(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜であって、
上記ステロイドホルモン化合物が下記式（Ｉ）で表されるものであり、
【化１】
0006505490.tif 000008
［式中、
Ｒ1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ4は、１以上の置換基αで置換されているＣ1-10アルキル基、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素原子または水酸基を示し、
Ｒ4とＲ5は一緒になってオキソ基を形成してもよく、
置換基αは、水酸基およびオキソ基から選択される置換基を示す］
自己組織化単分子膜の上にポリマー層が積層されている積層構造を有し、
上記自己組織化単分子膜の表面の一部にβ−シクロデキストリンが結合しており、
上記ポリマー層には上記ステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間が形成されており、
上記特異的認識空間の一端には上記β−シクロデキストリンが存在し、且つ、上記特異的認識空間の他端にはアミノオキシ基が存在することを特徴とする分子インプリンティング膜。
【請求項２】
分子インプリンティングポリマーの特異的認識空間を形成するための鋳型化合物であって、下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする鋳型化合物。
【化２】
0006505490.tif 000009
［式中、
ＸとＹは、独立して、Ｃ1-6アルキレン基、Ｃ6-12アリーレン基、アミノ基、エーテル基、チオエーテル基、カルボニル基、チオニル基、エステル基、アミド基、スルホキシド基、スルホニル基、およびこれら２以上、５以下が結合したリンカー基を示し、
Ｒ1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ5は、水素原子または水酸基を示し、
Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示す］
【請求項３】
ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜を製造するための方法であって、
金属基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程、
上記自己組織化単分子膜の表面にβ−シクロデキストリンを結合させる工程、
上記β−シクロデキストリンに、請求項２に記載の鋳型化合物のアダマンチル基を相互作用させる工程、
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含むビニルモノマーを添加し、上記鋳型化合物のビニル基と共重合させる工程、
上記鋳型化合物のオキシム基を加水分解し、上記鋳型化合物のステロイド部分を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
試料中におけるステロイドホルモン化合物を検出する方法であって、
上記ステロイドホルモン化合物は、請求項１で規定されている式（Ｉ）で表されるものであり、
溶媒中、請求項１に記載の分子インプリンティング膜と上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触により上記特異的認識空間内に取り込まれた上記ステロイドホルモン化合物を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
さらに、上記接触工程の前に、上記分子インプリンティング膜の特異的認識空間に、標識基を有し、上記ステロイドホルモン化合物に類似する化学構造を有し、上記特異的認識空間に取り込まれ得るものであり、且つ上記ステロイドホルモン化合物に比べて上記特異的認識空間に対する親和性が低い疑似ステロイドホルモン化合物を挿入する工程を含み、
上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記測定工程において、反応系の変化を、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス法または電気化学インピーダンス法で測定する請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステロイドホルモン化合物に対する感度が極めて高い分子インプリンティング膜、当該分子インプリンティング膜の製造方法、当該分子インプリンティング膜の製造に用いる鋳型化合物、および、当該分子インプリンティング膜を用いてステロイドホルモン化合物を検出する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内情報伝達物質は、細胞間における情報の伝達などを媒介し、生体の恒常性維持に寄与している。例えば、ステロイドホルモンであるコルチゾールは血圧や血糖値の調整において重要な役割を果たしており、ストレスに敏感に応答して分泌されることが知られている。そのため最近では、精神疾患の予防などのため、コルチゾールをストレスマーカーとして高感度で且つ簡便に検出するための研究が行われている。
【０００３】
生体内分子の主な検出法としてはＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）が挙げられる。ＥＬＩＳＡは、検出すべき生体内分子に特異的な抗体を固定化し、試料を添加した後、抗体に結合した生体内分子に標識した二次抗体を結合させ、抗体−標的生体内分子−酵素標識抗体の複合体を検出する方法である。その他、金微小電極を自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）で修飾し、その表面に抗コルチゾール抗体を結合させたセンサーが開発されている（非特許文献１，２）。何れにせよ、従来は、生体内分子の検出にあたり抗体や酵素を用いるのが主流であった。
【０００４】
しかし抗体や酵素には、その製造や単離には高コストがかかり、また、不安定であることから保存が難しく、製品化に難があるといった問題がある。
【０００５】
そこで、生体がもつ緻密な分子認識能を模倣した人工分子認識材料創製法である分子インプリンティング法（ＭＩ法）が注目を集めている。ＭＩ法は、検出すべき標的分子の存在下でモノマーを重合させ、得られたポリマーから標的分子を除去することにより、標的分子に特異的な認識空間を形成することを基本とする。
【０００６】
例えば特許文献１には、ステロイドホルモンの存在下、イタコン酸など、当該ステロイドホルモンと相互作用する官能基を２つ以上有するモノマーを重合させた後、得られたポリマーからステロイドホルモンを除去することにより製造される分子インプリンティングポリマーが開示されており、特許文献２には、同様のポリマーからなる微粒子が開示されている。
【０００７】
また、特許文献３には、検出すべき標的分子と同様の分子構造と比色指示薬を有する置換分子を選択的に受容して結合するための空間を有するコアを含む分子インプリンティングポリマーセンサー装置において、試料液と当該分子インプリンティングポリマーを接触させ、試料液における色の変化により試料液中の標的分子の存在を検出する方法が開示されている。
【０００８】
特許文献４には、コルチゾールに結合した発色団を含む分子インプリンティングポリマーを有するコルチゾール分子検出用センサーが開示されている。当該ポリマーは、コルチゾールの存在下、コルチゾールに結合するリガンドであってビニル基を有するものを重合させることにより製造されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０４６８２６号パンフレット
【特許文献２】特開２０１４−２１９３５３号公報
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０２８８９４４号明細書
【特許文献４】米国特許第６８３３２７４号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｕｎｉｌ  Ｋ．Ａｒｙａら，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２０１０，２５（１０），ｐｐ．２２９６−２３０１
【非特許文献２】Ｃｒｕｚ  ＡＦら，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ，２０１４，６２，ｐｐ．２４９−２５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、検出すべき標的分子に特異的な認識空間をポリマー中に形成し、標的分子の検出に用いるＭＩ法は既に知られている。しかし、従来のＭＩ法の選択性や感度は必ずしも十分ではなかった。
【００１２】
そこで本発明は、従来のＭＩ法に比して高い感度でのステロイドホルモン化合物の検出が可能になる分子インプリンティング膜、当該分子インプリンティング膜の製造方法、当該分子インプリンティング膜の製造に用いる鋳型化合物、および、当該分子インプリンティング膜を用いてステロイドホルモン化合物を高い感度で検出できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、まず、検出すべき標的化合物であるステロイドホルモンへ、オキシム基を介してビニル基を導入し、さらにアダマンチル基を導入した鋳型化合物をデザインした。当該鋳型化合物のアダマンチル基を自己組織化単分子膜の表面に結合させたβ−シクロデキストリンと相互作用させることにより、自己組織化単分子膜上に当該鋳型化合物を配向させつつ、当該ビニル基とビニルモノマーとを共重合させてポリマー化した。次に、オキシム基を加水分解することにより鋳型化合物を除去することにより、標的化合物に対する特異的認識空間が配向した分子インプリンティング膜を得ることに成功した。
【００１４】
従来、分子インプリンティングポリマーは、標的化合物と、ビニル基を有し且つ当該標的化合物との親和性を有するリガンド化合物およびビニルモノマーの混合物を共重合させることにより製造されており、標的化合物や特異的認識空間を配向させることは全く考慮されていなかった。その結果、分子インプリンティングポリマーの特性を均一にすることは難しかった。詳しくは、ポリマー中に無秩序状態で存在する鋳型化合物の中には除去できないものもあり、その場合には部分的に特異的認識空間が形成されないことになる。また、形成された特異的認識空間もポリマー中に無秩序状態で形成されているため、ある特異的認識空間が標的化合物の他の特異的認識空間への相互作用を阻害したり、特異的認識空間の重複などにより標的化合物に対する選択性が損なわれるといったことが考えられる。
【００１５】
それに対して本発明に係る分子インプリンティング膜では、特異的認識空間が規則的に配向しているため、おそらくは個々の特異的認識空間が標的化合物に対して有効に作用し、従来の分子インプリンティングポリマーに対して感度が顕著に高まっており、また、その品質は均一である。
【００１６】
以下、本発明を示す。
【００１７】
［１］  ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜であって、
上記ステロイドホルモン化合物が下記式（Ｉ）で表されるものであり、
【００１８】
【化１】
0006505490.tif 000002
【００１９】
［式中、
Ｒ1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ4は、１以上の置換基αで置換されているＣ1-10アルキル基、または水酸基を示し、
Ｒ5は、水素原子または水酸基を示し、
Ｒ4とＲ5は一緒になってオキソ基を形成してもよく、
置換基αは、水酸基およびオキソ基から選択される置換基を示す］
自己組織化単分子膜の上にポリマー層が積層されている積層構造を有し、
上記自己組織化単分子膜の表面にはβ−シクロデキストリンが結合しており、
上記ポリマー層には上記ステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間が形成されており、
上記特異的認識空間の一端には上記β−シクロデキストリンが存在し、且つ、上記特異的認識空間の他端にはアミノオキシ基が存在することを特徴とする分子インプリンティング膜。
【００２０】
［２］  分子インプリンティングポリマーの特異的認識空間を形成するための鋳型化合物であって、下記式（ＩＩ）で表されることを特徴とする鋳型化合物。
【００２１】
【化２】
0006505490.tif 000003
【００２２】
［式中、
ＸとＹは、独立してリンカー基を示し、
Ｒ1は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ2は、水素原子、水酸基またはオキソ基を示し、
Ｒ3は、メチル基、ヒドロキシメチル基またはホルミル基を示し、
Ｒ5は、水素原子または水酸基を示し、
Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示す］
【００２３】
［３］  ステロイドホルモン化合物の分子インプリンティング膜を製造するための方法であって、
金属基板上に自己組織化単分子膜を形成する工程、
上記自己組織化単分子膜の表面にβ−シクロデキストリンを結合させる工程、
上記β−シクロデキストリンに、上記［２］に記載の鋳型化合物のアダマンチル基を相互作用させる工程、
ビニルモノマーを添加し、上記鋳型化合物のビニル基と共重合させる工程、
上記鋳型化合物のオキシム基を加水分解し、上記鋳型化合物のステロイド部分を除去する工程を含むことを特徴とする方法。
【００２４】
［４］  試料中におけるステロイドホルモン化合物を検出する方法であって、
上記ステロイドホルモン化合物は、上記［１］で規定されている式（Ｉ）で表されるものであり、
溶媒中、上記［１］に記載の分子インプリンティング膜と上記試料を接触させる工程、および、
上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触による反応系の変化を測定する工程を含むことを特徴とする方法。
【００２５】
［５］  さらに、上記接触工程の前に、上記分子インプリンティング膜の特異的認識空間に、標識基を有する疑似ステロイドホルモン化合物を挿入する工程を含み、
上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定する上記［４］に記載の方法。
【００２６】
［６］  上記測定工程において、反応系の変化を、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス法または電気化学インピーダンス法で測定する上記［４］に記載の方法。
【００２７】
本発明において「Ｃ1-10アルキル基」とは、炭素数１以上、１０以下の直鎖状または分枝鎖状の一価飽和脂肪族炭化水素基をいう。例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、ｎ−オクチル、イソオクチル、１，５−ジメチルヘキシル、ｎ−ノナニル、ｎ−デカニルなどである。
【００２８】
「リンカー基」は、例えば上記化合物（ＩＩ）においてビニル基やアダマンチル基の自由度を高めることによりそれらの反応性や相互作用能を改善したり、化合物（ＩＩ）を合成し易くするといった機能を有し、比較的安定な構造をいう。例えば、Ｃ1-6アルキレン基、Ｃ6-12アリーレン基、アミノ基（−ＮＨ−）、エーテル基（−Ｏ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、チオニル基（−Ｃ（＝Ｓ）−）、エステル基（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、アミド基（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−または−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、スルホキシド基（−Ｓ（＝Ｏ）−）、スルホニル基（−Ｓ（＝Ｏ）2−）、およびこれら２以上が結合した基を挙げることができる。但し、本発明に係るリンカー基はある程度安定である必要があるので、上記の「これら２以上が結合した基」には、例えばペルオキシド基（−Ｏ−Ｏ−）など不安定な構造は含まれない。このような不安定な構造や合成不可能な構造は、当業者に公知である。また、リンカー基が過剰に長くなると、検出対象であるステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間の選択性が低下するおそれがあり得るため、リンカー基が２以上の上記基が結合した基である場合、結合した基の数としては１５以下が好ましく、１０以下がより好ましく、８以下がさらに好ましく、５以下がよりさらに好ましい。
【００２９】
また、上記ステロイドホルモン化合物（Ｉ）および鋳型化合物（ＩＩ）において、ステロイド骨格のＡ環における点線は、単結合または無結合を示す。即ち、当該Ａ環は、シクロヘキサンまたは４，５−シクロヘキセンであってもよい。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係る分子インプリンティング膜では、特定のステロイドホルモン化合物に対する特異的認識空間の方向と位置が揃っており、その配向性が高い。よって、個々の特異的認識空間の標的ステロイドホルモン化合物に対する選択性が均一であり、また、それぞれが有効に利用可能であると考えられる。その上、当該特異的認識空間には、ステロイドホルモン化合物のＡ環の第３位に存在するカルボニル基とオキシム基や水素結合を形成可能なアミノオキシ基があり、また、ステロイドホルモン化合物の基本骨格であるＡ〜Ｄ環と疎水性相互作用が可能なβ−シクロデキストリン構造も存在する。よって、本発明に係る分子インプリンティング膜は、従来の分子インプリンティングポリマーに比べて特定のステロイドホルモン化合物の検出感度が極めて高いという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明に係る分子インプリンティング膜の製造方法を模式的に示した図である。
【図２】図２は、本発明に係るコルチゾールに特異的な分子インプリンティング膜が形成された金／ガラス板と、それ以外のポリマー層が形成された金／ガラス板の存在下、コルチゾールの添加濃度と、コルチゾールにより各ポリマー層から反応溶液中へ移動する疑似ステロイドホルモン化合物の濃度に依存する反応溶液の相対蛍光強度変化量との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、上記図２に結果を示す実験において、コルチゾールに加え、それ以外のステロイドホルモン化合物を用いて行った同様の実験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、上記図２に結果を示す実験において、本発明に係る未架橋分子インプリンティング膜と架橋分子インプリンティング膜を用いて行った同様の実験の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、上記図２に結果を示す実験において、本発明に係る架橋分子インプリンティング膜を用い、且つ、コルチゾールに加え、それ以外のステロイドホルモン化合物を用いて行った同様の実験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、先ず、本発明に係る分子インプリンティング膜の特異的認識空間を形成するために用いられる鋳型化合物（ＩＩ）の製造方法につき説明する。
【００３３】
１．鋳型化合物（ＩＩ）の製造方法
本発明に係る分子インプリンティング膜は、上記ステロイドホルモン化合物（Ｉ）に対して選択性を示すので、その特異的認識空間を形成するための鋳型化合物（ＩＩ）は、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）を原料化合物とすることができる。
【００３４】
なお、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）は特に制限されず、その存在・不存在や濃度を測定することによりヒトの疾患、症状、状態などを評価できるものであればよい。例えば、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、２１−デオキシコルチゾール、コルチゾール、コルチゾン、プロゲステロン、１１−デオキシコルチコステロン、コルチコステロン、１８−ヒドロキシコルチコステロン、アルドステロン、テストステロン、１９−ヒドロキシテストステロン、１９−オキソテストステロン、アンドロステンジオン、１９−ヒドロキシアンドロステンジオン、１９−オキソアンドロステンジオン、１１β−ヒドロキシアンドロステンジオン、アドレノステロン、アンドロスタンジオン、アンドロステロンなどを挙げることができる。
【００３５】
鋳型化合物（ＩＩ）は、リンカー基であるＸおよびＹに応じて、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）から合成することができる。
【００３６】
例えばアダマンチル基は、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）のＲ4および／またはＲ5における水酸基やオキソ基を、さらに必要であればこれらを官能基変換した上で、リンカー基Ｙを形成するために、アダマンタン誘導体と反応させることにより導入できる。また、Ｒ4および／またはＲ5における官能基の反応選択性が他の官能基に対して同等または乏しい場合には、他の官能基を選択的に保護しておいてもよい。これら官能基変換、リンカー基Ｙの形成反応、選択的な保護反応や脱保護反応は、当業者であれば容易に実施できる。例えば、Ｒ4中の第一級水酸基と１−アダマンタンカルボン酸を脱水縮合剤により反応させた場合、エステル結合によりアダマンチル基を導入することができる。
【００３７】
また、ビニル基は、リンカー基Ｘを介してビニル基が導入されているヒドロキシアミン誘導体と、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）のＡ環の第３位カルボニル基とを反応させてオキシム基を形成することにより導入することができる。或いは、リンカー基Ｘを形成するための官能基を有するヒドロキシアミン誘導体とステロイドホルモン化合物（Ｉ）のＡ環の第３位カルボニル基とを反応させてオキシム基を形成した後、ビニル基およびリンカー基Ｘを形成するための官能基を有する化合物をさらに反応させることにより、ビニル基を導入してもよい。
【００３８】
次に、鋳型化合物（ＩＩ）を用いて本発明に係る分子インプリンティング膜を製造する方法を説明する。なお、当該製造方法を模式的に示したスキームを図１として示す。
【００３９】
２．分子インプリンティング膜の製造方法
（２−１）  自己組織化単分子膜の形成工程
本工程では、金属基板上に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ：Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成する。ＳＡＭは、金属基板へ化学結合していると共に、金属基板上に分子が分子間力により密に且つ規則的に整列していることから、安定で均一である。
【００４０】
金属基板を構成する金属としては、金が汎用されているが、銀、銅、白金、パラジウムなども用いることができる。また、ガラス基板やテフロン（登録商標）基板上にこれら金属の薄膜を形成したものも金属基板として利用可能である。
【００４１】
ＳＡＭを形成するための分子としては、通常、炭素数８以上の直鎖アルキルチオール、ジスルフィド、酢酸チオールなどを用いることができ、チオール基などに対する他端には、アミノ基など、次工程でβ−シクロデキストリン基を導入するための官能基を有する化合物を用いる。また、強固なＳＡＭを形成すべく長鎖部分が同一または類似するものである範囲で、β−シクロデキストリン基を導入するための官能基以外の官能基を有する分子を併用してもよい。他の官能基としては、例えば、ビニルモノマーの重合開始作用を有する基を挙げることができる。
【００４２】
ＳＡＭの形成は、常法に従えばよい。例えば、ＳＡＭ形成分子をエタノールなどに溶解し、得られた溶液に金属基板を常温で３０分間以上２４時間程度浸漬すれば、当該分子がチオエーテル結合を介して金属基板表面に結合し、且つ分子間力により配向しつつ密に集合し、ＳＡＭが形成される。次いで、過剰のＳＡＭ形成分子を洗浄により除去した後、乾燥すればよい。
【００４３】
次工程ではＳＡＭの表面にβ−シクロデキストリンを結合させるが、例えばＳＡＭが非常に密である場合には、かかる結合が難しい場合があり得る。そのような場合には、β−シクロデキストリンの結合を容易にするため、図１に示すように、ＳＡＭの表面にいったんリンカー基を導入してもよい。
【００４４】
（２−２）  β−シクロデキストリンの結合工程
本工程では、上記工程（２−１）により金属基板上に形成されたＳＡＭ、または当該ＳＡＭの表面に導入されたリンカー基に、β−シクロデキストリン（以下、「β−ＣＤ」と略記する）を結合させる。
【００４５】
β−ＣＤは、７個のＤ−グルコースがα（１→４）グルコシド結合により環状に結合した環状オリゴ糖であり、その空洞の大きさから、アダマンタンを選択的に包接するという特性を示す。本発明では、かかる特性を利用する。
【００４６】
β−ＣＤの結合は常法に従えばよい。具体的には、ＳＡＭ形成分子の末端官能基や、ＳＡＭ表面に結合したリンカー基の末端官能基と、β−ＣＤに導入した反応性官能基とを反応させればよい。
【００４７】
（２−３）  鋳型化合物（ＩＩ）の結合工程
本工程では、上記β−ＣＤに鋳型化合物（ＩＩ）のアダマンチル基を相互作用させる。この際、当該アダマンチル基はβ−ＣＤに包接させるので、鋳型化合物（ＩＩ）の向きは均一であり、上記ＳＡＭの表面に配向されることになる。
【００４８】
（２−４）  共重合工程
本工程では、ビニルモノマーを添加し、ＳＡＭ表面に配向させた鋳型化合物（ＩＩ）中のビニル基と共重合させることにより、鋳型化合物（ＩＩ）を含むポリマー層を形成する。
【００４９】
添加するビニルモノマーは、鋳型化合物（ＩＩ）中のビニル基と共重合可能なビニル基構造を有するものであれば特に制限されず、適宜選択することができるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを好適に用いることができる。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンはリン脂質と類似した構造を有し、そのポリマーは生体への親和性に優れるため、血液などの生体試料の分析に適しているという利点がある。
【００５０】
重合条件は、常法に従って設定すればよい。例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは水溶性であるので、水系溶媒に、少なくとも上記工程（２−１）〜（２−３）を経た基板と２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを添加し、重合開始剤（ＳＡＭ表面に結合させたものでもよい）により重合を開始すればよい。反応液には、リビングラジカル重合を行うため、１価の銅化合物や、２価の銅化合物とアスコルビン酸などの還元剤との組み合わせを添加してもよい。重合温度は常温、さらには０℃以上１２０℃以下程度でよく、重合時間は１０分間以上５０時間以下程度とすることができる。具体的な重合条件は、重合が十分でないと形成された特異的認識空間の標的化合物への選択性が低下するおそれがあり得る一方で、過剰に重合させると次工程で鋳型化合物を除去できなくなるおそれがあり得るので、予備実験などで決定してもよい。
【００５１】
重合反応後は、余分な試薬を除去するため、使用した溶媒などでよく洗浄することが好ましい。
【００５２】
（２−５）  鋳型化合物の除去工程
本工程では、ビニル基の共重合によりポリマー中に取り込まれている鋳型化合物（ＩＩ）のオキシム基を加水分解し、鋳型化合物（ＩＩ）のステロイド部分を除去する。その結果、ポリマー中には、除去されたステロイド部分に特異的な認識空間が形成される。なお、上記ステロイド部分とは、鋳型化合物（ＩＩ）のうち、リンカー基を介してアダマンチル基が結合したステロイド骨格部分をいう。
【００５３】
オキシム基の加水分解は、常法に従えばよい。例えば、２０℃以上６０℃以下程度の塩酸などの酸性水溶液に、上記工程（２−１）〜（２−４）を経た基板を２時間以上５０時間以下程度浸漬すればよい。また、上記ステロイド部分を十分に除去するために、上記ステロイド部分を溶解できる溶媒で基板を十分に洗浄することが好ましい。
【００５４】
以上で得られる本発明に係る分子インプリンティング膜には、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）と同様の三次元立体構造を有する特異的認識空間が形成されている。また、この特異的認識空間の方向と位置は均一であり、配向性が高い。また、当該特異的認識空間には、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）のＡ環の第３位カルボニル基と相互作用可能なアミノオキシ基が存在し、その他端にはステロイドホルモン化合物（Ｉ）の基本骨格であるＡ〜Ｄ環と疎水性相互作用が可能なβ−シクロデキストリン構造も存在する。よって、本発明に係る分子インプリンティング膜は、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）に対する親和性が極めて高く、その選択的な検出感度が極めて高い。
【００５５】
以下、本発明に係る分子インプリンティング膜を用いたステロイドホルモン化合物（Ｉ）の検出方法につき説明する。
【００５６】
本発明に係るステロイドホルモン化合物（Ｉ）の検出方法は、溶媒中、本発明に係る分子インプリンティング膜と試料を接触させる工程（接触工程）、および、上記分子インプリンティング膜と上記試料との接触による反応系の変化を測定する工程（測定工程）を含む。
【００５７】
測定すべき試料は、ステロイドホルモン（Ｉ）の存在または不存在を確認すべきもの、また、ステロイドホルモン（Ｉ）の濃度を測定すべきものであれば、特に制限されない。例えば、ヒトまたは動物の血液、血清、血漿、尿、唾液などを挙げることができる。
【００５８】
使用する溶媒は、試料中に含まれる程度の量のステロイドホルモン（Ｉ）を溶解できるものであれば特に制限されない。例えば、検出すべきステロイドホルモン（Ｉ）を適度に溶解できる緩衝液を用いることができる。また、試料が液体である場合は、試料自体を溶媒として用いてもよく、試料を希釈してもよい。
【００５９】
本発明の分子インプリンティング膜と試料とを接触させるには、試料、または溶媒と試料の混合物中に、分子インプリンティング膜を浸漬すればよい。その際の温度は、測定結果が温度により異なることがあり得るので、例えば２０℃以上３０℃以下、特に２５℃など、一定にすることが好ましい。また、浸漬時間は、対象となるステロイドホルモン（Ｉ）が特異的認識空間へ十分に取り込まれるよう十分な時間とし、例えば、５分間以上、５時間以下程度とすることができる。
【００６０】
本発明に係るステロイドホルモン化合物（Ｉ）の検出方法では、分子インプリンティング膜と試料との接触による反応系の変化、即ち、特異的認識空間内に取り込まれたステロイドホルモン化合物（Ｉ）を測定することにより、対象であるステロイドホルモン化合物（Ｉ）の存在の有無や濃度を求める。
【００６１】
反応液の変化を測定する方法としては、例えば、表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス法、電気化学インピーダンス法を挙げることができる。
【００６２】
本発明に係る分子インプリンティング膜を金属膜上に形成した場合には、そのまま表面プラズモン共鳴測定法で利用することができる。即ち、プリズムに分子インプリンティング膜を形成した金属膜を貼り付け、プリズム側から金属膜へ光を全反射する様に照射すると表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が生じることによって反射光強度が低下する入射角度がある。この際の角度は、金属上に形成された分子インプリンティング膜に取り込まれたステロイドホルモン化合物（Ｉ）の量、即ち質量変化により鋭敏に変化することから、ＳＰＲ測定装置では、試料の添加前と添加後における質量変化を反射光強度から測定データ（レゾナンスユニット：１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ2）として表示することができる。
【００６３】
水晶振動子マイクロバランス法と電気化学インピーダンス法も、試料の添加により分子インプリンティング膜の特異的認識空間内に取り込まれたステロイドホルモン化合物（Ｉ）の有無や量を、それぞれ水晶振動子の共振周波数の変化とインピーダンスの変化により測定することができる。これら方法の具体的な条件は、常法を適用することができる。
【００６４】
或いは、試料の添加前後における反応系の変化は、反応溶液中における標識化合物の量の変化により測定することもできる。具体的には、試料の添加前、即ち上記接触工程の前に分子インプリンティング膜の特異的認識空間に、標識基を有する疑似ステロイドホルモン化合物を挿入しておく。当該特異的認識空間は測定対象であるステロイドホルモン化合物（Ｉ）に対する特異性が高いため、上記接触工程において、特異的認識空間中に存在する疑似ステロイドホルモン化合物は試料中に含まれるステロイドホルモン化合物（Ｉ）に追い出される形となり、反応溶液中における疑似ステロイドホルモン化合物の濃度が高まる。よって、上記測定工程において、反応系の溶液における標識基の濃度変化を測定することにより、試料中におけるステロイドホルモン化合物（Ｉ）の有無や濃度を求めることが可能になる。
【００６５】
上記の疑似ステロイドホルモン化合物は、測定対象であるステロイドホルモン化合物（Ｉ）に類似する化学構造を有し、特異的認識空間に取り込まれ得るものである一方で、ステロイドホルモン化合物（Ｉ）に比べて特異的認識空間に対する親和性は低いものである必要がある。かかる疑似ステロイドホルモン化合物としては、ステロイド骨格と三次元立体構造が近いことが知られているビスフェノール化合物であって標識基を有するものを挙げることができる。
【００６６】
疑似ステロイドホルモン化合物の標識基としては、例えば蛍光発色基を挙げることができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００６８】
実施例１：  モレキュラーインプリンティングポリマー（ＭＩＰ）の製造
（１）  ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物の調製
【００６９】
【化３】
0006505490.tif 000004
【００７０】
（１−１）  アダマンタンカルボン酸エステルの調製
１−アダマンタンカルボン酸（２７０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２８５ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（１８３ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタンに溶解させ、氷冷下で撹拌した。そこにコルチゾール（３６２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。反応の初期には反応混合液は白濁していたが、一晩撹拌した後は淡黄色の溶液になっていた。薄層クロマトグラフィー（展開液−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）のスポットについて、ＤＭＡＰのＲｆ値は０、コルチゾールのＲｆ値は０．１２５、目的化合物のＲｆ値は０．３７５であり、一晩攪拌後でも原料化合物であるコルチゾールのスポットが消えていなかったので、新たに１−アダマンタンカルボン酸（１３５ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（１４３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）、およびＤＭＡＰ（９２ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を追加した。３時間後に薄層クロマトグラフィーで反応の進行を確認したが、原料スポットは依然として消えなかったので、反応を終了し、反応液を飽和クエン酸、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和食塩水で洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製した。その後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を白色固体として得た（収量：２１２ｍｇ，収率：４０．３％）。
1H-NMR（300.40MHz，CDCl3）：δ=5.68（s，1H，4位のH），2.03（s，3H，アダマンタン），1.91（s，6H，アダマンタン），1.72（t，6H，アダマンタン），2.8-1.4（m，コルチゾール）
MALDI-TOF-MS  m/z=525.6［M＋H+］，547.7［M＋Na+］
【００７１】
（１−２）  オキシム化
上記（１−１）で得た  アダマンタンカルボン酸エステル（１３１ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を、メタノール：ジクロロメタン＝１：１の混合溶媒に溶解させ、そこへピロリジン（１２４μＬ，１．５ｍｍｏｌ）を加えた。２０分後、溶液が黄色に変色したことを確認し、カルボキシメトキシアミン・０．５塩酸塩（５４．５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応終了時における薄層クロマトグラフィー（展開液−酢酸エチル）のスポットについて、ピロリジンのＲｆ値は０、目的化合物のＲｆ値は０．１であり、原料化合物のＲｆ値＝０．７２５のスポットの消失を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣に純水を加え、１Ｍ  ＨＣｌにてｐＨ＝２．０に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を淡黄色固体として得た（収量：１４９ｍｇ，収率：９９．７％）。
1H-NMR（300.40MHz，DMSO-d6）：δ=1.99（s，3H，アダマンタン），1.82（s，6H，アダマンタン），1.68（t，6H，アダマンタン），2.5-1.5（m，コルチゾール）
MALDI-TOF-MS  m/z=598.8［M＋H+］，620.8［M＋Na+］
【００７２】
（１−３）  モノマーの結合
上記（１−２）で得たオキシム化合物（１４９ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をメタノールに溶解させ、氷冷下、４−アミノスチレン（４４．５ｍｇ，０．３７５ｍｍｏｌ）とＤＭＴ−ＭＭ（１３８ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加えた。氷浴を外し、常温で一晩反応させた。反応終了時における薄層クロマトグラフィー（展開液−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）のスポットについて、目的化合物のＲｆ値は０．３５であり、原料化合物のＲｆ値＝０．７２５のスポットの消失を確認した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチルに溶解させ、飽和クエン酸水溶液と食塩水にて洗浄し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）で精製した。その後、無水硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を減圧留去し、真空乾燥することにより、目的化合物を白色固体として得た（収量：６１．０ｍｇ，収率：３４．９％）。
1H-NMR（300.40MHz，CDCl3）：δ=8.02（d，1H，NH），7.50（d，2H，ベンゼン環），7.38（d，2H，ベンゼン環），2.02（s，3H，アダマンタン），1.97（s，6H，アダマンタン），1.73（t，6H，アダマンタン），2.8-1.5（m，コルチゾール）
MALDI-TOF-MS  m/z=699.1［M＋H+］，721.3［M＋Na+］
【００７３】
（２）  モノアミノ−β−シクロデキストリンの調製
【００７４】
【化４】
0006505490.tif 000005
【００７５】
（２−１）  トシル化
氷冷下で０．４Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（４０ｍＬ）にβ−シクロデキストリン（２．０ｇ，１．７５ｍｍｏｌ）を溶解し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（２．０ｇ，６ｅｑ）を加え４間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（展開液  −  １−ブタノール：メタノール：水＝５：４：３にて目的物のスポット（Ｒｆ値＝０．６）および二置換体（Ｒｆ値＝０．６５）が確認されたことから、未反応のｐ−トルエンスルホニルクロリドをろ過で取り除き、ろ液を塩酸水溶液で中和した。その後一晩放置し、成長した結晶を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより目的化合物である６−トシル−β−シクロデキストリンを得た（収量：８３０ｍｇ，収率：３６．８％）。
1H-NMR（300.40MHz，DMSO-d6）：δ=7.76（d，2H，phenyl），7.43（d，2H，phenyl），5.89-5.57（m，14H，OH），4.91-4.73（m，7H，CD），4.52-4.31（m，7H，CD），3.77（m，42H，CD），2.43（s，3H，Methyl）
MALDI-TOF-MS  m/z=1311［M＋Na+］
【００７６】
（２−２）  アジド化
上記（２−１）で得た６−トシル−β−シクロデキストリン（８３０ｍｇ，０．６４４ｍｍｏｌ）を８０℃の水に懸濁し、アジ化ナトリウム（４５５ｍｇ，７ｍｍｏｌ）を加え、８０℃のオイルバス中で一晩反応させた。反応終了後、室温までゆっくり冷却した後、この溶液をアセトン（６０ｍＬ）に注ぎ込み、生じた白色沈殿を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより、目的化合物である６−アジド−β−シクロデキストリンを得た（収量：５４８ｍｇ，収率：７３．４％）。
1H-NMR（300.40MHz，DMSO-d6）：δ=5.74-5.63（m，14H，OH），4.82（m，7H，CD），4.52-4.46（m，6H，CD），3.62-3.57（m，42H，CD）
MALDI-TOF-MS  m/z=1182［M＋Na+］
【００７７】
（２−３）  アミノ化
上記（２−２）で得た６−アジド−β−シクロデキストリン（５４８ｍｇ，０．４７２ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（２６２ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦに溶解させ、室温で１時間撹拌後、反応液に超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水，１ｍＬ）を添加し、９０℃のオイルバス中で一晩反応させた。薄層クロマトグラフィー（展開液  −  １−ブタノール：メタノール：水＝５：４：３にて目的物のスポット（Ｒｆ値＝０．０７５）が確認され、原料化合物のスポット（Ｒｆ値＝０．５５）の消失が確認されたことから、反応を終了した。室温までゆっくり冷却した後、この溶液をアセトン（６０ｍＬ）に注ぎ込み、生じた白色沈殿を減圧ろ過により回収し、真空乾燥させることにより、目的化合物である６−アミノ−β−シクロデキストリンを得た（収量：４３０ｍｇ，収率：８０．４％）。
1H-NMR（300.40MHz，DMSO-d6）：δ=5.76-5.65（m，14H，OH），4.82（m，7H，CD），4.46（b，6H，CD），3.63-3.55（m，28H，CD）
MALDI-TOF-MS  m/z=1156［M＋Na+］
【００７８】
（３）  モレキュラーインプリンティングポリマー（ＭＩＰ）の製造
（３−１）  複合自己組織化単分子膜（複合ＳＡＭ膜）の形成
金／ガラス基板（日本分光社製）を水とエタノールで十分に洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。乾燥した金表面をＡｒエッチング処理した後、０．５ｍＭビス［２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）ウンデシル］ジスルフィド＋０．５ｍＭ  １１−アミノ−１−ウンデカンチオール塩酸塩を含むエタノール溶液（５ｍＬ）に、２５℃で２４時間浸漬した。なお、２−ブロモイソブチリル基は、重合開始作用を示す。
【００７９】
（３−２）  複合ＳＡＭ膜の活性化
上記金／ガラス基板を、さらに５ｍＭ  ＮＨＳ−ｄＰＥＧ4−ＮＨＳエステルを含むＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に、２５℃で１時間浸漬することにより、上記複合ＳＡＭ膜の末端アミノ基に、ＰＥＧ鎖を介してＮＨＳ活性化カルボキシ基を導入した。
【００８０】
（３−３）  β−シクロデキストリンの固定化
上記（２）で調製したモノアミノ−β−シクロデキストリン（２０．４ｍｇ，１８μｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、３ｍＭ溶液を調製した。次いで、ＮＨＳ活性化カルボキシ基が導入された上記金／ガラス基板を当該溶液に２５℃で３時間浸漬することにより、β−シクロデキストリンを固定化した。
【００８１】
（３−４）  ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物の固定化
上記（１）で調製したｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物（３．５ｍｇ，５μｍｏｌ）を少量のＤＭＳＯに溶解した後、水（５ｍＬ）を加えて１ｍＭ溶液を調製した。β−シクロデキストリンを固定化した上記金／ガラス基板を当該溶液に２５℃で２４時間浸漬することにより、ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物を固定化した。
【００８２】
（３−５）  重合反応
反応容器中に、水（５ｍＬ）、ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物が固定化された上記金／ガラス基板、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ，８８．６ｍｇ，３００μｍｏｌ）、臭化銅（ＩＩ）（１．３４ｍｇ，６μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ，１．２５μＬ，６μｍｏｌ）を加え、反応容器中の気相を窒素ガスで置換した。次いで、アスコルビン酸（０．５２ｍｇ，３μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解した０．５ｍＭ溶液を反応容器中に注入し、２５℃で３０分間重合反応を行った。
【００８３】
（３−６）  ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物の除去
重合反応後、上記金／ガラス基板を分離し、水で洗浄した。次いで、残留している銅イオン（ＩＩ）を除去するため、１Ｍ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液に、２５℃で１２時間浸漬した。
【００８４】
次に、オキシム基を加水分解することによりｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物を除去するため、上記金／ガラス基板を１００ｍＭ塩酸に４０℃で２４時間浸漬し、次いで、純水およびエタノールで十分に洗浄することにより、コルチゾールの特異的認識空間を有するＭＰＣ薄膜が形成された金／ガラス基板を得た。
【００８５】
比較例１：  β−シクロデキストリンのみが固定化された基板の作製
上記実施例１（３−４）〜（３−６）の「ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物の固定化」と「ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物の除去」を行わない以外は上記実施例１を同様にして、β−シクロデキストリンのみが固定化された高分子薄膜が形成された金／ガラス基板を作製した。
【００８６】
比較例２：  オキシム結合部位のみを有する基板の作製
（１）  自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）の形成
金／ガラス基板（日本分光社製）を水とエタノールで十分に洗浄した後、窒素ガスを吹き付けて乾燥した。乾燥した金表面をＡｒエッチング処理した。別途、ビス［２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）ウンデシル］ジスルフィド（１．８μＬ，３μｍｏｌ）をエタノール（６ｍＬ）に溶解し、０．５ｍＭ溶液を調製した。上記金／ガラス基板を当該溶液に２５℃で２４時間浸漬した。
【００８７】
（２）  重合反応
反応容器中に、水（３．００ｍＬ）、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）、上記（１）で得た金／ガラス基板、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ，６６．５ｍｇ，２２５μｍｏｌ）、上記実施例１（１）で得たｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物（３．１５ｍｇ，４．５μｍｏｌ）、臭化銅（ＩＩ）（１．００ｍｇ，４．５μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ，０．９４μＬ，４．５μｍｏｌ）を加え、反応容器中の気相を窒素ガスで置換した。次いで、アスコルビン酸（０．３９ｍｇ，２．２５μｍｏｌ）を水（０．５ｍＬ）に溶解した０．５ｍＭ溶液を反応容器中に注入し、２５℃で３０分間重合反応を行った。
【００８８】
（３）  ｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物の除去
重合反応後、上記金／ガラス基板を分離し、水で洗浄した。次いで、残留している銅イオン（ＩＩ）を除去するため、１Ｍ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ水溶液に、２５℃で１２時間浸漬した。
【００８９】
次に、オキシム基を加水分解することによりｔｅｍｐｌｅｔｅ化合物を除去するため、上記金／ガラス基板を１００ｍＭ塩酸に４０℃で２４時間浸漬することにより、コルチゾールの特異的認識空間を有するＭＰＣ薄膜が形成された金／ガラス基板を得た。但し、実施例１とは異なりβ−シクロデキストリンを固定化していないため、特異的認識空間の方向はランダムである。
【００９０】
実施例２：  蛍光測定によるコルチゾールの検出
フルオレセインイソチオシアネート−ビスフェノールＡ（ＦＩＴＣ−ＢＰＡ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、１００ｎＭ  ＦＩＴＣ−ＢＰＡ溶液を調製した。当該溶液に、コルチゾールに対するＭＩＰ膜が形成された金／ガラス基板（実施例１）を２５℃で１時間浸漬した後、コルチゾールを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した溶液を加えていき、上澄み液の蛍光を測定した。この際、コルチゾールとビスフェノールＡは立体コンフォメーションが似ているので、ビスフェノールＡはコルチゾールに対するＭＩＰ膜に捕捉される一方で、ＭＩＰ膜に対する親和性がより高いコルチゾールの添加により置換されて溶液中に漏出する。なお、蛍光測定における励起波長は４９５ｎｍとし、測定蛍光波長は５１５ｎｍとした。相対蛍光強度変化量［（Ｉ−Ｉ0）／Ｉ0］と、ＭＩＰ金／ガラス基板が浸漬されている溶液に添加したコルチゾール濃度との関係を図２に示す。また、測定結果をグラフ作成ソフト（日本ポラデジタル「ＤｅｌｔａＧｒａｐｈ」）で処理し、ＭＩＰ金／ガラス基板とコルチゾールとの結合定数Ｋを算出した。結果を表１に示す。
【００９１】
また、比較のために、β−シクロデキストリンのみが固定化されたＭＩＰ金／ガラス基板（比較例１）とオキシム結合部位のみを有するＭＩＰ金／ガラス基板（比較例２）を用い、同様に測定を行った。結果を図２と表１に示す。
【００９２】
【表１】
0006505490.tif 000006
【００９３】
図２と表１に示す結果のとおり、β−シクロデキストリンとオキシム結合部位の両方を有するコルチゾール特異的認識空間を有するＭＩＰ膜は、これら何れか一方のみを有するＭＩＰ膜に比べて、コルチゾールに対する選択的親和性が高いことが実証された。
【００９４】
実施例３：  コルチゾールに対する選択性試験
上記実施例２において、コルチゾールに加え、構造が類似する１７−β−エストラジオール、コレステロール、テストステロンおよびプロゲステロンを用いた以外は同様にして、本発明に係るＭＩＰ膜の親和性を測定した。各化合物の構造を以下に示し、測定結果を図３に示す。なお、図３中、コルチゾールの測定結果を「◆」で示し、その他の化合物の測定結果を「■」で示す。
【００９５】
【化５】
0006505490.tif 000007
【００９６】
図３に示す結果のとおり、本発明に係るＭＩＰ膜は、コルチゾールと構造が非常に似ているその他のステロイド化合物に比べても、コルチゾールに対する選択的な親和性を有することが明らかとなった。
【００９７】
実施例４：  架橋ＭＩＰ膜の作製と選択的親和性試験
上記実施例１（３−５）において、水（６ｍＬ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ，７０．９ｍｇ，２４０μｍｏｌ）、架橋剤であるＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ，９．２５ｍｇ，６０μｍｏｌ）、臭化銅（Ｉ）（１．３４ｍｇ，６μｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ，１．２５μＬ，６μｍｏｌ）およびアスコルビン酸（０．５２ｍｇ，３μｍｏｌ）を用いた以外は上記実施例１と同様にして、金／ガラス基板上に架橋ＭＩＰ膜を形成した。
【００９８】
得られた架橋ＭＩＰ膜と上記実施例１で得た未架橋ＭＩＰ膜を用い、上記実施例２と同様の条件で、コルチゾールに対する選択的親和性を試験した。結果を図４に示す。また、得られた測定結果より当該架橋ＭＩＰ膜のコルチゾールに対する結合定数Ｋを算出したところ、結合定数Ｋは２．３０×１０11Ｍ-1であった。これらの結果より、架橋ＭＩＰ膜は未架橋ＭＩＰ膜に比べると、相対蛍光強度変化量は小さくなったが、コルチゾールに対する結合定数は大きくなったことが読み取れる。よって、架橋により、コルチゾールに対する特異的な認識空間がより堅固に構築されることにより結合定数が大きくなり、また、非特異的な吸着サイトが減少したために相対蛍光強度変化量が小さくなったと考えられる。
【００９９】
さらに、コルチゾールに加えて１７−β−エストラジオール、コレステロール、テストステロンおよびプロゲステロンを用いて、相対蛍光強度変化量を測定した。結果を図５に示す。なお、図５中、コルチゾールの測定結果を「◆」で示し、その他の化合物の測定結果を「■」で示す。
【０１００】
図５に示す結果のとおり、架橋ＭＩＰ膜を用いた場合、未架橋ＭＩＰ膜を用いた場合に比べ、コルチゾールとその他のステロイド化合物のとの相対蛍光強度変化量の差はより大きくなっており、架橋ＭＩＰ膜のコルチゾールに対する選択的親和性はより一層高いといえる。
【図１】
0006505490.tif 000010
【図２】
0006505490.tif 000011
【図３】
0006505490.tif 000012
【図４】
0006505490.tif 000013
【図５】
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