(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、および相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号８、２８、４８、６８、および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２が、配列番号９、２９、４９、６９、および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３が、配列番号１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１が、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２が、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３が、配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択されるＶＨ；ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択されるＶＬまたは（ｉｉ）９７〜９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列を含むＶＨおよびＶＬを含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択される可変重鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択される可変重鎖；ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択される可変軽鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
（ｉ）配列番号１６、３６、５６、７６、または９６からなる群から選択される重鎖；ならびに配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６からなる群から選択される軽鎖または（ｉｉ）９７〜９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
配列番号１６、３６、５６、７６、または９６からなる群から選択される重鎖配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６からなる群から選択される軽鎖配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
配列番号１６、３６、５６、７６、または９６からなる群から選択される重鎖配列；ならびに配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６からなる群から選択される軽鎖配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
ヒトＬＯＸ−１に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含むＶＨ、および相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含むＶＬを含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号１１、３１、５１、７１、および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２が、配列番号１２、３２、５２、７２、および９２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３が、配列番号１３、３３、５３、７３、および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１が、配列番号２１、４１、６１、８１、および１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２が、配列番号２２、４２、６２、８２、および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３が、配列番号２３、４３、６３、８３、および１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
ヒトレクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、
相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含み、
ＨＣＤＲ１が、配列番号８のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ２が、配列番号９のアミノ酸配列を含み；ＨＣＤＲ３が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ１が、配列番号１８のアミノ酸配列を含み；ＬＣＤＲ２が、配列番号１９のアミノ酸配列を含み；およびＬＣＤＲ３が、配列番号２０のアミノ酸配列を含む、前記単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ；および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ヒトＬＯＸ−１に特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖；および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１２に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
（ｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号９のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号１０のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号１８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１９のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号２０のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号３０のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号３８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号４０のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号４８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号４９のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号５０のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号５８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号６０のアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１が配列番号６８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号６９のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号７０のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号７８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７９のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号８０のアミノ酸配列を含む；または
（ｖ）ＨＣＤＲ１が配列番号８８のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号８９のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号９０のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号９８のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号９９のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号１００のアミノ酸配列を含む；
請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１５】
（ｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号２３のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３２のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号３３のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号４１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号４２のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号４３のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ１が配列番号５１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号５２のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号５３のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号６２のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号６３のアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）ＨＣＤＲ１が配列番号７１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号７２のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号７３のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号８１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号８２のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号８３のアミノ酸配列を含む；または
（ｖ）ＨＣＤＲ１が配列番号９１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号９２のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号９３のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号１０３のアミノ酸配列を含む；
請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
ＨＣＤＲ１が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、およびＨＣＤＲ３が配列番号１３のアミノ酸配列を含み；ならびにＬＣＤＲ１が配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２２のアミノ酸配列を含み、およびＬＣＤＲ３が配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１７】
（ｉ）ＶＨが配列番号１４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号２４のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）ＶＨが配列番号３４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号４４のアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）ＶＨが配列番号５４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号６４のアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）ＶＨが配列番号７４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号８４のアミノ酸配列を含む；
（ｖ）ＶＨが配列番号９４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１０４のアミノ酸配列を含む；または
（ｖｉ）ＶＨが配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号１２２のアミノ酸配列を含む；
請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１８】
重鎖および軽鎖を含み、
（ｉ）重鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含み、および軽鎖が配列番号２６のアミノ酸配列を含む、
（ｉｉ）重鎖が配列番号３６のアミノ酸配列を含み、および軽鎖が配列番号４６のアミノ酸配列を含む、
（ｉｉｉ）重鎖が配列番号５６のアミノ酸配列を含み、および軽鎖が配列番号６６のアミノ酸配列を含む、
（ｉｖ）重鎖が配列番号７６のアミノ酸配列を含み、および軽鎖が配列番号８６のアミノ酸配列を含む、または
（ｖ）重鎖が配列番号９６のアミノ酸配列を含み、および軽鎖が配列番号１０６のアミノ酸配列を含む、
請求項１７に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２０】
ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
ＬＯＸ−１障害を処置するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
ＬＯＸ−１障害が心血管障害である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＬＯＸ−１障害が、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、高血圧症、心筋梗塞、血管の酸化ストレス、心筋虚血症、虚血症−再灌流、糖尿病性腎症、心筋症、心不全、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、冠動脈性心疾患、跛行、狭心症、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、脳卒中、または異常な内皮依存性血管拡張である、請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＬＯＸ−１障害が、間欠性跛行、ラザフォード分類ＩＩ／ＩＩＩ跛行、狭心症、または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）の１つ以上である、請求項２２または請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の単離抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸、または請求項２７に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２９】
哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗ＬＯＸ−１抗体またはその抗原結合性断片を製造する方法であって、
前記方法は、請求項２８または２９に記載の宿主細胞を培養すること、または請求項２８または２９に記載の宿主細胞を用いて前記抗体または断片を発現させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
血管疾患は依然として、全世界において、有病率および死亡率の主要原因のうちの１つである。従来の危険因子を標的とする薬物は、血管危険性の一部を低下させる。しかし、実験データおよび臨床データは、他の新規の因子が、冠動脈疾患、大脳動脈疾患、および末梢動脈疾患、ならびにそれらの臨床症状の危険性のより大きな部分を説明しうることを示唆する。
【０００２】
スカベンジャー受容体に媒介された血管細胞による、酸化修飾された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子（ｏｘＬＤＬ）の取込みの調節異常は、アテローム形成における極めて重要なステップであると考えられている。酸化脂質の取込みの媒介に加えて、スカベンジャー受容体は、内皮細胞およびマクロファージの活性化にも関与し、アテローム性動脈硬化の進行およびプラークのびらん／破裂のほか、組織潅流および酸素送達／酸素活用の機能障害を伴う、微小血管の機能不全をもたらす結果として、心筋虚血症または下肢虚血症ももたらす、酸化促進性シグナル伝達経路および炎症促進性シグナル伝達経路の活性化を媒介しうる。
【０００３】
レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体１（ＬＯＸ−１）とは、血管内皮細胞上、単球上およびマクロファージ上、血管平滑筋細胞上、ならびに血小板上で発現する、多機能性スカベンジャー受容体である。ＬＯＸ−１は、ｏｘＬＤＬ、ならびにＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化およびスーパーオキシドアニオンを含む活性酸素種の発生を結果としてもたらす、他の酸化脂質に結合する。スーパーオキシドアニオンは、内皮一酸化窒素を不活化し、ＭＡＰキナーゼおよびＮＦ−κＢを活性化する。これにより、炎症性接着分子、サイトカインおよびケモカインのほか、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ならびにアポトーシス促進性メディエーターの発現が誘導される。
【０００４】
内皮細胞内、平滑筋細胞内、およびマクロファージ内で、ｏｘＬＤＬ−ＬＯＸ−１により媒介されるシグナル伝達の、炎症促進性帰結、酸化促進性帰結、およびアポトーシス促進性帰結は、アテローム性動脈硬化の進行およびプラークの不安定性において鍵となる役割を果たし、また、虚血症を結果としてもたらす、組織潅流および酸素送達の機能障害においても役割を果たしうると考えられている。進行性アテローム性動脈硬化および臓器虚血症の臨床的帰結は、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、脳卒中、狭心症、跛行、および重篤な下肢虚血症を含む。加えて、酸化ストレス、血管炎症、および結果として生じる微小血管の機能不全は、腎症および網膜症を含む、糖尿病性血管疾患に寄与すると考えられている。
【０００５】
基礎的なＬＯＸ−１の内皮発現レベルは、正常な生理学的状態下では比較的低いが、血管内のＬＯＸ−１の発現は、血管疾患と関連する状態では、上方調節される。内皮ＬＯＸ−１レベルは、酸化ストレス、炎症促進性サイトカイン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびアンジオテンシンＩＩにより上昇することが示されている。ＬＯＸ−１はまた、アテローム性動脈硬化性動物および糖尿病性動物の内皮中、ならびに血管疾患を伴う患者から単離された単球／マクロファージ中でも上方調節される。また、高血糖症、終末糖化産物、およびアテローム形成性リポタンパク質によっても、ＬＯＸ−１の発現が上方調節されることから、糖尿病と、血管合併症との間の、特異的な分子機構的連関が提示される。
【０００６】
また、サイトカインおよびＣＲＰによるＬＯＸ−１の上方調節からも、従来の血管危険因子と、危険性の高い患者および糖尿病患者における血管疾患の加速化との連関が示唆される。急性冠動脈症候群を伴う患者では、ＣＲＰおよび可溶性ＬＯＸ−１のいずれもが増大する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータにより、抗ＬＯＸ−１抗体は、ＣＲＰに媒介される、単球の、ヒト大動脈内皮細胞への接着を防止することが示されたことから、血管炎症に関与性の接着分子としてのＬＯＸ−１の役割もさらに裏付けられている（Li et al., Circulation Research 2004, 95: 877-883）。
【０００７】
ｏｘＬＤＬおよび他の酸化リポタンパク質のレベルの上昇と連関するＬＯＸ−１の発現の増大は、部分的に、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化および活性酸素種の発生により、内皮機能不全を誘導する。実験では、ＡｐｏＥノックアウトマウスにおいて、酸化ストレスにより誘導される内皮機能不全を、抗ＬＯＸ−１中和抗体で逆転することができる（Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27:871-877）。この研究では、抗ＬＯＸ−１抗体により、一酸化窒素のバイオアベイラビリティーおよびｅＮＯＳタンパク質の発現のいずれもが増大した。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験データにより、酸化脂質の存在下の、血管およびマクロファージにおける、ＬＯＸ−１の過剰発現は、酸化促進性シグナル伝達経路および炎症促進性シグナル伝達経路を活性化させることにより、アテローム性動脈硬化および微小血管の機能不全に寄与することが指し示される。したがって、ＬＯＸ−１の阻害は、アテローム性動脈硬化、ならびに急性冠動脈症候群、心筋梗塞、および不安定狭心症など、その急性合併症の発症および進行を防止することが期待される。加えて、ＬＯＸ−１の阻害はまた、微小血管の機能不全を改善することから、慢性狭心症、不応性狭心症、跛行、および重篤な下肢虚血症など、組織虚血症の臨床症状を防止することも期待される。
【０００９】
ＬＯＸ−１の阻害は、アテローム性動脈硬化性血管疾患の処置および防止において有用であるだけでなく、また、関節リウマチ、多様な形態の血管炎、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性など、酸化ストレスおよび炎症を特徴とする他の病理学的状態の処置、ならびに自己免疫疾患（例えば、エリテマトーデス、乾癬）における心血管事象の防止においても有用である。
【００１０】
まとめると、実験データおよび臨床データは、ＬＯＸ−１は、酸化ストレス、炎症、および血管疾患を連関させる、極めて重要な酸化脂質受容体でありうることを示唆する。本発明で記載される抗ＬＯＸ−１抗体および抗原結合性断片は、ｏｘＬＤＬおよび他の酸化脂質／リポタンパク質の、ＬＯＸ−１への結合を阻害することから、ＬＯＸ−１の活性化を防止し、これにより、血管における酸化ストレスおよび炎症を軽減する。これらの抗体は、血管疾患の急性症状および慢性症状を防止および改善し、酸化ストレスおよび炎症を特徴とする他の疾患を防止および改善することが期待される。
【００１１】
発明の概要
本発明は、ヒトレクチン様酸化ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）受容体１（以下、場合によって、「ＬＯＸ−１」と称する）に結合するモノクローナル抗体、ならびにこれを含む医薬組成物および処置方法に関する。
【００１２】
本明細書で記載される単離抗ＬＯＸ−１抗体または抗原結合性断片は、ＬＯＸ−１に、１００ｐＭ以下の平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。例えば、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＬＯＸ−１に、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４５ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３５ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ヒトＬＯＸ−１にも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される３４ｐＭ以下のＫＤで、または溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される４ｐＭ以下のＫＤで結合することも可能であり、また、カニクイザルＬＯＸ−１に、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される５３ｐＭ以下のＫＤで、またはＳＥＴにより測定される４ｐＭ以下のＫＤで結合することも可能である。
【００１３】
本発明は、ヒトＬＯＸ−１およびカニクイザルＬＯＸ−１に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。本発明はまた、ＬＯＸ−１のＣ末端レクチン様ドメイン（ｏｘＬＤＬ結合性ドメイン）に結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、ヒトＬＯＸ−１（ＦＲＶＲＧＡＶＳＱＴＹＰＳＧＴＣＡＹＩ；配列番号３）に由来するアミノ酸残基２２８〜２４６を含むエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、ヒトＬＯＸ−１（配列番号１）のアミノ酸残基Ａｒｇ２２９およびＡｒｇ２３１を含むヒトＬＯＸ−１上のエピトープに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片も含む。
【００１４】
本発明はまた、ＬＯＸ−１に結合し、表１に記載されている抗体との結合についてさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表１に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にもさらに関する。
【００１５】
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、溶解平衡滴定（ＳＥＴ）により決定することができる。当技術分野では、ＳＥＴ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断片の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定することもできる。当技術分野では、Ｂｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。
【００１６】
本明細書で記載される単離抗ＬＯＸ−１抗体および抗原結合性断片を使用して、ＬＯＸ−１の、ｏｘＬＤＬ（修飾ＬＤＬとしてもまた公知の）への結合を阻害することができる。
【００１７】
本明細書で記載される単離抗ＬＯＸ−１抗体および抗原結合性断片を使用して、ＬＯＸ−１の、複数形態の修飾ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）への結合を、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５．２ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害することができる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＬＯＸ−１の、硫酸銅で酸化修飾されたＬＤＬ（ｏｘ−ＬＤＬ）への結合を、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５．２ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＬＯＸ−１の、マロンジアルデヒドで修飾されたＬＤＬへの結合を、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、または１８ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＬＯＸ−１の、次亜塩素酸で修飾されたＬＤＬへの結合を、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、３５ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または５ｎＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。
【００１８】
単離抗ＬＯＸ−１抗体またはその抗原結合性断片を使用して、ＬＯＸ−１および／またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＡＤＰＨとは、ＮＡＤＰまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元形態である）の発現を低減することができる。
【００１９】
単離抗ＬＯＸ−１抗体またはその抗原結合性断片は、例えば、ｏｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１への結合を阻害することを介して、酸化ストレスを阻害する（例えば、その誘導を遮断する）のに使用することができる。単離抗ＬＯＸ−１抗体またはその抗原結合性断片を使用して、ｏｘＬＤＬに刺激される活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を遮断することができる。単離抗体またはその抗原結合性断片を使用して、防止、処置、または改善しうる、血管の酸化ストレスは、血管収縮を誘導し、血管拡張の機能を障害し、酸素要求量を増大させることにより、心筋虚血症を引き起こす。
【００２０】
単離抗ＬＯＸ−１抗体またはその抗原結合性断片を使用して、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）レベルを、健常なホメオスタシス状態へと回復させることができる。内皮ＮＯＳとは、血管内で一酸化窒素（ＮＯ）を発生させ、平滑筋の収縮および血小板の凝集を阻害することにより、血管の緊張を調節することに関与する、一酸化窒素シンターゼであり、その下方調節は、ＬＯＸ−１に関連する内皮細胞機能不全と関連する。
【００２１】
本明細書で記載される単離抗ＬＯＸ−１抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはｓｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプでありうる。
【００２２】
本明細書で記載される単離抗ＬＯＸ−１抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、アミノ酸が、ヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列のそれぞれに由来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
【００２３】
本発明の別の態様は、表１に記載されているＦａｂの完全重鎖および軽鎖配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ  ＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ  ＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
【００２５】
本発明はまた、配列番号８、２８、４８、６８、および８８からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号９、２９、４９、６９、および８９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様では、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
【００２６】
本発明はまた、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
【００２７】
本発明はまた、ＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号８、９、および１０を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号１８、１９、および２０を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号２８、２９、および３０を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号３８、３９、および４０を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号４８、４９、および５０を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号５８、５９、および６０を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号６８、６９、および７０を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号７８、７９、および８０を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３が、配列番号８８、８９、および９０を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号９８、９９、および１００を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
【００２８】
本発明はまた、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、配列番号１４、３４、５４、７４、または９４の可変重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４の可変軽鎖のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する抗体または抗原結合性断片にも関する。本発明の別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定される、配列番号１４、３４、５４、７４、または９４の重鎖可変ドメイン配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４の軽鎖可変ドメイン配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有しうる。
【００２９】
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１４、３４、５４、７４、および９４からなる群から選択される重鎖可変ドメイン配列を含む。単離抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、ＬＯＸ−１に対する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号２４、４４、６４、８４、および１０４から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＬＯＸ−１に結合する。
【００３０】
本発明はまた、配列番号２４、４４、６４、８４、および１０４からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ヒトＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさって、ＬＯＸ−１に対する抗原結合性部位を形成する。
【００３１】
特に、ＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１４および２４；３４および４４；５４および６４；７４および８４；または９４および１０４、の配列をそれぞれ含む、重鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
【００３２】
本発明はさらに、配列番号１４、３４、５４、７４、および９４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＬＯＸ−１に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２４、４４、６４、８４、および１０４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する。
【００３３】
本発明はまた、配列番号２４、４４、６４、８４、および１０４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＬＯＸ−１に結合する。
【００３４】
本発明の別の態様では、ＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６、３６、５６、７６、または９６の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖と組み合わさって、ヒトＬＯＸ−１に対する抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６を含む配列を有しうる。特に、ＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６および２６；３６および４６；５６および６６；７６および８６；または９６および１０６、のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有しうる。
【００３５】
本発明はなおさらに、配列番号１６、３６、５６、７６、または９６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＬＯＸ−１に結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖も含む。
【００３６】
本発明はなおさらに、配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、ＬＯＸ−１に結合する。
【００３７】
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明は同様に、薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関する。とりわけ、本発明は、例えば、抗体のＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６など、表１の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物をさらに含む。本発明はまた、表１の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの２つ以上の組合せを含む医薬組成物にも関する。
【００３８】
本発明はまた、配列番号１４、３４、５４、７４、および９４から選択される配列を有する可変重鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号１５、３５、５５、７５、および９５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号１５、３５、５５、７５、および９５である。
【００３９】
本発明はまた、配列番号２５、４５、６５、８５、および１０５から選択される配列を有する可変軽鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号２５、４５、６５、８５、および１０５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号２５、４５、６５、８５、および１０５である。
【００４０】
本発明はまた、配列番号２５、４５、６５、８５、および１０５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸にも関する。
【００４１】
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの１つまたは複数を含むベクターにも関する。
【００４２】
本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で記載した抗体の軽鎖をコードする第２の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、この場合、前記ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現することが可能である。抗体は、ヒトモノクローナル抗体でありうることが企図される。また、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞であることも企図される。
【００４３】
本発明はまた、ＬＯＸ−１の発現および／またはＮＡＤＰＨオキシダーゼ発現を低減する方法であって、細胞を、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む、方法にも関する。
【００４４】
本発明はまた、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）の、ヒト酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）への結合を阻害するか、またはヒト酸化ＬＤＬ受容体に媒介される、酸化ＬＤＬの、細胞への組込みを阻害する方法であって、細胞を、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む、方法にも関する。
【００４５】
細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。一実施形態では、細胞は、内皮細胞であることが企図される。他の実施形態では、細胞は、マクロファージ、単球、樹状細胞、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）、軟骨細胞、および心筋細胞のうちの１つまたは複数でありうる。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
【００４６】
本発明はまた、対象におけるＬＯＸ−１関連障害を処置、改善、または防止する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。一態様では、ＬＯＸ−１関連障害は、跛行（例えば、間欠性跛行、ラザフォード分類ＩＩ／ＩＩＩ跛行）と関連する。一態様では、ＬＯＸ−１関連障害は、狭心症（例えば、不応性狭心症）と関連する。対象は、ヒトであることも企図される。
【００４７】
前出の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片でありうる。
【００４８】
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００４９】
「ＬＯＸ−１タンパク質」または「ＬＯＸ−１抗原」または「ＬＯＸ−１」または「Ｌｏｘ１」という用語は、互換的に使用され、異なる種におけるレクチン様酸化ＬＤＬ受容体１（ＬＯＸ−１）タンパク質を指す。例えば、ヒトＬＯＸ−１は、表１（配列番号１）に示される配列を有し、先行の報告および文献（Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ００２５３４）において記載されている。ヒトＬＯＸ−１は、血管細胞によるｏｘＬＤＬの取込み、および血管細胞内のｏｘＬＤＬシグナル伝達を媒介する、クラスＥのスカベンジャー受容体であり、それ自体、ｏｘＬＤＬの毒性効果のメディエーターでもある。ＬＯＸ−１は、血管内皮細胞の表面上で発現し、血管内皮細胞での単球およびマクロファージの蓄積に関与している。
【００５０】
加えて、本発明の文脈では、「ＬＯＸ−１」という用語は、天然のヒト酸化ＬＤＬ受容体の突然変異体であって、上述の報告において記載されている、天然の一次構造（アミノ酸配列）のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する、突然変異体を含む。本明細書では、「実質的に同じアミノ酸配列を有する、天然のヒト酸化ＬＤＬ受容体の突然変異体」という用語は、このような突然変異体のタンパク質を指す。
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで形成された、複数形態の修飾ＬＤＬは、ＬＯＸ−１に結合することが示されている。本明細書で使用される「修飾ＬＤＬ」および「酸化ＬＤＬ」（および「ｏｘＬＤＬ」）という用語は、多様な化学的因子および物理的因子（例えば、熱）と組み合わされた、血管内皮細胞などの細胞により酸化される、低密度リポタンパク質について記載するのに互換的に使用される。ＬＤＬは、例えば、アテローム形成状態下の血管壁内で酸化して、ｏｘＬＤＬを形成する。「修飾ＬＤＬ」という用語は、以下：酸化ＬＤＬ、硫酸銅で酸化修飾されたＬＤＬ、アセチルＬＤＬ、塩素化ＬＤＬ（例えば、化学的塩素化反応を介して修飾されたＬＤＬ）、ミエロペルオキシダーゼ修飾ＬＤＬ、次亜塩素酸で修飾されたＬＤＬ、スクシニルＬＤＬ、およびマロンジアルデヒドで修飾されたＬＤＬ（すなわち、マロンジアルデヒドとの反応を介して修飾されたＬＤＬであり、マロンジアルデヒドは、酸化ストレスの帰結として、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて産生される）を包含しうる。
【００５２】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
【００５３】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用語は、所与の抗原（例えば、ヒト酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１））に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片という用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Wardら、1989 Nature 341:544〜546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００５４】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Birdら、1988 Science 242:423〜426；およびHustonら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879〜5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
【００５５】
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、HollingerおよびHudson、2005、Nature Biotechnology、23、9、1126〜1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。
【００５６】
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapataら、1995 Protein Eng. 8（10）:1057〜1062；および米国特許第５，６４１，８７０号）。
【００５７】
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、ＫＤが１０−９Ｍ以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
【００５８】
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する個別の抗原結合部位の能力を指す。
【００６０】
抗体（例えば、ＬＯＸ−１結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原（例えば、ヒトＬＯＸ−１またはカニクイザルＬＯＸ−１）の存在を決定する結合反応を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００６１】
「ＬＯＸ−１に媒介された」という用語は、ＬＯＸ−１受容体が、ＬＯＸ−１リガンド、例えば、ｏｘＬＤＬが、ＬＯＸ−１に細胞表面上で結合したときの細胞応答を媒介し、次いで、これにより、細胞がある種の炎症促進性分子の産生を増大させることを誘発するという事実を指す。「炎症促進性遺伝子」という用語は、炎症過程において役割を果たすサイトカイン、ケモカイン、または細胞接着分子などであるがこれらに限定されない任意の分子をコードする遺伝子を指す。例示的な「炎症促進性」遺伝子は、インターロイキン８（ＩＬ−８）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１）、および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
本明細書で使用される「ＬＯＸ−１関連障害」、「ＬＯＸ−１関連状態」、「ＬＯＸ−１レベルの上昇と関連する疾患または状態」、または類似の用語は、ＬＯＸ−１タンパク質レベルが異常に高く、かつ／またはＬＯＸ−１タンパク質レベルの低減が求められる、任意の数の状態または疾患を指す。これらの状態は、心血管障害、内皮細胞機能不全、内皮細胞障害、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、高血圧症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、一酸化窒素欠乏、心筋梗塞、血管の酸化ストレス、心筋虚血症、虚血症−再灌流、敗血症、糖尿病性腎症、腎疾患、心筋症、心不全、末梢動脈疾患、冠動脈性心疾患、跛行（例えば、間欠性跛行、ラザフォード分類ＩＩ／ＩＩＩ跛行）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、狭心症（例えば、不応性狭心症）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（例えば、心臓に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化に起因する）、脳卒中、および異常な内皮依存性血管拡張を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
本明細書で使用される「内皮細胞機能不全」とは、内皮細胞がその正常な機能を維持できないことを意味する。内皮は、血管平滑筋の緊張および増殖、血管の透過性、炎症性応答、凝固、および血小板の接着の調節において極めて重要な役割を果たす。内皮細胞機能の非限定的な例は、バランスの良い血管の緊張を維持すること、血栓を阻害すること、炎症促進性過程を阻害すること、血管の完全性（例えば、血管系が漏出しないこと）を維持すること、ならびに内皮細胞内および平滑筋細胞内のいずれにおいても抗増殖状態を維持することを含む。脂質異常症、高血圧症、糖尿病、および喫煙など、アテローム性動脈硬化の素因となる一般的状態および危険因子は全て、アテローム性動脈硬化の発症、進行、および合併症を促進する内皮機能不全と関連する。内皮機能不全は一般に、内皮依存性血管拡張の機能障害と評価されている。これは、内皮依存性血管拡張が、他の重要な内皮機能についてのサロゲートマーカーであることを仮定する。この仮定の基礎は、内皮ＮＯシンターゼ（ｅＮＯＳ）により、Ｌ−アルギニンから合成される、内皮由来の一酸化窒素により、内皮依存性血管拡張および他の内皮血管保護機能が媒介されるという観察である。拡充されつつある臨床データベースは、内皮機能不全（内皮依存性血管拡張の機能障害）が、心筋虚血症および心筋梗塞、急性冠動脈症候群、跛行、および重篤な下肢虚血症、一過性虚血性発作、ならびに脳卒中を含む、主要な心血管有害事象と密接に関連することを示唆する。
【００６４】
実験データの蓄積はまた、内皮および心内における、ｅＮＯＳ由来のＮＯアベイラビリティーの機能障害は、異常な左室リモデリングをもたらしうるだけでなく、心不全の発症および進行に寄与する左室機能不全ももたらしうることも示唆する。
【００６５】
本明細書で使用される「内皮細胞障害」とは、内皮細胞機能不全を特徴とする任意の障害である。内皮細胞機能不全を特徴とする疾患または障害の非限定的な例は、腫瘍増殖を支援するのに血管新生を必要とするがんなどの血管新生性障害、感染性疾患、自己免疫障害、血管奇形、ディジョージ症候群、ＨＨＴ、海綿状血管腫、移植性動脈症、血液透析と関連する血管アクセス狭窄、血管炎（vasculitis）、血管炎（vasculitidis）、血管炎症性障害、アテローム性動脈硬化、肥満、乾癬、疣、アレルギー性皮膚炎、瘢痕ケロイド、膿原性肉芽腫、水疱形成性疾患、カポジ肉腫、硝子体過形成遺残症候群、未熟児網膜症、脈絡膜血管新生、黄斑変性、糖尿病性網膜症、眼内血管新生、原発性肺高血圧症、喘息、鼻腔内ポリープ、炎症性腸疾患および歯周病、腹水、腹膜癒着、避妊、子宮内膜症、子宮内出血、卵巣嚢胞、卵巣過剰刺激、関節炎、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、滑膜炎、骨関節炎、骨髄炎、骨棘形成、敗血症、および血管漏出を含む。内皮細胞機能不全は、内皮接着分子の発現の増大または一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の発現もしくは生物学的活性の減少の検出を含む、当技術分野で公知のアッセイを使用して決定することができる。
【００６６】
本明細書で使用される「跛行」とは、重度の跛行および他の類似の用語を含み、運動機能障害および満たされていない大きな医療上の必要について記載する。跛行とは、下肢末端の虚血症、筋肉疲労を引き起こすこと、休息により緩和される、労作時における疼痛、運動の制限、および生活の質の低下を特徴とする状態であり、アテローム性動脈硬化および内皮依存性血管拡張の異常（例えば、内皮依存性血管拡張の機能障害）により引き起こされる。米国内のその有病数は、患者８００〜１２００万人である。間欠性跛行を伴う患者のうち、７％は、下肢末端のバイパス手術を受け、４％は、大規模な切断術を必要とし、１６％は、跛行の悪化を発症する。５年間を超える重度の跛行罹患者のうちの２０％では、心筋梗塞および脳卒中などの心血管事象が生じる。現行の治療は、手術による治療であり、本発明の抗ＬＯＸ−１抗体の投与など、侵襲性の小さな手段を介する処置であれば、極めて大きな治療的飛躍を表すであろう。
【００６７】
本明細書で使用される「不応性狭心症」とは、冠動脈の閉塞または痙攣（例えば、冠動脈疾患に由来する）に一般に起因し、消耗性の症状、身体活動の大きな制限、および生活の質の低下を伴う、心筋の虚血に起因する胸痛を顕徴とする状態である。患者１００〜１８０万人の、米国内の不応性狭心症罹患者は、心血管による死亡率の、毎年１０％の増大率での増大を経ており、少なくとも１００，０００例の新たな不応性狭心症の症例が毎年生じている。
【００６８】
「キメラ抗体」という用語は、（ａ）抗原結合性部位（可変領域）を、クラス、エフェクター機能、および／もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および／もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変された可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置きかえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識におけるその特異性を保持しうる。
【００６９】
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけのコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
【００７０】
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton、Proteins（1984）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
【００７１】
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
【００７２】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含みうる。
【００７３】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を提示する抗体であって、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞へと融合させた、ヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生する。
【００７４】
「ヒト化」抗体とは、ヒトにおける免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分）で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6851〜6855、1984; MorrisonおよびOi、Adv. Immunol.、44:65〜92、1988; Verhoeyenら、Science、239:1534〜1536、1988; Padlan、Molec. Immun.、28:489〜498、1991；およびPadlan、Molec. Immun.、31:169〜217、1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、ＵＳ５，７６６，８８６において開示されているＸｏｍａ技術を含むがこれらに限定されない。
【００７５】
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。
【００７６】
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
【００７７】
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、SmithおよびWaterman （1970） Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443、1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444、1988による類似性検索法により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brentら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.（Ringbou編、2003）を参照されたい）により行うこともできる。
【００７８】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389〜3402、1977；およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403〜410、1990において記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschulら、前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915、1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
【００７９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5787、1993を参照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であり、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
【００８０】
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. MeyersおよびW. Miller（Comput. Appl. Biosci.、4:11〜17、1988）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のgcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch（J. Mol, Biol. 48:444〜453、1970）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
【００８１】
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
【００８２】
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＬＯＸ−１に特異的に結合する単離抗体は、ＬＯＸ−１以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＬＯＸ−１に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
【００８３】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するように施されている。
【００８４】
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
【００８５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
【００８６】
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
【００８７】
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる（Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081、1991; Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605〜2608、1985；およびRossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91〜98、1994）。
【００８８】
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
【００８９】
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
【００９０】
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
【００９１】
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
【００９２】
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００９３】
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で使用される「カニクイザル（cyno）」または「カニクイザル（cynomolgus）」という用語は、カニクイザル（cynomolgus monkey）（カニクイザル（Macaca fascicularis））を指す。
【００９４】
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害（例えば、ＬＯＸ−１関連障害）「〜を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメータを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的にモジュレートする（例えば、識別可能な症状の安定化）か、生理学的にモジュレートする（例えば、物理的パラメータの安定化）か、または物理的かつ生理学的にモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させることを指す。
【００９５】
例えばＬＯＸ−１関連障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防止」とは、例えば、前記悪化の危険性がある患者における、下記で記載される、ＬＯＸ−１関連疾患パラメータの悪化を防止または緩徐化する任意の作用を意味する。
【００９６】
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）などのウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、本発明の、選択されたＬＯＸ−１抗体による、ＯｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１タンパク質への結合の阻害について描示する図である。図１Ａは、高結合性ＯｘＬＤＬを示し、図１Ｂは、マロンジアルデヒド−ＬＤＬを示し、図１Ｃは、次亜塩素酸で修飾されたＬＤＬを示すが、これらの全ては、本明細書で記載されている。
【図１−２】（上記の通り。）
【図２】ｄｉＩ標識されたＯｘＬＤＬの、ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合を阻害するＬＯＸ−１抗体について描示する図である。
【図３】ＬＯＸ−１抗体による、ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内の、ｏｘＬＤＬ誘導活性酸素種（ＲＯＳ）産生の阻害についての用量応答曲線を描示する図である。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｆは、ＬＯＸ−１抗体（単独の抗体または架橋Ｆａｂ２の存在下における抗体）による、ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内の、ｏｘＬＤＬに誘導される反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生の阻害を裏付ける図である。図４Ａは、抗体であるＦＦ１を示し、図４Ｂは、抗体であるＦＦ３を示し、図４Ｃは、抗体であるＦＦ４を示し、図４Ｄは、抗体であるＦＦ５を示し、図４Ｅは、抗体であるＦＦ６を示し、図４Ｆは、対照であるｈＩｇＧ１−ＬＡＬＡを示す。
【図４−２】（上記の通り。）
【図４−３】（上記の通り。）
【図５】ヒト好中球の表面上における、ＬＯＸ−１抗体の、ＬＯＸ−１への結合について描示する図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、ヒトまたはカニクイザルのＡＰＰ−Ａｖｉ−ＬＯＸ−１タンパク質を伴う、溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイによる抗体の解離定数（ＫＤ）の決定について描示する図である。図６Ａは、ヒトＬＯＸ−１についてのデータについて描示し、図６Ｂは、カニクイザルＬＯＸ−１についてのデータについて描示する。
【００９８】
詳細な記載
本発明は部分的に、ＬＯＸ−１に特異的に結合し、その生物学的活性を阻害する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全ＩｇＧフォーマットの抗体、ならびにＦａｂ断片（例えば、抗体のＥ２Ｅ１０、ＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６）など、それらの抗原結合性断片の両方に関する。
【００９９】
したがって、本発明は、ＬＯＸ−１（例えば、ヒトＬＯＸ−１、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体、医薬組成物、このような抗体および組成物の作製法および使用法を提供する。
【０１００】
ＬＯＸ−１タンパク質
本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合し、その酸化促進活性および炎症促進活性を含む、その生物学的活性を阻害する抗体を提供する。酸化修飾されたＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）の受容体であるＬＯＸ−１は、血管細胞（内皮細胞および平滑筋細胞）、好中球、単球およびマクロファージ、および血小板の表面上で発現する。さらに、ＬＯＸ−１は、ヒトおよび動物のアテローム性動脈硬化性病変を含む血管疾患において上方調節される（Kataoka H, et al., Circulation 99; 3110-3117）。ＬＯＸ−１はまた、全身性炎症性疾患／全身性自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、および子癇前症）においても上方調節される。ＯｘＬＤＬは、血管疾患の発症機序に関与している。ｏｘＬＤＬに加えて、ＬＯＸ−１は、アセチル化ＬＤＬ、終末糖化産物（ＡＧＥ）、熱ショックタンパク質７０、（ＨＳＰ７０）、アポトーシス性細胞、老化赤血球、白血球、活性化血小板、細菌、ホスファチジルセリン、およびＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む他のリガンドにも結合する。
【０１０１】
ＬＯＸ−１は、Ｃ型レクチンファミリーに属するＩＩ型膜タンパク質である。ＬＯＸ−１はまた、クラスＥのスカベンジャー受容体としても分類される。ＬＯＸ−１は、４つのドメイン：短いＮ末端細胞質ドメイン、膜貫通領域、コネクティングネック、およびＣ末端におけるレクチン様ドメインからなる。Ｃ末端レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；また、ｏｘＬＤＬ結合性ドメインとも称する）は、リガンド結合性ドメイン（Sawamura T, et al., Nature 386; 73-77; Shi X, et al., J Cell Sci. 114; 1273-1282）である。ヒトＬＯＸ−１は、表１（配列番号１）に示される配列を有し、先行の報告および文献（Nature, Vol. 386, p. 73-77, 1997; Genomics, Vol. 54, No. 2, p. 191-199, 1998; Biochem. J., Vol. 339, Part 1, P. 177-184, 1999；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＰ００２５３４）において記載されている。
【０１０２】
ｏｘＬＤＬ／ＬＯＸ−１経路は、酸化ストレス、血管炎症、アテローム性動脈硬化、ならびに組織血流および酸素送達の機能障害に寄与する。ＬＯＸ−１リガンド（例えば、ｏｘＬＤＬ）の結合による、ＬＯＸ−１の活性化は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化に起因する、活性酸素種の発生、ならびに炎症を結果としてもたらす、後続のＮＦｋＢ経路およびＭＡＰキナーゼ経路の活性化を結果としてもたらす。ＬＯＸ−１により誘導される活性酸素種により、さらなるｏｘＬＤＬの形成が結果としてもたらされ、ＬＯＸ−１の発現が上方調節されるという点で、ｏｘＬＤＬ／ＬＯＸ−１シグナル伝達経路は、ポジティブフィードバックループとして作用する。また、ｏｘＬＤＬの、マクロファージの表面上で発現するＬＯＸ−１への結合も、泡沫細胞の形成およびアテローム性動脈硬化に寄与する、ｏｘＬＤＬの取込みを結果としてもたらす。重要なことは、血管炎症が、心筋梗塞および虚血性脳卒中を含む、アテローム性動脈硬化の急性血栓性合併症の病理生物学にとって極めて重要であると考えられることである。ＬＯＸ−１の活性化はまた、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを伴う機構により血管拡張の機能を障害することにより、血管運動機能を変化させることも示されている。血管拡張の機能障害は、慢性冠動脈疾患および狭心症を伴う患者、ならびに末梢動脈疾患および跛行を伴う患者において生じることが示されている。
【０１０３】
ＬＯＸ−１ノックアウトマウスおよびＬＯＸ−１アンタゴニスト抗体を用いた研究により、ＬＯＸ−１の阻害は、有益な心血管効果を及ぼしうることが示されている。例えば、ＬＯＸ−１をノックアウトすることにより、ｏｘＬＤＬに媒介される、血管弛緩の機能障害が防止され、アテローム性動脈硬化が低減される（Mehta et al, Circulation Research 2007, 100: 16344）。加えて、抗ＬＯＸ−１抗体は、（ｉ）ヒト内皮細胞内の、ｏｘＬＤＬにより誘導される酸化ストレスを遮断し（Ou et al., J Appl Phys 2010, 108: 1745）、（ｉｉ）スーパーオキシドの産生を阻害し、ｅＮＯＳの発現を回復させる結果として、ＮＯのバイオアベイラビリティーの改善および血管拡張をもたらすことが示されている（Xu et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27: 871-877）。
【０１０４】
本発明者らは、例えば、本発明の抗ＬＯＸ−１抗体の投与を介して、ＬＯＸ−１を阻害することにより、虚血性組織への血流および酸素送達を改善する結果として、治療的利益を、狭心症、跛行、および重篤な下肢虚血症を含む慢性血管疾患を伴う患者へともたらすことを提起する。また、例えば、本発明の抗ＬＯＸ−１抗体の投与を介して、ＬＯＸ−１を阻害することにより、アテローム性動脈硬化の進行を緩徐化または逆転し、その急性血栓性合併症（例えば、急性冠動脈症候群、不安定狭心症、心筋梗塞、および虚血性脳卒中）の発症率を低減することもできる。
【０１０５】
ＬＯＸ−１抗体および抗原結合性断片
本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１にも特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離されたヒトモノクローナル抗体およびＦａｂを含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体であって、配列番号１４、３４、５４、７４、または９４のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＬＯＸ−１タンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＨ  ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
【０１０７】
本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号２４、４４、６４、８４、および１０４のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、ＬＯＸ−１タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体であって、以下の表２に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＬ  ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
【０１０８】
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明の他の抗体は、ＣＤＲ領域内で、表２に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
本発明はまた、ＬＯＸ−１タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について最適化することができる（例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化された核酸配列を示す）。
【０１１０】
【表１−１】
0006505678.tif 000002
【０１１１】
【表１−２】
0006505678.tif 000003
【０１１２】
【表１−３】
0006505678.tif 000004
【０１１３】
【表１−４】
0006505678.tif 000005
【０１１４】
【表１−５】
0006505678.tif 000006
【０１１５】
【表１−６】
0006505678.tif 000007
【０１１６】
【表１−７】
0006505678.tif 000008
【０１１７】
【表１−８】
0006505678.tif 000009
【０１１８】
【表１−９】
0006505678.tif 000010
【０１１９】
【表１−１０】
0006505678.tif 000011
【０１２０】
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載されている配列となお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列内で描示された可変領域と比較した場合に、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
これらの抗体の各々は、ＬＯＸ−１に結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と）を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のＬＯＸ−１結合性抗体を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」ＬＯＸ−１結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
【０１２２】
したがって、一態様では、本発明は、配列番号１４、３４、５４、７４、および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、および１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、ＬＯＸ−１（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する。
【０１２３】
より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１４および２４；３４および４４；５４および６４；７４および８４；または９４および１０４、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
【０１２４】
別の態様では、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号１６、３６、５６、７６、または９６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または（ｉｉ）その抗原結合性部分を含む機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１４および２４；３４および４４；５４および６４；７４および８４；または９４および１０４、のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
【０１２５】
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがある。
【０１２６】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabatら（1991）、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikaniら、（1997）JMB 273、927〜948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定することができる。
【０１２７】
例えば、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内の抗体であるＦＦ１のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６６（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０４（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５５（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５７（ＨＣＤＲ２）、および９９〜１０４（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６６（ＨＣＤＲ２）、および９０〜１０４（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５５（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
【０１２８】
別の態様では、本発明は、表１に記載されている重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むＬＯＸ−１結合性抗体を提供する。抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号８、２８、４８、６８、および８８に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号９、２９、４９、６９、および８９に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１０、３０、５０、７０、および９０に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２０、４０、６０、８０、および１００に示されている。これらのＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して表される。
【０１２９】
代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Al-Lazikaniら、（1997）、JMB 273 927〜948）を使用して規定される通り、抗体のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１１、３１、５１、７１、および９１に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１２、３２、５２、７２、および９２に示されている。抗体のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１３、３３、５３、７３、および９３に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号２１、４１、６１、８１、および１０１に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２２、４２、６２、８２、および１０２に示されている。抗体のＶＬ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号２３、４３、６３、８３、および１０３に示されている。
【０１３０】
これらの抗体の各々は、ＬＯＸ−１に結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のＬＯＸ−１結合性分子を創出するのに、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含有することが好ましいが、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる）。このような「混合し、マッチさせた」ＬＯＸ−１結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して調べることができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ  ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３、またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むことが可能であり、この場合、断片は、ＬＯＸ−１に、単一の可変ドメインとして結合する。
【０１３１】
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原結合性断片は、Ｆａｂ  ＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
【０１３２】
本発明の他の実施形態では、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。
【０１３３】
具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１０の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１９の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号２０の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１３４】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号２８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号３０の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３９の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４０の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１３５】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号４８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５９の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６０の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１３６】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号６８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６９の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号７０の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７９の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号８０の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１３７】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号８８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８９の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号９０の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号９８の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９９の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１００の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１３８】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号１１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号１３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号２３の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１３９】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号３１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号３３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４３の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１４０】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号５１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号５３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号６１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６３の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１４１】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号７１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号７３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号８１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号８３の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１４２】
別の具体的な実施形態では、本発明は、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体であって、配列番号９１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号９３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１０１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１０２の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１０３の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１４３】
ある種の実施形態では、本発明は、表１に記載されている、ＬＯＸ−１に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、ＬＯＸ−１に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｆａｂ  ＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６である。
【０１４４】
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近似する（すなわち、同一性％が最大である）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができる。
【０１４５】
特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しかし、ＶＨフレームワーク領域またはＶＬフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトとして同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、アミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０１４６】
組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差異を提示することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、なおまたは、４、３、２、または１アミノ酸以下の差異を提示しうる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子の例は、下記で記載される生殖細胞系列の可変ドメイン断片のほか、ＤＰ４７およびＤＰＫ９も含むがこれらに限定されない。
【０１４７】
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、ＬＯＸ−１タンパク質（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に結合し、表１に記載されている抗体の所望の機能的特性を保持する。
【０１４８】
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；抗体は、ＬＯＸ−１（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号８、９、１０、１８、１９、および２０をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号１１、１２、１３、２１、２２、および２３をさらに含む。
【０１４９】
他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１５、３５、５５、７５、または９５、および配列番号２５、４５、６５、８５、または１０５のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
【０１５０】
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号１６、３６、５６、７６、または９６のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
【０１５１】
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０１５２】
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
【０１５３】
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１５４】
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschulら、1990 J. Mol. Biol. 215:403〜10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。
【０１５５】
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。
【０１５６】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなる単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号８、２８、４８、６８、および８８ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号９、２９、４９、６９、および８９ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号１０、３０、５０、７０、および９０ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号２０、４０、６０、８０、および１００ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、ＬＯＸ−１に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０１５７】
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されており、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現について最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号１６、３６、５６、７６または９６ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号２６、４６、６６、８６または１０６ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＬＯＸ−１（例えば、ヒト、およびカニクイザルＬＯＸ−１）に特異的に結合する抗体を提供する。
【０１５８】
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載されているＬＯＸ−１結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、ＬＯＸ−１結合アッセイ（実施例で記載されるＬＯＸ−１結合アッセイなど）において、本発明の他の抗体と競合する（例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、ＬＯＸ−１タンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、ＬＯＸ−１への結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、ＬＯＸ−１タンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じＬＯＸ−１上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のＬＯＸ−１との結合を、５０％を超えて（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％）阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。
【０１５９】
他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＬＯＸ−１のＣ末端レクチン様ドメイン（ｏｘＬＤＬ結合性ドメイン）に結合し、より具体的には、ヒトＬＯＸ−１（ＦＲＶＲＧＡＶＳＱＴＹＰＳＧＴＣＡＹＩ；配列番号３）に由来するアミノ酸残基２２８〜２４６を含むエピトープに結合する。ある種の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ヒトＬＯＸ−１（配列番号１）のアミノ酸残基Ａｒｇ２２９およびＡｒｇ２３１を含むヒトＬＯＸ−１上のエピトープに結合する。
【０１６０】
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
【０１６１】
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.ら、1998 Nature 332:323〜327; Jones, P.ら、1986 Nature 321:522〜525; Queen, C.ら、1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029〜10033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【０１６２】
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号８、２８、４８、６８、および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号９、２９、４９、６９、および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む重鎖可変領域と、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、ならびに配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ  ＣＤＲ配列およびＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
【０１６３】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A.ら、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication第91-3242号; Tomlinson, I. M.ら、1992 J. Mol. Biol. 227:776〜798；およびCox, J. P. L.ら、1994 Eur. J Immunol. 24:827〜836においても見出すことができる。
【０１６４】
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、およびＶＨ  ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列、およびＶＬ  ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、およびＶｋ２を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のｖＢａｓｅデータベースにおいて見出すことができる。
【０１６５】
したがって、本発明の実施形態は、配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離ＬＯＸ−１結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片に関する。
【０１６６】
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ  ＣＤＲ１領域内、ＶＨ  ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ  ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ  ＣＤＲ１領域内、ＶＬ  ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ  ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
【０１６７】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号８、２８、４８、６８、および８８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号８、２８、４８、６８、および８８と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号９、２９、４９、６９、および８９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号９、２９、４９、６９、および８９と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域、配列番号１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、３０、５０、７０、および９０と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１８、３８、５８、７８、および９８と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１９、３９、５９、７９、および９９と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２０、４０、６０、８０、および１００と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域からなる単離ＬＯＸ−１結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
【０１６８】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１１、３１、５１、７１、および９１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１１、３１、５１、７１、および９１と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ１領域、配列番号１２、３２、５２、７２、および９２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３２、５２、７２、および９２と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号１３、３３、５３、７３、および９３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１３、３３、５３、７３、および９３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ  ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域と、配列番号２１、４１、６１、８１、および１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２１、４１、６１、８１、および１０１と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ１領域、配列番号２２、４２、６２、８２、および１０２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２２、４２、６２、８２、および１０２と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号２３、４３、６３、８３、および１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２３、４３、６３、８３、および１０３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ  ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域とからなる単離ＬＯＸ−１結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
【０１６９】
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、ＬＯＸ−１に特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
【０１７０】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のＬＯＸ−１タンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ  ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；およびＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ  ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
【０１７１】
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの第１０モジュール（１０  Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（ＵＳ６，８１８，４１８を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
【０１７２】
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα−ヘリックスおよびβ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
【０１７３】
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号；同第２００５００５３９７３号；同第２００５００４８５１２号；および同第２００６０００８８４４号において記載されている方法を使用して創出することができる。
【０１７４】
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８アミノ酸からなる（例えば、ＵＳ５，８３１，０１２を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
【０１７５】
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ  ＰｒｏｔｅｏＬａｂ  ＡＧ社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９１６８７３号にある。
【０１７６】
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、ＷＯ２００１０４１４４において記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、ＷＯ２００４１０６３６８において記載されている。
【０１７７】
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
【０１７８】
本発明は、ＬＯＸ−１タンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＬＯＸ−１結合性抗体は、ヒト対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
【０１７９】
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバーを含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表されたＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
【０１８０】
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７５９，８０８号を参照されたい。また、Stijlemans, B.ら、2004 J Biol Chem 279:1256〜1261; Dumoulin, M.ら、2003 Nature 424:783〜788; Pleschberger, M.ら、2003 Bioconjugate Chem 14:440〜448; Cortez-Retamozo, V.ら、2002 Int J Cancer 89:456〜62；およびLauwereys, M.ら、1998 EMBO J 17:3512〜3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
【０１８１】
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
【０１８２】
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年８月１９日に公表された米国特許出願第２００４０１６１７３８号を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
【０１８３】
したがって、本発明の特色は、ＬＯＸ−１に対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、ＬＯＸ−１またはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、ＬＯＸ−１結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＬＯＸ−１を伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
【０１８４】
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことができる。
【０１８５】
したがって、本発明は、ＬＯＸ−１に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、ＬＯＸ−１の別のエピトープである。
【０１８６】
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープおよび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
【０１８７】
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
【０１８８】
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holligerら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448; Poljakら、1994 Structure 2:1121〜1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45（3〜4）:128〜30; Wuら、1996 Immunotechnology、2（1）:21〜36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる（HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45（34）:128〜30; Wuら、1996 Immunotechnology、2（1）:21〜36; PluckthunおよびPack、1997 Immunotechnology、3（2）:83〜105; Ridgwayら、1996 Protein Eng.、9（7）:617〜21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる（Luら、2004 J. Biol. Chem.、279（4）:2856〜65を参照されたい）。
【０１８９】
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１９０】
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovskyら、1984 J. Exp. Med. 160:1686； Liu, MAら、1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus、1985 Behring Ins. Mitt. 78号、118〜132; Brennanら、1985 Science 229:81〜83；およびGlennieら、1987 J. Immunol. 139:2367〜2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
【０１９１】
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
【０１９２】
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号において記載されている。
【０１９３】
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体間複合体の存在が検出される。
【０１９４】
別の態様では、本発明は、ＬＯＸ−１に結合する、本発明の抗体の少なくとも２つの同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
【０１９５】
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許であるＥＰ１０１２２８０Ｂ１において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
【０１９６】
半減期を延長した抗体
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、ＬＯＸ−１タンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
【０１９７】
多くの因子が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取込み）。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することができる。
【０１９８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化する方法が知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
【０１９９】
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（ＲｅＣＯＤＥ  ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを伝達するコドンへと転換する。
【０２００】
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
【０２０１】
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。ＰＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
【０２０２】
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
【０２０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際特許公開第ＷＯ９８／２３２８９号、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照されたい。
【０２０４】
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン；ＨＳＡ）へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際特許公開第ＷＯ９３／１５１９９号、同第ＷＯ９３／１５２００号、および同ＷＯ０１／７７１３７号；ならびに欧州特許第ＥＰ４１３，６２２号を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈では、抗体の特異性は、抗体の１つの結合性ドメインが、ＬＯＸ−１に結合するのに対し、抗体の第２の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、ＨＳＡに結合するようにデザインすることもできる。
【０２０５】
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
【０２０６】
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、ＬＯＸ−１タンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号；欧州特許第ＥＰ３０７，４３４および同第ＥＰ３６７，１６６号；国際特許公開第ＷＯ９６／０４３８８号および同第ＷＯ９１／０６５７０号；Ashkenaziら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535〜10539; Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590〜5600；およびVilら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341を参照されたい。
【０２０７】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、本発明の抗体またはそれらの断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号；Pattenら、1997、Curr. Opinion Biotechnol. 8:724〜33; Harayama、1998、Trends Biotechnol. 16（2）:76〜82; Hanssonら、1999、J. Mol. Biol. 287:265〜76；ならびにLorenzoおよびBlasco、1998、Biotechniques 24（2）:308〜313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。ＬＯＸ−１タンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
【０２０８】
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentzら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821〜824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilsonら、1984、Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
【０２０９】
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
【０２１０】
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさらに包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
【０２１１】
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
【０２１２】
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardoら、1998、Clin Cancer Res. 4（10）:2483〜90; Petersonら、1999、Bioconjug. Chem. 10（4）:553〜7；およびZimmermanら、1999、Nucl. Med. Biol. 26（8）:943〜50において記載されている。
【０２１３】
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら（編）、243〜56頁（Alan R. Liss, Inc. 1985）; Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery（2版）、Robinsonら（編）、623〜53頁（Marcel Dekker, Inc. 1987）; Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら（編）、475〜506頁（1985）; 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら（編）、303〜16頁（Academic Press 1985）；およびThorpeら、1982、Immunol. Rev. 62:119〜58を参照されたい。
【０２１４】
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
【０２１５】
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＬＯＸ−１結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号１５、３５、５５、７５、または９５に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号２５、４５、６５、８５、または１０５に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、ＬＯＸ−１抗原結合能を呈示することが可能である。
【０２１６】
本発明ではまた、上記で示したＬＯＸ−１結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したＬＯＸ−１結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
【０２１７】
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１６、３６、５６、７６、または９６に示される重鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６に示される軽鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、９０％、または９９％）同一な軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
【０２１８】
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＬＯＸ−１結合性抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narangら、1979、Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brownら、Meth. Enzymol. 68:109、1979によるホスホジエステル法；Beaucageら、Tetra. Lett., 22:1859、1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification、H.A. Erlich（編）、Freeman Press、NY、NY、1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Innisら（編）、Academic Press、San Diego、CA、1990; Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19:967、1991；およびEckertら、PCR Methods and Applications 1:17、1991において記載されている通りに実施することができる。
【０２１９】
本発明ではまた、上記で記載したＬＯＸ−１結合性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、ＬＯＸ−１結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harringtonら、Nat Genet 15:345、1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＬＯＸ−１結合性ポリヌクレオチドおよびＬＯＸ−１結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ  Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ  Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ  Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brentら、前出; Smith、Annu. Rev. Microbiol. 49:807、1995；およびRosenfeldら、Cell 68:143、1992を参照されたい。
【０２２０】
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、ＬＯＸ−１結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、ＬＯＸ−１結合性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる（例えば、Scharfら、Results Probl. Cell Differ. 20:125、1994；およびBittnerら、Meth. Enzymol., 153:516、1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
【０２２１】
発現ベクターはまた、挿入されたＬＯＸ−１結合性抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたＬＯＸ−１結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。ＬＯＸ−１結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体またはそれらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
【０２２２】
ＬＯＸ−１結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＬＯＸ−１結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
【０２２３】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＬＯＸ−１結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。哺乳動物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker、FROM GENES TO CLONES、VCH Publishers、N.Y.、N.Y.、1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queenら、Immunol. Rev. 89:49〜68、1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ  ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０２２４】
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる（一般に、Sambrookら、前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（ElliotおよびO'Hare、Cell 88:223、1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、およびｅｘ  ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、ＬＯＸ−１結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
【０２２５】
本発明のモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む、様々な技法により作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための多くの技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換または発がん性形質転換を援用することができる。
【０２２６】
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系、ラット系、およびウサギ系を含む。マウスにおけるハイブリドーマの産生は、十分に確立された手順である。当技術分野では、融合のための、免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび免疫化法が公知である。また、融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０２２７】
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するために、当技術分野で公知の方法（例えば、Cabilly et al.による、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するために、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Winterによる米国特許第５２２５５３９号；ならびにQueen et al.による、米国特許第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第５６９３７６２号；および同第６１８０３７０号を参照されたい。
【０２２８】
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＬＯＸ−１を指向するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソミックマウスを使用して作製することができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書では、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称し、本明細書では、まとめて、「ヒトＩｇマウス」と称するマウスを含む。
【０２２９】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μ鎖遺伝子座および内因性κ鎖遺伝子座を不活化する、標的化突然変異と併せて、再配列されていないヒト重（μおよびγ）軽鎖免疫グロブリン配列およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードする、ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を作り出す（Lonberg, N. et al., 1994 supra；Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93；およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総説されている）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノムの修飾は、それらの全ての内容が参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656；Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724；Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123；Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830；Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920；Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに記載されている。さらに、全てLonberg and Kayによる、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；Surani et al.による、米国特許第５，５４５，８０７号；全てLonberg and Kayによる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７１１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにKorman et al.による、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号も参照されたい。
【０２３０】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランス染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細書では、「ＫＭマウス」と称する、このようなマウスは、Ishida et al.による、ＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号において詳細に記載されている。
【０２３１】
当技術分野ではなおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、代替的なトランスジェニック動物系も利用可能であり、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称する代替的なトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.による、米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号；および同第６，１６２，９６３号において記載されている。
【０２３２】
当技術分野ではさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる、代替的なトランスクロモソミック動物系も利用可能であり、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖トランス染色体およびヒト軽鎖トランス染色体の両方を保有するマウスを使用することができ、このようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖およびヒト軽鎖トランス染色体を保有するウシも記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894）、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
【０２３３】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では、ヒト抗体を単離するための、このようなファージディスプレイ法が確立されているか、または下記の実施例において記載される。例えば、Ladner et al.による、米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，５７１，６９８号；Dower et al.による、米国特許第５，４２７，９０８号；および同第５，５８０，７１７号；McCafferty et al.による、米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号；ならびにGriffiths et al.による、米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号；および同第６，５９３，０８１号を参照されたい。
【０２３４】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化されると、ヒト抗体応答を作り出しうるように、ヒト免疫細胞を再構成した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilson et al.による、米国特許第５，４７６，９９６号および同第５，６９８，７６７号において記載されている。
【０２３５】
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
【０２３６】
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
【０２３７】
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスである。
【０２３８】
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
【０２３９】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
【０２４０】
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号；および同第６，１２１，０２２号において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
【０２４１】
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号；および同第５，６４８，２６０号においてさらに詳細に記載されている。
【０２４２】
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載されている。
【０２４３】
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号においてさらに記載されている。
【０２４４】
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号においてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields, R.L.ら、2001 J. Biol. Chen. 276:6591〜6604を参照されたい）。
【０２４５】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号；および同第６，３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。
【０２４６】
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、ＨａｎｇらによるＥＰ１，１７６，１９５は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L.ら、2002 J. Biol. Chem. 277:26733〜26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載している（また、Umanaら、1999 Nat. Biotech. 17:176〜180も参照されたい）。
【０２４７】
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するＬＯＸ−１結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなＬＯＸ−１結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＬＯＸ−１結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトＬＯＸ−１に結合し、また、ＬＯＸ−１の１つまたは複数の機能的特性も阻害すること（例えば、ＬＯＸ−１とＬＯＸ−１受容体の結合を阻害する、ＬＯＸ−１依存性の細胞増殖を阻害する）など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連するＬＯＸ−１結合性抗体を創出する。
【０２４８】
例えば、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換えにより、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、組換えにより操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるＬＯＸ−１結合性抗体を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
【０２４９】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号８、２８、４８、６８、および８８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号９、２９、４９、６９、および８９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるＬＯＸ−１結合性抗体を作製するステップと、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出するステップと、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
【０２５０】
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１１、３１、５１、７１、および９１からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１２、３２、５２、７２、および９２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１３、３３、５３、７３、および９３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号２１、４１、６１、８１、および１０１からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２２、４２、６２、８２、および１０２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号２３、４３、６３、８３、および１０３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるＬＯＸ−１結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。
【０２５１】
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化されたＬＯＸ−１結合性抗体であって、配列番号１６、３６、５６、７６、または９６の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号２６、４６、６６、８６、または１０６の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるＬＯＸ−１結合性抗体を調製し、全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。
【０２５２】
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、またはＵＳ２００５／０２５５５５２において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
【０２５３】
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＬＯＸ−１に特異的に結合すること；ならびに抗体が、Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイおよび／またはＢａ／Ｆ３−ＬＯＸ−１Ｒ細胞増殖アッセイにおいて、ＬＯＸ−１依存性の細胞増殖を阻害することを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるＬＯＸ−１結合性抗体の機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体である。
【０２５４】
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、ＬＯＸ−１結合性抗体コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入することができ、結果として得られる修飾ＬＯＸ−１結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
【０２５５】
本発明のある種の実施形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引き起こすことが公知である。脱アミドは、生物学的活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる（Anal Chem. 2005年3月1日;77（5）:1432〜9）。
【０２５６】
本発明のある種の実施形態では、抗体は、ｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。ｐＩが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しやすいことが公知である。さらに、ｐＩが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の抗ＬＯＸ−１抗体またはＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、抗体を高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。抗体を高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、心血管障害を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とすることができる。ｐＩの増大はまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎを媒介するリサイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求される注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、ｐＩの増大に起因して、抗体の全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびｉｎ  ｖｉｖｏにおける生物学的活性の延長がもたらされる。ｐＩは、８．２以上であることが好ましい。
【０２５７】
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
【０２５８】
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載されるＬＯＸ−１に結合する抗体は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、ＬＯＸ−１レベルの上昇および／またはＬＯＸ−１活性の増大と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＬＯＸ−１関連心血管障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、ＬＯＸ−１関連心血管障害を処置する方法を提供する。
【０２５９】
本発明の抗体を使用して、とりわけ、心血管障害、内皮細胞機能不全、内皮細胞障害、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、高血圧症、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、一酸化窒素欠乏、心筋梗塞、血管の酸化ストレス、心筋虚血症、虚血症−再灌流、敗血症、糖尿病性腎症、腎疾患、心筋症、心不全、末梢動脈疾患、冠動脈性心疾患、跛行（例えば、間欠性跛行、ラザフォード分類ＩＩ／ＩＩＩ跛行）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、狭心症（例えば、不応性狭心症）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）（例えば、心臓に血液を供給する動脈のアテローム性動脈硬化に起因する）、脳卒中、および異常な内皮依存性血管拡張を含むがこれらに限定されない、ＬＯＸ−１に関連する状態または障害を処置、防止、および改善することができる。
【０２６０】
心血管障害、例えば、ＬＯＸ−１関連心血管障害の処置および／または防止は、血管機能の臨床的に関与性の測定値を使用する医療ケア従事者により決定されうる。ＬＯＸ−１関連心血管障害の処置とは、血管機能、血管解剖学的特徴、および／もしくは血液動態パラメータの改善もしくは保存を結果としてもたらすか、またはこれらを結果としてもたらすことが企図される任意の作用（例えば、本明細書で記載される抗ＬＯＸ−１抗体の投与）を意味する。加えて、心血管障害と関連する状態または障害に関する場合の防止とは、本明細書で規定される、血管機能および／または心血管障害パラメータの悪化を、前記悪化の危険性がある患者において防止または緩徐化する、任意の作用（例えば、本明細書で記載される抗ＬＯＸ−１抗体の投与）を意味する。
【０２６１】
安定狭心症および急性虚血性症候群では、ｏｘＬＤＬおよび可溶性ＬＯＸ−１レベルのいずれも増大するので、本発明の抗ＬＯＸ−１抗体は、血管の酸化ストレスを阻害し、心筋虚血症を低減し、狭心症および運動耐容能を改善することが期待され、前記抗体は、利用可能な最初の疾患修飾抗狭心症処置となる潜在性を有する。
【０２６２】
前記治療的投与の有効性は、一過性虚血性事象（ホルターＥＣＧモニタリング）および狭心症（Ｓｅａｔｔｌｅ  ａｎｇｉｎａ  ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）の頻度および持続時間の逐次的評価、ならびに潅流イメージングの選択肢を伴う逐次的運動負荷試験により測定することができる。有効性はまた、血漿ｏｘＬＤＬ、可溶性ＬＯＸ−１、および酸化ストレスバイオマーカー（Ｆ２−イソプロスタン、マロンジアルデヒド、ミエロペルオキシダーゼ）など、バイオマーカーの使用によって測定することもできる。
【０２６３】
本明細書で使用される「跛行」とは、重度の跛行および他の類似の用語を含み、運動機能障害および満たされていない大きな医療上の必要について記載する。跛行とは、下肢末端の虚血症、筋肉疲労を引き起こすこと、休息により緩和される、労作時における疼痛、運動の制限、および生活の質の低下を特徴とする状態であり、アテローム性動脈硬化および内皮依存性血管拡張の異常（例えば、内皮依存性血管拡張の機能障害）により引き起こされる。米国内のその有病数は、患者８００〜１２００万人である。間欠性跛行を伴う患者のうち、７％は、下肢末端のバイパス手術を受け、４％は、大規模な切断術を必要とし、１６％は、跛行の悪化を発症する。５年間を超える重度の跛行罹患者のうちの２０％では、心筋梗塞および脳卒中などの心血管事象が生じる。現行の治療は、手術による治療であり、本発明の抗ＬＯＸ−１抗体の投与など、侵襲性の小さな手段を介する処置であれば、極めて大きな治療的飛躍を表すであろう。
【０２６４】
前記治療的投与の有効性は、疼痛の発症までの時間、運動持続時間、および歩行距離を含む評価項目を伴う、運動により誘導される跛行の逐次的評価（足底屈およびトレッドミル）により測定することができる。有効性はまた、血漿ｏｘＬＤＬおよび可溶性ＬＯＸ−１；酸化ストレスバイオマーカー（Ｆ２−イソプロスタン、マロンジアルデヒド、ミエロペルオキシダーゼ）など、機構的バイオマーカーの使用；運動により誘導される、下肢末端の血流および筋内Ｏ２飽和度の変化によっても測定することができる。
【０２６５】
別の満たされていない大きな医療上の必要であって、本発明の抗ＬＯＸ−１抗体が治療的に有用な医療上の必要は、不応性狭心症である。狭心症は、最適の医学的治療（例えば、長時間作用型ベータ遮断剤、硝酸薬、およびカルシウムチャネル遮断剤の投与）にもかかわらず、罹患した対象において再発し、血管再建のための選択肢が存在しない。不応性狭心症とは、心筋の虚血に起因する胸痛を顕徴とする状態であり、冠動脈の閉塞または痙攣（例えば、冠動脈疾患に由来する）に一般に起因し、消耗性の症状、身体活動の大きな制限、および生活の質の低下を伴う。患者１００〜１８０万人の、米国内の不応性狭心症罹患者は、心血管による死亡率の、毎年１０％の増大率での増大を経ており、少なくとも１００，０００例の新たな不応性狭心症の症例が毎年生じている。
【０２６６】
本発明の抗体はまた、ＬＯＸ−１関連障害を防止、処置、または改善するための他の薬剤と組み合わせても使用することができる。例えば、スタチン療法を、心血管障害を伴う患者を処置するために、本発明のＬＯＸ−１抗体および抗原結合性断片と組み合わせて使用することができる。
【０２６７】
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたＬＯＸ−１結合性抗体（インタクトなまたは結合性断片）を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、心血管障害の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
【０２６８】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
【０２６９】
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
【０２７０】
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co.、20版、2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、ＬＯＸ−１結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。ＬＯＸ−１結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
【０２７１】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０２７２】
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される心血管障害を処置するのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範囲であり、より通例では、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。抗体の硝子体内投与では、投与量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ〜眼１つ当たり５ｍｇの範囲でありうる。例えば０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、２．１ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌ、２．３ｍｇ／ｍｌ、２．４ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．６ｍｇ／ｍｌ、２．７ｍｇ／ｍｌ、２．８ｍｇ／ｍｌ、２．９ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．１ｍｇ／ｍｌ、３．２ｍｇ／ｍｌ、３．３ｍｇ／ｍｌ、３．４ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、３．６ｍｇ／ｍｌ、３．７ｍｇ／ｍｌ、３．８ｍｇ／ｍｌ、３．９ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．１ｍｇ／ｍｌ、４．２ｍｇ／ｍｌ、４．３ｍｇ／ｍｌ、４．４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、４．６ｍｇ／ｍｌ、４．７ｍｇ／ｍｌ、４．８ｍｇ／ｍｌ、４．９ｍｇ／ｍｌ、または５．０ｍｇ／ｍｌ。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与、または必要に応じた（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
【０２７３】
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるＬＯＸ−１結合性抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するように調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
【実施例】
【０２７４】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、添付の特許請求の範囲によっても包含される。
【０２７５】
実施例１：抗原としての使用のための、精製組換えヒト可溶性ＬＯＸ−１の調製
ヒトＣＤ３３、精製タグ（ＥＦＨＲ）、およびＢｉｒＡビオチニル化配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）に由来するＮ末端シグナルペプチド（配列番号１４４）を伴う、ヒトＬＯＸ−１ポリペプチドの細胞外ドメイン（アミノ酸残基６１〜２７３）をコードする核酸配列を、哺乳動物細胞用発現ベクターである、ｐＲＳ５ａへとサブクローニングした。結果として得られるプラスミドである、ｐＲＳ５ａ＿ＡＰＰ−Ａｖｉ−ヒト−ｓＬＯＸ−１（６１〜２７３）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へと、標準的なポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション法を使用して、一過性にトランスフェクトした。細胞は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ培地Ｍ１１Ｖ３（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）中の懸濁培養液中で増殖させ、トランスフェクションは、Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒを使用して、培地５リットル中に、１ｍｌ当たり１．４×１０６個の細胞の最終細胞濃度で実行した。
【０２７６】
トランスフェクションの５時間後、５リットルのＥｘＣｅｌｌ  ＶＰＲＯ無血清培地（Ｓｉｇｍａ）を添加した。細胞は、３７℃および５％のＣＯ２で１０日間にわたり増殖させた。次いで、細胞を、遠心分離により採取した後で、０．２２ミクロンの滅菌フィルターで濾過した。清明化させた上清に、ＰＢＳで平衡化させた２０ｍＬの抗ＡＰＰアフィニティー樹脂（Ｎｏｖａｒｔｉｓの特許品）上を通過させた。カラムは、２８０ｎｍにおけるベースラインの吸光度に達するまで、ＰＢＳで洗浄した。次いで、カラムを、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．３％のトリ−ｎ−ブチルリン酸を含有する１０カラム容量のＰＢＳに続き、２５カラム容量のＰＢＳで洗浄した。次いで、ｓＬＯＸ−１タンパク質を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０で溶出させ、画分を、１Ｍのトリス、ｐＨ９．０  １／１０容量で中和した。関与性の画分をプールし、ＰＢＳに対して十分に透析し、次いで、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させた。解析的サイズ決定解析により、精製された可溶性ＬＯＸ−１タンパク質材料が、このタンパク質の期待された形態である、＞９５％の二量体形態であることが示された。
【０２７７】
実施例２：ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の調製
抗ＬＯＸ１特異的抗体の結合特異性および機能的活性について調べるために、ヒトＬＯＸ−１を安定的に過剰発現させるＨＥＫ２９３細胞を発生させた。標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００トランスフェクション法を使用して、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に、全長ヒトＬＯＸ−１  ｃＤＮＡおよびハイグロマイシン耐性をコードする哺乳動物用発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた培養物を、トランスフェクション後３日目に、ＬＯＸ−１の表面における発現について、フローサイトメトリーにより査定し、次いで、ハイグロマイシン選択（２００μｇ／ｍｌ）にかけて、安定的発現細胞について濃縮した。クローン集団は、２ラウンドにわたる逐次的な限界希釈により得、発現は、フローサイトメトリーにより確認した。培養物中で、４週間を超えて安定的なＬＯＸ−１の発現を維持するクローンだけを選択し、後続の抗体特徴付けアッセイにおいて使用した。
【０２７８】
実施例３：モノクローナル抗体の調製
組換えヒトＬＯＸ−１タンパク質は、実施例１で記載した通りに社内調製し、抗ＬＯＸ−１ハイブリドーマクローンを作製するための免疫原として使用した。ＰＢＳ中のＬＯＸ−１抗原を、等容量のフロイントアジュバントと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫応答を増強した。完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｆ５８８１）を、初回の注射のために使用し、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｆ５５０６）を、その後における免疫化のために使用した。
【０２７９】
動物の免疫化および試料の回収は、ＩＡＣＵＣにより承認された標準的な動物使用プロトコールに従い実行した。略述すると、５〜６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ  ＶＡＦマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ヒトＬＯＸ−１タンパク質およびアジュバントによる抗原エマルジョンで免疫化した。マウスを、動物１匹当たり１００μＬの抗原−アジュバント混合物中に約２０μｇのタンパク質で、４回にわたり皮下免疫化した。注射は、２〜３週間ごとに実施して、動物において、免疫応答を発現させた。ハイブリドーマを作製するための細胞融合の３日前に、マウスに、不完全フロイントアジュバントと混合された、同じ用量のＬＯＸ−１抗原を、再度腹腔内追加投与し、細胞融合の日に、脾臓を回収するために、滅菌の手術条件下で、マウスを屠殺した。
【０２８０】
免疫化されたマウスに由来する脾臓を、２枚の滅菌つや消し顕微鏡用スライドガラスの間ですり潰して、ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、単一の細胞懸濁液を調製した。脾臓細胞は、ペレット化し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回にわたり洗浄した。細胞融合体に、ハイブリドーマクローンを発生させるため、脾臓細胞を混合し、標準的な融合プロトコール（Zhang C. 2012. Methods Mol. Biol. 901:117-135）に従い、ポリエチレングリコール１５００をフソゲンとして使用して、マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Kearney J.F. et al., 1979. J. Immunol., 123:1548-1550）と融合させた。細胞融合および遠心分離の後で、細胞を、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）補充物質（Ｓｉｇｍａ、Ｈ−０２６２）を含有する、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（脾臓１つ当たり２００ｍＬ）中に懸濁させ、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−Ｃｏｓｔａｒ  ３５９６）へと、ウェル１つ当たり２００μＬの細胞懸濁液で播種した。
【０２８１】
３７℃、５％のＣＯ２で、３〜４日間にわたるインキュベーションの後で、１００μＬの培養物上清を、プレートの各ウェルから除去し、ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）補充物質（Ｓｉｇｍａ、Ｈ−０１３７）を含有する、等容量の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地で置きかえた。プレートは、ハイブリドーマクローンが、抗体のスクリーニングを可能とするのに十分な程度に大きなコロニーに増殖するまで、５％のＣＯ２による雰囲気中、３７℃で、持続的にインキュベートした。
【０２８２】
実施例４：ハイブリドーマのスクリーニング、サブクローニング、および選択
ハイブリドーマ細胞が、プレートウェル内で増殖して、ハーフコンフルエントとなり、上清がオレンジ色へと変化した、融合後２週目において、細胞ベースのＬＯＸ−１抗原についての免疫蛍光フローサイトメトリー、またはＬＯＸ−１タンパク質抗原についてのＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによる抗体スクリーニングのために、ハイブリドーマ上清を、プレートからサンプリングした。一次スクリーニングのために、ＬＯＸ−１をトランスフェクトされた２９３−６Ｅ細胞を、非トランスフェクト細胞と対比して使用するフローサイトメトリーにより、ハイブリドーマ上清について調べた。略述すると、ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされた２９３−６Ｅ細胞、または非トランスフェクト細胞を、それぞれ、５０μＬのハイブリドーマ上清と共にインキュベートした後で、フルオレセイン−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆａｂ断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により標識付けし、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを伴う自動式のフローサイトメトリーにより解析した。
【０２８３】
フローサイトメトリー解析により、ＬＯＸ−１をトランスフェクトされた２９３−６Ｅ細胞とは反応するが、非トランスフェクト細胞とは反応しないハイブリドーマクローンを同定し、融合プレートから選択した。所望のハイブリドーマクローンを、さらなる特徴付けのために、Ｔ１２プレート内で増殖させた。ＬＯＸ−１特異的モノクローナル抗体を産生するモノクローナル集団を得るように、対象のハイブリドーマクローンを、限界希釈し、単一のコロニーを顕微鏡的に採取することによりサブクローニングした。選択されたハイブリドーマサブクローンを、Ｔ１２プレート内で増殖させ、低温保存のために凍結させるか、またはモノクローナル抗体を作製するために使用した。ハイブリドーマクローンに由来する、特異的なモノクローナル抗体のアイソタイプは、市販のアイソタイプ決定試薬を使用することにより決定した。
【０２８４】
スクリーニング結果に基づき、２４のヒトＬＯＸ−１特異的ハイブリドーマクローンのパネルを、ヒトＬＯＸ−１抗原によるマウスの免疫化から同定し、選択した。これらのハイブリドーマクローンのうちの１つである、クローン３９．１Ｅ２Ｅ１０（Ｅ２Ｅ１０と略記し、本明細書では、Ｅ２Ｅ１０またはマウス親クローンと称する）は、カッパ軽鎖を伴うＩｇＧ１のモノクローナル抗体を産生し、そのＬＯＸ−１結合特性に基づく抗体の配列決定およびヒト化のための主要な候補のうちの１つとして選択された。
【０２８５】
実施例５：ＯｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１への結合に対する阻害についての、モノクローナル抗体のスクリーニング
ＬＯＸ−１抗体は、標準的な方法（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）を使用して、ハイブリドーマ上清から精製した。
【０２８６】
実施例１で記載した通りに調製した、精製ＡＰＰ−Ａｖｉ可溶性ヒト可溶性ＬＯＸ−１（６１−２７３）タンパク質を、以下の通りにビオチニル化させた：５０ｍＭのビシンｐＨ８．３緩衝液中に、約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度の、精製可溶性ＬＯＸ−１タンパク質（８〜１０ｍｇ）を、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．１ｍＭのビオチン、およびＢｉｒＡビオチンリガーゼ（Ａｖｉｄｉｔｙ）の存在下において、３０℃で１時間にわたりインキュベートし、次いで、４℃で一晩にわたり静置した。次いで、タンパク質を、ＰＢＳで平衡化させたＳ２００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  １６／６０カラムを使用して精製した。関与性の画分をプールし、タンパク質を、約１ｍｇ／ｍＬの濃度まで濃縮し、アリコート分割し、液体窒素中で瞬時凍結させた。ビオチニル化パーセントは、非ビオチニル化試料およびビオチニル化試料の、質量分析によるペプチドマッピングにより評価した。ビオチニル化収率は、＞９５％であり、非ビオチニル化材料は検出されないことが典型的であった。解析的サイズ決定解析により、ビオチニル化させた材料は、このタンパク質の予想された形態である、１００％の二量体形態であることが示された。
【０２８７】
次いで、ビオチニル化可溶性ＬＯＸ−１タンパク質を、ＰＢＳ中に２．５μｇ／ｍＬの濃度まで希釈し、この溶液０．１ｍＬを、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ  ９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ型番１５１２８）のウェルへと添加し、次いで、プレートを、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳで３回にわたり洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり２５％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ型番ＢＵＦ０２９）０．３ｍＬを添加し、静かに振とうしながら、室温で２時間にわたり、プレートをインキュベートすることにより、ブロッキングした。次いで、プレートを、ＰＢＳで１回洗浄した。１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で希釈されたＬＯＸ−１抗体の系列希釈液を調製し、０．１ｍＬの希釈された抗体を、プレートへと添加した。プレートを、室温で１時間にわたりインキュベートし、次いで、ＰＢＳで３回にわたり洗浄した。次に、０．１ｍＬのｏｘＬＤＬ（高結合性ＯｘＬＤＬ、Ｋａｌｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ型番７７０２１２−７）を１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で、２ｕｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。
【０２８８】
ｏｘＬＤＬの検量線を作成するため、２０ｕｇ／ｍＬのｏｘＬＤＬの最高濃度を使用して、ＬＯＸ−１抗体の非存在下における、ｏｘＬＤＬの多様な濃度について調べた。次いで、プレートを、室温で２時間にわたりインキュベートし、次いで、プレートを、ＰＢＳで３回にわたり洗浄した。次いで、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：１０００に希釈された、ウェル１つ当たり０．１ｍＬのＨＲＰコンジュゲート抗ＡｐｏＢ１００抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．、型番ＰＰ０８６）を添加し、室温で２時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳで６回にわたり洗浄した。次いで、ウェル１つ当たり０．１ｍＬのＴＭＢ基質を添加し、プレートを、室温で１０分間にわたりインキュベートした。停止溶液（ウェル１つ当たり５０μＬの２Ｎ硫酸）を、各ウェルへと添加し、適切なプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２８９】
実施例６：モノクローナル抗体のヒト化
マウスモノクローナル抗体であるＥ２Ｅ１０は、そのタンパク質配列を、ヒト生殖細胞系列配列へと近似させ、その免疫原性を低下させるように、Ｈｕｍａｎｅｅｒ（商標）化されている。Ｈｕｍａｎｅｅｒ（商標）化技術は、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＫａｌｏＢｉｏｓにより利用可能である。抗体をＨｕｍａｎｅｅｒ（商標）化することにより、親抗体または基準抗体の特異性およびアフィニティーをなおも保持しながら、ヒト生殖細胞系列配列との相同性が大きなＶ領域配列により操作されたヒト抗体（米国特許公開第２００５／０２５５５５２号および同第２００６／０１３４０９８号）を作製する。工程ではまず、基準Ｆａｂの重鎖可変領域内および軽鎖可変領域内の最小の抗原結合特異性決定基（ＢＳＤ）（重鎖ＣＤＲ３内の配列および軽鎖ＣＤＲ３内の配列であることが典型的である）を同定する。これらの重鎖ＢＳＤおよび軽鎖ＢＳＤは、Ｈｕｍａｎｅｅｒ（商標）化工程において構築される全てのライブラリー内で維持されるので、各ライブラリーは、エピトープに焦点を合わせたものとなり、最終的な完全Ｈｕｍａｎｅｅｒ（商標）化抗体は、元のマウス抗体のエピトープ特異性を保持する。
【０２９０】
次に、カセットライブラリー（マウスＦａｂの重鎖可変領域または軽鎖可変領域の一部を、ヒト配列のライブラリーで置きかえた）を作製する。細菌分泌系を使用して、ライブラリーのメンバーを、抗体Ｆａｂ断片として発現させ、コロニーリフト結合アッセイ（ＣＬＢＡ）を使用して、ライブラリーを、抗原に結合するＦａｂについてスクリーニングする。陽性クローンをさらに特徴付けて、アフィニティーが最大のクローンを同定する。次いで、残りのマウス配列の文脈では結合を支援する、同定されたヒトカセットを、最終的なライブラリースクリーンにおいて組み合わせて、完全なヒトＶ領域を作製する。
【０２９１】
結果として得られるＨｕｍａｎｅｅｒ（商標）化Ｆａｂは、ヒトライブラリーに由来するＶセグメント配列を有し、ＣＤＲ３領域内で同定される、短いＢＳＤ配列を保持し、ヒト生殖細胞系列のフレームワーク４領域を有する。これらのＦａｂは、重鎖および軽鎖の可変領域を、ＩｇＧ発現ベクターへとクローニングすることにより、完全ＩｇＧへと転換される。この工程で作製された完全Ｈｕｍａｎｅｅｒ（商標）化抗体は、親抗体であるマウス抗体の結合特異性を保持し、抗原に対して、親抗体と同等以上のアフィニティーを有し、ヒト生殖細胞系列の抗体遺伝子と比較して、タンパク質レベルで、高度の配列同一性を伴うＶ領域を有することが典型的である。
【０２９２】
Ｈｕｍａｎｅｅｒ（商標）化ＬＯＸ−１抗体であるＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６の重鎖組成および軽鎖組成、ならびにそれらの最も近縁のヒト生殖細胞系列配列との、類似性パーセントを、表２に示す。
【０２９３】
【表２】
0006505678.tif 000012
【０２９４】
実施例７：ＬＯＸ−１抗体による、ＯｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１タンパク質への結合の阻害
ｏｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１タンパク質への結合を阻害するＬＯＸ−１抗体の能力は、実施例４で記載した方法を使用して決定した。このアッセイでは、硫酸銅に媒介されたＬＤＬの酸化により発生させた、Ｋａｌｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製の「ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ＯｘＬＤＬ」（型番７７０２１２−７）に加えて、他の２つの形態の修飾ＬＤＬ：マロンジアルデヒドで修飾されたＬＤＬ（Ａｃａｄｅｍｙ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．；型番２０Ｐ−ＭＤ−Ｌ１０５）、および次亜塩素酸で修飾されたＬＤＬについても調べた。次亜塩素酸で修飾されたＬＤＬは、以下の手順に従い調製した。ヒトＬＤＬ（Ｋａｌｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；型番７７０２００−４）は、ＰＢＳで、０．２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで希釈した。次いで、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ；ＪＴ  Ｂａｋｅｒ；型番９４１６−０１）を、０．１ｍＭの最終濃度まで添加した。溶液を、室温で４時間にわたりインキュベートし、次いで、２００μｌの総容量当たり１００ｍＭのメチオニン５μｌを添加して、Ｌ−メチオニンを反応の最終濃度まで添加することにより、反応を停止させた。修飾ＬＤＬの、ＬＯＸ−１への結合の、ＬＯＸ−１抗体による阻害を示す代表的なデータを、図１Ａ〜１Ｃに示し、表３に記載する。
【０２９５】
【表３】
0006505678.tif 000013
【０２９６】
実施例８：ＬＯＸ−１抗体による、ＯｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１／ＨＥＫ２９３細胞への結合の阻害
ｈｕＬＯＸ−１／ＨＥＫ２９３細胞は、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンを、含有するＤＭＥＭ中で、７５ｃｍ２の表面積当たり２０ｍｌの培養培地を含有するＴ型フラスコ内の接着性単層として維持した。細胞は、加湿されたインキュベーター内に、５％のＣＯ２および３７℃でインキュベートし、２〜３日ごとに継代培養した。細胞を継代培養するために、培養培地を除去し、単層を、１０〜２０ｍｌのあらかじめ加熱されたＰＢＳで１回洗浄する。洗浄した後で、１ｍｌのあらかじめ加熱されたＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓを添加し、細胞を、３７℃で５分間にわたりインキュベートした。次いで、あらかじめ加熱された新鮮な培養培地を添加した。
【０２９７】
ｈｕＬＯＸ−１／ＨＥＫ２９３細胞を、１ｍＬ当たり１×１０６個の細胞で再懸濁させ、ウェル１つ当たり５０μＬを、９６ウェルＶ型底プレートへと播種した（ウェル１つ当たり５×１０４個の細胞）。次いで、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ）中のＬＯＸ−１抗体または非関与性の対照抗体を、細胞へと添加した。典型的な最終抗体濃度は、０．００６μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの範囲とした。細胞を、３７℃で１時間にわたりインキュベートし、次いで、加熱されたＨＢＳＳで２回にわたり洗浄した。次いで、５０ｕｌのアッセイ培地中のＤｉｌ−ｏｘＬＤＬ（ヒトｄｉＩ標識「Ｈｉｇｈ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ」ＬＤＬ；Ｋａｌｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；型番７７０２６２−９；ＤｉＩとは、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロレートである）を、３０〜１００μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。次いで、細胞を、３７℃で２時間にわたりインキュベートし、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中に２％のＦＢＳ）で２回にわたり洗浄した。次いで、図２および表３に描示する通り、細胞を、フローサイトメトリーにより、Ｄｉ−Ｉ蛍光の強度について解析した。
【０２９８】
実施例９：ＯｘＬＤＬ誘導活性酸素種（ＲＯＳ）産生アッセイ
ＬＯＸ−１抗体または非関与性の対照抗体を、単独または（Ｆａｂ）２架橋剤（ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｆａｂ）２；Ａｂｃａｍ；型番ａｂ９８５２６））の存在下、０．０５ｍＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ）中に２倍の最終濃度で、室温で１５分間にわたりインキュベートした。（Ｆａｂ）２架橋剤の、ＬＯＸ−１抗体に対する比を変化させ、１：１および１：２の比を組み入れた。ＬＯＸ−１抗体または対照抗体単独（架橋剤を伴わない）による用量応答実験では、０．００５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの範囲の抗体濃度を使用した。抗体単独を、架橋剤を伴う抗体と比較する実験では、０．０３μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの範囲の抗体濃度を使用した。
【０２９９】
ヒトＬＯＸ−１を発現させる細胞（ｈｕＬＯＸ１／ＨＥＫ２９３）を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；型番１２６０５−０１０）を使用して解離させ、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、細胞を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ）中１ｍＬ当たり２×１０６個の細胞で再懸濁させ、ウェル１つ当たり５０μｌで（ウェル１つ当たり１×１０５個の細胞で）、９６ウェルＶ型底プレート（Ｃｏｓｔａｒ；型番３８９４）へと播種した。架橋Ｆａｂ（上記で記載した通りに調製した）を伴うかまたは伴わない、ウェル１つ当たり５０μｌのＬＯＸ−１（または対照）抗体溶液を添加し、混合物を、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。ＯｘＬＤＬ（アッセイ緩衝液中、ウェル１つ当たり０．１ｍＬ；Ｋａｌｅｎ製の「Ｈｉｇｈ  ｏｘＬＤＬ」；型番７７０２５２−７）を、２５μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加し、結果として生じる混合物を、３７℃で１００分間にわたりインキュベートした。Ｈ２ＤＣＦＤＡは、アッセイ培地中、ウェル１つ当たり０．１ｍＬで希釈し、５〜１０μＭの最終濃度まで添加し、混合物を、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含有する、ウェル１つ当たり２００μｌのＨＢＳＳで１回洗浄し、ウェル１つ当たり２００μｌの冷却したＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＦＢＳ）で１回洗浄し、ウェル１つ当たり５０〜１００μＬの、冷却したＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。Ｈ２ＤＣＦＤＡの酸化の結果として発生した蛍光は、フローサイトメーター（励起：４８８ｎｍ；発光：５００／５３０ｎｍ）を使用して測定した。例示的な結果を、図３および４、ならびに表４に示す。
【０３００】
【表４】
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【０３０１】
図４Ａ〜４Ｆに見られる通り、ＬＯＸ−１抗体は、ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内の、ｏｘＬＤＬに誘導される反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生を阻害する。ｏｘＬＤＬの非存在下では、ＬＯＸ−１抗体（単独の抗体または架橋Ｆａｂ２の存在下における抗体）は、ＲＯＳの産生を誘導しない。アイソタイプ対照抗体は、ヒトＬＯＸ−１をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内の、ｏｘＬＤＬに誘導されるＲＯＳ産生に対して影響を及ぼさない。
【０３０２】
実施例１０：ＬＯＸ−１抗体は、ヒト好中球上の内因性ＬＯＸ−１に結合する
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のキット（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｍｉｃｒｏ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２１９５５）を使用して、ＬＯＸ−１抗体を、ビオチニル化させた。０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ緩衝液中の抗体を、５０倍モル過剰量のＮＨＳ−ビオチン試薬と共に、室温で６０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＰＢＳ中で平衡化させ、製造元の指示書に従い使用される、脱塩スピンカラム（Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  ７Ｋ  ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番８９８８２）を使用して、ビオチニル化させた抗体を、過剰量のビオチニル化試薬から分離した。ビオチニル化させた抗体の濃度は、２８０ｎｍにおけるその吸光度の測定に基づき決定した。
【０３０３】
好中球を、標準的な方法を使用して、健常ドナーから得られたヒト血液試料から単離した。略述すると、ヒト全血液を、ＥＤＴＡを含有するバイアル内に回収した。１０ｍＬの血液試料へと、１０ｍＬの沈降緩衝液（３％のデキストラン、０．９％の塩化ナトリウム）を添加し、結果として得られる溶液を静かに混合し、室温で２０分間にわたり静置した。白血球に富む血漿を含む上層を、４℃、１２００ｒｐｍ（２５０〜５００×ｇ）で１０分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、室温、１０ｍＬの０．９％の塩化ナトリウム中に速やかに再懸濁させた。結果として得られる細胞懸濁液を、１０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを含有する５０ｍＬの円錐型試験管へと注意深く移し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅの上に細胞懸濁液を成層させ、次いで、試験管を、室温、１４００ｒｐｍ（４００×ｇ）で、３０分間にわたり遠心分離した。次いで、上層を廃棄した。結果として得られる細胞ペレットへと、１０ｍＬの０．２％の氷冷塩化ナトリウムを添加し、混合物を、正確に３０秒間にわたりインキュベートして、赤血球を溶解させ、次いで、１．６％の氷冷塩化ナトリウム１０ｍＬを添加して、等張性を回復させた。次いで、細胞懸濁液を、１２００ｒｐｍ（２５０〜５００×ｇ）で５分間にわたり遠心分離した。上清を廃棄し、赤血球溶解手順を今一度繰り返した。結果として得られる細胞ペレットを、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中に２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ、および０．２％のアジ化ナトリウム）中に、１ｍＬ当たり２×１０６個の細胞の細胞密度で再懸濁させた。
【０３０４】
単離したばかりのヒト好中球を含有する細胞懸濁液を、９６ウェルＶ型底プレートのウェル（ウェル１つ当たり１×１０５個の細胞で）（Ｃｏｓｔａｒ；型番３８９４）へと移した（ウェル１つ当たり５０μｌ）。ブロッキング緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中に２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＢＳＡ、および０．２％のアジ化ナトリウム）中で希釈された、４％の正常ウサギ血清）（ウェル１つ当たり５０μｌ）を添加し、プレートを、氷上で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中のビオチニル化ＬＯＸ−１抗体（１０ｕｌ）を、ウェルへと、１ｎｇ／ｍｌ〜５ｕｇ／ｍＬの範囲にわたる最終濃度まで添加し、プレートを、氷上で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、１２００ｒｐｍ（２５０〜３００×ｇ）で３分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。細胞を、０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回にわたり洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：２５０に希釈された、０．１ｍＬのＰＥ−ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；型番５５４０６１）を添加し、プレートを、氷上で３０分間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを再度遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を、０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で２回にわたり洗浄した。次いで、細胞を、０．１ｍＬの固定緩衝液（２％のパラホルムアルデヒドを伴うＦＡＣＳ緩衝液）中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ測定器を使用して解析した。ＬＯＸ−１抗体による好中球への結合についてのＥＣ５０値を決定するため、図５および表３において示される通り、ＦＡＣＳにより決定されるＬＯＸ−１による染色強度を、抗体の濃度と対比してプロットした。
【０３０５】
実施例１１：水素／重水素交換質量分析によるエピトープマッピング
質量分析（ＭＳ）と組み合わせた水素−重水素交換（ＨＤｘ）（Woods, 2001）を使用して、抗体であるＥ２Ｅ１０の結合部位を、ＬＯＸ−１上にマッピングした。ＨＤｘでは、タンパク質の交換可能なアミド水素を、重水素で置きかえる。この工程は、タンパク質の構造／動態および溶媒との接近可能性に対して高感度であり、したがって、リガンドの結合について報告することが可能である。ＨＤｘＭＳの非侵襲的性質、高感度、大型のタンパク質に対する作動能力、および結合部位をマッピングしうる高分解度により、ＨＤｘＭＳは、他の方法から区別される。これらの実験の目的は、ＬＯＸ１上の、Ｅ２Ｅ１０のエピトープの同定であった。
【０３０６】
自動式ＨＤｘ／ＭＳ実験は、文献（Chalmers, 2006）において記載されている方法と同様の方法を使用して実施した。ＬＥＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐａｌ  ＨＴＳ液体ハンドラー（ＬＥＡＰ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｒｂｏｒｏ、ＮＣ）を、全ての液体取扱い操作に使用した。液体ハンドラーは、ＬＥＡＰ  Ｓｈｅｌｌで書かれた自動化スクリプトにより制御し、２℃に維持される冷蔵筺体内に格納した。６ポートの注入弁および洗浄ステーションを、液体ハンドラーのレールに取り付け、クロマトグラフシステムへの試料の注入およびシリンジの洗浄を容易とした。オンラインの消化のために、酵素カラム（Ｐｏｒｏｓｚｙｍｅ固定化ペプシン、２０×２．１×３０ｍｍ、ＡＢＩ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を、注入弁とトラッピングカートリッジとの間に、インラインでつないだ。２つのさらなる弁（１５ｋＰＳＩ  Ｖａｌｃｏ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）、４μＬのＥＸＰ  Ｈａｌｏ  Ｃ１８逆相トラップカートリッジ（Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＯＲ）、および解析用カラム（内径３００μｍ、Ｈａｌｏ  ２．７μｍ  Ｃ１８、Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｉｎｃ．）からなるクロマトグラフシステムを、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の供給源の前に取り付けられた、別個の冷却筺体内に格納した。クロマトグラフシステムを格納する筺体の温度は、ペルチエ冷却器により０℃に維持した。
【０３０７】
非重水素化対照および重水素化対照のために、１０μＬのヒト可溶性ＬＯＸ−１溶液（０．７３ｍｇ／ｍＬ）を、１５μＬの５０ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．８）で希釈した。複合体は、１０μＬのＬＯＸ−１溶液（０．７３ｍｇ／ｍＬ）を、当モル量のＥ２Ｅ１０および適量の５０ｍＭトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ７．８）と混合して、総容量を２５μＬとすることにより調製した。複合体を形成した後で、溶液を、３０分間にわたりインキュベートさせた。交換反応を開始するために、７５μＬのＤ２Ｏ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ中のＤ２Ｏ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、１０分間にわたり交換させた。次いで、０．２５ｍＬの還元緩衝液（８Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、０．２５ＭのＴＣＥＰ、ｐＨ２．５）を添加することにより、混合物のｐＨを低下させて、ジスルフィド結合を還元し、交換速度を緩徐化することから、試料の交換状態を効果的に凍結した。１０分間にわたる還元の後、混合物を、０．５ｍＬの反応停止緩衝液（５０ｍＭのグリシン、ｐＨ２．５）で希釈した。次に、インラインの消化カラムを通して、０．５ｍＬの試料を、トラップへと注入し、下記で記載されるＬＣ−ＭＳにより解析した。
【０３０８】
クロマトグラフィーシステムでは、２つの個別のＨＰＬＣポンプを使用して、インラインの消化を実施し、消化されたペプチドを、Ｃ１８トラップカラムへとトラッピングし、トラッピングされたペプチドを、解析用カラムを通して、質量分析器へと溶出させる。１２５μＬ／分の流量（０．０５％のＴＦＡ）で作動させる「ローディング」ポンプ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳポンプ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により、試料を、ＰＡＬ注入弁の試料ループ（５００μＬ）から、ペプシンカラムを通して、逆相トラップカートリッジへと移した。６分間にわたるローディングステップの後、「ロード」弁を切り替えて、緩衝液（０．２５％のギ酸）が、「勾配」ポンプ（Ｎａｎｏ  Ａｃｑｕｉｔｙ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）から、２０μＬ／分の流量で、３分間の脱塩時間にわたり、トラップを通って流れることを可能とした。脱塩ステップの後、「脱塩」弁を切り替えて、ペプチドの、トラップから、解析用カラムおよび質量分析器のイオン源への溶出を容易とした。勾配ポンプにより、２０分間にわたりＢを０〜４０％とした後で、５分間にわたりＢを４０％〜７５％とする勾配を送達した。勾配のための合計時間は、３０分間であった。勾配ポンプの緩衝液組成は、Ａ：９９．７５：０．２５％ｖ／ｖ（Ｈ２Ｏ：ギ酸）およびＢ：９９．７５：０．２５％ｖ／ｖ（アセトニトリル：ギ酸）であった。
【０３０９】
タンパク質分解ペプチドは、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）により配列決定した。ペプチド同定のために使用するのは、非重水素化ＬＯＸ１ランに由来するＭＳ２データだけであるが、同じ方法を、非重水素化ＬＯＸ−１、重水素化ＬＯＸ−１、および重水素化複合体試料の全てを取得するために使用した。これらの取得のために、ＭＳ／ＭＳを、ＬＴＱで取得し、ＭＳ走査を、Ｏｒｂｉｔｒａｐで取得した。Ｏｒｂｉｔｒａｐにおける取得は、４００〜２０００のｍ／ｚ範囲にわたり、６０，０００の分解度で取得した。全ての実験のために使用される測定器パラメータは、３．５ｋＶのスプレー電圧、１０００ミリ秒の最大注射時間、イオン５０，０００個の、ＭＳのためのＬＴＱ  ＡＧＣ標的、およびイオン１，０００，０００個の、ＭＳのためのＦＴＭＳ  ＡＧＣ標的を含んだ。データ処理を開始するために、社内プログラム（ＲａｗＸｔｒａｃｔ）を使用して、Ｏｒｂｉｔｒａｐ．ＲＡＷファイルを、．ｍｚＸＭＬファイルへと転換した（Pedrioli 2004）。その後、．ｍｚＸＭＬファイルを、．ｍｚＢＩＮファイルへと転換し、ＳＥＱＵＥＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ）を使用して、タンデムＭＳ取得を検索した。ＳＥＱＵＥＳＴによる結果は、ＤＴＡＳｅｌｅｃｔを使用してフィルタリングした（Tabb 2002）。ペプチドの配列同定を使用して、各同定された配列のイオンについてのクロマトグラムを自動で抽出し、指定されたｍ／ｚ範囲および保持時間ウィンドウにわたる平均値スペクトルを作成するのに、社内で書かれたプログラム（Ｄｅｕｔｏｒｏｎｏｍｙ）を使用した。次いで、平均値スペクトルをスムージングおよび重心決定して、平均値の重水素取込みを決定した。初期の自動化処理の後、Ｄｅｕｔｏｒｏｎｏｍｙへと内蔵されたインタラクティブ型のデータビューアーを使用して、各平均値スペクトルの品質および重心決定を、手作業で検証または補正した。
【０３１０】
ＨＤｘＭＳマッピング実験により、著明に保護された、３つのＬＯＸ１領域を同定した。主要な保護は、ペプチドＦ２２８ＲＶＲＧＡＶＳＱＴＹＰＳＧＴＣＡＹＩ２４６（配列番号３）について観察された。また、ペプチドＮ１００ＥＬＫＥＭＩＥＴＬ１０９およびＳ２０７ＲＲＮＰＳＹＰＷＬＷＥ２１８についての副次的な保護も観察された（それぞれ、配列番号４および５）。保護領域は、タンパク質データバンクから得られた、ヒト可溶性ＬＯＸ−１  Ｃ末端レクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ）の結晶構造（１ＹＰＱ）へとマッピングした。保護領域のうちの１つである、Ｎ１００ＥＬＫＥＭＩＥＴＬ１０９（配列番号４）は、ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ結晶構造内には存在しない。ペプチドＦ２２８ＲＶＲＧＡＶＳＱＴＹＰＳＧＴＣＡＹＩ２４６（配列番号３）は、公表されている部位指向突然変異誘発研究（Ohki et al. (2005) Structure, 13: 905-917）により、リガンド結合に関与するＬＯＸ−１分子の表面へとマッピングされる。したがって、結果は、Ｅ２Ｅ１０が、ＬＯＸ−１に結合するＬＯＸ−１リガンドの競合的阻害剤として作用する可能性が高いことを指し示す。Ｅ２Ｅ１０を、ヒト化変異体であるＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６へと転換するのに使用されるｈｕｍａｎｅｅｒ化工程は、抗体のエピトープ特異性を変化させる可能性が非常に低い（実施例６を参照されたい）ので、これらの結果はまた、ＬＯＸ−１上のＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６の一次結合部位も同定する。
【０３１１】
Ｅ２Ｅ１０の、ＬＯＸ−１への結合に起因する、ＬＯＸ−１由来ペプチドによる重水素取込みの変化を、表５に示す。
【０３１２】
【表５−１】
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【０３１３】
【表５−２】
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【０３１４】
実施例１２：ＬＯＸ−１抗体結合アッセイにおける使用のための、精製組換えカニクイザル可溶性ＬＯＸ−１の調製
カニクイザルＬＯＸ−１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を決定するために、全ＲＮＡを、３匹の個別のサルから得られた臓器：Ｚｙａｇｅｎ／ＧＷ製の１匹の個体に由来する３つの臓器、およびＣｏｖａｎｃｅ，Ｉｎｃ製の２匹の個体に由来する１２の臓器から抽出した。次いで、全ＲＮＡを、公開データベース（Ｕｎｉｐｒｏｔ；ＮＣＢＩ）に従いデザインされた、非翻訳領域に由来するプライマーを使用するＰＣＲ増幅のために使用した。標準的な配列決定法を使用して、増幅されたＬＯＸ−１  ｍＲＮＡの核酸配列を決定した。カニクイザルＬＯＸ−１（アミノ酸６１〜２７３に対応する）の細胞外ドメイン内で、３匹の個別のサルに由来するカニクイザルＬＯＸ−１のアミノ酸配列は同一であった。
【０３１５】
ヒトＣＤ３３、精製タグ（ＥＦＨＲ）、およびＢｉｒＡビオチニル化配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）に由来するＮ末端シグナルペプチド（配列番号１４４）を伴う、カニクイザルＬＯＸ−１ポリペプチドの細胞外ドメイン（アミノ酸残基６１〜２７３）をコードする核酸配列を、哺乳動物細胞用発現ベクターであるｐＲＳ５ａへとサブクローニングした。カニクイザル可溶性ＬＯＸ−１の発現および精製は、実施例１でヒト可溶性ＬＯＸ−１について記載した方法と同じ方法を使用して実行した。成熟ＡＰＰ−Ａｖｉ−可溶性カニクイザルＬＯＸ−１（６１〜２７３）のアミノ酸配列を、表６に示す。いくつかの実験では、実施例５でヒト可溶性ＬＯＸ−１について記載した方法と同じ方法を使用して、カニクイザル可溶性ＬＯＸ−１タンパク質をビオチニル化させた。
【０３１６】
【表６】
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【０３１７】
実施例１２
Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイによる抗体の解離定数の決定
ヒトおよびカニクイザルのＬＯＸ−１に結合するマウスＬＯＸ−１抗体であるＥ２Ｅ１０について、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を、未使用の濾過されたランニング緩衝液（１倍濃度のＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ型番ＢＲ−１００６−６０））で準備した。マウス抗体捕捉キット（ＧＥ型番ＢＲ−１００８−３８）およびアミンカップリングキット（ＧＥ型番ＢＲ−１０００−５０）を使用して、ＣＭ５チップ（ＧＥ型番ＢＲ−１００５−３０）を調製した。略述すると、未使用のチップを、ＥＤＣ／ＮＨＳにより、１０ｕｌ／分で４２０秒間にわたり活性化した。抗マウスＩｇＧ抗体を、１０ｍＭの酢酸ｐＨ５．０中に３０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｌ／分で４２０秒間にわたり固定した。チップ表面を、１Ｍのエタノールアミン溶液で不活化し（１０ｕｌ／分で４２０秒間にわたり）、次いで、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５（ＧＥ型番ＢＲ−１００３−５４）により、６０ｕｌ／分で３０秒間ずつ、３回にわたりコンディショニングした。
【０３１８】
方法の実行は、抗ＬＯＸ−１抗体に結合するヒトまたはカニクイザルの可溶性ＬＯＸ−１の反応速度を測定するようにプログラミングした。５つのスタートアップサイクルを、以下：１）６０ｕｌ／分で３０秒間にわたるランニング緩衝液によるサイクル、２）解離を３５０秒間とし、６０ｕｌ／分で、３５０秒間にわたるランニング緩衝液、再生緩衝液（グリシン−ＨＣｌ  ｐＨ１．５、０．０５％のＰ２０（ＧＥ型番ＢＲ−１０００−５４））による追加洗浄のサイクル、３）６０ｕｌ／分で６０秒間にわたる再生緩衝液によるサイクル、４）６０ｕｌ／分で３５秒間にわたる再生緩衝液、ランニング緩衝液による追加洗浄のサイクルであり、キャリーオーバー対照を含むサイクルの通りに実行した。
【０３１９】
試料サイクルとしては、１）Ｍｓ−抗Ｈｕ  ＬＯＸ−１  ｍＡｂを、フローセル２、３、または４上において、１０ｕｌ／分で約２０ＲＵの捕捉を可能とする所定量の時間にわたり捕捉したサイクルであり、フローセル１は、基準として使用したサイクル、２）６０ｕｌ／分で３０秒間にわたるランニング緩衝液によるサイクル、３）ランニング緩衝液中、多様な濃度で希釈された、ヒト可溶性ＬＯＸ−１またはカニクイザル可溶性ＬＯＸ−１（解離時間を７５０秒間または３０００秒間とし、６０ｕｌ／分で３５０秒間にわたる、少なくとも２つの二連の試料および複数の緩衝液ブランクを伴う）によるサイクル、４）６０ｕｌ／分で６０秒間にわたる再生緩衝液によるサイクル、５）６０ｕｌ／分で３５秒間にわたるランニング緩衝液、ランニング緩衝液による追加洗浄のサイクルであり、キャリーオーバー対照を含むサイクルを行った。会合速度定数および解離速度定数（ｋａおよびｋｄ）ならびに平衡結合定数（ＫＤ）を決定するために、緩衝液ブランク、基準ブランク、および１：１の結合モデルを使用して、データを、曲線の当てはめについて解析した（表７〜８のＥ２Ｅ１０についての結果を参照されたい）。
【０３２０】
ヒト化ＬＯＸ−１抗体の、ヒトＬＯＸ−１またはカニクイザルＬＯＸ−１との相互作用を定量化する、表面プラズモン共鳴による測定は、ＣＭ５チップ上の光学バイオセンサーであるＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００により行った。ＣＭ５チップに、酢酸緩衝液、ｐＨ４．０中３，０００ＲＵのヤギ−抗ｈＩｇＧ（ガンマ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｈ１０５００）をコーティングした。使用したランニング緩衝液は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４（濾過し、脱気した）であった。被験抗体を、個々のフローセルへと、１ｕｇ／ｍＬの濃度、１０ｕＬ／分の流量でロードした。ＩｇＧ捕捉の標的数は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＰ２０）中に２０〜３０ＲＵの間であった。ヒト可溶性ＬＯＸ−１またはカニクイザル可溶性ＬＯＸ−１を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中３３ｎＭの濃度まで希釈し、次いで、０．１３７ｎＭの濃度まで系列希釈（１：３）した。これは、ヒトＬＯＸ−１またはカニクイザルＬＯＸ−１の６つの異なる濃度を表す。抗原を、個々のフローセルへと、３０ｕＬ／分の流量で導入した。会合時間についてのパラメータを、７００秒間に設定し、解離時間についてのパラメータを、５，４００秒間に設定した。会合速度定数および解離速度定数（ｋａおよびｋｄ）ならびに平衡結合定数（ＫＤ）を決定するために、緩衝液ブランク、基準ブランク、および１：１の結合モデルを使用して、データを、曲線の当てはめについて解析した（表７〜８のＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６についての結果を参照されたい）。
【０３２１】
【表７】
0006505678.tif 000018
【０３２２】
【表８】
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【０３２３】
実施例１３：溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイによる、抗体の解離定数の決定
以下のＳＥＴプロトコールを使用して、ヒト可溶性ＬＯＸ−１に結合する、ビオチニル化Ｅ２Ｅ１０についてのＫＤ値を決定した。９６ウェルＭＳＤプレート（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｂｉｎｄプレート、ＭＳＤ型番Ｌ１５ＸＡ−３）を、４℃で一晩にわたるインキュベーションにより、ＰＢＳ中に０．２５ｕｇ／ｍＬのヒト可溶性ＬＯＸ−１  ５０ｕＬでコーティングした。溶液相の試料は、ヒト可溶性ＬＯＸ−１を、ポリプロピレン製のＶ型底９６ウェルプレート内のＳＥＴ希釈剤（ＰＢＳ、０．５％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で滴定することにより調製した。この希釈系列を、ＳＥＴ希釈剤中で希釈されたビオチニル化Ｅ２Ｅ１０と、１：１で組み合わせ（合計１００μＬ）、試料を、振とうしながら、室温で一晩にわたりインキュベートした。
【０３２４】
プレート洗浄器を使用して、コーティングされたＭＳＤプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）で、３回にわたり洗浄し、次いで、反転させ、残りの液体を除去するように、Ｋｉｍｗｉｐｅ上でブロッティングした。次いで、プレートを、ウェル１つ当たり２００ｕＬの、ＳＥＴブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、２％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）でブロッキングし、静かに振とうしながら、１時間にわたりインキュベートした。プレートを１回洗浄した。ウェル１つ当たり２５μＬの、溶液相の平衡結合試料を、プレートへと、二連で添加し、振とうしながら、３０分間にわたりインキュベートした。プレートを、３回にわたり洗浄した。ＳＥＴ希釈剤中１：５００に希釈された、ウェル１つ当たり２５μＬのストレプトアビジンＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（ＭＳＤ型番Ｒ３２ＡＤ−１）を、プレートへと添加し、静かに振とうしながら、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、３回にわたり洗浄した。１００μＬのＲｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（ＭＳＤ型番Ｒ９２ＴＣ−１）を、プレートへと添加し、ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００上で読み取った。ＫＤ値は、データを、以下の式：
Ｙ＝（Ｂｍａｘ／（ＣＡｂ／２））×（（ＣＡｂ／２）−（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）／２）−（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）２）／４）−（ＣＡｇ×ＣＡｂ））０．５））２）／（２×ＣＡｂ）））
［式中、Ｂｍａｘは、ＬＯＸ−１タンパク質が溶液中に存在しない場合のシグナルであり、ＣＡｂは、溶液中のＬＯＸ−１抗体の一定の濃度であり、ＣＡｇは、溶液中の可溶性ＬＯＸ−１の濃度であり、ＫＤは、平衡結合定数である］へと当てはめることにより決定した。
【０３２５】
ヒト化ＬＯＸ−１抗体であるＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、およびＦＦ６について、以下の溶液平衡滴定（ＳＥＴ）アッセイプロトコールを使用して、ＫＤ値を決定した。アッセイは、９６ウェルポリプロピレンプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、型番ＡＢ−１１２７）内で以下の通りに実施した。ＳＥＴ緩衝液（ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２を伴わないＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｇｉｂｃｏ、型番Ｐ７９４９；０．５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン、脂肪酸非含有、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、型番２６５７５；および０．０２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０、Ｓｉｇｍａ、型番Ｐ７９４９）中に一定濃度（１ｐＭ）のＬＯＸ−１抗体を、異なる濃度（１ｎＭ〜０．０１７ｐＭの範囲にわたる３倍の系列希釈液）の非ビオチニル化ヒトＬＯＸ−１タンパク質または非ビオチニル化カニクイザルＬＯＸ−１タンパク質と混合した。最終的な反応容量は、８０μＬであった。プレートは、粘着フィルム（ＶＷＲ、型番６０９４１−０６２）を使用して密封し、一定の振とう（３００ｒｐｍ）を伴って、２２℃で１４時間にわたりインキュベートした。
【０３２６】
同じ時間内に、３８４ウェルストレプトアビジンコーティングＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、型番Ｌ２１ＳＡ）を、プレートを、ウェル１つ当たり５０μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５％ｗ／ｖのウシ血清アルブミン）と共に、４℃で一晩にわたりインキュベートすることによりブロッキングした。次いで、プレート洗浄器（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、ブロッキングされたＭＳＤプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ−２０）で、３回にわたり洗浄した。洗浄の後、ビオチニル化ヒト可溶性ＬＯＸ−１タンパク質またはビオチニル化カニクイザル可溶性ＬＯＸ−１タンパク質（２５ｐＭ、ウェル１つ当たり１５μＬ）を、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴う、２２℃で１時間にわたるインキュベーションにより、表面上に固定した。次いで、プレートを、前で記載した通り、３回にわたり洗浄した。一部の実験では、非ビオチニル化可溶性ヒトＬＯＸ−１タンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、型番１７９８−ＬＸ−０５０）を使用し、この場合、ＬＯＸ−１タンパク質は、標準的なＭＳＤプレート（ＭＳＤ、型番Ｌ２１ＸＡ）内に１ｎＭの濃度の、一晩にわたるインキュベーションにより固定した。次いで、平衡結合反応物（ウェル１つ当たり１５μＬ）を、ＬＯＸ−１を固定したＭＳＤプレートへと適用し、３０分間にわたりインキュベートした。結合しなかった材料は、プレートを洗浄することにより除去し、捕捉された抗体は、ウェル１つ当たり１５μＬの、Ｓｕｌｆｏタグ付けされたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、型番Ｒ３ＡＪ−１）の１：５００希釈液を添加することにより検出した。次いで、プレートを、一定の振とう（６００ｒｐｍ）を伴って、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、３回にわたり洗浄し、次いで、ウェル１つ当たり１５μＬの、１倍濃度のＭＳＤ  ｒｅａｄ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、型番Ｒ９２ＴＣ−２）を添加し、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、プレートを現像した。解析のために、データをＥｘｃｅｌへと移し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５を使用してプロットした。ＫＤ値は、データを、以下の式：
Ｙ＝（Ｂｍａｘ／（ＣＡｂ／２））×（（ＣＡｂ／２）−（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）／２）−（（（（（（ＣＡｇ＋ＣＡｂ）＋ＫＤ）２）／４）−（ＣＡｇ×ＣＡｂ））０．５））２）／（２×ＣＡｂ）））
［式中、Ｂｍａｘは、ＬＯＸ−１タンパク質が溶液中に存在しない場合のシグナルであり、ＣＡｂは、溶液中のＬＯＸ−１抗体の一定の濃度であり、ＣＡｇは、溶液中の可溶性ＬＯＸ−１の濃度であり、ＫＤは、平衡結合定数である。ＦＦ１、ＦＦ３、ＦＦ４、ＦＦ５、ＦＦ６、およびＥ２Ｅ１０についての結果を、表９および図６に示す］へと当てはめることにより決定した。
【０３２７】
【表９】
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【０３２８】
参照による組込み
本明細書で引用される全ての参考文献であって、特許、特許出願、論文、教科書などを含む参考文献、およびそれらにおいて引用された参考文献は、それらについて既に言及した程度において、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
同等物
前出の明細書は、当業者が、本発明を実施することを可能とするのに十分であると考えられる。前出の記載および実施例は、本発明のある種の好ましい実施形態について詳述し、本発明者らにより企図される最良の方式について記載する。しかし、前出の記載および実施例が、本文中でいかに詳述されているように見えるとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそれらの任意の同等物に従うとみなされるべきであることが察知されるであろう。
本発明は以下の態様を包含し得る。
［１］  単離抗ＬＯＸ−１抗体またはその断片。
［２］  ＬＯＸ−１のリガンド結合性ドメインに結合する、単離抗ＬＯＸ−１抗体またはその断片。
［３］  ＬＯＸ−１のエピトープに結合する単離抗体またはその断片であって、前記エピトープが、ＬＯＸ−１のアミノ酸残基１００〜１０９、２０７〜２１８、または２２８〜２４６を含む、単離抗体またはその断片。
［４］  ＯｘＬＤＬの、ＬＯＸ−１タンパク質への結合を遮断する、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［５］  ｏｘＬＤＬ誘導活性酸素種（ＲＯＳ）産生を阻害する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［６］  Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される３４ｐＭ以下のＫＤ、または溶液平衡滴定アッセイ（ＳＥＴ）により測定される４ｐＭ以下のＫＤで、ヒトＬＯＸ−１タンパク質に結合する、単離抗体またはその断片。
［７］  表１に列挙されたＣＤＲのうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の同一性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［８］  表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む、前記［１］〜［７］のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［９］  表１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、変異体が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のうちの１つにおいて、少なくとも１〜４カ所のアミノ酸変化を有する、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の単離抗体または断片。
［１０］  ヒトＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１１］  ヒトＬＯＸ−１に結合する単離抗体またはその断片であって、配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択されるＶＨ；ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択されるＶＬまたは９７〜９９％の同一性を有するそのアミノ酸配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１２］  配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択される可変重鎖配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１３］  配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１４］  配列番号１４、３４、５４、７４、または９４からなる群から選択される可変重鎖、ならびに配列番号２４、４４、６４、８４、または１０４からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む、単離抗体またはその断片。
［１５］  配列番号８、２８、４８、６８、および８８からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９、２９、４９、６９、および８９からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ２、１０、３０、５０、７０、および９０からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１８、３８、５８、７８、および９８からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１９、３９、５９、７９、および９９からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ２、ならびに配列番号２０、４０、６０、８０、および１００からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１６］  配列番号１１、３１、５１、７１、および９１からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１２、３２、５２、７２、および９２からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ２、１３、３３、５３、７３、および９３からなる群から選択される重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２１、４１、６１、８１、および１０１からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２２、４２、６２、８２、および１０２からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ２、ならびに配列番号２３、４３、６３、８３、および１０３からなる群から選択される軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１７］  配列番号８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９のＣＤＲ２、配列番号１０のＣＤＲ３、配列番号１１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１２のＣＤＲ２、および配列番号１３のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１８］  配列番号２８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２９のＣＤＲ２、配列番号３０のＣＤＲ３、配列番号３１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３２のＣＤＲ２、および配列番号３３のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［１９］  配列番号４８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４９のＣＤＲ２、配列番号５０のＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５２のＣＤＲ２、および配列番号５３のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２０］  配列番号６８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６９のＣＤＲ２、配列番号７０のＣＤＲ３、配列番号７１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７２のＣＤＲ２、および配列番号７３のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２１］  配列番号８８の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８９のＣＤＲ２、配列番号９０のＣＤＲ３、配列番号９１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号９２のＣＤＲ２、および配列番号９３のＣＤＲ３を含む、単離抗体またはその断片。
［２２］  上記［１］〜［２１］の一項に記載の抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
［２３］  ＬＯＸ−１障害を処置する方法であって、有効量の、前記［１］〜［２１］のいずれかに記載の抗体または断片を含む医薬組成物を、ＬＯＸ−１障害に罹患している対象へと投与するステップを含む、方法。
［２４］  前記対象が、間欠性跛行およびラザフォード分類ＩＩ／ＩＩＩ跛行のうちの１つまたは複数に罹患している、前記［２３］に記載の方法。
［２５］  前記対象が、狭心症に罹患している、前記［２３］に記載の方法。
［２６］  前記［１］〜［２１］のいずれかに記載の単離抗体または断片と同じエピトープに結合する、単離抗体またはその断片。
［２７］  ヒトＬＯＸ−１タンパク質に結合し、前記［１］〜［２１］のいずれかに記載の単離抗体または断片と交差競合する、単離抗体またはその断片。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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