(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、
（ｂ）β−１，３−グルカンとを
含む、複合体を含む抗がん用組成物であって、該ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、配列番号１に表されるヌクレオチド配列を含み、該ポリデオキシアデニル酸は、２０ヌクレオチド長以上、１００ヌクレオチド長以下であり、該β−１，３−グルカンは、シゾフィラン（ＳＰＧ）である、組成物。
【請求項２】
前記組成物は、細網内皮系および／またはリンパ節に送達されるように投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細網内皮系および／またはリンパ節は、腫瘍および貪食細胞を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細網内皮系は脾臓および／または肝臓を含む、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、がん抗原なしで投与されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記投与は全身性投与を含む、請求項２〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記全身性投与は、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、および腫瘍内投与から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記オリゴデオキシヌクレオチドは、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、
（ｂ）β―１，３−グルカンとを
含む、複合体を含む、がんの死細胞を細網内皮系および／またはリンパ節に集積させるための組成物であって、該ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、配列番号１に表されるヌクレオチド配列を含み、該ポリデオキシアデニル酸は、２０ヌクレオチド長以上、１００ヌクレオチド長以下であり、該β−１，３−グルカンは、シゾフィラン（ＳＰＧ）である、組成物。
【請求項１０】
前記オリゴデオキシヌクレオチドは、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細網内皮系および／またはリンパ節は、腫瘍および貪食細胞を含む、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細網内皮系は脾臓および／または肝臓を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物は全身性投与により投与されることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記全身性投与は、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、および腫瘍内投与から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規がん治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性のＣｐＧモチーフを含有する、短い（約２０塩基対）、一本鎖の合成ＤＮＡ断片であって、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）の強力なアゴニストであり、樹状細胞（ＤＣｓ）及びＢ細胞を活性化して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）及び炎症性サイトカインを産生させ（非特許文献１、２）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を含む、Ｔｈ１型の液性及び細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する（非特許文献３、４）。そこで、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染症、癌、喘息及び花粉症に対して可能性のある免疫療法剤とみなされてきた（非特許文献２、５）。【０００３】
骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、少なくとも４つの型のＣｐＧ  ＯＤＮがある（非特許文献６）。Ｄ型（Ａ型とも呼ばれる）ＣｐＧ  ＯＤＮは、典型的には、ホスホジエステル（ＰＯ）骨格及びホスホロチオエート（ＰＳ）ポリＧテイルと共に１つの回文構造のＣｐＧモチーフを含み、形質細胞様ＤＣｓ（ｐＤＣｓ）を活性化して大量のＩＦＮ−αを産生させるが、ｐＤＣ成熟化やＢ細胞活性化を誘導できない（非特許文献７、８）。他の３つの型のＯＤＮは、ＰＳ骨格からなる。Ｋ型（Ｂ型とも呼ばれる）ＣｐＧ  ＯＤＮは、典型的には、非回文構造の、複数のＣｐＧモチーフを含有し、Ｂ細胞を強力に活性化してＩＬ−６を産生させ、ｐＤＣｓを活性化して成熟化させるが、ほとんどＩＦＮ−αを産生しない（非特許文献８、９）。近年、開発されたＣ型及びＰ型のＣｐＧ  ＯＤＮはそれぞれ１つ及び２つの回文構造ＣｐＧ配列を含有しており、双方ともＫ型の様にＢ細胞を活性化させ、Ｄ型の様にｐＤＣｓを活性化させることができるが、Ｐ型ＣｐＧ  ＯＤＮと比較して、Ｃ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＩＦＮ−α産生をより弱く誘導する（非特許文献１０−１２）。特許文献１に、多数の優れたＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮが記載されている。【０００４】
Ｄ型及びＰ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、Ｇ−ｔｅｔｒａｄｓと呼ばれる平行４本鎖構造を形成するフーグスティーン塩基対、及びシス回文構造部位とトランス回文構造部位との間のワトソン−クリック塩基対、という高次構造をそれぞれ形成することが示されており、これらはｐＤＣｓによる強力なＩＦＮ−α産生に必要である（非特許文献１２−１４）。このような高次構造は初期エンドソームへの局在化やＴＬＲ９を介する情報伝達に必要であるようだが、これらは産物の多型性及び沈殿の影響を受け、その結果その臨床応用を妨げている（非特許文献１５）。従って、Ｋ型及びＣ型ＣｐＧ  ＯＤＮのみが、ヒト用の免疫療法剤及びワクチンアジュバントとして一般的に利用可能である（非特許文献１６及び１７）。Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、ヒト臨床試験において、感染症及び癌を標的とするワクチンの免疫原性を高めるが（非特許文献６、１６）、最適なアジュバント効果のためには、抗原とＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮとの間の化学的及び物理的連結が必要である。これらの結果は、４つの型（Ｋ、Ｄ、Ｐ、及びＣ）のＣｐＧ  ＯＤＮには長所及び短所があることを示しており、アグリゲーションすることなく、Ｂ細胞及びｐＤＣｓの両方を活性化する「オール・イン・ワン」ＣｐＧ  ＯＤＮの開発が期待されている。【０００５】
スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）由来の可溶性β−１，３−グルカンであるシゾフィラン（ＳＰＧ）は、子宮頸癌患者における放射線療法の賦活薬として日本においてここ３０年に亘り認可されている医薬である（非特許文献１８）。同様に、シイタケ由来の可溶性β−１，３−グルカンであるレンチナン（ＬＮＴ）は、１９８５年に承認された医薬であり、手術不能および再発胃癌患者に対しフルオロピリミジン系薬剤との併用で使用されている（非特許文献１９、２０）。β−１，３−グルカンは、ポリデオキシアデニル酸（ｄＡ）と三重螺旋構造の複合体を形成することが示されている（非特許文献２１）。【０００６】
特許文献２〜４には、シゾフィランを含むβ−１，３−グルカンと核酸（遺伝子）との水溶性複合体の遺伝子キャリアとしての使用が開示されている。これらの文献には、該複合体を形成することにより、遺伝子のアンチセンス作用及び核酸分解酵素（ヌクレアーゼ）への耐性作用が高められることが記載されている。【０００７】
特許文献５には、β−１，３−結合を有する多糖類をキャリアー（トランスフェクション剤）として用いることにより、ＣｐＧ配列を含み、リン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合に置換した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの作用が高められることが開示されている。【０００８】
特許文献６には、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、長鎖のβ−１，６−グルコシド結合側鎖を有するβ−１，３−グルカンとからなることを特徴とする免疫刺激性複合体が記載されている。【０００９】
本発明者らは、以前、ＳＰＧと複合体化した、５’末端にリン酸ジエステル結合を有するポリ（ｄＡ）を連結させたマウス及びヒト化したＣｐＧ  ＯＤＮが、サイトカイン産生を増強し、インフルエンザワクチンアジュバントやＴｈ２細胞関連疾患の予防または治療剤として作用することを示した（非特許文献２２、２３、特許文献７）。Ｋ型及びＤ型のそれぞれのＣｐＧの５’末端にポリ（ｄＡ）を付加し、ＳＰＧと複合体を形成すると、それぞれＫ型及びＤ型の特性を維持しつつ、その活性が増強された。しかしながら、より効果的で、費用効率が高い、前臨床及び臨床開発へ向けて、ＣｐＧ−ＳＰＧ複合体の高収率を達成することが困難であった。近年、ＣｐＧ  ＯＤＮにホスホロチオエート結合を有するポリ（ｄＡ）を連結すると、複合体形成がほとんど１００％にまで上昇することが示された（非特許文献２４）。しかしながら、最適なヒト化ＣｐＧ配列を同定し、４つの型のＣｐＧ  ＯＤＮの「オール・イン・ワン」活性を得るための因子を最適化するための綿密な試験はなされていない。【００１０】
特許文献８には、抗原／ＣｐＧオリゴヌクレオチド／β−１，３−グルカン系の三元複合体の製造方法が開示されている。【００１１】
トル様受容体９  （Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ９、ＴＬＲ９）のリガンドである合成核酸ＣｐＧ  オリゴデオキシヌクレオチド  （ＣｐＧ  ＯＤＮ）は強い自然免疫活性化能を有しており、ワクチンアジュバントとして期待されている。また、単剤での投与において抗腫瘍活性を有しているため、ＣｐＧ  ＯＤＮはがんに対する免疫療法剤としても期待されている。しかしながら、従来のＣｐＧ  ＯＤＮは抗腫瘍活性を有しているものの、腫瘍に直接投与する事でしか、効果を発揮する事ができず、臨床への応用は困難であると考えられていた。実際に、臨床の現場では初期の段階での腫瘍に直接薬剤を投与する事は困難であると考えられる。また、深部においては外科的処置も必要となり、そのハードルは高い。【００１２】
最近本発明者らはＣｐＧ  ＯＤＮを多糖のベータグルカンで包んだ、新たなＴＬＲ９のリガンド  （Ｋ３−ＳＰＧ）の開発を行った（ＰＣＴ出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７４８３５）））。Ｋ３−ＳＰＧは凝集塊を作る事なく、従来型のＣｐＧ  ＯＤＮに比べ、強く自然免疫を活性化する事、同時に強いアジュバント効果をマウスを用いた実験により示している。さらにＫ３−ＳＰＧは、マウスのみならずカニクイザルにおいても強い獲得免疫を誘導する事が明らかとなり、これまで懸念されていたマウスと霊長類での反応性の違いを克服できた。【００１３】
このように、このＣｐＧ  ＯＤＮはアジュバント剤としての用途は期待されているが、単独で医薬として使用し得るかは不明である。【００１４】
癌治療について言えば、１９９１年に細胞障害性Ｔ細胞が認識するがん関連抗原を同定して報告して以来（非特許文献２５＝ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）２５４，１６４３−１６４７  （１９９１））、非常に多くのがん関連抗原が分子レベルで同定され、それらを標的とするがん免疫療法の臨床的適用を達成した（非特許文献２６＝Ｊａｇｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８７，２６５−２７０  （１９９８）；非特許文献２７＝Ｊａｇｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５４，６６９−６７４  （２００１）．；非特許文献２８＝Ｉｍａｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １０４，３００−３０７  （２０１１）；非特許文献２９＝Ｋａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５，１３４３−１３４８  （１９９５））。特に注目されるがん免疫療法は、２０１０年４月に前立腺がん患者に対して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を初めて受けた、自己末梢血の抗原提示細胞を使用するがんワクチンＰｒｏｖｅｎｇｅである（非特許文献３０＝Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｃｏｕｌｄ  ｏｐｅｎ  ｆｌｏｏｄｇａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６，６１５−６１５  （２０１０）；非特許文献３１＝Ｈｉｇａｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １１５，３６７０−３６７９  （２００９））。その後、Ｔリンパ細胞の活性化の阻害性分子である細胞障害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）に対する阻害性抗体イピリムマブは、２０１１年５月に米国において、悪性黒色腫患者に対して承認された（非特許文献３２＝Ｐｈａｎ，Ｇ．Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，８３７２−８３７７  （２００３）；非特許文献３３＝Ｃａｍａｃｈｏ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２７，１０７５−１０８１  （２００９）；非特許文献３４＝Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６３，７１１−７２３  （２０１０））。さらに、免疫反応阻害因子のＰＤ−１（プログラム細胞死１）受容体阻害剤であるニボルマブは、臨床試験段階である（非特許文献３５＝ＡＺＩＪＬＩ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４，１４９３−１５０５  （２０１４）；非特許文献３６＝Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，１２１２−１２１８  （２０１３）；非特許文献３７＝Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  １１，３８８７−３８９５  （１９９２）；非特許文献３８＝Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６６，２４４３−２４５���  （２０１２））。【００１５】
樹状細胞が抗がんエフェクターを効果的に導く環境の形成は、炎症部での抗がん作用を示す自然免疫のパターン分子が必要とされる（非特許文献３９＝Ｃｈｉｂａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３，８３２−８４２  （２０１２））。上記分子群およびこれに関与する過程は特定されていないが、樹状細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＮＫなどのリンパ球を活性化する（非特許文献４０＝Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２１，４０２−４１７  （２０１２））。腫瘍浸潤マクロファージ（主要関連マクロファージ：ＴＡＭ）は、炎症反応の元凶として知られている（非特許文献４１＝Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １９，１−２  （２０１１））。他方で、抗がん免疫の担い手（ｐｌａｙｍａｋｅｒ）として機能する樹状細胞もまた、マクロファージと同じ骨髄細胞である（非特許文献４２＝Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，１７５６１−１７５６６  （２０１２））。これらを抗がん指向性に変える方法は見つかっていないが、腫瘍は、複雑な要因によって免疫を回避してきたと考えられている。ＴＡＭおよび樹状細胞の両方は、炎症およびパターン認識応答によって支配される（非特許文献４３＝Ｇａｒａｕｄｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，１２０ｒａ１１６  （２０１２）；非特許文献４４＝Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｏｍａｒｅｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３３，６６−７０  （２０１２））。免疫学的なエフェクター細胞ががん細胞と接触することは、がん細胞の攻撃のためには不可欠である（非特許文献４０＝Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２１，４０２−４１７  （２０１２）；非特許文献４５＝Ｐａｌｕｃｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ  １２，２６５−２７７  （２０１２））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＵＳ  ８，０３０，２８５  Ｂ２
【特許文献２】ＷＯ  ０１／０３４２０７  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ０２／０７２１５２  Ａ１
【特許文献４】特開２００４−１０７２７２号公報
【特許文献５】ＷＯ  ２００４／１００９６５  Ａ１
【特許文献６】特開２００７−７０３０７号公報
【特許文献７】特開２００８−１００９１９号公報
【特許文献８】特開２０１０−１７４１０７号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−７４５  （２０００）．
【非特許文献２】Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５，４７１−４８４  （２００６）．
【非特許文献３】Ｂｒａｚｏｌｏｔ  Ｍｉｌｌａｎ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９５，１５５５３−１５５５８  （１９９８）．
【非特許文献４】Ｃｈｕ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８６，１６２３−１６３１  （１９９７）．
【非特許文献５】Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，２４９−２５８  （２００４）．
【非特許文献６】Ｖｏｌｌｍｅｒ，Ｊ．＆  Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ６１，１９５−２０４  （２００９）．
【非特許文献７】Ｋｒｕｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３１，２１５４−２１６３  （２００１）．
【非特許文献８】Ｖｅｒｔｈｅｌｙｉ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６，２３７２−２３７７  （２００１）．
【非特許文献９】Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．＆  Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４，９４４−９５３  （２０００）．
【非特許文献１０】Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３３，１６３３−１６４１  （２００３）．
【非特許文献１１】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ７３，７８１−７９２  （２００３）．
【非特許文献１２】Ｓａｍｕｌｏｗｉｔｚ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２０，９３−１０１  （２０１０）．
【非特許文献１３】Ｋｅｒｋｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８０，８０８６−８０９３  （２００５）．
【非特許文献１４】Ｋｌｅｉｎ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  １１０，６８９−６９３  （２０１０）．
【非特許文献１５】Ｐｕｉｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４，６４８８−６４９５  （２００６）．
【非特許文献１６】Ｂｏｄｅ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  １０，４９９−５１１  （２０１１）．
【非特許文献１７】ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ４６，１３４１−１３４９  （２００７）．
【非特許文献１８】Ｏｋａｍｕｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ５８，８６５−８７２  （１９８６）．
【非特許文献１９】Ｏｂａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｂａｓｅｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｎａｎ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ／ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００９，２９，２７３９−２７４６．
【非特許文献２０】Ｎａｋａｎｏ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，１９９９，４６，２６６２−２６６８．
【非特許文献２１】Ｓａｋｕｒａｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２，６４１−６５０  （２００１）．
【非特許文献２２】Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，１２８０−１２８６  （２００７）．
【非特許文献２３】Ｋｏｙａｍａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，２５ｒａ２４  （２０１０）．
【非特許文献２４】Ｍｉｎａｒｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，９−１５  （２０１１）．
【非特許文献２５】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）２５４，１６４３−１６４７  （１９９１）
【非特許文献２６】Ｊａｇｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８７，２６５−２７０  （１９９８）
【非特許文献２７】Ｊａｇｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５４，６６９−６７４  （２００１）．
【非特許文献２８】Ｉｍａｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １０４，３００−３０７  （２０１１）
【非特許文献２９】Ｋａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５，１３４３−１３４８  （１９９５）
【非特許文献３０】Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏｖａｌ  ｃｏｕｌｄ  ｏｐｅｎ  ｆｌｏｏｄｇａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６，６１５−６１５  （２０１０）
【非特許文献３１】Ｈｉｇａｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １１５，３６７０−３６７９  （２００９）
【非特許文献３２】Ｐｈａｎ，Ｇ．Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００，８３７２−８３７７  （２００３）
【非特許文献３３】Ｃａｍａｃｈｏ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２７，１０７５−１０８１  （２００９）
【非特許文献３４】Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６３，７１１−７２３  （２０１０）
【非特許文献３５】ＡＺＩＪＬＩ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４，１４９３−１５０５  （２０１４）
【非特許文献３６】Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４，１２１２−１２１８  （２０１３）
【非特許文献３７】Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  ｊｏｕｒｎａｌ  １１，３８８７−３８９５  （１９９２）
【非特許文献３８】Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３６６，２４４３−２４５４  （２０１２）
【非特許文献３９】Ｃｈｉｂａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３，８３２−８４２  （２０１２）
【非特許文献４０】Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ２１，４０２−４１７  （２０１２）
【非特許文献４１】Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  １９，１−２  （２０１１）
【非特許文献４２】Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，１７５６１−１７５６６  （２０１２）
【非特許文献４３】Ｇａｒａｕｄｅ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，１２０ｒａ１１６  （２０１２）
【非特許文献４４】Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｏｍａｒｅｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３３，６６−７０  （２０１２）
【非特許文献４５】Ｐａｌｕｃｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ  １２，２６５−２７７  （２０１２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、従来アジュバントとして開発されていたＣｐＧ−βグルカン複合体（例えば、Ｋ３−ＳＰＧ（ヒト型Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮであるＫ３とベータグルカンとの複合体を単剤での抗腫瘍薬として用いたところ、従来型のＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｋ３）では効果がなかった静脈内投与において、Ｋ３−ＳＰＧは担癌状態のマウスにおける腫瘤の退縮を確認し（図２（Ａ〜Ｂ））、本発明を完成させた。本発明者らは、さらに、より臨床に近いモデルである腹膜播種モデルにおいても、強力な抗腫瘍活性を示すことを実証した（図２ｇ、ｍ（図２Ｂ））。本発明者らは、この効果には抗原の投与が必要ではなく、単剤での投与において効果を確認した。【００１９】
さらに、本発明者らはＫ３−ＳＰＧの抗腫瘍効果には獲得免疫応答が重要である事、自然免疫応答によって誘導されるＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）とＩＬ−１２が必須である事を遺伝子欠損マウスを用いて示した（図６ａ、ｂ、ｃ（図６Ａ））。また、本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧを静脈投与する事で、脾臓中にＣＤ４５陰性の腫瘍細胞が集積している事を確認し、この細胞の多くが細胞死（ｎｅｃｒｏｓｉｓまたはａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を起こしている事を明らかにした。このＣＤ４５陰性細胞をマウスに免疫すると、強力に抗腫瘍効果を発揮したことから、脾臓に集積しているＣＤ４５陰性細胞の細胞死が重要な役割を示しているようであることを明らかにした（図６ｇ，ｈ、ｉ、ｊ（図６Ｂ））。また、本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧを投与する事で、腫瘍に活性化されたＣＤ８Ｔ細胞が集積する事も確認しており、これらの細胞が抗腫瘍効果には必須である事を明らかとした。【００２０】
このため、全身性投与において抗腫瘍効果を発揮するＣｐＧ  ＯＤＮの開発はこれまでに困難であった癌腫においても、強力に働くことが期待される。さらには、ＣｐＧ  ＯＤＮは抗原無しに抗腫瘍効果を発揮する事から、単剤としての応用も期待することができる。【００２１】
これまでに、ＣｐＧ  ＯＤＮは、単剤治療（Ｐｒａｔｅｓｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，６３８８−６３９３  （２００５）；Ｍａｎｅｇｏｌｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ／  ＥＳＭＯ  ２３，７２−７７  （２０１２）；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１９，３５５−３６３  （２０１２）；Ｈｉｒｓｈ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２９，２６６７−２６７４  （２０１１）  ；Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  １１５，３９４４−３９５４  （２００９））またはがんワクチンアジュバント（Ｒｅｅｄ，Ｓ．Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９，１５９７−１６０８  （２０１３）；Ｐｅｒｒｅｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，６５９７−６６０８  （２０１３）；Ｍｂｏｗ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２２，４１１−４１６  （２０１０）；Ｄｕｔｈｉｅ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２３９，１７８−１９６  （２０１１））として有望な薬物であることが示されている。しかし、これまでのＣｐＧ−ＯＤＮによる抗癌剤としての治療は、腫瘍内に注射された場合にのみ、腫瘍の成長を抑制し得る（Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ：  ＣＩＩ  ６１，２０５５−２０６５  （２０１２）；Ｌｉｎ，Ａ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ６３５５０  （２０１３）；Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９，６５１６−６５２２  （２００３）；Ｌｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  （Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，Ｍｄ．：  １９９７）  ３４，２７９−２８８  （２０１１）；Ａｕｆ，Ｇ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７，３５４０−３５４３  （２００１）；Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ８３６８  （２００９）；Ｈｅｃｋｅｌｓｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９，３８９２−３８９９  （２００２））。本発明者らは、ここでＫ３−ＳＰＧというナノ粒子状のＴＬＲ９アゴニストを開発し、これはシゾフィラン（ＳＰＧ；βグルカン）およびＢ／Ｋ型ＣｐＧ（Ｋ３）複合体からなり、Ｋ３−ＳＰＧは、Ｋ３本来よりも強いワクチンアジュバント（強力なＩＦＮ−αの誘発を伴���）として機能したことを示した。本実施例において、本発明者らは、さらにがんに対するＫ３−ＳＰＧの単剤免疫療法の潜在性（さらなる腫瘍ペプチドおよび抗原を使用しない）を調べたところ、上記のような効果が得られることがわかり本発明を完成した。したがって、本発明は代表的に以下を提供する。【００２２】
（抗がん剤単剤）
（１）（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、
（ｂ）β―１，３−グルカンとを
含む、複合体を含む抗がん剤。
（２）前記抗がん剤は、がん抗原なしで投与されることを特徴とする、項目（１）に記載の抗がん剤。
（３）前記抗がん剤は、細網内皮系および／またはリンパ節に送達されるように投与されることを特徴とする、項目（１）または（２）に記載の抗がん剤。
（４）前記細網内皮系および／またはリンパ節は、腫瘍および貪食細胞を含む、項目（３）に記載の抗がん剤。
（５）前記細網内皮系は脾臓および／または肝臓を含む、項目（３）または（４）に記載の抗がん剤。
（６）前記抗がん剤は、がん抗原なしで投与されることを特徴とする、項目（１）〜（５）のいずれか１項に記載の抗がん剤。
（７）前記投与は全身性投与を含む、項目（２）〜（６）のいずれか１項に記載の抗がん剤。
（８）前記全身性投与は、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、および腫瘍内投与から選択される、項目（７）に記載の抗がん剤。
（９）前記オリゴデオキシヌクレオチドはＫ３（配列番号１）、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、ｄＡ４０−Ｋ３（配列番号３）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号１２→７）からなる群より選択される、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗がん剤。
（１０）前記β―１，３−グルカンはシゾフィラン（ＳＰＧ）、レンチナン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホランおよびラミナランからなる群より選択される、項目１〜９のいずれか１項に記載の抗癌剤。
（１１）前記複合体は、Ｋ３−ＳＰＧである、項目１〜１０のいずれか１項に記載の抗がん剤。
（細網内皮系（脾臓および／または肝臓を含む）および／またはリンパ節集積剤）
（１２）（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、
（ｂ）β―１，３−グルカンとを
含む、複合体
を含む、がんの死細胞を脾臓に集積させるための組成物。
（１３）前記オリゴデオキシヌクレオチドはＫ３（配列番号１）、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、ｄＡ４０−Ｋ３（配列番号３）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）からなる群より選択される、項目（１２）に記載の組成物。
（１４）前記β―１，３−グルカンはシゾフィラン（ＳＰＧ）、レンチナン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホランおよびラミナランからなる群より選択される、項目（１２）または（１３）に記載の組成物。
（１５）前記複合体は、Ｋ３−ＳＰＧである、項目（１２）〜（１４）のいずれか１項に記載の組成物。
（１６）  前記細網内皮系および／またはリンパ節は、腫瘍および貪食細胞を含む、項目１２〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
（１７）  前記細網内皮系は脾臓および／または肝臓を含む、項目（１２）〜（１６）のいずれか１項に記載の組成物。
（１８）前記投与は全身性投与を含む、項目（１２）〜（１７）のいずれか１項に記載の組成物。
（１９）前記全身性投与は、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与、および腫瘍内投与から選択される、項目（１８）に記載の組成物。
＜インターロイキン１２（ＩＬ１２）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）γの発現またはその促進のための組成物＞
（２０）（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、
（ｂ）β―１，３−グルカンとを
含む、インターロイキン１２（ＩＬ１２）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）γの発現またはその促進のための組成物。
（２１）前記オリゴデオキシヌクレオチドはＫ３（配列番号１）、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、ｄＡ４０−Ｋ３（配列番号３）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）である、項目（２０）に記載の組成物。
（２２）前記β―１，３−グルカンはシゾフィラン（ＳＰＧ）、レンチナン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホランおよびラミナランからなる群より選択される、項目（２０）または（２１）に記載の組成物。
（２３）前記複合体は、Ｋ３−ＳＰＧである、項目（２０）〜（２２）のいずれか１項に記載の組成物。【００２３】
本発明において、上述した１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解することにより、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明であるＫ３−ＳＰＧの抗腫瘍薬としての応用は、従来のＣｐＧ  ＯＤＮでは克服出来なかった全身性投与において強力な抗腫瘍効果を発揮する事ができる。そのため、臨床での観点からも非常に有用であると考えられる。また、ヒト細胞でも十分な効果（自然免疫応答）が確認されている事から、ヒトへの応用の可能性も高い。我々の研究結果により、これまでに臨床試験で用いられているＣｐＧ  ＯＤＮに比べ非常に強い自然免疫活性化能に加え、強い抗腫瘍効果を有している事が示されたことから、Ｋ３−ＳＰＧは有用な免疫療法薬として期待出来る。さらには、抗原の投与を必要とせず腫瘍細胞の細胞死を誘導する事で効果を発揮する事ができるため、様々な癌腫に応用出来る事が考えられる。これらの結果から、Ｋ３−ＳＰＧは抗原を必要としない自然免疫活性化型抗腫瘍薬としての可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ＣｐＧ  ＯＤＮとはＳＰＧの複合体化の方法を示す。
【図２Ａ】図２（Ａ〜Ｂ）は、抗原を含まないナノ粒子状のＣｐＧ（Ｋ３−ＳＰＧ）の全身性注射が、膵臓がん腹膜播種モデルを含む多くの確立された腫瘍モデルに適用され得ることを示す。図２Ａはａ〜ｉを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７細胞を０日目にｓ．ｃ．接種し、７、９および１１日目にＰＢＳ（ａ〜ｃ）、Ｋ３（３０μｇ）（ｄ〜ｆ）、またはＫ３−ＳＰＧ（１０μｇ）（ｇ〜ｉ）を、皮内（ｉ．ｄ．）（腫瘍周囲領域）（ａ、ｄ、ｇ）、腫瘍内（ｉ．ｔ．）（ｂ、ｅ、ｈ）、または静脈内（ｉ．ｖ．）（ｃ、ｆ、ｉ）に投与した。腫瘍サイズを２３日間測定した（ｎ＝４）。各曲線は、個々のマウスを表している。矢印は、治療の時期を示している。
【図２Ｂ】図２（Ａ〜Ｂ）は、抗原を含まないナノ粒子状のＣｐＧ（Ｋ３−ＳＰＧ）の全身性注射が、膵臓がん腹膜播種モデルを含む多くの確立された腫瘍モデルに適用され得ることを示す。図２Ｂはｊ〜ｎを示す。（ｊ〜ｌ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６細胞、Ｂ１６Ｆ１０細胞またはＭＣ３８細胞を０日目に接種した。Ｂ１６接種群を、Ｋ３−ＳＰＧで１０、１２および１４日目にｉ．ｖ．またはｉ．ｔ．処置した。Ｂ１６Ｆ１０接種群を、Ｋ３−ＳＰＧで７、９および１１日目にｉ．ｖ．またはｉ．ｔ．処置した。ＭＣ３８接種群を、Ｋ３−ＳＰＧで１４、１６および１８日目にｉ．ｖ．またはｉ．ｔ．処置した。エラーバーは平均＋ＳＥＭ（ｎ＝４）を表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｍ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎ０２細胞を０日目に腹腔内注射し、１１、１３および１５日目にＫ３またはＫ３−ＳＰＧあるいはＰＢＳ（コントロール）でｉ．ｖ．処置した。腫瘍の重量（ｇ）は２１日目を示している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｎ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐａｎ０２を０日目に腹腔内注射し、Ｋ３またはＫ３−ＳＰＧあるいはＰＢＳで３回ｉ．ｖ．処置した。生存率（％）を示している（ｎ＝８）。＊ｐ＜０．０５（ログランク検定）。
【図３】図３は、Ｋ３−ＳＰＧの全身性投与による結果を他のコントロール、Ｋ３と比較したものである。Ｋ３−ＳＰＧの全身性投与は抗原を必要としない癌免疫療法剤となり得ることが示された。腫瘍細胞株であるＥＧ７をマウスに移植後、Ｋ３、Ｋ３−ＳＰＧを３回（７、９、１１日目）静脈内投与した。腫瘍細胞を移植後７日目から腫瘍サイズを測定した。
【図４】図４は、Ｋ３−ＳＰＧが、腫瘍微小環境内の食細胞を標的とすることを示す。（ａ〜ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７を０日目にｓ．ｃ．接種し、ＰＢＳ（コントロール）、ＡＬＥＸＡ  ６４７−Ｋ３（３０μｇ）、またはＡＬＥＸＡ  ６４７−Ｋ３−ＳＰＧ（１０μｇ）を１２日目にｉ．ｖ．投与した。投与１時間後、マウスをｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージングシステム（ＩＶＩＳ）で分析し、相対蛍光で測定されたイメージを、表面放射輝度の物理単位（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）に変換した。白の矢印は、腫瘍接種領域を示している（ａ）。（ｂ、ｃ）図６ａ（図６Ａ）からの腫瘍の凍結切片を、抗ＣＤ３ｅ抗体（赤、ＥＧ７染色）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（青、核染色）で染色し、その後蛍光顕微鏡で分析した（スケールバー、１００μｍ）。白の矢印は、蛍光陽性領域を示している。（ｄ〜ｇ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７を０日目にｓ．ｃ．接種し、Ａｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３、Ａｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３−ＳＰＧ、またはＦＩＴＣ−ＳＰＧを、デキストラン−ＰＥと共に１２日目にｉ．ｖ．投与した。（ｄ〜ｆ）注射１時間後、腫瘍の凍結切片を蛍光顕微鏡で分析した（スケールバー、１００μｍ）。（ｇ）緑、赤またはマージした細胞を計数した（３つの各腫瘍から１０視野）。エラーバーは平均＋ＳＤを表している。アスタリスクは、Ｋ３を注射されたマージ細胞数との有意差を示している。（ｈ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３または４）に、ＥＧ７を０日目にｓ．ｃ．接種し、５日目にクロドロネートリポソームまたはコントロールリポソームをｉ．ｖ．投与した。マウスにＰＢＳ（コントロール）またはＫ３−ＳＰＧを７、９および１１日目に注射した。エラーバーは平均＋ＳＥＭを表している。矢印は治療の時期を示している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図５】図５は、腫瘍におけるＦ４／８０陽性細胞がクロドロネートリポソームにより枯渇したことを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７を０日目に接種し、クロドロネートリポソーム（ａ）またはコントロールリポソーム（ｂ）を５日目にｉ．ｖ．投与し、そして、７日目にＡｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置した。処置１時間後、腫瘍の凍結切片を、抗Ｆ４／８０抗体（赤）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（青）で染色し、その後蛍光顕微鏡で分析した（スケールバー、１００μｍ）。
【図６Ａ】図６（Ａ〜Ｂ）は、ＩＬ−１２およびＩＦＮの両方が、腫瘍縮小およびそれらの免疫原性細胞死における潜在的な役割に重要であることを示す。図６Ａは、ａ〜ｆを示す。（ａ〜ｃ）Ｉｌ１２ｐ４０ヘテロノックアウトマウス（ａ）、Ｉｆｎａｒ２ヘテロノックアウトマウス（ｂ）、およびＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウス（ｃ）に、ＥＧ７細胞を０日目にｓ．ｃ．接種し、これらのマウスを７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置した。エラーバーは平均＋ＳＥＭを表している（ｎ＝４）。矢印は治療の時期を示している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｄ、ｆ）Ｒａｇ２ヘテロおよびノックアウトならびにＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウスに、ＥＧ７細胞を０日目に接種し、Ｋ３−ＳＰＧで３回（７、９および１１日目、黒の矢印）、６回（７、９、１１、１４、１６、１８日目、グレーの矢印）、または０回（コントロール）ｉ．ｖ．処置した。（ｅ）拡大図は４日目から２１日目を示している。
【図６Ｂ】図６（Ａ〜Ｂ）は、ＩＬ−１２およびＩＦＮの両方が、腫瘍縮小およびそれらの免疫原性細胞死における潜在的な役割に重要であることを示す。図６Ｂは、ｇ〜ｋを示す。（ｇ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウスに、ＥＧ７細胞を０日目にｓ．ｃ．接種し、マウスを７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置し、その後、１２日目に屠殺した。脾細胞を回収して抗ＣＤ４５抗体で染色し、その後、その細胞をフローサイトメトリーで分析した。（ｈ）散布図は、ＣＤ４５陰性細胞集団を示している。エラーバーは平均＋ＳＥＭを表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｉ）ＣＤ４５陰性集団を、死細胞の染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２およびＰＩで染色し、その後フローサイトメトリーで分析した。棒グラフは、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、およびＣＤ４５陰性生細胞の集団を示している。エラーバーは平均＋ＳＤを表している（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｊ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＰＢＳまたはＣＤ４５陰性細胞で免疫化した。免疫化７日後、マウスにＥＧ７細胞を０日目にｓ．ｃ．接種し、腫瘍サイズを次の２５日間測定した（ｎ＝３）。エラーバーは平均＋ＳＥＭを表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。（ｋ）２５日目の腫瘍体積およびＯＶＡ２５７〜２６４特異的テトラマー＋ＣＤ８Ｔ細胞の数を、棒グラフおよび散布論文図によってそれぞれ表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図７】図７は、ＩＦＮ−βを腫瘍微小環境において検出したことを示す。（ａ）ＩＦＮ−βＧＦＰマウスに、ＥＧ７を０日目に接種し、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｄ．またはｉ．ｖ．処置した。接種１２日後、腫瘍を回収して、凍結切片を、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１６９抗体、抗Ｆ４／８０抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体（赤）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（青）で染色し、その後蛍光顕微鏡で分析した（スケールバー、１００μｍ）。（ｂ）ＩＦＮ−β陽性細胞を計数した（３つの各腫瘍から１０視野）。エラーバーは平均＋ＳＤを表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図８】図８は、ＩＬ１２−ｐ４０を腫瘍微小環境において検出したことを示す。（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７を０日目に接種し、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｄ．またはｉ．ｖ．処置した。接種１２日後、腫瘍を回収して、凍結切片を、抗ＩＬ１２−ｐ４０抗体（赤）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（青）で染色し、その後蛍光顕微鏡で分析した（スケールバー、１００μｍ）。（ｂ）ＩＬ１２−ｐ４０陽性細胞を計数した（３つの各腫瘍から１０視野）。エラーバーは平均＋ＳＤを表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図９】図９は、ＣＤ４５陰性細胞が腫瘍細胞に由来するが、宿主細胞に由来しないことを示す。ＧＦＰマウスにＥＧ７細胞を０日目にｓ．ｃ．接種し、そのマウスを、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置し、その後１２日目に屠殺した。脾細胞を回収して、抗ＣＤ４５抗体で染色し、その後細胞をフローサイトメトリーで分析した。
【図１０Ａ】図１０（Ａ〜Ｂ）は、Ｋ３−ＳＰＧ誘発性腫瘍縮小は、Ｉｌ１２、１型ＩＦＮ、Ｂａｔｆ３、ＣＤ８＋ＤＣ、および腫瘍に浸潤する強力な細胞障害性Ｔ細胞を含む自然免疫応答および適応免疫応答の両方を必要とすることを示す。図１０Ａはａ〜ｃを示す。Ｃ５７ＢＬ／６ノックアウトマウス（ａ）、ならびにＢａｔｆ３ヘテロおよびＢａｔｆ３ノックアウトマウス（ｂ）に、ＥＧ７細胞を０日目に接種し、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置した（黒の矢印）。（ａ）ＣＤ８枯渇抗体（２００μｇ／マウス）を、６日目および１３日目に投与した。エラーバーは平均＋ＳＥＭを表している（ｎ＝４）。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。矢印は治療の時期を示している。（ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７を０日目に接種し、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧをｉ．ｄ．またはｉ．ｖ．で処置した。接種１２日後、腫瘍を回収して、凍結切片を抗ＣＤ８β抗体（赤）およびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（青）で染色し、その後蛍光顕微鏡で分析した（スケールバー、１００μｍ）。ＣＤ８β陽性細胞を計数した（３つの各腫瘍から１０視野）。エラーバーは、平均＋ＳＤを表している。＊ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【図１０Ｂ】図１０（Ａ〜Ｂ）は、Ｋ３−ＳＰＧ誘発性腫瘍縮小は、Ｉｌ１２、１型ＩＦＮ、Ｂａｔｆ３、ＣＤ８＋ＤＣ、および腫瘍に浸潤する強力な細胞障害性Ｔ細胞を含む自然免疫応答および適応免疫応答の両方を必要とすることを示す。図１０Ｂはｄ〜ｅを示す。（ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６（ＷＴ）マウスおよびＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスに、ＥＧ７細胞を０日目に接種し、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置した。Ｋ３−ＳＰＧまたはＰＢＳのいずれかを注射された腫瘍保有マウス由来のＣＤ８α＋Ｔ細胞を、１４日目にＸｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＤｉＲ（登録商標）で染色して移し（ｉ．ｖ．）、その後、１５日目にマウスをＩＶＩＳで分析した。（Ｉ、ＩＩ）レシピエントマウス：Ｋ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置されたＥＧ７保有ＷＴマウス。マウスは、Ｋ３−ＳＰＧ処置されたＣＤ８α＋Ｔ細胞が移されるか（Ｉ）、または処置されていないＣＤ８α＋Ｔ細胞を移される（ＩＩ）。（ｅ）（Ｉ、ＩＩ）レシピエントマウス：処置されていないＥＧ７保有ＷＴマウス（Ｉ）およびＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置されたＤＫＯマウス。マウスは、Ｋ３−ＳＰＧ処置されたＣＤ８α＋Ｔ細胞を移された（Ｉ、ＩＩ）。
【図１１】図１１は、実験系の模式論文図を示す。ＷＴマウスおよびＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２  ＤＫＯマウスに、ＥＧ７細胞を０日目に接種し、７、９および１１日目にＫ３−ＳＰＧまたはＰＢＳでｉ．ｖ．処置した。１４日目に、ＣＤ８α＋Ｔ細胞を、これらのマウスの脾臓から精製して、Ｘｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＤｉＲ（登録商標）で標識し、そして、Ｋ３−ＳＰＧ処置（７、９および１１日目）された別のＥＧ７保有マウスに移し（接種１４日後）、その後Ｘｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＤｉＲ（登録商標）で標識されたＣＤ８Ｔ細胞の分布を、１５日目にＩＶＩＳで分析した。
【図１２】図１２は、Ｋ３−ＳＰＧ処置の戦略を示す。Ｋ３−ＳＰＧは、血流を介して腫瘍微小環境を標的とした。そして、Ｋ３−ＳＰＧは食細胞を標的とし、これらの細胞を活性化した。腫瘍微小環境において、ＩＦＮおよびＩＬ−１２は、Ｋ３−ＳＰＧ処置によって誘発された。そして、抗原を、リンパ流および血流を介して放出した。この抗原の提示が強力な腫瘍特異的ＣＴＬを誘発した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２７】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００２８】
本発明は、Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸（ｄＡ）を含む、オリゴデオキシヌクレオチド（以下、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと称する。）を提供するものである。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにはリン酸ジエステル結合が修飾（例えば、一部又は全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合により置換）されているものを含む。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩を含む。
【００２９】
本明細書において「ＣｐＧオリゴヌクレオチド（残基）」または「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（残基）」、「ＣｐＧ  ＯＤＮ（残基）」あるいは単に「ＣｐＧ（残基）」とは、交換可能に使用され、少なくとも１つのメチル化されていないＣＧジヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド、好ましくは、オリゴヌクレオチドをいい、末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義である。少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣｐＧモチーフを含み得る。本明細書中で使用される場合、句「ＣｐＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドと、それに続くグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのメチル化されていないジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸（残基）は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
【００３０】
ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性のＣｐＧモチーフを含有する、短い（約２０塩基対）、一本鎖の合成ＤＮＡ断片であって、Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）の強力なアゴニストであり、樹状細胞（ＤＣｓ）およびＢ細胞を活性化して、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮｓ）および炎症性サイトカインを産生させ（Ｈｅｍｍｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−７４５  （２０００）；Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５，４７１−４８４  （２００６）．）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を含む、Ｔｈ１型の液性および細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する（Ｂｒａｚｏｌｏｔ  Ｍｉｌｌａｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．，Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｓｉｅｇｒｉｓｔ，Ｃ．Ａ．＆  Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９５，１５５５３−１５５５８  （１９９８）．；Ｃｈｕ，Ｒ．Ｓ．，Ｔａｒｇｏｎｉ，Ｏ．Ｓ．，Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｐ．Ｖ．＆  Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｃ．Ｖ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８６，１６２３−１６３１  （１９９７））。そこで、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染症、癌、喘息および花粉症に対して可能性のある免疫療法剤とみなされてきた（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５，４７１−４８４  （２００６）；Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４，２４９−２５８  （２００４））。
【００３１】
ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、免疫賦活性の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有する一本鎖ＤＮＡであり、ＴＬＲ９のアゴニストである。ＣｐＧ  ＯＤＮには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、Ｋ型（Ｂ型とも呼ばれる）、Ｄ型（Ａ型とも呼ばれる）、Ｃ型及びＰ型の４つの型がある（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ６１，１９５−２０４  （２００９））。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、これらのうちＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮを含む。
【００３２】
Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、典型的には非回文構造の、複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを含有し、Ｂ細胞を活性化してＩＬ−６を産生させるが、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣｓ）のＩＦＮ−α産生をほとんど誘導しないという構造的及び機能的特性を有するＣｐＧ  ＯＤＮである。非メチル化ＣｐＧモチーフとは少なくとも１つのシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）配列を含む短いヌクレオチド配列であって、該シトシン−グアニン配列におけるシトシンの５位がメチル化されていないものを差す。なお、以下の説明において、ＣｐＧとは、特にことわらなり限り非メチル化ＣｐＧを意味する。従って、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮを含むことにより、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）を有する。当該技術分野において多数のヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６６，２３７２−２３７７  （２００１）；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４，９４４−９５３  （２０００）；ＵＳ  ８，０３０，２８５Ｂ２）。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、好ましくはヒト化されている。「ヒト化」とは、ヒトＴＬＲ９に対するアゴニスト活性を有することを意味する。従って、ヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮを含む本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒトに対してＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、ヒトＢ細胞を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）を有する。本発明において好適に用いられるＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、１０ヌクレオチド以上の長さであり、且つ式：
【００３３】
0006536964.tif 000002
（式中、中央のＣｐＧモチーフはメチル化されておらず、ＷはＡ又はＴであり、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５及びＮ６はいかなるヌクレオチドであってもよい）で表されるヌクレオチド配列を含む。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明のＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは１０ヌクレオチド以上の長さであり、上記式のヌクレオチド配列を含む。但し、上記式中、中央の４塩基のＣｐＧモチーフ（ＴＣｐＧＷ）は１０ヌクレオチド中に含まれていれば良く、必ずしも上記式中、Ｎ３及びＮ４の間に位置する必要はない。また、上記式中、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５及びＮ６はいかなるヌクレオチドであっても良く、Ｎ１及びＮ２、Ｎ２及びＮ３、Ｎ３及びＮ４、Ｎ４及びＮ５、並びにＮ５及びＮ６の少なくともいずれか一つ（好ましくは一つ）の組み合わせは２塩基のＣｐＧモチーフであっても良い。前記４塩基のＣｐＧモチーフがＮ３及びＮ４の間に位置しない場合、上記式中、中央の４塩基（４〜７番目の塩基）中の連続するいずれかの２塩基がＣｐＧモチーフであり、他の２つの塩基はいかなるヌクレオチドであっても良い。
【００３５】
本発明においてより好適に用いられるＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは１つまたは複数のＣｐＧモチーフを含む非回文構造を含有する。更に好適に用いられるＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは１つまたは複数のＣｐＧモチーフを含む非回文構造からなる。
【００３６】
ヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、一般的に、ＴＣＧＡ又はＴＣＧＴからなる４塩基のＣｐＧモチーフを特徴とする。また、多くのケースにおいて、一つのヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ中にこの４塩基のＣｐＧモチーフが２又は３個含まれる。従って、好ましい実施形態において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、少なくとも１個、より好ましくは２以上、更に好ましくは２又は３個、ＴＣＧＡ又はＴＣＧＴからなる４塩基のＣｐＧモチーフを含む。該Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮが２又は３個の４塩基のＣｐＧモチーフを有する場合、これらの４塩基のＣｐＧモチーフは同一であっても異なっていてもよい。ただし、ヒトＴＬＲ９に対するアゴニスト活性を有する限り、特に限定されない。
【００３７】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮは、より好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮの長さは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、好ましくは１００ヌクレオチド長以下（例えば、１０−７５ヌクレオチド長）である。Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮの長さは、より好ましくは５０ヌクレオチド長以下（例えば、１０−４０ヌクレオチド長）である。Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮの長さは、更に好ましくは３０ヌクレオチド長以下（例えば、１０−２５ヌクレオチド長）である。Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮの長さは、最も好ましくは、１２−２５ヌクレオチド長である。
【００３９】
ポリデオキシアデニル酸（ｄＡ）の長さは、β−１，３−グルカン（好ましくは、レンチナン、又はシゾフィラン）鎖とともに三重螺旋構造を形成するのに十分な長さであれば特に限定されるものではないが、安定な三重螺旋構造を形成する観点からは、通常２０ヌクレオチド長以上、好ましくは４０ヌクレオチド長以上、より好ましくは６０ヌクレオチド長以上である。ポリｄＡは、長ければ長いほどβ−１，３−グルカンと安定な三重螺旋構造を形成するので、理論的には上限はないが、長すぎると、オリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さにバラつきが生じる原因となるので、通常、１００ヌクレオチド長以下、好ましくは８０以下である。一方、前記安定な三重螺旋構造の形成に加え、単位量のβ−１，３−グルカンあたりに結合する本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量を増大させ、且つオリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さのばらつきの回避、複合化効率の観点からは、ポリｄＡの長さは、好ましくは、２０〜６０ヌクレオチド長（具体的には、２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９又は６０ヌクレオチド長）、より好ましくは、３０〜５０ヌクレオチド長（３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０ヌクレオチド長）１８、最も好ましくは、３０〜４５ヌクレオチド長（３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５ヌクレオチド長）である。特に、３０ヌクレオチド長以上の場合、良好な複合化効率を示す。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリｄＡを含むことにより、２本のシゾフィラン鎖とともに三重螺旋構造を形成する活性を有する。なお、ポリデオキシアデニル酸を「ポリ（ｄＡ）」又は「ｐｏｌｙ（ｄＡ）」と表記することもある。
【００４０】
１分子の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、複数個のＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮ及び／又はポリｄＡが含まれていてもよいが、好ましくは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ及ポリｄＡが１つずつ含まれ、最も好ましくは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ及ポリｄＡが１つずつからなる。
【００４１】
例示的なＣｐＧの配列としては、Ｋ３  ＣｐＧ（配列番号１＝５’−ａｔｃｇａｃｔｃｔｃｇａｇｃｇｔｔｃｔｃ−３’）等を挙げることができるがこれに限定されない。
【００４２】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリｄＡがＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮの３’側に配置されていることを特徴とする。この配置により、本発明の複合体（詳細は下に述べる）が、抗がん作用も増強される可能性があるものと思われるがこれらに限定されず、抗がん剤としてはいずれに結合させてもよい。
【００４３】
Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮとポリｄＡとは、直接共有結合により連結されていてもよいし、スペーサー配列を介して連結されていてもよい。スペーサー配列とは、２つの近接した構成要素の間に挿入される１以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を意味する。スペーサー配列の長さは、本発明の複合体が、免疫賦活活性（好ましくはＢ細胞を活性化してＩＬ−６を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、通常１〜１０ヌクレオチド長、好ましくは１〜５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜３ヌクレオチド長である。最も好ましくは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮとポリｄＡとが、直接共有結合により連結される。
【００４４】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ、ポリｄＡ及び任意的なスペーサー配列に加え、その５’末端及び／又は３’末端に付加的なヌクレオチド配列を有していてもよい。該付加的なヌクレオチド配列の長さは、本発明の複合体が免疫賦活活性（好ましくはＢ細胞を活性化してＩＬ−６を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）を有する限り、特に限定されないが、通常１〜１０ヌクレオチド長、好ましくは１〜５ヌクレオチド長、より好ましくは１〜３ヌクレオチド長である。
【００４５】
好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、このような５’末端及び／又は３’末端の付加的なヌクレオチド配列を含まない。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ、ポリｄＡ及び任意的なスペーサー配列からなり、更に好ましくは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ及びポリｄＡからなる。
【００４６】
最も好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ（具体的には、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチド）及びポリｄＡからなり、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮが該オリゴデオキシヌクレオチドの５’末端に、ポリｄＡが３’末端に、それぞれ位置する。具体的には、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの３’末端に２０〜６０ヌクレオチド長（より好ましくは、３０〜５０ヌクレオチド長（３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０ヌクレオチド長）、最も好ましくは、３０〜４５ヌクレオチド長（３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５ヌクレオチド長））のポリｄＡが結合したオリゴデオキシヌクレオチドであり、例えば、配列番号２、又は９〜１２で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドである。
【００４７】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの全長は、通常３０〜２００ヌクレオチド長、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド長、より好ましくは４０〜８０ヌクレオチド長（具体的には、４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９又は８０ヌクレオチド長）、より好ましくは、５０〜７０ヌクレオチド長（具体的には、５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０ヌクレオチド長）、最も好ましくは、５０〜６５ヌクレオチド長（具体的には、５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５ヌクレオチド長）である。  本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、インビボにおける分解（例、エクソ又はエンドヌクレアーゼによる分解）に対して抵抗性となるように適切に修飾されていてもよい。好ましくは、該改変はホスホロチオエート修飾又はホスホロジチオエート修飾を含む。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合により置換されている。
【００４８】
好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合の修飾を含み、より好ましくは、リン酸ジエステル結合の修飾は、ホスホロチオエート結合（即ち、ＷＯ  ９５／２６２０４に記載されているように、非架橋酸素原子のうちの１つが、硫黄原子に置換される）である。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合により置換されている。
【００４９】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合による修飾を含み、より好ましくは、該Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、ポリｄＡにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含み、より好ましくは、該ポリｄＡのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。更に好ましくは、本発明のヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含むオリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。最も好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例、配列番号１）の３’末端に２０〜６０ヌクレオチド長（より好ましくは、３０〜５０ヌクレオチド長（３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０ヌクレオチド長）、最も好ましくは、３０〜４５ヌクレオチド長（３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５ヌクレオチド長））のポリｄＡが結合したオリゴデオキシヌクレオチドであって、当該オリゴデオキシヌクレオチドに含まれる全てのリン酸ジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に置換されている。ホスホロチオエート結合により、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、分解に対する抵抗性のみならず、免疫賦活活性（例えば、ｐＤＣを活性化させてＩＦＮ−αを産生させる活性）の増強、及びＣｐＧ−β−１，３−グルカン複合体の高収率、ならびに抗がん活性の増強が期待されるからである。なお、本明細書におけるホスホロチオエート結合はホスホロチオエート骨格と、リン酸ジエステル結合はリン酸骨格と同義である。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドには、上記オリゴデオキシヌクレオチドのあらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、またはそのようなエステルの塩類を含む。
【００５０】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの薬学的に許容可能な塩類としては、好適にはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩等の金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリ−ルスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマ−ル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；及び、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩を挙げることができる。
【００５１】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、１本鎖、２本鎖、３本鎖のいずれの形態でもよいが、好ましくは１本鎖である。
【００５２】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離されたオリゴデオキシヌクレオチド」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とするオリゴデオキシヌクレオチド重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上である。
【００５３】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、優れた免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）を有するので、免疫賦活剤等として有用である。更に、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、２本のβ−１，３−グルカン（好ましくは、シゾフィラン、レンチナン又はスクレログルカン）とともに三重螺旋構造を形成する性質を有するので、本発明の複合体の調製に有用である。
【００５４】
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−１，３−グルカンを含有する複合体（以下、本発明の複合体と称する。）を提供するものである。
【００５５】
上述の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮを含むので、それ単独では、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）を発揮し、Ｄ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）に乏しい。しかしながら、驚くべきことに、β−１，３−グルカン（好ましくは、レンチナン、シゾフィラン）と複合体を形成することにより、Ｄ型ＣｐＧ  ＯＤＮの配列を要することなく、Ｄ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）を獲得する。即ち、本発明の複合体は、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）と、Ｄ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）の両方を有する。本発明で用いられるβ−１，３−グルカンとしては、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、レンチナン、ラミナラン等を挙げることが出来る。β−１，３−グルカンは、好ましくは、シゾフィラン、レンチナンまたはスクレログルカンのように、１，６−グルコピラノシド分枝を多く含有する（側鎖率３３〜４０％）β−１，３−グルカンであり、より好ましくはシゾフィランである。
【００５６】
レンチナン（ＬＮＴ）は、シイタケ由来の公知のβ−１，３−１，６−グルカンであり、分子式は（Ｃ６Ｈ１００５）ｎ、分子量は約３０〜７０万である。水、メタノール、エタノール（９５）、又はアセトンにはほとんど溶けないが、極性有機溶媒であるＤＭＳＯや水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。
【００５７】
レンチナンは活性化マクロファージ、キラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞及び抗体依存性マクロファージ仲介性細胞障害作用（ＡＤＭＣ）活性の増強作用を有する（Ｈａｍｕｒｏ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３９，５５１−５５９，１９８０、Ｈａｍｕｒｏ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２，１７１，１９８０、Ｈｅｒｌｙｎ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｇａｎｎ，７６，３７−４２，１９８５）。動物実験においては同系腫瘍及び自家腫瘍に対して化学療法剤との併用投与により腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。また、レンチナンの単独投与によっても腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。臨床試験においては手術不能又は再発胃癌患者に対して、テガフール経口投与との併用により生存期間の延長が認められ（医薬品インタビューフォーム「レンチナン静注用１ｍｇ「味の素」」）、本邦で承認されている。レンチナンの単独投与による効果は現在のところ確認されていない。
【００５８】
シゾフィラン（ＳＰＧ）は、スエヒロタケ由来の公知の可溶性β−グルカンである。ＳＰＧは、β−（１→３）−Ｄ−グルカンの主鎖と、各３個のグルコース当り１個のβ−（１→６）−Ｄ−グルコシル側鎖からなる（Ｔａｂａｔａ，Ｋ．，Ｉｔｏ，Ｗ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｔ．，Ｋａｗａｂａｔａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｍｉｓａｋｉ  Ａ．，「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．」，１９８１，８９，１，ｐ．１２１−１３５）。ＳＰＧは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として２０年以上の使用実績があり（清水，陳，荷見，増淵，「Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ」，１９９０，４，ｐ．１３９０長谷川，「Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」，１９９２，８，ｐ．２２５）、生体内での安全性が確認されている（Ｔｈｅｒｅｓａ，Ｍ．ＭｃＩｎｔｉｒｅ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ，Ａ．Ｂｒａｎｔ，「Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」，１９９８，１２０，ｐ．６９０９）。
【００５９】
本明細書において「複合体」とは、複数の分子が、静電結合、ファンデルワールス結合、水素結合、疎水性相互作用などの非共有結合又は共有結合を介して会合することにより得られる産物を意味する。
【００６０】
本発明の複合体は、好ましくは、三重螺旋構造状である。好ましい態様において、当該三重螺旋構造を形成する３本の鎖のうち、２本はβ−１，３−グルカン鎖であり、１本は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖である。なお、当該複合体は一部に、三重螺旋構造を形成していない部分を含んでいても良い。
【００６１】
本発明の複合体における、オリゴデオキシヌクレオチドとβ−１，３−グルカンの組成比は、オリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖長、及びβ−１，３−グルカンの長さ等に応じて、変化しうる。例えば、β−１，３−グルカン鎖と、ポリデオキシアデニル酸の鎖の長さが同等の場合には、２本のβ−１，３−グルカン鎖と、１本の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドが会合し、三重螺旋構造を形成し得る。一般的には、β−１，３−グルカン鎖に対して、ポリデオキシアデニル酸の鎖長は短いので、２本のβ−１，３−グルカン鎖に対して、複数の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸を介して会合し、三重螺旋構造を形成し得る（図１参照）。
【００６２】
本発明の複合体は、ヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ及びβ−１，３−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン）を含有する複合体であり、好ましくは、ヒト化Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ及びβ−１，３−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン）からなる複合体である。より好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に２０〜６０ヌクレオチド長（具体的には、２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９又は６０ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−１，３−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（例、Ｋ３−ｄＡ２０〜６０−ＬＮＴ、Ｋ３−ｄＡ２０〜６０−ＳＰＧ）であり、更に好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に３０〜５０ヌクレオチド長（具体的には、３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−１，３−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（例、Ｋ３−ｄＡ３０〜５０−ＬＮＴ、Ｋ３−ｄＡ３０〜５０−ＳＰＧ）であり、最も好ましくは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に３０〜４５ヌクレオチド長（具体的には、３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５ヌクレオチド長）のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ−１，３−グルカン（例、レンチナン、シゾフィラン）からなる複合体（Ｋ３−ｄＡ３０〜４５−ＬＮＴ、Ｋ３−ｄＡ３０〜４５−ＳＰＧ）である。
【００６３】
本発明の複合体の調製方法に関しては、非特許文献２１〜２４や、特開２００８−１００９１９号公報に記載された条件と同様に行うことができる。すなわち、本来は、天然で三重螺旋構造として存在するβ−１，３−グルカンを非プロトン性有機極性溶媒（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），アセトニトリル，アセトン等）またはアルカリ水溶液（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等）に溶解して一本鎖に解く。このようにして得られた一本鎖のβ−１，３−グルカンの溶液と本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの溶液（水溶液、中性付近のｐＨの緩衝水溶液、又は酸性の緩衝水溶液、好ましくは、水溶液又は中性付近のｐＨの緩衝水溶液）とを混合し、必要に応じて再度ｐＨを中性付近に調整後、適当時間保持する、例えば、５℃で一夜保持する。その結果、２本のβ−１，３−グルカン鎖と該オリゴデオキシヌクレオチド中のポリｄＡ鎖が三重螺旋構造を形成することにより、本発明の複合体が形成される。生成した複合体に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製、限外濾過、透析等を行うことにより、複合体未形成のオリゴデオキシヌクレオチドを除くことができる。また、生成した複合体に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことにより、複合体未形成のβ−１，３−グルカンを除くことができる。上記の方法により、複合体を適宜精製することができる。
【００６４】
本発明の複合体の形成は、例えばＣＤ（円偏光二色性）スペクトルによるコンフォメーション変化、サイズ排除クロマトグラフィーによるＵＶ吸収シフト、ゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動、キャピラリー電気泳動を測定することにより確認することができるが、これに限らない。
【００６５】
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドとβ−１，３−グルカンとの混合比は、ポリｄＡ鎖の長さ等を考慮して適宜設定することができるが、通常モル比（ＳＰＧ／ＯＤＮ）が０．０２〜２．０、好ましくは０．１〜０．５である。更なる態様において、モル比（β−１，３−グルカン（ＬＮＴ等）／ＯＤＮ）が例えば０．００５〜１．０、好ましくは０．０２０〜０．２５である。
【００６６】
本発明の複合体の調製方法についてＣｐＧ−ＯＤＮとＬＮＴ複合体を例に説明する。ＬＮＴを０．０５〜２Ｎ、好ましくは０．１〜１．５Ｎのアルカリ水溶液（例えば、０．２５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液）に溶解させ、１℃〜４０℃で１０時間〜４日間放置し（例えば、室温で一晩放置する）、一本鎖のＬＮＴ水溶液（例えば、５０ｍｇ／ｍｌのＬＮＴ水溶液）を調製する。前記ＬＮＴ水溶液と別途調製したＣｐＧ水溶液（例えば、１００μＭのＣｐＧ水溶液）をモル比（ＬＮＴ／ＯＤＮ）０．００５〜１．０で混合し、続いて、前記ＬＮＴ水溶液に酸性の緩衝水溶液（例えば、ＮａＨ２ＰＯ４）を加えて中和し、１〜４０℃で６時間〜４日間（例えば、４℃で一晩）維持することで複合化を完了させる。なお、前記複合化のためにＬＮＴ水溶液を最後に加え混合しても良い。複合体の形成は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、ＣｐＧ  ＯＤＮの高分子量側へのシフトを２４０〜２８０ｎｍ（例えば、２６０ｎｍ）における吸収をモニタリングすることによって確認することができる。
【００６７】
一態様において、本発明の複合体は、竿状の粒子の形態を呈する。粒子径は、材料として用いるβ−１，３−グルカン（例、シゾフィラン）が天然で三重螺旋構造を呈することにより形成する粒子の径と同等であり、通常平均粒子径が１０−１００ｎｍ、好ましくは２０−５０ｎｍである。該粒子径は、複合体を水に溶解し、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｚｅｔａ  Ｓｉｚｅｒを用いて８０℃の条件で動的光散乱法により計測することができる。
【００６８】
本発明の複合体は、好ましくは単離されている。「単離された複合体」の純度（評価対象物の総重量に占める目的とする複合体重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上である。
【００６９】
さらに、本発明の複合体は、抗がん活性のほか、優れた免疫賦活活性を有し、特に、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、Ｂ細胞（好ましくは、ヒトＢ細胞）を活性化してＩＬ−６を産生させる活性）と、Ｄ型ＣｐＧ  ＯＤＮに特有の免疫賦活活性（例えば、形質細胞様樹状細胞（好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞）を活性化してＩＦＮ−αを産生させる活性）の両方を有するので、免疫賦活剤等としても効果を付与し得るため有利でありうる。例えば、Ｋ型ＣｐＧ  ＯＤＮ（例えば、配列番号２、１１、１２とＳＰＧを含む複合体及びＫ型ＣｐＧ  ＯＤＮ（例えば、配列番号２）とＳＰＧを含む複合体（Ｋ３−ＳＰＧ）は、炎症応答誘導能（ｐａｎ−ＩＦＮ−ａ、ＩＬ−６等）、ウイルス接種個体における血清中抗原特異的ＩｇＧ抗体価（Ｔｏｔａｌ  ＩｇＧ，ＩｇＧ２ｃ等）の増強作用、ウイルス接種個体における抗原特異的サイトカイン産生能（ＩＦＮ−γ，ＩＬ２等）、ウイルスに対する感染防御効果を奏するものとしても有利でありうる。
【００７０】
（医薬組成物）
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体と薬理学的に許容され得る担体を含む。また、本医薬組成物は抗原を更に含んでいても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
【００７１】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のｐＨは５〜１０が挙げられ、好ましくは６〜８である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
【００７２】
また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の粉末製剤を調製することもできる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水性溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
【００７３】
医薬組成物中の本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１〜１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、有効成分として、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を単独で含有していてもよく、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を他の有効成分と組み合わせて含有していてもよい。
【００７５】
（医薬用途）
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体は、単独で抗がん作用を有することが見出された。このような効果は、アジュバント剤として開発されてきた本発明の特性からは予想外の効果であるといえる。それゆえ、これまでのアジュバントとしての使用のされ方、すなわち、がん抗原とともに投与することを必要とすることなく、しかも、特定のがん種に限定されることなく、汎用的な抗がん剤として身体にマイルドに作用する抗がん剤が提供されることになる。また、免疫賦活活性ももちろん有することから、他の疾患に対する免役賦活活性も期待され、体力の弱ったがん患者に対して相乗的な効果を有することも期待される。
【００７６】
抗がん作用に加え、本発明は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体又は医薬組成物を哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、Ｄ型ＣｐＧ  ＯＤＮの活性特性を有し、末梢血単核球を刺激して、Ｉ型インターフェロン（Ｐａｎ−ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−α２等）及びＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の両方を大量に産生させるので、Ｉ型インターフェロン産生誘導剤、ＩＩ型インターフェロン産生誘導剤、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン産生誘導剤として有用である。Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンの両方の産生を誘導することから、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、Ｉ型及びＩＩ型インターフェロンのいずれか一方又は両方が有効な疾患の予防又は治療に有用である。
【００７７】
医薬用途の実現方法としては、例えば（ａ）本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、又は本発明の複合体を含む組成物を、癌の患者または癌に罹患する可能性のあるヒトに投与することにより、該投与を受けた対象中の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を抗原特異的に活性化させ、直接的に（単剤効果として）癌を予防・治療することができる。
【００７８】
本明細書において「被験体（者）」とは、本発明の診断または検出、あるいは治療等の対象となる対象（例えば、ヒト等の生物または生物から取り出した細胞、血液、血清等）をいう。
【００７９】
本明細書において「薬剤」、「剤」または「因子」（いずれも英語ではａｇｅｎｔに相当する）は、広義には、交換可能に使用され、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８０】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害（例えば、がん、アレルギー）について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消退させることをいい、患者の疾患、もしくは疾患に伴う１つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。事前に診断を行って適切な治療を行うことは「コンパニオン治療」といい、そのための診断薬を「コンパニオン診断薬」ということがある。
【００８１】
本明細書において「治療薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、がん、アレルギー等の疾患など）を治療できるあらゆる薬剤をいう。本発明の一実施形態において「治療薬」は、有効成分と、薬理学的に許容される１つもしくはそれ以上の担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、例えば有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また治療薬は、治療のために用いられる物であれば使用形態は限定されず、有効成分単独であってもよいし、有効成分と任意の成分との混合物であってもよい。また上記担体の形状は特に限定されず、例えば、固体または液体（例えば、緩衝液）であってもよい。なおがん、アレルギー等の治療薬は、がん、アレルギー等の予防のために用いられる薬物（予防薬）、またはがん、アレルギー等の抑制剤を含む。
【００８２】
本明細書において「予防」とは、ある疾患または障害（例えば、アレルギー）について、そのような状態になる前に、そのような状態にならないようにすることをいう。本発明の薬剤を用いて、診断を行い、必要に応じて本発明の薬剤を用いて例えば、アレルギー等の予防をするか、あるいは予防のための対策を講じることができる。
【００８３】
本明細書において「予防薬（剤）」とは、広義には、目的の状態（例えば、アレルギー等の疾患など）を予防できるあらゆる薬剤をいう。
【００８４】
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬、抗体、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、検査薬、診断薬、治療薬をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、検査薬、診断薬、治療薬、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【００８５】
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を医師または他の使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の検出方法、診断薬の使い方、または医薬などを投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、経口、食道への投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００８６】
（好ましい実施形態の態様）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００８７】
＜単剤形態＞
１つの局面では、本発明は、（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、（ｂ）β―１，３−グルカンとを含む、複合体を含む抗がん剤を提供する。本発明では、本発明の複合体自体が抗がん剤として作用することを見出した。従来は、この複合体は、アジュバントとして用いられることを本発明者らが見出し出願したにすぎず、直接、単剤として抗がん剤として用いることができるとは予想していなかった。したがって、がん抗原なしで使用されるという点で予想外の効果をもたらすといえる。
【００８８】
１つの実施形態では、本発明の抗がん剤は、がん抗原なしで投与されることを特徴とする。
【００８９】
別の実施形態では、本発明の抗がん剤は、細網内皮系および／またはリンパ節に送達されるように投与されることを特徴とする。好ましくは、前記細網内皮系および／またはリンパ節は、腫瘍および貪食細胞を含む。例示的には、前記細網内皮系は脾臓および／または肝臓を含む。したがって、本発明の抗がん剤は、腫瘍および貪食細胞を含む細網内皮系臓器（脾臓、肝臓など）および／またはリンパ節に送達されるように投与されることを特徴とする。理論に束縛されることを望まないが、本発明の複合体は、腫瘍および貪食細胞に送達され、そこで、がんの死細胞を細網内皮系臓器（脾臓、肝臓など）にリクルートすることが示された。これにより、身体内のがん細胞をさらに駆逐することができると考えられる。したがって、本発明は、アジュバントとして特定のがん抗原を用いて特定のがんに対するのではなく、身体内に存在する任意のがん細胞を殺傷し得るということができ、従来にない抗がん剤を提供することができる、という点で顕著な効果をもたらすといえる。
【００９０】
したがって、より好ましい実施形態では、本発明の前記抗がん剤は、がん抗原なしで、腫瘍および貪食細胞に送達されるように投与されることを特徴とする。
【００９１】
このような送達手法は、任意の手法を用いることができ、例えば、前記投与は全身性投与を挙げることができるがこれに限定されない。好ましくは全身性投与であり、全身性投与としては、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与等を挙げることができる。
【００９２】
１つの実施形態では、本発明で用いられるオリゴデオキシヌクレオチドはＫ３（配列番号１）、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、ｄＡ４０−Ｋ３（配列番号３）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００９３】
１つの実施形態では、本発明で用いられるβ―１，３−グルカンはシゾフィラン（ＳＰＧ）、レンチナン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン等であってもよい。
【００９４】
好ましい実施形態では、本発明の複合体は、Ｋ３−ＳＰＧまたはその類似体である。ここで、類自体とは、ＣｐＧ側で構造がＫ３に類似するもの、βグルカン側で構造がＳＰＧに類似するもの等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００９５】
なお、抗がん作用は、種々の機構によることから、がんの死細胞を脾臓に集積させるため等の用途は容易に思いつくものではない。特に、全身性投与において、腫瘍に集積し、死んだ腫瘍細胞を脾臓などの組織に集積させるための、用途は思いつくものではない。また、インターロイキン１２（ＩＬ１２）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）αの発現またはその促進効果もまた、抗がん作用とは異なる機構によるものであり、インターロイキン１２（ＩＬ１２）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）αの発現またはその促進は抗がん以外でも発揮し得ることから、相互に容易に思いつくものではない。したがって、本発明のＣｐＧ−βグルカン複合体の各用途（抗がん用途（単剤での）、がんの死細胞を脾臓に集積させる用途、インターロイキン１２（ＩＬ１２）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）αの発現またはその促進のための用途）は、相互に容易に想到し得たとは言えない関係にあるといえる。
【００９６】
＜細網内皮系（脾臓および／または肝臓を含む）および／またはリンパ節集積剤＞
別の局面において、本発明は、（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、（ｂ）β―１，３−グルカンとを含む、複合体を含む、がんの死細胞を細網内皮系（脾臓および／または肝臓を含む）および／またはリンパ節に集積させるための組成物を提供する。理論に束縛されることを望まないが、本発明の複合体は、がんの死細胞を細網内皮系（脾臓および／または肝臓を含む）および／またはリンパ節に集積させることができることを見出した。実施例で例証されているように、Ｋ３−ＳＰＧのような本発明の複合体による処置は、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉの両方に依存する態様で、腫瘍細胞死を誘発することが実証された。このような作用を複合体が有することは従来予想されておらず、その意味で予想外の作用効果が達成されたといえる。すなわち、ＣｐＧが腫瘍微小環境における食細胞に標的化されるというものである。がんの死細胞が細網内皮系（脾臓および／または肝臓を含む）および／またはリンパ節に集積されると、その後、放出された腫瘍死細胞は複数の腫瘍抗原に対する抗腫瘍ＣＴＬを誘発し、身体にあるがん細胞が散弾銃で攻撃されるかのように殺傷され、根治させることも可能である。理論に束縛されることを望まないが、腫瘍微小環境におけるＩＬ１２およびＩＦＮ−Ｉサイトカインの両方を産生することは、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療に必須とまではいえないが、重要である。
【００９７】
１つの実施形態では、本発明で用いられるオリゴデオキシヌクレオチドはＫ３（配列番号１）、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、ｄＡ４０−Ｋ３（配列番号３）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）からなる群より選択される。
【００９８】
別の実施形態では、本発明で用いられるβ―１，３−グルカンはシゾフィラン（ＳＰＧ）、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホランおよびラミナランからなる群より選択される。
【００９９】
好ましい実施形態では、本発明の複合体は、Ｋ３−ＳＰＧである。
【０１００】
１つの実施形態では、本発明の組成物が対象とする細網内皮系および／またはリンパ節は、腫瘍および貪食細胞を含む。例示的には、前記細網内皮系は脾臓および／または肝臓を含む。したがって、本発明の組成物は、腫瘍および貪食細胞を含む細網内皮系臓器（脾臓、肝臓など）および／またはリンパ節に送達されるように投与されることを特徴とする。理論に束縛されることを望まないが、本発明の複合体は、腫瘍および貪食細胞に送達され、そこで、がんの死細胞を細網内皮系臓器（脾臓、肝臓など）にリクルートすることが示された。これにより、身体内のがん細胞をさらに駆逐することができると考えられる。したがって、本発明は、アジュバントとして特定のがん抗原を用いて特定のがんに対するのではなく、身体内に存在する任意のがん細胞を殺傷し得るということができ、従来にない抗がん剤を提供することができる、という点で顕著な効果をもたらすといえる。
【０１０１】
したがって、より好ましい実施形態では、本発明の前記抗がん剤は、がん抗原なしで、腫瘍および貪食細胞に送達されるように投与されることを特徴とする。
【０１０２】
このような送達手法は、任意の手法を用いることができ、例えば、前記投与は全身性投与を挙げることができるがこれに限定されない。好ましくは全身性投与であり、全身性投与としては、静脈内投与、腹腔内投与、経口投与、皮下投与、筋肉内投与等を挙げることができる。
【０１０３】
＜ＩＬ１２および／またはＩＦＮ発現促進剤＞
さらに別の局面では、本発明は、（ａ）ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化Ｋ型ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの３’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチドと、（ｂ）β―１，３−グルカンとを含む、インターロイキン１２（ＩＬ１２）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）γの発現またはその促進のための組成物を提供する。腫瘍微小環境におけるＩＬ１２およびＩＦＮ−Ｉサイトカインの両方を産生することは、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療における重要な作用効果であり、このような効果は、抗がん剤としての作用のほか、他の用途においても重要である。そのような処置の対象としては、がんのほか、ウイルスなどの慢性感染症疾患、ウイルス感染予防などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１０４】
１つの実施形態では、本発明で用いられるオリゴデオキシヌクレオチドはＫ３（配列番号１）、Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）、ｄＡ４０−Ｋ３（配列番号３）、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）およびＫ３−ｄＡ３５（配列番号７）からなる群より選択される。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明で用いられるβ―１，３−グルカンはシゾフィラン（ＳＰＧ）、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホランおよびラミナランからなる群より選択される。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明の複合体は、Ｋ３−ＳＰＧである。
【０１０７】
（医薬品、剤型等）
本発明は、上記種々の形態の医薬（治療薬または予防薬）として提供される。
【０１０８】
治療薬の投与経路は、治療に際して効果的なものを使用するのが好ましく、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、または経口投与等であってもよい。投与形態としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤等であってもよい。本発明の成分を投与する場合には、注射剤として用いることが効果的である。注射用の水溶液は、例えば、バイアル、またはステンレス容器で保存してもよい。また注射用の水溶液は、例えば生理食塩水、糖（例えばトレハロース）、ＮａＣｌ、またはＮａＯＨ等を配合してもよい。また治療薬は、例えば、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝液）、安定剤等を配合してもよい。
【０１０９】
一般的に、本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤等は、治療有効量の治療剤または有効成分、および薬学的に許容しうるキャリアもしくは賦形剤を含む。本明細書において「薬学的に許容しうる」は、動物、そしてより詳細にはヒトにおける使用のため、政府の監督官庁に認可されたか、あるいは薬局方または他の一般的に認められる薬局方に列挙されていることを意味する。本明細書において使用される「キャリア」は、治療剤を一緒に投与する、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このようなキャリアは、無菌液体、例えば水および油であることも可能であり、石油、動物、植物または合成起源のものが含まれ、限定されるわけではないが、ピーナツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油等が含まれる。医薬を経口投与する場合は、水が好ましいキャリアである。医薬組成物を静脈内投与する場合は、生理食塩水および水性デキストロースが好ましいキャリアである。好ましくは、生理食塩水溶液、並びに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、注射可能溶液の液体キャリアとして使用される。適切な賦形剤には、軽質無水ケイ酸、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が含まれる。組成物は、望ましい場合、少量の湿潤剤または乳化剤、あるいはｐＨ緩衝剤もまた含有することも可能である。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出配合物等の形を取ることも可能である。伝統的な結合剤およびキャリア、例えばトリグリセリドを用いて、組成物を座薬として配合することも可能である。経口配合物は、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的キャリアを含むことも可能である。適切なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ）に記載される。このような組成物は、患者に適切に投与する形を提供するように、適切な量のキャリアと一緒に、治療有効量の療法剤、好ましくは精製型のものを含有する。配合物は、投与様式に適していなければならない。これらのほか、例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含んでいてもよい。
【０１１０】
本発明の一実施形態において「塩」は、例えば、任意の酸性（例えばカルボキシル）基で形成されるアニオン塩、または任意の塩基性（例えばアミノ）基で形成されるカチオン塩を含む。塩類には無機塩または有機塩を含み、例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９に記載されている塩が含まれる。また例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。本発明の一実施形態において「溶媒和物」は、溶質および溶媒によって形成される化合物である。溶媒和物については例えば、Ｊ．Ｈｏｎｉｇｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｐ６５０  （１９５３）を参照できる。溶媒が水であれば形成される溶媒和物は水和物である。この溶媒は、溶質の生物活性を妨げないものが好ましい。そのような好ましい溶媒の例として、特に限定するものではないが、水、または各種バッファーが挙げられる。本発明の一実施形態において「化学修飾」は、例えば、ＰＥＧもしくはその誘導体による修飾、フルオレセイン修飾、またはビオチン修飾等が挙げられる。
【０１１１】
本発明を医薬として投与する場合、種々の送達（デリバリー）系が知られ、そしてこのような系を用いて、本発明の治療剤を適切な部位（例えば、食道）に投与することも可能であり、このような系には、例えばリポソーム、微小粒子、および微小カプセル中の被包：治療剤（例えば、ポリペプチド）を発現可能な組換え細胞の使用、受容体が仲介するエンドサイトーシスの使用；レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての療法核酸の構築などがある。導入法には、限定されるわけではないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が含まれる。好適な経路いずれによって、例えば注入によって、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば口腔、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって、医薬を投与することも可能であるし、必要に応じてエアロゾル化剤を用いて吸入器または噴霧器を使用しうるし、そして他の生物学的活性剤と一緒に投与することも可能である。投与は全身性または局所であることも可能である。本発明ががんに使用される場合、さらに、がん（病変部）に直接注入する等、適切な経路いずれかによって投与されうる。
【０１１２】
好ましい実施形態において、公知の方法に従って、ヒトへの投与に適応させた医薬組成物として、組成物を配合することができる。このような組成物は注射により投与することができる。代表的には、注射投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤および注射部位での疼痛を和らげるリドカインなどの局所麻酔剤も含むことも可能である。一般的に、成分を別個に供給するか、または単位投薬型中で一緒に混合して供給し、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中、凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として供給することができる。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌薬剤等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンを用いて、分配することも可能である。組成物を注射によって投与しようとする場合、投与前に、成分を混合可能であるように、注射用の無菌水または生理食塩水のアンプルを提供することも可能である。
【０１１３】
本発明の組成物、医薬、治療剤、予防剤を中性型または塩型あるいは他のプロドラッグ（例えば、エステル等）で配合することも可能である。薬学的に許容しうる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する遊離型のカルボキシル基とともに形成されるもの、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離型のアミン基とともに形成されるもの、並びにナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、および水酸化第二鉄などに由来するものが含まれる。
【０１１４】
特定の障害または状態の治療に有効な本発明の治療剤の量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、場合によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、対象臓器等により、適宜選択してもよい。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。悪性腫瘍マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【０１１５】
本発明の一実施形態において「患者」または「被験体」は、ヒト、またはヒトを除く哺乳動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、またはチンパンジー等の１種以上）を含む。
【０１１６】
本発明の医薬組成物または治療剤もしくは予防剤はキットとして提供することができる。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の組成物または医薬の１以上の成分が充填された、１以上の容器を含む、薬剤パックまたはキットを提供する。場合によって、このような容器に付随して、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形で、政府機関による、ヒト投与のための製造、使用または販売の認可を示す情報を示すことも可能である。
【０１１８】
特定の実施形態において、本発明の成分を含む医薬組成物を、リポソーム、微小粒子、または微小カプセルを介して投与することができる。本発明の多様な態様において、このような組成物を用いて、本発明の成分の持続放出を達成することが有用である可能性もある。
【０１１９】
本発明の治療薬、予防薬等の医薬等としての製剤化手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量等の実施形態を決定することができる。
【０１２０】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；  Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．  （１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；  Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２１】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆  Ｈａｌｌ；  Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１２２】
例えば、本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等から市販されるものなど）の使用によって、本発明のオリゴヌクレオチドを合成することも可能である。例えば、Ｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４４８−７４５１）等の使用によって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドを調製することも可能である。
【０１２３】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【０１２４】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１２５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１２６】
以下に実施例を記載する。必要な場合、以下の実施例で用いる動物の取り扱いは、全ての動物実験は、医薬基盤研究所及び大阪大学動物施設の機関ガイドラインに従って実施した。また、ヘルシンキ宣言に基づいて行った。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、和光純薬、ナカライ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＮＣ等）の同等品でも代用可能である。【０１２７】
（製造実施例）
以下のＣｐＧ  ＯＤＮｓは、（株）ジーンデザインで合成された（下線はホスホロチオエート結合を示す）。【０１２８】
【表１】
0006536964.tif 000003
【０１２９】
特に、上記Ｋ３−ｄＡ４０（配列番号２）に加え、Ｋ３−ｄＡ３５（配列番号７）、Ｋ３−ｄＡ３０（配列番号６）、Ｋ３−ｄＡ２５（配列番号５）及び、Ｋ３−ｄＡ２０（配列番号４）の合成（表２）について記載する。【０１３０】
【表２】
0006536964.tif 000004
【０１３１】
（上記配列中のｓは、ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されていることを示す。）【０１３２】
本オリゴデオキシヌクレオチドは、常法である固相ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９０）ｅｄ．Ｇ．Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｇａｉｔ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を用いて合成した。【０１３３】
オブアルブミン（ＯＶＡ）は、生化学工業（株）から購入した。ＤＱ−ＯＶＡ、Ａｌｅｘａ４８８−ＯＶＡ、ＣＦＳＥ、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ザイモザン及びカードランは、ＳＩＧＭＡから購入した。Ｚｙｍｏｓａｎ−ＤｅｐｌｅｔｅｄはＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。クロドロネートリポソームはＦｏｒｍｕＭａｘから購入した。インフルエンザスプリットプロダクトワクチン、ホルマリン不活化全ウイルス（ＷＩＶ）、及び精製インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）は、以前に記載したように調製した（Ｋｏｙａｍａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２，２５ｒａ２４（２０１０））。【０１３４】
ＣｐＧ  ＯＤＮとＳＰＧとの複合体化（製造実施例図１）
７．２２ｍｇのＫ３−ｄＡ４０を水（３．７ｍＬ）に溶解した。ＳＰＧ（三井製糖）１５ｍｇを０．２５Ｎ  ＮａＯＨ（１ｍＬ）に溶解した。１ｍＬの３３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４をＤＮＡ溶液に加え、次にＳＰＧ溶液をＤＮＡ／ＮａＨ２ＰＯ４溶液に加え、４℃にて一晩維持することにより複合体化を完了した。モル比（ＭＳＰＧ／ＭＤＮＡ）は、０．２７に固定した。複合体の形成は、マイクロチップ電気泳動装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ：ＭｕｌｔｉＮＡ）によって確認した複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、ＣｐＧ  ＯＤＮの高分子量側へのシフトを、２６０ｎｍにおける吸収をモニタリングすることによって確認した（Ｓｙｓｔｅｍ：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００ｓｅｒｉｅｓ、Ｃｏｌｕｍｎ：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＦ７Ｍ−ＨＱ（Ｓｈｏｄｅｘ）２本連結、Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、Ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：４０°Ｃ）。【０１３５】
（実施例に使用するための準備）
以下の実施例において、強い腫瘍縮小を誘発する腫瘍微小環境における貪食細胞を標的とするナノ粒子状ＴＬＲ９アゴニストによる全身性の単剤治療が可能であることを示した。【０１３６】
（材料および方法）
以下に、本実施例で用いられる試薬、材料、動物、細胞およびその方法について説明する。適宜、各実施例においても補充して説明する。【０１３７】
（動物および試薬）
６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＮｉｈｏｎ  ＣＬＥＡから購入した。Ｉｌ１２ｐ４０欠損マウスおよびＢａｔｆ３欠損マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｉｆｎａｒ２欠損マウス、Ｍｙｄ８８欠損マウスおよびＤｅｃｔｉｎ−１欠損マウスは以前記載した通りである（Ｋｏｂｉｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，３０８６−３０９１（２０１４））。全ての動物実験を、医薬基盤研究所の機関ガイドラインに従って行った。Ｋ３はＧｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎにより合成された。オバルブミン（ＯＶＡ）を生化学工業から購入した。【０１３８】
（細胞株）
ＥＬ４およびＯＶＡ発現ＥＬ４（ＥＧ７）は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胸腺腫細胞株であり、ＡＴＣＣから購入した。Ｂ１６（黒色腫）をＪａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｓｅｓから購入した。Ｂ１６Ｆ１０（黒色腫）を理研細胞バンクから購入し、ＭＣ３８（結腸がん）は、Ｆ．ＪＡＭＥＳ  Ｐｒｉｍｕｓ博士により提供された。Ｐａｎ０２（膵臓がん）をＪａｃｋｓｏｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ＥＬ４、ＥＧ７、ＭＣ３８、およびＰａｎ０２を、完全ＲＰＭＩ（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンが追加されたＲＰＭＩ  １６４０）で培養した。Ｂ１６およびＢ１６Ｆ１０を、完全ＤＭＥＭ（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンが追加されたＤＭＥＭ）で培養した。【０１３９】
（腫瘍実験および治療方法）
ＥＧ７、ＥＬ４、Ｂ１６、Ｂ１６Ｆ１０、およびＭＣ３８細胞（１０％マトリゲル／ＰＢＳ中に５×１０６細胞／ｍＬで１００μｌ）を、マウスの右側腹部の皮下（ｓ．ｃ）に接種した。腫瘍サイズを、腫瘍の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）、および高さ（Ｈ）で測定し、腫瘍体積（Ｖ）をＶ＝Ｌ×Ｗ×Ｈとして計算した。腫瘍内注射（ｉ．ｔ．）では、腫瘍部位に直接注射した。ＣｐＧ治療は、腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達してから開始し、その時期は、ＥＧ７およびＢ１６Ｆ１０の接種の７日後、Ｂ１６の接種の１０日後、ならびにＭＣ３８の接種の１４日後であった。腫瘍保有マウスを、Ｋ３（３０μｇ）またはＫ３−ＳＰＧ（１０μｇ）で１日おきに３回処置した。【０１４０】
（Ｐａｎ０２の腹膜播種モデル）
Ｐａｎ０２の腹膜播種モデルにおいて、１×１０６個のＰａｎ０２細胞（ＰＢＳ中に１×１０７細胞／ｍＬで１００μｌ）を、腹腔内に注射した。ＣｐＧ治療を接種１１日後に開始し、全ての腫瘍小結節を２１日目にマウスの腹膜から摘出し、その後これらの重量（ｇ）を測定した。ＣｐＧ治療での投与量は上記のとおりである。【０１４１】
（ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング実験）
Ｋ３およびＫ３−ＳＰＧの局在を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７を０日目にｓ．ｃ．接種し、ＰＢＳ（コントロール）、Ａｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３（３０μｇ）、またはＡｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３−ＳＰＧ（１０μｇ）を１２日目にｉ．ｖ．投与した。投与１時間後、マウスをＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍおよび分析ソフトウェア（Ｖｅｒ．２．６、Ｘｅｎｏｇｅｎ）で分析し、相対的蛍光で測定されたイメージを、表面放射輝度の物理単位（光子／秒／ｃｍ２／ｓｒ）に変換した。ｉｎ  ｖｉｖｏで標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために、脾細胞を、７、９、１１日目にＫ３−ＳＰＧで処置されたか、または処置されていない、ＥＧ７を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウスから１４日目に回収した。脾細胞の懸濁後、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ）で溶解し、細胞を完全ＲＰＭＩ中に維持した。ＣＤ８α＋Ｔ細胞をＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によりソートした。ＣＤ８α＋Ｔ細胞を陰性選択の方法でソートした。その後、ソートされたＣＤ８α＋Ｔ細胞を、Ｘｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＤｉＲ（登録商標）で染色した。染色されたＣＤ８α＋Ｔ細胞を、１４日目にレシピエントマウス（０日目にＥＧ７を接種し、７、９、１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置されたか、または処置されていないＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウス）に移した。染色した細胞を移して２４時間後に、マウスをＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｅｒ．２．６）で分析した。目的の領域を腫瘍領域に集約し、蛍光強度をＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖｅｒ．２．６、Ｘｅｎｏｇｅｎ）で分析した。【０１４２】
（免疫組織化学）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６−８週齢、雌、日本クレア）に、Ａｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３（３０μｇ）、Ａｌｅｘａ  ６４７−Ｋ３−ＳＰＧ（１０μｇ）、およびデキストラン−ＰＥ（２０μｇ）を尾静脈からｉ．ｖ．注射した。腫瘍を注射後１時間後に回収し、凍結切片を、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８と一緒に抗ＣＤ３ｅ抗体、抗ＣＤ８β抗体で染色した。細胞をＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１システムを使用して撮影した。イメージデータをＭｅｔａＭｏｒｐｈで分析した。【０１４３】
（枯渇実験）
食細胞（樹状細胞およびマクロファージ）を枯渇させるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、クロドロネートリポソームまたはコントロールリポソーム（１００ｎｍ）（片山化学）をＥＧ７の接種の５日後にｉ．ｖ．注射した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させるために、２００μｇの抗ＣＤ８α抗体を、ＥＧ７接種の６日後および１３日後に尾静脈にｉ．ｖ．注射した。【０１４４】
（脾細胞の分析）
脾細胞を、７、９、１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置されたか、処置されていない、ＥＧ７を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウスから１４日目に回収した。脾細胞の調製後、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、細胞を完全ＲＰＭＩで維持した。脾細胞をＨ−２Ｋｂ  ＯＶＡテトラマー（ＭＢＬ）、抗ＣＤ８α抗体（ＫＴ１５）、抗ＴＣＲβ抗体（Ｈ５７−５９７）、抗ＣＤ６２Ｌ抗体（ＭＥＬ−１４）、および抗ＣＤ４４抗体（ＩＭ７）、ならびに７−アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）で染色した。ＯＶＡテトラマー＋ＣＤ４４＋ＣＤ８α＋ＴＣＲβ＋の細胞数を、フローサイトメトリーで決定した。他の実験については、調製された脾細胞を、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ３ｅ抗体、抗ＣＤ８α抗体、および抗ＣＤ１１ａ抗体と共にインキュベートし、その後フローサイトメトリーで分析した。【０１４５】
（ＣＤ４５陰性細胞のアッセイおよび免疫化）
脾細胞を、７、９、１１日目にＫ３−ＳＰＧでｉ．ｖ．処置されたか、処置されていない、ＥＧ７を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２ダブルノックアウトマウスから１２日目に回収した。脾細胞の調製後、赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、細胞を完全ＲＰＭＩ中に維持した。脾細胞を抗ＣＤ４５抗体（ＡＰＣ）で染色し、ＣＤ４５−細胞の数をフローサイトメトリーで決定した。さらに、アポトーシス細胞、ネクローシス細胞、およびＣＤ４５陰性生細胞の集団を、ＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色し、その後フローサイトメトリーで分析した。次に、ＣＤ４５−細胞を、Ｋ３−ＳＰＧで処置された腫瘍保有Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、ＩＮＦＬＵＸ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によってソートした。【０１４６】
（ワクチン接種モデル）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５個のＣＤ４５−細胞を−７日目にｉ．ｖ．投与した。免疫化７日後、マウスに５×１０５個のＥＧ７細胞を０日目にｓ．ｃ．接種した。【０１４７】
（サイトカインの測定）
マウスＩＬ−１２ｐ４０、マウスＩＬ−１３、およびヒトＩＦＮγのレベルを、Ｒ＆ＤのＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。【０１４８】
（統計分析）
Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較検定を含む一元分散分析を、統計分析に用いた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。【０１４９】
（実施例１：Ｋ３−ＳＰＧの静脈内注射は、腫瘍抗原を全く追加しなくても強い腫瘍成長の抑制を誘発する）
本実施例では、Ｋ３−ＳＰＧの静脈内注射により、腫瘍抗原を全く追加しなくても強い腫瘍成長の抑制が誘発されることを実証した。【０１５０】
（ＥＧ７（ＯＶＡ発現マウス胸腺腫細胞株）モデルでの実験）
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＥＧ７（ＯＶＡ発現マウス胸腺腫細胞株）を右側腹部に０日目に接種し、尾基部付近の皮下（ｉ．ｄ．）投与、腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与、または静脈内（ｉ．ｖ．）投与の３つの異なる経路を介して、ＰＢＳ、および等モル量のＫ３（３０μｇ）またはＫ３−ＳＰＧ（１０μｇ）で３回処置した（接種の７、９、１１日後）。腫瘍サイズを２３日目まで２〜３日毎に測定した。【０１５１】
（結果）
結果は図２（Ａ〜Ｂ）以下に表す。ＰＢＳの群（コントロール）において、腫瘍成長はいずれの投与経路を介しても抑制されなかった（図２ａ、ｂ、ｃ（図２Ａ））。Ｋ３処置において、腫瘍縮小がｉ．ｔ．でのみ観察されたが、他の経路においては観察されなかった（図２ｄ、ｅ、ｆ（図２Ａ））。Ｋ３−ＳＰＧ処置において、ｉ．ｔ．およびｉ．ｖ．の両方で強い腫瘍縮小が観察されたが、ｉ．ｄ．投与は、腫瘍成長に対する影響を示さなかった（図２ｇ、ｈ、ｉ（図２Ａ））。コントロール、Ｋ３およびＫ３−ＳＰＧを比較して示した図を図（図２ａ、ｄ、ｇ（図２Ａ））に示す。【０１５２】
従来技術では、がんに対する全身性ＣｐＧ  ＯＤＮ治療での多くの試みは成功していなかった（Ｌｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，Ｍｄ．：  １９９７）３４，２７９−２８８  （２０１１）；Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ８３６８  （２００９））ことから、Ｋ３−ＳＰＧでのｉ．ｖ．単剤治療は、腫瘍成長を強く抑制し得るという事実は予測できなかったことであり、この点で本発明は予想外の効果を生じていることが実証された。【０１５３】
（他の腫瘍細胞株での実験）
このＫ３−ＳＰＧ全身性単剤治療の潜在性を調査するために、他の腫瘍細胞株もまた、ＥＧ７モデルにおいて使用された同様のプロトコルで試験した。【０１５４】
（結果）
Ｋ３−ＳＰＧの静脈内投与は、黒色腫（Ｂ１６およびＢ１６Ｆ１０）および結腸がん（ＭＣ３８）の成長も抑制した（図２ｊ、ｋ、ｌ（図２Ｂ））。本発明者らは、さらにより臨床的悪性度の高い腫瘍播種性モデルを作製することによって試験した。マウス膵臓腫瘍株、Ｐａｎ０２（１×１０６細胞）を、腹腔内（「ｉ．ｐ．」とも称する）に接種し、その後、Ｋ３またはＫ３−ＳＰＧによる治療（１日おきに３回）を接種の１１日後に開始した。２１日目に全てのマウスを屠殺し、腹腔の腫瘍の総重量を評価した（図２ｍ（図２Ｂ））。腫瘍成長は、Ｋ３−ＳＰＧ  ｉ．ｖ．処置群において顕著に抑制されたが、Ｋ３  ｉ．ｐ．およびＫ３−ＳＰＧ  ｉ．ｐ．処置群においては抑制されなかった（図２ｍ（図２Ｂ））。それに応じて、顕著な生存の延長が、Ｋ３−ＳＰＧ  ｉ．ｖ．処置群において観察されたが、Ｋ３  ｉ．ｖ．群では観察されなかった（図２ｎ（図２Ｂ））。これらの結果は、Ｋ３−ＳＰＧの全身性ｉ．ｖ．投与が、多くの異なるがんに対する有望な単剤治療であり、いずれの腫瘍ペプチドおよび抗原もさらに必要としないことを実証するものである。【０１５５】
（実施例２：Ｋ３−ＳＰＧは腫瘍微小環境において食細胞を標的とした）
次に、本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧの腫瘍微小環境におけるメカニズムを解明した。【０１５６】
Ｋ３−ＳＰＧは、約３０ｎｍのサイズのナノ粒子を形成する（Ｋｏｂｉｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，３０８６−３０９１  （２０１４））。本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧは、腫瘍までの薬物送達システムを介して機能すると仮定した（Ｎａ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １６３，２−９  （２０１２）；Ｐｅｔｒｏｓ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ９，６１５−６２７  （２０１０）；Ｐａｎｔｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １３，４２５−４３４  （２００２）；Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，７７１−７８２  （２００８）；Ｆａｒｏｋｈｚａｄ，Ｏ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ３，１６−２０（２００９））。【０１５７】
（蛍光標識イメージング）
ｉｎ  ｖｉｖｏでの分布を試験するために、Ｋ３およびＫ３−ＳＰＧを蛍光標識した。ＥＧ７腫瘍保有マウスにＰＢＳ、Ａｌｅｘａ６４７−Ｋ３（３０μｇ）、またはＡｌｅｘａ６４７−Ｋ３−ＳＰＧ（１０μｇ）をｉ．ｖ．注射し、その後、蛍光の分布をｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）によって試験した。【０１５８】
結果を図４以下に示す。【０１５９】
ＩＶＩＳイメージングは、Ｋ３ではなくＫ３−ＳＰＧが、ｉ．ｖ．投与１時間後で腫瘍部位に蓄積したことを明らかにした（図４ａ）。腫瘍におけるＫ３−ＳＰＧの蓄積は、ＣｐＧ単剤治療の腫瘍縮小の有効性によく関連していることが観察された（図２）。免疫組織化学（ＩＨＣ）試験において、本発明者らは、腫瘍微小環境においてＡｌｅｘａ６４７−Ｋ３を検出することができなかった（図４ｂ）。他方で、Ａｌｅｘａ６４７−Ｋ３−ＳＰＧは、腫瘍領域で観察された（図４ｃ）。本発明者らは、２４時間後にはＩＨＣでのＡｌｅｘａ６４７シグナルを検出することができなかった。ＥＧ７細胞は、その表面上にＣＤ３ｅを発現するが（なぜなら、ＥＧ７は胸腺腫細胞株に由来するため）、Ｋ３−ＳＰＧはＣＤ３ｅに会合せず、これはＫ３−ＳＰＧは非腫瘍細胞によって取り込まれたことを示した。ナノ粒子は、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）などの食細胞によって取り込まれることを選択し、これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＴＲＩＴＣ−デキストランによって標識され得る。そのため、本発明者は、蛍光染色されたＫ３、Ｋ３−ＳＰＧ、またはＳＰＧと一緒にＴＲＩＴＣ−デキストランを静脈内注射し、ＩＨＣによるそれらの共存について試験した（図４ｄ、ｅ、ｆ）。ｉ．ｖ．注射の１時間後、デキストランは、全試料の腫瘍領域の中で観察され（図４ｄ、ｅ、ｆ）、これは腫瘍微小環境が食細胞を含んでいることを示している。以前の結果と一貫して、Ａｌｅｘａ６４７−Ｋ３は腫瘍内で観察されなかった（図４ｄ）。腫瘍内で観察された約５０％のＡｌｅｘａ６４７−Ｋ３−ＳＰＧおよびＦＩＴＣ−ＳＰＧは、ＴＲＩＴＣ−デキストラン陽性細胞と共存し（図４ｅ、ｆ、ｇ）、これはＫ３−ＳＰＧが、腫瘍微小環境において食細胞によって取り込まれることを示している。一部のＫ３−ＳＰＧはデキストランと会合せず、本発明者らは、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を介して、それらは腫瘍組織内の空間に受動的に蓄積したと推測している。Ｋ３−ＳＰＧ  ｉ．ｖ．処置に対する食細胞の重要性を試験するために、本発明者らは、クロドロネートリポソームを静脈内注射した。本発明者らは、通常２００〜３００ｎｍのリポソームではなくて１００ｎｍのクロドロネートリポソームを使用して、これを注射することにより腫瘍内の食細胞を枯渇させ（Ｐａｎｔｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １３，４２５−４３４  （２００２）；Ｐａｎｔｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  １３，４２５−４３４  （２００２））、この注射により、腫瘍におけるＦ４／８０陽性細胞が２日でほとんど枯渇した（図５）。腫瘍保有マウスに、クロドロネートリポソームを５日目に（最初のＫ３−ＳＰＧ処置の２日前）注射するか、または注射せず、図２（Ａ〜Ｂ）と同様にマウスをＫ３−ＳＰＧで処置した。先にクロドロネートリポソームを注射した場合、Ｋ３−ＳＰＧ媒介腫瘍成長の抑制を顕著に相殺し（ｐ＜０．０５）（図４ｈ）、他方で、クロドロネートリポソームの注射それ自体は、ＰＢＳ処置マウスと比較して腫瘍成長に影響を与えなかった。これらの結果は、Ｋ３−ＳＰＧが、腫瘍微小環境���おける食細胞を標的とし、Ｋ３−ＳＰＧの抗腫瘍効果は、Ｋ３−ＳＰＧの腫瘍微小環境における食細胞への取り込みにほとんど依存していることを示している。【０１６０】
（実施例３：腫瘍微小環境におけるＩＬ１２およびＩＦＮ−Ｉサイトカインの両方を産生することは、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療に重要である）
次に、本実施例では、本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療の成功に必要とされる因子について試験した。【０１６１】
ＩＬ−１２およびＩＦＮ−Ｉなどのサイトカインは、Ｋ３−ＳＰＧ（Ｋｏｂｉｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，３０８６−３０９１  （２０１４））を含むＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６１，２４２８−２４３４  （１９９８）；Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，１２３−１２９  （１９９９）；Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，１６６−１７４  （２００４））の重要な免疫刺激因子であることが示されている。それゆえ、本発明者らは、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−Ｉが、Ｋ３−ＳＰＧの治療による腫瘍縮小に必要とされるかどうか試験した。【０１６２】
Ｉｌ１２ｐ４０およびＩＦＮＡＲ２欠損マウスに、ＥＧ７細胞を０日目に皮下に接種し、図２（Ａ〜Ｂ）のようにＰＢＳまたはＫ３−ＳＰＧ（１０μｇ）で３回ｉ．ｖ．処置をした。その後腫瘍縮小に対するＫ３−ＳＰＧの影響を観察した。
（結果）【０１６３】
結果を図６（Ａ〜Ｂ）以下に示す。腫瘍縮小に対するＫ３−ＳＰＧの影響は、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉシグナル伝達に部分的に依存していた（図６ａ、ｂ（図６Ａ））。また、本発明者らは、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮＡＲ２の二重欠損（ＤＫＯ）マウスを試験し、Ｋ３−ＳＰＧの影響は、ＤＫＯマウスにおいて完全に抑止されることを見出した（図６ｃ（図６Ａ））。ＩＦＮ−βおよびＩＬ−１２ｐ４０もまた、ＩＨＣ染色により腫瘍内で検出された（図７、図８）。これらのデータは、腫瘍内でのＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉサイトカインの両方の分泌は、Ｋ３−ＳＰＧ媒介性腫瘍抑制に重要であることを示した。【０１６４】
本発明者らはまた、Ｔ細胞およびＢ細胞媒介性の適応免疫応答を完全に欠損しているＲａｇ２マウスを試験した。Ｒａｇ２マウスは、Ｋ３−ＳＰＧ処置をしても、全ての腫瘍成長を制御できなかったが（図６ｄ（図６Ａ））、本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧでの３回の処置の間に、ｒａｇ２欠損マウスは、部分的に腫瘍成長を制御することができたことがわかった（図６ｆ（図６Ａ））。この観察を確かめるために、本発明者らは、ｒａｇ２マウスの６回処置群（７、９、１１日目および１４、１６、１８日目）を作製し、ｒａｇ２マウスのこのプロトコルにおいてより明白な腫瘍の制御を見出した（図６ｆ（図６Ａ））。興味深いことに、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮＡＲ２  ＤＫＯマウスは、この広範な処置プロトコルでも、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療に対して完全に非応答だった（図６ｅ（図６Ａ））。これらのデータは、Ｋ３−ＳＰＧの治療は、腫瘍内でＩＬ−１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉの両方を誘発し、その結果、腫瘍に対する自然免疫応答および適応免疫応答の両方を生じさせたことを示した。【０１６５】
（実施例４：Ｋ３−ＳＰＧ処置は、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉの両方に依存する態様で、腫瘍細胞死を誘発する）
本実施例では、Ｋ３−ＳＰＧ処置は、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉの両方に依存する態様で、腫瘍細胞死を誘発することを実証した。【０１６６】
ｒａｇ２マウスにおいて観察される適応免疫によらない部分的な腫瘍成長の抑制、およびＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮＡＲ２  ＤＫＯマウスにおけるその完全な抑止が観察されたため、本発明者らは、広範囲なＫ３−ＳＰＧ処置中の腫瘍−宿主相互作用を試験した。【０１６７】
本発明者らは、１２日目に取り除かれた脾臓（Ｋ３−ＳＰＧでの３回の処置の次の日）が、ＰＢＳ処置された脾臓と比較して、多量のＣＤ４５陰性細胞を含んでいたことを見出した（図６ｇ（図６Ｂ））。興味深いことに、これらのＣＤ４５陰性細胞は、ＩＬ１２ｐ４０およびＩＦＮＡＲ２  ＤＫＯマウスにおいて顕著に減少した（図６ｇ、ｈ（図６Ｂ））。本発明者らは、これらのＣＤ４５陰性細胞をソートした。このサイズおよび形態は、それらが腫瘍細胞に由来することを強く示した。ＧＦＰマウスにおけるＥＧ７接種実験により、これらのＣＤ４５陰性細胞もまたＧＦＰ陰性であることをさらに確認し、このことは、これらの細胞が腫瘍細胞由来であったことを示した（図９）。ＥＧ７細胞はＣＤ４５を発現しないので、ＣＤ４５が陰性であることもまた、この仮説を支持している。ＨｏｅｃｈｓｔおよびＰＩ染色は、脾臓におけるほとんどのＣＤ４５陰性細胞は、アポトーシスおよびネクローシスの両方の特徴からなる死細胞であった（図６ｉ（図６Ｂ））。これらのデータは、Ｋ３−ＳＰＧにより標的とされる腫瘍食細胞が、腫瘍微小環境においてＩＬ−１２ｐ４０およびＩＦＮ−Ｉを分泌し、これらのサイトカインが腫瘍細胞死を誘発し、それらを循環に放出して最終的に脾臓に捕捉されたことを示した。【０１６８】
（実施例５：放出された腫瘍死細胞は複数の腫瘍抗原に対する抗腫瘍ＣＴＬを誘発する）
本実施例では、放出された腫瘍死細胞は複数の腫瘍抗原に対する抗腫瘍ＣＴＬを誘発することを実証した。【０１６９】
Ｋ３−ＳＰＧ処置されたマウスの脾臓において見つかったこれらのＣＤ４５陰性細胞の免疫原性を試験するために、本発明者らはこれらの細胞をソートし、免疫化として無処置マウスに静脈内注射をした。その後、免疫化されたマウスを、ソートされた細胞投与の７日後にＥＧ７腫瘍細胞を移植した。ＣＤ４５陰性細胞免疫化マウスは、ＥＧ７腫瘍の増殖に対して顕著に防御された（図６ｊ（図６Ｂ））。興味深いことに、コントロールマウスおよび免疫化マウスにおけるＯＶＡ２５７テトラマー陽性細胞（図６ｋ（図６Ｂ）における赤の点）は、腫瘍サイズと相関せず（図６ｋ（図６Ｂ）の棒）、ＣＤ４５陰性細胞による免疫化は、単なるＯＶＡ２５７エピトープよりもむしろ、ＥＧ７腫瘍に対するより有効なさらなる免疫応答を誘発したことを示した（図６ｋ（図６Ｂ））。これらの結果は、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療は、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−Ｉの両方に依存する腫瘍細胞死を誘発し、この腫瘍死細胞は、抗腫瘍免疫応答のための効率的な免疫原として機能することを示した。【０１７０】
（ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｋ３−ＳＰＧ媒介性の腫瘍縮小において重要なエフェクターである）
Ｒａｇ２マウスの結果は、Ｋ３−ＳＰＧの腫瘍抑制効果もまた、適応免疫応答に依存することを示した。それゆえ、本発明者らは、Ｋ３−ＳＰＧ治療に必要なＣＤ８Ｔ細胞を試験した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ８  Ｔ細胞の枯渇は、Ｋ３−ＳＰＧの抗腫瘍効果を顕著に抑止し（図１０ａ（図１０Ａ））、ＣＤ８Ｔ細胞がこのＫ３−ＳＰＧ治療における重要なエフェクター細胞であることを示している。また、Ｋ３−ＳＰＧによる腫瘍縮小は、Ｂａｔｆ３（交差提示ＣＤ８α＋  ＤＣを欠損している）にも依存し（図１０ｂ（図１０Ａ））、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療が、ＣＤ８α＋  ＤＣ媒介性交差提示をも増強したことを示している。本発明者らは、ＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍浸潤と腫瘍成長との間の明らかな関連性を観察した。ＣＤ８Ｔ細胞は、Ｋ３−ＳＰＧ  ｉ．ｖ．群において腫瘍領域で蓄積したが、ｉ．ｄ．群では蓄積しなかった（図１０ｃ（図１０Ａ））。【０１７１】
最後に、本発明者らは、これらのＣＤ８Ｔ細胞が腫瘍領域に進入するために必要なものを試験した。ＷＴマウスおよびＩｌ１２ｐ４０−Ｉｆｎａｒ２  ＤＫＯマウスに、ＥＧ７細胞を０日目に接種し、７、９、および１１日目にＫ３−ＳＰＧまたはＰＢＳでｉ．ｖ．処置した。１４日目に、ＣＤ８α＋Ｔ細胞を、これらのマウスの脾臓から精製し、Ｘｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＤｉＲ（登録商標）で染色し、Ｋ３−ＳＰＧ処置された（７、９、および１１日目）別のＥＧ７保有マウスに移し（接種１４日後）、その後Ｘｅｎｏｌｉｇｈｔ  ＤｉＲ（登録商標）で標識されたＣＤ８Ｔ細胞の分布をＩＶＩＳで１５日目に分析した（図１１）。１５日目に、未処置腫瘍を保有するドナーマウス由来のＣＤ８Ｔ細胞は、Ｋ３−ＳＰＧで処置されてもＷＴレシピエントマウスの腫瘍部位で蓄積しなかった（図１０ｄ（図１０Ｂ）、ＩＩ）。他方で、Ｋ３−ＳＰＧで処置された腫瘍を保有するドナーマウス由来のＣＤ８Ｔ細胞は、レシピエントマウスの腫瘍部位で検出され（図１０ｄ（図１０Ｂ）、Ｉ）、Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療は、腫瘍微小環境へと移動して浸潤し得る抗腫瘍ＣＤ８Ｔ細胞を誘発したことを示した。これらのｉｎ  ｖｉｖｏ活性化ＣＤ８Ｔ細胞は、ＤＫＯレシピエントマウスの腫瘍微小環境に進入することが可能であった（図１０ｅ（図１０Ｂ））。たとえ、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−Ｉは、全身性のＫ３−ＳＰＧ単剤治療による自然免疫およびＣＤ８Ｔ細胞の誘発に重要であっても、この結果は、ＣＤ８Ｔ細胞がＫ３−ＳＰＧ治療で活性化されると、腫瘍微小環境におけるＩＬ−１２およびＩＦＮ−Ｉサイトカインの分泌がＣＤ８Ｔ細胞の腫瘍浸潤に必ずしも必要であるとは限らないことを示した。まとめると、これらの結果は、腫瘍特異的ＣＤ８Ｔ細胞の活性化が、腫瘍への浸潤に十分であることを示した。驚くべきことに、これらのＣＤ８Ｔ細胞の浸潤は、腫瘍微小環境におけるサイトカインの産生に依存しない。
（考察）【０１７２】
本発明者らは、新規ながん免疫療法の可能性を示した。これはＣｐＧが腫瘍微小環境における食細胞に標的化されるという新しい治療である（図１２）。ＴＬＲ９の刺激を介して、ＣｐＧが免疫細胞による免疫応答を誘発し、特にマクロファージおよびＤＣを活性化する（Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１，１２３−１２９  （１９９９）；Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，１６６−１７４（２００４））。この活性化は、抗がん免疫応答に非常に重要である。以前の報告では、ＣｐＧを直接腫瘍内に投与しなければならなかったが、ＳＰＧとＣｐＧの複合体ではＤＤＳ機能が追加され全身投与でも腫瘍内投与と同等もしくはそれ以上の有効性が示され（Ｓｃｈｅｔｔｉｎｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ：  ＣＩＩ  ６１，２０５５−２０６５  （２０１２）；Ｌｏｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  （Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，Ｍｄ．：  １９９７）３４，２７９−２８８  （２０１１）；Ｎｉｅｒｋｅｎｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ８３６８  （２００９）；Ｈｅｃｋｅｌｓｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６９，３８９２−３８９９  （２００２）；Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，１６６−１７４  （２００４））、本発明者らはこの課題を解決した。ナノ粒子の形成によるＳＰＧとＣｐＧとの複合体は（Ｋｏｂｉｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，３０８６−３０９１  （２０１４））、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて安定化することが可能であった。この効果が腫瘍環境を標的とすることを可能とすることがわかり、ＴＬＲ９免疫担当細胞が腫瘍環境に供された。本発明者らによって開発されたこの新規ＣｐＧは、ナノ粒子を形成させるために食細胞によって貪食される。【０１７３】
その後、腫瘍環境において、この新規ＣｐＧを貪食した食細胞は、ＩＦＮおよびＩＬ−１２などのサイトカインを産生する。これらのサイトカインが腫瘍環境において誘発されることは非常に重要である。以前の報告には、腫瘍環境を直接標的としたＩＦＮβ治療は、樹状細胞を腫瘍内に移動させ、腫瘍内微小環境内の抗原交差提示を増加させることによりＣＴＬを再活性化させることが記載されている。これらのサイトカインは、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす。さらに、本発明者らは、この効果が自然免疫の活性化によって及ぼされることを見出した。この細胞死は、非常に重要な役割を担っている。これは自然免疫と適応免疫との間の連携をなしていた。腫瘍細胞死が腫瘍微小環境から放出されることによって、獲得免疫を誘発する。この免疫原性腫瘍細胞死は、複数の細胞障害性Ｔリンパ球を誘発する。上記のようにｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍特異的に誘発されるＣＴＬは、腫瘍に応答して腫瘍微小環境に浸潤し得る。この抗腫瘍免疫システムは内因性抗原を使用し、がん免疫療法の障壁である免疫編集に対処し得ると考えられる。【０１７４】
Ｋ３−ＳＰＧ単剤治療後の腫瘍細胞の循環は、腫瘍に対するこの処置効果の優れたバイオマーカーとして機能し得る。【０１７５】
（実施例６：製剤例）
製剤は、例えば、７．２２ｍｇのＫ３−ｄＡ４０（配列番号２）を水（３．７ｍＬ）に溶解し、ＳＰＧ（１５ｍｇ）を０．２５Ｎ  ＮａＯＨ（１ｍＬ）に溶解した。１ｍＬの容積の３３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４をＤＮＡ溶液に加え、次いで、ＳＰＧ溶液をこのＤＮＡ／ＮａＨ２ＰＯ４溶液に加え、４℃で一晩維持して、複合体化を完了させた。モル比（ＭＳＰＧ／ＭＤＮＡ）は０．２７に固定して製造することができる。
【０１７６】
製剤に使用した薬剤は、ジーンデザイン、ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、Ｗａｋｏなどから入手することができる。【０１７７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明により、単剤として使用できる新たな形態の抗がん剤が提供される。したがって、本発明の複合体は、抗がん剤として医薬分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号１：Ｋ３
配列番号２：Ｋ３−ｄＡ４０
配列番号３：ｄＡ４０−Ｋ３
配列番号４：Ｋ３−ｄＡ２０
配列番号５：Ｋ３−ｄＡ２５
配列番号６：Ｋ３−ｄＡ３０
配列番号７：Ｋ３−ｄＡ３５
［配列表］
0006536964.tif 000005
0006536964.tif 000006
0006536964.tif 000007
0006536964.tif 000008
【図１】
0006536964.tif 000009
【図２Ａ】
0006536964.tif 000010
【図２Ｂ】
0006536964.tif 000011
【図３】
0006536964.tif 000012
【図４】
0006536964.tif 000013
【図５】
0006536964.tif 000014
【図６Ａ】
0006536964.tif 000015
【図６Ｂ】
0006536964.tif 000016
【図７】
0006536964.tif 000017
【図８】
0006536964.tif 000018
【図９】
0006536964.tif 000019
【図１０Ａ】
0006536964.tif 000020
【図１０Ｂ】
0006536964.tif 000021
【図１１】
0006536964.tif 000022
【図１２】
0006536964.tif 000023