(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であって、各Ｆｃポリペプチドは修飾された下ヒンジ領域を含み、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、位置Ｌ２３４及び位置Ｌ２３５におけるアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ほぼ生理的なｐＨ条件にて第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における正味の正の電荷を増やし、且つ前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｋ及びＬ２３５Ｒから選択され、
（ｂ）第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、位置Ｌ２３４におけるアミノ酸置換及び位置Ｌ２３５におけるアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は第１のＦｃポリペプチドの対応するアミノ酸置換とは異なり、且つ前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｋ及びＬ２３５Ｒから選択され、且つ
（ｃ）前記ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物に比べてＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して低下した結合を示し、
アミノ酸の番号付けがＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるものであり、且つ
ＩｇＧＦｃ構築物がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物である、
ヘテロ多量体。
【請求項２】
第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸置換が第２のＦｃポリペプチドの負の電荷の総数を増やす又は電荷中性である、請求項１に記載のヘテロ多量体。
【請求項３】
ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物に比べてＣ１ｑタンパク質に対して低下した結合をさらに示す、請求項１又は２に記載のヘテロ多量体。
【請求項４】
ＩｇＧＦｃ構築物が、ＦｃγＲＩＩａＨに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対して６μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対して６μＭを超えるＫＤ、及びＦｃγＲＩａに対して６．５ｎＭを超えるＫＤを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項５】
ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物に比べてエフェクター機能の低下を媒介する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項６】
エフェクター機能が、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、又はそれらの組み合わせである、請求項５に記載のヘテロ多量体。
【請求項７】
第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がさらに、独立してＥ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｒ及びＥ２３３Ｄから選択される位置Ｅ２３３でのアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項８】
第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、もしくはＥ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、又はＥ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む、請求項１に記載のヘテロ多量体。
【請求項９】
第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドが、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９Ｋ、Ｋ３２２Ａ、Ｋ３２２Ｅ、Ｐ３２９Ｗ、及びＥ３３３Ｋから選択される１つ又は複数のアミノ酸置換をさらに含む、請求項８に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０】
（ａ）第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む；又は
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含む；又は  
（ｃ）第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含む；又は
（ｄ）第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含む；又は
（ｅ）第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域がアミノ酸置換Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む、又は
（ｆ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含む；又は
（ｇ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓを含む；又は
（ｈ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋを含む；又は
（ｉ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａを含む；又は
（ｊ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗを含む；又は
（ｋ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含む；又は
（ｌ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ置換飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む、
請求項１に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１】
第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であって、
（ａ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２６９Ｑ／Ｄ２７０Ｎを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２７０Ｒを含む；又は
（ｂ）第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸置換Ｌ２３５Ｋ／Ａ３２７Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドが下ヒンジ領域にてアミノ酸置換を含まず；
ここでアミノ酸の番号付けはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるものであり、
且つ、前記ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物に比べてＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して低下した結合を示し、且つ
ＩｇＧＦｃ構築物がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物である、
ヘテロ多量体。
【請求項１２】
ＩｇＧＦｃ構築物が非グリコシル化又は脱グリコシル化されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３】
ＩｇＧＦｃ構築物が、ホモ二量体Ｆｃ領域に比べてヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸置換を含む変異体ＣＨ３領域を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１４】
（ａ）第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む；又は  
（ｂ）第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含む；又は
（ｃ）第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸置換Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸置換Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む；又は
（ｄ）第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む；又は
（ｅ）第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含む；又は
（ｆ）第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸置換Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含む、
請求項１３に記載のヘテロ多量体。
【請求項１５】
ＩｇＧＦｃ構築物に融合された少なくとも１つの抗原結合構築物をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６】
少なくとも１つの抗原結合構築物が、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、又は抗原を結合することが可能であるタンパク質若しくはその断片から選択される、請求項１５に記載のヘテロ多量体。
【請求項１７】
抗原結合構築物を１つ又は２つ含む、請求項１５又は１６に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８】
ＩｇＧＦｃ構築物がヒトＩｇＧ１Ｆｃ構築物である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９】
ＩｇＧＦｃ構築物が１又は複数の毒性薬物分子に連結されているか、或いは、１又は複数の非相同性ポリペプチドに連結されている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２０】
１又は複数の非相同性ポリペプチドが酵素及び毒素から選択される、請求項１９に記載のヘテロ多量体。
【請求項２１】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体の第１のＦｃポリペプチド、第２のＦｃポリペプチド、又は第１及び第２のＦｃポリペプチドの両方をコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体の調製方法であって、（ａ）請求項１〜１８のいずれか１項に記載のヘテロ多量体の第１及び第２のＦｃポリペプチドをコードする１又は複数の核酸を含む宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）宿主細胞の培養物からヘテロ多量体を回収する工程とを含む、方法。
【請求項２４】
電荷に基づく精製法を用いてヘテロ多量体を単離する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
電荷に基づく精製法がイオン交換クロマトグラフィである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
疾患の治療のための薬剤の調製における請求項１〜２０のいずれか１項に記載のヘテロ多量体の使用。
【請求項２８】
第１及び第２のＦｃポリペプチドの下ヒンジ領域を修飾する工程を含む、第１及び第２のＦｃポリペプチドを含むＩｇＧＦｃ構築物のエフェクター機能を低下させる方法であって、
第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、位置Ｌ２３４及び位置Ｌ２３５におけるアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換の少なくとも１つが、ほぼ生理的なｐＨ条件にて第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における正味の正の電荷を増やし、且つ前記アミノ酸置換がＬ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｋ及びＬ２３５Ｒから選択され、
第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、位置Ｌ２３４におけるアミノ酸置換及び位置Ｌ２３５におけるアミノ酸置換を含み、前記アミノ酸置換は第１のＦｃポリペプチドの対応するアミノ酸置換とは異なり、且つ前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ｋ及びＬ２３５Ｒから選択され、且つ
前記ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物に比べてＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して低下した結合を示し、
アミノ酸の番号付けがＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるものであり、且つ
ＩｇＧＦｃ構築物がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４Ｆｃ構築物である、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年５月３１日に出願されたＵＳ６１／８２９，９７３の利益を主張し、該出願はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、治療用抗体の設計の分野に関するものであり、具体的には、Ｆｃ領域が媒介するエフェクター機能をサイレント化する（silence）ために修飾されているヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
多数の疾患適応の治療のために治療用抗体が開発されている。これら幾つかの場合では、治療用抗体の有効性は少なくとも部分的に、１以上のエフェクター機能を媒介する抗体のＦｃ領域の能力から生じる。これらのエフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）を含む、抗体や抗体／抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用の結果生じ、種々の応答を刺激する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）（非特許文献１）；Ｗａｒｄ及びＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５）（非特許文献２）；並びにＲａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）（非特許文献３）に概説されている）。幾つかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域を結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）が媒介する。ＦｃＲは免疫グロブリンのアイソタイプについてのその特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれ、ＩｇＥ抗体についてはＦｃεＲと呼ばれ、ＩｇＡ抗体についてはＦｃαＲと呼ばれる等である。抗体のＦｃ領域はまた、ＦｃＲｎへの結合のような機能も媒介し、それは、抗体結合とは独立して作動し、循環における持続性を付与し、トランスサイトーシスにより細胞バリアを横切って移送される能力を付与する（Ｗａｒｄ及びＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２：７７−９４（１９９５）（非特許文献２））。
【０００４】
しかしながら、特定の疾患適応では、抗体のＦｃ領域が媒介するエフェクター機能が望ましくない有害効果を引き起こし得るため、低下した又はサイレント化したエフェクター機能を持つ抗体を操作する試みが為されている。
【０００５】
最近の出版物には、低下した又はサイレント化したエフェクター活性を持つ抗体を操作するのに使用されている戦略が記載されている（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０：６８５−６９１（非特許文献４）並びにＳｔｒｏｈｌ，ＷＲ及びＳｔｒｏｈｌ  ＬＭ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ"Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ．２２５−２４９（非特許文献５）を参照のこと）。これらの戦略には、グリコシル化の修飾を介したエフェクター機能の低下、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４足場の使用、又は抗体のＦｃ領域のヒンジ領域若しくはＣＨ２領域における変異の導入が挙げられる。
【０００６】
加えて、ＵＳ２０１１／０２１２０８７（Ｓｔｒｏｈｌ）（特許文献１）は、ＦｃγＲ（Ｆｃガンマ受容体）への結合及び得られる活性を低減し、種々の疾患及び障害の治療に使用することができるＦｃ領域にて変異を持つ抗体及び他のＦｃ含有分子を記載している。
【０００７】
ＷＯ２００６／１０５３３８（Ｘｅｎｃｏｒ）（特許文献２）は、最適化された特性を持つＦｃ変異体、その生成方法、最適化された特性を持つＦｃ変異体を含むＦｃポリペプチド、及び最適化された特性を持つＦｃ変異体の使用方法を記載している。
【０００８】
ＵＳ２０１２／０２２５０５８（Ｘｅｎｃｏｒ）（特許文献３）は、１以上のＦｃγＲへの結合を変化させたＦｃ変異体であって、親ＩｇＧＦｃ構築物のＦｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸の挿入を含む、親ＩｇＧＦｃ構築物のＦｃ変異体を記載している。
【０００９】
ＵＳ２０１２／０２５１５３１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）（特許文献４）は、Ｆｃ変異体を含む操作したポリペプチド及びその使用、さらに具体的には低下したエフェクター機能を示すＦｃ変異体を記載している。これらの変異体は、抗体によって引き出されるエフェクター機能を低減することが望ましい抗体によって治療され得る疾患を患う患者にとって利益をもたらすとしても記載されている。
【００１０】
Ｓｔｒｏｐら（（２０１２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９）（非特許文献６）は、ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ２のコアヒンジ領域及びＣＨ３領域に荷電変異を導入して二重特異性抗体の形成を改善することを記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ２０１１／０２１２０８７
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０５３３８
【特許文献３】ＵＳ２０１２／０２２５０５８
【特許文献４】ＵＳ２０１２／０２５１５３１
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）
【非特許文献２】Ｗａｒｄ及びＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５）
【非特許文献３】Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）
【非特許文献４】Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０：６８５−６９１
【非特許文献５】Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ及びＳｔｒｏｈｌ  ＬＭ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ"Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ．２２５−２４９
【非特許文献６】Ｓｔｒｏｐら（（２０１２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９）
【発明の概要】
【００１３】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、各Ｆｃポリペプチドは修飾された下ヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。
【００１４】
特定の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は修飾された下ヒンジ領域にて正味の正の電荷を増やし、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は負の電荷の総数を増やし、若しくは野生型のヒンジ領域に比べて電荷中性であり；又は第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は修飾された下ヒンジ領域にて正味の負の電荷を増やし、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は正の電荷の総数を増やす。
【００１５】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾された下ヒンジ領域は２以上のアミノ酸修飾を含む。
【００１６】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、ほぼ生理的なｐＨ条件で第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域にて正味電荷を増やす少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。
【００１７】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、正味電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正味の正の電荷の増加である。一部の実施形態では、正味の正の電荷の増加は、第１のＦｃポリペプチドにおける正に荷電したアミノ酸の総数の増加又は第１のＦｃポリペプチドにおける負に荷電したアミノ酸の総数の低下である。特定の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は、第１のＦｃポリペプチドにおける正に荷電したアミノ酸の総数を増やし、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は、第２のＦｃポリペプチドにおける負の電荷の総数を増やす、又は電荷中性である。
【００１８】
実施形態では、正味電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正味の負の電荷の増加である。特定の実施形態では、正味の負の電荷の増加は、第１のＦｃポリペプチドにおける負に荷電したアミノ酸の総数の増加又は正に荷電したアミノ酸の総数の低下である。特定の実施形態では、正味の負の電荷が負に荷電したアミノ酸の総数の増加である場合、第２のＦｃポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸修飾は正の電荷の総数を増やす。
【００１９】
一部の実施形態では、提供されるのは本明細書に記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第２のＦｃポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸修飾と組み合わせた第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は、ヒンジ領域の修飾を含まない対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＩｇＧＦｃ構築物の全体の正の電荷を増やす。
【００２０】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書に記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は２以上のアミノ酸修飾を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書に記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は２以上のアミノ酸修飾を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書に記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾は下ヒンジ領域にある。
【００２３】
提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、ＦｃγＲＩＩａＨに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対して６μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対して６μＭを超えるＫＤ、及びＦｃγＲＩａに対して６．５ｎＭを超えるＫＤを有する。
【００２４】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、アミノ酸修飾を含まない対応するＩｇＧＦｃ構築物に比べて低下したエフェクター機能を媒介する。一部の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物は、ＥＣ５０によって測定して、７０％未満、５０％未満、３０％未満、又は１０％未満のエフェクター機能を媒介する。一部の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物は、細胞の最大溶解によって測定して、１０％未満、５％未満、２％未満、又は１％未満のエフェクター機能を媒介する。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、又はそれらの組み合わせから選択される。
【００２５】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４及び／又はＬ２３５でのアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、及びＬ２３５Ａから選択されるアミノ酸修飾を含む。さらなる実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方は、Ｅ２３３にさらにアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、Ｅ２３３における修飾は、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｋ、及びＥ２３３Ｒから選択される。
【００２６】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチド双方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４及び／又はＬ２３５でのアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、Ｌ２３４及び／又はＬ２３５におけるアミノ酸修飾は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、及びＬ２３５Ｄから選択される。さらなる実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はさらにＥ２３３にアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、アミノ酸修飾のいずれか又は双方は独立して、Ｅ２３３Ａ又はＥ２３３Ｄである。
【００２７】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、又はＥ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含む。
【００２８】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１又は第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、又はＥ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【００２９】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；又は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み；又は第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋ含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む。
【００３１】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２６９Ｑ／Ｄ２７０Ｎを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２７０Ｒを含み；又は第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３５Ｋ／Ａ３２７Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはヒンジ領域若しくは下ヒンジ領域では修飾を含まず；該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。
【００３２】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は非グリコシル化される。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は脱グリコシル化される。
【００３３】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始は６８℃以上である。
【００３４】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、ヒンジ領域の修飾を含まない対応する親ＣＨ２領域の融解温度を超える又はそれと等しい融解温度を持つＣＨ２領域を有する。
【００３５】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、親ＣＨ２領域の融解温度よりも約１〜２℃高い融解温度を持つＣＨ２領域を有する。
【００３６】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、親ＣＨ２領域の融解温度よりも約２〜３℃高い融解温度を持つＣＨ２領域を有する。
【００３７】
実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、ヘテロ多量体が発現される際にホモ二量体Ｆｃ領域に比べてヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ３領域を含む。一部の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含み、他方のＦｃポリペプチドはＣＨ３のアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む。一部の実施形態では、第１及び／又は第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。さらなる実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ多量体は、電荷に基づく精製方法を用いてホモ二量体Ｆｃ領域を含む発現産物から分離される。
【００３８】
一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ヘテロ多量体はさらに、ＩｇＧＦｃ構築物に融合させた少なくとも１つの抗原結合構築物を含む。
【００３９】
一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、少なくとも１つの抗原結合構築物は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、又は抗原を結合することが可能なタンパク質若しくはその断片から選択される。一部の実施形態では、抗原結合構築物を１つ含むヘテロ多量体が本明細書で記載される。一実施形態では、抗原結合構築物を２つ含むヘテロ多量体が本明細書で記載される。
【００４０】
一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は１以上の毒性薬物分子に連結される。
【００４１】
一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は１以上の非相同性のポリペプチドに連結される。一部の実施形態では、１以上の非相同性のポリペプチドは酵素及び毒素から選択される。
【００４２】
実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧはＩｇＧ１である。
【００４３】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体の第１又は第２のＦｃポリペプチドをコードする核酸である。提供されるのは、本明細書で記載される核酸を含む宿主細胞である。提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体を調製する方法であり、該方法は、（ａ）本明細書で記載される宿主細胞を培養する工程と（ｂ）宿主細胞の培養物からヘテロ多量体を回収する工程とを含む。特定の実施形態では、ヘテロ多量体を調製する方法はさらに電荷に基づいた精製方法を用いてヘテロ多量体を単離する工程を含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体を調製する方法が本明細書で記載され、ここで、電荷に基づいた精製方法はイオン交換クロマトグラフィである。
【００４４】
提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体と薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物である。提供されるのは、それを必要とする患者に有効量の本明細書で記載される薬学的組成物を提供することを含む、疾患を治療する方法である。一部の実施形態では、疾患の治療のための薬剤の調製におけるヘテロ多量体の使用が本明細書で記載される。
【００４５】
一部の実施形態では、それを必要とする患者における疾患の治療のためのヘテロ多量体の使用が本明細書で記載される。
【００４６】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドの下ヒンジ領域を修飾することを含む、抗体構築物のエフェクター機能を低下させる方法であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。一部の実施形態では、修飾はＦｃ受容体に対する無視できる結合を生じる。
[本発明1001]
第1及び第2のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であって、各Ｆｃポリペプチドは修飾された下ヒンジ領域を含み、
（ａ）第1のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、
（ｂ）第2のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、第1のＦｃポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、且つ
（ｃ）該ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ1ｑタンパク質とに対して低下した結合を示す、
ヘテロ多量体。
[本発明1002]
（ａ）第1のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸修飾が、修飾された下ヒンジ領域における正味の正の電荷を増やし、且つ第2のＦｃポリペプチドにおける少なくとも1つのアミノ酸修飾が、野生型のヒンジ領域に比べて負の電荷の総数を増やす若しくは電荷中性であるか、又は
（ｂ）第1のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸修飾が、修飾された下ヒンジ領域における正味の負の電荷を増やし、且つ第2のＦｃポリペプチドにおける少なくとも1つのアミノ酸修飾が、正の電荷の総数を増やす、
本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1003]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾された下ヒンジ領域が2以上のアミノ酸修飾を含む、本発明1001又は1002のヘテロ多量体。
[本発明1004]
第1及び第2のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であって、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、
（ａ）第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域が、ほぼ生理的なｐＨ条件にて第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における正味電荷を増やす少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、
（ｂ）第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域が、第1のＦｃポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、且つ
（ｃ）前記ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ1ｑタンパク質とに対して低下した結合を示す、
ヘテロ多量体。
[本発明1005]
正味電荷の前記増加が第1のＦｃポリペプチドにおける正味の正の電荷の増加である、本発明1004のヘテロ多量体。
[本発明1006]
正味の正の電荷の前記増加が、第1のＦｃポリペプチドにおける正に荷電したアミノ酸の総数の増加であるか、又は第1のＦｃポリペプチドにおける負に荷電したアミノ酸の総数の低下である、本発明1005のヘテロ多量体。
[本発明1007]
第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸修飾が第1のＦｃポリペプチドにおける正に荷電したアミノ酸の総数を増やし、且つ第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸修飾が第2のＦｃポリペプチドの負の電荷の総数を増やす又は電荷中性である、本発明1004のヘテロ多量体。
[本発明1008]
正味電荷の前記増加が第1のＦｃポリペプチドにおける正味の負の電荷の増加である、本発明1004のヘテロ多量体。
[本発明1009]
正味の負の電荷の前記増加が、第1のＦｃポリペプチドにおける負に荷電したアミノ酸の総数の増加又は正に荷電したアミノ酸の総数の低下である、本発明1008のヘテロ多量体。
[本発明1010]
正味の負の電荷が、負に荷電したアミノ酸の総数の増加である場合、第2のＦｃポリペプチドにおける少なくとも1つのアミノ酸修飾が正の電荷の総数を増やす、本発明1008又は1009のヘテロ多量体。
[本発明1011]
第2のＦｃポリペプチドにおける少なくとも1つのアミノ酸修飾と組み合わせた第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸修飾が、親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＩｇＧＦｃ構築物の正の電荷全体を増やす、本発明1004〜1010のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1012]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域が2以上のアミノ酸修飾を含む、本発明1004〜1011のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1013]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域が2以上のアミノ酸修飾を含む、本発明1004〜1012のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1014]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における少なくとも1つのアミノ酸修飾が下ヒンジ領域にある、本発明1004〜1013のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1015]
ＩｇＧＦｃ構築物が、ＦｃγＲＩＩａＨに対して10μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対して10μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対して10μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対して6μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対して6μＭを超えるＫＤ、及びＦｃγＲＩａに対して6．5ｎＭを超えるＫＤを有する、本発明1001〜1014のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1016]
ＩｇＧＦｃ構築物が、前記アミノ酸修飾を含まない対応ＩｇＧＦｃ構築物に比べてエフェクター機能の低下を媒介する、本発明1001〜1015のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1017]
ＩｇＧＦｃ構築物が、ＥＣ50で測定して、エフェクター機能の70％未満、50％未満、30％未満、又は10％未満を媒介する、本発明1016のヘテロ多量体。
[本発明1018]
ＩｇＧＦｃ構築物が、細胞の最大溶解で測定して、エフェクター機能の10％未満、5％未満、2％未満、又は1％未満を媒介する、本発明1016のヘテロ多量体。
[本発明1019]
エフェクター機能が、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、又はそれらの組み合わせから選択される、本発明1016〜1018のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1020]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域がＬ234及び／又はＬ235でのアミノ酸修飾を含む、本発明1001〜1019のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1021]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域が、Ｌ234Ｋ、Ｌ234Ｒ、Ｌ234Ａ、Ｌ235Ｋ、Ｌ235Ｒ、及びＬ235Ａから選択されるアミノ酸修飾を含む、本発明1020のヘテロ多量体。
[本発明1022]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの一方がさらにＥ233でのアミノ酸修飾を含む、本発明1020又は1021のヘテロ多量体。
[本発明1023]
Ｅ233での前記修飾が、Ｅ233Ａ、Ｅ233Ｋ、及びＥ233Ｒから選択される、本発明1022のヘテロ多量体。
[本発明1024]
第1及び第2のＦｃポリペプチド双方の修飾されたヒンジ領域がＬ234及び／又はＬ235でのアミノ酸修飾を含む、本発明1001〜1023のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1025]
Ｌ234及び／又はＬ235での前記修飾が、Ｌ234Ａ、Ｌ234Ｋ、Ｌ234Ｒ、Ｌ234Ｄ、Ｌ234Ｅ、Ｌ235Ｋ、Ｌ235Ｒ、Ｌ235Ｅ、Ｌ235Ａ、及びＬ235Ｄから選択される、本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1026]
第1及び／又は第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がさらにＥ233でのアミノ酸修飾を含む、本発明1024又は1025の単離された抗体構築物。
[本発明1027]
アミノ酸修飾のいずれか又は双方が独立してＥ233Ａ又はＥ233Ｄである、本発明1026のヘテロ多量体。
[本発明1028]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域が、アミノ酸修飾Ｌ234Ｋ／Ｌ235Ｋ、Ｅ233Ａ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ、Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ、又はＥ233Ｋ／Ｌ234Ａ／Ｌ235Ｋを含む、本発明1001〜1027のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1029]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域が、アミノ酸修飾Ｌ234Ａ／Ｌ235Ａ、Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ、Ｅ233Ａ／Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ、又はＥ233Ａ／Ｌ234Ｋ／Ｌ235Ａを含む、本発明1001〜1028のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1030]
（ａ）第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｌ234Ｋ／Ｌ235Ｋを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｌ234Ａ／Ｌ235Ａを含む；
（ｂ）第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｌ234Ｋ／Ｌ235Ｋを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅを含む；
（ｃ）第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｅ233Ａ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｅ233Ａ／Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅを含む；
（ｄ）第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅを含む；又は
（ｅ）第1のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ａ／Ｌ235Ｋを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾Ｅ233Ａ／Ｌ234Ｋ／Ｌ235Ａを含む、
本発明1001〜1029のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1031]
（ａ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｅ233Ｋを含む；
（ｂ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ／Ｄ265Ｓを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｄ265Ｓを含む；
（ｃ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ／Ｅ269Ｋを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｅ269Ｋを含む；
（ｄ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ／Ｋ322Ａを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｋ322Ａを含む；
（ｅ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ／Ｐ329Ｗを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｐ329Ｗを含む；
（ｆ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ／Ｅ269Ｋ／Ｄ265Ｓ／Ｋ322Ａを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｅ269Ｋ／Ｄ265Ｓ／Ｋ322Ａを含む；又は
（ｇ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ234Ｄ／Ｌ235Ｅ／Ｅ269Ｋ／Ｄ265Ｓ／Ｋ322Ｅ／Ｅ333Ｋを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ233Ｋ／Ｌ234Ｒ／Ｌ235Ｒ／Ｅ269Ｋ／Ｄ265Ｓ／Ｋ322Ｅ／Ｅ333Ｋを含む、
本発明1001〜1029のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1032]
第1及び第2のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であって、
（ａ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ269Ｑ／Ｄ270Ｎを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｅ269Ｋ／Ｄ270Ｒを含む；又は
（ｂ）第1のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ235Ｋ／Ａ327Ｋを含み、且つ第2のＦｃポリペプチドがヒンジ領域又は下ヒンジ領域にてアミノ酸修飾を含まない；
且つ、前記ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ1ｑタンパク質とに対して低下した結合を示す、
ヘテロ多量体。
[本発明1033]
ＩｇＧＦｃ構築物が非グリコシル化されている、本発明1001〜1032のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1034]
ＩｇＧＦｃ構築物が脱グリコシル化されている、本発明1001〜1033のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1035]
サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始が68℃以上である、本発明1001〜1034のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1036]
ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＣＨ2領域の融解温度を超える又はそれに等しい融解温度を持つＣＨ2領域を有する、本発明1001〜1035のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1037]
ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＣＨ2領域の融解温度よりも約1〜2℃高い融解温度をもつＣＨ2領域を有する、本発明1001〜1035のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1038]
ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＣＨ2領域の融解温度よりも約2〜3℃高い融解温度をもつＣＨ2領域を有する、本発明1001〜1035のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1039]
ＩｇＧＦｃ構築物が、ヘテロ多量体が発現される際にホモ二量体Ｆｃ領域に比べてヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ3領域を含む、本発明1001〜1038のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1040]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ3のアミノ酸修飾Ｔ366Ｌ／Ｎ390Ｒ／Ｋ392Ｍ／Ｔ394Ｗを含み、且つ、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ3アミノ酸修飾Ｌ351Ｙ／Ｓ400Ｅ／Ｆ405Ａ／Ｙ407Ｖを含む、本発明1039のヘテロ多量体。
[本発明1041]
第1及び／又は第2のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｔ350Ｖを含む、本発明1040のヘテロ多量体。
[本発明1042]
ヘテロ二量体Ｆｃ領域を含むヘテロ多量体が、電荷に基づく精製法を用いてホモ二量体Ｆｃ領域を含む発現産物から分離される、本発明1039〜1041のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1043]
ＩｇＧＦｃ構築物に融合された少なくとも1つの抗原結合構築物をさらに含む、本発明1001〜1042のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1044]
少なくとも1つの抗原結合構築物が、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、又は抗原を結合することが可能であるタンパク質若しくはその断片から選択される、本発明1001〜1043のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1045]
抗原結合構築物を1つ含む、本発明1043又は1044のヘテロ多量体。
[本発明1046]
抗原結合構築物を2つ含む、本発明1043又は1044のヘテロ多量体。
[本発明1047]
ＩｇＧＦｃ構築物が1又は複数の毒性薬物分子に連結されている、本発明1001〜1046のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1048]
ＩｇＧＦｃ構築物が1又は複数の非相同性ポリペプチドに連結されている、本発明1001〜1046のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1049]
1又は複数の非相同性ポリペプチドが酵素及び毒素から選択される、本発明1048のヘテロ多量体。
[本発明1050]
ＩｇＧがＩｇＧ1である、本発明1001〜1049のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1051]
本発明1001〜1045のいずれかのヘテロ多量体の第1又は第2のＦｃポリペプチドをコードする核酸。
[本発明1052]
本発明1051の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1053]
本発明1001〜1050のいずれかのヘテロ多量体の調製方法であって、（ａ）本発明1052の宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）宿主細胞の培養物からヘテロ多量体を回収する工程とを含む、方法。
[本発明1054]
電荷に基づく精製法を用いてヘテロ多量体を単離する工程をさらに含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
電荷に基づく精製法がイオン交換クロマトグラフィである、本発明1054の方法。
[本発明1056]
本発明1001〜1050のいずれかのヘテロ多量体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
[本発明1057]
疾患の治療方法であって、それを必要とする患者に有効量の本発明1056の薬学的組成物を提供する工程を含む、方法。
[本発明1058]
疾患の治療のための薬剤の調製における本発明1001〜1050のいずれかのヘテロ多量体の使用。
[本発明1059]
疾患を治療するための、それを必要とする患者における治療的な量の本発明1001〜1050のいずれかのヘテロ多量体の使用。
[本発明1060]
第1及び第2のＦｃポリペプチドの下ヒンジ領域を修飾する工程を含む、抗体構築物のエフェクター機能を低下させる方法であって、
第1のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、
第2のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域が、第1のＦｃポリペプチドの少なくとも1つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、且つ、
前記ＩｇＧＦｃ構築物が、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべて又はＣ1ｑタンパク質に対して低下した結合を示す、
方法。
[本発明1061]
前記修飾がＦｃ受容体への無視できる結合を生じる、本発明1060の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
本発明のこれらの及び他の特徴は添付の図面を参照する以下の詳細な説明にてさらに明らかになるであろう。
【図１】ＦｃγＲの結合に関与するＦｃ領域の領域を示す図である。（Ａ）ＦｃγＲの結合（黒で示す）に関与するＦｃ（灰色で示す）のＣＨ２ドメインのループと下ヒンジを示す３ｂ／Ｆｃの結晶構造（ＰＤＢ：１Ｅ４Ｋ）。（Ｂ）ＣＨ２ドメインのトポロジー。鎖はＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６及びＳ７として示す；ループはＬ１、Ｌ２及びＬ３で示す。
【図２】野生型抗体（ＷＴ）と比べた典型的な非対称性抗体構築物のサーモグラムを示す図である。（図２Ａ）ＷＴ及びＡＡＣ２〜ＡＡＣ６についてのサーモグラムを示す。（図２Ｂ）ＷＴにおける２つの遷移の特定である。第１の遷移はＣＨ２ドメインの折り畳み構造のほどけ（アンフォールディング）に対応し、第２の遷移はＣＨ３＋Ｆａｂの折り畳み構造のほどけに対応する。（図２Ｃ）多数の試料の重ね合わせを示し、高い安定性を示す高いＴｍ値に変異体のＣＨ２遷移がどのようにシフトしたのかを示す。
【図３Ａ】典型的な非対称性抗体構築物を精製する場合に生じる成分のイオン交換クロマトグラフィによる分割を示す例となる結果を示す図である。
【図３Ｂ】例となる非対称性の変異体ＡＡＣ４を用いたｐＨ勾配（上のパネル）又は塩勾配（下のパネル）を用いた成分の分離を示す図である。
【図４】対照変異体（ｖ１０５１）及び本発明の典型的なヘテロ多量体（ＡＡＣ６）のＡＤＣＣを媒介する能力を示す図である。
【図５】ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）；トラスツズマブの重鎖のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）；トラスツズマブの軽鎖のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）；リツキシマブの重鎖のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）；リツキシマブの軽鎖のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を示す図である。
【図６】Ｄａｕｄｉ細胞におけるＡＤＣＣを媒介する変異体ＡＡＣ９〜ＡＡＣ１２、ＡＡＣ１４及びＡＡＣ１５の能力を示す図である。（図６Ａ）市販のリツキシマブを含む対照と比べたＡＡＣ１０及びＡＡＣ１１の結果を示す。（図６Ｂ）市販のリツキシマブを含む対照と比べたＡＡＣ１２及びＡＡＣ１４の結果を示す。（図６Ｃ）市販のリツキシマブを含む対照と比べたＡＡＣ９及びＡＡＣ１５の結果を示す。
【図７】Ｄａｕｄｉ細胞におけるＣＤＣを媒介する変異体ＡＡＣ９〜ＡＡＣ１２、ＡＡＣ１４及びＡＡＣ１５の能力を示す図である。
【図８−１】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−３】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−４】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−５】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−６】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−７】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−８】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−９】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１０】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１１】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１２】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１３】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１４】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１５】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１６】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１７】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１８】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−１９】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２０】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２１】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２２】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２３】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２４】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２５】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２６】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【図８−２７】図８は、添付して提出されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜６９の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
本発明はＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体を提供する。ＩｇＧＦｃ構築物は２つのＦｃポリペプチドを含み、それぞれ修飾されたヒンジ領域を有し、修飾されたヒンジ領域は、ＦｃγＲＩＩａＨ、ＦｃγＲＩＩａＲ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａＦ、ＦｃγＲＩＩＩａＶ、及びＦｃγＲＩａ受容体、及び補体因子Ｃ１ｑタンパク質へのＩｇＧＦｃ構築物の結合を低下させる又は排除する非対称性のアミノ酸修飾を含む。この結合のそのような低下又は排除は、通常野生型ＩｇＧＦｃ領域が媒介するエフェクター機能の低下又はサイレント化を生じる。言及されるように、修飾されたヒンジ領域は非対称性のアミノ酸修飾を含み、そのようなものとして、ＩｇＧＦｃ構築物の一方のポリペプチドのヒンジ領域におけるアミノ酸修飾は他方のポリペプチドのヒンジ領域におけるものとは異なる。一部の実施形態では、単離された抗体構築物は安定であり、且つＦｃＲｎに結合することが可能である。
【００４９】
特定の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の各ポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、ＩｇＧＦｃ構築物の他方のポリペプチドに比べてＩｇＧＦｃ構築物の一方のポリペプチドでの正の電荷を増やすために選択される１以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の各ポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、ＩｇＧＦｃ構築物の他方のポリペプチドに比べてＩｇＧＦｃ構築物の一方のポリペプチドでの負の電荷を増やすために選択される１以上のアミノ酸修飾を含む。
【００５０】
本発明に係るヘテロ多量体は、たとえば、細胞傷害性のような結果的に生じる副作用のためにエフェクター機能が望ましくない治療用抗体の開発において有用であり得る。一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、電荷に基づく方法を用いた精製を円滑にする特性も示す。
【００５１】
本明細書で提供されるのは、低下した又はサイレント化したエフェクター機能を持つヘテロ多量体構築物である。一実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体構築物が提供され、各Ｆｃポリペプチドは修飾された下ヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。特定の実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、本明細書で記載される修飾を有さない対応する親ＩｇＧＦｃ構築物と比べてＦｃγ受容体に対して無視できる結合しか示さない。一部の実施形態では、ヘテロ多量体構築物はＦｃγ受容体すべてに対して低下した結合を示し、少なくとも１つのＦｃγ受容体に対して無視できる結合しか示さない。特定の実施形態では、本明細書で記載されるヘテロ多量体構築物は、Ｆｃγ受容体に対して低下した結合を、及びＣ１ｑタンパク質に対して無視できる結合しか示さない。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方は、下ヒンジ領域には存在しない少なくとも１つのアミノ酸のさらなる修飾を含む。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方は、ヒンジ領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾をさらに含む。一部の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方は、ＣＨ２領域又はＣＨ３領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾をさらに含む。
【００５２】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、ほぼ生理的なｐＨ条件で第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域に正味の電荷を増やす少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、且つ該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。一部の実施形態では、正味電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正味の正の電荷の増加である。一実施形態では、正味の正の電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正に帯電したアミノ酸の総数の増加である。特定の実施形態では、正味電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正味の負の電荷の増加である。特定の実施形態では、正味の負の電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける負に荷電したアミノ酸の総数の増加である。一部の実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、本明細書で記載される修飾を有さない対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べて、Ｆｃγ受容体に対して無視できる結合しか示さない。特定の実施形態では、ヘテロ多量体構築物はＦｃγ受容体すべてに対して低下した結合を示し、少なくとも１つのＦｃγ受容体に対して無視できる結合しか示さない。一実施形態では、本明細書で記載されるヘテロ多量体構築物は、Ｆｃγ受容体に対して低下した結合を示し、Ｃ１ｑタンパク質に対して無視できる結合しか示さない。特定の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方は、下ヒンジ領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾をさらに含む。一部の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方は、ＣＨ２領域又はＣＨ３領域に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾をさらに含む。
【００５３】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で提供され、ここで、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における１以上のアミノ酸修飾は、ヒンジ領域における負若しくは正の電荷の数を改変し、又は野生型のヒンジ領域に比べて電荷中性である。特定の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は２以上のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、提供されるのは本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は２以上のアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態では、ヘテロ多量体構築物が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における１以上のアミノ酸修飾は下ヒンジ領域に存在する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１６〜２３、図５を参照のこと）。
【００５４】
一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、ＦｃγＲＩＩａＨに対して少なくとも約１０μＭのＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対して少なくとも約１０μＭのＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対して少なくとも約１０μＭのＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対して少なくとも約６μＭのＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対して少なくとも約６μＭのＫＤ、及びＦｃγＲＩａに対して少なくとも約６．５ｎＭのＫＤを有する。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、ＦｃγＲＩＩａＨに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対して１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対して６μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対して６μＭを超えるＫＤ、及びＦｃγＲＩａに対して６．５ｎＭを超えるＫＤを有する。
【００５５】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４及びＬ２３５の少なくとも一方のアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、及びＬ２３５Ａから選択されるアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、第１及び第２のＦｃポリペプチドの前記一方がＥ２３３にてアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、Ｅ２３３における修飾は、Ｅ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｋ及びＥ２３３Ｒから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４及びＬ２３５の少なくとも一方でアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、Ｌ２３４及びＬ２３５の少なくとも一方での修飾は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、及びＬ２３５Ｄから選択される。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はＥ２３３にてアミノ酸修飾をさらに含む。一実施形態では、第１又は第２のＦｃポリペプチドは、Ｅ２３３Ａ又はＥ２３３Ｄから選択されるアミノ酸修飾を含む。特定の実施形態では、第１又は第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方はさらに、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９Ｋ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｗ、及びＥ３３３Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。一部の実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドはさらに、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９Ｋ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｗ、及びＥ３３３Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【００５６】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、又はＥ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１又は第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、又はＥ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【００５７】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；又は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方は、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９Ｋ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｗ、及びＥ３３３Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。たとえば、一実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋを含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含む。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含み、第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む。
【００５９】
提供されるのは、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み；又は第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む。
【００６０】
提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２６９Ｑ／Ｄ２７０Ｎを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２７０Ｒを含み；又は第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３５Ｋ／Ａ３２７Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはヒンジ領域若しくは下ヒンジ領域にて修飾を含まず；該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。
【００６１】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は非グリコシル化される。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は脱グリコシル化される。
【００６２】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始は６８℃以上である。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は親ＣＨ２領域の融解温度に匹敵する融解温度を持つＣＨ２領域を有する。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、親ＣＨ２領域の融解温度より高い又はそれとほぼ同じである融解温度を持つＣＨ２領域を有する。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、親ＣＨ２領域の融解温度より約１〜２℃高い融解温度を持つＣＨ２領域を有する。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、親ＣＨ２領域の融解温度より約２〜３℃高い融解温度を持つＣＨ２領域を有する。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物は、親ＣＨ２領域の融解温度より約５℃高い融解温度を持つＣＨ２領域を有する。
【００６３】
本明細書で提供されるのは、ヘテロ多量体構築物であり、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物はヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ３領域を含む。
【００６４】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体構築物が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含み、他方のＦｃポリペプチドはＣＨ３のアミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む。
【００６５】
一実施形態では、ヘテロ多量体構築物が本明細書で記載され、ここで、ＩｇＧＦｃ構築物はＣＨ３領域の安定性を高めるアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。特定の実施形態では、ホモ二量体Ｆｃ構築物を伴った抗体構築物は、電荷に基づく精製方法を用いて前記ヘテロ多量体から明確に分離される。
【００６６】
提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、該ヘテロ多量体はさらに、ＩｇＧＦｃ構築物に融合された少なくとも１つの抗原結合構築物を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの抗原結合構築物は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、又は抗原を結合することが可能なタンパク質若しくはその断片から選択される。一部の実施形態では、抗原結合構築物を１つ含むヘテロ多量体である。一部の実施形態では、抗原結合構築物を２つ含むヘテロ多量体である。一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物が１以上の毒性薬物分子に連結されているヘテロ多量体である。特定の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物は１以上の非相同性のポリペプチドに連結される。一部の実施形態では、１以上の非相同性のポリペプチドは酵素及び毒素から選択される。
【００６７】
提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、ＩｇＧはＩｇＧ１である。
【００６８】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体の第１又は第２のＦｃポリペプチドをコードする核酸である。一部の実施形態では、本明細書で記載される核酸を含む宿主細胞である。特定の実施形態では、本明細書で記載されるヘテロ多量体を調製する方法であり、該方法は、（ａ）本明細書で記載される宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）宿主細胞の培養物からヘテロ多量体を回収する工程とを含む。
【００６９】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体と薬学的に許容可能なキャリアとを含む薬学的組成物である。特定の実施形態では、それを必要とする患者に有効量の本明細書で記載される薬学的組成物を提供することを含む、疾患を治療する方法である。一部の実施形態では、疾患の治療のための薬剤の調製における本明細書で記載されるヘテロ多量体の使用である。一部の実施形態では、それを必要とする患者における疾患の治療のための治療量の本明細書で記載されるヘテロ多量体の使用である。
【００７０】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドの下ヒンジ領域を修飾することを含む、抗体構築物のＡＤＣＣを低下させる方法であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は、少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。特定の実施形態では、ＡＤＣＣを低下させる方法であり、ここで、前記修飾はＦｃ受容体に対する無視できる結合しか生じない。
【００７１】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語はすべて請求される主題が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書での用語について複数の定義がある場合には、この節のものが優先する。ＵＲＬ又は他の識別子若しくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変わり得、インターネット上の特定の情報は移り変わり得るが、同等の情報がインターネットを検索することによって見いだされ得ることが理解される。それに対する参照はそのような情報の利便性及び公的な普及を証拠付けている。
【００７２】
前述の一般的な記載及び以下の詳細な記載は単に例となり、説明に役立つものであって、請求される主題を制約するものではないことが理解されるべきである。本出願では、単数の使用には、特に言及されない限り、複数が含まれる。
【００７３】
「親ＣＨ２ドメイン」は、本明細書で記載される第１及び第２のＦｃポリペプチドのヒンジ領域にて１以上のアミノ酸修飾を欠くが、ジスルフィドヒンジ修飾、付加されたＣＨ２ジスルフィド、グリコシル化修飾又は異なるＣＨ３ドメインの安定性の１以上を含んでもよく、且つ、本発明のヘテロ多量体のＣＨ２ドメインに比べてエフェクター機能が異なるアミノ酸配列を含むＦｃ領域のＣＨ２ドメインのポリペプチドを指す。親ＣＨ２ドメインは、ネイティブな配列のＦｃ領域又は既存のアミノ酸配列の修飾（たとえば、付加、欠失及び／又は置換）を伴うＦｃ領域を含み得る。
【００７４】
「非グリコシル化抗体」は発現の間にグリコシル化されない抗体又はヘテロ多量体を指す。非グリコシル化抗体は哺乳類のグリコシル化経路を欠く系、たとえば、大腸菌における発現、又はＮ２９７のような１以上のグリコシル化部位の突然変異によって調製することができる。
【００７５】
「脱グリコシル化抗体」は発現の間に当初グリコシル化されるが、その後、グリカンを取り外す、たとえば、ＰＮＧアーゼＦ処理のような生化学反応を受ける抗体又はヘテロ多量体を指す。
【００７６】
「中性側鎖を持つアミノ酸」は中性ｐＨで電荷を欠く側鎖を含有するアミノ酸を指す。リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びヒスチジンを除くアミノ酸はすべて中性と見なされる。一部の実施形態では、それが見いだされる構造的な環境によっては、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸及びヒスチジンも中性と見なされる。一実施形態では、「中性側鎖を持つアミノ酸」は生理的ｐＨで全体的に電荷を欠く側鎖を含有するアミノ酸を指す。
【００７７】
「正に荷電した側鎖を持つアミノ酸」は、プロトン化されて中性ｐＨで正に荷電する側鎖を含有する極性アミノ酸を指す。これらのアミノ酸はしばしば塩基性と呼ばれる。正に荷電した側鎖を持つアミノ酸の例には、リジン、アルギニンが挙げられる。一部の実施形態では、それが見出される構造的な環境によっては、ヒスチジンもプロトン化され、正に荷電した側鎖を有し得る。一実施形態では、「正に荷電した側鎖を持つアミノ酸」は、生理的なｐＨで正に荷電する側鎖を含有するアミノ酸を指す。
【００７８】
「負に荷電した側鎖を持つアミノ酸」は、脱プロトン化されて中性ｐＨで負に荷電する側鎖を含有する極性アミノ酸を指す。これらのアミノ酸はしばしば酸性と呼ばれる。負に荷電した側鎖を持つアミノ酸の例には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。一実施形態では、「負に荷電した側鎖を持つアミノ酸」は、生理的なｐＨで負に荷電する側鎖を含有するアミノ酸を指す。
【００７９】
「結合親和性」は一般に、分子（たとえば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（たとえば、抗原又はＦｃγＲ）との間での共有結合相互作用の合計の強度を指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性は一般に解離定数（Ｋｄ又はＫＤ）によって表すことができる。親和性は、本明細書で記載されるものを含めて当該技術で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は抗原（又はＦｃγＲ）を弱く結合し、容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性の抗体は抗原（又はＦｃγＲ）をしっかり結合し、長く結合したままである。
【００８０】
用語「Ｆｃ領域」（又は断片結晶化可能領域）は、抗体のＣ末端を定義するために用いられる。Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖であるＡ鎖及びＢ鎖の第２及び第３の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片で構成される。第２及び第３の定常ドメインはそれぞれＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとして知られる。ＣＨ２ドメインは、Ａ鎖のＣＨ２ドメイン配列とＢ鎖のＣＨ２ドメインの配列を含む。ＣＨ３ドメインは、Ａ鎖のＣＨ３ドメイン配列とＢ鎖のＣＨ３ドメインの配列を含む。本明細書で使用されるとき、Ｆｃ領域には以下で定義されるようなヒンジ領域が含まれる。
【００８１】
用語「Ｆｃ領域の配列」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために用いられる。「Ｆｃ領域の配列」はネイティブのＦｃ領域の配列又は変異体のＦｃ領域の配列であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の配列の境界は異なりうるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の配列は普通、Ｃｙｓ２２６位でのアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びるように定義される。
【００８２】
ヒトＩｇＧのＦｃ領域の配列の「ＣＨ２ドメイン配列」（「Ｃｙ２」ドメイン配列とも呼ばれる）は普通、アミノ酸２３１付近からアミノ酸３４０付近まで伸びる。ＣＨ２ドメイン配列は、それが別のドメイン配列と密接に対合しないという点で独特である。むしろ、インタクトなネイティブのＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン配列間に２つのＮ結合の分岐糖鎖が差し挟まれる。この糖がドメイン間対合のための置換基を提供し、ＣＨ２ドメインを安定化するのに役立っている可能性が推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５）。
【００８３】
「ＣＨ３ドメイン配列」はＦｃ領域配列におけるＣＨ２ドメイン配列までのＣ末端残基のストレッチ（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基３４１付近からアミノ酸残基４４７付近まで）を含む。
【００８４】
「機能的なＦｃ領域」はネイティブのＦｃ領域の「エフェクター機能」を持つ。「エフェクター機能」の例には、Ｃ１ｑの結合；補体依存性の細胞傷害性；Ｆｃ受容体の結合；抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（たとえば、Ｂ細胞受容体：ＢＣＲ）の下方調節等が挙げられる。そのようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（たとえば、抗体の可変ドメイン）と組み合わせることを必要とし、たとえば、本明細書で開示されるような種々のアッセイを用いて評価することができる。
【００８５】
「ネイティブなＦｃ領域配列」は、自然界で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。ネイティブな配列のヒトＦｃ領域にはネイティブな配列のヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；ネイティブな配列のヒトＩｇＧ２のＦｃ領域；ネイティブな配列のヒトＩｇＧ３のＦｃ領域；並びにネイティブな配列のヒトＩｇＧ４のＦｃ領域及び天然に存在するその変異体が挙げられる。
【００８６】
「変異体Ｆｃ領域配列」は、本明細書で定義されるような「１以上のアミノ酸修飾」によって、ネイティブなＦｃ領域配列のそれとは異なるアミノ酸配列を含む。変異体Ｆｃ領域配列は、ネイティブなＦｃ領域配列又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、たとえば、ネイティブなＦｃ領域配列又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列において約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、本明細書の変異体Ｆｃ領域配列は、ネイティブなＦｃ領域配列及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域配列との少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくはそれとの少なくとも約９０％の同一性、さらに好ましくはそれとの少なくとも約９５％の同一性を持つ。
【００８７】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために用いられる。好適なＦｃＲは、ネイティブのヒトＦｃＲである。さらに、特定の実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体を結合し（ガンマ受容体、ＦｃγＲ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）サブクラスの受容体を含み、これら受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング形態を含むものである。ＦｃγＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインで主として異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにて免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにて免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５−３４（１９９４）；並びにｄｅ  Ｈａａｓら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは本明細書での用語「ＦｃＲ」に包含される。用語「ＦｃＲ」には、母性ＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１、１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。用語「ＦｃγＲ」にはＦｃＲｎは含まれない。
【００８８】
「抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」は、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（たとえば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性の反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩを発現し、低レベルのＦｃγＲＩＩｃを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞におけるＦｃＲの発現はＲａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。
【００８９】
「ヒトのエフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣのエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は、そのネイティブの供給源から、たとえば、本明細書で記載されるように血液又はＰＢＭＣから単離されてもよい。
【００９０】
「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」ＦｃγＲ結合親和性及びＣ１ｑ結合親和性を伴ったヘテロ多量体は、親ポリペプチド又はネイティブのＦｃ領域配列を含むポリペプチドに比べてＦｃγＲ結合活性及びＣ１ｑ結合活性を低下させているものである。一部の実施形態では、「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」ＦｃγＲ結合親和性及びＣ１ｑ結合親和性を伴ったヘテロ多量体は、親ポリペプチド又はネイティブのＦｃ領域配列を含むポリペプチドに比べて「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣの活性を伴ったヘテロ多量体でもある。ＦｃγＲへの「低下した又は検出できない結合」を示すヘテロ多量体は、親ポリペプチドよりも低い親和性でＦｃγＲすべてを結合する。ＦｃγＲへの低下した結合を示すそのような変異体はＦｃγＲへの適切な結合をほとんど持たなくてもよく、又は全く持たなくてもよい。一実施形態では、変異体は、たとえば、本明細書の実施例で測定されるように又は平衡定数の変化によって測定されるように、ネイティブのＩｇＧのＦｃ領域に比べてＦｃγＲへの０〜２０％の結合を示す。一実施形態では、変異体はネイティブのＩｇＧのＦｃ領域に比べてＦｃγＲへの０〜１０％の結合を示す。一実施形態では、変異体はネイティブのＩｇＧのＦｃ領域に比べてＦｃγＲへの０〜５％の結合を示す。一実施形態では、変異体はネイティブのＩｇＧのＦｃ領域に比べてＦｃγＲへの０〜１％の結合を示す。
【００９１】
別の実施形態では、ＦｃγＲＩＩａＨへの「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」結合を伴ったヘテロ多量体は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定されるようにＦｃγＲＩＩａＨに対する５μＭを超えるＫｄを有する。別の実施形態では、ＦｃγＲＩＩａＲへの「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」結合を伴ったヘテロ多量体は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定されるようにＦｃγＲＩＩａＲに対する１０μＭを超えるＫｄを有する。別の実施形態では、ＦｃγＲＩＩｂへの「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」結合を伴ったヘテロ多量体は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定されるようにＦｃγＲＩＩｂに対する３０μＭを超えるＫＤを有する。別の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａＦへの「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」結合を伴ったヘテロ多量体は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定されるようにＦｃγＲＩＩＩａＦに対する２０μＭを超えるＫＤを有する。別の実施形態では、ＦｃγＲＩＩＩａＶへの「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」結合を伴ったヘテロ多量体は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定されるようにＦｃγＲＩＩＩａＶに対する６μＭを超えるＫＤを有する。別の実施形態では、ＦｃγＲＩａへの「大きく低下した」、「サイレント化した」、「無視できる」又は「除去された」結合を伴ったヘテロ多量体は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって測定されるようにＦｃγＲＩａに対する６．５ｎＭを超えるＫＤを有する。
【００９２】
「ヒトのエフェクター細胞の存在下で親抗体よりもさらに効果的に抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する」ヘテロ多量体は、アッセイに使用されるヘテロ多量体と親抗体の量が本質的に同じである場合、試験管内にて又は生体内にてＡＤＣＣを媒介することに実質的にさらに効果的であるものである。一般に、そのようなポリペプチドは本明細書で開示されるような試験管内のＡＤＣＣアッセイを用いて同定されるであろうが、たとえば動物モデル等にて、ＡＤＣＣ活性を測定する他のアッセイ又は方法も想定される。好ましいポリペプチドは、たとえば、本明細書で開示される試験管内のアッセイにて親分子よりも約１．５倍〜約１００倍、たとえば、約２倍〜約５０倍、ＡＤＣＣを媒介することに大きく効果的である。
【００９３】
「親抗体」、「親ポリペプチド」又は「ネイティブのＦｃ領域を含むポリペプチド」は、ヒンジ領域に対するアミノ酸修飾を含まない構築物を指す。一実施形態では、親抗体は、ヒンジ領域に対するアミノ酸修飾を含まず、且つヘテロ二量体のＦｃ領域の形成を促進するＣＨ３ドメインに対する修飾を含むものである。
【００９４】
「アミノ酸修飾」は所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列における変化を指す。典型的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書でのアミノ酸修飾は置換である。たとえばＦｃ領域の、特定の位置「でのアミノ酸修飾」は、特定の残基の置換又は欠失、又は特定の残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を指す。特定の残基に「隣接する」挿入によってその１〜２残基の範囲内での挿入を意味する。特定の実施形態では、挿入は特定の残基のＮ末端又はＣ末端である。
【００９５】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列における別の異なる「置き換え」アミノ酸残基による少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の置き換えを指す。置き換え残基（単数）又は残基（複数）は「天然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝子コードによってコードされた）であってもよく、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）：セリン（Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；及びバリン（Ｖａｌ）から成る群から選択される。好ましくは、置き換え残基はシステインではない。１以上の天然に存在しないアミノ酸残基による置換も本明細書のアミノ酸置換の定義に包含される。「天然に存在しないアミノ酸残基」は上に列記した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基であり、それはポリペプチド鎖にて隣接するアミノ酸残基に共有結合することができる。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及びＥｌｌｍａｎら．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）にて記載されたもののような他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するには、Ｎｏｒｅｎら．Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎら，上記の手順を使用することができる。手短には、これらの手順には、天然に存在しないアミノ酸残基によるサプレッサーｔＲＮＡの化学的活性化とその後の該ＲＮＡの試験管内の転写及び翻訳が関与する。
【００９６】
「アミノ酸挿入」は所定のアミノ酸配列への少なくとも１つのアミノ酸の取り込みを指す。特定の実施形態では、挿入は１又は２のアミノ酸残基の挿入から成る。特定の他の実施形態では、さらに大きな「ペプチド挿入」、たとえば、約３〜約５又は最大で約１０のアミノ酸残基の挿入がある。これらの実施形態では、挿入される残基は、上記で開示されたように天然に存在する又は天然に存在しない。
【００９７】
「アミノ酸欠失」は所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去をさす。
【００９８】
「ヒンジ領域」は一般にヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６〜Ｐｒｏ２３８と定義され、そのうちのＣｙｓ２２６〜Ｐｒｏ２３０は「コア」ヒンジ領域を形成する（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１−２０６（１９８５））一方で、Ａｌａ２３１〜Ｐｒｏ２３８は「下」ヒンジ領域を形成し、Ｇｌｕ２１６〜Ｔｈｒ２２５は「上」ヒンジ領域を形成する。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を同じ位置で形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによってＩｇＧ１の配列と整列させうる。
【００９９】
「Ｃ１ｑ」は免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドの多量体である。Ｃ１ｑは２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓと一緒に、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）経路の第１の成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトのＣ１ｑは、たとえば、カリフォルニア州、サンディエゴのＱｕｉｄｅｌから商業的に購入することができる。
【０１００】
用語「結合ドメイン」は別の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合、結合ドメインはＦｃ領域を結合することに関与するそのポリペプチド鎖（たとえば、そのα鎖）の部分を含むことができる。有用な結合ドメインの１つはＦｃＲα鎖の細胞外ドメインである。
【０１０１】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体（完全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。
【０１０２】
「抗体断片」は本明細書で定義されるとき、インタクトな抗体の少なくとも１つの抗原結合領域若しくは可変領域、又は抗体のＦｃ領域を一般に含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、線形抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。特定の実施形態では、抗体断片はＩｇＧ重鎖のヒンジ領域及び任意でＣＨ１領域の少なくとも一部を保持する。一部の実施形態では、抗体断片はＩｇＧ重鎖の定常領域全体を保持し、ＩｇＧ軽鎖を含む。
【０１０３】
用語「モノクローナル抗体」は本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在し得る考えられる天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられる。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるという抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とするとは解釈されるべきではない。特定の実施形態では、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法（米国特許４，８１６，５６７を参照）によって作製される。一部の実施形態では、「モノクローナル抗体」は、たとえば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）にて記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離される。
【０１０４】
本明細書のモノクローナル抗体には具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来する又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一である又は相同である一方で、鎖の残りの部分は、別の種に由来する又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一である又は相同である「キメラ抗体」（免疫グロブリン）、並びにそれらが所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる（ＵＳ４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１０５】
「障害」はポリペプチド変異体による治療から利益を得ることになる状態である。これには、哺乳類を当該障害に罹りやすくする生理的な状態を含む慢性の及び急性の障害又は疾患が含まれる。一実施形態では、障害は癌である。
【０１０６】
単語「標識」は本明細書で使用される場合、ポリペプチドに直接又は間接的に抱合される検出可能な化合物又は組成物を指す。特定の実施形態では、標識はそれ自体検出可能である（たとえば、放射性同位元素標識又は蛍光標識）。一部の他の実施形態では、標識は検出可能である基質化合物又は組成物の化学変化を触媒する。典型的な実施形態は、検出可能である基質化合物又は組成物の化学変化を触媒する酵素標識を含む。
【０１０７】
「単離された」核酸分子は、ポリペプチド核酸の天然の供給源にて通常会合する少なくとも１つの混入核酸分子から同定され、分離される核酸分子である。単離された核酸分子はそれが自然界で見いだされる形態又は設定以外のものである。従って単離された核酸分子は自然細胞に存在する核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子には、たとえば、核酸分子が自然細胞のそれとは異なる染色体の位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含有される核酸分子が含まれる。
【０１０８】
表現「制御配列」は特定の宿主生物にて操作可能に連結されたコーディング配列の発現に必要とされるＤＮＡ配列を指す。真核細胞に好適である制御配列には、たとえば、プロモータ、任意でオペレータ配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。原核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサを利用することが知られている。
【０１０９】
それが別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、核酸は「操作可能に連結されている」。たとえば、プレ配列又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるのであれば、ポリペプチドのためのＤＮＡに操作可能に連結されており；プロモータ又はエンハンサは、それが配列の転写に影響するのであれば、コーディング配列に操作可能に連結されており；又は、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されるのであれば、コーディング配列に操作可能に連結されている。一般に、「操作可能に連結されている」は、連結されるＤＮＡ配列は連続的であり、分泌リーダーの場合には、連続的かつ読み取り相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは連続的でなくてもよい。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しなければ、従来の実践に従って、合成オリゴヌクレオチドのアダプター又はリンカーを使用する。
【０１１０】
本明細書で使用されるとき、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は相互交換可能に使用され、そのような指示物にはすべて子孫が含まれる。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」には、一次対象細胞及び継代の数にかかわらずそれに由来する培養物が含まれる。意図的な又は不適切な突然変異のために子孫すべてがＤＮＡ内容物で正確に同一でない可能性があることも理解される。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が包含される。異なる指示物が意図される場合、それは文脈から明らかであろう。
【０１１１】
語句「低親和性受容体」は、当該リガンドに対する弱い結合親和性を有する、たとえば、約５０ｎＭより悪い親和性の解離定数を有する受容体を意味する。例となる低親和性受容体にはＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩが挙げられる。
【０１１２】
本明細書で使用される「Ｆｃ融合」は、１以上のポリペプチドがＦｃ領域又はその誘導体に操作可能に連結されることを意味する。Ｆｃ融合は本明細書では、当該技術で使用される用語「イムノアドヘシン」、「Ｉｇ融合」、「Ｉｇキメラ」及び「受容体グロブリン」（ダッシュ記号を伴うこともある）と同義語であることを意味する（Ｃｈａｍｏｗら，１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１４：５２−６０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１９５−２００）。Ｆｃ融合は、免疫グロブリンのＦｃ領域を、一般にタンパク質又は小分子であり得る融合相手と組み合わせる。Ｆｃ融合の非Ｆｃ部分、すなわち、融合相手の役割は標的結合を媒介することなので、それは抗体の可変領域と機能的に類似する。実際、任意のタンパク質又は小分子がＦｃに連結されてＦｃ融合を生成してもよい。タンパク質の融合相手には、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、又は幾つかの他のタンパク質又はタンパク質ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。小分子の融合相手には、Ｆｃ融合を治療標的に向ける治療剤が挙げられ得る。そのような標的は疾患に関与する任意の分子、好ましくは細胞外受容体であってもよい。多数の認可された小分子薬剤の標的である表面受容体の２つのファミリーは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、及び．＋、Ｎａ＋、Ｃａ＋チャンネルを含むイオンチャンネルである。世界中で現在上市されている薬剤すべてのほぼ７０％がＧＰＣＲを標的とする。従って、本明細書で記載されるＦｃタンパク質は、たとえば、１以上のＧＡＢＡ受容体、プリン受容体、アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、オピオイド受容体、ケモカイン受容体、グルタミン酸受容体、ニコチン酸受容体、５ＨＴ（セロトニン）受容体及びエストロゲン受容体を標的とする小分子に融合されてもよい。融合相手は治療上有用な標的を標的とするタンパク質の小分子模倣体であってもよい。Ｆｃ融合の相手として役立ち得る特定の薬剤の具体例は、Ｌ．Ｓ．Ｇｏｏｄｍａｎら，編，Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｅｄ．９，１９９６）に見いだすことができる。融合相手には、既存の薬剤に対する既知の標的を結合する小分子及びタンパク質だけでなく、薬剤標的として未だ存在していない希少受容体も含まれる。ゲノム及びプロテオームのプロジェクトの完成は創薬における原動力であることが判明しつつあり、これらのプロジェクトは希少受容体の宝庫を生み出している。これらの新しい分子を薬剤標的として検証し、それらを標的とするタンパク質及び小分子の治療剤を開発する多くの潜在力がある。そのようなタンパク質及び小分子の治療剤は本明細書で記載されるＩｇＧＦｃ構築物を採用するＦｃ融合相手として想定される。以下で定義され、記載される種々のリンカーを用いてＦｃを融合相手に共有結合してＦｃ融合を生成してもよい。
【０１１３】
本明細書で使用されるとき「標的抗原」は、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、糖類、脂質又は他の化合物であってもよい。
【０１１４】
本明細書で使用されるとき「標的細胞」は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【０１１５】
本明細書及びクレームの全体を通して、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、参照によって本明細書に明示的に組み入れられるＫａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９  １）において見られるようなＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基の番号付けを指す。
【０１１６】
１．ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体
本明細書で提供されるのは、低下した又はサイレント化したエフェクター機能を持つヘテロ多量体構築物である。一実施形態では、提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体構築物であり、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。
【０１１７】
本明細書で提供されるのは、低下した又はサイレント化したエフェクター機能を持つヘテロ多量体構築物である。一実施形態では、提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体構築物であり、各Ｆｃポリペプチドは修飾された下ヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾された下ヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。特定の実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、本明細書で記載される修飾を有さない対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べて、Ｆｃγ受容体に対する無視できる結合しか示さない。一部の実施形態では、ヘテロ多量体構築物はＦｃγ受容体すべてに対する低下した結合を示し、且つ少なくとも１つのＦｃγ受容体に対する無視できる結合しか示さない。特定の実施形態では、本明細書で記載されるヘテロ多量体構築物はＦｃγ受容体に対する低下した結合及びＣ１ｑタンパク質に対する無視できる結合しか示さない。
【０１１８】
本明細書で提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はほぼ生理的なｐＨ条件で第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジにおける正味電荷を増やす少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。一部の実施形態では、正味電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正味の正の電荷の増加である。一実施形態では、正味の正の電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正に荷電したアミノ酸の総数の増加である。特定の実施形態では、正味電荷の前記増加は第１のＦｃポリペプチドにおける正味の負の電荷の増加である。特定の実施形態では、正味の負の電荷の増加は第１のＦｃポリペプチドにおける負に荷電したアミノ酸の総数の増加である。一部の実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、本明細書で記載される修飾を有さない対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体に対して無視できる結合しか示さない。特定の実施形態では、ヘテロ多量体構築物は、Ｆｃγ受容体すべてに対して低下した結合を示し、且つ少なくとも１つのＦｃγ受容体に対して無視できる結合しか示さない。一実施形態では、本明細書で記載されるヘテロ多量体構築物はＦｃγ受容体すべてに対して低下した結合を示し、且つＣ１ｑタンパク質に対して無視できる結合しか示さない。
【０１１９】
提供されるのは、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、該ＩｇＧＦｃ構築物は第１及び第２のＦｃポリペプチドを有し、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域における正の電荷の数を増やす１以上のアミノ酸修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの１以上のアミノ酸修飾とは異なる１以上のアミノ酸修飾を含み、ＩｇＧＦｃ構築物はＦｃγ受容体又はＣ１ｑタンパク質に結合しない。
【０１２０】
１．１  Ｆｃ領域及びヒンジ領域
ヘテロ多量体はヒンジ領域を含むＩｇＧＦｃ構築物（Ｆｃ領域）を含む。抗体のＦｃ領域は通常、２つのポリペプチド鎖を含み、そのそれぞれがＩｇＧ重鎖ポリペプチドのＣ末端断片を含む。その結果、ＩｇＧＦｃ構築物は、それぞれＩｇＧ重鎖ポリペプチドから誘導され、ＦｃγＲ、補体、及びＦｃＲｎへの結合を媒介する領域と、ヒンジ領域とを含む、２つのＦｃポリペプチドを有する。
【０１２１】
一実施形態では、ヘテロ多量体は、ヒトＩｇＧ重鎖ポリペプチドに由来するＩｇＧＦｃ構築物を含む。幾つかのヒトＩｇＧ重鎖ポリペプチドの亜型が当該技術で既知であり、それにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が挙げられる。ヒトＩｇＧ亜型のうちで、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３は補体を活性化することが知られ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりもはるかに効果的にエフェクター機能ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害性）を媒介する。一実施形態では、ヘテロ多量体は、ヒトのＩｇＧ１重鎖ポリペプチドに由来するＩｇＧＦｃ構築物を含む。ヒトのＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列は当該技術で既知である（たとえば、ＩＭＧＴ受入番号Ｊ００２２８）。一実施形態では、ヘテロ多量体は、ヒトのＩｇＧ３重鎖ポリペプチドに由来するＩｇＧＦｃ構築物を含む。ヒトのＩｇＧ３重鎖の配列は当該技術で既知である（たとえば、ＩＭＧＴ受入番号Ｘ０３６０４）。一実施形態では、ヘテロ多量体は、ヒトのＩｇＧ４重鎖ポリペプチドに由来するＩｇＧＦｃ構築物を含む。ヒトのＩｇＧ４重鎖の配列は当該技術で既知である（たとえば、ＩＭＧＴ受入番号Ｋ０１３１６）。ヒンジ領域を含むヒトのＩｇＧＦｃ領域のアミノ酸配列を図５に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。
【０１２２】
さらなる実施形態では、ヘテロ多量体は、ＩｇＧのアロタイプに由来するＩｇＧＦｃ領域を含むことができる。ＩｇＧのアロタイプは当該技術で既知である（たとえば、Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓら、（２００９）、Ｍａｂｓ、１（４）：３３２−３３８を参照）。
【０１２３】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ領域は、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネウズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、カンツズマブ、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、イノツズマブオゾガミシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペルツッズマブ、ペキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウロトキサズマブ及びビシリズマブから選択される治療潜在力を持つヒト化モノクローナル抗体に由来する。
【０１２４】
別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ領域は、たとえばリツキシマブなどの、治療用抗体に由来する。
【０１２５】
ＩｇＧＦｃ構築物の各Ｆｃポリペプチドは、ヒンジ領域を含むＩｇＧ重鎖ポリペプチドのＦｃ領域の少なくとも一部を含む。ＩｇＧポリペプチドのＦｃ領域は、Ｆｃ領域のエフェクター機能を媒介する複数の受容体に対する結合部位を含む。そのような受容体の例には、ＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａが挙げられる。Ｆｃ領域はさらに補体因子Ｃ１ｑタンパク質に結合する領域を含む。
【０１２６】
ヒトＩｇＧ１重鎖ポリペプチドのＦｃ領域はＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２１６〜４４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、図５を参照）を含む。ヒトＩｇＧヒンジ領域の長さ及び配列は以下の表１で示すようにＩｇＧのアイソタイプによって異なる。
【０１２７】
（表１）ヒトＩｇＧヒンジ領域のアミノ酸配列の比較
0006567506.tif 000002
【０１２８】
ＩｇＧ１ポリペプチドのヒンジ領域は２１６から２３８までのアミノ酸残基を含む一方で、ヒトＩｇＧ１ポリペプチドの下ヒンジ領域は２３１から２３８までのアミノ酸残基を含む。
【０１２９】
従って、一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の各ＦｃポリペプチドはヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２１６〜４４７を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸残基２１６〜２３８を含むヒンジ領域にて少なくとも１つの修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なるヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の各ＦｃポリペプチドはヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７を含み、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸残基２３１〜２３８を含む下ヒンジ領域に少なくとも１つの修飾を含み、第２のＦｃポリペプチドは、第１のＦｃポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸修飾とは異なる下ヒンジ領域における少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。
【０１３０】
１．１．２  修飾されたヒンジ領域におけるアミノ酸修飾
ＩｇＧＦｃ構築物の第１及び第２のＦｃポリペプチドは、非対称性に修飾されて大きく低下した又は除去されたエフェクター機能を持つヘテロ多量体を生成する修飾されたヒンジ領域を含む。Ｆｃポリペプチドへの言及を伴う用語「第１」及び「第２」は、各ＩｇＧＦｃ構築物が第１のＦｃポリペプチドを１つと第２のＦｃポリペプチドを１つ含むという条件で相互交換可能に使用することができる。アミノ酸修飾は、以下でさらに詳細に記載されるように第１及び第２のＦｃポリペプチドのヒンジ領域に非対称性に導入される。
【０１３１】
ヘテロ多量体は以下の段落で記載されるコアのアミノ酸修飾を含む第１及び第２のＦｃポリペプチドを含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４及びＬ２３５の少なくとも一方でのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、及びＬ２３５Ａから選択されるアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、第１及び第２のＦｃポリペプチドの前記一方はＥ２３３でのアミノ酸修飾をさらに含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で提供され、ここで、Ｅ２３３における前記修飾はＥ２３３Ａ、Ｅ２３３Ｋ及びＥ２３３Ｒから選択される。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、Ｌ２３４及びＬ２３５の少なくとも一方でのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、Ｌ２３４及びＬ２３５の少なくとも一方での前記修飾は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、及びＬ２３５Ｄから選択される。一実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はさらにＥ２３３でのアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、第１又は第２のＦｃポリペプチドはＥ２３３Ａ又はＥ２３３Ｄから選択されるアミノ酸修飾を含む。
【０１３３】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１及び第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方の修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、又はＥ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含む。一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で記載され、ここで、第１又は第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、又はＥ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【０１３４】
本明細書で提供されるのは、本明細書で記載されるヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み；又は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はアミノ酸修飾Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、コアのアミノ酸修飾を含む第１及び第２のポリペプチドを含み、且つ以下の追加のアミノ酸修飾を含む。従って、一部の実施形態では、ヘテロ多量体が本明細書で提供され、ここで、第１又は第２のＦｃポリペプチドの少なくとも一方がさらに、Ｄ２６５Ｓ、Ｅ２６９Ｋ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ｗ、及びＥ３３３Ｋから選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。たとえば、一実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋを含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含む。別の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含む。さらに別の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含む。追加の実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む。
【０１３６】
提供されるのは、本明細書で記載されるようなヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２３３Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ｓを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｄ２６５Ｓを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｋ３２２Ａを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３２９Ｗを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｐ３２９Ｗを含み；第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ａを含み；又は第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ／Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２６５Ｓ／Ｋ３２２Ｅ／Ｅ３３３Ｋを含む。
【０１３７】
第１のＦｃポリペプチド
ＩｇＧＦｃ構築物の２つのＦｃポリペプチドのそれぞれは修飾されたヒンジ領域を含む。第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域はＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やす１以上のアミノ酸修飾を含む。「ヒンジ領域の正の電荷を増やす」とは、１以上のアミノ酸修飾を伴う修飾されたヒンジ領域が野生型のそれである未修飾のヒンジ領域よりも大きい全体の正の電荷を有することを意味する。第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、他方のＦｃポリペプチドの１以上のアミノ酸修飾とは異なる１以上のアミノ酸修飾を含む。本明細書で使用されるとき、非対称性のアミノ酸修飾は、ポリペプチドの１つ（たとえば、「第１のポリペプチド」）における特定の位置でのアミノ酸が同じ位置での第２のポリペプチド（たとえば、「第２のポリペプチド」）におけるアミノ酸とは異なる修飾である。これは、ＩｇＧＦｃ構築物の第１又は第２のポリペプチドに由来する２つのアミノ酸のうちの一方だけの修飾又は２つの異なるアミノ酸の双方のアミノ酸の修飾の結果であり得る。
【０１３８】
たとえば、第１のＦｃポリペプチドがアミノ酸修飾Ｌ２３５Ｋを含むのであれば、異なるアミノ酸修飾は、ヒンジ領域における他のアミノ酸、たとえば、Ｌ２３４若しくはＥ２３３の修飾、又はＬ２３５Ｋ以外のＬ２３５の修飾、たとえば、Ｌ２３５Ａ若しくはＬ２３５Ｄを含むことになる。従って、一実施形態では、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やす１以上のアミノ酸修飾を含み、且つ、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの２以上のアミノ酸修飾とは異なる１以上のアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やす２以上のアミノ酸修飾を含み、且つ、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの１以上のアミノ酸修飾とは異なる１以上のアミノ酸修飾を含む。代替の実施形態では、第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やす２以上のアミノ酸修飾を含み、且つ、第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は第１のＦｃポリペプチドの２以上のアミノ酸修飾とは異なる２以上のアミノ酸修飾を含む。
【０１３９】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾を１つ含む場合、該アミノ酸修飾は、中性の又は負に荷電した側鎖を有するアミノ酸を、正に荷電した側鎖を有するアミノ酸で置換するように行われる。たとえば、ヒンジ領域におけるＬ２３４又はＬ２３５は、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｏｒｎ（Ｏ）又はＡｒｇ（Ｒ）によって置換することができる。従って、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域がアミノ酸修飾を１つ含む実施形態では、ヒトＩｇＧ１の下ヒンジ領域におけるアミノ酸残基Ａ２３１、Ｐ２３２、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、又はＰ２３８は、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、又はＡｒｇで置換することができる。
【０１４０】
第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域が２以上のアミノ酸修飾を含む実施形態では、修飾の組み合わせの全体的な結果は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷の増加である。正の電荷の全体的な増加は、負に荷電した又は中性の側鎖を有するアミノ酸を、正に荷電した側鎖又は中性の側鎖で置換する、アミノ酸修飾の組み合わせの結果生じうる。たとえば、一実施形態では、ＩｇＧ１のＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの下ヒンジ領域における正の電荷を増やす２以上のアミノ酸修飾は、２以上のアミノ酸修飾の組み合わせが、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすという条件で、Ｅ２３３Ｋ、Ｅ２３３Ｒ、Ｅ２３３Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、及びＬ２３５Ａから選択することができる。同様に、ヒンジ領域内の他のアミノ酸修飾は、それらがヒンジ領域における正の電荷を増やす限り、行われてもよい。
【０１４１】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすＬ２３４又はＬ２３５におけるアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすＬ２３４及びＬ２３５におけるアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすＬ２３４、Ｌ２３５又はＥ２３３におけるアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすＬ２３４及びＥ２３３におけるアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすＬ２３５及びＥ２３３におけるアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、修飾されたヒンジ領域の正の電荷を増やすＬ２３４、Ｌ２３５及びＥ２３３におけるアミノ酸修飾を含む。
【０１４２】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第１のＦｃポリペプチドは、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｒ／Ｌ２３５Ｒ、又はＥ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｋを含む修飾されたヒンジ領域を含む。
【０１４３】
第２のＦｃポリペプチド
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、第１のＦｃポリペプチドのアミノ酸修飾とは異なり、修飾されたヒンジ領域の負の電荷を増やすか、又は野生型のヒンジ領域に比べて電荷中性である、１以上のアミノ酸修飾を含む。「修飾されたヒンジ領域の負の電荷を増やす」とは、１以上のアミノ酸修飾を持つＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域が、野生型の未修飾ヒンジ領域のそれよりも大きい全体的な負の電荷を有することを意味する。「電荷中性」は、１以上のアミノ酸修飾が、野生型のヒンジ領域のそれに比べて、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域の全体的な電荷における変化を生じないことを意味する。従って、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のポリペプチドのアミノ酸修飾には、中性の側鎖を有するアミノ酸を負に荷電した側鎖、正に荷電した側鎖又は異なる中性の側鎖を有するアミノ酸で置き換えるアミノ酸修飾、及び／又は負に荷電した側鎖を有するアミノ酸を中性の側鎖を有するアミノ酸で置き換えるアミノ酸修飾の組み合わせが挙げられる。これらのアミノ酸修飾の組み合わせは、それらが野生型のヒンジ領域に対して、修飾されたヒンジ領域の負の電荷の増加を生じる又は電荷中性である限り、好適である。
【０１４４】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドはＬ２３４又はＬ２３５におけるアミノ酸修飾（単数）を含む。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドはＬ２３４及びＬ２３５におけるアミノ酸修飾（複数）を含む。一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、及びＬ２３５Ｄから選択されるアミノ酸修飾を含む。
【０１４５】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドはＬ２３４及び／又はＬ２３５及びＥ２３３におけるアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｋ、Ｌ２３４Ｒ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３５Ｋ、Ｌ２３５Ｒ、Ｌ２３５Ｅ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｄ、Ｅ２３３Ａ及びＥ２３３Ｄから選択されるアミノ酸修飾を含む。
【０１４６】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物の第２のＦｃポリペプチドの修飾されたヒンジ領域は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、Ｅ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ、又はＥ２３３Ａ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ａを含む。
【０１４７】
２．ＩｇＧＦｃ構築物の他の修飾
一部の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体は以下で記載されるような追加の修飾を含む。
【０１４８】
本発明の一実施形態では、ヘテロ多量体は、ヘテロ二量体のＦｃ領域の形成を促進するようにさらに修飾されている修飾Ｆｃポリペプチドを含むＩｇＧＦｃ構築物を含む。そのようなさらに修飾されたＦｃポリペプチドは二重特異性抗体の文脈におけるヘテロ多量体の製造に有用である。一実施形態では、Ｆｃポリペプチドはヘテロ二量体のＦｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を有する変異体ＣＨ３ドメインを含む。好適な変異体ＣＨ３ドメインは当該技術で既知であり、それらには、たとえば、ＷＯ２０１２／０５８７６８及びＵＳ５，８２１，３３３、ＵＳ７，６９５，９３６に記載されたものが挙げられる。一実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、ここで第１及び第２のＦｃポリペプチドの一方がＣＨ３のアミノ酸修飾Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗを含み、他方のＦｃポリペプチドがＣＨ３アミノ酸修飾Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む。
【０１４９】
ヘテロ二量体のＦｃ領域の形成を促進するようにＦｃポリペプチドを修飾する追加の方法は、ＷＯ９６／０２７０１１（ノブ・イントゥ・ホール）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら．（２０１０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓら、（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ら．（２０１０）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＭｏｏｒｅら（２０１１）、Ｍａｂｓ．３：６，５４６−５５７に記載されている。
【０１５０】
一実施形態では、ヘテロ多量体はヘテロ二量体のＦｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾をさらに含むＩｇＧＦｃ構築物を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体はヘテロ二量体のＦｃ領域の形成を促進する各ＦｃポリペプチドのＣＨ３領域でのアミノ酸修飾をさらに含むＩｇＧＦｃ構築物を含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、ヘテロ多量体は、ＣＨ２ドメインの融解温度で測定して、ＩｇＧＦｃ構築物の安定性を高めるアミノ酸修飾をさらに含むＩｇＧＦｃ構築物を含む。好適なアミノ酸修飾は当該技術で既知であり、それらには、ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載されたものが挙げられる。具体的には、一実施形態では、ヘテロ多量体は第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチド双方にアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含むＩｇＧＦｃ構築物を含む。
【０１５２】
提供されるのは、第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体であり、ここで、第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２６９Ｑ／Ｄ２７０Ｎを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｅ２６９Ｋ／Ｄ２７０Ｒを含み；又は第１のＦｃポリペプチドはアミノ酸修飾Ｌ２３５Ｋ／Ａ３２７Ｋを含み、且つ第２のＦｃポリペプチドは上ヒンジ領域又は下ヒンジ領域にて修飾を含まず、該ＩｇＧＦｃ構築物は、対応する親ＩｇＧＦｃ構築物に比べてＦｃγ受容体すべてとＣ１ｑタンパク質とに対する低下した結合を示す。
【０１５３】
一実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ１Ｆｃ構築物、及びＩｇＧ２Ｆｃ構築物、ＩｇＧ３Ｆｃ構築物、又はＩｇＧ４Ｆｃ構築物である。
【０１５４】
一部の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物は、野生型のホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を伴ったヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する少なくとも１つのＣＨ３ドメインを含む。例となる修飾は以下に記載される。一部の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃの二量体化したＣＨ３ドメインは、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定して、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は８５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。一部の実施形態では、二量体Ｆｃは製造される際、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である；又は、発現される際若しくは単一細胞によって発現される際、Ｆｃが約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。
【０１５５】
一部の態様では、ＦｃはＣＨ３配列の少なくとも１つに１以上の修飾を含む。一部の態様では、ＦｃはＣＨ２配列の少なくとも１つに１以上の修飾を含む。
【０１５６】
一部の態様では、Ｆｃは、そのそれぞれの開示の全体があらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１１年１１月４日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８又は２０１２年１１月２日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載されたＦｃである。
【０１５７】
一部の態様では、本明細書で記載されるＦｃ構築物は、非対称性に修飾されている修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｆｃが第１の重鎖ポリペプチド１つと第２の重鎖ポリペプチド１つを含むという条件で相互交換可能に使用することができる、第１の重鎖ポリペプチド及び第２の重鎖ポリペプチドの２つの重鎖定常ドメインポリペプチドを含むことができる。一般に、第１の重鎖ポリペプチドは第１のＣＨ３配列を含み、第２の重鎖ポリペプチドは第２のＣＨ３配列を含む。
【０１５８】
非対称性に導入された１以上のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は通常、２つのＣＨ３配列が二量体化する場合、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体Ｆｃを生じる。本明細書で使用されるとき、「非対称性のアミノ酸修飾」は第１のＣＨ３配列における特定の位置でのアミノ酸が同じ位置での第２のＣＨ３配列におけるアミノ酸とは異なる修飾を指し、第１及び第２のＣＨ３配列は優先的に対合してホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体化は、各配列の同じアミノ酸位置での２つのアミノ酸の一方のみの修飾、又は第１及び第２のＣＨ３配列のそれぞれにおける同じ位置での各配列上での双方のアミノ酸の修飾の結果であり得る。ヘテロ二量体Ｆｃの第１及び第２のＣＨ３配列は１以上の非対称性のアミノ酸修飾を含むことができる。
【０１５９】
表Ｘは、完全長のヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応するヒトＩｇＧ１のＦｃ配列のアミノ酸配列を提供する。ＣＨ３配列は完全長のヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。通常、Ｆｃは二量体化することが可能な２つの連続する重鎖配列（Ａ及びＢ）を含むことができる。一部の態様では、Ｆｃの一方又は双方の配列は、ＥＵの番号付けを用いた位置Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００、及び／又はＮ３９０に、１以上の突然変異又は修飾を含む。一部の態様では、Ｆｃは表Ｘに示す変異配列を含む。一部の態様では、Ｆｃは変異体１Ａ−Ｂの変異を含む。一部の態様では、Ｆｃは変異体２Ａ−Ｂの変異を含む。一部の態様では、Ｆｃは変異体３Ａ−Ｂの変異を含む。一部の態様では、Ｆｃは変異体４Ａ−Ｂの変異を含む。一部の態様では、Ｆｃは変異体５Ａ−Ｂの変異を含む。
【０１６０】
（表Ｘ）例となるＦｃの配列及びＣＨ３の修飾
0006567506.tif 000003
【０１６１】
第１及び第２のＣＨ３配列は完全長のヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７を参照して本明細書で記載されるようなアミノ酸の突然変異を含むことができる。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列及び位置Ｔ３９４にアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う修飾ＣＨ３ドメインを含む。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上のアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列、並びにＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗから選択される１以上のアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う、修飾ＣＨ３ドメインを含む。
【０１６２】
一実施形態では、Ｆｃ構築物は、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列、並びに位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４でアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１又は第２のＣＨ３配列の一方がさらに位置Ｑ３４７でアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列が位置Ｋ３６０でアミノ酸修飾を含む、ヘテロ二量体Ｆｃを含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７でアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列、並びに位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４でアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１又は第２のＣＨ３配列の一方がさらに位置Ｑ３４７でアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列が位置Ｋ３６０でアミノ酸修飾を含み、前記ＣＨ３配列の一方又は双方がさらにアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書で提供されるＦｃ構築物は、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７でアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列、並びに位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４でアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１及び第２のＣＨ３配列の一方がさらにＤ３９９Ｒ又はＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列がＴ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄの１以上を含む、ヘテロ二量体Ｆｃを含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７でアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列、並びに位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４でアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１及び第２のＣＨ３配列の一方がさらにＤ３９９Ｒ又はＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列がＴ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄの１以上を含み、該ＣＨ３配列の一方又は双方がさらにアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。
【０１６４】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７でアミノ酸修飾を有する第１のＣＨ３配列、並びに位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４でアミノ酸修飾を有する第２のＣＨ３配列を伴う修飾ＣＨ３ドメインを含み、該ＣＨ３配列の一方又は双方がさらにＴ３５０Ｖのアミノ酸修飾を含む。
【０１６５】
一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、以下のアミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含み、ここで、「Ａ」は第１のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表し、「Ｂ」は第２のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表す：Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｂ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ、Ａ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、及び／又はＢ：Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ。
【０１６６】
上記１以上の非対称性のアミノ酸修飾は、ヘテロ二量体のＣＨ３ドメインが野生型のホモ二量体のＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進することができる。一実施形態では、１以上の非対称性のアミノ酸修飾は、ヘテロ二量体のＦｃドメインが野生型のホモ二量体のＦｃドメインに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する。一実施形態では、１以上の非対称性のアミノ酸修飾は、ヘテロ二量体のＦｃドメインが示差走査熱量測定試験における融解温度（Ｔｍ）を介して観察される安定性を有し、融解温度が対応する野生型のホモ二量体のＦｃドメインについて観察されるものの４℃以内にあるヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する。一部の態様では、Ｆｃは、野生型のホモ二量体のＦｃに匹敵する安定性を持つヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進するＣＨ３配列の少なくとも１つにおいて１以上のアミノ酸修飾を含む。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＨ３ドメインの安定性は、たとえば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によってＣＨ３ドメインの融解温度を測定することによって評価することができる。従って、さらなる実施形態では、ＣＨ３ドメインは約６８℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは約７０℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは約７２℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは約７３℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは約７５℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは約７８℃以上の融解温度を有する。一部の態様では、二量体化したＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、又は８５℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。
【０１６８】
一部の実施形態では、修飾されたＣＨ３配列をさらに含むヘテロ二量体Ｆｃを含むＦｃ構築物は、発現された生成物におけるホモ二量体Ｆｃに比べて少なくとも約７５％の純度で形成することができる。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは約８０％を超える純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは約８５％を超える純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは約９０％を超える純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは約９５％を超える純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは約９７％を超える純度で形成される。一部の態様では、Ｆｃは発現される際、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％を超える純度でヘテロ二量体形成される。一部の態様では、Ｆｃは、単一細胞を介して発現される際、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％を超える純度で形成されるヘテロ二量体である。
【０１６９】
単量体のＦｃポリペプチドを修飾してヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する追加の方法は、ＷＯ９６／０２７０１１（ノブ・イントゥ・ホール）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ．ら．（２０１０）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏ  ａｃｈｉｅｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓら．（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ら．（２０１０）、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  （ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＬａｂｒｉｊｎら、［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ１  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｆａｂ−ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ．  Ｌａｂｒｉｊｎ  ＡＦ，  Ｍｅｅｓｔｅｒｓ  ＪＩ，ｄｅ  Ｇｏｅｉｊ  ＢＥ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｅｍｅｒ  ＥＴ，Ｎｅｉｊｓｓｅｎ  Ｊ，ｖａｎ  Ｋａｍｐｅｎ  ＭＤ，Ｓｔｒｕｍａｎｅ  Ｋ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ  Ｓ，Ｋｕｎｄｕ  Ａ，Ｇｒａｍｅｒ  ＭＪ，ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ  ＰＨ，ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ  ＪＧ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  Ｊ，Ｐａｒｒｅｎ  ＰＷ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３、Ｍａｒ．２６；１１０（１３）：５１４５−５０に記載されている。
【０１７０】
３．ヘテロ多量体の機能的特徴
本発明に係るヘテロ多量体は、ＦｃγＲ及びＣ１ｑに対する大きく低下した／除去された結合を示す。加えて、特定の実施形態では、ヘテロ多量体はまた、追加の望ましい特性、たとえば、安定性、ＦｃＲｎを結合する能力、及び望ましくない生成物又は不純物からの所望の発現生成物の精製を円滑にする特性も示す。
【０１７１】
一実施形態では、本発明は、ＦｃγＲ受容体には測定可能には結合しないがＦｃＲｎには結合するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体を想定しており、それによって、これは、生体内での抗体の半減期は重要であるがエフェクター機能（たとえば、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ及びＡＤＣＣ）は不要であるか又は有害である適用に対する望ましい候補になる。
【０１７２】
ＦｃγＲ又はＣ１ｑに結合するＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体の能力を測定する方法は当該技術で既知であり、本明細書の別の場所に記載されている。
【０１７３】
３ａ．ＦｃγＲ及び補体への低下した／除去された結合
本発明に係るヘテロ多量体は親ポリペプチドに比べてＦｃγＲ及びＣ１ｑへの低下した／除去された結合を示す。一実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体は、親ポリペプチドのＫＤよりも少なくとも５倍高いＦｃγＲ及びＣ１ｑに対するＫＤを示す。別の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体は当該技術で既知の結合アッセイによって測定して、親ポリペプチドのＫＤよりも少なくとも１０倍大きいＦｃγＲ及びＣ１ｑに対するＫＤを示す。当該技術で既知の結合アッセイには、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）及びＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）に基づくアッセイ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）（増幅発光近接均質アッセイ）、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）としても知られる）、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、ゲル電気泳動、及びゲル濾過を含むクロマトグラフィが挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他の方法は一部の融合相手又は抗体の標識を活用してもよい。アッセイは、比色、蛍光、発光、又は放射性同位元素の標識を含むが、これらに限定されない種々の検出方法を採用してもよい。
【０１７４】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、ＦｃγＲＩＩａＨに対する５μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対する１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対する３０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対する２０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対する６μＭを超えるＫＤ、及びＦｃγＲＩａに対する６．５ｎＭを超えるＫＤを有する。別の実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定して、ＦｃγＲＩＩａＨに対する１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩａＲに対する１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩｂに対する１０μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＦに対する６μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩＩＩａＶに対する６μＭを超えるＫＤ、ＦｃγＲＩａに対する３０ｎＭを超えるＫＤを有し、且つ、Ｃ１ｑに結合しない。
【０１７５】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体は標準のアッセイによって測定して、検出可能なレベルのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣを示さない。エフェクター機能を調べる標準のアッセイの非限定例には、ここで提供される実施例に記載されるものが挙げられる。
【０１７６】
３ｂ．安定性
たとえば、安定性を含むヘテロ多量体の生物物理学的な特性は当該技術で既知の種々の方法を用いて評価される。タンパク質の安定性は、折り畳まれた状態とほどかれた状態の間での熱力学的平衡を測定することによって決定されてもよい。たとえば、化学変性剤、熱又はｐＨを用いて本発明のヘテロ多量体をほどいてもよく、円偏光二色性分光法、蛍光分光法、吸収分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定及びタンパク質分解を含むがこれらに限定されない方法を用いて、この推移をモニターしてもよい。当業者によって十分に理解されるように、これらの及び他の技法を用いて、折り畳むこととほどくことの推移の動態パラメータをモニターしてもよい。当該技術で既知の多種多様な方法を用いて、ヘテロ多量体の溶解性及び全体的な構造的完全性を定量的に又は定性的に測定してもよい。
【０１７７】
ヘテロ多量体の生物物理学的特性を特徴づけるのに使用することができる方法には、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及び逆相高速液体クロマトグラフィのようなクロマトグラフィ、ペプチドマッピング、多糖類マッピング、質量分光測定法、紫外線吸収分光法、蛍光分光法、円偏光二色性分光法、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、分析用超遠心分離、動的光散乱、タンパク質分解、及び架橋、濁度測定、フィルター遅延アッセイ、免疫アッセイ、蛍光色素結合アッセイ、タンパク質染色アッセイ、顕微鏡、及びＥＬＩＳＡ、又は他の結合アッセイを介した凝集体の検出が挙げられる。Ｘ線結晶法及びＮＭＲ分光法を用いた構造解析も使用され得る。一実施形態では、安定性及び／又は溶解性は、何らかの規定時間の後、タンパク質溶液の量を測定することによって測定されてもよい。このアッセイでは、タンパク質は、何らかの極端な条件、たとえば、高温、低ｐＨ、若しくは変性剤の存在に暴露されてもよいし、又は暴露されなくてもよい。機能は通常、安定で、可溶性であり、且つ／又はよく折り畳まれた／構造化されたタンパク質を必要とするので、前述の機能的アッセイ及び結合アッセイもそのような測定を行う方法を提供する。たとえば、ヘテロ多量体を含む溶液を標的抗原を結合する能力についてアッセイし、次いで１以上の規定時間のあいだ高温に暴露し、次いで再び抗原結合についてアッセイすればよい。ほどけて凝集したタンパク質は抗原を結合できるとは期待されないので、残っている活性量が、抗体の安定性及び溶解性の測定を提供する。
【０１７８】
一実施形態では、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体は、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体の１以上のドメインの融解温度によって測定して、安定である。ヘテロ多量体の融解温度は、当該技術で既知の、本明細書の別の場所でさらに詳細に記載される方法に従って決定することができる。たとえば、ヘテロ多量体の融解温度は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定することができ、ヘテロ多量体のサーモグラムを生成することができる。一実施形態では、ヘテロ多量体は、サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始が６５℃以上であるＩｇＧＦｃ構築物を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体は、サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始が６６℃以上であるＩｇＧＦｃ構築物を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体は、サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始が６８℃以上であるＩｇＧＦｃ構築物を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体は、サーモグラムにおけるＩｇＧＦｃ構築物の融解の開始が７０℃以上であるＩｇＧＦｃ構築物を含む。
【０１７９】
別の実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は親ポリペプチド又は抗体のＣＨ２ドメインの融解温度より高いか又はそれに等しい融解温度を持つＣＨ２ドメインを有する。一実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は親ＣＨ２ドメインの融解温度より約１〜２℃高い融解温度を持つＣＨ２ドメインを有する。一実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物が親ＣＨ２ドメインの融解温度より約２〜３℃高い融解温度を持つＣＨ２ドメインを有する。一実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物は親ＣＨ２ドメインの融解温度より約１〜２℃高い融解温度を持つＣＨ２ドメインを有し、該ヘテロ多量体はＡＡＣ４及びＡＡＣ５によって例示されるアミノ酸修飾を含む。一実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物が親ＣＨ２ドメインの融解温度より約２〜３℃高い融解温度を持つＣＨ２ドメインを有し、該ヘテロ多量体は、ＡＡＣ２、ＡＡＣ９、ＡＡＣ１０、ＡＡＣ１１、ＡＡＣ１２、ＡＡＣ１３、ＡＡＣ１４、及びＡＡＣ１５によって例示されるアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、該ＩｇＧＦｃ構築物が親ＣＨ２ドメインの融解温度より約４℃高い融解温度を持つＣＨ２ドメインを有し、該ヘテロ多量体はＡＡＣ６によって例示されるアミノ酸修飾を含む。
【０１８０】
３ｃ．ＦｃＲｎの結合
当該技術で知られるように、ＦｃＲｎへの結合は、エンドサイトーシスで取り込まれた抗体をエンドソームから血流へリサイクルする（Ｒａｇｈａｖａｎら，１９９６，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅら，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９−７６６）。この過程は、完全長分子の大きなサイズによる腎臓濾過の除外と相まって、１週間から３週間に及ぶ抗体の好ましい血清半減期を生じる。ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、抗体輸送でも鍵となる役割を担う。従って、一実施形態では、本発明のヘテロ多量体はＦｃＲｎに結合することができる。
【０１８１】
４．ヘテロ多量体の構成
４ａ．抗原結合ドメイン
一実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物のみから成る。他の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物と１以上の抗原結合ドメインとを含む。一実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物と抗原結合ドメイン１つとを含む。別の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物と抗原結合ドメイン２つとを含む。別の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物と抗原結合ドメイン３つとを含む。別の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物と抗原結合ドメイン４つとを含む。別の実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物と最大で６つの抗原結合ドメインとを含む。
【０１８２】
当該技術で既知の方法に従って、抗原結合ドメインをＩｇＧＦｃ構築物に融合することができる。
【０１８３】
一実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧＦｃ構築物を含み、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、抗原結合ペプチド、Ｆｃ融合タンパク質、又は抗原を結合することが可能なタンパク質から選択される。
【０１８４】
一実施形態では、ヘテロ多量体は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むＩｇＧＦｃ構築物を含み、少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＩＬ−２Ｒのα鎖（ＣＤ２５）、アミロイドβ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＢＬｙＳ（又はＢＡＦＦ）、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＲＳＶのＦタンパク質、Ｇ２５０、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体、Ｈｓｐ９０、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＬ−ｌβ、ＩＬ−５、ＩＬ−６受容体、インテグリンα−４／β−１、ムチン１６／ＣＡ−１２５、ＲＡＮ  Ｌ、ＴＮＦα、ＶＥＧＦ−Ａ、及び他の治療上有利な標的から選択される標的抗原を結合する。
【０１８５】
一実施形態では、ヘテロ多量体は第１及び第２のＦｃポリペプチドを有するＩｇＧＦｃ構築物を含み、各Ｆｃポリペプチドは修飾されたヒンジ領域を含み、該ヘテロ多量体は、アレムツズマブ、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネウズマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、セデリズマブ、セルトリズマブペゴル、シドフシツズマブ、シドツズマブ、ダクリズマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、イノツズマブオゾガミシン、イピリムマブ、ラベツズマブ、リンツズマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オクレリズマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペルツッズマブ、ペキセリズマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、シブロツズマブ、シプリズマブ、ソンツズマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウロトキサズマブ、及びビシリズマブから選択される、治療潜在力を持つヒト化モノクローナル抗体に由来する。
【０１８６】
別の実施形態では、ヘテロ多量体は、たとえばリツキシマブ又はトラスツズマブなどの、治療用抗体に由来するＩｇＧＦｃ構築物を含む。
【０１８７】
４ｂ．抗体／薬物抱合体
本発明に係るヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物及び／又はヘテロ多量体の他のドメインに連結される１以上の毒性薬物分子を含むことができることがさらに想定される。毒性薬物分子には細胞の機能を阻害する若しくは妨害する及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質が含まれる。一実施形態では、１以上の毒性薬物分子を、ＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体に連結することができる。別の実施形態では、１以上の毒性薬物分子を、ＩｇＧＦｃ構築物及び少なくとも１つの抗原結合ドメインを含むヘテロ多量体に連結することができる。ＩｇＧＦｃ構築物に連結することができる好適な毒性薬物分子は、放射性同位元素（たとえば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素）、化学療法剤、及びたとえば、その断片及び／又は変異体を含む細菌、真菌、植物若しくは動物が起源の小分子毒素又は酵素的に活性のある毒素のような毒素から選択される。
【０１８８】
ＩｇＧＦｃ構築物に連結することができる好適な化学療法剤は、たとえば、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）サイクロホスファミドのようなアルキル化剤；たとえば、ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ、及びウレドーパのようなアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミンを含むエチレンイミン及びメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）を含む）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ビロスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；たとえば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードのようなナイトロジェンマスタード；たとえば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチンのようなニトロソウレア；たとえば、エネジイン抗生剤（たとえば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンγ１Ｉ及びカリケアミシンωＩ１（たとえば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）のような抗生剤；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラミシン；同様にネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エネジイン抗生剤発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注入（ＤＯＸＩＬ（登録商標））及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、プロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；たとえば、メソトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような抗代謝薬；たとえば、デノプテリン、メソトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートのような葉酸類似体；たとえば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオクスウリジンのようなピリミジン類似体；カルステレオン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンのようなアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎薬；フロリン酸のような葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサンントレン；エダトラキセート；デフォファミド；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；マイタンシン及びアンサミトシンのようなマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２' ，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリクロテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベルラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムシチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（"Ａｒａ−Ｃ"）；チオテパ；タキソイド、たとえば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作したナノ粒子の形成（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））、及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メソトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのような白金類似体；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））；オキサリプラチン；レウコボビン；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸のようなレチノイド；上記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、たとえば、サイクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの組み合わせ療法の略記であるＣＨＯＰ、及び５−ＦＵ及びレウコボビンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による治療計画の略記であるＦＯＬＦＯＸのような上記の２つ以上の組み合わせから選択される。
【０１８９】
４ｃ．非相同性のペプチド又はポリペプチド
本発明に係るヘテロ多量体は１以上の非相同性のペプチド又はポリペプチドに連結されたＩｇＧＦｃ構築物を含むことがさらに想定される。１以上の非相同性のペプチド又はポリペプチドは、たとえば、検出可能なマーカー、リガンド／受容体の対のメンバー、酵素／基質の対のメンバー及び蛍光共鳴エネルギー移動の対のメンバーから選択される。
【０１９０】
５．ヘテロ多量体を作製し、精製する方法
上述のように、本発明に係るヘテロ多量体は第１及び第２のＦｃポリペプチドを含むＩｇＧＦｃ構築物を含む。ヘテロ多量体がＩｇＧＦｃ領域のみを含み実施形態、又はヘテロ多量体がさらに１以上の抗原結合ドメイン若しくは非相同性タンパク質を含む実施形態において、双方のＦｃポリペプチドは当該技術で既知の組換えＤＮＡ法を用いて容易に調製することができる。そのような分子をコードする核酸の設計は十分に、当業者の常識の範囲内である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第３版，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，第２版，１９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第４版，１９９９）；並びにＧｌｉｃｋ及びＰａｓｔｅｒｎａｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  （ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，第２版，１９９８）に記載されたもののような標準の技法を、組換え核酸法、核酸合成、細胞培養、導入遺伝子の組み入れ、及び組換えタンパク質の発現に使用することができる。
【０１９１】
本明細書の別の場所で示されるように、ＩｇＧ重鎖に由来するＦｃポリペプチドの核酸配列及びアミノ酸配列は当該技術で既知であり、核酸及び／又はタンパク質の配列決定法を用いて容易に決定することができる。本明細書で記載される非相同性タンパク質又は毒性薬物分子をＦｃポリペプチドに遺伝的に融合する方法は当該技術で既知であり、一部は以下及び実施例に記載される。
【０１９２】
Ｆｃポリペプチドの発現に好適な発現ベクター及び宿主細胞、並びに、必要に応じて、抗原結合ドメインをコードするポリペプチドも以下に記載されるように当該技術で周知である。
【０１９３】
５．１  ベクター及び宿主細胞
ヘテロ多量体のポリペプチドの組換え発現は、必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られている時点で、当該技術で周知の技法を用いた組換えＤＮＡ法によってポリペプチドの作出のためのベクターを作出してもよい。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法が本明細書で記載される。当業者に周知である方法を用いてポリペプチドのコーディング配列及び適当な転写シグナル及び転写制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえば、試験管内組換えＤＮＡ法、合成法及び生体内遺伝子組換えが挙げられる。従って、本発明はプロモータに操作可能に連結された、ヘテロ多量体のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
【０１９４】
従来の技法によって発現ベクターを宿主細胞に移入し、次いで、形質移入された細胞を従来の技法によって培養して本発明の方法で使用するためのポリペプチドを産生させる。特定の実施形態では、方法で使用するためのポリペプチドは、以下で詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、宿主細胞で同時発現させる。
【０１９５】
種々の宿主／発現ベクター系を利用してポリペプチドを発現させてもよい。そのような宿主／発現ベクター系は、それによって当該コーディング配列が作製されてその後精製されるビヒクルを表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又は形質移入されるとその場でポリペプチドを発現する細胞も表す。これらには、ポリペプチドのコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換させた細菌（たとえば、大腸菌及び枯草菌）；修飾した重鎖及び軽鎖のコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；ポリペプチドのコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ポリペプチドのコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた又は組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；又は哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモータ（たとえば、メタロチオネインプロモータ）又は哺乳類ウイルスに由来するプロモータ（たとえば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築物を持つ哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＳＯ、及び３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、大腸菌のような細菌細胞、又は真核細胞が、組換え抗体又は融合タンパク質分子であるポリペプチドの発現に使用される。たとえば、ヒトのサイトメガロウイルスに由来する主要中間初期遺伝子プロモータ要素のようなベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞は抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，１９８６，Ｇｅｎｅ、４５：１０１；及びＣｏｃｋｅｔｔら，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２）。特定の実施形態では、各ヘテロ二量体の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的なプロモータ、誘導性のプロモータ又は組織特異的なプロモータによって調節される。
【０１９６】
哺乳類の宿主細胞では、ウイルスに基づく複数の発現系が利用されてもよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、修飾された重鎖及び軽鎖をコードする当該配列はアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、たとえば、後期プロモータ及び三部分リーダー配列に連結されてもよい。次いでこのキメラ遺伝子を試験管内又は生体内の組換えによってアデノウイルスのゲノムに挿入してもよい。ウイルスのゲノムの非必須の領域（たとえば、領域Ｅ１又はＥ３）における挿入は、感染させた宿主にて生存可能で、ポリペプチドを発現することが可能である組換えウイルスを生じるであろう（たとえば、Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３５５−３５９を参照）。特定の開始シグナルも、挿入された抗体コーディング配列の効率的な翻訳に必要であろう。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドン及び隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドンは所望のコーディング配列の読み取りフレームと一致して挿入物全体の翻訳を確保しなければならない。これらの外来性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の双方のものである種々の起源のものであることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサ要素、転写ターミネータ等を含めることによって高めうる（たとえば、Ｂｉｔｔｎｅｒら，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照）。
【０１９７】
ヘテロ多量体のポリペプチドの発現は、当該技術で既知のプロモータ要素又はエンハンサ要素によって制御され得る。ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を制御するのに使用され得るプロモータには、ＳＶ４０早期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３'末端反復配列に含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７）、ヘルペスのチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７８．１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２）、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモータ（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５５５１）；たとえば、β−ラクタマーゼプロモータ（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７５：３７２７−３７３１）、又はｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：２１−２５；「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、１９８０、２４２：７４−９４も参照）のような原核細胞の発現ベクター；ノパリン合成酵素プロモータ領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ、３０３：２０９−２１３）又はカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモータ（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）、及び光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモータ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ、３１０：１１５−１２０）を含む植物の発現ベクター；酵母又は他の真菌に由来するプロモータ要素、たとえば、Ｇａｌ４プロモータ、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータ、及び、組織特異性を示しトランスジェニック動物で利用されている以下の動物の転写制御領域：膵臓の腺房細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、７：４２５−５１５）；膵臓のβ細胞で活性があるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：１１５−１２２）、リンパ系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ、３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳腺、リンパ系の細胞及び肥満細胞で活性があるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４５：４８５−４９５）、肝臓で活性があるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓で活性があるα−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５：５３−５８；肝臓で活性があるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄系細胞で活性があるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ、４６：８９−９４；脳における乏突起膠細胞で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ、４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２８３−２８６）；ニューロン細胞で活性があるニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９９９、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１−８３）；ニューロン細胞で活性がある脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．２５３：８１８−８２３）；星状細胞で活性があるグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモータ（Ｇｏｍｅｓら、１９９９、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３２（５）：６１９−６３１；Ｍｏｒｅｌｌｉら、１９９９、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１−８３）及び視床下部で活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４：１３７２−１３７８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
加えて、挿入配列の発現を調節するか、又は所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾及びプロセッシングする、宿主細胞の株を選択してもよい。特定のプロモータからの発現は特定の誘導因子の存在下で高めることができるので、遺伝子操作された融合タンパク質の発現は制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、翻訳並びに翻訳後のプロセッシング及び修飾（たとえば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化）について特徴的で特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株又は宿主系を選択して、発現される外来タンパク質の所望の修飾及びプロセッシングを確保することができる。たとえば、細菌系における発現はグリコシル化されない産物を生じ、酵母における発現はグリコシル化された産物を生じるであろう。遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセッシング（たとえば、グリコシル化及びリン酸化）のための細胞機構を持つ真核宿主細胞が使用され得る。そのような哺乳類の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ−２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＮＳＯ、及び特に神経細胞株、たとえば、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９８４、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７３：５１−５７）、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８２、７０４：４５０−４６０）、Ｄａｏｙヒト脳髄芽細胞腫（Ｈｅら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１１４４−１１４８）、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ膠芽細胞腫細胞（Ｋｒｕｓｅら、１９９２、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９−６１４）、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９７０、３０：２１１０−２１１８）、１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７７、７４：４８１６）、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８４、４９：２６９）、Ｕ８７ＭＧヒト膠芽細胞腫−星状細胞腫（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１９６８、７４：４６５−４８６）、Ａ１７２ヒト膠芽細胞腫（Ｏｌｏｐａｄｅら、１９９２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２５２３−２５２９）、Ｃ６ラット膠芽細胞腫細胞（Ｂｅｎｄａら、１９６８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６１：３７０−３７１）、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９７０、６５：１２９−１３６）、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９６２、４８：１１８４−１１９０）、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎら、１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４８：２１１−２２１）、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常星状細胞（Ｈａａｐａｌａら、１９８５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：８２７−８３３）、Ｍｐｆフェレットの脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅら、１９８２、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：９５２−９６０）、及びたとえば、ＣＴＸ  ＴＮＡ２ラット正常脳皮質（Ｒａｄａｎｙら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６４６７−６４７１）たとえば、ＣＲＬ７０３０及びＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、様々なベクター／宿主発現系は様々な程度にプロセッシング反応を達成し得る。
【０１９９】
組換えタンパク質の長期の高収率産生には、安定な発現が好ましいことが多い。たとえば、本発明のポリペプチド（たとえば、抗体又は融合タンパク質）を安定して発現する細胞株が操作されてもよい。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するよりむしろ、適当な発現制御要素（たとえば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位等）によって制御されたＤＮＡ及び選択可能なマーカーによって宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、強化された培地にて操作された細胞を１〜２日増殖させてもよく、次いで選択培地に入れ換える。組換えプラスミドにおける選択可能なマーカーは選抜に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に統合し、増殖して細胞増殖巣を形成することを可能にし、次いでこれをクローン化して細胞株へと拡張させることができる。
【０２００】
単純性ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９７７，Ｃｅｌｌ、１１：２２３）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ及びＳｚｙｂａｌｓｋｉ，１９６２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４８：２０２６）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら，１９８０，Ｃｅｌｌ、２２：８１７）を含むが、これらに限定されない多数の選抜系が使用されてよく、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞にて遺伝子を使用することができる。また、メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら，１９８１，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら，１９８４，Ｇｅｎｅ、３０：１４７）遺伝子についての選抜の基礎として抗代謝物耐性を用いることができる。
【０２０１】
抗体／薬物抱合体を調製する方法は当該技術で既知であり、その記載はＵＳ２０１１／０２００５９６にて見いだされる。
【０２０２】
５．２  ヘテロ多量体の精製
組換え法を使用する場合、ヘテロ多量体を細胞内で産生させることができ、又は培地に直接分泌させることができる。ヘテロ多量体が細胞内で産生されるのであれば、最初の工程として、たとえば、遠心分離又は限外濾過によって特定の残渣、宿主細胞又は溶解断片が取り除かれる。ヘテロ多量体が培地に分泌されるのであれば、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過ユニットを用いて一般に先ず、そのような発現系の上清を濃縮する。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を上述の工程のいずれかで含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生剤を含めて偶発的な混入物の増殖を妨げてもよい。
【０２０３】
細胞から調製されるヘテロ多量体組成物は、たとえば、クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製することができ、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は、ヘテロ多量体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４の重鎖に基づく抗体を精製するのに使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧはマウスのアイソタイプすべて及びヒトのγ３について推奨される（Ｇｕｓｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用可能である。たとえば、制御された孔のガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。ヘテロ多量体がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、たとえば、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィ、ヘパリンでのクロマトグラフィ、アニオン又はカチオンの交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィ、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安沈殿も、回収されるヘテロ多量体に応じて利用可能である。
【０２０４】
予備精製工程に続いて、当該ヘテロ多量体と混入物を含む混合物は、好ましくは低塩濃度（たとえば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される、約２．５〜４．５のｐＨでの溶出緩衝液を用いた低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供されてもよい。
【０２０５】
本発明のヘテロ多量体は、ＩｇＧＦｃ構築物の第１及び第２のＦｃポリペプチドに非対称性のアミノ酸修飾を含む。その結果、Ｆｃポリペプチドの固有の特性のために、Ｆｃポリペプチドが一緒に発現される場合、生じる産物は、第１のＦｃポリペプチドのホモ二量体、第２のＦｃポリペプチドのホモ二量体、並びに第１及び第２のポリペプチドのヘテロ二量体を含むであろう。
【０２０６】
一実施形態では、ヘテロ多量体は発現の後、精製又は単離される。発現の方法は本明細書の別の場所に記載されている。当業者に既知の種々の方法でタンパク質を単離又は精製してよい。標準の精製法には、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティ、サイジング又はゲル濾過を含むクロマトグラフィ法、及びたとえば、ＦＰＬＣ及びＨＰＬＣのような系を用いた常圧又は高圧で実施される逆相クロマトグラフィが挙げられる。精製方法にはまた、電気泳動法、免疫法、沈殿法、透析法及びクロマト分画法も挙げられる。タンパク質の濃縮と併せた限外濾過法及び透析濾過法も有用である。当該技術で周知のように、種々の天然のタンパク質はＦｃ及び抗体を結合し、これらのタンパク質はヘテロ多量体の精製のために本発明で使用することができる。たとえば、細菌のプロテインＡ及びプロテインＧはＦｃ領域に結合する。同様に、細菌のプロテインＬは、当然、抗体の標的抗原を結合するので、一部の抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は特定の融合相手によって可能になり得ることが多い。たとえば、抗体は、ＧＳＴ融合が採用されるのであれば、グルタチオン樹脂を用いて精製し、Ｈｉｓタグが採用されるのであれば、Ｎｉ＋２アフィニティクロマトグラフィを用いて精製し、又はｆｌａｇタグが使用されるのであれば、不動化した抗ｆｌａｇ抗体を用いて精製しうる。好適な精製法における一般的な指針については、たとえば、その全体が参照によって本明細書に本明細書に組み入れられるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。必要な精製の程度は抗体のスクリーニング及び使用に応じて変化するであろう。場合によっては、精製は必要ではない。たとえば、一実施形態では、抗体が分泌されるのであれば、スクリーニングは培地から直接行われる。当該技術で周知のように、選抜の一部の方法にはタンパク質の精製は関与しない。従って、たとえば、抗体のライブラリがファージディスプレイライブラリにされるのであれば、タンパク質の精製は実施されなくてもよい。
【０２０７】
従って、一実施形態では、ヘテロ多量体はＩｇＧＦｃ構築物を含み、ＩｇＧＦｃ構築物の発現が、ホモ二量体Ｆｃ領域を伴ったＩｇＧＦｃ構築物とヘテロ二量体Ｆｃ領域を伴ったＩｇＧＦｃ構築物との混合物を生じる場合、たとえば、イオン交換クロマトグラフィのような電荷に基づく精製法を用いてホモ二量体Ｆｃ領域を伴ったＩｇＧＦｃ構築物はヘテロ二量体Ｆｃ領域を伴ったＩｇＧＦｃ構築物から明確に分離される。
【０２０８】
追加の実施形態では、本明細書で記載されるＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体はまた、ホモ二量体Ｆｃ領域の形成ではなくヘテロ二量体Ｆｃ領域の形成を促進するアミノ酸修飾を含む変異体ＣＨ３領域も含むことができる。これらのヘテロ多量体の発現は、ホモ二量体Ｆｃ領域とヘテロ二量体Ｆｃ領域を有するヘテロ多量体の混合物を生じ得る。そのような混合物も上記で示されたような電荷に基づく精製法を用いて分離することができる。この方法で精製することができる例となる変異体には、ＡＡＣ３、ＡＡＣ４及びＡＡＣ５が挙げられる。
【０２０９】
６．ヘテロ多量体の試験
６．１  ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ及びＣ１ｑの結合
特定の実施形態では、産生された免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して所望の特性のみが維持されていることを確かにする。試験管内及び／又は生体内での細胞傷害性アッセイを行ってＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの活性の低下／枯渇を確認する。エフェクター機能を評価する方法はＪｉａｎｇら．（２０１１）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１０：１０１−１１１に記載されている。たとえば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、ヘテロ多量体がＦｃγＲへの結合を欠く（ので、ＡＤＣＣ活性も欠く可能性が高い）がＦｃＲｎへの結合能を保持していることを確かにすることができる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ.９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。当該分子のＡＤＣＣ活性を評価する試験管内アッセイの例はＵＳ５，５００，３６２又はＵＳ５，８２１，３３７にて記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに又はさらに、当該分子のＡＤＣＣ活性は、ＣｌｙｎｅｓらＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）にて開示されたもののような生体内での、たとえば、動物モデルにて評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、ヘテロ多量体がＣ１ｑに結合できず、そのためＣＤＣ活性を欠くことも、確認し得る。補体活性を評価するには、たとえば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）にて記載されたようなＣＤＣアッセイを行ってもよい。ＦｃＲｎへの結合及び生体内でのクリアランス／半減期の測定も当該技術で既知の方法を用いて行うことができる。
【０２１０】
ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又はＥＬＩＳＡに基づく方法によっても測定することができる。ＦｃγＲの結合はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別法）によっても測定することができる。市販のものを使用してＦｃγＲ又はＣ１ｑに結合するヘテロ多量体の能力を測定してもよい。
【０２１１】
６．２  安定性
当該技術で既知の方法に従ってヘテロ多量体の熱安定性を測定することができる。ＩｇＧＦｃ構築物の融解温度は熱安定性を示す。示差走査熱量測定のような技法を用いてＩｇＧＦｃ構築物の融点を測定してもよい（Ｃｈｅｎら（２００３）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０：１９５２−６０；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．６８：４７−５２）。或いは、円偏光二色性（Ｍｕｒｒａｙら．（２００２）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．４０：３４３−９）を用いてＩｇＧＦｃ構築物の熱安定性を測定してもよい。
【０２１２】
親ＣＨ２ドメインのＴｍを測定する方法論は当該技術で十分に記載されている（たとえば、Ｉｏｎｅｓｃｕら、（２００８）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．９７（４）：１４１４−２６を参照）。手短には、ＩｇＧ１のＦｃ領域の融解は、ＣＨ２ドメインの融解についてのものと、ＣＨ３ドメインの融解についてのものの、２つの遷移状態を生じる。これらの遷移状態はＦａｂの存在とは無関係であるが、Ｆａｂの遷移状態によって覆い隠され得る。通常、ＩＧＧ１のＦｃの融解は、ＣＨ２ドメインについて７１℃のＴｍをもつ遷移状態と、ＣＨ３ドメインについて８２℃のＴｍをもつ遷移状態とを生じる。ＣＨ２ドメインのＴｍはそのグリコシル化状態、ヒンジ領域の性質及びＣＨ３ドメインの固有の安定性によって影響される。非グリコシル化及び脱グリコシル化はＣＨ２ドメインのＴｍを１０℃低下させることが知られている。ヒンジのジスルフィドの除去はＣＨ２ドメインのＴｍを１０℃を超えて低下させることが知られている。ＣＨ３ドメインの安定性をＣＨ２ドメインのものよりも低くするＣＨ３ドメインの変化は、ＣＨ２ドメインのＴｍに変化を生じる可能性が高いが、効果を予測するのはさらに難しい。
【０２１３】
７．薬学的組成物
本発明はまた、本発明に係るヘテロ多量体を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は治療上有効な量のヘテロ多量体と薬学的に許容可能なキャリアとを含む。特定の実施形態では、用語「薬学的に許容可能な」は、動物において、さらに詳しくはヒトにおいて使用するために連邦政府若しくは州政府の規制当局によって認可されている、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認識された薬局方に載せられていることを意味する。用語「キャリア」はそれと共に治療剤が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルを指す。そのような薬学的キャリアは、たとえば、水、及び油、動物、植物又は合成を起源とするもの、たとえば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等を含む油のような無菌の液体であり得る。薬学的組成物が静脈内に投与される場合、水が好ましいキャリアである。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は液体キャリア、特に注射用溶液としても採用することができる。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は所望であれば、軽微な量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉剤、徐放性製剤等の形態を取ることができる。組成物は、トリグリセリドのような従来の結合剤及びキャリアと共に坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、たとえば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的なキャリアを含むことができる。好適な薬学的キャリアの例はＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、好適な量のキャリアと一緒に、好ましくは精製された形態での、治療上有効な量の化合物を含有するであろう。製剤は投与の方式に適合すべきである。
【０２１４】
特定の実施形態では、ヘテロ多量体を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた薬学的組成物として、通例の手順に従って製剤化される。通常、静脈内投与用の組成物は無菌で等張の水性緩衝液における溶液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤及びリグノカインのような局所麻酔剤も含んで注射部位での疼痛を和らげ得る。一般に、成分は、たとえば、活性剤の量を指示するアンプル又はサシェのような密閉した容器にて乾燥した凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として単位剤形にて別々に供給されるか、又は一緒に混合される。組成物が注射によって投与されるべきである場合、無菌の医薬等級の水又は生理食塩水を含有する輸液瓶にてそれを分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与の前に成分が混合され得るように無菌の注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２１５】
特定の実施形態では、本明細書で記載される組成物は中性の形態又は塩の形態として製剤化される。薬学的に許容可能な塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもののようなアニオンと共に形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するもののようなカチオンと共に形成されるものが挙げられる。
【０２１６】
治療タンパク質の異常な発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害の治療、抑制及び予防に有効となる本明細書で記載される組成物の量は、標準的な臨床技法によって決定することができる。加えて、試験管内のアッセイを任意で採用して最適な投与量範囲を特定するのに役立ててもよい。製剤で採用される正確な用量は、投与の経路及び疾患又は障害の深刻さにも左右され、主治医の判断及び患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、試験管内の又は動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線から推定される。
【０２１７】
８．治療／使用の方法
上述の方法のいずれかによって生成されるヘテロ多量体を用いて、細胞、組織、臓器、体液、又は一般には宿主におけるヒトの疾患又は特定の病態を診断し、治療し、検出し、又は調節してもよい。本明細書で教示されるように、Ｆｃガンマ受容体への結合及び特定のエフェクター機能を低下させる又は取り除くが、ヘテロ多量体が元々の標的化特性を保持する、抗体のＦｃ領域、Ｆｃ融合タンパク質又はＦｃ断片の修飾は、優れたスペクトルの活性、生物物理学的特性、安定性及び宿主の体内にて持続する能力を伴った抗体及びＩｇＧＦｃ構築物を提供する。
【０２１８】
本発明によって提供される組成物を用いた治療に適している疾患又は病的状態には、たとえば、これに限定されないがアルツハイマー病や、神経障害性疼痛を含む神経障害；皮膚疾患；代謝性疾患；変形性関節症；及び火傷又は外傷から生じる状態；心筋梗塞、鬱血性心不全、発作、虚血性発作及び出血を含むが、これらに限定されない循環器疾患；リウマチ疾患、乾癬及び強皮症を含む一般的な免疫媒介性の障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１９】
一実施形態では、細胞表面分子を標的とするために抗体が使用され、ＦｃγＲが媒介するエフェクター機能から生じるこれらの分子の枯渇が有害効果を有する、疾患の治療に、本発明に係るヘテロ多量体が使用される。
【０２２０】
一実施形態では、本発明に係るヘテロ多量体を使用して、その標的と免疫複合体を形成する抗体についての安全性指標を改善する。
【０２２１】
Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ及びＳｔｒｏｈｌ，ＬＭ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ"  Ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），２２５−２４９ページは、疾患の治療のためにＦｃγＲ媒介性及び補体媒介性エフェクター機能を欠く抗体を使用することの利点の記載を提供する。本発明に係るＩｇＧＦｃ構築物を含むヘテロ多量体は、疾患の治療のためにＦｃγＲ媒介性及び補体媒介性エフェクター機能を欠く抗体を調製することにおいて有用であることが想定される。
【０２２２】
９．キット
本発明はさらに１以上のヘテロ多量体を含むキットを提供する。キットの個々の成分は別々の容器に包装されることになり、そのような容器に関連付けられるものは、医薬又は生物製品の製造、使用及び販売を規制する政府機関によって指示された形態での通知であることができ、その通知は製造、使用及び販売の当局による認可を反映する。キットは任意で、ヘテロ二量体対のための使用方法又は投与計画の概要を示す指示書又は指示を含有してもよい。
【０２２３】
キットの１以上の成分が溶液、たとえば、水溶液又は無菌の水溶液として提供される場合、容器手段はそれ自体、吸入器、注射器、ピペット、点眼器、又はそのような他の器具であり、それから溶液が対象に投与されてもよく、又はキットの他の成分に適用され、混合されてもよい。
【０２２４】
キットの成分はまた、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供されてもよく、キットはさらに、凍結乾燥された成分の再構成のために好適な溶媒を含有することができる。容器の数又は種類にかかわらず、本発明のキットはまた、組成物の患者への投与を手助けするための機器を含んでもよい。そのような機器は、吸入器、鼻スプレー用具、注射器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、又は類似の医学的に認可された送達ビヒクルであってもよい。
【０２２５】
本明細書で記載される実施例及び実施形態は説明目的のみのためものであり、その観点での種々の改変又は変更が当業者に示唆され、本出願の精神及び範囲及び添付のクレームの範囲の範囲内に含められるべきであることが理解される。
【実施例】
【０２２６】
以下の実施例は本発明の実践を説明するように提供される。それらは本発明の範囲全体を限定する又は規定するように意図されるものではない。
【０２２７】
実施例１：抗体構築物（ヘテロ多量体）の調製及び発現
以下の抗体構築物を調製した。抗体構築物はすべて、野生型抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブの配列に基づき（図５、野生型トラスツズマブ重鎖アミノ酸配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；野生型トラスツズマブ軽鎖配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を参照）、アミノ酸変異を含まないＣＨ３ドメインに比べて高い安定性を持つヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進するために重鎖ＣＨ３ドメインにおける以下の付加修飾を導入した。
Ａ鎖：Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｓ４００Ｅ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ及び
Ｂ鎖：Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｎ３９０Ｒ／Ｋ３９２Ｍ／Ｔ３９４Ｗ
【０２２８】
上記修飾を伴ったこの構築物をｖ７９１と呼ぶ。本明細書で記載される配列はすべてＥＵ番号付け方式を用いて番号付けする。
【０２２９】
表Ａ１で示すような重鎖のヒンジ領域及び／又はＣＨ２ドメインにてアミノ酸修飾を伴う追加の変異体をｖ７９１に基づいて構築した。変異体はすべてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７（アミノ酸）及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４（ＤＮＡ）に示すトラスツズマブの軽鎖配列を含んだ。
【０２３０】
（表Ａ１）トラスツズマブに基づく非対称性の抗体構築物
0006567506.tif 000004
１０５１はＳｔｒｏｈｌ（２００９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０：６８５−６９１に記載された対照変異体である。
ＡＡＣ１は、重鎖の一方だけがＬ２３４／Ｌ２３５の二重変異を有する１０５１の非対称型である別の対照変異体である。
ＡＡＣ２〜ＡＡＣ８は非対称性の設計である。
【０２３１】
抗体及び対照をクローニングし、以下のように発現させた。常法を用いて部位特異的変異誘発によってｖ７９１を調製した。最終的なＤＮＡをベクターｐＴＴ５（ＷＯ２００９／１３７９１１を参照）にサブクローニングした。２ｍＬ又は５０ｍＬ又は５００ｍＬのＣＨＯ３Ｅ７細胞にて発現を行った。指数的増殖相（１．５〜２百万個の細胞／ｍＬ）にて、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡの比で１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）水溶液でＣＨＯ細胞に形質移入した（Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．ら．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体を形成するのに最適な濃度範囲を決定するために、ヘテロ二量体の形成を可能にする重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖Ｂの最適なＤＮＡ比（たとえば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／ＬＣ比＝２５：２５：５０％）でＤＮＡを形質移入した。５〜６日後、形質移入した細胞を回収し、４０００ｒｐｍの遠心分離の後培養培地を回収し、０．４５μｍのフィルターを用いて澄んだ液体にした。
【０２３２】
精製プロトコール：澄んだ培養培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに負荷し、ｐＨ７．２の１０カラム容量のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。ｐＨ３．６の１０カラム容量のクエン酸緩衝液で抗体を溶出し、プールした分画はｐＨ１１でのＴＲＩＳで中和した抗体を含有した。プロテインＡで精製した抗体をさらにゲル濾過（ＳＥＣ）で精製した。ゲル濾過のために、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、流速１ｍＬ／分にてAＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣを介してＳｅｐｈａｄｅｘ２００ＨｉＬｏａｄ１６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。流速１ｍＬ／分にてｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を用いた。精製された抗体に対応する分画を回収し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２３３】
表Ａ２は種々の試料についての発現収量を要約する。
0006567506.tif 000005
＊ｎ/ｄ＝測定しなかった
【０２３４】
試料の大半はＷＴ又は対照と類似の発現のレベルを示した。
【０２３５】
実施例２：トラスツズマブに基づく非対称性の抗体構築物はＦｃγＲに結合しない
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＦｃγＲＩＩａＨ、ＦｃγＲＩＩａＲ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａＦ、ＦｃγＲＩＩＩａＶ、及びＦｃγＲＩａに結合する非対称性の抗体構築物の能力を評価した。
【０２３６】
ｐＨ７．４での１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０と共に２５℃にてＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を用いたＳＰＲによって抗体Ｆｃに対するＦｃγＲの親和性を測定した。クエンチされた活性基を残しつつ、およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）が不動化され、２５μＬ／分にて１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中の４．０μｇ／ｍＬを注入することによって活性化ＧＬＭセンサーチップ上で組換えＨＥＲ−２を捕捉した。緩衝液注入に続いて２５μＬ／分で２４０秒間（およそ５００ＲＵを生じる）注入する際に４０μｇ／ｍＬの精製されたＨＥＲ−２／ｎｅｕに基づく抗体を間接的に捕捉し、安定なベースラインを確立した。１８０秒の解離相と共に６０μＬ／分で１２０秒間ＦｃγＲを注入し、一組の結合センサーグラムを得た。２又は３つの独立実験の平均値として報告された値と共に平衡適合モデルを用いて結合等温線から結果として得られるｋＤ値を決定した。
【０２３７】
ＳＰＲによって測定した、ＷＴに対する各変異体についての試験管内の結合Ｋａ比を、表Ｂに示す。
【０２３８】
（表Ｂ）野生型トラスツズマブに対するＦｃγ受容体への結合についてのＳＰＲのＫａ比
0006567506.tif 000006
*ｎ/ｄ＝測定しなかった
１．２ａｈのＫｄは０．４８μＭであった。受容体は１０μＭで流した。「低」はＫｄ＞＞１０μＭを意味し、ＮＢはＫｄ＞＞１００μＭを意味し、＞＞は「はるかに大きい」を示す。
２．２ａｒのＫｄは０．８７μＭであった。受容体は１０μＭで流した。「低」はＫｄ＞＞１０μＭを意味し、ＮＢはＫｄ＞＞１００μＭを意味する。
３．２ｂのＫｄは３．４μＭであった。受容体は１０μＭで流した。「低」はＫｄ＞＞１０μＭを意味し、ＮＢはＫｄ＞＞１００μＭを意味する。
４．３ａｆのＫｄは１．９μＭであった。受容体は６μＭで流した。「低」はＫｄ＞＞６μＭを意味し、ＮＢはＫｄ＞＞６０μＭを意味する。
５．３ａｖのＫｄは０．６０μＭであった。受容体は６μＭで流した。「低」はＫｄ＞＞６μＭを意味し、ＮＢはＫｄ＞＞６０μＭを意味する。
６．１ａのＫｄは０．６５ｎＭであった。受容体は３０ｎＭで流した。「低」はＫｄ＞＞３０ｎＭを意味し、ＮＢはＫｄ＞＞３００ｎＭを意味する。
【０２３９】
変異体のすべては受容体のすべてに対して有意に低下した結合を示した。ほとんどの場合、低い親和性のために、結合は検出できなかった又は定量できなかった。
【０２４０】
実施例３：トラスツズマブに基づく非対称性の抗体構築物はＣ１ｑに結合しない
非対称性の抗体構築物のＣ１ｑに結合する能力を以下のように調べた。ヒトのＣ１ｑはＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。抗体のＳＰＲチップへの不動化は実施例２で記載したとおりであった。実施例２にも記載したような標準のプロトコールを用いてｍＡｂ変異体について注入された３０ｎＭのＣ１ｑをＨＥＲ２のＳＰＲ表面に捕捉した。結果を以下の表Ｃに示す。
【０２４１】
（表Ｃ）Ｃ１ｑ結合アッセイの結果
0006567506.tif 000007
１．Ｃ１ｑは６：１の潜在的な定比性のｍＡｂ：Ｃ１ｑを持つヘテロ三量体の六量体である。結合動態は非常に複雑であり、適切なＫｄを決定することはできなかった。受容体は３０ｎＭで調べた。「部分的」は低下した結合を意味する。「ＮＢ」は検出できない結合を意味する。
【０２４２】
Ｃ１ｑへの低下したが検出可能な結合を示したＡＡＣ１を除いて、変異体はすべてＣ１ｑへの検出可能な結合を示さなかった。
【０２４３】
実施例４：トラスツズマブに基づく非対称性の抗体構築物はＦｃＲｎに結合する
ＦｃＲｎに結合する非対称性の抗体の能力をＳＰＲによって以下のように調べた。
【０２４４】
ヤギ抗ｈＩｇＧポリクローナル抗体によってＳＰＲチップの捕捉表面を調製した。変異体は縦線で上清から捕捉される。最大１μＭで３倍連続希釈のＦｃＲｎの流れを横線で流した。ｐＨ６での重複実験は類似の結果を生じた。ｐＨ７．４での実験を１回行って結合の欠如をチェックした。結果を以下の表Ｄに示す。
【０２４５】
（表Ｄ）ＦｃＲｎへの結合
0006567506.tif 000008
*ｎ/ｄ＝測定しなかった
１．ＦｃＲｎへの結合はｐＨ６．５及び７．４で測定した。ｐＨ６．５でＷＴの結合を伴い、ｐＨ７．４で検出可能な結合がなかった変異体を「結合した」として示した。
【０２４６】
実施例５：非対称性の抗体構築物は熱安定性である
以下のように示差走査熱量測定を用いて非対称性の抗体構築物のＣＨ２ドメインの熱安定性を測定した。実施例１に記載したように各抗体構築物を精製し、ＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＶＰ−キャピラリーＤＳＣによるＤＳＣ解析（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に合計４００μＬを使用した。各ＤＳＣ実験の開始時に、５回の緩衝液ブランク注入を行ってベースラインを安定化し、参照のために各抗体構築物の注入の前に緩衝液注入を行った。低フィードバック、８秒のフィルター、５分のｐｒｅＴｓｔａｔ、及び７０ｐｓｉの窒素圧で６０℃／時間の比率にて２０℃から１００℃まで各試料を走査した。得られたサーモグラムを参照し、Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウエアを用いて解析した。
【０２４７】
調べたヘテロ二量体についての熱ほどき曲線を図２に示す。調べたヘテロ多量体の融解温度を以下の表Ｅに示す。
【０２４８】
（表Ｅ）ヘテロ多量体の熱安定性
0006567506.tif 000009
*ｎ/ｄ＝測定しなかった
１．Ｔｍ開始は、図２のサーモグラムがベースラインを有意に超える最初の点として視覚的に捉えた。
２．Ｔｍは、図２で示すサーモグラムにおける最初の遷移の非２状態モデルを用いてデコンボルーションによって測定した。
【０２４９】
これらの結果は、対照ＷＴと比べた場合、多数の設計がＣＨ２ドメインの高いＴｍ開始及びＴｍを有することを示している。
【０２５０】
実施例６：トラスツズマブに基づく非対称性の抗体構築物の精製
選択した非対称性の抗体構築物を発現させ、ＵＰＬＣ  ＩＥＸ（超高速液体クロマトグラフィ−イオン交換クロマトグラフィ）によって以下のように精製した。
【０２５１】
変異体７９１（ＷＴヘテロ二量体）、ＡＡＣ３（Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ［Ａ鎖］｜Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋ［Ｂ鎖］）及びＡＡＣ５（Ｌ２３４Ｄ／Ｌ２３５Ｅ［Ａ鎖］｜Ｅ２３３Ｋ／Ｌ２３４Ｋ／Ｌ２３５Ｋ［Ｂ鎖］）のＡ鎖及びＢ鎖を５０ｍＬのＣＨＯ培養物にて比１：０（Ａ）、１：１（Ｃ）及び０：１（Ｅ）で発現させた。比ＡとＥはそれぞれＡ鎖及びＢ鎖のホモ二量体を生じた。試料すべてをプロテインＡによって精製し、次いでＰＢＳ緩衝液中でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６００カラムを用いてサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって精製し、その後、ＵＰＬＣ  ＩＥＸに負荷した。以下の条件下でＵＰＬＣ  ＩＥＸを行った（ｐＨ勾配）：溶媒：Ａ、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．４４；Ｂ、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９．２０；Ｃ、ミリＱ水；Ｄ、０．５ＭのＮａ酢酸、ｐＨ９．１３（ｌｏｔ＃０３−Ｄｅｃ−１２）。開始緩衝液：１８％Ａ、２％Ｂ、６８％Ｃ、１２％Ｄ＝２０ｍＭのＮａＰＯ４、６０ｍＭのＮａ酢酸、ｐＨ約５．９；勾配：７．２カラム容積にて２％Ａ、１８％Ｂ、６８％Ｃ、１２％Ｄ＝２０ｍＭのＮａＰＯ４、６０ｍＭのＮａ酢酸、ｐＨ約７．９まで。流速：０．３ｍｌ／分。温度：３０℃。圧力：約４２００ｐｓｉ。カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＭＡｂ、４．６×５０ｍｍ、１．７μｍの粒子、ＳＮ  ＵＳＤＪＡ０１０６１。
【０２５２】
結果を図３Ａに示す。ホモ二量体又はヘテロ二量体に対応する比Ａ、Ｃ及びＥについてのトレースを標識した。実施された場合、反復実験も示す。
【０２５３】
図３Ａは、下ヒンジ領域における非対称性の電荷の導入は、低い受容体結合（実施例３）及び高い熱安定性（実施例５）を有するだけでなく、それがイオン交換クロマトグラフィによってホモ二量体不純物から精製され得る設計を生じるということを示す。
【０２５４】
２つの条件下で変異体の１つ、ＡＡＣ４の分離を調べた。上述のようなｐＨ勾配のもとで、又は以下のような塩勾配のもとでそれを溶出した：溶媒：Ａ、０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ４．４４；Ｂ、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｐＨ９．２０；Ｃ、ミリＱ水；Ｄ、０．５ＭのＮａＣｌ。開始緩衝液：１８％Ａ、２％Ｂ、６８％Ｃ、１２％Ｄ＝２０ｍＭのＮａＰＯ４、６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約５．９。７．２カラム容量における１８％Ａ、２％Ｂ、０％Ｃ、８０％Ｄ（＝２０ｍＭのＮａＰＯ４、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ約５．９）への塩勾配。
【０２５５】
結果を図３Ｂに示す。図は塩勾配によるホモ二量体及びヘテロ二量体の分離がｐＨ勾配のそれに類似したことを示す。
【０２５６】
実施例７：トラスツズマブに基づく非対称性の抗体構築物はＳＫ−ＢＲ−３細胞にてＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性の細胞傷害性）を刺激しない
ＦｃγＲへの測定された結合の欠如が、ＡＤＣＣによって測定されるエフェクター機能を媒介する能力の無さに変わったかどうかを評価するために、ＳＫ−ＢＲ−３細胞におけるＡＤＣＣを刺激する能力について例となる変異体を調べた。ＳＫ−ＢＲ−３細胞はその表面でＨＥＲ２を発現しているのでトラスツズマブに結合し、トラスツズマブの存在下でＮＫ細胞が媒介するＡＤＣＣを可能にする。このアッセイにおけるＡＡ６の活性を表Ａで記載された対照変異体のそれ及び陽性対照のトラスツズマブと比較した。
【０２５７】
使用した細胞株：ＳＫ−ＢＲ−３細胞株（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−３０）、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ（１５８Ｖ／Ｖ）
検出装置：ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３，分子装置
陽性対照抗体：ハーセプチン（商標）（トラスツズマブ）
【０２５８】
細胞培養：３７℃の水槽にてバイアルを穏やかに回転させることによって凍結した細胞を融解した。１〜２分後、バイアルの培地は完全に融解した。バイアルの外側を７０％エタノールで拭った。次いで細胞浮遊液を１５ｍｌの遠心管に移し、その後、事前に温めた完全培地５ｍｌを加えた。５００ｇにて３〜５分間遠心した後、上清を吸引した。１０ｍｌの完全培地を加え、ピペットで数回上下させることによって細胞を再浮遊させた。トリパンブルー染色法によって細胞の生存率を測定した。次いで細胞浮遊液をフラスコに播種した。３７℃、５％ＣＯ２にて細胞を一晩インキュベートした。
【０２５９】
ＡＴＣＣのプロトコールに従って１０％ＦＢＳで補完した好適な培地で、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて維持し、定期的に継代した。
【０２６０】
抗体試料及び標準試料は断熱容器にて運ばれ、試験まで−２０℃で保存した。抗体試料及び標準試料を氷上で融解した後、４℃で保存した。フェノールレッドを含まないＭＥＭ培地（１％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補完された）で試料及び標準試料を希釈し、試験に適用した。
【０２６１】
ＡＤＣＣアッセイ緩衝液は９８％のフェノールレッドを含まないＭＥＭ培地、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ及び１％ＦＢＳで構成された。
【０２６２】
ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ（１５８Ｖ／Ｖ）細胞を従来のように維持した。
【０２６３】
８００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって標的細胞を回収し、アッセイ培地で１回洗浄し、ペレットの上の培地を完全に取り除いた。アッセイ培地で細胞を穏やかに浮遊させ、単一細胞溶液を作った。標的細胞の数を４×細胞ストック（５０μｌのアッセイ培地に１０，０００個の細胞）に調整した。被験物質を当該濃度で調製した。５０μＬの４×標的細胞ストックを９６ウェルアッセイプレートに播種し、５０μｌの４×試料希釈液を加えた。細胞培養インキュベータにてプレートを室温で３０分間インキュベートした。１００μｌのエフェクター細胞（Ｅ／Ｔ＝５：１、すなわち、ウェル当たり５０，０００個のエフェクター細胞）を加え反応を開始し、交差振盪によって穏やかに混合した。１％の最終濃度でエフェクター細胞及び抗体を入れない細胞対照にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて標的細胞を溶解し、これを最大溶解対照とした；エフェクター細胞及び抗体を入れない細胞対照にアッセイ緩衝液を加え、これを最小ＬＤＨ放出対照とした。抗体の非存在下でエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞は、双方の細胞が一緒にインキュベートされた場合の非特異的なＬＤＨ放出のバックグランド対照として設定された。３７℃／５％ＣＯ２のインキュベータで４〜６時間、プレートをインキュベートした。ＬＤＨキットによって細胞の生存率をアッセイした。Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３にてＯＤ４９２ｎｍ及びＯＤ６５０ｎｍでの吸光度データを測定した。
【０２６４】
バックグランド（ＯＤ６５０ｎｍ）を差し引いたＯＤ４９２ｎｍのデータを解析してＬＤＨ放出を検討した。細胞溶解の比率は式に従って算出した。
細胞溶解％＝１００*（１−（ＯＤ試料データ−ＯＤ腫瘍細胞＋エフェクター細胞）／（ＯＤ最大放出−ＯＤ最小放出））
【０２６５】
結果は図４に示し、例となるヘテロ多量体ＡＡ６はこのアッセイにてＡＤＣＣ活性をサイレント化できることを示している。
【０２６６】
実施例８：抗ＣＤ２０抗体リツキシマブに基づく抗体構築物（ヘテロ多量体）の調製及び発現
以下の抗体構築物を調製した。抗体構築物はすべて、野生型抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（図５参照、野生型リツキシマブ重鎖のアミノ酸配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、野生型リツキシマブ軽鎖の配列についてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の配列に基づいたが、アミノ酸変異を含まないＣＨ３ドメインに比べて高い安定性を持つヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進するために重鎖ＣＨ３ドメインにおける以下の付加修飾を導入した。
Ａ鎖：Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖ、及び
Ｂ鎖：Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗ
【０２６７】
上記の変異を持つこの構築物をｖ１２６１と呼ぶ。
【０２６８】
表Ｆに示すような重鎖のヒンジ領域又はＣＨ２ドメインにアミノ酸修飾を伴う追加の変異体をｖ１２６１に基づいて構築した。変異体はすべてさらにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８（アミノ酸）及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９（ＤＮＡ）にて示される軽鎖配列を含む。
【０２６９】
（表Ｆ）リツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物
0006567506.tif 000010
【０２７０】
抗体及び対照を以下のようにクローニングし、発現させた。常法を用いて部位特異変異誘発によってＶ１２６１を調製した。最終的なＤＮＡをベクターｐＴＴ５（国際公開ＷＯ２００９／１３７９１１を参照）にサブクローニングした。５０ｍＬ又は２５０ｍＬのＣＨＯ３Ｅ７細胞にて発現を行った。指数的増殖相（１．５〜２百万個の細胞／ｍＬ）にて、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡの比で１ｍｇ／ｍＬの２５ｋＤａポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）水溶液でＣＨＯ細胞に形質移入した（Ｒａｙｍｏｎｄ，Ｃ．ら．Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／ＬＣ比＝３０：３０：４０％の重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖ＢのＤＮＡ比でＤＮＡを形質移入した。５〜６日後、形質移入した細胞を回収し、４０００ｒｐｍの遠心分離の後培養培地を回収し、０．４５μｍのフィルターで澄んだ液体にした。
【０２７１】
精製プロトコール：澄んだ培養培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに負荷し、ｐＨ７．２の１０カラム容量のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。ｐＨ３．６の１０カラム容量のクエン酸緩衝液で抗体を溶出し、プールした分画はｐＨ１１でのＴＲＩＳで中和した抗体を含有した。プロテインＡで精製した抗体をさらにゲル濾過（ＳＥＣ）で精製した。ゲル濾過のために、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、流速１ｍＬ／分にてＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＦＰＬＣを介してＳｅｐｈａｄｅｘ２００ＨｉＬｏａｄ１６／６００  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。流速１ｍＬ／分にてｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を用いた。精製された抗体に対応する分画を回収し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。
【０２７２】
発現収量は以下のとおりである。
（表Ｇ）発現収量
0006567506.tif 000011
【０２７３】
収量のバッチ間の変動性を考慮すると、試料はすべて対照ＷＴリツキシマブに匹敵するレベルに十分に発現した。
【０２７４】
実施例９：リツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物はＦｃγＲに結合しない
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＦｃγＲＩＩａＨ、ＦｃγＲＩＩａＲ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａＦ、及びＦｃγＲＩＩＩａＶに結合するリツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物の能力を評価した。
【０２７５】
移動用緩衝液としてのｐＨ７．４で３．４ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳと共にＰｒｏｔｅＯｎＸＰＲ３６を２５℃で用いたＳＰＲによって抗体ＦｃへのＦｃγＲの親和性を測定した。およそ３０００共鳴単位（ＲＵ）に達するまで２５μＬ／分で１０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中の４．０μｇ／ｍＬを注入することによってＮＨＳ／ＥＤＣで活性化したＧＬＣセンサーチップにヤギポリクローナル抗ＩｇＧ抗体を不動化し、その後、エタノールアミンで残りの活性基をクエンチした。緩衝液を注入して検体方向で安定なベースラインを確立した後、リガンド方向にて２５μＬ／分で２４０秒間注入する（およそ５００ＲＵの捕捉を生じる）ことによって４０μｇ／ｍＬの精製したリツキシマブに基づく抗体を間接的に捕捉した。その後、１８０秒の解離相と共に５０μＬ／分で１２０秒間ＦｃγＲを注入して一組の結合センサーグラムを得た。ＰｒｏｔｅｏｎＭａｎａｇｅｒソフトウエアにて平衡適合モデルを用いて二重参照のセンサーグラムから結果的なＫｄ（親和性）値を決定した。２又は３回の独立した実験の平均値として報告された値。
【０２７６】
ＳＰＲによって測定した、各変異体についてのＷＴに関する試験管内の結合Ｋａ比を表Ｈに示す。
（表Ｈ）野生型トラスツズマブに関するＦｃγ受容体への結合についてのＳＰＲのＫａ比
0006567506.tif 000012
【０２７７】
対照ＷＴリツキシマブで変異を運ぶヘテロ二量体１２６１は、ホモ二量体ＷＴトラスツズマブに比べて受容体に対する親和性をわずかに上げた。変異を運ぶヘテロ二量体を含有する変異体は、Ｆｃγ受容体に対する有意に低下した結合又は検出できない結合を示した。
【０２７８】
実施例１０：リツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物は熱安定性である
示差走査熱量測定を以下のように用いて、リツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物のＣＨ２ドメインの熱安定性を測定した。各抗体構築物を実施例８に記載したように精製し、ＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＶＰキャピラリＤＳＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるＤＳＣ解析に合計４００μＬを用いた。各ＤＳＣ実験の開始時に、５回の緩衝液ブランクの注入を行ってベースラインを安定化し、参照のための各抗体構築物の注入の前に緩衝液の注入を行った。低フィードバック、８秒のフィルター、５分のｐｒｅＴｓｔａｔ、及び７０ｐｓｉの窒素圧で６０℃／時間の比率にて２０℃から１００℃まで各試料を走査した。得られたサーモグラムを参照し、Ｏｒｉｇｉｎ７ソフトウエアを用いて解析した。
【０２７９】
調べたヘテロ多量体の融解温度を以下の表Ｉに示す。
（表Ｉ）ヘテロ多量体の熱安定性
0006567506.tif 000013
１．最初の遷移状態はリツキシマブのＦＡＢ及びＣＨ２ドメイン双方のほどきを含んだ。Ｔｍは最初の遷移状態の非２状態モデルを用いてデコンボルーションによって測定した。
【０２８０】
これらの結果は、多数の設計が対照ＷＴと比べるとＣＨ２ドメインの高いＴｍ開始及びＴｍを有することを示している。
【０２８１】
実施例１１：リツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物はＤａｕｄｉ細胞におけるＡＤＣＣを刺激しない
ＦｃγＲへの測定された結合の欠如が、ＡＤＣＣによって測定されるエフェクター機能を媒介する能力の無さに変わったかどうかを評価するために、Ｄａｕｄｉ細胞におけるＡＤＣＣを刺激する能力について選択された変異体を調べた。Ｄａｕｄｉ細胞はその表面にＣＤ２０を発現しているのでリツキシマブに結合し、リツキシマブの存在下でＮＫ細胞が媒介するＡＤＣＣを可能にする。このアッセイにおける選択された変異体の能力を表Ｆに記載された対照リツキシマブ変異体のそれ及び市販のリツキシマブと比較した。
【０２８２】
使用した細胞株：Ｄａｕｄｉ細胞株（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＣＬ−２１３）、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ（１５８Ｖ／Ｖ）
検出装置：ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３、分子装置
陽性対照抗体：リツキシマブ
【０２８３】
細胞培養：３７℃の水槽にてバイアルを穏やかに回転させることによって凍結した細胞を融解した。１〜２分後、バイアルの培地は完全に融解した。バイアルの外側を７０％エタノールで拭った。次いで細胞浮遊液を１５ｍｌの遠心管に移し、その後、事前に温めた完全培地５ｍｌを加えた。５００ｇにて３〜５分間遠心した後、上清を吸引した。１０ｍｌの完全培地を加え、ピペットで数回上下させることによって細胞を再浮遊させた。トリパンブルー染色法によって細胞の生存率を測定した。次いで細胞浮遊液をフラスコに播種した。３７℃、５％ＣＯ２にて細胞を一晩インキュベートした。
【０２８４】
ＡＴＣＣのプロトコールに従って１０％ＦＢＳで補完した好適な培地で、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて維持し、定期的に継代した。
【０２８５】
抗体試料及び標準試料は断熱容器にて運ばれ、試験まで−２０℃で保存した。抗体試料及び標準試料を氷上で融解した後、４℃で保存した。フェノールレッドを含まないＭＥＭ培地（１％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで補完された）で試料及び標準試料を希釈し、試験に適用した。
【０２８６】
ＡＤＣＣアッセイ緩衝液は９８％のフェノールレッドを含まないＭＥＭ培地、１％ＦＢＳ及び１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐで構成された。
【０２８７】
ＮＫ９２／ＦｃＲγ３ａ（１５８Ｖ／Ｖ）細胞を従来のように維持した。
【０２８８】
８００ｒｐｍで３分間の遠心分離によって標的細胞を回収し、アッセイ培地で１回洗浄し、遠心分離し；ペレットの上の培地を完全に取り除いた。アッセイ培地で細胞を穏やかに浮遊させ、単一細胞溶液を作った。標的細胞の数を４×細胞ストック（５０μｌのアッセイ培地にて１０，０００個の細胞）に調整した。被験物質を当該濃度で調製した。５０μｌの４×標的細胞ストックを９６ウェルアッセイプレートに播種し、５０μＬの４×試料希釈液を加えた。細胞培養インキュベータにてプレートを室温で３０分間インキュベートした。１００μｌのエフェクター細胞（Ｅ／Ｔ＝５：１、すなわち、ウェル当たり５０，０００個のエフェクター細胞）を加え反応を開始し、交差振盪によって穏やかに混合した。１％の最終濃度でエフェクター細胞及び抗体を入れない細胞対照にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて標的細胞を溶解し、これを最大溶解対照とした；エフェクター細胞及び抗体を入れない細胞対照にアッセイ緩衝液を加え、これを最小ＬＤＨ放出対照とした。抗体の非存在下でエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞は、双方の細胞が一緒にインキュベートされた場合の非特異的なＬＤＨ放出のバックグランド対照として設定された。３７℃／５％ＣＯ２のインキュベータで４〜６時間、プレートをインキュベートした。ＬＤＨキットによって細胞の生存率をアッセイした。Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３にてＯＤ４９２ｎｍ及びＯＤ６５０ｎｍでの吸光度データを測定した。
【０２８９】
バックグランド（ＯＤ６５０ｎｍ）を差し引いたＯＤ４９２ｎｍのデータを解析してＬＤＨ放出を検討した。細胞溶解の比率は式に従って算出した。
細胞溶解％＝１００*（１−（ＯＤ試料データ−ＯＤ腫瘍細胞＋エフェクター細胞）／（ＯＤ最大放出−ＯＤ最小放出））
【０２９０】
結果を図６に示すが、それは変異体すべてが有意に低下した又は検出不能なＡＤＣＣ活性を示したことを示す。
【０２９１】
- 以下の表は結果を要約する。
（表Ｊ）変異体のＡＤＣＣ活性
0006567506.tif 000014
＊ｎ／ｄ＝測定しなかった
【０２９２】
ＫＯ変異体は有意に低下したＡＤＣＣ溶解活性を示し、多数の変異体については活性は全く検出されなかった。
【０２９３】
実施例１２：リツキシマブに基づく非対称性の抗体構築物はＤａｕｄｉ細胞にてＣＤＣ（補体依存性細胞傷害性）を低下させる
Ｃ１ｑに結合するその能力について調べてはいないが、選択された変異体を調べてそれらがＤａｕｄｉ細胞におけるＣＤＣを媒介することができるかどうかを判定した。このアッセイにおける選択された変異体の能力を表Ｆにて記載された対照リツキシマブ変異体のそれ及び商業的に入手したリツキシマブと比較した。
【０２９４】
使用した細胞株：Ｄａｕｄｉ細胞株（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃ＣＣＬ−２１３）、ＮＫ９２／ＣＤ１６ａ（１５８Ｖ／Ｖ）．検出装置：Ｆ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒＰｌｕｓ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ．陽性対照抗体：リツキシマブ 
【０２９５】
細胞培養：遠心分離によってＤａｕｄｉ細胞を回収し、アッセイ緩衝液でペレットを１回洗浄した。トリパンブルー色素によって生細胞を数えた。＞９９％の生存率の細胞集団のみをアッセイした。細胞濃度を調整し、５，０００個の細胞を２０μｌのＣＤＣ緩衝液に播種した。１０μｌの希釈した試料を加えた（３つ組にて６００ｎＭから減らして１：１０の希釈倍数で８種類の濃度）。試料及びリツキサン対照を室温で３０分間インキュベートした。１０μｌのＮＨＳ（４０μｌの反応容量にて１０％の最終濃度）を各ウェルに加えてＣＤＣアッセイを開始した。３７℃／５％ＣＯ２のインキュベータでプレートを２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイキットで細胞生存率試験を行った。ＰＨＥＲＡＳｔａｒ  Ｐｌｕｓにて発光を読み取り、相対的な光単位データを記録する。
【０２９６】
データ解析
細胞溶解の比率は式によって算出した。
％細胞溶解＝１００×（１−（ＲＬＵ試料）／（ＲＬＵ細胞＋ＮＨＳ））、式中、ＮＨＳは正常ヒト血清を表す。
【０２９７】
結果を図７に示すが、それは試料すべてが有意に低いＣＤＣ活性を示したことを示している。
（表Ｋ）変異体のＣＤＣ活性
0006567506.tif 000015
＊ｎ／ｄ＝測定しなかった
【０２９８】
ＫＯ変異体は有意に低下したＣＤＣ溶解活性を示した。
【０２９９】
実施例で採用された試薬は市販されている、又は市販の器具類、方法又は当該技術で既知の試薬を用いて調製することができる。前述の実施例は本発明の種々の態様及び本発明の方法の実践を説明する。実施例は、本発明の多数の異なる実施形態の網羅的な記載を提供するようには意図されない。従って、前述の発明は、理解の明瞭さの目的で説明及び例示を手段として少し詳しく記載されているが、当業者は、添付のクレームの精神又は範囲から逸脱することなく多数の変更及び改変がそれに為され得ることを容易に悟るであろう。
【０３００】
本明細書で言及された出版物、特許及び特許出願はすべて、各個々の出版物、特許及び特許出願が参照によって本明細書に組み入れられるように具体的に且つ個々に指示されるかのように同程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
【図１】
0006567506.tif 000016
【図２】
0006567506.tif 000017
【図３Ａ】
0006567506.tif 000018
【図３Ｂ】
0006567506.tif 000019
【図４】
0006567506.tif 000020
【図５】
0006567506.tif 000021
【図６】
0006567506.tif 000022
【図７】
0006567506.tif 000023
【図８−１】
0006567506.tif 000024
【図８−２】
0006567506.tif 000025
【図８−３】
0006567506.tif 000026
【図８−４】
0006567506.tif 000027
【図８−５】
0006567506.tif 000028
【図８−６】
0006567506.tif 000029
【図８−７】
0006567506.tif 000030
【図８−８】
0006567506.tif 000031
【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
0006567506.tif 000034
【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
0006567506.tif 000038
【図８−１６】
0006567506.tif 000039
【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図８−２０】
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【図８−２１】
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【図８−２２】
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【図８−２３】
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【図８−２４】
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【図８−２５】
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【図８−２６】
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【図８−２７】
0006567506.tif 000050
【配列表】
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