(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性のオリゴマー、プレフィブリル、プロトフィブリル、線維構造及びアミロイドプラークの形成に関連する、β−フォールディングされたアミロイド形成性タンパク質構造の細胞傷害性効果を予防するための組成物であって、該組成物がシャペロニンを含み、該シャペロニンが
式Ｉ
【化１】
0006595345.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、−アルキレニル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキレニル−Ｒ３、−アルキレニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ４であり；
Ｒ３は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−ジチオカルバマートアルキル、−Ｎ−アルキル−ジチオカルバミン酸アルカリ土類金属塩であるか；又はアミロイド形成性疾患の処置のための上記で列挙した基の薬学的に許容される塩であり；
Ｒ４は、スクシンイミジル基であり；
Ｒ２は、−Ｈ、−アルキルである］
の化合物である、上記組成物。
【請求項２】
可溶性のオリゴマー、プレフィブリル、プロトフィブリル、繊維構造及びアミロイドプラークを、更に阻害、低減、リフォールディング、及び／又は脱凝集するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、Ｎ−（２−アミノエチル）−Ｎ’−１−ナフチルスクシンアミド、メチル（２−｛［４−（１−ナフチルアミノ）−４−オキソブタノイル］アミノ｝エチル）ジチオカルバマート、Ｎ−［４−（１−ナフチルアミノ）−４−オキソブタノイル］−β−アラニン、６−｛［４−（１−ナフチルアミノ）−４−オキソブタノイル］アミノ｝ヘキサン酸、Ｎ３，Ｎ３’−エタン−１，２−ジイルビス（Ｎ１−１−ナフチルスクシンアミド）、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ’−１−ナフチルスクシンアミド、これらの塩、及び薬学的に許容される溶媒和物からなる群から選択されるシャペロニンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アミロイド形成性疾患が、糖尿病（ＩＩ型）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、及び伝達性海綿状脳症から選択される一つである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記疾患に存在するβ−フォールディング構造の細胞傷害性効果を更に低減するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の細胞傷害性の保護のための組成物であって、該組成物がシャペロニンを含み、該シャペロニンが
式Ｉ
【化１】
0006595345.tif 000005
［式中、
Ｒ１は、−アルキレニル−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−アルキレニル−Ｒ３、−アルキレニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒ４であり；
Ｒ３は、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−アルキル、−ＮＨ−ジチオカルバマートアルキル、−Ｎ−アルキル−ジチオカルバミン酸アルカリ土類金属塩であるか；又はアミロイド形成性疾患の処置のための上記で列挙した基の薬学的に許容される塩であり；
Ｒ４は、スクシンイミジル基であり；
Ｒ２は、−Ｈ、−アルキルである］
の化合物である、上記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
「アルキル」という用語は、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝状脂肪族鎖、水素及び飽和炭素原子であることを特徴とし、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基又はｉｓｏ−ブチル基を含む。「アルキレニル」という用語は、直鎖状又は分枝状アルキル基の二価類似体、好ましくはエチレニル（−ＣＨ２ＣＨ２−）又はブチレニル（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）基を指す。これらの化合物は、中性、親油性であり、低分子量を有する。式Ｉの化合物及びこれらの調製方法は、キューバ特許第２００９−５７号、ＰＣＴ−ＣＵ２０１０−０００００１、ＷＯ／２０１０／１１８７０６、ＥＰ２４３６６６６Ａ２０、及びメキシコ特許出願第２９／２０１１号、ブラジル特許出願２７／２０１１、米国特許出願１０／２０１２、マレーシア特許出願１２／２０１２、日本特許出願９／２０１２、カナダ特許出願７／２０１２、南アフリカ特許出願１８／１２０１２に記載されている。
【０００２】
本発明は、いずれも毒性クロスβ構造を呈することを特徴とするプレフィブリル、プロトフィブリル、アミロイド線維及びプラーク構造（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ＩＩ型糖尿病（ＤＭ２）等）の阻害、低減及び破壊により、ＣＤを予防及び治療処置するための新規の方法であって、本方法は、本明細書において化学シャペロニンとみなされた式Ｉの化合物を、タンパク質ミスフォールディングを引き起こす上記構造の形成の阻害、低減、除去等に加えて既に形成された線維を脱凝集させることができる、上記化合物又はその塩、プロドラッグ又は溶媒和物のうち１種又は複数の任意の薬学的に許容される組成物の形態で投与するステップによってなされる、上記方法を提供する。
【０００３】
本発明者らは、化学シャペロニンとして知られる１種又は複数の式Ｉの化合物を、任意の薬学的に許容される組成物又はその塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物の形態で投与するステップにより、プレフィブリル、プロトフィブリル、線維及びプラークとしての毒性クロスβ構造の形成をモジュレートすることを通じてコンフォメーション病を予防及び治療処置するこの新規の方法がこれまでに記載されたとは認識していない。
【０００４】
本発明は、医療の分野に適用される化学及び生化学に関する。本発明は、とりわけ、毒性クロスβ構造、すなわちコンフォメーション病（ＣＤ）、特にアミロイド起源のＣＤにおいて存在するプレフィブリル、プロトフィブリル、アミロイドプラーク及び線維（表１）の形成を阻害、低減又は予防する新規の方法であって、上述の構造の形成の阻害、低減、脱凝集、リフォールディング及び予防が可能な、化学シャペロニンとみなされた１種又は複数の式Ｉの化合物を投与することによる上記方法について述べる。
【０００５】
Ｃａｒｒｅｌｌら（Ｌａｎｃｅｔ  １９９７、３５０、１３４〜１３８）によって定義されたＣＤは、診断、処置及び予防の点で現在医学に難題を課す数多くの様々な疾患を引き起こす。これらの疾患は、それらの構造の変化によって特徴付けられ、組織中でのアミロイドフィブリルの形成とその沈着を引き起こす。これらの疾患の出現は、オリゴマーと呼ばれる線維状媒介物の毒性活性、又はタンパク質のその自然状態における生物学的機能の損失のいずれかと関係している可能性がある。ＣＤに関与する様々なタンパク質のアミノ酸配列に相同性はないが、分子の観点からは、これらの疾患は、問題となっているタンパク質のミスフォールディング及び線維の形態でのその蓄積という過程を伴う、同じ病態生理を共有している。
【０００６】
初期において、これらのタンパク質は、オリゴマー及びプロトフィブリルを形成する可能性があり、罹患した器官及びこれらの構造のそれぞれの細胞傷害性に応じて線維を発生させ、これにより、これらの疾患の遅延した又は一過性の発病を加速させる（Ｃａｒｒｅｌｌ，ＲＷ．及びＬｏｍａｓ，ＤＡ  Ｌａｎｃｅｔ、１９９７、３５０、１３４〜１３８）。様々な病態と明らかに関連するこれらのアミロイドフィブリルを形成し得る、１５種を超えるタンパク質が報告されている。様々なＣＤ及びその標的タンパク質の非網羅的な一覧を、表１に提示する。
表１：コンフォメーション病と関連する一部のタンパク質（Ｃｈｉｔｉ，Ｆ．及びＤｏｂｓｏｎ，ＣＭ  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００６、７５、３３３〜６６；Ｓｕｒｇｕｃｈｅｖ，Ａ及びＳｕｒｇｕｃｈｏｖ，Ａ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ２０１０、８１：１２〜２４；Ｇａｅｓｔｅｌ，Ｍ．、健康及び疾患における分子シャペロン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、ＨＥＰ、２００６、１７２：１〜４２、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）。
【表１−１】
0006595345.tif 000002
【表１−２】
0006595345.tif 000003
【０００７】
オリゴマーは、それらが形成されるアミロイドタンパク質にかかわらず、細胞レベルで毒性であることが報告されている。このことは、細胞傷害性効果がすべてのケースにおいて共通の分子機序であることを実証している（Ｂｕｃｃｉａｎｔｉｎｉ  Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２００２、４１６：５０７〜５１１；Ｗａｌｓｈ  ＤＭ及びＳｅｌｋｏｅ  ＤＪ、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ２００７、１０１、１１７２〜１１８４；Ｙａｎｋｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０、２５０、２７９〜２８２、Ｌｏｒｅｎｚｏら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９４、３６８、７５６〜７６０、Ｐｉｋｅら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９１、５６３、３１１〜３１４、Ｌｏｒｅｎｚｏ及びＹａｎｋｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  １９９４、９１、１２２４３〜１２２４７、Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５、９２、１９８９〜１９９３）。
【０００８】
アミロイド形成性タンパク質は主に、クロスβシートで構成されている。この構造はタンパク質のオリゴマー化及び凝集において安定であり、このことは、様々な器官で堅固で沈着したアミロイドが凝集し、組織損傷及び器官の機能障害を引き起こすことの説明となる（ＢＡ  Ｙａｎｋｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０、２５０、２７９〜２８２、Ｌｏｒｅｎｚｏ及びＡ．ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ  １９９４、３６８、７５６〜７６０；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＴＤら、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９５、１４７、６０９〜６１６、Ｃｈ  Ｊ．Ｐｉｋｅら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  １９９１、５６３、３１１〜３１４；Ｌｏｒｅｎｚｏ及びＹａｎｋｅｒ  ＢＡ  Ａ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９４、９１、１２２４３〜１２２４７；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９５、９２、１９８９〜１９９３）。
【０００９】
クロスβシート形成は、これらの構造の生成を活性化する複数の病態生理状態によって引き起こされる。これらの要因には、温度、イオン強度及びｐＨ変化に起因する、タンパク質の物理化学的特性の変化が含まれる。クロスβシート形成は、タンパク質分解、リン酸化及びグリコシル化によっても誘発され得る（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，ＴＫ及びＰ．Ｓｕｂｈａｎｄａｒ，Ｐ．、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００６、２７３、１３３１〜１３４９；Ｇａｇｇｅｌｌｉ  Ｅ．ら、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２００６、１０６：１９９５〜２０４４）。
【００１０】
通常、正常なパラメータ内で動作している生物学的系において、タンパク質凝集体の形成は観察されないが、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ミスフォールディングを有するタンパク質及びタンパク質複合体の分解の原因となる分子機構の一部である、タンパク質凝集体の形成を阻害する様々な機序を、細胞が有しているためである。この機構は、微小管輸送系、シャペロン、シャペロニン、ユビキチン−プロテアソーム系及びオートファジー性小胞からなる。細胞制御機構を阻害及び／又は失活させる要因と共に、これらの防御過程の性質を理解することは、ＣＤの予防及び処置のための戦略を開発するために、非常に重要である（ＺｅｒｏｖｎｉＫ，Ｅ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１０、７、７４〜８３；Ｃｏｈｅｎ，Ｆ．及びＫｅｌｌｙ、Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３、４２６、９０５〜９０９）。
【００１１】
多数の研究から、これらＣＤ同士、とりわけＤＭ２とＡＤとの相互関係の証拠が示されている（Ｎｉｃｏｌｌｓ，ＭＲ、Ｃｕｒｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４、１（１）、４７〜５４、Ｓｑｕｅａｌｅｄ，ＪＪら、Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．（Ｂａｒｃ．）２００８、１３０（１２）、４６６〜４７０、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｒ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ  ２００３、４２（１）、１１７〜１２４；Ｐａｍｂｉａｎｃｏ，Ｇ．ら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００６．５５（５）、１４６３〜１４６９）。ＤＭ２は、膵β細胞の進行性の死滅、標的組織におけるアミリン細胞傷害性アミロイド線維の沈着及びインスリン抵抗性を特徴とする代謝障害である。ＩＡＰＰとしても知られるアミリンは、インスリンと共に分泌される３７アミノ酸のペプチドである。一方、ＡＤは、脳内におけるアミロイドプラーク及び神経原線維格子の存在によって特徴付けられる。これらの神経病理学的沈着は、進行性変性及びニューロン死につながる過程中に含まれる（Ｚｈａｏ  ＷＱ及びＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００９、１７９２、４８２〜４９６；Ｐｒｏｆｅｎｎｏ，Ｌ．ら、Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１０、６７、５０５〜５１２）。老人斑は、ニューロンの細胞外空間に見出され、主に３９〜４２アミノ酸のβ−アミロイドペプチド（βＡ）の沈着によって形成される（Ｇｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３、１０（１８）、１０４１７〜２２）。
【００１２】
これらのアミロイド構造は、新規の処置の発見にとっての治療標的であった。現在、調査は、それらの形成を阻害、低減又は予防することが可能な医薬の探索を対象としている（Ｆｒｉｓａｒｄｉ，Ｖ．ら、Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０、９（４）、３９９〜４１７）。
【００１３】
ＣＤを制御するための上述の薬剤の中でも、発生期のポリペプチド鎖と結合して、合成が完了するまでそのフォールディングを一時的に遅延させる機能を有するものは、シャペロンである（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｉ及びＭｃ  Ｍｉｌｌａｎ  ＤＲ、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９８、８３：１１７〜３２）。
【００１４】
ミスフォールディングを有する構造の形成における、これらのシャペロンのモジュレート又は阻害活性を報告している研究が存在する。これらの分子は、分子的、化学的及び薬理学的に分類することができる。Ｍｏｇｋ，Ａ．ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９、１８、６９３４〜６９４９）、Ｓｅｏｎｇ，Ｉ．Ｓ．ら（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２０００、４７７、２２４〜２２９）及びＲ．Ｚａｈｎら（Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９６、２６１、４３〜６１）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々な分子シャペロンを評価しており（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ＩｂｐＢ、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＨｔｐＧ及びＳｅｃＢ並びにＤｅｇＰ、ＨｓｌＵ及びＩｏｎであるプロテアーゼＡ）、これらは、凝集を防ぎ、フィブリル構造の可溶化を容易にすることを証明している。実施された他の研究では（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  ＥＣら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６、２１、２８９〜２９６、Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｙ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９９３、１７５、６４８４〜６４９１）、Ｈｓｐ４０シャペロン、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ１００及びＨｓｐ１０４が協奏的に関与する証拠が存在し、これらはプリオンによる疾患の進行において非常に重要な可能性があることから、Ｈｓｐ１０４さえもが治療候補になり得ると主張している。しかし、決定的な研究は報告されておらず、リスク対効果比を明らかにすることのない、細胞レベル及び実験動物でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験に限定されている。
【００１５】
さらに、他の公知の化学及び薬理学的シャペロンを使用することにより、突然変異したタンパク質のミスフォールディングを阻害及び修正することができる（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｔ．Ｐａｕｌ，Ｓ．、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００６、２７３、１３３１〜１３４９及びＭｏｒｅｌｌｏ  Ｊ．Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２０００、２１、４６６〜４６９）。これらの分子はシャペロニンとも呼ばれ、低分子量を有し、熱ストレスに対するタンパク質のコンフォメーションを安定化させ、ミスフォールディングした構造の形成を阻害し、その後アミロイド線維の形成を阻害することができる（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２００２、１０、８８〜９９）。これらは、嚢胞性線維症（Ｓａｔｏ  Ｓ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６、２７１、６３５〜６３、Ｔａｍａｒａｐｐｏｏ  ＢＫ及びＶｅｒｋｍａｎ  ＡＳ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９９、１０１、２２５７〜２２６７）、α−アンチトリプシン（Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＪＡＪら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０００、９７、１７９６〜１８０１）、アクアポリン−２（ＢＫ及びＶｅｒｋｍａｎ  ＡＳ  Ｔａｍａｒａｐｐｏｏ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１９９９、１０１、２２５７〜２２６７）、受容体バソプレシンＶ２（Ｇａｌｋｉｎ  Ｖｅｋｉｌｏｖ  Ｏ．及びＰＧ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２００４、３３６、４３〜５９）、ガラクトシダーゼＡ（ＪＰ  Ｃｈａｐｐｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２００１、７、４１４〜４２１）、ｐ−５３及びＰ−糖タンパク質（Ｌｏｏ  ＴＷ及びＣｌａｒｋｅ  ＤＭ、Ｃｈｅｍ  １９９７、２７２、７０９〜７１２）における膜貫通コンダクタンス調節因子の場合のように、異なるミスフォールディングしたタンパク質の細胞内保持を逆転させることができることが示されている。グリセロールは、タンパク質の溶媒との接触面積を減らすことによってタンパク質の安定性を増加させることが示されている化学シャペロンの例である（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２００２、１０、８８〜９９；Ｒｅｉｂｅｋａｓ  ＡＡ及びＭａｓｓｅｙ  Ｖ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７、２７２、２２２４８〜２２２５２）。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、様々なキナクリン、Ｎ−オクチル−ｈ−バリエナミン（ＮＯＶ）、Ｎ−アルキル化デオキシノルジリマイシン（ｄｅｏｘｙｎｏｒｊｉｒｉｍｉｃｉｎｅ）、４−フェニル酪酸、アントラサイクリン、ポルフィリン及びアゾ化合物、並びにその他などの、他の例が存在する（Ｈ．Ｌｉｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  Ｍｏｌ  Ｂａｓｉｓ  Ｄｉｓ  ２００４：１〜１０；Ｓａｗｋａｒ  ＡＲら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２、９９、１５４２８〜１５４３３；Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｂｕｒｒｏｗｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００、９７、１７９６〜１８０１、Ｋｏｒｔｈ  Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１、９８、９８３６〜９８４１、Ｍａｙ  Ｂ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３、１００、３４１６〜３４２１）。薬理学的シャペロンの中でも特に、ＳＲ１２１４６３Ａ、ＶＰＡ９８５、１−デオキシガラクトノジリマイシン、ＣＰ３１３９８、ＣＰ２５７０４２、カプサイシン、シクロスポリン、ビンブラスチン及びベラパミルが挙げられる（Ｍｏｒｅｌｌｏ  Ｊ．Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２０００、２１、４６６〜４６９）。
【００１６】
これらの化合物のうちの大半は、ヒトにおいてβ−フォールディングの阻害剤として評価されていない。キナクリンのみが臨床的に認可されており、クロイツフェルト・ヤコブ病の患者においてこの分子の有効性を評価するための臨床試験が実施されている（Ｖｏｇｔｈｅｒｒ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００３、４６、３５６３〜３５６４）。
【００１７】
ＡＤの場合、現在までシャペロンの使用に基づく有効な療法は記載されていない。
【００１８】
Ａβフィブリル形成の阻害は、合理的な治療戦略である（Ｆｉｎｄｉｅｓ  ＭＡ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２、２、４１７〜４２３、Ｙａｎｇ  ＤＳら、Ａｍｙｌｏｉｄ  ２００１、８、１０〜１９）。よって、Ｎ末端及びＣ末端アミノ酸が修飾されたＡβ由来のＬＶＦＦＡアミノ酸配列に基づく模倣体ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価、並びにそれらの右旋性及び他の逆模倣体ペプチドへの変換が文献中に記載されているが、その薬理学的応用は今もなお現実にはほど遠い（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｔ．Ｐａｕｌ，Ｓ．、ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００６、２７３、１３３１〜１３４９、ＭｃＦａｄｄｅｎ，Ｆ．、ＣＡ  ２＿Ａ１  ２４０．０５；Ｆｅｚｏｕｉ，Ｙ．及びＪａｒａ−Ｓｏｔｏ，Ｃ．、Ｕ．Ｓ．２００７／０１５５９５５Ａ１）。
【００１９】
非ペプチド化合物の使用に関する数多くの特許も存在し、この使用は、アミロイド線維の阻害剤として説明されているか、又はアミロイド線維を不安定化すると説明されているが、これまでに治療標的に対する十分な有効性は示されていない。
【００２０】
このため、Ｓｚａｒｅｋらの特許（Ｕ．Ｓ．５，８６９，４６９）は、ホスホネート基及びカルボキシレートを含む化合物又は薬理学的に許容されるその塩の投与による、ヒトにおけるＡβ沈着をモジュレートする方法について特許請求した。提案された内容を支持する実験結果は示されていない。
【００２１】
Ｃｏｏｐｅｒ，Ｇ．ら、ＷＯ０３／０６３８８０は、１種又は複数の多環式化合物の使用による、細胞中のアミロイドタンパク質の毒性を遮断する方法を提供している。これらのうち、３つ又は４つの環を含む置換又は非置換のポリアセンが好ましい。特に、この発明は、プレフィブリル又はプロトフィブリルのアミロイド凝集体及び線維の阻害と共に、その可溶性の固有の構造からオリゴマー及び／又は不溶性のフィブリル状態へのアミリン遷移（ＩＡＰＰ）に対する中断法を記載している。これらの化合物はまた、膵臓アミロイドーシスの予防及び処置において使用できるような様式で、アミロイドタンパク質の産生を減少させる。特に、ＤＭ２を処置する方法が記載されている。使用される化合物には、キナクリン、クロルプロマジン及びテトラサイクリンが含まれる。また、他のテトラサイクリン関連化合物のように、アクリジン、フェノチアジン、アントラサイクリン、キナクリン、クロルプロマジン及びコンゴレッド（ＣＲ）である。
【００２２】
一方、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｕ．Ｓ．８，１０６，０４５Ｂ２は、多環式化合物型２−モルホリノ−４−ピリミドン及びその誘導体が、タウタンパク質の過剰活性によって引き起こされるＡＤの予防及び処置において有効である可能性があると示唆しており、これらの化合物による、他の神経変性疾患、ＤＭ２及びある種の新生物に存在するアミロイド構造に対する作用を主張している。
【００２３】
ＡＤ並びにＰＤ及びレビー小体におけるα−シヌクレインタンパク質フィブリルの存在を特徴とする疾患におけるアミロイドーシスを処置するための、芳香族ポリヒドロキシル化誘導体の使用が、Ｇ．Ｃａｓｔｉｌｌｏらによる米国特許２００１／００４７０３Ａ２１で特許請求されている。同様に、患者の脳中におけるフィブリル沈着の形成を低減、排除又は予防するのに有効であり得る方法に基づく、他のアミロイド形成性疾患の処置が特許請求されている。試験された化合物には、ミリセチン、エキシホン、ピロガロール、タンニン酸、ピロカテコール、ケルセチン、エラグ酸、１，２，４−ベンゼントリオール、５−ヒドロキシドーパミン、ガラミダ（ｇａｌｌａｍｉｄａ）三水和物、没食子酸、没食子酸エチル、キニン酸、及びその他が含まれる。
【００２４】
Ｂｏｒｊｅ  Ｖ．及びＫｕｒｔ  Ｌ．（Ｕ．Ｓ．５，６３７，５７１）は、ＡＤを含めたアミロイド形成性疾患の処置又は予防のための医薬組成物の調製における、ポドフィロトキシンＤ−グルコピラノシド及び４’−ジメチルポドフィロトキシンＤ−グルコピラノシドのアセタール、リグナン誘導体の使用を発表している。２００７年、三置換された最大で２個の炭素原子を含むアルキル鎖を有し、複数の変異体を有する、広範な有機化合物の使用を特許請求する特許（Ｕ．Ｓ．２００７／００１５７３７Ａ１）が、Ｃｌａｒｋ  Ａ．らにより公開された。置換基は、単一の元素（例えば、Ｈ、Ｏ、Ｎ）、官能基（例えば、エステル）、アニオン性基又は様々な複雑さの複素環であってもよい。具体的に、この発明者らは、治療用化合物として、３−（３−ヒドロキシ−１−プロピル）アミン−１−プロパンスルホン酸、ＤＬ−２−アミノ−５−ホスホロ吉草酸、４−フェニル−１−（３’−スルホプロピル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン、シクロヘキシルスルファミン酸、ホスホ−Ｌ−セリン、ヘキサフルオログルタル酸、８−メトキシキノリン５スルホン酸、３−アミノ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸、３−ジメチルアミノ−１−プロパンスルホン酸及びそのエステル、酸又は薬学的に許容される塩を報告した。著者らによるこれらの化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアミロイド沈着を阻害、低減又は中断させるために使用することができる。よって、この発明は、アミロイドーシスを処置する方法及び薬理組成物を提供している。
【００２５】
不溶性アミロイドタンパク質沈着に特異的に結合する他の種類の分子は、スチリルベンゼン誘導体（Ｚｈｕａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００１、４４、１２、１９０５〜１４）及びピリジン（Ｋｕｎｇら、Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ、２００３；５、６、４１８〜２６）である。また、Ｋｕｎｇら、ＷＯ０３０１８０７０及びＷＯ２００６０６６１０４によって示されたスチルベン誘導体は、アミロイド凝集の阻害剤として有効である。
【００２６】
疫学研究の結果、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の使用がＡＤの発病を遅延させることが知られている（ＪＣＳ  Ｂｒｅｉｔｎｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  １９９５、１６、５２３〜５３０、Ｓｔｅｗａｒｔ  ＷＦら、  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７；４８、６２６〜６３２、ＧＰ  Ｌｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ  ２００１、２０、１５、５７０９〜５７１４；Ｒｏｇｅｒｓ  Ｊ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  １９９３、４３：１６０９〜１６１１；Ａｇｄｅｐｐａ  ＥＤら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００３、１１７、７２３〜７３０）。これらの薬物はすべて、その一般構造中に芳香族環を含む。ＡＤの診断又は処置において使用することができる分子を発見することを目的とした様々な調査は、これらの化学構造に基づいている。
【００２７】
これらの分子の一部は、可視化技法によるアミロイドプラーク検出のために、１８Ｆで標識化されており、有望な結果が得られている（Ｓｈｏｇｈｉ−Ｊａｄｉｄ  Ｋら、Ｊ．Ａｍ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２００２、１０、２４〜３５、Ｂｒａｓｋｉｅ  ＭＮら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  ２０１０；３１、１０、１６６９〜１６７８；Ｂａｒｒｉｏ  ＪＲら、Ｊ．Ｎｕｔｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｇｉｎｇ  ２００８、１２、１、６１Ｓ〜６５Ｓ、Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ  Ｇら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００８、３５（付録１）、Ｓ７５〜Ｓ８１）。
【００２８】
「アミロイドフィブリル形成に関連する疾患の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」と題された米国特許第５，２７６，０５９号は、ＣＲ、その誘導体又はその薬学的に許容される塩の使用を、アミロイド形成性線維形成に起源を持つ疾患の処置のために採用してもよいと提案している。この発明は、特許請求された化合物は、アミロイド形成過程又は形成されたタンパク質構造の不安定性に干渉することができ、好ましくは、神経系の組織、ＤＭ２の場合は膵臓に関与する化合物であると報告している。前世紀の９０年代、ＣＲのＡβ沈着に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害作用が確認されたという結果が記載された（Ｂｕｒｇｅｖｉｎら、Ｎｅｕｒｏ  Ｒｅｐｏｒｔ、１９９４  ５、２４２９、Ｌｏｒｅｎｚｏ及びＹａｎｋｅｒ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ，Ｓｃｉ  １９９４、９１、１２２４３；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９５  １８４、１１３、Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９５  １９７、２１１）。しかし、仮にこの化合物、その塩又はその誘導体が中枢神経系の何らかの疾患のｉｎ  ｖｉｖｏにおける処置の際に使用されようとする場合、わずか０．０３％のＣＲしか血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できない点を考慮に入れなければならないと考えられる（Ｔｕｂｉｓら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍ．Ａｓｓｎ．１９６０、４９、４２２）。ある種のアゾ染料が発癌性であることも知られていることから（Ｍｏｒｇａｎら、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  １９９４、１０２（付録）、２、６３）、これらの化合物の治療的使用は、より大規模な研究によって裏付けられなければならない。
【００２９】
Ｋｌｕｎｋ  Ｗ．らは、彼らの特許（Ｕ．Ｓ．６，１３３，２５９）において、とりわけＡＤ、ダウン症候群、ＤＭ２、クロイツフェルト・ヤコブ病などのアミロイド形成線維の発症によって引き起こされる疾患の処置及び診断のための、医薬組成物中におけるクリサミンＧの非アゾ誘導体の使用を記載している。
【００３０】
アミロイド凝集体沈着を特徴とする疾患の処置のための、パモ酸などの他の芳香族化合物、誘導体及び類似物質の使用が、Ｇａｌｌｏらによる特許（ＷＯ０２００６０３）に記載されている。特に、パモ酸は、その構造中に２つのナフチル基を有する、ナフトエ酸誘導体である。Ｍｉｎｅｔｔｉら、ＷＯ２００７０４５５９３は、同様にアミロイド凝集を阻害する他のナフチル誘導体を記載しており、その発明者らによれば、これらはＢＢＢを通過する。また、Ｈａｙｓら（ＷＯ９７１６１９４）は、同様にアミロイド凝集を阻害し、これらの構造から発生する病態を処置するための医薬組成物中において使用することができる、いくつかのナフチル−アゾ化合物を記載している。現在まで、ＡＤ及びＤＭ２を含めたＣＤ（アミロイド形成性）の発病及び／又は進行を遅延させる有効な処置は開発されていない。米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）は、ドネペジル、ガランタミン又はリバスチグミンの使用を認可したが、これらの薬物はＡＤの進行を停止させることもＡＤの神経変性過程を逆転させることもなく、数カ月間又は数年間、一時的に有効であるにすぎない。
【発明の概要】
【００３１】
本発明は、本明細書において化学シャペロニンとみなされた式Ｉの化合物を投与するステップによって、将来生じ得るもののなかでも特に表１に記載したようないずれも毒性クロスβ構造の存在を特徴とするプレフィブリル、プロトフィブリル、線維及びプラーク構造を阻害、低減、脱凝集することにより、ＣＤ、特にアミロイド起源のＣＤを予防及び治療処置する新規の方法を提供する。これらの化合物及びこれらの調製方法は、とりわけ、キューバ特許第２００９−５７号、ＰＣＴ−ＣＵ２０１０−０００００１、ＷＯ／２０１０／１１８７０６、ＥＰ２４３６６６６Ａ２０、及びメキシコ特許出願第２９／２０１１号、ブラジル特許出願２７／２０１１、米国特許出願１０／２０１２、マレーシア特許出願１２／２０１２、日本特許出願９／２０１２、カナダ特許出願７／２０１２、南アフリカ特許出願１８／１２０１２に記載されている。
【００３２】
これらの化合物は、任意の薬学的に許容される組成物の形態で使用してもよく、様々な様式で投与してもよいし、単剤療法で投与してもよいし、又はミスフォールディングタンパク質から得られるこれらの構造を阻害、低減、除去若しくは脱凝集することが可能な１種若しくは複数の化合物、塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物と併用して投与してもよい。これらの化合物を投与して、このような線維の形成を完全に逆転させることもできる。
【００３３】
本発明の延長として、本明細書において記載される化合物、又はその塩、誘導体、プロドラッグ若しくは薬学的に許容される溶媒和物によって示される生物活性の利益を受ける可能性がある疾患を処置することが含まれる。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「誘導体」という用語には、薬物の製造中に使用可能な薬学的に許容される化合物、すなわち式Ｉの誘導体化合物が含まれ、加えて、薬学的に許容される誘導体の調製中に有用な可能性があるという理由から、薬学的に許容されない誘導体も含まれる。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「プロドラッグ」という用語には、個体に投与されたときに式Ｉの化合物を直接的又は間接的に供給することが可能な、式Ｉの化合物から誘導される任意の化合物、例えば、カルボン酸エステル、アミノ酸エステル、リン酸エステル、金属塩のスルホン酸エステル、カルバミン酸エステル、アミドが含まれるがこれらの例に限定されない、エステルが含まれる。有利には、この誘導体は、個体に投与されたときに式Ｉの化合物の生物学的利用能を高めるか、又は生物学的区画中で式Ｉの化合物の放出を促進する化合物である。前記プロドラッグの調製は、当業者公知の従来の方法によって行ってもよい。
【００３６】
本発明の化合物は、遊離化合物又は溶媒和物として結晶形態であってもよく、両方の形態が本発明の範囲内にあることが意図されている。この点に関して、本明細書において使用される場合、「溶媒和物」という用語には、薬物製造において使用することができる、薬学的に許容される溶媒和物、すなわち、式Ｉの化合物の溶媒和物、及び、薬学的に許容される塩又は溶媒和物の調製において有用であり得る、薬学的に許容されない溶媒和物が含まれる。
【００３７】
療法におけるその適用のために、式Ｉの化合物、その異性体、塩、プロドラッグ又は溶媒和物は、好ましくは、薬学的に許容される形態又は実質的に純粋である、すなわち、賦形剤及び担体などの通常の医薬添加物、さらに通常の用量レベルにおける毒性材料を除き、薬学的に許容される純度レベルを有する。活性化合物の純度レベルは、好ましくは９０％超である。好ましい実施形態において、純度レベルは、９５％超の式Ｉの化合物、又はその塩、溶媒和物若しくはプロドラッグである。
【００３８】
本発明の化合物、その薬学的に許容される塩、プロドラッグ及び／又は溶媒和物、並びにこれらを含有する医薬組成物を、他のさらなる薬物と共に使用して、併用療法としてもよい。このさらなる薬物は、同じ医薬組成物の一部とすることができ、又はその代わりに、１種又は複数の式Ｉの化合物、若しくはそのプロドラッグ、溶媒和物組成物、誘導体若しくは薬学的に許容される塩を含む医薬組成物に対して、別個の、同時若しくは同時でない投与のための組成物とすることができる。
【００３９】
本明細書において使用される意味では、「有効量」という用語は、所望の効果を生じさせるように計算された、その薬理学特性によって特定の治療作用を発揮することができる薬剤又は化合物の量を指し、一般に、他の要因の中でも、化合物自体の特性によって決定される。
【００４０】
年齢、患者の状態、障害又は異常の重症度などの患者の臨床データ、並びに投与の様式及び頻度は考慮されるべきである。
【００４１】
本発明において、他の目的、利点及び特徴は、本発明の記述的実施部から明らかとなる。
【００４２】
定義：
アミロイド形成性タンパク質。これは任意のポリペプチドを指す。好ましくは、フォールディングされていないか又はミスフォールディングされた、折り畳む必要があるポリペプチドであるか、その代わりにポリペプチドは、その十分にフォールディングされた状態で維持されていないか、又はプロトフィブリル及びアミロイド線維を形成しつつある、フォールディングされたポリペプチドであってもよい。ポリペプチドの例には、抗体、インスリン、アミリン、アミロイドβペプチド、毒素、ホルモン等（表１）として、医療及びバイオテクノロジーにおいて関連のあるポリペプチドが含まれる。
【００４３】
フォールディングの促進：これは、２つの状況を指す。第１の状況は、複製しようとするポリペプチドが、フォールディングされていないか若しくはミスフォールディングされた状態であるか、又はその両方であることである。この場合、本発明の方法によって正しいリフォールディングが促進される。第２の状況では、ミスフォールディングペプチドが既にプロトフィブリル及び／又はアミロイド線維を形成しつつあり、この場合、本発明の方法は、アミロイドフィブリル若しくはプロトフィブリルの形成を低減及び／又は阻害すること、並びに既に形成された線維を脱凝集及び破壊することに役立つ。
【００４４】
シャペロニン化学物質：全体として低分子量の化学化合物であるが、これはその定義においてその限りではなく、非酵素的様式でタンパク質のフォールディングの促進に関与し、異常なコンフォメーションを防止してポリペプチドの構造的アラインメントを容易にし、過程中の変則を修正するものである。これは、不安定若しくは固有ではない構造状態、又は誤った二次若しくは三次構造であるポリペプチドに結合する。これらの化学シャペロニンには、式Ｉの化合物が含まれる。
【００４５】
蓄積：この場合、フィブリル状ペプチド及び／又はそのオリゴマー前躯体が、細胞内又は細胞外空間に溜まることである。
【００４６】
凝集：互いに相互作用を形成する能力を有する、ミスフォールディングされたオリゴマーの重合に関する。
【００４７】
アミロイド形成性：クロスβ構造を有する線維を形成する特性を有するものである。
【００４８】
アポトーシス：これは、局所レベルと組織レベルの両方において、細胞が損傷の進行を防ぐために自己破壊するプログラム細胞死の過程である。
【００４９】
血液脳関門（ＢＢＢ）：これは、循環系と中枢神経系の細胞外環境との間の隔たりである。これは、ＣＮＳの毛細血管中の、緊密に連結した細胞によって形成された血管細胞壁からなる。
【００５０】
治療標的：ある処置に対する治療の標的又は攻撃中心である、器官、組織、細胞、受容体、遺伝子、タンパク質、又はその他である。
【００５１】
細胞傷害性：正常な細胞過程に干渉する力を有し、損傷、時には細胞死を引き起こす、あらゆる化合物である。
【００５２】
アゾ化合物：アゾ基（−Ｎ＝Ｎ−）をその構造中に含む化合物を指す。
【００５３】
コンフォメーション：１つ又は複数の共有単結合を介して起こる回転に対して、化学化合物がとる三次元構造である。
【００５４】
機能的コンフォメーション：目的として設計されるすべての機能を実施することができるタンパク質の構造を指す。
【００５５】
細胞制御：細胞の完全性及び環境を保つための機能である、細胞機序である。
【００５６】
誘導体：母物質と化学的に類似した物質である。
【００５７】
ナフタレン誘導体：これらは、ナフタレン構造に等しい芳香族二環式基を含む化学化合物である。本文書は、式Ｉの誘導体に関する。
【００５８】
コンフォメーション病：病態生理学的な線維蓄積、及びクロスβコンフォメーションであるペプチド又はミスフォールディングタンパク質の毒性オリゴマー形成に基づく疾患の群（表１）である。
【００５９】
熱ストレス：最適温度を超える温度への曝露によって、細胞損傷が発生する現象を指す。熱ストレス中、酵素及びタンパク質が影響を受け、細胞機構が損なわれ、一部の場合には細胞死を発生させる。
【００６０】
薬学的に許容される：治療剤として投与することができる塩に関する。
【００６１】
グリコシル化又はグルコシル化：末端と側方の両方のアミノ基と、単糖、二糖及びオリゴ糖を有する分子とのコンジュゲーションに関する。
【００６２】
阻害：正常な活性の減少を指す。この場合、化合物の存在による、動力学特性及びタンパク質凝集の減少を指す。
【００６３】
クロスβシート。これは、数本の直鎖が交差的相互作用によって互いに安定化する、二次タンパク質コンフォメーションの１種である。
【００６４】
モジュレーション。これは、シャペロニンによる、ミスフォールディングされたペプチドの凝集過程の改善を指す。正のモジュレーションでも負のモジュレーションでもあり得る。
【００６５】
モジュレーター。これは、ミスフォールディング構造を阻害、低減、排除及び脱凝集することが可能な式Ｉの化合物を指す。
【００６６】
単剤療法。これは、病態を処置するための、単一の物質の投与である。
【００６７】
神経変性。これは、神経変性過程が生じ、このとき慢性的に死滅又はニューロン機能障害をもたらすことを言う。
【００６８】
オリゴマー。これは、高分子量可溶性凝集体である。
【００６９】
アミロイドペプチド。いくつかの特徴を共有し、中でもクロスβシートを有するドメインが高含有量で存在する、線維状で不溶性の凝集体に関する。
【００７０】
老人斑。これらは、ニューロンの外にあるアミロイドタンパク質凝集体である。
【００７１】
フォールディング。タンパク質がその固有のコンフォメーションをとる過程である。時折、シャペロニンによって補助される。
【００７２】
プレフィブリル。線維を形成していない、凝集体及び可溶性のオリゴマーを言う。
【００７３】
活性成分。これは、医薬調製物中で生物学的効果を有する物質である。
【００７４】
プロドラッグ。ヒト身体中で治療活性を有する薬物に変換することができる物質である。
【００７５】
プロトフィブリル。これは、より小さいオリゴマーとの相互作用によって線維が生じ得る場合における、オリゴマーペプチドである。
【００７６】
投与様式。薬物が患者の身体に進入する様式である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】式Ｉの非限定的な例である、選択された化合物の構造及びＩＵＰＡＣ名を示し、使用される参照化合物（ナプロキセン及びクルクミン）と共にこれらの評価を例示した図である。
【図２】シャペロニンＡ（３．０１７μＭ及び９．０５１μＭ）の存在下、トリス（ｐＨ７．４、２０ｍＭ）中において６５℃で７２時間インキュベートした、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）フィブリル形成過程（３．０１７μＭ）の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図３】チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ  ２４μＭ）を用いた蛍光分光法によって測定された、被験シャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ（３００μＭ）の存在下又は非存在下、４２℃でのグリシン緩衝液（ｐＨ＝３、５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中におけるＨＳＡ線維形成（３００μＭ）の動力学を提示した図である。
【図４】チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ  ２４μＭ）を用いた蛍光分光法によって測定された、シャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（１μＭ）の存在下又は非存在下、６５℃でのグリシン（ｐＨ＝３、５０ｍＭ；ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）線維形成（１００μＭ）の動力学を提示した図である。
【図５】シャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（１μＭ）の存在下又は非存在下、６５℃でのグリシン（ｐＨ＝３、５０ｍＭ；ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中におけるＢＳＡフィブリル形成過程（１００μＭ）の、チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ  ２０μＭ）を用いた蛍光電子顕微鏡画像を示す図である。
【図６】チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ  ２４μＭ）を用いた蛍光分光法によって測定された、式Ｉの非限定的な例として選択された（図のパートＡ）シャペロニンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧの存在下又は非存在下におけるＢＳＡフィブリル形成（５０μＭ）の動力学、並びにＰＢＳ（ｐＨ＝８．９、１００ｍＭ）中、５０μＭ、７５℃におけるこれらのシャペロニンの作用によるフィブリル形成の阻害効果（図のパートＢ）を示す図である。
【図７】ＴｈＴ（２４μＭ）の存在下、６５℃でのグリシン（ｐＨ＝３、５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中におけるＢＳＡフィブリル形成（１００μＭ；ＢＳＡ：シャペロニンのモル比：１：０、１：０．００２５、１：０．００５、１：０．０１、１：０．０２、１：０．１及び１：１）の動力学に対する、式Ｉから選択された非限定的な例であるシャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの濃度効果を示すである。
【図８】ＴｈＴ（２４μＭ）の存在下、４２℃でのグリシン（ｐＨ＝３、５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中におけるＢＳＡフィブリル形成過程（３００μＭ、ＢＳＡ：シャペロニンのモル比：１：０、１：０．０１、１：０．０５、１：０．５、１：１、１：２．５、１：５）に対する阻害効果から決定された、シャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤについての実験ＩＣ５０値を示す図である。
【図９】式Ｉの非限定的例として選択されたシャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（５０μＭ）の存在下又は非存在下、撹拌を行わない、７５℃、３時間での、トリス（ｐＨ＝７．４、２０ｍＭ）中におけるＢＳＡフィブリル形成過程（７５μＭ）の透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図１０】式Ｉの非限定的例として選択されたシャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（１００μＭ）の存在下又は非存在下、２５℃でのＰＢＳ（ｐＨ７．４、１００ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中におけるＩＡＰＰ断片２０〜２９（１００μＭ）のフィブリル形成の動力学（図のパートＡ）、及びこれらのシャペロニンの作用によるフィブリル形成の阻害効果（パートＢ）を示す図である。ＩＡＰＰ：ＴｈＴのモル比、５０：１。
【図１１】２５℃でのＰＢＳ（ｐＨ７．４、１００ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中における、式Ｉの非限定的な例としてのシャペロニンＢ（ＩＡＰＰ：シャペロニンＢのモル比：１：０．５、１：１、１：５）の濃度がＩＡＰＰ断片２０〜２９（１００μＭ）のフィブリル形成の動力学に与える効果を提示した図である。ＩＡＰＰ：ＴｈＴのモル比、５０：１。
【図１２】式Ｉの非限定的な例として選択されたシャペロニンＢ及びＤの存在下又は非存在下、ＩＡＰＰ断片（ＩＡＰＰの断片２０〜２９：非凝集及び凝集モノマー）に曝露されたラット小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の細胞培養物における、細胞生存率の評価を示す図である。参照化合物：クルクミン。
【図１３】式Ｉの非限定的な例として選択されたシャペロニンＢ及びＤの存在下又は非存在下、ＩＡＰＰ断片（ＩＡＰＰの断片２０〜２９：非凝集及び凝集モノマー）に曝露されたラット小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の細胞培養物における、細胞アポトーシスの評価を示す図である。参照化合物：クルクミン。
【図１４】ラット小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）培養物に投与したとき、同時に低カリウム培地−ＫＣｌに供した、式Ｉの非限定的な例であるシャペロニンＢ、Ｃ及びＤの保護活性及び／又は修復の評価を示す図である。図のパートＡは−ＫＣｌ対照（保護効果）に関する結果を提示し、パートＢは標準カリウム＋ＫＣｌの対照（修復効果）に関する結果を提示する。
【図１５】ラット小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）培養物を投与し、その４時間後にそれらを低カリウム培養培地（−ＫＣｌ）に曝露したときのシャペロニンＢ、Ｃ及びＤの保護活性及び／又は修復の評価を示す図である。図のパートＡは−ＫＣｌ（保護効果）に関する結果を提示し、図のパートＢは標準カリウム（＋ＫＣｌ）の対照（修復効果）に関する結果を提示する。
【実施例】
【００７８】
発明の開示
以下の例は、いかなる形においても本発明の限定として解釈されるべきではない。これらは、本明細書において化学シャペロニンとみなす式Ｉの化合物を使用して、プレフィブリル及びプロトフィブリル、アミロイドプラーク及び線維の構造を阻害、低減、脱凝集することによる、ＣＤ、特にアミロイド起源のＣＤ（とりわけ、ＡＤ、ＤＭ２、ＥＰ、ＥＨ、ＥＴＴ）に対する新規の予防法及び治療処置法を例示する。
【００７９】
（例１）
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による、ＨＳＡ線維形成におけるシャペロニンのモジュレーター性の評価
シャペロニンＡ（３．０１７ｍＭ及び９．０５１ｍＭ）の存在下又は非存在下、トリス緩衝液（ｐＨ＝７．４、２０ｍＭ）中、３．０１７ｍＭのＨＳＡの最終濃度において、試料の調製を行った。６５℃で７２時間インキュベートした。ＴＥＭ研究のために、２時間ごとにアリコートを採取した。
【００８０】
ＨＳＡ溶液（５μｌ）を、３００メッシュのホルムバール被覆銅グリッド中に３分間置く。過剰な溶液をマイクロピペットで除去する。その後、事前に１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離したウラニル（５μＬ、２％）を添加する。過剰な明暗を２分の時点で除去し、グリッドを十分な時間空気乾燥した。試料の観察及び記録を、８０ｋｅＶで動作しデジタルカメラモデルＭＴＩ  ＣＣＤ−３００−ＲＣと連結された、顕微鏡ＪｅｏｌモデルＪＥＭ−１０１０を使用して行った。
【００８１】
図２は、シャペロニンの非存在下で、４８時間後に多くの長い線維が生成し、ＨＳＡに輪郭をもたらすことを示す。対照的に、シャペロニンＡの存在下では、線維は非常に小さく短い。より高い濃度のシャペロニンＡでは、線維は事実上消滅することも観察され、オリゴマーが観察されるのみであり、したがって、シャペロニンＡの阻害的性質が推測される。
【００８２】
（例２）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の線維形成におけるシャペロニンのモジュレート活性の評価
研究溶液の調製
チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）：Ｔｈ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ、４７ｍｇ）を最終体積である２５ｍＬになるまで水中に溶解させる。
【００８３】
ＨＳＡ：ＨＳＡ（３００μＭ）を、最終体積である１０ｍＬになるまで緩衝液（グリシン、ｐＨ＝３、５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中で調製する。溶液をａｃｒｏｄｉｓｃ型０．２ミクロン細孔を有するシリンジフィルター（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）で濾過する。
【００８４】
シャペロニン：式Ｉの非限定的な例である選択されたシャペロニン（７５．４μｍｏｌ；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を、２５ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させる。
【００８５】
実験手順
２５０μＬのＨＳＡ溶液（３００μＭ）及びシャペロニンとＨＳＡとの混合物（３００μＭ）を取り、それぞれのウェル（ポリスチレンプレート、９６ウェルＣｏｓｔａｒ  ３６１５、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｐｌａｔｅ）に入れ、ＴｈＴ（１μｌ）を各ウェルに添加して、２４μＭの最終濃度とした。蛍光分光光度計Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００、ＴＥＣＡＮ、Ａｕｓｔｒｉａ中で、蛍光シグナルをλｅｍｉｓ．＝４８２ｎｍ（λｅｘｃｉｔ．＝４５０ｎｍ）で測定した。４２℃で２０分ごとに読みを行った。水中のＴｈＴを含有するがＨＳＡを含有しない標的を調製し、これについてのバックグラウンドシグナルですべてのシグナルを補正する。
【００８６】
図３は、評価するシャペロニン（３００μＭ）の存在下又は非存在下、４２℃でのグリシン緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝３；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いたＨＳＡの線維形成（３００μＭ）の動力学から得られた結果を示す。ＨＳＡフィブリル形成の過程において、遅滞期が現れないことが観察される。シャペロニンを添加した場合、より少ない量のフィブリルに対応する、ＴｈＴの蛍光強度（ＦＩ）の減少が観察された。このことは、ＨＳＡフィブリル形成過程におけるシャペロニンの阻害能力を示している。
【００８７】
（例３）
蛍光分光法による、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の線維形成の動力学におけるシャペロニンのモジュレーター性の評価
研究溶液の調製
研究溶液の調製
チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）：Ｔｈ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ、１０ｍｇ）を水中に溶解させ、最終体積である５ｍＬにする。
【００８８】
ＢＳＡ：ＢＳＡ（画分Ｖ、ＭＭ：６６２９６Ｄａ、５００ｍｇ）を溶解させて、緩衝液（グリシン、ｐＨ＝３；５０ｍＭ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて最終体積である１０ｍＬにした。溶解液を０．４５μｍの細孔を有するａｃｒｏｄｉｓｃ型のフィルターシリンジ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で濾過する。ＢＳＡの正確な濃度を、モル吸光係数（ξ＝４３８２４ＡＵ・ｃｍ−１・Ｍ−１）の報告値を考慮することによって計算する。
【００８９】
シャペロニン：式Ｉの非限定的な例である選択されたシャペロニン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧに対して７５．４μｍｏｌ、図１）を１．２ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、緩衝液を用いて１０ｍＬの最終体積に希釈する。
【００９０】
実験手順
ＢＳＡ溶液から２５０μＬを取り（１００μＭ）、ＢＳＡとシャペロニンとの混合物（１μＭ）を対応するウェルに入れ、各ウェルにＴｈＴ（１μＬ）を添加して２４μＭの最終濃度を得る。蛍光分光光度計Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００、ＴＥＣＡＮ、Ａｕｓｔｒｉａ（９６ウェル、ｃｏｓｔ  ３６１５、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｐｔｉｃ  Ｐｌａｔｅポリスチレンプレート）中で、蛍光シグナルをλｅｍｉｓ．＝４８２ｎｍ（λｅｘｃｉｔ＝４５０ｎｍ）で測定した。６５℃でインキュベーション後、１０分ごとに読みを行った。水中のＴｈＴを含有するがＢＳＡを含有しない標的を調製し、このバックグラウンドシグナルですべてのシグナルを補正する。
【００９１】
図４は、評価するシャペロニン（１μＭ）の存在下又は非存在下、６５℃でのグリシン緩衝液（ｐＨ＝３；５０ｍＭ；ＮａＣｌ  １００ｍＭ）を用いたＢＳＡ（１００ｍＭ）線維形成の動力学から得られた結果を示す。述べたように、ＢＳＡフィブリル形成過程は十分に明確な遅滞期を示さず、約１２０分から安定化した。シャペロニンを添加した場合、より少ない量のフィブリルに対応する、ＴｈＴの蛍光強度（ＦＩ）の減少が認められた。このことは、シャペロニンの存在下で、フィブリル形成過程が阻害されることを示している。
【００９２】
（例４）
蛍光分光法の使用による、ＢＳＡ線維形成におけるシャペロニンのモジュレーター性の評価
試料調製を、例３で記載された試料調製と同様に行った。プレートを６５℃で３時間インキュベートする。次いで、１００μＬの試料をエッペンドルフチューブに入れ、ＴｈＴを添加して２０μＭの最終濃度を実現する。試料を１３００ｒｐｍで２分間遠心分離した。次いで、６μＬの試料をカバースリップを備えたスライド上に置く。蛍光顕微鏡Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｔａｒと青色フィルターを有する５０／ＡＣ  ＨＢＯランプにより、これを観察する。画像を１０×で記録する。
【００９３】
図５に、実験終了時に得られた試料の顕微鏡像を示す。シャペロニンを用いないＢＳＡ顕微鏡像では、長い多くの線維が観察された。対照的に、シャペロニンを使用した場合、より少ない短い線維が観察された。この結果は、シャペロニンのタンパク質フィブリル形成過程を阻害する能力を実証している。
【００９４】
（例５）
蛍光分光法による、ＢＳＡ線維形成の動力学におけるシャペロニンのモジュレーター性の評価
研究溶液の調製
チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）：１００ｍｇのＴｈＴ（Ｓｉｇｍａ）を水中に溶解させ、１０ｍＬの最終体積にした。
【００９５】
ＢＳＡ：ＢＳＡ（画分Ｖ、ＭＭ：６６，２９６Ｄａ、５００ｍｇ）を溶解させて、緩衝液（ＰＢＳ  ０．１Ｍ、ｐＨ＝８．９、トリス２０ｍＭ；ｐＨ＝７．４又はグリシン５０ｍＭ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ含有又は不含、ｐＨ＝３）中で最終体積である２５ｍＬにした。ＢＳＡの濃度を、モル吸光係数（ξ＝４３８２４ＡＵ・ｃｍ−１・Ｍ−１）の報告値を考慮することによって計算する。
【００９６】
シャペロニン：式Ｉの非限定的な例である選択されたシャペロニン（７５．４μｍｏｌ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ、図１）をＤＭＳＯ中に溶解させ、選択された緩衝液を用いて１０ｍＬの最終体積に希釈する。
【００９７】
実験手順
ＢＳＡ溶液（シャペロニン非存在下のＢＳＡ  ５０ｕＭ）及び同じ濃度のＢＳＡとシャペロニンとの混合物（ＢＳＡ：シャペロニンのモル比：１：０；１：０．００２５；１：０．００５、１：０．０１、１：０．０２、１：０．１、１：１、１：２）を０．２ミクロンの細孔を有するａｃｒｏｄｉｓｃ型シリンジフィルター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に通した。これらの溶液を、振盪せずに２０℃及び７５℃の温度でインキュベートした。次いで、これらの混合物の均一なアリコートを抽出し、ＴｈＴ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加して、モル比５０：１のＴｈＴを有するＢＳＡ溶液を得る。いずれも温度制御装置を備えたＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（セル形式）又はＩｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００、ＴＥＣＡＮ、Ａｕｓｔｒｉａ（ポリスチレンプレート形式９６ウェル、Ｃｏｓｔａｒ  ３６１５、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｏｐｔｉｃ  Ｐｌａｔｅ）で、蛍光シグナルをλｅｍｉｓ＝４８２ｎｍ（λｅｘｃｉｔ．＝４５０ｎｍ）で測定した。水中のＴｈＴを含有するがＢＳＡを含有しない標的を調製し、これについてのシグナル線ですべてのシグナルを補正する。
【００９８】
ＩＣ５０の計算のために、ＢＳＡ溶液（３００ｍＭ）及びＢＳＡとシャペロニンとの混合物を、ＢＳＡ：シャペロニンのモル比：１：０、１：０．０１、１：０．０５、１：０．５、１：１、１：２．５、１：５で調製した。試料を、上記で記載した手順に従って処理した。
【００９９】
図６（パートＡ）に、同じ濃度での、評価するシャペロニンの存在下又は非存在下、７５℃でのＰＢＳ（ｐＨ＝８．９、１００ｍＭ）中におけるＢＳＡ線維形成動力学（５０ｍＭ）の結果を示す。述べたように、ＢＳＡフィブリル形成の過程は遅滞期を有さず、最初の５０分で平坦期に達する。全体として、ＢＳＡ対照に対するＴｈＴのＦＩの減少によって表される、シャペロニンの存在下でのＢＳＡフィブリルの濃度の減少が存在する。
【０１００】
図６のパートＢでは、被験シャペロニンのいずれかの存在下で、１５０分後にＴｈＴのＦＩの顕著な減少が存在することが観察される。この効果は、シャペロニンＦ及びＧを使用した場合により明白であり、参照化合物（シャペロニンＣ又はナプロキセン）の効果よりも著しく高い。このことは、ＢＳＡフィブリル形成における阻害を示している。
【０１０１】
さらに、図７では、シャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの存在下、グリシン緩衝液（ｐＨ＝３；５０ｍＭ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ）中のＢＳＡフィブリル形成の過程の結果が観察された。線維形成の阻害は、１：０のＢＳＡ：シャペロニンモル比を考慮すると、１：１未満でより有効である。全般に、フィブリル形成の過程は、同じシャペロニンに対して使用される濃度に応じてモジュレートされ、得られる線維の濃度を著しく低下させる。
【０１０２】
図８において、表は、非限定的な例ではないそれぞれの評価された阻害剤から得られたＩＣ５０値を示す。計算は、対数関数によってデータを内挿することによってなされる。凝集の阻害活性がシャペロニン濃度に依存することが見出される。シャペロニンＡ及びＢの阻害活性は互いに類似しており、Ｃよりも２倍大きい。さらに、シャペロニンＤは先のシャペロニンよりも１７倍大きかった。これらの結果は、図７で得られた結果と一致し、タンパク質凝集において評価されたシャペロニンのモジュレート活性を裏付ける。
【０１０３】
（例６）
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による、ＢＳＡ線維形成におけるシャペロニンのモジュレーター性の評価
例５で記載された実験に関して、各試料の様々なアリコート（１０μＬ）を取り、この例で定義される緩衝液中に好適に希釈した（１／１０又は１／２０の希釈）。コロジオン及び炭素で被覆された銅グリッド（４００メッシュ）上に６μＬの各試料を置く。５分後、濾紙を使用して過剰な試料を除去し、調製物をＵＯ２（ＡｃＯ）２（１％）で染色した。電子顕微鏡ＪＥＭ−１０１０、ＪＥＯＬ（日本）を用いて８０ｋＶでＴＥＭ画像を記録した。
【０１０４】
選択されたシャペロニンのＢＳＡフィブリル形成におけるモジュレート作用を、直径が約８ｎｍのアミロイド線維を観察することが可能なＴＥＭ技法によって評価した。ＢＳＡ（５０ｍＭ）並びにＢＳＡシャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ（モル比１：１）を用いた実験について得られた顕微鏡像の例を図９に示す。
【０１０５】
第１の顕微鏡像は、長い、輪郭を有するＢＳＡの線維の存在を示していた。様々なシャペロニンの存在下での実験を表す他のすべての顕微鏡像では、オリゴマーとして定義されるアモルファスの円形構造が見られる。これらの結果は、式Ｉの非限定的な例である選択されたシャペロニンの線維に対する阻害又は脱凝集効果を実証している。
【０１０６】
（例７）蛍光顕微鏡法による、ＩＡＰＰフィブリル形成（２０から２９ａａ）の動力学におけるシャペロニンのモジュレーター性の評価
研究溶液の調製
チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）：１００ｍｇのＴｈ−Ｔ（Ｓｉｇｍａ）を水中に溶解させ、最終体積である１０ｍＬにした。
ＩＡＰＰ断片２０〜２９を、記載された手順に従って合成した（Ｋａｔｅｓ，Ｅ．及びＡｌｂｅｒｉｃｉｏ  Ｆ．、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２０００；Ｈｏｏｄ，ＣＡら、Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ  ２００８、１４、９７〜１０１）。ペプチドを、半分取逆相高速液体クロマトグラフィー（英語Ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙにおけるその頭字語は、ＳＰ−ＨＰＬＣ）によって精製したところ、その純度は９５％超であった。質量分析（英語Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙにおけるその頭字語は、ＥＳＩ−ＭＳ）により、予測される分子質量（ＭＭ：１０２９Ｄａ）が確認された。
【０１０７】
シャペロニン：式Ｉの非限定的な例である選択されたシャペロニンを１．２ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、緩衝液（ＰＢＳ  １００ｍＭ、ｐＨ７．４；ＮａＣｌ  １００ｍＭ）を用いて１０ｍＬの最終体積にした。
【０１０８】
実験手順
シャペロニンを含有するか（１００μＭ）又は含有しないＩＡＰＰ（２０〜２９、１００μＭ）の溶液を、５０：１のＩＡＰＰ：ＴｈＴのモル比におけるＴｈＴ（２０μＭ）の存在下、容積４．５ｍＬ、経路長１０ｍｍのメタクリレートセル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中において、２５℃でインキュベートし、動力学中、セルを撹拌した。ＩＦ（Ｃｒａｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ分光蛍光計）を、５ｎｍバンド幅を用いてλｅｍｉｓ＝４８２ｎｍ（λｅｘｃｉｔ．＝４５０ｎｍ）で連続的に記録した。すべてのシグナルを、タンパク質の非存在下における、ブランクとして使用された水中のＴｈＴを用いたバックグラウンドシグナルで補正する。
【０１０９】
図１０（パートＡ）に、２５℃でのＩＡＰＰ断片２０〜２９のフィブリル形成におけるシャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦのモジュレート効果を提示する。すべてのシャペロニンは、試験された濃度（ペプチド：シャペロニンのモル比は１：１）においてこの過程をモジュレートした。Ｅ及びＦのシャペロニンは、ＩＡＰＰ線維形成を加速させた。これに対し、シャペロニンＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは線維形成の平均時間を延長させ、したがって、フィブリル形成過程を遅延させた（図１０、パートＢ）。シャペロニンＢの場合、この阻害挙動は、１：１以下のモル比でのタンパク質：シャペロニンについて維持された（図１１）。しかし、モル比がより高い場合、過程は加速され、形成された線維の濃度は増加した。
【０１１０】
（例８）
ＩＡＰＰ２０〜２９（モノマー及び凝集）の存在下における、小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）の細胞生存率の評価。シャペロニンの細胞保護効果
試料調製
ＩＡＰＰ断片の２０〜２９（ＭＭ  １０２９Ｄａ）の溶液を、ＰＢＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４；ＮａＣｌ  １００ｍＭ）中で調製する。ＤＭＳＯ中でモノマーペプチド濃度は５．８ｍＭであり、凝集ペプチドは３２．６μＭであった。タンパク質濃度は、較正曲線を使用して計算される。
【０１１１】
シャペロニン：式Ｉの非限定的な例として選択されたシャペロニンＢ及びＤの溶液（２５μＭ）を１．２ｍＬのＤＭＳＯ中で調製し、緩衝液で希釈して、１０ｍＬの最終体積を得る。参照化合物として使用されるクルクミン（５．５ｍＭ）をエタノール中で調製した（Ｙａｎｇ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５、２８０、５８９２〜５９０１）。
【０１１２】
実験手順
Ｍｏｒａｎらによって報告された手順（Ｗｈｉｔｅ，Ｓ．及びＭｏｒａｎ，Ｊ．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２０１１、５８、９３４〜４２）に従って、生存率試験を行った。小脳顆粒細胞の細胞培養物を使用する（ＣＧＣ  ８分割）。
【０１１３】
特に、本発明では、ＣＧＣ細胞培養物の生存率を、モノマー形態及び凝集形態のＩＡＰＰの２０〜２９断片、又は様々なモル比におけるタンパク質：シャペロニンの混合物を用いて評価した。簡単に述べると、すべてのＣＧＣの試料において、培地の体積の半分を除去して、当該量の被験タンパク質又は異なるモル比（１：０．３又は１：１）を有するペプチド：シャペロニンの混合物を独立して添加する。その後、富化された細胞培養培地を再び合わせ、これを再び２０時間インキュベートする。生存率レベルを、ＭＴＴアッセイ（Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ａ．及びＪ．Ｍｏｒａｎ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ２００３、７１、３８３〜９６）を使用して見積もった。
【０１１４】
選択されたシャペロニンの存在下又は非存在下でモノマー形態又は凝集形態のＩＡＰＰ断片２０〜２９に曝露されたＣＧＣ細胞培養物の細胞生存率を、クルクミンを参照化合物として使用して、それらの報告された崩壊活性（Ｙａｎｇ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５、２８０、５８９２〜５９０１）によって行った。
【０１１５】
図１２では、ＭＴＴアッセイによる細胞生存率の評価の結果（これは、一元配置ＡＮＯＶＡ統計検定、続くポステリオリＬＳＤ検定（ＬＳＤとは、英語のＬｅａｓｔ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅの頭字語）によって分析された）が観察された。
【０１１６】
結果は、モノマー形態のタンパク質の細胞傷害性効果は、その凝集形態よりもＣＧＣにおいて３倍近く細胞傷害性が強いことを示していた（ｐ＜０．０５）。さらに、細胞をシャペロニンの存在下でモノマーに曝露する場合、試験された２つのモル比においてシャペロニンＢについては生存率が２倍高く、他の残りの被験化合物と有意に異なる（ｐ＜０．０５）ことが見出された。シャペロニンＤの場合、１：０．３のモル比については生存率はほぼ２倍高く、細胞をモノマー単独に曝露する場合、有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。対照的に、クルクミンの存在下では、有意差は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。これは、クルクミンは、細胞が凝集形態のタンパク質に曝露されるときに強力な細胞保護物質として働き、モノマーに対してはこの機能を果たさないことを示す一部の報告（Ｙａｎｇ  Ｆ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５、２８０、５８９２〜５９０１）と一致する。
【０１１７】
細胞傷害性モノマーＩＡＰＰの存在下でＣＧＣに対して評価された新規のシャペロニンの細胞保護効果は、作用機序の種類（とりわけ、凝集の阻害、凝集の低減又はモノマーの除去）によって説明することができると考えられる。
【０１１８】
シャペロニンＤの存在下でのＩＡＰＰの断片２０〜２９の凝集形態の場合、ＣＧＣの生存率は、ＩＡＰＰ２０〜２９の凝集断片に曝露された細胞と有意差はない（ｐ＞０．０５）。予測されるように、クルクミンは、残りの研究群と統計的に異なる（ｐ＜０．０５）顕著な細胞保護効果を示した。
【０１１９】
（例９）
ＩＡＰＰ断片２０〜２９（モノマー及び凝集）及びシャペロニンの小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）に対するアポトーシス効果の評価
試料調製
ＩＡＰＰ断片２０〜２９（１０２９Ｄａ  ＭＭ）の溶液をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４、１００ｍＭ；ＮａＣｌ１００ｍＭ）中で調製する。ＤＭＳＯ中でモノマーペプチド濃度は５．８ｍＭであり、凝集ペプチドは３２．６μＭであった。タンパク質濃度は、較正曲線を使用して計算される。
【０１２０】
ＤＭＳＯ中２５μＭのシャペロニン溶液Ｂ及びＤをそれぞれ１つずつと、エタノール中のクルクミン（５．５μＭ）とを調製した。
【０１２１】
実験手順
アポトーシス試験を、Ｊ．Ｍｏｒａｎらによって報告された手順（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９９、７３、５６８〜７７）に従い、８分割のＣＧＣ培養物を使用して行う。
【０１２２】
式Ｉから選択される非限定的な例であるシャペロニンＢ及びＤの、タンパク質のアポトーシス効果及び細胞保護効果を、ＣＧＣの細胞培養物中で評価し、クルクミンを参照化合物として使用した。簡単に述べると、すべての試料において、培養培地から半分の体積を除去して、当該量の被験タンパク質（モノマー形態及び凝集したＩＡＰＰ）、異なるモル比（１：０．３又は１：１）のタンパク質：シャペロニンの混合物、又はシャペロニンを独立して添加した。その後、富化された細胞培養培地を再び合わせ、これを再びさらに４時間インキュベートする。細胞アポトーシスを、分光蛍光計Ｂｉｏｔｅｃｋ−Ｓｙｎｅｒｇｙの使用により、カスパーゼ−３免疫蛍光レベル（Ｊ．Ｍｏｒａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９９、７３、２、５６８〜７７）を決定することによって見積もる。
【０１２３】
モノマー又は凝集ＩＡＰＰの断片２０〜２９の異なる形態に曝露されたＧＣＣのカスパーゼ−３のレベルは、有意差がなく（ｐ＞０．０５）、観察されたより高いアポトーシスレベルが得られた（図１３）。
【０１２４】
ＩＡＰＰ（モノマーＩＡＰＰ又は凝集ＩＡＰＰの断片２０〜２９）とシャペロニンとの混合物をＣＧＣ中へ添加することにより、カスパーゼ−３のレベルが有意に低下したことが見出された。よって、最大濃度のシャペロニンＢ及びＤを使用する場合、シャペロニンを含有しない対照に対して６倍強い阻害が得られる。これらの結果は、新規の被験シャペロニンが、ＩＡＰＰによって引き起こされる、プログラム細胞死の原因となるＣＧＣ細胞に対する細胞傷害性効果を阻害及び／又は低減することを実証している。
【０１２５】
（例１０）
小脳顆粒細胞（ＣＧＣ）に対するシャペロニンＢ、Ｃ及びＤの保護効果の評価
試料調製
シャペロニン溶液Ｂ、Ｃ及びＤを、ＤＭＳＯ中で調製する（２０μＭ）。
【０１２６】
実験手順
Ｊ．Ｍｏｒａｎらによって報告された手順（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９９、７３、５６８〜７７）に従って、アポトーシスアッセイを行う。８分割のＣＧＣ培養物を使用した。実験を三連で行った。
【０１２７】
式Ｉから選択される非限定的な例であるシャペロニンＢ、Ｃ及びＤの再生剤及び／又は保護剤効果を、低カリウム（−ＫＣｌ）のＣＧＣ培養物で評価する。２５ｍＭのＫＣｌ（＋ＫＣｌ）を有するウェルの培養培地を吸引によって除去し、培地−ＫＣｌ（５ｍＭ）で置き換える。
【０１２８】
シャペロニンＢ、Ｃ及びＤ（２５μＭ）を、アポトーシス促進刺激（−ＫＣｌ）の誘発の開始時（群Ｉ）又は４時間後（群ＩＩ）に別々に添加し、さらなる２つの対照群（−ＫＣｌ及び＋ＫＣｌ）を含めて４時間インキュベートした。アポトーシスを、分光蛍光計Ｓｙｎｅｒｇｙ−Ｂｉｏｔｅｃｋの使用により、免疫蛍光カスパーゼ−３レベル（Ｊ．Ｍｏｒａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９９、７３、２、５６８〜７７）を決定することによって見積もった。
【０１２９】
図１４及び１５は、得られた結果を示す。
【０１３０】
図１４では、ＧＣＣの群Ｉにおけるカスパーゼ−３のレベルの、−ＫＣｌ対照群に対する低下が観察された。この低下はＢ、Ｃ及びＤで処理された試料について、それぞれ９２％、８０％及び７８％であった（パートＡ、図１４）。一方、群ＩのシャペロニンＢ、Ｃ及びＤを有する試料についてのカスパーゼ−３のレベルは（パートＢ、図１４）、＋ＫＣｌ対照群に対して、それぞれ８４％、５４％及び５２％低かった。これらの結果は、両対照に対し、評価されたシャペロニンの保護効果を実証している。
【０１３１】
図１５（パートＡ）は、群ＩＩにおいて、シャペロニンＢ、Ｃ及びＤで処理された試料について、カスパーゼ−３のレベルが−ＫＣｌ対照群に対してより低く（それぞれ、５６％、６６％及び２６％）、したがって、保護効果が明白であることを示している。しかし、カスパーゼ−３のレベルを＋ＫＣｌ対照と比較した場合（図１５、パートＢ）、シャペロニンＢ及びＣの場合、認識可能な差が存在しないことが示される。シャペロニンＤの場合、カスパーゼ−３のレベルは＋ＫＣｌ対照に対して９４％高い。全体として、シャペロニンＢ及びＣの存在は、＋ＫＣｌ培地によって誘発されるものと類似した再生効果を有すると結論付けることができる。
【０１３２】
最後に、これらの結果は、シャペロニンＢ、Ｃ及びＤの誘発されたアポトーシスに対する保護効果を実証しており、これは、これらがストレスの多い刺激を正の方向に相殺するためである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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