(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレクサフルオール（登録商標）６４７を認識する抗体の重鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、該重鎖可変領域が、配列番号４に示すアミノ酸配列又は配列番号４と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列からなる、前記重鎖可変領域を構成するポリペプチド、及び
アレクサフルオール６４７を認識する抗体の軽鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、該軽鎖可変領域が、配列番号１０に示すアミノ酸配列又は配列番号１０と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列からなる、前記軽鎖可変領域を構成するポリペプチド
を含むことを特徴とする抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体。
【請求項２】
アレクサフルオール６４７を認識する抗体の重鎖を構成するポリペプチドであって、該重鎖が、配列番号６に示すアミノ酸配列又は配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、前記重鎖を構成するポリペプチド、及び
アレクサフルオール６４７を認識する抗体の軽鎖を構成するポリペプチドであって、該軽鎖が、配列番号１２に示すアミノ酸配列又は配列番号１２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる、前記軽鎖を構成するポリペプチド
を含むことを特徴とする請求項１記載の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２記載の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレクサフルオール（Alexa Fluor；登録商標、インビトロジェン社製）６４７のエピトープに結合することができる抗蛍光色素モノクローナル抗体や、該モノクローナル抗体を構成するポリペプチドや、該ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は研究用試薬、診断用試薬、各種物質モニター用試薬、抗体医薬等として、膨大な種類が開発・販売されている。抗体は、一般的に抗原で免疫した動物の血清から調製されるが、抗原は複数のエピトープ（抗原決定基）をもつことが多いため、単に血清から調製されたままでは、各々のエピトープに対する抗体が混ざっており、これをポリクローナル抗体という。一方、モノクローナル抗体は、免疫グロブリン分子種自体が均一であり、一つのエピトープに対する単一の分子種となるため、抗原特異性が全く同一の抗体となる。【０００３】
従来、モノクローナル抗体の作製には、抗原で免疫した動物の脾臓やリンパ節から取り出した抗体産生リンパ球のＢ細胞と、無限に増殖して免疫グロブリンを産生する形質細胞腫瘍の骨髄腫細胞を融合した、ハイブリドーマ細胞を用い、目的の抗体を産生する１個のハイブリドーマ細胞から増殖した細胞集団を、限界希釈法により分離し、該細胞集団が分泌する抗体を精製する方法がとられてきた。【０００４】
その他のモノクローナル抗体の作製法としては、目的の抗体が認識する抗原を標識化してなる標識化抗原を、前記抗体を産生するターゲット細胞を含む細胞集団に接触させ、前記標識化抗原を前記ターゲット細胞に結合させ、得られる標識化ターゲット細胞を分離し、分離した標識化ターゲット細胞を用いて、それが保有する抗体遺伝子を調製し、調製した抗体遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させる抗体作製方法［特許文献１］等が知られる。【０００５】
また、本発明者らは、既に確立した抗原特異的なヒト抗体を産生するＢ細胞を１細胞レベルで検出・同定し、ＰＣＲクローニング法により、直接抗体遺伝子を取得する技術［特許文献２］により、感染症やがん関連抗原に対する特異的なヒト抗体を産生するＢ細胞の検出が可能であることを示してきた。【０００６】
アレクサフルオール６４７は、以下の構造式を有し、その極大吸収波長が６５０ｎｍの蛍光物質である。また、蛍光物質を認識するモノクローナル抗体の応用としては、免疫組織化学におけるアルカリフォスファターゼ標識抗ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）抗体の二次抗体としての使用［特許文献３］や、抗Ｃｙ（登録商標）５モノクローナル抗体を結合させたマイクロビーズによる、Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５又はアレクサフルオール６４７標識の一次抗体で染色した細胞の間接磁気標識分離法［非特許文献１］等が知られている。【０００７】
【化１】
0006531262.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−１８０７０８号公報
【特許文献２】特許５２０５５９７号公報
【特許文献３】特許４００４３８５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Micro Beadsデータシート（ミルテニー社：Order no.130-091-395）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、アレクサフルオール６４７を認識する新規なモノクローナル抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、悪性グリオーマ患者１９症例において数種類のがん関連抗原タンパク（ＥＧＦＲ，ＶＥＧＦＲ２，ＶＥＧＦＲ３，ＣＤＨ１１等）に対する血液中のがん関連抗原に対する自家抗体価を測定していた。ＶＥＧＦＲ２に対する抗体価が最も高かった症例（患者）の末梢血Ｂ細胞を用いて、アレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２タンパク（細胞外ドメイン）とＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体による染色にて、ＶＥＧＦＲ２特異的な抗体をもつＢ細胞を選別し、更に、Single cell sorter (FACSAria, BD Bioscience)を用いて１細胞ごとのｍＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡクローニングを行った。クローニングされた抗体遺伝子を発現ベクターに組み込んで、バキュロウイルス発現系にて完全長抗体タンパクを発現・分泌させ、抗体を精製した。ＥＬＩＳＡ法にてＶＥＧＦＲ２−アレクサフルオール６４７及びＶＥＧＦＲ２タンパクに対する、精製抗体の結合活性を評価したところ、蛍光色素であるアレクサフルオール６４７特異的に結合活性を示すヒトモノクローナル抗体が、偶発的に同定された。本発明はこれらの知見に基づき完成に至ったものである。【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）アレクサフルオール６４７を認識するモノクローナル抗体。
（２）アレクサフルオール６４７を認識する抗体の重鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、該重鎖可変領域が配列番号２に示すアミノ酸配列からなる超可変領域を含むことを特徴とするポリペプチド。
（３）アレクサフルオール６４７を認識する抗体の重鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、該重鎖可変領域が配列番号４に示すアミノ酸配列、又は配列番号４と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（４）アレクサフルオール６４７を認識する抗体の重鎖を構成するポリペプチドであって、該重鎖が配列番号６に示すアミノ酸配列、又は配列番号６と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（５）アレクサフルオール６４７を認識する抗体の軽鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、該軽鎖可変領域が、配列番号８に示すアミノ酸配列からなる超可変領域を含むことを特徴とするポリペプチド。
（６）アレクサフルオール６４７を認識する抗体の軽鎖可変領域を構成するポリペプチドであって、該軽鎖可変領域が、配列番号１０に示すアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（７）アレクサフルオール６４７を認識する抗体の軽鎖を構成するポリペプチドであって、該軽鎖が、配列番号１２に示すアミノ酸配列、又は配列番号１２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
（８）上記（２）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
（９）上記（２）〜（４）のいずれかに記載のポリペプチド、及び上記（５）〜（７）のいずれかに記載のポリペプチドを含むことを特徴とする抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体。
（１０）上記（２）又は（３）に記載のポリペプチド、及び上記（５）又は（６）に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする上記（９）記載の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体。
（１１）上記（４）に記載のポリペプチド、及び上記（７）に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする上記（９）記載の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、アレクサフルオール６４７と特異的に結合するモノクローナル抗体を用いることから、アレクサフルオール６４７で標識された物質をモニタリングすることや、アレクサフルオール６４７で標識された物質を定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】サンドイッチＥＬＩＳＡ法において本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体を捕獲抗体として用い、検出抗体として酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる場合の一例の概略を示す図である。図中、「Ａｌｅｘａ６４７」はアレクサフルオール６４７を示す（図２、図５においても同様）。
【図２】磁気細胞分離法に基づく細胞分離・濃縮方法の概略を示す図である。
【図３】悪性グリオーマ１９症例における数種類のがん関連抗原タンパク（ＥＧＦＲ，ＶＥＧＦＲ２，ＶＥＧＦＲ３，ＣＤＨ１１等）に対する血液中の自家抗体価を示す図である。
【図４】ＧＢ−ＳＣＣ００８、ＧＢ−ＳＣＣ０１１症例患者血漿中自家抗体と、各がん関連抗原タンパクによるウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図５】ＧＢ−ＳＣＣ００８症例の末梢血Ｂ細胞を用いた、アレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２タンパク（細胞外ドメイン）とＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体染色による、ＶＥＧＦＲ２特異的な抗体をもつＢ細胞のセルソーティングの経過を示す図である。
【図６】Single cell sorter (FACSAria, BD Bioscience)を用いて１細胞ごとに回収されたｍＲＮＡの、ＲＴ−ＰＣＲを示す図である。
【図７】クローニングされた抗体遺伝子を発現ベクターに組み込んで、バキュロウイルス発現系にて完全長抗体タンパクを発現・分泌させ、精製した１５クローンの抗体について、ＶＥＧＦＲ２-アレクサフルオール６４７及びＶＥＧＦＲ２タンパクに対する結合活性をＥＬＩＳＡ法で評価した図である。
【図８】精製抗体＃４８，５１，５５を電気泳動した、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシーブリリアントブルー染色像を示す図である。
【図９】精製抗体＃４８，５１，５５における、Biacore（登録商標）を用いたSurface plasmon resonance（ＳＰＲ）法による抗原との結合・解離速度定数解析の結果を示す図である。
【図１０】サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、アレクサフルオール６４７標識トラスツズマブを測定した結果を示す図である。Ｘ軸が吸光度（４５０ｎｍ）、Ｙ軸がアレクサフルオール６４７標識トラスツズマブの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のポリペプチドとしては、アレクサフルオール６４７を認識する抗体の重鎖可変領域や重鎖、及び軽鎖可変領域や軽鎖を構成するポリペプチドであって、１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる超可変領域（相補性決定領域：ＣＤＲ３）を含む重鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ１］、２）配列番号４に示すアミノ酸配列、若しくは配列番号４と少なくとも９７％同一、好ましくは９８％以上同一、より好ましくは９９％以上同一であるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ２］、３）配列番号６に示すアミノ酸配列、又は配列番号６と少なくとも９５％同一、好ましくは９８％以上同一、より好ましくは９９％以上同一であるアミノ酸配列からなる重鎖を構成するポリペプチド［Ｐ３］、又は、４）配列番号８に示すアミノ酸配列からなる超可変領域（相補性決定領域：ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ４］、５）配列番号１０に示すアミノ酸配列、若しくは配列番号１０と少なくとも９７％同一、好ましくは９８％以上同一、より好ましくは９９％以上同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ５］、６）配列番号１２に示すアミノ酸配列、若しくは配列番号１２と少なくとも９５％同一、好ましくは９８％以上同一、より好ましくは９９％以上同一であるアミノ酸配列からなる軽鎖を構成するポリペプチド［Ｐ６］を挙げることができる。
【００１６】
本発明のＤＮＡとしては、上記本発明のアレクサフルオール６４７を認識する抗体の重鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ１］及び［Ｐ２］、重鎖を構成するポリペプチド［Ｐ３］、軽鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ４］及び［Ｐ５］、並びに、軽鎖を構成するポリペプチド［Ｐ６］をそれぞれコードするＤＮＡであれば特に制限されず、より具体的には、１）重鎖超可変領域をコードする配列番号１に示す塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ［Ｄ１］、２）重鎖可変領域をコードする配列番号３に示す塩基配列、若しくは配列番号３と少なくとも９５％同一、好ましくは９８％以上同一、より好ましくは９９％以上同一である塩基配列を含むＤＮＡ［Ｄ２］、３）重鎖をコードする配列番号５に示す塩基配列、若しくは配列番号５と少なくとも９０％同一、好ましくは９５％以上同一、より好ましくは９８％以上同一である塩基配列からなるＤＮＡ［Ｄ３］、４）軽鎖超可変領域をコードする配列番号７に示す塩基配列を含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ［Ｄ４］、５）軽鎖可変領域をコードする配列番号９に示す塩基配列、若しくは配列番号９と少なくとも９５％同一、好ましくは９８％以上同一、より好ましくは９９％以上同一である塩基配列を含むＤＮＡ［Ｄ５］、６）軽鎖をコードする配列番号１１に示す塩基配列、若しくは配列番号１１と少なくとも９０％同一、好ましくは９５％以上同一、より好ましくは９８％以上同一である塩基配列からなるＤＮＡ［Ｄ６］を挙げることができる。
【００１７】
また、上記アミノ酸配列や塩基配列において、例えば、少なくとも９５％同一とは、問題の配列が、アミノ酸やヌクレオチドの各挿入、欠失、置換等をただ１つの違いとして数えたとき、比較しようとしている配列と５％未満の異なるアミノ酸やヌクレオチドを含むことを意味する。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体としては、アレクサフルオール６４７に特異的に結合する抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体であれば特に制限されず、抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体の重鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ１］及び［Ｐ２］、重鎖を構成するポリペプチド［Ｐ３］のいずれかと、軽鎖可変領域を構成するポリペプチド［Ｐ４］及び［Ｐ５］、軽鎖を構成するポリペプチド［Ｐ６］のいずれかを含むモノクローナル抗体、例えば、［Ｐ１］と［Ｐ４］、［Ｐ２］と［Ｐ５］、［Ｐ３］と［Ｐ６］、［Ｐ１］と［Ｐ５］、［Ｐ２］と［Ｐ４］等をそれぞれ含むモノクローナル抗体を具体的に挙げることができる。
【００１９】
本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体が含まれ、また、本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体には、完全長（Full body）モノクローナル抗体の他、モノクローナル抗体の活性フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂ′、Ｆａｂ、Ｆｖ（variable fragment of antibody）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（disulphide stabilised Fv）、ｄＡｂ（single domain antibody）等も含まれる。
【００２０】
本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体の完全長抗体の作製方法としては、抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体の重鎖をコードするＤＮＡ［Ｄ３］と軽鎖をコードするＤＮＡ［Ｄ６］を組み込んだ発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞を適切な培地で培養して発現させることにより得ることができる。Ｆａｂ抗体の作製には、精製された上記完全長抗体をパパイン消化して、Ｆａｂ断片のみを再度精製する従来法が挙げられる。また、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）抗体の作製には、抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ［Ｄ１］又は［Ｄ２］と軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ［Ｄ４］又は［Ｄ５］とをリンカーで連結して宿主細胞内で発現させる方法等を挙げることができる。
【００２１】
本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体には、抗体可変領域（Ｆｖ）と、様々な動物種由来の抗体定常領域（Ｆｃ）を組み合わせたキメラ抗体やヒト化抗体も含まれる。かかるキメラ抗体やヒト化抗体は、Ｆｖ領域をコードする遺伝子とＦｃ領域をコードする遺伝子と結合させて発現させることにより、調製することができる。かかる動物種としては、一般的な抗体の動物種であるマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリ、サル、ヒト等を例示することができる。定常領域は、可変領域の由来するモノクローナル抗体と同一のものであっても、あるいは、異なるモノクローナル抗体に由来するものであってもよい。例えば、Ｆｃ領域として、公知のヒトのＩｇＧ１、マウスのＩｇＧ１のＦｃ領域が使用可能である。
【００２２】
なお、サンドイッチＥＬＩＳＡ法において本発明のヒト抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体を捕獲抗体として用いる場合には、かかる捕獲抗体の定常領域が検出抗体の定常領域と異なる動物種由来とすることで、捕獲抗体と検出抗体との交差反応をより防ぐことが可能となる。例えば、図１に示すように、検出抗体として酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体等の抗ヒト抗体を用いる場合には、捕獲抗体としてヒト−マウスキメラ抗体（マウス化抗体）を用いればよい。前記ヒト−マウスキメラ抗体は、例えば、ヒト由来の配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドコードする遺伝子のうちＦｃ領域配列を人工合成されたマウス由来のＦｃ領域配列と入れ替えた、配列番号１３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子を発現する発現ベクターを作製し、ヒト由来の配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードする遺伝子と共にｅｘｐｉ２９３細胞のような哺乳類細胞に導入して培養上清中に産生させることにより得ることができる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体の製造に用いることができる発現ベクターとしては、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、大腸菌、枯草金、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞等の宿主細胞において発現しうるものが好ましく、バキュロウイルスのAutographa californica nuclear polyhedrosis virus（AcNPV）ベクター及びバキュロウイルス用のシャトルベクター（pFastBac Dual vector）を好適に挙げることができる。また、宿主細胞がカイコ（Bombix mori）細胞のＢｍＮ４では、バキュロウイルスの核多角体病ウイルスBombix mori nuclear polyhedrosis virus（BmNPV）ベクターを好適に挙げることができる。また、上記発現ベクターには、プロモーター、ターミネーター、マーカー遺伝子としての薬剤耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００２４】
また、宿主細胞へのベクターの導入法としては、In-Fusionクローニングシステム（Clontech社）、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を挙げることができ、Lipofectin Reagent（登録商標）、Lipofectamine（登録商標）、Lipofectamine（登録商標）2000 Reagent（インビトロジェン社製）や、SuperFect（登録商標）Transfection Reagent（キアゲン社製）、FuGENE（登録商標）HD Transfection Reagent（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）、FuGENE（登録商標）6 Transfection Reagent（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等の市販のトランスフェクション試薬を用いる当技術分野で広く用いられている手法を挙げることができる。
【００２５】
本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体は、被検非ヒト動物対象に投与された、アレクサフルオール６４７で標識された物質のモニタリングに有利に使用することができる。より詳細には、特定疾患の生物学的製剤（医薬品）の開発に向け実験動物に使用する場合を例として、医薬品への感受性の確認や投与間隔及び投与量の調整等を目的とした、生物学的製剤濃度による有効性、及びin vivo／in situにおける生物学的製剤の局在に対するモニタリングに有利に使用することができる。具体的には、アレクサフルオール６４７で標識された開発候補医薬品を実験動物に投与したのち、適宜観察対象の臓器を取り出し、本発明の抗体を用いた免疫組織化学法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等により、対象の臓器に局在する該医薬品を同定、可視化、定量する手法を例示することができる。
【００２６】
本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体は、磁気細胞分離法に基づく細胞分離・濃縮を目的とした利用を例示することができ、ＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離システム（Miltenyi Biotec社）や、Dynabeads（登録商標）細胞分離システム（インビトロジェン社）、ＢＤ  ＩＭａｇ（商標）細胞分離システム等好適に挙げることができる。（ａ）アレクサフルオール６４７で標識された任意の抗体と特異的に結合している濃縮対象細胞を含む、細胞懸濁液試料を調製し；（ｂ）前記試料に、本発明の抗アレクサフルオール６４７モノクローナル抗体が結合した磁気ビーズを添加し、濃縮対象細胞をビーズに結合させ；（ｃ）前記試料を磁場の存在下で強磁性マトリックスに通過させ、強磁性マトリックスに結合しない濃縮非対象細胞を回収し；（ｄ）濃縮対象細胞を提供するために、実質的に磁場の非存在下で該マトリックスから結合細胞を溶出し、濃縮対象細胞を回収する方法を挙げることができる。磁気細胞分離法に基づく細胞分離・濃縮方法の概略を図２に示す。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。また、実施例において使用した患者検体（細胞および血漿）は、静岡県立静岡がんセンターにて治療中の患者の同意のもと、施設内の臨床研究倫理審査委員会の承認を受けた研究の範囲内で使用された。
【実施例１】
【００２８】
１．悪性グリオーマ患者血液中の自家抗体測定
悪性グリオーマ１９症例においてがん関連抗原タンパクの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３）、カドヘリン（ＣＤＨ１１）、血小板凝集因子（Ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ）及び陰性コントロールのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に対する、患者血液中の自家抗体の測定を、特開２０１０−２３７１２６号公報に開示される、本発明者が開発した「ＥＬＩＳＡ法を用いたヒト血清中の抗原特異的なＩｇＧ抗体力価測定の標準化法」にて実施した（図３）。
各組換えタンパク２０ｎｇを９６ウェルプレートに固相化し、４℃で一晩インキュベートした後、３％ＢＳＡ溶液にてブロッキングを行った。次に希釈した患者由来の血漿１００ｕｌを添加し、２時間室温にてインキュベートした。洗浄後、１０００倍希釈のＨＲＰ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（GEヘルスケア社製）、その後発色基質を添加し、イムノリーダー（Immuno Mini NJ-2300、ナルジェヌンク社製）にて吸光度の測定を行った。
その結果、ＧＢ−ＳＣＣ００８症例の血液中には、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３について自家抗体が顕著に存在することが示された。また、ＧＢ−ＳＣＣ００８症例の血液中の各種がん関連抗原タンパクに対する自家抗体は、ウェスタンブロッティングによっても確認できた（図４）。
【実施例２】
【００２９】
２．シングルセルソーターによるＶＥＧＦＲ２−アレクサフルオール６４７特異的抗体産生Ｂ細胞の分取
ＧＢ−ＳＣＣ００８症例の全血からFicoll-PaqueTM plus（GEヘルスケア社製）処理による密度勾配遠心分離を行い、末梢血単核球を分離した後、CD19マイクロビーズ（Miltenyi社製）を用いてAutoMACS (Miltenyi社製）装置にてCD19陽性細胞を選別した。その後、アレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２（細胞外ドメイン）タンパク(当研究室にて作製)、ＰＥ標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体（BD Bioscience社製）、ＰｅｒＣＰ標識マウス抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体（クローン：MfP9）（BD Bioscience社製）及びＰＩ（propidium iodide）を用いてＶＥＧＦＲ２抗体を産生する細胞分取用の染色を行った。また抗CEACAM5マウスハイブリドーマ細胞（クローン：T84.66A3.1A.1F2, ATCC, cat. HB-8747）を使用した実験では、アレクサフルオール６４７標識ヒトCEA-related cell adhesion molecules（ＣＥＡＣＡＭ５）タンパク(当研究室にて作製)、ＰＥ標識ラット抗マウスＣＤ１３８モノクローナル抗体（クローン：２８１−２）（BD Bioscience社製）を使用して細胞の染色を行った。
シングルセルソーター(FACSAria，BD Bioscience社製)を用いて、ＰＩ陰性生細胞のＣＤ１４陰性かつＣＤ１９陽性Ｂ細胞のうち、ＶＥＧＦＲ２（細胞外ドメイン）タンパクに結合する免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が細胞膜に結合しているＢ細胞にゲートを設定したところ、ＣＤ１９陽性細胞の０．０６％がＶＥＧＦＲ２特異的抗体産生Ｂ細胞であった（図５Ｂ）。セルソーターの検出感度は、抗ＣＥＡＣＡＭ５マウスハイブリドーマ細胞を含む患者末梢血単核球を用いて検討した。含まれる抗ＣＥＡＣＡＭ５マウスハイブリドーマ細胞は、アレクサフルオール６４７標識ＣＥＡＣＡＭ５抗原と抗マウスＣＤ１３８抗体を用いて検出した。セルソーターの検出限界は、１０細胞／１０６末梢血単核球であり、０．００１％であった（図５Ａ）。
【実施例３】
【００３０】
３．１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析及び同定
上記により、セルソーターで１細胞ごとに分取したＶＥＧＦＲ２−アレクサフルオール６４７特異的抗体産生Ｂ細胞の、１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析を、特許番号第５２０５５９７号公報に開示される、本発明者が開発した「１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法」に準拠して実施した。まずセルソーターにて１細胞ごとに９６ウェルプレートに分取した後、細胞を破砕させ、直接１細胞ごとにｍＲＮＡを回収した。その後ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、採取した６０個のＢ細胞のうち４０個でＩｇＨ遺伝子の増幅に成功した（図６  最上段）。また、分取したウェルごとの細胞の有無を確認するために実施した、βアクチンのＲＴ−ＰＣＲでは、３８個で成功した（図６  最下段）。最終的に同一細胞でＩｇＨ及びＩｇＬ遺伝子がともに増幅された細胞は、２２個であった。これらのすべての細胞からＨ鎖及びＬ（kappa）鎖の抗体遺伝子のｃＤＮＡがクローニングされた。
【実施例４】
【００３１】
４．バキュロウイルス発現系による完全長抗体タンパクの作製
２２クローンの抗体遺伝子を発現ベクターに組み込んで、バキュロウイルス発現系にて完全長抗体タンパクを発現・分泌させ、精製を行った。
抗体遺伝子（Ｈ鎖及びＬ鎖）をバキュロウイルス用のシャトルベクター（pFastBac Dual vector）に組み込んで、大腸菌DH10Bacに導入し、相同組換えにより組換えバクミドの作製を行った。バクミドＤＮＡは、昆虫由来のＳｆ９細胞に導入され、組換えバキュロウイルスの作製を行った。増幅されたウイルスは、タンパクの高産生株である昆虫由来のHigh Five細胞に感染させ、２７℃で６４時間無血清培地にて培養した。培養上清中に産生された抗体タンパクは、プロテインＡプレパックカラム（GEヘルスケア社製）を用いて精製を行った。取得できた１５クローンについて、アレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ２タンパクに対する結合活性をＥＬＩＳＡ法にて評価した（図７）。アレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２タンパクに対して強く結合したクローンが５種類認められた（＃４８，５１，５４，５５，５６）。このうちＶＥＧＦＲ２にも結合したものが、クローン＃４８，＃５１であった。従ってこの結果から、＃５４，＃５５，＃５６のクローンは、ＶＥＧＦＲ２タンパクではなく、アレクサフルオール６４７標識特異的に結合活性のある抗体である可能性が示された。ＶＥＧＦＲ２タンパクに対する抗体クローンの＃４８，＃５１，＃５５精製抗体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて電気泳動し、泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー染色したところ、Ｈ鎖、Ｌ鎖に分かれた明瞭なバンドを確認できた（図８）。
【実施例５】
【００３２】
５．抗体クローンのＳＰＲ法を用いた親和性測定
抗体クローンの＃４８，＃５１，＃５５精製抗体と、ＶＥＧＦＲ２タンパク及びアレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２タンパクとの親和性を、BIAcore X100（GEヘルスケア社製）の機器を用いた表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ解析）にて測定した。チップへのリガンド（各抗体クローン）固定化量は１０００〜１００００レスポンスユニット（ＲＵ）の間で行われた。抗体はＨＢＳ緩衝液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解し、流速１０μｌ／ｍｉｎ又は３０μｌ／ｍｉｎ、２５℃、最大１５０μＭの濃度で測定した。チップの再生を行う際には３molar塩化マグネシウムを用いた。BIAcore X100エバリュエーションソフトウェアを用いて測定データから動態定数を算出した。【００３３】
抗体クローン＃４８及び＃５１については、１：１結合モデルにて結合速度定数（Ｋａ）、解離速度定数（Ｋｄ）及び解離定数（ＫＤ）を求め、抗体クローン＃５５については、１：１結合反応の解離速度の差を利用したTwo-state reactionモデルにて解離定数を求めた。結果を表１に示す。ＳＰＲ解析の結果から、クローン＃４８及び＃５１抗体は、ＶＥＧＦＲ２に比較的強く結合活性を示すが、一方クローン＃５５抗体は、ＶＥＧＦＲ２タンパクには親和性を示さず、アレクサフルオール６４７標識ＶＥＧＦＲ２タンパクのみに結合することが明らかとなった。これよりクローン＃５５抗体は、蛍光色素であるアレクサフルオール６４７を特異的に認識するヒトモノクローナル抗体であることがわかった（図９）。【００３４】
【表１】
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【実施例６】
【００３５】
６．サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いたアレクサフルオール６４７標識抗体濃度の測定
アレクサフルオール６４７標識抗体として、アレクサフルオール６４７標識トラスツズマブを次の方法で作製した。まずトラスツズマブ（抗Ｈｅｒ２抗体）の重鎖を構成するポリペプチド（配列番号１４）と軽鎖を構成するポリペプチド（配列番号１５）をコードする遺伝子をそれぞれpcDNA3.3ベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込み、Expi293細胞に遺伝子導入し、５〜７日間培養した後に培養上清からプロテインＡを用いて回収精製することでトラスツズマブを得た。次に、得られたトラスツズマブに対して、Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、製品付属のマニュアルに従ってアレクサフルオール６４７標識操作を行い、アレクサフルオール６４７標識トラスツズマブを得た。【００３６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、アレクサフルオール６４７標識トラスツズマブを次の方法で測定した。９６穴イモビライザーアミノプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、ＰＢＳ中に希釈した１０μｇ／ｍｌの抗アレクサフルオール６４７抗体（抗体クローン＃５５）を捕獲抗体として５０μｌ／ウェルずつ分注し室温で２時間反応固定化した後、洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）を用いて３回洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて４℃で一晩反応させブロッキングを行った。上記プレートを洗浄液で３回洗浄した後、０、１５．６２５、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００及び１０００ｎｇ／ｍｌのアレクサフルオール６４７標識トラスツズマブを各ウェルに加え、室温で２時間反応させた。次に上記プレートを、洗浄液で３回洗浄後、検出抗体として５μｇ／ｍｌのビオチン標識した抗アレクサフルオール６４７抗体（抗体クローン＃５５）を５０μｌ／ウェルずつ加えて３０分間反応させ、洗浄液で３回洗浄した。さらに、０．２μｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（PN21130、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を５０μｌ／ウェルずつ加えて３０分間反応させ、洗浄液で７回洗浄した後、基質液（TMB substrate reagent set, BDバイオサイエンス社製）を１００μｌ／ウェルずつ加え、室温で３０分間インキュベートし、１Ｍの硫酸水溶液を５０μｌ／ウェルずつ添加し発色反応を停止させた。各ウェルの吸光度（４５０ｎｍ）をプレートリーダー（ImmunoMini NJ-2300、バイオテック社製)を用いて測定した。【００３７】
吸光度（４５０ｎｍ）をＸ軸に、アレクサフルオール６４７標識トラスツズマブの濃度（ｎｇ／ｍｌ）をＹ軸にしてプロットしたグラフを作成した（図１０）。その結果、吸光度とアレクサフルオール６４７標識トラスツズマブの濃度から相関係数が高い検量線を作成できることが確認できた。したがって、抗体クローン＃５５を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、アレクサフルオール６４７標識抗体の検量線を作成し、被検物質を上記と同様に処理して吸光度（４５０ｎｍ）を測定することで、被検物質中のアレクサフルオール６４７標識抗体の濃度を定量することが可能であることが明らかとなった。【００３８】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法によりレクサフルオール６４７標識抗体の濃度を定量することは、抗体医薬の開発に応用できる。例えば、正常な動物と腫瘍細胞を移植した動物に対して、アレクサフルオール６４７で標識した、前記腫瘍細胞を特異的に認識する抗体（以下、「アレクサ標識−腫瘍細胞認識抗体」ともいう）を投与した後、所定期間後にそれぞれの動物から血液を採取する。次に、本発明の抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により、それぞれの血液中に含まれるアレクサ標識−腫瘍細胞認識抗体の濃度を定量して比較することで、動物体内の腫瘍細胞に結合するアレクサ標識−腫瘍細胞認識抗体量を測定することができる。かかる腫瘍細胞に結合するアレクサ標識−腫瘍細胞認識抗体量の測定により、抗体医薬として用いた場合の抗体の投与量、投与時期等を判断することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、アレクサフルオール６４７標識抗体に対する２次抗体として標的細胞の選別や、アレクサフルオール６４７標識タンパクを定量しうるＥＬＩＳＡ系の構築が可能である。特にアレクサフルオール６４７標識抗体のin vivoでの血中濃度のモニタリング等に対し好適に利用することができ、抗体医薬の代謝や薬物動態の解析に有用性を発揮しうると期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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