(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギニンオペロン及びオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの活性が強化されたＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物であって、アルギニンオペロンは、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート還元酵素、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、及びアルギニンリプレッサーを含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼが、配列番号１又は配列番号３のアミノ酸配列である、請求項１に記載のＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムであることを特徴とする、請求項１に記載のＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培養培地で培養する段階と、
前記培養培地又は微生物からＬ−アルギニンを回収する段階とを含むＬ−アルギニンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属の微生物及びそれを用いたＬ−アルギニンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アルギニンはアミノ酸類強化剤、医薬品及び食品などに広く利用されるアミノ酸であり、産業界ではＬ−アルギニンを効率的に生産する方法の開発が求められて来た。
従来知られている生物学的発酵方によるＬ−アルギニンの製造方法は炭素源、窒素源から直接Ｌ−アルギニンを生産する方法として、グルタミン酸（glutamate）生産菌株であるブレビバクテリウム（Brevibacterium）又はコリネバクテリウム（Corynebacterium）属の微生物から誘導された変異株を利用する方法、細胞融合により生育改善されたアミノ酸生産菌株を利用する方法などが報告されている。最近では、アルギニン生合成オペロンの発現を抑制する遺伝子ａｒｇＲを不活性化させた遺伝子組換え菌株を利用する方法（特許文献１）及びアルギニンオペロンのａｒｇＦを過発現させる方法（特許文献２）などが報告されている。特に、従来アルギニン生産におけるアルギニンオペロンを調節するａｒｇＲの欠損が重要な要素として考えられてきた。
【０００３】
今までは、コリネバクテリウム微生物の場合、アルギニン生合成に関与するａｒｇＣＪＢＤＦＲ遺伝子がオペロンの形態で構成されており、細胞内のアルギニンによってフィードバック阻害を受けることが知られており（非特許文献１）、高収率のＬ−アルギニンを生産するには限界があることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第７，１６０，７０５号明細書
【特許文献２】韓国登録特許第１０−０８５４２３４号公報
【特許文献３】中国特許第１０２０２１１５４号明細書
【特許文献４】韓国登録特許第１０−０６２００９２号公報
【特許文献５】韓国登録特許第１０−０９３０２０３号公報
【特許文献６】韓国登録特許第１０−０８３０２９０号公報
【特許文献７】韓国登録特許第１０−０７９１６５９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vehary Sakanyan, et al., Microbiology, 142: 9-108, 1996
【非特許文献２】Amino Acids. 2012 Jul; 43(1): 255-66
【非特許文献３】Appl Microbiol Biotechnol, 1999 Oct; 52(4): 541-5
【非特許文献４】Chmiel; Bioprozesstechnik 1 Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)
【非特許文献５】Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig／Wiesbaden, 1994)
【非特許文献６】“Manual of Methods for General Bacteriology”from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)
【発明の概要】
【０００６】
［発明が解決しようとする課題］
このような背景下、本発明者らはＬ−アルギニンの生産収率を高めようと鋭意努力した結果、既存の重要な要素として知られていたアルギニンリプレッサー（argR）を欠損することなく、アルギニンオペロンの強化及びオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性を強化することにより、Ｌ−アルギニン生産親菌株に比べて高収率でＬ−アルギニンを生産することができることを確認し、本発明を完成した。
【０００７】
［課題を解決するための手段］
本発明の目的は、Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することである。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を用いて、Ｌ−アルギニンを生産する方法を提供することである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によるアルギニンオペロン及びオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ArgF又はArgF2）の活性が強化されたＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を用いることにより、高収率でＬ−アルギニンを生産することができる。また、前記高収率で生産されたＬ−アルギニンは、ヒト医薬及び薬学産業に有用に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［発明を実施するための最良の形態］
前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、アルギニンオペロン及びオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの活性が強化されたＬ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１１】
本発明におけるアルギニンオペロンは、Ｌ−アルギニンを生合成するメカニズムに関与する酵素からなるオペロンであって、特に、Ｌ−アルギニンの生合成の環状ステップを構成する酵素で構成されている。具体的には、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート還元酵素（N-acetyl glutamylphosphate reductase、ArgC）、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（glutamate N-acetyltransferase、ArgJ）、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（N-acetylglutamate kinase、ArgB）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（acetylornithine aminotransferase、ArgD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine cabomoyltransferase、ArgF）及びアルギニン抑制因子（argine repressor、ArgR）で構成されており、前記酵素は、Ｌ−アルギニン生合成過程の連続的な酵素反応に関与する。
【００１２】
アルギニンオペロンを構成する前記それぞれの酵素は、Ｌ−グルタミン酸を前駆体として最終的にＬ−アルギニンを生合成するのに関与する。グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）はＬ−グルタミン酸（L-glutamate）を前駆体としてＮ−アセチルグルタメート（N-acetylglutamate）を合成し、ａｒｇＪ遺伝子にコードされることができる。特に、アセチル基は、Ｎ−アセチルオルニチン（N-acetylornithine）をＬ−オルニチン（L-ornithine）に分解することによって得られる。コリネバクテリウム属微生物でのＬ−アルギニン生合成は、前記Ｌ−グルタメート−アセチルトランスフェラーゼがリサイクリング反応をすることが知られている。
【００１３】
生成されたＮ−アセチルグルタメート（N-acetylglutamate）は、Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（ArgB）酵素によってＮ−アセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に合成され、補酵素としてＡＴＰが消費されてＡＤＰが生成され、ａｒｇＢ遺伝子にコードされることができる。最終産物であるＬ−アルギニンによってフィードバック阻害を受けることが知られており、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害を解除する変異が公知され、これを活用してＬ−アルギニン生産能を向上させることができることが報告されている（特許文献３及び非特許文献２）。
【００１４】
Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート還元酵素（ArgC）は、大腸菌又は酵母では、アセチルグルタメートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（acetylglutamate semialdehyde dehydrogenase）とも呼ばれ、ａｒｇＣ遺伝子にコードされることができる。前記酵素によってＮ−アセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）をＮ−アセチルグルタメート５−セミアルデヒド（N-acetylglutamate 5-semialdehyde）に転換する。補酵素としては、ＮＡＤＰＨが使用されてエネルギーを提供する。生成されたＮ−アセチルグルタメート５−セミアルデヒドは、アミノ基供与体としてＬ−グルタミン酸を使用してＮ−アセチルオルニチン（N-acetylornithine）に変換され、この反応は、アセチルトランスフェラーゼ（ArgD）酵素によって媒介される。アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼはａｒｇＤ遺伝子によりコード化されることができる。そして、変換されたＮ−アセチルオルニチンは、グルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）酵素のリサイクリング反応によってアセチル基（acetyl group）をＬ−グルタミン酸に伝達してＬ−オルニチン（L-ornithine）になる。
【００１５】
オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ArgF）は、一般的にオルニチントランスルカルバモイラーゼとも呼ばれ、ａｒｇＦ又はａｒｇＦ２遺伝子にコードされることができる。Ｌ−オルニチンとカルバモイルホスフェート（carbamoyl phosphate）を結合することにより、Ｌ−シトルリン（L-citrullline）が生成され、リン酸基（phosphate）が副反応産物として生成される。生成されたＬ−シトルリンは、前記特許に記載されたアルギニンオペロンから分離して遺伝子に存在するアルギノサクシネートシンターゼ（ArgG）、アルギノサクシネートリアーゼ（ArgH）酵素反応によって、最終的にＬ−アルギニンに合成される。総８段階の生合成過程を経てＬ−アルギニンを合成することになり、本発明では、アルギニンオペロン（argCJBDFR）の活性を強化して、Ｌ−アルギニン生産能の向上を誘導した。
【００１６】
前記アルギニンオペロンを構成する酵素は、前記活性を有するものであれば、由来にかかわらず、本発明の範囲内に含まれるが、具体的には前記酵素はコリネバクテリウム属由来のタンパク質であることができる。より具体的にはグルタメートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）は配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むことができ、又はそれと少なくとも７０％、具体的には８０％、より具体的に９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。Ｎ−アセチルグルタメートキナーゼ（ArgB）は配列番号２１で表されるアミノ酸配列を含むことができ、又はこれと少なくとも７０％、具体的には８０％、より具体的に９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、当該酵素の場合は、アルギニンによってフィードバック阻害を解除するため、当業界に公知の変異を導入することができる。Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート還元酵素（ArgC）は、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含むことができ、又はそれと少なくとも７０％、具体的には８０％、より具体的に９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ArgD）は、配列番号２５で表されるアミノ酸配列を含むことができ、又はそれと少なくとも７０％、具体的には８０％、より具体的に９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ArgF）は、配列番号１又は配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むことができ、又は、前記配列番号１又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。具体的には、前記配列番号１又は３で表されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上のアミノ酸配列相同性を示すアミノ酸配列を含むことができる。また、前記アミノ酸と相同性を有し、実質的に前記タンパク質と同一又は対応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部配列が欠損、改変、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する場合も本発明の範囲に含まれるのは自明である。
【００１７】
本発明における用語、「相同性（homology）」は、２つの比較対象であるアミノ酸配列又は塩基配列の類似性を示すためのものであり、これらの相同性は二つの配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析する生物情報アルゴリズム（bioinformatic algorithm）を使用して決定することができる。前記二つのアミノ酸間の配列相同性はパーセントで示すことができる。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group、Madison、W、USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールにて利用可能である。他にも有用な配列に対するアルゴリズム及び相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。
【００１８】
本発明において前記アルギニンオペロン活性の強化は、アルギニンオペロンに存在する酵素の一つ以上の酵素の活性が増強されることを意味するが、ａｒｇＲ遺伝子を単独で強化する場合は含まれない。例えば、アルギニンオペロン活性の強化は、アルギニンオペロンに存在する一つの酵素のプロモーターを強化することにより、オペロンに存在する全ての酵素の活性が増強されることができ、具体的にはＮ−アセチルグルタミルホスフェート還元酵素（argC）のプロモーターを強化することにより、オペロン全体活性が強化されることができる。また、アルギニンオペロンを構成する酵素のうち、一つ以上の酵素をコードする遺伝子の発現を増加させることも、本発明におけるアルギニンオペロン活性の強化に該当することができる。
【００１９】
本発明における用語、活性の「強化」は、特定のタンパク質活性を持っていない微生物にそのタンパク質の活性を付与したり、そのタンパク質の活性を保持している微生物で細胞内活性を増加させることなどにより、前記タンパク質の細胞内活性を内在的活性に比べて増加させることを意味する。前記内在的活性とは、コリネバクテリア属微生物が天然の状態で有しているか、又は改変前の状態で持っている酵素の活性状態を意味する。
【００２０】
前記酵素の活性を強化又は増加させる方法は当該分野で公知の様々な方法の適用が可能である。その方法は、下記例に制限されるわけではないが、例えば、該当する酵素をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドをさらに染色体内に挿入する方法、又は前記ポリヌクレオチドをベクターシステムに導入する方法などにより酵素をコードする塩基配列のコピー数を増加させる方法、酵素のプロモーターを強いプロモーターに交換する方法、具体的にはプロモーターに変異を導入する方法が含まれることができ、遺伝子変異によって活性が強い酵素に変異させる方法などがある。
【００２１】
具体的な例として、本発明では、アルギニンオペロンに存在する酵素のプロモーターを変異又は置換により内在プロモーターに比べて強いプロモーターに変異させることができる。前記内在的酵素のプロモーターの代わりに塩基置換変異を有する改良型プロモーター又は異種プロモーターを連結することができるが、前記異種プロモーターの例としては、ｐｃｊ７プロモーター（特許文献４）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献５）、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡプロモーター、ａｃｅＢプロモーターなどがあるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明における用語、「プロモーター」は、ポリメラーゼの結合部位を含み、プロモーター下流の遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始活性を有する、コード領域の上流の未解読の核酸配列、すなわち、ポリメラーゼと結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域を意味し、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置する。
【００２３】
本発明で前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性を強化させる方法は当該分野で公知の様々な方法の適用が可能であり、これは前記で記述された通りである。具体的には、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを菌株に形質転換することにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
本発明における用語、「形質転換」は、ＤＮＡを宿主内に導入してＤＮＡが染色体外因子として、又は染色体統合の完成によって複製可能になることを意味する。具体的には、本発明の形質転換体は前記ＤＮＡを含むベクターが宿主細胞内に形質転換された後、ベクター内のプロモーター活性を有する核酸分子配列が宿主細胞ゲノム上の内因性（endogenous）目的遺伝子のプロモーター部位の配列と相同組換えを起こし、染色体内に挿入されたり、プラスミドの形で保持することができる。
【００２５】
本発明のベクターを形質転換させる方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法も含まれ、宿主細胞に応じて、当分野で公知のように、適切な標準技術を選択して実行することができる。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（CaPO4）沈殿法、塩化カルシウム（CaCl2）沈殿法、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（PEG）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法などを用いることができるが、これらに限定されない。
【００２６】
本発明における用語、「コリネバクテリウム属微生物（Corynebacterium sp．）」は、Ｌ−アルギニン生産能を有する全てのコリネバクテリウム属菌株を含むことができ、その例として、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacteriumglutamicum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）又はブレビバクテリウム・ファーメンタム（Brevibacterium fermentum）などを使用することができるが、これに限定されない。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）を使用することができるが、これらの例に限定されるものではない。
【００２７】
本発明のもう一つの態様として、本発明は、前記Ｌ−アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物を適切な培養培地で培養する段階を含む、Ｌ−アルギニンを生産する方法を提供する。
【００２８】
本発明における微生物の培養は、広く公知された方法によって実行することができ、培養温度、培養時間及び培地のpHなどの条件は適切に調節することができる。これらの公知の培養方法は、文献[非特許文献４、及び非特許文献５）]に詳細に記述されている。また、培養方法には、回分式培養（batch culture）、連続式培養（continuous culture）及び流加式培養（fed-batch culture）が含まれ、具体的には、バッチ工程、又は流加バッチ又は反復流加バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続的に培養することができるが、これらに限定されない。使用される培養培地は、特定の菌株の要求条件を適切に充足させなければならない。多様な微生物に対する培養培地は公知である（例えば、非特許文献６）。培地内の炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラッセ、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例：大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナツオイル）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例：グリセロール及びエタノール）、及び有機酸（例：酢酸）などを用いることができる。これらの物質は個別的に又は混合物として使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源は、窒素−含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及び尿素）、又は無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム）を用いることができ、これらの物質も個別的に又は混合物として使用することができる。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩を用いることができるが、これに限定されない。培養培地は、成長に必須の金属塩（例：硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）を含有することができ、上述の物質の外にアミノ酸及びビタミンなどの必須成長促進物質を使用することができる。また、適切な前駆体を前記培養培地にさらに加えることができる。前記供給物質は、培養培地に一度に全部加えるか、あるいは培養中に適切に供給することができる。
【００２９】
培養培地のｐＨは塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を適切に用いて調節することができる。発泡は脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて調節することができる。酸素または酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養培地中に導入させて好気性条件を維持させることができる。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃であってもよい。培養は所望のＬ−アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続けられ、具体的には、培養時間は１０〜１６０時間であってもよい。Ｌ−アルギニンは培養培地中に排出されるか、又は細胞中に含まれていてもよい。
【００３０】
一方、本発明の前記の微生物を培養する段階を含むＬ−アルギニンの生産方法は、前記培養段階で生成されるＬ−アルギニンを回収する段階をさらに含むことができる。すなわち、本発明のＬ−アルギニン生産方法は本発明のコリネバクテリウム属微生物を培養培地で培養する段階；及び前記培養培地及び微生物からＬ−アルギニンを回収する段階を含む、Ｌ−アルギニンを生産する方法であることができる。アルギニンを回収する段階は、当業界における公知のアルギニン回収方法を利用して、細胞又は培養培地からアルギニンを分離することができる。Ｌ−アルギニン回収方法の例として、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性、疎水性、サイズ排除及びHPLC）などの方法があるが、これらの例に限定されるものではない。
【００３１】
［発明を実施するための形態］
以下、下記実施例によって本発明をより具体的に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示的に実施するためのものであり、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されない。
【００３２】
実施例１：アルギニンオペロン強化ベクター製作
微生物の染色体上でアルギニンオペロンを強化するために、Ｎ−アセチルグルタミルホスフェート還元酵素（N-acetylglutamyl phosphate reductase、ArgC）の自己のプロモーターを欠損し、他のプロモーターに置換するベクターを作製した。置換プロモーターとしては強い発現誘導活性を有するｌｙｓＣＰ１（特許文献５、配列番号１８）を用いた。
【００３３】
まず、野生型コリネバクテリウム・グルタミクム（寄託番号ATCC13869）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３（SF_pargC_PR_pDC infusionプライマー；5’-CGAGCTCGGTACCCGGGCAAAGAATACGGCTTCCTTGGC-3’）及び配列番号１４（SR_pargC_PR_XbaI-XhoI-BamHI infusion／制限酵素プライマー；5’-CTGGATCCTCGAGTCTAGAGACGGGTTAGACATGCAAAA-3’）のプライマーペア及び、配列番号１５（SF_pargC_PR_SpeI-ScaI-BamHI infusion／制限酵素プライマー；5’-GACTCGAGGATCCAGTACTAGTATGATAATCAAGGTTGCAAT-3’）及び配列番号１６（SR_pargC_PR_pDC infusionプライマー；5’-TGCAGGTCGACTCTAGGGTAACGCCTTCTTTCAAAG-3’）プライマーペアを利用して１次ＰＣＲ（polymerase Chain Reaction）でＤＮＡ断片を増幅した。具体的なＰＣＲ条件は以下の通りである。ＰＣＲ装置（Bio-rad C1000 thermal cycler）はＰｆｕポリメラーゼ（Pfu polymerase、macrogen）を利用して、９５℃で１０分間変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間重合するサイクルを２８回繰り返した。
【００３４】
このように得られた１次ＰＣＲ断片は、ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（geneall）を用いて精製して、事前にＸｍａＩ−ＸｂａＩ制限酵素で切断して準備したｐＤベクターと混合し、３つのＤＮＡ断片を連結した。前記ＤＮＡ断片の連結は、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Clontech）を使用して、５０℃で１０分間反応によりｐＤ−ＲａｒｇＣ_ＰＲベクターを完成した。
【００３５】
置換プロモーターの挿入は、ｐＤＺ−ｌｙｓＣＰ１（特許文献７）を鋳型として、配列番号５（SF_PlysCP1_XhoI-XbaI infusionプライマー；5’-CCGTCTCTAGACTCGAGCCATCTTTTGGGGTGCGG-3’）及び配列番号６（SR_PlysCP1_SpeI infusionプライマー；5’-TTGATTATCATACTAGTCTTTGTGCACCTTTCGAT-3’）のプライマーペアを用いてｌｙｓＣＰ１プロモーターを増幅し、これをＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ制限酵素処理されたｐＤ−ＰａｒｇＣ_ＰＲベクターと混合して連結した。ＰＣＲ及びＩｎ−ｆｕｓｉｏｎ方法は前記と同一であり、これにより最終的にｐＤ−ＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１ベクターを完成した。
【００３６】
実施例２：オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの強化発現ベクター製作
アルギニン生合成酵素の一つであるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼを強化するために組換え発現ベクターを作製した。p１１７−ｃｊ７−ＧＦＰ（特許文献４）を基盤ベクターとして利用し、前記基盤ベクターでＧＦＰをコードする塩基配列をＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ制限酵素で処理して除去した後、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９由来ａｒｇＦ及び特許文献６のａｒｇＦ２を挿入した。
【００３７】
前記ａｒｇＦ遺伝子は、野生型コリネバクテリウム・グルタミクム（寄託番号ATCC13869）菌株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号７（SF_argF_EcoRV infusionプライマー；5’-ACGAAAGGAAACACTCGATATCATGACTTCACAACCACAGGT-3’）及び配列番号８（SR_argF_XbaI infusionプライマー；5’-GCCAAAACAGCTCTAGATTACCTCGGCTGGTGGGCCA-3’）プライマーペアを用いてＰＣＲによりＤＮＡ断片を増幅した。Ｐｆｕポリメラーゼを使用し、９５℃で１０分間変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間重合するサイクルを２８回繰り返す条件で行った。前記得られたＰＣＲ断片を精製し、ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ制限酵素処理されたｐ１１７−ｃｊ７−ＧＦＰと混合して、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ方法により接続して、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ組換え発現ベクターを完成した。
【００３８】
前記ａｒｇＦ２遺伝子は、野生型コリネバクテリウム・グルタミクム（寄託番号ATCC13032）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号９（SF_argF2_EcoRV infusionプライマー；5’-ACGAAAGGAAACACTCGATATCATGGCCAGAAAACATCTGCT-3’）及び配列番号１０（SR_argF2_XbaI infusionプライマー；5’-GCCAAAACAGCTCTAGACTACGCATTGATCGACCGAG-3’）のプライマーペアとＰｆｕポリメラーゼ（Pfu polymerase、macrogen）を使用して、９５℃で１０分間変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間重合するサイクルを２８回繰り返して得した。前記得られたＰＣＲ断片を精製して、ＥｃｏＲＶ−ＸｂａＩ制限酵素処理されたｐ１１７−ｃｊ７−ＧＦＰと混合して、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて接続した。前記過程を経て、最終的にｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２組換え発現ベクターを完成した。
【００３９】
さらにａｒｇＦ及びａｒｇＦ２遺伝子を同時発現する組換え発現ベクターを作製した。前記製作されたｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２発現ベクターを基にＮｏｔＩ制限酵素を処理した後、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２を挿入した。具体的にはｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２組み換えプラスミドを鋳型として、配列番号１１（SF_Pcj7_argF2_NotI infusionプライマー；5’-CCTTTTTGCGGCGGCCGCAGAAACATCCCAGCGCTACT-3’）及び配列番号１２（SR_argF2_NotI infusionプライマー；5’-CACCGCGGTGGCGGCCGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCA-3’）のプライマーをＰｆｕポリメラーゼを利用して、９５℃で１０分間変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２．５分間重合するサイクルを２８回繰り返して得た。前記得られたＰＣＲ断片を精製して、ＮｏｔＩ制限酵素が処理されたｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２と混合して、Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結した。前記過程を経て、最終的にｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ／Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２組換え発現ベクターを完成した。
【００４０】
実施例３：組換えベクターの挿入菌株の製作
３−１．アルギニンオペロンの強化ベクター挿入
コリネバクテリウムの染色体にアルギニンオペロンの自己のプロモーターを置換するために、既存のアルギニン生産菌株に前記実施例１で作製したｐＤ−ＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１組み換えベクターを形質転換させることで組換えベクター挿入菌株を製作した。具体的には、既存のアルギニン生産菌株であるＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（特許文献１０）及びＡＴＣＣ２１８３１に、前記実施例１で作製したｐＤ−ＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１組み換えベクターを形質転換させ、親菌株が持っている自己プロモーター配列と前記ベクター上のプロモーター配列とを相同組換えにより置換させることで、染色体内にｌｙｓＣＰ１プロモーター配列を挿入させた。
【００４１】
形質転換は、１次的に電気パルス法（非特許文献３）を利用して、組換えベクターをＫＣＣＭ１０７４１Ｐ及びＡＴＣＣ２１８３１に挿入させ、また、相同性配列の組換えによって染色体上に挿入された菌株は、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌで含有した培地から選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（cross-over）を経て、ｌｙｓＣＰ１プロモーターに置換されてベクターが除去された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株のプロモーターが置換されたかどうかは、配列番号５及び配列番号６のプライマーペアを使用してＰＣＲを行うことにより確認し、この菌株をＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１及びＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１と命名した。
【００４２】
３−２．オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ強化ベクター挿入
前記実施例２で製作したｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２、ｐ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ／Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２組換え発現ベクターを電気パルス法を用いて前記菌株ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１及びＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１に挿入し、カナマイシン（kanamycin）を２５ｍｇ／Ｌ含有した培地から選別して、最終的にａｒｇＦ２、ａｒｇＦ２、ａｒｇＦ／ａｒｇＦ２を追加発現する菌株を製作した。前記菌株をそれぞれＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ／Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２、ＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ、ＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２及び ＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ／Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２と命名し、このうちＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２をＣＡ０６−２０４４と再命名してブダペスト条約下で２０１３年１２月９日付で韓国微生物保存センター（KCCM）に寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１１４９８Ｐが付与された。
【００４３】
実施例４：製作した菌株の評価
前記実施例３で製作したアルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクム  ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ／Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２、ＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１、ＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ、ＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２及びＡＴＣＣ２１８３１_ΔＰａｒｇＣ:: ｌｙｓＣＰ１_Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ／Ｐｃｊ７−ａｒｇＦ２を用いて、アルギニンオペロン及びオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ活性強化のアルギニン生産能への影響を把握するために下記のような方法で培養した。このとき、対照群としては親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ及びＡＴＣＣ２１８３１を使用し、生産培地[グルコース６％、硫酸アンモニウム３％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム七水和物０．２％、ＣＳＬ（コーン浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ  １％、酵母エキス０．５％、ビオチン１００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２]を２５ｍｌ入れた２５０ｍｌのコーナー−バッフルプラスコに１白金耳の菌株を接種し、３０℃で４８時間、２００ｒｐｍで培養して生産した。培養終了後、ＨＰＬＣでＬ−アルギニンの生産量を測定し、その結果を表１に示した。
【００４４】
【表１】
0006476212.tif 000002
前記表１に示すように、アルギニンオペロン及びオルニチンカルバモいるイルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が同時に強化された菌株は、対照群に比べアルギニン生産能が最大５０％向上した。また、アルギニンオペロン単独強化（KCCM10741P_ΔPargC:: lysCP1及びATCC21831_ΔPargC:: lysCP1）で見られるアルギニン濃度の減少及びオルニチン濃度の増加は、ａｒｇＦ、ａｒｇＦ２又はａｒｇＦ及びａｒｇＦ２を導入することで解決され、結果的にアルギニン濃度が増加したことを示している。
【００４５】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであるだろう。なお、以上で記述した実施例はすべての面において例示的なものであり、限定的なものではないことを理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明ではなく特許請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導き出されるすべての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００４６】
【表２】
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【配列表】
0006476212000001.app