(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変酵母宿主細胞であって、
（ａ）前記酵母宿主細胞において発現するホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、
（ｂ）前記酵母宿主細胞において発現するホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸、および
（ｃ）アセチルホスフェートからアセテートへの変換を機能的に破壊する、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性グリセロール−１−ホスファターゼ酵素（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊
を含み、
アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない遺伝子改変されていない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項２】
前記グリセロール−１−ホスファターゼが、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体から選択され、
前記相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはＧＰＰ２／ＨＯＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項３】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体が機能的に破壊されており、
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項４】
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体が機能的に破壊されており、
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項５】
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体の両方が機能的に破壊されており、
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項２に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項６】
前記酵母宿主細胞において発現する、アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＡ；ＥＣ１．２．１．１０）をコードする異種核酸をさらに含む、請求項１から５までのいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項７】
イソプレノイドを産生することができる、請求項１から６までのいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項８】
イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含む、請求項７に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、
（ｂ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む、
（ｃ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む、
（ｄ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む、
（ｅ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む、
（ｆ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む、
（ｇ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む、または
（ｈ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、
請求項８に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項１０】
前記ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む、請求項８に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項１１】
（ａ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が単一の転写調節因子の制御下にある、
（ｂ）前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が複数の異種性転写調節因子の制御下にある、
（ｃ）イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、
（ｄ）ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、または
（ｅ）ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、
請求項８から１０までのいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項１２】
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、あるいは
（ａ）前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、
（ｂ）前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、または
（ｃ）前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択される、
請求項１１に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項１３】
前記酵母細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞。
【請求項１４】
イソプレノイドを産生するための方法であって、
（ａ）請求項７から１３までのいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収するステップ
を含む、方法。
【請求項１５】
酵母宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記酵母宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートからアセテートへの変換を機能的に破壊する、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性グリセロール−１−ホスファターゼ酵素（ＥＣ３．１．３．２１）を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。
【請求項１６】
前記グリセロール−１−ホスファターゼがＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体から選択され、
前記相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはＧＰＰ２／ＨＯＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体が機能的に破壊される、
（ｂ）ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体が機能的に破壊される、
（ｃ）ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体の両方が機能的に破壊され、
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体は、アセチルホスフェートをアセテートに変換し、かつ、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母宿主細胞において、アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＡ；ＥＣ１．２．１．１０）をコードする異種核酸を発現するステップをさらに含む、請求項１５から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵母宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１５から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母宿主細胞が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性グリセロール−１−ホスファターゼ酵素（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含まない細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、請求項１５から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／８００，３５６号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
１．発明の分野
本開示は、工学的に操作された宿主細胞においてアセチルＣｏＡ由来化合物を産生するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景
アセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）は、ポリケチド、脂肪酸、イソプレノイド、フェノール類、アルカロイド、ビタミン、およびアミノ酸を含めた必須の生物学的化合物の合成における重要な中間体である。アセチルＣｏＡに由来する代謝産物の中には、工業的に有用な化合物を含めた一次代謝産物および二次代謝産物がある。酵母では、アセチルＣｏＡはピルビン酸代謝で生合成される（図１）。しかし、この生合成経路では、ピルビン酸カルボキシラーゼおよび／またはピルビン酸デヒドロゲナーゼにより触媒される反応によってＣＯ２が失われる。工業的な発酵環境において、ピルビン酸代謝に対する代替物をもたらし、解糖を減少させることの１つの利益は、ピルビン酸の脱カルボキシル化において産生されるＣＯ２が減少し、したがって、最終産物においてより多くの炭素を捕捉し、それにより、最大理論収量を上昇させることができることである。第２の利益は、産生されるＮＡＤＨが減少し、したがって、それを再酸化するために必要な酸素が著しく減少することである。これは、ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）とホスホアセチルトランスフェラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）を併せて発現させることによって実現することができる。
【０００４】
ＰＫおよびＰＴＡは、フルクトース−６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）またはキシルロース−５−ホスフェート（Ｘ５Ｐ）がアセチルＣｏＡに変換される反応を触媒する。図１に示されている通り、ＰＫにより、ペントースホスフェート中間体であるキシルロース（ｘｙｕｌｏｓｅ）５−ホスフェートから、または、さらに上の解糖中間体であるＤ−フルクトース６−ホスフェート（Ｆ６Ｐ）から引き出される。ＰＫにより、Ｘ５Ｐがグリセルアルデヒド３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）とアセチルホスフェートに分かれる、またはＦ６Ｐがエリトロース４−ホスフェート（Ｅ４Ｐ）とアセチルホスフェートに分かれる。次いで、ＰＴＡにより、アセチルホスフェートがアセチルＣｏＡに変換される。Ｇ３Ｐはさらに下の解糖に再度入ることができ、Ｅ４Ｐはペントースホスフェート経路またはトランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼの非酸化的ペントースホスフェート経路ネットワークを通じた循環による解糖に再度入ることができる。
【０００５】
出願人らは、ＰＫ酵素およびＰＴＡ酵素を導入することで得ることができる異種性イソプレノイド産生の効率の改善について以前に記載した。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１２年１１月９日出願の米国特許出願第１３／６７３，８１９号（現在は米国特許第８，４１５，１３６号）を参照されたい。特に、ネイティブな酵母代謝ネットワークにおいて生じる化学反応のみを使用してグルコースから細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを合成する場合、メバロン酸経路によるグルコースからイソプレノイドであるファルネセンへの変換の可能性のある最大化学量論的収量は２３．６ｗｔ％である。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ；ＥＣ１．２．１．１０）およびＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼにより触媒される反応をメバロネート産生の代謝ネットワークに含めることによって、理論的な最大化学量論的収量は２５．２ｗｔ％に改善される。さらにＰＫおよびＰＴＡを導入することで、反応ネットワークは、最適な状態で、２９．８ｗｔ％またはそれを超える質量収量に到達することができ、これは最大理論収量の有意な上昇である。
【０００６】
Ｓｏｎｄｒｅｇｇｅｒらにより、キシロース利用酵母株におけるエタノール産生に関するＰＫおよびＰＴＡの利益についても記載されている。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｏｎｄｒｅｇｇｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７０巻（５号）：２８９２〜２８９７頁（２００４年）を参照されたい。Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性キシロースレダクターゼおよびＮＡＤ＋依存性キシリトールデヒドロゲナーゼの過剰発現に起因する低エタノール収量に対処するために、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに異種ホスホケトラーゼ経路（ＰＫ、ＰＴＡ、およびＡＤＡ）が導入された。この２つのオキシドレダクターゼ反応における補因子嗜好が異なることにより、還元された反応中間体であるキシリトールの広範囲にわたる蓄積、したがって、低エタノール収量として顕在化する嫌気性レドックス平衡問題が引き起こされる。ホスホケトラーゼ経路を導入することによってレドックス代謝の平衡化が行われ、それにより、エタノールに変換されるキシロース当たり１つのＮＡＤＨの正味の再酸化が導かれ、エタノール収量が２５％改善される。しかし、ＰＫの過剰発現によっても、アセテート蓄積の増大および発酵速度の低下が導かれる。ホスホケトラーゼ経路と、アセトアルデヒドをアセテートに変換するＡＬＤ６の変異を組み合わせることによっていくらかのアセテート蓄積は減少させることができるが、組換えホスホケトラーゼ経路を通じたフラックスは、キシリトールおよびグリセロールの蓄積を完全に排除するために必要になる最適なフラックスの約３０％であった。著者らにより、ホスホケトラーゼ経路に基づくアセテート形成を妨げるためにホスホトランスアセチラーゼおよび／またはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼのより高い活性が必要であり得ることが示唆された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８，４１５，１３６号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｏｎｄｒｅｇｇｅｒら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４年）７０巻（５号）：２８９２〜２８９７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、異種ＰＫ経路を導入することによりアセチルＣｏＡ由来化合物の収量の実質的な改善を導くことができるが、その一方で、ＰＫおよびＰＴＡによる最適な炭素フラックスを実現するために、この経路の実行のさらなる改善が必要であると思われる。本明細書で提供される組成物および方法は、この必要性に対処し、関連する利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
３．発明の概要
本明細書では、工業的に有用な化合物を産生するためのホスホケトラーゼ（ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）の利用を改善するための組成物および方法が提供される。これらの組成物および方法は、ホスホケトラーゼ経路に基づくアセテート蓄積が、ＰＫ触媒作用の産物であるアセチルホスフェートの酵素により触媒される加水分解に起因するという驚くべき発見に基づく。アセチルホスフェートの加水分解は、イソプレノイド、ポリケチド、および脂肪酸を含めたアセチルＣｏＡ由来の任意の種類の産物の産生に、炭素の枯渇によって負の影響を及ぼし得る望ましくない副反応である。アセチルホスフェート加水分解を触媒する宿主細胞内のネイティブな酵素を機能的に破壊することにより、アセテート蓄積が減少し、ＰＫ／ＰＴＡ経路を通じたアセチルＣｏＡ産生への炭素フラックスが増大する。
【００１１】
本明細書で提供される組成物および方法は、さらに、アセチルホスフェートからアセテートへの加水分解を触媒する酵母内のネイティブな酵素、すなわちＧＰＰ１／ＲＨＲ２、およびそれと密接に関連するホモログであるＧＰＰ２／ＨＯＲ２の予想外の発見に基づく。これらの酵素はどちらも、以前は単にグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１；あるいは「グリセロール−３−ホスファターゼ」と称される）活性を有すると特徴付けられており、したがって、これらの酵素の無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）アセチル−ホスファターゼ活性は予想外のものである。ＰＫおよびＰＴＡを異種発現する細胞では、ＲＨＲ２をコードする遺伝子およびＨＯＲ２をコードする遺伝子の一方または両方を欠失させることにより、アセテート蓄積の減少が導かれ、ＲＨＲ２をコードする遺伝子を単独で欠失させることにより、アセテートレベルの実質的な低下が導かれる。さらに、ＰＫ、ＰＴＡおよびメバロン酸経路を含むように工学的に操作された細胞においてＲＨＲ２遺伝子を欠失させることにより、アセチルＣｏＡ由来イソプレノイドであるファルネセンの産生が相当に増大する。
【００１２】
したがって、本明細書では、遺伝子改変宿主細胞および工業的に有用な化合物を産生するためのそれらの使用方法が提供される。一態様では、本明細書では、ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、およびアセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含む遺伝子改変宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸をさらに含む。
【００１３】
別の態様では、本明細書では、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸、およびアセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含む遺伝子改変宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸をさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントからなる群から選択される。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２の機能的破壊を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２の機能的破壊を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方の機能的破壊を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＤＡ；ＥＣ１．２．１．１０）をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ネイティブなピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）−バイパスの１種または複数種の酵素の機能的破壊をさらに含む。一部の実施形態では、ＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の酵素は、アセチルＣｏＡシンテターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、異種アセチルＣｏＡ由来化合物を産生することができる。一部の実施形態では、異種アセチルＣｏＡ由来化合物は、イソプレノイド、ポリケチド、および脂肪酸からなる群から選択される。特定の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソプレノイドを産生することができる。
【００１７】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸は単一の転写調節因子の制御下にある。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸は多数の異種性転写調節因子の制御下にある。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素は、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロール（ｐａｔｃｈｏｕｌｉｏｌ）シンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される。
【００１９】
一部の実施形態では、イソプレノイドは、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される。一部の実施形態では、イソプレノイドはセスキテルペンである。一部の実施形態では、イソプレノイドは、Ｃ５〜Ｃ２０イソプレノイドである。一部の実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択される。
【００２０】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２１】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２２】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；アセチルＣｏＡシンテターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群から選択されるネイティブなＰＤＨ−バイパスの少なくとも１種の酵素の機能的破壊；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２３】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素であって、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；アセチルＣｏＡシンテターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群から選択されるネイティブなＰＤＨ−バイパスの少なくとも１種の酵素の機能的破壊；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２４】
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の複数の酵素であって、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェラーゼを含む複数の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化（ＡＤＡ）をコードする異種核酸；アセチルＣｏＡシンテターゼ１（ＡＣＳ１）、アセチルＣｏＡシンテターゼ２（ＡＣＳ２）、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ６（ＡＬＤ６）からなる群から選択されるネイティブなＰＤＨ−バイパスの少なくとも１種の酵素の機能的破壊；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２５】
別の態様では、本明細書では、ポリケチドを産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、ポリケチド生合成経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２６】
別の態様では、本明細書では、脂肪酸を産生することができる遺伝子改変宿主細胞であって、脂肪酸生合成経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸；ホスホケトラーゼ（ＰＫ）をコードする異種核酸；ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）をコードする異種核酸；およびグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）の機能的破壊を含む細胞が提供される。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントである。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００２８】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡ由来化合物（例えば、イソプレノイド、ポリケチド、または脂肪酸）を産生する。
【００２９】
別の態様では、本明細書では、異種アセチルＣｏＡ由来化合物を産生するための方法であって、本明細書に記載の異種アセチルＣｏＡ由来化合物を産生することができる遺伝子改変宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記異種アセチルＣｏＡ由来化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および前記異種アセチルＣｏＡ由来化合物を培地から回収するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、異種アセチルＣｏＡ由来化合物は、イソプレノイド、ポリケチド、および脂肪酸からなる群から選択される。
【００３０】
別の態様では、本明細書では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を増大させるための方法であって、宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップ、およびアセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、当該方法は、宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む。
【００３１】
別の態様では、本明細書では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡの産生を増大させるための方法であって、宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、およびアセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップを含む方法が提供される。一部の実施形態では、当該方法は、宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む。
【００３２】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼは、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される。一部の実施形態では、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントを機能的に破壊する。一部の実施形態では、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントを機能的に破壊する。一部の実施形態では、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方を機能的に破壊する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態では、宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
（ａ）ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
（項目２）
ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸をさらに含む、項目１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３）
（ａ）ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊
を含む遺伝子改変宿主細胞。
（項目４）
ホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸をさらに含む、項目３に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目５）
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、項目１から４までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目６）
前記グリセロール−１−ホスファターゼが、ＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、項目５に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目７）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目８）
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目９）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、項目６に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１０）
イソプレノイドを産生することができる、項目１から９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１１）
イソペンテニルピロホスフェートを作製するためのメバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種または複数種の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含む、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１２）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１３）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１４）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１５）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１６）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１７）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１８）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目１９）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素が、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２０）
前記ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２１）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が単一の転写調節因子の制御下にある、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２２）
前記ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素をコードする前記１種または複数種の異種核酸が複数の異種性転写調節因子の制御下にある、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２３）
イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２４）
ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２５）
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む、項目１１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２６）
ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチョロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼ、およびアビエタジエンシンターゼからなる群から選択される、項目２５に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２７）
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペン、およびポリテルペンからなる群から選択される、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２８）
前記イソプレノイドがＣ５〜Ｃ２０イソプレノイドである、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目２９）
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレン、およびバレンセンからなる群から選択される、項目１０に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３０）
細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、項目１から２９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３１）
酵母細胞である、項目１から２９までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３２）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目３１に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３３）
アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、項目１から３２までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞。
（項目３４）
イソプレノイドを産生するための方法であって、
（ａ）項目１０から３３までのいずれか一項に記載の遺伝子改変宿主細胞の集団を、炭素源を含む培地中、前記イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および
（ｂ）前記イソプレノイド化合物を前記培地から回収するステップ
を含む、方法。
（項目３５）
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物の産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。
（項目３６）
前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
宿主細胞におけるアセチルＣｏＡの産生を増大させるための方法であって、
（ａ）前記宿主細胞においてホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ；ＥＣ２．３．１．８）をコードする異種核酸を発現させるステップ、および
（ｂ）アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素を機能的に破壊するステップ
を含む、方法。
（項目３８）
前記宿主細胞においてホスホケトラーゼ（ＰＫ；ＥＣ４．１．２．９）をコードする異種核酸を発現させるステップをさらに含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
アセチルホスフェートをアセテートに変換する前記酵素がグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である、項目３５から３８までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記グリセロール−１−ホスファターゼがＧＰＰ１／ＲＨＲ２、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２、ならびにその相同体およびバリアントから選択される、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ＧＰＰ２／ＨＯＲ２またはその相同体もしくはバリアントが機能的に破壊されている、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
ＧＰＰ１／ＲＨＲ２とＧＰＰ２／ＨＯＲ２の両方、またはＧＰＰ１／ＲＨＲ２の相同体もしくはバリアントとＧＰＰ２／ＨＯＲ２の相同体もしくはバリアントの両方が機能的に破壊されている、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞からなる群から選択される、項目３５から４３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記宿主細胞が酵母細胞である、項目３５から４３までのいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記宿主細胞が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の機能的破壊を含まない酵母細胞と比較して増大した量のアセチルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡ由来化合物を産生する、項目３５から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、酵母宿主細胞における糖（グルコースおよびキシロース）からアセチルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡ由来化合物への変換に関与する経路の略図である。太い矢印は組換えホスホケトラーゼ経路を示す。アセチルホスフェートはアセチルＣｏＡへのホスホケトラーゼ（ＰＫ）／ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓａｃｅｔｙｋｌａｓｅ）（ＰＴＡ）経路の中間体であり、ＲＨＲ２およびＨＯＲ２によってアセテートに加水分解される。略語：Ｇ６Ｐ、グルコース−６−ホスフェート；Ｒ５Ｐ、リブロース−５−ホスフェート；Ｘ５Ｐ、キシルロース−５−ホスフェート；Ｆ６Ｐ、フルクトース−６−ホスフェート；Ｅ４Ｐ、エリトロース（ｅｒｙｈｔｒｏｓｅ）−４−ホスフェート；ＦＢＰ、フルクトース−１，６−ビスホスフェート（ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；ＤＨＡＰ、ジヒドロキシアセトンホスフェート；Ｇ３Ｐ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート；ＰＥＰ、ホスホエノールピルベート；ＡＤＡ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化；ＡＣＰ、アセチルホスフェート。
【図２】図２は、イソプレノイド産生のためのメバロン酸経路の代表的な酵素を示す図である。略語：ＡｃＣｏＡ、アセチルＣｏＡ；ＡｃＡｃＣｏＡ、アセトアセチルＣｏＡ；ＨＭＧＣｏＡ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ；Ｍｅｖ５Ｐ、メバロネート−５−ホスフェート；Ｍｅｖ５ＤＰ、メバロネート−５−ジホスフェート；ＩＰＰ、イソペンテニルジホスフェート；ＤＭＡＰＰ、ジメチルアリルピロホスフェート；Ｅｒｇ１０、アセチルＣｏＡチオラーゼ；ＡＣＣ１、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ；ＡＡＣＳ、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ；Ｅｒｇ１３、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ；ＨＭＧｒ、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ；Ｅｒｇ１２、メバロン酸キナーゼ；Ｅｒｇ８、ホスホメバロン酸キナーゼ；Ｅｒｇ１９、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｂは、野生型（Ｙ９６７株、左）、ならびに、異種アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、およびネイティブなＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含む組換え酵母細胞（Ｙ１２８６９株；中央）、ならびに異種ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）をさらに含む組換え酵母細胞（Ｙ１２７４６株；右）の糖消費（Ａ）およびアセテート産生（Ｂ）を示す図である。
【図３−２】図３Ｃ〜３Ｄは、異種アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、およびネイティブなＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含む組換え酵母細胞（Ｙ１２８６９株；左）、ならびに、異種ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）（Ｙ１９３９０株；中央）またはホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）をさらに含む組換え酵母細胞（Ｙ１９３９１株；右）の糖消費（Ｃ）およびアセテート産生（Ｄ）を示す図である。
【図４】図４は、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙ９６７株の無細胞抽出物（ＣＦＥ）における、１２０分の時間経過にわたるアセチルホスフェート加水分解の実証を示す図である。ＣＦＥのみ（左）；ＣＦＥと、それに加えて、３０ｍＭの、広範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤であるフッ化ナトリウム（中央）、および熱失活させたＣＦＥ（右）が示されている。
【図５】図５は、Ｙ９６７無細胞抽出物に対する陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７、１ＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）の０〜１００％勾配を３０カラム体積にわたって毎分０．５ｍＬの流速で用いてタンパク質を溶出し、１ｍＬ画分を採取し、タンパク質ゲル電気泳動によって分析し（図５Ｂ）、アセチルホスファターゼ活性についてアッセイした（図５Ａ）。ＡＣＰ、アセチルホスフェート。
【図６】図６Ａは、Ｙ９６７の画分＃１０に対する陰イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図である。この精製による最も活性な画分であった＃１４を、質量分析によって分析して、画分中のタンパク質の同一性を決定した（図６Ｂ）。ＲＨＲ２を活性な画分中のホスファターゼとして同定した。
【図７】図７は、野生型酵母株（Ｙ９６８）、または、ＲＨＲ２の欠失、ＨＯＲ２の欠失もしくはＲＨＲ２とＨＯＲ２の両方の欠失を含む組換え酵母株のＣＦＥに対するアセチルホスファターゼ活性アッセイの結果を示すグラフである。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、組換え酵母株集団のアセテートレベル（Ａ）、グリセロールレベル（Ｂ）および光学濃度（Ｃ）を示すグラフである。Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２株はＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）、ホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）、およびファルネセン産生経路内の遺伝子を異種発現する。Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２ｒｈｒ２＾株は、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２株と同質遺伝子型であるが、ＲＨＲ２の欠失をさらに含む（ｒｈｒ２＾）。
【図８−２】図８Ｄ〜８Ｅは、組換え酵母株集団のアセテートレベル（Ｄ）および光学濃度（Ｅ）を示すグラフである。Ｙ１２７４５株は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）、ホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）、およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現する。Ｙ１２７４６ｒｈｒ２＾株はＹ１２７４６株と同質遺伝子型であるが、ＲＨＲ２の欠失をさらに含む（ｒｈｒ２＾）。
【図９】図９は、ＲＨＲ２遺伝子がインタクトであるか（ＲＨＲ２＋）、または欠失している（ｒｈｒ２−）組換え酵母株集団の相対的なファルネセンレベル（上）および相対的な光学濃度（下）を示す図である。Ｙ９６８（右側のパネル）は野生型酵母株である。Ｙ１２８６９．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２（「Ｙ１２８６９」；右から２番目のパネル）は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）およびファルネセン産生経路内の遺伝子を異種発現するが、ホスホケトラーゼまたはホスホトランスアセチラーゼを発現しない。Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２（「Ｙ１２７４６」；左から２番目のパネル）は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）およびファルネセン産生経路内の遺伝子を異種発現し、ファルネセンの合成に使用される細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを産生するための経路としてホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを使用する。Ｙ１２７４５．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２（「Ｙ１２７４５」；左側のパネル）は、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、ファルネセン産生経路内の遺伝子、ファルネセンの合成に使用される細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを産生するための経路としてホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを使用する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
５．  実施形態の詳細な説明
５．１  用語
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、通常は天然に見いだされないものを指す。「異種ヌクレオチド配列」という用語は、天然では所与の細胞において通常は見いだされないヌクレオチド配列を指す。このように、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞に対して外来（すなわち、その細胞に対して「外因性」）であるもの；（ｂ）宿主細胞において天然に見いだされる（すなわち、「内因性」である）が、細胞内に天然ではない数量（すなわち、宿主細胞において天然に見いだされるよりも多いもしくは少ない数量）で存在するもの；または、（ｃ）宿主細胞において天然に見いだされるが、その天然の遺伝子座以外に位置するものであり得る。「異種酵素」という用語は、天然では所与の細胞において通常は見いだされない酵素を指す。この用語は、（ａ）所与の細胞に対して外因性である（すなわち、宿主細胞に天然では存在しないまたは宿主細胞の所与の状況では天然には存在しないヌクレオチド配列によりコードされる）酵素；および（ｂ）宿主細胞において天然に見いだされる（例えば、細胞に対して内因性のヌクレオチド配列によりコードされる酵素である）が、宿主細胞において天然ではない量（例えば、天然に見いだされるよりも多いまたは少ない量）で産生される酵素を包含する。
【００３５】
他方では、「ネイティブ」または「内因性」という用語は、分子、特に酵素および核酸に関して本明細書で使用される場合、それが由来するまたは天然に見いだされる生物体において発現する分子をその発現レベルとは関係なく示し、発現レベルはネイティブな微生物におけるその分子の発現レベルよりも低くて、それと同等であっても、それよりも高くてもよい。ネイティブな酵素またはポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物では改変され得ることが理解される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、例えば標的遺伝子、例えばＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の遺伝子の「機能を破壊する」または「機能の破壊」とは、標的遺伝子を、宿主細胞において標的遺伝子によりコードされるタンパク質の活性が低下するように変更することを意味する。一部の実施形態では、標的遺伝子の機能的破壊により、標的遺伝子の発現レベルが、機能が破壊されていない場合のその発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。同様に、例えば標的タンパク質、例えばアセチルホスファターゼ活性を有するタンパク質の「機能を破壊する」または「機能の破壊」とは、標的タンパク質を、宿主細胞においてタンパク質の活性が低下するように変更することを意味する。一部の実施形態では、標的タンパク質の機能的破壊により、標的タンパク質の活性または発現レベルが、機能が破壊されていない場合のその活性または発現と比較して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％低下する。一部の実施形態では、宿主細胞における標的遺伝子によりコードされる標的タンパク質の活性が排除される。他の実施形態では、宿主細胞における標的遺伝子によりコードされる標的タンパク質の活性が低下する。標的遺伝子の機能的破壊は、遺伝子の全部または一部を欠失させ、その結果、遺伝子発現を排除するまたは低下させること、または遺伝子産物の活性を排除するまたは低下させることによって実現することができる。標的遺伝子の機能的破壊は、遺伝子の調節エレメント、例えば、遺伝子のプロモーターを変異させ、その結果、発現を排除するまたは低下させることによって、または、遺伝子のコード配列を変異させ、その結果、遺伝子産物の活性を排除するまたは低下させることによっても実現することができる。一部の実施形態では、標的遺伝子の機能的破壊により、標的遺伝子の完全なオープンリーディングフレームが除去される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「親細胞」という用語は、改変宿主細胞に対して工学的に操作された１つまたは複数の特定の遺伝子改変、例えば、ＡＤＡの異種発現、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種発現、ＡＡＣＳの異種発現、ホスホケトラーゼの異種発現、ホスホトランスアセチラーゼの異種発現、およびメバロン酸経路の１種または複数種の酵素の異種発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含まない以外は本明細書に開示されている遺伝子改変宿主細胞と同一の遺伝的背景を有する細胞を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「産生」という用語は、一般に、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞によって産生されるある量のイソプレノイドを指す。一部の実施形態では、産生は、宿主細胞によるイソプレノイドの収量で表される。他の実施形態では、産生は、イソプレノイドの産生における宿主細胞の生産性で表される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「生産性」という用語は、経時的な（１時間当たり）宿主細胞を培養する発酵培養液の量（体積）当たりの産生されたイソプレノイドの量（重量）として表された、宿主細胞によるイソプレノイドの産生を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「収量」という用語は、宿主細胞により消費された炭素源の量当たりの産生されたイソプレノイドの量として重量で表された、宿主細胞によるイソプレノイドの産生を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「アセチルＣｏＡ由来化合物」という句は、その生合成においてアセチルＣｏＡを基質として使用する化合物を指す。例示的なアセチルＣｏＡ由来化合物としては、これだけに限定されないが、イソプレノイド、ポリケチド、脂肪酸、およびアルコールが挙げられる。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡ由来化合物は、エタノール、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２５３，００１号に記載のペントース基質から産生されるバイオエタノールである。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、具体的に列挙されている「参照」ポリペプチド（例えば、野生型配列）とは、アミノ酸の挿入、欠失、変異、および置換により異なるが、参照ポリペプチドと実質的に同様の活性を保持するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、バリアントは、変異誘発などの組換えＤＮＡ技法によって創出される。一部の実施形態では、バリアントポリペプチドは、その参照ポリペプチドとは、１つの塩基性残基の別の塩基性残基での置換（すなわちＬｙｓのＡｒｇでの置換）、１つの疎水性残基の別の疎水性残基での置換（すなわちＩｌｅのＬｅｕでの置換）、または１つの芳香族残基の別の芳香族残基での置換（すなわちＴｙｒのＰｈｅでの置換）などにより異なる。一部の実施形態では、バリアントは、参照配列の実質的な構造類似性がもたらされる保存的置換が得られる類似体を含む。このような保存的置換の例としては、これだけに限定することなく、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換およびその逆；アスパラギンのグルタミンでの置換およびその逆；トレオニンのセリンでの置換およびその逆；アルギニンのリシンでの置換およびその逆；または、イソロイシン、バリンまたはロイシンのいずれかの互いでの置換が挙げられる。
【００４３】
５．２  宿主細胞
本明細書で提供される組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌細胞、原核生物細胞、または真核細胞が挙げられる。
【００４４】
適切な原核生物宿主としては、これだけに限定されないが、種々のグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、またはグラム不定細菌のいずれかが挙げられる。例としては、これだけに限定されないが、以下の属に属する細胞が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｎ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｎｎｅｃｏｃｃｕｓ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓ。原核生物株の例としては、これだけに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｇｅｒｉｎｃｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞である。
【００４５】
適切な古細菌宿主としては、これだけに限定されないが、以下の属に属する細胞が挙げられる：Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、およびＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ。古細菌株の例としては、これだけに限定されないが、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、およびＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘが挙げられる。
【００４６】
適切な真核生物宿主としては、これだけに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。一部の実施形態では、本方法において有用な酵母として、微生物受託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣなど）に寄託されており、とりわけ、以下の属に属する酵母が挙げられる：Ａｃｉｃｕｌｏｃｏｎｉｄｉｕｍ、Ａｍｂｒｏｓｉｏｚｙｍａ、Ａｒｔｈｒｏａｓｃｕｓ、Ａｒｘｉｏｚｙｍａ、Ａｓｈｂｙａ、Ｂａｂｊｅｖｉａ、Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ、Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ、Ｂｏｔｒｙｏｚｙｍａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｂｕｌｌｅｒａ、Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｄｅｋｋａｒａ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｏｐｓｉｓ、Ｄｉｐｏｄａｓｃｕｓ、Ｅｅｎｉｅｌｌａ、Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｅｌｌａ、Ｅｒｅｍａｓｃｕｓ、Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｅｌｌａ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｈａｓｅｇａｗａｅａ、Ｈｏｌｔｅｒｍａｎｎｉａ、Ｈｏｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｈｙｐｈｏｐｉｃｈｉａ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａｓｐｏｒａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｏｎｄｏａ、Ｋｕｒａｉｓｈｉａ、Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ、Ｍｒａｋｉａ、Ｍｙｘｏｚｙｍａ、Ｎａｄｓｏｎｉａ、Ｎａｋａｚａｗａｅａ、Ｎｅｍａｔｏｓｐｏｒａ、Ｏｇａｔａｅａ、Ｏｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ、Ｐｈａｃｈｙｔｉｃｈｏｓｐｏｒａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｓａｉｔｏｅｌｌａ、Ｓａｋａｇｕｃｈｉａ、Ｓａｔｕｒｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｃｈｉｚｏｂｌａｓｔｏｓｐｏｒｉｏｎ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ、Ｓｐｏｒｏｐａｃｈｙｄｅｒｍｉａ、Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｙｍｂｉｏｔａｐｈｒｉｎａ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｅｓ、Ｓｙｍｐｏｄｉｏｍｙｃｏｐｓｉｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ、Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ、Ｕｄｅｎｉｏｍｙｃｅｓ、Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉａ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｅｌｌａ、Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、Ｙａｍａｄａｚｙｍａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｚｙｇｏａｓｃｕｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ、およびＺｙｇｏｚｙｍａ。
【００４７】
一部の実施形態では、宿主微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ（以前はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓと称されていた）、Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在はＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａとして公知である）である。一部の実施形態では、宿主微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、またはＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓなどのＣａｎｄｉｄａ属の株である。
【００４８】
特定の実施形態では、宿主微生物はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態では、宿主は、パン酵母、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、ＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９６３、ＣＢＳ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、およびＡＬ−１からなる群から選択される、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。一部の実施形態では、宿主微生物は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、およびＳＡ−１からなる群から選択される、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株である。特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＰＥ−２である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＣＡＴ−１である。別の特定の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株はＢＧ−１である。
【００４９】
一部の実施形態では、宿主微生物は、工業的発酵に適した微生物である。特定の実施形態では、微生物を、工業的発酵環境のストレス条件と認識される高溶媒濃度、高温、基質利用の拡大、栄養分の制限、糖および塩に起因する浸透ストレス、酸味、亜硫酸塩および細菌コンタミネーション、またはこれらの組合せの下で生存するのに適当な状態にする。
【００５０】
５．３  アセチルＣｏＡへのホスホケトラーゼ（ＰＫ）／ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）経路
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞におけるホスホケトラーゼ経路は、細胞を、ホスホケトラーゼ、および任意選択でホスホトランスアセチラーゼをコードするポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを発現するように工学的に操作することよって活性化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態、特に、ホスホケトラーゼ活性とは関係なく、アセチルホスフェートを代謝中間体として供給することができる実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドと、ホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドの両方を含む。
【００５１】
５．３．１  ホスホケトラーゼ（ＰＫ）
ホスホケトラーゼ（ＥＣ４．１．２．９）により、キシルロース５−ホスフェートからグリセルアルデヒド３−ホスフェートおよびアセチルホスフェートへの変換；ならびに／またはフルクトース−６−ホスフェートからエリトロース−４−ホスフェートおよびアセチルホスフェートへの変換が触媒される。ホスホケトラーゼ活性は、キシロースを唯一の炭素源として用いて成長するいくつかの酵母株において同定されているが、グルコースを用いて成長する酵母株では同定されていない（ＥｖａｎｓおよびＲａｔｌｅｄｇｅ、Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３９巻：４８〜５２頁；１９８４年）。ホスホケトラーゼの阻害剤としては、これだけに限定されないが、エリトロース４−ホスフェートおよびグリセルアルデヒド３−ホスフェートが挙げられる。
【００５２】
ホスホケトラーゼ活性をコードするポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの多数の例が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞に使用することができる。一部の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ  ＭＤ３６３のキシルロース５−ホスフェートケトラーゼ（ＸｐｋＡ）である（Ｐｏｓｔｈｕｍａら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８巻：８３１〜７頁；２００２年）。ＸｐｋＡは、乳酸菌におけるホスホケトラーゼ経路（ＰＫＰ）の中心的な酵素であり、４．４５５μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの特異的活性を示す（Ｐｏｓｔｈｕｍａら、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８巻：８３１〜７頁；２００２年）。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓのホスホケトラーゼであり（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２７巻（１２号）；８５３〜８５８頁（２００５年））、これは９．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇの特異的活性を示し、４．５を超えるｐＨで安定である（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９巻：５１５〜５２０頁；１９６６年）。このホスホケトラーゼは、Ｄ−キシルロース５−ホスフェートに対しては４．７ｍＭのＫｍを示し、フルクトース６−ホスフェートに対しては２９ｍＭのＫｍを示す（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ９巻：５１５〜５２０頁；１９６６年）。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの代表的なホスホケトラーゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＡＹ８０４１９０、および本明細書で提供される配列番号１が挙げられる。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓの代表的なホスホケトラーゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿８１９４０５、ＡＡＶ６６０７７．１、および本明細書で提供される配列番号２が挙げられる。他の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、例えば、Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒら（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７０巻：２８９２〜７頁；２００４年）によるペントース代謝性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に記載されているＢ．ｌａｃｔｉｓ由来のＤ−キシルロース５−ホスフェート／Ｄ−フルクトース６−ホスフェートホスホケトラーゼ遺伝子ｘｆｐである。
【００５３】
他の有用なホスホケトラーゼとしては、これだけに限定されないが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７６７８（ＡＢＩＸ０２０００００２．１：２３５０４００．．２３５２８７７；ＥＤＴ４６３５６．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ（ＮＣ＿０１７８３４．１：１１２７５８０．．１１３００５７；ＹＰ＿００６２８０１３１．１）；およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ（ＡＹ５１８２１６．１：９８８．．３４６５；ＡＡＲ９８７８８．１）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣ  Ａ４（ＣＢＦ７６４９２．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ（ＡＡＲ９８７８７．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＩＭＢ  ４１１７１（ＺＰ  ０３６４６１９６．１）；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＨＮ０１９（ＺＰ  ０２９６２８７０．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１（ＮＰ＿７８６０６０．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ２７３０５（ＺＰ＿０３９４０１４２．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  １００−２３（ＺＰ＿０３０７３１７２．１）；およびＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３（ＹＰ＿８１８９２２．１）に由来するものが挙げられる。
【００５４】
他の有用なホスホケトラーゼとしては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１／１５９８５号に記載されているものが挙げられる。これらのホスホケトラーゼとしては、（ＹＰ＿００１６０１８６３．１；Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  Ｐａｌ  ５）、（ＹＰ＿００１０９３２２ｌ．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃａ  ＰＶ−４）、（ＹＰ＿９２６７９２．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ  ＳＢ２Ｂ）、（ＹＰ＿７３５０９３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＭＲ−４）、（ＹＰ＿００１０４９４３９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＯＳ１５５）、（ＺＰ＿０２１５７８８４．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂｅｎｔｈｉｃａ  ＫＴ９９）、（ＹＰ＿００１４７２９２５．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ３）、（ＹＰ＿００１７５９６６９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｗｏｏｄｙｉ  ＡＴＣＣ  ５１９０８）、（ＹＰ＿００１６７３３５２．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ  ＨＡ  Ｗ−ＥＢ４）、（ＹＰ＿５６３７３３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＯＳ２１７）、（ＺＰ＿０５１１１６９７．１；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｄｒａｎｃｏｕｒｔｉｉ  ＬＬＡＰ  １２）、（ＥＥＱ８４３０７．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ  ＥＲ−３）、（ＸＰ＿００２６２６７３４．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ  ＳＬＨ１４０８１）、（ＸＰ＿００１５３９００９．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＮＡｍ１）、（ＥＥＨ０４１３３．１；Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  Ｇ１８６ＡＲ）、（ＥＥＨ２０２５８．１；Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  Ｐｂ０３）、（ＥＥＨ４４６５２．１；Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  Ｐｂ  １８）、（ＸＰ＿００２５８２７５２．１；Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ  ｒｅｅｓｉｉ  １７０４）、（ＥＥＲ２６３７７．１；Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｐｏｓａｄａｓｉｉ  Ｃ７３５  ｄｅｌｔａ  ＳＯＷｇｐ）、（ＥＥＱ２８０８５．１；Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ  ＣＢＳ  １１３４８０）、（ＸＰ＿００１８１９７８５．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０）、（ＸＰ＿００１３９９７８０．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、（ＸＰ＿００１２６３３８２．１；Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＮＲＲＬ  １８１）、（ＸＰ＿００１２７１０８０．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ  ＮＲＲＬ  １）、（ＸＰ＿００１２１３７８４．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＩＨ２６２４）、（ＣＢＦ７６４９２．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ＦＧＳＣＡ４）、（ＸＰ＿００２５６１９１３．１；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５４−１２５５）、（ＸＰ＿００２４８０３９１．１；Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ  ＡＴＣＣ  １０５００）、（ＸＰ＿００２１４４０１４．１；Ｐｅｎｉｃｉｌ���ｉｕｍ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ  ＡＴＣＣ  １０５００）、（ＸＰ＿００２１４４０１４．１；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｍｅｆｆｅｉ  ＡＴＣＣ  １８２２４）、（ＸＰ＿７５４５４３．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ  Ａｆ２９３）、（ＸＰ＿００１５５６６３５．１；Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ  Ｂ０５．１  ０）、（ＸＰ＿００１５９２５４９．１；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  １９８０）、（ＸＰ＿３８６７２９．１；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  ＰＨ−１）、（ＥＥＵ４７１７１．１；Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ  ｍｐ  ＶＩ  ７７−１３−４）、（ＥＥＹ１６６３７．１；Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ａｌｂｏａｔｒｕｍ  ＶａＭｓ．ｌ  ０２）、（ＸＰ＿９５６６４９．１；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＯＲ７４Ａ）、（ＸＰ＿３６４２７１．２；Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ７０−１５）、（ＸＰ＿００１９０４５８５．１；Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎｅ）、（ＸＰ＿００１８３６１５９．１；Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ  ｏｋａｙａｍａ７＃１３０）、（ＮＰ＿５９５９６３．１；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ  ｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＸＰ＿００２１７３４４１．１；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ  ｅｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ  ｙＦＳ２７５）、（ＸＰ＿５７０８６０．１；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ．  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＪＥＣ２１）、（ＸＰ＿７５９５６１．１；Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ  ５２１）、（ＺＰ＿０５０２７０７８．１；Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ  ＰＣＣ  ７４２０）、（ＹＰ＿００３１０１１１４．１；Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ  ＤＳＭ  ４３８２７）、（ＺＰ＿０３５６８２４４．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｒｉｍａｅ  ＡＴＣＣ  ４９６２６）、（ＹＰ＿００３１８０２３７．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ  ＤＳＭ  ２０４６９）、（ＺＰ＿０３９４６９２８．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ  ＤＳＭ  １５８２９）、（ＺＰ＿０３２９６２９９．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＤＳＭ  １３２７９）、（ＡＡＲ９８７８７．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、（ＺＰ＿０３６１８９０９．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ＤＳＭ  ２０２１３）、（ＺＰ＿０３６４６１９６．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣＩＭＢ  ４１１７１）、（ＺＰ＿０４４４８１０１．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ２００９８）、（ＺＰ＿０３３２４２０４．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  １６９９２）、（ＡＡＲ９８７９０．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＣＦＡＲ  １７２）、（ＡＡＲ９８７８９．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ）、（ＺＰ＿０３９３７６１０．１；Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １４０１９）、（ＺＰ＿０５９６５２０１．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ２���０９３）、（ＺＰ＿０２９６２８７０．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＨＮＯ１９）、（ＡＡＲ９８７８８．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  Ｇｌｏｂｏｓｕｍ）、（ＺＰ＿０３９４６５１８．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ  ＤＳＭ  １５８２９）、（ＹＰ＿００１５１１１７１．１；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．  ＥＡＮｌｐｅｃ）、（ＹＰ＿７１３６７８．１；Ｆｒａｎｋｉａ  ａｌｎｉ  ＡＣＮ１４ａ）、（ＹＰ＿００２７７８３９５．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  Ｂ４）、（ＹＰ＿７０１４６６．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡ１）、（ＺＰ＿０４３８３８８０．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＳＫ１２１）、（ＹＰ  ９４７５９８．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ  ＴＣ  １）、（ＣＡＤ４８９４６．１；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、（ＮＰ＿７９１４９５．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  Ｔｏｍａｔｏ  ｓｔｒ．  ＤＣ３０００）、（ＹＰ＿００３１２５９９２．１；Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ  ｐｉｎｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ２５８８）、（ＡＢＸ５６６３９．１；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｖ４）、（ＹＰ＿００２３７１８８３．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８８０１）、（ＹＰ＿００１８０６５９６．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２）、（ＺＰ＿０１７３０６５２．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０）、（ＣＡＱ４８２８６．１；Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ  ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ  ＮＩＶＡ−ＣＹＡ  ９８）、（ＺＰ＿０３２７６２９８．１；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８）、（ＺＰ＿０３１５７２７７．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７８２２）、（ＹＰ＿００２３７９０３１．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７４２４）、（ＹＰ＿００１６５８５０１．１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＩＥＳ−８４３）、（ＺＰ＿０１６２１７７４．１；Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８１０６）、（ＮＰ＿４８５５２４．１；Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７１２０）、（ＺＰ＿０５０３６３５０．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７３３５）、（ＹＰ＿００１５１４８１３．１；Ａｃａｒｙｏｃｈ１ｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ  ＭＢＩＣ  １１  ０１７）、（ＺＰ＿０５０３９５３７．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７３３５）、（ＺＰ＿０２８８６２３５．１；Ｂｕｒｋｈｏ１ｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  Ｃ４  ＤＩＭ）、（ＺＰ＿０３２６４５０３．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  Ｈ１６０）、（ＺＰ＿０１０８５８１９．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ５７０１）、（ＺＰ＿０５０４５６０３．１；Ｃｙａｎｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７００１）、（ＺＰ＿０１１２３６４５．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ７８０５）、（ＹＰ＿００１２２３９３２．１；Ｓｙｎｅ��ｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＷＨ  ７８０３）、（ＺＰ＿０１０７９０３８．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＲＳ９９１７）、（ＹＰ＿００１８８９００２．１；Ｂｕｒｋｈｏ１ｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ  ＰｓＪＮ）、（ＹＰ＿５５３９６７．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ  ＬＢ４００）、（ＺＰ＿０２８８１７０９．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｇｒａｍｉｎｉｓ  Ｃ４ＤＩＭ）、（ＺＰ＿０３２７０５３２．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．  Ｈ１６０）、（ＹＰ＿００１８６１６２０．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍ  ＳＴＭ８１５）、（ＹＰ＿００２７５５２８５．１；Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ５１１９６）、（ＥＤＺ３８８８４．１；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．  Ｇｒｏｕｐ  ＩＩ  ‘５−ｗａｙ  ＣＯ’）、（ＥＥＳ５３２０４．１；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｆｅｒｒｏｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｕｍ）、（ＹＰ＿１７２７２３．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＰＣＣ  ６３０１）、（ＮＰ＿６８１９７６．１；Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ  ＢＰ−１）、（ＹＰ＿１１４０３７．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ｓｔｒ．  Ｂａｔｈ）、（ＹＰ＿００２４８２５７７．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７４２５）、（ＮＰ＿４４２９９６．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３）、（ＹＰ＿００２４８２７３５．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７４２５）、（ＺＰ＿０４７７４８６６．１；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０）、（ＺＰ＿０１４５３１４８．１；Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｙｄａｎｓ  ＰＶ−ｌ）、（ＺＰ＿０４８３０５４８．１；Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ  ｆｅｒｒｕｇｉｎｅａ  ＥＳ−２）、（ＸＰ＿００１２７３８６３．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ  ＮＲＲＬ  １）、（ＸＰ＿００１２５８６４３．１；Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＮＲＲＬ  １８１）、（ＸＰ＿００１７２７６８
０．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＲＩＢ４０）、（ＸＰ＿００１３９６３０６．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、（ＸＰ＿００１２１６０７５．１；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ  ＮＩＨ２６２４）、（ＸＰ＿００２５６７１３０．１；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５４−１２５５）、（ＸＰ＿００２１４３８５１．１；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉ  ＡＴＣＣ  １８２２４）、（ＸＰ＿００２４８０２１６．１；Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ  ＡＴＣＣ  １０５００）、（ＸＰ＿００１５５９９４９．１；Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ  Ｂ０５．１０）、（ＸＰ＿００１５９３１００．１；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ  １９８０）、（ＸＰ＿００１９３２１９２．１；Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ  ｔｒｉｔｉｃｉｒｅｐｅｎｔｉｓ  Ｐｔ−ｌＣ−ＢＦＰ）、（ＸＰ＿００１７９３７２９．１；Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｎｏｄｏｒｕｍ  ＳＮ  １５）、（ＸＰ＿５６７７７６．１；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｒｎａｎｓ  ｖａｒ．  ｎｅｏｆｏｒｒｎａｎｓ  ＪＥＣ２１）、（ＸＰ＿３８６５０４．１；Ｏｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ  ＰＨ−１）、（ＥＥＵ４６２６５．１；Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ  ｍｐ  ＶＩ  ７７−１３−４）、（ＡＣ０２４５１６．１；Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐ１ｉａｅ）、（ＸＰ＿９５９９８５．１；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＯＲ７４Ａ）、（ＸＰ＿００１９０４６８６．１；Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎｅ）、（ＹＰ＿００２２２０１４１．１；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ  ＡＴＣＣ  ５３９９３）、（ＹＰ＿００１２２０１２８．１；Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ  ｃｒｙｐｔｕｍ  ＪＦ  −５）、（ＹＰ＿００１４７１２０２．１；Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｌｅｔｔｉｎｇａｅ  ＴＭＯ）、（ＹＰ＿００２３５２２８７．１；Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ  ｔｕｒｇｉｄｕｍ  ＤＳＭ  ６７２４）、（ＹＰ＿５７１７９０．１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ  Ｘ１４）、（ＺＰ＿０１０９２４０１．１；Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＤＳＭ  ３６４５）、（ＹＰ＿００１３４０８０９．１；Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＷＹＬＩ）、（ＮＰ＿８６６３８４．１；Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）、（ＺＰ＿０５１０８５０２．１；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｄｒａｎｃｏｕｒｔｉｉ  ＬＬＡＰ  １２）、（ＺＰ＿０４９９５８１７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｇ１）、（ＺＰ＿０４０２３０５５．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＳＤ２１１２）、（ＺＰ＿０３９６００６０．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ４９５４０）、（ＺＰ＿０３０７３１７２．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  １００−２３）、（ＺＰ＿０５５５３０３１．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ  １０１−４−ＣＨＮ）、（ＺＰ＿０５８６３３４７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ２８−３−ＣＨＮ）、（ＺＰ＿０４０２１２８９．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＡＴＣＣ  ４７９６）、（ＺＰ＿０３９９５１９４．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  ｌＶ−ＶＯｌ）、（ＺＰ＿０４０１０９２２．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  １６０４７）、（ＺＰ＿０５５４９９６１．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  １２５−２−ＣＲＮ）、（ＺＰ＿０３９５１３６１．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ｌＶ−Ｖ０３）、（ＺＰ＿０５７４４５１５．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｅｒｓ  ＤＳＭ  １３３３５）、（ＹＰ＿６１８６３５．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １１８４２）、（ＺＰ＿０３９５５９１７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ  ｌＶ−ＶＩ６）、（ＺＰ＿０３９４２４１５．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ  ＡＴＣＣ  １１５７７）、（ＺＰ＿０１５４４８００．１；Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１６３）、（ＮＰ＿７８６０６０．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳＩ）、（Ｑ９３７Ｆ６；ＸＰＫＡ＿ＬＡＣＰＥ）、（ＹＰ＿３９４９０３．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＹＰ＿８０３８９１．１；Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５７４５）、（ＢＡＩ４０７２７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ）、（ＺＰ＿０３９４０１４２．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  ２７３０５）、（ＺＰ＿０４００９２７３．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ  １１７４１）、（ＺＰ＿０３９５８６４３．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５６４４）、（ＺＰ＿０４４３１４３３．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ３６Ｄ１）、（ＺＰ＿０４６０１９０６．１；Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ５１１４７）、（ＺＰ＿０５７３６９２７．１；Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ４９１７５）、（ＹＰ＿００１４４９６３１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ  ｓｔｒ．  Ｃｈａｌｌｉｓ  ｓｕｂｓｔｒ．  ＣＨＩ）、（ＮＰ＿７３６２７４．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ＮＥＭ３１６）、（ＺＰ＿０４４４２８５４．１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ  ＤＳＭ  ２０６０１）、（ＺＰ＿０５６４６３６０．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ  ＥＣ３０）、（ＺＰ＿０５６５０３２２．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＥＧ２）、（ＺＰ＿０５６７５３０７．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ｃｏｍ１２）、（ＢＡＨ６９９２９．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＰＧ  １８）、（ＹＰ＿００２０００００６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉ��ｉｄｉｓ  １５  ８Ｌ３−１）、（ＹＰ＿００１２５６２６６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  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ＢｉｓＢ５）、（ＹＰ＿４８７４６２．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＨａＡ２）、（ＮＰ＿９４７０１９．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＣＧＡ００９）、（ＹＰ＿５３３６６０．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ１８）、（ＹＰ＿９７３５１２．１；Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＪ２）、（ＺＰ＿０１４６４１９１．１；Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＤＷ４／３−１）、（ＹＰ＿００１２６７７７８．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  Ｆｌ）、（ＹＰ＿８２９６４４．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＦＢ２４）、（ＹＰ＿００２４８６３９２．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ  Ａ６）、（ＺＰ＿０５８１６６５１．１；Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒ  ｋｅｄｄｉｅｉｉ  ＤＳ���  １０５４２）、（ＹＰ＿００２８８３０５３．１；Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ  ｃａｖｅｍａｅ  ＤＳＭ  １２３３３）、（ＹＰ＿００３１６１５４０．１；Ｊｏｎｅｓｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  ２０６０３）、（ＺＰ＿０３９１１４８２．１；Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  ＤＳＭ  １５８９４）、（ＣＡＪ５７８５０．１；Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、（ＹＰ＿００１１３４６０５．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ  ＰＹＲ−ＧＣＫ）、（ＹＰ  ９５３８７７．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ  ＰＹＲ−ｌ）、（ＹＰ＿００３１５５６１１．１；Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＤＳＭ  ４８１０）、（ＹＰ＿００３１４８１２７．１；Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  ２０５４７）、（ＹＰ＿００１２２１１６８．１；Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ＮＣＰＰＢ  ３８２）、（ＹＰ＿００１１５８４２６．１；Ｓａ１ｉｎｉｓｐｏｒａ  ｔｒｏｐｉｃａ  ＣＮＢ−４４０）、（ＹＰ＿００１５３６４２０．１；Ｓａ１ｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏ１ａ  ＣＮＳ−２０５）、（ＺＰ＿０４６０８３０２．１；Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ３９１４９）、（ＹＰ＿８８７９１４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｓｔｒ．  ＭＣ２  １５５）、（ＹＰ＿６３９９５６．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＭＣＳ）、（ＺＰ＿０４７４９１５７．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ  ＡＴＣＣ  １２４７８）、（ＹＰ＿００１８５１０３９．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍＭ）、（ＮＰ＿９６０５０７．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０）、（ＺＰ＿０５２２４３３０．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ１ａｒｅ  ＡＴＣＣ  １３９５０）、（ＹＰ＿００１７０３２４０．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、（ＺＰ＿００９９５１３３．
１；Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＨＴＣＣ２６４９）、（ＹＰ＿２９１０２６．１；Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ  ＹＸ）、（ＺＰ＿０４０３１８４５．１；Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｕｒｖａｔａ  ＤＳＭ  ４３１８３）、（ＺＰ＿０４４７５５１４．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０２１）、（ＺＰ＿０４３３５６４１．１；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１）、（ＺＰ＿０４４８２２０１．１；Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ４４７２８）、（ＹＰ＿００３０９９７１２．１；Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ  ＤＳＭ  ４３８２７）、（ＮＰ＿７３３５０８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２））、（ＣＡＪ８８３７９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２３８７７）、（ＺＰ＿０５５３６８８３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００）、（ＺＰ＿０５０２０４２１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｖｉｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９０８３）、（ＣＢＧ６７６２５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２）、（ＮＰ＿８２２４４８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０）、（ＺＰ＿０４６８９５４７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  １４６７２）、（ＺＰ＿０５５３００２１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６）、（ＺＰ＿０５５１２５０１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３６５３）、（ＺＰ＿０５８００９２７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｙｏｇｒｉｓｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３３３１）、（ＹＰ＿００１８２８２７５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｒｉｓｅｕｓ  ＮＢＲＣ  １３３５０）、（ＺＰ＿０４７０５４９３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ  ＪＩ０７４）、（ＺＰ＿０４９９６９６３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｇｌ）、（ＺＰ＿０５４８５３０９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＰＢ７８）、（ＺＰ＿０３８６０８８２．１；Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ  ｆｌａｙｉｄａ  ＤＳＭ  １７８３６）、（ＹＰ＿１１７５３９．１；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２）、（ＹＰ＿００１５０５５５６．１；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．  ＥＡＮｌｐｅｃ）、（ＹＰ＿４８２６２７．１；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．  ＣｃＩ３）、（ＹＰ＿００３１１６８９３．１；Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ  ４４９２８）、（ＹＰ＿８７２２８０．１；Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｌｏｌｙｔｉｃｕｓ  ｌＩＢ）、（ＹＰ＿９２４８０７．１；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  ＪＳ６１４）、（ＹＰ＿００１１０４１５７．１；Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ  ２３３８）、（ＹＰ＿００２２８２６７３．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｙ��  ｔｒｉｆｏｌｉｉ  ＷＳＭ２３０４）、（ＹＰ＿００２９７７２５６．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｙ．  ｔｒｉｆｏｌｉｉ  ＷＳＭ１３２５）、（ＹＰ＿００１９７９７９６．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ  ＣＩＡＴ  ６５２）、（ＹＰ＿４７０９２６．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ  ＣＦＮ  ４２）、（ＹＰ＿００２５４０６３３．１；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  Ｋ８４）、（ＺＰ＿０５１８２３６６．１；Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．  ８３／１３）、（ＺＰ＿０４６８３３８４．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＬＭＧ  ３３０１）、（ＹＰ＿００１３７３２５４．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉ  ＡＴＣＣ  ４９１８８）、（ＹＰ＿００１２０４１０９．１；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＯＲＳ２７８）、（ＹＰ＿００１２３８４１８．ｌ；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＴＡｉｌ）、（ＮＰ＿７６９１５８．１；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＹＰ＿５７７１６４．１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ  Ｘ１４）、（ＹＰ＿００２９６１６１２．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＡＭ  １）、（ＹＰ＿６７４７９２．１；Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＢＮＣＩ）、（ＺＰ＿０５８１３６１７．１；Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｕｍ  ＷＳＭ２０７５）、（ＹＰ＿３１８５５９．１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ  Ｎｂ−２５５）、（ＹＰ＿００１７５５２８０．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＪＣＭ  ２８３１）、（ＹＰ＿００１７５３１１９．ｌ；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＪＣＭ  ２８３１）、（ＹＰ＿００３０６６０１１．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＤＭ４）、（ＹＰ＿００２９６４７７７．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  ＡＭ  １）、（ＹＰ＿００２５０１２９２．１；Ｍｅｔｈｙ１ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕ１ａｎｓ  ＯＲＳ  ２０６０）、（ＹＰ＿００２４９５２６５．１；Ｍｅｔｈｙ１ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｏｄｕ１ａｎｓ  ＯＲＳ  ２０６０）、（ＹＰ＿００１７７０３８７．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．４−４６）、（ＹＰ＿００２９４４７１２．１；Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ  Ｓ１１０）、（ＺＰ＿０１１５６７５７．１；Ｏｃｅａｎｉｃｏｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ  ＨＴＣＣ２５１６）、（ＺＰ＿０１６２８７８７．１；Ｎｏｄｕ１ａｒｉａ  ｓｐｕｍｌｇｅｎａ  ＣＣＹ９４１４）、（ＹＰ＿００１８６５５４６．１；Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ  ７３１０２）、（ＹＰ＿３２１０１５．１；Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉ１ｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３）、（ＺＰ＿０３７６９１４０．１；Ｎｏｓｔｏｃ  ａｚｏｌｌａｅ’  ０７０８）、（ＮＰ＿９２３９４３．１；Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏ１ａｃｅｕｓ  ＰＣＣ  ７４２１）、（ＹＰ＿４７７３８５．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏ��ｃｕｓｓｐ．  ＪＡ−２−３Ｂ’ａ（２−１３））、（ＹＰ＿００１３２８６５９．１；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｄｉｃａｅ  ＷＳＭ４１９）、（ＹＰ＿７６５６７０．１；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｖ．  ｖｉｃｉａｅ  ３８４１）、（ＮＰ＿３８４２１２．２；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１）、（ＺＰ＿０２９２８４５５．１；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  ４１３６）、（ＹＰ＿００１６３７５３９．１；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ  Ｐａｌ）、（ＺＰ＿０１０４５８２５．１；Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｎｂ−３１１Ａ）、（ＺＰ＿０２７３６６０２．１；Ｇｅｍｍａｔａ  ｏｂｓｃｕｒｉｇｌｏｂｕｓ  ＵＱＭ  ２２４６）、（ＹＰ＿００３１５７８７１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂａｃｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ４０２８）、（ＺＰ＿０３６３１３０４．１；ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｅｌｌｉｎ５１４）、（ＺＰ＿０４５７７５５８．１；Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ  ＨＯｘＢＬＳ）、（ＺＰ＿０４５７９７１２．１；Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｆｏｒｍｉｇｅｎｅｓ  ＯＸＣＣ１３）、（ＹＰ＿８２６１６９．１；Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ｕｓｉｔａｔｕｓ  Ｅｌｌｉｎ６０７６）、（ＹＰ＿００２０１８７５３．１；Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ  ｐｈａｅｏｃｌａｔｈｒａｔｉｆｏｒｍｅ  ＢＵ−１）、（ＹＰ＿００２０１６２８５．１；Ｐｒｏｓｔｈｅｃｏｃｈｌｏｒｉｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ  ＤＳＭ  ２７１）、（ＹＰ＿００１９４３３６９．１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｉｍｉｃｏｌａ  ＤＳＭ  ２４５）、（ＮＰ＿６６２４０９．１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ  ＴＬＳ）、（ＺＰ＿０１３８６１７９．１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ  ＤＳＭ  １３０３１）、（ＹＰ＿３７５４２２．１；Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｌｕｔｅｏｌｕｍ  ＤＳＭ  ２７３）、（ＹＰ＿２８５２７７．１；Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａ  ＲＣＢ）、（ＹＰ＿３１４５８９．１；Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５２５９）、（ＹＰ＿５４５００２．１；Ｍｅｔｈｙ１ｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ  ＫＴ）、（ＮＰ＿８４２１３９．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ  １９７１８）、（ＹＰ＿７４８２７４．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｃ９１）、（ＹＰ＿４１１６８８．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５１９６）、（ＹＰ＿３４４７００．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｃｅａｎｉ  ＡＴＣＣ  １９７０７）、（ＹＰ＿００７００４．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｈｌａｍｙｄｉａ  ａｍｏｅｂｏｐｈｉ１ａ  ＵＷＥ２５）、（ＮＰ＿４３５８３３．１；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  １０２１）、（ＺＰ＿０４４２１８７４．１；Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｄｅ１ｅｙｉａｎｕｍ  ＤＳＭ  ６９４６）、（ＮＰ＿１０７０５４．１；Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ  ＭＡＦＦ３０３０９９）、（ＹＰ＿００２２８９７９７．１；Ｏｌｉｇｏｔｒｏｐｈａ  ｃａｒｂｏｘｉｄｏｖｏｒａｎｓ  ＯＭ５）、（ＹＰ＿００１８３３３１２．ｌ；Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｄｉｃａ  ＡＴＣＣ  ９０３９）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なホスホケトラーゼとしては、本明細書に記載のホスホケトラーゼのいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のホスホケトラーゼのいずれかと実質的な相同性を共有し、かつ、（２）Ｘ５Ｐからグリセルアルデヒド３−ホスフェート（Ｇ３Ｐ）およびアセチルホスフェートへの変換；またはＦ６Ｐからエリトロース４−ホスフェート（Ｅ４Ｐ）およびアセチルホスフェートへの変換を触媒することができる。ホスホケトラーゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がホスホケトラーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれば、ホスホケトラーゼと「実質的な相同性」を共有するといえる。
【００５６】
５．３．２  ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ホスホトランスアセチラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）により、アセチルホスフェートがアセチルＣｏＡに変換される。
【００５７】
ホスホトランスアセチラーゼ活性をコードするポリヌクレオチド、遺伝子およびポリペプチドの多数の例が当技術分野で公知であり、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞に使用することができる。一部の実施形態では、このようなポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のホスホトランスアセチラーゼである。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの代表的なホスホトランスアセチラーゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００９７０６．１：１４２８５５４．．１４２９５５５、および本明細書で提供される配列番号３が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉの代表的なホスホトランスアセチラーゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００１３９４７８０および本明細書で提供される配列番号４が挙げられる。他の有用なホスホトランスアセチラーゼとしては、これだけに限定されないが、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ（ＮＣ＿０１０６０９．１：４６０３０３．．４６１２７７；ＹＰ＿００１８４１３８９．１０）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＣ＿０１４４７９．１：３６７１８６５．．３６７２８３６；ＹＰ＿００３８６８０６３．１）；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ（Ｌ２３１４７．１：２０７．．１２０８；ＡＡＡ７２０４１．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ（ＢＡＢ１９２６７．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１（ＮＰ＿７８４５５０．１）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１（ＺＰ  ０３９４４４６６．１）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．  １６８（ＮＰ＿３９１６４６．１）；Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（ＡＡＡ７２０４１．１）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ  ＤＳＭ  ４１５０（ＺＰ  ０３１５２６０６．１）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４（ＮＰ＿３４８３６８．１）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５（ＹＰ  ００１３９４７８０．１）；Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ＤＳＭ  ２００８（ＺＰ  ０３８５５２６７．１）；およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．  ＡＴＣＣ  ９１５０（ＹＰ＿  １４９７２５．１）に由来するものが挙げられる。
【００５８】
他の有用なホスホトランスアセチラーゼとしては、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１１／１５９８５号に記載されているものが挙げられる。これらのホスホトランスアセチラーゼとしては、（ＺＰ＿０５４２７７６６．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｐｈｅｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ４９９８９）、（ＺＰ＿０３６２７６９６．１；ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｅｌｌｉｎ５１４）、（ＺＰ＿０３１３１７７０．１；Ｃｈｔｈｏｎｉｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｆｌａｖｕｓ  Ｅｌｌｉｎ４２８）、（ＹＰ＿００１８７８０３１．１；Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ  ＴＣＣＢＡＡ−  ８３５）、（ＺＰ＿０４５６２９２４．１；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．３０＿２）、（ＹＰ＿００１４５１９３６．１；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｏｓｅｒｉ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８９５）、（ＹＰ＿１４９７２５．１；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  ｓｔｒ．  ＡＴＣＣ  ９１５０）、（ＹＰ＿００１５６９４９６．１；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｎｚｏｎａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ  ６２：ｚ４，ｚ２３：−−）、（ＮＰ＿４１６９５３．１；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｓｔｒ．  Ｋ−１２  ｓｕｂｓｔｒ．  ＭＧ１６５５）、（ＹＰ＿００２９２０６５４．１；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４）、（ＺＰ＿０４６３７７９７．１；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ  ＡＴＣＣ  ２９９０９）、（ＺＰ＿０１２２２６０４．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ３ＴＣＫ）、（ＺＰ＿０２１５６８５５．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂｅｎｔｈｉｃａ  ＫＴ９９）、（ＹＰ＿９５８５０８．１；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｑｕａｅｏｌｅｉ  ＶＴ８）、（ＹＰ＿０６６７７１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ＬＳｖ５４）、（ＹＰ＿００２７８０５３１．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ  Ｂ４）、（ＹＰ＿７０３５０６．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡ１）、（ＺＰ＿０５４７９９６３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＡＡ４）、（ＹＰ＿００２７６１３９８．１；Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  Ｔ−２７）、（ＺＰ＿０４６７０１８９．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿７＿４７ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０５４９３９５８．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｐｙｒｏｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ  ２７８２）、（ＹＰ＿００３１４３５０６．１；Ｓｌａｃｋｉａ  ｈｅｌｉｏｔｒｉｎｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＤＳＭ  ２０４７６）、（ＺＰ＿０５０９０８２２．１；Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ｓｐ．  Ｒ１１）、（ＺＰ＿０１７４８０２１．１；Ｓａｇｉｔｔｕｌａ  ｓｔｅｌｌａｔａ  Ｅ−３７）、（ＮＰ＿６０４０６９．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＺＰ＿０５８１４７３４．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ３＿１＿３３）、（ＺＰ＿０６０２６６１３．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ��ｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ３３６９３）、（ＺＰ＿０５６１７６３２．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ３＿１＿５Ｒ）、（ＺＰ＿０５６２８０３０．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｄ１２）、（ＺＰ＿０４８６０９４６．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖａｎｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７７２５）、（ＺＰ＿０４５６７４４４．１；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ９８１７）、（ＹＰ＿００１４８９４３７．１；Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｕｔｚｌｅｒｉ  ＲＭ４０１８）、（ＹＰ＿００３１６３２３６．１；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｂｕｃｃａｌｉｓ  Ｃ−１０１３−ｂ）、（ＺＰ＿０５９０２４２０．１；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｈｏｆｓｔａｄｉｉ  Ｆ０２５４）、（ＺＰ＿０６０１１３０８．１；Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗｉｉ  Ｆ０２６４）、（ＺＰ＿０４４７９５４８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ  ＤＳＭ  １２１１２）、（ＺＰ＿０３８５５２６７．１；Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ｐａｒｖｕｌａ  ＤＳＭ  ２００８）、（ＺＰ＿０３９２８５２３．１；Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  Ｄ２１）、（ＮＰ＿９７０６５９．１；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣ  ３５４０５）、（ＺＰ＿０５６２１５１０．１；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ  ＡＴＣＣ  ３５５８０）、（ＮＰ＿２１８５３４．１；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｔｒ．  Ｎｉｃｈｏｌｓ）、（ＺＰ＿０４０４７３１８．１；Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｍｕｒｄｏｃｈｉｉ  ＤＳＭ  １２５６３）、（ＹＰ＿００２７２０４７８．１；Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  ＷＡｌ）、（ＹＰ＿００１７４０７０６．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｃｌｏａｃａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、（ＥＥＲ０５０１３．１；Ｐｅｒｋｉｎｓｕｓ  ｍａｎｎｕｓ  ＡＴＣＣ  ５０９８３）、（ＹＰ＿９４５５８２．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｔｕｒｉｃａｔａｅ  ９１Ｅ１３５）、（ＹＰ＿００１８８４０１３．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｈｅｒｍｓｉｉ  ＤＡＨ）、（ＹＰ＿００２２２２２３３．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｄｕｔｔｏｎｉｉ  Ｌｙ）、（ＺＰ＿０３６７５３０６．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐｉｅｌｍａｎｉｉ  Ａ１４Ｓ）、（ＺＰ＿０３４３５３９４．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ａｆｚｅｌｉｉ  ＡＣＡ−ｌ）、（ＺＰ＿０３５４００１８．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｇａｒｉｎｉｉ  Ｆａｒ０４）、（ＺＰ＿０３６７２９２８．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｖａｌａｉｓｉａｎａ  ＶＳ１１６）、（ＮＰ＿２１２７２３．１；Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ  Ｂ３１）、（ＹＰ＿００１９５６２８７．１；ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｔｅｒｍｉｔｅ  ｇｒｏｕｐ  １  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｙｌｏｔｙｐｅ  Ｒｓ−Ｄ１７）、（ＮＰ＿９７５２６８．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｙｃｏｉｄｅｓ  ＳＣ  ｓｔｒ．  ＰＧｌ）、（ＹＰ＿４２４２１６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７３４３）、（ＹＰ＿０５３２８３．１；��ｅｓｏｐｌａｓｍａ  ｆｌｏｒｕｍ  Ｌｌ）、（ＣＡＫ９９５４０．１；Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｃｉｔｒｉ）、（ＮＰ＿０７２９６６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  Ｇ３７）、（ＮＰ＿１１０１１６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  Ｍ１２９）、（ＮＰ＿８５３４０３．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ  Ｒ）、（ＮＰ＿７５７８８９．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓ  ＨＦ−２）、（ＹＰ＿１１６０１６．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅａ  ２３２）、（ＹＰ＿００２９６０６０７．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｅ）、（ＹＰ＿００１２５６２８２．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ＰＧ２）、（ＢＡＨ６９５０３．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＰＧ１８）、（ＹＰ＿２７８７７１．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｙｎｏｖｉａｅ  ５３）、（ＮＰ＿３２６０６８．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｕｌｍｏｎｉｓ  ＵＡＢ  ＣＴＩＰ）、（ＹＰ＿０１５８６５．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｍｏｂｉｌｅ  １６３Ｋ）、（ＹＰ＿００１２５６６３０．１；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  ＰＧ２）、（ＹＰ＿８０２６８５．１；Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．  Ｃｃ（Ｃｉｎａｒａ  ｃｅｄｒｉ））、（ＹＰ＿００１８８５４３２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｂ  ｓｔｒ．  Ｅｋｌｕｎｄ  １７Ｂ）、（ＹＰ＿００１３０８３０２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＣｌＭＢ  ８０５２）、（ＺＰ＿０５１３１２８０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  ７＿２＿４３ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０２９４８６０４．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ５５２１）、（ＮＰ＿５６２６４１．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｓｔｒ．  １３）、（ＺＰ＿０５３９１２３２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ  Ｐ７）、（ＹＰ＿００１３９４７８０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５）、（ＺＰ＿０２９９５４１９．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ  １５５７９）、（ＮＰ＿７８１８７０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８）、（ＺＰ＿０４８６２１９２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｄ  ｓｔｒ．  １８７３）、（ＹＰ＿８７８２９８．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉ  ＮＴ）、（ＺＰ＿０４８０４９６０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ  ７４３Ｂ）、（ＮＰ＿３４８３６８．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ８２４）、（ＡＣＡ５１６６８．１；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）、（ＺＰ＿０５３３６８８６．１；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＳＭ  ５７１）、（ＮＰ＿６２３０９７．１；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＭＢ４）、（ＹＰ＿００１６６３３５４．１；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏ  ｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｘ５１４）、（ＹＰ＿００２５０８７７１．１；Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈ  ｒｉｘ  ｏｒｅｎｉｉ  Ｈ  １６８）、（ＹＰ＿００３１９０６７９．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ  ＤＳＭ  ７７１）、（ＹＰ＿００１９１７７７６．１；Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  ＪＷＩＮＭ−ＷＮ−ＬＦ）、（ＹＰ＿３６０２８８．１；Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ  Ｚ−２９０１）、（ＥＹ８３５５１．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．２＿１＿３３Ｂ）、（ＺＰ＿０２０３３４０８．１；Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｍｅｒｄａｅ  ＡＴＣＣ  ４３１８４）、（ＮＰ＿９０５２９７．１；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３）、（ＺＰ＿０４０５６０００．１；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｕｅｎｏｎｉｓ  ６０−３）、（ＺＰ＿０４３８９８８４．１；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５４０６）、（ＺＰ＿０２０６８８１５．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  ８４９２）、（ＺＰ＿０３４６０７４９．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ  ＤＳＭ  ２０６９７）、（ＺＰ＿０３６７６９４４．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  １４８３８）、（ＹＰ＿０９７７６１．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＹＣＨ４６）、（ＺＰ＿０４５４５８２５．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．  Ｄ１）、（ＺＰ＿０３６４３５４４．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ  １８２２８）、（ＺＰ＿０３２０７０７８．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｌｅｂｅｉｕｓ  ＤＳＭ  １７１３５）、（ＹＰ＿００１２９７８５５．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＡＴＣＣ  ８４８２）、（ＺＰ＿０５７３６７０２．１；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｔａｎｎｅｒａｅ  ＡＴＣＣ  ５１２５９）、（ＺＰ＿０６００７５８７．１；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｅｒｇｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  １７３６１）、（ＺＰ＿０５８５８９３５．１；Ｐｒ
ｅｖｏｔｅｌｌａ  ｖｅｒｏｒａｌｉｓ  Ｆ０３１９）、（ＺＰ＿０５９１６９９７．１；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ  ４７２  ｓｔｒ．  Ｆ０２９５）、（ＹＰ＿００２３０８７８２．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ａｚｏ  ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎ  ｙｍｐｈａｅ  ｇｅｎｏｍｏｖａｒ．  ＣＦＰ２）、（ＹＰ＿７５３４５９．１；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｗｏｌｆｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｗｏｌｆｅｉ  ｓｔｒ．  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、（ＺＰ＿０１７７１３８９．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２５９８６）、（ＺＰ＿０３２９６８４９．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ  ＤＳＭ  １３２７９）、（ＺＰ＿０４４４５３０８．１；Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ  ｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  ＤＳＭ  １３２８０）、（ＺＰ＿０３５６７５１５．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｒｉｍａｅＡＴＣＣ  ４９６２６）、（ＹＰ＿００３１７９６６７．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｐａｒｖｕｌｕｍ  ＤＳＭ  ２０４６９）、（ＺＰ＿０３９４６１３３．１；Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ  ｖａｇｉｎａｅ  ＤＳＭ  １５８２９）、（ＺＰ＿０３９９０６５４．１；Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｎｕｓ  Ｆ０２６８）、（ＺＰ＿０４４５０８４９．１；Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ＡＴＣＣ  ４９１７６）、（ＺＰ＿０５７９７６０１．１；Ｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ  ０７８  ｓｔｒ．  Ｆ０２６２）、（ＺＰ＿０３７３０２４７．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｍ６２／１）、（ＺＰ＿０４８５６２５２．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ５＿１＿３９ＢＦＡＡ）、（ＺＰ＿０１９６６３３２．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｂｅｕｍ  ＡＴＣＣ  ２９１７４）、（ＺＰ＿０５３４５６１６．１；Ｂｒｙａｎｔｅｌｌａ  ｆｏｒｍａｔｅｘｉｇｅｎｓ  ＤＳＭ  １４４６９）、（ＺＰ＿０３７８０８２９．１；Ｂｌａｕｔｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｒｏ  ｐｈｉｃａ  ＤＳＭ  １０５０７）、（ＺＰ＿０３２８９３６０．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｅｘｉｌｅ  ＤＳＭ  １７８７）、（ＺＰ＿０２０４２０９２．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｎａｖｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９１４９）、（ＺＰ＿０３１６８１１２．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔａｒｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９１７６）、（ＺＰ＿０１９６８８３７．１；Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｏｒｑｕｅｓ  ＡＴＣＣ  ２７７５６）、（ＺＰ＿０２４３０４２６．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃｉｎｄｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ３５７０４）、（ＺＰ＿０３７７９７４４．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｙｌｅｍｏｎａｅ  ＤＳＭ  １５０５３）、（ＺＰ＿０２２３４５９５．１；Ｄｏｒｅａ  ｆｏｒｍｉｃｉｇｅｎｅｒａｎｓ  ＡＴＣＣ  ２７７５５）、（ＺＰ＿０１９９４６７３．１；Ｄｏｒｅａ  ｌｏｎｇｉｃａｔｅｎａ  ＤＳＭ  １３８１４）、（ＹＰ＿００１５５８４４２．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈｙｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＩＳＤｇ）、（ＺＰ＿０４６６７０８５．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿７＿４７ＦＡＡ）、（ＺＰ＿０２０８５３９１．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ��  ｂｏｌｔｅａｅ  ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６１３）、（ＺＰ＿０５７９０８５３．１；Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｃｒｏｓｓｏｔｕｓ  ＤＳＭ  ２８７６）、（ＺＰ＿０２０２６０３４．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７５６０）、（ＹＰ＿００２９３０５１３．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｌｉｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ２７７５０）、（ＺＰ＿０４８０８２１３．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｕｌｌｏｒｕｍ  ＭＩＴ  ９８−５４８９）、（ＺＰ＿０３６５６１２０．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ  ＭＩＴ  ９８−５４９１）、（ＺＰ＿０４５８３２１７．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｇｈａｍｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣＢＡＡ−４３０）、（ＮＰ＿８６０８４０．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｐａｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ５１４４９）、（ＺＰ＿０３６５７８９６．１；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ  ＣＣＵＧ  １８８１８）、（ＺＰ＿０２４１７７７９．１；Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＤＳＭ  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ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ  ＬＭＧ  ３３０１）、（ＹＰ＿００１３７２０３６．１；Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ  ａｎｔｈｒｏｐｉｃ  ＡＴＣＣ  ４９１８８）、（ＹＰ＿００１８８８１１５．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ  ＰｓＪＮ）、（ＹＰ＿５５４６１３．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ  ＬＢ４００）、（ＹＰ＿００１８６２２９７．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｍａｔｕｍ  ＳＴＭ８１５）、（ＹＰ＿２９７９７４．１；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＪＭＰ１３４）、（ＹＰ＿００２００８２１９．１；Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、（ＹＰ＿００１５８４４８８．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ）、（ＹＰ＿００２２３３７９７．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ  Ｊ２３１５）、（ＺＰ＿０１２２０２３５．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ３ＴＣＫ）、（ＺＰ＿０３６９８３６１．１；Ｌｕｔｉｅｌｌａ  ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ  ２００２）、（ＺＰ＿０１８１１５１５．１；Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＳＷＡＴ−３）、（ＺＰ＿００９８８３４９．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ  １２Ｂ０１）、（ＺＰ＿０１８６６２３４．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ  ＡＫ１）、（ＺＰ＿０５８８５１６３．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣＢＡＡ−４５０）、（ＡＡＳ７８７８９．１；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、（ＹＰ＿３４５１９６．１；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１）、（ＡＡＮ０８４９０．１；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｅｌｌａ  ｄｅｆｒａｇｒａｎｓ）、（ＺＰ＿００９６１３４５．１；Ｒｏｓｅｏｖａｒｉｕｓ  ｎｕｂｉｎｈｉｂｅｎｓ  ＩＳＭ）、（ＹＰ＿１６８７５５．１；Ｒｕｅｇｅｒｉａ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＺＰ＿０１９０１１９３．１；Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＡｚｗＫ−３ｂ）、（ＺＰ＿０１７５２５７０．１；Ｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  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００１４６６９０１．１；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｎｃｉｓｕｓ  １３８２６）、（ＹＰ＿００１４０８２２１．１；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｕｒｖｕｓ  ５２５．９２）、（ＺＰ＿０５３６３３４８．１；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｏｗａｅ  ＲＭ３２７７）、（ＺＰ＿０３７４２９３３．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ２０４３８）、（ＺＰ＿０２９１８８８７．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｎｔｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ２７６７８）、（ＺＰ＿０２０２８８８３．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ  Ｌ２−３２）、（ＺＰ＿０４４４８１００．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｇｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ２００９８）、（ＺＰ＿０３６１８８８６．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ＤＳＭ  ２０２１３）、（ＺＰ＿０３９７６０８４．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ  ５５８１３）、（ＹＰ＿００２３２３１８３．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ  １５６９７）、（ＺＰ＿０３６４６１８７．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＮＣｌＭＢ  ４１１７１）、（ＺＰ＿０３９３７６１１．１；Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  １４０１９）、（ＺＰ＿０２９６２８６９．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ  ＨＮ０１９）、（ＺＰ＿０５９６５１８５．１；Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ２００９３）、（ＺＰ＿０２０４３４０８．１；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １７９８２）、（ＺＰ＿０３９２５１７６．１；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｅｏｃａｎｉｓ  ＤＳＭ  １５４３６）、（ＮＰ＿６０１９４８．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２）、（ＮＰ＿７３９２０１．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ  ＹＳ−３１４）、（ＮＰ＿９４０３７９．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ＮＣＴＣ  １３１２９）、（ＺＰ＿０４８３５２５５．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ５１８６７）、（ＺＰ＿０５７０８６２３．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ  ＡＴＣＣ  ３３０３０）、（ＺＰ＿０３９７７９１０．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｏｆｌａｖｕｍ  ＤＳＭ  ４４２９１）、（ＺＰ＿０３９３２０６４．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ４９７２５）、（ＺＰ＿０５３６６８９０．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｔｅａｒｉｃｕｍ  ＳＫ１４１）、（ＹＰ＿００２８３５８１７．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｎｍｕｃｏｓｕｍ  ＡＴＣＣ  ７００９７５）、（ＹＰ＿２５００２０．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｅｉｋｅｉｕｍ  Ｋ４１１）、（ＹＰ＿００１８０１１３２．���；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ７１０９）、（ＹＰ＿００２９０６９５４．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋｒｏｐｐｅｎｓｔｅｄｔｉｉ  ＤＳＭ  ４４３８５）、（ＺＰ＿０３３９３２９７．１；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ  ＳＫ４６）、（ＺＰ＿０３７１８９８７．１；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ  ＮＲＬ３００３１／Ｈ  ２１０）、（ＺＰ＿０５３１８９５６．１；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｉｃｃａ  ＡＴＣＣ  ２９２５６）、（ＹＰ＿００１５９８７３１．１；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  ０５３４４２）、（ＺＰ＿０４６０２９７７．１；Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｏｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ５１１４７）、（ＹＰ＿４２６４６６．１；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １１１７０）、（ＮＰ＿８７１１８３．１；Ｗｉｇｇｌｅｓｗｏｒｔｈｉａ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉａ  ｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔ  ｏｆ  Ｇｌｏｓｓｉｎａ  ｂｒｅｖｉｐａｌｐｉｓ）、（ＮＰ＿７７７７９３．１；Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．  Ｂｐ（Ｂａｉｚｏｎｇｉａ  ｐｉｓｔａｃｉａｅ））、（ＹＰ＿００３２４９４０６．１；Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｃｃｍｏｇｅｎｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕｃｃｍｏｇｅｎｅｓ  Ｓ８５）、（ＺＰ＿０３５３５３０２．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｔ１７）、（ＺＰ＿０４０５６４３８．１；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ３３６２４）、（ＹＰ＿００３１０８５００．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｕｌｃｉａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ＳＭＤＳＥＭ）、（Ｐ７７８４４；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、（ＺＰ＿０３９９４１６０．１；Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ  ＡＴＣＣ  ３５２４３）、（ＺＰ＿０３９２２６４０．１；Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｃｕｒｔｉｓｉｉ  ＡＴＣＣ  ４３０６３）、（ＺＰ＿０３７１６２０９．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ  ＤＳＭ  ３３５３）、（ＺＰ＿０３７１８１４３．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｌｉｉ  ＤＳＭ  ３３５３）、（ＺＰ＿０５６１４４３４．１；Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉ  ｕｍ  ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ  Ａ２−１６５）、（ＺＰ＿０２０３４８５２．１；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９７９９）、（ＺＰ＿０３７５３５４３．１；Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ  ＤＳＭ  １６８４１）、（ＺＰ＿０４７４５２７５．２；Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ  Ｌｌ−８２）、（ＹＰ＿００２９３７３３２．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｅｃｔａｌｅ  ＡＴＣＣ  ３３６５６）、（ＺＰ＿０２０７４２４４．１；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２−５０）、（ＺＰ＿０４４５５３７４．１；Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ  ｓａｔｅｌｌｅｓ  ＤＳＭ  １４６００）、（ＺＰ＿０３４８８４８０．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｏｒｍｅ  ＤＳＭ  ３９８９）、（ＺＰ＿０２０７８３２７．１；Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ  ＤＳＭ  ３９９１）、（ＺＰ＿０２０７７５５９．１；���ｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ  ＤＳＭ  ３９９１）、（ＺＰ＿０３３０５５３２．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｌｉｓ  ＤＳＭ  ７４５４）、（ＺＰ＿０５４７３２９１．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ５１１７０）、（ＺＰ＿０３９３１０５０．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｅｔｒａｄｉｕｓ  ＡＴＣＣ  ３５０９８）、（ＹＰ＿００３１５３４６３．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｅｖｏｔｉｉ  ＤＳＭ  ２０５４８）、（ＺＰ＿０３９１６０４８．１；Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ５１１７２）、（ＮＰ＿６０７２１３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ８２３２）、（ＡＡＫ３４００３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｍ１ＧＡＳ）、（ＹＰ＿００２５６２１８５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ  ０１４０１）、（ＹＰ＿００２７４４４５１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．  Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、（ＢＡＨ８８０１６．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＮＮ２０２５）、（ＺＰ＿０２９２０３０５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣＢＡＡ−１０２）、（ＹＰ＿３２９７９８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ  Ａ９０９）、（ＺＰ＿０４０６１７８９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＳＫ１２６）、（ＹＰ＿１３９８８１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ  ＬＭＧ  １８３１１）、（ＺＰ＿０４５２５０２４．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  ＣＣＲＩ  １９７４）、（ＺＰ＿０６０６０５７３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ２＿１＿３６ＦＡＡ）、（ＹＰ＿００１１９８４２３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ  ０５ＺＹＨ３３）、（ＮＰ＿９６４７３９．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ＮＣＣ  ５３３）、（ＹＰ＿１９３６１０．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＦＭ）、（ＺＰ＿０４０１１０１９．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  １６０４７）、（ＺＰ＿０３９９５２９７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ  ＪＶ−  ＶＯｌ）、（ＺＰ＿０５７５２７５３．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ  ＤＳＭ  ２００７５）、（ＺＰ＿０３９５６０２４．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ  ＪＶ−Ｖ１６）、（ＺＰ＿０４６４５１８７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ  ２６９−３）、（ＹＰ＿６１８７１９．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １１８４２）、（ＺＰ＿０５７４４３６６．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｅｒｓ  ＤＳＭ  １３３３５）、（ＮＰ＿３９１６４６．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．  １６８）、（ＹＰ＿００１４２３０４５．１；Ｂａｃｉ���ｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＦＺＢ４２）、（ＹＰ＿０８１０７３．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ  １４５８０）、（ＺＰ＿０３０５５１０１．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ＡＴＣＣ  ７０６１）、（ＹＰ＿００２３１７０９８．１；Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ  ＷＫＩ）、（ＹＰ＿００２９５１２７０．１；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＷＣＨ７０）、（ＹＰ＿００１１２７４４３．１；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＮＧ８０−２）、（ＹＰ＿１４９２６８．１；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＴＡ４２６）、（ＺＰ＿０１８６１２５１．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＳＧ−ｌ）、（ＺＰ＿０３２２８１７６．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｈｕｉｌｅｎｓｉｓ  ｍ４−４）、（ＺＰ＿０１１７３９４５．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．  ＮＲＲＬＢ−１４９１１）、（ＮＰ＿６９３９４４．１；Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ  ＨＴＥ８３１）、（ＺＰ＿０４３１４７５３．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ  ＢＧＳＣ  ６Ｅ１）、（ＹＰ＿０１４７２７．１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎ  ｅｓ  ｓｔｒ．  ４ｂ  Ｆ２３６５）、（ＺＰ＿０４４４３７５７．１；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ  ＤＳＭ  ２０６０１）、（ＮＰ＿２４４６９０．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ  Ｃ−１２５）、（ＹＰ＿１７７４０２．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ  ＫＳＭ−Ｋ１６）、（ＹＰ＿００２８８５８１６．１；Ｅｘｉｇｕｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．  ＡＴ１ｂ）、（ＹＰ＿００１８１２７２１．１；Ｅｘｉｇｕｏ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ  ２５５−１５）、（ＺＰ＿０２１６９３４６．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＭＬＳ１０）、（ＺＰ＿０４８１８３８６．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｍ２３８６４：Ｗ１）、（ＺＰ＿０３６１２９７３．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ  ＳＫ１４）、（ＺＰ＿０４６７７７９８．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏ
ｃｏｃｃｕｓ  ｗａｍｅｒｉ  Ｌ３７６０３）、（ＮＰ＿７６３９１４．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ  １２２２８）、（ＺＰ＿０５６８５６７８．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａ９６３５）、（ＹＰ＿２５４３１９．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＪＣＳＣ１４３５）、（ＺＰ＿０４０５９８１８．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ  ＳＫｌ１９）、（ＡＢＲ５７１７７．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）、（ＹＰ＿３０２２１４．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  １５３０５）、（ＹＰ＿００２６３３３４０．１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｍｏｓｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｍｏｓｕｓ  ＴＭ３００）、（ＹＰ＿００２５６１２３６．１；Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ  ＪＣＳＣ５４０２）、（ＺＰ＿０３９４４４６６．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９３１）、（ＺＰ＿０５５５３５０２．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ  １０１−４−ＣＨＮ）、（ＺＰ＿０３９５９６２９．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ４９５４０）、（ＹＰ＿００１２７１００４．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ  ＤＳＭ  ２００１６）、（ＺＰ＿０５７４５６６８．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒｉ  ＤＳＭ  １６０４１）、（ＹＰ＿８１８９３１．１；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ８２９３）、（ＹＰ＿００１７２７８３１．１；Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｅｕｍ  ＫＭ２０）、（ＺＰ＿０４７８２０４４．１；Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏ  ｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ  ３３３１３）、（ＺＰ＿０１５４４４６８．１；Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｅｎｉＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１１６３）、（ＺＰ＿０５７３７２９４．１；Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ａｄｉａｃｅｎｓ  ＡＴＣＣ  ４９１７５）、（ＺＰ＿０５８５１９１５．１；Ｇｒａｎｕｌｉｃａｔｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ  ＡＴＣＣ  ７００６３３）、（ＺＰ＿０２１８３９６５．１；Ｃａｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＡＴ７）、（ＺＰ＿０５６４９７５５．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ  ＥＧ２）、（ＺＰ＿０３９４７９１８．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＴＸ０１０４）、（ＺＰ＿０３９８２２２４．１；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＴＸ１３３０）、（ＹＰ＿３９５９５４．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＺＰ＿０４４４９７６２．１；Ｃａｔｏｎｅｌｌａ  ｍｏｒｂｉ  ＡＴＣＣ  ５１２７１）、（ＹＰ＿００１０３２１００．１；Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｎｓ  ＭＧ１３６３）、（ＹＰ＿８０６２３４．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ  ３３４）、（ＮＰ＿７８４５５０．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉ��ｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＷＣＦＳ１）、（ＹＰ＿７９４８４８．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＡＴＣＣ  ３６７）、（ＺＰ＿０３９５４８３１．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ  ＡＴＣＣ  ８２９０）、（ＢＡＢＩ９２６７．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ）、（ＺＰ＿０３９５８２８８．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５６４４）、（ＹＰ＿５３６０４２．１；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＵＣＣ１１８）、（ＺＰ＿０５７４７６３５．１；Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ  ＡＴＣＣ  １９４１４）、（ＹＰ＿８０３８７５．１；Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５７４５）、（ＺＰ＿０２０９３７８４．１；Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ  ｍｉｃｒａＡＴＣＣ  ３３２７０）、（ＹＰ＿００１６９２９２３．１；Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａＡＴＣＣ  ２９３２８）、（ＺＰ＿０４４３１４９９．１；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ  ３６Ｄｌ）、（ＺＰ＿０４７７５８１３．１；Ｇｅｍｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｓａｎｓ  ＡＴＣＣ  １０３７９）、（ＹＰ＿００１３６０６０９．１；Ｋｉｎｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ  ＳＲＳ３０２１６）、（ＺＰ＿０１１１５８６９．１；Ｒｅｉｎｅｋｅａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ  ＭＥＤ２９７）、（ＹＰ＿００３０７４２３８．１；Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃ  ｔｕｒｎｔｅｒｒａｅ  Ｔ７９０１）、（ＹＰ＿９５８４１１．１；Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｑｕａｅｏｌｅｉ  ＶＴ８）、（ＹＰ＿４３５５８０．１；Ｈａｈｅｌｌａ  ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ  ＫＣＴＣ  ２３９６）、（ＹＰ＿００１１８９１２５．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ  ｙｍｐ）、（ＹＰ＿７９２４４３．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｍｏｓａ  ＵＣＢＰＰ−ＰＡ１４）、（ＮＰ＿７９１００１．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｎｇａｅ  ｐｖ．  ｔｏｍａｔｏ  ｓｔｒ．  ＤＣ３０００）、（ＹＰ＿２５８０６９．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｐｆ−５）、（ＹＰ＿６０６６３７．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ  Ｌ４８）、（ＹＰ＿００２８００５７９．１；Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ  ＤＪ）、（ＹＰ＿００１１７１６６３．１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ  Ａ１５０１）、（ＮＰ＿８４０３８５．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ  ＡＴＣＣ  １９７１８）、（ＹＰ＿００２８０１２２１．１；Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ  ＤＪ）、（ＹＰ＿００２７８７１１１．１；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｓｅｒｔｉ  ＶＣＤｌ１５）、（ＹＰ＿６０３５２３．１；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ  ＤＳＭ  １１３００）、（ＮＰ＿２９３７９９．１；Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  Ｒ１）、（ＹＰ＿５２１５５０．１；Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ  ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  Ｔ１１８）、（ＹＰ＿５３０９６２．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ  ｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ���８）、（ＹＰ＿５３１８８２．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ  ｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＡ５３）、（ＺＰ＿０２３６７３４７．１；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｏｋｌａｈｏｍｅｎｓｉｓ  Ｃ６７８６）、（ＹＰ＿４２８０７９．１；Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｒｕｂｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １１１７０）、（ＹＰ＿５３０５３５．１；Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏ  ｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ１８）、（ＮＰ＿９０１２００．１；Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ  ＡＴＣＣ  １２４７２）、（ＺＰ＿０３６９８３４５．１；Ｌｕｔｉｅｌｌａ  ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ  ２００２）、（ＹＰ＿００１２７９２５０．１；Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＰＲｗｆ−１）、（ＹＰ＿５７９４８４．１；Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｙｏｈａｌｏｌｅｎｔｉｓ  Ｋ５）、（ＺＰ＿０５６１８９７８．１；Ｅｎｈｙｄｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｓａｃｃｕｓ  ＳＫ６０）、（ＺＰ＿０５３６２３１９．１；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ  ＳＫ８２）、（ＹＰ＿０４５２８８．１；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＡＤＰ１）、（ＺＰ＿０５８２３３１４．１；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＲＵＨ２６２４）、（ＺＰ＿０３８２４４１６．１；Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２７２４４）、（ＹＰ＿００１３８０２８０．１；Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  Ｆｗ１０９−５）、（ＹＰ＿４６６１０３．１；Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ  ２ＣＰ−Ｃ）、（ＹＰ＿０８８１９０．１；Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ  ＭＢＥＬ５５Ｅ）、（ＹＰ＿００１３４４９４９．１；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｍｏｇｅｎｅｓ  １３０Ｚ）、（ＹＰ＿００３００７４１１．１；Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＪ８７００）、（ＺＰ＿０１７８８７９８．１；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ３６５５）、（ＹＰ＿７１９０１２．１；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ  １２９ＰＴ）、（ＮＰ＿２４５６４２．１；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ｓｕｂｓｐ．  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  ｓｔｒ．  Ｐｍ７０）、（ＺＰ＿０５９２０４４４．１；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｄａｇｍａｔｉｓ  ＡＴＣＣ  ４３３２５）、（ＺＰ＿００１３３９９２．２；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｅｒｏｖａｒ  １  ｓｔｒ．  ４０７４）、（ＺＰ＿０４７５３５４７．１；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ  ＮＭ３０５）、（ＮＰ＿８７３８７３．１；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）、（ＺＰ＿０４９７８９０８．１；Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ  ＰＨＬ２１３）、（ＹＰ＿００２４７５０２２．１；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ  ＳＨ０１６５）、（ＺＰ＿０５７３０５８１．１；Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｐ．  Ａｔ−９ｂ）、（ＹＰ＿００１９０７１３３．１；Ｅｒｗｉｎｉａ  ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ  Ｅｔ１／９９）、（ＹＰ＿４５５２８７．１；Ｓｏｄａｌｉｓ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ  ｓｔｒ．  ‘ｍｏｒｓｉｔａｎｓ’）、（ＺＰ＿０５７２３９２２．１；Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  Ｅｃｈ５８６）、（ＹＰ＿００３２５８８８９．１；Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗａｓａｂｉａｅ  ＷＰＰ１６３）、（ＹＰ＿００２９８８１５９．１；Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  Ｅｃｈ７０３）、（ＮＰ＿６６８９３８．１；Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ＫＩＭ  １０）、（ＹＰ＿００１４７９５４３．１；Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ  ５６８）、（ＹＰ＿００２９３４０９８．１；Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｉｃｔａｌｕｒｉ  ９３−１４６）、（ＹＰ＿００２１５１５０２．１；Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ  ＨＩ４３２０）、（ＮＰ＿９３０３２８．１；Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｕｍｏｎｄｉｉ  ＴＴＯ１）、（ＹＰ＿００２９２０５５３．１；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｍａｅ  ＮＴＵＨ−Ｋ２０４４）、（ＹＰ＿００１１７７５５７．１；Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．６３８）、（ＹＰ＿００３２１１２８６．１；Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｕｒｉｃｅｎｓｉｓ）、（ＢＡＡ０４６６３．１；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（ＹＰ＿００２９２４４０３．１；Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｌｌａ  ｄｅｆｅｎｓａ  ５ＡＴ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ））、（ＺＰ＿０３８２７７３５．１；Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  ＰＢＲ１６９２）、（ＺＰ＿０１１５９２８２．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＫＡ３４）、（ＹＰ＿１３０９７３．１；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９）、（ＺＰ＿０６０５２４８１．１；Ｇｒｉｍｏｎｔｉａ  ｈｏｌｌｉｓａｅ  ＣＩＰ  １０１８８６）、（ＺＰ＿０５８７７０３５．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｕｍｉｓｓｉｉ  ＣＩＰ  １０２９７２）、（ＺＰ＿０５８８１９６０．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｙｉｉ  ＣＩＰ  ６９．１４）、（ＺＰ＿０５８８１９６０．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｙｉｉ  ＣＩＰ  ６９．１
４）、（ＺＰ＿０２１９６７４８．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．および４）、（ＮＰ＿９３４９２７．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ  ＹＪ０１６）、（ＺＰ＿０１８６６４４６．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｈｉｌｏｎｉｉ  ＡＫＩ）、（ＹＰ＿００２４１６６１２．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ  ＬＧＰ３２）、（ＹＰ＿００２２６３４８６．１；Ａｌｉｉｙｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ＬＦＩ１２３８）、（ＺＰ＿０４４１５１１４．１；Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｂｙ．  ａｌｂｅｎｓｉｓ  ＶＬ４２６）、（ＹＰ＿００１１４３１２５．１；Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  Ａ４４９）、（ＹＰ＿００２８９２０９１．１；Ｔｏｌｕｍｏｎａｓ  ａｕｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ  ９１８７）、（ＺＰ＿０１２１５３５０．１；Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＮＰＴ３）、（ＹＰ＿９４４５９８．１；Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｉｎｇｒａｈａｍｉｉ  ３７）、（ＹＰ＿００１４７３４４３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ３）、（ＹＰ＿００１７６１２５７．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｗｏｏｄｙｉ  ＡＴＣＣ  ５１９０８）、（ＹＰ＿００１０９４５１９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃａ  ＰＶ  −４）、（ＹＰ＿００１６７４８１１．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ４）、（ＹＰ＿８６９１９１．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．  ＡＮＡ−３）、（ＹＰ＿９２７３７１．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ  ＳＢ２Ｂ）、（ＹＰ＿７５１１６０．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ  ＮＣｌＭＢ  ４００）、（ＹＰ＿５６３４１３．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＯＳ２１７  ）、（ＹＰ＿００１４７５２７２．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｅｄｉｍｉｎｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ３）、（ＹＰ＿００１６７４９４９．１；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｈａｌｉｆａｘｅｎｓｉｓ  ＨＡＷ−ＥＢ４）、（ＺＰ＿０４７１６６６０．１；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃｌｅｏｄｉｉ  ＡＴＣＣ  ２７１２６）、（ＹＰ＿６６２１６０．１；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ  Ｔ６ｃ）、（ＺＰ＿０１６１２２２５．１；Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＴＷ−７）、（ＺＰ＿０１１３４６４０．１；Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｔｕｎｉｃａｔｅ  Ｄ２）、（ＹＰ＿２６９８７３．１；Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅ  ａ  ３４Ｈ）、（ＹＰ＿００１３４１１６７．１；Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＷＹＬ１）、（ＺＰ＿０１０７７３５２．１；Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＭＥＤｌ２１）、（ＹＰ＿００１２０９３６２．１；Ｄｉｃｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ  ｎｏｄｏｓｕｓ  ＶＣＳ１７０３Ａ）、（ＺＰ＿０５７０５１９３．１；Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｏｍｉｎｉｓ  ＡＴＣＣ  １５８２６）、（ＥＥＹ６２８１７．１；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  Ｔ３０−４）、（ＥＥＹ６２８１６．１；Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  Ｔ３０−４）、（ＸＰ  ００１６９４��０４．１；Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、（ＸＰ  ００１７５３１２０．１；Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｐａｔｅｎｓ）、（ＹＰ＿００１８０４５１０．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ５１１４２）、（ＺＰ＿０１７２９２２０．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＣＣＹ０１１０）、（ＹＰ＿００３１３８３３７．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８８０２）、（ＹＰ＿００２３８００３４．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７４２４）、（ＹＰ＿００１６６１１１０．１；Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｍｏｓａ  ＮＩＥＳ−８４３）、（ＹＰ＿００２４８５１５１．１；Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ７４２５）、（ＮＰ＿４４１０２７．１；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ６８０３）、（ＺＰ＿０１０６１１７１．１；Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋｉ  ｅｌｌａ  ｂｌａｎｄｅｎｓｉｓ  ＭＥＤ２１７）、（ＹＰ＿００１１９５８６２．１；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ  ＵＷ１０１）、（ＹＰ＿００３１９４９２７．１；Ｒｏｂｉｇｉｎｉｔａｌｅａ  ｂｉｆｏｒｍａｔａ  ＨＴＣＣ２５０１）、（ＺＰ＿０１１０７７９２．１；Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＨＴＣＣ２１７０）、（ＺＰ＿０１０５１７３１．１；Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＭＥＤ１５２）、（ＺＰ＿０１１１９２０４．１；Ｐｏｌａｒｉｂａｃｔｅｒ  ｉｒｇｅｎｓｉｉ  ２３−Ｐ）、（ＺＰ＿０３３９０９２９．１；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｓｐｕｔｉｇｅｎａ  ＡＴＣＣ  ３３６１２）、（ＹＰ＿００３１４１９７７．１；Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｏｃｈｒａｃｅａ  ＤＳＭ  ７２７１）、（ＹＰ＿０１２２４０．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｔｒ．  Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ）、（ＹＰ＿００２４３６２７６．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  ｓｔｒ．  ‘Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｆ’）、（ＹＰ＿３８９７３０．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｔｒ．  Ｇ２０）、（ＹＰ＿００２９９２１６５．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ  ＤＳＭ  ２６３８）、（ＹＰ＿００３１９７９０１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｒｅｔｂａｅｎｓｅ  ＤＳＭ  ５６９２）、（ＹＰ＿００３１５７５７７．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂａｃｕｌａｔｕｍ  ＤＳＭ  ４０２８）、（ＺＰ＿０３７３７９１１．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎｏｓｐｉｒａ  ｔｈｉｏｄｉｓｍｕｔａｎｓ  ＡＳ０３−１）、（ＹＰ＿００２９９０３３２．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ  ＤＳＭ  ２６３８）、（ＺＰ＿０３３１２２３７．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｐｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ  ２９０９８）、（ＹＰ＿００２４７８８９０．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ  ｓｔｒ．  ＡＴＣＣ  ２７７７４）、（ＹＰ＿０６４２９４．１；Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ＬＳｖ５４）���（ＹＰ＿５９４６５６．１；Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ  ＰＨＥ／ＭＮ１−００）、（ＺＰ＿０１６２１８２０．１；Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．  ＰＣＣ  ８１０６）、（ＺＰ＿０３２７２８９９．１；Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８）、（ＹＰ＿８４５５９６．１；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ  ｆｕｍａｒｏｘｉｄａｎｓ  ＭＰＯＢ）、（ＺＰ＿０４７７３９３２．１；Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  １８０）、（ＮＰ＿８６９００２．１；Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｂａｌｔｉｃａ  ＳＨ  １）、（ＹＰ＿３９２５７１．１；Ｓｕｌｆｕｒｉｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  １２５１）、（ＺＰ＿０５０７１７１７．１；Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＤ  １）、（ＺＰ＿０４４２１８９９．１；Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｄｅｌｅｙｉａｎｕｍ  ＤＳＭ  ６９４６）、（ＹＰ＿００１３５９２９５．１；Ｓｕｌｆｕｒｏｖｕｍ  ｓｐ．  ＮＢＣ３７−１）、（ＹＰ＿９５１５４４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉ  ＰＹＲ−１）、（ＹＰ＿００１１３１４８８．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｉｌｖｕｍ  ＰＹＲ−ＧＣＫ）、（ＹＰ＿６３７７１４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＭＣＳ）、（ＹＰ＿８８５１８８．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｓｔｒ．  ＭＣ２  １５５）、（ＹＰ＿００１７０４９５３．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｂｓｃｅｓｓｕｓ）、（ＺＰ＿０４７４７５２９．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ  ＡＴＣＣ  １２４７８）、（ＹＰ＿００１８４９０２４．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ）、（ＮＰ＿２１４９２２．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７Ｒｖ）、（ＮＰ＿９６２８１９．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｋ−１０）、（ＺＰ＿０５２２３８７２．１；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ  ＡＴＣＣ  １３９５０）、（ＹＰ＿００２７６４９１９．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ  ＰＲ４）、（ＹＰ＿７０２１６２．１；Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ  ＲＨＡＩ）、（ＹＰ＿１２１５６２．１；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｆａｒｃｉｎｉｃａ  ＩＦＭ  １０１５２）、（ＺＰ＿０４０２５３６１．１；Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｐａｕｒｏｍｅｔａｂｏｌａ  ＤＳＭ  ２０１６２）、（ＹＰ＿００３２７５４３１．１；Ｇｏｒｄｏｎｉａ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌｉｓ  ＤＳＭ  ４３２４７）、（ＹＰ＿００３１６０６１０．１；Ｊｏｎｅｓｉａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  ２０６０３）、（ＺＰ＿０５８１６６５０．１；Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒ  ｋｅｄｄｉｅｉｉ  ＤＳＭ  １０５４２）、（ＺＰ＿０４３６８０２７．１；Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｉｇｅｎａ  ＤＳＭ  ２０１０９）、（ＹＰ＿００２８８３０５４．１；Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａ  ｃａｖｅｍａｅ  ＤＳＭ  １２３３３）、（ＺＰ＿０３９１１４８１．１；Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ  ＤＳＭ  １５８９４）、（ＹＰ＿９２４１４３．１；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｐ．１Ｓ６１４）、（ＺＰ＿０３８６４７８９．１；Ｋｒｉｂｂｅｌｌａ  ｆｌａｖｉｄａ  ＤＳＭ  １７８３６）、（ＺＰ＿０１１３１０５７．１；ｍａｒｉｎｅ  ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＰＨＳＣ２０Ｃ１）、（ＹＰ＿００１７０８９４１．１；Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ  ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  Ｓｅｐｅｄｏｎｉｃｕｓ）、（ＹＰ＿０６１４６２．１；Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ  ｘｙｌｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉ  ｓｔｒ．  ＣＴＣＢ０７）、（ＹＰ＿７４８１８３．１；Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｃ９１）、（ＹＰ＿００３１１６８９２．１；Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ  ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ  ＤＳＭ  ４４９２８）、（ＹＰ＿００３１９９９８３．１；Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａ  ｍｕｉｔｉｐａｒｔｉｔａ  ＤＳＭ  ４４２３３）、（ＹＰ＿００３１５４３２１．１；Ｂｒａｃｈｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＤＳＭ  ４８１０）、（ＺＰ＿０３９２７４９２．１；Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌｉｓ  ＤＳＭ  １５４３４）、（ＹＰ＿００３１４８９３１．１；Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  ２０５４７）、（ＺＰ＿０５８０３９５０．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｏｇｒｉｓｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ３３３３１）、（ＹＰ＿００１８２３６２３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｒｉｓｅｕｓ  ＮＢＲＣ  １３３５０）、（ＺＰ＿０５００２６９３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ  ＡＴＣＣ  ２７０６４）、（ＺＰ＿０５０１５４９３．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｖｉｃｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２９０８３）、（ＺＰ＿０５５３８６６０．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ  Ｔｕ４０００）、（ＺＰ＿０４６８５７８９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｈａｎａｅｎｓｉｓ  ＡＴＣＣ  １４６７２）、（ＺＰ＿０５５３４３０８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６）、（ＺＰ＿０５５２３５５４．１；
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ＴＫ２４）、（ＮＰ＿８２３９９９．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＭＡ−４６８０）、（ＣＢＧ６９９２１．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ  ８７．２２）、（ＺＰ＿０４７０４９０５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ  １１０７４）、（ＺＰ＿０４９９７７４５．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｇｌ）、（ＺＰ＿０５５０９１４７．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｃ）、（ＺＰ＿０５５１４７１８．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ＡＴＣＣ  ５３６５３）、（ＺＰ＿０４９９４２９０．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＰＢ７４）、（ＺＰ＿０４４７４０８２．１；Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ  ４３０２１）、（ＹＰ＿００１１６０５０１．１；Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ｔｒｏｐｉｃａ  ＣＮＢ−４４０）、（ＹＰ＿００１５３８８５３．１；Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ  ａｒｅｎｉｃｏｌａ  ＣＮＳ−２０５）、（ＺＰ＿０４６０５５７５．１；Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ３９１４９）、（ＹＰ＿８３２７１６．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．  ＦＢ２４）、（ＡＢＲ１３６０３．１；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、（ＹＰ＿００２９５６２９６．１；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ  ＮＣＴＣ  ２６６５）、（ＺＰ＿０５３６７２４９．１；Ｒｏｔｈｉａ  ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｓａ  ＡＴＣＣ  ２５２９６）、（ＹＰ＿００１８５４００４．１；Ｋｏｃｕｒｉａ  ｒｈｉｚｏｐｈｉｌａ  ＤＣ２２０１）、（ＺＰ＿０４９８４４６３．１；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ  ＦＳＣ０２２）、（ＹＰ＿００１６７７４２２．１；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ  ＡＴＣＣ  ２５０１７）、（ＹＰ＿５８８８２７．１；Ｂａｕｍａｎｎｉａ  ｃｉｃａｄｅｌｌｉｎｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．  Ｈｃ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ  ｏａｇｕｌａｔａ））、（ＮＰ＿２４０００７．１；Ｂｕｃｈｎｅｒａ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ  ｓｔｒ．  ＡＰＳ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎｐｉｓｕｍ））、（ＺＰ＿０５０５７４９４．１；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＧ１２３５）、（ＺＰ＿０２９３０２５２．１；Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ  ４１３６）、（ＺＰ＿０１４５２３８６．１；Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｙｄａｎｓ  ＰＶ−ｌ）、および（ＺＰ＿０１３０７３９２．１；Ｂｅｒｍａｎｅｌｌａ  ｍａｒｉｓｒｕｂｒｉ）が挙げられる。
【００５９】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なホスホトランスアセチラーゼとしては、本明細書に記載のホスホトランスアセチラーゼのいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のホスホトランスアセチラーゼのいずれかと実質的な相同性を共有し、かつ、（２）アセチルホスフェートからアセチルＣｏＡへの変換を触媒することができる。ホスホトランスアセチラーゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がホスホトランスアセチラーゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれば、ホスホトランスアセチラーゼと「実質的な相同性」を共有するといえる。
【００６０】
５．４  アセチルホスファターゼ活性の機能的破壊
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素的機能の破壊を含む。一部の実施形態では、酵素は宿主細胞のネイティブなものである。
【００６１】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する酵素はグリセロール−１−ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２１）である。一部の実施形態では、グリセロール−１−ホスファターゼ活性を有する酵素は、ＲＨＲ２（ＧＰＰ１／ＲＨＲ２；系統名：ＹＩＬ０５３Ｗ）、またはそのホモログもしくはバリアントである。ＧＰＰ１／ＲＨＲ２は、グリセロール生合成に関与する構成的に発現されるグリセロール−１−ホスファターゼであり、嫌気ストレスおよび浸透ストレスの両方に応答して誘導される。例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１巻（２３号）：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）；Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２巻（９号）：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）；Ｐａｈｌｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻（５号）：３５５５〜３５６３頁（２００１年）；ＮｅｖｏｉｇｔおよびＳｔａｈｌ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２１巻（３号）：２３１〜４１頁（１９９７年）；ＢｙｒｎｅおよびＷｏｌｆ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １５巻（１０号）：１４５６〜６１頁、およびＨｉｒａｙａｍａら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２４９巻（２号）：１２７〜３８頁を参照されたい。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＰＰ１／ＲＨＲ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１巻（２３号）：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）、およびＰａｈｌｍａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６巻（５号）：３５５５〜３５６３頁（２００１年）を参照されたい。Ｇｐｐ１／Ｒｈｒ２により以下の反応が触媒されることが以前に記載されている：
グリセロール−１−ホスフェート＋Ｈ２Ｏ⇔グリセロール＋ホスフェート
代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＰＰ１／ＲＨＲ２ヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＭ＿００１１７９４０３．１、および本明細書で提供される配列番号５が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧｐｐ１／Ｒｈｒ２タンパク質配列としては、受託番号ＮＰ＿０１２２１１、および本明細書で提供される配列番号６が挙げられる。
【００６２】
同じくアセチルホスフェートのアセテートへの加水分解を触媒するＧＰＰ１／ＲＨＲ２の密接に関連するホモログはＨＯＲ２（ＧＰＰ２／ＨＯＲ２；系統名：ＹＥＲ０６２Ｃ）である。Ｇｐｐ２／Ｈｏｒ２も同様に、以下の反応を触媒することができるグリセロール−１−ホスファターゼであることが以前に記載されている：グリセロール−１−ホスフェート＋Ｈ２Ｏ⇔グリセロール＋ホスフェート。したがって、ＧＰＰ２／ＨＯＲ２の機能的破壊も同様に本明細書で提供される組成物および方法に使用される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＰＰ２／ＨＯＲ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１巻（２３号）：１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年）、およびＰａｈｌｍａｎら、Ｊ．  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６巻（５号）：３５５５〜３５６３頁（２００１年）を参照されたい。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＰＰ２／ＨＯＲ２ヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＭ＿００１１７８９５３．３、および本明細書で提供される配列番号７が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧｐｐ１／Ｒｈｒ２タンパク質配列としては、受託番号ＮＰ＿０１０９８４、および本明細書で提供される配列番号８が挙げられる。
【００６３】
当技術分野で理解される通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母に天然に存在するＧＰＰ１／ＲＨＲ２および／またはＧＰＰ２／ＨＯＲ２のホモログも同様に本明細書に記載の方法を使用して失活させることができる。さらに、アセチル−ホスファターゼ活性をコードするポリヌクレオチド、遺伝子および／またはポリペプチド（例えば、ＲＨＲ２および／またはＨＯＲ２）を、他のポリヌクレオチド、遺伝子および／もしくはポリペプチド配列を同定するため、または他の宿主細胞におけるアセチル−ホスファターゼ活性を有するホモログを同定するために使用することができる。このような配列は、例えば、文献においておよび／または当業者に周知のバイオインフォマティクスデータベースにおいて同定することができる。例えば、他の細胞型におけるアセチル−ホスファターゼ活性をコードする配列のバイオインフォマティクスを使用した同定は、本明細書で提供されるものなどのアセチル−ホスファターゼ活性および／またはグリセロール−１−ホスファターゼ活性をコードする公知のＤＮＡ配列およびポリペプチド配列を伴う公的に利用可能なデータベースのＢＬＡＳＴ（上記）検索によって実現することができる。同一性は、初期状態のパラメータ、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝０．１、およびタンパク質重み行列のＧｏｎｎｅｔ  ２５０シリーズを使用したアラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいたものであってよい。
【００６４】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素（例えば、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２）の活性または発現が少なくとも約５０％低下する。別の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の活性または発現が、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素の活性または発現の低下または欠失を含まない組換え微生物と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％低下する。一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素はＲＨＲ２またはその相同体である。一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換する内因性酵素はＨＯＲ２またはその相同体である。
【００６５】
当業者に理解される通り、これだけに限定されないが、調節型プロモーターの使用、弱い構成的プロモーターの使用、二倍体酵母におけるタンパク質をコードする遺伝子の２つのコピーのうちの１つの破壊、二倍体酵母における遺伝子の両方のコピーの破壊、アンチセンス核酸の発現、ｓｉＲＮＡの発現、内因性プロモーターの負の調節因子の過剰発現、内因性遺伝子もしくは異種遺伝子の活性の変更、特異的活性が低い異種遺伝子の使用など、またはこれらの組合せを含めた、グリセロール−１−ホスファターゼ（例えば、ＲＨＲ２および／またはＨＯＲ２）などのアセチルホスフェートをアセテートに変換するタンパク質の活性を低下させるまたは破壊するために利用可能ないくつかの機構が存在する。
【００６６】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチル−ホスファターゼ活性（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログもしくはバリアント）をコードする少なくとも１種の遺伝子の変異を含み、それにより、前記遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の低下がもたらされる。別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログもしくはバリアント）の部分的な欠失を含み、それにより、遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の低下がもたらされる。別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログもしくはバリアント）の完全な欠失を含み、それにより、遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性の低下がもたらされる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、アセチル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログもしくはバリアント）に付随する調節領域の改変を含み、それにより、前記遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の低下がもたらされる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、転写調節因子の改変を含み、それにより、アセチル−ホスファターゼ活性をコードする遺伝子（例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはそのホモログもしくはバリアント）の転写の低下がもたらされる。
【００６７】
一部の実施形態では、アセチルホスフェートからアセテートへの変換を触媒することができるタンパク質をコードする１種または複数種の遺伝子の破壊は、微生物細胞に構築物が導入されると、このような遺伝子（例えば、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２）を特異的に破壊し、それにより、破壊された遺伝子を非機能的にすることができる「破壊構築物」を使用することによって実現される。一部の実施形態では、標的遺伝子の破壊により、機能的タンパク質の発現が妨げられる。一部の実施形態では、標的遺伝子の破壊により、破壊された遺伝子から非機能的タンパク質が発現される。一部の実施形態では、アセチルホスフェートをアセテートに変換することができるタンパク質をコードする遺伝子の破壊は、「破壊性配列」を相同組換えにより標的遺伝子座に組み込むことによって実現される。このような実施形態では、破壊構築物は、標的遺伝子座のヌクレオチド配列の対と相同なヌクレオチド配列の対（相同配列）で挟まれた破壊性配列を含む。標的遺伝子の標的部分を破壊構築物で置き換えると、破壊性配列により、標的遺伝子からの機能的タンパク質の発現が妨げられるまたは非機能的タンパク質の発現が引き起こされる。
【００６８】
遺伝子を破壊することができる破壊構築物は、当技術分野で周知の標準の分子生物学技法を使用して構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい。本方法の実施において変動し得る破壊構築物のパラメータとしては、これだけに限定されないが、相同配列の長さ；相同配列のヌクレオチド配列；破壊性配列の長さ；破壊性配列のヌクレオチド配列、および標的遺伝子のヌクレオチド配列が挙げられる。一部の実施形態では、各相同配列の長さの有効な範囲は５０〜５，０００塩基対である。特定の実施形態では、各相同配列の長さは約５００塩基対である。遺伝子ターゲティングのために必要な相同性の長さの考察に関しては、Ｈａｓｔｙら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １１巻：５５８６〜９１頁（１９９１年）を参照されたい。一部の実施形態では、相同配列は標的遺伝子のコード配列を含む。他の実施形態では、相同配列は標的遺伝子の上流または下流の配列を含む。一部の実施形態では、１つの相同配列は標的遺伝子のコード配列の５’側に位置するヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含み、他の相同配列は標的遺伝子のコード配列の３’側に位置するヌクレオチド配列と相同なヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、破壊性配列は、破壊性配列を含む微生物細胞の選択を可能にする選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。したがって、このような実施形態では、破壊構築物は、二重の機能、すなわち、標的遺伝子を機能的に破壊する機能と、標的遺伝子が機能的に破壊された細胞を同定するための選択マーカーをもたらす機能を有する。一部の実施形態では、標的遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のある程度の活性を有する融合タンパク質が生じ得る翻訳リードスルーを防止するために、終結コドンを、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列の下流にインフレームで配置する。一部の実施形態では、破壊性配列の長さは一塩基対である。コード配列に単一の塩基対を挿入することにより、機能的タンパク質の発現が妨げられ得るフレームシフト変異が構成され得るので、標的遺伝子を破壊するためには単一の塩基対の挿入で十分であり得る。一部の実施形態では、破壊配列の配列は、相同配列間に位置する標的遺伝子のヌクレオチド配列とは単一の塩基対が異なる。標的遺伝子内のヌクレオチド配列を破壊性配列で置き換えると、導入される単一の塩基対の置換により、タンパク質内の重要な部位における単一のアミノ酸の置換および非機能的タンパク質の発現がもたらされ得る。しかし、非常に短い破壊性配列を使用して実施された破壊は自然突然変異によって野生型配列に後戻りしやすく、したがって、宿主株にアセチル−ホスファターゼ機能の回復がもたらされることが理解され���べきである。したがって、特定の実施形態では、破壊性配列は一塩基対〜数塩基対よりも長い。反対の極端な場合では、過剰な長さの破壊性配列では中程度の長さの破壊性配列に対していかなる利点も付与される見込みがなく、トランスフェクションまたはターゲティングの効率が低下する可能性がある。この場合の過剰な長さとは、標的遺伝子内の選択された相同配列間の距離よりも何倍もの長さである。したがって、ある特定の実施形態では、破壊性配列の長さは２〜２，０００塩基対であり得る。他の実施形態では、破壊性配列の長さは、破壊構築物内の相同配列とマッチする標的遺伝子座の領域間の距離とほぼ同等の長さである。
【００６９】
一部の実施形態では、破壊構築物は直鎖ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、破壊構築物は環状ＤＮＡ分子である。一部の実施形態では、環状破壊構築物は、上記の通り破壊性配列によって隔てられた相同配列の対を含む。一部の実施形態では、環状破壊構築物は単一の相同配列を含む。このような環状破壊構築物は、標的遺伝子座に組み込まれると、直線になり、相同配列の一部が各末端に位置し、標的遺伝子ヌクレオチド配列のいずれも置き換えることなく、破壊構築物の残りのセグメントが標的遺伝子に挿入され、それを破壊する。特定の実施形態では、環状破壊構築物の単一の相同配列は標的遺伝子のコード配列内に位置する配列と相同である。
【００７０】
破壊構築物は、それだけに限定することなく当業者に公知の任意の方法によって微生物細胞に導入することができる。このような方法としては、これだけに限定されないが、細胞による溶液からの分子の直接取り込み、または、例えばリポソームもしくは免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）を使用したリポフェクションにより容易にした取り込み；粒子媒介性トランスフェクションなどが挙げられる。例えば、米国特許第５，２７２，０６５号；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい。酵母細胞を形質転換するための特定の方法は当技術分野で周知である。Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５巻：１２９２〜３頁（１９７８年）；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：３３７６〜３３８５頁（１９８５年）を参照されたい。例示的な技法としては、これだけに限定されないが、スフェロプラスト法、電気穿孔、ＰＥＧ１０００媒介性形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性形質転換が挙げられる。
【００７１】
５．５  アセチルＣｏＡ産生を改善するためのさらなる改変  
５．５．１  ＡＤＡ
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（あるいは「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」、またはＡＤＡと称される（ＥＣ１．２．１．１０））をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【００７２】
本明細書で提供される組成物および方法に有用な、この反応を触媒することができるタンパク質としては、以下の４種のタンパク質が挙げられる：
（１）アセチルＣｏＡからアセトアルデヒドへの可逆的な変換、およびその後のアセトアルデヒドからエタノールへの可逆的な変換を触媒する二機能性タンパク質。この種類のタンパク質の例は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＡｄｈＥタンパク質（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ｎｏ：ＮＰ＿４１５７５７）である。ＡｄｈＥは、遺伝子融合の進化的な産物であると思われる。ＡｄｈＥタンパク質のＮＨ２末端領域はアルデヒド：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼと高度に相同であり、ＣＯＯＨ末端領域はＦｅ２＋依存性エタノール：ＮＡＤ＋  オキシドレダクターゼのファミリーと相同である（Ｍｅｍｂｒｉｌｌｏ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、（２０００年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻：３３８６９〜３３８７５頁）。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡｄｈＥは金属に触媒される酸化を受け、したがって、酸素感受性である（Ｔａｍａｒｉｔら（１９９８年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３巻：３０２７〜３２頁）。
【００７３】
（２）厳密にまたは通性の嫌気性微生物におけるアセチルＣｏＡからアセトアルデヒドへの可逆的な変換を触媒するが、アルコール脱水素酵素活性を有さないタンパク質。この種類のタンパク質の例は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉにおいて報告されている（Ｓｍｉｔｈら（１９８０年）Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２０３巻：６６３〜６７５頁）。ＡＤＡはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ＤＳＭ  ５５５（受託番号：ＥＤＫ３３１１６）のゲノム内にアノテートされている。相同なタンパク質ＡｃｄＨがＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのゲノムにおいて同定される（受託番号：ＮＰ＿７８４１４１）。この種類のタンパク質の別の例はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＮＲＲＬ  Ｂ５９３におけるａｌｄ遺伝子産物である（Ｔｏｔｈら（１９９９年）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６５巻：４９７３〜４９８０頁、受託番号：ＡＡＤ３１８４１）。
【００７４】
（３）エタノールアミン異化に関与するタンパク質。エタノールアミンは、炭素源と窒素源の両方として多くの腸内細菌により利用され得る（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（１９９５年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７巻：１３５７〜１３６６頁）。エタノールアミンは、まずエタノールアミンアンモニアリアーゼによってアンモニアおよびアセトアルデヒドに変換され、その後、アセトアルデヒドがＡＤＡによってアセチルＣｏＡに変換される。この種類のＡＤＡの例はＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＥｕｔＥタンパク質である（Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（１９９５年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７７巻：１３５７〜１３６６頁、受託番号：ＡＡＬ２１３５７；Ｕ１８５６０．１も参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉもエタノールアミンを利用することができ（Ｓｃａｒｌｅｔｔら（１９７６年）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９５巻：１７３〜１７６頁）、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍにおけるＥｕｔＥタンパク質と相同なＥｕｔＥタンパク質（受託番号：ＡＡＧ５７５６４；ＥＵ８９７７２２．１も参照されたい）を有する。
【００７５】
（４）４−ヒドロキシ−２−ケトバレレート異化に関与する二機能性アルドラーゼ−デヒドロゲナーゼ複合体の一部であるタンパク質。このような二機能性酵素により、多くの細菌種におけるフェノール、トルエート、ナフタレン、ビフェニルおよび他の芳香族化合物の分解の中間体であるカテコールに対するメタ開裂経路の最終的な２つのステップが触媒される（ＰｏｗｌｏｗｓｋｉおよびＳｈｉｎｇｌｅｒ（１９９４年）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ５巻、２１９〜２３６頁）。４−ヒドロキシ−２−ケトバレレートは、まず、４−ヒドロキシ−２−ケトバレレートアルドラーゼによってピルビン酸およびアセトアルデヒドに変換され、その後、アセトアルデヒドがＡＤＡによってアセチルＣｏＡに変換される。この種類のＡＤＡの例はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ  ＣＦ６００におけるＤｍｐＦタンパク質（受託番号：ＣＡＡ４３２２６）である（Ｓｈｉｎｇｌｅｒら（１９９２年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７４巻：７１１〜２４頁）。Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＣＦ６００におけるＤｍｐＦタンパク質と相同なＭｐｈＦタンパク質を有する（Ｆｅｒｒａｎｄｅｚら（１９９７年）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９巻：２５７３〜２５８１頁、受託番号：ＮＰ＿４１４８８５）。
【００７６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法に有用なＡＤＡ（またはこのような活性をコードする核酸配列）は、その内容全体が参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２００９／０１３１５９号に記載のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｄｈＥ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ  ａｄｈ２、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ａｄｈＥ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．Ｅ２  ａｄｈＥ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ（ＥＤＫ３３１１６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ａｃｄＨ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＹＰ００１２６８１８９）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＡＤＡは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｅｕｔＥ（ＦＲ７４５８７５．１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ  ｅｕｔＥ（ＣＲ５２２８７０．１）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＨＢＳ−２  ｅｕｔＥ（ＡＢＱ４４５１１．２）、Ｃａｌｄｉｔｈｒｉｘ  ａｂｙｓｓｉ  ｅｕｔＥ（ＺＰ＿０９５４９５７６）、およびＨａｌｏｒｕｂｒｕｍ  ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉｉ  ＡＴＣＣ  ４９２３９（ＹＰ＿００２５６５３３７．１）からなる群から選択される。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法に有用なＡＤＡは、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ由来のｅｕｔＥである。代表的なＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅのｅｕｔＥヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿０１２９１２．１：１１１０４７６．．１１１１８５５、および本明細書で提供される配列番号９が挙げられる。代表的なＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅのｅｕｔＥタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００３００３３１６、および本明細書で提供される配列番号１０が挙げられる。
【００７８】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なＡＤＡとしては、本明細書に記載のＡＤＡのいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のＡＤＡのいずれかと実質的な相同性を共有する、および（２）アセトアルデヒドからアセチルＣｏＡへの変換を触媒することができる。ＡＤＡの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が本明細書に記載のＡＤＡのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれば、ＡＤＡと「実質的な相同性」を共有するといえる。
【００７９】
５．５．２  ＰＤＨ−バイパスの機能的破壊
アセチルＣｏＡは、ミトコンドリアにおいてＰＤＨ複合体により触媒されるピルビン酸の酸化的脱カルボキシル化によって形成され得る。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはアセチルＣｏＡをミトコンドリアの外に輸送することができないので、ＰＤＨバイパスは、細胞質ゾル区画内にアセチルＣｏＡをもたらすことにおいて重要な役割を果たし、ピルビン酸をアセチルＣｏＡに変換するためのＰＤＨ反応に対する代替の経路をもたらす。ＰＤＨバイパスには、酵素であるピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ；ＥＣ４．１．１．１）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ；ＥＣ１．２．１．５およびＥＣ１．２．１．４）、およびアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ；ＥＣ６．２．１．１）が関与する。ピルビン酸デカルボキシラーゼにより、ピルビン酸からアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱カルボキシル化が触媒される。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼにより、アセトアルデヒドが酢酸に酸化される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、アルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは５種のメンバーを含有する。ＡＬＤ２（ＹＭＲ１７０ｃ）、ＡＬＤ３（ＹＭＲ１６９ｃ）、およびＡＬＤ６（ＹＰＬ０６１ｗ）は細胞質ゾル内アイソフォームに対応し、ＡＬＤ４（ＹＯＲ３７４ｗ）およびＡＬＤ５（ＹＥＲ０７３ｗ）はミトコンドリア内の酵素をコードする。主要な細胞質ゾル内アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォームは、ＡＬＤ６によりコードされる。アセテートからのアセチルＣｏＡの形成はＡＣＳにより触媒され、ＡＴＰの加水分解を伴う。ＡＣＳは２つの構造遺伝子、ＡＣＳ１およびＡＣＳ２によりコードされる。
【００８０】
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ＰＤＨ−バイパス経路の１種または複数種の遺伝子の機能的破壊をさらに含む。一部の実施形態では、宿主細胞のＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の遺伝子の破壊により、以下の反応のうちの１つまたは複数を触媒する能力が損なわれた遺伝子改変微生物細胞が生じる：（１）ピルビン酸デカルボキシラーゼによるピルビン酸からアセトアルデヒドへの脱カルボキシル化；（２）アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼによるアセトアルデヒドからアセテートへの変換、および（３）アセチルＣｏＡシンテターゼによるアセテートおよびＣｏＡからのアセチルＣｏＡの合成。
【００８１】
一部の実施形態では、親細胞と比較して、宿主細胞はＰＤＨ−バイパス経路の１種または複数種の遺伝子の機能的破壊を含み、機能が低下したまたは非機能的ＰＤＨ−バイパス経路の単独で、または弱いＡＤＡと組み合わせた活性は、宿主細胞の成長、生存能力、および／または健康を支持するために十分でない。
【００８２】
一部の実施形態では、ＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の内因性タンパク質の活性または発現が少なくとも約５０％低下する。別の実施形態では、ＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の内因性タンパク質の活性または発現が、ＰＤＨ−バイパスの１種または複数種の内因性タンパク質の活性または発現の低下または欠失を含まない組換え微生物と比較して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％低下する。
【００８３】
５．５．２．１  ＡＬＤ４およびＡＬＤ６
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＣＤＨ）活性をコードする１種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、ＡＬＤ６、ならびにそのホモログおよびバリアントからなる群から選択される遺伝子によりコードされる。
【００８４】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＡＬＤ４の機能的破壊を含む。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＬＤ４ヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＭ＿００１１８３７９４、および本明細書で提供される配列番号１１が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｌｄ４タンパク質配列としては、受託番号ＮＰ＿０１５０１９．１、および本明細書で提供される配列番号１２が挙げられる。
【００８５】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、細胞質ゾル内アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ６）の機能的破壊を含む。Ａｌｄ６ｐは、ネイティブなＰＤＨ−バイパスにおいて、アセトアルデヒドがアセテートに変換されるように機能する。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＬＤ６ヌクレオチド配列としては、受託番号ＳＣＵ５６６０４、および本明細書で提供される配列番号１３が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｌｄ６タンパク質配列としては、受託番号ＡＡＢ０１２１９、および本明細書で提供される配列番号１４が挙げられる。
【００８６】
当技術分野において理解される通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母に天然に存在するアルデヒドデヒドロゲナーゼのホモログも同様に本明細書に記載の方法を使用して失活させることができる。
【００８７】
当業者には理解される通り、２種以上のアルデヒドデヒドロゲナーゼの活性または発現を低下させるまたは排除することができる。具体的な一実施形態では、ＡＬＤ４およびＡＬＤ６またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。別の具体的な実施形態では、ＡＬＤ５およびＡＬＤ６またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。さらに別の具体的な実施形態では、ＡＬＤ４、ＡＬＤ５、およびＡＬＤ６またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。さらに別の具体的な実施形態では、細胞質ゾルに局在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ  ＡＬＤ２、ＡＬＤ３、およびＡＬＤ６またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。さらに別の具体的な実施形態では、ミトコンドリアに局在するアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤ４およびＡＬＤ５またはそのホモログもしくはバリアントの活性または発現を低下させるまたは排除する。
【００８８】
５．５．２．２  ＡＣＳ１およびＡＣＳ２
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）活性をコードする１種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。一部の実施形態では、アセチルＣｏＡシンテターゼは、ＡＣＳ１、ＡＣＳ２、ならびにそのホモログおよびバリアントからなる群から選択される遺伝子によりコードされる。
【００８９】
一部の実施形態では、宿主細胞におけるアセチルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）活性をコードする１種または複数種の遺伝子を機能的に破壊する。ＡＣＳ１およびＡＣＳ２はどちらもアセテートをアセチルＣｏＡに変換することができるアセチルＣｏＡシンテターゼである。ＡＣＳ１は呼吸性条件下でのみ発現され、ＡＣＳ２は構成的に発現される。ＡＣＳ２をノックアウトすると、株は呼吸性条件（例えば、エタノール、グリセロール、またはアセテート培地）では成長することができるが、発酵性炭素源（例えば、スクロース、グルコース）では死滅する。
【００９０】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＡＣＳ１の機能的破壊を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ１遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｎａｇａｓｕら、Ｇｅｎｅ  ３７巻（１〜３号）：２４７〜２５３頁（１９８５年）を参照されたい。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ１ヌクレオチド配列としては、受託番号Ｘ６６４２５、および本明細書で提供される配列番号１５が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｃｓ１タンパク質配列としては、受託番号ＡＡＣ０４９７９、および本明細書で提供される配列番号１６が挙げられる。
【００９１】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＡＣＳ２の機能的破壊を含む。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ２遺伝子の配列は以前に記載されている。例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３１巻（３号）：７０４〜７１３頁（１９９５年）を参照されたい。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＳ２ヌクレオチド配列としては、受託番号Ｓ７９４５６、および本明細書で提供される配列番号１７が挙げられる。代表的なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡｃｓ２タンパク質配列としては、受託番号ＣＡＡ９７７２５、および本明細書で提供される配列番号１８が挙げられる。
【００９２】
当技術分野において理解される通り、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の酵母に天然に存在するアセチルＣｏＡシンテターゼのホモログも同様に本明細書に記載の方法を使用して失活させることができる。
【００９３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、呼吸性条件下で（すなわち、宿主細胞を例えばエタノール、グリセロール、またはアセテートの存在下で成長させた場合に）アセテートをアセチルＣｏＡに変換することができる細胞質ゾル内アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を含む。一部のこのような実施形態では、宿主細胞はＡＣＳ１活性を含む酵母細胞である。他の実施形態では、親細胞と比較して、宿主細胞は、呼吸性条件下では内因性アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を含まない、またはそれが低下している。一部のこのような実施形態では、宿主細胞は、親細胞と比較してＡＣＳ１活性を含まない、またはそれが低下している酵母細胞である。
【００９４】
一部の実施形態では、宿主細胞は、非呼吸性条件下で（すなわち、宿主細胞を発酵性炭素源（例えば、スクロース、グルコース）の存在下で成長させた場合に）アセテートをアセチルＣｏＡに変換することができる細胞質ゾル内アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を含む。一部のこのような実施形態では、宿主細胞はＡＣＳ２活性を含む酵母細胞である。他の実施形態では、親細胞と比較して、宿主細胞は、非呼吸性条件下で内因性アセチルＣｏＡシンテターゼ活性を含まない、またはそれが低下している。一部のこのような実施形態では、宿主細胞は、親細胞と比較して、ＡＣＳ２活性を含まない、またはそれが低下している酵母細胞である。
【００９５】
一部の実施形態では、宿主細胞は、異種ＰＫおよび細胞質ゾル内アセチルＣｏＡシンテターゼ活性（例えば、ＡＣＳ１および／またはＡＣＳ２）を含む。このような実施形態では、宿主細胞においてＰＫによりアセチルホスフェートが産生される。インタクトな細胞質ゾル内ＡＣＳ活性により、ＲＨＲ２および／またはＨＯＲ２により触媒されるアセチルホスフェートのアセチルＣｏＡへの加水分解の結果として蓄積するアセテートが変換され得る。
【００９６】
５．６  イソプレノイド産生のためのＭＥＶ経路
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、ＭＥＶ経路の１種または複数種の異種酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡを縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを形成する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートにリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換する酵素を含む。一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルピロホスフェートに変換する酵素を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、ＭＥＶ経路の１種または複数種の酵素は、アセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンテターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼからなる群から選択される。一部の実施形態では、アセトアセチルＣｏＡの形成を触媒することができるＭＥＶ経路の酵素に関しては、遺伝子改変宿主細胞は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼ；またはアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、２分子のアセチルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼと、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成する酵素、例えばアセトアセチルＣｏＡシンターゼの両方を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２種以上の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換することができる酵素およびメバロネートをメバロネート５−ホスフェートに変換することができる酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の３種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の７種の酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素の全てをコードする複数の異種核酸を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ＩＰＰまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。
【０１００】
５．６．１  アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの変換
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、２分子のアセチル補酵素Ａを縮合させてアセトアセチルＣｏＡを形成することができる酵素、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＮＣ＿０００９１３  ＲＥＧＩＯＮ：２３２４１３１．２３２５３１５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、（Ｄ４９３６２；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、および（Ｌ２０４２８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１０１】
アセチルＣｏＡチオラーゼにより、２分子のアセチルＣｏＡの可逆的な縮合が触媒されてアセトアセチルＣｏＡが生じるが、この反応は熱力学的に好ましくない；アセトアセチルＣｏＡチオリシスがアセトアセチルＣｏＡ合成よりも好まれる。アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）（あるいはアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３．１．１９４と称される）により、アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡが縮合してアセトアセチルＣｏＡが形成される。アセチルＣｏＡチオラーゼとは対照的に、ＡＡＣＳにより触媒されるアセトアセチルＣｏＡ合成は、付随するマロニルＣｏＡの脱カルボキシル化に起因して、基本的にエネルギーが好まれる反応である。さらに、ＡＡＣＳはアセトアセチルＣｏＡに対してチオリシス活性を示さず、したがって、反応は不可逆的である。
【０１０２】
アセチルＣｏＡチオラーゼおよび異種ＡＤＡおよび／またはホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）を含む宿主細胞では、アセチルＣｏＡチオラーゼにより触媒される可逆反応では、アセトアセチルＣｏＡチオリシスが好まれ、大きなアセチルＣｏＡプールが生じ得る。ＡＤＡの可逆的な活性を考えると、このアセチルＣｏＡプールにより、今度はアセチルＣｏＡがアセトアルデヒドに変換される逆反応に向けてＡＤＡが駆動され、それにより、アセチルＣｏＡ産生に向かうＡＤＡによってもたらされる利益が減少する可能性がある。同様に、ＰＴＡの活性は可逆的であり、したがって、大きなアセチルＣｏＡプールにより、アセチルＣｏＡがアセチルホスフェートに変換される逆反応に向けてＰＴＡが駆動される可能性がある。したがって、一部の実施形態では、アセチルＣｏＡに対する強力な引きをもたらしてＡＤＡおよびＰＴＡの正反応を駆動するために、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞のＭＥＶ経路ではアセトアセチルＣｏＡシンターゼを利用してアセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを形成する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＡＡＣＳはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株に由来する（Ｏｋａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７巻（２５号）：１１２６５〜７０頁（２０１０年）。代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株のＡＡＣＳヌクレオチド配列としては、受託番号ＡＢ５４０１３１．１、および本明細書で提供される配列番号１９が挙げられる。代表的なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＣＬ１９０株のＡＡＣＳタンパク質配列としては、受託番号Ｄ７ＵＲＶ０、ＢＡＪ１００４８、および本明細書で提供される配列番号２０が挙げられる。本明細書で提供される組成物および方法に有用な他のアセトアセチルＣｏＡシンターゼとしては、これだけに限定されないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  （ＡＢ１８３７５０；ＫＯ−３９８８  ＢＡＤ８６８０６）；Ｓ．  ａｎｕｌａｔｕｓ  ９６６３株（ＦＮ１７８４９８；ＣＡＸ４８６６２）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ−３９８８  （ＡＢ２１２６２４；ＢＡＥ７８９８３）；Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ  ｓｐ．  Ａ４０６４４  （ＡＢ１１３５６８；ＢＡＤ０７３８１）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｃ  （ＮＺ＿ＡＣＥＷ０１００００６４０；ＺＰ＿０５５１１７０２）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ  ４３１１１  （ＮＺ＿ＡＢＵＩ０１００００２３；ＺＰ＿０４３３５２８８）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ  Ａｇｙ９９  （ＮＣ＿００８６１１；ＹＰ＿９０７１５２）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｒｉｎｕｍ  Ｍ  （ＮＣ＿０１０６１２；ＹＰ＿００１８５１５０２）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  Ｍｇ１  （ＮＺ＿ＤＳ５７０５０１；ＺＰ＿０５００２６２６）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＡＡ４  （ＮＺ＿ＡＣＥＶ０１００００３７；ＺＰ＿０５４７８９９２）；Ｓ．  ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ  ＮＲＲＬ  １５９９８  （ＮＺ＿ＡＢＹＢ０１０００２９５；ＺＰ＿０４６９６７６３）；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＡＣＴＥ  （ＮＺ＿ＡＤＦＤ０１００００３０；ＺＰ＿０６２７５８３４）；Ｓ．  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  ４０７３６  （ＮＺ＿ＡＣＥＺ０１００００３１；ＺＰ＿０５５２９６９１）；Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．  ＣｃＩ３  （ＮＣ＿００７７７７；ＹＰ＿４８０１０１）；Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ  （ＮＣ＿０１８６８１；ＹＰ＿００６８１２４４０．１）；およびＡｕｓｔｗｉｃｋｉａ  ｃｈｅｌｏｎａｅ  （ＮＺ＿ＢＡＧＺ０１０００００５；ＺＰ＿１０９５０４９３．１）が挙げられる。追加の適切なアセトアセチルＣｏＡシンターゼとして、その内容全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号および同第２０１１／０２８１３１５号に記載されているものが挙げられる。
【０１０４】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なアセトアセチルＣｏＡシンターゼとしては、本明細書に記載のアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、および（２）アセトアセチルＣｏＡが形成されるアセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡの不可逆的な縮合を触媒することができる。アセトアセチルＣｏＡシンターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がアセトアセチルＣｏＡシンターゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれば、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと「実質的な相同性」を共有するといえる。
【０１０５】
５．６．２  アセトアセチルＣｏＡからＨＭＧ−ＣｏＡへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチルＣｏＡとアセチルＣｏＡの別の分子を縮合させて３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＮＣ＿００１１４５．ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  １９０６１．２０５３６；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ９６６１７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｘ８３８８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＢ０３７９０７；Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ  ｇｒｉｓｅｏｌａ）、（ＢＴ００７３０２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７１；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。
【０１０６】
５．６．３  ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロネートへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロネートに変換することができる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨ使用ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ−ＣｏＡレダクターゼである。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４；ＥＣ１．１．１．８８）は、（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒するものであり、クラスＩ  ＨＭＧｒおよびクラスＩＩ  ＨＭＧｒの２つのクラスにカテゴリー化することができる。クラスＩは真核生物および大多数の古細菌由来の酵素を含み、クラスＩＩはある特定の原核生物および古細菌のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。配列の相違に加えて、この２つのクラスの酵素は、これらの補因子特異性に関しても異なる。ＮＡＤＰＨを排他的に利用するクラスＩ酵素とは異なり、クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨを識別するその能力が変動する。例えば、Ｈｅｄｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８６巻（７号）：１９２７〜１９３２頁（２００４年）を参照されたい。クラスＩＩ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを選択するための補因子特異性が以下に提供される。
【０１０７】
【表１】
0006595449.tif 000002
本明細書で提供される組成物および方法に有用なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとしては、ＮＡＤＨを補因子として利用することができるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉまたはＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ由来のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨのみを補因子として利用することができる。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉに由来する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．８８）をコードするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉの野生型ｍｖａ遺伝子の配列は以前に記載されている。ＢｅａｃｈおよびＲｏｄｗｅｌｌ、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７１巻：２９９４〜３００１頁（１９８９年）を参照されたい。代表的なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉのｍｖａＡヌクレオチド配列としては、受託番号Ｍ２４０１５、および本明細書で提供される配列番号２１が挙げられる。代表的なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｖａｌｏｎｉｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、ＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶ、および本明細書で提供される配列番号２２が挙げられる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉに由来する。代表的なＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、受託番号ＮＣ＿００６５６９．１、および本明細書で提供される配列番号２３が挙げられる。代表的なＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿１６４９９４、および本明細書で提供される配列番号２４が挙げられる。
【０１１０】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＤｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来する。代表的なＤｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列としては、ＮＣ＿０１０００２  ＲＥＧＩＯＮ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（３１９９８０．．３２１２６９）、および本明細書で提供される配列番号２５が挙げられる。代表的なＤｅｌｆｔｉａ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列としては、受託番号ＹＰ＿００１５６１３１８、および本明細書で提供される配列番号２６が挙げられる。
【０１１１】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍに由来する（Ｃｒａｎｅら、Ｊ．  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １５９巻：１３０１〜１３０７頁（２００２年））。
【０１１２】
本明細書で提供される組成物および方法において同様に有用なＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼとしては、本明細書に記載のＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉおよびＤ．ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓに由来するものいずれかの「誘導体」といわれる分子が挙げられる。このような「誘導体」は以下の特性を有する：（１）本明細書に記載のＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的な相同性を共有する、および（２）補因子としてＮＡＤＨを優先的に使用しながら（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒することができる。ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列がＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同じであれば、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと「実質的な相同性」を共有するといえる。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「ＮＡＤＨ使用」という句は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、例えば、ＮＡＤＨに対する特異的活性がＮＡＤＰＨに対するものよりも高いことが実証されることにより、補因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨに対して選択的であることを意味する。一部の実施形態では、補因子としてのＮＡＤＨに対する選択性は、ｋｃａｔ（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比で表される。一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのｋｃａｔ（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比は少なくとも５、１０、１５、２０、２５または２５超である。一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼはＮＡＤＨを排他的に使用する。例えば、ＮＡＤＨを排他的に使用するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＮＡＤＨを唯一の補因子として供給するといくらかの活性を示し、ＮＡＤＰＨを唯一の補因子として供給した場合には検出可能な活性を示さない。その内容全体が本明細書に組み込まれるＫｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９巻：１２２６〜１２３４頁（２０００年）、およびＷｉｌｄｉｎｇら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２巻（１８号）：５１４７〜５２頁（２０００年）に記載されているものを含めた、補因子特異性を決定するための当技術分野で公知の任意の方法を利用して、補因子としてＮＡＤＨを好むＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを同定することができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＰＤＨよりもＮＡＤＨに対して選択的になるように、例えば、補因子結合ポケットの部位特異的変異誘発によって工学的に操作されている。ＮＡＤＨ選択性を工学的に操作するための方法はＷａｔａｎａｂｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５３巻：３０４４〜３０５４頁（２００７年）に記載されており、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの補因子特異性を決定するための方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ９巻：１２２６〜１２３４頁（２０００年）に記載されている。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、メバロネート分解経路をネイティブに含む宿主種、例えば、メバロネートをその唯一の炭素源として異化する宿主種に由来する。これらの実施形態の中では、通常そのネイティブな宿主細胞内の内部移行した（Ｒ）−メバロネートの（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡへの酸化的アシル化を触媒するＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを利用して、メバロネート生合成経路を含む遺伝子改変宿主細胞における逆反応、すなわち（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡから（Ｒ）−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒する。メバロネートをそれらの唯一の炭素源として成長することができる原核生物は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１巻（１２号）：６４６８〜６４７２頁（１９８９年）；Ｂｅａｃｈら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７１巻：２９９４〜３００１頁（１９８９年）；Ｂｅｎｓｃｈら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４５巻：３７５５〜３７６２頁；Ｆｉｍｏｎｇｎａｒｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４巻：２０８６〜２０９０頁（１９６５年）；Ｓｉｄｄｉｑｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８巻：１１０〜１１３頁（１９６２年）；Ｓｉｄｄｉｑｉら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  ９３巻：２０７〜２１４頁（１９６７年）、およびＴａｋａｔｓｕｊｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．１１０巻：１８７〜１９３頁（１９８３年）に記載されている。
【０１１６】
本明細書で提供される組成物および方法の一部の実施形態では、宿主細胞は、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧｒとＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの両方を含む。ＮＡＤＰＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＮＭ＿２０６５４８；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、（ＮＣ＿００２７５８、Ｌｏｃｕｓ  ｔａｇ  ＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ  １１２２５７０；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ＡＢ０１５６２７；Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＫＯ  ３９８８）、（ＡＸ１２８２１３、切断型ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする配列をもたらす；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および（ＮＣ＿００１１４５：相補体（１１５７３４．１１８８９８；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１１７】
５．６．４  メバロネートからメバロネート−５−ホスフェートへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネートをメバロネート５−ホスフェートに変換することができる酵素、例えば、メバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｌ７７６８８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、および（Ｘ５５８７５；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１１８】
５．６．５  メバロネート−５−ホスフェートからメバロネート−５−ピロホスフェートへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネート５−ホスフェートをメバロネート５−ピロホスフェートに変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ４２９３８５；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＮＭ＿００６５５６；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、および（ＮＣ＿００１１４５．相補体  ７１２３１５．７１３６７０；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０１１９】
５．６．６  メバロネート−５−ピロホスフェートからＩＰＰへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、メバロネート５−ピロホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｘ９７５５７；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＦ２９００９５；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、および（Ｕ４９２６０；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）が挙げられる。
【０１２０】
５．６．７  ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路により生成したＩＰＰをジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）に変換することができる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、および（ＡＦ０８２３２６；Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）が挙げられる。
【０１２１】
５．６．８  ポリプレニルシンターゼ
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰ分子および／またはＤＭＡＰＰ分子を縮合させて炭素を６つ以上含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２２】
一部の実施形態では、宿主細胞は、１分子のＩＰＰと１分子のＤＭＡＰＰを縮合させて１分子のゲラニルピロホスフェート（「ＧＰＰ」）を形成することができる酵素、例えばＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ５１３１１１；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＦ５１３１１３；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ５３４６８６；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ５３４６８７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（Ｙ１７３７６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＥ０１６８７７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＰ１１０９２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ；ＡＴＣＣ  １４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、（ＡＹ５３４７４５；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ９５３５０８；Ｉｐｓ  ｐｉｎｉ）、（ＤＱ２８６９３０；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＡＦ１８２８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＡＦ１８２８２７；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＭＰＩ２４９４５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ）、（ＰＺＥ４３１６９７、Ｌｏｃｕｓ  ＣＡＤ２４４２５；Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、（ＡＹ８６６４９８；Ｐｉｃｒｏｒｈｉｚａ  ｋｕｒｒｏｏａ）、（ＡＹ３５１８６２；Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）および（ＡＦ２０３８８１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＦ１２８４３；Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）が挙げられる。
【０１２３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、２分子のＩＰＰと１分子のＤＭＡＰＰを縮合させるかＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に付加してファルネシルピロホスフェート（「ＦＰＰ」）の分子を形成することができる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＴＵ８０６０５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＡＵ３６３７６；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ４６１０５０；Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、（Ｄ００６９４；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＬ９５５２３；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＣＰ０００００９、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＷ６００３４；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ  ６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、（ＬＡＵ１５７７７；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＬＡＵ２０７７１；Ｌｕｐｉｎｕｓ  ａｌｂｕｓ）、（ＡＦ３０９５０８；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＰＡＦＰＳ１；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＰＡＦＰＳ２；Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＹＳＣＦＰＰ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（Ｄ８９１０４；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、（ＣＰ０００００３、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＴ８７３８６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＣＰ００００１７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＺ５１８４９；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（ＮＣ＿００８０２２、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿５９８８５６；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿６００８４５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿６０２８３２；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、（ＡＥ０００６５７、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ０６９１３；Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（Ｄ８４４３２、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＡ１２５７５；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｕ１２６７８、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ２８８９４；Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４０、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ＿８７３７５４；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ���ｕｃｒｅｙｉ  ３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＣ２３０８７；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  ＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＹＰ＿３９５２９４；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｓａｋｅｉ  ２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿０００２７３；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎｉ  ｓｔｒ．  Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、（ＮＣ＿００２９４６、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿２０８７６８；Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ  ＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＢ９１７５２；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、（ＣＰ００００３１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＶ９３５６８；Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＫ９９８９０；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｒ６）、および（ＮＣ＿００４５５６、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ  ７７９７０６；Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ  Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられる。
【０１２４】
一部の実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰまたはＩＰＰとＦＰＰを組み合わせてゲラニルゲラニルピロホスフェート（「ＧＧＰＰ」）を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＢＴ００５３２８；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１９８４５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００７４３０５２；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ＡＴＣＣ  ３５６４６  ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００１４４５０９；Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  ｓｕｂｓｐ．  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、ＡＴＣＣ  ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、（ＡＹ３７１３２１；Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、（ＡＢ０５５４９６；Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、（ＡＢ０１７９７１；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、（ＭＣＩ２７６１２９；Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ  ｆ．  ｌｕｓｉｔａｎｉｃｕｓ）、（ＡＢ０１６０４４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、Ｌｏｃｕｓ  ＮＣＵ０１４２７；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＣＵ２０９４０；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、Ｌｏｃｕｓ  ＺＰ＿００９４３５６６；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ  ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、（ＳＣＵ３１６３２；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、（ＡＢ０１６０９５；Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）、（ＳＡＧＧＰＳ；Ｓｉｎａｐｉｓ  ａｌｂａ）、（ＳＳＯＧＤＳ；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、（ＮＣ＿００７７５９、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿４６１８３２；Ｓｙｎｔｒｏｐｈｕｓ  ａｃｉｄｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０、Ｌｏｃｕｓ  ＹＰ＿２０４０９５；Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ  ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、（Ｄ９００８７、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＡ１４１２４；Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、（Ｘ５２２９１、Ｌｏｃｕｓ  ＣＡＡ３６５３８；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、（ＡＦ１９５１２２、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＦ２４２９４；Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、および（ＮＣ＿００４３５０、Ｌｏｃｕｓ  ＮＰ＿７２１０１５；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ＵＡ１５９）が挙げられる。
【０１２５】
５．６．９  テルペンシンターゼ
一部の実施形態では、宿主細胞は、ポリプレニルを修飾してヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイド、または修飾されたイソプレノイド化合物を形成することができる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、カレンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ４６１４６０、ＲＥＧＩＯＮ  ４３．１９２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）および（ＡＦ５２７４１６、ＲＥＧＩＯＮ：７８．１８７１；Ｓａｌｖｉａ  ｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）が挙げられる。
【０１２７】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ゲラニオールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、
（ＡＪ４５７０７０；Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｔｅｎｕｉｐｉｌｕｍ）、（ＡＹ３６２５５３；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＤＱ２３４３００；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  １８６４株）、（ＤＱ２３４２９９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  １８６１株）、（ＤＱ２３４２９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ  ４９３５株）、および（ＤＱ０８８６６７；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）が挙げられる。
【０１２８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドはリナロールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＦ４９７４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＣ００２２９４、Ｌｏｃｕｓ  ＡＡＢ７１４８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＹ０５９７５７；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１０４７９３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＡＦ１５４１２４；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）、（ＡＦ０６７６０３；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＦ０６７６０２；Ｃｌａｒｋｉａ  ｃｏｎｃｉｎｎａ）、（ＡＦ０６７６０１；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（Ｕ５８３１４；Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉ）、（ＡＹ８４００９１；Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、（ＤＱ２６３７４１；Ｌａｖａｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）、（ＡＹ０８３６５３；Ｍｅｎｔｈａ  ｃｉｔｒａｔｅ）、（ＡＹ６９３６４７；Ｏｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ）、（ＸＭ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＰ００４０７８、Ｌｏｃｕｓ  ＢＡＤ０７６０５；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＸＭ＿４６３９１８、Ｌｏｃｕｓ  ＸＰ＿４６３９１８；Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、（ＡＹ９１７１９３；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２３；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＤＱ１９５２７４；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、および（ＡＦ４４４７９８；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ変種ｃｒｉｓｐａ栽培品種Ｎｏ．  ７９）が挙げられる。
【０１２９】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、リモネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（＋）−リモネンシンターゼ（ＡＦ５１４２８７、ＲＥＧＩＯＮ：４７．１８６７；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）および（ＡＹ０５５２１４、ＲＥＧＩＯＮ：４８．１８８９；Ａｇａｓｔａｃｈｅ  ｒｕｇｏｓａ）および（−）−リモネンシンターゼ（ＤＱ１９５２７５、ＲＥＧＩＯＮ：１．１９０５；Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、（ＡＦ００６１９３、ＲＥＧＩＯＮ：７３．１９８６；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、および（ＭＨＣ４ＳＬＳＰ、ＲＥＧＩＯＮ：２９．１８２８；Ｍｅｎｔｈａ  ｓｐｉｃａｔａ）が挙げられる。
【０１３０】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ミルセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｕ８７９０８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＡＦ２７１２５９；Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、（ＡＹ４７３６２６；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、（ＡＦ３６９９１９；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、および（ＡＪ３０４８３９；Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｉｌｅｘ）が挙げられる。
【０１３１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、オシメンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ＡＹ１９５６０７；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０９；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＹ１９５６０８；Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ  ｍａｊｕｓ）、（ＡＫ２２１０２４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、（ＮＭ＿１１３４８５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１３４８３；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ−ＣＩＮ）、（ＮＭ＿１１７７７５；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿００１０３６５７４；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＡＴＴＰＳ０３）、（ＮＭ＿１２７９８２；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＴＰＳ１０）、（ＡＢ１１０６４２；Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ  ＣｉｔＭＴＳＬ４）、および（ＡＹ５７５９７０；Ｌｏｔｕｓ  ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｓ  ｖａｒ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）が挙げられる。
【０１３２】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、α−ピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（＋）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５３０、ＲＥＧＩＯＮ：１．１８８７；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＦ５４３５２７、ＲＥＧＩＯＮ：３２．１９２１；Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、および（＋）／（−）α−ピネンシンターゼ（ＡＧＵ８７９０９、ＲＥＧＩＯＮ：６１１１８９２；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）が挙げられる。
【０１３３】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、β−ピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（−）β−ピネンシンターゼ（ＡＦ２７６０７２、ＲＥＧＩＯＮ：１．１７４９；Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ）および（ＡＦ５１４２８８、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１８３４；Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ）が挙げられる。
【０１３４】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、サビネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来のＡＦ０５１９０１、ＲＥＧＩＯＮ：２６．１７９８が挙げられる。
【０１３５】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、γ−テルピネンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、（Ｃｉｔｒｕｓ  ｌｉｍｏｎ由来のＡＦ５１４２８６、ＲＥＧＩＯＮ：３０．１８３２）および（Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ由来のＡＢ１１０６４０、ＲＥＧＩＯＮ  １．１８０３）が挙げられる。
【０１３６】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、テルピノレンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｏｓｃｉｍｕｍ  ｂａｓｉｌｉｃｕｍ由来のＡＹ６９３６５０）および（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ由来のＡＹ９０６８６６、ＲＥＧＩＯＮ：１０．１８８７）が挙げられる。
【０１３７】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、アモルファジエンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例は、米国特許出願公開第２００４／０００５６７８号の配列番号３７である。
【０１３８】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、α−ファルネセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  ｃｕｌｔｉｖａｒ  ｄ’Ａｎｊｏｕ（セイヨウナシ；遺伝子名ＡＦＳ１）由来のＤＱ３０９０３４およびＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ（リンゴ；遺伝子ＡＦＳ１）由来のＡＹ１８２２４１が挙げられる。Ｐｅｃｈｏｕｕｓら、Ｐｌａｎｔａ  ２１９巻（１号）：８４〜９４頁（２００４年）。
【０１３９】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、β−ファルネセンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｍｅｎｔｈａ  ｘ  ｐｉｐｅｒｉｔａ（ペパーミント；遺伝子Ｔｓｐａ１１）由来の受託番号ＡＦ０２４６１５、およびＡｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ由来のＡＹ８３５３９８が挙げられる。Ｐｉｃａｕｄら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６巻（９号）：９６１〜９６７頁（２００５年）。
【０１４０】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ファルネソールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来の受託番号ＡＦ５２９２６６およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹＤＲ４８１Ｃ（遺伝子Ｐｈｏ８）が挙げられる。Ｓｏｎｇ，  Ｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２８巻：１４９〜１５８頁（２００６年）。
【０１４１】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ネロリドールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＡＦ５２９２６６が挙げられる（トウモロコシ；遺伝子ｔｐｓ１）。
【０１４２】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、パチョロールシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ由来のＡＹ５０８７３０  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５９が挙げられる。
【０１４３】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、ノートカトンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ由来のＡＦ４４１１２４  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６４７およびＰｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ由来のＡＹ９１７１９５  ＲＥＧＩＯＮ：１．１６５３が挙げられる。
【０１４４】
一部の実施形態では、異種ヌクレオチドは、アビエタジエンシンターゼをコードする。適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（Ｕ５０７６８；Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）および（ＡＹ４７３６２１；Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）が挙げられる。
【０１４５】
一部の実施形態では、宿主細胞はＣ５イソプレノイドを産生する。これらの化合物は１つのイソプレン単位に由来し、ヘミテルペンとも称される。ヘミテルペンの実例はイソプレンである。他の実施形態では、イソプレノイドはＣ１０イソプレノイドである。これらの化合物は、２つのイソプレン単位に由来し、モノテルペンとも称される。モノテルペンの実例は、リモネン、シトロネロール（ｃｉｔｒａｎｅｌｌｏｌ）、ゲラニオール、メントール、ペリリルアルコール、リナロール、ツジョン、およびミルセンである。他の実施形態では、イソプレノイドは、Ｃ１５イソプレノイドである。これらの化合物は、３つのイソプレン単位に由来し、セスキテルペンとも称される。セスキテルペンの実例は、ペリプラノンＢ、ギンコライドＢ（ｇｉｎｇｋｏｌｉｄｅ  Ｂ）、アモルファジエン、アルテミシニン、アルテミシン酸、バレンセン、ノートカトン、エピセドロール（ｅｐｉ−ｃｅｄｒｏｌ）、エピアリストロケン（ｅｐｉ−ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｅｎｅ）、ファルネソール、ゴシポール、サントニン（ｓａｎｏｎｉｎ）、ペリプラノン、フォルスコリン、およびパチョロール（パチョリアルコールとしても公知である）である。他の実施形態では、イソプレノイドは、Ｃ２０イソプレノイドである。これらの化合物は、４つのイソプレン単位に由来し、ジテルペンとも称される。ジテルペンの実例は、カスベン（ｃａｓｂｅｎｅ）、エリュテロビン、パクリタキセル、プロストラチン、シュードプテロシン（ｐｓｅｕｄｏｐｔｅｒｏｓｉｎ）、およびタキサジエンである。さらに他の例では、イソプレノイドは、Ｃ２０＋イソプレノイドである。これらの化合物は、５つ以上のイソプレン単位に由来し、トリテルペン（６つのイソプレン単位に由来するＣ３０イソプレノイド化合物）、例えば、アルブルシドＥ（ａｒｂｒｕｓｉｄｅＥ）、ブルセアンチン（ｂｒｕｃｅａｎｔｉｎ）、テストステロン、プロゲステロン、コルチゾン、ジギトキシン、およびスクアレン；テトラテルペン（８つのイソプレノイドに由来するＣ４０イソプレノイド化合物）、例えばβ−カロテン；およびポリテルペン（９つ以上のイソプレン単位に由来するＣ４０＋イソプレノイド化合物）、例えばポリイソプレンを含む。一部の実施形態では、イソプレノイドは、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチョロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群から選択される。イソプレノイド化合物としては、これだけに限定されないが、カロテノイド（例えば、リコピン、α−およびβ−カロテン、α−およびβ−クリプトキサンチン、ビキシン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、およびルテイン）、ステロイド化合物、ならびに他の化学基により修飾されたイソプレノイドで構成される化合物、例えば混合テルペン−アルカロイド、ならびに補酵素Ｑ−１０も挙げられる。
【０１４６】
５．６．１０  イソプレノイドを産生する方法
別の態様では、本明細書では、イソプレノイドを産生するための方法であって、（ａ）イソプレノイドを産生することができる本明細書に記載の遺伝子改変宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を含む培地中、イソプレノイド化合物を作製するのに適した条件下で培養するステップ、および（ｂ）前記イソプレノイド化合物を培地から回収するステップを含む方法が提供される。
【０１４７】
一部の実施形態では、遺伝子改変宿主細胞は、ホスホケトラーゼの異種発現、ホスホトランスアセチラーゼの異種発現、メバロン酸経路の１種または複数種の酵素の異種発現、および任意選択で、ＡＤＡの異種発現、ＮＡＤＨ使用ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの異種発現、およびＡＡＣＳの異種発現からなる群から選択される１つまたは複数の改変を含み、遺伝子改変宿主細胞は、１つまたは複数の改変を含まない親細胞または遺伝子改変宿主細胞の１つまたは複数の改変のサブセットのみを含むが他の点では遺伝的に同一の親細胞と比較して増大した量のイソプレノイド化合物を産生する。一部の実施形態では、増大した量は、例えば、収量、産生、生産性で、細胞培養物１リットル当たりのグラム数で、乾燥細胞重量１グラム当たりのミリグラム数で、細胞培養物の単位体積当たりで、単位乾燥細胞重量当たりで、単位時間当たりの細胞培養物の単位体積当たりで、または単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たりで測定して、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超である。
【０１４８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットル当たり約１０グラムを超える高レベルのイソプレノイドを産生する。一部のこのような実施形態では、イソプレノイドは細胞培養物１リットル当たり約１０〜約５０グラム、約１５グラム超、約２０グラム超、約２５グラム超、または約３０グラム超の量で産生される。
【０１４９】
一部の実施形態では、宿主細胞は、乾燥細胞重量１グラム当たり約５０ミリグラムを超える高レベルのイソプレノイドを産生する。一部のこのような実施形態では、イソプレノイドは乾燥細胞重量１グラム当たり約５０〜約１５００ミリグラム、約１００ミリグラム超、約１５０ミリグラム超、約２００ミリグラム超、約２５０ミリグラム超、約５００ミリグラム超、約７５０ミリグラム超、または約１０００ミリグラム超の量で産生される。
【０１５０】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベルよりも、細胞培養物の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれ以上高いものである高レベルのイソプレノイドを産生する。
【０１５１】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベルよりも、単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．  ５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれより高いものである高レベルのイソプレノイドを産生する。
【０１５２】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベルよりも、単位時間当たりの細胞培養物の単位体積当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．  ５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれより高いものである高レベルのイソプレノイドを産生する。
【０１５３】
一部の実施形態では、宿主細胞は、親細胞によって産生されるイソプレノイドのレベルよりも、単位時間当たりの単位乾燥細胞重量当たり、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１，０００倍、またはそれより高いものである高イソプレノイドを産生する。
【０１５４】
大多数の実施形態では、宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの産生を誘導性化合物によって誘導することができる。このような宿主細胞を誘導性化合物の不在下で容易に操作することができる。次いで、誘導性化合物を添加して宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの産生を誘導する。他の実施形態では、宿主細胞による高レベルのイソプレノイドの産生を、例えば成長温度、培地の構成物などの培養条件を変化させることによって誘導することができる。
【０１５５】
５．６．１１  培養培地および培養条件
微生物培養物を維持し、成長させるための材料および方法は微生物学または発酵科学の当業者に周知である（例えば、Ｂａｉｌｅｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８６年を参照されたい）。宿主細胞、発酵、およびプロセスの特定の必要条件に応じて、好気性条件、微好気性条件、または嫌気性条件について適切な培養培地、ｐＨ、温度、および必要条件を考察しなければならない。
【０１５６】
本明細書で提供されるイソプレノイドを産生する方法は、これだけに限定されないが、細胞培養プレート、フラスコ、または発酵槽を含めた適切な容器中の適切な培養培地（例えば、パントテン酸を補充したまたは補充していない）で実施することができる。さらに、当該方法は、微生物の産物の工業生産を支持するための当技術分野で公知の任意の発酵の規模で実施することができる。撹拌層型発酵槽、エアリフト型発酵槽、気泡型発酵槽、またはこれらの任意の組合せを含めた任意の適切な発酵槽を使用することができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主細胞として利用する特定の実施形態では、Ｋｏｓａｒｉｃら、Ｕｌｌｍａｎｎ’ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６版、１２巻、３９８〜４７３頁、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．  ＫＤａＡ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙに詳細に記載されている通り、発酵槽において株を成長させることができる。
【０１５７】
一部の実施形態では、培養培地は、イソプレノイドを産生することができる遺伝子改変微生物が生存すること、すなわち、成長および生存能力を維持することができる任意の培養培地である。一部の実施形態では、培養培地は、同化できる炭素、窒素源およびリン酸源を含む水性培地である。このような培地は、適切な塩、無機物、金属および他の栄養分も含んでよい。一部の実施形態では、炭素源および必須の細胞栄養分のそれぞれを増加的または継続的に発酵培地に添加し、必要な栄養分のそれぞれを、例えば、炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝機能または呼吸機能に基づく所定の細胞の成長曲線に従って、基本的に、成長している細胞による効率的な同化のために必要な最小限のレベルに維持する。
【０１５８】
微生物を培養するための適切な条件および適切な培地は当技術分野で周知である。一部の実施形態では、適切な培地は、例えば、誘導因子（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列が抑圧可能なプロモーターの制御下にある場合）、または選択剤（例えば、遺伝子改変を含む微生物を選択するための抗生物質）などの１種または複数種の追加の作用剤を補充したものである。
【０１５９】
一部の実施形態では、炭素源は、単糖（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）（単糖（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｕｇａｒ））、二糖、多糖、非発酵性炭素源、またはこれらの１つまたは複数の組合せである。適切な単糖の非限定的な例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、およびこれらの組合せが挙げられる。適切な二糖の非限定的な例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびこれらの組合せが挙げられる。適切な多糖の非限定的な例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびこれらの組合せが挙げられる。適切な非発酵性炭素源の非限定的な例としては、アセテートおよびグリセロールが挙げられる。
【０１６０】
培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、細胞の成長を促進するが、使用される微生物の成長を抑圧するほどには高くないものであるべきである。一般には、培養は、グルコースなどの炭素源を、成長およびバイオマスの所望のレベルが実現されるレベルであるが、検出不可能なレベル（約０．１ｇ／ｌ未満の検出限界）で添加して行われる。他の実施形態では、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は約１ｇ／Ｌ超、好ましくは約２ｇ／Ｌ超、より好ましくは約５ｇ／Ｌ超である。さらに、培養培地中のグルコースなどの炭素源の濃度は、一般には、約１００ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２０ｇ／Ｌ未満である。培養物成分濃度への言及は、最初の成分濃度および／または進行中の成分濃度のどちらを指す場合もあることに留意するべきである。いくつかの場合には、培養中に培養培地から炭素源を枯渇させることが望ましい。
【０１６１】
適切な培養培地に使用することができる同化できる窒素の供給源としては、これだけに限定されないが、単純な窒素源、有機窒素源および複合窒素源が挙げられる。このような窒素源としては、無水アンモニア、アンモニウム塩ならびに動物起源、植物起源および／または微生物起源の物質が挙げられる。適切な窒素源としては、これだけに限定されないが、タンパク質加水分解産物、微生物バイオマス加水分解産物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、およびアミノ酸が挙げられる。一般には、培養培地中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１．０ｇ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、窒素源を培養培地に添加することは微生物の成長のために有利ではない。結果として、培養培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約５ｇ／Ｌ未満である。さらに、いくつかの場合には、培養中に培養培地から窒素源を枯渇させることが望ましい。
【０１６２】
有効な培養培地は、無機塩、ビタミン、微量金属または成長プロモーターなどの他の化合物を含有してよい。このような他の化合物は、有効な培地中の炭素、窒素または無機物供給源の中に存在してもよく、培地に特異的に添加することもできる。
【０１６３】
培養培地は、適切なリン酸源も含有してよい。このようなリン酸源は、無機リン酸源および有機リン酸源の両方を含む。好ましいリン酸源としては、これだけに限定されないが、リン酸二水素ナトリウムまたはリン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムまたはリン酸一水素カリウム、リン酸アンモニウムならびにこれらの混合物などのリン酸塩が挙げられる。一般には、培養培地中のリン酸の濃度は約１．０ｇ／Ｌ超、好ましくは約２．０ｇ／Ｌ超、より好ましくは約５．０ｇ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、リン酸を培養培地に添加することは、微生物の成長のために有利ではない。したがって、培養培地中のリン酸の濃度は、一般には約２０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約１５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約１０ｇ／Ｌ未満である。
【０１６４】
適切な培養培地は、マグネシウムの供給源も、好ましくは硫酸マグネシウム七水和物などの生理的に許容される塩の形態で含んでよいが、同様の量のマグネシウムをもたらす濃度の他のマグネシウム源を使用することができる。一般には、培養培地中のマグネシウムの濃度は約０．５ｇ／Ｌ超、好ましくは約１．０ｇ／Ｌ超、より好ましくは約２．０ｇ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、マグネシウムを培養培地に添加することは微生物の成長のために有利ではない。したがって、培養培地中のマグネシウムの濃度は、一般には、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約３ｇ／Ｌ未満である。さらに、いくつかの場合には、培養中に培養培地からマグネシウム源を枯渇させることが望ましい。
【０１６５】
一部の実施形態では、培養培地は、クエン酸三ナトリウムの二水和物などの生物学的に許容されるキレート化剤も含んでよい。このような例では、培養培地中のキレート化剤の濃度は約０．２ｇ／Ｌ超、好ましくは約０．５ｇ／Ｌ超、より好ましくは約１ｇ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、キレート化剤を培養培地に添加することは微生物の成長のために有利ではない。したがって、培養培地中のキレート化剤の濃度は、一般には、約１０ｇ／Ｌ未満、好ましくは約５ｇ／Ｌ未満、より好ましくは約２ｇ／Ｌ未満である。
【０１６６】
培養培地は、培養培地の所望のｐＨを維持するために生物学的に許容される酸または塩基を最初に含んでもよい。生物学的に許容される酸としては、これだけに限定されないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸およびこれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容される塩基としては、これだけに限定されないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、使用される塩基は水酸化アンモニウムである。
【０１６７】
培養培地は、これだけに限定されないが塩化カルシウムを含めた生物学的に許容されるカルシウム源も含んでよい。一般には、培養培地中の塩化カルシウム二水和物などのカルシウム源の濃度は、約５ｍｇ／Ｌから約２０００ｍｇ／Ｌまでの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌから約１０００ｍｇ／Ｌまでの範囲内、より好ましくは約５０ｍｇ／Ｌから約５００ｍｇ／Ｌまでの範囲内である。
【０１６８】
培養培地は、塩化ナトリウムも含んでよい。一般には、培養培地中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌから約５ｇ／Ｌまでの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌまでの範囲、より好ましくは約２ｇ／Ｌから約４ｇ／Ｌまでの範囲内である。
【０１６９】
一部の実施形態では、培養培地は、微量金属も含んでよい。このような微量金属は、便宜上、培養培地の残りの部分とは別に調製することができるストック溶液として培養培地に添加することができる。一般には、培養培地に添加されるこのような微量金属溶液の量は、約１ｍｌ／Ｌ超、好ましくは約５ｍＬ／Ｌ超、より好ましくは約１０ｍＬ／Ｌ超である。しかし、ある特定の濃度を超えると、微量金属を培養培地に添加することは微生物の成長のために有利ではない。したがって、培養培地に添加されるこのような微量金属溶液の量は、一般には、約１００ｍＬ／Ｌ未満、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌ未満、より好ましくは約３０ｍＬ／Ｌ未満である。微量金属をストック溶液に添加することに加えて、個々の成分を、それぞれが上記の微量金属溶液の範囲により規定される成分の量に独立に対応する範囲内で別々に添加してもよいことに留意するべきである。
【０１７０】
培養培地は、パントテン酸、ビオチン、カルシウム、パントテン酸、イノシトール、ピリドキシン−ＨＣｌ、およびチアミン−ＨＣｌなどの他のビタミンも含んでよい。このようなビタミンは、便宜上、培養培地の残りの部分とは別に調製することができるストック溶液として培養培地に添加することができる。しかし、ある特定の濃度を超えると、ビタミンを培養培地に添加することは微生物の成長のために有利ではない。
【０１７１】
本明細書に記載の発酵方法は、これだけに限定されないが、回分、流加、細胞再利用、連続および半連続を含めた従来の培養方式で実施することができる。一部の実施形態では、発酵は流加方式で行われる。このような場合、発酵の産生段階の間のパントテン酸を含めた培地の成分のいくつかは培養中に枯渇させる。一部の実施形態では、このような成分を、例えば産生段階の最初に比較的高濃度で培養物に補充し、その結果、添加が必要になるまでの期間にわたって成長および／またはイソプレノイド産生を支持することができる。これらの成分の好ましい範囲を、レベルが培養物から枯渇したら添加を行うことによって培養全体を通して維持する。培養培地中の成分のレベルは、例えば、定期的に培養培地から試料採取し、濃度についてアッセイすることによってモニターすることができる。あるいは、標準の培養手順を展開したら、培養全体を通して特定の時間における既知のレベルに対応する時間設定した間隔で添加を行うことができる。当業者には理解される通り、栄養分の消費の速度は、培養中に培地の細胞密度が上昇するにつれて上昇する。さらに、外来微生物が培養培地中に導入されることを回避するために、当技術分野で公知の無菌添加法を使用して添加を実施する。さらに、培養中に少量の消泡剤を添加することができる。
【０１７２】
培養培地の温度は、遺伝子改変細胞の成長および／またはイソプレノイドの産生に適した任意の温度であってよい。例えば、培養培地に種菌を接種する前に、培養培地を約２０℃から約４５℃までの範囲内の温度、好ましくは約２５℃から約４０℃までの範囲内の温度、より好ましくは約２８℃から約３２℃までの範囲内の温度にし、その温度で維持することができる。
【０１７３】
培養培地のｐＨは、酸または塩基を培養培地に添加することによって制御することができる。ｐＨを制御するためにアンモニアを使用する場合では、アンモニアは培養培地中の窒素源としての機能も都合よく果たす。ｐＨは約３．０から約８．０まで、より好ましくは約３．５から約７．０まで、最も好ましくは約４．０から約６．５までで維持することが好ましい。
【０１７４】
一部の実施形態では、培養培地のグルコース濃度などの炭素源濃度を培養中にモニターする。培養培地のグルコース濃度は、例えば、上清、例えば培養培地の無細胞成分などのグルコース濃度をモニターするために使用することができるグルコースオキシダーゼ酵素試験または高圧液体クロマトグラフィーの使用などの公知の技法を使用してモニターすることができる。前記の通り、炭素源濃度は、細胞の成長阻害が起こるレベルよりも低く維持するべきである。このような濃度は生物体によって変動し得るが、炭素源としてのグルコースに関しては、約６０ｇ／Ｌを超えるグルコース濃度で細胞の成長阻害が起こり、これは試験によって容易に決定することができる。したがって、グルコースを炭素源として使用する場合、グルコースを発酵槽に送り込み、検出限界未満に維持することが好ましい。あるいは、培養培地中のグルコース濃度を約１ｇ／Ｌから約１００ｇ／Ｌまでの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌから約５０ｇ／Ｌまでの範囲内、およびさらにより好ましくは約５ｇ／Ｌから約２０ｇ／Ｌまでの範囲内で維持する。炭素源濃度は、例えば、実質的に純粋なグルコース溶液を添加することによって所望のレベル内に維持することができるが、元の培養培地の一定分量を添加することによって培養培地の炭素源濃度を維持することが許容され、それが好ましい場合がある。元の培養培地の一定分量の使用は、培地中の他の栄養分  （例えば、窒素源およびリン酸源）の濃度を同時に維持することができるので、望ましい場合がある。同様に、培養培地中の微量金属濃度を、微量金属溶液の一定分量を添加することによって維持することができる。
【０１７５】
５．６．１２  イソプレノイドの回収
イソプレノイドが宿主細胞によって産生されたら、それを、その後の使用のために、当技術分野で公知の任意の適切な分離および精製方法を使用して回収または単離することができる。一部の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から遠心分離によって分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から自然に分離させる。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を発酵物から解乳化剤および／または造核剤を発酵反応物に添加することによって分離する。解乳化剤の実例としては、凝集剤および凝固薬が挙げられる。造核剤の実例としては、イソプレノイド自体の液滴ならびにドデカン、ミリスチン酸イソプロピル（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｍｙｒｉｓｔｒａｔｅ）、およびオレイン酸メチルなどの有機溶媒が挙げられる。
【０１７６】
これらの細胞において産生されるイソプレノイドは、培養上清中に存在し、かつ／または宿主細胞に付随し得る。イソプレノイドが宿主細胞に付随する実施形態では、イソプレノイドの回収は、細胞を透過処理または溶解する方法を含み得る。その代わりに、またはそれと同時に、これだけに限定されないが、クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学的な誘導体化および結晶化を含めた回収プロセスを使用して培養培地中のイソプレノイドを回収することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、イソプレノイドを有機相中に存在し得る他の産物から分離する。一部の実施形態では、分離は、吸着、蒸留、ガス−液体抽出（ストリッピング）、液液抽出（溶媒抽出）、限外濾過、および標準のクロマトグラフィー技法を使用して実現される。
【０１７８】
５．７  ポリケチド
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルＣｏＡからポリケチドを産生することができる。ポリケチドは、協調した活性部位の群を含有する大きな多酵素タンパク質複合体である、ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）と称される酵素活性の集合により触媒される逐次的な反応によって合成される。ポリケチド生合成は、アセチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、ブチリルＣｏＡなどの単純な２炭素構成要素、３炭素構成要素、４炭素構成要素およびそれらの活性化された誘導体であるマロニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡおよびエチルマロニルＣｏＡから始まり、主にクライゼン縮合反応によるマロニルＣｏＡ由来単位の脱炭酸縮合を通じて段階的に進行する。ＰＫＳ遺伝子は通常、細菌において、および真核生物における遺伝子クラスターにおいて１つのオペロン内に組織化されている。３つの型のポリケチドシンターゼが特徴付けられている：Ｉ型ポリケチドシンターゼは、大きな、高度なモジュラータンパク質であり、２つのクラス：１）ドメインを周期的に再使用する反復ＰＫＳおよび２）別々のモジュール配列を含有し、ドメインを繰り返さないモジュラーＰＫＳに細分される。ＩＩ型ポリケチドシンターゼは、単機能性タンパク質の凝集体であり、ＩＩＩ型ポリケチドシンターゼはアシル担体タンパク質ドメインを使用しない。
【０１７９】
連続的な鎖伸長ステップのそれぞれに下記の通りケト還元、脱水およびエノイル、還元の固定されたひと続きがある脂肪酸の生合成とは異なり、ポリケチド生合成の個々の鎖伸長中間体は、官能基修飾の全てを受けるか、官能基修飾の一部を受けるか、官能基修飾を受けないかであり、それにより、多数の化学的に多様な産物がもたらされる。異なる開始単位および鎖伸長単位の使用ならびに新しい立体異性体の生成により、さらなる複雑さが生じる。
【０１８０】
ポリケチドシンターゼにより導かれる完全なポリケチド合成の順序は以下に従う（Ｎ末端からＣ末端の順序で）：アシル担体タンパク質への最初の炭素構成要素の開始またはローディング、成長しているマクロライド鎖の伸長を触媒する伸長モジュールおよび合成されたマクロライドの放出を触媒する終結モジュール。この生合成において活性な成分ドメインまたは別々の酵素機能性としては、開始剤、伸長剤および中間アシル単位のローディングのためのアシル−トランスフェラーゼ；成長しているマクロライドをチオールエステルとして保持するアシル担体タンパク質；鎖伸長を触媒するβ−ケト−アシルシンターゼ；アルコール官能性への最初の還元に関与するβ−ケトレダクターゼ；水を排除して不飽和チオールエステルを生じさせるデヒドラターゼ；最終的な還元を触媒して完全に飽和させるエノイルレダクターゼ、およびマクロライドの放出および環化を触媒するチオールエステラーゼが挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡの少なくとも１つをアシル担体タンパク質と縮合させることができる酵素、例えばアシル−トランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからなる群から選択される第１の反応物とマロニルＣｏＡまたはメチルマロニル−ＣｏＡからなる群から選択される第２の反応物を縮合させてポリケチド産物を形成することができる酵素、例えばβ−ケト−アシルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ポリケチド化合物上のβ−ケト化学基をβ−ヒドロキシ基に還元することができる酵素、例えばβ−ケトレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ポリケチド化合物のアルカン化学基を脱水させてα−β−不飽和アルケンを産生することができる酵素、例えばデヒドラターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ポリケチド化合物のα−β−二重結合を飽和アルカンに還元することができる酵素、例えばエノイル−レダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アシル担体タンパク質からポリケチド化合物を加水分解することができる酵素、例えばチオエステラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＫＳ触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＴ触媒領域を含む酵素をコードする２種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰ活性を含む酵素をコードする２種以上の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８７】
特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小の芳香族ＰＫＳ系、例えば、それぞれＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、ＣＬＦ触媒領域を含む酵素、およびＡＣＰ活性を含む酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、最小のモジュラーＰＫＳ系、例えば、それぞれＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む酵素、およびＡＣＰ活性を含む酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。さらに別の特定の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新規のポリケチド合成のためのモジュラー芳香族ＰＫＳ系、例えば、それぞれＫＳ触媒領域を含む酵素、ＡＴ触媒領域を含む１種または複数種の酵素、およびＡＣＰ活性を含む１種または複数種の酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、最小のＰＫＳ系、例えば、最小の芳香族ＰＫＳ系または最小のモジュラーＰＫＳ系を含むポリケチド産生細胞は、最終産物ポリケチドの産生に寄与し得る追加の触媒活性をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、新生ポリケチド骨格の環化を容易にするシクラーゼ（ＣＹＣ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ケトレダクターゼ（ＫＲ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、アロマターゼ（ＡＲＯ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、チオエステラーゼ（ＴＥ）触媒領域を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ＡＣＰのパンテテイニル化をもたらすホロＡＣＰシンターゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、合成後ポリケチド修飾活性を付与する１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、例えば、抗生物質活性を有するポリケチドが望まれる場合に、ポリケチドの合成後修飾をもたらすグリコシラーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、ヒドロキシラーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、エポキシダーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、メチラーゼ活性を含む酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、これだけに限定されないが、ポリケチド合成経路の酵素の少なくとも１種、および、アセチルＣｏＡ化合物を修飾して、マクロライド、抗生物質、抗真菌薬、細胞増殖抑制化合物、抗コレステロール化合物、抗寄生虫化合物、コクシジウム抑制化合物、動物成長プロモーターまたは殺虫剤などのポリケチド産物形成することができる酵素を含めた生合成酵素をコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物はポリエンである。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は環状ラクトンである。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、１４員、１５員、または１６員のラクトン環を含む。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、ポリケチドマクロライド、抗生物質、抗真菌薬、細胞増殖抑制薬、抗コレステロール薬、抗寄生虫薬、コクシジウム抑制薬、動物成長プロモーターおよび殺虫剤からなる群から選択されるポリケチドである。
【０１９１】
一部の実施形態では、ポリケチド産生細胞は、異種ヌクレオチド配列、例えば、これだけに限定されないが、以下のポリケチドから選択されるポリケチドを産生することができるＰＫＳ酵素およびポリケチド修飾酵素をコードする配列を含む：アベルメクチン（例えば、米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第４，７０３，００９号；欧州特許公開第１１８，３６７号；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３年、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」；Ｂａｌｔｚ、Ｈｅｇｅｍａｎ、＆  Ｓｋａｔｒｕｄ編（ＡＳＭ）、２４５〜２５６頁、「Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ  ｆｏｒ  Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ，  Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，  ａｎｄ  Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ」；ＭａｃＮｅｉｌら、１９９２年、Ｇｅｎｅ  １１５巻：１１９〜１２５頁；ならびにＩｋｅｄａおよびＯｍｕｒａ、１９９７年、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ９７巻：２５９９〜２６０９頁を参照されたい）；カンジシジン（ＦＲ００８）（例えば、Ｈｕら、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４巻：１６３〜１７２頁を参照されたい）；カルボマイシン、クラマイシン（例えば、Ｂｅｒｇｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９２年２月；１５巻（１号）：８０〜９頁を参照されたい）；ダウノルビシン（例えば、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９４年１０月；１７６巻（２０号）：６２７０〜８０頁を参照されたい）；エポチロン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／６６０２８号；およびＰＣＴ公開第００／０３１２４７号を参照されたい）；エリスロマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；米国特許第５，８２４，５１３号；Ｄｏｎａｄｉｏら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２巻：６７５〜９頁；およびＣｏｒｔｅｓら、１９９０年１１月８日、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８巻：１７６〜８頁を参照されたい）；ＦＫ−５０６（例えば、Ｍｏｔａｍｅｄｉら、１９９８年；Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５６巻：５２８〜５３４頁；およびＭｏｔａｍｅｄｉら、１９９７年、Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２４４巻：７４〜８０頁を参照されたい）；ＦＫ−５２０（例えば、ＰＣＴ公開第００／０２０６０１号；およびＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３０巻：５７８９〜９６頁を参照されたい）；グリセウシン（Ｇｒｉｓｅｕｓｉｎ）（例えば、Ｙｕら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９４年５月；１７６巻（９号）：２６２７〜３４頁を参照されたい）；ロバスタチン（例えば、米国特許第５，７４４，３５０号を参照されたい）；フレノリシン（Ｆｒｅｎｏｌｙｃｉｎ）（例えば、Ｋｈｏｓｌａら、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９３年４月；１７５巻（８号）：２１９７〜２０４頁；およびＢｉｂｂら、Ｇｅｎｅ  １９９４年５月３日；１４２巻（１号）：３１〜９頁を参照されたい）；グラナチシン（例えば、Ｓｈｅｒｍａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９８９年９月；８巻（９号）：２７１７〜２５頁；およびＢｅｃｈｔｏｌｄら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇ��ｎｅｔ．  １９９５年９月２０日；２４８巻（５号）：６１０〜２０頁を参照されたい）；メデルマイシン（例えば、Ｉｃｈｉｎｏｓｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００３年７月；１４９巻（Ｐｔ７号）：１６３３〜４５頁を参照されたい）；モネンシン（例えば、Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．  １９９２年８月；２３４巻（２号）：２５４〜６４頁を参照されたい）；ノナクチン（例えば、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０００年２月１日；１８３巻（１号）：１７１〜５頁を参照されたい）；ナナオマイシン（例えば、Ｋｉｔａｏら、Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）、１９８０年７月；３３巻（７号）：７１１〜６頁を参照されたい）；ネマデクチン（例えば、ＭａｃＮｅｉｌら、１９９３年、上記を参照されたい）；ニダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）（例えば、ＰＣＴ公開第９８／５１６９５号；およびＫａｋａｖａｓら、１９９７年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９巻：７５１５〜７５２２頁を参照されたい）；オレアンドマイシン（例えば、Ｓｗａｎら、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２４２巻：３５８〜３６２頁；ＰＣＴ公開第００／０２６３４９号；Ｏｌａｎｏら、１９９８年、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２５９巻（３号）：２９９〜３０８頁；およびＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９９／０５２８３号を参照されたい）；オキシテトラサイクリン（例えば、Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ．  １９９４年４月８日；１４１巻（１号）：１４１〜２頁を参照されたい）；ピクロマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／６１５９９号；ＰＣＴ公開第００／００６２０号；Ｘｕｅら、１９９８年、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５巻（１１号）：６６１〜６６７頁；Ｘｕｅら、１９９８年１０月、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻：１２１１１〜１２１１６頁を参照されたい）；プラテノリド（例えば、欧州特許公開第７９１，６５６号；および米国特許第５，９４５，３２０号を参照されたい）；ラパマイシン（例えば、Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年８月、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２巻：７８３９〜７８４３頁；およびＡｐａｒｉｃｉｏら、１９９６年、Ｇｅｎｅ  １６９巻：９〜１６頁を参照されたい）；リファマイシン（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９８／０７８６８号；およびＡｕｇｕｓｔら、１９９８年２月１３日、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５巻（２号）：６９〜７９頁を参照されたい）；ソランギウム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）（例えば、米国特許第６，０９０，６０１号を参照されたい）；ソラフェン（例えば、米国特許第５，７１６，８４９号；Ｓｃｈｕｐｐら、１９９５年、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７巻：３６７３〜３６７９頁を参照されたい）；スピノシン（例えば、ＰＣＴ公開第９９／４６３８７号を参照されたい）；スピラマイシン（例えば、米国特許第５，０９８，８３７号を参照されたい）；テトラセノマイシン（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９２年３月；１７４巻（６号）：１８１０〜２０頁；およびＳｈｅｎら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９２年６月；１７４巻（１１号）：３８１８〜２１頁を参照されたい）；テトラサイクリン（例えば、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．  ２００９年１２月９日；１３１巻（４８号）：１７６７７〜８９頁を参照されたい）；タイロシン（例えば、米国特許第５，８７６，９９１号；米国特許第５，６７２，４９７号；米国特許第５，１４９，６３８号；欧州特許公開第７９１，６５５号；欧州特許公開第２３８，３２３号；Ｋｕｈｓｔｏｓｓら、１９９６年、Ｇｅｎｅ  １８３巻：２３１〜６頁；ならびにＭｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓ  およびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ、１９９４年、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １３巻：３４９〜３５５頁を参照されたい）；および６−メチルサリチル酸（ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．  １９９９年４月；１巻（２号）：１８０〜７頁；およびＳｈａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００６年６月２３日；３４５巻（１号）：１３３〜９頁を参照されたい）。
【０１９２】
５．８  脂肪酸
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞は、アセチルＣｏＡから脂肪酸を産生することができる。脂肪酸は、脂肪酸シンターゼにより触媒されるアセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからの一連の脱炭酸クライゼン縮合反応によって合成される。ポリケチドシンターゼと同様に、脂肪酸シンターゼは単一の酵素ではなく、２７２ｋＤａの多機能性ポリペプチドで構成され、基質が１つの機能性ドメインから次の機能性ドメインに渡される酵素系である。２つの主要なクラスの脂肪酸シンターゼが特徴付けられている：Ｉ型脂肪酸シンターゼは、哺乳動物および真菌（しかし真菌のシンターゼと哺乳動物のシンターゼの構造的配置は異なる）および細菌のＣＭＮ群（コリネバクテリア、マイコバクテリア、およびノカルジア）に共通する単一の多機能性ポリペプチドである。古細菌および真正細菌に見いだされるＩＩ型シンターゼは、脂肪酸の合成に関与する一連の別個の単機能性酵素である。シンターゼの２つのクラスにおける脂肪酸の伸長および還元の機構は、これらの触媒事象に関与する酵素ドメインの大部分が２つのクラスの間で相同であるので、同じである。
【０１９３】
脱炭酸クライゼン縮合反応における脂肪酸鎖の伸長の各ラウンド後に、ケトレダクターゼ、デヒドラターゼ、およびエノールレダクターゼの逐次的な作用によってβ−ケト基が完全に飽和した炭素鎖に還元される。成長している脂肪酸鎖はアシル担体タンパク質に付着したこれらの活性部位間を移動し、最終的には、炭素鎖の長さが１６（パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ））に達するとチオエステラーゼの作用によって放出される。
【０１９４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、これだけに限定されないが、脂肪酸合成経路の酵素の少なくとも１種、およびアセチルＣｏＡ化合物を修飾して、パルミチン酸、パルミトイルＣｏＡ、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコサヘキサエン酸などの脂肪酸産物を形成することができる酵素を含めた生合成酵素をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＨＡＣＤ化合物は、パルミチン酸、パルミトイルＣｏＡ、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される脂肪酸である。
【０１９５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡの少なくとも１つをアシル担体タンパク質と共有結合により連結することができる酵素、例えばアシル−トランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、それぞれアシル担体タンパク質（ＡＣＰ）に結合したアセチル化学的部分とマロニル化学的部分を縮合させてアセトアセチル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ＮＡＤＰＨを用いてアセトアセチル−ＡＣＰ内の二重結合を還元してＤ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰ内にヒドロキシル基を形成することができる酵素、例えば、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルヒドロキシラーゼ−ＡＣＰを脱水してベータ炭素とガンマ炭素の間に二重結合を創出し、それによりクロトニル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０１９９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、ＮＡＤＰＨを用いてクロトニルＡＣＰを還元してブチリル−ＡＣＰを形成することができる酵素、例えばエノイルＡＣＰレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０２００】
一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変微生物は、アシル担体タンパク質からＣ１６アシル化合物を加水分解してパルミチン酸を形成することができる酵素、例えばチオエステラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、遺伝子改変されていない親細胞と比較して１種または複数種の脂肪酸の産生の増大をもたらすために、アセチルＣｏＡシンターゼおよび／またはマロニルＣｏＡシンターゼをコードする１種または複数種の異種ヌクレオチド配列を含む。
【０２０２】
例えば、アセチルＣｏＡ産生を増大させるために、以下の遺伝子のうちの１つまたは複数を細胞において発現させることができる：ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルビン酸および２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥＩｐデヒドロゲナーゼ成分およびＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分をコードする）、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、およびｆａｂＦ。このような酵素をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡ、ＡＡＣ７６９５２としても公知）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡＣ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）が挙げられる。
【０２０３】
一部の実施形態では、細胞において脂肪酸分解に関与するタンパク質をコードする遺伝子を減弱させるまたはノックアウトすることにより、脂肪酸レベルの上昇をもたらすことができる。例えば、ｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｉｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡ、および／またはａｃｋＢの発現レベルを、工学的に操作された宿主細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して減弱させるまたはノックアウトすることができる。このようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇｓｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、ＩｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａｄｈＥ（ＡＡＣ７４３２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡＣ７５３５６）、およびａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）が挙げられる。生じた宿主細胞を適切な環境で成長させると、アセチルＣｏＡ産生レベルが上昇する。
【０２０４】
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡに変換することができる酵素、例えば、多サブユニットＡｃｃＡＢＣＤタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。ＡｃｃＡＢＣＤをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号ＡＡＣ７３２９６、ＥＣ６．４．１．２が挙げられる。
【０２０５】
一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、リパーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。リパーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号ＣＡＡ８９０８７およびＣＡＡ９８８７６が挙げられる。
【０２０６】
一部の実施形態では、細胞において、脂肪酸生合成経路の初期のステップ（例えば、ａｃｃＡＢＣＤ、ｆａｂＨ、およびｆａｂｌ）を阻害する長鎖アシルＡＣＰのレベルの上昇を導く可能性があるＰｌｓＢを阻害することにより、脂肪酸レベルの上昇を実施することができる。ＰｌｓＢの発現レベルは、工学的に操作された宿主細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して減弱させるまたはノックアウトすることができる。ＰｌｓＢをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号ＡＡＣ７７０１１が挙げられる。特定の実施形態では、ｐｌｓＢ  Ｄ３１  ＩＥ変異を使用して、細胞における利用可能なアシル−ＣｏＡの量を増大させることができる。
【０２０７】
一部の実施形態では、細胞において、ｆａｂＡの抑制をもたらすｓｆａ遺伝子を過剰発現させることにより、一価不飽和脂肪酸の産生の増大をもたらすことができる。ｓｆａをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号ＡＡＮ７９５９２が挙げられる。
【０２０８】
一部の実施形態では、細胞において、脂肪酸基質の鎖長を制御する酵素、例えばチオエステラーゼの発現を調節することにより、脂肪酸レベルの上昇をもたらすことができる。一部の実施形態では、脂肪酸産生細胞は、ｔｅｓ遺伝子またはｆａｔ遺伝子を過剰発現するように改変されている。適切なｔｅｓヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号：（ｔｅｓＡ：ＡＡＣ７３５９６、Ｅ．ｃｏｌｉ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することができる）および（ｔｅｓＢ：ＡＡＣ７３５５５、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）が挙げられる。適切なｆａｔヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、（ｆａｔＢ：Ｑ４１６３５およびＡＡＡ３４２１５、Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ由来、Ｃ１２：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＢ２：Ｑ３９５１３およびＡＡＣ４９２６９、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ８：０〜Ｃ１０：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＢ３：ＡＡＣ４９２６９およびＡＡＣ７２８８１、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ１４：０〜Ｃ１６：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＢ：Ｑ３９４７３およびＡＡＣ４９１５１、Ｃｉｎｎａｍｏｎｕｍ  ｃａｍｐｈｏｒｕｍ由来、Ｃ１４：０脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＢ［Ｍ１４１Ｔ］：ＣＡＡ８５３８８、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来、Ｃ１６：１脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＡ：ＮＰ  １８９１４７およびＮＰ  １９３０４１、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することができる）、（ｆａｔＡ：ＣＡＣ３９１０６、Ｂｒａｄｖｒｈｉｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を優先的に産生することができる）、（ｆａｔＡ：ＡＡＣ７２８８３、Ｃｕｐｈｅａ  ｈｏｏｋｅｒｉａｎａ由来、Ｃ１８：１脂肪酸を産生することができる）、および（ｆａｔＡ１、ＡＡＬ７９３６１、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ由来）が挙げられる。
【０２０９】
一部の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用してチオエステラーゼＣ１８の発現または活性を減弱させることにより、Ｃ１０脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。チオエステラーゼＣ１８をコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号ＡＡＣ７３５９６およびＰ０ＡＤＡ１が挙げられる。他の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用してチオエステラーゼＣ１０の発現または活性を増大させることにより、Ｃ１０脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。チオエステラーゼＣ１０をコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号Ｑ３９５１３が挙げられる。
【０２１０】
一部の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して非Ｃ１４脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減弱させることにより、Ｃ１４脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。他の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して基質Ｃ１４−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現または活性を増大させることにより、Ｃ１４脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。このようなチオエステラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号Ｑ３９４７３が挙げられる。
【０２１１】
一部の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して非Ｃ１２脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼの発現または活性を減弱させることにより、Ｃ１２脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。他の実施形態では、細胞において、当技術分野で公知の技法を使用して基質Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼの発現または活性を増大させることにより、Ｃ１２脂肪酸のレベルの上昇をもたらすことができる。このようなチオエステラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列の実例としては、これだけに限定されないが、受託番号Ｑ４１６３５が挙げられる。
【０２１２】
５．９  他の化合物を産生するためのＰＫ／ＰＴＡ
一部の実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変宿主細胞（例えば、ＰＫ／ＰＴＡおよびアセチルホスファターゼ活性、例えば、ＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはその相同体をコードするポリペプチドの機能的破壊を含む宿主細胞）を、米国特許出願公開第２０１２０１５６７３５号に記載の通り、細胞内ピルビン酸から開始されて、例えば、２，３−ブタンジオール、２−ブタノール、２−ブタノン、バリン、ロイシン、乳酸、リンゴ酸塩、イソアミルアルコール、およびイソブタノールが産生される生合成経路が発現されるように工学的に操作する。生合成経路による産物形成へのピルビン酸の利用可能性を増大させるために、ピルビン酸を利用する生合成経路を発現するように工学的に操作された組換え宿主細胞における酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の破壊が使用されている。ピルビン酸を利用する生合成経路の産物を産生するためにＰＤＣ−ＫＯ組換え宿主細胞を使用することができるが、ＰＤＣ−ＫＯ組換え宿主細胞はそれらが成長するために、外因性炭素基質の補充（例えば、エタノールまたはアセテート）を必要とする。特に、２種の外因性炭素基質が必要であり、そのうちの一方が所望の産物に変換され、他方は成長するためにこのような補充を必要とする組換え宿主細胞によって完全にまたは部分的にアセチルＣｏＡに変換される。しかし、異種ホスホケトラーゼ経路の発現により、異種ＰＫ／ＰＴＡでないＰＤＣ−ＫＯ細胞と比較して、その成長のためにこれらの外因性炭素基質をもたらす必要性が低下するまたは排除される。したがって、アセチルホスフェートのアセテートへの加水分解を触媒することができるＲＨＲ２、ＨＯＲ２またはその相同体の追加の機能的破壊により、これらの細胞において細胞の成長のために利用可能な基質としてのアセチルＣｏＡの供給を増大させるＰＫ／ＰＴＡの能力がさらに改善されることが予想される。
【０２１３】
５．１０  遺伝子改変細胞を作製する方法
本明細書では、上記の改変のうちの１つまたは複数、例えば、ＰＫ、ＰＴＡ、および／または、例えばアセチルＣｏＡ由来化合物の生合成経路の酵素をコードする１種または複数種の異種核酸を含むように遺伝子操作された宿主細胞を作出するための方法も提供される。宿主細胞における異種酵素の発現は、酵素をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの制御下で含む核酸を宿主細胞に導入することによって実現することができる。一部の実施形態では、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができる染色体内組み込みベクターである。
【０２１４】
これらのタンパク質をコードする核酸は、それだけに限定することなく当業者に公知の任意の方法によって宿主細胞に導入することができる（例えば、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５巻：１２９２〜３頁；Ｃｒｅｇｇら（１９８５年）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５巻：３３７６〜３３８５頁；Ｇｏｅｄｄｅｌら編、１９９０年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、ＣＡ；Ｋｒｉｅｇｅｒ、１９９０年、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌら編、現行版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹを参照されたい）。例示的な技法としては、これだけに限定されないが、スフェロプラスト法、電気穿孔、ＰＥＧ１０００媒介性形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウム媒介性形質転換が挙げられる。
【０２１５】
宿主細胞における酵素のコピー数は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することによって変更することができる。これは、例えば、酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することによって（例えば、ヌクレオチド配列を含む発現ベクターのより多くのもしくはより少ないコピー数を使用することによって、またはヌクレオチド配列の追加のコピーを宿主細胞のゲノムに導入することによって、または宿主細胞のゲノム内のヌクレオチド配列を欠失させるもしくは破壊することによって）、オペロンのポリシストロニックｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変化させること、もしくはオペロンを分割して、それぞれがそれ自体制御エレメントを有する個々の遺伝子にすることによって、またはヌクレオチド配列が作動可能に連結したプロモーターもしくはオペレーターの強度を増大させることによって実現することができる。その代わりに、またはそれに加えて、宿主細胞における酵素のコピー数を、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを改変することによって変更することができる。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性を改変すること、リボソーム結合部位の配列を改変すること、酵素コード配列のリボソーム結合部位と開始コドンの間の距離または配列を改変すること、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流」に位置するもしくはそれと近接するシストロン間領域全体を改変すること、ヘアピンおよび特殊化された配列を使用してｍＲＮＡ転写物の３’末端を安定化すること、酵素のコドン使用を改変すること、酵素の生合成において使用される稀なコドンｔＲＮＡの発現を変更すること、ならびに／または酵素の安定性を、例えば、そのコード配列の変異によって増大させることによって実現することができる。
【０２１６】
宿主細胞における酵素の活性は、これだけに限定されないが、宿主細胞において溶解性の増大または減少を示す改変された形態の酵素を発現させること、酵素の活性の阻害をもたらすドメインを欠く変更された形態の酵素を発現させること、基質に対するＫｃａｔが高いもしくは低いまたはＫｍが低いもしくは高い改変された形態の酵素を発現させること、または経路内の別の分子によるフィードバック調節もしくはフィードフォワード調節の影響を多かれ少なかれ受ける変更された形態の酵素を発現させることを含めたいくつものやり方で変更することができる。
【０２１７】
一部の実施形態では、宿主細胞を遺伝子改変するために使用される核酸は、形質転換された宿主細胞を選択するためおよび宿主細胞に選択圧力をかけて外来ＤＮＡを維持させるために有用な１種または複数種の選択マーカーを含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの実例としては、これだけに限定されないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲ、およびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢＬＡ遺伝子産物により、ベータ−ラクタム系抗生物質（例えば、狭域セファロスポリン、セファマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）ならびにテモシリン以外の全ての抗グラム陰性細菌ペニシリンに対する耐性が付与される；Ｓ．ｎｏｕｒｓｅｉ由来のＮＡＴ１遺伝子産物により、ノーセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対する耐性が付与される；Ｓ．ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物により、ビアラホス（ｂｉａｌｏｐｈｏｓ）に対する耐性が付与される；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物により、オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に対する耐性が付与される；ＰＤＲ４遺伝子産物により、セルレニンに対する耐性が付与される；ＳＭＲ１遺伝子産物により、スルホメツロンメチルに対する耐性が付与される；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物により、クロラムフェニコールに対する耐性が付与される；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物により、メトトレキセートに対する耐性が付与される；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａのＨＰＨ遺伝子産物により、ハイグロマイシンＢに対する耐性が付与される；Ｅ．ｃｏｌｉのＤＳＤＡ遺伝子産物により、細胞がＤ−セリンを唯一の窒素源として伴うプレートで成長することが可能になる；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子により、Ｇ４１８に対する耐性が付与される；Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓ由来のＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物により、ゼオシン（ブレオマイシン）に対する耐性が付与される。一部の実施形態では、本明細書に開示されている遺伝子改変宿主細胞を単離した後、抗生物質耐性マーカーを欠失させる。
【０２１９】
一部の実施形態では、選択マーカーにより、遺伝子改変微生物における栄養要求性（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ）（例えば、栄養要求性（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ））がレスキューされる。このような実施形態では、親微生物は、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路において機能し、それが非機能的になると親細胞が１種または複数種の栄養分の補充を伴わない培地では成長することができなくなるような１種または複数種の遺伝子産物の機能的破壊を含む。このような遺伝子産物としては、これだけに限定されないが、酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次いで、親細胞を破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクターまたは染色体組み込み構築物で形質転換することによって栄養要求性表現型をレスキューすることができ、生成した遺伝子改変宿主細胞を、親細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択することができる。ＵＲＡ３遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、およびＬＹＳ２遺伝子を選択マーカーとして利用することには、正の選択と負の選択の両方が可能であるので、顕著な利点がある。正の選択はＵＲＡ３変異、ＴＲＰ１変異、およびＬＹＳ２変異の栄養要求性の補完によって行い、負の選択は特異的な阻害剤、すなわち、それぞれ原栄養株の成長は妨げるが、それぞれＵＲＡ３変異体、ＴＲＰ１変異体、およびＬＹＳ２変異体の成長は可能にする５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸、およびアミノアジピン酸（ａＡＡ）に基づく。他の実施形態では、選択マーカーにより、公知の選択方法によって同定することができる他の非致死的欠損または表現型がレスキューされる。
【０２２０】
本開示の方法、組成物および生物体において有用な具体的な遺伝子およびタンパク質が本明細書に記載されているが、このような遺伝子に対する絶対的な同一性は必要ないことが理解される。例えば、ポリペプチドまたは酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子またはポリヌクレオチドを変化させ、活性についてスクリーニングすることができる。一般には、このような変化は、保存的変異およびサイレント変異を含む。このような改変されたまたは変異したポリヌクレオチドおよびポリペプチドを、機能的酵素の発現について当技術分野で公知の方法を使用してスクリーニングすることができる。
【０２２１】
遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じまたは機能的に同等のポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドも、このような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、それを発現させるために使用することができる。
【０２２２】
当業者には理解される通り、コード配列を、特定の宿主におけるその発現が増強されるように改変することが有利であり得る。遺伝暗号は６４種の可能性のあるコドンを伴い重複するものであるが、大多数の生物体では、一般には、これらのコドンのサブセットが使用される。ある種においてほとんどの場合に利用されるコドンは最適なコドンと称され、それほど利用されないコドンは稀なまたは低使用コドンに分類される。コドンは、時には「コドン最適化」または「種コドンバイアスの制御」と称されるプロセスで宿主の好ましいコドン使用が反映されるように置換することができる。
【０２２３】
特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを含有する最適化されたコード配列（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７巻：４７７〜５０８頁）を、例えば、翻訳の速度を増大させるため、または、最適化されていない配列から産生される転写物と比較して半減期が長いことなどの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するために調製することができる。翻訳終止コドンを宿主の嗜好が反映されるように改変することができる。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な終止コドンは、それぞれＵＡＡおよびＵＧＡである。単子葉植物の典型的な終止コドンはＵＧＡであり、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉでは、一般にＵＡＡが終止コドンとして使用される（Ｄａｌｐｈｉｎら、１９９６年、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４巻：２１６〜８頁）。
【０２２４】
遺伝暗号の縮重性に起因して、ヌクレオチド配列が異なる種々のＤＮＡ分子を、本開示の所与の酵素をコードするために使用することができることが当業者には理解される。上記の生合成酵素をコードするネイティブなＤＮＡ配列は、本明細書では、ただ単に本開示のある実施形態を例示するために参照されており、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチドおよびタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ分子を包含する。同様に、ポリペプチドは、一般には、所望の活性の喪失または著しい喪失を伴うことなくそのアミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、および挿入を許容し得る。本開示は、本明細書に記載の具体的なタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するこのようなポリペプチドを、当該改変ポリペプチドまたはバリアントポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的同化活性または異化活性を有する限りは包含する。さらに、本明細書に示されているＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は、ただ単に本開示の複数の実施形態を例示する。
【０２２５】
さらに、本明細書で提供される組成物および方法に有用な酵素のホモログは本開示に包含される。一部の実施形態では、２つのタンパク質（またはタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する場合、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適に比較するために配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１のアミノ酸配列または核酸配列と第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較する目的で非相同配列を無視することができる）。一実施形態では、比較する目的でアラインメントする参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、一般には少なくとも４０％、より一般には少なくとも５０％、さらに一般には少なくとも６０％、さらにより一般には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位またはヌクレオチド位のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内のある位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合、それらの分子はその位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である。
【０２２６】
タンパク質またはペプチドに関して「相同」が使用される場合、同一ではない残基の位置は、多くの場合、保存的アミノ酸置換によって異なることが理解される。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換によりタンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。２つまたはそれより多いアミノ酸配列が保存的置換によって互いと異なる場合では、パーセント配列同一性または相同性の程度を上向きに調整して置換の保存的性質を補正することができる。この調整を行うための手段は当業者には周知である（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．  Ｒ．、１９９４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２５巻：３６５〜８９頁を参照されたい）。
【０２２７】
以下の６群はそれぞれ、互いに保存的置換になるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【０２２８】
ポリペプチドの配列相同性は、パーセント配列同一性とも称され、一般には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。分子配列と異なる生物体由来の多数の配列を含有するデータベースの比較に使用される典型的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物体由来の配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが典型的である。
【０２２９】
さらに、前述の酵素をコードする任意の遺伝子（または本明細書で言及されている任意の他の遺伝子（またはその発現を制御もしくは調節する任意の調節エレメント））を、当業者に公知の定向進化または合理的変異誘発などの遺伝子工学／タンパク質工学技法によって最適化することができる。このような措置により、当業者が酵素を酵母における発現および活性のために最適化することが可能になる。
【０２３０】
さらに、これらの酵素をコードする遺伝子を他の真菌種および細菌種から同定することができ、この経路を調節するために発現させることができる。これだけに限定されないが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＳ．ｕｖａｒｕｍを含めたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓを含めたＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａを含めたＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｓｐｐ．、Ｙ．ｓｐｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓを含めたＹａｍａｄａｚｙｍａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｓ．ｐｏｍｂｅを含めたＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、またはＵｓｔｉｌａｇｏ  ｓｐｐ．を含めた種々の生物体がこれらの酵素の供給源として機能し得る。嫌気性真菌由来の遺伝子の供給源としては、これだけに限定されないが、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、またはＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｓｐｐ．が挙げられる。有用な原核生物酵素の供給源としては、これだけに限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【０２３１】
追加の相同な遺伝子および相同な酵素を同定するために、当業者に公知の技法が適し得る。一般に、類似の遺伝子および／または類似の酵素は機能分析によって同定することができ、機能的な類似性を有する。類似の遺伝子および類似の酵素を同定するために、当業者に公知の技法が適し得る。例えば、相同なまたは類似のＰＫ、ＰＴＡ、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技法としては、これだけに限定されないが、目的の遺伝子／酵素公開された配列に基づくプライマーを使用したＰＣＲによる遺伝子のクローニング、または目的の遺伝子の間で保存された領域を増幅するために設計された変性プライマーを使用した変性ＰＣＲによる遺伝子のクローニングを挙げることができる。さらに、当業者は、機能的な相同性または類似性を有する相同なまたは類似の遺伝子、タンパク質、または酵素を同定するための技法を使用することができる。それらの技法は、細胞または細胞培養を触媒酵素の活性に関して、前記活性についてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイによって検査すること（例えば、本明細書またはＫｉｒｉｔａｎｉ，  Ｋ．、Ｂｒａｎｃｈｅｄ−Ｃｈａｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９７０年に記載の通り）、次いで、前記活性を有する酵素を精製することによって単離すること、酵素のタンパク質配列をエドマン分解などのなどの技法によって決定すること、可能性のある核酸配列に対してＰＣＲプライマーを設計すること、前記ＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅すること、および前記核酸配列をクローニングすることを含む。相同なまたは同様の遺伝子および／または相同なまたは同様の酵素、類似の遺伝子および／または類似の酵素またはタンパク質を同定するための技法は、候補遺伝子または酵素に関するデータをＢＲＥＮＤＡ、ＫＥＧＧ、またはＭｅｔａＣＹＣなどのデータベースと比較することも包含する。本明細書における教示に従って上記のデータベース内で候補遺伝子または酵素を同定することができる。
【実施例】
【０２３２】
６．実施例
６．１  実施例１：
ＰＫおよびＰＴＡを発現する宿主細胞におけるアセテート産生
この実施例では、ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを異種発現する酵母株におけるアセテートの産生を記載している。
【０２３３】
６．１．１  材料および方法
６．１．１．１  株の工学的操作
６．１．１．１．１  Ｙ９６７およびＹ９６８
Ｙ９６７およびＹ９６８は野生型原栄養Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＥＮ．ＰＫ２であり、Ｙ９６７はＭａｔＡであり、Ｙ９６８はＭａｔａｌｐｈａである。Ｙ１２８６９、Ｙ１２７４６、およびこれらの誘導体の全ての出発株はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙ００３株（ＣＥＮ．ＰＫ２、Ｍａｔアルファ、ｕｒａ３−５２、ｔｒｐ１−２８９、ｌｅｕ２−３，１２２、ｈｉｓ３＾１）であった。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＤＮＡ媒介性形質転換は全て、Ｇｉｅｔｚ  ＲＷおよびＷｏｏｄｓ  ＲＡ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｐａｒｔ  Ｂ．  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ：  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．８７〜９６頁（２００２年）に記載されている通り標準の酢酸リチウム手順を使用して行い、全ての場合において、構築物の組み込みをゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２３４】
６．１．１．１．２  Ｙ１２８６９
Ｙ１２８６９を、Ｙ００３への３回の連続的な組み込みによって生成した。まず、導入することによりＡＣＳ２遺伝子座の上流のヌクレオチドの配列からなる配列と下流のヌクレオチドの配列からなる配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＬＥＵ２遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ２２３５；配列番号２７）を導入することによって遺伝子ＡＣＳ２を欠失させた。この構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主細胞に導入されると、相同組換えによってゲノムのＡＣＳ２遺伝子座に組み込まれ、その組み込み配列でＡＣＳ２コード配列が置き換えられることによってＡＣＳ２が機能的に破壊され得る。形質転換体を、２％ＥｔＯＨを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｌｅｕプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ４９４０であった。
【０２３５】
次に、ＡＬＤ６を欠失させ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ  ｅｕｔＥを、以下に示されている組み込み構築物（ｉ７４８０４；配列番号２８）を用いてＹ４９４０に導入した。
【０２３６】
【化１】
0006595449.tif 000003
この組み込み構築物は、選択マーカー（ＴＲＰ１）、ならびにＴＤＨ３プロモーター（ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３コード領域の８４０塩基対上流）およびＴＥＦ２ターミネーター（ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＥＦ２コード領域の５０８塩基対下流）の制御下にあるＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ由来のｅｕｔＥ（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００３００３３１６．１）をコードする酵母コドン最適化配列遺伝子の２つのコピーを含む。これらの成分は、ＡＬＤ６遺伝子座の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれている。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＡＬＤ６コード配列が置き換えられることによってＡＬＤ６が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。構築物をＹ４９４０に導入してそれを形質転換し、２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＴＲＰプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はｙ１２６０２であった。
【０２３７】
次に、Ｙ１２６０２において、それ自体のプロモーターおよびターミネーターの下にある、ＡＣＳ１の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＩＳ３遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ７６２２０；配列番号２９）を導入することによってＡＣＳ１を欠失させた。形質転換体を、２％グルコースを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ１２７４７であった。
【０２３８】
次に、Ｙ１２７４７を、ネイティブなＵＲＡ３配列から増幅されたＰＣＲ産物で形質転換した。この配列により、ｕｒａ３−５２変異が修復される。ＲｏｓｅおよびＷｉｎｓｔｏｎ、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９３巻：５５７〜５６０頁（１９８４年）を参照されたい。形質転換体を、２％グルコースを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｕｒａプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ１２８６９であった。
【０２３９】
６．１．１．１．３  Ｙ１２７４５
Ｙ１２７４５を、Ｙ４９４０への３回の連続的な組み込みによって生成した。まず、Ｙ４９４０を以下に示されている組み込み構築物（ｉ７３８３０；配列番号３０）で形質転換した。
【０２４０】
【化２】
0006595449.tif 000004
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿８１９４０５．１）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コード配列の２５９ｂｐ下流）の制御下にあるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ホスホトランスアセチラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１３９４７８０．１）を含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置き換えられることによってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択した。生じた株を以下に示されている構築物（ｉ７４８１０；配列番号３１）で形質転換した。
【０２４１】
【化３】
0006595449.tif 000005
この構築物は、ＡＬＤ６遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＴＲＰ１）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの２つのコピーを含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＡＬＤ６コード配列が置き換えられることによってＡＬＤ６が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２４２】
次に、それ自体のプロモーターおよびターミネーターの下にある、ＡＣＳ１の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＩＳ３遺伝子からなる組み込み構築物（ｉ７６２２０；配列番号２９）を導入することによってＡＣＳ１を欠失させた。形質転換体を、２％グルコースを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２４３】
６．１．１．１．４  Ｙ１２７４６
Ｙ１２７４６を、Ｙ４９４０への３回の連続的な組み込みによって生成した。まず、Ｙ４９４０を以下に示されている組み込み構築物（ｉ７３８３０；配列番号３０）で形質転換した。
【０２４４】
【化４】
0006595449.tif 000006
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿８１９４０５．１）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コード配列の２５９ｂｐ下流）の制御下にあるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ  ホスホトランスアセチラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１３９４７８０．１）を含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置き換えられることによってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択した。
【０２４５】
生じた株を以下に示されている構築物（ｉ７４８１０；配列番号３１）で形質転換した。
【０２４６】
【化５】
0006595449.tif 000007
この構築物は、ＡＬＤ６遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＴＲＰ１）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの２つのコピーを含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＡＬＤ６コード配列が置き換えられることによってＡＬＤ６が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２４７】
最後に、生じた株を以下に示されている構築物（ｉ７６２２１；配列番号３２）で形質転換した。
【０２４８】
【化６】
0006595449.tif 000008
この構築物は、選択マーカー（ＨＩＳ３）；ならびにＴＤＨ３プロモーター（ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＤＨ３コード領域の８４０塩基対上流）およびＴＥＦ２ターミネーター（ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＴＥＦ２コード領域の５０８塩基対下流）の制御下にあるＤｉｃｋｅｙａ  ｚｅａｅ由来のｅｕｔＥ（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００３００３３１６．１）をコードする酵母コドン最適化配列遺伝子の２つのコピーを含む。これらの成分は、ＡＣＳ１遺伝子座の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれている。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＡＣＳ１コード配列が置き換えられることによってＡＣＳ１が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＨＩＳプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。生じた株はＹ１２７４６であった。
【０２４９】
６．１．１．１．５  Ｙ１９３９０
Ｙ１９３９０は、Ｙ１２８６９の直接の派生物である。Ｙ１２８６９のウラシル要求性誘導体を以下に示されている組み込み構築物ＭＳ４９２５３（配列番号３６）で形質転換した：
【０２５０】
【化７】
0006595449.tif 000009
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＴＤＨ３ターミネーター（ＴＤＨ３コード配列の２５９ｂｐ下流）の下にあるＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来のホスホケトラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列ＹＰ＿８１９４０５．１）の２つのコピーを含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置き換えられることによってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択した。
【０２５１】
６．１．１．１．６  Ｙ１９３９１
Ｙ１９３９１は、Ｙ１２８６９の直接の派生物である。Ｙ１２８６９のウラシル要求性誘導体を以下に示されている組み込み構築物ＭＳ４９２９８（配列番号３７）で形質転換した：
【０２５２】
【化８】
0006595449.tif 000010
この組み込み構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＵＤ９遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、選択マーカー（ＵＲＡ３）；ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３コード配列の８７０ｂｐ上流）およびＰＧＫ１ターミネーター（ＰＧＫ１コード配列の２５９ｂｐ下流）の制御下にあるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ由来のホスホトランスアセチラーゼの酵母コドン最適化バージョン（ＮＣＢＩ参照配列：ＹＰ＿００１３９４７８０．１）の２つのコピーを含む。この構築物は、宿主細胞に導入されると、相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＢＵＤ９コード配列が置き換えられることによってＢＵＤ９が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択した。
【０２５３】
６．１．１．２  培養条件
Ｙ９６７、Ｙ１２８６９、Ｙ１２７４５、Ｙ１２７４６、Ｙ１９３９０およびＹ１９３９１の種菌培養物を、単一のコロニーから、５０ｍＭのコハク酸、ｐＨ５．０、および２０ｇ／Ｌのスクロースを伴うシード培地５ｍｌ中、３０℃、２００ｒｐｍで一晩成長させた（１５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、８ｇ／Ｌのリン酸カリウム、６．１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１５０ｍｇ／ＬのＥＤＴＡ、５７．５ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、４．８ｍｇ／Ｌの塩化コバルト、３．２４ｍｇ／Ｌの塩化マンガン、５ｍｇ／Ｌの硫酸銅、２９．４ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム、２７．８ｍｇ／Ｌの硫酸鉄、４．８ｍｇ／Ｌ  モリブデン酸ナトリウム、０．６ｍｇ／Ｌのビオチン、１２ｍｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１２ｍｇ／Ｌのニコチン酸、３０ｍｇ／Ｌのイノシトール、１２ｍｇ／Ｌの塩酸チアミン、１２ｍｇ／Ｌの塩酸ピリドキシン、０．２４ｍｇ／Ｌのパラアミノ安息香酸）。次いで、前培養物を、５０ｍＭのコハク酸ｐＨ５．０、および４０ｇ／Ｌのスクロースを伴うシード培地２５ｍｌを含む１２５ｍｌのフラスコに接種し、最初のＯＤ６００を０．１にし、３０℃、２００ｒｐｍで成長させた。
【０２５４】
６．１．１．３．  アセテート、フルクトース、グルコース、およびスクロースの定量化
全細胞ブロス１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して１３，０００ＲＰＭで１分回転させて上清を清澄化することによってアセテートおよび糖（フルクトース、グルコース、スクロース）を定量化した。次いで、上清を８ｍＭの硫酸で希釈し（１：１ｖ／ｖ）、ボルテックスし、再度遠心分離した後に、１．８ｍｌのバイアルに移した。ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  ３００ｍｍ×７．８ｍｍカラムを使用して、可変性の波長および屈折率検出を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣを用いて試料を分析した。移動相は４ｍＭの硫酸であり、カラム温度は４０℃であり、流速は毎分０．５ｍｌであった。
【０２５５】
６．１．１．４．  結果
図３Ｂには、野生型Ｃｅｎ．ＰＫ２、Ｙ９６７がバッチ確定スクロース振とうフラスコ培養物中での成長中にアセテートを産生することが示されている。ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）を異種発現するＹ１２８６９により産生されるアセテートは、ＰＤＨ−バイパスを使用する野生型対照よりもはるかに少なく、これはアセトアルデヒドをアセテートに変換する細胞質ゾル内アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼであるＡＬＤ６の欠失に起因する可能性がある。ＰＤＨ−バイパスの欠失を含み（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）ならびにホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現するＹ１２７４６株では、アセテートの大きな増大が観察され、野生型Ｙ９６７によって産生される量に勝る。Ｙ１２８６９での結果により、ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δであり、細胞質ゾル内アセチルＣｏＡにフラックスを持っていくためにＡＤＡを使用する株ではアセテートのベースラインレベルが非常に低いことが示される。全ての場合において、糖消費の速度は同等であり（本明細書では、糖とは、培地中のスクロース、グルコース、およびフルクトースの合計と定義される）、これにより、アセテートレベルの差異がフィードストックの示差的な消費に起因するものではないことが例証される（図３Ａ）。これらの結果により、Ｙ１２７４６におけるアセテートの増大は、ホスホケトラーゼおよび／またはホスホトランスアセチラーゼの存在に起因することが示唆される。ホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの両方の触媒活性によりアセチルホスフェートが産生される。したがって、Ｙ１２７４６における自発的なまたは触媒されるアセチルホスフェートの加水分解からアセテート蓄積が生じ得る。
【０２５６】
ＡＤＡ、ＰＫおよびＰＴＡを発現する株（Ｙ１２７４６）におけるアセテートの供給源を決定するために、細胞質ゾル内ＡｃＣｏＡをもたらすためにＡＤＡのみを使用する株（Ｙ１２８６９、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアシル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）を異種発現する）を、（１）Ｙ１９３９０をもたらす、強力なプロモーターＰＴＤＨ３によって駆動されるＰＫの２つの過剰発現したコピーをコードする組込み構築物、または（２）Ｙ１９３９１をもたらす、強力なプロモーターＰＴＤＨ３によって駆動されるＰＴＡの２つの過剰発現したコピーをコードする組込み構築物のいずれかで形質転換した。図３Ｄに示されている通り、ＰＫまたはＰＴＡのいずれかを発現する株では親株と比較してアセテート蓄積の増大が観察された。アセテートレベルが示差的な糖消費に起因するものではないことを例証するために糖消費が図３Ｃに示されている。ＰＫはＸ５ＰをアセチルホスフェートおよびＧ３Ｐに変換するものであり、ＰＴＡは、アセチルＣｏＡ＋Ｐｉとアセチルホスフェート＋ＣｏＡを相互変換する。これらの知見により、図１に示されるように、ＰＫによりＸ５Ｐから引き出されたものであれ、ＰＴＡによりＡｃＣｏＡから引き出されたものであれ、アセチルホスフェートがアセテートに加水分解され得ることが示唆される。
【０２５７】
６．２  実施例２：
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける主要なアセチルホスファターゼの同定
この実施例では、酵母においてアセチルホスフェートを加水分解することができる酵素の同定を記載している。
【０２５８】
６．２．１  材料および方法
６．２．１．１  細胞培養
所与の酵母株の単一のコロニーを、２％デキストロースを伴う酵母抽出物ペプトン培地（ＹＰＤ）５ｍＬ中で一晩発端培養として培養した。翌日、ＹＰＤ５０ｍｌをこの発端培養物に接種し、ＯＤ６００を０．２にした。別段の指定がない限り、フラスコを３０℃、２００ＲＰＭで振とうしながら２４時間インキュベートした。
【０２５９】
６．２．１．２  無細胞抽出物の調製
細胞培養物を１５ｍＬのファルコンチューブ３つに分け、４０００×ｇで５分遠心分離することによって収集した。次いで、上清を廃棄し、氷冷した緩衝液Ｗ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）１０ｍＬに再懸濁させ、その後、４０００ｘｇで５分遠心分離することによって細胞を洗浄した。上清を廃棄し、細胞を溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＬ当たり１つのＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビター錠（Ｒｏｃｈｅ））１ｍＬに再懸濁させた。次いで、細胞を、Ｏリングキャップを伴う２ｍＬのプラスチックスクリューキャップ微量遠心チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｒａｎｄ  ５２０−ＧＲＤ）に移し、破壊ビーズ（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｅａｄｓ、０．５Ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ）およびビーズビーターを使用して、６Ｍ／Ｓで１分間にわたって細胞を溶解させた。チューブをすぐに氷水浴に入れ、少なくとも５分置いた。次いで、チューブを再度ビージビーターに戻し、６Ｍ／Ｓで１分置き、氷浴に戻して５分置いた。チューブを最低でも１６０００×ｇで２０分回転させて細胞片をペレット化した。次いで、上清を新しい低温チューブに移した。タンパク質の濃度を、タンパク質についての典型的なＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ  Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２巻、２４８〜２５４頁（１９７６年））。
【０２６０】
６．２．１．３  アセチルホスファターゼ反応およびアセチルホスフェートの定量化
アセチルホスファターゼ活性アッセイを、３０℃、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および１ｍＭのＭｇＣｌ２＋からなる反応緩衝液中で行った。アセチルホスフェートを、示されている通り５ｍＭまたは１０ｍＭのいずれかの出発濃度になるまで添加した。無細胞抽出物を示されている量で添加することによって反応を開始させた。ホスファターゼ阻害について試験するために、選択のためにフッ化ナトリウムをウェルに３０ｍＭの濃度で添加した。密閉した９６ウェルプレートで反応を行い、反応生成物の総体積は２５０μｌであった。アセチルホスフェート濃度を、ＬｉｐｍａｎｎおよびＴｕｔｔｌｅ（Ｌｉｐｍａｎｎ  Ｆ、Ｔｕｔｔｌｅ  ＬＣ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １５９巻、２１〜２８頁（１９４５年））により開発された方法によって測定した。反応混合物５０μｌを２Ｍのヒドロキシルアミン、ｐＨ６．８、５０μｌに添加し、十分に混合し、室温で少なくとも１０分インキュベートした。次いで、１５％トリクロロ酢酸３４μｌを添加し、混合し、その後、４ＮのＨＣｌ、３４μｌ、および５％ＦｅＣｌ３、３４μｌをそれぞれ添加した後に十分に混合した。次いで、プレートを、スイングバケットローターＪＳ−５．３を伴うＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機Ｊ−Ｅにおいて、３０００ｒｐｍで５分遠心分離して沈殿したタンパク質をペレット化した。次いで、次いで、上清１５０μｌを新鮮な９６ウェル透明平底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｃａｔ．−Ｎｏ．：６５５１６１）に移した。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーによって５０５ｎｍの波長において読み取った。
【０２６１】
６．２．１．４  活性なホスファターゼ画分の精製
所与の酵母株の単一のコロニーを、２％デキストロースを伴う酵母抽出物ペプトン培地（ＹＰＤ）５ｍＬ中で一晩発端培養として培養した。翌日、５００ｍｌのＹＰＤを伴う２．８Ｌのフェルンバッハフラスコ２つにこの発端培養物を接種し、ＯＤ６００を０．２にした。フラスコを、３０℃、１６０ＲＰＭで振とうしながら２４時間インキュベートした。培養物を、４０００ｘｇで５分遠心分離することによって収集した。細胞ペレットを滅菌水５００ｍＬで洗浄し、４０００ｘｇで５分遠心分離した。次いで、細胞ペレットを、氷冷した溶解緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＬ当たり１つのＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビター錠（Ｒｏｃｈｅ））５０ｍＬに再懸濁させた。細胞浮遊液を、破砕ビーズ（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｅａｄｓ、０．５Ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ）５ｍＬを満たした１５ｍＬのファルコンチューブ６つに分割した。次いで、チューブをビーズビーターに入れ、６Ｍ／Ｓで４５秒置いた。チューブをすぐに氷水浴に入れ、少なくとも５分置いた。ビーズビーティングをさらに３回繰り返し、各破砕セグメントの間に氷水浴に少なくとも５分入れた。チューブを、４℃に冷却したＪＡ−２０ローター内のＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機Ｊ−Ｅで１６，０００ｒｐｍ（３０，９６６×ｇ）で３０分回転させて、細胞片をペレット化した。細胞溶解物を、Ｓａｌｔら（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ：  Ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔｓ．  Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７巻、１０７〜１１３頁（１９９５年））に記載されている選択的フロキュレーション法によって以下の通りさらに清澄化した：無細胞溶解物を、５ｍＭのＮａＯＨストック溶液を添加することによってｐＨ７．４に調整した。次いで、等体積のＰＥＩ／Ｂｏｒａｘ溶液（０．５ＭのＮａＣｌ、０．２５％ＰＥＩ、１００ｍＭのＢｏｒａｘ）を細胞溶解物に添加し、十分に混合した。次いで、混合物を、４℃、２，５００×ｇで３０分遠心分離した。次いで、硫酸アンモニウムを８０％の飽和濃度に達するまで絶えず撹拌しながらゆっくりと添加することによってタンパク質沈殿させた。撹拌をさらに１０分継続し、次いで、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＪＡ−２０ローターにおいて４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分遠心分離することによって沈殿したタンパク質を収集した。上清を除去し、タンパク質を緩衝液Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７、１０％グリセロール）に穏やかに再懸濁させた。次いで、タンパク質を、３，５００Ｄａ分子量カットオフ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ＃６６３００）０．５〜３ｍＬに添加し、１．５Ｌの緩衝液Ａ中、４℃で一晩透析した。透析した試料を１６０００×ｇで１０分遠心分離して、沈殿したタンパク質をペレット化した。タンパク質の濃度を、タンパク質についての典型的なＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して測���した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ、Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２巻、２４８〜２５４頁（１９７６年））。タンパク質２０ｍｇをＧＥ  ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＦＰＬＣのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  ４．６／１００  ＰＥ陰イオン交換カラムにローディングした。緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７、１ＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール）の０〜１００％勾配を３０カラム体積にわたって毎分０．５ｍＬの流速で用いてタンパク質を溶出し、試料１ｍＬを採取した。各画分の活性をアッセイするために、各画分７５μＬを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する反応物２５０μＬ中８ｍＭのＡＣＰに添加し、上記の通りアッセイした。この分離からの活性な画分を緩衝液Ａに対して一晩、再度透析した。次いで、試料全体を同じＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ  ４．６／１００  ＰＥ陰イオン交換カラムにローディングし、０〜４５％緩衝液Ｂの勾配を３０カラム体積にわたって毎分０．５ｍＬの流速で用いて溶出し、試料１ｍＬを採取した。試料を活性について上記の通りアッセイした。
【０２６２】
６．２．１．５  タンパク質ゲル電気泳動
タンパク質画分を、基準ゲル電気泳動系を使用して分析した。画分１０μＬを、５％ｖ／ｖ２−メルカプトエタノールを伴う２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ番号１６１−０７３７）１０μＬに添加し、１０分煮沸した。次いで、試料を短時間遠心分離し、１５μｌを２６ウェル４〜１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌにローディングし、１×Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ緩衝液（ＢｉｏＲａｄにより調製されたもの、１０×Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＳＤＳ＃１６１−０７３２）に１３０ボルトで５０分流した。ゲルを脱イオン水２００ｍＬで３回、それぞれ５分すすいだ。次いで、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ番号ＬＣ６０６０）をゲルに添加してゲルを完全に覆い、次いで、室温で１時間、穏やかにゆすりながらインキュベートした。次いで、ＳａｆｅＳｔａｉｎを廃棄し、ゲルを、脱イオン水２００ｍＬを用いて１時間ゆすりながら洗浄した。
【０２６３】
６．２．１．６  活性なホスファターゼ画分中のタンパク質の同定
タンパク質消化およびペプチドの分離
総タンパク質１００μｇを、その後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定するためにトリプシンによるタンパク質分解に供した。総タンパク質１００μｇを、Ｔｒｉｓ−カルボキシエチルホスフィン（４ｍＭ）を用いて３７℃で３０分還元し、次いで、ヨードアセトアミド（１５ｍＭ）を用いて暗闇中、ＲＴで３０分アルキル化した。トリプシン５μｇを消化混合物に添加し、３７℃で１２時間にわたって完全に消化した。０．１％ギ酸を用いて反応をクエンチし、Ａｓｃｅｎｔｉｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｃｏｌｕｍｎ（５ｃｍｘ２．１ｍｍ  ＩＤ、粒子サイズ２．１ｕｍ）に注射し、０．１％ギ酸を修飾因子として使用し、低アセトニトリルから高アセトニトリルまでの９０分の勾配にわたって分離した。ＬＣポンプは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＣＢＭ２０Ａ  ＬＣ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒにより作動する２台のＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０ＡＤであった。
【０２６４】
質量分析パラメータ：
ＱＴＲＡＰ  ４０００ハイブリッドトリプル四重極リニアイオントラップ質量分析計を使用して、カラムから溶出するペプチドを同定した。ＩＤＡパラメータは以下の通りであった：選択イオン、３５０〜１３００ｄａ；電荷の状態を決定するために使用するＥＲスキャン；１＋イオン拒絶、未知許容；回転衝突エネルギー：あり（ｑｔｒａｐ４０００のＡＢ  ＳＣＩＥＸ標準）；各ＭＳ／ＭＳの最大充填時間：９５０ｍｓ。
【０２６５】
Ｍａｓｃｏｔによるペプチド同定
Ｍａｔｒｉｘ  ＳｃｉｅｎｃｅによるＭａｓｃｏｔを使用し以下のパラメータを用いてＣＥＮＰＫ２配列データベースからペプチドを同定した。固定修飾（Ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）：カルバミドメチル。可変修飾（Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）：脱アミド（ＮＱ）、酸化（ＭＷ）。前駆体質量許容差（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：０．５ｄａ。生成物質量許容差（Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：１．０ｄａ。切断ミス最大数（Ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅｓ  ａｌｌｏｗｅｄ）：１。
【０２６６】
６．２．１．７  株の工学的操作
機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くＹ９６８のバージョンを、ＲＨＲ２をノックアウトするためにｍｓ５９８５８を用いて、またはＨＯＲ２をノックアウトするためにｍｓ５９９７１を用いて形質転換した。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。この構築物中のＵＲＡ３マーカーは直接反復配列に挟まれており、それにより、当該マーカーの再利用が容易になる。ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、細胞をＹＰＤ中で一晩成長させ、次いで、５’ＦＯＡにプレーティングした。ＵＲＡ３のループアウトをＰＣＲ増幅、およびＣＳＭ−ＵＲＡプレートで成長できないことによって確認した。次いで、Ｙ９６８．ｍｓ５９８５８のｕｒａ−バージョンをｍｓ５９９７１で形質転換して、２重ＲＨＲ２およびＨＯＲ２ノックアウトＹ９６８．ｍｓ５９８５８．ｍｓ５９９７１株を生成した。
【０２６７】
６．２．２  結果
６．２．２．１  アセチルホスフェートの加水分解は酵素により触媒され、熱および広範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤により阻害される
図４に示されている通り、野生型Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｙ９６７株由来の無細胞抽出物の添加により、アセチルホスフェートの加水分解が触媒され、加水分解の速度は、添加する無細胞抽出物の量に左右される。無細胞抽出物の量を増大することにより、加水分解の速度が上昇する。無細胞抽出物を煮沸すると、漸増量の無細胞抽出物を添加することによりもはやアセチルホスフェートの加水分解速度は影響を受けず、これにより、反応性成分が熱により失活したことが示される。同様に、３０ｍＭの、広範なスペクトルのホスファターゼ阻害剤であるフッ化ナトリウムを添加することにより、アセチルホスフェートの加水分解時の無細胞抽出物の効力がなくなる。これらの結果により、ホスファターゼがアセチルホスフェート加水分解の触媒作用に関与する可能性があることが示唆される。
【０２６８】
６．２．２．２  タンパク質分画により、単一の富化された活性な画分が単離される
陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して無細胞抽出物中の可溶性タンパク質を分離した。図５Ａには、ホスファターゼ活性のほぼ全てが１つの画分に濃縮され、残りの活性がその画分の付近にあったことが示されている。これにより、無細胞抽出物中のこの活性に関与する酵素が、単一のタンパク質、または陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離した際に一緒に溶出する、同様のイオン性相互作用を有するタンパク質のいずれかであることが示される。
【０２６９】
ＦＰＬＣ陰イオン交換精製からの活性な画分＃１０について、より浅い０〜４５％緩衝液Ｂの勾配を使用して２回目の精製を行った。図６Ａに示されている通りこの精製による最も活性な画分であった＃１４を質量分析によって分析して、画分中のタンパク質の同一性を決定した。活性な画分において同定されたタンパク質のうち（図６Ｂ）、Ｒｈｒ２と、著しい配列類似性に起因し質量分析によって区別することができないそのホモログであるＨｏｒ２のみが、ＳＧＤデータベースによってホスファターゼと同定された一覧にあるタンパク質であった。Ｒｈｒ２は、高レベルで構成的に発現されるグリセロール−１−ホスファターゼである。Ｈｏｒ２は、同一の反応を触媒するが、正常状態下では低レベルでのみ発現され、浸透ストレスによって誘導される（Ｎｏｒｂｅｃｋら、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ  ｏｆ  ＤＬ−Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１３８７５〜１３８８１頁（１９９６年））。アセチルホスフェートは酵母のネイティブな代謝産物ではなく、したがって、加水分解は同様の基質を標的とする酵素の無差別な反応によって引き起こされることが予想される。Ｒｈｒ２／Ｈｏｒ２は、以下に示されている通りそれらのネイティブな基質であるグリセロール−１−ホスフェートもアセチルホスフェートと同様の低分子量のリン酸化化合物であるので、この反応の最上位の候補である。
【０２７０】
【化９】
0006595449.tif 000011
６．２．２．３  ＲＨＲ２および／またはＨＯＲ２の欠失によりホスファターゼ活性が低下する
Ｒｈｒ２および／またはＨｏｒ２がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて観察されるホスファターゼ活性に関与するかどうかを決定するために、ＲＨＲ２またはＨＯＲ２のいずれかを欠く新しい株、およびＲＨＲ２とＨＯＲ２を両方とも欠く１つの株を創出した。これらの株を以前に記載されている通り培養し、無細胞抽出物を調製し、アセチルホスファターゼ活性について試験した。図７に示されている通り、ＲＨＲ２の欠失によりホスファターゼ活性が劇的に低下するが、ＨＯＲ２の欠失にはアセチルホスフェートの加水分解の速度に対する効果はない。しかし、すでにＲＨＲ２が欠失している株ではＨＯＲ２の欠失によりアセチルホスフェートの加水分解が低下する。これは、ＲＨＲ２の欠失後にＨｏｒ２の発現が上方制御されることが示されている公開された研究と一致する（ＤｅＬｕｎａら、Ｎｅｅｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｉｒ  Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  Ｇｅｎｅｓ、ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌ．、８巻、ｅ１００００３４７頁（２０１０年））。図７に示されている通り、これらのホスファターゼを両方とも排除することにより、ほぼバックグラウンドレベルのアセチルホスフェート加水分解がもたらされる。これらの結果により、グリセロール−１−ホスファターゼであるＲｈｒ２およびＨｏｒ２がＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける大多数のアセチルホスファターゼ活性に関与することが確認される。
【０２７１】
６．３  実施例３：
アセチルホスフェートホスファターゼの欠失により、アセテート分泌が低下し、アセチルＣｏＡに由来する化合物の産生が改善される
６．３．１  材料および方法
６．３．１．１  株の構築
Ｙ９６８、Ｙ１２８６９、およびＹ１２７４６、機能的ＵＲＡ３遺伝子を欠くバージョンを、ファルネセン産生体に変換するために、ｍｓ６３９０７またはｍｓ６３９０９のいずれかを用いて、およびｍｓ６４４７２を用いて形質転換した。
【０２７２】
ｍｓ６３９０７組み込み構築物（ｉ８４０２２；配列番号３３）が下に示されている。
【０２７３】
【化１０】
0006595449.tif 000012
この構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＯエンドヌクレアーゼ遺伝子座の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれた、全てガラクトース−誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０のプロモーター）の下にある、選択マーカー（ＵＲＡ３）；それ自体のプロモーターの下にあるネイティブな酵母ＧＡＬ４転写因子のコピー；２つのネイティブな酵母のメバロン酸経路の酵素（アセトアセチルＣｏＡチオラーゼをコードするＥＲＧ１０、およびＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３）、ならびにＳｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ  ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの酵母コドン最適化バージョンの２つのコピーをコードするヌクレオチド配列を含む。宿主細胞に導入されると、ｍｓ６３９０７構築物は相同組込みによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＨＯコード配列が置き換えられることによってＨＯが機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。この構築物中のＵＲＡ３マーカーは直接反復配列に挟まれており、それにより、当該マーカーの再利用が容易になる。ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、細胞をＹＰＤ中で一晩成長させ、次いで、５’ＦＯＡにプレーティングした。ＵＲＡ３のループアウトをＰＣＲ増幅、およびＣＳＭ−ＵＲＡプレートで成長できないことによって確認した。ｍｓ６３９０９組み込み構築物（ｉ８４０２６；配列番号３４）は、Ｓ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする配列が、ネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする切断型ＨＭＧ１コード配列であるｔＨＭＧｒで置き換えられていることを１つの例外として、ｍｓ６３９０７と同一である。
【０２７４】
ｍｓ６４４７２組み込み構築物（ｉ８５２０７；配列番号３５）が下に示されている。
【０２７５】
【化１１】
0006595449.tif 000013
この構築物は、全てガラクトース−誘導性プロモーター（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＧＡＬ７のプロモーター）の下にある、選択マーカー（ＵＲＡ３）；５つのネイティブな酵母のエルゴステロール経路の酵素（メバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２、ホスホメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ８、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードするＥＲＧ１９、ジメチルアリル二リン酸イソメラーゼをコードするＩＤＩ１、およびファルネシルピロホスフェートシンテターゼをコードするＥＲＧ２０）、ならびに進化した、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ａｎｎｕａ  ファルネセンシンターゼの酵母コドン最適化バージョンをコードするヌクレオチド配列を含む。これらの配列は、ＧＡＬ８０の上流のヌクレオチド配列からなる相同配列と下流のヌクレオチド配列からなる相同配列で挟まれている。宿主細胞に導入されると、ｍｓ６４４７２構築物は相同組込みによって宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その組み込み配列でＧＡＬ８０コード配列が置き換えられることによってＧＡＬ８０が機能的に破壊される。構築物は米国特許第８，２２１，９８２号に記載の方法を使用して組み立てた。２％グルコースを伴うＣＳＭ−ＵＲＡプレート上で形質転換体を選択し、ＰＣＲ増幅によって確認した。この構築物中のＵＲＡ３マーカーは直接反復配列に挟まれており、それにより、当該マーカーの再利用が容易になる。ＵＲＡ３マーカーを再利用するために、細胞をＹＰＤ中で一晩成長させ、次いで、５’ＦＯＡにプレーティングした。ＵＲＡ３のループアウトをＰＣＲ増幅、およびＣＳＭ−ＵＲＡプレートで成長できないことによって確認した。
【０２７６】
次に、Ｙ９６８．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２、Ｙ１２８６９．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２、およびＹ１２７４７．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２のｕｒａ−バージョンを、ＲＨＲ２  ＯＲＦをノックアウトするためにｍｓ５９８５８で形質転換した。この組み込み構築物は、それ自体のプロモーターおよびターミネーターの下にある、ＲＨＲ２の上流のヌクレオチド配列と下流のヌクレオチド配列に挟まれたネイティブなＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子からなる。形質転換体を、２％グルコースを唯一の炭素源として含有するＣＳＭ−ｈｉｓプレートにプレーティングし、ＰＣＲ増幅によって確認した。
【０２７７】
６．３．１．２  培養条件
単一のコロニーを９６ウェルプレートのウェル中のシード培地（実施例１に記載されている）３６０μｌに接種し、３４℃で３日間、１０００ｒｐｍで振とうすることにより成長させた。次いで、培養物１４．４μｌを５０ｍＭのコハク酸ｐＨ５．０および４０ｇ／Ｌガラクトースを伴うシード培地３６０μｌ中に継代培養し、３４℃で２日間、１０００ｒｐｍで振とうすることによって成長させた。
【０２７８】
６．３．１．３  アセテートおよびグリセロールの定量化
アセテートおよびグリセロールを定量化した  全細胞ブロス１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、卓上遠心分離機を使用して１３，０００ＲＰＭで１分回転させて上清を清澄化することによって。次いで、上清を８ｍＭの硫酸で希釈し（１：１ｖ／ｖ）、ボルテックスし、再度遠心分離した後に、１．８ｍｌのバイアルに移した。ＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ  ３００ｍｍ×７．８ｍｍカラムを使用して、可変性の波長および屈折率検出を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣを用いて試料を分析した。移動相移動相は４ｍＭの硫酸であり、カラム温度は４０℃であり、流速は毎分０．５ｍｌであった。
【０２７９】
６．３．１．４  ファルネセンの定量化
３４℃で２日間のインキュベーションの最後に、全細胞ブロス９８μｌをナイルレッド溶液（ＤＭＳＯ中１００μｇ／ｍｌ）２μｌと混合して平底９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９１６）に入れ、９６ウェルプレート振とう機で３０秒混合した。次いでプレートをＢｅｃｋｍａｎ  Ｍ５プレートリーダーにおいて５００ｎｍにおける励起および５５０ｎｍにおける放出を用いて読み取った。
【０２８０】
６．３．１．５  光学濃度の定量化
９６ウェルアッセイプレートにおいて、培養物８μｌと希釈剤（２０％ＰＥＧ２００、２０％エタノール、２％トリトンＸ−１１４）９２μｌを混合し、室温で３０分インキュベートした。アッセイプレートをボルテックスした後、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｍ５プレートリーダーでＯＤ６００を測定した。
【０２８１】
６．３．２  結果
図８Ａには、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）ならびにホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現し、かつファルネセン産生経路内の遺伝子を過剰発現するＹ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２株により、ＲＨＲ２遺伝子が欠失したＹ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２バージョンよりも多くのアセテートが分泌されることが示されている。図８Ｂに示されている通り、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２  ｒｈｒ２＾のグリセロールレベルはＹ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２と比較して大きく変化しないので、ＲＨＲ２の欠失によるグリセロール産生に対する影響はない。図８Ｃに示されている通り、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２  ｒｈｒ２＾におけるアセテートの実質的なレベルの低下は、細胞密度はＲＨＲ２＋集団とｒｈｒ２＾集団のどちらについても同様であるので、細胞の成長の低下に起因するものではない。これらの結果により、無細胞抽出物におけるアセチルホスフェートホスファターゼ活性に関与するＲｈｒ２が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアセチルホスフェートのアセテートへの加水分解の主な原因でもあることが実証される。
【０２８２】
ＲＨＲ２が欠失すると観察されるアセテートの減少がファルネセン産生とは独立して起こるかものかどうかを決定するために、１２７４６株のＲＨＲ２遺伝子がインタクトであるまたは欠失しているがファルネセン産生経路内の遺伝子を発現しないバージョンにおけるアセテート産生を測定した。図８Ｄには、ＰＤＨ−バイパスの欠失（ａｃｓ１Δ  ａｃｓ２Δ  ａｌｄ６Δ）を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアセチル化（Ｄｚ．ｅｕｔＥ）ならびにホスホケトラーゼ（Ｌｍ．ＰＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（Ｃｋ．ＰＴＡ）を異種発現するＹ１２７４６株により、Ｙ１２７４６のＲＨＲ２遺伝子が欠失したバージョンよりも多くのアセテート分泌されることが示されている。図８Ｅに示されている通り、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０９．ｍｓ６４４７２  ｒｈｒ２＾におけるアセテートの実質的なレベルの低下は、細胞密度はＲＨＲ２＋集団およびｒｈｒ２＾集団のどちらについても同様であるので、細胞の成長の低下に起因するものではない。これらのデータにより、アセテートの減少が過剰発現したファルネセン産生経路の存在にかかわらず起こることが例証される。
【０２８３】
図９には、ｒｈｒ２の欠失により、ファルネセン産生がＹ１２７４６．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２では２．１倍改善され、Ｙ１２７４５．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２では１．４倍改善されることが示されている（各株バックグラウンドにおいて、ＲＨＲ２＋親を１に正規化）。さらに、ｒｈｒ２の欠失により、Ｙ１２７４６．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２の炭素消耗時の最終的な光学濃度が改善される。Ｙ１２７４５．ｍｓ６３９０７．６４４７２とＹ１２７４６．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２はどちらも、ファルネセンの合成に使用される細胞質ゾル内アセチルＣｏＡを産生するためにホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼを使用し、したがって経路の中間体としてアセチルホスフェートを使用する。Ｙ９６８．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２株およびＹ１２８６９．ｍｓ６３９０７．ｍｓ６４４７２株はホスホケトラーゼまたはホスホトランスアセチラーゼを発現せず、経路の中間体としてアセチルホスフェートを使用しない。これらの株バックグラウンドにおけるｒｈｒ２の欠失には、いずれの株バックグラウンドにおいてもファルネセン産生または光学濃度に対する効果はない。これにより、ｒｈｒ２を特異的にノックアウトすることの利益は、中間代謝産物よしてアセチルホスフェートを使用する株、例えば、異種ＰＫおよび／またはＰＴＡを株に当てはまることが示される。
【０２８４】
本明細書において引用されている刊行物、特許および特許出願は全て、個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたと同じく参照により本明細書に組み込まれる。前述の発明は、明瞭な理解のために図解および実施例により一部の詳細について記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなくそれらに対してある特定の変化および改変を成すことができることが当業者には容易に明らかになる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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