(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、バイオマス原料を製造するための方法：
（ｉ）ＤＹＲＫＰ−１タンパク質の発現および／または活性が損なわれている緑微細藻類細胞を培養するステップ；および
（ｉｉ）窒素、硫黄およびリンからなる群から選択される少なくとも１つの元素を欠損した培地（欠乏培地）において前記微細藻類細胞を光合成独立栄養条件でインキュベートすることによって、前記微細藻類による貯蔵化合物の蓄積および／またはバイオマス生産の増加を誘導するステップ。
【請求項２】
前記微細藻類は、機能的ＤＹＲＫＰ−１遺伝子を欠損する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微細藻類は、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微細藻類は、緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉ）は、微細藻類細胞を照射することを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記照射は、１日当たり８〜２４時間の間、２５と２０００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の間に含まれる強度で実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
欠乏培地中で微細藻類細胞をインキュベートするステップは、少なくとも２４時間続く、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
欠乏培地中で、微細藻類細胞をインキュベートするステップは、２〜８日、好ましくは３〜６日続く、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）において、該細胞は、欠乏培地中で、光合成独立栄養条件において、少なくとも１５時間の間、インキュベートされる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
油を製造するための、請求項９に記載の方法の使用。
【請求項１１】
でんぷんおよび／またはバイオマスを製造するための、請求項９に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑微細藻類の分野、およびバイオテクノロジーにおけるそれらの使用に関する。より具体的には、本発明は、ストレス条件下で、大量の中性脂質（トリアシルグリセリド：ＴＡＧ、すなわち油）および／または大量のでんぷんを製造するための、機能的ＤＹＲＫＰ−１タンパク質を欠損するクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）の使用を記載する。
【０００２】
それらの高いバイオマス生産性、およびでんぷん（バイオエタノールに変換できる）または油（バイオディーゼルに変換できる）を細胞内で多量に蓄積するそれらの能力により、微細藻類は、次世代バイオ燃料の生産のための有望な原料を提示する（Ｈｕら, ２００８年； ＷｉｊｆｆｅｌｓおよびＢａｒｂｏｓａ, ２０１０年）。しかしながら、それらの生産性は、持続可能なバイオ燃料生産に到達するために、増加する必要がある（Ｄｅｌｒｕｅら、２０１３年）。
【０００３】
微細藻類、より一般的には、光合成生物は、光、温度および栄養利用の定常的に変動する条件下で、増殖および生存を最適化する高度な戦略を開発した。微細藻類において、不可欠な主要栄養素の欠乏は、増殖に強い影響を与え、細胞代謝の急激な変化を誘導する。窒素または硫黄欠乏に対する一般的な応答は、本質的に、タンパク質合成の減少、細胞分裂の停止、でんぷんおよびトリアシルグリセロールなどの高エネルギー貯蔵化合物の大量の蓄積（Ｂａｌｌら, １９９０年; Ｍｅｒｃｈａｎｔら, ２０１２年）、および光合成ダウンレギュレーション（Ｇｒｏｓｓｍａｎ, ２０００年; ＰｅｌｔｉｅｒおよびＳｃｈｍｉｄｔ, １９９１年）である。貯蔵化合物の蓄積をもたらすこの栄養枯渇の要求は、それが、バイオマス生産性を損なうので、バイオテクノロジー目的のための微細藻類の主要な生物学的制限の１つである（Ｈｕら, ２００８年）。新しい原料としての微細藻類に対するかなりの関心にもかかわらず（Ｌａｒｋｕｍら、２０１２年）、栄養およびエネルギー状態との関係で、光合成エネルギー変換および貯蔵のプロセスを制御するシグナル伝達および調節遺伝子および経路についてほとんど知られていない。
【０００４】
したがって、栄養およびエネルギー状態に応じて、増殖、光合成および貯蔵蓄積を制御する調節機構を解読することは、バイオテクノロジー用途のための微細藻類の生産性の最適化に向けた重要な問題である。
【０００５】
栄養利用性に応じて、貯蔵の動力学に関与する調節機構を解明する目的で、本発明者らは、緑藻クラミドモナス（コナミドリムシ）（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の１つの変異体を特徴付け、でんぷん分解の欠陥をスクリーニングし、（でんぷん分解ｓｔａｒｃｈ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎに対して）ｓｔｄ１と呼んだ。ｓｔｄ１変異体は、ＤＹＲＫ（二重特異性チロシンンリン酸調節キナーゼ）ファミリーの遺伝子での挿入を提供し、ＤＫＲＫ２（クラミドモナスのゲノムのバージョン４．０）として当初は注釈を付けられたが、本明細書ではＤＹＲＫＰ−１と改名した。クラミドモナスｓｔｄ１変異体は、これまでに報告された緑藻系統の最初のｄｙｒｋ変異体であり、光合成独立栄養条件で栄養欠乏に応答してその野生型前駆体に比べてはるかに多くでんぷんおよび油を蓄積し、混合栄養条件でも栄養欠乏に応答してその野生型前駆体よりもより多く油を蓄積する。よって、本発明は、微細藻類からのでんぷんおよび／または脂質の最適生産のためにそれらの増殖を最適化するように微細藻類細胞を培養するための方法を提供する。本発明の方法は、微細藻類細胞内で、培養条件に依存して、でんぷんおよび／または油の蓄積を誘導し、増進する。開示される本発明の方法は、でんぷんおよび／または油に富む微細藻類の大規模生産に適する。
【０００６】
したがって、本発明の第１の側面は、
（ｉ）ＤＹＲＫＰ−１タンパク質の発現および／または活性が変更されている緑微細藻類細胞を培養するステップ；および
（ｉｉ）前記微細藻類による貯蔵蓄積および／またはバイオマス生産の増加を誘導するステップ
を含む、バイオマス原料を製造するための方法である。
【０００７】
本明細書中で定義される場合、「ＤＹＲＫＰ−１タンパク質」は、微細藻類によって発現されるＤＹＲＫタンパク質であり、これは、次の配列を有するＤＨ−ボックスを有する：Ｈ（Ｒ／Ｋ）ＴＧＦＥＥＸＫ（Ｄ／Ｅ／Ｎ）（Ｆ／Ｌ）（配列番号３）。緑藻クラミドモナスのＤＹＲＫＰ−１タンパク質のアミノ酸配列およびコード配列（５'−および３’−ＵＴＲを含むｃＤＮＡ配列）は、本明細書中で開示される（それぞれ、配列番号１および２）。これらの配列から、当業者は、配列番号１のタンパク質に相同するタンパク質を微細藻類において同定することによって、緑藻クラミドモナスと異なる任意の緑微細藻類でのＤＹＲＫＰ−１の配列を完全に同定することができる。本明細書において、タンパク質は、両方のタンパク質が共通の祖先を共有する場合、非常に近い一次配列（ＢＬＡＳＴによって測定される場合、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９％同一性）および二次および三次構造によって示されるとき、緑藻クラミドモナスからのＤＹＲＫＰ−１のホモログであると考えられる。
【０００８】
本明細書において、「変更される(ａｌｔｅｒｅｄ)または「損なわれる（ｉｍｐａｉｒｅｄ)」は、ＤＹＲＫＰ−１タンパク質の発現および／または活性が変更され、そのタンパク質の活性が減少することを意味する。例えば、ＤＹＲＫＰ−１遺伝子は、サイレンシングされ、ノックダウンされ、突然変異され、および／または分断されることができ、その結果、微細藻類は、機能的ＤＹＲＫＰ−１タンパク質を欠損する。ＤＹＲＫ−Ｐタンパク質の活性はまた、特異的阻害剤として働く化合物によって阻害され得る。
【０００９】
以下の実験の部で開示されるように、本発明に係る方法は、クラミドモナス、特に緑藻クラミドモナスを用いて行うことができる。
【００１０】
ステップ（ｉ）において、細胞は、当業者に知られる任意の通常のプロトコルに従って培養される。例えば、それらは、２％ＣＯ２で供給されるＭＯＰＳ緩衝最小培地（ＭＭ）中で光合成独立栄養的に２〜５×１０６細胞／ｍｌの密度に増殖されることができる。
【００１１】
この側面の特定の態様において、前記貯蔵の蓄積を誘導することは、欠乏培地、すなわち、十分な量で緑微細藻類の最適な増殖に必要な栄養の全てを含んではいない培地において、微細藻類細胞をインキュベートすることを含む。そのような欠乏培地の例としては、微細藻類によって代謝されることができる形態で、窒素、硫黄およびリンからなる群から選択される少なくとも１つの元素が欠乏している培地が挙げられる。もちろん、語句「欠乏する」は、絶対的な意味（すなわち、ゼロに等しい濃度で）で解釈されるのではなく、培地での前記栄養の濃度が、微細藻類培地のために使用される古典的な培地での前記栄養の濃度をはるかに下回る（少なくとも１０倍以下）ことを意味する。
【００１２】
ステップ（ｉ）およびステップ（ｉｉ）の間で、細胞を採取し、欠乏培地中に移すことができる。代替的に、典型的には、連続培養装置において、培地での欠乏は、少なくとも１つの栄養の外因性添加の不存在下で、細胞代謝によって作られる。例えば、実験部分および図９Ａで示されるように、（一定のレベルで細胞バイオマスを維持するための）タービドスタットとして操作される光バイオリアクターへの最低限Ｎを含まない培地の添加は、培地のアンモニア含量の減少をもたらし、２日未満に完全に使い尽くされた。
【００１３】
特定の態様において、貯蔵蓄積を誘導するステップは、光合成が生じるのを可能にする光で、微細藻類を照射することを含む。
例えば、この照射は、１日当たり８〜２４時間の間、例えば、２５と２０００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の間に含まれる、少なくとも２５μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１、または少なくとも１００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の強度で実施することができる。当業者は、光強度の効果は、実際には、微細藻類によって実際に受信される強度に依存し、したがって、細胞密度および光バイオリアクターの形状等のようないくつかのパラメーターに依存し、特定の遭遇する条件に照射強度を適合させ得ることをよく知っている。
【００１４】
注目すべきは、本発明者らは、栄養欠乏が、ＤＹＲＫＰ−１活性を欠く微細藻類によっては、通常、野生型微細藻類の場合で生じるような、光合成の急速な停止につながらないことを示している。細胞は、油および／またはでんぷんに富むだけでなく、加えて、全体的なバイオマスが、欠乏状態の数日の間、増加するので、これは、特に有利であり、著しく全体的に増加した脂質およびでんぷんの生産性につながる。
【００１５】
したがって、本発明の有利な態様において、欠乏培地での微細藻類細胞をインキュベートするステップは、少なくとも２４時間、例えば、２〜８日、好ましくは、３〜６日続く。もちろん、欠乏培地での細胞増殖は、実験条件、特に、細胞密度に強く依存し、よって、当業者は、欠乏培地でのインキュベーションの持続時間を、使用される特定の条件下、貯蔵蓄積および／またはバイオマス増加が最適となるように適合させるであろう。
【００１６】
本発明の特定の態様によると、ステップ（ｉｉ）は、例えば、酢酸塩などの有機炭素を含む培地中で微細藻類細胞をインキュベートすることを含む。以下の実施例で説明されるように、そのような混合栄養条件の非限定的な例によると、細胞は、ステップ（ｉｉ）において、少なくとも５０μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の連続照射下で、酢酸塩を含む窒素欠乏培地中で２〜６日間、インキュベートされる。本発明者らは、混合栄養条件において、ＤＹＲＫＰ−１活性を欠く微細藻類は、野生型細胞と比較して増加した脂質蓄積によって栄養枯渇に応答することを示している。したがって、本発明の方法の特定の態様は、油を生産するために、例えば、バイオディーゼル生産のために、有利に使用される。
【００１７】
別の態様によると、誘導ステップ（ｉｉ）は、前に定義されるような欠乏培地においておよび光合成独立栄養条件において、すなわち、放射エネルギーを生物学的に有用なエネルギーに変更し、炭素源として二酸化炭素、重炭酸塩または炭酸塩のみを使用して代謝化合物を合成するような条件で、微細藻類細胞をインキュベートすることを含む。典型的には、微細藻類細胞は、それらが代謝することができる有機炭素を本質的に欠く培地で照明の下でインキュベートされる。先行する記載において、「有機炭素を本質的に欠く」は、微細藻類によって代謝されることができる有機炭素が培地中に追加されていないことを意味する。この態様の好ましいバージョンによると、細胞は、少なくとも１５時間、好ましくは、少なくとも１、２または３日、そして６日までまたはそれ以上の日数までの間、栄養欠乏培地において、例えば、微細藻類によって代謝されることができる有機炭素を本質的に欠く窒素欠乏培地において、ステップ（ｉｉ）でインキュベートされる。本発明者らは、光合成独立栄養条件において、ＤＹＲＫＰ−１活性を欠く微細藻類が、栄養欠乏に応答して野生型前駆体に比べてでんぷんおよび油をはるかに多く蓄積することを示している。したがって、本発明の方法のこの特定の態様は、でんぷんを産生するために、例えばバイオエタノール産生のために、並びに油の産生のために、例えば、バイオディーゼル生産に対する有利に使用される。この態様は、光合成独立栄養条件下で、細胞が光合成によって完全に炭素に対する必要性を供給することができるので、特に興味深く、これは、増殖のための追加の供給炭素源を必要とする細胞（酵母または大腸菌など）と比較して、大きな利点である。
【００１８】
微細藻類は、多価不飽和脂肪（オメガ−３およびオメガ−６）、並びにカロテノイドなどの複雑な分子を自然に生成し、これらの高価値産物はまた、本明細書中で記載される方法にしたがって生産されることができることに留意されたい。したがって、この発明はまた、化粧品および／または医薬品産業、並びに補助食品のための脂肪酸、多価不飽和脂肪、カロテノイドおよび他の化合物を製造するための方法であって、上記で記載されるような方法を実施することによって、微細藻類ででんぷんおよび／またはトリアシルグリセロールを蓄積するステップを含む、方法に関連する。
【００１９】
本発明の方法は、微細藻類において、でんぷんおよび／またはトリアシルグリセロール蓄積を誘発した後、１つ以上の抽出ステップを含み得る。抽出ステップは、当業者に周知の溶媒または別の抽出方法を使用して、実施され得る。
本発明は、後続のさらなる記載からより明らかに理解され、これは、添付図面と同様に、栄養欠乏に対するＤＹＲＫＰ−１活性を欠く微細藻類の応答を説明する実施例を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１：ＤＹＲＫＰ−１遺伝子に影響を受けたクラミドモナスｓｔｄ１変異体の単離および分子特性。  （Ａ）ｓｔｄ１変異体のでんぷん分解表現型。藻類コロニーは、５日間のＮまたはＳ枯渇ＴＡＰ寒天上に紙フィルター上にスポットされ、でんぷん蓄積に導き、次に、でんぷん分解を誘導するために、２日間、最小培地（ＭＭ）上に暗くして置いた。でんぷん蓄積は、ヨウ素蒸気への暴露によって視覚化された。  （Ｂ）クラミドモナスＤＹＲＫＰ−１遺伝子モデルは、１４個のエクソン（黒四角）および１３個のイントロン（黒線）で構成される。エクソン−イントロンの境界およびその５’開始についての配列情報は、３つの重複するＲＴ−ＰＣＲから得られた。第３のＤＹＲＫＰ−１エクソンにおいて、パロモマイシン耐性カセット（ＡｐｈＶＩＩＩ遺伝子、白い四角）の挿入は、ゲノムウォーキングＰＣＲによって決定された。  （Ｃ）ＤＹＲＫＰ−１遺伝子発現は、ＴＰＡで増殖される野生型、ｓｔｄ１および２つの相補株（ｓｔｄ１：ＳＴＤ１ １および２）において、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。アクチンは、コントロール遺伝子として使用された。  （Ｄ）ＤＹＲＫＰ−１タンパク質発現は、８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離された光合成独立栄養的に増殖した細胞からの可溶性タンパク質溶解物での免疫検出によって分析した。  （Ｅ）Ｎ欠乏に応答するＤＹＲＫＰ−１転写産物の蓄積。野生型、ｓｔｄ１変異体および相補株ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １および２は、独立栄養条件下で、３日間、窒素飢餓であった。ＲＮＡは、ＤＹＲＫＰ−１断片をコードするプローブ；ローディングコントロールとして供給されたＣＢＬＰ２遺伝子とハイブリダイズされた。
【００２１】
【図２】図２：サザンブロット分析および変異体相補性。  （Ａ）野生型株１３７ＡＨおよびｓｔｄ１変異体株のサザンブロット分析。ＮｏｔＩ−、ＸｍａＩまたはＳｔｕＩ/ＳａｃＩ制限ゲノムＤＮＡは、サザンブロットされたアガロースゲル上にロードされ、ＡｐｈＶＩＩＩ遺伝子に対するプローブ（パロマイシン耐性カセット）とハイブリダイズされた。レーンごとのＤＮＡのロードされた量は、μｇで示される。  （Ｂ）ハイグロマイシン耐性マーカーとのｓｔｄ１相補性のためのプラスミドの構築。ＳＴＤ１をコードするゲノム野生型ＤＮＡは、ＰＣＲにより増幅され、ｐＳＬ１８から明らかになったｐＳＬ−Ｈｙｇベクター中にクローニングした。  （Ｃ）異なる欠乏条件における野生型株（１３７ＡＨ、黒色）、ｓｔｄ１変異株（白色）および２つの相補株（ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １および２、灰色）のでんぷんレベル。培養物は、ＴＡＰ培地（Ｃｏｎ．＝コントロール）で増殖され、２日間、窒素（ＴＡＰ−Ｎ）または硫酸（ＴＡＰ−Ｓ）飢餓に供し、これは、でんぷん蓄積（Ａｃｃ）を誘発した。続いて、飢餓の培養物を、遠心分離し、最小培地（ＭＭ）に再懸濁し、暗所で８または２４時間維持した。暗所で、ＭＭ（Ｎを含むがＣは含まない）中、でんぷんは、異化されるだろう（Ｄｅｇｒ）。でんぷん値は、少なくとも３回の生物学的複製の平均±ＳＤである。
【００２２】
【図３】図３：緑系統を含むＤＹＲＫタンパク質ファミリーの系統樹。  （Ａ）ＤＹＲＫタンパク質ファミリーの系統樹。ＪＧＩ、ＰｈｙｔｏｚｏｍｅまたはＮＣＢＩデータベースから検索した藻類、真菌および植物からの相同アミノ酸配列は、系統発生解析を実施することによって比較された。配列は、ＭＡＦＦＴバージョン６プログラムでアラインされた。系統樹は、近隣結合法を用いて得られた。以下の略語が使用された：Ａｓｐ：アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ｄ：キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、Ｄｄ：キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、ＣｈｌＮＣ：クロレラ種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ.）ＮＣ６４Ａ、Ｃｒｅ：緑藻クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、Ｍｉｃｐｕ：Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ ｐｕｓｉｌｌａ（ＣＣＭＰ１５４５／ｓｐ. ＲＣＣ２９９）、Ｏｓ：オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、Ｏｓｔ：Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ（ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ／ｔａｕｒｉ）、Ｐｈｙｐａ：Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ、Ｖａｃ：Ｖｏｌｖｏｘ ｃａｒｔｅｒｉ、Ｖｉｖ：ビニフェラ種（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（トウモロコシ配列は、コメホモログと組み合わせられ、ブラックコットンウット（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）はワインと組み合わせられた）。系統樹を構築するために使用されるＤＹＲＫ配列受託番号およびマルチアラインメントを表１に示す。  （Ｂ）図３Ａによる６つのＤＹＲＫサブグループのＤＹＲＫ相同性（ＤＨ）ボックスのコンセンサス配列；ＤＹＲＫＰサブグループにおいて、３つのマイナーなサブグループは、以下の７つのクラスを与えて区別された：ＤＹＲＫ１（７配列）、ＤＹＲＫ２（２２配列）、ＹＡＫ１（２１配列）、ＤＹＲＫＰ−Ａ（コケを含む１２の高等植物配列）、ＤＹＲＫＰ−Ｂ（１１の高等植物配列）、ＤＹＲＫＰ藻類（７配列）、および公開ＤＨコンセンサス配列（ＢｅｃｋｅｒおよびＪｏｏｓｔ, １９９９年から）、ここでは、ＤＹＲＫグループから９配列が比較された。
【００２３】
【表１】
0006605500.tif 000002
【００２４】
【表２】
0006605500.tif 000003
【００２５】
【表３】
0006605500.tif 000004
【００２６】
表１：図２において、系統樹に使用される配列に対する寄託番号
灰色の配列は、アラインメントのために利用されなかった。明らかに不完全な遺伝子モデルが示される。アミノ酸の予測された番号が２つの比較ゲノムデータベースで異なった場合、通常、より長いバージョンが選択された。いくつかの遺伝子は、遺伝子座で３つの転写産物をかくまう異なるスプライス変異体、例えば、「ＺｍＤＹＲＫＰ３」を有する。ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）の場合、全ての既存のＤＹＲＫ遺伝子は、アラインメントのために提供されなかった。
【００２７】
【図４】図４：窒素欠乏に応答した、ｓｔｄ１変異体での炭素貯蔵および光合成活動。細胞は、１００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の連続照射の下で、ＴＡＰまたは空気中２％ＣＯ２で最小培地で増殖された。０日目に、細胞は、ＴＡＰ−Ｎ（左のパネルＡ〜Ｃ）またはＭＭ−Ｎ（右のパネルＡ〜Ｃ）で遠心分離、洗浄および再懸濁された。測定は、野生型（ＷＴ）、ｓｔｄ１変異体において、および２つの相補株ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １およびｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ ２において実施された（Ａ〜Ｃ）。  （Ａ）細胞内でんぷん蓄積。ＴＡＰ−Ｎに対する４つの実験の平均（６日に対して３つ）の平均±ＳＤおよびＭＭ−Ｎに対する６つの実験（１０日に対して３つ）の平均±ＳＤが示される。  （Ｂ）中性脂質（ＴＡＧ）の細胞内蓄積。全細胞脂質を抽出する際に、ＴＡＧは、薄層クロマトグラフィーによって分離され、定量化された。３つの生物学的複製物のうちの１つの代表的な実験が、各条件（ＴＡＰ−ＮまたはＭＭ−Ｎ）に対して示される。ＴＡＧ値は、３つの技術的複製物の平均±ＳＤである。  （Ｃ）光合成電子伝達速度（ＥＴＲ）は、Ｎ欠乏の最初の３日の間、クロロフィル蛍光測定から決定された。プロットされた値は、約１００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の化学線照射下で、４つ（ＴＡＰ−Ｎ）または６つ（ＭＭ−Ｎ）の測定値の平均±ＳＤである。  （Ｄ）目的のタンパク質の免疫検出。全細胞タンパク質抽出物は、光合成独立栄養条件（ＭＭ−Ｎ）での窒素飢餓の１、２または６日後の免疫検出によって分析された。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ローディングコントロールに対してクマシーブルーによって染色し（図７Ｃ）、または示されたタンパク質を検出するために免疫ブロットした。
【００２８】
【図５】Ｎ欠乏またはＳ欠乏に付された光合成独立栄養的に増殖した培養での細胞内でんぷん蓄積および光合成活性。  ０日目、野生型（ＷＴ）、変異体（ｓｔｄ１）および２つの相補（ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １および２）株の光合成独立栄養的に増殖した培養物（ＭＭ、空気中で２％ＣＯ２）は、空気中で２％ＣＯ２の存在下、ＭＭ−ＮまたはＭＭ−Ｓ中で、遠心分離、洗浄および再懸濁された。異なる時点で、細胞ペレット、総細胞体積および乾燥重量バイオマスが分析された。  ３０〜４０μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の低光強度で、（Ａ）独立栄養Ｎ欠乏および（Ｂ）独立栄養Ｓ欠乏でのでんぷんダイナミクス。でんぷん値は、５つの生物学的複製物の平均±ＳＤ、および野生型ＣＣ１２５（ｍｔ＋ｎｉｔ１ ｎｉｔ２）とのｓｔｄ１（ｍｔ−ｎｉｔ１ ｎｉｔ２）の戻し交配から得られるｓｔｄ１子孫株１Ａおよび２Ａに対する３つの実験の平均であり、両方は、タイプ「１３７ｃ」株である。４つの実験は、３０〜４０μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の低光強度で、ＭＭ−Ｎ／ＣＯ２中で実施された。  （Ｃ）独立栄養条件下において約３５μＥｍ−２ｓ−１でＮ欠乏の３日間、野生型、ｓｔｄ１変異体および相補細胞、または（Ｄ）１００μＥｍ−２ｓ−１でＳ欠乏の光合成効率。プロットされた値は、約１００μＥｍ−２ｓ−１の照射で、５回の測定の平均±ＳＤである。
【００２９】
【図６】Ｎ欠乏光合成独立栄養条件の間のｓｔｄ１変異体のバイオマス生産性。  実験装置は、図５と同じであったが、ＭＭ−Ｎ培地のみを使用した。  （Ａ）細胞は、１ｍＬ培養物から採取され、遠心分離され、ペレットを撮影した。  （Ｂ）総細胞体積は、ｍＬごとに決定された。平均±ＳＤ（ｎ＝７）が示される。  （Ｃ）バイオマスは、ろ過、すすぎ、および一晩乾燥によって採取された５つの５ｍＬ培養物から乾燥重量として決定された。細胞内でんぷんの分析は、総バイオマスのでんぷん画分（斜線部）を決定することができた。平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【００３０】
【図７】ｓｔｄ１変異体細胞は、母細胞壁で囲まれた凝集体（ｐａｌｍｅｌｌｏｉｄ）を形成する。  （Ａ）最小培地および２％ＣＯ２で増殖され、次いで０、２または６日間、Ｎ欠乏に供された野生型、ｓｔｄ１変異体および相補（ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １および２）株の明視野および微分干渉画像。矢印は、母細胞壁を示す。スケールバー＝１０μｍ。  （Ｂ）それぞれ、細胞の分布または凝集体直径、および０、２または６日のＭＭ−Ｎ／ＣＯ２条件におけるＷＴ、ｓｔｄ１変異体および救出株ｓｒｄ１：：ＳＴＤ１ １および２のｍｌ当たりの細胞体積の比較。（Ａ）での同様の代表的な実験。  （Ｃ）図４Ｄに免疫検出実験のクマシーブルーロ−ディグコントロールを示す。
【００３１】
【図８】窒素欠乏中のクロロフィル含有量、総細胞体積、および細胞数の変化。細胞は、１００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１の連続照射下で、ＴＡＰまたは空気中２％ＣＯ２の最小培地中で増殖された。０日目に、細胞は、ＴＡＰ−Ｎ（左パネル）またはＭＭ−Ｎ（右パエル）中で遠心分離、洗浄および再懸濁された。測定は、野生型（ＷＴ），ｓｔｄ１変異体中で、および２つの相補株ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １およびｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ ２で実施された。  （Ａ）クロロフィル濃度。ＴＡＰ−Ｎに対する５つの実験およびＭＭ−Ｎに対する７つの実験（１０日に対して３つ）の平均±ＳＤを示す。  （Ｂ）μｍ３ｍＬ−１での総細胞体積。および（Ｃ）ｍＬごとの細胞または粒子濃度は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（登録商標）の３Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ）によって記録された。平均±ＳＤ（ＴＡＰ−Ｎ実験についてはｎ＝６およびＭＭ−Ｎ実験についてはｎ＝７）を示す。
【００３２】
【図９】急激な増殖からＮ欠乏条件への移行中のタービスタットとして操作される１Ｌの光バイオリアクター中で光合成独立栄養的に培養されたｓｔｄ１および野生型のクラミドモナス細胞の増殖能力。細胞密度は、吸収プローブを使用して測定され、新鮮な培地の注入によって一定レベルで維持された。ｓｔｄ１の凝集表現型により、ＯＤ８８０ｎｍは、ＷＴ（ＯＤ８８０ｎｍ＝０．４）およびｓｔｄ１（ＯＤ８８０ｎｍ＝０．３）対する異なる値で調節されて、両方の培養物において、同様のバイオマス濃度（０．１５ｇ乾燥重量。Ｌ−１）に到達した。２％ＣＯ２に富む空気の存在下で、連続照射下（５００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１）、ＭＭの存在下で安定化の４８時間後、希釈培地は、ＭＭ−Ｎによって置換された（ｔ０）。培地でのアンモニウム濃度の測定は、４５時間後、完全な消費を示した。（Ａ）累積的な量の新鮮な培地は、一定のバイオマス濃度で、培養物を維持するために添加した。累積的な量のＷＴおよびｓｔｄ１培養物に対する３つの生物学的複製物からのデータを示す；（Ｂ）バイオマス生産性の測定（乾燥重量ｇｄ−１Ｌ−１）は、膨張率およびバイオマス測定からのｔ０、ｔ４８およびｔ７２で決定された。平均±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【００３３】
【図１０】変異体ｓｔｄ１での酸化ＭＧＤＧの形成。  （Ａ）ＴＬＣプレート上で検出されたｓｔｄ１変異体における酸化ＭＧＤＧ種の過剰蓄積。  （Ｂ）ｓｔｄ１において蓄積する１つの酸化ＭＧＤＧ３４（１６：２  Ｏ２；１８：１）の構造の解明。  注：Ｃ２およびＣ７は、ｓｔｄ１変異体の２つの独立した相補株を表す。
【００３４】
【図１１】ＷＴ、ｓｔｄ１変異体および窒素飢餓に応答する２つの相補株におけるリピドームの完全な分析。
【００３５】
【図１２】変異体およびその種の分布における酸化ＭＧＤＧの過剰蓄積。  （Ａ）ＷＴ、ｓｔｄ１変異体、および２つの相補株において窒素飢餓の日に応答する酸化ＭＧＤＧの総蓄積。  （Ｂ）酸化ＭＧＤＧの分子種の分布。
【００３６】
【図１３】クラミドモナス変異体ｓｔｄ１における推定リポキシゲナーゼ１（ＣｒｅＬＯＸ１）の過剰蓄積。  約１１０ｋＤａの質量を有するより強いバンドの出現を証明するクマシーブルーによって染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの画像。野生型、ｓｔｄ１変異体および２つの独立した相補株（Ｃ２、Ｃ７）は、１００μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１で２％ＣＯ２を供給された最小培地での標準独立栄養条件で対数期へと増殖された。細胞溶解後、可溶性および不溶性のタンパク質は、スクロースクッションを用いる超遠心分離によって、分画された。膜を含むペレット画分からのタンパク質は、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００の添加によって再可溶化され、超遠心分離され、および１０％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離された。クマシーブリリアントブルーで染色した後、強いバンドが、約１１０ｋＤａにｓｔｄ１変異体において検出され、全てのサンプルの対応するゲル領域は、切除され、質量分光分析に供された。
【００３７】
【図１４】ＬＯＸ阻害剤による変異体におけるＴＡＧの阻害およびでんぷんの蓄積。  （Ａ）でんぷんの蓄積  （Ｂ）ＴＡＧ蓄積。
【実施例】
【００３８】
実施例１：緑藻クラミドモナスにおける栄養欠乏中の二重特異性チロシンリン酸調節キナーゼＤＹＲＫＰ−１陰性コントロールでんぷんおよび油蓄積
方法
株および培養条件
Ｃｈｏｃｈｏｉｓら, ２０１０年に記載されるように、株ＣＣ１２５（ｍｔ−ｎｉｔ１ ｎｉｔ２）は、異性体生成のための遺伝的背景として選択され、この研究において野生型株として使用された。変異株ｓｔｄ１は、パロモマイシン耐性カセットＡｐｈＶＩＩＩを有するＫｐｎＩ直線化プラスミドｐＳＬ−Ｘとの形質転換によって生成された。ｓｔｄ１の場合、約４８００ｂｐ−ｐＳＬ−Ｘの約１９００のｂｐ断片のみは、ゲノム中に挿入された。細胞は、約１００μＥｍ−２秒−１連続光の下で、２５℃のインキュベーターシェイカー中、トリス−酢酸―リン酸（ＴＡＰ）培地（Ｈａｒｒｉｓ, ２００９年）において、混合栄養的に増殖された。欠乏実験のために、前培養は、空気中で２〜５×１０６細胞ｍＬ−１の密度に、ＴＡＰ培地において混合栄養的に、またはＭＯＰＳ緩衝最小培地（Ｈａｒｒｉｓ, ２００９年）および空気中２％ＣＯ２で光合成独立栄養的に増殖された。ｔ＝０でサンプルを採取した後、培養物を４分間２５℃および１７８９ｇで遠心分離し、細胞ペレットを１度洗浄し、ＮまたはＳ欠乏培地中で再懸濁した。培養物の理想的に同一の細胞密度は、全ての研究株について比較可能なデータを取得するために重要であることに留意すべきである。ｓｔｄ１のパルメロイド（ｐａｌｍｅｌｌｏｉｄ）形成により、ｍＬあたりの総細胞体積またはクロロフィル含有量が飢餓前に培養物を調整するために比較された。
【００３９】
変異株ｓｔｄ１の遺伝的特性評価および相補性
挿入ＤＮＡの組み込み頻度を確認するために、サザンブロット分析が野生型およびｓｔｄ１変異体細胞を用いて行われた。ゲノムＤＮＡは、前記（Ｔｏｌｌｅｔｅｒら、２０１１年）のように準備され、ＮｏｔＩで制限された４、６または８μｇゲノムＤＮＡは、０．８％アガロースゲル中で分離され、ナイロン膜上にブロットされ、挿入耐性カセットのＡｐｈＶＩＩＩ遺伝子の部分に相補的なジゴキシゲニン標識プローブでハイブリダイズされた。ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏｃｈｅ）は、プライマー５’−ＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＴＴ−３’（配列暗号４）および５’−ＣＧＡＧＡＣＴＧＣＧＡＴＣＧＡＡＣＧＧＡＣＡ−３’（配列番号５）を使用するプローブ標識のために使用された。得られた４００ｂｐ−ＰＣＲ断片とのハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ ＥＡＳＹ Ｈｙｂ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）を使用して５０℃で一晩実施された。基質としての抗ジゴキシゲニンＡＰおよびＣＳＰＤ（Ｒｏｃｈｅ）は、Ｇ：ＢＯＸＣｈｅｍｉｎ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用してシグナルを検出するために使用された。パロモマイシン耐性カセットの組み込みの部位を決定するために、ゲノムウォ−キングは、ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒキットにより実施された。菌株ｓｔｄ１のゲノムＤＮＡは、ＦｓｐＩを用いて消化され、製造業者の指示に適切に処理された。
【００４０】
配列５’−ＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号６）（ＧＰＳ１）および５’−ＴＧＧＴＴＣＧＧＧＣＣＧＧＡＧＴＧＴＴＣＣＧＣＧＧＣＧＴＴ−３’（配列番号７）（ＧＰＳ２）は、挿入ＡｐＨＶＩＩＩカセットのゲノム配列の下流の決定を可能にする遺伝子特異的プライマーとして役立った。アドバンテージＧＣゲノムＬＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）は、増幅反応に用いられた。菌株ｓｔｄ１の相補性のために、ＰＣＲ反応は、プライマー５’−ＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＧＣＴＣＣＧＣＣＴＧＡＡＣＣＧＡＴＧ−３'（配列番号８）（ＸｂａＧ４ｆｏｒＨｙｇ）および５’−ＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧ−３'（配列番号９）（ＸｂａＧ４ＲｅｖＨｙｇ）およびＤｙＮＡｚｙｍｅ（登録商標）ＥＸＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ＦｉｎｎｚｙｍｅｓＯｙ）を使用して、ゲノム野生型ＤＮＡ上で実施された。ＤＹＲＫＰ−１遺伝子をコードする増幅された６９１３ｂｐは、ＸｂａＩで制限され、ＰＳＡＤプロモーターの制御下、ｐＳＬ１８に由来し（Ｄａｕｖｉｌｌｅｅら、２００３年）、ハイグロマイシンに対する耐性カセットを保持する（Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、２００２年）、ＸｂａＩ消化ベクターｐＳＬ−Ｈｙｇ中にクローン化された。ｓｔｄ１細胞はガラスビーズとの撹拌によって、ＫｐｎＩ直線化ｐＳＬ−Ｈｙｇ−ＳＴＤ１で形質転換され（Ｋｉｎｄｌｅ、１９９０年）、２０ｍＭハイグロマイシンに対して選択され、次に変異株を単離するための同じプロトコルを適用してスクリーニングされた（Ｃｈｏｃｈｏｉｓら、２０１０年）。形質転換は、ＳまたはＮ欠乏に数日間、暴露され、最小培地に移され、暗闇に供され、その後、残っているでんぷんレベルのための試験をするためにヨウ素染色を行った。
【００４１】
系統発生解析
アミノ酸配列は、ＭＡＦＦＴバージョン６ソフトウェアを使用して、アラインされた（Ｋａｔｏｈら、２００２年）。次に、得られたアラインメントは、ＳｅａＶｉｅｗバージョン４を使用して手動で、洗練され（Ｇｏｕｙら、２０１０年）、相同性が疑わしい領域は、さらなる分析から除外された。３１３アミノ酸位置の合計は、ＤＹＲＫタンパク質の系統発生解析のために保持された。系統発生解析は、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｈｙｌｉｐバージョン３．６９で近隣結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ））、最尤推定（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ（ＭＬ））およびＰａｒｓｉｍｏｎｙ（Ｐａｒｓ）アプローチを使用して実施された（Ｆｏｌｅｎｓｔｅｉｎら、２００５年）。ＰＲＯＴＭＬプログラムは、ＭＬ分析のために使用され、その配列入力順序は、無作為化された（２０ジャンブル）。ＳＥＱＢＯＯＴおよびＣＯＮＳＥＮＳＥプログラムは、それぞれ１００複製およびコンセンサスツリー再構成に対するブートストラップ値計算のために使用された。ノードの信頼性を調べるために、ＮＪおよびＰａｒｓ分析は、ＮＥＩＧＨＢＯＲおよびＰＲＯＴＰＡＲＳプログラムを使用して行われた。ＮＪ分析のために使用された距離マトリクスは、ＰＲＯＴＤＩＳＴプログラムを用いて作成された。系統樹は、ＭＥＧＡ５で描かれた（Ｔａｍｕｒａら、２０１１年）。
【００４２】
ＲＮＡ分析およびＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡは、Ｌｉｕら、２００５年で記載されるように、単離された。ＲＴ−ＰＲＣ反応のために、１μｇのＤＮアーゼＩ処理された総ＲＮＡは、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）の適用のために使用された。完全な転写ＤＹＲＫＰ−１／ＳＴＤ１遺伝子の配列情報を得るために、３つの重複ＲＴ−ＰＣＲは、プライマー対５’−ＣＡＴＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＣ−３’（配列番号１０）（Ｓｔｄ１ＵＴＲ１）および５’−ＡＧＣＧＴＧＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＧＣＣＧＴＣ−３’（配列番号１１）（Ｓｔｄ１Ｐ３ｒｅｖ）、５’−ＣＣＧＣＧＧＡＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣ−３’（配列番号１２）（Ｓｔｄ１ＦＷ２）および５’−ＧＡＴＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＡＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＡＧ−３’（配列番号１３）（Ｇ４ｒｅｖ１４）、および５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１４）（ＡＣＧ４_ＦＷ３）および５’−ＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１５）（ＡＣＧ４_Ｒｅｖ１）を使用して実施され、後者のプライマー対は、抗原として対応する領域を発現するために最初に作成された。野生型、変異体よび相補株での転写物レベルの比較のために、プライマー対Ｓｔｄ１ＦＷ２およびＧ４ｒｅｖ１４は、ＤＹＲＫＰ−１転写産物の一部を増幅するために使用された。特異的プライマーは、構成的に発現されるコントロール遺伝子（５’--ＡＡＴＣＧＴＧＣＧＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１６）および５’−ＴＴＧＧＣＧＡＴＣＣＡＣＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴ−３’（配列番号１７））として役目を果たす、アクチン（遺伝子座名Ｃｒｅ１３. ｇ６０３７００、タンパク質ＩＤ５１５０３１）のために設計された。
【００４３】
ノーザンブロット分析
ＲＮＡ抽出のために、相対的な時点での１５ｍＬの細胞培養物は、氷上に回収され、１分間、１７８９ｇで遠心分離され、５００μＬ細胞懸濁液は、氷上で１．５ｍＬチューブに移され、５００μＬのＲＮＡ溶解緩衝液と混合された。ＲＮＡ抽出、ホルムアルデヒドアガロースゲル上での分離およびノーザンブロットは、Ｌｉｕら、２００５年で記載されるように実施された。膜は、ローディグコントロールとしてＳＴＤ１遺伝子またはＣＢＬＰ２遺伝子の断片を含むＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズされた。Ａ１．ｐＡＣ−ＳＴＤ１プラスミドは、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限ベクターｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）とＤＹＲＫＰ−１の３’部分をコードするＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩ制限ＲＴ−ＰＣＲ産物の連結反応によって得られた。ＲＴ−ＰＣＲは、プライマー５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号１４）（ＡＣＧ４_ＦＷ３）および５’−ＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１５）（ＡＣＧ４_Ｒｅｖ１）を使用して実施され、ａ １１１６ ｐｂ生成物を生じさせた。このｐＡＣ−ＳＴＤ１プラスミドからの１−ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、およびＣＢＬＰ２の１−ｋｂ ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションのために使用された。放射性シグナルは、ＢＡＳ−ＩＰ ＭＳ２０４０ ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）プレート（Ｒａｙｔｅｓｔ； ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ. ｒａｙｔｅｓｔ. ｄｅ）を使用して検出され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ； ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ.ｂｉｏｒａｄ.ｃｏｍ/）を用いてスキャンされ、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ−４. ５. １プログラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して画像化された。
【００４４】
ゲノムＤＮＡ分析
窒素欠乏時間経過実験中のゲノムＤＮＡ濃度を決定するために、平均で１．２ｍｍ３総細胞体積に相当する細胞は、遠心分離によって採取され、−８０℃で保存された。各時点に対する２つの複製サンプルのゲノムＤＮＡは、前記のようなフェノール−クロロホルム抽出によって調製された（Ｔｏｌｌｅｔｅｒら、２０１１年）。ＤＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定された。
【００４５】
タンパク質調製、定量および免疫ブロット分析
ＤＹＲＫＰ−１の検出のために、可溶性細胞溶解物を次のように調製した：対数期における１００ｍＬの緑藻クラミドモナス細胞培養物（５×１０６細胞／ｍＬまたは０．８ｍｍ３／ｍＬに相当する）は、１７８９ｇで２分間の遠心分離によって採取され、１ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７. ２, １０ ｍＭＫＣｌ, １ ｍＭＭｇＣｌ２、１５４ ｍＭＮａＣｌ, ０. １×プロテアーゼ阻害剤カクテル；Ｓｉｇｍａ Ｐ９５９９）中で再懸濁された。細胞は、１秒パルス／１秒中断の設定で、９０秒間、氷上で超音波処理された。溶解物は、スクロースクッション（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７. ２, ０. ６ Ｍスクロース）にロードされ、１５１ ３００ｇおよび４℃で３０分間、ＭＬＡ−５５ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で遠心分離された。可溶性タンパク質は、２×サンプル（緩衝液Ｓｃｈｕｌｚ−Ｒａｆｆｅｌｔら、２００７年）または２×ＬＳＤサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１体積と混合され、８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での負荷前に５分間、９５℃または１０分間、７０℃で加熱された。ウエスタンブロットは、精製されたペプチド抗体（ｗｗｗ. ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ−ａｎｔｉｂｏｄｙ. ｃｏｍ）を使用して、ＥＣＬ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ, Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によるＤＹＲＫＰ−１の発現を検出するために、１：４５ｈ間実施された。
【００４６】
窒素飢餓動態の間に採取されたタンパク質サンプルは、次のように処理された：平均で１．２ｍｍ３の総細胞体積に相当する細胞ペレットは、使用まで、−８０℃で保存された。２つの複製サンプルの総タンパク質は、室温で、３０分間、５０ｍＭトリスｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび２％ＳＤＳを含む７０μＬ緩衝液で抽出され、その後２分の冷遠心分離を行った。タンパク質濃度を定量化するために、２μＬのタンパク質抽出物は、ビシンコニン酸（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との比色測定によって分析された。免疫ブロット分析について、１０〜１２μｇの総タンパク質抽出物は、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離され、ＢｉｏＴｒａｃ（登録商標）ＮＴニトロセルロース膜（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ, ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ. ｐａｌｌ. ｃｏｍ）に移し、ＡｔｐＢ、ＲｂｃＬ、ＣｙｔＦ、ＰｓＤ（Ｄ２）（Ａｇｒｉｓｅｒａ）およびＨＳＰ７０Ｂに対する抗体との免疫装飾（ｉｍｍｕｎｏｄｅｃｏｒａｔｉｏｎ）によって分析された（Ｓｃｈｒｏｄａら、１９９９年）。ＤＹＲＫＴ抗体は、担体タンパク質（ｗｗｗ.ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ−ａｎｔｉｂｏｄｙ.ｃｏｍ）としてＫＬＨ（キーホ−ルリンペットヘモシアニン）に結合する２つの合成ペプチド（ＤＧＭＤＤＰＧＹＳＲＫＥＶＰＮＰ−ｃｙｓおよびＰＡＶＮＨＥＤＶＥＬＦＲＮ−ｃｙｓ）を用いた２匹のウサギの免疫化によって得られた。
【００４７】
でんぷんおよびクロロフィルの測定
でんぷんおよびクロロフィル含有量は、Ｃｈｏｃｈｏｉｓら、２０１０年によって測定された。１ｍＬの培養物が採取され、１０分間、約２０，０００ｇで遠心分離され、クロロフィル抽出物のために１ｍＬのメチルアルコール中に再懸濁され、−８０℃で保存された。ペレットは乾燥され、４００μＬの水を加えた。でんぷんを可溶化するために、サンプルは、「乾燥サイクル」を設定してオートクレーブされた。その後、でんぷんは、２００μＬのアミログリコシド溶液（１Ｕ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ）を添加し、５５℃で１〜２時間インキュベーションによって、グルコースに分解された。自動化された糖分析器（Ｙｓｉモデル２７００セレクト、イエロースプリングス、ＯＨ、ＵＳＡ）を使用して、グルコース濃度が決定された。クロロフィルは、メタノールによって抽出され、クロロフィルａおよびｂは、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（ソフトウェアＳＰ２０００を用いるＳＡＦＡＳ ＵＶｍｃ２）を使用して、６５３、６６６および７５０ｎｍで吸光度を測定することによって決定された。
【００４８】
油含有量の定量化
緑藻クラミドモナス細胞（２ｍｍ３総細胞体積に相当する）は、（４℃で）２分間、１０００ｇで、遠心分離によって採取された。細胞は、−８０℃の下ですぐに凍結されるか、または即時脂質抽出のための熱イソプロパノール中でクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）された。総細胞脂質は、ヘキサンおよびイソプロパノールの混合物を使用して抽出された（Ｌｉ−Ｂｅｉｓｓｏｎら、２０１０年）。総細胞脂質を含む有機溶媒相を回収し、窒素気流下で乾燥させ、次に、２００μＬのクロロホルム：メタノール（２：１ｖ／ｖ）中に、再懸濁させた。トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、薄層クロマトグラフ上で、他の脂質クラスから最初に分離され、水中８％Ｈ３ＰＯ４中で溶解された２％ＣｕＳＯ４で炭化され、次にＴＡＧ含有量は、Ｃ１７：０ＴＡＧ標準を用いて生じた標準曲線と比較された後、デンシトメトリー法に基づいて計算された（Ｓｉａｕｔら、２０１１年）。
【００４９】
クロロフィル蛍光
クロロフィル蛍光は、Ｄｕａｌ Ｐａｍ−１００（Ｈｅｉｎｚ Ｗａｌｚ）を使用して測定された。サンプルは、室温で一定の撹拌下で、キュベットに入れ、測定前の５〜１０分間、暗所適用された。光曲線は、１５〜７１５μｍｏｌｍ−２ｓ−１ＰＡＲの範囲で１０の照射ステップで記録され、各光強度は、Ｆｍ’を測定するための飽和フラッシュ後３０秒間維持された。ＥＴＲは、前記Ｒｕｍｅａｕら、２００５年に記載されるように計算された。
【００５０】
バイオマス決定
培養物のバイオマス蓄積を決定するために、各時点で、３つの５ｍＬサンプルが、使い捨てのアルミニウム皿（ＶＷＲ、Ｒｅｆ．６１１−０７３９および−０７４１）上にガラス繊維フィルター上で滴下され、８０℃のオーブン中で一晩乾燥された。培地の３つの１０ｍＬサンプルは、同等に処理された。紙フィルターは、細胞を添加前および後に秤量され、培地に対する平均値が差し引かれた。
【００５１】
顕微鏡検査
光学顕微鏡について、ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＲＸＡ顕微鏡が使用された（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ）。必要に応じて、細胞は、培地中で、０．２５％グルタルアルデヒドで固定された。容易に細胞濃度を比較するために、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバが使用された。画像は、Ｓｐｏｔ Ｉｎｓｉｇｈｔ４ソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ., Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｈｅｉｇｈｔｓ, ＵＳＡ； ｗｗｗ. ｓｐｏｔｉｍａｇｉｎｇ. ｃｏｍ）で記録された。
【００５２】
結果
でんぷん分解変異体ｓｔｄ１の同定および遺伝的特性評価
パロモマイシン（ＡｐｈＶＩＩＩ）耐性カセットとの緑藻クラミドモナス野生株ＣＣ１２５の形質転換によって作成されるＤＮＡ挿入ライブラリーのスクリーニングから、でんぷん分解で影響を受けたいくつかの変異体が、以前に単離された（Ｃｈｏｃｈｏｉｓら、２０１０年）。でんぷん分解１のためにｓｔｄ１と呼ばれるこれらの変異体の１つは、野生型前駆体と比較して、暗所で、でんぷん分解のより遅い速度を示した（図１Ａ）。サザンブロット分析は、変異体ゲノム中へのパロモマイシンカセットの単一統合を示した（図２Ａ）。ＤＮＡ隣接領域のシークエンシングは、遺伝子の第３のエクソン内で、ＡｐｈＶＩＩＩカセットの挿入を示し、二重特異性チロシンリン酸化たんぱく質キナーゼＤＹＲＫ２（クラミドモナスゲノムバージョン４．０）として注釈を付け、ここでＤＹＲＫＰ−１と改名した（図１Ｂ）。クラミドモナスＤＹＲＫＰ−１遺伝子モデルは、ＲＴ−ＰＣＲによって産生された３つの重複するｃＤＮＡ断片をシークエンシングすることによって確認された（図１Ｂ）。クラミドモナスＤＹＲＫＰ−１は、１４のエクソンおよび１３のイントロン、３８３４のヌクレオチドを含むコード領域から構成される。遺伝子モデルＣｒｅ０７. ｇ３３７３００ (Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅｖ ９. ０)に関して、開始コドンは、５１ヌクレオチド上流に位置する。
【００５３】
ｓｔｄ１変異体は、ｐｓａＤプロモーターによって推進される野生型ＤＹＲＫＰ−１ゲノム配列を保持する構成を使用して、補完された（図２Ｂ）。ｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ １およびｓｔｄ１：：ＳＴＤ１ ２が単離された２つの独立した相補株は、野生型前駆体に対してわずかに低いＳＴＤ１遺伝子発現レベルおよびＳｔｄ１たんぱく質量を示した（図１Ｃ、Ｄ）。でんぷん蓄積および分解速度の同様のパターンは、補完株および野生型前駆体の両方で、ＮまたはＳ欠乏に応答して観察された（図２Ｃ）。ノーザンブロット分析は、ＤＹＲＫＰ−１転写物がＮ欠乏の１日後に強く誘導され、その転写物レベルは、欠乏の３日後の高いレベルのままであったことを明らかにした（図１Ｅ）。ＤＹＲＫＰ−１遺伝子発現は、補完株で構成ＰＳＡＤプロモーターによって推進されたが、ＤＹＲＫＰ−１転写物の蓄積は、Ｎ欠乏に応答して野性型と同様に増加したことに留意すべきであり、これは、ＤＹＲＫＰ−１遺伝子発現の調節は、転写後レベルで調節されることを示唆する。
【００５４】
クラミドモナスＤＹＲＫＰ−１／ＳＴＤ１は、ＤＹＲＫタンパク質ファミリーの新規な植物特異的グループのメンバーである。
ＤＹＲＫＰ遺伝子ファミリーの系統発生解析は、４つの異なる枝を区別することができた：前記のＤＹＲＫＰ１、ＤＹＲＫＰ２およびＹａｋサブファミリー、および新規ＤＹＲＫグループ、これはクラミドモナスＤＹＲＫＰ−１／ＳＴＤ１を含む緑系統（植物、コケおよび藻類）のメンバーだけを含むＤＹＲＫＰ（植物ＤＹＲＫのこと）とここでは命名する（図３Ａ）。藻類ゲノムは、ＤＹＲＫＰグループの１つのメンバーを有し、コケおよび高等植物は、２〜６の植物様ホモログを保持する。興味深いことに、植物および藻類ゲノムは、Ｙａｋホモログを含むが、ＤＹＲＫ１ホモログを含まず（Ｈａｎら、２０１２年）、ＤＹＲＫ２ホモログは、藻類およびコケにおいてのみ同定され，高等植物では同定されない。ＤＹＲＫキナーゼは、保存された配列の特徴、特に、保存された触媒ドメインに先行するＤＹＲＫホモロジー（ＤＨ）−ｂｏｘを示す（図３Ｂ）。ＤＹＲＫ１およびＤＹＲＫ２サブグループに対するコンセンサス配列は、Ｙａｋグループについてわずかに異なるＮｘＧＹＤＤ (Ｄ／Ｅ) (Ｎ／Ｒ)ｘＤＹである（図３Ｂ）。新規に同定されたＤＹＲＫＰグループのＤＨ−ｂｏｘは、変更されたモチーフ：(Ｎ／Ｈ)(Ｒ／Ｋ)ＴＧＦＥＥｘＫ(Ｄ／Ｅ／Ｎ)(Ｆ／Ｌ)を示す。
【００５５】
ｓｔｄ１は、光合成独立栄養条件で、栄養欠乏下、貯蔵蓄積の強い増加およびより強固な光合成活性を示す。
次に、窒素欠乏の効果は、細胞内エネルギー状態およびでんぷん（Ｒａｌら、２００６年）またはＴＡＧ（Ｇｏｏｄｓｏｎら、２０１１年）などの貯蔵化合物の蓄積に特異的に影響を与えることが知られる異なる増殖条件（混合栄養対光合成独立栄養）で試験された。（酢酸と光の両方の存在下で）混合栄養条件において、でんぷん蓄積の違いは、Ｎ欠乏に応答するＷＴおよびｓｔｄ１変異体の間で観察されなかったが（図４Ａ）、油含量の増加は、飢餓の１〜３日後に変異体で観察された（図４Ｂ）。完全な光合成独立栄養条件において、はるかに高い、難分解性のでんぷん蓄積が、ＷＴおよび両方の相補株と比較して、ｓｔｄ１で観察され（図４Ｂ）、油含有量は、飢餓の３日後の変異体で増加した（図４Ｂ）。Ｎ欠乏がより低いフルエンス率（３５μｍｏｌ光子ｍ−２ｓ−１）で、光合成独立栄養条件で行われた場合、ＷＴおよび相補変異体株は、低いでんぷんレベルのみを蓄積した一方、ｓｔｄ１変異体は、高いでんぷん量を蓄積した（図５Ａ〜Ｄ）。
【００５６】
より高いでんぷん蓄積はまた、硫黄欠乏に応答してｓｔｄ１で観察された（図５Ｅ〜Ｈ）。同じ結果が、硫黄欠乏に応答して得られた（データは示さず）。光合成電子伝達率（ＥＴＲ）は、クロロフィル蛍光測定から決定し、Ｎ欠乏が混合栄養条件で実現した場合、ｓｔｄ１およびコントロール株で並行減少を示した（図４Ｃ、左パネル）。対照的に、Ｎ欠乏は、光合成独立栄養条件下で実施された場合、ＥＴＲの低下の顕著性は、コントロール株と比較してｓｔｄ１でより少なかった（図４Ｃ、右パネル）。まとめると、これらのデータは、細胞内エネルギー状態に依存して、ｓｔｄ１は、より多くの貯蔵化合物を蓄積し、栄養欠乏に応答してコントロール株よりも高い光合成活性を維持することを示す。主要な光合成成分の免疫検出は、野生株前駆体と比較して、ｓｔｄ１でＰＳＩＩ、ＰＳＩ、チトクロームｂ６ｆ、ＡＴＰアーゼ、およびＲｕｂｉｓｃｏサブユニットの類似の減少を示した（図４Ｄ）。興味深いことに、そのミトコンドリアの代替オキシダーゼ（ＡＯＸ）は、ＷＴよりも変異体ではるかに豊富であり（図４Ｄ）、これは変異体での酸化還元不均衡を示した。
【００５７】
独立栄養窒素欠乏中のｓｔｄ１変異体における増加したバイオマス生産
バイオマス生産の強い増加は、Ｎ欠乏培地で培養の３および１０日後に採取した細胞ペレットの大きさからｓｔｄ１で観察された（図６Ａ）。特に、野性型および相補株は、約６〜７μｍ直径の単一細胞粒子としてカウントされ、ｓｔｄ１変異体は、母細胞壁によって囲まれた２、４および８細胞の凝集体からなり、１０〜２０μｍ直径の粒子として測定された（図７）。いくつかの緑藻クラミドモナス変異体で前に記載されたこの表現型の特徴は、パルメロイド（ｐａｌｍｅｌｌｏｉｄ）と呼ばれる（Ｈａｒｒｉｓ、２００９年）。細胞凝集にもかかわらず、総細胞体積は、Ｎ豊富な条件下、野生型および変異体培養で同様であった（図６Ｂ）。窒素欠乏に応答して、総細胞体積は、野生型および相補培養物でわずかな変動のみを示したが、ｓｔｄ１で強く増加した（図６Ｂ）。窒素欠乏が、混合栄養条件（ＴＡＰ−Ｎ）で行われた場合、ｓｔｄ１変異体は、野生型細胞として同様の挙動を示した（図８）。乾燥重量として測定されたバイオマスは、Ｎ欠乏の６日後の野生株および相補株で１．７倍、ｓｔｄ１で３倍超の増加が見られた（図６Ｃ）。
【００５８】
ｓｔｄ１で観察されるバイオマスおよびでんぷん産生の目覚しい増加を確認するために、追加実験が、タービドスタット（ｔｕｒｂｉｄｏｓｔａｔ）として動作される１Ｌのフォトバイオリアクターを使用してより制御された条件で実施された（図９）。これらの実験において、細胞バイオマスは、新鮮な培地の追加によって一定レベル（ＯＤ８８０ｎｍによってモニターされた）に維持され、よって、希釈率およびバイオマス生産性測定を可能にした。ｔ０で、最小のＮ豊富培地による希釈は、最小Ｎフリー培地によって置換され、培地のアンモニア含有量の減少をもたらし、これは、４５時間後、完全に消耗された（図９Ａ）。その時点で、ＷＴのバイオマス生産性は、しだいに減少を開始し、７２時間後、完全に停止した。鋭く対照的に、ｓｔｄ１のバイオマス生産性は、増加し（４５時間から６５時間）、次に、次第に減少し始め、７２時間でのバイオマス生産性は、ＷＴの最初の生産性よりずっと高かった。これらの実験は、光合成独立栄養条件下で、Ｎ欠乏に付された場合、ｓｔｄ１は、コントロール株よりも多くのでんぷんおよびバイオマスを生産することを照明する。
【００５９】
議論
我々は、ここで、緑系統に特異的な、新規サブグループに属するＤＹＲＫキナーゼホモログ（ＤＹＲＫＰと呼ばれる）で影響を受けるｓｔｄ１変異体の特性について報告する。ｓｔｄ１変異体、これまでに報告された緑系統の最初のＤＹＲＫ変異体は、高い細胞内でんぷんおよび油量を蓄積し、栄養飢餓に応答して、持続的な光合成活性を示す。
【００６０】
ＤＹＲＫキナーゼによるバイオマスおよび貯蔵蓄積の制御
異なる栄養条件（混合栄養対光合成独立栄養）で実施された実験で示されるように、栄養条件に加えて、細胞エネルギー状態は、変異体でのでんぷんおよび油蓄積の制御において、中心的な役割を果たす。混合栄養条件（酢酸含有培地で増殖する照射された細胞）、エネルギー状態が高い条件において、高いでんぷんレベルは、Ｎ欠乏に応答してＷＴで蓄積するが、でんぷんの増加は、ｓｔｄ１で観察されない。これらの条件において、油含有量の増加は、変異体で観察されたことに注意されたい。しかしながら、光合成独立栄養条件において、ＷＴでのでんぷん蓄積は、照射の強度に依存する（低い光強度で低く、より高い光でより高い）。驚くべきことに、でんぷん蓄積のエネルギー状態への依存性は、ｓｔｄ１で失われ、一方、異なる速度で、異なる栄養条件で、変異体細胞は、同様のでんぷん量を蓄積する（図４Ａおよび図５Ａ、Ｅ）。
【００６１】
酵母において、ＤＹＲＫホモログＹａｋ１は、グリコーゲン貯蔵、細胞内グリコーゲン含有量の増加を誘導するＹＡＫ１遺伝子の削除を制御することが報告されている（Ｗｉｌｓｏｎら、２０１０年）。Ｙａｋ１は、転写因子Ｍｓｎ２およびＨｓｆ１をリン酸化することによってグルコース欠乏に応答して、細胞周期の停止を制御するだろう（Ｍｏｒｉｙａ、２００１年）。さらに最近、Ｙａｋ１は、異なる転写因子を標的化することによって増殖およびストレス応答を制御する調節カスケードの中心に位置することが提案された（Ｍａｌｃｈｅｒら、２０１１年）。酵母Ｙａｋ１変異体としては、栄養欠乏に応答してｓｔｄ１の増加した貯蔵およびバイオマス生産は、増殖および貯蔵蓄積を停止するのに必要なシグナルが、正確に認識されないか、または転送されないことを示す。酵母において、Ｙａｋ１は、ＰＫＡおよびＴＯＲ経路の間の交点で、Ｓｆｐ１およびＭｓｎ２／４のような他の転写因子の間にある（Ｒｏｈｄｅら、２００８年）。クラミドモナスおよび高等植物ＤＹＲＫＰがＴＯＲおよびｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル伝達カスケードにどの程度まで関与するかは、解明にはさらなる調査が必要だろう。
【００６２】
ｓｔｄ１での光合成のフィードバック調整の損失
微細藻類において、光合成活性の低下は、光合成による還元力の発生および代謝目的のためにそれを使用する能力との間のバランスを維持するのを助ける栄養欠乏に対する一般的な細胞応答の一部である（Ｇｒｏｓｓｍａｎ、２０００年）。ｓａｃ１変異体（Ｓａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ応答の欠陥）が、光合成を下方制御することができないために、光でのＳ欠乏の２日で死亡が報告され、ＰＳＩＩセンターを損傷する反応性酸素種（ＲＤＳ）の過剰産生をもたらした（Ｄａｖｉｅｓら、１９９６年；Ｗｙｋｏｆｆら、１９９８年）。対照的に、ｓｔｄ１変異体は、コントロール株で観察されるものに類似する減少非光合成複合体を示すが（図４Ｄ）、その光合成活性は、減少する一方で、光合成独立栄養条件でコントロール株中より高い状態を維持している（図４Ｃおよび図５Ｂ、Ｆ）。並行して、ｓｔｄ１変異体は、コントロール株より多い貯蔵化合物を蓄積する。したがって、本発明者らは、ｓｔｄ１で発生する顕著なでんぷん蓄積が、光合成により発生する還元力のためのシンクとして機能し、したがって、光合成のフィードバック阻害を低減することを提案する。代謝物プロファイリング研究は、でんぷんバイオマス生産の間の負の相関関係の高等植物での存在を示す（Ｓｕｌｐｉｃｅら、２００９年）。そのような負の相関関係は、少なくとも栄養不足の状態で、並列でんぷんおよびバイオマス産生が観察される栄養制限の条件では、ｓｔｄ１変異体で破壊される。
【００６３】
バイオテクノロジー的な引き起こされるであろう結果
栄養欠乏の条件で増殖および貯蔵蓄積を制御する負の調節因子の発見は、微細藻類にとって、重要なバイオテクノロジー的な意味を有する。実際、これらの単細胞微生物は、ますます、期待できる次世代バイオ燃料の生産のためのバイオマス原料と考えられる。高等植物と比較した場合、微細藻類の主要な利点の１つは、高いでんぷんまたは脂質量を蓄積するそれらの能力であり、これらの化合物は、それぞれ、バイオエタノールまたはバイオディーゼルに転換可能である。しかしながら、テクノ経済分析は、貯蔵化合物の生産性が、経済的実現可能性に到達するために、増加される必要があることを示している。
【００６４】
実施例２：ＳＴＤ１変異体の特徴に関する追加情報
実施例１は、変異体ｓｔｄ１での長期窒素飢餓後の油およびでんぷんの大規模な蓄積を記載する。変異体遺伝子ＤＹＲＫと炭素貯蔵形成において観察された表現型の間の分子機構（複数可）を詳細に分析するために、変異体ｓｔｄ１の比較トランスクリプトミクスな、定量的プロテオミクス並びにリピドミック（ｌｉｐｉｄｏｍｉｃ）分析が実施され、その野生型バックグラウンド株１３７ＡＨと比較した。
【００６５】
結果
変異体ｓｔｄ１過剰蓄積酸化ＭＧＤＧ
実施例１において、本発明者らは、長期窒素飢餓後の変異体ｓｔｄ１において、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ、油）の過剰蓄積を観察した（図４Ｂ）。変異体において、全体のリピドミック変化の全体像を得るために、本発明者らは、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）に基づいて脂質クラスを定量化し、最先端のＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、脂質分子種での変化を比較した。第１に、各脂質クラスは、ＴＬＣに基づいて定量化された。図１０Ａに示されるように、全ての株に存在する古典的な極性脂質（すなわち、ＭＧＤＧ、ＤＧＤＧ、ＤＧＴＳ、ＰＧ、ＰＥ）に加えて、新しいバンドがＴＬＣプレート上で、変異体ｓｔｄ１中でのみＭＧＤＧのちょうど下で検出された（矢印で指す）。バンドに存在する脂質は、クロロホルムおよびメタノール（２：１）の混合液で溶出することを介して回収され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定に供された。質量分析は、不飽和度の異なるレベルを有するＣ１６およびＣ１８脂肪酸の組み合わせを有する酸化ＭＧＤＧ３４の混合物の存在を明らかにした。分子種酸化ＭＧＤＧ３４の１つについての質量分析：ｘを図１０Ｂに示す。
【００６６】
次に、変異体細胞でのこれらの酸化ＭＧＤＧの相対量は、ＷＴと比較して、また窒素飢餓に応答した時間依存的方法で、さらに調査された。中期対数期増殖細胞は、５日間、１日１回、採取され、総細胞脂質は、ヘキサンおよび熱イソプロパノールの方法によって抽出された。次に、総脂質抽出物は、最先端のｑＴＯＦ ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるリピドミック分析に供された。サンプルは、それぞれ、極性膜脂質および中性脂質検出のために、陽性および陰性分析の両方に供された。図１１で示されるように、ＤＧＴＳを除いて、有意差は、ＷＴ、変異体ｓｔｄ１および２つの相補株（それぞれ、ここでＣ２およびＣ７と呼ばれる）の間の全ての他の細胞脂質については観察されなかった。長期窒素飢餓後の有意なＴＡＧ蓄積が観察され、これは、以前のＴＬＣに基づく分析を確認する。まだ理解されていない理由のために、ＤＧＴＳレベルは、変異体ｓｔｄ１において一定のままであるが、窒素飢餓に応答して、ＷＴにおいて劇的に増加した。
【００６７】
酸化ＭＧＤＧの基礎レベルは、緑藻クラミドモナスの細胞に存在し、これは、ＷＴで窒素飢餓に応答して、変化しないままだった（図１２Ａ）。十分な栄養条件下、ｓｔｄ１変異体はすでに、野生型細胞より２倍超の酸化ＭＧＤＧを蓄積し、これは、窒素飢餓に応答して時間依存的方法で、よりさらに有意に増加した（１８倍の高さまで）。主要な酸化ＭＧＤＧ種は、Ｃ１６およびＣ１８種を含み、これらのオキシリンの詳細な構造は、現時点で研究室で調査中である（図１２Ｂ）。
【００６８】
総合的に、ヒドロペルオキシドＭＧＤＧのより高い蓄積／合成は、脂質酸化反応を触媒する、または調節するタンパク質をコードする遺伝子（複数可）の潜在的なｄｙｓ調節を指す。脂質酸化は、全ての生物学的システムで共通の代謝反応である。この反応は、主に、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ：ＥＣ：１．１３．１１．１２）と呼ばれるタンパク質によって触媒される。リポキシゲナーゼは、ジオキシゲナーゼを含む非ヘム鉄のファミリーである。ＬＯＸは、多価不飽和脂肪酸鎖の立体特異的位置への分子酸素の挿入を触媒する。ＬＯＸは、植物、哺乳類、珊瑚、コケ、真菌、また多くの菌類および微細藻類中に偏在的に見られる。
【００６９】
ＣｒｅＬＯＸ１は、ｓｔｄ１変異体での転写ならびにプロテオームレベルの両方で、上方調節される。
ＳＴＤ１タンパク質を含む潜在的な調節ネットワークのより良い理解を得るために、ＩｌｌｕｍｉｎａＲＮＡ配列シーケンス技術（Ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ）に基づく比較トランスクリプトミクス研究が実施された。トランスクリプトミックなデータセットの予備解析は、独立栄養条件下でＷＴ細胞と比較してＣｒｅＬＯＸ１転写産物の６ ｌｏｇ倍超の増加（ＬｏｇＦＣ）を明らかにした（表２）。１５Ｎ／１４Ｎ標識化に基づく定量的プロテオーム解析は、ＷＴよりも変異体でのＣｒｅＬＯＸ１タンパク質（最大３０ ｌｏｇＦＣ）の著しい増加を示した（表２）。変異体細胞でのＣｒｅＬＯＸ１タンパク質量のこの大きな増加は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で増加したシグナル（約１１０ｋＤａ）の観察によってさらに支持される。このバンドは回収され、主にＣｒｅＬＯＸ１タンパク質を実際に含むものとして同定された。（図１３および表３）。
【００７０】
これらの脂肪酸酸化反応に由来する生成物は、オキシリピン（ｏｘｙｌｉｐｉｎｓ）と総称され、これは、多くの生物学的プロセスで、親油性シグナル伝達分子である。餌として既知のシロイヌナズナリポキシゲナーゼを有するタンパク質相同性検索に基づいて、唯一の想定されるホモログ（ＣｒｅＬＯＸ１）は、緑藻クラミドモナスのゲノムにコードされる（バージョン５）。想定されるＣｒｅＬＯＸ１をコードする遺伝子座は、Ｃｒｅ１２．ｇ５１２３００である（フィトゾーム（ｐｈｙｔｏｓｏｍｅ）バージョン５）。ＣｒｅＬＯＸ１タンパク質は、１１８ｋＤａの理論上の分子量を有し、全てのその高等植物ホモログに類似する２つのリポキシゲナーゼドメインを含む。ＣｒｅＬＯＸ１は、オンラインＣｈｌｏｒｏＰソフトウェアを使用して、そのＮ末端に６５アミノ酸長の葉緑体トランジットペプチド（ｃＴＰ）を保有することが予測される。これは、隠れたシロイヌナズナのホモログは、色素体局在化ＡｔＬＯＸ５であるという見解と一致する。
【００７１】
【表４】
0006605500.tif 000005
【００７２】
表２：ＣｒｅＬＯＸ１は、転写産物およびタンパク質レベルの両方で、クラミドモナス変異体ｓｔｄ１において、上方調節される。２つの大規模研究が実施され、トランスクリプトームおよびプロテオーム法は、ｓｔｄ１変異体細胞でリポキシゲナーゼ１の上方調節を明らかにした。トランスクリプトームデータセットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ技術（Ｇｅｎｏｓｃｏｐｅ）を使用して、ＲＮＡシーケンシングによって得られた。野生型およびｓｔｄ１変異体細胞は、採取前に組み合わされた３重の前培養で、１００μＥｍ−２ｓ−１で、最小培地および空気中２％ＣＯ２での標準独立培養条件で増殖された。定量的プロテオーム解析のために、野生型および変異体細胞は、各菌株について４つの複製で、独立栄養条件で増殖され、１４Ｎを含む最小培地で２つの複製および１５Ｎアンモニウム塩を含む２つの複製は、全体の代謝標識をもたらした。細胞を遠心分離し、洗浄し、ＭＭ−Ｎ培地中で再懸濁し、および窒素欠乏の２４時間後に採取した。タンパク質抽出前に、１４Ｎ標識野生型からの細胞は、１５Ｎ標識ｓｔｄ１からの細胞と組み合わされ、逆もまた同様にして、４つの生物学的複製を与えた。タンパク質結果のＬｏｇ２倍変化（ｌｏｇＦＣ）は、４つの複製の平均であり、野生型と比較して与えられる。「調節ｐ値」は、複数の比較に対して調節されたｐ値である。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
表３：質量分析による図１３Ａで強調されたバンドにおけるタンパク質の同定。最初の５つの同定されたタンパク質は、各株について、それらのランク（ｒｋ）に従って一覧にされる。また特定のタンパク質に対応する、タンパク質のスコアおよび範囲並びに同定されたタンパク質の数が表示される。「指数関数的に修飾されたタンパク質の存在量指数」を示す値「ｅｍＰＡＩ」および観察された総（特定の）スペクトルの数（「スペクトル数」；関連および重複）は、１つのサンプルでのタンパク質の相対存在量の推定を与えるのに役立つ。
【００７５】
ＬＯＸ阻害剤は、炭素貯蔵（脂質およびでんぷん）形成を妨げた。
現在の結果に基づいて、本発明者らは、キナーゼＳＴＤ１は、ＬＯＸ１タンパク質の陰性の調節因子として働くと仮定した。実際に、リポキシゲナーゼの生成物、オキシリピンは、多くの発達並びにストレス応答シグナル伝達ネットワークにおいて役割を果たすシグナル分子の大きな配列に対する前駆体である。この仮説を試験するために、カテコール（シグマカタログ番号４５２６３７）が使用された。カテコールは、細胞反応性酸素種をクエンチングすることによりリポキシゲナーゼの活性を阻害する、既知のリポキシゲナーゼ阻害剤である。２つの異なるカテコール濃度（５ｍＭおよび１０ｍＭ）が最初に試験された。５ｍＭカテコールの存在で、ＴＡＧおよびでんぷん蓄積の両方は、窒素飢餓下で６日後のｓｔｄ１変異体において阻害された（図１４）。カテコールはまた、ＷＴ株で窒素飢餓に応答してＴＡＧ蓄積を阻害したが、しかしながら、でんぷん蓄積に対する効果は観察されなかった。他の条件が試験される。
【００７６】
上記から、ｓｔｄ１変異体中のＳＴＤ１の不活性化は、ＬＯＸ１上方調節を引き起こすようであり、よって、でんぷんおよびＴＡＧ蓄積に関与するオキシリピンのファミリーの形成、でんぷんおよびＴＡＧ蓄積を防止するカテコールによるＬＯＸ活性の阻害をもたらす。
【００７７】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ−Ｅ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ−１】
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【図１２Ｂ−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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