(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）下の式Ａ１：
【化１】
0006479812.tif 000037
によって表される化合物Ａ１もしくは医薬として許容されるその塩、または
（ｉｉ）下の式Ａ２：
【化２】
0006479812.tif 000038
によって表される化合物Ａ２もしくは医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、
（ｂ）下の式Ｂ：
【化３】
0006479812.tif 000039
によって表される化合物Ｂまたは医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを、別々にまたは一緒に含む、神経芽細胞腫の治療に用いるための、組合せ医薬。
【請求項２】
前記第１の薬剤が化合物Ａ１または医薬として許容されるその塩であり、
前記第２の薬剤が化合物Ｂまたは医薬として許容されるその塩である、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項３】
前記第１の薬剤が化合物Ａ２または医薬として許容されるその塩であり、
前記第２の薬剤が化合物Ｂまたは医薬として許容されるその塩である、請求項１に記載の組合せ医薬。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載の組合せ医薬、および少なくとも１種の賦形剤を含む、神経芽細胞腫の治療に用いるための、医薬組成物。
【請求項５】
前記神経芽細胞腫がＡＬＫ陽性のがんである、請求項１から３のいずれか１項に記載の組合せ医薬または請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記がんが、ＡＬＫ遺伝子の変異に依存する、請求項５に記載の組合せ医薬または請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記がんが、ＡＬＫ遺伝子の増幅に依存する、請求項５に記載の組合せ医薬または請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＡＬＫ遺伝子の変異がＲ１２７５Ｑである、請求項６に記載の組合せ医薬または請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ阻害剤とを含む組合せ医薬、がんの治療におけるかかる組合せ医薬の使用、ならびにがんに罹患したヒトを含めた温血動物を治療する方法であって、かかる治療を必要とする前記動物に有効用量のＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ阻害剤を投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＬＫ阻害剤
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）は、受容体チロシンキナーゼのインスリン受容体スーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、細胞外ドメイン、１回膜貫通領域に相当する疎水性の伸長部、および細胞内キナーゼドメインを含む。それは、脳の発達に重要な役割を果たし、神経系における特定のニューロンにその効果を発揮し、通常、神経組織の発達中に発現する。ＡＬＫの遺伝子変化は、造血器および非造血器腫瘍における腫瘍形成に関与している。この遺伝子は、未分化大細胞リンパ腫、神経芽細胞腫、および非小細胞肺がんを含めた一連の腫瘍では、再配置されている、変異している、または増幅されていることが見出されている。神経芽細胞腫および神経膠芽腫では完全長ＡＬＫ受容体タンパク質の異常発現が報告されており、未分化大細胞リンパ腫ではＡＬＫ融合タンパク質が生じている。染色体再配置がＡＬＫ遺伝子に最もよく見られる遺伝子変化であるが、乳がんおよび食道がんではＡＬＫの増幅が示されている。したがって、ＡＬＫ陽性腫瘍の治療において、選択的にＡＬＫを標的にする化合物を開発することは、潜在的に非常に望ましい。近年、ＡＬＫキナーゼ活性の小分子阻害剤が幾つか、例えばＷＯ２００８／０７３６８７Ａ１に記載されており、それらのうちあるものについては現在臨床評価が行われているところである。クリゾチニブという、ｃＭＥＴおよびＡＬＫのチロシンキナーゼ阻害剤が、ＡＬＫ陽性の進行性非小細胞肺がんを有する患者向けに認可されており、さらに効力の高いＡＬＫ阻害剤が近いうちに後に続く可能性があると思われる。
【０００３】
ＣＤＫ阻害剤
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、タンパク質キナーゼの一大ファミリーである。ＣＤＫは、哺乳動物の細胞周期の開始、進行、および終了を調節する。ＣＤＫの機能は、例えば、網膜芽細胞腫タンパク質、ラミン、ヒストンＨ１、および有糸分裂紡錘体の構成成分を含めたある種のタンパク質をリン酸化し、それによって活性化または不活性化することである。ＣＤＫによって仲介される触媒ステップは、ＡＴＰから高分子酵素基質へのリン酸基転移反応を含む。
【０００４】
腫瘍の発達は、ＣＤＫおよびそれらの調節因子の遺伝子変化および調節解除と密接に関連しており、そのためにＣＤＫの阻害剤が有用な抗がん治療法となり得ることが示唆される。実際に、初期の結果から、形質転換細胞と正常細胞とは、例えば、サイクリンＤ／ＣＤＫ４／６に対するそれらの要求が異なること、ならびに従来の細胞毒性薬および細胞分裂阻害薬に観察される一般的な宿主毒性のない、新規な抗悪性腫瘍薬を開発することが可能であり得ることが示唆されている。幾つかの化合物群（例えば、Fischer, P. M. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2001, 4, 623-634に概説される）には、ＣＤＫ特異的ＡＴＰ拮抗作用による抗増殖性があることが見出されている。したがって、ＣＤＫを総じて標的とした、または特定のＣＤＫを標的とした治療法を使用して、がんなどの増殖性障害を治療するための単独療法を開発することは、潜在的に非常に望ましい。ＣＤＫの阻害剤は公知であり、例えば、ＷＯ２００７／１４０２２２、ＷＯ２０１０／０２０６７５、およびＷＯ２０１１／１０１４０９など、かかる阻害剤に関する特許出願が出願されている。
【０００５】
ＡＬＫまたはＣＤＫ４／６のいずれかを阻害する化合物を調製するための試みが為されており、そのような化合物が幾つも当技術分野で開示されている。しかし、ＡＬＫおよびＣＤＫ４／６によって仲介される病理学的反応の数を考えると、有効で安全な治療剤への必要性および組合せ療法においてそれらを優先的に使用することへの必要性が依然として引き続き存在する。驚くべきことに、あるＡＬＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤と組み合わせると、強力な抗増殖作用およびｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答を誘発することが見出された。本発明は、増殖性疾患を治療するための特定の組合せ療法に関する。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、（１）ＡＬＫ阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（２）ＣＤＫ阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを、別々にまたは一緒に含む、組合せ医薬に関する。
【０００７】
第２の態様では、本発明は、第１の態様の組合せ医薬、および少なくとも１種の賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
【０００８】
第３の態様では、本発明は、増殖性疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、ＡＬＫ阻害剤である治療有効量の第１の薬剤と、ＣＤＫ阻害剤である治療有効量の第２の薬剤とを投与することを含み、第１および第２の薬剤が、同時に、別々に、または逐次投与される、方法に関する。
【０００９】
第４の態様では、本発明は、増殖性疾患を治療するための、第１の態様の組合せ医薬に関する。
【００１０】
第５の態様では、本発明は、増殖性疾患を治療するための医薬品を製造するための、第１の態様の組合せ医薬または第２の態様の医薬組成物の使用に関する。
【００１１】
第６の態様では、本発明は、第１の態様による組合せ医薬または第２の態様による医薬組成物を含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｌｏｅｗｅ相加性モデルに基づくＣＨＡＬＩＣＥソフトウェアの出力から、どのようにすれば化合物の組合せにおける有望な相乗的相互作用を評価できるのかを、仮想データで説明する図である。左の図は用量マトリックスプロットであり、図中、７×７のマトリックスの個々のブロックはそれぞれ、薬物処置による阻害（細胞死）の割合（パーセント）を報告している。単一の化合物の処置単独による阻害は、薬剤Ａについては一番左側の列、薬剤Ｂについては一番下の行に報告され、データは、０に設定されたビヒクル対照による阻害（薬剤Ａと薬剤Ｂの両方の濃度が０である場合の値）に対して正規化されている。右の図は、Ｌｏｅｗｅ過剰マトリックスプロット（Excess Matrix plot）であり、図中、個々のブロックはそれぞれ、用量マトリックス中の実験データを、Ｌｏｅｗｅ相加性モデルによって生成された阻害予想値に対して比較した、過剰阻害を報告する。この図では、相乗作用は値＞０として定義され、相加作用は値＝０として定義され、拮抗作用は値＜０として定義される。強調表示されるブロックによって、実験データで相乗作用が観察された組合せが特定される。
【図２】化合物Ａ１と化合物Ｂとの併用処置（最上段）、化合物Ａ１の自己交差（中段）および化合物Ｂの自己交差（最下段）による、ＬＡＮ−１ヒト神経芽細胞腫細胞の阻害に及ぼす用量効果（阻害の割合（％））を明示する、ＣＨＡＬＩＣＥマトリックスプロットを示す図である。
【図３】１５種の疾患の（ＡＬＫ変異体）および正常な（野生型）神経芽細胞腫細胞株（表２および３のデータ参照）における、薬物の組合せの相乗作用スコアを視覚的に要約したボックスプロットを示す図である。このプロットには、ＡＬＫ阻害剤（化合物Ａ１およびＡ２であるが、Ａ３ではない）から生成された相乗作用スコアを含めた。本明細書で使用される場合、ＡＬＫ阻害剤は化合物Ａ１または化合物Ａ２を指し、ＣＤＫ４／６阻害剤は化合物Ｂを指す。各ボックスは、特定の処置レジメン（ＡＬＫ×ＣＤＫ、ＡＬＫ自己交差、またはＣＤＫ自己交差）の相乗作用スコアの範囲を表し、ボックス内の白い横線は群の中央値を表し、縦の実線は群の標準偏差を表す。黒丸は異常値を表す。
【図４】「ヒットした」相乗的組合せを視覚的に特定できる散布図を示す。１５種の疾患の（ＡＬＫ変異体）および正常な（野生型）神経芽細胞腫細胞株（表２および３のデータ参照）における最大組合せ効力値を、ＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ４／６阻害剤との組合せ、ＡＬＫ阻害剤の自己交差、およびＣＤＫ４／６阻害剤の自己交差の相乗作用スコアに対してプロットした。これらのプロットでは、化合物Ａ１およびＡ２を用いて生成したデータのみプロットした。つまり、本明細書で使用される場合、ＡＬＫ阻害剤は化合物Ａ１または化合物Ａ２を指し、ＣＤＫ４／６阻害剤は化合物Ｂを指す。図４Ａは、１５種の細胞株における、２種のＡＬＫ阻害剤である化合物Ａ１およびＡ２の自己交差からのデータの散布図である。このプロットは、ＡＬＫ疾患に優先的な単剤効力を示す。図４Ｂは、ＣＤＫ阻害剤である化合物Ｂの自己交差からのデータの散布図である。このプロットは、最低限の単剤効力または相乗作用を示す。図４Ｃは、ＡＬＫ阻害剤である化合物Ａ１およびＡ２のいずれか１つと、ＣＤＫ阻害剤である化合物Ｂとの組合せからのデータの散布図である。このプロットは、４種の疾患細胞株（Ｌａｎ−５、Ｋｅｌｌｙ、Ｌａｎ−１、ＮＢ−１６４３、および２種の正常細胞株（ＮＢ−１、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ）において、相乗作用と効力の増大とを両方もたらす相互作用を示す。
【図５−１】ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組合せ指数（combination index）定理に基づく薬物の組合せのプロットの典型的な例およびそれらの解釈を示す図である。図５Ａは、一定の組合せ比についてのＦａ−ＣＩプロットである。Ｃｈｏｕによって定義されるＣＩは、以下の等式：ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２に従っており、式中、（Ｄｘ）１および（Ｄｘ）２は、個々に使用したときに所与のレベルの抗増殖効果を生じるのに必要な化合物Ｄ１およびＤ２の濃度であり、それに対して、（Ｄ）１および（Ｄ）２は、組み合わせて使用したときに同じ抗増殖効果を生じるそれらの濃度である。組合せ指数は、相加作用（ＣＩ＝１）、拮抗作用（ＣＩ＞１）、または相乗作用（ＣＩ＜１）として定義される、薬物相互作用の定量的尺度である。影響を受けた割合を意味するＦａは、所与の濃度の単独のまたは組み合わせた化合物によって影響を受けた細胞の割合として定義される。Ｆａ＝０は、用量によるＤＭＳＯ対照に基づいて求められ、Ｆａ＝１は完全応答である（生細胞が残らない）。典型的には、Ｆａ−ＣＩプロットは、本明細書で使用される場合、相乗作用を評価するために使用される。図５Ｂは、ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラムである。（Ｄ）１および（Ｄ）２はそれぞれ、薬物１および薬物２の濃度を意味する。ＥＤｘはＸ％の効果のときの用量を意味し、１００％の効果は、生細胞が残らないことを意味する。
【図５−２】ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組合せ指数（combination index）定理に基づく薬物の組合せのプロットの典型的な例およびそれらの解釈を示す図である。図５Ｃは、異なる比率で組み合わせた場合の、正規化されたアイソボログラムである。用語は、図５Ｂに定義される通りである。図５Ｄは、Ｆａ−ＤＲＩプロット（Chou and Chou, 1988; Chou and Martin, 2005）であり、図中、ＤＲＩは、用量低減指数（dose-reduction index）を意味しており、以下の等式：ＣＩ＝（Ｄ）１／Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２＝１／（ＤＲＩ）１＋１／（ＤＲＩ）２に従って、ＣＩと関係する。ＤＲＩは、相乗的な薬物を組み合わせて与えたときに、各薬物を個々に投与したときと同程度の効果を上げながら、各薬物の用量をどれほど低減させることができるかを推定する。
【図６−１】ＮＢ−１６４３細胞（疾患）における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａおよび化合物Ｂについての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（６Ａ）５０％有効プロット、（６Ｂ）用量効果曲線；ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、（６Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（６Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇＣＩプロット、（６Ｅ）標準的なアイソボログラム、ならびに（６Ｆ）控えめな（conservative）アイソボログラムを示す図である。これらのプロットを合わせると、組合せが、検査した濃度範囲にわたって相乗的であったことが明示される。
【図６−２】ＮＢ−１６４３細胞（疾患）における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａおよび化合物Ｂについての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（６Ａ）５０％有効プロット、（６Ｂ）用量効果曲線；ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、（６Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（６Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇＣＩプロット、（６Ｅ）標準的なアイソボログラム、ならびに（６Ｆ）控えめな（conservative）アイソボログラムを示す図である。これらのプロットを合わせると、組合せが、検査した濃度範囲にわたって相乗的であったことが明示される。
【図７−１】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（疾患）細胞における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａ１単独、および化合物Ｂ単独についての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（７Ａ）５０％有効プロット、（７Ｂ）用量効果曲線、（７Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（７Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇ（ＣＩ）プロット、（７Ｅ）ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、ならびに（７Ｆ）控えめなアイソボログラムを示す図である。図７Ｃから７Ｆから、組合せは、低用量では中程度に相乗的であり、高用量では相加的またはわずかに拮抗的であったことが示される。
【図７−２】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（疾患）細胞における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａ１単独、および化合物Ｂ単独についての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（７Ａ）５０％有効プロット、（７Ｂ）用量効果曲線、（７Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（７Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇ（ＣＩ）プロット、（７Ｅ）ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、ならびに（７Ｆ）控えめなアイソボログラムを示す図である。図７Ｃから７Ｆから、組合せは、低用量では中程度に相乗的であり、高用量では相加的またはわずかに拮抗的であったことが示される。
【図８−１】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅおよび８Ｆは、ＮＢ１６９１（正常）細胞における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａ、および化合物Ｂについての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（７Ａ）５０％有効プロット、（７Ｂ）用量効果曲線、（７Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（７Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇ（ＣＩ）プロット、（７Ｅ）ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、ならびに（７Ｆ）控えめなアイソボログラムを示す図である。図８Ｃ〜８Ｆから、組合せは、低用量では強力に共力的であり、より高用量では相加的であり、高用量の化合物Ａ１では拮抗的であったことが明示される。
【図８−２】図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅおよび８Ｆは、ＮＢ１６９１（正常）細胞における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａ、および化合物Ｂについての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（７Ａ）５０％有効プロット、（７Ｂ）用量効果曲線、（７Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（７Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇ（ＣＩ）プロット、（７Ｅ）ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、ならびに（７Ｆ）控えめなアイソボログラムを示す図である。図８Ｃ〜８Ｆから、組合せは、低用量では強力に共力的であり、より高用量では相加的であり、高用量の化合物Ａ１では拮抗的であったことが明示される。
【図９−１】ＥＤＣ１（正常）細胞における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａ、および化合物Ｂについての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（９Ａ）５０％有効プロット、（９Ｂ）用量効果曲線、（９Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（９Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇ（ＣＩ）プロット、（９Ｅ）ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、ならびに（９Ｆ）控えめなアイソボログラムを示す図である。図９Ｃ〜９Ｆから、組合せは、検査した濃度範囲にわたって共力的であったことが明示される。
【図９−２】ＥＤＣ１（正常）細胞における、化合物Ａ１とＢとの組合せ、化合物Ａ、および化合物Ｂについての薬物の組合せのプロットを示す図であって、（９Ａ）５０％有効プロット、（９Ｂ）用量効果曲線、（９Ｃ）Ｆａ−ＣＩプロット、（９Ｄ）Ｆａ−ｌｏｇ（ＣＩ）プロット、（９Ｅ）ＥＤ５０、ＥＤ７５、およびＥＤ９０における標準的なアイソボログラム、ならびに（９Ｆ）控えめなアイソボログラムを示す図である。図９Ｃ〜９Ｆから、組合せは、検査した濃度範囲にわたって共力的であったことが明示される。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄは、化合物Ａ１、Ｂ１または化合物Ａ１とＢとの組合せによる処置に応答するＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の形態を示す図であって、それぞれ、各化合物のＩＣ５０における、処置後７２時間のものであり、（ａ）ビヒクル、（ｂ）化合物Ａ１単独で処置されたもの、（ｃ）化合物Ｂ単独で処置されたもの、および（ｄ）化合物Ａ１とＢの組合せを用いて処置されたものを示す図である。
【図１１】図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｃは、（ａ）化合物Ａ１単独、（ｂ）化合物Ｂ単独、および（ｃ）等効力比（化合物それぞれのＩＣ５０の０、１／４、１／２、１、２、および４倍）で組み合わせた化合物Ａ１とＢとの組合せを用いた処置から７２時間後の、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）トリプレックスアッセイによって解析された、ＮＢ１６４３細胞の細胞生存率をアポトーシスと比較する図である。この結果から、薬物処置によって細胞死が増大するが、同レベルのアポトーシスが、化合物Ａ１単独で、化合物Ｂとの組合せと同様に観察されることが示される。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、（ａ）化合物Ａ１単独、（ｂ）化合物Ｂ単独、および（ｃ）等効力比で組み合わせた化合物ＡとＢとの組合せを用いた処置から７２時間後の、ＣＴＧアッセイによって解析されたＮＢ１６４３細胞の生存率を示す図である。この結果から、組合せ治療によって細胞死が増大することが確認される。
【図１３】図１３Ａ、１３Ｂおよび１３Ｃは、（ａ）化合物Ａ１単独、（ｂ）化合物Ｂ単独、および（ｃ）等効力比（化合物それぞれのＩＣ５０の０、１／４、１／２、１、２、および４倍）で組み合わせた化合物Ａ１とＢとの組合せを用いた処置から７２時間後の、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）トリプレックスアッセイによって解析された、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の細胞生存率をアポトーシスと比較する図である。この結果から、併用処置によって細胞死が増大することが示される。細胞は最大濃度で死滅するのが早くなったので、その濃度でアポトーシスを検出することができなかった。
【図１４】図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、（ａ）化合物Ａ１単独、（ｂ）化合物Ｂ単独、および（ｃ）等効力比（化合物それぞれのＩＣ５０の０、１／４、１／２、１、２、および４倍）で組み合わせた化合物Ａ１とＢとの組合せを用いた治療から７２時間後の、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）トリプレックスアッセイによって解析された、ＥＢＣ１細胞の細胞生存率をアポトーシスと比較する図である。このデータから、併用処置による細胞死またはアポトーシスの増大がほとんどまたは全くないことが示される。
【図１５】ビヒクル、ＩＣ５０用量の１／１６、１／８、１／４および４倍の化合物Ａ１、ＩＣ５０用量の１／１６、１／８、１／４および４倍の化合物Ｂ、ならびにそれぞれの化合物のＩＣ５０用量の１／１６、１／８、１／４および４倍の化合物Ａ１とＢとの組合せを用いた処置から２０時間後の、ＮＢ１６４３細胞における全部およびｐＡＬＫの発現のウエスタンブロットを示す図である。この結果から、併用処置は、ＩＣ５０用量の１／１６倍から、ＮＢ１６４３細胞におけるｐＡＬＫタンパク質の発現を大きく低減させることが示される。
【図１６】ビヒクル、ＩＣ５０用量の１／１６、１／８、１／４および４倍の化合物Ａ１、ＩＣ５０用量の１／１６、１／８、１／４および４倍の化合物Ｂ、ならびにそれぞれの化合物のＩＣ５０用量の１／１６、１／８、１／４および４倍の化合物Ａ１とＢとの組合せを用いた処置から２０時間後の、ＮＢ１６４３細胞における、全Ｒｂ、リン酸化Ｒｂ  Ｓ７８０、およびリン酸化Ｒｂ  Ｓ７９５の発現のウエスタンブロットを示す図である。この結果から、併用処置は、ＩＣ５０用量の１／１６倍から、ＮＢ１６４３細胞におけるｐＲｂの発現を低減させることが示される。この組合せは、ｐＲｂ  Ｓ７９５よりもｐＲｂ  Ｓ７８０の発現の低減に有効である。
【図１７】ビヒクル、ＩＣ５０用量の１／４、１／２、１および４倍の化合物Ａ１、ＩＣ５０用量の１／４、１／２、１および４倍の化合物Ｂ、ならびにそれぞれの化合物のＩＣ５０用量の１／４、１／２、１および４倍の化合物Ａ１とＢとの組合せを用いた処置から２０時間後の、ＮＢＥＢＣ１細胞における、ＡＬＫ、ｐＡＬＫ、全Ｒｂ、およびリン酸化Ｒｂ  Ｓ７９５の発現のウエスタンブロットを示す図である。この結果から、併用処置は、ｐＡＬＫおよびｐＲｂタンパク質の発現の低減の方により有効であることが示される。
【図１８】（１）ビヒクル対照、（２）５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１、（３）１８７．５〜２５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂ、および（４）５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１と１８７．５〜２５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂとの組合せである処置群について、ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおけるヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ異種移植片の相対腫瘍体積を経時的に示す図である。化合物Ｂの用量は２５０ｍｇ／ｋｇで開始され、５日目に１８７．５ｍｇ／ｋｇに低減された。この結果から、化合物Ａ１単独で処置しても、ビヒクル対照と比較して腫瘍増殖がわずかに遅延しただけであったことが示される。化合物Ｂ単独で処置すると、腫瘍増殖が遅くなった。併用処置によって既存の腫瘍が有効に縮小し、全腫瘍の寛解が達成された。
【図１９】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃおよび１９Ｄは、上の図１８に記載の処置群それぞれにおける個々のマウスの処置期間中（週単位）の腫瘍体積の変動を示す図である。
【図２０】上の図１８に記載の処置群それぞれにおける、処置期間（週単位）に対するマウスの生存（パーセント単位）を示す図である。７日目に４群のマウスのうち２匹が死亡し、１４日目に化合物Ｂ群のマウスが１匹死亡した。対照群および化合物Ａ１群のマウスは、それらの腫瘍の大きさのために安楽死させた。
【図２１】１６種の疾患の（ＡＬＫ変異体）および正常な（野生型）神経芽細胞腫細胞株（表１０のデータ参照）における、化合物Ａ１と化合物Ｂとの組合せ、およびそれらそれぞれの自己交差によるコンビナトリアルな薬物効果（効力対相乗作用スコア）の散布図である。相乗的組合せのヒットは、相乗作用スコア＞２と最大効力＞１００とを両方有するとして特定した（解釈については、図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃを参照されたい）。最上部のプロットは化合物Ａ１（ＡＬＫ阻害剤）の自己交差であり、ＡＬＫ疾患に優先的な単剤効力を示す。中央のプロットは化合物Ｂ（ＣＤＫ阻害剤）の自己交差であり、最低限の単剤効力または相乗作用を示す。最下部のプロットは、化合物Ａ１とＢとの組合せであり、このプロットは、２種の疾患の（ＮＢ−１６９１、Ｌａｎ−５）および１つの正常な（ＮＢ−１６９１）細胞株において、相乗作用と効力の増大とを両方もたらす相互作用を示す。
【図２２Ａ】Ｋｅｌｌｙヒト神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２２Ａは、化合物Ａ１（ＡＬＫ阻害剤）および化合物Ｂ（ＣＤＫ４／６阻害剤）での併用処置の用量効果を明示する用量マトリックスおよびアイソボログラムを示す。相乗作用スコアは１．７５と、組合せは中程度に相乗的であり、アイソボログラムは極めて強力な相互作用を示した。
【図２２Ｂ】Ｋｅｌｌｙヒト神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２２Ｂは、化合物Ａ２（ＡＬＫ阻害剤）および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する用量マトリックスおよびアイソボログラムを示す。相乗作用スコアは１．４８と、組合せは中程度に相乗的であり、アイソボログラムは極めて強力な相互作用を示した。
【図２３Ａ】ＫｅｌｌｙおよびＮＢ−１神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２３Ａは、Ｋｅｌｌｙ細胞における、化合物Ａ１（ＡＬＫ阻害剤）および化合物Ｂ（ＣＤＫ４／６阻害剤）での併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示す。計算した相乗作用スコアは２．５１であり、組合せは相乗的であった。
【図２３Ｂ】ＫｅｌｌｙおよびＮＢ−１神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２３Ｂは、Ｋｅｌｌｙ細胞に及ぼす、化合物Ａ２（ＡＬＫ阻害剤）および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示す。相乗作用スコアは２．２９であり、組合せは相乗的であった。
【図２３Ｃ】ＫｅｌｌｙおよびＮＢ−１神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２３Ｃは、ＮＢ−１ヒト神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、化合物Ａ１および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示す。この組合せは相乗的ではなかった。
【図２３Ｄ】ＫｅｌｌｙおよびＮＢ−１神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２３Ｄは、ヒトＮＢ−１神経芽細胞腫細胞の増殖に及ぼす、化合物Ａ２および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示す。この組合せは相乗的ではなかった。
【図２４Ａ】Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２４Ａは、Ｋｅｌｌｙ細胞の増殖に及ぼす、化合物Ａ１（ＡＬＫ阻害剤）および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示し、相乗作用スコアは０．８２０であった。
【図２４Ｂ】Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２４Ｂは、Ｋｅｌｌｙヒト神経芽細胞腫細胞における、化合物Ａ２（ＡＬＫ阻害剤）および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示し、相乗作用スコアは１．５２であった。
【図２４Ｃ】Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２４Ｃは、ＮＢ−１ヒト神経芽細胞腫細胞における、化合物Ａ１および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示し、この組合せは相乗的ではない。
【図２４Ｄ】Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２４Ｄは、ＮＢ−１ヒト神経芽細胞腫細胞における、化合物Ａ２および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示し、この組合せは相乗的ではない。
【図２４Ｅ】Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２４Ｅは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞における、化合物Ａ１および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示す。
【図２４Ｆ】Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における、ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果を示す図である。図２４Ｆは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙヒト神経芽細胞腫細胞における、化合物Ａ２および化合物Ｂでの併用処置の用量効果を明示する、用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ過剰マトリックスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
以下の一般的な定義は、本発明をより良く理解するために提供される。
「アルキル」は、例えばハロ置換アルキルやアルコキシのように他の基の構造要素としての部分を指し、直鎖状でも分枝状でもよい。任意に置換されているアルキル、アルケニルもしくはアルキニルは、本明細書で使用される場合、任意にハロゲン化されていてもよく（例えば、ＣＦ３）、またはＮＲ、ＯもしくはＳなどのヘテロ原子で置換されているもしくは置きかえられている１つもしくは複数の炭素を有していてもよい（例えば、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、アルキルチオール、チオアルコキシ、アルキルアミンなど）。
【００１４】
「アリール」は、炭素原子を含む単環式または縮合二環式の芳香族環を指す。「アリーレン」は、アリール基から誘導される二価のラジカルを意味する。例えば、アリール基は、フェニル、インデニル、インダニル、ナフチル、または１，２，３，４−テトラヒドロナフタレニルであってもよく、これらは、オルト、メタまたはパラ位で任意に置換されていてもよい。
【００１５】
「ヘテロアリール」は、本明細書で使用される場合、アリールについて上で定義した通りであり、この場合、環員の１つまたは複数がヘテロ原子である。ヘテロアリールの例には、ピリジル、ピラジニル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソール、イミダゾリル、ベンゾ−イミダゾリル、ピリミジニル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、チエニル、ピロリル、イソキノリニル、プリニル、チアゾリル、テトラジニル、ベンゾチアゾリル、オキサジアゾリル、ベンゾオキサジアゾリルなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
「炭素環式環」は、本明細書で使用される場合、炭素原子を含有する飽和または部分的に不飽和の、単環式、縮合二環式または架橋多環式の環を指し、これらは、例えば＝Ｏで任意に置換されていてもよい。炭素環式環の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロピレン、シクロヘキサノンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
「複素環式環」は、本明細書で使用される場合、炭素環式環について上で定義される通りであり、この場合、１つまたは複数の環炭素がヘテロ原子である。例えば、複素環式環は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、−Ｎ＝、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）、−Ｓ（Ｏ）２−、または−ＮＲ−を含有してもよく、式中、Ｒは、水素、Ｃ１〜４アルキルまたは保護基であってもよい。複素環式環の例には、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリジニル−２−オン、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニルオン（piperidinylone）、１，４−ジオキサ−８−アザ−スピロ［４．５］デカ−８−イル、１，２，３，４−テトラヒドロキノリニルなどが含まれるが、これらに限定されない。複素環式環は、本明細書で使用される場合、二環式アミンおよび二環式ジアミンを包含してもよい。
【００１８】
用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の通常２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくはさらに５％以内を意味する。あるいは、とりわけ生体系において、用語「約」は、所与の値の約１対数（すなわち、１桁分）以内、好ましくは２倍以内を意味する。
【００１９】
本明細書で使用される「未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤」は、酵素のキナーゼ活性を阻害する化合物に関する。かかる化合物は、「ＡＬＫ阻害剤」と呼ばれることになる。
【００２０】
「ＡＬＫ抵抗性腫瘍またはがん」は、以前のＡＬＫ阻害剤での治療に有利に応答しないがんまたは腫瘍、あるいはＡＬＫ阻害剤に有利に応答した後に再発または再燃するがんまたは腫瘍のいずれかを指す。がんまたは腫瘍は、治療開始時に抵抗性もしくは不応性であり得るか、治療中に抵抗性もしくは不応性になり得る。
【００２１】
「共投与する」、「共投与」または「組合せ投与」などは、選択された治療剤を単一の患者に投与することを包含することを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路によってまたは同時刻に投与されない処置レジメンを含むことを意図している。
【００２２】
「組合せ」は、組合せ投与のための、１つの単位剤形内に固定された組合せまたは固定されていない組合せ（またはキットオブパーツ）のいずれかを指し、この場合、化合物および組合せパートナー（例えば、以下に説明するような、「治療剤」、「薬剤」または「補助薬」とも呼ばれるもう１つの薬物）は、同時刻に個別に投与されても、時間間隔内に別々に投与されてもよく、とりわけこの場合、これらの時間間隔は、組合せパートナーが協同的効果、例えば相乗効果を示すことを可能にするものである。本明細書で利用される場合の用語「組合せ投与」などは、選択された組合せパートナーを、それを必要とする単一の対象（例えば患者）に投与することを包含することを意味し、薬剤が必ずしも同じ投与経路によってまたは同時刻に投与されない処置レジメンを含むことを意図している。用語「固定された組合せ」は、活性成分、例えば式Ａ１の化合物と組合せパートナーとが、単一の実体または調剤の形態で両方とも同時に患者に投与されることを意味する。用語「固定されていない組合せ」または「キットオブパーツ」は、活性成分、例えば式Ａ１の化合物と組合せパートナーとが両方とも、別々の実体として、同時に、共に、または特定の時間制限を有することなく逐次、のいずれかで患者に投与されることを意味しており、ここでは、かかる投与によって、２つの化合物は患者の体内で治療的に有効なレベルとなる。
【００２３】
「サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤」は、本明細書で定義される場合、サイクリン−ＣＤＫ複合体と相互作用してキナーゼ活性を阻止する小分子を指す。
【００２４】
「用量範囲」は、治療剤の指定量の許容される変化の上限および下限を指す。典型的には、指定された範囲内の任意の用量の治療剤を、治療を受けている患者に投与することができる。
【００２５】
組合せ療法に関する「共同的な治療有効量」は、一緒に、同時刻に個別に、または適正な時間間隔内で別々に投与されてもよい組合せパートナーそれぞれの量であって、疾患の進行を緩和する、遅延させる、または疾患の症状を抑制することを必要とする患者において、それらを行う上で、組合せパートナーが協同的に有益効果／治療効果を発揮する量を意味する。
【００２６】
「医薬として許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、哺乳動物、とりわけヒトの組織と接触させるのに適切であり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答および他の問題となる合併症を有することなく、妥当な利益／リスク比に見合うような、化合物、材料、組成物および／または剤形を指す。
【００２７】
「医薬製剤」または「医薬組成物」は、哺乳動物に影響を及ぼす特定の疾患または状態を予防する、治療するまたは制御するために、温血哺乳動物、例えばヒトに投与しようとする少なくとも１種の治療剤を含有する混合物または溶液を指す。
【００２８】
「塩」（「またはそれらの塩」または「またはその塩」が意味するもの）は、単独で、または遊離化合物、例えば式（Ｉ）の化合物との混合物で存在することができ、好ましくは医薬として許容される塩である。式（Ｉ）の化合物のかかる塩は、塩基性窒素原子を有する式（Ｉ）の化合物から、例えば、好ましくは有機または無機酸との、酸付加塩として形成される。適切な無機酸は、例えば、塩酸などのハロゲン酸、硫酸、またはリン酸である。適切な有機酸は、例えば、カルボン酸またはスルホン酸、例えば、フマル酸またはメタンスルホン酸である。単離または精製を目的として、医薬として許容されない塩、例えば、ピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。治療に使用する場合は、医薬として許容される塩または遊離化合物のみが用いられ（適用可能であれば、医薬製剤の形態で）、したがってこれらが好ましい。遊離形態の新規化合物とその塩の形態のもの（例えば新規化合物の精製または特定において中間体として使用できるその塩を含む）との関連が密接であることを考えると、前述または後述の遊離化合物へのいかなる言及も、必要に応じて適宜、対応する塩にも言及していると理解されるべきである。式（Ｉ）の化合物の塩は、好ましくは医薬として許容される塩であり、医薬として許容される塩を形成する適切な対イオンは当分野で公知である。
【００２９】
「単一医薬組成物」は、有効量の両方の治療剤を患者に送達するように製剤化された単一の担体またはビヒクルを指す。単一のビヒクルは、有効量の治療剤それぞれを、医薬として許容される任意の担体または賦形剤と共に送達するように設計される。幾つかの実施形態では、ビヒクルは、錠剤、カプセル剤、丸剤、または貼付剤である。他の実施形態では、ビヒクルは液剤または懸濁剤である。
【００３０】
「対象」、「患者」、または「温血動物」は、動物を含むことを意図している。対象の例には、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、および遺伝子導入非ヒト動物が含まれる。ある種の実施形態では、対象は、ヒト、例えば、脳腫瘍疾患に罹患しているヒト、脳腫瘍疾患に罹患するリスクのあるヒト、または潜在的に脳腫瘍疾患を罹患し得るヒトである。特に好ましくは、対象または温血動物は、ヒトである。
【００３１】
「治療的に有効な」は、好ましくは、増殖性疾患の進行に対して治療的に有効なまたはより広い意味では予防的にも有効な治療剤の量に関する。
【００３２】
「治療」には、がん性疾患または障害の予防的および治療的処置（一時的、治癒的、症状緩和、症状低減処置が含まれるが、これらに限定されない）ならびに進行の遅延が含まれる。用語「予防的」は、がんの発症または再発の防止を意味する。用語「進行の遅延」は、本明細書で使用される場合、治療しようとするがんの前段階または早期段階にあり、該当するがんの前の形態が診断されている、および／または、患者において該当するがんが発症すると見込まれる状態が診断されている、患者への組合せの投与を意味している。
【００３３】
「阻害」
【００３４】
好ましい実施形態の説明
本発明は、（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを、別々にまたは一緒に含む、組合せ医薬に関する。かかる組合せ医薬は、増殖性疾患の治療のために、同時に、別々にまたは逐次使用するためのものであり得る。
【００３５】
本発明の組合せに使用するのに適切なＡＬＫ阻害剤には、これに限定されないが、式Ａ：
【００３６】
【化１】
0006479812.tif 000002
の化合物または医薬として許容されるそれらの塩が含まれ、式中、
Ｗは、
【００３７】
【化２】
0006479812.tif 000003
であり、
Ａ１およびＡ４は独立に、ＣまたはＮであり；
Ａ２およびＡ３はそれぞれＣであり、またはＲ６とＲ７とが環を形成するときＡ２およびＡ３の一方はＮであり；
ＢおよびＣは独立に、任意に置換されている５〜７員の、炭素環式環、アリール、Ｎ、ＯもしくはＳを含有するヘテロアリールまたは複素環式環であり；
Ｚ１、Ｚ２およびＺ３は独立に、ＮＲ１１、Ｃ＝Ｏ、ＣＲ−ＯＲ、（ＣＲ２）１〜２または＝Ｃ−Ｒ１２であり；
Ｒ１およびＲ２は独立に、ハロ、ＯＲ１２、ＮＲ（Ｒ１２）、ＳＲ１２、または任意に置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルもしくはＣ２〜６アルキニルであり；あるいは、Ｒ１およびＲ２のうち一方はＨであり；
Ｒ３は、（ＣＲ２）０〜２ＳＯ２Ｒ１２、（ＣＲ２）０〜２ＳＯ２ＮＲＲ１２、（ＣＲ２）０〜２ＣＯ１〜２Ｒ１２、（ＣＲ２）０〜２ＣＯＮＲＲ１２またはシアノであり；
Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７およびＲ１０は独立に、任意に置換されている、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルもしくはＣ２〜６アルキニル；ＯＲ１２、ＮＲ（Ｒ１２）、ハロ、ニトロ、ＳＯ２Ｒ１２、（ＣＲ２）ｐＲ１３もしくはＸであり；または、Ｒ４、Ｒ７およびＲ１０は独立にＨであり；
Ｒ、Ｒ５およびＲ５’は独立に、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ８およびＲ９は独立に、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロもしくはＸ、または、Ｒ１とＲ２とが環を形成するとき、Ｒ８およびＲ９の一方はＨであり；但し、Ｒ８およびＲ９の一方はＸであり；
あるいは、Ｒ１およびＲ２、もしくはＲ６およびＲ７、Ｒ７およびＲ８、もしくはＲ９およびＲ１０は、炭素原子に結合しているとき、任意に置換されている５〜７員の、単環式もしくは縮合炭素環式環、アリール、Ｎ、Ｏおよび／もしくはＳを含むヘテロアリールもしくは複素環式環を形成してもよく；またはＲ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０は、Ｎに結合しているときは存在せず；
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、（ＣＲ２）ｐＣＯ１〜２Ｒ、（ＣＲ２）ｐＯＲ、（ＣＲ２）ｐＲ１３、（ＣＲ２）ｐＮＲＲ１２、（ＣＲ２）ｐＣＯＮＲＲ１２または（ＣＲ２）ｐＳＯ１〜２Ｒ１２であり；
Ｒ１２およびＲ１３は独立に、任意に置換されている、３〜７員の飽和もしくは部分的に不飽和の炭素環式環、またはＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む５〜７員の複素環式環；アリールもしくはヘテロアリールであり；またはＲ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルであり；
Ｘは、（ＣＲ２）ｑＹ、シアノ、ＣＯ１〜２Ｒ１２、ＣＯＮＲ（Ｒ１２）、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＮＲ（Ｒ１２）、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＯＲ１２、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＳＲ１２、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＳ（Ｏ）１〜２Ｒ１２または（ＣＲ２）１〜６ＮＲ（ＣＲ２）ｐＯＲ１２であり；
Ｙは、任意に置換されている、３〜１２員の炭素環式環、５〜１２員のアリール、またはＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む５〜１２員のヘテロアリールもしくは複素環式環であり、（ＣＲ２）ｑＹ中のｑが０のとき、前記ヘテロアリールまたは複素環式環の炭素原子を介してＡ２もしくはＡ３または両方に結合しており；
ｎ、ｐおよびｑは独立に、０〜４である。
【００３８】
式Ａの一変形では、Ｗは、
【００３９】
【化３】
0006479812.tif 000004
であり、式中、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲ１０は、上に定義した通りである。
【００４０】
別の変形では、ＡＬＫ阻害剤は、式Ａ１：
【００４１】
【化４】
0006479812.tif 000005
の化合物または医薬として許容されるそれらの塩であり、式中、
Ｒ１は、ハロまたはＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ２は、Ｈであり；
Ｒ３は、（ＣＲ２）０〜２ＳＯ２Ｒ１２であり；
Ｒ４は、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニルもしくはＣ２〜６アルキニル；ＯＲ１２、ＮＲ（Ｒ１２）、ハロ、ニトロ、ＳＯ２Ｒ１２、（ＣＲ２）ｐＲ１３もしくはＸであり；またはＲ４はＨであり；
Ｒ６は、イソプロポキシまたはメトキシであり；
Ｒ８およびＲ９の一方は（ＣＲ２）ｑＹであり、他方は、Ｃ１〜６アルキル、シアノ、Ｃ（Ｏ）Ｏ０〜１Ｒ１２、ＣＯＮＲ（Ｒ１２）またはＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＮＲ（Ｒ１２）であり；
Ｘは、（ＣＲ２）ｑＹ、シアノ、Ｃ（Ｏ）Ｏ０〜１Ｒ１２、ＣＯＮＲ（Ｒ１２）、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＮＲ（Ｒ１２）、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＯＲ１２、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＳＲ１２、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＳ（Ｏ）１〜２Ｒ１２または（ＣＲ２）１〜６ＮＲ（ＣＲ２）ｐＯＲ１２であり；
Ｙは、ピロリジニル、ピペリジニルまたはアゼチジニルであり、それらはそれぞれ炭素原子を介してフェニル環に結合しており；
Ｒ１２およびＲ１３は独立に、３〜７員の飽和もしくは部分的に不飽和の炭素環式環、またはＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む５〜７員の複素環式環；アリールもしくはヘテロアリールであり；あるいはＲ１２は、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
Ｒは、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
ｎは、０〜１である。
【００４２】
さらに別の変形では、ＡＬＫ阻害剤は、式Ａ２：
【００４３】
【化５】
0006479812.tif 000006
の化合物または医薬として許容されるそれらの塩であり、式中、
Ｒ１およびＲ２は一緒に、任意に置換されている５〜６員の、アリール、または１〜３個の窒素原子を含むヘテロアリールもしくは複素環式環を形成し；
Ｒ３は、（ＣＲ２）０〜２ＳＯ２Ｒ１２、（ＣＲ２）０〜２ＳＯ２ＮＲＲ１２、（ＣＲ２）０〜２Ｃ（Ｏ）Ｏ０〜１Ｒ１２、（ＣＲ２）０〜２ＣＯＮＲＲ１２、ＣＯ２ＮＨ２、またはシアノであり；
Ｒ、Ｒ５およびＲ５’は独立に、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり；
Ｒ６は、ハロまたはＯ（Ｃ１〜６アルキル）であり；
Ｒ８およびＲ９は独立に、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、ハロもしくはＸであり、またはＲ８およびＲ９の一方はＨであり；但し、Ｒ８およびＲ９の一方はＸであり；
Ｘは、（ＣＲ２）ｑＹ、シアノ、Ｃ（Ｏ）Ｏ０〜１Ｒ１２、ＣＯＮＲ（Ｒ１２）、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＮＲ（Ｒ１２）、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＯＲ１２、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＳＲ１２、ＣＯＮＲ（ＣＲ２）ｐＳ（Ｏ）１〜２Ｒ１２または（ＣＲ２）１〜６ＮＲ（ＣＲ２）ｐＯＲ１２であり；
Ｙは、任意に置換されている、３〜１２員の炭素環式環、５〜１２員のアリール、またはＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む５〜１２員のヘテロアリールもしくは複素環式環であり、（ＣＲ２）ｑＹ中のｑが０のとき、前記ヘテロアリールまたは複素環式環の炭素原子を介してＡ２もしくはＡ３または両方に結合しており；
Ｒ１２は、任意に置換されている３〜７員の飽和もしくは部分的に不飽和の炭素環式環、またはＮ、Ｏおよび／もしくはＳを含む５〜７員の複素環式環；アリールもしくはヘテロアリールであり；またはＲ１２は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキルであり；
ｐおよびｑは独立に、０〜４である。
【００４４】
本発明の組合せの幾つかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、以下のものまたは医薬として許容されるそれらの塩から選択される：
【００４５】
【表１】
0006479812.tif 000007
0006479812.tif 000008
【００４６】
本発明の組合せの別の実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、以下のものから選択される：
【００４７】
【表２】
0006479812.tif 000009
0006479812.tif 000010
0006479812.tif 000011
【００４８】
本発明の組合せの好ましい一実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、以下の化合物Ａ１、すなわち、５−クロロ−Ｎ２−（２−イソプロポキシ−５−メチル−４−（ピペリジン−４−イル）フェニル）−Ｎ４−［２−（プロパン−２−スルホニル）−フェニル］−ピリミジン−２，４−ジアミン：
【００４９】
【化６】
0006479812.tif 000012
または医薬として許容されるそれらの塩である。
【００５０】
別の好ましい実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、下の化合物Ａ２、すなわち、Ｎ６−（２−イソプロポキシ−５−メチル−４−（１−メチルピペリジン−４−イル）フェニル）−Ｎ４−（２−（イソプロピルスルホニル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミン：
【００５１】
【化７】
0006479812.tif 000013
または医薬として許容されるそれらの塩である。
【００５２】
さらに別の好ましい実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、下の化合物Ａ３、すなわち、クリゾチニブとして一般に知られており、商品名がＸＡＬＫＯＲＩ（登録商標）である）（Ｒ）−３−（１−（２，６−ジクロロ−３−フルオロフェニル）エトキシ）−５−（１−（ピペリジン−４−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン−２−アミン：
【００５３】
【化８】
0006479812.tif 000014
または医薬として許容されるそれらの塩である。
【００５４】
組合せの一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤である。一変形では、ＣＤＫ阻害剤はＣＤＫ４阻害剤である。別の変形では、ＣＤＫ阻害剤はＣＤＫ６阻害剤である。さらに別の変形では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の二重阻害剤である。
【００５５】
適切なＣＤＫ阻害剤には、これに限定されないが、式Ｂ：
【００５６】
【化９】
0006479812.tif 000015
の化合物または医薬として許容される塩が含まれ、式中、
Ｘは、ＣＲ９、またはＮであり；
Ｒ１は、Ｃ１〜８アルキル、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）ＯＲ４もしくはＣＯＮＲ５Ｒ６、５〜１４員のヘテロアリール基、または３〜１４員のシクロヘテロアルキル基であり；
Ｒ２は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ３〜１４シクロアルキル、または５〜１４員のヘテロアリール基であり、ここで、Ｒ２は、１つもしくは複数のＣ１〜８アルキルまたはＯＨで置換されていてもよく；
Ｌは、連結基、Ｃ１〜８アルキレン、Ｃ（Ｏ）、またはＣ（Ｏ）ＮＲ１０であり、ここでは、Ｌは、置換されていても置換されていなくてもよく；
Ｙは、Ｈ、Ｒ１１、ＮＲ１２Ｒ１３、ＯＨであり、またはＹは、以下の基の一部分であり、
【００５７】
【化１０】
0006479812.tif 000016
式中、ＹはＣＲ９またはＮであり；この場合、０〜３個のＲ８が存在してもよく、Ｒ８は、Ｃ１〜８アルキル、オキソ、ハロゲンであるか、または２つ以上のＲ８が架橋アルキル基を形成してもよく；
Ｗは、ＣＲ９またはＮであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル，Ｃ１〜８アルキルＲ１４、Ｃ３〜１４シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８ハロアルキル、Ｃ１〜８アルキルＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１４Ｒ１５、Ｃ１〜８シアノアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１４、Ｃ０〜８アルキルＣ（Ｏ）Ｃ０〜８アルキルＮＲ１４Ｒ１５、Ｃ０〜８アルキルＣ（Ｏ）ＯＲ１４、ＮＲ１４Ｒ１５、ＳＯ２Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８アルキルＣ３〜１４シクロアルキル、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜８アルキルＣ３〜１４シクロアルキル、Ｃ１〜８アルコキシ、またはＯＨであり、Ｒ３がＨではないとき、Ｒ３は、置換されていても置換されていなくてもよく；
Ｒ９は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、およびＲ１５はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ３〜１４シクロアルキル、３〜１４員のシクロヘテロアルキル基、Ｃ６〜１４アリール基、５〜１４員のヘテロアリール基、アルコキシ、Ｃ（Ｏ）Ｈ、Ｃ（Ｎ）ＯＨ、Ｃ（Ｎ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜８アルキルＮＨ２、Ｃ１〜６アルキルＯＨから選択され、ここでは、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３、Ｒ１４、およびＲ１５は、Ｈではないとき、置換されていても置換されていなくてもよく；
ｍおよびｎは独立に、０〜２であり；
ここでは、Ｌ、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３、Ｒ１４、およびＲ１５は、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ２〜８アルケニル、Ｃ２〜８アルキニル、Ｃ３〜１４シクロアルキル、５〜１４員のヘテロアリール基、Ｃ６〜１４アリール基、３〜１４員のシクロヘテロアルキル基、ＯＨ、（Ｏ）、ＣＮ、アルコキシ、ハロゲン、またはＮＨ２の１つまたは複数で置換されていてもよい。
【００５８】
一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、下の式によって記述される、化合物Ｂ１、すなわち、７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドである：
【００５９】
【化１１】
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【００６０】
本発明の組合せ医薬の特定の実施形態には、以下が含まれる：
（１）化合物Ａ１と化合物Ｂ１とを含む組合せ；
（２）化合物Ａ２と化合物Ｂ１とを含む組合せ；および
（３）化合物Ａ３と化合物Ｂ１とを含む組合せ。
【００６１】
同様に本発明の範囲内に含まれるのは、上述のような２種の別々の活性成分より多い組合せであり、すなわち、本発明の範囲内の組合せ医薬は、３種以上の活性成分を含むことが可能であろう。
【００６２】
別段の指示がない限り、化合物の構造とその化学名が一致していない場合、化合物の構造が優先される。
【００６３】
上の式（Ａ、Ａ１、Ａ２、およびＢ）の化合物、特に化合物Ａ１〜Ａ３およびＢは、その遊離塩基の形態またはその任意の塩の形態のいずれかで、本発明の組合せに組み込まれてもよい。塩は、単独で、または遊離化合物との混合物で存在することができ、好ましくは医薬として許容される塩である。化合物のかかる塩は、例えば、塩基性窒素原子と好ましくは有機または無機酸との、酸付加塩として形成される。適切な無機酸は、例えば、塩酸などのハロゲン酸、硫酸、またはリン酸である。適切な有機酸は、例えば、コハク酸、カルボン酸またはスルホン酸、例えば、フマル酸またはメタンスルホン酸である。単離または精製を目的として、医薬として許容されない塩、例えば、ピクリン酸塩または過塩素酸塩を使用することも可能である。治療に使用する場合は、医薬として許容される塩または遊離化合物のみが用いられ（適用可能であれば、医薬製剤の形態で）、したがってこれらが好ましい。
【００６４】
含まれるのは、同様に医薬として許容されるそれらの塩、対応するラセミ化合物、ジアステレオ異性体、鏡像異性体、互変異性体、ならびに、存在する場合、上に開示した化合物に対応する結晶変態、例えば、溶媒和物、水和物および多形体であり、これらはそこに開示される。本発明の組合せに活性成分として使用される化合物はそれぞれ、引用文献中に記載される通りに調製し、投与することができる。
【００６５】
薬理学および有用性
本発明の組合せの個々のパートナーは、阻害活性を有することが知られている化合物であることが留意される。今回、驚いたことに、本発明の組合せおよびそれらの医薬として許容される塩は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの無細胞キナーゼアッセイおよび細胞アッセイならびにｉｎ  ｖｉｖｏでのがんマウスモデルで検査したときに有益な協同的（例えば相乗的）治療特性を示し、したがって、増殖性疾患、特にがんの治療に役立つものとなるために、有用であることが見出された。用語「増殖性疾患」には、がん、腫瘍、過形成、再狭窄、心肥大、免疫異常および炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
一態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんの治療に使用するための、（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを、別々にまたは一緒に含む、組合せ医薬に関する。
【００６７】
別の態様では、本発明は、増殖性疾患、特にがんの治療用の医薬品を調製するための、（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤との組合せ医薬の、別々または一緒の使用を提供する。
【００６８】
一態様では、本発明はさらに、増殖性疾患の治療を必要とする対象における、増殖性疾患を治療する方法であって、（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを含む、共同的な治療有効量の組合せ医薬または医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法に関する。本発明によれば、第１の薬剤および第２の薬剤は、単一の医薬組成物で一緒に投与されても、別々の医薬組成物で個別にまたは逐次投与されても、いずれであってもよい。
【００６９】
好ましくは、本発明は、がんなどの増殖性疾患に罹患している哺乳動物、とりわけヒトを治療するのに有用である。
【００７０】
本発明の組合せで治療することができる増殖性疾患の例は、例えばがんであり、これらには、肉腫、神経芽細胞腫、リンパ腫；肺がん、気管支がん、前立腺がん、乳がん（散発性乳がん、およびカウデン病の罹患者を含む）、膵臓がん、胃腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸がん、結腸直腸腺腫、甲状腺がん、肝臓がん、肝内胆管がん、肝細胞がん、副腎がん、胃（stomach）がん、胃（gastric）がん、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮内膜がん、黒色腫、腎臓がん、腎盂がん、膀胱がん、子宮体がん、子宮頸がん、膣がん、卵巣がん、多発性骨髄腫、食道がん、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄性白血病、脳がん、脳の癌腫、口腔および咽頭がん、喉頭がん、小腸がん、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、絨毛結腸腺腫、腫瘍形成、上皮性（epithelial character）腫瘍形成、乳癌、基底細胞癌、未分化大細胞リンパ腫、非小細胞肺癌、扁平上皮細胞癌、光線性角化症、腫瘍性疾患（固形腫瘍を含む）、頸部または頭部の腫瘍、真性多血球血症、本態性血小板血症、骨髄様化生を伴う骨髄線維症、炎症性乳、ならびにワルデンシュトレーム病が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
さらなる例には、真性多血球血症、本態性血小板血症、骨髄様化生を伴う骨髄線維症、喘息、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、レフラー症候群、好酸球性肺炎、寄生虫の（特に後生動物）侵入（熱帯性好酸球増加症を含む）、気管支肺アスペルギルス症、結節性多発動脈炎（チャーグ−ストラウス症候群を含む）、好酸球性肉芽腫、薬物反応によって引き起こされる気道に影響を及ぼす好酸球関連障害、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形性紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、白斑、過敏性脈管炎、じんま疹、水疱性類天疱瘡、紅斑性狼瘡、天疱瘡、後天性表皮水疱症、自己免疫性血液障害（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、真性赤血球性貧血および特発性血小板減少性紫斑病）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーブンス−ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、歯槽骨炎、慢性過敏性肺臓炎、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎（前部および後部）、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎、循環器疾患、アテローム性動脈硬化症、高血圧、深部静脈血栓症、脳卒中、心筋梗塞、不安定狭心症、血栓塞栓症、肺塞栓症、血栓溶解疾患（thrombolytic disease）、急性動脈虚血、末梢血栓性閉塞（peripheral thrombotic occlusions）、および冠動脈疾患、再潅流障害、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症または高圧酸素誘導性網膜症（hyperbaric oxygen-induced retinopathy）、ならびに眼圧亢進または眼房水の分泌によって特徴付けられる状態、例えば緑内障が含まれる。
【００７２】
がん、腫瘍、腫瘍性疾患、肉腫、またはがんについて言及される場合、腫瘍および／または転移の場所がどこであれ、初発の臓器もしくは組織における転移および／または他のいかなる場所における転移もまた、代替的にまたは追加的に含意される。
【００７３】
本発明のＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ４／６阻害剤との組合せは、ＡＬＫ陽性のがん、すなわち、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）に仲介される／依存するがんの治療に特に有用である。本発明の組合せは、ＡＬＫ遺伝子および／またはタンパク質の過剰発現もしくは増幅および／または体細胞変異を示すがん、特に神経芽細胞腫の治療に有効であるというデータが本明細書に示される。
【００７４】
本発明のＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ４／６阻害剤との組合せは、ＡＬＫ抵抗性の腫瘍またはがんの治療にも有用であり得る。ＡＬＫ阻害剤で治療したときの腫瘍抵抗性の一機序は、ＡＬＫ遺伝子に変異が現れるためである。この機序は、クリゾチニブで治療されたＡＬＫ陽性腫瘍（ほとんどが非小細胞肺癌である）を有する患者での臨床治験で明示されている。これらの抵抗性変異の一部は、神経芽細胞腫に見出される変異に類似している。理論によって束縛されることを望むものではないが、これらの抵抗性変異によってＡＬＫが活性化して、腫瘍の増殖をさらに駆り立てていると想定される。例えば、ＡＬＫのＴ１１５１／Ｌ１１５２／Ｃ１１５６領域およびＩ１１７１／Ｆ１１７４領域の変異は、神経芽細胞腫の変異に類似している。本発明のＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ阻害剤との組合せは、増幅している変異を有する神経芽細胞腫腫瘍に有効であるため、この組合せはこれらのＡＬＫ抵抗性腫瘍に有効であると思われる。
【００７５】
したがって、一実施形態では、本発明の組合せは、ＡＬＫ遺伝子の増幅に依存する増殖性疾患の治療に有用である。別の実施形態では、本発明の組合せは、ＡＬＫ遺伝子の変異に依存する増殖性疾患の治療に有用である。さらに別の実施形態では、本発明の組合せは、ＡＬＫ遺伝子の変異および増幅に依存する増殖性疾患の治療に有用である。
【００７６】
一実施形態では、細胞増殖性疾患は、リンパ腫、骨肉腫、黒色腫、乳房の腫瘍、腎臓の腫瘍、前立腺の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、膵臓の腫瘍、神経細胞の腫瘍、肺の腫瘍、子宮の腫瘍または胃腸の腫瘍、ＡＬＫ抵抗性腫瘍、炎症性乳がん、未分化大細胞リンパ腫、非小細胞肺癌および神経芽細胞腫から選択される。
【００７７】
好ましい実施形態では、細胞増殖性疾患は未分化大細胞リンパ腫である。別の好ましい実施形態では、細胞増殖性疾患は非小細胞肺癌である。さらに別の好ましい実施形態では、細胞増殖性疾患は未分化大細胞リンパ腫である。さらに別の好ましい実施形態では、細胞増殖性疾患は神経芽細胞腫である。さらに別の好ましい実施形態では、細胞増殖性疾患はＡＬＫ抵抗性腫瘍である。
【００７８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの試験から、本発明の組合せ医薬を投与すると、症状の進行を緩和する、遅延させるまたは症状を抑制することに関して、本発明の組合せに使用される薬剤（ａ）または薬剤（ｂ）の一方だけを適用する単独療法と比較して、有益効果、例えば相乗的な治療効果をもたらすことが明示された。少量の活性成分を使用することができるという利益、例えば、投与量を少なくするおよび／または投与する頻度を少なくすることができるということは、副作用の発生率または重症度を減らし、それによって、生活の質を向上させるまたは病的状態を減少させることができると思われる。これは、治療を受けようとする患者の要望および要求に一致している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの試験の結果は、後の実施例の項で報告する。
【００７９】
本発明のＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ阻害剤との組合せが、良好な治療限界および他の利点を有する、増殖性疾患の有効な治療に特に適していることを明示するために、臨床治験を当業者に公知の方式で行うことができる。
【００８０】
適切な臨床試験は、例えば、増殖性疾患を有する患者における、非盲検、段階的用量増加試験である。かかる試験によって、特に、本発明の組合せの活性成分の共力作用が証明される。有益効果は、当業者にそれ自体公知であるこれらの試験の結果を通して直接決定することができる。かかる試験は、特に、活性成分を使用する単独療法の効果と本発明の組合せの効果とを比較するのに適している。好ましくは、薬剤（ａ）の用量を最大耐性用量に達するまで段階的に増大させ、薬剤（ｂ）を一定用量で投与する。あるいは、薬剤（ａ）を一定用量で投与し、薬剤（ｂ）の用量を段階的に増大させる。患者はそれぞれ、薬剤（ａ）の用量を毎日または間欠的に与えられる。かかる試験では、治療の効力は、例えば、１２週、１８週、または２４週後に、６週間ごとの症状スコアの評価によって決定することができる。
【００８１】
医薬組成物、投与および投与量
増殖性疾患を標的とすることまたは予防することに共同治療的に有効な分量の、本発明の組合せパートナーの薬剤（ａ）および（ｂ）それぞれを含む医薬組成物を提供することが、本発明の一目的である。
【００８２】
一態様では、本発明は、（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを別々にまたは一緒に含む組合せ医薬、および少なくとも１種の賦形剤を含む、医薬組成物に関する。ＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ阻害剤は、本発明の組合せの使用に適している。一実施形態では、本発明のかかる医薬組成物は、増殖性疾患の治療に使用するためのものである。本発明によれば、薬剤（ａ）および薬剤（ｂ）は、単一の医薬組成物で一緒に投与されても、組み合わされた１つの単位剤形もしくは２つの別々の単位剤形で別々に投与されても、または逐次投与されてもよい。単位剤形はまた、固定された組合せでもよい。
【００８３】
薬剤を別々に投与するための、または本発明による固定された組合せ（すなわち、少なくとも２種の組合せパートナー（ａ）および（ｂ）を含む単一のガレヌス製剤組成物）で投与するための医薬組成物は、それ自体公知の方式で調製されてもよく、ヒトなどの哺乳動物（温血動物）を含めた対象に経腸投与、例えば、経口または直腸投与、局所投与、および非経口投与するのに適したものであり、治療有効量の少なくとも１種の薬理学的に活性な組合せパートナーを単独で、例えば、上で示した通りに含むか、または１種もしくは複数の医薬として許容される担体もしくは希釈剤、とりわけ経腸もしくは非経口での適用に適したものと組み合わせて含む。適切な医薬組成物は、例えば、約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％の活性成分を含有する。
【００８４】
経腸または非経口投与用の組合せ療法のための医薬組成物は、例えば、糖衣錠剤、錠剤、カプセル剤、または坐剤、アンプル、注射用液剤または注射用懸濁剤などの単位剤形のものである。局所投与は、例えば皮膚または眼に投与するために、例えば、ローション、ゲル、軟膏もしくはクリームの形態、または経鼻もしくは坐剤の形態である。別段の指示がない限り、これらは、それ自体公知の方式で、例えば、従来の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥法によって調製される。複数の投与単位の投与によって必要な有効量に達することができるので、各剤形の個々の用量に含有される各薬剤の単位含有量はそれ自体で有効量を成す必要がないことが理解されよう。
【００８５】
医薬組成物は、１種または複数の医薬として許容される担体または希釈剤を含んでもよく、従来の方式で、一方または両方の組合せパートナーを医薬として許容される担体または希釈剤と混合することによって製造されてもよい。医薬として許容される希釈剤の例には、ラクトース、デキストロース、マンニトール、および／またはグリセリン、ならびに／あるいは滑沢剤および／またはポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。医薬として許容される結合剤の例には、これらに限定されないが、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、デンプン、例えば、トウモロコシ、コムギもしくはコメデンプン、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドンが含まれ、所望される場合、医薬として許容される崩壊剤には、これらに限定されないが、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム、および／または発泡性混合物、あるいは、吸着剤、色素、香味料および甘味料が含まれる。本発明の化合物を非経口で投与できる組成物の形態または輸液の形態で使用することも可能である。医薬組成物は、滅菌されてもよく、かつ／または賦形剤、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤化合物および／もしくは乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調節するための塩および／もしくは緩衝液を含んでもよい。
【００８６】
具体的には、本発明の組合せの治療有効量の組合せパートナーそれぞれは、同時にまたは逐次、いかなる順序で投与されてもよく、構成成分は、別々にまたは固定された組合せとして投与されてもよい。例えば、本発明によるがんを予防するまたは治療する方法は、（ｉ）遊離または医薬として許容される塩の形態で第１の薬剤を投与すること；および（ｉｉ）遊離または医薬として許容される塩の形態で第２の薬剤を、同時にまたは任意の順序で逐次、共同的な治療有効量で、好ましくは相乗的有効量で、例えば、本明細書に記載する量に相当する一日投与量または間欠的投与量で投与することを含んでもよい。本発明の組合せの個々の組合せパートナーは、療法の期間中に異なる時刻に別々に投与されても、分割されたもしくは単一の組合せ形態で同時に投与されてもよい。さらに、投与することという用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏで組合せパートナー自体に変わる、組合せパートナーのプロドラッグの使用も包含する。したがって、本発明は、同時または交互治療のかかるレジメンすべてを包含するとして理解されるべきであり、用語「投与すること」は、状況に応じて解釈されるべきである。
【００８７】
本発明の組合せに用いられる組合せパートナーの薬剤それぞれの有効投与量は、用いられる特定の化合物または医薬組成物、投与様式、治療されている状態、治療されている状態の重症度に応じて変わり得る。よって、本発明の組合せの投薬レジメンは、患者の種類、種、年齢、体重、性別および医学的状態；治療しようとする状態の重症度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに用いられる個々の化合物を含めた種々の因子に従って選択される。通常の技量を有する医師、臨床医または獣医師であれば、状態の進行を予防、逆転または抑止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。効力をもたらす範囲内の薬物濃度を達成する上での精度を最適にするには、標的部位に薬物が利用される動態に基づくレジメンが必要とされる。これには、薬物の分布、平衡、および排出を考慮することが含まれる。
【００８８】
本発明の目的のために、治療有効用量は一般に、単回または分割用量で受容者に投与される１日当たりの総用量となる。式（Ｉ）の化合物は、例えば、レシピエントの体重当たり約０．０５から約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくはレシピエントの体重当たり約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくはレシピエントの体重当たり約０．５から１０ｍｇ／ｋｇの１日当たりの投与量範囲で受容者に投与されてもよい。薬剤（ｂ）は、例えば、レシピエントの体重当たり約０．００１から１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくはレシピエントの体重当たり１．０から１００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくはレシピエントの体重当たり１．０から５０ｍｇ／ｋｇの１日当たりの投与量範囲で受容者に投与されてもよい。投与量単位の組成物は、日用量を構成する量の約数のような量を含有してもよい。
【００８９】
本発明のＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ阻害剤との組合せは、単独で使用することも、これらの病態に使用するための医薬として活性な少なくとも１種の他の化合物と組み合わせて使用することもできる。これらの活性化合物は、同一の医薬製剤に組み合わせることもできるし、組み合わせた製剤である「キットオブパーツ」の形態で組み合わせることもできる（組合せパートナーを個別に投薬しても、区別された量の組合せパートナーを有する異なる固定された組合せを使用してもよく、つまり、同時に投薬しても異なる時点で投薬してもよい、ということを意味する）。そのとき、キットオブパーツの構成品は、例えば、同時に投与されてもよく、または時間をずらして、すなわち、キットオブパーツの任意の構成品に対して異なる時点で、同じまたは異なる時間間隔で投与されてもよい。本発明のＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ阻害剤との組合せと組み合わせて使用するために挙げることができる化合物の非限定的な例には、細胞毒性化学療法薬、例えば、アナストロゾール、塩酸ドキソルビシン、フルタミド、デキサメタゾン、ドセタキセル、シスプラチン、パクリタキセルなどが含まれる。
【００９０】
キット
本発明はさらに、化合物Ａ１からＡ３または医薬として許容されるそれらの塩からなる群から選択される第１の化合物と、化合物Ｂまたは医薬として許容されるそれらの塩と、手引きを含む添付文書または他のラベルとを含む、増殖性疾患を治療するためのキットに関する。
【００９１】
本発明はさらに、化合物Ａ１〜Ａ３または医薬として許容されるそれらの塩から選択される第１の化合物と、手引きを含む添付文書または他のラベルとを含み、化合物Ｂまたは医薬として許容されるその塩と共投与することによって増殖性疾患を治療するためのキットに関する。
【実施例】
【００９２】
以下の実施例は、上記の発明を例示する。しかし、これらは、本発明の範囲をいかなる様にも限定することを意図するものではない。本発明の組合せ医薬の有益効果は、関連技術の当業者にそれ自体が公知の他の検査モデルによっても決定することができる。
【００９３】
実施例Ａ：Ｌｏｅｗｅ相加性モデルに基づく相乗的な組合せをハイスループットスクリーニングで特定する
薬物の組合せの相乗的相互作用は、Ｌｏｅｗｅ相加性モデルに基づいて、Ｃｈａｌｉｃｅソフトウェア［ＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ、ＭＡ］）を使用して評価した。Lehar J, Krueger AS, Avery W, et al., 2009, in Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity, Nat Biotechnol. 27:659-66を参照されたい。このソフトウェアは、２種の薬剤の組合せからの薬物処置の応答（阻害の割合（％）または細胞生存率の低減の割合（％））を、単独で作用させた薬剤の応答と、すなわち薬物それ自体との用量相加的な参照モデル（drug-with-itself dose-additive reference model）（Ｌｏｅｗｅ相加性モデル）に対して、比較する。用量相加からのずれは、「相乗作用スコア」で数値的に評価され、それによって組合せ効果の総合的な強さを定量化することができる。相乗作用スコア＞０は、相乗的な組合せを示す。強力に相乗的な組合せだけを確実に選択するために、受け入れ基準をより高いレベルに設定した。強力に相乗的な組合せは、相乗作用スコア＞２（バックグラウンド（非相乗作用）モデルの２倍の大きさが予測される相乗作用スコア）と最大効力＞１００（増殖阻害の計算から求められた、静止状態と等価な値）とを両方有するとして定義した。
【００９４】
詳細に特徴付けられた下の２０種のヒト神経芽細胞腫細胞株（表１）を、化合物Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＢで、個々におよび以下の組合せで処置した：
（１）化合物Ａ１およびＢ；
（２）化合物Ａ２およびＢ、ならびに
（３）化合物Ａ３およびＢ、
【００９５】
処置後に、各検査混合物について細胞生存率（生細胞の分量）を、アッセイの項に後述するＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって求めた。２０種の細胞株のうち１５種から高品質の一次スクリーニングデータが生成された。他の５種の細胞株は、増殖に失敗したか、ノイズが多過ぎるデータを生じたかのいずれかであったために、解析に含めなかった。処置に対する応答（細胞生存率が低減した割合（％））をＣｈａｌｉｃｅソフトウェア［ＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ、ケンブリッジ、ＭＡ］）を使用して解析した。データの評価およびグラフの生成は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌソフトウェアおよびＣｈａｌｉｃｅソフトウェアを使用して行った。
【００９６】
検査した３種の組合せについての相乗作用スコアを表２および表３にした。Ａ１とＢとの組合せについて、相乗作用は、ＬＡＮ１（Ｆ１１７４Ｌ）、ＬＡＮ５（Ｒ１２７５Ｑ）、ＮＢ−１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）、ＮＢ−ＳＤ（Ｆ１１７４Ｌ）、およびＮＢ−１６９１（野生型）細胞で観察された。この併用処置がＬＡＮ−５細胞でとりわけ相乗的であったことが留意される。Ａ２とＢとの組合せについて、相乗作用は、Ｋｅｌｌｙ（Ｆ１１７４Ｌ）、ＬＡＮ−５（Ｒ１２７５Ｑ）、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（野生型）、およびＮＢ−１６９１（野生型）で観察された。ＮＢ−１（ＡＬＫ増幅）細胞株における化合物Ａ２のそれ自体との組合せも相乗的として特定されたが、恐らくこの細胞株においてこの化合物の単剤の活性が強力であるためであろう。Ａ３とＢとの組合せについて、相乗作用は、検査したいかなる細胞株でも観察されなかった。
【００９７】
【表３】
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【００９８】
【表４】
0006479812.tif 000019
【００９９】
薬物処置の効果は、Ｃｈａｌｉｃｅマトリックスによって明示された。図２は、化合物Ａ１とＢとの組合せ（最上段）、化合物Ａの自己交差（中段）、および化合物Ｂの自己交差（最下段）によって処置されたＬＡＮ−１細胞についてのＣｈａｌｉｃｅ用量マトリックスおよびＬｏｅｗｅ（相加的）過剰阻害を示す。薬物処置によって阻害された割合（％）（細胞生存率の低減）を用量マトリックス（左）中のブロックに記録し、単剤処置は一番左の列および一番下の行に、組合せは残りの６×６の組合せブロックに記録した。用量マトリックス中のデータとＬｏｅｗｅモデルによって生成した予想阻害値との相違をＬｏｅｗｅ過剰マトリックスに報告した。この過剰阻害マトリックスにおいて、相乗作用は、値＞０（つまり、単純な相加的相互作用から予想されるものより大きい阻害）として定義される。拮抗作用は、値＜０（つまり、単純な相加的相互作用から予想されるものより大きい阻害）として定義される。薬物処置についての相乗作用スコアは、マトリックス内の６×６の組合せブロック全部を計算に入れてコンピュータ処理した。化合物Ａ１×Ｂ、化合物Ａ１×Ａ１および化合物Ｂ×Ｂについて得られたＬａｎ−１細胞における相乗作用スコアは、それぞれ、２．２６、１．０１および１．３２であった。Ａ１×Ｂの組合せは、Ｌａｎ−１細胞において相乗的であった。
【０１００】
表２および３にした相乗作用スコアの統計的変動をボックスプロット（図３）によって図示した。３種のＡＬＫ阻害剤のうち２種からのデータのみを含めた。このプロットで使用する場合、ＡＬＫ阻害剤は、化合物Ａ１または化合物Ａ２を指し、ＣＤＫ４／６阻害剤は化合物Ｂを指す。ＡＬＫ疾患細胞において、ＡＬＫ×ＣＤＫ４／６の組合せは強力に共力的であり、相乗作用スコアは２．２６、標準偏差は０．９であった。ＡＬＫ×ＡＬＫおよびＣＤＫ４／６×ＣＤＫ４／６の組合せは中程度に相乗的であり、相乗作用スコアは、それぞれ１．０１１（ｓｄ＝０．４）および１．１６（ｓｄ＝０．４３）である。ＡＬＫ正常細胞では、組合せおよび自己交差による処置は相乗的ではなく、相乗的スコアは約０．５であったが、類似した大きい標準偏差を有していた。
【０１０１】
強力な相乗的組成物を視覚的に特定するために、表２および３中のデータを散布図（図４Ａ〜Ｃ）に提示し、図中、最大組合せ効力を相乗作用スコアに対してプロットした。３種のＡＬＫ阻害剤のうち２種、すなわち化合物Ａ１およびＡ２からのデータのみを含めた。散布図において、垂直方向へのシフトは相加作用を含意し、右方向へのシフトは相乗的相互作用を含意し、対角線方向のシフトは効力が増強された相乗作用を含意する。相乗的組合せのヒットは、相乗作用スコア＞２かつ最大効力＞１００である、右上の四半分にあるものである。２種のＡＬＫ阻害剤（化合物Ａ１およびＡ２）は、ＡＬＫ正常細胞株よりＡＬＫ疾患細胞株に優先的な単剤効力を示した（図４Ａ）。ＣＤＫ阻害剤（化合物Ｂ）は、２種の疾患細胞株および１種の正常細胞株で単剤効力（＞１００）を示した（図４Ｂ）。ＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ４／６阻害剤との組合せは、検査した１５種の細胞株のうち７種において相乗作用と効力の増大とを両方をもたらす相互作用を生じた。また、それはＡＬＫ疾患細胞株に優先的である。
【０１０２】
この結果から、ＡＬＫ陽性のがん、特に神経芽細胞腫を治療するために、ＡＬＫ阻害剤とＣＤＫ阻害剤との組合せを使用することが支持される。
【０１０３】
実施例Ｂ：Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙモデルに基づくコンビナトリアルな薬物効果の決定
ＡＬＫとＣＤＫ４／６阻害剤との組合せのコンビナトリアルな薬物効果を、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの組合せ指数法（Trends Pharmacol Sci 4, 450-454）を使用し、ＣａｌｃｕＳｙｎ  ｖ２ソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ケンブリッジ、英国）を使用して定量化した。
【０１０４】
詳細に特徴付けられた４種のヒト神経芽細胞腫細胞株、ＮＢ１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）、ＳＨＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ）、ＮＢ１６９１（野生型）、およびＥＤＣ１（野生型）を試験用に選択した。一定の等効力比を使用した組合せを用いて（この場合、組合せパートナー、すなわち化合物Ａ１および化合物Ｂを、それら個々のＩＣ５０用量の４倍、２倍、１倍、１／２および１／４で組み合わせた）、および各化合物を個々に用いて、細胞株に三重で投薬した。抗増殖効果の濃度依存性を、組合せパートナー両方について、最初に単独で、次いで組み合わせて、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して測定した。それぞれの処置についてのＣＩをＣａｌｃｕＳｙｎ  ｖ２ソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ＭＯ）によってコンピュータ処理した。
【０１０５】
ＡＬＫ変異体細胞株ＮＢ１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）についてのＣＩを表５に報告する。０．９〜１．１のＣＩは相加的相互作用を示し、０．９より低い値は共力作用を示し、１．１を超える値は拮抗作用を示すことが理解される。このデータから、検査した組合せすべて（２種を除く）についてのＣＩは０．９未満であり、したがって、検査した化合物Ａと化合物Ｂとの組合せは相乗的であったことが示される。
【０１０６】
【表５】
0006479812.tif 000020
【０１０７】
ＮＢ−１６４３細胞におけるＡ１×Ｂの組合せの併用薬物効果を図６Ａ〜Ｄにプロットした。これらのプロットの解釈は、図５Ａ〜５Ｄおよび後のアッセイの項に見出すことができる。それぞれのプロットから、化合物Ａ１とＢとの組合せが、ＮＢ−１６４３細胞において相乗効果を示すことが視覚的に明示される。特に、Ｆａ−ＣＩプロット（図６ＣおよびＤ）から、ＣＩは、検査したすべての組合せについて１（相加的）よりはるかに低かったことが示される。加えて、アイソボログラムプロット（図６Ｅ）から、併用処置についてのＥＤ９０およびＥＤ７５用量は、それらのそれぞれのアイソボログラムよりはるかに低いことが示される。
【０１０８】
相乗的組合せの多くの利点のうちの１つは、使用する薬物の量を少なくして、または投薬の頻度を減らして、副作用を減少させながら同じ効力を達成できることである。用量低減指数（DRI、Chou and Chou, 1988）は、実験値または計算値から推定することができる。ＮＢ１６４３細胞について、実験値からの用量低減指数（ＤＲＩ）を表６に報告し、計算値からのものを表７に報告する。
【０１０９】
【表６】
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【０１１０】
【表７】
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【０１１１】
ＳＨＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ）細胞における化合物Ａ１とＢとの組合せの効果を表８に報告する。このデータから、この組合せは、低濃度から中濃度で中程度に相乗的であり、高濃度で拮抗的であったことが示される。
【０１１２】
【表８】
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【０１１３】
ＳＨＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ）細胞における化合物Ａ１とＢとの組合せの効果を、図７Ａ〜Ｆにプロットする。このプロットにより、この組合せは、わずかから中程度に相乗的であったことが視覚的に明示され、Ｆａ−ＣＩプロット（図７Ｃ）におけるＣＩ値は１よりわずかに低く、ＥＤ９０の濃度は、ＥＤ９０のアイソボログラムのすぐ上であった。
【０１１４】
ＮＢ１６９１（野生型）細胞における化合物Ａ１とＢとの組合せの効果を、図８Ａ〜Ｆにプロットする。Ｆａ−ＣＩプロット（図８Ｃ）から、ＣＩは、化合物濃度が低いときに１より低く、化合物濃度が高いときに１を超えていたことが示され、それにより、薬物の組合せは、低濃度範囲では相乗的であり、より高い濃度範囲では相加的またはわずかに拮抗的であったことが示唆される。この解釈はアイソボログラムプロット（図８Ｅ）によって支持され、このプロットから、ＥＤ５０およびＥＤ７５の組合せは共力的であったが、ＥＤ９０の組合せは拮抗的であったことが示される。
【０１１５】
ＮＢＥＤＣ１（野生型）細胞における化合物Ａ１とＢとの組合せの効果を、図９に報告する。このデータから、この組合せは、低濃度から中濃度で中程度に相乗的〜相乗的であり、高濃度で極めて強力に相乗的であったことが示される。
【０１１６】
【表９】
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【０１１７】
ＮＢＥＤＣ１（野生型）細胞における化合物Ａ１とＢとの組合せの効果を、図９Ａ〜Ｆにプロットする。Ｆａ−ＣＩプロット（図９Ｃ）から、ＣＩはすべて１より低かったことが示され、それによって、薬物の組合せは検査した濃度範囲にわたって相乗的であったことが示唆される。この解釈は、ＥＤ５０、ＥＤ７５およびＥＤ９０の組合せがすべて共力的であったことを示す、アイソボログラムプロット（図９Ｅ）によって支持された。
【０１１８】
上に提示したデータから、ＡＬＫ阻害剤（化合物Ａ１）とＣＤＫ阻害剤（化合物Ｂ）との組合せは、神経芽細胞腫細胞において、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの組合せ指数モデルに基づいて相乗的であったことが明示された。相乗作用は、ＡＬＫ陽性細胞株および野生型細胞株の両方に存在する。
【０１１９】
実施例Ｃ：細胞形態および細胞死に及ぼす併用処置の効果
本発明の組合せの相乗的な抗増殖効果を、光学顕微鏡法によって視覚化した。ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ）細胞を、それぞれＩＣ５０濃度である化合物Ａ１および化合物Ｂ、ならびにそれぞれそのＩＣ５０濃度である化合物Ａ１とＢとの組合せで処置した。処置から７２時間後に、処置した試料を光学顕微鏡法によって未処置の試料（ビヒクル）と比較し、顕微鏡写真に記録した（図１０Ａ〜Ｄ）。未処置の試料（図１０Ａ）と比較すると、化合物Ａ１単独で処置した試料（図１０Ｂ）は、無傷の細胞の数の有意な低減を示した。化合物Ｂ単独で処置した試料（図１０Ｃ）は、細胞数および細胞形態に最低限の効果を示す。化合物Ａ１と化合物Ｂとの組合せで処置した試料（図１０Ｄ）は、無傷の細胞をほとんど示さない。これらの顕微鏡写真から、本発明の組合せが、単一の化合物単独による処置と比較して細胞死の増大に相乗作用があることがはっきりと明示された。
【０１２０】
実施例Ｄ：細胞死に及ぼす併用処置の効果
本発明の組合せは、細胞死の増大に相乗効果を示すが、アポトーシスには示さない。本発明の組合せを用いた処置が細胞生存率およびアポトーシスに及ぼす影響を、３種のヒト神経芽細胞腫細胞株、すなわち、ＮＢ１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ）およびＥＢＣ１（野生型）で、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏトリプレックスアッセイを使用して評価した。確認するために、細胞生存率に及ぼす処置効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｒｅ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）発光細胞生存率アッセイを使用して、ＮＢ１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）でも評価した。アッセイは後述した。
【０１２１】
ＤＭＳＯビヒクルを用いて、化合物Ａ１および化合物Ｂを組合せ療法に使用するのと同用量で個々に用いて、ならびに化合物Ａ１とＢとの組合せを薬剤それぞれのＩＣ５０値の１／４、１／２、１、２および４倍という一定の等効力比で組み合わせて用いて、細胞株に三重に投薬した。化合物Ａ１および化合物ＢについてのＩＣ５０は、それぞれ２２２ｎＭおよび７４９．５ｎＭとして予め決定した。検査混合物を投薬から７２時間後までに評価し、結果を図１１Ａ〜Ｃ、１２Ａ〜Ｃ、１３Ａ〜Ｃおよび１４Ａ〜Ｃにプロットした。
【０１２２】
図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、ＮＢ１６４３細胞について、生存率およびアポトーシスに及ぼす処置の効果を示す。細胞生存率およびアポトーシスを、化合物の濃度に対する倍率での分数変化率として表した。このデータから、化合物Ａ１単独（図１１Ａ）または組合せ（図１１ｃ）は細胞死およびアポトーシスを引き起こすのに有効であり、化合物Ｂ単独は、わずかに有効でしかなかった（図１１Ｂ）ことが示される。特定の投与量で化合物Ａ１単独での応答と組み合わせた場合の応答（図１１Ｃ）とを比較すると、データから、併用処置では細胞死の有意な増大が示されるが、アポトーシスは同レベルであったことが観察された。
【０１２３】
併用処置により細胞死が増大したというこの知見は、処置したＮＢ１６４３細胞のＣＴＧアッセイによって別々に確認された。特定の投与量点で、組合せ処置（図１２Ｃ）は、単剤処置（図１２ＡおよびＢ）と比較すると、細胞死を有意に増大させる。
【０１２４】
図１３Ａ〜Ｃは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ）細胞についての処置の効果を示す。やはり、単剤処置（図１３ＡおよびＢ）と比較すると、組合せ処置（図１３Ｃ）は、細胞生存率に相乗効果を示すが、低化合物濃度では同レベルのアポトーシスを示す。濃度が高くなると細胞が早く死滅していたので、アポトーシスは検出不能であり、評価されなかったことが留意された。
【０１２５】
図１４Ａ〜Ｃは、ＥＢＣ１（野生型）細胞についての薬物処置の効果を示す。細胞を化合物Ａ１単独で処置したとき（図１４Ａ）または併用処置したとき（図１４Ｃ）に、同レベルの細胞死が観察された。ＥＢＣ１細胞については、組合せに相乗効果はなかった。
【０１２６】
この試験から、本発明の組合せ、特に化合物Ａ１と化合物Ｂとの組合せは、ＡＬＫ陽性の神経芽細胞腫細胞に相乗的な抗増殖効果を有することが明示される。本発明の組合せは、ＡＬＫ陽性の増殖性疾患、特にＡＬＫ陽性の神経芽細胞腫の治療に有用であると思われる。
【０１２７】
実施例Ｅ：併用処置はｐＡＬＫおよびｐＲｂタンパク質の発現を大幅に低減させる
ｐＡＬＫおよびｐＲｂはそれぞれ、ＡＬＫおよびＣＤＫ活性化のバイオマーカーである。網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）は、細胞周期の進行を阻害することによって過剰な細胞増殖を防止する、腫瘍抑制タンパク質である。種々の機序を通してｃｄｋ４またはｃｄｋ６を活性化することに依存する細胞増殖は、リン酸化Ｒｂタンパク質（ｐＲＢ）の増加を示すはずである。ＣＤＫを阻害すると、ｐＲｂが減少し、細胞周期が停止する。ＡＬＫを阻害すると、ＡＬＫのリン酸化の発現（ｐＡＬＫ）が低減し、ｐＡＬＫが減少すると、最終的なエンドポイントであるアポトーシスを伴い、増殖が減少する。
【０１２８】
ウエスタンブロット法を使用して、ＡＬＫ＋および野生型の神経芽細胞腫細胞における、全Ｒｂタンパク質およびリン酸化Ｒｂタンパク質の量ならびに全ＡＬＫおよびリン酸化ＡＬＫの量に及ぼす薬物処置の効果をアッセイし、これらのデータをＩＣ５０の分率で表した化合物用量と関連付けた。ＡＬＫ＋細胞株、ＮＢ１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）および野生型細胞株、ＥＢＣ１を本試験用に選択した。
【０１２９】
ＮＢ１６４３（Ｒ１２７５Ｑ）細胞を、化合物Ａ１および化合物Ｂで個々に、またそれぞれの化合物のＩＣ５０濃度の１／１６、１／８、１／４および４倍という一定の等効力比で組み合わせて処置した。化合物を含まないビヒクルで処置した試料を調製し、対照とした。細胞混合物を処置から２０時間後に解析した。
【０１３０】
ＥＢＣ１（野生型）細胞を、化合物Ａ１および化合物Ｂで個々に、またそれぞれの化合物のＩＣ５０濃度の１／４、１／２、１および４倍という一定の等効力比で組み合わせて処置した。化合物を含まないビヒクルで処置した試料を調製し、対照とした。細胞混合物を処置から７２時間後に解析した。
【０１３１】
図１５は、処置したＮＢ１６４３細胞の全ＡＬＫ（ｔＡＬＫ）およびｐＡＬＫの状態を示す。このデータから、薬剤単独あるいは組合せによる処置は、投薬範囲にわたって全ＡＬＫにほとんど効果を及ぼさないことが示される。薬剤単独あるいは組合せによる処置は、ＩＣ５０用量の１／１６倍からｐＡＬＫタンパク質の量を低減させたが、組合せによる処置の方がより顕著な低減効果を生じた。低減の程度がリン酸化の位置に依存することがさらに留意される。チロシンの１６０４番目のコドンでリン酸化されたｐＡＬＫは、チロシンの１２７８番目のコドンでリン酸化されたｐＡＬＫよりも大きい低減を示す。
【０１３２】
図１６は、処置したＮＢ１６４３細胞の全ＲｂおよびｐＲｂの状態を示す。薬剤単独あるいは２種の薬剤の組合せによる処置は、全ＲｂおよびｐＲｂタンパク質の発現を低減させた。低減は、組合せ処置からの方がより大きかった。処置の効果は、同様にリン酸化の位置に依存し、処置の効果は、ｐＲＢ  Ｓ７９５の方がｐＲｂ  Ｓ７８０より実質的に大きかった。
【０１３３】
図１７は、処置したＥＢＣ１（野生型）細胞の全ＡＬＫおよびｐＡＬＫの状態ならびに全ＲｂおよびｐＲｂの状態を示す。このブロットから、併用処置は、ｐＡＬＫおよびｐＲｂタンパク質の発現を低減させるのに有効であったことが示される。
【０１３４】
上の試験から、併用処置がｐＡＬＫおよびｐＲｂタンパク質の発現を低減させることが明確に示された。その効果は、併用処置した場合、単剤単独での処置と比較して増大した。したがって、本発明の組合せは、ＡＬＫ＋および野生型の細胞において相乗作用を示した。
【０１３５】
実施例Ｆ：併用処置はＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスにおけるヒト神経芽細胞腫腫瘍に対する治療効果を増大させた
効力の増大に関する試験を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスについて、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｆ１１７４Ｌ  ＡＬＫ変異を有する）異種移植片に対して行った。このマウスを４つの試験群に分けた：
１）  溶媒のビヒクルだけを用いて処置した対照群；
２）  化合物Ａ１だけを用いて、用量５０ｍｇ／ｋｇでの１日１回の強制経口投与によって処置した群（このマウスモデルでは効果がないことが予め示されている用量）；
３）  化合物Ｂだけを用いて、２５０ｍｇ／ｋｇで、５日目から１８７．５ｍｇ／ｋｇに減らして（毒性を低減させるため）処置した群。処置スケジュールは１日１回の強制経口投与であった、ならびに
４）  薬物の組合せを用いて処置した群（化合物Ａ１は５０ｍｇ／ｋｇであり、化合物Ｂは２５０ｍｇ／ｋｇで、５日目に１８７．５ｍｇ／ｋｇに減らした）。
【０１３６】
この試験の結果を、図１８、１９Ａ〜Ｄおよび２０に示す。
【０１３７】
化合物Ａ１と化合物Ｂとの組合せで処置された４群のマウスでは、他の群に対して腫瘍体積が実質的に低減したことが示された（図１８）。検査群中の各検査マウスの腫瘍体積を時間に対してプロットすると（図１９Ａ〜１９Ｄ）、４群（併用処置）のマウスでは腫瘍体積が時間と共に減少する一方で、他のすべての群では腫瘍体積が時間と共に増加したことが示される。図２０は、検査マウスの経時的な生存の割合（％）を示す。４群では、マウスのうち２匹が７日目に死亡し、残りは処置期間を通して生存した。３群（化合物Ｂ単独で処置された）では、マウスのうち１匹が１４日目に死亡し、残りは処置期間を通して生存した。１群および２群のマウスでは、腫瘍は大きく増殖し過ぎ、それぞれ１週半および３週目でマウスを安楽死させた。
【０１３８】
この結果から、ヒトＳＹ５Ｙ  ＮＢ異種移植片に対する組合せ療法は、各薬物単独で処置するより大きな効力を達成することが明示された。印象深いことに、このＳＹ５Ｙ異種移植モデルにおいて、ＮＢ  ＳＹ５Ｙ腫瘍（ＡＬＫ阻害剤の処置単独では応答しないことが予め示されていたもの）を有するＳＣＩＤマウスを、５０ｍｇ／ｋｇの薬理学的に適切な用量の化合物Ａ１とＢとの組合せで処置すると、定着腫瘍が縮小し、全腫瘍の寛解が達成されたのに対して、５０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ１単独で処置しても、このＳＹ５Ｙ異種移植片モデルのビヒクル対照と比較してわずかな腫瘍増殖の遅延をもたらしたに過ぎなかった。
【０１３９】
実施例Ｇ：神経芽細胞腫細胞における化合物Ａ１とＢとの強力な相乗的相互作用に関するスクリーニング
神経芽細胞腫細胞株において強力に相乗的な組成物を特定するために、化合物Ａ１とＢとの組合せを１６種の神経芽細胞腫細胞株のパネル（そのうちの１０種が活性型ＡＬＫ変異または増幅のいずれかを持っていた）（表１０）に対して検査した。アッセイの項に後述する通りに、細胞増殖が読み取れる１５３６ウェルの形式の７×７の用量マトリックスブロックを使用して、組合せを二重に検査した。化合物Ａ１およびＢをそれら自体と組み合わせて、予想される用量相加的相互作用の相乗作用評価パラメータに及ぼす、アッセイのノイズの影響を求めた。化合物を添加したときの細胞の数／生存率も同様に評価し、それらを使用して、アッセイの範囲内で観察された最大増殖阻害を、計算にＮＣＩの方法を用いて求めた。
【０１４０】
すべての相乗作用の計算は、Ｚａｌｉｃｕｓ製のＣＨＡＬＩＣＥソフトウェアパッケージを使用して行い、化合物の組合せ間の有望な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ相加性モデルに従う過剰阻害２Ｄマトリックス（Excess Inhibition 2D matrix）を使用して評価し、相乗作用スコアとして報告した（表１０）（Lehar et al）。強力に相乗的な組合せは、（１）２より大きい相乗作用スコア（バックグラウンド（非相乗作用）モデルの２倍の大きさが予測される相乗作用スコア）と（２）最大効力＞１００（増殖阻害の計算から求められた、静止状態とほぼ等価な値）との両方を有するとして特定した。評価したすべての組合せについての薬物効果を散布図（図２１）に示した。化合物Ａ１の自己交差で処置すると（最上部）、単剤効力はＡＬＫ野生型細胞株よりＡＬＫ疾患サブセットの細胞株に優先的であったことが観察された。化合物Ｂの自己交差で処理すると（中央）、検査した細胞株のいずれにも単剤効力を示さなかったことが示された。化合物Ａ１およびＢで併用処置すると（最下部）、検査した１６種の細胞株のうち３種で相乗作用と効力の増大とを両方もたらす相互作用を生じ、またＡＬＫ疾患細胞株に優先的であった。
【０１４１】
【表１０】
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【０１４２】
実施例Ｈ：Ｋｅｌｌｙ神経芽細胞腫細胞におけるＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果。
Ｋｅｌｌｙ神経芽細胞腫細胞におけるＡＬＫ阻害剤（化合物Ａ１またはＡ２）およびＣＤＫ４／６阻害剤（化合物Ｂ）での併用処置の用量効果を調査した。このアッセイは、もっと大規模なスクリーニングの一部として実行した。Ｋｅｌｌｙ細胞は、Ｎｏｖａｒｔｉｓの細胞ライブラリから入手し、化合物Ａ１とＢとの組合せおよび化合物Ａ２とＢとの組合せで処置した。このアッセイは、９×９の用量マトリックスを代わりに使用したことを除いて、アッセイの項に後述する通りであった。９×９の用量マトリックスブロックを使用して、組合せを二重に検査した。単剤は一番左の列および一番下の行に投薬し、残りの８×８の組合せブロックに３倍の段階希釈系列の化合物を投薬し、この場合、化合物Ａ１、Ａ２およびＢの原液の最高濃度はそれぞれ、１．６７ｍＭ、５ｍＭおよび５ｍＭであった。細胞阻害の読み取りは、アッセイの項に後述する通りであった。データの解析はＣｈａｌｉｃｅソフトウェアによって行い、化合物の組合せ間の有望な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ相加性モデルに従って評価した。それらを相乗作用スコアとして報告する。化合物を添加したときの細胞の数／生存率を同様に評価し、それらを使用して、アッセイの範囲内で観察された最大増殖阻害を、計算にＮＣＩの方法を用いて求めた。その結果を表１１にし、図２２Ａおよび２２Ｂに図示する。
【０１４３】
【表１１】
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【０１４４】
ＡＬＫ阻害剤のいずれか１つとＣＤＫ阻害剤との組合せは、Ｋｅｌｌｙ細胞の増殖を阻害するのに有効であり、特に高い方の化合物濃度で有効であった。相乗作用スコアは中程度であったが、アイソボログラムは極めて強い相互作用を示した。
【０１４５】
実施例Ｉ：ＫｅｌｌｙおよびＮＢ−１神経芽細胞腫細胞におけるＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果
Ｋｅｌｌｙ（ＡＬＫ＋、増幅およびＦ１１７４Ｌ）およびＮＢ−１（ＡＬＫ＋、増幅）神経芽細胞腫細胞におけるＡＬＫ阻害剤（化合物Ａ１またはＢ）およびＣＤＫ４／６阻害剤（化合物Ｂ）での併用処置の用量効果を調査した。このアッセイは、上の実施例Ｈの結果を確認するために実行した。Ｋｅｌｌｙ細胞およびＮＢ−１細胞は、Ｎｏｖａｒｔｉｓの細胞ライブラリから入手し、化合物Ａ１とＢとの組合せおよび化合物Ａ２とＢとの組合せで処置した。この実験では、９×９の用量マトリックスブロックを使用して組合せを二重に検査し、組合せブロックには３倍の段階希釈系列で投薬した。Ｋｅｌｌｙ細胞に使用した原液の最高濃度は、化合物Ａ１、Ａ２およびＢのそれぞれについて５ｍＭであった。ＮＢ−１細胞に使用した原液の最高濃度は、化合物Ａ１、Ａ２およびＢについて、それぞれ、０．５６ｍＭ、０．５６ｍＭ、および５ｍＭであった。細胞阻害の読み取りは、アッセイの項に後述する通りであった。データの解析はＣｈａｌｉｃｅソフトウェアによって行い、化合物の組合せ間の有望な相乗的相互作用はＬｏｅｗｅ相加性モデルに従って評価し、相乗作用スコアとして報告した。化合物を添加したときの細胞の数／生存率も同様に評価し、それらを使用して、アッセイの範囲内で観察された最大増殖阻害を、計算にＮＣＩの方法を用いて求めた。化合物を移す間に飛ばしたウェルがあったために、投薬しなかったブロックの結果は、相乗作用スコアおよび最大組合せ効力についてのコンピュータ処理に入力しなかった。この結果を表１２にし、処置に対する応答を図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄに図示する。
【０１４６】
【表１２】
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【０１４７】
ＡＬＫ阻害剤のいずれか１つとＣＤＫ阻害剤との組合せは、Ｋｅｌｌｙ細胞の増殖を阻害するのに有効であり、薬物相互作用は強力に相乗的であった。
【０１４８】
ＡＬＫ阻害剤のいずれか１つとＣＤＫ阻害剤との組合せはＮＢ−１細胞の増殖を阻害するのに有効ではなく、この組合せは相乗的ではなかった。
【０１４９】
実施例Ｊ：Ｋｅｌｌｙ、ＮＢ−１およびＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞におけるＡＬＫ阻害剤およびＣＤＫ４／６阻害剤での併用処置の用量効果。
Ｋｅｌｌｙ（ＡＬＫ＋、増幅およびＦ１１７４Ｌ）、ＮＢ−１（ＡＬＫ＋、増幅）においてＡＬＫ阻害剤（化合物Ａ１またはＡ２）およびＣＤＫ４／６阻害剤（化合物Ｂ）での併用処置の用量効果を決定するための実験を、様々な濃度の薬物化合物で繰り返した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞もこの実験に含まれていた。３種の細胞株はすべて、Ｎｏｖａｒｔｉｓの細胞ライブラリまたはＡＴＣＣから入手した。
【０１５０】
細胞を化合物Ａ１とＢとの組合せおよび化合物Ａ２と化合物Ｂとの組合せで処置した。この実験では、９×９の用量マトリックスブロックを使用して組合せを二重で検査し、組合せブロックには３倍の段階希釈系列で投薬した。Ｋｅｌｌｙ細胞に使用した原液の最高濃度は、化合物Ａ１、Ａ２およびＢそれぞれについて２．５ｍＭであった。ＮＢ−１細胞に使用した原液の最高濃度は、化合物Ａ１、Ａ２およびＢについて、それぞれ、０．２８ｍＭ、０．２８ｍＭ、および２．５ｍＭであった。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に使用した原液の最高濃度は、化合物Ａ１、Ａ２およびＢそれぞれについて２．５ｍＭであった。細胞阻害の読み取りは、アッセイの項に後述する通りであった。データの解析はＣｈａｌｉｃｅソフトウェアによって行い、化合物の組合せ間の有望な相乗的相互作用はＬｏｅｗｅ相加性モデルに従って評価した。それらを相乗作用スコアとして報告する。化合物を添加したときの細胞の数／生存率も同様に評価し、それらを使用して、アッセイの範囲内で観察された最大増殖阻害を、計算にＮＣＩの方法を用いて求めた。
【０１５１】
データの質の問題が観察された。Ｋｅｌｌｙ細胞におけるＡ１とＡ２の両方についての単剤の用量反応は、実施例Ｉのそれと比較したときに予想より低かった。投薬濃度の低下が低い相乗作用スコアの一因となった可能性があるが、他の要因、例えば、化合物の塩析または細胞株の不安定性が一役買った可能性も考えられる。この実験では組合せについての最大組合せ効力を求めなかった。ＫｅｌｌｙおよびＮＢ−１細胞株についての相乗作用スコアを表１３にし、処置の用量効果を図２４Ａ〜Ｄに図示する。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞株に伴うデータの質の問題はもっと深刻であり、データの解釈が困難となった（図２４Ｅおよび２４Ｆ）。この細胞株について相乗作用スコアを求めなかった。
【０１５２】
【表１３】
0006479812.tif 000028
【０１５３】
Ａ１×ＢおよびＡ２×Ｂの組合せについての相乗作用スコアは低〜中程度であり、強力に相乗的な組合せの基準（相乗作用スコア＞２）より低かった。ＡＬＫ阻害剤のいずれか１つとＣＤＫ阻害剤との組合せは、ＮＢ−１細胞では相乗的でなかった。観察されたデータの問題により、データが信頼できない場合もあり得ることが理解されるべきである。
【０１５４】
実施形態の一覧
本発明の種々の実施形態の一覧を本明細書に記載する。各実施形態に明記される特徴は、明記される他の特徴と組み合わせることができ、本発明のさらなる実施形態を提供することが理解されよう。
【０１５５】
実施形態１．この第１の実施形態では、本発明は、（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを、別々にまたは一緒に含む、組合せ医薬を提供する。
【０１５６】
実施形態２．ＡＬＫ阻害剤が下の式Ａ１：
【０１５７】
【化１２】
0006479812.tif 000029
によって表される化合物Ａ１である、実施形態１による組合せ医薬。
【０１５８】
実施形態３．ＡＬＫ阻害剤が下の式Ａ２：
【０１５９】
【化１３】
0006479812.tif 000030
によって表される化合物Ａ２である、実施形態１による組合せ医薬。
【０１６０】
実施形態４．ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤である、実施形態１から３のいずれか１つによる組合せ医薬。
【０１６１】
実施形態５．ＣＤＫ阻害剤がＣＤＫ４およびＣＤＫ６の二重阻害剤である、実施形態１から３のいずれか１つによる組合せ医薬。
【０１６２】
実施形態６．ＣＤＫ阻害剤が、下の式Ｂ１：
【０１６３】
【化１４】
0006479812.tif 000031
によって表される化合物Ｂである、実施形態１から５のいずれか１つによる組合せ医薬。
【０１６４】
実施形態７．２種の薬剤が、
化合物Ａ１および化合物Ｂ；ならびに
化合物Ａ２および化合物Ｂ
から選択される、実施形態１の組合せ医薬。
【０１６５】
実施形態８．本発明はまた、実施形態１から７のいずれか１つによる組合せ医薬、および少なくとも１種の賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
【０１６６】
実施形態９．本発明はまた、細胞増殖性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に共同的な治療有効量の実施形態１から７のいずれか１つによる組合せ医薬または実施形態８による医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１６７】
実施形態１０．第１の薬剤および第２の薬剤が、一緒に、個別に、または逐次投与される、実施形態９による方法。
【０１６８】
実施形態１１．細胞増殖性疾患がＡＬＫ陽性のがんである、実施形態９および実施形態１０による方法。
【０１６９】
実施形態１２．がんが、ＡＬＫ遺伝子の変異に依存する、実施形態１１による方法。
【０１７０】
実施形態１３．がんが、ＡＬＫ遺伝子の増幅に依存する、実施形態１１による方法。
【０１７１】
実施形態１４．がんが、リンパ腫、骨肉腫、黒色腫、乳房の腫瘍、腎臓の腫瘍、前立腺の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、膵臓の腫瘍、神経細胞の腫瘍、肺の腫瘍、子宮の腫瘍または胃腸の腫瘍、炎症性乳がん、未分化大細胞リンパ腫、非小細胞肺癌および神経芽細胞腫から選択される、実施形態１１から１３のいずれかによる方法。
【０１７２】
実施形態１５．がんが神経芽細胞腫である、実施形態１４による方法。
【０１７３】
実施形態１６．がんが未分化大細胞リンパ腫である、実施形態１４による方法。
【０１７４】
実施形態１７．がんが非小細胞肺癌である、実施形態１４による方法。
【０１７５】
実施形態１８．がんが炎症性乳がんである、実施形態１４による方法。
【０１７６】
実施形態１９．本発明はさらに、増殖性疾患を治療するための、実施形態１から７のいずれか１つによる組合せ医薬に関する。
【０１７７】
実施形態２０．本発明はさらにまた、増殖性疾患の治療用の医薬品を調製するための、実施形態１から７のいずれか１つによる組合せ医薬または実施形態９の医薬組成物の使用に関する。
【０１７８】
実施形態２１．本発明はさらにまた、増殖性疾患を治療するための、実施形態１から７のいずれか１つによる組合せ医薬または実施形態８による医薬組成物および使用法を説明する添付文書またはラベルを含むキットに関する。
【０１７９】
アッセイ
ＡＬＫおよびＣＤＫ阻害剤の調製
本明細書に開示する化合物は、当業者であれば慣例的な化学によって合成することができる。
【０１８０】
化合物Ａ１である、５−クロロ−Ｎ２−（２−イソプロポキシ−５−メチル−４−（ピペリジン−４−イル）フェニル）−Ｎ４−［２−（プロパン−２−スルホニル）−フェニル］−ピリミジン−２，４−ジアミンは、ＷＯ２０１０／０２０６７５の実施例６６として詳細に開示されており、そこに記載される合成手順によって調製した。
【０１８１】
化合物Ａ２である、Ｎ６−（２−イソプロポキシ−５−メチル−４−（１−メチルピペリジン−４−イル）フェニル）−Ｎ４−（２−（イソプロピルスルホニル）フェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４，６−ジアミンは、ＷＯ２０１０／０２０６７５の実施例２３１として詳細に開示されており、そこに記載される合成手順によって調製した。
【０１８２】
化合物Ａ３は、クリゾチニブ、商品名ＸＡＬＫＯＲＩ（登録商標）として一般に知られ、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｃｏｒｐ．によって販売され、商業的に入手できる。
【０１８３】
化合物Ｂである、７−シクロペンチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（５−（ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドは、ＷＯ２０１０／０２０６７５の実施例７４として開示されており、そこに記載される合成手順によって調製した。
【０１８４】
細胞株および細胞培養
この研究で利用される細胞株は、ヒト神経芽細胞腫由来であり、Ｎｏｖａｒｔｉｓ内部の細胞ライブラリ、ＡＴＣＣおよび／またはＴｈｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＣＨｏＰ）内のＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ＣＨｏＰ細胞株は、定期的にマイコプラズマ感染について検査するだけでなく、遺伝子型の同定も行って（ＡｍｐＦＬＳＴＲ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒキット、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、完全性を保証し、クロス汚染から保護した。加えて、細胞株は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＨ５５０  ＳＮＰチップで決定したゲノムワイドなＤＮＡコピー数状態、およびＩｌｌｕｍｉｎａ発現チップで決定したゲノムワイドなエキソンレベルの遺伝子発現を有していた。細胞株は、当技術分野で公知の推奨培地条件に従って維持することができる（例えば、Thiele, C. J. Neuroblastoma: in (Ed.) Masters, J. Human Cell Culture．Lancaster, UK: Kluwer Academic Publishers. 1998, Vol 1, p. 21-53）。具体的には、細胞は、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有する１０％ウシ胎児血清、および１％Ｌ−グルタミンを有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃および５％ＣＯ２で維持することができる。あるいは、細胞は凍結保存し、使用前に戻してもよい。
【０１８５】
細胞株は、一次組織におけるＡＬＫの標的状態、すなわち、ＡＬＫ変異陽性の状態、ＡＬＫ変異陰性であるが野生型ＡＬＫのゲノムが増幅および過剰発現した状態、ならびにＡＬＫ変異陰性でありコピー数が正常である状態、を等しく代表するように選択した。ＡＬＫ変異陽性であった細胞株は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）のチロシンキナーゼドメインに３つの独特な変異を示す。サンガー法シークエンシングでのエクソームシークエンシングによって、変異がＡＬＫチロシンキナーゼドメインにあったことが確認された。さらに、細胞株をそれらのＭｙｃＮ、ＴＰ５３、ＡＬＫ、ＴｒｋＡおよびＴｒｋＢの状態について特徴付けた。その結果を下の表１に要約する。
【０１８６】
【表１４】
0006479812.tif 000032
【０１８７】
本発明の組合せを検査するのに適した神経芽細胞腫細胞株が他にも存在することが理解される。これらの細胞株についての情報は、Thiele CJ.; Neuroblastoma: In (Ed.) Masters, J. Human Cell Culture. Lancaster, UK: Kluwer Academic Publishers. 1998, Vol 1, p 21-53から入手することができる。
【０１８８】
細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（ＣＴＧ）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって求めた。ＣＴＧ試薬を検査化合物で処置した細胞に添加し、生じた発光をプレートリーダー（例えば、Ｖｉｅｗｌｕｘ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。発光シグナル値（応答）の低減および増大を未処置（対照）細胞に対して計算した。計算したシグナル値は細胞生存率に比例する。
【０１８９】
Ｌｏｅｗｅ相加性モデルに基づいたハイスループット（high-through）スクリーニングにおける相乗的な治療的組合せの特定
相乗的な組合せをＬｏｅｗｅ相加性モデルに基づいて特定した。細胞生存率に及ぼす薬物の組合せの効果を測定するために、上の表１に列挙した２０種の細胞株からの細胞を、１５３６ウェルのアッセイプレート中にウェル当たり最終容積７μＬ中細胞３００個の密度で播種し、ＲＨ９５％およびＣＯ２５％のＧＮＦ  Ｓｙｓｔｅｍｓインキュベーター中で、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１９０】
検査化合物についての６点の用量反応曲線を、３８４ウェルのＥＣＨＯ互換性ソースプレート（Ｌａｂｃｙｔｅ  Ｐ−０５５２５）中で３倍の段階希釈系列を用いて調製した。例えば、６点の用量反応曲線で最高化合物濃度が５ｍＭである場合、ソースウェルの化合物の濃度は、５ｍＭ、１．６７ｍＭ、０．５６ｍＭ、０．１９ｍＭ、０．０６ｍＭおよび０．０２ｍＭであった。
【０１９１】
プレーティングからおよそ１８時間後に、細胞株ごとにレプリカプレートを有するＡＣＰ−１システムに組み込まれたＬａｂｃｙｔｅ  ＥＣＨＯ５５５を使用して、予め希釈されたソースプレートから７．５ｎＬの化合物を移すことによって、化合物の組合せをその場で生成した。ウェル当たりの最終ＤＭＳＯ濃度は０．２％であった。ウェル中の総容積は７μＬであったことが留意される。
【０１９２】
すべての組合せの抗増殖作用を偏りのない方式で評価すると共に、可能な濃度すべてで相乗効果を特定するために、段階希釈した検査薬剤６つ（または８つ）の可能な順列すべてを利用する、７×７のマトリックス（初期実験では９×９）のウェル（ブロック）に投薬した。２種の薬剤を、組合せブロックの第１列（左側）および第１行（最下部）の最初の６つのウェルに個別に投薬することによって、単剤の曲線を作成した。各ウェルには７．５ｎＬの検査化合物および７．５ｎＬのＤＭＳＯを与え、化合物濃度を左手下側角に向って徐々に下げた。化合物を与えなかった、第１列と第１行が交差するところにあるウェルには２×７．５ｎＬのＤＭＳＯを投薬し、対照とした。２種の化合物をそれらの全投与量範囲にわたって７．５ｎＬずつ各ウェルに投薬し、同様に左下角に向って徐々に化合物濃度を下げることによって、組合せの曲線を作成した。
【０１９３】
化合物を添加した後で、プレートをインキュベーターに１２０時間戻した。ＡＣＰ−１システムのＧＮＦ  Ｂｏｔｔｌｅ  Ｖａｌｖｅ分注器の１つを使用してＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７５７３）を添加することで、細胞の生存率に及ぼす組合せの効果を評価した。次いでプレートを室温で１０分間インキュベートし、組み込まれたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｅｗｌｕｘ（２秒露光、２×ビニング、高感度）で読み取った。各プレート内のＤＭＳＯ処置細胞である対照ウェルを使用して、生データを正規化した。化合物を添加したときの細胞の数／生存率も同様に評価し、それらを使用して、アッセイの範囲内で観察された最大増殖阻害を、計算にＮＣＩの方法を用いて求めた。Boyd, M. R.; Paull, K. D.; Rubinstein, L. R. In Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development; Vleriote, F. A.; Corbett, T. H.; Baker, L. H., Eds.; Kluwer Academic: Hingham, MA, 1992; pp 11-34, and Monks, A.; Scudiero, D. A.; Skehan, P.; Shoemaker, R. H.; Paull, K. D.; Vistica, D. T.; Hose, C.; Langley, J.; Cronice, P.; Vaigro-Wolf, M.; Gray-Goodrich, M.; Campbell, H.; Mayo, M. R. JNCI, J. Natl. Cancer Inst. 1991, 83, 757-766を参照されたい。
【０１９４】
すべての相乗作用の計算は、Ｚａｌｉｃｕｓ製のＣＨＡＬＩＣＥソフトウェアを使用して行った。Lehar J, Krueger AS, Avery W, et al., 2009, in Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity, Nat Biotechnol. 27:659-66を参照されたい。化合物の組合せ間の有望な相乗的相互作用をＬｏｅｗｅ相加性モデルに従う過剰阻害２Ｄマトリックスを使用して評価した。それらを相乗作用スコアとして報告する。
【０１９５】
化合物をそれら自体で組み合わせて、予想される用量相加的相互作用の相乗作用評価パラメータに及ぼす、アッセイのノイズの影響を求めた。相乗的組合せのヒット（強力に相乗的）は、相乗作用スコア＞２（バックグラウンド（非相乗作用）モデルの２倍の大きさが予測される相乗作用スコア）と最大効力＞１００（増殖阻害の計算から求められた、静止状態と等価な値）とを両方を有するとして特定した。
【０１９６】
相乗的相互作用は、ＣＨＡＬＩＣＥソフトウェアの２Ｄマトリックスの出力から視覚的に評価することができる。図１は、仮想の増殖阻害実験の２Ｄマトリックスプロットを示す。用量マトリックスプロット（左）は、Ｃｈａｌｉｃｅが表示する実験データであり、図中、単剤の用量反応曲線が一番左の列および一番下の行に示され、組合せブロックの右上の角が各薬剤の最高濃度を表している。Ｌｏｅｗｅ過剰阻害プロット（右）は、単剤の曲線から生成されたＬｏｅｗｅモデルに対する上の実験データの比較を表す。用量相加的モデルは、組合せマトリックス中の各ブロックについて予想阻害値を計算する。過剰阻害プロットにおいて、相乗作用は値＞０（つまり、阻害は単純な相加的相互作用から予想されるものより大きい阻害）として定義される。拮抗作用は値＜０（つまり、単純な相加的相互作用から予想されるものより小さい阻害）として定義される。
【０１９７】
薬物組合せ試験からのデータの視覚的表現の他の一般的な代替手段には、ブロックプロット（図３）および散布図（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）が含まれる。ボックスプロットは、処置レジメンの相乗作用スコアを比較するために使用した。散布図は、化合物間の相互作用の傾向を視覚化し、強力に相乗的な相互作用を特定するために使用した。
【０１９８】
Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの組合せ指数定理に基づく組合せの薬物効果の決定
細胞培養
この実験で使用する神経芽細胞腫細胞株については、上の細胞培養の項および表１に記載した。具体的には、細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有する１０％ウシ胎児血清、および１％Ｌ−グルタミンを有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
【０１９９】
化合物Ａ１および化合物Ｂ単独療法を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖のＩＣ５０
「セルインデックス」を測定する、リアルタイムで細胞を電気的に検知する９６ウェルのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（ＡＣＥＡ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて、５種の神経芽細胞腫細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害活性を求めた。セルインデックスは、基質接着性の増殖を測定するための生体適合性マイクロ電極表面と細胞とが各ウェル内で相互作用したときの電気インピーダンスの変化から誘導される。増殖動態に応じて、ウェル当たり以下の細胞密度で播いた：ＮＢ１６４３：２０，０００；ＳＨＳＹ５Ｙ：６，０００；ＳＫＢＥ２Ｃ：１０，０００；ＮＢＥＢＣ１：１１，０００；ＮＢ１６９１：３０，０００。２４時間後、播いた細胞を、それぞれ示した通りの用量の検査化合物またはＤＭＳＯビヒクル対照で三重に処置した。化合物Ａ１はウェル当たり１ｎＭから１０，０００ｎＭで投薬し、一方、化合物Ｂは、ウェル当たり０．６ｎＭから６，０００ｎＭまたは１ｎＭから１０，０００ｎＭで投薬した。薬物暴露から７２時間後に、セルインデックスを記録した。
【０２００】
ＩＣ５０は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０の４パラメータ可変傾斜フィッティングを使用して計算した。選択した細胞株における化合物Ａ１および化合物ＢのＩＣ５０を下の表４に要約する。これらの値は、以下の組合せ試験の投薬に使用した。
【０２０１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物組合せ試験
薬物の組合せ効果および相乗作用の定量化を、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの組合せ指数法（Trends Pharmacol Sci 4, 450-454）およびＣａｌｃｕＳｙｎ  ｖ２ソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ＭＯ）を使用して、４種の神経芽細胞腫細胞株で求めた。細胞を播き、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖を、上述の通りにｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムを使用して測定した。一定の等効力の薬物の組合せを用いて（この場合、２種の薬剤、例えば、化合物Ａ１および化合物Ｂを、それらの個々のＩＣ５０用量の４倍、２倍、１倍、１／２および１／４で組み合わせた）、また各薬剤を個々に用いて、細胞に三重で投薬した。
【０２０２】
個々の薬剤それぞれの抗増殖力を、５０％有効量、Ｄｍによって推定した。Ｄｍは５０％有効となる化合物濃度であり、「５０％有効プロット」でｘ切片として定義され、ここでは、以下の定義に従い、ｘ＝ｌｏｇ（Ｄ）およびｙ＝ｌｏｇ（ｆａ／ｆｕ）である：
Ｄ：薬物の用量；
Ｆａ：所与の濃度の単独のまたは組み合わせた化合物によって影響を受けた細胞の割合として定義される、影響を受けた割合。Ｆａ＝０は、用量によるＤＭＳＯ対照に基づいて決定され、Ｆａ＝１は、完全応答である（生細胞が残らない）；
Ｆｕ：用量によって影響を受けなかった割合であり、ここでは、ｆｕ＝１−ｆａである。
【０２０３】
選択した細胞株における化合物Ａ１および化合物ＢのＤｍを下の表４に要約する。
【０２０４】
【表１５】
0006479812.tif 000033
【０２０５】
組合せ薬物の効果を、Ｃｈｏｕによって以下の等式に従って定義される組合せ指数（ＣＩ）を利用して求めた：
ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／（Ｄｘ）２
式中、（Ｄｘ）１および（Ｄｘ）２は、個々に使用したときに所与のレベルの抗増殖効果を生じるのに必要な化合物Ｄ１およびＤ２の濃度であり、それに対して、（Ｄ）１および（Ｄ）２は、組み合わせて使用したときに同じ抗増殖効果を生じるそれらの濃度である。組合せ指数は、相加作用（ＣＩ＝１）、拮抗作用（ＣＩ＞１）、または相乗作用（ＣＩ＜１）として定義される、薬物相互作用の定量的尺度である。典型的には、ＣＩの範囲は、本明細書で使用される場合、相乗作用を評価するために使用される。０．９〜１．１の組合せ指数は相加的相互作用を示し、０．９より低い値は共力作用を示し、１．１を超える値は拮抗作用を示す。以下は、ＣＩの範囲の説明である：
＜０．１＋＋＋＋＋極めて強力な共力作用
０．１〜０．３＋＋＋＋強力な共力作用
０．３〜０．７＋＋＋共力作用
０．７〜０．８５＋＋中程度の共力作用
０．８５〜０．９０＋わずかな共力作用
０．９０〜１．１０±ほぼ相加的
１．１０〜１．２０−わずかな拮抗作用
１．２０〜１．４５−−中程度の拮抗作用
【０２０６】
組合せ指数は、用量低減指数（ＤＲＩ）（Chou and Chou, 1988）を評価するために使用し、ここでは：
ＣＩ＝（Ｄ）１／（Ｄｘ）１＋（Ｄ）２／Ｄｘ）２＝１／（ＤＲＩ）１＋１／（ＤＲＩ）２
【０２０７】
ＤＲＩは、相乗的な薬物を組み合わせて与えたときに、各薬物を個々に投与したときと同じ効果サイズを達成しつつ各薬物の用量をどれほど低減させることができるかを推定する。
【０２０８】
薬物の組合せ効果は、図示することができる。ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組合せ指数定理に基づく薬物の組合せのプロットの典型的な例には、（ａ）「Ｆａ−ＣＩプロット」、（ｂ）標準的なアイソボログラム；（ｃ）組合せ比が異なる組合せのための、正規化されたアイソボログラム、および（ｄ）Ｆａ−ＰＲＩプロット（Chou and Martin, 2005）が含まれる。種々のプロットの解釈は、図５Ａ〜Ｄに要約する。相乗効果を評価するためには、Ｆａ−Ｃｌプロットおよびアイソボログラムプロットの方が妥当である。
【０２０９】
Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７アッセイによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存率およびアポトーシス
ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏトリプレックスアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＡ）を３種の神経芽細胞腫細胞株で使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存率およびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７を同時にアッセイした。２４時間の時点で、ＤＭＳＯビヒクルを用いて、化合物Ａ１もしくは化合物Ｂを組合せ療法に使用するのと同用量で個々に用いて、または示した用量での一定の等効力比の組合せを用いて、細胞を三重に処置した。薬物暴露から７２時間後に、蛍光発生基質ＧＦ−ＡＦＣを添加した。検査混合物を１０分間インキュベートして、ＡＦＣの蛍光を励起３８０〜４００ｎｍおよび発光５０５ｎｍで測定した。ＧＦ−ＡＦＣはプロテアーゼによって切断された後に蛍光発光するが、プロテアーゼは細胞内であるときは活性であり、細胞膜の完全性が損なわれているときは不活性であるために、ＧＦ−ＡＦＣの蛍光は細胞生存率と相関する。
【０２１０】
生細胞の蛍光を測定した後に、発光原のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７基質およびルシフェラーゼを同じウェルに添加した。３０分のインキュベーション期間後に発光を測定した。ルシフェリンはカスパーゼ−３／７によって基質が切断された後に放出されるので、発光シグナルはカスパーゼ活性に比例する。
【０２１１】
ウエスタンブロット
各細胞株を信頼度が７０から８０％になるまで増殖させ、示した通りに、化合物Ａ１、化合物Ｂを用いて、または等効力比で組み合わせて用いて、２０時間または７２時間処置した。氷冷のリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、細胞全体のタンパク質ライセートを、ＡＬＫ、１：１０００；ｐＡＬＫ  Ｔｙｒ１６０４、１：１０００；ｐＡＬＫ  Ｔｙｒ１２７８、１：２０００；ＲＢ、１：２０００；ｐＲＢＳ７８０、１：２０００；ｐＲＢＳ７９５、１：２０００；サイクリンＤ１、１：１０００；サイクリンＤ３、１：１０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ＣＤＫ４、１：２０００；およびＣＤＫ６、１：３０００；（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に対する抗体で免疫ブロットすることによって、記載の通りに解析した（Mosse, et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gent, 2008, Nature Vol 455）。
【０２１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖阻害
雌のＣＢ１７  ｓｃｉｄマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）を使用して、皮下に移植した神経芽細胞腫腫瘍を増殖させた。腫瘍径を電子キャリパーで週に２回測定し、腫瘍体積を楕円形の式、（ｐ／６）×ｄ３（式中、ｄは平均径を表す）を用いて計算した。腫瘍体積が２００ｍｍ３を超えたら、ビヒクル、化合物Ａ１（用量当たり５０ｍｇ／ｋｇ）、化合物Ｂ（用量当たり１５０ｍｇ／ｋｇ）、または組み合わせた化合物Ａ１（用量当たり５０ｍｇ／ｋｇ）および化合物Ｂ（用量当たり１５０ｍｇ／ｋｇ）を強制経口投与によって毎日７週間与えられるように、マウスを無作為に割り付けた（ｎ＝群当たり１０）。マウスは、腫瘍体積が３０００ｍｍ３を超えたときまたは７週目の試験終結時に安楽死させた。混合効果線形モデルを使用して、腫瘍サイズに関して登録時に制御して、処置群とビヒクル群の間の経時的な腫瘍体積を評価した。無再発生存確率をカプラン−マイヤー法を使用して推定し、生存曲線をログランク検定（ＳＡＳ  ９．３およびＳｔａｔａ  １２．１）を使用して比較した。イベントは腫瘍体積≧３０００ｍｍ３となる時間として定義し、また７週後の腫瘍体積は除外した。マウスは、本発明者らの動物実験委員会によって認可されるプロトコルおよび条件の下で維持した。
本発明は、以下の態様を含む。
［１］
（ａ）未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第１の薬剤と、（ｂ）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤または医薬として許容されるその塩である第２の薬剤とを、別々にまたは一緒に含む、組合せ医薬。
［２］
前記ＡＬＫ阻害剤が、下の式Ａ１：
【化１５】
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によって表される化合物Ａ１である、［１］に記載の組合せ医薬。
［３］
前記ＡＬＫ阻害剤が、下の式Ａ２：
【化１６】
0006479812.tif 000035
によって表される化合物Ａ２である、［１］に記載の組合せ医薬。
［４］
前記ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ４阻害剤またはＣＤＫ６阻害剤である、［１］から［３］のいずれかに記載の組合せ医薬。
［５］
前記ＣＤＫ阻害剤が、ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の二重阻害剤である、［１］から［３］のいずれかに記載の組合せ医薬。
［６］
前記ＣＤＫ阻害剤が、下の式Ｂ：
【化１７】
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によって表される化合物Ｂである、［１］から［５］のいずれかに記載の組合せ医薬。
［７］
前記２種の薬剤が、
（ａ）化合物Ａ１および化合物Ｂ；ならびに
（ｂ）化合物Ａ２および化合物Ｂ
から選択される、［１］に記載の組合せ医薬。
［８］
［１］から［７］のいずれかに記載の組合せ医薬、および少なくとも１種の賦形剤を含む、医薬組成物。
［９］
細胞増殖性疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に共同的な治療有効量の［１］から［７］のいずれかに記載の組合せ医薬または［８］に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
［１０］
前記第１の薬剤および前記第２の薬剤が、一緒に、個別に、または逐次投与される、［９］に記載の方法。
［１１］
前記細胞増殖性疾患がＡＬＫ陽性のがんである、［９］および［１０］に記載の方法。
［１２］
前記がんが、ＡＬＫ遺伝子の変異に依存する、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記がんが、ＡＬＫ遺伝子の増幅に依存する、［１１］に記載の方法。
［１４］
前記がんが、リンパ腫、骨肉腫、黒色腫、乳房の腫瘍、腎臓の腫瘍、前立腺の腫瘍、結腸直腸の腫瘍、甲状腺の腫瘍、卵巣の腫瘍、膵臓の腫瘍、神経細胞の腫瘍、肺の腫瘍、子宮の腫瘍または胃腸の腫瘍、炎症性乳がん、未分化大細胞リンパ腫、非小細胞肺癌および神経芽細胞腫から選択される、［１１］から［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］
前記がんが神経芽細胞腫である、［１４］に記載の方法。
［１６］
前記がんが未分化大細胞リンパ腫である、［１４］に記載の方法。
［１７］
前記がんが非小細胞肺癌である、［１４］に記載の方法。
［１８］
前記がんが炎症性乳がんである、［１４］に記載の方法。
［１９］
増殖性疾患を治療するための、［１］から［７］のいずれかに記載の組合せ医薬。
［２０］
増殖性疾患の治療用の医薬品を調製するための、［１］から［７］のいずれかに記載の組合せ医薬または［９］の医薬組成物の使用。
［２１］
増殖性疾患を治療するための、［１］から［７］のいずれかに記載の組合せ医薬または［８］に記載の医薬組成物、および使用法を説明する添付文書またはラベルを含むキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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