(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、糖タンパク質への特異的連結方法:
付着したモノグリカンまたはジグリカンを有する糖タンパク質を得る工程；
前記糖タンパク質のモノグリカンまたはジグリカンの糖ユニットから反応性官能基を形成する工程；および
前記糖タンパク質上の反応性官能基に、リンカーまたはペイロードをカップリングする工程。
【請求項２】
前記糖タンパク質の糖ユニットが、ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃ、およびＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌからなる群から選択されるものであり、前記リンカーが、ヒドラジド部分、ヒドラジノ−ピクテ−スペングラー連結反応部分、アミン部分、オキサゾリン部分、メチルヒドラジン、およびＮ−メチルヒドロキシルアミンからなる群から選択されるものを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記反応性官能基の形成工程が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）酸化によるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記反応性官能基の形成工程が、ガラクトースオキシダーゼ酸化によるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記糖タンパク質の糖ユニットが、ＧｌｃＮＡｃであり、前記リンカーが、ヒドラジド部分、ヒドラジノ−ピクテ−スペングラー連結反応部分、アミン部分、オキサゾリン部分、メチルヒドラジン、およびＮ−メチルヒドロキシルアミンからなる群から選択される官能基を含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記反応性官能基の形成工程が、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）酸化によるものである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記反応性官能基の形成工程が、ガラクトースオキシダーゼ酸化によるものである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記リンカーのカップリング工程の後、このリンカーにペイロードをカップリングする工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記ペイロードが、治療薬、細胞傷害性因子（剤）、または造影剤である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗体薬物複合体（antibody-drug conjugates;ＡＤＣs）は、能力および治療ウインドウを増大させるための、抗体修飾の新規な方法の１つである。ＡＤＣは、抗体と、特定のリンカーを介した生物学的に活性のある細胞毒性のペイロードとから構成され、がん患者の治療を標的とした治療法として設計されている。抗体薬物複合体は、バイオ複合体および免疫複合体の例である。
【０００２】
最近、抗体とリンカーとの間の新しい結合方法についての研究が、多いに注目を集めている。一級アミンまたはヒンジ部のジスルフィドをターゲットとすることによってＡＤＣを調製する古典的複合体形成（conjugation）化学には、不均一な生成物の特性、連鎖（linkage）不安定性、および活性部位の結合の低減を含む、多くの欠点がある。抗体のグリコシル化部位をターゲットとすることによる新規な部位特異的複合体形成方法は、良好なアプローチである可能性がある。
【０００３】
グリコシル化は、タンパク質の最も一般的な翻訳後修飾の１つである。グリコシル化は、抗体を含むタンパク質の機能、免疫原性、血清安定性およびプロテアーゼ抵抗性に影響する。Ｎ−グリコシル化における最初の少数の糖残基は、よく保存されており、典型的にはＡｓｎ残基のγ−アミドに結合するＮ−アセチルグルコサミンを含んでいる。この最初の糖残基であるＮ−アセチルグルコサミンは、典型的に、２番目のＮ−アセチルグルコサミンに連結し、それが次にマンノースに連結する。
【０００４】
すべての抗体は可変領域と定常領域とを含んでいる。可変領域が、抗原を直接認識する。定常ドメインの分子構造は、異なるタイプの抗体間で変動する。抗原に結合する際、抗体は、異なる免疫細胞上のレセプターと相互作用し得る。Ｆｃ領域中の異なるグリコシル化パターンは、抗体の効力だけではなく安定性にも影響を与えることになる。Ｆｃ領域中のグリコシル化パターンは、抗体の機能を変更するために改変することができる。グリカン工学は、抗体のＦｃのグリカン構造、レセプターへのその親和性、およびその免疫反応を調整するために用いることができる。
【０００５】
治療用抗体の効力およびグリカン構造一貫性を改善するために、均質的にグリコシル化した抗体の産生用の糖鎖工学プラットフォームの開発が試みられてきた。例えば、米国特許出願公開番号２０１１／０２６３８２８Ａｌ、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００７／１４６８４７Ａ２、および米国特許仮出願番号６１９８６４７１を参照されたい。これらの特許は、たった１つの糖を備えた抗体を生成するいくつかの異なる方法を説明した：（１）抗体を、ｅｎｄｏ−Ｓ  のようなエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼで、続いて異なる条件下でα−フコシダーゼで、処理し、ほとんどのグリカンを除去して、単一の糖ユニットだけ（すなわちＧｌｃＮＡｃ）を後に残すこと；（２）特異的に改変された細胞を使用して均質のモノ−ＧｌｃＮＡｃ抗体を産生させること。これらのアプローチは、単一または２個の糖ユニット（ＧｌｃＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ−ＦｕｃおよびＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）を有する抗体を産出し得る。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の実施形態は、抗体上のＮ結合型モノ−ＧｌｃＮＡｃ部位、Ｎ結合型ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部位、またはＮ結合型ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃ部位との複合体形成（コンジュゲーション）によって、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を製造する方法に関する。抗体については、Ｎ結合型グリカンは、ＩｇＧ１定常ドメインのＡｓｎ２９７に付着したΝ結合型ＧｌｃＮＡｃのように、定常ドメインに付着していてもよい。本発明の方法は、抗体とリンカー（または治療薬のような他の部分）との間の共有結合の生成のために、酵素的方法または化学的方法を使用する。これらの均質のモノ−ＧｌｃＮＡｃ抗体は、先行技術において公知の方法から生成することができ、そして、そのまま使用することも、あるいは図２で示されるように、さらなる修飾のために使用することもできる。
【０００７】
本発明の１つの態様は、糖タンパク質への特定の連鎖のための方法に関する。本発明の１つの実施形態に従う方法は、それに付着したモノグリカンまたはジグリカンを有する糖タンパク質を得ること；この糖タンパク質上の糖ユニット上に反応性官能基を生成すること；およびこの糖タンパク質上の反応性官能基に、リンカーまたはペイロードをカップリングすることを含み得る。
【０００８】
本発明の上記の実施形態のうちのいずれに従っても、糖タンパク質は、モノグリカン（ＧｌｃＮＡｃ）、ジグリカン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃ）およびジグリカン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）からなる群から選択されるもののような、任意の糖タンパク質であってよい。
【０００９】
本発明の上記の実施形態のうちのいずれに従っても、リンカーは、ヒドラジド部分、ヒドラジノ−ピクテ−スペングラー連結反応部分、アミン部分、オキサゾリン部分、メチルヒドラジンおよびＮ−メチルヒドロキシルアミンのようなアルデヒド基にカップリングされるために官能基を含んでいてもよい。
【００１０】
本発明の上記の実施形態のうちのいずれに従っても、糖タンパク質上の反応性官能基を生成する方法は、過ヨウ素酸塩による酸化のような化学反応、あるいはガラクトシドオキシダーゼによる酸化のような酵素反応に関係していてもよい。
【００１１】
本発明の上記の実施形態のうちいずれに従っても、ＡＤＣは、糖タンパク質と直接結合したペイロードを有していてもよい。あるいは、ＡＤＣは、糖タンパク質に対してリンカーを介して結合したペイロードを有していてもよい。
【００１２】
本発明の上記の実施形態のうちのどれに従っても、ペイロードは、治療薬、細胞傷害性因子（剤）または造影剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、モノグリカン糖タンパク質を生成する２つの例示的な方法を示す。方法１（パネルＡ）に示されるように、１つは、Ｅｎｄｏ  Ｓのようなエンドグリコシダーゼの使用によって、糖タンパク質に付着した１個または２個の糖ユニットを有する糖タンパク質を生成することができる。たとえ当初の生成物がモノグリカンおよびジグリカンの混合物を含んでいたとしても、第２のグリカンユニットを切り取るため、２つ目の酵素（フコシダーゼ）で反応生成物をさらに精製することは可能である。方法２（パネルＢ）は、代替的な方法を示し、そこでは在来の糖タンパク質が生成された後、適切なグリコシダーゼで整形され得る。例えば、それはノイラミニダーゼで、続いてβ−ガラクトシダーゼで、処理され得る。
【００１４】
【図２】図２は、本発明の実施形態に従って、一例としてハーセプチン抗体を使用して、様々なモノグリカンまたはジグリカン糖タンパク質を生成するためのスキームを示す。図のように、ＧｌｃＮＡｃのみを有するモノグリカンハーセプチン抗体は、Ｅｎｄｏ  Ｓ処理と、それに続くフコシダーゼ処理によって生成され得る。あるいは、これは、Ｅｎｄｏ  Ｓを内部に持つ細胞から発現されたハーセプチン抗体の、ノイラミニダーゼ処理とそれに続くガラクトシダーゼ処理によって生成され得る。ジグリカン（ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃ）を備えたハーセプチン抗体は、Ｅｎｄｏ  Ｓ処理で、または単にＥｎｄｏ  Ｓ（または同様のエンドグリコシダーゼ）を内部に持つ細胞における抗体の発現によって、生成され得る。ジグリカン、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、ハーセプチン抗体のアナログは、Ｅｎｄｏ  Ｓを内部に持つ細胞での抗体発現と後に続くノイラミニダーゼによる処理によって生成され得る。
【００１５】
【図３】図３は、１個または２個のグリカンユニットを有する糖タンパク質の様々な形態からＡＤＣを生成するための、様々な方法を説明するスキームを示す。最初に、リンカーまたはペイロードを直接カップリングするための反応基（例えばアルデヒド）を生成するために、グリカンユニットを、酵素（例えばガラクトースオキシダーゼまたは同様の糖オキシダーゼ）で、または化学反応（例えば過ヨウ素酸酸化）によって、酸化する。
【００１６】
【図４】図４は、本発明の実施形態に従って調製された様々なＡＤＣを示す。
【００１７】
【図５】図５は、本発明の実施形態に従った糖タンパク質へのペイロードまたはリンカー−ペイロードの複合体形成が、糖タンパク質を損傷しないことを確認する、図４の様々なＡＤＣの結合を示す。
【００１８】
【図６】図６は、ペイロードまたはリンカー−ペイロードの複合体形成が上手くいったことを確認する、図４の様々なＡＤＣの結合を示す。
【００１９】
【図７】図７は、本発明の実施形態に従ってリンカーやペイロードとカップリングするための反応基を生成するために、過ヨウ素酸塩を使用する方法を説明するスキームを示す。
【００２０】
【図８】図８は、本発明の実施形態に従って、図７で示されるように、リンカーおよびペイロードとカップリングするための反応基を生成するために、過ヨウ素酸塩を使用する方法で生成された例として、様々なＡＤＣを示す。
【００２１】
【図９】図９は、過ヨウ素酸塩反応が抗体を損傷しないことを説明する、図８のＡＤＣのハーセプチン結合を示す。
【００２２】
【図１０】図１０は、ペイロード（すなわちビオチン）の成功した複合体形成を説明する、図８のＡＤＣのアビジン結合を示す。
【００２３】
【図１１】図１１は、ジグリカン抗体へのペイロードの複合体形成を説明するスキームを示し、そのカップリングは、第１、第２、または両方の糖ユニットに生じ得る。ガラクトシダーゼは、カップリング部位を評価するために、第１と第２の糖ユニット間を切断するために使用され得る。
【００２４】
【図１２】図１２は、図１１に示されるＡＤＣのビオチン−アビジン結合を示す。ガラクトシダーゼ処理は、いくらかの結合を低減し、少なくともいくらかの複合体形成がガラクトースユニットに生じたことを示す。
【００２５】
【図１３】図１３は、シッフ塩基形成（アミドリ（Amidori）反応を含む）またはピクテ−スペングラー反応において、リンカー上のヒドラジン官能基またはアミノ基を使用するような、過ヨウ素酸塩反応の後に、糖タンパク質へのペイロードの複合体形成が、異なる反応性連鎖で達成され得ることを示すスキームである。
【００２６】
【図１４】図１４は、図１３で示されるようにヒドラジン官能基で生成されたＡＤＣを示す。
【００２７】
【図１５】図１５は、抗体へのペイロードの成功した複合体形成を説明する、図１４のＡＤＣのアビジン結合を示す。
【００２８】
【図１６】図１６は、本発明の実施形態に従った、ペイロードとして蛍光基を有する様々なＡＤＣを示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、図１６のＡＤＣの検出を示す。左のパネルは、ＡＤＣの位置を示す、クマシーブルーで視覚化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。右のパネルは、蛍光体の成功した複合体形成を説明する、フルオログラフを示す。
【００３０】
【図１８】図１８は、本発明の実施形態に従った、ペイロードとして細胞毒性の基を有する、様々なＡＤＣを示す。
【００３１】
【図１９】図１９は、２つの異なる細胞株ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１で評価された、図１８のＡＤＣの細胞毒性を示す。結果は、ＡＤＣが有効な細胞傷害性薬剤であることを示す。
【００３２】
【図２０】図２０は、本発明の実施形態に従って、酵素的酸化を使用して、複合体形成のために糖ユニット上に反応基を生成する、ＡＤＣ複合体形成を説明するスキームを示す。
【００３３】
【図２１】図２１は、ガラクトースオキシダーゼによるガラクトースにおける反応を示す。
【００３４】
【図２２】図２２は、図２０のスキームに従って生成された様々なＡＤＣを示す。
【００３５】
【図２３】図２３は、図２０のスキームを使用してペイロードの複合体形成が成功したことを説明する、図２２のＡＤＣのアビジン−ビオチン結合を示す。
【００３６】
【図２４】図２４は、２つの異なる温度で生成されたＡＤＣを示す。
【００３７】
【図２５】図２５は、両方の温度でペイロードの複合体形成が成功したことを説明する、図２５のＡＤＣのアビジン−ビオチン結合を示す。
【００３８】
【図２６】図２６は、酵素反応の選択性の利用によって、あるタイプの糖タンパク質を別のタイプの糖タンパク質より容易に差次的に複合体形成させることが可能であることを説明する、異なる糖ユニットを有する糖タンパク質からのＡＤＣ生成を示す。
【００３９】
【図２７】図２７は、本発明の実施形態に従って、あるタイプの糖タンパク質への複合体形成の選択が成功したことを説明する、図２６のＡＤＣのアビジン−ビオチン結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
本発明の実施形態は、抗体上のＮ結合型モノ−ＧｌｃＮＡｃ部位、Ｎ結合型ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ部位、またはＮ結合型ＧｌｃＮＡ−Ｆｕｃ部位との複合体形成による、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を製造する方法に関する。抗体に対して、Ｎ結合型グリカンは、ＩｇＧ１定常ドメインのＡｓｎ２９７に付着したＮ結合型ＧｌｃＮＡｃのように、定常ドメインに付着していてもよい。本発明の方法は、抗体とリンカー（または治療薬のような他の部分）との間の共有結合を生成するために、酵素的方法または化学的方法のいずれかを用いる。図２で示されるように、これらの均質のモノ−ＧｌｃＮＡｃ抗体は、先行技術において公知の方法から生成することができ、そのまま使用することもでき、あるいはさらなる修飾のために使用することもできる。
【００４１】
過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）のような化学的方法またはガラクトースオキシダーゼのような酵素的方法のいずれかによって酸化したモノグリカンまたはジグリカン抗体は、グリカン部分上にアルデヒドを生成することができる。ヒドラジン含有リンカーを使用して、当業者は、アルデヒド基とリンカーを反応させて部位特異的な複合体形成を提供してもよい（図３参照）。さらに、還元的アミノ化、ピクテ−スペングラー反応、またはオキシム形成を含む他の公知の手法を使用して、リンカーを、これらのアルデヒドタグ部位を通じてモノグリカンまたはジグリカン抗体に付着させてもよい（図３参照）。
【００４２】
例としてハーセプチン抗体を使用して、いくつかのＡＤＣ構造を図３で示された方法を使用して調製した。付着ジグリカン（すなわちＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃ）を有するハーセプチン抗体（トラスツズマブ）を、例のために使用する。これらの化合物を図４に示す。これらの例において、ハーセプチン抗体は、コンセプトをテストするために、リンカーと共に、またはリンカーなしで、ビオチンと複合体形成させる。
【００４３】
これらの複合体の結合活性を、ハーセプチンタンパク質およびアビジンの両方を使用して調べた。図５に示されるように、ハーセプチンについてのこれらの複合体の結合親和性は、有意差を示していない。
【００４４】
図６は、これらの複合体のアビジン結合を表す。ＤＣＢ００５は、ネガティブコントロールであり、これは、ハーセプチン抗体上のジグリカンが除去されていて、ビオチン付着のための部位がないためである。図６に示されるように、ほとんどの複合体は著しいアビジン結合を示す。これらの結果は、所望のＡＤＣを作製するために図３に示される方法を成功裡に使用できることを証明している。
【００４５】
直接複合体形成に加えて、薬の複合体は、リンカーを介して抗体に連結されていてもよい。図７のスキームにおいて説明されるように、アルデヒド官能基を作るためのグリカン部分の酸化の後、リンカーを新しく作られたアルデヒド基に直接結合し、次に、ペイロード（例えば治療薬、マーカー、または造影剤）をリンカーに結合してもよい。あるいは、リンカーとペイロードは、最初にカップリングすることができ、その後に、リンカー−ペイロードを抗体と複合体形成する。
【００４６】
図８は、リンカーを有するＡＤＣの例、ならびにリンカーの無いコントロールＡＤＣを示す。ハーセプチンおよびアビジンに対するこれらのＡＤＣの結合を評価した。図９に示されるように、ハーセプチンに対するこれらのＡＤＣの結合において、差違は無い。図１０は、アビジンに対するこれらのＡＤＣの結合が、ほとんど判別不能なことを示す。これらの結果は、リンカーが使用されるかどうかは、抗体またはペイロードの結合に影響を与えないだろうということを示す。したがって、本発明の実施形態は、リンカー有りまたは無しでＡＤＣを生成するために、用いることができる。
【００４７】
過ヨウ素酸塩反応は、どんなビシニル（vixinyl）アルコールとでも生じ得る。したがって、上記の例におけるハーセプチン抗体へのビオチンの付着は、どちらの糖環上であることもできる。図１１に示されるように、ハーセプチン抗体はジグリカン、ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌを含む。この抗体から調製されたＡＤＣは、ＧａｌまたはＧｌｃＮＡｃ、または両方に、付着されたペイロード（例えばビオチン）を有していることができる。当業者は、ＡＤＣからＧａｌ残基を取り除くために、β−ガラクトシダーゼを使用し得る。ペイロードがＧａｌに付着していれば、それは除去されることになる。他方、ペイロードがＧｌｃＮＡｃまたは両方に付着している場合は、すべてのまたはいくらかのペイロードは、β−ガラクトシダーゼ処理の後にも残り得る。
【００４８】
図１２に示されるように、アビジン結合はβ−ガラクトシダーゼによる処理の後に、部分的に低減する。この結果は、少なくともビオチンの一部がＧａｌユニットに付着していることを示す。
【００４９】
本発明の実施形態は、糖タンパク質、または付着モノグリカンを有する抗体をも使用し得る。図１３に示されるように、同様のプロセスが、これらの抗体または糖タンパク質上にペイロードを付着させるために使用され得る。このようなＡＤＣの一例が、図１４に示される。
【００５０】
図１５は、このＡＤＣ（ＤＣＢ０１０）によるアビジン結合を示す。この結合の結果は、ＡＤＣがモノグリカン抗体（または糖タンパク質）を用いて成功裡に調製されたことを示す。
【００５１】
本発明の実施形態に従って、ＡＤＣは、その間にリンカーが有りまたは無しで、ペイロードに複合体形成した糖タンパク質または抗体を含み得る。糖タンパク質または抗体は、好ましくは付着した１個または２個の糖ユニット（すなわちモノグリカンまたはジグリカン）を有する。
【００５２】
本発明の実施形態に従って、ペイロードは、治療薬、細胞傷害性因子（剤）、造影剤（それは蛍光部分、放射性核種またはＮＭＲ反応原子（例えば２Ｈ、１３Ｃ、１９Ｆ、３１Ｐなど）を含む薬剤であってもよい。制がん剤（例えばビンクリスチン、タキソール、ゲムシタビン、シスプラチンなど）のような、いかなる治療薬や細胞傷害性因子（剤）も、本発明の実施形態と共に使用され得る。当業者であれば、ＡＤＣにおいて一般に使用されるいかなる治療薬も、本発明の実施形態と共に使用され得ることを認識するだろう。
【００５３】
図１６は、造影剤を含む本発明の実施形態に従った、ＡＤＣのいくつかの例を示す。これらの例において、フルオレセイン−５−チオセミカルバジドは、リンカー有りまたはリンカーなしで、糖タンパク質または抗体にカップリングするために使用される。このような蛍光部分は画像診断（イメージング）において使用することができる。
【００５４】
図１７は、図１６に示されたＡＤＣの検出の例を示す。図１７の左パネルは、ＡＤＣのバンドを見つけるためにクマシーブルーで探索されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１７の右パネルは、ＡＤＣが蛍光部分を含むことを示している、フルオログラフを示す。この例は蛍光検出を示しているが、当業者であれば、（ペイロード中の放射性部分を使用する）ラジオグラフ、スペクトルまたは蛍光イメージング（例えばペイロード中のＮＩＲ色素、蛍光体）、ＰＥＴ（陽電子射出断層撮影法，例えば１８Ｆ）、またはＳＰＥＣＴ（単一光子放射形コンピュータ断層撮影）のような、他のイメージング方法も使用し得ることを認識するだろう。Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ｆ−１８、Ｔｃ−９９、Ｌｕ−１７７、Ｚｏ−８９、Ｔｈ−２２７およびＧｄ−１５７のようないかなる適切な放射性核種も、本発明の実施形態と共に使用され得る。
【００５５】
本発明の実施形態に従って、リンカーは、ペイロードに糖タンパク質または抗体を接続するために使用され得る。一旦ＡＤＣが標的部位（例えばがん細胞中）に送達されると、リンカーは、ペイロードの効率的な送達および／または有効な放出を支援し得る。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態は、標的細胞を死滅させることができるペイロードを有していてもよい。図１８は、ペイロードとして細胞傷害性薬剤を含んでいるＡＤＣの例を示す。図１９は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いたこれらのＡＤＣの結果（ＩＣ５０）を示す。図１９に示されるように、本発明の実施形態に従うＡＤＣは、細胞死滅または増殖阻害に有効であることができる。
【００５７】
糖タンパク質または抗体へのペイロードの複合体形成のために、本発明の実施形態は、グリカン部分を利用する。糖ユニットは、ペイロードまたはリンカーとのカップリングのための反応基（例えばアルデヒド基）を生成するため、酸化されてもよい。上記の例において説明されるように、糖ユニットから反応基を生成する方法は、過ヨウ素酸塩（例えばＮａＩＯ４）による酸化を含んでいてもよい。さらに、酵素的酸化も本発明の実施形態と共に使用され得る。
【００５８】
図２０は、本発明の実施形態に従ってＡＤＣを生成するためにガラクトースオキシダーゼを使用する方法を説明するスキームを示す。図２１は、ガラクトースオキシダーゼによって触媒された化学反応を示す。図２２は、ガラクトースオキシダーゼによって生成されたＡＤＣのいくつかの例を示す。図２３は、ガラクトースオキシダーゼを使用して生成された２つのＡＤＣのアビジン−ビオチン結合を示す。結果は、１方が他方より良いものの、どちらのガラクトースオキシダーゼも有効であることを示す。
【００５９】
図２４は、２つの異なる温度、２５℃および４℃で生成された２つのＡＤＣを示す。ビオチン−アビジン結合アッセイ（図２５）で説明されるように、複合体形成反応は両方の温度で上手くいった。これらの結果は、本発明の実施形態に従う複合体形成反応が、広範囲の反応条件に寛容であることを示す。
【００６０】
本発明の実施形態に従って、糖タンパク質または抗体が異なる糖ユニットを含んでいる場合、他の糖ユニットより好ましい、あるタイプの糖で、選択的にＡＤＣを形成することが可能である。図２６は、一方はＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ、他方はＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃの、異なるジグリカンを含んでいるハーセプチン抗体の例を示す。一方の糖を他方より好む酵素を使用することによって、他方より好ましいあるタイプの糖タンパク質でＡＤＣを生成することが可能になる。
【００６１】
アビジン−ビオチンアッセイで示されるように、複合体形成用の反応基を生成するために、ガラクトースオキシダーゼを使用することは、フコースユニットよりガラクトースユニットを用いて、より速く進行する。その結果、ハーセプチン−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌを備えたＡＤＣは、ハーセプチン−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃより、カップリング効率が良い。
【００６２】
本発明の実施形態は、より均質のＡＤＣを生成するために、そこに付着する１個または２個の糖ユニットを有する抗体または糖タンパク質を利用する。均質な組成をもつ生物製剤は、それらが、より有効で、より安定で、より良い薬物動態学パラメーターを示し、製剤化を容易にするためのより良く定義された特性を持ち得る等の理由のため、当業者は、均質な組成の生物製剤が重要であると評価するだろう。
【００６３】
上記の例は、本発明の実施形態の利点を説明する。以下の具体的な実施例は、本発明のこれらおよび他の実施形態をさらに説明することになる。当業者であれば、これらの実施例が説明のためだけのものであり、本発明の範囲を制限することを意図しないことを、十分に理解するだろう。当業者であれば、これらの実施例の他の改変またはバリエーションが、本発明の範囲から外れずに可能であることを、十分に理解するであろう。
【実施例】
【００６４】
次の実施例は、本発明のある実施形態を説明するために示されるが、この本発明の範囲の制限として解釈されるべきではない。他の方法で示されない限り、各々の１Ｈ  ＮＭＲは、５００ＭＨｚで得られたデータである。他の方法で明示されない限り、ここに使用される略語は以下のとおりである：
Ｂｕ：ブチル；  Ｂｎ：ベンジル；  ＢＯＣ：ｔ−ブチルオキシカルボニル；  ＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ／ジメチルアミノ−ホスホニウム−ヘキサフルオロホスファート；  ＨＩＰＳ：ヒドラジノ−ピクテ−スペングラー連結反応；  ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド；  ＤＭＦ：Ν，Ν−ジメチルホルムアミド；  ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン；  ＥＤＣ：１−（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイミド塩酸塩；  ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル；  Ｅｑ．：等価物；  ＨＯＢｔ：ヒドロキシベンゾトリアゾール；  ＬＡＨ：水素化アルミニウムリチウム；  ＭｅＯＨ：メタノール；  ＭＨｚ：メガヘルツ；  ＭＳ（ＥＳ）：質量分光光度計電子スプレー；  ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリジノン；  Ｐｈ：フェニル基；  Ｐｒ：プロピル基；  ＴＥＡ：トリエチルアミン；  ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；  ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；  Ｔｅｔｒａｋｉｓ：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム。
【００６５】
「リンカー」は、２つの反応性末端を備えた分子であり、一方は、抗体（または糖タンパク質）への複合体形成用であり、他方は、ペイロード（例えば細胞毒素、治療薬、イメージング部分（例えば蛍光体または放射性核種）等）への複合体形成用である。リンカーの抗体結合反応性末端は、伝統的に抗体上のシステインのチオールまたはリジンのアミン基を介して抗体に複合体形成ができる部位であり、そのため典型的には（マレイミド中と同様の）二重結合のようなチオール反応基、あるいはクロロ、ブロモまたはヨードのような脱離基、またはＲ−スルファニル基、またはカルボキシル基のようなアミン反応基である；そのうえ、ジグリカン部分は、それが反応性末端となるための新法であるように、モノ−Ｎ−アセチルグルコサミンを含む糖タンパク質に付着してもよい。本発明の実施形態に従って、リンカーは、グリカンの酸化に由来する官能基と複合体形成する。そのような官能基はアルデヒドであってもよく、そのため、リンカー上の反応基は、シッフ塩基または再配置されたシッフ塩基連鎖（例えばアミドリ反応（Amidori reaction））を形成するためのアミノ基となることになる。
【００６６】
リンカーの抗体複合体形成反応性末端は、典型的には、細胞毒素上の塩基性アミン／アルコールまたはカルボキシル基との、アミド／エステル結合の形成を介して細胞毒素に複合体形成ができる部位であり、そして、典型的にはカルボキシル、アルコール、または塩基性アミン基である。用語「リンカー」が複合体形成形態中のリンカーを説明するのに使用される場合、一方または両方の反応性末端は、リンカーおよび／または細胞毒素の間の結合の形成のために、（チオール−反応基の脱離基のように）存在しなくなるか、(カルボン酸のカルボニルのみになるように)不完全となることになる。
【００６７】
糖タンパク質は、ポリペプチド側鎖に共有結合で付着された少糖類鎖（グリカン）を含むタンパク質である。炭水化物は、翻訳と同時の修飾または翻訳後修飾においてタンパク質に付着する。このプロセスはグリコシル化として知られている。分泌された細胞外タンパク質はしばしばグリコシル化される。細胞外に伸びるセグメントがあるタンパク質では、細胞外のセグメントもグリコシル化される。糖タンパク質は、多くの場合、重要かつ不可欠な膜タンパク質であり、そこでは、それらは細胞間相互作用において役割を果たす。
【００６８】
実施例１
【化１】
0006595600.tif 000002
【００６９】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ
【化２】
0006595600.tif 000003
【００７０】
ＴＨＦ（８３ｍＬ）に溶解したＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５．０ｇ、４３．４４ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（１ａ、９．４６２ｇ、４３．４４ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で３．０分間撹拌した。その後、ＣＨ２Ｃ１２（８３ｍＬ）に溶解したＤＣＣ（９．８５６ｇ、４５．５７ｍｍｏｌ）を、０℃でその溶液にゆっくり加え、次に室温に温めた。この反応混合物を、さらに１８時間撹拌した。その溶液を０℃に冷やし、沈殿を、ろ過してＥＡ（１００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥して、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（１ｂ、１３．２８ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ：５．０２（ｄ、１Ｈ）、４．６０（ｄ、１Ｈ）、２．８５（ｓ、４Ｈ）、２．３１（ｍ、１Ｈ）、１．４８（ｍ、９Ｈ）、１．０５（ｍ、６Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋１）：３１４．８。
【００７１】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ
【化３】
0006595600.tif 000004
【００７２】
Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）に溶解したＮａＨＣＯ３（３．５４４ｇ、４２．２０ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解したＬ−（＋）−シトルリン（７．３８９ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）を、室温で加えた。その後、ＤＭＥ（１００ｍＬ）に溶解したＢｏｃ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（１ｂ、１２．６２ｇ、４０．１９ｍｍｏｌ）を、その溶液にゆっくり加えた。この反応混合物を、室温で１８時間撹拌した。有機溶媒を除去し、溶液に１０％クエン酸を加え、その後１０％ＩＰＡ／ＥＡで抽出した。有機層を、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４（ｓ）上で乾燥し、減圧下で濃縮して、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ（１ｃ）を生じさせた。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ：４．３７〜４．４１（ｍ、１Ｈ）、３．９０（ｄ、１Ｈ）、３．１２（ｔ、２Ｈ）、１．５１〜２０．６（ｍ、５Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）、０．９７（ｄ、３Ｈ）、０．９２（ｄ、３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋１）：３７５．０。
【００７３】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ
【化４】
0006595600.tif 000005
【００７４】
室温のＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１２５ｍＬ）に溶解したＢｏｃ−Ｖａｌ−シトルリン（１ｃ、１２．９３ｇ、３４．５７ｍｍｏｌ）および４−アミノベンジルアルコール（ＰＡＢＯＨ、４．６８３ｇ、３８．０３ｍｍｏｌ）を、ＥＥＤＱ（１２．８３ｇ、５１．８６ｍｍｏｌ）で処理した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。溶剤を除去し、白い固形残渣をエーテルで粉末化した。固体をろ過によって集め、エーテルで洗浄し、減圧下で濃縮してＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（１ｄ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ：７．５４（ｄ、２Ｈ）、７．２９（ｄ、１Ｈ）、４．５２（ｓ、２Ｈ）、３．９０（ｄ、１Ｈ）、３．１９（ｍ、１Ｈ）、３．１０（ｍ、１Ｈ）、１．５１〜２０．６（ｍ、５Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）、０．９７（ｄ、３Ｈ）、０．９２（ｄ、３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋ｌ）：４８０．０。
【００７５】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
【化５】
0006595600.tif 000006
【００７６】
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（１ｄ、９．５６ｇ、１９．９５ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、室温で、乾燥ピリジン（３．５０ｍＬ）に溶解した。その溶液を０℃に冷やし、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解した４−ニトロフェニルクロロフォルマート（８．６９ｇ、４３．１３ｍｍｏｌ）を、その溶液中へゆっくり加えた。この反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。有機溶媒を除去し、溶液に１０％クエン酸を加え、次に、１０％ＩＰＡ／ＥＡで抽出した。有機層を、食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４（ｓ）上で乾燥し、減圧下で濃縮して白い固体を得た。カラムクロマトグラフイーによって精製し、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（１ｅ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ：８．３０（ｄ、２Ｈ）、７．６４（ｄ、２Ｈ）、７．４６（ｄ、２Ｈ）、７．４１（ｄ、２Ｈ）、５．２５（ｓ、２Ｈ）、４．５２（ｓ、１Ｈ）、３．９０（ｄ、１Ｈ）、３．２０（ｍ、１Ｈ）、３．１０（ｍ、１Ｈ）、１．５１〜２０．６（ｍ、５Ｈ）、１．４４（ｓ、９Ｈ）、０．９７（ｄ、３Ｈ）、０．９２（ｄ、３Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋ｌ）：６４５．０。
【００７７】
Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
【化６】
0006595600.tif 000007
【００７８】
室温のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）に溶解したＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（１ｅ、１．５ｇ）を、ＴＦＡ（３．０ｍＬ）で処理した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で４〜５時間撹拌した。溶剤を除去し、黄色の固形残渣をヘキサンで洗浄した。この固体をろ過によって集め、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥して、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（１ｅ）を得た。ＭＳ（Ｍ＋ｌ）：５４５。
【００７９】
エステル−プロパン酸−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ
【化７】
0006595600.tif 000008
【００８０】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解したＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯＨ（１ｆ、５４４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、３−（エトキシカルボニル）プロパン酸（２９２ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３８７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（０．７６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。その反応を水で止め、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機質層を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４（ｓ）上で乾燥し、減圧下で濃縮して黄色の固体を得た。この黄色の固体をカラムクロマトグラフイーによって精製し、エステル−プロパン酸−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（１ｇ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣ１３／ＣＤ３ＯＤ）：  δ：０．９９（ｍ、６Ｈ）、１．６４（ｍ、２Ｈ）、１．７８（ｍ、１Ｈ）、１．８１（ｍ、１Ｈ）、２．１６（ｍ、１Ｈ）、２．５０〜２．７０（ｍ、４Ｈ）、３．１２（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｓ、３Ｈ）、４．１９（ｍ、１Ｈ）、４．５１（ｍ、２Ｈ）、５．２９（ｓ、２Ｈ）、７．４０〜７．５５（ｍ、４Ｈ）、７．７５（ｄ、２Ｈ）、８．３４（ｄ、２Ｈ）、８．４６（ｔ、１Ｈ）、８．７６（ｔ、１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋１）：６５９。
【００８１】
エステル−プロパン酸−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ビオチン
【化８】
0006595600.tif 000009
【００８２】
室温のＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した、エステル−ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（１ｇ、１４３ｍｇ、０．２１７ｍｍｏｌ）およびアミノ−ビオチン（６７ｍｇ、０．２３４ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（６０．６ｍｇ）によって処理した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で１６時間撹拌した。その反応を水で止め、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４（ｓ）上で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣を、カラムクロマトグラフイーによって精製し、エステル−プロパン酸Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ビオチン（１ｈ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ：０．８３（ｍ、６Ｈ）、１．４０〜１．６０（ｍ、１１Ｈ）、２．００〜２．１０（ｍ、２Ｈ）、２．５５（ｍ、１Ｈ）、２．７０〜３．３０（ｍ、７Ｈ）、３．５５（ｓ、３Ｈ）、４．１０〜４．４６（ｍ、４Ｈ）、４．９３（ｓ、２Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、５．９７（ｓ、１Ｈ）、６．３５〜６．４４（ｓ、２Ｈ）、７．２２（ｄ、１Ｈ）、７．２７（ｍ、２Ｈ）、７．６０（ｍ、２Ｈ）、７．８２（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｄ、１Ｈ）、８．０９（ｄ、１Ｈ）、９．９４（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋１）：８０６。
【００８３】
ヒドラジド−プロパン酸−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ビオチン
【化９】
0006595600.tif 000010
エタノール（５．０ｍＬ）に溶解したエステル−プロパン酸−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ビオチン（１ｈ、８０．５ｍｇ）およびＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（１．０ｍＬ）の溶液を、窒素雰囲気下で１６時間還流した。その混合物を室温に冷やし、水で反応停止した。固体を、ろ過によって集め、ＣＨ２Ｃｌ２とメタノールで洗浄して、ヒドラジド−プロパン酸−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ビオチン（１ｉ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ：０．８３（ｍ、６Ｈ）、１．４０〜１．６０（ｍ、１１Ｈ）、２．００〜２．１０（ｍ、２Ｈ）、２．５５（ｍ、１Ｈ）、２．７０〜３．３０（ｍ、７Ｈ）、３．５５（ｓ、３Ｈ）、４．１０−４．４６（ｍ、４Ｈ）、４．９３（ｓ、２Ｈ）、５．４１（ｓ、２Ｈ）、５．９７（ｓ、１Ｈ）、６．３５−６．４４（ｓ、２Ｈ）、７．２２（ｄ、１Ｈ）、７．２７（ｍ、２Ｈ）、７．６０（ｍ、２Ｈ）、７．８２（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｄ、１Ｈ）、８．０９（ｄ、１Ｈ）、９．９４（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋ｌ）：８０６。
【００８４】
実施例２
【化１０】
0006595600.tif 000011
【００８５】
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル−１，２−ジメチル−２−（（１−（３−オキソ−３−（２−（５−（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）ヒドラジニル）プロピル）−１Ｈ−インドール−２−イル）メチル）ヒドラジン−１−カルボキシレート
【化１１】
0006595600.tif 000012
【００８６】
ＤＭＦ（１．９４ｍＬ）に溶解した５−（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンヒドラジド（０．１０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル−１，２−ジメチル−２−（（１−（３−オキソ−３−（パーフルオロフェノキシ）プロピル）−１Ｈ−インドール−２−イル）メチル）ヒドラジン−１−カルボキシレート（０．２８ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（０．１４ｇ、１．０４ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で１９時間撹拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、次に、Ｃ１８シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜１０％メタノール）によって精製し、（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル−１，２−ジメチル−２−（（１−（３−オキソ−３−（２−（５−（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）ヒドラジニル）プロピル）−１Ｈ−インドール−２−イル）メチル）ヒドラジン−１−カルボキシレート（２ａ）（０．１８ｇ）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ７２４（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８７】
Ｎ’−（３−（２−（（１，２−ジメチルヒドラジニル）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパノイル）−５−（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンヒドラジドの合成
【化１２】
0006595600.tif 000013
【００８８】
ジクロロメタン（１．１４ｍＬ）に溶解した（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル−１，２−ジメチル−２−（（１−（３−オキソ−３−（２−（５−（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタノイル）ヒドラジニル）プロピル）−１Ｈ−インドール−２−イル）メチル）ヒドラジン−１−カルボキシレート（０．４１ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）およびピペリジン（０．１１ｍＬ、１．３３ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で１７時間撹拌した。その混合物を減圧下で濃縮し、次に、Ｃ１８シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜１０％メタノール）によって精製し、Ｎ’−（３−（２−（（１，２−ジメチルヒドラジニル）メチル）−１Ｈ−インドール−１−イル）プロパノイル）−５−（（３ａＳ，４Ｒ，６ａＲ）−２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンヒドラジド（２ｃ）（０．１６ｇ）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  ５０２（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００８９】
実施例３
【化１３】
0006595600.tif 000014
【００９０】
ＳＭＣＣ−ＤＭ１
【化１４】
0006595600.tif 000015
【００９１】
室温のＴＨＦ（２．０ｍＬ）に溶解したＤＭ１（８７ｍｇ、０．１１７ｍｍｏｌ）およびＳＭＣＣ（１１８ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）を、ＤＩＰＥＡ（４５．７ｍｇ、０．３５４ｍｍｏｌ）によって処理した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。その反応を水で止め、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４（ｓ）上で乾燥し、減圧下で濃縮して黄色の固体を得た。この黄色の固体をカラムクロマトグラフイーによって精製し、ＳＭＣＣ−ＤＭ１（３ａ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）：  δ：０．８０（ｍ、３Ｈ）、１．０２（ｍ、３Ｈ）、１．２０〜２．００（ｍ、２５Ｈ）、２．０１〜４．００（ｍ、３６Ｈ）、４．１２（ｓ、３Ｈ）、４．２７（ｍ、１Ｈ）、４．７８（ｄ、１Ｈ）、５．３０（ｓ、１Ｈ）、５．３９（ｍ、１Ｈ）、５．７（ｍ、１Ｈ）、６．２６（ｓ、１Ｈ）、６．４３（ｍ、１Ｈ）、６．６０〜６．７１（ｍ、２Ｈ）、６．８３（ｄ、１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋１）：１０７３。
【００９２】
ヒドラジド−ＳＭＣＣ−ＤＭｌ
【化１５】
0006595600.tif 000016
【００９３】
エタノール（３．０ｍＬ）に溶解したＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０７．３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）およびＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏ（１．０ｍＬ）の溶液を、窒素雰囲気下で２時間還流した。その反応を水で止め、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４（ｓ）上で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフイーによって精製し、ヒドラジド−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（３ｂ）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）：  δ：０．８０（ｍ、３Ｈ）、１．２３（ｍ、２Ｈ）、１．２０〜２．００（ｍ、２５Ｈ）、２．０１〜４．００（ｍ、３６Ｈ）、３．９９（ｓ、３Ｈ）、４．２７（ｍ、１Ｈ）、４．７９（ｄ、１Ｈ）、５．３４（ｓ、１Ｈ）、５．６５（ｍ、１Ｈ）、６．２７（ｄ、１Ｈ）、６．４４（ｍ、１Ｈ）、６．６３（ｍ、２Ｈ）、６．９３（ｄ、１Ｈ）、７．２６（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ（Ｍ＋ｌ）：９９０。
【００９４】
ハーセプチン−ＧｌｃＮＡｃ−Ｆｕｃの調製
【００９５】
ハーセプチン（５００μＬ中１０ｍｇ）、１０＊ＧｌｙｃｏＢｕｆｆｅｒ（１００μＬ）、Ｅｎｄｏ  Ｓ（１０μＬ）および再蒸留水（３９０μＬ）を、一緒にバイアルに入れ、３７℃で１６時間撹拌した。その後、その溶液を、９．０ｍＬのＰＢＳおよび１．０ｍＬのプロテインＡビーズと共に、遠心分離チューブに加え、２５℃で１．０時間回転させた。その後、この反応混合物を、４℃で５．０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。樹脂カラムを１０ｍＬのＰＢＳによって洗浄した。抗体を、１００ｍＭグリシンで溶出させ、チューブ中で直ちにｐＨ８．０トリスで中和した。
【００９６】
抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌの調製
【００９７】
抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌは、Ｅｎｄｏ  ＳをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞または２９３ＨＥＫ細胞への、抗Ｈｅｒ２抗体発現ベクターの化学的トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって調製される。手短かに言えば、抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌの産生のため、宿主細胞を、２つのＧｌｃＮＡｃ間のβ１−４連鎖のグリコシド結合を開裂させて抗Ｈｅｒ２抗体のＡｓｎ２９７残基上にＧｌｃＮＡｃ部分を残し得るＥｎｄｏ  Ｓ発現ベクターでトランスフェクトすることによって、改変した。しかし、Ｅｎｄｏ  Ｓを発現するＣＨＯ細胞またはＦ２９３細胞は、抗Ｈｅｒ２発現ベクターを導入した後、３つの糖コンビネーション、すなわちモノ−ＧｌｃＮＡｃ（約５０％〜６０％）、ガラクトースに連結したＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）（約４０％〜５０％）、およびガラクトースに続いてシアル酸に連結したＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ）（１０％未満）を含んでいた。抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌの調製のために、３つの糖コンビネーション抗Ｈｅｒ２モノクローナル抗体を含んでいる培養培地を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー処理によって精製した。後続するシアル酸を有するガラクトースに連結したＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ）の余分なシアル酸は、ノイラミニダーゼ処理によって切り取った。モノ−ＧｌｃＮＡｃ（約３３％）、ガラクトースに連結したＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）（約６７％）を含む、抗Ｈｅｒ２抗体の最終生成物は、さらなるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー処理によって得られる。
【００９８】
抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃの調製
【００９９】
抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体の調製のために、翻訳後のグリコシル化が制限された細胞株を開発した。グリコシル化の制限された細胞株は、Ｅｎｄｏ  ＳがトランスフェクトされたＣＨＯ細胞または２９３ＨＥＫ細胞の化学的トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって調製される。しかし、ＥｎｄｏＳを発現するＣＨＯ細胞またはＦ２９３細胞は、抗Ｈｅｒ２発現ベクターを導入した後に３種の糖コンビネーション、すなわちモノ−ＧｌｃＮＡｃ（約５０％〜６０％）、ガラクトースが結合したＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ）（約４０％〜５０％）、およびシアル酸が後続するガラクトースに連結したＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−Ｓｉａ）（１０％未満）を含んでいた。抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃの産生のため、抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂをトランスフェクトされたＥｎｄｏ  Ｓ発現ＣＨＯ細胞の培養培地を、プロテインＡカラムによって精製した。抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂの３種の糖コンビネーションは、Ｅｎｄｏ  Ｓ発現ＣＨＯ細胞または２９３ＨＥＫ細胞の安定したプールの培養上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー処理によって精製することができる。抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃモノクローナル抗体を得るため、抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸の余分なシアル酸およびガラクトースを、さらなるノイラミニダーゼおよびガラクトシダーゼ処理によって切除し、純粋な抗Ｈｅｒ２  ｍＡｂ−ＧｌｃＮＡｃを得ることができる。
【０１００】
ＮａＩＯ４による酸化
【０１０１】
ｐＨ６．０の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の異なるグリカンタイプのモノクローナル抗体を、褐色のバイアル（光からの防御）に入れ、ＮａＩ０４（異なる当量で）を加え、アルゴン雰囲気下（異なる温度で）、０．５〜２．０時間撹拌した。その溶液を、ｐＨ６．０の１．０Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで、名目分子量限度（ＮＭＷＬ）３０ｋＤａのアミコンウルトラ−１５遠心式フィルターデバイスによって脱塩および濃縮した。次に、ｐＨ６．０の１．０Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで、モノクローナル抗体を２．０ｍｇ／ｍＬまで希釈する。
【０１０２】
ガラクトースオキシダーゼによる酸化
【０１０３】
１．０Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）中の異なるグリカンタイプのモノクローナル抗体を、褐色のバイアルに入れ（光からの防御）、ガラクトースオキシダーゼ（シグマまたはワーシントン）を加え、アルゴン雰囲気下（異なる温度で）、１６〜７２時間撹拌した。
【０１０４】
複合体形成プロトコール
【０１０５】
酸化後の異なるグリカンタイプのモノクローナル抗体を、褐色のバイアルに入れ（光からの防御）、異なる複合体形成部分（ヒドラジドまたはＨＩＰＳ）を備えたリンカーおよびペイロード（ビオチンまたはＤＭ１）を加え、アルゴン雰囲気下（異なる温度で）、１６〜７２時間撹拌した。その溶液を、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中で、ＮＭＷＬ３０ｋＤａのアミコンウルトラ−１５遠心式フィルターデバイスによって脱塩し濃縮した。
【０１０６】
ビオチン化アッセイのためのＥＬＩＳＡアッセイ
【０１０７】
コーティングバッファー中の１μｇ／ｍＬ濃度のＩｇＧを、１００μＬ／ウェルでプレートにコートした。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄する。３００μＬ／ウェルのＰＢＳ−５％スキムミルクでウェルをブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルで３回洗浄する。ＰＢＳで希釈された１００μＬ／ウェル当たり１００ｎｇのＡＤＣサンプルを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン（１：１００００）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢを、３７℃で１０分間加える。発色は、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを加えることによって止めることができる。そして、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０〜６５０ｎｍの吸光度の測定によって、プレートを読み取る。
【０１０８】
結合親和性についてＥＬＩＳＡアッセイ
【０１０９】
コーティングバッファーに１μｇ／ｍＬの濃度で溶解したＨｅｒ２を、１００μＬ／ウェルでプレートにコートした。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄する。３００μＬ／ウェルのＰＢＳ−５％スキムミルクでウェルをブロックし、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルで３回洗浄する。ＰＢＳ−１％ＢＳＡで希釈された１００μＬ／ウェル当たり１００ｎｇのＡＤＣサンプルを加え、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルの抗ヒトカッパ軽鎖を加え（１：１００００）、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを吸引し、３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴ（０．０５％トゥイーン２０）で３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢを、３７℃で１０分間加える。発色は、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを加えることによって止めることができる。そして、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０〜６５０ｎｍの吸光度の測定によって、プレートを読み取る。
【０１１０】
ＡＤＣのＬＣ／ＭＳ検出
【０１１１】
液体クロマトグラフィー−飛行時間型質量分析計（ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳ）分析は、モノクローナル抗体調製物中のグリコフォームの正確な分子量、およびあらゆる不均一性を決定するための重要なツールである。調製したモノクローナル抗体を特徴づけるために、その結果から再構築された、ＴＯＦ  ＭＳスペクトル、および軽鎖と重鎖に関する、この変性および還元されたモノクローナル抗体の質量グラフは、それぞれ液体クロマトグラフィー−質量分析法の分析を用いて、得られた。ところで、重鎖は、抗体のこの部分上で通常起こるグリコシル化のため、はるかに不均質なＴＯＦ  ＭＳスペクトルを生じる。重鎖は、Ａｓｎ２９７でのグリコシル化における不均質性に起因する多様なピークを示す。再構成された質量グラフは、重鎖に関する主要なピーク群が、異なるサイズのグリカンが付着した一連のタンパク質群であることを裏付けている。１６２Ｄａまでおよび２０３Ｄａの質量差は、グリカン構造上の異なる糖部分を暗示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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