(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびヒト血漿アルブミンを含む溶液中で胎
盤膜を０℃超１０℃未満の範囲の温度において少なくとも１４日間低温貯蔵することを含み、ヒト血漿アルブミンが組換えヒトアルブミン（ｒｈＡ）であり、ヒト血漿アルブミンの溶液中の濃度が２．０ｇ／Ｌ〜３．０ｇ／Ｌである、組織貯蔵方法。
【請求項２】
胎盤膜および溶液が、密閉容器内で低温貯蔵される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
胎盤膜が、溶液中で３６時間低温貯蔵された後に、１．５を超える生細胞対死細胞の比
を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
胎盤膜が、溶液中で１２０時間低温貯蔵された後に、１．０を超える生細胞対死細胞の
比を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
胎盤膜が、溶液中で３６０時間低温貯蔵された後に、２．０を超える生細胞対死細胞の
比を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胎盤膜が、溶液中で７２０時間低温貯蔵された後に、１．５を超える生細胞対死細胞の
比を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、１．０以上の生細胞対死細胞の
比を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温された後に、４５％〜８５％の範囲の細胞生存率
を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の膜完全性の保存を促
進することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
胎盤膜の膜完全性の保存を促進することが、胎盤膜の厚さの保存を促進すること、胎盤
膜の上皮細胞層への損傷を軽減すること、および胎盤膜の細胞外マトリックス内で細胞保
持を促進することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の細胞生存率を促進す
ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の総タンパク質含量の
保存を促進することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
胎盤膜が、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、総タンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇ
あたりタンパク質４５０ｎｇ超である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、総タンパク質含量が、胎盤膜１
ｍｇあたりタンパク質３００ｎｇ超である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の細胞外マトリックス
タンパク質の保存を促進することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜内の細胞外マトリック
スメタロプロテアーゼの減少を促進することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜内のマトリックスメタ
ロプロテアーゼ組織阻害因子１、２および４の保存を促進することをさらに含む、請求項
１に記載の方法。
【請求項１８】
胎盤膜が、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、マトリックスメタロプロテアーゼ組
織阻害因子１、２および４のタンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質４００ｎ
ｇ超である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、マトリックスメタロプロテアー
ゼ組織阻害因子１、２および４のタンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質２５
０ｎｇ超である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
胎盤膜が、入れ子状トレイ間に低温貯蔵される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載
の方法。
【請求項２１】
胎盤膜を溶液中で低温貯蔵する前に、胎盤膜を細分化することを含む、請求項１〜２０
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
胎盤膜を溶液中で低温貯蔵する前に、細分化された胎盤膜を哺乳動物のコラーゲンマト
リックスに吸着させることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細かく刻まれた軟骨を溶液に添加することを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記
載の方法。
【請求項２４】
胎盤膜が、溶液中で低温貯蔵される前に、低温貯蔵されている間に、または低温貯蔵さ
れた後に、凍結されていない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法によって、創傷に適用するための組織を貯
蔵することを含む、創傷を処置するための医薬を製造するための方法。
【請求項２６】
組織が羊膜である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
組織が軟骨である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
組織の間質表面が創傷に適用される、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１４年１０月７日に出願された、「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ  Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ」と題する米国非仮特許出願第１４／５０８，３９８号に基づき優先権を主張し、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、低温貯蔵組成物および方法を対象とする。より具体的には、本発明は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびヒト血漿アルブミンを含む低温貯蔵溶液、溶液中で胎盤膜などの組織を低温貯蔵する方法、ならびに溶液中に貯蔵された組織を創傷部位に適用することによる創傷を処置するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
胎盤は、妊娠中に胎児を包み込み、他の組織の中でも、胎児に面する内羊膜層、および一般的に非弾性の外殻または絨毛膜から構成される。胎盤は、子宮壁に胎児を固定し、栄養素の摂取、老廃物の除去、および母親の血液供給によるガス交換を可能にする。さらに、胎盤は、母親からの免疫応答から胎児を保護する。胎盤から、羊膜および絨毛膜層を含む無傷の胎盤膜を他の組織から分離することができる。羊膜は、胎盤の最内層であり、厚い基底膜および無血管間質基質からなる。
【０００４】
臨床医は、早くも１９１０年から医療処置において、羊膜および絨毛膜を含む無傷の胎盤膜を使用してきた［Ｄａｖｉｓ  Ｊ．Ｓ．、Ｊｏｈｎ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｍｅｄ  Ｊ、１５：３０７頁（１９１０年）］。羊膜はまた、無傷の胎盤膜から分離された場合、その有益な臨床特性のために使用され得る［Ｎｉｋｎｅｊａｄ  Ｈ．ら、Ｅｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｅｒ、１５：８８〜９９頁（２００８年）］。胎盤膜のある種の特性は、それが医学界による使用に魅力的になる。これらの特性には、限定されないが、その抗付着性、抗菌性、および抗炎症性；創傷保護；上皮形成を誘導するその能力；疼痛の軽減が含まれる［Ｍｅｒｍｅｔ  Ｉ．ら、Ｗｏｕｎｄ  Ｒｅｐ  Ｒｅｇｅｎ、１５：４５９頁（２００７年）］。
【０００５】
胎盤膜の他の用途には、細胞および組織の再成長のための足場を設けるまたは構造を提供するためのその使用が含まれる。足場を設けることにおける胎盤膜の重要な利点は、羊膜が上皮層を含有することである。この層に由来する上皮細胞は、幹細胞に類似し、該細胞はそれらを取り囲むタイプの細胞に分化することができる。また、幹細胞に類似する多能性細胞は、羊膜の本体内に含有される。さらに、羊膜は、表皮成長因子、インスリン様成長因子および線維芽細胞成長因子などの様々な成長因子および栄養因子、ならびに瘢痕および炎症を予防し、治癒を支援するのに有益であり得る高濃度のヒアルロン酸を含有する。したがって、胎盤膜は、多種多様な有益な医療用途を提供する。
【０００６】
細胞療法は、組織の修復および再生に相当な可能性を有する。これらの細胞療法に足場を加えることは、改善された結果をもたらしている［Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｉｔｈｙ  Ｇ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ、９９Ａ：５００〜５０６頁（２０１１年）］。理想的には、足場に使用される材料は、生体適合性であり、そのため、免疫応答をほとんど誘発せずまたは全く誘発せず、生分解性であり、実用的には十分な量で利用できる。胎盤膜は、臨床においてこの役割を満たす可能性のある材料として、長い間同定されてきたが、労力は、インビトロ研究、非実用的なインビボ技術に限定されていて、または最適ではない結果が得られている。さらに、足場が使用される条件は、治療効果に対して劇的な効果を有し得る。
【０００７】
多くの胎盤膜製品が文献において研究され、臨床的に使用され、２つの主なカテゴリーに分類されている。第一のカテゴリーは、無傷の膜の使用を伴い、それは、グリセロールまたはアルコール中で、新鮮な、乾燥した、凍結乾燥させた、凍結保存された、または保存された膜である。この処方においては、膜は多くの目的に有用であるが、注入を必要とする用途、または膜自体の薄い平面形状に適合しない空間の充填など、他の用途には適していない。
【０００８】
第二のカテゴリーは、膜を粉砕し、微粉化しおよび／またはホモジナイズして小粒子にすることを伴い、次に、溶液中に再懸濁してもよい。このような技術は、例えば、米国特許出願第１１／５２８，９０２号；同第１１／５２８，９８０号；同第１１／５２９，６５８号；および同第１１／５３５，９２４号に記載されている。この粉砕は、乾式または湿式で行うことができ、粉砕中の温度は、例えば、低温粉砕の場合などで、制御されてもよいし、または制御されなくてもよい。この方法を用いて製造された製品は、多数の用途に有用であり、適切な条件下で注入することができる。しかしながら、それらは、ある種の用途についてはいくつかの欠点がある。第一に、胎盤膜に含有される細胞は、粉砕プロセス中に破壊される。第二に、膜中のタンパク質および成長因子は、このプロセス中に浸出され、または喪失される可能性があり、任意のその後の洗浄または粉砕された粒子の他の処理を含む。実際に、成長因子などの潜在的な血管新生因子の除去は、このタイプの処理の目的であり得る。第三に、生理食塩水などの典型的な生理学的溶液へのこれらの小さな粒子の再懸濁は、低粘度の自由流動性流体をもたらす。注入または配置の際に、この流体は、所望の処置部位に留まるよりも消散する可能性がある。第四に、得られた断片は、必要に応じて、細胞生着および増殖を可能にするには十分に大きくない場合がある。
【０００９】
しかしながら、羊膜調製物は、有意に有益な生物活性を有することが示されている。これらの膜に含有される多くの細胞は、多重性または多能性である。膜はまた、成長因子、ならびにヒアルロン酸、コラーゲン、および組織治癒を支持することが示されている他の因子の豊富な供給源を含有する。羊膜は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および線維芽細胞などの組織治癒に関与する細胞の増殖を誘引し、刺激することが示されている。
【００１０】
関節軟骨は、身体全体の関節の骨の関節末端に位置し、硝子軟骨から構成され、ＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンなどの細胞外マトリックス材料に埋め込まれている、比較的少量の軟骨細胞を含有する［Ｍｏｒｉｙａ  Ｔ．ら、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃｉ、１２：２６５〜２７３頁（２００７年）］。関節軟骨は、部分的には軟骨の無血管特性に起因する自己修復能力が限られ、関節損傷および疾患の処置に重大な挑戦を課す。したがって、ヒトにおける軟骨欠損の修復は困難な努力であり得、外科医にはこのような欠損を処置するための複数の選択肢が存在する。外科医は、軟骨下骨の出血および凝塊の発生、最終的に欠損を満たす線維軟骨パッチの発生を刺激するマイクロフラクチャー、剥離または他の骨髄刺激技術を用いて欠損に影響を及ぼすことを選択することができる。他の選択肢は、自家移植片と同種移植片起源の両方の可変源の軟骨細胞による欠損の充填を可能にする。
【００１１】
他の多くの利用可能な療法よりも骨髄刺激技術の重要な利点は、骨髄刺激が、関節および周囲組織への破壊が最小限であり、比較的単純な外科技術を用いて関節鏡下で実施され得ることである［Ｍｉｔｈｏｅｆｅｒ  Ｋ．ら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ、８８（Ｓｕｐｐｌ  １  Ｐｔ  ２）：２９４〜３０４頁（２００６年）］。この技術はまた費用対効果も高い。したがって、骨髄刺激技術の結果を改善する努力がなされている。自家移植片または同種移植片（例えば、ＢｉｏＣａｒｔｉｌａｇｅとして市販されている製品）のいずれかである粉砕された軟骨は、この目的のために提案されている［Ｘｉｎｇ  Ｌ．ら、Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ  Ａｒｔｈｒｏｓｃ、２１：１７７０〜１７７６頁（２０１３年）］。しかしながら、自家移植片軟骨の使用は、追加の手術ステップおよびドナー部位の罹患を必要とする。さらに、同種移植片軟骨単独の使用は、満足のいく結果をもたらしていない。
【００１２】
細胞療法を含む現在の処置は、硝子軟骨というよりはむしろ望ましくない線維軟骨組織の生成をもたらしている［Ｄｉａｚ−Ｐｒａｄｏ  Ｓ．Ｍ．ら、ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、ＴＲＥＮＤＳ、ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、１９３〜２１６頁（２０１１年）］。このように、硝子様軟骨を特異的に再生することによって、損傷した関節軟骨を修復することができる療法に対する重要な臨床的必要性が依然として存在する。
【００１３】
半月板損傷の修復のための解決策についても同様の必要性が存在する。半月板は、関節円板とは対照的に、関節腔をほんの部分的に分割する、三日月形の線維軟骨構造である。ヒトにおいて、それらは、膝関節、肩鎖関節、胸鎖関節および顎関節に存在する。一般的に、用語「半月板」とは、側方または中間の半月板のいずれかの膝の軟骨を指す。両方とも軟骨組織であり、これは、張力およびねじれを受けると膝に構造的完全性を提供する。それらは、上部は凹形であり、底部は平坦であり、脛骨と関節接合している。それらは、脛骨の顆の間の小さな窪み（窩）（顆間窩）に付着され、中心に向かってそれらは付着されず、それらの形状は細い棚に狭まる。半月板の血流は、周辺部から半月板の中央までである。血流は年齢とともに減少し、半月板の中央は成人期に無血管であり、非常に低い治癒率となる。半月板損傷は、縫合または他の固定手法を用いて修復される。部分的な半月板切除術はまた一般的に使用される［Ｋｏｎ  Ｅ．ら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ、１８（１５〜１６）：１５７３〜１５８２頁（２０１２年）；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ  Ｇ．ら、Ａｒｔｈｒｏｓｃ  Ｔｅｃｈ、２（４）：ｅ３５５−ｅ３５９頁（２０１３年）；Ｓｃｏｔｔｉ  Ｃ．ら、Ｅｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｅｒ、２６：１５０〜１７０頁（２０１３年）］。
【００１４】
別の関連する課題は、ヒトの椎間板の再生を伴う。椎間板は、脊椎の椎体間の空間を占める線維軟骨組織である。それらは、脊椎可動性を可能にしながら、１つの椎骨から次の椎骨に力を伝える。椎間板の構造的性質は、水を引き付けて保持する能力に大きく依存する。椎間板中のプロテオグリカンは、圧縮負荷に対抗する浸透圧の「膨潤圧」を発揮する。椎間板の変性は、ヒトの老化の特徴である生理学的過程である。年齢とともに、椎間板は様々な変化を起こし、最も顕著なものは、プロテオグリカン含量の喪失により浸透圧が低下し、椎間板の高さおよび負荷を伝える能力が低下することである［Ｐａｒｋ  Ｓ．Ｈ．ら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ、１８（５〜６）：４４７〜４５８頁（２０１２年）］。椎間板変性は、頚部および背部の疼痛の大半を占める脊椎状態の重要であり、直接的な原因である。関連する軟骨細胞の場合と同様に、羊膜の成分は、椎間板および関連する細胞の治癒および回復を促進し得る。
【００１５】
胎盤膜の貯蔵および輸送は、多くの調節スキームの対象となる。例えば、膜は、対象において使用前の特定期間（すなわち、使用前の１４日間）に貯蔵しなければならず、その間、細菌、ウイルスおよび他の非胎盤細胞型からの汚染について定期的に試験される。さらなる遅延は、適切な医療施設への膜の輸送によって引き起こされる。この遅延は、胎盤膜細胞の生存率を低下させる可能性がある。羊膜内の細胞生存率を維持するためには、適切な補充剤を含有する細胞培養培地に貯蔵し、輸送する必要がある。これらの補充剤は、細胞生存率を最大にし、組織が確実に貯蔵される時間を延ばすために選択されるべきである。膜貯蔵培地は、製品の安全性を保証し、規制遵守を確実にするために、現在の臨床基準を満たすべきである。したがって、培地は、化学的に定義され／ｃＧＭＰに準拠していなければならず、異種由来成分とヒト由来成分の両方を含んではならない。
【００１６】
伝統的な組織貯蔵は、一般的に、細胞または組織全体が零下の温度まで冷却されることによって保存される極低温保存方法を伴う。低温は、組織損傷を引き起こす可能性のあるいずれもの酵素活性または化学活性を効果的に停止させる。凍結保存法は、凍結中の氷の形成による、さらなる損傷を引き起こすことなしに、低温に到達しようとする。伝統的な凍結保存技術は、細胞内の氷形成を防ぐために凍結保護剤を用いて細胞または組織をコーティングすることに依る。しかしながら、巨視的な氷形成が依然として起こり得、組織の完全性に影響する穿孔を引き起こす。
【００１７】
低温組織貯蔵は、一般的に、凍結よりも高い温度で、例えば、氷結晶形成を防ぐ０℃から２０℃の間で起こる。細胞の機能および生存率に関連する多くの問題は、後述するように、浸透圧、虚血、低酸素症および酸素由来フリーラジカルなどの低温組織貯蔵に関連する。
【００１８】
浸透圧。平衡状態では、Ｄｏｎｎａ効果として公知の現象として、より高濃度の無機イオンが、細胞外空間とは対照的に細胞内空間に存在する［Ｄｉｃｋ、Ｄ．Ａ．Ｔ．、Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｅｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｏｓｍｏｔｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ、ｉｎ  ＣＥＬＬ  ＷＡＴＥＲ、Ｅ．Ｅ  Ｂｉｔｔａｒ、Ｅｄｉｔｏｒ  １９６６年、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ：Ｌｏｎｄｏｎ．１５〜４３頁］。したがって、平衡状態では、細胞は水を取り込む傾向がある。細胞は、ナトリウムおよび塩化物などのイオンが、水の摂取およびその後の溶解を防ぐためにポンプを介して膜から輸送される活性イオン輸送を介して浸透圧を管理する。浸透圧は、束一的性質であり、溶液中に存在するイオンの量に依存し、それらの大きさまたは性質と異なる［Ｔａｙｌｏｒ  Ｍ．Ｊ．、Ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｉｎ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ、ｉｎ  ＴＨＥ  ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＬＯＷ  ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥＳ  ＯＮ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＹＳＴＥＭＳ、Ｂ．Ｗ．Ｗ．Ｇｒｏｕｔ  ＆  Ｇ．Ｊ．Ｍｏｒｒｉｓ編。１９８７年、Ｅｄｗａｒｄ  Ａｒｎｏｌｄ：  Ｌｏｎｄｏｎ．３〜７１頁］。活性輸送反応を実施するのに必要なＡＴＰ消費は、正常な体温で生じるように適合される。低温では、活性輸送ポンプは、ＡＴＰに結合して、それをエネルギーとして処理することができない。さらに、低温条件下では、ミトコンドリアのエネルギー変換（ＡＴＰ生成）が失敗すると、高いエネルギー貯蔵量が枯渇する。５℃でのナトリウムおよびカリウムポンプの活性は、生理学的温度で正常レベルの約１％である［Ｅｌｌｏｒｙ  Ｊ．Ｃ．＆Ｗｉｌｌｉｓ  Ｊ．Ｓ．、Ｐｈａｓｉｎｇ  ｏｕｔ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｕｍｐ、ｉｎ  ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＬＯＷ  ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥＳ  ＯＮ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＭＥＭＢＲＡＮＥＳ、Ｇ．Ｊ．Ｍｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｃｌａｒｋｅ編。１９８１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｌｏｎｄｏｎ．１０７〜１２０頁］。細胞外液の正常な浸透圧は、約２８０〜３１０ミリオスモル／Ｌである。ナトリウムおよびカリウムポンプは低温条件下では機能しないため、低温貯蔵培地は、この変化に対抗するためにわずかに高張性でなければならない。
【００１９】
虚血／低酸素症。臓器への血液供給の停止による即座の結果は、組織への酸素供給の喪失である。酸素は、好気性呼吸のプロセス、および細胞によって利用される主なエネルギー源であるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の産生に必要とされる。酸素が存在しない場合、ＡＴＰは数分以内に枯渇する。この枯渇は、好気性代謝から嫌気性代謝に移行し、自己制限的であり、乳酸塩およびプロトンの生成を引き起こすことになる。これは、最終的には壊死および細胞死に至るカスケードをもたらす。
【００２０】
温度が１０℃低下するごとに、細胞の酸素消費量は５０％減少する［Ｔａｙｌｏｒ  Ｍ．Ｊ．、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｌｄ：Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｓ、ｉｎ  ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＢＩＯＰＲＥＳＥＲＶＡＴＩＯＮ、Ｊ．Ｇ．Ｂａｕｓｔ＆Ｊ．Ｍ．Ｂａｕｓｔ編。２００７年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ］。これは、より遅い反応速度および細胞代謝の低下を生じさせる。
【００２１】
酸素由来フリーラジカル（ＯＤＦＲ）。細胞の冷却は、細胞がフリーラジカル形成を通常、取扱う機序を減らしながら、フリーラジカルを生成する細胞の感受性を増加させる［Ｆｕｌｌｅｒ  Ｂ．Ｊ．、Ｇｏｗｅｒ  Ｊ．Ｄ．、＆Ｇｒｅｅｎ  Ｃ．Ｊ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５（５）：３７７〜３９３頁（１９８８年）］。組織保存液中に見出されるものなどの低濃度の分子状酸素は、ＯＤＦＲの発生には十分である。このため、ＳＯＤ、カタラーゼ、またはマンニトールなどの天然の薬理学的スカベンジャーは、低温貯蔵された臓器の生存率を改善する可能性がある［Ｆｕｌｌｅｒら、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、２３（４）：３５８−３６５頁（１９８６年）］。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、組織の低温貯蔵に関する組成物と方法の両方を対象とする。本発明の１つの態様によれば、ＤＭＥＭおよびアルブミンを含む低温貯蔵培地の組成物が提供される。本発明の別の態様において、組織を低温貯蔵する方法が提供される。この方法は、ＤＭＥＭおよびアルブミンを含有する培地を調製または入手するステップ、組織を培地中に入れるステップ、ならびに組織および培地を低温貯蔵するステップを含む。本発明のさらに別の態様において、創傷処置のための方法が提供される。この方法は、低温貯蔵培地に組織を貯蔵するステップ、および組織を創傷部位に適用するステップを含む。また、組織は、細かく刻まれ、または粉砕されて粒子にすることができ、創傷部位に注入することができる。
【００２３】
本発明の本質および利点のさらなる理解は、本出願の本明細書の残りの部分および図面を参照することによって実現される。
【００２４】
本開示は、以下の図面を参照することにより、より良く理解することができる。図面の要素は、互いに比較して必ずしも縮尺を合わせる必要はなく、むしろ開示の原則を明確に示すことに重点を置いている。さらに、同様の参照符号は、いくつかの図を通して対応する部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａは、予備的な細胞生存率評価を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、細胞生存率の定量的画像を示す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、細胞生存率のさらなる定量的画像を示す図である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、細胞生存率のさらなる定量的画像を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、４２日目の胎盤膜細胞の生存率を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４２日目の胎盤膜細胞の生存率を示すさらなるグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、４２日目の胎盤膜細胞の生存率を示すさらなるグラフである。
【図３】図３は、経時的な細胞生存率の定性的評価の図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＭＥＭ溶液中に貯蔵された組織の巨視的な取扱適性の図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＤＭＥＭ＋組換えヒトアルブミン（ｒｈＡ）溶液中に貯蔵された組織の巨視的な取扱適性の図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＤＭＥＭ溶液中に４週間、貯蔵された組織の組織学的染色の図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に４週間、貯蔵された組織の組織学的染色の図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＤＭＥＭ溶液中に６週間、貯蔵された組織の組織学的染色の図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に６週間、貯蔵された組織の組織学的染色の図である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、胎盤膜細胞の総タンパク質含量を示すグラフである。
【図５Ｆ】図５Ｆは、胎盤膜細胞中のマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子の濃度を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、貯蔵溶液中で９週間、インキュベートされた細胞における応力試験を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、貯蔵溶液中で９週間、インキュベートされた細胞における歪み試験を示すグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、貯蔵溶液中で９週間、インキュベートされた細胞における係数試験を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、創傷上の実験的胎盤膜の配置を示すガイドである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、術後９日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷の図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、術後９日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷のさらなる図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、術後９日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷のさらなる図である。
【図８】図８は、術後９日に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷の組織学的検査の結果を列挙したチャートである。
【図９Ａ】図９Ａは、術後２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷の図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、術後に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷のさらなる図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、術後２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷のさらなる図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、術後２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷のさらなる図である。
【図１０】図１０は、術後２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷の組織学的検査の結果を列挙したチャートである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、術後２１日目に脱水羊膜を用いて処置された創傷の組織学的検査の図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、術後２１日目に新鮮な低温貯蔵胎盤膜を用いて処置された創傷の組織学的検査の図である。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、術後２１日目の未処置の創傷の組織学的検査の図である。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、術後２１日目に脱水メッシュを用いて処置された創傷の組織学的検査の図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、術後２１日目に脱水メッシュを用いて処置された創傷の組織学的検査のさらなる図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、術後２１日目に脱水メッシュを用いて処置された創傷の組織学的検査のさらなる図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、術後２１日目に脱水羊膜を用いて処置された創傷の組織学的検査のさらなる図である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、術後２１日目に脱水羊膜を用いて処置された創傷の組織学的検査のさらなる図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、術後９日目および２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷における異常組織の定量化を示すグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、術後９日目および２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷における斜子織りマトリックスの定量化を示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、術後９日目および２１日目に実験的胎盤膜を用いて処置された創傷における濾胞／腺形成の定量化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の組成物、物品、デバイスおよび／または方法が開示および記載される前に、それらは、他に指定されない限り、特定の方法に限定されず、または他に特定されない限り、特定の試薬に限定されず、このように変化し得ることを理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のためにだけ使用され、限定することを意図するものではないことを理解するべきである。
【００２７】
本出願は、様々な刊行物を参照する。これらの刊行物の開示は、それらの全体として、本出願が関連する最新技術水準をより十分に記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。開示された参考文献はまた、参照が依拠する文章において検討されているそれらの中に含有される材料に関して、参照により、個々におよび具体的に本明細書に組み込まれる。
【００２８】
Ａ．定義
本明細書および続く特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される多数の用語が言及される。
【００２９】
本明細書で使用するとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の点を明確に示していない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「創傷」への言及は、２つ以上の創傷を含む、などである。
【００３０】
本明細書で使用するとき、範囲は、「約」１つの特定値から、および／または「約」別の特定値までのように表すことができる。範囲がこのように表される場合、実施形態は、一方の特定値から、および／または他方の特定値までを含む。同様に、「約」の使用により、値が近似値として表される場合、その特定値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲の各々の端点は、他方の端点との関連でも、および他方の端点とは独立でも、有意であることが理解される。また、本明細書には多数の値が開示され、各々の値が、その値自体に加えて、「約」その特定値のように本明細書に開示されていることが理解される。例えば、「５０」という値が開示されている場合、「約５０」もまた開示されている。ある値が開示されている場合、当業者には理解されるように、「その値以下」、「その値以上」の値、および値間の可能な範囲もまた開示されることも理解される。例えば、値「５０」が開示されれば、「５０以下」および「５０以上」も開示される。本出願全体を通して、データは様々なフォーマットで与えられることもまた理解され、これらのデータは終点および始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせに対する範囲を表すことが理解される。例えば、特定のデータ点「５０」および特定のデータ点「１００」が開示されれば、５０および１００より大きい、５０および１００以上、５０および１００未満、５０および１００以下、ならびに５０および１００に等しい、さらに５０と１００の間も、開示されているとみなされることが理解される。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「羊膜組織」は、羊水細胞、胎盤膜、羊膜組織またはそれらの組み合わせを意味する。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「場合による」および「場合により」という用語は、後に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよいこと、ならびにその記載が、前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。
【００３３】
本明細書で使用するとき、語句「実質的に全て」は、当業者によって合理的に達成可能な最大量を指す。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「胎盤膜」および「羊膜組織」という語句は、胎盤膜の１つまたは複数の層を指す。例えば、胎盤膜または羊膜組織は、羊膜層と絨毛膜層の両方を含む胎盤膜を指し得る。別の例において、胎盤膜または羊膜組織は、絨毛膜が除去された胎盤膜を指す場合がある。別の例において、胎盤膜または羊膜組織は、上皮層が除去された胎盤膜を指す場合がある。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「処置」および「処置する」という用語は、疾患もしくは状態の症状または病状における任意の望ましい効果を含み、処置される疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーの最小限の低減を含むことができる。「処置」は、必ずしも疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。この処置を受ける対象は、処置を必要とする任意の動物であり、例えば、霊長類、特にヒト、他の動物、例えば、限定されないが、一般的には、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、家禽およびペットが挙げられる。
【００３６】
Ｂ．胎盤膜調製物の作製
本発明の低温貯蔵溶液を利用する胎盤膜は、以前に、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」と題する米国特許出願第１４／２１２，０１０号、「Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」と題する米国特許出願第１３／７５４，７４２号、および「Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」と題する米国特許出願第１３／７５４，７１６号に記載されるように調製することができ、これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、胎盤膜調製物は、羊膜組織、場合により羊水細胞を含む。胎盤膜調製物の羊膜組織成分は、米国食品医薬品局によって公布されたＣｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅガイドラインに従って、同意が得られたドナーから収集された胎盤から製造される。特に、帝王切開分娩によるヒト乳児の誕生直後に、無傷な胎盤を回収し、胎盤から胎盤膜を切り離す。その後、胎盤膜から残留血液を除去し、滅菌液槽に入れ、氷上で貯蔵し、加工のために輸送する。加工業者が受け取ったら、あらゆる残りの血塊を除去するために胎盤膜をリンスし、所望により抗生物質のリンス液でさらにリンスする［Ｄｉａｚ−Ｐｒａｄｏ  Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ、１１：１８３〜１９５頁（２０１０年）］。
【００３７】
抗生物質のリンス液としては、限定されないが、抗生物質：アミカシン、アミノグリコシド、アモキシシリン、アンピシリン、アンサマイシン、アルスフェナミン、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カプレオマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、カルベニシリン、セファクロル、セファドロキシル、セファレキシン、セファロチン、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフィキシム、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォキシチン、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリンフォサミル、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、クロファジミン、クロキサシリン、コリスチン、シクロセリン、ダプソン、ダプトマイシン、デメクロサイクリン、ジクロキサシリン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、エタンブトール、エチオナミド、フルクロキサシリン、ホスホマイシン、フラゾリドン、フシジン酸、ガチフロキサシン、ゲルダナマイシン、ゲンタマイシン、糖ペプチド、グレパフロキサシン、ハービマイシン、イミペネムまたはシラスタチン、イソニアジド、カナマイシン、レボフロキサシン、リンコマイシン、リンコサミド、リネゾリド、リポペプチド、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、マクロライド、マフェニド、メロペネム、メチシリン、メトロニダゾール、メズロシリン、ミノサイクリン、モノバクタム、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキサシリン、オキシテトラサイクリン、パロモマイシン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、プラテンシマイシン、ポリミキシンＢ、ピラジナミド、キノロン、キヌプリスチン／ダルホプリスチン、リファブチン、リファンピシンまたはリファンピン、リファペンチン、リファキシミン、ロキシスロマイシン、スルファジアジン銀、スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルアミド、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、スルホンアミドクリソイジン、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン、テマフロキサシン、テモシリン、テトラサイクリン、チアンフェニコール、チカルシリン、チゲサイクリン、チニダゾール、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、およびトロレアンドマイシン、トロバフロキサシン、またはバンコマイシンが挙げられる。
【００３８】
抗生物質のリンス液としては、また、限定されないが、抗真菌剤：アバファンジン、アルバコナゾール、アモロルフィン、アンホテリシンＢ、アニデュラファンギン、ビホナゾール、ブテナフィン、ブトコナゾール、カスポファンギン、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イソコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミカファンギン、ミコナゾール、ナフチフィン、ナイスタチン、オモコナゾール、オキシコナゾール、ポサコナゾール、ラブコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、テルビナフィン、テルコナゾール、チオコナゾール、ボリコナゾール、または１つもしくは複数の抗真菌特性を有する、他の薬剤もしくは化合物が挙げられる。
【００３９】
胎盤膜は多数の利点および用途を有するが、膜の利用可能性はそれらの使用を制限している。１度の出生から生じる胎盤膜の量は少ない。予想されるように、胎盤膜の供給は比較的少ないため、胎盤膜のコストは、ある価格または複雑さを上回る処置にのみそれらの使用を制限する。米国特許出願第１３／２５０，０９６号および同第１３／６４７，５２５号は、膜の拡張能力を増大させるために複数のスリットを含む胎盤膜を記載している。スリットは、膜を貫通して設けられ、膜を伸長させて、したがって、その長さおよび幅を増加させるメッシュ様パターンを生じさせるのに十分な数で設けられる。
【００４０】
胎盤膜は、膜の１つまたは複数の特定の層を除去するために処理することができる。絨毛膜は、当業者に周知である機械的手段によって、胎盤膜から除去することができる。絨毛膜は、例えば、鈍的切開を用いて胎盤膜の残りの部分から絨毛膜を注意深く剥離することによって除去することができる［Ｊｉｎ  Ｃ．Ｚ．ら、Ｔｉｓｓ  Ｅｎｇ、１３：６９３〜７０２頁（２００７年）］。胎盤膜からの上皮層の除去は、当業者に周知であるいくつかの方法を用いて達成することができる。上皮層は、保存してもよく、または所望により、例えば、上皮細胞における壊死を誘導するためにトリプシンを用いて除去してもよい［Ｄｉａｚ−Ｐｒａｄｏ  Ｓ．Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ、１１：１８３〜１９５頁（２０１０年）］。上皮層の除去は、例えば、０．１％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を用いて、３７℃で１５分間処理し、その後、セルスクレーパーを用いて物理的に除去することを含んでもよい［Ｊｉｎ  Ｃ．Ｚ．ら、Ｔｉｓｓ  Ｅｎｇ、１３：６９３〜７０２頁（２００７年）］。好ましくは、胎盤膜調製物の羊膜組織成分に利用される胎盤膜は、羊膜上皮細胞層を含むが、絨毛膜を除いた羊膜である。
【００４１】
胎盤膜は、当該技術分野において公知の技術を用いて粉砕してもよく、得られた粒子は、本明細書に記載されている低温貯蔵培地に再懸濁するかまたは乾燥させる。このような処理は、成長因子を含む膜のタンパク質含量を可能な限り保存するように実施することができる。好ましくは、粉砕は、クライオミル中などの温度制御条件下で行うべきである。好ましくは、このような粉砕された組織片は、１ｍｍ未満の粒径を有するべきである。あるいは、膜は、当該技術分野において公知の技術を用いて細かく刻んで、例えば、膜組織の小さな立方体を作製することができる。好ましくは、このような細かく刻まれた組織片は、０．１ｍｍ〜５ｍｍの範囲の粒径を有する。細かく刻まれた組織の粒子は、正方形、丸形、長方形または不規則な形状であってもよい。
【００４２】
粉砕されたまたは細かく刻まれた胎盤膜は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および羊膜組織細胞内に含有される組織化された羊膜ＥＣＭ、羊膜組織細胞および成長因子を含有する羊膜組織を含む。ＥＣＭには、羊膜由来のコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンが含まれる。羊膜由来のコラーゲンは、羊膜組織の上皮層、基底膜層、緻密層、線維芽細胞層、中間層および海綿質層に由来し得る。
【００４３】
胎盤膜調製物は、必要に応じて、出生前幹細胞と組み合わせることができる。例えば、調製物は、羊水穿刺中に収集される羊水から、または同意が得られたドナーから予定されたＣセクションから得られる羊水細胞を含むことができる。羊水を回転させて羊水細胞をペレット化する。得られた羊水細胞を粉砕した胎盤膜と混合し、およそ５〜１０ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および１５〜２５ｖ／ｖ％のタンパク質を含有する溶液中に凍結保存することができ、残部は晶質である。
【００４４】
本明細書に記載されているように、細かく刻まれた、粉砕されたまたは細分化された膜粒子は、凍結乾燥され、滅菌され、または凍結保存もしくは低温貯蔵溶液に貯蔵され得、いくつかの膜細胞の生存率の保存を可能にする。適切な粉砕胎盤膜調製物は、羊水細胞を含み、ＮｕＣｅｌ（商標）の名称でアラバマ州バーミングハムのＮｕＴｅｃｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｉｎｃ．によって販売されている。
【００４５】
胎盤膜調製物は、粉砕された軟骨、細かく刻まれた軟骨、軟骨ペーストおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される加工軟骨を含んでもよい。加工軟骨は、自家移植片軟骨、同種移植片軟骨またはそれらの組み合わせであり得る。加工軟骨が細かく刻まれたまたは粉砕された胎盤膜調製物に添加される場合、加工軟骨は、好ましくは、元の膜調製物に対して３：１〜１：３の体積比で提供される。さらなる実施形態において、細かく砕かれた、粉砕された、または細分化された膜粒子は、約１．５ｍｍ未満の平均粒径を有し、コラーゲンマトリックスに吸収される。次に、コラーゲンマトリックスは、以下により詳細に記載されるように、創傷を処置する方法において使用されてもよい。
【００４６】
胎盤膜調製物は、ヒアルロン酸、生理食塩水またはそれらの組み合わせを含み得る。ヒアルロン酸および生理食塩水は、調製物を骨格関節に注入することが望ましい場合、胎盤膜調製物とともに含まれてもよい。ヒアルロン酸または生理食塩水が胎盤膜調製物に添加される場合、ヒアルロン酸または生理食塩水は、好ましくは、元の膜調製物に対して２：１または１：１の体積比で提供される。
【００４７】
胎盤膜調製物は、１つまたは複数の生体適合性接着剤を含んでもよい。生体適合性接着剤は、接着剤として作用する天然高分子材料である。生体適合性接着剤は、糖などの生物学的モノマーから合成的に形成されてもよく、タンパク質および炭水化物などの様々な物質からなっていてもよい。ゼラチンなどのタンパク質、およびデンプンなどの炭水化物は、長年にわたって汎用性接着剤として使用されている。好ましくは、生体適合性接着剤は、Ｔｉｓｓｅｅｌなどのフィブリン接着剤である。フィブリンは、フィブリノーゲン（凍結乾燥させ、プールさせたヒト濃縮物）からできていて、また、トロンビン（塩化カルシウムを用いて再構成することができる）を含んでもよい。
【００４８】
Ｃ．低温貯蔵溶液
膜は、低温貯蔵溶液中に貯蔵し得、膜細胞の生存率を保存することができる。ここに記載されている溶液は、凍結よりも高い温度、例えば０℃〜２０℃の範囲の温度で、組織を貯蔵するのに有効である。さらなる実施形態において、溶液は、０℃超と１０℃未満の間の範囲の温度で有効である。１つの例示的な実施形態において、低温貯蔵溶液は、適切な補充剤を含む市販の組織培養培地を含み得る。溶液の全ての成分は、化学的に定義され／ｃＧＭＰに準拠し、異種由来成分とヒト由来成分の両方を含まない。この実施形態において、組織培養培地はＤＭＥＭを含む。ＤＭＥＭには、アミノ酸、塩（塩化カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、およびリン酸一ナトリウム）および高濃度グルコースおよびビタミン（葉酸、ニコチンアミド、リボフラビン、Ｂ１２）が含まれる。さらに、鉄およびフェノールレッドを含有する。ＤＭＥＭは、ほとんどのタイプの細胞に適し、ヒト、サル、ハムスター、ラット、マウス、ニワトリおよび魚の細胞が含まれる。ＤＭＥＭは、いくつかの供給者、例えば、コーニング社（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ  ＭＡ、カタログ番号１５−０１８）から市販されている。
【００４９】
本発明の低温貯蔵溶液は、細胞呼吸によって生じる二酸化炭素濃度の変化にもかかわらず、生理学的ｐＨを維持するのに適切な緩衝液による補充をさらに含む。一実施形態において、緩衝液は、両性イオン性有機化学緩衝剤であるＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を含む。ＨＥＰＥＳは、主に、重炭酸塩緩衝液と比較して、生理学的ｐＨを維持することがより良好であるという理由で、細胞培養において広く使用されている。ＨＥＰＥＳ緩衝液は、当業者に公知である濃度で、例えば、約２０ｍＭ〜３０ｍＭで使用することができる。一実施形態において、溶液は、２５ｍＭ濃度のＨＥＰＥＳを含有する。
【００５０】
低温貯蔵溶液は、アルブミンによる補充をさらに含む。一実施形態において、アルブミンはヒト血漿アルブミンである。さらなる実施形態において、ヒト血漿アルブミンは、組換えヒトアルブミン（ｒｈＡ）であり、例えば、ＩｎＶｉｔｒｉａ（Ｊｕｎｃｔｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＫＳ）によって製造されたＣｅｌｌａｓｔｉｍ  ｒｈＡである。ヒト血漿アルブミンは、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの濃度で使用することができる。一実施形態において、溶液は、約２．５ｇ／Ｌ濃度のｒｈＡを含有する。別の実施形態において、溶液は、少なくとも３．０ｇ／Ｌ濃度のｒｈＡを含有する。
【００５１】
Ｄ．胎盤膜の貯蔵
一実施形態において、本発明は、調製された胎盤膜を貯蔵する方法であって、低温貯蔵溶液を含む滅菌容器内に膜を入れることを含む、方法を対象とする。この実施形態において、貯蔵溶液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度の、ＤＭＥＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの市販の細胞培養培地、および約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの濃度のｒｈＡを含有する。さらなる実施形態において、滅菌容器は、貯蔵溶液対空気の比が約２：１〜５：１（溶液体積：空気体積）となるように、貯蔵溶液と接触させた大量の空気により密閉される。
【００５２】
この方法において、胎盤膜調製物は、本発明の低温貯蔵溶液中に貯蔵され、輸送され得る。一実施形態において、膜および貯蔵溶液は、ジャーまたはトレイなどの滅菌容器に入れられ、汚染を防ぐために密閉される。大量の空気が密閉容器内に含まれ、膜内の細胞による継続的な代謝を可能にする。当業者に公知であるように、貯蔵溶液の体積と空気の体積の比は変化してもよい。一実施形態において、この比は、約２：１〜５：１（溶液体積：空気体積）であってもよい。別の実施形態において、比は約３：１である。容器は、汚染物質からより大きな保護を提供するために、第二の容器内に配置され、密閉されてもよい。例えば、膜は、２つの滅菌した入れ子状トレイ間（「トレイ−イン−トレイ」形態）に、または滅菌ジャーと滅菌トレイの間（「ジャー−イン−トレイ」形態）に低温貯蔵されてもよい。
【００５３】
ここに記載されている貯蔵溶液内に含有されるヒトアルブミンは、胎盤膜細胞の生存率を長期間維持する。この実施形態において、低温貯蔵溶液内に貯蔵された胎盤膜は、以下の表１に示されるように、長期貯蔵後の生細胞対死細胞の比を示す。
【００５４】
【表１】
0006595588.tif 000002
【００５５】
さらなる実施形態において、胎盤膜は、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、４５％〜８５％の範囲の細胞生存率を示す。
【００５６】
一実施形態において、本方法の貯蔵溶液は、ヒトアルブミンを含有しない溶液と比較して、膜の完全性を有意に増加させ、浸透圧の膨潤を減少させ、および細胞生存率を経時的に保持する。例えば、溶液中のヒトアルブミンの包含は、厚さを保持し、膨潤を減少させ、上皮細胞層の損傷を減少させ、および胎盤膜の細胞外マトリックス内の細胞保持を促進する。膜の完全性の増加および細胞生存率の保存は、低温貯蔵溶液に有効量のヒト血漿アルブミンを添加することによって達成することができる。さらに、ヒト血漿アルブミンは、胎盤膜の総タンパク質含量を保存するように作用する。一実施形態において、本明細書に記載されている低温貯蔵溶液は、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、胎盤膜１ｍｇあたり約４５０ｎｇタンパク質を超える総タンパク質含量を維持する。さらなる実施形態において、貯蔵溶液は、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、胎盤膜１ｍｇあたり約３００ｎｇタンパク質を超える総タンパク質含量を維持する（図５Ｅを参照されたい）。
【００５７】
本方法のさらなる実施形態において、ヒト血漿アルブミンの添加は、マトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子（ＴＩＭＰ）１、２および４の活性を維持するように作用する。ＴＩＭＰは、種々のＥＣＭタンパク質を酵素的に分解することに関与する、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の公知の阻害因子である。ＴＩＭＰ活性の維持、および細胞外マトリクスタンパク質の減少は、経時的に膜活性を保存するように作用し得る。この実施形態において、本明細書に記載されている貯蔵溶液中に保存された胎盤膜は、本発明の低温貯蔵溶液中に２４時間貯蔵した後、胎盤膜１ｍｇあたり４００ｎｇを超える、総ＴＩＭＰ１、２および４濃度を有する。さらなる実施形態において、本明細書に記載されている貯蔵溶液中に保存された胎盤膜は、本発明の低温貯蔵溶液中に１０００時間の貯蔵後、胎盤膜１ｍｇあたり２５０ｎｇを超える総ＴＩＭＰ１、２および４濃度を有する（本明細書に記載される図５Ｆを参照されたい）。
【００５８】
さらなる実施形態において、本方法の胎盤膜は、本明細書に記載されるように、低温貯蔵溶液中で貯蔵する前に、細かく刻まれ、粉砕され、または細分化され得、いくつかの膜細胞の生存率の保存を可能にする。さらに、胎盤膜調製物は、粉砕された軟骨、細かく刻まれた軟骨、軟骨ペーストおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される加工軟骨をさらに含み得る。加工軟骨は、自家移植片軟骨、同種移植片軟骨またはそれらの組み合わせであり得る。加工軟骨を細かく刻まれたまたは粉砕された胎盤膜調製物に添加する場合、加工軟骨は、好ましくは、元の膜調製物に対して３：１〜１：３の体積比で提供される。さらなる実施形態において、細かく刻まれた、粉砕されたまたは細分化された膜は、約１．５ｍｍ未満のサイズを有する粒子に配置され、低温貯蔵溶液中に貯蔵される前にコラーゲンマトリックスに吸収され得る。次に、コラーゲンマトリックスは、以下により詳細に記載されるように、創傷を処置するための方法において使用されてもよい。さらに、胎盤膜組織は、ＤＭＥＭおよび少なくとも約０．０２５ｗ／ｖ％のヒト血漿アルブミンを含む貯蔵溶液中に少なくとも部分的に浸漬される。
【００５９】
さらなる実施形態において、本発明は、容器内で低温貯蔵された胎盤膜を含むシステムを含む。この容器は、ヒト血漿アルブミンおよび生理学的ｐＨを維持するのに適切な緩衝液で補充された市販の組織培養培地を含む低温貯蔵溶液を含む。一実施形態において、ヒト血漿アルブミンは、約２．０ｇ／Ｌ〜約３．０ｇ／Ｌの濃度の組換えヒトアルブミンである。一実施形態において、溶液は、約２．５ｇ／Ｌの濃度のｒｈＡを含有する。別の実施形態において、溶液は、少なくとも３．０ｇ／Ｌの濃度のｒｈＡを含有する。この実施形態において、緩衝液は、約２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む。一実施形態において、溶液は、２５ｍＭ濃度のＨＥＰＥＳを含有する。
【００６０】
胎盤膜および溶液を保持するための滅菌容器は、汚染を防ぐために密閉されてもよい。大量の空気が密閉容器内に含まれ、膜内の細胞による継続的な代謝を可能にする。当業者に公知であるように、貯蔵溶液の体積対空気の体積の比は変化してもよい。一実施形態において、この比は、約２：１〜５：１（溶液体積：空気体積）であってもよい。別の実施形態において、比は約３：１である。容器は、汚染物質からより大きな保護を提供するために、第二の容器内に配置され、密閉されてもよい。システムは、貯蔵溶液の成分としてＨＥＰＥＳ緩衝液をさらに含んでもよく、この場合、ＨＥＰＥＳ緩衝液は２０ｍＭ〜３０ｍＭの濃度である。
【００６１】
ここに記載されているシステムの貯蔵溶液内に含有されるヒトアルブミンは、胎盤膜細胞の生存率を長期間維持する。この実施形態において、低温貯蔵溶液内に貯蔵された胎盤膜は、表１に示されるように、長期貯蔵後の生細胞対死細胞の比を示す。さらなる実施形態において、溶液中のヒトアルブミンの包含は、ヒトアルブミンを含有しない溶液と比較して、膜の完全性を有意に増加させ、浸透圧の膨潤を減少させ、および細胞生存率を経時的に保持することによって、厚さを保存され、膨潤を減少させ、上皮細胞層の損傷を減少させ、および胎盤膜の細胞外マトリックス内の細胞保持を促進する。ヒト血漿アルブミンは、胎盤膜の総タンパク質含量を保存するように作用する。一実施形態において、本システムの低温貯蔵溶液は、溶液中で２４時間低温貯蔵後に、胎盤膜１ｍｇあたり約４５０ｎｇタンパク質を超える総タンパク質含量を維持する。さらなる実施形態において、システムに含まれる貯蔵溶液は、溶液中で１０００時間低温貯蔵後に、胎盤膜１ｍｇあたり約３００ｎｇタンパク質を超える総タンパク質含量を維持する（図５Ｅを参照されたい）。
【００６２】
別の実施形態において、システムの貯蔵溶液へのヒト血漿アルブミンの添加は、ＴＩＭＰ１、２および４の活性を維持するように作用する。この実施形態において、システムの貯蔵溶液中に保存された胎盤膜は、貯蔵の２４時間後、胎盤膜１ｍｇあたり４００ｎｇを超える総ＴＩＭＰ１、２および４濃度を有する。さらなる実施形態において、システムの貯蔵溶液中に保存された胎盤膜は、１０００時間の貯蔵後、胎盤膜１ｍｇあたり２５０ｎｇを超える総ＴＩＭＰ１、２および４濃度を有する（本明細書に記載される図５Ｆを参照されたい）。
【００６３】
本システムに含まれる胎盤膜調製物は、上記で詳細に記載したように、粉砕された軟骨、細かく刻まれた軟骨、軟骨ペーストおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される加工軟骨を含み得る。さらなる実施形態において、細かく刻まれた、粉砕されたまたは細分化された膜粒子は、約１．５ｍｍ未満の平均粒径を有し得、次に、コラーゲンマトリックスに吸収され得る。さらに、システムの胎盤膜は、その長さおよび幅を増加させるために伸長され得るようにメッシュ状であってもよい。システムの膜は、羊膜総と絨毛膜総の両方を含むことができる。羊膜組織の海綿質層は、保存された組織の意図された用途に応じて、除去されてもよいし、無傷のままであってもよい。別の例において、胎盤膜の絨毛膜が除去されている。別の例において、上皮層が胎盤膜から除去されている。
【００６４】
Ｅ．創傷および欠損の処置
胎盤膜調製物の実施形態は、本明細書に記載され、損傷組織を再生するために使用され得る。貯蔵溶液および方法は、限定されないが、裂傷または火傷などの外傷を含む、多数の臨床状態において使用される胎盤膜とともに利用され得る。
【００６５】
低温貯蔵溶液中の胎盤膜は、細胞生着および内部成長のための足場またはマトリックスとして作用し得る。したがって、保存された膜は、正常な位置で細胞は無傷であり、培養することはしない、完全なマトリックスとして作用することができる。胎盤膜はまた、流入する血液由来のＭＳＣ、軟骨細胞、および他の修復細胞を引き付ける成長因子のリザーバーを提供する。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、上記のように貯蔵された胎盤膜組織を創傷に適用することを含む、創傷を処置するための方法を含む。特定の実施形態において、胎盤膜は羊膜を含む。ここでは、組織の間質表面は、治癒を促進するために創傷に適用される。あるいは、膜組織は軟骨を含んでもよい。
【００６７】
さらなる実施形態において、胎盤膜は、貯蔵溶液中で胎盤膜を低温貯蔵する前に、当該技術分野において公知の技術を用いて、粉砕され、細かく刻まれ、または細分化することができる。このような膜は、創傷または欠損への移植のために、粉砕されもしくは細かく刻まれた自家移植片軟骨または同種移植片軟骨とさらに組み合わせてもよい。
【００６８】
さらなる実施形態において、胎盤膜は、膜を凍結させることなく、長期間、低温溶液内に貯蔵することができる。この実施形態において、膜は、溶液中での低温貯蔵の前または後に凍結されない。
【００６９】
さらなる実施形態において、本発明は、創傷を処置するためのシステムであって、容器内で低温貯蔵された胎盤膜を含むシステムを対象とする。本システムは、ＤＭＥＭおよびヒト血漿アルブミンの貯蔵溶液を含む。さらなる実施形態において、ヒト血漿アルブミンは、組換えヒトアルブミンである。システムの胎盤膜は、表１に示したような、長期貯蔵時間後に生細胞対死細胞の比を示す。さらなる実施形態において、システム内の溶液へのヒト血漿アルブミンの添加は、ＴＩＭＰ１、２および４の活性を維持するように作用する。ＴＩＭＰは、種々のＥＣＭタンパク質を酵素的に分解することに関与するＭＭＰの公知の阻害因子である。ＴＩＭＰ活性の維持、および細胞外マトリックスタンパク質の減少は、経時的に膜活性を保存するように作用し得る。
【００７０】
さらなる実施形態において、システム内の胎盤膜は、貯蔵溶液中で胎盤膜を低温貯蔵する前に、当該技術分野において公知の技術を用いて、粉砕され、細かく刻まれ、または細分化されてもよい。このような膜は、欠陥への移植のために、粉砕されたもしくは細かく刻まれた自家移植片軟骨または同種移植片軟骨とさらに組み合わせることができる。
【００７１】
実験
Ａ．定義
「細胞生存率」は、細胞懸濁液中の全細胞のうちの生存細胞の割合と定義される。これは、
【００７２】
【数１】
0006595588.tif 000003
【００７３】
（式中、Ｖは生存率の割合であり、Ｌは懸濁液中の生細胞の数であり、Ｄは懸濁液中の死細胞の数である）
と定義される。
【００７４】
「Ｈ＆Ｅ染色」は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色と定義される。
【００７５】
「係数」は、加えられた力に応答して、物体が変形に耐える程度と定義される。これは、
【００７６】
【数２】
0006595588.tif 000004
【００７７】
と定義される。
【００７８】
「歪み」は、長さの変化を元の長さで割ったものと定義される変形の標準化された尺度と定義される；ｅ＝ΔＬ／Ｌである。
【００７９】
「応力」は、
【００８０】
【数３】
0006595588.tif 000005
【００８１】
（式中、Ｆは、面積（Ａ、ｃｍ２）に作用する力（Ｎ）である）
と定義される。
【００８２】
「総タンパク質含量」は、４０個の公知のサイトカインの総レベルと定義される。バイアスを除去するために、タンパク質レベルを組織重量で標準化した。レベルは、
【００８３】
【数４】
0006595588.tif 000006
【００８４】
（式中、Ｔは総タンパク質含量であり、Ｐは各タンパク質の濃度であり、Ｗは組織試料の重量である）
と定義される。
【００８５】
Ｂ．予備的な細胞生存率研究
低温条件下での羊膜の貯蔵を評価する予備的研究を、以下のグループを用いて行った：
（１）Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ  ＣｅｌｌＧｒｏ
（２）Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ
（３）ＲＰＭＩ
（４）ＤＭＥＭ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する）
（５）完全補充ＤＭＥＭ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、インスリン、トランスフェリン、セレン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．２５ｗ／ｖ％  ｒｈＡを含有する）
（６）ＤＭＥＭ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液および０．２５ｗ／ｖ％  ｒｈＡを含有する）。
【００８６】
この予備的研究において、Ｍｕｌｔｉｔｏｘ  Ｆｌｕｏｒ生存率キットを用いて、経時的に生細胞の生存率を測定したが、これは膜の完全性の指標として役立つ。図１Ａは、（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡアッセイによって決定される）総ＤＮＡカウントに対するＭｕｌｔｉｔｏｘ生細胞の比としてグラフ化した結果を示す。ＤＭＥＭ＋組換えヒトアルブミン（ｒｈＡ）溶液は、経時的に細胞生存率を保持するのに最も効果的であった。図１Ｂ〜１Ｄは、３つの条件の定性的な画像化を示し、最良の生存率はそれらの終点に有する。これらの画像に示されるように、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液は４２日でかなりの生存率を有する。これらの結果は、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡを含有する低温貯蔵溶液が他の貯蔵培地と比較して優れた生存率を実証することを示す。
【００８７】
Ｃ．膜の完全性の尺度としての細胞生存率
１．Ｍｕｌｔｉｔｏｘアッセイ
この実験において、細胞生存率は膜の完全性の尺度として使用された。予備的データは、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡが膜の完全性を保存するための最良の組み合わせであることを示唆した。（ａ）「ジャー−イン−トレイ（ｊａｒ−ｉｎ−ｔｒａｙ）」または（ｂ）「トレイ−イン−トレイ（ｔｒａｙ−ｉｎ−ｔｒａｙ）」配置に含有されるＤＭＥＭ単独およびＤＭＥＭ＋ｒｈＡを調べた。貯蔵培地に対する酸素の類似した比は、両方のグループについて維持された。したがって、貯蔵条件間の主な変数は、使用される貯蔵培地の体積であった。「ジャー−イン−トレイ」形態は、１５ｃｃのジャーにおいて、１２ｍＬの培地の貯蔵溶液体積を可能にし、一方、「トレイ−イン−トレイ」形態は、４０ｃｃのトレイ中に３０ｍＬの培地という、貯蔵培地の有意に多い体積を可能にした。
【００８８】
１日目および４２日目に、異なる貯蔵培地およびパッケージング形態に貯蔵された膜は、ＰＢＳリンスに供した後、コラゲナーゼ中で消化して膜から細胞を遊離させた。次に、細胞が、Ｍｕｌｔｉｔｏｘ生存率アッセイを用いて生存率について直接的に評価された。図２Ａは、４人のドナーから採取された胎盤膜から単離された細胞の生存率を示す。生存率が約５５％の黒の実線は、１日目の平均生存率を示し、一方、破線および陰影の領域は標準偏差を示す。このデータの評価ではいくつかの傾向が明らかであった。このデータは、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡが、貯蔵条件と、「ジャー−イン−トレイ」形態と比較してより高い生存率へと向かう傾向にある「トレイ−イン−トレイ」形態の両方を通じて、ＤＭＥＭ単独よりも高い細胞生存率を保持したことを実証する。「トレイ−イン−トレイ」形態のＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に貯蔵された膜は、４２日で最大量の生存率を保持した。「トレイ−イン−トレイ」および「ジャー−イン−トレイ」試料を組み合わせて、貯蔵条件間に有意差があるかどうかを評価した。図２Ｂは、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液がＤＭＥＭ単独よりも有意に高い生存率を有することを示す。「トレイ−イン−トレイ」形態に関する２つのパッケージング条件間に有意差があり、おそらく貯蔵培地の体積がより高いため、ジャー−イン−トレイ形態よりも有意に高い生存率をもたらした（図２Ｃ）。
【００８９】
２．細胞画像化
貯蔵の４２日での膜消化後の細胞生存率を検証するための二次的手段として、Ｍｕｌｔｉｔｏｘ生存率試験後に残った細胞を２４ウェルプレートに播種し、標準成長培地（１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、１％アンホテリシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。４８〜７２時間後、細胞をカルセインＡＭを用いて染色し、蛍光顕微鏡下で画像化して、細胞生存率を定性的に分析した。Ｍｕｌｔｉｔｏｘ生存率研究の傾向は、４２日間の低温貯蔵後、細胞密度の定性的評価にもあてはまった。具体的には、４２日目に、「トレイ−イン−トレイ」パッケージ形態は「ジャー−イン−トレイ」パッケージ形態に対して改善された生存率を示し、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液はＤＭＥＭ単独よりも改善された細胞生存率を示したことが実証された（図３）。
【００９０】
Ｄ．膜の完全性のＨ＆Ｅ染色および顕微鏡検査
膜の完全性の定量的な比較に加えて、巨視的な取扱適性を評価し、長期の低温貯蔵後に膜の完全性の保存を評価するためにＨ＆Ｅ染色を行った。４２日間貯蔵された羊膜試料のいくつかの定性的な取扱適性は、（１）ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ中の試料は１日で一貫してより厚くなり、組織により類似していた；（２）ＤＭＥＭ単独で貯蔵された羊膜試料はより薄いようであった。
【００９１】
膜の完全性をより詳細に調べるために、ＤＭＥＭもしくはＤＭＥＭ＋ｒｈＡに４週間または６週間貯蔵された羊膜を横断面で切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。注目すべきことに、羊膜の４週間および６週間の染色は異なる回数で行われた；したがって、染色強度は、４週間および６週間の試料の間で異なる。４週間と６週間の時点の両方で、ＤＭＥＭ中に貯蔵された羊膜（図５Ａおよび５Ｃ）ならびにＤＭＥＭ＋ｒｈＡ中に貯蔵された羊膜（図５Ｂおよび５Ｄ）には明確な差異があった。これらの差異は、（１）ＤＭＥＭ溶液単独に貯蔵された膜の上皮層へのより多くの損傷；（２）ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に貯蔵された膜において、羊膜の厚さがより効率的に保存された；（３）より多くの細胞が、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に貯蔵された羊膜のＥＣＭ内に保持された。全体的に、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に貯蔵された組織は、ＤＭＥＭのみに貯蔵された組織と比較してより大きく、より厚く見えた。
【００９２】
Ｅ．タンパク質含量を評価するためのプロテオミクスアッセイ
次に、貯蔵された胎盤膜細胞の総タンパク質含量を評価して、貯蔵条件が経時的に膜の成長因子含量に影響を与えるかどうかを決定した。膜組織を所定の時点で秤量した。その後、組織を凍結ホモジナイズし、総タンパク質含量は、総タンパク質抽出緩衝液を用いて抽出された。次に、カスタムＱｕａｎｔｉｂｏｄｙマイクロアレイを用いて総タンパク質を測定し、各試料について同時に４０個の別個のサイトカインを定量的に評価した。各試料について、４０個全てのサイトカインのレベルを合計し、試料の重量で標準化して、膜のミリグラムあたりのピコグラムのタンパク質の総量を決定した（図５Ｅ）。各条件は二重に評価された。
【００９３】
プロテオミクスデータの手段によれば、組織学、細胞生存率、および細胞生存率画像化で見られるものと同様の傾向が観察された。組織阻害因子ＴＩＭＰ１、２および４の濃度を各試料について合計し、各貯蔵溶液条件について平均した（図５Ｆ）。ＴＩＭＰは、種々のＥＣＭタンパク質を酵素的に分解することに関与するＭＭＰの公知の阻害因子である。全体として、ＴＩＭＰ活性の維持は、経時的な膜の完全性の保存のための潜在的なメカニズムであり得るようである。
【００９４】
Ｆ．膜の完全性を評価するための機械的試験
機械的試験は、１日目にＤＭＥＭ貯蔵溶液中に貯蔵された試料について完了した。これらの値は、９週間でＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ＋ｒｈＡに貯蔵された膜について収集したデータと比較された。簡潔に述べると、ＭＴＳを用いて、１／１００秒ごとに時間、変位、および力を記録した。力の最大値および最大変位を膜障害時に計算した。最大変位およびクランプ間の初期距離を用いて、歪みを計算した：ｅ＝（Ｌｆ−Ｌｉ）／Ｌｉ（図６Ｂ）。応力を定義し、引張試験中に収集されたデータからの最大値を用いて計算した（図６Ａ）。最後に、弾性係数（「係数」＝応力／歪み）は、力が適用されたときに、弾性的に変形する物体の傾向の数学的記述である（図６Ｃ）。
【００９５】
応力、歪みおよび係数を計算し、全てのデータ点について評価した。興味深いことに、全ての機械的性質について、ＤＭＥＭ溶液中に貯蔵された羊膜試料とＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に貯蔵された羊膜試料の間に有意差があった。さらに、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中で低温貯蔵された羊膜試料は、１日目の羊膜の機械的性質と比較して、機械的性質において有意に異なっていなかった。ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液中に貯蔵された細胞は、ＤＭＥＭ溶液中に貯蔵されたものと比較して、最大応力を持続し、少ない歪みを受け、より大きな係数を有した。重要なことに、これらの特性は、１日のみ貯蔵された組織において見られたものと一致した。これらの結果は、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ中に貯蔵された試料が、ＤＭＥＭ単独で貯蔵された試料よりも組織分解が少なかったことを意味する。これらのデータは、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ貯蔵溶液が、ＤＭＥＭ単独よりも少ない膜の破壊および／または良好な保存をもたらすことを示唆する。
【００９６】
結論
実施された全ての試験は、低温貯蔵条件に供されたときの羊膜の完全性が、ＤＭＥＭ溶液と比較して、ＤＭＥＭ＋ｒｈＡ溶液を使用する場合に最も良く保存されることを示す。この結論は、細胞生存率研究、Ｈ＆Ｅ染色、プロテオミクスマイクロアレイ、および機械的試験からのデータによって裏付けられる。
【００９７】
Ｇ．動物研究
実験
胎盤膜試料は、創傷治癒の促進におけるそれらの有効性について調べられた。４つの１５ｍｍ径の十分な厚さの創傷は、３匹の実験ラットの背部皮膚表面（すなわち、背中）に作製された。４つのタイプの胎盤膜調製物は、各動物の創傷上に間質側を下にして入れられ、各創傷に１つのタイプの膜である。以下のタイプの膜を利用した：
（１）２５日間の貯蔵後、ＤＭＥＭ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２．５ｇ／Ｌ  ｒｈＡを含有する低温溶液中に貯蔵された新鮮な胎盤膜；
（２）脱水されたメッシュ状の胎盤細胞調製物；
（３）脱水された全く無傷の羊膜；および
（４）対照（膜なし）
一次包帯材（ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）（Ｃｕｔｉｃｅｒｉｎ）は、創傷を覆うためにステープルを用いて皮膚に固定された。
【００９８】
創傷を術後９日および２１日に検査し、創傷の組織学的試料を収集し、創傷治癒について評価した。
【００９９】
結果
術後９日に、新鮮な貯蔵膜、脱水メッシュおよび脱水羊膜で処置された創傷は、対照群のものよりも小さく見えた（図７Ｂ〜７Ｄ）。図７Ａは、創傷上の膜の配置を示すガイドを提供する。ここで図８を参照すると、組織学的検査は、新鮮に貯蔵された膜および脱水メッシュ試料で処置された創傷が、対照と比較してより多くの細胞性肉芽組織および再上皮化を示したことを示す。具体的には、図１３Ａに言及すると、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、脱水メッシュ、脱水羊膜および対照で処置された創傷と比較して、実質的により少ない異常組織を示した。これとは逆に、図１３Ｂに言及すると、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、他の３つの処置群よりも大きな斜子織りのマトリックスを示したが、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷における濾胞および皮脂腺の数は、９日間で他の処置群と比較して有意差はなかった（図１３Ｃ）。
【０１００】
術後２１日に、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、脱水メッシュ、脱水羊膜、および対照群の創傷と比較して小さかった（図９Ａ〜９Ｄ）。術後２１日の組織学的検査の結果を図１０〜１２に示す。図１０に示されるように、新鮮に貯蔵された胎盤膜で処置された創傷は、他の試料と比較して、創傷治癒の増加を示した。図１１Ｃに言及すると、未処置の創傷の組織学的試験は、肉芽組織および上皮化の薄い領域を示した。脱水メッシュ（図１１Ｄ）および脱水羊膜（図１１Ａ）の調製物で処置された創傷は、対照と比較してほんの僅かに増加した肉芽および上皮化を示した。対照的に、新鮮に貯蔵された胎盤膜で処置された創傷（図１１Ｂ）は、コラーゲン沈着の増加ならびに毛包および皮脂腺の広範な発生を示した。これらの変化は、瘢痕のない再生創傷治癒の指標である。図１２Ｄは、新鮮に貯蔵された胎盤膜で処置された創傷における、毛包および皮脂腺のこの発生の増加、ならびに新しいコラーゲン沈着および肉芽組織の形成を示す。対照的に、これらの発生は、対照（図１２Ａ）、脱水メッシュ（図１２Ｂ）または脱水羊膜（図１２Ｃ）の調製物で処置された創傷においては存在しない。さらに、図１３Ａに言及すると、全ての処置群は、９日間と比較して２１日目に異常な組織をほとんど示さなかったが、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、脱水メッシュ、脱水羊膜および対照で処置された創傷と比較して、引き続き、異常な組織をほとんど示さなかった。同様に、図１３Ｂに言及すると、全ての処置群の創傷は、より大きな斜子織りマトリックスを示したが、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、他の３つの処置群より大きな斜子織りマトリックスを示した。９日目とは異なり、２１日目には、新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、脱水メッシュおよび対照で処置された創傷よりも多数の濾胞および皮脂腺を示した（図１３Ｃ）。
【０１０１】
結論
代表的な組織学的画像（図１０〜１２）およびその定量化（図１３Ａ〜１３Ｃ）から明らかなように、新鮮に貯蔵された胎盤膜足場を用いた創傷の処置は、脱水羊膜および脱水メッシュ調製物と比較して、最良の皮膚再生応答をもたらした。新鮮に貯蔵された膜で処置された創傷は、９日目に再上皮化の証拠を示した。これらの創傷における上皮層は、健康な表皮治癒を代表する、真皮層に伸長した指状の突起を有する厚い層状の表皮に発育した。対照的に、他の調製物は、処置後の９日目に創傷床全体で限定された再上皮化だけを示した。
【０１０２】
全ての群について２１日の時点と比較して、９日の時点では血管の存在がより大きいようであった。脱水羊膜は、最高レベルの血管形成をもたらすようであった。創傷治癒過程が進行するにつれて、組織が再構築され、血管が壊れていたことは明らかである。
【０１０３】
これらのデータは、新鮮な低温貯蔵胎盤膜が創傷治癒過程を早めることを示唆している。さらに、新鮮に貯蔵された移植片は、創傷されていない皮膚を非常に模倣した皮膚組織を再生する身体の能力を増強した。これは、早期の表皮、毛包および腺の形成、ならびに高度の斜子織りマトリックスにより明らかである。新鮮な低温貯蔵胎盤調製物は、創傷治癒において顕著に高い応答を示した。
付記
＜１＞
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびヒト血漿アルブミンを含む溶液中で胎盤膜を低温貯蔵することを含む、組織貯蔵方法。
＜２＞
ヒト血漿アルブミンが組換えヒトアルブミン（ｒｈＡ）である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞
胎盤膜が、０℃超約１０℃未満の範囲の温度において溶液中で低温貯蔵される、＜１＞に記載の方法。
＜４＞
胎盤膜および溶液が、密閉容器内で低温貯蔵される、＜１＞に記載の方法。
＜５＞
ＤＭＥＭおよびヒト血漿アルブミンを含む溶液中で胎盤膜を少なくとも１４日間貯蔵することを含む、＜１＞に記載の方法。
＜６＞
胎盤膜が、溶液中で３６時間低温貯蔵された後に、１．５を超える生細胞対死細胞の比を示す、＜１＞に記載の方法。
＜７＞
胎盤膜が、溶液中で１２０時間低温貯蔵された後に、１．０を超える生細胞対死細胞の比を示す、＜１＞に記載の方法。
＜８＞
胎盤膜が、溶液中で３６０時間低温貯蔵された後に、２．０を超える生細胞対死細胞の比を示す、＜１＞に記載の方法。
＜９＞
胎盤膜が、溶液中で７２０時間低温貯蔵された後に、約１．５を超える生細胞対死細胞の比を示す、＜１＞に記載の方法。
＜１０＞
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、約１．０以上の生細胞対死細胞の比を示す、＜１＞に記載の方法。
＜１１＞
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温された後に、約４５％〜８５％の範囲の細胞生存率を示す、＜１＞に記載の方法。
＜１２＞
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の膜完全性の保存を促進することをさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜１３＞
胎盤膜の膜完全性の保存を促進することが、胎盤膜の厚さの保存を促進すること、胎盤膜の上皮細胞層への損傷を軽減すること、および胎盤膜の細胞外マトリックス内で細胞保持を促進することを含む、＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の細胞生存率を促進することをさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜１５＞
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の総タンパク質含量の保存を促進することをさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜１６＞
胎盤膜が、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、総タンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質約４５０ｎｇ超である、請求項１に記載の方法。
＜１７＞
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、総タンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質約３００ｎｇ超である、請求項１６に記載の方法。
＜１８＞
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜の細胞外マトリックスタンパク質の保存を促進することをさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜１９＞
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜内の細胞外マトリックスメタロプロテアーゼの減少を促進することをさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜２０＞
有効量のヒト血漿アルブミンを溶液中に含むことにより、胎盤膜内のマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子１、２および４の保存を促進することをさらに含む、＜１＞に記載の方法。
＜２１＞
胎盤膜が、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、マトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子１、２および４のタンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質４００ｎｇ超である、＜１＞に記載の方法。
＜２２＞
胎盤膜が、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、マトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子１、２および４のタンパク質含量が、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質２５０ｎｇ超である、＜１＞に記載の方法。
＜２３＞
胎盤膜が、入れ子状トレイ間に低温貯蔵される、＜１＞に記載の方法。
＜２４＞
胎盤膜を溶液中で低温貯蔵する前に、胎盤膜を細分化することを含む、＜１＞に記載の方法。
＜２５＞
胎盤膜を溶液中で低温貯蔵する前に、細分化された胎盤膜を哺乳動物のコラーゲンマトリックスに吸着させることを含む、＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞
細かく刻まれた軟骨を溶液に添加することを含む、＜１＞に記載の方法。
＜２７＞
胎盤膜が、溶液中で低温貯蔵される前に、低温貯蔵されている間に、または低温貯蔵さ
れた後に、凍結されていない、＜１＞に記載の方法。
＜２８＞
＜１＞に記載の方法によって貯蔵された組織を適用し、前記組織を創傷に適用することを含む、創傷を処置するための方法。
＜２９＞
組織が羊膜である、＜２８＞に記載の方法。
＜３０＞
組織が軟骨である、＜２８＞に記載の方法。
＜３１＞
組織の間質表面が創傷に適用される、＜２８＞に記載の方法。
＜３２＞
ＤＭＥＭおよびヒト血漿アルブミンの溶液を含む容器内で低温貯蔵された胎盤膜を含む、組織貯蔵システム。
＜３３＞
胎盤膜が、溶液中で３６時間低温貯蔵後に、１．５を超える生細胞対死細胞の比を示し、溶液中で１２０時間低温貯蔵後に、１．０を超える生細胞対死細胞の比を示し、溶液中で３６０時間低温貯蔵された後に、２．０を超える生細胞対死細胞の比を示し、溶液中で７２０時間低温貯蔵された後に、約１．５を超える生細胞対死細胞の比を示し、溶液中で低温貯蔵された１０００時間後に、約１．０以上の生細胞対死細胞の比を示す、＜３２＞に記載のシステム。
＜３４＞
胎盤膜が、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質約４５０ｎｇ超の総タンパク質含量を有し、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質約３００ｎｇ超の総タンパク質含量を有する、＜３２＞に記載のシステム。
＜３５＞
胎盤膜が、溶液中で２４時間低温貯蔵された後に、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質４００ｎｇ超のマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子１、２および４タンパク質含量を有し、溶液中で１０００時間低温貯蔵された後に、胎盤膜１ｍｇあたりタンパク質２５０ｎｇ超のマトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子１、２および４タンパク質含量を有する、＜３２＞に記載のシステム。
＜３６＞
容器は、内部に胎盤膜が位置付けられる一対の密閉されたトレイを含む、＜３５＞に記載のシステム。
＜３７＞
胎盤膜が、多孔性コラーゲンマトリックスに吸着される、約１．５ｍｍ未満の平均粒径を有する小片に配置される、＜３５＞に記載のシステム。
＜３８＞
胎盤膜がメッシュ状胎盤膜である、＜３７＞に記載のシステム。
＜３９＞
胎盤膜が、羊膜層および絨毛膜層を含む、＜３２＞に記載のシステム。
＜４０＞
胎盤膜が海綿質層を含む、＜３２＞に記載のシステム。
＜４１＞
溶液がＨＥＰＥＳ緩衝液を含有する、＜３２＞に記載のシステム。
＜４２＞
溶液中で２４０時間低温貯蔵後に、約１．５を超える生細胞対死細胞の比を示す胎盤膜を含む、組織。
＜４３＞
溶液中で７２０時間低温貯蔵後に、約１．５を超える生細胞対死細胞の比を示す胎盤膜を含む、＜４２＞に記載の組織。
＜４４＞
組織が、ＤＭＥＭおよび少なくとも約０．０２５ｗ／ｖ％のヒト血漿アルブミンを含む貯蔵溶液に少なくとも部分的に浸漬されている、＜４２＞に記載の組織。
【図１Ａ−１Ｄ】
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【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｆ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ−７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｂ】
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【図１１Ｃ−１１Ｄ】
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【図１２Ａ−１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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