(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
環化付加反応で結合を形成する方法であって、
第１のテトラジンと第１のジエノフィルとの反応とそれに続く第２のテトラジンと第２のジエノフィルとの反応とを含み、
第１のテトラジンと第１のジエノフィルとの反応が、第２のテトラジンの存在下で進行し、
（ｉ）第１のテトラジンが下記式の基を含み：
【化１】
0006479022.tif 000156
（式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｉ）第１のジエノフィルが下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含み：
【化２】
0006479022.tif 000157
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉｉ）第２のテトラジンが下記式の基を含み：そして、
【化３】
0006479022.tif 000158
（ｉｖ）第２のジエノフィルが下記式のシクロオクチニル基を含む方法。
【化４】
0006479022.tif 000159
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【請求項２】
第２のジエノフィルの存在下で、第１のテトラジンが優先的に第１のジエノフィルと反応する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１のテトラジンと第１のジエノフィルとの速度定数ｋが、通常、第１のテトラジンと第２のジエノフィルとの反応の速度定数ｋよりも少なくとも１０２倍大きい請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１のテトラジンと第１のジエノフィルとの速度定数ｋが約３７℃の温度で３０分以下の間続く請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、  該方法が、標的分子又は標的分子組成物と、
（ｉ）下記式の基を含む第１の標識剤：続いて、
【化５】
0006479022.tif 000160
（式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｉ）下記式の基を含む第２の標識剤とが接触する工程を含み、
【化６】
0006479022.tif 000161
標的分子が、
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：および、
【化７】
0006479022.tif 000162
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含み、
【化８】
0006479022.tif 000163
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
標的分子組成物が、
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１の標的分子：および、
【化９】
0006479022.tif 000164
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含む第２の標的分子を含む方法。
【化１０】
0006479022.tif 000165
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【請求項６】
ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の基であり、
【化１１】
0006479022.tif 000166
（式中、Ｒ１は水素である。）
第１のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含み、
【化１２】
0006479022.tif 000167
（式中、Ｒ３はメチルである。）
シクロオクチニル基が下記式の基であり、
【化１３】
0006479022.tif 000168
（式中、Ｒ２は水素である。）
第２のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【化１４】
0006479022.tif 000169
【請求項７】
第２のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物を第２のテトラジン又は標識剤と反応させる前に、実質的にすべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が反応できる条件の下、第１のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物と第１のテトラジン又は標識剤とを反応させる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
以下を含む細胞：
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基；及び、
【化１５】
0006479022.tif 000170
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基。
【化１６】
0006479022.tif 000171
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【請求項９】
シクロオクチニル基が第１のポリペプチドに結合し、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が第２のポリペプチドに結合し、第１及び第２のポリペプチドが異なるポリペプチドである請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の細胞を作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）
（ｉ）第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）第１のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；並びに、
（ｉｉｉ）標的ポリペプチドをコードし、第１及び第２のセレクターコドンを１つ以上含むポリヌクレオチド；又は第１の標的ポリペプチドをコードし、第１のセレクターコドンを１つ以上含む第１のポリヌクレオチド及び第２の標的ポリペプチドをコードし、第２のセレクターコドンを１つ以上含む第２のポリヌクレオチド；
を含む細胞であって、
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する、そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第１の非天然型アミノ酸；及び、
【化１７】
0006479022.tif 000172
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
下記式のシクロオクチニル基を有する、そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第２の非天然型アミノ酸を用いて第１のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる；又は、
【化１８】
0006479022.tif 000173
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する、そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第１の非天然型アミノ酸を用いて第１のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができ；そして、
【化１９】
0006479022.tif 000174
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のシクロオクチニル基を有する、そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第２の非天然型アミノ酸を用いて第２のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる、細胞を準備する工程；
【化２０】
0006479022.tif 000175
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
ｂ）前記細胞と、それらのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、それらのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第１及び第２の非天然型アミノ酸とを接触させる工程：並びに、
ｃ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、それによって、それらのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、それらのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第１及び第２の非天然型アミノ酸をセレクターコドンによってコードされる位置の標的ポリペプチドに組み込む工程。
【請求項１１】
そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第１の非天然型アミノ酸が、下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩であり；そして、
【化２１】
0006479022.tif 000176
［式中、
Ｘ１は下記式で表され；
【化２２】
0006479022.tif 000177
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい第２の非天然型アミノ酸が、下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である請求項１０に記載の方法。
【化２３】
0006479022.tif 000178
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【化２４】
0006479022.tif 000179
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【請求項１２】
以下を含むポリペプチド：
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基；及び、
【化２５】
0006479022.tif 000180
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基。
【化２６】
0006479022.tif 000181
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【請求項１３】
下記式の第１の残基；及び、
【化２７】
0006479022.tif 000182
［式中、
Ｘ１は下記式で表され；
【化２８】
0006479022.tif 000183
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
下記式の第２の残基を含む請求項１２に記載のポリペプチド。
【化２９】
0006479022.tif 000184
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【化３０】
0006479022.tif 000185
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【請求項１４】
下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む、そのα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されていてもよいか、または、そのカルボン酸基がエステルを形成していてもよい非天然型アミノ酸：
【化３１】
0006479022.tif 000186
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）。 
【請求項１５】
下記式で表される請求項１４に記載の非天然型アミノ酸又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩：
【化３２】
0006479022.tif 000187
［式中、
Ｘ１は下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基であり：
【化３３】
0006479022.tif 000188
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２回の環化付加反応を連続して実行することによって、テトラジンをジエノフィルに結合させて少なくとも２つの結合を形成する方法に関する。当該方法によって、特に多色標識の方法を確立することができる。
【背景技術】
【０００２】
人工的に作製された蛍光標識タグによって生体試料中の生体分子を可視化する技能は、現在のバイオテクノロジー、細胞生理学及び生命科学において重要なツールとなっている。比較的大きな自家蛍光タンパクと結合した融合タンパクをコードすることは、現在、最も広く応用されている技術である。一般的に、合成色素は自家蛍光タンパクに比べて良好な光物理的性質を示すので、Ｈａｌｏ−やＳＮＡＰ−タグ等の遺伝学的にコードされるユニークなタグを基に、代替戦略が開発されている。それらのタグは高い特異性を示すが、サイズはまだかなり大きい。複数のヒスチジン又は複数のシステインモチーフ等の小さなタグは、より小さな蛍光色素分子を認識するために使用できるが、それらの基本的な認識因子は天然のアミノ酸側鎖から作られるので、細胞内の環境ではそれらはしばしば特異性の問題を抱えている。そのような欠点は、温和な生理的条件下において非天然型部分の結合に依存する生体オルソゴナルの化学を利用することによって克服できる。  
【０００３】
生理的温度の下、高度に官能基化された生物環境において効率的に進められる強力な化学反応は、直鎖アジドとアルキン間の銅（Ｉ）触媒Ｈｕｉｓｇｅｎ型［３＋２］環化付加反応、直鎖アジドと歪みシクロアルキン間の銅を使用しない［３＋２］環化付加反応又は、トランス−シクロオクテンもしくはノルボルネン等の歪みジエノフィルと１，２，４，５−テトラジンとの逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ［４＋２］環化付加反応であり、これらはクリックケミストリーである（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；特許文献１；特許文献２）。アルキンとアジド間の標準的な［３＋２］環化付加反応は、細菌や哺乳類細胞に対して毒性のある銅触媒が必要とされ、このタイプのクリックケミストリーの生物学的適合性を強力に低下させている。基質として環歪みアルキンを利用する場合は、細胞毒性のある触媒を必要としないでクリック反応が容易に進行することを示したＢｅｒｔｏｚｚｉとその共同研究者によってこの欠点が克服された（非特許文献６；特許文献３）。それ以後、銅を使用しないクリックケミストリーは、生体分子の標識において、利用が次第に増加した。ｉｎ  ｖｉｖｏで酵素的に結合したアジド部分を含む糖質とタンパク質を標識するために、シクロオクチニル基を含む蛍光色素が使用され（非特許文献７）、そしてアジド蛍光体を用いたシクロアルキン修飾ホスファチジン酸の標識が非特許文献８に記載されている。これらの適用においては触媒を必要としなかった。  
【０００４】
化学の拡大するレパートリーの中で、テトラジンと歪みジエノフィル間の逆Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加反応のｉｎ  ｖｉｖｏにおける化学的応用は、特に生細胞や動物のイメージングの実行に興味を持つ者から大きな関心を集めている。テトラジンのライゲーションは、急速な、調節可能な速度だけでなく、蛍光発生プローブの存在の恩恵を受ける。テトラジン環化付加の生物医学的用途は広く記載されており、ナノ診断に対するテトラジンライゲーションの実施が取り組まれてきた。このすべてに関しては、例えば、非特許文献９のレビューやその引用文献を参照されたい。さらに、新規のテトラジンやその合成方法が開発されている（例えば、特許文献４を参照のこと）。より詳細には、特許文献５は逆Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応による次代の核酸の合成的修飾の方法とキットについて記載し、そして、特許文献６は、逆Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応と銅触媒クリック反応とを同時に行うことによるオリゴヌクレオチドの複数のオルソゴナルな標識の方法を記載する。特許文献７は、量子ドット（ＱＤ）に有機化合物を迅速かつ特異的に結合させるための、バイオオルソゴナルな逆電子要請型Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加反応を用いる組成物及び方法を提供する。
【０００５】
オルソゴナルなｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素ペアを用いて蛍光非天然型アミノ酸を遺伝的に直接コードすることによるタンパク質の翻訳修飾は、特異性に優れ、標的タンパク質での配置が自由であり、もしあったとしても構造変化は最少である。最初にＳｕｍｍｅｒｅｒ他によって、このアプローチはうまく応用され（非特許文献１０）、彼らは大腸菌由来のロイシルｔＲＮＡ／合成酵素ペアを、ＵＡＡダンシルアラニンを酵母で遺伝学的にコードするように発展させた。アンバー終止コドンＴＡＧに対応して、ダンシルアラニンは宿主の翻訳機構によって容易に導入された。一方、このアプローチは、いくつかの小さい色素と対象となる他の部分を遺伝学的にコードするために使用される。例えば、人工的に作製されたＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのチロシルｔＲＮＡｔｙｒ／合成酵素、大腸菌のロイシルｔＲＮＡｌｅｕ／合成酵素、そしてＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ及びＭ．ｂａｒｋｅｒｉのピロリシンｔＲＮＡｐｙｌ／合成酵素ペアは、ポリペプチド中のアジド部分を遺伝学的にコードするために使用された（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；特許文献８；特許文献９；特許文献１０；特許文献１１）。  
【０００６】
超解像顕微鏡法（ＳＲＭ）技術の能力は、蛍光色素分子の特性に大きく依存する。ほとんどの有機色素は優れた光物理的特性を有し、広く使用される蛍光タンパク質よりも一般的に２０以上倍小さい。アンバー抑制の技術の最近の進歩により、一般的に普及している小さな市販の蛍光色素分子を特定のタンパク質残基に直接向かわせることが、現在、可能である。Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ由来のオルソゴナルなｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素ペア（ｔＲＮＡ／ＲＳ）によって、歪みアルキンとアルケン側鎖を有する非天然アミノ酸（ＵＡＡ）は、アンバー（ＴＡＧ）終止コドンによってコードされた位置に遺伝的に組み込まれる（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；特許文献１２）。これらの修飾は、アミノ酸側鎖にほんの数個の原子を追加し、タンパク質の中に自由に配置することができ、機能的影響のリスクを低下させる。次いで歪みアルキンとアルケンＵＡＡは、それぞれアジド又はテトラジン（Ｔｅｔ）の官能性を有する有機蛍光色素分子を用いた、無触媒の歪みで促進されるアルキン−アジド環化付加反応（ＳＰＡＡＣ）と［歪みで促進される逆電子要請型］４＋２Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環化付加反応（ＳＰＩＥＤＡＣ）を経ることができる。両反応は完全に生体適合性である。アジドはアルキンとのみ反応し、アルケンとは反応しないので、それらはさらに互いにオルソゴナルである（非特許文献２０；非特許文献２１）。
【０００７】
ひとつのＵＡＡをコードすることが比較的簡単になり、複数のＵＡＡを組み込むことが記載されているが（特許文献１３；非特許文献２２）、哺乳動物系における強固で効率的な多色標識の方法についての需要が依然として存在する。ＵＡＡベースの二色標識とＳＲＭについて異なる実験デザインを提供する少なくとも２つの異なる方法が考えられる：ｉ）二つのオルソゴナルな化学物質（例えばＳＰＡＡＣとＳＰＩＥＤＡＣ）を有し、ひとつのタンパク質中（例えば、フェルスター共鳴エネルギー移動  ＦＲＥＴの研究）又は２つの異なるタンパク質中（例えば、２つの異なる分子の共局在顕微鏡法）のそれぞれの異なるコドンが認識されている、二つの異なるＵＡＡの同時取り込み；ｉｉ）単一のｔＲＮＡ／ＲＳ系を使用する同じコドンに応答して、二つのオルソゴナルな化学物質を有する二つの異なるＵＡＡの連続したコード化。これは、増殖培地に供給される第１のＵＡＡが、第２のＵＡＡに追われるというパルスチェイス法にて行うことができる。例えばこれは、蛋白質の選別の可視化を助けることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１１９３８９号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０５１５３０号
【特許文献３】国際公開第２００６／０５０２６２号
【特許文献４】国際公開第２０１３／１５２３５９号
【特許文献５】国際公開第２０１１／０９５３３６号
【特許文献６】国際公開第２０１３／０２９８０１号
【特許文献７】国際公開第２０１１／１１２９７０号
【特許文献８】国際公開第２０１３／１０８０４４号
【特許文献９】国際公開第２００２／０８５９２３号
【特許文献１０】国際公開第２００２／０８６０７５号
【特許文献１１】欧州特許出願公開第２１９２１８５号明細書
【特許文献１２】国際公開第２０１２／１０４４２２号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２０１０／２９７６９３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１３５１８−１３５１９
【非特許文献２】Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００１，４０：２００４
【非特許文献３】Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００９，４８：７０１３
【非特許文献４】Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ２００８，１９：２２９７
【非特許文献５】Ｄｅｖａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１０，４９：２８６９
【非特許文献６】Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００４，１２６：１５０４６
【非特許文献７】Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０，１０７：１８２１
【非特許文献８】Ｎｅｅｆ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００９，４８：１４９８
【非特許文献９】Ｓｅｃｋｕｔｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖａｒａｊ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３，１７，７６１−７６７
【非特許文献１０】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００６，１０３：９７８５
【非特許文献１１】Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００２，１２４：９０２６
【非特許文献１２】Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３，  ３０１：９６４
【非特許文献１３】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２００９，１３１：８７２０
【非特許文献１４】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００８，１５：１１８７
【非特許文献１５】（Ａ．Ｂｏｒｒｍａｎｎ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｊ．Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｋａｄｅ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｃ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ  Ｄｅｌｆｔ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１２，１３，２０９４−２０９９
【非特許文献１６】Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１１，５０，３８７８−３８８１
【非特許文献１７】Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，４１６６−４１７０
【非特許文献１８】Ｋ．Ｌａｎｇ，Ｌ．Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｗａｌｌａｃｅ，Ｍ．Ｍａｈｅｓｈ，Ｄ．Ｊ．Ｃｏｘ，Ｍ．Ｌ．Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１２，１３４，１０３１７−１０３２０
【非特許文献１９】Ｓ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｔｔｎｅｒ，Ｍ．Ｖｒａｂｅｌ，Ｖ．Ｆｌｕｇｅｌ，Ｖ．Ｌｏｐｅｚ−Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｓ．Ｐｒｉｌｌ，Ｔ．Ｃａｒｅｌｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１３，１４，２１１４−２１１８
【非特許文献２０】Ｙ．Ｌｉａｎｇ，Ｊ．Ｌ．Ｍａｃｋｅｙ，Ｓ．Ａ．Ｌｏｐｅｚ，Ｆ．Ｌｉｕ，Ｋ．Ｎ．Ｈｏｕｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１２，１３４，１７９０４−１７９０７
【非特許文献２１】Ｍ．Ｒ．Ｋａｒｖｅｒ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１１
【非特許文献２２】Ｈａｎ  Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１３，５２，１４０８０−１４０８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
多大な努力にもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質の部位特異的な標識を容易にするための方法と、特に哺乳動物系における強固な多色標識の方法について、まだ高い要求がある。実用的な理由から、バイオオルソゴナルなカップリング反応が非常に急速な反応速度（Ｋ＞１０２Ｍ−１ｓ−１）と高い特異性で進行した場合、有益である。反応速度を改善することで、高いカップリング収率を維持するために必要な時間と標識剤の量の両方が最小限となるであろう。したがって本発明の目的は、テトラジンとジエノフィルの間の非常に急速なバイオオルソゴナルなカップリング反応を設計することで、多色標識の方法を確立することである。より詳細には、本発明の目的は、多色標識の方法を確立することに加え、翻訳的にポリペプチド鎖に導入できるアミノ酸又はその類似体を提供し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏで得られるポリペプチドを標識することを可能とすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、環化付加反応によって結合を形成する方法に関する。当該方法は第１のテトラジンと第１のジエノフィルとを反応させた後、第２のテトラジンと第２のジエノフィルとを反応させることを含む方法であって、第１のテトラジンと第１のジエノフィルとの反応は第２のジエノフィルの存在下で進行し、
（ｉ）第１のテトラジンは下記式の基を含み：
【００１２】
【化１】
0006479022.tif 000002
【００１３】
（式中、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｉ）第１のジエノフィルは下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含み：
【００１４】
【化２】
0006479022.tif 000003
【００１５】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉｉ）第２のテトラジンは下記式の基を含み：そして、
【００１６】
【化３】
0006479022.tif 000004
【００１７】
（ｉｖ）第２のジエノフィルは下記式のシクロオクチニル基を含む。
【００１８】
【化４】
0006479022.tif 000005
【００１９】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【００２０】
したがって、本発明の方法においては、第１のテトラジンはｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１のジエノフィルと反応し、そして、第２のテトラジンはシクロオクチニル基を含む第２のジエノフィルと反応する。両方の反応の速度定数は大きいが、第１の反応は第１のテトラジンが実質的に第２のジエノフィルと反応することなく、第２のジエノフィルの存在下で進行する。したがって、第１のジエノフィルは第１のテトラジンが実質的に第２のジエノフィルと反応しない条件の下で第１のテトラジンと反応する。言い換えれば、第１のテトラジンは第２のジエノフィルの存在下で優先的に第１のジエノフィルと反応する。より詳細には、第１のテトラジンは第２のジエノフィルの存在下で特異的に第１のジエノフィルと反応する。その結果、本発明の方法によれば、最初に第１及び第２のジエノフィルを準備し、次いで第１及び第２のジエノフィルを第１のテトラジンと接触させ、第１のテトラジンが実質的に第２のジエノフィルと反応しない条件の下で第１のテトラジンと第１のジエノフィルを反応させることによって、高速ではあるが高い特異性で２つの異なる結合が形成される。
【００２１】
本発明によって実施される反応では、両反応の速度定数ｋは５０Ｍ-１ｓ-１以上、１×１０２Ｍ-１ｓ-１以上、又は、２×１０２Ｍ-１ｓ-１以上に達する。
【００２２】
本発明の一つの態様では、第１の反応（第１のジエノフィルと第１のテトラジンの）は、５×１０２Ｍ-１ｓ-１以上、１×１０３Ｍ-１ｓ-１以上又は２×１０３Ｍ-１ｓ-１以上の速度定数ｋで進行する。
【００２３】
本発明の第二の態様では、第２の反応（第２のジエノフィルと第２のテトラジンの）は、５０Ｍ-１ｓ-１以上、１×１０２Ｍ-１ｓ-１以上又は２×１０２Ｍ-１ｓ-１以上の速度定数ｋで進行する。
【００２４】
本発明の一つの実施態様では、第１の反応と第２の反応は前記の第一と第二の態様における速度定数で進行する。
【００２５】
便宜上、第２のジエノフィルの存在下で進行する第１の反応（第１のジエノフィルと第１のテトラジンの）については、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応よりも大きい速度定数で第１の反応が進行する。したがって、第１の反応の速度定数ｋは、通常、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応の速度定数ｋよりも少なくとも１００倍大きい。したがって、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応は、通常、５Ｍ-１ｓ-１以下、２Ｍ-１ｓ-１以下又は１Ｍ-１ｓ-１以下の速度定数ｋで進行する。第１の反応の速度定数ｋが、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応の速度定数ｋよりも、少なくとも２００倍、５００倍、１０００倍、５０００倍又は１００００倍大きいことが好ましい。したがって、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応は、０．５Ｍ-１ｓ-１以下、０．１Ｍ-１ｓ-１以下、０．０５Ｍ-１ｓ-１以下又は０．０１Ｍ-１ｓ-１以下の速度定数ｋで進行することが好ましい。
【００２６】
反応定数を決定する方法は当技術分野で周知であり、本明細書に開示された絶対的な反応定数は、特に本発明の実施例Jに記載の算出方法によるものである。
【００２７】
両反応は広範囲の温度で行うことができる。生物学的系においては、４℃〜４５℃の範囲、例えば約２２℃などの１５℃〜２５℃の範囲又は約３７℃などの３０℃〜４０℃の範囲の温度を便宜的に使用できる。
【００２８】
通常、第１の反応は、第２の反応が始まる前に、実質的に全てのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基（第１のジエノフィル）が第１のテトラジンと反応するのに十分な時間の間に進行する。通常、第１の反応が好適に進行するためには、数分間の反応時間、例えば６０、４５又は３０分間もしくはそれ以下、特に１０分以下が好ましい。しかし、第１の反応は、第２のジエノフィル（すなわち、シクロオクチニル基）と第１のテトラジンの反応が実質的にない限りにおいてのみ進行する。通常、実質的に第２のジエノフィルが第１のテトラジンと反応することなく、第１の反応が進行するためには、３０分未満の反応時間、例えば２５、２０又は１５分未満、特に１０分未満が特に好適である。
【００２９】
通常、第２の反応は、実質的に全てのシクロオクチニル基（第２のジエノフィル）が第２のテトラジンと反応するのに十分な時間の間に進行する。通常、第２の反応が完全に進行するためには、２時間以下の反応時間、例えば１時間以下、４５分以下又は３０分以下、特に２０分以下が好ましい。第２の反応は、通常、実質的に一度だけ行われ、すべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基（第１のジエノフィル）が第１のテトラジンと反応するので、第２の反応の反応時間は、さらに潜在的に競合する環化付加反応を考慮に入れる必要はない。しかしながら、第２の反応が１時間未満、例えば５０、４０又は３０分未満、特に２０分未満の間、続くことが好ましい。
【００３０】
本明細書に開示された反応時間は、特に本明細書に開示された反応温度、特に約３７℃などの周囲温度で行われる反応に適用される。
【００３１】
第１又は第２の反応が完全に実行されない場合、任意の残存する第１又は第２のジエノフィルについて、これらの基が第１又は第２のテトラジンとはもう反応することができない形に変換させる適切な方法で、反応させることができる。これは第１の反応を完了させるために特に好適であり、それによって残存する第１のジエノフィルが第２のテトラジンと反応することが防止される。例えば、第１の反応が完全に実行されず、未反応のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基（第１のジエノフィル）がいくらか残存している場合、これらの基を追加の第１のテトラジン（クエンチャー）と反応させることができる。ここで、追加の第１のテトラジンは下記式の基を含むが、最初に使用した第１のテトラジンとは異なる：
【００３２】
【化５】
0006479022.tif 000006
【００３３】
例えば、最初に使用された第１のテトラジンが標識を含む場合、標識されていない対応するテトラジンを追加の第１のテトラジンとして使用することができる。例えば、クエンチャーは下記式の化合物又はその酸付加塩であってもよい：
【００３４】
【化６】
0006479022.tif 000007
【００３５】
（式中、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルであり；そして、
Ｒ４は、最初に使用された第１のテトラジンの対応する位置の部分とは異なる有機基（例えば、ベンジル基）である。）
【００３６】
一つの実施態様では、クエンチャーは（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミン又はその酸付加塩である。
【００３７】
第１の反応を完全に進行させることが不利益につながり（なぜなら、比較的多い量の第１のテトラジンを使用しないと、便宜的な反応時間では完全に反応が進行しないので）、追加の第１のテトラジンを使用することが有益である（なぜなら、比較的少量の第１のテトラジンの使用量で、便宜的な反応時間内に反応を完全に進行させることに役立つので）場合には、このように進行させることが有利な場合がある。例えば、第１のテトラジンをかなり大量に使用することは不利益につながるが（例えば、それが高価であるため）、追加の第１のテトラジンには同様の不利益はなく、比較的大量に使用することで、便宜的な反応時間内に反応を完了させることができる。したがって、実質的にすべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基（第１のジエノフィル）を第１のテトラジンと反応させるということは、最初に存在していたｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基の少なくとも９５％、例えば９６、９７、９８又は９９％を第１のテトラジンと反応させる一方で、残存するｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を任意に追加の第１のテトラジンと反応させて、すべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基（すなわち、少なくとも９９．９％の最初に存在していたｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基）を（追加の）第１のテトラジンと反応させることを意味する。
【００３８】
第２の反応を行う前に未反応の第１のテトラジンを除去することが好ましい。これは、他に関係なくそれ自体を知られた方法で行うことができる。同様に、第２の反応を行う前に未反応の追加の第１のテトラジン（クエンチャー）を除去することが好ましい。これもまた、他に関係なくそれ自体を知られた方法で行うことができる。
【００３９】
本発明の特定の態様では、第１のテトラジンは下記式の基を含む：
【００４０】
【化７】
0006479022.tif 000008
【００４１】
（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルであり、Ａは１，４−フェニレン又はＣ１−Ｃ６−アルキレンである。）
【００４２】
本発明のさらなる特定の態様では、第２のテトラジンは下記式の基を含む：
【００４３】
【化８】
0006479022.tif 000009
【００４４】
（式中、Ａは１，４−フェニレン又はＣ１−Ｃ６−アルキレンである。）
【００４５】
Ａは、テトラジンをさらなる部分（例えば、標識）に結合させる基又は基の一部である。Ａは、第１のテトラジンと第２のテトラジンにおいて同じ基であってもよいし、第１のテトラジンのＡは第２のテトラジンのＡと異なっていてもよい。特にＡは１，４−フェニレンである。
【００４６】
したがって、本発明の特定の実施態様では、第１のテトラジンは下記式の基を含む：
【００４７】
【化９】
0006479022.tif 000010
【００４８】
（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルである。）
【００４９】
同様に、本発明の特定の実施態様では、第２のテトラジンは下記式の基を含む：
【００５０】
【化１０】
0006479022.tif 000011
【００５１】
第１のテトラジンが置換基Ｒ３を有するので、第１のジエノフィルと第１のテトラジンの反応性は、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応性とは十分に異なる。したがって、Ｒ３は、十分に異なる反応性を提供するように選択される。本発明においては、Ｒ３は好ましくはメチル又はエチルである。特に、メチルが好ましい。
【００５２】
ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル又はシクロオクチニル基の結合点は、二重又は三重結合のα、β又はγ位の環原子によるものであってもよい
【００５３】
特定の実施態様では、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル又はシクロオクチニル基は、二重又は三重結合のα位の環原子によって結合する。
【００５４】
したがって、本発明の特定の態様では、第１のジエノフィルは下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む：
【００５５】
【化１１】
0006479022.tif 000012
【００５６】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【００５７】
本発明のさらなる特定の態様では、第２のジエノフィルは下記式のシクロオクチニル基を含む：
【００５８】
【化１２】
0006479022.tif 000013
【００５９】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【００６０】
ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル又はシクロオクチニル基は、非置換（すなわち、Ｒ１とＲ２は水素である）であってもよいし、それぞれが１つ以上の置換基Ｒ１又はＲ２で置換されていてもよい。したがって、１つ以上の置換基Ｒ１及び／又Ｒ２が存在し得る。より具体的には、最大５つ、例えば１、２又は３つの置換基Ｒ１が存在してもよい。同様に、最大５つ、例えば１、２又は３つの置換基Ｒ２が存在してもよい。したがって、本発明におけるｔｒａｎｓ−シクロオクテニル又はシクロオクチニル基は、以下のように表すことができる。
【００６１】
【化１３】
0006479022.tif 000014
【００６２】
（式中、ａは０，１，２，３，４又は５であり、ｂは０，１，２，３，４又は５である。）
【００６３】
複数のＲ１基が存在する場合、それらは同一であっても異なる基であってもよく、２つのＲ１基は、同一又は異なる原子に結合していてもよい。同様に、複数のＲ２基が存在する場合も、それらは同一であっても異なる基であってもよく、２つのＲ２基は、同一又は異なる原子に結合していてもよい。例えば、Ｒ１及び／又はＲ２は、１つの炭素環原子に結合した２個のフッ素原子であってもよい。
【００６４】
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ，Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり、ＲａとＲｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。
【００６５】
特定の実施態様では、Ｒ１は水素である。
【００６６】
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ，Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり、ＲｃとＲｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。
【００６７】
特定の実施態様では、Ｒ２は水素である。
さらなる特定の実施態様では、Ｒ１は水素であり、Ｒ２は水素である。
【００６８】
本発明のさらなる特定の実施態様では、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基は下記式を有する：
【００６９】
【化１４】
0006479022.tif 000015
【００７０】
式中、Ｒ１は水素であり、そして、
第１のテトラジンは下記式の基を含む：
【００７１】
【化１５】
0006479022.tif 000016
【００７２】
（式中、Ｒ３はメチルである。）
【００７３】
本発明のさらなる特定の実施態様では、シクロオクチニル基は下記式を有する：
【００７４】
【化１６】
0006479022.tif 000017
【００７５】
式中、Ｒ１は水素であり、そして、
第２のテトラジンは下記式の基を含む：
【００７６】
【化１７】
0006479022.tif 000018
【００７７】
すなわち、本発明は、特に環化付加反応によって結合を形成する方法に関し、当該方法は第１のテトラジンと第１のジエノフィルとを反応させた後、第２のテトラジンと第２のジエノフィルとを反応させることを含み、第１のテトラジンと第１のジエノフィルとの反応は第２のジエノフィルの存在下で進行する。当該方法においては、
（ｉ）第１のテトラジンは下記式の基を含み：
【００７８】
【化１８】
0006479022.tif 000019
【００７９】
（ｉｉ）第１のジエノフィルは下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含み：
【００８０】
【化１９】
0006479022.tif 000020
【００８１】
（ｉｉｉ）第２のテトラジンは下記式の基を含み：そして、
【００８２】
【化２０】
0006479022.tif 000021
【００８３】
（ｉｖ）第２のジエノフィルは下記式のシクロオクチニル基を含む。
【００８４】
【化２１】
0006479022.tif 000022
【００８５】
また本発明は、本発明の方法を行う際に使用できるキットに関する。
【００８６】
本発明の特定のキットは、以下を含む。
（ｉ）下記式の基を含む第１のテトラジン：
【００８７】
【化２２】
0006479022.tif 000023
【００８８】
式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルであり、そして、
（ｉｉ）下記式の基を含む第２のテトラジン：
【００８９】
【化２３】
0006479022.tif 000024
【００９０】
前記第１及び第２のテトラジンは、特に標的分子又は標的分子組成物を標識するために使用できる薬剤であり、したがって本明細書では標識剤としても言及される。本明細書に開示されるように、これらは特定の標識剤を含む。
【００９１】
さらに、本発明の特定のキットは、以下を含む。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１の薬剤：及び、
【００９２】
【化２４】
0006479022.tif 000025
【００９３】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含む第２の薬剤。
【００９４】
【化２５】
0006479022.tif 000026
【００９５】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【００９６】
前記第１及び第２の薬剤は、特に標的分子又は標的分子組成物を修飾するために使用できる薬剤であり、したがって本明細書では変性剤としても言及される。本明細書に開示されるように、これらは特に非天然型アミノ酸とその類似体を含む。
【００９７】
さらに本発明のキットは、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１の薬剤とシクロオクチニル基を含む第２の薬剤に加え、本明細書に開示される第１及び第２のテトラジンを含むことができる。
【００９８】
本発明の方法は、さまざまな分子を互いに結合したり又は互いに連結したりすることに特に適している。例えば、これらの分子の中には、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン、脂質、染料、治療薬、診断薬、キレート剤／錯化剤、固相表面、ナノ粒子、量子ドットが存在する。
【００９９】
本発明の方法は、連続的に第１のテトラジンを第１のジエノフィルに結合し、次いで第２のテトラジンを第２のジエノフィルに結合することによって、分子を多色標識、すなわち、少なくとも二色標識することに、特に適している。このように、第１のテトラジンは第１の標識剤であり、第２のテトラジンは第２の標識剤である。
【０１００】
したがって、本発明は分子を標識する方法に関連し、該方法は、標的分子又は標的分子組成物に以下が接触することを含む。
（ｉ）下記式の基を含む第１の標識剤：
【０１０１】
【化２６】
0006479022.tif 000027
【０１０２】
式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルである；次いで、
（ｉｉ）下記式の基を含む第２の標識剤：
【０１０３】
【化２７】
0006479022.tif 000028
【０１０４】
標的分子には、以下が含まれる。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：及び、
【０１０５】
【化２８】
0006479022.tif 000029
【０１０６】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基。
【０１０７】
【化２９】
0006479022.tif 000030
【０１０８】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０１０９】
標的分子組成物には、以下が含まれる。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１の標的分子：及び、
【０１１０】
【化３０】
0006479022.tif 000031
【０１１１】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含む第２の標的分子。
【０１１２】
【化３１】
0006479022.tif 000032
【０１１３】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０１１４】
本発明における標識剤は、第１の標識剤の標識が第２の標識剤の標識とは異なることを条件として、任意の標識を含むことができる。本発明における標識は、これらには限定されないが、染料（例えば、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコンローダミン、ＢＯＤＩＰＹ又はシアニン色素等の蛍光、発光又は燐光染料）、発色団（例えば、フィトクロム、フィコビリン、ビリルビン等）、放射性標識（例えば、トリチウム、フッ素−１８、炭素−１１、炭素−１４、リン−３２、リン−３３、硫黄−３３、硫黄−３５、ヨウ素−１２３又はヨウ素−１２５等の水素、フッ素、炭素、リン、硫黄又はヨウ素の放射性形態）、ＭＲＩ感受性スピン標識、親和性タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、糖、脂質、ステロール、ＰＥＧリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシン又は補因子）、ポリエチレングリコール基（例えば、分岐ＰＥＧ、直鎖ＰＥＧ、異なる分子量のＰＥＧ等）、光架橋剤（例えば、p-アジドヨードアセトアニリド）、ＮＭＲプローブ、Ｘ線プローブ、ｐＨプローブ、ＩＲプローブ、樹脂、固体支持体および生物活性化合物（例えば、合成薬）が挙げられる。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、染料は近赤外域スペクトルで蛍光を発するＮＩＲコントラスト剤を含むことができる。例示的な近赤外蛍光色素分子としては、例えば染料や発光波長（例えば、ピーク発光波長）が、約６３０と１０００ｎｍの間（例えば、約６３０〜８００ｎｍ、約８００〜９００ｎｍ、約９００〜１０００ｎｍ、約６８０〜７５０ｎｍ、約７５０〜８００ｎｍ、約８００〜８５０ｎｍ、約８５０〜９００ｎｍ、約９００〜９５０ｎｍ又は約９５０〜１０００ｎｍ）にある他の蛍光色素分子を挙げることができる。発光波長（例えば、ピーク発光波長）が１０００ｎｍ以上の蛍光色素分子もまた本明細書に記載された方法で使用できる。
【０１１６】
本発明の方法に有用な蛍光色素分子は、これらには限定されないが、以下を挙げることができる：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商品名）（モレキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン州）、５−（及び−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（及び−６）−イソチオシアネート、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、６−［フルオレセイン５−（及び−６）−カルボキシアミド］ヘキサン酸、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート並びにＣＡＳＣＡＤＥ（商品名）Ｂｌｕｅアセチルアジド（モレキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン州）及びＡＴＴＯ色素。
【０１１７】
本発明のポリペプチドに結合することができる生理活性化合物としては、これらには限定されないが、細胞毒性化合物（例えば、癌化学療法化合物）；抗ウイルス化合物;生物学的応答調節剤（例えば、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、インターロイキンなど）;微小管作用薬;ホルモンモジュレーター;ステロイド化合物等を挙げることができる。
【０１１８】
本発明の標的分子は、標識される任意の分子であってもよい。本発明の標的分子としては、これらには限定されないが、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン及び脂質を挙げることができる。
【０１１９】
本発明の方法は、同じ標的分子（例えば、ポリペプチド）を標識するために使用することができるので、該標的分子が第１および第２の標識の両方を含むか、２つの異なる標的分子について第１の標的分子が第１の標識を含み、第２の標的分子が第２の標識を含むように標識することができる。２つの異なる標的分子が標識される場合、標的分子は同じ種類（例えば、二つのポリペプチド）、又は異なる種類（例えば、ポリペプチドとオリゴヌクレオチド）とすることができる。同じ種類（例えば、二つのポリペプチド）の２つの異なる標的分子を標識することは、ジエノフィルを別にすると基本的に同一である同じポリペプチドの２つの集団を標識することを含む。このようなポリペプチドは、例えば、異なる時点でポリペプチドの異なる集団に第１および第２のジエノフィルを組み込むなどの、種々の方法で得ることができる。
【０１２０】
したがって、本発明の１つの実施態様によれば、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基は標的ポリペプチドのアミノ酸残基に結合し、シクロオクチニル基は標的ポリペプチドのアミノ酸残基に結合する。本発明の特定の実施態様によれば、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基とシクロオクチニル基は標的ポリペプチドのアミノ酸残基に結合し、通常、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が結合しているアミノ酸残基は、シクロオクチニル基が結合しているアミノ酸残基とは異なる。本発明のさらなる特定の実施態様によれば、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基は第１の標的ポリペプチドのアミノ酸残基に結合し、シクロオクチニル基が第２の標的ポリペプチドのアミノ酸残基に結合する。
【０１２１】
第１および第２の標的分子を標識する場合、両者は標識反応に供される組成物の一部を形成する。本発明の組成物は、生物または生物学的サンプル等の生物学的系を含む。本発明の一実施形態によれば、生物学的試料は細胞を含む。
【０１２２】
したがって、また本発明は、例えば生物または生物学的サンプル、および特に細胞等の生物学的系に関し、以下を含む。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：及び、
【０１２３】
【化３３】
0006479022.tif 000033
【０１２４】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含む第２の標的分子。
【０１２５】
【化３４】
0006479022.tif 000034
【０１２６】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０１２７】
本発明における生物には、原核生物や真核生物等の生物のすべての種類が含まれる。したがって本発明における細胞には、原核細胞または真核細胞等の全ての細胞の種類が含まれる。本発明の一実施形態では、例えば哺乳動物細胞などの真核細胞である。
【０１２８】
本発明の一態様では、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニルとシクロオクチニル基を、例えばポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン及び脂質等の細胞構成物などの生物系の任意の構成物に結合させることができる。従って、本発明の特定の態様としては、ポリペプチドに結合しているｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基やポリペプチドに結合しているシクロオクチニル基が挙げられる。該ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基と該シクロオクチニル基は同じポリペプチドに結合しているか、または該ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基は第１のポリペプチドに結合しており、該シクロオクチニル基は第２のポリペプチドに結合し、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは異なるポリペプチドである。
【０１２９】
特定の実施態様によれば、本発明における細胞は以下の工程を含む方法で作製される。
ａ）
（ｉ）第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）第１のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；並びに、
（ｉｉｉ）標的ポリペプチドをコードし、第１及び第２のセレクターコドンを１つ以上含むポリヌクレオチド；又は第１の標的ポリペプチドをコードし、第１のセレクターコドンを１つ以上含む第１のポリヌクレオチド及び第２の標的ポリペプチドをコードし、第２のセレクターコドンを１つ以上含む第２のポリヌクレオチド；
を含む細胞であって、
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第１の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログ；及び、
【０１３０】
【化３５】
0006479022.tif 000035
【０１３１】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
下記式のシクロオクチニル基を有する第２の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログを用いて第１のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる；又は、
【０１３２】
【化３６】
0006479022.tif 000036
【０１３３】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第１の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログを用いて第１のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる；及び、
【０１３４】
【化３７】
0006479022.tif 000037
【０１３５】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のシクロオクチニル基を有する第２の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログを用いて第２のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる、細胞を準備する工程：
【０１３６】
【化３８】
0006479022.tif 000038
【０１３７】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
ｂ）前記細胞と、第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログとを接触させる工程：並びに、
ｃ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、それによって第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログをセレクターコドンによってコードされる位置の標的ポリペプチドに組み込む工程。
【０１３８】
本発明の１つの実施態様では、細胞を第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログに連続して接触させる。したがって、本発明の方法は以下の工程を含む。
ａ）第１の非天然型アミノ酸又はそのアナログを細胞に接触させる工程；そして、
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、その結果、第１の非天然型アミノ酸又はそのアナログを、セレクターコドンによってコードされた位置の標的ポリペプチドに組み込む工程；
ｃ）第２の非天然型アミノ酸又はそのアナログを細胞に接触させる工程；そして、
ｄ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、その結果、第２の非天然型アミノ酸又はそのアナログを、セレクターコドンによってコードされた位置の標的ポリペプチドに組み込む工程
【０１３９】
この実施態様では、単一のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡの対は、第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログを異なる時点で異なるポリペプチドの集団に組み込むために使用できる。
【０１４０】
本発明の１つの態様によれば、第１の非天然型アミノ酸又はそのアナログは、下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である。
【０１４１】
【化３９】
0006479022.tif 000039
【０１４２】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０１４３】
【化４０】
0006479022.tif 000040
【０１４４】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０１４５】
本発明の別の態様によれば、第２の非天然型アミノ酸又はそのアナログは、下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である。
【０１４６】
【化４１】
0006479022.tif 000041
【０１４７】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０１４８】
【化４２】
0006479022.tif 000042
【０１４９】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０１５０】
さらに本発明は下記を含むポリペプチドに関する。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：及び、
【０１５１】
【化４３】
0006479022.tif 000043
【０１５２】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基。
【０１５３】
【化４４】
0006479022.tif 000044
【０１５４】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０１５５】
本発明の１つの態様では、ポリペプチドは下記式の残基：及び、
【０１５６】
【化４５】
0006479022.tif 000045
【０１５７】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０１５８】
【化４６】
0006479022.tif 000046
【０１５９】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
下記式の残基を含む。
【０１６０】
【化４７】
0006479022.tif 000047
【０１６１】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０１６２】
【化４８】
0006479022.tif 000048
【０１６３】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０１６４】
また本発明は、本発明のポリペプチドを製造するための方法に関し、該方法は下記工程を含む。
ａ）
（ｉ）第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログ；
（ｉｉｉ）第１のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；並びに、
（ｉｖ）標的ポリペプチドをコードし、第１及び第２のセレクターコドンを１つ以上含むポリヌクレオチド：
を含む翻訳システムであって、
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第１の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログ（ｉｉ）を用いて、第１のｔＲＮＡ（ｉｉｉ）をアシル化することができ：そして、
【０１６５】
【化４９】
0006479022.tif 000049
【０１６６】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第２の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログ（ｉｉ）を用いて、第２のｔＲＮＡ（ｉｉｉ）をアシル化することができる翻訳システムを準備する工程。
【０１６７】
【化５０】
0006479022.tif 000050
【０１６８】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能とし、それによって第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログをセレクターコドンによってコードされる位置の標的ポリペプチドに組み込む工程。
【０１６９】
本明細書に開示される方法に従って、例えばｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基とシクロオクチニル基をそれぞれ含む非天然型アミノ酸に対応する位置に２つの異なる標識を導入するために、本発明におけるポリペプチドは第１のテトラジン、続いて第２のテトラジンと反応させることができる。
【０１７０】
さらに本発明は、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む非天然型アミノ酸又は該非天然型アミノ酸のアナログに関する。
【０１７１】
【化５１】
0006479022.tif 000051
【０１７２】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０１７３】
本発明の１つの態様によれば、前記の非天然型アミノ酸は下記式のアミノ酸又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である。
【０１７４】
【化５２】
0006479022.tif 000052
【０１７５】
［式中、
Ｘ１は下記式で表されるｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基であり：
【０１７６】
【化５３】
0006479022.tif 000053
【０１７７】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０１７８】
ポリペプチド鎖に翻訳的に組み込まれる非天然型アミノ酸の可能性に関して、変数Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、ｎ、ｍ、ｐ及びＲ４は、単独で又は組み合わせた場合、本明細書に開示された非天然型アミノ酸の特定の実施態様又はこれらの変数が生じる任意の他の式を表す以下の意味を特に有する。
【０１７９】
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨＣ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−である。
好ましくは、Ｘ２は−Ｏ−である。
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン、−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−又は単結合である；そして、ｍは、１，２，３，４，５又は６である。
Ｘ３に関して、Ｃ１−Ｃ６−アルキレンは好ましくは直鎖アルキレンである。
好ましくは、Ｘ３は−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−又は単結合である。
あるいはまた、Ｘ３は、−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−である；そして、ｐは、１，２，３，４，５又は６である。特定の実施態様では、Ｘ３は−ＣＨ２−Ｏ−である（すなわち、ｐは１である）。
本発明の１つの態様では、構成要素−Ｘ２−Ｘ３−は、主鎖に１〜６の原子を含み、例えば主鎖に１、２、３又は４つの原子を有する。
特定の実施態様によれば、−Ｘ２−Ｘ３−は、−Ｏ−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−である。
【０１８０】
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−である。
好ましくは、Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−である。
好適実施態様によれば、Ｘ４は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。
【０１８１】
Ｘ５は−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは本明細書に定義されるとおりである）又はフェニレン−ＣＨ２−である。
１つの実施態様では、Ｘ５は−（ＣＨ２）ｎ−である。
ｎは１〜４の整数である。
本発明の１つの態様では、ｎは３又は４である。
好適実施態様では、ｎは４である。
本発明の他の態様では、ｎは１である。
【０１８２】
本発明の他の態様では、Ｘ５はフェニレン−ＣＨ２−であり、式中、フェニレンは特に、１，３−フェニレン又は１，４−フェニレンであり、１，４−フェニレンが好ましい。フェニレンの部分はＸ４に結合し、メチレンはＲ４（又はＺ１）を有する炭素原子に結合している。
【０１８３】
特定の実施態様によれば、−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）ｎ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）ｎ−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは、好ましくは、３又は４であるか、ｎは１である。
好適実施態様では、−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎは、好ましくは、３又は４であるか、ｎは１である。
【０１８４】
さらなる特定の実施態様によれば、−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）３−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）３−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−（ＣＨ２）４−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−（ＣＨ２）３−である。
好適実施態様では、−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である。
さらなる実施態様によれば、−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−である。
【０１８５】
さらなる特定の実施態様では、−Ｘ４−フェニレン−ＣＨ２−は、−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−，−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−フェニレン−ＣＨ２−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−フェニレン−ＣＨ２−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−であり、式中、フェニレンは、好ましくは、１，４−フェニレンである。
【０１８６】
本発明の特定の態様では、−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−は、カルバメート官能基−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−を含む（例えば、Ｘ２が−Ｏ−であり，Ｘ３が単結合であり、そしてＸ４が−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であるか、Ｘ３が−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−もしくは−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−であり、Ｘ４が−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である）。
【０１８７】
特定の実施態様では、構成要素−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は主鎖に５〜１２の原子を含み、例えば、主鎖に６、７、８、９、１０又は１１の原子を有する。
特定の実施態様では、−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−又は−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である。
好適実施態様では、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、Ｘ１−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）４−，Ｘ１−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）４−又はＸ１−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）４−である。
さらなる好適実施態様では、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−は、Ｘ１−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−，Ｘ１−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−又はＸ１−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−である。
【０１８８】
さらなる好適実施態様では、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−フェニレン−ＣＨ２−は、Ｘ１−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−，Ｘ１−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−又はＸ１−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−フェニレン−ＣＨ２−であり，式中、フェニレンは、好ましくは、１，４−フェニレンである。
Ｘ６は、水素、Ｃ１−Ｃ６−アルキル、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル、Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルである。
特定の実施態様では、Ｘ６は水素、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシメチル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシエチ−１−イル（特に、１−（Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ）エチ−１−イル），Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシメチル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニルエチルである。
好適実施態様では、Ｘ６は水素である。
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり、好ましくは、Ｒ４は−ＮＨ２である。
【０１８９】
Ｒ４（及び、Ｚ１）を有する不斉炭素原子に関して、本発明の非天然型アミノ酸又はそのアナログは（カーン・インゴルド・プレローグ順位則に従って）Ｓ又はＲ配置を有することができ、Ｓ配置が好ましい。
好適実施態様では、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６は、下記式である。
【０１９０】
【化５４】
0006479022.tif 000054
【０１９１】
（式中、Ｒ４及びＸ６は本明細書に定義されるとおりであり、Ｘ６は特に水素である。）
さらなる好適実施態様では、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６は、下記式である。
【０１９２】
【化５５】
0006479022.tif 000055
【０１９３】
（式中、Ｒ４及びＸ６は本明細書に定義されるとおりであり、Ｘ６は特に水素である。）
さらなる好適実施態様では、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６は、下記式である。
【０１９４】
【化５６】
0006479022.tif 000056
【０１９５】
（式中、Ｒ４及びＸ６は本明細書に定義されるとおりであり、Ｘ６は特に水素である。）
さらなる特定の実施態様では、第１の非天然型アミノ酸は下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である。
【０１９６】
【化５７】
0006479022.tif 000057
【０１９７】
さらなる特定の実施態様では、第２の非天然型アミノ酸は下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である。
【０１９８】
【化５８】
0006479022.tif 000058
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】ａ）ＵＡＡの構造；ｂ）ＵＡＡの非存在下（−）又は存在下（＋）で発現した精製ＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。Ｙ３９ＴＡＧ変異が正常に抑制されている場合のみＧＦＰのバンド（矢印で示す分子量マーカー（３５ｋＤａ））が現れる。ＴＣＯ異性体（ＴＣＯ＊、ＴＣＯ＃）はＴＣＯよりも高い発現率を示す。；ｃ）ＴＣＯ異性体をシステアミン塩酸塩と混合し、及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを用いて、複数の時点および温度で測定した（シス−トランスの構造の観測に関連するシグナルのみを示す。ｘ軸はｐｐｍである。）（詳細は図８参照）。プロットは、０時間、室温（赤）と、２４時間、６０°Ｃ（青）で測定した化学シフトデータを示す。黒丸は、ＴＣＡ＊およびＴＣＯ＃のトランス型の二重結合と−ＣＨＯ−プロトンのシグナルを示す。黒矢印は、チオールおよび熱処理時に形成した対応するシス異性体由来のシグナルを示す。３種全てのＴＣＯがチオールの存在下で経時的に分解しているとき、ＴＣＯ＊が一番高い化学的安定性を示す（２４時間後、左のトランス異性体が約８０％）。；ｄ）精製したＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡ（２００ｎＭ）を２種のテトラジン（１５μＭ、２０分、３７℃）及びアジド（４５μＭ、１０時間、３７°Ｃ）と反応させた。走査ＵＶとクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。
【図２】ａ）アンバー変異を含むインスリン受容体（ＩＲＴＡＧ）の二色標識のために用いた発現と標識のスキームの概要；ｂ）ＵＡＡと色素の様々な組み合わせを用いたＩＲの二色標識の共焦点画像。左パネルはＳＰＥＡＫ（ＴＣＯ＊＋Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３）とＳＰＡＡＣ標識（ＢＣＮ＋アジド−Ｃｙ５）の組み合わせを示す。右パネルは、ＳＰＩＥＤＡＣ（ＴＣＯ＊＋Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５）と、ＳＣＯ及びＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２の間のｓｅＳＰＩＥＤＡＣの組み合わせを示す。；ｃ）ＴＣＯ＊及びＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５の間のＳＰＩＥＤＡＣ（上）と、ＳＣＯ及びＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２の間のｓｅＳＰＩＥＤＡＣ（下）が示すウイルス様粒子（ＶＬＰ）の二色標識。スケールバーは２０μｍである。
【図３】ＳＰＩＥＤＡＣとｓｅＳＰＩＥＤＡＣ標識後のＩＲおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）のＳＲＭ画像。ａ）図２ａおよび図２ｂに従ったＩＲＴＡＧ標識の広視野（左）とＳＲＭ（中央）の画像（マゼンタはＡｔｔｏ５３２、シアンはＣｙ５）。右のパネルには、中央のパネルのラインプロットをはめ込んだ（中央のパネルに示される矢印で強調表示されている線の全体）。マークされたピークの幅は半値全幅（ＦＷＨＭ）である。；ｂ）標識された（ａ）と類似するＶＬＰの広視野（左）、ＳＲＭ（中央）及びラインプロット。ＳＲＭ画像はフーリエ環相関（ＦＲＣ）により解析され、４５ｎｍの解像度で表示される。スケールバーは１μｍである。
【図４】本発明の方法において有用な化合物（及び実施例で使用された化合物）：未反応のシクロオクテニル基のクエンチングに有用である非蛍光のＭｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２；並びに蛍光色素アジド−Ｃｙ３，Ｈ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５，Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５，Ｈ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２，Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３及びアジド−Ｃｙ３。
【図５】ＦＲＥＴによる反応速度の測定。左のパネルは、Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３（上段）とＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２（下段）のいずれかとそれぞれ反応するＧＦＰＴＡＧ→３（ＴＣＯ＊）の典型的な時間依存性波長のスキャンを示す（黒：プローブを添加した後の最初のスキャン；グレー：反応の終了；ｎｏｒｍ．＝「０分」時点のＧＦＰ蛍光に対する正規化）。ＤおよびＡピークはＦＲＥＴの計算に使用し（ＦＲＥＴ＝Ａ／（Ａ＋Ｄ））、右のパネルでは全ての反応を経時的にプロットした（上段：Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３；下段：Ｈ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２）。ＦＲＥＴデータを正規化するために（ｎｏｒｍ．＝正規化）、それぞれの実験を本明細書に記載の単一指数モデルに当てはめた。続いて最大振幅に達した最初の時点を計算し、対応するＦＲＥＴ比を用いてＦＲＥＴデータを正規化した（全てのＵＡＡについて、別々に複製して）。最後に、ＵＡＡごとに３つの正規化された別個の実験を平均した。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】ＧＦＰＴＡＧ→３について３６時間行ったＦＲＥＴアッセイ。左のパネルは、ＧＦＰＴＡＧ→３＋Ｃｙ３の時間依存性波長のスキャンを示す（ｎｏｒｍ．＝「０分」時点のＧＦＰ蛍光に対する正規化）。ＤおよびＡピークはＦＲＥＴの計算に使用し（ＦＲＥＴ＝Ａ／（Ａ＋Ｄ））、右のパネルでは経時的にプロットした（ｎｏｒｍ．＝最大振幅に対する正規化）。サンプルは撹拌しなかった（しかし、表示された時点で時々混合した）。ＦＲＥＴ値は、経時的に一定であった。
【図７】ＦＲＥＴを用いた（１−４で）標識したＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡ＋Ｃｙ３の３日間以上の解析。左のパネルは、ＧＦＰＴＡＧ→３＋Ｃｙ３の典型的な時間依存性波長のスキャンを示す（ｎｏｒｍ．＝「０分」時点のＧＦＰ蛍光に対する正規化）。ＤおよびＡピークはＦＲＥＴの計算に使用し（ＦＲＥＴ＝Ａ／（Ａ＋Ｄ））、右のパネルでは１−４について経時的にプロットした。サンプルは時々混合したことに留意する。特に、１と３は経時的にＦＲＥＴ値が一定であった。
【図８】ａ）室温（ｒｔ；緑線）、３７°Ｃ（赤線）または６０°Ｃ（青線）のいずれかでの７２時間のインキュベーション後、ｄＰＢＳ／ジオキサン−ｄ８（Ｖ／Ｖ  １：１）中で測定されたＵＡＡ２（ＴＣＯ）、３（ＴＣＯ＊）および４（ＴＣＯ＃）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。これらのデータによると、全ての化合物について、ｄＰＢＳ／ジオキサン−ｄ８にＵＡＡを溶解後、直接測定された１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（紫線）と比較して変わらなかった。黒丸は、トランス型の二重結合と−ＣＨＯプロトンのシグナルを示す。；ｂ）室温（ｒｔ；緑線）、３７°Ｃ（赤線）または６０°Ｃ（青線）のいずれかでの２４時間のインキュベーション後、ｄＰＢＳ／ジオキサン−ｄ８（Ｖ／Ｖ  １：１）中で２当量のシステアミンとともに測定されたＵＡＡ２（ＴＣＯ）、３（ＴＣＯ＊）および４（ＴＣＯ＃）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。ＵＡＡをシステアミンと混合した後、直接測定された１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（上のライン）と比較すると、化合物２（ＴＣＯ）と４（ＴＣＯ＃）の９５％以上が、６０℃で２４時間後にシス型に変換された。対照的に、３（ＴＣＯ＊）は８０％以上がトランス型で残存した。黒丸は、トランス型の二重結合と−ＣＨＯ−プロトンのシグナルを示す。黒矢印は、チオールおよび熱処理時に形成した対応するシス異性体由来のシグナルを示す。；ｃ）ＵＡＡ３（ＴＣＯ＊）について、ｄＰＢＳ／ジオキサン−ｄ８（Ｖ／Ｖ  １：１）中で２当量のシステアミンと混合後（０日目；左パネルの上の線）、６０°Ｃでインキュベーション後の１日目（左パネルの中央の線）、２日目（左パネルの下の線）、３日目（右パネルの上の線）、７日目（右パネルの中央の線）または１０日目（右パネルの下の線）に測定した１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。黒丸は、トランス型の二重結合と−ＣＨＯ−プロトンのシグナルを示す。黒矢印は、チオールおよび熱処理時に形成した対応するシス異性体由来のシグナルを示す。
【図９】ＢＣＮのＳＰＡＡＣ標識。ＧＦＰチャネル（左）およびＣｙ５チャネル（右）。ａ）エンドサイトーシス阻害剤なしの標識；ｂ）エンドサイトーシス阻害剤を用いた標識。スケールバーは２０μｍである。
【図１０】ａ）クエンチャーなし（左）とあり（右）のＩＲのＴＣＯ＊二色標識のコントロール；ｂ）クエンチャーありのＴＣＯ＊及びＢＣＮ二色標識；ｃ）ＶＬＰのＴＣＯ＊二色標識のコントロール；ｄ）ｐＥＧＦＰＮ１＿ＩＲＫ６７６ＴＡＧのＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３／Ｈ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２標識。トランスフェクト細胞を黄色ダッシュ記号で強調し、非トランスフェクト細胞（非特異的な固着や標識を示さない）を赤の円で示した。スケールバーは２０μｍである。
【図１１】４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミン（下の線）、表示したジエノフィル（中央の線）及び４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミンと表示したジエノフィルとの混合後１０分後の反応生成物（上の線）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの比較。
【図１２】ＵＡＡ（２，３，３ａ，３ｂ又は４）の非存在下（コントロール）又は存在下で発現した精製後のＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡのクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。合成酵素のバンドは５５ｋＤａの分子量マーカーのわずか上方にあり、ＧＦＰのバンドは３５ｋＤａの分子量マーカーの高さ程度にある（矢印）。ＧＰＦのバンドはＹ３９ＴＡＧ変異がうまく抑制されている場合にのみ存在する。化合物３（ＴＣＯ＊）、３ａ（ＴＣＯ＊の軸異性体）、３ｂ（ＴＣＯ＊のエクアトリアル異性体）及び４（ＴＣＯ＃）は、ＴＣＯ（４）よりも高い発現量を示す。
【図１３】ａ）Ｈ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５と、ＧＦＰＴＡＧ−＞３（Ａ），ＧＦＰＴＡＧ−＞３ａ（Ｂ）又はＧＦＰＴＡＧ−＞３ｂ（Ｃ）とのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの標識反応中のＣｙ５（アクセプター）蛍光発光の増加；及びｂ）Ｈ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５濃度に対する観測された反応速度定数ｋｏｂｓ．の直線化。
【図１４】０ｈ，１ｈ，３ｈ，１ｄ，２ｄ，３ｄ，４ｄ，６ｄ，１３ｄ，１５ｄ，２１ｄ又は２８ｄの間、３７℃でシステアミン塩酸塩で処理したときの、軸異性体３ａとエクアトリアル異性体３ｂの１Ｈ−ＮＭＲプロファイルの変化；及び化合物４（ＴＣＯ），３ａ（ＴＣＯ＊の軸異性体），３ｂ（ＴＣＯ＊のエクアトリアル異性体）及び１（ＢＣＮ）の半減期。
【図１５】アンバーコドンがコード化した部位に化合物３、３ａ又は３ｂが組み込まれたインスリン受容体（ＩＲ）および（Ｃ末端）ＧＦＰの組換え融合物を発現する（すなわち、ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３，ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３ａ又はＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３ｂを発現する）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の共焦点画像（各々、Ｈ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５又はＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５で標識されている）。ＧＦＰ蛍光発光（ＧＦＰチャネル）は、組換えＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞ＵＡＡタンパク質の正常な発現を示す。Ｃｙ５の蛍光発光（Ｃｙ５チャネル）は、組換えＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞ＵＡＡタンパク質の正常な標識を示す。スケールバーは２０μｍである。
【発明を実施するための形態】
【０２００】
本発明は、アルキル置換テトラジンが、シクロオクチニル基を含む歪みジエノフィルと比較して、優先的にｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む歪みジエノフィルと反応するという発見にとりわけ基づいている。すなわち、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基とシクロオクチニル基が存在しているという競争がある状況では、アルキル置換テトラジンは優先的にｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基と反応する。本明細書中では、「優先的に反応する」という用語は、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む歪みジエノフィルがアルキル置換テトラジンと反応する速度定数ｋ１を、シクロオクチニル基を含む歪みジエノフィルがアルキル置換テトラジンと反応する速度定数ｋ２と比較した場合（すなわち、比はｋ１／ｋ２である）、速度定数ｋの比が１００以上、２００以上、５００以上または１０００以上であることをいう。したがって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む歪みジエノフィルとのアルキル置換テトラジンの反応は、実質的に全くシクロオクチニル基がまだアルキル置換テトラジンと反応していない間に、実質的にすべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基がアルキル置換テトラジンと反応しているという段階で進むことができる。
【０２０１】
本発明の特定の実施形態では、アルキル置換テトラジンは特にｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む歪みジエノフィルと反応する。その結果、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基とシクロオクチニル基が存在しているという競争がある状況では、アルキル置換テトラジンは優先的にｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基と反応する。本明細書中では、「特に反応する」という用語は、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む歪みジエノフィルがアルキル置換テトラジンと反応する速度定数ｋ１を、シクロオクチニル基を含む歪みジエノフィルがアルキル置換テトラジンと反応する速度定数ｋ２と比較した場合（すなわち、比はｋ１／ｋ２である）、速度定数ｋの比が２０００以上、５０００以上または１００００以上であることをいう。したがって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む歪みジエノフィルとのアルキル置換テトラジンの反応は、実質的に全くシクロオクチニル基がまだアルキル置換テトラジンと反応していない間に、実質的にすべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基がアルキル置換テトラジンと反応しているという段階で進むことができる。
【０２０２】
適切な反応条件によって、本発明の反応はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実行できる。第１と第２のジエノフィル基（例えば、標的ポリペプチド上に存在する前記の基を含む非天然型アミノ酸）のみがライゲーション反応に関与するので、本発明の方法は確実に明確に定義された複合体（例えば、定義された化学量論と定義されたライゲーション部位を含む標的ポリペプチド標識の複合体）の均一な集団を高効率に特異性に生産するために使用することができる。第１および第２のジエノフィル基を含む任意のさまざまな反応性の第１及び第２の変性剤（例えば、非天然型アミノ酸）は、さまざまな任意の分子（例えば標的ポリペプチド）に組み込むことができるので、複合体（例えば、標的ポリペプチドの複合体）の製造は特定の分子（例えば、ポリペプチド）に限定されるものではない。また既存の技術で、ポリペプチド中の任意のアミノ酸の位置に非天然型アミノ酸を有益に組み込むことは可能である。従って、標的ポリペプチドにおける第１および第２の化学的に反応性の非天然アミノ酸の位置、標的ポリペプチドの位置又は得られた標的ポリペプチド標識の複合体の位置は、任意に、例えば、その位置における配置が変化するかどうか、例えば、コンフォメーション、生物活性、薬理作用、安定性、生物学的利用もしくは他の特性に基づいて選択することができる。
【０２０３】
用語「非天然型アミノ酸」は２０の必須アミノ酸のひとつではなく又はセレノシステインはなく又はピロールリジンではないアミノ酸をいう。またこの用語は、アミノ酸類似体、例えばα−アミノ基がヒドロキシル基に置換されたもの、又は、カルボン酸基がエステルを形成するものについても言及する。実際に、Ｘ６が水素以外である本発明における非天然型アミノ酸またはその塩が、翻訳システムにおけるポリペプチドの調製に使用される場合、Ｘ６は元の位置で、例えばポリペプチドに組み込まれる前に酵素的に選択された翻訳システム内で除去されると考えられる。したがってＸ６は、本発明の非天然型アミノ酸又はその塩をアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって認識され、処理される形態に変換する翻訳システムの能力に適合するように便宜的に選択される。
【０２０４】
本発明の化合物又は塩は、不斉中心を有し、異なる空間的配置で、又は、異なる互変異性体として存在できる。ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基又はシクロオクチニル基を有するポリペプチドを生産するために、鏡像異性体混合物、特にラセミ体、ジアステレオマー混合物及び互変異性体混合物を使用できる。あるいはまた、本発明の化合物又は塩のそれぞれの本質的に純粋な鏡像体、ジアステレオマー及び互変異性体もその目的に使用できる。
【０２０５】
より詳細には、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基は、
【０２０６】
【化５９】
0006479022.tif 000059
【０２０７】
ｔｒａｎｓ−シクロオクテン環が分子の残基に結合している炭素原子での絶対配置によって、互いに異なる２つの異性体を包含することを意味する。すなわち、区別することができるＳ又はＲ配置を有する２つの鏡像体、例えば下記式の鏡像異性体である。
【０２０８】
【化６０】
0006479022.tif 000060
【０２０９】
アトロプ異性のために、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基は、４つの異なる立体異性体が存在する。ｔｒａｎｓ−シクロオクテン環が結合している炭素原子に関しては、軸異性体とエクアトリアル異性体がある（すなわち、分子の残基はｔｒａｎｓ−シクロオクテン環に対して、軸方向またはエクアトリアルの位置に結合する）。前記軸異性体のそれぞれと、前記エクアトリアル異性体のそれぞれについて、２つの鏡像異性体が存在する。したがって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基の立体異性体は下記式で表すことができる。
【０２１０】
【化６１】
0006479022.tif 000061
【０２１１】
特に断りのない限り、用語「軸異性体」は、軸異性体の両方の鏡像異性体の混合物（特にラセミ体）を示し、用語「エクアトリアル異性体」は、エクアトリアル異性体の両方の鏡像異性体の混合物（特にラセミ体）を示す。
【０２１２】
上記の定義で述べた有機部分の変数は（用語「アルキル基」と同様に）個々の基の員の個々の列挙のための集合的な用語である。いずれの場合も接頭部Ｃｎ〜ｍは、該基中の炭素原子の可能性のある数を示す。
【０２１３】
用語「ハロゲン」は、いずれの場合も、フッ素、臭素、塩素又はヨウ素基、特にフッ素基を意味する。
【０２１４】
アルキル基は、１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。例としては、メチル基や、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、２−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基又はｔｅｒｔ−ブチル基等のＣ２〜Ｃ４アルキル基、またペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、ヘキシル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１，２，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−１−メチルプロピル基及び１−エチル−２−メチルプロピル基を挙げることができる。
【０２１５】
アルケニル基は、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する不飽和結合が１つの炭化水素基であり、例えばビニル、アリル（２−プロペン−１−イル）、１−プロペン−１−イル、２−プロペン−２−イル、メタリル（２−メチルプロパ−２−エン−１−イル）等である。Ｃ３−Ｃ５アルケニルは、特にアリル、１−メチルプロパ−２−エン−１−イル、２−ブテン−１−イル、３−ブテン−１−イル、メタリル、２ペンテン−１−イル、３−ペンテン−１−イル、４−ペンテン−１−イル、１−メチルブタ−２−エン−１−イル、２−エチルプロパ−２−エン−１−イル、２−ヘキセン−１−イル等である。
【０２１６】
アルキレン基は、１〜６の炭素原子、特に１〜４の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキレン基である。例としては、メチレン基、エチレン基、１，２−エチレン基、１，３−プロピレン基、イソプロピレン基、１，４−ブチレン基、１，５−ペンチレン基等を挙げることができる。
【０２１７】
アルコキシ基は、式Ｒ−Ｏ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。
【０２１８】
アルケノキシ基は、式Ｒ−Ｏ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルケニル基である。
【０２１９】
アルカノイルオキシ基は、式Ｒ−（ＣＯ）−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。
【０２２０】
アルキルアミノカルボニルオキシ基は、式Ｒ−ＮＨ−（ＣＯ）−Ｏ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。
【０２２１】
アルキルチオ基は、式Ｒ−Ｓ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜４の、好ましくは１〜３の炭素原子を有するアルキル基である。
【０２２２】
アルカノイルスルファニル基は、式Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４又は１〜３の炭素原子を有する直鎖又は分岐したアルキル基である。
【０２２３】
アルキルアミノ基は、式Ｒ−ＮＨ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４の炭素原子を有するアルキル基である。例としては、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ−プロピルアミノ、ｉｓｏ−プロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、２−ブチルアミノ、ｉｓｏ−ブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ等が挙げられる。
【０２２４】
ジアルキルアミノ基は、式ＲＲ’Ｎ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒ及びＲ’は互いに独立して１〜６の、特に１〜４の炭素原子を有するアルキル基である。
例としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミノ等が挙げられる。
【０２２５】
アルケニルアミノ基は、式Ｒ−ＮＨ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは２〜６の、特に２〜４の炭素原子を有するアルキル基である。例としては、ビニルアミノ、アリルアミノ（２−プロペン−１−イルアミノ）、１−プロペン−１−イル−アミノ、２−プロペン−２−イル−アミノ、メタリルアミノ（２−メチルプロパ−２−エン−１−イル−アミノ）等が挙げられる。
【０２２６】
Ｎ−アルキル−Ｎ−アルケニルアミノ基は、式ＲＲ’Ｎ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒは１〜６の、特に１〜４の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ’は２〜６の、特に２〜４の炭素原子を有するアルキル基である。例としては、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−アリルアミノ（Ｎ−メチル−Ｎ−２−プロペン−１−イル−アミノ）、Ｎ−メチル−Ｎ−１−プロペン−１−イルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−２−プロペン−２−イル−アミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−メタリルアミノ（Ｎ−メチル−Ｎ−２−メチルプロパ−２−エン−１−イル−アミノ）等が挙げられる。
【０２２７】
ジアルケニルアミノ基は、式ＲＲ’Ｎ−の基であり、本明細書中に定義するように、Ｒ及びＲ’は互いに独立して２〜６の、特に２〜４の炭素原子を有するアルキル基である。例としては、ジビニルアミノ、ジアリルアミノ（ジ−（２−プロペン−１−イル）アミノ）、Ｎ−ビニル−Ｎ−アリル−アミノ等が挙げられる。
【０２２８】
特に記載がない限り、用語「置換される」は、基が、１、２又は３個、特に１又は２個の置換基、特に、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基、ＣＮ、ＣＦ３、ヒドロキシル、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ４アルカノイルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ４アルキルアミノカルボニルオキシ基及びＣ１〜Ｃ４アルキルチオ基から成る群から選択される置換基で置換されることを意味する。
【０２２９】
本発明の化合物の酸又は塩基付加塩は、特に生理的に許容された酸又は塩基を有する付加塩である。生理的に許容された酸付加塩は、適切な有機又は無機の酸で本発明の化合物の原形を処理することで形成できる。酸性プロトンを含む本発明の化合物は、適切な有機又は無機の塩基で処理することによって、その非毒性金属塩又はアミン付加塩の形に変えることができる。また本発明の化合物と塩には、その水和物や溶媒を添加した形、例えば水和物やアルコラート等が含まれる。
【０２３０】
生理的に許容された酸又は塩基とは、特に、第１および第２のジエノフィルの取り込みに使用されるシステム（例えば、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基又はシクロオクチニル基を用いたポリペプチドの生産に用いられる翻訳システム等の生物学的システム）に使用することができるもの、
例えば実質的に生存細胞に非毒性のものである。
【０２３１】
本発明の化合物及び塩（例えば、本発明のジエノフィル及びテトラジン）は、当技術分野で周知の方法と類似の方法で製造できる。式（Ｉ）の化合物の適切な製造方法は、本明細書で引用した様々な刊行物に見られ、その全てが全体として本明細書に参照により組み込まれる。いくつかの方法が本明細書中に概説されている。
【０２３２】
本発明の化合物と塩は、１つ以上のシクロオクチニル又はｔｒａｎｓ−シクロオクテニル類似基を含むポリペプチドの生産に使用できる。本発明は、該ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生産方法を提供する。特に、本発明の化合物又は塩は、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに翻訳的に導入できる。ポリペプチドは、典型的には、これには限らないが、共有ペプチド結合によって結合した、任意の長さのアミノ酸（天然型もしくは非天然型又はその組み合わせ）の残基の任意のオリゴマーである。ポリペプチドは、任意のソースから得ることができる。例えば、天然に存在するポリペプチド、組換え分子遺伝学的技術により産生したポリペプチド、細胞もしくは翻訳システムに由来するポリペプチド又は無細胞の合成手段により産生されたポリペプチドである。ポリペプチドは、そのアミノ酸配列、例えばその構成アミノ酸残基の一次構造によって特徴付けられる。本明細書では、ポリペプチドのアミノ酸配列は全長配列には限定されず、部分的または完全な配列とすることができる。さらに、ポリペプチドは任意の特定の生物学的活性を有するか否かにより限定されるものではない。本明細書では、用語「タンパク質」はポリペプチドと同義である。用語「ペプチド」は、これには限定されないが、例えば長さが２〜２５アミノ酸などの小さなポリペプチドをいう。本明細書では、「非天然型アミノ酸を組み込む」とは、例えば、翻訳または化学合成を介して、標的ポリペプチドの一次構造の構築中に、成長中のポリペプチド鎖に非天然型アミノ酸を直接加えることをいう。
【０２３３】
当該技術分野で公知の多くの方法のいずれかを使用して、第１および第２の非天然型アミノ酸を標的ポリペプチドに組み込むことができる。多くの実施態様では、非天然型アミノ酸を直接組み込むルートとして直交性の翻訳システムが使用されるが、他の直接組み込み法（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システム、固相合成等）を代わりに使用することもできる。本明細書中の典型的な実施形態において、非天然型アミノ酸は、好ましくは標的ポリペプチドに、すなわちポリペプチドの構築中に組み込まれること、そして翻訳後の化学的誘導体化を介しては加えられないことが理解されるであろう。
【０２３４】
本明細書に記載の特定の実施形態においては、直交ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酸素対を使用して、部位特異的に、高効率、高適合的に、非天然型アミノ酸を標的ポリペプチドに組み込むことができる。メチロトローフ酵母は、異種の組換え発現系としての使用に魅力的な候補であり、治療に有用なタンパク質である。メチロトローフ酵母の真核細胞性の亜細胞組織は、哺乳動物由来の生物学的に活性なキャリアポリペプチドおよび／または標的ポリペプチドを合成するために必要な翻訳後の折り畳み、プロセシング及び修飾イベントの多くを実行可能にする。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発現するタンパク質とは異なり、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａとしても知られている）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉおよびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐｐ．などのメチロトローフ酵母によって生産されるタンパク質は、異種発現した糖タンパク質のダウンストリームプロセッシングを妨げる可能性のある高マンノース型のグリカン構造を有する可能性が低い。またメチロトローフ酵母で合成された標的ポリペプチドは、有利なことに、しばしば大腸菌で発現したタンパク質の特徴とされる発熱性および抗原性の化合物を含まない。最も重要なことは、メチロトローフ酵母発現系が大規模合成に特に有用なことである。例えば、メチロトローフ酵母における直交性の翻訳システムでは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、細菌、昆虫または哺乳動物のシステムよりも１０〜１００倍高いレベルで非天然型アミノ酸を含む標的ポリペプチドの発現を可能とすることができる。またメチロトローフ酵母は、バキュロウイルス発現系では必要とされる高価な培地添加剤や装置の必要性を排除し、簡単な、既存の塩培地で容易に培養することができる。
【０２３５】
用語「翻訳システム」は、伸長しているポリペプチド鎖（タンパク質）に、自然界のアミノ酸を導入するために必要な構成要素に言及する。翻訳システムの構成要素には、例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、合成酵素、ｍＲＮＡ等を含むことができる。
【０２３６】
翻訳システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏの翻訳システムでも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの翻訳システムでもよい。
【０２３７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの翻訳システムは、無細胞翻訳システムでもよい。無細胞翻訳システムは、例えば細胞抽出液の形などで、ｍＲＮＡの翻訳に必要なタンパク因子を得た後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの反応を再構成することにより、所望のタンパク質を合成するシステムである。タンパク質合成のための該無細胞システムとその使用は当技術分野で公知である。例としては、大腸菌の抽出物、麦芽抽出物、ウサギ網状赤血球溶解物を挙げることができる（Ｓｐｉｒｉｎ  ａｎｄ  Ｓｗａｒｔｚ，Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，２００８）。
【０２３８】
好ましくは、本発明の方法で使用される翻訳システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏの翻訳システムである。ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳システムは、例えば、原核細胞又は真核細胞等の細胞とすることができる。その細胞は、細菌性細胞（例えば、大腸菌）；酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはメチロトローフ酵母）等の真菌細胞；植物細胞又は昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ細胞またはＨｅＬａ細胞）等の動物細胞とすることができる。ポリペプチドの発現に使用される真核細胞は、単一細胞でもよいし、多細胞組織の一部でもよい。
【０２３９】
特定の実施態様では、その翻訳システムは大腸菌の細胞である。
【０２４０】
さらなる特定の実施態様では、その翻訳システムは、哺乳動物細胞、例えばＨＥＫ細胞またはＨｅＬａ細胞である。
【０２４１】
本発明のポリペプチドの生産に有用な翻訳システムには、特に、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；セレクターコドンに対応するアンチコドンを有するｔＲＮＡ、又は、前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；および標的ポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドが含まれる。
【０２４２】
例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をコードするポリヌクレオチド、ｔＲＮＡ及び本発明のポリペプチドは、当技術分野において公知の形質導入／形質転換によって細胞に導入できる。
【０２４３】
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＲＳ）は、アミノ酸又はアミノ酸類似体を用いてｔＲＮＡをアシル化することができる酵素である。本発明の方法で使用されるＲＳは、本発明の非天然型アミノ酸を用いてｔＲＮＡを便宜的にアシル化することができる。
【０２４４】
本発明の方法では、ｔＲＮＡアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｔＲＮＡ／ＲＳ）ペアを便宜的に利用する。好ましくは、本発明の方法で使用されるｔＲＮＡ／ＲＳペアは、翻訳システムにおいて直交性を有している。
【０２４５】
本明細書中で使用される用語「直交性」は、対象となる翻訳システム（細胞等）に、低下した効率で使用される分子［例えば、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交系アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（Ｏ−ＲＳ）］を示す。「直交性」は、不能又は低下した効率を示し、対象の翻訳システムの内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又は内因性のｔＲＮＡの働きに対し、直交性ｔＲＮＡ又は直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素では、例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率又は例えば１％未満の効率となる。
【０２４６】
例えば、内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素による内因性のｔＲＮＡのアシル化と比較すると、対象となる翻訳システムにおいて、直交性ｔＲＮＡは、低下した又はゼロの効率で、対象の翻訳システムの内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によってアシル化される。別の例では、内因性のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素による内因性のｔＲＮＡのアシル化と比較すると、対象となる翻訳システムにおいて、直交性アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、低下した又はゼロの効率で、内因性のｔＲＮＡをアシル化する。
【０２４７】
好ましくは、本発明の方法で使用される直交性ｔＲＮＡ／ＲＳペアは、以下の性質を有する：Ｏ−ｔＲＮＡは、本発明の非天然型アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによって選択的にアシル化される。加えて、直交ペアは、対象の翻訳システムで機能する（例えば、その翻訳システムは本発明の非天然型アミノ酸をポリペプチド鎖に導入するために、Ｏ−ｔＲＮＡをアシル化した非天然型アミノ酸を使用する）。取り込みは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ内で部位特異的に行われる（例えば、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバー終止コドン等のセレクターコドンを認識する）。
【０２４８】
いくつかの態様では、翻訳システムは、例えば第２の非天然型アミノ酸を利用する第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡなどの第２の直交ペアを含むので、現在では該システムは、ポリペプチド中の選択された異なる位置に、少なくとも二つの異なる非天然型アミノ酸を組み込むことができる。本実施形態では、第２のＯ−ＲＳは、第１の非天然型アミノ酸とは異なる第２の非天然型アミノ酸で第２のＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは、第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されたセレクターコドンとは異なるセレクターコドンを認識する。二つの直交性ｔＲＮＡ／ＲＳペアを含む適切な翻訳システムは当該技術分野で公知である。例えば、Ｈａｎ  Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１３，５２，１４０８０−１４０８３を参照のこと。
【０２４９】
いくつかの実施態様では、翻訳システムは細胞、例えば哺乳動物、昆虫、酵母、細菌または大腸菌の細胞を含む。使用される細胞のタイプは、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがその細胞の環境でそれらの直交性を保持する限り、特に限定されるものではない。
【０２５０】
用語「選択的にアシル化する」とは、対象の翻訳システムの内因性のｔＲＮＡ又はアミノ酸と比較して、Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを非天然型アミノ酸でアシル化する効率が、例えば、約５０％の効率、約７０％の効率、約７５％の効率、約８５％の効率、約９０％の効率、約９５％の効率、約９９％以上の効率であることを示す。そして、非天然型アミノ酸は、伸長するポリペプチドに高い忠実度で取り込まれる（例えば、所定のセレクターコドンに対して約７５％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約８０％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約９０％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約９５％以上の効率で、所定のセレクターコドンに対して約９５％以上の効率で、もしくは、所定のセレクターコドンに対して約９９％以上の効率で、又は、それ以上の効率で）。
【０２５１】
用語「セレクターコドン」は翻訳過程においてＯ−ｔＲＮＡによって認識され、内因性のｔＲＮＡでは認識されないコドンを示す。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、ポリペプチド内のこの部位で、そのアミノ酸、例えば、非天然型アミノ酸を導入する。セレクターコドンには、例えば、終止コドン等のナンセンスコドン、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン；４塩基又はそれ以上の塩基コドン；天然型又は非天然型塩基対由来のコドン等が含まれる。また、所定のシステムでは、セレクターコドンは天然型の３塩基コドンのひとつを含むこともでき（すなわち、天然型トリプレット）、そこでは内因性システムは、前記天然型トリプレットを使用しない（例えば、天然型トリプレットを認識するｔＲＮＡが欠損しているシステム、又は、天然型トリプレットがレアコドンであるシステム）。
【０２５２】
アンチコドンは、対応するコドンの逆の相補配列を有する。
【０２５３】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば、抑制性ｔＲＮＡ等）及びＯ−ＲＳで構成されている。
【０２５４】
抑制性ｔＲＮＡは、所定の翻訳システムにおいて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読み取りを変えるｔＲＮＡである。抑制性ｔＲＮＡは、例えば、終止コドン、４塩基コドン又はレアコドンを読むことができる。
【０２５５】
Ｏ−ｔＲＮＡは、内因性の合成酵素ではアシル化されず、また本明細書に記載するようにセレクターコドンを解読することができる。Ｏ−ＲＳは、例えば、拡張アンチコドンループを用いてＯ−ｔＲＮＡを認識し、選択的に非天然型アミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡをアシル化する。
【０２５６】
本発明の方法で使用されるｔＲＮＡとＲＳは、天然由来でもよいし、様々な組織から自然発生したｔＲＮＡ及び／又はＲＳの変異に由来してもよい。様々な実施態様では、１つ以上の組織からｔＲＮＡとＲＳが得られる。別の実施態様では、そのｔＲＮＡは最初の組織から自然発生又は変異して自然発生したｔＲＮＡから得られ、そのＲＳは、２番目の組織から自然発生又は変異して自然発生したＲＳから得られる。
【０２５７】
適切なｔＲＮＡ／ＲＳペアは、例えば、ライブラリのスクリーニング結果に基づき、変異型ｔＲＮＡとＲＳのライブラリから選択できる。或いはまた、適切なｔＲＮＡ／ＲＳペアは、発生源種から翻訳システムに導入される異種のｔＲＮＡ／合成酵素ペアであってもよい。好ましくは、翻訳システムとして使用される細胞は、前記発生源種と異なる。
【０２５８】
例えば、適切な直交性ＲＮＡは、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉおよびＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  種のＮＲＣ−Ｉ）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌から得ることができ、一方、直交性Ｏ−ＲＳは、生物または生物の組み合わせ、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉおよびＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のＮＲＣ−Ｊ）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｋｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌から得ることができる。ひとつの実施形態では、真核生物の供給源、例えば、植物、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、節足動物等）も、Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの供給源として使用できる。
【０２５９】
ｔＲＮＡ／ＲＳペアを発展させた方法は、例えば、ＷＯ０２／０８５９２３とＷＯ０２／０６０７５に記載されている。
【０２６０】
好ましくは、ＲＳは、本発明の非天然型アミノ酸を用いてｔＲＮＡをアシル化できるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素（ｐｙｌＲＳ）である。
【０２６１】
本発明の方法で使用されるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、野生型又は遺伝子工学的に作られたｐｙｌＲＳであってもよい。野生型ｐｙｌＲＳの例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｂｕｒｔｏｎｉｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ及びＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｆｎｉｅｎｓｅ等の古細菌及び真正細菌のｐｙｌＲＳが含まれるが、これには限定されない。
【０２６２】
遺伝子工学的につくられたｐｙｌＲＳは、例えば、ノイマン他（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４：２３２，２００８）、柳沢他（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００８，１５：１１８７）及びＥＰ２１９２１８５Ａ１に記載されている。
【０２６３】
特定の実施態様では、本発明のポリペプチドの生産に使用されるピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、Ｍ．ｍａｚｅｉの野生型のピロリシルｔＲＮＡ合成酵素である。
【０２６４】
特定の実施態様では、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号１に記載の野生型のＭ．ｍａｚｅｉピロリシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列又はその機能的断片を含む。
【０２６５】
配列番号：１：
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARAL  60
RHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLE 120
NTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMS 180
APVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERE 240
NYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM 300
LAPNLYNYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLE 360
SIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVYGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA 420
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL                           454
【０２６６】
別の特定の実施態様では、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、１つ以上のアミノ酸改変を含むＭ．ｍａｚｅｉのピロリシルｔＲＮＡ合成酵素であり、好ましくは、アミノ酸置換Ｙ３０６Ａ及びＹ３８４Ｆから選択される。
【０２６７】
特定の実施態様では、ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、配列番号２に記載の変異型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列又はその機能的断片を含む。
【０２６８】
配列番号：２：
MDKKPLNTLISATGLWMSRTGTIHKIKHHEVSRSKIYIEMACGDHLVVNNSRSSRTARAL  60
RHHKYRKTCKRCRVSDEDLNKFLTKANEDQTSVKVKVVSAPTRTKKAMPKSVARAPKPLE 120
NTEAAQAQPSGSKFSPAIPVSTQESVSVPASVSTSISSISTGATASALVKGNTNPITSMS 180
APVQASAPALTKSQTDRLEVLLNPKDEISLNSGKPFRELESELLSRRKKDLQQIYAEERE 240
NYLGKLEREITRFFVDRGFLEIKSPILIPLEYIERMGIDNDTELSKQIFRVDKNFCLRPM 300
LAPNLANYLRKLDRALPDPIKIFEIGPCYRKESDGKEHLEEFTMLNFCQMGSGCTRENLE 360
SIITDFLNHLGIDFKIVGDSCMVFGDTLDVMHGDLELSSAVVGPIPLDREWGIDKPWIGA 420
GFGLERLLKVKHDFKNIKRAARSESYYNGISTNL                           454
【０２６９】
本明細書中に記載のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、いずれも本発明の非天然型アミノ酸を用いたアシル化に使用される。
【０２７０】
本発明のひとつの態様では、野生型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。
【０２７１】
【化６２】
0006479022.tif 000062
【０２７２】
本発明のさらなる態様では、野生型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。
【０２７３】
【化６３】
0006479022.tif 000063
【０２７４】
本発明の別の態様では、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。
【０２７５】
【化６４】
0006479022.tif 000064
【０２７６】
本発明の別の態様では、アミノ酸置換Ｙ３０６ＡとＹ３８４Ｆを含む変異型Ｍ．ｍａｚｅｉピロリシルｔＲＮＡ合成酵素は、下記式の化合物又はその塩を用いたｔＲＮＡのアシル化に使用される。
【０２７７】
【化６５】
0006479022.tif 000065
【０２７８】
ｐｙｌＲＳ（ｔＲＮＡｐｙｌ）と組み合わせて用いられるｔＲＮＡは、野生型のｔＲＮＡであっても、遺伝子工学的につくられたｔＲＮＡであってもよい。野生型ｔＲＮＡｐｙｌの例には、上記のようにピロリシル残基の翻訳導入を促進する古細菌と真正細菌のｔＲＮＡが含まれるが、これには限定されない。
【０２７９】
同様に、適切なｔＲＮＡＴｙｒ／ＴｙｒＲＳおよびｔＲＮＡＬｅｕ／ｌｅｕｃｙｌ−ｔＲＮＡ合成酵素ペアを準備し、使用することができる。
【０２８０】
本発明の方法で利用されるセレクターコドンは、使用される翻訳システムのタンパク質合成機構の遺伝子のコドンの枠組みを広げる。例えば、セレクターコドンには、ユニークな３塩基コドン、終止コドン（例えば、アンバーコドン、オパールコドン）等のナンセンスコドン、非天然型コドン、４塩基以上のコドン等が含まれる。多くのセレクターコドンは、所望のポリペプチド（目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドに導入できる（例えば、１以上、２以上、３以上等）。
【０２８１】
６４の遺伝子コドンは、２０のアミノ酸と３つの終止コドンをコードする。翻訳の終了にはひとつの終止コドンだけが必要なので、原理的に他の２つの終止コドンはタンパク質を構成しない（ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ）アミノ酸をコードするために使用できる。アンバー終止コドン（ＵＡＧ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生合成システムや、アフリカツメガエル卵母細胞中での非天然型アミノ酸の導入に使用するのに成功している。３つの終止コドンのうち、ＵＡＧは少なくとも大腸菌において終止コドンとして使用される。いくつかの大腸菌の株は、ＵＡＧを認識し、天然型アミノ酸を挿入する天然型の抑制性ｔＲＮＡを含む。さらに、これらのアンバー抑制性ｔＲＮＡは従来のタンパク質の突然変異誘発に使用されている。哺乳動物細胞（ＨＥＫ細胞）において、オーカー（ＴＡＡ）コドン及びアンバー（ＴＡＧ）コドンは、同じポリペプチドの異なる部位に二つの異なる非天然型アミノ酸を組み込むために使用されている。例えば、Ｈａｎ  Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１３，５２，１４０８０−１４０８３参照のこと。
【０２８２】
１つの実施態様では、本発明の方法には、本発明の化合物を導入するための終止コドンであるセレクターコドンの使用が含まれる。例えば、終止コドン（好ましくはアンバー終止コドン）を認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、本発明の化合物を用いて、Ｏ−ＲＳによってアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは自然界のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素には認識されない。目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、対象とする部位に終止コドン（例えば、アンバー終止コドン）を導入するために、従来の部位特定的変異誘発が使用できる。翻訳システムにおいてＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び変異遺伝子を組み合わせたとき、アンバー終止コドンに対応して非天然型アミノ酸が特異的な部位で導入され、非天然型アミノ酸類似体（すなわち、本発明の化合物）を含むポリペプチドが与えられる。
【０２８３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの本発明の化合物の導入は、大腸菌又はＨＥＫもしくはＨｅＬａ細胞等の宿主の大きな混乱なく行うことができる。例えば、アンバー終止コドンの抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば、アンバー抑制性ｔＲＮＡ）と終結因子１（ＲＦ１）（アンバー終止コドンに結合し、伸長しているペプチドのリボゾームからの遊離を開始させる因子）間の競合に依存しているので、その抑制効率は、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ（例えば、抑制性ｔＲＮＡ）の発現レベルを上昇させること、又は、ＲＦ１欠損株を用いることのどちらかによって調節できる。
【０２８４】
特定の実施態様では、本発明の方法で使用されるｔＲＮＡｐｙｌは、アンバー終止コドンに対するＣＵＡアンチコドンを含む。
【０２８５】
本発明の化合物をコードするための有用な他のセレクターコドンはレアコドンである。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのタンパク質合成反応においてアルギニン濃度が低下しているときには、レアアルギニンコドン（ＡＧＧ）は、アラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるアラニン（Ａｌａ）の挿入に有効であることが証明されている。この場合、合成ｔＲＮＡは、大腸菌中に少数種として存在する自然界のｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生物は、全てのトリプレットコドンを使用するわけではない。例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓの割り当てられていないコドンであるＡＧＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物中ではアミノ酸の挿入に利用されている。したがって、本発明の方法で利用される翻訳システムによって使用されないトリプレットコドンは、いずれもセレクターコドンとして機能することができる。
【０２８６】
本発明にかかるＵＡＡをポリペプチドに組み込むためのさらなる代替手段は、セレクターコドンとしての四重（４塩基）コドン及び対応するＯ−ｔＲＮＡ／ＲＳペアを使用することである。
【０２８７】
この翻訳システムは、リボゾームが本発明のポリペプチドを形成できる条件で、適切な時間維持される。目的のポリペプチドをコードし、１つ以上のセレクターコドンを含むｍＲＮＡはリボゾームに結合する。そして、それぞれのアミノアシルｔＲＮＡと結合するコドンにコードされた位置で、アミノ酸が段階的に結合することによって、ポリペプチドが形成される。このようにして、本発明の化合物はセレクターコドンにコードされた位置で目的のポリペプチドの中に導入される
【０２８８】
翻訳システムによる目的のポリペプチドの翻訳は、当技術分野で周知の手順で実施できる。効率的な翻訳を促進するために、翻訳システムの構成要素は組み合わせることができる。翻訳システムとして使用される細胞は適切に培養され、目的のポリペプチドを生産するために、適切な発現培地中で、適切な時間、適切な条件下で維持される。アラビノース、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）又はテトラサイクリン等、目的のポリペプチド遺伝子の転写を可能にする化合物を添加して、発現を誘導することが必要であろう。
【０２８９】
翻訳後に本発明のポリペプチドを翻訳システムから任意に回収できる。この目的ために、当業者に使用されている当業者に公知の手順により、本発明のポリペプチドを回収、精製し、部分的に又は十分に均質にすることができる。当技術分野において周知の標準的な手順としては、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を挙げることができる。正しく折りたたまれた成熟タンパク質の作製では、必要に応じてタンパク質リフォールディングステップを使用することができる。高純度が望まれる精製最終工程では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の好適な方法を使用することができる。本発明の非天然型アミノ酸又はポリペプチドに対して作製された抗体は、精製試薬（すなわち、ポリペプチドのアフィニティー精製用）として使用することができる。
【０２９０】
様々な、精製／タンパク質折りたたみ法が当技術分野において周知であり、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）及びそれらに引用された参考文献に示されたものが挙げられる。
【０２９１】
すでに述べたように、ポリペプチドは合成、発現及び／又は精製後に、関連するポリペプチドの所望の構造とは異なる構造を有する可能性があることを当業者は認識している。例えば、原核生物のシステムによって生産されたポリペプチドは、しばしばカオトロピック試薬に曝露することによって最適化され、適切に折りたたまれる。例えば、大腸菌の溶解物から精製する間に、発現したポリペプチドは任意に変性され、復元される。これは、例えば、塩酸グアニジン等のカオトロピック試薬中でタンパク質を可溶化することにより達成される。一般的に、発現したポリペプチドを変性、還元し、次に、ポリペプチドを好ましい構造に再び折りたたむことが時折望まれる。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、及び／又は、シャペロニンを対象の翻訳産物に加えることができる。タンパク質の還元、変性及び復元の方法は、当業者に周知である。例えば、酸化グルタチオンやＬ−アルギニンを含むレドックス緩衝液中でポリペプチドはリフォールディングすることができる。
【０２９２】
化学的に反応性の非天然アミノ酸を含む本発明の標的ポリペプチドを構築する特定の方法は、本明細書に詳述されており、例えば直交性の翻訳システムを用いることであるが、それらは必ずしも限定するものとして解釈されるべきではない。さらに、他の、例えば直交性ではない、非天然型アミノ酸を有する標的ポリペプチドを構築する方法もまた多くの実施形態として本明細書に含まれている。これらの方法は、本明細書でさらに詳細に記載されている。
【０２９３】
本発明の別の実施形態において、本発明の標的ポリペプチドは、直交翻訳システムなどの直接組み込み法によって構築することができる。これは、部位特異的に組み込まれた非天然型アミノ酸を用いて正しく折り畳まれて翻訳後に修飾されたポリペプチドを高収率で生産するという直交性システムの能力のために、好適な実施形態となる。しかしながら、代替的にまたは付加的に、ポリペプチド鎖に非天然型アミノ酸を直接組み込むための別の方法を、第１および第２の非天然型アミノ酸を標的ポリペプチドに組み込むために使用することができる。例えば、非天然型アミノ酸を例えば標的ポリペプチドの一次構造の構築中に組み込むためのひとつの一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法は、所望の非天然型アミノ酸で化学的にアシル化され、次いでタンパク質の生合成を支持することができる抽出物に追加され、所望のアンバーナンセンス変異を有する遺伝子を含むナンセンス又はフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを使用する。この方法は、事実上あらゆる大きさの様々なタンパク質に１００を超える非天然型アミノ酸を部位特異的に組み込むために使用されており、本明細書中では、非天然型アミノ酸を含む標的ポリペプチドを作製するために使用することができる。別の実施形態では、化学合成を介して、非天然型アミノ酸をより小さい標的ポリペプチド（６０−１００個のアミノ酸の範囲）に直接組み込むことができる。固相ペプチド合成は、非天然型アミノ酸を含む小タンパク質やポリペプチドを化学的に合成するために広く使用される方法であり（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．」ＪＡＣＳ  ８５：２１４９−２１５４参照のこと）、本発明の標的ポリペプチドを生産するために適合させることができる。この技術は、通常、２つの段階を含む：固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の第１段階は、カップリング−脱保護の反復サイクルを介してポリマー支持体上の保護されたアミノ酸誘導体を用いるペプチド鎖のアセンブリを含む。そして固相が結合したペプチドの遊離Ｎ末端アミンは、ひとつのＮ保護アミノ酸ユニット、例えば非天然型アミノ酸に結合することができる。次いでこのユニットは脱保護され、さらにアミノ酸が結合することができる新しいＮ末端アミンを現す。ペプチドが段階的な方法によって通常に合成されている間、全ての可溶性試薬は、濾過によって、ペプチド−固体支持体マトリックスから除去され、各カップリング工程の終了時に洗い流すことができる。ＳＰＰＳの第２段階では、ペプチドを支持体から開裂し、側鎖保護基を除去してペプチド（例えば、１つ以上の非天然型アミノ酸を含む標的ポリペプチド）を作製する。固相ペプチド合成に使用される二つの主要な型がある：塩基に不安定なα−アミノ保護基が使用されるＦｍｏｃ（Ｃａｒｐｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）「９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ．」Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ３７：３４０４−３４０９）および酸に不安定な保護基が使用されるｔ−Ｂｏｃである。それぞれの方法は、様々な樹脂と、ア��ノ酸の側鎖保護およびその結果としての開裂／脱保護工程を含む。
【０２９４】
本発明の方法の手段によって、合成により得られたオリゴヌクレオチドに複数のラベルを導入することも可能である。このために必要な本発明のジエノフィルを含むアミダイトを容易に調製することができる。オリゴヌクレオチドは、３〜１００００ヌクレオチド、好ましくは４〜５０００ヌクレオチド、より好ましくは５〜１０００ヌクレオチドまたは１０〜５００ヌクレオチド、最も好ましくは１０〜２００ヌクレオチドの任意の長さとすることができる。本発明の特定の実施形態では、本発明の方法により修飾されるオリゴヌクレオチドは５０以上、好ましくは１００以上のヌクレオチドを有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってもよいし、核酸アナログ（例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ）やそれらのＤＮＡおよび／またはＲＮＡとのキメラであってもよい。
【０２９５】
本発明のジエノフィルを含む非天然型糖質は、代謝的にグリカンに組み込むことができる。例えば、ノイラミン酸またはＮ−アセチルマンノサミンは、本発明のジエノフィルを含むように修飾することができ、したがって、本発明の方法は、本発明のジエノフィルを含む非天然型糖質が組み込まれたグリカンの複数の標識を可能にする。
【０２９６】
さらなる応用では、本発明のジエノフィルを官能基化して、反応性固相の合成に使用することができる基（例えば、トリメトキシシリル基）を有させることができる。その結果、固相は第１と第２のジエノフィルの両方を有しやすくなる。これに続く応用は、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド又はグリカンのためのチップ技術から触媒表面と固相試薬にまで及ぶ。
【０２９７】
量子ドットは、特別な光学特性を有する、ＣｄＳ又はＣｄＳｅなどの化合物で構成されるナノ粒子を意味すると理解される。レーザーにより励起されて、それらのサイズの関数として非常に強く蛍光を発するので、それらが個々の分子の検出を可能にし、ますます広く特に診断の分野で使用される。しかし、このための前提条件は、ＳＨ基を介して進行し、検出される分子とのその後の相互作用を可能とする官能基をドープすることである。
【０２９８】
また金ナノ粒子は、その特殊な性質のために、生体分子の電子顕微鏡調査用と考えられる。表面上の分子の固定はＳＨ基を介しても達成される。
【０２９９】
それらの表面に分子を結合させるために本発明の方法を使用できる。この目的のために、ＳＨ基含有ジエノフィルを製造することができる。通常、対応するジスルフィドが作製され、次いで、ジチオスレイトールで還元することによってそれからメルカプト化合物が調製できる。そのようなジスルフィドは、金の表面に固定することができる。結果として、ジエノフィルは、量子ドットまたは他の金属の表面に結合させることができる。例えば、抗体、糖または治療薬は、診断または治療目的のために、量子ドットの表面に固定することができる。
【０３００】
本発明のキットは、特に本発明のポリペプチドを生産するために使用できる。この目的のために、キットは、ポリペプチドを生産するための一つ以上の手段を含むことができる。該手段は以下を含むが、これには限定されない：
（ｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、又は、それをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）本明細書中に記載されるｔＲＮＡ、又は、それをコードするポリヌクレオチド
【０３０１】
例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素とｔＲＮＡは共に、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の１つ以上の発現ベクターと対応するｔＲＮＡの形で提供されてもよい。
【０３０２】
また、該キットには、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えばＧＦＰの発現ベクターが含まれ、前記レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にはアンバー終止コドンが含まれる。該レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、シクロオクチニル又はトランス−シクロオクテニル類似基を有するポリヌクレオチドの発現を確認するための陽性コントロールとして機能できる。
【０３０３】
さらに、該キットには、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの翻訳の手段、例えば、大腸菌細胞、ＨｅＬａ細胞、大腸菌抽出物、麦芽抽出物又はウサギの網状赤血球溶解物等の翻訳システム及びその取扱説明書が含まれる。
【０３０４】
第１のジエノフィルと第１のテトラジンの反応が第２のテトラジンの存在下で進行する場合、本発明の反応は逆の順序で実施する必要があることは、当業者によって理解されるであろう。すなわち、本発明は環化付加反応より結合を形成するための方法に関する。該方法は第１のジエノフィルと第１のテトラジンの反応とそれに続く第２のジエノフィルと第２のテトラジンの反応を含み、第１のジエノフィルと第１のテトラジンの反応は、第２のテトラジンの存在下で進行し、
（ｉ）第１のテトラジンは下記式の基を含み：
【０３０５】
【化６６】
0006479022.tif 000066
【０３０６】
（ｉｉ）第１のジエノフィルは下記式のシクロオクチニル基を含み：
【０３０７】
【化６７】
0006479022.tif 000067
【０３０８】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０３０９】
（ｉｉｉ）第２のテトラジンは下記式の基を含み：そして、
【０３１０】
【化６８】
0006479022.tif 000068
【０３１１】
（式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｖ）第２のジエノフィルは下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む。
【０３１２】
【化６９】
0006479022.tif 000069
【０３１３】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０３１４】
この方法の特定の態様および実施形態は、類似の方法がこの逆順の方法に適用できる本明細書中の開示から直接得ることができる。逆の順序の反応を含む本発明の方法は、それらをジエノフィルと反応させる前に第１および第２のテトラジン適切に有することが好ましい用途に特に好適であろうことに留意されたい。これは例えば表面の標識などの非生物学的システムにおける特定の応用のケースであってもよく、テトラジンの特性を考慮に入れるために適切な条件を選択するより多くの自由がある。
【０３１５】
要約すると、特に本発明は以下の実施形態Ｅ１〜１１０Ｅに関する：
【０３１６】
Ｅ１：環化付加反応で結合を形成する方法であり、第１のジエノフィルと第１のテトラジンの反応とそれに続く第２のジエノフィルと第２のテトラジンの反応を含み、第１のジエノフィルと第１のテトラジンの反応は、第２のテトラジンの存在下で進行し、
（ｉ）第１のテトラジンは下記式の基を含み：
【０３１７】
【化７０】
0006479022.tif 000070
【０３１８】
（式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｉ）第１のジエノフィルは下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含み：
【０３１９】
【化７１】
0006479022.tif 000071
【０３２０】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉｉ）第２のテトラジンは下記式の基を含み：そして、
【０３２１】
【化７２】
0006479022.tif 000072
【０３２２】
（ｉｖ）第２のジエノフィルは下記式のシクロオクチニル基を含む。
【０３２３】
【化７３】
0006479022.tif 000073
【０３２４】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０３２５】
Ｅ２：実施形態Ｅ１の方法であって、第２のジエノフィルの存在下で第１のテトラジンが優先的に第１のジエノフィルと反応する方法。
【０３２６】
Ｅ３：実施形態Ｅ１又はＥ２の方法であって、第１のジエノフィルと第１のテトラジンの速度定数ｋが、通常、第２のジエノフィルと第１のテトラジンの反応の速度定数ｋよりも少なくとも１０２倍大きい方法。
【０３２７】
Ｅ４：実施形態Ｅ１〜Ｅ３のいずれか一つの方法であって、第１のジエノフィルと第１のテトラジンの速度定数ｋが約３７℃の温度で３０分間以下の間続く方法。
【０３２８】
Ｅ５：実施形態Ｅ１〜Ｅ４のいずれか一つの方法であって、標的分子又は標的分子組成物が、
（ｉ）下記式の基を含む第１の標識剤：続いて、
【０３２９】
【化７４】
0006479022.tif 000074
【０３３０】
（式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｉ）下記式の基を含む第２の標識剤と接触することを含み、
【０３３１】
【化７５】
0006479022.tif 000075
【０３３２】
標的分子が、
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：および、
【０３３３】
【化７６】
0006479022.tif 000076
【０３３４】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含み、
【０３３５】
【化７７】
0006479022.tif 000077
【０３３６】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
標的分子組成物が、
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１の標的分子：および、
【０３３７】
【化７８】
0006479022.tif 000078
【０３３８】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含む第２の標的分子を含む方法。
【０３３９】
【化７９】
0006479022.tif 000079
【０３４０】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０３４１】
Ｅ６：実施形態Ｅ１〜Ｅ５のいずれか一つの方法であって、第１のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む方法。
【０３４２】
【化８０】
0006479022.tif 000080
【０３４３】
（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルであり、Ａは１，４−フェニレン又はＣ１−Ｃ６−アルキレンである。）
【０３４４】
Ｅ７：実施形態Ｅ１〜Ｅ６のいずれか一つの方法であって、第１のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む方法。
【０３４５】
【化８１】
0006479022.tif 000081
【０３４６】
（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルである。）
【０３４７】
Ｅ８：実施形態Ｅ１〜Ｅ７のいずれか一つの方法であって、Ｒ３がメチルである方法。
【０３４８】
Ｅ９：実施形態Ｅ１〜Ｅ８のいずれか一つの方法であって、第２のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む方法。
【０３４９】
【化８２】
0006479022.tif 000082
【０３５０】
（式中、Ａは１，４−フェニレン又はＣ１−Ｃ６−アルキレンである。）
【０３５１】
Ｅ１０：実施形態Ｅ１〜Ｅ９のいずれか一つの方法であって、第２のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む方法。
【０３５２】
【化８３】
0006479022.tif 000083
【０３５３】
Ｅ１１：実施形態Ｅ１〜Ｅ１０のいずれか一つの方法であって、標識剤が、染料、放射性標識、ＭＲＩ感受性スピン標識、親和性タグ、ペグ化基および生物活性化合物からなる群から選択される標識を含む方法。
【０３５４】
Ｅ１２：実施形態Ｅ１１の方法であって、染料が、蛍光性染料、発光性染料および燐光性染料からなる群から選択される方法。
【０３５５】
Ｅ１３：実施形態Ｅ１１の方法であって、染料が、ダンシル、クマリン、フルオレセイン、アクリジン、ローダミン、シリコーンローダミン、ＢＯＤＩＰＹおよびシアニン色素からなる群から選択される方法。
【０３５６】
Ｅ１４：実施形態Ｅ１１の方法であって、親和性タグが、ビオチン、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、糖質、脂質、ステロール、ＰＥＧリンカー、ベンジルグアニン、ベンジルシトシンおよび補因子からなる群から選択される方法。
【０３５７】
Ｅ１５：実施形態Ｅ１１の方法であって、トリチウム、フッ素−１８、炭素−１１、炭素−１４、リン−３２、リン−３３、硫黄−３３、硫黄−３５、ヨウ素−１２３およびヨウ素−１２５などの放射性の水素、フッ素、炭素、リン、硫黄およびヨウ素からなる群から選択される方法。
【０３５８】
Ｅ１６：実施形態Ｅ１１の方法であって、生物活性化合物が、細胞傷害性化合物；抗ウイルス化合物；生物反応調節剤；微小管作用薬；ホルモン調節物質；ステロイド化合物から選択される方法。
【０３５９】
Ｅ１７：実施形態Ｅ１〜Ｅ１６のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の基である方法。
【０３６０】
【化８４】
0006479022.tif 000084
【０３６１】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０３６２】
Ｅ１８：実施形態Ｅ１７の方法であって、Ｒ１が水素である方法。
【０３６３】
Ｅ１９：実施形態Ｅ１〜Ｅ１８のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基がアミノ酸残基に結合している方法。
【０３６４】
Ｅ２０：実施形態Ｅ１〜Ｅ１９のいずれか一つの方法であって、シクロオクチニル基が下記式の基である方法。
【０３６５】
【化８５】
0006479022.tif 000085
【０３６６】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０３６７】
Ｅ２１：実施形態Ｅ１〜Ｅ２０のいずれか一つの方法であって、Ｒ２が水素である方法。
【０３６８】
Ｅ２２：実施形態Ｅ１〜Ｅ２１のいずれか一つの方法であって、シクロオクチニル基がアミノ酸残基に結合している方法。
【０３６９】
Ｅ２３：実施形態Ｅ１〜Ｅ２２のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の基であり、
【０３７０】
【化８６】
0006479022.tif 000086
【０３７１】
（式中、Ｒ１は水素である。）
第１のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む方法。
【０３７２】
【化８７】
0006479022.tif 000087
【０３７３】
（式中、Ｒ３はメチルである。）
【０３７４】
Ｅ２４：実施形態Ｅ１〜Ｅ２３のいずれか一つの方法であって、シクロオクチニル基が下記式の基であり、
【０３７５】
【化８８】
0006479022.tif 000088
【０３７６】
（式中、Ｒ２は水素である。）
第２のテトラジン又は標識剤が下記式の基を含む方法。
【０３７７】
【化８９】
0006479022.tif 000089
【０３７８】
Ｅ２５：実施形態Ｅ１〜Ｅ２４のいずれか一つの方法であって、第１のテトラジン又は標識剤とｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基とを反応させる方法。
【０３７９】
Ｅ２６：実施形態Ｅ１〜Ｅ２５のいずれか一つの方法であって、第１の標識剤が実質的にシクロオクチニル基と反応しない条件の下、第１のテトラジン又は標識剤と第１のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物とを反応させる方法。
【０３８０】
Ｅ２７：実施形態Ｅ１〜Ｅ２６のいずれか一つの方法であって、第２のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物を第２のテトラジン又は標識剤と反応させる前に、実質的にすべてのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が反応できる条件の下、第１のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物と第１のテトラジン又は標識剤とを反応させる方法。
【０３８１】
Ｅ２８：実施形態Ｅ１〜Ｅ２７のいずれか一つの方法であって、第１のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物と、過剰モル量の第１のテトラジン又はｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基ベースの標識剤とを反応させる方法。
【０３８２】
Ｅ２９：実施形態Ｅ１〜Ｅ２８のいずれか一つの方法であって、第２のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物を第２のテトラジン又は標識剤と反応させる前に、未反応の第１のテトラジン又は標識剤を除去する方法。
【０３８３】
Ｅ３０：実施形態Ｅ１〜Ｅ２９のいずれか一つの方法であって、第２のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物を第２のテトラジン又は標識剤と反応させる前に、未反応のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基をクエンチャーと反応させる方法。
【０３８４】
Ｅ３１：実施形態Ｅ３０の方法であって、クエンチャーが下記式の化合物又はその酸付加塩である方法。
【０３８５】
【化９０】
0006479022.tif 000090
【０３８６】
（式中、
Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ３−アルキルであり：そして、
Ｒ４は、有機基である。）
【０３８７】
Ｅ３２：実施形態Ｅ３１の方法であって、クエンチャーが（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミン又はその酸付加塩である方法。
【０３８８】
Ｅ３３：実施形態Ｅ３０〜Ｅ３２のいずれか一つの方法であって、第２のジエノフィル又は標的分子もしくは標的分子組成物を第２のテトラジン又は標識剤と反応させる前に、組成物から反応していないクエンチャーを除去する方法。
【０３８９】
Ｅ３４：実施形態Ｅ１〜Ｅ３３のいずれか一つの方法であって、組成物が生物学的系である方法。
【０３９０】
Ｅ３５：実施形態Ｅ３４の方法であって、生物学的系が生物又は生物標本である方法。
【０３９１】
Ｅ３６：実施形態Ｅ３４又はＥ３５の方法であって、生物標本が細胞を含む方法。
【０３９２】
Ｅ３７：実施形態Ｅ１〜Ｅ３６のいずれか一つの方法であって、標的分子がポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン及び脂質からなる群から選択される方法。
【０３９３】
Ｅ３８：実施形態Ｅ１〜Ｅ３７のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の軸異性体である方法。
【０３９４】
【化９１】
0006479022.tif 000091
【０３９５】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ１〜Ｅ３７のいずれか一つで定義されるとおりである。）
【０３９６】
Ｅ３９：以下を含むキット。
（ｉ）下記式の基を含む第１のテトラジン：及び、
【０３９７】
【化９２】
0006479022.tif 000092
【０３９８】
（式中、Ｒ３はＣ１−Ｃ３−アルキルである。）
（ｉｉ）下記式の基を含む第２のテトラジン。
【０３９９】
【化９３】
0006479022.tif 000093
【０４００】
Ｅ４０：以下を含むキット。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む第１の変性剤：及び、
【０４０１】
【化９４】
0006479022.tif 000094
【０４０２】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基を含む第２の変性剤。
【０４０３】
【化９５】
0006479022.tif 000095
【０４０４】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０４０５】
Ｅ４１：実施形態Ｅ４０のキットであって、第１の変性剤が非天然型アミノ酸又はそのアナログであるキット。
【０４０６】
Ｅ４２：実施形態Ｅ４０又はＥ４１のキットであって、第２の変性剤が非天然型アミノ酸又はそのアナログであるキット。
【０４０７】
Ｅ４３：実施形態Ｅ４０のキットであって、第１の変性剤が非天然型ヌクレオチド又はそのアナログであるキット。
【０４０８】
Ｅ４４：実施形態Ｅ４０又はＥ４３のキットであって、第２の変性剤が非天然型ヌクレオチド又はそのアナログであるキット。
【０４０９】
Ｅ４５：実施形態Ｅ４０のキットであって、第１の変性剤が非天然型グリカン又はそのアナログであるキット。
【０４１０】
Ｅ４６：実施形態Ｅ４０又はＥ４５のキットであって、第２の変性剤が非天然型グリカン又はそのアナログであるキット。
【０４１１】
Ｅ４７：実施形態Ｅ４０〜Ｅ４６のいずれか一つのキットであって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の軸異性体であるキット。
【０４１２】
【化９６】
0006479022.tif 000096
【０４１３】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ４０〜Ｅ４６のいずれか一つで定義されるとおりである。）
【０４１４】
Ｅ４８：以下を含む細胞。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：及び、
【０４１５】
【化９７】
0006479022.tif 000097
【０４１６】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基：
【０４１７】
【化９８】
0006479022.tif 000098
【０４１８】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０４１９】
Ｅ４９：哺乳動物細胞である実施形態Ｅ４８の細胞。
【０４２０】
Ｅ５０：実施形態Ｅ４８又はＥ４９の細胞であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基がポリペプチドに結合している細胞。
【０４２１】
Ｅ５１：実施形態Ｅ４８〜Ｅ５０のいずれか一つの細胞であって、シクロオクチニル基がポリペプチドに結合している細胞。
【０４２２】
Ｅ５２：実施形態Ｅ４８〜Ｅ５１のいずれか一つの細胞であって、シクロオクチニル基とｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が同じポリペプチドに結合している細胞。
【０４２３】
Ｅ５３：実施形態Ｅ４８〜Ｅ５１のいずれか一つの細胞であって、シクロオクチニル基が第１のポリペプチドに結合し、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が第２のポリペプチドに結合し、第１及び第２のポリペプチドが異なるポリペプチドである細胞。
【０４２４】
Ｅ５４：実施形態Ｅ４８〜Ｅ５３のいずれか一つの細胞であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の軸異性体である細胞。
【０４２５】
【化９９】
0006479022.tif 000099
【０４２６】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ４８〜Ｅ５３のいずれか一つで定義されるとおりである。）
【０４２７】
Ｅ５５：実施形態Ｅ４８〜Ｅ５３のいずれか一つの細胞を作製する方法であって、以下の工程を含む方法。
ａ）
（ｉ）第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）第１のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；並びに、
（ｉｉｉ）標的ポリペプチドをコードし、第１及び第２のセレクターコドンを１つ以上含むポリヌクレオチド；又は第１の標的ポリペプチドをコードし、第１のセレクターコドンを１つ以上含む第１のポリヌクレオチド及び第２の標的ポリペプチドをコードし、第２のセレクターコドンを１つ以上含む第２のポリヌクレオチド；
を含む細胞であって、
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第１の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログ；及び、
【０４２８】
【化１００】
0006479022.tif 000100
【０４２９】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
下記式のシクロオクチニル基を有する第２の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログを用いて第１のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる；又は、
【０４３０】
【化１０１】
0006479022.tif 000101
【０４３１】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第１の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログを用いて第１のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる；及び、
【０４３２】
【化１０２】
0006479022.tif 000102
【０４３３】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のシクロオクチニル基を有する第２の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログを用いて第２のｔＲＮＡ（ｉｉ）をアシル化することができる、細胞を準備する工程：
【０４３４】
【化１０３】
0006479022.tif 000103
【０４３５】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
ｂ）前記細胞と、第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログとを接触させる工程：並びに、
ｃ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、それによって第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログをセレクターコドンによってコードされる位置の標的ポリペプチドに組み込む工程。
【０４３６】
Ｅ５６：実施形態Ｅ５５の方法であって、細胞を第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログに連続して接触させる方法。
【０４３７】
Ｅ５７：実施形態Ｅ５３の方法であって、以下の工程を含む方法。
ａ）第１の非天然型アミノ酸又はそのアナログを細胞に接触させる工程；そして、
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、その結果、第１の非天然型アミノ酸又はそのアナログを、セレクターコドンによってコードされた位置の標的ポリペプチドに組み込む工程；
ｃ）第２の非天然型アミノ酸又はそのアナログを細胞に接触させる工程；そして、
ｄ）ポリヌクレオチド（ｉｉｉ）の翻訳を可能とし、その結果、第２の非天然型アミノ酸又はそのアナログを、セレクターコドンによってコードされた位置の標的ポリペプチドに組み込む工程
【０４３８】
Ｅ５８：実施形態Ｅ５５〜Ｅ５７のいずれか一つの方法であって、第１の非天然型アミノ酸又はそのアナログが、下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である方法。
【０４３９】
【化１０４】
0006479022.tif 000104
【０４４０】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０４４１】
【化１０５】
0006479022.tif 000105
【０４４２】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０４４３】
Ｅ５９：実施形態Ｅ５５〜Ｅ５８のいずれか一つの方法であって、第２の非天然型アミノ酸又はそのアナログが、下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である方法。
【０４４４】
【化１０６】
0006479022.tif 000106
【０４４５】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０４４６】
【化１０７】
0006479022.tif 000107
【０４４７】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０４４８】
Ｅ６０：実施形態Ｅ５８又はＥ５９の方法であって、Ｘ２が−Ｏ−である方法。
【０４４９】
Ｅ６１：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６０のいずれか一つの方法であって、Ｘ３が−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−又は単結合である方法。
【０４５０】
Ｅ６２：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６１のいずれか一つの方法であって、構造要素−Ｘ２−Ｘ３−が主鎖中に１〜６の原子を含む方法。
【０４５１】
Ｅ６３：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６２のいずれか一つの方法であって、Ｘ４が−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−である方法。
【０４５２】
Ｅ６４：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６３のいずれか一つの方法であって、Ｘ４が−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である方法。
【０４５３】
Ｅ６５：実施形態Ｅ５５〜Ｅ６４のいずれか一つの方法であって、ｎが３又は４である方法。
【０４５４】
Ｅ６６：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６５のいずれか一つの方法であって、構造要素−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−が主鎖中に５〜１２の原子、例えば主鎖中に６，７，８，９，１０又は１１の原子を含む方法。
【０４５５】
Ｅ６７：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６６のいずれか一つの方法であって、Ｘ６が水素，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシメチル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシエチ−１−イル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシメチル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニルエチルである方法。
【０４５６】
Ｅ６８：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６６のいずれか一つの方法であって、Ｘ６が水素である方法。
【０４５７】
Ｅ６９：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６８のいずれか一つの方法であって、化合物がＲ４を有する不斉炭素原子に関してＳ配置を有する方法。
【０４５８】
Ｅ７０：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６９のいずれか一つの方法であって、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６が下記式である方法。
【０４５９】
【化１０８】
0006479022.tif 000108
【０４６０】
（式中、Ｒ４及びＸ６は実施形態Ｅ５８〜Ｅ６９のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０４６１】
Ｅ７１：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６９のいずれか一つの方法であって、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６が下記式である方法。
【０４６２】
【化１０９】
0006479022.tif 000109
【０４６３】
（式中、Ｒ４及びＸ６は実施形態Ｅ５８〜Ｅ６９のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０４６４】
Ｅ７２：実施形態Ｅ５８〜Ｅ６９のいずれか一つの方法であって、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６が下記式である方法。
【０４６５】
【化１１０】
0006479022.tif 000110
【０４６６】
（式中、Ｒ４及びＸ６は実施形態Ｅ５８〜Ｅ６９のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０４６７】
Ｅ７３：実施形態Ｅ５５〜Ｅ５７のいずれか一つの方法であって、第１の非天然型アミノ酸が下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である方法。
【０４６８】
【化１１１】
0006479022.tif 000111
【０４６９】
Ｅ７４：実施形態Ｅ７３の方法であって、第１の非天然型アミノ酸がｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基に関して軸異性体である方法。
【０４７０】
Ｅ７５：実施形態Ｅ５５〜Ｅ５７、Ｅ７３及びＥ７４のいずれか一つの方法であって、第２の非天然型アミノ酸が下記式の化合物又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩である方法。
【０４７１】
【化１１２】
0006479022.tif 000112
【０４７２】
Ｅ７６：実施形態Ｅ５５〜Ｅ７５のいずれか一つの方法であって、前記翻訳システムが、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する細胞である方法。
【０４７３】
Ｅ７７：実施形態Ｅ７６の方法であって、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がピロリシルｔＲＮＡ合成酵素である方法。
【０４７４】
Ｅ７８：実施形態Ｅ７７の方法であって、前記ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素が配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含む方法。
【０４７５】
Ｅ７９：実施形態Ｅ５５〜Ｅ７２及びＥ７５〜Ｅ７８のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の基の軸異性体である方法。
【０４７６】
【化１１３】
0006479022.tif 000113
【０４７７】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ５５〜Ｅ７２及びＥ７５〜Ｅ７８のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０４７８】
Ｅ８０：以下を含むポリペプチド。
（ｉ）下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基：及び、
【０４７９】
【化１１４】
0006479022.tif 000114
【０４８０】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
（ｉｉ）下記式のシクロオクチニル基：
【０４８１】
【化１１５】
0006479022.tif 000115
【０４８２】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５アルケニル−Ｃ１−Ｃ４アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０４８３】
Ｅ８１：実施形態Ｅ８０のポリペプチドであって、下記式の残基：及び、
【０４８４】
【化１１６】
0006479022.tif 000116
【０４８５】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０４８６】
【化１１７】
0006479022.tif 000117
【０４８７】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
下記式の残基を含むポリペプチド。
【０４８８】
【化１１８】
0006479022.tif 000118
【０４８９】
［式中、
Ｘ１は下記式で表され：
【０４９０】
【化１１９】
0006479022.tif 000119
【０４９１】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−（ＣＨ２）ｎ−であり；
Ｚ１は、−Ｏ−又は−ＮＨ−であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０４９２】
Ｅ８２：実施形態Ｅ８１のポリペプチドであって、Ｘ２が−Ｏ−であるポリペプチド。
【０４９３】
Ｅ８３：実施形態Ｅ８１又はＥ８２のポリペプチドであって、Ｘ３が−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−又は単結合であるポリペプチド。
【０４９４】
Ｅ８４：実施形態Ｅ８１〜Ｅ８３のいずれか一つのポリペプチドであって、構造要素−Ｘ２−Ｘ３−が主鎖中に１〜６の原子を含むポリペプチド。
【０４９５】
Ｅ８５：実施形態Ｅ８１〜Ｅ８４のいずれか一つのポリペプチドであって、Ｘ４が−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−であるポリペプチド。
【０４９６】
Ｅ８６：実施形態Ｅ８１〜Ｅ８４のいずれか一つのポリペプチドであって、Ｘ４が−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であるポリペプチド。
【０４９７】
Ｅ８７：実施形態Ｅ８１〜Ｅ８６のいずれか一つのポリペプチドであって、ｎが３又は４であるポリペプチド。
【０４９８】
Ｅ８８：実施形態Ｅ８１〜Ｅ８７のいずれか一つのポリペプチドであって、構造要素−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−が主鎖中に５〜１２の原子、例えば主鎖中に６，７，８，９，１０又は１１の原子を含むポリペプチド。
【０４９９】
Ｅ８９：実施形態Ｅ８１〜Ｅ８８のいずれか一つのポリペプチドであって、化合物がＺ１を有する不斉炭素原子に関してＳ配置を有するポリペプチド。
【０５００】
Ｅ９０：実施形態Ｅ８０〜Ｅ８９のいずれか一つのポリペプチドであって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の軸異性体であるポリペプチド。
【０５０１】
【化１２０】
0006479022.tif 000120
【０５０２】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ８０〜Ｅ８９のいずれか一つで定義されるとおりである。）
【０５０３】
Ｅ９１：実施形態Ｅ８０〜Ｅ８９のいずれか一つのポリペプチドを製造するための方法であって、下記工程を含む方法。
ａ）
（ｉ）第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログ；
（ｉｉｉ）第１のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第１のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び任意に第２のセレクターコドンに対するアンチコドンを有する第２のｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；並びに、
（ｉｖ）標的ポリペプチドをコードし、第１及び第２のセレクターコドンを１つ以上含むポリヌクレオチド：
を含む翻訳システムであって、
前記第１のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第１の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログ（ｉｉ）を用いて、第１のｔＲＮＡ（ｉｉｉ）をアシル化することができ：そして、
【０５０４】
【化１２１】
0006479022.tif 000121
【０５０５】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
前記第２のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を有する第２の非天然型アミノ酸もしくはそのアナログ（ｉｉ）を用いて、第２のｔＲＮＡ（ｉｉｉ）をアシル化することができる翻訳システムを準備する工程。
【０５０６】
【化１２２】
0006479022.tif 000122
【０５０７】
（式中、
Ｒ２は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｃＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｄＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒｃ、Ｒｄは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能とし、それによって第１及び第２の非天然型アミノ酸又はそれらのアナログをセレクターコドンによってコードされる位置の標的ポリペプチドに組み込む工程。
【０５０８】
Ｅ９２：実施形態Ｅ９１の方法であって、前記翻訳システムが、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する細胞である方法。
【０５０９】
Ｅ９３：実施形態Ｅ９２の方法であって、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がピロリシルｔＲＮＡ合成酵素である方法。
【０５１０】
Ｅ９４：実施形態Ｅ９３の方法であって、前記ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素が配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含む方法。
【０５１１】
Ｅ９５：実施形態Ｅ９１〜Ｅ９４のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の基の軸異性体である方法。
【０５１２】
【化１２３】
0006479022.tif 000123
【０５１３】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ９１〜Ｅ９４のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０５１４】
Ｅ９６：下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含む非天然型アミノ酸又は該非天然型アミノ酸のアナログ。
【０５１５】
【化１２４】
0006479022.tif 000124
【０５１６】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
【０５１７】
Ｅ９７：実施形態Ｅ９６の非天然型アミノ酸であって、下記式の非天然型アミノ酸又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩。
【０５１８】
【化１２５】
0006479022.tif 000125
【０５１９】
［式中、
Ｘ１は下記式のｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基であり：
【０５２０】
【化１２６】
0006479022.tif 000126
【０５２１】
（式中、
Ｒ１は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲａＯ）２Ｐ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、（ＲｂＯ）２Ｐ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４−アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシ、−Ｏ−ＣＦ３、Ｃ２−Ｃ５−アルケノキシ、Ｃ２−Ｃ５−アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノカルボニルオキシもしくはＣ１−Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ１−Ｃ４−アルキルアミノ、Ｄｉ−（Ｃ１−Ｃ４−アルキル）アミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニルアミノ、Ｃ２−Ｃ５−アルケニル−Ｃ１−Ｃ４−アルキル−アミノ又はＤｉ−（Ｃ２−Ｃ５−アルケニル）アミノであり；そして、
Ｒａ、Ｒｂは、独立して、水素又はＣ２−Ｃ５−アルカノイルオキシメチルである。）
Ｘ２は、−ＣＨ２−，−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−，−ＯＣ（Ｏ）−，−Ｃ（Ｏ）Ｏ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であり；
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ６−アルキレン，−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ−，−（ＣＨ２−Ｏ）ｐ−又は単結合であり；
Ｘ４は、−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＣＨ（ＮＨ２）−ＮＨ−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−Ｃ（Ｏ）−又は−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｘ５は、−（ＣＨ２）ｎ−又はフェニレン−ＣＨ２−であり；
Ｘ６は、水素，Ｃ１−Ｃ６−アルキル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシ−Ｃ１−Ｃ２−アルキル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニル−Ｃ１−Ｃ２−アルキルであり；
Ｒ４は、−ＯＨ又は−ＮＨ２であり；
ｎは、１〜４の整数であり；
ｍは、１〜６の整数であり；そして、
ｐは、１〜６の整数である。］
【０５２２】
Ｅ９８：実施形態Ｅ９６又はＥ９７の非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｒ２が水素である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２３】
Ｅ９９：実施形態Ｅ９６〜Ｅ９８のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ２が−Ｏ−である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２４】
Ｅ１００：実施形態Ｅ９６〜Ｅ９９のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ３が−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−又は単結合である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２５】
Ｅ１０１：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１００のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、構成要素−Ｘ２−Ｘ３−が主鎖に１〜６の原子を含む非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２６】
Ｅ１０２：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０１のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ４が−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−，−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−，−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−，−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−又は−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ−である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２７】
Ｅ１０３：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０２のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ４が−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２８】
Ｅ１０４：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０３のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ５が−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０３のいずれか一つに定義されるとおりである。）である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５２９】
Ｅ１０５：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０４のいずれか一つの化合物又は塩であって、ｎが３又は４である化合物又は塩。
【０５３０】
Ｅ１０６：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０５のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、構造要素−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−（ＣＨ２）ｎ−が主鎖中に５〜１２の原子、例えば主鎖中に６，７，８，９，１０又は１１の原子を含む方法。
【０５３１】
Ｅ１０７：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０６のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ６が水素，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシメチル，Ｃ１−Ｃ６−アルコキシエチ−１−イル，Ｃ２−Ｃ７−アルカノイルオキシメチル又はＣ２−Ｃ７−アルカノイルスルファニルエチルである非天然型アミノ酸又は塩。
【０５３２】
Ｅ１０８：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０６のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｘ６が水素である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５３３】
Ｅ１０９：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０８のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、Ｒ４を有する不斉炭素原子に関してＳ配置を有する非天然型アミノ酸又は塩。
【０５３４】
Ｅ１１０：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０９のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６が下記式である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５３５】
【化１２７】
0006479022.tif 000127
【０５３６】
（式中、Ｒ４及びＸ６は実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０９のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０５３７】
Ｅ１１１：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０９のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６が下記式である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５３８】
【化１２８】
0006479022.tif 000128
【０５３９】
（式中、Ｒ４及びＸ６は実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０９のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０５４０】
Ｅ１１２：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０９のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩であって、−Ｘ５−ＣＨＲ４−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｘ６が下記式である非天然型アミノ酸又は塩。
【０５４１】
【化１２９】
0006479022.tif 000129
【０５４２】
（式中、Ｒ４及びＸ６は実施形態Ｅ９６〜Ｅ１０９のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０５４３】
Ｅ１１３：実施形態Ｅ９６〜Ｅ１１２のいずれか一つの方法であって、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基が下記式の基の軸異性体である方法。
【０５４４】
【化１３０】
0006479022.tif 000130
【０５４５】
（式中、Ｒ１は実施形態Ｅ９６〜Ｅ１１２のいずれか一つに定義されるとおりである。）
【０５４６】
Ｅ１１４：実施例Ｅ９６の非天然型アミノ酸又は塩であって、下記式の化合物である非天然型アミノ酸又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩。
【０５４７】
【化１３１】
0006479022.tif 000131
【０５４８】
Ｅ１１５：実施例Ｅ１１４の非天然型アミノ酸又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩であって、そのｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基に関して軸異性体である非天然型アミノ酸又はその酸付加塩もしくは塩基付加塩。
【０５４９】
Ｅ１１６：ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル基を含むポリペプチドを製造するための方法であって、下記工程を含む方法。
ａ）
（ｉ）アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素又はそれをコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）実施形態Ｅ９６〜Ｅ１１５のいずれか一つの非天然型アミノ酸又は塩；
（ｉｉｉ）セレクターコドンに対するアンチコドンを有するｔＲＮＡ又は前記ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド；及び、
（ｉｖ）標的ポリペプチドをコードし、セレクターコドンを１つ以上含むポリヌクレオチド：
を含み、
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ｉ）が、化合物又は塩（ｉｉ）を用いてｔＲＮＡ（ｉｉｉ）をアシル化することができる、翻訳システムを準備する工程；
ｂ）ポリヌクレオチド（ｉｖ）の翻訳を可能とし、それによって化合物（ｉｉ）をセレクターコドンによってコードされる位置の標的ポリペプチドに組み込む工程。
【０５５０】
Ｅ１１７：実施形態Ｅ１１６の方法であって、前記翻訳システムが、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を発現する細胞である方法。
【０５５１】
Ｅ１１８：実施形態Ｅ１１７の方法であって、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素がピロリシルｔＲＮＡ合成酵素である方法。
【０５５２】
Ｅ１１９：実施形態Ｅ１１８の方法であって、前記ピロリシルｔＲＮＡ合成酵素が配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列を含む方法。
【実施例】
【０５５３】
［製造実施例］
一般的な材料と方法
【０５５４】
特に記載のない限り、化学合成用の材料は、最高純度の市販製品（Ａｃｒｏｓ，Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｆｏｘ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を入手し、さらに精製することなく用いた。無水溶媒（Ｄｒｙ  ｓｏｌｖｅｎｔ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ及びＡｃｒｏｓから購入し、モレキュラーシーブ上で保管し、供給して使用した。抽出及びクロマトグラフィーに用いられる溶媒は、Ａｃｒｏｓ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ及びＢＤＨ  Ｐｒｏｌａｂｏ（ＶＷＲ）から購入した。蛍光色素分子のテトラジンとアジドは、ライフ・テクノロジーズ（ダルムシュタット、ドイツ）、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ（ジーゲン、ドイツ）またはイエナバイオサイエンス（イエナ、ドイツ）から購入した。重水素化溶媒は、Ｄｅｕｔｅｒｏ  ＧｍｂＨ（カステラウン、ドイツ）から入手した。フラッシュクロマトグラフィーは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌシリカゲル６０（０．０４〜０．０６３ｍｍ，２３０〜４００メッシュ）と下記の溶媒系を用いて実施された。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、アルミニウムで支持され、事前にシリカゲルゲルでコートされたプレート（Ｍｅｒｃｋ  ＴＬＣ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４）上で、溶離液としてＣ６Ｈ１２／ＥｔＯＡｃ、ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（／ＡｃＯＨ）又はアセトン／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏの混合液（容量％）を用いて実施した。スポットは、λ＝２５４ｎｍもしくはλ＝３６６ｎｍのＵＶハンドランプ、又は、ａ）アニスアルデヒド染色液（８５ｍｌ  ＥｔＯＨ，１０ｍｌ  ＡｃＯＨ，５ｍｌ濃Ｈ２ＳＯ４，０．５ｍｌアニスアルデヒド）、ｂ）ＫＭｎＯ４染色液（３．０ｇＫＭｎＯ４，２０ｇＫ２ＣＯ３／３００ｍｌ  ５％ＮａＯＨ水溶液）もしくはｃ）ニンヒドリン染色液（２５０ｍｌ  ＥｔＯＨ，１．５ｍｌ  ＡｃＯＨ，５．０ｇニンヒドリン）のいずれかを用いた染色とその後の熱処理によって検出した。１００％溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡを含む水）から開始する溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリル）の濃度増加の勾配を使用した逆相（ＲＰ）Ｃ１８  ＨＰＬＣをウォーターズのシステム（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７  Ｄｕａｌ  λ  Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ，  Ｗａｔｅｒｓ  １５２５  Ｂｉｎａｒｙ  ＨＰＬＣ  ｐｕｍｐ）にて実施した。ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＵｌｔｒａＳｈｉｅｌｄＴＭ  Ａｄｖａｎｃｅ  ４００（４００ＭＨｚ，１Ｈ；１００ＭＨｚ，１３Ｃ）スペクトロメータを用いて２５℃で記録した。化学シフトδは、内部標準（例えば、ＣＤＣｌ３：δ＝７．２６（１Ｈ）、７７．１６（１３Ｃ）ｐｐｍ）として残留プロトン化溶媒のシグナルを基準にする。１Ｈおよび１３Ｃのシグナルの割り当ては、ＡＰＴと相関二次元分光法（Ｈ，Ｈ−ＣＯＳＹ）のデータに基づく。シグナルの多重度３Ｊ（Ｈ，Ｈ）は、ｓ（一重項）、ｂｒ（ブロード一重項）、ｄ（二重項）、ｄｄ（ダブルダブレット）、ｄｑ（ダブルクアドラプレット）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｄｔ（ダブルトリプレット）またはｍ（多重項）と略す。高分解能（ＨＲ）マススペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡｐｅｘＱｅ  ｈｙｂｒｉｄ  ９．４Ｔ  ＦＴ−ＩＣＲでエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法（ＭＳ法）を用いて又は高速原子衝撃（ＦＡＢ）と電子イオン化（ＥＩ，電子衝突）を用いて、それぞれＪＥＯＬ  ＪＭＳ−７００磁場型質量分析計で、ハイデルベルク大学で記録した。生産物はＮＭＲ（１Ｈ，１３Ｃ）及び／又はＭＳ／ＨＲ  ＭＳによって特性化した。
【０５５５】
実施例１：Ｎ−ε−（（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−メチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン
【０５５６】
【化１３２】
0006479022.tif 000132
【０５５７】
非天然型リジンベースのアミノ酸１をシリウスファインケミカルズ  ＳｉＣｈｅｍ（ブレーメン、ドイツ）から購入した。化合物１は、エンドおよびエキソ異性体の混合物として使用した。化合物１はＢＣＮとも呼ばれる。
【０５５８】
実施例２：Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン
【０５５９】
【化１３３】
0006479022.tif 000133
【０５６０】
化合物２はＷＯ２０１２／０５１８８５及びＴ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，４１６６−４１７０に記載されるように合成した。化合物２はＴＣＯとも呼ばれる。
【０５６１】
実施例３：Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン
スキームＳ１は、ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２’−エン−官能基化リジン誘導体３（ＴＣＯ＊とも呼ばれる）の合成を示す。
【０５６２】
【化１３４】
0006479022.tif 000134
【０５６３】
試薬と条件：ａ）ＫＯｔＢｕ，ＣＨＢｒ３，ペンタン、０°Ｃ〜ｒｔ，ｏ／ｎ；ｂ）ＡｇＣｌＯ４、アセトン／Ｈ２Ｏ，ｒｔ，１ｈ；ｃ）ペンタン中のｔＢｕＬｉ、Ｅｔ２Ｏ、−７８℃〜−２０℃、４ｈ；ｄ）ｈ・ν（λ＝２５４ｎｍ），安息香酸メチル，Ｃ６Ｈ１２／ＥｔＯＡｃ，ｒｔ，８ｈ；ｅ）クロロギ酸  ４−ニトロフェニル、ピリジン、ＣＨ２Ｃｌ２，ｒｔ、２ｈ；ｆ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ＊ＨＣｌ，ＤＩＥＡ；ＤＭＳＯ，ｒｔ，ｏ／ｎ；ｇ）ピペリジン、ＣＨ２Ｃｌ２、ｒｔ、３０分
【０５６４】
【化１３５】
0006479022.tif 000135
【０５６５】
文献公知の８，８−ジブロモビシクロ［５．１．０］オクタン１１は、以前に報告されたように、市販のｃｉｓ−シクロヘプテンから出発して合成し（Ａ．Ｂ．Ｎｅｅｆ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ２００９，４８，１４９８−１５００）、クロマトグラフィー精製なしで使用した。
【０５６６】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝２．３２−２．２１（ｍ，２Ｈ），１．９４−１．７８（ｍ，３Ｈ），１．７７−１．６６（ｍ，２Ｈ），１．４５−１．３０（ｍ，２Ｈ），１．２７−１．１０（ｍ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【０５６７】
【化１３６】
0006479022.tif 000136
【０５６８】
文献公知の２−ブロモシクロオクタ−２−エン−１−オール１２を以前に報告されたプロトコルに従って合成した（ａ）Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ，Ａ．Ｓｈａｗ，Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋ  Ｔ  １  １９７５，２４２２−２４３４；ｂ）Ｈ．Ｊ．Ｊ．Ｌｏｏｚｅｎ，Ｊ．Ｗ．Ｄｅｈａａｎ，Ｈ．Ｍ．Ｂｕｃｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７７，４２，４１８−４２２）。簡潔には、アセトン（０．５Ｍ）及び水（１５．０当量）中の８，８−ジブロモビシクロ［５．１．０］オクタン１１（１．０当量）撹拌溶液に、ＡｇＣｌＯ４（２．０当量）を室温で３０分間にわたって少量ずつ添加し、さらに６０分間撹拌した。白色沈殿物の形成が終了するまで、１Ｍ  ＨＣｌを添加した。混合物を濾過し、残渣をＥｔＯＡｃで洗浄した。濾液を分離し、水層をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。合わせた有機画分を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、シリカゲルで濾過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｃ６Ｈ１２中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、淡黄色の液体として１２を得た。
【０５６９】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の２０％  ＥｔＯＡｃ）＝０．４
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝６．１２（ｄｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１１．７，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１０．４，５．３Ｈｚ，１Ｈ），２．６８（ｄｑ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１１．９，５．５Ｈｚ，１Ｈ），２．３６−２．２９（ｍ，１Ｈ），２．２３−２．１０（ｍ，２Ｈ），２．０８−２．００（ｍ，２Ｈ），１．９４−１．６７（ｍ，４Ｈ），１．５６−１．４４（ｍ，１Ｈ），１．３１−１．２２（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【０５７０】
【化１３７】
0006479022.tif 000137
【０５７１】
２−ブロモシクロオクタ−２−エン−１−オール１２（１．０当量、１０．２４ｇ、４９．７ｍｍｏｌ）の乾燥Ｅｔ２Ｏ（０．７Ｍ、７１ｍｌ）溶液に、ｔＢｕＬｉ（３．２当量、１５９ｍｍｏｌ、１．６ＭのｔＢｕＬｉペンタン溶液９９．４ｍｌ）を−７８°Ｃで、１時間かけてアルゴン下で滴下した。添加の完了後、混合物をさらに１０分間−７８℃で撹拌し、次いで３時間かけて−２０℃に加温した。溶液をｓａｔ．ａｑ．ＮａＨＣＯ３溶液の添加によりクエンチし、室温で１時間撹拌した。層を分離し、有機層をＥｔＯＡｃで抽出した（３回）。次に、合わせた有機画分をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。粗生成物をＦＣ（Ｃ６Ｈ１２中の２０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、無色液体として化合物１３（４．３７ｇ、３４．６ｍｍｏｌ、７０％収率）を得た。
【０５７２】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の２０％ＥｔＯＡｃ）＝０．４．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝５．７１−５．５０（ｍ，２Ｈ），４．７０−４．６０（ｍ，０．３Ｈ），４．３２−４．２２（ｍ，０．７Ｈ），２．４５−２．３５（ｍ，０．７Ｈ），２．２０−２．０４（ｍ，１．３Ｈ），２．０２−１．３４（ｍ，６Ｈ），１．１０−１．０３（ｍ，０．６Ｈ），０．９４−０．８４（ｍ，０．７Ｈ），０．８１−０．７０（ｍ，０．７Ｈ）ｐｐｍ（２つの異性体）．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１３５．６，１３４．９，１３２．０，１２８．７，７６．９，６９．５，４４．３，３８．９，３５．４，２９．１，２９．１，２７．７，２６．３，２５．９，２３．７ｐｐｍ（２つの異性体）．
ＨＲ  ＭＳ（ＥＩ  ｐｏｓ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ８Ｈ１４Ｏ［Ｍ＋ｅ−］＋：１２６．１０４５，ｍｅａｓ．：１２６．１０４０．
【０５７３】
【化１３８】
0006479022.tif 000138
【０５７４】
先に記載した手順に従って、そのｃｉｓ−前駆体１３から出発して化合物１４を調製した（ａ）Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ，Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ，Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ２００９，４８，７０１３−７０１６；ｂ）Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ，Ｇ．Ｐ．Ｙａｐ，Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００８，１３０，３７６０−３７６１）。トランス異性体の活性除去と光異性化は、室温で８時間、Ｒａｙｏｎｅｔ  ＲＰＲ−１００  ＵＶ反応器（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ブランフォード、コネチカット、米国）中で実施した（反応器内部の温度は約３０℃であった）。簡潔には、１３（１．０当量、１．８９ｇ、１４．９ｍｍｏｌ）、安息香酸メチル（１．５当量、３．５１ｇ、２．８０ｍｌ、２２．４ｍｍｏｌ）及び溶媒（Ｅｔ２Ｏ中２０％Ｃ６Ｈ１２、１０００ｍｌ）で、ＵＶ反応器を充填した。処理の後、黄色の油状物（０．９４ｇ、７．４２ｍｍｏｌ、５０％）が得られ、それをさらに精製することなく次の工程に使用した。ＮＭＲ分析により、１．０：１．１の比率で２つの異性体の存在が証明された。
【０５７５】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の２０％  ＥｔＯＡｃ）＝０．４．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝６．００−５．９１（ｍ，０．５Ｈ），５．７１−５．６２（ｍ，０．５Ｈ），５．６１−５．５１（ｍ，１Ｈ），４．６２（ｂｒ，０．５Ｈ），４．２７（ｄｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝９．５，５．５Ｈｚ，０．５Ｈ），２．５２−２．４５（ｍ，０．５Ｈ），２．４３−２．３６（ｍ，０．５Ｈ），２．２０−２．１２（ｍ，０．５Ｈ），２．０８−１．９２（ｍ，２Ｈ），１．９０−１．７９（ｍ，１Ｈ），１．７７-１．６６（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．３７（ｍ，２．５Ｈ），１．１６−１．０６（ｍ，０．５Ｈ），０．９４−０．８４（ｍ，０．５），０．８２−０．７１（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１３５．５，１３５．１，１３２．０，１３０．５，７６．８，７１．２，４４．３，４３．２，３６．１，３５．８，３５．８，３５．４，２９．２，２９．０，２７．６，２３．１ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＥＩ  ｐｏｓ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ８Ｈ１４Ｏ［Ｍ＋ｅ−］＋：１２６．１０４５，ｍｅａｓ．：１２６．１０４４．
【０５７６】
【化１３９】
0006479022.tif 000139
【０５７７】
化合物１４（１．０当量、０．９４ｇ、７．４２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）撹拌溶液に、ピリジン（２．５当量、１．５０ｍｌ、１８．６ｍｍｏｌ）をＡｒ下で加えた。クロロギ酸  ４−ニトロフェニル（１．１当量、１．６５ｇ、８．１７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）溶液を室温で添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。ＮＨ４Ｃｌのｓａｔ．水溶液（５０ｍｌ）を用いて反応を停止した。相分離後、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２回）で抽出した。合わせた有機層をＮＨ４Ｃｌのｓａｔ．水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。粗生成物をＦＣ（Ｃ６Ｈ１２中の５％ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、淡黄色のワックス（Ｔｍ＝７４．６〜７６．８℃）として化合物１５（１．６３ｇ、５．５９ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
【０５７８】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の１０％  ＥｔＯＡｃ）＝０．４．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝８．３１−８．２５（ｍ，２Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，２Ｈ），６．０３−５．９４（ｍ，０．５Ｈ），５．９０−５．８０（ｍ，０．５Ｈ），５．６６（ｄｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１６．２，９．５Ｈｚ，０．５Ｈ），５．５６（ｄｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１６．５，２．２Ｈｚ，０．５Ｈ），５．４４（ｂｒ，０．５Ｈ），５．１７（ｄｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１０．１，５．６Ｈｚ，０．５Ｈ），２．５６−２．４４（ｍ，１Ｈ），２．３８−２．３０（ｍ，０．５Ｈ），２．２６−２．１８（ｍ，０．５Ｈ），２．１２−１．８５（ｍ，３Ｈ），１．８２−１．６５（ｍ，１．５Ｈ），１．６１−１．３９（ｍ，１．５Ｈ），１．２３−１．１２（ｍ，０．５Ｈ），０．９８−０．７８（ｍ，１．５Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１５５．６，１５１．９，１５１．７，１４５．３，１３４．８，１３３．２，１３０．１，１２９．３，１２５．３，１２５．３，１２１．８，８３．３，７８．８，４０．５，４０．４，３６．０，３５．９，３５．６，３５．５，２８．９，２８．８，２７．３，２４．０ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＦＡＢ  ｐｏｓ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１５Ｈ１７ＮＯ５［Ｍ＋ｅ−］＋：２９１．１１０７，ｍｅａｓ．：２９１．１１１６．
【０５７９】
【化１４０】
0006479022.tif 000140
【０５８０】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ＊ＨＣｌ（２．０ｅｑ．，４．４５ｇ，１１．０ｍｍｏｌ）をＡｒ下でＤＩＥＡ（３．０ｅｑ．，２．８７ｍｌ，１６．５ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＳＯ（０．２Ｍ，２７ｍｌ）に溶解した。次に、無水ＤＭＳＯ（０．２Ｍ，２７ｍｌ）中の化合物１５（１．０ｅｑ．，１．６０ｇ，５．４９ｍｍｏｌ）の透明な溶液をＡｒ下で２時間かけて室温で滴下した。反応混合物をオーバーナイトで、室温で攪拌した。Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）と酢酸エチル（１５０ｍｌ）を加え、水層のｐＨを濃塩酸で１〜３に調節した。相を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３回）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２回）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。全ての揮発性成分を減圧下で蒸発させ、粗生成物をＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ）で精製し、白色の泡状物として化合物１６（１．４５ｇ、２．７９ｍｍｏｌ、５１％）を得た。
【０５８１】
Ｒｆ（８％ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２中の２％ＡｃＯＨ）＝０．５．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ＝７．７９（ｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６７（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３９（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），５．８８−５．６４（ｍ，１Ｈ），５．５８−５．４３（ｍ，１Ｈ），５．２２（ｂｒ，０．５Ｈ），（４．９８（ｄｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝９．９，５．２Ｈｚ，０．５Ｈ），４．３７−４．３２（ｍ，２Ｈ），４．２２（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝６．７Ｈｚ，１Ｈ），４．１３−４．０４（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｑ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４５−２．３４（ｍ，１Ｈ），２．１６−２．０８（ｍ，０．５Ｈ），２．０５−１．３４（ｍ，１０．５Ｈ），１．１９−１．０７（ｍ，０．５Ｈ），０．９２−０．７５（ｍ，１．５Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ＝１５７．２，１４４．０，１４３．８，１４３．８，１４１．２，１３２．４，１３１．８，１３１．５，１３１．２，１２７．４，１２６．８，１２４．９，１１９．５，７８．５，７３．７，６６．５，５４．７，４７．１，４０．８，４０．３，４０．１，４０．０，３５．６，３５．４，３５．２，３４．９，３１．３，２９．１，２８．７，２８．６，２７．０，２３．８，２７．８，２７．７ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＥＳＩ  ｎｅｇ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３０Ｈ３５Ｎ２Ｏ６［Ｍ−Ｈ］−：５１９．２５００６，ｍｅａｓ．：５１９．２５１２７．
【０５８２】
【化１４１】
0006479022.tif 000141
【０５８３】
化合物１６（１．０当量、１．４３ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２中の２０％ピペリジンに溶解し（４０ｍｌ  ｖ／ｖ）、室温で３０分間撹拌した。Ｈ２Ｏ（５０ｍｌ）を添加した後、すべての揮発性成分を減圧高真空下で除去した。シリカゲル上で粗生成物をＦＣで精製し（アセトン：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  ８５：１０：５  ｖ／ｖ／ｖを用いてすべての不純物を洗い流し、次に６５：２５：１０  ｖ／ｖ／ｖで生成物を溶出した。）、白色粉末として化合物３（０．８１ｇ、２．７０ｍｍｏｌ、９８％）を得た。精製した２を加熱分解（１８０℃で開始）した。本明細書中では化合物３をＴＣＯ＊ともいう。化合物３は、ＴＣＯ＊の軸異性体の混合物（本明細書では化合物３ａまたはＴＣＯ＊ａという）であり、ＴＣＯ＊のエクアトリアル異性体である（本明細書では化合物３ｂまたはＴＣＯ＊ｅという）。
【０５８４】
Ｒｆ（アセトン：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  ６５：２５：１０  ｖ／ｖ／ｖ）＝０．６．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝５．７７-５．６４（ｍ，１Ｈ），５．５８−５．４４（ｍ，１Ｈ），５．１５（ｂｒ，０．５Ｈ），４．９５（ｄｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝９．５，５．５Ｈｚ，０．５Ｈ），３．５１（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｑ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４１−２．２９（ｍ，１Ｈ），２．１３−２．０４（ｍ，０．５Ｈ），１．９７−１．８４（ｍ，２．５Ｈ），１．７９−１．２４（ｍ，８Ｈ），１．０５−０．９４（ｍ，０．５Ｈ），０．８８−０．７１（ｍ，１．５Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ＝１７１．６，１５５．９，１３２．９，１３２．７，１３１．１，７７．９，７３．０，５３．３，４３．９，４１．４，４０．５，３６．１，３５．７，３５．３，３０．６，２９．５，２８．９，２７．３，２４．２，２２．６，２２．４，２２．２ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＥＳＩ  ｎｅｇ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１５Ｈ２５Ｎ２Ｏ４［Ｍ−Ｈ］−：２９７．１８１９８，ｍｅａｓ．：２９７．１８２８５．
【０５８５】
実施例３ａ：Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジンの軸異性体及びエクアトリアル異性体の準備
【０５８６】
ＵＶ照射（参照：上記スキームＳ１のステップｄ）後、化合物１４（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２−エン−１−オール）の軸異性体及びエクアトリアル異性体をシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン＝１：４；Ｒｆ  ＴＣＯ＊ａ＝０．３８，Ｒｆ  ＴＣＯ＊ｅ＝０．２７）を用いて分離し、その後別々にリジンに結合させて（上記実施例３の化合物１４について記載したように）、化合物３の軸異性体３ａとエクアトリアル異性体３ｂを準備した。
【０５８７】
実施例４：Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−３−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン
スキームＳ２は、ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２’−エン−官能基化リジン誘導体４（ＴＣＯ＃とも呼ばれる）の合成を示す。
【０５８８】
【化１４２】
0006479022.tif 000142
【０５８９】
試薬と条件：ａ）３−クロロ過安息香酸，ＣＨＣｌ３，ｒｔ，ｏ／ｎ；ｂ）ＬｉＡｌＨ４，ＴＨＦ，０°Ｃ〜ｒｔ，ｏ／ｎ；ｃ）ｈ・ν（λ＝２５４ｎｍ），安息香酸メチル，Ｃ６Ｈ１２／ＥｔＯＡｃ，ｒｔ，１０ｈ；ｄ）クロロギ酸  ４−ニトロフェニル，ピリジン，ＣＨ２Ｃｌ２，ｒｔ  ２ｈ；ｅ）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ＊ＨＣｌ，ＤＩＥＡ；ＤＭＳＯ，ｒｔ，ｏ／ｎ；ｆ）ピペリジン，ＣＨ２Ｃｌ２，ｒｔ，３０分．
【０５９０】
【化１４３】
0006479022.tif 000143
【０５９１】
文献公知の化合物１７を先に記載のプロトコールに従って、市販の１，３−シクロオクタジエンから出発して合成した（Ｋ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ａ．Ｌａｃｋｅｙ，Ｊ．Ｃｕｉ，Ｇ．Ｎ．Ｔｅｗ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１１，１３３，４１４０−４１４８）。簡単に述べると、ＣＨＣｌ３（１１００ｍｌ）中の３−クロロ過安息香酸（７０〜７７％、０．８当量、８６．７５ｇ、３２７ｍｍｏｌ）の溶液を、１，３−シクロオクタジエン（１．０当量、５０．６３ｇ、４６８ｍｍｏｌ）に、撹拌しながら２時間かけて滴下した。反応混合物を１５時間室温で攪拌した。濾過により３−クロロ安息香酸を除去した後、濾液を亜硫酸水素ナトリウム溶液（Ｈ２Ｏ中１０％）、炭酸水素ナトリウム溶液（Ｈ２Ｏ中１０％）、およびブラインで順次洗浄した。次に、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。ＦＣ（Ｃ６Ｈ１２中５％ＥｔＯＡｃ）で透明な液体として１７（４８．２８ｇ、３８９ｍｍｏｌ、８３％）を得た。
【０５９２】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の１０％  ＥｔＯＡｃ）＝０．３．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝５．８１−５．７４（ｍ，１Ｈ），５．６２−５．５６（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．４４（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．０９（ｍ，１Ｈ），２．３７−２．２６（ｍ，１Ｈ），２．１４−１．９７（ｍ，２Ｈ），１．８３−１．６０（ｍ，３Ｈ），１．５３−１．３７（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ．
【０５９３】
【化１４４】
0006479022.tif 000144
【０５９４】
ＬｉＡｌＨ４の溶液（０．５当量、ＴＨＦ中１．０Ｍ溶液８１．５ｍｌ、８１．５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．０Ｍ、１６３ｍｌ）中の１７（１．０当量、２０．２３ｇ、１６３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃、アルゴン下で滴下して加えた。反応混合物を室温まで温め、オーバーナイトで攪拌した。Ｈ２Ｏ（約２０ｍｌ）を注意深く加えて反応を停止させた。反応混合物を濾過し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。ＦＣ（Ｃ６Ｈ１２中２０％ＥｔＯＡｃ）で透明な液体として１８（１５．８１ｇ、１２５ｍｍｏｌ、７７％）を得た。
【０５９５】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中２０％ＥｔＯＡｃ）＝０．４．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝５．７６−５．６０（ｍ，２Ｈ），３．８４−３．７７（ｍ，１Ｈ），２．３６（ｄｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．５，６．３Ｈｚ，２Ｈ），２．２８−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．１４−２．０５（ｍ，１Ｈ），１．８７−１．７８（ｍ，１Ｈ），１．７３−１．６３（ｍ，１Ｈ），１．６１−１．４３（ｍ，４Ｈ），１．４０−１．３０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１３２．４，１２５．０，７２．２，３５．１，３４．０，２８．３，２５．７，２１．２ｐｐｍ．
【０５９６】
【化１４５】
0006479022.tif 000145
【０５９７】
先に記載した手順に従って、そのｃｉｓ−前駆体１８から出発して化合物１９を調製した（ａ）Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ，Ｒ．Ｕｐａｄｈｙａｙ，Ｊ．Ｂ．Ｈａｕｎ，Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  ２００９，４８，７０１３−７０１６；ｂ）Ｍ．Ｒｏｙｚｅｎ，Ｇ．Ｐ．Ｙａｐ，Ｊ．Ｍ．Ｆｏｘ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００８，１３０，３７６０−３７６１）。トランス異性体の活性除去と光異性化は、室温で１０時間、Ｒａｙｏｎｅｔ  ＲＰＲ−１００  ＵＶ反応器（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ブランフォード、コネチカット、米国）中で実施した（反応器内部の温度は約３０℃であった）。簡潔には、１９（１．０当量、６．１７ｇ、４８．９ｍｍｏｌ）、安息香酸メチル（１．５当量、９．２０ｇ、２．８０ｍｌ、７３．３ｍｍｏｌ）及び溶媒（Ｅｔ２Ｏ中３０％Ｃ６Ｈ１２、１０００ｍｌ）で、ＵＶ反応器を充填した。処理の後、ＦＣ（Ｃ６Ｈ１２中２０％ＥｔＯＡｃ）で透明な油状物（４．２５ｇ、３３．７ｍｍｏｌ、６９％）が得られた。ＮＭＲ分析により、１．０：１．２の比率で２つの異性体の存在が示された。
【０５９８】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の２０％ＥｔＯＡｃ）＝０．４．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝５．８５−５．７６（ｍ，０．４５Ｈ），５．６１−５．４４（ｍ，１Ｈ），５．３２−５．２３（ｍ，０．５５Ｈ），４．４４−４．３８（ｍ，０．４５Ｈ），３．７４−３．６５（ｍ，０．５５Ｈ），２．８７−２．７９（ｍ，０．５５Ｈ），２．４８−２．３４（ｍ，１．４５Ｈ），２．２１−２．１２（ｍ，０．４５Ｈ），２．１０−１．７８（ｍ，３．５６Ｈ），１．５６−１．２９（ｍ，２．９Ｈ），１．２４−１．０６（ｍ，１．５５Ｈ），０．８１−０．７１（ｍ，０．５５Ｈ）ｐｐｍ．
【０５９９】
【化１４６】
0006479022.tif 000146
【０６００】
化合物１９（１．０当量、４．２５ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４４ｍｌ）撹拌溶液に、ピリジン（２．５当量、６．８１ｍｌ、８４．２ｍｍｏｌ）をＡｒ下で加えた。クロロギ酸  ４−ニトロフェニル（１．１当量、７．４７ｇ、３７．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍｌ）溶液を室温で添加し、得られた反応混合物を２時間撹拌した。ＮＨ４Ｃｌのｓａｔ．水溶液を用いて反応を停止した。相分離後、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２回）で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。粗生成物をＦＣ（Ｃ６Ｈ１２中の５％ＥｔＯＡｃ）を用いて精製し、淡黄色のワックス（Ｔｍ＝７５．３〜７８．７℃）として化合物２０（８．５１ｇ、２９．２ｍｍｏｌ、８７％）を得た。
【０６０１】
Ｒｆ（Ｃ６Ｈ１２中の５％ＥｔＯＡｃ）＝０．２．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝８．３１−８．２５（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３５（ｍ，２Ｈ），５．８０−５．５５（ｍ，１．５Ｈ），５．３５−５．３０（ｍ，０．５Ｈ），５．２８−５．１９（ｍ，０．５Ｈ），４．７２−４．６３（ｍ，０．５Ｈ），３．０４−２．９６（ｍ，０．５Ｈ），２．７４−２．６５（ｍ，０．５Ｈ），２．５３−２．１９（ｍ，２．５Ｈ），２．１１−１．８３（ｍ，３Ｈ），１．６１−１．４７（ｍ，１Ｈ），１．４２−１．１２（ｍ，２Ｈ），０．８９−０．７７（ｍ，０．５Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝１５５．７，１５５．６，１５２．０，１５１．８，１４５．３，１３８．５，１３７．０，１２８．１，１２５．３，１２５．１，１２１．８，１２１．８，８５．９，８３．５，４０．５，３９．８，３６．０，３５．６，３５．６，３５．５，３２．７，３０．６，２３．５，２０．４ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＦＡＢ  ｐｏｓ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１５Ｈ１８ＮＯ５［Ｍ＋Ｈ］＋：２９１．１１８５，ｍｅａｓ．：２９２．１１８９．
【０６０２】
【化１４７】
0006479022.tif 000147
【０６０３】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ＊ＨＣｌ（１．５ｅｑ．，５．４３ｇ，２０．０ｍｍｏｌ）をＡｒ下でＤＩＥＡ（３．０ｅｑ．，６．９７ｍｌ，４０．０ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＳＯ（０．２Ｍ，６７ｍｌ）に溶解した。次に、無水ＤＭＳＯ（０．５Ｍ，２７ｍｌ）中の化合物２０（１．０ｅｑ．，３．８８ｇ，１３．３ｍｍｏｌ）の透明な溶液をＡｒ下で２時間かけて室温で滴下した。反応混合物をオーバーナイトで、室温で攪拌した。Ｈ２Ｏ（８０ｍｌ）とＥｔＯＡｃ（１７０ｍｌ）を加えた。水層のｐＨを濃塩酸で１〜３に調節した。相を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（３回）で抽出した。合わせた有機層をブライン（２回）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。全ての揮発性成分を減圧下で蒸発させ、粗生成物をＦＣ（ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ）で精製し、白色の泡状物として化合物２１（４．７９ｇ、９．２０ｍｍｏｌ、７１％）を得た。
【０６０４】
Ｒｆ（８％ＭｅＯＨ及びＣＨ２Ｃｌ２中の２％ＡｃＯＨ）＝０．５．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝７．７６（ｄ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６４−７．５５（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），５．７３−５．４４（ｍ，２．５Ｈ），５．２７−５．１８（ｍ，０．５Ｈ），４．５２−４．３３（ｍ，３Ｈ），４．２７−４．１８（ｍ，１Ｈ），３．２４−３．１２（ｍ，２Ｈ），２．６０−０．７３（ｍ，１４Ｈ）ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＥＳＩ  ｎｅｇ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３０Ｈ３５Ｎ２Ｏ６［Ｍ−Ｈ］−：５１９．２５００６，ｍｅａｓ．：５１９．２５１１４；ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３０Ｈ３５Ｎ２Ｏ７［Ｍ−ＯＨ］−：５３５．２４４９８，ｍｅａｓ．：５３５．２４６００．
【０６０５】
【化１４８】
0006479022.tif 000148
【０６０６】
化合物２１（１．０当量、４．１６ｇ、７．９８ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍｌ）中の２０％ピペリジンに溶解し、室温で３０分間撹拌した。Ｈ２Ｏ（３０ｍｌ）を添加した後、すべての揮発性成分を減圧高真空下で除去した。シリカゲル上で粗生成物をＦＣで精製し（アセトン：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  ８５：１０：５  ｖ／ｖ／ｖを用いてすべての不純物を洗い流し、次に６５：２５：１０  ｖ／ｖ／ｖで生成物を溶出した。）、白色粉末として化合物４（２・０２ｇ、６．７８ｍｍｏｌ、８５％）を得た。精製した３を加熱分解（１８０℃で開始）した。本明細書中では化合物４をＴＣＯ＃ともいう。
【０６０７】
Ｒｆ（アセトン：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ  ６５：２５：１０  ｖ／ｖ／ｖ）＝０．６．
１Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ＝５．７６−５．４７（ｍ，１．５Ｈ），５．３１−５．２１（ｍ，０．５Ｈ），５．１３（ｂｒ，０．５Ｈ），４．５７−４．４９（ｍ，０．５Ｈ），３．５４−３．４７（ｍ，１Ｈ），３．１５−３．０６（ｍ，４Ｈ），２．８２−２．７３（ｍ，０．５Ｈ），２．４８−２．３４（ｍ，１．５Ｈ），２．２３−２．１２（ｍ，１Ｈ），２．０６−１．７５（ｍ，４．５Ｈ），１．７４−１．６７（ｍ，０．５Ｈ），１．５７−１．３７（ｍ，４Ｈ），１．２７−１．０６（ｍ，１．５Ｈ），０．８９−０．７８（ｍ，０．５Ｈ）ｐｐｍ．
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＭｅＯＤ）δ＝１５０．７，１４９．２，１３７．４，１３５．７，１３２．３，５４．７，４５．５，４４．４，４０．８，３９．８，３９．７，３７．６，３５．０，３２．７，３０．５，２９．２，２４．０，２３．３，２２．５，２２．１ｐｐｍ．
ＨＲ  ＭＳ（ＥＳＩ  ｎｅｇ．）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１５Ｈ２５Ｎ２Ｏ４［Ｍ−Ｈ］−：２９７．１８１９８，ｍｅａｓ．：２９７．１８２８７．
【０６０８】
実施例５：Ｎ−ε−（（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン
【０６０９】
【化１４９】
0006479022.tif 000149
【０６１０】
非天然型リジンベースのアミノ酸５をシリウスファインケミカルズ  ＳｉＣｈｅｍ（ブレーメン、ドイツ）から購入した。化合物５は、ＷＯ２０１２／０５１８８５に記載されているように合成することもできる。化合物５はＳＣＯとも呼ばれる。
【０６１１】
実施例６：プロパルギル−リジン
【０６１２】
【化１５０】
0006479022.tif 000150
【０６１３】
非天然型リジンベースのアミノ酸６をシリウスファインケミカルズ  ＳｉＣｈｅｍ（ブレーメン、ドイツ）から購入した。化合物６はＰｒＫとも呼ばれる。
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ１５Ｈ２７Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋：２９９．１９６５３，ｍｅａｓｕｒｅｄ：２９９．１９６５６．
【０６１４】
生物学的実施例
実施例Ａ：大腸菌中での組み換えタンパク質の発現
先に報告したプラスミドｐＥｖｏｌｖ  ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦおよびｐＢＡＤ  ＧＦＰＹ３９ＴＡＧは、それぞれの非天然型アミノ酸（ＵＡＡ）を遺伝子的にコードするＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡを発現するために使用された。（ａ）Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１１，５０，３８７８−３８８１；ｂ）Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，４１６６−４１７０）。簡潔には、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にプラスミドを共形質転換し、アンピシリンとクロラムフェニコールの存在下、３７℃で増殖させた。小スケールの発現のために、振盪フラスコ中で５０ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地に植菌するために１昼夜培養液０．５ｍｌを使用した。化合物１〜５（図１ａ）から選択した化合物および化合物３ａおよび３ｂ（８０ｍＭのの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液の保存液）、または等量の０．１Ｍ  ＮａＯＨ（対照実験用）を最終濃度１ｍＭになるように添加した時点で、培養液は２時間以内でＯＤが０．２〜０．３に増殖した。培養液をＯＤ  ０．４〜０．６まで増殖させ、０．０２％のアラビノースを用いて発現を誘導した。培養液を３７℃で６〜８時間振盪した後、遠心によって集菌した。ペレットを４×リン酸緩衝液（４×ＰＢＳ、ｐＨ８．０）に懸濁し、細胞（菌体）を超音波処理によって溶解した。その上清を約５０μｌのＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ，デュッセルドルフ，ドイツ）とインキュベートした。４×ＰＢＳ，ｐＨ８中の２０ｍＭイミダゾールを用いてＮｉ−ｂｅａｄｓ（ニッケルビーズ）を洗浄し、１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液を用いて溶出した。
【０６１５】
化合物３と同様の導入効率を示すその純粋な軸異性体およびエクアトリアル異性体である３ａおよび３ｂは、化合物２に比べて約２倍容易に導入され（図１２）、タンパク収量が改善された（０．４ｍｇ／Ｌ）。
【０６１６】
実施例Ｂ：ＳＰＡＡＣおよびＳＰＩＥＤＡＣ反応の  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの交差反応性と直交性
上記で述べたように、１，３および５の存在下で大腸菌にてＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡを発現した。次に、精製したタンパク（Ｎｉ−ＮＴＡ，上記参照）をＣｙ３−アジド（４５μＭ，６ｈ，３７°Ｃ）、Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３またはＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２（両者とも１５μＭ，２０分間，３７°Ｃ）のいずれかを用いて標識した。３つの染色液すべてをＪｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。標識後、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに直接ロードし、ＵＶ励起および臭化エチジウムの検出フィルター設備を用いて市販のゲルドキュメンテーションシステム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，ＣＡ）上で蛍光分析を実施した。その後、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅで染色した（図１ｄ）。ＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡ以外のタンパクは標識されず、標識反応の直交性が示された。
【０６１７】
実施例Ｃ：哺乳動物細胞においてインシュリンレセプター（ＩＲ）を発現するためのコンストラクト
ｐＥＧＦＰＮ１＿ＩＲプラスミドのＰＣＲに基づいた部位特定的変異によってＩＲＴＡＧアンバー突然変異体を作製し、ＩＲ遺伝子内のＫ６７６にＴＡＧ変異を作った。この部位は利用可能なＩＲ構造に基づき選択した（ＰＤＢ：２ＤＴＧ）（Ｎ．Ｍ．ＭｃＫｅｒｎ，Ｍ．Ｃ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｖ．Ａ．Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，Ｍ．Ｚ．Ｌｏｕ，Ｔ．Ｅ．Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｏ．Ｌｏｖｒｅｃｚ，Ｔ．Ｃ．Ｅｌｌｅｍａｎ，Ｋ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｄ．Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｐ．Ａ．Ｐｉｌｌｉｎｇ，Ｐ．Ａ．Ｈｏｙｎｅ，Ｋ．Ａ．Ｃａｒｔｌｅｄｇｅ，Ｔ．Ｍ．Ｐｈａｍ，Ｊ．Ｌ．Ｌｅｗｉｓ，Ｓ．Ｅ．Ｓａｎｋｏｖｉｃｈ，Ｖ．Ｓｔｏｉｃｈｅｖｓｋａ，Ｅ．Ｄａ  Ｓｉｌｖａ，Ｃ．Ｐ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．Ｆｒｅｎｋｅｌ，Ｌ．Ｇ．Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｒ．Ｔ．Ｆｅｒｎｌｅｙ，Ｖ．Ｃ．Ｅｐａ，Ｃ．Ｗ．Ｗａｒｄ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４３，２１８−２２１）。作製されたｐＥＧＦＰＮ１＿ＩＲＴＡＧは、図２、図９および図１０で使用された。Ｃ末端に結合したＧＦＰからの蛍光シグナルはアンバー抑制が成功した後にのみ認められるので、ＩＲＴＡＧの発現がうまく読み取られた情報として使用した。ＳＲＭ実験におけるＧＦＰのコンタミネーションを避けるために（図３）、空のｐＣＩ哺乳動物発現ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）にＩＲＫ６７６ＴＡＧ−ＩＲＥＳ−ＣＦＰカセットを挿入することによってバイシストロン性のｐＣＩ−ＩＲＴＡＧ−ＩＲＥＳ−ＣＦＰコンストラクトを作製した。ＩＲＴＡＧのＣ末端に、ＩＲＥＳ配列の前のＴＡＧ終止コドンが続くＦｌａｇタグを導入した。哺乳動物細胞でのＰｙｌＲＳＡＦ／ｔＲＮＡＰｙｌの発現のために、前に述べたｐＣＭＶ  ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦプラスミドを使用した。（ａ）Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１１，５０，３８７８−３８８１；ｂ）Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，４１６６−４１７０）。
【０６１８】
実施例Ｄ：細胞培養とＩＲコンストラクトの形質転換
インシュリン受容体実験のために、１０％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１％  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）および１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したダルベッコ変更イーグル培地−ＤＭＥＭ（高グルコース−４．５ｇ／ｌ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５％  ＣＯ２雰囲気、３７°Ｃで培養した。細胞を２〜３日ごとに最大で１５〜２０回継代した。顕微鏡観察のために、トランスフェクションの１５〜２４時間前に４−ｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒｅｄ  Ｌａｂ−Ｔｅｋ＃１．０  ｂｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ  ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍａ  ＵＳＡ）に細胞を播種した。ＪｅｔＰｒｉｍｅ試薬（ＰｅｑＬａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，ドイツ）を用いて製造業者のマニュアルに従ってトランスフェクションを実施した。簡単に言うと、ＩＲおよびｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦベクターを用いたダブルトランスフェクションのために、ＤＮＡ総量を１μｇで保持し、１：１の割合のプラスミドを使用した。２つのパルスでのトランスフェクション後にＵＡＡを添加した（図２ａ参照）。ＵＡＡをＤＭＳＯ（２５０ｍＭ  ＰｒＫストック；１００ｍＭ  ＴＣＯ＊ストック）または２０％ギ酸ＤＭＳＯ（５００ｍＭ  ＢＣＮストック；２５０ｍＭ  ＳＣＯストック）に溶解した。それぞれのＵＡＡは２５０μＭの最終濃度で使用した。２回目のＵＡＡパルス後、細胞（菌体）を新しい培地で洗浄し、ＤＭＥＭ中で１晩保持した。
【０６１９】
実施例Ｅ：ＩＲのパルスチェイス標識
トランスフェクションの翌朝に、培地を、１０％  ＦＢＳおよびＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを添加した無血清の高濃度グルコースＤＭＥＭと交換し、その後のすべての洗浄および標識のステップも実施した。その後、トランスフェクションした細胞（菌体）を以下の手順に従って標識した。ＳＰＩＥＤＡＣ−ＳＰＡＡＣの組み合わせの場合、無血清のＤＭＥＭで溶解した１０μＭのスルホ−Ｃｙ５−アジド（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ，Ｈａｎｎｏｖｅｒ，ドイツ）溶液と共に、細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、新しい培地で洗浄し、５μＭのスルホン酸化−Ｃｙ３−Ｍｅ−Ｔｅｔ（６−メチル−テトラジン−スルホ−Ｃｙ３，Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｅｎａ，ドイツ）溶液と共に３７℃で１０分間インキュベートし、その後、新しい培地で洗浄し、固定前に３７℃で維持した。ＳＰＡＡＣ標識に関する更なる詳細については実施例Ｍを参照のこと。
【０６２０】
ＳＰＩＥＤＡＣとｓｅＳＰＩＥＤＡＣの組み合わせの場合、最初に細胞を無血清培地ＤＭＥＭに溶解した５μＭのスルホン酸化Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５（６−メチル−テトラジン−スルホ−Ｃｙ５，Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）溶液と共に３７℃で１０分間インキュベートした。Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５標識後、細胞を新しい培地で洗浄した。次に、反応していないＴＣＯ＊をクエンチするために（クエンチャーの選択の詳細については、図１０参照）、無血清ＤＭＥＭに溶解した５０μＭの非蛍光性のＭｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２と共に細胞をインキュベートした。Ｍｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２  （（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）−フェニル）−メタンアミン）塩酸塩を文献の手順に従って合成した（Ｍ．Ｒ．Ｋａｒｖｅｒ，Ｒ．Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ，Ｓ．Ａ．Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１１）。このステップ後、無血清ＤＭＥＭで細胞を２回洗浄し、その後、５μＭの溶液中で約１０分間インキュベートすることによってＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて標識した。５００μＭの濃度のＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５及びＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２の保存液をＤＭＳＯ溶液中に調製した。標識後、細胞を再び洗浄し、培地を交換し、固定ステップ前の１〜５時間インキュベータ内で細胞を保持した。ＰＢＳ中の２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて室温で１０分間固定をする前に、細胞をＰＢＳで洗浄した。
【０６２１】
実施例Ｆ：ＩＲの顕微鏡観察
細胞を固定後、同日または最大で１〜２日後に顕微鏡で観察した。これは特にＳＲＭ画像解析のために重要であった。ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ  １００ｘ／１．４０  ＯＩＬ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（マンハイム，ドイツ）を備えた市販のＬＥＩＣＡ  ＴＣＳ  ＳＰ８  顕微鏡ですべての共焦点画像解析を実施した。異なったレベルの標識を比較する画像解析のため、すべての実験に同じ画像取得設定を使用した。細胞をＰＢＳ中で画像解析し、単一の平面画像を１１４ｎｍの画素サイズで取得した。すべてのＳＲＭは、Ｌｅｉｃａ  ＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ  １００ｘ／ＮＡ  １．４７  Ｏｉｌ  ＣＯＲＲ  ＴＩＲＦ  ＰＩＦＯＣ  ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ並びにＣｙ３及びＣｙ５フィルターセットを備えた市販のＬｅｉｃａ  ＧＳＤ顕微鏡で実施した。ＳＲＭについては、文献のプロトコール（Ｇ．Ｔ．Ｄｅｍｐｓｅｙ，Ｊ．Ｃ．Ｖａｕｇｈａｎ，Ｋ．Ｈ．Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｂａｔｅｓ，Ｘ．Ｚｈｕａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１，８，１０２７−１０３６）に従い、チオール（１０ｍＭ  ２−アミノエタンチオール，ＭＥＡ）の存在下で、酸素スカベンジングシステム（グルコースオキシダーゼとカタラーゼ−ＧＬＯＸ）を含む画像解析緩衝液を使用した。その緩衝液は新しく調製し、画像解析の３時間後または不十分なちらつきがある場合はそれより早く交換した。すべての画像解析は落射蛍光モードで、最初はＣｙ５、次にＡｔｔｏ５３２チャネルで取得した。Ｃｙ５チャネルについては６４２ｎｍレーザーを、Ａｔｔｏ５３２チャネルについては５３２ｎｍレーザーをそれぞれ１０ミリ秒の暴露時間の点滅をポンピング及び画像解析のために使用した。蛍光色素分子の基底状態への戻りを促進するために、４０５ｎｍレーザーを非常に低い強度で使用した。
【０６２２】
実施例Ｇ：ほ乳動物細胞におけるＶＬＰ発現のためのコンストラクト
真核細胞発現ベクターｐＣＡＧＧＳ内のＭ１（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／６８）およびＨＡ（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８）をＭｉｋｈａｉｌ  Ｍａｔｒｏｓｏｖｉｃｈ（Ｍａｒｂｕｒｇ）から入手した。ＨＡ配列は、ｐＣＩ発現ベクターにクローン化し、ＨＡ（ＰＤＢ：１Ｅ０８）の利用可能な構造（Ｘ．Ｍｏｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃｚｊｚｅｋ，Ｃ．Ｅ．Ｈａｔｃｈｉｋｉａｎ，Ｏ．Ｂｏｒｎｅｔ，Ｊ．Ｃ．Ｆｏｎｔｅｃｉｌｌａ−Ｃａｍｐｓ，Ｎ．Ｐ．Ｐａｌｍａ，Ｊ．Ｊ．Ｍｏｕｒａ，Ｆ．Ｇｕｅｒｌｅｓｑｕｉｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００，２７５，２３２０４−２３２１０）および異なったｆｌｕ変異間の配列保存についての情報に基づき、異なるアミノ酸部位を選択し、標準の部位特異的変異を用いたアンバーＴＡＧコドンによって置換した。この試験では、アミノ酸置換ＨＡ３４２を使用し、良好なＵＡＡ挿入および標識効率を示した。
【０６２３】
実施例Ｈ：細胞培養およびＶＬＰのサンプル調製
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびＬ−グルタミン酸を添加したＤＭＥＭ（低グルコース，ピルビン酸塩，グルタミンなし，フェノールレッドなし，１１８８０−０２８  ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２で維持（培養）した。
【０６２４】
蛍光およびＳＲＭ用に、６穴の組織培養皿中の十分に洗浄した高精度カバースリップ（O＝１８ｍｍ，厚さ＝０．１７±０．００５ｍｍ，ＣａｒｌＲｏｔｈ）の上に細胞を播種した。製造業者の取り扱い説明書に従い、ｊｅｔＰｒｉｍｅ（ＰＥＱＬＡＢ）または２３９Ｅｘｐｒｅｓｓｏ（Ｅｘｃｅｌｌｇｅｎ）トランスフェクション試薬を用いて、適当なプラスミドを１：１の比率でトランスフェクションする前に、細胞を７０〜８０％コンフルエンス（密集）するまで増殖させた。トランスフェクションの１時間後、２５０μＭ  ＳＣＯ，ＰｒＫまたはＴＣＯ＊を増殖培地に添加した。フィラメント状のウイルス粒子の産生がＨＡおよびＭ１の同時トランスフェクションによって誘導された場合、シアル酸へのＨＡの結合を介した産生細胞への生じたフィラメントの即時の付着を避けるために、外因性のバクテリアのノイラミニターゼを１００ｍＵ／ｍｌの濃度（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，フランクフルト，ドイツ）でＵＡＡに添加するのに加えて、両方のＵＡＡパルスの間に添加した。１０時間後に、ＵＡＡを含む培地を２番目のＵＡＡと増殖培地を交換し、１８時間インキュベートした。このチェイス後、その細胞を通常の増殖培地で１時間インキュベートし、テトラジン修飾された染色液を用いて導入されたＵＡＡを３７℃で２０〜３０分間標識した。最初に、ＴＣＯ＊をＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５μＭの最終濃度）を用いて標識し、反応しなかったＴＣＯ＊を５０μＭ  Ｍｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２を用いて５分間クエンチし、ＳＣＯをＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５μＭの最終濃度）を用いて標識した。くぼみスライド上でカバースライド（１．２−１．５ｍｍ，Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｅｓｅｒ／Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をのせる前に、一旦、細胞を通常の増殖培地で３０分間洗浄し、次に、ＰＢＳ中の２％ＰＦＡで１０分間固定した。ＳＲＭについては、上記で述べたＩＲ用と同じ画像取得設定を使用した。共焦点顕微鏡法用にサンプルを標準の対象スライド上にＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて封入し、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８顕微鏡を用いて画像解析するまで、室温で２４時間保存した。
【０６２５】
実施例Ｉ：画像解析
共焦点画像は、富士画像Ｊを用いて加工した（Ｊ．Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｉ．Ａｒｇａｎｄａ−Ｃａｒｒｅｒａｓ，Ｅ．Ｆｒｉｓｅ，Ｖ．Ｋａｙｎｉｇ，Ｍ．Ｌｏｎｇａｉｒ，Ｔ．Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｓ．Ｐｒｅｉｂｉｓｃｈ，Ｃ．Ｒｕｅｄｅｎ，Ｓ．Ｓａａｌｆｅｌｄ，Ｂ．Ｓｃｈｍｉｄ，Ｊ．Ｙ．Ｔｉｎｅｖｅｚ，Ｄ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ，Ｖ．Ｈａｒｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｐ．Ｔｏｍａｎｃａｋ，Ａ．Ｃａｒｄｏｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２，９，６７６−６８２）。ＩＲ画像用に、２画素の半径を有する中間フィルターを適応した。また、画像ＪはＩＲおよびＶＬＰ画像の両方のディスプレイのためのコントラストおよび明るさ（直線的な変化だけを適応させた）を調整するために使用した（図２、９、１０）。次に、個々のカラーＴＩＦＦファイルを、２つのチャンネルを手動で調整することによって単一の二色画像に融合させた。
【０６２６】
ＳＲＭの加工はＩｇｏｒＰｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ  ＯＲ，ＵＳＡ）で実施した。画像Ｊはディスプレイための直線的なコントラストおよび明るさの調整のために使用した。ＳＲＭ映像の分子は、ＩｇｏｒＰｒｏ用の「ローカライザーパッケージ」（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ  Ｄｅｄｅｃｋｅｒ，Ｋａｔｈｏｌｉｅｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｏｕｖａｉｎ，ベルギー）を用いて、各フレームに局在化した。個々の分子は、単一分子のそれぞれの点滅の場所（ｘ，ｙ）を決定するためにＧａｕｓｓｉａｎを用いて適合させた。次に、再構成したＳＲＭ画像における点の偏向を測定するために用いたデータセットの解像度を評価するために、局所化した位置をフーリエ環相関によって解析した（ａ）Ｎ．Ｂａｎｔｅｒｌｅ，Ｋ．Ｈ．Ｂｕｉ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ｍ．Ｂｅｃｋ，Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２０１３；ｂ）Ｒ．Ｐ．Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｚｅｎ，Ｋ．Ａ．Ｌｉｄｋｅ，Ｍ．Ｂａｔｅｓ，Ｄ．Ｌ．Ｐｕｉｇ，Ｄ．Ｇｒｕｎｗａｌｄ，Ｓ．Ｓｔａｌｌｉｎｇａ，Ｂ．Ｒｉｅｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３，１０，５５７−５６２）。最終的な画像は８ｘ８ｎｍ２画素サイズで表した。
【０６２７】
実施例Ｊ：ＦＲＥＴアッセイによる標識キネティクスの測定
標識キネティクスを調べるために、１〜５を用いてＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡを発現した（ＵＡＡｓの構造は図１ａ参照）。吸収スペクトルに基づき大腸菌の溶解液をＧＦＰの最終濃度２００ｎＭに調整した。Ｈ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２  ７またはＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３  ８（図４参照）をそれぞれ、最終濃度２μＭになるように添加し、蛍光スペクトル（励起波長λ＝４５０ｎｍ，蛍光波長λ＝４７０〜６５０ｎｍ）を異なった時点で記録した。実験は総量２ｍｌで攪拌しながら実施した。ＤＭＳＯに溶解した１ｍＭの染色保存液を用いた。ＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡの標識がうまくいっているかどうかについては、共有結合しているときのＧＦＰクロモフォア（供与体Ｄとして機能）から合成蛍光色素（受容体Ａ）へのフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によってモニターした。個々のスペクトルにおいて、これは、時間の経過とともにＧＦＰ蛍光の減少（おおよそλ＝５０３〜５０６ｎｍ）およびＡｔｔｏ５３２−（λ＝５５１ｎｍ）またはＣｙ３−蛍光発光（λ＝５６３ｎｍ）の同時の増加によってそれぞれ可視化される（図５の左にＧＦＰＴＡＧ→３（ＴＣＯ＊）の例を示す）。図５の右側に５つの異なるＵＡＡおよび２つの異なるテトラジンプローブの時間経過（数分間）におけるＦＲＥＴプロットを示す。「０分」のポイントは、タンパク溶液に染色液を加えてピペット操作した約１５秒後の時間と定義していることに留意のこと。
得られた反応キネティクスは以下の簡単な単一指数関数モデルと一致した。
【０６２８】
【数１】
0006479022.tif 000151
【０６２９】
式中、Ａ０は適合した振幅に対応しており、最初のＧＦＰ濃度に比例している。Ｂは反応液中の色素濃度に対応している。反応速度定数ｋは反応（大過剰な色素のために有効な）中の定数Ｂの仮定での適合から得られる。２０℃で測定されたこれらの実験条件下におけるおおよその速度定数を以下の表１に示した。これらは、各ＵＡＡの３つの独立した実験からのＦＲＥＴトレースの適合（異なるタンパク発現、異なる色素）およびその後の平均化によって得た。
【０６３０】
【表１】
0006479022.tif 000152
【０６３１】
Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３誘導体とＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２誘導体を比較していることに留意する（市販品のため）。しかし、染色液の違いは観察される反応性の違いにほとんど関係しないものと予想される。
【０６３２】
すべてのＵＡＡはＨ−Ｔｅｔを用いたときに比べてＭｅ−Ｔｅｔを用いたときに反応性が低下した。しかし、反応性の低下はアルケンに比べてアルキンで劇的に大きく、基本的にテストされた実験条件下においてＳＣＯの検出可能な反応を誘導しなかった。
【０６３３】
また、本実施例で用いたテトラジンの置換が、強力な逆電子要求が説明したＳＰＩＥＤＡＣ反応の速度のための主要な原動力ではないことを示唆することに留意する。
【０６３４】
図５に示されるように、あらゆる反応性が欠如してるため、ＧＦＰＴＡＧ→５に関しては、この測定条件下ではバックグランドの上の安定したＦＲＥＴシグナルが観察されず、したがって反応キネティクスの概算を求めることができなかった。
【０６３５】
実施例Ｊ１：Ｃｙ５標識テトラジン誘導体と、ＧＦＰＴＡＧ−＞３，ＧＦＰＴＡＧ−＞３ａ及びＧＦＰＴＡＧ−＞３ｂとの反応
上で述べたように、ＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡは、１，３，３ａ，３ｂおよび５の存在下において大腸菌で発現した。次に、下記のように、精製したタンパク（Ｎｉ−ＮＴＡ、上記参照）をＨ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した「Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−Ｃ５」）またはＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した「６−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ−Ｓｕｌｆｏ−Ｃｙ５」）を用いて標識した。ストップトフロー分光法（ＳＦＭ−３０００，Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ）を用いてキネティクス実験を実施した。蛍光分子Ｃｙ５（受容体，Ａ）に対するＧＦＰクロモフォア（ドナーの役割，Ｄ）のＦｏｓｔｅｒｓ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＦＲＥＴ）のためにそれぞれのＧＦＰのＵＡＡに共有結合したときの標識反応のキネティクスはＣｙ５の蛍光の増加を検出することによってモニターした。スペクトルにおいて、これは時間経過におけるＣｙ５蛍光の増加によって可視化される（図１３ａ）。
【０６３６】
Ｃｙ５が過剰に存在する場合、ＧＦＰシグナルに起こる光物理的効果のためにＦＲＥＴ効率曲線は解析できなかった。精製した１００ｎＭのＧＦＰＴＡＧ−＞ｘおよび過剰な量（１０−４０μＭ）のＣｙ５染色液（Ｈ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５またはＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５）を用いてＰＢＳ  ｐＨ７．４中の擬一次条件下で測定を実施した。Ｃｙ５蛍光データを下記の逆単一指数関数に対して適合することによってデータの解析を行った。
【０６３７】
【数２】
0006479022.tif 000153
【０６３８】
双指数関数よりも単一指数関数が良好に適合するまで、曲線のタイムポイントを決定するためにＡｋａｉｋｅの情報基準を用いた。その適合に基づいて決定した様々な観察された反応速度定数ｋｏｂｓをＣｙ５染色液の濃度に対してプロットし、０に対して強制的に適合させて直線にすることによって反応速度定数Ｋを得た（図１３ｂ、表２）。実験は３連で実施した。
【０６３９】
【表２】
0006479022.tif 000154
【０６４０】
実施例Ｋ：標識タンパクにおける共有結合の長期安定性の測定
ＳＰＩＥＤＡＣ反応において形成されたＴＣＯ＊と染色液Ｔｅｔとの共有結合の安定性を証明するために、長期のＦＲＥＴ実験を実施した。基本的に、蛍光色素分子のタンパクへの共有結合が持続するかどうかを３６時間にわたって調べるために上記と同じＦＲＥＴアッセイを用いた。２００ｎＭのＧＦＰＴＡＧ→３を２μＭのＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３と室温で別々に反応させ、ＤとＡの蛍光色素分子の割合を経時的に追跡した。時間経過による小分子の蛍光色素分子の消失の可能性はデータに示さない（図６）。
【０６４１】
別の実験では、Ｎｉ−ＮＴＡで精製したＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡ（１−４）をＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３を用いて標識した（２ｈ，３７°Ｃ）。過剰なＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３はフィルターで除去した（約２時間）。上記のように、２００ｎＭの標識ＧＦＰＴＡＧ→ＵＡＡ＋Ｃｙ３（１−４を使用）をＦＲＥＴによって時間とともに追跡した。最初のデータポイントは、テトラジンのタンパクへの添加後、約４時間かかったことに留意する。４時間後と７６時間後に測定されたＦＲＥＴ率に有意な変化はみられなかった（図７）。
【０６４２】
実施例Ｌ：１Ｈ−ＮＭＲによる様々なｔｒａｎｓ−シクロオクテニル異性体の安定性の評価
以前の研究では、チオールの存在下において１および４のような高い環歪みを有する化合物の分解が示された（ａ）Ｂ．Ｒ．Ｖａｒｇａ，Ｍ．Ｋａｌｌａｙ，Ｋ．Ｈｅｇｙｉ，Ｓ．Ｂｅｎｉ，Ｐ．Ｋｅｌｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，１８，８２２−８２８；ｂ）Ｒ．ｖａｎ  Ｇｅｅｌ，Ｇ．Ｊ．Ｐｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ  Ｄｅｌｆｔ，Ｗ．Ｃ．Ｂｏｅｌｅｎｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，２３，３９２−３９８）。ｔｒａｎｓ−シクロオクテンの例では、Ｌ−システイン処理および熱処理をしたとき、シス型に比べて何桁も反応性が低いが、対応する型へのトランス型の異性化が観察された（Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓｅｃｋｕｔｅ，Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｅ，Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，７４７６−７４７９）。
【０６４３】
１Ｈ−ＮＭＲ解析は、Ｄ２ＯまたはＤＭＳＯ−ｄ６のいずれかの溶媒で０．１Ｍに調整したＮａＯＤ溶液で溶解したＵＡＡ  １−５が、室温（ｒｔ）、３７℃および６０℃で７２時間にわたって安定であることを示した（データは示さず）。したがって、０．１Ｍ  ＮａＯＨ（大腸菌）およびＤＭＳＯ（哺乳動物細胞）は生物学的実験のための保存液の調製として適した溶媒である。しかし、保存液は−２０°Ｃで保存し、使用する前に３０分間かけて溶解した。
【０６４４】
１Ｈ−ＮＭＲ解析は、１，４−ジオキサン−ｄ８を混合したＤ２Ｏ（ｐＨ７．４）（ｖ／ｖ  １：１）中の１×重水素化ＰＢＳ（ｄＰＢＳ）に溶解したＵＡＡ２−４が、室温（ｒｔ）、３７℃および６０℃で７２時間にわたって安定であることを示した（図８ａ）。精製された化合物の性質を考慮すると、これらの条件は、生物学的実験でみられるような可能な限り最も近い生理的条件に類似している（生細胞、タンパクの水性緩衝液）（（ａ）Ｂ．Ｒ．Ｖａｒｇａ，Ｍ．Ｋａｌｌａｙ，Ｋ．Ｈｅｇｙｉ，Ｓ．Ｂｅｎｉ，Ｐ．Ｋｅｌｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，１８，８２２−８２８；ｂ）Ｒ．ｖａｎ  Ｇｅｅｌ，Ｇ．Ｊ．Ｐｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ  Ｄｅｌｆｔ，Ｗ．Ｃ．Ｂｏｅｌｅｎｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，２３，３９２−３９８）。
【０６４５】
チオールに対する安定性を調べるために、ＵＡＡ２−４をそれぞれｄＰＢＳ／ジオキサン−ｄ８（ｖ／ｖ  １：１）中の２つの等量のシステアミン塩酸塩と結合させて、ＮＭＲチューブをしっかりと封をして、室温、３７℃または６０℃でインキュベートした。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、インキュベートの２４時間後およびその後の時間ポイント（３の場合）で測定した。１Ｈ−ＮＭＲデータは、すべてのＵＡＡが温度依存的にシステアミンの存在下で異なった速さで時間とともに分解することを示した（図８ｂ）。すべての３つのｔｒａｎｓ−シクロオクテンを含むＵＡＡに関して、ｔｒａｎｓ−シクロオクテニル型のそれに対応するｃｉｓ−シクロオクテニル型への変換が観察された（図８ｂ）。２と４は同等の速さで異性化されたが（６０℃で２４時間後に残ったトランス異性体は＜５％）、３はより安定であることが分かった（６０℃で２４時間後に残ったトランス異性体は約８０％）。これらの数値は、以前他者によって実施された類似の化合物と同じように、（可能であれば／適用可能であれば）熱処理の前後の二重結合プロトンおよび−ＣＨＯ−プロトンの積分を比較することによって得られた（（ａ）Ｂ．Ｒ．Ｖａｒｇａ，Ｍ．Ｋａｌｌａｙ，Ｋ．Ｈｅｇｙｉ，Ｓ．Ｂｅｎｉ，Ｐ．Ｋｅｌｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，１８，８２２−８２８；ｂ）Ｒ．ｖａｎ  Ｇｅｅｌ，Ｇ．Ｊ．Ｐｒｕｉｊｎ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ  Ｄｅｌｆｔ，Ｗ．Ｃ．Ｂｏｅｌｅｎｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，２３，３９２−３９８；Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓｅｃｋｕｔｅ，Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｅ，Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，７４７６−７４７９）。様々な温度での観察は、温度が高くなると、より速く／より容易に異性化するという予想と一致した。サンプル中で持続するシス型への異性化は、室温または３７℃で２４時間後も維持された（データ示さず）。
【０６４６】
また３（ＴＣＯ＊）が、６０℃で、チオール存在下で完全にシス型に変換できることを示すために、６０℃でのインキュベーションを持続し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図８ｃに示された時間ポイントを越えてからも測定した。システアミンの２当量と共に６０℃で２４時間のインキュベーションした２（ＴＣＯ）及び４（ＴＣＯ＃）と比較して、より多くの３（ＴＣＯ＊）が、１０日（２４０時間）後もそのトランス型で残存した。
【０６４７】
さらに、ＴＣＯ＊軸異性体３ａがより安定であること、すなわち、ＴＣＯ＊エクアトリアル異性体３ｂよりも（主にシス型への変換によって）減衰する傾向がないことが分かった。３ａの半減期は６０℃で約２日間、３７℃で約３４日間と測定されたが、一方、３ｂはこれらの条件下で数時間のうちに減衰した（図１４ａおよび１４ｂ）。
【０６４８】
実施例Ｍ：エンドサイトーシス阻害剤の存在下または非存在下でのインシュリンレセプターのＳＰＡＡＣ標識
上記のように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ｐＥＧＦＰＮ１＿ＩＲＫ６７６ＴＡＧおよびｐＣＭＶ  ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦプラスミドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をＢＣＮと一晩インキュベートした。次の日、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄した。２時間後に標識を行った。図２ｂに示したように、１０分間のインキュベーションおよび１０μＭの染色液を用いたアジド標識では明らかな標識がみられなかった。アジド標識反応を最適化するために、Ｃｙ５−アジドの濃度を５０μＭに増量し、３７℃で２時間インキュベートした。標識後、細胞を固定し、共焦点顕微鏡での観察を行うまで、３７℃で維持した（詳細は上記参照）。図９ａは、ＩＲＴＡＧからのＧＦＰチャンネル（左パネル）と同時局在しているＣｙ５−チャネル（右パネル）の特異的膜標識を示している。加えて、Ｃｙ５−チャネルにおいて、細胞内に非常に高いバックグランドと非特異的な染色液の付着が観察されたが、おそらく染色液インキュベーションのステップを延長したためであった。エンドサイトーシス阻害剤（Ｄｙｎａｓｏｒｅ  ｈｙｄｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，フランクフルト，ドイツ）を用いた場合（無血清ＤＭＥＭ中の８０μＭ溶液、標識前の２０〜３０分間およびＣｙ５−アジドのインキュベーションの間）のみ、非特異的な染色液の蓄積は減少した（図９ｂ）。
【０６４９】
さらなる実験において、トランスフェクションされた細胞を２５０μＭの３，３ａまたは３ｂとともに８時間インキュベートした。次の日に、その細胞をＤＭＥＭ中で、５μＭのＨ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５またはＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙを用いて３７℃で１０分間標識した。培地を新鮮なＤＭＥＭに交換した後、細胞をさらに１〜２時間３７℃でインキュベートした。その後、細胞を固定し、共焦点顕微鏡で解析した（詳細は上記参照）。図１５に示されるように、５μＭのＨ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５とのインキュベーションにより、すべての３つの融合タンパクであるＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３，ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３ａおよびＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３ｂの確実な標識が産生された。細胞をより遅い反応のＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５とインキュベートしたとき、ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３ｂ，の染色は検出されなかったが、ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３およびＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞３ａは、Ｈ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５標識に比べていくらか弱い検出可能な染色を示した。
【０６５０】
実施例Ｎ：ＩＲの二色標識コントロール
上記のようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＥＧＦＰＮ１＿ＩＲＴＡＧ及びｐＣＭＶ  ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦでトランスフェクションした。トランスフェクション後、最初に細胞をＵＡＡ１でパルスし、その後、ＵＡＡ２でチェイスした（図２参照）。
【０６５１】
ＴＣＯ＊はＭｅ−Ｔｅｔ（第１の標識工程の間に適用される）およびＨ−Ｔｅｔ（第２の標識工程の間に適用される）の両方と反応できるので、全てのＴＣＯ＊が第１の工程で反応しないで第２の工程でＨ−Ｔｅｔによって標識される可能性を排除する必要があった。第１の標識工程におけるＴＣＯ＊の完全な消費は、あいまいな結果を生み出さないように直交性の二色標識デザインのために必要である。このような現象は、例えば、細胞が高い濃度のＴＣＯ＊を発現し、Ｍｅ−Ｔｅｔとの最初の標識反応で完全に消費されない場合に発生する。これを試験するために、以下のコントロール実験を実施した。
【０６５２】
トランスフェクション後、細胞を最初にＵＡＡ１（ＴＣＯ＊）でパルスし、次に、ＵＡＡ２（ＰｒＫ）でチェイスした（図２参照）。プロパルギルリシン（ＰｒＫ）は脂肪族アルキンであり、ＴＣＯ＊，ＢＣＮおよびＳＣＯと同様の収率で同じｔＲＮＡ／ＲＳＡＦによって取り込まれる不活性なＵＡＡとして、ＳＰＡＡＣまたはＳＰＩＥＤＡＣ反応および機能には参加しない（Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１１，５０，３８７８−３８８１；Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｃ．Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ，Ｒ．Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，４１６６−４１７０；Ｄ．Ｐ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｌｕｓｉｃ，Ｈ．Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｐ．Ｂ．Ｋａｐａｄｎｉｓ，Ａ．Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００９，１３１，８７２０−８７２１；Ａ．Ｂｏｒｒｍａｎｎ，Ｓ．Ｍｉｌｌｅｓ，Ｔ．Ｐｌａｓｓ，Ｊ．Ｄｏｍｍｅｒｈｏｌｔ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｒｋａｄｅ，Ｍ．Ｗｉｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｊ．Ｃ．ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，Ｆ．Ｌ．ｖａｎ  Ｄｅｌｆｔ，Ｅ．Ａ．Ｌｅｍｋｅ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１２，１３，２０９４−２０９９）。その後、Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５（無血清のＤＭＥＭ中に５μＭ，３７°Ｃで１０分間）を最初に適用した。第２の標識工程において、Ｈ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２を適用した（図２の比較）。予想されたように、非常に高いＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５のシグナルがみられた（図１０ａ）。しかし、Ａｔｔｏ５３２チャネルにおいて、いくつかの蛍光も観察できる。ＴＣＯ＊だけが反応性のＵＡＡとして存在したので、すべてではないが、ほとんどのＴＣＯ＊（＞８０％）が第１の標識工程で消費されたことが示された。この現象は、細胞の発現レベル、染色液の濃度、標識時間および温度に依存する。広範囲のパラメータを越えて働く頑健なプロトコールを確立するために、クエンチング工程を導入することが実質的であることがわかった。この目的で、比較的安価に入手できる染色液と比較して使用した高濃度の小分子Ｍｅ−Ｔｅｔ（ＮＨ２−Ｍｅ−Ｔｅｔ）は、迅速に分散し、細胞から洗浄除去することができる。全ての試験した実験で消費されていないＴＣＯ＊と反応した無血清ＤＭＥＭに溶解した５０μＭの２分間のパルス（室温）を測定した（図１０ａ）。したがって、その後のすべてのＳＰＩＥＤＡＣ−ｓｅＳＰＩＥＤＡＣ標識実験においてクエンチャーの使用を継続した。
【０６５３】
ＵＡＡ１（ＴＣＯ＊）を用いた細胞のパルスおよびＵＡＡ２（ＢＣＮ）を用いたチェイス後に二色標識も実施した。上記のように、ＴＣＯ＊を目標としたＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５（無血清のＤＭＥＭ中に５μＭ，３７°Ｃで１０分間）標識後、クエンチングを行った。第２の標識工程において、ＢＣＮを標的としたＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２を適用した。図１０ｂに示されるように、ＴＣＯ＊はうまく標識されたが、ＢＣＮとクエンチャーからの高濃度のＭｅ−Ｔｅｔの間の反応性のために、Ａｔｔｏ５３２チャネルのシグナルは観察されなかった。これは、試験された条件下で、ＢＣＮとＭｅ−Ｔｅｔの残存する反応性（図５、６及び７のキネティクスのライン並びに図のゲルアッセイ）が、Ｍｅ−Ｔｅｔを用いたＴＣＯ＊の反応に対する直交性の二色標識アプローチを不可能にすることを示す。
【０６５４】
また図１０ｃに示されるのは、同じ標識およびクエンチング条件を用いたウイルス様粒子（ＶＬＰ）のためのＴＣＯ＊およびＰＲＫを用いた同じコントロール実験（ＩＲについての上記記載のように）の繰り返しである（図２参照）。
【０６５５】
図１０ｄにおいて、非特異的な標識の可能性を試験するために、より大きな視野でここに示した（図２参照）。この画像からは、ｐＥＧＦＰＮ１＿ＩＲＫ６７６ＴＡＧ陽性細胞のみがＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２／Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５で標識されたことが明らかである。
【０６５６】
実施例Ｏ：質量分析による検証
示されたタンパク質（図１参照）に対応する質量分析による検証のために、ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦプラスミドを有する大腸菌で発現したＧＦＰＴＡＧ→３及びＧＦＰＴＡＧ→４を切除（抽出）し、続いてトリプシン（ｔｒｙｐ）で分解後、標準のプロトコルに従い高分解能ペプチド質量分析を行った。オービトラップ質量分析（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）を用いてペプチドを解析した。マスコットアルゴリズムを用いてデータを解析し、３および４の挿入が成功したことを確かめる結果を表３にまとめた。ＧＦＰＴＡＧ→５は、陽性コントロールとして解析した。
【０６５７】
【表３】
0006479022.tif 000155
【０６５８】
Ｙ３９部位でアンバー変異が抑制される場合、全長発現と従って蛍光発光のみを与えるＧＦＰＴＡＧレポーター構築のテスト発現は、ＴＣＯ＊およびＴＣＯ＃が、大腸菌発現培養液から約１０ｍｇ産出されるオリジナルなシクロオクタ−４−エンＴＣＯに比べて約３倍ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦ対によって受け入れられることを示す（図１ｂ、表３の質量分析データ）。図５、６、７は、３つのすべてのＴＣＯがＳＰＩＥＤＡＣ反応において同様の反応性を維持していることを示す。しかしながら、ｔｒａｎｓ−シクロオクテンは化学的安定性に問題を有し、特に、チオールの存在下において非反応性のシス型に異性化する傾向にあることが知られている（Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓｅｃｋｕｔｅ，Ｃ．Ｍ．Ｃｏｌｅ，Ｎ．Ｋ．Ｄｅｖａｒａｊ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，７４７６−７４７９）。チオールは、哺乳動物細胞のサイトゾルに豊富であることから、長期発現の間のＵＡＡ生物的安定性の阻害を示すことができる。図１ｃと図８に示されたＮＭＲ測定は、ＴＣＯ＊がチオール存在下で少なくとも１０倍以上の安定性を有し、カルバマート結合の近似性によるチオールへのトランス二重結合の効率的な遮断を示した。
【０６５９】
ｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦ変異対は、それぞれＳＰＩＥＤＡＣおよびＳＰＡＡＣ反応を行うことができるＴＣＯ＊およびＢＣＮのコード化を可能にする（図１ｄ）。生細胞の二色標識用のこのＵＡＡ対の能力を探索するため、それはインシュリンレセプター（ＩＲ）のパルスチェイス標識に使用された。ＩＲの機能および受容体リサイクルは、新規に現れた遺伝子制御の役割とともに、糖尿病における中心的な役割のため、現代に非常にふさわしいトピックである（Ｋ．Ｓｉｄｄｌｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１１，４７，Ｒ１−１０；Ｒ．Ｓａｒｆｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｗｅｒｎｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１３，１５４，１６７２−１６７９）。タンパク質（Ｋ６７６）の細胞外側の部位はアンバー変異のために選択され、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦをコードするプラスミドの存在下においてＩＲＴＡＧを発現した。
【０６６０】
次に、図２ａに概説されているパルスチェイス実験（増殖培地を第１のＵＡＡ（ＴＣＯ＊）を用いて４時間パルスする）を実施し、第２のＵＡＡ（ＢＣＮ）を用いて４時間チェイスした。ＩＲＴＡＧは、それぞれ生細胞で１０分間インキュベートすることにより、最初にアジド−Ｃｙ５で標識し、その後、Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３で標識した。図２ｂ（第１のパネル）で見られるように、共焦点画像はＳＰＩＥＤＡＣ反応からのＭｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ３を用いたＩＲＴＡＧ→ＴＣＯ＊の膜染色を可視化した。アジド−Ｃｙ５でのＩＲＴＡＧ→ＢＣＮの短時間標識は結果が得られなかった。図９で詳しく示すように、これはＳＰＩＥＤＡＣ反応より３〜４桁遅いＳＰＡＡＣ反応速度の結果であると考えることができた。
【０６６１】
シクロオクチニル−リジン誘導体（ＳＣＯ）（図１ａ）は、ＴＣＯ＊と同等の収率の同じｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦペアによって受け入れられた。ＴＣＯ＊はｉｎ  ｖｉｔｒｏキネティスクアッセイおよび標識実験において＞１０００  １／Ｍｓの反応速度でＨ−ＴｅｔおよびＭｅ−Ｔｅｔと反応するが、ＳＣＯはテストされた条件下でＭｅ−Ｔｅｔとの十分な反応性は示さなかった（反応キネティクスについては図５、６および７参照、図１ｄ参照）。しかし、アジドとのＳＰＡＡＣ反応におけるＢＣＮに比べて、ＳＣＯはＨ−ＴｅｔとのＳＰＩＥＤＡＣ反応において約２桁速く反応する。パルスチェイス実験はＴＣＯ＊およびＳＣＯを用いて繰り返され（図２ａ）、Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５で標識され、その後、Ｈ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２で１０分間標識された。図２ｂに示すように、この組み合わせは両方のチャネルに関して細胞膜中のＩＲの標識を明るくした。ＳＣＯは、実験のタイムスケールにおいて選択的にＨ−Ｔｅｔと反応したが、Ｍｅ−Ｔｅｔとは反応しなかった。すなわち、ＴＣＯ＊とＭｅ−Ｔｅｔの間のＳＰＩＥＤＡＣに対する直交性の反応であった。本明細書では、この副反応のタイプを「選択的に増幅されたＳＰＩＥＤＡＣ（ｓｅＳＰＩＥＤＡＣ）」という。ＴＣＯ＊はＭｅ−ＴｅｔおよびＨ−Ｔｅｔの両方と高い反応性があり、すべてのＴＣＯ＊が第２の標識工程に進む前に消費されることを保証するために実験条件が選択されなければならないことに留意する（詳細に関しては図１０参照）。
【０６６２】
さらに図１ｄおよび図１０は、ＢＣＮのＭｅ−Ｔｅｔに対する反応性のために、ＳＣＯの代わりに高い環歪みのＢＣＮを使用するとｓｅＳＰＩＥＤＡＣの速度をさらに上げることができないことを示す（図５、６及び７）。
【０６６３】
Ｃｙ５およびＡｔｔｏ５３２は一般的に局在に基づくＳＲＭのために使用されることから、二色ＳＲＭ測定を実施した（Ｍ．Ｈｅｉｌｅｍａｎｎ，Ｓ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｌｉｎｄｅ，Ｍ．Ｓｃｈｕｔｔｐｅｌｚ，Ｒ．Ｋａｓｐｅｒ，Ｂ．Ｓｅｅｆｅｌｄｔ，Ａ．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｐ．Ｔｉｎｎｅｆｅｌｄ，Ｍ．Ｓａｕｅｒ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２００８，４７，６１７２−６１７６；Ｍ．Ｂａｔｅｓ，Ｂ．Ｈｕａｎｇ，Ｇ．Ｔ．Ｄｅｍｐｓｅｙ，Ｘ．Ｚｈｕａｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７，３１７，１７４９−１７５３；Ｊ．Ｆｏｌｌｉｎｇ，Ｍ．Ｂｏｓｓｉ，Ｈ．Ｂｏｃｋ，Ｒ．Ｍｅｄｄａ，Ｃ．Ａ．Ｗｕｒｍ，Ｂ．Ｈｅｉｎ，Ｓ．Ｊａｋｏｂｓ，Ｃ．Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，Ｓ．Ｗ．Ｈｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００８，５，９４３−９４５）。共焦点（図２）および広範囲画像はＴＣＯ＊およびＳＣＯの二色標識後の二色のＩＲの細胞膜染色の重なりを示した。しかしながら、ＳＲＭは膜でのＩＲクラスターの不均一な分布を明らかにした（図３ａ）。また、特に、ＳＲＭ研究を用いた他の成長因子受容体については、クラスター化が観察されている（Ｓ．Ｗｉｌｍｅｓ，Ｍ．Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌ，Ｄ．Ｌｉｓｓｅ，Ｃ．Ｐ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｏ．Ｂｅｕｔｅｌ，Ｋ．Ｂ．Ｂｕｓｃｈ，Ｓ．Ｔ．Ｈｅｓｓ，Ｊ．Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ２０１２，５１，４８６８−４８７１）。
【０６６４】
本発明の手法の一般性を示すために、標識されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）をインフルエンザウイルスタンパクヘマグルチニン（ＨＡ）およびマトリックスタンパク１（Ｍ１）の同時発現によって作製した（Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｓｍａｎ，Ｒ．Ａ．Ｌａｍｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０１１，４１１，２２９−２３６参照）。ウイルスゲノムはコンパクトであり、時々、遺伝的にコードされたタグを特別な方法でウイルスタンパクに挿入させる重なり合った遺伝子が含まれる。ＨＡのタグ変異を作製し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＭ１およびｔＲＮＡＰｙｌ／ＰｙｌＲＳＡＦと一緒に発現させた。ＴＣＯ＊およびＳＣＯを用いたパルスチェイスプロトコールを繰り返し、Ｍｅ−Ｔｅｔ−Ｃｙ５およびＨ−Ｔｅｔ−Ａｔｔｏ５３２での標識を行った。図２ｃに示されるように、作製されたＶＬＰと一致するＡｔｔｏ５３２およびＣｙ５で染色したフィラメント上の突出部が可視化された。ＳＲＭの増幅された解像は、個々のフィラメントの可視化を可能にする（図３ｂ）。特に、二色間に重要な空間的な重なりがあり、異なった時点で翻訳されたタンパク質が同様に作製されたＶＬＰにの取り込まれることを示唆する。
【０６６５】
要約すると、遺伝学的にコードされたＳＰＩＥＤＡＣ反応は、生細胞内のタンパクの迅速な標識を実施するために使用される２つの相互に直交するＳＰＩＥＤＡＣ反応に適応した。これは、ＳＰＩＥＤＡＣおよびＳＰＡＡＣからＳＰＩＥＤＡＣ、ｓｅＳＰＩＥＤＡおよびＳＰＡＡＣへと広がった遺伝子コードを用いる生体適合性のある「クリック」標識法の既存のレパートリーを広げる。２つの迅速なＳＰＩＥＤＡＣ反応は哺乳動物細胞の二色標識実験をＳＲＭに適合させ、一方、ＳＰＡＡＣの遅い反応性は生細胞の迅速で高コントラストな標識に不十分であるように見えた。
【０６６６】
ＴＣＯ＊は、高い生体内安定性と導入効率を有する改良されたＴＣＯである。ＴＣＯ＊は試験された両テトラジン（Ｍｅ−Ｔｅｔ、Ｈ−Ｔｅｔ）と迅速に反応するが、ＢＣＮはＭｅ−Ｔｅｔへの反応性を比較的大きく減少させた。実施された実験条件下では、ＳＯＣはＨ−Ｔｅｔのみと反応し、Ｍｅ−Ｔｅｔとは反応しなかった。二色標識は無作為に選んだｔＲＮＡ／ＲＳ対とパルスチェイス手法を用いて実現した。生細胞中で標識工程が行われ、高い解像度でタンパクの運命を研究するための新しい可能性を作りだした。温度感受性変異やプロモーター制御などの遺伝子交換を用いた本発明の二色標識を組み合わせることにより、異なるタンパクの標識を可能にするかもしれない。しかし、本発明の標識化学は、一般的であり、２つの異なったコドンを介した特異的なコード化に直接応用することもできる。
【０６６７】
他のタンパクおよび脂質との多機能な相互作用が大きなタグによって予期しない方法で影響されるかもしれないときは、他の遺伝子コードされた蛍光タグと比較して、その小さなＵＡＡタグは、特にＩＲおよびＨＡなどの複合体タンパク作製の研究のための大きな利点である。特に、ウイルス遺伝子はしばしば非常にコンパクトであり、大きな修飾を許容しない。ひとつのコドンのみの変換の必要性は、タンパク機能を変更しない許容部位を見つける可能性を劇的に増加させる。
【０６６８】
本発明の技術は２つの調整されたＳＰＩＥＤＡＣ反応の遺伝子結合メカニズムに依存するため、生細胞の細胞内標識に適した色素開発と親和性があり、ＭＲＩおよびＰＥＴ研究などのインストールするタグに関しては広範囲な他の分野に応用できる。
【０６６９】
実施例Ｐ：ｓｅＳＰＩＥＤＡＣおよびＳＰＩＥＤＡＣ反応の直交性を証明するための１Ｈ−ＮＭＲアッセイ
最終濃度１０ｍＭのＤＭＳＯ−ｄ６中のジエノフィル保存液を調製した。２０ｍＭのＤＭＳＯ−ｄ６中の（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミン（メチルテトラジン又はＭｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２と呼ばれる）の蟻酸塩の保存液も調製した。コントロール実験として、ジエノフィルまたはジエン（Ｍｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２）のいずれかを、ＤＭＳＯ−ｄ６とそれぞれＮＭＲチューブ内で混合し［１：１（ｖ／ｖ；全量７６０μｌ）］、最終濃度で５ｍＭまたは１０ｍＭの濃度とした。ジエノフィルがジエン（Ｍｅ−Ｔｅｔ−ＮＨ２）と反応するか否かを確認するため、対応する保存液をＮＭＲチューブ内で混合し［１：１（ｖ／ｖ；全量７６０μｌ）］、最終濃度で５ｍＭのジエノフィルまたは１０ｍＭのジエンとした。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、１Ｈ−ＮＭＲで解析した。
【０６７０】
反応混合液を用いたジエノフィルとジエンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの比較は、ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２’−エンとテトラジンとを混合した１０分後に、ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２’−エンがテトラジンと完全に反応することを示した（図１１ａ）。トランス二重結合に対応するシグナル（中央のスペクトルの黒丸）は、インキュベーション後には検出されなかった。予想されたように、テトラジンは過剰に用いられたため、残存するテトラジンが検出された（下のスペクトルの黒丸）。芳香族領域の新しいシグナル（上のスペクトル）が新規に形成された反応生成物に対応して検出された。ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２’−エンの異なる異性体の反応はｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２’−エンの反応に比べて遅いことが分かった（図１１ｂ）。黒い矢印は、反応におけるトランス二重結合プロトンの積分の減少および芳香族領域の新しいシグナルの出現を示す（上のスペクトル）。反応時間の延長、温度の上昇または大過剰のテトラジンを使用することによって、その反応を終了することができる。
【０６７１】
反対に、５−ノルボルネン−２−オール（エンド−及びエキソ−異性体）およびシクロオクチン部分のいずれもテトラジンと全く反応しなかった（図１１ｃ、図１１ｄおよび図１１ｅの黒丸で示す）。ジエノフィルとテトラジンの混合後１０分以内に新しいシグナルは検出されなかった。ビシクロノニン部分（２つの異性体）との反応は起こったが、混合１０分後ではまだ完全にテトラジンとは反応はしなかった（図１１ｆの上のスペクトル）。したがって、この反応対の反応は図１１ａの反応対の反応に比べて遅いことが分かった。黒い矢印は反応において新しく出現したシグナルを示している（上のスペクトル）。反応時間の延長、温度の上昇または大過剰のテトラジンを使用することによって、その反応を終了することができる。
【０６７２】
１，４−ジオキサン−ｄ８と混合したＤ２Ｏ（ｐＨ７．４）中の１×重水素化ＰＢＳ（ｄＰＢＳ）（ｖ／ｖ  １：１）中で実施した同様の実験は、同じ結果を示した。
【０６７３】
略語
ＡｃＦ＝ｐ−アセチルフェニルアラニン
ＡｃＯＨ＝酢酸
ａｑ．＝水の
Ａｒ＝アルゴン／不活性ガス雰囲気
ＢＣＮ＝Ｎ−ε−（（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−メチルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リシン（図１ａ：化合物１）
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ＝Ｎ−α−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−リジン
ｂｒｉｎｅ＝ｓａｔ．ａｑ．ＮａＣｌ溶液
ｃａｌｃｄ＝計算された
ｃＨｅｘ＝シクロヘキサン
ｃｏｎｃ．＝濃縮された
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデ−７−セン
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＩＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ｅｑ．＝等価の
ＥｔＯＨ＝エタノール
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＦＣ＝フラッシュクロマトグラフィー
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ＝Ｎ−α−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ−リジン
ＦＲＥＴ＝蛍光共鳴エネルギー移動
ＭｅＯＨ＝メタノール
ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質
ＧＦＰＷＴ＝野生型ＧＦＰ
ＧＦＰＴＡＧ＝許容部位３９にアンバー終止コドンＴＡＧを含む配列によってコードされたＧＦＰ
ＧＦＰＴＡＧ−＞ｘ＝アンバーコドンがコード化した部位に化合物Ｘが導入されたＧＦＰＴＡＧ（例えば、ＧＦＰＴＡＧ−＞１＝アンバーコドンがコード化した部位に化合物１が導入されたＧＦＰＴＡＧ）
ｈ＝時間
ＩＧＦＰ＝ＧＦＰの平均強度
ＩＲ＝インシュリンレセプター
ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ＝ＩＲの許容部位６７６にアンバー終止コドンＴＡＧを含む配列によってコードされたＧＦＰ−ＩＲ融合構築物
ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞ｘ＝アンバーコドンがコード化した部位に化合物Ｘが組み込まれたＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ融合物（例えば、ＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ−＞１＝ＩＲの部位６７６に化合物１が組み込まれたＧＦＰ−ＩＲＴＡＧ融合物）
ＭＢＰ＝マルトース結合タンパク
ＭＢＰＴＡＧ＝許容部位３８にアンバー終止コドン、Ｃ末端にＨｉｓタグ（ＭＢＰＴＡＧ）を有する配列によってコードされたＭＢＰ
ＭＢＰＴＡＧ−＞１＝アンバーコドンがコード化した部位に化合物１が導入されたＭＢＰＴＡＧ
ｍＣｈｅｒｒｙＷＴ＝野生型ｍＣｈｅｒｒｙ
ｍＣｈｅｒｒｙＴＡＧ−＞１＝アンバーコドンがコード化した部位に化合物１が導入されたｍＣｈｅｒｒｙ
ｍｅａｓ．＝測定された
ｍｉｎ＝分
ＮＬＳ＝核局在配列
ＯＤ６００＝６００ｎｍの吸光度
ｏ／ｎ＝オーバーナイト
ＰＢＳ＝リン酸緩衝溶液
ＰＭＳＦ＝フッ化フェニルメチルスルホニル
ＲＳ＝アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素
ｒｔ＝室温／周囲温度（２０〜２５℃）
ｓａｔ．＝飽和した
ＳＣＯ＝Ｎ−ε−（（シクロオクタ−２−イン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（図１ａ：化合物５）
ＳＤ＝標準誤差
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｓｍＦＲＥＴ＝ＦＲＥＴの１分子観察
ＴＡＭＲＡ＝テトラメチルローダミン
ＴＢ＝ＴＢ培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）
ＴＣＯ＝Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（図１ａ：化合物２）
ＴＣＯ＊＝Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−２−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（図１ａ：化合物３）
ＴＣＯ＃＝Ｎ−ε−（（ｔｒａｎｓ−シクロオクタ−３−エン−１−イルオキシ）カルボニル）−Ｌ−リジン（図１ａ：化合物４）
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
ＵＡＡ＝非天然型アミノ酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
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