(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グラム陰性細菌感染を治療する医薬の製造のための、ヒト起源EGFドメインタンパク質又は該ヒト起源EGFドメインタンパク質を含む医薬組成物の使用であって、前記ヒト起源EGFドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号:1〜配列番号:1498のいずれか１つに記載される、前記使用。
【請求項２】
グラム陰性細菌感染によって生じる内毒素血症を治療する医薬の製造のための、ヒト起源EGFドメインタンパク質又は該ヒト起源EGFドメインタンパク質を含む医薬組成物の使用であって、前記ヒト起源EGFドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号:1〜配列番号:1498のいずれか１つに記載される、前記使用。
【請求項３】
前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列表の配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:108、配列番号:109、配列番号:1472、配列番号:1473、配列番号:1474、配列番号:1475、配列番号:1476、配列番号:1477、配列番号:1478又は配列番号:1479に記載されたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質が、原核細胞若しくは真核細胞組換えプラスミドによって発現されるか、又は化学合成によって調製されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス及びセラチア・マルセッセンスから選択される１以上であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
グラム陰性細菌のリポ多糖を加水分解する方法であって、前記リポ多糖をヒト起源EGFドメインタンパク質又は該ヒト起源EGFドメインタンパク質を含む組成物で処理する工程を含み、前記ヒト起源EGFドメインタンパク質のアミノ酸配列は配列表の配列番号:1〜配列番号:1498のいずれか１つに記載される、前記方法。
【請求項７】
前記タンパク質のアミノ酸配列が、配列表の配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:108、配列番号:109、配列番号:1472、配列番号:1473、配列番号:1474、配列番号:1475、配列番号:1476、配列番号:1477、配列番号:1478又は配列番号:1479に記載されたことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、原核細胞若しくは真核細胞組換えプラスミドによって発現されるか、又は化学合成によって調製されることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記グラム陰性細菌が、大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス及びセラチア・マルセッセンスから選択される１以上であることを特徴とする、請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体医療分野に属し、特にヒト起源EGFドメインタンパク質及び製薬工業における前記の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陰性細菌は広くグラム染色反応で赤色に染色される細菌を指し、それらは、グラム染色においてグラム陽性細菌とは細胞壁の違いのために相違を示す（陽性細菌は紫色に染色される）。グラム陰性細菌は、大腸菌（Escherichia coli）の他にプロテウス属（Proteus）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、ブルセラ・バシリ（Brucella bacilli）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfluenzae）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、アシネトバクター属（Acinetobacter）などが代表的である。そのような細菌の病原性は、しばしばそれらの細胞壁中の特定の成分、リポ多糖（内毒素としても知られている）と密接に関係する。人体では、多糖類は大量のサイトカインの産生及び免疫系の活性化を当該人体に誘発させ、最終的に体内の病原性細菌に対する生来の免疫応答を惹起させる。例えば、発赤及び腫脹は大量のサイトカインの生成及び放出の結果である。
【０００３】
感染巣の除去並びに対症療法及び支持療法に加えて、抗生物質もまたグラム陰性細菌感染の治療時に使用される必要がある。現在では、主として用いられる抗生物質はアミノグリコシド、ベータ-ラクタムなどである。これらの抗生物質は多様なグラム陰性細菌に強力な殺菌作用を有し、さらにまたより長期のポスト抗生物質作用を一般的なグラム陰性杆菌（例えば緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎杆菌及び大腸菌）に対して示す。抗生物質に加えて、例えばプロスタグランジンシンターゼ阻害剤、レバミゾール及びタフトシンのような薬剤もまたグラム陰性細菌感染の治療に有用である。しかしながら、抗生物質の広範囲な適用とともに、臨床医療における抗生物質の濫用は、一剤耐性から多剤耐性へと細菌の薬剤耐性進行をもたらし、したがって代替物として効果的に用いられてきた多くの第二選択抗生物質を無効にさせている。第二に、抗菌薬は細菌を殺滅/抑制しながら内毒素の生成を誘発することがあり、そのことは、当該疾患の治療の難度を高める。したがって、強力な殺滅作用を有する新規な抗生物質が持続的に表れ、進歩的な支持療法が出現しているが、グラム陰性細菌感染によって引き起こされる内毒素血症の治療は、臨床シナリオ、特に20−30％の許容不能な死亡率を有するものではなお難題である。リポ多糖は、グラム陰性細菌感染後に生じる一連の毒性反応をもたらす主要な病原性因子であると報告されている。抗生物質は良好な細菌排除作用を有するが、それら抗生物質は、血中の遊離リポ多糖及び当該遊離リポ多糖で持続的に刺激される標的細胞によって産生される非常に多様な有害サイトカインに対しては作用をもたない。したがって、臨床で抗菌薬を選択するとき、薬剤感受性検査の結果及び内毒素放出を誘発する特性について総合的な配慮が払われるべきである。第三に、リポ多糖はグラム陰性細菌の細胞壁の表面に存在するので初期タイプの抗生物質の多くはそのような細菌を効果的に抑制することができない。これらの理由から、ここ数年、グラム陰性細菌感染の治療で新規な分野が活発に開拓されつつある。
【０００４】
抗微生物ペプチド（AMP）は抗菌活性を有する短いペプチドを指し、それらの大半は、熱安定性、高アルカリンシティー、及び広域抗菌活性を有する。これまで、約2000以上のAMPが多様な生物から既に同定されている。これらのAMPは誘発後に合成され、病原体の侵入に対抗する生物の耐性で重要な中心的役割を果たし、生物における非特異的な免疫学的機能のための重要な防御構成成分と考えられる。したがって、グラム陰性細菌に対する新規なAPMの発見は最大の関心事及び努力の甲斐がある課題となっている。
EGFドメイン（EGF様ドメイン、上皮成長因子様ドメイン）はタンパク質ドメインであり、前記は進化時に相対的に保存され、当該ドメインが上皮成長因子で最初に同定されたことによる呼称である。EGFドメインは、通常は30−50アミノ酸残基を含み、これまでのところ多くの動物タンパク質で同定されている（例えば、ヒト凝固第VII因子（ヒト第VII因子、hF VIII））。hF VIIは人体で天然に存在するタンパク質であり、約50kDの分子量を有する。前記の分子は以下の4つのドメインを含む：膜結合N-末端γ-カルボキシグルタミン酸ドメイン（Glaドメイン）、2つのEGFドメイン、（EGF1及びEGF2）、及びC-末端セリンプロテアーゼドメイン。ヒト凝固因子VII-EGF1ドメイン（hF VII-EGF1）は約3.9kDの分子量を有する。ヒト起源では、hF VIII-EGF1の配列と類似する配列を有する多くのアナローグもまた存在する。例えば、ヒト起源凝固因子VII-EGF2タンパク質（hF VII-EGF2）、ヒト起源凝固因子IX-EGF1タンパク質（hF IX-EGF1）、ヒト起源凝固因子IX-EGF2タンパク質（hF IX-EGF2）、ヒト起源凝固因子X-EGF1タンパク質（hF X-EGF1）、ヒト起源凝固因子X-EGF2タンパク質（hF X-EGF2）などである。現在まで、抗菌剤としてヒト起源EGFドメインタンパク質を用いる細菌感染治療についての関連報告、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる内毒素血症を治療する医薬の調製に関する報告は存在しない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的の1つは、人工的に調製されたヒト起源EGFドメインタンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、該ヒト起源EGFドメインタンパク質がグラム陰性細菌に対し阻害作用を有すること、及び該ヒト起源EGFドメインタンパク質が内毒素を加水分解ししたがって内毒素を除去することを証明して、グラム陰性細菌感染を治療する新規なクラスの医薬、及びグラム陰性細菌によって引き起こされる内毒素血症を治療する医薬を開発することである。
本発明で示されるヒト起源EGFドメインタンパク質は表1に示すように称される。
【０００６】
表1：本発明で示されるヒト起源EGFドメインタンパク質の呼称
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【０００７】
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【０００８】
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【０００９】
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【００１０】
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【００１１】
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【００１２】
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【００１３】
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【００１４】
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【００１５】
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【００１６】
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【００１７】
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【００１８】
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【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
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【００２２】
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【００２３】
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【００２４】
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【００２５】
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【００２６】
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【００２７】
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【００２８】
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【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
上記に記載のヒト起源EGFドメインタンパク質は、原核細胞又は真核細胞組換えプラスミドから発現されるか、又は化学合成によって調製される。
本発明で用いられる工程は以下の通りである：
（1）ヒト起源EGFドメインタンパク質hF VII-EGF1をコードする遺伝子又は前記と50％を超える相同性を有する遺伝子、同様に蛍光タンパク質をコードする遺伝子をPCR増幅又は人工合成によって入手する工程、及びRFP融合タンパク質、RFP-hF VII-EGF1ヒト起源EGFドメインタンパク質をコードする融合遺伝子又は前述の融合タンパク質と50％を超える相同性を有する融合タンパク質の遺伝子をオーバーラップPCR増幅反応により入手する工程；
（2）組換え融合タンパク質をコードする上記に記載の個々の遺伝子フラグメントをそれぞれ原核細胞又は真核細胞ベクターに挿入して組換え原核細胞又は真核細胞プラスミドを構築し、続いて生成組換えプラスミドでコンピテントな細菌を形質転換して培養し、続いて正しく挿入されたフラグメントを含む組換えプラスミドを配列決定によってスクリーニングする工程；
（3）正しい配列決定結果を有する組換え原核細胞プラスミドで操作細菌を形質転換して発現させ、さらに発現タンパク質を単離及び精製し、融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1又は該融合タンパク質と50％を超える相同性を有するタンパク質を入手する工程、又は正しい配列決定結果を有する生成組換え真核細胞プラスミドを哺乳動物細胞にトランスフェクトして培養し、真核細胞発現について安定な細胞株を樹立し、発現タンパク質を単離及び精製し、融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1又は該融合タンパク質と50％を超える相同性を有するタンパク質を入手する工程；
（4）組換えタンパク質hF VII-EGF1又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質を、rTEV酵素で酵素的に消化することによって遊離させ、該タンパク質を精製する工程；
（5）組換えタンパク質hF VII-EGF1又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質の抗菌活性を分析する工程；
（6）組換えタンパク質hF VII-EGF1又は前記と50％を超える相同性を有するタンパク質によるリポ多糖の加水分解を銀染色によって分析する工程；
ここで、該原核細胞ベクターはpETプラスミド系（原核細胞発現プラスミド、例えばpET-14b、pET-19b、pET-21a(+)、pET-28a(+)、pET-42a(+)などが含まれる）であり、真核細胞ベクターはpcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(-)などである。
ヒト起源EGFドメインタンパク質の化学合成は、通常は専門企業に外注される。
【００５６】
本発明で示す1498のヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は、グラム陰性細菌のリポ多糖（内毒素（グラム陰性細菌の外膜の主要成分）としても知られている）を加水分解して細胞構造の安定性を破壊し、それによって殺菌作用を発揮することが実験的に明らかにされた。一方、ヒト起源EGFドメインタンパク質、例えばhF VII-EGF1、hF VII-EGF2、hF IX-EGF1、hF IX-EGF2、hF X-EGF1、及びhF X-EGF2は組織因子と非常に強く結合する。身体が損傷されたとき、組織因子は創傷で大量に暴露され、したがって創傷でそのようなEGFドメイン含有タンパク質を凝集させて標的誘導静菌作用を発揮させるであろう。抗菌活性に関するアッセイは、本発明で示す1498のヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）はグラム陰性細菌を顕著に阻害できることを示している。大腸菌DH5α、大腸菌BL21、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、 シトロバクター・ジベルスス（Citrobacter diversus）、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）に対する上述の組換えタンパク質の最小阻害濃度（MIC）は、下記実施例の表2及び3で示される。
【００５７】
本発明で示す1498のヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は、グラム陰性細菌のリポ多糖（実施例17に示すように内毒素としても知られる）を加水分解することができ、リポ多糖は内毒素血症を引き起こす主要な病原性因子である。したがって、本発明で示す1498のヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は、グラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する医薬の調製で用いることができる。
本発明は以下の有益な作用を有する：
1．本発明で提供される1498の人工的に調製されるヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は、グラム陰性細菌の外膜を加水分解することができ、さらに、前記はグラム陰性細菌に対して顕著な阻害作用を有することが実験的に示され、したがってグラム陰性細菌感染によって生じる疾患を治療する新規なクラスの治療薬を提供する。
2．本発明で提供される1498の人工的に調製されるヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は、グラム陰性細菌のリポ多糖（内毒素としても知られる）を加水分解でき、したがってグラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する新規なクラスの治療薬を提供する。
3．人工的に調製される、本発明で提供される6つのヒト起源EGFドメインタンパク質（すなわちhF VII-EGF1、hF VII-EGF2、hF IX-EGF1、hF IX-EGF2、hF X-EGF1、及びhF X-EGF2）は、組織因子との結合を介する創傷部位における標的誘導局在によって創傷部位でグラム陰性細菌に対して優れた標的誘導殺菌作用を示すことができ、新規な標的誘導抗菌薬の調製における使用が期待され得る。
4．1498のヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は人体で天然かつ固有の成分であり、本発明での静菌性ドメインとしてのEGFドメインタンパク質の使用は該医薬の免疫原性を効果的に低下させることができる。
5．1498の組換えヒト起源EGFドメインタンパク質（表１のPRT1からPRT1498）（例えばhF VII-EGF1）は、遺伝子操作技術を介して直接的に大腸菌細胞で適切に発現させることができるので、製造経費が低く、工業生産に適している。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図1は、実施例1の組換えタンパク質hF VII-EGF1 をコードする遺伝子配列のPCR増幅の電気泳動図である。レーン1はDNA分子量マーカー（下記（TIANGEN BIOTECH Co. Ltd.）から購入したMarker 1)であり、レーン2はhF VII-EGF1をコードする配列のPCR増幅である。矢印は問題の増幅フラグメントを指し示す。
【図２】図2は、実施例１の融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1をコードする遺伝子配列のPCR増幅の電気泳動図である。レーン1はDNA分子量マーカー（下記（TIANGEN BIOTECH Co. Ltd.）から購入した1kb Marker)であり、レーン2はRFP-hF VII-EGF1をコードする配列のPCR増幅である。
【図３】図3は、実施例2の組換え原核細胞プラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1の模式図である。反時計回りの配列はフォワード遺伝子フラグメントであり、時計回りの配列はリバース遺伝子フラグメントである。
【図４】図4は、実施例2の組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1の制限エンドヌクレアーゼ消化フラグメントの同定のための電気泳動図である。レーン1はDNA分子量マーカー（下記（TIANGEN BIOTECH Co. Ltd.）から購入した1kb Marker)であり、レーン2は、組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1の制限エンドヌクレアーゼ二重消化後に得られるpET19bベクターフラグメント及び組換えタンパク質RFP-hF VII-EGF1をコードするDNAフラグメントである。
【図５】図5は、実施例3の融合タンパク質RFP-hF VII-EGF2をコードする遺伝子配列のPCR増幅の電気泳動図である。レーン1はDNA分子量マーカー（下記（TIANGEN BIOTECH Co. Ltd.）から購入した1kb Marker)であり、レーン2はRFP-hF VII-EGF2をコードする配列のPCR増幅である。
【図６】図6は、実施例5及び8の大腸菌における組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1及びpET19bRFP-FVII-EGF2の融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1及びRFP-hF VII-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導により融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は誘導前で融合タンパク質RFP-hF VII-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン5は誘導により融合タンパク質RFP-hF VII-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図７】図7は、実施例7及び8でrTEVにより融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1及びRFP-hF VII-EGF2を酵素消化した後で得られた組換えタンパク質hF VII-EGF1及びhF VII-EGF2の同定のためのTricienゲル分析図である。レーン1は低分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入したPageRuler無染色低域タンパク質ラダー）であり、レーン2はrTEV酵素消化後に得られた組換えタンパク質hF VII-EGF2であり、レーン3はrTEV酵素消化後に得られた組換えタンパク質hF VII-EGF1であり、矢印は酵素消化後の問題のタンパク質を示す。
【図８】図8は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahF IX-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-hF IX-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-hF IX-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-hF IX-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図９】図9は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahF IX-EGF2-RFPの融合タンパク質RFP-hF IX-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-hF IX-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-hF IX-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１０】図10は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahF X-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-hF X-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-hF X-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-hF X-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１１】図11は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahF X-EGF2-RFPの融合タンパク質RFP-hF X-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-hF X-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-hF X-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１２】図12は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahDelta & Notch-like epidermal growth factor-related-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-デルタ＆ノッチ様上皮成長因子関連-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-デルタ＆ノッチ様上皮成長因子関連-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-デルタ＆ノッチ様上皮成長因子関連-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-デルタ＆ノッチ様上皮成長因子関連-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１３】図13は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahZonadhesin-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-ゾナドヘシン-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-ゾナドヘシン-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-ゾナドヘシン-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-ゾナドヘシン-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１４】図14は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahEGF-latrophilin＆seven transmembrane domain-containing protein 1-EGF2-RFPの融合タンパク質RFP-EGF、ラトロフィリン＆7トランスメンブレンドメイン含有タンパク質1-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-EGF、ラトロフィリン＆7トランスメンブレンドメイン含有タンパク質1-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-EGF、ラトロフィリン＆7トランスメンブレンドメイン含有タンパク質1-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-EGF、ラトロフィリン＆7トランスメンブレンドメイン含有タンパク質1-EGF2である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１５】図15は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahProstaglandin G/H synthase 1-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-プロスタグランジンG/Hシンターゼ1-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-プロスタグランジンG/Hシンターゼ1-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-プロスタグランジンG/Hシンターゼ1-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-プロスタグランジンG/Hシンターゼ1-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１６】図16は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahNeurexin-1-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-ニューレキシン-1-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-ニューレキシン-1-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-ニューレキシン-1-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-ニューレキシン-1-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１７】図17は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahEGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-EGF含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質1-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-EGF含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質1-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-EGF含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質1-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-EGF含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質1-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１８】図18は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahNetrin-3-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-ネトリン-3-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（下記（Thermo Scientific）から購入した無染色タンパク質マーカー）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-ネトリン-3-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-ネトリン-3-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-ネトリン-3-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図１９】図19は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahPutative EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 4-EGF2-RFPの融合タンパク質RFP-推定EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様4-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-推定EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様4-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-推定EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様4-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-推定EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様4-EGF2である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２０】図20は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahProtransforming growth factor alpha-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-前形質転換成長因子アルファ-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-前形質転換成長因子アルファ-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-前形質転換成長因子アルファ-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-前形質転換成長因子アルファ-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２１】図21は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahDelta-like protein 4-EGF2-RFPの融合タンパク質RFP-デルタ様タンパク質4-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-デルタ様タンパク質4-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-デルタ様タンパク質4-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-デルタ様タンパク質4-EGF2である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２２】図22は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahNidogen-1-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-ニドゲン-1-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-ニドゲン-1-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-ニドゲン-1-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-ニドゲン-1-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２３】図23は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahNidogen-1-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-ウロモジュリン様1-EGF3の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-ウロモジュリン様1-EGF3を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-ウロモジュリン様1-EGF3を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-ウロモジュリン様1-EGF3である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２４】図24は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahSushi, von Willebrand factor type A-EGF & pentraxin domain-containing protein 1-EGF2-RFPの融合タンパク質ヒトスシ、フォン・ヴィレブラント因子A型-EGF＆ペントラキシンドメイン含有タンパク質1-EGF2の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質ヒトスシ、フォン・ヴィレブラント因子A型-EGF＆ペントラキシンドメイン含有タンパク質1-EGF2を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質ヒトスシ、フォン・ヴィレブラント因子A型-EGF＆ペントラキシンドメイン含有タンパク質1-EGF2を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質ヒトスシ、フォン・ヴィレブラント因子A型-EGF＆ペントラキシンドメイン含有タンパク質1-EGF2である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２５】図25は、実施例8の大腸菌における組換えプラスミドpET21ahProtocadherin Fat 2-EGF1-RFPの融合タンパク質RFP-プロトカドヘリンFat 2-EGF1の誘導性発現のSDS-PAGE分析である。レーン1はタンパク質分子量マーカー（BIO-RADから購入したPrecision Plus Protein Standards）であり、レーン2は誘導前で融合タンパク質RFP-プロトカドヘリンFat 2-EGF1を発現していない大腸菌の全タンパク質であり、レーン3は誘導によって融合タンパク質RFP-プロトカドヘリンFat 2-EGF1を発現した後の大腸菌の全タンパク質であり、レーン4は精製融合タンパク質RFP-プロトカドヘリンFat 2-EGF1である。矢印は発現された融合タンパク質を示す。
【図２６】図26は、実施例9の組換え真核細胞プラスミドpcDNA3.1-RFP-hF VII-EGF1の模式図である。反時計回りの配列はフォワード遺伝子フラグメントであり、時計回りの配列はリバース遺伝子フラグメントである。
【図２７】図27は、実施例14の組換えタンパク質hF VII-EGF1で処理した大腸菌DH5αの増殖曲線である。
【図２８】図28は、実施例17の組換えタンパク質hF VII-EGF1による大腸菌EH100のLPSの加水分解のための銀染色である。レーン1は前染色タンパク質マーカーであり、レーン2は処理されていない大腸菌EH100のLPSであり、レーン3はhF VII-EGF1で処理された大腸菌EH100のLPSである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
詳細な説明
本発明は実施例と連携させながら下記でさらに詳述されるであろう。以下に記載される実施例では、詳細な実験条件は特段には記載されないが、前記は、当業者に周知の通常の条件、例えば以下の文献に記載の条件及び実験工程にしたがうか（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al (Ed.), New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；An Conventional Manual for Laboratory Animals (National Center for Standard Laboratory Animals, November, 2004)；及びa Manual of Basic Technique, 5th Edition (John Wiley & Sons, Inc., 2005)）、又は製造業者の推奨する条件及び実験工程にしたがう。実施例における詳細な実験方法は、タンパク質hF VII-EGF1によって例証され、他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）についての実験方法は、タンパク質hF VII-EGF1の実験方法を参考にして実施される。対象の発現タンパク質のヌクレオチド配列は、ウェブ（http://www.uniprot.org/又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/）のデータベースから入手できる。
【００６０】
［実施例１］
赤色蛍光タンパク質（RFP）タグを有する融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の遺伝子の入手
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）：
【００６１】
0006503342.tif 000051
【００６２】
2．PCR増幅によるhF VII-EGF1及びRFPのコード配列の入手
（1）hF VII-EGF1 をコードするDNAフラグメントの入手
鋳型としてhF VII CDS領域を含むプラスミド（FulenGen Co. Ltd., Guangzhou）を用いプライマー2及び4によりPCR増幅を実施した。プライマー4の配列にBamHI制限部位を導入し、さらに組換えタバコモザイクウイルスプロテイナーゼ（rTEV）のための酵素切断部位及びBsp119Iの制限部位をプライマー2の配列に導入して、他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）の発現のために、発現能力を有する配列による取替えを容易にした。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー2（10 mM）：1μL
プライマー4（10 mM）：1μL
hF VII CDS領域を含むプラスミド（100ng/μL）：2μL
プライムスター（PrimeStar）DNAポリメラーゼ：0.5μL
【００６３】
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼ（Takaraから購入）の指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で30秒の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し、hF VII-EGF1のコード配列を含むDNAフラグメントを入手し（図1参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
（2）タンパク質タグRFPをコードするDNAフラグメントの入手
鋳型としてRFPタンパク質の遺伝子のコード配列を含むプラスミド（Takaraから購入）を用いプライマー1及び3によりPCR増幅を実施した。プライマー1の配列にNdeI制限部位を導入した。反応系は、hF VII-EGF1をコードするDNAフラグメントの入手のための反応系を参考にして設定さた。
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で1分の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し、RFPのコード配列を含むDNAフラグメントを入手し、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
【００６４】
3．オーバーラッピングPCRによる融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1をコードする遺伝子の増幅
鋳型として上記に記載の2つのPCR増幅から入手したDNAフラグメントを用いてオーバーラッピングPCR増幅を実施し、融合遺伝子フラグメントRFP-ｈF VII-EGF1を得た。前記はRFP-TEV酵素切断部位及びヒト凝固因子VII-EGF1タンパク質のコード配列を含む。PCR反応系（50μL）は以下の通りであった：
脱イオン水：31.5μL
5ｘ反応緩衝液：10μL
dNTPミックス：4μL
プライマー1（10 mM）：1μL
プライマー4（10 mM）：1μL
第一のPCR増幅から得られたhF VII-EGF1コードDNAフラグメント（100ng/μL）：
2μL
プライムスター（PrimeStar）DNAポリメラーゼ：0.5μL
【００６５】
PCR増幅の反応条件はプライムスターDNAポリメラーゼの指示を参考に設定された：98℃で2分の前変性、以下の30サイクル（98℃で10秒の変性、55℃で15秒のアニーリング、及び72℃で1.5分の伸長）に続いて72℃で4分の伸長。
増幅生成物を2％アガロースゲル電気泳動で分析し、RFP-hF VII-EGF1をコードする配列を含むフラグメントを入手し（図2参照）、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従って回収した。
【００６６】
［実施例２］
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現する組換え原核細胞プラスミドの構築
1．RFP-hF VII-EGF1遺伝子フラグメント及び原核細胞発現ベクターpET19bの前処理
実施例1で入手したRFP-hF VII-EGF1遺伝子フラグメント及び原核細胞発現ベクターpET19b（Novagenの製品、このプラスミドは赤色蛍光タンパク質を保持するように改変されてある）を個々に制限エンドヌクレアーゼNdeI及びBamHI（両方ともTakara又はFermentasから購入）を用い37℃で一晩二重消化した。反応系は以下のように確立された:
0006503342.tif 000052
二重消化完了後、反応生成物を1％アガロースゲル電気泳動で分析し、問題のフラグメントをゲル回収キット（Omegaから購入）の指示に従ってゲル画像化系から紫外線ランプの下で回収した。
【００６７】
2．RFP-hF VII-EGF1遺伝子と原核細胞発現ベクターpET19bとの連結及び形質転換
（1）上記工程で入手したRFP-hF VII-EGF1及び原核細胞ベクターフラグメントを大雑把に定量し、続いて遺伝子フラグメントの分子数と原核細胞ベクターの分子数の比を3:1とする連結反応の原則に従い連結に付した。連結反応系は以下のように設定された:
0006503342.tif 000053
（2）T4 DNAリガーゼ（Fermentasから購入）で処理される全連結反応を16℃で一晩進行させた。上記で増幅させた遺伝子フラグメントRFP-hF VII-EGF1を原核細胞発現ベクターpET19bに挿入した。組換え原核細胞プラスミドの構築は図3に模式的に示した。
（3）連結生成物で大腸菌Top10（Invitrogen社から購入）のコンピテント細胞（文献（Molecular Cloning: a Laboratory Manual）にしたがって調製）を形質転換した。連結生成物による形質転換手順の主要な工程は以下の通りであった:
1）1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞に5μLの連結生成物をピペットで加えた。陰性コントロールは、1.5mLのエッペンドルフチューブに入れた100μLの大腸菌Top10コンピテント細胞である；
2）チューブを氷上に30分間置いた；
3）コンピテント細胞に金属浴で42℃にて90秒のショックを与えた；
4）チューブを氷浴に迅速に移して2分間冷却した；
5）900μLのSOC培地（10gペプトン、5g酵母抽出物、0.5g NaCl、0.186g KC1、0.95g MgCl2、ddH2Oに溶解して体積を980mLにし、オートクレーブして室温に冷却してから20％の無菌的グルコース水溶液を添加）を添加し、氷上に置いた；
6）チューブを180rpmで振盪しながら37℃で1時間インキュベートした；
7）細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離し、200μLの上清を残して過剰な培地を除去した。200μLの残留上清を用いて細菌を再懸濁した；
8）再懸濁した形質転換体を固形LB培地（0.1g/mLのアンピシリンを含む）に均質にプレートし37℃の定常温度のインキュベータで一晩インキュベートした。
【００６８】
3．組換えプラスミドの同定
上記に記載の形質転換大腸菌Top10の単一クローンを摘みとり少量中で培養し、プラスミド抽出キット（OMEGAから購入）を用いてプラスミド抽出に付し、続いて本実施例の工程1の工程に示す二重消化を実施した。ゲル電気泳動によって分けた二重消化生成物の結果は図4に示されている。酵素消化によって生じた2つのバンドのサイズは期待される生成物のサイズと一致し、問題のプラスミドの構築の成功を示した。
二重消化によって正しいものと認定されたプラスミドを、挿入された融合遺伝子フラグメントの配列決定のために北京ゲノミクスインスチチュート（Beijing Genomics Institute）に送った。最終的に、正しい配列決定の結果を有するRFP-hF VII-EGF1遺伝子を含む組換え原核細胞プラスミドはpET19bRFP-hF VII-EGF1と称される。
【００６９】
［実施例３］
赤色蛍光タンパク質（RFP）タグを有する他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）のRFP融合タンパク質のための融合遺伝子の入手
本発明で示されるヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT1からPRT1498）の発現される配列のいずれも公表されているので、発現能力を有するヌクレオチド配列は人工合成によって直接得ることができる。本実施例では、遺伝子フラグメントの合成はそれぞれ営利企業（例えば北京ゲノミクスインスチチュート、GENEWIZ社（GENEWIZ (Beijing) Co. Ltd.）など）に外注した。合成するときは、Bsp119I制限部位をこれら全ての遺伝子フラグメントの上流に導入して原核細胞発現プラスミドの構築を容易にした。融合タンパク質RFP-hF VII-EGF2をコードする遺伝子配列のオーバーラッピングPCR増幅の電気泳動は図5に示される。
【００７０】
［実施例４］
他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）のRFP融合タンパク質を発現する原核細胞組換えプラスミドの構築
1．遺伝子及び原核細胞発現ベクターpET19bの前処理
他のヒト起源EGFドメインタンパク質の遺伝子フラグメント及び実施例2で構築した組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1を、制限エンドヌクレアーゼBsp119I及びBamHI（両方ともTakara又はFermentasから購入）を用い37℃で一晩二重消化した。
2．発現遺伝子のプラスミドへの連結及び同定のための他の工程は実施例2を参考にして実施した。
【００７１】
［実施例５］
組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1の発現
1．実施例2で構築した組換えプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1で大腸菌BL21(DE3)（Invitrogenから購入）を形質転換した。単一クローンをLB培地（0.1g/mLのアンピシリンを含む）に摘みとり、約0.6のOD600まで185rpmで振盪しながら37℃でインキュベートした。1mLの細菌懸濁物を採取し-20℃で凍結した。続いてIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトシド）を残りの細菌懸濁物に0.8mMの最終濃度で添加した。インキュベーションを6時間進行させ、1mLの細菌懸濁物を採取して-20℃で凍結した。
2．上記記載のIPTG誘導前及び誘導後のサンプルをSDS-PAGE電気泳動（スタッキングゲル5％及び分離ゲル12％）によってアッセイし、問題のタンパク質の発現を分析した。結果は、タンパク質が正常に発現されることを示した。
【００７２】
［実施例６］
アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の精製
1．細菌RFP-hF VII-EGF1-pET19bBL21-(DE3)を実施例5の方法にしたがって大規模で培養し、IPTGの添加によって誘導し、続いて175rpmで振盪しながら18℃で一晩培養した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離して細菌を収集した。細菌ペレットをEW緩衝液（20mMリン酸ナトリウム、500mM NaCl、1mM DTT、0.1mM PMSF（pH 7.4））に再懸濁して洗浄した。細菌懸濁物を4000ｘgで3分間遠心分離し上清を廃棄した。再度、細菌ペレットを10mLのEW緩衝液に再懸濁した。
3．細菌を超音波処理により破壊した（パワー：300W、超音波処理持続時間：10秒、間隔：10秒、超音波処理の合計時間：3分、氷浴中で実施）。超音波処理の完了後、細菌懸濁物を48,400ｘgで1時間4℃にて遠心分離した。上清を収集して氷上に置いた。
4．クロマトグラフィーカラムをCo2+精製系（Talon Metal Affinity Resin, Clontech 社の製品）の指示にしたがってプレロードし、さらにサンプルをロードした。カラムを10mLのEW緩衝液で2回洗浄し、さらにタンパク質不純物を10mMのイミダゾール溶液で洗い流した。最後に、タンパク質を100mMのイミダゾールで溶出させた。
5．緩衝液交換及び濃縮のために、問題のタンパク質を含む溶離液をトリス-Cl緩衝液（pH7.4）で限外ろ過した。限外ろ過後に、高濃度の融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を入手できる。発現細菌懸濁物1リットル当たり90％を超える純度を有する約15mgの問題のタンパク質を入手できることがタンパク質定量によって示された。
【００７３】
［実施例７］
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の酵素切断及び組換えタンパク質hF VII-EGF1の精製
1．樹脂Niカラム（GEから購入したNiカラム）を以下のように処理した:200μLのNiカラムミックスを1.5mLのEPチューブ（AxyGEN）にピペットで加え、700ｘgで2分間遠心分離し、樹脂Niカラム用保存料溶液（20％エタノール）を廃棄し、続いてNiカラムを1mLの脱イオン水で2回洗浄し、続いて1mLの結合緩衝液（0.5M NaCl、20mMリン酸緩衝液（pH 7.4））でNiカラムを平衡させた。
2．Niカラムの平衡後に、450μLの融合タンパク質（3μg/μL）を処理Niカラムと均質になるまで個々に混合し、バーティカルロータリーミキサー上で4℃にて1時間一緒にインキュベートした。
3．インキュベーション完了後、混合物を700ｘgで2分間4℃にて遠心分離した。遠心分離の完了後、遠心分離によって得られたNiビーズを500μLの結合緩衝液で2回洗浄した。洗浄完了後にNiビーズを収集した。
4．423μLの結合緩衝液でビーズを再懸濁した。再懸濁し良く混合した後、得られた混合物をrTEVプロテイナーゼ（Shanghai Sangonから購入）による4℃での切断に付した。混合物をバーティカルロータリーミキサー上に時間を10時間に限定して一晩置いた。酵素切断の完了後に、混合物を700ｘgで5分間4℃にて遠心分離した。遠心分離の完了後に、上清を組換えタンパク質hF VII-EGF1として収集した。rTEVによる融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の酵素切断後に得られた組換えタンパク質hF VII-EGF1の同定のためのTricienゲル分析図は図7に示されている。酵素切断系は以下のように設定された:
20ｘTEV緩衝液      22.5μL
0.1M DTT            1.5μL
タンパク質ビーズ    420μL
rTEV酵素            3μL
【００７４】
［実施例８］
他の組換えヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）の原核細胞発現
実施例5−7の方法と同じ方法を用いて、他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）を原核細胞で発現させ、精製することができる。部分的なプロフィールは図6から25に示されている。
【００７５】
［実施例９］
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現する組換え真核細胞プラスミドの構築
1．下記に示すPCR増幅用プライマーを合成した（Invitrogen Biological Technology Co. Ltd.による）。
【００７６】
0006503342.tif 000054
【００７７】
2．PCR増幅系
鋳型として実施例2で構築したプラスミドpET19bRFP-hF VII-EGF1を用いプライマー1及び2によりPCR増幅を実施した。BamHI制限酵素切断部位及びKozak配列をプライマー1の配列に導入し、XhoI制限酵素切断部位をプライマー2の配列に導入した。PCR反応は実施例1を参考に実施した。
3．融合タンパク質RFP-ｈF VII-EGF1の真核細胞発現用組換えプラスミドの構築
クローン化遺伝子フラグメントRFP-hF VII-EGF1及び真核細胞発現ベクターpcDNA3.1(+)（Novagenの製品）を制限エンドヌクレアーゼBamHI及びXhoI（両方ともTaKaRa又はFermentasから購入）で二重消化した。反応系は実施例2を参考にして設定した。真核細胞発現ベクターとの遺伝子フラグメントの連結、組換えプラスミドによる形質転換及び前記の同定のための工程は実施例2を参考にして実施した。
最終的に、正確な配列決定結果を示すRFP-hF VII-EGF1遺伝子を含む組換えプラスミドをpcDNA3.1-RFP-hF VII-EGF1と称した。
【００７８】
［実施例10］
融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1を発現する安定な細胞株の構築
1．細胞の調製
10％FBS（ウシ胎児血清、Hiclonyから購入）を補充したα-MEM完全培養液（L-グルタミン、リボ核酸及びデオキシリボ核酸を含む；Hiclonyから購入）でDG44細胞（ATCCから購入）を培養した。トランスフェクションの前日に、DG44細胞を4ｘ105細胞/mLで6ウェルプレートにウェル当たり2mLでシードした。
2．細胞のトランスフェクション
リポフェクタミン(商標)（LipofectamineTM）2000キットの指示にしたがい、リポソーム法を用いて細胞にトランスフェクトした。詳細な工程は以下の通りである:
1）細胞培養液を無血清α-MEM培養液と取替える（2mL/ウェル）。
2）実施例9で構築した組換え真核細胞発現プラスミドpcDNA3.1-RFP-hF VII-EGF1を250μLのOpti-MEMと混合し、一方、10μLのリポフェクタミン(商標)2000を250μLのOpti-MEMと混合して5分間インキュベートした。
3）2つの溶液を良く混合し、20分間インキュベートした。リポソーム複合物を細胞とともにウェルに添加し、穏やかに混合し、インキュベータに置き、37℃で培養した。
4）5時間後、培養液を10％FBS補充α-MEM完全培養液と取替えた。
3．陽性細胞クローンのスクリーニング及び増量
組換えプラスミドによるトランスフェクションの24時間後に、細胞を1：2000の比率で100mmのペトリ皿に移した。スクリーニングのために、G418（Gibcoから購入）を最終濃度800μg/mLで添加した。空ベクターをトランスフェクトした細胞又はトランスフェクションを実施しなかった細胞をコントロールとして用いた。15日後、単一コロニーを24ウェルプレートに摘みとって培養し、細胞がコンフルエンシーに達したら6ウェルプレート、100mmペトリ皿に連続的に移して培養を増量させた。細胞のコンフルエンシーが90％になったとき、1：4の割合にて10％DMSO（Gibcoから購入）含有FBSで細胞を凍結した。
4．陽性細胞クローンの同定
摘みとった陽性細胞クローンをゲノムPCR及びRT-PCRによって同定した。問題のフラグメントは前記両技術によって増幅させることができ、融合遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていること、及び機能的mRNAが転写されることを示した。得られた安定な細胞株はDG44-RFP-hF VII-EGF1と称された。
【００７９】
［実施例11］
真核細胞により発現される融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の収集
1．DG44-RFP-hF VII-EGF1細胞を、400μg/mLのG418を補充した10％FBS含有α-MEM完全培養液で培養し、10プレートに継代した。
2．各プレートの細胞が90％を超えるコンフルエンシーに達したときに、10％FBS含有α-MEM完全培養液をCHO無血清培養液と取替え、ビタミンK（Sigma）を最終濃度1μg/mLで補充した。
3．培養3日後に、細胞ペレットを収集し破壊した。続いて上清を遠心分離によって収集し、コバルトイオンアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、SDS-PAGE及びウェスタンブロットによって同定した。工程は実施例6の工程を参考にした。
【００８０】
［実施例12］
真核細胞発現融合タンパク質RFP-hF VII-EGF1の酵素切断及びhF VII-EGF1の回収
実験方法は実施例7の方法にしたがった。
【００８１】
［実施例13］
他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）の真核細胞発現及び前記の精製
実施例9−10の方法にしたがい、他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）のRFP融合タンパク質のための真核細胞発現プラスミドを構築し、これら融合タンパク質を安定的に発現する細胞株を樹立した。
実施例11−12の方法にしたがって、真核細胞発現融合タンパク質を収集し、酵素切断に付し、最終的に他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）を得た。
【００８２】
［実施例14］
組換えタンパク質hF VII-EGF1の抗菌活性の決定
1．大腸菌DH5αを例にとった。大腸菌DH5αをLB固形培地上でストリーキングして培養した。続いて、典型的なクローンを摘みとり、通常のLB液体培地に接種し、185rpmで振盪しながら対数増殖期（OD600が約0.5）に達するまで37℃で培養した。細菌培養を4000ｘgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し菌体を新しいLB培地に再懸濁した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり100μLの総体積及び5ｘ105CFU/mLの細菌数で接種した。
3．組換えタンパク質hF VII-EGF1を、最高のタンパク質濃度のウェルの最終タンパク質濃度が50μg/mLとなるように上記に記載のウェルに添加した。この最終濃度に基づいて、50、25及び12.5μg/mLから成るタンパク質濃度勾配が得られるまで２倍連続希釈を実施した。3列のウェルを当該各濃度勾配について整えた。
4．上記に記載の96ウェルプレートを37℃の振盪インキュベータに置き、175rpmで振盪しながら培養した。サンプルを30分毎に採取し、600nmの波長の吸収値を紫外線分光光度計下で決定し、阻害曲線を作成した。MICの判定：培養8時間後に、増殖を裸眼で観察するか、又は紫外線分光光度計下で600nmの波長で判定される。最小阻害濃度MICは、細菌の増殖がない組換えタンパク質の最低濃度と定義される。
組換えタンパク質hF VII-EGF1で処理された大腸菌DF5αの増殖曲線は図27に示される。該曲線は、組換えタンパク質hF VII-EGF1は大腸菌DH5αの増殖に対し顕著な阻害作用を発揮することを示し、MICは12.5μg/mLである。
【００８３】
［実施例15］
他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRTからPRT1498）の抗菌活性の決定
実施例14の実験手順にしたがって、他のヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT2からPRT1498）の大腸菌DH5αに対する最小阻害濃度（MIC、μg/mL）を決定した。結果は表2に示されている。
【００８４】
表2：ヒト起源EGFドメインタンパク質の大腸菌DH5αに対するMIC（μg/mL）
0006503342.tif 000055
【００８５】
0006503342.tif 000056
【００８６】
0006503342.tif 000057
【００８７】
0006503342.tif 000058
【００８８】
0006503342.tif 000059
【００８９】
0006503342.tif 000060
【００９０】
0006503342.tif 000061
上記表から、ヒト起源EGFドメインタンパク質の全て（表1のPRT1からPRT1498）が大腸菌DH5αに対して阻害作用を有することを知ることができる。
【００９１】
［実施例16］
ヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT1からPRT1498）、例えば組換えタンパク質hF VII-EGF1などの多様なグラム陰性細菌の増殖に対する作用
グラム陰性細菌（例えば大腸菌BL21、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、セラチア・マルセッセンスなど）を固形LB培地にストリーキングし、それぞれ培養した。続いて、典型的なクローンを摘みとって通常の液体LB培地にそれぞれ接種し、185rpmで振盪しながらMcFarland比濁度が0.5になるまで37℃で培養した。各グラム陰性細菌の細菌培養を4000ｘgで3分間遠心分離し、上清を廃棄し菌体を新しいLB培地に再懸濁した。
2．上記に記載の細菌懸濁物を希釈し、96ウェルプレートにウェル当たり、細菌懸濁物の最終濃度が5ｘ105CFU/mLとなるように接種した。
3．精製ヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT1からPRT1498）の各々を上記ウェルの各々に添加し、2倍段階濃度希釈に付した。
4．上記に記載の96ウェルプレートを37℃の振盪インキュベータに置き、175rpmで振盪しながら培養した。MICの判定：培養10時間後に、増殖を裸眼で観察するか、又は紫外線分光光度計下で600nmの波長で判定した。最小阻害濃度MICは、細菌の増殖がない組換えタンパク質の最低濃度と定義される。結果は表3に示される。
【００９２】
表3：ヒト起源EGFドメインタンパク質の多様なグラム陰性細菌に対するMIC（μg/mL）
0006503342.tif 000062
【００９３】
0006503342.tif 000063
【００９４】
0006503342.tif 000064
【００９５】
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【００９６】
0006503342.tif 000066
【００９７】
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【００９８】
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【００９９】
0006503342.tif 000069
【０１００】
0006503342.tif 000070
【０１０１】
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【０１０２】
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【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
0006503342.tif 000080
【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
0006503342.tif 000086
【０１１７】
0006503342.tif 000087
【０１１８】
0006503342.tif 000088
【０１１９】
0006503342.tif 000089
【０１２０】
0006503342.tif 000090
【０１２１】
0006503342.tif 000091
【０１２２】
0006503342.tif 000092
【０１２３】
0006503342.tif 000093
【０１２４】
0006503342.tif 000094
【０１２５】
0006503342.tif 000095
【０１２６】
0006503342.tif 000096
【０１２７】
0006503342.tif 000097
【０１２８】
0006503342.tif 000098
【０１２９】
0006503342.tif 000099
【０１３０】
結論：上記の表から、本発明で示すヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT1からPRT1498）は、多様なグラム陰性細菌（例えば大腸菌、緑膿菌、肺炎杆菌、エンテロバクター・クロアカエ、アエロモナス・ヒドロフィラ、 シトロバクター・ジベルスス、モラクセラ・カタラーリス、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、セラチア・マルセッセンスなど）に対して阻害性作用を発揮することを知ることができる。
【０１３１】
［実施例17］
ヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRTからPRT1498）、例えば組換えタンパク質hF VII-EGF1などによって加水分解される内毒素（LPS）の銀染色検出
1．入手したヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRTからPRT1498）、例えば組換えタンパク質hF VII-EGF1と一緒に大腸菌EH100 LPS（Sigma）サンプルをそれぞれインキュベートした。コントロールグループはTBS緩衝液と一緒にインキュベートしたLPSサンプルであった。インキュベーションは一晩続けた。続いて遠心分離を実施してペレットを収集した。
2．LPSのための1ｘのローディング緩衝液（10g/L SDS、100g/Lシュクロース、0.5％β-メルカプトエタノール、10mg/Lブロモフェノールブルーを含む0.05Mトリス-HCl（pH6.8））を処理ペレットのサンプルと混合し、金属浴にて5分間100℃でインキュベートした。
3．分離ゲル（15％）は良く混合して調製した。分離ゲルの上部に水を重層した。分離ゲルは4mol/Lの尿素（Bio-Rad）を含み厚さは1.0mmを有する。詳細な組成は以下の通りである：1.15mLの脱イオン水、2.5mLの30％アクリルアミド、1.3mLの1.5mol/Lトリス-HCl （pH8.8、10％のSDSを含む）、50μLの10％過硫酸アンモニウム、4μLのTEMED。
4．以下のように5％のスタッキングゲルを調製した：下記（1.42 mLの脱イオン水、0.33mLの30％アクリルアミド、0.25mLの1mol/Lトリス-HCl（pH6.8、10％のSDSを含む）、20μLの10％過硫酸アンモニウム、2μLのTEMED）をよく混合して注ぎ入れた。10ウェルの櫛を迅速に挿入した。
5．ゲルを調製した後でサンプルをロードした。続いて、ゲルを120Vの電圧で泳動してサンプルを分離させた。泳動後、ゲルを採取して銀染色を開始した。ゲルをトレーに移し脱イオン水で徹底的に洗浄し、続いてゲルを3回脱イオン水で洗浄した。
6．洗浄完了後、ゲルを酸化のために50mLの固定溶液（30％アルコール、10％氷酢酸、7g/L過ヨウ素酸）で室温にて25分間固定した。固定完了後に、ゲルを毎回脱イオン水で3回5分間洗浄した。
7．洗浄完了後、ゲルを100mLのAgNO3（1g/L）中で室温にて40分間染色した。染色完了後、ゲルを1回ddH2Oで洗浄した。
8．ゲルを予め氷上で冷却した50mLのNa2CO3（30g/L）に移した（前記には可視化直前に0.02％のホルムアルデヒドが添加される）。バンドが出現したとき、又は暗色になり始めたとき、6mLの氷酢酸を添加して反応を停止させた。前記停止溶液を停止反応完了時に除去し、ゲルを脱イオン水中で維持した。
銀染色図は図28に示すようにタンパク質hF VII-EGF1で例証した。hF VII-EGF1で処理した後、LPSバンドは明瞭に減少し弱くなり、タンパク質hF VII-EGF1はLPSの大半を除去することを示した。表1のPRT2からPRT1498の銀染色図は図28の銀染色図と類似する。このことは、本発明に記載するヒト起源EGFドメインタンパク質（表1のPRT１からPRT1498）はLPSを加水分解でき、グラム陰性細菌によって生じる内毒素血症を治療する医薬の調製で用いることができることを示している。
【図１】
0006503342.tif 000100
【図２】
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【図３】
0006503342.tif 000102
【図４】
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【図５】
0006503342.tif 000104
【図６】
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【図７】
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【図８】
0006503342.tif 000107
【図９】
0006503342.tif 000108
【図１０】
0006503342.tif 000109
【図１１】
0006503342.tif 000110
【図１２】
0006503342.tif 000111
【図１３】
0006503342.tif 000112
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006503342.tif 000115
【図１７】
0006503342.tif 000116
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
0006503342.tif 000119
【図２１】
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【図２２】
0006503342.tif 000121
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
0006503342.tif 000127
【配列表】
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