(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未修飾アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）タンパク質またはその触媒活性部分のアミノ酸の配列において修飾を含む、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分であって、
ａ）触媒活性部分が、配列番号５に記載するアミノ酸の配列の残基７７〜４７３に相当するＡＤＡドメインを含み；
ｂ）未修飾ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が、
ｉ）配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５および３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、もしくはその触媒活性部分；
ｉｉ）推定受容体結合（ＰＲＢ）ドメインの全てもしくは一部の欠如を有する、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５および３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、もしくはその触媒活性部分、ここで、ＰＲＢドメインは配列番号５の残基９８〜１５６に相当する残基からなる；または
ｉｉｉ）ＰＲＢドメインの全てもしくは一部の欠如を有しその代わりにリンカーを有する、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５および３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、もしくはその触媒活性部分、ここで、ＰＲＢドメインは配列番号５の残基９８〜１５６に相当する残基からなり、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）または（Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝２〜２０）である；
中から選択され、
ｃ）変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が、未修飾ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分と比較して、ＰＲＢドメインの全てもしくは一部の欠如に加えて、最大２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を有し；
ｄ）アミノ酸修飾がアミノ酸置き換え、欠失および挿入の中から選択され；
ｅ）変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９Ｎ、Ｓ２６２ＭおよびＳ２６２Ｎに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸残基２１９および２６２に相当する位置の一方または両方でアミノ酸置き換えを含み；
ｆ）変異型ＡＤＡ２タンパク質が二量体形態である場合、配列番号５の未修飾ＡＤＡ２タンパク質の二量体形態またはその触媒活性部分の二量体形態と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増加を示し；
ｇ）アデノシンデアミナーゼ活性が、アデノシンのイノシンへの変換の触媒作用である、
変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項２】
Ｒ２１９またはＳ２６２、またはＲ２１９およびＳ２６２での置き換えに加えて、アミノ酸修飾が、未修飾ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増加、ヘパリン結合の低減、より長い血清半減期、ｐＨ最適条件の変更、熱安定性の増加、受容体結合の変更、またはグリコシル化部位の導入を与え、
アデノシンデアミナーゼ活性の増加を与える置き換えが、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ｅ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、およびＲ２０Ａ／Ｋ３７１Ａの中から選択され；
ヘパリン結合の低減を与える置き換えが、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２０Ｅ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２０Ｅ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、およびＲ２０Ｅ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅの中から選択され；
より長い血清半減期を与える置き換えが、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２０ＥおよびＫ３７１Ｄの中から選択され；
ｐＨ最適条件の変更を与える置き換えが、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ、Ｓ２６２Ｎ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２０Ｅ／Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２０Ｅ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２０Ｅ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２０Ｅ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２０Ｅ／Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２０Ｅ／Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２０Ｅ／Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２０Ｅ／Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、およびＲ２０Ｅ／Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄの中から選択され；
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、置き換えＫ３７１Ｅが、熱安定性の増加を与え；
受容体結合の変更を与える置き換えが、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ２２４Ｎ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｐ１２４Ａ、およびＰ１２４Ｓの中から選択され；
グリコシル化部位の導入を与えるアミノ酸修飾が、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５Ｓ、Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ、Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、およびＰ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓの中から選択される、
請求項１に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項３】
未修飾ＡＤＡ２タンパク質がホモ二量体であり、単量体形態が配列番号５に記載するアミノ酸残基の配列を含む、請求項１または２に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項４】
未修飾ＡＤＡ２タンパク質が配列が配列番号５に記載されるポリペプチドの相当する触媒活性部分のホモ二量体であり、相当する部分がアラインメントにより決定される、請求項１〜３のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質の触媒活性部分。
【請求項５】
未修飾ＡＤＡ２タンパク質が配列番号５、３２６〜３３０および３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列を含むかまたはその触媒活性部分である、請求項１〜４のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項６】
未修飾ＡＤＡ２タンパク質が配列番号５、３２６〜３３０および３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列からなるかまたはその触媒活性部分である、請求項１〜４のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項７】
未修飾ＡＤＡ２タンパク質が配列番号５に記載するアミノ酸の配列を含むかまたはその触媒活性部分である、請求項１〜５のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項８】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｓ２６２Ｎに相当する置き換えを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項９】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、またはＲ２１９Ｎに相当する置き換えを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１０】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎに相当する置き換えを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１１】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１０、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）７、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝２〜２０）、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝２〜２０）、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１０、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）７、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ、Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ、
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６ＷおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙのいずれかの中から選択される修飾を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１２】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、変異型ＡＤＡ２タンパク質が、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０ＥおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１３】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓに相当する修飾を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１４】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓに相当するアミノ酸置き換えを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１５】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ；Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ；Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ；Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ；Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ；Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ；Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴおよびＰ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓの中から選択される修飾の１つまたは複数に相当する推定受容体結合（ＰＲＢ）ドメインにおける修飾をさらに含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１６】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４ＡおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１７】
配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝２〜２０）；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）ｎ（式中、ｎ＝２〜２０）；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（Ｇｌｙ）３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１〜５）；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌの中から選択される修飾を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１８】
変異型ＡＤＡ２タンパク質が配列番号３８〜４０、５３、５４、５９〜６３および２６３〜２７３のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項１に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項１９】
変異型ＡＤＡ２タンパク質が配列番号５９６〜６４５、６５８−７００、７０２−７１０、７１３−７９１、８０７−８２２および８３８−９３１のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項１に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項２０】
配列番号５に関して、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ；Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；およびＳ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項２１】
変異型ＡＤＡ２タンパク質の配列が配列番号２７３に記載される、請求項１０に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項２２】
変異型ＡＤＡ２タンパク質がペグ化されている、請求項２１に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項２３】
触媒活性部分が配列番号５に記載するアミノ酸の配列の残基７７−４７３に相当する残基からなるＡＤＡドメインを含み；
触媒活性部分が、所望により、配列番号５の残基９８−１５６に相当する残基からなるＰＲＢドメインまたはＰＲＢドメインの一部を含む、
請求項１〜２２のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の複数の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分を含む変異型ＡＤＡ２多量体であって、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が同じかまたは異なる、変異型ＡＤＡ２多量体。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分を含む、変異型ＡＤＡ２二量体。
【請求項２６】
請求項１０に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分を含む、変異型ＡＤＡ２二量体。
【請求項２７】
同じである２つの変異型ＡＤＡ２タンパク質またはそれらの触媒活性部分を含むホモ二量体である、請求項２５に記載の変異型ＡＤＡ２二量体またはその触媒活性部分。
【請求項２８】
互いに異なる２つの変異型ＡＤＡ２タンパク質またはそれらの触媒活性部分を含むヘテロ二量体である、請求項２５に記載の変異型ＡＤＡ２二量体またはその触媒活性部分。
【請求項２９】
直接的にまたはリンカーを介して間接的に異種部分に連結されている請求項１〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体を含むコンジュゲートであって、異種部分が半減期延長部分である、コンジュゲート。
【請求項３０】
半減期延長部分がＰＥＧであり、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体をコードする、核酸分子。
【請求項３２】
請求項３１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項３３】
請求項３２に記載のベクターを含む、単離細胞または細胞培養物。
【請求項３４】
細胞が腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される、請求項３３に記載の細胞または細胞培養物。
【請求項３５】
細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および変異型ＡＤＡ２タンパク質または二量体をコードする核酸分子を含むＴ細胞であり、該細胞がＣＡＲおよび変異型ＡＤＡ２タンパク質または二量体を発現し、ＣＡＲが腫瘍細胞抗原に特異的である、請求項３４に記載の細胞または細胞培養物。
【請求項３６】
変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分を産生する方法であって、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が発現される条件下で、請求項３３〜３５のいずれかに記載の細胞を培養することを含む方法。
【請求項３７】
生じる変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が二量体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
がんを処置するための使用のための細胞を産生する方法であって、請求項３３または３４に記載の細胞を培養または増殖させることを含む方法。
【請求項３９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体、または請求項２９または３０に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項４０】
変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
変異型ＡＤＡ２タンパク質が配列番号２７３に記載するアミノ酸残基の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
腫瘍、がん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または免疫不全疾患を処置するための使用のための、請求項１〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体または請求項２９または３０に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
変異型ＡＤＡ２タンパク質が配列番号２７３に記載するアミノ酸残基の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項４２に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体、またはコンジュゲート。
【請求項４４】
変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項４２に記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体、またはコンジュゲート。
【請求項４５】
対象における腫瘍、がん、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または免疫不全疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体、または請求項２９または３０に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項４６】
変異型ＡＤＡ２タンパク質が配列番号２７３に記載するアミノ酸残基の配列またはその触媒活性部分を含む、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分がペグ化されている、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
腫瘍を処置するための使用のための、請求項１〜２８のいずれかに記載の変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、または二量体または多量体、または請求項２９または３０に記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項４９】
請求項３８に記載の方法によって産生された細胞。
【請求項５０】
がんを処置するための使用のための、請求項３８に記載の方法によって産生された細胞。
【請求項５１】
がんを処置するための使用のための細胞を産生する方法であって、請求項３５に記載の細胞を培養または増殖させることを含む方法。
【請求項５２】
腫瘍を処置するための使用のための、請求項４１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
Christopher Thanos、Lin WangおよびH. Michael ShepardによるCOMPOSITIONS OF ADENOSINE DEAMINASE-2 (ADA2), VARIANTS THEREOF AND METHODS OF USING SAMEという名称の２０１４年１０月１４日に出願された米国仮出願番号第６２／０６３,９３６号に対して優先権の利益を主張する。認められる場合、この出願の主題は、その全体が参照により援用される。
【０００２】
電子的に提供される配列表の参照による援用
電子版の配列表が、本明細書とともに提出され、その内容は、それらの全体が参照により援用される。電子ファイルは、２０１５年１０月１４日に作られ、サイズが３,１７７キロバイトであり、3121seqPC1.txtという題名である。
【０００３】
変異型アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)タンパク質が提供される。また、ＡＤＡ２コンジュゲートおよびＡＤＡ２タンパク質またはＡＤＡ２コンジュゲートを含有する組成物も提供される。また、腫瘍またはがんなどの疾患および状態、特にアデノシンもしくは他の関連マーカーの上昇に関連した任意の疾患または状態を処置するためのＡＤＡ２タンパク質またはコンジュゲートの使用も提供される。
【背景技術】
【０００４】
アデノシンは、免疫機能の有名なエフェクターである。Ｔ細胞では、アデノシンは、ＮＦ−κＢのＴ細胞受容体誘導性活性化を減少させ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γを阻害する。アデノシンは、Ｔ細胞傷害性を減少させ、Ｔ細胞アネルギーを増加させ、Ｆｏｐ３＋またはＬａｇ−３＋調節性(Ｔ−ｒｅｇ)Ｔ細胞へのＴ細胞分化を増加させる。ＮＫ細胞上で、アデノシンは、ＩＦＮ−γ産生を減少させ、ＮＫ細胞傷害性を抑制することが知られている。アデノシンは、好中球接着および血管外溢出を阻止し、食作用を減少させ、スーパーオキシドおよび一酸化窒素のレベルを減衰させることが知られている。アデノシンはまた、マクロファージ上でＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＭＩＰ−１αの発現を減少させ、ＭＨＣ  クラスII発現を減衰させ、ＩＬ−１０およびＩＬ−６のレベルを増加させる。さらに、アデノシンは、マクロファージ上で、食作用ならびにスーパーオキシドおよび一酸化窒素レベルを減少させる。これらの免疫関連活性などによって、アデノシンの異常または蓄積レベルは、アデノシン媒介性免疫抑制効果が役割を果たすものを含むいくつもの疾患および状態と関連付けられる。したがって、かかる疾患および状態の処置が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
未修飾アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ２)タンパク質またはその触媒活性部分のアミノ酸の配列において修飾を含有する変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分が本明細書中に提供される。ある態様においては、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列、もしくは配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列を含むことができるかまたはそれらの触媒活性部分であり、アミノ酸修飾は、アミノ酸置き換え、欠失および挿入の中から選択され、変異型ＡＤＡ２は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増加、ヘパリン結合の低減、より長い血清半減期、ｐＨ最適条件の変更、熱安定性の増加、受容体結合の変更および過グリコシル化の中から選択される１以上の特性を示すことができる。置き換え、欠失および挿入を含む様々なアミノ酸修飾が提供される。特定の活性または特性を付与する慎重な修飾は、組み合わせることができ、突然変異または修飾のタンパク質効果で見られるように、一般的に付加的であることが理解されよう。置き換え、欠失および挿入を含む修飾を含有する本明細書中に提供される変異型ＡＤＡ２またはその触媒活性部分および変異型ＡＤＡ２またはその触媒活性部分をコードする核酸のいずれも、本明細書中に提供する方法、組成物、コンジュゲート、修飾形態、ベクター、細胞、組合せ、使用および使用のための組成物、ならびに使用のための組合せのいずれかで使用することができる。
【０００６】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、二量体形態である場合、アデノシンデアミネーゼ活性の増加またはアデノシンデアミナーゼ活性の増加およびヘパリン結合の低減を示す。
【０００７】
ある態様においては、未修飾ＡＤＡ２タンパク質はホモ二量体であり、単量体形態は、配列番号５に記載するアミノ酸残基の配列を含む。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、本明細書中に提供するような変異型ＡＤＡ２タンパク質の触媒活性部分であり、ここで未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列が配列番号５に記載されるポリペプチドの相当する触媒活性部分のホモ二量体であり、相当する部分は、アライメントにより決定される。
【０００８】
ある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関するナンバリングを用いて、Ｈ７Ｒ、Ｇ１８Ａ、Ｇ１８Ｒ、Ｇ１８Ｖ、Ｉ６４Ｔ、Ａ８０Ｄ、Ｈ８３Ｑ、Ｖ９０Ａ、Ｃ１０８Ｇ、Ａ１２０Ｖ、Ｈ１２１Ｒ、Ｗ１３３Ｇ、Ｒ１２５Ｃ、Ｒ１４０Ｑ、Ｋ１４１Ｒ、Ｒ１４２Ｗ、Ｐ１６４Ｌ、Ｐ２２２Ｌ、Ｗ２３５Ｓ、Ｈ３０６Ｒ、Ｅ３３０Ｇ、Ｗ３３３Ｇ、Ｖ３６５Ｌ、Ｙ４２４Ｃ、Ｆ４６４Ｓに相当するアミノ酸置き換えまたはＲ８−Ｋ１４ｄｅｌ→−−に相当する欠失の中から選択される修飾を含有しない。
【０００９】
ある態様においては、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含むことができるかまたはその触媒活性部分である。例えば、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列とまたはその相当する触媒活性部分と少なくとも９５％配列同一性を有する。例えば、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列を含むかまたはその触媒活性部分であるか、あるいは未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５および３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列を有するかまたはその触媒活性部分である。特定の態様では、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列を含むかまたはその触媒活性部分である。
【００１０】
ある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質の触媒活性部分は、推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインドの全てもしくは一部を欠如するＡＤＡ２タンパク質であり得る。例えば、ＡＤＡ２タンパク質の触媒活性部分は、配列番号５４８〜５５０に記載するアミノ酸の配列を含み得る。ある態様においては、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の触媒活性部分は、配列番号５に記載するタンパク質の残基７７〜４７３として記載する配列を有する。
【００１１】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質と比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０またはそれ以上のアミノ酸修飾を含むことができる。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、最大２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸修飾を含む。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号１、５、６８、２８６〜３０２、３２６〜３４２または３７４〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を含有しない。ある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質変異体の一次アミノ酸配列は、配列番号１、５、６８、２８６〜３０２、３２６〜３４２または３７４〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列ではない。
【００１２】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性を示して、アデノシンをイノシンに変換する。本明細書中のある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約５×１０３Ｍ−１ｓ−１、６×１０３Ｍ−１ｓ−１、７×１０３Ｍ−１ｓ−１、８×１０３Ｍ−１ｓ−１、９×１０３Ｍ−１ｓ−１、１×１０４Ｍ−１ｓ−１、２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができる。
【００１３】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくとも５８℃の融解温度(Ｔｍ)を有して熱安定性を示すことができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質のＴｍは、少なくとも５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃またはそれ以上である。
【００１４】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、アミノ酸置き換えである修飾を含有することができ、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基１１、１３、２０、２２、２６、８６、１７９、２１７、２１９、２２１、２５８、２６２、２６４、２６６、２６７、２７７、２８３、２９６、３０９、３１７、３２１、３５２、３６６、３７１、３７２、３７３、３７４、４０３、４０４、４０５、４０６、４４１、４４４、４５２、４６１、４６９または４７０に相当するアミノ酸位置で、１以上のアミノ酸置き換えを含む。例えば、アミノ酸置き換えは、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基１１、２０、２１９、２２１、２６２、２６４、３６６、３７１、３７２または４５２に相当する位置である。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｋ１３Ｄ、Ｋ１３Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２０Ｎ、Ｖ２２Ｓ、Ｋ２６Ａ、Ｋ２６Ｄ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ８６Ａ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｅ、Ｄ８６Ｆ、Ｄ８６Ｇ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｌ、Ｄ８６Ｍ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ８６Ｐ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｒ、Ｄ８６Ｓ、Ｄ８６Ｔ、Ｄ８６Ｖ、Ｄ８６Ｗ、Ｄ８６Ｙ、Ｅ１７９Ａ、Ｅ１７９Ｃ、Ｅ１７９Ｄ、Ｅ１７９Ｆ、Ｅ１７９Ｇ、Ｅ１７９Ｈ、Ｅ１７９Ｉ、Ｅ１７９Ｋ、Ｅ１７９Ｌ、Ｅ１７９Ｍ、Ｅ１７９Ｎ、Ｅ１７９Ｐ、Ｅ１７９Ｑ、Ｅ１７９Ｒ、Ｅ１７９Ｓ、Ｅ１７９Ｔ、Ｅ１７９Ｖ、Ｅ１７９Ｗ、Ｅ１７９Ｙ、Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ａ、Ｒ２１９Ｃ、Ｒ２１９Ｄ、Ｒ２１９Ｅ、Ｒ２１９Ｆ、Ｒ２１９Ｇ、Ｒ２１９Ｈ、Ｒ２１９Ｉ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｌ、Ｒ２１９Ｍ、Ｒ２１９Ｎ、Ｒ２１９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９Ｓ、Ｒ２１９Ｔ、Ｒ２１９Ｖ、Ｒ２１９Ｗ、Ｒ２１９Ｙ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｃ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ、Ｌ２２１Ｆ、Ｌ２２１Ｇ、Ｌ２２１Ｈ、Ｌ２２１Ｉ、Ｌ２２１Ｋ、Ｌ２２１Ｍ、Ｌ２２１Ｎ、Ｌ２２１Ｐ、Ｌ２２１Ｑ、Ｌ２２１Ｒ、Ｌ２２１Ｓ、Ｌ２２１Ｔ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｗ、Ｌ２２１Ｙ、Ｋ２５８Ａ、Ｋ２５８Ｄ、Ｋ２５８Ｅ、Ｓ２６２Ａ、Ｓ２６２Ｃ、Ｓ２６２Ｄ、Ｓ２６２Ｅ、Ｓ２６２Ｆ、Ｓ２６２Ｇ、Ｓ２６２Ｈ、Ｓ２６２Ｉ、Ｓ２６２Ｋ、Ｓ２６２Ｌ、Ｓ２６２Ｍ、Ｓ２６２Ｎ、Ｓ２６２Ｐ、Ｓ２６２Ｑ、Ｓ２６２Ｒ、Ｓ２６２Ｔ、Ｓ２６２Ｖ、Ｓ２６２Ｗ、Ｓ２６２Ｙ、Ｈ２６４Ａ、Ｈ２６４Ｃ、Ｈ２６４Ｄ、Ｈ２６４Ｅ、Ｈ２６４Ｆ、Ｈ２６４Ｇ、Ｈ２６４Ｉ、Ｈ２６４Ｋ、Ｈ２６４Ｌ、Ｈ２６４Ｍ、Ｈ２６４Ｎ、Ｈ２６４Ｐ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｒ、Ｈ２６４Ｓ、Ｈ２６４Ｔ、Ｈ２６４Ｖ、Ｈ２６４Ｗ、Ｈ２６４Ｙ、Ｓ２６６Ａ、Ｓ２６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｓ２６６Ｅ、Ｓ２６６Ｆ、Ｓ２６６Ｇ、Ｓ２６６Ｈ、Ｓ２６６Ｉ、Ｓ２６６Ｋ、Ｓ２６６Ｌ、Ｓ２６６Ｍ、Ｓ２６６Ｎ、Ｓ２６６Ｐ、Ｓ２６６Ｑ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２６６Ｔ、Ｓ２６６Ｖ、Ｓ２６６Ｗ、Ｓ２６６Ｙ、Ｋ２６７Ａ、Ｋ２６７Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｋ２６７Ｅ、Ｋ２６７Ｆ、Ｋ２６７Ｇ、Ｋ２６７Ｈ、Ｋ２６７Ｉ、Ｋ２６７Ｌ、Ｋ２６７Ｍ、Ｋ２６７Ｎ、Ｋ２６７Ｐ、Ｋ２６７Ｑ、Ｋ２６７Ｒ、Ｋ２６７Ｓ、Ｋ２６７Ｔ、Ｋ２６７Ｖ、Ｋ２６７Ｗ、Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２７７Ａ、Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２８３Ａ、Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２８３Ｅ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ２９６Ｃ、Ｖ２９６Ｄ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｆ、Ｖ２９６Ｇ、Ｖ２９６Ｈ、Ｖ２９６Ｉ、Ｖ２９６Ｋ、Ｖ２９６Ｌ、Ｖ２９６Ｍ、Ｖ２９６Ｎ、Ｖ２９６Ｐ、Ｖ２９６Ｑ、Ｖ２９６Ｒ、Ｖ２９６Ｓ、Ｖ２９６Ｔ、Ｖ２９６Ｗ、Ｖ２９６Ｙ、Ｋ３０９Ａ、Ｋ３０９Ｄ、Ｋ３０９Ｅ、Ｋ３１７Ａ、Ｋ３１７Ｄ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３２１Ａ、Ｋ３２１Ｄ、Ｋ３２１Ｅ、Ｒ３５２Ａ、Ｒ３５２Ｄ、Ｒ３５２Ｅ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ３７２Ｎ、Ｄ３７３Ｓ、Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ、Ｇ４０４Ｎ、Ｈ４０５Ｓ、Ｐ４０６Ｓ、Ｒ４４１Ａ、Ｒ４４１Ｄ、Ｒ４４１Ｅ、Ｋ４４４Ａ、Ｋ４４４Ｄ、Ｋ４４４Ｅ、Ｋ４５２Ａ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ４６１Ａ、Ｋ４６１Ｄ、Ｋ４６１Ｅ、Ｋ４６９Ａ、Ｋ４６９Ｄ、Ｋ４６９Ｅ、Ｋ４７０Ａ、Ｋ４７０Ｄ、Ｋ４７０Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、Ｈ２６４Ａ；Ｈ２６４Ｑ；Ｈ２６４Ｎ；Ｈ２６４Ｇ；Ｒ２１９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ；Ｒ２１９Ｎ；Ｒ２１９Ａ；Ｌ２２１Ａ；Ｌ２２１Ｖ；Ｌ２２１Ｇ；Ｅ１７９Ｄ；Ｅ１７９Ａ；Ｅ１７９Ｓ；Ｅ１７９Ｔ；Ｅ１７９Ｖ；Ｅ１７９Ｇ；Ｓ２６２Ａ；Ｓ２６２Ｖ；Ｓ２６２Ｍ；Ｓ２６２Ｎ；Ｄ８６Ａ；Ｄ８６Ｃ；Ｄ８６Ｅ；Ｄ８６Ｆ；Ｄ８６Ｇ；Ｄ８６Ｈ；Ｄ８６Ｉ；Ｄ８６Ｋ；Ｄ８６Ｌ；Ｄ８６Ｍ；Ｄ８６Ｎ；Ｄ８６Ｐ；Ｄ８６Ｑ；Ｄ８６Ｒ；Ｄ８６Ｓ；Ｄ８６Ｔ；Ｄ８６Ｖ；Ｄ８６Ｗ；Ｄ８６Ｙ；Ｅ１７９Ｃ；Ｅ１７９Ｆ；Ｅ１７９Ｈ；Ｅ１７９Ｉ；Ｅ１７９Ｋ；Ｅ１７９Ｌ；Ｅ１７９Ｍ；Ｅ１７９Ｎ；Ｅ１７９Ｐ；Ｅ１７９Ｑ；Ｅ１７９Ｒ；Ｅ１７９Ｗ；Ｅ１７９Ｙ；Ｒ２１９Ｃ；Ｒ２１９Ｄ；Ｒ２１９Ｅ；Ｒ２１９Ｆ；Ｒ２１９Ｇ；Ｒ２１９Ｈ；Ｒ２１９Ｉ；Ｒ２１９Ｌ；Ｒ２１９Ｍ；Ｒ２１９Ｐ；Ｒ２１９Ｓ；Ｒ２１９Ｔ；Ｒ２１９Ｖ；Ｒ２１９Ｗ；Ｒ２１９Ｙ；Ｌ２２１Ｃ；Ｌ２２１Ｄ；Ｌ２２１Ｅ；Ｌ２２１Ｆ；Ｌ２２１Ｈ；Ｌ２２１Ｉ；Ｌ２２１Ｋ；Ｌ２２１Ｍ；Ｌ２２１Ｎ；Ｌ２２１Ｐ；Ｌ２２１Ｑ；Ｌ２２１Ｒ；Ｌ２２１Ｓ；Ｌ２２１Ｔ；Ｌ２２１Ｗ；Ｌ２２１Ｙ；Ｓ２６２Ｃ；Ｓ２６２Ｄ；Ｓ２６２Ｅ；Ｓ２６２Ｆ；Ｓ２６２Ｇ；Ｓ２６２Ｈ；Ｓ２６２Ｉ；Ｓ２６２Ｋ；Ｓ２６２Ｌ；Ｓ２６２Ｐ；Ｓ２６２Ｑ；Ｓ２６２Ｒ；Ｓ２６２Ｔ；Ｓ２６２Ｗ；Ｓ２６２Ｙ；Ｈ２６４Ｃ；Ｈ２６４Ｄ；Ｈ２６４Ｅ；Ｈ２６４Ｆ；Ｈ２６４Ｉ；Ｈ２６４Ｋ；Ｈ２６４Ｌ；Ｈ２６４Ｍ；Ｈ２６４Ｐ；Ｈ２６４Ｒ；Ｈ２６４Ｓ；Ｈ２６４Ｔ；Ｈ２６４Ｖ；Ｈ２６４Ｗ；Ｈ２６４Ｙ；Ｓ２６６Ａ；Ｓ２６６Ｃ；Ｓ２６６Ｄ；Ｓ２６６Ｅ；Ｓ２６６Ｆ；Ｓ２６６Ｇ；Ｓ２６６Ｈ；Ｓ２６６Ｉ；Ｓ２６６Ｋ；Ｓ２６６Ｌ；Ｓ２６６Ｍ；Ｓ２６６Ｎ；Ｓ２６６Ｐ；Ｓ２６６Ｑ；Ｓ２６６Ｒ；Ｓ２６６Ｔ；Ｓ２６６Ｖ；Ｓ２６６Ｗ；Ｓ２６６Ｙ；Ｋ２６７Ａ；Ｋ２６７Ｃ；Ｋ２６７Ｄ；Ｋ２６７Ｅ；Ｋ２６７Ｆ；Ｋ２６７Ｇ；Ｋ２６７Ｈ；Ｋ２６７Ｉ；Ｋ２６７Ｌ；Ｋ２６７Ｍ；Ｋ２６７Ｎ；Ｋ２６７Ｐ；Ｋ２６７Ｑ；Ｋ２６７Ｒ；Ｋ２６７Ｓ；Ｋ２６７Ｔ；Ｋ２６７Ｖ；Ｋ２６７Ｗ；Ｋ２６７Ｙ；Ｖ２９６Ａ；Ｖ２９６Ｃ；Ｖ２９６Ｄ；Ｖ２９６Ｅ；Ｖ２９６Ｆ；Ｖ２９６Ｇ；Ｖ２９６Ｈ；Ｖ２９６Ｉ；Ｖ２９６Ｋ；Ｖ２９６Ｌ；Ｖ２９６Ｍ；Ｖ２９６Ｎ；Ｖ２９６Ｐ；Ｖ２９６Ｑ；Ｖ２９６Ｒ；Ｖ２９６Ｓ；Ｖ２９６Ｔ；Ｖ２９６Ｗ；およびＶ２９６Ｙに相当する置き換えの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含有する。
【００１５】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基２１９および２６２に相当する位置の一方または両方でアミノ酸置き換えを含有する。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｓ２６２ＮまたはＳ２６２Ｑに相当する置き換えを含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、Ｓ２６２Ｎに相当する置き換えを含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９ＮまたはＲ２１９Ａに相当する置き換えを含有する。他の態様では、変異型ＡＤＡ２は、Ｒ２１９Ｑに相当する置き換えまたは置き換えＲ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅを含有する。他の態様では、変異型ＡＤＡ２は、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎに相当する置き換えを含有する。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ、Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ａ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ、Ｒ２１９���／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ���Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ、Ｒ２１９Ｃ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｄ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｅ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｆ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｇ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｈ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｉ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｌ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｍ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｐ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｓ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｔ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｖ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｗ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｙ／Ｓ２６２Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／
Ｈ２６４Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６ＷおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙのいずれかの中から選択される修飾を含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｒ２１９Ｑ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ、Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ、Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌおよびＳ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌの中から選択される修飾を含有する。
【００１６】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性の増加を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２の相当する二量体形態の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％またはそれ以上の活性を示すことができ、ここでアデノシンデアミナーゼ活性は、同じ条件下で評価される。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態の触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)と比較して、少なくともまたは少なくとも約１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２.０倍、２.２倍、２.５倍、３.０倍、３.５倍、４倍、４.５倍、５.０倍、６.０倍、７.０倍、８.０倍、９.０倍、１０.０倍またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができ、ここでアデノシンデアミナーゼ活性の触媒効率は、同じ条件下で評価される。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができる。
【００１７】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３、Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ、Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌおよびＫ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌの中から選択される修飾を含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ、Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ２２４Ｎ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｐ１２４Ａ、Ｐ１２４Ｓ、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２およびＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３の中から選択される修飾を含有する。
【００１８】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ、Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ、Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ２２４Ｎ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｐ１２４Ａ、Ｐ１２４Ｓ、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２およびＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３の中から選択される修飾を含有する。
【００１９】
例えば、かかる変異型ＡＤＡ２タンパク質の中には、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基１１、２０、２１９、２２１、２６２、２６４、３６６、３７１、３７２または４５２に相当するアミノ酸位置で、１以上のアミノ酸置き換えを含むものが挙げられる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｓ２６２Ｎ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２ＤおよびＫ４５２Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０ＥおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎの中から選択されるアミノ酸置き換えを含むことができる。
【００２０】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、ヘパリン結合の低減を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以下のヘパリン結合を示すことができ、ここでヘパリン結合は、同じ条件下で評価される。
【００２１】
例えば、かかる変異型ＡＤＡ２タンパク質の中には、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基２０、２６２、３６６、３７１、３７２または４５２に相当するアミノ酸位置で、１以上のアミノ酸置き換えを含むものが挙げられる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２ＥおよびＫ４５２Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１ＤおよびＳ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅの中から選択されるアミノ酸置き換えを含むことができる。
【００２２】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｋ１１Ａ；Ｋ１１Ｄ；Ｋ１１Ｅ；Ｋ１３Ａ；Ｋ１３Ｄ；Ｋ１３Ｅ；Ｋ３７１Ａ；Ｋ３７１Ｄ；Ｋ３７１Ｅ；Ｋ３７２Ａ；Ｋ３７２Ｄ；Ｋ３７２Ｅ；Ｋ４５２Ａ；Ｋ４５２Ｄ；Ｋ４５２Ｅ；Ｒ２０Ａ；Ｒ２０Ｄ；Ｒ２０Ｅ；Ｒ３６６Ａ；Ｒ３６６Ｄ；Ｒ３６６Ｅ；Ｋ２６Ａ；Ｋ２６Ｄ；Ｋ２６Ｅ；Ｒ２１７Ａ；Ｒ２１７Ｄ；Ｒ２１７Ｅ；Ｋ２５８Ａ；Ｋ２５８Ｄ；Ｋ２５８Ｅ；Ｒ２７７Ａ；Ｒ２７７Ｄ；Ｒ２７７Ｅ；Ｒ２８３Ａ；Ｒ２８３Ｄ；Ｒ２８３Ｅ；Ｋ３０９Ａ；Ｋ３０９Ｄ；Ｋ３０９Ｅ；Ｋ３１７Ａ；Ｋ３１７Ｄ；Ｋ３１７Ｅ；Ｋ３２１Ａ；Ｋ３２１Ｄ；Ｋ３２１Ｅ；Ｒ３５２Ａ；Ｒ３５２Ｄ；Ｒ３５２Ｅ；Ｒ４４１Ａ；Ｒ４４１Ｄ；Ｒ４４１Ｅ；Ｋ４４４Ａ；Ｋ４４４Ｄ；Ｋ４４４Ｅ；Ｋ４６１Ａ；Ｋ４６１Ｄ；Ｋ４６１Ｅ；Ｋ４６９Ａ；Ｋ４６９Ｄ；Ｋ４６９Ｅ；Ｋ４７０Ａ；Ｋ４７０Ｄ；およびＫ４７０Ｅに相当する１以上のアミノ酸置き換えを含有する。
【００２３】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、より長い血清半減期(ｔ１／２)を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態の半減期よりも少なくともまたは少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％またはそれ以上長い半減期を示すことができ、ここで半減期は、同じ条件下で評価される。
【００２４】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、熱安定性の増加を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態の融解温度(Ｔｍ)と比較して、少なくともまたは少なくとも約０.５℃、１.０℃、２.０℃、３.０℃、４.０℃、５.０℃、６.０℃、７.０℃、８.０℃、９.０℃、１０.０℃またはそれ以上増加されるＴｍを有して熱安定性を示すことができ、ここでＴｍは、同じ条件下で評価される。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、少なくともまたは少なくとも約６７.６℃、６７.８℃、６８.０℃、６８.２℃、６８.４℃、６８.６℃、６８.８℃、６９.０℃、６９.２℃、６９.４℃、６９.６℃、６９.８℃、７０.０℃、７０.２℃、７０.４℃、７０.６℃、７０.８℃、７１.０℃、７１.２℃、７１.４℃、７１.６℃、７１.８℃またはそれより高い熱融解温度(Ｔｍ)を有することができる。
【００２５】
本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質のいずれかの例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼ活性は、ｐＨ６.５±０.２でもしくは約ｐＨ６.５±０.２で評価され得るかまたは示され得る。いくつかの例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性に関するｐＨ最適条件の変更を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態のｐＨ最適条件と比較して、より高いｐＨであるアデノシンデアミナーゼ活性に関するｐＨ最適条件を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５またはより高いｐＨを伴ってｐＨ最適条件を有することができる。他の例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、未修飾ＡＤＡ２タンパク質の相当する二量体形態のｐＨ最適条件と比較して、より低いｐＨであるアデノシンデアミナーゼ活性に関するｐＨ最適条件を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、６.５、６.４、６.３、６.２、６.１、６.０もしくはそれ以下よりも低いかまたは約６.５、６.４、６.３、６.２、６.１、６.０もしくはそれ以下よりも低いｐＨを伴ってｐＨ最適条件を有することができる。
【００２６】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインにおける１以上のアミノ酸の修飾を含むことができ、ここで修飾は、アミノ酸欠失、挿入または置き換えである。かかる例のいずれかにおいて、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸置き換えＣ１０８Ｇ、Ａ１２０Ｖ、Ｈ１２１Ｒ、Ｒ１２５Ｃ、Ｒ１４０Ｑ、Ｋ１４１ＲまたはＲ１４２Ｗに相当するアミノ酸置き換えである修飾を含有しない。
【００２７】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインの全てもしくは一部を欠如するかまたはＰＲＢの修飾を有し、それにより任意の受容体結合または増殖因子活性が、低減もしくは排除されるかまたはデアミナーゼ活性以外のＡＤＡ２の他の活性が、低減もしくは排除されるかまたはＡＤＡドメインとの相互作用が、低減もしくは排除され、ＰＲＢドメインは、配列番号５に記載する残基９８〜１５６に相当する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、残基１０５〜１４８または１０５〜１４７または９９〜１４４を欠如する。いくつかの例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、配列番号５４８〜５５０および５７９のいずれかに記載するアミノ酸の配列を含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、ＰＲＢドメインの全てまたは一部の欠失および適宜ペプチドリンカーの挿入を含有する。
【００２８】
いくつかの例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間または約アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間の(両端を含む)、任意の１以上の連続するアミノ酸残基に相当する１以上の連続するアミノ酸残基の欠失を有することができる。かかる例のいずれかにおいて、ＡＤＡ２ポリペプチドの変異体は、ペプチドリンカーによる欠失領域の置換をさらに含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号３６８)(式中、ｎは、２〜２０である)、(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号３４３)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＳＳＳＳＧ)ｎ(配列番号３４４)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ)ｎ(配列番号３５０)(式中、ｎは、１〜６である)、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号３４５)、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３４６)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号３４７)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号３４８)およびＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号３４９)の中から選択され得る。例えば、ペプチドリンカーは、ＧＧＧ(配列番号３６９)、ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)、ＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７０)、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７１)およびＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７２)の中から選択され得る。
【００２９】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５またはＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３などの、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎは、２〜２０である)に相当するＰＲＢドメインにおける修飾を含むことができる。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；およびＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３に相当するＰＲＢドメインにおける修飾を含むことができる。
【００３０】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ２２４Ｎ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｐ１２４ＡおよびＰ１２４Ｓに相当する置き換えの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ａ；およびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｋ３７１Ｄ��Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；およびＳ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；およびＳ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌの中から選択される修飾を含有する。
【００３１】
修飾ＰＲＢドメインを含有する例を含む変異型ＡＤＡ２タンパク質のある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、同じ条件下で評価される場合の同じ受容体への未修飾ＡＤＡ２タンパク質の結合と比較して、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３の中から選択される任意の１以上のアデノシン受容体(ＡＤＲ)への結合の低減を示すことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、少なくともまたは少なくとも約０.５倍、１倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上低減される結合を有する。
【００３２】
本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２のある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、例えば自然または非自然グリコシル化部位の導入でグリコシル化され得る。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、非自然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を変更させる修飾を含むことができ、それにより、グリコシル化を変更させる修飾を含み、それにより、グリコシル化が可能な細胞において発現されると、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質と比較して過グリコシル化される。例えば、非自然グリコシル化部位は、１個、２個もしくは３個のアミノ酸のアミノ酸置き換えまたは挿入により導入される。例えば、修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳおよびＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓに相当する修飾の中から選択される。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２またはその触媒活性部分は、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓに相当する修飾を含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴおよびＰ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓの中から選択される修飾の１つまたは複数に相当する推定受容体結合ドメイン(ＰＲＢ)における修飾を含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓに相当するアミノ酸置き換えを含有する。
【００３３】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、ヒトＡＤＡ２であり得る。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、単離または精製され得る。
【００３４】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５またはその触媒活性部分に対して少なくとも６５％配列同一性を示すポリペプチドを含有することができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５またはその触媒活性部分に対して少なくとも７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すポリペプチドを含有することができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号１３〜６３もしくは７１〜２８５のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはそれらの触媒活性部分を有するポリペプチドを含有する。ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、配列番号５５１〜５７９もしくは５８１〜９３３のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはそれらの触媒活性部分を含有する。
【００３５】
ある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分は、配列番号５に関して、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ；Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ａ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ；Ｒ２１９Ｃ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｄ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｅ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｆ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｇ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｈ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｉ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｌ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｍ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｐ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｓ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｔ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｖ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｗ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｙ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；およびＳ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａに相当する置き換えの中から選択されるアミノ酸置き換えを含有することができる。
【００３６】
変異型ＡＤＡ２タンパク質は、単量体または二量体であり得る。特に、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質の中には、提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質のいずれかを含むことができる変異型ＡＤＡ２タンパク質の二量体が挙げられる。いくつかの例において、二量体は、ホモ二量体であり得る。他の例において、二量体は、ヘテロ二量体であり得る。
【００３７】
本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質をコードする核酸分子が提供される。また、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質のいずれかをコードする核酸を含むベクターが、本明細書中に提供される。ベクターは、哺乳動物ベクターもしくはウイルスベクターなどの真核生物または原核生物ベクターであり得る。例えば、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ポックスウイルスベクターまたはサイトメガロウイルスベクターである。ある態様においては、ベクターは、腫瘍溶解性ベクターである。ある態様においては、ベクターはまた、可溶性ヒアルロニダーゼもコードすることができる。また、本明細書中に提供するベクターのいずれかを含有する細胞が、本明細書中に提供される。細胞は、哺乳動物細胞などの真核細胞であり得る。ヒトである場合、細胞は、単離されるかまたは細胞培養物として供給される。例えば、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳動物細胞である。ある態様においては、細胞は、二量体などの変異型ＡＤＡ２タンパク質を発現することができる。また、本明細書中に提供する細胞により産生される変異型ＡＤＡ２二量体などの変異型ＡＤＡ２タンパク質が、本明明細書中に提供される。ある態様においては、細胞は、真核細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、もしくはヒト幹細胞ではない細胞などの単離細胞または細胞培養物である。ある態様においては、細胞は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球(ＴＩＬ)、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞またはリンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞などの免疫細胞である。ある態様においては、細胞は、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)および変異型ＡＤＡ２タンパク質または二量体をコードおよび発現するＴ細胞である。いくつかの例において、ＣＡＲは、腫瘍細胞抗原に特異的であり、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソセリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲおよびＧＤ２ならびにそれらの組合せの中から選択される。
【００３８】
直接的にまたはリンカーを介して間接的に毒素または治療薬などの異種部分に連結されている本明細書中の任意の例において提供する変異型ＡＤＡ２二量体などの本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質または任意のＡＤＡ２タンパク質の触媒活性部分を含むコンジュゲートが、本明細書中に提供される。
【００３９】
また、直接的にまたはリンカーを介して間接的に異種部分に連結されているＡＤＡ２タンパク質を含むコンジュゲートが、本明細書中に提供される。コンジュゲートのいずれかにおいて、ＡＤＡ２タンパク質は、単量体または二量体であり得る。いくつかの例において、二量体は、ホモ二量体であり、他の例において、それは、ヘテロ二量体である。本明細書中の例におけるコンジュゲートのいずれかにおいて、異種部分は、二量体における一方または両方のサブユニットにコンジュゲートしている。例えば異種部分は、ペプチド、小分子、核酸、炭水化物およびポリマーの中から選択され得る。
【００４０】
本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、異種部分は、半減期延長部分まである。例えば、半減期延長部分は、生体適合性脂肪酸およびそれらの誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(ＨＡＳ)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリ(Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ)ｎ、ホモアミノ酸ポリマー(ＨＡＰ)、ヒアルロン酸(ＨＡ)、ヘパロサンポリマー(ＨＥＰ)、ホスホリルコリンベースのポリマー(ＰＣポリマー)、フレキシマー(Fleximer)、デキストラン、ポリシアル酸(ＰＳＡ)、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、ＸＴＥＮ配列、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチドおよびそれらの任意の組合せの中から選択される。
【００４１】
いくつかの例において、半減期延長部分はＰＥＧであり、ＡＤＡ２タンパク質はペグ化されている。例えば、ＰＥＧは、メトキシ−ポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(ＣＤＩ−ＰＥＧ)、分岐状ＰＥＧおよびポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)の中から選択され得る。いくつかの例において、ＰＥＧは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量を有する。ＰＥＧは、直鎖状または分岐状であり得る。本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、ＰＥＧ部分は、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート(ｍＰＥＧ−ＳＰＡ)、ｍＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル(ｍＰＥＧ−ＳＣＭ)、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルα−メチルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＭＢ)、ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド(butyrldehyde)、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カーボネートおよびＰＥＧ−プロピオンアルデヒドの中から選択されるＰＥＧ試薬との反応に起因する。例えば、ＰＥＧ部分は、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ(２０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ(３０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ(５ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ(２０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ(３０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ(２０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＭＢ(３０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド(３０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ(２０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ(３０ｋＤａ)、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(１０ｋＤａ分岐)、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(２０ｋＤａ分岐)、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(４０ｋＤａ分岐)、ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ(６０ｋＤａ分岐)、ＰＥＧ−ＮＨＳ−ビオチン(５ｋＤａビオチン化)、ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート(３０ｋＤａ)およびＰＥＧ−プロピオンアルデヒド(３０ｋＤａ)の中から選択されるＰＥＧ試薬との反応に起因する。
【００４２】
本明細書中に提供するコンジュゲートの態様では、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示す配列またはそれらの触媒活性形態を含有することができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含有することができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含有することができる。別の例において、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を有するポリペプチドを含むことができる。
【００４３】
本明細書中に提供するコンジュゲートの態様では、ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質のアミノ酸の配列において修飾を含むアミノ酸の配列を含有する変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分であり、ここで未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列、もしくは配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示すアミノ酸の配列を含有するかまたはそれらの触媒活性部分である。かかる例のいずれかにおいて、アミノ酸修飾は、アミノ酸置き換え、欠失および挿入の中から選択され、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性を示して、アデノシンをイノシンに変換することができる。本明細書中に提供するコンジュゲートのいずれかにおいて、ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約５×１０３Ｍ−１ｓ−１、６×１０３Ｍ−１ｓ−１、７×１０３Ｍ−１ｓ−１、８×１０３Ｍ−１ｓ−１、９×１０３Ｍ−１ｓ−１、１×１０４Ｍ−１ｓ−１、２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができる。
【００４４】
本明細書中に提供するコンジュゲートの態様のいずれかにおいて、ＡＤＡ２タンパク質の修飾は、アミノ酸置き換えであってもよく、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基１１、１３、２０、２２、２６、８６、１７９、２１７、２１９、２２１、２５８、２６２、２６４、２６６、２６７、２７７、２８３、２９６、３０９、３１７、３２１、３５２、３６６、３７１、３７２、３７３、３７４、４０３、４０４、４０５、４０６、４４１、４４４、４５２、４６１、４６９または４７０に相当するアミノ酸位置で、１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。例えば、本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｋ１３Ｄ、Ｋ１３Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２０Ｎ、Ｖ２２Ｓ、Ｋ２６Ａ、Ｋ２６Ｄ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ８６Ａ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｅ、Ｄ８６Ｆ、Ｄ８６Ｇ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｌ、Ｄ８６Ｍ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ８６Ｐ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｒ、Ｄ８６Ｓ、Ｄ８６Ｔ、Ｄ８６Ｖ、Ｄ８６Ｗ、Ｄ８６Ｙ、Ｅ１７９Ａ、Ｅ１７９Ｃ、Ｅ１７９Ｄ、Ｅ１７９Ｆ、Ｅ１７９Ｇ、Ｅ１７９Ｈ、Ｅ１７９Ｉ、Ｅ１７９Ｋ、Ｅ１７９Ｌ、Ｅ１７９Ｍ、Ｅ１７９Ｎ、Ｅ１７９Ｐ、Ｅ１７９Ｑ、Ｅ１７９Ｒ、Ｅ１７９Ｓ、Ｅ１７９Ｔ、Ｅ１７９Ｖ、Ｅ１７９Ｗ、Ｅ１７９Ｙ、Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ａ、Ｒ２１９Ｃ、Ｒ２１９Ｄ、Ｒ２１９Ｅ、Ｒ２１９Ｆ、Ｒ２１９Ｇ、Ｒ２１９Ｈ、Ｒ２１９Ｉ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｌ、Ｒ２１９Ｍ、Ｒ２１９Ｎ、Ｒ２１９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９Ｓ、Ｒ２１９Ｔ、Ｒ２１９Ｖ、Ｒ２１９Ｗ、Ｒ２１９Ｙ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｃ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ、Ｌ２２１Ｆ、Ｌ２２１Ｇ、Ｌ２２１Ｈ、Ｌ２２１Ｉ、Ｌ２２１Ｋ、Ｌ２２１Ｍ、Ｌ２２１Ｎ、Ｌ２２１Ｐ、Ｌ２２１Ｑ、Ｌ２２１Ｒ、Ｌ２２１Ｓ、Ｌ２２１Ｔ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｗ、Ｌ２２１Ｙ、Ｋ２５８Ａ、Ｋ２５８Ｄ、Ｋ２５８Ｅ、Ｓ２６２Ａ、Ｓ２６２Ｃ、Ｓ２６２Ｄ、Ｓ２６２Ｅ、Ｓ２６２Ｆ、Ｓ２６２Ｇ、Ｓ２６２Ｈ、Ｓ２６２Ｉ、Ｓ２６２Ｋ、Ｓ２６２Ｌ、Ｓ２６２Ｍ、Ｓ２６２Ｎ、Ｓ２６２Ｐ、Ｓ２６２Ｑ、Ｓ２６２Ｒ、Ｓ２６２Ｔ、Ｓ２６２Ｖ、Ｓ２６２Ｗ、Ｓ２６２Ｙ、Ｈ２６４Ａ、Ｈ２６４Ｃ、Ｈ２６４Ｄ、Ｈ２６４Ｅ、Ｈ２６４Ｆ、Ｈ２６４Ｇ、Ｈ２６４Ｉ、Ｈ２６４Ｋ、Ｈ２６４Ｌ、Ｈ２６４Ｍ、Ｈ２６４Ｎ、Ｈ２６４Ｐ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｒ、Ｈ２６４Ｓ、Ｈ２６４Ｔ、Ｈ２６４Ｖ、Ｈ２６４Ｗ、Ｈ２６４Ｙ、Ｓ２６６Ａ、Ｓ２６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｓ２６６Ｅ、Ｓ２６６Ｆ、Ｓ２６６Ｇ、Ｓ２６６Ｈ、Ｓ２６６Ｉ、Ｓ２６６Ｋ、Ｓ２６６Ｌ、Ｓ２６６Ｍ、Ｓ２６６Ｎ、Ｓ２６６Ｐ、Ｓ２６６Ｑ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２６６Ｔ、Ｓ２６６Ｖ、Ｓ２６６Ｗ、Ｓ２６６Ｙ、Ｋ２６７Ａ、Ｋ２６７Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｋ２６７Ｅ、Ｋ２６７Ｆ、Ｋ２６７Ｇ、Ｋ２６７Ｈ、Ｋ２６７Ｉ、Ｋ２６７Ｌ、Ｋ２６７Ｍ、Ｋ２６７Ｎ、Ｋ２６７Ｐ、Ｋ２６７Ｑ、Ｋ２６７Ｒ、Ｋ２６７Ｓ、Ｋ２６７Ｔ、Ｋ２６７Ｖ、Ｋ２６７Ｗ、Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２７７Ａ、Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２８３Ａ、Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２８３Ｅ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ２９６Ｃ、Ｖ２９６Ｄ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｆ、Ｖ２９６Ｇ、Ｖ２９６Ｈ、Ｖ２９６Ｉ、Ｖ２９６Ｋ、Ｖ２９６Ｌ、Ｖ２９６Ｍ、Ｖ２９６Ｎ、Ｖ２９６Ｐ、Ｖ２９６Ｑ、Ｖ２９６Ｒ、Ｖ２９６Ｓ、Ｖ２９６Ｔ、Ｖ２９６Ｗ、Ｖ２９６Ｙ、Ｋ３０９Ａ、Ｋ３０９Ｄ、Ｋ３０９Ｅ、Ｋ３１７Ａ、Ｋ３１７Ｄ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３２１Ａ、Ｋ３２１Ｄ、Ｋ３２１Ｅ、Ｒ３５２Ａ、Ｒ３５２Ｄ、Ｒ３５２Ｅ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ３７２Ｎ、Ｄ３７３Ｓ、Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ、Ｇ４０４Ｎ、Ｈ４０５Ｓ、Ｐ４０６Ｓ、Ｒ４４１Ａ、Ｒ４４１Ｄ、Ｒ４４１Ｅ、Ｋ４４４Ａ、Ｋ４４４Ｄ、Ｋ４４４Ｅ、Ｋ４５２Ａ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ４６１Ａ、Ｋ４６１Ｄ、Ｋ４６１Ｅ、Ｋ４６９Ａ、Ｋ４６９Ｄ、Ｋ４６９Ｅ、Ｋ４７０Ａ、Ｋ４７０Ｄ、Ｋ４７０Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｓ２６２Ｎ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２ＤおよびＫ４５２Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。いくつかの例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０ＥおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎの中から選択されるアミノ酸置き換えを含むことができる。
【００４５】
本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、アミノ酸欠失、挿入または置き換えである推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインにおける１以上のアミノ酸の修飾を含むことができる。例えば、本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間または約アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間の(両端を含む)、任意の１以上の連続するアミノ酸残基に相当する１以上の連続するアミノ酸残基の欠失を含むことができる。いくつかの例において、コンジュゲートにおける変異型ＡＤＡ２タンパク質は、ペプチドリンカーによる欠失領域の置換をさらに含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号３６８)(式中、ｎは、２〜２０である)、(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号３４３)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＳＳＳＳＧ)ｎ(配列番号３４４)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ)ｎ(配列番号３５０)(式中、ｎは、１〜６である)、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号３４５)、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３４６)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号３４７)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号３４８)およびＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号３４９)の中から選択され得る。いくつかの例において、ペプチドリンカーは、ＧＧＧ(配列番号３６９)、ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)、ＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７０)、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７１)およびＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７２)の中から選択される。例えば、ＰＲＢドメインにおける修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｃ１０５−Ｔ１４８ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５またはＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３などの、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎは、２〜２０である)に相当し得る。
【００４６】
本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、コンジュゲートにおける変異型ＡＤＡ２タンパク質は、１つもしくは複数の自然または非自然グリコシル化部位でグリコシル化され得る。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質を含有する本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、コンジュゲートにおける変異型ＡＤＡ２タンパク質は、非自然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を変更させる修飾を含むことができる。非自然グリコシル化部位は、１個、２個もしくは３個のアミノ酸のアミノ酸置き換え、挿入または欠失を導入することにより正準なグリコシル化配列(ＮＸＴ／Ｓ、式中、Ｘは、Ｎ連結された炭水化物に関して、Ｓ／Ｔは、Ｏ連結された炭水化物に関してＰｒｏではない)を創出することにより導入され得る。例えば、グリコシル化を変更させる修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳおよびＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓに相当する修飾の中から選択される。
【００４７】
本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、コンジュゲートにおける変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号１３〜６３もしくは７１〜２８５のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはそれらの触媒活性部分を有することができる。
【００４８】
本明細書中に提供するＡＤＡ２または変異型ＡＤＡ２タンパク質を含有するコンジュゲートのある態様においては、コンジュゲートは、コンジュゲートしていないＡＤＡ２タンパク質と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性を保持する。例えば、コンジュゲートは、コンジュゲートしていないＡＤＡ２タンパク質の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上のアデノシンデアミナーゼ活性などの、コンジュゲートしていないＡＤＡ２タンパク質の５０％〜５００％、５０％〜２００％、５０％〜１００％、５０％〜８０％、８０％〜５００％、８０％〜２００％、８０％〜１００％、１００％〜５００％もしくは１００％〜２００％または約５０％〜５００％、５０％〜２００％、５０％〜１００％、５０％〜８０％、８０％〜５００％、８０％〜２００％、８０％〜１００％、１００％〜５００％もしくは約１００％〜２００％(それぞれ、両端を含む)のアデノシンデアミナーゼ活性を示すことができる。本明細書中に提供するコンジュゲートのある態様においては、コンジュゲートにおけるＡＤＡ２は、少なくともまたは少なくとも約５×１０３Ｍ−１ｓ−１、６×１０３Ｍ−１ｓ−１、７×１０３Ｍ−１ｓ−１、８×１０３Ｍ−１ｓ−１、９×１０３Ｍ−１ｓ−１、１×１０４Ｍ−１ｓ−１、２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができる。
【００４９】
本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質のいずれかまたはその触媒活性部分、本明細書中に提供する任意の変異型ＡＤＡ２二量体または本明細書中に提供する例のいずれかの任意のコンジュゲートおよび治療剤を含有する組合せが、本明細書中に提供される。また、任意のＡＤＡ２タンパク質および治療剤を含有する組合せが、本明細書中に提供される。本明細書中に提供する組合せの任意の例において、ＡＤＡ２タンパク質は、単量体または二量体であり得る。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、ホモ二量体などの二量体であり得る。
【００５０】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、治療剤は、抗体、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、免疫賦活剤、免疫抑制剤、免疫チェックポイント阻害剤、抗生物質および抗血管新生剤の中から選択され得る。例えば、治療剤は、抗がん剤であり得る。本明細書中に提供する組合せのある態様においては、抗がん剤は、抗がん抗体、化学療法剤、放射免疫治療薬、抗血管新生剤または免疫チェックポイント阻害剤であり得る。
【００５１】
例えば、抗がん剤は免疫チェックポイント阻害剤であってもよく、免疫チェックポイント阻害剤の標的は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の中から選択され得る。本明細書中に提供する組合せのある態様においては、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、融合タンパク質、アプタマーまたはそれらの免疫チェックポイントタンパク質結合断片であり得る。例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体またはその抗原結合断片である。特定の例において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬ４抗体、その誘導体またはそれらの抗原結合断片、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その誘導体またはそれらの抗原結合断片および抗ＰＤ−１抗体、その誘導体またはそれらの抗原結合断片の中から選択される。例えば、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片、トレメリムマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片、ニボルマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片およびピジリズマブ、その誘導体またはそれらの抗原結合断片の中から選択され得る。
【００５２】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、治療剤は、抗ヒアルロナン剤であり得る。例えば、抗ヒアルロナン剤は、可溶性ヒアルロニダーゼであり得る。本明細書中に提供する組合せのある態様においては、可溶性ヒアルロニダーゼは、中性ｐＨでヒアルロニダーゼ活性を示すことができる。特に、可溶性ヒアルロニダーゼは、ウシＰＨ２０、ヒツジＰＨ２０またはグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカー結合配列の全てもしくは一部を欠如するＣ末端切断型ヒトＰＨ２０の中から選択され得る。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４、もしくは５２６〜５３２のいずれかに記載するものまたはアミノ酸の配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４、もしくは５２６〜５３２のいずれかに記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するものなどの、ＧＰＩアンカー結合配列の全てまたは一部を欠如するＣ末端切断型ヒトＰＨ２０であり、可溶性であり、ヒアルロニダーゼ活性を保持する。本明細書中に提供する組合せのある態様においては、抗ヒアルロナン剤または可溶性ヒアルロニダーゼは、ＰＥＧ部分などのポリマーにコンジュゲートし得る。
【００５３】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示すことができる配列またはそれらの触媒活性形態を含むことができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を有するタンパク質を含むことができる。特定の例において、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列を含有することができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列を含有することができる。
【００５４】
本発明に提供する組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾ＡＤＡ２ポリペプチドのアミノ酸の配列において修飾を含むアミノ酸の配列を有する変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分である。かかる例のいずれかにおいて、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列、もしくは配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列を含むことができるかまたはそれらの触媒活性部分であり、アミノ酸修飾は、アミノ酸置き換え、欠失および挿入の中から選択され、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性を示して、アデノシンをイノシンに変換することができる。
【００５５】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約５×１０３Ｍ−１ｓ−１、６×１０３Ｍ−１ｓ−１、７×１０３Ｍ−１ｓ−１、８×１０３Ｍ−１ｓ−１、９×１０３Ｍ−１ｓ−１、１×１０４Ｍ−１ｓ−１、２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができる。
【００５６】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、未修飾ＡＤＡ２タンパク質のアミノ酸の配列における修飾は、アミノ酸置き換えを含むことができ、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基１１、１３、２０、２２、２６、８６、１７９、２１７、２１９、２２１、２５８、２６２、２６４、２６６、２６７、２７７、２８３、２９６、３０９、３１７、３２１、３５２、３６６、３７１、３７２、３７３、３７４、４０３、４０４、４０５、４０６、４４１、４４４、４５２、４６１、４６９または４７０に相当するアミノ酸位置で、１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｋ１３Ｄ、Ｋ１３Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２０Ｎ、Ｖ２２Ｓ、Ｋ２６Ａ、Ｋ２６Ｄ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ８６Ａ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｅ、Ｄ８６Ｆ、Ｄ８６Ｇ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｌ、Ｄ８６Ｍ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ８６Ｐ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｒ、Ｄ８６Ｓ、Ｄ８６Ｔ、Ｄ８６Ｖ、Ｄ８６Ｗ、Ｄ８６Ｙ、Ｅ１７９Ａ、Ｅ１７９Ｃ、Ｅ１７９Ｄ、Ｅ１７９Ｆ、Ｅ１７９Ｇ、Ｅ１７９Ｈ、Ｅ１７９Ｉ、Ｅ１７９Ｋ、Ｅ１７９Ｌ、Ｅ１７９Ｍ、Ｅ１７９Ｎ、Ｅ１７９Ｐ、Ｅ１７９Ｑ、Ｅ１７９Ｒ、Ｅ１７９Ｓ、Ｅ１７９Ｔ、Ｅ１７９Ｖ、Ｅ１７９Ｗ、Ｅ１７９Ｙ、Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ａ、Ｒ２１９Ｃ、Ｒ２１９Ｄ、Ｒ２１９Ｅ、Ｒ２１９Ｆ、Ｒ２１９Ｇ、Ｒ２１９Ｈ、Ｒ２１９Ｉ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｌ、Ｒ２１９Ｍ、Ｒ２１９Ｎ、Ｒ２１９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９Ｓ、Ｒ２１９Ｔ、Ｒ２１９Ｖ、Ｒ２１９Ｗ、Ｒ２１９Ｙ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｃ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ、Ｌ２２１Ｆ、Ｌ２２１Ｇ、Ｌ２２１Ｈ、Ｌ２２１Ｉ、Ｌ２２１Ｋ、Ｌ２２１Ｍ、Ｌ２２１Ｎ、Ｌ２２１Ｐ、Ｌ２２１Ｑ、Ｌ２２１Ｒ、Ｌ２２１Ｓ、Ｌ２２１Ｔ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｗ、Ｌ２２１Ｙ、Ｋ２５８Ａ、Ｋ２５８Ｄ、Ｋ２５８Ｅ、Ｓ２６２Ａ、Ｓ２６２Ｃ、Ｓ２６２Ｄ、Ｓ２６２Ｅ、Ｓ２６２Ｆ、Ｓ２６２Ｇ、Ｓ２６２Ｈ、Ｓ２６２Ｉ、Ｓ２６２Ｋ、Ｓ２６２Ｌ、Ｓ２６２Ｍ、Ｓ２６２Ｎ、Ｓ２６２Ｐ、Ｓ２６２Ｑ、Ｓ２６２Ｒ、Ｓ２６２Ｔ、Ｓ２６２Ｖ、Ｓ２６２Ｗ、Ｓ２６２Ｙ、Ｈ２６４Ａ、Ｈ２６４Ｃ、Ｈ２６４Ｄ、Ｈ２６４Ｅ、Ｈ２６４Ｆ、Ｈ２６４Ｇ、Ｈ２６４Ｉ、Ｈ２６４Ｋ、Ｈ２６４Ｌ、Ｈ２６４Ｍ、Ｈ２６４Ｎ、Ｈ２６４Ｐ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｒ、Ｈ２６４Ｓ、Ｈ２６４Ｔ、Ｈ２６４Ｖ、Ｈ２６４Ｗ、Ｈ２６４Ｙ、Ｓ２６６Ａ、Ｓ２６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｓ２６６Ｅ、Ｓ２６６Ｆ、Ｓ２６６Ｇ、Ｓ２６６Ｈ、Ｓ２６６Ｉ、Ｓ２６６Ｋ、Ｓ２６６Ｌ、Ｓ２６６Ｍ、Ｓ２６６Ｎ、Ｓ２６６Ｐ、Ｓ２６６Ｑ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２６６Ｔ、Ｓ２６６Ｖ、Ｓ２６６Ｗ、Ｓ２６６Ｙ、Ｋ２６７Ａ、Ｋ２６７Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｋ２６７Ｅ、Ｋ２６７Ｆ、Ｋ２６７Ｇ、Ｋ２６７Ｈ、Ｋ２６７Ｉ、Ｋ２６７Ｌ、Ｋ２６７Ｍ、Ｋ２６７Ｎ、Ｋ２６７Ｐ、Ｋ２６７Ｑ、Ｋ２６７Ｒ、Ｋ２６７Ｓ、Ｋ２６７Ｔ、Ｋ２６７Ｖ、Ｋ２６７Ｗ、Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２７７Ａ、Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２８３Ａ、Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２８３Ｅ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ２９６Ｃ、Ｖ２９６Ｄ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｆ、Ｖ２９６Ｇ、Ｖ２９６Ｈ、Ｖ２９６Ｉ、Ｖ２９６Ｋ、Ｖ２９６Ｌ、Ｖ２９６Ｍ、Ｖ２９６Ｎ、Ｖ２９６Ｐ、Ｖ２９６Ｑ、Ｖ２９６Ｒ、Ｖ２９６Ｓ、Ｖ２９６Ｔ、Ｖ２９６Ｗ、Ｖ２９６Ｙ、Ｋ３０９Ａ、Ｋ３０９Ｄ、Ｋ３０９Ｅ、Ｋ３１７Ａ、Ｋ３１７Ｄ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３２１Ａ、Ｋ３２１Ｄ、Ｋ３２１Ｅ、Ｒ３５２Ａ、Ｒ３５２Ｄ、Ｒ３５２Ｅ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ３７２Ｎ、Ｄ３７３Ｓ、Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ、Ｇ４０４Ｎ、Ｈ４０５Ｓ、Ｐ４０６Ｓ、Ｒ４４１Ａ、Ｒ４４１Ｄ、Ｒ４４１Ｅ、Ｋ４４４Ａ、Ｋ４４４Ｄ、Ｋ４４４Ｅ、Ｋ４５２Ａ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ４６１Ａ、Ｋ４６１Ｄ、Ｋ４６１Ｅ、Ｋ４６９Ａ、Ｋ４６９Ｄ、Ｋ４６９Ｅ、Ｋ４７０Ａ、Ｋ４７０ＤおよびＫ４７０Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。特定の例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｓ２６２Ｎ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２ＤおよびＫ４５２Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。本明細書中に提供する組合せのいくつかの例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０ＥおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎの中から選択されるアミノ酸置き換えを含むことができる。
【００５７】
本明細書中に記載する組合せのある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインにおける１以上のアミノ酸の修飾を含むことができ、ここで修飾は、アミノ酸欠失、挿入または置き換えである。例えば、変異型ＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間または約アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間の(両端を含む)、任意の１以上の連続するアミノ酸残基に相当する１以上の連続するアミノ酸残基の欠失を含むことができる。ある態様においては、ＡＤＡ２ポリペプチドの変異体は、ペプチドリンカーによる欠失領域の置換をさらに含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号３６８)(式中、ｎは、２〜２０である)、(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号３４３)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＳＳＳＳＧ)ｎ(配列番号３４４)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ)ｎ(配列番号３５０)(式中、ｎは、１〜６である)、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号３４５)、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３４６)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号３４７)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号３４８)およびＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号３４９)の中から選択され得る。特定の例において、ペプチドリンカーは、ＧＧＧ(配列番号３６９)、ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)、ＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７０)、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７１)およびＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７２)の中から選択される。本明細書中に提供する組合せのある態様においては、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドのＰＲＢドメインにおける修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５またはＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３などの、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎは、２〜２０である)に相当する。
【００５８】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、組合せにおけるＡＤＡ２タンパク質は、１つもしくは複数の自然または非自然グリコシル化部位でグリコシル化され得る。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質を含有する本明細書中に提供する組合せのある態様においては、組合せにおける変異型ＡＤＡ２タンパク質は、非自然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を変更させる修飾を含む。非自然グリコシル化部位は、１個、２個もしくは３個のアミノ酸のアミノ酸置き換えまたは挿入により導入される。例えば、過グリコシル化を変更させる修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳおよびＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓに相当する修飾の中から選択され得る。
【００５９】
本明細書中に提供する組合せのある態様においては、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、配列番号１３〜６３もしくは７１〜２８５のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはそれらの触媒活性部分を有する。
【００６０】
本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分のいずれか、本明細書中に提供する任意の変異型ＡＤＡ２二量体または本明細書中に提供する任意のコンジュゲートを薬学的に許容される媒体中に含むことができる医薬組成物が、本明細書中に提供される。ある態様においては、医薬組成物は、局所または全身投与用に製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、静脈投与用に製剤化され得る。
【００６１】
本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質もしくはその触媒活性部分のいずれか、本明細書中に提供する任意の変異型ＡＤＡ２二量体、本明細書中に提供する任意のコンジュゲートまたは本明細書中に提供する任意の組合せを対象に投与することを含むことができる、対象における腫瘍またはがんを処置する方法が、本明細書中に提供される。また、対象における腫瘍またはがんを処置するための、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質もしくはその触媒活性部分のいずれか、本明細書中に提供する任意の変異型ＡＤＡ２二量体または本明細書中に提供する任意のコンジュゲートの医学的使用または使用のための医薬組成物が提供される。また、腫瘍またはがんを処置する際における使用のための本明細書中に提供する組合せのいずれかの使用のための組合せが提供される。
【００６２】
また、任意のＡＤＡ２タンパク質を対象に投与することを含むことができる、対象における腫瘍またはがんを処置する方法が、本明細書中に提供される。また、腫瘍またはがんを処置するためのＡＤＡ２タンパク質の医学的使用またはＡＤＡ２タンパク質を含有する使用のための医薬組成物が提供される。また、腫瘍またはがんを処置するためのＡＤＡ２タンパク質および治療剤を含有する使用のための組合せが提供される。
【００６３】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物のある態様においては、腫瘍は、固形腫瘍または転移性腫瘍であり得る。特定の例において、腫瘍は、癌腫、神経膠腫、肉腫、腺癌、腺肉腫または腺腫であり得る。ある態様においては、腫瘍は、胸部、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部および頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓の腫瘍であり得る。
【００６４】
本明細書中に提供する方法のある態様においては、対象は、血漿アデノシンのレベルの上昇、アデノシン受容体(ＡＤＲ)の腫瘍関連発現またはヌクレオチダーゼの腫瘍関連発現に基づいて処置のために選択され得る。特定の例において、ＡＤＲは、Ａ２ＡまたはＡ２Ｂである。特定の例において、ヌクレオチダーゼは、ＣＤ３９またはＣＤ７３である。本明細書中に提供する方法のある態様においては、レベルの上昇は、既定レベルまたは既定量または対照試料と比較して、少なくとも０.５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上である。
【００６５】
本明細書中に提供する方法のある態様においては、対象における腫瘍またはがんを処置する方法は、１つもしくは複数の抗がん剤または処置の投与をさらに含むことができる。例えば、抗がん剤は、抗がん抗体、化学療法剤、放射免疫治療薬、抗血管新生剤および免疫チェックポイント阻害剤の中から選択され得る。
【００６６】
非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害もしくは重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)である疾患または状態を処置するための、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質もしくはその触媒活性部分、本明細書中に提供する任意の変異型ＡＤＡ２二量体、本明細書中に提供する任意のコンジュゲートまたは本明細書中に提供する任意の組合せを対象に投与することを含むことができる、対象における疾患または状態を処置する方法が、本明細書中に提供される。また、対象における非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)を処置するための、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質もしくはその触媒活性部分、本明細書中に提供する任意の変異型ＡＤＡ２二量体または本明細書中に提供する任意のコンジュゲートの医学的使用または使用のための医薬組成物が提供される。また、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)を処置する際における使用のための本明細書中に提供する組合せのいずれかの使用のための組合せが提供される。また、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)である疾患または状態を処置するための任意のＡＤＡ２タンパク質を対象に投与することを含むことができる、対象における疾患または状態を処置する方法が、本明細書中に提供される。また、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)である疾患または状態を処置するためのＡＤＡ２タンパク質の医学的使用またはＡＤＡ２タンパク質を含有する使用のための医薬組成物が提供される。また、非がん過剰増殖性疾患、線維性疾患、感染性疾患、血管障害または重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)である疾患または状態を処置するためのＡＤＡ２タンパク質および治療剤を含有する使用ための組合せが提供される。
【００６７】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物のある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、単量体または二量体であり得る。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、二量体、特にホモ二量体である。本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示すことができる配列またはそれらの触媒活性形態を含有することができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を有するタンパク質を含有することができる。特定の例において、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列またはその触媒活性部分を含有することができる。例えば、ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載のアミノ酸の配列を含有することができる。
【００６８】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾ＡＤＡ２ポリペプチドのアミノ酸の配列またはその触媒活性部分において修飾を含む変異型ＡＤＡ２タンパク質である。かかる例のいずれかにおいて、未修飾ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列、もしくは配列番号５に記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％配列同一性を示すことができるアミノ酸の配列を含むことができるかまたはそれらの触媒活性部分であり、アミノ酸修飾は、アミノ酸置き換え、欠失および挿入の中から選択され、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、アデノシンデアミナーゼ活性を示して、アデノシンをイノシンに変換することができる。
【００６９】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、少なくともまたは少なくとも約５×１０３Ｍ−１ｓ−１、６×１０３Ｍ−１ｓ−１、７×１０３Ｍ−１ｓ−１、８×１０３Ｍ−１ｓ−１、９×１０３Ｍ−１ｓ−１、１×１０４Ｍ−１ｓ−１、２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示すことができる。
【００７０】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、未修飾ＡＤＡ２ポリペプチドのアミノ酸の配列における修飾は、アミノ酸置き換えを含むことができ、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基１１、１３、２０、２２、２６、８６、１７９、２１７、２１９、２２１、２５８、２６２、２６４、２６６、２６７、２７７、２８３、２９６、３０９、３１７、３２１、３５２、３６６、３７１、３７２、３７３、３７４、４０３、４０４、４０５、４０６、４４１、４４４、４５２、４６１、４６９または４７０に相当するアミノ酸位置で、１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｋ１３Ｄ、Ｋ１３Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２０Ｎ、Ｖ２２Ｓ、Ｋ２６Ａ、Ｋ２６Ｄ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ８６Ａ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｅ、Ｄ８６Ｆ、Ｄ８６Ｇ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｌ、Ｄ８６Ｍ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ８６Ｐ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｒ、Ｄ８６Ｓ、Ｄ８６Ｔ、Ｄ８６Ｖ、Ｄ８６Ｗ、Ｄ８６Ｙ、Ｅ１７９Ａ、Ｅ１７９Ｃ、Ｅ１７９Ｄ、Ｅ１７９Ｆ、Ｅ１７９Ｇ、Ｅ１７９Ｈ、Ｅ１７９Ｉ、Ｅ１７９Ｋ、Ｅ１７９Ｌ、Ｅ１７９Ｍ、Ｅ１７９Ｎ、Ｅ１７９Ｐ、Ｅ１７９Ｑ、Ｅ１７９Ｒ、Ｅ１７９Ｓ、Ｅ１７９Ｔ、Ｅ１７９Ｖ、Ｅ１７９Ｗ、Ｅ１７９Ｙ、Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ａ、Ｒ２１９Ｃ、Ｒ２１９Ｄ、Ｒ２１９Ｅ、Ｒ２１９Ｆ、Ｒ２１９Ｇ、Ｒ２１９Ｈ、Ｒ２１９Ｉ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｌ、Ｒ２１９Ｍ、Ｒ２１９Ｎ、Ｒ２１９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９Ｓ、Ｒ２１９Ｔ、Ｒ２１９Ｖ、Ｒ２１９Ｗ、Ｒ２１９Ｙ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｃ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ、Ｌ２２１Ｆ、Ｌ２２１Ｇ、Ｌ２２１Ｈ、Ｌ２２１Ｉ、Ｌ２２１Ｋ、Ｌ２２１Ｍ、Ｌ２２１Ｎ、Ｌ２２１Ｐ、Ｌ２２１Ｑ、Ｌ２２１Ｒ、Ｌ２２１Ｓ、Ｌ２２１Ｔ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｗ、Ｌ２２１Ｙ、Ｋ２５８Ａ、Ｋ２５８Ｄ、Ｋ２５８Ｅ、Ｓ２６２Ａ、Ｓ２６２Ｃ、Ｓ２６２Ｄ、Ｓ２６２Ｅ、Ｓ２６２Ｆ、Ｓ２６２Ｇ、Ｓ２６２Ｈ、Ｓ２６２Ｉ、Ｓ２６２Ｋ、Ｓ２６２Ｌ、Ｓ２６２Ｍ、Ｓ２６２Ｎ、Ｓ２６２Ｐ、Ｓ２６２Ｑ、Ｓ２６２Ｒ、Ｓ２６２Ｔ、Ｓ２６２Ｖ、Ｓ２６２Ｗ、Ｓ２６２Ｙ、Ｈ２６４Ａ、Ｈ２６４Ｃ、Ｈ２６４Ｄ、Ｈ２６４Ｅ、Ｈ２６４Ｆ、Ｈ２６４Ｇ、Ｈ２６４Ｉ、Ｈ２６４Ｋ、Ｈ２６４Ｌ、Ｈ２６４Ｍ、Ｈ２６４Ｎ、Ｈ２６４Ｐ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｒ、Ｈ６５４Ｓ、Ｈ２６４Ｔ、Ｈ２６４Ｖ、Ｈ２６４Ｗ、Ｈ２６４Ｙ、Ｓ２６６Ａ、Ｓ２６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｓ２６６Ｅ、Ｓ２６６Ｆ、Ｓ２６６Ｇ、Ｓ２６６Ｈ、Ｓ２６６Ｉ、Ｓ２６６Ｋ、Ｓ２６６Ｌ、Ｓ２６６Ｍ、Ｓ２６６Ｎ、Ｓ２６６Ｐ、Ｓ２６６Ｑ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２６６Ｔ、Ｓ２６６Ｖ、Ｓ２６６Ｗ、Ｓ２６６Ｙ、Ｋ２６７Ａ、Ｋ２６７Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｋ２６７Ｅ、Ｋ２６７Ｆ、Ｋ２６７Ｇ、Ｋ２６７Ｈ、Ｋ２６７Ｉ、Ｋ２６７Ｌ、Ｋ２６７Ｍ、Ｋ２６７Ｎ、Ｋ２６７Ｐ、Ｋ２６７Ｑ、Ｋ２６７Ｒ、Ｋ２６７Ｓ、Ｋ２６７Ｔ、Ｋ２６７Ｖ、Ｋ２６７Ｗ、Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２７７Ａ、Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２８３Ａ、Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２８３Ｅ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ２９６Ｃ、Ｖ２９６Ｄ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｆ、Ｖ２９６Ｇ、Ｖ２９６Ｈ、Ｖ２９６Ｉ、Ｖ２９６Ｋ、Ｖ２９６Ｌ、Ｖ２９６Ｍ、Ｖ２９６Ｎ、Ｖ２９６Ｐ、Ｖ２９６Ｑ、Ｖ２９６Ｒ、Ｖ２９６Ｓ、Ｖ２９６Ｔ、Ｖ２９６Ｗ、Ｖ２９６Ｙ、Ｋ３０９Ａ、Ｋ３０９Ｄ、Ｋ３０９Ｅ、Ｋ３１７Ａ、Ｋ３１７Ｄ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３２１Ａ、Ｋ３２１Ｄ、Ｋ３２１Ｅ、Ｒ３５２Ａ、Ｒ３５２Ｄ、Ｒ３５２Ｅ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ３７２Ｎ、Ｄ３７３Ｓ、Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ、Ｇ４０４Ｎ、Ｈ４０５Ｓ、Ｐ４０６Ｓ、Ｒ４４１Ａ、Ｒ４４１Ｄ、Ｒ４４１Ｅ、Ｋ４４４Ａ、Ｋ４４４Ｄ、Ｋ４４４Ｅ、Ｋ４５２Ａ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ４６１Ａ、Ｋ４６１Ｄ、Ｋ４６１Ｅ、Ｋ４６９Ａ、Ｋ４６９Ｄ、Ｋ４６９Ｅ、Ｋ４７０Ａ、Ｋ４７０ＤおよびＫ４７０Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。
【００７１】
特定の例において、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｓ２６２Ｎ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２ＤおよびＫ４５２Ｅの中から選択される１以上のアミノ酸置き換えを含むことができる。本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ、Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０ＥおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎの中から選択されるアミノ酸置き換えを含むことができる。
【００７２】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、アミノ酸欠失、挿入または置き換えなどの推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインにおける１以上のアミノ酸の修飾を含むことができる。例えば、変異型ＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間または約アミノ酸残基９８と１５６もしくはアミノ酸残基１０５と１４８との間の(両端を含む)、任意の１以上の連続するアミノ酸残基に相当する１以上の連続するアミノ酸残基の欠失を含むことができる。本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのかかる例のいずれかにおいて、ＡＤＡ２タンパク質の変異体は、ペプチドリンカーによる欠失領域の置換をさらに含むことができる。例えば、ペプチドリンカーは、(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号３６８)(式中、ｎは、２〜２０である)、(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号３４３)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＳＳＳＳＧ)ｎ(配列番号３４４)(式中、ｎは、１〜６である)、(ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ)ｎ(配列番号３５０)(式中、ｎは、１〜６である)、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号３４５)、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３４６)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号３４７)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号３４８)およびＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号３４９)の中から選択される。特定の例において、ペプチドリンカーは、ＧＧＧ(配列番号３６９)、ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)、ＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７０)、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７１)およびＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７２)の中から選択される。例えば、ＡＤＡ２タンパク質のＰＲＢドメインにおける修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５またはＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３などの、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎは、２〜２０である)に相当する。
【００７３】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、ＡＤＡ２タンパク質は、１つもしくは複数の自然または非自然グリコシル化部位でグリコシル化され得る。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質を含有する本明細書中に提供するある態様においては、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、非自然グリコシル化部位の導入によりグリコシル化を変更させる修飾を含む。例えば、非自然グリコシル化部位は、１個、２個もしくは３個のアミノ酸のアミノ酸置き換えまたは挿入により導入される。特定の例において、グリコシル化を変更させる修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関して、−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳおよびＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓに相当する修飾の中から選択される。
【００７４】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物または使用のための組合せのある態様においては、変異型ＡＤＡ２は、配列番号１３〜６３もしくは７１〜２８５のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはそれらの触媒活性部分を有するポリペプチドを含むことができる。
【００７５】
本明細書中に提供する方法、使用、使用のための医薬組成物のある態様においては、対象は、哺乳動物、特にヒトであり得る。本明細書中に提供する方法のある態様においては、医薬組成物は、非経口的に、局所的にまたは全身的に投与され得る。例えば、医薬組成物は、鼻腔内に、筋肉内に、皮内に、腹腔内に、静脈内に、皮下に、経口的にまたは肺投与により投与され得る。
【００７６】
ある態様においては、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２タンパク質またはその触媒活性部分、方法、組成物、コンジュゲート、修飾形態、ベクター、細胞、組合せ、使用および使用のための組成物における変異型ＡＤＡ２タンパク質、ならびに本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２をコードする核酸および核酸を含むベクターにおいて、修飾は、下記アミノ酸置き換え、挿入、欠失およびそれらの任意の組合せの任意の１つまたは複数に由来し得る。以下で列挙する修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸位置において記載するように、成熟ナンバリング(mature numbering)に関するものである。本明細書中に提供する例示的なＡＤＡ２変異体は、下記であり、種々のタイプの突然変異体(アミノ酸修飾)を組み合わせて、各タイプの突然変異の特性を活用することができることが理解されよう。概して、タンパク質における突然変異の影響が少なくとも相加的であり、相乗的であり得ることが当業者に理解されよう。
【００７７】
１. ヘパリン結合突然変異体
下記修飾は、ヘパリン結合の低減を付与し得る。ヘパリンへの結合は、投与されるＡＤＡ２の循環レベルを激減させ得る。したがって、下記ＡＤＡ２変異体は、投与されるＡＤＡ２のバイオアベイラビリティおよび薬物動態を増加し得る：
Ｋ１１Ａ；Ｋ１１Ｄ；Ｋ１１Ｅ；Ｋ１３Ａ；Ｋ１３Ｄ；Ｋ１３Ｅ；Ｋ３７１Ａ；Ｋ３７１Ｄ；Ｋ３７１Ｅ；Ｋ３７２Ａ；Ｋ３７２Ｄ；Ｋ３７２Ｅ；Ｋ４５２Ａ；Ｋ４５２Ｄ；Ｋ４５２Ｅ；Ｒ２０Ａ；Ｒ２０Ｄ；Ｒ２０Ｅ；Ｒ３６６Ａ；Ｒ３６６Ｄ；Ｒ３６６Ｅ；Ｋ２６Ａ；Ｋ２６Ｄ；Ｋ２６Ｅ；Ｒ２１７Ａ；Ｒ２１７Ｄ；Ｒ２１７Ｅ；Ｋ２５８Ａ；Ｋ２５８Ｄ；Ｋ２５８Ｅ；Ｒ２７７Ａ；Ｒ２７７Ｄ；Ｒ２７７Ｅ；Ｒ２８３Ａ；Ｒ２８３Ｄ；Ｒ２８３Ｅ；Ｋ３０９Ａ；Ｋ３０９Ｄ；Ｋ３０９Ｅ；Ｋ３１７Ａ；Ｋ３１７Ｄ；Ｋ３１７Ｅ；Ｋ３２１Ａ；Ｋ３２１Ｄ；Ｋ３２１Ｅ；Ｒ３５２Ａ；Ｒ３５２Ｄ；Ｒ３５２Ｅ；Ｒ４４１Ａ；Ｒ４４１Ｄ；Ｒ４４１Ｅ；Ｋ４４４Ａ；Ｋ４４４Ｄ；Ｋ４４４Ｅ；Ｋ４６１Ａ；Ｋ４６１Ｄ；Ｋ４６１Ｅ；Ｋ４６９Ａ；Ｋ４６９Ｄ；Ｋ４６９Ｅ；Ｋ４７０Ａ；Ｋ４７０Ｄ；およびＫ４７０Ｅ。
【００７８】
これらの置き換えを含有するヘパリン結合突然変異体の例。
Ｋ１１Ａ(配列番号１３)；Ｋ１１Ｄ(配列番号１４)；Ｋ１１Ｅ(配列番号１５)；Ｋ１３Ａ(配列番号１６)；Ｋ１３Ｄ(配列番号１７)；Ｋ１３Ｅ(配列番号１８)；Ｋ３７１Ａ(配列番号１９)；Ｋ３７１Ｄ(配列番号２０)；Ｋ３７１Ｅ(配列番号２１)；Ｋ３７２Ａ(配列番号２２)；Ｋ３７２Ｄ(配列番号２３)；Ｋ３７２Ｅ(配列番号２４)；Ｋ４５２Ａ(配列番号２５)；Ｋ４５２Ｄ(配列番号２６)；Ｋ４５２Ｅ(配列番号２７)；Ｒ２０Ａ(配列番号２８)；Ｒ２０Ｄ(配列番号２９)；Ｒ２０Ｅ(配列番号３０)；Ｒ３６６Ａ(配列番号３１)；Ｒ３６６Ｄ(配列番号３２)；Ｒ３６６Ｅ(配列番号３３)；Ｋ２６Ａ(配列番号７１)；Ｋ２６Ｄ(配列番号７２)；Ｋ２６Ｅ(配列番号７３)；Ｒ２１７Ａ(配列番号７４)；Ｒ２１７Ｄ(配列番号７５)；Ｒ２１７Ｅ(配列番号７６)；Ｋ２５８Ａ(配列番号７７)；Ｋ２５８Ｄ(配列番号７８)；Ｋ２５８Ｅ(配列番号７９)；Ｒ２７７Ａ(配列番号８０)；Ｒ２７７Ｄ(配列番号８１)；Ｒ２７７Ｅ(配列番号８２)；Ｒ２８３Ａ(配列番号８３)；Ｒ２８３Ｄ(配列番号８４)；Ｒ２８３Ｅ(配列番号８５)；Ｋ３０９Ａ(配列番号８６)；Ｋ３０９Ｄ(配列番号８７)；Ｋ３０９Ｅ(配列番号８８)；Ｋ３１７Ａ(配列番号８９)；Ｋ３１７Ｄ(配列番号９０)；Ｋ３１７Ｅ(配列番号９１)；Ｋ３２１Ａ(配列番号９２)；Ｋ３２１Ｄ(配列番号９３)；Ｋ３２１Ｅ(配列番号９４)；Ｒ３５２Ａ(配列番号９５)；Ｒ３５２Ｄ(配列番号９６)；Ｒ３５２Ｅ(配列番号９７)；Ｒ４４１Ａ(配列番号９８)；Ｒ４４１Ｄ(配列番号９９)；Ｒ４４１Ｅ(配列番号１００)；Ｋ４４４Ａ(配列番号１０１)；Ｋ４４４Ｄ(配列番号１０２)；Ｋ４４４Ｅ(配列番号１０３)；Ｋ４６１Ａ(配列番号１０４)；Ｋ４６１Ｄ(配列番号１０５)；Ｋ４６１Ｅ(配列番号１０６)；Ｋ４６９Ａ(配列番号１０７)；Ｋ４６９Ｄ(配列番号１０８)；Ｋ４６９Ｅ(配列番号１０９)；Ｋ４７０Ａ(配列番号１１０)；Ｋ４７０Ｄ(配列番号１１１)；およびＫ４７０Ｅ(配列番号１１２)。
【００７９】
２. 活性部位突然変異体
下記修飾は、触媒効率の増加を付与し得る。修飾は、活性部位の限定された残基に存在し、アデノシンに関する触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)の改善を達成し得る。ヘパリンへの結合は、投与されるＡＤＡ２の循環レベルを激減させ得る。したがって、下記ＡＤＡ２変異体は、アデノシンデアミナーゼ活性の増加を付与し得る：
Ｈ２６４Ａ；Ｈ２６４Ｑ；Ｈ２６４Ｎ；Ｈ２６４Ｇ；Ｒ２１９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ；Ｒ２１９Ｎ；Ｒ２１９Ａ；Ｌ２２１Ａ；Ｌ２２１Ｖ；Ｌ２２１Ｇ；Ｅ１７９Ｄ；Ｅ１７９Ａ；Ｅ１７９Ｓ；Ｅ１７９Ｔ；Ｅ１７９Ｖ；Ｅ１７９Ｇ；Ｓ２６２Ａ；Ｓ２６２Ｖ；Ｓ２６２Ｍ；Ｓ２６２Ｎ；Ｄ８６Ａ；Ｄ８６Ｃ；Ｄ８６Ｅ；Ｄ８６Ｆ；Ｄ８６Ｇ；Ｄ８６Ｈ；Ｄ８６Ｉ；Ｄ８６Ｋ；Ｄ８６Ｌ；Ｄ８６Ｍ；Ｄ８６Ｎ；Ｄ８６Ｐ；Ｄ８６Ｑ；Ｄ８６Ｒ；Ｄ８６Ｓ；Ｄ８６Ｔ；Ｄ８６Ｖ；Ｄ８６Ｗ；Ｄ８６Ｙ；Ｅ１７９Ｃ；Ｅ１７９Ｆ；Ｅ１７９Ｈ；Ｅ１７９Ｉ；Ｅ１７９Ｋ；Ｅ１７９Ｌ；Ｅ１７９Ｍ；Ｅ１７９Ｎ；Ｅ１７９Ｐ；Ｅ１７９Ｑ；Ｅ１７９Ｒ；Ｅ１７９Ｗ；Ｅ１７９Ｙ；Ｒ２１９Ｃ；Ｒ２１９Ｄ；Ｒ２１９Ｅ；Ｒ２１９Ｆ；Ｒ２１９Ｇ；Ｒ２１９Ｈ；Ｒ２１９Ｉ；Ｒ２１９Ｌ；Ｒ２１９Ｍ；Ｒ２１９Ｐ；Ｒ２１９Ｓ；Ｒ２１９Ｔ；Ｒ２１９Ｖ；Ｒ２１９Ｗ；Ｒ２１９Ｙ；Ｌ２２１Ｃ；Ｌ２２１Ｄ；Ｌ２２１Ｅ；Ｌ２２１Ｆ；Ｌ２２１Ｈ；Ｌ２２１Ｉ；Ｌ２２１Ｋ；Ｌ２２１Ｍ；Ｌ２２１Ｎ；Ｌ２２１Ｐ；Ｌ２２１Ｑ；Ｌ２２１Ｒ；Ｌ２２１Ｓ；Ｌ２２１Ｔ；Ｌ２２１Ｗ；Ｌ２２１Ｙ；Ｓ２６２Ｃ；Ｓ２６２Ｄ；Ｓ２６２Ｅ；Ｓ２６２Ｆ；Ｓ２６２Ｇ；Ｓ２６２Ｈ；Ｓ２６２Ｉ；Ｓ２６２Ｋ；Ｓ２６２Ｌ；Ｓ２６２Ｐ；Ｓ２６２Ｑ；Ｓ２６２Ｒ；Ｓ２６２Ｔ；Ｓ２６２Ｗ；Ｓ２６２Ｙ；Ｈ２６４Ｃ；Ｈ２６４Ｄ；Ｈ２６４Ｅ；Ｈ２６４Ｆ；Ｈ２６４Ｉ；Ｈ２６４Ｋ；Ｈ２６４Ｌ；Ｈ２６４Ｍ；Ｈ２６４Ｐ；Ｈ２６４Ｒ；Ｈ２６４Ｓ；Ｈ２６４Ｔ；Ｈ２６４Ｖ；Ｈ２６４Ｗ；Ｈ２６４Ｙ；Ｓ２６６Ａ；Ｓ２６６Ｃ；Ｓ２６６Ｄ；Ｓ２６６Ｅ；Ｓ２６６Ｆ；Ｓ２６６Ｇ；Ｓ２６６Ｈ；Ｓ２６６Ｉ；Ｓ２６６Ｋ；Ｓ２６６Ｌ；Ｓ２６６Ｍ；Ｓ２６６Ｎ；Ｓ２６６Ｐ；Ｓ２６６Ｑ；Ｓ２６６Ｒ；Ｓ２６６Ｔ；Ｓ２６６Ｖ；Ｓ２６６Ｗ；Ｓ２６６Ｙ；Ｋ２６７Ａ；Ｋ２６７Ｃ；Ｋ２６７Ｄ；Ｋ２６７Ｅ；Ｋ２６７Ｆ；Ｋ２６７Ｇ；Ｋ２６７Ｈ；Ｋ２６７Ｉ；Ｋ２６７Ｌ；Ｋ２６７Ｍ；Ｋ２６７Ｎ；Ｋ２６７Ｐ；Ｋ２６７Ｑ；Ｋ２６７Ｒ；Ｋ２６７Ｓ；Ｋ２６７Ｔ；Ｋ２６７Ｖ；Ｋ２６７Ｗ；Ｋ２６７Ｙ；Ｖ２９６Ａ；Ｖ２９６Ｃ；Ｖ２９６Ｄ；Ｖ２９６Ｅ；Ｖ２９６Ｆ；Ｖ２９６Ｇ；Ｖ２９６Ｈ；Ｖ２９６Ｉ；Ｖ２９６Ｋ；Ｖ２９６Ｌ；Ｖ２９６Ｍ；Ｖ２９６Ｎ；Ｖ２９６Ｐ；Ｖ２９６Ｑ；Ｖ２９６Ｒ；Ｖ２９６Ｓ；Ｖ２９６Ｔ；Ｖ２９６Ｗ；およびＶ２９６Ｙ。
【００８０】
これらの置き換えを含有する活性部位突然変異体の例：
Ｈ２６４Ａ(配列番号３４)；Ｈ２６４Ｑ(配列番号３５)；Ｈ２６４Ｎ(配列番号３６)；Ｈ２６４Ｇ(配列番号３７)；Ｒ２１９Ｋ(配列番号３８)；Ｒ２１９Ｑ(配列番号３９)；Ｒ２１９Ｎ(配列番号４０)；Ｒ２１９Ａ(配列番号４１)；Ｌ２２１Ａ(配列番号４２)；Ｌ２２１Ｖ(配列番号４３)；Ｌ２２１Ｇ(配列番号４４)；Ｅ１７９Ｄ(配列番号４５)；Ｅ１７９Ａ(配列番号４６)；Ｅ１７９Ｓ(配列番号４７)；Ｅ１７９Ｔ(配列番号４８)；Ｅ１７９Ｖ(配列番号４９)；Ｅ１７９Ｇ(配列番号５０)；Ｓ２６２Ａ(配列番号５１)；Ｓ２６２Ｖ(配列番号５２)；Ｓ２６２Ｍ(配列番号５３)；Ｓ２６２Ｎ(配列番号５４)；Ｄ８６Ａ(配列番号１１３)；Ｄ８６Ｃ(配列番号１１４)；Ｄ８６Ｅ(配列番号１１５)；Ｄ８６Ｆ(配列番号１１６)；Ｄ８６Ｇ(配列番号１１７)；Ｄ８６Ｈ(配列番号１１８)；Ｄ８６Ｉ(配列番号１１９)；Ｄ８６Ｋ(配列番号１２０)；Ｄ８６Ｌ(配列番号１２１)；Ｄ８６Ｍ(配列番号１２２)；Ｄ８６Ｎ(配列番号１２３)；Ｄ８６Ｐ(配列番号１２４)；Ｄ８６Ｑ(配列番号１２５)；Ｄ８６Ｒ(配列番号１２６)；Ｄ８６Ｓ(配列番号１２７)；Ｄ８６Ｔ(配列番号１２８)；Ｄ８６Ｖ(配列番号１２９)；Ｄ８６Ｗ(配列番号１３０)；Ｄ８６Ｙ(配列番号１３１)；Ｅ１７９Ｃ(配列番号１３２)；Ｅ１７９Ｆ(配列番号１３３)；Ｅ１７９Ｈ(配列番号１３４)；Ｅ１７９Ｉ(配列番号１３５)；Ｅ１７９Ｋ(配列番号１３６)；Ｅ１７９Ｌ(配列番号１３７)；Ｅ１７９Ｍ(配列番号１３８)；Ｅ１７９Ｎ(配列番号１３９)；Ｅ１７９Ｐ(配列番号１４０)；Ｅ１７９Ｑ(配列番号１４１)；Ｅ１７９Ｒ(配列番号１４２)；Ｅ１７９Ｗ(配列番号１４３)；Ｅ１７９Ｙ(配列番号１４４)；Ｒ２１９Ｃ(配列番号１４５)；Ｒ２１９Ｄ(配列番号１４６)；Ｒ２１９Ｅ(配列番号１４７)；Ｒ２１９Ｆ(配列番号１４８)；Ｒ２１９Ｇ(配列番号１４９)；Ｒ２１９Ｈ(配列番号１５０)；Ｒ２１９Ｉ(配列番号１５１)；Ｒ２１９Ｌ(配列番号１５２)；Ｒ２１９Ｍ(配列番号１５３)；Ｒ２１９Ｐ(配列番号１５４)；Ｒ２１９Ｓ(配列番号１５５)；Ｒ２１９Ｔ(配列番号１５６)；Ｒ２１９Ｖ(配列番号１５７)；Ｒ２１９Ｗ(配列番号１５８)；Ｒ２１９Ｙ(配列番号１５９)；Ｌ２２１Ｃ(配列番号１６０)；Ｌ２２１Ｄ(配列番号１６１)；Ｌ２２１Ｅ(配列番号１６２)；Ｌ２２１Ｆ(配列番号１６３)；Ｌ２２１Ｈ(配列番号１６４)；Ｌ２２１Ｉ(配列番号１６５)；Ｌ２２１Ｋ(配列番号１６６)；Ｌ２２１Ｍ(配列番号１６７)；Ｌ２２１Ｎ(配列番号１６８)；Ｌ２２１Ｐ(配列番号１６９)；Ｌ２２１Ｑ(配列番号１７０)；Ｌ２２１Ｒ(配列番号１７１)；Ｌ２２１Ｓ(配列番号１７２)；Ｌ２２１Ｔ(配列番号１７３)；Ｌ２２１Ｗ(配列番号１７４)；Ｌ２２１Ｙ(配列番号１７５)；Ｓ２６２Ｃ(配列番号１７６)；Ｓ２６２Ｄ(配列番号１７７)；Ｓ２６２Ｅ(配列番号１７８)；Ｓ２６２Ｆ(配列番号１７９)；Ｓ２６２Ｇ(配列番号１８０)；Ｓ２６２Ｈ(配列番号１８１)；Ｓ２６２Ｉ(配列番号１８２)；Ｓ２６２Ｋ(配列番号１８３)；Ｓ２６２Ｌ(配列番号１８４)；Ｓ２６２Ｐ(配列番号１８５)；Ｓ２６２Ｑ(配列番号１８６)；Ｓ２６２Ｒ(配列番号１８７)；Ｓ２６２Ｔ(配列番号１８８)；Ｓ２６２Ｗ(配列番号１８９)；Ｓ２６２Ｙ(配列番号１９０)；Ｈ２６４Ｃ(配列番号１９１)；Ｈ２６４Ｄ(配列番号１９２)；Ｈ２６４Ｅ(配列番号１９３)；Ｈ２６４Ｆ(配列番号１��４)；Ｈ２６４Ｉ(配列番号１９５)；Ｈ２６４Ｋ(配列番号１９６)；Ｈ２６４Ｌ(配列番号１９７)；Ｈ２６４Ｍ(配列番号１９８)；Ｈ２６４Ｐ(配列番号１９９)；Ｈ２６４Ｒ(配列番号２００)；Ｈ２６４Ｓ(配列番号２０１)；Ｈ２６４Ｔ(配列番号２０２)；Ｈ２６４Ｖ(配列番号２０３)；Ｈ２６４Ｗ(配列番号２０４)；Ｈ２６４Ｙ(配列番号２０５)；Ｓ２６６Ａ(配列番号２０６)；Ｓ２６６Ｃ(配列番号２０７)；Ｓ２６６Ｄ(配列番号２０８)；Ｓ２６６Ｅ(配列番号２０９)；Ｓ２６６Ｆ(配列番号２１０)；Ｓ２６６Ｇ(配列番号２１１)；Ｓ２６６Ｈ(配列番号２１２)；Ｓ２６６Ｉ(配列番号２１３)；Ｓ２６６Ｋ(配列番号２１４)；Ｓ２６６Ｌ(配列番号２１５)；Ｓ２６６Ｍ(配列番号２１６)；Ｓ２６６Ｎ(配列番号２１７)；Ｓ２６６Ｐ(配列番号２１８)；Ｓ２６６Ｑ(配列番号２１９)；Ｓ２６６Ｒ(配列番号２２０)；Ｓ２６６Ｔ(配列番号２２１)；Ｓ２６６Ｖ(配列番号２２２)；Ｓ２６６Ｗ(配列番号２２３)；Ｓ２６６Ｙ(配列番号２２４)；Ｋ２６７Ａ(配列番号２２５)；Ｋ２６７Ｃ(配列番号２２６)；Ｋ２６７Ｄ(配列番号２２７)；Ｋ２６７Ｅ(配列番号２２８)；Ｋ２６７Ｆ(配列番号２２９)；Ｋ２６７Ｇ(配列番号２３０)；Ｋ２６７Ｈ(配列番号２３１)；Ｋ２６７Ｉ(配列番号２３２)；Ｋ２６７Ｌ(配列番号２３３)；Ｋ２６７Ｍ(配列番号２３４)；Ｋ２６７Ｎ(配列番号２３５)；Ｋ２６７Ｐ(配列番号２３６)；Ｋ２６７Ｑ(配列番号２３７)；Ｋ２６７Ｒ(配列番号２３８)；Ｋ２６７Ｓ(配列番号２３９)；Ｋ２６７Ｔ(配列番号２４０)；Ｋ２６７Ｖ(配列番号２４１)；Ｋ２６７Ｗ(配列番号２４２)；Ｋ２６７Ｙ(配列番号２４３)；Ｖ２９６Ａ(配列番号２４４)；Ｖ２９６Ｃ(配列番号２４５)；Ｖ２９６Ｄ(配列番号２４６)；Ｖ２９６Ｅ(配列番号２４７)；Ｖ２９６Ｆ(配列番号２４８)；Ｖ２９６Ｇ(配列番号２４９)；Ｖ２９６Ｈ(配列番号２５０)；Ｖ２９６Ｉ(配列番号２５１)；Ｖ２９６Ｋ(配列番号２５２)；Ｖ２９６Ｌ(配列番号２５３)；Ｖ２９６Ｍ(配列番号２５４)；Ｖ２９６Ｎ(配列番号２５５)；Ｖ２９６Ｐ(配列番号２５６)；Ｖ２９６Ｑ(配列番号２５７)；Ｖ２９６Ｒ(配列番号２５８)；Ｖ２９６Ｓ(配列番号２５９)；Ｖ２９６Ｔ(配列番号２６０)；Ｖ２９６Ｗ(配列番号２６１)；およびＶ２９６Ｙ(配列番号２６２)。
【００８１】
３. 過グリコシル化突然変異体
下記修飾は、ＡＤＡ２において非自然グリコシル化を導入する。Ｎ連結されたグリコシル化部位などの非自然グリコシル化部位の導入は、安定性および薬物動態プロファイルの増加を付与し得る。したがって、下記ＡＤＡ２変異体は、ＡＤＡ２の過グリコシル化を達成して、投与されるＡＤＡ２の安定性および薬物動態プロファイルを増加することができる：
−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳおよびＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ。
【００８２】
これらの置き換えを含有する過グリコシル化突然変異体の例：
−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３(配列番号２７４)、Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ(配列番号２７５)、Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ(配列番号２７６)、Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ(配列番号２７７)、Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５Ｓ(配列番号２７８)およびＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ(配列番号２７９)。
【００８３】
４. ＰＲＢ欠失および置き換え突然変異体
下記変異体は、修飾ＰＲＢドメインを含有する。ＰＲＢドメインの修飾として、ＰＲＢドメインの全てもしくは一部の欠失(すなわち、ＰＲＢドメインの１以上の残基の欠失)、ＰＲＢドメインへの１つもしくは複数のアミノ酸残基の挿入、ＰＲＢドメインの１つもしくは複数の残基のアミノ酸置き換えまたはそれらの組合せが挙げられ得る。例えば、ＰＲＢドメインの欠失および／または置換は、活性の変更、受容体への結合および／または受容体により媒介される活性の低減を付与し得る。
Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；およびＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３。
【００８４】
これらの置き換えを含有するＰＲＢ欠失および置き換え突然変異体の例：
Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号２８０)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５(配列番号２８１)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０(配列番号２８２)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７(配列番号２８３)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５(配列番号２８４)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３(配列番号２８５)；Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ(配列番号５４８)；Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ(配列番号５４９)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ(配列番号５５０)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ(配列番号５７９)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号５８１)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号５８２)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号５８３)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号５８４)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号５８５)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号５８６)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号５８７)；およびＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号５８８)
【００８５】
５. ＰＲＢ過グリコシル化突然変異体
下記修飾は、ＰＲＢドメインにおいて非自然グリコシル化部位を導入することができる。ＰＲＢドメインにおけるＮ連結されたグリコシル化部位などの非自然グリコシル化部位の導入は、安定性および薬物動態プロファイルおよび／または他の活性の増加、例えば受容体への結合の低減を付与し得る。したがって、下記ＡＤＡ２変異体は、ＰＲＢドメインにおいてＡＤＡ２の過グリコシル化を達成して、受容体結合を低減させて、投与されるＡＤＡ２の安定性および薬物動態プロフィールを増加させることができる：
Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ、Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ、Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ、Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ、Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ、Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ、Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴおよびＰ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ。
【００８６】
これらの置き換えを含有するＰＲＢ過グリコシル化突然変異体の例：
Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ(配列番号５５２)；Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ(配列番号５５３)；Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ(配列番号５５４)；Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ(配列番号５５５)；Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ(配列番号５５６)；Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ(配列番号５５７)；Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ(配列番号５５８)；Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ(配列番号５５９)；およびＰ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ(配列番号５６０)。
【００８７】
６. ＰＲＢ−ＡＤＡドメイン相互作用突然変異体
下記修飾は、ＰＲＢドメインとＡＤＡ２の残余(アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)ドメイン)との間の相互作用の変更を付与し得る。ＰＲＢドメインとＡＤＡドメインなどのＡＤＡ２の残余との間の相互作用を変更させることにより、活性、例えばアデノシンデアミナーゼ活性の増加および受容体結合の低減を付与し得る：
Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ２２４Ｎ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ、Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｐ１２４ＡおよびＰ１２４Ｓ。
【００８８】
これらの置き換えを含有するＰＲＢ−ＡＤＡドメイン相互作用突然変異体の例：
Ｆ１１９Ｓ(配列番号５６１)；Ｆ１１９Ｋ(配列番号５６２)；Ｙ２２４Ｒ(配列番号５６３)；Ｙ２２４Ｎ(配列番号５６４)；Ｙ１９１Ｓ(配列番号５６５)；Ｙ１９１Ｄ(配列番号５６６)；Ｆ１８３Ｋ(配列番号５６７)；Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ(配列番号５６８)；Ｆ１０９Ｓ(配列番号５６９)；Ｆ１０９Ａ(配列番号５７０)；Ｒ１１８Ｄ(配列番号５７１)；Ｒ１１８Ａ(配列番号５７２)；Ｙ１３９Ｔ(配列番号５７３)；Ｙ１３９Ａ(配列番号５７４)；Ｗ１３３Ｓ(配列番号５７５)；Ｗ１３３Ｔ(配列番号５７６)；Ｐ１２４Ａ(配列番号５７７)；およびＰ１２４Ｓ(配列番号５７８)。
【００８９】
７. 突然変異と過グリコシル化突然変異体との組合せ
下記変異体は、Ｒ２１９Ｑおよび／またはＳ２６２Ｎなどのアデノシンに関する触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)の改善を達成する修飾を、非自然グリコシル化部位を導入する突然変異と組み合わせる：
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳおよびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ。
【００９０】
これらの置き換えを含有する過グリコシル化突然変異体との組合せ：
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３(配列番号５９６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ(配列番号５９７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ(配列番号５９８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ(配列番号５９９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５Ｓ(配列番号６００)；およびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ(配列番号６０１)。
【００９１】
８. 突然変異とＰＲＢ過グリコシル化突然変異体との組合せ
下記変異体は、Ｒ２１９Ｑおよび／またはＳ２６２Ｎなどのアデノシンに関する触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)の改善を達成する修飾を、ＰＲＢドメインにおいて非自然グリコシル化部位を導入する修飾と組み合わせる：
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ；およびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ。
【００９２】
これらの置き換えを含有するＰＲＢ過グリコシル化突然変異体との組合せの例：
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ(配列番号６０７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ(配列番号６０８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ(配列番号６０９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ(配列番号６１０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ(配列番号６１１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ(配列番号６１２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ(配列番号６１３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９Ｔ(配列番号６１４)；およびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ(配列番号６１５)。
【００９３】
９. ＰＲＢ−ＡＤＡドメイン相互作用突然変異体との組合せ
下記変異体は、Ｒ２１９Ｑおよび／またはＳ２６２Ｎなどのアデノシンに関する触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)の改善を達成する修飾を、ＰＲＢドメインとＡＤＡ２の残部(例えば、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)ドメイン)との間の相互作用を変更させる修飾と組み合わせる：
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ａ；およびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓ。
【００９４】
これらの置き換えを含有するＰＲＢ−ＡＤＡドメイン相互作用突然変異体との組合せ：
Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ(配列番号６１６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ(配列番号６１７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ(配列番号６１８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ(配列番号６１９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ(配列番号６２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ(配列番号６２１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ(配列番号６２２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ(配列番号６２３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ(配列番号６２４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ(配列番号６２５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ(配列番号６２６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ(配列番号６２７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ(配列番号６２８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ(配列番号６２９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ(配列番号６３０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ(配列番号６３１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ａ(配列番号６３２)；およびＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓ(配列番号６３３)。
【００９５】
１０. ＰＲＢ欠失突然変異体との組合せ
下記変異体は、Ｒ２１９Ｑおよび／またはＳ２６２Ｎなどのアデノシンに関する触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)の改善を達成する修飾および／またはＫ３７１Ｄなどのヘパリン結合の低減を付与する修飾を、ＰＲＢドメインにおける修飾、例えば欠失、挿入、置換および／または置き換えと組み合わせる：
Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−���１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)；Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；およびＳ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；およびＳ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ。
【００９６】
これらの置き換えを含有するＰＲＢ欠失突然変異体との組合せの例：
Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号５８９)；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号５９０)；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号５９１)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号５９２)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号５９３)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号５９４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５(配列番号６０２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０(配列番号６０３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７(配列番号６０４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５(配列番号６０５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３(配列番号６０６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号６３４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号６３５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号６３６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号６３７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号６３８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号６３９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号６４０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号６４１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号６４２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号６４３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号６４４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号６４５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)(配列番号６４６)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５(配列番号６４７)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０(配列番号６４８)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７(配列番号６４９)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５(配列番号６５０)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３(配列番号６５１)；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号６５２)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号６５３)；Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ(配列番号６５４)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ(配列番号６５５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ(配列番号６５６)；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ(配列番号６５７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)(配列番号６５８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号６６４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号６６５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ(配列番号６６６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ(配列番号６６７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ(配列番号６６８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ(配列番号６６９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)(配列番号６７０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５(配列番号６７１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０(配列番号６７２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７(配列番号６７３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５(配列番号６７４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３(配列番号６７５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号６７６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号６７７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ(配列番号６７８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ(配列番号６７９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ(配列番号６８０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ(配列番号６８１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)(配列番号９１８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号９１９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号９２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ(配列番号９２１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ(配列番号９２２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ(配列番号９２３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ(配列番号９２４)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎ＝２〜２０)(配列番号９２５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号９２６)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中、ｎ＝１〜５)(配列番号９２７)；Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ(配列番号９２８)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ(配列番号９２９)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ(配列番号９３０)；およびＳ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ(配列番号９３１)。
【００９７】
１１. 他の組合せ突然変異体
下記変異体は、Ｒ２１９Ｑおよび／またはＳ２６２Ｎなどのアデノシンに関する触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)の改善を達成する修飾、Ｋ３７１Ｄなどのヘパリン結合の低減を付与する修飾および他の修飾などの各種修飾を組み合わせる：
Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ；Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ａ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ；Ｒ２１９Ｃ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｄ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｅ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｆ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｇ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｈ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｉ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｌ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｍ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｐ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｓ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｔ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｖ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｗ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｙ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；およびＳ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ。
【００９８】
これらの置き換えを含有するこれらの組合せ突然変異体の例：
Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ(配列番号５５)；Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号５６)；Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号５７)；Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号５８)；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ(配列番号５９)；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ(配列番号６０)；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ(配列番号６１)；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ(配列番号６２)；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ(配列番号６３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ(配列番号２６３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ(配列番号２６４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ(配列番号２６５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ(配列番号２６６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ(配列番号２６７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ(配列番号２６８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ(配列番号２６９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ(配列番号２７０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ(配列番号２７１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ(配列番号２７２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号２７３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ(配列番号６５９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ(配列番号６６０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ(配列番号６６１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ(配列番号６６２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ(配列番号６６３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ(配列番号６８２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ(配列番号６８３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ(配列番号６８４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ(配列番号６８５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ(配列番号６８６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ(配列番号６８７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ(配列番号６８８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ(配列番号６８９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ(配列番号６９０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ(配列番号６９１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ(配列番号６９２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ(配列番号６９３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ(配列番号６９４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ(配列番号６９５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ(配列番号６９６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ(配列番号６９７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ(配列番号６９８)；Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号６９９)；Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７００)；Ｒ２１９Ａ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７０１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ(配列番号７０２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ(配列番号７０３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ(配列番号７０４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ(配列番号７０５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ(配列番号７０６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ(配列番号７０７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ(配列番号７０８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ(配列番号７０９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ(配列番号７１０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ａ(配列番号７１１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｖ(配列番号７１２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ(配列番号７１３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ(配列番号７１４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号７１５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号７１６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号７１７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ(配列番号７１８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ(配列番号７１９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ(配列番号７２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ(配列番号７２１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ(配列番号７２２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ(配列番号７２３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ(配列番号７２４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ(配列番号７２５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ(配列番号７２６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ(配列番号７２７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ(配列番号７２８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ(配列番号７２９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ(配列番号７３０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ(配列番号７３１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ(配列番号７３２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ(配列番号７３３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ(配列番号７３４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ(配列番号７３５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ(配列番号７３６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ(配列番号７３７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ(配列番号７３８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ(配列番号７３９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ(配列番号７４０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ(配列番号７４１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ(配列番号７４２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ(配列番号７４３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ(配列番号７４４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ(配列番号７４５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ(配列番号７４６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ(配列番号７４７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ(配列番号７４８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ(配列番号７４９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ(配列番号７５０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ(配列番号７５１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ(配列番号７５２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ(配列番号７５３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ(配列番号７５４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ(配列番号７５５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ(配列番号７５６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ(配列番号７５７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ(配列番号７５８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ(配列番号７５９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ(配列番号７６０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ(配列番号７６１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ(配列番号７６２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ(配列番号７６３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ(配列番号７６４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ(配列番号７６５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ(配列番号７６６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２��２Ｎ／Ｄ８６Ｋ(配列番号７６７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ(配列番号７６８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ(配列番号７６９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ(配列番号７７０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ(配列番号７７１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ(配列番号７７２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ(配列番号７７３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ(配列番号７７４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ(配列番号７７５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ(配列番号７７６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ(配列番号７７７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ(配列番号７７８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ(配列番号７７９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ(配列番号７８０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ(配列番号７８１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ(配列番号７８２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ(配列番号７８３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ(配列番号７８４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ(配列番号７８５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ(配列番号７８６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ(配列番号７８７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ(配列番号７８８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ(配列番号７８９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ(配列番号７９０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ(配列番号７９１)；Ｒ２１９Ｃ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９２)；Ｒ２１９Ｄ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９３)；Ｒ２１９Ｅ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９４)；Ｒ２１９Ｆ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９５)；Ｒ２１９Ｇ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９６)；Ｒ２１９Ｈ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９７)；Ｒ２１９Ｉ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９８)；Ｒ２１９Ｌ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号７９９)；Ｒ２１９Ｍ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８００)；Ｒ２１９Ｐ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８０１)；Ｒ２１９Ｓ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８０２)；Ｒ２１９Ｔ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８０３)；Ｒ２１９Ｖ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８０４)；Ｒ２１９Ｗ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８０５)；Ｒ２１９Ｙ／Ｓ２６２Ｎ(配列番号８０６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ(配列番号８０７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ(配列番号８０８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ(配列番号８０９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ(配列番号８１０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ(配列番号８１１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ(配列番号８１２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ(配列番号８１３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ(配列番号８１４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ(配列番号８１５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ(配列番号８１６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ(配列番号８１７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ(配列番号８１８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ(配列番号８１９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ(配列番号８２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ(配列番号８２１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ(配列番号８２２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｃ(配列番号８２３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｄ(配列番号８２４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｅ(配列番号８２５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｆ(配列番号８２６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｇ(配列番号８２７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｈ(配列番号８２８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｉ(配列番号８２９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｋ(配列番号８３０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｌ(配列番号８３１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｐ(配列番号８３２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｑ(配列番号８３３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｒ(配列番号８３４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｔ(配列番号８３５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｗ(配列番号８３６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｙ(配列番号８３７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ(配列番号８３８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ(配列番号８３９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｅ(配列番号８４０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ(配列番号８４１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ(配列番号８４２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ(配列番号８４３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ(配列番号８４４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ(配列番号８４５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ(配列番号８４６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ(配列番号８４７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ(配列番号８４８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ(配列番号８４９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ(配列番号８５０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ(配列番号８５１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ(配列番号８５２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ(配列番号８５３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ(配列番号８５４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ(配列番号８５５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ(配列番号８５６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ(配列番号８５７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ(配列番号８５８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ(配列番号８５９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ(配列番号８６０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ(配列番号８６１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ(配列番号８６２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ(配列番号８６３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ(配列番号８６４)；Ｒ２１９Ｑ／
Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ(配列番号８６５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ(配列番号８６６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ(配列番号８６７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ(配列番号８６８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ(配列番号８６９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ(配列番号８７０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ(配列番号８７１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ(配列番号８７２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ(配列番号８７３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ(配列番号８７４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ(配列番号８７５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ(配列番号８７６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ(配列番号８７７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ(配列番号８７８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ(配列番号８７９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ(配列番号８８０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ(配列番号８８１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ(配列番号８８２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ(配列番号８８３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ(配列番号８８４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ(配列番号８８５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ(配列番号８８６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ(配列番号８８７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ(配列番号８８８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ(配列番号８８９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ(配列番号８９０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ(配列番号８９１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ(配列番号８９２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ(配列番号８９３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ(配列番号８９４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ(配列番号８９５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ(配列番号８９６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ(配列番号８９７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ(配列番号８９８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ(配列番号８９９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ(配列番号９００)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ(配列番号９０１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ(配列番号９０２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ(配列番号９０３)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ(配列番号９０４)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ(配列番号９０５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ(配列番号９０６)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ(配列番号９０７)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｗ(配列番号９０８)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙ(配列番号９０９)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ(配列番号９１０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号９１１)；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号９１２)；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号９１３)；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ(配列番号９１４)；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号９１５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号９１６)；およびＳ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ(配列番号９１７)。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、配列番号２に記載する前駆体ヒトアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２に相当する残基３０〜５１１)と他のＡＤＡ２タンパク質との例示的なアラインメントを示す。「＊」とは、整列された残基が同一であることを意味し、「：」とは、整列された残基が同一でないが、同様であり、かつその整列された位置で保存的アミノ酸残基を含むことを意味し、かつ「.」とは、その整列された残基が同様であって、その整列された位置で半保存的アミノ酸残基を含むことを意味する。推定の受容体結合ドメイン(ＰＲＢ)に相当する残基には下線を付している。アミノ酸置き換えの例示的で非限定的な、対応する位置は強調によって示す。例えば、図１Ａは、配列番号２に記載するＡＤＡ２と、配列番号２８６に記載するチンパンジーのＡＤＡ２とのアラインメントを示す。図１Ｂは、配列番号２に記載するＡＤＡ２と、配列番号２８７に記載するゴリラのＡＤＡ２とのアラインメントを示す。図１Ｃは、配列番号２に記載するＡＤＡ２と、配列番号２８８に記載するピグミーチンパンジーとのアラインメントを示す。図１Ｄは、配列番号２に記載するＡＤＡ２と、配列番号２８９に記載するスマトラオランウータンのＡＤＡ２とのアラインメントを示す。図１Ｅは、配列番号２に記載するＡＤＡ２と、配列番号２９０に記載するキタホオジロテナガザルのＡＤＡ２とのアラインメントを示す。図１Ｆは、配列番号２に記載するＡＤＡ２と、配列番号２９１に記載するカニクイザルのＡＤＡ２とのアラインメントを示す。
【図２】図２は、細胞外アデノシンの生合成および代謝、ならびにアデノシン受容体シグナル伝達を示す[Antonioli et al. (2013) Nat Rev Can 13:842-857から適合]。生理学的条件、例えば、低酸素症、虚血、炎症、腫瘍環境または外傷は、細胞表面酵素ＣＤ３９によってＡＭＰに代謝されるＡＴＰの細胞外蓄積を促進し得る。ＡＭＰは次に、ＣＤ７３によってアデノシンに代謝される。細胞外アデノシンは、付近の免疫、腫瘍または他の細胞の細胞表面で発現される、４つの異なるＧタンパク質共役アデノシン受容体(ＡＤＲ；すなわち、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３)に結合して、種々の下流のアデノシン媒介性シグナル伝達および活性、例えば、免疫抑制、がん細胞増殖、がん細胞遊走および／または転位、血管形成ならびに他の影響を媒介し得る。ヌクレオシド輸送体(ＮＴ)は、細胞中への細胞外アデノシンの取り込みを容易にする。アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)、例としては、外因性のＡＤＡ２または本明細書に示される変異型は、アデノシンのイノシンへの変換を触媒することによって細胞外アデノシンを破壊し得る。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
詳細な説明
概要
Ａ. 定義
Ｂ. アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ２)およびアデノシン媒介性腫瘍免疫抑制の調節
１. 腫瘍免疫および免疫回避
２. がんおよび腫瘍微小環境(ＴＭＥ)におけるアデノシン免疫調節
３. がんの処置におけるアデノシンデアミナーゼおよび標的化アデノシン
Ｃ. アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)およびその変異型
１. ＡＤＡ２の構造および活性
ａ. ＡＤＡ２の構造
ｂ. ＡＤＡ２の活性
２. ＡＤＡ２変異型
ａ. 例示的な修飾
ｉ. アミノ酸置き換え
ii. ＰＲＢドメインの修飾
iv. 過グリコシル化
ｂ. 核酸分子
ｃ. 変異型ＡＤＡ２タンパク質の生成
Ｄ. ＡＤＡ２コンジュゲートおよび融合タンパク質
１. 半減期延長部分
ａ. 低複雑性ポリペプチド
ｂ. ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)
ｃ. 免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)またはその一部
ｄ. アルブミンまたはその断片または変異型
ｅ. アルブミン結合部分
ｆ. ＰＡＳ配列
ｇ. ＨＡＰ配列
ｈ. ＸＴＥＮ配列
ｉ. トランスフェリンまたはその断片
ｊ. ポリマーコンジュゲーション
ｉ. ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)
ii. ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)
iii. ポリシアル酸(ＰＳＡ)
iv. 他のポリマー
２. コンジュゲートまたは融合タンパク質を生成する方法
リンカー
ｉ. ペプチドリンカー
ii. ヘテロ二機能性連結剤
Ｅ. ＡＤＡ２およびそのポリペプチドをコードする核酸を生成する方法
１. ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
２. 突然変異体または修飾された核酸およびコードするポリペプチドの生成
３. ベクターおよび細胞
本明細書に提供されるＡＤＡ２変異型をコードおよび発現する免疫細胞
４. 発現
ａ. 原核生物細胞
ｂ. 酵母細胞
ｃ. 昆虫細胞
ｄ. 哺乳動物細胞
ｅ. 植物
５. 精製技術
Ｆ. ＡＤＡ２の活性および物理的特性を評価する方法
１. アデノシンデアミナーゼアッセイ
２. ヘパリン結合を評価する方法
ａ. アフィニティアッセイ
ｂ. ＥＬＩＳＡアッセイ
ｃ. ドットブロットおよび他の放射性標識ヘパリン結合アッセイ
３. 安定性を評価するための方法
ａ. 条件
ｉ. 血漿中の安定性
ii. 熱安定性
iii. ｐＨでの安定性または最適ｐＨ
iv. 他の条件
ｂ. 物理的特性の決定
ｉ. 酵素活性
ii. タンパク質純度のクロマトグラフィー分析
iii. 示差走査熱量測定
iv. 示差走査蛍光定量法
ｖ. 内部蛍光分光法
vi. 円偏光二色性
vii. 動的光散乱
viii. 静的光散乱
ix. 濁度測定
ｘ. 安定性を決定するための他の方法
４. 治療活性のアッセイ
ａ. インビトロ試験
ｂ. インビボ動物モデル
ｉ. 腫瘍代謝活性
ii. 腫瘍のサイズおよび容量
ｃ. 臨床モニタリング
５. 薬力学／薬物動態学および耐性
Ｇ. 医薬組成物および製剤
１. 製剤−液体、注射用、エマルジョン
凍結乾燥粉末
２. 他の投与経路用の組成物
３. 投薬量および投与
４. 包装および製品
Ｈ. アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)を用いる処置の方法
１. 例示的な疾患および状態
ａ. がんおよび腫瘍
ｂ. 非がん性過剰増殖性疾患
ｃ. 線維症
ｄ. 感染性疾患
ｅ. 他の疾患および状態
２. 患者選択の方法
ａ. アデノシン関連バイオマーカー
ｉ. 血漿アデノシンレベル
ii. アデノシン受容体(ＡＤＲ)
iii. エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３
ｂ. 患者選択
３. 投薬量および投与
４. 併用療法
ａ. 抗がん剤
ｉ. 抗がん抗体
ii. 化学療法剤
iii. 放射線療法
iv. 抗血管新生剤
ｖ. 免疫チェックポイント阻害剤
(ａ)抗ＣＴＬＡ４療法
(ｂ)抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１療法
ｂ. 他の免疫調節剤
ｃ. ヒアルロン酸分解酵素
可溶性ヒアルロン酸分解酵素(例えば、可溶性ＰＨ２０)
ｄ. 感染性疾患を処置するための抗体
ｅ. 抗生物質および抗真菌剤
Ｉ. 実施例
【０１０１】
Ａ.  定義
特に断らない限り、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の開示全体にわたって言及される特許、特許出願、公開済の出願および刊行物、ジェンバンク配列、データベース、ウェブサイトおよび他の出版物は全て、特に断らない限り、それらの全体が参照により援用される。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在する事象では、このセクションにおける定義が優勢である。ＵＲＬまたは他のかかる識別子もしくはアドレスに対して言及する場合、かかる識別子は変化することができ、インターネットに関する特定の情報が移り変わり得るが、インターネットを検索することにより、等価な情報を見出すことができることが理解されよう。それらに対する言及は、かかる情報の利用可能性および公的普及を証拠立てる。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、「アデノシン」は、β−Ｎ９−グリコシド結合を介してリボース糖分子(リボフラノース)部分に結合しているアデニンの分子で構成されるプリンヌクレオシドを指す。アデノシンは、アデノシン受容体とのその相互作用を通じて、様々な生理学的プロセスを調節することができる。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、「ミカエリス定数」またはＫｍは、有効な触媒作用が起こるのに必要とされる基質濃度の尺度である。例えば、高いＫｍを有する酵素は、基質に関してより低いＫｍを有する酵素よりも、所定の反応速度を達成するのにより高い基質濃度を必要とし得る。Ｋｍは、基質に関する酵素の親和性を表し得る。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、「触媒効率」は、酵素が基質と反応して、生成物を形成する効率である。それは、ｋｃａｔ／Ｋｍ(Ｍ−１ｓ−１または１／Ｍｓ)で表される。ｋｃａｔ／Ｋｍを含む触媒活性の動態パラメーターを評価する方法は、当業者に周知である。概して、ｋｃａｔ／Ｋｍは、定常状態条件下で測定される。
【０１０５】
本明細書中で使用する場合、「アデノシンデアミナーゼ」または「ＡＤＡ」は、アデノシンの加水分解性脱アミノ化を触媒して、イノシンを形成する酵素を指す。ＡＤＡはまた、２’デオキシアデノシンを２’デオキシイノシンへ脱アミノ化することができ、したがって、２’デオキシアデノシンデアミナーゼ活性を有する酵素を含む。ヒトにおいては、分子量、触媒パラメーターおよび他の特性が異なるＡＤＡ１およびＡＤＡ２と呼ばれる２つのＤＮＡアイソザイムが存在する。
【０１０６】
本明細書中で使用する場合、「アデノシンデアミナーゼ１」またはＡＤＡ１は、シグナルペプチドを欠如しており、細胞内部で遍在的に発現されるＡＤＡを指す。それは、単量体として産生される。例示的なＡＤＡ１は、配列番号１１に記載するヌクレオチドの配列を有し、配列番号１２に記載するアミノ酸の配列をコードするヒトヒトＡＤＡ１である。ヒトにおいて、野生型ＡＤＡ１は、５.２×１０−５Ｍまたは約５.２×１０−５ＭのＫｍを特徴とし、７〜７.５または約７〜７.５のｐＨ最適条件を有し、アデノシンおよび２’デオキシアデノシンの両方に関して類似した親和性を示す。例えば、ＡＤＡ１は、少なくともまたは少なくとも約０.７０、例えば少なくともまたは少なくとも約０.７５の２’デオキシアデノシン／アデノシンデアミナーゼ比を有する。ＡＤＡ１に対する言及は、ヒトおよび非ヒト対象を含む哺乳動物中に存在する野生型または自然ＡＤＡ１を含む。例えば、ＡＤＡ１に対する言及は、配列番号１２に記載するアミノ酸の配列を有するポリペプチドを含有するヒトＡＤＡ１を含む。ＡＤＡ１に対する言及はまた、配列番号１２に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するポリペプチドを含み、またアデノシンデアミナーゼ活性を示す対立遺伝子変異体、種変異体、スプライス変異体および他の変異体などのその変異体を含む。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「アデノシンデアミナーゼ２」または「ＡＤＡ２」は、原形質中を含む細胞外環境中に存在するＡＤＡを指す。ＡＤＡ２は、シグナルペプチドを含有する前駆ポリペプチド(例えば、配列番号２に記載するＡＤＡ２)から産生され、それは、除去されて、シグナルペプチドを欠如する成熟タンパク質(例えば、配列番号５に記載するＡＤＡ２)を生じる。分泌されたＡＤＡ２は、各サブユニットの残基間で無極性相互作用を介して相互作用する２つの同一ポリペプチド鎖を含有するホモ二量体である。ヒトにおいて、野生型ＡＤＡ２は、２００×１０−５Ｍであるかまたは約２００×１０−５ＭであるＫｍを特徴とし、６.５±０.２または約６.５±０.２のｐＨ最適条件を有し、２’デオキシアデノシンに関して弱い親和性を示す。例えば、ＡＤＡ２は、０.４０未満の、例えば０.３０未満もしくは約０.３０または０.２５未満もしくは約０.２５の２’デオキシアデノシン／アデノシンデアミナーゼ比を有する。ＡＤＡ２に対する言及は、２’デオキシアデノシン／アデノシンデアミナーゼ比を有する。ＡＤＡ２に対する言及は、ヒトおよび非ヒト対象を含む哺乳動物中に存在する野生型または自然ＡＤＡ２を含む。例えば、ＡＤＡ２に対する言及は、配列番号２に記載するアミノ酸の配列を有するポリペプチド、配列番号５に記載する成熟形態、配列番号５の触媒活性部分およびそれらの二量体形態を含有するヒトＡＤＡ２を含む。ＡＤＡ２に対する言及は、前駆形態、成熟形態、触媒活性形態および配列番号２に記載する前駆ポリペプチドまたは配列番号５に記載するその成熟形態に対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を有するポリペプチドを含み、また活性形態である場合にアデノシンデアミナーゼ活性を示す対立遺伝子変異体、種変異体、スプライス変異体および他の変異体などのそれらの変異体である二量体形態を含む。かかる変異体は、活性形態である場合に、自然または野生型ＡＤＡ２ポリペプチドの活性よりも少なくとも４０％、５０％、７０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％。２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上の活性を示す。本明細書中で使用する場合、ＡＤＡ２に関して「野生型」または「自然」は、自然界においてヒトおよび他の動物を含む生物中に存在する対立遺伝子変異体を含む自然または天然に存在するＡＤＡ２遺伝子によりコードされるポリペプチドを含有するＡＤＡ２タンパク質を指す。種に関連しない野生型ＡＤＡ２に対する言及は、任意の種の野生型ＡＤＡ２を包含すると意図される。コードされる前駆ポリペプチド、その断片およびシグナルペプチドを欠如する成熟形態などのそのプロセシングされる形態、ならびにそれらの任意の翻訳前もしくは後にプロセシングまたは修飾される形態は、野生型ＡＤＡ２ポリペプチドの中に含まれる。同様に、グリコシル化、カルボキシル化およびヒドロキシル化による修飾を含むが、それらに限定されない翻訳後に修飾されるものもまた、自然ＡＤＡ２タンパク質の中に含まれる。自然ＡＤＡ２タンパク質はまた、ポリペプチド単量体ならびに二量体形態を含む。例えば、ヒトは、自然ＡＤＡ２を発現する。野生型ヒトＡＤＡ２は、配列番号２(前駆)および配列番号５(成熟)に記載され、本明細書中に記載するような触媒活性形態および配列番号３７６〜３８３のいずれかに記載する対立遺伝子変異体(前駆または成熟)または配列番号６８に記載するＡＤＡ２などのＡＤＡ２のアイソフォームを含む。非ヒト種由来の野生型または自然ＡＤＡ２として、チンパンジー(Pan troglodytes)(チンパンジー、配列番号２８６由来の前駆、配列番号３２６由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００３３１７１２７.１)、ゴリラ(Gorilla gorilla)(ゴリラ、配列番号２８７由来の前駆、配列番号３２７由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００４０６３０２４.１)、ボノボ(Pan paniscus)(ピグミーチンパンジー、配列番号２８８由来の前駆、配列番号３２８由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００３８２８３４５.１)、スマトラオランウータン(Pongo abelii)(スマトラオランウータン、配列番号２８９由来の前駆、配列番号３２９由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００１１２５３６０.１)、ホオジロテナガザル(Nomascus leucogenys)(キタホオジロテナガザル(Northern white-cheeked gibbon)、配列番号２９０由来の前駆、配列番号３３０由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００４０８８５１７.１)、カニクイザル(Macaca fascicularis)(カニクイザル、配列番号２９１由来の前駆、配列番号３３１由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００５５６８１１１.１)、サバンナモンキー(Chlorocebus sabaeus)(ミドリザル、配列番号２９２由来の前駆、配列番号３３２由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００７９７２９９０.１)、アカゲザル(Macaca mulatta)(アカゲザル、配列番号２９３、３３７由来の前駆、配列番号３３３、３４０由来の成熟、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ. Ｎｏ. ＡＦＨ３２７９５.１、ＥＨＨ２０００２.１)、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)(マーモセット、配列番号２９４、３７４由来の前駆、配列番号３３４、３７５由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＸＰ＿００９００４５９１.１、ＸＰ＿００９００４５８６.１)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)(アフリカツメガエル、配列番号２９５由来の前駆、配列番号３３５由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.００１０９０５３１.１)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(ミバエ、配列番号２９６〜３００由来の前駆、配列番号３３６、３３８、３３９由来の成熟、ＡＡＬ４０９１３.１、ＡＡＬ４０９２０.１、ＡＡＬ４０９１１.１、ＡＡＬ４０９１２.１およびＡＡＬ４０９１０.１)、カイコ(Bombyx mori)(カイコガ、配列番号３０１由来の前駆、配列番号３４１由来の成熟、ＮＣＢＩ  Ａｃｃ.Ｎｏ.ＮＰ＿００１０９８６９８.１)およびセンチニクバエ(Sarcophaga perigrina)(ニクバエ、配列番号３０２由来の前駆、配列番号３４２由来の成熟、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ. Ｎｏ. ＢＡＡ１１８１２.１)が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、前駆ＡＤＡ２は、分泌に関してタンパク質を標的とするＮ−末端シグナルペプチドを含有するＡＤＡ２の非分泌形態を指す。シグナルペプチドは、小胞体中で切断される。例示的なＡＤＡ２前駆ポリペプチドは、配列番号２に記載するポリペプチド、あるいは配列番号２８６〜３０２、３３７または３７６〜３７９のいずれかに記載するものなどの対立遺伝子もしくは種変異体またはそれらの他の変異体である。
【０１０９】
本明細書中で使用する場合、「成熟ＡＤＡ２」は、シグナル配列を欠如するＡＤＡ２を指す。例示的な成熟ＡＤＡ２は、配列番号５に記載され、また配列番号３２６〜３３６、３３８〜３４２、３７５および３８０〜３８３のいずれかに記載するものなどの種および対立遺伝子変異体ならびに他の変異体などのその変異体を含む。成熟ＡＤＡ２に対する言及は、その二量体形態を含む。
【０１１０】
本明細書中で使用する場合、種変異体は、マウスおよびヒトなどの種々の哺乳動物種を含む種々の種間でのポリペプチドにおける変異体を指す。
【０１１１】
本明細書中で使用する場合、対立遺伝子変異体は、同じ種の成員間でのタンパク質における変形を指す。
【０１１２】
本明細書中で使用する場合、ドメイン(通常、３つまたはそれ以上、一般的には５つもしくは７つまたはそれ以上のアミノ酸の配列)は、分子の他の部分と構造的におよび／または機能的に異なり、かつ同定可能であるタンパク質またはコード核酸などの分子の一部を指す。例えば、ドメインは、１以上の構造モチーフで構成され、かつ／またはタンパク質分解活性などの機能活性によって認識されるタンパク質内で個別にフォールディングされた構造を形成し得る。タンパク質は、１つまたは１つよりも多い異なるドメインを有し得る。例えば、ドメインは、プロテアーゼドメインを規定するモチーフに対する相同性などの、その中の配列の、関連ファミリーの成員に対する相同性により同定、規定または識別され得る。別の例では、ドメインは、その機能により、例えばタンパク質分解活性またはＤＮＡ結合、リガンド結合および二量体形成などの生体分子と相互作用する能力により識別され得る。個別にまたは別の分子に融合されたドメインが、例えばタンパク質分解活性またはリガンド結合などの活性を遂行することができるように、ドメインは個別に、生物学的機能または活性を示すことができる。ドメインは、アミノ酸の直鎖状配列またはアミノ酸の非直鎖状配列であり得る。多くのポリペプチドは、複数のドメインを含有する。かかるドメインは公知であり、当業者により同定され得る。本明細書中の例証に関して、定義が提供されるが、それは、名称により特定のドメインを認識することが当業者内で周知であることが理解される。必要とされる場合、適切なソフトウェアを用いて、ドメインを同定することができる。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、「触媒ドメイン」または「ＡＤＡドメイン」は、アデノシンデアミナーゼ活性を付与するドメインを指す。酵素の触媒ドメインは、アデノシンデアミナーゼ活性などのその酵素活性に要される当該タンパク質の必須の特性の全てを含有する。ＡＤＡドメインは構造的に、バレルに近付く８重鎖の平行βシートで構成され、古典的なα／β−ＴＩＭバレルモチーフヘリックスおよびβ１とα１との間に(Ｈ１、Ｈ２およびＨ３)、またＣ末端(Ｈ４およびＨ５)に位置するさらに５つで取り囲まれる(Zavialov et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377)。β鎖とαヘリックスとの間のループは、活性に要される活性部位残基の多くを含有する。活性部位残基は、亜鉛結合、活性部位プロトン供与体および受容体残基および基質結合残基を配位させる残基を含む。ヒトＡＤＡ２における例示的なかかる残基を表４に記載する。ヒトＡＤＡ２に関して、ＡＤＡドメインは、配列番号２に記載するアミノ酸の前駆配列の残基１０６〜５０２に相当する(配列番号５に記載する成熟タンパク質の残基７７〜４７３に相当する)領域中に含有されるが、ただし、その中に含有される推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインに相当する残基は、触媒活性に要されない。
【０１１４】
本明細書中で使用する場合、「その触媒活性部分」または「その触媒活性断片」は、完全長配列未満の成熟ＡＤＡ２ポリペプチドを含有するが、アデノシンデアミナーゼ活性に十分な、触媒ドメインの全てまたは一部を含むＡＤＡ２のアミノ酸の連続する部分を含有するＡＤＡ２ポリペプチドを指す。例えば、ＡＤＡ２の触媒活性部分は、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関して、残基８３、８５、３２７、３３０、３５５および４１２に相当するアミノ酸残基を含むが、成熟ＡＤＡ２ポリペプチドの完全アミノ酸配列を含まないＡＤＡ２ポリペプチドの成熟配列のアミノ酸の連続する配列を含有するポリペプチドを含むものである。例えば、触媒活性部分は、アミノ酸残基８３、８５、３２７、３３０、３５５および４１２を含むが、配列番号５に記載するアミノ酸の完全長配列を含まない配列番号５に記載するＡＤＡ２の成熟配列のアミノ酸の連続する配列を含有するポリペプチドを含むものである。ＡＤＡ２ポリペプチドの触媒活性部分を含有するＡＤＡ２は、活性形態である場合、完全長成熟ＡＤＡ２ポリペプチドを含有するＡＤＡ２と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の活性、例えば少なくとも１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の活性を示す。一例において、ＡＤＡ２ポリペプチドの触媒活性部分は、推定受容体結合(ＰＲＢ)ドメインの全てまたは一部を欠如するポリペプチドを含む。別の例では、ＡＤＡ２ポリペプチドの触媒活性部分は、成熟ポリペプチドの１以上のＣ末端アミノ酸を欠如するポリペプチドを含み、すなわち、それは、成熟ＡＤＡ２ポリペプチドと比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上の連続するＣ末端アミノ酸残基が、Ｃ末端で切断される。変異型ＡＤＡ２またはその触媒活性部分に対する本明細書中での言及は、触媒活性部分が修飾(例えば、アミノ酸置き換えを含有することを意味することが理解されよう。
【０１１５】
本明細書中で使用する場合、「推定受容体結合ドメイン」または「ＰＲＢドメイン」は、一方の側面上のＨＲおよび部分的にＨ２のαヘリックス、ならびに他方の側面上のプロリンリッチなＳＲ２−ＳＲ３ループにより取り囲まれるＳＲ１−ＳＲ２−ＳＲ３と称される３重鎖の逆平行β−シートを含有するαおよびβ−フォールドで構成される個別にフォールディングされた構造を形成するＡＤＡ２の一部を指す(Zavialov et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377)。ＰＲＢドメインは、配列番号２に記載する前駆ＡＤＡ２のＣ１３７とＣ１５９(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の位置Ｃ１０８およびＣ１３０)との間にジスルフィド結合を形成する保存されたシステイン残基を含有する。ＰＲＢドメインは、その受容体へのＡＤＡ２の結合に関与すると報告されている。ドメインを構成する特定の残基は、例えばドメインを同定するのに使用する方法に応じて多様であり得る(例えば、より長いかまたはより短い)ことが理解されよう。ヒトＡＤＡ２に関して、ＰＲＢドメインは、配列番号２に記載する前駆ＡＤＡ２の残基１２７〜１８５または１３４〜１７７(それぞれ、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基９８〜１５６または１０５〜１４８)に相当すると報告されている。
【０１１６】
本明細書中で使用する場合、ＰＲＢドメインの全てまたは一部などのドメインの全てまたは一部を欠如するタンパク質は、参照または未修飾タンパク質と比較して、ＰＲＢドメインなどのドメインの１つもしくは複数のアミノ酸またはアミノ酸の全ての欠失を有するポリペプチドを指す。ドメインの全てまたは一部を欠如するポリペプチドにおいて欠失されるアミノ酸は連続であり得るが、同族ポリペプチドのドメイン内で連続するアミノ酸である必要はない。ドメインの全てまたは一部を欠如するポリペプチドは、参照または未修飾タンパク質の活性と比較して、ポリペプチドの活性の損失または低減を含み得る。
【０１１７】
本明細書中で使用する場合、「活性な形態」は、アデノシンデアミナーゼ活性を示す任意のＡＤＡ２酵素を指す。酵素の活性な形態は、アミノ酸の完全長配列を含有し得るかまたはその触媒活性部分であり得る。酵素の活性な形態は、単量体または二量体であり得る。通常、活性な酵素は、二量体である。活性な酵素は、少なくともまたは少なくとも約５×１０３Ｍ−１ｓ−１、６×１０３Ｍ−１ｓ−１、７×１０３Ｍ−１ｓ−１、８×１０３Ｍ−１ｓ−１、９×１０３Ｍ−１ｓ−１、１×１０４Ｍ−１ｓ−１、２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１、６×１０５Ｍ−１ｓ−１、７×１０５Ｍ−１ｓ−１、８×１０５Ｍ−１ｓ−１、９×１０５Ｍ−１ｓ−１、１×１０６Ｍ−１ｓ−１、２×１０６Ｍ−１ｓ−１、３×１０６Ｍ−１ｓ−１、４×１０６Ｍ−１ｓ−１、５×１０６Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示す任意の形態である。
【０１１８】
本明細書中で使用する場合、「多量体」は、例えば非共有結合性相互作用により、一緒に保持もしくは結合されるいくつかの同一のまたは異なるサブユニットで構成される分子を指す。
【０１１９】
本明細書中で使用する場合、「二量体」は、一緒に連結される２つのポリペプチドを含有する分子を指す。通常、ポリペプチドは、非共有結合的に連結される。例えば、ＡＤＡ２二量体は、２つのポリペプチドの残基間の疎水性相互作用を含む無極性サブユニット間相互作用により形成される。
【０１２０】
本明細書中で使用する場合、「ホモ二量体」は、２つの同一のポリペプチドにより形成される二量体を指す。
【０１２１】
本明細書中で使用する場合、「ヘテロ二量体」は、２つの異なるポリペプチドにより形成される二量体を指す。
【０１２２】
本明細書中で使用する場合、「単量体」は、単一のタンパク質またはポリペプチドユニットを指す。単量体は、二量体または他の多量体と比較して、比較的低い分子量を有する。単量体は、個別に存在し得るかまたはそれは、他の分子と結合して、二量体または他の多量体を形成し得る。
【０１２３】
本明細書中で使用する場合、ＡＤＡ２タンパク質に関して「相当する形態」は、２つのＡＤＡ２タンパク質の特性または活性を比較する場合に、タンパク質の同じ構造形態を使用して、特性が比較されることを意味する。例えば、ＡＤＡ２タンパク質が、第１のＡＤＡ２タンパク質の相当する形態の活性と比較して、より低い活性を有すると述べられている場合、それは、二量体などの特定の形態が、第１のＡＤＡ２タンパク質の二量体と比較して、より低い活性を有することを意味する。
【０１２４】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチド」は、タンパク質分子の鎖、形成部または全体において一緒に結合される多数のアミノ酸残基を含有する直鎖状有機高分子を指す。
【０１２５】
本明細書中で使用する場合、「タンパク質」もしくは「タンパク質分子」またはその変形は、アミノ酸の直鎖状配列から構成される１以上のポリペプチド鎖で構成される巨大分子を指す。したがって、タンパク質は、単量体であり得るかまたは二量体もしくは他の多量体であり得る。タンパク質は、構造的、機械的、生化学的またはシグナル伝達活性を示すことができる。
【０１２６】
本明細書中で使用する場合、「ポリペプチドサブユニット」または「タンパク質サブユニット」は、多量体複合体であるタンパク質分子を形成するように他のポリペプチドまたは単量体と集合することが可能である単一のポリペプチドまたは単量体を指す。
【０１２７】
本明細書中で使用する場合、「変異型ＡＤＡ２タンパク質」は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質と比較して、１以上のアミノ酸の違いを有する、完全長、触媒活性部分、単量体または二量体などのその任意の形態を含むＡＤＡ２タンパク質を指す。１以上のアミノ酸の違いは、１以上のアミノ酸置き換え(置換)、挿入または欠失などのアミノ酸突然変異であり得るか、あるいは完全ドメインの挿入または欠失およびそれらの任意の組合せであり得る。通常、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質と比較して、一次配列において１以上の修飾を有する。例えば、本明細書中に提供する変異型ＡＤＡ２は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質と比較して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５個またはそれ以上のアミノ酸の違いを有し得る。生じるタンパク質が、アデノシンデアミナーゼ活性を示す限りは、任意の修飾が意図される。
【０１２８】
本明細書中で使用する場合、修飾は、ポリペプチドのアミノ酸残基の配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列の修飾を指し、それぞれ、アミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置き換えを含む。修飾はまた、翻訳後修飾または直接的もしくは間接的に、別の部分への結合または連結に起因して起こり得る分子に対する他の変化を含み得る。ポリペプチドを修飾する方法は、例えば組換えＤＮＡ方法論を使用することにより、当業者にとって日常的である。
【０１２９】
本明細書中で使用する場合、「欠失」は、核酸またはポリペプチド配列の修飾について言及する場合、標的ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは自然もしくは野生型配列などの配列と比較して、１以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の除去を指す。したがって、野生型配列と比較して、１以上の欠失を含有するアミノ酸配列または核酸分子は、直鎖状の配列長内に、１つまたはそれよりも少ないアミノ酸またはヌクレオチドを含有する。
【０１３０】
本明細書中で使用する場合、「挿入」は、核酸またはアミノ酸配列の修飾について言及する場合、標的、自然、野生型または他の関連配列内での、１以上のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の包含について記載する。したがって、野生型配列と比較して、１以上の挿入を含有するアミノ酸配列または核酸分子は、直鎖状の配列長内に、１つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸またはヌクレオチドを含有する。
【０１３１】
本明細書中で使用する場合、核酸およびアミノ酸に対する「付加」は、別の配列と比較して、いずれかの末端上へのヌクレオチドまたはアミノ酸の付加について記載する。
【０１３２】
本明細書中で使用する場合、修飾に関する「置換」または「置き換え」は、分子の長さ(残基の数において記載するような)を変更させることなく、自然、標的、野生型もしくは他の核酸またはポリヌクレオチド配列における１つもしくは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、代替的なヌクレオチドまたはアミノ酸で置き換えることを指す。したがって、分子における１以上の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変更させない。特定のポリペプチドと比較したアミノ酸置き換えは、ポリペプチド配列または参照ポリペプチド配列の長さに沿ったアミノ酸残基の数に関して表現され得る。例えば、イソロイシン(Ｉｌｅ、Ｉ)に代わるシステイン(Ｃｙｓ、Ｃ)の置換であるアミノ酸配列の１９位にあるアミノ酸において修飾を有する修飾ペプチドは、「１９位に相当する位置でのＣｙｓまたはＣによる置き換え」、Ｉ１９Ｃ、Ｉｌｅ１９Ｃｙｓまたは単にＣ１９と表現することができ、修飾された１９位にあるアミノ酸がシステインであることを示す。この例において、置換を有する分子は、未修飾ポリペプチドのＩｌｅ１９で修飾を有する。
【０１３３】
本明細書中で使用する場合、「未修飾ポリペプチド」または「未修飾ＡＤＡ２」およびそれらの文法的変形は、本明細書中に提供するような修飾に関して選択される出発ポリペプチドを指す。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する野生型形態であり得る。例示的な未修飾ＡＤＡ２ポリペプチドは、配列番号５に記載するヒトＡＤＡ２またはその触媒活性部分である。さらに、出発ポリペプチドは、それが、自然の野生型アイソフォームと異なるが、それにもかかわらず、本明細書中で産生される、続いて修飾されるポリペプチドに対して、出発未修飾ポリペプチドと本明細書中で称されるように、変更または突然変異され得る。したがって、未修飾参照タンパク質と比較して、特定の活性または特性において所望の増加または減少を有するように修飾された当該技術分野で公知の既存のタンパク質を、出発未修飾ポリペプチドとして選択および使用することができる。例えば、１以上の単一のアミノ酸変化によりその自然形態から修飾されて、グリコシル化を変更させるためのアミノ酸残基(単数または複数)の変化などの所望の特性における増加または減少のいずれかを保有するタンパク質は、同じかまたは異なる特性のいずれかのさらなる修飾に関して、標的タンパク質であってもよく、本明細書中で未修飾と称される。
【０１３４】
本明細書中で記載する場合、「相当する残基」は、整列させた遺伝子座で生じる残基を指す。本明細書中の目的では、タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に記載する前駆ＡＤＡ２または配列番号５に記載するその成熟形態に対して(図１を参照)または配列番号４に記載する、Zavialov et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377でならびにＰＤＢ受託番号３ＬＧＧおよび３ＬＧＤで使用される残基のナンバリングであるＺａｖｉａｌｏｖナンバリングに使用されるＡＤＡ２配列に対して整列させる。関連または変異型ポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法により整列される。かかる方法は通常、適合を最大限にし、例えば手動アラインメントを使用する方法ならびに当業者に公知の利用可能な多数のアラインメントプログラム(例えば、ＢＬＡＳＴＰ)他を使用することによる方法を含む。ＡＤＡ２ポリペプチドの配列を整列させることにより、当業者は、ガイドとして保存および同一アミノ酸残基を使用して、相当する残基を同定することができる。概して、ポリペプチドのアミノ酸が、開示する配列におけるアミノ酸に相当するとの記述は、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムを使用して、同一性または相同性(保存アミノ酸が整列される場合)を最大限にする、ポリペプチドと開示する配列とのアラインメント時に同定されたアミノ酸を指す。
【０１３５】
本明細書中で使用する場合、ＡＤＡ２の「特性」は、３次元構造、ｐＩ、半減期、立体配座および他のかかる物理的特徴などの物理または構造特性を指す。
【０１３６】
本明細書中で使用する場合、ＡＤＡ２の「活性」または「ＡＤＡ２活性」は、ＡＤＡ２タンパク質の活性形態、通常二量体形態により示される任意の活性を指す。かかる活性は、インビトロでおよび／またはインビボで試験することができ、アデノシンデアミナーゼ活性、成長因子活性、ヘパリンを結合する能力および／またはアデノシン受容体(ＡＤＲ)に結合する能力を含むが、それらに限定されない。活性は、例えばインビトロでまたはインビボでアデノシンデアミナーゼ活性を測定することにより、認識されるアッセイを使用して、インビトロでまたはインビボで評価され得る。かかるアッセイの結果により、ポリペプチドは、インビボでポリペプチドの活性に相関され得る活性を示すことが示され、ここでインビボ活性は、生物活性と称され得る。ＡＤＡ２の修飾形態の機能性または活性を決定するためのアッセイは、当業者に公知であり、例示的なアッセイは、本明細書中に記載される。
【０１３７】
本明細書中で使用する場合、「アデノシンデアミナーゼ活性」は、酵素の、アデノシンの加水分解的脱アミノ化を触媒して、イノシンを形成する能力を指す。ＡＤＡ２活性は、酵素反応の産物の産生の速度を測定することにより、直接的にまたは間接的に評価することができる。例えば、イノシンまたはアンモニアの産生は、直接的にまたは間接的に測定され得る。他の例において、酵素の基質、例えばアデノシンまたは２−デオキシアデノシンの減少が測定される。アデノシンデアミナーゼ活性を評価するアッセイは、当業者に公知であり、基質の減少または産物の増加が、分光光度法により直接的に、あるいは発色基質を使用するかまたは反応の吸光スペクトルを変化させる続く酵素反応もしくは続く酸化−還元反応により間接的に測定されるアッセイを含むが、それらに限定されない。
【０１３８】
本明細書中で使用する場合、「アデノシンデアミナーゼ活性の増加」は、ＡＤＡ２タンパク質、例えば変異型ＡＤＡ２タンパク質の、参照タンパク質と比較した場合にアデノシンデアミナーゼ活性を示す能力の増強を指す。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質の、アデノシンデアミナーゼ活性を示す能力は、未修飾ＡＤＡ２タンパク質のアデノシンデアミナーゼ活性よりも大きくてもよい。アデノシンデアミナーゼ活性は、参照または未修飾タンパク質のアデノシンデアミナーゼ活性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上分、増加させることができる。
【０１３９】
本明細書中で使用する場合、グリコシル化部位は、炭水化物部分が結合され得るポリペプチドにおけるアミノ位置を指す。通常、グリコシル化されるタンパク質は、炭水化物部分の結合用のアスパラギンもしくはセリンなどの１以上のアミノ酸残基を含有する。
【０１４０】
本明細書中で使用する場合、自然グリコシル化部位は、野生型ポリペプチドにおいて炭水化物部分が結合されるアミノ酸位置を指す。配列番号５に関して、残基Ｎ９８、Ｎ１４５、Ｎ１５６およびＮ３４９に相当するＡＤＡ２における４つのＮ連結される自然グリコシル化部位が存在する。
【０１４１】
本明細書中で使用する場合、非自然グリコシル化部位は、野生型ポリペプチド中に存在しない修飾ポリペプチドにおいて炭水化物部分が結合されるアミノ位置を指す。非自然グリコシル化部位は、アミノ酸置き換えによりＡＤＡ２ポリペプチドへ導入され得る。Ｏ−グリコシル化部位は、例えばセリンまたはトレオニンによる自然残基のアミノ酸置き換えにより創出させることができる。Ｎ−グリコシル化部位は、例えばモチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ(式中、Ｘａａは、プロリンではない)を確立させることにより創出させることができる。アミノ酸修飾によるこのコンセンサス配列の創出は、例えば、アスパラギンによる自然アミノ酸残基の単一のアミノ酸置き換え、セリン、トレオニンもしくはシステインによる自然アミノ酸残基の単一のアミノ酸置き換えまたはアスパラギンによる自然残基の第１のアミノ酸置き換えおよびセリン、トレオニンまたはシステインによる自然残基の第２のアミノ酸置き換えを含む二重アミノ酸置き換えまたはモチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓ(式中、Ｘａａは、プロリンではない)などの非自然Ｎ−グリコシル化モチーフの挿入を包含し得る。
【０１４２】
本明細書中で使用する場合、「グリコシル化のレベル」は、例えば、グリコシル化が可能な宿主細胞における発現時にグリカンにより占有されることが可能なグリコシル化部位の数を指す。
【０１４３】
本明細書中で使用する場合、グリコシル化のレベルに関する増加は、未修飾または野生型ＡＤＡ２に関して、より多くの数のグリカンにより占有されることが可能なグリコシル化部位が存在することを意味する。グリコシル化のレベルの増加を示す変異型ＡＤＡ２は、未修飾または野生型ＡＤＡ２と比較して、より多くの数のグリカンにより占有されるグリコシル化部位が存在する場合に、過グリコシル化され得る。
【０１４４】
本明細書中で使用する場合、「タンパク質安定性」は、環境条件(例えば、温度の上昇)に応答したタンパク質の１以上の物理特性の維持の尺度を指す。一態様では、物理特性は、タンパク質の共有結合性構造の維持(例えば、タンパク質分解性切断、望ましくない酸化または脱アミドの非存在)である。別の態様では、物理特性は、適切にフォールディングされた状態におけるタンパク質の存在(例えば、可溶性もしくは不溶性の凝集物または沈殿物の非存在)である。一態様では、タンパク質の安定性は、タンパク質の生物物理学的特性、例えば熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、溶解度、生化学的機能(例えば、受容体などのタンパク質へ結合する能力または酵素活性)および／またはそれらの組合せをアッセイすることにより測定される。別の態様では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性により実証される。安定性は、当該技術分野で公知のおよび／または本明細書中に記載する方法を使用して測定され得る。
【０１４５】
本明細書中で使用する場合、「半減期」は、生体が、投与される物質の量の半分を、排除のその正常なチャネルを通じて排除するのに要する時間を指す。排除の正常なチャネルは概して、腎臓および肝臓を含むが、他の排出経路を含み得る。半減期は、物質の濃度が、排除曲線上の定常状態からまたはある特定の点からその濃度を半減させるのにかかる時間として記載することができる。半減期は通常、血漿中で測定され、単回用量の薬物を付与すること、続いて血漿中の薬物の濃度を折々測定して、時間と、物質が排除される際の濃度の減少との間の関連性を決定することにより決定され得る。
【０１４６】
本明細書中で使用する場合、「延長された半減期」は、参照タンパク質と比較して、タンパク質分子のより長い半減期を指す。したがって、それは、物質の濃度が、その濃度を半減させるのにかかる時間が、参照タンパク質の濃度が半減するのにかかる時間に関するよりも長いことを意味する。半減期は、未修飾ポリペプチドの半減期と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１１００％、１２００％、１３００％、１４００％、１５００％、１６００％、１７００％、１８００％、１９００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、６０００％、７０００％、８０００％、９０００％、１００００％またはそれ以上増加され得る。半減期を評価するためのアッセイは、当該技術分野において公知であり、標準的である。
【０１４７】
本明細書中で使用する場合、「熱安定性」は、高温または上昇させた温度への暴露時に起きるタンパク質の変性に対する抵抗性の尺度を指し、したがって、タンパク質の、特定の温度で機能する能力である。ポリペプチドは、それが、ある温度でポリペプチドの活性または特性の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上を保持する場合に、その温度で熱的に安定である。熱安定性は、公知の手順によりまたは本明細書中に記載する方法により測定することができる。ある特定の態様では、熱安定性は、タンパク質の融解温度(Ｔｍ)を測定することによりまたは熱負荷アッセイ(Ｔｃ)により評価される。
【０１４８】
本明細書中で使用する場合、「増加された熱安定性」は、タンパク質の変性に対するより高度な抵抗性を指す。例えば、それは、タンパク質が参照タンパク質よりも高温で熱的に安定性であることを意味することができる。同様に、それはまた、タンパク質が、同じ温度で参照タンパク質の活性と比較して、特定の温度でより大きな保持活性を示すことを意味することができる。場合によっては、増加された熱安定性は、タンパク質が、参照タンパク質と比較して、より高い融解温度Ｔｍを有することを意味する。例えば、熱安定性は、タンパク質のＴｍが、参照または未修飾タンパク質よりも少なくとも０.１℃、０.２℃、０.３℃、０.４℃、０.５℃、０.６℃、０.７℃、０.８℃、０.９℃、１.０℃、１.５℃、２.０℃、２.５℃、３.０℃、４.０℃、５.０℃またはそれ以上である場合に増加される。
【０１４９】
本明細書中で使用する場合、融解温度(Ｔｍ、遷移温度とも呼ばれる)は、組成物の分子の５０％がフォールディングされた状態で存在する熱遷移曲線の中間点にある温度である。したがって、それは、巨大分子の５０％が変性されるようになる温度であり、タンパク質の熱安定性について記載するための標準的なパラメーターである。Ｔｍを決定する方法は、当業者に周知であり、例えば、示差走査熱量測定(ＤＳＣ)、円偏光二色性(ＣＤ)分光法、蛍光放出分光法または核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法などの、しかしそれらに限定されない分析用分光方法を含む。
【０１５０】
本明細書中で使用する場合、「ｐＨ最適条件」または「ｐＨ最適条件(単数)」は、アデノシンデアミナーゼ活性などの任意の酵素反応が、所定の条件下で最も有効であるｐＨを指す。そのアデノシンデアミナーゼ活性に関して、ＡＤＡ２は、ｐＨ６.５であるかまたは約ｐＨ６.５であるｐＨ最適条件を示す。
【０１５１】
本明細書中で使用する場合、「ｐＨ最適条件の変更」または「ｐＨ最適条件(単数)の変更」は、アデノシンデアミナーゼ活性に関する最適ｐＨであるｐＨの変化(増加または減少)を指す。ｐＨ最適条件が、参照または未修飾タンパク質のｐＨ最適条件と比較して、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.０、２.５またはそれ以上を上回る場合に、ｐＨ最適条件の増加が見られる。ｐＨ最適条件が、参照または未修飾タンパク質のｐＨ最適条件と比較して、０.１、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.０、２.５もしくはそれ以下を下回るかまたはそれよりも低い場合に、ｐＨ最適条件の減少が見られる。
【０１５２】
本明細書中で使用する場合、「結合する」、「結合される」またはそれらの文法的変形は、別の分子との任意の引力相互作用での分子の関与を指し、２つの分子が互いに非常に近接する安定な結合をもたらす。結合としては、非共有結合性結合、共有結合(可逆的および不可逆的共有結合などの)が挙げられるが、それらに限定されず、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質および薬物を含む化学的化合物などの小分子などの、しかしそれらに限定されない分子間での相互作用を含む。通常、結合は、１以上の非共有結合性結合による１以上の分子の結合を包含する。結合は、平衡透析、ラジオイムノアッセイ、放射標識された標的抗原、イムノアッセイ(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ))、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)、等温滴定熱量測定(ＩＴＣ)および当業者に周知の他の方法を含むが、それらに限定されない当該技術分野で公知の標準的な方法により評価することができる。
【０１５３】
本明細書中で使用する場合、結合活性は、それが１以上の結合パートナーを結合するかどうか、またどのように結合するかに関する、分子、例えばポリペプチドの特徴を指す。結合活性は、結合パートナーを結合する能力、それが結合パートナーに結合する親和性(例えば、高い親和性)、それが結合パートナーに結合するアビディティー、結合パートナーとの結合の強度および／または結合パートナーと結合するための特異性を含む。
【０１５４】
本明細書中で使用する場合、「ヘパリン結合」は、可変的に硫酸化される反復二糖ユニットから構成される高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであるヘパリンを結合する、ＡＤＡ２の能力を指す。一般的に、ヘパリン二糖ユニットは、２−Ｏ−硫酸化イズロン酸および６−Ｏ−硫酸化,Ｎ−硫酸化グルコサミン、ＩｄｏＡ(２Ｓ)−ＧｌｃＮＳ(６Ｓ)から構成される。
【０１５５】
本明細書中で使用する場合、「ヘパリン結合の低減」または「ヘパリン結合の減衰」は、ヘパリンに対する結合活性の減少または低減を指す。例えば、それは、変異型ＡＤＡ２などのＡＤＡ２タンパク質の結合のレベルまたは度合いが、参照タンパク質よりも少ないことを意味することができる。例えば、ヘパリン結合は、ヘパリンへのＡＤＡ２タンパク質の結合のレベルまたは程度が、ヘパリンへの参照または未修飾ＡＤＡ２タンパク質の結合の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以下である場合に低減される。場合によっては、ヘパリン結合は、参照または未修飾ＡＤＡ２タンパク質のヘパリン結合と比較して、少なくともまたは少なくとも約０.５倍、１倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上低減される。
【０１５６】
本明細書中で使用する場合、「アデノシン受容体」またはＡＤＲは、アデノシンを結合するＧタンパク質結合受容体の種類を指す。アデノシン受容体はまた、ＡＤＡ２に結合することができる。４つのタイプのアデノシン受容体が存在する。例えば、ヒトでは、ＡＤＲは、Ａ１(配列番号５３３)、Ａ２Ａ(配列番号５３４)、Ａ２Ｂ(配列番号５３５)およびＡ３(配列番号５３６〜５３８)と称される。
【０１５７】
本明細書中で使用する場合、「受容体結合」は、ＡＤＡ２の、アデノシン受容体を結合する能力を指す。
【０１５８】
本明細書中で使用する場合、「受容体結合の低減」は、アデノシン受容体に対する結合活性の減少または低減を指す。例えば、それは、変異型ＡＤＡ２などのＡＤＡ２タンパク質の結合のレベルまたは度合いが、同じアデノシン受容体に関して、参照タンパク質の結合よりも少ないことを意味することができる。例えば、受容体結合は、アデノシン受容体に対するＡＤＡ２タンパク質のレベルまたは程度が、同じアデノシン受容体に関して、参照または未修飾ＡＤＡ２タンパク質の結合の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以下である場合に低減される。場合によっては、受容体結合は、同じアデノシン受容体に関して、参照または未修飾ＡＤＡ２タンパク質の受容体結合と比較して、少なくともまたは少なくとも約０.５倍、１倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上低減される。
【０１５９】
本明細書中で使用する場合、タンパク質が、「同じ条件下で比較される」という記述は、タンパク質もしくは作用物質の活性または特性に影響を及ぼし得る任意の１以上の条件が、試験作用物質間で変動されないかまたは実質的に変動されないように、種々のタンパク質が、同一にまたは実質的に同一に処理されることを意味する。例えば、ＡＤＡ２のアデノシンデアミナーゼ活性を未修飾ＡＤＡ２タンパク質と比較する場合、タンパク質の量または濃度、活性剤以外の製剤中の賦形剤、担体または他の構成成分の量を含む存在、温度、ｐＨおよび／または他の条件などの任意の１以上の条件は、比較されるポリペプチドの間および中で、同一であるかまたは実質的に同一である。
【０１６０】
本明細書中で使用する場合、「免疫チェックポイント」は、付帯的組織損傷を最低限に抑えるために、自己寛容を維持して、末梢組織における生理学的免疫応答の持続期間および大きさを調節するのに関与する免疫系の阻害経路を指す。免疫チェックポイントは、免疫チェックポイントタンパク質により制御される。
【０１６１】
「免疫チェックポイントタンパク質」は、免疫応答の程度を制御または調節するタンパク質、通常受容体(例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１)またはリガンド(例えば、ＰＤ−Ｌ１)である。免疫チェックポイントタンパク質は、阻害性または刺激性であり得る。特に、免疫チェックポイントタンパク質は、免疫応答の活性化に対して阻害性である。したがって、阻害性免疫チェックポイントタンパク質の阻害は、Ｔ細胞活性化および増殖などの免疫応答を刺激または活性化するように作用する。
【０１６２】
本明細書中で使用する場合、「免疫チェックポイント阻害剤」または「免疫チェックポイント阻害性作用物質」または「免疫チェックポイント阻止性作用物質」は、阻害性免疫チェックポイントタンパク質を結合して、その活性を阻止する作用物質を指す。阻害は、立体的もしくはアロステリック的であり得る競合または非競合阻害であり得る。免疫チェックポイントタンパク質が、免疫刺激タンパク質である場合、免疫チェックポイント阻害剤は、例えば刺激性免疫チェックポイントタンパク質を結合および活性化することによりまたは刺激性免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤を妨害することにより、例えば結合または不活性化することにより、免疫刺激タンパク質の活性を促進するように作用する。免疫チェックポイント阻害剤の例は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体である。
【０１６３】
免疫チェックポイント阻害剤の「標的」は、免疫チェックポイント阻害剤または免疫チェックポイント阻害性作用物質が結合して、活性を阻止する免疫チェックポイントタンパク質である。通常、免疫チェックポイント阻害剤は、標的に特異的に結合する。例えば、イプリムマブと称される例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体の標的は、ＣＴＬＡ４である。
【０１６４】
本明細書中で使用する場合、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体は、免疫チェックポイントタンパク質またはその可溶性断片に特異的に結合して、阻止する任意の抗体を指す。抗免疫チェックポイントタンパク質抗体は通常、免疫チェックポイントリガンドタンパク質または免疫チェックポイント受容体タンパク質を結合して、受容体の、標的免疫チェックポイントリガンドタンパク質への結合またはリガンドの、標的免疫チェックポイント受容体タンパク質への結合を阻止して、それにより、免疫応答を抑制する阻害性シグナル伝達を防止する。したがって、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体は、免疫チェックポイント阻害剤である。本明細書中の抗免疫チェックポイントタンパク質抗体に対する言及は、免疫チェックポイントリガンドまたは受容体タンパク質を特異的に結合する完全長抗体およびそれらの抗原結合断片を含む。例示的な抗免疫チェックポイントタンパク質抗体として、抗細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４(ＣＴＬＡ４)抗体および抗プログラム細胞死タンパク質１(ＰＤ−１)抗体が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６５】
本明細書中で使用する場合、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体の抗原結合断片は、抗免疫チェックポイントタンパク質に由来であるが、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体の完全長配列未満である抗体を指すが、抗原結合部位を形成するのに十分な抗体の可変領域(重および軽)の少なくとも一部(例えば、１以上のＣＤＲ、概して全てのＣＤＲ)を含有し、したがって抗免疫チェックポイントタンパク質抗体の結合特異性および／または活性を保持する。
【０１６６】
本明細書中で使用する場合、抗ＣＴＬＡ４抗体は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質(ＣＴＬ４)またはその可溶性断片に特異的に結合して、リガンドの、ＣＴＬＡ４への結合を阻止し、それによりＣＴＬＡ４の競合阻害およびＴ細胞活性化のＣＴＬＡ４媒介性阻害をもたらす。したがって、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＴＬＡ４阻害剤である。本明細書中の抗ＣＴＬＡ４に対する言及は、ＣＴＬＡ４に特異的に結合するそれらの抗原結合断片などの完全長抗体およびその誘導体を含む。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体として、イピリムマブもしくはトレメリムマブまたはそれらの誘導体もしくは抗原結合断片が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６７】
本明細書中で使用する場合、抗ＰＤ−１抗体は、プログラム細胞死タンパク質１(ＰＤ−１)またはその可溶性断片に特異的に結合して、リガンドの、ＰＤ−１への結合を阻止し、それによりＰＤ−１の競合阻害およびＴ細胞活性化のＰＤ−１媒介性阻害の阻害をもたらす任意の抗体を指す。したがって、抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１阻害剤である。本明細書中の抗ＰＤ−１抗体に対する言及は、完全長抗体およびＰＤ−１に特異的に結合するその抗原結合断片などの誘導体を含む。例示的な抗ＰＤ−１抗体として、ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ピジリズマブまたはそれらの誘導体もしくは抗原結合断片が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６８】
本明細書中で使用する場合、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、プログラム死−リガンド１(ＰＤ−Ｌ１)またはその可溶性断片に特異的に結合して、リガンドの、ＰＤ−１への結合を阻止して、それによりＰＤ−１の競合阻害およびＴ細胞活性のＰＤ−１媒介性阻害の阻害をもたらす抗体を指す。したがって、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１阻害剤である。本明細書中の抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する言及は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するそれらの抗原結合断片などの完全長抗体およびその誘導体を含む。例示的な抗ＰＤ−１抗体として、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６またはそれらの誘導体もしくは抗原結合断片が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１６９】
本明細書中で使用する場合、「抗体」は、抗原結合部位を形成して、また集合すると、抗原を特異的に結合するのに十分である免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域の少なくとも一部を含有するそれらの任意の断片を含む、天然であろうとまたは部分的にもしくは全体的に合成的に、例えば組換え的に産生される、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片を指す。したがって、抗体は、免疫グロブリン抗体結合ドメイン(抗体複合部位)に相同的であるかまたは実質的に相同的である結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖(それらは、ＨおよびＨ’で表示され得る)および２つの軽鎖(それらは、ＬおよびＬ’で表示され得る)を含有する抗体を指し、ここで重鎖はそれぞれ、完全長免疫グロブリン重鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なその一部であってもよく(例えば、重鎖として、ＶＨ鎖、ＶＨ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３鎖が挙げられるが、それらに限定されない)、軽鎖はそれぞれ、完全長軽鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なその一部であってもよい(例えば、軽鎖として、ＶＬ鎖およびＶＬ−ＣＬ鎖が挙げられるが、それらに限定されない)。各重鎖(ＨおよびＨ’)は、１つの軽鎖(それぞれ、ＬおよびＬ’)と対形成する。通常、抗体は、可変重(ＶＨ)鎖および／または可変軽(ＶＬ)鎖の全てまたは少なくとも一部を最小限に含む。抗体はまた、定常領域の全てまたは一部を含み得る。
【０１７０】
本明細書中の目的では、抗体という用語は、完全長抗体および抗体断片を含むそれらの一部を含む。抗体断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ(ａｂ’)２断片、Ｆｖ断片、ジスルフィド連結Ｆｖｓ(ｄｓＦＶ)、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦＶ)、単鎖Ｆａｂ(ｓｃＦａｂ)、二特異性抗体、抗イディオタイプ(抗Ｉｄ)抗体または上記のいずれかの抗原結合断片が挙げられるが、それらに限定されない。抗体はまた、合成抗体、組換え的に産生される抗体、多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および細胞内抗体を含む。本明細書中に提供する抗体は、任意の免疫グロブリンタイプ(例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ)、任意のクラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２)またはサブクラス(例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ)の成員を含む。
【０１７１】
本明細書中で使用する場合、モノクローナル抗体などの別の抗体に由来する抗体断片に関する場合の「に由来する」または「誘導体」という語句は、元のまたは親抗体の結合特異性を保持する抗体断片(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)、Ｆ(ａｂ’)２、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、二特異性抗体、ＦｄおよびＦｄ’断片)の操作を指す。かかる断片は、酵素的切断、化学的架橋、組換え手段またはそれらの組合せを含むが、それらに限定されない当該技術分野で公知の様々な方法により得られ得る。概して、得られた抗体断片は、抗体断片および親抗体が、同じエピトープを結合するように、親抗体の同一のまたは実質的に同一の重鎖可変領域(ＶＨ)および軽鎖可変領域(ＶＬ)を共有する。
【０１７２】
本明細書中で使用する場合、抗ヒアルロナン剤は、ヒアルロナン(ＨＡ)合成または分解を調節して、それにより組織または細胞中のヒアルロナンレベルを変更させる任意の作用物質を指す。本明細書中の目的では、抗ヒアルロナン剤は、作用物質の非存在と比較して、組織または細胞におけるヒアルロナンレベルを低減させる。かかる作用物質は、ＨＡシンターゼ(ＨＡＳ)およびヒアルロナン代謝に関与する他の酵素または受容体をコードする遺伝子材料の発現を調節するかまたはＨＡＳ機能または活性を含むヒアルロナンを合成または分解するタンパク質を調節する化合物を含む。上記作用物質は、小分子、核酸、ペプチド、タンパク質または他の化合物を含む。例えば、抗ヒアルロナン剤として、アンチセンスまたはセンス分子、抗体、酵素、小分子阻害剤およびＨＡＳ基質アナログが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７３】
本明細書中で使用する場合、ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンポリマー(ヒアルロン酸またはＨＡとも称される)の、より低分子量断片への切断を触媒する酵素を指す。例示的なヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロニダーゼおよびヒアルロナンを解重合する能力を有する特定のコンドロイチナーゼおよびリアーゼである。ヒアルロナン分解酵素である例示的なコンドロイチナーゼとして、コンドロイチンＡＢＣリアーゼ(コンドロイチナーゼＡＢＣとしても知られている)、コンドロイチンＡＣリアーゼ(コンドロイチン硫酸リアーゼまたはコンドロイチン硫酸エリミナーゼとしても知られている)およびコンドロイチンＣリアーゼが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１７４】
本明細書中で使用する場合、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素の種類を指す。ヒアルロニダーゼとして、細菌ヒアルロニダーゼ(ＥＣ４.２.２.１またはＥＣ４.２.９９.１)、ヒル、他の寄生生物および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ(ＥＣ３.２.１.３６)および哺乳動物型ヒアルロニダーゼ(ＥＣ３.２.１.３５)が挙げられる。ヒアルロニダーゼは、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、サカナ、カエル、細菌、ならびにヒル、他の寄生生物および甲殻類のいずれかを含むが、それらに限定されない非ヒト起源のいずれかを含む。例えば、ヒアルロニダーゼは、ヒト起源のものを含む。例示的なヒトヒアルロニダーゼとして、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＰＨ２０(配列番号４８０および５５１)が挙げられる。また、ヒツジＰＨ２０およびウシＰＨ２０を含む可溶性ヒアルロニダーゼ、可溶性ヒトＰＨ２０および可溶性ｒＨｕＰＨ２０も、ヒアルロニダーゼの中に含まれる。市販のウシまたはヒツジ可溶性ヒアルロニダーゼの例として、Ｖｉｔｒａｓｅ(登録商標)(ヒツジヒアルロニダーゼ)、Ａｍｐｈａｄａｓｅ(登録商標)(ウシヒアルロニダーゼ)およびＨｙｄａｓｅ(商標)(ウシヒアルロニダーゼ)が挙げられる。
【０１７５】
ヒアルロナン分解酵素またはヒアルロニダーゼに対する言及は、前駆ヒアルロナン分解酵素ポリペプチドおよび成熟ヒアルロナン分解酵素ポリペプチド(シグナル配列が除去されたものなどの)、活性を有するそれらの切断型形態を含み、また前駆ポリペプチドまたはそれらの成熟形態に対して少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、スプライス変異体によりコードされる変異体および他の変異体を含む。ヒアルロナン分解酵素およびヒアルロニダーゼはまた、化学的または翻訳後修飾を含有するものおよび化学的または翻訳後修飾を含有しないものを含む。かかる修飾として、ペグ化、アルブミン化(albumination)、グリコシル化、フェネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化および当該技術分野で公知の他のポリペプチド修飾が挙げられるが、それらに限定されない。切断型ＰＨ２０ヒアルロニダーゼは、それらの任意のＣ末端切断形態、特にＮ−グリコシル化される場合に切断されて、中性活性である形態である。
【０１７６】
本明細書中で使用する場合、「ウシＰＨ２０」は、ウシ精巣抽出物から精製されるウシヒアルロニダーゼを指す(例えば、米国特許第２,４８８,５６４号、第２,４８８,５６５号、第２,８０６,８１５号、第２,８０８,３６２号、第２,６７６,１３９号、第２,７９５,５２９号、第５,７４７,０２７号および第５,８２７,７２１号を参照)。市販の精製ウシ精巣ヒアルロニダーゼの例として、Ａｍｐｈａｄａｓｅ(登録商標)およびＨｙｄａｓｅ(商標)、ならびにSigma Aldrich、Abnova、EMD Chemicals、GenWay Biotech, Inc.、Raybiotech, Inc.およびCalzymeから入手可能なものを含むが、それらに限定されないウシヒアルロニダーゼが挙げられる。また、組換え的に産生されるウシヒアルロニダーゼも含まれる。
【０１７７】
本明細書中で使用する場合、「ヒツジＰＨ２０」は、ヒツジ精巣抽出物から精製されるヒツジヒアルロニダーゼを指す(例えば、米国特許第２,４８８,５６４号、第２,４８８,５６５号および第２,８０６,８１５号、ならびに国際公開第２００５／１１８７９９号を参照)。市販の精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼの例として、Ｖｉｔｒａｓｅ(登録商標)およびSigma Aldrich、Cell Sciences、EMD Chemicals、GenWay Biotech, Inc.、Mybiosource.comおよびRaybiotech, Inc.から入手可能なものを含むが、それらに限定されないヒツジシヒアルロニダーゼが挙げられる。また、組換え的に産生されるヒツジヒアルロニダーゼも含まれる。
【０１７８】
本明細書中で使用する場合、「ＰＨ２０」は、精子中に見られ、中性活性であるヒアルロニダーゼのタイプである。ＰＨ−２０は、精子表面上およびリソソーム由来の先体中で見られ、そこで、それは、内部先体膜に結合されている。ＰＨ−２０は、ヒト、チンパンジー、カニクイザル、アカゲザル、マウス、ウシ、ヒツジ、モルモット、ウサギおよびラット起源を含むが、それらに限定されない任意の起源のものを含む。例示的なＰＨ２０ポリペプチドは、ヒト(配列番号５５１に記載する前駆および配列番号４８０に記載する成熟)を含む。
【０１７９】
本明細書中で使用する場合、「可溶性ＰＨ２０」は、生理学的条件下で可溶性であるＰＨ２０の任意の形態を指す。可溶性ＰＨ２０は、例えば、３７℃でのＴｒｉｔｏｎ(登録商標)Ｘ−１１４溶液の水相へのその分配により同定することができる(Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7)。ＧＰＩにアンカーされたＰＨ２０を含む脂質にアンカーされたＰＨ２０などの膜にアンカーされたＰＨ２０は、洗浄剤に富んだ相へ分配するが、ホスホリパーゼＣによる処理後には洗浄剤が乏しい相または水相へ分配する。膜へのＰＨ２０のアンカリングに関連する１以上の領域が除去されたかまたは修飾された膜でアンカーされたＰＨ２０は、可溶性ＰＨ２０の中に含まれ、そこで可溶性形態は、ヒアルロニダーゼ活性を保持する。可溶性ＰＨ２０はまた、組換え可溶性ＰＨ２０および例えばヒツジまたはウシ由来の精巣抽出物などの天然供給源中に含有されるかまたはそれらから精製されるものを含む。かかる可溶性ＰＨ２０の例は、可溶性ヒトＰＨ２０である。例示的な可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４または５２６〜５３２のいずれかに記載されるかまたは配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４または５２６〜５３２のいずれかに記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性であり、可溶であり、かつヒアルロニダーゼ活性を保持するアミノ酸の配列を有する。
【０１８０】
本明細書中で使用する場合、「可溶性組換えヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)」は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞中で組換え的に発現および分泌されるようなヒトＰＨ２０の可溶性形態を含有する組成物を指す。可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、シグナル配列を含み、かつ配列番号４８１に記載するポリペプチドをコードする核酸分子によりコードされる。可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸は、成熟ポリペプチドを分泌するＣＨＯ細胞で発現される。培養培地中で産生される場合、Ｃ末端で不均一性が見られ、その結果、生成物は様々な存在量で配列番号４８１〜４８６の任意の１つまたは複数を含むことができる種の混合物を含む。
【０１８１】
本明細書中で使用する場合、「ヒアルロニダーゼ活性」は、ヒアルロン酸の切断を酵素的に触媒する能力を指す。ヒアルロニダーゼに関する米国薬局方(ＵＳＰ)ＸＸIIアッセイは、酵素をＨＡと３７℃で３０分間、反応させた後、より高分子量のヒアルロン酸またはヒアルロナン(ＨＡ)基質の量を測定することにより、間接的にヒアルロニダーゼ活性を決定する(USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc., Rockville, MD)。参照標準溶液をアッセイで使用して、任意のヒアルロニダーゼのユニットでの相対活性を確かめることができる。可溶性ＰＨ２０およびｅｓＰＨ２０を含むＰＨ２０などのヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を決定するためのインビトロアッセイは、当該技術分野で公知であり、本明細書中に記載する。例示的なアッセイとして、非切断ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合する場合に形成される不溶性沈殿物を検出することにより、間接的にヒアルロニダーゼによるヒアルロン酸の切断を測定する微小濁度(microturbidity)アッセイ、ならびにストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートおよび発色性基質を用いて、マイクロタイタープレートウェルに非共有結合的に結合された残存ビオチン化ヒアルロン酸を検出することにより、間接的にヒアルロン酸の切断を測定するビオチン化ヒアルロン酸アッセイが挙げられる。参照標準物質を使用して、例えば、試験されているヒアルロニダーゼのユニットでの活性を決定するための標準曲線を作成することができる。
【０１８２】
本明細書中で使用する場合、「中性活性」は、ＰＨ２０ポリペプチドの、中性ｐＨで(例えば、ｐＨ７.０でまたは約ｐＨ７.０で)ヒアルロン酸の切断を酵素的に触媒する能力を指す。
【０１８３】
本明細書中で使用する場合、抗がん剤または化学療法剤は、がん細胞などの迅速に分割する細胞を死滅させることが可能である作用物質を指す。当業者は、化学療法剤を含む抗がん剤に精通している。例示的な作用物質を本明細書中に記載する。
【０１８４】
本明細書中で使用する場合、「生物活性」は、化合物のインビボ活性または化合物、組成物もしくは他の混合物のインビボ投与時に生じる生物学的応答を指す。したがって、生物活性は、かかる化合物、組成物および混合物の治療効果ならびに医薬品活性を包含する。生物活性は、かかる活性を試験または使用するように設計されたインビトロシステムにおいて観察することができる。したがって、本明細書中の目的では、ＡＤＡ２の生物活性は、アデノシンデアミナーゼ活性を包含する。
【０１８５】
本明細書中で使用する場合、「評価する」という用語およびその文法的変形は、ポリペプチドの活性に関して絶対値を獲得するという意味でのおよび同様に活性のレベルを示す指数、比、割合、視覚的および他の値を獲得するという意味での定量的ならびに定性的決定を含むと意図される。評価は、直接的または間接的であり得る。例えば、ポリペプチドによる基質の切断の検出は、生成物の直接的な測定によるものであり得るかまたは切断された基質の生じる活性を決定することにより、間接的に測定され得る。
【０１８６】
本明細書中で使用する場合、「成熟ナンバリング」または「標準的なナンバリング」は、成熟ＡＤＡ２ポリペプチドに基づいた順々の残基のナンバリングを指す。本明細書中での目的では、成熟ナンバリングは、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基のナンバリングに基づいている。
【０１８７】
本明細書中で使用する場合、「Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリング」は、Zavialov et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377でおよびＰＤＢ受託番号３ＬＧＧおよび３ＬＧＤで使用される残基のナンバリングを指す。Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングは、配列番号４に記載するＡＤＡ２の残基のナンバリングに基づいている。したがって、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングは、配列番号４とのアラインメントにより決定することができる。以下の表１は、成熟ナンバリングとＺａｖｉａｌｏｖナンバリングとの間の相当する位置番号を記載している。表１は、配列番号４(Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングに関する参照配列)に記載するアミノ酸の配列、その位置番号および配列番号５(本明細書中で使用する場合の成熟ナンバリングに関する参照配列)に関する相当する位置番号を提供する。
【０１８８】
【表１】
0006625627.tif 000002
【表２】
0006625627.tif 000003
【０１８９】
【表３】
0006625627.tif 000004
【表４】
0006625627.tif 000005
【表５】
0006625627.tif 000006
【０１９０】
本明細書中で使用する場合、「コンジュゲート」は、１つもしくは複数の他のポリペプチドまたは化学部分に、直接的にまたは間接的に連結されるポリペプチドを指す。かかるコンジュゲートとして、融合タンパク質、化学的コンジュゲートにより産生されるものおよび任意の他の方法により産生されるものが挙げられる。例えば、コンジュゲートは、１つもしくは複数の他のポリペプチドまたは化学的部分に、直接的にまたは間接的に連結されるＡＤＡ２タンパク質を指し、それにより、コンジュゲートが、アデノシンデアミナーゼ活性を保持する限り、少なくとも１つのＡＤＡ２ポリペプチドサブユニットが、別のポリペプチドまたは化学的部分に、直接的にまたは間接的に連結される。
【０１９１】
本明細書中で使用する場合、「結合されている」または「コンジュゲートしている」は、共有結合性または非共有結合性相互作用を介して結合していることを意味する。
【０１９２】
本明細書中で使用する場合、キメラポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチド由来のまたは単一ポリペプチドの２つの非連続部分由来の部分を含有するポリペプチドを指す。したがって、キメラポリペプチドは概して、あるポリペプチドの全てまたは一部由来のアミノ酸残基の配列および別の異なるポリペプチドの全てまたは一部由来のアミノ酸の配列を含む。２つの部分は、直接的にまたは間接的に連結させることができ、例えば、等張性ｐＨ７緩衝生理食塩水中での平衡条件および生理学的条件下で、ペプチド結合、他の共有結合、キメラポリペプチドのかなりの部分の完全性を維持するのに十分な強度の共有結合性相互作用を介して連結させることができる。
【０１９３】
本明細書中で使用する場合、融合タンパク質は、例えば、ベクターの長さ方向に沿って、互いに近接近した、例えば隣接した２つのポリペプチドをコードする２つの核酸を含有するベクターから融合タンパク質を発現させることにより、一緒に結合されている２つの別個のポリペプチドに対応するアミノ酸の配列を含有するように操作されたポリペプチドである。したがって、融合タンパク質は、直接的にまたはペプチド結合を介して間接的に連結される２つのタンパク質またはペプチド、あるいは２つまたはそれ以上のタンパク質またはペプチド由来の部分を含有するキメラタンパク質を指す。２つの分子は、コンストラクト中で隣接し得るかまたはリンカー、もしくはスペーサーポリペプチドにより分離され得る。
【０１９４】
本明細書中で使用する場合、「リンカー」または「スペーサー」ペプチドは、２つのポリペプチド配列を結合させるアミノ酸(またはかかるアミノ酸配列をコードする核酸)の短配列を指す。「ペプチドリンカー」は、２つのポリペプチド配列を結合させるアミノ酸の短配列を指す。例示的なポリペプチドリンカーは、ペプチド形質導入ドメインを抗体へ結合させるリンカーまたはｓｃＦＶ断片などの合成抗体断片における２つの抗体鎖を結合させるリンカーである。リンカーは周知であり、任意の公知のリンカーを、本提供方法で使用することができる。例示的なポリペプチドリンカーは、溶解度を増加するためにいくつかのＧｌｕまたはＬｙｓ残基が全体にわたって分散されている(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎアミノ酸配列である。他の例示的なリンカーが本明細書中に記載され、これらおよび他の公知のリンカーのいずれかを、本提供組成物および方法とともに使用することができる。
【０１９５】
本明細書中で使用する場合、多量体化ドメインは、ポリペプチド分子と、１以上のさらなるポリペプチド分子との安定な相互作用を促進するアミノ酸配列を指し、それぞれが、相補的な多量体化ドメインを含有し、それらは、同じかまたは異なる多量体化ドメインであり、最初のドメインとともに安定な多量体を形成し得る。概して、ポリペプチドは、多量体化ドメインに、直接的にまたは間接的に結合されている。例示的な多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列またはそれらの一部、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域および適合性タンパク質間相互作用ドメインを含む。例えば多量体化ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプを含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＭならびにそれらの修飾形態由来の例えばＦｃドメインまたはその一部などの免疫グロブリン定常領域またはドメインであり得る。
【０１９６】
本明細書中で使用する場合、「部分」または「異種部分」は、共有結合性もしくは非共有結合性相互作用により、直接的にまたは間接的に、別の分子と結合することが可能である分子を指す。通常、分子は、それが結合されている実体の分子とは別個の実体に由来する。一態様では、異種部分は、融合ポリペプチドまたはタンパク質を産生するために別のポリペプチドに融合されるポリペプチドであり得る。別の態様では、異種部分は、ポリペプチドまたはタンパク質にコンジュゲートしているＰＥＧなどのポリマーなどの非ポリペプチドであり得る。
【０１９７】
本明細書中で使用する場合、「半減期延長部分」は、それがコンジュゲートされている分子の半減期の増加を促進する異種部分である。
【０１９８】
本明細書中で使用する場合、「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体重鎖の定常領域を含有するポリペプチドを指す。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインまたはＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指す。Ｆｃドメインは、これらのドメインに対してＮ末端にある可撓性ヒンジの全てまたは一部を含んでもよい。ＩｇＡおよびＩｇＭに関して、Ｆｃは、Ｊ鎖を含むことができる。ＩｇＧの例示的なＦｃドメインに関して、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３、ならびに適宜、Ｃγ１とＣγ２との間のヒンジの全てまたは一部を含有する。Ｆｃ領域の境界は多様であり得るが、通常、ヒンジ領域の少なくとも一部を含む。さらに、Ｆｃはまた、ＦｃＲへの結合を変更させるかまたはＦｃ媒介性のエフェクター機能を変更させる任意の変異体または修飾形態などの、任意の対立遺伝子もしくはスプライス変異体または任意の変異体もしくは修飾形態を含む。
【０１９９】
本明細書中で使用する場合、「Ｆｃキメラ」は、１以上のポリペプチドが、Ｆｃ領域またはその誘導体に、直接的にまたは間接的に連結されるキメラポリペプチドを指す。通常、Ｆｃキメラは、免疫グロブリンのＦｃ領域を別のポリペプチドと組み合わせる。Ｆｃポリペプチドの誘導体または修飾Ｆｃポリペプチドは、当業者に公知である。
【０２００】
本明細書中で使用する場合、「ポリマー」は、直接的にまたはリンカーを介して間接的にポリペプチドにコンジュゲートされている、すなわち安定に連結される任意の高分子量の天然または合成部分を指す。かかるポリマーは通常、血清半減期を延長させ、シアル酸部分、ペグ化部分、デキストラン、ならびに例えばグリコシル化用の糖および他の部分を含むが、それらに限定されない。例えば、変異型ＡＤＡ２などのＡＤＡ２タンパク質は、ポリマーにコンジュゲートさせることができる。
【０２０１】
本明細書中で使用する場合、「ペグ化」は、変異型ＡＤＡ２などのＡＤＡ２を含むタンパク質へのポリエチレングリコール(ペグ化部分ＰＥＧ)などの高分子部分の共有結合または他の安定な結合を指す。ペグ化は、ＡＤＡ２の半減期を延長させることができる。
【０２０２】
本明細書中で使用する場合、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸(ＰＮＡ)を含むそれらのアナログ、ならびにそれらの混合物を含む。核酸は、単鎖または二重鎖であり得る。例えば蛍光または放射標識などの検出可能な標識で標識されてもよいプローブまたはプライマーに関して言及する場合、単鎖分子が意図される。かかる分子は、通常それらの標的が、ライブラリーをプロービングまたはプライミングするのに統計学的に特有であるかまたは低コピー数(通常、５未満、概して３未満)を有するような長さを有する。概して、プローブまたはプライマーは、目的の遺伝子に相補的なまたは同一の配列の少なくとも１４、１６または３０個の連続するヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
【０２０３】
本明細書中で使用する場合、ペプチドは、２〜４０アミノ酸長であるポリペプチドを指す。
【０２０４】
本明細書中で使用する場合、本明細書中に提供するアミノ酸の各種配列に見られるアミノ酸は、それらの公知の３文字または１文字略記(表２)に従って同定される。各種核酸断片に見られるヌクレオチドは、当該技術分野で日常的に使用される標準的な１文字表示で指定される。
【０２０５】
本明細書中で使用する場合、「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。本明細書中の目的では、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸アナログ(すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸)を含む。
【０２０６】
J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968)に記載されまたは37 C.F.R. §§ 1.821-1.822で採択される標準的なポリペプチド命名法を踏まえて、アミノ酸残基に関する略記を表２に示す：
【表６】
0006625627.tif 000007
【０２０７】
式で本明細書中に表される全てのアミノ酸残基配列が、アミノ末端からカルボキシ末端の従来の方向で、左から右への配向性を有することに留意すべきである。さらに、「アミノ酸残基」という語句は、37 C.F.R. §§ 1.821-1.822で言及されるものおよび参照により本明細書に援用されるものなどの、対応関係の表(表２)に列挙するアミノ酸ならびに修飾および異常アミノ酸を含むように広範に規定されている。さらに、アミノ酸残基配列の開始または末端にある破線は、１つもしくは複数のアミノ酸残基のさらなる配列へ、ＮＨ２などのアミノ末端基へまたはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示す。
【０２０８】
本明細書中で使用する場合、「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ疎水性コンセンサススケールを使用して、疎水性であると決定されたアミノ酸のいずれか１つを含む。イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、アラニン、グリシン、システインおよびチロシンなどの天然に存在する疎水性アミノ酸は例示的である(Eisenberg et al., (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120)。天然に存在しない疎水性アミノ酸もまた含まれる。
【０２０９】
本明細書中で使用する場合、「酸性アミノ酸」の中に、天然に存在するアミノ酸アスパラギン酸およびグルタミン酸残基を含む。天然に存在しない酸性アミノ酸もまた含まれる。
【０２１０】
本明細書中で使用する場合、「極性アミノ酸」は、側鎖が水性(すなわち、水)環境中に存在することを好むような、親水性物質であるアミノ酸を指す。かかるアミノ酸は概して、タンパク質の表面上に位置する。かかるアミノ酸は概して、それらが、水との水素結合に関与し得る酸素または窒素を含有する酸、アミド、アルコールまたはアミンなどの官能基を有する極性側鎖を有するものを含む場合に分類される。例示的なかかるアミノ酸は、Ａｒｇ(Ｒ)、Ａｓｎ(Ｎ)、Ａｓｐ(Ｄ)、Ｇｌｕ(Ｅ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ｈｉｓ(Ｈ)、Ｌｙｓ(Ｋ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)およびＴｙｒ(Ｙ)である。Ｃｙｓ(Ｃ)およびＴｒｐ(Ｗ)もまた、弱い極性であると考えられる。
【０２１１】
本明細書中で使用する場合、極性および中性アミノ酸は、中性側鎖を含有する極性アミノ酸である。置き換えに関する例示的なかかるアミノ酸残基は、Ａｓｎ(Ｎ)、Ｇｌｎ(Ｑ)、Ｓｅｒ(Ｓ)、Ｔｈｒ(Ｔ)、Ｃｙｓ(Ｃ)またはＴｙｒ(Ｙ)である。
【０２１２】
本明細書中で使用する場合、「天然に存在するアミノ酸」は、ポリペプチド中に見られる２０個のＬアミノ酸を指す。
【０２１３】
本明細書中で使用する場合、「非天然アミノ酸」は、表２に列挙する天然に存在するアミノ酸の１つではないアミノ基およびカルボン酸基を含有する有機化合物を指す。したがって、天然に存在しないアミノ酸は、例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸のアナログを含み、アミノ酸のＤ−立体異性体を含むが、それに限定されない。例示的な非天然アミノ酸は、当業者に公知であり、修飾ＡＤＡ２ポリペプチドにおいて含まれ得る。
【０２１４】
本明細書中で使用する場合、アミノ酸の適切な保存的置換は、当業者に公知であり、一般的に生じる分子の生物活性を変更させることなく作製することができる。概して、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物活性を実質的に変更しないことを、当業者は理解されよう(例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987、The Benjamin/Cummings Pub.co.,p.224を参照)。かかる置換は、下記のとおりに表３に記載するものに従って成され得る。
【表７】
0006625627.tif 000008
【０２１５】
他の置換もまた許容可能であり、経験的にまたは公知の保存的置換に従って決定することができる。
【０２１６】
本明細書中で使用する場合、ＤＮＡコンストラクトは、実際は見られない様式で組み合わせられて並べられたＤＮＡのセグメントを含有する単鎖もしくは二重鎖の直鎖状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒトの操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
【０２１７】
本明細書中で使用する場合、ＤＮＡセグメントは、指定属性を有するより大きなＤＮＡ分子の部分である。例えば、指定ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片などのより長いＤＮＡ分子の部分であり、それらは、５’から３’方向で読み取られると、指定ポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
【０２１８】
本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドという用語は、５’から３’末端へ読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または二重鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然供給源から単離され得るか、インビトロで合成され得るかまたは天然分子および合成分子の組合せから調製され得る。ポリヌクレオチド分子長は、ヌクレオチド(「ｎｔ」と省略)または塩基対(「ｂｐ」と省略)の観点で本明細書中で付与される。ヌクレオチドという用語は、文脈が許容する場合、単鎖または二重鎖分子に使用される。その用語が二重鎖分子にあてはめられる場合、それは、長さ全体を表すのに使用されて、塩基対という用語に等価であることが理解される。二重鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖は、長さがわずかに異なり得ることおよびそれらの末端がねじれ型であり得ること、したがって二重鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチオが対形成され得ないことを、当業者は理解されよう。かかる不対の末端は、概して、２０ヌクレオチド長を超えない。
【０２１９】
本明細書中で使用する場合、「一次配列」は、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列を指す。
【０２２０】
本明細書中で使用する場合、２つのタンパク質または核酸間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸の配列または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を指す。類似性は、残基の配列の同一性および／または相同性の程度、ならびにその中に含有される残基に基づく。タンパク質または核酸間の類似性の度合いを評価する方法は、当業者に公知である。例えば、配列類似性を評価する方法の１つでは、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列は、配列間の同一性の最大レベルを生じる様式で整列させる。「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列およびある程度ヌクレオチド配列のアラインメントはまた、アミノ酸(またはヌクレオチド)における保存的差異および／または頻回な置換を考慮に入れることができる。保存的差異は、関与する残基の物理化学特性を保存するものである。アラインメントは、全般的であり得る(配列の長さ全体にわたるおよび全ての残基を含む比較配列のアラインメント)か、局所的であり得る(最も類似した領域(単数または複数)のみを含む配列の部分のアラインメント)。
【０２２１】
本明細書中で使用する場合、「相同性」および「同一性」という用語は、交換可能に使用されるが、タンパク質に関する相同性は、保存的アミノ酸変化を含み得る。一般的に、相当する位置を同定するために、最高の桁のマッチが得られるようにアミノ酸の配列がアラインメントされる(例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照)。
【０２２２】
本明細書中で使用する場合、「配列同一性」は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと間の比較における同一アミノ酸(またはヌクレオチド塩基)の数を指す。相同的なポリヌクレオチドは、既定数の同一または相同的なアミノ酸残基を指す。相同性は、保存的アミノ酸置換ならびに同一残基を含む。配列同一性は、各供給業者によって確立されているデフォルトギャップペナルティを用いて使用される標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムにより決定することができる。相同的な核酸分子は、既定数の同一または相同的なヌクレオチドを指す。相同性は、コードされるアミノ酸を変更させない置換(すなわち、「サイレントな置換」)、さらに同一残基を含む。実質的に相同的な核酸分子は、核酸の長さ全てに沿ってまたは目的の完全長核酸分子の少なくとも約７０％、８０％もしくは９０％に沿って、通常、中程度のストリンジェンシーでまたは高いストリンジェンシーで、ハイブリダイズする。また、ハイブリダイズ用核酸分子におけるコドンに代わって縮重コドンを含有する核酸分子も意図される(タンパク質の相同性の決定に関して、保存的アミノ酸ならびに同一アミノ酸をアラインメントすることができ、この場合、同一性のパーセントおよび相同性パーセントは多様である)。任意の２つの核酸分子が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」であるヌクレオチド配列を有する(かまたは任意の２つのポリペプチドが、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％「同一」であるアミノ酸配列を有する)かどうかは、例えば、Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)で見られるようなデフォルトパラメーターを使用した「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピューターアルゴリズムを使用して決定することができる(他のプログラムとして、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984))、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ(Altschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990)、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994)およびCarrillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988))が挙げられる。例えば、国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)データベースのＢＬＡＳＴ機能を使用して、同一性を決定することができる。他の市販のまたは公的に利用可能なプログラムとして、DNAStarの「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム(マディソン、ＷＩ)およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(ＵＷＧ)の「Ｇａｐ」プログラム(マディソン、ＷＩ)が挙げられる)。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えば、SmithおよびWatermanにより修正されるように(Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981))、ＧＡＰコンピュータープログラムを使用して(例えば、Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970))、配列情報を比較することにより決定することができる。簡潔に述べると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列の短い方におけるシンボルの総数で除算された、類似であるアラインメントされるシンボル(すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸)の数として、類似性を規定している。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメーターは、(��)Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)によって記載されるように、一変数比較行列(アイデンティティに関して１および非アイデンティティに関して０の値を含有する)およびGribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)の加重比較行列、(２)各ギャップに関してペナルティ３.０および各ギャップにおける各シンボルに関してさらなる０.１０のペナルティおよび(３)末端ギャップに関してはペナルティなしを含むことができる。
【０２２３】
したがって、本明細書中で使用する場合、「同一性」という用語は、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの間の比較を表す。１つの非限定的な例では、「に対して少なくとも９０％同一である」は、参照ポリペプチドに対して９０〜１００％の同一性パーセントを指す。９０％またはそれ以上のレベルでの同一性は、例示目的で仮定して、１００個のアミノ酸の試験ポリヌクレオチド長および参照ポリヌクレオチド長を比較して、試験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％(すなわち、１００個のうちの１０個)以下が、参照ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示している。類似した比較を、試験ポリヌクレオチドと参照ポリヌクレオチドとの間で行うことができる。かかる差異は、アミノ酸配列の長さ全体にわたって無作為に分布される点突然変異として表すことができるかまたはそれらは、最大の許容可能な、例えば１０／１００のアミノ酸の差異(およそ９０％同一性)に至る様々な長さの１以上の位置でクラスター形成され得る。差異は、核酸もしくはアミノ酸の置換、挿入または欠失として規定される。約８５〜９０％を上回る相同性または同一性のレベルで、結果は、設定されるプログラムおよびギャップパラメーターから独立するはずであり、かかる高レベルの同一性は、多くの場合ソフトウェアに依存せずに容易に評価することができる。
【０２２４】
本明細書中で使用する場合、同様に、「実質的に同一な」または「類似した」という用語は、当業者により理解されるように文脈により多様であるが、当業者は、それらを評価することができることが理解されよう。
【０２２５】
本明細書中で使用する場合、アラインメントされる配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列において相当する位置をアラインメントするための相同性(類似性および／または同一性)の使用を指す。通常、５０％またはそれ以上の同一性により関連される２つまたはそれ以上の配列がアラインメントされる。配列のアラインメントされる組は、相当する位置でアラインメントされて、ゲノムＤＮＡ配列とアラインメントされるＥＳＴおよび他のｃＤＮＡなどのＲＮＡに由来する整列配列を含むことができる２つまたはそれ以上の配列を指す。
【０２２６】
本明細書中で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」は、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)の相補的な塩基対形成により、標的核酸分子へアニーリングすることを指す。当業者は、特定の分子の長さおよび組成などの特異的なハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメーターに精通している。インビトロハイブリダイゼーションに特に関連するパラメーターは、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度をさらに含む。非特異的に結合されている核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高いストリンジェンシーでは、０.１×ＳＳＰＥ、０.１％ＳＤＳ、６５℃であり、中程度のストリンジェンシーでは、０.２×ＳＳＰＥ,０.１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は、当該技術分野で公知である。当業者は、核酸分子の、特定の用途に適した標的核酸分子への特異的なハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメーターを容易に調節することができる。
【０２２７】
本明細書中で使用する場合、単離もしくは精製されたポリペプチドまたはタンパク質あるいはそれらの生物学的に活性な部分は、タンパク質が由来する細胞もしくは組織由来の細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まないかまたは化学的に合成される場合、化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、それらが、かかる純度を評価するために当業者により使用される薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの標準的な分析方法により決定される場合に、容易に検出可能な不純物を含まないようである場合に実質的に含まないと、あるいはさらなる精製が、物質の酵素活性および生物活性などの物理特性ならびに化学特性を検出可能に変更させないように十分純粋であると決定され得る。実質的に化学的に純粋な化合物を産生するための化合物の精製方法は、当業者に公知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であり得る。かかる場合では、さらなる精製が、化合物の比活性を増加し得る。
【０２２８】
したがって、単離もしくは精製されたタンパク質またはその触媒活性タンパク質に対する言及は、それが、タンパク質が由来する組織の細胞由来の細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まないかまたは化学的に合成される場合、化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないことを意味する。調製物は、それらが、かかる純度を評価するために当業者により使用される薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの標準的な分析方法により決定される場合に、容易に検出可能な不純物を含まないようである場合に実質的に含まないと、あるいはさらなる精製が、物質のタンパク質分解活性および生物活性などの物理特性ならびに化学特性を検出可能に変更させないように十分純粋であると決定され得る。実質的に純粋なポリペプチドを産生するためのタンパク質の精製方法は、当業者に公知である。
【０２２９】
細胞材料を実質的に含まないという用語は、タンパク質が、それが単離されるかまたは組換え的に産生される細胞の細胞構成成分と分離されているタンパク質の調製物を含む。一態様では、細胞材料を実質的に含まないという用語は、約３０％未満(乾燥重量に基づいて)の非プロテアーゼタンパク質(本明細書中では、混入タンパク質とも称される)、概して約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質もしくは約１０％未満の非プロテアーゼタンパク質または約５％未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質またはその活性部分が、組換え的に産生される場合、それはまた、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の２０％、１０％もしくは５％未満に相当するか、約２０％、１０％もしくは５％に相当するかまたは２０％、１０％もしくは５％に等しい。
【０２３０】
本明細書中で使用する場合、化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質が、タンパク質の合成に関与する化学前駆物質または他の化学物質と分離されているプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。上記用語は、約３０％(乾燥重量に基づいて)、２０％、１０％、５％またはそれ以下を下回る化学前駆物質または非プロテアーゼ化学物質または構成成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。
【０２３１】
本明細書中で使用する場合、組換えＤＮＡ方法を使用することによる組換え方法による産生は、クローニングされたＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学の周知の方法の使用を指す。
【０２３２】
本明細書中で使用する場合、ベクター(またはプラスミド)は、異種核酸を、その発現または複製のために細胞へ導入するのに使用される別個の要素を指す。ベクターは通常、エピソームにとどまるが、それらの遺伝子または一部の、ゲノムの染色体への組込みをもたらすように設計することができる。また、細菌人工染色体、酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体などの人工染色体であるベクターも意図される。かかる媒体の選択および使用は、当業者に周知である。
【０２３３】
本明細書中で使用する場合、発現は、核酸がｍＲＮＡに転写されて、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へ翻訳されるプロセスを指す。核酸が、ゲノムＤＮＡに由来する場合、適切な真核生物宿主細胞または生物が選択される場合、発現は、ｍＲＮＡのスプライシングなどのプロセシングを含む。
【０２３４】
本明細書中で使用する場合、発現ベクターは、かかるＤＮＡ断片の発現をもたらすことが可能であるプロモーター領域などの制御配列と作動的に連結されたＤＮＡを発現することが可能なベクターを含む。かかるさらなるセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含むことができ、１以上の複製起点、１以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含んでもよい。発現ベクターは概して、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するかまたは両方の要素を含有することができる。したがって、発現ベクターは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適切な宿主細胞への導入時に、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらす他のベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。適切な発現ベクターは、当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能であるもの、ならびにエピソームにとどまるものまたは宿主細胞ゲノムへ組み込むものを含む。
【０２３５】
本明細書中で使用する場合、ベクターはまた、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」を含む。ウイルス性ベクターは、外来性遺伝子に作動的に連結されて、外来性遺伝子を細胞へ移入する操作されたウイルス(媒体またはシャトルとして)である。
【０２３６】
本明細書中で使用する場合、「作動可能に」または「作動的に連結された」は、ＤＮＡセグメントに関して言及する場合、セグメントが、それらがそれらの意図される目的に呼応して機能するように、例えば転写が、プロモーターの下流および任意の転写配列の上流で開始するように配列されることを意味する。プロモーターは通常、転写機構が結合して、転写を開始させて、コードセグメントを通って、ターミネーターへと進むドメインである。
【０２３７】
本明細書中で使用する場合、ヒトタンパク質は、全ての対立遺伝子および保存的変形を含むヒトのゲノム中に存在するＤＮＡなどの核酸分子によりコードされるものである。タンパク質の変異体または修飾は、修飾がヒトタンパク質の野生型または顕著な配列に基づく場合、ヒトタンパク質である。
【０２３８】
本明細書中で使用する場合、「組成物」は、２つまたはそれ以上の生成物または化合物の任意の混合物を指す。それは、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそれらに任意の組合せであり得る。
【０２３９】
本明細書中で使用する場合、「組合せ」は、２つまたはそれ以上の品目または要素、例えば一緒に使用することができる２つまたはそれ以上の品目間での任意の結合を指す。例えば、組合せは、ＡＤＡ２タンパク質および別の治療剤を含むことができる。かかる組合せは、キットとしてパッケージングされ得る。
【０２４０】
本明細書中で使用する場合、キットは、組合せの使用のための指示書および／またはかかる使用のための他の反応および構成成分を含んでもよいパッケージングされた組合せである。
【０２４１】
本明細書中で使用する場合、「製造品」は、製造および販売される生成物である。本明細書全体にわたって使用する場合、上記用語は、パッケージの物品中に含有されるＡＤＡ２タンパク質、例えば変異型ＡＤＡ２タンパク質を包含すると意図される。
【０２４２】
本明細書中で使用する場合、直接的な投与は、希釈なしで投与される組成物を指す。
【０２４３】
本明細書中で使用する場合、単回投薬製剤は、１回のみの使用のための製剤を指す。通常、単回投薬製剤は、直接的な投与用である。
【０２４４】
本明細書中で使用する場合、複数回投薬製剤は、反復投与における使用のための製剤を指す。
【０２４５】
本明細書中で使用する場合、ｍｇ／対象のｋｇに基づいて投与量を言及する場合、平均ヒト対象は、重量約７０ｋｇ〜７５ｋｇ、例えば７０ｋｇおよび体表面積(ＢＳＡ)１.７３ｍ２を有するとみなされる。
【０２４６】
本明細書中で使用する場合、「疾患または傷害」は、感染、後天的状態、遺伝的状態を含むが、それらに限定されず、また同定可能な症状を特徴とする原因または状態に起因する生物における病的状態を指す。本明細書中の目的の疾患および障害は、異常または高アデノシンレベルに関連付けられるものである。
【０２４７】
本明細書中で使用する場合、新生物としても公知である腫瘍は、細胞が異常に高速で増殖する場合に生じる組織の異常な塊である。腫瘍は、構造的組織化および正常組織との機能的協応の部分的または総合的な欠如を示し得る。腫瘍は、良性(非がん性)または悪性(がん性)であり得る。本明細書中で使用する場合、腫瘍は、造血器腫瘍ならびに固形腫瘍を包含すると意図される。
【０２４８】
悪性腫瘍は広範に、３つの主なタイプへ分類することができる。癌腫は、上皮構造(例えば、胸部、前立腺、肺、結腸、膵臓)から生じる悪性腫瘍である。肉腫は、筋肉、軟骨、脂肪または骨などの、結合組織または間葉系細胞から生じる悪性腫瘍である。白血病およびリンパ腫は、免疫系の構成成分を含む造血器構造(血液細胞の形成に関する構造)に影響を及ぼす悪性腫瘍である。他の悪性腫瘍として、神経系の腫瘍(例えば、神経線維腫)、胚細胞腫瘍および芽細胞腫瘍が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２４９】
本明細書中で使用する場合、腫瘍性疾患は、腫瘍発達、成長、転移および進行を含むがんを含む任意の障害を指す。
【０２５０】
本明細書中で使用する場合、がんは、転移性がん、リンパ系腫瘍および血液のがんを含む任意のタイプの悪性腫瘍により引き起こされるかまたはそれを特徴とする疾患に関する用語である。例示的ながんとして、膀胱、脳、胸部、骨髄、頸部、結腸／直腸、腎臓、肝臓、肺／気管支、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、甲状腺または子宮のがんが挙げられるが、それらに限定されない。
【０２５１】
本明細書中で使用する場合、「静脈内投与」は、静脈へ直接的に、治療薬を送達することを指す。
【０２５２】
本明細書中で使用する場合、対照は、それが試験パラメーターで処理されないことまたはそれが血漿試料である場合には、それが目的の状態に罹患していない正常なボランティアに由来し得ることを除いて、試験試料に実質的に同一である試料を指す。対照はまた、内部対照であり得る。
【０２５３】
本明細書中で使用する場合、正常なレベルまたは値は、当業者に公知の様々な方法で規定され得る。通常、正常なレベルは、健常な集団にわたるマーカー(例えば、アデノシン、ＡＤＲまたはヌクレオシダーゼ)の発現レベルを指す。正常なレベル(または参照レベル)は、指定供給源(すなわち、血液、血清、組織または他の供給源)由来などの健常な対象の測定に基づく。多くの場合、正常なレベルは、「正常な範囲」として指定され、それは通常、健常な集団のメジアンの９５％の値の範囲を指す。参照値は、本明細書中では正常なレベルと交換可能に使用されるが、対象または供給源に応じて、正常なレベルと異なり得る。参照レベルは通常、集団の特定のセグメントの正常なレベルに依存する。したがって、本明細書中の目的では、正常なレベルまたは参照レベルは、試験患者を比較することができる既定の標準物質または対照である。
【０２５４】
本明細書中で使用する場合、レベルの上昇は、列挙した閾値または正常な閾値を上回るマーカーの量または発現の任意のレベルを指す。
【０２５５】
本明細書中で使用する場合、生物学的試料は、巨大分子および生体分子の生存もしくはウイルス供給源または他の供給源から得られる任意の試料を指し、核酸もしくはタンパク質または他の巨大分子を得ることができる対象の任意の細胞型または組織を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接的に得られる試料または加工処理される試料であり得る。例えば、増幅される単離核酸は、生物学的試料を構成する。生物学的試料として、血液、血漿、血清、体液、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、ならびに生検腫瘍試料を含む動物由来の組織および臓器試料が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２５６】
本明細書中で使用する場合、検出は、タンパク質またはマーカーの可視化(眼または装置による)を可能にする方法を含む。タンパク質は、タンパク質に特異的な抗体を使用して可視化させることができる。タンパク質の検出はまた、エピトープタグまたは標識を含むタグとのタンパク質の融合により容易であり得る。
【０２５７】
本明細書中で使用する場合、疾患または状態を伴う対象を「処置すること」は、対象の症状が、部分的にもしくは全体的に軽減されるかまたは処置後に静止状態のままであることを意味する。したがって、処置は、予防、治療および／または治癒を包含する。予防は、潜在的疾患の防止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の防止を指す。
【０２５８】
本明細書中で使用する場合、薬学的に有効な作用物質は、小分子薬および治療用タンパク質を含む、例えば化学療法薬、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬を含むが、それらに限定されない任意の治療剤または生理活性剤を含む。
【０２５９】
本明細書中で使用する場合、処置は、状態、障害もしくは疾患または他の適応症の症状が、回復されるかまたはそうでなければ有益に変更される任意の様式を意味する。
【０２６０】
本明細書中で使用する場合、治療効果は、疾患もしくは状態の症状を変更させ、通常改善させるかまたは回復させるか、あるいは疾患または状態を治癒する対象の処置に起因する効果を意味する。治療有効量は、対象への投与後に治療効果をもたらす組成物、分子または化合物の量を指す。
【０２６１】
本明細書中で使用する場合、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の症状の回復は、例えば、変異型ＡＤＡ２などのＡＤＡ２の投与に関連付けられるかまたは投与時に起きる有害作用の減少などの、永続的であろうと一時的であろうと、持続的であろうと一過性であろうと、症状または状態の有害作用の任意の軽減を指す。
【０２６２】
本明細書中で使用する場合、防止または予防は、疾患または状態を発症する危険性の低減を指す。
【０２６３】
本明細書中で使用する場合、「治療有効量」または「治療有効用量」は、治療効果をもたらすのに少なくとも十分である作用物質、化合物、材料または化合物を含有する組成物の量を指す。したがって、それは、疾患または障害の症状を防止、治癒、回復、停止または部分的に停止させるのに必要な量である。
【０２６４】
本明細書中で使用する場合、単位用量形態は、当業者に公知であるように、ヒトおよび動物対象に適しており、個別にパッケージングされる物理的に別個のユニットを指す。
【０２６５】
本明細書中で使用する場合、「対象」という用語は、人間などの哺乳動物を含む動物を指す。対象は、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類、マウスおよびラットなどの齧歯類、ニワトリなどの鳥類、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物、ブタおよび他の動物などの、それらに限定されない任意の動物を含み得る。非ヒト動物は、意図する動物としてヒトを排除する。
【０２６６】
本明細書中で使用する場合、患者は、疾患または障害の症状を示すヒト対象を指す。
【０２６７】
本明細書中で使用する場合、ほぼ同じは、当業者が、同じであるかまたは許容可能な範囲の誤差内であるとみなす量内を意味する。例えば、通常、医薬組成物に関して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％または１０％内が、ほぼ同じであるとみなされる。かかる量は、対象による特定の組成物における変動に対する許容度に応じて多様であり得る。
【０２６８】
本明細書中で使用する場合、単数表現は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞外ドメイン」を含むかまたは含有する化合物に対する言及は、１以上の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
【０２６９】
本明細書中で使用する場合、範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。約はまた、正確な量も含む。したがって、「約５つの塩基」は、「約５つの塩基」および同様に「５つの塩基」を意味する。
【０２７０】
本明細書中で使用する場合、「適宜の」または「適宜(〜してもよい)」は、続いて記載する事象または状況が起きるかまたは起きないことおよびその記述が、上記事象または状況が起きる場合およびそれが起きない場合を含むことを意味する。例えば、適宜置換される基は、その基が無置換であるかまたは置換されることを意味する。
【０２７１】
本明細書中で使用する場合、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に関する略記は、別記されない限り、それらの一般的な用法、認識される略記または生化学命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会に従う((1972) Biochem. 11:1726を参照)。
【０２７２】
Ｂ. アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)およびアデノシン媒介性腫瘍免疫抑制の調節
本明細書に提供されるのは、任意のアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)タンパク質、例としては、その変異型またはコンジュゲートを対象に投与することによって、がんまたは腫瘍などの疾患または状態を処置する方法である。細胞外アデノシンは、免疫調節などの重要な生物学的プロセスの調節を担う[Blay, J. (2012) Encyclopedia of Cancer pp.49-52]。腫瘍微小環境(ＴＭＥ)などの病態生理学的状態では、細胞外アデノシン濃度は、ＴＭＥの特定の部分で急激に増大し、腫瘍増殖を促進する免疫抑制ニッチを生じる。ＡＤＡ２は、細胞外環境においてアデノシンレベルを調節し、それによって、アデノシンシグナル伝達およびアデノシン依存性免疫抑制に影響する。ＡＤＡ２は、アデノシンをイノシンに変換することによって細胞外アデノシンレベルを増大し、ＴＭＥにおける免疫抑制効果を克服し得る。例えば、本明細書に示されるとおり、ＡＤＡ２の投与は、アデノシン依存性免疫抑制を逆転し得、かつインビボにおいて腫瘍増殖を低減し得る。
【０２７３】
１. 腫瘍免疫および免疫回避
がん細胞は、免疫系によって認識される腫瘍特異的抗原を含む。腫瘍免疫では、免疫系の目標は、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞およびマクロファージを含む免疫細胞の作用を通じてこれらのがん細胞を攻撃し、かつ根絶することである。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、それぞれ、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)クラスＩまたはクラスII分子に対する抗原提示細胞上に提示された抗原性ペプチドの認識の際に活性化され得る。活性化されたＣＤ８＋細胞または細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在によって補助され得る、抗原を発現する腫瘍細胞を殺傷し得る。細胞傷害性Ｔ細胞の直接殺傷効果に加えて、Ｔ細胞はまた、種々のサイトカインおよびケモカインを生成し得、これが腫瘍微小環境に対して、好中球、マクロファージまたはＮＫ細胞などの他のエフェクター免疫細胞を補充し得る。ＮＫ細胞はまた、がん細胞を直接殺傷し得る。
【０２７４】
研究によって、免疫系が腫瘍増殖を妨げ得ることが実証された。例えば、免疫不全マウスは、野性型マウスよりも多くのがんを発症し得る[Dunn et al.(2004)Immunity,21:137-48]。リンパ細胞およびＩＦＮγは、発癌物質誘発性肉腫および自発性上皮性癌の形成を妨げるように共同することが示された[Shankaran et al.(2001)Nature,410:1107-1111]。さらに、遺伝子標的化およびリンパ球サブセット枯渇マウスは、腫瘍拒絶においてＮＫ細胞の役割を実証した。例えば、ＮＫ細胞およびＮＫ１.１＋Ｔ細胞の両方が枯渇したマウスは、対照マウスと比較して腫瘍形成に対する感受性が増大していることが見出され、同様の結果が、ＮＫ細胞を選択的に排除する、抗アシアロＧＭ１を用いたマウスの処置の際に観察された[Smyth et al.(2001)Int Immunol., 13;459-63]。さらに、原発性腫瘍における腫瘍免疫浸潤の数、種類および位置は、ヒト患者におけるがんの生存の予後因子である[Pages et al. (2005) N Engl J Med, 353:2654-2666]。
【０２７５】
しかし、ほとんどの腫瘍は、免疫系を回避し得る。腫瘍微小環境は、複雑であり、かつ腫瘍細胞に対して内因性であるかまたは他の細胞もしくは分子によって媒介され得る種々の免疫抑制機構を包含する。これらの機構を通じて、単独でまたは免疫系と組み合わせて、腫瘍の進行が促進され得る。これらの機構としては限定するものではないが、免疫応答を惹起する腫瘍細胞抗原を排除すること；主要組織適合性複合体クラスＩ(ＭＨＣＩ)などの免疫活性化に必要なリガンドの発現を妨げるかまたは下方制御すること；インターロイキン−１０(ＩＬ−１０)、トランスフォーミング成長因子−βまたはアデノシンなどの免疫抑制媒介因子の生成；Ｔ調節性細胞(Ｔｒｅｇｓ)または骨髄由来サプレッサー細胞(ＭＤＳＣ)などの、エフェクター免疫細胞機能を抑制する免疫細胞サブセットの補充；あるいは、エフェクターＴ細胞機能を減弱し得る、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４(ＣＴＬＡ４)などのチェックポイント阻害剤の上方制御が挙げられる。例えば、アデノシンは、腫瘍微小環境における顕著な免疫抑制剤である。
【０２７６】
２. がんおよび腫瘍微小環境(ＴＭＥ)におけるアデノシン免疫調節
アデノシン(アデニン−９−β−Ｄ−リボフラノシド；Ａｄｏ)は、細胞エネルギー代謝に広範に関与するアデニンヌクレオチド(ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰ)の一部として存在し、多くのプロセスにおいて前駆体分子として作用するヌクレオシドである。アデノシンは、細胞の内側および外側の両方で遊離型で存在し得る。
【０２７７】
アデノシンは、特に免疫系に関する、重要なインビボのシグナル伝達分子である。具体的には、アデノシンは、免疫機能の周知のエフェクターである。Ｔ細胞では、アデノシンは、ＮＦ−κＢのＴ細胞受容体誘発性の活性化を低減し、かつＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γを阻害する。アデノシンは、Ｔ細胞細胞傷害性を低下し、Ｔ細胞アネルギーを増大し、Ｆｏｘｐ３＋またはＬａｇ−３＋調節性Ｔ細胞へのＴ細胞分化を増大する。アデノシンは、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を低下し、かつＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する。アデノシンは、好中球接着および溢出をブロックし、食作用を低下し、かつスーパーオキシドおよび一酸化窒素のレベルを低減する。アデノシンはまた、マクロファージ上のＴＮＦ−α、ＩＬ−１２およびＭＩＰ−１αの発現を低下し、ＭＨＣクラスII発現を減弱し、かつＩＬ−１０およびＩＬ−６のレベルを増大する。さらに、アデノシンは、食作用、ならびにマクロファージ上のスーパーオキシドおよび一酸化窒素レベルを低下する[Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358]。
【０２７８】
図２は、アデノシンの生合成および異化作用を示す。細胞外アデノシンは、死亡細胞または瀕死の細胞から生じたＡＴＰおよびＡＤＰのリン加水分解によって一緒にアデノシンを生成する、膜会合した外酵素ＣＤ３９およびＣＤ７３の逐次的活性によって生じる。ＣＤ３９(エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ；配列番号５４２とも呼ばれる)は、細胞外ＡＴＰ(またはＡＤＰ)を５’ＡＭＰに変換する。次いで、ＣＤ７３(５’ヌクレオチダーゼとも呼ばれる；配列番号５４３)は、５’ＡＭＰをアデノシンに変換する。ＣＤ３９の活性は、ＮＤＰキナーゼおよびアデニレートキナーゼの作用によって可逆性であるが、ＣＤ７３の活性化は非可逆性である。ＣＤ３９およびＣＤ７３は、内皮細胞およびＴｒｅｇｓを含む腫瘍間質細胞で発現され、また多くのがん細胞でも発現される。例えば、内皮細胞上のＣＤ３９およびＣＤ７３の発現は、腫瘍微小環境の低酸素条件下で増大される。腫瘍低酸素症は、不十分な血液供給および組織化されていない腫瘍血管系から生じ得、酸素の送達を損なう[Carroll and Ashcroft (2005), Expert. Rev. Mol. Med. 7(6):1-16]。低酸素症はまた、アデノシンをＡＭＰに変換して、極めて高い細胞外アデノシン濃度をもたらす、アデニレートキナーゼ(ＡＫ)を阻害する。したがって、アデノシンは、固形腫瘍中でまたはその周囲で腫瘍微小環境(ＴＭＥ)を生じる場合が多い条件である、低酸素症に応答して高濃度で放出される。
【０２７９】
したがって、アデノシンの濃度は、組織および血液中で典型的には低いが、局所アデノシン濃度は、損傷またはストレス、例えば、炎症、虚血および低酸素症の結果として有意に増大し得る。例えば、低酸素の腫瘍微小環境におけるアデノシンの細胞外濃度は、最大１０μＭまでのアデノシンであり得、これは、約０.１μＭの典型的な細胞外アデノシン濃度よりも約１００倍まで高い[Antonioli et al. (2013) Nat Rev Can 13:842-857]。腫瘍中の低酸素領域は、微小環境の周囲に中心があるので、腫瘍の領域中のアデノシンの局所濃度は、正確にはより高い場合がある。
【０２８０】
アデノシン免疫調節活性は、腫瘍の細胞外空間へのその放出および標的免疫細胞、がん細胞または内皮細胞の表面上のアデノシン受容体(ＡＤＲ)の活性化の後に生じる。４種類のＡＤＲ、Ａ１(配列番号５３３)、Ａ２Ａ(配列番号５３４)、Ａ２Ｂ(配列番号５３５)およびＡ３(配列番号５３６〜５３８)があり、これは各々が、アデノシンおよび異なる下流シグナル伝達経路について異なる親和性を有する、Ｇタンパク質共役受容体である。Ａ１およびＡ３受容体の活性化は、細胞外サイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)レベルを低下し、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の活性化は、アデニリルシクラーゼの活性化を通じてｃＡＭＰレベルを増大する。Ａ１、Ａ２ＡおよびＡ３の各々は、アデノシンの生理学的濃度(例えば、３０〜３００ｎＭ)で活性化され得るが、Ａ２Ｂは、アデノシンに関する親和性が低く、活性化のために高レベルのアデノシンを必要とする[Stagg et al. (2010) Oncogene, 29:5346-5358]。ＡＤＲの活性化の結果は、細胞種および受容体の種類に応じて異なる：これは、細胞機能および細胞死の活性化または抑制をもたらし得る[Antonioli et al. (2013) Nat Rev Can 13:842-857]。４種全ての受容体は、腫瘍微小環境における細胞上、例としては、がん細胞、間質性細胞、内皮細胞、ならびに炎症および免疫細胞上に存在し得、かつ全てが、腫瘍微小環境中に存在するアデノシン濃度で活性化され得る。
【０２８１】
腫瘍微小環境における高いアデノシンレベルは、局所免疫抑制を生じ、これは、免疫系ががん細胞を排除する能力を制限する。例えば、アデノシンは、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、多形核顆粒球および食作用細胞、例えば、組織マクロファージの種々の機能を抑制し得る。具体的には、Ａ２Ａ受容体は、単球、マクロファージ、肥満細胞、顆粒球、リンパ球、樹状細胞(ＤＣ)、ＮＫ細胞および内皮細胞で発現されることが公知であり、かつ多くの細胞種でのその発現は、低酸素症によって誘発される[Stagg and Smyth (2010) Oncogene, 29:5346-5358]。Ａ２Ａの活性化は、ＮＫ細胞機能を抑制し、Ｔ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞細胞傷害性およびサイトカイン産生を阻害し、かつマクロファージ活性化を阻害することが示された[Stagg and Smyth (2010); Antonioli et al. (2013)]。Ａ２Ｂの活性化は、ＤＣ分化を抑制して、Ｔ細胞活性化を制限し、かつＭＳＤＣの増殖および蓄積を促進することが示された[Stagg and Smyth (2010); Antonioli et al. (2013)]。
【０２８２】
免疫系を阻害する直接効果に加えて、アデノシンはまた、がん細胞増殖、アポトーシスおよび血管形成に対する効果によってがん細胞増殖および播種を制御し得る。例えば、アデノシンは、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の刺激を主に通じて、血管形成を促進し得る。内皮細胞に対する受容体の刺激は、内皮細胞に対する細胞内接着分子１(ＩＣＡＭ−１)およびＥ−セレクチンの発現を調節し、血管の完全性を維持し、かつ血管増殖を促進し得る[Antonioli et al. (2013)]。さらに、アデノシンによる種々の細胞に対するＡ２Ａ、Ａ２ＢまたはＡ３の１以上の活性化は、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、インターロイキン−８(ＩＬ−８)またはアンジオポイエチン２などの血管形成促進性因子の産生を刺激し得る[Antonioli et al. (2013)]。
【０２８３】
アデノシンはまた、がん細胞上の受容体との相互作用を通じて、腫瘍細胞増殖、アポトーシスおよび転移を直接調節し得る。例えば、研究によって、Ａ１およびＡ２Ａ受容体の活性化は、いくつかの乳がん細胞株で腫瘍細胞増殖を促進し、Ａ２Ｂ受容体の活性化は、結腸がん細胞において、がん増殖促進性特性を有することが示された[Antonioli et al. (2013)]。アデノシンはまた、がん細胞のアポトーシスを誘発し得、種々の研究は、Ａ３を通じた外因性のアポトーシス経路またはＡ２ＡおよびＡ２Ｂを通じたこの内因性アポトーシス経路の活性化に対してこの活性を関連付けた[Antonioli et al. (2013)]。さらに、アデノシンは、腫瘍細胞遊走および転移を、細胞移動度、細胞外基質に対する接着、ならびに細胞接着タンパク質および受容体の発現を増大して細胞移動度を促進することによって促進し得る。
【０２８４】
３. がんの処置におけるアデノシンデアミナーゼおよび標的化アデノシン
アデノシンのレベルは、アデノシンをイノシンへまたは２’−デオキシアデノシンを２’−デオキシイノシンに変換する酵素である、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)の作用によって調節され得る。具体的には、ＡＤＡは、アデノシンまたはデオキシアデノシンのいずれかを、水の存在下で、イノシンまたはデオキシイノシンおよびアンモニアに以下のとおり変換する：アデノシン＋Ｈ２Ｏ＝イノシン＋ＮＨ３または２’−デオキシアデノシン＋Ｈ２Ｏ＝２’−デオキシイノシン＋ＮＨ３。局所腫瘍微小環境におけるアンモニアの増大は、ｐＨを増大し得る。
【０２８５】
ヒトでは２種類のＡＤＡである、ＡＤＡ１およびＡＤＡ２が存在する。ＡＤＡ１は、細胞の内側に普遍的に存在し、かつ約５.２×１０−５ＭのＫｍで、アデノシンおよび２’デオキシアデノシンについて同様の結合親和性を示す。ＡＤＡ１は原則的に、細胞内で機能して、リンパ球などの細胞に対して毒性であり得るアデノシンのレベルを低下させる。例えば、アデノシンデアミナーゼ１(ＡＤＡ１)の欠乏は、未熟なリンパ系細胞におけるアデノシンの毒性の蓄積に起因して、重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)に対して軽度の免疫不全に関連し、それによって、リンパ球のアポトーシス性の死滅、ならびにＴ、ＢおよびＮＫ細胞の顕著な枯渇を生じる[Hershfield, M.S. (2005) Eur. J. Immunol. 35:25-30]。対照的に、ＡＤＡ２は、分泌シグナル配列を含み、かつ優勢な細胞外ＡＤＡである。正常なヒト血清または血漿におけるＡＤＡ活性の大部分は、ＡＤＡ２由来である[Neidzwicki and Aberneth (1991) Biochemical Pharmacology 41:1615-1624]。ＡＤＡ２は、約２００×１０−５ＭというＫｍでアデノシンにかなり低い親和性を有し、２’デオキシアデノシンにはさらに弱い親和性を示す。また、ＡＤＡ１とは異なり、ＡＤＡ２は、酸性の最適ｐＨを有する。
【０２８６】
ＴＭＥ中のアデノシンの腫瘍特異的な蓄積を低下することは、腫瘍およびがんを処置するための魅力的な治療選択肢である。ＡＤＡ２の組換え型を対象に投与して、ＴＭＥを選択的に標的化してもよく、ここで、この組換え型は、アデノシンをイノシンまで脱アミノ化することによって細胞外アデノシンレベルを低下し、それによってアデノシンの免疫抑制効果を逆転し得る。具体的には、ＡＤＡ２は、高アデノシン濃度に適合した細胞外アデノシンデアミナーゼである。上記で考察されるとおり、アデノシンは、ＴＭＥ中で能動的に生成され、ＴＭＥの領域は、他の組織環境よりも約１００倍高いアデノシン濃度を有し得る。下にさらに考察される、基質結合のための疎水性サブポケットのおかげで、アデノシンに関するＡＤＡ２のＫｍは、ＡＤＡ１のものよりも約１００倍である。しかし、回転率(ｋｃａｔ)は、ＡＤＡ１のものと同様である。なぜならＡＤＡ２は、同様の回転率を有するが、アデノシンに対する親和性が低く、ＡＤＡ２は、低いアデノシン濃度を有する正常な微小環境におけるアデノシン代謝に影響することなく、ＴＭＥまたは炎症の部位などの高いアデノシン濃度を有する環境で特異的に活性であり得るからである。
【０２８７】
本明細書の結果によって、組換えＡＤＡ２は、腫瘍環境に対して選択的に標的化されることが実証される。さらに、本明細書に提供される結果によって、アデノシンは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞中で免疫抑制を媒介することおよびこの抑制が、投与されたアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)によって逆転され得ることが確認される。ＴＭＥ中のアデノシンレベルを低下するためのＡＤＡ２の選択的活性は、ＡＤＡ２の活性がさらに遍在性であった場合に生じ得る、望ましくない副作用または不要な副作用を制限し得る。例えば、多くの既存の腫瘍治療剤は、専門性も選択性もないせいで、対象において有害な副作用を生じ得るので、限定される。本明細書に提供される方法でのＡＤＡ２またはその変異型もしくはコンジュゲートの使用は、望ましくない副作用を少なくするか、もしくは低下するかおよび／またはより高用量を投与する能力のおかげで有効性の改善を示し得る。
【０２８８】
したがって、ＡＤＡ２は、ＡＤＡ１に比較して利点を提供する。選択的な腫瘍標的化分子としてＡＤＡ２の使用を可能にするアデノシンについての結合親和性の相違に加えて、ＡＤＡ１はまた、細胞外環境での使用には適していない。例えば、ＡＤＡ１は主にインビボでは細胞内であり、かつ実質的には、本明細書で提供される結果で示されるように、血漿中などの細胞外環境では安定性が低い。対照的に、ＡＤＡ２は、細胞外環境における、タンパク質分解から分子を保護する過剰なグリコシル化および保存されたジスルフィド結合に起因して、細胞外環境では安定性の増大を示す。ＡＤＡ２はまた、ＡＤＡ１と比較して高い温度で、実質的にさらに安定である[Daddona and Kelley (1981) Biochim. Biophys. Acta 658:280-290]。ＡＤＡ２は、高い熱安定性を有することおよびＡＤＡ２は、血漿などの細胞外環境では、ＡＤＡ１よりも安定性であることも本明細書では見出されている。
【０２８９】
ＡＤＡ２はまた、酸性ｐＨを有する環境などの、ＴＭＥ中で共通して見出される環境で最適活性を示す。例えば、野性型ＡＤＡ２の最適ｐＨは、約ｐＨ６.５であるが、ＡＤＡ１については、最適ｐＨはｐＨ７.５である。ＴＭＥは、多様な細胞種および細胞外条件からなる腫瘍の中および周囲の複雑な微小環境である。ＴＭＥは、通常は、乳酸および他の酸性代謝物(腫瘍の低酸素状態における嫌気性の解糖によって生じる)によって生じる、細胞外環境が酸性である領域を有する[Kato et al. (2013) Cancer Cell International 13:89]。
【０２９０】
さらに、ＡＤＡ２はまた、アデノシンを標的化する治療剤を含む、既存の治療剤が遭遇した他の問題も克服する。例えば、アデノシンは、複数の受容体を有するので、抗ＡＤＲ抗体を用いてアデノシンを標的化することは困難である。なぜなら、４つ全てのＡＤＲ受容体が、ＴＭＥに存在して、アデノシンによって活性化され得るからである。したがって、単一の受容体の標的化では、アデノシン免疫調節活性の完全な減弱は達成されないであろう。
【０２９１】
したがって、本明細書に提供される方法は、アデノシンの異常な生成または蓄積した生成に関与する、がんまたは腫瘍および他の疾患または状態などの疾患または状態の処置のために、任意のＡＤＡ２、例えば、組換えヒトＡＤＡ２(ｒＨｕＡＤＡ２)またはその変異型および／またはコンジュゲートを用いる処置の方法を包含する。また本明細書に提供されるのは、ヘパリン結合の低下、触媒性有効性の増大、安定性の増大、グリコシル化状態の変化および／またはｐII最適化の変更などの、特性の変化を有する、ＡＤＡ２変異型および修飾型である。任意のＡＤＡ２タンパク質を、本明細書に提供される処置の方法で用いてもよい。また本明細書では、任意のＡＤＡ２および他の免疫調節剤、化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤またはヒアルロン酸分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼまたはポリマーコンジュゲート可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、ＰＥＧＰＨ２０)を用いる併用療法の方法も提供される。
【０２９２】
Ｃ. アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)およびその変異型
本明細書に提供されるのは、野性型ヒトＡＤＡ２、ＡＤＡ２変異型および／またはコンジュゲートまたはそれらの他の修飾型を含む、アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)を用いる処置の方法である。本明細書に提供されるのは、特性が変更されているＡＤＡ２の変異型である。ＡＤＡ２は、腫瘍微小環境中または炎症の場合などの、アデノシン依存性の免疫調節または他のアデノシン依存性の活性の調節が必要である環境中でアデノシンレベルを調節するために用いてもよい。
【０２９３】
１. ＡＤＡ２の構造および活性
アデノシンデアミナーゼは、アデノシンをイノシンに変換する酵素である。３つの公知のＡＤＡである、ＡＤＡ１、ＡＤＡ２およびＡＤＡ３が存在するが、ＡＤＡ３の活性は、未知である。公知のアデノシンデアミナーゼ活性を有するタンパク質に関して、ヒトは、ＡＤＡ２およびＡＤＡ１の両方を有するが、ハエでは、ＡＤＡ２のホモログ(ＡＤＧＦホモログとして知られる)は、唯一の活性なアデノシンデアミナーゼ酵素であり、げっ歯類は、ＡＤＡ１のみを有し、これは、２つのタンパク質が、重複するがまた別個の機能を有することを示している。別個の機能は、酵素活性の発現、細胞位置および動態学的特性の相違、他の構造的特徴の相違、ならびに追加の増殖因子およびヘパリン結合特性に関する[Zavialov et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。
【０２９４】
ＡＤＡ１およびＡＤＡ２は構造的に同様であって、アデノシンをイノシンに変換する共有の触媒性機構を示すが、それが呈する配列類似性はわずかである。ＡＤＡ２は、シグナル配列(配列番号２のアミノ酸残基１〜２９に相当する)を含む、配列番号２に記載する、５１１アミノ酸タンパク質をコードする、配列番号１に記載するヌクレオチド配列を有する。成熟ＡＤＡ２は、シグナル配列を欠いており、かつ配列番号５に記載するアミノ酸の配列を有する分泌されたタンパク質である。ＡＤＡ１は、シグナル配列を含まず、かつ配列番号１２に記載するアミノ酸の配列を有する３６３個のアミノ酸のタンパク質をコードする、配列番号１１に記載するヌクレオチド配列を有する。Ｎ末端メチオニン残基が切断されて、配列番号６６に記載する成熟の３６２個のアミノ酸タンパク質が生じる。
【０２９５】
下にさらに詳細に考察されるように、ＡＤＡ１と比較して、ＡＤＡ２はかなり長く、かつ二量体化およびグリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン)結合に関与するＮ末端での８０〜１００アミノ酸伸長を含む[Maier et al. (2005) Mol Evol 61:776-794]。ＡＤＡ２はまた、追加の推定の受容体結合(ＰＲＢ)ドメインを有し、これは、細胞表面受容体に対する結合を媒介しおよび／またはその増殖因子もしくは他のシグナル伝達機能に寄与することが報告されている。また、ＡＤＡ１とは異なり、ＡＤＡ２は、二量体であって、かつ分泌されるが、ＡＤＡ１は、単量体であって、かつほとんどは細胞内である。ＡＤＡ２はまた、広範にグリコシル化され、保存されたジスルフィド結合を有する。ＡＤＡ２の構造的および機能的な特徴は、限定するものではないが、より大きい安定性および腫瘍選択性の増大を含む、治療分子としての利点を提供する。
【０２９６】
ａ. ＡＤＡ２の構造
ＡＤＡ２はまた、樹状細胞由来増殖因子(ＤＣＤＧＦ)またはアデノシンデアミナーゼ増殖因子(ＡＤＧＦ)としても公知であり、タンパク質のアデノシンＡＤＧＦファミリーのメンバーである。ＡＤＡ２は、真核生物でおよび主には多細胞生物体でのみ見出される。対照的に、ＡＤＡ１は、原核生物および真核生物の両方で見出される。具体的には、ＡＤＡ２／ＡＤＧＦホモログは、昆虫および他の脊椎動物、例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅviｓで、同様にヒトで特徴付けられた。昆虫におけるＡＤＧＦファミリーのタンパク質は、最初、増殖因子活性を有するタンパク質として特定され、後には、アデノシンデアミナーゼ活性を保有することも見出された。
【０２９７】
ヒトでは、ＡＤＡ２は、ネコ眼症候群臨界領域遺伝子１(cat eye syndrome critical region gene 1：ＣＥＣＲ１)の遺伝子によってコードされる[Riazi et al. (2000) Genomics 64:277-285]。ヒトＣＥＣＲ１遺伝子(配列番号１に記載するコード領域のヌクレオチド配列)は、５１１個のアミノ酸の前駆体タンパク質をコードする(配列番号２に記載する配列；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＫ５)。ＡＤＡ２は、Ｎ末端の２９残基のシグナル配列(配列番号２のアミノ酸残基位置１〜２９)を有し、これは、ＥＲへの輸送後に切断されて、４８２個のアミノ酸の成熟タンパク質を形成する(配列番号５に記載する配列)。成熟ＡＤＡ２タンパク質は、２つのポリペプチド鎖の間の非極性相互作用に起因してホモ二量体として存在する。ヒトＡＤＡ２の他の配列も報告されており、例えば、米国特許第５,９６８,７８０号を参照のこと(前駆体型配列番号３７６および成熟型配列番号３８０)、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＡＧ３６９９６９.１(前駆体型配列番号３７７および成熟型配列番号３８１)；ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＦ６５９４１(前駆体型配列番号３７８および成熟型配列番号３８２)；ならびにＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ５１７５５(前駆体型配列番号３７９および成熟型配列番号３８３)。非標準の第２のイソ型(ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって形成される)は、２７０個のアミノ酸の短いタンパク質(配列番号６８に示される配列；Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＫ５−２)をコードしており、これは、Ｎ末端の２４１アミノ酸を欠いており、かつ標準のイソ型とは異なるＮ末端中の１０アミノ酸配列を含む。
【０２９８】
他の種における例示的なＡＤＡ２ホモログとしては、限定するものではないが、Pan troglodytes由来のＡＤＡ２(チンパンジー；前駆体型配列番号２８６、成熟型配列番号３２６；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００３３１７１２７.１)；ゴリラ・ゴリラ(Gorilla gorilla)(ゴリラ；前駆体型配列番号２８７、成熟型配列番号３２７；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００４０６３０２４.１)；パン・パニスカス(Pan paniscus)(ピグミーチンパンジー；前駆体型配列番号２８８、成熟型配列番号３２８；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００３８２８３４５.１)；ポンゴ・アベリイ(Pongo abelii)(スマトラオランウータン；前駆体型配列番号２８９、成熟型配列番号３２９；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１２５３６０.１)；ノマスカス・レウコゲニス(Nomascus leucogenys)(キタホオジロテナガザル；前駆体型配列番号２９０、成熟型配列番号３３０；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００４０８８５１７.１)；マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis)(カニクイザル；前駆体型配列番号２９１、成熟型配列番号３３１；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００５５６８１１１.１)；コロロセバス・サバエウス(Chlorocebus sabaeus)(サバンナモンキー；前駆体型配列番号２９２、成熟型配列番号３３２；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００７９７２９９０.１)；マカカ・ムラッタ(Macaca mulatta)(Rhesus macaque；前駆体型配列番号Ｓ：２９３、３３７、成熟型配列番号Ｓ：３３３、３４０；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦＨ３２７９５.１,ＥＨＨ２０００２.１)；カリスリックス・ジャッカス(Callithrix jacchus)(マーモセット；前駆体型配列番号Ｓ：２９４、３７４、成熟型配列番号３３４、３７５；ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿００９００４５９１.１、ＸＰ＿００９００４５８６.１)；ゼノパス・レービス(Xenopus laevis)(アフリカツメガエル；前駆体型配列番号２９５、成熟型配列番号３３５；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０９０５３１.１)；ドロソフィラ・メラノガステル(Drosophila melanogaster)(ショウジョウバエ；前駆体型配列番号Ｓ：２９６−３００、成熟型配列番号Ｓ：３３６、３３８、３３９；ＡＡＬ４０９１３.１、ＡＡＬ４０９２０.１、ＡＡＬ４０９１１.１、ＡＡＬ４０９１２.１およびＡＡＬ４０９１０.１)；ボムビックス・モリ(Bombyx mori)(カイコ(silk moth)；前駆体型配列番号３０１、成熟型配列番号３４１；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０９８６９８.１)；およびサルコファーガ・ペルグリナ(Sarcophaga perigrina)(ニクバエ；前駆体型配列番号３０２、成熟型配列番号３４２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ１１８１２.１)が挙げられる。
【０２９９】
ＡＤＡ２中のドメイン最適化は、Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377に記載されている。ＡＤＡ２は、アミノ酸配列のうち７０％超を構成し、ＡＤＡ１の中のＡＤＡドメインと構造的に類似である、コアＡＤＡドメインまたは触媒性ドメインを含む。単量体では、ＡＤＡドメインは、活性部位である中央の深いポケットを囲む、平行なα／βバレルの８つの鎖にフォールディングされる。さらに、ＡＤＡドメインはまた、β１鎖とα１らせんとの間に位置する３つの追加のらせん(Ｈ１、Ｈ２およびＨ３と命名される)および２つの追加のらせんをＣ末端に含む(Ｈ４およびＨ５と命名)。ＡＤＡドメインは、配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２の残基１０６〜５０２に相当する領域(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基７７〜４７３に相当する)に含まれる。ＡＤＡ領域では、ＡＤＡ２は、ＡＤＡ１と比較してアミノ酸残基の挿入を含み、この残基には、推定の受容体結合(ＰＲＢ)ドメイン(下に考察される)を構成し、かつＡＤＡ２の触媒性機能に関与しない残基を含む。ＡＤＡドメインは、ＡＤＡ１の配列とは高い配列相同性を有さないが(１８〜２１％同一の残基)、２つのＡＤＡドメインは、高い構造的な類似性を有する。表４は、基質結合および触媒に関与する活性部位の残基をまとめる。
【０３００】
【表８】
0006625627.tif 000009
【０３０１】
Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285に報告される結晶構造に基づいて、基質結合に関与する残基である、アデニンのＣ６位置で四面体中間体を模倣する転移状態阻害剤、コホルマイシン(ＣＦ)を用いてＡＤＡ２の１２３６７−１２３７７を特定した。これらとしては、配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２の残基Ｄ１１５、Ｉ１１６、Ｗ２０４、Ｆ２０７、Ｅ２０８、Ｆ２１１、Ｈ２９３、Ｖ３２５、Ｇ３２６、Ｅ３５９、Ｈ３８４、Ｌ４１５、Ｄ４４１およびＤ４４２が挙げられる(配列番号５に記載する、成熟ＡＤＡ２の残基Ｄ８６、Ｉ８７、Ｗ１７５、Ｆ１７８、Ｅ１７９、Ｆ１８２、Ｈ２５４、Ｖ２９６、Ｇ２９７、Ｅ３３０、Ｈ３５５、Ｌ３８６、Ｄ４１２およびＤ４１３に相当する)。触媒性部位の構造的特徴は、ＡＤＡ２とＡＤＡ１との間で同様であるが、ＡＤＡ２のＡＤＡドメイン中の疎水性基質結合サブポケットは、より開放的であり、かつ含んでいる疎水性残基は少ない。これらの相違によって、アデノシンに関するＡＤＡ２の親和性の低さが説明され得る。
【０３０２】
ＡＤＡ２は、攻撃水を水酸化物イオンに活性化する強力な求電子試薬として機能する、活性について結合亜鉛との配位を要する亜鉛依存性ヒドロラーゼである。配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２のアミノ酸残基Ｈ１１２、Ｈ１１４、Ｈ３５６およびＤ４４１(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２のＨ８３、Ｈ８５、Ｈ３２７、Ｄ４１２に対応する)は、亜鉛活性中心を配位することに関与する。触媒の間、Ｚｎ＋＋は、活性部位で水分子の酸素原子によってカルボニル炭素上で求核攻撃を促進する。配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２のＥ３５９、Ｈ３８４およびＤ４４１の組合せ(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２のＥ３３０、Ｈ３５５およびＤ４１２に相当する)は、亜鉛リガンドとして関与する。Ｈ３８４およびＤ４４１の位置、攻撃水、Ｅ３５９は、攻撃水分子からプロトンを引き出すことによって反応を促進する活性部位触媒性プロトン供与体残基であり、かつＨ３８４は、プロトン受容体として働く。触媒活性部位残基は、ＡＤＡ１の対応する活性部位残基を構造的に模倣し、このことは、触媒性機構が、２つのアデノシンデアミナーゼの間で同様であることを示す[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。
【０３０３】
活性なＡＤＡ２は、ホモ二量体として存在する。ＡＤＡ２の二量体化は、ＨＮ１、ＨＮ２、ＨＮ３およびＨＮ４と命名されるＡＤＡ２のＮ末端αらせんにおける残基(配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２の残基２９〜１０５または配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基１〜７６に相当する)、ならびに、Ｈ５と命名されるＣ末端αらせんにおける残基(配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２の残基５０３〜５１１または配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基４７４〜４８２に相当する)で媒介される。これらの領域は、非極性のサブユニット間相互作用の７０％超を担うので、それらは、二量体化ドメインと命名される。第１のＮ末端らせんであるＨＮ１は、残基Ｒ３４とＥ４１との間(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基Ｒ５およびＥ１２)と、近隣のサブユニットのＤ３７３およびＨ３９１(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基Ｄ３４４およびＨ３６２)とのイオン性相互作用、ならびに残基Ｉ３０、Ｔ３３、Ｌ３７、Ｌ３８、Ｋ４０およびＭ４４(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基Ｉ１、Ｔ４、Ｌ８、Ｌ９、Ｋ１１およびＭ１５)と近隣のサブユニットにおける残基との間の疎水性相互作用に起因してらせんアンカーを形成する。疎水性結合ポケットは、近隣のサブユニット由来のＷ３３６(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基Ｍ４２、Ａ４５、Ｍ４６、Ｌ４９およびＦ５１)残基に適合する残基Ｍ７１、Ａ７４、Ｍ７５、Ｌ７８およびＦ８０によって形成される。
【０３０４】
二量体を形成しないＡＤＡ１は、「二量体化ドメイン」を構成する残基を含まない。また、ＡＤＡ１と比較して、ＡＤＡ２中の残基Ｗ３３６は、β５とα５との間の活性部位の領域に挿入され、ここでは、これは二量体化におけるその関与に起因して触媒活性に対して間接的に寄与する。置換Ｗ３３６Ｇは、部分的に単量体に解離して、触媒活性の変化を呈するＡＤＡ２分子を生じる[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。全酵素活性に影響することに加えて、二量体化はまた、ＡＤＡ２の分泌にも関与する。アミノ酸Ｔ３３およびＥ４１の欠失(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２のＴ４およびＥ１２に相当する)は、ＡＤＡ２の培養培地への分泌を無効にする[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。
【０３０５】
ＡＤＡ２は、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸などの、ヘパリンおよびそのアナログを含む、グリコサミノグリカン類(ＧＡＧ)に結合する。タンパク質二量体化は、ＧＡＧ結合部位を形成する、二量体の境界で、大きく、高度に正に荷電された表面を生じる[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。具体的には、ＧＡＧ結合部位は、前駆体ＡＤＡ２のアミノ酸残基近辺の位置Ｉ３０〜Ｒ４５、Ｓ３８９〜Ｔ３９６およびＲ４２２〜Ｔ４２８を含む(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２のＩ１−Ｒ１６、Ｓ３６０−Ｔ３６７およびＲ３９３−Ｔ３９９に相当する)。ＧＡＧとの相互作用は、ＡＤＡ２二量体を安定化するのにある役割を果たすと考えられる。
【０３０６】
ＡＤＡ２は、配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２の残基１２７〜１８５または１３４〜１７７に相当すると報告されている(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の、それぞれ位置９８〜１５６または１０５〜１４８)、推定受容体結合(putative receptor-binding：ＰＲＢ)ドメインと命名された、触媒性ドメイン内の挿入配列を有する。ＰＲＢドメインは、一方の側のαらせんおよびもう一方の側のプロリンリッチループによって囲まれる３鎖の逆並行のβシートから構成されるαフォールディングおよびβフォールディングから構成されるケモカイン様ドメインにフォールディングする。前駆体ＡＤＡ２の位置１３７と１５９との間のジスルフィド結合(配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の位置１０８および１３０)は、ＡＤＡ２分泌および構造的安定性に必要であるＰＲＢドメインに存在する。ＡＤＡ２の結晶構造によって、ＰＲＢドメインは、ＡＤＡ２の触媒性機能に関与しないが、活性部位の端部でアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)ドメインの頂部に位置することが示される。ＡＤＡ２が二量体化する場合、二量体中の２つのＰＲＢドメインは、二量体の同じ側に存在し、かつ二量体受容体に結合するかまたは受容体二量体化を誘導する[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377; Zavialov et al.(2010) J. Leukoc. Biol. 88:279-290]。ＡＤＡ２は、二量体受容体であるアデノシン受容体(ＡＤＲ)に結合する。ＰＲＢドメインは、受容体結合活性を通じてその増殖因子活性にかかわる[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377; Zavialov et al.(2010) J. Leukoc. Biol. 88:279-290]。したがって、このドメインの排除または修飾は、この活性を低減、軽減または排除し得る。
【０３０７】
ＡＤＡ２は、４つの天然のＮ連結グリコシル化部位を、前駆体ＡＤＡ２のＮ１２７、Ｎ１７４、Ｎ１８５およびＮ３７８に有する(配列番号５に記載する、成熟ＡＤＡ２のＮ９８、Ｎ１４５、Ｎ１５６およびＮ３４９に相当する)。３つのＮグリコシル化部位が、ＰＲＢドメイン中で、Ｎ１２７、Ｎ１７４およびＮ１８５に存在し、１つは、分子の反対側でＮ３７８に存在する。ＡＤＡ２分子の３つの異なる表面上に位置するオリゴ糖鎖は、細胞外環境におけるタンパク質分解に対して酵素を保護して、安定性の増大を提供する[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。
【０３０８】
ｂ. ＡＤＡ２の活性
ＡＤＡ２は、いくつかの活性を有する。ＡＤＡ２は、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)活性を有し、この活性は、アデノシンをイノシン(アデノシン＋Ｈ２Ｏ＝イノシン＋ＮＨ３)および２’−デオキシアデノシンを２’−デオキシイノシン(２’−デオキシアデノシン＋Ｈ２Ｏ＝２’−デオキシイノシン＋ＮＨ３)反応に触媒する。コホルマイシンおよび２’−デオキシコホルマイシンは、ＡＤＡ１およびＡＤＡ２の強力な阻害剤である。しかし、基質結合ポケットにおける相違に起因して、阻害剤(＋)−エリスロ−９−(２−ヒドロキシ−３−ノニル)アデニン(ＥＨＮＡ)は選択的に、ＡＤＡ１を阻害するが、ＡＤＡ２は阻害しない。また、基質結合ポケットにおける相違は、ＡＤＡ１とＡＤＡ２との間の基質結合親和性の相違を説明する。例えば、アデノシンに対するｋｃａｔ値は、ＡＤＡ２およびＡＤＡ１における触媒性残基の高い構造的類似性に起因して同様であるが、アデノシンについてのＫｍは異なる。アデノシンについてのＡＤＡ２のＫｍは、約２.２５ｍＭである。ＡＤＡ２は、基質結合のための疎水性サブポケットを有するので、基質に対するＡＤＡ２の親和性は、ＡＤＡ１の親和性とは異なる。アデノシンに対するＡＤＡ２のＫｍは、ＡＤＡ１のもの(約０.１ｍＭ)よりも約１００倍高い。
【０３０９】
ＡＤＡ２の活性に関する最適ｐＨは、約ｐＨ６.５であり、その活性は、７.０より高いｐＨでは低下する。対照的に、ＡＤＡ１の最適ｐＨは、約ｐＨ７.５である。種々の基質親和性およびｐＨ最適化によって、ＡＤＡ２は、特定の微小環境に適合し、アデノシンの濃度およびシグナル伝達の調節における重複するさらに異なる機能を果たす[Zavialov et al.(2005) Biochem. J. 391:51-57]。ＡＤＡ２に対する酸性の最適ｐＨおよび高いアデノシン濃度の必要性によって、ＡＤＡ２は、炎症または腫瘍の部位(アデノシン濃度が高くかつｐＨが低い)などの、活性な特定の環境であり得ることが示される。腫瘍微小環境では、腫瘍細胞は、低酸素環境に起因して、広範な解糖を受ける場合があり、細胞外微小環境は、特定の領域では酸性(ｐＨ６.５〜６.９)になる。
【０３１０】
ヒトでは、ＡＤＡ２は、広範に発現され、成人の心臓、肺、リンパ芽球および胎盤、ならびに胎児の肺、肝臓および腎臓で最も豊富に発現される。ＡＤＡ２はまた、血漿中でタンパク質レベルでも検出される。正常なヒト血清または血漿におけるＡＤＡ活性のほとんどは、ＡＤＡ２由来である[NeidzwickiおよびAberneth(1991) Biochemical Pharmacology 41:1615-1624]。ＡＤＡ２は、活性化された単球および他の免疫細胞を含む、活性化細胞によっておよびそれよりは限られた程度まで、刺激されていないリンパ球によって分泌される[Iwaki-Egawa et al.(2006) Biol. Chem. 387:319-321]。免疫細胞、例えば、単球は、細胞外アデノシンデアミナーゼが蓄積される、炎症部位および腫瘍で活性化される[Sitkovsky et al.(2004) Annu. Rev. Immunol. 22:657-682]。ＡＤＡ２は、これらの特異的な環境におけるアデノシンレベルの調節に関与し得る[Zavialov et al.(2010) J. Leukoc. Biol. 88:279-290]。例えば、ＡＤＡ２は、炎症部位でまたは低酸素条件のある腫瘍微小環境においてなど、高アデノシン濃度の環境でアデノシンのレベルを低下するように機能し得る。
【０３１１】
ＡＤＡ２活性は、慢性肝炎および肝硬変などの肝疾患、ＡＩＤＳ、成人Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、結核および糖尿病に罹患している患者由来の血漿中で上昇される[Zavialov et al.(2005) Biochem. J. 391:51-57]。さらに、ＡＤＡ２レベルは、最近のマイコバクテリウム・ツベルクローシス(ＭＴＢ)感染の結核の胸水で(Valdez)または内臓リーシュマニア症(visceral leishmaniasis)で上昇している[Tripathi et al., Clinica Chimica Acta 388(2008) 135-138]。ＭＴＢ感染の胸水は、多数のマクロファージおよびＣＤ４＋細胞を含み、これによって、マクロファージによるＡＤＡ２分泌がＭＴＢ感染の間の免疫応答を調節し得ることが示される[Zavialov et al.(2010) J. Leukoc. Biol. 88:279-290]。
【０３１２】
ＡＤＡ２は、ＧＡＧプロテオグリカン(例えば、ヘパリン)およびＡＤＲを介して細胞表面に結合する。ヘパリンアナログ、例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(ＨＳＰＧ)またはコンドロイチン硫酸(ＣＳ)含有プロテオグリカンは、細胞表面上に存在して、タンパク質局在化および細胞シグナル伝達に関与する。ＡＤＡ２は、これらのヘパリンアナログを介して種々のタイプの細胞に結合し得、かつこの結合は、硫酸化の低いヘパリンに対してよりも、高度に硫酸化されたヘパリン硫酸に対して緊密であり、これによって、この結合は広範なイオン性相互作用に関与することが示されている。ＡＤＡ２と対照的に、ＡＤＡ１は、ヘパリンには結合しない[Zavialov et al.(2005) Biochem. J. 391:51-57, Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。
【０３１３】
プロテオグリカンを含むヘパリンアナログに加えて、ＡＤＡ２二量体は、アデノシン受容体(ＡＤＲ)に結合し、これは二量体として機能する[Zavialov et al.(2005) Biochem. J. 391:51-57, Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]。ＡＤＡ２は、細胞と相互作用して、増殖因子活性を媒介することが報告されている。ＡＤＡ２はまた、いくつかの二量体のアデノシン受容体に直接結合し、その触媒活性とは独立して単球活性化ＣＤ４Ｔ細胞の増殖を刺激し、マクロファージへの単球のＴ細胞依存性分化を誘発し、かつマクロファージ増殖を刺激し得る。例えば、ＡＤＡ２は、単球活性化ＣＤ４Ｔ細胞の増殖の速度を、その触媒活性とは独立して増大し、かつ単球のマクロファージへのＴ細胞依存性の分化を誘発し、かつマクロファージ増殖を刺激する[Zavialov et al.(2010) J. Leukoc. Biol. 88:279-290]。
【０３１４】
ＡＤＡ２の欠損または欠乏は、血管炎症および脈管障害に関連付けられ、具体的には、結節性多発動脈炎またはスネドン症候群に関連付けられている[Zhou et al.(2014) N. Engl. J. Med 370:911-920;Navon Elkan et al.(2014) N. Engl. J. Med 370:921-931;Garg et al.(2014) Eur. J. Pediatr 173:827-830;Bras et al.(2014) New Eng. J. Med., 371:479-48;Belot et al.(2014) Pediatric Rheumatology 12:44]。例えば、血管炎は、配列番号２に記載する前駆体ＡＤＡ２に関して突然変異体Ｇ４７Ａ、Ｇ４７Ｒ、Ｇ４７Ｖ、Ａ１０９Ｄ、Ｈ１１２Ｑ、Ｖ１１９Ａ、Ｇ１４２Ｓ、Ｒ１６９Ｑ、Ｐ１９３Ｌ、Ｐ２５１Ｌ、Ｗ２６４Ｓ、Ｙ４５３Ｃによって特徴付けられるＡＤＡ２をコードする遺伝子中の劣性突然変異に関連する[Navon Elkan et al.(2014) N. Engl. J. Med 370:921-931;Zhou et al.(2014) N. Engl. J. Med 370:911-920;Bras et al.(2014) New Eng. J. Med., 371:479-480]。
【０３１５】
２. ＡＤＡ２変異型
本明細書に提供されるのは、参照または未修飾のＡＤＡ２に比較して１以上のアミノ酸修飾(すなわち、アミノ酸配列の変化)を含むポリペプチドを含んでいるＡＤＡ２の変異型または突然変異体である。その修飾は、参照ＡＤＡ２が既にその修飾された位置でアミノ酸変化を含まない限り、任意の参照または未修飾のＡＤＡ２ポリペプチドにあってもよい。例えば、この修飾は、ＡＤＡ２ポリペプチド中にあってもよく、このポリペプチドは、配列番号５または３２６〜３３６、３３８〜３４２、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列、その触媒活性断片、あるいは配列番号５または３２６〜３３６、３３８〜３４２、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を含むが、修飾は含まない。
【０３１６】
特定の例では、この修飾は、配列番号５に記載するＡＤＡ２ポリペプチド、その触媒活性断片中にまたは配列番号５に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸またはその触媒活性断片の配列中であるが、この修飾は含まない。例えば、修飾は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５または３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列を有するＡＤＡ２中にあってもよい。修飾はまた、配列番号５の触媒活性部分中であってもよい。例えば、触媒活性ＡＤＡ２は、配列番号５４８〜５５０または５７９のいずれかに記載するものなどの、ＰＲＢドメインの全てもしくは一部を欠くＡＤＡ２であってもよい。具体的な例では、修飾は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列を含むヒトＡＤＡ２中である。
【０３１７】
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例では、変異型ＡＤＡ２は、配列番号１、５、６８、２８６〜３０２、３２６〜３４２または３７４〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列を有さない。また、本明細書における例では、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、欠失Ｒ８−Ｋ１４ｄｅｌ→−−であるかまたはアミノ酸置換Ｈ７Ｒ、Ｇ１８Ａ、Ｇ１８Ｒ、Ｇ１８Ｖ、Ｉ６４Ｔ、Ａ８０Ｄ、Ｈ８３Ｑ、Ｖ９０Ａ、Ｃ１０８Ｇ、Ｈ１２１Ｒ、Ｗ１３３Ｇ、Ｒ１４０Ｑ、Ｋ１４１Ｒ、Ｐ１６４Ｌ、Ｐ２２２Ｌ、Ｗ２３５Ｓ、Ｈ３０６Ｒ、Ｅ３３０Ｇ、Ｗ３３３Ｇ、Ｖ３６５Ｌ、Ｙ４２４Ｃ、Ｆ４６４Ｓである修飾を含まない(ナンバリングは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する)。
【０３１８】
変異型ＡＤＡ２は、単量体であってもまたはヘテロ二量体もしくはホモ二量体などの二量体であってもよい。本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、イノシンへのアデノシンの変換を触媒するアデノシンデアミナーゼ活性を示す。このような活性は、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドが活性型である場合、例えば、二量体として存在する場合に示されることが理解される。典型的には、このような活性は、ＡＤＡ２が二量体形態である場合に存在する。したがって、本明細書に提供される任意の変異型を用いて、アデノシン依存性の免疫調節または他のアデノシン依存性の活性の調節が必要な環境で、例えば、腫瘍微小環境でまたは炎症のために、アデノシンレベルを調節してもよい。したがって、本明細書に提供される任意の変異型を、本明細書に記載されるような腫瘍またはがんを処置する方法で用いてもよい。
【０３１９】
活性型の場合、例えば、二量体形態の場合、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む変異型ＡＤＡ２は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５もしくは３８０〜３８３に記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を含むＡＤＡ２ホモ二量体などの、修飾を含まないＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)の対応する形態と比較してアデノシンデアミナーゼ活性の約５０％〜５００％、例えば、約５０％〜４００％、５０％〜３００％、５０％〜２００％、５０％〜１５０％、５０％〜１００％、５０％〜８０％、８０％〜４００％、８０％〜３００％、８０％〜２００％、８０％〜１５０％、８０％〜１００％、１００％〜４００％、１００％〜３００％、１００％〜２００％または１００％〜１５０％を示し得る。例えば、活性型の場合、例えば、二量体形態である場合、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含んでいる変異型ＡＤＡ２は、修飾を含まないＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)の対応する形態、例えば、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５もしくは３８０〜３８３に記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を含むＡＤＡ２ホモ二量体に比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％またはそれ以上を示し得る。典型的には、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む変異型ＡＤＡ２は、二量体形態の場合、配列番号５に記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を含むＡＤＡ２ホモ二量体の対応する形態のアデノシンデアミナーゼ活性を保持しており、その結果、変異型ＡＤＡ２は、二量体形態である場合、配列番号５に記載するアミノ酸配列またはその触媒活性断片を含むＡＤＡ２ホモ二量体のアデノシンデアミナーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％またはそれ以上を示す。
【０３２０】
通常は、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む変異型ＡＤＡ２の触媒効率すなわちｋｃａｔ／ＫＭ(Ｍ−１ｓ−１)は、少なくとも５,０００、例えば、一般には約５×１０３〜５×１０６、５×１０３〜２.５×１０６、５×１０３〜１×１０６、５×１０３〜５×１０５、５×１０３〜２.５×１０５、５×１０３〜１×１０５、５×１０３〜８×１０４、５×１０３〜５×１０４、５×１０３〜２.５×１０４、５×１０３〜１×１０４、１×１０４〜５×１０５、１×１０４〜２.５×１０５、１×１０４〜１×１０５、１×１０４〜８×１０４、１×１０４〜５×１０４、１×１０４〜２.５×１０４、２.５×１０４〜５×１０６、２.５×１０４〜２.５×１０６、２.５×１０４〜１×１０６、２.５×１０４〜５×１０５、２.５×１０４〜２.５×１０５、２.５×１０４〜１×１０５、２.５×１０４〜８×１０４、２.５×１０４〜５×１０４、５×１０４〜５×１０６、５×１０４〜２.５×１０６、５×１０４〜１×１０６、５×１０４〜５×１０５、５×１０４〜２.５×１０５、５×１０４〜１×１０５、５×１０４〜８×１０４、８×１０４〜５×１０６、８×１０４〜２.５×１０６、８×１０４〜１×１０６、８×１０４〜５×１０５、８×１０４〜２.５×１０５、８×１０４〜１×１０５、１×１０５〜５×１０６、１×１０５〜２.５×１０６、１×１０５〜１×１０６、１×１０５〜５×１０５、１×１０５〜２.５×１０５、２.５×１０５〜５×１０６、２.５×１０５〜２.５×１０６、２.５×１０５〜１×１０６、２.５×１０５〜５×１０５、５×１０５〜５×１０６、５×１０５〜２.５×１０６または５×１０５〜１×１０６Ｍ−１ｓ−１である。例えば、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む変異型ＡＤＡ２は、少なくとも５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５もしくはそれ以上または６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６Ｍ−１ｓ−１もしくはそれ以上というｋｃａｔ／ＫＭ(Ｍ−１ｓ−１)の触媒性有効性を有する。
【０３２１】
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、アミノ酸の置き換え(すなわち、置換)、付加(すなわち、挿入)、欠失、切断またはそれらの組合せを含んでもよい。変異型ＡＤＡ２は、得られた変異型ＡＤＡ２が、活性型で、例えば、二量体として、少なくともアデノシンデアミナーゼ活性を保持する場合、ＡＤＡ２ポリペプチドの任意の領域またはドメイン中に修飾を含んでもよい。本明細書の目的のためには、ＡＤＡ２ポリペプチド中の修飾に対する参照は、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２ポリペプチドの残基に関する。アミノ酸置換は、当該分野で公知の任意のＡＤＡ２ポリペプチドまたは変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、任意のＡＤＡ２ポリペプチドまたはその触媒活性断片の対応する残基でなされてもよい。対応する残基は、配列番号５に記載する成熟ポリペプチドとのアラインメントによって特定され得る(例えば、図１、表１を参照のこと)。また、Ｚａｖｉａｌｏｖ[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]に基づくナンバリングに対して本出願および実施例全体にわたっても参照するが、これは、配列番号４に記載するアミノ酸残基のナンバリングに基づく。Ｚａｖｉａｌｏｖのナンバリング(配列番号４)および成熟ＡＤＡ２ナンバリング(配列番号５)の対応する位置の番号を示す、表１を参照のこと。
【０３２２】
アデノシンデアミナーゼ活性を保持するために、修飾は通常は、変化に対する耐性が乏しい位置ではない。このような位置は、触媒活性、基質結合および／または二量体化に必要なドメインまたは領域内であってもよい。例えば、このような位置としては、亜鉛配位に必要な残基または活性部位残基などの高度に保存されている領域が挙げられる。当業者は、活性に必要であって、かつ変化すべきではないアミノ酸残基を承知しているかまたは容易に特定し得る。また、修飾がこれらの位置であるいくつかの場合には、修飾は一般には、保存的アミノ酸置換である。当業者は、表３に示すような保存的アミノ酸置換を理解し、これを用いて活性の低下を生じる修飾の確率を低下し得る。
【０３２３】
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに記載するポリペプチド配列またはその触媒活性断片などの、未修飾または参照のＡＤＡ２ポリペプチドのポリペプチド配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すポリペプチドサブユニットを含んでもよい。具体的には、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２タンパク質は、配列番号５に記載するポリペプチド配列またはその触媒活性断片に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すポリペプチドサブユニットを含む。本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２タンパク質は、未修飾または参照ＡＤＡ２ポリペプチドのポリペプチド配列に比較して、少なくともまたは約または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれ以上のアミノ酸修飾を含み得るポリペプチドサブユニットを含んでもよい。二量体または多量体として存在する場合、変異型ＡＤＡ２は、少なくともまたは約または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のアミノ酸修飾を含んでもよい。
【０３２４】
本明細書における目的のため、アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸、アミノ酸位置およびアミノ酸置換によって示す(例えば、成熟ナンバリングによればＫ１１Ａであって、これは、そのアミノ酸が、配列番号５のアミノ酸残基１１に相当する位置のアミノ酸、例えば、リジンがアラニンで置き換えられていることを示す)。本明細書における目的のため、アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸、アミノ酸位置およびアミノ酸置き換えによって示してもよい(例えば、ＺａｖｉａｌｏｖナンバリングによればＫ１４Ａであって、これは、配列番号４のアミノ酸残基１４に相当する位置のアミノ酸、例えば、リジンがアラニンで置き換えられていることを示す)。Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリング(配列番号４)および成熟ＡＤＡ２ナンバリング(配列番号５)の対応する位置の数を示す、表１を参照のこと。成熟ナンバリングによっておよび／または配列番号４によって、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングによって、配列番号５の対応する位置でのアミノ酸残基の挿入(−−→その後ろに挿入の位置が続く)または欠失(例えば、欠失(ｄｅｌ)の位置に続いて→−−)を示す命名法も本明細書で使用する。例えば、−−→Ｎ１は、成熟ナンバリングによれば、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の対応する配列と比較して、残基が１位置で挿入されていることを意味する。例えば、−−→Ｎ４は、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングによれば、配列番号４に記載するＡＤＡ２の対応する配列と比較して、残基が４位置で挿入されていることを意味する。いくつかの場合には、アミノ酸残基の欠失または挿入に起因して、変異型ＡＤＡ２ポリペプチド中の残基のナンバリングは、配列番号５に記載する残基のナンバリングに比較して変更されていることが理解される。このような状況では、例えば、図１に示されるようなアラインメントによって、配列番号５の残基に対応する、対応する変異型ＡＤＡ２ポリペプチド中の残基を特定することは当業者の水準の範囲内である。例えば、変異型ＡＤＡ２ポリペプチド中の残基のナンバリングは、Ｚａｖｉａｌｏｖ[Zavialov et al.(2010) J. Biol. Chem. 285:12367-12377]に基づいてナンバリングされ得るが、これは、配列番号４に記載するアミノ酸残基のナンバリングに基づく。Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリング(配列番号４)および成熟ＡＤＡ２ナンバリング(配列番号５)の対応する位置の数を示す、表１を参照のこと。
【０３２５】
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドにおける例示的な修飾は、下にさらに詳細に記載される。本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２は、活性型である場合、修飾を含まない参照または野性型のＡＤＡ２(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)の対応する形態に比較して、変化したかまたは改善された活性または特性を示すＡＤＡ２を含む。例えば、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２は、活性型である場合、配列番号５に対して少なくとも８５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するＡＤＡ２ポリペプチドまたはその触媒活性断片、例えば、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに記載するものまたはその触媒活性断片を含む未修飾のＡＤＡ２の対応する形態と比較して、変化したかまたは改善された活性または特性を示すＡＤＡ２を含む。具体的には、本明細書に提供される修飾は、修飾を含まないＡＤＡ２(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)の対応する形態に比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増大、ヘパリン結合の低減、半減期の延長、最適ｐＨの変化、熱安定性の増大、受容体結合の低下または過グリコシル化のうちから任意の１以上の活性に影響し得る。
【０３２６】
具体的には、活性型は、二量体形態、例えば、ホモ二量体形態であって、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む。したがって、本明細書の例では、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態である場合、修飾を含まない参照または野性型のＡＤＡ２の対応する二量体形態と比較して変更されたかまたは改善された活性または特性を示す。例えば、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２としては、二量体形態である場合、配列番号５またはその触媒活性断片、例えば、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに記載するものに対して少なくとも８５％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するＡＤＡ１ポリペプチドまたはその触媒活性部分を含む未修飾のＡＤＡ２の対応する二量体形態と比較して、変化したかまたは改善された活性または特性を示すＡＤＡ２が挙げられる。例えば、提供されるのは、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む変異型ＡＤＡ２であって、二量体形態である場合、配列番号５に記載するアミノ酸の配列を含むＡＤＡ２ホモ二量体またはその触媒活性断片と比較して、変化したかまたは改善された活性または特性を示す変異型ＡＤＡ２である。具体的には、本明細書に提供される修飾は、修飾を含まないＡＤＡ２(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)の対応する形態に比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増大、ヘパリン結合の低減、半減期の延長、最適ｐＨの変化、熱安定性の増大、受容体結合の低下または過グリコシル化のうちから任意の１以上の活性に影響し得る。
【０３２７】
例えば、本明細書に提供されるのは、変異型ＡＤＡ２タンパク質であって、二量体形態などの活性型である場合、アデノシンデアミナーゼ活性の増大を示す。例えば、変異型ＡＤＡ２タンパク質は、二量体形態などの活性型である場合、未修飾のＡＤＡ２の対応する形態の少なくとも１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれ以上の活性を示し得、ここでアデノシンデアミナーゼ活性は、同じ条件下で評価される。アデノシンデアミナーゼ活性の増大を示す変異型ＡＤＡ２の触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)は、未修飾のＡＤＡ２の対応する形態の触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の触媒効率を、同じ条件下で評価して、少なくともまたは少なくとも約１.２倍、１.３倍、１.４倍、１.５倍、１.６倍、１.７倍、１.８倍、１.９倍、２.０倍、２.２倍、２.５倍、３.０倍、３.５倍、４倍、４.５倍、５.０倍、６.０倍、７.０倍、８.０倍、９.０倍、１０.０倍もしくはそれ以上または１１.０倍、１２.０倍、１３.０倍、１４.０倍、１５.０倍もしくはそれ以上である。例えば、二量体形態である場合、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２は、少なくとも２×１０４Ｍ−１ｓ−１、３×１０４Ｍ−１ｓ−１、４×１０４Ｍ−１ｓ−１、５×１０４Ｍ−１ｓ−１、６×１０４Ｍ−１ｓ−１、７×１０４Ｍ−１ｓ−１、８×１０４Ｍ−１ｓ−１、９×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２×１０５Ｍ−１ｓ−１、３×１０５Ｍ−１ｓ−１、４×１０５Ｍ−１ｓ−１、５×１０５Ｍ−１ｓ−１もしくはそれ以上または６×１０５Ｍ−１ｓ−１、７×１０５Ｍ−１ｓ−１、８×１０５Ｍ−１ｓ−１、９×１０５Ｍ−１ｓ−１、１×１０６Ｍ−１ｓ−１、２×１０６Ｍ−１ｓ−１、３×１０６Ｍ−１ｓ−１、４×１０６Ｍ−１ｓ−１、５×１０６Ｍ−１ｓ−１もしくはそれ以上である触媒効率(ｋｃａｔ／ＫＭ)を示す。
【０３２８】
本明細書の例においては、本明細書に提供されるのは、二量体形態などの活性型である場合、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２ＢおよびＡ３のおよび典型的には、Ａ２ＡまたはＡ２Ｂの一方または両方の中から選択された任意の１以上のアデノシン受容体(ＡＤＲ)に対する結合の低下を示す、変異型ＡＤＡ２タンパク質である。理論によって束縛されることはないが、アデノシンをイノシンに変換するための本明細書に提供されるアデノシンデアミナーゼ活性の活性は、ＡＤＲに対するＡＤＡ２の結合が低下される場合、より大きい効率であると本明細書では考えられる。例えば、本明細書に提供されるのは、二量体形態などの活性型である場合、１以上のＡＤＲに対する結合が、未修飾のＡＤＡ２の対応する形態と比較して、少なくともまたは少なくとも約０.５倍、１倍、１.５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上、低下されている、変異型ＡＤＡ２である。
【０３２９】
本明細書の例においては、本明細書に提供されるのは、二量体形態などの活性型である場合、低下または減弱したヘパリン結合を示す変異型ＡＤＡ２タンパク質である。ＡＤＡ２は、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸などの、ヘパリンおよびそのアナログを含む、グリコサミノグリカン(ＧＡＧ)に結合する。ヘパリン／ＧＡＧに対する高親和性結合は、二量体の境界で、大きく、高度に正に荷電された表面によって媒介され、ＡＤＡ２の二量体化は、ヘパリン結合部位を形成する。グリコサミノグリカンは身体全体に広く存在するので、これは、投与されたＡＤＡ２と相互作用して、末梢のシンクとして機能する。したがって、ヘパリン結合が低下したＡＤＡ２は、投与されたＡＤＡ２のバイオアベイラビリティおよび薬物動態を増大し得る。例えば、本明細書に提供されるヘパリン結合の減弱したＡＤＡ２変異型は、投与された場合、半減期の延長などの、改善されたバイオアベイラビリティおよび薬物動態を生じる。なぜなら、投与されたＡＤＡ２分子は、ＧＡＧに対する結合によって末梢シンク中で隔絶されないからである。具体的には、本明細書に提供されるのは、二量体形態などの活性型である場合、ヘパリン結合を同じ条件下で評価して、未修飾のＡＤＡ２の対応する形態のヘパリン結合の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以下を示す、変異型ＡＤＡ２タンパク質である。
【０３３０】
本明細書の例においては、提供されるのは、二量体形態などの活性型である場合、増大したかまたは延長した血漿半減期または血清半減期(ｔ１／２)を示す変異型ＡＤＡ２タンパク質である。例えば、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２は、二量体形態などの活性型である場合、同じ条件下で半減期を評価して、未修飾のＡＤＡ２の対応する形態の半減期よりも少なくともまたは少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％もしくはそれ以上または９００％、１０００％、１１００％、１２００％、１３００％、１４００％、１５００％、１６００％、１７００％、１８００％、１９００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、６０００％、７０００％、８０００％、９０００％、１００００％またはそれ以上長い半減期を示す。
【０３３１】
本明細書の例においては、提供されるのは、変異型ＡＤＡ２タンパク質であって、これは、二量体形態などの活性型である場合、熱安定性の増大を示すＡＤＡ２タンパク質である。例えば、二量体形態などの活性型である場合、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２は、融点(Ｔｍ)を同じ条件下で評価して、未修飾のＡＤＡ２の対応する形態のＴｍと比較して、少なくともまたは少なくとも約０.５℃、１.０℃、２.０℃、３.０℃、４.０℃、５.０℃、６.０℃、７.０℃、８.０℃、９.０℃、１０.０℃またはそれ以上増大されるＴｍを伴う熱安定性を示す。本明細書に提供される、変異型ＡＤＡ２の融点(Ｔｍ)は、二量体形態などの活性型である場合、少なくともまたは少なくとも約６７.６℃、６７.８℃、６８.０℃、６８.２℃、６８.４℃、６８.６℃、６８.８℃、６９.０℃、６９.２℃、６９.４℃、６９.６℃、６９.８℃、７０.０℃、７０.２℃、７０.４℃、７０.６℃、７０.８℃、７１.０℃、７１.２℃、７１.４℃、７１.６℃、７１.８℃またはそれ以上であってもよい。
【０３３２】
本明細書の例では、ＡＤＡ２または変異型のアデノシンデアミナーゼ活性は、ｐＨ６.０〜ｐＨ７.６、またほぼその値の最適ｐＨで、例えば、少なくともｐＨ６、６.２５、６.５、６.７５、７、７.２５または７.５というｐＨで示され得る。例えば、ＡＤＡ２は、ｐＨ６.５±０.２であるかほぼその値である最適ｐＨを有する。本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２タンパク質は、ｐＨ６.０〜ｐＨ６.８またはほぼその値、例えば、ｐＨ６.５±０.２またはほぼその値のアデノシンデアミナーゼ活性についての最適ｐＨを示し得る。いくつかの場合には、変異型ＡＤＡ２は、示す最適ｐＨが変化しており、触媒活性は、ｐＨ６.８〜ｐＨ７.６またはほぼその値、例えば、ｐＨ７.０〜ｐＨ７.５またはほぼその値またはｐＨ７.２〜ｐＨ７.４(各々包含)より高いｐＨで示され得る。ＴＭＥ中の血管付近の増殖組織は、より中性のｐＨを有してもよいので、このような変異型は、特定の腫瘍環境でより活性であり得る。例えば、ＡＤＡ２変異型は、少なくともｐＨ６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６またはそれ以上というアデノシンデアミナーゼ活性に関する最適ｐＨを示し得る。
【０３３３】
この説明に基づいて、記載される修飾のうちのいずれか１つまたは複数を含む変異型ＡＤＡ２を生成して、本明細書に記載のように、アデノシンデアミナーゼ活性ならびに／またはヘパリン結合、半減期、最適ｐＨ、熱安定性、受容体結合および／もしくはグリコシル化のうちから１以上の特性について各々を試験することは当業者の水準の範囲内である。
【０３３４】
ａ. 例示的な修飾
ｉ. アミノ酸置き換え
一例では、修飾は、アミノ酸置き換えであってもよい。本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸残基１１、１３、２０、２２、２６、８６、１０９、１１８、１１９、１２４、１３３、１３９、１７９、１８３、１９１、２１７、２１９、２２１、２２４、２５８、２６２、２６４、２６６、２６７、２７７、２８３、２９６、３０９、３１７、３２１、３５２、３６６、３７１、３７２、３７３、３７４、４０３、４０４、４０５、４０６、４４１、４４４、４５２、４６１、４６９または４７０に相当するアミノ酸位置でＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、アミノ置き換えは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸残基Ｋ１１、Ｋ１３、Ｒ２０、Ｖ２２、Ｋ２６、Ｄ８６、Ｆ１０９、Ｒ１１８、Ｆ１１９、Ｐ１２４、Ｗ１３３、Ｙ１３９、Ｅ１７９、Ｆ１８３、Ｙ１９１、Ｒ２１７、Ｒ２１９、Ｌ２２１、Ｙ２２４、Ｋ２５８、Ｓ２６２、Ｈ２６４、Ｓ２６６、Ｋ２６７、Ｒ２７７、Ｒ２８３、Ｖ２９６、Ｋ３０９、Ｋ３１７、Ｋ３２１、Ｒ３５２、Ｒ３６６、Ｋ３７１、Ｋ３７２、Ｄ３７３、Ｉ３７４、Ｔ４０３、Ｇ４０４、Ｈ４０５、Ｐ４０６、Ｒ４４１、Ｋ４４４、Ｋ４５２、Ｋ４６１、Ｋ４６９またはＫ４７０に相当するアミノ酸位置であってもよい。
【０３３５】
例えば、本明細書に提供されるのは、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドであって、これは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｄ、Ｋ１１Ｅ、Ｋ１３Ａ、Ｋ１３Ｄ、Ｋ１３Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２０Ｎ、Ｖ２２Ｓ、Ｋ２６Ａ、Ｋ２６Ｄ、Ｋ２６Ｅ、Ｄ８６Ａ、Ｄ８６Ｃ、Ｄ８６Ｅ、Ｄ８６Ｆ、Ｄ８６Ｇ、Ｄ８６Ｈ、Ｄ８６Ｉ、Ｄ８６Ｋ、Ｄ８６Ｌ、Ｄ８６Ｍ、Ｄ８６Ｎ、Ｄ８６Ｐ、Ｄ８６Ｑ、Ｄ８６Ｒ、Ｄ８６Ｓ、Ｄ８６Ｔ、Ｄ８６Ｖ、Ｄ８６Ｗ、Ｄ８６Ｙ、Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｐ１２４Ａ、Ｐ１２４Ｓ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｅ１７９Ａ、Ｅ１７９Ｃ、Ｅ１７９Ｄ、Ｅ１７９Ｆ、Ｅ１７９Ｇ、Ｅ１７９Ｈ、Ｅ１７９Ｉ、Ｅ１７９Ｋ、Ｅ１７９Ｌ、Ｅ１７９Ｍ、Ｅ１７９Ｎ、Ｅ１７９Ｐ、Ｅ１７９Ｑ、Ｅ１７９Ｒ、Ｅ１７９Ｓ、Ｅ１７９Ｔ、Ｅ１７９Ｖ、Ｅ１７９Ｗ、Ｅ１７９Ｙ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｒ２１７Ａ、Ｒ２１７Ｄ、Ｒ２１７Ｅ、Ｒ２１９Ａ、Ｒ２１９Ｃ、Ｒ２１９Ｄ、Ｒ２１９Ｅ、Ｒ２１９Ｆ、Ｒ２１９Ｇ、Ｒ２１９Ｈ、Ｒ２１９Ｉ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｌ、Ｒ２１９Ｍ、Ｒ２１９Ｎ、Ｒ２１９Ｐ、Ｒ２１９Ｑ、Ｒ２１９Ｓ、Ｒ２１９Ｔ、Ｒ２１９Ｖ、Ｒ２１９Ｗ、Ｒ２１９Ｙ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｃ、Ｌ２２１Ｄ、Ｌ２２１Ｅ、Ｌ２２１Ｆ、Ｌ２２１Ｇ、Ｌ２２１Ｈ、Ｌ２２１Ｉ、Ｌ２２１Ｋ、Ｌ２２１Ｍ、Ｌ２２１Ｎ、Ｌ２２１Ｐ、Ｌ２２１Ｑ、Ｌ２２１Ｒ、Ｌ２２１Ｓ、Ｌ２２１Ｔ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｗ、Ｌ２２１Ｙ、Ｙ２２４Ｒ、Ｙ２２４Ｎ、Ｋ２５８Ａ、Ｋ２５８Ｄ、Ｋ２５８Ｅ、Ｓ２６２Ａ、Ｓ２６２Ｃ、Ｓ２６２Ｄ、Ｓ２６２Ｅ、Ｓ２６２Ｆ、Ｓ２６２Ｇ、Ｓ２６２Ｈ、Ｓ２６２Ｉ、Ｓ２６２Ｋ、Ｓ２６２Ｌ、Ｓ２６２Ｍ、Ｓ２６２Ｎ、Ｓ２６２Ｐ、Ｓ２６２Ｑ、Ｓ２６２Ｒ、Ｓ２６２Ｔ、Ｓ２６２Ｖ、Ｓ２６２Ｗ、Ｓ２６２Ｙ、Ｈ２６４Ａ、Ｈ２６４Ｃ、Ｈ２６４Ｄ、Ｈ２６４Ｅ、Ｈ２６４Ｆ、Ｈ２６４Ｇ、Ｈ２６４Ｉ、Ｈ２６４Ｋ、Ｈ２６４Ｌ、Ｈ２６４Ｍ、Ｈ２６４Ｎ、Ｈ２６４Ｐ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｒ、Ｈ２６４Ｓ、Ｈ２６４Ｔ、Ｈ２６４Ｖ、Ｈ２６４Ｗ、Ｈ２６４Ｙ、Ｓ２６６Ａ、Ｓ２６６Ｃ、Ｓ２６６Ｄ、Ｓ２６６Ｅ、Ｓ２６６Ｆ、Ｓ２６６Ｇ、Ｓ２６６Ｈ、Ｓ２６６Ｉ、Ｓ２６６Ｋ、Ｓ２６６Ｌ、Ｓ２６６Ｍ、Ｓ２６６Ｎ、Ｓ２６６Ｐ、Ｓ２６６Ｑ、Ｓ２６６Ｒ、Ｓ２６６Ｔ、Ｓ２６６Ｖ、Ｓ２６６Ｗ、Ｓ２６６Ｙ、Ｋ２６７Ａ、Ｋ２６７Ｃ、Ｋ２６７Ｄ、Ｋ２６７Ｅ、Ｋ２６７Ｆ、Ｋ２６７Ｇ、Ｋ２６７Ｈ、Ｋ２６７Ｉ、Ｋ２６７Ｌ、Ｋ２６７Ｍ、Ｋ２６７Ｎ、Ｋ２６７Ｐ、Ｋ２６７Ｑ、Ｋ２６７Ｒ、Ｋ２６７Ｓ、Ｋ２６７Ｔ、Ｋ２６７Ｖ、Ｋ２６７Ｗ、Ｋ２６７Ｙ、Ｒ２７７Ａ、Ｒ２７７Ｄ、Ｒ２７７Ｅ、Ｒ２８３Ａ、Ｒ２８３Ｄ、Ｒ２８３Ｅ、Ｖ２９６Ａ、Ｖ２９６Ｃ、Ｖ２９６Ｄ、Ｖ２９６Ｅ、Ｖ２９６Ｆ、Ｖ２９６Ｇ、Ｖ２９６Ｈ、Ｖ２９６Ｉ、Ｖ２９６Ｋ、Ｖ２９６Ｌ、Ｖ２９６Ｍ、Ｖ２９６Ｎ、Ｖ２９６Ｐ、Ｖ２９６Ｑ、Ｖ２９６Ｒ、Ｖ２９６Ｓ、Ｖ２９６Ｔ、Ｖ２９６Ｗ、Ｖ２９６Ｙ、Ｋ３０９Ａ、Ｋ３０９Ｄ、Ｋ３０９Ｅ、Ｋ３１７Ａ、Ｋ３１７Ｄ、Ｋ３１７Ｅ、Ｋ３２１Ａ、Ｋ３２１Ｄ、Ｋ３２１Ｅ、Ｒ３５２Ａ、Ｒ３５２Ｄ、Ｒ３５２Ｅ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７１Ｎ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ３７２Ｎ、Ｄ３７３Ｓ、Ｉ３７４Ｓ、Ｔ４０３Ｎ、Ｇ４０４Ｎ、Ｈ４０５Ｓ、Ｐ４０６Ｓ、Ｒ４４１Ａ、Ｒ４４１Ｄ、Ｒ４４１Ｅ、Ｋ４４４Ａ、Ｋ４４４Ｄ、Ｋ４４４Ｅ、Ｋ４５２Ａ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２Ｅ、Ｋ４６１Ａ、Ｋ４６１Ｄ、Ｋ４６１Ｅ、Ｋ４６９Ａ、Ｋ４６９Ｄ、Ｋ４６９Ｅ、Ｋ４７０Ａ、Ｋ４７０ＤおよびＫ４７０Ｅのうちのいずれか１つまたは複数であるＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置換を含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３３６】
具体的には、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｓ２６２Ｎ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２ＥおよびＫ４５２Ｅのうちの任意の１つまたは複数であるＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、以下：Ｋ１１Ａ、Ｋ１１Ｅ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｋ、Ｒ２１９Ｑ、Ｌ２２１Ａ、Ｌ２２１Ｖ、Ｌ２２１Ｇ、Ｓ２６２Ｎ、Ｈ２６４Ｑ、Ｈ２６４Ｇ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２ＤおよびＫ４５２Ｅのうちの任意の１つまたは複数であるＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。別の例では、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｄ、Ｒ２０Ｅ、Ｓ２６２Ｎ、Ｒ３６６Ａ、Ｒ３６６Ｄ、Ｒ３６６Ｅ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ａ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２ＥおよびＫ４５２Ｅのうちの任意の１つまたは複数であるＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例では、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、Ｋ１１Ａ、Ｒ２０Ａ、Ｒ２０Ｅ、Ｒ２１９Ｑ、Ｓ２６２Ｎ、Ｋ３７１Ａ、Ｋ３７１ＤまたはＫ３７１Ｅのうちの任意の１つまたは複数であるＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３３７】
また本明細書に提供されるのは、修飾を含まない参照ＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、未修飾ＡＤＡ２)と比較して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、得られたＡＤＡ２変異型が、アデノシンデアミナーゼ活性を示すかまたは保持する限りは、上記で提供される任意の２つ以上のアミノ酸置き換えを含んでもよい。２つ以上のアミノ酸置き換えは、同じ変更された活性または異なる変更された活性を付与してもよい。例えば、１つのアミノ酸置換は、変更されたヘパリン結合を付与し得、かつ他のアミノ酸置換は、アデノシンデアミナーゼ活性の増大を付与し得る。したがって、得られたＡＤＡ２ポリペプチド変異型は、２つ以上の変更された活性または特性を示す。
【０３３８】
例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸置き換えＫ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０ＥまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３３９】
例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸置き換えＫ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｄ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｅ／Ｒ２０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｒ２０ＥまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３４０】
このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号１３〜６３もしくは７１〜２７３のいずれかに記載するいずれかまたはその触媒活性部分である。
【０３４１】
他の例では、また本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸置き換えＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｇ；Ｒ２１９Ｋ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｎ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ａ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２５８Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２７７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２８３Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３０９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３１７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ３５２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ４４１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４４４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４６９Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ４７０Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｄ８６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１７９Ｙ；Ｒ２１９Ｃ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｄ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｅ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｆ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｇ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｈ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｉ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｌ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｍ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｐ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｓ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｔ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｖ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｗ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｙ／Ｓ２６２Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｌ２２１Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｈ２６４Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ２６６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｖ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ２６７Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｃ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｅ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｆ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｇ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｈ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｉ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｍ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｐ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｑ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｗ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ２９６Ｙ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１Ａ；Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ａ／Ｋ３７１ＡまたはＳ２６２Ｎ／Ｋ１１Ａ／Ｋ３７１Ａを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３４２】
このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号６５９〜６６３もしくは６８２〜９１７のいずれかに記載するいずれかまたはその触媒活性部分である。
【０３４３】
ii. ＰＲＢドメインの修飾
他の例では、また本明細書に提供されるのは、修飾されたＰＲＢドメインを含む修飾されたＡＤＡ２ポリペプチドである。ＰＲＢドメインは、触媒活性には必要ではなく、したがって、本明細書に示されるとおり、除去されてもよく、その結果、ＡＤＡ２によって媒介される、デアミナーゼ活性以外のＡＤＡ２変異型タンパク質活性は、軽減されるかまたは排除される。ＡＤＡ２の報告されたドメイン組織化によれば、ＰＲＢドメインは、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基９８〜１５６または１０５〜１４８に相当する。ＰＲＢドメインの修飾は、ＰＲＢドメインの全てまたは一部の欠失(すなわち、ＰＲＢドメインの１以上の残基の欠失)、ＰＲＢドメインへの１以上のアミノ酸残基の挿入、ＰＲＢドメインの１以上の残基のアミノ酸置き換えまたはそれらの組合せであって、それによって、受容体に対するドメインの結合もしくはその他の活性を低減もしくは阻害するそれらの組合せを包含し得る。例えば、ＰＲＢドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８もしくは５９または最大でその値またはほぼその値の修飾位置、例えば、一般には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３もしくは４４または最大でその値またはほぼその値の修飾位置を含んでもよい。
【０３４４】
一例では、下にさらに詳細に記載されるように、ＰＲＢドメインの全てまたは一部は、ＰＲＢドメインの１以上の連続のアミノ酸残基の欠失などによって欠失されてもよい。例えば、本明細書に提供されるのは、変異型ＡＤＡ２であって、ここでは、配列番号５に記載する残基に関して、包括的にアミノ酸残基９８〜１５６またはアミノ酸残基１０５〜１４８またはアミノ酸残基１０５〜１４７またはアミノ酸残基９９〜１４４の間またはほぼその値の間の１以上の連続アミノ酸残基が欠失されている。このようなＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、連続残基９８〜１５６、１０５〜１４８、１０５〜１４７、１０２〜１４７または１０８〜１５０に相当する連続アミノ酸残基の欠失である。例えば、このようなＡＤＡ２ポリペプチドの例としては、配列番号５に記載するアミノ酸の配列に関する成熟ナンバリングによる、ポリペプチドＡＤＡ２＿ｄｅｌ９８−１５６(９８−１５６ｄｅｌ；配列番号５４８)；ＡＤＡ２＿ｄｅｌ１０５−１４８(１０５−１４８ｄｅｌ；配列番号５４９)；ＡＤＡ２＿ｄｅｌ１０５−１４７(１０５−１４７ｄｅｌ；配列番号５５０)；およびＡＤＡ２＿ｄｅｌ９９−１４４(９９−１４４ｄｅｌ；配列番号５７９)が挙げられる。
【０３４５】
いくつかの例では、連続残基の欠失などのＰＲＢドメイン中の修飾を含む変異型ＡＤＡ２はまた、ペプチドリンカーによる、修飾されたまたは欠失された領域の置換も含む。結果として、ＰＲＢドメインの全てまたは一部は、立体的に許容可能なペプチドリンカー配列で置換され得る。このような例では、ＰＲＢドメイン由来の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または全てのより多くの連続のアミノ酸が、一般には６０アミノ酸を超えず、かつ一般には２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸を超えないペプチドリンカーのアミノ酸で置換されてもよくまたは置き換えられてもよい。任意の適切なリンカーは、得られた変異型ＡＤＡ２が、アデノシンデアミナーゼ活性を示す限り、選択され得る。
【０３４６】
ペプチドリンカーの例としては、限定するものではないが：(Ｇｌｙ)ｎ(式中、ｎは２〜２０)(配列番号３６８)；＿＿Ｇｌｙ−Ｇｌｙ＿＿；ＧＧＧ(配列番号３６９)；ＧＧＧＧ(配列番号３６２)；ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)；ＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７０)；ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７１)；ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７２)；ＧＧＧＧＳまたは(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号３４３)；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号５８０)；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３６７)；ＳＳＳＳＧまたは(ＳＳＳＳＧ)ｎ(配列番号３４４)；ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号３４５)；ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３４６)；ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号３４７)；ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号３４８)；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号３４９)またはＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａまたは(ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ)ｎ(配列番号350)、が挙げられ、ここでｎは、１〜６、例えば、１、２、３または４である。特定の例では、ペプチドリンカーは、ＧＧＧ(配列番号３６９)；ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)；ＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７０)；ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７１)；ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ(配列番号３７２)；ＧＧＧＧＳ(配列番号３４３)；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号５８０)またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３６７)である。
【０３４７】
このような修飾の例は、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号２８０)と命名された変異型ＡＤＡ２であって、ここでｎは、２〜２０であり、これによって、配列番号５におけるナンバリングに関して、残基１０５〜１４７に相当する領域中のＰＲＢドメインは、２〜２０アミノ酸残基長のグリシンリンカーで置き換えられている。例えば、変異型ＡＤＡ２は、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５(配列番号２８１)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０(配列番号２８２)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７(配列番号２８３)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５(配列番号２８４)またはＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３(配列番号２８５)であってもよい。このような修飾のさらなる例は、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号５８１)と命名された変異型ＡＤＡであって、ここでｎは１〜５であり、それによって、配列番号５におけるナンバリングに関して、残基９９〜１４４に相当する領域中のＰＲＢドメインは、(ＧＧＧＧＳ)ｎリンカーで置き換えられ、ここでこのリンカー中のアミノ酸の配列は、１〜５回繰り返され、その結果このリンカーは、５、１０、１５、２０または２５アミノ酸残基長である。例えば、変異型ＡＤＡ２は、Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号５８３)；Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号５８４)またはＶ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号５８５)であってもよい。このような修飾のさらなる例は、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号５８２)と命名された変異型ＡＤＡであって、ここでｎは、１〜５であり、これによって、配列番号５におけるナンバリングに関して残基１０５〜１４７に相当する領域中のＰＲＢドメインは、(ＧＧＧＧＳ)ｎリンカーで置き換えられ、ここでこのリンカー中のアミノ酸の配列は、１〜５回繰り返され、その結果このリンカーは、５、１０、１５、２０または２５アミノ酸残基長である。例えば、変異型ＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列に関する成熟ナンバリングによって、Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１(配列番号５８６)；Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２(配列番号５８７)またはＣ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３(配列番号５８８)であってもよい。このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号２８１〜２８５および５８３〜５８８のいずれかに記載するいずれかまたはその触媒活性部分である。
【０３４８】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される他の欠失、挿入、置換および／またはアミノ酸置き換えと組み合わせて、ＰＲＢドメイン中に欠失、挿入、置換および／またはアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、提供されるのは、未修飾の参照ＡＤＡ２と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加のアミノ酸置き換えと組み合わせた、ＰＲＢドメインの１以上の連続アミノ酸残基の欠失などによる、ＰＲＢドメインの全てまたは一部の欠失を含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。また本明細書に提供されるのは、連続残基の欠失などの、ＰＲＢドメイン中に修飾を含み、かつ未修飾の参照ＡＤＡ２と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加のアミノ酸置き換えと組み合わせて、ペプチドリンカーによる、修飾または欠失領域の置換を含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、得られたＡＤＡ２変異型が、アデノシンデアミナーゼ活性を示すかまたは保持する限り、ＰＲＢドメインの全てまたは一部の欠失および上記で示される任意の１以上のアミノ酸置き換えの両方を含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチド。この欠失および／またはアミノ酸置き換えは、同じ活性の変更を付与する場合もあるしまたは異なる活性の変更を付与する場合もある。例えば、ＰＲＢドメインの欠失および／または置換は、１つの活性の変更、例えば、受容体に対する結合の低下を付与する場合もあるしおよびアミノ酸置き換えは、アデノシンデアミナーゼ活性の増大を付与する場合もある。したがって、得られたＡＤＡ２ポリペプチド変異型は、２つ以上の活性または特性の変化を示す。
【０３４９】
例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)１；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)２；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中ｎは２〜２０)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中は１〜５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中ｎは２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中ｎは２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)１０；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)７；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)５；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｄ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中ｎは２〜２０)；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｒ２１９Ｑ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ；Ｒ２１９Ｑ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(Ｇｌｙ)ｎ(式中ｎは２〜２０)；Ｓ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌ→(ＧＧＧＧＳ)ｎ(式中ｎは１〜５)；Ｓ２６２Ｎ／Ｎ９８−Ｎ１５６ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｅ１４８ｄｅｌ；Ｓ２６２Ｎ／Ｃ１０５−Ｔ１４７ｄｅｌおよびＳ２６２Ｎ／Ｖ９９−Ｑ１４４ｄｅｌの欠失および／または置換および／またはアミノ酸置き換えの組合せを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３５０】
このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号５８９〜５９４、６０２〜６０６、６３４〜６５８、６６４〜６８１、９１８〜９３１のいずれかに記載するいずれかまたはその触媒活性部分である。
【０３５１】
iii. ＰＲＢドメインとＡＤＡ２の他の領域との間で相互作用が変化しているアミノ酸の置き換え
さらに他の例では、また本明細書に提供されるのは、ＰＲＢドメインと残りのＡＤＡ２(例えば、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)ドメイン)との間の相互作用の変化を付与するアミノ酸置換を含む修飾されたＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、ＡＤＡ２の報告されたドメイン組織化によれば、ＰＲＢドメインは、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２の残基９８〜１５６または１０５〜１４８に相当する。本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸残基１０９、１１８、１１９、１２４、１３３、１３９、１８３、１９１または２２４に相当するアミノ酸位置でＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、アミノ置き換えは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関して、アミノ酸残基Ｆ１０９、Ｒ１１８、Ｆ１１９、Ｐ１２４、Ｗ１３３、Ｙ１３９、Ｆ１８３、Ｙ１９１またはＹ２２４に対応するアミノ酸位置であってもよい。各々の位置での修飾またはそれらの組合せは、ＡＤＡドメインなどの、ＡＤＡ２中のＰＲＢドメインと他のドメインとの間の相互作用を変更し得る。
【０３５２】
例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、以下の内の任意の１つまたは複数であるＡＤＡ２ポリペプチド中に１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである：Ｆ１０９Ｓ、Ｆ１０９Ａ、Ｒ１１８Ｄ、Ｒ１１８Ａ、Ｆ１１９Ｓ、Ｆ１１９Ｋ、Ｐ１２４Ａ、Ｐ１２４Ｓ、Ｗ１３３Ｓ、Ｗ１３３Ｔ、Ｙ１３９Ｔ、Ｙ１３９Ａ、Ｆ１８３Ｋ、Ｙ１９１Ｓ、Ｙ１９１Ｄ、Ｙ２２４ＲまたはＹ２２４Ｎ。
【０３５３】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される他の欠失、挿入、置換および／またはアミノ酸置き換えと組み合わせて、ＰＲＢドメインと残りのＡＤＡ２との間の相互作用の変更を付与するアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、提供されるのは、修飾を含まない参照のＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)と比較して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、得られたＡＤＡ２変異型が、アデノシンデアミナーゼ活性を示すかまたは保持する限り、上記に提供される任意の２つ以上のアミノ酸置き換えを含んでもよい。２つ以上のアミノ酸置換が、同じ活性の変更を付与する場合もあるしまたは異なる活性の変更を付与する場合もある。例えば、１つのアミノ酸置き換えが、ＰＲＢドメインとＡＤＡドメインとの間の相互作用の変更を付与してもよく、かつ他のアミノ酸置き換えが、アデノシンデアミナーゼ活性の増大を付与する場合もある。したがって、得られたＡＤＡ２ポリペプチド変異型は、２つ以上の活性または特性の変化を示す。
【０３５４】
例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによって、アミノ酸置き換えＹ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１１９Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ２２４Ｎ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１８３Ｋ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１９１Ｄ／Ｙ２２４Ｒ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｆ１０９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ｄ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１８Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｙ１３９Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｗ１３３Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４ＡまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２４Ｓを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３５５】
このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号５６１〜５７８または６１６〜６３３のいずれかに記載するいずれかまたはその触媒活性部分である。
【０３５６】
iv. 過グリコシル化
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２の中に含まれるのは、未修飾のＡＤＡ２と比較してグリコシル化のレベルおよび／または種類を変更することによって改変されたＡＤＡ２
である。グリコシル化は、未修飾のＡＤＡ２ポリペプチドと比較して増大されてもよくまたは低下されてもよい。いくつかの場合には、グリコシル化のレベルまたは程度は、増大され、過グリコシル化されたＡＤＡ２ポリペプチドまたはタンパク質が生じる。これは、例えば、未修飾のＡＤＡ２ポリペプチドまたは炭水化物が連結されるタンパク質中で見出されない少なくとも１つの天然でないグリコシル化部位の組込みによって達成され得る。過グリコシル化されたＡＤＡ２ポリペプチドはまた、未修飾のＡＤＡ２ポリペプチド中で見出されたがグリコシル化されていない少なくとも１つの天然のグリコシル化部位に対する炭水化物部分の連結によって生成されてもよい。
【０３５７】
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２タンパク質は、変更された、例えば、新しい、Ｏ連結グリコシル化、Ｎ連結グリコシル化またはＯ連結およびＮ連結グリコシル化を含んでもよい。いくつかの例では、変異型ＡＤＡ２は、各々が異なるグリコシル化部位に連結された、１、２、３、４、５またはそれ以上の炭水化物部分を含む。このグリコシル化部位は、天然のグリコシル化部位であってもおよび／または天然でないグリコシル化部位であってもよい。いくつかの例では、変異型ＡＤＡ２を２つ以上の非天然のグリコシル化部位でグリコシル化する。例えば、変異型ＡＤＡ２を修飾して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の天然でないグリコシル化部位を導入してもよい。
【０３５８】
天然でないグリコシル化部位は、アミノ酸の置き換えによって導入してもよい。Ｏ−グリコシル化部位は、例えば、セリンまたはトレオニンによる天然の残基のアミノ酸置き換えによって、作製してもよい。Ｎ連結グリコシル化部位は、Ｘａａがプロリンではない、モチーフＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｃｙｓを作製することによって作製してもよい。アミノ酸修飾によるこのコンセンサス配列の作製は、アスパラギンによる天然のアミノ酸残基の置き換え、セリン、トレオニンもしくはシステインによる天然のアミノ酸残基の置き換えまたはアスパラギンによる天然のアミノ酸残基の置き換えおよびセリン、トレオニンもしくはシステインによる天然の残基のアミノ酸置き換えを包含し得る。天然でないグリコシル化部位は、ＡＤＡ２ポリペプチド中の任意の領域中で作製されてもよい。グリコシル化のレベル(例えば、導入された天然でないグリコシル化部位の数)は、未修飾または野性型のＡＤＡ２の対応する形態のグリコシル化のレベルと比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上まで増大されてもよい。
【０３５９】
本明細書に提供される例示的な修飾は、以下による置き換えを含むがこれらに限定はしない１以上のアミノ酸置き換えを用いた修飾によって、天然でないグリコシル化部位を導入することを包含する：２０位置に相当する位置のＮおよび２２位置に相当する位置のＳ；３７１位置に相当する位置のＮおよび３７３位置に相当する位置のＳ；３７２位置に相当する位置のＮおよび３７４位置に相当する位置のＳ；４０３位置に相当する位置のＮおよび４０５位置に相当する位置のＳ；ならびに４０４位置に相当する位置のＮおよび４０６位置に相当する位置のＳ(各々が、配列番号５に記載する位置に関する成熟ナンバリングによる)。例えば、天然でないグリコシル化部位を導入するアミノ酸置き換えとしては以下を挙げることができる：Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ；Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ；Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ；Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５ＳまたはＧ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ(配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによる)。
【０３６０】
他の例では、本明細書に提供される修飾としては、ＰＲＢドメインまたはその付近の１以上のアミノ酸置き換えでの修飾によって、天然でないグリコシル化部位を導入することを包含する。本明細書に提供される例示的な修飾は、以下による置き換えを含むがこれらに限定されない１以上のアミノ酸置き換えでの修飾によって天然でないグリコシル化部位を導入することを包含する：１２５位置に相当する位置のＮおよび１２６位置に相当する位置のＡ；１２７位置に相当する位置のＮおよび１２９位置に相当する位置のＳ；１２６位置に相当する位置のＮおよび１２８位置に相当する位置のＴ；１１２位置に相当する位置のＮおよび１１４位置に相当する位置のＴ；１３４位置に相当する位置のＮ、１３５位置に相当する位置のＣおよび１３６位置に相当する位置のＴ；１３４位置に相当する位置のＮ、１３５位置に相当する位置のＳおよび１３６位置に相当する位置のＴ；１４２位置に相当する位置のＮおよび１４４位置に相当する位置のＳ；１３７位置に相当する位置のＮおよび１３９位置に相当する位置のＴ；１１１位置に相当する位置のＮおよび１１３位置に相当する位置のＳ(各々が、配列番号５に記載する位置に関する成熟ナンバリングによる)。例えば、天然でないグリコシル化部位をＰＲＢドメインまたはその付近に導入するアミノ酸置き換えとしては以下を挙げることができる：Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ；Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ；Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ；Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ；Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ；Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ；Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴまたはＰ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓ(配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによる)。
【０３６１】
他の例では、また本明細書では、Ｎ末端またはＣ末端で１以上の連続残基の追加(すなわち、挿入)を含む、修飾ＡＤＡ２ポリペプチドも提供される。このような置き換えによって、天然でないグリコシル化部位が導入され得る。この修飾されたＡＤＡ２ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端の一方または両方でまたは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上または最大でその値またはほぼその値のアミノ酸残基の挿入を含み得る。例えば、アミノ酸の追加または挿入によって、コードされたタンパク質中で変更されたグリコシル化部位が提供され得る。修飾の例は、配列番号５に記載するアミノ酸位置に関する成熟ナンバリングによる、Ｎ末端での挿入−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３である。
【０３６２】
このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号２７４〜２７９および５５２〜５６０のいずれかに記載するいずれかである。
【０３６３】
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される他の欠失、挿入、置換および／またはアミノ酸置き換えと組み合わされた、天然でないグリコシル化部位を導入する１以上のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。例えば、提供されるのは、修飾を含まない参照ＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、未修飾のＡＤＡ２)に比較して２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸置き換えを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、得られたＡＤＡ２変異型が、アデノシンデアミナーゼ活性を示すかまたは保持する限り、上記で提供される任意の２つ以上のアミノ酸置き換えを含んでもよい。この２つ以上のアミノ酸置換は、同じ活性の変更を付与する場合もあるしまたは異なる活性の変更を付与する場合もある。例えば、１つのアミノ酸置き換えが、天然でないグリコシル化部位を導入してもよく、そして別のアミノ酸置き換えが、アデノシンデアミナーゼ活性の増大を付与してもよい。したがって、得られたＡＤＡ２ポリペプチド変異型は、２つ以上の変更された活性または特性を示す。
【０３６４】
例えば、本明細書に提供されるのは、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関する成熟ナンバリングによる、アミノ酸置換Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／−−→Ｎ１／−−→Ａ２／−−→Ｓ３；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ２０Ｎ／Ｖ２２Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７１Ｎ／Ｄ３７３Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｋ３７２Ｎ／Ｉ３７４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｔ４０３Ｎ／Ｈ４０５Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｇ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１２５Ｎ／Ｐ１２６Ａ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｓ１２７Ｎ／Ｋ１２９Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１２６Ｎ／Ｅ１２８Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１１２Ｎ／Ｉ１１４Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｃ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｉ１３４Ｎ／Ｌ１３５Ｓ／Ｌ１３６Ｔ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｒ１４２Ｎ／Ｑ１４４Ｓ；Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｅ１３７Ｎ／Ｙ１３９ＴまたはＲ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ／Ｐ１１１Ｎ／Ｇ１１３Ｓを含む変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。
【０３６５】
このような変異型ＡＤＡ２ポリペプチドの例は、配列番号５９６〜６０１もしくは６０７〜６１５またはその触媒活性部分のいずれかに記載するいずれかである。
【０３６６】
ｂ. 核酸分子
また本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される任意の変異型ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸分子である。本明細書に提供される任意の変異型ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする修飾された核酸分子は、本明細書に提供される修飾に相当するコドン変化(例えば、１以上のヌクレオチドの置き換えもしくは置換、挿入もしくは付加または欠失)を含む。本明細書の修飾されたアミノ酸の例証に基づいてこのようなコドン変化を特定することは、種々のアミノ酸に相当するコドンに精通している、当業者の水準の範囲内である。特定の例では、核酸配列は、例えば、コードされた配列の発現レベルを増大するために、最適化されたコドンであり得る。特定のコドン用法は、修飾されたポリペプチドが発現される宿主生物体に依存する。当業者は、哺乳動物またはヒト細胞中で、例えば、エシュリキア・コリまたはサッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)を含む、細菌または酵母の発現のための最適コドンについて精通している。例えば、コドン用法の情報は, kazusa.or.jp.codonで利用可能なCodon Usage Detabaseから入手可能である[データベースの詳細については、例えば、Richmond(2000)Genome Biology,1:241を参照のこと]。また、Forsburg(2004)Yeast,10:1045-1047;Brown et al.(1991)Nucleic Acids Research, 19:4298;Sharp et al.(1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211;Sharp et al.(1991) Yeast, 657-78も参照のこと。ＡＤＡ２ポリペプチドの発現および産生のための核酸分子を含むベクターが提供される。
【０３６７】
ｃ. 変異型ＡＤＡ２タンパク質の生成
本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドおよびコードする核酸分子は、当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。標的タンパク質中で任意の１以上のアミノ酸の突然変異を達成するために当該分野で公知の任意の方法を使用してもよい。方法は、コードする核酸分子の標準の部位指向性もしくはランダム突然変異誘発または固相ポリペプチド合成法を包含する。具体的には、ペプチド合成に続いてペプチド連結を含む全化学合成法を使用してもよい。ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸分子を、突然変異誘発、例えば、コードする核酸のランダム突然変異誘発、エラープローンＰＣＲ、部位指向性突然変異誘発(例えば、キット、例えば、Stratageneから入手可能なQuikChangeなどのキット)、オーバーラップＰＣＲ、遺伝子シャッフリングまたは他の組換え方法に供してもよい。次いで、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞に導入して、異種で発現させてもよい。いくつかの例では、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを、全化学合成、固相または溶液相ペプチド合成などを用いて、合成的に生成する。
【０３６８】
任意の変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸分子を生成および発現するための例示的な方法を、セクションＥに記載する。変異型ＡＤＡ２分子を生成する方法または修飾の特別な性質次第で、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、単量体として生成しても、二量体として生成してもまたは他の多量体として生成してもよい。例えば、変異型ＡＤＡ２は、ヘテロ二量体またはホモ二量体である。
【０３６９】
具体的には、ＡＤＡ２は正常には、２つの同一のポリペプチド鎖から構成されるホモ二量体として存在する。上記で記載されるとおり、２つの同一のポリペプチドサブユニットの残基の間の非極性相互作用は、細胞からのＡＤＡ２の分泌の際にホモ二量体の形成を媒介する。野性型ＡＤＡ２はホモ二量体であるので、参照または未修飾のＡＤＡ２のアミノ酸配列という言及は、単一のＡＤＡ２ポリペプチドサブユニットのアミノ酸の配列を指すことが理解される。変異型ＡＤＡ２は、同じ(すなわち、ホモ二量体)または異なる(すなわち、ヘテロ二量体)である、１以上のＡＤＡ２ポリペプチドサブユニットを含んでもよい。例えば、変異型ＡＤＡ２ホモ二量体は、配列番号１３〜６３、７１〜２８５もしくは５５２〜９３１のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性断片を有するポリペプチドをコードする核酸など、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸分子で形質転換された細胞によって容易に生成かつ分泌される。細胞が、各々異なるＡＤＡ２ポリペプチドをコードする２つ以上の異なる核酸分子でコードされる場合、ヘテロ二量体が生成され得る。
【０３７０】
一例では、本明細書において提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、二量体である。例えば、得られた変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは、同じである(すなわち、各々が、参照または未修飾のＡＤＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して同一の修飾を含む同じアミノ酸配列を有する)第１および第２のポリペプチドサブユニットを含むホモ二量体である。このホモ二量体は、変異型ポリペプチドをコードする核酸分子を細胞中に形質転換することによって形成され得、これは、分泌の際、２つの変異型ポリペプチドサブユニットの残基の間の非極性の相互作用を生じて、二量体の形成を媒介する。
【０３７１】
別の例では、得られたＡＤＡ２ポリペプチドは、異なる第１および第２のポリペプチドサブユニットを含むヘテロ二量体である。このような例では、第１または第２のポリペプチドサブユニットの一方または両方が、参照または未修飾のＡＤＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して修飾を含むアミノ酸の配列を含む。いくつかの場合には、第１および第２のポリペプチドサブユニットの両方が、未修飾のＡＤＡ２ポリペプチドの参照と比較して修飾を含むが、修飾の性質は異なるアミノ酸の配列を含み得る。ヘテロ二量体は、第１の変異型ポリペプチドサブユニットをコードする第１の核酸分子および第２の異なるポリペプチドサブユニットをコードする第２の核酸分子の両方を細胞中に形質転換することによって形成され得る。この第２の核酸分子は、参照もしくは野性型のＡＤＡ２のアミノ酸の配列を含むポリペプチドサブユニットをコードしてもよくまたは参照もしくは未修飾のＡＤＡ２のアミノ酸配列に対して修飾を含むアミノ酸の配列を含む変異型ポリペプチドサブユニットをコードし得る。ヘテロ二量体は、２つのポリペプチドサブユニットの残基の間の非極性の相互作用の結果として細胞からの発現および分泌の際に生成されて、二量体の形成を媒介する。このようなプロセスでは、一般に、ホモ二量体およびヘテロ二量体を含む、二量体分子の混合物が形成される。ヘテロ二量体の生成のために、精製のための追加の工程が必要である場合がある。例えば、第１および第２のポリペプチドを遺伝子操作して、タグが異なる、金属キレートまたは他のエピトープとのタグを含んでもよい。タグ付けされたドメインを、金属キレートクロマトグラフィーによっておよび／または抗体によって急速精製に用いて、ウエスタンブロット、免疫沈降またはバイオアッセイにおける活性欠失／ブロックによる検出を可能にしてもよい。
【０３７２】
他の例では、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドは単量体である。単量体は、アデノシンデアミナーゼ活性が保持されている限り、タンパク質二量体化に関与する１以上の残基の突然変異によって生成され得る。突然変異誘発のために標的化され得る残基の例としては、限定するものではないが、配列番号５に記載するアミノ酸残基に関して、アミノ酸残基１、４、５、８、９、１１、１２、１５、３４４、３６２または３６６が挙げられる。この残基は、その位置で他の１９個のアミノ酸残基のうちの１つで置き換えられてもよい。ポリペプチドを生成して単量体形成を評価することは当業者の水準の範囲内である。例えば、単量体形成を評価して、単量体を、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)によって精製してもよい。アデノシンデアミナーゼ活性をまた、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知の任意のアッセイなどを用いて評価してもよい。
【０３７３】
いくつかの例では、変異型ＡＤＡ２の二量体または他の多量体分子は、安定な構造を形成するためにそれ自体が相互作用し得る、任意の部分または他のポリペプチドに対するコードされた変異型ＡＤＡ２のコンジュゲーションまたは融合によって形成され得る。例えば、別々のコードされたＡＤＡ２ポリペプチド(ここで少なくとも１つは変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである)が、多量体化によって結合されてもよく、これによってポリペプチドの多量体化は、多量体化ドメインによって媒介される。変異型ＡＤＡ２二量体または多量体は、キメラ分子の生成によって形成されてもよく、キメラ分子では、変異型ＡＤＡ２は、多量体化ドメインに対して直接または間接的に連結されている。変異型ＡＤＡ２をコードする核酸分子は、多量体化ドメインをコードする核酸と結合され得る(直接または間接的に)。例えば、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２二量体は、多量体化ドメインに対してリンカーを介して直接または間接的に連結された第１のＡＤＡ２ポリペプチドサブユニットおよび多量体化ドメインに対してリンカーを介して直接または間接的に連結された第２のＡＤＡ２ポリペプチドサブユニットを含んでもよく、ここで第１および第２のポリペプチドの一方または両方が、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドである。この第１および第２のＡＤＡ２ポリペプチドは、同じであっても異なってもよい。多量体化ドメインの例は、下にさらに記載されるＦｃドメインである。
【０３７４】
ホモ多量体またはヘテロ多量体のポリペプチドを、ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする別の核酸分子の同時発現から生成してもよい。キメラのＡＤＡ２ポリペプチドは、適切な核酸分子で形質転換された哺乳動物細胞などの細胞によって、容易に生成および分泌され得る。例えば、細胞は、変異型ＡＤＡ２をコードする第１の核酸分子および同じまたは異なるＡＤＡ２をコードする第２の核酸分子で形質転換されてもよい。この第２の核酸分子は、参照または野性型のＡＤＡ２のアミノ酸の配列を含むポリペプチドサブユニットをコードしてもよくまたは参照もしくは未修飾のＡＤＡ２のアミノ酸配列に対して修飾を含むアミノ酸の配列を含む変異型ポリペプチドサブユニットをコードしてもよい。ＡＤＡ２ポリペプチドの分泌型としては、変異型ＡＤＡ２が、第１のコードされた変異型ＡＤＡ２ポリペプチドのホモ二量体であるもの、第２のコードされたＡＤＡ２ポリペプチドのホモ二量体、例えば、野性型または第２の変異型ＡＤＡ２ポリペプチド、ならびに異なる２つのポリペプチドサブユニットを含むＡＤＡ２ヘテロ二量体が挙げられる。いくつかの場合には、より高次の多量体が形成されてもよい。
【０３７５】
多量体化ドメインは、当業者に周知である。一般には、多量体化ドメインは、安定なタンパク質間相互作用を形成できる任意のドメインを含む。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列(例えば、Ｆｃドメイン；例えば、国際特許ＷＯ９３／１０１５１およびＷＯ２００５／０６３８１６；米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号；米国特許第５,４５７,０３５号)、ロイシンジッパー(例えば、核形質転換タンパク質ｆｏｓおよびｊｕｎ、もしくはプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃからまたはGeneral Control of Nitrogen(ＧＣＮ４)から)、疎水性領域、親水性領域または遊離のチオール(ホモ二量体またはヘテロ二量体のキメラ分子の間の分子間ジスルフィド結合を形成する)を介して相互作用し得る。さらに、多量体化ドメインは、例えば、米国特許第５,７３１,１６８号；国際特許ＷＯ９８／５０４３１およびＷＯ２００５／０６３８１６；Ridgway et al.(1996) Protein Engineering, 9:617-621に記載のように、穴を備えるアミノ酸配列に相補的な突起を含むアミノ酸配列を含んでもよい。このような多量体化領域は、立体的な相互作用が安定な相互作用を促進するだけでなく、キメラ単量体の混合物からホモ二量体を上回ってヘテロ二量体の形成をさらに促進もするように、操作されてもよい。一般には、突起は、第１のポリペプチドの境界からの小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)で置き換えることによって構築してもよい。第２のポリペプチドの境界上に、突起に対して同一または同様のサイズの相補的な腔を、大きいアミノ酸側鎖を小さい側鎖(例えば、アラニンまたはトレオニン)で置き換えることによって、作製してもよい。
【０３７６】
ＡＤＡ２ポリペプチド、例えば、本明細書に提供される任意の変異型ＡＤＡ２ポリペプチドなどを、多量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端に対して、いずれかに、ただし典型的はそのＮ末端またはＣ末端を介して、連結して、キメラポリペプチドを形成してもよい。その連結は、リンカーを介して直接であっても間接であってもよい。またキメラポリペプチドは、融合タンパク質であってもよくまたは共有的相互作用または非共有的相互作用などのキメラ連結によって形成してもよい。例えば、多量体化ドメインを含むキメラポリペプチドを調製する場合、ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸は、直接または間接的にまたは適宜リンカードメインを介して、多量体化ドメイン配列をコードする核酸に対して作動可能に連結されてもよい。そのコンストラクトは、多量体化ドメインのＮ末端に対してＡＤＡ２ポリペプチドのＣ末端が連結される、キメラタンパク質をコードし得る。いくつかの事例では、コンストラクトは、ＡＤＡ２ポリペプチドのＮ末端が、多量体化ドメインのＮ末端またはＣ末端に連結されるキメラタンパク質をコードし得る。
【０３７７】
多量体化ドメインがポリペプチドである例では、ＡＤＡ２多量体化ドメインキメラポリペプチドをコードする遺伝子融合物を、適切な発現ベクター中に挿入する。得られたＡＤＡ２−二量体化ドメインキメラタンパク質は、組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で発現されて、多量体に組み合わされることを可能にされてもよく、ここでは多量体化ドメインが相互作用して多価ポリペプチドを形成する。ＡＤＡ２ポリペプチドに対する多量体化ドメインの化学的連結はまた、ヘテロ二機能性リンカーを用いて達成されてもよい。
【０３７８】
この得られたキメラポリペプチドおよびそれから形成された多量体は、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムにながす、アフィニティクロマトグラフィーなどによる任意の適切な方法によって精製してもよい。異なるＡＤＡ２キメラポリペプチドをコードする２つの核酸分子が細胞中に形質転換される場合、ホモ二量体およびヘテロ二量体の形成が生じる。ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体形成を上回るように、発現の条件を調節してもよい。例えば、Ｆｃ多量体化ドメインのジスルフィド連結の相互作用によって形成される多量体について、ホモ二量体は、鎖間ジスルフィドの破壊を優先するが、鎖内ジスルフィドには影響しない条件下で低下され得る。あるいは、この種のヘテロ二量体の形成は、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓロイシンジッパー組合せを用いるなど、ヘテロ二量体の形成を促進する多量体化ドメインを用いて、ＡＤＡ２融合分子を遺伝子的に操作および発現することによって付勢され得る。ロイシンジッパーは優勢的にヘテロ二量体を形成するので、それらを用いて所望の場合、ヘテロ二量体の形成を駆動してもよい。ＡＤＡ２ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含むかまたは他の多量体化ドメインをまた、所望のヘテロ二量体の精製を可能にするタグを備えるように遺伝子操作してもよい。核オンコジーンｆｏｓおよびｊｕｎの生成物は、ヘテロ二量体を優先的に形成するロイシンジッパードメインを含む[O’Shea et al.(1989) Science, 245:646;Turner and Tijian(1989) Science, 243:1689]。例えば、ヒト転写因子ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓのロイシンジッパードメインは、１：１の化学量論で安定なヘテロ二量体を形成することが示された[例えば、Busch and Sassone-Corsi(1990) Trends Genetics, 6:36-40;Gentz et al.(1989) Science, 243:1695-1699を参照のこと]。ｊｕｎ−ｊｕｎホモ二量体も形成されることが示されたが、それらは、ｊｕｎ−ｆｏｓヘテロ二量体よりも安定性が約１０００分の１である。
【０３７９】
Ｄ. ＡＤＡ２コンジュゲートおよび融合タンパク質
本明細書に提供されるいずれかを含む、任意のＡＤＡ２分子は、１以上の異種部分に対して直接または間接的にコンジュゲートされてもよい。ＡＤＡ２は、対立遺伝子および種変異型を含む、野性型ＡＤＡ２であってもよくまたは本明細書において、上記でセクションＣ.２に記載される任意の変異型であってもよい。コンジュゲート中のＡＤＡ２分子は、単量体または二量体、例えば、ヘテロ二量体またはホモ二量体であってもよい。典型的には、コンジュゲート中のＡＤＡ２はホモ二量体である。異種部分は、二量体の一方のポリペプチドサブユニットにコンジュゲートされてもよくまたは両方のポリペプチドサブユニットにコンジュゲートされてもよい。
【０３８０】
例えば、ＡＤＡ２は、配列番号５もしくは３２６〜３３６、３３８〜３４２、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列または配列番号５もしくは３２６〜３３６、３３８〜３４２、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するポリペプチドまたはその触媒活性断片を含むいずれであってもよい。一例では、本明細書に提供されるコンジュゲート中のＡＤＡ２は、配列番号５もしくは３２６〜３３６、３３８〜３４２、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかに記載するアミノ酸の配列またはその触媒活性断片、例えば、配列番号５、３２６〜３３４、３４０、３７５もしくは３８０〜３８３のいずれかまたはその触媒活性断片を有するポリペプチドを含んでもよい。例えば、本明細書に提供されるコンジュゲート中のＡＤＡ２は、配列番号５に記載するアミノ酸の配列を有するポリペプチドまたはその触媒活性部分を含んでもよい。この触媒活性部分は、配列番号５４８〜５５０または５７９のいずれかに記載するものなどの、ＰＲＢドメインの全てまたは一部を欠くものであってもよい。
【０３８１】
本明細書に提供されるコンジュゲートの他の例では、このコンジュゲートは、本明細書のいずれかに記載されるような、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む。例えば、本明細書に提供されるコンジュゲートは、配列番号１３〜６３、７１〜２８５または５５２〜９３１のいずれかに記載する変異型ポリペプチドを含むＡＤＡ２であってもよい。
【０３８２】
この異種部分は、タンパク質を含んでもまたはポリペプチド部分を含んでもまたは非ポリペプチド部分を含んでもよい。例えば、この異種部分は、限定するものではないが、ペプチド、低分子、核酸、炭水化物およびポリマーであってもよい。この異種部分は、ＡＤＡ２タンパク質分子に対して、直接または間接的に連結され得る。例えば、この異種部分は、ＡＤＡ２ポリペプチドに対して直接もしくは間接的にコンジュゲートされてもよくまたは直接もしくは間接的に融合される融合タンパク質として生成されてもよい、タンパク質もしくはポリペプチド部分であり得る。他の場合には、この異種部分は、ＡＤＡ２分子にコンジュゲートされる非ペプチド部分である。
【０３８３】
ＡＤＡ２タンパク質は、１以上の異種部分、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異種部分に対してコンジュゲートされてもよい。異種部分は、異種ポリペプチド部分であってもまたは異種非ポリペプチド部分であってもまたは両方であってもよい。他の例では、異種部分は、異種ポリペプチドと非ポリペプチド部分との組合せを包含し得る。いくつかの例では、全ての異種部分が同一である。いくつかの例では、少なくとも１つの異種部分は、他の異種部分とは異なる。いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、直列の２、３またはそれ以上の異種部分に対してコンジュゲートされてもよい。他の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、２、３またはそれ以上の異種部分にコンジュゲートされてもよく、ここで少なくとも追加の部分が、２つの異種部分(例えば、ＡＤＡ２ポリペプチド、リンカー、プロテアーゼ切断基質、自己破壊型スペーサーまたはそれらの組合せ)の間に差し挟まれる。
【０３８４】
異種部分とのコンジュゲーションは、異種部分とコンジュゲートされないＡＤＡ２分子と比較して有益な特性を付与し得る。例示的な異種部分は、分子のインビボ半減期を延長する部分である。異種部分によって得られる他の例示的な有益な特性としては、限定するものではないが、哺乳動物発現系におけるタンパク質発現の増大、生物物理学的特性、例えば、安定性および溶解度の改善、タンパク質の精製および検出の改善、可視化および局在化ならびに／または酵素活性の増大が挙げられる。例えば、異種部分は、異種部分を含むＡＤＡ２タンパク質分子またはその断片の検出、可視化および／または位置決めを容易にする部分であってもよい。その任意のＡＤＡ２断片の検出、可視化および／または位置決めは、インビボであっても、インビトロであっても、エキソビボであってもまたはそれらの組合せであってもよい。
【０３８５】
いくつかの場合には、ＡＤＡ２またはその断片に対してコンジュゲートされた場合、その異種部分は、ＡＤＡ２またはその断片の安定性を増大する。例えば、異種部分の存在によって、異種部分の非存在下での物理的特性と比較して環境条件(例えば、温度の上昇またはｐＨ条件の高低)に応答してＡＤＡ２の１以上の物理的特性が維持され得る。いくつかの例では、物理的特性は、ＡＤＡ２の共有構造の維持を包含し得る(例えば、タンパク質分解切断、望ましくない酸化または脱アミドがない)。他の例では、この物理的特性は、適切にフォールディングされた状態の維持である場合がある(例えば、可溶性または不溶性の凝集または沈殿がない)。任意のＡＤＡ２またはＡＤＡ２コンジュゲートの安定性は、タンパク質の生物物理学的特性、例えば、熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、溶解性、生化学的機能(例えば、アデノシンデアミナーゼ活性またはヘパリン結合活性)および／またはそれらの組合せをアッセイすることによって測定され得る。安定性は、当該分野で公知の方法、例えば、ＨＰＬＣ(高速液体クロマトグラフィー)、ＳＥＣ(サイズ排除クロマトグラフィー)、ＤＬＳ(動的光散乱)を用いて測定され得る。熱安定性を測定するための方法としては、限定するものではないが、示差走査熱量測定法(ＤＳＣ)、示差走査蛍光定量法(ＤＳＦ)、円偏光二色性(ＣＤ)および熱的課題アッセイが挙げられる。任意のＡＤＡ２またはコンジュゲートの安定性を評価する例示的な方法は、下のセクションＦに記載される。
【０３８６】
いくつかの例では、ＡＤＡ２またはその断片にコンジュゲートした場合、異種部分の存在は、異種部分を含まないＡＤＡ２タンパク質(すなわち、遊離または非コンジュゲートのＡＤＡ２)と比較して、ヘパリンおよび他のグリコサミノグリカン(ＧＡＧ)に対するＡＤＡ２の結合を低減または減弱する。例えば、本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、異種部分を含まない(すなわち、遊離または非コンジュゲートのＡＤＡ２)ＡＤＡ２タンパク質のヘパリン結合の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以下を示すものを含む。例えば、ＰＥＧ化したＡＤＡ２は、対応するＰＥＧ化されていないＡＤＡ２と比較してヘパリン結合の低下を示すことが本明細書では示される(例えば、実施例８を参照のこと)。典型的には、ヘパリン結合は、ＡＤＡ２が二量体形態であり、ＡＤＡ２コンジュゲートが二量体である場合に示される。コンジュゲートされた形態とコンジュゲートされてない形態との間の結合の比較は、同じ条件または実質的に同じ条件下で評価されることも理解される。具体的には、コンジュゲート中の異種部分の存在における結合の低下は、立体的な遮断および／または表面上の静電気荷電の変化に起因し得る。
【０３８７】
本明細書に提供されるコンジュゲートの例では、異種部分は、ＡＤＡ２タンパク質の生物学的活性にも機能にも(例えば、アデノシンデアミナーゼ活性)実質的に影響することなく、ＡＤＡ２の１以上の特性(例えば、半減期)を改善する。例えば、本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、異種部分を含まないＡＤＡ２タンパク質(すなわち、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２)と比較して約５０％〜５００％、例えば、約５０％〜４００％、５０％〜３００％、５０％〜２００％、５０％〜１５０％、５０％〜１００％、５０％〜８０％、８０％〜４００％、８０％〜３００％、８０％〜２００％、８０％〜１５０％、８０％〜１００％、１００％〜４００％、１００％〜３００％、１００％〜２００％または１００％〜１５０％のアデノシンデアミナーゼ活性を示す。例えば、ＡＤＡ２コンジュゲートは、異種部分を含まないＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２)と比較して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％またはそれ以上のアデノシンデアミナーゼ活性を示し得る。いくつかの場合には、本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、異種部分を含まないＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２)と比較して、アデノシンデアミナーゼ活性の増大または改善、例えば、１００％超以上のアデノシンデアミナーゼ活性を示す。典型的には、アデノシンデアミナーゼ活性は、ＡＤＡ２が二量体形態であり、かつＡＤＡ２コンジュゲートが二量体である場合に示される。コンジュゲート型と非コンジュゲート型との間のアデノシン結合の比較は、同じ条件または実質的に同じ条件下で評価されることも理解される。
【０３８８】
１. 半減期延長部分
異種部分の非限定的な例としては、ＡＤＡ２分子に対してコンジュゲートされるかまたは連結された(直接または間接的に)場合、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２と比較して、インビボおよび／またはインビトロの半減期の延長を付与する部分が挙げられる。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の半減期は、当業者に公知のおよび／または本明細書に記載の任意の方法、例えば、アデノシンデアミナーゼ活性アッセイによって決定され得る。このような半減期延長部分の例は、以下の小区分に記載される。
【０３８９】
例えば、異種部分は、ＡＤＡ２にコンジュゲートされた場合インビボ半減期の延長と関連する構造化されていないかまたは構造化されている特徴のいずれかを有するペプチドおよびポリペプチドである。非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)のβサブユニット、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンまたはその断片、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合部分、コンジュゲーションまたは半減期延長に基づく非天然のアミノ酸またはこれらのポリペプチドの任意の断片、誘導体、変異型もしくは組合せが挙げられる。
【０３９０】
異種部分とは、半減期延長部分、すなわち、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のインビボ半減期を、そのような異種部分を欠いているＡＤＡ２のインビボ半減期に比較して延長する異種部分であり得る。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のインビボ半減期は、当業者に公知および／または本明細書に記載の任意の方法、例えば、アデノシンデアミナーゼ活性アッセイによって決定してもよい。
【０３９１】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対して直接または間接的にコンジュゲートされ得る、例示的な半減期延長部分としては以下が挙げられる：生体適合性の脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルデンプン(ＨＡＳ)[例えば、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)]、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリ(Ｇｌｙｘ−Ｓｅｒｙ)ｎ、ホモ−アミノ酸ポリマー(ＨＡＰ)、ヒアルロン酸(ＨＡ)、ヘパロサンポリマー(ＨＥＰ)、ホスホリルコリン系のポリマー(ＰＣポリマー)、フレキシマー、デキストラン、ポリシアル酸(ＰＳＡ)、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、ＸＴＥＮ配列、アルブミン結合ペプチド、ＣＴＰペプチド、非天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸コンジュゲートおよびそれらの任意の組合せ。
【０３９２】
いくつかの例では、ＡＤＡ２またはその断片に対してコンジュゲートされた場合、１以上の半減期延長部分の存在によって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の半減期が、このような１以上の半減期延長部分を欠いているＡＤＡ２(すなわち、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２)の半減期と比較して増大される。例えば、本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、異種部分を含まないＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２)の半減期よりも、少なくとも約１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７００％、８００％またはそれ以上の長さであるかまたは異種部分を含まないＡＤＡ２ポリペプチド(すなわち、遊離のまたはコンジュゲートされていないＡＤＡ２)の半減期よりも９００％、１０００％、１１００％、１２００％、１３００％、１４００％、１５００％、１６００％、１７００％、１８００％、１９００％、２０００％、３０００％、４０００％、５０００％、６０００％、７０００％、８０００％、９０００％、１００００％またはそれ以上長い半減期を示す。いくつかの例では、半減期延長部分に対して直接または間接的に連結されている、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２コンジュゲートの半減期は、このような半減期延長部分を欠いている対応するＡＤＡ２の半減期よりも約１.５倍〜約２０倍、約１.５倍〜約１５倍、約１.５倍〜約１０倍またはそれ以上、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２.５倍〜約１０倍、約２.５倍〜約９倍、約２.５倍〜約８倍、約２.５倍〜約７倍、約２.５倍〜約６倍、約２.５倍〜約５倍、約２.５倍〜約４倍、約２.５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約７倍または約６倍〜約８倍またはそれ以上である半減期を示す。典型的には、インビボにおける活性の半減期は、ＡＤＡ２が二量体形態であり、かつＡＤＡ２コンジュゲートが二量体である場合に示される。コンジュゲート型と非コンジュゲート型との間の半減期の比較は、同じ条件または実質的に同じ条件下で評価されることも理解される。
【０３９３】
いくつかの例では、半減期延長部分に対して直接または間接的に連結されている、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２コンジュゲートの半減期は、約１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２５時間、２６時間、２７時間、２８時間、２９時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４６時間、４８時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、７０時間、７５時間、８０時間またはそれ以上であってもよくまたは少なくともそれであるかまたは少なくともおよそそれであってもよい。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２コンジュゲートの半減期は、１０時間〜６０時間、例えば、１２時間〜４８時間または１３時間〜３６時間であってもよい。例えば、実施例９によって、ＰＥＧ化されたＡＤＡ２であるＡＤＡ２コンジュゲートが、約またはおよそ１２〜１４時間の半減期を示し、かつＰＥＧ化した変異型ＡＤＡ２分子(例えば、Ｒ２０ＥまたはＫ３７１Ｄ)が、約またはおよそ１６時間〜２４時間のさらに大きい半減期を示すことが示される。実施例１４では、他のＰＥＧ化した変異型ＡＤＡ２分子(例えば、Ｒ２１９Ｑ／Ｓ２６２Ｎ)が、約またはおよそ３９時間から４７時間というさらにより長い半減期を示すことが示される。
【０３９４】
以下の小区分は、本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートの例示的な半減期延長部分を記述する。
【０３９５】
ａ. 低複雑性ポリペプチド
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、低い組成上および／または構造上の複雑性を有するポリペプチド(例えば、生理学的条件下で溶液中で二次構造も三次構造もない無秩序なポリペプチド)である少なくとも１つの異種部分に対して直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を含んでもよい。一例では、低い複雑性のポリペプチド配列は、構造化されていない親水性のアミノ酸ポリマーからできている。この低い複雑性のポリペプチドは、例えば、タンパク質が、ＨＰＬＣ精製などの高い温度または厳しい条件に供される場合、有益な特性を提供し得る。
【０３９６】
ｂ. ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットの１つのＣ末端ペプチド(ＣＴＰ)またはその断片、変異型、もしくは誘導体を含む異種部分に対して直接または間接的に結合されるＡＤＡ２を含んでもよい。組換えタンパク質に挿入された１以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボ半減期を延長することが公知である(例えば、米国特許第５,７１２,１２２号を参照のこと)。例示的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ(配列番号３０３)またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ(配列番号３０４)が挙げられる(例えば、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１号を参照のこと)。
【０３９７】
ｃ. 免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)またはその一部
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、Ｆｃドメインまたはその変異型に対して、直接または間接的に連結されているＡＤＡ２を含み得る。Ｆｃドメイン、断片、変異型および誘導体は、当業者に公知であり、例えば、各々その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第５,４５７,０３５号；米国特許出願公開第２００６／００２４２９８、国際公開ＷＯ２０１１／０６９１６４、ＷＯ２０１２／００６６２３、ＷＯ２０１２／００６６３５またはＷＯ２０１２／００６６３３に記載される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分(Ｆｃドメインを含む)に融合されたポリペプチドを含む融合タンパク質の調製物は、記載されており、例えば、Ashkenazi et al.(1991) PNAS 88:10535;Byrn et al.(1990)Nature, 344:667;and Hollenbaugh and Aruffo,(2002)「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins,」 in Current Protocols in Immunology, Ch. 10, pp. 10.19.1-10.19.11.を参照のこと。
【０３９８】
Ｆｃ領域は、ＣＨ(定常重鎖)ドメインと表示されたドメイン[ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３(適宜ＣＨ４)]を有する。アイソタイプ次第で、(すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ  ＩｇＤまたはＩｇＥ)、Ｆｃ領域は、３つのＣＨドメインを有してもまたは４つのＣＨドメインを有してもよい。いくつかのアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ)Ｆｃ領域はまた、ヒンジ領域を含む(Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Yを参照のこと)。ヒトでは、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥクラスの抗体を生じさせる、それぞれ、デルタ(δ)、ガンマ(γ)、ミュー(μ)およびアルファ(α)およびイプシロン(ε)と命名されたそれらの重鎖に基づいて分類された５つの抗体アイソタイプがある。ＩｇＡおよびＩｇＧクラスは、サブクラスＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。免疫グロブリン重鎖間の配列差異は、例えば、Ｃドメインの数、ヒンジ領域の存在、ならびに鎖間ジスルフィド結合の数および位置が異なる、種々のアイソタイプをもたらす。例えば、ＩｇＭおよびＩｇＥ重鎖は、ヒンジ領域を置き換える余分のＣドメイン(ＣＨ４)を含む。ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡのＦｃ領域は、互いにそれらのＣγ３、Ｃδ３およびＣα３ドメインを介して対となり、一方、ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、それらのＣμ４およびＣε４ドメインを介して二量体化する。ＩｇＭおよびＩｇＡは、それぞれ１０個および４個の抗原結合部位を有する多量体構造を形成する。
【０３９９】
Ｆｃ領域は、当業者に公知であり、かつ得られたコンジュゲートが、アデノシンデアミナーゼ活性を保持する限り、本明細書に提供されるコンジュゲート中で用いられ得る任意のものである。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を生成するためのＦｃ領域またはその一部は、多数の異なる供給源から得てもよい。いくつかの例では、Ｆｃ領域またはその一部は、ヒト免疫グロブリン由来である。Ｆｃ領域またはその一部はまた、例えば、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット)または非ヒト霊長類(例えば、チンパンジー、サル)種を含む、別の哺乳動物種の免疫グロブリン由来であってもよい。さらに、Ｆｃ領域またはその一部は、ＩｇＧ(ヒトサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む)、ＩｇＡ(ヒトサブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む)、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含む任意の免疫グロブリンクラス由来であり得る。一例では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１を用いる。免疫グロブリンのＦｃ領域に対してコンジュゲートされる、本明細書に提供されるＡＤＡ２は、安定性の増大、血清半減期の延長[Capon et al.(1989)Nature 337:525]および新生児Ｆｃ受容体(ＦｃＲｎ)などのＦｃ受容体への結合(その各々が、全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許第６,０８６,８７５号、同第６,４８５,７２６号、同第６,０３０,６１３号；ＷＯ０３／０７７８３４；米国特許出願公開第２００３／０２３５５３６号)の、いくつかの所望の特性を付与し得る。他の例では、Ｆｃ−Ｆｃ受容体(ＦｃＲ)相互作用によって媒介されるエフェクター機能が最小化される場合、例えば、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４のＦｃのなどの補体またはエフェクター細胞を補充することに劣るＩｇＧアイソタイプとの融合が考慮される。さらに、リンカーを用いて、Ｆｃを別のポリペプチドに共有結合して、Ｆｃキメラを生成してもよい。
【０４００】
ヒトＩｇＧサブタイプの重鎖定常領域の例示的な配列は、配列番号３５５(ＩｇＧ１)、配列番号３５６(ＩｇＧ２)、配列番号３５７(ＩｇＧ３)および配列番号３５８(ＩｇＧ４)に記載する。例えば、配列番号３５５に記載する例示的な重鎖定常領域について、ＣＨ１ドメインは、アミノ酸１〜９８に相当し、ヒンジ領域は、アミノ酸９９〜１１０に相当し、ＣＨ２ドメインは、アミノ酸１１１〜２２３に相当し、ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２２４〜３３０に相当する。
【０４０１】
修飾されたＦｃドメインはまた、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションについて本明細書で考慮される。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、野性型免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域のエフェクター機能に比較して変化した(すなわち、大きいかまたは小さい)エフェクター機能を生じるようにＦｃＲに対する結合の変化を呈するように修飾される。したがって、修飾されたＦｃドメインは、Ｆｃ受容体についての親和性の増大または低下または親和性がないことを含むがこれらに限定されない、親和性の変化を有し得る。例えば、異なるＩｇＧサブクラスは、Ｆｃγ受容体(ＦｃγＲ)に異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は通常は、Ｉｇ２およびＩｇ４よりも受容体に対して実質的によく結合する。さらに、異なるＦｃγＲは、異なるエフェクター機能を媒介する。ＦｃγＲ１、ＦｃγＲIIａ／ｃおよびＦｃγＲIIIａは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する細胞内ドメインを有することによって特徴付けられる、免疫複合体誘発活性化の正の調節因子である。しかし、ＦｃγＲIIｂは、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)であって、したがって阻害性である。いくつかの事例では、本明細書に提供されるＦｃドメインを含むＡＤＡ２コンジュゲートを修飾して、補体タンパク質Ｃ１ｑに対する結合を増強してもよい。
【０４０２】
特定の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションのためのＦｃ領域は、１以上の切断されたＦｃ領域を含んでもよく、この領域は、それにもかかわらず、Ｆｃ領域に対してＦｃ受容体(ＦｃＲ)結合特性を付与するのに十分である。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域の一部(すなわち、ＦｃＲｎ結合部分)は、ＩｇＧ１のほぼアミノ酸２８２〜４３８を含んでもよく、主な定常部分は、ＣＨ２ドメインのアミノ酸２４８、２５０〜２５７、２７２、２８５、２８８、２９０〜２９１、３０８〜３１１および３１４、ならびにＣＨ３ドメインのアミノ酸残基３８５〜３８７、４２８および４３３〜４３６である[ＥＵナンバリングシステムに基づくアミノ酸ナンバリング；Edelman et al.(1969)PNAS 63:78-85およびKabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと]。したがって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２中のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含んでもよい。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプの重鎖由来であり得る。受容体のＦｃ領域の親和性を変化することで、Ｆｃドメインと関連するエフェクター機能および／または薬物動態学的特性を調節し得る。修飾されたＦｃドメインは、当業者に公知であって、文献中に記載されており、例えば、例示的な修飾については、米国特許第５,４５７,０３５号；米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号；および国際公開ＷＯ２００５／０６３８１６を参照のこと。
【０４０３】
特定の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションのためのＦｃ領域は、以下のうちの少なくとも１つを含んでもよい：ヒンジ(例えば、上、中および／または下部のヒンジ領域)ドメイン(ＥＵナンバリングに基づいて、抗体Ｆｃ領域のほぼアミノ酸２１６〜２３０)、ＣＨ２ドメイン(ＥＵナンバリングに基づいて、抗体Ｆｃ領域のほぼアミノ酸２３１〜３４０)、ＣＨ３ドメイン(ＥＵナンバリングに基づいて、抗体Ｆｃ領域のほぼアミノ酸３４１〜４３８)、ＣＨ４ドメインまたはその変異型、一部もしくは断片。他の例では、Ｆｃ領域は、補体Ｆｃドメイン(すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン)を含んでもよい。いくつかの例では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合されたヒンジドメイン(またはその一部)、ＣＨ２ドメイン(またはその一部)に融合されたヒンジドメイン(またはその一部)、ＣＨ３ドメイン(またはその一部)に融合されたＣＨ２ドメイン(またはその一部)、ヒンジドメイン(またはその一部)およびＣＨドメイン(またはその一部)の両方に融合されたＣＨ２ドメイン(またはその一部)を含んでもよい。さらに他の例では、Ｆｃ領域は、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部(例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部)を欠く。特定の例では、Ｆｃ領域は、２２１〜４４７に相当するアミノ酸を含んでもよい[ＥＵナンバリングシステムに基づく；Edelman et al.(1969) PNAS 63:78-85およびKabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照のこと]。
【０４０４】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションのためのＦｃ領域は、例えば、国際公開番号ＷＯ８８／０７０８９、ＷＯ９６／１４３３９、ＷＯ９８／０５７８７、ＷＯ９８／２３２８９、ＷＯ９９／５１６４２、ＷＯ９９／５８５７２、ＷＯ００／０９５６０、ＷＯ００／３２７６７、ＷＯ００／４２０７２、ＷＯ０２／４４２１５、ＷＯ０２／０６０９１９、ＷＯ０３／０７４５６９、ＷＯ０４／０１６７５０、ＷＯ０４／０２９２０７、ＷＯ０４／０３５７５２、ＷＯ０４／０６３３５１、ＷＯ０４／０７４４５５、ＷＯ０４／０９９２４９、ＷＯ０５／０４０２１７、ＷＯ０４／０４４８５９、ＷＯ０５／０７０９６３、ＷＯ０５／０７７９８１、ＷＯ０５／０９２９２５、ＷＯ０５／１２３７８０、ＷＯ０６／０１９４４７、ＷＯ０６／０４７３５０およびＷＯ０６／０８５９６７；米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、同第２００７／０２３１３２９号、同第２００７／０２３７７６５号、同第２００７／０２３７７６６号、同第２００７／０２３７７６７号、同第２００７／０２４３１８８号、同第２００７／０２４８６０３号、同第２００７／０２８６８５９号、同第２００８／００５７０５６または米国特許第５,６４８,２６０号；同第同第５,７３９,２７７号；同第５,８３４,２５０号；同第５,８６９,０４６号；同第６,０９６,８７１号；同第６,１２１,０２２号；同第６,１９４,５５１号；同第６,２４２,１９５号；同第６,２７７,３７５号；同第６,５２８,６２４号；同第６,５３８,１２４号；同第６,７３７,０５６号；同第６,８２１,５０５号；同第６,９９８,２５３号；同第７,０８３,７８４号；同第７,４０４,９５６号；および同第７,３１７,０９１号(各々その全体が参照によって本明細書に援用される)に開示される１以上のアミノ酸位置で、修飾(例えば、アミノ酸置換)を含んでもよい。一例では、特定の修飾(例えば、当該分野で開示される１以上のアミノ酸の特定の置換)を、１以上の開示されたアミノ酸位置で行ってもよい。別の例では、開示されたアミノ酸位置のうちの１つまたは複数での異なる変化(例えば、当該分野で開示される１以上のアミノ酸位置の異なる置換)を作製してもよい。
【０４０５】
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、融合タンパク質として少なくとも１つのＦｃ領域にコンジュゲートされてもよい。典型的には、このような融合は、免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持する。例えば、ＩｇＧ１の全長Ｆｃ配列は、配列番号３５５に記載する配列のアミノ酸９９〜３３０を含む。ｈＩｇＧ１の例示的なＦｃ配列は、配列番号３５９に示され、かつほとんど全てのヒンジ配列、ならびに配列番号３５５に記載するＣＨ２およびＣＨ３ドメインの完全な配列を含む。別の例示的なＦｃポリペプチドは、配列番号３６１に記載するＦｃポリペプチドである。別の例示的なＦｃポリペプチドは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／１０１５１に示されており、かつＮ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域の天然のＣ末端まで伸長する単鎖ポリペプチドである(配列番号３５９)。この連結が作製される正確な部位は、重要ではない：特定の部位は周知であって、かつＡＤＡ２タンパク質分子の生物学的活性、分泌または結合特徴を最適化するために選択され得る。例えば、他の例示的なＦｃポリペプチド配列は、配列番号３５５に記載する配列のアミノ酸Ｃ１０９またはＰ１１３で開始する(例えば、米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号を参照のこと)。
【０４０６】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションのためのＦｃ領域はまた、当該分野で公知のキメラタンパク質のグリコシル化を変更するアミノ酸置換を含んでもよい。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のＦｃ領域を、グリコシル化の低下につながる突然変異(例えば、Ｎ連結またはＯ連結のグリコシル化)を有するＦｃ領域に対してまたは野性型Ｆｃ部分の変化した糖型(例えば、低いフコースまたはフコースなしのグリカン)に対してコンジュゲートしてもよい。
【０４０７】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションのためのＦｃ領域をまた、遺伝子操作して、金属キレートまたは他のエピトープを有するタグを含めてもよい。このタグ付けされたドメインを、金属−キレートクロマトグラフィーによっておよび／または抗体による急速精製に用いて、ウエスタンブロッティング、免疫沈降またはバイオアッセイでの活性枯渇／ブロッキングによって検出可能にしてもよい。
【０４０８】
ｄ. アルブミンまたはその断片もしくは変異型
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、アルブミンまたはその機能的な断片を含む異種部分に対して直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を含んでもよい。ヒト血清アルブミン(ＨＳＡまたはＨＡ)、６０９アミノ酸のタンパク質は、その全長型(配列番号３０５に記載する例示的な配列)で、血清の浸透圧のかなりの割合を担い、また内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。アルブミンは、全長アミノ酸であってもまたはその機能的な断片、変異型、誘導体もしくはアナログであってもよい。アルブミンまたはその断片もしくは変異型の例は、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１号、同第２００８／０００４２０６号、同第２００８／０１６１２４３号、同第２００８／０２６１８７７または同第２００８／０１５３７５１号またはＰＣＴ公開番号２００８／０３３４１３、２００９／０５８３２２または２００７／０２１４９４(その各々が全体が参照によって本明細書に援用される)に開示される。
【０４０９】
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、アルブミンまたはその断片または変異型(免疫グロブリン定常領域またはその一部(例えば、Ｆｃ領域)から選択される異種部分に対してさらに結合される)、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ、ＸＴＥＮ配列、ＰＥＧまたはそれらの任意の組合せを含んでもよい。
【０４１０】
ｅ. アルブミン結合部分
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、アルブミン結合部分である異種部分、例えば、アルブミン結合ペプチド、細菌のアルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片、脂肪酸またはそれらの任意の組合せに対して直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を含み得る。
【０４１１】
例えば、このアルブミン結合タンパク質は、細菌のアルブミン結合タンパク質、抗体または抗体断片を含むドメイン抗体であってもよい(米国特許第６,６９６,２４５を参照のこと)。アルブミン結合タンパク質は、細菌のアルブミン結合ドメイン、例えば、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧの結合ドメインであってもよい[Konig, T. and A. Skerra, A.(1998) J Immunol. Methods 218:73-83]。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対してコンジュゲートするために用いられ得るアルブミン結合ペプチドの他の例は、例えば、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓコンセンサス配列(配列番号３０６)を有するペプチドであって、ここでＸａａ１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり；Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであり；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり；かつＸａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒである[米国特許出願公開第２００３／００６９３９５；Dennis et al.(2002) J. Biol. Chem. 277: 35035-35043]。
【０４１２】
StreptococcalのプロテインＧ由来のドメイン３[Kraulis et al,(1996) FEBS Lett. 378:190-194;Linhult et al.(2002) Protein Sci. 11:206-213]は、細菌のアルブミン結合ドメインの例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ(配列番号３０７)を有する一連のペプチドが挙げられる[例えば、Dennis et al.(2002) J. Biol. Chem. 277: 35035-35043を参照のこと]。アルブミン結合ペプチドの他の例としては以下が挙げられる：RLIEDICLPRWGCLWEDD(配列番号３０８)；QRLMEDICLPRWGCLWEDDF(配列番号３０９)；QGLIGDICLPRWGCLWGDSVK(配列番号３１０)およびGEWWEDICLPRWGCLWEEED(配列番号３１１)。
【０４１３】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対してコンジュゲートされ得るアルブミン結合抗体断片の例としては、その各々が、その全体を参照によって本明細書に援用される、Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther.(2007) 9:319-326;Roovers et al.(2007), Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317;Holt et al.(2008) Prot. Eng. Design Sci., 21 :283-288に開示のものが挙げられる。このようなアルブミン結合部分の例は、２−(３−マレイミドプロパンアミド)−６−(４−(４−ヨードフェニル)ブタンアミド)ヘキサノエート(「Ａｌｂｕ」タグ)である[Trussel et al.(2009) Bioconjugate Chem. 20:2286-2292]。
【０４１４】
脂肪酸、具体的には、長鎖脂肪酸(ＬＣＦＡ)および長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を用いて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のインビボ半減期を延長してもよい。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例は、１６−(１−(３−(９−(((２,５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ)カルボニルオキシ)−メチル)−７−スルホ−９Ｈ−フルオレン−２−イルアミノ)−３−オキソプロピル)−２,５−ジオキソピロリジン−３−イルチオ)ヘキサデカン酸である(例えば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照のこと)。
【０４１５】
ｆ. ＰＡＳ配列
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、主にアラニンおよびセリン残基を含むかまたは主にアラニン、セリンおよびプロリン残基を含むアミノ酸配列である、ＰＡＳ配列である少なくとも１つの異種部分に対して直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を包含し得る。このアミノ酸配列は、生理学的条件下でランダムコイル高次構造を形成する。したがって、ＰＡＳ配列は、構築ブロック、アミノ酸ポリマーまたは配列カセット(アラニン、セリンおよびプロリンからできている)であり、これは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２にコンジュゲートされた異種部分の一部として用いられ得る。
【０４１６】
当業者は、アミノ酸ポリマーがまた、ＰＡＳ配列中のわずかな構成としてアラニン、セリンおよびプロリン以外の残基が添加されたとき、ランダムコイル高次構造を形成し得ることを承知している。小さい構成としては、特定の程度まで、例えば、最大約１２％まで、すなわち、ＰＡＳ配列の１００アミノ酸のうち約１２まで、最大約１０％まで、すなわち、ＰＡＳ配列の１００アミノ酸のうち約１０まで、最大９％まで、すなわち、１００アミノ酸のうち約９、最大約８％まで、すなわち、１００アミノ酸のうち約８、約６％、すなわち、１００アミノ酸のうち約６、約５％、すなわち、１００アミノ酸のうち約５、約４％、すなわち、１００アミノ酸のうち約４、約３％、すなわち、１００アミノ酸のうち約３、約２％、すなわち、１００アミノ酸のうち約２または約１％、すなわち、１００アミノ酸のうち約１が、ＰＡＳ配列中に追加されてもよい、アラニン、セリンおよびプロリン以外のアミノ酸が挙げられる。アラニン、セリンおよびプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌから選択され得る。
【０４１７】
生理学的条件下では、ＰＡＳ配列ストレッチは、ランダムコイル高次構造を形成し、それによって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するインビボおよび／またはインビトロの安定性の増大を媒介し得る。ランダムコイルドメインは、それ自体は安定な構造も機能も採用しないので、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２によって媒介される生物学的活性は本質的に保存される。他の例では、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に、血漿中でのタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面受容体に対する結合または内部移行に関して、生物学的に不活性であるが、それでも生分解性であって、ＰＥＧなどの合成ポリマーを上回る明確な利点が得られる。
【０４１８】
ランダムコイル高次構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的な例としては、ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(配列番号３１２)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(配列番号３１３)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(配列番号３１４)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(配列番号３１５)、SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(配列番号３１６)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(配列番号３１７)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(配列番号３１８)などのアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せが挙げられる。ＰＡＳ配列の追加の例は、当該分野で公知である(例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０および国際公開番号ＷＯ２００８／１５５１３４を参照のこと)。
【０４１９】
ｇ. ＨＡＰ配列
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、グリシン−リッチなホモ−アミノ酸ポリマー(ＨＡＰ)である少なくとも１つの異種部分に対して直接または間接的に連結されているＡＤＡ２を包含し得る。このＨＡＰ配列は、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、１２０アミノ酸、１４０アミノ酸、１６０アミノ酸、１８０アミノ酸、２００アミノ酸、２５０アミノ酸、３００アミノ酸、３５０アミノ酸、４００アミノ酸、４５０アミノ酸または５００アミノ酸長である、グリシンの反復性配列を包含し得る。一例では、ＨＡＰ配列は、そのＨＡＰ配列に対して融合されるかまたは連結された部分の半減期を延長し得る。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、限定するものではないが、(Ｇｌｙ)ｎ(配列番号３６８)、(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(配列番号３４３)またはＳｅｒ(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(配列番号５９５)が挙げられ、ここでｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９,または２０である。一例では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である。別の例では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０,または２００である。
【０４２０】
ｈ. ＸＴＥＮ配列
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、ＸＴＥＮ配列、そのポリペプチドまたはその断片、変異型、もしくは誘導体を含む、少なくとも１つの異種部分に対して、直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を含んでもよい。ＸＴＥＮ配列は、主に小型の親水性アミノ酸から構成される、天然には存在しない、実質的に非反復性の配列を用いて伸長された長さのポリペプチド配列であって、この配列は、生理学的条件下で、低い次元のまたは非二次構造または三次構造を有する[Schellenberger et al.(2009) Nat Biotechnol. 27(12):1186-1190]。例示的なＸＴＥＮ配列は、この部分に融合されたタンパク質の血漿半減期を延長する、８６４個のアミノ酸の構造化されていない組換えポリペプチド(配列番号３７３)である。異種部分として、ＸＴＥＮ配列は、半減期延長部分として機能し得る。さらに、ＸＴＥＮ配列は、限定するものではないが、薬物動態学的パラメーターの向上および溶解性の特徴を含む所望の特性を提供し得る。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するＸＴＥＮ配列のコンジュゲーションは、以下の有利な特性のうちの１つまたは複数を付与し得る：高次構造の可塑性、水溶性の向上、高い程度のプロテアーゼ耐性、低い免疫原性、哺乳動物受容体に対する低い結合または流体力学的(またはストークス)半径の増大。いくつかの例では、ＸＴＥＮ配列は、インビボ半減期の延長または曲線下面積(ＡＵＣ)の増大などの薬物動態学的特性を増大し得、それによって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２が、インビボで維持され、かつＸＴＥＮ異種部分なしの同じＡＤＡ２と比較して、期間が延びてもアデノシンデアミナーゼ活性が保持される。
【０４２１】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対してコンジュゲートされた異種部分として用いられ得るＸＴＥＮ配列の例としては、その各々が、その全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許第７,８５５,２７９号および同第７,８４６,４４５号、米国特許出願公開第２００９／００９２５８２号、同第２０１０／０２３９５５４号、同第２０１０／０３２３９５６号、同第２０１１／００４６０６０号、同第２０１１／００４６０６１号、同第２０１１／００７７１９９号、同第２０１１／０１７２１４６号、同第２０１２／０１７８６９１号、同第２０１３／００１７９９７号、もしくは同第２０１２／０２６３７０１号または国際公開番号ＷＯ２０１００９１１２２、ＷＯ２０１０１４４５０２、ＷＯ２０１０１４４５０８、ＷＯ２０１１０２８２２８、ＷＯ２０１１０２８２２９またはＷＯ２０１１０２８３４４に記載の任意の配列が挙げられる。
【０４２２】
ｉ. トランスフェリンまたはその断片
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、トランスフェリンまたはその断片である少なくとも１つの異種部分に対して、直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を包含し得る。任意のトランスフェリンが、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２にコンジュゲートされてもよい。例えば、野性型ヒトＴｆ(Ｔｆ)は、約７５ｋＤａ(グリコシル化を除く)という６７９個のアミノ酸のタンパク質(配列番号３２０および３２４に記載するアミノ酸配列；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０５４.１およびＡＡＢ２２０４９.１；配列番号３１９および３２２〜３２３に記載する核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１０６３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５およびＳ９５９３６)であって、２つの主なドメインである、Ｎ末端ドメイン(約３３０アミノ酸)およびＣ末端ドメイン(約３４０アミノ酸)があり、これは、遺伝子複製が起源であると思われる。このＮドメインは、２つのサブドメイン、Ｎ１ドメインおよびＮ２ドメインを含み、このＣドメインは、２つのサブドメイン、Ｃ１ドメインおよびＣ２ドメインを含む。
【０４２３】
一例では、このトランスフェリン異種部分は、トランスフェリンスプライス変異型を含む。一例では、トランスフェリンスプライス変異型は、ヒトトランスフェリンのスプライス変異型であってもよい(配列番号３２５；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ６１１４０)。別の例では、キメラタンパク質のトランスフェリン部分としては、トランスフェリン配列の１以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０４２４】
ｊ. ポリマーコンジュゲーション
本明細書に提供されるＡＤＡ２コンジュゲートは、重合体分子(ポリマー)である、少なくとも１つの異種部分に対して、直接または間接的に連結されるＡＤＡ２を含み得る。ポリマーの例は、例えば、ポリオール(すなわち、ポリ−ＯＨ)、ポリアミン(すなわち、ポリ−ＮＨ２)およびポリカルボキシル酸(すなわち、ポリ−ＣＯＯＨ)およびさらなるヘテロポリマー、すなわち、１以上の種々のカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーである。適当な重合体分子の例としては、ポリアルキレンオキシド(ＰＡＯ)、例えばポリプロピレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、メトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)およびポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール(ＰＡＧ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(ＣＤＩ−ＰＥＧ)分枝ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリ−Ｄ,Ｌ−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラン、ヘパリン、相同的アルブミン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースを含むセルロース、キトサンの加水分解物、デンプン、例えばヒドロキシエチル−デンプンおよびヒドロキシプロピル−デンプン、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、バイオポリマーおよび当該分野で開示されるもの、例えば、米国特許第８,７４１,２８３および国際公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ２００７／１４９６８６に開示されるものの中から選択されるポリマー分子が挙げられる。
【０４２５】
例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２にコンジュゲートされたポリマーは、一般には、以下の式：
[Ｒ−ＮＨ]ｚ−(ＡＤＡ２)
に相当し得、ここで(ＡＤＡ２)は、本明細書に記載の任意のＡＤＡ２、例えば、その野性型、変異型または修飾型を表し；
ＮＨ−は、ポリマーに対する結合のために本明細書に提供されるＡＤＡ２で見出されるアミノ酸のアミノ基である；
ｚは、正の整数、例えば、約１〜約３２または１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、１８〜２０、１９〜２１、２０〜２２、２１〜２３、２２〜２４、２３〜２５、２４〜２６、２５〜２７、２６〜２８、２７〜２９、２８〜３０、２９〜３１または３０〜３２であり；
Ｒは、遊離型または非遊離型で本明細書に提供されるＡＤＡ２に結合される、実質的に非抗原性のポリマー分子である。例示的な非抗原性の重合体の分子は、本明細書のいずれかに記載され得、かつ例えば、米国特許第８,７４１,２８３号および国際公開番号ＷＯ２００７／１４９６８６において、当該分野で開示されるものであってもよい。
【０４２６】
例えば、本明細書に記載される任意のＡＤＡ２は、少なくとも１つのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)分子にコンジュゲートされ得る。いくつかの例では、このポリマーは、水溶性であってもよい。いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、ＰＥＧ異種部分にコンジュゲートされ、かつさらに、免疫グロブリン定常領域またはその一部(例えば、Ｆｃ領域)、ＰＡＳ配列、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)およびアルブミンまたはそれらの断片もしくは変異型、ＸＴＥＮ配列またはそれらの任意の組合せから選択される異種部分を含む。
【０４２７】
変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、任意のＡＤＡ２ポリペプチドに対するポリエチレングリコール[ＰＥＧ化部分(ＰＥＧ)]などの重合体分子の共有結合または他の適切な結合(コンジュゲーション)は、得られたＡＤＡ２ポリマー組成物に対して有益な特性を付与する。このような特性としては、生体適合性の改善、血漿、細胞および／または対象内の他の組織中のタンパク質(および酵素活性)半減期の延長、プロテアーゼおよび加水分解からのタンパク質の有効な遮蔽、生体分布の改善、薬物動態および／または薬物動態学の改善、安定性の増大、免疫原性の低下、対象における処置効果の延長／持続、ならびに水溶性の増大が挙げられる(米国特許第４,１７９,３３７号を参照のこと)。
【０４２８】
ｉ. ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)
ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)は、生体材料、バイオテクノロジーおよび医薬において広範に用いられており、この理由は主に、ＰＥＧが、典型的には非免疫原性である生体適合性の非毒性の水溶性ポリマーであるからである(Zhao and Harris、ACS Symposium Series 680:458-72, 1997)。薬物送達の領域では、ＰＥＧ誘導体は、免疫原性、タンパク質分解および腎クリアランスを低下するため、ならびに溶解度を向上するため、タンパク質に対する共有結合(すなわち、「ＰＥＧ化」)において広範に用いられていた(Zalipsky、Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995)。同様に、ＰＥＧは、溶解度を向上し、毒性を低下し、生体分布を変更するために、低分子量の比較的疎水性の薬物に対して結合されていた。典型的には、ＰＥＧ化薬物は、溶液として注射される。
【０４２９】
密接に関連する適用は、薬物送達における使用のための架橋された分解性ＰＥＧ網目状構造または製剤の合成である。なぜなら、分解性の溶解性薬物担体の設計で用いられるのとほぼ同じ化学を、分解性ゲルの設計に用いてもよいからである(Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993)。高分子間複合体が２つの相補的なポリマーの溶液を混合することによって形成され得ることも公知である。このような複合体は一般には、関与するポリマーの間の静電相互作用(ポリアニオン−ポリカチオン)および／または水素結合(ポリ酸−ポリ塩基)によっておよび／または周囲の水の中のポリマーの間の疎水性相互作用によって安定化される(Krupers et al., Eur. Polym J. 32:785-790, 1996)。例えば、適切な条件下のポリアクリル酸(ＰＡＡｃ)およびポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)の混合溶液は、ほとんど水素結合に基づいて、複合体の形成を生じる。生理学的条件でのこれらの複合体の解離は、遊離の薬物(すなわち、非ＰＥＧ化)の送達に用いられてきた。さらに、相補的なポリマーの複合体は、ホモポリマーおよびコポリマーの両方から形成された。
【０４３０】
ペグ化のための多くの試薬が当該分野で記載されている。このような試薬としては、限定するものではないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル(ＮＨＳ)活性化ＰＥＧ、スクシンイミジルｍＰＥＧ、ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルアルファ−メチルブタノエート、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧカルボキシメチル３−ヒドロキシブタノイック酸スクシンイミジルエステル、ホモ二官能的ＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート、ホモ二官能的ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二官能的ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、ｐ−ニトロフェニル−カーボネートＰＥＧ、ｍＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート、プロピオンアルデヒドＰＥＧ、ｍＰＥＧブチルアルデヒド、分枝ｍＰＥＧ２ブチルアルデヒド、ｍＰＥＧアセチル、ｍＰＥＧピペリドン、ｍＰＥＧメチルケトン、ｍＰＥＧ「リンカーレス」マレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホン、ｍＰＥＧチオール、ｍＰＥＧオルトピリジルチオエステル、ｍＰＥＧオルトピリジルジスルフィド、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｂｏｃ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、ビニルスルホンＰＥＧ−ＮＨＳ、アクリレートＰＥＧ−ＮＨＳ、フルオレセインＰＥＧ−ＮＨＳおよびビオチンＰＥＧ−ＮＨＳが挙げられる(例えば、Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995;Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997；米国特許第５,６７２,６６２号；米国特許第５,９３２,４６２号；米国特許第６,４９５,６５９号；米国特許第６,７３７,５０５号；米国特許第４,００２,５３１号；米国特許第４,１７９,３３７号；米国特許第５,１２２,６１４号；米国特許第５,３２４,８４４号；米国特許第５,４４６,０９０号；米国特許第５,６１２,４６０号；米国特許第５,６４３,５７５号；米国特許第５,７６６,５８１号；米国特許第５,７９５,５６９号；米国特許第５,８０８,０９６号；米国特許第５,９００,４６１号；米国特許第５,９１９,４５５号；米国特許第５,９８５,２６３号；米国特許第５,９９０,２３７号；米国特許第６,１１３,９０６号；米国特許第６,２１４,９６６号；米国特許第６,２５８,３５１号；米国特許第６,３４０,７４２号；米国特許第６,４１３,５０７号；米国特許第６,４２０,３３９号；米国特許第６,４３７,０２５号；米国特許第６,４４８,３６９号；米国特許第６,４６１,８０２号；米国特許第６,８２８,４０１号；米国特許第６,８５８,７３６号；米国特許第８,７４１,２８３号；米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号；米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号；米国特許出願公開第２００１／００４６４８１号；米国特許出願公開第２００２／００５２４３０号；米国特許出願公開第２００２／００７２５７３号；米国特許出願公開第２００２／０１５６０４７号；米国特許出願公開第２００３／０１１４６４７号；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号；米国特許出願公開第２００３／０１５８３３３号；米国特許出願公開第２００３／０２２０４４７号；米国特許出願公開第２００４／００１３６３７号；米国特許出願公開第２００４／０２３５７３４；ＷＯ０５０００３６０号；米国特許出願公開第２００５／０１１４０��７号；米国特許出願公開第２００５／０１７１３２８号；米国特許出願公開第２００５／０２０９４１６号；欧州特許第１０６４９５１号；欧州特許第０８２２１９９号；ＷＯ０１０７６６４０；ＷＯ０００２０１７；ＷＯ０２４９６７３；ＷＯ９４／２８０２４；およびＷＯ０１／８７９２５を参照のこと)。
【０４３１】
具体的には、このポリマーは、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)である。変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む任意のＡＤＡ２ポリペプチドに対する結合のための適切な重合体の分子としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびＰＥＧ誘導体、例えば、メトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル(Ｅｐｏｘ−ＰＥＧ)、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(ＣＤＩ−ＰＥＧ)、分枝ＰＥＧおよびポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)が挙げられる[例えば、Roberts et al.、Advanced Drug Delivery Review(2002) 54: 459-476;Harris and Zalipsky, S(eds.)「Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications」ACS Symposium Series 680, 1997;Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000;Harris,(2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221;and Tsubery,(2004) J Biol. Chem 279(37):38118-24を参照のこと]。
【０４３２】
重合体の部分、例えば、ＰＥＧ部分は、通常約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａに及ぶ分子量であってもよい。ある態様においては、本明細書に提供されるような任意のＡＤＡ２などのタンパク質にコンジュゲートされる重合体の分子は、少なくともまたは少なくとも約または５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｋＤａもしくは１０００ｋＤａ超の分子量を有する。他のサイズが、所望のプロフィール(例えば、望ましい徐放性の期間、もしあれば、生物学的活性に対する効果、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠失、タンパク質またはアナログに対するポリエチレングリコールの他の公知の効果)次第で、用いられてもよい。
【０４３３】
ＰＥＧ部分は、任意の分子量であってもよく、かつ分岐されてもよくまたは未分岐であってもよい。いくつかの例では、異種ポリマーは、分岐した構造を有するＰＥＧである。分岐したポリエチレングリコールは、例えば、米国特許第５,６４３,５７５号；Morpurgo et al.(1996) Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72；Vorobjev et al.(1999) Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750；およびCaliceti et al.(1999) Bioconjug. Chem. 10:638-646(その各々が、その全体として参照によって本明細書に援用される)に記載される。
【０４３４】
多数の反応がＰＥＧ化について記載されているが、最も一般的に適用可能な反応は、方向性を付与し、軽度の反応条件を利用し、かつ毒性の触媒または副産物を除去するために過度の下流処理を必要とはしない。例えば、モノメトキシＰＥＧ(ｍＰＥＧ)は、反応性の末端ヒドロキシルを１つだけ有し、したがってその使用は、得られたＰＥＧタンパク質生成物混合物のある程度の不均一性を制限する。末端メトキシ基に反対側のポリマーの終わりのヒドロキシル基を活性化させることは一般には、効果的なタンパク質ＰＥＧ化を達成するために必要であり、その目的は、求核攻撃をさらに受けやすい派生的なＰＥＧを作製することである。求核攻撃は通常は、リジン残基のイプシロンアミノ基であるが、他のアミンもまた、局所条件が好適である場合に反応し得る(例えば、Ｎ末端アルファ−アミンまたはヒスチジンの環アミン)。
【０４３５】
さらに指向性の結合が、単一のリジンまたはシステインを含むタンパク質中で可能である。後者の残基は、チオール特異的な修飾のためにＰＥＧ−マレイミドによって標的化され得る。あるいは、ＰＥＧヒドラジドは、過ヨウ素酸酸化タンパク質と反応して、ＮａＣＮＢＨ３の存在下で還元され得る。さらに具体的には、ＰＥＧ化したＣＭＰ糖は、適切なグリコシルトランスフェラーゼの存在下でタンパク質と反応し得る。あるいは、ＡＤＡ２のｐｅｇ化は、タンパク質内の最適化位置で部位特異的な化学的コンジュゲーションを可能にする非天然のアミノ酸による置換を含む変異型中で生じ得る。ＰＥＧ化技術によって、多数の重合体の分子が、該当のポリペプチドとカップリングされることが可能になり得る。この技術を用いる場合、免疫系は、抗体の形成を担うポリペプチドの表面上のエピトープの認識が困難であり、そのせいで免疫応答が低下する。特定の生理学的な効果を得るためにヒト身体の循環系へ直接導入されるポリペプチドについては(すなわち、薬剤)、典型的な潜在的な免疫応答は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ反応であるが、呼吸器系を通じて吸引されるポリペプチド(すなわち、産業上のポリペプチド)は潜在的には、ＩｇＥ反応(すなわち、アレルギー反応)を生じ得る。免疫応答の低下を説明する理論の１つは、ポリペプチドの表面上の重合体の分子シールドエピトープが抗体形成をもたらす免疫応答を担うということである。別の理論または少なくとも部分的な要因は、コンジュゲートが重いほど、免疫応答がさらに低下するということである。
【０４３６】
典型的には、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、本明細書に提供されるＰＥＧ化ＡＤＡポリペプチドを作製するためには、ＰＥＧ部分を、共有結合を介して、ポリペプチドにコンジュゲートする。ＰＥＧ化のための技術としては、限定するものではないが、専門的なリンカーおよびカップリング化学(例えば、Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002を参照のこと)、単一のコンジュゲート部位への複数のＰＥＧ部分の結合(例えば、分岐したＰＥＧの使用を介する；例えば、Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002を参照のこと)、部位特異的なＰＥＧ化および／または単一ＰＥＧ化(例えば、Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999を参照のこと)および部位指向性酵素ＰＥＧ化(例えば、Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002を参照のこと)が挙げられる。当該分野で記載される方法および技術は、単一タンパク質分子に結合された少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を生成し得る(例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８を参照のこと)。
【０４３７】
各々のＡＤＡ２分子に結合されたポリエチレングリコール部分の数もまた変化し得る。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、平均で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０またはそれ以上のポリエチレングリコール分子にコンジュゲートされ得る。例えば、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含むＰＥＧ化したＡＤＡ２ポリペプチドは一般には、１分子あたり少なくとも５個のＰＥＧ部分を含む。他の例では、タンパク質分子あたりのＰＥＧ分子の数の範囲は、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、１８〜２０、１９〜２１、２０〜２２、２１〜２３、２２〜２４、２３〜２５、２４〜２６、２５〜２７、２６〜２８、２７〜２９、２８〜３０、２９〜３１または３０〜３２であり得る。例えば、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含むＡＤＡ２ポリペプチドは、ＰＥＧ対タンパク質のモル比３２：１〜１：１、例えば、約または最大３０：１、２０：１、１５：１、１０：１および５：１を有し得る。１タンパク質あたりのＰＥＧ分子の数は、当業者によって決定されるとおり、任意の特定の臨床状態にあてはまる組み合わせたコンジュゲートの物理的および動態的特性を改変するために変更してもよい。ＰＥＧ対タンパク質モル比を決定するための方法は、当該分野において、例えば、Delgado et al.(1992) Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304に開示される。
【０４３８】
薬物に対するＰＥＧの共有結合(「ＰＥＧ化」としても公知)は、公知の化学合成技術によって達成され得る。例えば、タンパク質のＰＥＧ化は、適切な反応条件下でタンパク質とのＮＨＳ活性化ＰＥＧとの反応によって達成され得る。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を共有結合すること(コンジュゲートすること)(すなわち、「ＰＥＧ化」)によってポリペプチドを修飾する種々の方法は、当該分野で公知である(例えば、米国特許第５,６７２,６６２号；米国特許第６,７３７,５０５号；米国特許出願公開第２００４／０２３５７３４号；米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号を参照のこと)。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体などの種々のポリマーの共有結合は、米国特許第８,７４１,２８３号に記載される。
【０４３９】
活性化されたポリマーおよび誘導体を使用して、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するポリマーのコンジュゲーションを容易にしてもよい。活性化されたポリマーおよび誘導体は、脱離基または活性化基を有し、これが本明細書に提供されるＡＤＡ２などのポリペプチド上に見出されるアミン基に対するポリマー系の結合を容易にする。例えば、活性化された基は、リジンのイプシロンアミン基などの、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２上で見出されるアミン基(求核試薬)と反応し得る基である。例示的な活性化基としては：
【化１】
0006625627.tif 000010
または他の適切な脱離基または活性化基、例えば、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールイル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジル、イミダゾリル、Ｏ−アシルウレア、ペンタフルオロフェノール、２,４,６−トリ−クロロフェノールまたは当業者に明らかな他の適切な脱離基が挙げられる。
【０４４０】
例示的な活性化されたＰＥＧとしては、例えば、米国特許第５,１２２,６１４号、同第５,３２４,８４４号、同第５,６１２,４６０号および同第５,８０８,０９６号(スクシンイミジルカルボネート活性化ポリエチレングリコール(ＳＣ−ＰＥＧ)および関連の活性化ＰＥＧ)および米国特許第５,３４９,００１号(環状イミドチオン活性化ＰＥＧ)など、当該分野で開示されるＰＥＧが挙げられる。コンジュゲーションの反応は通常は、数倍モル過剰の活性化ＰＥＧを用いて適切な緩衝液中で行われる。いくつかの例では、ＳＣ−ＰＥＧなどの直鎖ＰＥＧで作製されたコンジュゲートは、平均して、タンパク質分子１つあたり、約１〜約３２個のＰＥＧ分子を含んでもよい。結果として、これらのために、数百倍のモル過剰、例えば、約２００〜約１０００倍のモル過剰を使用してもよい。分岐したポリマーおよび酵素に結合されたポリマーに用いられるモル過剰は低く、かつ当該分野で公知の技術を用いて決定できる。
【０４４１】
いくつかの例では、重合体の系の活性化されたポリマーリンカーは、米国特許第６,１８０,０９５号、同第６,７２０,３０６号、同第５,９６５,１１９号、同第６,６２４,１４２号および同第６,３０３,５６９号に記載されるように、ベンジル排除またはトリメチルロックラクトン化に基づいた。他の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のポリマーコンジュゲーションは、例えば、米国特許第７,１２２,１８９号、同第７,０８７,２２９号および同第８,７４１,２８３号において、当該分野で記載されるように、ビシンポリマー残基を用いて達成され得る。他の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のポリマーコンジュゲーションは、米国特許第５,６８１,５６７号、同第５,７５６,５９３号、同第５,６４３,５７５号；同第５,９１９,４５５号、同第６,１１３,９０６号、同第６,１５３,６５５号、同第６,３９５,２６６号および同第６,６３８,４９９号、同第６,２５１,３８２号、同第６,８２４,７６６号および同第８,７４１,２８３号に記載のポリマー残基などの分岐したポリマー残基を用いて達成され得る。他の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のポリマーコンジュゲーションは、国際公開ＷＯ２００８／０３４１１９に記載のものなどの、ヒンダードエステル系リンカーを用いて達成され得る。いくつかの例では,活性化されたポリエチレングリコールは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などのタンパク質とのウレタン連結またはアミド連結を提供するものである。
【０４４２】
高純度で末端カルボン酸を有するポリマーを調製する方法は、当該分野において、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１７３６１５に記載されている。この方法は、ポリアルキレンオキシドの三級アルキルエステルを最初に調製し、続いてそのカルボン酸誘導体に変換することを包含する。このプロセスのＰＡＯカルボン酸の調製の最初の工程は、ポリアルキレンオキシドカルボン酸のｔ−ブチルエステルなどの中間体を形成することを包含する。この中間体は、ＰＡＯとｔ−ブチルハロアセテートとをカリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下で反応させることによって形成される。一旦、ｔ−ブチルエステル中間体が形成されれば、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体は、９２％を超える純度、例えば、９７％、９９％または９９.５％を超える純度で容易に得ることができる。
【０４４３】
他の例では、末端アミン基を有するポリマーを使用して、本明細書に提供されるＡＤＡ２に対するコンジュゲートを作製してもよい。高純度で末端アミンを含有するポリマーを調製する方法は、当該分野において、例えば、米国特許第７,８６８,１３１号および同第７,５６９,６５７号に記載されている。例えば、アジドを有するポリマーは、トリフェニルホスフィンなどのホスフィンベースの還元剤またはＮａＢＨ４などのアルカリ金属ホウ化水素還元剤と反応する。あるいは、脱離基を含むポリマーは、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボネートのカリウム塩(ＫＮＭｅＢｏｃ)またはジ−ｔｅｒｔ−ブチルイミドジカルボネートのカリウム塩(ＫＮＢｏｃ２)などの保護されたアミン塩と反応し、その後に保護されたアミン基の脱保護がある。これらのプロセスによって形成される末端アミンを含むポリマーの純度は、約９５％より大きく、例えば、９９％超である。
【０４４４】
いくつかの例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２のポリマーコンジュゲートのＰＥＧ部分は、以下の中から選択され得る：
Ｊ−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−
Ｊ−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２Ｃ(Ｏ)−Ｏ−、
Ｊ−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＲ−および
Ｊ−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ−、
式中、ｕは、重合体化の程度であって、すなわち、約１０〜約２,３００であり；
Ｒは、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１２分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、フェノキシおよびＣ１〜６ヘテロアルコキシの中から選択され、かつ
Ｊは、キャッピング基、すなわち、ポリマーの末端で見出される基であって、ある面では、ＮＨ２(またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２)、Ｈ、ＳＨ(またはＣＨ２ＣＨ２ＳＨ)、ＣＯ２Ｈ(またはＣＨ２ＣＯ２Ｈ)、Ｃ１〜６アルキル、例えば、メチルまたは当該分野で公知の他のＰＥＧ末端活性化基の中から選択され得る。
【０４４５】
例えば、ポリマーコンジュゲートのＰＥＧ部分は、
ＣＨ３−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−、ＣＨ３−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２Ｃ(Ｏ)−Ｏ−、
ＣＨ３−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−およびＣＨ３−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２ＳＨ−、
の中から選択されてもよく、
式中、ｕは、ポリマー部分の平均総分子量が、約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａに及ぶような正の整数である。
【０４４６】
他の例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２のポリマーコンジュゲートのＰＥＧ部分は、以下の中から選択され得：
−Ｙ１−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２Ｙ１−、
−Ｙ１−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２Ｃ(＝Ｙ２)−Ｙ１−、
−Ｙ１−Ｃ(＝Ｙ２)−(ＣＨ２)ａ１−Ｙ３−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ３−(ＣＨ２)ａ１−Ｃ(＝Ｙ２)−Ｙ１−、
−Ｙ１−(ＣＲ２Ｒ３)ａ２−Ｙ３−(ＣＨ２)ｂ１−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｂ１−(ＣＨ２)ｂ１−Ｙ３−(ＣＲ２Ｒ３)ａ２−Ｙ１−、
−Ｙ１−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２−、
−Ｙ１−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２Ｃ(＝Ｙ２)−、
−Ｃ(＝Ｙ２)−(ＣＨ２)ａ１−Ｙ３−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ３−(ＣＨ２)ａ１−Ｃ(＝Ｙ２)−および
−(ＣＲ２Ｒ３)ａ２−Ｙ３−(ＣＨ２)ｂ１−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−(ＣＨ２)ｂ１−Ｙ３−(ＣＲ２Ｒ３)ａ２−、
式中、Ｙ１およびＹ３は、独立して、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、ＮＲ４または結合であり；
Ｙ２は、Ｏ、ＳまたはＮＲ５である；
Ｒ２−Ｒ５は独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ３〜１９分岐アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ２〜６置換アルケニル、Ｃ２〜６置換アルキニル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ１〜６ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ２〜６アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ２〜６置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ２〜６置換アルカノイルオキシおよび置換アリールカルボニルオキシの中から選択され；
ａ１、ａ２およびｂ１は、独立してゼロまたは１〜６の正の整数、例えば、０、１または２であり；かつ
ｕは、約１０〜約２３００の整数である。
【０４４７】
他の例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２のポリマーコンジュゲートのＰＥＧ部分は、例えば、以下の方式：
−Ｃ(＝Ｙ４)−(ＣＨ２)ｍ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−、
−Ｃ(＝Ｙ４)−Ｙ−(ＣＨ２)ｍ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−、
−Ｃ(＝Ｙ４)−ＮＲ２−(ＣＨ２)ｍ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−、
−ＣＲ６Ｒ７−(ＣＨ２)ｍ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｕ−
において官能化されてもよく、
式中、Ｒ２、Ｒ６およびＲ７は独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキルおよび置換Ｃ１〜６アルキルの中から選択され；
ｍは、ゼロであるかまたは正の整数、例えば１または２であり、
Ｙ４は、ＯまたはＳであり、
ｕは、重合化の程度を示す。
【０４４８】
いくつかの例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２のポリマーコンジュゲートは、米国特許第５,１２２,６１４号または同第５,８０８,０９６号に記載の活性化技術を用いて、適切な活性化ポリマー中に、日油株式会社(日本、東京)が製造したような、マルチアームのＰＥＧ−ＯＨまたは「スター−ＰＥＧ」製品を変換することを包含する方法によって作製されてもよい。一例では、マルチアームポリマーは、４つ以上のポリマーアームおよび好ましくは４つまたは８つのポリマーアームを備えてもよい。いくつかの例では、ＰＥＧアームのうちの４つは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などのポリペプチドに対する結合を促進するために、スクシンイミジルカルボネート(ＳＣ)などの適切な官能基に変換される。
【０４４９】
本明細書に提供される重合体のコンジュゲートは、室温で水溶性であり得る。このようなポリマーの非限定的な列挙としては、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーが挙げられる。
【０４５０】
変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、ＰＥＧ化ＡＤＡ２ポリペプチドを作製するための例示的な実例の方法は、ＰＥＧアルデヒド、スクシンイミドおよびカルボネートを各々、ＰＥＧ部分、典型的には、スクシンイミジルＰＥＧにコンジュゲートするために適用されている。例示的なスクシンイミジルモノＰＥＧ(ｍＰＥＧ)試薬としては、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルプロピオネート(ｍＰＥＧ−ＳＰＡ)、ｍＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル(ｍＰＥＧ−ＳＣＭ)、ｍＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)および(「分岐した」ＰＥＧを結合するため)ｍＰＥＧ２−Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドが挙げられる。これらのＰＥＧ化したスクシンイミジルエステルは、ＰＥＧ基と活性化された架橋との間の異なる長さの炭素骨格および単一または分岐したＰＥＧ基のいずれかを含む。これらの相違を用いて、例えば、異なる反応速度論を提供して、潜在的にＡＤＡ２に対するＰＥＧ結合に利用可能な部位を、コンジュゲーションプロセスの間に制限してもよい。このようなＰＥＧ化したＡＤＡ２組成物は、少なくとも約９０％〜約１００％のＰＥＧ化したＡＤＡ２分子を有しており、かつＰＥＧ化されていないＡＤＡ２を実質的に含まない組成物を得るために容易に精製できる(非ＰＥＧ化が５％未満)。
【０４５１】
一例では、ＰＥＧ化は、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、任意のＡＤＡ２ポリペプチドに対するｍＰＥＧ−ＳＣＭ、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ−２０Ｋ(約２０ｋＤａの分子量を有する)またはＰＥＧ誘導体の別のスクシンイミジルカルボキシメチルエステルのコンジュゲーションを含む。ＰＥＧ誘導体のスクシンイミジルカルボキシメチルエステル、例えば、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ−２０Ｋは、タンパク質中のリジンのアミノ基または生物学的に活性な分子中のＮ末端アミンに容易にカップリングする。例えば、ｍ−ＰＥＧ−ＳＣＭ−２０ＫおよびＡＤＡ２(これは、単量体としてほぼ５９ｋＤａのサイズである)の共有結合的なコンジュゲーションによって、ＡＤＡ２とｍＰＥＧとの間の安定なアミド結合が得られる。典型的には、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ−２０Ｋまたは他のＰＥＧが、適切な緩衝液中で、１５：１のＰＥＧ：ポリペプチドモル比で、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む任意のＡＤＡ２ポリペプチドに加えられ、その後滅菌、例えば、滅菌ろ過が続けられ、例えば、冷却した部屋で４℃で一晩、撹拌しながら、コンジュゲーションが続けられる。
【０４５２】
ポリペプチドに対して、ｍＰＥＧ−ＳＢＡ−３０Ｋなどのブタン酸誘導体を含む、ＰＥＧのスクシンイミジルエステルをカップリングする他の方法は、当該分野で公知である(例えば、米国特許第５,６７２,６６２号；米国特許第６,７３７,５０５号；米国特許第８,７８４,７９１号；米国特許仮出願第２００４／０２３５７３４号および米国特許出願公開第２００５／０１５８２７３号を参照のこと)。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などのポリペプチドを、４℃で１時間の間、ホウ酸緩衝液(０.１Ｍ、ｐＨ８.０)中での反応によってＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体に対してカップリングしてもよい。得られたＰＥＧ化タンパク質を、超遠心分離によって精製してもよい。あるいは、ウシアルカリホスファターゼのＰＥＧ化は、ホスファターゼとｍＰＥＧ−ＳＢＡとを、０.２Ｍのリン酸ナトリウムおよび０.５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液(ｐＨ７.５)中で４℃で、３０分間混合することによって達成してもよい。未反応のＰＥＧは、超遠心分離によってまたはＣａｐｔｏ  Ｐｈｅｎｙｌ樹脂カラム(ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)などの樹脂カラムを用いて除去してもよい。別の方法では、トリエチルアミンを添加して、ｐＨを７.２〜９に上昇させている脱イオン水中で、ポリペプチドとｍＰＥＧ−ＳＢＡとを反応させる。得られた混合物を室温で数時間撹拌して、ＰＥＧ化を完了させる。
【０４５３】
本明細書に示されるとおり、変異型ＡＤＡ２のＰＥＧ化は、ＡＤＡ２に対するヘパリン結合特性の低下をもたらす。ヘパリン結合の低下はさらに、ヘパリン結合を低下するアミノ酸置き換えから生じる任意のヘパリン結合の減弱であってもよい。したがって、ＡＤＡ２のＰＥＧ化はまた、ＡＤＡ２の薬物動態学的特性を改善し、ＰＥＧ化は、ヘパリン結合を減弱するために、アミノ酸置き換えの代わりにまたはそれに加えて用いられ得る。
【０４５４】
ii. ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)
いくつかの例では、少なくとも１つの異種部分は、ポリマー、例えば、ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)またはその誘導体である。ヒドロキシエチルデンプン(ＨＥＳ)は、天然に存在するアミロペクチンの誘導体であって、身体内でアルファ−アミラーゼによって分解される。ＨＥＳは、最大で９５重量％までの濃度でコーンスターチ中に存在する、炭水化物ポリマーアミロペクチンの置換誘導体である。ＨＥＳは、有利な生物学的特性を示し、かつ血液代用剤としておよび血液希釈療法で臨床で用いられる。
【０４５５】
アミロペクチンはグルコース部分を含み、ここで主鎖では、α−１,４−グリコシド結合が存在して、分岐した部位では、α−１,６−グリコシド結合が見出される。この分子の物理−化学的特性は主に、グリコシド結合の種類によって決定される。ニックのあるα−１,４−グリコシド結合に起因して、１ターンあたり約６つのグルコース単量体があるらせん構造が生成される。ポリマーの物理化学的特性および生化学的特性は、置換によって改変され得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリヒドロキシエチル化を介して達成され得る。反応条件を適合することによって、ヒドロキシエチル化に対する非置換のグルコース単量体中のそれぞれのヒドロキシ基の種々の反応性を開発することができる。当業者は、置換パターンを決定し得る。ＨＥＳは主に、モル重量分布および置換の程度(ＤＳ)(置換のモル比を指す)によって特徴付けられる。
【０４５６】
一例では、ヒドロキシエチルデンプンは、１〜３００ｋＤ、２〜２００ｋＤ、３〜１００ｋＤまたは４〜７０ｋＤの平均分子量(重量平均)を有する。ヒドロキシエチルデンプンはさらに、０.１〜３、好ましくは０.１〜２、より好ましくは０.１〜０.９、好ましくは０.１〜０.８という置換モル度(ＤＳ)およびヒドロキシエチル基に対して２〜２０という範囲でＣ２：Ｃ６置換の間の比を示し得る。約１３０ｋＤという平均分子量を有するＨＥＳの非限定的な例は、０.２〜０.８、例えば、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７または０.８というＤＳおよび具体的には、０.４〜０.７、例えば、０.４、０.５、０.６または０.７というＤＳを有するＨＥＳである。
【０４５７】
一例では、ＨＥＳは、約１３０ｋＤという平均分子量を有してもよく、ＶＯＬＵＶＥＮ(登録商標)(Fresenius Kabi, Germany)である。ＶＯＬＵＶＥＮ(登録商標)は、人工的なコロイドであり、例えば、血液量減少の治療および予防のために治療適用で用いられる容量置換のために使用される。ＶＯＬＵＶＥＮ(登録商標)の特徴は、１３０±２０ｋＤａという平均分子量であって、モル置換は０.４およびＣ２：Ｃ６比は約９：１である。他の例では、ヒドロキシエチルデンプンの平均分子量の範囲は、例えば、４〜７０ｋＤａまたは１０〜７０ｋＤａまたは１２〜７０ｋＤａまたは１８〜７０ｋＤａまたは５０〜７０ｋＤａまたは４〜５０ｋＤａまたは１０〜５０ｋＤａまたは１２〜５０ｋＤａまたは１８〜５０ｋＤａまたは４〜１８ｋＤａまたは１０〜１８ｋＤａまたは１２〜１８ｋＤａまたは４〜１２ｋＤａまたは１０〜１２ｋＤａまたは４〜１０ｋＤａである。他の例では、使用されるヒドロキシエチルデンプンの平均分子量は、４ｋＤａ超から７０ｋＤａ未満の範囲、例えば、約１０ｋＤａまたは９〜１０ｋＤａまたは１０〜１１ｋＤａまたは９〜１１ｋＤａの範囲または約１２ｋＤａまたは１１〜１２ｋＤａの範囲)または１２〜１３ｋＤａまたは１１〜１３ｋＤａまたは約１８ｋＤａまたは１７〜１８ｋＤａのまたは１８〜１９ｋＤａまたは１７〜１９ｋＤａの範囲または約３０ｋＤａまたは２９〜３０または３０〜３１ｋＤａまたは約５０ｋＤａの範囲または４９〜５０ｋＤａまたは５０〜５１ｋＤａまたは４９〜５１ｋＤａの範囲である。
【０４５８】
いくつかの例では、異種部分は、異なる平均分子量および／または異なる程度の置換および／または異なる比のＣ２：Ｃ６置換を有するヒドロキシエチルデンプンの混合物であり得る。したがって、異なる平均分子量および異なる程度の置換および異なる比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたは異なる平均分子量および異なる程度の置換および同じもしくはほぼ同じ比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたは異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ程度の置換および異なる比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたは同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる程度の置換および異なる比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたは異なる平均分子量および同じもしくはほぼ同じ程度の置換および同じもしくはほぼ同じ比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたは同じもしくはほぼ同じ平均分子量および異なる程度の置換および同じもしくはほぼ同じ比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたは同じもしくはほぼ同じ平均分子量および同じもしくはほぼ同じ程度の置換および異なる比のＣ２：Ｃ６置換を有するかまたはほぼ同じ平均分子量およびほぼ同じ程度の置換およびほぼ同じ比のＣ２：Ｃ６置換を有する、ヒドロキシエチルデンプンの混合物を使用してもよい。
【０４５９】
iii. ポリシアル酸(ＰＳＡ)
特定の例では、少なくとも１つの異種部分はポリマー、例えば、ポリシアル酸(ＰＳＡ)またはその誘導体である。ポリシアル酸(ＰＳＡ)は、特定の細菌株によっておよび特定の細胞中の哺乳動物において産生されるシアル酸の天然に存在する未分岐のポリマーである[Roth J., et al.(1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A.(Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348]。それらは、限られた酸加水分解によってまたはノイラミニダーゼでの消化によってまたはポリマーの天然の細菌由来型の断片化によって、約８０以上のシアル酸残基から約２という種々の程度の重合化で産生され得る。
【０４６０】
種々のポリシアル酸の組成物も変化し、その結果、ホモポリマー型、すなわち、神経細胞接着分子(Ｎ−ＣＡＭ)の胚型でも見出される、大腸菌株Ｋ１およびＢ群髄膜炎菌の莢膜多糖類のα−２,８連結ポリシアル酸が存在する。大腸菌株Ｋ９２のα−２,８α２,９ポリシアル酸およびN. meningitidisのＣ群多糖類が交互にあるヘテロポリマー型もまた存在する。シアル酸はまた、Ｗ１３５群またはＹ群のN. meningitidisなどのシアル酸以外の単量体を有する交互のコポリマーでも見出され得る。ポリシアル酸は、病原性細菌による免疫系および補体系の回避、ならびに胎児発達の間の未熟な神経のグリア接着性の調節(ポリマーが抗接着機能を有する)を含む、重要な生物学的機能を有する[Cho and Troy,(1994) P.N.A.S. 91:11427-11431]が、哺乳動物ではポリシアル酸の受容体は知られていない。
【０４６１】
他の例では、大腸菌株Ｋ１のα−２,８連結ポリシアル酸はまた、コロミン酸としても公知であり、(種々の長さで)用いられる。ポリペプチドに対してポリシアル酸を結合またはコンジュゲートする種々の方法が記載されている(例えば、その各々が、その全体として参照によって本明細書に援用される、米国特許第５,８４６,９５１号；ＷＯ０１／８７９２２および米国特許出願公開第２００７／０１９１５９７号を参照のこと)。
【０４６２】
iv. 他のポリマー
他の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対するコンジュゲーションのためのポリマー部分は、当該分野で公知であるかおよび／または米国特許第６,１５３,６５５号に記載の他のポリマーを含む１以上の事実上非抗原性の材料、例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系のポリマー、ヒドロキシプロピルメタ−アクリルアミド(ＨＰＭＡ)、ポリアルキレンオキシドおよび／またはそれらのコポリマーの中から選択され得る。使用の目的に基づいてポリマーを選択し、適切なコンジュゲーション方法を選択することは当業者の水準の範囲内である。
【０４６３】
２. コンジュゲートまたは融合タンパク質を生成する方法
異種部分は、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対して直接コンジュゲートされてもまたは間接的にコンジュゲートされてもよい。例えば、異種部分は、翻訳後方式で、ＡＤＡ２ポリペプチドの組換え生成の後に、直接の化学結合によってまたはリンカーを介して間接的にコンジュゲートされてもよい。他の例では、タンパク質またはポリペプチド部分である異種部分は、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２に対して直接コンジュゲートされてもまたは間接的にコンジュゲートされてもよい。一例では、タンパク質またはポリペプチド部分は、例えば、融合タンパク質として直接連結されてもよい。他の例では、この異種部分は、間接的に、リンカーを介してコンジュゲートされる。他の例では、異種部分は、異種部分中のチオール基と、本明細書に提供されるＡＤＡ２中のシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合によって連結されてもよい。
【０４６４】
リンカー
リンカーまたはスペーサーを用いて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などの、異種部分およびポリペプチドを接続してもよい。リンカーとは、ペプチドまたはポリペプチド配列(例えば、合成のペプチドまたはポリペプチド配列)または非ペプチドリンカー(その主な機能は、本明細書に提供されるＡＤＡ２および異種部分などの２つの部分を接続することである)を指す。リンカーを用いて、個々の残基の構造的可塑性および他の高次構造的特徴をまたはポリペプチドコンジュゲートもしくは融合タンパク質のドメインもしくは部分の二次、三次または四次構造レベルで維持して、その部分の機能的特性を維持してもよい。リンカーはまた、ポリペプチドコンジュゲートまたは融合タンパク質に対して、追加の有益な特性、例えば、哺乳動物発現系におけるタンパク質発現の増大、安定性および溶解度などの生物物理学的特性の改善、タンパク質精製および検出の改善、ならびに／または酵素活性の増大を提供する。いくつかの例では,２つ以上のリンカーが、直列に連結されてもよい。リンカーは、ＡＤＡ２ポリペプチドに対してタンパク質またはポリペプチドを連結するペプチドリンカーであってもよい。他の例示的なリンカーとしては、化学連結剤およびヘテロ二機能性連結剤が挙げられる。
【０４６５】
多数のリンカーが、ＡＤＡ２と異種部分との間に存在する場合、各々のリンカーは同じであっても異なってもよい。一般には、リンカーは、ポリペプチド分子に可塑性を提供する。リンカーは、典型的には切断されない；しかし、特定の例では、このような切断が望ましい場合がある。したがって、ある態様においては、リンカーは、リンカーの配列内またはリンカー配列のいずれかの末端でリンカーに隣接して配置されてもよい１以上のプロテアーゼ切断部位を含んでもよい。
【０４６６】
リンカーは、当該分野で公知の技術(例えば、化学的コンジュゲーション、組換え技術またはペプチド合成)を用いて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などのポリペプチド配列に導入されてもよい。修飾は、ＤＮＡ配列分析によって確認され得る。いくつかの例では、リンカーは、組換え技術を用いて導入され得る。他の例では、リンカーは、固相ペプチド合成を用いて導入され得る。他の例では、ポリペプチド、例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、組換え技術を用いて導入された１以上のリンカーおよび固相ペプチド合成または当該分野で公知の化学的コンジュゲーションの方法を用いて導入された１以上のリンカーを同時に含んでもよい。
【０４６７】
ｉ. ペプチドリンカー
ペプチドリンカーを用いて、本明細書に提供されるＡＤＡ２ポリペプチドに対して異種部分に連結してもよい。一例では、ペプチドリンカーは、第１ポリペプチド(例えば、ＡＤＡ２ポリペプチド)のＣ末端および第２のポリペプチド(例えば、タンパク質またはポリペプチド異種部分)のＮ末端に融合されてもよい。この構造を、少なくとも１つ、好ましくは２、３、４またはそれ以上のポリペプチドが、それらのそれぞれの末端でペプチドリンカーを介してお互いに連結されるように何度も繰り返してもよい。
【０４６８】
例えば、２つの分子(例えば、ＡＤＡ２ポリペプチドおよび異種部分)は、コンストラクト中で隣接されてもよくまたは１、２、３またはそれ以上のアミノ酸を含むリンカーポリペプチドによって隔てられてもよい。いくつかの例では、ペプチドリンカーは、少なくとも２つのアミノ酸、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０または少なくとも１００アミノ酸を含んでもよい。他の例では、このペプチドリンカーは、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００または少なくとも１,０００個のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの例では、このペプチドリンカーは、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００個のアミノ酸を含んでもよい。このペプチドリンカーは、１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸、１００〜２００個のアミノ酸、２００〜３００個のアミノ酸、３００〜４００個のアミノ酸、４００〜５００個のアミノ酸、５００〜６００個のアミノ酸、６００〜７００個のアミノ酸、７００〜８００個のアミノ酸、８００〜９００個のアミノ酸または９００〜１０００個のアミノ酸を含んでもよい。このリンカーは、２つの可変ドメインが、実質的な干渉なしで架橋されるような長さである。例えば、リンカーポリペプチドは、配列Ｚ１−Ｘ−Ｚ２を有し、ここでＺ１およびＺ２は、それぞれ、ＡＤＡ２ポリペプチドおよび異種部分であり、ここでＸは、ペプチドリンカーの配列である。別の例では、このポリペプチドは、Ｚ１−Ｘ−Ｚ２(−Ｘ−Ｚ)ｎの配列を有し、式中、「ｎ」は、任意の整数、すなわち、一般には１または２である。
【０４６９】
通常は、ペプチドリンカーは、ＡＤＡ２ポリペプチドおよび異種部分の両方が、それらの高次構造および機能を保持することを可能にするのに十分な長さのリンカーである。ペプチドリンカーの例としては限定するものではないが：＿＿Ｇｌｙ−Ｇｌｙ＿＿、ＧＧＧＧ(配列番号３６２)、ＧＧＧＧＧ(配列番号３６０)、ＧＧＧＧＳまたは(ＧＧＧＧＳ)ｎ(配列番号３４３)、ＳＳＳＳＧまたは(ＳＳＳＳＧ)ｎ(配列番号３４４)、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ(配列番号３４５)、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ(配列番号３４６)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ(配列番号３４７)、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ(配列番号３４８)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ(配列番号３４９)、ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａまたは(ＡｌａＡｌａＰｒｏＡｌａ)ｎ(配列番号３５０)、ＳＧＧＳＧＧＳ(配列番号３６３)、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧ(配列番号３６４)、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３６５)、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ(配列番号３６６)、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号３６７)、Ｓｅｒ(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)ｎ(配列番号５９５)または(Ｇｌｙ−Ｓｅｒ)ｎ残基が挙げられ、ＧｌｕまたはＬｙｓ残基のいくつかが、全体に分散されており、溶解度が増大され、式中でｎは、１〜２０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であり得る。他の例示的なリンカーとしては、式[(Ｇｌｙ)ｘ−Ｓｅｒｙ]ｚを有するペプチドリンカーが挙げられ、ここでｘは、１〜４であり、ｙは０または１であり、かつｚは、１〜５０である。他の例では、このペプチドリンカーは、配列Ｇｎを含み、ここでｎは、１〜１００の整数であり得る。別の例では、このペプチドリンカーの配列は、(ＧＡ)ｎであってもまたは(ＧＧＳ)ｎであってもよい。他の例示的なリンカーとしては以下が挙げられる：
(１)Ｇｌｙ４ＳｅｒとＮｃｏＩ末端(配列番号３５１)
ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ  ＧＣＣＡＴＧＧ
(２)(Ｇｌｙ４Ｓｅｒ)２とＮｃｏＩ末端(配列番号３５２)
ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＧ  ＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ  ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ  ＧＣＴＣＴＧＣＣＡＴ  ＧＧ
(３)(Ｓｅｒ４Ｇｌｙ)４とＮｃｏＩ末端(配列番号３５３)
ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣ  ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ  ＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴ  ＣＧＴＣＧＧＧＣＴＣ  ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ  ＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴ  ＣＧＴＣＧＧＧＣＧＣ  ＣＡＴＧＧ
(４)(Ｓｅｒ４Ｇｌｙ)２とＮｃｏＩ末端(配列番号３５４)
ＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣ  ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧ  ＧＧＣＴＣＧＴＣＧＴ  ＣＧＴＣＧＧＧＣＧＣ  ＣＡＴＧＧ
【０４７０】
連結部分は、例えば、Huston et al.(1988) PNAS 85:5879-5883、Whitlow et al.(1993) Protein Engineering 6:989-995および Newton et al.,(1996) Biochemistry 35:545-553に記載される。他の適切なペプチドリンカーとしては、参照によって援用される、米国特許第４,７５１,１８０号または４,９３５,２３３号に記載される任意のリンカーが挙げられる。所望のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な従来の技術を用いて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２をコードするポリペプチドと同じリーディングフレーム、とタンパク質またはポリペプチドの異種部分との間におよび中に挿入されてもよい。連結部分はまた、天然に存在するアミノ酸の誘導体およびアナログを含んでもよく、ならびに当該分野で公知の、疎水性または非疎水性の種々の天然には存在しないアミノ酸(Ｄ−またはＬ−)を含んでもよい。
【０４７１】
いくつかの例では、ペプチドリンカーとしては、ペプチド(またはポリペプチド)(例えば、天然のまたは天然には存在しないペプチド)が挙げられ、これは、アミノ酸の第２の直鎖配列(ここにはアミノ酸の第一の直鎖配列は自然には連結されないし、自然には遺伝子的に融合されることもない)に対してアミノ酸の第１の直鎖配列を連結するかまたは遺伝子的に融合するアミノ酸配列を含む。例えば、ペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの修飾型である天然に存在しないポリペプチドを含んでもよい(例えば、これは、付加、置換または欠失などの突然変異を含む)。別の例では、ペプチドリンカーは、自然には存在しないアミノ酸を含んでもよい。別の例では、ペプチドリンカーは、自然には存在しない直鎖配列中に存在する天然に存在するアミノ酸を含んでもよい。さらに別の例では、このペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチド配列を含んでもよい。
【０４７２】
ii. ヘテロ二機能性連結剤
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および異種部分の連結は、直接であってもまたは間接的であってもよい。例えば、連結は、当該分野で公知であるかまたは本明細書に提供される任意のものなど、化学的連結によって達成されてもよくまたは二機能的もしくはヘテロ二機能性リンカーによって容易にされてもよい。
【０４７３】
アミノ酸とチオール基との間の共有結合を形成するためにおよびタンパク質に対してチオール基を導入するために用いられる多数のヘテロ二機能性架橋試薬は、当業者に公知である(例えば、このような試薬の調製および使用を記載しており、かつこのような試薬の市販の供給源を提供する、the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993を参照のこと；また、例えば、Cumber et al.(1992) Bioconjugate Chem. 3:397-401;Thorpe et al.(1987) Cancer Res. 47:5924-5931;Gordon et al.(1987) Proc. Natl. Acad Sci. 84:308-312;Walden et al.(1986) J. Mol. Cell Immunol. 2:191-197;Carlsson et al.(1978) Biochem. J. 173: 723-737;Mahan et al.(1987) Anal. Biochem. 162:163-170;Wawrzynczak et al.(1992)  Br. J. Cancer 66:361-366;Fattom et al.(1992) Infection & Immun. 60:584-589を参照のこと。これらの試薬を用いて、異種部分のＮ末端部分と、本明細書に提供されるＡＤＡ２のＣ末端部分との間にまたはそれらの一部のいずれかとリンカーとの間に共有結合を形成してもよい。これらの試薬としては、限定するものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(ＳＰＤＰ；ジスルフィドリンカー)；スルホスクシンイミジル６−[３−(２−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ)；スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチルベンジルチオスルフェート(ＳＭＢＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー)；スクシンイミジル６−[３−(２−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート(ＬＣ−ＳＰＤＰ)；スルホスクシンイミジル４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)；スクシンイミジル３−(２−ピリジルジチオ)ブチレート(ＳＰＤＢ；ヒンダードジスルフィド結合リンカー)；スルホスクシンイミジル２−(７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセトアミド)エチル−１,３’−ジチオプロピオネート(ＳＡＥＤ)；スルホ−スクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート(ＳＡＭＣＡ)；スルホスクシンイミジル−６−[α−メチル−α−(２−ピリジルジチオ)トルアミド]−ヘキサノエート(スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ)；１,４−ジ−[３’−(２’−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン(ＤＰＤＰＢ)；４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−(２−ピリジルチオ)トルエン(ＳＭＰＴ、ヒンダードジスルフェートリンカー)；スルホスクシンイミジル−６−[α−メチル−α−(２−ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート(スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ)；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル(ＭＢＳ)；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミドエステル(スルホ−ＭＢＳ)；Ｎ−スクシンイミジル(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(ＳＩＡＢ；チオエーテルリンカー)；スルホスクシンイミジル−(４−ヨードアセチル)アミノベンゾエート(スルホ−ＳＩＡＢ)；スクシンイミジル−４−(ｐ−マレイミドフェニル)ブチレート(ＳＭＰＢ)；スルホスクシンイミジル−４−(ｐ−マレイミド−フェニル)ブチレート(スルホ−ＳＭＰＢ)；アジドベンゾイルヒドラジド(ＡＢＨ)；マレイミドカプロイル(ＭＣ)；マレイミドプロパノイル(ＭＰ)；スクシンイミジル４−(Ｋ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシレート(ＳＭＣＣ)；ｍ−マレイ��ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＭＢＳ)；Ｎ−スクシンイミジル(４−ヨードアセチル)アミノベンゾネート(ＳＩＡＢ)；およびスクシンイミジル６−[３−(２−ピリジルジチオ)−プロピオンアミドヘキサノエート(ＬＣ−ＳＰＤＰ)が挙げられる(例えば、米国特許第７,３７５,０７８号を参照のこと)。他の例示的なリンカーとしては、限定するものではないが、以下の式：
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＯＣＨ２Ｃ(Ｏ)−；
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＮＨＣＨ２Ｃ(Ｏ)−；
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＳＣＨ２Ｃ(Ｏ)−；
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(Ｏ)−および
−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＣＨ２Ｃ(Ｏ)−。
を有するリンカーが挙げられる。
【０４７４】
これらのリンカーは、例えば、可塑性または溶解度を増大するかまたは立体障害を提供するかもしくは排除するペプチドリンカーなどのペプチドリンカーと組み合わされてもよい。別の分子に対してポリペプチド分子を連結するための当業者に公知の任意の他のリンカーを使用してもよい。一般的な特性は、得られた分子がアデノシンデアミナーゼ機能およびタンパク質の安定性を保持するような特性である。ＡＤＡ２コンジュゲートまたは融合タンパク質のインビボ使用のために、一般には、リンカーは、ヒトを含む動物への投与に対して生体適合性でなければならない。
【０４７５】
Ｅ. ＡＤＡ２およびそのポリペプチドをコードする核酸を生成する方法
変異型またはその修飾型を含む、本明細書に記載の任意のＡＤＡ２のポリペプチドは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現について当該分野で周知の方法によって得てもよい。ポリペプチドはまた化学合成されてもよい。修飾型または改変型を、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて野性型ポリペプチドから遺伝子操作してもよい。例えば、変異型または修飾型を含む任意のＡＤＡ２を、部位指向性突然変異誘発などによって、野性型ポリペプチドから遺伝子操作してもよい。
【０４７６】
１. ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸の単離または調製
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するために当該分野で公知の任意の利用可能な方法を用いてクローニングしてもまたは単離してもよい。このような方法としては、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニングおよび活性ベースのスクリーニングを含む、核酸のＰＣＲ増幅およびライブラリーのスクリーニングが挙げられる。例えば、ポリペプチドが組換え手段によって生成される場合、所望の遺伝子をコードする核酸の特定について当業者に公知の任意の方法を用いてもよい。当該分野で利用可能な任意の方法を用いて、細胞または組織供給源などから、ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする全長または部分的な(すなわち、全コード領域を包含する)ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡクローンを得てもよい。
【０４７７】
核酸の増幅の方法を用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法を含む、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離してもよい。このような方法の例は、Perkin-Elmer CetusサーマルサイクルおよびＴａｑポリメラーゼ(Gene Amp, Applied Biosystems, Carlsbad, CA)の使用を包含する。核酸含有物質を、所望のポリペプチドコード核酸分子を単離できる出発材料として用いてもよい。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、液体試料(例えば、血液、血清、唾液)、健康なおよび／または疾患の対象由来の試料を増幅法で用いてもよい。この供給源は、限定するものではないが、脊椎動物、哺乳動物、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌおよび他の霊長類の供給源を含む任意の真核生物種由来であってもよい。核酸ライブラリーはまた、出発材料の供給源として用いてもよい。プライマーを設計して、所望のポリペプチドを増幅してもよい。例えば、プライマーは、所望のポリペプチドが生成される発現された配列に基づいて設計してもよい。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳(ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ)に基づいて設計してもよい。所望の場合、縮重プライマーを増幅に用いてもよい。所望の配列の３’および５’末端で配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを、プライマーとして用いて、核酸試料からＰＣＲ配列によって増幅してもよい。プライマーを用いて、全長ＡＤＡ２を増幅してもよい。増幅によって生成された核酸分子を配列決定し、確認して、所望のポリペプチドをコードしてもよい。
【０４７８】
さらに、ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸分子は、化学的に合成してもよくまたは半合成法で生成してもよい。合成的にまたは半合成的に生成した核酸分子は、上記のセクションＣにおいて本明細書のいずれかに記載されるような、任意のＡＤＡ２のアミノ酸配列をコードし得る。例えば、合成または半合成で生成された核酸分子は、本明細書のいずれかに記載のヌクレオチドの配列を有する核酸分子によってコードされ得る。化学合成された核酸分子は、野性型ＡＤＡ２遺伝子の全長またはその切断配列にまたがってもよい。化学的な遺伝子合成は、当該分野で公知の任意の方法、例えば、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって達成され得る。また、半合成の遺伝子アセンブリ、例えば、ギブソンアセンブリ法を用いて、本明細書に記載などの、変異型を含む任意のＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸分子を生成してもよい。
【０４７９】
任意のＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸は、コドン最適化核酸分子(ここでこのコドンは、ポリペプチドを生成するために用いられる発現系に最適化される)であってもよい(すなわち、発現系の生物体中で好ましいコドンを、合成された核酸中でさらに頻繁に用いる)。例えば、大腸菌の発現系におけるポリペプチドの産生について、大腸菌中の最も好ましいコドンを各々のアミノ酸に用いるように、各々のアミノ酸のコドンを最適化してもよい。
【０４８０】
さらなるヌクレオチド配列を、ベクター、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質コードＤＮＡ配列の増幅のために設計したベクター中へ合成遺伝子をクローニングする目的のために制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいるリンカー配列を含む、ポリペプチドをコードする核酸分子に連結してもよい。さらに、機能的なＤＮＡエレメントを特定する追加のヌクレオチド配列を、ポリペプチドコード核酸分子に対して作動可能に連結してもよい。このような配列の例としては、限定するものではないが、細胞内タンパク質発現を容易にするために設計されたプロモーター配列および分泌配列、例えば、タンパク質分泌を容易にするために設計された異種シグナル配列が挙げられる。このような配列は、当業者に公知である。追加のヌクレオチド残基配列、例えば、タンパク質結合領域を特定する塩基の配列もまた、酵素コード核酸分子に連結してもよい。このような領域としては、限定するものではないが、特定の標的細胞への酵素の取り込みを容易にするかまたは容易にするタンパク質をコードするかまたはそうでなければ、合成遺伝子の生成物の薬物動態を変更する残基の配列が挙げられる。
【０４８１】
さらに、タグまたは他の部分を、例えば、ポリペプチドの検出または親和性精製の補助のために追加してもよい。例えば、追加のヌクレオチド残基配列、例えば、エピトープタグまたは他の検出マーカーを特定する塩基の配列も、酵素コード核酸分子に連結してもよい。このような配列の例としては、ＦＬＡＧ(登録商標)タグまたはＳｔｒｅｐタグをコードする核酸配列が挙げられる。
【０４８２】
次いで、特定されかつ単離された核酸を、適切なクローニングベクター中に挿入してもよい。当該分野で公知の多数のベクター−宿主系を用いてもよい。可能なベクターとしては、限定するものではないが、プラスミドまたは修飾されたウイルスが挙げられるが、このベクター系は、用いられる宿主細胞と適合しなければならない。このようなベクターとしては、限定するものではないが、バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体またはプラスミド、例えば、ｐＣＭＶ４、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣプラスミド誘導体またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター(Stratagene, La Jolla, CA)が挙げられる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、ＤＮＡ断片を、相補的な粘着性の末端を有するクローニングベクター中に連結することによって達成され得る。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター(Invtrogen, Carlsbad, CA)を用いて達成されてもよい。
【０４８３】
断片ＤＮＡに対して用いられる相補的な制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を、酵素的に修飾してもよい。あるいは、所望される任意の部位を、ＤＮＡ末端上のヌクレオチド配列(リンカー)を連結することによって生成してもよい；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。別の方法では、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子を、ホモポリマーテーリングによって修飾してもよい。
【０４８４】
組換え分子を、多くの遺伝子配列のコピーが生成されるように、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーション(ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ)を介して宿主細胞に導入してもよい。特定の態様では、単離されたタンパク質遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成されたＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換によって、多数の遺伝子コピーの生成が可能になる。したがって、遺伝子は、形質転換体を増殖すること、組換えＤＮＡ分子をその形質転換体から単離することおよび適宜、その単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することによって大量に得ることができる。
【０４８５】
組換え産生に加えて、任意のＡＤＡ２(本明細書に提供されるその変異型または修飾型を含む)を、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって生成してもよい[例えば、Stewart et al.(1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San Francisco;Merrifield J(1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154を参照のこと]。インビトロタンパク質合成は、手技的技術を用いるかまたは自動によって行ってもよい。自動化合成は、例えば、製造業者によって提供される指示に従って、Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer, Foster City CA)を用いて行ってもよい。種々のポリペプチドの断片を、別々に化学的に合成して、化学的方法を用いて合わせてもよい。
【０４８６】
２. 突然変異体または修飾された核酸およびコードするポリペプチドの生成
本明細書に提供される修飾は、当業者に慣用的であるとおり、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製してもよい。標的タンパク質中の任意の１以上のアミノ酸の突然変異を達成する、当該分野で公知の任意の方法を使用してもよい。方法は、コードする核酸分子の標準の部位指向性の突然変異誘発(例えば、Stratageneから入手可能なQuikChangeなどのキットを用いる)を含むかまたは固相ポリペプチド合成法による。野性型ＡＤＡ２または本明細書に提供される任意のＡＤＡ２変異型に対する部位特異的な改変をまた、このような方法を用いてＡＤＡ２をコードする核酸配列を生成する場合、化学的な遺伝子合成または半合成遺伝子アセンブリの間に導入してもよい。
【０４８７】
３. ベクターおよび細胞
本明細書に記載の任意のＡＤＡ２ポリペプチドなどの、所望のタンパク質の１以上の組換え発現のために、タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む核酸を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳について必須のエレメントを含むベクター中に挿入してもよい。必須の転写および翻訳シグナルはまた、酵素遺伝子の天然のプロモーターおよび／またはそれらの隣接領域によって提供されてもよい。
【０４８８】
また提供されるのは、酵素をコードする核酸を含むベクターである。ベクターを含む細胞もまた提供される。この細胞としては、真核生物細胞および原核生物細胞が挙げられ、このベクターは、その中での使用に適切な任意のベクターである。
【０４８９】
ベクターを含む内皮細胞を含む、原核生物および真核生物の細胞が提供される。このような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。この細胞を用いて、コードされるタンパク質が細胞によって発現されるような条件下で上記の細胞を増殖することおよび発現されたタンパク質を回収することによって、そのタンパク質を生成する。本明細書の目的のために、例えば、酵素を培地中に分泌してもよい。
【０４９０】
提供されるのは、天然または異種のシグナル配列に結合された任意のＡＤＡ２ポリペプチドまたは変異型をコードするヌクレオチドの配列およびその複数のコピーを含むベクターである。このベクターは、細胞中の酵素タンパク質の発現のためにまたは酵素タンパク質が分泌されたタンパク質として発現されるように選択されてもよい。
【０４９１】
当業者に周知の任意の種々の宿主ベクター系を用いて、タンパク質コード配列を発現してもよい。これらとしては、限定するものではないが、ウイルスに感染した哺乳動物細胞系(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス)；ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母などの微生物またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントは、その強度および特異性が変化する。用いられる宿主−ベクター系次第で、多数の適切な転写物および翻訳エレメントのうちのいずれか１つを用いてもよい。
【０４９２】
ベクターへのＤＮＡ断片の挿入について当業者に公知の任意の方法を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列とを含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡおよび合成技術およびインビボの組換え(遺伝子組換え)を包含し得る。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、断片もしくはホモログをコードする核酸配列の発現を、その遺伝子または断片が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、第２の核酸配列によって調節してもよい。例えば、タンパク質の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーによって制御され得る。特定の態様では、プロモーターは、所望のタンパク質の遺伝子に対して天然ではない。用いられ得るプロモーターとしては、限定するものではないが、ＳＶ４０早期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310(1981)]、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復中に含まれるプロモーター[Yamamoto et al., Cell 22:787−797(1980)]、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター[Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441−1445(1981)]、メタロチオネイン遺伝子の調節性配列[Brinster et al., Nature 296:39−42(1982)]；原核生物発現ベクター、例えば、βラクタマーゼプロモーター[Jay et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543(1981)]またはｔａｃプロモーター[DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21−25(1983)]が挙げられ；[また、「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」:Scientific American 242:74−94(1980)]も参照のこと)；ノパリンシンテターゼプロモーター[Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)]またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター[Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)]および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター[Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)]を含む植物発現ベクター；酵母および他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えばＧａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターおよび組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物で使用されてきた、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域[Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)]；膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域[Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)]、リンパ球様細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域[Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)]、精巣、乳房、リンパ球様細胞およびマスト細胞中で活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域[Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)]、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域[Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)]、肝臓中で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域[Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 (1987)]、肝臓中で活性なα−１アンチトリプシン遺伝子制御領域[Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)]、骨髄性細胞中で活性なβグロビン遺伝子制御領域[Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)]、脳の希突起膠細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域[Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)]、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域[Shani, Nature 314:283-286 (1985)]および視床下部の性腺刺激細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域[Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)]が挙げられる。
【０４９３】
特定の例では、所望のタンパク質またはそのドメイン、断片、誘導体もしくはホモログをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター、１以上の複製起点および適宜、１以上の選択マーカー(例えば抗生物質耐性遺伝子)を含有するベクターを用いる。大腸菌細胞を形質転換するための例示的なプラスミドベクターとしては、例えばｐＱＥ発現ベクター(Qiagen, Valencia,CAから入手可能)が挙げられる。ｐＱＥベクターによって、６×Ｈｉｓタグを組換えタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに置くことが可能になる。そのようなプラスミドとしては、３つのリーディングフレーム全てにマルチクローニング部位を与え、かつＮ末端が６×Ｈｉｓでタグ付けされたタンパク質の発現をもたらす、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０およびｐＱＥ３１が挙げられる。(Ｉｗ／ｐＣＭＶスタッフを満たすのに必要)。大腸菌細胞を形質転換するための他の例示的プラスミドベクターとしては、例えば、イソプロピルβ−Ｄ−１チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)誘導性Ｔ５プロモーター、強力なリボソーム結合部位(ＲＢＳ)およびｐＵＣ由来複製起点を含む、ｐＤ４４４−ＳＲ(DNA2.0, Menlo Park, CA)が挙げられる。大腸菌細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターとしては、例えば、ｐＥＴ発現ベクター(米国特許第４,９５２,４９６号；Novagen, Madison,WIから入手可能、を参照のこと；また、このシステムを記述するNovagenが公開した文献も参照のこと)。このようなプラスミドとしては、ｐＥＴ１１ａ(Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌  ｌａｃオペレーターおよびｌａｃリプレッサー遺伝子を含む)；ｐＥＴ１２ａ−ｃ(Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーターおよび大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含む)；ならびにｐＥＴ１５ｂおよびｐＥＴ１９ｂ(NOVAGEN, MADISON, WI)(これらは、Ｈｉｓカラムによる精製に使用するためのＨｉｓ−Ｔａｇ(商標)リーダー配列およびカラムでの精製後に切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域およびＴ７ターミネーターを含む)が挙げられる。
【０４９４】
哺乳動物細胞発現のためのベクターの例は、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ発現ベクター(Agilent Technologies, Santa Clara, CA；カタログ番号２１２２２０)である。ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔベクターは、高コピー数のｐＵＣベースのプラスミド由来であり、かつヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)早初期プロモーターを広範な種々の細胞株中のクローニングされた挿入物の構成的発現のために含む。このベクターは、βラクタマーゼプロモーター、ならびにネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子(ｎｅｏ／ｋａｎ)に連結されたＳＶ４０初期プロモーターをコードするＤＮＡ、ｆ１複製起点、(ＣＭＶ)早初期プロモーター、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル(ＳＶ４０)および単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)−チミジンキナーゼ(ＴＫ)ポリＡシグナルを含む。哺乳動物発現ベクターの別の例は、ｐＣＩベクター骨格(Promega)由来のＨＺ２４発現ベクターである。これは、βラクタマーゼ耐性遺伝子(ＡｍｐＲ)をコードするＤＮＡ,Ｆ１複製起点、サイトメガロウイルス早初期エンハンサー／プロモーター領域(ＣＭＶ)およびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル(ＳＶ４０)を含む。この発現ベクターはまた、ＥＣＭＶウイルス(Clontech)由来の内部リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)遺伝子も有する。
【０４９５】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２変異型はまた、インビボ発現のための発現ベクター、特に腫瘍細胞中の発現のための腫瘍標的化または腫瘍崩壊性ベクター中にコードされてもよい。インビボ発現のためのベクターとしては、腫瘍への送達およびその中での発現のためまたは他の細胞および組織への送達について標的化された腫瘍崩壊性ベクターまたは遺伝子治療ベクターが挙げられる。送達のための腫瘍崩壊性ベクターとしては、ニューカッスル病ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、レオウイルス、はしかウイルス、水疱性口内炎ウイルス(ＶＳＶ)、腫瘍崩壊性アデノウイルスおよびヘルペスウイルスが挙げられる。標的化送達のための腫瘍崩壊性のウイルスベクターは、当業者に周知であり、これには、例えば、水疱性口内炎ウイルス(例えば、米国特許第７,７３１,９７４号、同第７,１５３,５１０号、同第６,６５３,１０３号および米国特許出願公開第２０１０／０１７８６８４号、同第２０１０／０１７２８７７号、同第２０１０／０１１３５６７号、同第２００７／００９８７４３号、同第２００５０２６０６０１号、同第２００５０２２０８１８号および欧州特許第１３８５４６６号、同第１６０６４１１号および同第１５２０１７５号を参照のこと)；単純ヘルペスウイルス(例えば、米国特許第７,８９７,１４６号、同第７７３１,９５２号、同第７,５５０,２９６号、同第７,５３７,９２４号、同第６,７２３,３１６号、同第６,４２８,９６８号および米国特許出願公開第２０１１／０１７７０３２号、同第２０１１／０１５８９４８号、同第２０１０／００９２５１５号、同第２００９／０２７４７２８号、同第２００９／０２８５８６０号、同第２００９／０２１５１４７号、同第２００９／００１０８８９号、同第２００７／０１１０７２０号、同第２００６／００３９８９４号および同第２００４０００９６０４号を参照のこと)；レトロウイルス(例えば、米国特許第６,６８９,８７１号、同第６,６３５,４７２号、同第６,６３９,１３９号、同第５,８５１,５２９号、同第５,７１６,８２６号、同第５,７１６,６１３号および米国特許出願公開第２０１１０２１２５３０号を参照のこと)；ならびにアデノ随伴ウイルス(例えば、米国特許第８,００７,７８０号、同第７,９６８,３４０号、同第７,９４３,３７４号、同第７,９０６,１１１号、同第７,９２７,５８５号、同第７,８１１,８１４号、同第７,６６２,６２７号、同第７,２４１,４４７号、同第７,２３８,５２６号、同第７,１７２,８９３号、同第７,０３３,８２６号、同第７,００１,７６５号、同第６,８９７,０４５号および同第６,６３２,６７０号を参照のこと)が挙げられる。このベクターを、本明細書に記載の免疫療法のための免疫細胞などの、細胞療法のための細胞に導入してもよい。
【０４９６】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２変異型の標的化送達のためのベクターはまた、追加の薬剤、例えば、タンパク質またはポリペプチドである併用療法のための薬剤、例えば、他の免疫療法剤、化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤またはヒアルロン酸分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼまたはポリマーコンジュゲート可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、ＰＥＧＰＨ２０)をコードしてもよい。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２変異型に加えて、ヒアルロン酸分解酵素を、インビボ発現のための発現ベクター、特に、腫瘍細胞中での発現のための腫瘍標的化または腫瘍崩壊性のベクター中にコードしてもよい(例えば、米国特許第８,４５０,４７０号および米国特許出願公開第２０１１／０１５２３５９号を参照のこと；また米国特許仮出願第２０１２／０１４８５３５号も参照のこと)。
【０４９７】
本明細書に提供されるＡＤＡ２変異型をコードおよび発現する免疫細胞
本明細書に提供される任意の修飾されたアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)変異型は、養子免疫治療の方法で使用され得る。治療用タンパク質または他のタンパク質を発現するために修飾された免疫細胞を用いる養子免疫治療のための方法、ならびに、適宜、がんの免疫抑制効果を克服するかおよび／または特定の細胞に対して免疫細胞を標的化するために免疫応答を増大する、他のタンパク質および受容体は、当業者に周知である。したがって、提供されるのは、本明細書に提供されるＡＤＡ２変異型のうちの１つまたは複数をコードする免疫細胞および特に、特定の腫瘍の免疫抑制効果を克服するために、腫瘍標的化および免疫応答を増強する適宜追加される分子である。この免疫細胞としては、限定するものではないが、腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)、細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、リンホカイン活性化キラー(ＬＡＫ)細胞および免疫細胞、例えば、キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)を発現するＴ細胞が挙げられる。
【０４９８】
免疫細胞の投与による免疫治療のための方法は周知である。免疫細胞、これは、自系であってもまたは異種であってもよく、ただし、典型的には、処置されるべき対象から回収され、本明細書に提供されるＡＤＡ２変異型の任意の１つまたは複数をコードする核酸を発現するように修飾され、必要に応じて腫瘍細胞を除去するために処置されて、必要に応じて増殖される自系免疫細胞である。例えば、核酸は、発現ベクター中に導入されてもまたは免疫細胞の染色体中にＡＤＡ２変異型をコードするＤＮＡの組込みを生じるベクターもしくは人工染色体中に導入されてもよい。免疫細胞は、処置のための腫瘍を有する対象中に培養されて、増殖されて、導入される。ある態様においては、免疫細胞は、腫瘍細胞中に標的化される。例えば、ある態様においては、この細胞はＡＤＡ２変異型をコードし、またキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)も発現する。特定の腫瘍抗原に標的化されるＣＡＲを含む細胞およびこのような細胞を調製するための方法は、当業者に公知である(例えば、国際公開番号ＷＯ２０１４／１８６４６９を参照のこと)。
【０４９９】
ＣＡＲは、周知であり、例えば、任意の国際公開番号ＷＯ２０１２／０３１７４４、ＷＯ２０１２／０７９０００、ＷＯ２０１３／０５９５９３、ＷＯ２０１５／１１２６２６、ＷＯ２０１４／０１１９８８および米国特許第８,４６５,７４３(これは、ＣＡＲおよびそれらを発現する細胞およびそれらの使用およびそれらの改善を記載している)を参照のこと；また米国特許仮出願第２０１５００６４１５４号(ここでは、細胞療法における使用のために腫瘍を標的化する免疫細胞を産生するための細胞および発現系を記載する)も参照のこと。細胞は、当業者に公知の標準的な方法を用いてこれらの異種タンパク質を発現するようにトランスフェクトされても、形質導入されても、そうでなければ修飾されてもよい。ＣＡＲは、目的の任意の腫瘍細胞抗原を標的化するために操作してもよく、これには、限定するものではないが、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲおよびＧＤ２、ならびにそれらの組合せが挙げられる。ＣＡＲによって認識される例示的な腫瘍抗原は、当業者に公知である[例えば、Renkvist et al. Cancer Immunol Immunother. 50(1):3-15(2001) and Novelino et al. Cancer Immunol Immunother. 54(3):187-207(2005)を参照のこと]。抗原結合領域は、例えば、腫瘍細胞抗原に特異的な特定のヒトモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片(ｓｃＦｖ)のＶＨおよびＶＬ鎖の断片を含んでもよくまたはヒト抗原特異的抗体の複数の抗原結合ドメインを含んでもよい。ｓｃＦｖは、例えば、可塑性膜貫通ドメイン、続いてチロシンベースの活性化モチーフに連結されてもよい[例えば、Sadelain et al. Curr. Opin. Immunol. 21、215-223(2009)を参照のこと]。ＣＡＲは、Ｔ細胞の生存および増殖を増強するために、ＣＤ２８およびＣＤ１３７などの同時刺激性分子から追加の活性化ドメインを備えてもよい。ＣＡＲおよび／またはそれらを発現する細胞はさらに、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−ｌＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、リンパ球機能関連抗原−１(ＬＦＡ−１)、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３の細胞内ドメイン、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドおよびそれらの任意の組合せなどの同時刺激分子の細胞内ドメインを含む、同時刺激性シグナル伝達領域をコードおよび発現し得る。
【０５００】
種々のＣＡＲコンストラクトおよびそれらの発現ベクターは、当該分野で公知である。その発現ベクターは、エピソームを保持するベクターであってもまたは相同組込みによってもしくはトランスポゾン配列の包含などによって、染色体中にＣＡＲおよび／もしくはＡＤＡ２変異型をコードする核酸の組込みを生じるベクターであってもよく、その結果、トランスポザーゼの存在によって、トランスフェクトされた細胞の染色体へのコード配列の組込みが可能になる。ＡＤＡ２変異型およびＣＡＲをコードする核酸は、同じベクター中に組み込まれてもよくまたは別のベクター中に導入されてもよい。トランスポゾンが用いられる場合、細胞は、トランスポザーゼを発現し得、これがトランスフェクトされた細胞の染色体中への、ＣＡＲおよび／またはＡＤＡ２変異型をコードする核酸の組込みを容易にする。トランスポゾン系は公知である(例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／１８６４６９を参照のこと)。トランスポザーゼは、ＤＮＡ発現ベクター中でまたは一過性発現のための発現性ＲＮＡもしくはタンパク質として提供されてもよい。トランスポゾン系において、トランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞では生じないということは、当業者には公知である。任意のトランスポザーゼ系を、態様に従って用いてもよい。他の面では、細胞をレンチウイルスで感染させて、ＣＡＲコード配列およびＡＤＡ２変異型をコードする核酸配列を細胞のゲノムへ組み込むことを容易にしてもよい。
【０５０１】
４. 発現
変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む任意のアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)ポリペプチドを、インビボおよびインビトロの方法を含む、当業者に公知の任意の方法で生成してもよい。所望のタンパク質を、例えば、投与および処置に必要な量および形態など、タンパク質の必要な量および形態を生じるのに適切な任意の生物体中で発現してもよい。発現宿主としては、原核生物および真核生物、例えば、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む哺乳動物細胞が挙げられる。発現宿主は、それらのタンパク質産生のレベルおよび発現されるタンパク質上に存在する翻訳後修飾の種類が異なる場合がある。発現宿主の選択は、これらおよび他の要因、例えば、調節性および安全性の考慮、生成のコスト、ならびに精製の必要性および方法に基づいて行われ得る。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２はまた、インビボ発現のための発現ベクター、特に、腫瘍細胞中の発現のための腫瘍標的化または腫瘍溶解性のベクターの中にコードされてもよい。
【０５０２】
多くの発現ベクターが、当業者に利用可能であって、かつ公知であり、タンパク質の発現のために用いられ得る。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響される。一般には、発現ベクターは、転写プロモーターおよび適宜、エンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終止シグナルを含んでもよい。適切な形質転換のために用いられる発現ベクターは典型的には、形質転換された細胞の選択および維持を可能にする選択マーカーを有する。いくつかの場合には、複製起点を用いて、ベクターのコピー数を増幅してもよい。
【０５０３】
変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、ＡＤＡ２ポリペプチドはまた、タンパク質融合物として利用されても発現されてもよい。例えば、酵素融合物を生成して、酵素に対して追加の機能を加えてもよい。酵素融合タンパク質の例としては、限定するものではないが、シグナル配列、局在化のためのなどのタグ、例えば、Ｈｉｓ６タグまたはＦＬＡＧ(商標)タグまたは精製のためのタグの融合、例えば、ＧＳＴ融合、ならびに、タンパク質分泌および／または膜会合を指向するための配列が挙げられる。
【０５０４】
ａ. 真核生物細胞
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質を生成するための系を提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡便かつ迅速な技術である。大腸菌用の発現ベクターは、誘導性プロモーターを含んでもよく、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに有用であり、宿主細胞に対してなんらかの毒性を示すタンパク質を発現させるのにも有用である。誘導性プロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター、ならびに温度調節型λＰＬプロモーターなどが挙げられる。
【０５０５】
タンパク質、例えば本明細書に示される任意のタンパク質は、大腸菌の細胞質環境中で発現させてもよい。細胞質は還元的環境であり、一部の分子にとって、これは不溶性封入体の形成をもたらし得る。タンパク質を再可溶化するには、ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどの還元剤、ならびにグアニジン−ＨＣｌおよび尿素などの変性剤を用いてもよい。代替的アプローチは、酸化的環境ならびにシャペロニン様イソメラーゼおよびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生をもたらすことができる、細菌の周辺腔におけるタンパク質の発現である。典型的に、タンパク質をペリプラズムに向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。次いで、リーダーは、ペリプラズムの内側で、シグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズム標的化リーダー配列の例としては、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーが挙げられる。ある場合には、ペリプラズム発現により、発現されたタンパク質の培養培地への漏出が可能になる。タンパク質の分泌は、培養上清からの迅速かつ簡便な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によってペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、時には、タンパク質が不溶性になることもあり、可溶化およびリフォールディングが容易になるように、変性剤および還元剤を用いてもよい。誘導温度および成長温度も、発現レベルおよび溶解性に影響を及ぼすことがあり、典型的には、２５℃〜３７℃の温度を用いる。典型的には、細菌は、非グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能するためにグリコシル化を要求する場合は、宿主細胞から精製した後に、インビトロでグリコシル化を追加してもよい。
【０５０６】
ｂ. 酵母細胞
サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母は、タンパク質(例えば本明細書に記載する任意のタンパク質)の生産に使用することができる周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで形質転換させてもよくまたは相同組換えによる安定染色体組込みで形質転換させてもよい。典型的には、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターを用いる。そのようなプロモーターの例としては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばＣＵＰ１、ＡＯＸ１または他のピキア(Pichia)プロモーターもしくは他の酵母プロモーターが挙げられる。発現ベクターは、形質転換されたＤＮＡを選択し維持するために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡ３などの選択マーカーを含む場合が多い。酵母中で発現されたタンパク質は、溶解性であることが多い。シャペロニン、例えば、Ｂｉｐおよびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの同時発現により、発現レベルおよび溶解性が改善され得る。さらに、酵母中で発現されるタンパク質は、例えばサッカロミセス・セレビシェに由来する酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物およびＡｇａ２ｐ接合付着受容体またはアークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を用いて、分泌について指示され得る。発現されたポリペプチドが分泌経路を出た時に、融合された配列が発現されたポリペプチドから除去されるように、プロテアーゼ切断部位、例えばＫｅｘ−２プロテアーゼの切断部位を遺伝子操作してもよい。酵母はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでグリコシル化が可能である。
【０５０７】
ｃ. 昆虫細胞
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いるものは、任意のＡＤＡ２ポリペプチドまたは変異型などのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、かつ高度の真核生物が使用する翻訳後修飾のほとんどを行うことができる。バキュロウイルスは、宿主範囲が制限されており、それによって安全性が向上し、かつ真核細胞発現に関する規制上の懸念が減少する。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを用いる。通常用いられるバキュロウイルス系は、例えばオートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多核体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)およびカイコ(Bombyx mori)核多核体病ウイルス(ＢｍＮＰＶ)などのバキュロウイルス、ならびに、例えばツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)由来のＳｆ９、シューダレチア・ユニパンクタ(Pseudaletia unipuncta)(Ａ７Ｓ)およびオオカバマダラ(Danaus plexippus)(ＤｐＮ１)などの昆虫細胞株を含む。高レベル発現のためには、発現されるべき分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは、昆虫細胞で正確にプロセシングされ、これらのシグナルを用いて、発現されたタンパク質を培養培地中に分泌させ得る。さらに、細胞株シューダレチア・ユニパンクタ(Ａ７Ｓ)およびオオカバマダラ(ＤｐＮ１)は、哺乳動物細胞系と類似するグリコシル化パターンを持つタンパク質を産生する。
【０５０８】
昆虫細胞におけるもう一つの発現系は、安定形質転換細胞の使用である。発現には、シュナイダー(Schneider)２(Ｓ２)細胞およびＫｃ細胞[キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)]およびＣ７細胞[ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)]などの細胞株を用いてもよい。ショウジョウバエ(Drosophila)メタロチオネインプロモーターを用いて、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベル発現を誘導してもよい。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択マーカーの使用によって維持される。
【０５０９】
ｄ. 哺乳動物細胞
哺乳動物発現系を用いて、変異型ＡＤＡ２ポリペプチドなどの任意のＡＤＡ２ポリペプチドを含むタンパク質を発現してもよい。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのウイルス感染によってまたはリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接的ＤＮＡ導入によって、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳動物細胞に導入してもよい。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的には、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列(コザック(Kozak)コンセンサス配列)およびポリアデニル化エレメントを含む。選択マーカーなどの別の遺伝子との２シストロン性発現が可能になるように、ＩＲＥＳエレメントも追加してもよい。そのようなベクターは、高レベル発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス(ＲＳＶ)の末端反復配列などを含む場合が多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞タイプにおいて活性である。発現には、組織型および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も用いてもよい。例示的なプロモーター／エンハンサー領域としては、限定するものではないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α１アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域などの遺伝子に由来するものが挙げられる。発現コンストラクトを持つ細胞を選択し、かつ維持するために、選択マーカーを用いてもよい。選択マーカー遺伝子の例としては、限定するものではないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(ＤＨＦＲ)およびチミジンキナーゼが挙げられる。例えば、ＤＨＦＲ遺伝子を発現させる細胞だけを選択するために、メトトレキサートの存在下で発現を行ってもよい。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合により、細胞表面上で活性な状態にあるタンパク質の発現を指向してもよい。
【０５１０】
哺乳類発現には、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞など、多くの細胞株を利用することができる。例示的な細胞株としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０(非分泌性)および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８およびＨＫＢ細胞などが挙げられる。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適応した細胞株も利用できる。例としては、ＣＨＯ−Ｓ細胞(Invtrogen, Carlsbad, CA, カタログ番号１１６１９−０１２)および無血清ＥＢＮＡ−１細胞株[Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42]が挙げられる。発現量が最大になるように最適化された特別な培地での成長に適応した細胞株も利用できる。例えばＤＧ４４  ＣＨＯ細胞は、動物性産物を含まない合成培地における懸濁培養で成長するように適合されている。
【０５１１】
ｅ. 植物
トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を用いて、本明細書に記載する任意のタンパク質などのタンパク質を発現してもよい。発現コンストラクトは、典型的には、微粒子銃およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性の移入などといった直接的ＤＮＡ導入を用いておよびアグロバクテリウム媒介性の形質転換を用いて、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結エレメントおよび翻訳制御エレメントを含んでもよい。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常は、アラビドプシス(Arabidopsis)およびタバコなどの双子葉植物宿主用と、トウモロコシおよびイネなどの単子葉植物宿主用との間で分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびＵＢＱ３プロモーターが挙げられる。形質転換細胞の選択と維持が容易になるように、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーを用いる場合が多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養物中で維持してもよくまたは全植物体に再生してもよい。トランスジェニック植物細胞としては、任意のＡＤＡ２ポリペプチドを産生するように遺伝子操作された藻類も挙げられる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主中で生産されたタンパク質の選択に影響を及ぼし得る。
【０５１２】
５. 精製の技術
変異型ＡＤＡ２ポリペプチドなどの任意のＡＤＡ２ポリペプチドを含む、ポリペプチドを宿主細胞から精製するための方法は、選択した宿主細胞および発現系に依存するであろう。分泌される分子について、タンパク質は一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現に関しては、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製してもよい。トランスジェニック植物およびトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に用いる場合は、組織または臓器を、溶解細胞抽出物を作るための出発物質として用いてもよい。さらに、トランスジェニック動物生産には、乳または卵におけるポリペプチドの生産を含んでもよく、それらを収集し、必要であれば、当技術分野における標準的方法を用いて、タンパク質を抽出し、さらに精製してもよい。
【０５１３】
ＡＤＡ２ポリペプチドなどのタンパク質は、当技術分野において公知の標準的なタンパク質精製技術、例えば、限定するものではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて精製してもよい。調製の効率および調製物の純度を改善するために、親和性精製技術を利用してもよい。例えば、親和性精製では、ＡＤＡ２酵素に結合する抗体、受容体および他の分子を用いてもよい。発現コンストラクトを遺伝子操作して、ＦＬＡＧ(商標)エピトープ、ＧＳＴ融合物またはＨｉｓ６などのタンパク質にアフィニティタグを付加し、それぞれ抗ＦＬＡＧ(商標)抗体、グルタチオン樹脂およびＮｉ樹脂を用いて親和性精製してもよい。
【０５１４】
タンパク質が、形質転換された細菌によって大量に発現される場合(通常はプロモーター誘導後)、発現は構成的であり得るが、ポリペプチドは、不溶性の凝集物を形成し得る。当業者に公知のポリペプチド封入体の精製に適切ないくつかのプロトコールがある。多くの変異型は、当業者に明らかである。例えば、一方法では、細胞懸濁物は一般には、遠心分離して、封入体を含むペレットを、封入体を溶解しないが洗浄する緩衝液(例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.２)、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、非イオン性界面活性剤)中に再懸濁した。できるだけ多くの細胞細片を除去するために洗浄工程を繰り返すことが必要である場合もある。封入体の残りのペレットを、適切な緩衝液(例えば、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６.８、１５０ｍＭのＮａＣｌ)中に再懸濁してもよい。他の適切な緩衝液は、当業者に明らかである。
【０５１５】
あるいは、タンパク質は、細菌周辺質から精製してもよい。タンパク質が、細菌の周辺質に輸送される場合、細菌の周辺質の画分を、当業者に公知の他の方法に加えて、冷浸透圧ショックによって単離してもよい。例えば、一方法では、周辺質から組換えポリペプチドを単離するため、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成する。ペレットを、２０％スクロースを含有する適切な緩衝液中に再懸濁してもよい。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離して、ペレットを氷冷５ｍＭ  ＭｇＳＯ４中に再懸濁し、約１０分間氷浴中に保持してもよい。細胞懸濁物を、遠心分離し、上清をデカントして保管する。上清中に存在する組換えタンパク質を、当業者に周知の標準の分離技術、例えば、本明細書に記載の分離技術によって宿主タンパク質から分離してもよい。これらの方法としては、限定するものではないが、以下の工程が挙げられる：溶解度分画、サイズ差濾過およびカラムクロマトグラフィー。
【０５１６】
９５ｋＤａ〜１２０ｋＤａまたはほぼその値および一般には１００ｋＤａ〜１１０ｋＤａまたはほぼその値(包括的)の分子量を有するＡＤＡ２タンパク質分子を収集して、精製してもよい。単量体形態の場合またはＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上の還元条件下で評価した場合、ＡＤＡ２の分子量は一般には、５０ｋＤａ〜６０ｋＤａまたはほぼその値、例えば、一般には、５７ｋＤａ〜５９ｋＤａまたはほぼその値である。変異型または他の修飾型は、より高い分子量または低い分子量を示す場合があることが理解される。例えば、典型的には、過グリコシル化された変異型または本明細書に提供されるコンジュゲートは、より高い分子量を示す場合がある。
【０５１７】
純度は、ゲル電気泳動および染色および分光光度技術を含む当該分野で公知の任意の方法によって評価してもよい。変異型ＡＤＡ２ポリペプチドを含む、任意のＡＤＡ２ポリペプチドは、６０％、７０％、８０％の純度および通常は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度まで精製してもよい。純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマーシー染色などによる標準の方法によって評価してもよい。
【０５１８】
Ｆ. ＡＤＡ２の活性および物理的特性を評価する方法
アッセイを用いて、本明細書に提供される、その野性型および変異型および修飾型を含む任意のＡＤＡ２タンパク質分子の物理的特性、安定性および／または活性を評価してもよい。特性および活性は、生物学的活性および／または腫瘍処置活性に関連し得る。そのアッセイは、インビトロで行われてもまたはインビボで行われてもよい。例えば、そのアッセイを用いて、ＡＤＡ２のアデノシンデアミナーゼ活性、ヘパリン結合、熱安定性、最適ｐＨ、薬物動態、腫瘍増殖阻害活性および他の活性および特性を評価してもよい。別の例では、そのアッセイを用いて、投与の効果および投与経路を含めて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を投与する効果を評価してもよい。そのアッセイはまた、ＡＤＡ２の活性を治療用途に関して保持したままで、本明細書に提供される製剤に対するわずかな調節を行うために用いてもよい。このようなアッセイは、当業者に周知である。非限定的な例示的アッセイは、以下のサブセクションに記載される。
【０５１９】
１. アデノシンデアミナーゼアッセイ
野性型、変異型またはコンジュゲートを含む、本明細書に記載される任意のＡＤＡ２のアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ；ＥＣ３.５.４.４)活性を、当該分野で周知の方法を用いて評価してもよい。ＡＤＡ活性アッセイは通常、酵素反応の生成物の生成の速度を、直接または間接的に測定する。例えば、イノシンまたはアンモニアの生成は、直接測定されてもまたは間接的に測定されてもよい。他の例では、酵素、例えば、アデノシンまたは２−デオキシアデノシンの基質の低下が測定される。基質の低下または生成物の増大は、分光光度法によって直接測定されてもよくまたはその後酵素または酸化−還元反応によって間接的に測定されてもよく、これは発色性基質を用いるかまたは反応の吸収スペクトルを変化させる。
【０５２０】
例えば、いくつかの市販のアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)アッセイ、例えば、BQ Kits(San Diego, CA；カタログ番号ＢＱ０１４ＥＡＬＤ)およびＤiazyme(Poway, CA；カタログ番号ＤＺ１１７Ａ−Ｋ)から入手可能なＡＤＡアッセイキットは、発色性基質および分光光度的な読み取りを利用して、ＡＤＡ酵素によるイノシンへのアデノシンの変換を決定する。これらのアッセイでは、イノシンの生成は、発色色素を生成する多段階酵素反応によって検出される。アデノシンの酵素的脱アミノ反応は、イノシンを生成し、これが、反応中に存在するイノシン特異的なプリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ；ＥＣ２.４.２.１)によってヒポキサンチンに変換される。次いで、ヒポキサンチンは、キサンチンオキシダーゼ(ＸＯＤ；ＥＣ１.１.３.２２)によって尿酸および過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)に変換される。Ｈ２Ｏ２はさらに、ペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)の存在下でＮ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３−メチルアニリン(ＥＨＳＰＴ)および４−アミノアンチピリン(４−ＡＡ)と反応して、キノン色素が生成され、これは、ＵＶ分光計を５５６ｎｍで用いて反応速度論方式で検出可能である。ウシ肝臓アデノシンデアミナーゼは、標準として用いられ得る。３７℃での経時的な５５６ｎｍでの吸光度の変化(ΔＡ５５６)を測定する。１単位のＡＤＡは、３７℃で１分あたりのアデノシンから１μモルのイノシンを生成するＡＤＡの量として定義される。アデノシンデアミナーゼ活性(ｍＵ／ｍＬ)は、以下の式を用いて算出する：
１ｍＵ／ｍＬ＝(ΔＡ５５６／分×Ｔｖ)／(Ｓｖ×ε×ｌ)
式中Ｔｖ＝反応の総容量；Ｓｖ＝試料容量、ε＝３２.２×１０−３μＭ−１ｃｍ−１、ｌ＝０.５ｃｍである。
【０５２１】
ＡＤＡ活性は、他の比色法(例えば、Manchenko, G.P., Handbook of Detection of Enzymes on Electrophoretic Gels、CRC Press, pp. 453-454を参照のこと)を用いて可視化してもよい。例えば、上記のＡＤＡアッセイ法で生成されたＨ２Ｏ２は、フェナジンメタスルフェート(ＰＭＳ)の添加によって可視化され得、これはＨ２Ｏ２によってジヒドロＰＭＳに変換され、次いでジヒドロＰＭＳが、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド(ＮＢＴ)をホルマザンに変換する。ホルマザンの吸光度は、５７０ｎｍで決定され得る。
【０５２２】
ＡＤＡ活性を測定するための別の方法は、脱アミノされてイノシンを形成するとき、アデノシンからのアンモニアの放出を測定することによる。アンモニア放出は、アンモニアアッセイキット(カタログ番号Ａ０８５３, Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)などの市販のキットを用いて測定されてもよい。このキットは、α−ケトグルタル酸およびＮＡＤＰＨを含む乾燥試薬を含む。アンモニアは、α−ケトグルタル酸(ＫＧＡ)および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(ＮＡＤＰＨ)とＬ−グルタメートデヒドロゲナーゼ(ＧＤＨ；カタログ番号Ｇ２２９４, Sigma-Aldrich)の存在下で反応する。ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ＋への酸化に起因する、３４０ｎｍでの吸光度の低下は、アンモニア濃度に、したがってアデノシンデアミナーゼ活性に比例する。吸光度の低下は、分光光度計を用いて測定してもよい。アデノシンデアミナーゼ活性(ｍＵ／ｍＬ)(μＭ／分に等価)は、以下の式を用いて算出する：
１ｍＵ／ｍＬ＝(ΔＡ／分×Ｔｖ)／(Ｓｖ×ε×ｌ)
式中、Ｔｖ＝総容量、Ｓｖ＝試料容量、ε＝６.２２×１０−３μＭ−１ｃｍ−１、１＝１ｃｍである。
【０５２３】
他の分光光度法ベースのアデノシンデアミナーゼアッセイとしては、アデノシンの吸光度の変化を直接測定する連続光学アッセイが挙げられる。アデノシンの吸収は、２６５ｎｍで測定しおよび２６５ｎｍでの吸光度の低下は、アデノシンとしてイノシンに脱アミンされるにつれて、経時的に測定される。試料は、１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７.５、２５℃(０.１％(ｗ／ｖ)のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)含有)中で調製して、１.３５ｍＭのアデノシン溶液(ｐＨ７.０)２５℃とともにインキュベートする。２６５ｎｍでの吸光度の低下(ΔＡ２６５)を、約５分間測定する。このアッセイでは、ＡＤＡ活性(Ｕ／ｍＬ)は、以下の式を用いて算出する：
単位／ｍＬ酵素＝[(ΔＡ２６５／分)(Ｔｖ)(ｄｆ)]／(８.１)(ＶＥ)
式中、Ｔｖ＝アッセイの総容量(ｍＬ)；ｄｆ＝希釈係数；８.１＝２６５ｎｍでのアデノシンのミリモル吸光係数；ＶＥ＝用いられる酵素の容量(ミリリットル)。
【０５２４】
１単位は、２５℃で、ｐＨ７.５で、１分あたりアデノシンの１.０μモルをイノシンに脱アミノする。このような方法は、９６ウェルマイクロタイタープレート形式などの大きいスケールの形式で行ってもよい[例えば、Lu et al.(2012) Clinica Chimica Acta 413:1637-1640を参照のこと]。
【０５２５】
この方法のバリエーションを、吸光度測定に対して必要な補正を行って、用いてもよい。アデノシンおよびイノシンのＵＶ吸収ピークは、それぞれ、２６１ｎｍおよび２４９ｎｍであって、スペクトルは有意に重複する。脱アミノ反応の間、アデノシンの吸光度は低下するが、イノシンの吸光度は時間とともに増大する。相対的なアデノシン(そのスペクトルがイノシンのスペクトルと重複する)を決定するために、２つの分光光度的な測定を行う。アデノシンおよびイノシンが同じ吸光係数を有し、かつ未変化のままである等吸収点は、２５３ｎｍであって、濃度非依存性である。等吸収点をまた、参照点として測定して、容量および強度の相違について補正する。２６１ｎｍの吸収／２５３ｎｍの吸収の比(Ａ２６１／Ａ２５３)を用いて、標準曲線に基づいて、アデノシン濃度の変化を測定する。
【０５２６】
２. ヘパリン結合を評価する方法
ヘパリン結合または別のＧＡＧに対する結合(野性型、変異型またはコンジュゲートを含む、本明細書に記載される任意のＡＤＡ２による)を、当該分野で周知の方法を用いて評価してもよい。ＧＡＧに対する結合を評価するための、これらの方法および当該分野で公知の他の方法を用いて、ヘパリン結合が変化した(例えば、ヘパリン結合の減弱またはヘパリン結合の増大)ＡＤＡ２変異型に対する結合を評価するかおよび／またはＡＤＡ２変異型を選択してもよい。一般には、ヘパリン結合は、金属イオン、尿素および界面活性剤(陰イオン性、非イオン性および両性イオン性)の存在に対して鋭敏である。Ｃａ２＋およびＭｇ２＋ならびに両性イオン性界面活性剤３−[(３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネートは、ヘパリン結合を増大する。ＮａＣｌ、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムおよびＬａ３＋の存在は、ヘパリン結合を低下する。
【０５２７】
ａ. アフィニティアッセイ
ＡＤＡ２がヘパリンに結合する能力は、固定されたヘパリンによってアフィニティ結合アッセイを用いて評価してもよい。ヘパリンは、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであり、かつ一般的なアフィニティリガンドとして広範に用いられる。その硫酸化の程度が高いことによって、分子の強力な酸性の性質が付与され、したがって、これは、ＡＤＡ２を含む多くの物質に、イオン相互作用によって結合する。さらに、ヘパリンは、固有の炭水化物配列を含み、これがいくつかのタンパク質の特定の結合部位として作用する。固定されたヘパリンを含むカラムを用いて、ヘパリンと高い親和性を有するタンパク質、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、凝固因子、リポタンパク質およびタンパク質合成因子との結合を評価してタンパク質を精製する。例えば、市販のヘパリン樹脂カラム、例えば、ヘパリン−Sepharose(商標)樹脂(GE Healthcare, Pittsburgh, PA；カタログ番号１７−０９９８−０１)をロードされたHiTrap Heparin HPを用いて、ＡＤＡ２などの特定のタンパク質の結合を評価してもよい。ヘパリン−Sepharose(商標)樹脂では、ヘパリンを、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドカップリング方法を介してSeparose High Performanceベースマトリックスにカップリングして、高い能力、パフォーマンスおよび低い漏出レベルを得る。
【０５２８】
ヘパリン結合を、ヘパリン−Sepharose(商標)樹脂を用いて、アフィニティアッセイによって評価してもよい。このような例示的なアッセイでは、３５μＬのＡＤＡ２、野性型または変異型を、２０μＬのヘパリン−Sepharose(商標)樹脂(GE Healthcare, Pittsburgh,PA；カタログ番号１７−０９９８−０１)と混合し、続いて３０分間室温でインキュベートする。次いで、混合物を、０.２２μｍの遠心分離フィルターを通じて遠心分離し、未結合のタンパク質を含む流出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの分析のために収集する。３５μＬの１.５ＭのＮａＣｌをヘパリン−Sepharose樹脂に添加し、室温(ＲＴ)で１０分間インキュベートして、残りのヘパリン結合したタンパク質を、ヘパリン−Sepharoseから溶出する。ヘパリン結合の程度は、入力中の量に対して、樹脂および流出物に結合したＡＤＡ２、野性型および変異型の量を比較することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価する。
【０５２９】
ｂ. ＥＬＩＳＡアッセイ
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などのタンパク質のヘパリン結合はまた、酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ＥＬＩＳＡ)ベースの方法を用いて評価してもよい。ＥＬＩＳＡベースの方法は、マイクロタイタープレートなどの表面に固定されたヘパリンを用いる。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などの、ヘパリンに結合する目的のタンパク質を、ヘパリンコーティングプレート中でインキュベートして、結合を本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などの、目的のタンパク質を検出する抗体を用いて検出する。
【０５３０】
例えば、Ｎａ２ＣＯ３緩衝液(ｐＨ９.６)中の１００μＬの２００μｇ／ｍＬヘパリンナトリウム塩(Calibochem, EMD Milipore, Billerica,MA；カタログ番号３７５０９５)でコーティングされた９６ウェルプレートを用いて、ヘパリンに対するＡＤＡ２結合を試験してもよい。ＡＤＡ２、例えば、その野性型または変異型または修飾型の結合後、ウェルを洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合体化検出抗体、例えば、ＨＲＰ抗ＦＬＡＧ抗体(Abcam, Cambridge, UK；カタログ番号Ａｂ１２３８)とともにインキュベートして、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などの、目的のタンパク質上のＦＬＡＧタグを検出する。インキュベーションおよび洗浄の後、プレート上の固定されたヘパリンに対する目的のタンパク質の結合の程度は、発色性基質、例えば、ＨＲＰ用の３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質溶液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)によって可視化して、発色のために追加する。各々の反応の光学密度(ＯＤ)を、プレートリーダーで測定する。
【０５３１】
別の例では、ヘパリンを、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL；カタログ番号１５５２０)などのストレプトアビジンでコーティングされたマイクロタイタープレートを、ビオチン化ヘパリン、例えば、ビオチン−ヘパリン(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO；カタログ番号Ｂ９８０６−１０ＭＧ)とともにインキュベートすることによって固定する。ＡＤＡ２、その野性型または変異型または修飾型の結合後、ウェルを洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合体化検出抗体、例えば、ＨＲＰ抗ＦＬＡＧ抗体(Abcam, Cambridge, UK；カタログ番号Ａｂ１２３８)とともにインキュベートして、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などの目的のタンパク質上のＦＬＡＧタグを検出する。インキュベーションおよび洗浄の後、プレート上に固定されたヘパリンに対する目的のタンパク質の結合の程度は、ＨＲＰ用の発色性基質、例えば、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質溶液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)によって可視化して、色の発色のために追加する。各々の反応の光学密度(ＯＤ)をプレートリーダー上で測定する。
【０５３２】
当該分野で公知のこれらの方法の任意のバリエーションも用いてもよい。例えば、特定のｐＨ条件などの特定のアッセイ条件次第で、適切な固体支持体を選択することは当業者の水準の範囲内である。ニッケルコーティングマイクロプレートは、Ｈｉｓタグ化タンパク質の結合に適切でない場合がある。なぜなら、緩衝液ｐＨは、Ｎｉコーティングされたプレートに対する抗原コーティングには影響し得るが、高結合プレートには影響し得ない。さらに、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)とのコンジュゲーションまたは過剰のヘパリンと硫酸プロタミンを用いる他の担体コーティングなど、種々の方法を用いて、プレートに対してヘパリンを固定してもよい。
【０５３３】
緩衝液、ブロッキング溶液および反応条件はまた、所望の結合アッセイに基づいて選択してもよい。例えば、ブロッキング溶液としては、ヒト、ウシ、ウマまたは他の血清アルブミンまたはゼラチンを含む溶液が挙げられる。プレートなどの固体支持体のブロッキングは、１以上のブロッキング剤が添加される結合アッセイ緩衝液を用いて行ってもよい。例示的なブロッキング剤としては、１〜５％のウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、１〜５％の脱脂粉乳、０.１〜１％のゼラチンおよび２５％のヒト血清が挙げられる。界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０および防腐剤、例えば、チメロサールをブロッキング溶液に添加してもよい。結合アッセイ緩衝液としては、すなわち、腫瘍微小環境緩衝液または正常な生理学的緩衝液が挙げられる。水性のタンパク質溶液−固体支持体混合物が通常は、３０分間、１時間またはそれ以上の時間期間にわたって維持されて、温度の関数として変化し得る。ブロッキング反応は、任意の温度で行ってもよく、一般には、４℃〜３７℃、例えば、４℃、室温(すなわち、２２℃)または３７℃で行ってもよい。いくつかの例では、その反応は、約４℃〜３７℃の温度で少なくとも１時間進行させる。例えば、ブロッキングは、室温で１時間達成され得る。インキュベーションおよびブロッキングの後、得られた固相において、その後に未結合のタンパク質を洗い流し、その後に、試験分子(例えば、本明細書に提供される、ＡＤＡ２野性型、変異型および修飾型)と接触させてもよい。
【０５３４】
酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが挙げられる。シグナルを発色するために添加され得る酵素基質の例としては、ＰＮＰＰ(ｐ−ニトロフェニルリン酸、二ナトリウム塩)、ＡＢＴＳ(２,２’−アジノビス[３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸]−ジアンモニウム塩)、ＯＰＤ(ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド)およびSureblue TMB Microwell Peroxidase Substrate 1-component(KPL, #52-00-03)を含む、ＴＭＢ(３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン)(SOMA Labs, Romeo,Mich.)が挙げられる。この反応は、停止試薬を添加することによって、停止され得る(例えば、ＴＭＢ停止溶液)。適切な波長の吸光度(すなわち、４５０ｎｍ)が決定され得る。
【０５３５】
蛍光に関して、多数の蛍光光度計が利用可能である。化学発光検出、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)基質の検出、照度計またはフィルムが利用可能である。酵素を使用して、蛍光、化学発光または着色生成物は、蛍光定量的に、発光定量的に、分光光度的にまたは視覚的に決定してもまたは測定してもよい。例えば、抗タグ試薬は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)または他の検出可能因子に対してコンジュゲートしてもよい。
【０５３６】
検出は、蛍光部分、放射性部分または他の検出可能部分の存在によって容易にできる。例えば、野性型およびその改変型ポリペプチドおよび修飾型を含む、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２ポリペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端タグ、例えば、ＦＬＡＧタグを保有し得、かつ抗ＦＬＡＧ抗体などの抗タグ試薬を用いて検出してもよい。抗タグ試薬の選択は、結合分子またはタンパク質とともに使用されるタグの機能である。さらに、そのアッセイで用いられる環境条件(例えば、ｐＨ)と適合する抗タグ試薬を選択する。このような試薬を特定または選択して、アッセイ条件とのそれらの適合性を試験することは当業者の水準の範囲内である。抗タグ試薬は、市販の供給源または他の供給源などから容易に入手可能である。本明細書の方法での検出に用いられ得る例示的な抗タグ試薬としては、限定するものではないが、抗ＦＬＡＧ抗体または抗Ｍｙｃ抗体(Abcam, Cambridge, MA; GeneTex, Irvine, CAなどの供給業者から入手可能である)が挙げられる。さらに、目的のタンパク質およびシグナルの強度次第で、他の抗体および／または発色性基質を、ＥＬＩＳＡの改変型バージョンで用いてもよい。例えば、タグを保有しない天然のタンパク質については、検出は、２つの抗体、例えば、天然の標的を認識する一次抗体と、検出に用いられる酵素とコンジュゲートされた二次抗体とを用いて達成してもよい。
【０５３７】
通常は、本明細書の方法では、結合された複合体の検出の方法は、定量可能である方法である。例えば、標識は、シグナル、例えば、比色定量シグナル、化学発光シグナル、化学蛍光シグナルまたは放射性シグナルを生じ得る。標識の性質次第で、標識を検出または検出および定量するために、種々の技術を使用してもよい。例えば、定量の方法としては、限定するものではないが、分光光度的方法、蛍光方法および放射性の方法が挙げられる。
【０５３８】
ｃ. ドットブロットおよび他の放射性標識ヘパリン結合アッセイ
ヘパリン結合の程度はまた、放射性標識したヘパリンによるブロットベースの方法を用いて検出してもよい。例えば、ドットブロットの方法を用いて、目的のヘパリン結合タンパク質のピコモル量を検出して定量してもよい。タンパク質をニトロセルロース上にスポットし、次いで１２５Ｉ−ヘパリンとともにインキュベートする。タンパク質に対するヘパリンの結合は、オートラジオグラフィーによって検出して、スキャンニングデンシトメトリーによって定量する；タンパク質はアミドブラック染色のニトロセルロースのデンシトメトリー分析によって定量する[Hirose et al.(1986) Analytical Biochemistry 156(2):320-325]。別の例では、放射性標識したヘパリン、例えば、３Ｈ−ヘパリンを、９６ウェルマイクロタイター形式中で、その野性型、変異型または修飾型を含む、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２などの、目的のヘパリン結合タンパク質とともにインキュベートする。次いで、この混合物を、９６ウェルマイクロタイターフィルタープレートに移して、未結合のヘパリンおよび目的のタンパク質を濾過する。結合は、シンチレーションカウントによって検出する[Proudfoot et al.(2003). PNAS 100(4):1885-1890を参照のこと]。
【０５３９】
３. 安定性を評価するための方法
特定の条件で本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の安定性は、タンパク質安定性を評価するために用いられる当業者に公知の任意の方法によって決定され得る。特定の条件での安定性(例えば、熱安定性に関する高温条件、ｐＨ耐容性に関する高いまたは低いｐＨ条件、血漿安定性のための血漿条件および長期安定性に関する長期間保管)を、限定するものではないが、構造的な構成または高次構造、酵素活性、タンパク質アンフォールディング、凝集および溶解度を含むポリペプチドの物理的特性における変化を、特定の条件に対して暴露することなく前後で、決定することによって評価してもよい。安定性はまた、天然、野性型または参照のＡＤＡ２ポリペプチドと比較して、１以上の変性条件の存在下で任意の１以上の活性、凝集または他の物理的特性を比較することによって評価されてもよい。
【０５４０】
タンパク質安定性は、環境条件(例えば、上昇した温度)に応答して、タンパク質の１以上の物理的特性の維持の測定を包含する。一例では、物理的特性とは、タンパク質の共有結合構造の維持である(例えば、タンパク質分解性切断、望ましくない酸化または脱アミド化がない)。別の例では、物理的特性は、適切にフォールディングされた状態(例えば、溶解性または不溶性の凝集または沈殿がない)でのタンパク質の存在である。一例では、タンパク質の安定性は、タンパク質の生物物理学的特性、例えば熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、グリコシル化の安定な除去、溶解度、生化学的機能(例えば、酵素活性、タンパク質に結合する能力(例えば、リガンド、受容体、抗原など)または化学部分、など)および／またはそれらの組合せをアッセイすることによって測定する。別の例では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって実証される。さらに、安定性は、視覚検査、回収パーセント、タンパク質純度および見かけの融点によって評価してもよい。安定性の測定はまた、重要な生物学的情報を提供し；安定性の低下は、処置に無効なポリペプチドをもたらし得る、タンパク質アンフォールディング、ミスフォールディングおよび凝集の徴候であり得る。このようなアッセイは、タンパク質不安定性を生じ得る任意の条件下で行われてもよく、ＡＤＡ２タンパク質に関連する任意の物理的または機能的な特性が評価されてもよい。安定性は、当該分野で公知であるかおよび／または本明細書で記載される任意の方法を用いて測定され得る。
【０５４１】
ａ. 条件
ｉ. 血漿中の安定性
治療用途のために、例えば、腫瘍またはがんの処置のために、治療効果に十分な時間、血漿のアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)活性を維持する投与量のＡＤＡ２を対象に投与することが望ましい。したがって、処置の有効性には、血漿および腫瘍微小環境(ＴＭＥ)中の安定性の十分な保持が必要である。野性型、変異型またはコンジュゲートなどの本明細書に記載される任意のＡＤＡ２の血漿安定性は、酵素活性および／または他の物理的特性の変化を、血漿、例えば、エキソビボの哺乳動物血漿中でのインキュベーションの前後に、測定することによって決定してもよい。
【０５４２】
安定性は、インビトロで評価してもまたはインビボで評価してもよい。例えば、安定性は、所望の時間の長さに応じて、当業者によって経験的に決定または選択され得る、所望の時間の長さにわたって血漿に暴露した後に試験してもよい。例えば、インキュベーション時間は、少なくとも１時間、例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２４、３０、３６、４８、６０、７２時間またはそれ以上であってもよい。タンパク質は、直接、全身に、例えば、静脈内に投与されてもよく、活性が評価されてもよい。他の例では、タンパク質は、インビトロで適切なインキュベーション条件に供してもよい。一例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２のＡＤＡ活性の安定性は、ヒトまたは非ヒトの血漿または血清、例えば、マウス血清などの２５％のエキソビボの血漿または血清中で、３７℃でのインキュベーション後に測定され得る。例えば、本明細書に示されるとおり、ＡＤＡ２は、血漿中の長いインキュベーション(例えば、２４時間)後、ＡＤＡ１よりも安定になる。他の条件、例えば、温度、血漿の種類および緩衝液の条件はまた、試験すべき所望の条件に基づいて選択してもよい。
【０５４３】
ii. 熱安定性
タンパク質は、熱安定性[または熱的安定性]の程度が異なる。具体的には、生物学的活性を有するタンパク質、例えば、酵素は、種々の最適温度を有し得る。比較的高温でその化学的または物理的構造における可逆性の変化に耐えるタンパク質の質である、熱安定性は、タンパク質の全体的な安定性の指標である。温度の上昇は通常は、タンパク質アンフォールディングおよびタンパク質の二次的、三次的および四次的な構造の破壊を誘導し、タンパク質の不安定化につながる。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２ポリペプチドなどのタンパク質の熱安定性は、比較的高温または低温でのインキュベーションの前後に、酵素活性および／または他の物理的特性の変化を測定することによって決定され得る。
【０５４４】
タンパク質の安定性は、タンパク質の活性を時間の関数として測定することによって決定され得る。そのタンパク質の融点(Ｔｍ)は、タンパク質について溶液安定性およびインビボ安定性のマーカーとして用いられ得る。特定のタンパク質のアンフォールディング温度は、タンパク質がその二次構造をおよび通常はその活性を失う温度を指し、示差走査熱量測定法(ＤＳＭ)など、当業者に公知であって、かつ本明細書に記載される方法を用いて決定され得る。別の例では、動的光散乱(ＤＬＳ)などのタンパク質の物理的特性を決定するための他の方法を用いて、タンパク質の安定性を温度の関数として特徴付けてもよい。他の例では、熱安定性は、生化学的に測定され得る。熱安定性を評価するための例示的な生化学的方法は、熱的課題アッセイである。「熱的課題アッセイ」では、ポリペプチドを、ある範囲の上昇した温度に、一定時間期間供する。例えば、一態様では、試験ポリペプチドを、ある範囲の漸増温度に対して、例えば、１０分間供する。次いで、タンパク質の活性は、関連の生化学的アッセイ(例えば、アデノシンデアミナーゼアッセイ)によってアッセイする。熱的課題アッセイを用いて、５０％のアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)活性が保持される温度(すなわち、ＴＣ値またはＴ５０)を決定してもよい。ＴＣまたはＴ５０値は、生物物理学的に誘導されたＴｍ値に等価である必要はない。このようなアッセイを行って、その野性型、変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む、本明細書で提供される任意のＡＤＡ２の熱安定性を評価してもよい。
【０５４５】
iii. ｐＨでの安定性または最適ｐＨ
タンパク質はまた、ｐＨの変化に抵抗する能力も異なりまたは生物学的活性について異なる最適ｐＨを有する場合もある。環境におけるｐＨの変動は、天然の構造を不安定化し得る静電気的相互作用の変化を生じるタンパク質中のアミノ酸側鎖の塩基性基および酸性基に対する荷電の変化を生じ得る。ｐＨの比較的小さい変化は、タンパク質の高次構造安定性においてかなり劇的な低下を生じ得、かつ高次構造安定性の変化はまた、タンパク質の凝集も生じ得る。溶液中のイオン性強度および溶液の等電点(ｐＩ)はまた、異なるｐＨ条件での溶液中のタンパク質の安定性に寄与する。
【０５４６】
例えば、腫瘍のｐＨ環境および特定のタンパク質の最適ｐＨは、ＡＤＡ２タンパク質の治療有効性に影響し得る。例えば、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)は、一般には、比較的酸性のｐＨ、例えば、ｐＨ６.５〜６.９以下である、低酸素エリアにある領域を有する。他方では、血管付近などの増殖性の組織のある領域では、ＴＭＥのｐＨはさらに中性である。したがって、ＡＤＡ２タンパク質の最適ｐＨは、本明細書に記載されるような腫瘍を処置する方法で用いられるタンパク質の投薬量および製剤の決定における重要な因子であり得る。
【０５４７】
特定のｐＨ環境における、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２ポリペプチドなどのタンパク質の安定性は、比較的高いまたは低いｐＨでのインキュベーションの前後に、酵素活性および／または他の物理的特性における変化を測定することによって決定してもよい。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の酵素的活性を、種々のｐＨ条件で(例えば、６.０〜８.０またはほぼその値、例えば、６.５〜７.５またはほぼその値(包括的)、例えば６.５±０.２または７.４±０.２に及ぶｐＨで)、本明細書に記載のＡＤＡ活性アッセイを用いて測定してもよい。別の例では,タンパク質の物理的特性を決定する他の方法、例えば、動的光散乱(ＤＬＳ)を用いて、溶液ｐＨの関数として、タンパク質の安定性を特徴付けしてもよい。
【０５４８】
iv. 他の条件
環境または製剤の他の条件、例えば、イオン強度、緩衝液組成物、腫瘍微小環境中の他のタンパク質などの他の物質の存在、薬学的賦形剤の存在または併用療法に用いられる他の剤の存在は、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２ポリペプチドなどの処置の方法で用いられるポリペプチドの安定性に寄与し得る。タンパク質の安定性および機能に影響し得る条件でのポリペプチドの安定性は、下に記載の方法を用いて試験してもよいが、特定の条件でのインキュベーション後に試験してもよい。用いられ得るアッセイは、本明細書に提供される製剤に対してわずかに調節されるが、併用療法で用いられるＡＤＡ２および／または他の剤の安定性は保持されている。
【０５４９】
ｂ. 物理的特性の決定
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２ポリペプチドなどのポリペプチドの安定性は、当該分野で公知の任意の方法を用いて、酵素的活性、構造的な構成または高次構造、酵素的活性、タンパク質アンフォールディング、凝集および溶解度など、ポリペプチドの物理的または機能的な特性または活性の変化を測定することによって決定してもよい。評価される機能的または物理的な特性は、条件(例えば、血漿、温度、ｐＨまたは他の条件)の有無で比較してもよい。ある条件の存在下で、その条件がない場合と比較して、タンパク質の安定性を比較または評価するためのアッセイは、存在する条件の存在または程度を除いて、実質的に同じであることが理解される。
【０５５０】
タンパク質は、水素結合、疎水性相互作用、静電相互作用、ジスルフィド結合およびファンデルワールス力などの物理的力によって安定化される。任意のこれらの力の破壊によって、タンパク質は不安定化され得、これらの力の破壊は、当該分野で公知の種々の方法を用いて測定され得る。また、特定の条件、例えば、特定のｐＨもしくは温度または過剰発現の間の高いタンパク質濃度では、ポリペプチドは、タンパク質凝集体を形成し得る。タンパク質凝集体は、自然には可溶性であっても不溶性であってもよい、天然または非天然のタンパク質構造を有する高次オリゴマーを形成する不可逆的にアセンブルされたタンパク質分子である。凝集は、タンパク質の高次構造の不安定化を生じる場合が多い。
【０５５１】
物理的特性の変化を決定する方法としては、分光法、熱力学的方法、水力学的方法、クロマトグラフィー、電気泳動、生物学的活性の分析およびタンパク質間の相互作用の分析が挙げられる[例えば、Uversky, V. and E. Permiakov, eds., Methods in Protein Structure and Stability Analysis, Nova Science Publishers, New York(2007);Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64を参照のこと]。粒径の増大および／または融点の低下はまた、ＡＤＡ２ポリペプチドの変性およびその後の凝集を示し得る。さらに、タンパク質安定性は、電気泳動法によるタンパク質完全性の視覚検査、回収パーセントを算出すること、タンパク質純度および見かけの融点によって評価してもよい。タンパク質安定性を評価する例示的なアッセイを下に記載する。
【０５５２】
ｉ. 酵素活性
安定性の破壊は、酵素活性の破壊につながる酵素の活性部位の三次構造で変化を生じ得る。生物学的活性は、円偏光二色性スペクトルなどの、タンパク質の他の物理的特性の変化と密接に相関する場合が多い。機能分析、例えば、酵素的活性のアッセイ(上記の任意のアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)活性アッセイを含む)を、評価された条件の有無で、タンパク質安定性の指標として用いてもよい。例えば、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)の安定性は、特定の条件、例えば、セクションＦ.２.ａで上記で記載された条件に対する暴露の前後で測定して、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の安定性を評価してもよい。血漿中でのインキュベーションなどの特定の条件に対する暴露は、固定した時点で行ってもよくまたはいくつかの時点にまたがって評価してもよい。
【０５５３】
ii. タンパク質純度のクロマトグラフィー分析
天然のタンパク質の純度を評価する方法を指標として用いて、タンパク質の分解の状態または他の脱安定化事象を決定してもよい。タンパク質純度は、クロマトグラフィーの方法、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)を用いて測定してもよい。タンパク質純度とは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した場合、存在するタンパク質種の全てと比較した、存在する主なＡＤＡ２タンパク質ピークのパーセントである。したがって、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび当業者に公知の同様の方法は、酵素の分解を評価し得る。タンパク質純度は、経時的に評価してもよい。タンパク質純度は、１以上の条件、例えば、セクションＦ.２.ａにおいて上記する条件の存在下で、かつその種々の量で評価してもよい。回収パーセントはまた、参照試料と比較して異なる長さの時間について種々の条件の存在下でポリペプチドの相対パーセンテージとして決定してもよい。本明細書に提供される、その野性型、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型を含む任意のＡＤＡ２ポリペプチドの安定性はまた、ＲＰ−ＨＰＬＣによるポリペプチドの酸化を測定することによって決定してもよい。酸化パーセントは、主要ピーク(ｏｘ−１)およびマイナーピーク(ｏｘ−２)のピーク面積の合計の測定である。
【０５５４】
別の例では、他のクロマトグラフィー法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を用いて、タンパク質のフォールディングまたは多量体化の状態を決定してもよい。ＳＥＣは、高分子相互作用を保存する、天然の溶液の条件下で行ってもよい。サイズ排除クロマトグラフィーによって、水力学的容量(分子量ではない)を測定し、同じタンパク質のフォールディングバージョンおよびアンフォールディングバージョンを識別することが可能になる。ＳＥＣによるタンパク質製剤中の凝集体レベルの定量的評価は、通常は、ＵＶ検出によって、時には、多数の波長でおよび多くの場合は、多角光散乱検出による分子量特徴付けと組み合わせて、達成される。ＳＥＣはまた、可逆性のタンパク質自己会合を研究するために使用してもよい[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５５５】
iii. 示差走査熱量測定
本明細書に提供される、その野性型、変異型および修飾型を含む任意のＡＤＡ２などの、溶液中でのポリペプチドの熱安定性を、示差走査熱量測定法(ＤＳＣ)を用いて決定してもよい。ＤＳＣでは、試料細胞(タンパク質および緩衝液を含む)および参照の細胞(緩衝液のみ)を、一緒に加熱して、温度を定常状態に上げ、両方の細胞で等しい温度を維持するために試料細胞中で必要な過剰な熱(温度の増大につれて、フォールディングされた天然状態のタンパク質からアンフォールディング型への移行に起因する)を記録する。熱移行の中間点温度(または熱融解温度、Ｔｍ)を、共通して、熱安定性の指標として用いる。ＤＳＣによってまた、実験条件が、可逆的な熱移行を可能にする場合、エンタルピーの変化(ΔＨ)、エントロピーの変化(ΔＳ)、ギブスの自由エネルギーの変化(ΔＧ)および熱容量の変化(ΔＣｐ)を含む、タンパク質アンフォールディングの熱力学的なパラメーターに対する詳細情報も得られる。ＤＳＣを用いて、溶液条件(ｐＨ、イオン強度)の効果およびタンパク質製剤化の間のタンパク質安定性に対する賦形剤を決定してもよい[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５５６】
iv. 示差走査蛍光定量法
示差走査蛍光定量法(ＤＳＦ)はまた、蛍光熱シフトアッセイとも呼ばれ、蛍光色素の存在下でアンフォールディングなどのタンパク質の温度遷移をモニターするために用いられる方法である。ＤＳＦに用いられる極性に敏感な蛍光色素は、非極性の環境では(例えば、(部分的に)アンフォールディングのタンパク質の疎水性ポケットでは)高度に蛍光性であるが、蛍光は、水溶液中でおよび／または天然のタンパク質の存在下でクエンチされる。ＤＳＦを用いて、タンパク質の高次構造の安定性を決定してもよい。タンパク質の存在下での色素の蛍光強度を温度の関数としてプロットした時、そのタンパク質の遷移温度(Ｔｈ)の中間点は、得られたＳ字形グラフの変曲点に由来し得る。ＤＳＦ実験から得られるとおり、種々の溶液中の種々のタンパク質のＴｈ値は、示差走査熱量測定法によって決定される熱融解温度(Ｔｍ)とよく相関する。さらに、マルチドメインタンパク質中の協力的な(２状態)または複合のアンフォールディング遷移についての情報は、ＤＳＦによって得ることができる[Chaudhury et al.(2014)The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５５７】
色素は、低分子、ペプチドまたは核酸であってもよく、従来のリアルタイムＰＣＲ機器を用いて行ってもよい。通常用いられる蛍光色素としては、ＳＹＲＰＯ  Ｏｒａｎｇｅ、ＡＮＳ、ＲＯＸ(商標)およびＮｉｌｅレッドが挙げられる。例えば、野性型、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型を含む、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の融点を、ＲＯＸ(商標)タンパク質熱シフト色素(Applied Biosystems, Carlsbad, CA；カタログ番号４４６１１４６)を蛍光色素として用いおよびＶiiＡ７  ＲＴ−ＰＣＲシステム(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)を用いて評価し、試料の温度が増大するにつれて、蛍光のシフトを測定してもよい。
【０５５８】
ｖ. 内部蛍光分光法
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む)などのポリペプチドの安定性は、その内部蛍光の変化を測定することによって決定してもよい。内部蛍光分光法は、芳香族アミノ酸残基トリプトファンおよびチロシンなどのタンパク質の内部フルオロフォアからの蛍光を検出する。トリプトファンの蛍光の特性(その強度および最大発光の波長を含む)は特に、それらの局所環境に鋭敏である。結果として、その発光は、タンパク質の高次構造における変化を研究するためのプローブとして用いられる場合が多い。タンパク質アンフォールディングは、蛍光強度の低下およびＴｒｐ残基の最大発光のより長い波長へのシフト(赤方偏移)を伴う場合が多い。プレートリーダーおよび温度管理能力を装備した蛍光光度計を使用して、タンパク質治療剤の高次構造の安定性を評価してもよい[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５５９】
vi. 円偏光二色性
円偏光二色性(ＣＤ)分光法は、左右の円偏光の示差的吸収を測定し、温度および溶液の条件の関数として、タンパク質の二次的な構造の内容(すなわち、αらせんおよびβシート)を特徴付けるための一般向けのツールである。遠ＵＶのＣＤスペクトル(１６０〜２５０ｎｍ)をこの目的に用いるが、近ＵＶのＣＤスペクトル(２３０〜３２０ｎｍ)は、芳香族アミノ酸側鎖およびジスルフィドの局所環境についての情報を提供し得、次にこれを用いて、三次構造の変化をモニターしてもよい。ＣＤは、特定の緩衝液および添加物(高いＵＶ吸収を有する)とは不適合である[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５６０】
vii. 動的光散乱
動的光散乱(ＤＬＳ)はまた、光子相関分光法または準弾性光散乱としても公知であり、溶液中のタンパク質の水力学的特性(例えば、凝集)の変化をモニターし、また絶対サイズ測定を行うために用いられる。ＤＬＳは、溶液からの散乱した光の強度の時間依存性の変動を測定し、自己相関分析を通じて、拡散係数、流体力学半径および数ナノメートルから最大で約１μｍまでのサイズを有する粒子のサイズ分布を含む情報を提供し得る。ＤＬＳシグナルは、溶液中の最大サイズの粒子の存在に極めて鋭敏である。ＤＬＳは、高次のタンパク質オリゴマーおよび凝集物の検出に有用である。ＤＬＳは、溶液のｐＨおよび温度の関数としてモノクローナル抗体など、タンパク質治療剤のコロイド安定性を特徴付けるために使用される。ＤＬＳはまた、多くのタンパク質の生成、送達および投与の間に存在する物理的なストレスに応答したタンパク質の凝集特性を評価するためにも適用される[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。特定の条件に曝した後のＡＤＡ２凝集物の形成は、種々の条件(例えば、変性条件または他の貯蔵条件)下で動的光散乱によって粒子の流体力学半径を測定することによって決定され得る。
【０５６１】
viii. 静的光散乱
静的光散乱(ＳＬＳ)は、散乱光の時間平均強度を測定する技術であり、溶液中に懸濁された粒子のサイズについての情報を提供する。多角度光散乱(ＭＡＬＳ)は、多角度からの静的光散乱強度を収集して分析する技術であって、タンパク質およびより大きい分子量のオリゴマーの絶対的分子量および回転運動の半径を決定するために用いられ得る。ＭＡＬＳ検出は、タンパク質凝集物を分離し、次いで特徴付けるために、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)または流動場分別(ｆｌｏｗ  ｆｉｅｌｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ：ＦＦＦ)と組み合わされてもよい。光散乱はまた、蛍光および光散乱の両方を含むスペクトル領域全体を通じた単純な走査によって蛍光検出を用いて測定されてもよい。これによって、高次構造安定性および凝集の両方のデータを得ることが可能になる[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５６２】
ix. 濁度測定
溶液の濁度(または光学密度)の大きさは、溶液中のタンパク質凝集体のサイズおよび量の両方と比例する(光学密度＝吸光度＋光散乱)。濁度は通常は、３２０〜４００ｎｍの波長で測定する。なぜならタンパク質は通常は、この波長範囲では有意な吸光度を有さず、光散乱シグナルの大きさは、波長が低くなるにつれて大きくなるからである。安定性試験の間、種々の製剤中のタンパク質の凝集体の特性は、温度傾斜法(濁度変化を、漸増する温度の関数として測定する)または速度論的方法(濁度変化を一定温度での時間の関数として測定する)のいずれかによって評価され得る[Chaudhury et al.(2014) The AAPS Journal 16(1):48-64]。
【０５６３】
ｘ. 安定性を決定する他の方法
本明細書に提供される処置の方法において、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)の安定性を決定するために用いられ得る当業者に公知の他の方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ)およびタンパク質強度の視覚的分析、イムノブロッティング、核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光法、等温滴定熱量計、トランスバース尿素勾配電気泳動(transverse urea gradient electrophoresis：ＴＵＧ−ＰＡＧＥ)、中性子散乱、分析用超遠心、トリチウムＸ線断層撮影および粘度測定分析が挙げられる。タンパク質の完全性の視覚的分析としては、例えば、ＰＡＧＥゲルでの低分子量分解生成物または高分子量凝集生成物の観察が挙げられる。
【０５６４】
４. 治療活性のアッセイ
本明細書に提供される処置の方法で用いる任意のＡＤＡ２の治療活性、例えば、抗がん活性は、インビトロおよびインビボの機能的アッセイを用いて測定してもよい。本明細書に提供されるのは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２での処置の治療効果をモニターするために用いられる例示的なアッセイおよびシステムである。
【０５６５】
ａ. インビトロ試験
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型ならびに変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む)の抗がん活性、ならびに本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および他の剤を用いる併用療法を、インビトロで、例えば、がん細胞培養物を、誘導体とともにインキュベートすることによって、次いで、培養物中での細胞増殖阻害を評価することによって試験してもよい。このような試験のための適切な細胞としては、限定するものではないが、マウスＰ３８８白血病、Ｂ１６黒色腫およびＬｅｗｉｓ肺がん細胞、同様に、ＭＣＦ７ヒト乳がん細胞、ＯＶＣＡＲ−３がん細胞、Ａ５４９肺がん細胞、ＭＸ−１ヒト乳房腫瘍細胞、ＨＴ２９結腸がん細胞株、ＨｅｐＧ２肝臓がん細胞、ＨＣＴ１１６結腸がん細胞、Ｃａｃｏ−２ヒト大腸がん細胞、Ｕ１３８ＭＧヒトグリオーマ細胞株、ＤＵ１４５ヒト前立腺がん細胞、Ｌ１２１０リンパ管白血病細胞、Ｌ４９４６リンパ管白血病細胞、６Ｃ３ＨＥＤリンパ肉腫細胞、ＴＡ３乳腺腺癌細胞、Ｅ２エーリッヒ癌腫細胞、７５５腺癌細胞、１８０肉腫細胞およびＢ１６黒色腫細胞が挙げられる。
【０５６６】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型ならびに変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む)、ならびに本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および他の剤を用いる併用療法によるアデノシン媒介性の免疫抑制の逆転は、インビトロで、例えば、増殖アッセイを行うことによって、試験してもよい。このようなアッセイとしては、限定するものではないが、Ｔ細胞増殖アッセイまたはＮＫおよびＴ(ＮＫ／Ｔ)細胞増殖アッセイの混合(アデノシンおよび／または本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および／または任意の他の併用治療剤の存在下)が挙げられる。例えば、リンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、多形核顆粒球および食細胞(組織マクロファージなど)などの種々の免疫細胞に対するアデノシンの免疫抑制効果を、末梢血単核球(ＰＢＭＣ)から調製したＮＫ細胞およびＴ(ＮＫ／Ｔ)細胞の混合物などの、免疫細胞またはその混合物を用いて増殖アッセイによって評価してもよい。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および本明細書に提供される任意の他の併用療法剤の効果は、本明細書に提供される、免疫チェックポイント阻害剤を含む任意のＡＤＡ２および／または本明細書に提供される任意の他の併用療法剤の添加の有無において、アデノシンの存在下でこのような増殖アッセイの結果を比較することによって評価してもよい。併用療法剤は、下のセクションＨ.４に記載する。
【０５６７】
増殖アッセイを用いて、アデノシンの存在下で、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および他の剤を用いて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型ならびに変異型、コンジュゲートおよび他の修飾型を含む)および併用療法の活性を測定してもよい。このアッセイは、免疫細胞(その活性がアデノシンの添加によって抑制される)の増殖を測定し得る。細胞は、細胞にとって増殖を示すのに十分な時間インキュベートされ得る(例えば、１２時間または１、２、３、４、５、６、７日、２、３、４、５週またはそれ以上)。細胞増殖は、当該分野で公知の任意の方法によって測定されてもよく、この方法としては、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ、５−ブロモ−２−デオキシウリジン(ＢｒｄＵ)、ＥＬＩＳＡ、テトラゾリウムマイクロプレートアッセイおよび酸性ホスファターゼアッセイが挙げられる[例えば、Maghni et al.(1999) J. Immunol. Method. 223(2):185-194]。細胞増殖はまた、以下の入手可能なキットを用いて測定してもよい：Invtrogen(Cyquant NF細胞増殖アッセイキット)、Cambrex(ViaLight HS(高感度)BioAssay)、Ｐromega(CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay)、Guava Technologies(CellGrowthアッセイ)、Stratagene(Quantos細胞増殖アッセイ)(例えば、細胞増殖研究用アッセイ[Assays for Cell Proliferation Studies), Genetic Eng. Biotechnol. News. 26(6)]。いくつかの例では、細胞増殖は、アデノシンの存在下で細胞の増殖を正規化され得る。いくつかの例では、細胞増殖は、アデノシンの非存在下で細胞の増殖に正規化してもよい。例示的な増殖アッセイでは、細胞を、アデノシンおよび本明細書に提供される任意のＡＤＡ２またはアッセイすべき任意の他の併用療法剤を含む正常な増殖培地中で、９６ウェルプレートのウェルに添加してもよい。
【０５６８】
ｂ. インビボ動物モデル
動物モデルを用いて、本明細書に提供される腫瘍増殖阻害活性などの治療活性の効果を、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いて評価してもよい。例えば、動物モデルを用いて、腫瘍のサイズ、容量または増殖を評価してもよい。さらに、動物モデルを用いて、組成物または組合せの薬物動態または耐性を評価してもよい。
【０５６９】
動物モデルとしては、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類モデルが挙げられる。動物モデルは、遺伝モデルならびに異種移植モデルを含む。例えば、異種移植モデルとしては、薬剤試験前に、腫瘍を適切な試験動物、例えば、免疫欠損または免疫適格性の動物で確立できるモデルが挙げられる。いくつかの例では、ヌードマウスまたはＳＣＩＤマウスなどの免疫欠損マウスに、アデノシン関連がん由来などの腫瘍細胞株を移植し、そのがんの動物モデルを確立する。他の場合には、免疫適格性の動物を使用する同系のモデルを用いる。
【０５７０】
アデノシンシグナル伝達に関連するがんを含む例示的な細胞株としては、限定するものではないが、ＣＴ２６マウス結腸がん細胞、ＭＣＦ７ヒト乳がん細胞、ＨｅｐＧ２肝臓がん細胞、Ｃａｃｏ−２ヒト結腸がん細胞、Ｕ１３８ＭＧヒトグリオーマ細胞株、ＤＵ１４５ヒト前立腺がん細胞、Ｌ１２１０リンパ管白血病細胞、Ｌ４９４６リンパ管白血病細胞、６Ｃ３ＨＥＤリンパ肉腫細胞、ＴＡ３乳腺腺癌細胞、Ｅ２エーリッヒ癌腫細胞、７５５腺癌細胞、１８０肉腫細胞およびＢ１６黒色腫細胞が挙げられる。動物の異種移植片モデルで用いられ得る他のがん細胞としては、ＰＣ３前立腺癌腫細胞、ＢｘＰＣ−３膵臓腺癌細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌細胞、ＢＴ４７４乳房腫瘍細胞、Ｔｒａｍｐ  Ｃ２前立腺腫瘍細胞、Ｍａｔ−ＬｙＬｕ前立腺がん細胞、ＭＨ１９４マウス膵臓癌腫細胞およびＫＬＮ２０５マウス肺がん細胞が挙げられる。
【０５７１】
本明細書に提供されるＡＤＡ２を用いるがんの処置の効果を評価するために用いられ得る動物腫瘍モデルの例は、ＣＴ２６同系腫瘍モデルである。このモデルは、ＣＴ２６マウス原発性結腸がん腫(ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６３８)細胞の同系ＢＡＬＢ／ｃマウスへの皮下注射によって作製する。このマウスを腫瘍が確立されるまで管理し、次いで、処置に用いる剤、例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２またはＡＤＡ２処置を含む併用療法を投与する。膵臓がんの動物腫瘍モデルの別の例は、ＢｘＰＣ−３膵臓腺癌細胞を用いる動物での腫瘍の生成を含む[例えば、Von Hoff et al.(2011) J. Clin. Oncol., 29:4548-54を参照のこと]。動物腫瘍モデルの他の例としては、マウスＭＨ１９４＋ＰＳＣ４同系腫瘍モデルおよびマウス肺がんＫＬＮ２０５同系腫瘍モデルが挙げられる。
【０５７２】
他の動物モデル、例えば、がん免疫療法または併用療法を研究するために開発されたマウスモデルを用いて、ＡＤＡ２を用いる処置の治療効果を評価してもよい。例えば、がん免疫療法の有効性および免疫関連有害事象(ｉｒＡＥ)の両方を研究するために開発されたマウスモデルを用いてもよい。抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−１併用療法などの免疫調節受容体を標的化するいくつかのがん免疫療法はまた、ｉｒＡＥ、例えば、発疹、下痢、大腸炎および肝障害を誘発し得る。したがって、臨床で観察される応答の動態を模倣し得るマウスモデルおよび可能性のあるｉｒＡＥを反映し得るモデルを用いて、処置に関連する有効性および可能性のある有害事象の両方を評価してもよい。このようなモデルとしては、発癌物質誘発性であるモデル、例えば、メチルコラントレン(ＭＣＡ)誘発線維肉腫および７,１２−ジメチルベンズ[α]アントラセン(ＤＭＢＡ)／１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート(ＴＰＡ)誘発性皮膚乳頭腫または遺伝子操作されたマウス腫瘍モデル(発癌遺伝子の強制的な発現および／または腫瘍抑制機能の喪失を、多くの場合腫瘍特異的および／または時間制御方式で有する)が挙げられる。例としては、乳がんを模倣するＨｅｒ２／ｎｅｕまたはＰｙＭＴトランスジェニックマウス、自然転移黒色腫およびＢｒａｆＣＡＴｙｒ−ｃｒｅＥＲＴ２Ｐｔｅｎｆｌ／ｆｌマウスのＭＴ／ｒｅｔモデル(ここで４−ヒドロキシタモキシフェン(４−ＨＴ)が新規な黒色腫を誘発する)、ならびに自然発症肺腫瘍を誘発する肺上皮において発癌遺伝子Ｋｒａｓおよび腫瘍抑制遺伝子Ｔｐ５３中に突然変異を選択的に誘発するＣｒｅリコンビナーゼをコードするアデノウイルスベクターの使用が挙げられる。がんの発癌物質誘発性マウスモデルは、免疫原性のがんをより良好に模倣する。あるいは、腫瘍移植片モデルでは、腫瘍は、腫瘍の微小環境をさらに正確に反映するために、皮下にではなく、同所性に、すなわち、出現の正常な位置に移植されてもよい。併用のがん免疫療法の有効性およびｉｒＡＥを評価するための別の例示的なマウスモデルは、Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲマウスであって、これは、全ての免疫細胞での最大抑制を模倣するようにそれらのＴｒｅｇｓを条件的に欠いている場合がある。このモデルによって、同時阻害／同時刺激の受容体の調節または他の治療を用いた有効性を評価して抗腫瘍免疫／ｉｒＡＥを軽減することが可能になる[Liu et al.(2014) Clinical & Translational Immunology 3:e22]。
【０５７３】
動物が腫瘍の生成または形成を生じる１以上の遺伝子を欠くようにされている遺伝子モデルもまた用いてもよい。このような遺伝子操作されたマウスモデル(ＧＥＭＭ)は、疾患の分子特徴および臨床特徴を繰り返してもよい。例えば、例示的な膵臓がん遺伝子モデルは、欠損表現型を示す突然変異マウス(ＫＰＣマウスと命名される；ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ、ＬＳＬ−Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ、Ｐｄｘ−１−Ｃｒｅ)を生じる内因性の突然変異体ＫｒａｓおよびＴｒｐ５３対立遺伝子の膵臓特異的な発現に関与する。ＫＰＣマウスは、ヌクレオシドアナログゲムシタビンに対する耐性を含めて、ヒト疾患に同様の特徴を示す原発性の膵臓腫瘍を発症する[例えば、Frese et al.(2012) Cancer Discovery, 2:260−269を参照のこと]。
【０５７４】
ｉ. 腫瘍代謝活性
腫瘍代謝活性の低下は、本明細書に提供されるＡＤＡ２処置について試験され得る。腫瘍代謝活性は、当該分野で公知の標準的な手順を用いて評価してもよい。例えば、[１８Ｆ]−フルオロデオキシグルコースポジトロン放出断層撮影(ＦＤＧ−ＰＥＴ)を用いてもよい。ＰＥＴは、非侵襲性の診断であって、灌流、細胞生存、組織の増殖および／または代謝活性の画像および定量的パラメーターを提供する。この画像は、ポジトロン放出放射性同位体で標識した種々の生物学的物質(例えば、糖、アミノ酸、代謝前駆体、ホルモン)の使用から生じる。例えば、ＦＤＧは、グルコースのアナログであって、正常なグルコース経路の第１段階を介して生きている細胞によって取り込まれる。がんでは、解糖系活性の増大の存在によって、がん細胞でのＦＤＧの捕捉が生じる。ＦＤＧ捕捉の低下は、腫瘍代謝活性および抗がん活性の低下と相関する。ＰＥＴ画像化のガイドラインは、当業者に公知であって、いずれかの処置医師または技師に従うべきである。
【０５７５】
ii. 腫瘍のサイズおよび容量
例えば、腫瘍および／または転移のサイズおよび位置をモニターしてもよい。腫瘍および転移のサイズは、外部評価法または断層撮影または磁気画像化法、例えば、本明細書に記載の検出法を含む、当該分野で公知の任意の種々の方法によってモニターしてもよい。いくつかの時点にまたがるモニタリングのサイズは、本明細書に記載の治療方法の有効性に関する情報を提供し得る。さらに、腫瘍または転移のサイズの増減をモニタリングして、対象に追加の腫瘍および／または転移が存在することに関する情報(すなわち、検出および／または診断)を得てもよい。いくつかの時点にまたがる腫瘍のサイズのモニタリングでは、対象における新生物疾患の発症に関する情報、例としては、本明細書に提供される処置などの、対象における新生物疾患の処置の有効性が提供され得る。
【０５７６】
特定の例では、腫瘍のサイズおよび／または容量の低下は、治療が機能していることを示す。腫瘍のサイズおよび容量は、当業者に公知の技術に基づいてモニターされ得る。例えば、腫瘍のサイズおよび容量は、Ｘ線撮影、超音波画像化、剖検によって、キャリパーの使用によって、ｍｉｃｒｏＣＴによってまたは１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴによってモニターしてもよい。腫瘍のサイズはまた、視覚的に評価してもよい。特定の例では、腫瘍のサイズ(直径)を、キャリパーを用いて直接測定する。
【０５７７】
他の例では、腫瘍容量は、キャリパーまたは超音波評価によって得た腫瘍直径(Ｄ)の測定の平均を用いて測定してもよい。例えば、腫瘍容量は、VisualSonics Vevo 770高解像度超音波)または他の同様の超音波を用いて決定してもよい。容量は、式Ｖ＝Ｄ３×π／６(キャリパーを用いて測定した直径に関して)またはＶ＝Ｄ２×ｄ×π／６(超音波を用いて測定した直径に関して、ここでｄは深さまたは厚み)から決定し得る。例えば、キャリパーの測定で、腫瘍の長さ(ｌ)および幅(ｗ)をとり、腫瘍容量を長さ×幅２×０.５２として算出してもよい。別の例では、ｍｉｃｒｏＣＴスキャンを用いて、腫瘍容量を測定してもよい[例えば、Huang et al.(2009) PNAS, 106:3426-3430を参照のこと]。例として、マウスに、Optiray Pharmacyイオベルソール注射液７４％造影剤(例えば、１ｍＬあたり７４１ｍｇのイオベルソール)を注射し、マウスを麻酔して、ＭｉｃｒｏＣａｔ  １Ａスキャナーまたは他の同様のスキャナー(例えば、ＩＭＴｅｋ)を用いてＣＴスキャンを行ってもよい(４０ｋＶ, ６００μＡ, １９６回転工程、全回転角度＝１９６)。画像はソフトウェア(例えば、ＲＶＡ３ソフトウェアプログラム；ＩｍＴｅｋ)を用いて再構築してもよい。腫瘍容量は、利用可能なソフトウェア(例えば、Ａｍｉｒａ  ３.１ソフトウェア；Mercury Computer Systems)を用いることによって決定してもよい。腫瘍の容量またはサイズはまた、腫瘍のサイズまたは重量に基づいて決定してもよい。
【０５７８】
腫瘍増殖阻害のパーセントは、以下の式を用いて容量に基づいて算出され得る：％ＴＧＩ＝[１−(Ｔｎ−Ｔ０)÷(Ｃｎ−Ｃ０)]×１００％(式中、「Ｔｎ」は、ＡＤＡ２の最終投与後「ｎ」日目での処置群についての平均腫瘍容量；「Ｔ０」は、その処置群の０日目(処置前)の平均腫瘍容量であり；「Ｃｎ」は、「ｎ」日目での対応する対照群の平均腫瘍容量であり；かつ「Ｃ０」は、０日目(処置前)の対照群における平均腫瘍容量である)。腫瘍容量の統計学的分析が決定され得る。
【０５７９】
ｃ. 臨床モニタリング
本明細書に提供される方法は、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる腫瘍処置などの処置効果をモニタリングする１以上の工程をさらに包含し得る。対象は、腫瘍、対象の一般的健康度および／または対象の疾患の経過をモニタリングすることによってモニターしてもよい。任意の種々のモニタリング工程が、本明細書に提供される方法に含まれてもよく、これには限定するものではないが、腫瘍のサイズのモニタリング、抗−(腫瘍抗原)抗体力価のモニタリング、転移の存在および／またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリングおよび血液または尿のマーカーを含む対象の体重または他の健康の指標のモニタリングが挙げられる。モニタリングの目的は、対象の健康状態、もしくは対象の治療処置の進行を評価するためであってもよくまたはＡＤＡ２のさらなる投与が正当化されるか否かを決定するためであってもよくまたはさらなる剤または処置を施す時点もしくは施すか否かを決定するためであってもよくまたは併用療法を施すかもしくは継続するか否かを決定するためであってもよい。
【０５８０】
対象の健康の指標であるパラメーターもまたモニターしてもよい。対象の健康をモニタリングすることを用いて、当該分野で公知のとおり、治療方法の有効性を決定してもよい。新生物疾患または他の疾患などの疾患をモニタリングするための任意の種々の健康診断方法を、当該分野で公知のとおり、モニタリングしてもよい。例えば、対象の体重、血圧、脈拍、呼吸、顔色、体温または他の観察可能な状態は、対象の健康を示し得る。さらに、対象由来の試料中の１以上の成分の有無またはレベルは、対象の健康を示し得る。典型的な試料としては、血液および尿の試料が挙げられ得、ここで１以上の成分の有無またはレベルは、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断試験を行うことによって決定され得る。対象の健康の指標である例示的な成分としては、限定するものではないが、白血球カウント、ヘマトクリットまたは反応性タンパク質濃度が挙げられる。
【０５８１】
５. 薬力学／薬物動態学および耐容性
任意の投与された剤の薬物動態および薬力学的特性に対する、単独でまたは別の治療剤と組み合わせた、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)の投与の効果はまた、臨床試験の条件などで、動物モデルおよび／またはヒト対象を用いて、インビボで評価されてもよい。薬物動態または薬力学的な研究は、動物モデルを用いて行ってもよくまたは本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)を投与された患者での研究の間に行ってもよい。
【０５８２】
動物モデルとしては、限定するものではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモットおよびカニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類モデルが挙げられる。いくつかの場合には、薬力学または薬物動態学的研究は、健康な動物を用いて行われる。他の例では、この研究は、任意のアデノシン関連の疾患または障害の動物モデル、例えば、腫瘍モデルなど、ＡＤＡ２を用いる治療が考慮される疾患の動物モデルを用いて行われる。
【０５８３】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)の薬物動態学的特性は、最大(ピーク)濃度(Ｃｍａｘ)、ピーク時間(すなわち、最大濃度が生じる時間；Ｔｍａｘ)、最小濃度(すなわち、投与の間の最小濃度；Ｃｍｉｎ)、排出半減期(Ｔ１／２)および曲線下面積(すなわち、時間対濃度をプロットして作成される曲線下面積；ＡＵＣ)などのパラメーターを、投与後測定することによって評価され得る。ＡＤＡ２の絶対値のバイオアベイラビリティは、静脈内送達後のＡＤＡ２のＡＵＣ(ＡＵＣiv)と、皮下送達後のＡＤＡ２の曲線下面積(ＡＵＣｓｃ)とを比較することによって決定され得る。絶対値のバイオアベイラビリティ(Ｆ)は、以下の式を用いて算出され得る：Ｆ＝([ＡＵＣ]ｓｃ×用量ｓｃ)／([ＡＵＣ]iv×用量iv)。ある範囲の用量および投与の種々の投与頻度を、薬物動態学的研究で施して、その用量で、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)などの酵素の濃度を増減することの効果を評価してもよい。
【０５８４】
処置の安全性および耐容性を評価する研究はまた、当該分野で公知であり、かつ本明細書で用いられ得る。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２または本明細書に提供される任意の併用療法を施した後、なんらかの有害反応の発症をモニターしてもよい。有害反応としては、限定するものではないが、浮腫または腫脹などの注射部位反応、頭痛、発熱、疲労、悪寒、顔面紅潮、目まい、蕁麻疹、喘鳴または胸部緊張、悪心、嘔吐、硬直、背痛、胸痛、筋けいれん、てんかんまたはけいれん、血圧の変化およびアナフィラキシー反応または重度過敏症反応が挙げられる。通常は、ある範囲の投与量および種々の投与頻度を、安全性および耐容性の研究で施して、その用量の併用療法で用いられる任意のＡＤＡ２または剤の濃度を増減することの効果を評価する。
【０５８５】
Ｇ. 医薬組成物および製剤
本明細書に提供されるのは、アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)、例えば、その野性型ＡＤＡ２、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型および薬学的に許容される賦形剤または添加物を含む医薬組成物である。この医薬組成物は、アデノシンレベルの上昇に関連する疾患または状態(例えば、過剰増殖性疾患または状態、例えば、腫瘍またはがん)の処置に用いられ得る。任意のＡＤＡ２を、単剤の治療に投与してもよくまたは本明細書に記載されるようなさらなる剤または処置との併用療法で投与してもよい。この組成物は、単一剤投与のために製剤化してもまたは複数回の投与のために製剤化してもよい。この剤は、直接投与のために製剤化してもよい。この組成物は、液体として提供されてもまたは凍結乾燥製剤として提供されてもよい。
【０５８６】
薬学的に許容される組成物は、規制機関または他の機関の承認を考慮して調製され、動物およびヒトでの使用について一般に認識される薬局方に従って調製される。この組成物は、溶液、懸濁液、粉末として調製されてもよくまたは徐放性製剤として調製されてもよい。通常は、この化合物は、当該分野で周知の技術および手順を用いて医薬組成物中に製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと)。この製剤は、投与の方式に適合しなければならない。
【０５８７】
組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内の注射、皮下、腫瘍内、硬膜外、経鼻、口腔、膣、直腸、局部、局所、耳、吸入、口腔内(例えば、舌下)および経皮投与または任意の経路などの当業者に公知の任意の経路での投与のために製剤化されてもよい。他の投与方式もまた考慮される。投与は、処置の場所次第で、局所投与、局部投与または全身投与であってもよい。処置の必要な領域に対する局所投与は、例えば、限定するものではないが、術中の局所注入、局所適用、例えば、術後の創傷被覆と組み合わせて、注射によって、カテーテルによって、坐剤によってまたはインプラントによって、達成されてもよい。組成物はまた、連続的に、間欠的にまたは同じ組成物中で、他の生物学的に活性な剤とともに投与されてもよい。投与はまた、徐放性の製剤を含む徐放性のシステムおよびポンプなどによるデバイス管理放出を包含し得る。
【０５８８】
任意の所定の場合に最も適切な経路は、種々の要因、例えば、疾患の性質、疾患の進行、疾患の重篤度および用いられる特定の組成物に依存する。医薬組成物は、各々の投与経路に適切な剤形に製剤化されてもよい。具体的には、この組成物は、全身、腹腔内、口腔または直接の投与のための任意の適切な医薬調製物中に製剤化されてもよい。例えば、組成物は、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内への投与のために製剤化されてもよい。ある態様においては、この組成物は、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸、例えば、腫瘍崩壊性ウイルスベクターまたは遺伝子治療ベクターまたは細胞、例えば、養子免疫治療のための修飾された免疫細胞を含み、かつ特定の組成物が、特定の組成物に適切な剤形で製剤化されてもよい。
【０５８９】
抗原性および免疫原性の応答を介して、タンパク質分解性の変性および免疫学的介入などの分解プロセスに対する活性剤の暴露を低下するための投与法を使用してもよい。このような方法の例としては、処置または連続注入の部位での(例えば、ＡＤＡ２ポリペプチドまたはその変異型の)局所投与が挙げられる。
【０５９０】
この化合物は、経口投与のための、溶液、懸濁液、錠剤、分散剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤またはエリキシルなどの適切な医薬調製物中に製剤化されても、同様に、経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器として製剤化されてもよい。通常は、この化合物は、当該分野で周知の技術および手順を用いて医薬組成物中に製剤化される(例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと)。一般には、製剤化の方式は、投与経路の関数である。一般には、この組成物は、凍結乾燥型に製剤化されるかまたは液体型に製剤化される。組成物が凍結乾燥型で提供される場合、それらは、適切な緩衝液、例えば、滅菌生理食塩水によって使用直前に再構成されてもよい。
【０５９１】
１. 製剤−液体、注射液、エマルジョン
この製剤は一般には、投与経路に適するように作製される。非経口投与(一般には、皮下、筋肉内、静脈内または皮内のいずれかの注射または注入によって特徴付けられる)が本明細書で考慮される。非経口投与のための調製物としては、注射用滅菌溶液、無菌乾燥溶液生成物、例えば、皮下注射用錠剤、注射用滅菌懸濁液、使用直前にすぐ媒体と組み合わせる無菌の乾燥不溶性製品および無菌のエマルジョンなどの凍結乾燥粉末(使用直前にすぐ溶媒と組み合わせる)が挙げられる。注射液は、従来型で、液体の溶液または懸濁物のいずれかとして、注射前に液体中で溶液または懸濁液に適切な固体型としてまたはエマルジョンとして、調製してもよい。凍結乾燥製剤は、後の使用または貯蔵のための大きい単位用量の貯蔵に理想的である。
【０５９２】
一例では、医薬調製物は、液体型、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であってもよい。液体型で提供される場合、その医薬調製物は、使用前に治療有効濃度に希釈すべき濃縮製剤として提供されてもよい。この医薬調製物はまた、使用のために希釈を必要としない剤形で提供されてもよい。このような液体調製物は、薬学的に許容される添加物、例えば、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化可食脂肪)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステルまたは分画植物油)；および防腐剤(例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)と共に従来の手段により調製してもよい。別の例では、医薬調製物は、使用前に水または他の適当な媒体で再構成するための凍結乾燥形態で提供されてもよい。
【０５９３】
注射液は、局所投与および全身投与のために設計される。注射液は、従来型で、液体溶液または懸濁剤のいずれかとして、注射前に液体中の溶液または懸濁液に適切な固体型としてまたはエマルジョンとして、調製してもよい。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。非経口投与のための調製物としては、すぐ注射できる滅菌溶液、無菌乾燥溶液生成物、例えば、皮下注射用錠剤、すぐ注射できる無菌懸濁液、使用直前にすぐ媒体と組み合わせる無菌の乾燥不溶性製品および無菌のエマルジョンなどの凍結乾燥粉末(使用直前にすぐ溶媒と組み合わせる)が挙げられる。この溶液は、水性であっても非水性であってもよい。静脈内に投与する場合、適切な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)、ならびにグルコース、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールならびにそれらの混合物など、増粘剤および可溶化剤を含む溶液が挙げられる。
【０５９４】
医薬組成物は、担体または他の賦形剤を含んでもよい。例えば、本明細書に提供される医薬組成物は、希釈剤、アジュバント、接着阻害剤、結合剤、コーティング、増量剤、香料、着色料、潤滑剤、流動促進剤、防腐剤、界面活性剤、吸着剤または甘味料のうちのいずれか１つまたは複数およびそれらの組合せを含んでもよくまたは修飾ＰＨ２０ポリペプチドが一緒に投与される媒体を含んでもよい。例えば、非経口調製物で用いられる薬学的に許容される担体または賦形剤としては、水性の媒体、非水性の媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁および分散剤、乳化剤、隔離剤またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質が挙げられる。液体調製物を含む製剤は、薬学的に許容される添加物または賦形剤を用いて従来の手段で調製されてもよい。
【０５９５】
医薬組成物は、その組成物とともに投与される担体、例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤または媒体を含んでもよい。適切な薬学的担体の例は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」にE. W. Martinが記述している。このような組成物は、患者に対する適切な投与のための形態を得るために、治療有効量の化合物または剤を、一般には、精製型または部分的に精製された型で、適切な量の担体と一緒に含む。このような薬学的な担体は、無菌の液体、例えば、石油、動物、植物または合成に由来するもの、例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油およびゴマ油を含む、水またはオイルであってもよい。水は、典型的な担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に適切な溶液のために使用されてもよい。組成物は、活性成分と一緒に：希釈剤、例えば、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロース；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよび滑石；ならびに結合剤、例えばデンプン、天然ゴム、例えばアカシアガム、ゼラチン、グルコース、モラセス、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に公知の他のこのような結合剤を含んでもよい。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、一ステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水およびエタノールが挙げられる。例えば、適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。組成物は、必要に応じて、また、他の微量の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、安定化剤、溶解度向上剤および他のこのような剤、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエートおよびシクロデキストリンを含んでもよい。
【０５９６】
非経口調製物に用いられる薬学的に許容される担体としては、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張性剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁剤および分散剤、乳化剤、隔離剤またはキレート剤および他の薬学的に許容される物質が挙げられる。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張デキストロース注射、滅菌水注射、デキストロースおよび乳酸リンゲル注射が挙げられる。非水性非経口媒体としては、植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油およびピーナツ油が挙げられる。静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤を、多数回投与容器に包装された非経口調製物に添加してもよく、これには、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースが挙げられる。緩衝剤としては、リン酸およびクエン酸が挙げられる。抗酸化剤としては、硫酸水素ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁および分散剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、ポリソルベート８０(ＴＷＥＥＮ  ８０)が挙げられる。金属イオンの隔離またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。医薬担体としてはまた、水混和性媒体のためのエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールならびにｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸が挙げられる。
【０５９７】
具体的には、静菌性または静真菌性濃度(例えば、抗菌有効量)の抗菌剤(例えば、防腐剤)を、多数回投与容器に包装された非経口調製物に添加してもよく、これにはフェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【０５９８】
医薬組成物はまた、他の少量の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解度向上剤および他のこのような剤、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエートおよびシクロデキストリンなどを含んでもよい。一定レベルの投薬量が維持されるような徐放性の移植物または徐放性の系の移植物(例えば、米国特許第３,７１０,７９５号を参照のこと)も、本明細書において考慮される。このような非経口組成物に含まれる活性化合物の割合は、その特定の性質に対して、同様に、化合物の活性および対象の必要性にも高度に依存する。
【０５９９】
凍結乾燥粉末
本明細書で目的とするのは、溶液、エマルジョンおよび他の混合物などの投与のために再構成され得る凍結乾燥粉末である。それらはまた、再構成されて、固体またはゲルとして製剤化されてもよい。この凍結乾燥された粉末は、上記の任意の溶液から調製されてもよい。この医薬調製物は、使用前に、水または他の適切な媒体との再構成のための凍結乾燥型で提示されてもよい。
【０６００】
滅菌の凍結乾燥された粉末は、緩衝液中に化合物を溶解することによって調製される。緩衝液溶液は、その粉末または粉末から調製される再構成された溶液の安定性または他の薬理学的成分を改善する、賦形剤を含んでもよい。続く溶液の滅菌ろ過、その後の当業者に公知の標準条件下の凍結乾燥によって、所望の製剤が得られる。要するに、凍結乾燥粉末は、賦形剤、例えば、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適切な剤などを、適切な緩衝液、例えば、クエン酸塩、ナトリウムまたはカリウムリン酸塩または当業者に公知の他のこのような緩衝液中に溶解することによって調製される。次いで、選択された酵素、剤または化合物を、得られた混合物に添加し、溶解するまで撹拌する。得られた混合物を、滅菌ろ過するかまたは粒子を除去して無菌性を確保するように処理し、凍結乾燥のためにバイアル中に分配する。各々のバイアルは、化合物の単一用量(１ｍｇ〜１ｇ、一般には１〜１００ｍｇ、例えば、１〜５ｍｇ)または本明細書に記載されるような他の投薬量または複数回投薬量を含む。この凍結乾燥された粉末は、約４℃〜室温などの、適切な条件下で保管されてもよい。
【０６０１】
緩衝溶液を用いるこの凍結乾燥された粉末の再構成によって、非経口投与での使用のための製剤が得られる。正確な量は、処置される適応および選択される化合物に依存する。このような量は、経験的に決定され得る。
【０６０２】
２. 他の投与経路用の組成物
処置される条件次第で、他の投与経路、例えば、局所適用、経皮パッチ、経口および直腸投与も本明細書において考慮する。
【０６０３】
例えば、直腸投与用の医薬剤形は、全身的作用のための直腸坐剤、カプセルおよび錠剤である。直腸坐剤は、体温で融解または軟化して、１以上の薬理学的または治療的活性成分を遊離する、直腸に挿入するための固形物を含む。直腸坐剤に利用される薬学的に許容される物質は、基剤または媒体および融点を上げるための剤である。基剤の例としては、カカオバター(カカオ脂)、グリセリン−ゼラチン、カーボワックス(ポリオキシエチレングリコール)および脂肪酸モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリドの適切な混合物を含む。種々の基剤の組合せを用いてもよい。坐剤の融点を上げる剤としては鯨蝋およびろう状物質が挙げられる。直腸坐剤は、圧縮方法または鋳造により調製されてもよい。直腸坐剤の典型的な重量は約２〜３ｇｍである。直腸投与用の錠剤およびカプセルは、経口投与用製剤と同じ薬学的に許容される物質および同じ方法を用いて製造される。直腸投与に適切な製剤は、単位用量の坐剤として提供されてもよい。これらは、活性化合物と１以上の従来の固体担体、例えば、カカオバターとを混合し、得られた混合物を成形することにより調製できる。
【０６０４】
経口投与のために、医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム)；潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石またはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容される賦形剤を用いて、従来法で調製した錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。錠剤は当該分野で周知の方法によりコーティングできる。
【０６０５】
バッカル(舌下)投与に適する製剤としては、例えば、風味付けした基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性化合物を含むロゼンジ；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に化合物を含む芳香錠が挙げられる。
【０６０６】
局所混合物を局所および全身投与について記載したとおりに製造する。得られた混合物は溶液、懸濁液、エマルジョンなどであってよく、クリーム、ゲル、軟膏、エマルジョン、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、フォーム、エアロゾル、灌水、スプレー、坐剤、バンデージ、皮膚パッチまたは局所投与に適する任意の他の製剤として製剤化する。
【０６０７】
化合物または薬学的に許容されるその誘導体を、例えば吸入による局所適用のためのエアロゾルとして製剤化してもよい(例えば、炎症性疾患、特に喘息の処置に有用なステロイドの送達用エアロゾルを記載する米国特許第４,０４４,１２６号、同第４,４１４,２０９号および同第４,３６４,９２３号を参照のこと)。これらの呼吸管に投与するための製剤は、単独またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせたエアロゾルもしくはネブライザー用溶液の形態であってもまたは空気混入用の超微粒粉末としてであってもよい。このような場合、製剤の粒子は、典型的には、５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径である。
【０６０８】
化合物は、皮膚および眼などの粘膜への局所適用などの、局部または局所適用のために、ゲル、クリームおよびローションの形態で、ならびに眼への適用または嚢内もしくは脊髄内適用のために製剤化してもよい。局所投与は、経皮送達のためおよびまた眼もしくは粘膜への投与のためまたは吸入治療のために考慮される。活性化合物単独または他の薬学的に許容される添加物と組み合わせた経鼻溶液も投与できる。
【０６０９】
経皮投与に適切な製剤を提供する。これらは、長時間レシピエントの表皮と密接に接触したままであるのに適する分離したパッチなどの任意の適切な形式で提供できる。このようなパッチは、活性化合物を、例えば、活性化合物に関して０.１〜０.２Ｍ濃度の緩衝化してもよい水溶液中に含む。経皮投与に適する製剤はまた、イオン泳動により送達されてもよく[例えば、Tyle, P, Pharmaceutical Research 3(6), 318 (1986)を参照のこと]、通常は、活性化合物の緩衝化されてもよい水溶液の形態を取ってもよい。
【０６１０】
医薬組成物はまた、徐放性の製剤および／または送達デバイスによって投与され得る(例えば、米国特許第３,５３６,８０９号；同第３,５９８,１２３号；同第３,６３０,２００号；同第３,８４５,７７０号；同第３,９１６,８９９号；同第４,００８,７１９号；同第４,７６９,０２７号；同第５,０５９,５９５号；同第５,０７３,５４３号；同第５,１２０,５４８号；同第５,５９１,７６７号；同第５,６３９,４７６号；同第５,６７４,５３３号および同第５,７３３,５６６号を参照のこと)。
【０６１１】
３. 投薬量および投与
野性型、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型を含む本明細書のいずれかに記載の、組成物中のＡＤＡ２は、単回投与または複数回投与のための医薬組成物として製剤化され得る。このタンパク質は、処置される患者に対する望ましくない副作用がない、治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれてもよい。例えば、薬学的に活性な化合物の濃度は、所望の薬理学的効果を生じるのに有効な量を注射がもたらすように調節される。治療上有効な濃度は、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知のアッセイを用いることなどによって、公知のインビトロおよびインビボ系でタンパク質を試験することによって経験的に決定できる。例えば、標準的な臨床技術を使用してもよい。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを、最適投与量範囲の同定を容易にするために使用してもよい。経験的に決定できる正確な投与量は、患者または動物の年齢、体重および状態、投与される特別なＡＤＡ２分子、投与経路、処置される疾患の種類、ならびに疾患の重症度に依存し得る。
【０６１２】
したがって、正確な投与量および処置の期間は、処置されている疾患の関数であり、かつ公知の試験プロトコールを用いて経験的にまたはインビボもしくはインビトロの試験データからの推定によって決定され得る。濃度および投薬量の値はまた、軽減されるべき状態の重篤度とともに変化し得ることも注目されるべきである。任意の特定の対象に関して、特定の投与レジメンは、個体の必要性および組成物の投与を施すかまたは管理する人の専門的な判定に応じて経時的に調節されなければならないこと、ならびに本明細書に示される濃度範囲が、例示にすぎず、組成物およびそれらを含む併用の範囲または使用を制限することは意図していないことがさらに理解されるべきである。この組成物は、１時間ごと、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与されてもよい。一般には、投薬レジメンは、毒性を制限するために選択される。担当医は、毒性または骨髄、肝臓もしくは腎臓または他の組織機能不全に起因して、どのようにおよびいつ治療を停止するか、中断するかまたは低投与量に調節すべきかを承知していることに注意すべきである。逆に、担当医はまた臨床的応答が不適であるならば、(毒性副作用を防止しながら)どのようにおよびいつ処置を高いレベルに調節するかも承知している。
【０６１３】
ＡＤＡ２タンパク質の組成物(例えば、その野性型、変異型、コンジュゲートまたは他の修飾型)は、治療上有用な効果を発揮するために十分な量で組成物中に含まれる。例えば、その量は、がんなどの過剰増殖性の疾患または状態の処置における治療効果を達成する量である。一般には、組成物は、０.５μｇ〜１００グラムのＡＤＡ２タンパク質、例えば２０μｇ〜１０グラム、２０μｇ〜５０グラム、２０μｇ〜１グラム、２０μｇ〜５００ｍｇ、２０μｇ〜２００ｍｇ、２０μｇ〜５ｍｇ、２０μｇ〜０.５ｍｇ、０.５ｍｇ〜１００グラム、０.５ｍｇ〜１０グラム、０.５ｍｇ〜５グラム、０.５ｍｇ〜１グラム、０.５ｍｇ〜５００ｍｇ、０.５ｍｇ〜２００ｍｇ、０.５ｍｇ〜５ｍｇ、５ｍｇ〜１００グラム、５ｍｇ〜１０グラム、５ｍｇ〜５グラム、５ｍｇ〜１グラム、５ｍｇ〜５００ｍｇ、５ｍｇ〜２００ｍｇ、１００ｍｇ〜１００グラム、１００ｍｇ〜１０グラム、１００ｍｇ〜５グラム、１００ｍｇ〜１グラム、１００ｍｇ〜５００ｍｇ、１００ｍｇ〜２００ｍｇ、２００ｍｇ〜１００グラム、２００ｍｇ〜１０グラム、２００ｍｇ〜５グラム、２００ｍｇ〜１グラム、２００ｍｇ〜５００ｍｇ、５００ｍｇ〜１００グラム、５００ｍｇ〜１０グラム、５００ｍｇ〜５グラム、５００ｍｇ〜１グラム、１グラム〜１００グラム、１グラム〜１０グラム、１グラム〜５グラム、５グラム〜１００グラム、５グラム〜１０グラムまたは１０グラム〜１００グラムを含む。例えば、この組成物は、少なくともまたは少なくとも約または１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１グラム、５グラム、１０グラム、２０グラム、３０グラム、４０グラム、５０グラム、６０グラム、７０グラム、８０グラム、９０グラム、１００グラム、２００グラム、３００グラムまたはそれ以上である量のＡＤＡ２を含んでもよい。
【０６１４】
さらなる例では、この組成物は、１ミリユニット(ｍＵ)〜１０,０００ユニット(Ｕ)、１ｍＵ〜１,０００Ｕ、１ｍＵ〜１００Ｕ、１ｍＵ〜１０Ｕ、１ｍＵ〜１Ｕ、１ｍＵ〜１００ｍＵ、１ｍＵ〜１０ｍＵ、１０ｍＵ〜１０,０００Ｕ、１０ｍＵ〜１,０００Ｕ、１０ｍＵ〜１００Ｕ、１０ｍＵ〜１０Ｕ、１０ｍＵ〜１Ｕ、１０ｍＵ〜１００ｍＵ、１００ｍＵ〜１０,０００Ｕ、１００ｍＵ〜１,０００Ｕ、１００ｍＵ〜１００Ｕ、１００ｍＵ〜１０Ｕ、１００ｍＵ〜１Ｕ、１Ｕ〜１０,０００Ｕ、１Ｕ〜１,０００Ｕ、１Ｕ〜１００Ｕ、１Ｕ〜１０Ｕ、１０Ｕ〜１０,０００Ｕ、１０Ｕ〜１,０００Ｕ、１０Ｕ〜１００Ｕ、１００Ｕ〜１０,０００Ｕ、１００Ｕ〜１,０００Ｕ、１,０００Ｕ〜１０,０００Ｕの間またはほぼその値の間のＡＤＡ２を含む。例えば、この組成物は、少なくともまたは少なくとも約または１ｍＵ、２ｍＵ、３ｍＵ、４ｍＵ、５ｍＵ、６ｍＵ、７ｍＵ、８ｍＵ、９ｍＵ、１０ｍＵ、２０ｍＵ、３０ｍＵ、４０ｍＵ、５０ｍＵ、６０ｍＵ、７０ｍＵ、８０ｍＵ、９０ｍＵ、１００ｍＵ、２００ｍＵ、３００ｍＵ、４００ｍＵ、５００ｍＵ、６００ｍＵ、７００ｍＵ、８００ｍＵ、９００ｍＵ、１Ｕ、１０Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、６０Ｕ、７０Ｕ、８０Ｕ、９０Ｕ、１００Ｕ、２００Ｕ、３００Ｕ、４００Ｕ、５００Ｕ、６００Ｕ、７００Ｕ、８００Ｕ、９００Ｕ、１０００Ｕ、２０００Ｕ、３０００Ｕ、４０００Ｕ、５０００Ｕ、６０００Ｕ、７０００Ｕ、８０００Ｕ、９０００Ｕ、１００００Ｕまたはそれ以上である量のＡＤＡ２を含んでもよい。
【０６１５】
本明細書に提供されるＡＤＡ２を含む組成物の容量は、約０.１ｍＬ〜１００ｍＬ、例えば０.５ｍＬ〜１００ｍＬ、０.５ｍＬ〜５０ｍＬ、０.５ｍＬ〜１０ｍＬ、１ｍＬ〜１００ｍＬ、１ｍＬ〜５０ｍＬ、１ｍＬ〜４０ｍＬ、１ｍＬ〜２０ｍＬ、１ｍＬ〜１０ｍＬまたは３ｍＬ〜１０ｍＬの間であってもまたはほぼその値の間であってもよい。通常は、組成物の注射または注入の容量は、少なくともまたは少なくとも約０.０１ｍＬ、０.０５ｍＬ、０.１ｍＬ、０.２ｍＬ、０.３ｍＬ、０.４ｍＬ、０.５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬまたはそれ以上である。
【０６１６】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２、野性型、変異型またはコンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)は、１ｍＵ／ｍＬ、１０ｍＵ／ｍＬ、２０ｍＵ／ｍＬ、１０ｍＵ／ｍＬ、２０ｍＵ／ｍＬ、３０ｍＵ／ｍＬ、４０ｍＵ／ｍＬ、５０ｍＵ／ｍＬ、６０ｍＵ／ｍＬ、７０ｍＵ／ｍＬ、８０ｍＵ／ｍＬ、９０ｍＵ／ｍＬ、１００ｍＵ／ｍＬ、２００ｍＵ／ｍＬ、３００ｍＵ／ｍＬ、４００ｍＵ／ｍＬ、５００ｍＵ／ｍＬ、６００ｍＵ／ｍＬ、７００ｍＵ／ｍＬ、８００ｍＵ／ｍＬ、９００ｍＵ／ｍＬ、１Ｕ／ｍＬ、２Ｕ／ｍＬ、３Ｕ／ｍＬ、４Ｕ／ｍＬ、５Ｕ／ｍＬ、６Ｕ／ｍＬ、７Ｕ／ｍＬ、８Ｕ／ｍＬ、９Ｕ／ｍＬ、１０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、１５０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、２５０Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、１０００Ｕ／ｍＬ、２０００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、３０００Ｕ／ｍＬ、４０００Ｕ／ｍＬ、５０００Ｕ／ｍＬ、６０００Ｕ／ｍＬ、７０００Ｕ／ｍＬ、８０００Ｕ／ｍＬ、９０００Ｕ／ｍＬまたは１０,０００Ｕ／ｍＬの濃度またはほぼその濃度または少なくともその濃度または少なくともほぼその濃度で提供されてもよい。この組成物は、直接使用のために調製されてもよくまたは使用前に有効な濃度まで希釈用に調製されてもよい。
【０６１７】
薬学的におよび治療的に活性な化合物およびその誘導体は、単位剤形または複数剤形で典型的には製剤化および投与される。各単位用量は、必要な薬学的担体、媒体または希釈剤と組み合わせて所望の治療効果をもたらすのに十分な所定量の治療的に活性な化合物を含む。単位剤形は、適切な量の化合物または薬学的に許容されるその誘導体を含む、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、顆粒、無菌非経口溶液または懸濁液および経口溶液または懸濁液、ならびに油水エマルジョンを含むが、これらに限定されない。単位投与量形態は、アンプルおよびシリンジに含まれてもよくまたは錠剤もしくはカプセルに個々に包装されてもよい。単位剤形は、その画分で投与されてもまたは複数回で投与されてもよい。複数剤形とは、分離した単位剤形で投与される、一容器中に包装された複数の同一単位剤形である。複数剤形の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセルのボトルまたはパイントもしくはガロンのボトルが挙げられる。それゆえに、複数剤形は、包装で分離されていない複数の単位用量である。一般には、０.００５％〜１００％範囲の活性成分と、非毒性担体からなる残りを含む剤形または組成物を調製してもよい。医薬組成物は、各投与経路に適切な剤形で製剤化されてもよい。
【０６１８】
単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針付きのシリンジに包装される。薬学的に活性な化合物を含む、液体溶液または再構成された粉末調製物の容量は、処置される疾患および包装のために選択される製造の特定の物品の関数である。非経口投与のための全ての調製物は、当該分野で公知であり、かつ実行されるように、無菌でなければならない。
【０６１９】
示したとおり、本明細書に提供される組成物は、限定するものではないが、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内の注射、硬膜外、膣、直腸、局所、耳、経皮投与または任意の投与経路を含む、当業者に公知の任意の経路のために製剤化されてもよい。このような経路に適切な製剤は、当業者に公知である。組成物はまた、他の生物学的に活性な剤とともに、連続的に、間欠的にまたは同じ組成物中で投与されてもよい。
【０６２０】
医薬組成物は、徐放性製剤および／または送達デバイスによっても投与されてもよい(例えば、米国特許第３,５３６,８０９号；同第３,５９８,１２３号；同第３,６３０,２００号；同第３,８４５,７７０号；同第３,８４７,７７０号；同第３,９１６,８９９号；同第４,００８,７１９号；同第４,６８７,６６０号；同第４,７６９,０２７号；同第５,０５９,５９５号；同第５,０７３,５４３号；同第５,１２０,５４８号；同第５,３５４,５５６号；同第５,５９１,７６７号；同第５,６３９,４７６号；同第５,６７４,５３３号および同第５,７３３,５６６号を参照のこと)。
【０６２１】
リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現できる組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシスおよびＡＤＡ２、例えば、その野性型、変異型または修飾型をコードする核酸分子の送達またはレトロウイルス送達系などの他の剤を含むが、これらに限定されない種々の送達系が知られており、選択した組成物の投与に用いられ得る。ある態様においては、この組成物は、本明細書に提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸、例えば、腫瘍崩壊性ウイルスベクターもしくは遺伝子治療ベクターまたは細胞、例えば、養子免疫療法のための修飾された免疫細胞を含み、ならびに特定の組成物が、特定の組成物に適切な送達系で投与されてもよい。
【０６２２】
それゆえに、特定の態様では、リポソームおよび／またはナノ粒子も、本明細書の組成物の投与および併用とともに使用できる。リポソームは、水性媒体および自然に形成される多層状同心性二層小胞[別称多重層ベシクル(ＭＬＶ)]に分散されるリン脂質から形成される。ＭＬＶは、一般には、直径２５ｎｍ〜４μｍを有する。ＭＬＶの超音波処理は、コアに水溶液を含む直径２００〜５００オングストロームの範囲の小単層ベシクル(ＳＵＶ)の形成を生じる。一態様では、リポソームは多重層リポソーム(ＭＶＬ)であってもよい。
【０６２３】
リン脂質は、脂質対水のモル比によって、水に分散したときリポソーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比では、リポソームが形成される。リポソームの物理的特徴はｐＨ、イオン性強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームはイオン性および極性物質に低透過性を示し得るが、高温で相転移を受け、これは顕著に透過性を変更する。相転移は、ゲル状態として知られる密接に充填された、秩序立った構造から、流動状態として知られるゆるく充填された、あまり秩序立てられていない構造への変化を含む。これは、特徴的相転移温度で生じて、イオン、糖および薬物に対する不透過性を増大させる。
【０６２４】
リポソームは、以下の種々の機構を介して細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球などの網内系の食作用性細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性もしくは静電力によるかまたは細胞−表面成分との特異的相互作用による細胞表面への吸着；リポソームの脂質二層の原形質膜への挿入による細胞の原形質膜との融合と同時のリポソーム内容物の細胞質への放出；およびリポソーム内容物の結合がないリポソーム脂質の細胞膜または細胞内膜への伝達またはその逆。リポソーム製剤の変動は、どの機構が操作的であるかを変更できるが、１つまたは複数が同時に操作的であり得る。ナノカプセルは、一般に化合物を安定かつ再現性ある方法で封入し得る。細胞内重合体過負荷による副作用を避けるため、このような超微細粒子(約０.１μｍのサイズ)を、インビボで分解できるポリマーを用いて設計すべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本明細書での使用について意図され、このような粒子は容易に製造できる。
【０６２５】
４. 包装および製品
また提供されるのは、包装材料を含む製品、本明細書に提供される任意の医薬組成物およびその組成物が、本明細書に記載される疾患または状態の処置に用いられることを示す表示である。例えば、この表示は、その処置が腫瘍またはがんであることを示し得る。この表示はまた、その処置が、本明細書に記載されるようなマーカーの上昇、例えば、組織または細胞でのアデノシンレベルの上昇または蓄積、アデノシン受容体(ＡＤＲ)の上昇および／またはＣＤ７３もしくはＣＤ３９のレベルの上昇と関連する疾患または状態についてであることを示し得る。
【０６２６】
本明細書に記載される、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型および別の治療剤の組合せを含むＡＤＡ２タンパク質もまた、製品中に包装されてもよい。一例では、その製品は、ＡＤＡ２、例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を含有する医薬組成物を含み、さらなる剤も処置もない。他の例では、その製品は、ＡＤＡ２または別のさらなる治療剤を含む医薬組成物を含む。例えば、この製品は、ＡＤＡ２および別の処置、例えば、免疫チェックポイント阻害剤または抗がん剤を含む医薬組成物を含む。この例では、この剤は、製品としての包装のために、一緒に提供されてもまたは別々に提供されてもよい。
【０６２７】
本明細書に提供される製品は、包装材料を含む。医薬品を包装するのに用いるための包装材料は、当業者に周知である。例えば、各々その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５,３２３,９０７号、同第５,０５２,５５８号および同第５,０３３,２５２号を参照のこと。医薬包装材料の例としては、限定するものではないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトルおよび選択した製剤、ならびに意図する投与方法および処置に適する任意の包装材料が挙げられる。例示的な製品は、単一の薬室を備える容器および二重薬室の容器である。この容器としては、限定するものではないが、チューブ、ボトルおよびシリンジが挙げられる。この容器はさらに、静脈内投与用の針を備えてもよい。
【０６２８】
包装の選択は、薬剤およびこのような組成物が一緒に包装されるかまたは個別に包装されるかによる。一般に、包装は、含まれる組成物と非反応性である。他の例において、成分のいくつかを混合物として包装してもよい。他の例では、全成分を個別に包装する。したがって、例えば、この成分を、投与直前の混合により、直接一緒に投与できる別個の組成物として包装してもよい。あるいは、この成分を、別個に投与するための別個の組成物として包装してもよい。
【０６２９】
その製品を含む選択した組成物を、キットとしても提供してもよい。キットは、本明細書に記載する医薬組成物および製品として提供される投与用アイテムを備えてもよい。例えば、ＡＤＡ２は、投与用のデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、投与カップ、点滴器、アプリケーターなどで供給されてもよい。組成物は、投与用のアイテムに含まれてもよくまたは後で追加されるように別々に提供されてもよい。キットは、適宜、投与量、投与レジメンおよび投与方法の指示を含む、適用のための指示書を備えてもよい。キットはまた本明細書に記載される医薬組成物および診断用アイテムも備えてもよい。
【０６３０】
Ｈ. アデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)を用いる処置の方法
本明細書に提供される方法は、その症状が、対象のアデノシンまたはデオキシアデノシンのレベルが低下することによって、減弱または低減され得る疾患または状態を有する対象を処置するために、本明細書に記載される任意のアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型を投与するかまたは用いる方法を包含する。例えば、その疾患または状態は、アデノシンレベルの上昇を伴うものである。例えば、ＡＤＡ２は、アデノシンに関してＫｍが約２００×１０−５Ｍという低い結合親和性を示すので、ＡＤＡ２は、アデノシンのレベルが上昇したかまたは高いという条件下で優先的に活性を示す。したがって、治療剤としてのＡＤＡ２の使用は、疾患または異常な環境について特異性を示すという利点を提供するが、アデノシンレベルが低い正常な環境下では活性を示さない。特定の例では、下に記載のとおり、この疾患または状態は、腫瘍またはがんである。この対象は、細胞外アデノシンのレベル、アデノシン受容体(ＡＤＲ)発現のレベルおよび／またはエクトヌクレオチダーゼ発現のレベルに基づいて選択され得る。さらに、抗がん剤または抗ヒアルロン酸剤などの、処置のための１以上の追加の剤との併用療法もまた提供される。
【０６３１】
１. 例示的な疾患および状態
低レベルでストレスのない組織の間質液中に生理学的に存在するアデノシンの濃度は、低酸素症、虚血、腫瘍環境または外傷などの病理学的条件に応答して急速に増大し得る。細胞外腔に放出された場合、アデノシンは、危険のシグナルとして機能し、アデノシン受容体(ＡＤＲ)の活性化を通じて、種々の細胞応答が生じて、組織の恒常性が修復される。アデノシンは、限定するものではないが、腫瘍増殖および血管形成の刺激、サイトカイン合成および内皮壁に対する免疫細胞の接着の阻害、Ｔ細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞の機能の阻害、ならびに腫瘍転移の促進を含む、疾患または状態の疫学に寄与し得る種々の活性に関連する。
【０６３２】
アデノシンデアミナーゼ、例えば、本明細書に記載の任意のＡＤＡ２またはその変異型、コンジュゲートもしくは他の修飾型は、アデノシン分子をイノシンに脱アミノすることによって、このような条件での細胞外アデノシンレベルを調節し得る。このように、任意のこのような疾患は、本明細書に記載されるＡＤＡ２、例えば、野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型で処置され得る。具体的には、ＡＤＡ２は、細胞外安定性に寄与する特性、例えば、広範なグリコシル化および保存されたジスルフィド結合の存在を保有しており、これによって望ましい治療剤となる。ＡＤＡ２処置が用いられ得る例示的な疾患および状態を本明細書に示す。
【０６３３】
ＡＤＡ２を含む組成物は、疾患または状態の処置のために望ましい任意の経路によって投与され得る。投与の特定の経路は、特定の疾患または状態、その疾患または状態の重篤度、特定の製剤および当業者の水準の範囲内の他の要因に依存し得る。通常は、この組成物は、静脈内経路によって投与されるが、他の投与経路、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内の注射、硬膜外、膣、直腸、局所、耳、経皮投与または任意の投与経路など、当業者に周知の任意の投与経路が考慮される。
【０６３４】
ａ. がんおよび腫瘍
ＡＤＡ２、例えば、本明細書に記載される、野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型を含む任意のＡＤＡ２を、腫瘍またはがんを処置するために用いてもよい。腫瘍微小環境(ＴＭＥ)における高い細胞外アデノシンは、局所免疫抑制環境を生み出し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性を抑制する。特定の腫瘍および免疫細胞に対する免疫抑制性のＴＭＥおよびＡＤＲシグナル伝達の生成を通じて、アデノシンは、一般には、腫瘍の増殖、血管新生および転移に好都合であるＴＭＥを生じる。
【０６３５】
アデノシンシグナル伝達を調節する薬剤は、乳がん、肺がん、結腸がん、前立腺がんおよび黒色腫細胞などの種々のがんの種類において、腫瘍増殖を阻害し、下流の細胞シグナル伝達を調節するのに効果を有することが示されている[Antonioli et al.(2013) Nat Rev Can 13:842-857]。アデノシンデアミナーゼ、例えば、本明細書に記載される任意のＡＤＡ２またはその変異型、コンジュゲート、もしくは修飾型は、腫瘍環境における細胞外アデノシンレベルを、アデノシン分子をイノシンに脱アミノすることによって調節し得る。したがって、任意のＡＤＡ２、その変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または修飾型は、アデノシンレベルおよびシグナル伝達を調節し、抗腫瘍免疫応答の免疫抑制を逆転し、最終的に腫瘍増殖を低減する剤として用いられ得る。
【０６３６】
具体的には、本明細書に提供される方法によって処置されるかまたは減弱され得る疾患または状態としては、例えば、腫瘍増殖が、高いアデノシン濃度および／またはアデノシン受容体(ＡＤＲ)シグナル伝達を通じて刺激されるものが挙げられる。例えば、高濃度のアデノシンを能動的に生成し、それによって局所の免疫抑制環境を生じるＴＭＥは、ＡＤＡ２処置に対してさらに感受性であり得る。約またはほぼ０.１マイクロモルという正常なアデノシンレベルと比較して、ＴＭＥ中のアデノシンレベルは、約１０マイクロモルまで上昇する。ＡＤＡ２は、高いＫｍを有し、かつ優先的に、通常、腫瘍微小環境(ＴＭＥ)で存在するような、上昇したアデノシンを含む条件では活性であるので、ＡＤＡ２は、ＴＭＥ中のアデノシンレベルを、そのアデノシンデアミナーゼ活性によって低下し得る。本明細書に提供される、ＡＤＡ２野性型、その変異型および修飾型を含む任意のＡＤＡ２は、ＴＭＥ中でアデノシン濃度が高い、固形腫瘍を含む腫瘍を処置するために用いてもよい。
【０６３７】
さらに、本明細書に示されるとおり、ＡＤＡ２または変異型はまた、優先的にＴＭＥ内の領域を標的化し得る種々の最適ｐＨを呈する。例えば、ＴＭＥの低酸素領域は一般に、ＡＤＡ２の最適ｐＨと同じである、約またはほぼｐＨ６.５という低いｐＨを有する。例えば、変更されたｐＨは、ＴＭＥ中などの疾患状態で見出される共通の微小環境である[例えば、Fogh Andersen et al.(1995) Clin. Chem., 41:1522-1525;Bhujwalla et al.(2002) NMR Biomed., 15:114-119;Helmlinger et al.(1997) Nature Med., 3:177;Gerweck and Seetharaman(1996)、Cancer Res. 56(6):1194-1198を参照のこと]。例えば、多くの腫瘍では、ワールブルク効果が、約５.６〜約６.８に及ぶｐＨ、例えば、ｐＨ５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７または６.８未満またはほぼその値またはその値である微小環境を生み出す。したがって、中性のｐＨよりも酸性のｐＨでさらに活性であるＡＤＡ２、例えば、ＡＤＡ２野性型または本明細書に記載の変異型を用いて、非標的疾患の細胞または組織中の活性を最小限にしながら、低ｐＨのＴＭＥ内の腫瘍を処置してもよい。
【０６３８】
したがって、イノシンへのアデノシンの酵素的変換によってＴＭＥ中のアデノシン濃度を減らすために、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を投与することを用いて、非標的疾患の細胞または組織中の活性を最小限にしながら、腫瘍の増殖および転移を妨げてもよい。
【０６３９】
本明細書に提供される方法は、処置されるべき対象において、アデノシンレベルの上昇に関連するかおよび／またはアデノシンもしくはデオキシアデノシンのレベルの低下に感受性である、がんを含む全ての種類の腫瘍を処置することに適用可能である。広義には、これらとしては、血液の腫瘍および固形腫瘍が挙げられる。腫瘍の中でもとりわけ、アデノシンレベルが低下されるとき、その増殖が抑制される腫瘍が含まれる。腫瘍の中でもとりわけ、アデノシンレベルの低下によって、対象の免疫系が、腫瘍の増殖をより効果的に抑制することが可能になる腫瘍かおよび／またはその腫瘍の増殖が、アデノシンのレベルの低下が血液供給を阻害するときに抑制される腫瘍、例えば、低酸素腫瘍が含まれる。具体的には、固形腫瘍は、本明細書に提供される方法による処置に感受性である。なぜなら、それらは、アデノシンレベルの低下から生じる、腫瘍血管形成の低下にさらに感受性であるからである。ＴＭＥの部分での高いアデノシンレベルは、血管形成を促進し、かつ本明細書に提供される方法を用いるアデノシンレベルの低下は、アデノシンの血管形成効果の低下を生じ得る。さらに、高いアデノシンレベルおよびＣＤ７３活性は、がん細胞播種および転移と関連する。したがって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の投与によって達成されるアデノシンレベルの低下は、がん細胞の播種および転移の抑制を生じ得る。
【０６４０】
本明細書に提供される方法による処置に供される腫瘍としては、限定するものではないが、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、消化管、中枢および末梢の神経系、腎臓系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、関節、脂肪組織を含む結合組織系および血管壁を含む循環系に由来する腫瘍が挙げられる。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２またはその変異型または修飾型を投与することによって処置され得る腫瘍の例としては、癌腫、神経膠腫、肉腫(脂肪肉腫を含む)、腺癌、腺肉腫および腺腫が挙げられる。このような腫瘍は、事実上、身体の全ての部分、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓で生じ得る。
【０６４１】
骨格系の腫瘍としては、例えば、肉腫および芽細胞腫、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫および軟骨芽細胞腫が挙げられる。筋肉および心臓の腫瘍としては、骨格筋および平滑筋の両方の腫瘍、例えば、平滑筋腫(平滑筋の良性腫瘍)、平滑筋肉腫、横紋筋腫(骨格筋の
良性腫瘍)、横紋筋肉腫、心臓肉腫が挙げられる。消化管の腫瘍としては、例えば、口腔、食道、胃、小腸、結腸および結腸直腸の腫瘍、ならびに消化器の分泌臓器、例えば、唾液腺、肝臓、膵臓および胆管の腫瘍が挙げられる。中枢神経系の腫瘍としては、脳、網膜および脊髄の腫瘍が挙げられ、また関連する結合組織、骨、血管または神経組織にも由来し得る。末梢神経系の腫瘍の処置もまた考慮される。末梢神経系の腫瘍としては、悪性の末梢神経鞘腫瘍が挙げられる。腎臓系の腫瘍としては、腎臓の腫瘍、例えば、腎細胞癌、ならびに尿管および膀胱の腫瘍が挙げられる。生殖系の腫瘍としては、頸部、子宮、卵巣、前立腺、精巣および関連の分泌腺の腫瘍が挙げられる。免疫系の腫瘍としては、血液系の腫瘍および固形腫瘍の両方が挙げられ、これには、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方が挙げられる。呼吸器系の腫瘍としては、鼻腔、気管支および肺の腫瘍が挙げられる。乳房の腫瘍としては、小葉および腺管癌の両方が挙げられる。
【０６４２】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２またはその変異型または修飾型を用いて処置され得る腫瘍の他の例としては、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、胃腸および腎臓の癌腫および肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽細胞腫(例えば、多形性グリア芽細胞腫)および平滑筋肉腫が挙げられる。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２または変異型または修飾型を用いて処置され得るがんの例としては、限定するものではないが、リンパ腫、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫および白血病またはリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。このようながんの例としては、血液系悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫(バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉症、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆体細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大型顆粒リンパ性白血病を含む成熟Ｔ細胞およびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄新生物、例えば、成熟を伴うＡＭＬ、分化なしのＡＭＬを含む急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球白血病、骨髄異形成症候群および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害；中枢神経系の腫瘍、例えば、神経膠腫、神経膠芽腫、神経芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫および網膜芽細胞腫；頭頸部の固形腫瘍(例えば、鼻咽頭がん、唾液腺癌および食道がん)、肺の固形腫瘍(例えば、小細胞肺がん、非小細胞性肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌)、消化器系の固形腫瘍(例えば、消化器がんを含む胃部または胃がん、胆道または胆管のがん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がんおよび肛門癌)、生殖器系の固形腫瘍(例えば、精巣がん、陰茎がんまたは前立腺がん、子宮がん、膣がん、外陰がん、子宮頸部、卵巣がんおよび子宮内膜がん)、皮膚の固形腫瘍(例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞がん、光線性角化症、皮膚黒色腫)、肝臓の固形腫瘍(例えば、肝臓のがん、肝癌、肝細胞がんおよび肝細胞腫)、骨の固形腫瘍(例えば、骨巨細胞腫および溶骨性骨がん)、付加的組織および臓器の固形腫瘍(例えば、膵がん、膀胱がん、腎臓のまたは腎性のがん、甲状腺がん、乳がん、腹膜のがんおよびカポジ肉腫)、血管系の腫瘍(例えば、血管肉腫および血管外皮腫)、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫およびユーイング肉腫が挙げられる。
【０６４３】
ｂ. 非がん性過剰増殖性疾患
本明細書に記載する任意のＡＤＡ２、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型を用いて、対象における非がん性過剰増殖性疾患を処置してもよい。アデノシンおよびＡＤＲシグナル伝達は、種々の細胞性応答、例えばマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化、遺伝子転写および増殖に対して、Ｇタンパク質共役型受容体(ＧＰＣＲ)を含む種々のシグナル伝達経路、サイクリックＡＭＰ(ｃＡＭＰ)シグナル伝達および／またはサイトカインシグナル伝達においてある役割を果たす。Ａ１受容体などの、特定のアデノシン受容体(ＡＤＲ)の活性化は、細胞増殖につながる細胞経路を開始し得る。過剰な発現および／または過剰な刺激が過剰増殖を生じ得る。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いて、過剰増殖性障害に関与する細胞でＡＤＲの活性化を低下することによって、非がんの過剰増殖性障害を処置してもよい。
【０６４４】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(本明細書に提供される、その野性型、変異型および修飾型を含む)によって処置され得る過剰増殖性疾患の例としては、例えば、乾癬、日光角化症および脂漏性角化症、疣贅、ケロイド瘢痕および湿疹を含む任意の過剰増殖性疾患が挙げられる。またウイルス感染、例えばパピローマウイルス感染が原因の過剰増殖性疾患も含まれる。異なるタイプの乾癬は、例えば膿様疱疹(膿疱性乾癬)、皮膚の重度脱落(紅皮症乾癬)、液滴様点(滴状乾癬)および滑らかな炎症病変(逆性乾癬)などの特徴を示し得る。乾癬の処置は、全てのタイプの乾癬(例えば、尋常性乾癬、膿疱性乾癬、紅皮症乾癬、関節症性乾癬、類乾癬、掌蹠膿疱症)の処置を含むことが理解される。
【０６４５】
ｃ. 線維症
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型を用いて、線維症および特にアデノシンの上昇と関連した疾患を処置してもよい。アデノシンのレベルは、ストレスのある状態、例えば、低酸素症、虚血、炎症、腫瘍環境または外傷で上昇する。これらの状態では、細胞外アデノシンは、危険のシグナルとして作用して、組織の恒常性に種々の応答を促進する。しかし、急性損傷段階を超えてアデノシン濃度の増大が続けば、免疫抑制を誘発するかまたは絶え間のない創傷治癒プロセスを促進する経路を活性化することによって組織に対して有害になり得、これが線維の再構築につながる[Antonioli et al.(2013) Nat Rev Can 13:842-857]。細胞外アデノシン中のストレス関連増大を低下し得る、本明細書に提供されるＡＤＡ２の投与を用いて、過剰な線維の組織沈着を伴う疾患または状態、例えば、線維症(修復過程または反応過程での臓器または組織中の過剰の線維性結合組織の形成)を処置してもよい。線維症に関連する疾患または状態としては、例えば、特発性肺線維症および嚢胞性線維症を含む肺の線維症；肝硬変を含む肝臓の線維症；心内膜心筋線維症、心筋梗塞、動脈線維症を含む心臓の線維症；ならびに他の線維症状態、例えば、縦隔線維症(縦隔の軟部組織の線維症)、骨髄線維症(骨髄の線維症)、後腹膜線維症(後腹膜の軟部組織の線維症)、進行性塊状線維症(肺の線維症)、腎性全身性線維症(皮膚の線維症)、クローン病(腸の線維症)、ケロイド(皮膚の線維症)、強皮症／全身性硬化症(皮膚、肺の線維症)、関節線維症(膝、肩、他の関節の線維症)、ペイロニー病(陰茎の線維症)、デュプイトラン拘縮(手、指の線維症)および癒着性関節包炎(肩の関節症)が挙げられる。
【０６４６】
ｄ. 感染性疾患
本明細書に記載される任意のＡＤＡ２、例えば、その野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型は、アデノシンの上昇と関連する感染性疾患を処置するために用いてもよい。侵襲性の病原体は、宿主の内因性の免疫抑制機構、例えば、アデノシン媒介性の免疫抑制を利用して、宿主内の伝播または生存を促進し得る。例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の菌糸は、アデノシンを放出して、生物体の好中球媒介性殺傷を抑制し、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)はまた、アデノシンを生成して、宿主の免疫応答を抑制する。さらに、新生児および高齢者での感染に対する感受性の増大はまた、上昇したアデノシンレベルシグナル伝達とも関連している[Hasko et al.(2013)  Front Immunol. 4:85]。
【０６４７】
したがって、特定の感染性疾患では、ＡＤＡ２は、アデノシン媒介性の免疫抑制を低下するための処置として用いられ得る。本明細書に記載される、その野性型、変異型および改変型を含む任意のＡＤＡ２を用いて、感染症を処置してもよい。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２で処置できる感染症としては、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫などの病原体が原因の疾患が挙げられる。感染性疾患は、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、デング、エプスタイン・バー、ハンタ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスII型、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、インフルエンザ、麻疹、ムンプス、パポーバウイルス、ポリオ、呼吸器合胞体ウイルス、牛疫、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹、ＳＡＲＳウイルス、天然痘およびウイルス性髄膜炎を含むウイルスによって生じる場合がある。感染症はまた、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、ジフテリア(Diphtheria)、大腸菌、レジオネラ(Legionella)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、マイコバクテリウム・リケッチア(Mycobacterium rickettsia)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコプラズマ・ナイセリア(Mycoplasma Neisseria)、百日咳(Pertussis)、シュードモナス・エールギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、連鎖球菌(Streptococcus)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、コレラ菌(Vibrio cholerae)およびペスト菌(Yersinia pestis)を含む細菌によって生じる場合もある。感染性疾患はまた、真菌、例えば、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、ブラストマイセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicanｓ)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)およびペニシリウム・マルネッフェイ(Penicillium marneffei)によって生じる場合もある。感染性疾患はまた、原虫および寄生虫、例えばクラミジア、コクシジウム、リーシュマニア、マラリア、リケッチアおよびトリパノソーマによって生じる場合もある。
【０６４８】
ｅ. 他の疾患および状態
ＡＤＡ１遺伝子の有害な突然変異を保有する個体は、軽度から重度の種々の程度の免疫不全障害を発症し得る。このような免疫不全障害は、酵素基質、アデノシンおよびデオキシアデノシンの、未熟なリンパ系細胞中での毒性の蓄積に起因する。この障害の発症はまた、遺伝した突然変異によって、幼児期から成人に及んでもよい。ＡＤＡ１の不全は、小児の重症複合免疫不全(ＳＣＩＤ)の主な原因の１つであって、遺伝子治療アプローチの主な標的の１つである(R. Parkman et al., 2000,”Gene therapy for adenosine deaminase deficiency”, Ann. Rev. Med., 51:33-47)。
【０６４９】
本明細書に提供されるＡＤＡ２、例えば、野性型、変異型、コンジュゲート(例えば、ＰＥＧ化ＡＤＡ２)または他の修飾型は、ＳＣＩＤまたは他のＡＤＡ１媒介性の免疫不全症の処置に用いられ得る。免疫不全症は一般には、後天性の免疫不全症または遺伝した免疫不全症のいずれかに分類される。後天性の免疫不全症としては、ヒト免疫不全症ウイルス−１(ＨＩＶ−１)感染、ヘルペスウイルス感染、エプスタイン−バーウイルス感染、癩腫癩および火傷患者の皮膚の火傷から生じる免疫能低下、すなわち火傷関連免疫不全症が挙げられる。遺伝した免疫不全症としては、ＳＣＩＤのいくつかの遺伝的に異なる形態、例えば、アデノシンデアミナーゼ不全依存性ＳＣＩＤ(ＡＤＡ  ＳＣＩＤ)、Ｂ細胞の有無による常染色体劣性ＳＣＩＤ(ＡＤＡ欠損なし)、Ｂ細胞なしの劣性のＸ連鎖ＳＣＩＤ、常染色体劣性ＳＣＩＤ(ＡＤＡ欠損あり)、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症(ＰＮＰ  ＳＣＩＤ)、重症複合免疫不全(ＩＬ−２受容体欠損症；すなわち、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ)および露出リンパ球症候群が挙げられる。他の免疫不全症としては、種々の形態の先天性または遺伝的に決定された造血系の異常、重度の高リスク白血病およびいくつかの型の重症の生命にかかわる再生不良性貧血が挙げられる。処置され得るさらに他の免疫不全症としては、ウィスコット・アルドリッチ症候群；ブラックファン−ダイアモンド症候群；ファンコーニ貧血；重症好中球機能不全；小児の慢性肉芽腫性疾患；重症(コストマン型)無顆粒球症；軟骨毛髪形成不全の免疫不全症および好中球減少症；幼児期および後発性の骨粗しょう症；再生不良性貧血−毒性化学、特発性、免疫学的および遺伝的(非ファンコーニ)；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；バーキットリンパ腫および再発性急性リンパ性白血病が挙げられる。特別な例では、処置される免疫系障害は、アデノシンデアミナーゼ欠損依存性の重症複合免疫不全症(ＡＤＡ  ＳＣＩＤ)である。
【０６５０】
２. 患者選択の方法
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載されるアデノシン関連バイオマーカーのレベルに基づいた、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置のための患者選択の方法である。例示的なアデノシン関連のバイオマーカーとしては、血漿アデノシンレベル、アデノシン受容体(ＡＤＲ)レベルおよびエクトヌクレオチダーゼレベルが挙げられる。
【０６５１】
例えば、血漿または他の試料中のアデノシンレベルの上昇がある対象は、ＡＤＡ２を用いる処置に対してより反応性であり得る。なぜなら、ＡＤＡ２投与の効果は、上昇した細胞外アデノシンレベルを直接低下するからである。別の例では、腫瘍試料などの試料中のＡ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体など、上昇したまたは高レベルのＡＤＲを発現する対象は、ＡＤＡ２を用いる処置に対してさらに反応性であり得る。なぜなら、アデノシンおよび腫瘍増殖に対する効果は、腫瘍細胞上で発現されるＡＤＲに対して結合することによって直接媒介され得るからである。さらなる例では、腫瘍試料または他の試料中のＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼのレベルまたは発現が上昇している対象は、ＡＤＡ２を用いる処置に対してさらに反応性であり得る。なぜなら、ＣＤ３９およびＣＤ７３の発現の増大は、アデノシンレベルの上昇につながり、そしてＡＤＲを通じたシグナル伝達を介するアデノシンレベルの上昇は、下流のがん促進性効果を有するからである。したがって、これらのバイオマーカーを用いて、処置に対して反応性であると予想される患者を選択もしくは特定するかおよび／または処置および処置の有効性をモニターし、それによって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いて、腫瘍またはがんなどの、アデノシン関連疾患または状態の改良された処置レジメンを得る。
【０６５２】
ａ. アデノシン関連バイオマーカー
本明細書に提供されるのは、ＡＤＡ２を用いる処置が適用可能な腫瘍を有する患者を選択する方法である。本明細書に提供される方法は、アデノシンレベルの上昇と関連するかおよび／または処置される対象におけるアデノシンもしくはデオキシアデノシンレベルの低下の影響を受けやすい状態および疾患を処置することに適用可能である。例えば、このような状態または疾患としては、腫瘍またはがんが挙げられる。アデノシン関連のバイオマーカーのレベル、例えば、血漿アデノシンレベル、アデノシン受容体(ＡＤＲ)レベルおよびエクトヌクレオチダーゼレベルは、アデノシン関連の疾患もしくは状態の診断もしくは予後診断に、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２もしくは併用療法に対するアデノシン関連の疾患もしくは状態を有する対象の応答性を予測するためおよび／または、本明細書に提供されるＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)を用いて処置されたアデノシン関連の疾患もしくは状態を有する対象の処置の有効性をモニターもしくは予測するために用いられ得る。
【０６５３】
本明細書に提供される任意の例では、アデノシン関連の疾患または状態とは、アデノシンレベルが、その疾患または状態において原因として、結果として上昇されるか、そうでなければ観察される、疾患および状態である。例示的なアデノシン関連の疾患または状態としては、限定するものではないが、がん、腫瘍、炎症性疾患、感染、ならびにアデノシンレベルの上昇に関連するかおよび／または処置される対象でのアデノシンまたはデオキシアデノシンレベルの低下の影響を受けやすい他の状態および疾患が挙げられる。具体的には、アデノシン関連の疾患および状態としては、限定するものではないが、細胞外環境におけるアデノシンレベルの上昇があるがん、例えば、低酸素である固形腫瘍を含む腫瘍が挙げられる。本明細書に提供されるのは、アデノシン関連のバイオマーカーの測定および本明細書に提供される任意のＡＤＡ２での処置のための対象の選択を包含する処置の方法である。
【０６５４】
ｉ. 血漿アデノシンレベル
一例では、患者または対象は、血漿などの試料中の細胞外アデノシンのレベルまたは発現に基づいて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置のために選択され得る。他の例では、特定の腫瘍の腫瘍微小環境における細胞外アデノシンのレベルを用いてもよい。血漿のアデノシンレベルは、クロマトグラフィーベースの方法を含む、当該分野で公知の任意の方法を用いて測定してもよい。当該分野で公知のアッセイを用いて血漿試料中のアデノシンレベルを評価、定量、決定および／または検出することは、当業者の水準の範囲内である。アッセイには、インビトロアッセイまたはインビボアッセイが挙げられる。試料中のアデノシンレベルを、評価、推定、決定、定量および／またはそうでなければ特異的に検出するために用いられ得る例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)ベースのアッセイ[例えば、Jackson and Ohnishi(1987) Hypertension 10:189-197を参照のこと]、分光光度的な方法、放射性酵素アッセイ[例えば、German and Kredich(1984) Anal Biochem. 142(2):536-541を参照のこと]、微小電極ベースの検出およびインビボ画像化法、例えば、生物発光ベースの方法が挙げられる。いくつかの例では、血漿アデノシンレベルは、アデノシンを蛍光誘導体、例えば、アデノシンレベルの検出のための１,Ｎ６−エタノアデノシンに変換する反応を利用する改変ＨＰＬＣ法を用いて検出され得る[Howard et al.(1998) Investigative Opthalmology & Visual Science, 39(10):1942-1946]。
【０６５５】
ii. アデノシン受容体(ＡＤＲ)
アデノシン受容体(ＡＤＲ)の発現のレベルは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置のための患者または対象の選択のためのバイオマーカーとして用いられ得る。具体的には、腫瘍細胞および／または腫瘍免疫に関与する免疫細胞中で発現されるＡＤＲ、例えば、Ａ２Ａ(配列番号５３４に記載するアミノ酸配列)およびＡ２Ｂ(配列番号５３５に記載するアミノ酸配列)のアデノシン受容体を用いてもよい。Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体などの、上昇したかまたは高いレベルのＡＤＲを発現する腫瘍は、ＡＤＡ２を用いる処置に対してさらに反応性であり得る。なぜなら、アデノシンおよび腫瘍増殖に対する効果は、腫瘍細胞で発現されるＡＤＲに対するアデノシン結合によって媒介され得る。いくつかの腫瘍は、上昇した発現のＡＤＲ、特にＡ２ＡおよびＡ２Ｂを有し、これらの受容体の発現は、下流のがん促進性効果を有する。他の例では、アデノシンシグナル伝達は、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の刺激を通して、内皮炎症性プロセスおよび腫瘍血管形成を調節する。他の例では、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体などのＡＤＲの発現は、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の活性化および分化に対して阻害性の効果を有する。したがって、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体などのＡＤＲの測定を用いて、アデノシンレベルの上昇に関連するかおよび／またはアデノシンもしくはデオキシアデノシンレベルの低下の影響を受けやすい、がんを含む腫瘍を選択してもよい。Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体などのＡＤＲのレベルは、処置に対して応答性であることが予測される患者を選択もしくは特定するためおよび／または、処置および処置の有効性をモニターし、それによって、腫瘍またはがんなどの、アデノシン関連の疾患または状態の改善された処置レジメンを提供するために用いてもよい。
【０６５６】
例えば、患者または対象は、腫瘍を有するかまたは腫瘍を有すると疑われる対象由来の腫瘍または液体試料など、試料中のＡ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体のレベルまたは発現に基づいて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いて処置について選択され得る。ＡＤＲ、例えば、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体の発現のレベルは、細胞上の細胞外受容体のレベルを決定するための当該分野で公知の任意の方法を用いて測定され得る。当該分野で公知のアッセイを用いて、試料中のＡ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体のレベルなどのＡＤＲのレベルを、評価、定量、決定および／または検出することは当業者の水準の範囲内である。アッセイには、インビトロアッセイまたはインビボアッセイが挙げられる。試料中のＡ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体のレベルなどのＡＤＲのレベルを、評価、推定、決定、定量および／またはそうでなければ特異的に検出するために用いられ得る例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、固相結合アッセイ[例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)]、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、免疫放射定量測定法、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ウエスタンブロットおよび組織化学的方法、例えば、免疫組織化学(ＩＨＣ)または偽免疫組織化学(非抗体結合剤を用いる)が挙げられる。固相結合アッセイ方法では、このようなＥＬＩＳＡ方法、例えば、アッセイは、サンドイッチ方式であってもよくまたは競合阻害方式であってもよい。他の例では、インビボの画像化法を用いてもよい。
【０６５７】
本明細書に提供される方法は、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体などのＡＤＲに対する抗体を用いて、腫瘍を有するかまたは腫瘍を有すると疑われる対象由来の腫瘍または液体試料などの試料中における、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体のタンパク質レベルなどのＡＤＲタンパク質レベルの測定に関する。アデノシン受容体Ａ２Ａに対する例示的な抗体としては、Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX；カタログ番号ｓｃ−７０３２１)、Abcam(Cambridge, UK；カタログ番号ａｂ３４６１)およびEMD Milipore(Billerica, MA；カタログ番号ＡＢ１５５９Ｐ)の抗体が挙げられる。アデノシン受容体Ａ２Ｂに対する例示的な抗体としては、Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX；カタログ番号ｓｃ−７５０５)、Abcam(Cambridge, UK；カタログ番号ａｂ４０００２)およびEMD Milipore(Billerica,MA；カタログ番号ＡＢ１５８９Ｐ)の抗体が挙げられる。この抗体は、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫放射測定法、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイおよびウエスタンブロットなどの方法を用いて、試料中のＡＤＲタンパク質レベルを検出するために用いられ得る。この抗体は、ビオチン、蛍光部分、放射性標識または他の検出可能標識に対する直接または間接的なコンジュゲーションによって修飾され得る。他の例では、検出可能な標識にコンジュゲートされる二次抗体を用いてもよい。
【０６５８】
ＡＤＲレベル、例えば、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体のレベルはまた、インビボ画像化方法を用いて決定してもよい。例えば、ポジトロン放出体である炭素−１１(１１Ｃ)、例えば１１Ｃ−ＳＣＨ４４２４１６、１１Ｃ−ＫＦ１７８３、１１Ｃ−ＫＦ１８４４６、１１Ｃ−ＫＦ１９６３１、１１Ｃ−ＣＳＣ、１１Ｃ−ＫＷ−６００２および１１Ｃ−ＴＭＳＸで放射性標識した、Ａ２Ａ受容体アンタゴニスト活性を有する、キサンチン誘導体の投与を用いるポジトロン放出断層撮影(ＰＥＴ)[Grachev et al.(2014) Journal of Diagnostic Imaging in Therapy 1(1):1-19]。
【０６５９】
Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体のものなど、ＡＤＲレベルを決定する他の方法としては、核酸ベースの方法、例えば、逆転写酵素連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、ハイスループットトランスクリプトーム配列決定および他のそのような方法が挙げられる。
【０６６０】
iii. エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３
腫瘍細胞中で発現される、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３の発現のレベルを、本明細書で提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置について患者または対象の選択のためのバイオマーカーとして用いてもよい。ＣＤ３９およびＣＤ７３は、アデノシン三リン酸(ＡＴＰ)から細胞外アデノシンを生成するエクトヌクレオチダーゼである。ＣＤ３９(エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１；ＥＣ３.６.１.５；配列番号５４２に記載するアミノ酸配列)は、細胞外ＡＴＰを代謝して、アデノシン二リン酸(ＡＤＰ)およびアデノシン一リン酸(ＡＭＰ)を生成し、ならびにＣＤ７３(エクト−５’−ヌクレオチダーゼ；ＥＣ３.１.３.５；配列番号５４３に記載するアミノ酸配列)はＡＭＰを代謝して、アデノシンを生成する。ＣＤ３９およびＣＤ７３は、低酸素症、虚血、炎症、腫瘍環境または外傷などの、アデノシンレベルの急激な上昇と関連する状態の間の細胞外アデノシンの主な供給源である。これらの状態では、細胞外ＡＴＰが増大し、これが、ＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼの作用によって、アデノシンレベルのその後の増大につながる。特定のがんの種類では、ＣＤ３９およびＣＤ７３のレベルは過剰発現され、上昇したＣＤ７３のレベルは、良くない予後予測および早期の腫瘍再発の高さと関連している。したがって、エクトヌクレオチダーゼＣＤ３９およびＣＤ７３の発現のレベルは、アデノシンレベルの上昇を伴う腫瘍のためおよび本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いた処置のための患者の選択のためのバイオマーカーとして用いられ得る。
【０６６１】
例えば、患者または対象は、腫瘍を有するかもしくは腫瘍を有すると疑われる対象由来の腫瘍もしくは液体試料または免疫細胞など、試料中のＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼのレベルまたは発現に基づいて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いて処置について選択され得る。ＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼの発現のレベルは、原形質膜または細胞外タンパク質のレベルを決定するための当該分野で公知の任意の方法を用いて測定され得る。当該分野で公知のアッセイを用いて、試料中のＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼの発現のレベルを、評価、定量、決定および／または検出することは当業者の水準の範囲内である。アッセイには、インビトロアッセイまたはインビボアッセイが挙げられる。試料中のＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼの発現のレベルを、評価、推定、決定、定量および／またはそうでなければ特異的に検出するために用いられ得る例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、固相結合アッセイ[例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)]、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、免疫放射定量測定法、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、ウエスタンブロットおよび組織化学的方法、例えば、免疫組織化学(ＩＨＣ)または偽免疫組織化学(非抗体結合剤を用いる)が挙げられる。固相結合アッセイ方法では、このようなＥＬＩＳＡ方法、例えば、アッセイは、サンドイッチ方式であってもよくまたは競合阻害方式であってもよい。他の例では、インビボの画像化法を用いてもよい。
【０６６２】
本明細書に提供される方法は、ＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼに対する抗体を用いて、腫瘍を有するかまたは腫瘍を有すると疑われる対象由来の腫瘍もしくは液体試料など、試料中のＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼの測定に関する。ＣＤ３９に対する例示的な抗体としては、Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX；カタログ番号ｓｃ−６５２６２), Abcam(Cambridge, UK；カタログ番号ａｂ４９５８０)およびEMD Milipore(Billerica, MA；カタログ番号０４−９７３)由来の抗体が挙げられる。ＣＤ７３に対する例示的な抗体としては、Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX；カタログ番号ｓｃ−８５０２)、Abcam(Cambridge, UK；カタログ番号ａｂ４０５６)およびEMD Milipore(Billerica,MA；カタログ番号ＩＨＣＲ２０２３−６)由来の抗体が挙げられる。この抗体を用いて、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫放射測定法、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイおよびウエスタンブロットなどの方法を用いて、試料中のＡＤＲタンパク質レベルを検出してもよい。この抗体は、ビオチン、蛍光部分、放射性標識または他の検出可能標識に対する直接的または間接的なコンジュゲーションによって修飾されてもよい。他の例では、検出可能標識にコンジュゲートされる二次抗体を用いてもよい。
【０６６３】
ＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼレベルを決定する他の方法としては、核酸ベースの方法、例えば、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ−ＰＣＲ)、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、ハイスループットトランスクリプトーム配列決定および他のこのような方法が挙げられる。
【０６６４】
ｂ. 患者選択
一旦、バイオマーカーのレベル、例えば、血漿アデノシンレベル、Ａ２ＡまたはＡ２ＢなどのＡＤＲのレベルまたはＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼのレベルの量が決定されれば、その量を対照または閾値のレベルと比較してもよい。対照または閾値のレベルは一般には、アデノシンレベルの上昇と関連する疾患または状態(例えば、腫瘍またはがん)の指標である所定の閾値のレベルまたは量である。このようなレベルまたは量は、当業者によって経験的に決定され得る。本明細書の方法に関する特定の所定の選択または分類の基準は、アデノシン関連のバイオマーカーのレベルを検出するために用いられる特定のアッセイおよび試験されている特定の試料に依存する。あるアッセイが特定の試料を試験することに適合するか否かを決定することは当業者の水準の範囲内である。インビトロの固相アッセイまたは高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)ベースのアッセイを、体液試料を試験するために用いてもよい。組織化学または免疫組織化学などのアッセイを、組織試料を試験するために用いてもよい。所定のレベルもしくは量に対してまたは対照もしくは参照の試料に対しての比較を包含する方法では、同じ種類の試料を用いて、ならびに同じアッセイおよび試薬(同じ検出部分および検出方法を含む)を用いて参照を行うことも理解される。
【０６６５】
例えば、所定の閾値レベルは、レベルまたは発現での相違を評価するために、対象の集団中のマーカーの中央または平均のレベルまたは量など、参照または対照の試料中のマーカーのレベルまたは量に基づいて決定され得る。一例では、所定の閾値レベルは、健康な対象またはアデノシンレベルの上昇に関連する状態もしくは疾患(例えば、腫瘍またはがん)を有することが既知の対象由来の試料中のアデノシン関連バイオマーカーの平均または中央のレベルまたは量を示し得る。一態様では、正常な組織または体液試料由来のアデノシン関連のバイオマーカーの所定のレベルまたは量は、正常な試料(例えば、全ての正常な分析された試料)中で観察される平均のレベルまたは量である。別の態様では、正常な組織または体液試料由来のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量は、正常な試料中で観察されるレベルまたは量についての中央値である。所定の閾値レベルはまた、細胞株または他の対照試料(例えば、腫瘍細胞株)中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量に基づき得る。本明細書において記載されるとおり、これらの所定の値は、同じ検出のアッセイによって、ならびに同じ試薬、例えば、同じ抗体および検出方法を用いて決定される対応する正常な試料中のアデノシン関連のバイオマーカーレベルの比較または知識によって決定され得る。
【０６６６】
参照または対照の試料は、別の組織、細胞または体液、例えば、正常な組織、細胞または体液、例えば、組織、細胞または体液であってもよく、これは、試験されている試料と同様であって、種々の対象から単離される。対照または参照の対象は、正常な(すなわち、疾患も状態も有さない)対象または対象集団、疾患は有するが、試験されている対象が有するかまたは有すると疑われる種類の疾患も状態も有さない対象、例えば、アデノシンレベルの上昇に関連する状態も疾患(例えば、腫瘍またはがん)も有さない対象または同様の疾患もしくは状態を有するが、その疾患は、それほど重篤でないかおよび／または比較的低いアデノシン関連のバイオマーカーを発現する別の対象由来の類似の組織であり得る。例えば、試験されている細胞、組織または体液が、がんを有する対象または対象集団である場合、マーカーのレベルまたは量を、重度の低いがん、例えば、早期段階か、分化したかまたは他の種類のがんを有する対象由来の組織、細胞または体液中のマーカーのレベルまたは量と比較してもよい。別の例では、対照または参照の試料は、体液、組織、抽出物(例えば、細胞または核抽出物)、核酸またはペプチド調製物、細胞株、生検、標準または他の試料(アデノシン関連のバイオマーカーの既知量または相対量を有する)、例えば、このような細胞株を用いて生成される腫瘍モデル由来の腫瘍細胞株または腫瘍などの試料である。
【０６６７】
本明細書の任意の方法では、アデノシンレベルの上昇に関連する状態または疾患(例えば、がん)を有すると疑われるかまたは有することが既知の対象由来の試料中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルは、参照または正常な組織中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルの決定と同時に決定され得る。あるいは、アデノシンレベルの上昇に関連する状態または疾患(例えば、がん)を有すると疑われるかまたは有することが既知の対象由来の試料中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルを、正常な組織または体液中で以前に決定されるアデノシン関連のバイオマーカーのレベルと比較してもよい。したがって、正常もしくは健康な試料または任意の検出、比較、決定もしくは評価に使用される他の参照試料中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルは、ヒト患者由来の試料中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量のなんらかの検出、決定または評価の前に決定されたレベルまたは量であり得る。
【０６６８】
アデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量は、疾患に関連するアデノシン関連のバイオマーカーの所定の表現型に対して決定されるかおよび／またはスコア付けされて比較される。特定の疾患、アデノシン関連のバイオマーカーの検出の用いられるアッセイおよび／または用いられている検出試薬に依存して、疾患診断のための閾値レベルを決定することは当業者の水準の範囲内である。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置に対する反応性を分類するためにアデノシン関連のバイオマーカーの閾値レベルを決定することは当業者の水準の範囲内である。処置のための対象の診断、予後予測または選択のために腫瘍試料または体液試料を層別化するための例示的な方法は本明細書に示す。
【０６６９】
特定の変化、例えば、アデノシン関連のバイオマーカーの増大または低下は、用いられるアッセイに依存することが理解される。ＥＬＩＳＡでは、特定の波長での吸収でまたはタンパク質の量での増大または低下の倍数(例えば、標準曲線を用いることによって決定される)を、対照に対して表現してもよい。ＲＴ−ＰＣＲなどのＰＣＲアッセイでは、発現レベルは、標準を用いるなど、当該分野で公知の方法を用いて、対照の発現レベル(例えば、倍数の変化として表す)と比較してもよい。
【０６７０】
本明細書における方法の特定の例では、対象は、アデノシン関連のバイオマーカーの量が、試料中で上昇されると確認された場合、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる治療のための候補として選択される。例えば、健康または正常な対象と比較して、疾患の対象における上昇または蓄積したアデノシン関連のバイオマーカーレベルは、アデノシンレベルの上昇に関連する状態または疾患(例えば、腫瘍またはがん)の指標である。アデノシン関連のバイオマーカーは、０.５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上増大され得る。したがって、本明細書の方法の例では、対象由来の試料中のアデノシン関連のバイオマーカーの量が試験されている場合、マーカーの検出によって、対象由来の試料(例えば、がん性細胞、組織または体液)中のアデノシン関連のバイオマーカーの量が既定レベルまたは量または対照試料と比較して、上昇されていることが決定され得る。一例では、この対象は、組織、細胞または体液中のアデノシン関連のバイオマーカーの量が、既定レベルまたは量または対照試料と比較して、約０.５倍、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、５００倍、１０００倍またはそれ以上上昇されているかまたはほぼそれくらい上昇されている場合、アデノシンレベルの上昇と関連する状態または疾患を有することが確認される。
【０６７１】
対象は、対象由来の試料(例えば、血漿)中のアデノシンレベルのレベルまたは量に基づいて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)を用いる治療の候補として選択され得る。例えば、０.１ｍＭより大きい、例えば、０.１ｍＭ、０.２ｍＭ、０.３ｍＭ、０.４ｍＭ、０.５ｍＭ、０.６ｍＭ、０.７ｍＭ、０.８ｍＭ、０.９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭまたはそれ以上の血漿アデノシンレベルは、腫瘍またはがんの存在と相関する。このような方法を用いて、本明細書に提供される例示的な方法では、対象は、体液試料、例えば、血漿試料中のアデノシンのレベルが、０.１ｍＭより大きい、例えば、０.１ｍＭ、０.２ｍＭ、０.３ｍＭ、０.４ｍＭ、０.５ｍＭ、０.６ｍＭ、０.７ｍＭ、０.８ｍＭ、０.９ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭまたはそれ以上である場合、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置に選択され得る。
【０６７２】
対象は、細胞または組織試料中のＡ２Ａ(配列番号５３４)およびＡ２Ｂ(配列番号５３５)アデノシン受容体またはＣＤ３９(配列番号５４２)およびＣＤ７３(配列番号５４３)エクトヌクレオチダーゼなどの、ＡＤＲなどのアデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量に基づいて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる治療の候補として選択され得る。このような例では、このレベルが疾患の指標であるならば、患者は、アデノシンレベルの上昇と関連する状態または疾患と診断される。例えば、染色の割合が高ければ、その対象が、アデノシン関連のバイオマーカー、例えば、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂアデノシン受容体などのＡＤＲまたはＣＤ３９およびＣＤ７３エクトヌクレオチダーゼが上昇した腫瘍を有することを示し、これは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置から利益があり、したがって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置のための候補である腫瘍の存在の指標である。他の例では、対象は、アデノシン関連のバイオマーカー染色の程度が、例えば、総染色面積のうち１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上であり、かつ一般には少なくとも２５％以上である場合、染色の割合に基づいて、本明細書で提供される任意のＡＤＡ２での処置のために選択され得る。組織化学的方法を用いて、検出されるアデノシン関連のバイオマーカーの量を定量して、アデノシン関連のバイオマーカー陽性のピクセルおよび／またはスコアの割合として示す。例えば、試料中で検出されるアデノシン関連のバイオマーカーの量は、アデノシン関連のバイオマーカー陽性のピクセルの割合として定量され得る。いくつかの例では、試料中に存在するアデノシン関連のバイオマーカーの量は、染色される面積の割合、例えば、アデノシン関連のバイオマーカー陽性のピクセルの割合として定量される。例えば、試料は、総染色面積と比較して、少なくともまたは少なくとも約または約０、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは以上のアデノシン関連のバイオマーカー陽性のピクセルを有してもよい。
【０６７３】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いる処置の有効性または、処置に対する応答性はまた、対象中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量を経時的に比較することによってモニターされ得る。アデノシン関連のバイオマーカーのレベルまたは量の変化を用いて、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いた処置の投与または計画を最適化してもよい。この方法では、処置された対象由来の試料中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルを、所定のレベルのアデノシン関連のバイオマーカーと比較する。
【０６７４】
処置をモニタリングする目的のために、所定のレベルのアデノシン関連のバイオマーカーは、正常もしくは健康な対象、処置前のベースラインのアデノシン関連のバイオマーカーの値、処置後早期に同じ対象における、前に測定されたアデノシン関連のバイオマーカーのレベル、疾患進行または退行に関連することが既知のアデノシン関連のバイオマーカーレベルの分類もしくは層別化由来であり得る。例えば、アデノシン関連のバイオマーカーレベルが、比較された参照または対照の試料とほぼ同じかまたは低い(または低下している)場合、その処置は、有効であることが示され、その処置は、継続されてもまたは中断されてもまたは変更されてもよい。例えば、所定のレベルのアデノシン関連のバイオマーカーは、正常または健康な組織試料由来のアデノシン関連のバイオマーカーレベルであってもよく、処置後に対象で測定されたアデノシン関連のバイオマーカーのレベルが、正常なアデノシン関連のバイオマーカーレベルよりも高いならば、処置は、再開されるかまたは継続される。例えば、所定のレベルのアデノシン関連のバイオマーカーは、処置前のベースラインのアデノシン関連のバイオマーカー値から決定されたアデノシン関連のバイオマーカーのレベルであり得、そして処置の経過は、適宜決定され得る。例えば、アデノシン関連のバイオマーカーのレベルが、ベースラインのレベルと同じであれば、処置は継続されるかまたは再開される；アデノシン関連のバイオマーカーのレベルが、ベースラインのレベルより高ければ、処置は継続されるか、もしくは再開されるかまたは処置は加速されるかもしくは増大される(例えば、ＡＤＡ２の投薬量を増大することによりまたは投薬レジメン周期の投薬スケジュールを増大することにより)；アデノシン関連のバイオマーカーがベースラインのレベル未満であるならば、処置は継続されるかもしくは再開されるか、終結されるかまたは低下されるか、もしくは減少される(例えば、ＡＤＡ２の投薬量を低下することによりまたは投薬レジメン周期の投薬スケジュールを減少することにより)。さらなる例では、所定のレベルのアデノシン関連のバイオマーカーは、同じ対象の処置の早期の経過において前の測定で決定された、アデノシン関連のバイオマーカーレベルであってもよい。例えば、アデノシン関連のバイオマーカーのレベルが、早期に測定されたレベルと同じであるならば、処置は継続されるかまたは再開される；アデノシン関連のバイオマーカーのレベルが、早期に測定されたレベルよりも高いならば、処置は継続されるかもしくは再開されるかまたは処置は加速されるかもしくは増大される(例えば、ＡＤＡ２の投薬量を増大することによりまたは投薬レジメン周期の投薬スケジュールを増大することにより)；アデノシン関連のバイオマーカーのレベルが早期に測定されたレベル未満であるならば、処置は継続されるかもしくは再開されるか、終結されるかまたは低下されるか、もしくは減少される(例えば、ＡＤＡ２の投薬量を低下することによりまたは投薬レジメン周期の投薬スケジュールを減少することにより)。
【０６７５】
モニタリング方法または処置の有効性を決定する方法では、特定の治療を処置の経過の間に変更して、個々の応答を最大にしてもよい。処置の投薬およびスケジュールは、レベルの変化に応答して改変してもよい。他の抗がん剤など、他の治療剤を用いる併用療法も、このような処置法で使用してもよい。処置の正確な経過を決定することは処置医師の技術水準内である。例えば、処置は、投薬量、スケジュール(例えば、投与頻度)またはレジメンが、適宜調節されるように変更されても、例えば、中断、低下もしくは頻度減少されてもまたはその疾患もしくは状態のための別の処置と組み合わされてもよい。他方では、アデノシン関連のバイオマーカーレベルが、比較の参照または対照の試料を上回るならば、患者は、処置に対して応答しないことが示される。このような場合、ＡＤＡ２または併用療法などの治療剤の特定の性質または種類をモニターしても、変化してもよい。他の場合には、投薬量、量、スケジュールおよび／またはレジメンは、適宜調節されてもよく、例えば、増大されるかまたはさらに頻繁にされてもよい。処置の正確な経過を決定することは処置医師の水準の範囲内である。
【０６７６】
処置の有効性をモニタリングする目的のために、所定のレベルまたは量のアデノシン関連のバイオマーカーは、経験的に決定され得、それによって、そのレベルまたは量は、その処置が機能していることを示す。これらの所定の値は、検出の同じアッセイによっておよび同じ試薬を用いて、決定される、対応する正常な試料または疾患の対象の試料中のアデノシン関連のバイオマーカーレベルの比較または知識によって決定され得る。例えば、定量スコアスキームを用いて免疫組織化学的方法によって評価される、高レベルのアデノシン関連のバイオマーカーまたは２５％より大きいアデノシン関連のバイオマーカーの腫瘍染色の割合は、ある範囲のがんの種類にまたがる悪性疾患の存在と相関し、患者が処置に応答しないことが示される。
【０６７７】
本明細書の方法では、所定のレベルに対する比較または対照もしくは参照の試料のレベルに対する比較は、当業者に公知の任意の方法によって決定され得る。例えば、アデノシン関連のバイオマーカーのレベルと、参照、対照または所定のレベルとの比較は、自動のシステム、例えば、ソフトウェアプログラムまたは情報システム(アッセイが行われる装備(例えば、コンピュータープラットフォーム)の一部であるかまたはそれと適合する)によって行われ得る。あるいは、この比較は、医師または他の訓練を受けた者、もしくは経験のある専門家もしくは技術者によって行われてもよい。
【０６７８】
３. 投薬量および投与
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、単回投与または複数回投与のための医薬組成物として製剤化されてもよい。ＡＤＡ２ポリペプチドは、この組成物中に、処置される患者に対する望ましくない副作用の非存在下で治療上有用な効果を発揮するために十分な量で含まれる。治療上有効な濃度は、本明細書に提供されるかまたは当該分野で公知のアッセイを用いることなどにより、公知のインビトロおよびインビボのシステムでそのポリペプチドを試験することによって、経験的に決定され得[例えば、Taliani et al.(1996) Anal. Biochem., 240: 60-67;Filocamo et al.(1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al.(1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Bouffard et al.(1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al.(1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake et al.(1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al.(1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al.(1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita et al.(1997) Anal. Biochem., 247:242-246を参照のこと;また、例えば、Shimizu et al.(1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani et al.(1996) J. Virol. 70:7219-7223;Mizutani et al.(1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci., 93:1412-1417; Hahm et al.,(1996) Virology, 226:318-326;Ito et al.(1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054;Mizutani et al.(1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho et al.(1997) J. Virol. Meth. 65:201-207も参照のこと]、次いで、ヒトへの投与についてそれから推定され得る。
【０６７９】
疾患または状態の処置のために投与される本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、インビトロアッセイおよび動物モデルを使用して、最適の投与範囲を特定することを補助してもよい。経験的に決定され得る正確な投薬量は、特定の剤、投与経路、処置される疾患の種類および疾患の重篤性に依存し得る。ある態様においては、投与される組成物は、本明細書において提供される変異型ＡＤＡ２ポリペプチドをコードする核酸、例えば、腫瘍崩壊性ウイルスベクターもしくは遺伝子治療ベクターまたは養子免疫治療のための修飾された免疫細胞などの細胞を含んでもよい。特定の投薬量は、特定の投与経路、特定の疾患または状態、疾患または状態の重篤度、特定の製剤および当業者の水準の範囲内の他の要因に依存し得る。
【０６８０】
したがって、正確な投薬量および処置期間は、処置されている疾患の関数であって、経験的に、公知の試験プロトコールを用いてまたはインビボもしくはインビトロの試験データから推定によって決定され得ることが理解される。濃度および投薬範囲はまた、緩和されるべき状態の重篤度に応じて変化し得ることにも注意すべきである。任意の特定の対象に関しては、特定の投薬レジメンが、個々の必要性および組成物の投与を施すかまたは監督する人の専門的な判定に応じて経時的に調節されるべきであること、ならびに本明細書に示される濃度範囲は例示であるにすぎず、組成物およびそれらを含む組合せの範囲または使用を制限する意図はないことがさらに理解されるべきである。この組成物は、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年または１回投与されてもよい。一般には、投薬レジメンは、毒性を制限するために選択される。担当医は、毒性、あるいは骨髄、肝臓もしくは腎臓または他の組織機能不全に起因して治療を終わらせるか、中断するかまたは低用量に調節する方法および時期を承知していることに注意すべきである。逆に、担当医はまた、臨床の応答が不十分である場合(毒性の副作用は除外)、処置を高レベルに調節する方法および時期についても承知している。
【０６８１】
当業者は、臨床設定では、ヒトまたは動物などの個々の対象の腫瘍の臨床応答および副作用のプロファイル次第で、投与のための本明細書に提供されるＡＤＡ２の個々の投薬量を決定する。例えば、本明細書に提供されるＰＥＧ化したＡＤＡ２の組成物は、２５Ｕ／ｍＬで製剤化されてもよい。２５ｇのマウスにこの製剤の０.２ｍＬを注射する場合、これは、体重１ｋｇあたり２００Ｕになる。当業者は、ヒトについてほぼ１６Ｕ／体重ｋｇという、体表面積に基づいた、ヒト等価用量(human equivalent dose：ＨＥＤ)を決定し得る。適切なＨＥＤは、体表面積または体重ベースの変換を用いて算出してもよい[Reagan-Shaw et al.(2008) The FASEB Journal 22(3):659-661]。
【０６８２】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の用量の範囲は、１０ｍＵ／体重ｋｇ〜５０Ｕ／体重ｋｇ以上であってもまたはほぼその値であってもよい。例えば、単回用量は、１０ｍＵ／体重ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ、２０ｍＵ／ｋｇ、３０ｍＵ／ｋｇ、４０ｍＵ／ｋｇ、５０ｍＵ／ｋｇ、６０ｍＵ／ｋｇ、７０ｍＵ／ｋｇ、８０ｍＵ／ｋｇ、９０ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ、２００ｍＵ／ｋｇ、３００ｍＵ／ｋｇ、４００ｍＵ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ、６００ｍＵ／ｋｇ、７００ｍＵ／ｋｇ、８００ｍＵ／ｋｇ、９００ｍＵ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ、２Ｕ／ｋｇ、３Ｕ／ｋｇ、４Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ、６Ｕ／ｋｇ、７Ｕ／ｋｇ、８Ｕ／ｋｇ、９Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ、２０Ｕ／ｋｇ、３０Ｕ／ｋｇ、４０Ｕ／ｋｇまたは５０Ｕ／体重ｋｇであってもよい。他の例では、単回用量は、１０ｍＵ／体重ｋｇ〜５０Ｕ／体重ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜４０Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜３０Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜２０Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜１０Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜９Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜８Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜７Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜６Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜５Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜４Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜３Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜２Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜１Ｕ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜９００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜８００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜７００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜６００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜５００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜４００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜３００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜２００ｍＵ／ｋｇ、１０ｍＵ／ｋｇ〜１００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜５０Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜４０Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜３０Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜２０Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜１０Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜９Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜８Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜７Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜６Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜５Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜４Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜３Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜２Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜１Ｕ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜９００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜８００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜７００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜６００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜５００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜４００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜３００ｍＵ／ｋｇ、１００ｍＵ／ｋｇ〜２００ｍＵ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜５０Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜４０Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜３０Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜２０Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜１０Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜９Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜８Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜７Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜６Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜５Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜４Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜３Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜２Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜１Ｕ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜９００ｍＵ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜８００ｍＵ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜７００ｍＵ／ｋｇ、５００ｍＵ／ｋｇ〜６００ｍＵ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜５０Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜４０Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜３０Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜２０Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜１０Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜９Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜８Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜７Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜６Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜５Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜４Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜３Ｕ／ｋｇ、１Ｕ／ｋｇ〜２Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜５０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜４０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜３０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜２０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜１０Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜９Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜８Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜７Ｕ／ｋｇ、５Ｕ／ｋｇ〜６Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ〜５０Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ〜４０Ｕ／ｋｇ、１０Ｕ／ｋｇ〜３０Ｕ／ｋｇおよび１０Ｕ／体重ｋｇ〜２０Ｕ／体重ｋｇであってもまたはほぼその値であってもよい。
【０６８３】
別の例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の用量の範囲は、０.１ｍｇ／体重ｋｇ〜５０ｍｇ／体重ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.９ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.８ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.７ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.６ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.５ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.４ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.３ｍｇ／ｋｇ、０.１ｍｇ／ｋｇ〜０.２ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜０.９ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜０.８ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜０.７ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ〜０.６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／体重ｋｇ〜５０ｍｇ／体重ｋｇであってもまたはほぼその値であってもよい。この用量は、単回で投与され��もまたは複数回投与されてもよい。適切な用量は、投与のレジメンに基づいて、当業者によって決定され得る。特定の期間にまたがる総用量もまた、当業者によって選択され得る。
【０６８４】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)を含む組成物の投与のための最適用量範囲は、血漿モニタリングによって調節され得る。投与の用量は、対象が、血漿ＡＤＡ活性を約１０〜１,０００ｍＭ／時間の範囲で維持し、かつ赤血球アデノシンの低下、すなわち、投与前試料中で測定した場合、濃厚赤血球中の約０.００１〜約０.０５７ｍＭ、例えば、約０.００５〜約０.０１５ｍＭ以下のｄＡＴＰまたは正常アデノシンレベルの総赤血球アデノシン(すなわち、ＡＴＰ＋ｄＡＴＰ含量)の約１％以下を示すような用量であり得る。ｄＡＴＰの正常値は、約０.００１ｍＭ未満である。
【０６８５】
したがって、本明細書に提供される方法は、対象に対して有効量のＡＤＡ２を投与することを包含する、腫瘍を処置する方法を包含する。対象中のアデノシンまたはデオキシアデノシンの組織レベルを低下するための有効量(ここで腫瘍の増殖または伝播は、対象中のアデノシンの実質的に低下した組織レベルによって阻害される)は、当業者によって容易に決定される。また本明細書で提供されるのは、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２での処置について対象を選択するために対象中のアデノシン関連のバイオマーカーのレベルを評価するための方法である。用量または処置レジメンは、本明細書に示される方法を用いて当業者によって決定されるように、処置に対する患者の感受性に基づいて変化されても調節されてもよい。
【０６８６】
本明細書に提供されるＡＤＡ２が、免疫チェックポイント阻害剤、ヒアルロン酸分解酵素または抗腫瘍剤などの別の治療剤と同時に製剤化されるかまたは同時投与される場合、投薬量は、投与される他の治療剤の量に対してある比の量のＡＤＡ２ポリペプチドとして提供されてもよい。例えば、ＡＤＡ２ポリペプチドは、１ＵのＡＤＡ：１Ｕの他の治療剤(１：１)〜５０：１またはそれ以上、例えば、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１またはそれ以上またはほぼその値で投与されてもよい。他の例では、ＡＤＡ２ポリペプチドは、１ＵのＡＤＡ：１Ｕの他の治療剤(１：１)〜１：５０以下、例えば、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、１：５０以下またはほぼその値で投与されてもよい。
【０６８７】
４. 併用療法
本明細書に提供される方法では、本明細書に提供されるＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、１以上の他の治療レジメンまたは剤の前後またはそれと同時に投与され得る。熟練した医療従事者は、経験的にまたは薬剤の薬物動態および作用方式を考慮することによって、各々の治療レジメンまたは薬剤の適切な用量、ならびに投与の適切なタイミングおよび方法を決定し得る。追加の治療レジメンまたは薬剤は、本明細書に提供されるＡＤＡ２の有効性または安全性を改善し得る。いくつかの例では、追加の治療レジメンまたは薬剤は、本明細書に提供されるＡＤＡ２の作用を変更するのではなく、同じ疾患または併存疾患を処置し得る。いくつかの例では、追加の治療レジメンまたは薬剤は、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２の投与と関連する１以上の副作用を軽減、低減または排除し得る。
【０６８８】
例えば、本明細書に記載されるＡＤＡ２は、化学療法、放射線療法または化学療法および放射線療法の両方を施されてもよい。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、限定するものではないが、抗体、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、心臓保護剤、免疫刺激剤、免疫抑制剤、免疫チェックポイント阻害剤、抗生物質、血管形成阻害剤または他の治療剤を含む、１以上の他の予防剤または治療剤と組み合わせて投与されてもよい。本明細書に提供されるＡＤＡ２を用いる処置と組み合わせて用いられる他の治療剤は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子剤、毒素、脂質、炭水化物もしくはそれらの組合せまたは任意の他の種類の治療剤であってもよい。他の例では、この追加の治療レジームは、放射線療法であってもよい。
【０６８９】
１以上の追加の薬剤を、その本明細書に提供される任意のＡＤＡ２と同時に、連続してまたは間欠的に投与してもよい。この剤は、そのＡＤＡ２と、例えば、同じ医薬組成物または同じ送達方法の一部として、同時投与されてもよい。いくつかの例では、その剤は、そのＡＤＡ２と同じ時点で、本明細書に提供されるＡＤＡ２と、ただし異なる送達方法によって、同時投与されてもよい。その剤はまた、そのＡＤＡ２の投与とは異なる時点で、ただし、併用した予防的効果または治療的効果を有するためにＡＤＡ２の投与の時間に十分近く投与されてもよい。いくつかの例では、１以上の追加の薬剤は、本明細書に提供されるＡＤＡ２の投与に引き続いてまたはその前に、選択された期間分けられて投与される。いくつかの例では、その期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、１月、２月または３月である。いくつかの例では、１以上の追加の剤は、複数回投与されるかおよび／または本明細書に提供されるＡＤＡ２は、複数回投与される。他の例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２変異型およびタンパク質である１以上の追加の薬剤は、インビボ発現のための１以上の発現ベクター、特に腫瘍細胞内での発現のための腫瘍標的化または腫瘍崩壊性ベクター中にコードされてもよい。さらに別の例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２変異型およびタンパク質である１以上の追加の薬剤は、修飾された免疫細胞で発現されてもよく、この修飾された免疫細胞は、養子免疫治療のために投与されて、これが特に腫瘍細胞に対して、ＡＤＡ２および追加の薬剤を標的化して送達し得る。
【０６９０】
ａ. 抗がん剤
本明細書に提供されるＡＤＡ２を用いる処置方法は、当該分野で公知の１以上の抗がん剤と組み合わせて施してもよい。本発明の併用処置は、ＡＤＡ２を、本明細書に記載されるかまたは当該分野で公知の抗がん剤の有効量とともに、同時にまたは連続して投与することを包含する。抗がん剤は、例えば、化学療法剤、抗体、ペプチドまたは遺伝子治療ベクター、ウイルスもしくはＤＮＡまたはそれらの組合せであってもよい。
【０６９１】
併用処置のための抗がん剤の例としては、例えば、Ｔａｘｏｌ(商標)、ベバシズマブ[Ａｖａｓｔｉｎ(登録商標)]、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ネオマイシン、コンブレタスタチン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、アンギオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン、αｖ−β３アンタゴニスト、カルシウムイオノフォア、カルシウム流誘発剤およびそれらの任意の誘導体またはプロドラッグが挙げられる。併用療法のための抗がん剤としてはまた、化学療法剤、放射性治療剤、サイトカイン、抗血管新生剤、アポトーシス誘発剤または抗がん免疫毒性またはコアグリガンド、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ(登録商標)(セツキジマブ)も挙げられる。例示的な化学療法剤としては、限定するものではないが、５−アザシチジン、５−フルオロウラシルを、適宜以下と組み合わせて、ロイコボリン、５−フルオロデオキシウリジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ミトキサントロン、アジリジニルベンゾキノン(ＡＺＱ)、カルムスチン[ＢＣＮＵまたはＢｉＣＮＵ；Bristol-Myers Squibb]、ブレオマイシン、カルボプラチン(ＣＢＤＣＡ)、ロムスチン(ＣＣＮＵ)、メチル−ＣＣＮＵまたはＭｅＣＣＮＵ、クロラムブシル、クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デオキシコホルマイシン、ドキソルビシン、デオキシコホルマイシン、ＤＴＩＣ(ダカルバジン)、エピルビシン、エトポシド(ＶＰ−１６)、フルダラビン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イホスファミドおよびメスナ、レバミゾール、Ｎ−アセチルシステイン(ＮＡＣ)、ｌ−フェニルアラニンマスタード、４’−(９−アクリジニルアミノ)メタンスルホン−ｍ−アニシジド(ｍＡＭＳＡ)、多剤耐性の阻害剤(すなわち、ＭＤＲ阻害剤)、メルファラン、メトトレキサート、適宜、以下と組み合わせて、ロイコボリン、ミトラマイシン、マイトマイシン−ｃ、タンパク質に関連する多剤耐性の阻害剤(「ＭＲＰ」阻害剤)、パクリタキセル、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、Ｎ,Ｎ’Ｎ’−トリエチレンチオホスホラミド(「チオＴＥＰＡ」)、トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼIIの阻害剤、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリステイン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびテニポシド[ＶＭ−２６(登録商標)]が挙げられる。
【０６９２】
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)の投与の後、同時または前に投与され得る他の例示的な抗がん剤としては、限定するものではないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン(９−Ｃｉｓ−レチノイン酸)；アロプリノール；アルトレタミン；アルボシジブ；アンバゾン；アンボマイシン；アメタントロン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アナキシロン；アンシタビン；アントラマイシン；アパジコン；アルギメスナ；三酸化ヒ素；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アトリムスチン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バノキサントロン；バタブリン；バチマスタット；ＢＣＧ  Ｌivｅ；ベナキシビン；ベンダムスチン；ベンゾデパ；ベキサロテン；ベバシズマブ；ビカルタミド；ビエタセルピン；ビリコダル；ビスアントレン；ビスアントレン；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブレキナール；ブロピリミン；ブドチタン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カネルチニブ；カペシタビン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルボコン；カルモフール；カルムスチンとポリフェプロザン；カルムスチン；カルビシン；カルゼルシン；セデフィンゴール；セレコキシブ；セマドチン；クロラムブシル；シオテロネル；シプラクチン；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クランフェヌル；クロファラビン；クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビンリポソーム；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダルベポエチンアルファ；ダウノルビシンリポソーム；ダウノルビシン／ダウノマイシン；ダウノルビシン；デシタビン；デニロイキンジフチトクス；デキシニグルジピン；デキソナ；デキスラゾキサン；デザグアニン；ジアジクオン；ジブロスピジウム；ジエノゲスト；ジナリン；ジセルモリド；ドセタキセル；ドフェキダル；ドキシフルリジン；ドキソルビシンリポソーム；ドキソルビシンＨＣＬ；ドキソルビシンＨＣＬリポソーム注射；ドキソルビシン；ドロロキシフェン；ドロモスタノロンプロピオネート；デュアゾマイシン；エコムスチン；エダトレキサート；エドテカリン；エフロルニチン；エラクリダール；エリナフィド；エリオットのＢ溶液；エルサミトルシン；エミテフール；エンロプラチン；エンプロマート；エンザスタウリン；エピプロピジン；エピルビシン；エポエチンアルファ；エプタロプロスト；エルブロゾール；エソルビシン；エストラムスチン；エタニダゾール；エトグルシド；エトポシドホスフェート；エトポシドＶＰ−１６；エトポシド；エトプリン；エキセメスタン；エクシスリンド；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラビン；フルオロウラシル；５−フルオロウラシル；フルオキシメステロン；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン；ホストリエシン；ホトレタミン；フルベストラント；ガラルビシン；ガロシタビン；ゲムシタビン；ゲムツズマブ／オゾガマイシン；ゲロキノール；ギマテカン；ギメラシル；グロキサゾン；グ���ホスファミド；ゴセレリンアセテート；ヒドロキシウレア；イブリツモマブ／チウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；イロマスタット；イマチニブメシレート；イメキソン；インプロスルファン；インジスラム；インプロクオン；インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα；インターフェロンβ；インターフェロンγ；インターフェロン；インターロイキン−２および他のインターロイキン(組換えインターロイキンを含む)；イントプリシン；ヨーベングアン[１３１−Ｉ]；イプロプラチン；イリノテカン；イルソグラジン；イクサベピロン；ケトトレキサート；Ｌ−アラノシン；ランレオチド；ラパチニブ；レドキサントロン；レトロゾール；ロイコボリン；リュープロリド；ロイプロレリン(ロイプロリド)；レバミソール；レキサカルシトール；リアロゾール；ロバプラチン；ロメテレキソール；ロムスチン／ＣＣＮＵ；ロムスチン；ロナファルニブ；ロソキサントロン；ルルトテカン；マホスファミド；マンノスルファン；マリマスタット；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード；メゲストロールアセテート；メゲストロール；メレンゲストロール；メルファラン；メルファランＬ−ＰＡＭ；メノガリル；メピチオスタン；メルカプトプリン；６−メルカプトプリン；メスナ；メテシンド；メトトレキサート；メトキサレン；メトミデート；メトプリン；メツレデパ；ミボプラチン；ミプロキシフェン；ミソニダゾール；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；マイトフラキソン；ミトギリン；ミトグアゾン；ミトマルシン；マイトマイシンＣ；マイトマイシン；メトナフィド；ミトキドン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン；ミトゾロミド；ミボブリン；ミゾルビン；モファロテン；モピダモール；ムブリチニブ；ミコフェノール酸；ナンドロロンフェンプロピオネート；ネダプラチン；ネルザラビン；ネモルビシン；ニトラクリン；ノコダゾール；ノフェツモマブ；ノガラマイシン；ノラトレキシド；ノルトピキサントロン；オクトレオチド；オプレルベキン；オルマプラチン；オルタタキセル；オテラシル；オキサリプラチン；オキシスラン；オキソフェナルシン；パクリタキセル；パミドロネート；パツビロン；ペガデマーゼ；ペガスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペルデシン；ペリオマイシン；ペリトレキソール；ペメトレキセド；ペンタムスチン；ペントスタチン；ペプロマイシン；ペルホスファミド；ペリホシン；ピコプラチン；ピナフィド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピルフェニドン；ピロキサントロン；ピクサントロン；プレビトレキセド；プリカマイシンミトラマイシン；プリカマイシン；プロメスタン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィマー；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン；プロパミジン；プロスピジウム；プミテパ；ピューロマイシン；ピラゾフリン；キナクリン；ラニムスチン；ラスブリカーゼ；リボプリン；リトロスルファン；リツキシマブ；ログレチミド；ロキニメックス；ルフォクロモマイシン；サバルビシン；サフィンゴール；サルグラモスチム；サトラプラチン；セブリプラチン；セムスチン；シムトラゼン；シゾフィラン；ソブゾキサン；ソラフェニブ；スパルホサート；スパルホス酸；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；スピロプラチン；スクアラミン；ストレプトニグリン；ストレプトバリシン；ストレプトゾシン；スホスファミド；スルフェヌア；スニチニブマレート；６−ＴＧ；タセジナリン；タルク；タリソマイシン；タリムスチン；タモキシフェン；タリキダル；タウロムスチン；テコガラン；テガフール；テロキサントロン；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド／ＶＭ−２６；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアミプリン；チアゾフリン；チロミソール；チロロン；チムコダル；チモナシク；チラパザミン；トピクサントロン；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラベクテジン(エクテイナサイジン７４３)；トラスツマブ；トレストロン；トレチノイン／ＡＴＲＡ；トリシリビン；トリロスタン；トリメトレキサート；トリプラチンテトラニトレート；トリプトレリン；トロホスファミド；ツブロゾール；ウベニメクス；ウラシルマスタード；ウレデパ；バルルビシン；バルスポダール；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビンデシン；ビネピジン；ビンフルニン；ビンホルミド；ビングリシナート；ビンロイシノール；ビンロイロシン；ビノレルビン；ビンロシジン；ビントリプトール；ビンゾリジン；ボロゾール；キサントマイシンＡ(グアメシクリン)；ゼニプラチン；ジラスコルブ[２−Ｈ]；ジノスタチン；ゾレドロネート；ゾルビシン；およびゾスキダル；アルデスロイキン[例えばＰＲＯＬＥＵＫＩＮ(登録商標)]；アレムツズマブ[例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ(登録商標)]；アリトレチノイン[例えば、ＰＡＮＲＥＴＩＮ(登録商標)]；アロプリノール[例えば、ＺＹＬＯＰＲＩＭ(登録商標)]；アルトレタミン[例えば、ＨＥＸＡＬＥＮ(登録商標)]；アミホスチン[例えばＥＴＨＹＯＬ(登録商標)]；アナストロゾール[例えば、アリミデックス(登録商標)]；三酸化ヒ素[例えば、ＴＲＩＳＥＮＯＸ(登録商標)]；アスパラギナーゼ[例えば、ＥＬＳＰＡＲ(登録商標)]；ＢＣＧ  Ｌｉｖｅ[例えば、ＴＩＣＥ(登録商標)ＢＣＧ]；ベキサロテン[例えば、ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標)]；ベバシズマブ[ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)]；ブレオマイシン[例えば、ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ(登録商標)]；ブスルファン静注[例えば、ＢＵＳＵＬＦＥＸ(登録商標)]；ブスルファン経口[例えば、ＭＹＬＥＲＡＮ(商標)]；カルステロン[例えば、ＭＥＴＨＯＳＡＲＢ(登録商標)]；カペシタビン[例えば、ＸＥＬＯＤＡ(登録商標)]；カルボプラチン[例えば、ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ(登録商標)]；カルムスチン[例えばＢＣＮＵ(登録商標)、ＢｉＣＮＵ(登録商標)]；カルムスチンとポリフェプロザン[例えば、グリアデル(登録商標)ウェーハ]；セレコキシブ[例えば、ＣＥＬＥＢＲＥＸ(登録商標)]；クロラムブシル[例えば、ＬＥＵＫＥＲＡＮ(登録商標)]；シスプラチン[例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ(登録商標)]；クラドリビン[例えば、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ(登録商標)、２−ＣｄＡ(登録商標)]；シクロホスファミド[例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標)、ＮＥＯＳＡＲ(登録商標)]；シタラビン[例えば、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ(���録商標)]；シタラビンリポソーム[例えば、ＤｅｐｏＣｙｔ(登録商標)]；ダカルバジン(例えば、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ)：ダクチノマイシン[例えば、ＣＯＳＭＥＧＥＮ(登録商標)]；ダルベポエチンアルファ[例えば、ＡＲＡＮＥＳＰ(登録商標)]；ダウノルビシンリポソーム[例えば、ＤＡＮＵＯＸＯＭＥ(登録商標)]；ダウノルビシン／ダウノマイシン[例えば、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ(登録商標)]；デニロイキンジフチトクス[例えば、ＯＮＴＡＫ(登録商標)]；デキスラゾキサン[例えば、ＺＩＮＥＣＡＲＤ(登録商標)]；ドセタキセル[例えば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)]；ドキソルビシン[例えば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標)、ＲＵＢＥＸ(登録商標)]；ドキソルビシンＨＣＬリポソーム注射を含むドキソルビシンリポソーム[例えば、ＤＯＸＩＬ(登録商標)]；ドロモスタノロンプロピオネート[例えば、ＤＲＯＭＯＳＴＡＮＯＬＯＮＥ(登録商標)およびＭＡＳＴＥＲＯＮＥ(登録商標)注射]；エリオットのＢ溶液[例えば、エリオットのＢ溶液(登録商標)]；エピルビシン[例えば、ＥＬＬＥＮＣＥ(登録商標)]；エポエチンアルファ[例えば、ＥＰＯＧＥＮ(登録商標)]；エストラムスチン[例えば、ＥＭＣＹＴ(登録商標)]；エトポシドホスフェート[例えば、ＥＴＯＰＯＰＨＯ(登録商標)]；エトポシドＶＰ−１６[例えば、ＶＥＰＥＳＩＤ(登録商標)]；エキセメスタン[例えば、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)]；フィルグラスチム[例えば、ＮＥＵＰＯＧＥＮ(登録商標)]；フロクスウリジン[例えばＦＵＤＲ(登録商標)]；フルダラビン[例えば、ＦＬＵＤＡＲＡ(登録商標)]；５−ＦＵを含むフルオロウラシル[例えば、ＡＤＲＵＣＩＬ(登録商標)]；フルベストラント[例えば、ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標)]；ゲムシタビン[例えば、ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)]；ゲムツズマブ／オゾガマイシン[例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ(登録商標)]；ゴセレリンアセテート[例えば、ＺＯＬＡＤＥＸ(登録商標)]；ヒドロキシウレア[例えば、ＨＹＤＲＥＡ(登録商標)]；イブリツモマブ／チウキセタン[例えば、ＺＥＶＡＬＩＮ(登録商標)]；イダルビシン[例えば、ＩＤＡＭＹＣＩＮ(登録商標)]；イホスファミド[例えば、ＩＦＥＸ(登録商標)]；イマチニブメシレート[例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ(登録商標)]；インターフェロンα−２ａ[例えば、ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ(登録商標)]；インターフェロンα−２ｂ[例えば、ＩＮＴＲＯＮ  Ａ(登録商標
)]；イリノテカン[例えば、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ(登録商標)]；レトロゾール[例えば、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)]；ロイコボリン[例えば、ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ(登録商標)、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ(登録商標)]；レバミソール[例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ(登録商標)]；ロムスチン／ＣＣＮＵ[例えば、ＣｅｅＢＵ(登録商標)]；メクロレタミン／ナイトロジェンマスタード[例えば、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ(登録商標)]；メゲストロールアセテート[例えば、ＭＥＧＡＣＥ(登録商標)]；メルファラン／Ｌ−ＰＡＭ[例えば、ＡＬＫＥＲＡＮ(登録商標)]；６−ＭＰを含むメルカプトプリン[例えば、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ(登録商標)]；メスナ[例えば、ＭＥＳＮＥＸ(登録商標)]；メトトレキサート；メトキサレン[例えば、ＵＶＡＤＥＸ(登録商標)]；マイトマイシンＣ[例えば、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ(登録商標)、ＭＩＴＯＺＹＴＲＥＸ(登録商標)]；ミトタン[例えば、ＬＹＳＯＤＲＥＮ(登録商標)]；ミトキサントロン[例えば、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ(登録商標)]；ナンドロロンフェンプロピオネート[例えば、ＤＵＲＡＢＯＬＩＮ−５０(登録商標)]；ノフェツモマブ[例えば、ＶＥＲＬＵＭＡ(登録商標)]；オプレルベキン[例えば、ＮＥＵＭＥＧＡ(登録商標)]；オキサリプラチン[例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ(登録商標)]；パクリタキセル[例えば、ＰＡＸＥＮＥ(登録商標)、ＴＡＸＯＬ(登録商標)]；パミドロネート[例えば、ＡＲＥＤＩＡ(登録商標)]；ペガデマーゼ[例えば、ＡＤＡＧＥＮ(登録商標)]；ペガスパルガーゼ[例えば、ＯＮＣＡＳＰＡＲ(登録商標)]；ペグフィルグラスチム[例えば、ＮＥＵＬＡＳＴＡ(登録商標)]；ペントスタチン[例えば、ＮＩＰＥＮＴ(登録商標)]；ピポブロマン[例えば、ＶＥＲＣＹＴＥ(登録商標)]；プリカマイシン／ミトラマイシン[例えば、ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ(登録商標)]；ポルフィマーナトリウム[例えば、ＰＨＯＴＯＦＲＩＮ(登録商標)]；プロカルバジン[例えば、ＭＡＴＵＬＡＮＥ(登録商標)]；キナクリン[例えば、ＡＴＡＢＲＩＮＥ(登録商標)]；ラスブリカーゼ[例えば、ＥＬＩＴＥＫ(登録商標)]；リツキシマブ[例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ(登録商標)]；サルグラモスチム[例えば、ＰＲＯＫＩＮＥ(登録商標)]；ストレプトゾシン[例えば、ＺＡＮＯＳＡＲ(登録商標)]；スニチニブマレート[例えば、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)]；タルク[例えば、ＳＣＬＥＲＯＳＯＬ(登録商標)]；タモキシフェン[例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)]；テモゾロミド[例えば、ＴＥＭＯＤＡＲ(登録商標)]；テニポシド／ＶＭ−２６[例えば、ＶＵＭＯＮ(登録商標)]；テストラクトン[例えば、ＴＥＳＬＡＣ(登録商標)]；６−ＴＧを含むチオグアニン；チオテパ[例えば、ＴＨＩＯＰＬＥＸ(登録商標)]；トポテカン[例えば、ＨＹＣＡＭＴＩＮ(登録商標)]；トレミフェン[例えば、ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)]；トシツモマブ[例えば、ＢＥＸＸＡＲ(登録商標)]；トラスツマブ[例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標)]；トレチノイン／ＡＴＲＡ[例えば、ＶＥＳＡＮＯＩＤ(登録商標)]；ウラシルマスタード；バルルビシン[例えば、ＶＡＬＳＴＡＲ(登録商標)]；ビンブラスチン[例えばＶＥＬＢＡＮ(登録商標)]；ビンクリスチン[例えば、ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標)]；ビノレルビン[例えば、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)]；およびゾレドロネート[例えば、ＺＯＭＥＴＡ(登録商標)]が挙��られる。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２は、他の抗がん剤、例えば、本明細書に提供されるものおよび／またはGoodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eds. Hardman and Limbird, Tenth edition(2002)に記載のものとの併用療法に用いられ得る。
【０６９３】
ｉ. 抗がん抗体
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２と同時投与され得る抗がん抗体の例としては、限定するものではないが、抗１７−ＩＡ細胞表面抗原抗体、例えば、Ｐａｎｏｒｅｘ(登録商標)(ドレコロマブ)；抗４−１ＢＢ抗体；抗４Ｄｃ抗体；抗Ａ３３抗体、例えば、Ａ３３およびＣＤＰ−８３３；抗α１インテグリン抗体、例えば、ナタリズマブ；抗α４β７インテグリン抗体、例えば、ＬＤＰ−０２；抗αＶβ１インテグリン抗体、例えば、Ｆ−２００、Ｍ−２００およびＳＪ−７４９；抗αＶβ３インテグリン抗体、例えば、アブシキシマブ、ＣＮＴＯ−９５、Ｍａｂ−１７Ｅ６およびＶｉｔａｘｉｎ(登録商標)；抗補体因子５(Ｃ５)抗体、例えば、５Ｇ１.１；抗ＣＡ１２５抗体、例えば、ＯｖａＲｅｘ(登録商標)(オレゴボマブ)；抗ＣＤ３抗体、例えば、Ｎｕｖｉｏｎ(登録商標)(ビシリズマブ)およびＲｅｘｏｍａｂ；抗ＣＤ４抗体、例えば、ＩＤＥＣ−１５１、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＯＫＴ４Ａ；抗ＣＤ６抗体、例えば、オンコリシン(Ｏｎｃｏｌｙｓｉｎ)ＢおよびオンコリシンＣＤ６；抗ＣＤ７抗体、例えば、ＨＢ２；抗ＣＤ１９抗体、例えば、Ｂ４３、ＭＴ−１０３およびオンコリシンＢ；抗ＣＤ２０抗体、例えば、２Ｈ７、２Ｈ７.ｖ１６、２Ｈ７.ｖ１１４、２Ｈ７.ｖ１１５、Ｂｅｘｘａｒ(登録商標)(トシツモマブ)、Ｒｉｔｕｘａｎ(登録商標)(リツキシマブ),およびＺｅｖａｌｉｎ(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン)；抗ＣＤ２２抗体、例えば、Ｌｙｍｐｈｏｃｉｄｅ(登録商標)(エプラツズマブ)；抗ＣＤ２３抗体、例えば、ＩＤＥＣ−１５２；抗ＣＤ２５抗体、例えば、バシリキシマブおよびＺｅｎａｐａｘ(登録商標)(ダクリズマブ)；抗ＣＤ３０抗体、例えば、ＡＣ１０、ＭＤＸ−０６０およびＳＧＮ−３０；抗ＣＤ３３抗体、例えば、Ｍｙｌｏｔａｒｇ(登録商標)(ゲムツズマブオゾガマイシン)、オンコリシンＭおよびＳｍａｒｔ  Ｍｌ  ９５；抗ＣＤ３８抗体；抗ＣＤ４０抗体、例えば、ＳＧＮ−４０およびトラリズマブ；抗ＣＤ４０Ｌ抗体、例えば、５ｃ８、Ａｎｔｏｖａ(登録商標)およびＩＤＥＣ−１３１；抗ＣＤ４４抗体、例えば、ビバツズマブ；抗ＣＤ４６抗体；抗ＣＤ５２抗体、例えば、Ｃａｍｐａｔｈ(登録商標)(アレムツズマブ)；抗ＣＤ５５抗体、例えば、ＳＣ−１；抗ＣＤ５６抗体、例えば、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１；抗ＣＤ６４抗体、例えば、ＭＤＸ−３３；抗ＣＤ６６ｅ抗体、例えば、ＸＲ−３０３；抗ＣＤ７４抗体、例えば、ＩＭＭＵ−１１０；抗ＣＤ８０抗体、例えば、ガリキシマブおよびＩＤＥＣ−１１４；抗ＣＤ８９抗体、例えば、ＭＤＸ−２１４；抗ＣＤ１２３抗体；抗ＣＤ１３８抗体、例えば、Ｂ−Ｂ４−ＤＭ１；抗ＣＤ１４６抗体、例えば、ＡＡ−９８；抗ＣＤ１４８抗体；抗ＣＥＡ抗体、例えば、ｃＴ８４.６６、ラベツズマブおよびＰｅｎｔａｃｅａ(登録商標)；抗ＣＴＬＡ４抗体、例えば、ＭＤＸ−１０１；抗ＣＸＣＲ４抗体；抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、ＡＢＸ−ＥＧＦ、Ｅｒｂｉｔｕｘ(登録商標)(セツキシマブ)、ＩＭＣ−Ｃ２２５およびＭｅｒｃｋ  Ｍａｂ  ４２５；抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えば、Ｃｒｕｃｅｌｌの抗ＥｐＣＡＭ、ＩＮＧ−１およびＩＳ−ＩＬ−２；抗エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４抗体；抗Ｈｅｒ２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ(登録商標)]、ＭＤＸ−２１０；抗ＦＡＰ(線維���細胞活性化タンパク質)抗体、例えば、シブロツズマブ；抗フェリチン抗体、例えば、ＮＸＴ−２１１；抗ＦＧＦ−１抗体；抗ＦＧＦ−３抗体；抗ＦＧＦ−８抗体；抗ＦＧＦＲ抗体,抗フィブリン抗体；抗Ｇ２５０抗体、例えば、ＷＸ−Ｇ２５０およびＲｅｎｃａｒｅｘ(登録商標)；抗ＧＤ２ガングリオシド抗体、例えば、ＥＭＤ−２７３０６３およびＴｒｉＧｅｍ；抗ＧＤ３ガングリオシド抗体、例えば、ＢＥＣ２、ＫＷ−２８７１およびミツモマブ；抗ｇｐIIｂ／IIIａ抗体、例えば、ＲｅｏＰｒｏ；抗ヘパリナーゼ抗体；抗Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２抗体、例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ(登録商標)(トラスツズマブ)、ＭＤＸ−２１０およびペルツズマブ；抗ＨＬＡ抗体、例えば、Ｏｎｃｏｌｙｍ(登録商標)、Ｓｍａｒｔ  １Ｄ１０；抗ＨＭ１.２４抗体；抗ＩＣＡＭ抗体、例えば、ＩＣＭ３；抗ＩｇＡ受容体抗体；抗ＩＧＦ−１抗体、例えば、ＣＰ−７５１８７１およびＥＭ−１６４；抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、ＩＭＣ−Ａ１２；抗ＩＬ−６抗体、例えば、ＣＮＴＯ−３２８およびエルシリモマブ；抗ＩＬ−１５抗体、例えば、ＨｕＭａｘ(登録商標)−ＩＬ１５；抗ＫＤＲ抗体；抗ラミニン５抗体；抗Ｌｅｗｉｓ  Ｙ抗原抗体、例えば、Ｈｕ３Ｓ１９３およびＩＧＮ−３１１；抗ＭＣＡＭ抗体；抗Ｍｕｃ１抗体、例えば、ＢｒａｖａＲｅｘおよびＴｒｉＡｂ；抗ＮＣＡＭ抗体、例えば、ＥＲＩＣ−１およびＩＣＲＴ；抗ＰＥＭ抗原抗体、例えば、ＴｈｅｒａｇｙｎおよびＴｈｅｒｅｘ；抗ＰＳＡ抗体；抗ＰＳＣＡ抗体、例えば、ＩＧ８；抗Ｐｔｋ抗体；抗ＰＴＮ抗体；抗ＲＡＮＫＬ抗体、例えば、ＡＭＧ−１６２；抗ＲＬＩＰ７６抗体；抗ＳＫ−１抗原抗体、例えば、Ｍｏｎｏｐｈａｒｍ  Ｃ；抗ＳＴＥＡＰ抗体；抗ＴＡＧ７２抗体、例えば、ＣＣ４９−ＳＣＡおよびＭＤＸ−２２０；抗ＴＧＦ−β抗体、例えば、ＣＡＴ−１５２；抗ＴＮＦ−α抗体、例えば、ＣＤＰ５７１、ＣＤＰ８７０、Ｄ２Ｅ７、Ｈｕｍｉｒａ(登録商標)(アダリムマブ)およびＲｅｍｉｃａｄｅ(登録商標)(インフリキシマブ)；抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体；抗ＶＥ−カドヘリン−２抗体；ならびに抗ＶＬＡ−４抗体、例えば、Ａｎｔｅｇｒｅｎ(登録商標)が挙げられる。さらに、抗イディオタイプ抗体、例としては、限定するものではないが、ＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２およびｇｐ７２エピトープ抗体１０５ＡＤ７を用いてもよい。さらに、限定するものではないが、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体Ｂｉ２０を含む二重特異性抗体を用いてもよい。
【０６９４】
ii. 化学療法剤
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、１以上の化学療法剤とともに投与される。化学療法剤の例としては、限定するものではないが、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド[ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標)]；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗エストロゲン、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４(５)−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン(Ｆａｒｅｓｔｏｎ)；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；アジリジン、例えば、ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ；エチレンイミンおよびメチルメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミン；葉酸補給物質、例えば、フロリン酸；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；タンパク質、例えば、アルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン,５−ＦＵ；タキサン、例えば、パクリタキセル(ＴＡＸＯＬ(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)およびドセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；チミジレート合成酵素阻害剤(例えば、Ｔｏｍｕｄｅｘ)；追加の化学療法剤、例えば、アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デフォスファミド；デメコルシン；ジアジコン；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２,２’,２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド(「Ａｒａ−Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；エトポシド(ＶＰ−１６)；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；Ｘｅｌｏｄａ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカンが挙げられる。任意の上記の薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた用いられてもよい。
【０６９５】
化学療法剤は、プロドラッグとして投与されてもよい。本明細書に提供される任意のＡＤＡ２とともに投与され得るプロドラッグの例としては、限定するものではないが、リン酸塩含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、適宜、置換されるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは適宜、置換されるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグ(さらに活性な細胞毒性のない薬物に変換され得る)が挙げられる。
【０６９６】
iii. 放射線療法
本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、他の治療レジメンと組み合わされてもよい。例えば、一態様では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を用いて処置される患者は、放射線療法を受けてもよい。放射線療法は、当該分野で通常使用され、当業者に公知であるプロトコールに従って投与され得る。このような治療としては、限定するものではないが、セシウム、イリジウム、ヨード、コバルトの照射、Ｘ線の照射、γ線、例えば、直接照射およびトモグラフィー標的化の両方、移植された放射性ペレットもしくは「シード」を用いるがん組織の処置、ホウ素化合物をプライムした組織の中性子ビーム照射、ならびに／または当該分野で公知の他の種類の粒子ビーム治療が挙げられる。放射線療法は、全身照射であってもよくまたは肺、膀胱もしくは前立腺などの身体内もしくは身体上の特定の部位または組織に対して局所的に指し向けられ得る。通常は、放射線療法は、約１〜２週の期間にわたってパルスで施される。しかし、放射線療法は、長期間にわたって施されてもよい。例えば、放射線療法は、頭頸部がんを有する患者に対して、約６〜約７週間施されてもよい。適宜、放射線療法は、単回用量で投与されてもまたは複数回の連続用量で投与されてもよい。熟練した医療従事者は、本明細書で有用な放射線療法の適切な用量を経験的に決定し得る。いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)および適宜１以上の他の抗がん療法を使用して、エキソビボでがん細胞を処置する。このようなエキソビボ処置は、骨髄移植および特に自家骨髄移植において有用であり得ると考えられる。例えば、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２および１以上の抗がん治療を用いる、がん細胞を含む細胞および組織の処置を使用して、レシピエント患者における移植前にがん細胞を枯渇させてもよくまたは実質的に枯渇させてもよい。放射線療法はまた、同位体的に標識された分子、例えば、抗体を用いる処置を包含し得る。ただし、放射免疫療法の例としては、Ｚｅｖａｌｉｎ(登録商標)(Ｙ−９０標識の抗ＣＤ２０)、ＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ(登録商標)(Ｙ−９０標識の抗ＣＤ２２)およびＢｅｘｘａｒ(登録商標)(１−１３１標識の抗ＣＤ２０)が挙げられる。さらに、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、手術または光線療法などのさらに他の治療技術と組み合わせて患者または対象に施され得る。
【０６９７】
iv. 抗血管新生剤
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、１以上の抗血管新生剤とともに投与される。例えば、抗血管新生因子は、血管新生を促進することに関与する増殖因子または増殖因子受容体に結合する、低分子またはタンパク質(例えば、抗体、Ｆｃ融合物またはサイトカイン)であってもよい。抗血管新生剤の例としては、限定するものではないが、血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor：ＶＥＧＦ)に結合するかまたはＶＥＧＦ−Ｒに結合する抗体、ＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ−Ｒ発現のレベルを低下するＲＮＡベースの治療剤、ＶＥＧＦ−毒素融合物、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎのＶＥＧＦ−トラップ、アンギオスタチン(プラスミノーゲン断片)、アンチトロンビンIII、アンジオザイム、ＡＢＴ−６２７、Ｂａｙ１２−９５６６、ＢｅｎｅＦｉｎ、ベバシズマブ、ビスホスホネート、ＢＭＳ−２７５２９１、軟骨由来阻害剤(ＣＤＩ)、ＣＡＩ、ＣＤ５９補体断片、ＣＥＰ−７０５５、Ｃｏｌ３、コンブレスタチンＡ−４、エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、フィブロネクチン断片、グロ−ベータ(gro-beta)、ハロフギノン、ヘパリナーゼ、ヘパリンヘキササッカライド断片、ＨＭＶ８３３、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、ＩＭ−８６２、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターフェロン誘導性タンパク質１０(ＩＰ−１０)、インターロイキン−１２、クリングル５(プラスミノーゲン断片)、マリマスタット、メタロプロテイナーゼ阻害剤(例えば、ＴＩＭＰ)、２−メトキシエストラジオール、ＭＭＩ２７０(ＣＧＳ２７０２３Ａ)、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤(ＰＡＩ)、血小板因子−４(ＰＦ４)、プリノマスタット、プロラクチン１６ｋＤａ断片、プロリフェリン関連タンパク質(ＰＲＰ)、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５９４、レチノイド、ソリマスタット、スクアラミン、ＳＳ３３０４、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８、テトラヒドロコルチゾール−Ｓ、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンスポンジン−１(ＴＳＰ−１)、ＴＮＰ４７０,トランスフォーミング成長因子β(ＴＧＦ−β)、バスキュロスタチン、バソスタチン(カルレティキュリン断片)、ＺＳ６１２６,およびＺＤ６４７４が挙げられる。
【０６９８】
ｖ. 免疫チェックポイント阻害剤
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、免疫チェックポイントタンパク質をブロックすることによって免疫応答を増大する１以上の剤(すなわち、免疫チェックポイント阻害剤)とともに投与される。本明細書に提供される併用療法では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４(ＣＴＬＡ４またはＣＤ１５２)、プログラムされた細胞死タンパク質１(ＰＤ−１)またはプログラムされた細胞死タンパク質１リガンド１(ＰＤ−Ｌ１)に対する抗体であってもよい。
【０６９９】
具体的には、本明細書に提供される併用療法は、処置される対象における、アデノシンレベルの上昇と関連するかおよび／またはアデノシンまたはデオキシアデノシンレベルの低下の影響を受けやすい、がんを含む全種類の腫瘍を処置することに適用可能である。広義には、これらとしては、血液の腫瘍および固形腫瘍が挙げられる。例示的ながんとしては、限定するものではないが、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、消化管、中枢神経系および末梢神経系、腎系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、関節を含む結合組織系、脂肪組織および血管壁を含む循環器系に由来するがんが挙げられる。
【０７００】
がんを処置するための治療としては、免疫抑制的なシグナル伝達を阻害するかまたは免疫刺激性のシグナル伝達を増強する免疫療法(例えば、阻害性チェックポイントタンパク質のアンタゴニストまたはアゴニスト)が挙げられる。腫瘍自体を直接標的化するのではなく、このような治療では、宿主の内因性の防御を用いて、腫瘍と戦う。例えば、同時刺激性受容体の阻害性チェックポイントタンパク質のアンタゴニストおよび／またはアゴニストは、抗原特異的なＴ細胞応答を増幅することによって、宿主の内因性抗腫瘍免疫応答を刺激し得る。宿主の免疫応答を増強することによって、その効果が長期持続し得、その結果対象が、処置の停止後数か月から数年にわたって持続し得る、耐久性の抗腫瘍応答を発達し得るという点で、細胞毒性の療法を上回る利点が得られる。
【０７０１】
特定の例では、本明細書に提供される併用療法は、阻害性チェックポイントタンパク質を標的化する剤(例えば、抗体)を使用する。例示的な阻害性免疫チェックポイント標的タンパク質および標的のための治療タンパク質は、表５に示す。
【表９】
0006625627.tif 000011
【０７０２】
具体的には、免疫学的な阻害性分子ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の阻害剤は、本明細書に提供される併用および方法について考慮される。ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１は両方とも負の調節因子として機能するが、各々、免疫応答を調節する非冗長性の役割を置く：ＣＴＬＡ４は、ナイーブおよび記憶(休止)Ｔ細胞の早期活性化を減弱することに関与するが、ＰＤ−１は、末梢組織中でＴ細胞活性化を調節することに役割を果たす[例えば、Keir et al.(2008) Annu Rev Immunol. 26:677-704; Pardoll,(2012) Nat Rev Cancer. 12(4):252-264; Quezada et al.,(2013) Br J Cancer. 108(8):1560-1565; Callahan et al.,(2010) Semin Oncol. 37(5):473-84を参照のこと]。
【０７０３】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４(ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２とも呼ばれる；配列番号５４４)は、ナイーブまたは休止Ｔ細胞の細胞質中で維持される小胞中にパッケージングされる同時阻害性受容体である。Ｔ細胞活性化が開始される場合、Ｔ細胞の表面へのＣＴＬ４を含む小胞の移動も誘発される。ＣＴＬＡ４の阻害性活性は、刺激性シグナルの振幅を弱めるように作用する。この役割では、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞活性化を低下し、それによって自己免疫を制限するように機能する。ＣＴＬＡ４はまた、ヘルパーＴ細胞活性化の下方制御においておよび調節性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞活性の増強においてある役割を果たす。例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体を投与することによるＣＴＬ４の阻害は、ＣＴＬの活性を増大すること、エフェクターおよびヘルパーＴ細胞の存在を増大することによって、ならびに／またはＴｒｅｇ細胞の抑制機能を阻害することによって免疫応答を増強し得る。ＣＴＬＡ４の阻害によって、免疫応答の初期段階の間にＴ細胞の完全な活性化が可能になる。
【０７０４】
Ｔ細胞活性化および血流への進入の際に、Ｔ細胞活性化を阻害する受容体である、プログラムされた細胞死タンパク質１(ＰＤ−１；配列番号５４５)の発現が誘発される。ＰＤ−１はまた、調節性Ｔ(Ｔｒｅｇ)細胞、疲弊したＴ細胞、活性化Ｂ細胞、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、樹状細胞(ＤＣｓ)および活性化単球上に存在する。ＰＤ−１は、２つの主なリガンド、ＰＤ−１リガンド１(ＰＤ−Ｌ１；Ｂ７−Ｈ１またはＣＤ２７４とも呼ばれる；配列番号５４６)およびＰＤ−Ｌ２(Ｂ７−ＤＣまたはＣＤ２７３とも呼ばれる)を有する。組織中の炎症性シグナルは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現を誘発する。そのリガンドの１つを結合する際、ＰＤ−１は、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)のシグナル伝達、免疫刺激性サイトカインの分泌の下方制御および生存タンパク質の発現を阻害することによって、ならびに免疫抑制サイトカインＩＬ−１０のＴ細胞生成を増大することによって、Ｔ細胞活性を減弱するように作用する。これらの活性は、側副の組織損傷を制限し、かつ正常な条件下で免疫応答の間の自己免疫を制限するように作用する。例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することによってＰＤ−１シグナル伝達経路をブロックすれば、腫瘍細胞の殺傷および免疫刺激性サイトカン、例えば、インターフェロンガンマ(ＩＦＮ−γ)、インターロイキン−２(ＩＬ−２)および腫瘍壊死因子α(ＴＮＦ−α)の分泌など、腫瘍特異的なＴ細胞エフェクター機能などのＴ細胞エフェクター機能の復旧が生じる。
【０７０５】
他の免疫チェックポイントリガンドおよび受容体は、免疫応答の調節に関与し、かつ抗腫瘍免疫を増強する目的の治療を標的化し得る。さらに、２つ以上の協調的に発現される受容体またはリガンドの遮断は、相加的または相乗的な抗腫瘍活性を生じ得る。標的としては、Ｂ７阻害性リガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２以外、例えば、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４(腫瘍細胞または腫瘍浸潤性細胞で上方制御される)が挙げられる。リンパ球活性の阻害に関連する他の標的としては、リンパ球活性化遺伝子３(ＬＡＧ３；ＣＤ２２３とも呼ばれる)、２Ｂ４(ＣＤ２４４とも呼ばれる)、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター(ＢＴＬＡまたはＣＤ２７２)、Ｔ細胞膜タンパク質３(ＴＩＭ３またはＨＡＶｃｒ２)、アデノシンＡ２ａ受容体(Ａ２ａＲ)およびキラー阻害性受容体のファミリーが挙げられる。これらの免疫チェックポイント受容体の多くが、エフェクターＴ細胞およびＴｒｅｇ細胞の活性を調節する。例えば、ＬＡＧ３は、免疫抑制活性を増幅するために重要であると考えられる、Ｔｒｅｇ細胞(自己免疫の防止を助ける)上で高度に発現される。ＬＡＧ３はまた、エフェクターＴ細胞活性の阻害に関連し、かつＴ細胞アネルギーを誘導し得る[Pardoll,(2012) Nat Rev Cancer. 12(4):252-264。これらのタンパク質の抗体標的化は、単独でまたは組み合わせて、動物のがんモデルで抗腫瘍免疫を増強し得る。多くの腫瘍細胞は、複数の阻害性リガンドを発現し、腫瘍浸潤性リンパ球は、複数の阻害性受容体を発現するので、これらのタンパク質を阻害するためのコンビナトリアルアプローチは、抗腫瘍免疫を増強するのに有効であり得る[概説に関しては、Pardoll,(2012) Nat Rev Cancer. 12(4):252-264を参照のこと]。分泌されるかまたは膜結合した阻害性リガンドに加えて、代謝酵素、例えば、インドールアミン２,３ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)およびアルギナーゼ(通常は腫瘍に浸潤する阻害性骨髄由来サプレッサー細胞によって発現される)は、Ｔ細胞の同化代謝に必須のアミノ酸を枯渇させることによって免疫応答を局所的に阻害し得る。これらの酵素は、低分子薬物によって阻害され得る。
【０７０６】
免疫チェックポイント阻害剤は、免疫細胞に作用して、免疫応答を増強するので、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)と組み合わせて提供される場合、応答の増大は、腫瘍に対する免疫細胞(例えば、ＣＴＬ)の漸増性の増大に対する効果に起因し得る。例えば、上記されるとおり、腫瘍および間質細胞は、免疫抑制効果を発揮し得る、高レベルのアデノシンを産生する。アデノシン媒介性の免疫抑制を低下することによって、腫瘍に対する循環性の免疫細胞の活性の増大があり得、それによって、腫瘍細胞を殺傷するのに利用可能な細胞傷害性細胞および他の免疫細胞の数が増大する。抗腫瘍剤または薬物、例えば、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体)の有効性もまた、増大され得る。
【０７０７】
したがって、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型、例えば、ＰＥＧ化したＡＤＡ２を含む)の使用は、免疫媒介性の応答に対して腫瘍を感作し得、これは、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体および抗ＰＤ１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体)の存在下でさらに増大され得る。腫瘍に対する免疫細胞の活性を増強すること、すなわち、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２によって、アデノシン媒介性の免疫抑制の効果を低減することは、治療有効性を維持または増強したままで、免疫チェックポイント阻害剤の用量を低下することを可能にし得る。抗体投薬量をさらに効果的に調節する能力によって、抗体治療に関連し得る有害事象の低下が生じ得る。したがって、本明細書に提供される併用療法は、腫瘍の根絶および腫瘍処置のための増強された抗腫瘍免疫応答を促進し得る。
【０７０８】
本明細書に提供される、組成物、併用および方法ならびにそれらの使用を含む併用療法は、免疫チェックポイントタンパク質をブロックして抗腫瘍免疫応答を刺激する免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤を含む。このような免疫チェックポイント阻害剤は、当該分野で公知である。このような阻害剤の例は、本明細書で提供されており、これには、表５に記載される阻害性チェックポイントタンパク質を標的化する任意の阻害性剤が挙げられる。例えば、免疫チェックポイント阻害剤または阻害性剤は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の阻害剤である。具体的な例では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体またはアプタマーである。ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の例示的な阻害剤としては、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアプタマーが挙げられる。
【０７０９】
アプタマーである阻害剤は、本明細書に提供される併用療法で使用され得る。アプタマーとしては、オリゴヌクレオチド(ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＸＮＡ)またはペプチドアプタマーが挙げられる。アプタマーは、一価であってもまたは多価であって、例えば、二価であっても四価であってもよい。いくつかの場合には、このアプタマーを、コレステロールまたはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)などのポリマーによって修飾して、循環中のアプタマーの半減期を延長してもよい。
【０７１０】
特定の例では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント分子(例えば、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１)をブロックする抗体である。この抗体は、免疫チェックポイント分子(例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１)に免疫特異的に結合する全長抗体またはその抗原結合断片であり得る。本明細書に提供される併用での使用、方法および用途に考慮される他の免疫調節剤としては、阻害性受容体リンパ球活性化遺伝子３(ＬＡＧ３)およびＴ細胞膜タンパク質３(ＴＩＭ３)に対して標的化された阻害性剤、阻害性リガンド、例えば、ＰＤ−Ｌ２(またはＢ７−Ｈ２)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４およびＣＤ２５、ならびに免疫抑制酵素インドレアミン２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)が挙げられる。ＬＡＧ３に対する剤(例えば、融合タンパク質ＩＭＰ３２１および複数のｍＡｂ)および抗Ｂ７−Ｈ３抗体(例えば、ＭＧＡ２７１)が特徴付けられており、臨床試験で使用中である。Ｂ７−Ｈ４およびＴＩＭ３の抗体または阻害性剤は、前臨床開発中である(Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012 Mar 22;12(4):252-264)。これらの剤のうちのいずれか１つまたは複数が、本明細書に提供される任意の組合せに含まれてもよい。さらに、この抗体の変異型および修飾型も、本明細書に提供される併用療法の方法で用いられ得る。
【０７１１】
(ａ)抗ＣＴＬＡ４療法
ＣＴＬＡ４をブロックする２つの抗体、イピリムマブおよびトレメリムマブは、いくつかのがん、例えば、黒色腫、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、腎細胞がん(ＲＣＣ)、結腸直腸がん(ＣＲＣ)、胃がんおよびＮＳＣＬＣの有効な処置のために用いられてきた[概説については、Kyi et al.,(2014) FEBS Letters 588:368-376を参照のこと]。治療的なＣＴＬＡ４遮断は、治療の終了後、数か月から数年の腫瘍退行を果たし得る[Prieto et al.,(2012) Clin Cancer Res. 18(7):2039-2047;Kirckwood et al.,(2010) Clin Cancer Res. 16(3):1042-1048]が、他の宿主組織に対する抵抗も低下し得、免疫関連有害事象(immune-related adverse events：ｉｒＡＥ)などの有害事象につながる。
【０７１２】
組成物およびその方法および使用を含む、本明細書に提供される併用療法は、ＣＴＬＡ４を阻害する治療剤を含んでもよい。阻害剤としては、抗体およびアプタマーが挙げられる。ＣＴＬＡ４に結合して、ＣＴＬＡ４シグナル伝達を阻害する抗体およびアプタマー阻害剤は公知である。ＣＴＬＡ４に結合し、ＣＴＬＡ４機能を阻害し、腫瘍免疫を増強する例示的なアプタマーは記載されており、配列番号３８４〜３８８、５３９〜５４１に記載されている[Santulli-Marotto(2003) Cancer Res. 63(21):7483-7489;Gilboa et al.,(2013) Clin Cancer Res 19(5):1054-1062]。
【０７１３】
記載されたＣＴＬＡ４に結合し、かつＣＴＬＡ４活性を阻害するいくつかの抗体が、抗腫瘍免疫療法において用いられてきた。抗ＣＴＬＡ４抗体としては、限定するものではないが、米国特許第６,６８２,７３６号、同第６,９８４,７２０号；米国特許出願公開第２００２／００８６０１４号；同第２００９／００７４７８７号；欧州特許第１２６２１９３号；およびＷＯ２０００／０３７５０４に記載の任意の抗体が挙げられる。具体的には、抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ(ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、１０Ｄ１とも呼ばれる；ドラッグバンク(Ｄｒｕｇ  Ｂａｎｋ)アクセッション番号ＤＢ０６１８６)およびトレメリムマブ(チシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６または１１.２.１とも呼ばれる)が挙げられる。
【０７１４】
例えば、本明細書で提供される併用療法での使用のための抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ(ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、１０Ｄ１；ドラッグバンクアクセッション番号ＤＢ０６１８６)またはその誘導体、例えば、イピリムマブの変異型または抗原結合断片が挙げられる。イピリムマブは、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する完全ヒトＩｇＧ１κモノクローナル抗体である(例えば、米国特許仮出願第２００２／００８６０１４号および米国特許第６,９８４,７２０号の１０Ｄ１と命名された抗体を参照のこと)。イピリムマブの重鎖は、配列番号３８９に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号３９０に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)を有する。重鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＶＨＣＤＲ１(配列番号３９３に記載する)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号３９４に記載する)；およびＶＨＣＤＲ３(配列番号３９５に記載する)を含む。イピリムマブの軽鎖は、配列番号３９１に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号３９２に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)を有する。軽鎖のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１(配列番号３９６に記載する)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号３９７に記載する)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号３９８に記載する)を含む。組換え生成された場合、イピリムマブは、４つのポリペプチド鎖(各々４４７アミノ酸の２つの同一の重鎖および各々２１５アミノ酸の２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７１５】
別の例では、本明細書に提供される併用療法での使用のための抗ＣＴＬＡ４抗体としては、トレメリムマブ(チシリムマブ、ＣＰ−６７５,２０６または１１.２.１とも呼ばれる)またはその誘導体、例えば、トレメリムマブの変異型または抗原結合断片が挙げられる。トレメリムマブは、ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体である(例えば、ＷＯ００／３７５０４の１１.２.１と命名された抗体を参照のこと)。トレメリムマブの重鎖は、配列番号３９９に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４００に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)を有する。重鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４７１に記載する)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４７２に記載する)；およびＶＨＣＤＲ３(配列番号４７３に記載する)を含む。トレメリムマブの軽鎖は、配列番号４０１に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４０２に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)を有する。軽鎖のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１(配列番号４７４に記載する)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４７５に記載する)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４７６に記載する)を含む。組換え生成された場合、トレメリムマブは、４つのポリペプチド鎖(２つの同一の重鎖および２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７１６】
これらの抗ＣＴＬＡ４抗体は、がんの処置のための多数の臨床試験に関与している。イピリムマブは、黒色腫の処置に関してＦＤＡが承認しており、前立腺がん、肺がんおよびＲＣＣなどの他のがんに関しては臨床試験中であった。トレメリムマブは、ＣＲＣ、胃がん、黒色腫およびＮＳＣＬＣの処置について臨床試験で検討された。
【０７１７】
本明細書に提供される併用療法での抗ＣＴＬＡ４抗体はまた、イピリムマブもしくはトレメリムマブの変異型またはその抗原結合断片(バリエーションを含む)を含んでもよく、この変異型抗体は、免疫特異的にＣＴＬＡ４に結合する。そのバリエーションとは、例えば、アミノ酸置き換え、アミノ酸の挿入または欠失であり得る。
【０７１８】
(ｂ)抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１療法
本明細書に提供される併用療法(組成物およびその方法および使用を含む)は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を阻害する治療剤を包含する。抗体および融合タンパク質、アプタマー、抗体、アプタマーおよび融合タンパク質阻害剤(ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、かつＰＤ−１阻害性シグナル伝達を阻害する)を含む阻害剤は公知である。例示的な融合タンパク質としては、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されるＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合可溶性受容体であるＡＭＰ−２２４(Ｂ７−ＤＣＩｇとしても公知)が挙げられる。
【０７１９】
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、かつＰＤ−１−阻害性活性を阻害するいくつかの抗体が記載されており、これは、抗腫瘍免疫療法に用いられている。抗ＰＤ−１抗体としては、限定するものではないが、米国特許第７,９４３,７４３号、同第８,００８,４４９号、同第８,７７９,１０５号、同第８,７３５,５５３号；米国特許仮出願第２００５／０１８０９６９号、同第２００７／０１６６２８１号；国際公開番号ＷＯ２００８／１５６７１２に記載される任意の抗体が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、限定するものではないが、米国特許仮出願第２０１３／００３４５５９号および同第２０１３／００４５２０２号；米国特許第７,９４３,７４３号、同第８,２１７,１４９号、同第８,６７９,７６７号および同第８,７７９,１０８号；ならびに国際公開番号ＷＯ２０１０／０７７６３４およびＷＯ２０１３／０１９９０６に記載の任意の抗体が挙げられる。
【０７２０】
具体的には、抗ＰＤ−１抗体としては、ニボルマブ(また、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８または５Ｃ４としても公知)、ＭＫ−３４７５(またペムブロリズマブ、ラムブロリズマブまたはｈ４０９Ａ１１としても公知)、ピジリズマブ(またｈＢＡＴ−１またはＣＴ−０１１としても公知)およびＡＭＰ−２２４(またＢ７−ＤＣＩｇとしても公知)が挙げられる。これらの抗ＰＤ−１抗体は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、ＲＣＣ、血液学的悪性腫瘍、リンパ腫、白血病、膵臓がん、前立腺がん、肺がんおよび多発性骨髄腫などのがんの処置のための多くの臨床試験に関与していた。
【０７２１】
例えば、本明細書に提供される併用療法での使用のための抗ＰＤ−１抗体としては、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８または５Ｃ４としても公知)またはその誘導体、例えば、ニボルマブの変異型または抗原結合断片が挙げられる。ニボルマブは、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であって、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する(例えば、米国特許第８,００８,４４９号の５Ｃ４と命名された抗体を参照のこと)。ニボルマブの重鎖は、配列番号４０３に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４０４に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)を有する。重鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４０７に記載する)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４０８に記載する)；およびＶＨＣＤＲ３(配列番号４０９に記載する)を含む。ニボルマブの軽鎖は、配列番号４０５に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４０６に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)を有する。軽鎖のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１(配列番号４１０に記載する)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４１１に記載する)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４１２に記載する)を含む。組換え生成された場合、ニボルマブは、４つのポリペプチド鎖(２つの同一の重鎖および２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７２２】
別の例では、本明細書に提供される併用療法での使用のための抗ＰＤ−１抗体としては、ＭＫ−３４７５(ペムブロリズマブ、ラムブロリズマブまたはｈ４０９Ａ１１としても公知)またはその誘導体、例えば、ＭＫ−３４７５の変異型または抗原結合断片が挙げられる。ＭＫ−３４７５は、ヒト化ＩｇＧ４κモノクローナル抗体であって、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する(例えば、ＷＯ２００８／１５６７１２のｈ４０９Ａ１１と命名された抗体を参照のこと)。ＭＫ−３４７５の完全重鎖は、配列番号４１３に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４１４に記載するアミノ酸の配列を有し、完全軽鎖は、配列番号４１５に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４１６に記載するアミノ酸の配列を有する。この重鎖は、配列番号４１７に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４１８に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)から構成される。軽鎖は、配列番号４１９に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４２０に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)およびヒト化κ軽鎖定常領域から構成される。組換え生成された場合、ＭＫ−３４７５は、４つのポリペプチド鎖(各々４４７アミノ酸の２つの同一の重鎖および各々２１８アミノ酸の２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７２３】
ＭＫ−３４７５のＣＤＲは、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４２１)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４２２)；ＶＨＣＤＲ３(配列番号４２３)；ＶＬＣＤＲ１(配列番号４２４)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４２５)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４２６)を含む。
【０７２４】
別の例では、本明細書で提供される併用療法での使用のための抗ＰＤ−１抗体は、ピジリズマブ(ｈＢＡＴ−１またはＣＴ−０１１とも呼ばれる)またはその誘導体、例えば、ピジリズマブの変異型または抗原結合断片を含んでもよい。ピジリズマブは、Ｂリンパ系細胞膜に対して惹起され、かつＴ細胞およびＮＫ細胞ベースの活性を惹起することが示された、マウス抗体(ＢＡＴ)から生成されたヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ピジリズマブは、ヒトＰＤ−１に結合する(例えば、米国特許仮出願第２００５／０１８０９６９号でＢＡＴ−１  ＲκＤ／ＲＨＣと命名された抗体を参照のこと)。ピジリズマブの完全重鎖は、配列番号４２７に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４２８に記載するアミノ酸の配列を有し、完全軽鎖は、配列番号４２９に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４３０に記載するアミノ酸の配列を有する。この重鎖は、配列番号４３１に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４３２に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)から構成される。軽鎖は、配列番号４３３に記載する核酸の配列によってコードされる、配列番号４３４に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)およびヒト化κ軽鎖定常領域から構成される。組換え生成された場合、ピジリズマブは、４つのポリペプチド鎖(２つの同一の重鎖および２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７２５】
ピジリズマブのＣＤＲは、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４３５に記載するアミノ酸配列)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４３６に記載するアミノ酸配列)；ＶＨＣＤＲ３(配列番号４３７に記載するアミノ酸配列)；ＶＬＣＤＲ１(配列番号４３８に記載するアミノ酸配列)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４３９に記載するアミノ酸配列)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４４０に記載するアミノ酸配列)を含む。
【０７２６】
本明細書で提供される併用療法における抗ＰＤ−１抗体としてはまた、ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ピジリズマブおよびＡＭＰ−２２４の変異型またはその抗原結合断片(バリエーションを含む)も挙げられ、ここでこの変異型抗体は、免疫特異的にＰＤ−１に結合する。このバリエーションは、例えば、アミノ酸置き換え、アミノ酸の挿入または欠失であってもよい。
【０７２７】
具体的には、抗ＰＤ−Ｌ１(または抗Ｂ７Ｈ１)抗体としては、限定するものではないが、ＢＭＳ−９３６５５９と呼ばれる抗体(ＭＤＸ−１１０５または１２Ａ４としても公知)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(ＲＧ７４４６としても公知)およびＭＥＤＩ４７３６が挙げられる。これらの抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、卵巣がん、ＲＣＣおよび肺がんなどのがんの処置のための多くの臨床試験に関与していた。
【０７２８】
例えば、本明細書で提供される併用療法での使用のための抗ＰＤ−１抗体としては、ＢＭＳ−９３６５５９(ＭＤＸ−１１０５または１２Ａ４としても公知)またはその誘導体、例えば、ＢＭＳ−９３６５５９の変異型または抗原結合断片が挙げられる。ＢＭＳ−９３６５５９は、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であって、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する(例えば、米国特許第７,９４３,７４３号で１２Ａ４と命名される抗体を参照のこと)。ＢＭＳ−９３６５５９の重鎖は、配列番号４４１に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４４２に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)を有する。重鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４４５に記載する)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４４６に記載する)；およびＶＨＣＤＲ３(配列番号４４７に記載する)を含む。ＢＭＳ−９３６５５９の軽鎖は、配列番号４４３に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４４４に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)を有する。軽鎖のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１(配列番号４４８に記載する)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４４９に記載する)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４５０に記載する)を含む。組換え生成された場合、ＢＭＳ−９３６５５９は、４つのポリペプチド鎖(２つの同一の重鎖および２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７２９】
別の例では、本明細書に提供される併用療法での使用のための抗ＰＤ−１抗体としては、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(ＲＧ７４４６としても公知)またはその誘導体、例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａの変異型または抗原結合断片が挙げられる。ＭＰＤＬ３２８０Ａは、完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体であって、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する(例えば、米国特許第８,２１７,１４９号およびＷＯ２０１３／０１９９０６を参照のこと)。ＭＰＤＬ３２８０Ａは、配列番号４６３に記載するアミノ酸の配列を有する重鎖可変ドメイン(ＶＨ)および配列番号４６４に記載するアミノ酸の配列を有する軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)を含む。全長抗体は、配列番号４７７または４７９に記載するアミノ酸の重鎖配列および配列番号４７８に記載するアミノ酸の軽鎖配列を含む。全長抗体はまた、配列番号４６１に記載するアミノ酸の重鎖配列および配列番号４６２に記載する軽鎖配列を含むことが報告されている(ＷＯ２０１３０１９９０６を参照のこと)。重鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４６５に記載する)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４６６に記載する)；およびＶＨＣＤＲ３(配列番号４６７に記載する)を含む。軽鎖のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１(配列番号４６８に記載する)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４６９に記載する)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４７０に記載する)を含む。組換え生成された場合、ＭＰＤＬ３２８０Ａは、４つのポリペプチド鎖(２つの同一の重鎖および２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７３０】
別の例では、本明細書に提供される併用療法での使用のための抗ＰＤ−１抗体としては、ＭＥＤＩ４７３６またはその誘導体、例えば、ＭＥＤＩ４７３６の変異型または抗原結合断片が挙げられる。ＭＥＤＩ４７３６は、完全ヒトＩｇ１κモノクローナル抗体であって、ヒトＰＤ−１に特異的に結合する(例えば、米国特許出願公開第２０１３／００３４５５９号の２.７Ａ４ＯＰＴと命名された抗体を参照のこと)。ＭＥＤＩ４７３６の重鎖は、配列番号４５１に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４５２に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＨ)を有する。重鎖の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、ＶＨＣＤＲ１(配列番号４５５に記載する)；ＶＨＣＤＲ２(配列番号４５６に記載する)；およびＶＨＣＤＲ３(配列番号４５７に記載する)を含む。ＭＥＤＩ４７３６の軽鎖は、配列番号４５３に記載するヌクレオチドの配列によってコードされる、配列番号４５４に記載するアミノ酸の配列を有する可変ドメイン(ＶＬ)を有する。軽鎖のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１(配列番号４５８に記載する)；ＶＬＣＤＲ２(配列番号４５９に記載する)；およびＶＬＣＤＲ３(配列番号４６０に記載する)を含む。組換え生成された場合、ＭＥＤＩ４７３６は、４つのポリペプチド鎖(２つの同一の重鎖および２つの同一のκ軽鎖)からできている。各々の重鎖および軽鎖の対は、鎖間ジスルフィド結合を通じて連結される。
【０７３１】
本明細書に提供される併用療法での抗ＰＤ−１抗体としては、また、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＰＤＬ３２８０ＡおよびＭＥＤＩ４７３６の変異型またはその抗原結合断片(バリエーションを含む)が挙げられ、ここでこの変異型抗体は、免疫特異的にＰＤ−Ｌ１に結合する。このバリエーションは、例えば、アミノ酸置き換え、アミノ酸の挿入または欠失であってもよい。
【０７３２】
ｂ. 他の免疫調節剤
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、１以上の免疫調節剤とともに投与される。このような剤は、１以上のサイトカインの産生を増加または減少してもよく、自己抗原提示を上方制御または下方制御してもよく、ＭＨＣ抗原をマスクしてもよくまたは１種または複数の免疫細胞の増殖、分化、遊走もしくは活性化状態を促進してもよい。免疫調節剤の例としては、限定するものではないが、非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)、例えば、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、オキサプロジン、ナブメトン、スリンダク、トルメチン、ロフェコキシブ、ナプロキセン、ケトプロフェンおよびナブメトン；ステロイド(例えば、グルココルチコイド、デキサメサゾン、コルチゾン、ヒドロキシコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、エイコサノイド、例えばプロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエン；ならびに局所ステロイド、例えばアントラリン、カルシポトリエン、クロベタゾールおよびタザロテン)；サイトカイン、例えばＴＧＦｂ、ＩＦＮａ、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、ＩＬ４、ＩＬ−１０；サイトカイン、ケモカインまたは受容体アンタゴニスト、例えば、ＢＡＦＦ、Ｂ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、補体因子(Ｃ５、Ｄ)ＣＴＬＡ４、エオタキシン、Ｆａｓ、ＩＣＡＭ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮＡＲ、ＩｇＥ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１３Ｒ１、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２３、インテグリン、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣ、セレクチン、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＮＦ−Ｒ１に対する抗体、可溶性受容体および受容体−Ｆｃ融合体、Ｔ細胞受容体、例えば、Ｅｎｂｒｅｌ(登録商標)(エタネルセプト)、Ｈｕｍｉｒａ(登録商標)(アダリムマブ)およびＲｅｍｉｃａｄｅ(登録商標)(インフリキシマブ)；異種抗リンパ球グロブリン；他の免疫調節分子、例えば２−アミノ−６−アリール−５置換ピリミジン、ＭＨＣ結合ペプチドおよびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体、アザチオプリン、ブレキナール(ｂｒｅｑｕｉｎａｒ)、ブロモクリプチン、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、Ｄ−ペニシラミン、デオキシスペルグアリン、ＦＫ５０６、グルタラルデヒド、金、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、マロノニトロアミド(例えば、レフルノミド)、メトトレキサート、ミノサイクリン、ミゾルビン、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよびスルファサラジンが挙げられる。
【０７３３】
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、１以上のサイトカインとともに投与される。サイトカインの例としては、限定するものではないが、リンホカイン、モノカインおよび従来型ポリペプチドホルモンが挙げられる。サイトカインに含まれるのは、増殖ホルモン、例えばヒト増殖ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト増殖ホルモンおよびウシ増殖ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)および黄体ホルモン(ＬＨ)；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよびβ；ミュラー管抑制因子；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経増殖因子、例えばＮＧＦ−β；血小板−増殖因子；トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦ)、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β；インシュリン様増殖因子ＩおよびII；エリスロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘導因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、βおよびγ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ(Ｍ−ＣＳＦ)；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)および顆粒球−ＣＳＦ(Ｇ−ＣＳＦ)；インターロイキン(ＩＬ)、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β；ならびにＬＩＦおよびｋｉｔリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。
【０７３４】
免疫チェックポイントタンパク質を標的化および阻害する阻害性抗体に加えて、その標的タンパク質／受容体に結合することによって免疫応答を刺激し得るアゴニストの抗体が、本明細書に提供される併用での使用、方法および用途について考慮される。例えば、ウレルマブ(Ｕｒｅｌｕｍａｂ)(ＢＭＳ−６６３５１３および抗４−１ＢＢとしても公知)は、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)／神経増殖因子(ＮＧＦ)ファミリーの受容体のメンバーである、ＣＤ１３７共受容体を標的化するアゴニストのヒト化モノクローナル抗体であり、免疫刺激性の特性を有する、炎症部位の樹状細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、顆粒球および血管壁の細胞で発現される。ウレルマブは、本明細書に提供される併用療法の一部として投与された場合、腫瘍細胞に対して開始され得る免疫応答、特に細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激する、ＣＤ１３７発現性免疫細胞に対して特異的に結合して活性化する[例えば、Vinay et al.,(2012) Mol Cancer Ther. 11(5):1062-1070を参照のこと]。他の４−１ＢＢアゴニストもまた、Immunol Rev. 244:197-217(2011)でSnellらが記載したいずれかのように、本明細書に提供される併用に含まれてもよい。ＯＸ４０(ＣＤ１３４としても公知)は、ＯＸ４０アゴニスト、例えば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇらが、Immunol Rev. 244(1):218-231(2011)で記載するものなどを、本明細書に提供される併用に組み込むことによって標的化され得る、ＴＮＦファミリーの別の免疫刺激性受容体である。４−１ＢＢまたはＯＸ４０シグナル伝達に結合して刺激するアプタマーリガンドもまた記載されており(Gilboa et al.、Clin Cancer Res. 19(5):1054-1062)、本明細書に提供される併用療法への包含について考慮される。
【０７３５】
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)は、１以上のサイトカインまたは免疫系の細胞を刺激し、望まれるエフェクター機能を増強する他の剤とともに投与する。例えば、ＩＬ−２を含むが、これに限定されないＮＫ細胞を刺激する剤が、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２とともに投与できる。別の態様では、限定するものではないが、Ｃ５ａ、ホルミルペプチド、例えば、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン[Beigier-Bompadre et. al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8]を含む、マクロファージを刺激する薬剤を、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２とともに投与してもよい。また、限定するものではないが、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含む好中球を刺激する剤を、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２とともに投与してもよい。さらに、免疫刺激性サイトカインなどの遊走を促進する剤を、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２とともに投与してもよい。また限定するものではないが、インターフェロンγ、ＩＬ−３およびＩＬ−７を含むさらなる薬剤は、１以上のエフェクター機能を促進できる。いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を、１以上のサイトカインまたはエフェクター細胞機能を阻害する他の薬剤とともに投与する。
【０７３６】
ｃ. ヒアルロナン分解酵素
本明細書に提供される、併用ならびにその方法および用途を含む併用療法には、本明細書に提供されるＡＤＡ２に加えて、抗ヒアルロナン剤、例えば、可溶性のヒアルロナン分解酵素を含んでもよい。ヒアルロナン分解酵素は、ヒアルロナンの加水分解を触媒し、かつヒアルロナンを一時的に分解し得る酵素である。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの成分および間質性障壁の主な構成要素である。ヒアルロナン分解酵素群は、交互のβ−１→４およびβ−１→３グリコシド結合を介して互いに連結されている二糖類単位であるＤ−グルクロン酸(ＧｌｃＡ)およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)の反復から構成されるヒアルロナンポリマーを開裂することにより、ヒアルロナンを分解するように働く。ヒアルロナン鎖は、約２５,０００二糖反復以上の長さに達し得、ヒアルロナンのポリマーのサイズはインビボで約５,０００〜２０,０００,０００Ｄａの範囲であり得る。間質性障壁の主な構成要素であるヒアルロナンの加水分解を触媒することにより、ヒアルロナン分解酵素群はヒアルロナンの粘度を下げ、それにより組織透過性を高める。そのようなものとして、ヒアルロナン分解酵素群、例えばヒアルロニダーゼ群は、例えば、分散および送達を亢進するために他の薬剤、薬物およびタンパク質と組み合わせて展着剤または分散剤として使用されている。
【０７３７】
炎症性疾患およびがんを含む、特定の疾患はまた、ヒアルロナンの発現および／または生産にも関連する。ＨＡは、そのような疾患の進行にかかわる種々の生物学的過程に関連付けられている[例えばItanoら (2008) Semin Cancer Biol 18(4):268-274;Tammiら (2008) Semin Cancer Biol 18(4):288-295を参照のこと]。例えば、ＨＡは、上皮間葉移行およびｐ５３サプレッサー経路などの腫瘍進行に関連する生物学的過程に関連付けられている。また、ＨＡは、腫瘍などの疾患組織における水分摂取および間質液圧(ＩＦＰ)の増大にも関与し、それによって腫瘍脈管構造の圧迫が生じる。例えば、炎症の部位または腫瘍病巣では、ヒアルロナン、他の基質構成要素および水が急速に蓄積する。この急速な蓄積ゆえに、疾患部位はその環境との平衡状態に達することができず、それゆえに正常組織より高い間質液圧を有することになる。
【０７３８】
ポリマーコンジュゲートした可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、ＰＥＧＰＨ２０)などのヒアルロナン分解酵素を用いる処置は、腫瘍細胞上を含めて、蓄積した組織および細胞上でＨＡを分解し得る。この処置は、組織が収縮し、血管が拡張し、より多くの血液がその部位を流れることができるようにヒアルロナンを減少し得る。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼまたはポリマーコンジュゲートした可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、ＰＥＧＰＨ２０)などのヒアルロナン分解酵素を用いる処置は、間質の液圧(ＩＦＰ)ならびに組織部位での水分含量および関連する血管灌流の増大を下げ、それによって、腫瘍およびがんなどのヒアルロナン関連の疾患または状態を処置する。したがって、本明細書に提供される併用、使用および方法のためのヒアルロナン分解酵素としては、ヒアルロナン二糖鎖またはポリマーの切断を触媒する能力を有する任意の酵素が挙げられる。
【０７３９】
ヒアルロナン分解酵素群は、ヒアルロニダーゼ、ならびにヒアルロナンを切断する能力を有する、コンドロチナーゼおよびリアーゼなどの他の酵素を包含する。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロナン分解酵素の大きいファミリーのメンバーである。３つの一般的なクラスのヒアルロニダーゼがある：哺乳動物種のヒアルロニダーゼ、細菌のヒアルロニダーゼ、ならびにヒル、他の寄生生物および甲殻類のヒアルロニダーゼ。哺乳動物型ヒアルロニダーゼ群(ＥＣ３.２.１.３５)は、ヒアルロナンのβ−１→４グリコシド結合を四糖類および六糖類などの種々のオリゴ糖長に加水分解するエンド−β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。これらの酵素は、加水分解性およびトランスグリコシダーゼ活性の両方を有し、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸(ＣＳ)、一般的にＣ４−ＳおよびＣ６−Ｓを分解できる。５つのヒトヒアルロニダーゼ様遺伝子がヒトゲノムで特定されている、ＰＨ２０(またはＳＰＡＭ１)、ＨＹＡＬ１、ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ３、ＨＹＡＬ４およびＨＹＡＬＰ１。
【０７４０】
哺乳動物ヒアルロニダーゼ群は、主に精巣抽出物で見られる中性活性のものおよび主に肝臓などの臓器で見られる酸活性のものにさらに細分できる。ＨＹＡＬＰ１は、偽遺伝子であり、かつＨＹＡＬ３はあらゆる既知の基質に対して酵素活性を有することは示されていない。ＨＹＡＬ４は、コンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対して示す活性はわずかである。ＨＹＡＬ１は、プロトタイプ酸活性酵素であり、ＰＨ２０(配列番号５５１に記載する前駆体ポリペプチドおよび配列番号４８０に記載する成熟タンパク質)はプロトタイプの中性活性酵素である。酸活性ヒアルロニダーゼ群、例えば、ＨＹＡＬ１およびＨＹＡＬ２は、一般的に中性ｐＨ(すなわちｐＨ７)で触媒活性を欠く。例えば、ＨＹＡＬ１は、インビトロでｐＨ４.５を超えるとほとんど触媒活性を有しない[Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269]。ＨＹＡＬ２は、インビトロで極めて低比活性の酸活性酵素である。ヒアルロニダーゼ様酵素群はまた、一般的にヒトＨＹＡＬ２およびヒトＰＨ２０などのグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを介して原形質膜に結合するもの[Danilkovitch-Miagkova, et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5]およびヒトＨＹＡＬ１のように一般的に溶解性であるもの[Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5]によって特徴付けもできる。多くのヒアルロニダーゼはまた、グリコシル化されており、活性にはグリコシル化を必要とする。例えば、ヒトＰＨ２０は、配列番号５５１に例示されるポリペプチドのＮ８２、Ｎ１６６、Ｎ２３５、Ｎ２５４、Ｎ３６８、Ｎ３９３およびＳ４９０部位で６つのＮ連結グリコシル化部位を含む。
【０７４１】
ＰＨ２０は、精子−卵付着に天然に関与し、ヒアルロン酸を消化することにより卵丘細胞の層への精子浸透を助ける。ＰＨ２０は、精子表面におよびリソソーム由来アクロソームに位置し、アクロソームでは、ＰＨ２０はアクロソーム内膜に結合する。ヒトＰＨ２０のｍＲＮＡ転写物は、正常には翻訳されて、Ｎ末端で３５のアミノ酸シグナル配列(アミノ酸残基位置１〜３５)およびＣ末端で１９アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカー結合シグナル配列(アミノ酸残基４９１〜５０９)を含む５０９アミノ酸の前駆体ポリペプチド(配列番号５５１)を生成する。したがって、成熟ＰＨ２０は、配列番号４８０に記載する４７４アミノ酸のポリペプチドである。ＥＲへの前駆体ポリペプチドへの輸送およびシグナルペプチドの除去に続き、Ｃ末端ＧＰＩ付着シグナルペプチドは開裂されて、配列番号５５１に記載する前駆体ポリペプチドの４９０位に対応するアミノ酸位置に新たに形成されたＣ末端アミノ酸に対するＧＰＩアンカーの共有結合が促進される。対照的に、クリアなＧＰＩアンカーは、ヒト以外の多くの他のＰＨ２０種では予測されない。したがって、ヒツジおよびウシから産生されたＰＨ２０ポリペプチドは、本来可溶性形態として存在する。ウシＰＨ２０は、原形質膜へ極めてゆるく結合して存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されていない[Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36]。ウシヒアルロニダーゼのこの独特な特徴によって、臨床使用のための抽出物としての可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素の使用が可能になる[Ｗｙｄａｓｅ(登録商標)、Ｈｙａｌａｓｅ(登録商標)]。
【０７４２】
したがって、ヒアルロナン分解酵素は、膜結合型または細胞から分泌される可溶型で存在する。ヒアルロナン分解酵素群は、細胞から発現され、分泌されるように可溶性にされてもよい。例えば、ヒアルロナン分解酵素が、グリコシルホスファチジルイノシトール(ＧＰＩ)アンカーを含むかおよび／またはそうでなければ、膜結合もしくは不溶性である場合、ヒアルロナン分解酵素は、酵素を分泌および可溶性にさせるためにＧＰＩアンカーの全てまたは一部の切断および除去により溶解型で提供されてもよい。可溶性のヒアルロナン分解酵素は、本明細書に提供される併用治療の方法で用いられ得る。したがって、ヒアルロナン分解酵素は、切断改変型、例えば、ＧＰＩアンカーの全てまたは一部を除去するように切断された改変型を包含する。このような可溶性ヒアルロニダーゼの例としては、可溶性ＰＨ２０ヒアルロニダーゼ、例えば、米国特許第７,７６７,４２９号；米国特許出願公開第２００４０２６８４２５号、同第２０１００１４３４５７号または同第２０１３０３０２２７５号に記載の任意のものが挙げられ、また配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４または５２６〜５３２のいずれかに記載の例示的な可溶性ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼも参照のこと)。
【０７４３】
ヒアルロニダーゼを含む種々の形態のヒアルロナン分解酵素が調製されており、ヒトを含む対象における治療的使用が承認されている。例えば、動物由来ヒアルロニダーゼ調製物としては、Ｖｉｔｒａｓｅ(登録商標)(ISTA Pharmaceuticals)、精製ヒツジ精巣ヒアルロニダーゼ、Ａｍｐｈａｄａｓｅ(登録商標)(Amphastar Pharmaceuticals)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼおよびＨｙｄａｓｅ(商標)(Prima Pharm Inc.)、ウシ精巣ヒアルロニダーゼが挙げられる。Ｈｙｌｅｎｅｘ(登録商標)(Halozyme Therapeutics)は、ｒＨｕＰＨ２０と命名された可溶型のＰＨ２０をコードする核酸を含む、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞によって生成されるヒト組換えヒアルロニダーゼである(例えば、米国特許出願公開第２００４０２６８４２５号；米国特許第７,７６７,４２９号を参照のこと)。任意のヒアルロニダーゼ調製物を本明細書で提供される併用療法の方法で用いてもよいことは理解されるべきである(例えば、米国特許第２,４８８,５６４号、同第２,４８８,５６５号、同第２,６７６,１３９号、同第２,７９５,５２９号、同第２,８０６,８１５号、同第２,８０８,３６２号、同第５,７４７,０２７号および同第５,８２７,７２１号、ならびに国際公開番号ＷＯ２００５／１１８７９９；米国特許出願公開第２００４０２６８４２５号；米国特許第７,７６７,４２９号または本明細書に提供されるいずれかを参照のこと)。
【０７４４】
本明細書に記載されるのは、ヒアルロナン分解酵素の非限定的な例、例えば、ヒアルロニダーゼ酵素または可溶性ヒアルロニダーゼ酵素、例えば、本明細書で提供される併用および方法での使用のためのＰＨ２０である。一般には、このようなヒアルロニダーゼ分解酵素としては、ポリマーにコンジュゲートされるものが挙げられる。ヒアルロナン分解酵素、例えば、ヒアルロニダーゼは、例えば、ヒト由来、哺乳動物由来、細菌由来または他の生物学的由来であってもよい。他の例では、ヒアルロナン分解酵素は、例えば、ポリマーに対するコンジュゲーションによって修飾されてもよい。
【０７４５】
可溶性のヒアルロナン分解酵素(例えば、可溶性ＰＨ２０)
具体的には、本明細書で提供されるのは、任意の変異型ＡＤＡ２タンパク質および可溶性ヒアルロナン分解酵素、例えば、可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、可溶性ＰＨ２０)など、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２を含む併用治療の方法および組成物である。可溶性ヒアルロナン分解酵素としては、発現の際に細胞(例えば、ＣＨＯ細胞)から分泌されて、可溶型で存在する任意のヒアルロナン分解酵素が挙げられる。このような酵素としては、限定するものではないが、可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、非ヒト可溶性ヒアルロニダーゼ、例えば、非ヒト動物可溶性ヒアルロニダーゼ、細菌可溶性ヒアルロニダーゼおよびヒトヒアルロニダーゼ、Ｈｙａｌ１、ウシＰＨ２０およびヒツジＰＨ２０、それらの対立遺伝子変異型およびそれらの他の変異型が挙げられる。例えば、可溶性ヒアルロナン分解酵素の中でも、可溶性になるように改変された任意のヒアルロナン分解酵素が含まれる。例えば、ＧＰＩアンカーを含むヒアルロナン分解酵素は、ＧＰＩアンカーの全部または一部の切断および除去によって可溶型にされてもよい。一例では、ＧＰＩアンカーを介して正常に膜固定されているヒトヒアルロニダーゼＰＨ２０は、Ｃ末端でのＧＰＩアンカーの全部または一部の切断および除去によって可溶性にされてもよい。
【０７４６】
可溶性のヒアルロン酸分解酵素としてはまた、中性の活性および酸活性のヒアルロニダーゼが挙げられる。限定するものではないが、投与後の酵素の所望の活性のレベルおよび／または投与部位などの要因次第で、中性の活性および酸活性のヒアルロニダーゼが選択され得る。具体的な例では、ヒアルロン酸分解酵素は、可溶性中性活性のヒアルロニダーゼ、例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチドである。
【０７４７】
可溶性ＰＨ２０ポリペプチドは、ヒツジＰＨ２０、ウシＰＨ２０またはＣ末端で切断されており、ＧＰＩアンカー結合配列の全てもしくは一部を欠く可溶性ＰＨ２０であってもよい。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼの例は、そのヒアルロニダーゼが可溶性であり(発現の際、分泌される)、かつヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、Ｃ末端ＧＰＩアンカーの全てまたは一部を欠いている任意の種由来のＰＨ２０またはその切断型である。いくつかの場合には、可溶性ヒアルロン酸分解酵素、例えば、可溶性ＰＨ２０は正常には、ＧＰＩアンカーされ(例えば、ヒトＰＨ２０など)、Ｃ末端で切断により可溶性にされる。このような切断は、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の全てを除去してもよくまたはＧＰＩアンカー結合シグナル配列のごく一部を除去してもよい。例えば、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５またはそれ以上のＣ末端アミノ酸残基が除去されてもよい。しかし、得られたポリペプチドは、可溶性である。可溶性ヒアルロン酸分解酵素、例えば、可溶性ＰＨ２０が、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の一部を保持する場合、ポリペプチドが可溶性であるならば、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列の最大で１、２、３、４、５、６、７、８、９またはそれ以上のアミノ酸残基が保持されてもよい。当業者は、当該分野で周知の方法を用いて、あるポリペプチドがＧＰＩアンカー結合されるか否かを決定し得る。このような方法としては、限定するものではないが、ＧＰＩアンカー結合シグナル配列およびω部位の存在および位置を予測するための公知のアルゴリズムを用いること、ならびにホスファチジルイノシトール特異的なホスホリパーゼＣ(ＰＩ−ＰＬＣ)またはＤ(ＰＩ−ＰＬＤ)を用いる消化の前後に溶解度分析を行うことが挙げられる。
【０７４８】
通常は、可溶性ヒアルロン酸分解酵素、例えば、可溶性ＰＨ２０は、ヒトである。他の動物由来のヒアルロン酸分解酵素、例えば、ＰＨ２０を利用してもよいが、このような調製物は、それらは動物のタンパク質であるので、可能性としては免疫原性である。例えば、有意な割合の患者が、摂取した食物に対して二次的な事前感作を示し、これらが動物タンパク質であるために、全ての患者は、その後に感作される危険性がある。したがって、非ヒトの調製物は、慢性使用には適切でない場合もある。非ヒト調製物が望ましい場合、本明細書では、免疫原性の低下した、このようなポリペプチドが調製されることが考慮される。このような改変は、当業者の水準の範囲内であり、かつ例えば、分子の１以上の抗原性エピトープの除去および／または置換を包含し得る。
【０７４９】
可溶性ヒアルロニダーゼの例は、可溶性ヒトＰＨ２０である。組換えヒトＰＨ２０の可溶型は生成されており、公知である。ＰＨ２０のこのような可溶型の生成は、米国特許出願公開第２００４０２６８４２５号；同第２００５０２６０１８６号、同第２００６０１０４９６８号、同第２０１００１４３４５７号および国際公開番号ＷＯ２００９１１１０６６に記載される。完全にＧＰＩアンカー結合シグナル配列の全てまたは一部を欠く可溶性ＰＨ２０ポリペプチドが、中でもこれらのポリペプチドに含まれる。例えば、可溶性ＰＨ２０(ｅｓＰＨ２０)ポリペプチドは、ＧＰＩアンカーの少なくとも１つのアミノ酸を含んでもよくまたはＧＰＩアンカーの全てのアミノ酸残基を欠く場合もある。したがって、ＥＲ中のタンパク質のＣ末端に共有結合されたＧＰＩアンカーを有しかつ原形質膜の細胞外リーフレットに固定されている代わりに、これらのポリペプチドは分泌され、可溶性である。Ｃ末端切断型ＰＨ２０ポリペプチドは、全長野生型ポリペプチド、例えば配列番号４８０に記載する配列を有する全長野生型ポリペプチドまたはその対立遺伝子変異型もしくは種変異型もしくはその他の変異型と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個またはそれ以上のアミノ酸がＣ末端で切断されてもよい。
【０７５０】
可溶型のヒトＰＨ２０としては一般に、配列番号５５１に記載するアミノ酸３６〜４６４を含むものが挙げられる。例えば、可溶型としては、限定するものではないが、配列番号５５１に記載するアミノ酸の配列のうちＣ末端アミノ酸残基４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を有する、配列番号５５１に記載するヒトＰＨ２０のＣ末端切断ポリペプチド、その成熟型またはそれに少なくとも８５％同一性を示すポリペプチドが挙げられる。例えば、哺乳動物細胞で発現される場合、３５アミノ酸のＮ末端シグナル配列は、プロセシングの間に切断され、成熟型のタンパク質が生成されて、分泌され得る。したがって、成熟可溶性ポリペプチドは、配列番号４４１のアミノ酸３６〜４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００を含む。表６は、その前駆体型および成熟型を含む、例示的なＣ末端切断の可溶性ＰＨ２０ポリペプチドの非限定的な例を示す。下の表６では、前駆体および成熟型の長さ(アミノ酸)、ならびにＣ末端切断のＰＨ２０タンパク質の前駆体および成熟ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を示す配列識別子(配列番号)を示す。野性型ＰＨ２０ポリペプチドもまた、比較のために表６に含める。
【０７５１】
【表１０】
0006625627.tif 000012
【０７５２】
例えば、本明細書に提供される併用での使用のための可溶型のＰＨ２０としては、例えば、配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４、もしくは５２６〜５３２のいずれかに記載するアミノ酸の配列または配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４もしくは５２６〜５３２のいずれかに記載するアミノ酸の配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有しており、可溶性であってヒアルロニダーゼ活性を保持するポリペプチドが挙げられる。アミノ酸変異型は、保存的変異および非保存的突然変異を含む。上記のいずれかに記載されるかまたは当業者に公知であるような、ヒアルロニダーゼの活性に重要であるか、そうでなければ必要である残基は、一般には不変であり、かつ変化できないことが理解される。これらとしては、例えば、活性部位の残基が挙げられる。したがって、例えば、ヒトＰＨ２０ポリペプチドまたはその可溶型のアミノ酸残基１１１、１１３および１７６(配列番号５５１に記載する成熟ＰＨ２０ポリペプチド中の残基に対応する)は一般には、不変であり、かつ変更されない。適切なフォールディングに必要なグリコシル化およびジスルフィド結合の形成をもたらす他の残基も不変であり得る。
【０７５３】
具体的には、可溶性ヒトＰＨ２０ポリペプチドは、配列番号５５１に記載する配列のアミノ酸４８２の後で切断されるポリペプチドである。このようなポリペプチドは、シグナル配列を含んでおり、かつアミノ酸３６〜４８２をコードする核酸分子から生成され得る。このシグナル配列は、活性なシグナル配列であっても、ＩｇＧκシグナル配列であってもまたは分泌のためにタンパク質をプロセシングし得る他のシグナル配列であってもよい。翻訳後のプロセシングは、シグナル配列を取り除き、４７４個のアミノ酸の可溶性組換えヒトＰＨ２０(配列番号４８０)が残る。発現の際に生成される生成物は、ｒＨｕＰＨ２０と命名された分泌生成物を、培養培地中に生じ、これは、Ｃ末端で異種性を示し、その結果この生成物は、種々の量で配列番号４８１〜４８６のうちの任意の１つまたは複数を含み得る種の混合物を含む。通常は、ｒＨｕＰＨ２０は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞(例えば、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞)などの、活性を保持するために正確なＮ−グリコシル化を容易にする細胞中で生成される。Ｈｙｌｅｎｅｘ(登録商標)(Ｈａｌｏｚｙｍｅ)は、切断型ヒトＰＨ２０ポリペプチド(ｒＨｕＰＨ２０と命名)をコードする核酸を含む、遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞によって生成されるヒト組換えヒアルロニダーゼである。
【０７５４】
ＰＨ２０の変異型、例えば、ヒトＰＨ２０(例えば、可溶性ヒトＰＨ２０)は、公知であって、米国特許出願公開第２０１３／０３０２２７５に記載されている。米国特許出願公開第２０１３／０３０２２７５に記載される任意のＰＨ２０変異型を、本明細書に提供される併用での使用のために可溶性ＰＨ２０ポリペプチド中に組み込んでもよい。このような変異型としては、変性条件(例えば、フェノール系防腐剤)に対する抵抗の増大または活性の増大を示すものが挙げられる。このようなポリペプチドの例は、配列番号４８０に記載する全長ヒトＰＨ２０中にまたは配列番号４８１〜４８８、４９３〜５１４、もしくは５２６〜５３２のいずれかに記載する可溶性ヒトＰＨ２０中に記載するアミノ酸の配列に関して、アミノ酸置き換えＦ２０４Ｐ、Ｖ５８ＫまたはＶ５８Ｒを含む可溶性ヒトＰＨ２０である。
【０７５５】
一般には、ＰＨ２０の可溶型は、ポリペプチドが活性を保持することを保証するために正確なＮ−グリコシル化を容易にするタンパク質発現系を用いて生成する。なぜならグリコシル化は、ヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性に重要であるからである。このような細胞としては、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(例えば、ＤＧ４４ＣＨＯ細胞)が挙げられる。
【０７５６】
本明細書に提供される併用での、ヒアルロニダーゼ(例えば、ＰＨ２０)を含むヒアルロン酸分解酵素は、組換え的に生成されてもよくまたは例えば、試験抽出物などの天然の供給源から精製されても、もしくは部分的に精製されてもよい。組換えヒアルロン酸分解酵素を含む組換えタンパク質の生成のための方法は、本明細書のいずれかに示されており、かつ当該分野で周知である。
【０７５７】
ヒアルロン酸分解酵素は、半減期を延長する形式で投与されてもよい。例えば、ヒアルロン酸分解酵素は、リポソームまたはマルチセル層状小胞または他のこのような送達媒体の一部として提供されてもよい(例えば、本明細書の実施例２４を参照のこと)。ヒアルロン酸分解酵素は、送達用の腫瘍崩壊性ベクターまたは標的化ベクターなどのベクター中にコードされてもよい。
【０７５８】
ヒアルロン酸分解酵素、例えば、本明細書の併用に提供される可溶性ヒアルロニダーゼ(例えば、可溶性ＰＨ２０ポリペプチド)は、ポリマーで修飾されてもよい。いくつかの例では、このポリマーは、ポリアルキレングリコール、デキストラン、プルランまたはセルロースである。ヒアルロン酸分解酵素を修飾し得るポリアルキレングリコールポリマーとしては、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)およびメトキシポリエチレングリコール(ｍＰＥＧ)が挙げられる。ヒアルロン酸分解酵素がＰＥＧで修飾される例では、ＰＥＧは分岐であっても直鎖であってもよい。ある態様においては、ポリマーは、メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)(５ｋＤａ)；メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)(２０ｋＤａ)；メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＢＡ)(３０ｋＤａ)；メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルα−メチルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＭＢ)(２０ｋＤａ)；メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルα−メチルブタノエート(ｍＰＥＧ−ＳＭＢ)(３０ｋＤａ)；メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−ブチルアルデヒド(ｍＰＥＧ−ブチルアルデヒド)(３０ｋＤａ)、メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルプロピオネート(ｍＰＥＧ−ＳＰＡ)(２０ｋＤａ)；メトキシ−ポリ(エチレングリコール)−スクシンイミジルプロピオネート(ｍＰＥＧ−ＳＰＡ)(３０ｋＤａ)；(メトキシ−ポリ(エチレングリコール))２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ)(１０ｋＤａ分岐)；(メトキシ−ポリ(エチレングリコール))２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ)(２０ｋＤａ分岐)；(メトキシ−ポリ(エチレングリコール))２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ)(４０ｋＤａ分岐)；(メトキシ−ポリ(エチレングリコール))２−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ)(６０ｋＤａ分岐)；ビオチン−ポリ(エチレングリコール)−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル(ビオチン−ＰＥＧ−ＮＨＳ)(５ｋＤａビオチン化)；ポリ(エチレングリコール)−ｐ−ニトロフェニルカルボネート(ＰＥＧ−ｐ−ニトロフェニル−カルボネート)(３０ｋＤａ)またはポリ(エチレングリコール)−プロピオンアルデヒド(ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド)(３０ｋＤａ)との反応によって生成され得る。ある態様においては、このポリマーは、３０キロダルトンまたは約３０キロダルトンの分子量を有するＰＥＧであってもよい。
【０７５９】
ｄ. 感染性疾患を処置するための抗体
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２、例えば、その野性型、変異型および修飾型は、感染性疾患を処置するために１以上の抗体または抗体断片とともに投与される。感染性疾患を処置するために投与され得る抗体の例としては、限定するものではないが、抗炭疽菌抗体、例えばＡＢｔｈｒａｘ、抗ＣＭＶ抗体、例えばＣｙｔｏＧａｍおよびセヴィルマブ、抗クリプトスポリジウム抗体、例えばＣｒｙｐｔｏＧＡＭ、Ｓｐｏｒｉｄｉｎ−Ｇ、抗ヘリコバクター抗体、例えばＰｙｌｏｒａｎ、抗Ｂ型肝炎抗体、例えばＨｅｐｅＸ−Ｂ、Ｎａｂｉ−ＨＢ、抗ＨＩＶ抗体、例えばＨＲＧ−２１４、抗ＲＳＶ抗体、例えばフェルビズマブ、ＨＮＫ−２０、パリビズマブ、ＲｅｓｐｉＧａｍおよび抗ブドウ球菌抗体、例えばＡｕｒｅｘｉｓ、Ａｕｒｏｇｒａｂ、ＢＳＹＸ−Ａ１１０およびＳＥ−Ｍａｂが挙げられる。
【０７６０】
ｅ. 抗生物質および抗真菌剤
いくつかの例では、本明細書に提供される任意のＡＤＡ２(その野性型、変異型および修飾型を含む)を、１以上の抗生物質、例えば、限定するものではないが：アミノグリコシド抗生物質(例えば、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン)、アミノシクリトール(例えば、スペクチノマイシン)、アンフェニコール抗生物質(例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコールおよびチアンフェニコール)、アンサマイシン抗生物質(例えば、リファミドおよびリファンピン)、カルバペネム(例えば、イミペネム、メロペネム、パニペネム)；セファロスポリン(例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セファレキシン、セフラジン)、セファマイシン(セフブペラゾン、セフォキシチン、セフミノクス、セフメタゾールおよびセフォテタン)；リンコサミド(例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン)；マクロライド(例えば、アジスロマイシン、ブレフェルジンＡ、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トブラマイシン)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、カルモナムおよびチゲモナム)；ムピロシン；オキサセフェム(例えば、フロモキセフ、ラタモキセフおよびモキサラクタム)；ペニシリン(例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸、ベンジルペニシリンナトリウム、エピシリン、フェンベニシリン、フロキサシリン、ペナメシリン、ペネタマートヨウ化水素酸塩、ペニシリンｏ−ベネタミン、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンゾエート、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリンおよびフェネチシリンカリウム)；ポリペプチド(例えば、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、テイコプラニン、バンコマイシン)；キノロン(アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、エンロフロキサシン、フレロキサシン、フルメキン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、ペフロキサシン、ピペミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシンおよびトロバフロキサシン)；リファンピン；ストレプトグラミン(例えば、キヌプリスチン、ダルホプリスチン)；スルホンアミド(スルファニルアミド、スルファメトキサゾール)；テトラサイクリン(クロルテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、デメチルクロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、デュラマイシン、ミノサイクリン、ネオマイシン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、テトラサイクリンおよびバンコマイシン)とともに投与する。
【０７６１】
いくつかの例では、本明細書に提供される、その野性型、変異型および修飾型を含む任意のＡＤＡ２を、１以上の抗真菌剤、限定するものではないが、例えば、アンホテリシンＢ、シクロピロクス、クロトリマゾール、エコナゾール、フルコナゾール、フルシトシン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ニスタチン、テルビナフィン、テルコナゾールおよびチオコナゾールとともに投与する。いくつかの例では、本明細書に提供されるＡＤＡ２を、１以上の抗ウイルス剤、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤およびその他、例えば、Ｉ型インターフェロン、ウイルス融合阻害剤、ノイラミニダーゼ阻害剤、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、クレブジン、エンフビルチド、エンテカビル、フォスカーネット、ガンシクロビル、イドクスウリジン、インジナビル、ロピナビル、プレコナリル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、トリフルリジン、ビダラビンおよびジドブジンとともに投与する。
【実施例】
【０７６２】
Ｉ. 実施例
以下の実施例は、例示の目的で含まれるだけであって、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【０７６３】
実施例１：ヒトアデノシンデアミナーゼ２(ＡＤＡ２)のクローニングおよびＡＤＡ２変異型の生成
Ａ. 野性型(ＷＴ)ＡＤＡ２のクローニング
野性型ヒトアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ２)遺伝子であって、そのシグナル配列(配列番号１に記載する核酸配列；配列番号２に記載するアミノ酸配列(前駆体)をコードする)を増幅して、ｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔベクター(Agilent Technologies, Santa Clara, CA；カタログ番号２１２２２０；配列番号６に記載する配列)のＳｃａＩとＸｈｏＩの制限部位の間でクローニングした。コード配列のＣ末端では、停止コドンを、ＦＬＡＧ(商標)タグ(配列番号８に記載する核酸配列；配列番号９に記載するアミノ酸配列をコードする)をコードする核酸配列および停止コドンによって、タンパク質精製および／または検出の目的のために置き換えた。得られたコンストラクトｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ−ｈＡＤＡ２−ＦＬＡＧは、ＷＴ組換えヒトＡＤＡ２−ＦＬＡＧポリペプチド(配列番号７に記載するアミノ酸配列)をコードする。
【０７６４】
Ｂ. ＡＤＡ２変異型の生成
上記のＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２をコードする得られたコンストラクトを用いて、部位特異的なアミノ酸置換を導入して、ＡＤＡ２変異型を創出する。下のサブセクションに記載されるように、部位特異的なアミノ酸置換は、ＡＤＡ２のモデリング研究に基づいて行い、ヘパリン結合、触媒活性に関与するかおよび／またはＡＤＡ２とＡＤＡ２が結合する任意の他の受容体との間のタンパク質間相互作用を減弱することが示されている残基を特定した。生成されたＡＤＡ２変異型の各々は、上記のｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ−ｈＡＤＡ２−ＦＬＡＧベクターから、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies, Santa Clara, CA；カタログ番号２１０５１４)を用いる部位特異的な置換によって、製造業者の指示に従って作成した。
生成された変異型は、下の表７〜１２に示す。この変異型は、ＰＤＢアクセッション番号３ＬＧＧおよび３ＬＧＤ[配列番号４に記載する結晶構造で用いられるポリペプチドのアミノ酸配列；Zavialov et al., J. Biol. Chem. 285:12367-12377(2010)に基づく]で用いられるナンバリングに採用された、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングを用いておよび配列番号５に記載する成熟ヒトＡＤＡ２アミノ酸配列(Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９ＮＺＫ５に基づく；シグナル配列のアミノ酸残基１〜２９を含む前駆体アミノ酸配列は配列番号２に記載する)に基づく、成熟ＡＤＡ２ナンバリングを用いて命名される。表１は、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリング(配列番号４)および成熟ＡＤＡ２ナンバリング(配列番号５)の対応する位置の数を示す。
【０７６５】
ａ. ヘパリン結合が変更された候補変異型
ヘパリンは、身体全体の組織の表面に広く存在する、天然に存在するグリコサミノグリカンである。ＡＤＡ２は、ヘパリンと物理的に相互作用することが知られており[Zavialov et al., J. Biol. Chem. 285:12367-12377(2010)]、ヘパリンに対する結合は、投与されたＡＤＡ２の循環レベルを枯渇させるであろう。薬物動態の改善されたＡＤＡ２変異型を生成するために、モデリング研究に基づいて、ヘパリン結合に関与すると本明細書で特定された残基の置き換えを行った。Zavialov et al., J. Biol. Chem. 285:12367-12377(2010)に記載の、ヒトＡＤＡ２の２つの利用可能な結晶構造を用いて、突然変異誘発の候補位置を特定した：結合したヘパリンを欠いており、かつショウジョウバエの細胞から発現されるＡＤＡ２の結晶構造(RCSB Protein Data Bank(ＰＤＢ)Ｎｏ.３ＬＧＧ；遷移状態アナログコンホルマイシンに結合したヒトＡＤＡ２)；およびアポ型のヒトＡＤＡ２(Protein Data Bankアクセッション番号３ＬＧＤ；補因子も結合した基質もない空の(ｅｍｐｔｙ)酵素)。血漿構造から、静電気表面電位を算出し、オープンソースの３Ｄ分子可視化パッケージＰｙＭＯＬを用いて、正の静電ポテンシャルを有するＡＤＡ２上の表面を特定した。正の静電ポテンシャルを有する表面は、高度に負に荷電されたヘパリン硫酸との相補的な静電相互作用を形成し得る。静電表面ポテンシャルの算出から、１セットのリジンおよびアルギニン残基を、ヘパリンとＡＤＡ２変異型との間の電荷斥力を生じるため、アミノ酸であるアラニン(タンパク質のファイ−プサイ角に影響することのない、メチレン基での正に荷電されたリジンまたはアルギニン側鎖の置換のため)、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩(２つの公知の負に荷電されたアミノ酸)での置換のための候補部位として特定した。
モデリングに基づいて、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングによるアミノ酸残基１４、１６、２３、２９、２２０、２６１、２８０、２８６、３１２、３２０、３２４、３６９、３７４、３７５、４４４、４４７、４５５、４６４、４７２または４７３(成熟ナンバリングによる、それぞれ、残基１１、１３、２０、２６、２１７、２５８、２７７、２８３、３０９、３１７、３２１、３５２、３６６、３７１、３７２、４４１、４４４、４５２、４６１、４６９または４７０に対応する)を、突然変異誘発のために標的化した。ＡＤＡ２変異型は、アラニン、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩に対する位置で、アミノのアミノ酸置き換えによって生成した。単一のアミノ酸置き換え、ならびに、二重および三重のアミノ酸置き換えも行った。表７は、例示的な候補変異型におけるアミノ酸置換を示す。実施例７は、表７に示される選択候補変異型のヘパリン結合およびアデノシンデアミナーゼ活性を評価する研究を記載する。
【０７６６】
【表１１】
0006625627.tif 000013
【表１２】
0006625627.tif 000014
【０７６７】
ｂ. 候補活性部位(ＡＳ)変異型
触媒効率が改善されたＡＤＡ２変異型を生成するために、候補変異型は、分子モデリング研究に基づいて特定した活性部位でのアミノ酸残基の置き換えによって生成した。上記のような、遷移状態アナログであるコホルマイシン(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋアクセッション番号３ＬＧＧ)およびそのアポ型(Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋアクセッション番号３ＬＧＤ)に結合したヒトＡＤＡ２の結晶構造は、オープンソース３Ｄ分子モデリングプログラムＰｙＭｏｌを用いて可視化した。インシリコの部位特異的突然変異誘発は、ＰｙＭｏｌを用いて行い、活性部位内のアデノシンまたは隣接の残基に対する導入されたアミノ酸側鎖のパッケージングを評価し、活性部位付近または活性なポケットの割れ目での隣接残基に対するパッキングを評価し、導入された残基の立体的衝突の距離およびポテンシャルを測定し、活性部位ポケットの相対凹面に対する変化を評価し、アデノシンについての電位を評価して活性部位を評価した。突然変異誘発について標的化された選択された残基は、アデノシンについて触媒効率(ｋｃａｔ／Ｋｍ)の改善を達成するための候補として本明細書で特定され、そのためアデノシンデアミナーゼ活性が増大しているものであった。
モデリングに基づいて、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングによるアミノ酸残基８９、１８２、２２２、２２４、２６５、２６７、２６９、２７０および２９９(成熟ナンバリングによる残基８６、１７９、２１９、２２１、２６２、２６４、２６６、２６７,または２９６に相当する)を、突然変異誘発のために標的化した。ＡＤＡ２変異型は、全部で１９の他のアミノ酸に対する位置でのアミノ酸のアミノ酸置き換えによって生成した。表８は、例示的な候補変異型のアミノ酸置き換えを示す。実施例１０は、選択候補変異型のアデノシンデアミナーゼ活性を評価する研究を記載している。
【０７６８】
【表１３】
0006625627.tif 000015
【表１４】
0006625627.tif 000016
【０７６９】
【表１５】
0006625627.tif 000017
【表１６】
0006625627.tif 000018
【表１７】
0006625627.tif 000019
【０７７０】
ｃ.グリコシル化の変更された候補変異型
過グリコシル化されているＡＤＡ２変異型を生成するために、候補変異型を残基の突然変異(例えば、挿入および／またはアミノ酸置き換え)によって生成して、新しいＮ−グリコシル化部位モチーフ(Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ)の組込みによりＮ−グリコシル化部位を創出した。表９は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
【表１８】
0006625627.tif 000020
【０７７１】
ｄ. 受容体結合(ＰＲＢ)ドメインを欠いている候補変異型
受容体結合(ＰＲＢ)ドメインを欠くＡＤＡ２変異型を生成するために、残基Ｖ１０２−Ｑ１４７(成熟ナンバリングによるＶ９９−Ｑ１４４)またはＣ１０８−Ｔ１５０(成熟ナンバリングによるＣ１０５−Ｔ１４７)を、欠失させて、種々の長さ(例えば、３、５、７、１０または１５；配列番号２８０を参照のこと)のグリシンリンカーまたは種々の長さ(例えば、ｎ＝１、２または３；配列番号５８１および５８２を参照のこと)の(ＧＧＧＧＳ)ｎリンカーで置き換えた。表１０は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
【表１９】
0006625627.tif 000021
【０７７２】
ｅ.受容体結合(ＰＲＢ)ドメイン中のグリコシル化が変更された候補変異型
受容体結合(ＰＲＢ)を通じて潜在的受容体とのＡＤＡ２の潜在的相互作用を破壊するために、ＡＤＡ２候補変異型を、残基の突然変異(例えば、挿入および／またはアミノ酸置き換え)を導入することによって生成して、ＰＲＢドメイン中の新しいＮ−グリコシル化部位モチーフ(Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ)の組込みによりＮ−グリコシル化部位を創出した。表１１は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
【表２０】
0006625627.tif 000022
【０７７３】
ｆ. 受容体結合(ＰＲＢ)ドメインとＡＤＡドメインとの間の相互作用が変更された候補変異型
受容体結合(ＰＲＢ)ドメインと残りのＡＤＡ２(例えば、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)ドメイン)との間の相互作用が変更されたＡＤＡ２変異型を生成するために、突然変異を、ＰＲＢドメイン中の個々のまたは複数のアミノ酸中に導入した。構造ベースのデザインを用いて、ＰＲＢドメインがＡＤＡ２中のＰＲＢドメインの外側の他の接触残基と相互作用する能力を破壊し得るその三次元構造の状況で、ＡＤＡ２の表面上で残基を特定した。表１２は、例示的な候補変異型の突然変異を示す。
【表２１】
0006625627.tif 000023
【０７７４】
実施例２：組換えヒトアデノシンデアミナーゼ２(ｒＨｕＡＤＡ２)および変異型の生成
Ａ. 一過性発現
実施例１で生成された野性型ＡＤＡ２および変異型の一過性発現のために、３００ｍｌの１.０×１０６細胞／ｍｌのＣＨＯ−Ｓ細胞(Invtrogen、カタログ番号１１６１９−０１２)を、３７５μｇのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ−ｈＡＤＡ２−ＦＬＡＧプラスミドまたは変異型プラスミドによって、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ(商標)ＭＡＸ試薬(Life Technologies, Carlsbad, CA；カタログ番号１６４４７−５００)を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を４日間増殖して、培養上清を１００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって収集した。
収集された上清を用いて、各々がＦＬＡＧタグを有する、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２または成熟変異型(例えば、表７〜１２に示される変異型)のいずれかのタンパク質を精製した。バッチ精製を、製造業者の指示に従って、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティ樹脂(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO、カタログ番号Ａ２２２０)を用いて行った。ＡＤＡ２は、ＦＬＡＧ(商標)ペプチドを用いて樹脂から溶出した。溶出したタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を用いて評価した。ＳＥＣの結果により、精製されたタンパク質が二量体であることが確認された。Ｎ末端配列決定も行って、シグナル配列が配列番号２のアミノ酸残基１〜２９に相当することを確認し、その結果、精製された成熟タンパク質は、配列番号５に記載するアミノ酸残基ＩＤＥＴで開始する。
【０７７５】
Ｃ. クローニングおよび安定な発現
野性型ヒトＡＤＡ２遺伝子(配列番号１に記載する核酸配列)またはＣ末端ＦＬＡＧ(商標)タグを有する変異型(配列番号８に記載する核酸配列；配列番号９に記載するアミノ酸配列をコードする)を、レンチウイルス発現ベクターｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄのマルチクローニング部位(ＭＣＳ)中にサブクローニングした。得られた発現ベクター、ｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ｈＡＤＡ２−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄ(配列番号１０に記載する核酸配列)を用いて、ＣＨＯ−Ｓ細胞を安定にトランスフェクトできるレンチウイルスを生成した。発現ベクター中では、組換えヒトＡＤＡ２遺伝子の発現は、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動された。ＩＲＥＳ配列を、トランス遺伝子後に挿入し、続いて、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)のｃＤＮＡを、形質導入された細胞の選択のために用いられるブラスチシジン耐性遺伝子(Ｂｓｄ)と組み合わせて、顕微鏡による形質導入された細胞の特定のために用いた。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element：ＷＰＲＥ)をＧＦＰ−Ｂｓｄ配列の後に挿入して、遺伝子発現を増強した。
【０７７６】
構築されたレンチウイルス発現ベクターｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ｈＡＤＡ２−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄを用いて、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ(商標)(Invtrogen, Carlsbad, CA)製造業者の指示マニュアルに記載のとおりレンチウイルスを生成した。要するに、２９３ＦＴ細胞を、１０ｃｍの組織培養プレート上に６×１０６個の細胞でプレートした。２４時間後、９μｇのViraPower(商標)Packaging Mix(ｐＬＰ１、ｐＬＰ２およびｐＬＰ／ＶＳＶＧプラスミドの混合物を、１μｇ／μｌで、製造業者が供給したＴＥ緩衝液、ｐＨ８.０中に含む)および３μｇのｐＬＶ−ＥＦ１ａ−ｈＡＤＡ２−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−Ｂｓｄレンチウイルス発現プラスミドを、１.５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Life Technologies)培地中で混合した。３６μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ(商標)２０００(ＬＦ２０００；Life Technologies, Carlsbad, CA)を、１.５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Life Technologies)に希釈した。ＤＮＡおよびＬＦ２０００を穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ＤＮＡおよび脂質を複合体形成させた。その一方で、一晩培養培地を、５.０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ(抗生物質なし)で置き換えた。ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を、トランスフェクションのために２９３ＦＴ細胞に添加した。その細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で一晩インキュベートした。ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を含む培地を、１０ｍＬの完全培地で置き換え、細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃で一晩インキュベートした。上清を、トランスフェクション後、４８時間で収集して、培地を無菌のストレージチューブ中に移した。ウイルス含有培地を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、収集の間に積み残された２９３ＦＴ細胞をペレットにした。その上清を無菌のストレージチューブに注意深く移した。
【０７７７】
形質導入のために、ＣＨＯ−Ｓ細胞(Life Technologies, Carlsbad, CA；カタログ番号１６４４７−５００)を、ＣＤ  ＣＨＯ培地(Life Technologies, Carlsbad, CA；カタログ番号１０７４３−０２９)中で培養した。ＣＨＯ−Ｓ細胞株の形質導入は、２×１０７個のレンチウイルス単位(ＩＵ)および２×１０６個のＣＨＯ−Ｓ細胞を、４ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ(Invtrogen, Carlsbad, CA)および４μｇ／ｍＬの臭化ヘキサジメトリン(Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Biosettia, San Diego, CA)を補充した２ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地中に含有する、６ウェルプレートで行った。感染した細胞を、加湿空気インキュベーター中で、５％ＣＯ２を用いて６時間、３７℃で約３０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。次いで、細胞を回収して、低速(１０００×ｇ、５分)で遠心分離して、形質導入培地を取り出して、新鮮ＣＤ−ＣＨＯ培地で置き換えた。その細胞を、Ｔ−２５ｍＬベント型フラスコに移し、インキュベーターに戻した。最初の感染の４日後、その培地に１μｇ／ｍＬのブラストサイジン(Invtrogen, Carlsbad, CA)を補充した。その培地を、ＣＨＯ−Ｓ細胞のコンフルエンシーが約９０％に達して、細胞がフラスコからはがれ始めるまで３〜４日ごとに交換した。細胞を、増殖、細胞バンクおよびタンパク質生成のためのシェーカーフラスコに移した。
【０７７８】
馴化培地を収集して、各々がＦＬＡＧタグを有する、配列番号５に記載する成熟ＡＤＡ２または成熟変異型(例えば、表７〜１２に示される)のいずれかのタンパク質を精製した。２〜５リットルの馴化培地を回収して、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティ樹脂(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO、カタログ番号Ａ２２２０)を通過させた。その樹脂は、馴化培地をロードする前に、４ｍＬ／分の流速で、約１０倍の総容量の洗浄緩衝液(Tris Buffered Saline(ＴＢＳ)、ｐＨ７.５)を用いて平衡化した。次いで、ロードしたカラムを、総容量の約１０倍のＴＢＳを用いて洗浄し、次いでＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)に接続し、結合したタンパク質を低いｐＨの緩衝液(０.１ＭのＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ、ｐＨ２.７)を用いて溶出した。その画分を、１／１０容量の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.８を用いて直ちに中和した。
【０７７９】
精製されたタンパク質の画分をプールして、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット(２０ｋＤ  ＭＷＣＯ；Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いる２回の緩衝液交換によって４リットルのＰＢＳ中で透析した。次いで、透析したタンパク質生成物を、Amicon Ultra遠心分離濃縮器(３０ｋＤ  ＭＷＣＯ；EMD Milipore, Billerica,MA)を用いて濃縮し、最終のタンパク質濃度を、Pierce(商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific,Rockford, IL)を用いて決定した。調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて評価して、アデノシンデアミナーゼ活性を、実施例４で下に記載のとおり試験した。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した、ｒＨｕＡＤＡ２−ＦＬＡＧタンパク質調製物の純度は、９５％以上であった。その調製物をまた、サイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)によって特徴付け、これによって、ｒＨｕＡＤＡ２−ＦＬＡＧタンパク質が、曲線下面積(ＡＵＣ)計算で評価した場合、９５％より大きい純度で単一分子量種として存在することが示された。
あるいは、野性型ｒＨｕＡＤＡ２および変異型は、製造業者の仕様に従い、CHO Freedom CHO-S Kit(Invtrogen)を用いて発現して、上記のとおり精製した。
【０７８０】
実施例３：組換えヒトアデノシンデアミナーゼ１(ｒＨｕＡＤＡ１)の生成
Ａ. 野性型(ＷＴ)ＡＤＡ１のクローニング
ヒトアデノシンデアミナーゼ１(ＡＤＡ１)遺伝子(配列番号１１に記載する核酸配列；配列番号１２に記載するアミノ酸配列をコードする)を増幅して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)誘導性プロモーター(ＤＮＡ  ２.０,Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ)の制御下で、ｐＤ４４４−ＳＲ：Ｔ５−ｓＲＢＳ−ＯＲＦ(ＤＮＡ  ２.０, Menlo Park, CA；カタログ番号ＦＰＢ−２７−４４４)大腸菌発現ベクター中にクローニングした。そのコンストラクトはまた、タンパク質の親和性精製を容易にするために、リンカー(配列番号６４に記載するアミノ酸配列)およびＣ末端Ｓｔｒｅｐタグ(配列番号６５に記載するアミノ酸配列)を含んだ。コードされたＡＤＡ１−Ｓｔｒｅｐのアミノ酸配列は、配列番号３に示す。タンパク質の成熟型では、Ｎ末端メチオニン残基が除去されており、その結果、成熟ＡＤＡ１−Ｓｔｒｅｐポリペプチドは、配列番号６７に記載するアミノ酸配列(Ｓｔｒｅｐタグなしで、配列番号６６に記載する成熟ポリペプチド配列に相当する)を有する。
【０７８１】
Ｂ. ＡＤＡ１変異型の生成
ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ１−Ｓｔｒｅｐをコードするこの得られたコンストラクトを用いて、部位特異的なアミノ酸置換を導入して、配列番号６７に記載する成熟ＡＤＡ１に基づくナンバリングによるＡＤＡ１変異型Ｃ７４Ｓ(配列番号１２に記載するポリペプチドに基づくナンバリングによるＣ７５Ｓに相当する)を創出した。この変異型は、活性を安定化する候補として生成した。なぜなら、ＡＤＡ１中の溶媒露出システイン残基は、血漿中で酸化され得、かつ血漿中の酵素活性に負に影響し得るからである。部位特異的な置換は、製造業者の指示に従って、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies,Santa Clara, CA；カタログ番号２１０５１４)を用いて行った。成熟型のタンパク質では、成熟Ｃ７４Ｓ−ＡＤＡ１−Ｓｔｒｅｐ変異型は、配列番号６９に記載するアミノ酸の配列を有する(Ｓｔｒｅｐタグなしで、配列番号７０に記載する成熟ポリペプチド配列に相当する)。
【０７８２】
Ｃ. 大腸菌における発現
野性型ＡＤＡ１および変異型の発現のために、得られたクローニングされたコンストラクトをエシュリキア・コリＢＬ２１−ＤＥ３(Calbiochem,San Diego, CA)中に形質転換した。形質転換された細菌をLuria Broth(ＬＢ)アガーアンピシリンプレート(TekNova, Hollister, CA)上にプレートして、単一のコロニーを大規模培養のために選択した。選択されたコロニー由来の細菌を、抗生物質カルベニシリン(５０μｇ／ｍＬ；EMD Millipore, Billerica, MA)を補充したＬＢ培地中で一晩(３７℃、２００ｒｐｍ)増殖させた。その培養物を用いて、大きいシェーカー培養物に播種した。培養物を、約０.８のＯＤ６００に達するまで増殖させ、次いでタンパク質の発現を１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘導した。次いで培養物を２５℃のインキュベーターに移して、２００ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させた(約１５時間)。翌日、細菌の細胞を、９０００×ｇで３０分間遠心分離し、ペレット中の細胞を、約５分間２０％のデューティーサイクルで、氷上で反復パルスを用いて、Branson Sonifier 250(Emerson, Danbury, CT)を用いる超音波処理によって溶解した。次いで、細菌の溶解液をリゾチーム(１００μｇ／ｍＬ；Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)およびベンゾナーゼ(５０Ｕ／ｍＬ；Sigma-Aldrich, St.Louis, MO)とともに、穏やかに撹拌しながら４℃で４時間インキュベートした。細菌の溶解液を遠心分離して(５０００×ｇ；４５分)、細胞細片を除去した。
培養溶解液を用いて、各々がＳｔｒｅｐタグを有する、配列番号６６に記載する成熟ＡＤＡ１または配列番号６９に記載する成熟Ｃ７４Ｓ−ＡＤＡ１変異型のいずれかのタンパク質を精製した。浄化された溶解液を取り出して、無菌ろ過した後、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ(商標)アフィニティ樹脂を含むＳｔｒｅｐＴｒａｐ(商標)カラム(５ｍＬ容量；GE Healthcare, Pittsburgh, PA)上にロードした。次いで、カラムをＡＫＴＡ精製装置に接続し、タンパク質を、緩衝液(１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.０,１５０ｍＭのＮａＣｌ,１ｍＭのＥＤＴＡ)中に２.５ｍＭのｄ−デスチオビオチンが含有される溶液を用いて溶出した。精製されたタンパク質を含有する画分をプールして、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette(２０ｋＤ  ＭＷＣＯ；Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いる２つの緩衝液交換により４時間の間４リットルの１×リン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳ)緩衝液中で、４℃で透析した。次いで、そのタンパク質調製物を、Amicon Ultra遠心分離濃縮器(３０ｋＤ  ＭＷＣＯ；EMD Milipore, Billerica, MA)を用いて濃縮し、最終のタンパク質濃度を、Pierce(商標)BCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いて決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した、タンパク質調製物の純度は、９５％以上であった。
【０７８３】
実施例４：アデノシンデアミナーゼ酵素活性試験
アデノシンデアミナーゼ活性は、アデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)アッセイキット(Genway, San Diego, CA；カタログ番号ＢＱ０１４ＥＡＬＤ)をわずかに改変して用いて決定した。ＡＤＡアッセイは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(ＰＮＰ)によってヒポキサンチンに変換される、アデノシンからイノシンへの酵素的脱アミノ反応に基づく。次いで、ヒポキサンチンは、キサンチンオキシダーゼ(ＸＯＤ)によって尿酸および過酸化水素に変換される。過酸化水素はさらに、Ｎ−エチル−Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３−メチルアニリン(ＥＨＳＰＴ)および４−アミノアンチピリン(４−ＡＡ)と、ペルオキシダーゼ(ＰＯＤ)の存在下で反応して、反応速度論的方式でモニターされるキノン色素が生成される。
要するに、二連の５μＬの試料(定常状態の飽和でない酵素活性を測定するために適切な希釈で)を、製造業者の指示に従って、９６ウェルプレート中で１２０μＬのＲ１試薬(製造業者によって提供される；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、ｐＨ８.０、２ｍＭの４−ＡＡ、０.１Ｕ／ｍＬのＰＮＰ、０.２Ｕ／ｍＬのＸＯＤ、０.６Ｕ／ｍＬペルオキシダーゼ)に添加した。その混合物を、３７℃で約５分間インキュベートし、６０μＬのＲ２試薬(製造業者によって提供される；５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ４.０、１０ｍＭのアデノシン,２ｍＭのＥＨＳＰＴ)を、混合物に添加した。次いで、３７℃で５５６ｎｍの吸光度(ΔＡ)の変化を経時的に測定した。１単位のＡＤＡとは、３７℃で１分あたりアデノシンから１μモルのイノシンを生じるＡＤＡの量である。アデノシンデアミナーゼ活性(ｍＵ／ｍＬ)は、以下の式を用いて算出した：
１ｍＵ／ｍＬ＝(ΔＡ／分×Ｔｖ)／(Ｓｖ×ε×ｌ)
式中、Ｔｖ＝総容量(１８５μＬ)、Ｓｖ＝試料容量(５μＬ)、ε＝３２.２×１０−３μＭ−１ｃｍ−１、ｌ＝０.５ｃｍ。
【０７８４】
実施例５：ＡＤＡ１対ＡＤＡ２のインビトロの血漿安定性
ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ１、ｒＨｕＡＤＡ１−Ｃ７４ＳおよびｒＨｕＡＤＡ２の精製された調製物の酵素活性を、２４時間にわたる哺乳動物血漿中のインキュベーションの前後にアッセイして、組換えタンパク質調製物の安定性を試験した。変異型ｒＨｕＡＤＡ１−Ｃ７４Ｓをまた試験して、血漿中の安定性が、溶媒露出されたシステイン残基の置換によって改善され得るか否かを決定した。
【０７８５】
Ａ. 血漿中の精製されたｒＨｕＡＤＡ１およびｒＨｕＡＤＡ２調製物のインキュベーション
精製されたｒＨｕＡＤＡ１、ｒＨｕＡＤＡ２およびｒＨｕＡＤＡ１−Ｃ７４Ｓ調製物を個々に、エキソビボで２５％ＢＡＬＢ／ｃマウス血漿に、０.１７ｍｇ／ｍｌ(マウス中で１０ｍｇ／ｋｇの等価というほぼ等価用量に相当する)という最終濃度で添加した。その試料を、３７℃で２４時間インキュベートした。対照として、タンパク質を個々に、０.２％のＢＳＡ(安定化剤として)を含有するＰＢＳ中で０.１７ｍｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。インキュベーション後、０、４および２４時間で、各々の血漿インキュベートした試料および各々のＰＢＳインキュベートした対照の３つの小さいアリコートを取り出して、その後の分析まで−２０℃で保管した。
インキュベーション後のエキソビボの血漿中のタンパク質の安定性は、実施例４に記載される方法を用いてアデノシンデアミナーゼ酵素活性の変化を比較することによって決定した。タンパク質の分子量および安定性もまた、ウエスタンブロットによって検査して、可能性のあるタンパク質分解を検出した。約２００ｎｇのタンパク質を、ウエスタンブロットを用いて個々にアッセイして、タンパク質バンドをＥＣＬ(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて検出した。ウサギ抗ヒトＡＤＡ１(Abcam, Cambridge, MA)およびヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)(EMD Millipore, Billerica, MA)を、ｒＨｕＡＤＡ１用のそれぞれ一次抗体および二次抗体として用いた。抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ(Ａｂｃａｍ)を用いて、ｒＨｕＡＤＡ２を検出した。
【０７８６】
Ｂ. 結果
１. ｒＨｕＡＤＡ１安定性
表１３は、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ１およびｒＨｕＡＤＡ１−Ｃ７４Ｓのアデノシンデアミナーゼ活性試験の平均および標準偏差(ｓｔｄｅｖ)を示す。その結果、３７℃で血漿中の２４時間のインキュベーション後にｒＨｕＡＤＡ１活性の有意な低下があったことが示される。例えば、２４時間の血漿での処置後、１％未満の活性が保持されたが、同じ期間の間、ＰＢＳ／ＢＳＡ対照での場合は、８０％を超える活性が保持された。活性で観察された低下は、タンパク質分解では生じない。なぜならタンパク質レベルは、ウエスタンブロットで測定した場合、全ての時点で比較的一定であったからである。
その結果また、溶媒露出されたシステイン残基(Ｃ７４)が血漿中の酵素活性に対する負の影響の主な原因ではないことも示される。なぜなら同様の結果がＣ７４Ｓ変異型について得られたからである。例えば、７４位に露出したチオールを有さないにもかかわらず、変異型はやはり、血漿中での２４時間インキュベーション後、活性の強力な低下を示した。その結果、２４時間後、変異型酵素の活性の約１％が血漿での処置後に保持されるが、ＰＢＳ／ＢＳＡの対照での場合、活性のうち８０％より多くが保持されることが示された。
正常には、ＡＤＡ１は、細胞内の様式で発現され、転位して、細胞外ジペプチジルペプチダーゼ−４(ＤＰＰＩＶ)と関連することが公知である。これらの結果、この環境外では、ＡＤＡ１は血漿に対する暴露によって急速に不活性化されることおよび表面露出システイン７４の変異は、不活性化を妨げなかったことが実証される。
【０７８７】
【表２２】
0006625627.tif 000024
【０７８８】
２. ｒＨｕＡＤＡ２安定性
下の表１４は、血漿とのインキュベーション２４時間後、ｒＨｕＡＤＡ２のアデノシンデアミナーゼ活性試験の平均および標準偏差(ｓｔｄｅｖ)を示す。ＡＤＡ１の結果と対照的に、この結果により、ＡＤＡ２は実質的に、３７℃での２４時間インキュベーション後に血漿中で実質的にさらに安定であったことが示される。例えば、２４時間の血漿での処置後に約６５％の活性が保持されたが、同じ期間のＰＢＳ／ＢＳＡ対照での処置の場合は、活性の変化は観察されなかった。
【表２３】
0006625627.tif 000025
【０７８９】
実施例６：免疫応答のアデノシン媒介性調節に対するＡＤＡ２の効果
細胞外アデノシンは、免疫応答の炎症性調節因子であり、腫瘍微小環境におけるアデノシンのレベルの上昇は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のエフェクター機能を低下および／または阻害し得、それによって腫瘍増殖が支持される。アデノシンの効果が、免疫細胞増殖を評価することによってモニター可能か否かを評価するために、ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合物(ＮＫ／Ｔ)を用いて、増殖実験を行った。さらに実験を行って、ｒＨｕＡＤＡ２が、アデノシンのイノシンへの酵素的変換を通じて、アデノシン媒介性の増殖阻害から免疫細胞を救済し得るか否かを評価した。
【０７９０】
Ａ. ＮＫ／Ｔ細胞増殖に対するアデノシンの効果を評価すること
ＮＫ細胞およびＴ細胞の混合物(ＮＫ／Ｔ)を、健常ドナー末梢血単核球(ＰＢＭＣ)から調製した。要するに、１０×１０７個のヒトＰＢＭＣを、２０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３  ｅBioscience, San Diego, CA；カタログ番号１６−００３９)および５００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン２(ｒｈＩＬ−２；カタログ番号２００−０２, PeproTech, Rocky Hill, NJ)の存在下で、ＡＢ型の血液のドナー由来の５％ヒト血清(ヒトＡＢ血清；カタログ番号３５−０６０−Ｃｌ, Mediatech, Mannassas, VA)を有する幹細胞増殖培地(ＳＣＧＭ；Ｏｒｄｅｒ  Ｎｏ.２０８０２−０５００、CellGenix, Freiburg, Germany)中で６〜７日間培養した。次いで、細胞を、５００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ−２の存在下で、ＳＣＧＭ中でさらに２〜３週間培養した。２〜４週間培養したＮＫ／Ｔ細胞を実験に用いた。
ＮＫ／Ｔ細胞増殖のアデノシン媒介性の阻害を試験するために、ＮＫ／Ｔ細胞(１０, ０００細胞／ウェル)を、２００μＬ容量中で透明な底の９６ウェル白色プレートにプレートした。その細胞を、２０μＬのアデノシン(ＳＫＵ  Ｎｏ.Ａ９２５, Sigma  Ａｌｄｒｉｃｈ)を用いて、１ｍＭで開始して３倍希釈系列で得られる濃度、すなわち、１ｍＭ、３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０.３μＭおよび０.１μＭで処置した。ＮＫ／Ｔ細胞は、５％のＣＯ２を用いて、３７℃で、加湿組織培養インキュベーター中で５日間増殖させた。処置の５日後、細胞を９６ウェルプレート中で１２, ０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞の各々のウェルから１００μＬの培地を取り出し、続いて、１００μＬのCell Titer Glow(ＣＴＧ)試薬(カタログ番号Ｇ７５７０、Promega, Madison, WI)を添加して、室温で１５分間インキュベートし、その後、製造業者の指示に従って、SpectraMax M3プレートリーダーで蛍光を測定した。平均の細胞生存(％)は、アデノシンで処理していない対照の細胞に対して、測定した発光を比較することによって決定した。
その結果を表１５に示す。この結果では、５日間アデノシンを用いたＮＫ／Ｔ細胞の処置は、ＮＫ／Ｔ細胞増殖の用量依存性のアデノシン阻害を生じることが示された。応答が半分まで低下されるアデノシンの濃度であるＩＣ５０は、１６.２μＭであった。
【表２４】
0006625627.tif 000026
【０７９１】
Ｂ. ＮＫ／Ｔ細胞の増殖のアデノシン媒介性の阻害に対するＡＤＡ２の効果を評価する
ｒＨｕＡＤＡ２を試験して、これが、ＮＫ／Ｔ細胞増殖のアデノシン媒介性の阻害を１ｍＭのアデノシンで逆転し得るか否かを評価した。ＮＫ／Ｔ細胞(１０,０００細胞／ウェル)を、１８０μＬ全容量中で、透明な底の９６ウェル白色プレートにプレートした。細胞を、２０μＬのｒＨｕＡＤＡ２を用いて、３倍希釈系列から生じる濃度で処理して、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０.３ｎＭ、０.１ｎＭおよび０.０３ｎＭという最終のｒＨｕＡＤＡ２濃度を得て、次いで、各々のウェルもまた、２０μＬのアデノシンを１ｍＭで用いて処理した。処理後、ＮＫ／Ｔ細胞を、培養し、処理し、発光を上記のように測定した。平均細胞生存(％)は、アデノシンまたはｒＨｕＡＤＡ２で処理していない対照の細胞に対して、測定した発光を比較することによって決定した。
【０７９２】
その結果を表１６に示す。この結果では、ｒＨｕＡＤＡ２が、ＮＫ／Ｔ細胞増殖のアデノシン媒介性の阻害を、用量依存性の方式で救済することが示された。ＥＣ５０(ベースラインと最大の間で応答の半分を誘導するｒＨｕＡＤＡ２の濃度)は、８.５ｎＭであった。
【表２５】
0006625627.tif 000027
【０７９３】
また実験も行って、ｒＨｕＡＤＡ２の効果が、ＮＫ／Ｔ細胞増殖のアデノシン媒介性の阻害を種々の濃度のアデノシンで逆転することも評価した。その実験は、上記と同様の方式で行い、最終アデノシン濃度は、１ｍＭ、１００、５０または２５μＭで、かつ最終ｒＨｕＡＤＡ２濃度は、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０.３ｎＭ、０.１ｎＭおよび０.０３ｎＭであった。
その結果を表１７に示す。上記の結果と同様に、ｒＨｕＡＤＡ２によるＮＫ／Ｔ細胞増殖の用量依存性の救済が、種々のアデノシン濃度で観察された。種々の固定濃度のアデノシンでのｒＨｕＡＤＡ２についてのＥＣ５０値を表１８に示す。その結果、アデノシンがＮＫ／Ｔ細胞増殖を阻害することおよびｒＨｕＡＤＡ２の追加が、アデノシン媒介性の増殖阻害からヒトＮＫ／Ｔ細胞を救済し得ることが示される。
【表２６】
0006625627.tif 000028
MS% = 平均生存(%)
SD - 標準偏差
【０７９４】
【表２７】
0006625627.tif 000029
【０７９５】
実施例７：ヘパリン結合の低下を示すＡＤＡ２ヘパリン結合部位変異型の特定
ヘパリン結合に関与する残基中のアミノ酸置換を有する、上記の表７に記載される選択された候補変異型を、スクリーニングして、ヘパリン結合の減弱が示されるか否かを評価した。表１９は、試験された変異型を列挙する。ヘパリン結合は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いるかおよび／または酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を用いて評価した。さらに、変異型のアデノシンデアミナーゼ活性も評価した。実験を行うために、精製されたＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２および試験された変異型を、各々の実験でタンパク質の量を正規化するために０.３ｍｇ／ｍＬ濃度で調製した。
【０７９６】
Ａ. ヘパリン結合
１. ヘパリン親和性クロマトグラフィー
ヘパリンに対する変異型の結合を評価するために、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを使用して、ヘパリン結合の変異型を特定した。ヘパリン結合は、３５μＬのｒＨｕＡＤＡ２  ＷＴおよび変異型と、２０μＬのヘパリン−Sepharose(商標)樹脂(GE Healthcare, Pittsburgh, PA；カタログ番号１７−０９９８−０１)とを混合すること、続いて３０分間室温でインキュベートすることによって試験した。次いで、混合物を、０.２２μｍの遠心分離フィルターを通して遠心分離し、未結合のタンパク質を含有する流出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでの分析用に収集した。３５μＬの１.５ＭのＮａＣｌを、ヘパリン−Sepharose樹脂に添加して、室温で(ＲＴ)１０分間インキュベートして残りのヘパリン結合したタンパク質を、ヘパリン−Sepharoseから溶出した。精製されたＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２および試験された変異型の試料を、ヘパリン−Sepharose樹脂との混合の前後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、ヘパリン結合の程度を比較した。
【０７９７】
その結果を表１９に示す。この結果では、タンパク質の溶出の低下は、２５の試験した変異型のうち１６について達成されたことが示され、これによって、これらの変異型が、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２に比較してヘパリン結合の減弱を示すことが示される。他の変異型は、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２と同様の溶出を示した。
【表２８】
0006625627.tif 000030
【０７９８】
２. ヘパリン結合特性のためのＥＬＩＳＡアッセイ
ヘパリンコーティングしたマイクロタイタープレートを用いる酵素連結免疫吸着剤アッセイ(ＥＬＩＳＡ)を行って、上記でスクリーニングしたｒＨｕＡＤＡ２のＨＢＰ変異型のヘパリン結合特性の減弱を確認した。９６ウェルプレートを、Ｎａ２ＣＯ３緩衝液(ｐＨ９.６)中に含有される２００μｇ／ｍＬのヘパリンナトリウム塩(Calibochem, EMD Milipore, Billerica, MA；カタログ番号３７５０９５)の１００μＬで、４℃で一晩コーティングした。そのウェルを、ＰＢＳ中に含有される５％のミルクでブロックして、ＰＢＳを用いて６回洗浄した。３μＭの選択ｒＨｕＡＤＡ２変異型(表２０を参照のこと)、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２(陽性対照)およびＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ１(陰性対照)を、個々にウェルに添加して、室温で２時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳを用いて６回洗浄した。１００μＬの１：１０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)抗ＦＬＡＧ抗体(Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ,ＵＫ；カタログ番号Ａｂ１２３８)を、ウェルに添加して、結合を検出し、室温で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡ反応は、製造業者の指示に従って、３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質溶液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を添加して発色させ、光学密度を４５０ｎｍ(ＯＤ４５０)で、プレートリーダー上で読んだ。
【０７９９】
その結果を表２０に示しており、これは、試験した変異型について平均のＯＤ４５０読み取りおよび標準偏差(Ｓｔｄｅｖ)を示す。この結果では、ＷＴＡＤＡ２はヘパリンに結合を示すいずれの試験したタンパク質のうちでも測定されたＯＤが最高であったが、陰性対照であるＡＤＡ１は、検出可能なシグナルを生じなかったことが示される。この結果では、ヘパリンに対する結合の低下を呈する上記で特定された変異型である、全ての試験された変異型が、ＷＴ  ＡＤＡ２よりもＯＤ読み取りの測定が低く、したがってヘパリンコーティングプレートに対して結合が低下していることが示される。したがって、上記の結果と一致して、この結果によって、野性型ヒトｒＨｕＡＤＡ２と比較して、ヘパリンに対する結合の減弱が示された。
【表２９】
0006625627.tif 000031
【０８００】
Ｂ. アデノシンデアミナーゼ活性アッセイ
上記で試験したＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２および変異型のアデノシンデアミナーゼ活性を、実施例４に記載のアデノシンデアミナーゼ活性(ＡＤＡ)アッセイを用いて決定した。活性は、５μｇ／ｍＬに希釈した精製されたｒＨｕＡＤＡ２  ＷＴおよび変異型でアッセイし、次いで連続して２倍希釈して、４つの測定値を得た。
表２１がこの結果を示す。最後の列は、ｒＨｕＡＤＡ２  ＷＴと比較した相対的な酵素的活性(ＷＴに対する活性％)を示す。
この結果によって、ヘパリン結合の低下を示すほとんどの変異型が、ＷＴ  ＡＤＡ２に比較して同様であるかまたは増大したかいずれかのアデノシンデアミナーゼ活性を示すことが示される。具体的には、Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングによる変異型Ｒ２３Ｅ、Ｋ３７４Ｄ、Ｋ３７４Ｅ、Ｋ３７５Ｄ、Ｋ３７５Ｅ、Ｋ４５５Ｄ、Ｋ４５５ＥおよびＲ３６９Ｅ(成熟ナンバリングによる、それぞれ、Ｒ２０Ｅ、Ｋ３７１Ｄ、Ｋ３７１Ｅ、Ｋ３７２Ｄ、Ｋ３７２Ｅ、Ｋ４５２Ｄ、Ｋ４５２ＥおよびＲ３６６Ｅ)は、ヘパリン結合の減弱を示すだけでなく、酵素的活性の改善も示す。
対照的に、変異型Ｒ２３Ａ、Ｒ２３ＤおよびＲ３６９Ａ(成熟ナンバリングによりそれぞれＲ２０Ａ、Ｒ２０ＤおよびＲ３６６Ａ)は、ヘパリン結合の低下を示すだけでなく、アデノシンデアミナーゼ活性の低下も示す。
【０８０１】
この結果では、Ｋ１４Ｅ変異型(成熟ナンバリングによるＫ１１Ｅ)およびＫ４５５Ｄ変異型(成熟ナンバリングによるＫ４５２Ｄ)は、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２に対して酵素的活性の改善を示したが、ヘパリン結合特性は減弱されなかったことが示される。
【表３０】
0006625627.tif 000032
【０８０２】
実施例８：ｒＨｕＡＤＡ２のペグ化、ならびにアデノシンデアミナーゼ活性およびヘパリン結合の評価
ｒＨｕＡＤＡ２、Ｋ３７４Ｄ−ＡＤＡ２変異型(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)またはＲ２３Ｅ−ＡＤＡ２変異型(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)を、直鎖ＰＥＧ−２０Ｋとの反応によって表面露出リジン上でＰＥＧ化した。ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２または変異型をヘパリン結合およびアデノシンデアミナーゼ活性について評価した。
【０８０３】
Ａ. ＰＥＧ化
酵素をＰＥＧ化するために、３ｍｇ／ｍＬのＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２、ｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)またはｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)変異型を、各々個々に、直鎖ＰＥＧ−２０Ｋ(JenKem Technology, Plano, TX；カタログ番号Ｍ−ＳＣＭ−２０Ｋ)と１：１５のモル比で混合して、４℃で１６時間インキュベートした。その反応混合物を０.２２μｍの遠心分離フィルターを通して遠心分離して、ＰＥＧ化した酵素を含む流出物を収集した。
【０８０４】
ＰＥＧ化の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。この結果では、少なくとも８０％のＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２、ｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)およびｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)が、ＰＥＧ化ｒＨｕＡＤＡ２分子を示す複数の大きいバンドの出現を伴う未修飾のｒＨｕＡＤＡ２バンドの強度の低下で示されるような、反応条件下でＰＥＧ化されたことが示された。
【０８０５】
Ｂ. ヘパリン結合ＥＬＩＳＡ
ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２または変異型のヘパリン結合を、捕獲ＥＬＩＳＡによって評価した。ｒＨｕＡＤＡ１の結合を、陰性対照として評価した。１００μＬの０.２ｍｇ／ｍＬビオチン−ヘパリン(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO；カタログ番号Ｂ９８０６−１０ＭＧ)を、ストレプトアビジンコーティングした９６ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL；カタログ番号１５５２０)に添加して、室温で１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳを用いて６回洗浄した。次いで、１５０μＬの１μＭのＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２を、ヘパリンコーティングしたプレートに添加して、３×連続希釈で滴定し、室温で２時間インキュベートした。次いで、そのプレートを、ＰＢＳを用いて６回洗浄した。１０００×希釈のヤギＨＲＰ抗ＦＬＡＧ  ｐＡｂ(Abcam, Cambridge, UK；カタログ番号Ａｂ１２３８)を、ＥＬＩＳＡプレートに添加して、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを、Ｔｗｅｅｎ含有リン酸緩衝化生理食塩水(ＰＢＳＴ)を用いて６回洗浄し、製造業者の指示に従って３,３’,５,５’−テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質溶液(Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)を用いて発色させ、プレートリーダーで４５０ｎｍの光学密度(ＯＤ４５０)を読んだ。
【０８０６】
表２２は、ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２野性型および変異型のヘパリン結合捕獲ＥＬＩＳＡアッセイからの平均ＯＤ４５０読み取りおよび標準偏差(Ｓｔｄｅｖ)を示す。この結果では、ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２および変異型が、ヘパリン結合の有意な低下を有することが示される。ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)およびｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)変異型について、ＰＥＧ化は、ヘパリン結合の低下したＰＥＧ化されていない形態と比較してヘパリン結合特性のさらなる低下をもたらした。したがって、これらの結果によって、ＰＥＧ部分によるｒＨｕＡＤＡ２タンパク質の修飾は、立体ブロックによるヘパリン結合および／またはｒＨｕＡＤＡ２の表面上での静電帯電の変化を低下することが示される。
【表３１】
0006625627.tif 000033
【０８０７】
Ｃ. アデノシンデアミナーゼ活性アッセイ
ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２および変異型のアデノシンデアミナーゼ活性を、実施例４に記載の方法を用いて評価し、対応するＰＥＧ化されていない形態の活性と比較した。
その結果を表２３に示す。この結果では、ＰＥＧ化したＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２が、ＰＥＧ化されていない形態と比較して匹敵するアデノシンデアミナーゼ活性を有したことが示される。同様に、ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)およびｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)変異型はまた、ＰＥＧ化されていない形態と比較して匹敵するアデノシンデアミナーゼ活性を示した。ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２は、３２リジン残基を単量体としておよび６４リジン残基を二量体として含むが、ＰＥＧ化はリジン残基では、ｒＨｕＡＤＡ２のアデノシンデアミナーゼ活性に影響を有さなかった。
【表３２】
0006625627.tif 000034
【０８０８】
Ｄ. 結論
実験の結果、ｒＨｕＡＤＡ２変異型のＰＥＧ化は、アミノ酸置換から生じるヘパリン結合の減弱に加えてヘパリン結合を低下するが、ただしアデノシンデアミナーゼ活性の損失はないことが実証される。したがって、この結果では、ヘパリン結合変異型のＰＥＧ化は、アデノシンデアミナーゼ活性に影響することなく、ｒＨｕＡＤＡ２変異型の薬物動態学的特性を改善し得ることが示される。ＰＥＧ化を変異の代わりに用いて、ヘパリン結合を減弱してもよい。
【０８０９】
実施例９：ｒＨｕＡＤＡ２、ＡＤＡ２変異型およびＰＥＧ化形態のインビボ薬物動態分析
ＺａｖｉａｌｏｖナンバリングによるＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２、ＡＤＡ２−Ｋ３７４ＤおよびＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ変異型(成熟ナンバリングによって、それぞれＫ３７１ＤおよびＲ２０Ｅ)の非ＰＥＧ化形態およびＰＥＧ化形態の薬物動態(ＰＫ)を、免疫適格性マウスモデルで分析した。
【０８１０】
Ａ. 研究デザイン
５４匹の雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、６つの投薬群に分け、種々の時点での血液のサンプリングのために各々３つの群にさらに分けた。このように、マウスを全部で１８の群に無作為化した。マウスを研究の開始前に秤量して、それらの体重に基づいて１８の群に無作為化した。各々のサンプリング群では、(３)マウスの３つの群を、各試験品を投与するために用いて、動物からの血液の重複を防いだ。ベースラインのＡＤＡ２レベルの測定のために、血液試料を、１２匹の無作為に選択されたマウスから得て、血漿を、抗凝固剤カリウム(Ｋ３)エチレンジアミン四酢酸(Ｋ３−ＥＤＴＡ)を用いて調製した。全ての血液は顎下の静脈穿刺によって収集した。
各々のマウスに、表２４に示される６つのＡＤＡ２試験品、すなわち、ｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)、ＰＥＧ−ｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄ(ＰＥＧ−成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)、ｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)、ＰＥＧ−ｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(ＰＥＧ−成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)またはＷＴ  ＡＤＡ２およびＰＥＧ−ＷＴＡＤＡ２のうちの１つの７.５ｍｇ／ｋｇの用量を、静脈内の尾静脈注射によって注射した。ＰＥＧ化したＡＤＡ２変異型は、実施例８Ａに記載のＰＥＧ化方法を用いて調製した。各々の試験品の濃度は、１.５ｍｇ／ｍＬであって、これによってマウスの体重(ＢＷ)次第で９３〜１１９μＬの投与容量範囲とした。個々の動物の投与容量および体重は、表２５に示す。
【０８１１】
血液は、下の表２４に示されるようにマウスの適切な群から指定したサンプリング時点で収集し、血漿調製まで氷上で保持した。血漿は、血液を遠心分離すること(５００×ｇ、４℃で５分間)によって調製し、血漿を新鮮なチューブに移し、直ちに、アデノシンデアミナーゼ活性アッセイまで−８０℃で凍結させた。アデノシンデアミナーゼ活性は、実施例４に記載のように決定した。半減期、すなわち、ＡＤＡ２タンパク質の活性が半分に低下されるのにかかる時間を算出した。また、総暴露を濃度時間の曲線下面積(ＡＵＣ)を算出することによって測定した。
【表３３】
0006625627.tif 000035
【０８１２】
【表３４】
0006625627.tif 000036
【表３５】
0006625627.tif 000037
【０８１３】
Ｂ. 結果
１. ＰＥＧ化されていないｒＨｕＡＤＡ２  ＷＴおよび変異型の薬物動態
Ｚａｖｉａｌｏｖナンバリングによる変異型ＡＤＡ２−Ｋ３７４ＤおよびＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによって、それぞれ、Ｋ３７１ＤおよびＲ２０Ｅ)と比較したＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２の薬物動態(ＰＫ)の特性を、表２６および２７に示す。表２６は、曲線下面積(ＡＵＣ)算出を用いて測定した総暴露を示し、表２７は半減期(ｔ１／２)を示す。この結果では、変異型の各々が、野性型ＡＤＡ２と比較して薬物動態パラメーターの改善を示したことが示される。例えば、変異型ｒＨｕＡＤＡ２−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)は、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２についてよりも１９％高いＡＵＣおよびＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２よりも１１９％長い半減期を示した。変異型ｒＨｕＡＤＡ２−Ｋ３７４Ｄは、ＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２について１２８％高いＡＵＣおよびＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２について２３０％長い半減期を示した。
【表３６】
0006625627.tif 000038
【０８１４】
【表３７】
0006625627.tif 000039
【０８１５】
２. ＰＥＧ化したｒＨｕＡＤＡ２  ＷＴおよび変異型の薬物動態
変異型、ＰＥＧ−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)およびＰＥＧ−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)のＰＥＧ化形態と比較した天然およびＰＥＧ化したＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２の薬物動態学的(ＰＫ)特性を、表２８および２９に示す。表２８は、曲線下面積(ＡＵＣ)算出を用いて測定した総暴露を示し、表２９は、半減期(ｔ１／２)を示す。
野性型ＡＤＡ２に関しては、この結果では、ＰＥＧ化は実質的に薬物動態プロフィールを改善する。この結果では、ＰＥＧ−ＷＴＡＤＡ２は、非ＰＥＧ化ＷＴ  ＡＤＡ２よりも４２９１％高いＡＵＣおよびＰＥＧ化されていないＷＴ  ＡＤＡ２よりも１０７８％長い半減期を呈することが示される。同様に、改変型のＰＥＧ化はまた、非ＰＥＧ化形態と比較して薬物動態の改善を生じた。したがって、測定されるＰＫ成分であるＡＵＣおよびｔ１／２の両方に関して、ＰＥＧ化は、ＰＥＧ化されていない形態と比較してＰＫ値の改善をもたらした。
この結果では、ＡＤＡ２改変型のＰＥＧ化形態はまたＰＥＧ−ＷＴ  ＤＡ２と比較してＰＫ成分の一方または両方の改善を呈するが、これらの改善は、ＰＥＧ−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)についてよりも、変異型ＰＥＧ−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)について大きかったことも示される。例えば、ＰＥＧ−Ｒ２３Ｅ(成熟ナンバリングによるＲ２０Ｅ)は、ＰＥＧ化されていないＷＴ  ＡＤＡ２よりも４２７１％高いＡＵＣ(ＰＥＧ−ＷＴ  ＡＤＡ２についての４２９１％と比較)およびＰＥＧ化されていないＷＴ  ＡＤＡ２よりも１４２０％長い半減期(ＰＥＧ−ＷＴＡＤＡ２についての１０７８％と比較)を呈した。対照的に、ＰＥＧ−Ｋ３７４Ｄ(成熟ナンバリングによるＫ３７１Ｄ)は、ＰＥＧ化されていないＷＴ  ＡＤＡ２よりも８１８７％高いＡＵＣ(ＰＥＧ−ＷＴ  ＡＤＡ２についての４２９１％と比較)およびＰＥＧ化されていないＷＴ  ＡＤＡ２よりも１７９１％長い半減期(ＰＥＧ−ＷＴＡＤＡ２についての１０７８％と比較)を呈した。
【表３８】
0006625627.tif 000040
【０８１６】
【表３９】
0006625627.tif 000041
【０８１７】
実施例１０：酵素活性が増大しているＡＤＡ２活性部位変異型の特定
上記の表８に記載される選択された候補変異型(酵素活性において役割を果たす残基中のアミノ酸置換を含む)を、実施例４に記載の方法を用いてそれらのアデノシンデアミナーゼ活性について評価した。表３０は、試験された変異型を列挙する。実験を行うために、精製されたＷＴ  ｒＨｕＡＤＡ２および試験された変異型を５μｇ／ｍＬ濃度で調製して、各々の実験でのタンパク質の量を正規化した。
アデノシンデアミナーゼ活性アッセイの結果を、下の表３０に示す。ＷＴ−ＡＤＡ２と比較した各々の変異型の活性パーセント(％)を示す。この結果では、１８２位(成熟ナンバリングによる１７９位)で置換を含む全ての試験した変異型の活性が実質的に低下されたことが示され、このことは、グルタミン酸(Ｅ)残基が酵素活性に重要であることを示している。
【０８１８】
対照的に、他の置換は、酵素活性の増大を保持するかまたは呈する。具体的には、活性の増大を有する特定された変異型としては、以下が挙げられる：ＷＴの１７０％の活性を有するＲ２２２Ｑ変異型(成熟ナンバリングによるＲ２１９Ｑ)、ＷＴの１１４％の活性を有するＨ２６７Ｑ変異型(成熟ナンバリングによるＨ２６４Ｑ)、ＷＴの１５３％の活性を有するＨ２６７Ｇ(成熟ナンバリングによるＨ２６４Ｇ)、ＷＴの１５２％の活性を有するＲ２２２Ｋ変異型(成熟ナンバリングによるＲ２１９Ｋ)、ＷＴの１２８％の活性を有するＬ２２４Ａ変異型(成熟ナンバリングによるＬ２２１Ａ)、ＷＴの１２３％の活性を有するＬ２２４Ｖ(成熟ナンバリングによるＬ２２１Ｖ)、ＷＴの１１３％の活性を有するＬ２２４Ｇ(成熟ナンバリングによるＬ２２１Ｇ)およびＷＴに対し臣銼볯醼볯꺁듦Ꞁ苣覜臣讂볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㈴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼뗧袐臣覤闧讞臣龔裦㲐牢ਾ†藩ꂴ듦Ꞁ苣鞢ꓥ鞁胣颃菣ꪃ菣邵郥銂룦놼臣龁苣龃菣뢅뷧鮏苣ꮐ苣蒵郥鮁ꓥ낕黥⢋潣扭湩瑡潩⁮慶楲瑡銂铧邈臣龁胣랅뷤蒚臣꾁胣龮雦设볯邼臣風볨閁苣讂苣蚁臣떅듧뮴胦꺁鳦ꞤꋥꞤ苣节臣覂臣ꊂ菣躃藩꺽迦뎼볯隼볯꺼臣袂臣込臣龁臣늼볯銼볯놼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯銼볯誁苣뎁볯뺁臣꾁볯銼볯馼볯⦱苣膀껥붖뻤鞼臣릉껥閁苣讂苣龃菣뢅뷧鮏볯鎼볯钼볯膀볯鎼볯钼볯誁苣뎁볯뺁臣꾁볯銼볯ꖼ邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣誂胣鶁苣麁苣膀볯鎼볯醼볯膀볯鎼볯醼볯誁苣뎁볯뺁臣꾁볯銼볯ꖼ꺁臣ꆁ臣醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣蒵臣袐苣鮁臣芀ꓥ낕黥꾁胣冁極䍫慨杮⁥楌桧湴湩⁧畍瑬⁩楓整䐭物捥整⁤畍慴敧敮楳⁳楋銂铧蒁臣龮雦设볯ꞁ룤風臣貂苣袂臣ꮁ铧邈臣龁胣龔裦閁苣龁뗧袐臣覤闧讞苣ꢡ볯醼臣몤臣芀뗧袐臣覤闧讞臣袂臣뺯뿥馁苣颍룤꺁苣龃菣뢅뷧鮏苣膀苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣뮴胦꺁迥鲿胩ꚺꯨ蒚菣ꦃ菣벃苣벃臣ꒁ臣ꚁ臣袂臣颃菣ꪃ菣邵郥ꮁ臣蒁臣閩뻤鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㌴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†藩鞈闧랏볯馼胣隼볯ꮁ꣨覼臣讂ꓥ낕볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼誁苣뎁볯뺁臣꾁藩鞈闧랏볯隼볯鲀볯鞼볯ꮁ꣨覼臣讂볯銼볯銼볯⢱裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣늼볯醼볯놼膀臣覂臣ꮁ꿥鲿臣讂跥肸苣龃菣뢅뷧鮏苣ꮐ苣蒵郥鮁ꓥ낕黥銂胣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣趏뿥龀뫥隫髧醃菣ꆃ菣뾂菣ꮁ臣蒁臣閩뻤鞁臣芀藩鞈闧랏볯馼胣隼볯ꮁ꣨覼臣讂ꓥ낕볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣���袂苣뎼볯隼볯꺼誁苣뎁꿥鲿臣讂跥肸苣龃菣뢅뷧鮏苣ꮐ苣蒵郥鮁ꓥ낕黥銂胣颃菣ꪃ菣邵郥뮴胦ꮁ臣蒁臣閩뻤鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖ꆼ‮苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣뮴胦꺁迥鲿胩ꚺꯨ蒚ꧨꆾ戼㹲 醼‮苣莃苣ꒂ雦閳戼㹲 ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣膀苣躃苣뎃臣誣臣貂臣ꢁ臣膀苣螃菣랂菣讁苣뺔蟥閁苣讂苣뎃菣讃苣꺁룦骮臣袂臣ꚁ뇦骮臣龁胣ꊂ菣ꊃ菣ꊂ臣膀룥ꦲ臣ꊂ菣ꊃ菣ꊂ苣莃苣ꒂ苣莃菣⢈苣뾂菣낂闧랏볯ꆼ볯醼볯邼匬杩慭䄭摬楲档‬瑓䰮畯獩‬位銂铧蒁臣겸껥鞁臣芀臣꺁苣莃菣꾁胣캁銈苣袃苣ꮃ苣ꮃ藩誁苣뎁볯ꆼ볯낼볯銂郥肂매ꖇꧨ겖苣ꮐ臣膀臣貂臣膀苣莃苣ꒂ臣꺁뷤ꢔ觥ꮁ볯趽볯꺁냦ꞁ蛥讧裦閁苣龁胣ꊂ菣ꊃ菣ꊂ臣膀뇎裢놂菣낂菣뾂菣뢅ꮼ볯ꆼ誁苣뎁苩莅菣뎂菣뎃苣龃菣ꊂ菣讃菣뢂菣꾂菣ꪂ菣覃菣뎃藩⢸볯ꆼ볯낼볯⦨臣膀볯銈苣ꮃ苣龃菣뢅苣銃菣궃苣誃菣벂Ꞽ볯ꢼ꺁귥ꢜ룤ꞁ迥鲿臣讂胣꺼볯꒼볯ꢼ臣뢅賥ꮁ뗨ꂛ臣讂胣鎼볯邼뷯趽臣꺁郥覅뫥꺁뷤许臣膀苣뎃菣讃苣莿뫥ꢁ胣鞁臣貁臣ꚁ苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣뮴胦ꢁ꿦设臣讂胣㲂牢ਾ†뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯ₒ랼볯誁苣뎁ꓥ낕黥꺁迥鲿胩ꚺꯨ蒚菣ꦃ菣벃苣벃苣膀臣꺁苣莃苣ꒂ苣ꢔ臣ꚁ胣邽볯鞼閼臣袂臣隼閼臣꺨胣꺁苣螃菣랂菣莿뫥ꞁ꿦莼臣龁胣銼볯캐궼胣銼볯趽볯ꮁ迥뚁苣螃菣랂菣莿뫥銂铧蒁臣芀菣ꮃ뿦ꚺ鳦肺臣ꊂ菣躃苣뎃苣袃菣꾂苣醼볯꺁볯膽볯ꢼ룤ꞁꫨ붣臣龁胣㲂牢ਾ†뷯ꢼ볯⺗볯ꞁ臣떅듧蒚苣莃苣ꒂ臣龁苣ꮁ胣ꊂ菣躃苣뎃苣膀볯邼볯趽볯꺁藩뢅菣袃菣Ꚃ菣⢠볯膽볯ꆼ뷯⦃胣邽볯钼馼苣ꢔ臣ꚁ胩骶룥袇臣龁胣銼韃迥鲿럦袐觧銂胣뾪ꏨ鞁胣鎁苣꾁蛥讧裦閁苣龁苣뎃菣讃苣ꊂ菣뮂苣ꚩ雨⢬듧钼뷯궼臣캮銈苣袃苣ꮃ苣ꮃ藩ꦡ臣袂臣蒴볯邼볯캐궼臣꺼볯꒼볯ꢼ苣ꮐ苣⦀胣랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼臣龁臣覤闧讞苣醼볎뷯込뷯겼醼볯躽볯⦭臣誁苣뎁苣ꮃ苣龃菣뢅菣銃菣궃苣誃菣벂Ꞽ볯ꢼ醼볯閼볯貸蟩⦈苣ꮐ苣ꂁ胣颼볯캕겼臣ꊂ菣躃苣뎃苣膀볯뚼胩躘菣벃菣ꢂ菣ꊂ菣것菣袃룤ꮁ뫤ꎀ臣膀볯閼볎볯꺁볯쎒랷郥ꦉ臣뮷諥鞁臣芀껥ꦸ臣꺁뗧芙髧ꪁ볯钼볯躽뷯ꞁ臣뢐藥ꚺ臣覤賥⢖铎볯⦡苣ꊃ菣뾂菣鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖 邽볯隼閼臣꺁藩ꂴ髧ꊂ菣뮂苣꺁臣膂臣膀苣螃菣랂菣銂볯邼볯趽볯꺁菣骃菣뢂菣銈볯Ⲯ볯馀裢鎃苣⢹볯銈苣뾂菣릂菣鮃菣뢅⠩볯ꦼ볯ꖼ볯⦳胣邽볯隼閼苣ꢔ臣ꚁ胩骶룥袇臣龁胣銼볯邼뷯궼臣낼볯낼볯뎼胣邽볯隼閼臣ꮐ���貂苣銼韃迥鲿럦袐觧銂ꫨ붣臣膀臣貂臣钼뷯궼뇎裢놂菣낂菣뾂菣뢅胣鎼볯邼볎볯꺁볯ꆼ볯낼볯膀볯캑螽볯趽볯⢬볯鞼뷯궼꺁뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯뺁臣꾁ꓥ낕黥誁苣뎁볯邼볯込뷯겼臣Ꞽ볯ꢼꮂ苣궃苣ꪕ迥Ꞽ볯隼볯隼匬杩慭裢ꆼ뷯蒽뷯覽뷯袽銂郥鎂臣芀藩ꂴ髧趏뿥꾁胣誸꣨꺁苣蚁臣膀볯뚼胩躘菣벃菣ꢂ菣ꊂ菣것菣袃臣銼韃럦袐觧ꮁ귧릮蟩꺁苣螃菣랂菣銂럦ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ雩讧臣膀껥ꦸ臣꺁뗧芙髧ꪁ볯钼볯躽뷯ꞁ臣뢐藥ꚺ臣覤賥⢖铎볯⦡苣ꊃ菣뾂菣鞁臣芀戼㹲 ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ趽볯込뷯겼⠩볎볯込裥覭뻤ꦉ銂胣ꖻ룤꺁볥銂铧蒁臣鞮蟥鞁臣骼戼㹲 醼뷯떼볯趽볯鶼裢⢒裢캒ꆼ볯蚈韃볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲖猯扵⤾볯⢏볯㲳畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲖猯扵쌾캗쎵貽㰩牢ਾ†볥궸胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隽⼼畳㹢볯辷껥辇醼볯邼볎볯⦬胣뎼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隽⼼畳㹢볯ꚩ雦릮蟩⢏볯閼볎볯⦬胣캁鶼볯⺖볯銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲓猯灵츾궼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵莽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢醼⼼畳㹰胣貽볯醼뷯趽臣芁苣芀戼㹲 뮴胦螃菣뾂苣膀片灡灨摡倠楲浳苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ菣ꮂ苣ꪃ苣銈菣뎃菣뎃볥꺁鷩骷뷥麛룥ꮁ臣ꚁ臣膂胣ꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽⼼畳㹢臣袂臣뚼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽뷯颽⼼畳㹢苣鞾臣芀믤꺁迥鲿胩ꚺꯨ醃菣ꆃ菣뾂菣膀뻤袁臣膀뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵誁苣뎁뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵节뇦骮臣龁胣㲂牢ਾ†뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵⠾볯込뷯⦓볯뚼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽뷯颽⼼畳㹢볯宏볯嶥猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢戼㹲 뚼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽뷯颽⼼畳㹢跥趽볯캝궼볯蚈戼㹲 嬠볯嶥猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢볯颼閼뷯궼臣龁臣邼邼볯颼볯캕궼戼㹲 讽猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰莽뷯钽⼼畳㹢볯뚼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽뷯颽⼼畳㹢볯邼邼볯颼볯込볯邼戼㹲 讽猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰莽뷯钽⼼畳㹢볯ꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽⼼畳㹢跥趽볯醼볯궼뷯ઓ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ볯⺒邵黦㲜牢ਾ†ꇨ鎼볯誁苣뎁볯鎼臣膀臣貂臣貂胣邽볯鞼隼臣袂臣邽볯隼閼臣膀뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯躇胦讞臣袂臣覤闧讞臣趏뿥龀뫥隫髧醃菣ꆃ菣뾂菣銂ꓧ馁胣랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼臣ꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧���≰趽⼼畳㹢臣膀뷯ꢼ볯⺗볯ꞁ볯⺕볯閼뷯궼臣袂臣邽볯隼閼臣鎼隼볯趽볯ꞁ臣誂胣랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼臣ꚧꫥ릊軧⢇뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵⤾臣膀뷯ꢼ볯⺗볯ꞁ볯ⲙ볯閼볯誁苣뎁뷯ꢼ볯⺖볯ꞁ볯鞼邼볯邼臣芁臣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣鎁苣覂臣邵黦ꞁ臣膀볯뒼†뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯꾁胣邽볯隼閼臣袂苣Ꞥ臣蒁듦Ꞁ苣袑臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀藥ꚁ臣ꚩ꣩鞁臣覤闧讞臣膀볯뒼裢ꆼ볯ꆼ볯ꢁ꿦莼臣ꚁ铦蒖臣貂臣떅듧꺁迥鲿胩ꚺꯨ銂ꓧ鞁臣芀룤겈臣꾁胣궨꣨鞁臣覤闧讞臣떅듧趏뿥龀뫥隫臣릔雥꾁胣邽볯鞼隼苣誂苣邽볯隼閼臣閁苣ꮁꇩ鞑臣뎦꿥閁苣龁胣㲂牢ਾ†뻤袁臣膀볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼꾁胣랼볯ꢁ꿦莼臣ꚁ鳦辄臣릔雥閁苣龁迥鲿胩ꚺꯨ蒚觧Ꞁ苣覜臣龁胣銽볯閽볯꒼볯銼臣뮴胦ꢃ뷤ꞁ苣ꪃ菣议鿥銼볯閼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯隼볯⦒臣ꊂ苣醃菣꺂菣뢁臣꺽迦꾁胣ꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽⼼畳㹢臣ꒀ苣邽볯鞼隼臣鎼邼볯趽볯뺁臣誁苣뎁뷯ꢼ볯⺖볯ꞁ볯⺑볯馼뷯궼臣躽룤鞁胣ꚧꫥ릊軧⢇뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵⤾苣膀뷯ꢼ볯⺗볯ꞁ볯ⲙ볯閼볯鲀볯銼銼볯颼醼볯궼뷯⦓臣誁苣뎁뷯ꢼ볯⺖볯ꞁ볯鞼邼볯邼胣隼볯Ⲑ볯鎼볯⢙볯込볯鎽ꮁꋥꞤ臣龁胣늼볯銼볯놼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯⦱臣뺁臣膀볯뒼臣钯볨鞁臣覜蓦ꮁ铦蒖臣貂臣趏뿥龀뫥隫臣릉胦銂鳦鞁臣芀菣뢂菣议鿥銼볯銼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯醼볯⦙臣낂菣뾂菣뎃臣꺁뷧鮏臣膀뷯ꢼ볯⺗볯ꞁ볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵꺁胥銂볯⺑볯銼뷯궼臣誁苣뎁뷯ꢼ볯⺖볯ꞁ볯⺐볯馼볯趽볯ꮁ뷤许臣鮁胣ꚧꫥ릊軧⢇뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵⤾苣膀뷯ꢼ볯⺗볯ꞁ볯ⲙ볯閼볯讁苣隼볯Ⲑ볯馼볯⢗볯込볯鎽ꮁ臣袂臣邽볯隼閼臣醼볯ⲗ볯隼볯讁苣颼볯ⲓ볯钼볯⢖볯込볯鎽ꮁꋥꞤ臣龁胣㲂牢ਾ†菣醃菣뎃뗧袐臣鮸볥銂苣龁苣馁臣릉껥閁苣龁胣몼뷯隽뷯膽뷯辽뷯誃菣邃菣뎃苣ꮁ臣醁苣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞볯鎼볯钼볯膀볯鎼볯钼볯誁苣뎁볯銼볯ꖼ邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣誂胣鶁苣麁苣膀볯鎼볯醼볯膀볯鎼볯醼볯誁苣뎁볯銼볯ꖼ꾁臣龁胣邽볯隼閼臣Ꞥ臣讁臣龁胣랼볯ꢁ꿦莼臣ꚁ胣趏뿥龀뫥隫觧Ꞁ臣릔雥节ꓧ鞁臣芀볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼���郥肂뗧袐臣覤闧讞臣閁苣ꮁ胣랼볯ꢁ꿦莼臣ꚁ꟨銪듦Ꞁ臣릔雥銂ꓧ鞁臣芀藥鎽髧ꮁ臣膀뗧袐臣覤闧讞볯銼볯閼볯込볯鎼볯钼볯膀볯銼볯閼볯込볯銼볯ꖼ臣袂臣뎼볯隼볯꺼볯늼볯鎼볯込볯鎼볯钼볯꾁胣ꚩ꣩鞁臣覤闧讞臣궸臣节뷯ꢼ볯⺖볯ꞁ꟨銪듦Ꞁ臣肜ꓥ꺁铦蒖苣몤臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞臣꾁臣龁胣늼볯銼볯놼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯⦱苣ꮐ苣蒵郥鮁ꓥ낕黥꾁胣랼볯₴ꆼ볯ꆼ볯誁苣뎁볯銼볯銼볯⢱裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣늼볯醼볯놼ꢁ꿦릁臣覜蓦ꮁ铦蒖臣貂臣趏뿥龀뫥隫觧Ꞁ苣覜臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀ꧨ鎨臣龁볯꒼볯銼뗧袐臣覤闧讞臣궸臣节胣貺蟩膪蓧覤闧鎽볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣늼볯醼볯놼볯뎼볯隼볯꺼꾁胣趏뿥龀뫥隫觧Ꞁ臣肜ꓥ꺁铦蒖苣袑臣膀볯뒼†볯꒼볯銼臣钯臣ꚁ胣邽볯鞼隼臣膀볯⺔볯趀뷤蒁볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵誁苣뎁볯閼胥颫臣ꚧꫥ릊軧⢇뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵⤾臣袂臣邽볯隼閼臣閼邼胥躽臣ꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰趽⼼畳㹢臣袂臣颼銼胥颫臣ꚧꫥ릊軧⢇뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵⤾苣몤臣龁胣鶁臣邵黦ꞁ臣뺁臣膀볯꒼볯銼†볯뒼臣袂臣覤闧讞苣ꮐ苣ꢅ臣꺁ꧨ鎨臣龁볯銼볯銼볯⢱裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣늼볯醼볯놼꾁胣邽볯隼閼臣꾁胣邽볯鞼隼臣袂苣节뷤蒁볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵銂鳦馁苣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㐰㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㔴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ볯⺢蒵郥鮁ꓥ낕黥꺁菣醃菣뎃뗧袐戼㹲 颍룤꺁ꫧ뚄ꓥ낕뷤誁苣뎁볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼銂郥肂뗧袐臣覤闧讞臣颃菣ꪃ菣邵郥뮴胦銂胣誸꣨꺁껥붖뻤鞼ꆼ臣風볨꺁볯겼볯뎼볯馃菣릂臣颃菣ꪃ菣邵郥ꊂ菣뮂苣銂铧蒁臣閩뻤鞁臣芀臣꺁뗧鲞苣ꢡ볯钼臣몤臣芀臣꺁뗧鲞胣覤闧讞볯鎼볯钼볯膀볯鎼볯钼볯誁苣뎁볯銼볯ꖼ臣膀볯뒼裢ꆼ볯ꆼ볯ꮁ꿦莼臣ꚁ菣醃菣뎃臣뺯臣讂뗧袐臣鮸볥銂ꓧ馁臣ꢁ臣몢ꫨ閁苣龁胣閁苣ꮁ胣뮴胦ꢃ뷤议鿥꺁铦覤臣袂苣떅듧뮴胦꺁铦蒖臣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣뎼볯隼볯꺼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯銼볯⦮ꓥ���黥꾁臣龁胣颃菣ꪃ菣뎂菣蚃苣뎃苣鞁臣鞃菣벃菣ꮁ꿥馁苣邵郥꺁룦놼苣鶿鳦鞁臣誁苣膀臣貂臣袂臣ꚁ胣떅듧뮴胦ꢃ뷤꺁铦覤臣膀苣궃苣蚃菣莃苣ꪁ雦込臣颃菣ꪃ菣邵郥ꮁ뷥뾟臣鞾苣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣閁苣ꮁ胣ꢅ臣꺁ꧨ鎨臣貂臣蒵郥鮁ꓥ낕黥貁胣颃菣ꪃ菣ꮁ꿥馁苣覜蓦ꮁ룦놼臣龁뗧袐苣몤臣膀臣꺁臣ꢁ臣膀苣螃菣랂菣ꮁ郥讁臣떅듧뮴胦꺁铦蒖臣袂臣颃菣ꪃ菣ꮁ꿥馁苣邵郥꺁룦놼苣몤臣覤闧讞臣蒵郥鮁臣떉蟥閁苣鞾苣鎁臣銂뻤몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㐰㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯銼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯銼볯銽볯閽볯꒼볯銼†볯뒼臣袂臣覤闧讞臣놆껥骮胦㲧牢ਾ†뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯ₒ랼볯誁苣뎁ꓥ낕黥꺁껥骮胦꾁胣뢼ꋥꦸ뫥ꞁꓧ꺷뗨뮟鯨覅껥辇돦⢕볯뎼볯⦦臣袂臣ꚁ룦骮臣龁胣꒼볯ꚼ臣膀蛧覮껥Ꞁ臣뢛雩馁苣膀ꯩꆬ꟦ꂀ髧ꪁ껥骮胦銂룦骮臣讂胣꒼볯ꚼ룤꺁黨ꎧ룦ꚺ뒼뷯⦍臣膀苣뎃菣꾂돨ꊂ菣閃苣벃菣螃苣뎃苣랁꟧꺁룤鎖苧ꢁ껥ꦾ臣讂胣㲂牢ਾ†鷩낼볯Ꞽ賥랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼胣麝볯ꖼ볯隌뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞胣ꪁ苣뎁臣랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼臣袂臣銽볯閽볯꒼볯銼ꓥ낕黥꺁볯ꖼ볯隌뷥讅苣膀볯⺐볯鲀볯趽뷯込뷯겼臣莿뫥ꞁꫨ붣臣膀볯꾼볯⢸闥馨뾂菣醃苣ꪳ蛧랂菣袃觨ꂴ䄨灰楬摥䈠潩祳瑳浥ⱳ䌠牡獬慢Ɽ䌠鮼苣뾂菣낂闧랏볯钼볯醼볯钼볯⦖臣膀볯銼볯趀룥袇臣릂菣莃苣늼볯뢼蚕꣦⦙뫦늶臣뢛뷥馁苣肜뗧늉듧莿뫥뺁臣랷郥鞁臣芀곦蒁臣膀苣뎃菣꾂돨ꚩ雦銂胣覸胩ꞁ胣醼苣Ꞃ菣芁臣誂볯邼볎볯ꢁ臣蚁껥辇臣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤ꮁ菣벃菣鞁臣芀楖䅩‷呒倭剃匠獹整⡭灁汰敩⁤楂獯獹整獭‬慃汲扳摡‬䅃銂铧蒁臣膀ꧨ首臣ꦸ뫥貁룤螘臣讂臣ꒁ苣ꚁ胣趛藥꺁苣閃菣銂룦骮臣龁胣鶁臣趏뿥ꦉ苣膀믤许臣ꖷ꣧ꮁ뻤鞁臣骼볯閼蓢ꞁ볯蚈雩꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣鮼볯閼胣馼볯莄臣ꦸ뫥ꞁ볯銧臣龁苣邼邼볯莄臣龀뫥꺁若鲖볯骶臣ꚁ볯蚈雩膀볯馼蓢ꞁ臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃胣몙藥誁苣뎁諥략臣ꢔ臣覂苣讂돦랕臣膀臣貂臣貂胣隼볯鎼菣躃菣벃菣ꮃ躽뷯⦍臣袂臣閼볯邼뷯趽臣芁臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ鎼볯꾁胣꒼볯ꚼ裥邞臣覂뇦骮臣龁黨ꎧ룦ꚺ뒼뷯⦍苣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣꾁胣覤闧讞볯鎼볯钼볯⢥裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣ꮼ볯鞼볯ꖼ꺁볯趽臣膀볯뒼†볯꒼볯銼苣誂苣醼钼蓢颫臣鎁臣貁ꓧ閁苣膀臣貂臣膀臣꺁ꓥ낕黥꺁蛧覮껥Ꞁ臣릔雥銂ꓧ馁胣隻臣ꚩ꣩閁苣龁ꓥ낕黥꾁���랼볯₴ꆼ볯ꆼ볯ꮁ賥떕臣讂臣뺁臣꾁苣骁臣ꮁ뷤蒁볯趽苣몤臣芀臣꺁뗧鲞胣ꢅ臣꺁볯ꖼ볯隌뷥讅臣膀鯧鎽臣讂鷩낼볯Ꞽ賥ꊽ藦袂苣节ꯩ蒁볯趽苣袑臣讂臣ꢁ臣몤臣貂胣鎁苣ꮁ苣ꎁ臣뺁臣膀볯ꖼ볯隌臣膀藩ꂴ臣놆껥骮胦銂铦蒖臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㜴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯ₒ랼볯誁苣뎁ꓥ낕黥꺁鳦ꦁ뷯ꢼ戼㹲 銽볯閽볯꒼볯銼臣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣袂臣覤闧讞苣꺨胣꺁뷯ꢼ臣閩뻤鞁臣膀郥薀臣肜臩邽볯銂뇦骮臣龁胣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣膀苣螃菣랂菣뢐藥ꚺ臣覤賥꺁鯧ꖎ룦骮臣袂臣ꚁ裥覅藥ꚺ髧ꮁ뇦骮臣龁胣ꊂ菣躃苣뎃ꆼ볯꾼誁苣뎁苣躃苣뎃ꦼ볯꾼꺁볯뚼郥躏苣骃苣袃菣꾁ꗦ膂臣麡볤鞁臣誁苣膀臣貂苣꾁鳦辄臣趇ꓨ鞁胣鶁苣麁苣꺁郥覅뫥钃菣꾂臣銼볯醼뷯趽臣袂臣銼볯馼뷯趽臣芁苣芀蓨ꊂ菣躃迥鲿迥鲿臣鎖胣ꆼ볯꾼臣뢐藥ꚺ臣躽룤馁苣貁胣ꦼ볯꾼臣뢐藥ꚺ臣芙雩ꢁ臣节臣鞢ꓥ馁苣芀郥覅뫥꺁该蒚臣覤賥ꮁ苣ꎁ臣膀跥肸돦랕臣뮴胦銂菣讃苣벃臣讂臣ꢁ臣낛鯩ꮁ臣讂臣ꞁ胣뢛꿥蒚臣ꆼ볯꾼듦Ꞁ臣膀귧뢐迥릂馁臣辂臣膀볯꒼볯誁苣뎁볯꺼볯貁郥颁郥覅뿤낕苣覜臣讂돦랕ꮁ꿥馁苣ꆼ볯꾼菣벃苣꺁꿦ꢁ臣ꚁ뇦骮臣龁胣銼볯鎼뷯趽臣芁苣覭郥躏苧꾁胣ꪜꓥ隌臣뺁臣ꞁ臣誂胣莿뫥ꢁ臣겋ꯧ鞁臣誁苣膀臣꺁뗧鲞胣覭郥躏苧꾁胣릮蟩뺁臣꾁볥ꚺ臣鮟鯧ꮁ臣蒁臣莼귦馁苣龁苣꺁迥ꞅ菣ꒂ菣袃臣芁苣芀臣貂苣袁胣ꊂ菣躃苣뎃뿦ꚺ胣鞁臣貁臣ꚁ苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣뮴胦꺁ꓥ隌臣膀꣦隺鯦骷臣몟臣蒁臣膀볯隼볯躽뷯꺁郥覅뫥込볯閼볯躽뷯꺁郥覅뫥꺁꿦⢔볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯隼볯㲑猯扵込볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯閼볯㲓猯扵⤾臣鞁臣閩뻤鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖ꆼ‮꣦隺鯦骷戼㹲 ꆼ볯꾼臣袂臣ꦼ볯꾼臣ꒁ臣ꚁ꣦隺鯦骷苣鲽裦馁苣龁苣ꮁ胣꺨胣꺁뿦ꚺ臣ꆼ볯꾼臣袂臣ꦼ볯꾼苣ꮐ苣邼邼볯醼볯꺁볯鞽뷯薽뷯銈볯邼룤꺁룤ꎀ臣뚺뛦랷郥ꦉ苣뾪ꏨ鞁臣芀볯꒼볯誁苣뎁볯꺼볯랷郥ꦉ臣辷뿦ꚺ臣膀볯쎑낼볯뎼醼볯趽볯꺁菣뎃藩ꦡ胣醼볯鞼뷯궼臣꺼뷯ꎼ뷯膀볯⺒볯趽볯꺁볯ꎼ뷯⦌胣邽볯鞼钼臣궸臣閼볯캐궼臣芁臣龁胣鎁臣ꚩ雦銂胣銼볯邼뷯趽胣鎼볯邼뷯趽臣ꊳ闩銂铧蒁臣릂苣ꎃ菣鞁臣膀藥ꚁ臣릂菣꾂菣ꮃ臣꒺럥馁苣覭郥躏苧銂뇦骮臣龁胣���ꢡ볯隼臣膀꣦隺鯦骷臣겸껥ꒀ苣몤臣芀볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯隼볯㲑猯扵込볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯閼볯㲓猯扵钯苣膀볯꒼볯莿뫥ꮁ꿥鞁臣鞃菣莃菣鞁胣骷뷥閃苣莃菣ꎂ菣낂臣袂臣ꚁ胣ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯醼⼼畳㹢볯ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯鎼⼼畳㹢볯邼邼볯钼볯宙볯꒼볯嶯裢邼邼볯閼볯⢒볯㲲畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯灵鶼볯⺐볯馼볯⦙臣蒁臣馨뫦늛럧銂铧颁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯隼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㠴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ볯⺢ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ裥覅藥ꚺ苣莃苣ꒂ戼㹲 ꆼ볯ꆼ볯誁苣뎁ꓥ낕黥꺁裥覅藥ꚺ髧ꪁ苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣ꊂ菣뮂苣銂ꇨ蚁臣膂胣醼볯邼뷯궼臣ꪃ菣뢅苣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦⢲볯낼볯⦢胣꺨胣꺁뷯ꢼ馁臣辂臣膀볯⺕볯膀볯膀볯⺖볯膀볯⺖볯閼胣鞼胣鞼銼볯膀볯⺗볯膀볯⺗볯閼臣袂臣颼꺁볯⺐볯薼臣뒼뷯薽뷯躽裢銼볯궸臣膀볯邼뷯궼臣ꆼ볯꾼苣ꮐ鳦馁苣銼볯뚺뛦銂ꫨ붣臣龁胣銼볎뷯込뷯겼臣랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼臣龁臣覤闧讞苣ꮐ鳦馁苣ꖈ臣銼韃뫦늶苣膀郥颁볯邼볯趽볯ꪃ菣뢅苣ꪃ苣ꂃ럧鶡뛦⢲볯낼볯⦢胣邼醼볯꺁볯鞽뷯薽뷯銈볯邼룤ꞁ胣鶁苣麁苣꺁뷯ꢼ馁臣辂臣膀볯⺕볯膀볯膀볯⺖볯膀볯⺖볯閼胣鞼胣鞼銼볯膀볯⺗볯膀볯⺗볯閼臣袂臣颼ꞁꫨ붣臣龁胣覭껥辇臣ꆼ볯꾼뫦늶臣袂臣ꆼ볯ꆼ볯뚺뛦⢲蟩Ꞁ黥뺁臣꾁ꓥ낕黥⦋苣랷郥鞁臣膀迥鲿苣讖꟥鞁臣芀郥芙苧⢹臣ꪁ苣ꆁ胣醼胣鎼胣閼胣鞼胣馼胣醼볯膀볯鎼臣袂臣醼볯蚈ꞁ胣辰臣蒁苣ꪃ苣벃菣⢈볯캔貽銂迥誂蟥鞁臣膀볯馼볯캖貽臣醼韃볯ꊼ볯膀뷯ꢼ볯⺗볯ꮁ럦ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ볯邼胥貸蟩鞁臣芀룥袇臣貂臣ꚩ雦銂臣覂臣膀볯뚼胩躘菣벃菣ꢂ菣ꊂ菣것菣袃룤꺁볯閼볎뷯꺁볯쎑낼볯뎼臣颼볯캕貽臣ꚩ雦銂럦ꂊ臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣銼胥⢍뫤ꎀ臣⦧룥袇臣龁胣蒐胣꺁룥袇臣貂臣ꚩ雦꺁볯閼볯躽뷯誁苣뎁볯隼볯躽뷯꺁郥覅뫥銂룦骮臣龁胣㲂牢ਾ†苣螃菣랂菣莿뫥꾁胣ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯醼⼼畳㹢볯ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯鎼⼼畳㹢臣钯臣袂臣馨뫦늛럧銂铧蒁臣몱껥鞁臣芀苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣뮴胦꾁胣醼裥芁臣誂臣ꆼ볯꾼뿦ꚺ臣ꂲ臣覤賥쎖醼볯邼臣袂臣ꚁ룦骮臣龁胣㲂牢ਾ†ꇨ鎼볯꾁胣꺨胣꺁뷯ꢼ臣膀裥覅藥ꚺ髧ꪁ苣莃苣ꒂ臣袂臣ꚁ룦骮臣龁胣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣邵黦銂ꓧ馁胣鎁臣邵黦ꞁ臣膀볯뒼†뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯���뮴胦ꮁ臣蒁臣肜臩邽볯⢨鳦颫臣螃苣龃菣벃苣뮴胦⦧臣膀듧隼閼臣芁苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞볯鎼볯钼볯⢤裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣ꮼ볯鞼볯꒼誁苣뎁볯鎼볯钼볯⢥裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣ꮼ볯鞼볯ꖼ꾁胣랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼臣貐꟦꺁듦Ꞁ뷯ꢼ菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣覜臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†꿥ꞅ髧ꮁ胣ꆼ볯ꆼ볯ₒ뎼볯隼볯꺼ꓥ낕黥⢋裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼꾁胣鞼銼볯ꢁ臣蚁苣誂ꯩ蒁뷯ꢼ臣肜臩邽볯銂鳦馁苣芀볯銼볯閼볯覤闧⢰裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뎼볯隼볯꺼銂郥肂뫤趇臣袂臣覸蟩꺁ꓥ낕黥꾁臣龁胣鞼銼볯ꞁ郥颧臣肜臩邽볯銂铧颁苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㤴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼볯ꖼ볯隌뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯蒵郥鮁ꓥ낕黥꺁苣뎃菣鲃臣겖觧開藦ꚭ髧蚈黦㲐牢ਾ†볯膽뷯覽뷯貽뷯隽菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣膀볯ꖼ볯隌臣龁볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼胣낼볯Ꞽ賥鞁臣ꆼ볯ꆼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯誁苣뎁볯ꖼ볯隌臣龁볯꒼볯銼裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼볯ꮼ볯鞼볯꒼ꓥ낕黥⢋裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂臣ꚁ胣鶁苣麁苣膀볯鎼볯醼볯膀볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯誁苣뎁볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯込볯鎼볯醼볯⦤臣겖觧開藦⢋볯ꮼ銂胣超雧ꦁꃦꞀ菣Ꚃ苣ꊃ菣ꮃ臣蚈黦鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖ꆼ‮ꃧ뚩꣨袨戼㹲 銼볯릌臣蒛胦ꊼ볯겼볯込뷯麃苣릂苣鎼臣꺁諦躸뻧ꮁ裥醁胣閁苣ꮁ胣꺨胣꺁駦릂臣股뛦꺁苣뎃菣ꪃ菣낂臣龁苣ꮁ郥薀볯ꒁ臣꒾臣蚈臣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣麃苣릂苣ꢅ菩ꞁ매⢝볯⦙臣꺁뻧ꮁ蓧鲽苧隌臣龁胣麃苣릂臣钠ꧧ꺁雩讧觥ꮁ꟧辇臣膀臣꺁뷤趇臣몟臣蒁臣膀볯ꒁ臣꒾臣ꆄ뷤몂賥鞁臣芀郥薀臣떂菣鞃菣뎃苣꒾臣꾁胣開觧讁苣股뛦꺁臩낉臣떂菣鞃菣뎃苣銂飩邁臣膂臣膀볯ꒁ臣꒾臣⢮볯⦓菣Ꚃ苣銂胣蒐ꧨ鎨鏥銂諦躸臣讂臣膂臣ꢔ臣龁胣馃菣릂菣ꒂ菣꺁볯꒼볯銼菣馃菣銂룦骮臣讂臣膂臣膀ꇨ늶ꧨ首苣膀볯銼賥꺁蓧鲽苧ꮁ臩麊臣龁菣Ꚃ苣讁苣鞾臣膀ꇨ뾼苣膀諦鶇鯥ꒉ苣ꪃ苣ꂃꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹢ꢂ菣것菣뢂苣龃菣鮛藩뢅ꮼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹢裢ꖼ볯뒼볯⦡苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣龁胣ꢅ臣꺁ꇨ늶臣躡룤꺁鷩袄ꧧ몈臣袂臣ꚁ迥蚛臣龁胣㲂牢ਾ†郥薀臣麃苣릂臣膀ꇨ鎼볯ꮁꓧ閁苣讂볯ꒁ臣낼볯Ꞽ賥ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞ꧨ鎨鏥⢁臣ꪁ苣ꆁ胣낼볯Ꞽ裢銽볯閽볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼���邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯鎼볯醼볯⦤胣낼볯Ꞽ裢銽볯閽볯꒼볯銼裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯⦮臣龁臣낼볯Ꞽ裢銽볯閽볯꒼볯銼裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼볯ꮼ볯鞼볯꒼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯込볯鎼볯醼볯⦤臣蚁臣꺁볯ꒁ臣鎼뷯螽볯讽뷯ꢔ蟩銂胣馝蓨薆臣뺰鷩袄돦蒰臣袂臣ꚁ돦蒰臣龁胣낼볯Ꞽ賥ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞臣膀苣骁臣ꮁ铦覤臣ꚁ껥붖뻤颼ꆼ臣風볨꺁臣誁苣膀볯ꖼ볯隌雦閳苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣龁胣膦臣讂臣膀藥ꚁ臣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞苣膀볯邼뷯螽볯趽볯ꞁ胣뒛軩낼볯Ꞽ裢銼볯ꮼꪼ뷯躽볯薽뷯₍뒼뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯膀볯貽뷯躽뷯膀볯뢼볯ꮂ苣궃苣ꪕ迥궼裢뎼볯궼裢銼볯ꮼ銂볯骼볯閼菣ꮃ꿦ꞁ铧蒁臣낼볯Ꞽ賥鞁胣肜裥膀볯鞼냂臣鎼볯蚈雩膀곦蒁臣钼蓢ꞁ볯隼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ臣袂臣蚈黦뎼볯ꎼ臣邵黦膀볯꒼볯銼ꓥ낕黥꺁볯邼볯薼臣膀鳦ꦁ賥閁苣龁볯ꖼ볯隌鷦뚻룤ꞁ볯ꖼ볯隌臣貂胣ꢅ臣꺁볯ꖼ볯隌臣龁볯꒼볯銼ꓥ낕黥貁볯邼볯薼臣떅듧蒚듦Ꞁ苣鶿賦鞁臣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣㲂牢ਾ†듧銼볯邼볎볯꺁藥股苣膀룤꺁ꇨ鎼볯ꮁꓧ馁苣蚁臣麃苣릂臣ꦁ裥ꪁ뻧讁苣螌껥꺁苣뎃菣ꪃ菣낂駦릂臣躏鯩鞁胣股볦꺁ꫨ붣臣ꞁ냦誸臣鶿賦鞁臣芀鳦鶈臣銼臣꺁ꇨ늶ꧨ首臣膀ꇩ许臣馝蓨뾩裥ꮁ苣ꎁ臣躏鯩鞁臣芀鳦芵ꧨ首臣膀鳦꾫臣ꆎꇨ讁苣躏鯩鞁臣芀ꇨ뾼臣膀ꇨ늶苣ꂁ뿥蚈鯩馁苣鎁臣⢨볯邼볯쎐螽臣閼裥鎖胣钼蓢⦃胣股볦銂雦꺮臣膃菣벃菣ꮁ꟧馁臣ꢁ臣袂臣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ苣莃苣ꒂ臣ꞁ裢颼볯莄臣뒛臣ꮁ蟥邵臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁꫨ붣臣龁胣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣膀껥붖뻤钼臣風볨꺁臣誁苣몱껥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 躃菣뎂菣醃菣袃菣뎃菣蚈黦⢐潮⵮潣灭牡浴湥慴⁬湡污獹獩볯꺼볯ꆼ銂胣傁潨湥硩圠湩潎汮湩瘠牥楳湯㘠㌮倨慨獲杩瑨䌠牯Ɒ匠⹴潌極ⱳ䴠⁏㌶〱⤱苣ꢔ臣ꚁꇨꎁ臣芀跥鮸鳦膀臣ꪁ苣ꆁ胣ꆼ볯ꆼ볯뾂菣醃苣ꪳ臣뮴胦貁跥蚈臣ꞁ뷤许臣讂臣ꮁ臣讁苣芙雩銂껧몇臣龁胣뺁臣膀럧뒚鳩銂胣莿뫥銈駦鎖臣늛럧许鷩趩ꆼ볯ꎼ銂껧몇臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ룦骮臣龁胣ꆼ볯ꎼ臣袂臣認룦龜臣ꒀ臣膀郥ꚩ꣩膓뻧讁苣꺁蟩뾁臣鞁臣뎹鷥讁苣鞾臣芀桐敯楮⁸楗乮湯楬鞃菣낂菣ꂃ臣誁臣讂믤许臣뢁諦ꊂ苣螃菣뾂裥邞臣ꢔ臣龁볯⢚뷯⦉볯떼볯꺁럧ꊽ迥ꊽ볯骷뷥鲣雩ꪂ菣랂菣뎃볯⢛楩ꮜꯧ릂菣벃菣꺁臣膂臣馃苣袃���ꎂ菣袃苣궃菣鞃臩麊苣鞃苣ꞃ菣鮼臣袂臣⢳楩⥩菣벃苣꺁鷥肸蟩뾁믤醁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㔰㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖ꊼ‮뗧鲞戼㹲 醼‮鷩낼볯Ꞽ賥銽볯閽볯꒼볯銼†볯뒼臣袂臣覤闧讞臣겖觧開藦㲋牢ਾ†볯ꖼ볯隌臣龁볯꒼볯銼ꓥ낕黥ꞁ臣讂胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯鎼볯醼볯⦤胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯⦮臣袂臣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼볯ꮼ볯鞼볯꒼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯込볯鎼볯醼볯⦤臣겖觧開藦ꚭ髧⢄볯ꮼ릉胦銂胣ꢡ볯馼臣袂臣ꢡ볯邼臣몤臣芀ꇨ鎼볯꾁胣늛럧许鷩趩ꆼ볯ꎼ鞮蟥銂铧蒁臣겸껥鞁臣辷髦늜苣몤臣膀ꇨ钼볯꾁胣ꚩ꣩閁苣龁볯ꖼ볯隌臣龁뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞臣認룦龜钽猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯銼⼼畳㹢銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ†臣꺁뗧鲞胣낼볯Ꞽ賥꾁껥ꪳ髧ꮁ胣ꆼ볯ꆼ볯꺁雨ꦉ该讅귥蒚菣궃菣ꆂ苣ꮃ苣릔雥鞁胣讁臣ꢅ臣꺁ꧨ鎨臣貂臣낼볯Ꞽ賥鞁臣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞臣膀鷩낼볯Ꞽ賥꺁볯뒼†뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯袂苣节鳦辄臣颫臣ꆼ볯ꎼ臣袂臣랕臣認룦龜苣袑臣龁臣ꢁ臣몤臣貂苣⢋껥붖뻤馼胣ꪁ苣뎁臣ꢡ볯隼臣袂臣ꢡ볯鞼苣芏藧꺁臣ꢁ芀볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯⢮裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣늼볯醼볯놼볯뎼볯隼볯꺼꾁胣肜ꓥ꺁铦蒖苣袑臣膀볯떼볯꾁胣麝볯ꖼ볯隌볯뒼†뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯袂苣节볯馼볯隼볯薼ꯩ辁胣讁臣認룦龜臣膀鷩낼볯Ꞽ賥랼볯₴銽볯閽볯꒼볯銼苣誂苣钼볯钼볯薼闩讁臣龁胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯鎼볯醼볯⦤臣膀ꧨ鎨鏥銂ꫨ붣臣讂臣ꮁ铧蒁苣貂苣肜臩隌볯ꖼ볯ꆝ믤ꮁ뗨ꂛ臣鞾苣膀껥붖뻤馼臣覂臣ꮁꇨ銼볯誁苣뎁볯鞼臣誁臣讂郥颁ꧨ鎨鏥꒾臣钯臣ꚁ볯ꮼ觧Ꞁ臣Ꞥ臣蒁铦蒖苣袑臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㔰㰱愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㈵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼뿨ꂊ臣蒵郥鮁ꓥ낕黥꺁铧邈戼㹲 붿諥꺁뗧袐臣覤闧讞苣龔裦鞁胣鎁苣꾁胣떅듧뮴胦貁ꋥꞤ臣龁苣龃菣뢅뷧鮏臣袂臣込臣龁臣颃菣ꪃ菣邵郥꺁룦놼苣节臣覂臣ꊂ菣躃藩꺽迦銂뗧뾁郥辂臣ꚁ臣誂胣隻臣뮴胦꺁ꓥ뒛苣节臣覂臣膀곦놤볯뾌藥込뷧鮏臣袂臣ꊂ菣躃藩꺽臣���臣ꪁ臣꺁믤꺁뿤뺣苣覜臣讂胣랅뷤蒚臣꾁胣龮雦设볯邼臣風볨꺁藩ꂴ듦Ꞁ臣肜ꓥ鞢ꓥ銂苣龁苣馁胣ꊂ菣躃藩꺽迦뎼볯隼볯꺼臣袂臣込臣龁臣늼볯銼볯놼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂胣뎼볯隼볯꺼臣袂臣込臣龁臣늼볯醼볯놼銂胣趉臣龮雦设臣風볨꺁믤꺁볯꒼볯銼뿤뺣臣蒵臣袐苣鮁臣芀苣龃菣뢅뷧趁迦袁볯鎼볯钼볯⢤裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣ꮼ볯鞼볯꒼銂臣龁胣趉臣龮雦设臣風볨꺁믤꺁볯꒼볯銼뿤뺣臣节뗧뾁郥辂臣龁胣蒵郥鮁ꓥ낕黥꾁胣ꢡ볯醼臣몤臣貂苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鎼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㌵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㔰㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㔵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㔰㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㜵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㔰㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㤵⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ閼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㘰㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯ₒ낼볯ꊼ菣ꆃ苣뎃ꓦ몇뗧袐臣覤闧讞臣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ臣趏뿥龀뫥隫髧閩뻤㲡牢ਾ†藩鞈闧랏볯颼볯鲀볯馼볯ꮁꓧ閁苣讂胣ꮼ볯鞼볯꒼ꓥ낕邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯鎼볯醼볯⦤臣袂臣⢳볯Ꞽ볯Ꞽ볯⦳猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢菣뎃苣벃臣꺽臣鮏臣龁볯늼볯ꂬꓥ銂郥肂胣蒵郥鮁ꓥ낕黥銂胣誸꣨龮雦设볯醼ꆼ臣風볨꺁苣莃苣ꒂ돦銂铧蒁臣膀苣螃菣랂菣螃苣龃菣벃苣뮴胦꺁迥鲿胩ꚺꯨ蒚菣ꦃ菣벃苣벃臣ꒁ臣ꚁꧨꆾ臣龁胣견볯뮂菣袃臣覤闧讞臣膀꣧薀臣랕臣꺁Ꞽ볯Ꞽ볯뎼㰩畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲎猯扵ꪃ菣ꮂ菣⢼뻤袁臣膀뷯鶼볯膀볯뺁臣꾁볯鮼藩鞈闧랏볯颼볯鲀볯馼볯ꮁ꣨覼臣讂ꞁ뷧趁迦袁苣貂臣膀껦몟볯醼볯銼胣놼볯钼볯⢗裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣뚼볯馼胣놼볯钼볯⦔臣ꂬꓥ銂郥뾁胣견볯꺁苣莃菣꺁ꓥ낕黥꾁胣꺨胣꺁闩閁臣⢮볯Ꞽ볯Ꞽ볯⦳猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢菣뎃苣벃设臣낁胣躽볯醼胣銼臣龁臣鎼볯超裥ꪕ迥閼볯醼胣閼볯鎼臣風볨馁苣⦋臣���꺽臣鮏臣覂苣龁胣议鿥ꎼ볯邼볯鲀볯醼볯邼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯醼볯閼胣뒼볯钼볯⦗臣ꂬꓥ銂郥肂胣趏뿥龀뫥隫髧醃菣ꆃ菣뾂菣銂胣邽볯鞼隼臣ꚩ꣩鞁胣邵黦銂ꇨ钼볯ꮁꓧ馁胣㲂牢ਾ†臣꺁뗧鲞臣꾁胣ꢅ臣꺁ꧨ鎨臣貂臣ꆼ볯ꆼ볯ₒ낼볯ꊼ菣ꆃ苣뎃곦놤ꓥ낕뷤貁藩ꂴ듦Ꞁ苣鶿賦鞁胣讁臣肸裨ꮁ臣랼볯₴ꆼ볯ꆼ볯ꢁ꿦莼臣ꚁ胣蒴볯鲀볯趀뷤蒁볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵誁苣뎁볯鲀볯醼胥颫臣ꚧꫥ릊軧⢇뷯㲋畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯膽뷯㲔猯扵込볯㲫畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲍猯扵⤾苣邽볯鞼隼臣袑臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯邼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㈶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼볯뒼볯隼郥뮳藨趘菣螃菣銂铧蒁苣낼볯Ꞽ賥銽볯閽볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼臣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯Ꞽ볯⦩ꧨꆾ戼㹲 麃苣릂볯뒼볯隼郥뮳藨趘菣螃菣銂铧蒁臣膀볯꒼볯銼臣鞊藨趘듦Ꞁ苣閩뻤鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖ꆼ‮郥뮳藨趘菣螃菣誁苣뎁蟥꺽戼㹲 钼볯릌臣蒛胦ꊼ볯겼볯込뷯麃苣릂臣膀该ꦉ볯릌臣龁苣邼醼뷯겼臣ꢳ냥릮蟩ꞁ볯쎕醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲖猯灵讀臣麃苣릂뗧뢅臣鎂藨趘듧麃ꎼ볯銼볯膀볯뒼볯ꎼ†볯늼볯銈볯隼볯颼銂髧许돦蒰臣龁胣ꮅ飧릮蟩꾁胣몛뷥ꮅ飧誡臣랕臣⢕볯⦬臣袂臣薹랼꺁苣ꎃ菣醃菣겸껥ꮁ苣ꎁ臣螃苣뾂菣궂菣ꪃ菣벃苣ꢔ臣ꚁ뇦骮臣龁胣ꮅ飧릮蟩⢏볯뚼꾁胣⢁볯쎬랼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹰込볯ꢁ臣ꚁ껧몇臣龁胣ꮅ飧銂ꋥ隮臣鮁臣膀藨趘뿤覜菣Ꚃ苣銂胣ꮅ飧貁꟨모迥붃臣芁苣膀臣ꒁ듧閼볯鲀볯邼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣讂臣겸껥閁苣讂駦뺁臣薗鳦蚈ꇩ鞁臣芀戼㹲 낼볯Ꞽ賥銽볯閽볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯鎼볯醼볯⦤苣膀苣骁臣ꮁ铦覤臣ꚁ胣龮雦设볯⺘볯ꮁ꣨覼臣ꢁ臣誂ꫨ붣臣ꚁ胣蚈귥꺁臣ꆁ臣벁볯邼볯薼臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꞁꧨꆾ臣ꚁ볯ꖼ볯隌臣貂臣蒁苣膀ꫨ붣觧銂铧邈臣龁胣膦臣讂臣膀볯邼뷯螽볯趽볯ꞁ臣銽볯閽볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯鎼볯醼볯⦤臣뾪ꏨ銂胣뒛軩낼볯Ꞽ裢銼볯ꮼꪼ뷯躽볯薽뷯₍뒼뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯ⲙ볯貽뷯躽뷯ⲏ볯뢼볯ꮂ苣궃苣ꪕ迥궼裢뎼볯궼裢銼볯ꮼꢁ胣醼볯醼볯ꊃ菣钯臣랷郥鞁胣肜裥ꮁ볯莄臣醼볯芙雩膀곦蒁臣鎼볯莄臣隼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣㲂牢ਾ†蟥꺽臣龁苣ꮁ胣開觧���銂볯ꒁ臣꒾躽볯颼볯꒾ꮁ蓧鲽苧隌臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣ꎼ볯銼볯ꮅ飧鶿鳦麃苣릂臣膀볯ꖗ臣趁臣膀볯趽뷯込뷤趇뷯螽胣醼볯趽뷯込뷤趇뷯螽苣鞁臣꾁볯邼뷯螽볯鎽蟩讽뷯ꢔ蟩꺁볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯⢤裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼뺁臣꾁ꫥ鎽꿥ꞅꦷꇨ늶臣뾁銂볯ꖗ臣趁臣馝蓨薆돦蒰臣龁胣ꮅ飧릮蟩꾁胣誸꣨꺁苣蚁臣궂菣ꪃ菣벃룦骮苣ꢔ臣ꚁ볯ꖗ鯧誁苣뎁볯ꖗ鯧ꮁ룦骮臣龁胣蒐胣꺁臣貂臣貂臣ꮅ飧ꊃ菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯閽뷯辽뷯ₒꞼ뷯辽뷯钽뷯₈ꦼ뷯袽뷯芽뷯钽뷯辽뷯骼볯Ꞽ볯⦩菣벃苣뎃菣꾁胣ꖻ룤꺁볥銂铧蒁臣鞮蟥鞁臣骼戼㹲 薼볯Ꞽ볯鶼醼裢⢒볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲎猯扵銈볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲐猯扵⤾럃ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢裢ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢崩韃볯邼볯薼戼㹲込룤膀胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢胣꾁胣肜뗧ꢔ蟩꺁볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯뺁臣꾁꿥ꞅ臣貾胣貀뷯趀韦꺛臣꺁蟥꺽뻧ꮁ臣蒁臣꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢胣꾁胣ꚇ뷧趉胣邼韦꺛臣ꚇ뷧꒾臣뎹鷥ꮅ飧릮蟩ꞁ臣誂볯貀볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲎猯扵趀臣膀胣躽胣ꖗ鯧ꞁ臣뺯뿥馁苣뺯藧꒾臣ꒁ臣ꚁ臣뎹鷥ꮅ飧릮蟩ꞁ臣誂볯貀볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲐猯扵趀臣膀蟥꺽觥膀볯ꖗ鯧꺁꿥ꞅ뻧ꮁ臣醁苣뎹鷥ꮅ飧릮蟩ꞁ臣讂胣銪뷤꒾铧ꖝ臣醼賥꺁菣Ꚃ苣銂胣覜蓦ꪁ藨趘ꋥ隮飩뎮臣략鯥鞁臣銎駩鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖ꊼ‮뗧鲞戼㹲 ꢡ볯鎼臣膀ꫥ鎽돦蒰꿥ꞅ臣钯볨鞁臣膀볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯銂諦躸臣貂臣麃苣릂룤ꞁ볯ꖗ鯧꺁맥螝藨趘껥辇臣袂臣ꮅ飧鞢껦뮘껥꺁뗧鲞苣몤臣芀볯ꖗ鯧ꮁ胣銪뷤뺯藧꒾臣뎹鷥ꮅ飧릮蟩꾁胣钼볯隼隼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣ꎁ臣⢟뷯鶼볯⦗胣鎼뷯螽볯讽뷯꺁볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯銂돦蒰臣龁뻧ꞁ臣膀맥螝藨趘껥辇臣銼볯鞼鞼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣ꎁ臣膀臣貂臣閼볯薼臣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯Ꞽ볯⦩苣몤臣⢙뷯鶼볯鮼뷯ꒀ볯邼邼볯鞼芀볯邼뷯螽볯讽뷯꺁볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯銂돦蒰臣龁뻧ꞁ臣膀맥螝藨趘껥辇臣銼볯鞼颼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣ꎁ臣膀볯鎼볯꺁볯Ꞽ볯銂ꓧ馁躽볯颼볯邽胥鶼볯⺐볯邼볯隼芀볯邼뷯螽볯讽뷯꺁볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯銂돦蒰臣貂臣꒾臣꾁胣뎹鷥ꮅ飧릮蟩꾁볯颼���⺗볯銼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣芁臣ꚁ胣鎁苣꾁볯颼볯꺁볯Ꞽ볯銂ꓧ馁躽볯颼볯邽胥鶼볯⺐볯邼볯閼芀臣꺁뗧鲞胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼臣閊룤꾁胣覜蓦ꪁ藨趘ꋥ隮飩뎮苣龔臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㌶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯隼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼菣낂賥銽볯閽볯꒼볯銼胣鞊볯꒼裢醼臣袂臣鞊볯뒼볯ꆼ볯銂铧蒁苣떽铧뮲駧꺁藨趘ꋥ隮飩뎮뒼볯ꦼ閩뻤㲡牢ਾ†菣Ꚃ苣ꎼ볯銼볯貐돧ꮅ飧ꊃ菣ꮃ苣ꢔ臣ꚁ胣膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ諦낼볯銈볯誁苣뎁諦ꎼ볯겼볯钼諦鎽臣袂苣낼볯Ꞽ賥鞁臣ꆼ볯ꆼ볯銂铧蒁苣떽铧芙돦꺁諦ꮅ飧뮴胦銂꿦莼臣龁胣ꎼ볯銼볯貐돧ꮅ飧銂胣蒛胦ꊼ뷯貽뷯込볯麃苣릂臣뎏蓨ꢪ釥늛臣训苨궸臣醼賥꺁该ꦉ臣龁苣邼邼볯趽볯꺁돦蒰뫦늶臣ꮐ臣貂苣銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰胥꺁볯뒼볯隼듧麃苣ꢳ냥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣龔裦鞁臣芀藨趘뿤覜菣Ꚃ苣銂胣뎹鷥꺁藨趘臣떂苣몂臣醼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣钁臣讂駦ꮁ蟥꺽뻧ꮁ裥麡臣龁胣㲂牢ਾ†蟥꺽臣龁苣ꮁ胣開觧銂믤许臣ꢁ臣誂볯꒾躽볯颼볯꒾ꮁ蓧鲽苧隌臣龁볯醼龔郧龣ꇥ뒰ꫥ鎽꿥ꞅ胣銼낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯膀볯⦓뇎裢ꎼ볯겼볯钼諦鎽ꎼ뷯辽뷯薽†볯꒼볯膀苣뾂菣낂闧랏볯ꖼ볯醼볯钼볯䊛潩䍘汥ⱬ圠獥⁴敌慢潮Ɱ丠ⱈ㐠츩銈볯꒼裢醼諦鎽䌨潬敮删偍ⴱ㐱胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ꊼ볯邼볯钼볯鮼楂塯敃汬‬敗瑳䰠扥湡湯‬䡎膀볯⦕볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼볯캋銈볯뒼볯ꆼ볯鮼볯⦖볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯讼뇎裢낼볯銈볯鮼볯⦗뇎裢ꎼ볯겼볯钼볯캋銈볯꒼裢醼臣龁臣颼覸臣蒵臣꺁뗧袐臣⢛牴灩敬挠浯潢⠩볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼볯캋銈볯뒼볯ꆼ볯讼뇎裢낼볯銈볯⦑胣낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯銂胣醼볯趽뷯込뷯螽臣놀臣鎼韃鷩袄蛥閊룤鞁胣캁銈볯뒼볯ꆼ볯銂胣钼뷯螽볯讽뷯ꞁ胩ꮁ볯麛藨钅蛥閊룤鞁胣캁銈볯꒼裢醼臣膀胩ꮁ볯麛볯趽뷯込뷯螽臣릅藨薆諦躸臣龁胣蒵郥鮁뻧ꞁ臣閊룤꺁ꃩ辺臣ꖻ룤꺁臣誁苣ꞁ臣ꎁ臣骼볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼胣骶臣ꚁ胣캁銈볯뒼볯ꆼ볯膀뛧蒁臣캦銈볯꒼裢醼胣㲂牢ਾ†藨趘껥辇臣膀볯薽뷯辽볯醼볯邼嘨獩慵⁬潓楮獣‬潔潲瑮Ɐ䌠湡摡⥡苣ꢔ臣ꚁ뛨뎟돦뮔菥隌苣讻臣ꚁ꿦놀볯麛ꧨꆾ臣ꚁ胣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯Ꞽ볯⦩苣몱껥鞁臣芀该ꦉ苣膀藨趘껥辇苣겸껥馁苣鎖胣薵臣ꒂ苣閃菣ꦃ菣뮺藩銂铧蒁臣뮺藩鞁���芀藨趘룦骮臣龁苣ꮁ胣꺛髧꺁ꃩ龟苣薶鿩ꊳ苣ꮃ倨牡敫⁲慌潢慲潴楲獥‬慆物楦汥Ɽ丠⥊룤ꞁ苣邃菣鞁胣늼볯뚼裢鞼볯隼Ꚅ苧놷뫥鶼볯鞼閼뷯趽릂苣ꎃ菣颃菣覃苣膀鯧蒚臣颠鿥誸臣뒛軦超뷧鞁臣芀볯꒼菣벃菣꺁雩膀藨趘臣뮁臣궸뿥銂藩꺽臣鮁臣膀볥趁뛧趁胣뮔菥⢏듧醼볯邼胣銼볯邼菣것菣ꂃ銂胣鎼볯ꊃ菣覃苣ꢔ臣ꚁ苣ꎃ菣膃菣벃臣龁胣醼볯邼胣銼볯邼菣것菣ꂃ臣蚁臣뮁臣醼볯鲀볯邼菣것菣ꂃ苣蚈黦鞁胣ꮅ飧릮蟩銂껧몇臣ꚁ胣趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁꇨ鞁臣芀藨趘ꋥ隮飩뎮뒼볯ꦼ꾁룤風臣袂臣ꮁ껧몇臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞苣ꢡ볯钼臣몤臣芀ꇨ钼볯꾁胣醼뻧芁臣誂臣뎹鷥ꮅ飧릮蟩銂胣钠ꧧ醼볯ꖗ鯧⢮볯꒼볯邼膀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼臣钼볯芙雩貾胣ꪁ苣뎁臣캫銈볯뒼볯ꆼ볯誁苣뎁뇎裢낼볯銈볯꺁볯銼駦鎖뻥ꮁ胣ꪁ苣뎁臣鶁臣꒾臣ꢅ臣꺁该ꦉ臣ꮅ飧릮蟩꺁꿧늛苣몤臣芀ꫥ鎽꿥ꞅ臣钯볨鞁臣뒼볯ꦼ苣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣꾁胣낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯膀뇎裢ꎼ볯겼볯钼臣袂臣캳銈볯꒼裢醼臣蒐胣貁胥薀臣膀藨趘ꋥ隮飩뎮듦Ꞁ苣몤臣膀뇎裢ꎼ볯겼볯钼臣膀믤꺁跥肸蟥꺽苣誂苣覜蓦ꮁ藨趘ꋥ隮臣躽룤銂ꓧ馁臣ꢁ臣몤臣貂苣芀臣꺁뗧鲞臣꾁胣캁銈볯뒼볯ꆼ볯뺁臣꾁뇎裢낼볯銈볯꺁臣骁苣讁臣꺁볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼臣떽铧芙돦꺁苣骁臣ꪁ鯧鞹諥鲞臣몤臣貂苣芀藨趘ꋥ隮飩뎮臣誁臣讂臣覂臣讂ꋥꞤ臣膀룤趇臣떽铧芙돦ꞁꛨ龯臣貂臣芀꿥ꞅ髧ꮁ胣캁銈볯뒼볯ꆼ볯誁苣뎁뇎裢낼볯銈볯꺁뷤ꢔ駧閳臣뾁臣膀뇎裢ꎼ볯겼볯钼臣꺁蟥꺽臣钯볨鞁臣膀藨趘ꋥ隮飩뎮苣辂臣讁臣鞢ꓥ鞁臣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㐶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤醼볯骼볯뒼볯隼臣鮄ꫩꢑ鯥ꮅ飧뺁臣꾁귦뢸臣鎇駥궸臣낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯蚈룥㲃牢ਾ†藨趘뻥辰鋧莢臣龁臣ꎭ룥鎇駥궸臣閊룤閁苣龁볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼臣蚈룥誁苣뎁軦몇苣閩뻤馁苣龁苣ꮁ胣超雧趛藥銂铧蒁臣膀菣Ꚃ苣ꮁ諦躸臣貂臣낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯꺁귥ꢜ苣閩뻤鞁臣芀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼臣膀껥ꦸ臣隼볯蚈雩膀볯馽볯覽뷯袽뷯鞼볯閼苣ꮃ菣銃菣ꪃ菣趏뿥늉듧⢠畓晬摹祲⵬敒捡楴敶䐠敹⠩볯겼볯閼볯⦕胣醿볯늼鯨覅苣ꢔ臣ꚁ胣䒁䱹杩瑨㜠㔵諦鎽꣦颭苣莃菣⢈桔牥潭匠楣湥楴楦Ᵽ潒正潦摲䤬⥌苣ꢔ臣ꚁ꣦颭臣龁胣䆂敬慸䘠畬牯㜠〵䄨⁆㔷⤰꣦颭臣龁苣���ꇨ薸苣ꮃ菣龃菣⢳볯뎼볯ⲡ醼뷯螽볯趽볯⦬臣覂돨ꖅ臣龁䰨晩⁥敔档潮潬祧䌬牡獬慢Ɽ䅃芀㰊䥄㹖胣邼볯钼볯醀⼼䥄㹖ꆼ‮볯뒼볯隼蓨ꢪ釥늛藨趘臣꺁裥莸戼㹲 ꎼ볯銼볯貐돧ꮅ飧銂胣蒛胦ꊼ뷯貽뷯込볯麃苣릂臣뎏蓨ꢪ釥늛귧覂臣꺁该ꦉ볯릌臣龁苣邼邼볯趽볯꺁돦蒰껥辇臣銼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰胥꺁듧麃苣ꢳ냥馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣龔裦鞁臣芀맥螝臣ꮅ飧꺁苣ꒂ苣貁볯邼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꮁ臩馁苣芙胣ꮅ飧鶿鳦麃苣릂苣膀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鞼볯閼⼼畳㹰臣邼閼뷯螽볯讽뷯뺁臣꾁볯뎼볯㲡畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯ꚼ볯閼볯㲐猯灵꺁볯⺐볯趽뷯込뷯螽臣蒁臣貂臣銂鷩袄蛥ꮁ諦躸臣讂臣膂臣銼뻧⢤뷯鶼볯込뻧⦤臣蚈ꇩ鞁臣芀菣Ꚃ苣꺁藨趘臣誁臣讂胣꒼볯鞼볯閼꣦颭臣龁볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯㲤畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯겼볯閼볯㲕猯灵⤾臣袂臣ꆼ볯₦鞼볯邼꣦颭臣龁볯뎼볯⢡볯뎼볯㲡畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯ꚼ볯閼볯㲐猯灵⤾臣蚈룥꾁胣鞼볯閼뷯趽臣놊뗨ꊳ闩誁苣뎁볯邼볯躽뷯꺁駧覅돦랕臣袂苣䦋䥖⁓慃楬数鯨覅铧较賥랂苣蚃菣⢠慃楬数⁲楌敦匠楣湥散ⱳ䄠慬敭慤‬䅃銂铧蒁臣閩뻤鞁胣랂苣誃菣랼뫥꾁胣䲁癩湩䥧慭敧苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ룦骮臣龁胣뮔菥銂胣馨귨鞁臣뾂菣醃苣ꪳ臣閊룤趉臣膀臣覂臣ꮁ꣦颭苣뎃菣꾂돨꺁諦躸뻥膀볯邼裥膀볯膀볯芙雩誁苣뎁꿦ꖗ鋦ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 邵黦銂ꇨ钼볯ꮁꓧ馁胣鶁臣뮔菥꾁胣ꢅ臣꺁蟥꺽뻧ꮁ臣醁苣ꮅ飧ꢃ뷤ꞁ볥鮊臣趛藥랼뫥銂ꓧ鞁臣芀铧较臣趛藥랼뫥ꮁ苣ꎁ臣膀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鞼볯閼⼼畳㹰臣ꎼ볯銼볯ꮅ飧ꮁ꿥鞁臣ꖀ胩ꮁ軦醿臣膀볯颼駦鎖臣鞃菣袃菣ꮁ臩馁苣鎁臣貁껥벨臣貂臣芀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鞼볯閼⼼畳㹰돦蒰뻥隼韦ꞁ藨趘臣覂軦꒙臣貂臣꺁臣낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯㲤畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯겼볯閼볯㲕猯灵꺁볯邼볯꺁臣ꞁ臣ꎁ臣芀꿥ꞅ髧ꮁ胣ꮅ飧ꮁ꿥鞁臣閩뻤閁苣龁꿥ꞅ觥ꊼ볯ꆼ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ꆼ볯鞼볯邼⼼畳㹰臣醰臣蒁臣ꦁ胣趛藥랼뫥꾁胦龀臣躽룤閁苣龁胣醼볯邼볯醿臣꺁볯뎼볯㲡畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯ꚼ볯閼볯㲐猯灵貁볯ꖗ鯧ꮁ藨趘臣覂軦몇臣貂臣芀臣龁臣ꎁ臣膀臣꺁뗧鲞臣꾁胣낼볯Ꞽ裢���ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯㲤畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯겼볯閼볯㲕猯灵貁볯뒼볯隼藨趘臣뺯臣ꚁꯩ蒁ꛨ貒胦銂鳦馁苣鎁臣貁껥벨臣貂苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㔶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ볯⺢ꎼ볯銼볯銈藨趘뿤覜菣Ꚃ苣뺁臣꾁볯膽뷯芽볯ꎼ菣ꒂ菣隃菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣蚈룥꺁꿦莼戼㹲 誃苣벃菣ꪁ菣Ꚃ苣ꮁ臣醁苣蚈룥銂꿦莼臣讂臣膂臣膀볯뒼볯隼裢ꮅ飧鶿鳦麃苣릂苣膀룤風臣袂臣ꮁ铧邈臣膀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鞼볯閼⼼畳㹰苣邼閼뷯螽볯讽뷯ꞁ鷩袄蛥ꮁ諦躸臣龁躽볯鎼芀裥ꮁ胣誃苣벃菣ꪁ볯膽뷯芽볯莽菣Ꚃ苣꾁臣龁胣낼볯Ꞽ裢ꆼ볯ꆼ볯銈볯鎼볯钼볯㲤畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯겼볯閼볯㲕猯灵銂볯⺐볯趽뷯込뷯螽臣馝蓨薆諦躸臣貂臣⢟뷯鶼볯⦔胣鶁臣麃苣릂苣ꂱ껦鞁臣膀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鞼볯閼⼼畳㹰돦蒰볯钼駦鎖뻥ꮁ菣醃菣뎃럦ꂊ铧蚐ꏩꦡ냦銂胣莿蟨銂胩颁臣讁苣膵臣鮁臣芀藨趘뿤覜菣Ꚃ苣놔鷦꺁藨趘臣袂臣誃苣벃菣ꪁ菣Ꚃ苣놔鷦꺁蟨ꢙ苣躏鯩鞁臣膀볯뚼볯뎼铧较苣릂菣ꂃ臣뮔菥隌臣ꚁ胣꒼볯鞼볯閼苣낂菣ꮃ볥ꚺ苣膀룤風臣ꢁ臣誂楌楶杮浉条붂菣袃苣Ꞃ苣銂铧蒁臣겸껥鞁臣芀苣낂菣ꮃ볥ꚺ臣膀뗧钹蟨ꢙ蟩辇臣袂臣ꚁ귦辦賥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 鶁臣邵黦銂ꇨ钼볯ꮁꓧ馁胣랂苣誃菣랼뫥뺁臣꾁郥鎇駥銂胣ꮅ飧꺁苣낂菣ꮃ볥ꚺ臣钯볨鞁胣钯臣鞁臣몤臣⢙藨趘볯鎇駥⦨胣鎁臣邵黦ꞁ臣膀믤꺁蟨ꢙ臣钯볨鞁臣膀藨趘臣꾁鳦颫臣랂苣誃菣랼뫥貁ꛨ龯臣貂苣鎁臣貁ꓧ閁苣龁胣鶂蟨誁苣뎁蓨鎇臣꾁胣颫臣趛藥랼뫥銂ꓧ鞁胣鎁苣꾁胣ꮅ飧ꮁ臣醁苣袂苣节胣鶁苣麁苣膀볯⺑볯趀臣袂臣銼醼胥躽臣ꎁ臣芀믤꺁蟨ꢙ胣设臣낁胣뎄臣袂臣莿蟨꾁胣躽臣랂苣誃菣랼뫥銂ꓧ鞁胣ꮅ飧袂苣节臣貂臣貂苣낂菣ꮃ볥ꚺ臣銼볯趀臣袂臣醼볯趀뷤讁臣龁胣鞁臣貁臣ꚁ胣鶁臣邵黦膀볯ꖼ볯銈볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰꒼볯鞼볯閼⼼畳㹰臣膀귦뢸蟨ꢙ臣뺯臣ꚁ뷤蒁ꛨ貒胦銂鳦馁苣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㘰㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯邼볯궼볯醼볯钼볯낼볯ꎼ볯貐돧ꮅ飧ꊃ菣ꮃ苣ꢔ臣讂볯ꖼ볯隌뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯꺁藨趘ꋥ隮飩뎮뒼볯ꦼ誁苣뎁铧���ꧨꆾ戼㹲 麃苣릂볯ꢼ볯馼볯讼볯뎼볯钼郥뮳藨趘菣螃菣銂铧蒁臣膀볯ꖼ볯隌뗧鮏臣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂볯⢒볯꒼볯銼膀볯ꖼ볯隌臣龁뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯⢮볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯鮼裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣낼볯Ꞽ裢늼볯醼볯놼볯뎼볯隼볯꺼꺁諦ꮅ飧覜諥Ꞁ苣閩뻤鞁臣芀볯ꢼ볯馼볯麃苣릂蛨鎇臣鎂듧麃苣膀볯銽뷯鎽볯뎼볯⺬볯醼볯꒼볯讼뷯閼볯늼볯鞼볯ꢼ볯讼볯蒽뷯ꎼ뷯薽뷯螽볯讼臩鶼귥趓뷤麃苣릂菣螃菣讁苣颪냥馁苣芀볯뎼볯钼듧麃苣颍鯩鞁臣膀蛨鎇臣龘諧내菨銂룤뮭賥馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖ꆼ‮郥뮳臣ꮅ飧ꊃ菣ꮃ戼㹲 麃苣릂볯ꢼ볯馼볯讼볯뎼볯钼郥뮳藨趘菣螃菣銂铧蒁臣膀볯ꖼ볯隌뗧鮏臣ꊂ菣躃苣뎃菣ꊂ菣誃菣벂볯⢒볯꒼볯銼膀볯ꖼ볯隌뷯ꢼ뷯ꆼ볯ꆼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯⢮볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯鮼裦龆菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂苣낼볯Ꞽ裢늼볯醼볯놼볯뎼볯隼볯꺼꺁諦ꮅ飧覜諥Ꞁ苣閩뻤鞁臣芀戼㹲 낼볯ꎼ볯내菨銂跥ꊛ臣ꚁ胣떆蟨꺁飦뚊듧麃苣趸귦隌臣讂胣낼볯ꎼ볯내菨銂铧邈臣讂臣膂臣膀볯閼볯ꊼ볯込볯麃苣릂铧ꖝ臣떆蟨銂觥肈臣莈臣뮈苣ꞁ胣Ꞽ뷯馽臣뎹ꇨꦡ뫦늶Ꞽ볯뎼볯⦳臣ꮐ鳦閁苣讂볯⺐볯閼볯꺁苣ꦃ苣誃菣벂볯膀볯⺐볯薼臣꒼볯ꆼ뷯薽臣袂臣邼邼볯薼臣鞃菣誃菣벂苣ꮐ鳦馁苣銼뷯겼臣袶賥ꦷꇨ늶룤ꮁ藥貂臣芀郥薀臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣貾胣袂臣랷郥鞁臣鎼볯莄臣銼鯥꺁볯閼裥꺁뛦隌苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣꺁뻥膀뻥覂苣龁듧麃蟦膿뛦銂胣醼볯邼볎뷯꺁菣ꒂ菣뎃菣莃苣ꖃ苣骀臣ꚁ苣躁臣膀볯⺐볯薼苣랂ꇨ薸苣ꮃ菣龃菣⢳볯뎼볯⦡苣ꮐ苣Ꞽ볯뎼볯궸臣銼鯥鞴뗦鞁臣膀볯邼뷯겼臣Ꞽ볯뎼볯込볯뎼볯궸臣趆蟦膿臣龁胣颼뷯겼臣ꢼ뷯鎽뷯辽뷯薽뷯骽匨杩慭胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥꒼볯醼볯颼銂듧麃蟦膿뛦ꮁ럦ꂊ臣ꚁ胣ꢅ뷤꺁껥辇苣隼뷯겼臣Ꞽ볯뎼볯込볯뎼볯许臣钃菣莃菣ꎂ菣낂臣ꚁ胣趸胩骶꿥ꚺ该超苣龔裦鞁臣芀苣궃臣隃菣벃苣뮂菣袃臣醼钼볯邼뷯ꞁ볯邼裥鎖臣ꂁ뿥蚈鯩貾胣肉鳦꺁듧麃苣銼臣꺁꿥ꚺ껥辇臣鎖臣莢闧ꊝ臣覂鯥躏臣ꚁ胣낼볯뎼苣ꢔ臣ꚁ볯麛臣袂臣銼뷯궼臣겼苣ꮃ苣龃菣膀볯邼볯꺁苣랂菨钻ꇨ薸臣袂臣醼볯꺁苣뎃菣蚃菣랂菣ꊼ貮藥꒼볯ꖼ볯⦭苣鲣藥鞁臣꒼볯ꖼ볯릟鳥銂铧蒁臣醼鯥鞴뗦鞁臣芀듧麃苣膀ꏨꂀꗦ薀臣鞃菣袃苣벃菣銂铧蒁臣膀敌瑮⵩噓〴䌨灡瑩污䈠潩捳敩据獥胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ꎼ볯낼裢邼볯���醼볯⦑苣ꢔ臣ꚁ룤뮭賥鞁臣芀볯뎼볯钼臣붑郥閁苣讂胣鞾苣貂臣내菨ꪠ苣膀껥ꢅ볯궼볯궼룤ꞁ닧肝胦꺁跥꒱臣鞁臣蒵맧릟ꓩ궸臣膀볯鞼蓢讁臣閼볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵ꞁ뛧膌臣龁胣궼볯醼볯钼菣Ꚃ苣떆蟨貁苣내菨꾁胣ꮼ뷯膽뷯겼볯겼Ꞽ볯銼볯込볯邽볯鎼볯醼볯銼볯込볯낼뷯颽볯銽뷯钽뷯込볯몁볤邭鏦鲽臣貂臣麃苣릂菣螃菣ꮁ铧ꖝ臣讂胣㲂牢ਾ†볯ꢼ볯馼볯讼볯뎼볯钼郥뮳藨趘菣螃菣銂铧邈臣讂臣膂臣膀菣Ꚃ苣⢹慔潣楮⁣慆浲讁苣钼胣隼胩ꞁ藥讉臣ꚁ胣醼苣벃苣芁臣誂볯릌迥릮臣龁鯩Ꞁ볯閼볯ꊼ볯込볯麃苣릂ꮁ胣뎏蓨ꢪꫩ鲆臣ꎚ軦鞁臣膀귧覂蛥ꮁ胣閼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰閼⼼畳㹰胥꺁볯뎼볯钼ꢅ菩ꞁ볯쎕醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲖猯灵讀臣내菨⦞臣ꢁ苣ꮁꛨ꺁볯ꢼ볯馼볯내菨銂郥肂볯邼볎볯꺁듧麃蟦膿觧銂돦蒰臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†볯馼賥꺁鯩Ꞁ볯閼볯ꊼ볯込볯麃苣릂臣膀该ꦉ볯릌臣龁苣膀볯⺐볯趽볯꺁돦蒰껥辇룤ꮁ郥뺁苣讂胣閼韃볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隼⼼畳㹰胥꺁럦袐觧꺁菣Ꚃ苣궼볯醼볯钼蛨鎇臣鎂藨趘듧麃臣袂臣麃苣릂볯뎼볯钼蛨鎇飦뚊듧麃苣貐駦꺚룤ꖎ꣧鞁臣芀藨趘껥辇苣膀鯥ꊽ藨趘ꇥ꺁闩閁겼誁苣뎁맥⢅볯⦷臣겸껥銂믤鞁臣螃苣뾂菣궂菣ꪃ菣벃苣ꢔ臣ꚁ뇦骮臣龁胣ꮅ飧릮蟩⢏볯뚼꾁胣⢁볯쎬랼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹰込볯ꢁ臣ꚁ껧몇臣龁胣ꮅ飧銂ꋥ隮臣鮁臣膀藨趘뿤覜菣Ꚃ苣銂胣ꮅ飧貁꟨모迥붃臣芁苣膀듧閼볯鲀볯邼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣讂臣겸껥閁苣龁駦膀ꧨ鎨鏥閊룤ꮁ雩鞁臣蚈ꇩ鞁臣芀戼㹲 낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼苣膀苣骁臣ꮁ铦覤臣ꚁ胣龮雦设볯⺘볯ꮁ꣨覼臣貂苣节臣ꢁ郥颧臣릖돦銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁胣蚈귥꺁臣ꆁ듧醼볯邼볯貁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ臣袂臣ꚁꧨꆾ臣龁ꃥ袐볯ꖼ볯隌臣貂臣뾪ꏨꦉ苣龔裦鞁臣芀ꛨ馁苣ꮁ胣銽볯閽볯꒼볯銼裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯⦮臣醼볯趽뷯込뷯겼臣뾪ꏨꦉ苣膀鯧階볯ꖼ볯銈볯邼볯⢫볯薽뷯ꮼ뷯趽†볯薽뷯袽뷯辽뷯辽뷯馽낼뷯膽뷯辽뒼볯鮼苣뾂菣낂闧랏볯銈볯ꎼ볯銈볯邼볯⦫臣ꢁ苣ꮁ볯骼볯閼臣ꊃ菣钯臣랷郥鞁胣肜裥ꮁ볯莄臣醼볯芙雩膀곦蒁臣鎼볯莄臣隼볯蚈苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖 ꚇ뷧꺁臣膂臣膀볯ꢼ볯馼볯讼볯뎼볯钼藨趘뿤覜菣Ꚃ苣銂볯���臣ꚇ뷧꒾臣ꆄ뷤몂賥鞁臣⢟뷯鶼觢颼骼ꫥ鎽꿥ꞅꦷꇨ늶臣뾁뺁臣꾁볯ꒁ臣ꚇ뷧ꢔ蟩꺁볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯芀곦蒁臣膀볯ꢼ볯馼볯讼볯뎼볯钼藨趘뿤覜菣Ꚃ苣ꮁ胣邼邼볯鎼뷯螽볯鎽蟩讽뷯膀볯⺐볯鎼뷯螽볯鎽蟩讽뷯膀볯⺐볯趽뷯込뷤趇뷯螽臣袂臣鎼뷯螽볯鎽蟩讽뷯꺁볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯뺁臣꾁ꫥ鎽苣膀볯ꖗ臣趁臣馝蓨薆ꦼ볯⦶돦蒰臣龁胣ꮅ飧릮蟩銂胣誸꣨閁苣讂苣蚁臣궂菣ꪃ菣벃룦骮苣ꢔ臣ꚁ볯ꖗ鯧誁苣뎁볯ꖗ鯧ꮁ룦骮臣龁胣蒐胣꺁臣貂臣貂臣ꮅ飧ꊃ菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯Ꞽ볯⦩菣벃苣뎃菣꾁胣ꖻ룤꺁볥銂铧蒁臣鞮蟥鞁臣骼戼㹲 薼볯Ꞽ볯鶼醼裢⢒볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲎猯扵銈볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲐猯扵⤾럃ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢裢ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢崩韃볯邼볯薼戼㹲込룤膀胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢胣꾁胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼臣龁臣뺯藧꺁鳦芵諦躸뻥貀뷯趀韦꺛臣꺁蟥꺽뻧ꮁ臣蒁臣꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢胣꾁胣鶁臣ꚇ뷧꒾臣邼韦꺛ꚇ뷧趉꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼胣ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢胣꾁胣貀뷯趀韦꺛臣꺁꿥鲿臣讂꿥ꞅ뻧꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼臣ꒁ胣ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢胣꾁胣邼韦꺛ꚇ뷧趉꺁꿥ꞅ뻧ꮁ臣醁苣뎹鷥ꮅ飧릮蟩ꞁ臣讂胣궸ꓥ龔귥芙雩⢓볯뎼볯⦴ꖗ闦⦰臣꾁胣讀胣꺁뻧꺁菣Ꚃ苣꺁볯邼볯貁믤许臣ꢂ菣覃菣ꒂ菣袃臣蚁臣꺁볯ꒁ臣钁臣龁駦릂臣鞁臣鞮蟥鞁臣骼醼ꮅ飧릮蟩貁볯邼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣钁臣讂駦讁胣⢁볯⦒该ꦉ臣膀臣꺁뷤趇臣蚁臣銼볯薼뛨銂ꓥ蚁駦讁臣龁臣⢯볯⦓该ꦉ臣門귦ꢁ臣覂苣讂駦芀㰊䥄㹖胣邼볯閼볯醀⼼䥄㹖ꊼ‮뗧鲞戼㹲 ꢡ볯鞼臣膀ꫥ鎽꿥ꞅ臣钯볨鞁臣膀볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯銂諦躸臣貂臣麃苣릂臣꺁볯醼韦꺛臣뎹鷥ꮅ飧릮蟩誁苣뎁藨趘ꋥ隮飩뎮臣邵黦銂ꓧ馁胣醼볯ꖗ鯧ꮁ胣銪뷤뺯藧꒾臣뎹鷥ꮅ飧릮蟩꾁胣蒴볯钼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣ꎁ臣芀볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯⢮볯⺐볯邼볯趽뷯込뷯螽ꞁ蟥꺽臣貂臣꒾臣ꒁ臣ꚁ臣膀맥螝藨趘껥辇臣蒴볯銼볯趽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵ꞁ臣ꎁ臣膀꿥ꞅ뻧ꮁ꿥鞁臣膀듧鞼볯薼躽볯颼볯邽볯邼邼볯隼ꢁ臣蚁藨趘ꋥ隮飩뎮���볯ꦼꞁ臣誂胣鎁苣ꮁ苣ꎁ臣膀볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯閊룤꾁胣覜蓦ꪁ藨趘ꋥ隮飩뎮苣龔臣讂臣ꢁ臣龮꣨閁苣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†ꇨ钼볯꾁胣銪뷤뺯藧꒾臣뺯臣ꚁ胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼苣閊룤閁苣龁菣Ꚃ苣꺁룤꺤铧颭駦鎖臣邵黦銂ꓧ馁胣뺯藧꒾臣ꢅ臣꺁菣Ꚃ苣貁胣醼볯ꖗ鯧鲀볯隼韦꺛臣鎖臣뮭뫤鞁胣銼볯ꖗ臣蒁臣궸ꓥ龔귥芙雩⢓볯뎼볯⦴臣龔臣讂胣颼賥꺁볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯ꢳ냥鞁臣⢟볯讽뷯芁臣誂볯⺐볯邼볯趽뷯꺁铧辇麃苣릂臣蚁臣閼賥貁胣钼볯ꖗ苣薶臣ꚁ铧颭臣ꚁ臣誂胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼蟥꺽臣龁菣Ꚃ苣ꮁ臣蒁臣꾁胣궼볯뒼臣膀볯⺐볯邼볯趽뷯込뷯螽臣ꢔ蟩ꞁ볯隼韦ꞁ臣ꎁ臣芀臣꺁뗧鲞臣꾁胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼諦躸臣膀볯ꢼ볯馼볯讼볯뎼볯钼藨趘苣鶿鳦馁苣麃苣릂臣꺁铧颭苣覜蓦ꮁ闩辁臣讂臣ꢁ臣몤臣貂苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㜶⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㘰㰸愯㰾䐯噉ਾ⨊궃苣ꦃ菣꾂麃菣蚃菣뮃苣莃苣릂鲤껥ચ䐼噉邀볯颼볯邼胣㲑䐯噉ਾ껥붖뻤銼볯骼菣낂賥銽볯閽볯꒼볯銼臣袂臣鞊볯꒼裢醼苣ꢔ臣讂뷤ꢔ駧閳臣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯Ꞽ볯⦩ꧨꆾ戼㹲 麃苣릂苨貁苣ꮼ볯꺼볯邼볯貐돧ꮅ飧ꊃ菣ꮃ苣ꢔ臣ꚁ胣膃苣莃苣鶃苣뎃菣뮘껥ꒉ諦낼볯銈볯鞊뷤ꢁ뗧뾁郥辂臣龁볯ꖼ볯隌臣龁볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼볯邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯ꖼ볯銈볯鎼볯醼볯⦤臣鞊藨趘듦Ꞁ苣钯볨鞁臣芀戼㹲 ꮼ볯꺼볯邼볯貐돧ꮅ飧ꊃ菣ꮃ苣膀볯릌臣開觧芁臣誂볯⺐볯趽볯꺁돦蒰껥辇룤ꮁ郥覜臣貂苣膀볯쎕醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲕猯灵‾ꮼ볯꺼볯邼볯麃苣릂苨貁苣ꮅ飧내菨⢞볯뒼볯ꎼ†볯늼볯銈볯钼볯鎼銂胣鎼볯릌臣꒼볯ꆼ볯銼菣Ꚃ苣ꮁ髧许돦蒰臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ铧邈臣龁胣ꮅ飧鶿鳦麃苣릂苣膀맥螝臣ꮅ飧꺁苣ꒂ苣貁듧醼볯邼뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼⼼畳㹰臣钁臣讂駦ꮁ蟥꺽뻧ꮁ裥麡臣龁胣㲂牢ਾ†蟥꺽臣ꊖ臣ꚁ胣開觧銂볯ꒁ臣꒾躽볯颼볯꒾ꮁ蓧鲽苧隌臣龁볯醼龔郧龣ꇥ뒰ꫥ鎽꿥ꞅ胣銼낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼胣鎼츩銈볯꒼裢醼諦鎽䌨潬敮删偍ⴱ㐱胣ꮂ苣궃苣ꪕ迥ꊼ볯邼볯钼볯鮼楂塯敃汬‬敗瑳䰠扥湡湯‬䡎뺁臣꾁볯⦔볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯讼뇎裢낼볯銈볯芀볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯꾁胣邼鎼뷯螽볯���讽뷯ꞁ胩ꮁ볯麛鷩袄蛥閊룤鞁胣캁銈볯꒼裢醼臣膀볯趽뷯込뷯螽臣놀臣銼鯥릅藨薆臣閊룤鞁臣⦟胣떽铧꒾臣誁臣讂諦겖臣蚠뫥꾁胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼臣뒛뻥ꮁ뇎裢낼볯銈볯ꞁ臣ꎁ臣芀藨趘껥辇臣膀껥붖뻤醼볯⺗볯ꮁ臣蒁臣誸꣨閁苣讂苣蚁臣궂菣ꪃ菣벃룦骮苣ꢔ臣ꚁ胩ꮁ볯麛룦骮臣龁胣蒐胣꺁臣貂臣貂臣ꮅ飧ꊃ菣ꮃ臣ꒁ臣ꚁ臣ꮅ飧鞢껦뮘껥⢳볯Ꞽ볯⦩菣벃苣뎃菣꾁胣ꖻ룤꺁볥銂铧蒁臣鞮蟥鞁臣骼戼㹲 薼볯Ꞽ볯鶼醼裢⢒볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢뷯㲎猯扵銈볯㲴畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲐猯扵⤾럃ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢裢ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢崩韃볯邼볯薼戼㹲込룤膀胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢胣꾁胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼臣袂臣캳銈볯꒼裢醼臣龁臣뺯藧꺁鳦芵諦躸뻥貀뷯趀韦꺛臣꺁蟥꺽뻧ꮁ臣蒁臣꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼胣뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢胣꾁胣鶁臣ꚇ뷧꒾臣邼韦꺛ꚇ뷧趉꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼胣ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰躽⼼畳㹢胣꾁胣貀뷯趀韦꺛臣꺁꿥鲿臣讂꿥ꞅ뻧꺁맥螝藨趘껥辇臣芁苣鮼臣ꒁ胣ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰邼⼼畳㹢胣꾁胣邼韦꺛ꚇ뷧趉꺁꿥ꞅ뻧ꮁ臣醁苣뎹鷥ꮅ飧릮蟩ꞁ臣讂胣ં䐼噉邀볯颼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣꺁뗧鲞苣ꢡ볯馼臣몤臣芀ꇨ钼볯꾁胣醼볯ꖗ鯧⢮볯꒼볯钼꺁볯꒾臣龁苣꺁맥螝藨趘껥辇苣몤臣芀臣꺁뗧鲞臣꾁胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼跥겋胣캁銈볯꒼裢醼跥겋臣袂臣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼볯캋銈볯꒼裢醼臣蒵郥鮁臣ꢅ臣貁胣뺯藧꒾臣钯볨鞁臣ꮅ飧鞢껦銂飩뎮臣龁臣ꢁ臣몤臣貂苣芀볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯颍诧ꞁ臣膀뇎裢낼볯銈볯ꚇ뷧颍诧뺁臣꾁볯ꖼ볯銈볯鎼볯钼볯讼뇎裢낼볯銈볯떽铧芙돦꺁臣骁苣讁苣誂苣Ꞥ臣蒁藨趘ꋥ隮飩뎮苣袑臣龁胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㘰㰹愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯銼볯誁鯩낼볯Ꞽ賥ꢃ裥꺁駩뮎戼㹲 뎂菣뢂菣늂菣袃臣ꚁ臣ꪁ臣膀臩ꊛ볯ꖼ볯隌菩蚈苣膀볯膽뷯钽뷯₏낼뷯薽뷯馽뷯릨蓨ꮂ菣ꂃ苣ꢔ臣ꚁ胣낼볯Ꞽ賥ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞臣뺯臣讂迥鲿臣覂駩뮎臣龁胣誁鯩낼볯Ꞽ苣膀껥붖뻤颼ꆼ臣袂臣銼볯⺐볯ꮁ꣨覼臣낼볯Ꞽ賥릖돦銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁臣膀볯ꖼ볯隌볯꒼볯銼裢ꮼ볯鞼볯꒼낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼볯邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯ꖼ볯銈볯鎼볯醼볯⦤臣袂臣낼볯Ꞽ賥銽볯閽볯꒼볯銼裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯���낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼볯邈蛧誃菣邃菣뎃苣ꮁ苣讂볯ꖼ볯銈볯銼볯馼볯込볯銼볯銼볯⦮臣뾪ꏨꦉ臣覂迥誂蟥鞁臣芀戼㹲 낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼ꫨ붣觧讁苣誁鯩낼볯Ꞽ苣꒙軥馁苣龁苣ꮁ胣鎼閼볯꺁ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꂃ苣膀볯ꊼ볯궸臣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼臣뮷諥鞁臣膀볯ꊼ볯궸臣邼鞼볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣ꢁ臣蚁鳦芵뿦ꚺ苣钁裦鞁臣芀곦蒁臣膀ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꢁ臣节臣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼苣膀볯ꊼ볯궸臣邼鞼볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣ꞁ뫤趉맥ꆡ賥鞁臣䎟灡潴倠敨祮릨蓨ꮂ菣ꂃ䜨⁅效污桴慣敲ꮁ꿥鞁臣膀볯趽뷯꺁꣦芄臣龁苣閼뷯螽臣낼볯Ꞽ賥뾂菣醃苣ꪳ臣蒁臣钯臣ꂊ臣龁胣궃菣覃臣貂臣ꎼ뷯邽뷯辽†볯袽뷯躽뷯貽꣦芄苣膀볯ꊼ볯궸臣邼鞼볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣꺁볯邼苣ꦃ菣뚺뛦ꞁ듦蒵臣龁胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼苣膀볯ꊼ볯궸臣邼鞼볯궼ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꂃ臣覂胣낼볯뎼룤꺁볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣뺁臣뢼룦馁苣뺋藩ꞁ뫦몇臣龁胣钼볯薼该超뫦몇낼볯뎼룤꺁볯⺐볯銼볯ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣⦠뻥ꮁ뫦몇臣龁铧蚈苣鞃菣ꮃ臣龁胣鞃菣ꮃ臣龁뫦몇铧蚈苣膀볯鲀볯趽뷯込뷯겼臣莿뫥뺁臣莿룧鞁胣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꮁ苣ꎁ臣蚈黦鞁臣芀臩ꊛ볯ꖼ볯銂胣䎁牯湯⡡闥馨䌩慨杲摥䄠牥獯汯䐠瑥捥潴⡲桔牥潭匠楣湥楴楦Ᵽ畓湮癹污ⱥ䌠⥁苣ꢔ臣ꚁꓦ몇臣龁胣ં䐼噉邀볯颼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯讁苣誁鯩낼볯Ꞽ苣꒙軥馁苣龁苣ꮁ胣鎼閼볯꺁ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꂃ苣膀볯ꊼ볯ꮁ郥뺁苣讂볯ꖼ볯銈볯銼볯銼볯込볯銼볯閼볯궸臣뮷諥鞁臣膀볯ꊼ볯궸臣肜뗧莿뫥邼隼볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣銂臩邈臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣ꢁ苣膀볯ꊼ볯궸臣邼隼볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣ꞁ뫤趉맥ꆡ賥鞁臣䎟灡潴倠敨祮릨蓨ꮂ菣ꂃ䜨⁅效污桴慣敲ꮁ꿥鞁臣膀꣦芄볯趽뷯芁臣誂볯趽뷯꺁볯ꖼ볯隌苣뎃菣꾂돨꺁꿦ꞁ諥袁臣芀菣벃菣閁苣龁慃瑰⁯桐湥汹꣦芄苣膀볯ꊼ볯궸臣ꮐ臣貂苣邼隼볯궼ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꂃ臣醼볯ꮂ菣ꂃ껥趩苣ꢔ臣ꚁ듦蒵臣龁胣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼苣膀볯ꊼ볯궸臣邼隼볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣讁苣낼볯뎼룤꺁볯궼臣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣꺁볦鮸该超臣뚺蟥鞁臣芀볯邼볯뺋藩뚺蟥⢺볯ꊼ볯궸臣邼銼볯隼볯ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣⦠뻥ꮁ뫦몇臣龁铧蚈苣鞃菣ꮃ臣龁胣醼볯趽볯ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣膀뷯ꢼ볯⺗볯꺁볯邼苣ꦃ菣릮蟩ꞁ臣붿諥꺁뫦몇苣뺁臣膀鳦鶈臣���菣ꮃ臣貂臣뚺蟥뮔裥ꞁ菣벃菣鞁臣芀臣꺁菣벃菣閁苣龁뫦몇铧蚈苣膀볯鲀볯趽뷯込뷯겼臣莿뫥뺁臣莿룧鞁胣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꮁ苣ꎁ臣蚈黦鞁臣芀臩ꊛ볯ꖼ볯銂胣䎁牯湯⡡闥馨䌩慨杲摥䄠牥獯汯䐠瑥捥潴⡲桔牥潭匠楣湥楴楦Ᵽ匠湵祮慶敬‬䅃銂铧蒁臣鲤蟥鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 誁鯩낼볯Ꞽ駩뮎臣邵黦銂ꇨ閼볯ꮁꓧ馁胣鎁臣邵黦ꞁ臣膀臩ꊛ볯ꖼ볯꺁蟩꾁胣낼볯Ꞽ裢ꮼ볯鞼볯꒼ꫨ붣觧ꮁ臣蒁臣꾁胣醼뷯螽臣뾂菣醃苣ꪳ臣龁苣蒴볯⺓볯趽뷯꺁臩ꊛ볯ꖼ볯讁苣膀볯趽뷯꺁苣뎃菣꾂돨芁臣誂볯⺐볯鎼뷯螽臣誁鯩낼볯Ꞽ臣ꞁ臣袂臣낼볯Ꞽ裢늼볯銼볯놼볯뎼볯隼볯꺼ꫨ붣觧ꮁ臣蒁臣꾁볯趽뷯꺁苣뎃菣꾂돨芁臣誂볯⺓볯趽뷯꺁臩ꊛ볯ꖼ볯讁苣醼뷯螽臣뾂菣醃苣ꪳ臣龁苣誁鯩낼볯Ꞽ臣龁苣邼銼뷯螽臣ꞁ胣躽룤鞁臣鎁臣貁ꓧ閁苣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ隼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㜰㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯鎼볯骤냥麃뷤ꪃ菣붂菣ꂃ궼볯겼낼볯銼볯붣觥㲤牢ਾ†藥ꮺ諦躸臣龁苣ꮁ胣銃苣ꮃ菣讃菣벃苣膀뻤袁臣꾏뫦Ꞁ菣ꊂ菣궃菣肃菣벂苣膀菣鶃苣벃菣ꪁ臣꺁蓨ꪳ냥麃룤ꮁꫨ붣臣ꚁ苣袂臣芀臣貂苣꺁뻤꾁胣骤냥麃뷤ꪃ菣붂菣ꂃ궼볯겼ꞁ臣讂胣꺨胣꺁뻥뺔胦꺁ꓥ辰菨鎽菣鶃苣벃菣낼볯銼볯⢐볯뚼볯銈볯ꢼ볯邼붣觥銂胣ꖻ룤꺁룤겈髧讉ꃩ銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁臣芀臣龁볯ꎼ볯겅雩ꪕ迥랼볯銼볯醼볯込볯邼볯鎼볯鞼臣袂臣뎱鯥릉꣨몇ꇩ겅雩견볯邼볯鎼볯邼볯閼볯鞼볯隼苣芏藧꺁臣ꢁ胣鎁臣芄돨뚺뛦꾁胣꺨胣꺁룤Ꞁ蓨ꪳ臣랷郥ꦉ胣设臣낁胣袃菣낂菣뮂菣覃뒼볯⦧菣ꪃ苣것苣뎃ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯骼볯㲑猯扵⤾胣袃菣ꮂ菣ꪃ菣뎃ꎼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰颼볯邼⼼畳㹢誁苣뎁苣것苣蚃菣벃菣膀臣覂臣ꮁ귦꺁鯩랍臣袂臣ꂲ臣뮛跨銂鳦馁苣芄돨膀뻤ꢁ臣ꚁ臣膀菣릂菣ꆂ菣뢂菣뎂菣뎃ꇩ⢞볯ꎼ膀苣ꪂ菣ꪂ苣ꮃ菣릂菣ꆂ菣뢂菣뎂菣뎃꒼볯낼볯膀볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯颼볯醼⼼畳㹢膀苣ꢂ菣뎂苣ꮃ菣릂菣ꆂ菣뢂菣뎂菣뎃꒼볯낼볯膀볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銼볯醼⼼畳㹢誁苣뎁苣醃菣龃菣ꒂ菣鮃苣鮃菣ꮃ苣ꪃ苣궃菣ꮃ꒼볯낼볯膀볯㲣畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯隼볯醼⼼畳㹢貁賦銁苣貂苣芀럧낼볯莿뫥꾁鳦Ꞥ볯馼颼뷯궼臣芁臣ꚁ胣뎂菣릂菣궃菣ꮃ뿦ꚺ臣鎼볯趽볯膀볯Ꞽ뿦ꚺ臣肜ꓥ鎼馼뷯궼臣芁臣ꚁ胣꒼볯낼볯莿뫥꾁볯⺔볯趽볯ꞁ臣ꎁ臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯���⼼䥄㹖ꆼ‮볯뚼볯銈볯ꢼ볯邼ꏨꒉ臣龔裦㲐牢ਾ†꣧薀臣ꊃ菣醃菣뮂菣袃臣꒼볯낼볯誁苣뎁볯꾼볯ꎼ邼胣醼볯邼볯⦅胣ꪁ苣뎁臣꺨胣꺁菣ꮃ菣벃苣뎃菣꺁菣ꪃ苣것苣뎃臣袂臣袃菣ꮂ菣ꪃ菣뎃邼胣醼볯邼볯⦅胣꒼볯낼볯膀苣것苣蚃菣벃菣誁苣뎁볯⺐볯膀볯⺐볯閼胣邼閼胣醼臣龁臣銼뷯螽볯趽볯꺁볯ꢼ볯邼苣ꮐ苣궼볯겼ꏨꒉ苣뾪ꏨ鞁臣芀곧醼臣ꖷ꣧ꞁ臣膀苣궃菣鮃菣ꂃ룤꺁蓨ꪳ릲鯧⦸臣袂臣견볯꺁냦뚺뛦궸臣낼볯銼볯⢐냦뢛銂뗧뾁郥辂臣ꚁ胣뎹賥鞁臣膀닦궸냦讞苣麃菣뢂菣뎃苣ꊽ裦鞁胣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣膀볯ꢼ볯邼苣膀菣뎃蓨ꪳ跥꒱臣袂臣ꚁ苣鞃苣ꮃ賥鞁臣芀곧銼臣ꖷ꣧ꞁ臣膀곧銼臣뒰뫦늶苣뮷諥鞁臣膀매隌臣膀臣貂臣袂臣ꚁ냦궸닦궸냦讞鞽뷯钽뷯銽裢覽뷯銈뷯覽뷯銈뷯躽裢鞽뷯钽뷯銽ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣銂뷥邈臣龁胣견볯꺁냦뚺뛦꺁곧銼臣ꊂ菣뎂菣袃臣뮷諥貾胣꾂菣궃菣ꮃ菣뚺ꫥ銂鋨몙臣鮁臣膀ꓥ辰菨鎽菣鶃苣벃菣銂郥肂뻥覂苣龁铧邈觧銂胣견볯꺁냦뚺뛦궸臣낕鯥鞴뗦鞁臣膀듧閼볯薼臣ꪃ菣꾂菣莃菣⢈菣莃苣閁苣龁닧邭껥辇ꮁ蛥뢇뿦鞁胣銼胣颼蓢ꞁ뿤ꆮ臣龁胣㲂牢ਾ†뻤몤髧ꪁꏨꒉ臣膀菣讃菣ꮃ菣莃苣릂苣ꢔ臣ꚁꫨ붣臣讂臣뺁臣꾁볯趽뷯覽菣궂苣벃伨湭⁩慍牣⁯卅‬浏楮䤠瑮牥慮楴湯污‬敋湮獥睡‬䅇銂铧蒁臣Ꞥꛨꆨ臣뾪ꏨ鞁臣芀뻥薀臣꾼뷯躽뷯龃苣떂菣閳臣꾁胣꾂菣궃菣ꮃ菣⢠볯趽볯⦬臣ꮐ鳦閁苣讂蓨ꪳ뫦늶苣膀볯ⲗ볯邼볯銽뷯趽臣颼裥鎖胣꾼뷯躽뷯龃苣떂菣銂铧蒁胣隼뷯겼臣견볯꺁냦뚺뛦宲볯邼뷯궼臣ꢼ뷯鎽裢ꢼ볯貽胣邽볯隼閼胣閼볯릂苣궃菣릂苣ꮐ苣⢀꣧薀臣莿뫥꺁볯ꢼ볯邼郥覜崩臣뎹賥鞁臣膀닦궸냦讞苣麃菣뢂菣뎃苣龔裦鞁臣芀볯邼뷯궼臣ꪃ苣뎃邽볯醼볯⺐볯⦐苣ꮐ鳦馁苣鎼銼볯낂菣뎂菣릂臣銼볯趽볯꺁곧銼臣뒰뫦늶苣ꢔ臣ꚁ볯鲀볯蚈雩膀볯閼볯邼뷯邽뷯ꞁ볥趁뛧趁매隌臣ꚁ胣뒰룤릲룤뒰黥꺁곧銼臣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣銂뻥龁胣鎁臣견볯꺁苣麃菣뢂菣뎃苣膀볯ꒁ臣ꢂ菣것菣麃苣ꒃ菣閃菣릂苣ꮁ귧鞁臣뮧臣膀裥꺁볯邼뷯겼苣ꪃ苣벃菣꺁곧銼臣뒰뫦늶苣膀룤릖臣閃菣릂苣ꮁ럦ꂊ臣龁胣鶁臣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣꺁ꇨꊝ룤ꮁꫧꂴ苣閃菣莃苣ꖃ臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ胣鎼볯莄臣꾂菣궃菣ꮃ菣銂迥誂駩蒁臣芀볯ꢼ볯邼苣ꮐ鳦馁苣궼볯겼닧邭苣膀볯邼뷯겼臣견볯꺁냦뚺뛦宲볯閼뷯궼臣ꢼ뷯鎽裢ꢼ볯貽럧鶡뛦膀뷯ꢼ볯⺖볯⢐볯銼볯趽볯꺁볯膽볯貽苣ꮐ苣⦀銂铧蒁臣膀臣꺁뫦늶苣뮷諥馁苣鎁臣膀迥ꊻ臣ꚁ臩莿裥ꊛ껧���銂럦袐臣讂臣ꢁ臣袂臣랆铨鎍룤ꂁ뿥蚈鯩ꢙ臣膀볯莄臣鎼볯邼볯銽뷯趽臣膀볯邼裥鎖臣ꂁ뿥蚈鯩ꮁ苣ꎁ臣膀볯麛듦蒵臣龁胣肜뗧蒚臣膀볯뚼볯銲귥銂곧鎼臣뒰뫦늶룤ꮁ蛥뢇뿦鞁臣膀듧閼볯薼臣ꪃ菣꾂菣莃菣붣觥銂뷥邈臣ꚁ胣銼胣颼蓢ꞁ蟥邵뿤颭臣龁胣龃菣鲃菣蚃菣꾂苣讉ꃩ꾁郥颧臣芁臣ꚁ胣ꢡ볯邼臣몤臣醃菣ꆃ菣뾂菣銂铧蒁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 许臣ꢡ볯醼臣膀곧醼胣견볯꺁臣袂臣견볯꺁냦뚺뛦銂臣ꢁ苣ꚁ臣讂胣ꢡ볯醼臣뺁臣膀볯뚼볯鞃菣뮂苣꺁郥薀臣ꖷ꣧꺁껥辇胣ꚩ雨莿뫥誁苣뎁믤꺁菣ꦃ菣벃苣벃苣膦듧鞁臣蒁苣芀戼㹲㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㜰㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖ꊼ‮뻤몤髧ꪁ볯뚼볯銈볯ꢼ볯邼ꏨꒉ臣뺁臣膂戼㹲 꺨胣꺁菣ꮃ꿦꺁蓨ꪳ胣낼볯銼볯誁苣뎁믤꺁럦ꂊ觧銂郥覜臣讂臣辁臣讁臣궼볯겼裢낼볯銼볯붣觥銂胣誸꣨ꢁ郥颁룤겈髧讉ꃩ銂铧蒁臣뾪ꏨ鞁臣芀꣧薀臣붿諥꺁럦ꂊ觧銂胣견볯꺁냦뚺뛦궸臣ꮐ苣ꚁ胣ꮂ菣뮂菣隌臣龁볯ꢼ볯邼臣覮껥Ꞁ苣醐룤뺁臣꾁뿤颭臣龁胣设臣낁胣붣觥ꚼ볯颼臣袂臣ꚼ볯馼臣膀ꇥ隌苣ꮃ苣Ꚃ菣銂郥鎂臣芀ꏨꒉ볯颼볯꾁胣隼볯邼볎볯꺁苣궃菣鮃菣ꂃ鯧誁苣뎁볯邼볯캐겼臣견볯꺁냦뚺뛦뢛苣蚈臣讂룤鎖鯧ꢁ臣ꚁ볯閼볯캐겼臣낂菣뮂菣벃菣銂郥鎂臣芀ꏨꒉ볯颼볯꾁胣邼醼볯螃苣릂菣ꦃ菣钼볯Ⲑ볯邼볯誁苣뎁볯⺐볯薼臣낼볯Ꞽ裢隼볯邼볯銂郥鎂臣芀ꏨꒉ볯颼볯銈볯颼볯꾁胣銃苣ꮃ菣뎃藩⢸볯ꆼꪂ菣뒂菣벃苣ꮐ苣ꂁ胣蒁臣ꒁ臣꺁ꏨꒉ臣膀臣貂苣꺁럦袐볯뎹賥讉ꃩꞁꓥ隌臣龁胣设臣낁胣붣觥ꚼ볯隼臣ꊖ臣ꚁ臣膀곧醼臣뎹賥ꖷ꣧銂胣颼裥ꞁ臣ꪁ臣钼裥財臣膀臣貂臣袂臣ꚁ냥辇臣ꪃ菣붂菣ꂃ菣것菣袃苣鞾臣芀ꏨꒉ볯隼볯銂胣龃菣鲃菣蚃菣꾂苣ꞁ臣ꪁ臣궃菣뾂菣鮃苣벃菣ꞁ럦袐臣ꚁ胣랷郥꺁雩ꮁ铧颁苣ꪉ雦銂냥ꪁ臣鞁臣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 许臣ꢡ볯銼臣膀꣧薀臣궼볯겼裢낼볯銼볯붣觥銂ꓧ鞁臣誁苣膀臣貂臣꾁胣붣觥ꪕ迥膀ꏨꒉ볯ꎼ鮃苣閃苣膃苣ꮃ苣ꪃ菣⦳臣袂臣뒼볯⢧菣ꪃ苣ꪃ苣ꪃ菣⦉菣ꮃ볯钯胣몇駧莿뫥꺁볯ꢼ볯邼趽뷯込뷯겼膀苣麃菣뢂菣뎃苣鲽ꏨ馁苣龁苣ꮁ铧蒁苣龃苣떂菣誁苣뎁곧醼臣뒰뫦늶臣ꮐ臣貂臣뮻蓦꺁럦ꂊ觧銂郥肂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㜰㰳愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖���ꢡ볯銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㐷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰ㄾ⼼畳㹰鿧蒁곧ㆬ臣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣랷郥芙雩貁苣誂鿧蒁㐨裥⦆戼㹲㰊畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢㰲猯灵늶뷤뚺뛦궸臣股냥뾝铧ꖝ苣것苣蚃菣벃菣꺁믤辂苣ꮁ铧蒁苣貂苣開觧놔鷦꺁苣것苣蚃菣벃菣㲫牢ਾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰㌾⼼畳㹰곧ㆬ臣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣랷郥芙雩貁苣誂鿧辁㐨裥⦆胣견꺁苣麃菣뢂菣뎃럦袐駦鎖臣袂苣궟臣⢄〳꟧⦒㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖龮雦设볯钼볯设ꓧ蒚臣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞臣袂臣꺿ꏩ閁苣龁苣뎃菣꾂돨꺁ꃩ龟臣ꢡ臣뺁臣膂戼㹲 ꢡ볯鎼臣膀鳦躘듧뢛臣设꣨閁苣讂ꓥ낕黥ꆼ볯ꆼ볯鶃菣骃菣膃菣꺁臣ꢁ苣銂ꓧ馁胣鎁臣ꢡ臣膀볯膽뷯覽뷯貽뷯隽菣뎃菣ꪃ菣낂臣袂臣邈蛧超裥誃菣邃菣뎃苣ꮁ鿥ꖁ臣꺿ꏩ꺁뷤꺽胣ꪁ苣뎁臣鎁臣袂臣ꪁ뿤뺣苣ꮐ苣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞臣뾂菣醃苣ꪳ臣设ꓧ蒚臣超裥ꪕ迥銂ꓧ馁胣꺿ꏩ貁뗧뾁郥辂臣貂臣节苣蒁臣ꢁ臣袂臣붿諥꺁ꓥ낕黥貁胨꺅臣貂苣鎁臣貁郧ꎧ臣貂苣芀돦風臣貂臣ꊂ菣躃藩议鿥꾁룤겈臣꾁胣鶿귥蒚뷧鮏臣낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤銂觥몇臣ꪁ臣躁苣ꪃ苣랂菣隌臣ꦁ臣뒠郥銂駩趁胣鶿귥蒚苣龃菣뢅뷧鮏设臣낁胣ꢡ볯銂迥ꞅ臣鎁臣⦨臣꺽臣鮏臣ꚁ苣袂臣芀臣龁臣ꎁ臣膀뻤袁臣膀볯꾁胣놼臣龁臣ꢼ臣꺽臣鮏臣覂苣ꚁ苣袂臣芀郥薀臣ꢳ꣨閁苣龁뿤뺣苣ꮐ苣ꆼ볯ꆼ볯覤闧讞菣ꪃ菣鞃菣覃臣몤臣貂苣芀臣貂苣꺁룤ꞁ苣膀藩鞈臣超裥颭裥邭臣芏藧閁苣讂菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꮐ臣貂苣芀믤辄臣꺿ꏩ꺁뗧袐臣节迦鮾臣貂苣芀臣龁胣鮃菣貺蟩鎽臣袂臣颃菣궃뫤辇뷤銂郥肂胣꺿ꏩ閁苣龁볯꒼볯銼ꓥ낕黥貺蟩鎽苣邏뻤閁苣讂胣뺁臣邏뻤閁苣讂臣꾁ꓥ낕黥꺁ꓥ辇뷤ꞁ臣讂胣뺁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣讂苣蚁臣ꚇ뷧릖돦膀蟥꺽臣龁苣꺁뷤ꢔ胣떽铧誁苣뎁賥겖뗧邈觧ꢁ郥颧胣覤闧讞臣袂臣骤蟩鎽臣袂臣貺蟩鎽苣ꮐ苣뎂菣뢂菣늂菣袃苣邏뻤閁苣讂胣肜뻥꺁裥꾁胣꺿ꏩ꺁ꃩ龟苣鞁臣꾁菣ꆃ苣뎃臣龁臣꺿ꏩ貁믤躸臣讂듦Ꞁ苣貐껥馁苣芀룤겈臣꾁胣覤闧꾁胣设臣낁胣뮴胦銂ꋥꞤ臣讂臣膀菣醃菣뎃뗧袐苣躽룤馁苣讁胣鮜臣鞁臣ꪁ臣뢛뫤鲽铧銂ꛥ銁苣낂菣뎂苣ꮃ賥銂ꫨ躰臣讂臣誁苣뎁볯뺁臣꾁ꇨ薸跥鮸鳦銂믥랕臣讂臣膀볯꒼볯ꚧꫥ뮴胦ꢃ裥銂鳦馁苣낼볯ꊼ菣ꆃ苣뎃臣뢛뫤鲽铧銂ꛥ銁苣讁苣鞁臣꾁뷤许臣讂臣誁苣뎁볯뺁臣꾁菣ꊂ菣誃菣벂듦Ꞁ믤隤臣뮴胦膀뻤袁臣膀臣꺁苣蚁臣뮴胦���ꫥ讻臣讂迥릮뷤ꮁ꿥馁苣邵郥銂ꛥ銁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣ꆼ볯ꆼ볯꺁ꋥ隮鯥邭듦Ꞁ苣躽룤馁苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㔷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㜰㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㜷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㜰㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㤷⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㠰㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㠰㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㌸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㠰㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㔸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㠰㰶愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯閼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㜸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㠰㰸愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鞼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㤸⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㤰㰰愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㤰㰲愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯醼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㌹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀ꇨ馼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㤰㰴愯㰾䐯噉ਾ㰊䥄㹖胣邼볯颼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖胣ꢡ볯鎼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰〰㔹⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉邀볯颼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†뿤뺣臣鎽ꗦ薀臣躘駧ꢁ臣讂臣ꞁ胣겜駧躘臣膀럦颻臣릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣袂臣ꚁ臣뾁駩骮臣貂苣鎁臣貁蓦뎛臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㤰㰶愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠���㤰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㤰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰㤰㰹愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰〱㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥醼볯醀⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦〢〰㘶㔲㈶⸷楴≦〾〰㘶㔲㈶⸷楴쉦゠〰〱㰱愯㰾䐯噉ਾ䐼噉邀鯥銼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〰㘰㈶㘵㜲琮晩㸢〰㘰㈶㘵㜲琮晩ꃂ〰㄰㈰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣超裥ꢡ胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽⼮〰㘰㈶㘵㜲〯〰㘶㔲㈶〷〰〰⼱〰㘰㈶㘵㜲〰〰㄰愮灰㸢〰㘰㈶㘵㜲〰〰㄰愮灰⼼㹡⼼䥄㹖㰊䐯噉ਾ⼼潢祤ਾ⼼瑨汭ਾ