(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）生成物を製造するための方法であって、
（ａ）ＨＡと１種以上の多官能性架橋剤とを水溶液中で反応させることによってＨＡの架橋を開始して、活性化ＨＡを得ることと、
（ｂ）前記活性化ＨＡから未反応の架橋剤を除去することと、
（ｃ）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、前記活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供することによって前記活性化ＨＡの前記架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることとを含み、前記完結架橋工程（ｃ）が、液体沈殿媒体と、沈殿形態の前記活性化ＨＡとを含む懸濁液中で実施される、方法。
【請求項２】
前記除去工程（ｂ）が、
（ｂ１）前記活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、前記液体沈殿媒体と、沈殿形態の前記活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｂ２）沈殿した活性化ＨＡの前記懸濁液から未反応の架橋剤を除去することとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記除去サブ工程（ｂ２）が、前記沈殿した活性化ＨＡを液体沈殿媒体で洗浄することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記完結架橋工程（ｃ）が、
（ｃ１）前記活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、前記液体沈殿媒体と、沈殿形態の前記活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｃ２）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、沈殿した活性化ＨＡの前記懸濁液をさらなる架橋条件に供することによって前記活性化ＨＡの前記架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液体沈殿媒体が、６５重量％超の水溶性有機溶媒を含有する、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶性有機溶媒が、エタノールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記初期架橋工程（ａ）が、ゲル形態の活性化ＨＡをもたらす、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から選択される、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｄ）工程（ｃ）からの前記沈殿した架橋ＨＡ生成物を非沈殿条件に供する工程と、（ｅ）非沈殿形態の前記架橋ＨＡ生成物を単離する工程と
をさらに含む、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記架橋ＨＡ生成物を滅菌する工程を含む、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
３５％以上の有効クロスリンカー比を有し、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、および、ジエポキシオクタンからなる群から選択される架橋剤により架橋されるエーテルである、架橋ＨＡ生成物。
【請求項１３】
ＨＡ１ｇあたり４〜５００ｍＬの膨潤度を有する、請求項１２に記載の架橋ＨＡ生成物。
【請求項１４】
皮膚充填、体形矯正、もしくは顔面輪郭矯正である美容手術における医薬または医療デバイスの製造における、請求項１２〜１３の何れか１項に記載の架橋ＨＡ生成物の使用。
【請求項１５】
皮膚充填、体形矯正、もしくは顔面輪郭矯正である美容手術、または、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁の治療、もしくは整形外科用途である医療手術における医薬または医療デバイスとしての使用のための、請求項１２〜１３の何れか１項に記載の架橋ＨＡ生成物。
【請求項１６】
工程（ｃ）における最終架橋の前に、工程（ａ）において得られた活性化ＨＡの所望の形状を調製することを含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ａ）において得られた活性化ＨＡの所望の形状の調製が、工程（ｂ）における活性化ＨＡからの未反応の架橋剤の除去の前に行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所望の形状が、０．１〜５．０ｍｍのサイズを有する粒子である、請求項１６〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
所望の形状が、紐（string）、ネット、またはフィルムである、請求項１６〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
所望の形状が、紐であり、前記紐が、５：１以上のその長さとその幅との比を有する、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、多糖の分野に関連する。より具体的には、本発明は、ヒアルロン酸（ＨＡ）を架橋する、および架橋ＨＡ生成物を製造する、新規な方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
医学的使用のための最も広く使用されている生体適合性ポリマーの１つは、ヒアルロン酸（ＨＡ）である。これは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の群に属する天然に存在する多糖である。ＨＡおよび他のＧＡＧは、多量の水を吸収する容量を有する負に荷電したヘテロ多糖鎖である。ＨＡおよびＨＡに由来する生成物は、生物医学および美容の分野において、たとえば、粘弾性液手術中（viscosurgery）におよび皮膚充填剤（dermal filler）として広く使用されている。
【０００３】
吸水性ゲル、またはヒドロゲルは、生物医学分野において広く使用されている。それらは、一般的に、ポリマーを化学的に架橋して無限の網目構造とすることによって調製される。天然ＨＡおよびある特定の架橋ＨＡ生成物は、完全に溶解するまで水を吸収する一方で、架橋ＨＡゲルは、典型的には、飽和するまである特定の量の水を吸収する、すなわち、有限の液体保持容量、または膨潤度を有する。
【０００４】
ほとんどの生物において、ＨＡはその分子質量を除いて同一の化学構造で存在することから、最小限の反応をもたらし、高度な医学的使用を可能にする。ＨＡ分子の架橋および／または他の修飾は、インビボでのその耐分解性または持続時間を改善するために必要である。さらに、そのような修飾は、ＨＡ分子の液体保持容量に影響する。その結果として、ＨＡは、多くの修飾の試みの対象となっている。
【０００５】
生体適合性ポリマーからゲルを調製する際、高い生体適合性を維持するために、低い架橋度を確保することが有利である。しかしながら、適正な生物医学的効果を有するためにより濃厚なゲルが必要とされることが多く、そのような場合、生体適合性が失われることが多い。
【０００６】
インプラントを伴う一部の公知の軟部組織増大治療は、時に、インプラントまたはその一部が所望の治療部位から離れて移動するという欠点を有する。
【０００７】
ＷＯ８７／０７８９８は、ＨＡフィルムを調製するための方法を開示している。エポキシ活性化ＨＡの水溶液を乾燥してフィルムとすることを伴う架橋工程まで、いかなるゲル形成も回避すべきである。架橋工程におけるすべての他の成分が揮発性でなければならないことは、この方法に固有である。
【０００８】
ＷＯ２００４／０９２２２３は、エポキシドを実質的に除去せずにＨＡおよびエポキシド架橋剤の混合物を乾燥することによって架橋ＨＡゲルを生成する方法を開示している。
【０００９】
同様に、ＷＯ２０１１／１０９１２９およびＷＯ２０１１／１０９１３０は、非変性条件下、架橋剤の存在下でＨＡを乾燥することによってＨＡ糸を生成する方法を開示している。
【００１０】
ＵＳ５，８２７，９３７は、高い架橋度を有する多糖を調製するための方法を開示している。
【００１１】
ＷＯ００／０４６２５３は、各々架橋剤の存在下での２種類の架橋工程を伴う、ＨＡの架橋度を増加させるための方法を開示している。
【００１２】
ＵＳ２００７／００６６８１６は、二重架橋ＨＡを調製するための方法であって、ＨＡ基材を、２つの工程で、それぞれエポキシドおよびカルボジイミドにより架橋することを伴う、方法を開示している。
【００１３】
ＵＳ６，８５２，２５５は、ＨＡの水溶液を架橋し、続いて、たとえば、有機溶媒を添加して架橋ＨＡを沈殿させることによって、架橋ＨＡを成形することを伴う方法を開示している。
【００１４】
ＵＳ４，７１６，２２４は、増加した耐酵素分解性を有する架橋ＨＡを生成するための方法に関連する。架橋剤の添加の前にＨＡを沈殿させてもよいと記述されている。
【００１５】
ＫＲ２００７／０００４１５９は、固相のＨＡを有機溶媒中で架橋剤に供することによって架橋ＨＡを調製する方法を開示している。
【００１６】
ＥＰ２１９９３０８は、架橋剤の添加の前にＨＡ粉末を水性アルコール中に分散させることによって架橋ＨＡを生成する方法に関連する。
【００１７】
ＵＳ６，９２１，８１９は、多官能性架橋剤を固体状態のＨＡとその水和中に反応させる、ＨＡを架橋するための方法を開示している。
【００１８】
当分野におけるこれらの進歩にもかかわらず、好適な液体保持容量および分解プロファイルを有しながら生体適合性が保持されている、架橋ＨＡ生成物を製造する代替方法が依然として必要である。たとえば、液体保持容量として測定できる、所望のゲル強度を有するＨＡゲル生成物を得るために必要とされる修飾度を最小化することが、特に望ましい。
【発明の概要】
【００１９】
本発明の一目的は、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）生成物を製造するための新規な方法を提供することであり、以下の要件の１つ以上を満たす：
−  架橋剤の組み込みが少ないこと
−  たとえば周囲の媒体およびハロゲン化物イオンとの副反応が限定されていること
−  反応条件が制御されていること
−  プロセス再現性が良好であること
−  工業プロセスにスケールアップするのに好適であること
−  全体のプロセス時間が限定されていること
−  埋入時の変形および移動に耐える十分なゲル強度
−  方法工程において複数の種類の作用物質（たとえば、緩衝液、塩基、酸、塩）の使用が可能であること。
【００２０】
これらの目標および／または本明細書から明らかである他の目標を果たすために、本発明の根底にある目的は、低から中程度の修飾度を有しながら、同時に低から中程度の液体保持容量、または膨潤度によって示される高いゲル強度を有する、架橋ＨＡ生成物を製造するための方法を提供することであることが分かった。
【００２１】
本発明は、ＨＡの特定の架橋剤についての修飾効率を制御すること、すなわち、所望の強度のゲルの生成における架橋手順の効率を制御することによって、ＨＡ架橋プロセスの汎用的制御を可能にする。したがって、本発明は、所望の強度（限定された膨潤度）を有するゲルを、ＨＡの驚くほど低い化学修飾で製造することを可能にする。これは、生体適合性の問題を最小化するために有利であるが、一般的に、ＨＡ架橋プロセスの制御を改善するためにも有利である。
【００２２】
また、本発明の一目的は、高い割合で結合した架橋剤が（少なくとも）２つの端部で接合されている、すなわち、高い架橋効率を実現する、架橋ＨＡ生成物を製造するための方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、低から中程度の修飾度と、同時に低から中程度の液体保持容量、または膨潤度とを有する、架橋ＨＡ生成物を提供することである。
【００２４】
本発明の一目的は、高い耐変形性を有する架橋ＨＡ生成物を提供することである。
【００２５】
これらの目的および本開示から明らかとなる他の目的のため、本発明は、第１の側面によれば、架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）生成物を製造するための方法であって、
（ａ）ＨＡと１種以上の多官能性架橋剤とを水溶液中で反応させることによってＨＡの架橋を開始して、活性化ＨＡを得ることと、（ｂ）活性化ＨＡから未反応の架橋剤を除去することと、（ｃ）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供することによって活性化ＨＡの架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることと
を含み、完結架橋工程（ｃ）が、液体沈殿媒体および沈殿形態の活性化ＨＡの懸濁液中で実施される、方法を提供する。
【００２６】
この方法は、最終架橋工程の良好な制御を可能にし、その理由は、それが固体（沈殿）相のみで行われるからである。得られる生成物は、ＨＡの低い修飾度にもかかわらず、低い膨潤度を有するゲルであるという点で独特である。限定された膨潤度を有するゲル生成物が、この低い修飾度で得られることは非常に驚くべきことである。
【００２７】
本発明に従う方法の一態様では、除去工程（ｂ）は、（ｂ１）活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、液体沈殿媒体と、沈殿形態の活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｂ２）沈殿した活性化ＨＡの懸濁液から未反応の架橋剤を除去することと
を含む。任意に、除去サブ工程（ｂ２）は、沈殿した活性化ＨＡを液体沈殿媒体で洗浄することを含む。
【００２８】
沈殿形態の活性化ＨＡからの架橋剤の除去は有利であり、その理由は、非常に清浄な中間生成物、すなわち、未反応の架橋剤が残存しないものが急速に得られるからである。この架橋剤除去工程はまた、大規模プロセスにおいても非常に有用である。
【００２９】
本発明に従う方法の別の態様では、完結架橋工程（ｃ）は、（ｃ１）活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、液体沈殿媒体と、沈殿形態の活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｃ２）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、沈殿した活性化ＨＡの懸濁液をさらなる架橋条件に供することによって活性化ＨＡの架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることと
を含む。
【００３０】
本発明に従う方法のある特定の態様では、液体沈殿媒体は、６５重量％超の水溶性有機溶媒、好ましくは７０〜８０重量％の水溶性有機溶媒と、２０〜３０重量％の水とを含有する。
【００３１】
本発明に従う方法の一部の態様では、水溶性有機溶媒は、１種以上の低級アルキルアルコール、好ましくはエタノールを含んでいる、またはそれからなっている。
【００３２】
本発明に従う方法の具体的な態様では、初期架橋工程（ａ）は、ゲル形態の活性化ＨＡをもたらす。このゲル形態により、下流の工程、たとえば、取り扱い、成形、洗浄、および沈殿が容易になる。
【００３３】
本発明に従う方法のある特定の態様では、架橋剤は、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から選択される。架橋剤の好ましい群は、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなっており、特に１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）が好ましい。
【００３４】
本発明に従う方法の具体的な態様では、本方法は、（ｄ）工程（ｃ）からの沈殿した架橋ＨＡ生成物を非沈殿条件に供する工程と、
（ｅ）非沈殿形態の架橋ＨＡ生成物を単離する工程と
をさらに含んでいる。
【００３５】
本発明に従う方法の一部の態様では、本方法は、架橋ＨＡ生成物を滅菌する工程をさらに含んでいる。
【００３６】
本発明は、第２の側面によれば、０．３５または３５％以上、好ましくは、３５〜８０％、たとえば、４０〜８０％または５０〜８０％の範囲の有効クロスリンカー比を有する架橋ＨＡ生成物を提供する。有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）は、結合した全架橋剤（ＨＡ−Ｘ−ＨＡおよびＨＡ−Ｘ）のうち２個（以上）の二糖に結合しているもの（ＨＡ−Ｘ−ＨＡのみ）の割合を表し、ここで、Ｘは、架橋剤である。有効クロスリンカー比は、たとえば、ＨＡゲルの酵素分解に続いて、ＬＣ−ＭＳによって決定してもよい。一例として、有効クロスリンカー比の決定は、たとえばＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ由来のコンドロイチナーゼＡＣまたはＰｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを使用して、ＨＡゲルを主要二糖（Δｄｉ−ＨＡ）からなる断片および１〜８個の二糖を含有する結合した架橋剤（ＨＡ−Ｘ）を含む断片に酵素分解し、続いて、ＬＣ−ＭＳを使用してＨＡ−Ｘ断片を決定することによって行うことができる。次いで、断片を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して分離し、質量分析（ＭＳ）を使用して検出することができる。この方法は、（Ｋｅｎｎｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９１（２０１３）４１０〜４１８）に概説された原理を使用し、使用される具体的な架橋剤に対してＬＣ−ＭＳ取得方法におけるＨＡ−ＸおよびＨＡ−Ｘ−ＨＡ断片の質量を補正／適合して、任意の多官能性架橋剤に容易に適合させることができる。
【００３７】
本発明に従う架橋ＨＡ生成物の一部の態様では、生成物はＨＡ１ｇあたり４〜５００ｍＬ、好ましくはＨＡ１ｇあたり１５〜３００ｍＬの膨潤度を有する。
【００３８】
本発明は、第３の側面によれば、本発明に従う架橋ＨＡ生成物と、任意に緩衝剤および／または等張化剤とを含む、水性組成物を提供する。
【００３９】
第４の側面によれば、本発明は、本発明に従う架橋ＨＡ生成物またはその水性組成物を事前に充填した、事前充填シリンジを提供する。
【００４０】
本発明は、第５の側面によれば、たとえば、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正などの美容手術、たとえば、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネル（channel）の形成、失禁の治療、および整形外科用途などの医療手術、ならびに皮膚に水分を補給するおよび／または活力を付与するための、本発明に従う架橋ＨＡ生成物またはその水性組成物の使用を提供する。
【００４１】
第６の側面によれば、本発明は、美容または医療手術を受けている対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明に従う架橋ＨＡ生成物またはその水性組成物を投与することを伴う、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】図１は、ＨＡを架橋するための方法を概略的に示す。
【図１−２】図１は、ＨＡを架橋するための方法を概略的に示す。
【図２】図２は、ＨＡを架橋するための方法の続きを概略的に示す。
【図３】図３は、最終架橋工程における異なる反応時間および温度の場合のＨＡ粒子についての有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）を示す。
【図４】図４は、架橋ＨＡゲルの熱誘導性分解を示す。
【図５】図５は、架橋ＨＡゲルのペルオキシルラジカル誘導性分解を示す。
【００４３】
態様の項目化リスト
１．架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）生成物を製造するための方法であって、
（ａ）ＨＡと１種以上の多官能性架橋剤とを水溶液中で反応させることによってＨＡの架橋を開始して、活性化ＨＡを得ることと、
（ｂ）活性化ＨＡから未反応の架橋剤を除去することと、
（ｃ）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供することによって活性化ＨＡの架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることと
を含み、完結架橋工程（ｃ）が、液体沈殿媒体および沈殿形態の活性化ＨＡの懸濁液中で実施される、方法。
【００４４】
２．除去工程（ｂ）が、
（ｂ１）活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、液体沈殿媒体と、沈殿形態の活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｂ２）沈殿した活性化ＨＡの懸濁液から未反応の架橋剤を除去することと
を含む、態様１に記載の方法。
【００４５】
３．除去サブ工程（ｂ２）が、沈殿した活性化ＨＡを液体沈殿媒体で洗浄することを含む、態様２に記載の方法。
【００４６】
４．完結架橋工程（ｃ）が、
（ｃ１）活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、液体沈殿媒体と、沈殿形態の活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｃ２）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、沈殿した活性化ＨＡの懸濁液をさらなる架橋条件に供することによって活性化ＨＡの架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることと
を含む、態様１に記載の方法。
【００４７】
５．液体沈殿媒体が、６５重量％超の水溶性有機溶媒を含有する、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００４８】
６．液体沈殿媒体が、７０〜８０重量％の水溶性有機溶媒と、２０〜３０重量％の水とを含有する、態様５に記載の方法。
【００４９】
７．水溶性有機溶媒が、１種以上の低級アルキルアルコールを含んでいる、態様５〜６の何れか１つに記載の方法。
【００５０】
８．水溶性有機溶媒が、エタノールである、態様７に記載の方法。
【００５１】
９．完結架橋工程（ｃ）における懸濁液が、９以上のｐＨを有する、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５２】
１０．完結架橋工程（ｃ）が、１０〜５０℃の温度で行われる、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５３】
１１．初期架橋工程（ａ）における溶液が、９以上のｐＨを有する、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５４】
１２．初期架橋工程（ａ）が、１０〜５５℃の温度で行われる、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５５】
１３．初期架橋工程（ａ）が、ゲル形態の活性化ＨＡをもたらす、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５６】
１４．工程（ｃ）における最終架橋の前に、工程（ａ）において得られた活性化ＨＡの所望の形状を調製することを含む、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００５７】
１５．工程（ａ）において得られた活性化ＨＡの所望の形状の調製が、工程（ｂ）における活性化ＨＡからの未反応の架橋剤の除去の前に行われる、態様１４に記載の方法。
【００５８】
１６．所望の形状が、０．１〜５．０ｍｍのサイズを有する粒子である、態様１４または１５の何れか１つに記載の方法。
【００５９】
１７．所望の形状が、紐（string）、ネット、またはフィルムである、態様１４または１５の何れか１つに記載の方法。
【００６０】
１８．所望の形状が、紐であり、前記紐が、５：１以上のその長さとその幅との比を有する、態様１７に記載の方法。
【００６１】
１９．架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から選択される、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００６２】
２０．架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンからなる群から選択される、態様１９に記載の方法。
【００６３】
２１．架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、態様２０に記載の方法。
【００６４】
２２．（ｄ）工程（ｃ）からの沈殿した架橋ＨＡ生成物を非沈殿条件に供する工程と、
（ｅ）非沈殿形態の架橋ＨＡ生成物を単離する工程と
をさらに含む、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００６５】
２３．架橋ＨＡ生成物を滅菌する工程を含む、先行する態様の何れかに記載の方法。
【００６６】
２４．３５％以上の有効クロスリンカー比を有する架橋ＨＡ生成物。
【００６７】
２５．３５〜８０％の範囲の有効クロスリンカー比を有する、態様２４に記載の架橋ＨＡ生成物。
【００６８】
２６．ＨＡ１ｇあたり４〜５００ｍＬの膨潤度を有する、態様２４または２５の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物。
【００６９】
２７．ＨＡ１ｇあたり１５〜３００ｍＬの膨潤度を有する、態様２６に記載の架橋ＨＡ生成物。
【００７０】
２８．態様１〜２３の何れか１つに記載の方法によって調製される架橋ＨＡ生成物。
【００７１】
２９．態様１〜２３の何れか１つに記載の方法によって調製される、態様２４〜２７の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物。
【００７２】
３０．ＨＡ生成物が、０．１〜５．０ｍｍのサイズを有する粒子の形状を有する、態様２４〜２９の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物。
【００７３】
３１．ＨＡ生成物が、紐、ネット、またはフィルムの形状を有する、態様２４〜２９の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物。
【００７４】
３２．形状が、紐であり、前記紐が、５：１以上のその長さとその幅との比を有する、態様３１に記載の架橋ＨＡ生成物。
【００７５】
３３．ＨＡ生成物が、乾燥形態である、態様２４〜３２の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物。
【００７６】
３４．態様２４〜３２の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物と、任意に緩衝剤および／または等張化剤とを含む、水性組成物。
【００７７】
３５．１種以上の医薬用化合物（medical compound）をさらに含む、態様３４に記載の水性組成物。
【００７８】
３６．前記医薬用化合物が、局所麻酔薬、抗炎症薬、抗生物質、および骨成長因子からなる群から選択される、態様３５に記載の水性組成物。
【００７９】
３７．前記医薬用化合物が、塩酸リドカインを含む、態様３６に記載の水性組成物。
【００８０】
３８．たとえば、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正などの美容手術における、態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物の使用。
【００８１】
３９．美容手術が、顔面輪郭矯正である、態様３８に記載の使用。
【００８２】
４０．皮膚に水分を補給するおよび／または活力を付与するための、態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物の使用。
【００８３】
４１．医薬または医療デバイスとしての使用のための、態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物。
【００８４】
４２．たとえば、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正など美容手術、またはたとえば、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁の治療、および整形外科用途など医療手術における使用のための、態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物。
【００８５】
４３．美容手術が、顔面輪郭矯正である、態様４２に記載の架橋ＨＡ生成物。
【００８６】
４４．たとえば、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正などの美容手術、またはたとえば、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁の治療、および整形外科用途などの医療手術における使用のための医薬または医療デバイスの製造における、態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物の使用。
【００８７】
４５．美容手術が、顔面輪郭矯正である、態様４４に記載の使用。
【００８８】
４６．態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物を事前に充填した事前充填シリンジ。
【００８９】
４７．美容または医療手術を受けている対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、態様２４〜３３の何れか１つに記載の架橋ＨＡ生成物または態様３４〜３７の何れか１つに記載の水性組成物を投与することを伴う、方法。
【００９０】
４８．美容手術が、顔面輪郭矯正である、態様４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【００９１】
本発明は、第１の側面によれば、非常に望ましい特性を示す架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）生成物を製造するための方法を提供する。この方法は最終架橋工程の良好な制御を可能にし、その理由は、それが固体（沈殿）相のみで行われるからである。得られる生成物は、ＨＡの低い修飾度にもかかわらず、低い膨潤度を有するゲルであるという点で独特である。限定された膨潤度を有するゲル生成物が、この低い修飾度で得られることは非常に驚くべきことである。多くの用途の中でも、この方法は、製造過程中に保持される規定の形状を有する架橋ＨＡ生成物の製造を可能にする。本方法はまた、生体適合性の成形された架橋ＨＡ生成物の製造を可能にする。
【００９２】
別段の規定がない限り、「ヒアルロン酸」および「ＨＡ」という用語は互換的に使用され、様々な鎖長および電荷状態の、ならびに様々な化学修飾を有する、ヒアルロン酸またはヒアルロナンのすべてのバリアントおよびバリアントの組合せを包含する。つまり、この用語はまた、ＨＡの様々なヒアルロン酸塩、たとえば、ヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）を包含する。ＨＡの様々な修飾もまた、この用語に包含され、たとえば、酸化、たとえば、ＣＨ2ＯＨ基のＣＯＯＨへの酸化；ビシナルヒドロキシル基の過ヨウ素酸酸化、任意に、それに続く還元またはイミン形成等；還元、たとえば、ＣＯＯＨのＣＨ2ＯＨへの還元；硫酸化；脱アミド化、任意に、それに続く新たな酸による脱アミノ化またはアミド形成；エステル化；様々な化合物による置換、たとえば、架橋剤またはカルボジイミドを使用するもの；異なる分子、たとえば、タンパク質、ペプチド、および活性薬物成分のＨＡとのカップリング；ならびに脱アセチル化を含む。様々な形態のＨＡが、化学修飾および分析中に考慮しなければならない異なる化学特性を有することは、当業者に周知である。たとえば、ある特定のｐＨを有するＨＡ溶液を得ることが望まれる場合、溶解される材料の酸性度、溶解する液体の酸性度、および緩衝能はすべて、溶液が得るｐＨに影響する。
【００９３】
ＨＡ基材は、化学修飾されていない、すなわち、本発明の製造方法の前に架橋または他の修飾に供されていない、ＨＡまたはヒアルロン酸塩であることが好ましい。
【００９４】
ＨＡは、動物および非動物起源の様々な供給源から得ることができる。非動物起源の供給源には、酵母、および好ましくは細菌が含まれる。単一のＨＡ分子の分子量は、典型的には１．５〜３ＭＤａの範囲であるが、他の分子量範囲、たとえば０．５〜１０ＭＤａも可能である。
【００９５】
本方法によって製造される生成物は、架橋ＨＡである。本方法は、ＨＡ鎖間の架橋をもたらし、これにより、共有結合的架橋、ＨＡ鎖の物理的絡み合い、ならびに様々な相互作用、たとえば、水素結合、ファンデルワールス力、および静電相互作用によって結び付いている、ＨＡ分子の連続的に成形された網目構造が作り出される。本発明に従う架橋ＨＡ生成物は、ゲル、またはヒドロゲルである。つまり、これは、液体、典型的には水性液体に供した際に、水不溶性であるが実質的に希薄な、ＨＡ分子の架橋系とみなすことができる。
【００９６】
得られる架橋ＨＡ生成物は、好ましくは、生体適合性である。これは、治療された個体において、免疫応答が生じない、または非常に軽度の免疫応答しか生じないことを示唆する。
【００９７】
架橋ＨＡゲル生成物は、高度に複雑な化学構造であることから、典型的には、その化学構造およびその物理的特性の組合せによって特徴付けられる。非修飾ＨＡからの化学構造の逸脱は、典型的には、修飾度（degree of modification）、修飾度（modification degree）、架橋度、架橋指数、または化学修飾として報告され、これらはすべて、ＨＡに共有結合した架橋剤の量に関連する。この本文を通じて、修飾度という用語が使用される。
【００９８】
架橋ＨＡゲル生成物の最も意義のある物理的特性は、ゲルが吸収できる液体の体積およびゲルのレオロジー特性である。２つの特性は、ゲルの強度、または堅固性と称されることが多いゲルの構造的安定性を表すが、液体の吸収は乾燥ゲルについて決定できる一方で、レオロジー特性は所望の濃度まで膨潤したゲルで測定しなければならない。液体吸収に対する従来の表現は、膨潤、膨潤容量、液体保持容量、膨潤度（swelling degree）、膨潤度（degree of swelling）、最大液体取り込み、および最大膨潤である。この本文を通じて、膨潤度という用語が使用される。架橋ＨＡゲル生成物のレオロジー特性に関して、回転式レオメトリーは、液体のレオロジーの決定にのみ有用であるのに対し、振動式レオメトリーは、ゲルのレオロジーを決定するために必要であることが分かる。測定により、弾性係数および粘性係数の観点からの変形に対するゲルの耐性が得られる。ゲル強度が高いと、所望の濃度まで膨潤したゲル生成物の耐変形性が大きくなる。
【００９９】
インプラントを伴う一部の公知の軟部組織増大治療は、時に、インプラントまたはその一部が所望の治療部位から離れて移動するという欠点を有する。この問題を回避するために、ゲルは、変形に耐えるためにある特定のゲル強度を有することが必要とされる。この特性は、振動モードのレオメトリーを使用して測定することができる。
【０１００】
本発明に従う方法は、少なくとも３つの工程：初期または開始架橋工程、架橋剤除去工程、および最終または完結架橋工程を含んでおり、任意に、それらからなっている。第１の架橋工程は、多くの異なる、温度、時間、および濃度を使用して実施することができる。修飾度が決定され、小部分の架橋が生じるのは、第１の架橋工程中である。第１の架橋がいかにして実施されるかとは無関係に、有効クロスリンカー比は、第２の架橋工程において、典型的には２〜６倍に、またはさらにそれ以上に増加する。
【０１０１】
第１の方法工程において、ＨＡ基材の架橋が開始され、または別の言葉で表現すれば、ＨＡ基材の初期架橋が実施される。ＨＡ基材は、水溶液中に存在し、１種以上の多官能性架橋剤と反応する。これは、ＨＡ基材の実質的な架橋を生じる、すなわち、この工程において既に、２個の別々のＨＡ分子または同じＨＡ分子の２つの離れた部分の共有結合的カップリングが実現される。他の方法工程の開示から明らかとなるように、架橋剤は、この初期架橋工程の前、またはその間にのみ添加される。
【０１０２】
好ましい態様では、初期架橋工程は、ゲル形態の活性化ＨＡをもたらす。別々のＨＡ分子間または同じＨＡ分子の離れた部分の間のこれらの架橋に加えて、これは単一の位置でＨＡ基材に共有結合的にカップリングされている多数の架橋剤も生じ、またこの工程から得られるＨＡは、反応性架橋機能を示すいくつかの架橋剤によって置換されている。したがって、得られる活性化ＨＡは、各架橋が（少なくとも）２個の別々のＨＡ分子間または同じＨＡ分子の２つの離れた部分の間の共有結合的カップリングを伴う、架橋ＨＡ分子と、反応性架橋機能を示す架橋剤によって置換されたＨＡ、すなわち、典型的には、なお反応性の架橋剤とＨＡとの単一の共有結合的カップリングを伴うＨＡとの混合物を含有する。
【０１０３】
ＨＡ基材は、水溶液に溶解している。「溶解した」および「溶液」という用語は、ＨＡ基材が、液体との均質な混合物として存在し、その混合物中で、エネルギー的に有利な相互作用が生じると理解される。溶液に液体を添加すると、溶解したＨＡ基材の濃度が低下する。溶液は、水性である、すなわち、水を含有する。水溶液は、水に溶解したＨＡ基材のみからなっていてもよい。好ましい態様では、初期架橋工程における溶液は、９以上、たとえば、１０以上、またはさらに１１以上のｐＨを有する。
【０１０４】
一般的に言えば、初期架橋工程は、ＨＡの初期架橋が実現され、ＨＡに共有結合的に付着した残存する反応性架橋剤が存在する限り、あらゆる濃度のＨＡおよび架橋剤を使用して行うことができ、時間および温度は変動してもよい。
【０１０５】
初期架橋工程は、典型的には、１０〜７５℃の温度で実行されるが、この工程は、室温、たとえば２０〜２５℃で実行されることが好ましい。他の好ましい温度範囲は、１０〜５５℃、たとえば、１８〜３５℃および３５〜５５℃である。
【０１０６】
初期架橋工程の水溶液は、多官能性である、すなわち、架橋されるＨＡ分子との共有結合を形成するための２つ以上の反応部位を有する、１種以上の架橋剤を含有する。この第３の工程において使用される架橋剤は、二官能性である、すなわち、架橋されるＨＡ分子との共有結合を形成するための２つの反応部位を有することが好ましい。有用な多官能性架橋剤として、これらに限定されないが、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシド、たとえば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンが挙げられ、好ましくはＢＤＤＥである。１種以上の多官能性架橋剤は、エーテル架橋をもたらすことが望ましい。
【０１０７】
初期架橋工程はまた、得られた活性化ＨＡの所望の形状、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸（strand）、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズの調製を伴うか、またはそれが後に続いてもよい。これは、様々な様式、たとえば、押出、細断、および成型で達成してよい。ＨＡ基材の押出は、典型的には、それを所望のサイズの開口部を通してプレスすることを伴う。繊維、紐、または撚糸の寸法、たとえば太さは、開口部の寸法もしくは種類、たとえば、０．１〜２ｍｍもしくは１４〜３０Ｇの範囲の様々な開口部直径の使用、押出圧力、押出速度、および／またはＨＡ濃度を変動させることによって制御することができる。他の種類のオリフィスおよび隙間を使用することによって、異なる形状または構造を生成することができる。別法では、所望のサイズの粒子またはビーズは、活性化ＨＡのゲルを細断することによって、たとえば、活性化ＨＡを所望のメッシュ（開口部）サイズを有するメッシュ材料を通してプレスすることによって調製することができる。ＨＡはまた、様々な形態で、たとえば、フィルム、ネット、ディスク、またはビーズとして成型することもできる。
【０１０８】
この形状は、製造過程を通じておよび最終生成物において維持することができる。ＨＡ基材が生理食塩水中で膨潤形態である場合、形状は５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満で、０．５ｍｍよりも大きい、またはさらに０．８ｍｍよりも大きい延伸を有することが好ましい。生理食塩水中で完全に膨潤した際の、好ましい形状は０．１〜５．０ｍｍ、たとえば０．５〜１ｍｍのサイズを有する粒子またはビーズである。繊維、紐、撚糸、ネット、およびフィルムの場合、１つまたは２つの寸法が、それぞれ、５ｍｍよりもはるかに大きい寸法が適用可能であり得る。
【０１０９】
初期架橋および任意の成形に続いて、架橋剤除去工程が行われる。この工程は、活性化ＨＡから未反応の架橋剤を除去することを伴う。上記のように、初期架橋工程から得られる活性化ＨＡは、架橋ＨＡ分子と、反応性架橋機能を示す架橋剤によって置換されたＨＡとの混合物を含有する。初期架橋工程の後、ＨＡに共有結合的にカップリングされていない架橋剤もまた有意に存在し、その理由はＨＡが、全く反応しなかったからか、または水分子もしくは水性媒体の他の成分、たとえば塩化物イオンと反応したからか、その何れかである。未反応の架橋剤、すなわち、ＨＡに共有結合的にカップリングされていない架橋剤は、この工程において、たとえば、濾過、デカンテーション、および／または遠心分離を伴う、任意の好適な手段、たとえば透析および洗浄によって除去される。この工程において架橋剤が添加されないことは言うまでもない。
【０１１０】
好ましい態様では、未反応の架橋剤と関連している活性化ＨＡを、未反応の架橋剤を除去する前、またはそれと同時に、液体沈殿媒体中に沈殿させる。
【０１１１】
活性化ＨＡは、ＨＡの可溶性の低減に起因して沈殿する。これは、典型的には、活性化ＨＡが不溶である液体媒体に活性化ＨＡを供することによって実現される。当業者に熟知されているように、これは、沈殿媒体に活性化ＨＡを添加することによって、活性化ＨＡに沈殿媒体を添加することによって、または他の好適な方法工程によって実現してもよい。液体沈殿媒体は、ＨＡの沈殿条件をもたらすある量の１種以上の水溶性有機溶媒を含む。得られる固体のＨＡ沈殿物は、溶質相から析出し、典型的には、濾過、デカンテーション、遠心分離によって、または手動でピンセットなどを使用して、残液から分離することができる。得られる懸濁液は、液体沈殿媒体と、沈殿形態の活性化ＨＡとを含んでいる。未反応の架橋剤は、たとえば、濾過、デカンテーション、および／または遠心分離を伴う、任意の好適な手段、たとえば、透析および洗浄によって洗浄除去される。沈殿した活性化ＨＡを液体沈殿媒体、典型的には、活性化ＨＡの沈殿のために使用された同じ種類の液体沈殿媒体で洗浄することによって、沈殿した活性化ＨＡの懸濁液から未反応の架橋剤を除去することが好ましい。沈殿形態の活性化ＨＡからの架橋剤の除去は有利であり、その理由は、非常に清浄な中間生成物、すなわち、未反応の架橋剤が残存しないものが急速に得られるからである。この架橋剤除去工程はまた、大規模プロセスにおいて非常に有用である。
【０１１２】
ＨＡまたはＨＡゲルは、それが存在している液体媒体に応じて、溶解したもしくは膨潤したゲル形態、または沈殿形態であり得る。
【０１１３】
ＨＡの良溶媒中、すなわち、ＨＡおよび溶媒間の相互作用が、ＨＡ分子自体の間の相互作用に対して、エネルギー的に有利である溶媒中では、ＨＡまたはＨＡゲルは、溶解したまたは膨潤したゲル形態となる。ＨＡの良溶媒の一例は、水である。
【０１１４】
ＨＡの貧溶媒またはＨＡの非溶媒中、すなわち、ＨＡ分子自体の間の相互作用が、ＨＡおよび溶媒間の相互作用に対して、エネルギー的に有利である溶媒中では、ＨＡまたはＨＡゲルは、沈殿形態となる。ＨＡの貧溶媒の一例は、エタノールである。
【０１１５】
ここで使用される「液体沈殿媒体」という用語は、活性化ＨＡが浸漬された際に沈殿状態となる液体媒体を指す。言い換えれば、液体沈殿媒体は、活性化ＨＡに対する非溶媒である。
【０１１６】
液体沈殿媒体は、典型的には、水に溶解した、５０重量％超、たとえば６５重量％超の水溶性有機溶媒と、任意のさらなる構成成分、たとえば、塩、緩衝液、塩基、および酸とを含有する。水溶性有機溶媒は、活性化ＨＡの沈殿を実現するのに十分な濃度で存在すべきであるが、必ずしも過剰量で存在するとは限らない。好ましい態様では、液体沈殿媒体は、５０重量％超の水溶性有機溶媒と、最大５０重量％の水とを、好ましくは、６０〜９０重量％または６５〜８５重量％の水溶性有機溶媒と、１０〜４０重量％または１５〜３５重量％の水とを含んでいる、または含有する。具体的な態様では、液体沈殿媒体は、６０重量％超、好ましくは、６０〜９０重量％、または６５〜８５重量％の水溶性有機溶媒と、さらなる構成成分、たとえば、塩、緩衝液、塩基、および酸と、水とを合計１００重量％まで含んでいる。
【０１１７】
本発明に従って使用される有機溶媒は、炭素含有溶媒であり、多様な極性度を示してよい。これらの有機溶媒は「溶媒」と呼ばれるが、これらは製造過程中に、ＨＡの可溶性を均衡およびシフトさせるのに利用されると理解されたい。ＨＡは、ある特定の有機溶媒濃度間隔では、有機溶媒に非常に良く溶解し得るが、有機溶媒濃度が増加すると、析出し、沈殿物を形成する。たとえば、ＨＡは、有機溶媒、たとえば低級アルキルアルコールおよび水の５０／５０（重量／重量）混合物には溶解することができるが、９０／１０（重量／重量）混合物中では析出し、沈殿物を形成する。非沈殿条件、たとえば、５０／５０または０／１００混合物に供すると、ＨＡは、沈殿していない溶解状態に戻る。他の因子、たとえば、温度、ｐＨ、イオン強度、および有機溶媒の種類が、ＨＡの沈殿のための限界有機溶媒濃度に影響を及ぼし得ることは、当業者に熟知されている。所与の条件下でのＨＡの沈殿のための限界濃度は、当業者に周知であるか、または当業者が容易に決定することができる。例として、ＨＡの沈殿のための限界濃度（水およびエタノールの混合物中）は、およそ６５重量％エタノールである。
【０１１８】
本発明に従う有機溶媒として、これらに限定されないが、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、１，４−ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、酢酸エチル、アセトアミド、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メチルエチルケトン、アセトン、低級アルキルアルコール、たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノールからなる群から選択することができる。本発明に従う有機溶媒は、水溶性である。有機溶媒の好ましい群は、低級アルキルアルコールである。低級アルキルアルコールという用語には、１から６個の炭素原子を有する、第一級、第二級、および第三級アルキルアルコール、すなわち、Ｃ1〜6アルキルアルコールが含まれる。低級アルキルアルコールの具体的な例として、メタノール、エタノール、変性スピリット、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、およびｔ−ブタノールが挙げられる。好ましい低級アルキルアルコールは、価格、入手のしやすさ、および容易な取り扱いより、メタノールおよびエタノール、特にエタノールである。
【０１１９】
架橋剤除去工程はまた、得られた活性化ＨＡの所望の形状、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、およびビーズの調製を伴うか、または続けて行ってもよい。活性化ＨＡの所望の形状の調製は、工程における活性化ＨＡからの未反応の架橋剤の実際の除去の前に行われることが好ましい。したがって、所望の形状の調製は、好ましくは、活性化ＨＡの一切の沈殿の前に行ってもよい。
【０１２０】
所望の形状の調製は、様々な様式、たとえば、押出、細断、および成型で達成してよい。ＨＡ基材の押出は、典型的には、それを所望のサイズの開口部を通してプレスすることを伴う。繊維、紐、または撚糸の寸法、たとえば太さは、開口部の寸法もしくは種類、たとえば、０．１〜２ｍｍもしくは１４〜３０Ｇの範囲の様々な開口部直径の使用、押出圧力、押出速度、および／またはＨＡ濃度を変動させることによって制御することができる。他の種類のオリフィスおよび隙間を使用することによって、異なる形状または構造を生成することができる。別法では、所望のサイズの粒子またはビーズは、活性化ＨＡのゲルを細断することによって、たとえば、活性化ＨＡを所望のメッシュ（開口部）サイズを有するメッシュ材料を通してプレスすることによって調製することができる。またＨＡは様々な形態で、たとえば、フィルム、ネット、ディスク、またはビーズとして成型することもできる。
【０１２１】
この形状は製造過程を通じて，および最終生成物において維持することができる。ある特定の好ましい態様では、ＨＡ基材が生理食塩水中で膨潤形態である場合、形状は５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満で、０．５ｍｍよりも大きい、またはさらに０．８ｍｍよりも大きい延伸を有する。生理食塩水中で完全に膨潤した際の、好ましい形状は０．１〜５．０ｍｍ、たとえば、０．２〜３．０ｍｍまたは０．５〜１ｍｍのサイズを有する粒子またはビーズである。ある特定の他の好ましい態様では、ＨＡ基材が生理食塩水中で膨潤形態である場合、形状は少なくとも１つの寸法が、５ｍｍ超、または５ｍｍをはるかに超える延伸を有する。好ましい形状は、数センチメートル、たとえば１〜１００センチメートルの長さを有する、繊維、紐、または撚糸である。その長さとその幅またはその平均直径との比は、５：１以上、たとえば１００：１以上であり、任意に、１００００：１以下、たとえば２５００：１以下であることが好ましい。
【０１２２】
架橋剤除去および任意の成形に続いて、最終または完結架橋工程が行われる。この方法工程において、活性化ＨＡ基材の架橋を完結させる。初期架橋工程においてＨＡに共有結合的に付着した架橋剤中の残存する反応性基を、活性化ＨＡ上のさらなる利用可能な部位と反応させて、さらなる架橋、すなわち、（少なくとも）２個の別々のＨＡ分子間または同じＨＡ分子の２つの離れた部分の間の共有結合的カップリングを実現する。初期架橋工程において得られた活性化ＨＡの所望の形状を、この完結架橋工程の前に調製することが好ましい。
【０１２３】
この工程は、ＨＡの架橋を完結させるが、この工程において遊離したまたは未結合の架橋剤は存在しないことに留意されたい。初期架橋工程から残存する未結合の一切の架橋剤は、架橋剤除去工程において除去されている。したがって、この工程において、または初期架橋工程もしくは架橋剤除去工程の後に続く一切の工程において、架橋剤は添加すべきでないということになる。最終架橋ＨＡ生成物を異なる形状に加工してもよいが、活性化ＨＡは、最終架橋工程の前に、所望の形状に加工されていることが好ましい。
【０１２４】
活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供することによって、活性化ＨＡの架橋ＨＡ生成物への架橋を完結させる。完結架橋工程は、液体沈殿媒体および沈殿形態の活性化ＨＡの懸濁液中で実施される。これは、有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）、すなわち、結合した全架橋剤（ＨＡ−Ｘ−ＨＡおよびＨＡ−Ｘ）のうち２個（以上）の二糖に結合しているもの（ＨＡ−Ｘ−ＨＡのみ）の割合を改善すると考えられる。何れかの特定の理論に拘泥することは望まないが、これは、第１に、ＨＡ鎖が互いに接近すること、および第２に、沈殿したＨＡ網目構造内における競合する水分子の局所的非存在に起因し得る。また沈殿形態の活性化ＨＡの懸濁液中で完結架橋工程を実施することは、たとえば周囲の沈殿媒体およびハロゲン化物イオンとの副反応を限定する。この工程において追加の架橋剤は添加されない。
【０１２５】
完結架橋とは、沈殿形態の活性化ＨＡの懸濁液中で架橋条件を導入するときに生じる架橋を意味する。架橋条件とは、反応性機能を示す架橋剤が活性化ＨＡ上の利用可能な部位と反応して、さらなる架橋を実現する条件を意味する。
【０１２６】
最終または完結という用語は、第２の架橋工程を第１の開始架橋工程と区別するために使用される。完結架橋は、結合した全架橋剤（ＨＡ−Ｘ−ＨＡおよびＨＡ−Ｘ）のうち２個（以上）の二糖に結合しているもの（ＨＡ−Ｘ−ＨＡのみ）の割合を増加させる。
【０１２７】
上記のように、活性化ＨＡは、未反応の架橋剤を除去する前、またはそれと同時に、液体沈殿媒体中に沈殿させてもよい。別法では、液体沈殿媒体中での活性化ＨＡの沈殿は、未反応の架橋剤の除去の後、たとえば、最終架橋工程において活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供する前に実施される。したがって、最終架橋工程は、活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、液体沈殿媒体と、沈殿形態の活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、沈殿した活性化ＨＡの懸濁液をさらなる架橋条件に供することによって活性化ＨＡの架橋を完結させることとを伴っていてもよい。やはり、この工程においても追加の架橋剤は添加されない。
【０１２８】
好ましい態様では、完結架橋工程における懸濁液は、９以上、たとえば、１０以上、１１以上、またはさらに１２以上のｐＨを有する。
【０１２９】
完結架橋工程は、典型的には、１０〜７５℃の温度で実行されるが、この工程は、室温、たとえば２０〜２５℃で実行されることが好ましい。好ましい温度範囲は、１０〜５０℃、たとえば１８〜４０℃である。
【０１３０】
本発明に従う方法はまた、１つ以上のさらなる工程を含んでいてもよい。好ましい方法工程は、完結架橋工程からの沈殿した架橋ＨＡ生成物を非沈殿条件に供することを伴う。これは、典型的には、架橋ＨＡ生成物を液体媒体に供し、非沈殿状態に戻すことを伴う。液体媒体は、典型的には、水、生理食塩水、またはそれらの混合物および／もしくは組合せであり、任意に、非沈殿濃度の有機溶媒、たとえば、メタノールまたはエタノールを含む。
【０１３１】
架橋に起因して、得られるＨＡ生成物は、相互接合され絡み合ったＨＡ鎖の連続的な網目構造であり、これは、非沈殿条件下で、液体を吸収（膨潤）し、ゲルを形成する。膨潤は、ゲルが完全に膨潤し、さらなる液体を吸収できなくなるまで膨潤を進行させることもでき、またはより初期の段階で中断して、部分的に膨潤したゲルを得ることもできる。部分的に膨潤したゲルは、ゲルのさらなる加工のための中間体として有用であり得、たとえば、所望のサイズおよび形状のゲル構造のさらなる機械的生成を実施することができる。例として、フィルムを切断して粒子、薄片、または小片とすることができる、ゲル繊維を切断してより短い断片とすることができる、明確に画定された不規則な形状をフィルムから設計することができる、等である。架橋ＨＡの、繊維、紐、または撚糸はまた、架橋完了後、乾燥の前または後に、織り合わせてネットまたはフィルムを形成することもできる。部分的に膨潤した、成形されたゲル生成物を所望の部位でその埋入中に使用して、投与を容易化し、患者の不快感を最小化し、残存膨潤容量を使用することによって挙上能（lifting capacity）を高めることも好都合であり得る。
【０１３２】
成形されたゲル生成物を過剰の液体中で非沈殿条件に供すると、その最大膨潤度（ＳｗＤ）、または逆にその最小ＨＡ濃度（Ｃmin）、すなわち、ゲル生成物が完全に膨潤する際のＨＡ濃度を決定することも可能である。本発明に従う製造方法を使用すると、ＨＡ１ｇあたり４〜５００ｍＬ、好ましくは、ＨＡ１ｇあたり１５〜３００ｍＬの膨潤度を得ることが可能である。これは、０．２〜２５％（ｗ／ｗ）、すなわち２〜２５０ｍｇ／ｇ、たとえば、０．３〜７％（ｗ／ｗ）、すなわち３〜７０ｍｇ／ｇの範囲のＣmin値を示唆する。Ｃmin値は、０．３〜５％（ｗ／ｖ）、すなわち３〜５０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。所望の膨潤度（またはＣmin値）を、最小限の修飾度で実現できることが非常に有利であるが、膨潤度を調節する従来の様式は、修飾度を変動させる手段によるものである。したがって、本発明の製造方法は、成形されたゲル生成物の膨潤容量を調節するための新たな概念を提供し、これは、驚くべきことに、ゲルの低い修飾度に対する高いＣmin値（低い膨潤度）を有する、堅固に成形されたゲルの生成を可能にする。
【０１３３】
修飾効率（ＭｏＥ）は、ゲルの最小ＨＡ濃度（Ｃmin）、または硬度／強度と、架橋剤によるその化学修飾度（ＭｏＤ）との比の尺度である。本発明に従う製造方法を使用すると、２以上、好ましくは３〜５００、たとえば、５〜２００または７〜１００の範囲の修飾効率を有する架橋ＨＡ生成物を得ることが可能である。何れかの具体的な理論に限定されることは望まないが、ゲルの有益な特性は、驚くほど高い程度の有効な架橋、すなわち、高い程度の結合した架橋剤（有効クロスリンカー比、典型的には、３５％以上、たとえば、４０％以上またはさらに５０％以上）が、実際に、ＨＡに２つ（以上）の部位で結合していることと、所望の目的のための架橋の有効な位置決定、および恐らくは、極めて高い程度の絡み合いの保持とを組み合わせた結果であると企図される。得られるＨＡ生成物の低い修飾度から当業者が予測するものとは対照的に、本発明に従う方法は、驚くべきことに、高い硬度／強度を有するゲルを提供する。いかなる状況下でも、本発明に従う方法は、修飾度に対する膨潤度をさらに調節する有用な様式を提供する。
【０１３４】
任意に、製造方法はまた、架橋ＨＡ生成物を単離する工程を伴う。生成物が沈殿条件下に保たれるかまたは非沈殿条件に供されたかに応じて、この工程は、沈殿形態または非沈殿形態の生成物を単離することを伴い得る。次いで、単離された沈殿または非沈殿生成物は、滅菌した架橋ＨＡ生成物を得るために、滅菌、たとえば、オートクレーブ、放射線照射、加熱等に供することができる。
【０１３５】
所望の場合、他の物質、たとえば、局所麻酔薬（たとえば塩酸リドカイン）、抗炎症薬、抗生物質、および他の好適な補助的薬剤、たとえば、骨成長因子または細胞を、架橋ＨＡ生成物が得られた後に添加してもよい。
【０１３６】
ここで図面を参照すると、架橋ＨＡ生成物を製造するための一部の好ましい方法が図１〜２に概略的に図示されている。図１に示された方法工程の各組合せ（１Ａ〜１Ｆ）は、架橋ＨＡ生成物をもたらすが、これらは何れも、点線矢印によって図示され図２（２Ａ〜２Ｄ）に例示されたように、さらなる下流の方法工程の任意の組合せと組み合わせてもよい。
【０１３７】
最も一般的な方法が図１Ａに図示されており、ここで、ＨＡと多官能性架橋剤とを水溶液中で反応させることによってＨＡの架橋を開始して、活性化ＨＡを得る。一切の未反応の架橋剤を活性化ＨＡから除去する。いかなる追加の架橋剤も添加せずに、液体沈殿媒体の懸濁液中で沈殿形態の活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供することによって活性化ＨＡの架橋を完結させる。これらの工程は、低から中程度の修飾度を有しながら、同時に低から中程度の液体保持容量、または膨潤度によって示される高いゲル強度を有する、本発明に従う架橋ＨＡ生成物をもたらす。
【０１３８】
図１Ｂ〜１Ｃおよび１Ｅ〜１Ｆに図示したように、活性化ＨＡの沈殿は、溶液中での初期架橋と完結架橋との間の何れの時点で行ってもよい。したがって、活性化ＨＡの沈殿は、未結合の架橋剤の除去の前（図１Ｂ、１Ｅ〜１Ｆ）に行ってもよく、または未結合の架橋剤の除去の後（図１Ｃ）に行ってもよい。
【０１３９】
本発明に従う方法はまた、図１Ｄ〜１Ｆに図示したように、活性化ＨＡを成形することを伴っていてもよい。成形は、溶液中での初期架橋と完結架橋との間の何れの時点で行ってもよい。したがって、成形は、未結合の架橋剤の除去の前（図１Ｄ、１Ｆ）に行ってもよく、または未結合の架橋剤の除去の後（図１Ｆ）に行ってもよい。成形はまた、活性化ＨＡの沈殿の前（図１Ｅ）に行ってもよく、または活性化ＨＡの沈殿の後（図１Ｆ）に行ってもよい。
【０１４０】
また架橋ＨＡ生成物はさらなる下流の方法工程、たとえば、非沈殿条件下での再膨潤ならびに／または生成物の単離および／もしくは滅菌に供してもよい。たとえば、架橋ＨＡ生成物は、図２Ａに記載されたように、非沈殿条件に供し、生成媒体から単離してもよい。
【０１４１】
架橋ＨＡ生成物はまた、図２Ｂ〜２Ｄに図示したように、滅菌、たとえばオートクレーブに供してもよい。多くの用途の場合、図２Ｃ〜２Ｄに図示したように、すぐに使用できるデバイス、たとえば注射器に架橋ＨＡ生成物をローディングすることが好ましい。ＨＡ生成物は、デバイスへのローディングの前（図２Ｄ）またはデバイスへのローディングの後（図２Ｃ）に、滅菌、たとえばオートクレーブしてもよい。
【０１４２】
一側面によれば、本発明は、架橋ＨＡ生成物を提供する。一態様によれば、生成物は、本発明の製造方法によって製造される、または製造することができる。本発明に従う架橋ＨＡ生成物は、ゲル、またはヒドロゲルである。つまり、これは、液体、典型的には水性液体に供した際に、水不溶性であるが実質的に希薄な、ＨＡ分子の架橋系とみなすことができる。ゲルは、重量で大部分が液体であり、たとえば、９０〜９９．９％の水を含有することができるが、液体中の３次元の架橋ＨＡ網目構造に起因して、固体のように挙動する。その相当な液体含量に起因して、成形されたゲルは、構造的に柔軟であり、天然の組織と類似しており、これにより、組織工学における足場としておよび組織増大のために非常に有用となる。ＨＡ鎖の天然の絡み合いとともに、ゲルにその構造および特性を付与するのは、ＨＡ分子における架橋およびその付着位置であり、これらは、その膨潤度に緊密に関連する。  付着した架橋剤の量は、修飾度（ＭｏＤ）、すなわち、繰り返しＨＡ二糖単位の総数に対する結合した架橋剤のモル量として定量化し、報告することができる。本発明に従う架橋ヒアルロン酸生成物は、二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜９０個（０．１〜９％）、好ましくは、二糖単位１０００個あたり架橋剤単位１〜４０個（０．１〜４％）の修飾度を有することが好ましい。架橋反応の有効性は、１つ（以上）のＨＡ鎖に（少なくとも）２つの端部で接合されている、付着した架橋剤の量によって示され、有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）として報告される。驚くべきことに、ＣｒＲは、有利なことに、架橋反応を２つの別々の工程に分けることによって、特に、最終架橋工程の前にＨＡ沈殿工程を組み入れることによって何倍にも増加し得ることが今回分かり、実験で示された。具体的には、ＣｒＲは、最終架橋工程によって、少なくとも１．５倍、好ましくは、２〜１０倍、たとえば２〜６倍増加する。本発明に従う生成物は、３５％以上、より好ましくは４０％以上、たとえば、４０〜８０％、またはさらに５０〜８０％の範囲の有効クロスリンカー比を有することが好ましい。これらの生成物は、結果的に生成物中に有効な架橋をもたらさない少数の架橋剤を有する。高い有効クロスリンカー比は、ゲル強度に対して驚くほど低い総修飾度を可能にし、これは、高い生体適合性を確保するのに有利である。
【０１４３】
ゲルの別の特徴は、完全に膨潤するまで水を吸収するその容量である。液体をさらに添加しても、ゲルは希釈されず、すなわち、ゲルは、遊離分子の溶液のように無限に希釈することができない。ゲルを非沈殿条件に供すると、その膨潤度、または逆にその最小濃度（Ｃmin）、すなわち、ゲル生成物が完全に膨潤する際のＨＡ濃度を決定することも可能である。硬質（低膨潤）のゲルは、一般的に、軟質（高膨潤）のゲルよりも、粘性が低く、弾性が高く、長いインビボ半減期を有すると予測される。しかしながら、硬質のゲルは、高度に化学修飾されている場合、身体によって異物として認識され得る。本発明に従う生成物は、ＨＡ１ｇあたり４〜５００ｍＬ、好ましくは、ＨＡ１ｇあたり１５〜３００ｍＬの膨潤度を有することが好ましい。これは、０．２〜２５％（ｗ／ｗ）、すなわち２〜２５０ｍｇ／ｇ、たとえば、０．３〜７％（ｗ／ｗ）、すなわち３〜７０ｍｇ／ｇの範囲のＣmin値を示唆する。Ｃmin値は、０．３〜５％（ｗ／ｖ）、すなわち３〜５０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。
【０１４４】
本発明に従う架橋ＨＡ生成物は、多官能性である１種以上の架橋剤により架橋されており、すなわち、架橋剤は、架橋されるＨＡ分子との共有結合を形成するための２つ以上の反応部位を有する。架橋剤は、二官能性であり、すなわち、架橋されるＨＡ分子との共有結合を形成するための２つの反応部位を有することが好ましい。有用な多官能性架橋剤として、これらに限定されないが、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシド、たとえば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）、およびジエポキシオクタンが挙げられ、好ましくはＢＤＤＥである。ＨＡゲル生成物は、好適な安定性をもたらすエーテル架橋により架橋されていることが望ましい。
【０１４５】
成形されたＨＡゲル生成物は、多重架橋であり、すなわち、好ましくはエーテル結合を含む少なくとも２つの異なる種類の結合を含有することもできる。ＨＡ生成物は、一重架橋であり、すなわち、単一の種類の架橋、好ましくはエーテル架橋を本質的に含有することが好ましい。一重架橋生成物は、化学的に明確に定義されているという利点を有する。単一の種類の架橋を有する生成物が、そのような望ましい特性を示すことが有利である。具体的な態様では、ＨＡ生成物は、エーテル架橋により架橋されており、これにより、安定した、オートクレーブ可能な生成物が得られる。
【０１４６】
生成物の所望の膨潤度（またはＣmin値）を最小限の修飾度で得られることが非常に有利であるが、膨潤度を調節する従来の様式は、修飾度を変動させる手段によるものである。修飾度を最小化する主要な理由は、ゲルの生体適合性が高いことを確保することにあるが、当業者は他の利点を熟知している。成形された生成物は、ゲルの修飾度に対する高いＣmin値（低い膨潤度）を特徴とする。修飾効率（ＭｏＥ）は、ゲルの硬度および強度を反映する最小ＨＡ濃度（Ｃmin）と、架橋剤によるゲルの化学修飾度との比の尺度である。本発明に従う架橋ＨＡ生成物は、２以上、好ましくは３〜５００の範囲、たとえば、５〜２００または７〜１００の範囲の修飾効率を有する。１０以上、たとえば２０〜１９０の範囲の修飾効率を有する生成物は、低から中程度の修飾度と、同時に低から中程度の膨潤度、または液体保持容量とを初めて兼ね備える。それにより、生体適合性であり高い耐変形性を有する、堅固な架橋ＨＡ生成物を提供することが可能である。
【０１４７】
さらに、本発明に従う架橋ＨＡゲル生成物は、粘弾性であることが好ましい。これは、ゲル生成物が粘性および弾性特性の組合せを示すことを示唆する。当業者に周知であるように、粘弾性特性は、レオメーターを用いて決定することができる。振動モードにおいて、弾性係数（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）を、０．１または１Ｈｚの周波数で決定することができる。本発明に従うある特定の粘弾性ゲル生成物の場合、以下の関係を満たすことが好ましい：
【０１４８】
【数１】
0006479783.tif 000002
【０１４９】
本発明に従う生成物は、規定の物理的形態または構造、たとえば、粒子、繊維、紐、撚糸、ネット、フィルム、ディスク、またはビーズで製造することができる。ＨＡ基材が生理食塩水中で膨潤形態である場合、形状は５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満で、０．５ｍｍよりも大きい、またはさらに０．８ｍｍよりも大きい延伸を有することが好ましい。生理食塩水中で完全に膨潤した際の、好ましい形状は０．１〜５．０ｍｍ、たとえば０．５〜１ｍｍのサイズを有する粒子またはビーズである。
【０１５０】
本発明の一態様によれば、架橋ＨＡゲル生成物は、薬物送達デバイスとして有用であり、薬物送達の方法において使用され得る。
【０１５１】
本発明に従う架橋ＨＡ生成物は、皮膚に水分を補給するおよび／または活力を付与するのに有用である。この目的では、生成物は、たとえば、皮膚内に注射してもよく、または皮膚に塗布されるクリームに組み入れてもよい。
【０１５２】
本発明に従う架橋ＨＡ生成物は、美容または医療手術において有用である。美容手術の非限定的な例は、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正、特に顔面輪郭矯正である。医療手術の非限定的な例は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、整形外科用途、失禁の治療、膀胱尿管逆流（ＶＵＲ）の治療、ならびにたとえば眼科における排液を目的とした、および組織を離しておくためのチャネルの形成である。
【０１５３】
一側面によれば、本発明は、美容または医療手術を受けている対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明に従う架橋ＨＡ生成物を投与することを伴う、方法を提供する。医療手術の非限定的な例は、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、整形外科用途、たとえば、腰および関節治療、ならびにたとえば眼科における排液を目的とした、および組織を離しておくためのチャネルの形成である。
【０１５４】
所望の形状およびサイズは、生成物の製造中に構成され、すなわち、完結架橋の前に基材を所望の形状に構成することによって構成される。所望の構造サイズを得る別の好適な様式は、所望の濃度の架橋ＨＡゲル生成物を製造し、ゲルを機械的破砕に供する、たとえば、膨潤したもしくは部分的に膨潤したゲル、または沈殿した架橋生成物を、細断する、磨砕する、または好適な細孔径を有するフィルターもしくはメッシュに通過させることを伴う。得られるゲル粒子または小片を生理食塩液中に分散させて、所望のサイズおよび形状の粒子を有するゲル分散液またはスラリーが得られる。形状に応じて、ゲル構造のサイズは、任意の好適な様式で、たとえば、レーザー回折、顕微鏡法、濾過等によって決定してよく、粒子の２つの端部間の最長距離によって決められる。球形構造の場合、直径は、この目的でのサイズと同等である。
【０１５５】
有用なゲル構造のサイズ範囲および形状は、意図された用途によって決まる。軟部組織増大、好ましくは皮下投与、筋肉下投与、または骨膜上投与の場合、生理食塩液に供した際に０．１ｍｍ超のサイズを有する、ゲルの、粒子、小片、または繊維が有用である。ここで使用される「軟部組織増大」という用語は、これらに限定されないが、顔面輪郭矯正（たとえば、より目立つ頬または顎）、陥凹変形の修正（たとえば、外傷後、ＨＩＶ関連脂肪組織萎縮症）、および加齢による深い顔面しわの修正を含む、軟部組織の任意の種類の体積増大を指す。したがって、軟部組織増大は、単に、美容目的で、または医療目的で、たとえば、外傷または変性疾患後に使用してもよい。これらの２つの目的は、当業者によって容易に区別される。ここで使用される「軟部組織」という用語は、身体の他の構造および器官を接合する、支持する、または取り囲む組織を指す。軟部組織には、筋肉、線維組織、および脂肪が含まれる。軟部組織増大は、ヒトを含む任意の哺乳動物において実施してよい。本方法は、ヒト対象において実施されることが好ましい。
【０１５６】
ここで使用される「表皮下投与（subepidermal administration）」または「上皮下投与（subcuticular administration）」という用語は、皮膚の表皮下への投与を指し、真皮、皮下組織、もしくはより深く、たとえば筋肉下への、または適用可能な場合は、骨膜（骨組織の近傍の）への投与を含む。
【０１５７】
ゲル構造の投与は、任意の好適な様式で、たとえば、標準的なカニューレおよび適切なサイズの針からの注射、またはたとえばフィルムの投与の場合、外科的挿入によって実施してよい。投与は、軟部組織増大が望まれる箇所、たとえば、顎、頬、または顔もしくは身体の他の箇所で実施される。ゲルおよびゲル構造を顔面輪郭矯正において利用することが好ましい。
【０１５８】
本発明に従うインプラントは、本発明に従う架橋ＨＡ生成物、たとえば、≧０．１ｍｍ大のＨＡゲル構造の形状のもの、たとえば、粒子、ビーズ、繊維、または切り出された切片と、任意に緩衝剤および／または等張化剤とを含む、水性組成物であってもよい。組成物は、典型的には、生理食塩緩衝液を含有していてもよい。組成物は、他の好適な活性物質および医薬用化合物、たとえば、局所麻酔薬（たとえば、塩酸リドカイン）、抗炎症薬、抗生物質、および他の好適な補助的薬剤、たとえば、骨成長因子または細胞をさらに含んでいてもよい。本発明に従う架橋ＨＡ生成物またはその水性組成物は、事前充填シリンジ、すなわち、滅菌済みの架橋ＨＡ生成物または成形された生成物を含む滅菌済みの水性組成物を事前に充填したシリンジとして提供されてもよい。架橋ＨＡ生成物は任意に、シリンジ、バッグ、または他の好適な容器中に沈殿形態で保たれ、注射の前にまたはその注射後に体内でその非沈殿形態とされてもよい。
【０１５９】
膨潤したまたは部分的に膨潤した架橋ＨＡ生成物は、オートクレーブ可能であることが好ましく、その理由は、これが最終生成物を滅菌する最も好都合な様式であるからである。これは、滅菌した架橋ＨＡ生成物の調製を可能にする。
【０１６０】
本発明に従うゲル構造、たとえば繊維のサイズは、ゲルをどれだけ膨潤させたか、ならびにゲル構造に含まれるおよび／またはそれを取り囲む、緩衝液、溶液、または担体のイオン強度によって決まることは言うまでもない。本明細書を通じて、所与の構造サイズは、生理的条件、特に等張条件を想定している。ゲル構造は、生理食塩液を含有し、その中に分散していることが好ましいが、本発明に従うゲル構造は、ゲル構造を別の張性、異なるｐＨの溶液に供することによって、またはゲル構造をその最大サイズまで膨潤させていない場合、一時的に異なるサイズとすることができると企図されることに留意されたい。
【０１６１】
ここで使用される場合、生理または等張溶液は２００〜４００ｍＯｓｍ／ｌ、好ましくは２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｌ、より好ましくはおよそ３００ｍＯｓｍ／ｌの範囲のオスモル濃度を有する溶液である。
【０１６２】
本発明に従う架橋ＨＡゲル生成物は、生理的条件下で、恒久的ではないが安定している。本発明の一態様によれば、架橋ＨＡゲル生成物の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも９０％は、インビボで少なくとも２週間、より好ましくは２週間〜２年間残存する。「分解された」という用語は、２０％未満、好ましくは１０％未満の媒体が体内に残存することを示唆する。
【０１６３】
本発明に従う架橋ＨＡゲル生成物は、天然のＨＡよりも、インビボでの耐生分解性が大きいが、市販の架橋ＨＡゲル生成物と比べても同様である（例８および９参照）。安定なゲル生成物の長期にわたる存在は、患者にとって有利であり、その理由は、治療間の時間が増加するからである。天然ＨＡの高い生体適合性を維持するために、生成物が天然ＨＡと高度に類似していることも重要である。
【０１６４】
定義
本開示を通じて、下記の用語は以下のように定義される。
【０１６５】
【表Ａ−１】
0006479783.tif 000003
【０１６６】
【表Ａ−２】
0006479783.tif 000004
【０１６７】
【表Ａ−３】
0006479783.tif 000005
【０１６８】
これらに限定されることは望まないが、本発明を例として以下に例示する。
【０１６９】
［実施例］
分析方法
ＨＡ濃度の決定
ＨＡ含量の決定のための方法は、欧州薬局方１４７２に記載されたヒアルロン酸ナトリウムについての検定試験から採用する。この方法の原理は、硫酸中での加熱によって形成されたフルフラール誘導体の縮合反応がカルバゾール試薬により生じて、紫色の生成物を形成することである。反応は、ＨＡのＤ−グルクロン酸部分に対して特異的である。吸光度を５３０ｎｍで測定し、グルクロン酸を標準化のために使用する。
【０１７０】
試料中のＤ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）の含量から形成された生成物を、カルバゾールとの反応によって決定する。均質な試料溶液を得るため、ＨＡの安定化ゲルを７０℃で硫酸によって分解し、０．９％ＮａＣｌ溶液で希釈する。溶液を９５℃で硫酸と混合し、その後、カルバゾール試薬と混合する。反応によりピンク色の溶液が得られる。色の強度を、比色計を用いて５３０ｎｍで測定すると、各試料の吸光度は、ＧｌｃＡ含量に正比例する。ＨＡ含量を、各試料中のＧｌｃＡ含量から計算する。
【０１７１】
ゲル含量（ＧｅｌＣ）の決定
ＧｅｌＣについては、全ＨＡのうちゲル形態で結合しているものの割合を％で表す。ゲル含量は、０．２２μｍフィルターを通過しない試料中のＨＡの量として定義される。ＧｅｌＣは、ここでは抽出可能ＨＡと称される、濾液中に収集されたＨＡの量から計算される。ゲル含量および抽出可能ＨＡ含量は、ゲル試料中のＨＡの総量に対するパーセントで示される。手短に言えば、ゲル含量は、ある特定の量のゲル試料を試験管中で０．９％ＮａＣｌと混合することによって決定される。ゲルを膨潤させ、その後、ＮａＣｌ相を、０．２２μｍフィルターを通して濾過することによって、ゲル相から分離する。濾液中のＨＡの濃度を、ＨＡ濃度の決定のための手順に従って決定する。
【０１７２】
膨潤度（ＳｗＤ）の決定
ＳｗＤは、ＨＡヒドロゲル生成物の液体吸収能力、すなわち、０．９％ＮａＣｌを吸収するその能力を表し、ＨＡ１グラムあたりで得られる完全に膨潤したゲルの重量（グラム）として報告される。生成物は、典型的には部分的に膨潤した架橋ＨＡゲルであるが、乾燥状態でも存在し得る。ＳｗＤは、膨潤係数（ＳｗＦ）から決定することができる。ＳｗＦは、ある特定の重量（ｗ）の部分的に膨潤した生成物を生理食塩水中で膨潤させると形成される、完全に膨潤したゲルの体積（Ｖ）としてメスシリンダーにおいて測定され、以下のように計算される：
【０１７３】
【数２】
0006479783.tif 000006
【０１７４】
次いで、ＳｗＤは、以下のように計算される：
【０１７５】
【数３】
0006479783.tif 000007
【０１７６】
式中、［ＨＡ］は、部分的に膨潤したゲルのＨＡ濃度（ｇ／ｍＬゲル）であり、ＧｅｌＣは、ゲル含量（％）である。ＧｅｌＣは、ゲルの膨潤に寄与しない抽出可能ＨＡ含量に対して補正するために式中に含まれる。完全に膨潤したゲルの密度は、１．０ｇ／ｍＬであると想定される。
【０１７７】
とりわけ、強いゲルほど低いＳｗＤを有し、弱いゲルほど高いＳｗＤを有する。
【０１７８】
最小濃度（Ｃmin）の決定
Ｃmin（またはｃmin）は、すべての抽出可能ＨＡを除去した後の、０．９％ＮａＣｌ中で完全に膨潤した架橋ＨＡゲル生成物中のゲル形態ＨＡの濃度を表す。生成物はこれ以上液体を吸収できないことから、この濃度は、この特定のゲル生成物について得ることができる最小ＨＡ濃度である。とりわけ、強いゲルほど高いＣminを有し、弱いゲルほど低いＣminを有する。
【０１７９】
Ｃmin（ｍｇ／ｍＬまたはｍｇ／ｇ）は、上記のＳｗＤの決定と同様にして、以下の関係を使用して決定される：
【０１８０】
【数４】
0006479783.tif 000008
【０１８１】
修飾度（ＭｏＤ）の決定
ＭｏＤは、繰り返しＨＡ二糖単位の総数に対する結合した架橋剤のモル量を表す（Ｋｅｎｎｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９１（２０１３）４１０〜４１８）。この尺度は、単連結された架橋剤と実際に架橋された架橋剤とを区別せず、すなわち、少なくとも１つの共有結合を介してＨＡに結合しているすべての架橋剤が含まれる。たとえば、ＢＤＤＥにより架橋されたＨＡゲルについての１％のＭｏＤは、ＨＡゲル中の二糖単位１００個あたり結合した（単連結されたまたは架橋された）ＢＤＤＥ分子が１個存在することを意味する。
【０１８２】
ＭｏＤは、酵素分解されたゲル生成物に対するＮＭＲ分光法を使用して決定される。可溶性ＨＡ、残留（非結合）架橋剤、およびその誘導体を、ゲルの分解の前に０．２２μｍフィルターで濾過することによって洗浄除去する。ゲル生成物を、コンドロイチナーゼを使用する酵素処理によって３７℃で分解する。分解されたゲル生成物を、標準的な５ｍｍプローブを備えた５００ＭＨｚ分光計で１次元1Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録することによってＮＭＲ分光法に供する。
【０１８３】
ＮＭＲスペクトルを、連結されたＢＤＤＥ分子中の４個のプロトンを起源とするδH１．６ｐｐｍのシグナル、およびＨＡ二糖のＮ−アセチルグルコサミン残基上のＣＨ3基中の３個のプロトン由来のδＨ２．０ｐｐｍのシグナルの積分によって評価する。これらの２つのシグナルについての積分間の比は、各シグナルに関与するプロトンの数に対する補正後の、結合したＢＤＤＥのモル量と二糖のモル量との比に比例し、したがって、ＭｏＤが求められる。
【０１８４】
【数５】
0006479783.tif 000009
【０１８５】
修飾効率（ＭｏＥ）の決定
ＭｏＥは、ゲルの最小ＨＡ濃度と修飾度との比であり、すなわち：
【０１８６】
【数６】
0006479783.tif 000010
【０１８７】
Ｃmin（ｍｇ／ｇまたはｍｇ／ｍＬ）およびＭｏＤ（％）は、以前に記載されたように決定される。Ｃminはゲルの強度に密接に関連することから、ＭｏＥは、架橋手順が所望の強度のゲルを生成するのにいかに効率的であるかの尺度である。高いＭｏＥを有するプロセスは、高いＣminおよび低いＭｏＤを有するゲルを生成する、すなわち、ＨＡの限定された化学修飾にもかかわらず、強いゲルが生成される。
【０１８８】
有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）の決定
ＣｒＲは、結合した全架橋剤（ＨＡ−Ｘ−ＨＡおよびＨＡ−Ｘ）のうち２個（以上）の二糖に結合しているもの（ＨＡ−Ｘ−ＨＡのみ）の割合を表す：
【０１８９】
【数７】
0006479783.tif 000011
【０１９０】
式中、Ｘは、架橋剤である。
【０１９１】
この方法は、アースロバクター・アウレッセンス由来のコンドロイチナーゼＡＣまたはプロテウス・ブルガリス由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを使用して、ＨＡゲルを主要二糖（Δｄｉ−ＨＡ）からなる断片および１〜８個の二糖を含有する結合した架橋剤（ＨＡ−Ｘ）を含む断片に分解し、続いて、ＬＣ−ＭＳを使用してＨＡ−Ｘ断片を決定することに基づく。断片は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して分離され、質量分析（ＭＳ）を使用して検出される。各断片群についてのピーク面積を合計し、ＣｒＲを以下のように計算する：
【０１９２】
【数８】
0006479783.tif 000012
【０１９３】
すべての種類のＨＡ−Ｘ断片は、ＭＳ検出器において同じ応答を有する、すなわち、すべての種類のＨＡ−Ｘ断片について、ある特定のピーク面積は、所与のモル量に相当すると想定される（Ｋｅｎｎｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９１（２０１３）４１０〜４１８）。
【０１９４】
ＣｒＲを決定する際、エーテル連結によって結合したＢＤＤＥのみを含めるように注意すべきである。架橋中の条件に応じて、ＢＤＤＥは、エーテル連結とエステル連結の両方を介して、ＨＡに結合し得る。エステル連結は、容易に加水分解されることから、長期的なゲル強度および持続時間に寄与するのはエーテル結合したＢＤＤＥのみである。エステル結合したＢＤＤＥを有する断片は、エーテル結合したＢＤＤＥと同じ質量を有するが、わずかに異なるクロマトグラフィー保持時間を有することから、検出することができる。エステル結合したいかなるＢＤＤＥも含まないＣｒＲを決定するため、分析の前に試料を加水分解すべきである。試料の加水分解は、たとえば、酵素分解の前または後に塩基および／または熱を加えることによって行うこともできる。
【０１９５】
ＣｒＲを決定するための方法を、ＢＤＤＥで架橋されたＨＡを実例として使用してこれまで説明してきたが、これは、クロスリンカーおよび多糖のこの具体的な組合せに決して限定されない。この方法は、（Ｋｅｎｎｅら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ９１（２０１３）４１０〜４１８）に概説された原理を使用し、ＬＣ−ＭＳ取得方法におけるＨＡ−ＸおよびＨＡ−Ｘ−ＨＡ断片の質量を使用される具体的な架橋剤に対して補正／適合して、他の任意の多官能性架橋剤に容易に適合させることができる。
【０１９６】
レオメトリー
振動モードのレオメトリーを使用して、膨潤したゲル生成物の粘弾性特性を決定する。弾性係数（Ｇ’）は、弾性変形に対するゲルの物理的耐性の観点からのゲル強度を表す。粘性係数（Ｇ”）は、粘性変形に対するゲルの物理的耐性の観点からのゲル強度を表す。測定は、振動式レオメーターを使用して実施される。
【０１９７】
レオメトリー測定は、以下のように実施される。周波数掃引を、試料ローディングおよび測定間の少なくとも１５分の休止時間、ならびに０．１％のひずみ（γ）で行う。直径２５ｍｍの平行平板プローブをギャップ１または２ｍｍで使用する。弾性係数（Ｇ’）および粘性係数（Ｇ”）の平均値を、周波数掃引から０．１および１Ｈｚで評価する。振幅掃引を１Ｈｚで行って、周波数掃引が線形粘弾性範囲内のひずみ（γ）で実施されたことを検証する。
【０１９８】
例
例１
１ｇのＨＡを７ｇの０．２５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。ＨＡが溶解した後、０．２ｇの０．２５Ｍ  ＮａＯＨと混合した５０ｍｇのＢＤＤＥを添加した。５０℃で２時間、初期架橋反応を発生させた。活性化ＨＡを金属メッシュに通過させ、３０ｇの水中で短時間膨潤させた。膨潤したゲルをエタノール中に沈殿させ、エタノール／水／ＮａＯＨ混合物で３回洗浄した。５０℃で２時間、エタノールおよびＮａＯＨの溶液中で架橋を完結させた。エタノール濃度は約７０重量％であり、ＮａＯＨ濃度は５０ｍＭであった。見かけのｐＨ７までＨＣｌで中和を実施した。沈殿物を洗浄し、乾燥した。
【０１９９】
得られた乾燥粉末を、緩衝した０．９％ＮａＣｌ中で２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ濃度まで膨潤させて、ゲルとした。ゲルをシリンジに充填し、オートクレーブした。
【０２００】
沈殿およびエタノール混合物中での最終架橋を伴わずに、上記の方法を使用して、標準ゲルを作製した。
【０２０１】
ＭｏＤおよびＣｒＲを分析した。何れのゲルも、３．４％のＭｏＤを有していた。標準物質についてのＣｒＲは０．１であり、これは、沈殿形態で最終架橋されたゲルについては３倍高かった。
【０２０２】
例２
比較実験
架橋ＨＡ生成物を４つの異なる様式Ａ〜Ｄで調製した：
（Ａ）：ＷＯ８７／０７８９８の例２４に従って、架橋ＨＡフィルムを作製した。ヒアルロン酸ナトリウム（３ｗ／ｖ％）を０．７５％（ｖ／ｖ）ＮａＯＨと混合した。１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）を０．２２％（ｗ／ｖ）の濃度まで添加し、２４時間反応させた。流れる蒸留水に対して混合物を２４時間透析した。透析された混合物にアンモニア（２５ｖ／ｖ％）を添加し、混合物をポリスチレンのペトリ皿に注ぎ入れた。これを室温で２日間乾燥させておいた。透明で平面の水不溶性フィルムが得られた。次いで、フィルムを粒子に分割し、生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。
【０２０３】
変法（Ｂ）から（Ｄ）を作製して、変法（Ｂ）に相当するＷＯ８７／０７８９８に記載された乾燥プロセスと、沈殿工程を伴う本発明に従うより有効な架橋プロセスである、変法（Ｃ）および（Ｄ）とがいかに異なるかを実証した。すべての変法（Ｂ）〜（Ｄ）において同じＭｏＤが実現された。
【０２０４】
（Ｂ）：第１の架橋工程で、０．２２％のＢＤＤＥ濃度および０．７５％のＮａＯＨ濃度を使用した。変法（Ａ）に記載されたように、透析、アンモニアの添加、および乾燥を実施した。得られたフィルムは変法（Ａ）と同様の外見であり、同じ様式で処理した。得られた粒子を生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。
【０２０５】
（Ｃ）：変法（Ｂ）と同様の第１の架橋。変法（Ａ）に記載されたように、透析を実施した。ゲルをエタノール中に沈殿させ、７０％ＥｔＯＨおよび０．２３％ＮａＯＨの水溶液中で第２の完結架橋を実施した。粒子を生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。
【０２０６】
（Ｄ）：変法（Ｃ）と同様の製造方法であるが、透析工程を沈殿後の洗浄工程と交換して、一切の未反応のクロスリンカー分子を取り除いた。
【０２０７】
表１に示したように、有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）を、各実験Ａ〜Ｄからの得られたＨＡ粒子について決定した。
【０２０８】
【表１】
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【０２０９】
実験ＡおよびＢにおける乾燥工程を沈殿形態のＨＡの最終架橋で置きかえること（Ｃ〜Ｄ）は、ＭｏＤを増加させることなくＣｒＲを最大６倍に劇的に増加させると結論付けられる。これは、全体の架橋手順の効率が大幅に向上することを示唆し、その理由は、より多数の共有結合的に組み込まれた架橋剤がＨＡの実際の架橋に関与するからである。実験Ａ〜Ｃの透析を沈殿形態のＨＡの洗浄で置きかえること（Ｄ）は、やはりＭｏＤを増加させることなくＣｒＲをさらに増加させることも明らかである。
【０２１０】
例３
初期架橋工程における架橋剤濃度
ＨＡをＢＤＤＥにより架橋する初期工程を実施した。標準試料（Ｒｅｆ）では、さらなる沈殿工程または沈殿したＨＡの架橋を実施しなかった。以下の試料もまた調製した：
（Ａ）：標準物質と同じＢＤＤＥおよびＨＡ濃度であるが、沈殿形態の活性化ＨＡの架橋を伴う
（Ｂ）：Ａと同様、ただし、ＢＤＤＥ＝２／３＊Ａ
（Ｃ）：Ａと同様、ただし、ＢＤＤＥ＝１／３＊Ａ
完結架橋工程を２３℃で４５時間、５０ｍＭ  ＮａＯＨを含有する７０％ＥｔＯＨ中で行った。各試料からの粒子を生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。表２に示したように、修飾度（ＭｏＤ）、有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）、膨潤（ＳｗＤ）、およびゲル含量を、各実験Ａ〜Ｄからの得られたＨＡ粒子について決定した。
【０２１１】
【表２】
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【０２１２】
変法（Ａ）における完結架橋工程の組み入れは、標準試料よりも強いゲル（低い膨潤）および高いＣｒＲをもたらすことが明らかである。初期架橋工程における架橋剤の濃度の減少は高いＣｒＲを維持し、より緩いゲル（より高い膨潤）をもたらすが、ゲル含量の減少を伴う。
【０２１３】
例４
完結架橋工程におけるｐＨ
ＨＡをＢＤＤＥにより架橋する初期工程を実施した。標準試料（Ｒｅｆ）では、さらなる沈殿工程または沈殿したＨＡの架橋を実施しなかった。以下の試料もまた調製した：
（Ａ）：２３℃で４５時間、ＮａＯＨを添加していない７０％ＥｔＯＨ中での完結架橋工程。
【０２１４】
（Ｂ）：２３℃で４５時間、５０ｍＭ  ＮａＯＨを含有する７０％ＥｔＯＨ中での完結架橋工程。
【０２１５】
各実験からの粒子を生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。表３に示したように、修飾度（ＭｏＤ）、有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）、膨潤（ＳｗＤ）、およびゲル含量を、各実験Ａ〜Ｃからの得られたＨＡ粒子について決定した。
【０２１６】
【表３】
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【０２１７】
沈殿形態のＨＡの最終架橋を実施すること（Ａ〜Ｂ）は、特にＮａＯＨを添加した場合（Ｂ）、ＭｏＤを増加させることなくＣｒＲを増加させることが示される。加えて、沈殿形態のＨＡの最終架橋により、得られる生成物のゲル含量が増加し、これにより全体の架橋手順の効率が向上することを示している。
【０２１８】
例５
完結架橋工程における沈殿剤濃度およびｐＨ
ＨＡをＢＤＤＥにより架橋する初期工程を実施した。標準試料（Ｒｅｆ）では、さらなる沈殿工程または沈殿したＨＡの架橋を実施しなかった。試料Ａ〜Ｅは、表４に記載されたように、６０〜９０％（体積／体積）ＥｔＯＨおよび３０〜７０ｍＭ  ＮａＯＨを用いて、２３℃で４５時間の完結架橋工程を伴い調製した。
【０２１９】
各々の実験からの粒子を生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。表４に示したように、修飾度（ＭｏＤ）および有効クロスリンカー比（ＣｒＲ）を、各実験Ａ〜Ｅからの得られたＨＡ粒子について決定した。
【０２２０】
【表４】
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【０２２１】
有効クロスリンカー比は、完結架橋工程における沈殿剤（エタノール）濃度およびｐＨ（ＮａＯＨ濃度）とは無関係であると結論付けられる。
【０２２２】
例６
完結架橋工程における時間および温度
ＨＡをＢＤＤＥにより架橋する初期工程を実施した。活性化ＨＡを沈殿させ、２３℃または３５℃で、７０％ＥｔＯＨおよび５０ｍＭ  ＮａＯＨ中で完結架橋工程を実施し、最大４８時間進行させた。得られた粒子を生理食塩水中で膨潤させ、シリンジに充填し、オートクレーブした。
【０２２３】
図３に示したように、有効クロスリンカー比を、異なる反応時間および温度から得られたＨＡ粒子について決定した。有効クロスリンカー比は、温度によっては特に影響されず、２０時間未満後にプラトーに達すると結論付けられる。
【０２２４】
例７
市販のＨＡゲルの架橋比（ＣｒＲ）（比較例）
多数の市販のゲルについてのＣｒＲを、上記の分析方法セクションに記載されたように決定した。
【０２２５】
【表５】
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【０２２６】
比較として、本発明に従う架橋ＨＡ生成物は０．３５以上、たとえば０．３５〜０．８の範囲のＣｒＲを示す。本発明に従う製造方法は、高いＣｒＲ値を有する新たな範囲のＨＡゲル生成物をもたらすと結論付けられる。
【０２２７】
例８
ＨＡゲルの熱分解速度
熱分解速度を、上記の例３Ｂに従って製造されたＨＡゲル試料について決定した。標準物質として、Ｑ−Ｍｅｄ／ガルデルマ（Ｇａｌｄｅｒｍａ）製の市販製品レスチレン（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ）を使用した。実験は２連で実施した。試料のＣｒＲは０．６であり、標準物質のＣｒＲは０．２であった。
【０２２８】
試料および標準物質をバイアルに移し、９０℃で保存した。異なる時点で、１つのバイアルの試料および１つのバイアルの標準物質を室温に冷却し、ゲル含量について分析した。熱誘導性ゲル分解の結果が図４に示されており、ここで、例３Ｂに従って作製された試料ゲルからの値は、記号（三角形）によって示され、対応するレスチレン標準物質の値は、記号（バツ印）によって示される。
【０２２９】
高いＣｒＲを有する試料について、分解速度は、標準物質と比較して約２倍遅いと結論付けられる。したがって、例３Ｂに従って作製されたゲルは、標準物質の約２倍の予測インビボ持続時間を有する。
【０２３０】
例９
ＨＡゲルのペルオキシルラジカル誘導性分解速度
例６に従って、ゲル試料を製造した。完結架橋工程における温度は、２４時間で３５℃であった。標準物質として、Ｑ−Ｍｅｄ／ガルデルマ製の市販製品レスチレンを使用した。試料のＣｒＲは０．５であり、標準物質のＣｒＲは０．２であった。
【０２３１】
ラジカル分解速度をゲルおよび標準試料について決定した。実験は２連で行った。０．２５ｇのゲルを１０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水中に分散させることによって、ラジカル分解速度を決定した。ラジカル発生剤、２，２’−アゾビス−２−メチル−プロパンイミドアミド、二塩酸塩を１０ｍＭの濃度まで添加し、反応を３７℃で実施した。上澄み液のＨＡ含量を異なる時点で決定した。ゲル含量を、ゲルの初期重量および異なる時点での上澄み液中のＨＡ含量から計算した。ペルオキシルラジカル誘導性分解の結果が図５に示されており、ここで、例６に従って作製された試料ゲルからの値は、記号（四角形）によって示され、対応するレスチレン標準物質の値は、記号（バツ印）によって示される。
【０２３２】
高いＣｒＲを有する試料について、分解速度は、標準物質と比較して約２倍遅いと結論付けられる。したがって、０．５の有効クロスリンカー比を有する例６に従って作製されたゲルは、標準物質の約２倍の予測インビボ持続時間を有する。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
架橋ヒアルロン酸（ＨＡ）生成物を製造するための方法であって、
（ａ）ＨＡと１種以上の多官能性架橋剤とを水溶液中で反応させることによってＨＡの架橋を開始して、活性化ＨＡを得ることと、
（ｂ）前記活性化ＨＡから未反応の架橋剤を除去することと、
（ｃ）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、前記活性化ＨＡをさらなる架橋条件に供することによって前記活性化ＨＡの前記架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることとを含み、前記完結架橋工程（ｃ）が、液体沈殿媒体および沈殿形態の前記活性化ＨＡの懸濁液中で実施される、方法。
［２］
前記除去工程（ｂ）が、
（ｂ１）前記活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、前記液体沈殿媒体と、沈殿形態の前記活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｂ２）沈殿した活性化ＨＡの前記懸濁液から未反応の架橋剤を除去することとを含む、［１］に記載の方法。
［３］
前記除去サブ工程（ｂ２）が、前記沈殿した活性化ＨＡを液体沈殿媒体で洗浄することを含む、［２］に記載の方法。
［４］
前記完結架橋工程（ｃ）が、
（ｃ１）前記活性化ＨＡを液体沈殿媒体中に沈殿させて、前記液体沈殿媒体と、沈殿形態の前記活性化ＨＡとを含む懸濁液を得ることと、
（ｃ２）いかなる追加の架橋剤も添加せずに、沈殿した活性化ＨＡの前記懸濁液をさらなる架橋条件に供することによって前記活性化ＨＡの前記架橋を完結させて、架橋ＨＡ生成物を得ることと
を含む、［１］に記載の方法。
［５］
前記液体沈殿媒体が、６５重量％超の水溶性有機溶媒を含有する、先行する態様の何れかに記載の方法。
［６］
前記水溶性有機溶媒が、エタノールである、［５］に記載の方法。
［７］
前記初期架橋工程（ａ）が、ゲル形態の活性化ＨＡをもたらす、先行する態様の何れかに記載の方法。
［８］
前記架橋剤が、ジビニルスルホン、マルチエポキシド、およびジエポキシドからなる群から選択される、先行する態様の何れかに記載の方法。
［９］
前記架橋剤が、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）である、［７２］に記載の方法。
［１０］
（ｄ）工程（ｃ）からの前記沈殿した架橋ＨＡ生成物を非沈殿条件に供する工程と、（ｅ）非沈殿形態の前記架橋ＨＡ生成物を単離する工程と
をさらに含む、先行する態様の何れかに記載の方法。
［１１］
前記架橋ＨＡ生成物を滅菌する工程を含む、先行する態様の何れかに記載の方法。
［１２］
３５％以上の有効クロスリンカー比を有する架橋ＨＡ生成物。
［１３］
ＨＡ１ｇあたり４〜５００ｍＬの膨潤度を有する、［１２］に記載の架橋ＨＡ生成物。
［１４］
たとえば、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正などの美容手術における、［１２］〜［１３］の何れか１に記載の架橋ＨＡ生成物の使用。
［１５］
たとえば、皮膚充填、体形矯正、および顔面輪郭矯正などの美容手術、またはたとえば、皮膚充填、体形矯正、組織癒着の防止、チャネルの形成、失禁の治療、および整形外科用途などの医療手術における医薬または医療デバイスとしての使用のための、［１２］〜［１３］の何れか１に記載の架橋ＨＡ生成物。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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