(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）１，１７-ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、またはその薬学的に許容される塩、
（ｉｉ）１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、
（ｉｉｉ）コレステロール、および
（ｉｖ）ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン（４０）ステアレートからなる群より選択される１つ以上の界面活性剤
を含む形質移入試薬組成物；および
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１のウェル、
（ｂ）第１のウェルと流体連通する第１のチャネル、
（ｃ）第２の溶媒を含む第２の溶液を受容するための第２のウェル、
（ｄ）第２のウェルと流体連通する第２のチャネル、
（ｅ）それぞれ、第１および第２のウェルから第１および２のチャネルへと流れる第１および第２のストリームを受容するための第３のチャネルであり、導入される第１および第２のストリームをチャネルに流すように構成された第１の領域、ならびに第１および第２のストリームの内容物を混合して、粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を有する第３のチャネル、および；
（ｆ）粒子を含む第３のストリームを受容するための第３のウェル、
を含む脂質粒子を作製するためのデバイスであって、
ここで、前記第１のチャネルと前記第２のチャネルは異なったチャネルインピーダンスを有するデバイス、
を含む脂質ナノ粒子を調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第６１／７９８，４９５号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する宣言
本出願に添付されている配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提供されており、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、４３９３５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｆｉｎａｌ＿２０１４−０３−１４．ｔｘｔである。このテキストファイルは７４８バイトであり、２０１４年３月１４日に作成され、本明細書の出願と共にＥＦＳ−Ｗｅｂから提出されている。
【０００３】
脂質は、水性媒体に分散されると、単層小胞および多層小胞等のリポソームを容易に形成する。リポソームを使用して、核酸、タンパク質、および低分子薬を含む広範囲の化学薬品を封入し、細胞に送達することが成功している。
【０００４】
陽イオン性脂質およびリン脂質の組成物から調製される陽イオン性リポソームは、ＤＮＡおよびＲＮＡ等の陰イオン性巨大分子との集合体を容易に形成する。これら陽イオン性リポソーム−核酸集合体は、複合体の正味電荷が正であるように操作されていることが多く、それにより、陰イオン性細胞表面との相互作用が促進され、それにより、封入されている積荷の取り込みおよびその後の細胞形質移入が増強されると考えられている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の形質移入に一般的に使用される陽イオン性脂質組成物の一例は、１：１のモル比でジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と混合されたＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）である。
【０００５】
陽イオン性リポソーム−核酸集合体のサイズおよび構造は、脂質組成および製造方法に依存する。これら構造は、サイズが数百ナノメートルからマイクロメートルまでの範囲であってもよく、電子顕微鏡で視覚化すると、古典的な「スパゲッティおよびミートボール」コンフォメーションを含む不均一な形態を有していることが多い。
【０００６】
陽イオン性リポソーム−核酸集合体は、初代細胞、つまり生命体から回収された細胞での有効性に制限がある。これは、過剰な陽イオン電荷による毒性の結果であると考えられている。また、毒性であることおよび粒径が大きいことにより、陽イオン性リポソーム−核酸集合体を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ形質移入には制限がある。
【０００７】
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、最も臨床的に進んでいる薬物送達系であり、７つのＬＮＰに基づく薬物が規制認可を受けている。これら認可を受けた薬物は、抗癌剤等の低分子を含有しており、「遊離」薬物と比較して、効力の向上および／または毒性の低減を示す。また、ＬＮＰキャリア技術は、タンパク質発現用のプラスミド、または遺伝子サイレンシング用の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（ＯＧＮ）等の「遺伝子」陰イオン性巨大分子の送達に応用されている。
【０００８】
遺伝子薬物の封入および送達に使用されるＬＮＰ技術および陽イオン性脂質の最近の発展により、陽イオン性リポソーム−核酸集合体に固有な欠点を克服し、形質移入が困難な初代細胞で、および静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の非ヒト霊長類を含む動物モデルで、治療関連標的遺伝子のサイレンシングを媒介することが示されているｓｉＲＮＡ−ＬＮＰが可能になっている。これらｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、現在、幾つかの臨床試験で評価中である。
【０００９】
遺伝子薬物を含有するＬＮＰ系を配合する方法は、様々なものが開発されている。これら方法は、事前形成されたＬＮＰをＯＧＮとエタノールの存在下で混合すること、またはエタノールに溶解した脂質を、ＯＧＮを含有する水性媒体と混合することを含み、１００ｎｍ以下の直径を有し、６５〜９５％のＯＧＮ封入効率を有するＬＮＰをもたらす。これら方法は両方とも、ＯＧＮの封入を達成するための陽イオン性脂質の存在、ならびに凝集および大型構造の形成を阻害するためのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質の存在に依存する。サイズおよびＯＧＮ封入効率を含む、生成されたＬＮＰ系の特性は、イオン強度、脂質およびエタノール濃度、ｐＨ、ＯＧＮ濃度、および混合速度等の様々な配合パラメータの影響を受けやすい。一般的に、混合時の相対的な脂質およびＯＧＮ濃度、ならびに混合速度等のパラメータは、現在の配合手順を使用して制御するのが難しく、調製物内と調製物間の両方で、生成されたＬＮＰの特徴がばらつくことになる。
【００１０】
マイクロ流体デバイスは、温度、滞留時間、および溶質濃度を精密に制御して、ナノリットルスケールで液体を迅速に混合する。抑制された迅速なマイクロ流体混合は、無機ナノ粒子およびマイクロ粒子の合成に以前に応用されており、ナノ粒子の大規模生産では、マクロスケール系よりも性能がよい場合がある。マイクロ流体二相液滴技術は、薬物送達用の単分散ポリマーマイクロ粒子の生産、または細胞、タンパク質、もしくは他の生体分子を封入するための大型小胞の生産に応用されている。試薬の迅速混合をもたらす一般的なマイクロ流体技術である流体力学的フローフォーカシングを使用すると、制御されたサイズの単分散リポソームが生成されることが実証されている。また、この技法は、ポリマーナノ粒子の生産に有用であることが証明されており、大量生産法と比べて、より小さく、より単分散性の粒子が、より高い低分子封入で得られる。
【発明の概要】
【００１１】
細胞形質移入に使用可能な産物が数多くあるにもかかわらず、ｓｉＲＮＡ  ＯＧＮおよび他の陰イオン性巨大分子を、形質移入が困難なｉｎ  ｖｉｔｒｏの初代細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏの標的細胞に効率的に送達するためのデバイスおよび方法の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たすことを目的とし、疾患細胞のゲノム配列決定により有望な薬物またはバイオマーカ標的として特定された異常遺伝子の検証を妨害する主要な問題に取り組むための更なる関連利点を提供する。
【００１２】
１つの側面では、本発明は、脂質および界面活性剤を含む形質移入試薬組成物を提供する。
【００１３】
１つの態様では、形質移入試薬は、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、および（ｃ）１つ以上のステロール、および（ｄ）１つ以上の界面活性剤を含む。
【００１４】
１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。ある態様では、粒子は、約３０から約９５モルパーセントまでの陽イオン性脂質を含む。
【００１５】
１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
【００１６】
１つの態様では、ステロールは、コレステロールである。
【００１７】
１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルである。更なる態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（４０）ステアレートである。ある態様では、粒子は、約０．１から約２０モルパーセントまでの界面活性剤を含む。
【００１８】
別の態様では、脂質ナノ粒子は、本明細書で規定されているような、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、（ｃ）１つ以上のステロール、および（ｄ）１つ以上の界面活性剤を含む。１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。１つの態様では、ステロール脂質は、コレステロールである。１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルである。
【００１９】
別の態様では、脂質ナノ粒子は、本明細書で規定されているような、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、（ｃ）１つ以上のステロール、および（ｄ）１つ以上の界面活性剤を含む。１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。１つの態様では、ステロール脂質は、コレステロールである。１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（４０）ステアレートである。
【００２０】
他の側面では、本発明は、形質移入試薬組成物および陰イオン性巨大分子を含む脂質ナノ粒子を提供し、ここで、脂質ナノ粒子は、本明細書に規定されているように、実質的に中実なコアを含む。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、形質移入試薬組成物および核酸を含む脂質ナノ粒子を提供する。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現可能なプラスミドであってもよい。
【００２２】
別の態様では、本発明は、形質移入試薬組成物およびアンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを含む脂質ナノ粒子を提供する。ハイブリダイゼーションプローブは、分子ビーコンであってもよい。
【００２３】
別の側面では、本発明は、本明細書に規定されているような、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、（ｃ）１つ以上のステロール、ならびに（ｄ）１つ以上の界面活性剤および１つ以上の核酸を含む脂質ナノ粒子を提供する。１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。１つの態様では、ステロール脂質は、コレステロールである。１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルである。１つの態様では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【００２４】
別の側面では、本発明は、本明細書に規定されているような、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、（ｃ）１つ以上のステロール、ならびに（ｄ）１つ以上の界面活性剤および１つ以上の核酸を含む脂質ナノ粒子を提供する。１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。１つの態様では、ステロール脂質は、コレステロールである。１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（４０）ステアレートである。１つの態様では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。
【００２５】
別の側面では、本発明は、本明細書に規定されているような、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、（ｃ）１つ以上のステロール、ならびに（ｄ）１つ以上の界面活性剤および１つ以上の核酸を含む脂質ナノ粒子を提供する。１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。１つの態様では、ステロール脂質は、コレステロールである。１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルである。１つの態様では、核酸は、プラスミドＤＮＡである。
【００２６】
別の側面では、本発明は、本明細書に規定されているような、（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質、（ｂ）１つ以上の第２の脂質、（ｃ）１つ以上のステロール、ならびに（ｄ）１つ以上の界面活性剤および１つ以上の核酸を含む脂質ナノ粒子を提供する。１つの態様では、陽イオン性脂質は、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである。１つの態様では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。１つの態様では、ステロール脂質は、コレステロールである。１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（４０）ステアレートである。１つの態様では、核酸は、プラスミドＤＮＡである。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、対象に核酸を投与する方法であって、本発明の脂質ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２８】
１つの態様では、本発明は、核酸を細胞に導入する方法であって、細胞を本発明の脂質ナノ粒子と接触させることを含む方法を提供する。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法であって、細胞を本発明の脂質ナノ粒子と接触させることを含み、核酸が、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節可能である方法を提供する。
【００３０】
１つの態様では、本発明は、対象中でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の脂質ナノ粒子を対象に投与することを含み、核酸が、ポリペプチドの発現をサイレンシングまたは減少させることが可能である方法を提供する。
【００３１】
１つの態様では、本発明は、対象中でポリペプチドが発現されないことまたは発現が過少であることを特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の脂質ナノ粒子を対象に投与することを含み、核酸が、ポリペプチドを発現またはポリペプチドの発現を増加させることが可能である方法を提供する。
【００３２】
他の側面では、本発明は、脂質ナノ粒子を作製する方法を提供する。
【００３３】
１つの態様では、本発明は、核酸を含有する脂質ナノ粒子を作製する方法であって、
（ａ）第１の溶媒中の核酸を含む第１のストリームをマイクロ流体デバイスに導入することであって、デバイスは、導入される１つ以上のストリームをデバイスに流すように構成された第１の領域、および１つ以上のストリームの内容物をマイクロ流体ミキサで混合するための第２の領域を有すること、
（ｂ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２のストリームをデバイスに導入することであって、デバイスは、導入される１つ以上のストリームをマイクロチャネルに流し、それらを１つ以上のストリームの内容物を混合するための第２の領域に向けるように構成されている第１の領域を有し、形質移入試薬組成物は、陽イオン性脂質を含み、第１および第２の溶媒は同じではないこと、
（ｃ）１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームを、デバイスの第１の領域からデバイスの第２の領域に流すこと、および
（ｄ）１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの内容物を、デバイスの第２の領域で混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することを含む方法を提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、核酸を含有する脂質ナノ粒子を作製する方法であって、
（ａ）第１の溶媒中の核酸を含む第１のストリームをチャネルに導入することであって、デバイスは、導入される１つ以上のストリームをチャネルに流すように構成された第１の領域、および１つ以上のストリームの内容物を混合するための第２の領域を有すること、
（ｂ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２のストリームを導入することであって、チャネルは、導入される１つ以上のストリームをチャネルに流すように構成された第１の領域、および１つ以上のストリームの内容物を混合するための第２の領域を有すること、
（ｃ）１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームを、２つのストリームの物理的分離を維持しつつ、チャネルの第１の領域からチャネルの第２の領域に流すことであって、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームは、チャネルの第２の領域に到着するまで混合されないこと、および
（ｄ）流れている１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの内容物を、マイクロチャネルの第２の領域で混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することを含む方法を提供する。
【００３５】
上記の方法のある態様では、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの内容物の混合は、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの濃度または相対的混合速度を変更することを含む。
【００３６】
上記の方法のある態様では、本方法は、第３のストリームを水性緩衝液で希釈することを更に含む。ある態様では、第３のストリームの希釈は、第３のストリームおよび水性緩衝液を、第２の混合構造に流すことを含む。
【００３７】
上記の方法のある態様では、本方法は、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む水性緩衝液を透析して、第２の溶媒の量を低減することを更に含む。
【００３８】
上記の方法のある態様では、第１の溶媒は、水性緩衝液である。上記の方法のある態様では、第２の溶媒は、水性アルコールである。
【００３９】
上記の方法のある態様では、第１および第２のストリームの内容物の混合は、カオス的移流を含む。上記の方法のある態様では、第１および第２のストリームの内容物の混合は、マイクロミキサでの混合を含む。
【００４０】
上記の方法のある態様では、核酸封入効率は、約８０から約１００％までである。
【００４１】
上記の方法のある態様では、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの混合は、第１の領域では障壁により防止される。ある態様では、障壁は、チャネル壁、シース流体、または同心チューブである。
【００４２】
本発明の別の側面では、脂質ナノ粒子を作製するためのデバイスが提供される。１つの態様では、本発明は、核酸を封入している脂質ナノ粒子を生成するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒中の核酸を含む第１の溶液を受容するための第１の入口、
（ｂ）第１の溶媒中の核酸を含む第１のストリームを提供するための、第１の入口と流体連通する第１の入口マイクロチャネル、
（ｃ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２の溶液を受容するための第２の入口、
（ｄ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２のストリームを提供するための、第２の入口と流体連通する第２の入口マイクロチャネル、および
（ｅ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルを含み、第３のマイクロチャネルは、導入される第１および第２のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第１の領域、ならびに第１および第２のストリームの内容物を混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を有するデバイスを提供する。
【００４３】
１つの態様では、デバイスは、第３のストリームを希釈して、封入された核酸を有する安定化脂質ナノ粒子を含む希釈ストリームを提供するための手段を更に含む。ある態様では、第３のストリームを希釈するための手段は、マイクロミキサを含む。
【００４４】
１つの態様では、マイクロチャネルは、約２０から約３００μｍまでの流体力学的直径を有する。
【００４５】
１つの態様では、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。１つの態様では、マイクロチャネルの第２の領域は、主流れ方向、および少なくとも１つの溝または凸部がそこに設けられている１つ以上の表面を有し、溝または凸部は、主方向と角度を形成する配向性を有する。１つの態様では、第２の領域は、マイクロミキサを含む。
【００４６】
ある態様では、デバイスは、第１および第２のストリームの流量を変更するための手段を更に含む。
【００４７】
ある態様では、デバイスは、１つ以上の第１のストリームと１つ以上の第２のストリームとを第１の領域にて物理的に分離するのに効果的な障壁を更に含む。
【００４８】
本発明の先述の側面および付随する利点の多くは、添付の図面と共に受け取ると、以下の詳細な説明を参照することによってより良く理解されるのと同様に、より容易に理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】異なる界面活性剤（ポリオキシエチレン（４０）ステアレート（Ｍｙｒｊ  Ｓ４０）、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ  ９８）Ｂｒｉｊ  ３５Ｐ−ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３５Ｐ））を用いて調製したｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング活性が、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）マウスモデルを使用して示されている。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、マイクロ流体法を使用して製造した。活性は、ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ配合に使用した界面活性剤のモルパーセント（ｍｏｌ％）の関数としての、残留ＦＶＩＩタンパク質レベルのパーセントとして測定した。ＬＮＰは全て、処方に従って以下の脂質組成で構成されていた：１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート：ＤＳＰＣ：コレステロール：界面活性剤（５０％：１０％：４０％−界面活性剤％：界面活性剤％）。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ対脂質比は、０．０６重量／重量だった。１ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡと等しい単回用量を、マウス（ｎ＝３）に尾静脈注射した。注射の２４時間後に血液採取を実施し、ＦＶＩＩレベルを比色測定法により決定した。データは、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量でｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを単回静脈注射した２４時間後、血液中のＦＶＩＩレベルが、対照と比較して＞９５％低減したことを示す。この観察は、使用した界面活性剤またはｓｉＲＮＡ−ＬＮＰに組み込んだ界面活性剤のｍｏｌ％に依存しなかった。
【図２】界面活性剤ポリオキシエチレン（４０）ステアレートを用いて調製したｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング活性が、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）マウスモデルを使用して示されている。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、マイクロ流体法を使用して製造した。活性は、ｓｉＲＮＡ用量および時間の関数としての、残留ＦＶＩＩタンパク質レベルのパーセントとして測定した。ＬＮＰは全て、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート：ＤＳＰＣ：コレステロール：ポリオキシエチレン（４０）ステアレート（５０：１０：３７．５：２．５ｍｏｌ％）を含んでいた。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ対脂質比は、０．０６重量／重量だった。０．０１、０．０５、０．１、０．３、０．５、および１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡと等しい単回用量を、マウス（ｎ＝３）に尾静脈注射した。注射後の１日目、７日目、１４日目、および２１日目に血液採取を実施し、ＦＶＩＩレベルを比色測定法により決定した。データは、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量でｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを単回静脈注射した少なくとも７日後の場合、血液中のＦＶＩＩレベルが、比較して＞９５％低減したことを示す。
【図３】界面活性剤ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルを用いて調製したｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング活性が、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）マウスモデルを使用して示されている。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、マイクロ流体法を使用して製造した。活性は、ｓｉＲＮＡ用量および時間の関数としての、残留ＦＶＩＩタンパク質レベルのパーセントとして測定した。ＬＮＰは全て、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４（ジメチルアミノ）ブタノエート：ＤＳＰＣ：コレステロール：ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（５０：１０：３８：２ｍｏｌ％）を含んでいた。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ対脂質比は、０．０６重量／重量だった。０．０１、０．０５、０．１、０．３、０．５、および１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡと等しい単回用量を、マウス（ｎ＝３）に尾静脈注射した。注射後の１日目、７日目、１４日目、および２１日目に血液採取を実施し、ＦＶＩＩレベルを比色測定法により決定した。データは、≧０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量でｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを単回静脈注射した少なくとも７日後の場合、血液中のＦＶＩＩレベルが、比較して＞９５％低減したことを示す。
【図４】界面活性剤ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを用いて調製したｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏサイレンシング活性が、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）マウスモデルを使用して示されている。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰは、マイクロ流体法を使用して製造した。活性は、ｓｉＲＮＡ用量および時間の関数としての、残留ＦＶＩＩタンパク質レベルのパーセントとして測定した。ＬＮＰは全て、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート：ＤＳＰＣ：コレステロール：ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（５０：１０：３８：２ｍｏｌ％）を含んでいた。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ対脂質比は、０．０６重量／重量だった。０．０１、０．０５、０．１、０．３、０．５、および１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡと等しい単回用量を、マウス（ｎ＝３）に尾静脈注射した。注射後の１日目、７日目、１４日目、および２１日目に血液採取を実施し、ＦＶＩＩレベルを比色測定法により決定した。データは、≧０．５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量でｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを単回静脈注射した少なくとも７日後の場合、血液中のＦＶＩＩレベルが、比較して＞９５％低減したことを示す。
【図５】脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を作製するための本発明の代表的なマイクロ流体（ＭＦ）法の模式図である。脂質−エタノールおよびｓｉＲＮＡ−水溶液を、マイクロ流体混合デバイスの入口にポンプで送り込み、デバイス中のヘリンボーン特徴により、ストリームのカオス的移流が誘発され、脂質種が水性ストリームと迅速に混合され、脂質ナノ粒子が形成される。混合チャネルは、幅が３００μｍであり、高さが１３０μｍである。ヘリンボーン構造は、高さが４０μｍであり、厚さが５３μｍである。
【図６】本発明の形質移入試薬組成物から調製された代表的な脂質ナノ粒子のＺ−ＡｖおよびＰＤＩを要約する表である。
【図７】本発明の形質移入試薬組成物から調製された代表的な脂質ナノ粒子の核酸封入効率を要約する表である。
【図８】少容積の粒子を調製するための本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図であり、入力および出力レザバー（ウェル）の組み合わせを使用して、流量および流れタイミングを制御するデバイスである。このデバイスでは、入力流体を含有する入力ウェルが使用されている。チャネルインピーダンスを使用して、流れ間の相対的流量を入力から決定する。出口ウェルが付加されている。ある態様では、入力に圧力を加える前に、出口ウェルに背圧または栓を加えて、入力ウェルにある流体の重量によるまたは他の現象による、入力からの流体の移動を停止させる。ある態様では、背圧は、流体を入力ウェルに加える前に、流体を出口ウェルに加えることにより達成される。この場合、最も低い表面張力を有する流体は、最も速い速度でチップを通って移動する流体であるため、最後に加えられる。その後、入力流体を入力レザバーに加え、入力を加圧して、流体の流れを生成する。異なる流れの流量は、入力からミキサチャンバーへのチャネルのインピーダンスにより制御される。流れは、入力ウェルを同時に加圧することにより、同様の時点でミキサに到達するようにタイミングを調整することができる。ある態様では、デバイスでは、ナノ粒子製造後に、流体（ガスまたは液体）を入力に加え、ミキサを通して流すことにより残留流体をパージする。
【図９】図８の模式図に示されている代表なデバイスの例である。このデバイスは、２つの入口ウェル（１つは水相用であり、１つはエタノール／脂質相用である）および１つの出口ウェルを有する。実際には、希釈緩衝液を出口ウェルに負荷し、この緩衝液により、デバイスの出力に背圧を加え、最終産物のエタノール濃度を低下させ、それにより粒子を安定化させる。試薬水溶液およびエタノール中の脂質を入力ウェルに負荷し、その後、マニフォールドを入口ウェルにクランプし、注射器または他の機構を使用して加圧する。加圧により、入口ウェル中の試薬は、ミキサ（例えば、スタガードヘリンボーンミキサ）を通って出口ウェルへと押し出される。その後、配合された粒子を、ピペットを使用して回収する。表示されているデバイスは、３部の水溶液対１部のエタノールの流量比を有するように設計されており、それは、入力ウェルからミキサに至るチャネル長さが異なることにより達成される。この場合、２．５：１の比率が使用されており、これは、所望の流量比、および入力試薬間の粘性差を考慮に入れている。
【図１０】少容積の粒子を調製するための本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図であり、溶媒の第１のストリーム（入力ウェル１からｎ）を、出口レザバー（希釈ウェル）に含有されている第２の溶媒へと流すデバイスである。第１のストリームと出口レザバーの内容物との混合は、（ｉ）第１のストリームをレザバーに導入することにより生じる対流、および（ｉｉ）第１のストリームをレザバーに導入する際の混合流体の能動混合を含む、種々の機序により生じさせることができる。
【図１１】図１０の模式図に示されている代表なデバイスの例である。デバイスは、脂質／エタノール溶液用の単一入力ウェル、および水溶液が負荷される出口ウェルを有する。デバイスは、出口ウェルに至る多数のマイクロチャネルを有する。マイクロチャネルのインピーダンスは、それらを供給するチャネルより高い。これは、流体の均一な分布に必要である。試薬を負荷した後、入口ウェルを加圧する。入口ウェルの流体は、マイクロチャネルを通って出力ウェルに流れ込む。流体は、対流により、および出口ウェルに流れ込む気泡により混合される。
【図１２】少容積の粒子を調製するための本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図であり、入口または出口のいずれかのバルブを使用して、混合チャンバーへの流体の流れの導入タイミングを調節するデバイスである。
【発明の詳細な説明】
【００５０】
本発明は、形質移入試薬組成物、陰イオン性巨大分子を含有する脂質ナノ粒子、ならびに形質移入試薬組成物を使用して、陰イオン性巨大分子を含有する脂質ナノ粒子を作製するための方法およびデバイス、ならびに脂質ナノ粒子を使用して、細胞を形質移入する方法を提供する。
【００５１】
形質移入試薬組成物
１つの側面では、本発明は、形質移入試薬組成物を提供する。形質移入試薬組成物は、１つ以上の陽イオン性脂質、１つ以上の第２の脂質、１つ以上のステロール、および１つ以上の界面活性剤を含む。
【００５２】
脂質ナノ粒子
１つの側面では、本発明は、陰イオン性巨大分子を含有する脂質ナノ粒子を提供する。脂質ナノ粒子は、１つ以上の陽イオン性脂質、１つ以上の第２の脂質、および１つ以上の核酸を含む。
【００５３】
陽イオン性脂質
脂質ナノ粒子は、陽イオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、用語「陽イオン性脂質」は、ｐＨが脂質のイオン化可能基のｐＫよりも低いと陽イオン性であるまたは陽イオン性になるが（プロトン化される）、より高いｐＨ値では次第により中性になる脂質を指す。この脂質は、ｐＫ未満のｐＨ値では、負に荷電した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と結合することができる。本明細書で使用される場合、用語「陽イオン性脂質」は、ｐＨが低下すると正電荷性になると推定される双性イオン性脂質を含む。本発明に有用な陽イオン性脂質には、ＰＥＧリン脂質（例えば、ポリエチレンオキシド含有リン脂質）が含まれない。
【００５４】
用語「陽イオン性脂質」は、生理学的ｐＨ等の選択ｐＨで正味正電荷をおびる幾つかの脂質種のいずれかを指す。そのような脂質には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）。加えて、本発明で使用することができる陽イオン性脂質の幾つかの市販調製物が、入手可能である。それらには、以下のものが含まれる：例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、グランドアイランド、ニューヨーク州から入手可能な、ＤＯＴＭＡおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を含む市販の陽イオン性リポソーム）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能な、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−アンモニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）および（ＤＯＰＥ）を含む市販の陽イオン性リポソーム）；およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、マディソン、ウィスコンシン州から入手可能な、エタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を含む市販の陽イオン性脂質）。以下の脂質は、陽イオン性であり、生理学的なｐＨ未満で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（本明細書では「陽イオン性リピドＡ」と呼ばれる）。
【００５５】
１つの態様では、陽イオン性脂質は、アミノ脂質（またはその薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩））である。本発明に有用である好適なアミノ脂質には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０１６１８４に記載されているものが含まれる。代表的なアミノ脂質には、以下のものが含まれる：１，２−ジリノイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、および２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ならびにそれらの薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）。
【００５６】
好適なアミノ脂質には、以下の式を有するものまたはそれらの薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）が含まれる
【化１】
0006605446.tif 000002
【００５７】
（式中、Ｒ1およびＲ2は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ２４アルキル、任意に置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ２４アルケニル、任意に置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ２４アルキニル、または任意に置換されていてもよいＣ１０〜Ｃ２４アシルであり、
Ｒ3およびＲ4は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、または任意に置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルキニルであり、またはＲ3およびＲ4は、一緒になって、４〜６つの炭素原子、ならびに窒素および酸素から選択される１つまたは２つのヘテロ原子の、任意に置換されていてもよい複素環を形成してもよく、
Ｒ5は、存在していないまたは存在しているのいずれかであり、存在する場合は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｍ、ｎ、およびｐは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎ、およびｐは、同時に０ではなく、
ｑは、０、１、２、３、または４であり、
ＹおよびＺは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである）。
【００５８】
別の態様では、陽イオン性脂質は、以下の式、またはそれらの薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩）を有する
【化２】
0006605446.tif 000003
【００５９】
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；オキソ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
または、Ｒ1およびＲ2は、それらが両方とも結合するＮ原子と一緒になって、３〜８員環へテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、ここで、へテロアリールおよびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシで；シアノ；オキソ；ニトロ；ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよい、Ｃ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Ｒ3は、非存在、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
Ｒ4およびＲ5は、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；オキソ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ4−、−Ｓ−Ｓ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｏ）−、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ4−、−ＣＲ4Ｒ5−であり、
ＹおよびＺは、独立して、式Ｌ1−（ＣＲ6Ｒ7）α−［Ｌ2−（ＣＲ6Ｒ7）β］γ−Ｌ3−Ｒ8を有するＣ10〜Ｃ30基であり、式中、
Ｌ1は、結合、−（ＣＲ6Ｒ7）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ8−、−Ｓ−、またはそれらの組み合わせであり、
各Ｒ6およびＲ7は、独立して、Ｈ；ハロ；ヒドロキシル、シアノ；ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｌ2は、結合、−（ＣＲ6Ｒ7）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ8−、−Ｓ−、
【化３】
0006605446.tif 000004
【００６０】
もしくはそれらの組み合わせであるか、または下記式を有し、
【化４】
0006605446.tif 000005
【００６１】
式中、ｂ、ｃ、およびｄは、各々独立して、０、１、２、または３であり、ただし、ｂ、ｃ、およびｄの合計は、少なくとも１および８以下であり、Ｒ9およびＲ10は、各々独立してＲ7であるか、または隣接したＲ9およびＲ10は、一緒になって、任意に結合であってもよく、
Ｌ3は、結合、−（ＣＲ6Ｒ7）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ8−、−Ｓ−、
【化５】
0006605446.tif 000006
【００６２】
またはそれらの組み合わせであり、
Ｒ8は、独立して、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル；アリール；へテロアリール；もしくはヘテロシクリルであるか、またはＲ8は、下記式を有し、
【化６】
0006605446.tif 000007
【００６３】
ａは、０、１、２、３、または４であり、
αは、０〜６であり、
各βは、独立して、０〜６であり、
γは、０〜６である）。
【００６４】
他の好適な陽イオン性脂質には、具体的に上述されているものに加えて、以下のものが含まれる：生理学的ｐＨ付近で正味正電荷をおびる陽イオン性脂質、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオルアセタート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）。加えて、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む。ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）等の、陽イオン性脂質の幾つかの市販調製物を使用することができる。
【００６５】
陽イオン性脂質は、約３０から約９５モルパーセントまでの量で、形質移入試薬組成物に存在する。１つの態様では、陽イオン性脂質は、約３０から約７０モルパーセントまでの量で、形質移入試薬組成物に存在する。１つの態様では、陽イオン性脂質は、約４０から約６０モルパーセントまでの量で、形質移入試薬組成物に存在する。
【００６６】
中性脂質
ある態様では、形質移入試薬組成物は、１つ以上の中性脂質を含む。
【００６７】
用語「脂質」は、脂肪酸のエステルであり、水に不溶性だが、多くの有機溶媒に可溶性であることを特徴とする一群の有機化合物を指す。脂質は、通常、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）油脂ならびにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」、および（３）ステロイド等の「誘導脂質」。
【００６８】
用語「中性脂質」は、生理学的なｐＨでは、非荷電または中性のいずれかである双性イオン形態で存在する幾つかの脂質種のいずれか１つを指す。本発明で有用な中性脂質には、ＰＥＧ−リン脂質（例えば、ポリエチレンオキシド含有リン脂質）が含まれない。代表的な中性脂質には、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドが含まれる。
【００６９】
例示的な脂質には、以下のものが含まれる：例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓ  ＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、および１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）。
【００７０】
１つの態様では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
【００７１】
ステロール
ある態様では、形質移入試薬組成物は、１つ以上のステロールを含む。
【００７２】
用語「ステロール」は、ステロイドアルコールとしても知られているステロイドの亜群を指す。ステロールは、通常２つのクラスに分類される：（１）「フィトステロール」としても知られている植物ステロール；および（２）「ズーステロール」としても知られている動物ステロール。
【００７３】
例示的なステロールには、例えば、カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、およびコレステロールが含まれる。
【００７４】
１つの態様では、ステロールは、コレステロールである。
【００７５】
界面活性剤
ある態様では、形質移入試薬組成物は、１つ以上の界面活性剤を含む。
【００７６】
用語「界面活性剤」は、本明細書で使用される場合、疎水基と親水基の両方を含有する非イオン性の両親媒性化合物を指す。本発明に有用な界面活性剤には、ＰＥＧリン脂質（例えば、ポリエチレンオキシド含有リン脂質）が含まれない。
【００７７】
１つの態様では、界面活性剤は、下記式により表わされる
【化７】
0006605446.tif 000008
【００７８】
（式中、
Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ2−、−S−Ｓ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ2Ｃ（＝Ｏ）−、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ2−、−ＮＲ2Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ2−、−ＮＲ2Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ2−、−ＮＲ2Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−、ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ2−、−ＮＲ2Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ2−、−ＣＲ2Ｒ3−であり、
Ｒ2およびＲ3は、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；オキソ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Ｙは、式Ｌ1−（ＣＲ4Ｒ5）α−［Ｌ2−（ＣＲ4Ｒ5）β］γ−Ｌ3−Ｒ6を有するＣ10〜Ｃ40基であり、式中、
Ｌ1は、結合、−（ＣＲ4Ｒ5）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ2−、−Ｓ−、またはそれらの組み合わせであり、各Ｒ4およびＲ5は、独立して、Ｈ；ハロ；ヒドロキシル、シアノ；ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｌ2およびＬ3は、各々独立して、結合、−（ＣＲ4Ｒ5）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ2−、−Ｓ−、
【化８】
0006605446.tif 000009
【００７９】
またはそれらの組み合わせであり、
Ｒ6は、独立して、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル；アリール；へテロアリール；もしくはヘテロシクリルであるか、またはＲ6は、下記式を有し、
【化９】
0006605446.tif 000010
【００８０】
ａは、２〜１００であり、
αは、０〜６であり、
各βは、独立して、０〜６であり、
γは、０〜６である）。
【００８１】
別の態様では、界面活性剤は、下記式により表わされる
【化１０】
0006605446.tif 000011
【００８２】
（式中、
ｘ＝１〜５０、
ｙ＝１〜５０、および
ｚ＝１〜５０である）。
【００８３】
別の態様では、界面活性剤は、下記式により表わされる
【化１１】
0006605446.tif 000012
【００８４】
（式中、
ｘ＝１〜５０、
ｙ＝１〜５０、および
ｚ＝１〜５０である）。
【００８５】
ある態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ジブロックポリオキシエチレンアルキルエーテルコポリマー、およびトリブロックポリオキシエチレンアルキルエーテルコポリマーからなる群から選択される。好適な界面活性剤には、以下のものが含まれる：ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（４０）ステアレート、ポリ（プロピレングリコール）11−ブロック−ポリ（エチレングリコール）16−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）11、ポリ（プロピレングリコール）12−ブロック−ポリ（エチレングリコール）28−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）12。
【００８６】
ある態様では、界面活性剤は、約０．１から約２０モルパーセントまでの量で、形質移入試薬組成物に存在する。１つの態様では、界面活性剤は、約０．５から約１０モルパーセントまでの量で、形質移入試薬組成物に存在する。１つの態様では、界面活性剤は、約２モルパーセントで脂質ナノ粒子に存在する。
【００８７】
１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルである。
【００８８】
１つの態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレン（４０）ステアレートである。
【００８９】
１つの態様では、形質移入試薬組成物は、
（ａ）アミノ脂質である陽イオン性脂質またはその薬学的に許容される塩、
（ｂ）リン脂質である中性脂質、
（ｃ）コレステロールであるステロール、および
（ｄ）ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン（４０）ステアレートから選択される界面活性剤を含む。
【００９０】
別の態様では、形質移入試薬組成物は、
（ａ）１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートである陽イオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩、
（ｂ）１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である中性脂質、
（ｃ）コレステロールであるステロール、および
（ｄ）ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン（４０）ステアレートから選択される界面活性剤を含む。
【００９１】
ある態様では、本発明の形質移入試薬組成物には、ＰＥＧリン脂質（例えば、ポリエチレンオキシド含有リン脂質）が含まれない。
【００９２】
陰イオン性巨大分子
本発明の脂質ナノ粒子は、陰イオン性巨大分子の全身または局所送達に有用である。本明細書に記載のように、形質移入試薬組成物は、その結果生じる脂質ナノ粒子に組み込まれる陰イオン性巨大分子と混合される。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「陰イオン性巨大分子」は、ｐＨが巨大分子のイオン化可能基のｐＫを超えて高いと、陰イオン性であるかまたは陰イオン性になるが（脱プロトン化される）、より低いｐＨ値では次第により中性になる巨大分子を指す。したがって、ｐＫを超えるｐＨ値では、巨大分子は、正荷電の脂質（例えば、陽イオン性脂質）と結合することができる。本明細書で使用される場合、用語「陰イオン性巨大分子」は、ｐＨが高くなると、負電荷が想定される双性イオン性巨大分子を含む。
【００９４】
用語「陰イオン性巨大分子」は、生理学的ｐＨ等の選択ｐＨで正味負電荷をおびる幾つかの種のいずれかを指す。そのような巨大分子には、これらに限定されないが、核酸、タンパク質、ペプチド、および炭水化物が含まれる。
【００９５】
核酸
本発明の脂質ナノ粒子は、核酸の全身または局所送達に有用である。本明細書に記載のように、形質移入試薬組成物は、その結果生じる脂質ナノ粒子に組み込まれる核酸と混合される。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことが意図されている。最大５０個のヌクレオチドを含有する断片は、一般的にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さが２０〜５０個のヌクレオチドである。本発明の状況では、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、天然の塩基、糖、および糖（骨格）間結合で構成されるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。また、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同様に機能する、非天然モノマーまたはそれらの部分を含むポリマーまたはオリゴマーを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取込みの増強およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増強等の特性のため、天然形態よりも好ましいことが多い。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドに分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、この糖の５’および３’炭素でホスフェートと共有結合で結合して、交互非分枝ポリマーを形成するデオキシリボースと呼ばれる５−炭素糖で構成される。リボオリゴヌクレオチドは、５−炭素糖がリボースである場合、同様の反復構造で構成される。本発明による脂質ナノ粒子に存在する核酸は、既知の任意の形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。二本鎖ＤＮＡの例には、構造遺伝子、制御および終結領域を含む遺伝子、およびウイルスまたはプラスミドＤＮＡ等の自己増殖系が含まれる。二本鎖ＲＮＡの例には、ｓｉＲＮＡおよび他のＲＮＡ干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡ、および三重鎖成形オリゴヌクレオチドが含まれる。
【００９７】
１つのあ態様では、ポリ核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ある態様では、核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、予め凝縮したＤＮＡ、またはアプタマーである。
【００９８】
また、用語「核酸」は、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、他のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、およびそれらの組み合わせを指し、一本鎖、二本鎖であってもよく、または適切な場合は、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。
【００９９】
用語「ヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、一般的に、以下の用語：ヌクレオチド塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体、およびユニバーサルヌクレオチドを包含する。それらは下記のように定義される。
【０１００】
用語「ヌクレオチド塩基」は、本明細書で使用される場合、１つ以上の置換または無置換の親芳香族環を指す。幾つかの態様では、１つ以上の芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含有する。幾つかの態様では、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基と、ワトソン−クリック型および／またはフーグスティーン型の水素結合を形成可能である。例示的なヌクレオチド塩基およびそれらの類似体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、アデニン（Ａ）、エテノアデニン、Ｎ６−２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ６−メチルアデニン、グアニン（Ｇ）、イソグアニン、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン（６ｓＧ）ヒポキサンチン、およびＯ６−メチルグアニン等のプリン；７−デアザアデニン（７−デアザ−Ａ）および７−デアザグアニン（７−デアザ−Ｇ）等の７−デアザ−プリン；シトシン（Ｃ）、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、チミン（Ｔ）、４−チオチミン（４ｓＴ）、５，６−ジヒドロチミン、Ｏ４−メチルチミン、ウラシル（Ｕ）、４−チオウラシル（４ｓＵ）、および５，６−ジヒドロウラシル（ジヒドロウラシル；Ｄ）等のピリミジン；ニトロインドールおよび４−メチルインドール等のインドール；ニトロピロール等のピロール；ネブラリン；塩基（Ｙ）。幾つかの態様では、ヌクレオチド塩基は、ユニバーサルヌクレオチド塩基である。更なる例示的なヌクレオチド塩基は、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３８５〜３９４頁、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．およびそこに引用されている参考文献に見出すことができる。ユニバーサル塩基の更なる例は、例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎ．Ａ．Ｒ．２００１、２９：２４３７〜２４４７およびＳｅｅｌａ  Ｎ．Ａ．Ｒ．２０００、２８：３２２４〜３２３２に見出すことができる。
【０１０１】
用語「ヌクレオシド」は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチド塩基が、ペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合で結合されている化合物を指す。幾つかの態様では、結合は、ヘテロ芳香族環窒素を介している。典型的なペントース糖には、これらに限定されないが、炭素原子の１つ以上が、各々独立して、同じまたは異なる−−Ｒ、−−ＯＲ、−−ＮＲＲ、またはハロゲン基の１つ以上で置換され、各Ｒが、独立して、水素（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールであるペントースが含まれる。ペントース糖は、飽和していてもよく、または不飽和であってもよい。例示的なペントース糖およびその類似体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：リボース、２’−デオキシリボース、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、および２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース。また、例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４０６７〜７４）、２’−４’−および３’−４’−結合および他の「ロックド」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾（ＷＯ９８／２２４８９、ＷＯ９８／３９３５２、ＷＯ９９／１４２２６）を参照されたい。「ＬＮＡ」または「ロックド核酸」は、リボース環が、２’−酸素と３’−または４’−炭素との間のメチレン結合により拘束されるように、コンフォメーション的にロックされているＤＮＡ類似体である。結合により課されるコンフォメーションの制限は、相補的配列に対する結合親和性を増加させ、そのような二本鎖の熱安定性を増加させることが多い。
【０１０２】
糖は、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロ、およびブロモ等の修飾を、２’−または３’−位に含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドには、天然Ｄ立体配置異性体（Ｄ型）、ならびにＬ立体配置異性体（Ｌ型）が含まれる（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ、米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ、米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ、ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４１５９〜６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９〜７０）。核酸塩基がプリン、例えば、ＡまたはＧである場合、リボース糖は、核酸塩基のＮ９位に結合されている。核酸塩基がピリミジン、例えば、Ｃ、Ｔ、またはＵである場合、ペントース糖は、核酸塩基のＮ１位に結合されている（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）。
【０１０３】
ヌクレオシドのペントース炭素の１つ以上は、リン酸エステルで置換されていてもよい。幾つかの態様では、リン酸エステルは、ペントースの３’−または５’−炭素に結合されている。幾つかの態様では、ヌクレオシドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、ユニバーサルヌクレオチド塩基、特定のヌクレオチド塩基、またはそれらの類似体であるものである。
【０１０４】
用語「ヌクレオチド類似体」は、本明細書で使用される場合、ペントース糖、および／またはヌクレオチド塩基、および／またはヌクレオシドのリン酸エステルの１つ以上が、その対応する類似体と置きかえられていてもよい態様を指す。幾つかの態様では、例示的なペントース糖類似体は、上述されているものである。幾つかの態様では、ヌクレオチド類似体は、上述のようなヌクレオチド塩基類似体を有する。幾つかの態様では、例示的なリン酸エステル類似体には、これらに限定されないが、アルキルホスホナート、メチルホスホナート、ホスホルアミダート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリダート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートが含まれ、結合している対イオンが含まれていてもよい。他の核酸類似体および塩基には、例えば、インターカレーション核酸（ＩＮＡ、ＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎおよびＰｅｄｅｒｓｅｎ、２００２に記載）、およびＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ、米国特許第５，４３２，２７２号）が含まれる。また、種々の核酸類似体の更なる説明は、以下の文献に見出すことができる：例えば、（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の引用文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；およびＰａｕｗｅｌｓら、ＣｈｅｍｉｃａＳｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１（１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許第５，６４４，０４８号。他の核酸類似体は、以下のものを含む：ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））、Ｏ−メチルホスホロアミダイト連結（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照）、正の骨格を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７（１９９５）；非イオン性骨格を有するもの（米国特許第５，３８６，０２３号；第５，３８６，０２３号；第５，６３７，６８４号；第５，６０２，２４０号；第５，２１６，１４１号；および第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７（１９４）：第２および３章、ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））；および米国特許第５，２３５，０３３号および第５，０３４，５０６号、ならびにＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ編、第６および７章に記載のものを含む非リボース骨格を有するもの。１つ以上の炭素環糖を含有する核酸も、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）、１６９〜１７６頁を参照）。Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３５頁にも、幾つかの核酸類似体が記載されている。
【０１０５】
用語「ユニバーサルヌクレオチド塩基」または「ユニバーサル塩基」は、本明細書で使用される場合、窒素原子を含有していてもよく、または含有していなくともよい芳香族環部分を指す。幾つかの態様では、ユニバーサル塩基を、ペントース糖のＣ−１’炭素に共有結合で結合して、ユニバーサルヌクレオチドを作製してもよい。幾つかの態様では、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。幾つかの態様では、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、特定の標的ポリヌクレオチドにある全てのヌクレオチド塩基に限り、ヌクレオチド塩基と水素結合する。幾つかの態様では、ヌクレオチド塩基は、疎水性スタッキングにより、同じ核酸鎖にある隣接したヌクレオチド塩基と相互作用してもよい。ユニバーサルヌクレオチドには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる：デオキシ−７−アザインドールトリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリルトリホスフフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシＩｍＰｙトリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰトリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）、またはデオキシプロピニル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）。そのようなユニバーサル塩基の更なる例は、特に、米国特許出願公開第１０／２９０，６７２号および米国特許第６，４３３，１３４号に見出すことができる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合連結、例えば、３’−５’および２’−５’、逆位連結、例えば、３’−３’および５’−５’、分枝構造、またはヌクレオチド間類似体により連結された、２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む、ヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、およびＮａ＋等の対イオンと結合する。ポリヌクレオチドは、もっぱらデオキシリボヌクレオチドで構成されていてもよく、もっぱらリボヌクレオチドで構成されていてもよく、またはそれらのキメラ組成物で構成されていてもよい。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間介在物、核酸塩基、および／または糖類似体で構成されていてもよい。ポリヌクレオチドは、典型的には、サイズが、少数のモノマー単位、例えば３〜４０個から数千個の単量体ヌクレオチド単位の範囲であり、少数のモノマー単位の場合は、当技術分野では一般的にオリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い。別様に指定されていない限り、ポリヌクレオチド配列が示されている場合は常に、ヌクレオチドは、左から右に５’から３’の順であり、別様に指定されていない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシトシンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すと理解されるだろう。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「核酸塩基」は、核酸技術を使用するかまたはペプチド核酸技術を使用して、それにより、核酸と配列特異的に結合することができるポリマーを生成する者に一般的に知られている、天然および非天然複素環部分を意味する。好適な核酸塩基の非限定的な例には、次のものが含まれる：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシル、および２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）、およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）。好適な核酸塩基の他の非限定的な例には、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（ＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３）の図２（Ａ）および２（Ｂ）に示されている核酸塩基が含まれる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「核酸塩基配列」は、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの、任意のセグメント、または２つ以上のセグメントの集合体（例えば、２つ以上のオリゴマーブロックの核酸塩基配列集合体）を意味する。好適なポリマーまたはポリマーセグメントの非限定的な例には、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組合せオリゴマー、核酸類似体、および／または核酸模倣体が含まれる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基サブユニットを含む、完全な単一ポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の単一核酸鎖は、ポリ核酸塩基鎖である。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはそれらの類似体から形成されている骨格を有する、核酸塩基配列含有ポリマーまたはポリマーセグメントである。
【０１１１】
好ましい核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡである。
【０１１２】
また、本明細書で使用される場合、核酸は、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」を指していてもよく、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含むが、核酸サブユニット（またはそれらの類似体）を含まない、任意のオリゴマーまたはポリマーセグメント（例えば、ブロックオリゴマー）を意味し、それらには、これらに限定されないが、以下の文献でペプチド核酸であると参照または主張されているオリゴマーまたはポリマーセグメントがいずれも含まれる：米国特許第５，５３９，０８２号；第５，５２７，６７５号；第５，６２３，０４９号；第５，７１４，３３１号；第５，７１８，２６２号；第５，７３６，３３６号；第５，７７３，５７１号；第５，７６６，８５５号；第５，７８６，４６１号；第５，８３７，４５９号；第５，８９１，６２５号；第５，９７２，６１０号；第５，９８６，０５３号；および第６，１０７，４７０号。これらの文献の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、以下の刊行物に記載されている核酸模倣体の２つ以上のサブユニットを含む、任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントにも当てはまるものとする：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４：１０８１〜１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６：７９３〜７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５〜４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７〜６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７〜６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１〜６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１〜１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７：１７４３〜１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、（１９９７）１：５３９〜５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７〜５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５５５〜５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１〜５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ．−Ｈ．ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７：１１１９〜１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８：１６５〜１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３７：３０２〜３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３８：４２１１〜４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３：１１６７〜１１７６（１９９７）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．３：９１２〜９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（９）：１２６９〜１２７２（２００１）；およびＷＯ９６／０４０００に開示されている、Ｓｈａｈらのｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭＳ）。
【０１１３】
本発明の脂質ナノ粒子は、他の同様に構成されている物質とは、その形態が異なり、実質的に中実なコアを有することを特徴とする。実質的に中実なコアを有する脂質ナノ粒子は、内部に広範な水性領域を有しておらず、主に脂質である内部を有する粒子である。１つの態様では、広範な領域とは、粒子容積の半分を超える容積を有する連続的水性領域である。第２の態様では、広範な水性領域は、粒子容積の２５％を超える。内部水性領域の範囲は、電子顕微鏡で決定してもよく、低電子密度の領域として観察される。更に、中実コア（solid core）ナノ粒子の内部は、主に脂質であるため、粒子を構成する脂質１単位当たりの粒子の水性内容物（「捕捉容積」）は、同じ半径を有する単層二分子膜脂質小胞で予想される捕捉容積未満である。１つの態様では、捕捉容積は、同じ半径を有する単層二分子膜小胞で予想される捕捉容積の５０％未満である。第２の態様では、捕捉容積は、同じサイズの単層二分子膜小胞で予想される捕捉容積の２５％未満である。第３の態様では、捕捉容積は、粒子の全容積の２０％未満である。１つの態様では、脂質１単位当たりの捕捉容積は、脂質１マイクロモル当たり２マイクロリットル未満である。別の態様では、捕捉容積は、脂質１マイクロモル当たり１マイクロリットル未満である。加えて、脂質１単位当たりの捕捉容積は、二分子膜脂質小胞の場合、小胞の半径が増加すると共に実質的に増加するが、脂質１単位当たりの捕捉容積は、中実コアナノ粒子の半径が増加しても実質的に増加しない。１つの態様では、脂質１単位当たりの捕捉容積は、平均サイズが、直径２０ｎｍから直径１００ｎｍに増加すると、５０％未満増加する。第２の態様では、脂質１単位当たりの捕捉容積は、平均サイズが、直径２０ｎｍから直径１００ｎｍに増加すると、２５％未満増加する。捕捉容積は、文献に記載されている様々な技法を使用して測定することができる。中実コア系は、粒子内部に脂質を含有するため、脂質１モル当たりの、所与半径の生成粒子の総数は、二分子膜小胞系で予想される総数よりも少ない。脂質１ｍｏｌ当たりの生成粒子数は、中でも蛍光技法により測定することができる。
【０１１４】
また、本発明の脂質ナノ粒子は、電子顕微鏡で特性決定することができる。実質的に中実なコアを有する本発明の粒子は、電子顕微鏡で見られるように高電子密度のコアを有する。高電子密度は、中実コア粒子の投影面積の内部５０％の面積平均電子密度（２Ｄ極低温ＥＭ画像に見られるような）が、粒子の周囲の最大電子密度のｘ％（ｘ＝２０％、４０％、６０％）未満であることと規定する。電子密度は、ナノ粒子を含有していない領域のバックグラウンド強度と、目的領域の画像強度との差の絶対値として算出される。
【０１１５】
封入効率
本発明の脂質ナノ粒子は、更に、封入効率が優れていてもよい。下記に記載されているように、本発明の脂質ナノ粒子は、形成プロセスで使用される核酸のほぼ１００％（例えば、８０〜１００％）が、粒子に封入されるプロセスにより調製される。１つの態様では、脂質ナノ粒子は、形成プロセスで使用される核酸の約９０から約９５％までが粒子に封入されるプロセスにより調製される。
【０１１６】
脂質ナノ粒子を作製するためのマイクロ流体法
１つの態様では、本発明は、脂質形質移入試薬組成物を使用して、陰イオン性巨大分子を含有する脂質ナノ粒子を作製するための方法を提供する。１つの態様では、本方法は、
（ａ）第１の溶媒中の陰イオン性巨大分子（例えば、ポリ核酸）を含む第１のストリームをマイクロチャネルに導入することであって、マイクロチャネルは、導入される１つ以上のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第１の領域、および１つ以上のストリームの内容物を混合するための第２の領域を有すること、
（ｂ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２のストリームをマイクロチャネルに導入して、デバイスに流れる第１および第２のストリームを準備することであって、形質移入試薬組成物は、イオン化可能な陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、および界面活性剤を含み、第１および第２の溶媒は同じではないこと、
（ｃ）１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームを、マイクロチャネルの第１の領域から、マイクロチャネルの第２の領域に流すこと、および
（ｄ）流れている１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの内容物を、マイクロチャネルの第２の領域で混合して、封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することを含む。
【０１１７】
第１および第２のストリームの内容物は、カオス的移流により混合することができる。１つの態様では、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの内容物の混合は、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの濃度または相対的混合速度を変更することを含む。上記の態様では、本方法は、公知の方法とは異なり、混合後に希釈することを含まない。
【０１１８】
封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含有する第３のストリームを更に安定させるため、本方法は、第３のストリームを水性緩衝液で希釈することを含むことができるが、必ずしも更に含んでいる必要はない。１つの態様では、第３のストリームの希釈は、第３のストリームおよび水性緩衝液を、第２の混合構造に流すことを含む。別の態様では、封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含む水性の緩衝液を透析して、第２の溶媒の量を低減させる。
【０１１９】
第１のストリームは、第１の溶媒中の陰イオン性巨大分子を含む。好適な第１の溶媒には、陰イオン性巨大分子が可溶性であり、第２の溶媒と混和性である溶媒が含まれる。好適な第１の溶媒には、水性緩衝液が含まれる。代表的な第１の溶媒には、クエン酸緩衝液および酢酸緩衝液が含まれる。
【０１２０】
第２のストリームは、第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む。好適な第２の溶媒には、脂質および界面活性剤が可溶性であり、第１の溶媒と混和性である溶媒が含まれる。好適な第２の溶媒には、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド，酸、およびアルコールが含まれる。代表的な第２の溶媒には、９０％水性エタノールが含まれる。
【０１２１】
本発明の方法は、幾つかの点で他のマイクロ流体混合法より優れている。ある公知の方法は、等しいかまたは実質的に等しい割合の水性および有機溶媒（つまり、１：１）を必要とするが、本発明の方法では、概して、１：１を超える水性溶媒対有機溶媒の溶媒比が使用される。ある態様では、水性溶媒対有機溶媒の溶媒比は、約２：１である。ある態様では、水性溶媒対有機溶媒の溶媒比は、約３：１である。ある態様では、水性溶媒対有機溶媒の溶媒比は、約４：１である。ある他の態様では、水性溶媒対有機溶媒の溶媒比は、約５：１、約１０：１、約５０：１、または約１００：１以上である。
【０１２２】
本発明の脂質ナノ粒子は、有利には、比較的迅速な混合および高流量が使用されるマイクロ流体プロセスで形成される。迅速な混合は、サイズ、均一性、封入効率を含む上述の有利な特性を有する脂質ナノ粒子を提供する。本発明の方法の実施に使用される混合速度は、約１００μ秒から約１０ミリ秒までの範囲である。代表的な混合速度には、約１から約５ミリ秒までが含まれる。流体力学的フローフォーカシング法は、比較的低い脂質容積で、比較的低流量（例えば、５〜１００μＬ／分）にて行われるが、本発明の方法は、比較的高流量および比較的高脂質容積で行われる。ある態様では、単一の混合領域（つまり、ミキサ）が組み込まれている方法の場合、流量は、約１０ｍＬ／分である。ミキサアレイ（例えば、１０個のミキサ）を使用する本発明の方法の場合、１００ｍＬ／分の流量が使用される（１００個のミキサの場合、流量は１０００ｍＬ／分）。したがって、本発明の方法は、容易に大規模化して、厳しい生産条件が必要な脂質ナノ粒子量を提供することができる。有利な粒径および均一性および封入効率が実現されることに加えて、本発明の方法は、脂質ナノ粒子を生産するための既知マイクロ流体法の欠点を克服する。脂質ナノ粒子を作製するための本発明の方法の１つの利点は、本方法は大規模化が可能であることであり、それは、本方法が規模に依存して変化せず、規模に対する対応性が優れていることを意味する。
【０１２３】
脂質ナノ粒子を作製するためのマイクロ流体デバイス
別の側面では、本発明は、形質移入試薬組成物を使用して、陰イオン性巨大分子を封入している脂質ナノ粒子を生産するためのデバイスを提供する。１つの態様では、本デバイスは、
（ａ）第１の溶媒中の核酸を含む第１の溶液を受容するための第１の入口、
（ｂ）第１の溶媒中の核酸を含む第１のストリームを提供するための、第１の入口と流体連通する第１の入口マイクロチャネル、
（ｃ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２の溶液を受容するための第２の入口、
（ｄ）第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２のストリームを提供するための、第２の入口と流体連通する第２の入口マイクロチャネル、および
（ｅ）第１および第２のストリームを受容するための第３のマイクロチャネルを含み、第３のマイクロチャネルは、導入される第１および第２のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第１の領域、ならびに第１および第２のストリームの内容物を混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を有する。
【０１２４】
１つの態様では、デバイスは、第３のストリームを希釈して、封入された陰イオン性巨大分子を有する安定化脂質ナノ粒子を含む希釈ストリームを提供するための手段を更に含む。
【０１２５】
本発明のデバイスは、１つ以上のマイクロチャネル（つまり、その最大寸法が１ミリメートル未満であるチャネル）を含むマイクロ流体デバイスである。１つの態様では、マイクロチャネルは、約２０から約３００μｍまでの流体力学的直径を有する。上述のように、マイクロチャネルは、２つの領域を有し、第１の領域は、少なくとも２つのストリーム（例えば、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリーム）を受容し、デバイスに流す。第１および第２のストリームの内容物は、マイクロチャネルの第２の領域で混合される。１つの態様では、マイクロチャネルの第２の領域は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号に記載されているように、主ストリーム方向、および少なくとも１つの溝または凸部がそこに設けられている１つ以上の表面を有し、溝または凸部は、主方向と角度を形成する配向性を有する（例えば、スタガードヘリンボーンミキサ）。１つの態様では、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。最大混合速度を達成するために、混合領域前での過剰な流体抵抗を回避することが有利である。したがって、本発明の１つの態様は、直径が１０００ミクロンを超える非マイクロ流体チャネルを使用して、流体を単一の混合チャネルに送達するデバイスである。
【０１２６】
１つの態様では、マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。デバイスは、２つの入口、上記で調製した溶液の各々に１つずつ、および１つの出口を有する。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。デバイスは、高さがおよそ４０μｍで厚さが７５ｍの特徴によりチャネルの天井に形成されたヘリンボーン構造を有する、幅が３００μｍで高さがおよそ１３０μｍの混合チャネルを特徴とする。デバイスは、デバイスの入口および出口ポートと一致するように穿孔された３つの１．５ｍｍ穴を有する４０×３６×２ｍｍのスライドガラスに、酸素プラズマ処理を使用して密封した。
【０１２７】
第２の態様では、マイクロ流体デバイスは、環式オレフィンコポリマー等の硬質熱可塑材で生産される。ＣＮＣミルを使用してネガティブツールを機械加工し、射出成形を使用してデバイスを形成した。チャネル寸法は、垂直面に対して１°〜５°の範囲の抜勾配を付加することで保存した。成形品は、これらに限定されないが、積層、溶剤接着、ヒートプレス、およびそれらの組み合わせを含む様々な技法を使用して、空基材に密封した。接合したデバイスを焼きなまして、生産プロセスに由来する残留応力を除去した。形成したら、デバイスを、エラストマーデバイスと同じ方法で特注機器に設置し、使用した。
【０１２８】
本発明の他の側面では、第１および第２のストリームは、他のマイクロミキサで混合される。好適なマイクロミキサには、液滴ミキサ、Ｔ型ミキサ、ジグザグミキサ、多層ミキサ、または他のアクティブミキサが含まれる。
【０１２９】
また、第１および第２のストリームの混合は、第１および第２のストリームの濃度および相対的流量を変更するための手段を用いて達成することができる。
【０１３０】
別の態様では、陰イオン性巨大分子を封入している脂質ナノ粒子を生産するためのデバイスは、第１および第２のストリームを受容するためのマイクロチャネルを含み、マイクロチャネルは、導入される第１および第２のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第１の領域、ならびに第１および第２のストリームの内容物を混合して、封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を有する。この態様では、第１および第２のストリームは、上述のように、第１および第２のマイクロチャネル以外の手段によりマイクロチャネルに導入される。
【０１３１】
最大混合速度を達成するためには、混合領域前での過剰な流体抵抗を回避することが有利である。したがって、本発明の１つの態様は、直径が１０００ミクロンを超える非マイクロ流体チャネルを使用して、流体を単一の混合チャネルに送達するデバイスである。陰イオン性巨大分子を封入している脂質ナノ粒子を生産するためのこのデバイスは、
（ａ）第１の溶媒中の陰イオン性巨大分子を含む第１の溶液と、第２の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第２の溶液の両方を受容するための単一の入口マイクロチャネル、および
（ｂ）第１および第２のストリームの内容物を混合して、封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を含む。
【０１３２】
そのような態様では、第１および第２のストリームは、単一の入口により、またはミクロ寸法を有していない１つまたは２つのチャネル、例えば、１０００μｍを超える（例えば、１５００、または２０００μｍ以上）寸法を有する１つ以上のチャネルにより、マイクロチャネルに導入される。これらチャネルは、隣接したまたは同心状のマクロサイズチャネルを使用して、入口マイクロチャネルに導入されてもよい。
【０１３３】
脂質ナノ粒子を使用して陰イオン性巨大分子を送達する方法
本発明の形質移入試薬組成物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで陰イオン性巨大分子を細胞に送達するための脂質ナノ粒子を調製してもよい。特定の態様では、陰イオン性巨大分子は核酸であり、それが、本発明の核酸−脂質ナノ粒子を使用して細胞に送達される。本方法および形質移入試薬組成物は、そのような治療から利益を得るであろう任意の疾患または障害を治療するための任意の好適な陰イオン性巨大分子を送達するように容易に構成することができる。
【０１３４】
ある態様では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞に導入するための好ましい核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、免疫刺激オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、およびリボザイムである。これら方法は、本発明の形質移入試薬組成物で調製された脂質ナノ粒子を、細胞内送達が生じるのに十分な期間、細胞と接触させることにより実施してもよい。
【０１３５】
典型的な応用には、周知の手順を使用して、ｓｉＲＮＡの細胞内送達をもたらし、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングさせることが含まれる。或いは、応用には、治療上有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列を送達することが含まれる。このように、欠損したまたは存在しない遺伝子産物を供給することにより、遺伝疾患の療法が提供される。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施してもよい。例えば、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。
【０１３６】
本発明の形質移入試薬組成物を使用して調製された脂質ナノ粒子によるｓｉＲＮＡの送達、および遺伝子発現をサイレンシングするその有効性を、下記に記載する。
【０１３７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与の場合、医薬組成物は、好ましくは、非経口的に（例えば、関節内に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、または筋肉内に）投与される。特定の態様では、医薬組成物は、ボーラス注入により静脈内にまたは腹腔内に投与される。他の投与経路には、局所（皮膚、眼、粘液膜）、経口、肺性、鼻腔内、舌下、直腸、および膣が含まれる。
【０１３８】
１つの態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これら方法は、概して、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することが可能な核酸と結合する本発明の形質移入試薬を使用して調製された脂質ナノ粒子を、細胞と接触させることを含む。本明細書で使用される場合、用語「調節」は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変更することを指す。調節は、増加もしくは増強を意味してもよく、または減少もしくは低減を意味してもよい。
【０１３９】
関連する態様では、本発明は、対象中でのポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に提供することを含み、陰イオン性巨大分子が、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含む方法を提供する。
【０１４０】
更なる側面では、本発明は、本発明の形質移入試薬を使用して調製された脂質ナノ粒子、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。代表的な薬学的に許容される担体または希釈剤には、静脈注射用の溶液（例えば、生理食塩水またはデキストロース）が含まれる。組成物は、クリーム、軟膏、ゲル、懸濁液、または乳剤の形態を取ることができる。
【０１４１】
以下には、代表的な形質移入試薬組成物、脂質ナノ粒子系、形質移入試薬組成物を使用して脂質ナノ粒子系を作製するためのデバイスおよび方法、ならびに陰イオン性巨大分子を送達するためのＬＮＰを使用するための方法が記載されている。
【０１４２】
迅速なマイクロ流体混合は、単分散脂質ナノ粒子の生産を可能にする
脂質ナノ粒子の配合物は、カオス的移流を誘発し、中間的なレイノルズ数（２４＜Ｒｅ＜２４０）に制御された混合環境を提供するように設計されたマイクロ流体ミキサ（図５）内で、脂質−エタノール溶液を水性緩衝液と迅速に混合することにより実施した。マイクロ流体チャネルは、周期半ばでヘリンボーン構造の配向性を変更することによりカオス的流れを生成し、局所的な回転および伸長流の中心に周期的変化を引き起こすヘリンボーンを含有する。
【０１４３】
以下の代表的な形質移入試薬組成物は、イオン化可能な陽イオン性脂質、見かけのｐＫａが６．３である１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（陽イオン性リピドＡ）を含む。このｐＫａは、脂質を、低ｐＨでのｓｉＲＮＡ封入に好適なものにし、生理学的なｐＨでほぼ中性の陽イオン性表面電荷密度を提供する。形質移入試薬組成物をモデル系として使用して、マイクロ流体混合によるＬＮＰ形成時の界面活性剤の選択および安定剤のｍｏｌ％を決定した。エタノール溶液は、形質移入試薬組成物を含有していた。水性緩衝液は、０．０６（重量／重量）のｓｉＲＮＡ／総脂質比をもたらすようにｓｉＲＮＡを含有していた。形成されたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを、緩衝液に直接希釈して、エタノール含有量をおよそ２２容積％に低減した。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ粒径は、形質移入試薬組成物に存在する界面活性剤の選択および界面活性剤のｍｏｌ％に依存した。粒径は、形質移入試薬組成物中の界面活性剤のｍｏｌ％が増加すると共に減少した。形質移入試薬組成物中の界面活性剤ポリオキシエチレン（４０）ステアレートの割合を、１ｍｏｌ％から１０ｍｏｌ％に増加させることにより、その結果生じたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ粒子直径は、１０３．２ｎｍから３７．４ｎｍに減少した（表１）。
【０１４４】
マイクロ流体デバイスでの自己集合は、封入がほぼ完全なＬＮＰをもたらすことができる
形質移入試薬組成物からｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系を生産する際、ロバストなプロセスは、ＯＧＮ産物の高い封入パーセントを必然的に提供することになる。ｓｉＲＮＡ封入は、界面活性剤の選択、および形質移入試薬組成物中の界面活性剤の関連割合の関数として評価した。ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ配合物は、使用した界面活性剤および界面活性剤の相対的割合に関わらず、１００パーセントに近い封入パーセントを達成した（表２）。
【０１４５】
形質移入試薬組成物を使用してマイクロ流体により生産されたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系は、ｉｎ  ｖｉｖｏで非常に強力な遺伝子サイレンシング作用剤であり得る
ｉ．ｖ．注射後にｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子サイレンシングを誘導する、ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系の能力を、マウス第ＶＩＩ因子モデルを使用して調査した。ｓｉＲＮＡ対脂質比が０．０６重量／重量の配合物１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル（４−（ジメチルアミノ）ブタノエート：ＤＳＰＣ：コレステロール：界面活性剤）（５０：１０：４０−界面活性剤％：界面活性剤％）を、マイクロ流体手法を使用して生成した。１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡと等しい単回用量を、マウス（ｎ＝３）に尾静脈注射した。注射の２４時間後に血液採取を実施し、ＦＶＩＩレベルを比色測定法により決定した。データ（図１）は、１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ用量と等しい単回静脈注射の２４時間後、血液中のＦＶＩＩレベルが、対照と比較して＞９５％低減したことを示す。
【０１４６】
結果は、スタガードヘリンボーンミキサを含有するマイクロ流体デバイスを使用すると、脂質組成が異なる形質移入試薬組成物を使用してＬＮＰを生成することができ、ｓｉＲＮＡ等のＯＧＮを効率的に封入することができ、生産されたｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で優れた遺伝子サイレンシング能力を示した。
【０１４７】
本発明のマイクロ流体デバイスおよびシステムは、形質移入試薬組成物を使用して、ＬＮＰを形成すること、および１００ｎｍ以下のサイズの、ＯＧＮを含有しているＬＮＰを形成し、１００％のＯＧＮ封入をもたらすことを可能する。ＬＮＰの形成に関し、混合の速度および比率は、明らかに重要なパラメータである。エタノール−脂質溶液を水性緩衝液と迅速に混合することにより、媒体極性の増大がもたらされ、それにより溶解した脂質の溶解度が低減し、溶液からの析出およびナノ粒子の形成がもたらされる。迅速な混合により、溶液は、混合容積の全体にわたって、脂質ユニマーの高過飽和状態を素早く達成し、ナノ粒子の迅速で均一な核形成がもたらされる。核形成の増加およびナノ粒子の成長により、周囲液体の遊離脂質が枯渇し、それにより、遊離脂質の集合によるその後の成長が制限される。
【０１４８】
中実コアＬＮＰ
ＬＮＰ構造は、イオン化可能な陽イオン性脂質形態がＬＮＰ内部に逆ミセル構造を形成することを示す限界サイズを示す。陽イオン性脂質が高電子密度ＬＮＰコアに寄与することは、そのようなＬＮＰ系の分子構造はどのようなものであり得るのかという疑問を呈示する。陽イオン性脂質は、対イオンと結合しており、逆ミセル等の逆構造を取ると提唱することは論理的であり、これは、これら脂質が、陰イオン性脂質を有する組成で六方晶ＨII相等の逆構造を取りやすい傾向があることと一致する。次いで、これは、純粋な陽イオン性脂質で構成されるＬＮＰ系は、本質的に、２〜３ｎｍの直径を有する逆ミセル内部を取り囲む２つの二分子膜の厚さである１０ｎｍの範囲の直径を有する限界サイズを示すはずであるということを示唆するだろう。ＨII相中のホスファチジルエタノールアミンの場合に見出される水性チャネルの直径は、２．６ｎｍである。マイクロ流体配合プロセスは、ＬＮＰ系の限界サイズ系の生成を促進する迅速混合動力学を提供する。
【０１４９】
このモデルは、マイクロ流体混合配合プロセス中に１００％近いｓｉＲＮＡ封入効率をどのように達成することができるかに関する理解を提供する。陽イオン性脂質が二分子膜の両側に等しく分布していると仮定すると、ｓｉＲＮＡ内部移行は最大で５０％であることが予想されることになるため、これは、二分子膜系にｓｉＲＮＡを封入する際の主要な課題である。このモデルは、ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのサイズ、組成、および表面電荷を容易に調節することができる方法を指し示す。サイズに関して、限界サイズ構造は、明らかに、１粒子当たり１つのｓｉＲＮＡモノマーを含有する構造であり、限界サイズは、およそ１５〜２０ｎｍであることを示唆している。そのようなｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ粒子は、本発明のマイクロ流体法を使用して容易に達成される。ｓｉＲＮＡのモノマーで構成される限界サイズｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系は、マイクロ流体混合技術を使用して、様々な組成および表面電荷のｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系を達成するための基本単位として使用することができる可能性がある。例えば、事前形成された限界サイズｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを、負荷電脂質を含有するエタノール溶液と迅速に混合することにより、過剰な陽イオン性脂質との相互作用がもたらされ、内部逆ミセルコア構造および負荷電表面が生成されることを予想することができる。
【０１５０】
本明細書に記載されている本発明の形質移入試薬組成物および脂質ナノ粒子は、列挙されている成分を含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）（つまり、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ））。ある態様では、本発明の形質移入試薬組成物および脂質ナノ粒子は、列挙されている成分、および粒子の特徴に影響を及ぼさない他の追加成分を含む（つまり、形質移入試薬組成物および脂質ナノ粒子は、列挙されている成分から本質的になる）。形質移入試薬組成物および脂質ナノ粒子の特徴に影響を及ぼす追加成分には、粒子の治療特性および効力を不利に変更するかまたは影響を及ぼす追加の陰イオン性巨大分子、列挙されている陰イオン性巨大分子成分を可溶化する粒子の能力を不利に変更するかまたは影響を及ぼす追加成分、および列挙されている陰イオン性巨大分子成分の細胞取込みまたは生物学的利用能を増加させる粒子の能力を不利に変更するかまたは影響を及ぼす追加成分などの成分が含まれる。他の態様では、本発明の形質移入試薬組成物および脂質ナノ粒子は、列挙されている成分のみを含む（つまり、からなる）。
【０１５１】
別の側面では、本発明は、脂質ナノ粒子を調製するためのキットを提供する。キットは、本発明の形質移入試薬組成物を含む。ある態様では、キットは、陰イオン性巨大分子（例えば、核酸）を含む。キットは、脂質ナノ粒子を作製するためのデバイス（例えば、マイクロ流体ミキサ）を任意に含む。
【０１５２】
キットで使用される有用なデバイスには、上述のデバイス、ならびにＷＯ２０１１／１４０６２７およびＷＯ２０１３／０５９９２２に記載のものが含まれる。これらの文献の各々は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１５３】
ある態様では、キットに有用なデバイスは、少容積の粒子を生産するためのデバイスである。本明細書で使用される場合、用語「少容積」は、２ｍＬ未満の容積、およびある態様では、１ｍＬ未満の容積（例えば、数十マイクロリットル）を指す。
【０１５４】
１つの態様では、本デバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１のウェル、
（ｂ）第１のウェルと流体連通する第１のチャネル、
（ｃ）第２の溶媒を含む第２の溶液を受容するための第２のウェル、
（ｄ）第２のウェルと流体連通する第２のチャネル、
（ｅ）それぞれ、第１および第２のウェルから第１および２のチャネルへと流れる第１および第２のストリームを受容するための第３のチャネルであり、導入される第１および第２のストリームをチャネルに流すように構成された第１の領域、ならびに第１および第２のストリームの内容物を混合して、粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を有する第３のチャネル、および
（ｆ）粒子を含む第３のストリームを受容するための第３のウェルを含む。
【０１５５】
この態様は、図８、９、および１２に示されている。
【０１５６】
デバイスは、１つ以上の第１のウェル、１つ以上の第１のチャネル、１つ以上の第２のウェル、１つ以上の第２のチャネル、１つ以上の第３のチャネル、および１つ以上の第３のウェルを含むことができる。
【０１５７】
１つの態様では、デバイスは、第３のストリームを希釈して、安定化粒子を含む希釈ストリームを提供するための手段を更に含む。
【０１５８】
別の態様では、本デバイスは、
（ａ）第１の溶媒を含む第１の溶液を受容するための第１のウェル、
（ｂ）第１のウェルと流体連通する第１のチャネル、および
（ｃ）第２の溶媒を含む第２の溶液を受容するための第２のウェルを含み、第２のウェルは、第１のウェルから第１のチャネルに流れる第１のストリームを更に受容し、第１のストリームおよび第２の溶液の内容物を第２のウェルで混合して、粒子を含む第３の溶液を提供するように構成されている。
【０１５９】
この態様は、図１０および１１に示されている。
【０１６０】
デバイスは、１つ以上の第１のウェル、１つ以上の第１のチャネル、および１つ以上の第２のウェルを含むことができる。
【０１６１】
ある態様では、デバイスは、マクロ流体またはマイクロ流体デバイスである。ある態様では、第１および第２のストリームは、カオス的移流、乱流混合、噴流、ボルテックス法、バブル混合、マイクロ音響流、撹拌、または他の混合法により混合することができる。混合は、能動混合デバイスまたは受動混合デバイスにより達成してもよい。混合は、連続流形式または限定容積形式で生じさせてもよい。混合は、ヘリンボーンミキサ、ジグザグミキサ、マイクロジェットミキサ、またはマイクロボルテックスミキサを含むマイクロ流体ミキサを使用して達成してもよい。混合は、Ｔ型ミキサ、Ｙ型ミキサ、またはＷ型ミキサを含む巨視的ミキサを使用して達成してもよい。
【０１６２】
ある態様では、デバイスは、１つ以上のマイクロチャネル（つまり、その最も大きな寸法が１ミリメートル未満であるチャネル）を含むマイクロ流体デバイスである。１つの態様では、マイクロチャネルは、約２０から約４００μｍまでの流体力学的直径を有する。ある態様では、マイクロチャネルは、２つの領域を有し、第１の領域は、少なくとも２つのストリーム（例えば、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリーム）を受容し、デバイスに流す。第１および第２のストリームの内容物は、マイクロチャネルの第２の領域で混合される。１つの態様では、マイクロチャネルの第２の領域は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号に記載されているように、主ストリーム方向、および少なくとも１つの溝または凸部がそこに設けられている１つ以上の表面を有し、溝または凸部は、主方向と角度を形成する配向性を有する。（例えば、スタガードヘリボーンミキサ）。１つの態様では、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を含む。最大混合速度を達成するために、混合領域前での過剰な流体抵抗を回避することが有利である。したがって、本発明の１つの態様は、直径が１０００ミクロンを超える非マイクロ流体チャネルを使用して、流体を単一の混合チャネルに送達するデバイスである。
【０１６３】
ある態様では、第１および第２のストリームの混合は、第１および第２のストリームの濃度および相対的流量を変更するための手段を用いて達成することもできる。異なる流れ割当量は、流れに加えられる圧力差、フローチャネル前後の圧力低下差、第１および第２のストリームに加えられるチャネルインピーダンス差、またはそれらの組み合わせのいずれかにより可能にしてもよい。チャネルの、高さ、幅、長さ、または表面特性を変更することによるチャネルのインピーダンス差を使用して、様々な流量を達成してもよい。１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの流れの、流体表面張力、粘性、および他の表面特性を使用および考慮して、様々な流量を達成してもよい。
【０１６４】
ある態様では、デバイスは、システムを完全にまたは部分的にパージして廃棄容積を最小限に抑えるための手段を更に含む。粒子の製造後または製造中、デバイスは、流体またはガスを、チャネルの第１の領域からチャネルの第２の領域へ、１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームに流して、第１のストリームおよび第２のストリームを放出させることができる。第１および第２のチャネルは、この方法に基づいて完全にまたは部分的にパージすることができる。空気、窒素、アルゴン、または他のもの等のガスを使用してもよい。水、水性緩衝液、エタノール、油類、または他の液体を含む液体を使用してもよい。
【０１６５】
ある態様では、デバイスは、背圧を加えて、チャネルの第１の領域から第２の領域への１つ以上の第１のストリームおよび１つ以上の第２のストリームの流れを、初期の所望入力圧力が達成されるまで制限することを保証することが可能である。これは、出口チャネルに圧力を加え、入力チャネルに陰圧を加えることにより達成してもよい。これは、最終粒子溶液に必要であってもよくまたは必要でなくともよい流体を出口レザバーに負荷することにより達成してもよい。
【０１６６】
ある態様では、デバイスは、流体廃棄を最小限に抑える様式で流体がデバイスに導入されるように設計されている。これは、流体をデバイスにピペットすること、デバイスから出てくる流体をピペットすること、デバイスを注射器に接続すること、または他の方法により達成してもよい。
【０１６７】
ある態様では、デバイスは、マイクロ流体用であり、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産される。デバイスは、２つの入口、上記で調製した溶液の各々に１つずつ、および１つの出口を有する。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。一例では、デバイス特徴は、高さがおよそ２５μｍで厚さが５０μｍの特徴によりチャネルの天井に形成されたヘリボーン構造を有する、幅が２００μｍで高さがおよそ７０μｍの混合チャネルである。デバイスは、酸素プラズマ処理を使用して、７５×２５×１．５ｍｍのスライドガラスに密封した。他の例には、より小さいか（幅１２０μｍ）またはより大きな（幅３００μｍ）幅および関連相対寸法を有するデバイスが含まれる。デバイスには、入力および出力ポートが穿孔されている。
【０１６８】
他の態様では、デバイスは、マイクロ流体用であり、環式オレフィンコポリマー等の硬質熱可塑材で生産される。ＣＮＣミルを使用してネガティブツールを機械加工し、射出成形を使用してデバイスを形成する。チャネル寸法は、垂直面に対して１°〜５°の範囲の抜勾配を付加することで保存する。成形品を、これらに限定されないが、積層、溶剤接着、ヒートプレス、およびそれらの組み合わせを含む様々な技法を使用して、空基材に密封する。接合したデバイスを焼きなまして、生産プロセスに由来する残留応力を除去する。形成したら、デバイスを、エラストマーデバイスと同じ方法で特注機器に設置し、使用する。
【０１６９】
最大混合速度を達成するためには、混合領域前での過剰な流体抵抗を回避することが有利である。したがって、１つの態様では、デバイスは、流体を単一の混合チャネルに送達するために使用される、直径が１０００ミクロンを超える非マイクロ流体チャネルを有する。粒子を生産するためのこのデバイスは、
（ａ）溶媒のみであるか溶媒と幾つかの溶液を含む第１の溶液、および第２の溶媒中の粒子成分を含む第２の溶液を受容するための単一の入口チャネル、および
（ｂ）第１および第２のストリームの内容物を混合して、粒子を含む第３のストリームを提供するように構成された第２の領域を含む。
【０１７０】
そのような態様では、第１および第２のストリームは、単一の入口により、またはミクロの寸法を有していない１つまたは２つのチャネル、例えば、１０００μｍを超える（例えば、１５００、または２０００μｍ以上の）寸法を有する１つ以上のチャネルにより、チャネルに導入される。これらチャネルは、隣接したまたは同心状のマクロサイズチャネルを使用して、入口チャネルに導入されてもよい。
【０１７１】
以下の例は、特許請求されている本発明を説明するために提供されており、特許請求されている本発明を限定するためのものではない。
【０１７２】
［実施例］
材料
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）およびコレステロールは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（アラバスター、アラバマ州）から入手した。４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、コレステロール、および界面活性剤は、Ｓｉｇｍａ（セントルイス、ミズーリ州）から入手した。（フェアローン、ニュージャージー州）。ＲＮａｓｅ  Ａは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ（オースティン、テキサス州）から入手した。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）標的および低ＧＣ陰性対照ｓｉＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から購入した。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡ：５’−ＧＧＡＵＣＡＵＣＵＣＡＡＧＵＣＵＵＡＣＴＴ−３’［配列番号１］（ＦＶＩＩセンス）、および５’−ＧＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＣＴＴ−３’［配列番号２］（ＦＶＩＩアンチセンス）。１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートは、ＡｌＣａｎａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）により合成された。
【０１７３】
例１
ＬＮＰ系の調製
この例には、事前形成小胞法を使用したｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系の調製が記載されている。
【０１７４】
ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系を、以下の文献に記載の事前形成小胞法を使用して作製した：Ｎ．Ｍａｕｒｅｒ、Ｋ．Ｆ．Ｗｏｎｇ、Ｈ．Ｓｔａｒｋ、Ｌ．Ｌｏｕｉｅ、Ｄ．ＭｃＩｎｔｏｓｈ、Ｔ．Ｗｏｎｇ、Ｐ．Ｓｃｈｅｒｒｅｒ、Ｓ．Ｓｅｍｐｌｅ、およびＰ．Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ、「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｕｐｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ」Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．８０：２３１０〜２３２６（２００１）。まず、陽イオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−脂質を、適切なモル比でエタノールに可溶化した。その後、脂質組成物を、水性緩衝液（クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液、ｐＨ４）に、ボルテックスしながら滴加して、最終エタノールおよび脂質濃度を３０％（容積／容積）にした。その後、Ｌｉｐｅｘ押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、バンクーバー、カナダ）を使用して、２つの積み重ねた８０ｎｍ細孔サイズのフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）から、水和した脂質を室温で５回押し出した。ｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する同一の水溶液に可溶化した）を、小胞懸濁液に混合しながら添加した。概して、０．０６（重量／重量）の標的ｓｉＲＮＡ／脂質比を使用した。この組成物を３５℃で３０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡの小胞再組織化および封入を可能にした。その後、エタノールを除去し、５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４．０に対して透析し（１２〜１４ｋ  ＭＷのカットオフ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、その後、ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析することにより、外部緩衝液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に取りかえた。
【０１７５】
例２
ＬＮＰ系の調製
この例では、マイクロ流体スタガードヘリンボーンミキサを使用して、本発明のｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ系を調製するために使用される代表的な形質移入試薬組成物が記載されている。
【０１７６】
ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ調製
オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）溶液を、ｐＨ４．０の２５ｍＭ酢酸緩衝液で調製した。所望のオリゴヌクレオチド対脂質比および配合物濃度に応じて、０．３ｍｇ／ｍｌ〜１．９ｍｇ／ｍｌ総脂質の目的濃度の溶液を調製した。１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル４（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＳＰＣ、コレステロール、および界面活性剤を、適切なモル比で含有する脂質溶液を、エタノールで調製し、２５ｍＭ酢酸緩衝液で希釈して、９０％（容積／容積）のエタノール濃度を達成した。図５は、この例で使用したマイクロ流体装置の模式図である。デバイスは、２つの入口、上記で調製した溶液の各々に１つずつ、および１つの出口を有する。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。デバイスは、２つの入口、上記で調製した溶液の各々に１つずつ、および１つの出口を有する。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。デバイスは、高さがおよそ４０μｍで厚さが７５μｍの特徴によりチャネルの天井に形成されたヘリンボーン構造を有する、幅が３００μｍで高さがおよそ１３０μｍの混合チャネルを特徴とする。デバイスは、デバイスの入口および出口ポートと一致するように穿孔された３つの１．５ｍｍ穴を有する４０×３６×２ｍｍのスライドガラスに、酸素プラズマ処理を使用して密封した。接合したデバイスは、デバイスを機器に密封するためのＯ−リングを有する上部プレート、および試薬を注射器に負荷するためのルアーフィッティングを有する裏側プレートを有する特注機器に設置した。デバイスおよび試薬を負荷すると、機器は、流体を規定の速度でデバイスから分配するシリンジポンプとして作動する。各ストリームの流量は、０．１ｍｌ／分から２０ｍｌ／分まで変化させた。機器は、２つの溶液をマイクロ流体デバイスに導入し、そこで、２つの溶液はＹ型接合部で接触する。この時点で、拡散による層流下でわずかな混合が生じるが、２つの溶液は、ヘリンボーン構造および屈曲したチャネルを通過する共に混合される。
【０１７７】
カオス的移流により、これら構造で混合が生じるため、積層ストリームの特徴的分離が次第に少なくなり、それにより迅速な拡散が促進される。この混合は、ミリ秒の時間スケールで生じ、脂質が次第により水性の環境に移動する結果となり、それらの溶解度が低減され、ＬＮＰの自発的形成がもたらされる。オリゴヌクレオチド種の封入は、形質移入試薬組成物に陽イオン性脂質を含めることにより、正荷電の脂質頭部基および負荷電のオリゴヌクレオチドが結合することで得られる。マイクロ流体デバイスで混合した後、ＬＮＰ組成物を、概して、２容積の撹拌緩衝液を含有するガラスバイアルに希釈した。５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４．０に対して透析し、その後ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して透析することにより、エタノールを最終的に除去する。緩衝溶液にオリゴヌクレオチドを存在させずに、空小胞を同様に生成した。
【０１７８】
ＬＮＰの特性決定
粒径は、Ｎｉｃｏｍｐ３７０型サブミクロン粒径測定器（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンタバーバラ、カリフォルニア州）を使用して、動的光散乱により決定した。数加重および強度加重分布データを使用した。脂質濃度は、Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ（リッチモンド、バージニア州）のコレステロールＥ酵素アッセイを使用して、総コレステロールを測定することにより確認した。遊離ｓｉＲＮＡの除去は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ、ゲッティンゲン、ドイツ）を用いて実施した。その後、７５％エタノールで溶離物を溶解し、２６０ｎｍの吸光度を測定することによりｓｉＲＮＡを定量化した。封入効率は、遊離オリゴヌクレオチド内容物の除去前後のオリゴヌクレオチド比から決定し、脂質含有量に対して正規化した。
【０１７９】
ＦＶＩＩ活性に対するｓｉＲＮＡ−ＬＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ活性
６〜８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを、０．２μｍフィルターでろ過し、使用前に無菌リン酸緩衝生理食塩水で必要な濃度に希釈した。配合物を、１０ｍｌ／ｋｇの容積で側尾静脈から静脈内投与した。２４時間後、動物をケタミン／キシラジンで麻酔にかけ、心穿刺により血液を収集した。試料を、血清に加工し（マイクロティナ血清分離チューブ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州）、直ちに試験したか、または後の血清因子ＶＩＩレベル分析のために−７０℃で保管した。手順は全て、該当する場合、地域、州、および連邦規則に従って実施し、組織内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されていた。
【０１８０】
血清因子ＶＩＩレベルを、比色定量Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＶＩＩアッセイキット（Ａｎａｉｒａ）を使用して決定した。対照血清を貯留し、連続希釈して（２００％から３．１２５％に）、処置動物中のＦＶＩＩレベルを算出するための較正曲線を生成した。処置動物（１用量当たりｎ＝３）および生理食塩水対照群（ｎ＝４）に由来する適切に希釈された血漿試料を、製造業者の説明書に従ってＢｉｏｐｈｅｎ  ＶＩＩキットを使用して分析した。９６ウェル平底非結合ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、コーニング、ニューヨーク州）で分析を実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。処置動物中の第ＶＩＩ因子レベルを、連続希釈した対照血清で生成した較正曲線で決定した。
【０１８１】
例３
形質移入試薬組成物を使用した代表的な脂質ナノ粒子の調製および特徴
この例では、本発明の代表的な形質移入試薬組成物を使用して、本発明の代表的なｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを調製したことが記載される。
【０１８２】
０．６７ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ溶液を、ｐＨ４．０の２５ｍＭ酢酸緩衝液で調製した。１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート：ＤＳＰＣ：コレステロール：界面活性剤Ｍｒｙｊ５２（５０：１０：３７．５：２．５ｍｏｌ％）を含有する脂質溶液を、エタノール中１９．８２ｍｇ／ｍＬの濃度で調製した。ｓｉＲＮＡ対脂質比は、０．０７（重量／重量）だった。各溶液を、３：１の水溶液：エタノールの流量比、１２ｍＬ／分の合計流量でマイクロ流体ミキサに入力し、２５容積％のエタノール終濃度をもたらした。ＭＥＳクエン酸塩ｐＨ６．７（１：５００希釈）で透析することにより、エタノールを除去した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で更に透析することにより、最終ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰを調製した。
【０１８３】
粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔs、ウェストボロー、マサチューセッツ州、米国）を使用して、動的光散乱により決定した。試料測定は、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で実施し、強度加重分布データを使用した。粒子は、４９．７ｎｍの平均粒子直径を有し、多分散性指数（ＰＤＩ）＝０．０６だった。
【０１８４】
例示的な態様が例示および記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、それらに種々の変更をなすことができることが認識されるだろう。
【０１８５】
排他的な所有または特権が請求されている本発明の態様は、以下のように定義される。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
形質移入試薬組成物であって、
（ａ）１つ以上の陽イオン性脂質またはその薬学的に許容される塩、
（ｂ）１つ以上の中性脂質、
（ｃ）１つ以上のステロール、および
（ｄ）１つ以上の界面活性剤
を含む組成物。
［２］
前記陽イオン性脂質が、アミノ脂質またはその薬学的に許容される塩である、［１］に記載の組成物。
［３］
前記陽イオン性脂質が、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ・Ｃｌ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］
前記陽イオン性脂質が、下記式またはその薬学的に許容される塩を有する
【化１２】
0006605446.tif 000013
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいＣ10〜Ｃ24アルキル、任意に置換されていてもよいＣ10〜Ｃ24アルケニル、任意に置換されていてもよいＣ10〜Ｃ24アルキニル、または任意に置換されていてもよいＣ10〜Ｃ24アシルであり、
Ｒ3およびＲ4は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキル、任意に置換されていてもよいＣ2〜Ｃ6アルケニル、または任意に置換されていてもよいＣ2〜Ｃ6アルキニルであり、またはＲ3およびＲ4は、一緒になって、４〜６つの炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１つまたは２つのヘテロ原子の、任意に置換されていてもよい複素環を形成してもよく、
Ｒ5は、存在しいていないまたは存在しているのいずれかであり、存在する場合は、水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
ｍ、ｎ、およびｐは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎ、およびｐは、同時に０ではなく、
ｑは、０、１、２、３、または４であり、
ＹおよびＺは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、Ｏ、Ｓ、またはＮＨである）、［１］〜［３］のいずれか一に記載の組成物。
［５］
前記陽イオン性脂質が、下記式またはその薬学的に許容される塩を有する
【化１３】
0006605446.tif 000014
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；オキソ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
または、Ｒ1およびＲ2は、それらが両方とも結合するＮ原子と一緒になり、３〜８員環へテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、
ここで、へテロアリールおよびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；オキソ；ニトロ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Ｒ3は、非存在、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
Ｒ4およびＲ5は、各々独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；オキソ；ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、−ＮＲ4−、−S−Ｓ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｓ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ4−、−ＮＲ4Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ4−、または−ＣＲ4Ｒ5−であり、
ＹおよびＺは、独立して、式Ｌ1−（ＣＲ6Ｒ7）α−［Ｌ2−（ＣＲ6Ｒ7）β］γ−Ｌ3
−Ｒ8を有するＣ10〜Ｃ30基であり、式中、
Ｌ1は、結合、−（ＣＲ6Ｒ7）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ8−、−Ｓ−、またはそれらの組み合わせであり、
各Ｒ6およびＲ7は、独立して、Ｈ；ハロ；ヒドロキシル；シアノ；ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルであり、
Ｌ2は、結合、−（ＣＲ6Ｒ7）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ8−、−Ｓ−、
【化１４】
0006605446.tif 000015
またはそれらの組み合わせであるか、または下記式を有し、
【化１５】
0006605446.tif 000016
式中、ｂ、ｃ、およびｄは、各々独立して、０、１、２、または３であり、ただし、ｂ、ｃ、およびｄの合計は、少なくとも１および８以下であり、Ｒ9およびＲ10は、各々独立してＲ7であるか、または隣接したＲ9およびＲ10は、一緒になって、任意に結合であってもよく、
Ｌ3は、結合、−（ＣＲ6Ｒ7）−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＮＲ8−、−Ｓ−、
【化１６】
0006605446.tif 000017
またはそれらの組み合わせであり、
Ｒ8は、独立して、Ｈ；ハロ；ヒドロキシ；シアノ；アルコキシ；アリール；へテロアリール；またはハロ、ヒドロキシ、もしくはヘテロシクリルにより任意に置換されていてもよいＣ1〜Ｃ6アルキルであるか、またはＲ8は、下記式を有し、
【化１７】
0006605446.tif 000018
ａは、０、１、２、３、または４であり、
αは、０〜６であり、
各βは、独立して、０〜６であり、
γは、０〜６である）、［１］〜［３］のいずれか一に記載の組成物。
［６］
前記陽イオン性脂質が、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートまたはその薬学的に許容される塩である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［７］
前記中性脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［８］
前記中性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［９］
前記ステロールがコレステロールである、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［１０］
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ジブロックポリオキシエチレンエーテルコポリマー、トリブロックポリオキシエチレンアルキルエーテルコポリマー、および両親媒性分枝ポリマーからなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［１１］
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（４０）ステアレート、ポリ（プロピレングリコール）11−ブロック−ポリ（エチレングリコール）16−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）11、ポリ（プロピレングリコール）12−ブロック−ポリ（エチレングリコール）28−ブロック−ポリ（プロピレングリコール）12からなる群から選択される、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［１２］
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルまたはポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルである、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［１３］
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（４０）ステアレートである、［１］〜［５］のいずれか一に記載の組成物。
［１４］
（ａ）前記陽イオン性脂質が、アミノ脂質またはその薬学的に許容される塩であり、
（ｂ）前記中性脂質が、リン脂質であり、
（ｃ）前記ステロールが、コレステロールであり、かつ
（ｄ）前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン（４０）ステアレートから選択される、［１］に記載の組成物。
［１５］
（ａ）前記陽イオン性脂質が、１，１７−ビス（２−オクチルシクロプロピル）ヘプタデカン−９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエートまたはその薬学的に許容される塩であり、
（ｂ）前記中性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）であり、
（ｃ）前記ステロールが、コレステロールであり、かつ
（ｄ）前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン（４０）ステアレートから選択される、［１］に記載の組成物。
［１６］
約２０から約９５モルパーセントまでの陽イオン性脂質を含む、［１］〜［５］、［１５］、または［１６］のいずれか一に記載の組成物。
［１７］
約０．１から約２０モルパーセントまでの界面活性剤を含む、［１］〜［５］、［１５］、または［１６］のいずれか一に記載の組成物。
［１８］
［１］〜［１７］のいずれか一に記載の組成物、および陰イオン性巨大分子を含む脂質ナノ粒子。
［１９］
前記ナノ粒子が中実コアを有する、［１８］に記載の粒子。
［２０］
前記陰イオン性巨大分子が、核酸、陰イオン性タンパク質、および陰イオン性ペプチドからなる群から選択される、［１８］に記載の粒子。
［２１］
前記陰イオン性巨大分子が核酸である、［１８］に記載の粒子。
［２２］
［１］〜［１７］のいずれか一に記載の組成物、および核酸を含む脂質ナノ粒子。
［２３］
前記ナノ粒子が中実コアを有する、［２２］に記載の粒子。
［２４］
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現可能なプラスミドである、［２２］または［２３］に記載の粒子。
［２５］
前記核酸が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡである、［２２］または［２３］に記載の粒子。
［２６］
前記核酸が、ｓｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはｍＲＮＡである、［２２］または［２３］に記載の粒子。
［２７］
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、［２２］または［２３］に記載の粒子。
［２８］
前記核酸が、ハイブリダイゼーションプローブである、［２２］または［２３］に記載の粒子。
［２９］
前記ハイブリダイゼーションプローブが、分子ビーコンである、［２８］に記載の粒子。
［３０］
対象に核酸を投与する方法であって、［２２］〜［２７］のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
［３１］
対象中でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、［２２］〜［２７］のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含み、前記核酸が、前記ポリペプチドの発現をサイレンシングまたは減少させることが可能である方法。
［３２］
対象中でポリペプチドが過少発現されることを特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、［２２］〜［２７］のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含み、前記核酸が、前記ポリペプチドを発現または前記ポリペプチドの発現を増加させることが可能である方法。
［３３］
核酸を細胞に導入する方法であって、細胞を、［２２］〜［２７］のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子と接触させることを含む方法。
［３４］
標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法であって、細胞を、［２２］〜［２７］のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子と接触させることを含み、前記核酸が、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することが可能である方法。
［３５］
核酸を含有する脂質ナノ粒子を作製する方法であって、
（ａ）第１の溶媒中の核酸を含む第１のストリームをデバイスに導入することであって、前記デバイスは、導入される１つ以上のストリームを前記デバイスに流すように構成された第１の領域、および前記１つ以上のストリームの内容物をミキサで混合するための第２の領域を有すること、
（ｂ）第２の溶媒中の［１］〜［１７］のいずれか一に記載の組成物を含む第２のストリームを前記デバイスに導入して、第１および第２のストリームを提供することであって、前記形質移入試薬組成物は陽イオン性脂質を含み、前記第１および第２の溶媒が同じではないこと、
（ｃ）前記１つ以上の第１のストリームおよび前記１つ以上の第２のストリームを、前記デバイスの前記第１の領域から前記デバイスの前記第２の領域に流すことであって、前記第１のストリームと前記第２のストリームとの容積比が、１．０を超えること、および
（ｄ）前記１つ以上の第１のストリームおよび前記１つ以上の第２のストリームを、前記デバイスの前記第２の領域で、約１００μｓから約１０ｍｓまでの期間混合することであって、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第３のストリームを提供することを含む方法。
［３６］
前記１つ以上の第１のストリームおよび前記１つ以上の第２のストリームが、約１ｍＬ／分から約４０ｍＬ／分まで流量で流される、［３５］に記載の方法。
［３７］
前記形質移入試薬組成物の濃度が、約１０ｍＭから約５０ｍＭまでである、［３５］に記載の方法。
［３８］
前記封入された核酸を有する脂質ナノ粒子が、約１５ｎｍから約３００ｎｍまでの直径を有する、［３５］に記載の方法。
［３９］
前記核酸が、前記脂質ナノ粒子に、約８０から約１００％までの効率で封入される、［３５］に記載の方法。
［４０］
前記ミキサが、約１０００μｍ未満のサイズの特徴を有する、［３５］に記載の方法。
［４１］
前記ミキサが、マイクロ流体ミキサである、［３５］に記載の方法。
［４２］
［１］〜［１７］のいずれか一に記載の形質移入試薬組成物を含む脂質ナノ粒子を調製するためのキット。
［４３］
陰イオン性巨大分子を更に含む、［４２］に記載のキット。
［４４］
前記陰イオン性巨大分子が核酸である、［４２］に記載のキット。
［４５］
マイクロ流体ミキサを更に含む、［４２］〜［４４］のいずれか一に記載のキット。
［４６］
［４２］〜［４５］のいずれか一に記載のキットを使用して、［１８］〜［２９］のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を調製する方法。
【図１】
0006605446.tif 000019
【図２】
0006605446.tif 000020
【図３】
0006605446.tif 000021
【図４】
0006605446.tif 000022
【図５】
0006605446.tif 000023
【図６】
0006605446.tif 000024
【図７】
0006605446.tif 000025
【図８】
0006605446.tif 000026
【図９】
0006605446.tif 000027
【図１０】
0006605446.tif 000028
【図１１】
0006605446.tif 000029
【図１２】
0006605446.tif 000030
【配列表】
0006605446000001.app