役割は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４それぞれとの相互作用によるＴ細胞刺激および阻害経路の両方に拡大している。系統制限ＩＣＯＳＬ発現を有するトランスジェニックマウスの作製は、Ｔ細胞応答、Ｔ細胞トレランスおよびＴ細胞依存Ｂ細胞応答を刺激することにおけるＩＣＯＳＬ−ＩＣＯＳ相互作用の役割を示しており、その抗体媒介性疾患での重要性は、ＲＡ、ＳＬＥおよびブドウ膜炎を含むヒト疾患の前臨床モデルで確認されている（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，  Ｓ．，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，    Ｎａｔｕｒｅ，  １９９９．  ４０２（８２７）：  ｐ．  ８２７−８３２；  ，  Ａｉｃｈｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０００．  １６４（９）：  ｐ．  ４６８９−４６９６；  Ｌａｒｉｍｏｒｅ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０１２．  １３（２９）；  ｐ．  １−１７；    Ｉｗａｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００２．  １６９（８）：  ｐ．  ４３３２−４３３９；  Ｆｒｅｙ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．，  ２０１０．  ６９（８）：  ｐ．  １４９５−１５０１；  Ｕｓｕｉ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００６．  ３６（１１）：  ｐ．  ３０７１−３０８１；  Ｈｕ，  Ｙ．，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００９．  １８２（３）：  ｐ．  １４２１−１４２８）。標的化Ｔ細胞集団は、胚中心Ｂ細胞と相互作用する濾胞ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）であることが示されている（Ｈｕ，  Ｙ．，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００９．  １８２（３）：  ｐ．  １４２１−１４２８）。
【００１０】
より最近では、ＩＣＯＳＬ−ＩＣＯＳ相互作用は、免疫抑制の腫瘍関連制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の調節を通じて腫瘍の発生に関与しているとされる（Ｓｔｒａｕｓｓ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００８．  １８０：  ｐ．２９６７-２９８０；  Ｇｏｂｅｒｔ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２００９．  ６９：  ｐ．  ２０００-２００９；  Ｆａｇｅｔ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２０１２．  ７２（２３）：  ｐ．    ６１３０−６１４１）。Ｔｒｅｇの増加数と有病率は、癌患者で確認されており、すい臓癌および乳癌、結腸直腸癌、胃癌および食道癌、白血病およびリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、ならびに肝細胞癌を含む異なる腫瘍および腫瘍間質から単離されている（Ｍｅｎｅｔｒｉｅｒ−Ｃａｕｘ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２０１２．  ７：  ｐ．  １５-２８）。
【００１１】
ＩＣＯＳＬは、２つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＣおよびＩｇＶ）を有するＢ７関連膜貫通糖たんぱく質である。突然変異解析は、ＩｇＶドメインがレセプターとリガンドとの間のインターフェースを形成し、ヒトとげっ歯類との間の低い種のホモロジー（ヒトとマウスの間で約４４％）を示すことを明らかにしている。タンパク質複合体の全体的な整合性のため必要とされるが、ＩｇＣドメインは、ＩＣＯＳとのいかなるコンタクトインターフェースを形成せず、ＩｇＶドメインに近接して関連する膜である（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００６．  １７７（６）：  ｐ．  ３９２０−３９２９）。活性タンパク質の組織は、主に非共有結合ヘテロダイマーであると考えられており、これらのクラスタリングまたはオリゴマー化が細胞表面で起こることを示唆する証拠がある（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００６．  １７７（６）：  ｐ．  ３９２０−３９２９）。げっ歯類およびヒト標的ドメインの間の配列ホモロジーが低いものであっても、前臨床開発のためのネズミ科またはラットサロゲート分子の単離および開発は有用で有りうる。ＩＣＯＳＬに対するかかるサロゲート抗体の単離および開発は、かねてより実証されている（Ｉｗａｉ，  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ２００２．  １６９（８）：  ｐ．  ４３３２−４３３９；  Ｈｕ，  Ｙ．，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２００９．  １８２（３）：  ｐ．  １４２１−１４２８）。
【００１２】
ＩｇＶ領域に結合し、４０〜４００ｎＭの範囲で親和性を示すマウスＩＣＯＳＬに対する合成ライブラリＥＬＳＳ１から単離されたＶＮＡＲは、２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）。ヒトＩＣＯＳＬに対して単離されたＶＮＡＲドメイン（ＩｇＶドメインとしてもまた認識されている）は、単離された抗マウスＶＮＡＲドメインと比較して、標的に対して少なくとも一桁は高い親和性を有する。治療上の利益のために、これは、ＩＣＯＳＬに対して単離されたドメインが、その結果、ＩＣＯＳとの相互作用を阻害することに拮抗すること、それに続き免疫応答を誘導するための下流のシグナル伝達に重要である。Ｔ細胞増殖アッセイは、このＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬ間の相互作用の阻害を測定する強力な手段であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリード分子の有効性を実証するためにすでに行われている。この研究の間に単離された抗ヒトＩＣＯＳＬドメインは、それらの抗マウスカウンターパートと比較して、Ｔ細胞アッセイでの効力において１００倍を超える増加を示した。これは、抗マウスのものと比較してターゲットへの抗ヒトドメインの増加した親和性によるものである可能性が高い。したがって、これらのドメインがｉｎ  ｖｉｖｏでのより高い有用性を示すであろうことが予測される。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、中和アッセイでの予想外の有用性、高い親和性およびターゲットへの選択性、ならびに天然ソースおよび非天然ソースからのヒトＩＣＯＳＬに対して単離されたＶＮＡＲドメインの多様性に関する。
【００１４】
本発明の第１の態様によると、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列：
【００１５】
【化１】
0006591964.tif 000002
【００１６】
Ａ−は、配列番号１、配列番号４または配列番号７であり、
Ｘは、６または７のアミノ酸残基を有するＣＤＲ１領域であり、
Ｂ−は、配列番号２、配列番号５または配列番号８であり、
Ｙは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のアミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
Ｃ−は、配列番号３、配列番号６または配列番号９であり、
または、それと少なくとも５０％相同の配列を含む、ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子が提供される。
【００１７】
この際、
配列番号１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴ、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
配列番号２は、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号３は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号４は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴであり、
配列番号５は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号６は、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号７は、ＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＰまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＡまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＧまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＥＳであり、
配列番号８は、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＡまたはＴＣＷＳＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＬ、ＴＣＷＴＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＡＬ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＶ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＳＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨであり、
配列番号９は、ＣＧＧＧＴＶＶＴＶＮ、ＣＧＧＧＴＡＶＴＶＮ、ＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮ、またはＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮである。
【００１８】
Ａ、Ｘ、Ｂ、Ｙおよび／またはＣで表されるアミノ酸配列は、板鰓亜綱（Ｅｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉ  ｓｕｂｃｌａｓｓ）の同じまたは異なる種に由来するであろう。Ａ、Ｘ、Ｂ、Ｙおよび／またはＣで表されるアミノ酸配列はまた、ＶＮＡＲ配列の同じまたは異なるアイソタイプ、例えばタイプＩ、タイプＩＩおよび／またはタイプＩＩＩ（タイプＩｂ、タイプＩＩｂおよびタイプＩＩＩｂを含む）に由来するであろう。したがって、任意の一般的に適する組み合わせのソースマテリアルが可能である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、式（ＩＩ）Ａ−Ｘ−Ｂ−Ｙ−Ｃは、エレメントＡ、ＢおよびＣが（ｉ）配列番号１、２、および３；（ｉｉ）配列番号１、２、および６；（ｉｉｉ）配列番号１、５、および３；（ｉｖ）配列番号１、５、および６；（ｖ）配列番号４、５、および６；（ｖｉ）配列番号４、５、および３；（ｖｉｉ）配列番号４、２、および６；（ｖｉｉｉ）配列番号４、２、および３；（ｉｘ）配列番号７、８、および９によって表される配列から構成されるであろう。
【００２０】
ＣＤＲ１領域は、図１０Ａもしくは１０Ｂ、またはそれと少なくとも５０％相同の配列で表される、任意のＣＤＲ１領域でありうる。ＣＤＲ３領域は、図１０Ａ、１０Ｂもしくは１０Ｃ、またはそれと少なくとも５０％相同の配列で表される任意のＣＤＲ３領域でありうる。
【００２１】
ＩＯＣＳＬは、２つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＣおよびＩｇＶ）を有するＢ７関連膜貫通糖たんぱく質である。ＧｅｎＢａｎｋでのＩＣＯＳＬのヒトおよびマウス配列は、次のとおりである：
Ｈｕｍａｎ：  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：  Ｏ７５１４４．２；  ＧＩ：  １９８５５０６６  （３０２  ａａ）
Ｍｏｕｓｅ：  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：  Ｑ９ＪＨＪ８．１；  ＧＩ：  １５２１４０５３  （３２２  ａａ）。
【００２２】
アミノ酸配列を整列した場合、総合スコアが４３．３８であり、％アイデンティティが４７．８０である。本発明のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子は、抗原としていかなるＩＣＯＳＬ配列に対して惹起されうる。適切には、ＩＣＯＳＬ配列は、ヒトＩＣＯＳＬ（ｈＩＣＯＳＬ）配列、もしくはそれと相同の配列、または本明細書で記載される標準的な分子生物学技術を用いてヒト化後の抗原として表されるであろう他の動物種からのＩＣＯＳＬ配列でありうる。ＩＣＯＳＬのヒト配列の例は、図１２に示される。
【００２３】
本発明の一つの実施形態において、ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子は、図９Ａもしくは図９Ｃ、またはそれと少なくとも５０％相同の配列で表される配列でありうる。
【００２４】
ＣＤＲ３領域が合成ライブラリに由来するＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子で表される場合、前記領域は、７〜２１のアミノ酸残基、適切には７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１６、または２１のアミノ酸残基を含むであろう。
【００２５】
ＣＤＲ３領域が免疫手順により由来するＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子で表される場合、前記領域は、１３〜２１のアミノ酸残基、適切には１３、１９、２０、または２１のアミノ酸残基を含むであろう。
【００２６】
したがって、ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子はまた、単離されたＶＮＡＲドメインとして定義されうる。
【００２７】
非天然および天然ソースから単離された本発明のＶＮＡＲドメインの配列は、高い親和性を持って、ヒトＩＣＯＳＬに特異的に結合し、ＩＣＯＳＬとＩＣＯＳとの間の相互作用を中和する。
【００２８】
本発明の一つの実施形態において、抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、調製された合成ライブラリから単離され得、２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）。かかるライブラリの一例は、複数の組み合わせで融合された２つの連続したペプチドドメインからなるフレームワーク融合合成ライブラリである合成ライブラリＥＬＳＳ１である。この合成ライブラリデザインは、強力なプラットホームであることが証明されており、このプラットホームから、その一因がライブラリの結合分子多様性を著しく増やすためにアイソタイプとサメ種にわたる異なるフレームワークを融合するユニークな方法の一部により複数のターゲットクラスに対するＶＮＡＲを単離する。抗ヒトＩＣＯＳＬドメインは、それらがユニークなＣＤＲ３およびＣＤＲ１配列に加えて異なるアイソタイプフレームワーク残基から構成されるため、さらにこのことを例示している。この実施形態において、ＶＮＡＲドメインは、ストレプトアビジンビースに固定化されたビオチン化単量体ヒトＩＣＯＳＬを有するライブラリのスクリーニングにより単離されるであろう。別の実施形態において、免疫チューブのような固体表面に直接固定化されたＶＮＡＲドメインは、ヒトＩＣＯＳＬを有するライブラリのスクリーニングにより単離されるであろう。
【００２９】
本発明の他の実施形態において、抗ヒトＶＮＡＲドメインは、免疫化サメ（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｓｈａｒｋ）から単離しうる。テンジクザメは、フロイド完全アジュバントでの単量体ヒトＩＣＯＳＬにより免疫化することができ、その後、ＰＢＳ中で反復して毎月のブーストが行われる。標的に対するＩｇＮＡＲの血清力価は、モニターすることができ、ヒトＩＣＯＳＬへの応答が可溶性抗原の１回のブーストと３回のブーストとの間で見られうるかどうかを決定することができる。ブリード４（ｂｌｅｅｄ  ｆｏｕｒ）からの力価は、かかる状況での典型的な被験動物から達成できる最大の応答とみなすことができ、ＲＮＡは、末梢血リンパ球（ｐｂｌｓ）から抽出することができる。そのようなサンプルから、ｃＤＨＡを生産することができ、ＶＮＡＲレパートリーをフレームワーク１およびフレームワーク４特異的プライマーを用いて増幅することができる。
【００３０】
アンプリコンは、約１×１０８クローンのディスプレイライブラリを作製するために、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換されたファージミドベクターにてクローン化することができる。この実施形態において、ＶＮＡＲドメインは、ストレプトアビジンビースに固定化されたビオチン化単量体ヒトＩＣＯＳＬを有するライブラリのスクリーニングにより単離されるであろう。別の実施形態において、免疫チューブのような固体表面に直接固定化されたＶＮＡＲドメインは、ヒトＩＣＯＳＬを有するライブラリのスクリーニングにより単離されるであろう。
【００３１】
本発明の重要な利点としては、単離されたＶＮＡＲドメインによって示されるＩＣＯＳ−ＩＣＯＳＬ相互作用の強力な中和を示したことである。ＩＣＯＳとＩＣＯＳＬとの間の相互作用に拮抗することの効果は、細胞ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはＥＬＳＡベースの抗原アッセイのような他の方法で示すことができる。中和の効果は、制限されないが、単量体ペリプラズム発現タンパク質、精製タンパク質としておよび哺乳類細胞上清としてのＶＮＡＲドメイン−Ｆｃ融合物ならびにペプチドリンカーを通じてパートナータンパク質もしくは複数のタンパク質とＮ末端および／またはＣ末端で結合した抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲのような分子融合タンパク質を含む、複数のタンパク質フォーマットで示すことができる。
【００３２】
本発明の一つの実施形態において、可溶性ペリプラズム発現単量体抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、ＩＣＯＳを発現した細胞表面とマルチウェルプレートＥＬＩＳＡフォーマットでのＩＣＯＳＬ−Ｆｃ融合タンパク質との間の相互作用をブロックする。
【００３３】
本発明のさらなる実施形態において、哺乳類の発現し精製された抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲ−Ｆｃドメインは、ＩＣＯＳを発現した細胞表面と濃度依存的なＩＣＯＳＬ−Ｆｃ融合タンパク質との間の相互作用をブロックできる。
【００３４】
さらなる実施形態は、Ｎ末端もしくはＣ末端またはその両方、分子ペプチドリンカーを介する二量体もしくは三量体以上複数の融合物に単量体抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインを再フォーマットするための柔軟性がある。抗ヒト血清アルブミンＶＮＡＲドメインと三量体フォーマットで融合した抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインおよび抗マウスＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、ｈＩＣＯＳＬと結合する能力を保持し、ＩＣＯＳとＩＣＯＳＬとの間の相互作用をブロックする。この三官能フォーマットにおいて、３つのドメインのすべては、それらの特異的ターゲットへの結合を保持する。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態において、精製した抗ヒト単量体ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、初代ヒトＴ細胞の増殖をブロックできる。本発明の別の実施形態において、抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、哺乳類の宿主細胞で発現しうるＦｃタンパク質融合構築物へと変換することおよび精製することができる。この精製されたマテリアルは、初代ヒトＴ細胞アッセイで滴定することができ、Ｔ細胞増殖の濃度依存性阻害を示すことができる。
【００３６】
本発明のもう一つの利点としては、抗ヒトＩＣＯＳＬドメインによって示される高い親和性と選択性である。
【００３７】
本発明の一実施形態において、抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、可溶性の単量体タンパク質ドメインとして発現することができ、結合相互作用による結合および解離速度を測定するためにＢＩＡｃｏｒｅチャンバーでの固定化ｈＩＣＯＳＬを通過することができる。
【００３８】
本発明のもう一つの実施形態において、抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインは、哺乳類の宿主細胞で発現しうるＦｃタンパク質融合構築物へと変換することおよび精製することができる。そしてこのマテリアルは、結合相互作用の結合および解離速度を測定するためにＢＩＡｃｏｒｅチャンバーでの固定化ｈＩＣＯＳＬを通過することができる。
【００３９】
本発明の一実施形態において、抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの選択性は、ＩＣＯＳおよびＩＣＯＳＬを発現するＣＨＯ細胞株への結合、二次蛍光色素タグ抗体を用いる検出、ならびにＦＡＣＳ解析を用いて測定された結合により示すことができる。さらなる実施形態は、異なるタンパク質の複数のクラスに対するＥＬＩＳＡによって選択性を示す。
【００４０】
本発明の第二の態様によると、本発明の第一の態様のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子の薬剤組成物を提供する。
【００４１】
本発明の薬剤組成物は、任意の適切なおよび薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはバッファー液を含むことができる。前記組成物は、さらに薬学的活性剤を含むことができる。このような担体は、制限されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含むことができる。
【００４２】
このような組成物は、示したように、さらに薬学的活性剤を含むことができる。追加の剤は、治療上の化合物であってもよく、例えば、抗炎症薬、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤または抗生物質である。このような追加の剤は、それを必要とする患者への投与のために適切な形態であろうし、このような投与は、同時、個別または逐次的であろう。成分は、適切な説明書を含むことができるキットの形態で調製することができる。
【００４３】
薬剤組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内または皮内経路などを含む、患者の疾患を治療するのに効果的な、任意の有効で便利な方法で投与することができる。治療において、または予防薬として、前記活性剤は、注射用組成物として、例えば、滅菌水性分散剤、好ましくは等張のものを個体に投与することができる。
【００４４】
哺乳類、特にヒトへの投与のために、活性剤の日用量は、体重あたり０．０１ｍｇ／ｋｇから、一般的には約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇまでであろう。いずれにしても医師は、個体の年齢、体重、性別および応答を含むファクターに依存しうる個体に最も適しているであろう実際の投与量を決めることができる。上記投与量は、平均的なケースでの例である。もちろん、より高いまたはより低い投与量が有益である例もあるであろうし、そのようなものは、本発明の範囲内である。
【００４５】
本発明はまた、使用説明書と共に本明細書で定義される薬剤組成物を含むキットを提供する。
【００４６】
本発明の第二の態様によると、医薬に使用するための第二の態様の薬剤組成物を提供する。かかる使用は、ＩＣＯＳＬと、限定されないが、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４を含むそのレセプターパートナーとの間の相互作用に関連した疾患、ならびに／またはＴ細胞調節に関連した疾患、ならびに／または上記本発明の薬剤組成物の治療上有効な用量の投与を介する抗体媒介性疾患を治療するための方法を含む。前記組成物は、少なくとも一つの本発明のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲドメイン）、またはかかる分子の組み合わせおよび／もしくはそのヒト化バリアントを含む。
【００４７】
本明細書において、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、ヒトに利益を与えることができる任意のレジームを含む。前記治療は、任意の既存の状態もしくは障害に関する治療的処置、または予防（予防的処置）でありうる。
【００４８】
本発明の組成物で治療できる疾患は、特にサブセット、ＴＦＨ細胞を含むＴ細胞活性化で媒介される自己免疫および炎症性疾患を含む。このような疾患の例としては、制限されないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬グレーブス病、重症筋無力症、水疱性類天疱瘡、抗リン脂質症候群、ブドウ膜炎、デビック病、ランバート・イートン筋無力症候群、ギラン・バレー／ミラー・フィッシャー、スティッフマン症候群、自己免疫性脳炎、尋常性天疱瘡を含む。本発明の組成物で治療できるその他の疾患は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の活性化により媒介される癌を含み、癌は、制限されないが、すい臓癌および乳癌、結腸直腸癌、胃癌および食道癌、白血病およびリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、卵巣癌ならびに肝細胞癌を含む。
【００４９】
本発明のこの態様によると、ＩＣＯＳＬと、限定されないが、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４を含むそのレセプターパートナーとの間の相互作用に関連した疾患、ならびに／または調節性Ｔ細胞に関連した疾患、ならびに／または抗体媒介性疾患の治療のための薬剤の製造に使用される第一の態様の組成物を提供する。
【００５０】
本発明のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子はまた、患者における疾患状態の性質を調べるために使用できる。ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子は、Ｘ線、ガンマ線、もしくはＰＥＴスキャンのような画像化技術または類似技術を用いて被験者の身体における疾患部位の画像化を作成するために使用できる。したがって、本発明は、適切に検出可能な標識ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子の被験者への投与およびそれに続く被験者の身体のスキャニングを含む、被験者における疾患部位の画像化方法まで及ぶ。また、当該分子の被験者への投与は、分子の投与に続く被験者からのサンプルを分析することによる試験結果を提供できる。かかる実施形態は、本発明のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子の投与を含む被験者における疾患または医学的状態の診断法を含むことができる。
【００５１】
本発明の一実施形態において、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列：
【００５２】
【化２】
0006591964.tif 000003
【００５３】
Ａ−は、配列番号１または配列番号４であり、
Ｘは、５、６または７のアミノ酸残基を有するＣＤＲ１領域であり、
Ｂ−は、配列番号２または  配列番号５であり、
Ｙは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７のアミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
Ｃ−は、配列番号３または配列番号６であり、
または、それと少なくとも５０％相同の配列を含む抗原特異的抗原結合分子を提供する。
【００５４】
この際、
配列番号１は、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴ，  ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
配列番号２は、  ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号３は、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号４は、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴであり、
配列番号５は、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号６は、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮである。
【００５５】
前記ＣＤＲ１領域は、図１０Ａまたは１０Ｂで表される、任意のＣＤＲ１領域でありうる。前記ＣＤＲ３領域は、図１０Ａ、１０Ｂまたは１０Ｃで表される、任意のＣＤＲ３領域でありうる。
【００５６】
本発明のこの実施形態の配列は、図９Ａで表されるものでありうる。
【００５７】
本発明の他の実施形態において、式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列：
【００５８】
【化３】
0006591964.tif 000004
【００５９】
Ａ−は、配列番号７であり、
Ｘは、６のアミノ酸残基を有するＣＤＲ１領域であり、
Ｂ−は、配列番号８であり、
Ｙは、１４、２０、または２２のアミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
Ｃ−は、配列番号９であり、
または、それと少なくとも５０％相同の配列を含む抗原特異的抗原結合分子を提供する。
【００６０】
この際、
配列番号７は、ＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＰまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＡまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＧまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＥＳであり、
配列番号８は、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＡまたはＴＣＷＳＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＬ、ＴＣＷＴＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＡＬ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＶ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＳＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨであり、
配列番号９は、ＣＧＧＧＴＶＶＴＶＮ、ＣＧＧＧＴＡＶＴＶＮ、ＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮ、またはＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮである。
【００６１】
前記ＣＤＲ１領域は、１０Ｂで表される、任意のＣＤＲ１領域でありうる。前記ＣＤＲ３領域は、１０Ｂで表される、任意のＣＤＲ３領域でありうる。
【００６２】
本発明のこの実施形態の配列は、図９Ｃで表されるものでありうる。
【００６３】
定義
本発明の抗原特異的抗原結合分子は、可変新規抗原レセプター（ＶＮＡＲ）分子の合成ライブラリに由来したまたはＶＮＡＲ分子の免疫ライブラリに由来したアミノ酸配列を含む。用語ＶＮＡＲ、免疫グロブリン新規抗原レセプター（ＩｇＮＡＲ）および新規抗原レセプタ（ＮＡＲ）はまた、交互に用いることができる。
【００６４】
アミノ酸は、一文字コードもしくは三文字コードのいずれかまたはその両方により本明細書で表される。
【００６５】
用語「親和性精製（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、パートナー部分への結合または連結を維持したまま、分子を不純物から分離することができる組み合わせまたはコンプレックスを形成するために、特異的誘引、または分子の化学的もしくは結合のパートナーへの結合に基づく、分子の精製を意味する。
【００６６】
用語「相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）」またはＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３）は、ＶＮＡＲドメインのアミノ酸残基を指し、それらの存在は抗原結合のために必要である。各ＶＮＡＲは、典型的には、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３として識別された３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、「相補性決定領域」からのアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（ＨＶ）からのアミノ酸残基を含むことができる。いくつかの例において、相補性決定領域は、ＣＤＲ領域および超可変ループ両方からのアミノ酸を含むことができる。ＶＮＡＲ分子への一般的に認められた命名法によると、ＣＤＲ２領域は存在しない。
【００６７】
「フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」（ＦＷ）は、ＣＤＲ残基以外のＶＮＡＲ残基である。各ＶＮＡＲは、典型的には、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂおよびＦＷ４として識別される５つのフレームワーク領域を有する。
【００６８】
「細胞（ｃｅｌｌ）」、「細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）」、および「細胞培養（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）は、交互に用いられ（文脈がそうでないことを示さない限り）、かかる名称は、細胞または細胞株の全ての子孫を含む。したがって、例えば、「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ）」および「形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」のような用語は、形質転換の数に関係なく、初代被験細胞および初代被験細胞に由来する培養を含む。計画的または意図しない変異により、すべての子孫がＤＮＡ量において正確に同一であることはないであろうことも理解されている。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異体の子孫を含む。
【００６９】
「コントロール配列（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」は、発現を指す場合、特定の宿主生物における制御可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適なコントロール配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列、リボソーム結合部位などを含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーのようなコントロール配列を使用する。
【００７０】
用語「コートタンパク質」は、タンパク質、少なくともタンパク質の一部がウイルス粒子の表面に存在するものを意味する。機能的観点から、コートタンパク質は、宿主細胞におけるウイルス構築プロセスの間ウイルス粒子に関連する任意のタンパク質であり、他の宿主細胞に感染するまで構築されたウイルスとの関連を維持する。
【００７１】
特定のアッセイにおける化学物質の「検出限界（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔ）」は、そのアッセイのバックグラウンドレベルを超えて検出できるその物質の最小濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡにおいて、特定の抗原結合フラグメントをディスプレイする特定のファージの「検出限界」は、特定のファージが抗原結合フラグメントをディスプレイしないコントロールファージにより生成されたものを超えるＥＬＩＳＡシグナルを生成するファージ濃度である。
【００７２】
「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」および「融合ポリペプチド（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、互いに共有結合している２つの部分を有するポリペプチドを指し、各々の部分は、異なる性質（ｐｒｏｐｅｒｔｙ）を有するポリペプチドである。前記性質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ活性のような、生物学的性質でありうる。前記性質はまた、ターゲット抗原への結合、反応の触媒作用などのような、シンプルな化学的または物理的特性でありうる。前記２つの部分は、単一のペプチド結合によりまたは１以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して直接結合することができる。一般的に、前記２つの部分および前記リンカーは、互いにリーディングフレームであろう。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は、異種または異なるポリペプチドから得られる。
【００７３】
このテキストにおける用語「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、一般的な用語で、水素結合もしくは塩橋を含む、化学的方法により、もしくはタンパク質合成を介したペプチド結合によりまたはその両方により、互いに結合した１以上のタンパク質を意味する。
【００７４】
「異種ＤＮＡ（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ）」は、宿主細胞に導入される任意のＤＮＡである。前記ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびそれらの融合または組み合わせを含む多様なソースに由来することができる。前記ＤＮＡは、宿主もしくはレシピエント細胞として同一細胞もしくは細胞型からのＤＮＡ、または異なる細胞型から、例えば同種もしくは異種ソースからのＤＮＡを含むことができる。前記ＤＮＡは、必要に応じて、マーカー遺伝子または選択遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子、温度耐性遺伝子などを含むことができる。
【００７５】
「高度に多様化した位置（ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、既知のおよび／または天然の抗体のアミノ酸配列または抗原結合フラグメントを比較した際の位置で表される多くの異なるアミノ酸を有する軽鎖および重鎖の可変領域に位置するアミノ酸の位置を意味する。高度に多様化した位置は、典型的には、ＣＤＲ領域内である。
【００７６】
「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列を比較することによって決定された、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列の間の関係を表現する。同一性はまた、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度（相同性）を意味し、場合によっては、かかる配列のストリング間の一致によって決定される。２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定するための方法は多数存在する一方、同一性を決定するために通常用いられる方法は、コンピュータプログラムに体系化される。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムは、制限されないが、ＧＣＧプログラムパッケージを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １２，  ３８７  （１９８４），  ＢＬＡＳＴＰ，  ＢＬＡＳＴＮ，  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ  （Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９０）  ２１５，  ４０３）。
【００７７】
好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）により提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９０）  ２１５，  ４０３−４１０）のデフォルトパラメータを用いて、本明細書で開示するアミノ酸配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも５０％の同一性を有する
タンパク質配列は、本明細書で表されるアミノ酸配列に対し、核酸またはアミノ酸レベルで、より好ましくは、少なくとも５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらに好ましくは、９５％（さらに好ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有するであろう。
【００７８】
タンパク質はまた、本明細書で開示される配列に対し、ＨＧＭＰにより提供されたＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含むことができる。
【００７９】
「ライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）」は、複数のＶＮＡＲもしくはＶＮＡＲフラグメント配列またはそれらの配列をコードする核酸を指す。ライブラリの起源は、多様性が自然または自然フレームワークの組み合わせで操作された、非天然ソースまたは自然の中での合成からであり得、または免疫化された動物から抽出したＲＮＡから単離されたＶＮＡＲドメインから例示されるように天然ソースからでありうる。
【００８０】
「ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）」は、２つの核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスである。２つのフラグメントのライゲーションのため、前記フラグメントの末端は、互いに適合可能でなければならない。いくつかのケースにおいて、前記末端は、エンドヌクレアーゼによる消化後、直接的に適合可能であろう。しかし、最初に、ブラントエンドへのエンドヌクレアーゼによる消化後、通常生成される互い違いの末端をライゲーションのために適合可能にすることが必要であるだろう。末端をブラントにするため、ＤＮＡは、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下、約１０ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴ４ＤＮＡポリメラーゼで、少なくとも１５分間１５℃で、適切なバッファーにより処理される。ＤＮＡは、その後、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりまたはシリカ精製により精製される。互いにライゲートされうるＤＮＡフラグメントは、溶液中にほぼ等モル量で加えられる。前記溶液はまた、ＡＴＰ、リガーゼバッファー、およびＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼを、０．５μｇのＤＮＡあたり約１０ユニット、含むであろう。前記ＤＮＡをベクターにライゲートされうるのであれば、前記ベクターは、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化により最初に線状にされる。線状フラグメントは、その後、ライゲーション工程の間のセルフライゲーションを抑制するためにバクテリアのアルカリホスファターゼまたは仔ウシ腸のホスファターゼで処理される。
【００８１】
「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、削除、挿入、または野生型配列のような、基準ヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの置換である。
【００８２】
「天然（ｎａｔｕｒａｌまたはｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」ＶＮＡＲは、非合成ソース、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで得られた組織ソースから、または板鰓亜綱の動物の血清から同定されたＶＮＡＲを指す。これらのＶＮＡＲは、天然またはその他のいずれかで誘導された、任意のタイプの免疫応答で生成されたＶＮＡＲを含むことができる。天然ＶＮＡＲは、アミノ酸配列、およびこれらの抗体を構成もしくはコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書において、天然ＶＮＡＲは、「合成ＶＮＡＲ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ＶＮＡＲｓ）」とは異なり、合成ＶＮＡＲは、例えば、異なるアミノ酸を有する特定の位置で、１つのアミノ酸、もしくは１つ以上のアミノ酸の置換、削除または付加により、ソースまたはテンプレート配列から変更されているＶＮＡＲ配列を指し、前記異なるアミノ酸は、ソースの抗体配列とは異なる抗体配列を提供する。
【００８３】
用語「核酸構築物（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、一般的に、クローニングにより得られたまたは化学合成により生成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡであろう任意の長さの核酸を指す。前記ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖でありうる。一本鎖ＤＮＡは、コーディングセンス鎖であろうし、またはノンコーディングもしくはアンチセンス鎖であろう。治療での使用のため、核酸構築物は、好ましくは、治療される被験者で発現することができる形態である。
【００８４】
「制御可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、核酸を指す場合、核酸が他の核酸配列と機能的な関係に置かれていることを意味する。例えば、プレ配列または分泌リーダ（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｌｅａｄｅｒ）としてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドとしてのＤＮＡと制御可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合、コード配列と制御可能に連結している；またはリボソーム結合サイトは、翻訳を促進するために配置される場合、コード配列と制御可能に連結している。一般的に、「制御可能に連結した」は、連結したＤＮＡ配列が隣接しており、および分泌リーダーの場合、付随的であり、並びにリーディングフレームであることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結（ｌｉｎｋｉｎｇ）は、適当な制限部位でのライゲーションにより達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来のプラクティスに従って使用される。
【００８５】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドが、ファージ粒子、例えば繊維状ファージ粒子の表面で少なくともコートタンパク質の一部との融合タンパク質として提示される手法である。ファージディスプレイ技術は、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリを調製することができ、高い親和性で標的抗原に結合したそれらの配列を迅速および効率的にソートできる。ファージでのペプチドおよびタンパク質ライブライのディスプレイは、特異的結合特性をもつポリペプチドのために何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用できる。ポリバレントファージディスプレイメソッドは、繊維状ファージのコートタンパク質、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩまたはｐＩＸをコードする遺伝子への融合を通じて小さなランダムペプチドおよび小さなタンパク質を提示するために用いられている。
【００８６】
「ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）」は、バクテリア起源の複製、例えばＣｏｌＥｌ、およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、繊維状バクテリオファージおよびラムダ状バクテリオファージを含む、任意の既知であるバクテリオファージを用いることができる。プラスミドはまた、一般的に、抗生物質耐性のための選択マーカーを含むであろう。これらのベクターにクローン化されたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖できる。これらのベクターを有する細胞がファージ粒子を製造するために必要なすべての遺伝子とともに提供された場合、プラスミドの複製のモードは、プラスミドＤＮＡの一本鎖のコピーを生成し、ファージ粒子をパッケージングするためにローリングサークル複製へ変化する。ファージミドは、感染性または非感染性ファージ粒子を形成するであろう。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面に提示されるように遺伝子融合として異種ポリペプチド遺伝子と連結したファージコートタンパク質遺伝子またはそのフラグメントを含むファージミドを含む。ファージミドディスプレイベクターの例としては、ｐＷＲＩＬ−１がある。
【００８７】
用語「ファージベクター（ｐｈａｇｅ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、異種遺伝子を含み、複製可能である二本鎖複製型のバクテリオファージを意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ起源の複製を有する。前記ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆｌ、Ｐｆ３ファージもしくはそれらの派生体のような繊維状バクテリオファージ、またはラムダ、２１、ｐｈｉ８０、もしくはそれらの派生体のようなラムダ状ファージである。
【００８８】
用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、一般的な用語では、ペプチド結合により互いに結合した複数のアミノ酸残基を意味する。それは、交互に用いられる、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマーまたはポリペプチドと同じ意味であり、糖たんぱく質およびその誘導体を含む。用語「タンパク質」はまた、タンパク質のフラグメント、類似体、変異体および誘導体を含むことを意図し、前記フラグメント、類似体、変異体および誘導体は、基準タンパク質としての生物学的活性または機能と同じものを基本的に保持している。タンパク質類似体および誘導体の例としては、ペプチド核酸、およびＤＡＲＰｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含む。「本発明のポリペプチド」は、本明細書において、ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子である。
【００８９】
タンパク質のフラグメント、類似体、変異体および誘導体は、少なくとも２５、好ましくは３０もしくは４０、もしくは５０もしくは１００までの、または６０〜１２０のアミノ酸長であってよく、長さは由来するオリジナルのタンパク質配列の長さに依存する。９０〜１２０、１００〜１１０のアミノ酸の長さがいくつかの場合においては便利である。
【００９０】
タンパク質のフラグメント、誘導体、変異体または類似体は、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存されたまたは非保存のアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換され、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされたものであってもよいし、そうでなくてもよいもの、（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製に用いられるリーダーまたは補助配列のような成熟ポリペプチドに結合したものであってよい。このようなフラグメント、誘導体、変異体または類似体は、本明細書での教示から当業者が有する範囲内であると思われる。
【００９１】
「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」は、既知の方法（例えば、固相技術を用いた、ホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホルアミダイトケミストリー）によって化学的に合成された短い長さの、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらなる方法は、遺伝子の全体の核酸配列が公知である、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が利用できる場合に用いられるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。また、ターゲットのアミノ酸配列が公知の場合、それぞれのアミノ酸残基のための公知で好ましいコーディング残基を用いて可能性のある核酸配列を推測できる。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムまたは沈殿により精製できる。ＤＮＡは、ＤＮＡが（極性、非極性、イオン性などであろう）非核酸不純物から分離された場合、「精製」される。
【００９２】
「ソース（ｓｏｕｒｃｅ）」または「テンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＶＮＡＲ」は、本明細書において、ＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗原結合フラグメントを指し、その抗原結合配列は、本明細書で記載される基準による多様化が実行されたテンプレート配列として働く。抗原結合配列は、ＶＮＡＲ中に、好ましくはフレームワーク領域を含み、好ましくは少なくとも一つのＣＤＲを一般的に含む。
【００９３】
「転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１以上の下記のコンポーネントを含むであろう：エンハンサーエレメント、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子、および転写終止配列。
【００９４】
「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、細胞がＤＮＡを取り込み、「形質転換細胞（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）となるプロセスを意味する。ＤＮＡ取り込みは、永続的または一過性でありうる。「形質転換細胞」は、ＤＮＡに関連した表現型（例えば、ＤＮＡによってコードされたタンパク質によって付与される抗生物質耐性）の発現によって示されるようにＤＮＡを取り込み、維持する細胞である。
【００９５】
出発または基準ポリペプチド（例えば、ソースＶＮＡＲまたはそのＣＤＲ）の「変異（ｖａｒｉａｎｔ）」または「突然変異（ｍｕｔａｎｔ）」、例えば融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージに対する異種）は、（１）出発または基準ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列、および（２）天然または人工変異のいずれかによる出発または基準ポリペプチドに由来する、ポリペプチドである。かかる変異は、例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の削除、および／または挿入、および／または置換を含む。例えば、（ソースＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメントにおける対応する位置で発見されたアミノ酸に関して）変異アミノ酸の配列をコードする非ランダムコドンセットを含むオリゴヌクレオチドを用いて生成された本発明の融合ポリペプチドは、ソースＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメントに関する変異ポリペプチドであろう。したがって、変異ＣＤＲは、出発または基準ポリペプチド配列（例えば、ソースＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメントの配列）に関する変異配列を含むＣＤＲを指す。変異アミノ酸は、この内容において、出発または基準ポリペプチド配列（例えば、ソースＶＮＡＲまたは抗原結合フラグメントの配列）内の対応する位置でのアミノ酸と異なるアミノ酸を指す。最終の構築物が望ましい機能特性を有することを条件として、削除、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終の変異または突然変異構築物に至るためになされるであろう。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数および位置を変化させるような、ポリペプチドの翻訳後プロセスを変化させることができる。
【００９６】
コートタンパク質、またはソースＶＮＡＲのＣＤＲのような、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」もしくは「基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」配列または「野生型」もしくは「基準」タンパク質／ポリペプチドの配列は、変異ポリペプチドが突然変異の導入により得られる基準配列でありうる。一般的には、所定のタンパク質の「野生型」配列は、自然の中で最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然の中で最も一般的に発見される遺伝子の配列である。突然変異は、自然のプロセスまたはヒトにより誘発される方法のいずれかを通じて、「野生型」遺伝子（したがって、それがコードするタンパク質）に導入することができる。このようなプロセスの生成物は、オリジナルの「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異」または「突然変異」形態である。
【００９７】
ライブラリ構築
合成ライブラリは、上記の適切な技術のいずれによっても構築することができる。合成ライブラリからＶＮＡＲを生成する一つの方法は、２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）。
【００９８】
テンプレート核酸で選択されたアミノ酸を置換する方法は、当技術分野で確立されている。例えば、ライブラリは、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８７），  １５４，  ３６７−３８２）を用いて変異アミノ酸をもつアミノ酸置換のための少なくとも一つのＣＤＲ領域でのアミノ酸の位置を標的とすることにより作製することができる。したがって、特異的なコドンセットは、望ましいように構築することができる。
【００９９】
コドンセットは、望ましい変異アミノ酸をコードするために用いられる異なるヌクレオチドトリプレット配列のセットである。コドンセットは、以下で示すように、ＩＵＢコードによる、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を指定するためにシンボルを用いて表すことができる。
【０１００】
ＩＵＢコード
Ｇ  グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）
Ａ  アデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）
Ｔ  チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）
Ｃ  シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）
Ｒ  （ＡまたはＧ）
Ｙ  （ＣまたはＴ）
Ｍ  （ＡまたはＣ）
Ｋ  （ＧまたはＴ）
Ｓ  （ＣまたはＧ）
Ｗ  （ＡまたはＴ）
Ｈ  （ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ  （ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ  （ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ  （ＡまたはＧまたはＴ）Ｈ
Ｎ  （ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドまたはプライマーセットは、標準的な方法を用いて合成することができる。オリゴヌクレオチドのセットは、例えば、コドンセットにより提供されるヌクレオチドトリプレットのすべての可能な組み合わせを表し、望ましい群のアミノ酸をコードするであろう配列を含む、固相合成によって、合成することができる。
【０１０２】
特定の位置での選択されたヌクレオチド「縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。特定のコドンセットを有するそのようなヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡから入手可能）を用いて合成することができ、または商業的に入手することができる（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃ，  Ｈａｗｔｈｏｒｎ  ＮＹ、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）。したがって、特定のコドンセットを有する合成されたオリゴヌクレオチドのセットは、全体の配列内のコドンセットにより確立された差異である、異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを一般的に含むであろう。本発明により用いられる、オリゴヌクレオチドは、可変ドメイン核酸テンプレートにハイブリダイゼーションでき、またクローニング目的のための制限酵素部位を含むことができる配列を有する。
【０１０３】
その他のソースまたはテンプレート分子をコードする核酸は、公知である、または容易に決定することができる。一般的に、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチドのいずれのサイドでのテンプレートと完全に相補的である１２〜１５ヌクレオチドを有するであろう。このことは、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡテンプレート分子へと適切にハイブリダイズするであろうことを確保する。オリゴヌクレオチドは、Ｃｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  （１９８７）  ７５：  ５７６５に記載されているような当技術分野で公知の技術を用いて容易に合成される。
【０１０４】
ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクター（商業的に入手可能なＭ１３ｍｐｌ８およびＭ１３ｍｐｌ９ベクターが適切である）、またはＶｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  （１９８７）  １５３，  ３に記載の一本鎖ファージ起源の複製を含むこれらのベクターのいずれかに由来するベクターにより生成することができる。したがって、突然変異されたＤＮＡは、一本鎖テンプレートを生成するために、それらのベクターの一つに挿入することができる。
【０１０５】
ネイティブなＤＮＡ配列を変化させるために、オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件下で、一本鎖テンプレートにハイブリダイズされる。ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）、通常ではＴ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片は、その後、合成のプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いてテンプレートの相補鎖を合成するために加えられる。したがって、ヘテロ２本鎖分子は、ＤＮＡの一方の鎖がコード配列１の突然変異形態をコードし、もう一方の鎖（オリジナルテンプレート）がネイティブ、コード配列１の変化していない配列をコードするために形成される。そして、ヘテロ２本鎖分子は、適切な宿主細胞、通常はＥ．Ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１のような原核生物内で形質変換される。細胞の増殖後、それらは、アガロースプレート上にプレーティングされ、突然変異ＤＮＡを含むバクテリアのコロニーを同定するために３２−ホスフェートで放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングされる。
【０１０６】
直前に記載の方法は、ホモ２本鎖分子を生成するために改変することができ、この際、プラスミドの両方の鎖は、突然変異を含む。改変は、以下のとおりである：一本鎖オリゴヌクレオチドは、上述した通り、一本鎖テンプレートにアニールされる。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物は、ｄＣＴＰ−（ａＳ）（Ａｍｅｒｓｈａｍから得ることができる）と呼ばれる改変したチオデオキシリボシトシンと組み合わされる。この混合物は、テンプレート−オリゴヌクレオチドコンプレックスに加えられる。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基を除き、テンプレートと同じＤＮＡの鎖が生成される。加えて、このＤＮＡの新たな鎖は、ｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、このことは、制限エンドヌクレアーゼ消化からそれを保護するために役立つ。２本鎖のヘテロ２本鎖のテンプレート鎖は、適切な制限酵素でニックされた後、テンプレート鎖は、突然変異が誘発された部位を含む領域を越えて、ＥｘｏＩＩヌクレアーゼまたはその他の適切なヌクレアーゼで消化することができる。反応は、その後、部分的に一本鎖だけである分子を残すために停止される。完全な２本鎖ＤＮＡホモ２本鎖は、次に、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼすべての存在下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて形成される。そして、このホモ２本鎖分子は、適切な宿主細胞内で形質転換することができる。
【０１０７】
先で示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列は、テンプレート核酸とハイブリダイズするのに十分な長さであり、また、必ずしも必要ではないが、制限部位を含むことができる。ＤＮＡテンプレートは、バクテリオファージＭ１３ベクターまたはＶｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８７），  １５３，  ３）に記載された一本鎖ファージ起源の複製を含むベクターのいずれかに由来するベクターにより生成することができる。したがって、突然変異されるＤＮＡは、一本鎖テンプレートを生成するために、それらのベクターの一つに挿入されなければならない。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドセットは、核酸カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製するためのテンプレートとして核酸テンプレート配列を用いてポリメラーゼ連鎖反応にて使用することができる。核酸テンプレート配列は、ＶＮＡＲ分子の任意の部分（すなわち、置換のターゲットとされるアミノ酸をコードする核酸配列）でありうる。核酸テンプレート配列は、第１の核酸鎖と補完的な第２の核酸鎖とを有する二本鎖ＤＮＡ分子の一部である。核酸テンプレート配列は、少なくともＶＮＡＲドメインの一部を含み、少なくとも一つのＣＤＲを有する。いくつかのケースにおいて、核酸テンプレート配列は、一つ以上のＣＤＲを含む。核酸テンプレート配列の上流部分と下流部分は、上流のオリゴヌクレオチドセットおよび下流のオリゴヌクレオチドセットのメンバーとともにハイブリダイゼーションのために標的化することができる。
【０１０９】
上流のプライマーセットの第１のオリゴヌクレオチドは、第１の核酸鎖とハイブリダイズすることができ、下流のプライマーセットの第２のオリゴヌクレオチドは、第２の核酸鎖とハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、１以上のコドンセットを含むことができ、核酸テンプレート配列の一部とハイブリダイズするために設計することができる。それらのオリゴヌクレオチドの使用は、ＰＣＲ後のＰＣＲ生成物（すなわち、核酸カセット）に２以上のコドンセットを導入することができる。ＶＮＡＲドメインをコードする核酸配列の領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換のために標的化されたＣＤＲ残基をコードする部分を含む。
【０１１０】
上流および下流のオリゴヌクレオチドセットはまた、オリゴヌクレオチド配列内に制限部位を含むために合成することができる。それらの制限部位は、追加のＶＮＡＲ配列を有する発現ベクター内に核酸カセット（すなわち、ＰＣＲ反応生成物）の挿入を促進できる。
【０１１１】
タンパク質発現
本発明の抗原特異的抗原結合分子をコードする核酸配列は、核酸構築物に存在してもよい。このような核酸構築物は、ベクターの形態、例えば、発現ベクターであることができ、とりわけ、染色体の、エピソームの、およびウイルス由来のベクター、例えば、バクテリア由来の、バクテリオファージ由来の、トランスポゾン由来の、酵母エピソーム由来の、挿入エレメント由来の、酵母染色体エレメント由来の、バクロウイルス、ＳＶ４０のようなパポーバウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、牛痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、ならびに、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメント、例えば、コスミドおよびファージミドのような、これらの組み合わせ由来のベクターを含むことができる。一般的に、宿主内でポリペプチドを発現するために核酸を維持、増殖または発現するために適切な任意のベクターは、この点について発現のために使用することができる。
【０１１２】
核酸構築物は、適切には、核酸の発現を制御するプロモーターまたはその他の調節配列を含むことができる。核酸の発現を制御するプロモーターおよびその他の調節配列は、同定されており、当技術分野で公知である。当業者は、全体のプロモーターまたはその他の調節配列を利用する必要がないであろうことが分かるであろう。最小の必須な調節エレメントだけが要求されるであろうし、実際、このようなエレメントは、キメラ配列またはその他のプロモーターを構築するために使用できる。必須の要件は、もちろん、組織および／または時間的特異性を維持することである。プロモーターは、任意の適切な公知のプロモーター、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＢ）プロモーター、ＣＭＶ最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ＳＶ４０ｅａｒｌｙおよびｌａｔｅプロモーター、または腫瘍ウイルス（ＲＳＶ）のようなレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーターおよびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターであってよい。プロモーターは、プロモーター活性のために構成される最小を含むことができ、例えば、ＣＭＶプロモーターの最小配列である。好ましくは、プロモーターは、核酸配列に隣接している。
【０１１３】
本明細書において、核酸構築物は、ベクターの形態でありうる。ベクターは、それらでトランスフェクトされた（または形質転換された）細胞を選別可能な、および好ましくは、異種ＤＮＡを組み込んだベクターを含む細胞の選別が可能な、１以上の発現マーカーをしばしば含む。適切なスタートおよびストップシグナルは、一般的に存在するであろう。
【０１１４】
ベクターは、ｐＥＴのような、任意の適切な発現ベクターでありうる。ベクターは、必要に応じて、例えば、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光など）、開始および終結配列を含む、転写制御配列およびプロモーター、そのような追加の制御配列を含むことができる。
【０１１５】
プロモーターは、例えば、ＣＭＶプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターのような、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を引き起こすための任意のプロモーターでありうる。
【０１１６】
このようなベクターは、宿主細胞に存在するであろう。本発明の核酸構築物の発現に適した宿主細胞の代表的な例は、ウイルスベクター；バクテリア細胞、例えば、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；酵母細胞のような、単細胞（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞、動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＰＨＫ．２９３、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞ならびにその他の適切なヒト細胞；ならびに植物細胞、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に核酸のカプセル化を可能にするウイルスパッケージングセルを含む。適切には、宿主細胞は、真核細胞であり、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞である。
【０１１７】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性−リピッド−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、バリスティック導入、感染、またはその他の方法により達成できる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）のような、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【０１１８】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞、酵母、バクテリア、またはその他の細胞を含む、宿主細胞内で発現することができる。無細胞翻訳系（Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ）は、本発明の第３の態様の核酸構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を生成するために使用できる。原核生物および真核生物で用いるための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）に記載されている。
【０１１９】
本発明はまた、本明細書に記載の発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本発明によれば、本明細書における、適切な宿主細胞内に当該分子をコードする核酸配列を発現する工程を含む、本発明の抗原特異的抗原結合分子の製造方法を提供する。
【０１２０】
タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンおよび／またはヘパリンクロマトグラフィーを含む標準的な方法により組換え細胞培養から回収し、精製することができる。治療のため、核酸構築物（例えば組換えベクターの形態）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  （１９８９）に記載のカラムクロマトグラフィーのような、当技術分野で公知の技術により生成することができる。
【０１２１】
したがって、本発明のこの態様は、宿主細胞で発現することにより組み換えられた融合タンパク質の製造、ペプチド結合、水素もしくは塩結合、または化学的架橋による、発現した融合タンパク質の精製を含む本発明の融合タンパク質の調製方法にも及ぶ。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、例えば、二量体または三量体などの多量体を可能にする水素または塩結合を用いて調製することができるであろう。
【０１２２】
ライブラリとしてのタンパク質発現
タンパク質のライブラリの形態におけるタンパク質発現は、任意の適切な技術により達成することができる。ライブラリのタンパク質の発現の一つの方法は、２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）。
【０１２３】
例として、核酸カセットは、生成された標的化アミノ酸置換を含むＶＮＡＲの一部または全体の発現のための任意の適切なベクターにクローニングすることができる。核酸カセットは、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した（例えば、融合タンパク質を作製すること）ＶＮＡＲ鎖配列の一部または全体を生産でき、粒子または細胞の表面に提示されるベクターにクローニングすることができる。いくつかのタイプのベクターは利用可能であり、本発明を実施するために使用できる一方、比較的容易に構築することができ、容易に増幅することができるため、ファージミドベクターが、本明細書で使用するための好ましいベクターである。ファージミドベクターは、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製部位の起点、およびその他の必要なコンポーネントを含む様々なコンポーネントを通常含む。
【０１２４】
他の実施形態、この際、特定の変異アミノ酸の組み合わせが発現できる場合において、核酸カセットは、ＶＮＡＲ配列のすべてまたは一部をコードでき、および変異アミノ酸の組み合わせをコードできる配列を含む。それらの変異アミノ酸または変異アミノ酸の組み合わせを含む抗原特異的抗原結合分子の製造のため、核酸カセットは、追加のＶＮＡＲ配列、例えば様々なＣＤＲ、フレームワークおよび／または超可変領域のすべてまたは一部を含む発現ベクターに挿入することができる。それらの追加配列はまた、ウイルスコートタンパク質コンポーネントをコードし、よって融合タンパク質を製造できる配列のような、その他の核酸配列と融合することができる。
【０１２５】
本発明の一つの態様は、遺伝子融合をコードする核酸配列を含む複製可能な発現ベクターを含み、この際、遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部へ融合した、ＶＮＡＲ配列および第２のＶＮＡＲ配列を含む融合タンパク質をコードする。ベクターは、様々なコンポーネントを含むことができ、好ましくは、異なるベクター間のＶＮＡＲ配列の移動を可能にするため、および／または異なるフォーマットにおける融合タンパク質のディスプレイを提供するために構築される。
【０１２６】
ベクターの例は、ファージベクターを含む。ファージベクターは、ファージの複製およびファージ粒子の形成を可能にするファージの複製起点を有する。ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはそれらの派生体のような繊維状ファージ、またはラムダ、２１、ｐｈｉ８０、８２、４２４、４３４など、もしくはそれらの派生体のようなラムダ様ファージである。
【０１２７】
ウイルスコートタンパク質の例は、感染性タンパク質ＰＩＩＩ、メジャーコートタンパク質ＰＶＩＩＩ、ｐ３、Ｓｏｃ（Ｔ４）、Ｈｏｃ（Ｔ４）、（バクテリオファージラムダの）ｇｐＤ、マイナーバクテリオファージコートタンパク質６（ｐＶＩ）（繊維状ファージ；Ｈｕｆｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  （１９９９），  ２３１，  （１−２）：  ３９−５１）、Ｍ１３バクテリオファージメジャーコートタンパク質（Ｐ８）のバリアント（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  （２０００）  ９  （４）：  ６４７−５４）を含む。融合タンパク質は、ファージの表面に提示することができ、適切なファージシステムは、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、およびＰｈｉ  Ｘ  １７４、ｐＪｕＦｏファージシステム（Ｐｅｒｅｂｏｅｖ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  （２００１）；  ７５（１５）：  ７１０７−１３）、ならびにハイパーファージ（Ｒｏｎｄｏｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２００１）；  １９（１）：  ７５−８）を含む。好ましいヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７であり、好ましいコートタンパク質は、Ｍ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉであり、Ｅ．ｃｏｌｉのプロテアーゼ欠損株である。ｆｔｈｌベクター（Ｅｎｓｈｅｌｌ−Ｓｅｉｊｆｆｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （２００１）；  ２９（１０）：  Ｅ５０−０）のような、ベクターは、融合タンパク質の発現に有用でありうる。
【０１２８】
発現ベクターはまた、各ＶＮＡＲまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡへと融合した分泌シグナル配列を有することができる。この配列は、一般的には、遺伝子の５’のすぐに位置しており、したがって、融合タンパク質のアミノ末端で転写されるであろう。しかし、あるケースでは、シグナル配列は、分泌されるタンパク質をコードする遺伝子の５’以外の部位に位置することが示されている。この配列は、バクテリア細胞の内膜にわたり結合しているタンパク質をターゲットにする。シグナル配列をコードするＤＮＡは、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子から制限エンドヌクレアーゼ断片として得ることができる。適切な原核生物のシグナル配列は、例えば、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ，  （１９８３）  ６８，  １９３１）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡをコードする遺伝子およびその他の遺伝子から得ることができる。
【０１２９】
本発明を実施するための好ましい原核生物のシグナル配列は、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （Ｇｅｎｅ  ５５．  １８９  （１９８７））に記載のＥ．ｃｏｌｉ耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列、およびＭａｌＥである。
【０１３０】
ベクターはまた、融合タンパク質の発現を駆動するためのプロモーターを通常含む。原生生物のベクターで最も一般的に用いられるプロモーターは、ｌａｃＺプロモーターシステム、アルカリホスファターゼｐｈｏＡプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージＸＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーにより調節されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）、トリプトファンプロモーター、およびバクテリオファージＴ７プロモーターを含む。一般的なプロモーターの説明は、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．のセクション１７を参照。それらは、最も一般的に用いられるプロモーターであるが、その他の適切な微生物のプロモーターも同様に、使用することができる。
【０１３１】
ベクターはまた、その他の核酸配列を含むことができ、例えば、ファージまたは細胞の表面に発現した融合タンパク質の検出または精製に有用でありうる、ｇＤタグ、ｃ−Ｍｙｃエピトープ、ポリ−ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、または、β−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする配列である。
【０１３２】
例えば、ｇＤタグをコードする核酸配列はまた、融合タンパク質を発現する細胞またはウイルスのポジティブまたはネガティブ選択を提供する。いくつかの実施形態において、ｇＤタグは、好ましくは、ウイルスコートタンパク質コンポーネントに融合しないＶＮＡＲ配列に融合される。例えば、ポリヒスチジンタグをコードする核酸配列は、免疫組織化学作用を用いて特異的抗原に結合するＶＮＡＲ配列を含む融合タンパク質を同定するために有用である。抗原結合を検出するのに有用なタグは、ウイルスコートタンパク質コンポーネントに結合しないＶＮＡＲ配列またはウイルスコートタンパク質コンポーネントに融合するＶＮＡＲ配列のいずれかに融合することができる。
【０１３３】
本発明を実施するために用いられるベクターの別の有用なコンポーネントは、表現型選択遺伝子である。典型的な表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。実例として、アンピシリン耐性遺伝子（ＡＭＰｒ）、およびテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｅｔｒ）が、この目的のために容易に利用される。
【０１３４】
ベクターはまた、ユニークな制限部位および抑制可能なストップコドンを含む核酸配列を含む。ユニークな制限部位は、異なるベクターと発現システムとの間のＶＮＡＲ配列の移動のために有用である。抑制可能なストップコドンは、融合タンパク質の発現レベルを制御し、可溶性ＶＮＡＲの精製を容易にするために有用である。例えば、アンバーストップコドンは、ファージディスプレイを可能にするためにｓｕｐＥ宿主内でＧｌｎとして読むことができ、一方、ｎｏｎ−ｓｕｐＥホストでは、ファージコートタンパク質への融合をせず、可溶性ＶＮＡＲフラグメントを生成するためにストップコドンとして読まれる。それらの合成配列は、ベクター内の１以上のＶＮＡＲ配列に融合することができる。
【０１３５】
目的の配列、例えば、変異アミノ酸を有するＣＤＲをコードする核酸をベクターシステムから容易に取り除き、別のベクターシステムに入れることができるベクターシステムを用いることが便利であろう。例えば、適切な制限部位は、ＶＮＡＲをコードする核酸配列の除去を容易にするためにベクターシステムで操作できる。制限配列は、ベクター内で唯一であるために通常選択され、効率的な切除と新たなベクターへのライゲーションを容易にする。ＶＮＡＲ配列は、その後、ウイルスコートタンパク質またはその他の配列タグのような、外来の融合配列なしで、ベクターから発現することができる。
【０１３６】
ＶＮＡＲ配列をコードする核酸（ｇｅｎｅ１）とウイルスコートタンパク質コンポーネント（ｇｅｎｅ２）との間に、終止またはストップコドンをコードするＤＮＡを挿入してもよく、かかる終止コドンは、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）およびＵＧＡ（オパール）を含む（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈａｒｐｅｒ  ＆  Ｒｏｗ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８０，  ｐｐ．２３７，  ２４５−４７  ａｎｄ  ３７４）。野生型宿主細胞で発現した終止またはストップコドンは、連結したｇｅｎｅ２タンパク質なしで、ｇｅｎｅ１タンパク質生成物の合成をもたらす。しかし、サプレッサー宿主細胞での増殖は、検出可能な量の融合タンパク質の合成をもたらす。このようなサプレッサー宿主細胞は、よく知られており、記載されており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉサプレッサー株である（Ｂｕｌｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：  ３７６−３７９  （１９８７））。任意の許容できる方法は、このような終止コドンを融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに配置するために用いることができる。
【０１３７】
抑制可能なコドンは、ＶＮＡＲ配列をコードする第１の遺伝子と、少なくともファージコートタンパク質の一部をコードする第２の遺伝子との間に挿入することができる。また、抑制可能な終止コドンは、ＶＮＡＲ配列内の最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質内の最初のアミノ酸を置き換えることにより融合部位に隣接して挿入することができる。抑制可能な終止コドンは、二量体化ドメインのＣ−末端にまたはその後に位置することができる。抑制可能なコドンを含むプラスミドがサプレッサー宿主細胞内で増殖した場合、ポリペプチドおよびコートタンパク質を含む融合ポリペプチドの検出可能な生成物をもたらす。プラスミドが、非サプレッサー宿主細胞内で増殖した場合、ＶＮＡＲ配列は、挿入された抑制可能なトリプレットＵＡＧ、ＵＡＡ、またはＵＧＡでの終止により、ファージコートタンパク質への融合なしで実質的に合成される。非サプレッサー細胞において、抗体可変領域は、合成され、さもないと宿主の膜に固定される、融合ファージコートタンパク質の不在により、宿主細胞から分泌される。
【０１３８】
本発明の抗原特異的抗原結合分子
本発明の特定の実施形態において、抗原特異的抗原結合分子は、図９で示される群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１３９】
本発明の一実施形態において、抗原特異的抗原結合分子は、ＨＧＭＰにより提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、５０％の同一性、または少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む、図９、または任意の変異体、類似体、誘導体もしくはそのフラグメントで表されるアミノ酸配列である。本発明の一実施形態において、抗原特異的抗原結合分子は、ヒト化される。約２０％から約８５％のヒト化、例えば約２０％から約６０％のヒト化で本発明のヒト化結合分子を提供することが便利であろう。ＶＮＡＲドメインのヒト化は、かねてより行われており（ＷＯ  ２０１３／１６７８８３；  Ｋｏｖａｌｅｎｋａ，  Ｏ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０１２．  ２８８（２４）：  ｐ．  １７４０８−１７４１９）、機能性のロスを最小限に抑えて、ヒト抗体フレームワークに対するアミノ酸残基の同一性率を増加する能力を例示している。アブラツノザメに由来した、抗ヒトアルブミン結合ＶＮＡＲ  Ｅ６は、ヒト化され（Ｅ０６  ｐａｔｅｎｔ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ；  Ｋｏｖａｌｅｎｋａ，  Ｏ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０１２．  ２８８（２４）：  ｐ．  １７４０８−１７４１９）、標的への結合能力を維持している。ＥＬＳＳ１ライブラリ（２Ｖおよび５Ｖとして知られる）からの融合アイソタイプフレームワークはまた、アブラツノザメに由来しており、そのため、Ｅ０６のフレームワークに対して、図９Ａ（１Ｄ１２）の例えば抗ヒトＩＣＳＬのフレームワーク残基にわたり９２％の同一性である。合成抗ヒトＩＣＯＳＬドメインは、同じ方法を用いてヒト化できるであろうことが予測されるであろう。同じことが、ヒト化もされている、抗ＨＥＬドメイン、５Ａ７に類似する、テンジクザメタイプＩドメインである免疫化抗ヒトＩＣＯＳＬドメインにも当てはまる（ＷＯ  ２０１３／１６７８８３；  Ｋｏｖａｌｅｎｋａ，  Ｏ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０１２．  ２８８（２４）：  ｐ．  １７４０８−１７４１９）。
【０１４０】
抗原特異的抗原結合分子は、本明細書に記載の分子の製造のためのプロセスの間、精製および／または単離で補助することができる使用に先立ち追加の切断されたＮ末端またはＣ末端配列を含むであろう。例えば、分子のＣ末端の（Ａｌａ）３（Ｈｉｓ）６。
【０１４１】
いくつかの、例えば、５から２０、もしくは１から５、もしくは１から３、２、１のアミノ酸残基が置換され、削除されもしくは任意の組み合わせで付加された、またはアミノ酸残基が、置換されず、削除されずもしくは任意の組み合わせで付加されないタンパク質のアミノ酸配列を有する変異体、類似体、誘導体およびフラグメントもまた、本発明に含まれる。それらの中でも特に好ましくは、サイレント置換、付加および削除であり、これらは、本発明のタンパク質の特性や活性を変化させない。また、これに関して特に好ましくは、本発明のタンパク質の特性が、オリジナルの形態に対し変異体の形態で保存される保存的置換である。変異体はまた、本発明による抗原特異的抗原結合分子を含む、融合タンパク質を含む。
【０１４２】
上述したように、本発明の変異体の例は、１以上のアミノ酸と１以上のその他のアミノ酸との置換があるタンパク質を含む。当業者は、さまざまなアミノ酸が類似した特性を有することを認識している。物質の１以上のかかるアミノ酸は、物質の望ましい活性を阻害または排除することなく、１以上のその他のかかるアミノ酸によって、しばしば置換することができる。このような物質は、「非保存（ｎｏｎ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」アミノ酸置換と呼ばれている。
【０１４３】
したがって、アミノ酸のグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、互いに、しばしば置換されうる（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換から、グリシンおよびアラニンが、互いに置換するために用いられ（それらが比較的短い側鎖を有するため）、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが、互いに置換するために用いられる（それらが疎水性であるより大きな脂肪族鎖を有するため）ことが好ましい。しばしば互いに置換されうるその他のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性の側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（側鎖を含む硫黄を有するアミノ酸）を含む。この性質を有する置換は、しばしば「保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」または「半保存的（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」アミノ酸置換と呼ばれる。
【０１４４】
アミノ酸の削除または挿入はまた、上記融合タンパク質のアミノ酸配列に対してなされうる。したがって、例えば、ポリペプチドの活性に実質的に影響を与えない、または少なくともそのような活性を排除しないアミノ酸は、削除することができる。このような削除は、いまだ活性を保持しながら、全体の長さおよびポリペプチドの分子量を減らすことができるので、有利でありうる。このことは、減らすという特定の目的、例えば、投与レベルを減らすことができるために必要なポリペプチドの量を可能にする。
【０１４５】
上記融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の挿入もまた、なされうる。このことは、本発明の物質の性質を変化するためになされるであろう（例えば、融合タンパク質に関連して上記で説明したように、同定、精製または発現をアシストするために）。
【０１４６】
本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸変化は、任意の適切な技術を用いて、例えば、部位特異的突然変異誘発法を用いることによりなされうる。
【０１４７】
本発明の範囲内のアミノ酸の置換または挿入は、天然または非天然アミノ酸を用いてすることができる。天然または合成アミノ酸を用いるであろうとなかろうと、Ｌアミノ酸だけが存在することが好ましい。
【０１４８】
本発明のタンパク質は、追加のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸配列を有することができる。このような配列は、さまざまな理由、例えばグリコシル化のために供することができる。
【０１４９】
融合タンパク質は、融合タンパク質の構造要素を提供する異種ペプチドまたはタンパク質配列に融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を含むことができる。その他の実施形態において、融合タンパク質は、生物学的活性を有する分子と融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を含むことができ、すなわち薬理学的に有用な活性を有する治療用タンパク質である。分子は、ペプチドもしくはタンパク質配列、またはそのたの生物学的に活性な分子でありうる。
【０１５０】
例えば、抗原特異的抗原結合分子は、ポリアミノ酸配列、例えば複数のヒスチジン残基もしくは複数のリジン残基（適切には、２、３、４、５、もしくは６残基）、または免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）でありうる異種ペプチド配列に融合することができる。
【０１５１】
異種ペプチド配列へのリファレンスは、マウスおよびヒトのような、その他の哺乳類種からの配列およびその他のＶＮＡＲドメインに由来する任意の異種ペプチド配列を含む。
【０１５２】
融合タンパク質が生物学的活性を有する分子と融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を含む場合、生物学的に活性な部分は、酵素、免疫ブログリン、サイトカインまたはそれらのフラグメントのような生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質でありうる。また、生物学的に活性な分子は、抗生物質、抗ガン薬、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、鎮痛剤、トキシンまたはその他の薬剤的に活性な剤でありうる。抗ガン薬は、細胞毒性または細胞増殖抑制薬を含むことができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、その他の免疫グロブリン可変もしくは定常領域、またはその他の本発明の抗原特異的抗原結合分子に融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を含むことができる。言い換えると、本発明の抗原特異的抗原結合分子の融合は、可変長、例えば、二量体、三量体、四量体またはそれ以上の高次多量体（すなわち、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体もしくは十量体またはそれ以上）でありうる。特定の実施形態において、単量体ＶＮＡＲサブユニットの多量体として表すことができる。
【０１５４】
例えば、ＶＮＡＲ  ＣＤＲが追加のペプチド配列に融合する場合、前記追加のペプチド配列は、ウイルス粒子または細胞の表面の１以上の融合ポリペプチドの相互作用を提供できる。したがって、これらのペプチド配列は、「二量体形成領域（ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ）」ということができる。二量体形成領域は、少なくとも１以上の二量体化配列、もしくは少なくともシステイン残基を含む一つの配列またはその両方を含むことができる。適切な二量体化配列は、両親媒性αへリックスを有するタンパク質の二量体化配列を含み、前記αへリックスにおいて、疎水性残基は、規則的に配置され、各タンパク質の疎水性残基の相互作用によって二量体を形成することができ；かかるタンパク質およびタンパク質の部分は、例えば、ロイシンジッパー領域を含む。
【０１５５】
二量体化ドメインはまた、１以上のシステイン残基（例えば、二量体化ドメインの抗体ヒンジ配列の含有により提供される）を含むことができる。前記ヒスチジン残基は、１以上のジスルフィド結合の形成によって二量体化を提供できる。一実施形態において、ストップコドンは、二量体化ドメイン後に存在し、二量体化ドメインは、少なくとも一つのシステイン残基を含む。二量体化ドメインは、好ましくは、抗体可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質コンポーネントとの間に位置される。
【０１５６】
本発明の融合タンパク質において、抗原特異的抗原結合分子は、融合タンパク質のその他のエレメントとリンカー部分を介して直接融合または結合できる。前記リンカーは、ペプチド、ペプチド核酸、またはポリアミド結合でありうる。適切なポリペプチドリンカーは、複数のアミノ酸残基、例えば、（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ）４（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）４のような、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０もしくは２５のアミノ酸、もしくはそれらの組み合わせ、またはそれらの多量体（たとえば、二量体、三量体、もしくはそれ以上）を含みうる。例えば、適切なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３でありうる。また、リンカーは、（Ａｌａ）３（Ｈｉｓ）６またはその多量体を含む。ＨＧＭＰにより提供されたＢＬＡＳＴコンピュータプログラムのデフォルトパラメータを用いて、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列もまた含まれる。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、ベクターは、コートタンパク質に融合した単一ＶＮＡＲ−ファージポリペプチドをコードする。これらの場合において、ベクターは、特定のプロモーターの制御下、一つのトランスクリプトを発現する、「モノシストロニック（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）であると考えられる。
【０１５８】
このようなベクターの具体例は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはＴａｃプロモーターを利用して、ドメイン間のリンカーペプチドを有する、ＶＮＡＲ領域をコードするモノシストロニック配列の発現を駆動する。シストロニック配列は、５’末端で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、およびその３’末端でウイルスコートタンパク質（例えば、ｐＩＩＩタンパク質）のすべてまたは部分と結合することができる。ベクターはさらに、第２の可変ドメイン配列とウイルスコートタンパク質配列との間に、その３’末端に二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー）をコードする配列を含むことができる。二量体化ドメインを含む融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの複合体を形成するために二量体化することができる。
【０１５９】
その他の場合において、ＶＮＡＲ配列（複数のＶＮＡＲ配列またはフラグメント）は、別のポリペプチドとして発現することができ、したがってベクターは「バイシストロニック」であり、別のトランスクリプトを発現できる。これらのベクターにおいて、ＰｔａｃまたはＰｈｏＡプロモーターのような、適切なプロモーターは、バイシストロニックメッセージの発現を駆動するために用いることができる。例えば、第１のＶＮＡＲ配列をコードする、第１のシストロンは、５’末端でＥ．ｃｏｌｉ  ＭａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、および３’末端でｇＤタグをコードする核酸配列と結合することができる。例えば、第２のＶＮＡＲｇ配列をコードする、第２のシストロンは、５’末端でＥ．ｃｏｌｉ  ＭａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、および３’末端でウイルスコートタンパク質のすべてまたは部分と結合することができる。
【０１６０】
例えば、ベクターは、５’末端でＥ．ｃｏｌｉ  ＭａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、および３’末端でｇＤタグをコードする核酸配列と、制御可能に結合されたＶＮＡＲ配列をコードする第１のシストロンの発現を駆動するＰｔａｃまたはＰｈｏＡ（ＡＰ）プロモーターのような適切なプロモーターを、含むことができる。第２のシストロンは、例えば、５’末端でＥ．ｃｏｌｉ  ＭａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と、および少なくともウイルスコートタンパク質の部分が続く、ＩｇＧヒンジ配列およびロイシンジッパー配列を含む二量体化ドメインを有する３’末端と、作動可能に結合されたその他のＶＮＡＲ配列をコードする。
【０１６１】
ＶＮＡＲ配列の融合ポリペプチドは、様々なフォーマットで細胞、ウイルスまたはファージミド粒子の表面にディスプレイすることができる。これらのフォーマットは、一本鎖フラグメントおよび多価の形態のこれらのフラグメントを含む。前記多価の形態は、二量体、またはそれ以上の多量体でありうる。多価の形態のディスプレイは、それらが、一般的に低い親和性クローンの同定につながり、また選択過程の間、稀なクローンのより効果的な選別を可能にする、１以上の抗原結合部位を有するため、便利であろう。
【０１６２】
本発明の記載により構築されたベクターは、増幅および／または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む標準の形質転換法を用いて宿主細胞に導入できる。ベクターがウイルスのような感染粒子である場合、前記ベクター自体が、宿主細胞への侵入を提供する。標準的な手順による遺伝子融合およびファージ粒子の生成をコードする複製可能な発現ベクターを含む宿主細胞のトランスフェクションは、融合タンパク質がファージ粒子の表面にディスプレイされたファージ粒子を提供する。
【０１６３】
複製可能な発現ベクターは、複数の方法を用いて宿主細胞に導入される。一実施形態において、ベクターは、細胞を用いて導入できる。細胞は、必要に応じて、約６〜４８時間（またはＯＤ６００＝０．６〜０．３まで）、約３７℃で、標準培養液中で培養増殖され、その後、前記液は、遠心分離され、上清を除去する（例えばデカント）。最初の精製は、好ましくは、バッファー液（例えば、１．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）中で細胞ペレットを再懸濁することにより、その後再遠心分離および上清の除去を行う。結果として得られた細胞ペレットは、希釈グリセロール（例えば、５〜２０％  ｖ／ｖ）中で再懸濁され、再度細胞ペレットを形成するために再遠心分離され、上清を除去する。最終的な細胞濃度は、水または希釈グリセロール中で細胞ペレットを再懸濁し、所望の濃度にすることにより得られる。
【０１６４】
エレクトロポレーションの間、より高いＤＮＡ濃度（約１０倍）の使用は、形質転換の効率を増加し、宿主細胞にて形質転換されたＤＮＡ量を増加する。高い細胞濃度の使用はまた、効率を増加する（約１０倍）。より多い量の転移ＤＮＡは、より多くの多様性を有し、より多くの数のコンビナトリアルライブラリのユニークなメンバーを表す、より大きなライブラリを生成する。形質転換細胞は、一般的に、抗生物質を含む培地での成長により選択される方法論における様々な置換および変異を有する、標的抗原バインダーを同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野において十分に確立されている。一つのアプローチは、融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合と制御可能に連結した転写調節エレメントを含む変異の複製可能なベクターのファミリーを構築すること、適切な宿主細胞を形質転換すること、ファージ粒子の表面の融合ポリペプチドをディスプレイするファージ粒子を形成するために形質転換細胞を培養することを含み、少なくとも粒子の集団の一部分が、選択のプロセスにおいて結合しない粒子に関連して粒子から結合する前記粒子のサブセットを増やし、および豊かにすることを目的として、標的と結合するために、組み換えファージ粒子と標的抗原とを接触させることによって、選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）またはソート（ｓｏｒｔｉｎｇ）を伴うプロセスが続く。選択したプールは、異なるまたは同じストリンジェンシーを有する同じ標的のソートの別のラウンドのために宿主細胞を感染させることによって増幅することができる。結果として得られた変異体のプールは、その後、新規高親和性結合タンパク質を同定するために標的抗原に対してスクリーニングされる。
【０１６５】
これらの新規高親和性結合タンパク質は、治療薬として、アンタゴニストもしくはアゴニストとして、ならびに／または診断および研究試薬として有用でありうる。
【０１６６】
変異のアミノ酸を含む抗体可変ドメインのような融合ポリペプチドは、ファージ、ファージミド粒子、または細胞の表面で発現することができ、その後、通常目的の抗原である標的抗原に結合する融合ポリペプチドのグループのメンバーの能力のために選択および／またはスクリーニングされる。
【０１６７】
このような融合タンパク質は、化学合成経路と同様に、宿主細胞または無細胞系での発現による組み換え技術を含む、任意の適切な経路によって調製することができる。
【０１６８】
ＩＣＯＳＬ特異的なライブラリメンバーの選択
標的へのバインダーの選択プロセスはまた、タンパク質Ｌのような抗体可変ドメインまたはファージ上にディスプレイされる抗体もしくは抗体フラグメントへ結合するタグ特異的抗体への親和性を有する一般的なタンパク質のソートを含むことができ、このことは、正しく折りたたまれた抗体フラグメント（融合ペプチド）をディスプレイするライブラリメンバーを豊かにするために使用できる。
【０１６９】
標的ＩＣＯＳＬタンパク質は、天然ソースから単離することができ、または当技術分野で知られている手順による組み換え法により調製することができる。親和性のための選択（ソート）の２つの主な戦略は、（ｉ）固体支持法（ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍｅｔｈｏｄ）またはプレートソート（ｐｌａｔｅ  ｓｏｒｔｉｎｇ）もしくは固定された標的ソート（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｏｒｔｉｎｇ）；および（ｉｉ）溶液結合法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）である。
【０１７０】
固体支持法のために、標的タンパク質は、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、さまざまなアクリルコポリマー、ヒドロキシアルキルメタアクリレートゲル、ポリアクリルおよびポリメタアクリルコポリマー、ナイロン、中性およびイオン性のキャリアなどのような当技術分野で知られている適切な固体または半固体マトリクスと結合することができる。
【０１７１】
マトリクスへの標的抗原の結合後、固定化された標的は、固定化された標的抗原と少なくともファージ粒子の集団のサブセットとの結合に適した条件下、融合ポリペプチドを発現するライブラリと接触される。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む、前記条件は、生理的条件を模倣するであろう。固定化された標的への結合粒子（「バインダー（ｂｉｎｄｅｒｓ）」は、洗浄によって標的と結合しないこれらの粒子から分離される。洗浄条件は、高親和性バインダーを除いたすべてを除去するために調節することができる。バインダーは、様々な方法によって固定化された標的から解離することができる。これらの方法は、野生型リガンドを用いた競争的解離（例えば、過剰な標的抗原）、ｐＨの変化および／またはイオン強度、ならびに当技術分野で公知の方法を含む。バインダーの選択は、通常、適切な溶出材、例えば、０．１Ｍ  ＨＣＬのような酸またはリガンドによる親和性マトリクスからの溶出を含む。リガンドの濃度を増加することによる溶出は、親和性を増加する提示された結合分子を溶出するであろう。
【０１７２】
バインダーは、単離することができ、その後、バインダー（および例えば、ウイルス粒子がファージミドである場合、必要であればヘルパーファージ）であるウイルス粒子で細胞に感染させることにより適切な宿主細胞内で再増幅することができ、宿主細胞は、所望の融合ペプチドをディスプレイする粒子の増幅に適した条件下、培養される。ファージ粒子は、次に、回収され、選択プロセスは、標的抗原のバインダーがある程度充実するまで１回以上繰り返される。任意の数のラウンドの選択またはソートを用いることができる。選択またはソート手順の一つは、タンパク質Ｌのような一般的な親和性タンパク質またはｇＤタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体のような提示されたポリペプチドに存在するポリペプチドタグに対する抗体に結合するバインダーの単離を含むことができる。  別の選択方法は、従来の溶液ソート法に対して改善された効率を有する溶液相ソートを可能にする「溶液結合法」である。溶液結合法は、ランダムライブラリからオリジナルのバインダーを見つけるために、または特定の結合クローンまたはクローンのグループの親和性を改善するために設計されたライブラリから改善されたバインダーを見つけるために使用されている。前記方法は、ファージまたはファージミド粒子（ライブラリ）に提示されたもののような、複数のポリペプチドと、標識またはタグ分子と融合した標的抗原とを接触させることを含む。前記タグは、ビオチンまたは特定のバインダーが利用可能なその他の部分でありうる。溶液相のストリンジェンシーは、第１の溶液結合相における標識標的抗原の濃度低減を用いることによって、変化することができる。
【０１７３】
さらにストリンジェンシーを増加するために、第１の溶液結合相は、第１の溶液相における標識標的との最初の結合後、高濃度の非標識抗原を有する第２の溶液結合相を続けることができる。通常、標識標的に対して１００〜１０００倍の非標識標的は、第２の相（もし含まれるなら）において用いられる。第１の溶液相のインキュベーションの時間の長さは、平衡に到達するために数分から１時間またはそれ以上の間で変えることができる。第１の相における結合のため、より短い時間の使用は、バイアスをかけるまたはファストオンレート（ｆａｓｔ  ｏｎ−ｒａｔｅ）を有するバインダーを選択するであろう。第１の相における時間の長さおよびインキュベーションの温度は、ストリンジェンシーを増加するために変化することができる。このことは、ゆっくりと標的から外れること（オフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅ））を有するバインダーのための選択バイアスを提供する。
【０１７４】
複数のポリペプチド（ファージ／ファージミド粒子で提示された）と標的抗原とを接触させた後、標識標的と結合したファージまたはファージミド粒子は、結合していないファージから分離される。結合の溶液相からの粒子−標的混合物は、標識標的部分と接触させること、および短時間（例えば、２〜５分）で標識標的部分に結合した分子への結合を可能にすることにより単離される。標識標的抗原の最初の濃度は、約０．１ｎＭから約１０００ｎＭの範囲でありうる。結合粒子は、溶出され、次のラウンドのソートのために増やすことができる。複数ラウンドのソートは、各ラウンドのソートについて、より低い濃度の標識標的抗原を用いることが好ましい。
【０１７５】
例えば、この要素は経験的におよび／または実施する者の希望に合わせるために決定することができるが、約１００から２５０ｎＭの標識標的抗原を用いた最初のソートまたは選択は、広範囲の親和性を捕えるために十分でなければならない。第２のラウンドの選択において、約２５から１００ｎＭの標識標的抗原を用いることができる。第３のラウンドの選択において、約０．１から２５ｎＭの標識標的抗原を用いることができる。例えば、１００ｎＭのバインダーの親和性を改善するために、２０ｎＭで開始し、その後５および１ｎＭ標識標的へと進め、その後、約０．１ｎＭの標識標的抗原のような、さらに低い濃度へと続くことが望ましいであろう。
【０１７６】
本明細書において、固体支持法および溶液ソート法の組み合わせは、望ましい特性を有するバインダーを単離するために、有利に用いることができる。数ラウンドでの標的抗原の選択／ソート後、選択したプールからの個々のクローンのスクリーニングは、一般的に、望ましい性質／特性を有する特異的なバインダーを同定するために実施される。好ましくは、スクリーニングのプロセスは、ライブラリ候補の高いスループットスクリーニングを可能にするために自動化システムにより行われる。
【０１７７】
２つの主なスクリーニング方法は、下記に記載する。しかし、その他の方法もまた、用いることができる。第１のスクリーニング方法は、固定化された標的抗原を用いたファージＥＬＩＳＡアッセイを含み、非結合クローンから特異的な結合クローンの同定を提供する。特異性は、標的コートウェル（ｃｏａｔｅｄ  ｗｅｌｌ）およびＢＳＡまたはその他の非標的タンパク質コートウェル上のクローンの同時定量により決定することができる。
【０１７８】
一例では、複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリを生成すること；結合に適した条件下で、ライブラリを標的抗原および少なくとも一つの非標的抗原と接触させること；非バインダーからライブラリ内のポリペプチドバインダーを分離すること；標的抗原へ結合し、非標的抗原へ結合しないバインダーを同定すること；標的抗原からバインダーを溶出させること；および特異的な抗原へ結合するポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅することによって、抗体可変ドメインのライブラリから特異的な標的抗原に結合する抗体可変ドメインを選択する方法が含まれる。
【０１７９】
別の例では、高いスループット方法において、低い親和性を有するクローンから高い親和性を有するクローンのためのスクリーニングを提供する親和性スクリーニングアッセイが含まれる。前記アッセイにおいて、各クローンは、簡単に標的コートウェルに適用する前に（例えば、５〜１５分）、しばらくの間（例えば、３０〜６０分）、特定の濃度の標的抗体との最初のインキュベーションありとなしの両方でアッセイされる。その後、結合ファージは、例えば、抗Ｍ１３  ＨＲＰコンジュゲートを用いて、通常のファージＥＬＩＳＡ法により測定される。一つのウェルは標的とあらかじめインキュベートされ、別のウェルは、標的抗原とあらかじめインキュベートされない、これら２つのウェルの結合シグナルの比は、親和性の指標である。第１のインキュベーションのための標的の濃度の選択は、興味のある親和性の範囲による。例えば、１０ｎＭより高い親和性を有するバインダーが望ましい場合、第１のインキュベーションにおいて、１０００ｎＭの標的がよく用いられる。バインダーが特定のラウンドのソート（選択）から発見された場合、それらのクローンは、高い親和性を有するバインダーを同定するために親和性スクリーニングアッセイでスクリーニングすることができる。
【０１８０】
上記ソート／選択法のいずれかの組み合わせは、役に立つものとして採用することができる。例えば、一実施形態において、ポリペプチドバインダーは、固定化標的抗原へ結合するために最初に選択される。
【０１８１】
固定化標的抗原へ結合するポリペプチドバインダーは、その後、増幅し、標的抗原への結合および非標的抗原への結合の欠如についてのスクリーニングすることができる。特異的に標的抗原へ結合するポリペプチドバインダーは、増幅される。これらのポリペプチドバインダーは、次に、コンプレックスを形成するための標識標的抗原の濃度と接触することによって、より高い親和性のために選択することができ、この際、標識標的抗原の濃度範囲は、約０．１ｎＭから約１０００ｎＭであり、前記コンプレックスは、標的抗原上のラベルへ結合する剤と接触することによって単離される。ポリペプチドバインダーは、その後、標識標的抗原から溶出され、必要に応じて、選択のラウンドは繰り返され、一回ごとに、より低濃度の標識標的抗原が用いられる。この選択方法を用いて単離された高い親和性ポリペプチドバインダーは、次に、例えば、溶液相ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて高い親和性についてのスクリーニングをすることができる。
【０１８２】
バインダーが標的抗原への結合によって同定された後、核酸を抽出できる。抽出されたＤＮＡは、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を形質転換するために直接使用することができ、または代わりに、コード配列は、例えば、適切なプライマーによるＰＣＲを用いて増幅することができ、典型的な配列決定法により配列決定することができる。バインダーの可変ドメインのＤＮＡは、消化された制限酵素であり得、そしてタンパク質発現のためにベクターに挿入することができる。
【０１８３】
その他の選択の適切な方法は、１以上の多様なＣＤＲ領域を有する複数のポリペプチドを生成すること、結合に適した条件下、複数のポリペプチドと標的抗原とを接触させることにより標的抗原へのバインダーのための複数のポリペプチドをソートすること；標的抗原へのバインダーを結合していないバインダーから分離すること；バインダーを単離すること；および高い親和性のバインダーを同定することを含むことができる。必要に応じて、ポリペプチドは、標的抗原のソートと組み合わせて、バインダーをソートするために用いることができるｇＤ、ｐｏｌｙ−ｈｉｓまたはＦＬＡＧのようなポリペプチドタグと融合することができる。
【０１８４】
別の例は、ＶＮＡＲのライブラリから標的抗原へ結合する抗原特異的抗原結合分子を選択することを含み：ａ）複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリを生成すること；ｂ）結合に適した条件下、ライブラリを固定化された標的抗原と接触させることによりライブラリから標的抗原へのポリペプチドバインダーを単離すること；ｃ）非バインダーからライブライ内のポリペプチドバインダーを分離することおよび標的抗原からバインダーを溶出すること；ｄ）ポリペプチドバインダーを有する複製可能な発現ベクターを増幅すること；ならびにｅ）必要に応じて、ステップａ−ｄを少なくとも２回繰り返すこと、を含む。
【０１８５】
方法としては、さらに：ｆ）混合物を精製するために結合に適した条件下、０．１ｎＭから１０００ｎＭの範囲の標識標的抗原の濃度を有するポリペプチドバインダーを含む増幅した複製可能な発現ベクターをインキュベートすること；ｇ）前記混合物と標的抗原上のラベルへ結合する固定化された剤とを接触させること；ｈ）標識標的抗原へ結合したポリペプチドバインダーを分離することおよび標識標的抗原からポリペプチドバインダーを溶出すること；ｉ）ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅すること；ならびにｊ）必要に応じて、一回ごとに、より低濃度の標識標的抗原を用いて、ステップｆ−ｉを少なくとも２回繰り返すこと、を含むことができる。必要に応じて、前記方法は、過剰の非標識標的抗原を混合物に加えることおよび標識標的抗原から低親和性のバインダーを溶出するのに十分な時間、インキュベートすることを含むことができる。
【０１８６】
別の例は、複製可能な発現ベクターのライブラリから標的抗原への高い親和性のバインダーを単離または選択する方法を含み：ａ）複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリを生成すること；ｂ）標的抗原へのポリペプチドバインダーを単離するため、ライブラリと少なくとも約０．１ｎＭから１０００ｎＭの濃度の標的抗原とを接触させること；ｃ）標的抗原からポリペプチドバインダーを分離することおよびポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅すること；ｄ）必要に応じて、最も低い濃度の標的抗原へ結合するポリペプチドバインダーを単離するために、一回ごとに、より低濃度の標的抗原でステップａ−ｃを少なくとも２回繰り返すこと；ｅ）標的抗原の複数の異なる希釈でのポリペプチドバインダーをインキュベートすることによって、高い親和性のため最も低い濃度の標的抗原へ結合するポリペプチドバインダーを選択することおよびポリペプチドバインダーのＩＣ５０を決定すること；ならびにｆ）約０．１ｎＭから２００ｎＭの標的抗原に対する親和性を有するポリペプチドバインダーを同定すること、を含む。
【０１８７】
別の例は、複数の本発明のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリからポリペプチドバインダーを選択するためのアッセイを含み：ａ）結合に適した条件下、ポリペプチドバインダーと標識標的抗原とのコンプレックスを形成するために、ライブラリを０．１ｎＭから１０００ｎＭの範囲の標識標的抗原の濃度で接触させること；ｂ）コンプレックスを単離することおよび標識標的抗原からポリペプチドバインダーを分離すること；ｃ）ポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅すること；ｄ）必要に応じて、一回ごとに、より低い濃度の標的抗原を用いて、ステップａ−ｃを少なくとも２回繰り返すこと、を含む。
【０１８８】
必要に応じて、前記方法は、過剰の非標識抗原をポリペプチドバインダーおよび標的抗原のコンプレックスへ追加することを、さらに含むことができる。好ましい実施形態において、前記工程のステップは、２回繰り返され、選択の第１のラウンドにおける標的の濃度は、約１００ｎＭから２５０ｎＭであり、選択の第２のラウンドにおいて、約２５ｎＭから１００ｎＭであり、選択の第３のラウンドにおいて、約０．１ｎＭから２５ｎＭである。
【０１８９】
目的の結合タンパク質を同定するその他の可能性のあるルートは、本発明の複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリをスクリーニングする方法を含み：ａ）ポリペプチドが標的抗原へ結合するのに適した条件下での標的抗原の濃度でライブラリの第１のサンプルをインキュベートすること；ｂ）標的抗原を有さないライブライリの第２のサンプルをインキュベートすること；ｃ）ポリペプチドが固定化された標的抗原へ結合するのに適した条件下、第１および第２のサンプルそれぞれを固定化された標的抗原と接触させること；ｄ）各サンプルに対して固定化された標的抗原へ結合したポリペプチドの量を検出すること；ｅ）第２のサンプルからの結合したポリペプチドの量に対する第１のサンプルからの結合したポリペプチドの量の比を算出することによって標的抗原に対するポリペプチドの親和性を決定すること、を含む。
【０１９０】
ライブラリはまた、特異的な標的への結合についておよび非標的抗原への結合の欠如についてスクリーニングすることができる。一つの態様において、別の実施形態は、ＶＮＡＲのライブラリからの特異的な標的抗原へ結合する抗体可変ドメインについてのスクリーニング方法を提供し：ａ）本発明の複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリを生成すること；ｂ）結合に適した条件下、ライブラリと標的抗原および少なくとも一つの非標的抗原とを接触させること；ｃ）非バインダーからライブラリ内のポリペプチドバインダーを分離すること；ｄ）標的抗原に結合し、非標的抗原に結合しないバインダーを同定すること；ｅ）標的抗原からバインダーを溶出すること；ならびにｆ）特異的な抗原に結合するポリペプチドバインダーを含む複製可能な発現ベクターを増幅すること、を含む。
【０１９１】
上記ソート／選択方法のいずれかの組み合わせは、スクリーニング方法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態において、ポリペプチドバインダーは、最初に、固定化された標的抗原への結合のために選択される。
【０１９２】
固定化された標的抗原へ結合するポリペプチドバインダーは、その後、増幅することができ、標的抗原への結合についておよび非標的抗原への結合の欠如についてスクリーニングすることができる。特異的に標的抗原へ結合するポリペプチドバインダーは、増幅される。これらのポリペプチドバインダーは、その後、コンプレックスを形成するための標識標的抗原の濃度で接触させることによって、より高い親和性のために選択することができ、この際、前記標識標的抗原の濃度は、約０．１ｎＭから１０００ｎＭであり、前記コンプレックスは、標的抗原上の標識へ結合する剤と接触させることによって単離される。その後、ポリペプチドバインダーは、標識標的抗原から単離され、必要に応じて、選択のラウンドは繰り返され、１回ごとに、より低い濃度の標識標的抗原が用いられる。この選択方法を用いて単離された高い親和性のポリペプチドバインダーは、その後、例えば、溶液相ＥＬＩＳＡアッセイまたはスポット競合ＥＬＩＳＡアッセイ用いて、高い親和性についてスクリーニングすることができる。
【０１９３】
薬剤組成物および使用
本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結合分子の薬剤組成物を提供する。かかる組成物は、当該抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質を含む。
【０１９４】
前記薬剤組成物はまた、治療用タンパク質、またはそのフラグメントへ融合した本発明の抗原特異的抗原結合分子を含むことができる。前記治療用タンパク質は、ホルモン、増殖因子（例えば、ＴＧＦβ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子、インスリン様成長因子、胎盤増殖因子）；分化因子；血液凝固因子（例えば、ＶＩＩａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、フォンヴィレブランド因子またはプロテインＣ）または血液凝固カスケードからの別のタンパク質（例えば、アンチトロンビン）；サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２もしくはＩＬ−３３またはインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３）；インターロイキンレセプターアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ＲＩＩ）；ケモカイン（例えば、ＭＩＰｓ（マクロファージ炎症性タンパク質）例えば、ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１β；ＭＣＰｓ（単球走化性タンパク質）例えば、ＭＣＰ１、２もしくは３；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ））；栄養因子；サイトカインインヒビター；サイトカインレセプター；酵素、例えば、フリーラジカル捕捉酵素、例えば、スーパーオキシドジスムターゼもしくはカタラーゼもしくはプロドラッグ変換酵素（例えば、アンギオテンシン変換酵素、デアミナーゼ、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼおよびホスファターゼ）；ペプチドミメティック；プロテアーゼインヒビター；メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰｓ、例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３もしくはＴＩＭＰ４）またはセルピン（セリンプロテアーゼのインヒビター）でありうる。
【０１９５】
本発明の他の実施形態において、融合タンパク質中の治療用タンパク質は、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）２（化学的に結合したＦ（ａｂ’）２鎖を含む）、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ（その多量体の形態、すなわちｄｉ−ｓｃＦｖ、またはｔｒｉ−ｓｃＦｖを含む）、ｓｄＡｂ、またはＢｉＴＥ（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）を含む、抗体、またはその操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）フラグメントでありうる。抗体フラグメントはまた、その他のＶＮＡＲ型フラグメント（ＩｇＮＡＲ分子）と同じく、複数のドメインおよびそのフラグメントを含む。本発明の抗原特異的結合分子は、単量体もしくは二量体もしくは三量体または多量体であり得、同じもしくは異なる標的および／または同じもしくは異なるエピトープに結合可能な同種または異種でありうる。言い換えると、前記抗原特異的結合分子は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、または多重特異性でありうる。本発明の異種の抗原特異的結合分子への言及は、同じ標的上の異なるエピトープへの結合を意味する。操作されたフラグメントはまた、本発明の抗原特異的結合分子のＦｃ融合および抗体のＦｃフラグメントを含む。
【０１９６】
薬剤組成物は、治療用タンパク質へ融合した、いくつかの本発明の抗原特異的結合分子、例えば、二量体、三量体、またはより高次の多量体、すなわち、ニ、三、四、五、六、七、もしくは八量体から構成することができる。
【０１９７】
治療用タンパク質への本発明の抗原特異的結合分子の融合は、タンパク質上の任意の都合の良い部位であろうし、Ｎ末端、Ｃ末端および／またはＮ／Ｃ末端融合でありうる。本発明の一実施形態において、本発明の抗原特異的結合分子の融合は、治療用タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方である。
【０１９８】
本発明の薬剤組成物は、任意の適切で薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバントまたはバッファー溶液を含むことができる。前記組成物は、さらに薬学的に活性な剤を含むことができる。かかる担体は、これらに限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含むことができるが。
【０１９９】
かかる組成物は、示されるように、さらに薬学的に活性な剤を含むことができる。追加の剤は、治療用化合物、例えば、抗炎症剤、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤または抗生物質でありうる。かかる追加の剤は、それを必要とする患者への投与に適した形態で存在するであろうし、かかる投与は、同時、個別または逐次的でありうる。成分は、適切な指示書を含むであろうキットの形態で調製することができる。
【０２００】
薬剤組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内または皮内経路などによる投与を含む患者の疾患を治療するのに効果的な任意の効果的で、便利な方法で投与することができる。治療においてまたは予防薬として、前記活性な剤は、注入可能な組成物として、例えば、滅菌水分散液、好ましくは等張の滅菌水分散液として個体に投与することができる。
【０２０１】
哺乳類、特にヒトへの投与のため、活性剤の日用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇまでであろうことが予期される。いずれにしても、医師は、個体の年齢、体重、性別および応答を含む要因に依存するであろう個体に最も適した実際の投与量を決定するであろう。上述の用量は、平均ケースの例である。もちろん、より多いまたは少ない用量が有益である例があり、これらは本発明の範囲内である。
【０２０２】
本発明によれば、薬剤で使用するための本発明の抗原特異的抗原結合分子を提供する。したがって、本発明のこの態様は、必要とする患者への疾患を治療するための薬剤の製造におけるそのような本発明の抗原特異的抗原結合分子の使用にまで及ぶ。本発明の抗原特異的抗原結合分子はまた、本発明の薬剤組成物に関連して、上記で定義したような抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質を調製するために用いることができる。
【０２０３】
かかる使用はまた、治療上有効な用量の、本発明の抗原特異的抗原結合分子を含む、本明細書に記載の薬剤組成物の患者への投与を含む治療を必要とする患者における疾患の治療方法を含む。
【０２０４】
本明細書において、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、ヒトまたは非ヒト動物に利益をもたらすことができるいかなるレジームを含む。獣医学における非ヒト動物の治療は、馬およびコンパニオンアニマル（例えば、猫および犬）を含む、家畜ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマのファミリーのメンバーを含む農場／農業動物にまで及ぶ。治療は、既存の状態または疾患に関する治療的処置または、予防的なもの（予防的治療）でありうる。治療は、遺伝性または後天性疾患の治療でありうる。治療は、急性または慢性状態の治療でありうる。治療は、炎症および／または癌に関連した状態／疾患の治療でありうる。本発明の抗原特異的抗原結合分子は、制限されないが、変形性関節症、強皮症、腎疾患、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、または炎症性疾患を含む、疾患の治療に用いることができる。
【０２０５】
本発明の抗原特異的抗原結合分子はまた、患者における疾患状態の性質を調べるために用いることができる。抗原特異的抗原結合分子は、Ｘ線、ガンマ線、もしくはＰＥＴスキャンのような画像技術または類似のものを用いて被験者の身体における疾患の部位の画像を用意するために用いることができる。したがって、本発明は、適切に検出可能な標識抗原特異的抗原結合分子の被験者への投与およびその後の被験者の身体のスキャンを含む被験者における疾患の部位を画像化する方法にまで及ぶ。また、被験者への前記分子の投与は、分子の投与に続く被験者からのサンプルを分析することによって試験結果を提供することができる。
【０２０６】
また、抗原特異的抗原結合分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏサンプルまたは患者の身体内での標的分析物の存在をアッセイするために用いることができる。前記サンプルは、細胞、組織、血液、血漿、唾液、涙、精液、脳脊髄液（ＣＳＦ）および／またはミルクなどの身体からの任意の生物学的サンプルでありうる。かかる方法は、適切に検出可能な標識抗原特異的抗原結合分子の目的のサンプルへの添加を含むことができる。適切に検出可能な標識抗原特異的抗原結合分子の標的分析物への結合は、その後、標準的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および／または放射免疫測定（ＲＩＡ）法に従って、蛍光、放射能などのような任意の適切な方法によって検出することができる。
【０２０７】
かかる実施形態は、本発明の抗原特異的抗原結合分子の患者への投与、または前記抗原特異的抗原結合分子のサンプルへの添加を含む、患者の疾患または医学的状態を診断する方法を含むことができる。
【０２０８】
抗原特異的抗原結合分子は、目的の分子の免疫親和性精製におけるさらなる用途を見出すことができる。適切には、本発明の抗原特異的抗原結合分子は、目的の分子が結合解除可能に抗原特異的抗原結合分子へ結合するために目的の分子を含むサンプルが通過または導入された基質に結合させることができる。免疫親和性精製のかかる方法は、例えば、治療物質のような、十分に純粋な形態で調製することは困難であろう生物学的ソースまたは化学反応からの物質のバイオプロセスにおける用途を見出すことができる。
【０２０９】
抗原特異的抗原結合分子が結合することができる基質は、ビーズまたはパウダーの形態であるポリマーを含むカラム、プレート（例えば、マルチウェルプレート）、マイクロ流体システムでありうる。かかる基質は、シリコン、ガラスまたはプラスチック材料のような、必要に応じてチップの形態である、任意の適切な不活性物質から構成されるであろう。いくつかの構成において、同じまたは異なる抗原特異的な複数の抗原特異的抗原結合分子をかかる基質上に置くことは便利であろう。物質を抗原特異的抗原結合分子へ結合させた後、基質は、非結合材料を除去するために洗浄することができ、その後、精製物質は適切な方法によって溶出させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
本願において、図の番号は以下を参照する。
【図１】図１は、テンジクザメにおけるこのタンパク質免疫原への免疫応答を高める能力を示す免疫化サメの血清からのヒトＩＣＯＳＬ特異的な力価を示す。ネガティブコントロールは、ミルクであった。
【図２】図２は、ポジティブなセレクションヒットからのモノクローナル可溶性ペリプラズム発現タンパク質で行われた細胞ベース中和アッセイを示す。低いシグナルは、ｈＩＣＯＳＬへのポジティブな結合およびレセプターリガンド相互作用の結果として得られる阻害を示すものである。ポジティブな中和クローンは、灰色の楕円形で強調表示される。標的に対するたった１ラウンドの選択後、ｈＩＣＯＳＬ特異的なポジティブヒットの充実は、およそ６０％のリガンド（ＩＣＯＳＬ）のレセプター（ＩＣＯＳ）への結合をブロックする能力を示し、さらなる分析のために進められたことで明らかであった。公知の中和１５０ｋＤａ  ｍＡｂクローンは、黒で示され、アッセイのポジティブコントロールとしてここでは用いられた。
【図３】図３は、合成ライブラリＥＬＳＳ１から単離された抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの結合を示す。ＶＮＡＲドメインは、ＣＨＯ細胞を発現するｈＩＣＯＳＬへの精製Ｆｃ融合物として結合について評価された。また、２Ｖとして知られるネガティブ（非結合）ＶＮＡＲ−Ｆｃを含む。
【図４】図４は、ｈＩＣＯＳＬもしくはｍＩＣＯＳＬのいずれか一方を発現するＣＨＯ細胞、または親のＣＨＯ細胞に対する合成および免疫ライブラリの両方から単離されたヒットの選択性を示す。ポジティブクローンは、可溶性タンパク質として発現し、ＦＡＣＳベースアッセイを用いて、親の細胞と比べた、細胞表面発現標的への結合のためにテストされた。ポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬおよび抗ｍＩＣＯＳＬ  ｍＡｂｓは、ポジティブ細胞結合が検出された際の予測されるシフトを示すために、ポジティブコントロールとして含まれた。野生型コントロールは、ナイーブな非結合コントロールドメインであるＶＮＡＲ  ２Ｖである。図４Ａは、実施例１に記載のｈＩＣＯＳＬ免疫ライブラリから単離されたポジティブヒットであるドメイン１〜１６を示す。図４Ｂは、ｈＩＣＯＳＬに対するＥＬＳＳ１から単離された合成ライブラリ由来のヒットの選択性を示す。
【図５】図５は、可溶性タンパク質結合ＥＬＩＳＡによる、複数の異なる抗原（ｈＩＣＯＳＬ、ＨＳＡ、ＴＮＦ−α、ＫＬＨ、ＭＰＢＳ、ＴＧ，ＨＥＬおよびＢＳＡ）に対する抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲヒットの選択性を例示するデータを示す。暗い領域は、高レベルの結合を示す；バックグラウンド結合は、グレーで示される。ポジティブコントロール抗ＨＳＡおよび抗ｈＩＣＯＳＬ結合クローンは、図に示されるとおりＥＬＩＳＡｓに組み込まれた。
【図６−１】図６は、Ｔ−１００  ＢＩＡｃｏｒｅで分析された、単離されたリード（ｌｅａｄ）クローンの親和性を示す。図６Ａは、発現し、精製されたＦｃ構築物および結合のキネティクスとして、７つのリード免疫化抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンの各々からのセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）を示す。２Ｖ−Ｆｃは、ネガティブコントロールとして用いられた。
【図６−２】図６は、Ｔ−１００  ＢＩＡｃｏｒｅで分析された、単離されたリード（ｌｅａｄ）クローンの親和性を示す。図６Ｂは、リード合成ライブラリおよび免疫ライブラリ由来のクローンの計算されたＫＤ値を一覧にした。
【図７−１】図７は、可溶性ＩＣＯＳと細胞発現ＩＣＯＳＬとの間の相互作用を阻害するために合成ライブラリおよび免疫ライブラリから単離された抗ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの能力を示す。精製されたＦｃ融合ＶＮＡＲドメインは、細胞ベースアッセイにおいて、発現され、精製され、滴定された。減少した吸収レベルは、ポジティブな中和を示す。ネガティブコントロールは、ＶＮＡＲ  ドメイン、２Ｖ−ＦＣであった。図７Ａは、免疫ライブラリからのリード抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの結果を示す。
【図７−２】図７は、可溶性ＩＣＯＳと細胞発現ＩＣＯＳＬとの間の相互作用を阻害するために合成ライブラリおよび免疫ライブラリから単離された抗ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの能力を示す。精製されたＦｃ融合ＶＮＡＲドメインは、細胞ベースアッセイにおいて、発現され、精製され、滴定された。減少した吸収レベルは、ポジティブな中和を示す。ネガティブコントロールは、ＶＮＡＲ  ドメイン、２Ｖ−ＦＣであった。図７Ｂは、合成ライブラリからのこれらのリードの結果を示す。
【図８】図８は、抗ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲが一次ヒトＴ細胞増殖アッセイに組み込まれた際に測定されたＩＣ５０値を示す。１Ｃ８、１Ｃ４、１Ｇ５、１Ａ１、２Ｄ４、１Ｈ２および１Ｄ１２は、すべてＥＬＳＳ１から単離されたＶＮＡＲドメインであり、Ｆｃフォーマットに再フォーマットされ、精製された。商業的に利用可能なｈＩＣＯＳＬ抗体、ｍＡｂ１６５は、ポジティブコントロールである。結果は、ドナー４５０およびドナー４５２として知られている２つの独立したドナーから示される。
【図９−１】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ａは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインのアミノ酸配列を一覧表示する。
【図９−２】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ａは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインのアミノ酸配列を一覧表示する。
【図９−３】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｂは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図９−４】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｂは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図９−５】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｂは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図９−６】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｂは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図９−７】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｃは、免疫ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインのアミノ酸配列を一覧表示する。
【図９−８】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｄは、免疫ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図９−９】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｄは、免疫ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図９−１０】図９は、合成（クローン１Ａ９、１Ｃ８、１Ｄ１２、２Ｂ６、２Ｄ３、２Ｄ４、２Ｅ８、１Ｇ５、１Ｈ０２、１Ａ１、１Ｃ０４、１Ａ６、１Ｂ２、２Ｃ１０、２Ｃ７、２Ｇ６、３Ｅ８、３Ｇ１１、４Ｂ５、４Ｇ１、５Ａ１２、５Ｂ１０、５Ｂ９、５Ｃ１、５Ｅ６、５Ｆ３、５Ｆ６および５Ｇ１）および免疫（クローン１、２、８、１１、１２、１３および１７）ライブラリの両方から単離された、全てのポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンのアミノ酸および核酸配列の両方を一覧表示する。図９Ｄは、免疫ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの核酸配列を一覧表示する。
【図１０−１】図１０は、合成および免疫ライブラリ両方から単離された全てポジティブな抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンからのＣＤＲ１およびＣＤＲ３アミノ酸配列を一覧表示する。図１０Ａは、合成ライブラリから単離されたものを一覧表示する。ポジティブヒットは、すべて上記の異種および異なるアイソタイプフレームワーク融合物である。
【図１０−２】図１０は、合成および免疫ライブラリ両方から単離された全てポジティブな抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンからのＣＤＲ１およびＣＤＲ３アミノ酸配列を一覧表示する。図１０Ａは、合成ライブラリから単離されたものを一覧表示する。ポジティブヒットは、すべて上記の異種および異なるアイソタイプフレームワーク融合物である。
【図１０−３】図１０は、合成および免疫ライブラリ両方から単離された全てポジティブな抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンからのＣＤＲ１およびＣＤＲ３アミノ酸配列を一覧表示する。図１０Ｂは、免疫ライブラリから単離されたものを一覧表示する。ポジティブヒットは、すべて上記の異種および異なるアイソタイプフレームワーク融合物である。
【図１０−４】図１０は、合成および免疫ライブラリ両方から単離された全てポジティブな抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲクローンからのＣＤＲ１およびＣＤＲ３アミノ酸配列を一覧表示する。図１０Ｃは、ＥＬＳＳ２合成ＶＮＡＲライブラリから単離されたＩＣＯＳＬポジティブなＶＮＡＲクローンの配列を示す。ポジティブヒットは、すべて上記の異種および異なるアイソタイプフレームワーク融合物である。
【図１１】図１１は、アルブミン結合ＶＮＡＲドメイン（Ｅ６）への分子融合として再フォーマットされたときの標的への抗ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの結合を示す。図１１Ａは、抗マウスＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメイン、抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインへの（ＧＧＧＳ）４アミノ酸ストレッチを介して連結したＣＣ３、抗ヒト血清アルブミンＶＮＡＲドメイン、Ｅ６への（ＧＧＧＳ）４アミノ酸ストレッチを介して連結した２Ｄ４からなる三量体ＶＮＡＲドメイン融合タンパク質の結合を示す。発現した三量体融合タンパク質は、ＥＬＩＳＡによりｍＩＣＯＳＬ、ｈＩＣＯＳＬおよびＨＳＡへの結合のためにテストされた。濃度依存曲線は、各標的への結合が達成され、よってタンパク質融合が三官能であることを示す。図１１Ｂは、分子の融合物の順番が抗ｍＩＣＯＳＬおよび抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメイン間でＮおよびＣ末端の両方で融合されたＥ６の結果により変更される三量体変異体を示す。この配向性において、すべてのＶＮＡＲドメインによるそれらの特異的な標的への結合もまた示される。
【図１２】図１２は、受託番号Ｏ７５１４４で、２０１４年４月１６日に記録された、ｈＩＣＯＳＬのＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を示す（Ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｏ７５１４４．２  ＧＩ：１９８５５０６６；  ＤＢＳＯＵＲＣＥ  ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：  ｌｏｃｕｓ  ＩＣＯＳＬ＿ＨＵＭＡＮ，  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｏ７５１４４）。
【実施例】
【０２１１】
本発明はまた、例示の目的のためだけであり、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない下記の実施例を参照して、さらに説明される。
【０２１２】
使用する略語：ＶＮＡＲ、可変新規抗原レセプター（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）；ｓｃＦｖ、一本鎖抗体フラグメント（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）；ＦＷ、フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）；ＨＶ、超可変ループ（Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）；ＣＤＲ、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）；ＳＯＥ−ＰＣＲ、スライス−バイ−オーバーラップエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ｓｐｌｉｃｅ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）。
【０２１３】
実施例１：ＥＬＳＳ１合成ＶＮＡＲライブラリのバイオパニングによる抗ｈ−ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの単離
抗ｈ−ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインを単離するために、ＥＬＳＳ１合成ライブラリ（２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１の記載（参照により引用される）により調製された）は、単量体のヒトＩＣＯＳＬに対してソリッドステートおよびプレコートビーズベース法の両方を用いてスクリーニングされた。ポジティブヒットは、両方の方法を用いて得られた。簡単には、ソリッドステート選択は、下記のとおり実施された：イムノチューブは、４ｍｌ  ＰＢＳ中で所望の濃度の標的抗原でコートされた。前記チューブは、その後、シールされ、回転しながら４℃で一晩、インキュベートのために放置した。ＰＢＳで３回洗浄後、１時間、２％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳでチューブをブロックした。１時間、回転しながらＭ−ＰＢＳ（２％（ｗ／ｖ）最終濃度）中で０．５〜１ｍｌのインプットファージをブロックした。その後、ブロックしたファージをチューブに加え、２％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳで４ｍｌとし、１時間、２０ｒｐｍで回転しながらインキュベートし、さらに１時間、インキュベーション（静置）した。非結合ファージは、破棄され、チューブは、５〜１０回、ＰＢＳＴで洗浄され、その後、ＰＢＳで５〜１０回洗浄された。ファージは、１０分まで、２０ｒｐｍで回転しながら、１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンの添加によって溶出された。アウトプットファージ溶液は、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）の添加により中和された。溶出されたファージは、１０ｍｌのｍｉｄ−ｌｏｇＥＲ２７３８細胞に加えられ、混合され、攪拌なしで３７℃３０分、インキュベートされ、その後、１５分間２，５００ｘｇで遠心分離された。ペレットは、１ｍｌの２ｘＴＹ−Ｇに再懸濁され、ＴＹＥ−ＧＡアガーを含むＢｉｏ−Ａｓｓａｙ  ｄｉｓｈに広げられ、一晩３０℃でインキュベートされた。
【０２１４】
プレコートビーズベースアッセイのため、抗原は、製造者の指示に従いビオチン化した。ビオチン化した材料は、３０μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、３０分間、２０ｒｐｍのＲ／Ｔ回転でインキュベートされた。プレデコレートされた（ｐｒｅ−ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）ビーズでのライブラリ選択は、主にソリッドステート選択と同じ上記の方法を用いて行われ、インプットファージおよびＤｙｎａｂｅａｄｓは、１時間、Ｒ／Ｔで回転しながら４％（ｗ／ｖ）Ｍ−ＰＢＳでプレブロックされ、ファージは、その後、１時間、Ｒ／Ｔで回転しながらブロックされたビーズの添加、次に、１時間、２０ｒｐｍのＲ／Ｔで抗原コートビーズの添加によってはずされた。ＰＢＳＴで５回の洗浄後、結合ファージは、４００μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ中で、８分間、回転することによって溶出され、２００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）の添加によって中和された。溶出されたファージのＥ．ｃｏｌｉ感染は、ソリッドステート選択で記載したように行われた。
【０２１５】
可溶性ＶＮＡＲタンパク質のペリプラズム発現は、以下のように行われた；一晩培養の選択されたコロニーは、播種され、５時間、２５０ｒｐｍで、１ｍｌ／ｗｅｌｌの２ｘＴＹ、０．１％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むディープウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）で増殖された。転写は、１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により誘導され、一晩、２８℃および２５０ｒｐｍでインキュベートされた。ディープウェルプレートは、１０分間、３２００ｒｐｍで遠心分離され、結果として得られたペレットは、２００μｌの氷冷ＴＥＳバッファー、その後２００μｌの氷冷１：５ＴＥＳバッファーに再懸濁された。氷上での３０分間のインキュベーション後、遠心分離は、結果として得られた上清に存在する可溶性ＶＮＡＲとともに繰り返された。発現は、イムノプレート（Ｎｕｎｃ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にコートされた１μｇ／ｍｌの抗原および検出抗体としてのａｎｔｉ−ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、標準結合ＥＬＩＳＡを介して評価された。可溶性発現モノクローナルは、９６ウェルベース細胞中和アッセイにおいて、特異的に標的に結合する能力およびレセプター、ＩＣＯＳに結合することから標的をブロックする能力の両方のために評価された。リガンド−レセプター中和アッセイは、以下のように行われた；ＣＨＯ細胞発現ヒトＩＣＯＳレセプターは、９６ウェル細胞培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）中のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋５％  ＦＢＳ培地で培養密度まで増殖された。ｈＩＣＯＳＬ−ｈＦｃ（４５０ｎｇ／ｍｌでの２０μｌ）は、１時間、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ中の４０μｌの抗ｈＩＣＯＳＬ−ＶＮＡＲドメインでプレインキュベートされ、その後、細胞に添加された。１６℃、１時間のインキュベーション後、細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％  ＦＢＳで３回優しく洗浄され、同じ培地中に１：１００００に希釈されたヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ（ＳＩＧＭＡ）と、さらに４０分間、１６℃でインキュベートされた。その後、細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ培地および一回はＰＢＳで再び３回洗浄され、ＴＭＢ基質で培養された。
【０２１６】
実施例２：ｈＩＣＯＳＬで免疫化されたテンジクザメからのファージディスプレイライブラリの構築
テンジクザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  ｃｉｒｒａｔｕｍ）は、完全フロイントアジュバント中の２５０μｇの総タンパク質量により皮下で免疫化され、ＰＢＳ中の２５０μｇの総タンパク質量の３ヶ月ごとに静脈内ブーストがされた。ヒトＩＣＯＳＬへ応答する血清力価は、抗テンジクザメＩｇＮＡＲモノクローナル抗体、ＧＡ８を用いて分析された。検出された応答は、図１に示す。末梢血リンパ球は、ブリード４から単離され、全ＲＮＡは、ＳＩＧＭＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｇｒａｄｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉプロトコルに従って精製された。ｃＤＮＡは、製造者の指示（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）に従って合成され、ＶＮＡＲ  ＤＮＡは、下記のテンジクザメ特異的プライマーの組み合わせを用いて製造者のプロトコルに従って増幅された（ＮＥＢ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）：
ＦＷ１  ５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＧ−３’、ＦＷ４ｒ１  ５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴＣ−３’またはＦＷ４ｒ２  ５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＴＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＣＴＣ−３’のいずれかとの組み合わせ。
【０２１７】
増幅されたＰＣＲ生成物は、ＳｆｉＩで一晩、消化され、ＳｆｉＩで消化されたファージミドディスプレイベクターにクローン化された。結合されたサンプルは、製造者のプロトコルに従ってエレクトロコンピーテントＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換された。ライブラリサイズの推定は、１×１０８クローンであった。ライブラリＱＣは、ベクター特異的なプライマー１０８２（５’−ＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧ−３’）および１０５９（５’−ＧＧＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡＣＣＧＡＴＴＧＡＧ−３’）でのＰＣＲによりライブラリモノクローナルで行われた。
【０２１８】
ライブラリモノクローナルは、２時間、３７℃、２８５ｒｐｍにより、８００μｌの２ｘＴＹ、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンで増殖された。培養物は、３０分間、３７℃で１０９Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）を感染させ、その後、３７℃、１５ｒｐｍで振とうしながら１時間インキュベートした。培養物は、１０分間、３２００ｒｐｍで遠心分離された。ペレットは、２ｘＴＹ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンで再懸濁され、一晩、２５℃、２８０ｒｐｍでインキュベートされた。プレートは、２０分間、３２００ｒｐｍで遠心分離され、６００μｌの上清を１５０μｌの氷冷２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌに移し、氷上で３０分間、インキュベートされた。ファージは、２０分間、３２００ｒｐｍで遠心分離によって収集され、ペレットは、２００μｌの４％（ｗ／ｖ）ＭＰＢＳに再懸濁された。
【０２１９】
実施例３：ポジティブ抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲヒットのための免疫化ライブラリのスクリーニング
プレコートビーズ選択は、ビオチン化ｈＩＣＯＳＬを用いて行われ、同様の方法が実施例１に記載の合成ライブラリスクリーニングのために用いられた。ポジティブファージヒットは、実施例１において合成ライブラリスクリーニングのために記載されたペリプラズム発現タンパク質として結合および中和のために評価された。図２は、セルベースアッセイにおけるＩＣＯＳＬおよびＩＣＯＳのブロッキングを示すポジティブヒットを例示する。影付きの楕円形で強調されたクローンは、次へ進み、配列決定された。
【０２２０】
実施例４：ｈＩＣＯＳＬに対する合成ライブラリおよび免疫ライブラリ由来のＶＮＡＲヒットのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合および選択性
ポジティブな結合および中和ユニークドメインは、さらなる分析のために、以下のようにＦｃフォーマットに変換された：選択されたポジティブな単量体のＶＮＡＲドメインは、制限部位およびＨＥＫ２９３懸濁培養におけるＰＥＩを介する一過性発現後、発現したタンパク質のタンパク質Ａ親和性精製を促進したプロクプライエタリＦｃ哺乳類発現ベクターをクローニングするために適合性のあるフランキング配列を導入するプライマーでＰＣＲ増幅された。ＶＮＡＲ  Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルは、一般的に、無結成培地を用いて、リットル当たり５０〜７０ｍｇの範囲であった。基本的に、発現後の細胞デブリは、遠心分離および０．２μｍろ過により条件培地から除かれ、その後、上記で詳述したアフィニティークロマトグラフィーにより、タンパク質は、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  ２６／６０サイズ排除カラムを通過させることにより最後の精製工程にかけられた。ＳＥＣからの溶出したピークは、Ａｍｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて濃縮され、タンパク質濃度は、ＵＶ分光法によって決定された。生成されたＦｃタンパク質は、次に、図３に示す細胞表面発現ｈＩＣＯＳＬへの結合のために評価された。
【０２２１】
抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの選択性は、以下のように実施されたＦＣＡＳアッセイを用いて評価された：親の、ｍＩＣＯＳＬおよびｈＩＣＯＳＬリガンド発現ＣＨＯ細胞は、ＰＢＳで洗浄され、３７℃、１０〜１５分間、ＰＢＳおよび５％ＥＤＴＡの添加によってフラスコから除かれた。細胞は、フラスコの表面に対して上下へのピペッティングにより単分散され、１２００ｒｐｍでスピンダウンされ、５％ＦＣＳをプラスしたＤＭＥＭに再懸濁された。細胞は、０．５〜１×１０６の密度／ウェルで、９６ウェルＵ底プレートに等分された。細胞は、３０分間、１６℃で、ＨＥＫ２９３  ＶＮＡＲ−ｈＦｃ発現タンパク質を含む１００μｌ組織培養上清とインキュベートされ、その後、２％ＦＣＳをプラスしたＰＢＳで３回洗浄された。細胞は、その後、３０分間、１６℃で、１μｇ／ｍｌのａｎｔｉ−ｈＦｃ−ｂｉｏｔｉｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１００μｌでインキュベートされた。２％ＦＣＳをプラスしたＰＢＳで３回洗浄した後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＡＰＣ  （ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、３０分間、１６℃で１μｇ／ｍｌ添加された。２％ＦＣＳをプラスしたＰＢＳで１回洗浄した後、細胞は、４００μｌの２％ＦＣＳをプラスしたＰＢＳに再懸濁され、ＦＡＣＳ−Ｃａｎｔｏ−２での分析のためにＦＡＣＳチューブに移された。図４ａは、合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインのＦＡＣＳ分析を示し、図４ｂは、免疫ライブラリ由来のドメインのＦＡＣＳ分析を示す。データを合わせると、左への読み出しにおけるシフトによって示されるヒトＩＣＯＳＬ発現ＣＨＯ細胞への結合が明らかであることを示す。
【０２２２】
合成ライブラリ由来の抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの選択性はまた、図５で例示されるように、複数の無関係なタンパク質に対してＥＬＩＳＡを結合することによって、明確に示される。すべてのポジティブな抗ｈＩＣＯＳＬクローンの結合は、左側の暗い影によって視覚化される。他に含まれる標的；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ミルクリン酸生理食塩水（ＭＰＢＳ）、サイログロブリン（ＴＧ）、ニワトリ卵黄リゾチーム（ＨＥＬ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への非結合は、検出可能である。ＨＳＡに対するポジティブコントロールが含まれ、ポジティブな結合を示す暗い領域として明確に示すことができる。
【０２２３】
ヒットの親和性測定は、単量体およびＦｃフォーマット両方のポジティブリードで実施された（図６）：すべてのＢＩＡｃｏｒｅ分析は、Ｔ−１００バイオセンサー、ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５  ｃｈｉｐｓ、アミンカップリングキット、ｐＨ４、４．５、５．０および５．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム固定化バッファー、１０Ｘ  ＨＢＳ−Ｐランニングバッファーならびに５０ｍＭのＮａＯＨ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行われた。アッセイ条件は、物質移動、結合活性および再結合のイベントを最小限にするために設定された。標的化リガンド固定化プログラム（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）は、それぞれｐＨ４のフローセル（Ｆｃ）２および３での精製されたｈＩＣＯＳＬ−Ｆｃ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびｈＩＣＯＳＬモノマーの約１０００応答単位（ＲＵ）を固定化するためにセットされた。精製されたＶＮＡＲタンパク質は、最終濃度の範囲（グローバルフィット分析を用いた反応速度定数の計算のために６００〜３７．５ｍＭから開始する２倍希釈）となるようにＨＢＳ−Ｐランニングバッファーに溶出された。各濃度は、５ｍＭのＮａＯＨでの５秒間再生パルスに続き、３分間、３０ｍｌ／分の速い流速で注入され、５分間解離された。各濃度のためのリファレンス減算（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）センサーグラムは、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア（１．１．１）を用いて分析された。
【０２２４】
実施例５：ｈＩＣＯＳＬに対するヒットのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能的検証
抗ｈＩＣＯＳＬ−Ｆｃヒットのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性は、２つのセルベースアッセイにより測定された。第１は、実施例１に記載のリガンド−レセプター中和アッセイであった。合成および免疫ライブラリ両方からの精製された抗ｈＩＣＯＳＬ−Ｆｃ  ＶＮＡＲドメインは、中和アッセイにて滴定され、ＩＣＯＳＬ−ＩＣＯＳ相互作用を特異的にブロックする能力を示した（図７ＡおよびＢ）。実施された第２のセルベース機能性アッセイは、健常なドナーから単離された初代ヒトＴ細胞を用いるＴ細胞増殖アッセイであった。その方法は、簡単には以下のとおりである：最初のプレートコートのために、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌの抗ｈｕＣＤ３クローンＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ．  ＃１６−５８８９ａＣＤ３）と１０μｇ抗ｈＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ．  ＃１０９−００６−０９８）とを、合計１００μｌ／ウェルとなるように加えた。４℃で一晩放置し、その後溶液をウェルから除き、ウェルをＰＢＳで２回洗浄する。第２のコーティングのために、ＰＢＳ中の４μｇ／ｍｌのｈＢ７−２．Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ．  ＃１４１−Ｂ２−１００）と５００ｎｇのｈＩＣＯＳＬ．Ｉｇ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｃａｔ．＃１６５−Ｂ７−１００）とを１００μｌ／ウェルとなるように加える。３時間、室温で放置し、その後、ＰＢＳで２回洗浄する。アッセイプレートのすべてのウェルに５０μｌ培地を加える。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように溶出させ、試験抗体は、所望の最終濃度の３倍となるように溶出させた。各ウェルの５０μｌ培地に対し、５０μｌの抗体溶液および５０μｌの細胞懸濁液は、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルの最終濃度で、１５０μｌ／ウェルの最終的な量となるように添加された。サンプルは、３日間放置され、その後、３日目に６〜８時間、１μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンでパルスされ、数が計測された。図８は、２つの独立したドナーから単離されたＴ細胞を用いて合成ライブラリからの抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの計算されたポテンシー（ＩＣ５０値）を示す。
【０２２５】
実施例５：分子融合タンパク質としての抗ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメインの再フォーマット
合成ライブラリ、ＥＬＳＳ１から単離された抗ＩＣＯＳＬドメインは、（ＧＧＧＳ）４アミノ酸ストレッチと結合した三量体の融合生成物を生成するためにタンデムにクローニングすることができ、発現することができ、精製することができ、ＥＬＩＳＡによる３つの個別標的すべてへ結合することを示すことができる。図１１は、抗ヒトＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメイン、２Ｄ４、および抗ＨＳＡ特異的ＶＮＡＲドメイン、Ｅ６（ＷＯ２０１３／１６７８８３の記載のように調製した）の両方へ融合した、抗マウスＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメイン  ＣＣ３（２０１３年４月２３日に出願されたＵＳ６１／８１５，０４３からの優先権を主張する２０１４年４月２３日に出願された同時係属中の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８２５１にて記載されている（参照により引用される）方法に従って調製された）を用いる３量体構築物の２つの異なる配向性を例示する。３つのＶＮＡＲドメインのすべては、単一の分子融合タンパク質として結合した場合、標的へ結合する能力を保持している。
１．式（Ｉ）により表されるアミノ酸配列
【化４】
0006591964.tif 000005
Ａ−は、配列番号１、配列番号４もしくは配列番号７であり、
Ｘは、６もしくは７を有するアミノ酸残基のＣＤＲ１領域であり、
Ｂ−は、配列番号２、配列番号５もしくは配列番号８であり、
Ｙは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１のアミノ酸残基を有するＣＤＲ３領域であり、
Ｃ−は、配列番号３、配列番号６もしくは配列番号９であり、
またはそれと少なくとも５０％相同な配列を含むＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子であって、
この際、
配列番号１が、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴ、ＴＲＶＤＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＶＴＧＡであり、
配列番号２が、ＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＳＷＦＲＫＮＰＧＴＴＤＷＥＲＭＳＩＧＧＲＹＶＥＳＶＮＫＧＡＫＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号３が、ＤＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号４が、ＡＳＶＮＱＴＰＲＴＡＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＴＤＴであり、
配列番号５が、ＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＹＣＫＡまたはＴＹＷＹＲＫＮＰＧＳＳＮＱＥＲＩＳＩＳＧＲＹＶＥＳＶＮＫＲＴＭＳＦＳＬＲＩＫＤＬＴＶＡＤＳＡＴＹＩＣＲＡであり、
配列番号６が、ＹＧＡＧＴＶＬＴＶＮであり、
配列番号７が、ＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＰまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＡまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＤＧまたはＡＲＶＤＱＴＰＲＳＶＴＫＥＴＧＥＳＬＴＩＮＣＶＬＲＥＳであり、
配列番号８が、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＡまたはＴＣＷＳＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＬ、ＴＣＷＴＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＡＬ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＶ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＮＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨ、ＴＣＷＹＲＫＫＳＧＳＴＮＥＥＳＩＳＫＧＧＲＹＶＥＴＶＮＳＧＳＫＳＦＳＬＲＩＳＤＬＴＶＥＤＧＧＴＹＲＣＧＨであり、
配列番号９が、ＣＧＧＧＴＶＶＴＶＮ、ＣＧＧＧＴＡＶＴＶＮ、ＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮ、またはＣＧＤＧＴＡＶＴＶＮである、ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
２．前記ＣＤＲ３領域が、図１０Ａ、図１０Ｂまたは図１０Ｃで示されるＣＤＲ３領域である、上記１に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
３．前記ＣＤＲ１領域が、図１０Ａまたは図１０Ｂで示されるＣＤＲ１領域である、上記１または２に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
４．前記抗原特異的抗原結合分子が、図９Ａまたは図９Ｃのいずれかで示される配列を有する、上記１から３のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
５．ヒト化された、上記１〜４のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子。
６．上記１〜５のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子を含む、融合タンパク質。
７．前記ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子が、生物学的に活性なタンパク質へ融合している、上記６に記載の融合タンパク質。
８．上記１〜５のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子、または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
９．上記８に記載の核酸を含む、核酸構築物。
１０．上記９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
１１．上記１〜５のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質の製造方法であって、
宿主細胞で前記分子をコードする核酸配列を発現する工程を有する、方法。
１２．上記１〜５のいずれか１項に記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質を含む、薬剤組成物。
１３．薬剤に使用される、上記１〜５のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質。
１４．疾患の治療を必要とする患者への前記治療のための薬剤の製造における上記１〜５のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質の使用。
１５．治療上有効な量の上記１２に記載の薬剤組成物を患者に投与することを含む、治療を必要とする患者における疾患の治療方法。
１６．上記１〜５のいずれか一つに記載の検出可能な標識ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質をサンプルに添加し、および前記分子の標的分析物への結合を検出することを含む、前記サンプル中の前記標的分析物の存在をアッセイする方法。
１７．上記１〜５のいずれか一つに記載の検出可能な標識ＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質を被験者に投与することを含む、前記被験者の疾患の部位を画像化する方法。
１８．上記１〜５のいずれか一つに記載のＩＣＯＳＬ特異的抗原結合分子または上記６もしくは７に記載の融合タンパク質を被験者に投与することを含む、前記被験者の疾患または医学的状態を診断する方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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