(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種のシトクロムP450の活性を表す蛍光パターンを炎症性腸疾患のバイオマーカーとし、検体の存在下で少なくともCYP2B6、CYP1A2、CYP2C19、CYP2C8、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A5、CYP2D6、CYP2E1、CYP1A1、CYP2A13、CYP2C18を含むシトクロムP450と蛍光性基質とを反応させ、該蛍光性基質から変換した蛍光性物質が発する蛍光を測定することにより蛍光パターンを検出することを含む、炎症性腸疾患のバイオマーカーを検出する方法。
【請求項２】
シトクロムP450が、シトクロムP450とP450還元酵素とを共発現するためのシトクロムP450発現用カセットプラスミドを宿主細胞に導入し、シトクロムP450とP450還元酵素を発現させた後、宿主細胞の細胞膜画分を単離して調製されたものである、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
検体が血液由来成分である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
複数の区画を有するアレイの各区画内において、検体存在下での１種のシトクロムP450と１種の蛍光性基質との反応が行われる、請求項１〜３のいずれか１に記載の検出方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、炎症性腸疾患の検査のための解析方法：
（１）請求項１〜４のいずれか１に記載の検出方法により、被験者の検体について蛍光パターンを検出する工程；
（２）工程（１）の被験者の検体から検出した蛍光パターンについて、炎症性腸疾患患者の検体から予め作成した蛍光パターンとの重複を解析する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な炎症性疾患のバイオマーカーに関するものであり、当該炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症性疾患には、急性炎症に基づく疾患と、慢性炎症に基づく疾患があることが知られている。ノロウイルスやロタウイルス感染などの嘔吐下痢症に代表される急性炎症に基づく疾患の多くでは、一過性に臓器障害が発生するものの数日から数週間で治癒に至る。慢性炎症に基づく疾患では、長期間にわたる炎症の持続により臓器機能不全の出現や発癌などがおこる。慢性炎症性疾患には、潰瘍性大腸炎、クローン病を初めとする炎症性腸疾患（IBD）が含まれる。
【０００３】
IBDは、主として消化管に原因不明の慢性炎症を生じる難治性疾患である。患者数は近年増大しており、世界規模では400万人を超える患者数が知られている。IBDは、完治することが難しく再燃と寛解を繰り返す慢性疾患の一種であり、長期間に渡る経過観察を行うことが必要となっている。IBDの診断は、臨床症状、内視鏡やX線検査の所見、及び血液学的検査等による医師の主観的な総合判断によりなされているが、長期間の経過観察を行うには、患者にとっても医師にとっても負担が大きい。現在、IBDの診断に利用可能な有用バイオマーカーは知られていない。従来よりIBDのバイオマーカーの探索にLC/MSなどの機器分析が利用されているが、病態依存的なピークを検出することが困難であり、有望なバイオマーカーの検出には至っていない。IBDを含む炎症性疾患を簡便かつ正確に診断し得るバイオマーカーの開発が望まれている。
【０００４】
炎症性疾患発症時に、代謝酵素シトクロムP450の酵素活性が変動することが明らかになっている。非特許文献１および２では、炎症性腸疾患モデル由来の肝細胞において、シトクロムP450の発現量が変動することが報告されている。非特許文献３では、大腸炎モデルラット由来の肝臓ミクロソームについて、シトクロムP450の活性の低下が認められたことが報告されている。また、非特許文献４および非特許文献５では、テレピン誘発炎症モデルウサギまたはヒト急性炎症患者由来の血清を、炎症モデルマウス由来の肝細胞と培養して、肝細胞のシトクロムP450の活性を確認したところ、活性が低下したことが開示されている。非特許文献４および５はシグナル伝達機構に注力して、炎症性疾患における血清中因子のシトクロムP450への影響を解明しようとするものである。また、非特許文献３〜５では、HPLCを用いて、シトクロムP450により産生される代謝産物を検出することにより、シトクロムP450の活性を確認している。
【０００５】
本発明者は、大腸菌に導入するカセットプラスミドを開発することにより、シトクロムP450の大量発現を達成し得ることを報告した（特許文献１）。また本発明者は、複数のシトクロムP450の活性を、ルテニウム錯体を含んだ酸素センサーにより測定して、代謝パターンを取得する方法を開発し、かかる代謝パターンに基づき体内に取り込まれた化合物の毒性（変異原性）を予測することを報告した（特許文献２）。特許文献２におけるシトクロムP450の活性測定系は、酸素分圧低下によりルテニウム錯体が蛍光を生じる現象を利用するものである。被験者の検体の存在下で、蛍光性基質を用いて複数種のシトクロムP450活性を測定すること、および、蛍光性基質を用いた測定により得られる蛍光パターンを、炎症性疾患のバイオマーカーとすることについては、これまでに報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第4899050号
【特許文献２】特開2013-158307号公開公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Madhusudana, R.C. Biochemical Pharmacology 77 464 . 471( 2009)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2932663/pdf/nihms231877.pdf）
【非特許文献２】河内正二 「腸疾患時の肝臓および小腸における薬物代謝機能変動に関する研究」（https://kobeyakka.repo.nii.ac.jp/index.php?action=pages_view_main&active_action=repository_action_common_download&item_id=35&item_no=1&attribute_id=42&file_no=1&page_id=25&block_id=46）
【非特許文献３】Masubuchi, Y et al. Drug Metabolism and Disposition 32 437.441 (2004)（http://dmd.aspetjournals.org/content/36/3/597.full.pdf+html）
【非特許文献４】Levitchi, M. Biochemical Pharmacology 68 573.582 (2004)（http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006295204002333）
【非特許文献５】Ayman, O. S. Drug Metabolism and Disposition 28 1112-1120（2000）（http://dmd.aspetjournals.org/content/28/9/1112.full.pdf+html）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、炎症性疾患を簡便かつ正確に診断するためのバイオマーカーおよび当該バイオマーカーを検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、血清の存在下で複数種のシトクロムP450と蛍光性基質とを反応させて蛍光性基質を蛍光性物質に変換させ、シトクロムP450の活性を蛍光性物質の蛍光を検出することにより、炎症性疾患または炎症性疾患のフェーズや病期に特異的な蛍光パターンを取得し得ることを見出し、当該蛍光パターンを炎症性疾患のバイオマーカーとして検出することに着目し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．複数種のシトクロムP450の活性を表す蛍光パターンを炎症性疾患のバイオマーカーとし、検体の存在下で複数種のシトクロムP450と蛍光性基質とを反応させ、該蛍光性基質から変換した蛍光性物質が発する蛍光を測定することにより蛍光パターンを検出することを含む、炎症性疾患のバイオマーカーを検出する方法。
２．シトクロムP450が、少なくともCYP2B6、CYP1A2、CYP2C19を含む、前項１に記載の検出方法。
３．シトクロムP450が、少なくともCYP2B6、CYP1A2、CYP2C19、CYP2C8、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A5、CYP2D6、CYP2E1、CYP1A1、CYP2A13、CYP2C18を含む、前項１又は２に記載の検出方法。
４．シトクロムP450が、シトクロムP450とP450還元酵素とを共発現するためのシトクロムP450発現用カセットプラスミドを宿主細胞に導入し、シトクロムP450とP450還元酵素を発現させた後、宿主細胞の細胞膜画分を単離して調製されたものである、前項１〜３のいずれか１に記載の検出方法。
５．検体が血液由来成分である、前項１〜４のいずれか１に記載の検出方法。
６．複数の区画を有するアレイの各区画内において、検体存在下での１種のシトクロムP450と１種の蛍光性基質との反応が行われる、前項１〜５のいずれか１に記載の検出方法。
７．炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、前項１〜６のいずれか１に記載の検出方法。
８．以下の工程を含む、炎症性疾患の検査方法：
（１）前項１〜７のいずれか１に記載の検出方法により、被験者の検体について蛍光パターンを検出する工程；
（２）工程（１）の被験者の検体から検出した蛍光パターンについて、炎症性疾患患者の検体から予め作成した蛍光パターンとの重複を解析することにより、炎症性疾患についての判定が行われる工程。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のバイオマーカーの検出方法によれば、炎症性疾患を簡便かつ正確に診断するための診断材料を提供することが可能となる。また本発明のバイオマーカーの検出方法は、検体として血液由来成分を用いることから、非侵襲的で被験者への負担が少なく、炎症性腸疾患等の長期間に渡る経過観察を好適に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】シトクロムP450を産生するためのシトクロムP450発現用カセットプラスミドを示す（Ncas：シトクロムP450のN末端カセット、CPR：NADPH-シトクロムP450還元酵素、P：tacプロモーター配列、T：tacターミネーター配列、P450：N末端を削除したP450遺伝子の塩基配列）。（参考例１）
【図２】13種のシトクロムP450発現用カセットプラスミドの構造と、シトクロムP450のN末端カセットのN末端アミノ酸配列を示す図である（CPR：NADPH-シトクロムP450還元酵素、P：tac プロモーター配列、T：tac ターミネーター配列、P450：N末端を削除したP450遺伝子の塩基配列）。（参考例１）
【図３】3種のシトクロムP450発現用カセットプラスミドの構造と、シトクロムP450のN末端カセットのN末端アミノ酸配列を示す図であり、シグナル配列付加プラスミドの構造を示す図である（CPR：NADPH-シトクロムP450還元酵素、P：tacプロモーター配列、T：tacターミネーター配列、P450：N末端を削除したP450遺伝子の塩基配列）。（参考例１）
【図４】DSS処理により作製した潰瘍性大腸炎モデルマウスの体重変化を示す図である。（参考例２）
【図５】潰瘍性大腸炎モデルマウスから採取した血清のシトクロムP450活性への影響について、蛍光パターンを解析した結果を示す図である。（実施例１）
【図６】ヒト由来血清のシトクロムP450活性への影響について、蛍光パターンを解析した結果を示す図である。（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、新規な炎症性疾患のバイオマーカーを包含する。本発明はさらに、複数種のシトクロムP450の活性を表す蛍光パターンを炎症性疾患のバイオマーカーとし、検体の存在下で複数種のシトクロムP450（以下「シトクロムP450」を単に「P450」または「CYP」と表記することがある）と蛍光性基質とを反応させ、P450の作用により蛍光性基質から変換した蛍光性物質の発する蛍光を測定して、蛍光パターンを検出することを含む、炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法に関する。本発明の検出方法において得られた蛍光パターンは、本発明の新規な炎症性疾患のバイオマーカーであり、当該蛍光パターンは複数種のP450の活性を反映するものである。本発明において蛍光性物質の発する蛍光は、蛍光強度の測定により検出することができ、蛍光強度は蛍光性物質の量を反映する。
【００１４】
本発明において炎症性疾患とは、慢性炎症性疾患と、急性炎症性疾患を含むが、好ましくは慢性炎症性疾患である。慢性炎症性疾患は、医療分野で診断され得る慢性炎症性疾患であればよく、特に限定されない。本発明における慢性炎症性疾患として具体的には、炎症性腸疾患（IBD）（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、糸球体腎炎（ネフローゼ症候群（特発性ネフローゼ症候群、微小変化ネフロパシーなど）、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、重症筋無力症、特発性スプルー、サルコイドーシス、ライター症候群、Ｉ型糖尿病、原田病、ベーチェット病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、Basedow病、慢性甲状腺炎、自己免疫性血液疾患（溶血性貧血、再生不能性貧血、特発性血小板減少症など）、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、慢性活動性ＥＢウイルス感染症、乾癬様関節炎、炎症性皮膚疾患（扁平苔癬、天疱瘡、水泡性類天疱瘡、表皮水泡症、円形性脱毛症など）などが挙げられる。本発明の炎症性疾患としては、炎症性腸疾患であることが好適であり、潰瘍性大腸炎であることがより好適である。
【００１５】
本発明において検体とは、被験者から採取された血液由来成分である。具体的には、全血、血漿、血清から選択されるものであり、好適には血清が用いられる。採取された検体は、検査を行うに際し、適宜前処理を行うことができる。例えば、ヒト血清を検体として用いる場合は、血清を10倍〜100倍、好ましくは30〜50倍、より好ましくは40倍に希釈して用いることが好ましい。希釈に用いる溶液は、本発明の目的を達成し得るものであれば特に限定されない。上記倍率で希釈したヒト血清を用いて得られる蛍光パターンは、各種P450の活性に対するヒト血清の影響をより正確に反映したものとなるため、好適である。
【００１６】
本発明においてP450は、ヒト由来のものが好ましいが、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギなどの哺乳動物に由来するP450であってもよい。P450は、任意に選択できるが、薬剤代謝型P450を選択するのが好ましい。具体的には、現在知られている57種のP450から適切なP450を選択でき、例えばCYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A5, CYP4F2, CYP4F12, CYP4X1, CYP17A1, CYP27A1, CYP51A1からなる23種のP450が挙げられ、これらのP450から適切な数のP450を選択すればよい。蛍光パターンを得るためのP450の数は、3種以上、好ましくは5種以上、より好ましくは12種以上、特に好ましくは16種以上であり、57種以下、好ましくは30種以下、より好ましくは25種以下、特に好ましくは23種以下である。本発明におけるP450は、少なくともCYP2B6、CYP1A2、CYP2C19を含むことが好ましく、少なくともCYP2B6、CYP1A2、CYP2C19、CYP2C8、CYP3A4、CYP2C9、CYP3A5、CYP2D6、CYP2E1、CYP1A1、CYP2A13、CYP2C18を含むことがより好ましい。
【００１７】
本発明におけるP450は、in  vitroで安定して、蛍光性基質と反応し得るものであればよい。P450は、P450を発現するためのベクター、より具体的にはP450とP450還元酵素とを共発現するためのベクターを宿主細胞に導入し、P450とP450還元酵素を発現させた後、宿主細胞の細胞膜画分を単離して調製されたものであることが好ましい。大腸菌等の宿主細胞において、P450を発現させた後、細胞を破砕して遠心分離等を行うことにより、細胞膜画分を調製することができる。本発明においては、P450をコードする塩基配列を用いて得られた組換えP450を用いることができる。本発明に用いられる組み換えP450は、それ自体が炎症性疾患患者のP450活性変化を反映するものではない。細胞膜画分として調製された組換えP450は、-80℃等の一定条件下では、数年間の保存安定性を持ち、かつ保存後に特別な操作なしに直ぐ利用可能である、また細胞膜画分は、細胞と異なり、P450の均一性および再現性を担保できるという利点がある。
【００１８】
各種P450のアミノ酸配列は公知であり、例えば、http://www.p450.kvl.dk/cyp_all_112401.pdfに掲載されている。また各種P450をコードする遺伝子の塩基配列も公知であり、例えば、http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.htmlの動物・植物の欄に掲載されている。当業者はこれらの情報を用いて、P450を発現するためのベクターを作製することができる。P450還元酵素についても、公知のアミノ酸配列および塩基配列を用いてP450を発現するためのベクターを作製することができる（Sevrioukova IF1, Peterson JA. NADPH-P-450 reductase: structural and functional comparisons of the eukaryotic and prokaryotic isoforms. Biochimie. 1995; 77(7-8): 562-72）。P450還元酵素の一例としては、Homo sapiens P450 (cytochrome) oxidoreductase (POR), mRNA, NCBI Reference Sequence: NM_000941.2が挙げられる。P450を発現するためのベクターにおいては、P450の膜結合領域をコードする塩基配列の開始メチオニンのコドンの次のコドンが、アラニンのコドンであることが好ましい。
【００１９】
P450を発現するためのベクターとしては、いかなるベクターであってもよく、公知のP450発現用ベクターであってもよいし、今後開発されるP450発現用ベクターであってもよい。例えば、P450を発現するためのベクターとして特許文献１を参照して作製したP450発現用カセットプラスミドを宿主細胞に導入することにより、安定かつ大量に組換えP450を取得することができる。シトクロムP450発現用カセットプラスミドは、P450の膜結合領域（P450のN末端領域）をコードする塩基配列と、N末端領域を削除したP450遺伝子の塩基配列を含み、膜結合領域の3'末端が高度に保存されたプロリン−グリシンをコードするためのSmaI認識部位であり、膜結合領域の5'末端にプロモーターを有し、膜結合領域の下流にターミネーターを有するものである。P450の膜結合領域をコードする塩基配列は、P450の膜結合領域と可溶性領域の切り替え点付近にあるPPG（プロリン−プロリン−グリシン）配列のG（グリシン）までの部分をコードする塩基配列である。本明細書では、当該P450の膜結合領域をコードする塩基配列をシトクロムP450のN末端カセットとも称する。シトクロムP450発現用カセットプラスミドは、さらにP450還元酵素（例えば、NADPH-シトクロムP450還元酵素）をコードする塩基配列を含み、P450還元酵素をコードする塩基配列の5'末端にプロモーター、3'末端にターミネーターを有するものである。
【００２０】
P450を発現するためのベクターにおいては、P450の膜結合領域をコードする塩基配列の5'末端、および、P450還元酵素をコードする塩基配列の5'末端にプロモーターが連結されるのが通常である。プロモーターはP450またはP450還元酵素の発現を促進するものであれば、いずれのものであってもよく、様々なものが当業者に公知である。宿主細胞が大腸菌である場合、プロモーターとしては、tacプロモーター、T7lacプロモーター、cspAプロモーター、talプロモーター等が挙げられる。プロモーターは１個であってもよく、同一または同種のものを複数個、あるいは異種のものを複数個連結してもよい。またP450を発現させるためのベクターにおいては、P450をコードする塩基配列の3'末端、および、P450還元酵素をコードする塩基配列の5'末端に、ターミネーターが連結されるのが通常である。適切なターミネーターは当該分野において公知であり、当業者はそれらを選択して使用することができる。P450を発現させるためのベクターは、シグナル配列を含んでいてもよい。
【００２１】
P450を発現させるためのベクターの構築に際して骨格となるベクターについては特に制限はなく、いずれのものであってもよいが、発現に用いる宿主細胞に適したものを使用することが好ましい。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、pETベクター、pGEXベクター、pColdベクター等のベクターを骨格として用いることができる。
【００２２】
本発明において、蛍光性基質とは、P450の作用により蛍光性物質に変換される物質である。蛍光性基質は、P450により特異的に分解または酸化されることにより、蛍光性物質に変換される。蛍光性物質は、好ましくはP450により特異的に酸化されることにより生じる蛍光性代謝物である。蛍光性物質は、蛍光性基質に対して検出可能な蛍光の変化を生ずるものである。より具体的には、蛍光性基質は蛍光性を持たない物質であり、P450の作用により、蛍光性基質の構造の一部が変化し、蛍光を発する蛍光性物質に変化する。蛍光性基質は、実質的にP450以外の酵素による作用を受けないか、或いはP450以外の酵素による作用を受けたとしても蛍光の変化を生じないものが好ましい。本発明の蛍光性基質として、Vivid(R)蛍光性基質（Invitrogen）、7-エトキシクマリン、7-エトキシレゾルフィン、またはクマリンを用いることができ、より具体的にはVivid(R)DBOMF、Vivid(R)BOMCC、Vivid(R)EOMCCを用いることができる。蛍光性物質の発する蛍光は、公知の手法により検出することができ、例えば蛍光強度を測定することにより検出することができる。
【００２３】
本発明において、検体の存在下での複数種のP450と蛍光性基質との反応は、蛍光の変化を検出し得るものであれば、いかなる手段を用いてもよい。複数の区画を有するアレイの各区画内において、検体存在下での１種のP450と１種の蛍光性基質との反応を行い、蛍光の変化を検出することもできる。区画とは、他のP450や蛍光性基質と接触しない閉ざされた領域内を意味し、反応槽とも呼ばれる。複数の区画を有するアレイは、複数の反応槽を有するデバイスであり、デバイスとしてはプレートやディスクが例示される。
【００２４】
例えばアレイとして、複数のウェルを有するプレートを用いる場合を例示して以下説明を行う。プレート内の単一のウェル内には１種のP450と１種の蛍光性基質が含まれ、プレート全体として複数種のP450を担持することとなる。P450と蛍光性物質と検体とをウェル内に存在させることにより、蛍光競合アッセイを行うことができる。検体を添加したウェルにおける蛍光と、検体を添加していないウェルにおける蛍光とを比較することにより、検体による蛍光の変化を検出する。各ウェル内では、検体中に存在する物質に依存して、P450の酵素反応が影響（阻害または促進）され、蛍光性物質の産生量が変化する。検体中にP450に親和性のある物質が存在する場合には、P450の酸化活性が低下して蛍光性物質による蛍光強度が低下し、検体中にP450の酸化活性を増強し得る物質が存在する場合には、P450の酸化活性が上昇して蛍光性物質による蛍光強度が上昇すると考えられる。かかるP450の酸化活性の変化を、蛍光性物質が発する蛍光により検出して蛍光パターンを得ることができ、当該蛍光パターンを炎症性疾患のバイオマーカーとすることができる。P450と蛍光性基質のいずれか一方（好ましくは蛍光性基質）は、予め各反応槽（例えばウェル）内に添加され、固定化されていてもよい。
【００２５】
本発明における蛍光パターンは、複数種のP450の活性のパターンに基づくものであり、複数種のP450の活性を蛍光により検出して網羅的にパターン化したものであればよい。本発明の蛍光パターンは、いかなる測定方法および算出方法を使用して作成されたものであってもよい。例えば、本発明における蛍光パターンは、検体の非存在下と比較して検体の存在下において、蛍光強度が特徴的な変化を示すP450種を特定することにより構築することもできる。また、本発明における蛍光パターンは、検体の非存在下と比較して検体の存在下において、蛍光強度が低下するP450種、蛍光強度が変化しないP450種、および蛍光強度が増大するP450種を特定することにより構築することもできる。蛍光パターンは、各P450の蛍光強度の変化の有無だけでなく、各P450の蛍光強度の変化の程度を特定することにより構築されてもよい。蛍光強度の値から、検体による各P450の活性の阻害率を算出し、阻害率のパターンを蛍光パターンとすることもできる。
【００２６】
本発明の方法は、以下の工程を含む、炎症性疾患の検査方法も包含する。
（１）上記炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法により、被験者の検体について蛍光パターンを検出する工程。
（２）工程（１）の被験者の検体から検出した蛍光パターンについて、炎症性疾患患者の検体から予め作成した蛍光パターンとの重複を解析することにより、炎症性疾患についての判定が行われる工程。
【００２７】
本発明の炎症性疾患の検査方法では、まず工程（１）において、被験者の検体を用いて本発明の炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法により、蛍光パターンを得る。被験者の検体から得られた蛍光パターンが、予め作成した炎症性疾患患者の検体についての蛍光パターンと重複するかを確認することにより、炎症性疾患についての判定を行うことができる。予め作成した蛍光パターンは、本発明の検査方法の基準となるものである。炎症性疾患患者の検体についての蛍光パターンは、本発明の炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法により、予め作成しておくことが好ましい。例えば、炎症性疾患の種類ごとの蛍光パターン、同じ炎症性疾患のフェーズごとや病期ごとの蛍光パターンを予め作成しておけばよい。また本発明の炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法により、健常人の検体についての蛍光パターンを予め取得しておくことも好ましい。かかる蛍光パターンを基準として用いることにより、炎症性疾患の種類の判定、同じ炎症性疾患のフェーズや病期の判定を行うことができる。炎症性疾患の病期としては、初期、活動期、寛解期などが例示される。本発明の検査方法により、炎症性疾患の発症の診断のみならず、炎症性疾患患者の病態のモニタリング、治療の奏功の評価、予後の診断などを行うことが可能である。例えば、炎症性疾患が慢性炎症性疾患（好ましくは炎症性腸疾患）である場合、少なくともCYP2B6、CYP1A2、CYP2C19の活性が上昇している蛍光パターンを確認したときに、被験者が慢性炎症性疾患（好ましくは炎症性腸疾患）であると判定される。
【００２８】
本発明は、本発明の炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法に用いるための試薬キットも包含する。本発明の試薬キットには、複数種のP450、蛍光性基質（P450および蛍光性基質のいずれか一方は、アレイの区画内に予め固相化されていてもよい）、検体を希釈するための緩衝液等を含むことができる。
【実施例】
【００２９】
本発明の理解を助けるために、以下に参考例および実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３０】
（参考例１）  P450発現大腸菌膜画分の調製
（１−１） P450発現用カセットプラスミドの作製
特許文献１に基づき、P450発現用カセットプラスミドは、ヒトP450の大腸菌発現用に改変したN末端カセット（Ncas）、NADPHからヒトP450へと電子を伝達するNADPH-シトクロムP450還元酵素（CPR）、ヒトP450およびCPR発現用のtacプロモーター配列（P）およびtacターミネーター配列（T）を持つようにデザインした（図１）。また、大腸菌での発現にシグナル配列の付加が有効な場合があることから、3種のシグナル配列（OmpA、OmpT、PelB）を付加するカセットプラスミドの構築を試みた。
【００３１】
＜準備＞
用いた試薬および機器を以下に示す。
［試薬］
Ａ．オリゴヌクレオチドプライマー：末端に制限酵素認識部位（NdeI-SmaI）を付加したNcas配列をコードするDNA断片を化学合成した。また、それぞれのP450分子種のNcas領域以降のPCR増幅のために、SmaIおよびSalI（またはSmaIおよびSpeI）認識部位を含む遺伝子特異的プライマーを化学合成した。これら合成オリゴヌクレオチドプライマーによるN末端アミノ酸改変の結果を以下の表１に示す。
【表１】
0006501607.tif 000002
【００３２】
Ｂ．P450発現プラスミド：アメリカ国立衛生研究所の根岸博士より、大腸菌でのタンパク質発現に用いるためのpCWoriプラスミドを提供していただいた（H. Iwata, K. Fujita, H. Kushida, A. Suzuki, Y. Konno, K.Nakamura, A. Fujino, T. Kamataki, Biochem Pharmacol. 55 (1998) 1315-1325.）。
Ｃ．酵素：NdeI、SmaI、SalI、SpeIをタカラバイオより購入した。
Ｄ．PCR増幅用DNAポリメラーゼ：Primestarシリーズ（タカラバイオ）、KODシリーズ（東洋紡）などの高正確性のDNAポリメラーゼを使用した。
Ｅ．ライゲーションキット：DNA ligation kit <MightyMix>（タカラバイオ）を購入した。
［機器］
サーマルサイクラー  PC-818  （アステック）
【００３３】
＜操作＞
P450発現用カセットプラスミドの作製手順の概要を図１に示した。
１．取得したcDNA断片（Ncas）をDNA ligation kit <Mighty Mix>のプロトコールに従い、pCWプラスミドにライゲーションした（pNM450）
２．制限酵素認識部位を含む遺伝子特異的プライマーを用いて、N末端領域を削除したP450遺伝子の塩基配列（以下「P450配列」と称する）をPCR増幅し、得られたcDNA断片を任意のベクターに組み込んだ（pNΔP450）。
３．NdeIおよびSalI（またはNdeIおよびSpeI）処理とライゲーションにより、pNM450にP450配列を組込んだ組換えプラスミド（pNMΔ450）を作製した。
４．pNMΔ450をNdeIおよびSalI（またはNdeIおよびSpeI）処理することで得られたcDNAフラグメントを、CPR発現系を含むベクターpNMCPRの二重に挿入されたP配列の下流に組み込んだ（P450発現用カセットプラスミド）。
【００３４】
本参考例において作製した16種のP450発現用カセットプラスミドの構造とN末端アミノ酸配列を、図２および図３に示す。図２中の各P450発現用カセットプラスミドのNdeIとSmaIとの間の領域はNcasに該当し、Ncasとして13種類の具体例が示されている。例えばpCWRm1A2N（1A2カセット）は、N末端のMALLのアミノ酸配列と、m1A2遺伝子（マウスCYP1A2遺伝子）がコードするアミノ酸配列の20番目から33番目までのアミノ酸配列とからなるNcasである。なお図２中、m1A2遺伝子はNM_009993.3、rab2C3遺伝子はNM_001171265.1、r2C11遺伝子はNM_019184.1、h2E1遺伝子はNM_000773.3、m2C29遺伝子はNM_007815.3、h2J2遺伝子はNM_000775.2、h3A5遺伝子はNM_000777.4、h3A43遺伝子はNM_022820.4、h17A1遺伝子はNM_000102.3、h27A1遺伝子はNM_000784.3、h46A1遺伝子はNM_006668.1、h1B1遺伝子はNM_000104.3、h2F1遺伝子はNM_000774.3に示されたものである。
【００３５】
（１−２）P450を発現させるためのベクターの構築
５種類のヒトP450（CYP2C8、CYP2B6、CYP2D6、CYP2A13、CYP2C18）について、上記（１−２）で作製したP450発現用カセットプラスミドにより、P450を発現するためのベクターの構築を行った。図２および図３中の「P450」と示された部分に、上記５種類のヒトP450遺伝子のN末端領域を削除した塩基配列を組み込んだ。また、７種類のヒトP450（CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1、CYP3A5、CYP3A7）について、P450発現用カセットプラスミドを用いず個別にP450のN末端の改変を行い、P450発現用ベクターの構築を行った。P450発現用カセットプラスミドおよびP450発現用ベクターの全ては、TE緩衝液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 7.4）に溶解し、-30℃で保存した。
【００３６】
＜準備＞
Ａ．オリゴヌクレオチドプライマーの作製
P450発現用カセットプラスミドを用いずにP450発現用ベクターの構築を行った上記７種類のP450について、P450のN末端のアミノ酸改変用にオリゴヌクレオチドプライマーを化学合成した。改変部位のオリゴヌクレオチドプライマーを表２に示す。P450発現用カセットプラスミドを用いる場合には、それぞれのP450遺伝子と完全に一致した塩基配列の末端に制限酵素認識部位（SmaI/SalIもしくはSmaI/SpeI）を持つ特異的プライマーを合成した。
【表２】
0006501607.tif 000003
【００３７】
Ｂ．ヒト臓器由来cDNAライブラリー
市販のヒト肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、脳由来cDNAライブラリーを購入した。これらのcDNAライブラリーを混合し、大腸菌DH5αに導入して増幅したものをヒト臓器由来cDNAライブラリーとした。
【００３８】
＜操作＞
１．ヒト臓器由来cDNAライブラリーよりオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR増幅し、cDNA断片を取得した。
２．制限酵素処理とライゲーションにより、任意のクローニングベクターにcDNA断片を挿入した。
３．定法により、クローニングしたcDNA断片のDNA配列を確認した。
４．制限酵素処理とライゲーション反応により、既存のpCWプラスミドのマルチクローニングサイト、もしくはP450発現用カセットプラスミドのP450領域（図１）に挿入した。
【００３９】
（１−３）シトクロムP450発現大腸菌の培養と膜画分の調製
＜準備＞
用いた試薬を以下に示す。
［試薬］
Ａ．50%グリセロール：100%グリセロール500mlとミリQ水500mlを混合し、オートクレーブ後、使用するまで常温で保存した。ミリQ水はMILLIPORE社製の純水製造装置から採水した。オートクレーブはTOMY HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER BS-245を用いて120℃, 20min行った。
Ｂ．10×リン酸カリウム緩衝液 (KPB)：リン酸二水素カリウム (KH2PO4) 23g、リン酸水素二カリウム (K2HPO4) 125gを、ミリQ水で溶解し、1000mlにメスアップし、オートクレーブした。使用するまで常温で保存した。KH2PO4 、K2HPO4ともにナカライテスク製の特級品を使用した。
Ｃ．LB培地：トリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム (NaCl) 10gを精製水で溶解し、1000mlまでメスアップした。オートクレーブ後、使用するまで常温で保存した。トリプトン、イーストエクストラクトはナカライテスクより、NaClは和光純薬工業株式会社より特級品を購入した。
Ｄ．TB培地：トリプトン12g、イーストエクストラクト 24g、50%グリセロール8ml、10×KPB100mlを、精製水で溶解し、1000mlまでメスアップした。オートクレーブ後に冷却し、使用するまで常温で保存した。
Ｅ．Stock solution buffer：10×KPB 100ml、グリセロール200ml、0.5M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 2mlをミリQ水で1000mlにメスアップし、オートクレーブした。冷却後、使用するまで4℃で保存した。グリセロール特級品はナカライテスクより、EDTA特級品は和光純薬工業株式会社より購入した。
Ｆ．5-アミノレブリン酸 (ALA)：0.5MになるようにミリQ水にて溶解した。使用するまで-30℃で保存した。ALA実験用はコスモ石油株式会社から購入した。
Ｇ．イソプロピルβ―D-チオガラクトピラノシド (IPTG)：1MになるようにミリQ水にて溶解した。使用するまで-30℃で保存した。IPTG特級品はナカライテスクから購入した。
Ｈ．アンピシリン水溶液 (Amp)：終濃度が50mg/mlになるようにミリQ水にて溶解した。0.45nmフィルターろ過後、使用するまで-30℃で保存した。Amp特級品は和光純薬工業株式会社より購入した。
Ｉ．牛血清アルブミン (BSA)水溶液：終濃度10mg/ml となるように、ミリQ水にて溶解した。次に、それを元に0.5, 0.25, 0.1, 0.05mg/mlとなるように段階希釈した。使用するまで4℃で保存した。BSA生化学用はSIGMA社より購入した。
Ｊ．タンパク質定量：タンパク質定量は、ProteinAssayキットを用いた。BIO-RAD Protein AssayをミリQ水で5倍希釈した。ろ紙を用いて濾過した。この試薬は測定前に用事調製して用いた。
【００４０】
＜操作＞
１．大腸菌の前培養
クリーンベンチ内で、50μg/mlになるようにAmpを添加した4mlのLB培地を14mlチューブに分注し、ヒトP450発現大腸菌 (CYP2C8, CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, CYP3A5, CYP1A2, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP1A1, CYP2A13, CYP2C18の計12分子種のP450発現用カセットプラスミドもしくはP450発現用ベクターが挿入されている（表３）） およびヒトP450非発現大腸菌（空ベクターであるpCWoriが挿入されている）を、つまようじを用いて拾い上げ、各々培地へと植菌した。なお、CYP2B6, CYP2D6発現大腸菌のみ合計10mlのLB培地に植菌した。YAMATO INCUBATOR MODEL IC-62を用いて160-200rpm, 37℃でover night振とう培養した。
【表３】
0006501607.tif 000004
【００４１】
２．大腸菌の本培養
クリーンベンチ内にて、前日に作製しオートクレーブ処理した後のTB培地に対し50μg/mlになるようにAmpを添加した。TB培地は各分子種に対して400ml、500mlフラスコ4本に分けて使用した。また、CYP2B6, CYP2D6については1000ml、3000mlフラスコ2本に分けて使用した。前培養後の大腸菌液、990μlをそれぞれのTB培地に分注した。また、CYP2B6, CYP2D6については、4950μlずつ分注した。TAITEC Bio-shaker BR-300Lを用いて160-200rpm, 37℃で振とう培養した。CYP2B6, CYP2D6のみ、TAITEC Bio-shaker BR-40LFを用いた。
【００４２】
３．P450発現の誘導処理
OD600値が0.2-0.5になったところで (約3.5h)、P450発現誘導処理を行った。OD600値は、Gene Quant pro RNA/DNA Calculatorを用いて測定した。クリーンベンチ内で、ALAその後、IPTGという順にそれぞれ500uM,1mMになるように各試薬を加え、よく混合した。その後、各振とう機で、160-200rpm, 20-24h,25℃で振とう培養した。なお、CYP1A2のみ30℃で振とう培養した。
【００４３】
４．CO差スペクトルの測定
培養後の大腸菌液をプラボトルに加え、3500rpm, 15min, 4℃で遠心分離した。遠心後の上清を除去し、3500rpm,10min, 4℃で再度遠心分離した。残渣を1mlピペットマンで回収し、20mlの4℃のstocksolution bufferを加えてボルテックス処理した。ボルテックスにはScientificIndustries VORTEX-GENIE2を使用した。サンプルを50mlファルコンチューブに移し、1.6mlをCO差測定用の2mlチューブに分取した。残りのサンプルは後に使用するまで-80℃にて保存した。先の2mlチューブにハイドロサルファイトナトリウム (還元剤) を加え、転倒混和により溶解した。大腸菌菌液を760μlずつ2本の石英セルに分注後、HITACHI U-3000PSpectrophotometerを用いて両サンプルの可視光における吸収を測定することで両者の吸収差を補正した。次に、測定サンプル側のセルに一酸化炭素 (CO) を2min吹き込み、その後直ちに400-500nmにおける還元型CO差スペクトルを測定した。各P450発現大腸菌中のP450発現量を表３に示す。ハイドロサルファイトナトリウム特級品はナカライテスクより、COガスは住友精化より購入した。
【００４４】
５．大腸菌の超音波破砕および膜画分の調製
各シトクロムP450発現大腸菌菌液を氷上で2回破砕処理した。大腸菌の破砕処理には、TAITEC ULTRASONICHOMOGENIZER VP-300を用い、3min, 出力30%で行った。その後、HITACHI himac CR20G High-Speed Refrigerated Centrifuge を用いて7920rpm, 10minで遠心分離する事で破砕残渣と上清を分離した。得られた上清を50mlファルコンチューブに移し、氷上にて保存した。沈殿に対して4℃のstock solution buffer 20mlを加えボルテックス処理を行った。次に同条件で超音波破砕処理を行い、再度遠心分離、および4℃のstock solution buffer20mlを加えボルテックス処理した。同条件下で三度菌体の破砕および遠心分離を行った。この間、超遠心用遠沈管をミリQ水でよく洗浄した。三回分の上清をまとめて超遠心用遠沈管に入れた。このとき、沈殿が入らないように、一度50mlファルコンチューブに入れた後、再度超遠心用遠沈管へと移した。超音波破砕によってP450が失活していないかを確認するために、本上清1.6mlを用いて還元型CO差スペクトルを測定した。各分子種について超遠心前の遠沈管の重量をstock solution bufferを用いて統一した。次に、HITACHIhimac CP65βEXを用いて、40000rpm,70min, 4℃で遠心した。遠心分離後、上清を除去した。次に、シトクロムP450を発現した大腸菌膜を含む沈殿を回収した。回収方法は以下の通りである。まず、各シトクロムP450分子種を含む沈殿に対して、4℃下に保存した 6.6mlのstock solution bufferを加えた。その後ミリQ水でよく洗浄した毛筆を用いて、丁寧に本膜画分を含む沈殿の懸濁処理を行った。1.6mlをCO差測定用へ、10μlをタンパク定量用へ、残りは14mlファルコンチューブに分注し使用するまで-80℃で保存した。膜画分の還元型CO差スペクトルを先に示した方法を用いて測定し、各ヒトP450の発現量を評価した。これまでの作業を2回繰り返し、それぞれの分子種について2ロット分の膜画分を取得し、以降の実験に用いた。
【００４５】
６．P450発現大腸菌膜画分のタンパク定量
P450発現大腸菌膜画分のタンパク質量は、ブラッドフォード法を用いて測定した。0, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5mg/mlのBSA水溶液を検量線用として用いて、P450非発現大腸菌（pCWoriが挿入）から回収した膜画分、及びP450発現大腸菌から回収した膜画分（P450膜画分）を、Stocksolution bufferで10倍、20倍に希釈することでサンプルとした。測定には、バイオラッド社製のprotein assay キットを用いた。測定方法は、キットに付属のマニュアルに従った。
【００４６】
（参考例２）潰瘍性大腸炎モデルマウスの作製
以下の材料および操作により、潰瘍性大腸炎モデルマウスを作製した。 
＜材料＞
Ａ．マウス：C57BL/ 6JJmsSlc(日本SLC社)8週齢、メス、体重16〜21gを用いた。
Ｂ．デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) 水溶液：ミリQ水中、終濃度3%になるように溶解したものを使用した。DSSはMP Biomedicals社より購入した。
Ｃ．麻酔薬：イソフルランを、脱脂綿の入った瓶の中に添加してその中にマウスを入れることで麻酔をかけた。イソフルランは4℃保存。
Ｄ．飼育環境の条件設定：神戸大学動物実験施設内の飼育室を用いた。ケージごとに換気システムが内蔵されているマウス飼育用ゲージを用いた。マウスの飼育は、明期暗期が12h交代になるように設定した。
【００４７】
＜操作＞
１．マウスの飼育と潰瘍性大腸炎の発症処理および血清の回収
Hamed Laroui らの方法（PLoS One. 2012;7(3):e32084. doi:10.1371/journal.pone.0032084. Epub 2012.  Laroui H1,Ingersoll SA, Liu HC, Baker MT, Ayyadurai S, Charania MA, Laroui F, Yan Y,Sitaraman SV, Merlin D.）を参考にして、通常マウス飼育時に与える水道水を、DSS水溶液に変化させることで、DSSを自由飲水させた。マウスは1ケージに4匹以内とした。飲水期間は図４に示すと通りである。飲み水を変化させる以外は、餌の量、温度、明期暗期の周期、性別、週齢等、他のファクターは均一化した。実験開始後の体重を測定した（図４）。また、その際、各マウスについて外見上の差異が生じていないかを観察した。DSS水溶液の飲水期間が長くなるほど、相対体重が減少しており、炎症が重症化していると考えられた。
【００４８】
２．マウス血清の回収処理
飼育試験終了後、イソフルランを吸引させることで麻酔をかけた後、心臓または後大静脈より全採血を行った。また、肝臓や結腸の一部を採取し、液体窒素で急速冷凍し、使用するまで-80℃で保存した。血液は常温で30min放置した後、遠心分離により血清を精製し、使用するまで-30℃で保存した。
【００４９】
（実施例１） 潰瘍性大腸炎モデルマウスの血清についての蛍光パターンの検出
以下の材料および操作により、参考例２により作製した潰瘍性大腸炎モデルマウスの血清を基質競合剤として用いて、シトクロムP450と蛍光性基質とを反応させ、蛍光競合アッセイを行い、蛍光パターンを得た。蛍光パターンは、対照群と試験群間のパターンの差異を評価することにより得た。なお対照群とは、血清の添加のない群であり、試験群とは血清の添加のある群である。
【００５０】
＜材料＞
Ａ．2×Reaction buffer (0.1M KPB-pH8.0)：0.2M KH2PO4および、0.2M K2HPO4 をpHメーターでpH8.0になるように調整して混合した。使用するまで常温で保存した。pHメーターはHORIBA pH METER F-51を使用した。
Ｂ．5×NADPH Regeneration System：10×KPB 5ml、D-グルコース6リン酸 (G6P) 650.34mg、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ (G6PDH) 100unit、β-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸四水和物 (NADPH・4H2O) 452.705mgをミリQ水を用いて溶解し100mlとし、1.5mlチューブに910μlずつ分注した後、使用するまで-80℃で保存した。G6P, G6PDH, NADPH・4H2Oは、オリエンタル酵母から購入した。
Ｃ．保存用Vivid(R)蛍光性基質：Vivid(R)DBOMFにはアセトニトリル (MeCN) を85μl加えて小瓶中の結晶が溶解するまでボルテックス処理した。Vivid(R)BOMCC には MeCNを160μl、Vivid(R)EOMCCには205μl 加えて同様にボルテックス処理した。各サンプルは、-30℃、遮光条件下にて保存した。MeCN特級試薬はナカライテスクより購入した。各Vivid(R)蛍光性基質はInvitrogenより購入した。
Ｄ．Vivid(R)mixture：上記ＣのMeCNで溶解したVivid(R)DBOMF 0.8μl に2×Reaction buffer 79.2μlを加えた。基質の終濃度は2μMとなる。Vivid(R)BOMCC 5.5μl には104.5μlを、Vivid(R)EOMCC 13μl には247μlの2×Reaction bufferを加えた。両基質の終濃度は10μMとなる。これらは用事調整で、ボルテックス処理後直ちに使用した。
Ｅ．蛍光競合アッセイ用プレート：NUNC 460518384well plate（黒）を用意した。プレートの配置を、下の表４に示した。●一つ一つが各ウェルを示している。
【表４】
0006501607.tif 000005
なお、表４中の「,」は、蛍光物質、CYP分子種、ウェルを省略して表したものである。蛍光物質とCYP分子種の具体的な組み合わせは、後述する表５に示す。
【００５１】
＜操作＞
１．P450膜画分の保存溶液の調整
Stock solution buffer を用いて、参考例１により調製した各P450膜画分を希釈し、-80℃で保存した。用いた分子種とそれらの酵素量、対応する蛍光性基質とその励起波長および蛍光波長を表５に示す。
【表５】
0006501607.tif 000006
【００５２】
２．蛍光競合アッセイ用プレートの準備
NUNC 460518 384well plate (黒) を用意した。プレートの配置は先の表４に示した。Ａ〜Ｄの4グループの反応系を作製し、各グループ4点ずつデータを取得した。ＢとＤの差から血清による各P450の阻害率を求めた。なおＡとＣにより、血清中に蛍光を発する化合物が含まれていないかを確認した。
【００５３】
３．血清によるP450阻害反応
まず、2×Reaction bufferを各ウェル10μlずつ8連ピペッターで加えた。次に、5×NADPH Regeneration Systemを各ウェル4μlずつ加えた。P450膜画分を各ウェル6μlずつ加えた。血清なしのウェルには16μlの精製水を加えた。血清ありのウェルには、20倍から100倍に希釈したマウス血清を加えた。30min 37℃ 遮光条件で静置した。インキュベーターはBioShaker BR-13FPを使用した。
【００５４】
４．蛍光強度の測定
MTP-810を用いて上記測定条件で蛍光強度を測定した。図５は、マウス血清を40倍希釈して用いたものの結果である。4点のデータから平均および標準偏差を算出し、P450分子種ごとに各試験対象である血清による蛍光強度の阻害率を算出し、それを12分子種並べて示すことでP450活性の蛍光パターンとした。
【００５５】
（実施例２） ヒト由来血清についての蛍光パターンの検出
潰瘍性大腸炎モデルマウスの血清の代わりに、健常人のヒト血清（シグマ社製、Sera human（ヒト血清））を用いる以外は実施例１と同様の手法により、血清の存在下におけるP450活性の蛍光パターンを検出した。
【００５６】
結果を、図６に示す。ヒト血清（40倍希釈）を検体として用いた場合にも、血清の存在下でのP450活性に基づく蛍光パターンが確認できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の炎症性疾患のバイオマーカーの検出方法によれば、炎症性疾患を簡便かつ正確に診断するための診断材料を提供することが可能となる。また本発明のバイオマーカーの検出方法は、検体として血液を用いることから、非侵襲的で被験者への負担が少ない。また、本発明における炎症性疾患のバイオマーカーは、炎症性疾患の病期やフェーズに応じて取得することができるため、炎症性腸疾患等の長期間に渡る経過観察に好適である。
【図１】
0006501607.tif 000007
【図２】
0006501607.tif 000008
【図３】
0006501607.tif 000009
【図４】
0006501607.tif 000010
【図５】
0006501607.tif 000011
【図６】
0006501607.tif 000012
【配列表】
0006501607000001.app