(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
厚さ方向に複数の貫通孔を有する細胞捕捉フィルタに対して被検液を通過させることにより、細胞捕捉フィルタの一方の面上に前記被検液に含まれる単離対象の細胞を捕捉する細胞捕捉ステップと、
前記細胞捕捉ステップにおいて前記細胞が捕捉された前記細胞捕捉フィルタの一方の面上に光硬化性ハイドロゲルを導入し、当該光硬化性ハイドロゲルにより前記細胞を包埋するゲル包埋ステップと、
前記細胞を包埋した前記光硬化性ハイドロゲルに対して光を照射することで、当該光硬化性ハイドロゲルを硬化させるゲル硬化ステップと、
前記ゲル硬化ステップにおいて硬化した前記光硬化性ハイドロゲルを前記細胞捕捉フィルタから剥離する剥離ステップと、
を含む細胞単離方法。
【請求項２】
厚さ方向に複数の貫通孔を有する細胞捕捉フィルタに対して被検液を通過させることにより、細胞捕捉フィルタの一方の面上に前記被検液に含まれる単離対象の細胞を捕捉する細胞捕捉ステップと、
前記細胞捕捉ステップにおいて前記細胞が捕捉された前記細胞捕捉フィルタの一方の面上に刺激応答性ハイドロゲルを導入し、当該刺激応答性ハイドロゲルにより前記細胞を包埋するゲル包埋ステップと、
前記細胞を包埋した前記刺激応答性ハイドロゲルに対して刺激を与えることで、当該刺激応答性ハイドロゲルを硬化させるゲル硬化ステップと、
前記ゲル硬化ステップにおいて硬化した前記刺激応答性ハイドロゲルを前記細胞捕捉フィルタから剥離する剥離ステップと、
を有し、
前記ゲル硬化ステップにおいて、前記細胞を包埋した前記刺激応答性ハイドロゲルのうち単離対象の前記細胞の周囲のみを局所的に硬化させる細胞単離方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタであって、
前記一方の面側において隣接する前記貫通孔間の距離が８０μｍ以上である細胞捕捉フィルタ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞単離方法及びこの細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは世界各国で死因の上位を占めるため、その早期発見および治療が望まれている。がんによる人の死亡は、がんの転移再発によるものがほとんどである。がんの転移再発は、癌細胞が原発巣から血管またはリンパ管を経由して、別臓器組織の血管壁に定着、浸潤して微小転移巣を形成することで起こる。このような血管又はリンパ管を通じての人の体内を循環するがん細胞は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ、以下、場合により「ＣＴＣ」という。）と呼ばれている。【０００３】
がんの転移再発を引き起こす可能性のある血管中のがん細胞（ＣＴＣ）の有無およびその量を測定できれば、がん治療に大きな貢献が可能となる。血液中のがん細胞を捕らえる従来技術としては、例えば、特許文献１に記載の構成が知られている。特許文献１記載の技術は、血液中のがん細胞をフィルタで捕獲しようとするもので、ここではフィルタの半導体技術を用いた製造方法、フィルタを収納したセルユニットの形状、および血液および処理液を流す流路の構造が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／００５３１５２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、近年、血管中のがん細胞の状況についてより正確に把握をする目的から、がん細胞の個体についてそれぞれ観察したいという要求がある。しかしながら、例えば特許文献１記載の技術を用いてフィルタ上にがん細胞を捕捉したとしても、がん細胞個体を観察するのは困難である。また、フィルタ上のがん細胞は弾性変形しやすいため取り扱いが困難である一方で損傷させてしまうとがん細胞の観察を好適に行うことができない。【０００６】
本発明は上記を鑑みてなされたものであり、細胞捕捉フィルタ上に捕捉されたがん細胞を損傷させることなく単離することが可能な細胞単離方法及びこの細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る細胞単離方法は、厚さ方向に複数の貫通孔を有する細胞捕捉フィルタに対して被検液を通過させることにより、細胞捕捉フィルタの一方の面上に前記被検液に含まれる単離対象の細胞を捕捉する細胞捕捉ステップと、前記細胞捕捉ステップにおいて前記細胞が捕捉された前記細胞捕捉フィルタの一方の面上に刺激応答性ハイドロゲルを導入し、当該刺激応答性ハイドロゲルにより前記細胞を包埋するゲル包埋ステップと、前記細胞を包埋した前記刺激応答性ハイドロゲルに対して刺激を与えることで、当該刺激応答性ハイドロゲルを硬化させるゲル硬化ステップと、前記ゲル硬化ステップにおいて硬化した前記刺激応答性ハイドロゲルを前記細胞捕捉フィルタから剥離する剥離ステップと、を含むことを特徴とする。【０００８】
上記の細胞単離方法では、細胞捕捉ステップにおいて細胞が捕捉された細胞捕捉フィルタ２の一方の面上に刺激応答性ハイドロゲルを導入し、当該刺激応答性ハイドロゲルにより細胞を包埋した後、刺激応答性ハイドロゲルに対して刺激を与えることで、当該刺激応答性ハイドロゲルを硬化させ、硬化した刺激応答性ハイドロゲルを細胞捕捉フィルタから剥離する。このように、刺激応答性ハイドロゲルを用いて細胞を単離することにより、細胞が刺激応答性ハイドロゲルに包埋された状態で細胞を操作するため、単離対象の細胞を直接操作する場合と比較して取り扱い性が向上し、細胞を損傷させることなく単離することが可能となる。【０００９】
ここで、前記ゲル硬化ステップにおいて、前記細胞を包埋した前記刺激応答性ハイドロゲルのうち単離対象の前記細胞の周囲のみを局所的に硬化させる態様とすることができる。【００１０】
このように、ゲル硬化ステップにおいて、単離対象の前記細胞の周囲のみを局所的に硬化させる構成とした場合には、細胞毎に個別に硬化されたハイドロゲルを操作することができるため、取り扱い性がさらに向上する。【００１１】
また、本発明の一形態に係る細胞捕捉フィルタは、上記の細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタであって、前記一方の面側において隣接する前記貫通孔間の距離が８０μｍ以上であることを特徴とする。【００１２】
上記の細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタ２は、一方の面側において隣接する貫通孔間の距離が８０μｍ以上である構成とすることで、隣接する貫通孔に捕捉された細胞がハイドロゲルによって一度に硬化されることを防ぐことができるため、細胞の単離を好適に行うことができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞捕捉フィルタ上に捕捉された細胞を損傷させることなく単離することが可能な細胞単離方法及びこの細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】細胞捕捉デバイスの概略構成図である。
【図２】細胞捕捉デバイスの分解斜視図である。
【図３】細胞捕捉フィルタについて説明する図である。
【図４】細胞捕捉フィルタについて説明する図である。
【図５】細胞単離方法について説明する図である。
【図６】ＰＥＧＤＡについて説明する図である。
【図７】硬化後のＰＥＧＤＡの構造について説明する図である。
【図８】単離後のＰＥＧＤＡのＳＥＭ画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００１６】
図１は、本発明の一形態に係る細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタを含む細胞捕捉デバイスの構成を説明する図である、図２は、細胞捕捉デバイスの分解斜視図である。また、図３及び図４は、細胞捕捉フィルタについて説明する図である。
【００１７】
細胞捕捉デバイスは、被検液となる細胞分散液を細胞捕捉フィルタによってろ過することで、被検液中に含まれる細胞を捕捉する装置である。また、細胞捕捉フィルタにより捕捉された細胞を以下の実施形態で説明する単離方法により単離することで、細胞の特定及び細胞の個体数のカウント等が行われる。被検液となる細胞分散液としては、例えば血液及び血液を希釈した液体が挙げられる。細胞捕捉デバイスは、例えば、ＣＴＣと呼ばれる循環癌細胞等の希少細胞が含まれる血液中から、血液中に含まれる赤血球、血小板及び白血球（以下、これらを総称して「血球成分」とする）を通過させる一方で、希少細胞を捕捉する目的に好適に用いられる。希少細胞の種類はＣＴＣに限定されるものではない。例えば、循環内皮細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ＣＥＣ）、及び、血管循環内皮前駆細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＣＥＰ）等も捕捉対象の希少細胞として取り扱うことができる。
【００１８】
図１及び図２に示すように、細胞捕捉デバイス１は、厚さ方向に貫通孔が複数形成された細胞捕捉フィルタ２の上方に枠材３が設けられていると共に下方に排出流路が形成されたものである。
【００１９】
細胞捕捉フィルタ２の材質としてはなるべく硬質なものがよく、特に金属が望ましい。金属は加工性に優れているため、フィルタの加工精度を高めることができる。これにより、捕獲対象とする成分の捕獲率を更に向上させることができる。また、金属はプラスチックなどの他の材料と比べて剛直であるため、外部から力が加わってもそのサイズ及び形状が維持される。このため、貫通孔よりも若干大きな成分を変形させて通過させる場合、より高精度の分離・濃縮が可能となる。
【００２０】
金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウム、ルテニウム、クロムのいずれか、もしくはこれらの合金が好ましい。このうち、特に金属の主成分として銅又はニッケルが用いられることが好ましい。
【００２１】
細胞捕捉フィルタ２として、本実施形態では、厚さ２５μｍのニッケル基板を用いた場合について説明するが、厚さは適宜変更することができ、例えば１０μｍ〜１００μｍとすることができる。細胞捕捉フィルタ２は、図３に示すように、中央に複数の貫通孔２１が形成されたフィルタ領域２２が形成される。
【００２２】
細胞捕捉フィルタ２のフィルタ領域２２は、図４（Ａ）に示すように、上方から見たときに直径８μｍの円形の貫通孔２１が複数設けられている。貫通孔２１は、隣接する貫通孔２１との間隔が１２５μｍとなるように格子状に配置されていて、フィルタ領域２２内に貫通孔２１が６３×６３＝３９６９個配置されている。また、断面から見た場合、図４（Ｂ）で示すように、上面側（被検液が導入される側）では貫通孔２１の周囲に深さ２μｍの凹部２３が形成されている。また、上面側から下面側（被検液が排出される側）へ向けて、貫通孔２１の孔径が徐々に大きくなるように傾斜している。
【００２３】
貫通孔２１の形状及び配置は適宜変更することができるが、本実施形態に係る細胞捕捉フィルタ２では、隣接する貫通孔２１との距離が８０μｍ以上であることが好ましい。貫通孔２１間の距離を上記の範囲とすることにより、捕捉した細胞の単離が容易となる。
【００２４】
図１及び図２に戻り、細胞捕捉フィルタ２の上方の枠材３は、細胞捕捉フィルタ２のフィルタ領域２２よりも外側において、細胞捕捉フィルタ２を囲むように設けられる。枠材３は、例えば、樹脂等のように細胞捕捉フィルタ２に対して密着性を有する材料により構成されることが好ましい。また、枠材３よりも上方において、細胞捕捉デバイス１に対して被検液又は処理液を導入するために導入流路を有する導入部材等を設ける構成としてもよい。
【００２５】
細胞捕捉フィルタ２の下方には、枠材５及び流路部材６によって、細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１を上方から下方へ通過した被検液を外部に排出するための排出流路６１と、排出流路６１に対し被検液を移動させる排出領域６２とが設けられている。
【００２６】
具体的には、流路部材６には排出流路６１が形成されている。流路部材６の上部には、シール部材７を介して枠材５が設けられている。枠材５は、内側にフィルタ領域２２に対応した開口が形成された環状の部材である。この枠材５により囲まれた領域が排出領域６２とされる。細胞捕捉フィルタ２と枠材５との間にはシール部材８が設けられる。
【００２７】
枠材５及び流路部材６は、樹脂等によって構成することができる。枠材５は、例えばＰＭＭＡ（Poly(methyl methacrylate)）によって構成することができる。また、流路部材６は、例えば、排出流路６１をシリコンチューブにより形成して、その周囲をＰＤＭＳ（poly(dimethylsiloxane)）により覆うことで成形する構成とすることができる。シール部材７，８はそれぞれ細胞捕捉フィルタ２、枠材５及び流路部材６に対して密着性を有する材料により構成されることが好ましい。また、枠材３、シール部材７，８としては、例えば、in situ PCR seal (Bio-Rad Laboratories社製)を用いることができる。
【００２８】
このように形成した細胞捕捉デバイス１は、排出流路６１をポンプ等に接続し、ポンプによる吸引によって被検液等を吸引することで、被検液が細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１を通過すると共に通過できない細胞が細胞捕捉フィルタ２の上面側に捕捉される。
【００２９】
なお、被検液を導入する前には、例えばＰＢＳ（０．５％  ＢＳＡ（N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））等によって細胞捕捉デバイス１内を満たしておくことにより、被検液を好適に導入することができる。また、細胞を捕捉した後も、ＰＢＳ等によって捕捉された細胞の洗浄処理を行うことが好ましい。なお、捕捉した後の細胞については、固定液、染色液等を用いて所望の処理を行ってもよい。この場合、細胞捕捉デバイス１内に固定液、染色液等を導入して所定の時間静置した後に、ＰＢＳにより洗浄する方法を用いることができる。
【００３０】
次に、細胞捕捉デバイス１からの細胞の単離方法について、図５を参照しながら説明する。図５は、細胞捕捉デバイス１を用いた細胞の単離方法を説明する図である。まず、図５（Ａ）に示すように、被検液を細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１を通過することで、例えばＣＴＣ等の捕捉対象の細胞が貫通孔２１上に捕捉される（細胞捕捉ステップ）。この際、捕捉対象であるＣＴＣ９１の他に、血中成分である赤血球９２及び白血球９３等の他の細胞も細胞捕捉フィルタ２上に捕捉されることがある。
【００３１】
次に、刺激応答性ハイドロゲルを細胞捕捉フィルタ２の細胞が捕捉されている上面側に導入して刺激応答性ハイドロゲル３１により捕捉された細胞を包埋する（ゲル包埋ステップ）。刺激応答性ハイドロゲル３１は、温度、電場、光等の外部環境のわずかな変化に応答して、親・疎水性などの物理化学的特性が劇的に変化するハイドロゲルのことをいう。本実施形態に係る細胞単離方法では、刺激に応答して、硬化するゲルが好適に用いられる。
【００３２】
このような刺激応答性ハイドロゲルとしては、例えば、Polyethyleneglycol diacrylate（ＰＥＧＤＡ）を用いることができる。ＰＥＧＤＡは、図６に示すように、紫外線照射により架橋構造を得ることができる。また、他の刺激応答性ハイドロゲルとしては、Poly(N-isopropylacrylamide)（ＰＮＩＰＡＡｍ）、キトサンゲル等が挙げられる。
【００３３】
ＰＥＧＤＡを用いる場合、例えば、2-hydroxy-2-methylpropiophenoneを添加した溶液を細胞捕捉フィルタ２上に導入して枠材３上からカバーガラスを積層する方法を用いることができる。
【００３４】
ＰＥＧＤＡを用いる場合、刺激応答性ハイドロゲルの導入量は、単離対象の細胞を包埋することができる量であれば特に制限されないが、例えば、細胞捕捉フィルタ２上に導入された刺激応答性ハイドロゲルの高さが１００μｍ〜６００μｍ程度となるように、導入することが好ましい。このような範囲とすることにより、１０μｍ〜数１０μｍ程度の大きさの単離対象の細胞を好適に包埋することができる。また、硬化後のハイドロゲルの取り扱い性が向上する。高さが１００μｍ以下である場合には硬化後のハイドロゲルの取り扱いが難しくなる。また、高さが６００μｍよりも高くなると、硬化する領域の大きさを好適に制御することが難しくなる可能性がある。刺激応答性ハイドロゲルの導入量について、より好ましくは、高さが２００μｍ〜３００μｍ程度とされる。
【００３５】
次に、図５（Ｃ）及び図５（Ｄ）に示すように、刺激応答性ハイドロゲル３１を硬化させる（ゲル硬化ステップ）。刺激応答性ハイドロゲル３１が光硬化性の場合には、光源からの光を捕捉対象の細胞の周囲に対してのみ光を照射することにより、細胞の周囲のみを硬化させることができる。なお、刺激応答性ハイドロゲル３１としてＰＥＧＤＡを用いる場合、紫外線レーザ光を照射することで、細胞の周囲のＰＥＧＤＡを硬化させることができる。細胞の周囲の刺激応答性ハイドロゲルを選択的に硬化させることにより、他の細胞とは別に当該細胞を硬化させることができる。
【００３６】
その後、図５（Ｅ）に示すように、硬化後の刺激応答性ハイドロゲル３２を細胞捕捉フィルタ２上から剥離する（剥離ステップ）。これにより、単離対象の細胞（ＣＴＣ９１）を個別に取り出すことができる。剥離した後は、ハイドロゲル中から細胞を個別に取出してもよいし、そのまま分析に使用してもよい。
【００３７】
ここで、刺激応答性ハイドロゲルとしてＰＥＧＤＡを用いる場合について詳細を検討した結果を示す。
【００３８】
細胞捕捉フィルタ２として、直径８μｍの貫通孔２１が間隔１２５μｍで格子状に配置されたＮｉ基板を準備した。また、捕捉対象の細胞として、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞またはＨＣＣ８２７細胞１００又は１０００ｃｅｌｌｓを健常者血液およびＰＢＳ（０．５％  ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍｌ中に添加したものを被検液とした。
【００３９】
まず、細胞捕捉デバイス１に対してＰＢＳ１ｍｌを導入し、細胞捕捉デバイス１内のＰＢＳで満たした。次に、細胞捕捉デバイス１内に被検液を導入し、ペリスタルティックポンプを用いて流量１５０−１７５０μｌ／ｍｉｎで送液した。その後、被検液中の血球成分を流きるためにＰＢＳ１ｍｌを導入して洗浄を行い、ペリスタルティックポンプにより溶液を吸引操作することによって、細胞捕捉デバイス１内のＰＢＳを除去すると共に、細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１上に細胞を捕捉した。その後流量を２００μｍ／ｍｉｎに変更し、細胞固定処理として４％paraformaldehyde（ＰＦＡ） in PBSを導入し、１５分間静置した。細胞捕捉デバイス１内を、ＰＢＳによりPFA in PBSを洗浄し、0.2% TritonX-100 in PBSに置換して１５分間静置することで透過処理を行った。次に、ＰＢＳにて洗浄した後、染色液（FITC標識抗cytokeratin抗体、PE標識抗CD45抗体、Hoechst33342）に置換して３０分間静置することで染色を行った。その後、ＰＢＳにて洗浄した。
【００４０】
その後、Mn 250、575、700のＰＥＧＤＡに対して、2-hydroxy-2-methylpropiophenoneを１．０％の割合で添加した溶液を作成して、細胞捕捉デバイス１の細胞捕捉フィルタ２上に導入し、その上面にカバーガラスを積層した。その後、細胞捕捉デバイス１を共焦点レーザ走査型顕微鏡(FV1000-D IX81;Olympus社製)に設置し、１０倍対物レンズを用いて基板上の単離対象細胞を選択した。対物レンズ１００倍油浸レンズに切り替えた後に、レンズをカバーガラスに接触させ、レーザ強度1.4mW、波長405nmの励起光を180 秒間照射し、局所的にＰＥＧＤＡを硬化させた。その後、カバーガラスを剥離し硬化したハイドロゲルを細胞捕捉フィルタ２上から剥離することで、ハイドロゲル中に包埋された細胞を単離することができた。
【００４１】
細胞捕捉フィルタ２上でカバーガラス５１に覆われた後に光により硬化するハイドロゲル３２の形状を模式的に示したものが図７である。ハイドロゲル３１のうち、破線で示す光線Ｌに囲われた領域が硬化する。また、剥離したハイドロゲル（ＰＥＧＤＡ）の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮影した結果を示したものが図８である。図８（Ａ）は、剥離したハイドロゲルの全体像である。また、図８（Ｂ）は、剥離したハイドロゲルが存在した領域を破線で示した像である。また、図８（Ｃ）は、細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１周辺に対応するハイドロゲルの拡大像であり、細胞を捕捉していることを示したものである。
【００４２】
硬化後のハイドロゲル３２は、幅（細胞捕捉フィルタ２と対向する面での大きさ）が１００μｍ〜４００μｍ程度となり、高さが１００μｍ〜５００μｍ程度となる。また、レーザ光をＰＥＧＤＡに対して照射した場合、硬化後のハイドロゲルは、図７に示すように中央部分が線対称のくびれを有する形状となる。このときのくびれＳ（図７参照）は、対物レンズの焦点面であると考えらえる。なお、くびれＳの有無等のハイドロゲルの形状は、レーザ光照射条件又はハイドロゲルの高さ等によって変更される。硬化後のハイドロゲルがくびれＳを有する場合、ピンセット等でハイドロゲルを保持することが容易になるため、取り扱い性が向上する。また、細胞が包埋されたハイドロゲルは、細胞単体と比較して十分大きくなるため、肉眼でも視認が可能となる。したがって、細胞単体を取り扱う場合と比較して、取り扱い性がさらに向上する。
【００４３】
硬化後のハイドロゲル（ＰＥＤＧＡ）の高さを２００μｍ〜３００μｍとした場合、レーザ光による硬化領域について、細胞捕捉フィルタ２に対向する側の面（単離対象の細胞が存在する側の面）において半径２５０μｍ以下とすることができた。硬化領域の面積を小さくすることができれば、細胞の単離精度が向上することができるため、ＰＥＤＧＡの高さは２００μｍ〜３００μｍとすることが好ましい。一方、複数の細胞をその位置関係を維持したまま細胞捕捉フィルタ２から剥離することを目的とした場合には、ＰＥＤＧＡの高さ等の条件は適宜変更することができる。
【００４４】
なお、上記のようにＰＥＤＧＡを用いて単離した細胞について、全ゲノム増幅反応を行ったところ、ＰＥＤＧＡを用いずに細胞を単離した場合と同様に、遺伝子量が４５−５３万倍程度に増幅されることが確認された。すなわち、ＰＥＤＧＡのハイドロゲルによるゲノム増幅阻害は確認されなかった。なお、細胞がＰＥＤＧＡのハイドロゲルに全て包埋されている場合には、全ゲノム増幅に関与する酵素等が細胞に接近できなかったため、遺伝子量の増幅が生じないことも確認されたため、細胞の一部が外部に露出した状態であれば、全ゲノム増幅が可能であることから、単離された細胞に係る解析（遺伝子変異解析等）等を実施することが可能である。
【００４５】
以上のように、本実施形態に係る細胞単離方法では、細胞捕捉ステップにおいて細胞が捕捉された細胞捕捉フィルタ２の一方の面上に刺激応答性ハイドロゲルを導入し、当該刺激応答性ハイドロゲルにより細胞を包埋した後、刺激応答性ハイドロゲルに対して刺激を与えることで、当該刺激応答性ハイドロゲルを硬化させ、硬化した刺激応答性ハイドロゲルを細胞捕捉フィルタから剥離する。このように、刺激応答性ハイドロゲルを用いて細胞を単離することにより、細胞が刺激応答性ハイドロゲルに包埋された状態で細胞を操作するため、単離対象の細胞を直接操作する場合と比較して取り扱い性が向上し、細胞を損傷させることなく単離することが可能となる。
【００４６】
特に、ゲル硬化ステップにおいて、前記細胞を包埋した前記刺激応答性ハイドロゲルのうち単離対象の前記細胞の周囲のみを局所的に硬化させる構成とした場合には、細胞毎に個別に硬化されたハイドロゲルを操作することができるため、取り扱い性がさらに向上する。
【００４７】
また、上記の細胞単離方法に用いられる細胞捕捉フィルタ２は、一方の面側において隣接する貫通孔２１間の距離が８０μｍ以上である構成とすることで、隣接する貫通孔に捕捉された細胞がハイドロゲルによって一度に硬化されることを防ぐことができるため、細胞の単離を好適に行うことができる。従来は、細胞捕捉の速度を向上させるため、例えば、貫通孔間の距離を６０μｍ程度としていた。この場合には、細胞の捕捉自体は好適に行われるものの、貫通孔毎に個別にハイドロゲルを硬化させることが困難であるため、ハイドロゲルを用いて細胞を１つずつ単離することが難しかった。これに対して、細胞捕捉フィルタ２における貫通孔２１間の距離を大きくすることで、ハイドロゲルを用いた細胞毎の単離を好適に行うことができる。なお、複数の細胞が１つのハイドロゲル中に含まれた状態でハイドロゲルを硬化させて取り出してもよい場合には、貫通孔２１間の距離は８０μｍよりも小さくてもよい。この場合であっても、ハイドロゲルを用いることで、捕捉後の細胞の単離を好適に行うことができる。
【００４８】
以上、本実施形態に係る細胞単離方法及び細胞捕捉フィルタについて説明したが、本発明に係る細胞単離方法及び細胞捕捉フィルタは、上記実施形態に限定されず、種々の変更を行うことができる。
【００４９】
例えば、細胞捕捉フィルタが用いられる細胞捕捉デバイスは上記実施形態の構造に限定されず適宜変更される。細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１に単離対象の細胞が捕捉できればよく、その形状等は限定されない。また、細胞捕捉フィルタ２の貫通孔２１の形状等についても特に限定されず、開口形状としては、楕円、正方形、長方形、角丸長方形、多角形等が例示できる。なお、細胞の捕捉効率の観点からは、円、長方形又は角丸長方形が好ましい。角丸長方形とは２つの等しい長さの長辺と２つの半円形からなる形状である。
【符号の説明】
【００５０】
１…細胞捕捉デバイス、２…細胞捕捉フィルタ、３，５…枠材、６…流路部材、７，８…シール部材、６１…排出流路、６２…排出領域。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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