(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞の増殖を促進するための、６０〜１２０ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸またはその塩と、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化フカンとを含んでなる、局所用組成物。
【請求項２】
硫酸化フカンに対するヒアルロン酸の質量比率が０．１〜１０の間である、請求項１に記載の局所用組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの皮膚科学的または化粧品的に許容可能な賦形剤を含んでなる、請求項１または２に記載の局所用組成物。
【請求項４】
他の有効成分をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所用組成物。
【請求項５】
前記他の有効成分が、老化防止剤、治療剤、無痛化剤、鎮痒剤、抗ラジカル剤、ＵＶ防止剤、皮膚高分子の合成またはエネルギー代謝を刺激する剤、水和剤、脱色素剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤およびそれらの混合物から選択される、請求項４に記載の局所用組成物。
【請求項６】
前記他の有効成分がレチンアルデヒドである、請求項４に記載の局所用組成物。
【請求項７】
前記他の有効成分がδ−トコフェリル−グルコピラノシドである、請求項４に記載の局所用組成物。
【請求項８】
皮膚加齢の兆候に対処するための、６０〜１２０ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸またはその塩と、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化フカンとを含んでなる局所用組成物。
【請求項９】
硫酸化フカンに対するヒアルロン酸の質量比率が０．１〜１０の間である、請求項８に記載の局所用組成物。
【請求項１０】
少なくとも１つの皮膚科学的または化粧品的に許容可能な賦形剤を含んでなる、請求項８または９に記載の局所用組成物。
【請求項１１】
他の有効成分をさらに含んでなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の局所用組成物。
【請求項１２】
前記他の有効成分が、老化防止剤、治療剤、無痛化剤、鎮痒剤、抗ラジカル剤、ＵＶ防止剤、皮膚高分子の合成またはエネルギー代謝を刺激する剤、水和剤、脱色素剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、麻酔剤およびそれらの混合物から選択される、請求項１１に記載の局所用組成物。
【請求項１３】
前記他の有効成分がレチンアルデヒドである、請求項１１に記載の局所用組成物。
【請求項１４】
前記他の有効成分がδ−トコフェリル−グルコピラノシドである、請求項１１に記載の局所用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸またはその塩と、低分子量硫酸化多糖との新規組合せ；ならびにアンチエイジングおよび治癒の分野でのその組合せの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、皮膚において最も重要な役割を有する分子である。ヒアルロン酸は、実際には、細胞外マトリックスの主要成分である。細胞外マトリックスは、結合組織の細胞外高分子の集合を指す。細胞外マトリックスは、主に、糖タンパク質、純粋なタンパク質ならびにグリコサミノグリカンで構成されている。ＨＡは、繰り返し二糖単位からなる線状の非硫酸化グリコサミノグリカンであり、その繰り返し二糖単位自体は二量体間で交互のβ１−３およびβ１−４グリコシド結合により連結しているＤ−グルクロン酸およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構成される(Tammi R., Agren U.M., Tuhkanen A.L., Tammi M. Hyaluronan metabolism in skin. Progress in Histochemistry & Cytochemistry 29(2):1-81, 1994)。そのネイティブ形態では、ＨＡは、６００，０００Ｄａ〜３ＭＤａの間の非常に高い分子量を有するポリマーである(Toole BP. Hyaluronan: from extracellular glue to peracellular cue. Nat Rev Cancer 2004, 4:538-539)。
【０００３】
年齢とともに、ＨＡは、量および重合度が減少し、その結果、細胞外マトリックスに保持される水が少なくなる。皮膚は、その後加齢プロセスを経て、繊維症の増加および弾性繊維含量の低下をきたす。加齢プロセスの間に、皮膚の構造および機能の改変が観察される。この加齢は、本質的に生理学的であるが光で誘起される、すなわち、日光、特に、紫外線に対する皮膚の繰り返し暴露によることもある。皮膚加齢の主な臨床兆候は、年齢とともに明らかに増加する筋および深いしわの出現である。溝およびしわは目立ち；皮膚はくぼんだ状態になり、その堅さを失い；表面では、皮膚はその輝きを失う。
【０００４】
硫酸化多糖類は、とりわけ、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化フカン類(fucanes sulfates)および硫酸化ウルバン類(ulvanes sulfates)を含んでなる。
【０００５】
これらの低分子量硫酸化多糖類は有利な生化学的特性：コラーゲンおよびエラスチンの分解の阻害、再構築、抗炎症作用、およびＨＡ産生の誘導、を有する。
【０００６】
加齢の間に、繊維芽細胞は老化に入り、それらの増殖能力は大きく低下する。従って、これらの細胞の増殖を新たに刺激することができるという事柄は、皮膚加齢に対処するために研究された経路の１つである。
【０００７】
さらに、創傷治癒は、正常な組織修復における多数の局所性および全身性因子の相互作用を引き出す複雑かつ動的な生物学的プロセスである。治癒は３つの相互依存的な段階：止血および炎症、増殖およびリモデリングで進行する(General principles of wound healing. Witte MB, Barbul A. Surg Clin North Am. 1997 Jun; 77(3):509-28.)。増殖には、３つの明らかに観察可能なプロセス：肉芽化、収縮および再上皮化が含まれる。
【０００８】
肉芽化の間に、細胞の創傷床への増殖および移動が観察され、その創傷床が残りの修復プロセスに介入する。従って、マクロファージ、繊維芽細胞および内皮細胞はそこで見出される。マクロファージは、走化性因子および増殖因子を絶えず放出する。繊維芽細胞は、創傷の基部での細胞増殖に必要な新しい細胞マトリックスを構築する。この足場は細胞移動を支援する。最後に、内皮細胞は、新たな毛細血管を構成する血管芽の形成を引き起こし、それによって、潅流を回復させ、創傷内の細胞の代謝活性に必須の酸素および栄養分の供給を確保する。
【０００９】
創傷の収縮は、創傷の大きさを減少させる機構であり、繊維芽細胞はこの収縮において主導的役割を果たす。
【００１０】
再上皮化は、外部環境に対する効果的なバリアを形成するために創傷を覆い、有色素状態にすることとその感覚機能および免疫機能を回復させることとが可能な表皮の再生にある。従って、再上皮化は、ケラチノサイトの移動および増殖の細胞プロセスだけでなく、この新しい上皮の分化および真皮と表皮とをつなぐ基底膜の修復も含む。創傷の中心方向への基底細胞の移動により２つの創傷端が接触し得ると、細胞の有糸分裂が相次いで起こり、その移動によって残された空間が埋まり、三次元再生において上皮組織に細胞が提供される。
【００１１】
ケラチノサイト細胞、繊維芽細胞または内皮細胞の増殖期は、活性剤の治癒活性を示す機能的現象の１つと考えることができる。繊維芽細胞増殖の増加は深い創傷（真皮に達している）の治癒に関与し、一方、ケラチノサイト増殖の増加は再上皮化に関与する。
【００１２】
皮膚加齢の兆候に対処するための新規な化粧組成物を提案する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１３】
出願人は、繊維芽細胞増殖に対して、ヒアルロン酸と低分子量硫酸化多糖との間に相乗作用が存在することを示した。この活性は、アンチエイジングの分野だけでなく、組織再生および皮膚病変の治療においても特に有利である。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明は、目的として、ヒアルロン酸またはその塩と、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化多糖とを含んでなる組合せを有する。
【００１５】
本発明の文脈において、用語「ヒアルロン酸」、「ヒアルロン酸フラグメント」、「ＨＡ」および「ヒアルロナン」は、ヒアルロン酸を指すために同義的に使用される。ヒアルロン酸が塩形態で存在する場合、それはヒアルロン酸塩と呼ばれる。
【００１６】
本発明の特定の実施態様では、前記組合せは、その重量平均分子量（Ｍｗ）が５０，０００〜７５０，０００Ｄａの間となるヒアルロン酸またはその塩を含んでなる。
【００１７】
本発明の特定の実施態様では、前記ＨＡフラグメントまたはその塩は、サイズ排除クロマトグラフィー(size-exclusion chromatography)（ＳＥＣ）と、粘度計(viscosimetre)（ＶＩＳ）および示差屈折計(refractometre differentiel)（ＲＩ）と連結されたマルチアングル光散乱光度計(multi-angle light scattering photometer)（ＭＡＬＳ）とを組み合わせた分析方法により測定された６０〜１２０ｋＤａの間の重量平均分子量を特徴とする。
【００１８】
特定の実施態様では、それはヒアルロン酸ナトリウムとなる。
【００１９】
前記ＨＡまたはその塩の分子量は、ウベローデ毛細管粘度計を用いて極限粘度(viscosite intrinseque)を測定する欧州薬局方の方法を用いて測定することができる（欧州薬局方  ７．６、ヒアルロン酸ナトリウムモノグラフ  参照資料：０１／２０１１：１４７２参照）。この粘度値は、次に、マーク・ホーウィンクの関係(relation de Mark-Houwink)により平均分子量と関連付けられる。この方法は長く、完全な再現性が必要である。
【００２０】
本発明の文脈において、前記ＨＡまたはその塩の重量平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）と、粘度計（ＶＩＳ）および示差屈折計と連結されたマルチアングル光散乱光度計（ＭＡＬＳ）とを組み合わせた分析方法であるＳＥＣ−ＭＡＬＳ−ＶＩＳ−ＲＩ法によって測定される。この技術により重量平均分子量（Ｍｗ）を得ることが可能になる。
【００２１】
この技術により、ＨＡの分子量を正確かつ再現可能な方法で特徴付けることが可能になる(Stepan Podzimek & al. Solution of Hyaluronic Acid and Comparison of SEC-MALS-VIS Data with Off-line Capillary Viscometry. Journal of Applied Polymer Science. 2009)。
【００２２】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をＭＡＬＳ検出器と合わせることによって、クロマトグラフィーシステムへポリマー溶液を注入した後、これらのポリマーをクロマトグラフィーカラムでサイズにより分離し、このサイズを光散乱により測定し、かつ示差屈折計またはＵＶ分光器を用いてそれらを定量することが可能になる。
・ヒアルロン酸またはその塩を０．１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液に可溶化し、その後、較正された孔径を有するポリスチレン・ジビニルベンゼンビーズを充填したカラムで溶出させる。大きなポリマー鎖は総ての孔に進入せず、従って、小さな鎖の前に溶出される。
・ＭＡＬＳ検出器は入射光の散乱を様々な角度で測定する。これらの角度によって、外挿により、角度０での散乱であるＲ０を測定することが可能になる。Ｒ０は分子サイズに正比例する。
・示差屈折計の応答Ｓｉは、下式（１）に従って、重合度ｉを有するポリマーの総質量Ｃｉに比例する：
Ｓｉ＝Ｋ’・ｄｎ／ｄｃ・Ｃｉ
（式中、Ｓｉは示差屈折計の応答であり、
Ｋ’は装置に関連した定数であり、
Ｃｉは重合度ｉを有するポリマーの総質量（重量）であり（Ｃｉ＝Ｎｉ×Ｍｉ）、Ｎｉはモル質量Ｍｉの鎖の数である）。
【００２３】
さらに、屈折率増分ｄｎ／ｄｃは、調査中のポリマーの特定の値である。
【００２４】
このｄｎ／ｄｃ比率は、ヒアルロン酸ナトリウムを用いて例示する以下のプロトコールに従って測定することができる。
【００２５】
ａ／装置および溶液の調製：
測定は、入射光源としてヘリウム・ネオンレーザー（λ＝６３３ｎｍ）を備えたＢｒｉｃｅ−Ｐｈｏｅｎｉｘモデルのような屈折計で行う。
【００２６】
調査する様々なポリマー濃度は、秤量によって独立に調製する（溶解の持続時間＝２４時間）。その後、屈折計を使用してそれぞれの屈折率（ｄｎ）を測定する。
【００２７】
ｂ／結果
結果は、グラフｄｎ＝ｆ（濃度）の形で示す（図１参照）。次に、タイプＹ＝Ａ＋Ｂ＊Ｘの線形回帰を決定する。
【００２８】
ヒアルロン酸ナトリウムの場合、決定されたＡおよびＢの値はそれぞれＡ＝−２．０３０およびＢ＝１４９２７．９１１である。
【００２９】
従って、ｄｎ／ｄｃ比率は、ｋ×Ｂに相当し、ここで、ｋは装置の定数であり、この例では０．９７・１０−５に等しい。
【００３０】
従って、ヒアルロン酸ナトリウムでは、ｄｎ／ｄｃは０．９７・１０−５×１４９２７．９１１＝０．１４５ｍｌ／ｇで数値を出す。
【００３１】
下式は総ての測定パラメーター間の関係を示している：
Ｒ０＝Ｋ・Ｃｉ・Ｍｉ
（式中、Ｒ０は散乱角度０でのレイリー比であり、
Ｋは装置の定数であり、
Ｃｉは注入した溶液の［式（１）に従って計算した］重合度ｉを有するポリマーの総質量であり、
Ｍｉは求めるポリマー鎖のモル質量である）。
【００３２】
次に、下式に従って重量平均分子量Ｍｗを計算することができる：
Ｍｗ＝ΣＣｉＭｉ／ΣＣｉ。
【００３３】
総ての分子量はダルトンで表している。
【００３４】
本発明の目的であるヒアルロン酸またはその塩は、当業者に公知の方法の１つ、例えば、文献欧州特許第１９８７１５３号明細書に記載されているものなどに従って得ることができる。
【００３５】
ＨＡは、主に、産業的には、細菌発酵によって得られる。ヒアルロン酸フィラメントは細菌によって合成される。
【００３６】
従って、本発明の特定の実施態様では、選択した細菌株を用いた細菌発酵によって、一般的に、１ＭＤａ〜２ＭＤａの範囲の高分子量を有するネイティブＨＡが得られる。
【００３７】
得られたポリマーは、次に、細菌から分離することができる。その後、溶液を精製した後、所望の分子量が得られるまで、制御した酸加水分解によって加水分解する。
【００３８】
ヒアルロン酸ナトリウムの調製の場合、ＮａＯＨを添加することにより中和工程に進める。
【００３９】
ヒアルロン酸塩は、選好的には、ヒアルロン酸ナトリウムとなる。
【００４０】
本発明との関係においては、低分子量硫酸化多糖類は、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化フカン類および硫酸化ウルバン類から選択することができる。
【００４１】
硫酸化フカン類は、硫酸化Ｌ−フコースを含んでなる多糖類である。これらの多糖類は、特に、褐藻類から、例えば、ヒバマタ目(Fucales)またはコンブ目(Laminariales)から抽出することができる。
【００４２】
硫酸化ウルバン類は、繰り返しモチーフ中に分布している、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸）および硫酸化可能な糖類（例えば、３−サルフェートのラムノース、ガラクトース、キシロース、グルコース）を含んでなる硫酸化アニオン性多糖類である。主要なモチーフは以下である：
・１→４型結合によってβ−Ｄ−グルクロン酸と連結している３−サルフェートα−Ｌ−ラムノースからなるウルバノビウロン酸３−サルフェート(acide 3-sulfate ulvanobiurohique)型Ａ、および
・１→４型結合によってα−Ｌ−イズロン酸と連結している３−サルフェートα−Ｌ−ラムノースからなるウルバノビウロン酸３−サルフェート型Ｂ。
【００４３】
ウルバン類は、特に、アオサまたはアオノリタイプ（アオサ属種(Ulva sp.)およびアオノリ属種(Enteromorpha sp.)）の緑藻類から抽出することができる。
【００４４】
特定の実施態様によれば、前記低分子量硫酸化フカンは国際公開第２０１０／０８６１９７号に記載されているとおりである。
【００４５】
藻類アスコフィルム・ノドスム(Ascophyllum nodosum)から抽出された専売商品Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）（Ａｌｇｕｅｓ  ｅｔ  Ｍｅｒ）が挙げられる。
【００４６】
別の特定の実施態様によれば、前記低分子量硫酸化ウルバンは国際公開第２０１３／１５０２５３号に記載されているとおりである。
【００４７】
また、藻類オオバアオサ(Ulva lactuca)由来の特定のオリゴ糖に基づいた、Ｇｒｅｅｎ  Ｔｅｃｈ社によって市販されているフラクション(fraction)ＱＴ４０（商標）：スルホオリゴラムノグルクロナン(sulpho-oligorhamnoglucuronane)が挙げられる。
【００４８】
本発明の特定の実施態様によれば、多糖に対するヒアルロン酸の質量比率は０．１〜１０の間である。
【００４９】
本発明の別の特定の実施態様によれば、多糖に対するヒアルロン酸の質量比率は、０．５〜５の間、好ましくは、０．５〜２の間である。
【００５０】
本発明はさらに、繊維芽細胞増殖を促進するための使用のための、ヒアルロン酸またはその塩と、本発明による（すなわち、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する）低分子量硫酸化多糖との組合せに関する。
【００５１】
本発明はまた、老化防止有効成分として、ヒアルロン酸またはその塩と、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化多糖との組合せを含んでなり、かつ少なくとも１つの化粧品的に許容可能な賦形剤をさらに含んでなる化粧組成物に関する。
【００５２】
好ましくは、前記化粧品的に許容可能な賦形剤は、局所投与に適している。
【００５３】
許容可能な賦形剤により、特に、良好な安定性と心地よい質感および感触を保証することが可能になる。それらはまた、例えば、化粧品において既知の慣例的使用の処方剤または添加剤であり得る：界面活性剤、着色剤、保存料、香料、皮膜形成剤、増粘剤などが挙げられる。
【００５４】
老化防止組成物は、皮膚への局所投与のために一般的に知られている形態、すなわち、特に、クリーム、ローション、化粧水、美容液、マスク、しわ充填剤、アイライナーなどであり得る。
【００５５】
本発明の目的は、皮膚加齢の兆候に対処するための、本発明による組合せまたは本発明によるこの化粧組成物の化粧品的使用に向けられる。本発明による組合せまたは本発明による化粧組成物の化粧品的使用は、より詳細には、皮膚に成分を回復させ、その堅さ(fermete)を強化し、かつ目立つしわおよび深い溝を視覚的に減らすことを目的としている。
【００５６】
本発明はまた、皮膚加齢の兆候に対処するための方法であって、本発明による組合せまたは本発明による化粧組成物の有効量をそれを必要とする人に、好ましくは局所に、投与することを含む方法に関する。
【００５７】
本発明の別の目的は、皮膚の完全性および質を回復させるために皮膚修復を促進することを意図した皮膚科学組成物であって、皮膚科学または化粧品有効成分として、ヒアルロン酸またはその塩と、その分子量が５〜２５ｋＤａの間である硫酸化多糖との上述の組合せを含んでなり、かつ少なくとも１つの皮膚科学的または化粧品的に許容可能な賦形剤をさらに含んでなる皮膚科学組成物に関する。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様では、前記組成物は局所適用を目的としている。
【００５９】
皮膚科学的（薬学的）または化粧品的に適合する賦形剤は、乳状液、クリーム、バーム(baume)、オイル、ローション、ゲル、発泡ゲル、軟膏、スプレーなどの形態の局所適用用組成物を得るための、当業者に公知のものの中の任意の賦形剤であり得る。
【００６０】
好ましい実施態様では、前記組成物はクリームまたは軟膏の形態となる。
【００６１】
特定の実施態様では、本発明による皮膚科学および化粧組成物は、少なくとも１つの他の有効成分を含んでなる。
【００６２】
この他の有効成分は、特に、老化防止剤、治療剤、無痛化剤、鎮痒剤、酸化防止剤、抗ラジカル剤、ＵＶ防止剤、皮膚高分子の合成またはエネルギー代謝を刺激する剤、水和剤、脱色素剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗炎症剤、または麻酔剤を含んでなる群から選択することができる。
【００６３】
特定の実施態様によれば、本発明による、好ましくは化粧用の、組成物は、レチンアルデヒドをさらに含んでなる。この追加の老化防止活性剤は、即時的細胞代謝再賦活効果のためのレチノイン酸の直接前駆体である。レチンアルデヒドは、ＨＡ受容体であるＣＤ４４の発現を増加させ、ＨＡ合成を誘導する。
【００６４】
従って、本発明による組成物は、ヒアルロン酸またはその塩と、低分子量硫酸化多糖と、レチンアルデヒドとの組合せを含んでなる。そのような組合せは、表皮真皮接合部および真皮乳頭層において再構築および再緻密化(redensifiant)効果を有する。
【００６５】
本発明の別の実施態様によれば、前記組成物は、δ−トコフェリル−グルコピラノシドを含むトコフェロール誘導体をさらに含んでなることになる：その強力な抗酸化作用は、皮膚を保護し、その輝きを保存する。
【００６６】
従って、本発明による組成物は、ヒアルロン酸またはその塩と、低分子量硫酸化多糖と、δ−トコフェリル−グルコピラノシドとの組合せを含んでなる。
【００６７】
別の特定の実施態様によれば、前記他の有効成分は、治療剤、無痛化剤およびそれらの混合物から選択されることになる。そのような有効成分は、好ましくは、皮膚科学組成物に使用されることになる。
【００６８】
最後に、本発明の別の目的は、特に、皮膚病変の処置および治療を意図した、薬剤（より詳細には、皮膚用薬剤）としての使用のための、本発明による、ヒアルロン酸もしくはその塩と低分子量硫酸化多糖との組合せ、またはそれを含有する皮膚科学組成物に向けられる。
【００６９】
本発明はまた、特に、皮膚病変の処置および治療を意図した、薬剤（より詳細には、皮膚用薬剤）の調製のための、ヒアルロン酸またはその塩と、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化多糖との組合せの使用に関する。
【００７０】
本発明はまた、皮膚病変の処置および治療のための方法であって、本発明による、ヒアルロン酸もしくはその塩と、５〜２５ｋＤａの間の分子量を有する硫酸化多糖との組合せ、またはそれを含有する皮膚用組成物の有効量をそれを必要とする人に、好ましくは局所に、投与することを含む方法に関する。
【００７１】
本発明による皮膚科学および化粧組成物は、特に、以下の損傷した皮膚のケアを目的としている：
・次の侵襲的な行為／処理：縫合を行うまたは行わない外科的行為（切除、シェービング）、凍結療法、レーザーアブレーション、中等度または重度の剥離、メソセラピー、掻爬、
・表面の(superficielles)切り傷または熱傷による外傷後、
・（皮膚の完全修復までの）長期使用のための、皮膚回復を促進する治療製品を必要とする次の表面的（非侵襲的）行為、
・次の軽度の外的損傷：表面的な表皮剥脱、日焼け。
【００７２】
本発明による皮膚および粘膜の病変の処置は、特に、切り傷、縫合、表皮剥脱、引掻き傷、擦り傷、外科手術後または美容皮膚科学的処置後の瘢痕、表在性熱傷、日焼けの処置を含んでなり得る。
【００７３】
本発明はさらに、治療および皮膚修復を改善することを意図した、本発明による化粧組成物の使用に関する。
【００７４】
本発明は、その範囲を限定することなく本発明を説明する以下の結果を読むことによってよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、屈折率ｄｎをヒアルロン酸ナトリウムの濃度ｃの関数として示す。
【図２】図２は、繊維芽細胞増殖に対する、１００および１０００μｇ／ｍｌの発明によるＨＡ（ＨＡＦ１２０）ならびに１０および１００μｇ／ｍｌのＡｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）の効果を示す。＊：ｐ＜０．０５および＊＊：ｐ＜０．０１。３回の独立した実験を代表する実験。
【図３】図３は、繊維芽細胞増殖に対する、１００μｇ／ｍｌの発明によるＨＡ（ＨＡＦ１２０）、１０μｇ／ｍｌのＡｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）およびそれらの組合せの効果を示す。＊：ｐ＜０．０５。３回の独立した実験を代表する実験。
【図４】図４は、繊維芽細胞増殖に対する、１０００μｇ／ｍｌの発明によるＨＡ（ＨＡＦ１２０）、１０μｇ／ｍｌのＡｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）およびそれらの組合せの効果を示す。＊：ｐ＜０．０５および＊＊：ｐ＜０．０１。３回の独立した実験を代表する実験。
【実施例】
【００７６】
繊維芽細胞増殖に対する、６０〜１２０ｋＤａの間の重量平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムフラグメント（ＨＡＦ１２０）と、低分子量（５〜２５ｋＤａ）を有する硫酸化フカンとの組合せの薬理学的評価
プロトコール：
使用した技術は、３７℃でのＳ期細胞のＤＮＡ中へのヌクレオチド、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン(5-bromo-2’-deoxyuridine)（ＢｒｄＵ）、チミジン類似体の取り込みである。この技術により、細胞周期における進行が特徴である増殖細胞である細胞（Ｓ期またはＤＮＡ合成期）を定量することが可能になる。
【００７７】
外科的廃棄皮膚から単離された正常ヒト繊維芽細胞(fibroblastes normaux humains)（ＮＨＦ）は、通常、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)（ＤＭＥＭ）中で培養される。本発明者らの実験条件では、試験する製品の希釈液は３％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで調製される。
【００７８】
最初に、細胞からＦＣＳを２４時間枯渇させ、細胞増殖を停止させた後、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４４時間評価する分子の存在下で、それらをインキュベートする。
【００７９】
細胞増殖速度に比例するＢｒｄＵ取り込みは、抗ＢｒｄＵ抗体系(Roche Applied Science)によって評価する。対応する吸光度（ＤＯ）は、４５０ｎｍで測定する。従って、このデータは細胞増殖速度に比例する。
【００８０】
評価した活性剤は以下の通りである：
・陽性対照：１０ｎｇ／ｍｌの上皮増殖因子(epidermal growth factor)（ＥＧＦ）
・専売商品Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）（Ａｌｇｕｅｓ  ｅｔ  Ｍｅｒ）：１０および１００μｇ／ｍｌ（それぞれ０．００１％および０．０１％に相当）
・実施例１による６０〜１２０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウム：１００および１０００μｇ／ｍｌ（それぞれ０．０１および０．１％に相当）
・Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）および６０〜１２０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウムをそれぞれ、以下の各濃度で含んでなる組合せ：
・１０μｇ／ｍｌ＋１００μｇ／ｍｌ、
・１０μｇ／ｍｌ＋１０００μｇ／ｍｌ。
【００８１】
結果の解析：
・ＤＯとして表す（ＢｒｄＵ取り込みに比例し、従って、細胞増殖速度に比例する）
・刺激パーセントとして表す：
【数１】
0006625558.tif 000002
・平均の標準誤差として表す：ＳＥＭ＝標準偏差（ＳＤ）／√ｎ
【００８２】
統計解析：
対応のない両側スチューデントｔ検定を用いた統計解析を未加工のＤＯ値で行った。
【００８３】
この検定によって、様々な条件について得られた結果の有意性を特徴付けるｐ値が得られる。有意性の程度は以下のとおりに設定する：
ｐ＜０．０５（＊）は有意である
ｐ＜０．０１（＊＊）は非常に有意である
ｐ＜０．００１（＊＊＊）は極めて有意である
ｐ＞０．０５は有意ではない
【００８４】
結果：
これらの実験条件では、
・Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）は、特に、１００μｇ／ｍｌでは、非常に再現性が高くかつ統計的に有意に繊維芽細胞増殖を誘導した（図２）。
・ヒアルロン酸ナトリウム単独では、繊維芽細胞増殖に対して適度の効果を有する（図２）。
・これら２つの化合物の組合せは、相乗的に繊維芽細胞増殖を誘導した（図３および図４）。
【００８５】
結論：
これらの実験条件では、Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）は、非常に再現性が高くかつ統計的に有意に繊維芽細胞増殖を誘導した。Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）とＨＡＦ１２０との組合せは、相乗的に繊維芽細胞増殖を誘導した。
【００８６】
繊維芽細胞増殖を誘導することにより、Ａｓｃｏｐｈｙｓｃｉｅｎｔ（商標）および６０〜１２０ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウムフラグメントとのその組合せは、細胞代謝を回復させ、皮膚修復および抗加齢に関与する。
【００８７】
例示的組成物
実施例１
【００８８】
【表１】
0006625558.tif 000003
実施例２
【００８９】
【表２】
0006625558.tif 000004
【図１】
0006625558.tif 000005
【図２】
0006625558.tif 000006
【図３】
0006625558.tif 000007
【図４】
0006625558.tif 000008