(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を含む炭水化物の糖化を触媒する方法であって、前記炭水化物を、配列番号６のアミノ酸配列からなる単離または精製された切断型プルラナーゼと、糖化に適した条件で接触させることを含み、前記条件にはｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つが含まれる、方法。
【請求項２】
前記糖化のための条件が、ｐＨ４．０であることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖化のための条件が、温度が６０℃であることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖化のための条件が、ｐＨが４．５以下であり、かつ、温度が６０℃〜６４℃であることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記炭水化物が、デンプン、アミロペクチン、デキストラン、マルトデキストリン、プルラン、およびグリコーゲンからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、配列番号４のアミノ酸配列からなる親プルラナーゼを用いて実施した方法と比較したときに、糖化速度増加、ｐＨ４．５未満の酸性ｐＨでのより高い触媒活性、および６４℃までの温度でのより高い触媒活性のうちの少なくとも１つを示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を含む炭水化物の糖化を触媒する方法であって、前記炭水化物を、グルコアミラーゼと、配列番号６のアミノ酸配列からなる単離または精製された切断型プルラナーゼと、糖化に適した条件で接触させることを含み、前記条件にはｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つが含まれる、方法。
【請求項８】
前記糖化のための条件がｐＨ４．０であることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記糖化のための条件がｐＨ４．５以下であり、かつ温度６０℃〜６４℃であることを含む、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記炭水化物が、デンプン、アミロペクチン、デキストラン、マルトデキストリン、プルラン、およびグリコーゲンからなる群から選択される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、配列番号４のアミノ酸配列からなる親プルラナーゼを用いて実施した方法と比較したときに、糖化速度増加、ｐＨ４．５未満の酸性ｐＨでのより高い触媒活性、および６４℃までの温度でのより高い触媒活性のうちの少なくとも１つを示す、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を含む炭水化物の糖化を触媒するシステムであって、前記炭水化物とグルコアミラーゼと配列番号６のアミノ酸配列からなる単離または精製された切断型プルラナーゼを含む、システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
トウモロコシ、キャッサバ、米、ジャガイモおよび小麦から抽出されたデンプンは、デンプン産業において、糖および誘導体を大量生産するための原材料の主要な供給源として役立っている。一般的なデンプンは、通常、アミロースとアミロペクチンの２種類の巨大分子で構成されており、それぞれの相対量は主に種によって異なる。アミロースは、α−１，４−グルコシド結合のみによって連結されたグルコース残基からなる線状多糖類であるのに対して、アミロペクチンでは、α−１，４−グルコシド結合の他に、グルコース残基はα−１，６−グルコシド結合によっても連結して、分岐点を形成する。デンプンを分解して単糖を得るために、デンプンは最初α−１，４−グルコシド結合を部分的に加水分解する熱安定性α−アミラーゼにより解重合され、続く糖化工程ではさらに、より小さい分岐型のおよび直線状の単位にグルコアミラーゼまたはβ−アミラーゼが添加されて、グルコースまたはマルトースに変換される（ノーマン（Ｎｏｒｍａｎ）、１９８２）。
【０００２】
デンプンの糖化工程中にα−１，６−グルコシド結合を加水分解することができる脱分枝酵素を添加することにより、より高純度のグルコースおよびマルトースシロップが得られることが提案されている。同時に、脱分枝酵素によって、糖化時間を短縮し、使用する基質の濃度を高めることができる（バクシ（Ｂａｋｓｈｉ）ら、１９９２）。今日、デンプンの転換、ビールの醸造、およびアミロースの製造などの業界で、このような用途が広まっている。
【０００３】
プルラナーゼ（プルラン６−グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．４１）は、デンプン、プルランおよび関連する分枝状多糖類に含まれているα−１，６−グルコシド結合を特異的に加水分解する脱分枝酵素として分類されるものである。デンプンを糖化する間の酵素技術の改善と生産コストの低減に対する需要が高まるにつれて、デンプン転換においてより効率的である改善されたプルラナーゼの探索は、産学官にとって重要な領域となっている。
【０００４】
植物および細菌から多くの微生物プルラナーゼが見出されており、それらには、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ダンフェール（ｄ  Ｅｎｆｅｒｔ）、リター（Ｒｙｔｅｒ）ら、１９８７）、フェルビドバクテリウム・ペンナボランス（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｎｎａｖｏｒａｎｓ）（コッホ（Ｋｏｃｈ）、カンガネラ（Ｃａｎｇａｎｅｌｌａ）ら、１９９７）、サーモアクチノミセス・サルポフィルス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｔｈａｌｐｏｐｈｉｌｕｓ）（オジボ（Ｏｄｉｂｏ）ら、１９８８）などが挙げられる（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら、１９７５）。細菌プルラナーゼ由来の改変型プルラナーゼ酵素も報告されている（例えば、米国特許第７，９０６，３０６号、米国特許第７，４４９，３２０号、および米国特許第７，９６８，６９１号）。例えば、米国特許第７，４４９，３２０号では、成熟プルラナーゼを組換え宿主細胞の細胞外プロテアーゼで切断して得られる、天然のプルラナーゼ（配列番号２５）に由来し、Ｎ末端の９８アミノ酸残基が欠失している切断型と１０２アミノ酸残基が欠失している切断型プルラナーゼの混合物が報告されている。この混合物は、ｐＨ４．５で最も安定であると報告されている。しかし、切断型は単離されておらず、混合物の活性は、切断されていない成熟型の活性と比較されてもいない。
【０００５】
米国特許第７，９６８，６９１号では、Ｎ末端の１０４個のアミノ酸が欠失している、天然の細菌プルラナーゼに由来する切断型プルラナーゼが開示されている。切断型プルラナーゼをコードするプラスミドを枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に形質転換し、プルラン過剰アッセイ（１００ｍＭ  ＮａＡｃ  ｐＨ５．０，１％中で０．１％）でのハロー形成についてスクリーニングすることによって、プルラナーゼ活性を試験した。
【０００６】
商業的に最も価値の高いプルラナーゼは、バチルス種、特にバチルス・アシドプルリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）由来のプルラナーゼ（ラパライネン（Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ）ら、１９９１；クサノ（Ｋｕｓａｎｏ）ら、１９８８）およびバチルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）由来のプルラナーゼ（デウィア（Ｄｅｗｅｅｒ）ら、米国特許第６，０７４，８５４号、２０００年）である。これらのプルラナーゼは、他の供給源から得られるプルラナーゼと同様に、分子量が約１００ｋＤで、６０℃、酸性ｐＨの範囲でα−１，６−グルコシド結合を加水分解する能力を有する。バチルス・アシドプルリティクスおよびバチルス・デラミフィカンス由来のプルラナーゼは、デンプン産業における高純度のグルコースおよびマルトースの製造に適しているが、高温および低ｐＨ、特に、工業プロセスを制御するために用いられることが多い条件である、６０℃を超える温度および４．５未満のｐＨ値で、糖化速度が遅く、酵素活性が低下する。
【０００７】
したがって、当技術分野において、温度６０℃超、ｐＨ値４．５未満の酸性ｐＨにおいて、糖化率が高く、かつ、酵素活性の改善された改良型プルラナーゼ酵素が必要とされている
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、対応する親プルラナーゼ酵素と比較して、α−１，６−グルコシド結合の糖化を触媒する点で、改善された能力を有する切断型プルラナーゼ酵素を提供することによって、このニーズを満たすものである。特に、本発明の切断型プルラナーゼ酵素は、対応する親プルラナーゼ酵素の酵素活性と比較して、６０℃を超える温度および４．５未満の酸性ｐＨ値で、改善された酵素活性を示す。
【０００９】
１つの一般的な側面において、本発明は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む親プルラナーゼの、アミノ末端から９４〜１１５番目のアミノ酸残基が欠失している、単離または精製された切断型プルラナーゼに関する。
【００１０】
本発明の特定の態様によれば、切断型プルラナーゼは、親プルラナーゼのアミノ末端から９４アミノ酸、１０２アミノ酸、または１０４アミノ酸を欠失している。他の特定の態様では、切断型プルラナーゼは、配列番号６，８または９のアミノ酸配列からなる。
【００１１】
別の一般的な側面において、本発明は、炭水化物に含まれるα−１，６−グルコシド結合を加水分解する方法に関し、この方法は、１，６−グルコシド結合を加水分解するのに適した条件で、炭水化物を本発明の単離されたまたは精製された切断型プルラナーゼと接触させることを含む。
【００１２】
別の一般的な側面において、本発明は、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を含む炭水化物の糖化を触媒する方法に関し、この方法は、炭水化物を、親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５番目のアミノ酸残基が欠失している単離または精製された切断型プルラナーゼと、糖化に適した条件で接触させることを含み、ここでこの条件には、ｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つが含まれ、ならびに、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
別の一般的な側面において、本発明は、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を含む炭水化物の糖化を触媒する方法に関し、この方法は、炭水化物を、グルコアミラーゼおよび親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５番目のアミノ酸残基が欠失している単離または精製された切断型プルラナーゼと、糖化に適した条件で接触させることを含み、ここでこの条件には、ｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つが含まれ、ならびに、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
さらに別の一般的な側面において、本発明は、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を含む炭水化物の糖化を触媒するシステムに関し、このシステムは、炭水化物とグルコアミラーゼと親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５番目のアミノ酸残基が欠失している単離または精製された切断型プルラナーゼを、糖化に適した条件下で含み、ここでこの条件には、ｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つが含まれ、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明の特定の態様において、切断型プルラナーゼは、配列番号６、配列番号８、および配列番号９からなる群より選択されるアミノ酸からなる。
【００１６】
さらに別の一般的な側面において、本発明は、グルコアミラーゼと、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を有する親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５番目のアミノ酸残基が欠失している単離または精製された切断型プルラナーゼを含む組成物に関する。
【００１７】
さらに別の一般的な側面において、本発明は、本発明の切断型プルラナーゼを製造する方法に関し、この方法は、
（ａ）切断型プルラナーゼをコードしている合成ポリヌクレオチドを含んでいる組換え宿主細胞を、切断型プルラナーゼの発現に適した条件下で生育させること；および、
（ｂ）組換え宿主細胞またはその上清から切断型プルラナーゼを得ること、
を含む。
【００１８】
本発明の態様はまた、本発明の切断型プルラナーゼをコードするポリヌクレオチド、本発明の切断型プルラナーゼをコードしている合成ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびその発現ベクターを含む組換え宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ｐＹＦ−ｔｓＤＥベクターの模式図である。このベクターは、３０℃で活性のある温度感受性複製起点と、大腸菌では３００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに、そして枯草菌では５μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに耐性をもつエリスロマイシン決定遺伝子（ＥｒｍＣ）を含み、本発明の態様による切断型プルラナーゼをコードする合成核酸を含む組換え宿主細胞を構築するために使用することができる。
【図２】図２は、ｐＵＣ５７−ＫＳ−ｅｒｍベクターの模式図である。本発明の一態様では、このｐＵＣ５７−ＫＳ−ｅｒｍベクターからｐＹＦ−ｔｓＤＥベクターを得ることができる。
【図３】図３は、親プルラナーゼ（配列番号４）（レーン１）と対応する切断型プルラナーゼ（配列番号８）（レーン２）とのサイズ比較を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。切断型プルラナーゼは、親プルラナーゼのＮ末端の１〜１０４アミノ酸残基を欠失している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特段の規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本出願では特定の用語が使用されるが、これらは、明細書中で示される意味を有する。本明細書および添付の請求項で使用する場合、単数形の「１つ」「１種」および「この」は、そうでないことが明示されていない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
【００２１】
本明細書で使用する場合「プルラナーゼ」および「プルラナーゼ酵素」という用語は、多糖類に含まれるα−１，６−グルコシド結合を加水分解することができる酵素を指す。プルラナーゼ酵素は、デンプンのような分岐した多糖類中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解して、直鎖多糖類、二糖類、または単糖成分を生じることができるため、脱分岐酵素としても知られている。例えば、プルラナーゼ酵素は、デンプンを分解して、α−１，４−結合グルコース糖の一次ポリマーである直鎖アミロースポリマーを生じることができる。
【００２２】
本明細書で使用する場合「親プルラナーゼ」および「親プルラナーゼ酵素」という用語は、天然のプルラナーゼを指す。この天然のプルラナーゼには、好ましくは、バチルス・スブチリス、クレブシエラ・ニューモニエ、フェルビドバクテリウム・ペンナバンス（Ｆｅｒｖｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｎｎａｖａｎｓ）、サーモアクチノミセス・サルポフィルス、バチルス・アシドプルリティクス、バチルス・デラミフィカンスおよびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来の細菌プルラナーゼが含まれるが、これらには限定されない。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、天然のプルラナーゼは、バチルス菌株、好ましくはバチルス・アシドプルリティクスまたはバチルス・デラミフィカンス由来のプルラナーゼである。バチルス・アシドプルリティクスおよびバチルス・デラミフィカンスから得られるプルラナーゼの完全長コード配列を、それぞれ、配列番号１および３に示す。これらのプルラナーゼに対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２および４に示す。
【００２４】
本明細書で使用する場合「切断型プルラナーゼ」という用語は、対応する親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５アミノ酸残基のＮ末端欠失を有し、かつ、α−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を保持している、親プルラナーゼの天然に存在しない変異体を指す。本発明の態様によれば、Ｎ末端欠失は、親プルラナーゼのアミノ酸配列の最初のアミノ酸残基、すなわち１番目のアミノ酸残から始まるものである。
【００２５】
本明細書で使用する場合「糖化」という用語は、炭水化物を、単糖類、二糖類および多糖類を含むより小さな成分に分解するプロセスを総称するものとする。プルラナーゼ酵素または切断型プルラナーゼに関して使用される場合、「糖化」という用語は、具体的には、炭水化物に含まれるα−１，６−グルコシド結合、特に分岐した炭水化物中のα−１，６−グルコシド結合の加水分解を指す。
【００２６】
本明細書で使用する場合「α−１，６−グルコシド結合」という用語は、１つ目のグルコース糖のＣ６炭素と、２つ目のグルコース糖のアノマー炭素（Ｃ１炭素）に結合した酸素との間に形成される結合を指し、２つ目のグルコース糖はαアノマーである。
【００２７】
本発明は、親プルラナーゼ由来の切断型プルラナーゼに関する。親プルラナーゼは天然のプルラナーゼであり、好ましくは天然の細菌プルラナーゼである。本発明の態様によれば、切断型プルラナーゼは、親プルラナーゼ酵素のアミノ酸配列のＮ末端から９４〜１１５アミノ酸残基を欠失しており、欠失は親プルラナーゼ酵素の１番目のアミノ酸残基から始まる。
【００２８】
本発明は、切断型プルラナーゼの変異体も包含する。本発明の態様によれば、切断型プルラナーゼの変異体は、切断型プルラナーゼ酵素のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列、例えば９５％、９６％、９７％、９８％９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。切断型プルラナーゼは、例えば、１つ以上のアミノ酸残基を介して小分子との共有結合させることによって修飾することもできる。
【００２９】
本発明の態様によれば、親プルラナーゼのアミノ末端からの欠失は、９４個から１１５個までのアミノ酸残基の欠失であり得る。例えば、Ｎ末端欠失は、または親プルラナーゼのアミノ末端から始まる、アミノ酸残基１〜１１５の欠失；アミノ酸残基１〜１１１の欠失；アミノ酸残基１〜１１０の欠失；アミノ酸残基１〜１０４の欠失；アミノ酸残基１〜１０２の欠失；アミノ酸残基１〜１００の欠失；アミノ酸残基１〜９４の欠失であり得る。
【００３０】
本発明の好ましい態様によれば、切断型プルラナーゼは、親プルラナーゼのアミノ末端からの９４，１０２または１０４個のアミノ酸を欠失している。
【００３１】
本発明の態様によれば、親プルラナーゼ酵素は、好ましくは、天然の細菌プルラナーゼである。細菌プルラナーゼとしては、バチルス・スブチリス、クレブシエラ・ニューモニエ、フェルビドバクテリウム・ペンナボランス、サーモアクチノミセス・サルポフィルス、バチルス・アシドプルリティクス、バチルス・デラミフィカンスおよびバチルス・セレウス由来の細菌プルラナーゼが含まれるが、これらには限定されない。
【００３２】
本発明の態様によれば、親プルラナーゼは、バチルス属の細菌、好ましくはバチルス・アシドプルリティクスまたはバチルス・デラミフィカンスから得られるプルラナーゼ、より好ましくはバチルス・デラミフィカンスから得られるプルラナーゼである。特定の態様において、親プルラナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を有するバチルス・アシドプルリティクスのプルラナーゼ、または配列番号４のアミノ酸配列を有するバチルス・デラミフィカンスのプルラナーゼである。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、切断型プルラナーゼは、配列番号４を有する天然のバチルス・デラミフィカンス由来のプルラナーゼを親プルラナーゼとするものである。好ましい一態様では、配列番号４を有する親プルラナーゼのＮ末端から１〜９４のアミノ酸残基を欠失させて、配列番号６を含む短縮型プルラナーゼを提供する。別の好ましい態様では、配列番号４を有する親プルラナーゼのＮ末端から１〜１０４のアミノ酸残基を欠失させて、配列番号８を含む短縮型プルラナーゼを提供する。本発明によるこれらの切断型プルラナーゼ酵素は、それぞれ、配列番号５および配列番号７に示したポリヌクレオチド配列によってコードすることができる。さらに別の好ましい態様では、配列番号４を有する親プルラナーゼのＮ末端から１〜１０２のアミノ酸残基を欠失させて、配列番号９を含む切断プルラナーゼを提供する。
【００３４】
本発明の特定の態様では、切断型プルラナーゼは、配列番号６、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列からなる。
【００３５】
本発明による切断型プルラナーゼは、α−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒する能力を保持している。さらに、これらの切断型プルラナーゼは、早い糖化速度、酸性ｐＨで（特にｐＨ値４．５未満で）のより高い触媒活性、および、反応温度が高ければ高いほど触媒活性が高くなるなど、親プルラナーゼよりも優れた特性を有する。
【００３６】
本発明の態様によれば、切断型プルラナーゼは対応する親プルラナーゼの触媒活性と比較して、酸性のｐＨ値、特にｐＨ４．５未満でより高い触媒活性を有し、かつ、６０℃以上の温度、特に６０℃〜６４℃の温度でより高い触媒活性を有する。これらの優れた特性から、本発明の切断型プルラナーゼはデンプン産業において用いられる調製法およびプロセスにとって、特に望ましいものと言える。これは、少なくとも、そのようなプロセスが、４．５未満のｐＨ値および６０℃を超える温度で実施されることが多いという点によってである。
【００３７】
従って、別の一般的な側面において、本発明は、炭水化物中のα−１，６−グルコシド結合を加水分解する方法であって、加水分解反応に適した条件で、炭水化物と本発明の単離または精製された切断型プルラナーゼとを接触させることを含む方法を提供する。本明細書に記載の切断型プルラナーゼはいずれも、本発明によるα−１，６−グルコシド結合を加水分解する方法において使用することができる。
【００３８】
本発明によるα−１，６−グルコシド結合を加水分解する方法では、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を有する任意の炭水化物を使用することができる。１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を有する炭水化物の非限定的な例には、デンプン、アミロペクチン、デキストラン、マルトデキストリン、プルラン、グリコーゲンなどが挙げられる。
【００３９】
本発明はまた、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を有する炭水化物の糖化を触媒する方法を提供する。本発明の態様によれば、この方法は、糖化に適した条件で、炭水化物と、親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５個のアミノ酸が欠失した単離または精製された切断型プルラナーゼとを接触させることを含み、ここで、前記条件とは、ｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つであり、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
α−１，６−グルコシド結合を有する炭水化物の多くは、さらに、α−１，４−グルコシド結合を含み、そのような例としては、例えば、アミロペクチンが挙げられる。「α−１，４−グルコシド結合」とは、１つ目のグルコース糖のＣ４炭素と、２つ目のグルコース糖のアノマー炭素に結合した酸素との間に形成される結合を指し、２つ目のグルコース糖はαアノマーである。
【００４１】
したがって、さらに別の一般的な側面において、本発明は、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を有する炭水化物の糖化を触媒する方法を提供し、この方法は、炭水化物を、グルコアミラーゼと、親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５個のアミノ酸が欠失した単離または精製された切断型プルラナーゼとを接触させることを含み、ここで、前記条件とは、ｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つであり、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本明細書に記載の切断型プルラナーゼはいずれも、本発明による糖化方法に使用することができる。好ましい態様において、切断型プルラナーゼは、細菌性親プルラナーゼに由来するものであり、より好ましくは、バチルス・デラミフィカンス由来のプルラナーゼを親プルラナーゼとする。特に好ましい態様において、本発明の方法で使用される切断型プルラナーゼは、配列番号６、配列番号８、または配列番号９のアミノ酸配列からなる。
【００４３】
本発明の態様による糖化方法は、親プルラナーゼを用いて実施される方法と比較して、早い糖化速度、ｐＨ４．５未満の酸性ｐＨでのより高い触媒活性、および、６４℃までの温度でのより高い触媒活性のうちの少なくとも１つを示す。
【００４４】
本開示の観点から見ると、いずれのアミラーゼも糖化の方法で使用することができる。本明細書で使用する場合「アミラーゼ」および「アミラーゼ酵素」は、α−１，４−グルコシド結合を加水分解するグリコシド加水分解酵素を指す。アミラーゼの例としては、これらには限定されないが、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、およびβ−アミラーゼが挙げられる。アミラーゼはグルコアミラーゼであることが好ましい。
【００４５】
糖化反応において、本発明の切断型プルラナーゼをグルコアミラーゼと組み合わせて使用することには、デンプンからより高純度のグルコースおよびマルトースシロップを提供できるという利点がある。さらに、このような糖化反応では、基質濃度を低めることや高い転化効率が可能になり、さらに、デンプンを分解する産業プロセスにおいて用いられることが多い、高温かつ酸性ｐＨ値でのより高い触媒活性も実現可能となる。
【００４６】
糖化方法および／またはα−１，６−グルコシド結合を加水分解する方法は、本発明の切断型プルラナーゼによるα−１，６−グルコシド結合の加水分解に適した任意の温度およびｐＨで行うことができる。例えば、糖化反応は、６０℃から６１℃、６２℃、６３℃または６４℃などの６０℃から６４℃の高温で実施することができる。糖化および加水分解反応は、例えば、ｐＨ４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、５．０または５．５などの４．０〜５．５の範囲の酸性ｐＨ値で行うこともできる。
【００４７】
特定の一態様において、糖化のための条件には、ｐＨが４．０であることが含まれる。
【００４８】
別の特定の態様において、糖化のための条件には、温度が６０℃であることが含まれる。
【００４９】
さらに別の特定の態様において、糖化のための条件には、ｐＨが４．５以下であることおよび温度が６０〜６４℃であることが含まれる。
【００５０】
本発明の態様によれば、本発明の切断型プルラナーゼで行われる糖化反応は、親プルラナーゼを用いて実施される方法と比較して、早い糖化速度、酸性ｐＨでのより高い触媒活性、および６０℃より高い温度でのより高い触媒活性のうちの少なくとも１つを示す。好ましくは、この糖化反応は、４．５未満のｐＨおよび／または６０℃〜６４℃の温度で、α−１，６−グルコシド結合の加水分解を、より早く触媒する。
【００５１】
本発明はまた、グルコアミラーゼと、親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５アミノ酸が欠失した単離または精製された切断プルラナーゼを含む組成物に関し、ここで、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００５２】
本発明の態様によれば、組成物は、本明細書に記載の通り、本発明の切断型プルラナーゼのいずれかを含み得る。好ましい態様では、組成物は、親プルラナーゼのアミノ末端から１〜９４，１〜１０２または１〜１０４のアミノ酸残基が欠失した切断型プルラナーゼを含み、ここで、親プルラナーゼは配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。特に好ましい態様では、組成物は、配列番号６、配列番号８、または配列番号９からなる切断型プルラナーゼを含む。
【００５３】
本発明の態様によれば、本発明の切断型プルラナーゼおよびグルコアミラーゼを含む組成物は、本明細書に記載の糖化方法のいずれにおいても使用することができる。
【００５４】
さらに別の一般的な態様において、本発明は、１つ以上のα−１，６−グルコシド結合を有する炭水化物の糖化を触媒するためのシステムに関し、このシステムには、炭水化物、グルコアミラーゼ、および親プルラナーゼのアミノ末端から９４〜１１５番目までのアミノ酸を欠失している単離または精製された切断型プルラナーゼを、糖化に適した条件下に含み、ここでこの条件には、ｐＨ４．５以下および温度６０℃以上のうちの少なくとも１つが含まれ、親プルラナーゼは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
本明細書に記載されている切断型プルラナーゼはいずれも、本発明のシステムと共に使用することができる。糖化に適した条件はいずれも、本発明のシステムと共に使用することができる。
【００５６】
このシステムの特定の態様において、切断型プルラナーゼは、配列番号６、配列番号８、および配列番号９のアミノ酸配列からなる。
【００５７】
別の特定の態様において、糖化に好適な条件には、ｐＨが４．０であることが含まれる。
【００５８】
別の特定の態様において、糖化に好適な条件には、温度が６０℃であることが含まれる。
【００５９】
さらに別の特定の態様において、糖化に好適な条件には、ｐＨが４．５以下であることおよび温度が６０〜６４℃であることが含まれる。
【００６０】
さらに別の一般的な側面において、本発明は、本発明の切断型プルラナーゼをコードしている合成ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびそのような発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。本発明による発現ベクターは、本明細書に記載の切断型プルラナーゼのいずれかをコードする合成ポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある。発現ベクターはまた、宿主細胞の染色体に組み込まれる能力を有する場合がある。本発明の特定の態様によれば、発現ベクターは、配列番号５または配列番号７の合成ポリヌクレオチドを含む。
【００６１】
本発明による発現ベクターは、天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位、および天然または合成の終結配列をさらに含む場合がある。これらの遺伝的要素はまた、本発明による切断型プルラナーゼ酵素をコードしている合成ポリヌクレオチド配列と共に、発現カセットの一部を形成している場合もあり、そのような発現カセットは発現ベクターの一部を成している。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列、合成のリボソーム結合部位、本発明の切断型プルラナーゼをコードしている合成ポリヌクレオチド、および合成の終結配列などの要素を有する発現カセットを含んでいる場合がある。発現された切断型プルラナーゼの分泌を誘導するシグナル配列も発現ベクターまたは発現カセットに含めることができ、シグナル配列は、好ましくは、切断型プルラナーゼをコードしているポリヌクレオチドの開始コドンの上流に挿入される。好ましくは、発現ベクターは、切断型プルラナーゼの分泌を促すシグナル配列を含む。
【００６２】
本発明の好ましい態様によれば、発現ベクターは、細菌性宿主細胞、好ましくはバチルス株、より好ましくはバチルス・スブチリスにおいて発現させるのに適している。特に好ましい態様では、発現ベクターはバチルス株の染色体、より好ましくはバチルス・スブチリスの染色体に組み込むことができる。ポリヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むために使用され得る発現ベクターおよびそのような発現ベクターを構築する方法は、本開示を踏まえて、当業者にはよく知られている。
【００６３】
本発明の態様によれば、組換え宿主細胞を遺伝的に操作して、本発明の切断型プルラナーゼをコードする１つ以上の合成ポリヌクレオチド配列を含めることができる。当技術分野でよく知られている方法のいずれかを用いて、例えば染色体組込みによって、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明による切断型プルラナーゼ酵素をコードする１つ以上の合成ポリヌクレオチド配列を含めることができる。組込み工程で使用することができるベクターは、当技術分野でよく知られており（スエハル（Ｓｕｅｈａｒｕ）ら、１９９２）、好ましくは温度感受性起点および選択マーカーを含む。そのようなベクターでは、キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）型の機構によって、指定された座位で宿主細胞の染色体に選択的に組み込まれ、その後のインキュベーション期間中に、プラスミドの選択マーカーは、相同組換えによって除去される。
【００６４】
本発明の態様によれば、組換え宿主細胞は、内在性タンパク質を不活性化するように遺伝子操作された改変組換え宿主細胞であり得る。修飾された宿主細胞において不活性化され得る内在性タンパク質には、胞子形成細菌における胞子形成に影響する細胞外プロテアーゼおよびタンパク質が含まれるが、これらには限定されない。組換え宿主細胞は、本発明の切断型プルラナーゼをコードする１つ以上の合成ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する前に、または本発明の切断型プルラナーゼをコードする１つ以上の合成ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入した後に、内在性タンパク質を不活性化するように改変することができる。本発明の切断型プルラナーゼをコードする１つ以上の合成ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する前に、組換え宿主細胞を、内在性タンパク質を不活性化するように改変することが好ましい。
【００６５】
好ましい態様において、組換え宿主細胞は、いくつかの内在性タンパク質を不活性化するように既に操作されているバチルス・スブチリス細胞である。特に、バチルス・スブチリス株は、スブチリシン（ＡｐｒＥ）および中性メタロプロテアーゼＥ（ＮｐｒＥ）のような細胞外プロテアーゼを不活性化するように操作することができる。バチルス・スブチリス株は、ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子によってコードされる胞子形成特異的シグマ−Ｆ因子のような、胞子形成において役割を果たすタンパク質を不活性化するように操作することもできる。そのような遺伝子操作されたバチルス・スブチリス株は、発現されたプルラナーゼ酵素の発現および分泌の点で改良されているという利点を有する。
【００６６】
さらに別の一般的な側面において、本発明は、本発明による切断型プルラナーゼを産生する方法を提供する。本発明の態様によれば、この方法は、本発明の切断型プルラナーゼをコードしているポリヌクレオチド配列を含んでいる組換え宿主細胞を、切断型プルラナーゼの発現に適した条件下で生育させること、および組換え宿主細胞またはその上清から切断型プルラナーゼを得ること、を含む。
【００６７】
本明細書中に記載される組換え宿主細胞はいずれも、本発明による切断型プルラナーゼを産生する方法において使用することができる。本発明の切断型プルラナーゼをコードしている少なくとも１つの合成ポリヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を、切断型プルラナーゼの発現に適した任意の培養条件下で発現・培養することができる。組換え宿主細胞から分泌された切断型プルラナーゼは、組換え宿主細胞またはその上清からのものを含む細胞培養物から、ろ過、遠心分離などを含むがこれに限定されない当技術分野でよく知られている任意の方法によって回収することができる。
【００６８】
本発明の態様によれば、切断型プルラナーゼをコードしている合成ポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物を組み込んだ改変型バチルス・スブチリスの発酵によって、本発明の切断型プルラナーゼを高収率で産生することができる。使用されるバチルス・スブチリス株は抗生物質耐性遺伝子を欠くことが好ましく、したがって、環境にやさしく、食品工業用のグルコースまたはマルトースの商業的製造に使用できる切断型プルラナーゼの生産に適している。
【００６９】
いかなる理論にも拘束されることは望まないが、結晶構造の分析から、バチルス・アシドプルリティクス由来の成熟プルラナーゼのＮ末端の最初の１１１アミノ酸は不規則であると考えられている（ツルケンブルグ（Ｔｕｒｋｅｎｂｕｒｇ）、ブルゾゾウスキ（Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ）ら、２００９）。まだよく分かっていない成熟プルラナーゼタンパク質のＮ末端の構造に関するこの知見から、この酵素からは天然の三次元構造を損なうことなくＮ末端残基を除去することができ、そうすることで、より良好な構造安定性およびより高い酵素活性をもたらす可能性があると示唆される。ここでもいかなる理論にも拘束されることは望まないが、末端を切断することによる構造変化は、高温での選抜を行うことなく、タンパク質の熱安定性および酵素触媒活性の改善方を探索するための、迅速で効率的かつ非常に有効な方法であると考えられている。このような切断形態の酵素はまた、微生物中で行われるデンプンの糖化から得られる、またはそこから産生される天然のプルラナーゼよりも、分子量が小さいこと、および触媒活性が高く、特異的だという点で利点があり、これによってデンプン産業でも有用であり得る。したがって、バチルス・アシドプルリティクス由来の成熟プルラナーゼの結晶構造からの示唆に基づいて、この酵素は前述の理由により、Ｎ末端アミノ酸残基の除去を潜在的に許容すると考えられる。
【００７０】
本発明の以下の実施例は、本発明の性質をさらに説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって決定されると理解されたい。
【実施例】
【００７１】
実施例１：プラスミドｐＹＦ−ｔｓＤＥの構築
【００７２】
温度感受性プラスミドであるｐＹＦ−ｔｓＤＥ（図１参照）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に使えるシャトルプラスミドである。ｐＹＦ−ｔｓＤＥプラスミドは、３０℃で活性を示す温度感受性複製起点と、大腸菌では３００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに、そして枯草菌では５μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに耐性をもつエリスロマイシン決定遺伝子（ＥｒｍＣ）（スエハルら、１９９２）を含む。非許容温度である３７℃で複製起点は脱活性化され、プラスミドは、ＥｒｍＣ遺伝子選択のために指定された遺伝子座で宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００７３】
以下のように、ｐＹＦ−ｔｓＤＥプラスミドを構築した。ｐＵＣ５７−ＫＳ−ｅｒｍ（ジーンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）より入手、図２）をＢｇｌＩＩで二重消化した。酵素消化により生じた３．８ｋｂｐ断片を精製し、Ｔ４リガーゼ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いて再連結した。クローニングしたプラスミドをｐＹＦ−ｔｓＤＥとした。大腸菌ＴＯＰ１０細胞中で増殖させ、以下し示す全遺伝子操作に骨格として用いた。
【００７４】
実施例２：プロテアーゼ欠損枯草菌（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の構築
【００７５】
遺伝子操作された桿菌を組換え酵素生産のための宿主細胞として使用する方法は十分に確立されている（ウィドナー（Ｗｉｄｎｅｒ）ら、２０００）。これらの組換え宿主細胞は、一般に、発現させたい標的酵素配列をコードしている核酸構築物を、１つ以上含んでいる。本発明では、枯草菌を遺伝子操作のための受容株として選択した。バチルス株の核酸構築物による形質転換は、コンピテント細胞、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト形質転換（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびスピジゼン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）、１９６１；シゲカワ（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ）およびドワー（Ｄｏｗｅｒ）１９８８；チャン（Ｃｈａｎｇ）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）１９７９）など、当技術分野でよく知られている方法によって達成することができる。
【００７６】
本発明では、単一のプルラナーゼ酵素発現カセットを設計し、これは通常、天然または合成のプロモーター配列、輸送を効率的にするために桿菌から選択したシグナル配列、合成リボソーム結合部位、バチルス・デラミフィカンス由来のプルラナーゼコード遺伝子および合成の転写終結因子を含めた。この配置は、宿主株における遺伝子の発現レベルおよびプルラナーゼの分泌を実質的に増強する。プルラナーゼ酵素をコードする遺伝子を、バチルス細胞の染色体上の指定された遺伝子座での遺伝子交換するのは、プラスミド媒介性でシングルのクロスオーバー型相同組換えによって行うことができる。
【００７７】
細胞外プロテアーゼ活性は、桿菌における不均一な酵素分泌に有害な場合がある。２つの主要な細胞外プロテアーゼ、スブチリシンＥ（ＡｐｒＥ）と中性メタロプロテアーゼＥ（ＮｐｒＥ）は、桿菌における細胞外プロテアーゼ活性の８５％以上に寄与することが示されている。さらに、胞子形成桿菌は、発酵中に、生産効率を指数関数的に低下させる休眠細胞を形成する可能性がある。胞子形成特異的シグマ−Ｆ因子をコードしているｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子は、ＲＮＡポリメラーゼ転写の特異性を導くのに極めて重要な役割を果たし、ｓｐｏＩＩＡＣの遺伝子発現産物は胞子形成に必要である。
【００７８】
したがって、本発明では、プルラナーゼ遺伝子の発現が、構造的に完全なものになるように、前述した３つの遺伝子を、キャンベル型のシングルクロスオーバー機構によって連続的に不活性化した。簡単に説明すると、ｐＹＦ−ｔｓＤＥ（実施例１に記載したようにして得た）をＢｇｌＩＩで消化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して再連結を阻害した。それぞれの遺伝子を欠失させるために、欠失させたい遺伝子に隣接する約５００塩基対の相同領域をゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。単離したバチルス・スブチリスのコロニーを９８℃で５分間加熱し、これを直接、ＰＣＲ反応のゲノムＤＮＡ鋳型として用いた。ジーンスクリプトにより、以下に示すプライマー（配列番号１３〜２４）を合成し、ＰＣＲに使用して、バチルス・スブチリスのＡｐｒ、Ｎｐｒ及びＳｐｏＩＩＡＣ遺伝子の隣接配列をそれぞれ増幅した。
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【００７９】
増幅反応は、典型的には、全容積を５０μＬとし、９８℃で８分間初期変性を行い、続いて、９６℃で１５秒間、５８℃で１５秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを２５〜３０サイクル、最後に７２℃で２分間反応させて反応を終了させた。０．８％アガロースゲルで増幅産物を同定し、精製した。
【００８０】
内部に欠失を含む変異型を、スプライスオーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥ）により、以下のように構築した。別々のＰＣＲ反応から精製した各遺伝子の上流と下流の配列を１：１のモル比で一緒に混合して、増幅鋳型とした。ＸＸ−ＣＺ−Ｆ１およびＸＸ−ＣＺ−Ｒ２と標識したプライマーを用いて、各遺伝子のスプライシングされた断片を作製した。続いて、このフラグメントを、ジーンスクリプト社のクローンイージー（Ｃｌｏｎｅ−ＥＺ）クローニングキットを使い、ＢｇｌＩＩ部位で直線化したｐＹＦ−ｔｓＤＥベクターにクローニングした。構築された温度感受性プラスミドは、典型的には、対応する完全な遺伝子と比較して、４００〜５００塩基対の内部欠失を含有していた。これらの組換えプラスミドは、それぞれｐＹＦ−ｔｓＤＥ−Ａｐｒ、ｐＹＦ−ｔｓＤＥ−ＮｐｒおよびｐＹＦ−ｔｓＤＥ−ＳｐｏＩＩと表示した。
【００８１】
シングルクロスオーバー相同組換えによって、元の染色体遺伝子を有する完全な遺伝子の異なる対立遺伝子での交換を行った。ヤング（ヤングおよびスピジゼン、１９６１）に記載されている改変型の方法により、桿菌のコンピテント細胞に、対応する欠失プラスミドを形質転換した。３０℃の許容温度でエリスロマイシンを添加したプレートから、１個の形質転換体を選抜し、別のエリスロマイシン含有プレートに画線し、温度感受性プラスミドが宿主の染色体に組み込まれた形質転換体を選抜するために、３７℃の非許容温度でインキュベートした。指定された遺伝子座で遺伝子が置換された形質転換体を得るために、プレートから複数のコロニーを選抜して２ＹＴ培地に移し、３０℃で５〜７日間インキュベートした（新鮮な２ＹＴ培地を２日ごとに交換した）。エリスロマイシン感受性バチルス細胞を、プラスミドの切断および対立遺伝子置換（配列番号９，１０および１１参照）のためのＰＣＲによってスクリーニングした。さらに、１．０％脱脂粉乳を添加したＬＢプレート上で生育させた時に認められるハローの収縮によって、プロテアーゼ欠損の表現型を確認した。
【００８２】
実施例３：プルラナーゼ産生バチルス株の構築
【００８３】
組込みプラスミドは、ｐＹＦ−ｔｓＤＥを使用して基本的には前述したのと同様の方法で構築した。発現カセットを染色体の指定されたＡｍｙＥ座に組み込むために、プルラナーゼ発現カセットに、染色体のＡｍｙＥ座の上流および下流配列の８００塩基対相同領域を隣接させた。選択した、いくつかの天然の細菌染色体ＤＮＡ断片の全体と、プルラナーゼ遺伝子の発現を制御するために必要な機能を有する合成配列を構築した。
【００８４】
典型的なプルラナーゼ発現カセットには、天然または合成のプロモーター配列、合成のリボソーム結合部位、バチルス・デラミフィカンス由来の切断プルラナーゼコード遺伝子、および合成の終結配列を含めた。これらの配列を合成し、ジーンスクリプトで、一緒に作動可能に構築した。下流にあるコード領域から発現された酵素を効率的に分泌させる、バチルス・スブチリスから選択された強力な天然のシグナル配列を、プルラナーゼコード遺伝子の開始コドンの上流に挿入した。プルラナーゼ発現カセット全体を、ジーンスクリプトのクローンイージー・クローニングキットにより、ＢｇｌＩＩ部位で直線化したｐＹＦ−ｔｓＤＥに挿入した。得られた温度感受性組み込みプラスミドをｐＹＦ−ｔｓＩＮＴ−ｐｕＩとし、プロテアーゼを欠損しており、かつ、胞子形成不能なバチルス・スブチリスのコンピテント株に導入した。
【００８５】
マーカーを使わない、ＡｍｙＥのプルラナーゼ発現カセットによる遺伝子置換は、実質的に、前述したのと同様の方法で行った。赤色のプルランプレート上でのハロー形成によって、プルラナーゼコード遺伝子がバチルス・スブチリスの染色体に上手く組込まれたことを確認した。さらにＰＣＲ反応によって、発現カセットが実際に受容株のＡｍｙＥ座に存在することを確認した。
【００８６】
改変したプルラナーゼ産生株を−８０℃で保存した。
【００８７】
実施例４：振盪フラスコ法におけるプルラナーゼの産生
【００８８】
プルラナーゼ発現カセットを含有する単一の新鮮なバチルス・スブチリスのコロニーを、４．０％のマルトースシロップ、２．０％のペプトン、０．１％の酵母抽出物、および０．６％のＫＨ2ＰＯ4を含有する培地２０ｍＬ中で対数期中期まで１６時間増殖させた。次に、１．２ｍＬの培養した培養物を、１２．０％のマルトースシロップ、１．０％のペプトン、１．０％の酵母抽出物、０．２％のＫＨ2ＰＯ4および０．００３％のＭｎＣｌ2を含有する培地３０ｍＬに播種し、往復式（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）シェーカーを使い、１分間当たり１２０ストロークで、３日インキュベートした。２４時間後、４８時間後および７２時間後に試料（１ｍＬ）を採取し、１００００ｇで１分間遠心分離した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために保存し、親プルラナーゼおよび切断型プルラナーゼ酵素を、図３に示すように、それぞれ、８〜１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーン１および２で泳動させた。切断型プルラナーゼ酵素（配列番号８）は、親プルラナーゼ酵素のＮ末端から１〜１０４番目のアミノ酸残基を欠失しており（配列番号４）、その欠失は、親プルラナーゼのアミノ末端から始まるものである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、いずれのタンパク質も高純度で得られたことが分かった。予想通り、親プルラナーゼの見かけの分子量は約１００ｋＤであり、切断型の分子量は約８６ｋＤであった。
【００８９】
以下の実施例６に記載の方法を用いて、プルラナーゼ活性を試験するためのアッセイを行った。
【００９０】
実施例５：流加発酵プロセスにおけるプルラナーゼの生産
【００９１】
実施例３に記載したようにして得た、遺伝子改変し、−８０℃で凍結保存しておいたバチルス菌株を寒天斜面に画線し、３７℃で一晩インキュベートした。斜面寒天培地は、１．０％  トリプトン、０．５％  酵母エキス、１．０％  ＮａＣｌおよび２．０％バクトアガー（Ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ）（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））になるように調製した。
【００９２】
４．０％のマルトースシロップ、２．０％のペプトン、０．１％の酵母エキス、および０．６％のＫＨ2ＰＯ4を入れた５０ｍＬの種フラスコに、複数の新鮮なコロニーを懸濁した。３７℃で１６時間インキュベートした後、この全量を、６．０％のマルトースシロップ、１．０％のペプトン、１．０％の酵母エキス、０．２％のＫＨ2ＰＯ４および０．００３％のＭｎＣｌ2を組成とする培地を入れた７Ｌのステンレス鋼パイロット発酵槽に移した。培養は、攪拌機の速度を１４０ｇに設定して３７℃で行った。６時間の連続発酵の後、通気速度を６５０Ｌ／Ｈに調整した。次いで、５．０％のリン酸で、培養物のｐＨを５．７±０．２に調整した。最初の１８時間は、０．５Ｌ／１８時間の速度で滅菌した合成培地（４８％マルトースシロップ、６．０％ペプトン、８．０％酵母抽出物）を培養物に連続的に供給し、その後は１Ｌ／１８時間の速度で供給した。発酵は約２９時間の供給後に終了させた。発酵槽から全ブロスを回収し、４℃、８０００ｇで３０分間遠心分離し、上清のプルラナーゼ活性を測定した。
【００９３】
実施例６：プルラナーゼ活性の測定
【００９４】
プルラナーゼ活性は、ベストザイム・プルラナーゼ単位（Ｂｅｓｔｚｙｍｅ  Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ  Ｕｎｉｔ、ＢＰＵ）で測定される。１ＢＰＵは、６０℃およびｐＨ４．５の条件で１分間にプルランから還元糖（グルコースとして計算）３６０μｇを生成する酵素の量として定義される。
【００９５】
簡単に説明すると、適切に希釈したプルラナーゼ酵素の試料１ｍＬを、０．５％のプルラン１ｍＬと混合し、６０℃で３０分間インキュベートした。次に、３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液３ｍＬを加え、試料を７分間沸騰させた。試料を冷却した後、水（１０ｍＬ）を加えて混合した。生成された還元糖を、ソモギー・ネルソン法（Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法、ソモギー（Ｓｏｍｏｇｙｉ）ら、１９４４）によって決定した。
【００９６】
実施例７：切断型プルラナーゼ酵素の製剤および用途
【００９７】
以下に示される結果は、配列番号６および配列番号８に示される切断型プルラナーゼに基づくもので、これら切断型プルラナーゼはこれ以降、それぞれ、「Ｔｄ−Ａ」および「Ｔｄ−Ｄ」と言う。これらの切断型プルラナーゼは、配列番号４に示される親プルラナーゼのアミノ末端から１〜９４番目のアミノ酸残基か、または１〜１０４番目のアミノ酸残基のいずれかを欠失している。
【００９８】
特段の規定のない限り、使用される単位は以下の定義に従うものとする。
【００９９】
ＢＧＵ：グルコアミラーゼの活性は、ベストザイム・グルコアミラーゼ単位で測定する。１ＢＧＵは、４０℃およびｐＨ４．６の条件で、１時間当たり、可溶性デンプンから２００ｍｇのグルコースを産生する酵素の量として定義される。
【０１００】
ＢＰＵ：プルラナーゼの活性は、ベストザイム・プルラナーゼ単位で測定する。１ＢＰＵは、６０℃およびｐＨ４．５の条件で、１分間当たり、プルランから３６０μｇのグルコース相当還元糖を放出する酵素の量として定義される。
【０１０１】
ｇＤＳ：乾燥固体の重量、グラム。
【０１０２】
バチルス・スブチリス細胞で発現させ、単離したプルラナーゼ酵素を、最初に、乾燥重量（ＤＳ）３１％に調整し、良く混合したトウモロコシマルトデキストリン溶液を用いて、糖化について試験した。次いで、ＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ４．３に調整した。反応は２００ｍＬの反応容量で行った。プルラナーゼは、水道水で希釈したストック溶液からグルコアミラーゼ溶液（０．２２５ＢＧＵ／ｇＤＳで固定濃度）に、それぞれ０．３００，０．２５０および０．１５０ＢＰＵ／ｇＤＳの用量で添加した。親プルラナーゼ（０．３００ＢＰＵ／ｇＤＳ）を対照としての別のフラスコに加えた。反応は６０℃で２４時間、４０時間、４８時間保持した。次いで、試料を回収し、０．２２μｍ膜を通して濾過し、ＨＰＬＣ分析のために１００℃まで加熱することによって酵素を不活性化した。結果を表１にまとめた。
【０１０３】
【表１】
0006505240.tif 000002
【０１０４】
結果から、０．３００ＢＰＵ／ｇＤＳの用量を使用し、２４時間反応させた親酵素のグルコースの収率（９４．５％）は、グルコアミラーゼ単独での方法（９０．９％）から得られたグルコース収率よりも高いことが見て取れ、糖化プロセスにプルラナーゼ酵素を含めることの積極的な意義が確認された。切断型酵素を使用した場合、同じ酵素用量（０．３００ＢＰＵ／ｇＤＳ）では、親酵素のグルコース収率（９４．５％〜９６．４％）と比較して、グルコース収率（９５．６％〜９６．５％）は維持または増加されるという結果になり、このことから、プルラナーゼの酵素活性を損なうことなくＮ末端残基を除去できることが分かった。重要なことに、反応の最初の２４時間では、切断型プルラナーゼは少ない用量でも（０．１５０ＢＰＵ／ｇＤＳに減らした）、同様のグルコース収率を維持することができ、この活性は最長４８時間まで維持された。さらに、反応の最初の２４時間では、切断型プルラナーゼ酵素によって触媒される糖化の速度は、親酵素の糖化速度よりも速かった（データは示さない）。まとめると、これらの知見から、プルラナーゼのＮ末端残基を、Ｎ末端の最初のアミノ酸残基から始まる欠失で除去することにより、構造がより安定し、より高い酵素活性をもたらすことが示唆される。
【０１０５】
次に、より低いｐＨで糖化プロセスを実施することによって、切断型プルラナーゼ酵素のｐＨ耐性を試験した。具体的には、糖化反応は、ｐＨを４．０にした以外は、前述したのと同じように実施した。結果を以下の表２に示す。
【０１０６】
【表２】
0006505240.tif 000003
【０１０７】
表２に示した結果から分かるように、ｐＨ４．０では、切断型プルラナーゼ酵素で触媒した糖化反応のグルコース収率（９５．８％および９５．６％）は、最初の２４時間では、親酵素の収率（９２．８％）よりも高く、そして最長４８時間持続した。注目すべきことに、親プルラナーゼは、反応時間を４８時間まで延長しても、デンプン産業に必要とされる最小グルコース収率（９６％）に達しなかった。対照的に、切断されたプルラナーゼ酵素は、ｐＨ４．０の酸性条件で、より高い触媒活性を示した。切断型プルラナーゼ酵素で得られた９６．５％および９６．４％の最終グルコース収率は、反応時間を４０時間としたときに達成された（表２）。複数の実験から同様の結果が得られた（データは示さない）。
【０１０８】
さらに、切断型プルラナーゼ酵素の熱安定性および熱活性を試験した。糖化反応は、デンプン産業でよく使用される温度である６０℃、６２℃および６４℃でそれぞれ実施した。結果を以下の表３に示す。
【０１０９】
【表３】
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【０１１０】
予想通り親プルラナーゼは、反応の最初の２４時間の間に、６４℃という高い温度で糖化反応を触媒する能力が低下した（表３）。対照的に切断型プルラナーゼは、６４℃までの温度でも有意に高い触媒能を保持し、親プルラナーゼ酵素のＮ末端を切断することが、熱安定性および熱活性に対してポジティブな影響を与えることが示された（表３）。
【０１１１】
第３の切断型プルラナーゼを枯草菌細胞で発現・離し、この第３の切断型プルラナーゼの活性を、より厳しい試験条件で、前段で特徴づけた２種の切断型プルラナーゼ酵素の活性と比較した。この第３切断プルラナーゼは「Ｔｄ−Ｃ」と呼ばれ、配列番号９に示すもので、配列番号４に示した親プルラナーゼ酵素のアミノ末端から１〜１０２番目のアミノ酸残基を欠失している。
【０１１２】
より厳しい試験条件を次のように適用した：乾燥固形分（ＤＳ）３２％のトウモロコシマルトデキストリン溶液をよく混合し、ＨＣｌを用いてｐＨを４．０に調整した。反応は２００ｍＬの反応容量で行った。水道水で希釈したストック溶液から０．２７０ＢＰＵ／ｇＤＳ用量のグルコアミラーゼ溶液に切断型プルラナーゼ（Ｔｄ−Ｃ、Ｔｄ−ＡおよびＴｄ−Ｄ）を添加した。溶液中のグルコアミラーゼ濃度は０．２２５ＢＧＵ／ｇＤＳに固定した。反応は６０℃でそれぞれ２４時間、４０時間および４８時間保持した。次いで、試料を回収し、０．２２μｍメンブレンを通して濾過し、ＨＰＬＣ分析用に、１００℃まで加熱することで酵素を不活性化した。結果を以下の表４にまとめた。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
表４に示した結果から分かるように、より厳しい条件では、４０時間の反応時間終了時に、各切断型プルラナーゼによって触媒される糖化反応と同様のグルコース収率が達成された。反応の最初の２４時間には、切断型プルラナーゼＴｄ−ＡおよびＴｄ−Ｄは（９５．４％および９５．１％）、切断型プルラナーゼＴｄ−Ｃ（９４．９％）よりわずかに速い糖化速度とわずかに良好なグルコース収率を示した。しかし、試験した３種の切断型プルラナーゼ酵素のグルコース収率は同等である。
【０１１５】
まとめると、以上の結果から、本発明の切断型プルラナーゼ酵素が、グルコース収率を犠牲にすることなく、反応時間をより短くし（例えば、３６時間以下）、糖化反応をより低いｐＨで行うか、またはより高い温度条件で行いたいと考えているグルコース製造者にとって望ましい有利な特性を有することが示された。特に、これらの結果は、本発明の切断型プルラナーゼのｐＨ４．５未満のｐＨ値（ｐＨを４．０まで下げることを含む）での安定性と、６０℃〜６４℃という高い温度での安定性が、同じ温度およびｐＨ条件での親プルラナーゼの安定性と比較して、高いということを示している。
【０１１６】
さらに、分子量が小さい切断型プルラナーゼは、比活性（活性／単位重量）がより高いという利点を有する。したがって、これらの切断型プルラナーゼ酵素は、活性を犠牲にすることなく、より少ない量で糖化プロセスに使用することができる。言い換えれば、本発明は、α−１，４−グルコシド結合の加水分解の触媒作用において同等の活性（例え改善されていないにしても）を有する低分子量型プルラナーゼを提供し、これにより、本発明の切断型プルラナーゼは、デンプン産業における使用に特に有利になる。
【０１１７】
最後に、大麦β−アミラーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、１２３０ＤＰ／ｇＤＳ）を含有する酵素組成物との糖化反応における切断型プルラナーゼ酵素の性能も試験した。この反応は、マルトース生産産業におけるプルラナーゼの重要な用途である。簡単に説明すると、乾燥固体（ＤＳ）３１％として調製したマルトデキストリン溶液をよく混合し、次にＨＣｌを用いてｐＨを５．２に調整した。プルラナーゼおよびβ−アミラーゼ酵素をマルトデキストリン溶液（２００ｍＬ）にそれぞれ１．０００ＢＰＵ／ｇＤＳおよび１．２３ＤＤＰ／ｇＤＳの用量で添加した。対照としてマルトデキストリン（３１％ＤＳ、２００ｍＬ）を含有する別のフラスコにβ−アミラーゼ（１．２３ＤＰ／ｇＤＳ）を単独で添加した。反応容量を２００ｍＬとし、６０℃で２４時間保持した。次いで、試料を回収し、０．２２μｍメンブレンを通して濾過し、１００℃まで１５分間加熱して酵素を不活性化し、続いてＨＰＬＣで分析した。結果を以下の表５に示す。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
表５に示した結果から分かるように、親プルラナーゼと比較して、切断型プルラナーゼは、同じ反応条件でより良好な性能を示した。予想通り、親酵素を用いたプロセスからのマルトース収率（７３．３％）は、β−アミラーゼ単独のプロセス（６１．９％）よりも高かった。切断型プルラナーゼを使用すると、マルトース収率（７５．９％）は親プルラナーゼを使用した場合よりも著しく高くなり、切断型が高い触媒活性を有することが示された。
【０１２０】
総合すると、これまでの実験の結果から、本発明による切断型プルラナーゼが親酵素と比較して、よりｐＨ耐性の向上、高い熱安定性、および高い熱活性を有することが示された。したがって、本発明の切断型プルラナーゼ酵素は、炭水化物の糖化プロセス、特にデンプン産業で使用できる可能性を有する。
【０１２１】
当業者であれば、本発明の広い概念から逸脱することなく、上述した態様に変更を加えることができることが理解されよう。したがって、本発明は、開示された特定の態様に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲内での変更も包含することが意図されていることが理解される。
【０１２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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