(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する上皮性悪性腫瘍に対して免疫応答を誘起するための、
同じ割合で、計２００μｇ／用量のＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体の膜貫通領域を含まない細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、並びに
ガングリオシドＧＭ３と髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体との結合によって形成された非常に小さいサイズのプロテオリポソーム
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
薬学的に許容されるアジュバントをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
薬学的に許容されるアジュバントが、鉱油又はアルミナを含む、請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する上皮性悪性腫瘍に対する免疫応答の誘起に使用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
隔週で、少なくとも５回の皮下投与し、その後、
維持投与として少なくとも１年間にわたり毎月皮下投与される、
請求項１に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの健康に適用されるバイオテクノロジー及び免疫学に関する。本発明は、特に悪性腫瘍の治療のためのワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体は、ＥｒｂＢファミリーとして知られる受容体のファミリーに属する、チロシンキナーゼ活性を有する膜貫通型糖タンパク質である（Ｎｏｒｍａｎｎｏ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６，（３）：２４３−２５７）。Ｈｅｒ１は、肺、乳房、頭頚部、直腸結腸、膵臓、膀胱、卵巣腫瘍、神経膠芽腫において過発現される（ＴＭ  Ｂｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１（９）：７７７−７９２）；（Ｚｈａｕ  ＨＹ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３，（２６）：１５１５２−１５１５７；Ｌｉｕ  ＸＨ，ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ７７（６）：１４７２−１４７８；Ｎｅａｌ  ＤＥ，ｅｔ  ａｌ，（１９８５）  Ｌａｎｃｅｔ  １（８４２５）：３６６−３６８；Ｇｕｌｌｉｃｋ  ＷＪ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４６（１）：２８５−２９２；Ｓａｌｏｍｏｎ  ＤＳ，ｅｔ  ａｌ，（１９９５）  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９（３）：１８３−２３２）。Ｈｅｒ１の過発現は、頭頚部腫瘍及び肺癌における予後不良、疾患再発の高リスク（Ｔｕｒｋｅｒｉ  ＬＮ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５１（４）：６４５−６４９；Ｃｈｏｗ  ＮＨ，ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７（２Ｂ）：１２９３−１２９６）、卵巣、結腸、膀胱、甲状腺及び頭頚部癌を有する患者の生存率の低下に関連する（Ｇｒａｎｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｒ  ６９（１）：５５−６２）。
【０００３】
さらに、Ｈｅｒ１の発現レベルは、従来型療法に対する耐性と相関する（Ｈｏｌｂｒｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２８４（１）：９９−１１０）。また、正常組織中での発現と比べて異常なＨｅｒ２受容体の発現が、乳房、胃、卵巣及び前立腺腫瘍で見出されている（Ｔａｉ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４６（３）：２６４−２７５）。加えて、この受容体の脱制御が気道の悪性形質転換において観察されており（Ａｎｄｒａｄｅ  Ｆｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、これは、抗Ｈｅｒ１療法に対する腫瘍耐性の機構である（Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１（９）：７７７−７９２）。乳房腫瘍におけるＨｅｒ２の過発現は、より低い総生存率及び無再発生存率と互いに関係付けられている。
【０００４】
上述の腫瘍の多くは、高レベルのＨｅｒ１及びＨｅｒ２を同時発現し、両受容体の過発現は、患者生存率の低下に関連する（Ｗｉｓｅｍａｎ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ．Ｍａｙ  １；１０３（９）：１７７０−７）。Ｈｅｒ２陽性乳房腫瘍を有する患者は、疾患に関連する死亡の高いリスクを有し、これに加えて、これらの腫瘍におけるＨｅｒ１及びＨｅｒ２の同時発現は、このリスクを著しく増加させ、このことは、これら癌腫におけるＨｅｒ１の発現が、Ｈｅｒ２の発現に及ぼす相乗効果を有することを示している（Ｓｕｏ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９６（１）：１７−２５）。細胞の悪性転換中にこれらの受容体間で相乗的相互作用が存在することが、実験的に立証されている（Ｋｏｋａｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８（２）：２８７−２９２）。Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２の同時発現が見出された腫瘍の他の例は、脳、卵巣、頭頚部、肺、食道及び結腸の癌である（Ｅｍａｎｕｅｌ  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ，（２００８）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７３（２）：３３８−３４８；Ａｋｏ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  １７（４）：８８７−８９３；Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１（１）：７８−８６）。
【０００５】
腫瘍におけるＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体の異常な発現及び同時発現の生理学的役割が文献中に十分に記載されている。これらの受容体は、二量体及びヘテロ二量体の形成を通して（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ  １５（１０）：２４５２−２４６７）、持続的増殖、血管新生、アポトーシスの阻害、代謝的再プログラミング並びに浸潤能及び転移能などの腫瘍生物学における重要なプロセスを制御する（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）Ｃｅｌｌ  １４４（５）：６４６−６７４）。
【０００６】
両受容体Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、一回膜貫通ドメイン及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる類似した構造を有する。Ｈｅｒ１のＥＣＤ（ＥＣＤ−Ｈｅｒ１）及びＨｅｒ２のＥＣＤ（ＥＣＤ−Ｈｅｒ２）は、それぞれ１０５及び１１０ｋＤａの分子量を有し、分子の残部のものとは異なる空間における立体配座を有し得る。ＥＣＤは、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶと命名された４つのサブドメインを含む。サブドメインＩ及びＩＩＩは、リガンド結合部位を形成し、潜在的グリコシル化部位を含有する領域である。サブドメインＩＩは、受容体間の二量体化のために重要な領域であり、これは「二量体化アーム」と呼ばれる（Ｇａｒｒｅｔｔ  ＴＰ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｃｅｌｌ  １１０（６）：７６３−７７３；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １１（２）：５０７−５１７）。
【０００７】
７つのＨｅｒ１リガンドが記述されており、それらの中で腫瘍形成に最も関連するものは、受容体を発現する上皮細胞の増殖を促進する上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）及びアンフィレグリン（Ｎｏｒｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）  Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ６（３）：  ２４３−２５７）である。ＥＣＤ−Ｈｅｒ１は、動的平衡状態として存在し、「閉鎖」立体配座及びサブドメインＩＩがより柔軟な状態で存在する立体配座を含む複数の立体配座を有する。リガンドの結合は、平衡状態を、二量体化を行う能力がある立体配座の状態である「伸長」又は活性立体配座にシフトさせる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＫＭ，（２００８）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３７：  ３５３−３７３）。
【０００８】
しかしながら、Ｈｅｒ２に特異的なリガンドが発見されている。この受容体はその二量体化サブドメインを露出する構成形態の活性又は「伸長」立体配座を有するため、この受容体を介したシグナル伝達は増殖因子を必要としない（Ｃｈｏ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  ４２１（６９２４）：７５６−７６０）。この理由から、Ｈｅｒ２受容体は、Ｈｅｒ１を含むＥｒｂＢファミリーの全ての他のメンバーにとって好ましい二量体化パートナーである（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５（４）：３１７−３２８）。Ｈｅｒ２とのヘテロ二量体化は、Ｈｅｒ１のエンドサイトーシスの程度の減少及びヘテロ二量体を形成する受容体の膜への再利用の増加に寄与する（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ  Ａ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ  １７（１２）：３３８５−３３９７）。
【０００９】
Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（２００９）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ９（７）：４６３−４７５）により記載されるように、リガンド誘起二量体化は、受容体の細胞質領域のチロシン残基の自己リン酸化及びリン酸基転移を可能にする。生成されたホスホチロシン残基は、複数の細胞内シグナル伝達経路を開始する。開始されたシグナル伝達経路のうちの１つは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のものであり、この活性化カスケードは、細胞外制御タンパク質キナーゼＥｒｋ１及びＥｒｋ２に関与する。これらは、細胞周期のＧ１／Ｓ期への進行を促進するサイクリンＤ１などの、細胞増殖に関与する遺伝子の転写を増加させる転写因子の発現を誘起する。ヘテロ二量体の組合せが最も強力なシグナル伝達複合体であり、細胞周期の直接制御を有する（Ｐｉｎｋａｓ−Ｋｒａｍａｒｓｋｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）ＥＭＢＯ  Ｊ  １５（１０）：２４５２−２４６７）。
【００１０】
これらの腫瘍標的は、臨床試験において広範囲にわたって検証が行われている。ゲフィチニブ及びラパチニブなどの、これらの受容体のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）による治療の臨床効果が評価されている（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６（５）：２０５３−２０６３；Ｋｏｎｄｏ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２３（４）：９５７−９６３）。Ｈｅｒ１のＥＣＤに特異的であるセツキシマブ（Ｊｅａｎ  ＧＷ  ｅｔ  ａｌ，（２００８）  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ８（６）：７４２−５４）及びニモツズマブ（Ｒａｍｏｓ  ＴＣ，  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５（４）：３７５−３７９）、並びにＨｅｒ２のＥＣＤを認識するトラスツズマブ（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ  Ａ，（２００７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ；３５７：３９−５１）などの上述の標的に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いる治験からの報告もある。セツキシマブなどのこれら治療薬のいくつかの強力な抗腫瘍効果にもかかわらず、耐性の分子機構、中でも、このファミリーの別の受容体、例えばＨｅｒ２の発現のレベルの増加が報告されている（Ｂｒａｎｄ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１（９）：７７７−７９２）。これに反して、Ｈｅｒ２ヘテロ二量体を発現する乳癌及び肺癌におけるペルツズマブ抗Ｈｅｒ１ネズミＭＡｂに対する良好な応答が、ＥｒｂＢファミリーの他のメンバーで見出されている（Ａｇｕｓ  ＤＢ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３（１１）：２５３４−２５４３）。これは、ヘテロ二量体化の阻害が癌療法にとって魅力的な戦略であるという考えを裏付けるものである。
【００１１】
さらに、癌ワクチンによる積極的な療法が、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２を発現する腫瘍を有する患者における免疫系応答を活性化することを目的とする新しい治療選択肢として浮上してきた。しかしながら、この種の療法は腫瘍の抑制効果によって低下した免疫系の刺激を伴い、このことが、有効な応答を生じさせることを助けするために、ワクチン製剤にアジュバントを用いることを必要とさせるため、この種の療法には困難な課題がある。このような例は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質に由来する非常に小さなサイズのプロテオリポソーム（ＶＳＳＰ）のアジュバントの場合であり、２００１年１２月６日に出願されたＷＯ  ０２／４５７４６号特許に記載されているように、ＶＳＳＰは、樹状細胞（ＤＣ）を活性化し且つ免疫応答を１型ヘルパーＴ細胞応答（Ｔｈ１）のパターンに向かって偏向させることができる。Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体は、前臨床試験及び臨床試験で評価された種々のワクチン候補物質の標的であった。Ｈｅｒ２に基づくワクチンの設計において、ＤＣワクチン（Ｃｚｅｍｉｅｃｋｉ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６７（４）：１８４２−１８５２）、Ｈｅｒ２ペプチド及びＥＤＣ−Ｈｅｒ２が用いられている（Ｌａｄｊｅｍｉ  ＭＺ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５９（９）：１２９５−１３１２）。乳癌患者での第ＩＩ相臨床試験において、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をアジュバントとして用いる、Ｈｅｒ２  ＥＣＤに由来し且つＭＨＣ−Ｉによって提示されるペプチドｐ３６９−３７７（ペプチドＥ７５）による能動免疫が評価された。このワクチンは、Ｈｅｒ２を過発現する細胞に対して、特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をインビボで生じさせることができ、現在第ＩＩ相臨床試験の段階にある（Ｋｎｕｔｓｏｎ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８（５）：１０１４−１０１８；Ｐａｔｉｌ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１０）Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ  ２１０（２）：１４０−１４７）。加えて、Ｈｅｒ２のＥＣＤに基づき、ＧＭ−ＣＳＦをアジュバントとする治療用ワクチンが設計され、このワクチンは、Ｈｅｒ２を発現する癌の増殖を遅延させ、免疫した動物の生存期間を延長することができる（Ｈｅｌｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｖａｃｃｉｎｅ  １６；２４（３）：３０４−１６）。
【００１２】
ガングリオシドに対する抗体応答を刺激若しくは増加し、免疫原及び免疫学的アジュバントを含むワクチン組成物は、特許出願ＥＰ−Ａ−６６１０６１号及び米国特許第６，１４９，９２１（Ａ）号に記載されている。記載された免疫原は、Ｎ−アセチル化ガングリオシドＧＭ３（Ｎ−ＡｃＧＭ３）及びＮ−グリコリルＧＭ３（Ｎ−ＧｃＧＭ３）と髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）との結合によって形成されたＶＳＳＰである。免疫原Ｎ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及びＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰは、非常に小さいサイズであり、実際には電子顕微鏡では見ることができず、水に可溶性であり、且つ高い浮揚性を有する。特許ＷＯ−Ａ−０２１４５７４６号は、（Ａ）１つ又は複数の低免疫原性抗原、（Ｂ）ガングリオシドを組み入れたＶＳＳＰ、主としてＮ−ＡｃＧＭ３／ＶＳＳＰ及びＮ−ＧｃＧＭ３／ＶＳＳＰ、並びに（Ｃ）任意選択で１つ又は複数のアジュバントを含有するワクチン組成物を記載している。特に、その活性成分がＥＣＤ−Ｈｅｒ１であり、ＶＳＳＰ及びモンタニドＩＳＡ５１  ＶＧをアジュバントとして用いるワクチンが記載されている。このワクチンを用いる前臨床試験は、インビトロ及びインビボにおけるその抗腫瘍効果を立証した（Ｒａｍｉｒｅｚ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９（９）：２１９０−２１９９；Ｒａｍｉｒｅｚ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６（３８）：４９１８−４９２６）。
【００１３】
これらの結果は一価療法で得られたものであるが、これらの療法は、腫瘍塊を完全に除去することができず、最終的に腫瘍のサイズが減少する場合であっても、耐性変異体が生じた後に、腫瘍が復帰するため、十分効果的ではなかった。このことは、特異的攪乱が腫瘍などの複雑な生物学的な系を抑止することができないことを示唆している。これについての説明は、ＥｒｂＢファミリーのメンバーを標的とする単剤療法によって生じた耐性変異体が、このファミリーの他のメンバーの発現レベルを増加させ（Ｂｒａｎｄ  ＴＭ，ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１（９）：７７７−７９２）、これにより腫瘍を免疫系の攻撃から回避させることであり得る。このため、１つを超えるＥｒｂＢ受容体の不活性化を介した腫瘍生物学における複数の攪乱が、効力の増加をもたらし得る。
【００１４】
特許出願ＷＯ−Ａ−０２１４５７４６号は、増殖因子受容体Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２及びＰＤＧＦ−Ｒ又は膜貫通領域の有無を問わず、細胞外ドメインを含有するその任意の変異体を含む組成物も特許請求している。しかしながら、この出願も当該技術分野の任意の他の文献も、ワクチン接種した個体において抗体の産生を誘起するのに有効な二価ワクチンを生成するために、２つの受容体、特にＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤを組み合わせる方法は教示してはいない。
【００１５】
本発明の著者らは、同じ割合でＨｅｒ１及びＨｅｒ２のＥＣＤ並びにＶＳＳＰ−ＧＭ３を混合すると、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２のリン酸化を阻害する抗体価の産生を誘起できるワクチン組成物が得られ、これらの抗体が腫瘍細胞に対して抗増殖効果を有することを発見した。本発明者らはまた、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２のＥＣＤを組み合わせる割合が、所望の免疫応答を得るために重要であり、すなわち、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤのどの組合せでもこの免疫応答を引き起こすのではないことも見出した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、同じ割合のＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ並びにＶＳＳＰ−ＧＭ３を有する、皮下投与用の新しいワクチン組成物である。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、増殖因子Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２の受容体を発現する腫瘍によって引き起こされる疾患に罹患した患者を治療する方法であって、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ並びにＶＳＳＰ−ＧＭ３のワクチン組成物の皮下投与を含み、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤは、等しい割合で見出される方法である。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、同じ割合のＨｅｒ１及びＨｅｒ２のＥＣＤ並びにＶＳＳＰ−ＧＭ３、さらに油性又は非油性であってもよい追加のアジュバントを有するワクチン組成物である。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する悪性腫瘍の治療のために免疫応答を誘起する方法である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する悪性腫瘍に対する免疫応答を誘起するために用いられる、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ又はその断片を含むワクチン組成物に関する。このワクチン組成物は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜のタンパク質から精製された非常に小さいサイズのプロテオリポソーム及びＧＭ３（ＶＳＳＰ−ＧＭ３）をさらに含む。特定の実施形態では、本発明の組成物は、薬学的に好適なアジュバントをさらに含む。これらの薬学的に好適なアジュバントとしては、高度に精製された鉱油及び界面活性剤などの油性アジュバント並びにアルミナなどの非油性アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、受容体のＥＣＤを組み合わせる割合が、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する悪性腫瘍に対する免疫応答の誘起に関連することを見出した。本明細書に記載される二価ワクチン組成物は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤを同じ割合で含む。Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤである両活性物質を他の割合で含む混合物は、免疫系に対して望ましい効果を有さない。一実施形態では、本発明の組成物は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤを約１００〜約８００μｇ／用量の濃度範囲で含む。より具体的には、本発明の組成物は、水溶液中で皮下投与される、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ又はその断片のいずれかを８００μｇ／用量で含み、さらに１．２ｍｇ／用量のＶＳＳＰ−ＧＭ３を含む。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、モンタニドＩＳＡ  ５１又はアルミナであり得るアジュバントと混合され得る、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ又はその断片、各８００μｇ／用量並びに１．２ｍｇ／用量のＶＳＳＰ−ＧＭ３のこれらの用量を含む。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する悪性腫瘍の治療法として、免疫応答の誘起において用いられる、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ又はその断片を含むワクチン組成物に関する。本発明の治療法は、約１００〜約８００μｇ／用量の用量範囲のＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ又はその断片、さらに約１．２ｍｇ／用量のＶＳＳＰ−ＧＭ３の２００μｇ／用量の皮下投与を含む。この投与は、隔週の皮下投与で、合計５回の投与で完了するものであってもよく、その後維持用量が１年間投与されよう。特定の実施形態では、本発明は、筋肉内投与されるアジュバントのモンタニドＩＳＡ  ５１を含むワクチン組成物を含む。
【００２４】
本発明は、タンパク質合成又は遺伝子工学技術によって得られるＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体のＥＣＤ又はその断片の使用を含む。本発明において、用語二価ワクチン製剤又は二価ワクチン組成物は、互換的に使用され、全ての場合で、これらは、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する悪性腫瘍に対する免疫応答を引き起こすために使用されるＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はその断片を含み、さらにＶＳＳＰ−ＧＭ３を含んでもよいワクチン組成物を指す。
【００２５】
このワクチン組成物で治療される悪性腫瘍としては、Ｈｅｒファミリーの少なくとも１つの受容体、特にＨｅｒ１及びＨｅｒ２を発現する腫瘍が含まれる。好ましくは、両方の受容体を発現する腫瘍、より好ましくは、両方の受容体を過発現するこれらの腫瘍である。好ましい実施形態では、本発明は、上皮起源の腫瘍、より具体的には、頭頚部、乳房、肺、結腸、膵臓、前立腺、膀胱及び卵巣の腫瘍並びに神経膠腫を含む。略語ＭＡｂ及びＰＡｂは、それぞれモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を指す。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】２００μｇのＶＳＳＰ中、１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で１４日毎に４回皮下免疫接種し、最後の免疫後３０日目のＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）におけるＩｇＧ  Ａｂの動態を示す図である。採血は７、２１、３５、５６、８７及び１０２日目に行い、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて免疫血清中のＩｇＧ  Ａｂ価を測定した。Ａｂ  ＩｇＧの動態は、各抽出日について対数（１／力価中央値＋１）として表され、この場合、ＥＣＤ−Ｈｅｒ１（ａ）及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２（ｂ）で被覆されていた。個々のマウス（ｎ＝５）のＡｂ応答を図に示し、この応答は、ＥＣＤ−ＨＥＲ１（ｃ）及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２（ｄ）に特異的であり、免疫プロトコールの８７日目に、Ａｂ価に１を加えた対数の逆数をプロットすることによって測定された。異なる文字は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）検定補正（ｐ＜０．０５）を用いる、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（処置群因子）によって検定された統計的有意性を示す。
【図２】フローサイトメトリーを用いた、二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２によって誘起された免疫血清によるＭＤＡＭＢ４６８及びＭＣＦ７／ＨＥＲ２腫瘍細胞系の認識を示す図である。上述のヒト腫瘍細胞系を、免疫プロトコールの３５日目に、免疫血清（ｎ＝５）と、又は１：２００に希釈された免疫前血清の混合物と、同様に受容体の発現の対照、すなわちＭＡｂのニモツズマブ及びトラスツズマブ（１０μｇ／ｍｌの濃度にて）と共にインキュベートした。その後、細胞をフルオレセインイソチオシアナート結合型ヤギＰＡｂ抗マウスＩｇＧで標識した。標識細胞をフローサイトメトリーにより可視化した。血清及びＭＡｂによって認識された細胞の割合を、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア  バージョン５．７．２を用いて決定した。異なる文字は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）検定補正（ｐ＜０．０５）を用いる、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（処置群因子）によって検定された統計的有意性を示す。
【図３】フローサイトメトリーを用いた、二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２によって誘起された免疫血清によるＨ２９２腫瘍細胞系の認識を示す図である。ヒト腫瘍細胞を、免疫プロトコールの３５日目に、免疫血清（ｎ＝５）と、又は１：３００に希釈された免疫前血清の混合物と、同様に受容体の発現の対照、すなわちＭＡｂのニモツズマブ及びトラスツズマブ（１０μｇ／ｍｌの濃度にて）と共にインキュベートした。その後、細胞をフルオレセインイソチオシアナート結合型ヤギＰＡｂ抗マウスＩｇＧで標識した。標識細胞をフローサイトメトリーにより可視化した。血清及びＭＡｂによって認識された細胞の割合を、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア  バージョン５．７．２を用いて決定した。異なる文字は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）検定補正（ｐ＜０．０５）を用いる、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（処置群因子）によって検定された統計的有意性を示す。
【図４】二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２投与によって誘起された免疫血清により引き起こされたＨｅｒ１及びＨｅｒ２リン酸化の阻害を示す図である。Ｈ２９２細胞を、二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２によって誘起された５つの免疫血清の混合物中でインキュベートした。ＥＧＦによる刺激後及び異なる処置による刺激後のＨｅｒ１及びＨｅｒ２のリン酸化のレベルを、ウェスタンブロットにより決定した。未処置細胞を陰性対照として用い、免疫前血清（ＰＩ）の混合物による処置を特異性の陰性対照として用いた。ＴＫＩ  ＡＧ１４７８を阻害についての陽性対照として用いた。図は異なる処置により得たＰ−Ｈｅｒ１（ａ）及びＰ−Ｈｅｒ２（ｂ）のレベルを示す。棒グラフは、実行された２つの実験から選択された１つの代表的な実験から得た写真の濃度測定分析を示す。
【図５】Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチンによって誘起されたＡｂのＨ２９２腫瘍系に及ぼす抗増殖効果を示す図である。Ｈ２９２細胞を、免疫プロトコールの８７日目に、１：２に希釈された５つの免疫血清の混合物中で４８時間にわたってインキュベートした。この実験では、ＰＩ血清の混合物を陰性対照として用いた。細胞生存率を、光学密度（ＯＤ）の差を決定するＭＴＴ比色法により、６２０ｎｍにおけるＯＤの値に対して５４０ｎｍにおけるＯＤの値を減算することによって決定した。最大生存率は、ＰＩ血清とのインキュベーションの吸光度の差を減算する場合に認められた。棒は各処置についての３回の３通りの実験の平均を表す。異なる文字は、ａ対ｂについてはｐ＜０．０１であり、ａ対ｃについてはｐ＜０．００１であるデュネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）Ｔ３検定に従う統計的有意性を示す。
【図６】等量又は等量ではない量の各受容体を含有するか二価ワクチン製剤Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２によって誘起されたＥＣＤ−Ｈｅｒ１及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２を認識するＡｂの力価を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を、群１では１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群２では１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び２００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群３では１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び３００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群４では２００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群５では３００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、１４日毎に４回、皮下免疫接種した。全ての製剤は、２００μｇのＶＳＳＰを含有した。ＥＣＤ−Ｈｅｒ１及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２に特異的な抗体価の決定は、５６日目に採取した血液からのＥＬＩＳＡアッセイによって血清で行った。Ａｂ  ＩｇＧの動態は、各抽出日について、対数の逆数プラス１の中央値として表される。個々のマウス（ｎ＝５）のＩｇＧ  Ａｂの応答を、抗体価の逆数をプロットすることによって決定した。  ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）検定補正（ｐ＜０．０５）を用いる、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（処置群因子）によって検定されるとき、統計的な差は観察されなかった。以下の実施例は、例示を意味するものにすぎず、主張された発明を決して限定するものではない。
【実施例】
【００２７】
（例１）Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチンにより誘起されたＥＣＤ−Ｈｅｒ１及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２に対する特異的抗体価
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２を含有する二価ワクチン製剤で皮下免疫接種した。マウスの第２群を、１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１を含有する一価ワクチン製剤で免疫し、第３群を、１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２を含有する一価ワクチン製剤で免疫した。上述の３つのワクチン製剤は２００μｇのＶＳＳＰアジュバントを含有した。免疫は、０、１４、２８、４２及び７２日目に行い、血清を処理するために−２、２１、５６、８７及び１０２日目に血液を採取した。血清中のＨｅｒ１及びＨｅｒ２のＥＣＤに対する特異的抗体価を、ＥＬＩＳＡ法を用いて決定した。
【００２８】
Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチンで免疫したマウスは、ＥＣＤ−Ｈｅｒ１及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２に対する特異的ＩｇＧアイソタイプ抗体を生じた。これらの受容体のそれぞれに対して誘起された抗体価は、対応の一価ワクチンによって誘起されたものと差がなかった。ＥＣＤ−Ｈｅｒ１に対する抗体応答の場合、Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチン及び一価ワクチンの双方によって誘起された力価は、１／１０．０００値に達した。二価及び一価ワクチンの双方によって誘起されたＥＣＤ−Ｈｅｒ２に対する応答は、１／２００．０００の抗体価値に達した（図１）。
【００２９】
この結果は、単一のワクチン製剤中で２つの受容体を混合することは、これらのそれぞれの免疫原性に個々に影響を及ぼすことはなく、このワクチン製剤の潜在的な使用を裏付けることを示している。
【００３０】
（例２）二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２により誘起された血清によるＨｅｒ１＋／Ｈｅｒ２−、Ｈｅｒ１−／Ｈｅｒ２＋腫瘍系の認識
１／２００で希釈された二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２で免疫したマウスからの血清を異なる腫瘍細胞系：乳癌に由来するＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１３２）、及びＭＣＦ７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）細胞系の完全長Ｈｅｒ２によるトランスフェクションから生じたＭＣＦ７／Ｈｅｒ２の細胞１０５個と共にインキュベートした。ＰＩ血清を特異的の陰性対照として用いた。Ｈｅｒ１を認識するＭａｂのニモツズマブ、Ｈｅｒ２を認識するハーセプチンモノクローナル抗体を陽性対照として用いた。
【００３１】
二価ワクチンによって生じた血清は、一価ワクチンＨｅｒ１によって生じた血清と同じ割合のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞を認識した。さらに、デュネットＴ３（ｐ＞０．０５）検定によると、二価ワクチンによって生じた血清は、一価ワクチンＨｅｒ２によって生じた血清と同じ割合のＭＣＦ７／Ｈｅｒ２細胞を認識した（図２）。これらの受容体の認識の強さも非常に類似していた（表１）。この結果は、短縮Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を含有する二価製剤により誘導された抗体は、腫瘍細胞膜内の完全長Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体の認識に影響を及ぼさないことを立証している。このことはまた、認識された細胞の数及び認識の強さの双方において、この認識が一価ワクチンからの血清により得られたものと同じであったために、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２に対する抗体が両受容体に基づく製剤から生成される場合、この認識の質には影響がないことも示している。
【表１】
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【００３２】
（例３）Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチンによって誘起された血清によるＨｅｒ１＋／Ｈｅｒ２＋腫瘍系の認識
１／３００で希釈したＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチン並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２で免疫されたマウスからの血清を肺の扁平上皮癌に由来する腫瘍細胞系Ｈ２９２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８４８）と共にインキュベートした。免疫前血清を陰性特異的対照として用いた。ＭＡｂのニモツズマブ及びＭＡｂのハーセプチンを陽性対照として用いた。デュネットＴ３検定（ｐ＜０．０５）によれば、認識されたＨ２９２細胞の割合は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２一価ワクチンによって生成された血清の認識と比べて、二価ワクチンによって生じた血清で統計的に高かった（図３）。
【００３３】
このことは、二価製剤によって誘起されたポリクローナル抗体が、細胞膜上で両方の受容体Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２を同時に認識するその能力のために、腫瘍細胞の認識のより高い閾値を有することを立証している。これは、二価ワクチンが、認識された受容体の数によって判定されるＨ２９２腫瘍細胞に及ぼす生物学的効果の点から、一価ワクチンに比してより高い潜在能力を有することを示唆している。このようなことは、腫瘍の増殖に関与するＨｅｒファミリーからの受容体の活性化の阻害の場合が当てはまる。
【００３４】
（例４）二価Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２ワクチンによるＨＥＲ１及びＨＥＲ２受容体の活性化の阻害
１／１００で希釈した二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２で免疫されたマウスからの血清をＨ２９２腫瘍細胞系由来の細胞と共にインキュベートした。細胞を１００ｎｇ／ｍＬのＥＧＦで１０分間刺激し、次いで溶解させた。免疫血清のＥＧＦＲリン酸化の阻害に及ぼす効果を、リン酸化ＥＧＦＲ及び総ＥＧＦＲの検出のための特異的抗体を用いて、ウェスタンブロットアッセイにより決定した。このアッセイでは、１０μＭのＡＧ１４７８チロシンキナーゼ阻害薬をリン酸化阻害の陽性対照として用い、ＰＩ血清を特異性の陰性対照として用いた。
【００３５】
二価ワクチンによって生じた血清は、リン酸化に関して測定されたＨｅｒ１及びＨｅｒ２受容体の活性化を一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２の血清よりも大きな程度まで阻害した。ウェスタンブロットから得た膜を濃度測定分析にかけた。濃度測定分析からのデータは、二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２によって誘起された免疫血清によって生じたＨｅｒ１リン酸化における減少は、ＰＩ血清に対して１１．２倍であったことを示した。同様な分析を一価ワクチンＨｅｒ１によって誘起された血清に対して行ったときに、Ｈｅｒ１リン酸化の減少は１．７倍であった。一価ワクチンＨｅｒ２の群から得た血清の場合、減少は２．２倍であった。Ｈｅｒ２の場合、Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチンで免疫されたマウスからの血清によって誘起されたＨｅｒ２リン酸化の減少は、ＰＩ血清に対して８．７倍であった。一価ワクチンＨｅｒ１によって誘起された血清で同様な分析を行った場合、Ｈｅｒ２リン酸化における減少は、１．７倍であり、一価ワクチンＨｅｒ２群から得た血清については、減少は３．５倍であった（図４）。
【００３６】
このことは、二価ワクチンの一価ワクチンに対する優位性を立証している。二価ワクチンは、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ２受容体のリン酸化を直接阻害し、これがリガンド結合をブロックし、二量体化アームに対してブロックする抗体を通してホモ二量体（Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２／Ｈｅｒ２）を形成し得たのみならず、Ｈｅｒ１／Ｈｅｒ２ヘテロ二量体の一部である受容体の活性化を低減することで、一価ワクチンよりも効率的でもあり得た。
【００３７】
（例５）Ｈｅｒ１＋Ｈｅｒ２二価ワクチンにより誘起された血清のＨｅｒ１＋／Ｈｅｒ２＋腫瘍系に及ぼす抗増殖効果
Ｈ２９２細胞を、１：２０で希釈された二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２並びに一価ワクチンＨｅｒ１及びＨｅｒ２で免疫されたマウスからの血清と共に４８時間インキュベートした。その後、培養上清を取り出し、ＭＴＴ試薬を１ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。４時間のインキュベーション後に、上清を取り出し、１００μＬのジメチルスルホキシドを添加し、ホルマザン結晶を溶解し、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、５４０ｎｍにおけるＯＤを６２０ｎｍにおけるＯＤ値に対して減算することによってＯＤの差を測定して、吸光度を測定した。生存細胞を、５４０ｎｍと６２０ｎｍとの間の吸光度における差を決定することによって評価した。ＰＩ血清において得られた吸光度の差を、最大生存率として取得した。
【００３８】
デュネットＴ３統計的検定（ｐ＜０．０５）によると、二価ワクチンＨｅｒ１＋Ｈｅｒ２によって誘起された血清で処置された腫瘍細胞は、一価ワクチンによって誘起された血清と共にインキュベートした腫瘍細胞よりも低い生存率を有した（図５）。これは、二価ワクチンの投与は、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２受容体を発現する一価ワクチンよりも、抗増殖効果の点で、細胞に及ぼす高い抗腫瘍効果を誘起したことを立証している。このことは、両受容体を発現する上皮腫瘍に対する効果的な治療薬であるその可能性を示唆している。
【００３９】
（例６）ＥＣＤ−Ｈｅｒ１及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２の非等価用量は、生成された抗体のＨ１２５／Ｈｅｒ１＋／Ｈｅｒ２＋を認識する能力を低下させる
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＥＣＤ−Ｈｅｒ１及びＥＣＤ−Ｈｅｒ２の非等価用量の組合せを含有する二価ワクチン製剤で皮下免疫した。群１は１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群２は１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び２００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群３は１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び３００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群４は２００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で、群５は３００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ１及び１００μｇのＥＣＤ−Ｈｅｒ２で免疫した。全ての上述のアジュバントワクチン製剤は、２００μｇのＶＳＳＰを含有した。免疫は、皮下注射を介して、０、１４及び２８日目に行い、４２日目に血液を採取し、血清を処理した。Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２のＥＣＤに対する特異的抗体価をＥＬＩＳＡ法を用いて決定し、上述の血清がＨｅｒ１及びＨｅｒ２を発現するＨ１２５腫瘍細胞系を認識するための能力をＦＡＣＳによって評価した（図６）。
【００４０】
免疫血清によって認識される腫瘍細胞の割合は、評価された全ての群について１００％であり、このことは、Ｈｅｒ１及びＨｅｒ２に対する抗体価を誘起するために評価された製剤の変形形態の能力によって説明される。しかしながら、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関して測定された認識の質は、両受容体が等価用量（表２）で組み合わされた、群１でより高かった。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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