(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、
（ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程、
を含む方法；
ここで、当該プライマー対は、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対である。
【請求項２】
プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれかに記載の方法によりアデノ随伴ウイルスゲノムを定量する工程を包含する、アデノ随伴ウイルスの力価測定方法。
【請求項５】
アデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物であって、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物；
ここで、当該プライマー対は、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対である。
【請求項６】
プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
アデノ随伴ウイルスゲノムの定量用のキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含むキット；
ここで、当該プライマー対は、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対である。
【請求項９】
プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、請求項８又は９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムの定量方法、ＡＡＶの力価測定方法、ＡＡＶゲノムを定量するための組成物、ＡＡＶゲノムの定量用キット、ＡＡＶの定量方法、ＡＡＶを定量するための組成物、及びＡＡＶの定量用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属する線状一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶは、ヒトを含む広範な種の細胞に感染可能であり、血球、筋、神経細胞等の分化を終えた非分裂細胞にも感染する。野生型のＡＡＶは、ヒトに対する病原性がない。また、ＡＡＶ粒子は物理化学的に極めて安定である。これらの特徴から、ＡＡＶは、遺伝子導入用のベクターとして開発が進められている。【０００３】
ＡＡＶ粒子は、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３）を有するタンパク質カプシドと、それに囲まれた一本鎖ＤＮＡゲノムとからなる。野生型のＡＡＶのゲノムは、両端にＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ：逆方向末端反復配列）と呼ばれるＴ字型のヘアピン構造を形成する核酸配列を持ち、その間の直鎖状一本鎖ゲノムの半分はＲｅｐタンパク質をコード（ｒｅｐ遺伝子）し、残りの半分はカプシドタンパク質をコード（ｃａｐ遺伝子）している。ヒトに感染し得る野生型のＡＡＶとしては、現在までに少なくとも１３種類の血清型（ＡＡＶ１〜１３）が知られている。【０００４】
典型的な組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子とが所望の遺伝子等と置換されたゲノム構造を有する。ｒＡＡＶベクターの作製方法の一例としては、ＡＡＶの両端のＩＴＲ間に目的遺伝子を挿入したベクタープラスミド、ＡＡＶの複製やウイルス粒子の形成に必要とされるウイルスタンパク質を供給するためのヘルパープラスミド、及びＡＡＶの増殖に必要とされるアデノウイルスのヘルパー作用を担う遺伝子領域の一部を有するアデノウイルスヘルパープラスミドを一括して２９３細胞等の宿主細胞に導入し、宿主細胞内の核内にｒＡＡＶベクターを産生させる方法が挙げられる。細胞への遺伝子導入にｒＡＡＶベクターを用いる際には、十分に高い力価のｒＡＡＶベクターを調製する必要がある。このため、ｒＡＡＶベクターを調製した際には、その力価の測定が必須である。【０００５】
ｒＡＡＶの力価の測定方法としては、サザンブロッティング法、ドットブロッティング法、及びリアルタイムＰＣＲ法等が利用されている。このうち、操作の簡便性や迅速性等の観点からは、リアルタイムＰＣＲ法の利用が好適と言える。ｒＡＡＶベクターのＩＴＲは、ＰＣＲ増幅が困難な二次構造を有する。このため、ｒＡＡＶベクターの力価のリアルタイムＰＣＲによる測定の標的配列としては、ベクターに挿入された外来遺伝子が利用されている。しかしながら、標的配列として外来遺伝子を利用する場合、構築されたベクター毎にＰＣＲに利用するプライマーを設計する必要がある。最近、ＩＴＲ配列のみを標的配列とした、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲによるｒＡＡＶベクターの力価の測定方法について報告があった（非特許文献１）。しかしながら、ＴａｑＭａｎプローブを用いるリアルタイムＰＣＲは、二重標識した核酸プローブを合成する必要があるため、インターカレーティング色素を用いる定量リアルタイムＰＣＲと比較してコストがかかる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１２年２月、Ｐａｒｔ  Ｂ  ２３、ｐ．１８−２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、簡便で、かつ、効率の良いアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の定量方法、ＡＡＶの力価測定方法、ＡＡＶゲノムの定量方法、ＡＡＶを定量するための組成物、ＡＡＶゲノムを定量するための組成物、ＡＡＶの定量用のキット、及びＡＡＶゲノムの定量用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、ＩＴＲ配列のみを標的配列としたインターカレーティング色素を用いた定量リアルタイムＰＣＲにより、ＡＡＶゲノムの定量が可能であることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、下記の[１]〜[１３]に関する。
[１]  アデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法であって、
（ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、
（ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程、
を含む方法。
[２]  プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[１]に記載の方法。
[３]  プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[１]又は[２]に記載の方法。
[４]  インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[１]〜[３]いずれかに記載の方法。
[５]  [１]〜[４]いずれかに記載の方法によりアデノ随伴ウイルスゲノムを定量する工程を包含する、アデノ随伴ウイルスの力価測定方法。
[６]  アデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物であって、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物。
[７]  プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[６]に記載の組成物。
[８]  プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[６]又は[７]に記載の組成物。
[９]  インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[６]〜[８]いずれかに記載の組成物。
[１０]  アデノ随伴ウイルスゲノムの定量用のキットであって、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含むキット。
[１１]  プライマー対が、配列表の配列番号１で表される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号７で表される塩基配列を含むプライマーとからなる、[１０]に記載のキット。
[１２]  プライマー対が、配列表の配列番号１又は２で表される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号７又は８で表される塩基配列からなるプライマーとからなる、[１０]又は[１１]に記載のキット。
[１３]  インターカレーティング色素が、シアニン系色素を含む、[１０]〜[１２]いずれかに記載のキット。
ここで、本発明で用いるシアニン系色素としては、ＣＡＳ登録番号  １６３７９５−７５−３の下記式（Ｉ）に示される［２−［Ｎ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ］あるいはその塩が使用できる。言い換えると、Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［４−［（Ｅ）−（３−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−１−ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ−１−ｉｕｍ−２−ｙｌ］−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩が使用できる。これらは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉと称されている。さらにｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性体であってもよく、下記式（ＩＩ）に示されるＮ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［４−［（Ｚ）−（３−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−１−ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ−１−ｉｕｍ−２−ｙｌ］−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩が使用できる。【００１０】
【化１】
0006567974.tif 000002
【００１１】
【化２】
0006567974.tif 000003
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、簡便で、かつ、効率の良いアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の定量方法、ＡＡＶの力価測定方法、ＡＡＶゲノムの定量方法、ＡＡＶを定量するための組成物、ＡＡＶゲノムを定量するための組成物、ＡＡＶの定量用のキット、及びＡＡＶゲノムの定量用キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を示す図である。図中Ｌ１＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ１及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示す。
【図２】実施例３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を示す図である。図中Ｌ３＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ３及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示す。
【図３】実施例３におけるリアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を示す図である。図中Ｌ５＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ５及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示す。
【図４】実施例４におけるリアルタイムＰＣＲの結果を示す図である。図中Ｌ１＿Ｒ１は、プライマーペアとしてプライマーＬ１及びプライマーＲ１を用いた反応であることを示し、各プライマーセットについて、上から順に、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の増幅曲線、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の融解曲線分析結果、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の増幅曲線、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の融解曲線分析結果、及び各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲの結果より作成した検量線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量方法は、（ａ）検体、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む組成物を調製する工程、（ｂ）工程（ａ）により調製した組成物を用いて核酸増幅反応を行う工程、並びに（ｃ）工程（ｂ）により得られた増幅産物を検出する工程を含む。
【００１５】
本発明の方法は、公知のいずれの血清型のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムにも適用可能であり、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群より選択された少なくとも１種のＡＡＶのゲノムの定量に利用することができる。本発明の方法におけるＡＡＶとしては、本発明を特に限定するものではないが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）が例示される。なお、本明細書においてｒＡＡＶベクターの血清型について述べる場合、カプシドの由来となる血清型を基準とする。すなわち、ｒＡＡＶ調製時に使用されるｃａｐ遺伝子の由来に応じてそのｒＡＡＶベクターの血清型を決定するものとし、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノムの血清型の由来には依存しないものとする。例えば、カプシドがＡＡＶ６由来で、ｒＡＡＶ粒子中に封入されているＡＡＶゲノム中のＩＴＲがＡＡＶ２由来の場合は、本明細書中では当該ｒＡＡＶベクターは血清型６とする。
【００１６】
本発明のＡＡＶゲノムの定量方法は、ＡＡＶの定量に使用することができる。従って、本発明のＡＡＶゲノムの定量方法を利用したＡＡＶの定量方法は、本発明の好適な一態様である。ＡＡＶを含む組成物中のＡＡＶ粒子外のＤＮＡを分解又は除去した後に、ＡＡＶ粒子内よりゲノムＤＮＡを遊離させ、このゲノムＤＮＡを本発明のＡＡＶゲノムの定量方法で定量することにより、元のＡＡＶの量を推定することができる。同様に、こうしてＡＡＶの量を測定することにより実施されるｒＡＡＶベクターの力価の測定方法は、本発明の好適な一態様である。なお、ＡＡＶゲノムの定量により推定されたＡＡＶの力価は、ゲノム力価（ゲノムタイター）と言われることもある。ｒＡＡＶベクターは、ゲノムＤＮＡとカプシドとが異なる血清型のＡＡＶに由来するものであってもよい。例えば、本発明の方法により、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲとその内側に挿入された外来遺伝子とを含むゲノムＤＮＡを有し、ＡＡＶ２以外の血清型のＡＡＶに由来するカプシドを有するｒＡＡＶベクターの力価を測定することもできる。
【００１７】
本発明の方法における検体としては、ＡＡＶが存在するか、ＡＡＶの存在の有無の確認を要するサンプルからＡＡＶのゲノムＤＮＡを遊離させる工程を経て得られた検体が例示される。上記のサンプルとしては、例えば、宿主細胞内で産生したＡＡＶを宿主細胞から抽出する工程を経て得られた組成物や、ＡＡＶを産生する細胞の培養上清が例示され、なかでもｒＡＡＶベクター産生細胞からｒＡＡＶベクターを抽出する工程を経て得られたｒＡＡＶベクターを含む組成物や、ｒＡＡＶベクター産生細胞の培養上清が好適に例示される。
【００１８】
ＡＡＶの宿主細胞からの抽出方法、例えばｒＡＡＶベクターのｒＡＡＶベクター産生細胞からの抽出方法としては、本発明を特に限定するものではないが、例えば、凍結融解法、超音波破砕法、及び溶液抽出法が例示される。溶液抽出法としては、宿主細胞を酸性の溶液と接触させる方法が例示される。宿主細胞を酸性の溶液と接触させる方法は、遠心分離やろ過によって回収された宿主細胞の酸性の溶液への懸濁、又は宿主細胞を含む培養液への当該培養液を酸性とし得る成分の添加により実施される。酸性の溶液のｐＨとしては、例えばｐＨ３．０〜６．９、好ましくはｐＨ３．０〜６．０、より好ましくはｐＨ３．０〜５．０が例示される。また、酸性の溶液としては、本発明を特に限定するものではないが、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、及びそれらの塩、並びにＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ等の緩衝域がｐＨ７未満のグッドバッファーからなる群より選択された少なくとも１種を含有する溶液が例示される。本発明には、このうち、クエン酸、酢酸、リン酸、及びそれらの塩が好適に例示され、このうちクエン酸がより好適に例示される。
【００１９】
宿主細胞と酸性の溶液との接触の時間は、本発明を特に限定するものではないが、例えば１分〜４８時間、好適には５分〜２４時間が例示される。宿主細胞と酸性の溶液との接触の際の温度条件としては、例えば０〜４０℃、好適には４〜３７℃が例示される。宿主細胞から抽出されたＡＡＶ抽出液は、宿主細胞由来のＤＮＡを含有することがある。例えば、デオキシリボヌクレアーゼによる処理をＡＡＶ抽出液に施して、このＤＮＡを分解してもよい。
【００２０】
ＡＡＶからゲノムＤＮＡを遊離させるには、ＡＡＶのカプシドを破壊できる公知の方法を利用すればよく、例えば、ＡＡＶをタンパク質変性剤や界面活性剤を含む溶液で処理することによりゲノムＤＮＡを遊離させる方法、及び熱処理によりＡＡＶのカプシドを破壊する方法が例示される。こうして調製される遊離のＡＡＶゲノムを含有する溶液は、本発明のＡＡＶの定量方法における検体として用いることができる。
【００２１】
本発明の方法におけるアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対は、インターカレーティング色素を利用した定量的な核酸増幅反応に用いることによりＡＡＶベクターのゲノムＤＮＡの定量が可能なプライマー対であれば特に限定はない。本発明の方法をｒＡＡＶベクターのゲノムＤＮＡの定量に利用する場合、本発明を特に限定するものではないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６及びＡＡＶ７からなる群より選択された少なくとも１種のＡＡＶのＩＴＲに含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対が好ましい。
【００２２】
このようなプライマー対としては、例えば、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対、配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対、配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対、及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーと配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対が好適に例示される。これらのプライマーはＡＡＶ２及びＡＡＶ６由来のＩＴＲ配列を元に設計したプライマーであり、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６及びＡＡＶ７のＡＡＶゲノムや、これらの血清型のＡＡＶに由来するＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターのゲノムの定量に使用することができる。リアルタイムＰＣＲにより算出されるＣｔ値と鋳型量との相関性、高い相関性が得られる鋳型量の範囲、及びＰＣＲの増幅効率の観点からは、配列表の配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと配列表の配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマー対がより好適に例示される。本発明の方法において核酸増幅反応に使用される各プライマーの量は、本発明を特に限定するものではないが、核酸増幅反応の反応液２５μＬあたり０．５〜１５ｐｍｏｌが、好適には１〜１０ｐｍｏｌが、より好適には２〜８ｐｍｏｌ、例えば５ｐｍｏｌが例示される。
【００２３】
本明細書においてインターカレーティング色素とは、二本鎖核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素のことを言う。本発明におけるインターカレーティング色素は、特にこれらに限定されるものではなく、核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素であれば、本発明におけるインターカレーティング色素に包含される。当該色素としては、特に限定はされないが例えば、臭化エチジウムやシアニン系色素が挙げられる。前記シアニン系色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯ、ＳＹＴＯ９、ＬＣＧｒｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、及びこれらの類似体等が例示される。本発明の方法におけるインターカレーティング色素としては、なかでもＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉが好適である。
【００２４】
ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、非対称シアニン系色素であり、その構造はＺｉｐｐｅｒ  Ｈら（“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”、２００４年、第３２巻、第１２号、ｅ１０３）により明らかにされている。当該文献では、下記式（Ｉ）に示される［２−［Ｎ−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ］、あるいはその塩と解析されている。言い換えると、Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［４−［（Ｅ）−（３−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−１−ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ−１−ｉｕｍ−２−ｙｌ］−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩である。これらは、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉと称されている。さらに当該色素は、前記式（Ｉ）で表される化合物のｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性体であってもよく、下記式（ＩＩ）に示される、Ｎ’，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−Ｎ−［４−［（Ｚ）−（３−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−１−ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｌｉｎ−１−ｉｕｍ−２−ｙｌ］−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌｐｒｏｐａｎｅ−１，３−ｄｉａｍｉｎｅ、あるいはその塩も使用できる。
【００２５】
【化３】
0006567974.tif 000004
【００２６】
【化４】
0006567974.tif 000005
【００２７】
Ｚｉｐｐｅｒ  Ｈらによれば、ライフテクノロジーズ社より販売されているＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＩのＤＭＳＯ溶液の１０，０００倍希釈液（×１濃度）のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉのモル濃度は、約２μＭである。定量的な核酸増幅反応に好適なインターカレーティング色素の濃度は、当業者であれば公知の情報を参考に適宜決定可能であるが、例えば×０．０２５濃度（約５０ｎＭ）以上、好適には×０．０５濃度（約１００ｎＭ）〜×２濃度（約４μＭ）、より好適には×０．１濃度（約２００ｎＭ）〜×１濃度（約２μＭ）が例示される。
【００２８】
本発明の方法に利用可能な核酸増幅反応としては、ＤＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する反応であれば特に限定はないが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＩＣＡＮ、ＬＡＭＰ、ＳＤＡ等の当分野で周知の核酸増幅反応が例示され、なかでもＰＣＲが好適に例示される。
【００２９】
本発明の方法にＰＣＲを利用する場合、ＰＣＲの温度サイクル条件としては一般的な条件が適用できる。例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、又は「シャトルＰＣＲ」［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸  酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６）］と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング及び伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応によりＰＣＲが実施される。ＰＣＲの温度サイクルは、本発明を特に限定するものではないが、非特異的な増幅産物の産生を避けるため、４０サイクル未満、例えば３５サイクル程度が好ましい。特に限定はされないが例えば、９５℃  ２分間処理後、９５℃  ５秒、６０℃  ３０秒を１サイクルとする３５サイクル反応が挙げられる。
【００３０】
本発明の方法における核酸増幅反応により得られた増幅産物の検出は、インターカレーティング色素の蛍光強度を測定することにより実施できる。インターカレーティング色素の蛍光強度の測定は、核酸増幅反応を行う工程の過程において実施しても良く、この場合、核酸増幅過程のモニタリングが可能である。核酸増幅過程のモニタリングには、例えば市販のリアルタイムＰＣＲ用装置、例えばＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いればよい。
【００３１】
核酸増幅過程のモニタリング結果を利用したＤＮＡの定量は、当該技術分野で公知の方法を利用すればよい。本発明を特に限定するものではないが、例えば、核酸増幅反応に使用するプライマー対による核酸増幅の鋳型となる核酸配列を有するスタンダードＤＮＡ（ポジティブコントロールＤＮＡ）の希釈系列を作成し、これを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を算出して検量線を作成し、これに基づいて検体中のＤＮＡを定量することができる。上記のスタンダード核酸としては、例えばプラスミドＤＮＡを用いることができる。Ｃｔ値の算出方法としては、例えば閾値と増幅曲線の交点をＣｔ値とする方法（Ｃｒｏｓｓｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ法）や、増幅曲線の２次導関数を求めてそれが最大となる点をＣｔ値とする方法（２ｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ法）が利用できる。
【００３２】
本発明の方法は、更に融解曲線分析を実施する工程を含んでもよい。融解曲線分析では、核酸増幅反応後に反応液の温度を徐々に上げ、その際にインターカレーティング色素の蛍光シグナルをモニタリングする。低温では核酸増幅産物が二本鎖を形成して強い蛍光シグナルを示すが、ある一定の温度に達すると一本鎖に解離し、インターカレーティング色素の蛍光シグナル強度は急激に低下する。このときの温度が融解温度（Ｔｍ値）である。融解曲線分析により増幅産物のＴｍ値を調べ、特異的な増幅産物であるか否かを確認することができる。
【００３３】
本発明のアデノ随伴ウイルスゲノムを定量するための組成物は、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含み、本発明の方法の実施に利用できる。本発明の組成物は、更にＤＮＡポリメラーゼ、反応緩衝剤、２価の金属イオン、及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸からなる群より選択された少なくとも１種を含んでもよい。
【００３４】
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば特に限定はない。本発明を特に限定するものではないが、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼとしては、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）や好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の真正細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来ＤＮＡポリメラーゼ等）やＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）等の古細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが例示される。また、ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来酵素、組換体酵素のいずれであっても本発明に使用でき、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する範囲で天然由来のアミノ酸配列に改変が施されたＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用できる。
【００３５】
本発明の組成物には、２種類以上のＤＮＡポリメラーゼが含まれていても良い。２種類以上のＤＮＡポリメラーゼとしては、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが例示される。なお、このような２種類のＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行う技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）として知られている。本発明を特に限定するものではないが、本発明には３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせが好適である。
【００３６】
本発明の組成物中のＤＮＡポリメラーゼの濃度は、ＤＮＡ合成反応が実施可能な濃度であれば特に限定はなく、例えばＰＣＲが実施可能な濃度が例示される。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来ＤＮＡポリメラーゼを用いて反応液量２５μＬでＰＣＲを行う場合、反応液中のＤＮＡポリメラーゼの量は０．１２５〜５Ｕ程度にすればよい。なお、本明細書に記載の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、市販の酵素の表示に基づくものであり、例えば、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、活性測定用反応液（２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、各２００μＭ  ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＴＴＰ、１００μＭ  ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ  活性化サケ精子ＤＮＡ）中にて、７４℃において３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとする。
【００３７】
本明細書において反応緩衝剤とは、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物のｐＨは、ＰＣＲが実施される通常の範囲、例えばｐＨ８．０〜ｐＨ９．５の範囲に設定されるのが適当である。
【００３８】
本発明の組成物に含まれる２価の金属イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン、及びコバルトイオンが例示される。各ＤＮＡポリメラーゼに適する２価の金属イオンとその濃度は、当該分野でよく知られている。２価の金属イオンは塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物中の２価の金属イオンの濃度としては、例えば０．５〜２０ｍＭが例示される。
【００３９】
デオキシリボヌクレオチドは、有機塩基に結合したデオキシリボースにホスホジエステル結合を介してリン酸基が結合した化合物である。それぞれアデニン、グアニン、シトシン及びチミン塩基を有する４種のデオキシリボヌクレオチドが天然型ＤＮＡに見られる。塩基のアデニン、グアニン、シトシン、及びチミンはそれぞれ、Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴと略されることが多い。デオキシリボヌクレオチドは、遊離の一リン酸型、二リン酸型及び三リン酸型（すなわち、リン酸基が、それぞれ、１つ、２つ又は３つのリン酸部分を有する）を含む。また、塩基部分にヒポキサンチンやウラシルを有するデオキシリボヌクレオシド三リン酸も核酸増幅反応に使用できることが知られている。本発明の組成物には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＵＴＰ）及びそれらの誘導体の少なくとも１種が使用できる。本発明の組成物に含まれうるデオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ（又はｄＵＴＰ）の混合物が例示される。
【００４０】
本発明のアデノ随伴ウイルスの定量用のキットは、ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素を含む。ＤＮＡポリメラーゼ、アデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復配列に含まれる核酸配列のみを増幅するための少なくとも１対のプライマー対、及びインターカレーティング色素は、これらのうち一部又は全部が混合された状態でキットに包含されていても、それぞれが単独のコンポーネントの状態でキットに包含されていてもよい。
【００４１】
本発明のキットは、更に反応緩衝剤、２価の金属イオン、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、宿主細胞からＡＡＶを抽出するための試薬、ＡＡＶのウイルス粒子外のＤＮＡを分解又は除去するための試薬、ＡＡＶからＡＡＶゲノムを遊離させるための試薬、ＤＮＡ溶液の希釈のための試薬、及び検量線作成用のポジティブコントロールＤＮＡからなる群より選択された少なくとも１種を含んでも良い。
【００４２】
上記の宿主細胞からＡＡＶを抽出するための試薬としては、本発明を特に限定するものではないが、ｐＨ３．０〜６．９、好ましくはｐＨ３．０〜６．０、より好ましくはｐＨ３．０〜５．０の酸性の溶液が例示される。また、酸性の溶液としては、本発明を特に限定するものではないが、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸、ギ酸、及びそれらの塩、並びにＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ等の緩衝域がｐＨ７未満のグッドバッファーからなる群より選択された少なくとも１種を含有する溶液が例示される。本発明には、このうち、クエン酸、酢酸、リン酸、及びそれらの塩が好適に例示され、このうちクエン酸がより好適に例示される。
【００４３】
上記のＡＡＶのウイルス粒子外のＤＮＡを分解又は除去するための試薬としては、例えばＤＮａｓｅＩ等のデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）が例示される。ＡＡＶのウイルス粒子外のＤＮＡを分解又は除去するための試薬としてＤＮａｓｅを利用する場合、本発明のキットは、更にＤＮａｓｅ用の反応緩衝液を含んでいてもよい。
【００４４】
上記のＡＡＶからＡＡＶのゲノムＤＮＡを遊離させるための試薬としては、例えば、タンパク質変性剤や界面活性剤を含む溶液が例示される。
【００４５】
上記の検量線作成用のポジティブコントロールＤＮＡとしては、本発明のキットに含まれるプライマー対により核酸増幅が可能な核酸配列を含む核酸が例示される。このような核酸としては、例えばプラスミドＤＮＡが例示される。
【実施例】
【００４６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の実施例におけるリアルタイムＰＣＲの反応装置としては、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（タカラバイオ社製）を使用した。【００４７】
実施例１  プライマー設計
２型ＡＡＶ（以下、ＡＡＶ２）のゲノム塩基配列情報（ＲｅｆＳｅｑ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＮＣ＿００１４０１）を元に、ＡＡＶ２のＩＴＲに対して５’側プライマー及び３’側プライマーを設計した。５’側プライマーは、Ｌ１（配列番号１）、Ｌ２（配列番号２）、Ｌ３（配列番号３）、Ｌ４（配列番号４）、Ｌ５（配列番号５）、及びＬ６（配列番号６）の６種類、３’側プライマーは、Ｒ１（配列番号７）、Ｒ２（配列番号８）、Ｒ３（配列番号９）、Ｒ４（配列番号１０）、Ｒ５（配列番号１１）、Ｒ６（配列番号１２）、及びＲ７（配列番号１３）の７種類である。【００４８】
実施例２  ｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノムの調製
（１）ｒＡＡＶ２ベクター製造用細胞の播種
細胞培養用１０ｃｍディッシュ（コーニング社製）に、１０％ＦＢＳ（ギブコ社製）を含むＤＭＥＭ（シグマ社製）に懸濁した２９３細胞を播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで終夜培養し、細胞がおよそ７０％コンフルエントになっていることを確認した。【００４９】
（２）ｒＡＡＶ２ベクター製造用プラスミドのトランスフェクション
前記実施例２−（１）で調製した細胞に、リン酸カルシウム法を用いて、ＡＡＶ２のＲｅｐタンパク質及びＣａｐタンパク質をコードするプラスミド、アデノウイルスのＥ２Ａ、ＶＡ、Ｖ４配列を含むプラスミド、並びにＡＡＶ２の２つのＩＴＲの間に蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１の発現カセットを含むプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクション７時間後、培地を完全に除去した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭをディッシュ１枚当たり１５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２日間培養した。【００５０】
（３）ｒＡＡＶ２ベクター産生細胞の回収
（２）の培養終了後、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶液３ｍＬを各ディッシュへ添加し、室温で数分間反応させることで細胞を剥離させた。その後、溶液ごと細胞を回収し、１，７５０×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清を除去した。細胞ペレットにクエン酸を含有する酸性バッファーを添加し、遠心分離後、その上清をｒＡＡＶ２ベクター抽出液とした。得られたｒＡＡＶ２ベクター抽出液中のＡＡＶ２のウイルス粒子外の核酸をＤＮａｓｅＩにて消化した後、タンパク質変性剤を用いてＡＡＶ２粒子よりゲノムＤＮＡを遊離させた。こうして得られた溶液を、ｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液とした。【００５１】
実施例３  プライマーペア選定のためのスクリーニング
実施例１において設計した６種類の５’側プライマーと７種類の３’側プライマーとを組み合わせてプライマーペア（全４２通り）とし、ＡＡＶゲノムの定量に有効なプライマーペアのスクリーニングを行った。スクリーニングには、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を使用し、以下の反応組成で行った。ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２×ｃｏｎｃ．）  １２．５μＬ、各１０μＭ  プライマーミックス  ０．５μＬ、鋳型  ５．０μＬを混合し、滅菌水にて全量を２５μＬにした。鋳型にはポジティブコントロールとして実施例２で調製したｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた。また、鋳型の代わりに滅菌水を使用する以外は上記と同様の反応組成のものを調製し、これをネガティブコントロールの反応液とした。反応は、ネガティブコントロールとポジティブコントロール共に、プライマーペア毎に２反応ずつ行った。反応及び検出は、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩを使用し、９５℃、２分（初期変性）の後、９５℃、５秒〜６０℃、３０秒を１サイクルとする３５サイクルのリアルタイムＰＣＲにより行った。また、ＰＣＲ終了後には、融解曲線分析を行った。【００５２】
リアルタイムＰＣＲにより得られた増幅曲線と融解曲線分析の結果を各プライマーペアについてまとめたものを、図１、２、３に示す。また、この結果に基づいて、ポジティブコントロールにおける反応性について各プライマーペアに関して行った判定を表１に、ネガティブコントロールにおける非特異的増幅の有無について各プライマーペアに関して行った判定を表２に示した。表１中、「○」は良好な増幅シグナルが認められる組み合わせを、「×」はそうでない組み合わせを示し、表２中、「○」は非特異的増幅シグナルが認められない組合せを、「×」は非特異的増幅シグナルが認められる組み合わせをそれぞれ示す。【００５３】
【表１】
0006567974.tif 000006
【００５４】
【表２】
0006567974.tif 000007
【００５５】
この結果より、プライマーの組み合わせとしては、全４２種類の組合せのうち、僅かにＬ１／Ｒ１、Ｌ１／Ｒ２、Ｌ２／Ｒ１、Ｌ２／Ｒ２の組み合わせのみが有望であった。【００５６】
実施例４  定量性の確認
実施例３より有望であったプライマーセットＬ１／Ｒ１、Ｌ１／Ｒ２、Ｌ２／Ｒ１、Ｌ２／Ｒ２の４通りを用いて定量性の確認を行った。定量性の確認には、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）を使用し、以下の反応組成で行った。ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２×ｃｏｎｃ．）  １２．５μＬ、前記４通りの各１０μＭ  プライマーミックス  ０．５μＬ、鋳型  ５．０μＬを混合し、滅菌水にて全量を２５μＬにした。反応液は、鋳型として実施例２で調製したｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を使用したもの、ＡＡＶ２のＩＴＲ中の増幅領域を搭載したプラスミドＤＮＡの１０倍段階希釈物（１×１０２コピー／５μＬ、１×１０３コピー／５μＬ、１×１０４コピー／５μＬ、１×１０５コピー／５μＬ、１×１０６コピー／５μＬ、又は１×１０7コピー／５μＬ）を使用したもの、及びネガティブコントロールとして鋳型の代わりに滅菌蒸留水を用いたものを調製した。反応及び検出は、９５℃、２分（初期変性）の後、９５℃、５秒〜６０℃、３０秒を１サイクルとする３５サイクルのリアルタイムＰＣＲにより行った。また、リアルタイムＰＣＲの終了後には融解曲線分析を行った。さらに、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲの結果より検量線を作成し、得られた検量線よりｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノムの定量解析を行った。【００５７】
結果を図４に示した。図４では、各プライマーセットについて、上から順に、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の増幅曲線、各コピー数のプラスミドＤＮＡを鋳型として用いた場合の融解曲線分析結果、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の増幅曲線、鋳型としてｒＡＡＶ２ベクター由来の粗精製ゲノム溶液を用いた場合とネガティブコントロールの反応の融解曲線分析結果、及び検量線を示す。図４から明らかな通り、いずれのプライマーセットも良好な定量性を示し、ｒＡＡＶ２のゲノムＤＮＡを定量することができた。また、非特異的増幅も認められなかった。Ｌ１／Ｒ１の組み合わせでは、１×１０３コピー〜１×１０７コピーの鋳型量の範囲で相関係数（Ｒ２）が１．０００の検量線が得られた。また、この鋳型量の範囲でのＬ１／Ｒ１をプライマーセットとして用いた場合の反応効率は９９．７％であり、４種類のプライマーセットを用いた反応のうち最も１００％に近い反応効率であった。本実施例により、プライマーセットＬ１／Ｒ１、Ｌ１／Ｒ２、Ｌ２／Ｒ１、Ｌ２／Ｒ２の４通りがＡＡＶ２のゲノムＤＮＡの定量用のプライマーセットとして優れており、なかでもＬ１／Ｒ１の組み合わせが最も優れていることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、医学、遺伝子工学、生物学分野において特に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５９】
SEQ ID NO:1 ; Designed PCR primer "L1"
SEQ ID NO:2 ; Designed PCR primer "L2"
SEQ ID NO:3 ; Designed PCR primer "L3"
SEQ ID NO:4 ; Designed PCR primer "L4"
SEQ ID NO:5 ; Designed PCR primer "L5"
SEQ ID NO:6 ; Designed PCR primer "L6"
SEQ ID NO:7 ; Designed PCR primer "R1"
SEQ ID NO:8 ; Designed PCR primer "R2"
SEQ ID NO:9 ; Designed PCR primer "R3"
SEQ ID NO:10 ; Designed PCR primer "R4"
SEQ ID NO:11 ; Designed PCR primer "R5"
SEQ ID NO:12 ; Designed PCR primer "R6"
SEQ ID NO:13 ; Designed PCR primer "R7"
【図１】
0006567974.tif 000008
【図２】
0006567974.tif 000009
【図３】
0006567974.tif 000010
【図４】
0006567974.tif 000011
【配列表】
0006567974000001.app