(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体又はその抗原結合断片であって、前記Ｃ末端アミノ酸伸長は、４〜５０アミノ酸長を有し、ここで、
前記Ｃ末端アミノ酸伸長は、内因性ヒトアミノ酸配列又は修飾ヒトアミノ酸配列を含み、
前記ヒトアミノ酸配列は、ヒト抗体ヒンジ領域もしくは、その一部、又はＴ細胞受容体ヒンジ領域もしくはその一部を含み、
前記Ｃ末端アミノ酸伸長は抗原に特異的に結合しない、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長は５〜５０アミノ酸長である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長は５〜２５アミノ酸長である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長は、システイン残基を含有しないアミノ酸スペーサーを含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記スペーサーは、３〜２０のアミノ酸を含有する、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記スペーサーは、１以上のグリシン（Ｇ）残基、及び１以上のセリン（Ｓ）残基を含む、請求項４又は５に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記スペーサーは、配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を含有する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記抗体がＩｇＧである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記内因性ヒトアミノ酸配列が、ヒト抗体ヒンジ領域の少なくとも２、３、４、５又は６個の連続アミノ酸を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長が、１又はそれ以上のシステイン残基が挿入又は置換によって導入されている内因性ヒトアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０のいずれか１つに記載の配列、又はその一部分を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長が、配列番号９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、又は１０３のいずれか１つで表される配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
２つの軽鎖ポリペプチドであって、それぞれがシステイン残基を含むＣ末端アミノ酸伸長を含むポリペプチドを含有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
抗体が、第１重鎖ポリペプチド及び第１軽鎖ポリペプチドを含む第１モノエピトープ性抗原結合ドメイン、並びに第２重鎖ポリペプチド及び第２軽鎖ポリペプチドを含む第２モノエピトープ性抗原結合ドメインを含み、第１軽鎖ポリペプチド及び第２軽鎖ポリペプチドのうちの１つがシステイン残基を含むＣ末端アミノ酸慎重を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
抗体が、第１重鎖ポリペプチド及び第１軽鎖ポリペプチドを含む第１モノエピトープ性抗原結合ドメイン、並びに第２重鎖ポリペプチド及び第２軽鎖ポリペプチドを含む第２モノエピトープ性抗原結合ドメインを含み、第１軽鎖ポリペプチド及び第２軽鎖ポリペプチドの両方がシステイン残基を含むＣ末端アミノ酸伸長を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。 
【請求項１７】
二重特異性抗体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片；及び
前記Ｃ末端アミノ酸伸長の前記システイン残基を介して前記抗体又はその抗原結合断片に結合されている剤、
を含有する複合体であって、当該剤が治療剤又は標識剤である、複合体。
【請求項１９】
前記剤が、リンカーを介して前記システイン残基に結合されている、請求項１８に記載の複合体。
【請求項２０】
前記剤が、治療剤である、請求項１８又は１９に記載の複合体。
【請求項２１】
前記治療剤が、オーリスタチンもしくはそのアナログ、又はヘミアステリンもしくはそのアナログである、請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記剤が、標識剤である、請求項１８又は１９に記載の複合体。
【請求項２３】
前記標識剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング剤である、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
前記抗体又はその抗原結合断片が、前記Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基以外のシステイン残基に結合された剤を含有しない、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２５】
前記Ｃ末端アミノ酸伸長が、２以上のシステイン残基を含有し、及び、ここで、前記２以上のシステイン残基のうちの少なくとも２つは、治療剤及び標識剤から独立して選択される剤に結合されている、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２６】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２７】
請求項２６に記載の核酸を含有するベクター。
【請求項２８】
請求項２６に記載の核酸、または請求項２７に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、または請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の複合体；及び
薬学的に受容可能な添加剤
を含有する医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２６に記載の核酸を宿主細胞中で発現することを含む、抗体又はその抗原結合断片の軽鎖を作製する方法。
【請求項３１】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片に剤を結合させることを含む、抗体複合体を作製する方法であって、ここで、前記剤は、前記Ｃ末端アミノ酸伸長の前記システイン残基に結合され、前記剤は治療剤又は診断剤である、方法。
【請求項３２】
前記抗体又はその抗原結合断片に前記剤を結合させる前に、前記Ｃ末端アミノ酸伸長の前記システイン残基の前記スルフヒドリル基を還元することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記還元することが、
（ａ）前記Ｃ末端アミノ酸伸長中ではないシステイン残基ではなく、前記Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基を優先的に１つ以上還元すること、又は
（ｂ）前記Ｃ末端アミノ酸伸長中の１以上のシステイン残基を還元し、前記Ｃ末端アミノ酸伸長中でない任意のシステイン残基を還元しないこと、
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記結合することが、マレイミド化学反応、ハロアセチル化学反応、ビニルスルホン化学反応、またはピリジルジスルフィド化学反応を用いて、前記還元スルフヒドリル基に前記剤を架橋させることを含む、請求項３２又は３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連文献の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）の定めに従い、本出願は、２０１３年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／９２０，４２５号の優先権を主張するものであり、当該開示は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
近年、治療対象となる特定疾患の病因の根底にある細胞に対する選択性が改善され、治療剤の開発は目覚ましい発展を遂げている。抗体の抗原特異性を利用し、薬剤ペイロードの抗原特異的な送達が行われている。
【０００３】
そのような薬剤を担持した抗体は、抗体薬剤複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、ＡＤＣ）と呼称される。ＡＤＣは一般的に化学的または酵素的に薬剤（たとえば、細胞毒性薬剤）に、多くの場合リンカーを介して連結された抗体から構成される。典型的には、ＡＤＣは循環中で安定であり、抗原特異的結合後に細胞内に薬剤が放出され、及び一部の例においては、ＡＤＣが内在化されるよう設計される。ＡＤＣは「ペイロード」（たとえば細胞毒性剤等）を細胞標的に送達するよう設計されるため、当該剤による標的細胞調節の有効性（たとえば、標的細胞の殺傷）は、対応する抗体単独または薬剤単独と比較して、ＡＤＣが関連することにより、より強力なものとなりうる。
【０００４】
抗体の選択された部位（複数含む）での薬剤ペイロードの結合をもたらすＡＤＣは、抗体薬剤複合体製剤では製品が均質であることが望ましい等の多くの理由により、興味の対象となっている。この目的に対し、一部のグループでは、抗体の構造及び機能を維持しつつ、部位特異的なペイロードの付加を促進するための試みにおいて、抗体内の特定部位でのアミノ酸置換について、研究を行っている。たとえば、Ｓｈｅｎらは、抗体重鎖及び軽鎖内の様々な位置で体系的にシステイン置換を検証し、複合体の安定性に対する部位選択の影響を明らかにした（たとえば、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ３０：１８４−１８９，  ２０１２）。特に、これらの研究により、抗体上の付加部位へ溶媒が近づきやすい場合、得られたＡＤＣの安定性に負の影響を与えうることが明らかとなっている。
【０００５】
さらに、重鎖と軽鎖の関連性を含む、抗体安定性に負の影響を与える改変は、抗原に対する抗体のアフィニティ、ならびにＡＤＣの安定性を損なう可能性があり、それにより毒性が高まり、特異性が低下し、及び有用性が損なわれる。抗体のアフィニティ、または得られたＡＤＣの安定性を著しく損ねることなく、部位特異的な様式でペイロードを付加することに適した部位を決定する、または作り出すことが非常に望ましい。
【０００６】
また、抗体の抗原特異性を利用し、標識された剤を組み込み、診断的決定もしくは予後診断的決定、及び治療過程に関する情報を伝えるエピトープならびに／または細胞を認識する診断ツール及び画像解析ツールが提供される。そのような診断ツール及び予後診断ツールは、抗原検出に対するツールとしての抗体のアフィニティに依存しており、及び特定のシグナル伝達に対するツールとしての抗体による標識剤の保持に依存している。したがって、ＡＤＣと同様に、抗体のアフィニティを損なうことなく、または得られた複合体の安定性を損なうことなく、部位特異的な様式で付加を標識することに適した部位を決定すること、または作り出すことが非常に望ましい。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、Ｃ末端アミノ酸伸長を含む抗体軽鎖ポリペプチド、ならびに当該改変軽鎖ポリペプチドを含有する抗体及び抗体複合体を提示するものであり、当該Ｃ末端伸長は、１以上のシステイン残基を含有する。また、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基を介して剤に結合された、本発明の抗体を含む複合体も提示される。本発明はさらに、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含む抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を提示する。本開示の抗体または複合体を含む医薬組成物もまた提示され、同様に、本開示の抗体及び複合体の作製方法ならびに使用方法も提示される。
【０００８】
ある態様において、本開示は、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含む軽鎖ポリペプチドを含む抗体を提示するものである。
【０００９】
一部の実施形態において、本開示により、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含む軽鎖ポリペプチドを含む抗体が提示され、ここで、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、抗原に特異的に結合しない（たとえば、当該伸長は、抗体の抗原結合部分、または抗体断片の抗原結合部分を含まない）。
【００１０】
ある態様において、本開示は、少なくとも１つのモノエピトープ性の抗原結合二量体を含有する抗体を提示するものであり、当該モノエピトープ性抗原結合二量体は、重鎖ポリペプチド、及びＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有し、当該伸長はシステイン残基を含有する。当該２つのモノエピトープ性二量体の各々は、同じエピトープに結合してもよい。他の態様においては、当該２つのモノエピトープ性二量体の各々は、異なるエピトープに結合する。
【００１１】
ある実施形態によると、上記に要約される任意の抗体のＣ末端アミノ酸伸長は、システイン残基を含有していないアミノ酸スペーサーを含有する。ある態様において、当該スペーサーは、１〜３０アミノ酸、３〜２０アミノ酸、または４〜１７アミノ酸である。ある実施形態において、当該スペーサーは、グリシン（Ｇ）残基及びセリン（Ｓ）残基を含有する。たとえば、当該スペーサーは、１以上のグリシン（Ｇ）残基及び１以上のセリン（Ｓ）残基からなってもよい。そのようなスペーサーは、任意選択的に、配列ＧＧＧＳを有する。ある実施形態において、当該伸長は、内因性ヒトアミノ酸配列、または改変ヒトアミノ酸配列を含有する。これらは、ヒト抗体ヒンジ領域配列、Ｔ細胞受容体配列、または他のヒト配列を含有してもよい。ある態様において、当該伸長は、細胞外タンパク質アミノ酸配列、及び／または細胞表面上に存在するタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含有してもよい。１つの実施形態において、当該伸長は、１以上の天然型システイン残基を含有する内因性ヒトアミノ酸配列を含有する。これらは、ヒト抗体ヒンジ領域配列、Ｔ細胞受容体配列、または他のヒトタンパク質システイン含有配列を含有してもよい。ある態様において、当該伸長は、細胞外タンパク質アミノ酸配列、及び／または細胞表面上に存在するタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を含有してもよい。１つの実施形態において、当該伸長は、改変ヒトアミノ酸配列を含有し、ここで、１以上のシステインが、挿入または置換により当該内因性ヒトアミノ酸配列に導入されている。
【００１２】
本開示抗体のＣ末端アミノ酸伸長は、２以上のスペーサーを含有してもよい。たとえば、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、２〜１０のスペーサーを含有してもよい。当該スペーサーは、同じアミノ酸配列を有してもよい。他の態様において、当該スペーサーのうちの少なくとも２つのアミノ酸配列は、異なっている。ある実施形態によると、システインが、当該各スペーサーの間に存在する。あるいは、当該スペーサーのうちの少なくとも２つは、隣接していてもよく、たとえば、Ｃ末端アミノ酸伸長中の当該スペーサーのうちの少なくとも２つは、当該スペーサーの間にいずれのアミノ酸（たとえば、いずれのシステイン）も含有していない。１つの実施形態において、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、システインで停止する。
【００１３】
ある態様において、本開示抗体のＣ末端アミノ酸伸長内のシステインは、還元されたスルフヒドリル基を含有する。ある実施形態によると、当該抗体は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に結合された剤を含有する。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に直接結合されている。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基にリンカーを介して間接的に結合されている。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基よりも、軽鎖のＣ末端アミノ酸伸長のシステインに優先的に結合される。１つの実施形態において、当該剤は、抗体軽鎖のＣ末端アミノ酸伸長のシステインを介して、抗体に排他的に結合される。ある態様において、当該剤は、治療剤（たとえば細胞毒性剤）または標識剤（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング剤）である。ある実施形態によると、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、治療剤及び標識剤から独立して選択される剤に各々結合されるシステインを２つ以上含有する。
【００１４】
１つの実施形態において、２以上の剤が、独立して、Ｃ末端アミノ酸伸長の２以上のシステイン残基に直接または間接的に結合される。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステインよりも、当該軽鎖のＣ末端アミノ酸伸長のシステインに優先的に結合される。１つの実施形態において、当該剤は、抗体軽鎖の当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステインを介して、抗体に排他的に結合される。
【００１５】
本開示の抗体は、抗体またはその結合断片であってもよい。たとえば、当該抗体は、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、二特異性抗体等であってもよい。
【００１６】
また、本開示により、複合体が提示される。一部の実施形態によると、当該複合体は、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含む軽鎖ポリペプチドを含有する抗体を含む。
【００１７】
ある態様において、当該複合体は、システイン残基を含むＣ末端アミノ酸伸長を含む軽鎖ポリペプチドを含有する抗体を含み、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、抗原に特異的に結合しない（たとえば、抗体の抗原結合部分を含まないか、または抗体断片の抗原結合部分を含まない）。
【００１８】
一部の実施形態において、当該複合体は、少なくとも１つのモノエピトープ性の抗原結合二量体を含有する抗体を含有し、当該モノエピトープ性抗原結合二量体は、重鎖ポリペプチド、及びＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有し、当該伸長はシステイン残基を含有する。そのような複合体の抗体は、２つのモノエピトープ性抗原結合二量体を含有してもよい。当該２つのモノエピトープ性二量体の各々は、同じエピトープに結合してもよい。他の態様においては、当該２つのモノエピトープ性二量体の各々は、異なるエピトープに結合する。
【００１９】
さらに、当該複合体は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基を介して抗体に結合された剤を含有する。本開示の複合体の抗体及び剤は、上記に要約され、または以下の詳細な説明及び実施例において記述される抗体の特性ならびに剤の特性のいずれかを有してもよく、ならびに本明細書に記述される結合戦略、または同じ結合結果が得られる任意の他の適切な戦略を用いて結合されてもよい。
【００２０】
本開示の態様には、本開示の抗体のすべて、または一部をコードする核酸が含有される。たとえば、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含む抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸が提示される。当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、本開示抗体に関し上述され、ならびに以下の詳細な説明及び実施例において記述される特性のいずれかを含有してもよい。そのような核酸を含有するベクター、ならびに本開示の核酸及びベクターを含有する宿主細胞（たとえば原核宿主細胞または真核宿主細胞）もまた提示される。
【００２１】
ある態様において、本開示により、医薬組成物が提示される。ある実施形態によると、当該医薬組成物は、本開示抗体及び複合体に関し上記に要約され、ならびに以下の詳細な説明及び実施例において記述される抗体または複合体のいずれかを含有する。また、本開示の抗体及び複合体に関し上記に要約され、ならびに以下の詳細な説明及び実施例において記述される医薬組成物、抗体、または複合体のいずれかの治療有効量を、その必要のある患者に投与することを含む方法が開示される。
【００２２】
また、抗体軽鎖を作製する方法が開示される。当該方法には、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中で発現することが含まれる。ある態様において、当該方法はさらに、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元することを含む。１つの実施形態において、当該方法は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基の還元よりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基のスルフヒドリル基を優先的（または偏向的）に還元することを含有する。１つの実施形態において、当該方法は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基の還元よりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基のシステイン残基のスルフヒドリル基を排他的に還元することを含む。
【００２３】
ある態様において、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、２以上のシステイン残基を含有する。ある態様において、当該方法はさらに、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元することを含む。１つの実施形態において、当該方法は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基の還元よりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基のスルフヒドリル基を優先的（または偏向的）に還元することを含有する。１つの実施形態において、当該方法は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基の還元よりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基のシステイン残基のスルフヒドリル基を排他的に還元することを含む。
【００２４】
本開示の態様には、抗体複合体を作製することが含まれる。当該方法は、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含む抗体に、剤を結合させることを含み、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に結合されている。当該抗体複合体の作製方法はさらに、抗体に剤を結合させる前に、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステインのスルフヒドリル基を還元させることを含んでもよい。ある態様において、当該結合させることは、マレイミド化学反応、ハロアセチル化学反応、ビニルスルホン化学反応、またはピリジルジスルフィド化学反応を用いて、還元スルフヒドリル基に剤を架橋させることを含む。ある態様によると、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に結合された剤は、治療剤または標識剤である。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基よりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に優先的に結合される。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側の任意のシステイン残基ではなく、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に結合される。
【００２５】
ある態様において、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、２以上のシステイン残基を含有し、２以上の剤が当該Ｃ末端アミノ酸伸長の当該システイン残基に結合されている。当該抗体複合体を作製する方法はさらに、抗体に剤を結合させる前に、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元することを含んでもよい。ある態様において、当該結合することは、マレイミド化学反応、ハロアセチル化学反応、ビニルスルホン化学反応、またはピリジルジスルフィド化学反応を用いて、還元スルフヒドリル基に剤を架橋させることを含む。ある態様によると、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に結合された剤は、治療剤及び／または標識剤である。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基よりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長中のシステイン残基に優先的に結合される。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側の任意のシステイン残基ではなく、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に結合される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を含有する抗体の概略図である。
【図２】本開示の１つの実施形態に従う複合体の概略図である。
【図３】本開示の実施形態に従う、２例の抗体複合体に関する、がん細胞活性データを示す。
【図４】パネルＡ及びＢは、本開示のある実施形態に従う、非複合体化抗体に対する抗体結合データを示す。
【図５】パネルＡ及びＢは、本開示のある実施形態に従う、抗体−薬剤複合体に対する抗体結合データを示す。
【図６】本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体に対する示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）のデータを示す。
【図７】本開示の１つの実施形態に従う、抗体へのＡｌｅｘａ４８８結合を示すゲルの画像である。
【図８】本開示のある態様に従う、抗体または抗体複合体が投与されたマウスにおける、継時的なｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍体積変化を示す。
【図９】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＶＬｃｙｓ１）に対するサイズ排除クロマトグラフィー‐質量分析法（ＳＥＣ−ＭＳ）のデータを示す。
【図１０】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＶＬｃｙｓ２）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１１】パネルＡ及びＢは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＶＬｃｙｓ４）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１２】パネルＡ及びＢは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ２）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１３】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ３）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１４】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ４）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１５】パネルＡ及びＢは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ５）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１６】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ６）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１７】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ７）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１８】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ１０）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図１９】パネルＡ〜Ｃは、本開示の１つの実施形態に従う、Ｃ末端軽鎖伸長を有する抗体（Ｔ−ＳＰ１１）に対するＳＥＣ−ＭＳデータを示す。
【図２０】Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．９２であった。
【図２１】Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．１２であった。
【図２２】Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．１６であった。
【図２３】Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．４６であった。
【図２４】Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、０．９８であった。
【図２５】Ｔｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．６４であった。
【図２６】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３（ラージスケール）に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、２．０であった。
【図２７】Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、２．６６であった。
【図２８】ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、２．６６であった。
【図２９】ＴＶＬＣｙｓ２−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、０．２２であった。
【図３０】ＴＶＬＣｙｓ４−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、０．７０であった。
【図３１】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３（ラージスケール）に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、２．１２であった。
【図３２】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４（ラージスケール）に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、３．７６であり、平均付加は１．８８であった。
【図３３】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１（ラージスケール）に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．９４であった。
【図３４】Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３（ラージスケール）に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、２．４６であった。
【図３５】Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３（ラージスケール）に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．８２であった。
【図３６】Ｔ−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、０．１６であった。
【図３７】Ｂｓｐ１０−ＭＣｖｃＰＡＢＣ−ＭＭＡＥに対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示し、「Ｂ」は、ブレンツキシマブ抗ＣＤ３０抗体に対する略語である。平均薬剤担持量は、２．１２であった。
【図３８】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．９６であった。
【図３９】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ５に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、２．１８であった。
【図４０】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．９８であった。
【図４１】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ６に対する複合体反応産物のＨＩＣクロマトグラフを示す。平均薬剤担持量は、１．８７であった。
【図４２】Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨｅｒ２発現ＨＣＣ１９５４細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４３】Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨｅｒ２発現ＨＣＣ１９５４細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４４】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨｅｒ２発現ＨＣＣ１９５４細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４５】Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨＥＲ２抗原陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４６】Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨＥＲ２抗原陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４７】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨＥＲ２抗原陽性ＨＣＣ１９５４細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４８】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３、及びフリーＴｏｘｉｎ１で処置されたＨＥＲ２抗原陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図４９】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３、及びＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３で処置されたＨＥＲ２抗原陽性Ｎ８７細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５０】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１、及びＴｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４で処置されたＨＥＲ２抗原陽性Ｎ８７細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５１】Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１、及びＴｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４で処置されたＨＥＲ２抗原陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５２】Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３、及びＴｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３で処置されたＨＥＲ２抗原陽性Ｎ８７細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５３】Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３、及びＴｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３で処置されたＨＥＲ２抗原陽性Ｎ８７細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５４】ブレンツキシマブ、及びＢｓｐ１０で処置されたＣＤ３０抗原陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５５】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ５で処置されたＣＤ３０抗原陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５６】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、及びＢｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４で処置されたＣＤ３０抗原陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５７】Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ６で処置されたＣＤ３０抗原陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５８】Ｂｓｐ１０−ＭＣｖｃＰＡＢＣ−ＭＭＡＥで処置されたＣＤ３０抗原陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を用いた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイの結果のプロットを示す。
【図５９】固相化タンパク質上での精製後のトラスツズマブ軽鎖伸長変異体の非還元変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を示すゲル画像である。左から右へ、レーン１〜１２：分子サイズマーカー；ＴＳｐ２；ＴＳｐ３；ＴＳｐ４；ＴＳｐ５；ＴＳｐ６；ＴＳｐ９；Ｔｓｐ１０；ＴＳｐ１１；ＴＶＬＣｙｓ１；ＴＶＬＣｙｓ２；ＴＶＬＣｙｓ４。レーン１のサイズマーカーラダーは、元のタンパク質が約１５０ｋＤａであることを示す。
【図６０】トラスツズマブ軽鎖伸長変異体の還元（＋ＤＴＴ）変性ＰＡＧＥを示すゲル画像である。左から右へ、レーン１〜１２：分子サイズマーカー；ＴＳｐ２；ＴＳｐ３；ＴＳｐ４；ＴＳｐ５；ＴＳｐ６；ＴＳｐ９；Ｔｓｐ１０；ＴＳｐ１１；ＴＶＬＣｙｓ１；ＴＶＬＣｙｓ２；ＴＶＬＣｙｓ４。レーン１のサイズマーカーラダーは、還元タンパク質が約５０ｋＤａの重鎖断片及び約２５ｋＤａの軽鎖断片を含有することを示す。
【図６１】トラスツズマブ軽鎖伸長抗体薬剤複合体の非還元変性ＰＡＧＥを示すゲル画像である。左から右へ、レーン１〜１２：分子サイズマーカー；Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．９２）；Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．８８）；Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  ２．０６）；Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．４６）；Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．８０）；Ｔｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．３２）；Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  ２．１２）；Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４（ＤＡＲ  １．６６）；Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ  １（ＤＡＲ  ２．０４）；Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  ２．０２）；ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．０６）。
【図６２】トラスツズマブ軽鎖伸長抗体薬剤複合体の還元（＋ＤＴＴ）変性ＰＡＧＥを示すゲル画像である。左から右へ、レーン１〜１２：分子サイズマーカー；Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．９２）；Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．８８）；Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  ２．０６）；Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．４６）；Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．８０）；Ｔｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．３２）；Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  ２．１２）；Ｔｓｐ１０−ＭＰ−Ｔｏｘｉｎ４（ＤＡＲ  １．６６）；Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１（ＤＡＲ  ２．０４）；Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  ２．０２）；ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．０６）。
【図６３】熱安定性試験を用いて測定されたトラスツズマブ軽鎖伸長抗体薬剤複合体の安定性データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明者らは、抗体軽鎖間の構造的差異、及び抗体安定性に対するその影響を評価し、抗体軽鎖のＣ末端にアミノ酸を付加することにより、不安定化するという効果があることを見出した（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ５：３，４１８−４３１，２０１３）。他者らも、多特異抗体を作製するための、ＩｇＧ軽鎖のＣ末端への単一ドメインタンパク質スキャホールドとｓｃＦｖの連結は、軽鎖‐重鎖のジスルフィド結合を不安定化させ、それにより部分的にアセンブリされたＩｇＧ融合分子が増加すると報告している（Ｏｒｃｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ，２３：２２１−２２８，２０１０；Ｓｐａｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，４２２：５３２−５４４，２０１２）。さらに、溶媒のペイロード付加部分へのアクセスのし易さは、ＡＤＣの安定性に影響を与えることが報告されている（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０：１８４−１８９，２０１２）。これら報告とは逆に、本発明は、Ｃ末端アミノ酸伸長（本明細書において「ペイロードアダプター」とも呼称される）が、その伸長部分として抗体軽鎖Ｃ末端に共有結合されることにより、ペイロードに対する安定した付加点をもたらし、それにより安定で、抗原に対するアフィニティを保持した抗体ペイロード複合体が得られるという驚くべき発見に一部基づくものである。
【００２８】
従って、本開示により、Ｃ末端アミノ酸伸長を含有する抗体軽鎖ポリペプチド、ならびにそのような改変軽鎖ポリペプチドを含有する抗体及び抗体複合体が提示され、当該Ｃ末端伸長は、１以上のシステイン残基を含有している。当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基を介して剤に結合された本開示抗体を含む複合体もまた開示される。本開示はさらに、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含む抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を提示するものである。本開示抗体または複合体を含有する医薬組成物もまた提示され、ならびに本開示の改変抗体及び複合体を作製する方法及び使用する方法も提示される。
【００２９】
本開示の抗体、複合体、核酸、医薬組成物、及び方法を詳細に記述する前に、本開示の当該態様は、記述される特定の実施形態に限定されるものではなく、もちろん、変化しうるものであることを理解されたい。また、本明細書に用いられている専門用語は特定の実施形態を記述する目的のためのみであり、限定の意図はなく、本開示の抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法の範囲は、添付のクレームにのみ定義されるものである。
【００３０】
値の範囲が開示されている場合、他で明確に述べられない限り、当該範囲の上限値と下限値の間にある各値、及び当該記述された範囲の他の記述された値または間にある値は、下限値の単位の１０分の１まで、本発明抗体、複合体、核酸、医薬組成物、及び方法内に包含される。これら小範囲の上限値及び下限値は、当該小範囲に独立して含まれ得、及び本抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法内に包含され、当該記述された範囲の任意の具体的な除外限界値に供される。当該記述される範囲が１つ、または両方の限界値を含有する場合、それら含有される限界値のいずれか、または両方を除外する範囲もまた本抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法に含まれる。
【００３１】
本明細書において、ある範囲は、「約」という用語が先行する数値を用いて表される。「約」という用語は、本明細書において、それが先行するまさにその数値、ならびに当該用語が先行する数値の近似または前後の数値に対する文言上の支持を与えるために用いられる。数値が具体的に列記された数値の近似または前後のいずれであるかを決定するなかで、それが表された文脈において、近似または前後の列記されていない数値は、具体的に列記された数値と実質的な同等性を備える数値でありうる。
【００３２】
他で定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び本方法が属する分野の当業者により普遍的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法もまた、本抗体、複合体、核酸、医薬組成物、及び方法の実施または検証に用いることができるが、本明細書では代表的な実例のための抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法が記載されている。
【００３３】
本明細書において引用されるすべての公表文献及び特許は、個々の各公表物または特許が具体的に、及びここに参照により援用されると示されるように、参照により本明細書に援用され、及び当該公表物が引用された事物と関連し、当該方法及び／または物質を開示ならびに記述するために、参照により本明細書に援用される。任意の公表物の引用は、出願日の前のその開示を目的としており、当該公表物が先行するために、先行発明を理由として、本発明方法が権利を与えられないことに承認を与えるとはみなされない。さらに、提示される公表日は、実際の公表日とは異なっている可能性があり、個々に確認を行う必要がある。
【００３４】
本明細書及び添付のクレームにおいて、単数形の「ひとつの（ａ）」「(an)」及び「当該（ｔｈｅ）」は、文脈において異なることを明確に指定されない限り、複数の指示対象を含むことに注意されたい。たとえば、本明細書において、「システインを含有する」Ｃ末端アミノ酸伸長、または「システイン含有」と記述されるＣ末端アミノ酸伸長は、複数のシステイン残基を含有しうる（すなわち、当該伸長は、少なくとも１つのシステインを含有する）。さらに、クレームは、任意の選択的な構成要素を除外するよう起草されうる。そのため当該記述は、たとえば、クレーム構成要素の列挙と関連し、「唯一」、「のみ」といった排他的な用語の使用の先行詞として、または「負の」限定の使用の先行詞として用いられることが意図される。
【００３５】
抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法のある特性は、明確性を目的とし、別々の実施形態に関連して記述され、また１つの実施形態において組み合わせて提示されうる。逆に、抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法の様々な特性が、簡潔性を目的とし、１つの実施形態において記述され、また別々に提示され、もしくは任意の適切な別の組み合わせで提示されうる。実施形態のすべての組み合わせは、本発明により具体的に包含され、ならびに各組合せ及び全ての組み合わせが個々に、及び明白に開示されているように、当該組合せが操作可能な抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法を包含する範囲内で、本明細書に開示される。さらに、そのような可変性を記述する実施形態に列記されている全ての別の組み合わせもまた、本発明抗体、複合体、核酸、医薬組成物、及び方法に具体的に包含され、そのような別の組み合わせの各組合せ、及び全ての組み合わせが個々に及び明白に本明細書に開示されるように本明細書に開示される。
【００３６】
当業者には本開示を読み取ることで明白であるが、本明細書に記述され、解説される個々の実施形態の各々は、本発明抗体、複合体、核酸、医薬組成物及び方法の範囲または主旨から逸脱することなく、いくつかの他の実施形態の任意の特性から容易に分離される、または組み合わされる個々の構成要素及び特性を有している。任意の列記された方法は、列記された事象の順序で、または論理的に可能な任意の他の順序で、実施することができる。
【００３７】
定義
「抗体」及び「イムノグロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体またはイムノグロブリンである、完全抗体（たとえば、テトラマーから構成される抗体であり、当該テトラマーは同様に重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの２つのヘテロダイマーから構成され、完全ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を含む）；半抗体（たとえば、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの１つの二量体を含む抗体）；限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二特異性抗体、及びダイアボディを含む、対象抗原への特異的結合を保持している抗体断片（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体等の完全抗体の断片）；キメラ抗体；モノクローナル抗体；ヒト化抗体（たとえば、ヒト化モノクローナル抗体、またはヒト化抗体断片）；または完全なヒト抗体（ヒトイムノグロブリンタンパク質配列のみを含有する抗体）を含む。また、体細胞変異ならびに／またはＶ−Ｄ−Ｊ再構成の結果としてＮヌクレオチドもしくはＰヌクレオチドの付加及び欠失を含むヒトモノクローナル抗体が含まれる。また、合成配列がＣＤＲに挿入されているヒト抗体が含まれる（たとえば、Ｍｉｅｒｓｃｈ  Ｓ  ＆  Ｓｉｄｈｕ  ＳＳ  （２０１２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５７（４）：４８６−９８；及びＫｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｆｕｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  （ＨｕＣＡＬ）ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ＣＤＲｓ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６（１）：５７−８６）を参照のこと）。ある態様において、本開示抗体は、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４抗体）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦａｂ’から選択される。
【００３８】
抗体のパパイン消化により、２つの同一な抗原結合断片（いわゆる「Ｆａｂ」断片）が得られ、各々、１つの抗原結合部位を有しており、残りの「Ｆｃ」断片は、容易に結晶化する能力を意味する。ペプシン処置により、２つの抗原結合部位を有し、さらに抗原に架橋する能力を保持しているＦ（ａｂ’）２断片が産生される。
【００３９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を有する最小の抗体断片を含む。この領域は、緊密な非共有結合の１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この構成において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、相互作用し、ＶH−ＶL二量体表面上の抗原結合部位を規定する。合わせて、６つのＣＤＲにより、抗原結合の特異性が抗体に与えられる。しかしながら、全結合部位よりもアフィニティは低いが、１つの可変ドメイン（または抗原特異的な３つのＣＤＲのみを含有するＦｖの半分）であっても、抗原を認識し、結合する能力はある。
【００４０】
また、「Ｆａｂ」断片は、軽鎖定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ1）を含有する。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含有する、重鎖ＣＨ1ドメインのカルボキシ末端での数残基の付加により、Ｆａｂ’断片とは異なっている。Ｆａｂ’‐ＳＨとは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数含む）が遊離チオール基を保有しているＦａｂ’を表すものである。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は、対の間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として元々作製された。他の抗体断片の化学的結合もまた公知である。
【００４１】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶH及びＶLドメインを含有し、これらドメインは、１つのポリペプチド鎖中に存在する。一部の実施形態において、Ｆｖポリペプチドはさらに、ＶHドメインとＶLドメインの間にポリペプチドリンカーを含有し、それにより、ｓＦｖは、抗原結合に望ましい構造を形成することができる。
【００４２】
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、それら断片は、同じポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）中で、軽鎖可変ドメイン（ＶL）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶH）を含有する。同一鎖上で２つのドメインの間に対を形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、当該ドメインは、他の鎖の相補性ドメインと対を形成することを余儀なくされ、２つの抗原結合部位が形成される。
【００４３】
本明細書において、「軽鎖ポリペプチド」とは、少なくとも抗体軽鎖可変領域（ＶL）を有しているポリペプチドを指す。軽鎖ポリペプチドは、部分的な、または全長の抗体軽鎖定常領域（ＣL）を含有していてもよい。「全長軽鎖ポリペプチド」は、全長軽鎖可変領域（ＶL）と全長軽鎖定常領域（ＣL）を含有する。軽鎖ポリペプチドは、任意の脊椎動物種（たとえば、ヒト、げっ歯類等の哺乳類）由来であってもよい。
【００４４】
本明細書において、「重鎖ポリペプチド」または「重鎖」とは、少なくとも抗体重鎖可変領域（ＶH）を有するポリペプチドを指す。重鎖ポリペプチドは、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する抗体重鎖定常領域を部分的または全長で含有してもよい。「全長重鎖ポリペプチド」は、全長重鎖可変領域（ＶL）と全長重鎖定常領域（ＣH）を含有する。任意の脊椎動物種（たとえば、げっ歯類、ヒト等の哺乳類）由来の抗体（イムノグロブリン）及び任意のクラスのイムノグロブリンの重鎖ポリペプチドが包含される。重鎖ポリペプチド、及び当該重鎖ポリペプチドを含有する抗体は、当該重鎖ポリペプチドの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてクラスに分類される。イムノグロブリンの５つの主要なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。そしてこれらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられてもよい（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）。
【００４５】
本明細書において、「組み換え」抗体という用語は、組み換え手法により作製され、発現され、生成され、または単離されるすべての抗体を含むことが意図され、たとえば、（ｉ）宿主細胞にトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体；（ｉｉ）組み換えコンビナトリアル抗体ライブラリから単離された抗体；（ｉｉｉ）ヒトイムノグロブリンに関しトランスジェニックである動物（たとえばマウス）から単離された抗体；または（ｉｖ）他のＤＮＡ配列へのヒトイムノグロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳銀術に関しては、Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｃａｌａｂｌｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４，Ｉｓｓｕｅ  ２を参照のこと）により作製され、発現され、生成され、または単離された抗体、が挙げられる。そのような組み換え抗体は、ヒト化、ＣＤＲ移植、キメラ、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製抗体を含み；及び任意選択的に、ヒト生殖細胞イムノグロブリン配列由来の定常領域を含有してもよい。
【００４６】
「ヒト化抗体」という用語は、イムノグロブリン、半抗体、イムノグロブリン鎖（たとえば軽鎖ポリペプチド）、またはそれらの断片（たとえばＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の抗原結合部分配列）を指し、それらは最小限の非ヒトイムノグロブリン由来の配列を含有する。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望される特異性、アフィニティ、及び能力を有する、非ヒト種（たとえばマウス、ラット、リャマ、ラクダ、またはウサギ）のＣＤＲの残基（ドナー抗体）により置換されているヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）であってもよい。一部の例において、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒトの残基と置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体または輸入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも存在しない残基を含有してもよい。
【００４７】
ヒト軽鎖ポリペプチドは、通常、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。さらにヒト重鎖ポリペプチドは、通常、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして抗体アイソタイプが規定される。軽鎖及び重鎖内で、可変領域と定常領域が、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域により連結され、当該重鎖はまた、約１０アミノ酸以上の「Ｄ」領域を含有する。
【００４８】
「治療すること」、「治療する」、または「治療」とは、疾患もしくは障害及び／またはその付随する症状を緩和または消失させることを意味する。本明細書において、疾患または障害を「緩和する」とは、当該疾患もしくは障害の症状の重症度及び／または発生頻度を低減させることを意味する。本明細書において、「治療すること」、「治療する」、または「治療」という言及は、治癒的、緩和的及び予防的処置への言及を含むことを理解されたい。
【００４９】
「治療有効量」または「有効量」とは、所望される結果を得るために十分な投与量を意味する（たとえば、対照と比較し、疾患（たとえば、癌または任意の他の対象疾患）の症状の低減等の有益または所望される治療（予防を含む）結果をもたらすために十分な量）。「治療有効量」は、抗体または複合体、疾患及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重等により変化する。
【００５０】
Ｃ末端伸長（「ペイロードアダプター」）を有する軽鎖ポリペプチド
１つの態様において、本明細書は、抗体へのペイロード付加のためのペイロードアダプター（本明細書において、「Ｃ末端アミノ酸伸長」または「Ｃ末端伸長」とも呼称される）、ならびに当該ペイロードアダプターを含有する抗体を提示する。
【００５１】
本発明のペイロードアダプターは、ペイロードの共有結合のための基質として利用されるタンパク質モジュールであり、各ペイロードアダプターは抗体のＣ末端伸長を構成し、それにより１以上のペイロードが抗体に連結される。ペイロードアダプターは、ペイロード付加のためのシステイン残基を少なくとも１つ含有する。
【００５２】
本発明のペイロードアダプターは、抗体軽鎖のＣ末端伸長として発現されることができ、及び適切な化学物質を使用して広範なペイロードに共有結合することができ、それによりペイロード及びペイロードアダプターを含有する抗体は安定性を示し、抗原に対するアフィニティを保持する。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明のペイロードアダプターを含有する抗体は、その天然型抗体配列内にシステイン置換を含有しておらず、それらは別の方法で、軽鎖のＣ末端にポリペプチドを付加するための代償的ジスルフィド結合をもたらすために導入される。ゆえに、１つの実施形態において、本発明のペイロードアダプターを含有する抗体は、元の抗体中に存在するすべてのシステイン残基を含有する。１つの実施形態において、ペイロードアダプターは、分子内ジスルフィド結合を形成しない複数のシステイン残基を含有し、または他のペイロードアダプターとジスルフィド結合を形成しない複数のシステイン残基を含有する。
【００５４】
１つの実施形態において、ペイロードアダプターは、抗原に特異的に結合しない。１つの実施形態において、ペイロードアダプターは、本発明の抗体または抗体複合体に対するエピトープ結合活性に寄与しない。当該実施形態において、本発明の抗体及び抗体複合体による抗原結合は、ペイロードアダプター以外の要素により決定される。１つの実施形態において、ペイロードアダプターは、成長因子受容体（たとえばＥＧＦ受容体）のリガンド結合ドメインを含有しない。他の実施形態において、ペイロードアダプターは、成長因子受容体のリガンドを含有しない（たとえばＥＧＦ受容体のリガンドを含有しない）。
【００５５】
より具体的には、上述されるように、本発明により、１以上のシステイン残基を有するＣ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチド、及び当該改変軽鎖ポリペプチドを少なくとも１つを有する抗体が開示される。Ｃ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドは、任意のタイプの軽鎖ポリペプチド（たとえば、ラムダ（λ）またはカッパ（κ）軽鎖ポリペプチド）のアミノ酸配列を含有してもよく、及び任意の対象（たとえば、げっ歯類、ヒト等の哺乳類等の任意の脊椎動物）起源の軽鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を含有してもよい。
【００５６】
「Ｃ末端軽鎖ポリペプチド伸長」、「Ｃ末端軽鎖アミノ酸伸長」、「Ｃ末端伸長」、「ペイロードアダプター」、という用語、及びそれらの均等物は、本明細書において、当該伸長が無い元の軽鎖ポリペプチドにおいて異なる様式でＣ末端残基を構成する軽鎖ポリペプチド残基に対しＣ末端に位置付けられたアミノ酸（たとえばシステイン）または２以上のアミノ酸の連続した配列を指すために用いられる。
【００５７】
ある態様において、元の軽鎖ポリペプチドは、軽鎖可変領域（ＶL）のみを含有し（たとえば、当該元の抗体は、ＳｃＦｖであってもよい）、それにより当該伸長は、元の軽鎖ポリペプチドのＶLのＣ末端を別の様式で構成する残基に対してＣ末端である（たとえば、当該残基から伸長する）。他の態様において、元の軽鎖ポリペプチドは、軽鎖可変領域（ＶL）及び軽鎖定常領域（ＣL）の一部を含有し、それにより当該伸長は、元の軽鎖ポリペプチドの部分ＣLのＣ末端を別の様式で構成する残基に対しＣ末端である（たとえば、当該残基から伸長する）。
【００５８】
ある実施形態によると、元の軽鎖ポリペプチドは、全長軽鎖可変領域（ＶL）及び全長軽鎖定常領域（ＣL）を含有する全長軽鎖ポリペプチドであり、それにより、当該伸長は、元の軽鎖ポリペプチドで、全長ＣLのＣ末端を別の様式で構成する残基に対し、Ｃ末端である（たとえば、当該残基から伸長する）。１つの実施形態に従うと、当該伸長のＮ末端部分は、元の全長軽鎖ポリペプチドに別の様式で存在する配列の少なくとも一部を含有し、それにより、元の軽鎖ポリペプチドのＣ末端の伸長は、「伸長」の一部として、「付加戻し「ａｄｄｉｎｇ ｂａｃｋ」の親配列を含有する。
【００５９】
一部の実施形態に従うと、元の軽鎖ポリペプチドは、野生型の全長軽鎖ポリペプチドのＣ末端に通常存在する末端システインの欠失を含有し、それにより、当該軽鎖伸長は、当該Ｃ末端システインが欠失した位置に対してすぐＮ末端側の残基に対しＣ末端である（たとえば、当該残基から伸長する）。１つの実施形態において、元の軽鎖ポリペプチドは、野生型全長軽鎖ポリペプチドのＣ末端に通常存在する末端システインの置換を含有する。
【００６０】
ある態様において、元の抗体は、断片化重鎖ポリペプチド（たとえば、重鎖可変領域（ＶH）のみを含有する重鎖ポリペプチド、または重鎖可変領域（ＶH）と重鎖定常領域（ＣH）の一部を含有する重鎖ポリペプチド）を有する。これらの態様に従うと、Ｃ末端軽鎖ポリペプチド伸長は、重鎖ポリペプチド配列と（断片化によって）対を形成していない天然型（たとえば野生型）軽鎖ポリペプチド配列を含有してもよい。１つの実施形態に従うと、そのようなＣ末端軽鎖ポリペプチド伸長はさらに、１以上の非天然型アミノ酸（たとえば、元の軽鎖ポリペプチドには存在していない１以上のシステイン）を含有してもよく、ある態様においては、２以上のアミノ酸の非天然型配列であってもよい。
【００６１】
ある態様において、本発明は、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体を開示する。
【００６２】
一部の実施形態において、本発明により、システイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体が開示され、当該Ｃ末端アミノ酸伸長は、抗原に特異的に結合しない（たとえば、当該伸長は、抗体の抗原結合部分を含有しないか、または抗体断片の抗原結合部分を含有しない）。
【００６３】
ある態様において、本発明は、少なくとも１つのモノエピトープ性抗原結合二量体を含有する抗体を開示し、当該モノエピトープ性抗原結合二量体は、重鎖ポリペプチド、及びＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有し、当該伸長は、システイン残基を含有する。当該２つのモノエピトープ性二量体の各々は、同じエピトープに結合してもよい。他の態様において、当該２つのモノエピトープ性二量体の各々は、異なるエピトープに結合する。
【００６４】
本明細書において、「モノエピトープ性抗原結合ドメイン」は、重鎖ポリペプチドのＣＤＲと軽鎖ポリペプチドのＣＤＲの相互作用により形成される抗原結合ドメインを示す。「モノエピトープ性抗原結合ドメイン」は、たとえば、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含有する二量体により定義されてもよく、または一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）の場合には、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含有するモノマー融合タンパク質により定義されてもよい。ゆえに、軽鎖Ｃ末端アミノ酸伸長を含有するモノエピトープ性抗原結合ドメインにおいて、当該軽鎖ポリペプチドのアミノ酸伸長は、抗原に特異的に結合しない。本発明の抗体は、同じ、または異なるモノエピトープ性抗原結合二量体を含有する抗体を含む。たとえば、ヘテロ二量体の二量体（すなわち、四量体）を含有する抗体は、以下を含有してもよい：１）重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含有する第一のモノエピトープ性抗原結合ドメイン、及び重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含有する第二のモノエピトープ生抗原結合ドメインであって、当該軽鎖ポリペプチドのうちの１つ、または両方が、Ｃ末端アミノ酸伸長を含有し、及び当該第一及び第二のモノエピトープ性抗原結合ドメインは、同じエピトープに結合する：または２）第一及び第二のモノエピトープ性抗原結合ドメインであって、当該ドメインの軽鎖ポリペプチドのうちの１つまたは両方が、Ｃ末端アミノ酸伸長を含有し、当該第一のモノエピトープ性抗原結合ドメインの抗原結合領域は、当該第二のモノエピトープ性抗原結合ドメインにより結合されるエピトープとは異なるエピトープに結合する。
【００６５】
Ｃ末端伸長は、任意の所望の長さであってもよい。ある実施形態によると、当該伸長は、１〜２００アミノ酸、１〜１５０アミノ酸、１〜１００アミノ酸、１〜７５アミノ酸、１〜５０アミノ酸、１〜２５アミノ酸、１〜２０アミノ酸、１〜１５アミノ酸、１〜１０アミノ酸、または１〜５アミノ酸の長さであり、及び５〜２００アミノ酸、５〜１５０アミノ酸、５〜１００アミノ酸、５〜７５アミノ酸、５〜５０アミノ酸、５〜２５アミノ酸、５〜２０アミノ酸、５〜１５アミノ酸、または５〜１０アミノ酸の長さであってもよい。ある態様において、当該伸長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の長さである。
【００６６】
当該Ｃ末端伸長は、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０システイン等の、任意の所望される数のシステインを含有してもよい。一部の実施形態においてＣ末端伸長は、少なくとも、２、３、４、５またはそれ以上のシステインを含有する。一部の実施形態において、Ｃ末端伸長は、２、３、４、５、６、７、８、９または１０未満のシステインを含有する。ある態様において、当該伸長は、１〜５のシステイン、６〜１０のシステイン、１１〜１５のシステイン、または１６〜２０のシステインを含有する。
【００６７】
ある実施形態によると、当該Ｃ末端伸長は、２以上の連続したシステインを含有する。たとえば、当該伸長は、２つの隣接したシステインを含有してもよく、当該２つの隣接したシステインは、当該２つの隣接したシステインに対してＮ末端及びＣ末端の非システイン含有スペーサー配列を有している。当該Ｃ末端伸長に連続したシステイン（たとえば、２つの隣接したシステイン）を有しているため、たとえば、結合または標識戦略に金属キレート化を含有する場合等、結合または標識戦略に「架橋」が関与する場合の用途が見いだされる（たとえば、あるジハロ‐マレイミド化学結合等の場合）。ある態様において、本発明により、剤（たとえば、薬剤または標識剤）が複数の連続したシステイン（たとえば、２つの隣接したシステイン）に、直接または１以上のリンカーを介して付加されている複合体、及び当該複合体の作製方法が開示される。
【００６８】
１つの実施形態においては、当該Ｃ末端伸長は、元の軽鎖末端システインとともに使用された際に、上述の用途が見いだされる２つの連続したシステインをもたらすＮ末端システインを含有する。
【００６９】
ある態様において、本発明により、剤（たとえば薬剤または標識剤）が、直接、または１以上のリンカーを介してのいずれかで、複数の非連続的なシステインに付加されている複合体、及び当該複合体を作製する方法が開示される。
【００７０】
一部の実施形態において、当該Ｃ末端伸長は１以上のスペーサーにより分離されており、そのため、当該システインは当該Ｃ末端伸長の連続残基ではない。「スペーサー」とは、当該伸長中の２つのシステイン残基の間に配置された１以上の連続した非システインアミノ酸；当該軽鎖ポリペプチドのＣ末端残基を構成するもの、もしくは軽鎖可変領域と軽鎖定常領域の少なくとも一部を含有するその断片のＣ末端残基を構成するものと、当該Ｃ末端伸長の第一のシステイン残基の間に配置された１以上の連続した非システイン残基；及び／または、任意選択的に、当該伸長の最もＣ末端のシステインに対してＣ末端に配置された１以上の連続した非システインアミノ酸、を意味する。任意の数のスペーサーが、当該Ｃ末端伸長にあってもよい。ある実施形態によると、当該Ｃ末端伸長は、１〜５０個のスペーサー、１〜４０個のスペーサー、１〜３０個のスペーサー、１〜２０個のスペーサー、１〜１０個のスペーサー（たとえば２〜１０個のスペーサー）、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０個のスペーサーを含有してもよい。
【００７１】
当該Ｃ末端伸長が２以上のスペーサーを含有する場合、当該スペーサーの各々は、同じアミノ酸配列を有してもよい。あるいは、当該Ｃ末端伸長が２以上のスペーサーを含有する場合、当該スペーサーのうちの少なくとも２つのアミノ酸配列が異なっていてもよい。当該伸長が複数のスペーサーを含有する場合、各スペーサーの間にシステインが存在してもよい。他の態様において、当該伸長が複数のスペーサーを含有する場合、当該スペーサーの内の少なくとも２つが連続していてもよい（たとえば、当該スペーサーは、１以上のシステイン残基により分離されていない）。
【００７２】
当該スペーサーは、２０のシステインではない、遺伝的にコードされている天然型アミノ酸（アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、及び／またはバリン（Ｖ））、またはその変異型（たとえば、翻訳語修飾の結果として生じる変異型等）、天然型のコードされないアミノ酸、または非天然型アミノ酸のいずれかを含有してもよく、及び任意の所望される配列及び長さであってもよい。ある態様において、スペーサーは、１〜３０個のアミノ酸（たとえば、３〜２０個のアミノ酸、３〜１５個のアミノ酸、３〜１０個のアミノ酸、３〜５個のアミノ酸）を含有してもよく、及び、たとえば４〜１７個のアミノ酸であってもよい。たとえば、当該スペーサーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個以上のアミノ酸を含有してもよく、及び一部の例においては、３０以下、または２５以下のアミノ酸を含有し、当該スペーサーがシステイン残基を含有しない場合には、任意の所望されるアミノ酸配列であってもよい。
【００７３】
ある態様において、当該スペーサーは、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）残基と少なくとも１つのセリン（Ｓ）残基を含有する。たとえば、当該スペーサーは、１以上のグリシン残基と１以上のセリン残基を含有してもよい。
【００７４】
対象のスペーサーの例は、配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーである。他の態様において、当該スペーサーは、以下のアミノ酸配列の内のいずれかからなる、または含有してもよい：ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号３）；ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号４）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号５）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）；ＳＡＫＴＴＰ（配列番号７）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号８）；ＲＡＤＡＡＰ（配列番号９）；ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号１０）；ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号１１）；ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ4Ｓ）4（配列番号１２）、ＳＡＫＴＴＰ（配列番号１３）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号１４）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１５）；ＡＤＡＡＰ（配列番号１６）；ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１７）；ＴＶＡＡＰ（配列番号１８）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１９）；ＱＰＫＡＡＰ（配列番号２０）；ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号２１）；ＡＫＴＴＰＰ（配列番号２２）；ＡＫＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号２３）；ＡＫＴＴＡＰ（配列番号２４）；ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号２５）；ＡＳＴＫＧＰ（配列番号２６）；ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２７）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２８）；ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号２９）；ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号３０）；ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号３１）；ＡＡ；ＧＧＧＧＳ（配列番号１２８）；ＧＧＧＧＳＳＧＧＧＧＳＳ；（配列番号１３１）、または１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸置換を含有するそれらの変異体。
【００７５】
ある態様において、当該軽鎖ポリペプチドのＣ末端伸長は、内因性ヒトアミノ酸配列または改変ヒトアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含有する。これらは、ヒト抗体ヒンジ領域配列、Ｔ細胞受容体配列、または対象の任意の他のヒトタンパク質配列を含有してもよい。用いられうる、さらなるアミノ酸配列としては、限定されないが、細胞外タンパク質アミノ酸配列ならびに細胞表面上に存在するタンパク質の細胞外ドメインの配列があげられる。１つの実施形態において、当該伸長は、１以上の天然型システイン残基を含有する内因性ヒトアミノ酸配列を含有する。そのような天然型ヒト配列が、配列改変無く、１以上のシステイン残基を含有する場合、当該システイン残基に対しＮ末端及びＣ末端の当該非システイン含有アミノ酸配列は、当該Ｃ末端伸長のスペーサー配列を構成する。１つの実施形態において、当該伸長は、挿入または置換により１以上のシステインが内因性ヒトアミノ酸配列に導入されている改変ヒトアミノ酸配列を含有する。また、そのような配列に関連し、天然型システイン残基が置換または欠失されてもよい。
【００７６】
ある実施形態によると、当該Ｃ末端伸長が内因性ヒトアミノ酸配列または改変ヒトアミノ酸配列を含有する場合、患者に投与された際の当該抗体（またはその複合体）は、当該ヒトアミノ酸配列または改変ヒトアミノ酸配列を欠いた対応する伸長と比較し、免疫原性が低下している。
【００７７】
好ましいスペーサーは、野生型配列（たとえば、野生型ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤ抗体分子のヒンジ領域、またはＴ細胞受容体の一部、またはその断片等）に対し、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または１００％同一な配列を有するアミノ酸配列を含有する。１つの態様において、「ヒンジ」領域とは、重鎖ポリペプチド（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＤ抗体の重鎖ポリペプチド）のＣH１とＣH２ドメインの間に位置する抗体のアミノ酸配列（たとえば、図１及び２の例に示されている）を指す。本発明の構築物のヒンジ領域は、長さ及びアミノ酸配列が変化してもよい。たとえば、ヒトＩｇＧ1、ＩｇＧ2、及びＩｇＧ4のヒンジ領域は、１２〜１５アミノ酸の長さであり、一方で、ヒトＩｇＧ3は６２アミノ酸のヒンジ領域を有する。ヒトＩｇＤ抗体分子は、６４アミノ酸のヒンジ領域を有する。ある実施形態によると、当該Ｃ末端伸長がヒンジ領域配列またはその配列変異体を含有する場合、患者に投与された際の当該抗体（またはその複合体）、当該ヒンジ領域配列を欠いた対応する伸長と比較し免疫原性が低下しており、及び当該伸長は、当該ヒンジ領域を欠いた伸長と比較し柔軟性が増加していてもよい。
【００７８】
そのすべて、または一部（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６以上の連続残基）が本発明のＣ末端伸長に含有されうる、ヒンジ領域アミノ酸配列の非限定的な例としては、限定されないが、ＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴ（配列番号３２）（Ｔ細胞受容体α定常）；ＤＣＧＦＴＳ（配列番号３３）（Ｔ細胞受容体β定常）；ＤＶＩＴＭＤＰＫＤＮＣＳＫＤＡＮ（配列番号３４）（Ｔ細胞受容体γ定常）；ＤＨＶＫＰＫＥＴＥＮＴＫＱＰＳＫＳＣＨＫＰＫ（配列番号３５）（Ｔ細胞受容体デルタ定常）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号３６）（ＩｇＣＨＧ１）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号３７）（ＩｇＣＨＧ２）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号３８）（ＩｇＣＨ３−Ｈ１）；ＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰ（配列番号３９）（ＩｇＣＨ３−Ｈ２、ＩｇＣＨ３−Ｈ３、及びＩｇＣＨ３−Ｈ４）；ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号４０）（ＩｇＨ４）；ＶＰＰＰＰＰ（配列番号４１）（ＩｇＡ２）及びＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰ（配列番号４２）があげられる。
【００７９】
そのすべて、またはその一部（たとえば、少なくとも２、３、４、５、６以上の連続残基）が本発明のＣ末端伸長にスペーサーとして使用されうるヒンジ領域アミノ酸配列由来の非システイン含有アミノ酸配列の例としては、限定されないが、ＥＳＳ（配列番号４３）；ＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴ（配列番号４４）；ＧＦＴＳ（配列番号４５）；ＤＶＩＴＭＤＰＫＤＮ（配列番号４６）；ＳＫＤＡＮ（配列番号４７）；ＤＨＶＫＰＫＥＴＥＮＴＫＱＰＳＫＳ（配列番号４８）；ＨＫＰＫ（配列番号４９）；ＥＰＫＳ（配列番号５０）；ＤＫＴＨＴ（配列番号５１）；ＥＲＫ（配列番号５２）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号５３）；ＤＴＰＰＰ（配列番号５４）；ＶＥ（配列番号５５）；ＰＲ（配列番号５６）；ＰＰ（配列番号５７）；ＰＳ（配列番号５８）；ＥＳＫＹＧＰＰ（配列番号５９）；及びＤＶＫＬＶ（配列番号９１）があげられる。
【００８０】
本発明の軽鎖ポリペプチドのＣ末端伸長は、１以上のスペーサー（またはスペーサーは無し）及び１以上のシステイン残基の任意の所望される組合せを含有するように設計されてもよい。ゆえに、本発明のある態様において、１以上のシステインを有する軽鎖ポリペプチドのＣ末端に伸長が備えられ（たとえば、互いに分離されて、もしくは互いに分離されずに；元の軽鎖ポリペプチドのＣ末端から離れて、もしくは元の軽鎖ポリペプチドのＣ末端から離れずに；及び／または軽鎖伸長のＣ末端から離れて、もしくは軽鎖伸長のＣ末端から離れずに）、それにより、当該抗体の複合体化産物の当該システイン（複数含む）に連結される剤（たとえば、細胞毒性剤、標識剤等）の対応する数及び配置を制御することができる。
【００８１】
ある実施形態によると、Ｃ末端伸長は、以下の式Ｉ（Ｎ末端からＣ末端）により表されるアミノ酸配列を含有する：
（ＸaＣb）c（Ｘ’dＣe）f    （Ｉ）
ここで、
Ｘ及びＸ’は、１以上のアミノ酸のスペーサーを表し、ここで、各Ｘ及びＸ’のアミノ酸配列は、独立して、本明細書に開示されるスペーサーアミノ酸配列の例のいずれかを含む、対象の任意のアミノ酸配列から選択され、
Ｃは、システイン残基を表し、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０から独立して選択される整数を表し、ここで、ｂ及びｅの総計は、少なくとも１であり、ならびにｃ及びｆの総計は少なくとも１である。Ｘ及びＸ’は、同じであっても異なっていてもよい。ｃが１よりも大きい場合、（ＸaＣb）cの各Ｘは、（ＸaＣb）cの各反復単位内で、同じアミノ酸配列であっても異なるアミノ酸配列であってもよい。ｄが１よりも大きい場合、（Ｘ’dＣe）fの各Ｘ’は、（Ｘ’dＣe）fの各反復単位内で、同じアミノ酸配列であっても異なるアミノ酸配列であってもよい。
【００８２】
本発明はまた、式ＩのＣ末端伸長をコードする核酸、ならびに式ＩのＣ末端伸長を含有する軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を開示するものである。
【００８３】
ある実施形態において、Ｃ末端伸長は、Ｎ末端からＣ末端へ、上述の式Ｉにより表されてもよく、ｂ及びｅが、０、１及び２から独立して選択される整数である場合、ｂ及びｅの総計は、少なくとも１であり、ならびにａ、ｃ、ｄ及びｆが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０から独立して選択される整数であり、ｃ及びｆの総計は、少なくとも１である。
【００８４】
ある実施形態において、Ｃ末端伸長は、Ｎ末端からＣ末端へ、上述の式Ｉにより表されてもよく、ｂ及びｅが、０、１及び２から独立して選択される整数である場合、ｂ及びｅの総計は、少なくとも２であり、ならびにａ、ｃ、ｄ及びｆが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０から独立して選択される整数であり、ｃ及びｆの総計は、少なくとも１である。
【００８５】
ある実施形態において、Ｃ末端伸長は、Ｎ末端からＣ末端へ、上述の式Ｉにより表されてもよく、ｂ及びｅが０、１及び２から独立して選択される整数である場合、ｂ及びｅの総計は、少なくとも１であり、ａ及びｄが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から独立して選択される整数である場合、ならびにｃ及びｆが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から独立して選択される整数であり、ｃ及びｆの総計は、少なくとも１である。
【００８６】
ある実施形態において、Ｃ末端伸長は、Ｎ末端からＣ末端へ、上述の式Ｉにより表されてもよく、ｂ及びｅが０、１及び２から独立して選択される整数である場合、ｂ及びｅの総計は、少なくとも２であり、ａ及びｄが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から独立して選択される整数であり、ならびにｃ及びｆが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から独立して選択される整数であり、ｃ及びｆの総計は、少なくとも１である。
【００８７】
解説を目的とした式Ｉに関連した例として、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ、ｂ及びｃが各々＝１であり；ならびにｆ＝０である場合、Ｃ末端伸長は、配列ＧＧＧＳＣ（配列番号６０）（本明細書において「Ｃｙｓ１」とも呼称される）を有する。本実施形態に従うＣ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドを有する抗体の例を、図１に概略的に示す。示されているように、抗体１００は、軽鎖可変ドメイン（ＶL）及び定常ドメイン（ＣL）を含有する２つの軽鎖ポリペプチド、ならびに当該（ＣL）ドメインの各々のＣ末端残基から伸長する配列ＧＧＧＳＣを有するＣ末端伸長１０２及び１０４を含有する。
【００８８】
１つの実施形態において、ＸがＧＧＧＳ（配列番号１）である場合、ａは１であり、ｃは１であり、及びｆは０である。
【００８９】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ及びｃが各々＝１であり、ｂ＝２であり、ならびにｆ＝０である場合、Ｃ末端伸長は、配列ＧＧＧＳＣＣ（配列番号６１）を有する。
【００９０】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ＝２であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、及びｆ＝０である場合、Ｃ末端伸長は、配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＣ（配列番号６２）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【００９１】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝２であり、及びｆ＝０である場合、Ｃ末端伸長は、配列ＧＧＧＳＣＧＧＧＳＣ（配列番号６３）（本明細書において、「Ｃｙｓ２」とも呼称される）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【００９２】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝４であり、及びｆ＝０である場合、当該伸長は、配列ＧＧＧＳＣＧＧＧＳＣＧＧＧＳＣＧＧＧＳＣ（配列番号６４）（本明細書において、「Ｃｙｓ４」とも呼称される）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【００９３】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝３であり、ｅ＝１及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＧＧＧＳＣＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＣ（配列番号６５）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【００９４】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ＝２であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝１であり、ｅ＝１及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＣＧＧＧＳＣ（配列番号６６）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【００９５】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝２であり、ｅ＝１及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＧＧＧＳＣＧＧＧＳＧＧＧＳＣ（配列番号６７）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【００９６】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）を有するスペーサーであり、及びＸ’がＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）である場合、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝２であり、ｅ＝１及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＧＧＧＳＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号８９）を有する。
【００９７】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、一番目の（ＸaＣb）cの出現に関連し、ｃ＝２であり、Ｘが配列ＧＧＧＳ（配列番号１）であり、及び二番目の（ＸaＣb）cの出現に関連し、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、Ｘ’がＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）である場合、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝２であり、ｄ＝２であり、ｅ＝１及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＧＧＧＳＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号９０）を有する。
【００９８】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例として、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）を有するスペーサーである場合、ａ、ｂ、ｃは各々、＝１であり；ならびにｆ＝０である場合、当該Ｃ末端伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号６８）を有する。
【００９９】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、ａ＝２であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、及びｆ＝０である場合、当該Ｃ末端伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号６９）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【０１００】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝２であり、及びｆ＝０である場合、当該Ｃ末端伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号７０）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【０１０１】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝４であり、及びｆ＝０である場合、当該伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号７１）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【０１０２】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝３であり、ｅ＝１であり、及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号７２）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【０１０３】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、ａ＝２であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝１であり、ｅ＝１であり、及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号７３）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【０１０４】
解説を目的とした式Ｉに関連した１つの例において、ＸがＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号２）であり、ａ＝１であり、ｂ＝１であり、ｃ＝１であり、ｄ＝２であり、ｅ＝１であり、及びｆ＝１である場合、当該伸長は、配列ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＣ（配列番号７４）を有する（各スペーサー配列が同一である場合）。
【０１０５】
他の例において、本発明のＣ末端伸長は、以下の式ＩＩにより表されてもよい：
（ＸaＣb）c（Ｘ’dＣe）f（Ｘ”gＣh）i      （ＩＩ）
ここで、
Ｘ、Ｘ’及びＸ’’は、１以上のアミノ酸のスペーサーを表し、ここで、各Ｘ、Ｘ’及びＸ’’のアミノ酸配列は、独立して、本明細書に開示されるスペーサーアミノ酸配列の例のいずれかを含む、対象の任意のアミノ酸配列から選択され、
Ｃは、システイン残基を表し：及び、
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ及びｉは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、及び２０から独立して選択される整数であり、ここで、ｂ、ｅ、及びｈの総計は、少なくとも１であり、ならびにｃ、ｆ及びｉの総計は少なくとも１である。Ｘ、Ｘ’及びＸ’’は、同じであっても異なっていてもよい。ｃが１よりも大きい場合、（ＸaＣb）cの各Ｘは、（ＸaＣb）cの各反復単位内で、同じアミノ酸配列であっても異なるアミノ酸配列であってもよい。ｄまたはｆが１よりも大きい場合、（Ｘ’dＣe）fの各Ｘ’は、（Ｘ’dＣe）fの各反復単位内で、同じアミノ酸配列であっても異なるアミノ酸配列であってもよい。ｇまたはｉが１よりも大きい場合、（Ｘ’’gＣh）iの各Ｘ’’は、（Ｘ’’gＣh）iの各反復単位内で、同じアミノ酸配列であっても異なるアミノ酸配列であってもよい。
【０１０６】
本発明のＣ末端伸長は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣ（配列番号９２）（本明細書において、伸長１とも呼称される）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ（配列番号９３）（本明細書において、伸長２とも呼称される）；ＥＰＫＳＣ（配列番号９４）（本明細書において、伸長３とも呼称される）；ＥＳＫＹＧＰＰＣ（配列番号９５）（本明細書において、伸長４とも呼称される）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣ（配列番号９６）（本明細書において、伸長５とも呼称される）；ＥＲＫＣ（配列番号９７）（本明細書において、伸長６とも呼称される）；ＤＶＩＴＭＤＰＫＤＮＣ（配列番号９８）（本明細書において、伸長７とも呼称される）；ＤＨＶＫＰＫＥＴＥＮＴＫＱＰＳＫＳＣＨＫＰＫ（配列番号９９）（本明細書において、伸長８とも呼称される）；ＥＳＳＣ（配列番号１００）（本明細書において、伸長９とも呼称される）；ＥＳＳＣＤＶＫＬＶ（配列番号１０１）（本明細書において、伸長１０とも呼称される）；ＤＨＶＫＰＫＥＴＥＮＴＫＱＰＳＫＳＣ（配列番号１０２）（本明細書において、伸長１１とも呼称される）；ＤＶＩＴＭＤＰＫＤＮＣＳＫＤＡＮ（配列番号１０３）（本明細書において、伸長１２とも呼称される）；ＣＡＡ、ＣＣＡＡ（配列番号１３２）、ＡＡＣＡＡ（配列番号１２９）、及びＧＧＧＧＳＣＡＡ（配列番号１３０）から選択されるアミノ酸配列を含有してもよい（たとえば、からなるものであってもよい）。
【０１０７】
本発明により、本明細書に開示されるＣ末端伸長（たとえば、式ＩＩのＣ末端伸長等）のいずれかをコードする核酸、及び本明細書に開示される軽鎖ポリペプチド（たとえば、式ＩＩのＣ末端伸長を含有する軽鎖ポリペプチド等）のいずれかをコードする核酸もまた開示される。
【０１０８】
本発明により、本発明のＣ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドを少なくとも１つ有する抗体が開示される。一部の実施形態において、当該抗体は、本発明のＣ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドを２つ有する。一部の実施形態において、当該抗体は、当該抗体の軽鎖ポリペプチドのうちの少なくとも１つに存在するＣ末端伸長中の少なくとも１つのシステインに共有結合を介して付加された剤／ペイロード（例えば、薬剤）に結合されていてもよい。１つの実施形態において、当該ペイロードは、当該Ｃ末端伸長のシステインに直接付加されている。他の実施形態において、当該ペイロードは、リンカーを介して当該Ｃ末端伸長のシステインに付加されている。１つの実施形態において、当該ペイロードは、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステインではなく、当該Ｃ末端伸長のシステインに優先的に付加される。１つの実施形態において、当該ペイロードは、当該Ｃ末端伸長のシステインに排他的に付加される。
【０１０９】
核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明により、Ｃ末端アミノ酸伸長（本明細書において、簡便性を目的として「改変軽鎖ポリペプチド」と呼称される）を有する軽鎖ポリペプチドをコードする核酸、ならびに、当該核酸を含有するベクター及び宿主細胞が開示される。当該核酸によりコードされる当該改変軽鎖ポリペプチドは、上述の特性のいずれかを任意の組み合わせで含有してもよい。たとえば、当該複合体の抗体部分のＣ末端伸長は、当該伸長の長さ、当該伸長のアミノ酸組成、当該伸長中のスペーサーの数、及びそのアミノ酸配列に関し、上述のＣ末端伸長の特性のいずれかを含有してもよく、１以上のスペーサー及び１以上のシステイン残基の組み合わせに基づいた伸長構成のいずれかを含有してもよく、ならびに上述及び本明細書の他の部分に記述されるＣ末端伸長の任意の他の態様を含有してもよい。
【０１１０】
Ｃ末端伸長含有軽鎖ポリペプチドをコードする核酸（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡ）は、１以上の制御性因子（たとえばプロモーター及びエンハンサー等）に操作可能に連結されていてもよく、それにより宿主細胞（たとえば、当該コードされた改変軽鎖ポリペプチドを合成するよう遺伝的に改変された細胞）において当該核酸が発現されうる。
【０１１１】
たとえば、宿主細胞は、原核宿主細胞であり、プロモーターの例としては、限定されないが、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ｌａｃ  ｏｐｅｒｏｎプロモーター；ハイブリッドプロモーター（たとえば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター等）；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーター等；ａｒａＢＡＤプロモーター；ｉｎ  ｖｉｖｏ制御プロモーター（たとえば、ｓｓａＧプロモーターまたは関連プロモーターのｐａｇＣプロモーター）；ｎｉｒＢプロモーター；ｓｉｇｍａ７０プロモーター（たとえばコンセンサスシグマ７０プロモーター；静止期プロモーター（たとえばｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーター等）；病原性アイランドＳＰＩ−２由来のプロモーター；ａｃｔＡプロモーター；ｒｐｓＭプロモーター；ｔｅｔプロモーター；ＳＰ６プロモーター等が挙げられる。たとえば大腸菌等の原核細胞における使用に適した強力なプロモーターの例としては、限定されないが、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、及びＰLambdaが挙げられる。細菌性宿主細胞における使用に適したオペレーターの非限定的な例としては、ラクトースプロモーターオペレーター（ＬａｃＩリプレッサータンパク質はラクトースと接触した際に構造を変化させ、それによりＬａｃＩリプレッサータンパク質がオペレーターに結合することが妨げられる）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体化した際には、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合する構造を有し、トリプトファンの非存在下では、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合しない構造を有する）、及びｔａｃプロモーターオペレーターが挙げられる。
【０１１２】
一部の実施形態において、たとえば酵母細胞における発現に対しては、プロモーターは、たとえばＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーター等の構成的プロモーター；またはたとえばＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、及びＡＯＸ１（たとえばＰｉｃｈｉａにおける使用）等の制御性プロモーターであってもよい。
【０１１３】
改変軽鎖ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター及び／またはクローニングベクターに存在していてもよい。たとえば本発明の改変軽鎖ポリペプチドを有する抗体を作製するための等の、当該改変軽鎖ポリペプチドと、抗体の１以上の他のポリペプチド構成要素を発現することが望ましい場合、当該２以上のポリペプチドをコードする対応するヌクレオチド配列は、同じベクターまたは別のベクターにクローニングされてもよい。発現ベクターは、選択マーカー、複製起源、ならびにベクターの複製及び／または維持をもたらす他の特性を含有してもよい。
【０１１４】
通常、発現ベクターは、異種タンパク質をコードする核酸の挿入を行うため、プロモーター配列の近傍に配置された簡便な制限酵素部位を有している。発現ベクターの例としては、限定されないが、ウイルスベクター（たとえば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス；レトロウイルスベクター（たとえば、Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ、脾壊死ウイルス、ならびにたとえばＲｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ、Ｈａｒｖｅｙ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルス等のレトロウイルス由来のベクター）等）が挙げられる。
【０１１５】
また、当該改変軽鎖ポリペプチドをコードする核酸のいずれかを含有する宿主細胞、または当該核酸のいずれかを含有するベクターが開示される。ある態様において、宿主細胞は、原核細胞性の宿主細胞または真核細胞性の宿主細胞である。宿主細胞は、本発明の核酸を用いて遺伝的に改変されている（たとえば、形質転換またはトランスフェクションされている）、単離遺伝子改変宿主細胞（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞）であってもよい。一部の実施形態において、本発明の遺伝子改変宿主細胞は、本明細書に開示される特性のいずれかを有しうる抗体軽鎖ポリペプチドである、本発明の改変軽鎖ポリペプチドを産生することができる。
【０１１６】
宿主細胞の例としては、たとえば哺乳類細胞、昆虫宿主細胞、酵母細胞等の真核宿主細胞；たとえば細菌細胞等の原核細胞が挙げられる。当該宿主細胞への当該核酸の導入は、たとえば、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、リポソーム介在性トランスフェクション、エレクトロポレーション、または他の公知の方法により行われてもよい。
【０１１７】
哺乳類宿主細胞の例としては、初代細胞及び不死化細胞株が挙げられる。適切な哺乳類宿主細胞の例としては、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（たとえば、マウス、ラット等）細胞株等が挙げられる。適切な哺乳類宿主細胞としては、限定されないが、ＨｅＬａ細胞（たとえば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（たとえば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（たとえば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）、ベロ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（たとえば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（たとえば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞等が挙げられる。
【０１１８】
酵母宿主細胞の例としては、限定されないが、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ等が挙げられる。
【０１１９】
原核細胞の例としては、限定されないが、様々な実験用大腸菌株のいずれか、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．等が挙げられる。本発明に用いることができるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の例としては、限定されないが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ及びＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが挙げられる。適したＳｈｉｇｅｌｌａ株としては、限定されないが、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ  ｄｉｓｅｎｔｅｒｉａｅが挙げられる。典型的には、実験用株は、非病原性の株である。他の適切な細菌の非限定的な例としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．等が挙げられる。
【０１２０】
抗体軽鎖ポリペプチド及び抗体の作製方法
上述のように、本発明により、改変軽鎖ポリペプチド（すなわち、本発明のＣ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチド）の作製方法、ならびに１つ以上の当該改変軽鎖ポリペプチドを含有する抗体の作製方法が開示される。
【０１２１】
１つの実施形態によると、抗体の軽鎖ポリペプチドの作製方法が開示され、当該方法は、本明細書に開示されるＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞中で発現させることを含む。当該軽鎖ポリペプチドは、任意の簡便な方法（たとえば、タンパク質合成のための標準的な合成方法、組み換えＤＮＡ法等）により作製されてもよい。Ｃ末端アミノ酸伸長を有する軽鎖ポリペプチドは、対象の重鎖ポリペプチドの作製と組み合わせて作製されてもよく、または作製後に、重鎖ポリペプチドと組み合わされてもよい（たとえば、本発明の軽鎖ポリペプチドと重鎖ポリペプチドを別々に発現する組み換え細胞を融合することにより、組み合わされる）。
【０１２２】
当該軽鎖ポリペプチドの作製に組み換え技術を用いることができる。たとえば、対象の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクターに挿入されてもよい。当該軽鎖ポリペプチドをコードする核酸セグメントは、当該軽鎖ポリペプチドを確実に発現する発現ベクター中の１以上の制御配列に操作可能に連結されてもよい。発現制御配列としては、限定されないが、プロモーター（たとえば天然型または異種のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサー因子、及び転写終結配列が挙げられる。発現制御配列は、真核宿主細胞（たとえばＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞）に形質転換またはトランスフェクションすることができるベクター中の真核細胞性プロモーターシステムであってもよい。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、当該宿主は、当該ヌクレオチド配列の望ましいレベルの発現、ならびに当該軽鎖ポリペプチドの回収及び精製に適した条件下で維持される。
【０１２３】
遺伝子コードの縮重があるため、様々な核酸配列が、所望の軽鎖ポリペプチドをコードすることができる。当該軽鎖ポリペプチドをコードする核酸配列は、ｄｅ  ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成により、元の抗体（Ｃ末端アミノ酸伸長を欠いている）の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸のポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘導（たとえば重複ＰＣＲ）により、作製されてもよい。Ｃ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を作製するための重複ＰＣＲに使用される方法の例は、本明細書の実施例に詳細に記述される。
【０１２４】
適した発現ベクターは通常、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な一部としてのいずれかで、宿主生物体中で複製可能である。標準的には、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の選択ができるよう、選択マーカー（たとえばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性、またはネオマイシン耐性）を含有している。発現ベクターと宿主細胞の例は上述されている。たとえば、宿主細胞は原核細胞（たとえば大腸菌、桿菌（たとえばＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種等）、酵母細胞（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（たとえばＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐｉｃｈｉａ等））、及び哺乳類細胞（たとえばＣＨＯ細胞株、Ｃｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞株、形質転換Ｂ細胞、ハイブリドーマ等）であってもよい。
【０１２５】
軽鎖ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相または固相を介して進展してもよい。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（当該配列のＣ末端アミノ酸が不溶性の支持体に付着され、次いで、当該配列の残りのアミノ酸が順次付加される）は、軽鎖ポリペプチドの化学合成の適切な方法の例である。たとえばＦｍｏｃ及びＢｏｃ等の様々な形式のＳＰＰＳが、軽鎖ポリペプチドの合成に利用可能である。固相合成法は当分野で利用可能である。たとえば、ペプチド鎖が形成された機能性ユニットを用いて、小さな不溶性の多孔性ビーズを処置する。カップリング／脱保護のサイクルを繰り返した後、付着された固相の遊離Ｎ末端アミンが、１つのＮ保護アミノ酸ユニットにカップリングされる。次いで、このユニットを脱保護し、追加のアミノ酸が付着される新たなＮ末端アミンが露出される。ペプチドは固相上に固定されたまま、切り離される前にろ過プロセスを経る。
【０１２６】
（組み換え的に、または化学的に）合成された時点で、当該改変軽鎖ポリペプチドは、単独で、または抗体の一部としてのいずれかで、標準的な方法により精製されてもよい。当該改変軽鎖ポリペプチドは、単独で、または抗体の一部としてのいずれかで、実質的に純粋であってもよい（たとえば、少なくとも約８０％〜８５％の純度、少なくとも約８５％〜９０％の純度、少なくとも約９０％〜９５％の純度、または９８％〜９９％以上の純度であり、たとえば当該軽鎖ポリペプチド以外の細胞残渣、微小分子等の混入物がない状態）。
【０１２７】
ある実施形態によると、当該軽鎖ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳により産生される。たとえば、Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｃａｌａｂｌｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４，Ｉｓｓｕｅ  ２を参照にされたい。
【０１２８】
当該抗体は、たとえばキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、二特異性抗体、脱免疫化抗体、及び／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製された抗体等の組み換え抗体であってもよい。
【０１２９】
複合体
本発明は、Ｃ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドを少なくとも１つ有する抗体を開示するものであり、当該Ｃ末端伸長のうちの少なくとも１つのシステインは、剤（たとえば薬剤）に結合されている。
【０１３０】
本発明の複合体の抗体部分のＣ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドは、上述の任意の特性を任意の組み合わせで含有してもよい。たとえば、当該複合体の抗体部分のＣ末端伸長は、当該伸長の長さ、当該伸長のアミノ酸組成、当該伸長中のスペーサーの数、及びそのアミノ酸配列に関し、上述のＣ末端伸長の特性のいずれかを含有してもよく、１以上のスペーサー及び１以上のシステイン残基の組み合わせに基づいた伸長構成のいずれかを含有してもよく、ならびに上述及び本明細書の他の部分に記述されるＣ末端伸長の任意の他の態様を含有してもよい。
【０１３１】
従って、本発明の抗体複合体は、Ｃ末端伸長を有する軽鎖ポリペプチドを少なくとも１つ有し、当該Ｃ末端伸長の少なくとも１つのシステインは、剤に結合されている。一部の実施形態において、本発明の抗体複合体の軽鎖ポリペプチドの各々は、Ｃ末端伸長を有しており、当該改変軽鎖ポリペプチドのＣ末端伸長のシステイン残基の少なくとも１つは剤に結合されている。たとえば、第一の剤は、第一の改変軽鎖ポリペプチドのＣ末端伸長のシステイン残基に結合されていてもよく、及び第二の剤は、第二の軽鎖ポリペプチドのＣ末端伸長のシステイン残基に結合されていてもよい。１つの実施形態において、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側のシステイン残基よりも、当該Ｃ末端伸長のシステイン残基に優先的に付加される。ある態様において、当該剤は、当該Ｃ末端伸長のシステイン残基に排他的に付加される。本発明の抗体複合体は、結合に利用可能な当該Ｃ末端伸長中のシステインの数に従い（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９またはそれ以上のシステイン）、当該改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端伸長に結合される任意の数の剤を含有しうる。一部の実施形態において、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端伸長は、当該Ｃ末端伸長の少なくとも１、２、３、４、５以上への共有結合を介して剤（複数含む）に結合されている。一部の実施形態において、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端伸長は、当該Ｃ末端伸長の２、３、４、５、６、７、８、９または１０個未満のシステインへの共有結合を介して剤（複数含む）に結合されている。ある態様において、当該伸長は、直接、または１以上のリンカーを介してのいずれかで、当該伸長中の隣接するシステイン残基の２つ以上に結合されている。たとえば、当該伸長は、当該伸長中の２つの隣接するシステイン残基に結合されている剤を含有してもよい。
【０１３２】
ある実施形態において、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端伸長に結合されている剤の数は、薬剤と抗体の比率（ＤＡＲ）により特徴づけられてもよい。一部の例において、複数の抗体複合体の分布は、当該分布における、抗体複合体の平均ＤＡＲを測定することにより特徴づけられてもよく、当該平均ＤＡＲは、分布における、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端伸長に結合された剤の平均数を示す。「平均」とは、算術平均を意味する。ある場合において、平均ＤＡＲは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により解析される。したがって、平均ＤＡＲは、ＤＡＲ解析により提示される、分布における抗体複合体の薬剤と抗体の平均比率の指標を示す。
【０１３３】
一部の例において、本発明の抗体複合体のＤＡＲは、０〜２０の範囲であり、たとえば、１〜１７、または１〜１５、または１〜１２、または１〜１０、または１〜９、または１〜８、または１〜７、または１〜６、または１〜５、または１〜４、または１〜３である。たとえば、ＤＡＲが０の場合、抗体が複合体化されていないことを示し；ＤＡＲが１の場合、１つの剤（たとえば薬剤）が当該抗体の改変軽鎖ポリペプチドのＣ末端伸長に結合されていることを示し；ＤＡＲが２の場合、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端伸長の１以上に２つの剤が結合されていることを示し；ＤＡＲが３の場合、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端の１以上に３つの剤が結合されていることを示し；ＤＡＲが４の場合、当該抗体の改変軽鎖ポリペプチド（複数含む）のＣ末端の１以上に４つの剤が結合されていることを示す。一部の例において、本発明の抗体複合体のＤＡＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。
【０１３４】
一部の例において、本発明の抗体複合体の分布の平均ＤＡＲは、０〜２０の範囲であり、たとえば、１〜１７、または１〜１５、または１〜１２、または１〜１０、または１〜９、または１〜８、または１〜７、または１〜６、または１〜５、または１〜４、または１〜３である。たとえば、平均ＤＡＲが０の場合、平均して、分布において抗体が複合体化されていないことを示し；平均ＤＡＲが１の場合、平均して、分布において１つの剤（たとえば薬剤）が各抗体に結合されていることを示し；平均ＤＡＲが２の場合、平均して、分布において２つの剤が各抗体に結合されていることを示し；平均ＤＡＲが３の場合、平均して、分布において３つの剤が各抗体に結合されていることを示し；平均ＤＡＲが４の場合、平均して、分布において４つの剤が各抗体に結合されていることを示す。一部の例において、本発明の抗体複合体の分布の平均ＤＡＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。
【０１３５】
ある実施形態において、本発明の抗体複合体を含有する試料は、非複合体化抗体と複合体化（たとえば、一複合体化、二複合体化、三複合体化等）抗体の混合物を含有する。抗体複合体の各分布の平均ＤＡＲは、たとえばＨＩＣにより分析されてもよい。たとえば、抗体複合体を含有する試料は、非複合体化抗体（すなわち、平均ＤＡＲ＝０を有する抗体複合体）の分布、一複合体化抗体（すなわち、平均ＤＡＲ＝１を有する抗体複合体）の分布、二複合体化抗体（すなわち、平均ＤＡＲ＝２を有する抗体複合体）の分布、三複合体化抗体（すなわち、平均ＤＡＲ＝３を有する抗体複合体）の分布等を含有してもよい。
【０１３６】
本発明の実施形態に従う抗体複合体の例は、図２に概略されている。示されているように、複合体２００は、軽鎖可変（ＶL）と定常（ＣL）ドメインを含有する軽鎖ポリペプチドを２つ、及び各（ＣL）ドメインのＣ末端残基から伸長する配列ＧＧＧＳＣを有するＣ末端伸長、を有する抗体が含まれる。複合体２００はさらに、リンカーを介して当該伸長のシステイン残基に連結された剤２０２及び２０４を含有する。
【０１３７】
リンカー
ある態様において、当該剤は、リンカーを介してシステイン残基に結合されている。本発明の複合体における用途が見いだされるリンカーとしては、マレイミド、またはマレイミドをベースとしたリンカー；バリン‐シトルリンリンカー；ヒドラゾンリンカー；Ｎ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルジチオ）酪酸塩（ＳＰＤＢ）リンカー；スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）リンカー；ビニルスルホンをベースとしたリンカー；システインに適合された金属原子（複数含む）を含有するリンカー；たとえば限定されないがテトラエチレングリコール等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有するリンカー；プロパン酸を含有するリンカー；カプロレイン酸を含有するリンカー；Ｆｌｅｘｉｍｅｒ（登録商標）ポリマー（Ｍｅｒｓａｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含有するリンカー、またはＦｌｅｘｉｍｅｒポリマーに薬剤を付加するために用いられるリンカー（たとえば、ＵＳＰＮ  ８，５２４，２１４（参照によりその全体で本明細書に援用される）を参照のこと）；及びそれらの任意の組み合わせを含有するリンカーが挙げられる。
【０１３８】
ある態様において、リンカーは、化学的に不安定なリンカーであり、たとえば中性ｐＨ（血流のｐＨ７．３〜７．５）で安定であるが、弱酸性のエンドソーム（ｐＨ５．０〜６．５）及び標的細胞（たとえばがん細胞）のリソソーム（ｐＨ４．５〜５．０）に内在化されると加水分解される、酸‐開裂可能なリンカーがある。化学的に不安定なリンカーとしては、限定されないが、ヒドラゾンをベースとしたリンカーが挙げられる。ある実施形態によると、当該リンカーは、酵素的に不安定なリンカーであり、たとえば、血流中では安定であるが、標的細胞内に内在化されると、酵素的に開裂される（たとえば標的細胞（たとえば癌細胞）のリソソーム中でリソソームプロテアーゼ（たとえばカテプシンまたはプラスミン等）により酵素的に開裂される）。酵素的に不安定なリンカーとしては、限定されないが、ペプチド結合を含有するリンカー（たとえばマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジル（ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ）リンカー等のバリン−シトルリンリンカー）が挙げられる。ある態様において、当該リンカーは、非開裂可能なリンカーであり、たとえば非開裂可能なチオエーテル結合を含有するリンカーである。化学的に不安定なリンカー、酵素的に不安定なリンカー、及び非開裂可能なリンカーは公知であり、たとえばＤｕｃｒｙ  ＆  Ｓｔｕｍｐ（２０１０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２１：５−１３に詳述されている。
【０１３９】
ある実施形態によると、当該リンカーは、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基（複数含む）の１以上の還元スルフヒドリル基（またはチオール、−ＳＨ）と反応することができるスルフヒドリル反応性化学基である（または、含有する）。当該Ｃ末端伸長のシステインへの剤の連結に用途が見いだされるスルフヒドリル基反応性化学基としては、限定されないが、マレイミド、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、アジリジン、アクリロイル、アリール化剤、ビニルスルホン、ＴＮＢ−チオール、金属及びジスルフィド還元剤が挙げられる。当該基は、アルキル化（たとえばチオエーテル結合の形成により）、ジスルフィド交換（ジスルフィド結合の形成）等によりスルフヒドリルに結合されてもよい。
【０１４０】
剤
本発明の抗体複合体のペイロードとなる剤は、任意の適切な剤であってもよい。本発明の抗体複合体での使用に選択される剤は、当該複合体が用いられる応用法により変化しうる（たとえば、殺傷、細胞増殖阻害、ホルモン療法、標的画像化及び／または遺伝子治療等）。対象の剤としては、限定されないが、治療剤（たとえば、薬剤（たとえば、細胞毒性剤））、検出可能な剤（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング剤）、及び／または対象の特定の抗体をベースにした応用法に有用な他の剤が挙げられる。
【０１４１】
そのような剤の非限定的な例としては、毒素、毒素の断片、レクチン、アルキル化剤、酵素、抗生物質（たとえば抗菌物質、抗真菌剤、抗マイコプラズマ剤等）、抗ウイルス剤、抗代謝剤、抗増殖剤、または抗新生物剤、ＤＮＡ、放射線不透過性色素、放射性同位元素（たとえば、Ｉ123、Ｉ131ならびに放射性金属イオン）、金属イオン、蛍光性化合物、マーカー化合物、及び細胞膜透過性を変化させる化合物が挙げられる。ある態様において、当該剤は、特異的結合対（たとえば、アビジン／ストレプトアビジンと特異的な結合対を形成するビオチン等）の一つである（または、含む）。
【０１４２】
ある実施形態によると、当該剤は、治療剤である。対象の治療剤としては、細胞／組織表面上の抗原への当該複合体の抗体部分の特異的結合を介して当該複合体が結合し、細胞／組織の機能に影響を与えることができる剤が挙げられる。たとえば、当該剤は、当該複合体が特異的に結合する、細胞／組織の機能を強化してもよい。あるいは、当該細胞／組織の機能が病的である場合には、当該細胞／組織の機能を低下させる剤が用いられてもよい。ある態様において、本発明の複合体は、細胞増殖を阻害することにより、及び／または当該細胞／組織を殺傷することにより、標的細胞／組織の機能を低下させる剤を含有する。そのような剤は変化してもよく、ならびに細胞増殖抑制剤及び細胞毒性剤を含有してもよい（たとえば、標的細胞内への内在化を伴っても、伴わなくても、標的細胞を殺傷することができる剤）。
【０１４３】
ある態様において、治療剤は、エンジイン、レキシトロプシン（ｌｅｘｉｔｒｏｐｓｉｎ）、ズオカルマイシン、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド、及びビンカアルカロイドから選択される細胞毒性剤である。一部の実施形態において、当該細胞毒性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ＣＣ−１０６５、ＣＰＴ−１１（ＳＮ−３８）、トポテカン、ドキソルビシン、モルホリノ−ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、ドラスタチン−１０、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアミシン、メイタンシン、メイタンシンＤＭ１、メイタンシンＤＭ４、ＤＭ−１、オーリスタチン、または他のドラスタチン誘導体（たとえばオーリスタチンＥまたはオーリスタチンＦ）、ＡＥＢ（ＡＥＢ−０７１）、ＡＥＶＢ（５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル）、ＡＥＦＰ（抗体−エンドスタチン融合タンパク質）、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、エリュテロビン、ネトロプシン、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１４４】
ある実施形態によると、当該剤は、ヘミアステリン及びヘミアステリンアナログ（たとえばＨＴＩ−２８６（たとえば、ＵＳＰＮ７，５７９，３２３；ＷＯ２００４／０２６２９３；及びＵＳＰＮ８，１２９，４０７を参照のこと。それら公開文書のすべては、参照により本明細書に援用される）、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、エンドトキシン、緑膿菌外毒素、緑膿菌エンドトキシン、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽菌毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２、アフラトキシン、マウロトキシン、アジトキシン、カリブドトキシン、マルガトキシン、スロトキシン、スキラトキシン、ヘフトキシン、カルシセプチン、タイカトキシン、カルシクルジン、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、オクラトキシンＡ、パツリン、リシン、ストリキニーネ、トリコテセン、ゼアラレノン、及びテトラドトキシンから選択されるタンパク質毒素である。用いられ得る酵素的に活性な毒素及びその断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害物質、クルシン、クロチン、サポアオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン類が挙げられる。
【０１４５】
ある態様において、当該剤は、標識剤である。「標識剤」（または検出可能な標識）とは、抗体を検出可能に標識する剤を意味しており、それによって抗体を、対象の応用法（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／もしくはｉｎ  ｖｉｖｏ研究、ならびに／または臨床応用）において検出することができる。対象の検出可能な標識としては、放射性同位元素、検出可能な産物を生成する酵素（たとえば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光性タンパク質、常磁性原子等が挙げられる。ある態様において、当該抗体は、検出可能な標識の特異的結合パートナーに結合されている（たとえば、検出が、アビジン／ストレプトアビジンを含有する検出用標識を介して発生するよう、ビオチンに結合されている）。
【０１４６】
ある実施形態によると、当該剤は、たとえば近赤外線（ＮＩＲ）光学イメージング、単光子放出コンピューター断層（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴ画像法、ポジトロン放出断層画像法（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法等のｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析法における用途が見いだされる標識剤である。そのような応用法における用途が見いだされる標識剤としては、限定されないが、蛍光性標識、放射性同位元素等が挙げられる。ある態様において、当該標識剤は、２以上の画像解析法を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析法が可能となるような複合型ｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析剤である（たとえば、Ｔｈｏｒｐ−Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｏｇａｎ  （２０１１）Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９−６１４３を参照のこと）。
【０１４７】
ある態様において、当該標識剤は、近赤外光（ＮＩＲ）画像解析法において用途が見いだされるｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析剤であり、当該剤は、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−ＳＩＧＨＴ色素、Ｐｚ  ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０及び８００  Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ  ５．５及び７Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０及び７５０  Ｄｙｅｓ、ＩＲＤｙｅ  ６８０及び８００ＣＷ  Ｆｌｕｏｒｓから選択される。ある実施形態によると、当該標識剤は、ＳＰＥＣＴ画像解析法における用途が見いだされるｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析剤であり、当該剤は、99mＴｃ、111Ｉｎ、123Ｉｎ、201Ｔ１、及び133Ｘｅから選択される。ある態様において、当該標識剤は、ポジトロン放出断層（ＰＥＴ）画像解析法における用途が見いだされるｉｎ  ｖｉｖｏ画像解析剤であり、当該剤は、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆ、64Ｃｕ、62Ｃｕ、124Ｉ、76Ｂｒ、82Ｒｂ及び68Ｇａから選択される。
【０１４８】
結合方法
本発明はまた、抗体複合体の作製方法を開示するものである。当該方法は、Ｃ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体に剤を結合することを含み、当該伸長はシステイン残基を含有し、当該剤は、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に、直接、または間接的（たとえばリンカーを介して）に結合される。１つの実施形態において、当該方法は、当該Ｃ末端伸長の外側のシステインではなく、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン残基に優先的に（または「偏向的に」）剤が結合することを含む。ある態様において、当該結合は、たとえばマレイミド化学反応、ハロアセチル化学反応、ピリジルジスルフィド化学反応、または本明細書に記述される他の任意の適切な化学反応を用いて、当該システイン残基のスルフヒドリル基にリンカーを結合させることを含む。当該複合体を作製する方法はさらに、結合工程の前に、たとえば上述の適切な還元剤及び反応条件を用いて、システイン残基をスルフヒドリル基（すなわちチオール）に還元することを含む。適切な還元剤としては、限定されないが、ＤＴＰＡ、システアミン、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）、それらの組み合わせ等が挙げられる。ある実施形態において、当該複合体を作製する方法は、Ｃ末端伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体と還元剤を接触させることを含む。ある実施形態において、当該複合体を作製する方法は、Ｃ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体と、第一の還元剤を接触させ、次いで、Ｃ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体と、第二の還元剤を接触させることを含む。本発明の別の実施形態では、当該軽鎖伸長内のシステインが合成産物としてすでに還元状態にあるため、還元工程を必要としない。ある実施形態において、還元抗体は、適切な酸化剤と接触させられてもよい。適切な酸化剤としては、限定されないが、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）等が挙げられる。抗体に結合される剤は、任意の有用な剤であってもよい。ある態様において、当該剤は、治療剤または標識剤であり、当該剤は、本明細書の他の箇所に記述されている。
【０１４９】
ある態様において、当該剤は、マレイミド化学反応を用いて当該Ｃ末端伸長のシステインに連結されている。マレイミド基は、当該反応混合物のｐＨがｐＨ６．５〜７．５の間にある場合にスルフヒドリル基と特異的に反応してもよく、それにより、安定なチオエーテル結合が形成される。たとえば、マレイミド改変剤（たとえば、薬剤）を、Ｃ末端アミノ酸伸長の還元システイン（たとえば、スルフヒドリル基またはチオール基）と反応させ、当該剤と抗体の間にチオエーテル結合を形成させてもよい。よりアルカリ性の条件下（ｐＨ＞８．５）では、第一級アミンを、マレイミドとの反応に対し、チオールと競合させてもよく、また、当該マレイミド基の非反応性マレアミド酸への加水分解の速度を上げてもよい。マレイミドは、チロシン、ヒスチジン、またはメチオニンとは反応しない。マレイミドをベースとしたリンカーを用いた生体結合法は、たとえば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ２００８；Ａｓｌａｍ  ＆  Ｄｅｎｔ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ  １９９８；Ｋａｌｉａ  ＆  Ｒａｉｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１４（２）：１３８−１４７に記述されている。本発明の実施形態に従う、マレイミドをベースとしたリンカーを用いた適切な結合方法の例は、本明細書の実施例の項に詳細に記述されている。
【０１５０】
ある実施形態によると、当該剤は、ハロアセチル化学反応を用いて当該Ｃ末端伸長のシステインに連結されている。ある態様において、ヨードアセチル基またはブロモアセチル基を含有するハロアセチルリンカーが用いられる。ある実施形態において、ハロアセチル基は、生理学的なｐＨでスルフヒドリル基と反応する。当該ヨードアセチル基の反応は、スルフヒドリル基由来の硫黄原子とヨウ素原子の求核置換により進行し、それにより、安定したチオエーテル結合が生じる。
【０１５１】
ある態様において、当該剤は、ピリジルジスルフィド化学反応を用いて、当該Ｃ末端伸長のシステインに連結される。ある実施形態において、ピリジルジスルフィドは、広範なｐＨ範囲（ｐＨ４〜５が最適）で、スルフヒドリル基と反応し、ジスルフィド結合を形成する。当該反応の間、ジスルフィド交換が、当該抗体のスルフヒドリル基と２−ピリジルジチオール改変剤の２−ピリジルジチオール基の間に発生する。結果として、ピリジン−２−チオンが放出され、分光光度法により測定され（Ａｍａｘ＝３４３ｎｍ）、当該反応の進行をモニターすることができる。
【０１５２】
当該剤が（たとえばリンカーを介して）付加されるＣ末端アミノ酸伸長のシステイン中に還元スルフヒドリルを生成するために、当該システインは、還元スルフヒドリル基を生成するのに十分な条件下で、適切な還元剤と接触されてもよい。ある態様において、当該還元剤は、システアミン塩酸塩、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエチルアミン、トリス（２−カルボキシル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、システインＨＣｌ、Ｎ−エチルマレイミド、ナシステリン（Ｎａｃｙｓｔｅｌｙｎ）、ドルナーゼアルファ、サイモシンβ４、グアイフェネシンＴＣＥＰ  ＨＣｌ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。そのような還元剤の反応条件は当分野に公知であり、たとえば元の抗体中に存在しているシステイン残基（たとえば、軽鎖及び重鎖のＣLとＣH１の間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基、及び／または重鎖のヒンジ領域の間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基）に対し、当該Ｃ末端伸長中に存在するシステイン（複数含む）の優先的または「偏向的」な還元を促進するために、最適化されていてもよい。本発明の別の実施形態では、合成産物として当該軽鎖伸長内のシステインはすでに還元状態であるため、還元工程は必要としない。
【０１５３】
当該Ｃ末端アミノ酸伸長の外側の１以上のシステインよりも、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン（複数含む）のシステインを優先的に還元する（または当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステイン（複数含む）を排他的に還元する）ことは、適切な還元条件を選択することにより行われる。ある態様において、適切な還元条件は、以下の１つ以上の適切な選択を含む：還元剤に、当該Ｃ末端アミノ酸伸長のシステインの還元を優先させる立体的かさ高さを有する、軽度な還元剤及び／もしくは還元剤；還元剤と基質の濃度；還元反応が行われる温度、還元反応混合物のｐＨ；還元反応に用いられる緩衝剤；ならびに／または伸長Ｃ末端軽鎖ポリペプチドを発現する細胞が、たとえば、当該Ｃ末端伸長上に遊離チオールを得るための、及び／もしくは還元分子間ジスルフィドの作製を容易にするための条件下で培養されること。
【０１５４】
医薬組成物
上記に要約されるように、本発明により、組成物が開示される。本発明の組成物は、上述のいずれかの抗体、複合体、核酸、ベクター及び／または宿主細胞を含有してもよい。本発明の態様には、医薬組成物が含まれる。ある実施形態において、当該医薬組成物は、本明細書のいずれかに記述される任意の抗体（たとえば、上述のシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを含有する抗体）、または本明細書のいずれかに記述される任意の複合体（たとえば、上述のシステイン残基を含有するＣ末端アミノ酸伸長を含有する軽鎖ポリペプチドを有する抗体構成要素を含有する複合体）、及び薬学的に受容可能な添加剤を含有する。当該医薬組成物中に存在する抗体または複合体は、本発明の抗体、または本発明の複合体に関し、任意の組み合わせで、上述の特性のいずれかを含有してもよい。たとえば、抗体のＣ末端伸長、または複合体の抗体部分は、伸長の長さ、伸長を構成するアミノ酸、伸長中のスペーサーの数、及びそのアミノ酸配列、１以上のスペーサーと１以上のシステインの組み合わせに基づいた伸長の構造、ならびに上述及び本明細書のいずれかに記述されるＣ末端伸長の任意の他の態様に関し、上述のＣ末端伸長の特性のいずれかを含有してもよい。
【０１５５】
医薬組成物は通常、本発明の抗体または複合体の治療有効量を含有する。有効量は、１回以上の投与で投与されてもよい。
【０１５６】
本発明の抗体または複合体は、所望される治療効果または診断的効果が得られる任意の簡便な手段を用いて患者に投与されてもよい。ゆえに、当該抗体または複合体は、治療用投与のための様々な剤型に組み込まれてもよい。より具体的には、当該抗体は、適切な、薬学的に受容可能な担体または希釈物質と組み合わせることにより、医薬組成物に処方されてもよく、及び固体、半固体、液体、または気体状の形態で製剤へと処方されてもよい（たとえば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、注射物、吸入物、及びエアロゾル等）。
【０１５７】
患者への投与に適した（たとえば、ヒト投与に適した）本発明抗体または複合体の製剤は、通常、滅菌されており、及び、検出可能な発熱物質、または選択された投与経路により患者への投与が禁忌とされている他の混入物質がない状態であってもよい。
【０１５８】
医薬投与剤型において、抗体は、その薬学的に受容可能な塩の形態で投与されてもよく、または単独で用いられてもよく、もしくは他の薬学的に活性な化合物と適切に結合されて、ならびに組み合わせて用いられてもよい。以下の方法及び添加剤は、単に例示であり、限定ではない。
【０１５９】
経口用調整物に関しては、当該抗体または複合体は、単独、または錠剤、粉末、顆粒もしくはカプセルを作製するのに適した添加剤と組み合わせて用いられてもよく、たとえば、標準的な添加剤（たとえばラクトース、マンニトール、コーンスターチ、またはポテトスターチ）；結合剤（たとえば結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等）；崩壊剤（たとえばコーンスターチ、ポテトスターチ、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム等）；潤滑剤（たとえば滑石、またはステアリン酸マグネシウム等）；及びもし所望される場合には、希釈剤、緩衝材、湿潤剤、保存剤、及び香味剤と組み合わされて用いられてもよい。
【０１６０】
当該抗体または複合体は、水性溶媒もしくは非水性溶媒（たとえば植物油または他の類似した油、合成脂肪酸グリセリド、高次脂肪酸エステル、またはプロピレングリコール等）中への溶解、懸濁、または乳化により、及びもし所望の場合には、標準的な添加剤（たとえば可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤、及び保存剤）とともに注射用調整物へと製剤化されてもよい。
【０１６１】
本発明の医薬組成物は、所望される純度を有する抗体または複合体と、任意選択的な生理学的に受容可能な担体、添加剤、安定化剤、界面活性剤、緩衝剤、及び／または等張化剤を混合することにより調製されてもよい。受容可能な担体、添加剤、及び／または安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で、受領者に対し非毒性であり、及び緩衝剤（たとえばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン及びクエン酸を含有する）；保存剤（たとえばエタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、またはそれらの組み合わせ）；アミノ酸（たとえば、アルギニン、グリシン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン及びそれらの組み合わせ）；単糖、二糖、及び他の炭水化物；低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）；タンパク質（たとえばゼラチンまたは血清アルブミン）；キレート剤（たとえばＥＤＴＡ）；糖類（たとえばトレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ−メチルグルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸）；及び／または非イオン性界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含有する。
【０１６２】
当該医薬組成物は、液状、凍結乾燥状態、または凍結乾燥状態から再構成された液状であってもよく、当該凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液を用いて再構成されるものである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準的な手順は、ある量の純水（通常、凍結乾燥の間に除去された体積と等量）を加え戻すことであるが、抗菌剤を含有する溶液を経口投与用医薬組成物の作製に用いてもよい。
【０１６３】
本発明に従う医薬組成物中の提示的な抗体濃度または複合体濃度は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、または約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
【０１６４】
当該抗体または複合体の水性剤型は、ｐＨ緩衝溶液（たとえば、約４．０〜約７．０、または約５．０〜約６．０もしくは約５．５の範囲）中で調製されてもよい。この範囲内のｐＨに適した緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、スクシン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及び他の有機酸緩衝液が挙げられる。緩衝液濃度は、たとえば緩衝剤及び製剤の所望される等張性に依存し、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約５ｍＭ〜約５０ｍＭであってもよい。
【０１６５】
当該製剤の等張性を調節するために、等張剤が抗体製剤または複合体製剤に含有されてもよい。例示的な等張剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、及びアミノ酸、糖類の任意の成分、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、水性製剤は、等張であるが、高張溶液、または低張溶液が適切であってもよい。「等張」という用語は、たとえば生理学的塩溶液または血清等の比較される数種の他の溶液と同じ等張性を有する溶液を意味する。等張剤は、約５ｍＭ〜約３５０ｍＭの量で（たとえば、１００ｍＭ〜３５０ｍＭの量で）用いられてもよい。
【０１６６】
また、製剤化された抗体もしくは複合体の凝集を低下させるため、及び／または当該製剤中の粒子形成を最小化するため、及び／または吸着を低下させるために、当該抗体または複合体製剤に界面活性剤を添加してもよい。例示的な界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及び硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。適切なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０（商標）の商標で販売されている）及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商標）の商標で販売されている）である。適切なポリエチレン−ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８またはＰｏｌｏｘａｍｅｒ１８８（商標）の名称で販売されている製品である。適切なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標で販売されている製品である。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１〜約１％ｗ／ｖの範囲であってもよい。
【０１６７】
また、凍結乾燥プロセスの間の不安定な状態に対し、活性成分（たとえば当該抗体または当該複合体）を保護する目的で、凍結保護材が添加されていてもよい。たとえば、公知の凍結保護材としては、糖類（グルコース及びスクロースを含む）；ポリオール（マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む）；及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結保護材は、約１０ｍＭ〜５００ｎＭの量で含有されてもよい。
【０１６８】
ある態様において、当該製剤は、本発明の抗体または複合体、及び上述の剤（たとえば、界面活性剤、緩衝液、安定化剤、等張剤）を１種以上含有し、１種以上の保存剤（たとえば、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クロロ−ｍ−クレゾール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及びそれらの組み合わせ等）を実質的に含まない。他の実施形態において、保存剤が当該製剤中に（たとえば、約０．００１〜約２％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度で）含まれている。
【０１６９】
たとえば、当該製剤は、非経口投与に適した液体（たとえば、水性溶液またはエマルション）、またはその凍結乾燥製剤であってもよく、対象抗体または複合体を約１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ；少なくとも１つの界面活性剤を約０．００１％〜約１％；緩衝剤を約１ｍＭ〜約１００ｍＭ；任意選択的に安定化剤を約１０ｍＭ〜５００ｍＭ；及び等張剤を約５ｍＭ〜約３０５ｍＭを含有してもよく、ならびに約４．０〜約７．０のｐＨを有している。
【０１７０】
本発明の抗体または複合体は、吸入を介した投与のために、エアロゾル製剤中で用いられてもよい。当該抗体は、たとえばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の受容可能な加圧ガス中で製剤化されてもよい。
【０１７１】
経口投与用の単位投与剤型（たとえば、シロップ、エリキシル、及び懸濁液等）が提供されてもよく、ここで、各投与単位は、たとえば小さじ一杯、大さじ一杯、または錠剤であり、１以上の阻害物質を含有する組成物の所定量を含有する。同様に、注射用または静脈内投与用の単位投与剤型は、滅菌水、通常の生理食塩水、または他の薬学的に受容可能な担体の溶液として、組成物中に抗体または複合体を含有してもよい。
【０１７２】
本明細書において、「単位投与剤型」という用語は、ヒト及び動物対象に対する単一投薬量として適した、物理的に別個の単位を指し、各単位は、薬学的に受容可能な希釈物質、担体またはビヒクルとともに、所望の効果を得るために十分な量で算出された本発明化合物の所定量を含有する。対象抗体または複合体の仕様は、用いられる特定の抗体、得られる効果、及び宿主中での各抗体に関連した薬力学に依存しうる。
【０１７３】
ある態様において、医薬組成物（任意選択的に、単位投与剤型で提供される）は、約１０ｍｇ／ｍＬ〜約１０００ｍｇ／ｍＬ、たとえば約２５ｍｇ／ｍＬ〜約５００ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬ、約７５ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬ、または約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ（たとえば約１２５ｍｇ／ｍＬ）の濃度の本発明抗体または複合体を含有する。
【０１７４】
一部の実施形態において、当該抗体または複合体は、放出制御製剤で製剤化される。徐放性製剤は、当分野公知の方法を用いて調製されうる。徐放性製剤の適切な例としては、当該抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含有するものであり、当該マトリクスは、造形品の形態（たとえば、フィルムまたはマイクロカプセル等）である。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレンビニル酢酸、ハイドロゲル、ポリラクチド、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１７５】
本発明の範囲内の放出制御は、多くの持続放出型の投与剤型のうちの任意の１つを意味すると捉えられる。以下の用語は、本発明の目的に対し、実質的に放出制御と同等であるとみなされ得る：連続放出、制御放出、遅延放出、蓄積（デポー）、漸次放出、長期間放出、プログラム化放出、延長放出、比例放出（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ  ｒｅｌｅａｓｅ）、長期的放出、貯蔵（レポジトリ）、遅延（ｒｅｔａｒｄ）、徐放、間隔放出、持続的放出（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）、時限被膜、時限放出、遅延作用、延長作用、層状化時限作用、長期的作用、継続作用、反復作用、遅延作用、遅滞作用、持続作用、持続作用医薬品、及び持続的放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）。
【０１７６】
適切な投薬量は、様々な臨床因子に基づき、医師の参加により、または他の適格な医療従事者により決定されることができる。医療分野において公知であるが、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者の大きさ、身体の表面積、年齢、投与される特定の抗体または複合体、患者の性別、時間及び投与経路、一般健康状態、及び同時に投与される他の薬剤を含む、多くの因子に依存する。本発明の抗体または複合体は、１回投与量当たり１ｎｇ／体重ｋｇ〜２５ｍｇ／体重ｋｇ（たとえば、０．１ｍｇ／体重ｋｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ、たとえば、０．５ｍｇ／体重ｋｇ〜８ｍｇ／体重ｋｇ、たとえば、１ｍｇ／体重ｋｇ〜６ｍｇ／体重ｋｇ、たとえば、２ｍｇ／体重ｋｇ〜５ｍｇ／体重ｋｇ）の量で投与されてもよい；しかしながら、特に前述の因子を考慮し、これらの例示範囲を下回る、または上回る投与量も想定されうる。もしレジメンが連続点滴である場合、１μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇ／分の範囲であってもよい。
【０１７７】
当業者であれば、投与量が、特定の抗体、症状の重症度、及び副作用に対する当該対象の感受性に応じて変化しうることを容易に認識しうるであろう。所与の化合物に対する好ましい投与量は、様々な手段により、当業者に容易に決定されうる。
【０１７８】
標準的な、及び薬学的に受容可能な投与経路としては、静脈内、動脈内、筋肉内、鼻腔内、気管内、皮下、皮内、局所投与、経鼻、経口、及び他の腸内投与経路及び非経口投与経路が挙げられる。投与経路は、もし所望であれば、組み合わされてもよく、または当該抗体もしくは複合体及び／または所望される効果に基づき調節されてもよい。当該医薬組成物は、単回投与または複数回投与で投与されてもよい。一部の実施形態において、当該組成物は静脈内投与される。一部の実施形態において、当該組成物は経口的に投与される。一部の実施形態において、当該組成物は、吸入経路を介して投与される。一部の実施形態において、当該組成物は、鼻腔内に投与される。一部の実施形態において、当該組成物は、局所投与される。一部の実施形態において、当該組成物は、頭蓋内に投与される。
【０１７９】
治療方法
本発明は、疾患または障害の治療方法を開示するものである。当該方法は、本明細書のいずれかに記述される抗体、複合体、または医薬組成物のいずれかの治療有効量を、その必要のある対象に投与することを含んでもよい。当該抗体または複合体は、単独で投与されてもよく（たとえば、単剤療法）、または１以上の追加の治療剤と組み合わされて投与されてもよい（たとえば、併用療法）。
【０１８０】
一部の実施形態において、当該抗体または複合体の有効量は、単独（たとえば単剤療法）または１以上の追加の治療剤と組み合わされて（たとえば併用療法）、１以上の投与量で投与された際に、当該抗体または複合体を用いた治療を行わなかった個体における症状と比較し、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％以上まで、個体における疾患または障害の症状を低下させるために有効な量である。
【０１８１】
本発明の方法を用いて、対象の疾患または症状のいずれかを治療してもよい。ある態様において、当該方法を用いて、癌が治療される。たとえば、一部の実施形態において、本発明抗体または複合体は、当該抗体または複合体が有効量で投与された際に、宿主における癌細胞（複数含む）の増殖、転移及び／または浸潤を阻害する。「癌細胞」とは、たとえば、異常な細胞の成長、異常な細胞の増殖、密度依存性増殖阻害の消失、固定非依存性増殖潜在力、腫瘍増殖を促進する能力、及び／もしくは免疫不全の非ヒト動物モデルにおける発生、ならびに／または細胞変質の任意の適切な指標のうちの１以上により特徴づけられ得る腫瘍性細胞性の表現型を示す細胞を意味する。「癌細胞」は、本明細書において、「腫瘍細胞」、「悪性細胞」、または「癌性細胞」と相互交換可能に用いられてもよく、及び固形腫瘍、半固形腫瘍、原発腫瘍、転移腫瘍等の癌細胞を包含する。
【０１８２】
ある態様において、当該方法が癌治療を目的とした場合、当該抗体または当該複合体の抗体成分は、癌細胞の表面上の抗原に特異的に結合する。「抗原」及び「エピトープ」という用語は、当分野において公知であり、免疫システムの構成要素（たとえば抗体またはＴ細胞抗原受容体）により特異的に認識される高分子（たとえばポリペプチド）の一部を指す。本明細書において、「抗原」という用語は、抗原性エピトープ、たとえば抗原性エピトープである抗原の断片を包含する。また、ハプテンは、抗原の例である。エピトープは、溶液中の抗体（たとえば、他の分子から遊離している）により認識されてもよい。エピトープは、当該エピトープが、クラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体分子に関連づけられている場合、Ｔ細胞抗原受容体により認識されてもよい。
【０１８３】
がん治療に関連した対象抗原としては、腫瘍特異的抗原が挙げられ、たとえば、悪性細胞の表面上に存在し、非悪性細胞上には存在しない抗原がある。他の態様において、抗体に結合される抗原は、腫瘍関連抗原である。「腫瘍関連抗原」とは、悪性細胞上で発現され、正常組織の細胞上にはわずかしか発現されない抗原、正常細胞に対して悪性細胞上で、非常に高密度で発現される抗原、または発生段階で発現される抗原を意味する。
【０１８４】
任意の腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原が、本発明抗体または複合体の標的とされてもよい。ある態様において、本発明が、癌治療を目的としたものである場合、本発明抗体または本発明複合体の抗体成分に特異的に結合される抗原は、限定されないが、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５６、ＣＤ６６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８、ネクチン−４、メソテリン、膜貫通型糖蛋白質ＮＭＢ（ＧＰＮＭＢ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＳＬＣ４４Ａ４、ＣＡ６、ＣＡ−ＩＸ、または対象の任意の他の腫瘍関連抗原もしくは腫瘍特異的抗原を含んでもよい。
【０１８５】
抗体の特徴に関連し、「特異的に結合すること」または「特異的に結合する」とは、異なる抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に選択的に結合する抗体の能力を指す。ある実施形態において、特異的結合相互作用は、試料または生物体（例えば、ヒト）において、一部の実施形態においては、約１０〜１００倍以上（たとえば、約１０００倍または１０，０００倍超）で、望ましい抗原と望ましくない抗原（または「標的」と「標的ではない」抗原）を識別する。ある実施形態において、抗体‐抗原複合体中で特異的に結合される場合、抗体と抗原の間のアフィニティは、１０-6Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、１０-8Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、または約１０-12Ｍ未満のＫＤ（解離定数）により特徴づけられる。
【０１８６】
本発明方法を用いて治療されうる癌は、限定されないが、固形腫瘍、乳がん、前立腺がん、すい臓がん、大腸がん、腎細胞がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、及び抗体ベースの療法または抗体‐複合体ベースの療法を用いて治療されうる任意の他のタイプの癌が挙げられる。
【０１８７】
キット
本発明はまた、キットを開示する。ある実施形態によると、当該キットは、本明細書のいずれかに記述される特性のいずれかを有する、本発明の抗体、複合体または医薬組成物のいずれかを含有しうる。あるいは、またはさらに、当該キットは、本発明抗体、またはその軽鎖ポリペプチド、または本発明の複合体のいずれかの作製に有用な任意の試薬を含有してもよい。たとえば、当該キットは、システイン含有Ｃ末端アミノ酸伸長を含有する抗体軽鎖ポリペプチドをコードする核酸を含有してもよい。そのようなキットは、たとえば、本発明抗体または複合体の作製に用途が見いだされるコンピテント細胞、または１以上の抗体軽鎖ポリペプチド及び／もしくは重鎖ポリペプチドをコードする核酸をすでに有している細胞、当該Ｃ末端軽鎖ポリペプチド伸長中のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元するための還元剤、システイン残基の還元スルフヒドリル基に剤を結合させるためのリンカー、剤（リンカーに付加される、またはリンカーから分離される）、試薬、緩衝液、精製カラム等、またはその任意の組み合わせを含有してもよい。当該キットは、本発明方法（たとえば、疾患もしくは障害の治療方法、抗体軽鎖ポリペプチドの作製方法、及び／または抗体複合体の作製方法）の実施において、用途が見いだされる。
【０１８８】
当該方法を実施するためのキットは、本明細書に開示される抗体または複合体を含有する医薬組成物を１つ以上含有してもよい。ゆえに、当該キットは、１以上の単位剤型として、単一の医薬組成物を含有してもよい。さらに他の実施形態において、当該キットは、２以上の別々の医薬組成物を含有してもよい。
【０１８９】
当該キットの構成要素は、別々の容器に存在してもよく、または複数の構成要素が１つの容器に存在してもよい。ある実施形態において、凍結乾燥形態で当該構成要素が備えられることが簡便であり、それにより、すぐに使用でき、室温で簡便に保存することができる。
【０１９０】
上述の構成要素に加え、本発明のキットはさらに、本発明抗体もしくは複合体を用いた疾患または障害の治療のための、または本発明抗体もしくは複合体を作製するための当該キットの構成要素の使用説明書を含有してもよい。当該説明書は通常、適切な記録媒体に記録されている。たとえば、当該説明書は、紙またはプラスチック等の基板上に印刷されていてもよい。当該説明書は、添付文書として当該キット中に存在してもよく、当該キットまたはその構成要素の容器のラベル中に存在してもよい（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連づけられている）。他の実施形態において、当該説明書は、適切なコンピューター読み取りが可能な記憶媒体（たとえばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）等）に存在する電子記憶データとして存在する。さらに他の実施形態において、実際の説明書はキット中には存在しないが、遠隔ソースから、たとえばインターネットを介して当該説明書を得るための手段が備えられている。本実施形態の例は、当該説明書を見ることができるウェブアドレス、及び／または当該説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、適切な基板上に記載されている。
【０１９１】
以下の実施例は、限定ではなく、解説の目的で提示されるものである。
【実施例】
【０１９２】
実施例１
Ｃ末端軽鎖ポリペプチドシステイン含有伸長を有する抗体をコードする核酸のクローニング
ヒトＩｇＧ１Ｃ及びヒトＩｇＧｋＣクローニングベクターを作製するために、ヒトＩｇＧＣ及びＩｇｋＣ領域をｐＴＴ５ベクターへとクローニングした（図１）。定常領域を伴う、インフレームでの可変領域のクローニングを容易にするために、制限酵素部位を定常領域の５’末端に導入した。重鎖定常領域配列を、ＧＣＣ  ＴＣＣからＧＣＴ  ＡＧＣへと変え、元のアミノ酸配列を維持しながらＮｈｅＩ制限酵素部位を導入した。軽鎖ポリペプチド定常領域配列を、ＣＧＡ  ＡＣＴからＣＧＴ  ＡＣＧへと変え、元のアミノ酸配列を維持しながらＢｓｉＷＩ制限酵素部位を作製した。当該変化は、Ｏｐｅｒｏｎ−Ｅｕｒｏｆｉｎｓから購入したミスマッチＰＣＲプライマーを設計することにより導入した。ｐＴＴ５ベクターはＢｓｉＷＩ部位を含有していなかったため、ＩｇｋＣ５’プライマーを、５’ＮｈｅＩオーバーハングを用いて設計し、当該ベクターへのクローニングを容易にした。３’プライマーは、ストップコドンのＢａｍＨＩ制限酵素部位３’を用いて設計した。
【０１９３】
ＰＣＲ反応のｃＤＮＡ鋳型を作製するために、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニプレップキットを用いてヒト末梢血からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）から購入したオリゴｄＴプライマーとＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素を用いて合成した。
【０１９４】
ＰＣＲの後、断片及びベクターを、関連制限酵素を用いて消化し、１％アガロースゲルで分離した。消化断片はＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いてゲルから抽出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてベクターにライゲートした。コンピテントＤＨ５α大腸菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、単一細胞コロニーを、アンピシリン選択ＬＢプレート上で一晩、３７℃で増殖させた。プラスミドを単離するために、単一細胞コロニーを、液体ＬＢ−アンピシリン培地に播種し、一晩、３７℃で増殖させ、プラスミドをＱｉａｇｅｎ（登録商標）ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）スピンミニプレップキットを用いて単離した。クローンは、ミニプレップＤＮＡ消化によりスクリーニングし、Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓから購入したＧｅｎｅｉｏｕｓ配列アライメント、アセンブリ、及び解析のソフトウェアを用いた配列解析により確認した。クローニングに用いたプライマーの配列を表１に示す。
【０１９５】
【表１】
0006585600.tif 000002
【０１９６】
ＥＲＢＢ特異的抗体４Ｄ５ヒト化変異体８を作製するために、ハーセプチンＶ遺伝子を、ＩＤＴ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片として合成した。合成された配列を表２に示す。
【０１９７】
【表２】
0006585600.tif 000003
【０１９８】
当該断片は、上述されたように、重鎖ポリペプチドに対してはＥｃｏＲＩとＮｈｅＩ消化を用いて、軽鎖ポリペプチドに対してはＥｃｏＲＩとＢｓｉＷＩ消化を用いて、上述された定常領域ｐＴＴ５ベクターへとクローニングされた。
【０１９９】
軽鎖ポリペプチドに（ＧＧＧＳＣ）ｘ伸長を付加するために（ｘは、付加されたリピートの数である）、３’末端プライマーを設計し、所望の配列をＥｕｒｏｆｉｎｓＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎに注文した（表３に示す）。ＰＣＲ反応の鋳型として上述のハーセプチンＶＫ構築物を用いて、標準的なクローニング法が行われた。４システイン構築物を作製するために、２工程のオーバーラッピング法が用いられ、プライマーＩｇｋ＿ｒｅｖ＿３＿ｃｙｓは最初のＰＣＲに用いられ、次いで、プライマーＩｇｋ＿ｒｅｖ＿４＿ｃｙｓ＿Ｂａｍと、鋳型として最初のＰＣＲから得られたＰＣＲ産物を用いて増幅が行われた。すべての反応において用いられた５’プライマーは、ｐＴＴ５＿ｆｏｒ（表３）であった。ＰＣＲ断片を消化し、クローニングし、上述のように解析した。
【０２００】
【表３】
0006585600.tif 000004
【０２０１】
実施例２−抗体作製及び精製
上述の実施例１で作製されたプラスミドのＱｉａｇｅｎマキシプレップを行い、トランスフェクション用のプラスミドを単離した。ＨＥＫ２９３細胞に、ハーセプチン重鎖及びハーセプチン軽鎖‐ｃｙｓ構築物を用いて、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて共トランスフェクトした。細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）（０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ）溶液を補充）中で５日間、増殖させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞に０．５％トリプトンを補充した。上清を回収し、プロテインＡセファロースバッチ重力プロトコール（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分泌抗体を精製し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ１５フィルター（３０ｋＤａ  ＭＷカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＰＢＳ  ＰＨ７．４に緩衝液交換を行った。
【０２０２】
実施例３−ハーセプチン‐ＶＬＣｙｓＸジスルフィド結合の還元
ＰＢＳに溶解したハーセプチン及びハーセプチン‐ＶＬＣｙｓＸ（Ｘ＝１、２または４）の試料（１〜５ｍｇ）を、１００ｍＭ  リン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＰＡ、ｐＨ６．１に前調整したＺｅｂａ（商標）スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ＃８７７６７）にアプライし、メーカーの説明書に従い緩衝液交換を行った。タンパク質濃度を確立するための標準物としてハーセプチン、及び遊離チオール基の無い場合を確立するための標準物としてシステインを使用したＥｌｌｍａｎ‘ｓ試薬を用いて、ビシンコニン酸アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２５）により溶出物を解析した。
【０２０３】
ハーセプチンまたはハーセプチン‐ＶＬＣｙｓＸ（５〜３０μＭ）（１００ｍＭリン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＰＡ、ｐＨ６．１に溶解）は、同じ緩衝液に溶解した１．０Ｍストックからのシステアミン塩酸塩（５〜１０ｍＭ）を添加し、室温または３７℃のいずれかで４０〜１８０分間インキュベーションを行うことにより還元した。室温にまで冷却した後、１００ｍＭリン酸、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＤＴＰＡ、ｐＨ６．１で前調整したＺｅｂａ（商標）スピンカラム（４０ＫＤａ  ＭＷＣＯ）を通すことにより、反応混合物からシステアミンを除去した。余剰システアミンが除去されたことを確認するために、システイン連続希釈のアッセイにより作製された標準曲線を使用したＥｌｌｍａｎ’ｓ試薬を用いて解析した。また、このアッセイにより、タンパク質当たりの平均チオール含量の測定値がいくつか得られた。
【０２０４】
実施例４−ハーセプチン‐ＶＬＣｙｓＸの細胞毒性剤への結合
上述の実施例３の溶出物を氷上で冷却した後、マレイミド毒素（ｔｏｘｉｎ１、またはｔｏｘｉｎ２）が、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液（通常、チオール当たり２．０ｅｑであり、等量が還元ハーセプチン対照に加えられている（ハーセプチン‐ｔｏｘｉｎ２））から添加された。精製及び緩衝液交換（２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５）の前に、氷上で３０〜７０分間、結合反応を進ませた。精製された複合体を滅菌ろ過（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）０．２２ｕｍ遠心フィルター、＃８１６１）を行い、ＢＣＡ試薬を用いて総タンパク質含量の解析を行った。
【０２０５】
本明細書において、「Ｔｏｘｉｎ１」は、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−毒素であり、当該毒素は、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−（アミノメチル）ベンジルスルホニル）−２，５−ジメチル−４−（（Ｓ）−Ｎ，３，３−トリメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）−３−フェニルブタンアミド）ブタンアミド）ヘキサ−２−エナミドである。
【０２０６】
本明細書において、「Ｔｏｘｉｎ２」は、ＭＣ−ｖｃ−毒素であり、当該毒素は、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノベンジルスルホニル）−２，５−ジメチル−４−（（Ｓ）−Ｎ，３，３−トリメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）−３−フェニルブタンアミド）ブタンアミド）ヘキサ−２−エナミドである。
【０２０７】
本明細書において、「Ｔｏｘｉｎ３」は、ＭＴ−ｖｃ−毒素であり、当該毒素は、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノフェニルスルホニル）−２，５−ジメチル−４−（（Ｓ）−Ｎ，３，３−トリメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）−３−フェニルブタンアミド）ブタンアミド）ヘキサ−２−エナミドである。
【０２０８】
本明細書において、「Ｔｏｘｉｎ４」は、ＭＰ（Ｔ−ｖｃ−毒素）2であり、当該毒素は、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−アミノフェニルスルホニル）−２，５−ジメチル−４−（（Ｓ）−Ｎ，３，３−トリメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）−３−フェニルブタンアミド）ブタンアミド）ヘキサ−２−エナミドである。
【０２０９】
本明細書において、「Ｔｏｘｉｎ５」は、ＭＴ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−毒素であり、当該毒素は、（Ｓ，Ｅ）−Ｎ−（４−（アミノメチル）ベンジルスルホニル）−２，５−ジメチル−４−（（Ｓ）−Ｎ，３，３−トリメチル−２−（（Ｓ）−３−メチル−２−（メチルアミノ）−３−フェニルブタンアミド）ブタンアミド）ヘキサ−２−エナミドである。
【０２１０】
【化１】
0006585600.tif 000005
【０２１１】
本明細書において、「Ｔｏｘｉｎ６」は、ＭＴ−ｖｃ−毒素であり、当該毒素は、以下である：
【０２１２】
実施例５−癌細胞の活性に対する、ハーセプチンＶＬＣｙｓＸの効果の検証
上述の実施例４で作製された抗体薬剤複合体を、Ｈｅｒ２陽性ヒト乳がん細胞株ＨＣＣ１９５４に対し、様々な濃度で検証を行った。化合物添加の前日、ＨＣＣ１９５４細胞（１００μＬ）を、不透明壁で、透明な底の９６ウェル組織培養処置マイクロタイタープレートに、完全増殖培地を用いて、２５００細胞／１０μＬ培地の密度で添加した。ＨＣＣ１９５４細胞は、一晩、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートし、マイクロタイタープレート表面に細胞を付着させた。抗体薬剤複合体は、所望される最終最大濃度の５倍で完全増殖培地中に希釈され、次いで、化合物は、同じ培地、８工程で１：３に用量設定された。化合物がない対照（増殖培地のみ）は、６連で、各マイクロタイタープレートに含まれた。調製された化合物希釈を３連でＨＣＣ１９５４細胞に添加した（２５μＬ／ウェル）。細胞及び化合物希釈は、３〜５晩、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を用いて、各アッセイウェルに調整済みのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）を３０μＬ添加することにより、細胞活性を測定した。マイクロプレートルミノメーターを用いて発光を測定する前に、最短で２０分間、混合物をインキュベートした（５００ｍｓの積分時間）。集められた相対発光単位（ＲＬＵ）は、上述の増殖培地単独対照を用いて、細胞毒性％に転換された（細胞毒性％＝１−[ウェルＲＬＵ／平均培地単独対照ＲＬＵ]）。Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄソフトウェアで使用可能な非線形回帰法を用いて、データを曲線に適合させた。本実験から得られたデータを示すグラフは図３に示す。Ｈｅｒ−ＶＬＣｙｓ２−ｔｏｘｉｎ２、Ｈｅｒ−ＶＬＣｙｓ１−ｔｏｘｉｎ１、及びハーセプチン‐ｔｏｘｉｎ２のＥＣ５０値は、表４に示す。
【０２１３】
【表４】
0006585600.tif 000006
【０２１４】
実施例６−Ｃ末端軽鎖ポリペプチドシステイン含有伸長を含有する、追加の抗体をコードする核酸のクローニング
追加の軽鎖伸長を作製するために、ＩＤＴ（登録商標）の合成ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）遺伝子断片を、所望の配列で注文し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリクローニングキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ハーセプチンＶＫへインフレームでクローニングした。すべてのクローンは、配列を確認され、実施例１に記述されるように解析された。
【０２１５】
軽鎖アミノ酸配列、及び当該配列をコードする核酸配列を、以下の表５に示す。
【０２１６】
【表５−１】
0006585600.tif 000007
【表５−２】
0006585600.tif 000008
【０２１７】
【表６−１】
0006585600.tif 000009
【表６−２】
0006585600.tif 000010
【表６−３】
0006585600.tif 000011
【表６−４】
0006585600.tif 000012
【表６−５】
0006585600.tif 000013
【表６−６】
0006585600.tif 000014
【０２１８】
実施例７−抗体作製及び精製
実施例６で作製されたクローンのＱｉａｇｅｎマキシプレップを行い、トランスフェクションの準備が整ったプラスミドを単離した。２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に、ハーセプチン重鎖とハーセプチン軽鎖‐ｃｙｓ構築物を共トランスフェクトした。細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｇｉｂｃｏ）（０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｇｉｂｃｏ）溶液を補充）中で５日間、増殖させた。トランスフェクションの２４時間後、細胞に０．５％トリプトンを補充した。上清を回収し、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ装置及びＨｉｔｒａｐ  Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（カタログ＃１１−００３４−９３）を用いて上清から分泌抗体を精製し、次いで、３０ｋＤａ  ＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ１５フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、ＰＢＳ  ＰＨ７．４に緩衝液交換を行った。
【０２１９】
実施例８−二重還元及び複合体化
ハーセプチン  ＶＬＳｐａｃｅｒＸ（３０μＭ、ＰＢＳ）を、１．２５ｍＭジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）（２．５ｍＭ、ｐＨ６．７のストック溶液からのＰＢＳ溶液）を添加し、次いで、システアミン塩酸塩（最終濃度１ｍＭ）を１．０Ｍストックから添加することにより、還元した。試料を、３７℃で１２０分間、インキュベートした。室温にまで冷却した後、ＰＢＳ＋１ｍＭ  ＤＴＰＡ  ｐＨ７．３で前調整したＺｅｂａ（商標）スピンカラム（４０ＫＤａ  ＭＷＣＯ）を通すことにより、反応混合物からシステアミンを除去した。
【０２２０】
溶出物を冷却した後、マレイミド毒素（ｔｏｘｉｎ１、ｔｏｘｉｎ３、またはｔｏｘｉｎ４）が、１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液（通常、抗体濃度に基づき、５．０ｅｑであり、等量が還元ハーセプチン対照に加えられている）から添加された。氷上で３０〜７０分間、複合体化反応を進ませ、その後、ＰＢＳで前調整したＺｅｂａ（商標）スピンカラム（４０ＫＤａ  ＭＷＣＯ）を通した。
【０２２１】
高い薬剤担持量を得るため、開始物質として複合体化された物質を用いて、上述の還元及び複合体化の手順を繰り返した。
【０２２２】
実施例９−還元及び再酸化による、複合体化のための軽鎖伸長抗体の作製
軽鎖が伸長された全長モノクローナル抗体は、ＰＢＳ及び１ｍＭ  ＤＴＰＡ中で、２時間、３７℃、約１２倍のＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）を用いて還元された（最終抗体濃度は２．５ｍｇ／ｍＬ）。還元された軽鎖伸長抗体を、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ、４０Ｋ  ＭＷＣＯにロードし、ＰＢＳを用いて溶出した。溶出された還元抗体を、１０等量の１０ｍＭ  デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）を用いて、室温で３０分間、ＰＢＳ中で処理した。
【０２２３】
実施例１０−軽鎖伸長抗体の複合体化
実施例９の再酸化された抗体を、抗体に対し３．５モル等量で組合せ、混合し、室温で約１時間反応させ、複合体化を行い、軽鎖伸長抗体‐薬剤複合体（ＡＤＣ）（Ｔｓｐ２−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ３−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ４−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ５−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ６−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ９−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４、Ｔｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１、Ｔｓｐ１１−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＶＬＣｙｓ１−Ｔｏｘｉｎ３（ＤＡＲ  １．０６）、Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４、Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１、Ｂｓｐ１０−Ｔｏｘｉｎ６、及びＢｓｐ１０−ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥを含む）を形成させた。複合体混合物は、Ｚｅｂａ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ、４０Ｋ  ＭＷＣＯにロードし、ＰＢＳで溶出した。
【０２２４】
実施例１１−抗体結合アッセイ
ＨＥＲ２発現ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をトリプシン処理し、計数し、及び試料当たり５０，０００個の細胞を、非複合体化ＭＡｂまたは複合体化ＡＤＣとともに２４時間、４℃、総量５０μｌでインキュベートした。１０％ウシ胎児血清を補充したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ‘ｓ  Ｌ１５培地において、２００００、４０００、８００、１６０、３２、６．４、１．２８及び０．２５６ｎｇ／ｍｌで抗体をアプライした。インキュベーション後、細胞を氷冷したＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中で２回洗浄し、Ａｌｅｘａ  ６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（２ｕｇ／ｍＬ）二次抗体＋２．５ｕｇ／ｍＬ  ７−アミノアクチノマイシンＤとともにインキュベートした。細胞を３０分間インキュベートし、２回洗浄し、５０μｌ  ＰＢＳ＋１％ＦＢＳ中に再懸濁し、及びフローサイトメトリーにより解析した。非複合体化抗体に対する結合の結果を図４（パネルＡ及びＢ）に示し、ＡＤＣに対する結合の結果を図５（パネルＡ及びＢ）に示す。「ＴＳＰ２」は、配列番号１０５の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ３」は、配列番号１０６の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ４」は、配列番号１０７の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ５」は、配列番号１０８の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ６」は、配列番号１０９の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ９」は、配列番号１１２の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ１０」は、配列番号１１３の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。「ＴＳＰ１１」は、配列番号１１４の軽鎖ポリペプチドを有する抗体である。ＶＬｃｙｓ１は、Ｃ末端軽鎖伸長ＧＧＧＳＣ（配列番号６０）を有するトラスツズマブである。
【０２２５】
実施例１２−示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）実験を、試料：伸長１０を有するトラスツズマブ（ＴＳＰ１０）、及びトラスツズマブ（Ｔ）（ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４）に対して行った。ＤＳＣセルに試料をロードする前に、試料は、室温で平衡化され、緩衝液で希釈され、及び攪拌しながら８分間、真空下で脱気された。試料は、ＶＰＣａｐｉｌｌａｒｙ−ＤＳＣ、ＭｉｃｒｏＣａｌを用いて、６０℃／時のスキャン速度で、１０℃から１００℃までスキャンされた。対照細胞はＰＢＳ緩衝液を含有した。結果を図６に示す。
【０２２６】
実施例１３−Ａｌｅｘａ４８８複合体化
５−マレイミド‐Ａｌｅｘａ４８８を、上述の還元／複合体化方法を用いてＭＡｂに結合させた。抗体は、１００μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液から１：１５〜１：４０希釈された試料を用いて、各レーンに２０μｌロードされ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析された。ゲルは、Ａｌｅｘａ４８８の蛍光を測定するＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（商標）撮像装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて画像化された。結果を図７に示す。
【０２２７】
実施例１４−Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のプロトコール
７〜８週齢のメスのＮＯＤ／ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に、マトリゲルと１：１で混合された５*１０６  ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  Ｃａｔ＃ＣＲＬ−５８２２）（総量は１００μｌ）を接種した。腫瘍は、毎月曜日、水曜日、及び金曜日に測定された。腫瘍が１５０〜２００ｍｍ3のサイズに到達した時点で、動物を以下の表６の処置群に割り当て、群間の平均腫瘍サイズの釣り合いをとった。「Ｔ」は、トラスツズマブの略語である。
【０２２８】
【表７】
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【０２２９】
動物は、表６に示される濃度で、各試験品を用いて単回静脈内注射により処置され、６０日目まで、または腫瘍サイズが８００ｍｍ3に到達するまで、毎月曜日、水曜日、及び金曜日に腫瘍計測が続けられた。すべての動物は、Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄに示される用量を投与された。Ｐｏｓｔ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｒｄ（ＰＩＣＯＲ）形式を用いて、注射後の急性毒性をモニターした。体重の有意な低下はいずれの群においても観察されず、及び注射後の急性毒性反応もＰＩＣＯＲファイルに記載されなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果は、図８に示す。
【０２３０】
実施例１５−疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による、抗体‐薬剤複合体の解析
抗体薬剤複合体のＨＩＣ解析を、ＴＳＫｇｅｌ  Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（２．５ｕＭ、４．６ｍｍ  ｘ  ３．５ｃｍ）を用いて、２８０ｎｍで、ＤＡＤを備えたＨＰ１１００Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣで行った。当該方法は、９５％から５％の線形勾配の移動相Ａで、１２分にわたり、１ｍＬ／分で泳動し、３分間、再平衡化し、９５％Ａに戻した（Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム及び２５ｍＭ第一リン酸ナトリウム、ｐＨ４．４；Ｂ：２５％ＩＰＡの２５ｍＭリン酸ナトリウム溶液、ｐＨ４．７３）。Ｃｈｅｍｉｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを、データ回収、解析及びピーク面積定量に用いた。結果を図２０〜４１に示す。
【０２３１】
実施例１６−ネイティブサイズ排除クロマトグラフィーによる、抗体及び抗体薬剤複合体の解析
組み換え抗体及び抗体複合体の非変性ＳＥＣ解析を、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  ２００  ＳＥＣカラム（１．７ｕＭ、４．６ｍｍ  ｘ  １５０ｃｍ）を用いて、２８０ｎｍで、ＤＡＤを備えたＨＰ１１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣで行った。解析は、２５ｍＭリン酸ナトリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、０．２ｍＬ／分で２０分にわたり、均一濃度溶離を用いて行われた。Ｃｈｅｍｉｓｔａｔｉｏｎソフトウェアをデータ回収、解析、及びピーク面積定量に用いた。
【０２３２】
ＴＳｐ１０、ＴＳｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＳｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１、ＴＳｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４、ＴＳｐ６−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＳｐ４−Ｔｏｘｉｎ３のＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７）の個々の分注物を調製した。非変性ＳＥＣ−ＵＶ解析（前述）は、３７℃でのインキュベーションの前、ゼロ時点で、１０μＬの注入体積で行われた。各試料の分注物は、インキュベーションの１９１時間後、及びインキュベーションの３３０時間後に、非変性ＳＥＣ−ＵＶにより解析された。各種の単量体ピーク面積の割合は、各ゼロ時点での測定値に対して調節された。
【０２３３】
トラスツズマブ対照に関しては、タンパク質試料の９９．３６％が単量体の状態であり、凝集体が別に１つ、０．６３％で存在していた。Ｔ−ＶＬＣｙｓ１に関しては、タンパク質試料の９８．３９％が単量体の状態であり、他に凝集体は、１．１６％、０．２６６％及び０．１７５％で存在していた。Ｔ−ＳＰ２に関しては、タンパク質試料の９６．５％が単量体の状態であり、別に２つの凝集体が０．３％、１．５％及び１．８％存在していた。Ｔ−ＳＰ３に関しては、タンパク質試料の９８．５％が単量体の状態であり、別に２つの凝集体が１．１７％及び０．３５％存在していた。Ｔ−ＳＰ４に関しては、タンパク質試料の９８％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が１．４％、０．３９％及び０．２２％存在していた。Ｔ−ＳＰ５に関しては、タンパク質試料の９４％が単量体の状態であり、別に２つの凝集体が２．１％及び３．２％存在していた。Ｔ−ＳＰ６に関しては、タンパク質試料の８９％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が１．５％、及び８．８％存在していた。Ｔ−ＳＰ７に関しては、タンパク質試料の９５．９５％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が３％、０．５１％及び０．５０％存在していた。Ｔ−ＳＰ９に関しては、タンパク質試料の９４．５％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が０．６％、３．８％及び１％存在していた。Ｔ−ＳＰ１０に関しては、タンパク質試料の９７．３％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が２．２％、０．２７％及び０．２２％存在していた。Ｔ−ＳＰ１１に関しては、タンパク質試料の７７．７％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が６．３％、８．６％、２．７％及び４．５％存在していた。Ｔ−ＳＰ１２に関しては、タンパク質試料の８７．５％が単量体の状態であり、他に別の凝集体が２．２％、１．６％、８．６％及び４．５％存在していた。
【０２３４】
実施例１７−サイズ排除クロマトグラフィーによる抗体及び抗体薬剤複合体の解析‐完全質量
組み換え抗体及び抗体薬剤複合体の完全質量解析のために、変性ＳＥＣ高分解能質量分析法（ＨＲＭＳ）を、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  ２００  ＳＥＣカラム（１．７ｕＭ、４．６ｍｍ  ｘ  １５０ｃｍ）を用いて、２８０ｎｍで、ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  Ｈ  Ｃｌａｓｓ  ＵＰＬＣで行った。高分解能質量分析検出は、ＭｉｃｒｏＭａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒを用いて行われた（スキャン範囲は、２５０〜４９００ｍ／ｚ）。解析は、０．１％ＴＦＡ及び０．１％ＦＡを用いて、７０／３０  Ｈ２０／ＡＣＮで、１１分にわたり、０．２５ｍｌ／分で均一濃度溶離により行われた。データ回収及び解析は、ＭａｘＥｎｔ１でデコンヴォルーションされたスペクトルで、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１を用いて行われた。
【０２３５】
配列番号６０の伸長を有する抗体（Ｔ−ＶＬＣｙｓ１）の結果を図９のパネルＡ−Ｃに示す。配列番号６３の伸長を有する抗体（Ｔ−ＶＬＣｙｓ２）の結果を図１０のパネルＡ−Ｃに示す。配列番号６４の伸長を有する抗体（Ｔ−ＶＬＣｙｓ４）の結果を図１１のパネルＡ及びＢに示す。配列番号１０５の軽鎖を有する抗体の結果を図１２のパネルＡ及びＢに示す。配列番号１０６の軽鎖を有する抗体の結果を図１３のパネルＡ〜Ｃに示す。配列番号１０７の軽鎖を有する抗体の結果を図１４のパネルＡ〜Ｃに示す。配列番号１０８の軽鎖を有する抗体の結果を図１５のパネルＡ及びＢに示す。配列番号１０９の軽鎖を有する抗体の結果を図１６のパネルＡ〜Ｃに示す。配列番号１１０の軽鎖を有する抗体の結果を図１７のパネルＡ〜Ｃに示す。配列番号１１３の軽鎖を有する抗体の結果を図１８のパネルＡ〜Ｃに示す。配列番号１１４の軽鎖を有する抗体の結果を図１９のパネルＡ〜Ｃに示す。
【０２３６】
実施例１８−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイは、上述の実施例５に記述される方法と類似した方法を用いて行われ、様々なトラスツズマブ（「Ｔ」）ベースのＡＤＣ及び対照を用いて、ＨＥＲ２発現ＨＣＣ１９５４細胞、ＨＥＲ２発現Ｎ８７細胞、及びＨＥＲ２抗原陰性Ｊｕｒｋａｔ細胞を処置した。「遊離Ｔｏｘｉｎ１」は、上述のＴｏｘｉｎ３の遊離形態（すなわち、抗体に結合されていない）である。結果は図４２〜５３に示し、以下の表７及び８に要約する。
【０２３７】
【表８】
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【０２３８】
【表９】
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【０２３９】
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖アッセイが、様々なブレンツキシマブ（「Ｂ」）ベースのＡＤＣ及び対照を用いてＣＤ３０抗原陽性Ｋａｒｐａｓ２９９細胞を処置することにより行われた。結果を図５４〜５８に示し、以下の表９に要約する。
【０２４０】
【表１０】
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【０２４１】
実施例１９−トラスツズマブＣ末端軽鎖伸長変異体の変性ＰＡＧＥ
トラスツズマブ軽鎖伸長変異体は、固相化プロテインＡで精製され、非還元変性または還元（＋ＤＴＴ）変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に供された。結果を図５９〜６２に示す。
【０２４２】
実施例２０−複合体の安定性
ＡＤＣの安定性は、熱安定性試験を用いて評価された。ＴＳｐ１０、ＴＳｐ１０−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＳｐ１０−Ｔｏｘｉｎ１、ＴＳｐ１０−Ｔｏｘｉｎ４、ＴＳｐ６−Ｔｏｘｉｎ３、ＴＳｐ９−Ｔｏｘｉｎ３のＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７）の個々の分注物を調製した。非変性ＳＥＣ−ＵＶ解析（前述）は、３７℃でのインキュベーションの前、ゼロ時点で、１０μＬの注入体積で行われた。各試料の分注物は、インキュベーションの１９１時間後、及びインキュベーションの３３０時間後に、非変性ＳＥＣ−ＵＶにより解析された。各種の単量体ピーク面積の割合は、各ゼロ時点での測定値に対して調節された。結果を図６３、パネルＡ及びＢに示す。
【０２４３】
前述の発明は理解の明確性を目的とし、解説及び実施例のために一部詳細に記述されているが、当業者であれば、本発明の教示を考慮し、添付のクレームの主旨または範囲から逸脱することなく、ある変更及び改変が加えられうることが容易に理解されるであろう。
【０２４４】
従って、上記は、単に本発明の主旨を解説するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記述または示されていなくとも、様々な変更を考案することが可能であり、本発明の主旨を具現化し、その目的及び範囲内に含まれることが明白であろう。さらに、本明細書に列記されるすべての実施例及び条件付きの文言は、主として、読み手による本発明主旨、及び発明者らにより当分野の発展に寄与される概念の理解を補助することを意図しており、当該具体的な列記される実施例及び条件に限定されないとみなされる。さらに、本発明の主旨、態様及び実施形態ならびにそれらの具体的な実施例を列記する本明細書のすべての記述は、その構造的均等及び機能的均等の両方を包含することが意図される。さらに、当該均等は、現在公知の均等及び将来的に開発される均等（すなわち、構造にかかわらず、同じ機能を果たす、すべての開発された要素）の両方を包含することが意図される。本発明の範囲は、ゆえに、本明細書に示され、記述される例示的な実施形態に限定されることは意図されない。本発明の主旨及び範囲は、添付のクレームにより具体化されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【配列表】
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