(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体で十分に拡散される組織試料（９１０）を得る方法であって、
（ａ）前記組織試料を前記液体の体積の中に浸漬するステップと、
（ｂ）前記組織試料を通じての前記液体の拡散を追跡するステップであって、
（ｂ１）前記組織試料が前記液体中に浸漬されるときに、音響信号を送信機（９０２）から前記組織試料を通じて送信し、
（ｂ２）受信機（９０４）によって、前記送信された音響信号が前記組織試料を通過した後に前記送信された音響信号を検出し、
（ｂ３）プロセッサ（２０５）を備えたコンピューティングシステム上で前記音響信号の飛行時間（ＴｏＦ）を計算し、
（ｂ４）前記組織試料が前記液体で十分に拡散されることを示す予め定められた閾値に、前記計算されたＴｏＦが到達するまで（ｂ１）〜（ｂ３）を繰り返す
ことによって追跡するステップと
を含み、
前記ステップ（ｂ１）は、複数（Ｎ個）の異なる周波数をそれぞれ有する音響信号（９２０）のセットを前記送信機から前記受信機へ送信することによって実行され、前記受信機に遭遇する前に前記周波数が物質を通過するように前記送信機及び受信機が配置され、
前記ステップ（ｂ２）は、前記受信機によって受信された前記音響信号のセットごとに実行され、
前記方法は、
前記（Ｎ個の）異なる周波数の各々における前記送信された音響信号（９２０）の位相に対する前記受信機によって受信された各前記音響信号（９２２）の位相シフト（φｅｘｐ）を測定するステップ
をさらに含み、
前記ステップ（ｂ３）における前記ＴＯＦの前記計算は、
前記周波数ごとに及び複数（Ｍ個）の予め定められた候補ＴＯＦ値ごとに、それぞれの候補位相シフト（φｃａｎｄ）を計算し、
特定の周波数について算出された前記候補位相シフトごとに、前記計算された候補位相と前記周波数について測定された前記位相シフト（φｅｘｐ）との間の距離を示す誤差関数を得、
前記誤差関数のエンベロープ関数を生成し、前記誤差関数の曲線にあるとともに前記周波数について測定された前記位相シフトから最小の差を有する位相シフト値を示す前記誤差関数の最小値を特定し、
前記周波数についての結果ＴＯＦ値を算出するために前記示された位相シフト値を使用し、
前記複数（Ｎ個）の周波数ごとに特定されている全ての前記ＴＯＦの平均を計算し、
前記平均ＴＯＦを返す
ことによって実行される、方法。
【請求項２】
前記組織試料は対象から新たに得られた固定されていない組織試料であり、前記液体は固定剤溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固定剤溶液は、架橋結合固定剤溶液である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記架橋結合固定剤は、０℃から１５℃の温度である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも前記ステップ（ａ）及び（ｂ１）〜（ｂ４）を実行しつつ、０℃から１５℃の温度で前記組織試料及び前記液体の前記温度を維持するステップをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記予め定められた閾値に到達すると、前記組織試料及び前記液体の前記温度が周囲温度まで上昇することを可能にするステップと、又は前記組織試料及び前記液体の前記温度を２０℃よりも高い温度まで加熱するステップとをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記誤差関数は干渉写真である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エンベロープ関数は、前記誤差関数のヒルベルト変換を実行することによって生成される、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項９】
液体で十分に拡散される組織試料（９１０）を得る方法であって、
（ａ）前記組織試料を前記液体の体積の中に浸漬するステップと、
（ｂ）前記組織試料を通じての前記液体の拡散を追跡するステップであって、
（ｂ１）前記組織試料が前記液体中に浸漬されるときに、音響信号を送信機（９０２）から前記組織試料を通じて送信し、
（ｂ２）受信機（９０４）によって、前記送信された音響信号が前記組織試料を通過した後に前記送信された音響信号を検出し、
（ｂ３）プロセッサ（２０５）を備えたコンピューティングシステム上で前記音響信号の飛行時間（ＴｏＦ）を計算し、
（ｂ４）前記組織試料が前記液体で十分に拡散されることを示す予め定められた閾値に、前記計算されたＴｏＦが到達するまで（ｂ１）〜（ｂ３）を繰り返す
ことによって追跡するステップと
を含み、
前記ステップ（ｂ１）は、複数（Ｎ個）の異なる周波数をそれぞれ有する音響信号（９２０）のセットを前記送信機から前記受信機へ送信することによって実行され、前記受信機に遭遇する前に前記周波数が物質を通過するように前記送信機及び受信機が配置され、
前記ステップ（ｂ２）は、前記受信機によって受信された前記音響信号のセットごとに実行され、
前記方法は、
前記（Ｎ個の）異なる周波数の各々における前記送信された音響信号（９２０）の位相に対する前記受信機によって受信された各前記音響信号（９２２）の位相シフト（φｅｘｐ）を測定するステップ
をさらに含み、
前記ステップ（ｂ３）における前記ＴＯＦの前記計算は、
前記複数（Ｎ個）の周波数値ごとに、前記それぞれ測定された位相シフト（φｅｘｐ）を示す測定三角波（６６１）を生成し、
前記周波数ごとに及び複数（Ｍ個）の予め定められた候補ＴＯＦ値ごとに、それぞれの候補位相シフト（φｃａｎｄ）を計算し、
前記計算された候補位相シフトごとに、前記複数（Ｍ個）の候補ＴＯＦごとに及び前記複数（Ｎ個）の周波数の特定の１つについて、前記それぞれ計算された候補位相シフトφｃａｎｄを示す候補三角波（６６２）を生成し、
前記測定された候補三角波と最も近く整合する前記候補三角波のうちの１つを特定するために前記候補三角波の１つ又は複数をそれぞれ前記測定三角波と比較し、
最も近い整合する候補三角波を生成するために使用される前記候補位相シフトを計算するために使用された前記候補ＴＯＦを返す
ことによって実行される、方法。
【請求項１０】
前記候補三角波についての複数（Ｒ個）の予め定められた候補オフセットにアクセスするステップと、
前記候補三角波ごとに及び前記複数（Ｒ個）の候補オフセットごとに、前記候補オフセットによって前記候補三角波をシフトすることによりさらなる候補三角波によって前記生成された候補三角波を補足するステップと、
をさらに含み、
前記候補三角波と前記測定三角波の比較は、補足候補三角波のうちの１つ又は複数を前記測定三角波と比較することも含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記三角波の比較を比較する前に、前記測定三角波及び各前記候補三角波の振幅を正規化するステップをさらに含む、請求項９から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記三角波比較は、前記比較される候補三角波と前記測定三角波の各々の間の距離を決定するための誤差関数を用いることを含み、前記測定三角波と最も近く整合する前記候補三角波は、前記誤差関数による距離が最小値である前記１つ又は複数の候補三角波のうちの１つである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記候補三角波及び前記測定三角波の逐一二乗合計差を定量化する関数として前記誤差関数を生成するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
最も近くで整合している候補周波数の波は、前記誤差関数の最小値を有する前記候補三角波のうちの前記１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記比較は、前記候補三角波を算出するために使用された前記候補ＴＯＦに従って分類された前記複数（Ｍ個）の候補三角波に関してのループプロセスとして実施され、前記測定された候補三角波と最も近く整合する前記候補三角波のうちの前記１つが得られるまで、前記ループプロセスは、候補周波数のうちの１つが変えられていると判断すると中止される、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記誤差関数は、前記複数（Ｍ個）の候補ＴＯＦ及び複数（Ｒ個）の候補オフセットの関数として３Ｄグラフにグラフで描かれる、請求項９から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記誤差関数のエンベロープ関数を生成するステップと、
前記誤差関数の最小値を特定するステップであって、前記最小値は前記候補三角波と前記測定三角波の位相シフトの最小の差を示し、前記誤差関数の前記最小値は前記エンベロープ関数から推定することができる特定のＴＯＦに対応する、特定するステップと、
前記特定のＴＯＦを返すステップと
をさらに含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
液体で十分に拡散される組織試料（９１０）を得る方法であって、
（ａ）前記組織試料を前記液体の体積の中に浸漬するステップと、
（ｂ）前記組織試料を通じての前記液体の拡散を追跡するステップであって、
（ｂ１）前記組織試料が前記液体中に浸漬されるときに、音響信号を送信機（９０２）から前記組織試料を通じて送信し、
（ｂ２）受信機（９０４）によって、前記送信された音響信号が前記組織試料を通過した後に前記送信された音響信号を検出し、
（ｂ３）プロセッサ（２０５）を備えたコンピューティングシステム上で前記音響信号の飛行時間（ＴｏＦ）を計算し、
（ｂ４）前記組織試料が前記液体で十分に拡散されることを示す予め定められた閾値に、前記計算されたＴｏＦが到達するまで（ｂ１）〜（ｂ３）を繰り返す
ことによって追跡するステップと
を含み、
前記ステップ（ｂ１）は、複数（Ｎ個）の異なる周波数をそれぞれ有する音響信号（９２０）のセットを前記送信機から前記受信機へ送信することによって実行され、前記受信機に遭遇する前に前記周波数が物質を通過するように前記送信機及び前記受信機が配置され、
前記ステップ（ｂ２）は、前記受信機によって受信された前記音響信号のセットごとに実行され、
前記方法は、
前記（Ｎ個の）異なる周波数の各々における前記送信された音響信号（９２０）の位相に対する前記受信機によって受信された各前記音響信号（９２２）の位相シフト（φｅｘｐ）を測定するステップ
をさらに含み、
前記ステップ（ｂ３）における前記ＴＯＦの前記計算は、
前記複数（Ｎ個）の周波数値ごとに、前記それぞれ測定された位相シフト（φｅｘｐ）を示す測定三角波（６６１）を生成し、
データ点が前記データ点のそれぞれのクラスタを構成する線形セクションにある又はそれに隣接している前記測定三角波における複数の前記線形セクション（８９０、８９２、８９４）を決定し、
前記クラスタについて回帰線を算出するとともに前記回帰線の勾配を決定するために各前記クラスタの前記データ点に関する線形回帰を実行し、低品質クラスタを特定するために前記回帰線の前記勾配及び／又は前記回帰線からの前記クラスタの前記データ点の距離を解析し、低品質クラスタでない全てのクラスタの前記回帰線の前記勾配から平均勾配を選択的に算出し、
前記平均勾配からＴＯＦを算出し、
前記算出されたＴＯＦを返すことによって実行される、方法。
【請求項１９】
前記特定された線形セクションごとに、
「０」の位相シフト値まで最小値距離を有する前記線形セクションによって構成された前記クラスタの前記データ点のうちの１つを前記クラスタのルートデータ点として特定するステップ
をさらに含み、
前記クラスタの前記回帰線は、前記回帰線が前記ルートデータ点を横断するように生成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
個々の線形セクションごとに信頼度を計算するステップと、信頼度が品質閾値未満である線形セクションのクラスタを低品質クラスタとして特定するステップとをさらに含む、請求項１８から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
低品質クラスタの閾値数が特定されるか自動的に判断するステップ、
その場合、超音波周波数掃引を繰り返すために推奨メッセージの出力をトリガするステップ、又はステップ（ａ）及び（ｂ）の前記繰り返しを自動的にトリガするステップ
をさらに含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数の候補ＴＯＦは、１０μｓ〜３０μｓの範囲を含み、１０ｎｓ未満、１ｎｓ未満、５００ｐｓ未満、又は２５０ｐｓ未満の距離だけ互いからそれぞれ分離されている、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｂ３）における前記ＴＯＦ計算は、ナノ秒、より好適にはナノ秒未満の時間分解能を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記送信機及び前記受信機は音響モニタリングシステムの変換器であり、前記音響モニタリングシステムはプロセッサ及びコンピュータ解釈可能命令を備えたコンピュータシステムに動作可能に結合され、前記命令は、前記請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法に従って前記ステップ（ｂ３）を実行するために、前記音響モニタリングシステムによって与えられる測定された位相シフトと、生体試料に適用された前記複数（Ｎ個）の周波数に関する情報とを前記プロセッサに処理させる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記計算されたＴＯＦが予め定められた閾値に到達したことを判断した後に、前記組織試料の温度を能動的又は受動的に上昇させることによって前記組織試料を固定するステップと、
不安定生物指標化合物に結合することができる特定の結合実体を用いて固定された前記組織試料に接触させるステップと、
前記特定の結合実体の結合を検出するステップと
をさらに含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記送信機及び受信機に通信可能に結合された信号解析システムを備えた組織試料の中への液体の拡散をモニタするためのシステムであって、前記信号解析システムは、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の前記ステップ（ｂ３）を実行するとともに前記計算されたＴＯＦが前記予め定められた閾値に到達するときに信号を生成するように構成されたプロセッサを備えるシステム。
【請求項２７】
物質（９１０）を通じて移動する音響信号の飛行時間を正確に計算するためのコンピュータによって実行される方法であって、
送信機（９０２）と受信機（９０４）の間で前記音響信号の周波数掃引を送信するステップであって、前記送信機及び前記受信機は、前記受信機に遭遇する前に周波数が前記物質を通過するように配置される、送信するステップと、
前記受信機を用いて前記音響信号の前記周波数掃引を検出するステップと、
前記音響信号の周波数掃引の誤差関数を得て前記誤差関数のエンベロープを生成することによって、コンピュータシステム上で前記音響信号の飛行時間を計算するステップと
を含み、
前記飛行時間は、前記誤差関数の最小値に基づいている方法。
【請求項２８】
前記誤差関数は、音響モニタリングシステムから得られた複数の音響周波数にわたって前記周波数掃引を実行することによって得られる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記誤差関数は干渉写真である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記エンベロープは、前記誤差関数のヒルベルト変換を実行することによって生成される、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記エンベロープの最小値に基づいて前記飛行時間をグラフに描くステップをさらに含む、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
物質を通じて移動する音響信号の飛行時間を正確に計算するためのコンピュータによって実行される方法であって、
前記音響信号の周波数掃引を生成するステップと、
複数の候補周波数及び複数の候補位相に関して候補三角波を前記周波数掃引と比較するステップと
を含み、
前記飛行時間は、最も近くで整合している候補周波数及び候補位相に基づいて計算される方法。
【請求項３３】
前記候補三角波の振幅は、前記周波数掃引の振幅に基づいて正規化される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記比較するステップは、前記候補三角波と前記周波数掃引の間の誤差を決定するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記誤差に基づいて誤差関数を生成するステップをさらに含み、前記誤差関数は、前記候補三角波及び前記周波数掃引の逐一二乗合計差を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
最も近くで整合している候補周波数及び候補位相は、前記誤差関数の最小値に基づいて見つけられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記誤差関数の前記最小値が得られるまで複数の前記候補周波数が変化させられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記誤差関数の前記最小値が得られるまで複数の前記位相が変化させられる、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記誤差関数は、候補ＴＯＦ及び候補位相の関数として３Ｄグラフにグラフで描かれる、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記飛行時間は、前記誤差関数の前記最小値から計算される、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
物質を通じて移動する音響信号の飛行時間を正確に計算するためのコンピュータによって実行される方法であって、
前記音響信号の超音波周波数掃引の複数の個々の線形セクションを決定するステップと、
平均勾配を決定するように個々の線形セクションごとに線形回帰を実行するステップと
を含み、
前記飛行時間は、前記平均勾配に基づいて計算される方法。
【請求項４２】
各個々の線形セクションは、前記周波数掃引内で複数の潜在的なルート及び単一の真のルートを見つけることによって決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記線形回帰は、前記真のルートを中心として実行される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
個々の線形セクションごとに信頼度を計算するステップをさらに含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
低信頼度を有する個々の線形セクションは、前記飛行時間を決定する前に処分される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
低信頼線形セクションの閾値数は、前記超音波周波数掃引を繰り返すように推奨することをトリガする、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
組織試料を固定する方法であって、
（ａ）架橋結合固定剤溶液で十分に拡散される組織試料を得るステップであって、
（ａ１）対象から前記架橋結合固定剤溶液の体積の中に新たに得られる固定されていない組織試料を浸漬するサブステップ、及び
（ａ２）前記組織試料を通じての前記架橋結合固定剤溶液の拡散を追跡するサブステップであって、
（ａ２ａ）前記組織試料が前記架橋結合固定剤溶液中に浸漬されるときに、音響信号を送信機から前記組織試料を通じて送信し、
（ａ２ｂ）送信された音響信号が前記組織試料を通過した後に前記送信された音響信号を検出し、
（ａ２ｃ）請求項２７から４５のいずれか一項に記載の前記方法を含む命令のセットをプロセッサ上で実行することによって前記プロセッサを備えたコンピューティングシステム上での前記音響信号の飛行時間（ＴｏＦ）を算出し、
（ａ２ｄ）前記組織試料が前記架橋結合固定剤溶液で十分に拡散されることを示す予め定められた閾値に、前記計算されたＴｏＦが到達するまで（ａ２ａ）〜（ａ２ｃ）を繰り返すことによって追跡するサブステップ
による架橋結合固定剤溶液で十分に拡散される組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記組織試料が前記架橋結合固定剤溶液で十分に拡散された後に室温から５０℃の範囲内の温度まで前記組織試料の温度を上昇させるステップと、前記組織試料の固定を可能にするのに十分な期間の間温度の前記範囲内で前記組織試料を保持するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
組織試料中の不安定生物指標化合物を検出する方法であって、
（ａ）固定された組織試料を得るために請求項４７に記載の前記方法に従って前記組織試料を固定するステップと、
（ｂ）前記不安定生物指標化合物に結合することができる特定の結合実体を用いて前記固定された組織試料に接触させるステップと、
（ｃ）前記特定の結合実体の結合を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
前記不安定生物指標化合物は、リン酸化たんぱく質、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
組織試料の中への液体の拡散をモニタするためのシステムであって、
（ａ）前記液体の体積中に前記組織試料を浸漬するための容器と、
（ｂ）前記組織試料が前記容器内の液体の前記体積中に浸漬されるときに、前記組織試料を通じての音響信号の送信を可能にする位置で前記容器内又は前記容器の周りに配置される送信機と、
（ｃ）前記音響信号が前記組織試料を通じて送信された後に、前記送信機から一定の距離において前記容器内又は前記容器の周りに配置されるとともに前記音響信号を受信するように配置された受信機と、
（ｄ）前記送信機及び前記受信機に通信可能に結合されたコンピューティングデバイスであって、
（ｄ１）請求項２７から４５のいずれ一項の方法に従って前記送信機と前記受信機の間の前記音響信号の飛行時間（ＴｏＦ）を計算し、
（ｄ２）前記ＴｏＦが予め決定された閾値に近づくときに信号を生成する
ように構成されたコンピューティングデバイスと
を備えるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]２０１４年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０９３，１７３号の利益がここで主張され、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[002]本開示は、例えば生体試料を含む物質の音響解析に関する。より詳細には、本開示は、物質を通じて移動する音響信号の飛行時間を測定するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[003]物質を通過する音響信号の飛行時間の測定は、いくつかの商業分野において使用されている。いくつかの分野は、飛行時間のとても小さい変化を頼りにする。
[004]音響飛行時間を計算するために使用される現在の方法は、特にサブナノ秒のスケールにおいて、様々な環境的又はシステム的な要因により、場合によって異常に高い又は低い読取値になりやすい。観測されたそのような短いＴＯＦにおける測定誤差は、問題となり得る。例えば、ＵＳ２０１３／０２２４７９１は、組織プロセシング中に固定剤（ｆｉｘａｔｉｖｅ）の拡散をモニタする方法を開示する。標準的なコア生検の場合、測定される全ＴＯＦ（ｔｏｔａｌ  ＴＯＦ）は、１００ナノ秒未満である。そのような状況ではナノ秒スケールの誤差でも受け入れられない。
【０００４】
[005]誤差を最小にする既存の方法は、これらのスプリアス信号の影響を防ぐために、結果をただ単に平らにし、及び／又は滑らかにする。しかしながら、そのような方法は、ＴＯＦ測定に関する異常な読取値の影響を完全には考慮しておらず、したがって依然として受け入れられない誤差が生じやすい。本発明者の知っている限りでは、サブナノ秒のスケールでなされたＴＯＦ測定における誤差を十分に補正する方法は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[006]本開示は、（１）誤差関数の最小値のより正確な決定を可能にする誤差関数についてのエンベロープを計算すること、（２）ＴＯＦがベストフィットから直接計算される場合に、超音波周波数掃引データを複数のシミュレートされたＴＯＦ周波数掃引にフィットすること、及び／又は（３）超音波周波数掃引の個々の線形部分に対して線形回帰分析を実行し、ＴＯＦ計算における誤差を表し得る周波数掃引のアブノーマルセクションの特定を可能にすることといった３つやり方うちの１つにおける、音波の音響飛行時間（ＴＯＦ）について改善された決定をするシステム及びコンピュータによって実行される方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[007]例示的な一実施形態では、本開示は、物質を通じて移動する音響信号の飛行時間を正確に計算するためのコンピュータによって実行される方法であって、音響信号の周波数掃引の誤差関数を取得するステップと、誤差関数のエンベロープを生成するステップとを含み、飛行時間が誤差関数の最小値に基づいている方法を提供する。
【０００７】
[008]例示的な別の実施形態では、本開示は、物質を通じて移動する音響信号の飛行時間を正確に計算するためのコンピュータによって実行される方法であって、音響信号の周波数掃引を生成するステップと、複数の候補周波数（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）及び複数の候補位相（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｐｈａｓｅ）に関して候補三角波（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｒｉａｎｇｌｅ  ｗａｖｅ）を周波数掃引と比較するステップとを含み、飛行時間は最も近くで整合している候補周波数及び候補位相に基づいて計算される、方法を提供する。
【０００８】
[009]例示的なさらに別の実施形態では、本開示は、物質を通じて移動する音響信号の飛行時間を正確に計算するためのコンピュータによって実行される方法であって、音響信号の超音波周波数掃引の複数の個々の線形セクションを決定するステップと、平均勾配を決定するように個々の線形セクションごとに線形回帰を実行するステップとを含み、飛行時間は平均勾配に基づいて計算される、方法を提供する。
【０００９】
[0010]これらの方法の各々は、本明細書中にさらに説明されるように、電子式ＴＯＦ取得システムにおいて実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】[0011]本明細書中に開示された本開示の例示的な各実施形態によって補正される誤差を示すグラフである。
【図１Ｂ】本明細書中に開示された本開示の例示的な各実施形態によって補正される誤差を示すグラフである。
【図１Ｃ】本明細書中に開示された本開示の例示的な各実施形態によって補正される誤差を示すグラフである。
【図２】[0012]本開示の１つの例示的な実施形態による音響飛行時間（ＴＯＦ）を正確に計算するためのシステムを示す図である。
【図３】[0013]本開示の１つの例示的な実施形態によるエンベロープ検出を用いて音響ＴＯＦを正確に計算するための方法を示す流れ図である。
【図４Ａ】[0014]本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図４Ｂ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図４Ｃ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図４Ｄ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図５】[0015]本開示の１つの例示的な実施形態によるモデル化された周波数掃引相関性を用いて音響ＴＯＦを正確に計算するための方法を示す流れ図である。
【図６Ａ】[0016]本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図６Ｂ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図６Ｃ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図６Ｄ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図７】[0017]本開示の１つの例示的な実施形態によるクラスタ化された複数の線形回帰（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を用いて音響ＴＯＦを正確に計算するための方法を示す流れ図である。
【図８Ａ】[0018]本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図８Ｂ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図８Ｃ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図８Ｄ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図８Ｅ】本開示の１つの例示的な実施形態による誤差関数とエンベロープ検出法を用いて計算されたＴＯＦとを示すグラフである。
【図９Ａ】[0019]位相シフトによってＴＯＦを測定するための送信機と受信機のペアを備えたシステムであって、変換器ペアと試料の相対位置は、温度の変動によって引き起こされるＴＯＦのばらつきを補償するために使用することができる基準ＴＯＦ値を生成するように修正することができるシステムを示す図である。
【図９Ｂ】位相シフトによってＴＯＦを測定するための送信機と受信機のペアを備えたシステムであって、変換器ペアと試料の相対位置は、温度の変動によって引き起こされるＴＯＦのばらつきを補償するために使用することができる基準ＴＯＦ値を生成するように修正することができるシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0020]ＴＯＦ：飛行時間
[0021]１．技術的実装（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
[0022]図９ａは、本発明の実施形態による超音波信号の飛行時間をモニタするためのシステムを示す。超音波ベースの飛行時間（ＴＯＦ）モニタリングシステムは、超音波信号の位相シフトに基づいて飛行時間の測定を実行するための一対又は複数対の変換器（例えば、ＴＡ００４０１０４−１０、ＣＮＩＲＨｕｒｒｉｃａｎｅ  Ｔｅｃｈ）を備えることができる。図９ａに示される実施形態では、システムは、超音波（「ＵＳ」）送信機９０２と超音波受信機９０４とからなる少なくとも１対の変換器を備え、超音波（「ＵＳ」）送信機９０２及び超音波受信機９０４は、送信機から受信機までのビーム経路９１４内に配置される組織試料９１０が２つの変換器９０２、９０４の共通焦点の近くに位置するように、互いに対して空間的に配列される。組織試料９１０は、例えば、固定液で満たされている試料容器９１２（例えば、ＣｅｌｌＰａｔｈの「セルセーフ（ＣｅｌｌＳａｆｅ）５」のような標準的な組織カセット、又はＣｅｌｌＰａｔｈの「セルセーフ・バイオプシー・カプセル（ＣｅｌｌＳａｆｅ  Ｂｉｏｐｓｙ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ）」のようなバイオプシーカプセル）内に収容することができる。位相シフトベースのＴＯＦ測定は、バイオプシーカプセル９１２が固定液で満たされる前に、そのときに、その後に実行することができる。送信機として働く一方の変換器は、組織を横断する音響パルスを送出し、受信機として働く他方の変換器によって検出される。送信機受信機変換器ペアを構成する２つの変換器の間の総距離は「Ｌ」と呼ばれる。超音波信号が送信機９０２と受信機９０４の間の距離を横断するのに必要とする合計時間は、信号の飛行時間と呼ぶことができる。送信機９０２は、例えば、４ＭＨｚに集中され、３．７〜４．３ＭＨｚの周波数掃引範囲をサポートすることができる。
【００１２】
[0023]各実施形態によれば、距離Ｌは、ここでは少なくとも概算で知られていると仮定される。例えば、変換器の距離は、（例えば、光学的測定技法、超音波ベースの測定技法、又は他の測定技法によって）正確に測定することができ、又は音響モニタリングシステムの製造業者によって開示することができる。
【００１３】
[0024]送信変換器９０２は、定められた時間間隔、例えば数百マイクロ秒の間に、定められた周波数について正弦波（又は「正弦波信号」）を送信するように波形発生器（例えば、Ａｎａｌｏｇ  ＤｅｖｉｃｅｓからのＡＤ５９３０）を用いてプログラム可能である。この信号は、流体及び／又は組織を横断した後に受信変換器９０４によって検出される。受信された超音波信号９２２及び発せられた（「送信された」とも呼ばれる）正弦波信号９２０は、デジタル位相比較器（例えば、ＡＤ８３０２、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて電子的に比較される。
【００１４】
[0025]本明細書中に使用される「受信された」「信号」（又は波）は、変換器、例えば信号を受信する受信機９０４によって特定され提供される特性（位相、振幅、及び／又は周波数など）を有する信号である。したがって、信号特性は、信号が試料又は任意の他の種類の物質を通った後に特定される。
【００１５】
[0026]本明細書中に使用される「送信された」又は「発せられた」「信号」（又は波）は、変換器、例えば信号を発する送信機９０２によって特性される特性（位相、振幅、及び／又は周波数など）を有する信号である。したがって、信号特性は、信号が試料又は任意の他の種類の物質を通ってしまう前に特定される。
【００１６】
[0027]例えば、送信された信号は、送信変換器によって特定される信号特性によって特徴付けすることができ、受信された信号は、受信変換器によって測定された信号特性よって特徴付けすることができ、そしてそれによって送信変換器及び受信変換器は、音響モニタリングシステムの位相比較器に動作可能に結合される。
【００１７】
[0028]位相比較の出力は、発せられた信号と受信された信号の間の位相シフトφｅｘｐを示す電圧信号に例えば統合型アナログ／デジタル変換器を用いて出力が変換される前に、安定することが可能とされる。
【００１８】
[0029]各実施形態によれば、発せられた信号９２０と受信された信号９２２との間の位相シフトφｅｘｐを決定するこのプロセスは、周波数範囲にわたって入力正弦波と出力正弦波の間の位相関係を構築するために、（例えば、「周波数掃引」とも呼ばれる）周波数範囲にわたって複数の音響周波で繰り返される。例えば、変換器９０２、９０４の帯域幅全体又は帯域幅の一部が、周波数範囲として使用され得る。本発明の各実施形態について本明細書中に説明されるように、例えば、複数の予め定められた周波数は、スキャンされる１００１個の異なる周波数値を含むことができる。複数の周波数ごとに受信した位相シフトφｅｘｐは、典型的には１秒未満でとられる測定段階中に測定される。そして、後処理段階中に、得られた位相シフトは、サブナノ秒の精度で通過時間（ｔｒａｎｓｉｔ  ｔｉｍｅ）を示すことができる組織試料９１０を横断するビーム経路９１４についてのＴＯＦ値を算出するために使用される。
【００１９】
[0030]図９ｂは、例えば試料を含む容器の温度の変動によって引き起こされるＴＯＦ測定誤差を補償することがさらに可能であり得る超音波信号の飛行時間を監視するためのシステムの１つの実施形態を示す。本実施形態では、１つ又は複数の変換器ペア９０２、９０４及び試料容器９１２は、互いに対して移動することができる。好適には（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）、このシステムは、固定液をもっぱら含み組織を含まない容器の領域９１４をＵＳビームが横断するように容器９１２の位置を移し変えることができる容器ホルダを備える。
時間Ａにおいて、組織が任意の固定液によってまだ囲まれていないとき、又はまだ固定液が試料の中にまだ拡散させられていないとき、図９ａに説明されるように、多数の周波数が、それぞれの多数の位相シフトφｅｘｐを測定するために横断することができる。次いで、測定データは、時間Ａについて及びビーム経路９１４によって横断される試料の特定のセクションについての最終的なＴＯＦ値を算出するために使用される。したがって、時間Ａにおいて取得されたＴＯＦは、試料の物理的特性を示す。時間Ａ１、Ａ２、Ａ３、・・・、のさらなる瞬間において、組織試料は、固定液中にすでに沈められており、この固定液は、少なくとも一部試料の中にすでに拡散させられている。図９ａに関して説明されるように、多数の周波数が、それぞれの多数の位相シフトφｅｘｐを測定するために、時間Ａ１、Ａ２、Ａ３、・・・のさらなる瞬間ごとに横断することができる。次いで、測定データは、時間Ａ１、Ａ２、Ａ３ごとにそれぞれの最終的なＴＯＦ値を算出するために使用される。したがって、時間Ａ１、Ａ２、Ａ３において取得されたＴＯＦは、試料の中への流体の拡散の程度についての試料及び固定流体の物理的特性を示す。
【００２０】
[0031]時間Ａの前もしくは時間Ａの後であり得る、又はさらなる時間Ａ１、Ａ２、Ａ３のいずれかであり得る時間Ｂにおいて、試料ボックス９１２は、移動後のビーム経路９１６がもっぱら固定液を含み組織試料を含まない試料ボックス９１２のセクションを横断するように、変換器ペア９０２、９０４に対して移動させられる。図９ａに説明されるように、しかしビーム経路９１４ではなく９１６について、多数の周波数は、それぞれの多数の位相シフトφｅｘｐを測定するために横断することができる。次いで、測定データは、時間Ｂについての最終的なＴＯＦ値を算出するために使用され、これは、基準値（ＴＯＦＲＥＦ）として使用される。基準ＴＯＦ値は、試料容器９１２内の温度の変動のような様々な環境的影響について補正されている「デルタＴＯＦ」を得るために、時間Ａ、Ａ１、Ａ２、・・・、又はＡ３について得られるＴＯＦ値から差し引かれ得る。したがって、「デルタＴＯＦ」の算出は、環境的な変動を補償することを可能にすることができ、それによってＴＯＦ測定の精度をさらに向上させる。流体中の音の速さは、検出されたＴＯＦをかなり変え得る熱的な変動に影響を受けやすい。
【００２１】
[0032]約６ｍｍの生体試料９１０によってもたされる時間Ａ及び時間Ｂについて得られるＴＯＦの「デルタＴＯＦ」は、例えば、５〜５０ｎｓの範囲内にあり得る。
[0033]好ましい実施形態によれば、時間Ａ及び時間Ｂは、５分未満だけ、好適には１分未満だけ、より好適には３０秒未満だけ時間的に分離される。
【００２２】
[0034]典型的には、ＴＯＦは、直接記録されず、代わりに送受信した音響波の位相を算出することによって評価される。実際には、経験的周波数掃引が、送信機によって媒体を介して送信され、受信機によって検出される。（送信機のエレクトロニクスによってプログラムされており、送信機の外側の任意の対象をそれらが横断してしまう前の）送信された波と受信された波の位相は、比較され、時間位相シフトへ変換される。次いで、シミュレーションは、様々な候補ＴＯＦ（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ＴＯＦ）で候補時間位相シフト（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐｈａｓｅ  ｓｈｉｆｔ）をモデル化するように実行され、候補時間位相シフトと経験的時間位相シフトとの間の誤差が、誤差関数として生成されグラフ化される。誤差関数の最小値をもたらすＴＯＦは、「観測された」ＴＯＦとして選択される。
【００２３】
[0035]例えば、固定剤溶液中に浸漬された組織試料のサブナノ秒ＴＯＦ値をロバストに検出することができる後処理アルゴリズムが開発されている。プログラム可能な波形発生器でプログラムされた送信変換器は、６００μｓの間に３．７ＭＨｚの正弦波信号を送信する。このパルス列は、流体及び組織を横断した後に受信変換器によって検出され、次いで、送受信されたＵＳ正弦曲線は、デジタル位相比較器を用いて電子的に比較される。位相比較器の出力はアナログ／デジタル変換器を用いて照会され、平均が記録される。このプロセスは、多数の音響周波数（ν）で繰り返される。変換器が中心周波数（４．０ＭＨｚ）及び比帯域幅（≒６０％）であるとすると、典型的な掃引範囲は３．７〜４．３ＭＨｚであり、６００Ｈｚごとに位相比較器が照会される。
【００２４】
[0036]例えば、周波数掃引０．６ＭＨｚ＝６０００００Ｈｚ及び周波数ステップ幅例えば６００Ｈｚの周波数範囲であるとすると、スキャンを受ける１００１個の離散的な周波数があることになる。以下において、周波数掃引を横断するときにスキャンされる周波数の個数は、「Ｎ」と呼ばれる。スキャンした周波数ごとに、各送信機は、少なくとも、発せられた信号がそれぞれの周波数で安定してしまうまで、かつ受信機が特定の周波数について受信された信号の位相を記録することができるまで超音波信号を受信機へ送信することができる。これは、Ｎ個の周波数ごとに、送信された信号（例えば、図９ａの９２０参照）と受信された信号（例えば、図９ａの９２２参照）の間のそれぞれの位相シフト（又は「時間位相シフト」）が得られることを確実にする。位相情報は、後処理段階においてＮ個の周波数ごとに時間位相シフトφｅｘｐを算出するために使用することができる。
【００２５】
[0037]典型的には、新しい周波数及びそれぞれの位相測定における送信機の安定化は、とても迅速に実行することができる。したがって、１００１個の異なる超音波信号周波数についての周波数スキャン全体は、約１秒以内に実行することができる。本明細書中に使用される「スキャンした周波数」又は「候補周波数」は、スキャンされる周波数掃引の複数のＮ個の周波数のうちの１つである。
【００２６】
[0038]各実施形態によれば、位相シフト測定によるＴＯＦの決定は、以下の式に基づくことができ、すなわち、送信機受信機変換器ペアを構成する２つの変換器の間の総距離Ｌは、波長λの端数ｎと組み合わせて所与の候補周波数の超音波信号の完全な波長λの総数ＣとしてＬ＝（Ｃ＋ｎ）λのように記述することができ、ただし、Ｃは、送信機と受信機の間の完全な波長の個数であり、ｎは、Ｃ個の波長に加えると変換器の間の総距離Ｌをもたらす送信機と受信機の間の波長の端数である（例えば、図９ａ参照）。距離Ｌは、速度に時間を乗じたものに等しく、したがってＴＯＦは、
【００２７】
【数１】
0006618540.tif 000002
【００２８】
のように計算することができ、ただし、ｃＳは、送信機と受信機の間のビーム経路内の組織試料及びバルク流体（例えば、組織学的な流体及び／又は送信機と試料容器の間の結合用流体）を横断する間の超音波の速度である（実際には、上記式は、いくつかの実施形態におけるビームが変換器の間で組織試料だけでなくバルク流体も横切るときに発見的に使用することができ、しかしここでは、（例えば、図９ｂに説明された）基準ＴＯＦを試料及びいくらかの流体の体積を通るビーム経路について測定されたＴＯＦ値から差し引くことによって影響は後で相殺することができるので、バルク流体の影響は無視することができる）。
【００２９】
[0039]さらなる計算ステップでは、表現ｃＳ／λは、以下の式、すなわち
【００３０】
【数２】
0006618540.tif 000003
【００３１】
を得るために信号の周波数νによって置き換えられ、これはφ＝２μ（ＴＯＦ（ν）−Ｃ）に従って位相について解かれる。超音波周波数に関して式を微分することによって、以下の関係、すなわち、
【００３２】
【数３】
0006618540.tif 000004
【００３３】
が得られる。したがって、時間あたりの超音波信号の位相変化が時間あたりのそのそれぞれの周波数変化によって除算されたものは、絶対ＴＯＦに正比例する。
[0040]各実施形態によれば、周波数掃引中にスキャンされる周波数νごとに及び複数の候補ＴＯＦごとに所与の信号周波数における位相とＴＯＦの間の知られている関係が使用され、それによって現在の候補周波数及び現在の候補ＴＯＦに依存する「時間位相シフト」とも呼ばれるそれぞれの位相シフトφｅｘｐを予測した。例えば、時間位相シフトは、Ｎ個のスキャンした周波数のうちの特定の１つで測定される位相のシフトである。したがって、Ｎ個のスキャンした周波数値ごとに、１つのそれぞれ経験的に測定された「位相シフト」φｅｘｐが測定される。
【００３４】
[0041]各実施形態によれば、位相比較器からの電圧は、時間位相シフトに変換され、経験的に決定された位相（φｅｘｐ）又は「経験的に決定された位相シフト」と呼ばれる。図９ａに説明されるように、位相シフトは、所与の周波数の信号についての送信された信号と受信された信号の間の位相のシフトである。
【００３５】
[0042]次に、力づくのシミュレーションを使用して、観測された位相周波数掃引が異なる候補ＴＯＦ値のように見えるものを計算する。入力正弦波周波数の関数としての候補時間位相値は、式Ｉ
【００３６】
【数４】
0006618540.tif 000005
【００３７】
に従って計算される。
[0043]ここで、ＴＯＦｃａｎｄはナノ秒単位の候補ＴＯＦ値であり、Ｔはナノ秒単位の入力正弦波の周期であり、ｒｎｄは最も近い整数関数のラウンド（ｒｏｕｎｄ）を表し、｜．．．｜は絶対値の記号である。所与の候補ＴＯＦ及び周波数値（すなわち周期）について、右側の項は、最も近いサイクル数が生じるのにどのくらい長くかかるのかを表す。この値は、ＴＯＦｃａｎｄから差し引かれて次の完全なサイクルに入る又はそこまでの時間位相を計算する。したがって、位相値は、２００ｐｓ間隔で１０〜３０μｓの範囲に最初にある複数の候補ＴＯＦ値について算出される。
【００３８】
[0044]したがって、各実施形態によれば、候補ＴＯＦのセットは、値の間に２００ｐｓ間隔が空いている１０μｓから３０μｓまでの範囲にあり得る。本実施形態では、候補ＴＯＦの個数Ｍは、１００．０００個の候補ＴＯＦを含むことができる。それによって、Ｍは、例えば、文献又は他の情報の源から得られた予め定められた候補ＴＯＦの個数を示す数値である。
【００３９】
[0045]例えば、Ｎ個の候補周波数とＭ個の候補ＴＯＦについては、Ｎ×Ｎ個の「モデル化された」、「予想された」、「シミュレートされた」又は「予測された」位相φｃａｎｄが算出される。Ｆ＝１００１及びＭ＝２５．０００、２５．０２５．０００について、「予測された」又は「候補」位相φｃａｎｄが算出される。
【００４０】
[0046]各実施形態によれば、候補ＴＯＦのセットは、後続の候補ＴＯＦが互いから離れること１０ｎｓ未満、より好適には１ｎｓ未満、より好適には５００ｐｓ未満、及びより好適には２５０ｐｓ未満で間隔をおいて配置されるように選ばれる。例えば、候補ＴＯＦの個数Ｍは、１０．０００よりも大きく、より好適には２０．０００よりも大きく、より好適には５０．０００よりも大きく、より好適には１００．０００よりも大きいものであり得る。候補ＴＯＦの個数がより大きくなりかつ後続の候補ＴＯＦが互いにより近くなるにつれて、「真のＴＯＦ」を特定する方法の分解能がより高くなる。
各実施形態によれば、候補ＴＯＦの範囲は、送信機と受信機の間の距離Ｌの関数である。例えば、距離Ｌ＝音速＊時間、したがって関連した流体及び／又は組織内の音速は、例えば、１〜２ｍｍ／μｓである。そして、候補ＴＯＦの範囲は、以下の式：
【００４１】
【数５】
0006618540.tif 000006
【００４２】
を満足させる候補ＴＯＦのセットとして定義することができる。範囲は、他のＬＳ及び／又は他のタイプの流体について異なり得、特に、複数の異なる流体及び／又は組織のタイプをカバーするようにより広くなり得る。個々の候補ＴＯＦの間の距離は、上述したように選ぶことができる。
【００４３】
[0047]経験的位相シフトφｅｘｐと周波数掃引中にスキャンされた複数Ｎ個の周波数の各々の候補位相シフトφｃａｎｄのいずれか１つとの間の誤差は、式ＩＩ、すなわち、
【００４４】
【数６】
0006618540.tif 000007
【００４５】
によって個々の候補ＴＯＦ値について最小二乗のやり方で計算される。
[0048]ただし、Ｎは、掃引中の周波数の総数である。候補ＴＯＦの関数としての正規化された誤差関数は、光学的干渉写真（すなわち、干渉計において生成された干渉パターンの記録）に似ている。例えば、各特徴は、１つの音響周期（Ｔ＝１／４ＭＨｚ＝２５０ｎｓ）の幅を有する。最大差関数は、候補位相周波数掃引が等しい波長を有するが、経験的位相周波数掃引に関して位相の外にあることを示す。逆に、誤差が最小化されるとき、２つは完全に調和させられ、したがって再構築されたＴＯＦは、式ＩＩＩ、すなわち、
【００４６】
【数７】
0006618540.tif 000008
【００４７】
に従って誤差関数の全体最小値（大域的最小点、ｇｌｏｂａｌ  ｍｉｎｉｍｕｍ）として記録される。
[0049]したがって、単一の「真のＴＯＦ」ＴＯＦｒｅｃｏｎは、式ＩＩは全周波数にわたって誤差を合計するので、周波数掃引の全周波数の位相シフトデータから特定することができる。誤差関数を最小にする候補位相及び候補ＴＯＦは、「ＴＯＦｒｅｃｏｎ」として特定及び使用される。「真のＴＯＦ」は、本発明の各実施形態に従って決定されるとともに実際の（「リアルな」）通過時間をとても正確に反映する距離Ｌを横断する通過時間とみなすことができる。
【００４８】
[0050]音響波をデジタル比較するこの技法は、センタートラフの鮮明さによって高い精度になり、非常によく整合された候補位相周波数掃引及び経験的位相周波数掃引になる。
[0051]残念なことに、送信中の試料の移動、環境的な変動、エレクトロニクスの異常などのいくつかの要因は、周波数掃引の読取値を損なう可能性がある。これは、記録されたＴＯＦにおいて「ジャンプ」として現れる可能性があり、その原因は、局所的最小の間でジャンプする誤差関数の最小、又は元の音響周波数掃引の位相出力内の位相の不連続及び不規則まで遡り得る。図１Ａは、そのような方法によって生成された変化に富むＴＯＦ信号を示す。誤差を含むＴＯＦ値１０１は、図１Ａ中に特定される。図１Ｂは、ＴＯＦ信号を取得するのに使用される位相比較器の出力中の誤差を示す。それ自体に折り返される位相の誤差１０２及び不連続１０３が特定される。図１Ｃは、３つの異なる時点にわたって（ＴＯＦ値に基づいて）隣接した局所的最小の間でジャンプする誤差関数を示す。
【００４９】
[0052]本開示は、誤差関数についてのエンベロープの生成の１つ又は複数を引き起こし、非線形曲線を超音波周波数掃引にフィットし、又は超音波周波数掃引の個々の線形部分に対してクラスタ区分的線形回帰（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｐｉｅｃｅ−ｗｉｓｅ  ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を実行することによってより高い精度でかつより繰り返し可能なやり方で試料物質を通る音波の音響飛行時間（ＴＯＦ）を決定するシステム及びコンピュータによって実行される方法を提示することによって上記特定された課題を解決する。
ＩＩ．システム及び方法
[0053]１つの実施形態では、ＴＯＦを計算するシステムが提供され、システムは、プロセッサとこのプロセッサに結合されたメモリとを含む信号解析器を備え、このメモリは、プロセッサによって実行されたときに、以下さらに詳細にそれぞれ説明される
（１）ＴＯＦ計算のエンベロープ法、
（２）ＴＯＦ計算の曲線適合法、及び
（３）ＴＯＦ計算の線形回帰法
のうちの１つ又は複数を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶する。
【００５０】
[0054]信号解析器に入力されるデータは、音響モニタリングシステムによって生成される音響データセットであり、音響データセットは、音響信号が関心の物質に遭遇するように音響信号を送信し、次いで音響信号が関心の物質に遭遇した後に音響信号を検出することによって生成される。したがって、さらなる実施形態では、本明細書中に開示されたような信号解析器と以下にさらに詳細に述べられる音響モニタリングシステムとを備えたシステムが提供される。それに加えて、又は代替として、本明細書中に開示されたような信号解析器と、本明細書中に開示されたような音響モニタリングシステムから得られる音響データセットを含む非一時的なコンピュータ可読媒体とを備えたシステムが提供されてもよい。１つの実施形態では、音響モニタリングシステムによって送受信される音響データは、周波数掃引によって生成される。本明細書中に使用されるとき、用語「周波数掃引」は、最初のセットの音響波が第１の一定の持続期間の間に一定の周波数で媒体を通じて発せられ、後続のセットの音響波が後続の（好ましくは等しい）持続期間の間に一定の周波数間隔で発せされるように、媒体を通じて一定の周波数の間隔で送信される一連の音響波を指すものとする。
【００５１】
[0055]いくつかの実施形態では、システムは、多孔性物質の中への流体の拡散をモニタするようになされている。そのような実施形態では、（ａ）本明細書中に述べられたような信号解析器、（ｂ）本明細書中に述べられたような音響モニタリングシステム及び／又は音響モニタリングシステムによって生成される音響データセットを含む非一時的なコンピュータ可読媒体、並びに（ｃ）流体の体積中に浸漬された多孔性物質を保持するための機器を備えるシステムが提供され得る。１つの実施形態では、システムは、組織試料の中への固定剤の拡散をモニタするためのものである。
【００５２】
[0056]図２は、本開示の１つの例示的な実施形態による音響飛行時間（ＴＯＦ）を正確に計算するための例示的なシステム２００を示す。システム２００は、コンピュータ２０１に結合されたプロセッサ２０５によって実行される複数の処理モジュール又は論理命令を記憶するためのメモリ２１０に通信可能に結合される音響モニタリングシステム２０２を備える。音響モニタリングシステム２０２は、１つ又は複数の送信機と、１つ又は複数の受信機とを備えることができる。メモリ２１０内の処理モジュールは、音響モニタリングシステム２０２から信号を受信し処理するための音響データ取得モジュール２１１と、音響データ取得モジュール２１１から取得した音響データの誤差関数を生成するための誤差関数計算モジュール２１２と、エンベロープ検出、モデル周波数掃引相関性、又はクラスタ化された複数の線形回帰のうちの１つ又は複数を用いて誤差補正を実行するための後処理モジュール２１３と（これらはそれぞれ本明細書中にさらに詳細に説明される）、ディスプレイ上に結果を提示し、指令を実行し、又はその他に物理的結果、定量的結果、又はグラフィカルな結果をユーザ操作コンピュータ又は試料処理機器に出力するための出力モジュール２０１とを備えた、プロセッサ２０５が動作を実行することを可能にするための非一時的な論理的コンピュータ可読命令を含むことができる。図２には示されていないが、出力モジュール２０１は、より大きいコンピューティングシステムの一部であってもよく、キーボード、マウス、スタイラス、及びディスプレイ／タッチスクリーンなどのさらなるユーザ入出力デバイスを備える。
Ａ．音響モニタリングシステム
[0057]１つの実施形態では、音響データセットを収集するための音響モニタリングシステムが提供され、音響モニタリングシステムは送信機及び受信機を備えており、送信機及び受信機は、送信機によって生成される音響信号が受信機によって受信されコンピュータ可読信号に変換されるように配置される。１つの実施形態では、システムは、超音波送信機及び超音波受信機を備える。本明細書中に使用されるとき、「送信機」は、電気信号を音響エネルギーに変換することができるデバイスであり、「超音波送信機」は、電気信号を超音波音響エネルギーに変換することができるデバイスである。本明細書中に使用されるとき、「受信機」は、音響波を電気信号に変換することができるデバイスであり、「超音波受信機」は、超音波音響エネルギーを電気信号」に変換することができるデバイスである。
【００５３】
[0058]電気信号から音響エネルギーを生成するのに役立つある種の物質は、音響エネルギーから電気信号を生成するのにも役立つ。したがって、送信機及び受信機は、必ずしも別個の構成部品とする必要はないが、送信機及び受信機は、別個の構成部品とすることができる。送信機及び受信機は、送信された波が関心の物質に遭遇した後に受信機が送信機によって生成された音響波を検出するように配置される。いくつかの実施形態では、受信機は、関心の物質によって反射された音響波を検出するように配置される。他の実施形態では、受信機は、関心の物質を通じて送信された音響波を検出するように配置される。
【００５４】
[0059]１つの実施形態では、送信機は、変換器に動作可能にリンクされた少なくとも波形発生器を備え、波形発生器は、変換器と通信する電気信号を生成するためのものであり、変換器は、電気信号を音響信号に変換するためのものである。いくつかの実施形態では、波形発生器はプログラム可能であり、例えば、開始周波数及び／又は終了周波数、周波数掃引の周波数の間のステップサイズ、周波数ステップの個数、及び／又は各周波数を送信する持続期間を含む周波数掃引のいくつかのパラメータを修正することができるようになっている。他の実施形態では、波形発生器は、１つ又は複数の予め決定された周波数掃引パターンを生成するように事前プログラムされる。他の実施形態では、波形発生器は、事前プログラムされた周波数掃引とカスタマイズされた周波数掃引の両方を送信するようになされ得る。送信機は、集束要素を含むこともでき、この集束要素は、変換器によって生成される音響エネルギーが特定のエリアへ予測可能に集束及び方向付けされることを可能にする。
【００５５】
[0060]動作時、送信機は媒体を通じて周波数掃引を送信し、次いでこの周波数掃引は受信機によって検出され、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体に記憶される及び／又は解析のために信号解析器へ送信される音響データセットに変換される。音響データセットが送信された音響波と受信された音響波の間の位相差を表すデータを含む場合、音響モニタリングシステムは位相比較器を含むこともでき、この位相比較器は、送信された音響波と受信された音響波の間の位相差に対応する電気信号を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、音響モニタリングシステムは、送信機及び受信機に通信可能にリンクされた位相比較器を備える。位相比較器の出力がアナログ信号である場合、音響モニタリングシステムは、位相比較器のアナログ出力をデジタル信号へ変換するアナログ／デジタル変換器を備えることもできる。次いで、デジタル信号は、例えば、非一時的なコンピュータ可読媒体に記憶することができ、又は解析のために信号解析器へ直接通信することができる。
Ｂ．信号解析器
[0061]１つの実施形態では、ＴＯＦを計算するシステムが提供され。システムは、プロセッサとこのプロセッサに結合されたメモリとを含む信号解析器を備え、このメモリは、プロセッサによって実行されたときに、以下さらに詳細にそれぞれ述べられる
（１）ＴＯＦ計算のエンベロープ法、
（２）ＴＯＦ計算の曲線適合法、及び
（３）ＴＯＦ計算の線形回帰法
のうちの１つ又は複数を含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶する。
【００５６】
[0062]用語「プロセッサ」は、例として、プログラム可能なマイクロプロセッサ、コンピュータ、システムオンチップ、又は複数のもの、あるいは前述のものの組み合わせを含むデータを処理する全ての種類の機器、デバイス、及び機械を包含する。機器は、専用論路回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）を備えることができる。機器は、ハードウェアに加えて、問題のコンピュータプログラムのための実行環境を生成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームルーチン環境、仮想マシン、又はそれらのうちの１つ又は複数の組み合わせを構成するコードを含むこともできる。機器及び実行環境は、ウェブサービスインフラストラクチャ、分散コンピューティングインフラストラクチャ、グリッドコンピューティングインフラストラクチャなどの様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャを実現することができる。
【００５７】
[0063]（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプト、又はコードとしても知られる）コンピュータプログラムは、コンパイルされた又は解釈された言語、宣言型言語又は手続き型言語を含む任意の形態のプログラミング言語で記述することができ、それは、スタンドアローンプログラムとして、又はモジュール、コンポーネント、サブルーチン、オブジェクト、又はコンピューティング環境における使用に適した他のユニットとしてなどの任意の形態で展開することができる。コンピュータプログラムは、必要ではないが、ファイルシステム中のファイルに対応することができる。プログラムは、他のプログラム又はデータ（例えば、マークアップ言語ドキュメントに記憶される１つ又は複数のスクリプト）を保持するファイルの一部に、問題のプログラムに専用の単一ファイルに、又は複数の座標ファイル（例えば、１つ又は複数のモジュール、サブプログラム、又はコード部分を記憶するファイル）に記憶することができる。コンピュータプログラムは、１つのコンピュータ上、又は１つにサイトに位置するもしくは複数のサイトにわたって分散し通信ネットワークによって相互接続された複数のコンピュータ上で実行されるように展開することができる。
【００５８】
[0064]本明細書中に記載されたプロセス及び論理の流れは、入力データを演算し出力を生成することによってアクションを実行するように１つ又は複数のコンピュータプログラムを実行する１つ又は複数のプログラム可能なプロセッサによって実行することができる。プロセス及び論理の流れは、専用論路回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって実行することもでき、機器は、専用論路回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）として実装することもできる。
【００５９】
[0065]コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサは、例として、汎用マイクロプロセッサと専用マイクロプロセッサの両方、及び任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つ又は複数のプロセッサを含む。一般に、プロセッサは、読出し専用メモリもしくはランダムアクセスメモリ又は両方から命令及びデータを受信する。コンピュータの必須の要素は、命令に従ってアクションを実行するプロセッサ、並びに命令及びデータを記憶する１つ又は複数のメモリデバイスである。一般に、コンピュータは、例えば磁気ディスク、光磁気ディスク、又は光ディスクなどのデータを記憶するための１つ又は複数の大容量記憶デバイスも備え、あるいはそれらからデータを受信しもしくはそれらにデータを送信し又は両方を行うように動作可能に結合される。しかしながら、コンピュータは、そのようなデバイスを有することを必要としない。また、コンピュータは、別のデバイス、例えば、いくつか例を挙げると、携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯オーディオ又は動画プレイヤ、ゲーム機、全地球測位システム（ＧＰＳ）受信機、又はポータブル記憶デバイス（例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）フラッシュドライブ）に組み込むことができる。コンピュータプログラム命令及びデータを記憶するのに適したデバイスは、全ての形態の不揮発性メモリ、媒体、及びメモリデバイスを含み、例として半導体メモリデバイス、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリデバイス、磁気ディスク、例えば、内蔵ハードディスク又はリムーバブルディスク、光磁気ディスク、並びにＣＤ−ＲＯＭディスク及びＤＶＤ−ＲＯＭディスクが含まれる。プロセッサ及びメモリは、専用論路回路に補足されてもよく、又は専用論路回路に組み込まれてもよい。
【００６０】
[0066]ユーザとのやり取りを行うために、本明細書中に記載された本主題の各実施形態は、表示デバイス、例えば、ユーザに情報を表示するためのＬＣＤ（液晶ディスプレイ）、ＬＥＤ（発光ダイオード）ディスプレイ、又はＯＬＥＤ（有機発光ダイオード）ディスプレイ、並びにキーボード、及びポインティングデバイス、例えば、マウス又はトラックボール（これによってユーザはコンピュータに入力を行うことができる）を有するコンピュータ上で実施することができる。いくつかの実施では、タッチスクリーンが、情報を表示するとともにユーザから入力を受け取るために使用され得る。他の種類のデバイスが、同様にユーザとのやり取りを行うために使用されてもよく、例えば、ユーザに送られるフィードバックは、感覚フィードバック、例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、又は触覚フィードバックの任意の形態とすることができ、ユーザからの入力は、音響入力、音声入力、又は触覚入力を含む任意の形態で受け取ることができる。加えて、コンピュータは、ユーザによって使用されるデバイスへドキュメントを送信し、ユーザによって使用されるデバイスからドキュメントを受信することによって、例えば、ウェブブラウザから受信した要求に応じてウェブページをユーザのクライアントデバイス上のウェブブラウザへ送信することによって、ユーザとやり取りすることができる。
【００６１】
[0067]本明細書中に記載された本主題の各実施形態は、例えばデータサーバとしてバックエンドコンポーネントを含む、又はミドルウェアコンポーネント、例えばアプリケーションサーバを含む、又はフロントエンドコンポーネント、例えば、ユーザが本明細書中に記載された本主題の実施とのやり取りすることができるグラフィカルユーザインターフェースもしくはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータを含む、あるいは１つ又は複数のそうしたバックエンドコンポーネント、ミドルウェアコンポーネント、又はフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含むコンピューティングシステムにおいて実施することができる。システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信、例えば、通信ネットワークに関する任意の形態又は媒体によって相互接続することができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）及び広帯域ネットワーク（「ＷＡＮ」）、相互接続ネットワーク（例えば、インターネット）、並びにピアツーピアネットワーク（例えば、アドホックピアツーピアネットワーク）が含まれる。
【００６２】
[0068]コンピューティングシステムは、任意の個数のクライアント及びサーバを含むことができる。一般に、クライアント及びサーバは、互いから遠く離れており、典型的には通信ネットワークを介して総合接続する。クライアントとサーバの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行するとともに互いにクライアントサーバ関係を有するコンピュータプログラムによって生じる。いくつかの実施形態では、サーバは、（例えば、クライアントデバイスへデータを表示するために、及びクライアントデバイスとやり取りするユーザからのユーザ入力を受信するために）データ（例えば、ＨＴＭＬページ）をクライアントデバイスへ送信する。クライアントデバイスで生成されたデータ（例えば、ユーザのやり取りの結果）は、サーバでクライアントデバイスから受信することができる。
【００６３】
[0069]動作時、信号解析器は、試験物質から記録された音響データセットを入力として受け入れる。音響データセットは、周波数掃引が関心の物質に遭遇した後に検出される周波数掃引の少なくも一部を表す。いくつかの実施形態では、検出される周波数掃引の一部は、関心の物質によって反射される音響波を構成する。他の実施形態では、検出される周波数掃引の一部は、関心の物質を通過した音響波を構成する。信号プロセッサに入力される音響データセットの構成は、ＴＯＦを計算するやり方次第であり、その各々は以下に述べられる。
Ｂ１，ＴＯＦ計算のエンベロープ法
[0070]ＴＯＦ計算のエンベロープ法では、ＴＯＦは、計算された誤差関数の最小値のエンベロープに基づいている。エンベロープを計算するために、誤差関数が、まず生成されなければならない。一般に、誤差関数の生成は、（１）記録された絵周波数掃引から生成される時間位相シフトと、（２）複数の候補ＴＯＦに基づいてシミュレートされた複数の候補時間位相シフトとの間の比較を必要とする。これは、周波数掃引の周波数ごとに繰り返される。観測された時間位相シフトと各候補時間位相シフトとの間の誤差は、誤差関数として計算されグラフに描かれる。次いで、エンベロープ関数が、誤差関数に適用される。エンベロープ関数の最小値は、観測されたＴＯＦとして選択される。
【００６４】
[0071]例えば、Ｎ個の時間位相シフトφｅｘｐは、Ｎ個の別個の周波数を含む周波数掃引について決定され、それによって各時間位相シフトは、送信機がそれぞれの信号周波数で安定化されると測定される。時間位相シフトは、それが送信された信号と受信された信号の位相の差として例えば後処理段階において算出されるときに経験的に決定される。したがって、スキャンした周波数値ごとに、それぞれ測定された位相シフトφｅｘｐが１つ得られる。加えて、後処理段階は、Ｎ個の周波数ごとに、Ｍ個の候補位相シフトφｃａｎｄを算出することを含み、それによって複数のＭ個の予め定められた候補ＴＯＦ値の１つを入力としてそれぞれ用いる。Ｍ個の候補ＴＯＦが文献から、予備試験から、又は任意の他の情報源から得られていてもよい。したがって、Ｎ個の周波数の各々は、１個の測定された時間位相シフトφｅｘｐ及びＭ個の候補位相シフト（φｃａｎｄ）に対応する。
【００６５】
[0072]観測された時間位相シフトは、本質的に、一定の時点における送信された音響波及び受信された音響波の位相の比較である。一実施形態では、観測された時間位相シフトは、正弦波超音波信号を同時に送信するとともに検出し、送信された正弦波超音波信号と検出された正弦波超音波信号の位相を比較し、位相の差と相関する信号を生成することによって生成される。これは、送信された音響波と受信された音響波の間の位相差と相関する電気信号を生成する位相比較器によって行うことができる。
【００６６】
[0073]候補時間位相シフトは、所与の候補ＴＯＦについて予期される時間位相シフトの数学的モデルである。一実施形態では、複数の候補時間位相シフト値は、時間位相シフトが周波数掃引の各周波数で複数の候補ＴＯＦについてモデル化される力づくのシミュレーションを用いて計算される。１つの実施形態では、候補時間位相値は、入力正弦波周波数の関数として計算される。１つの例示的な実施形態では、候補時間位相シフト値は、式ＩＩＩ、すなわち、
【００６７】
【数８】
0006618540.tif 000009
【００６８】
に従って計算され、ただし、ＴＯＦｃａｎｄはナノ秒単位の候補ＴＯＦ値であり、Ｔはナノ秒単位の入力正弦波の周期であり、ｒｎｄは最も近い整数関数のラウンドを表し、｜．．．｜は絶対値の記号である。
【００６９】
[0074]候補時間位相シフトが生成されると、誤差関数は、観測された時間位相シフト及び候補時間位相シフトに適用されて、誤差を計算する。本明細書中に使用されるとき、「誤差関数」は、試験データセットとシミュレートデータセットとの間の数学的比較を指す。誤差関数の出力は、試験データセット（例えば、特定の周波数についての経験的に決定された時間位相シフトφｅｘｐ）及びシミュレートデータセット（例えば、周波数についてのＭ個の候補位相シフト）がどのくらい整合しているのかについての数学的表現である。誤差関数の出力がゼロに近づくと、試験データセットとシミュレートデータセットの間の整合は増加する。数多くの誤差関数が知られている。例示的な非限定の一実施形態では、誤差関数は、最小二乗のやり方で計算される。例示的な非限定の別の実施形態では、誤差は、式ＩＩ、すなわち、
【００７０】
【数９】
0006618540.tif 000010
【００７１】
によって個々の候補ＴＯＦ値について最小二乗のやり方で計算され、ただし、Ｎは、掃引における周波数の総数である。
[0075]次いで、誤差関数のエンベロープが計算され、エンベロープの最小値に相関する候補ＴＯＦが観測されたＴＯＦとして選択される。本明細書中に使用されるとき、「誤差関数のエンベロープ」は、誤差関数の極値の外径を描く滑らかな曲線を指す。実際には、誤差関数のエンベロープは、曲線によって誤差関数の全てのピークをつなげることを含む。曲線は、「エンベロープ」、「誤差エンベロープ」、又は「誤差エンベロープ曲線」とも呼ばれ得る。エンベロープを計算する多くの関数が知られており、例えば、ヒルベルト変換、及び二乗、及びローパスフィルタリングが含まれる。
【００７２】
[0076]例えば、「エンベロープ曲線」は、「エンベロープ関数」によって特定することができる。エンベロープ曲線は、関数又は分布の極値誤差値が滑らかにされるように誤差関数の極値の外形を描くことができる。明細書中に使用されるとき、曲線を滑らかにすることは、雑音又は他の微細スケール構造／急速な現象を除外しつつ元の曲線における重要なパターンを取り込もうとする近似関数として関数を生成する数学的概念である。
【００７３】
[0077]リンギングアーティファクト（ｒｉｎｇｉｎｇ  ａｒｔｉｆａｃｔ）（例えば、信号中の鋭い遷移の近くのスプリアス信号）が現れるいくつかの実施形態では、ダウンサンプリングステップを含むことが有用となり得る。
【００７４】
[0078]図３は、本開示の１つの例示的な実施形態によるエンベロープ検出を用いて音響ＴＯＦを正確に計算するための例示的な方法を示す。誤差関数（Ｓ３３０）は、１章に実質的に上述されたように周波数掃引を実行することによって得られる。このようにして計算された例示的な誤差関数が、図４Ａ、左側、曲線４４１に示される。この誤差関数は、図１Ｃに示された誤差関数と同様であり得、これは局所的最小の変動を受けたものであり、信頼できないＴＯＦ値になっている。図３に戻って参照すると、誤差関数を処理することができ、誤差関数のヒルベルト変換によって誤差関数の変調に係るエンベロープが得られ（Ｓ３３１）、その後に関数のリンギングを取り除くためにダウンサンプリングが続く。例示的なエンベロープが、図４Ａ、右側、曲線４４１に示される。
【００７５】
[0079]図３に戻って参照すると、エンベロープの最小値が得られる（Ｓ３３２）。図４Ｂは、誤差関数の最小とエンベロープの最小の間の差を示す。誤差関数４４１は、図１Ｃに示された同じ３つの点にやはり対応するが、エンベロープ４４２を含む。この最小値は、局所的最小値の間でジャンプしにくいよりロバストな値を与える。例えば、元のエンベロープ４４１の最小値は、５７１７８．６ｎｓ、５６９６０．９ｎｓ、及び５７１７８．４ｎｓの間の３回の期間にわたって変動し、数百ナノ秒の差という結果になる。これは、エンベロープ４４２の最小値と対照をなし得、これは３回にわたって安定したままであり、すなわち、５７０６３．５ｎｓ、５７０６２．２ｎｓ、及び５７０６３．０ｎｓの間で変動するだけである。図４Ｃは、誤差関数エンベロープ４４２の最小値と元の誤差関数４４１の隣接した局所的最小の拡大図を示す。
【００７６】
[0080]ＴＯＦ計算は、エンベロープ最小を用いてグラフに描かれる（Ｓ３３３）。誤差関数エンベロープのこの安定した最小値によって、スプリアス信号をもたらさないより正確なＴＯＦ計算になる（例えば、図４Ｄ参照）。
【００７７】
[0081]例えば、図４Ｃに示されるように、誤差関数は、所与の候補ＴＯＦ及び特定の周波数について周波数について測定された位相シフトφｅｘｐから算出された候補位相シフトφｃａｎｄの偏差の関数であり得る。誤差関数は、図４Ａ〜図４Ｃに示されるようにグラフに描かれ、誤差エンベロープ曲線は、誤差関数の上にグラフで描かれている。限られたセットの候補ＴＯＦが入力として使用されるので、図４Ｃに示されるように、誤差曲線エンベロープの最小値は、元の誤差関数４４１のそれぞれの誤差データ点に対応しないエンベロープ４４２中の位置にあることが起こり得る。それにもかかわらず、非常に正確な「真の」ＴＯＦ値は、推定された候補位相シフトφｃａｎｄと測定された位相シフトφｅｘｐの間の差が最小値であるエンベロープで推定された候補ＴＯＦ値（図４Ｃ中、例えば、５．７８×１０４ｎｓ）を特定することによって特定されることができる。
【００７８】
[0082]図４Ｄは、１３００個のデータ点について決定されたように、元の誤差関数を用いて計算されたＴＯＦ４４４及びエンベロープに基づいたＴＯＦ４４５を示す。明らかに、ＴＯＦ４４５は、元のエンベロープに単に基づいたＴＯＦ４４４に対して、エンベロープアルゴリズムを用いてかなり安定している。飛行時間の精度の向上は、組織タイプが変わり、単一のＴＯＦの結果は定量化が一般に困難であるときに、異なる特徴を有する異なる組織についてより信頼できる結果をもたらす。また、本実施形態は、水だけを用いた経験的結果に基づいており、安定化がどの程度改善されたかを示す。これらの方法は、任意の他のシステムに適用されてもよく、又は既存のシステムを較正するために適用されてもよい。
Ｂ２．ＴＯＦ計算の曲線適合法
[0083]ＴＯＦを計算する「曲線適合法」は、周波数掃引を通じて累積された位相の比較の線形性を利用する。２つの超音波変換器の間のＴＯＦは、周波数掃引について得られた位相周波数曲線の勾配によって計算することができる。しかしながら、完全なサイクルが累積されるとき、位相は０に戻り、したがって位相対超音波周波数は三角波のように見える。このアルゴリズムは、所与の振幅、周波数、及び位相を有する候補三角波を生成する。候補三角波の振幅、周波数、及び位相は、周波数掃引から経験的に見つけられた三角形に対して変化させられ、比較される。次いで、候補の波と経験的な波の間の最も近い整合を使用して、三角波の周波数とその勾配の絶対値の間の知られた関係を用いて観測されたＴＯＦを直接計算する。次いで、勾配を使用してＴＯＦを計算する。
【００７９】
[0084]図５は、本開示の１つの例示的な実施形態によるモデル化された周波数掃引相関性を用いて音響ＴＯＦを正確に計算するための方法を示す。本実施形態では、この方法は、音響分光法によって決定された周波数掃引を通じて累積された位相比較の線形性を利用する。この方法は、２つの超音波変換器の間で測定された周波数掃引についての「測定された」、「経験的な」、又は「モデル化された」三角波を生成するステップ（Ｓ５５０）と、周波数掃引の経験的三角波を候補三角波と比較するステップ（Ｓ５５１）と、整合が見つかるまで三角波の周波数及び位相を連続的にループさせるステップ（ループＳ５５１〜Ｓ５５５）とを含む。例示的な周波数掃引、経験的三角波、及び候補三角波は、図６Ａに示されている。概して、ＴＯＦは、周波数掃引の勾配によって計算することができる。しかしながら、完全なサイクルが累積されるとき、位相は０に戻り、したがって位相対超音波周波数は、図６Ａの上半分（要素６６１）によって示されるように、三角波のように見える。したがって、元の又は経験的周波数掃引６６１の上に重ねられた候補波６６２を示す図６Ａの下半分によって示されるように、説明した方法は、所与の振幅、周波数、及び位相を有する「候補」三角波６６２をもたらす。
【００８０】
[0085]各実施形態によれば、各三角波は、ｘ軸上の周波数とｙ軸上にグラフで描かれた周波数掃引の周波数ごとに得られる位相シフトとを用いてグラフが描かれている。したがって、波の勾配は、位相シフト対音響周波数の変化を示すことができる。
【００８１】
[0086]候補三角波６６２は、振幅、位相オフセット、及び周波数を有する。振幅は、経験的波６６１の振幅に整合又は正規化され、全ての位相オフセット及び候補ＴＯＦは、どの位相及び周波数が経験的信号６６１と最も良く整合するのか数的に決定するまでずっとループされる。図５に戻って参照すると、比較ステップ（Ｓ５５１）は、候補三角波と経験的三角波の間の誤差の決定を可能にする。比較ステップ（Ｓ５５１）は、経験的三角波及び候補三角波の逐一二乗合計差（ｐｏｉｎｔ−ｂｙ−ｐｏｉｎｔ  ｓｑｕａｒｅｄ  ｓｕｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）を含む誤差関数を生成することを含むことができる。比較ループは、候補波の周波数を経験的三角波と比較するステップ（Ｓ５５２）と、整合が見つかるまで候補ＴＯＦを変化させるステップ（Ｓ５５３）とを含む。いくつかの実施形態では、複数の候補ＴＯＦは、整合が見つかるまで変化させることができる（Ｓ５５３）。他の実施形態では、全ての候補三角波は、経験的三角波（Ｓ５５１）と比較することができ、結果として得られた誤差関数を使用して真のＴＯＦを決定する（Ｓ５５７）。さらに、整合を決定する（Ｓ５５４）ために、複数の候補位相も変化させられる（Ｓ５５５）。候補周波数の場合のように、位相は、整合が見つかるまで変化させることができ、又は複数の位相は、モデル化された三角波（Ｓ５５０）を経験的データと比較するために使用することができ、誤差関数が、結果に基づいて生成される。
【００８２】
[0087]例えば、図６Ｂは、シミュレートされた又はモデル化された三角波の誤差関数対候補位相と候補ＴＯＦの三次元グラフを示す。全体最小値における周波数は、ＴＯＦを計算するために使用される。３Ｄ誤差関数は、次元が減じられ、理想的な候補位相における候補ＴＯＦ（６６３）の関数としての二次元誤差関数及び理想的な候補ＴＯＦにおける候補位相（６６４）の関数としての二次元誤差関数を示す図６Ｃに示されるようにグラフに描かれ得る。
【００８３】
[0088]図５に戻って参照すると、誤差は、誤差関数に基づいて特定することができる（Ｓ５５６）。例えば、位相周波数掃引が人工的オフセット又は位相シフトを有する場合、ステップＳ５５６は、これらのオフセットを潜在的な誤差源として特定する。次いで、候補と経験的波の間の最も近い整合を使用して、三角波の周波数とその勾配の絶対値との間の知られている関係を用いて真のＴＯＦ（Ｓ５５７）を直接計算する。言い換えれば、ベストフィッティングの勾配を使用してＴＯＦを計算する。
【００８４】
[0089]各実施形態によれば、周波数掃引の複数のＮ個の周波数について、前もって説明されたように、Ｎ個の位相シフトφｅｘｐのそれぞれのセットが経験的に決定される。
[0090]次に、周波数掃引全体について、「測定三角波」又は「測定された三角曲線」と呼ばれる以下にある三角曲線が生成される。測定三角波は、周波数掃引のＮ個の周波数をｘ軸上にグラフで描くとともに位相比較器によって出力された位相シフト信号をｙ軸上にグラフで描くことによって生成され、それによって位相シフト信号は、ｘ軸のゼロ位相シフト値基準（例えば、一例として、図６ａの上のグラフ参照）を中心とする。グラフに描かれたデータ点は、三角形の形態を有する曲線によって結ばれる。本明細書中に使用される「三角波」又は「三角曲線」は、それを三角形形状と名付けた非正弦波の形態である。それは、周期的区分線形連続実関数である。
【００８５】
[0091]次いで、信号解析器のプロセッサは、Ｍ個の予め定められた候補ＴＯＦに関して（又はＭ個の候補ＴＯＦの全体性が解析される前に整合が見つからなかった場合）ループに入ることができる。Ｍ個の候補ＴＯＦに関するループの各ステップにおいて、候補位相は、以下の式に従って、周波数掃引の各Ｎ個の周波数ごとに及びループステップにおいて選択された特定の１つの候補ＴＯＦについて算出される。
【００８６】
[0092]
【００８７】
【数１０】
0006618540.tif 000011
【００８８】
[0093]したがって、Ｎ個の周波数値ごとに、それぞれの候補位相は、現在選択されている候補ＴＯＦについて算出された。候補位相値は、測定三角波に類似する「候補三角曲線」又は「候補三角波」を生成するために一連のＮ個の周波数にわたってグラフが描かれる。現在の候補ＴＯＦについての各ループにおいて、それぞれの候補三角波は、周波数掃引のＮ個の周波数をｘ軸上にグラフで描くとともにＮ個の異なる周波数について算出された候補位相シフト信号をｙ軸上にグラフで描くこともよって生成され、それによって候補位相シフト信号は、ｘ軸のゼロ位相シフト値基準をやはり中心とする。候補三角波は、すでに測定された三角曲線（例えば、図６ａの下のグラフを参照）を含むグラフ中に重ね書きとしてグラフ化することができ、又は別々にグラフが描かれてもよい。候補位相シフトのグラフに描かれたデータ点は、現在の候補ＴＯＦの「候補三角波」を生成するために線によって結ばれる。候補三角波は、測定三角波と並べられ、それと比較される。誤差関数は、測定されたえ三角波と候補三角波の間の差を算出するために使用される（例えば、２つの比較された三角波の並べられた線形セクションによって定められた面積、又は同じベースに並べられた２つの三角波についての任意の他の類似測度である（振幅は「０」に等しい）。誤差測度が減少する限り、ループは継続され、それによって新しいループステップごとに、候補ＴＯＦの新しい１つがループの現在の候補ＴＯＦとして選択され、新しいそれぞれの候補三角波が算出される。この方法は、測定三角波と現在の候補三角波の間の「誤差」又は「距離」がゼロに等しい場合、又は誤差がいくつかのループ反復の間に減少した後に再び上昇を始めた場合、終了することができる。
【００８９】
[0094]他の各実施形態では、候補三角波は、Ｍ個の候補ＴＯＦごとに算出され、候補三角波（及びその対応する候補ＴＯＦ）が測定三角波と同一であること又は測定三角波との最小の差を有することは、後続の処理ステップにおいて特定される。
【００９０】
[0095]したがって、Ｎ個の異なる周波数を含む周波数掃引について及びＭ個の予め定められた候補ＴＯＦについて、単一の測定三角波及びＭ個までの候補三角波が生成され、グラフに描かれ、測定三角波に最も類似する（に対して最小誤差を有する）Ｍ個（までの）候補三角波のうちの１つの候補三角波の候補ＴＯＦを特定するのに使用される。特定された候補ＴＯＦは、本発明の実施形態により高精度で特定される「真の」ＴＯＦとして使用することができる。
【００９１】
[0096]各実施形態によれば、測定三角波の振幅とともに各候補三角波の振幅は、予め定められた最大振幅値、例えば「１」に正規化される。単一の基準値に関しての測定された三角波及び候補三角波の振幅の正規化は、候補三角波を用いて測定されたものとの後の比較を容易にすることができる。
【００９２】
[0097]測定三角波及びＭ個の候補三角波を生成しグラフに描いた後及び適宜の正規化ステップの後、候補三角波ごとに、候補三角波と測定三角波の間の差（「誤差」）が計算される。
【００９３】
[0098]各実施形態によれば、「真のＴＯＦの特定」は、「候補オフセット（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｏｆｆｓｅｔ）」とも呼ばれる「人工的オフセット」を、候補三角波を計算するために使用される計算モデルに加えることによってさらに洗練することができる。例えば、信号解析器のプロセッサは、候補三角波についてＲ個の予め定められた候補オフセットに関してループに入ることができる。例えば、３６０個の異なる候補オフセットが存在でき、各候補オフセットは、
【００９４】
【数１１】
0006618540.tif 000012
【００９５】
の位相シフトに対応する。Ｒ個の人工的オフセットに関してのループの各ステップにおいて、候補位相が、周波数掃引のＮ個の各周波数について、候補ＴＯＦループステップにおいて選択された現在の候補ＴＯＦについて、及び以下の式に従った現在の人工的オフセットについて算出される。
【００９６】
[0099]（φｃａｎｄ（ＴＯＦｃａｎｄ，ν，ＯＦｃａｎｄ）＝ＴＯＦｃａｎｄ，ν）＋ＯＦｃａｎｄ
[00100]したがって、Ｎ個の周波数値ごとに、それぞれの候補位相は、現在選択されている候補ＴＯＦ及び現在選択されている候補人工的オフセットについて算出された。前述の段落においてすでに説明されたように、候補位相値は、「候補三角波」を生成するために一連のＮ個の周波数に関してグラフに描かれる。現在の候補人工的オフセットについての各ループにおいて、それぞれの候補三角波は、周波数掃引のＮ個の周波数をｘ軸上にグラフで描くとともにＮ個の異なる周波数について算出された候補位相シフト信号をｙ軸上にグラフで描くことによって生成され、それによって候補位相シフト信号は、ｘ軸のゼロ位相シフト値基準をやはり中心とする。候補三角波は、すでに測定された三角曲線（例えば、図６ａの下のグラフを参照）を含むグラフ中に重ね書きとしてグラフ化することができ、又は別々にグラフが描かれてもよい。
【００９７】
[00101]したがって、Ｍ個の候補ＴＯＦ及びＲ個の候補人工的オフセットについて、測定三角波と同一である又は測定三角波に最も類似する候補三角波の１つを特定するために、１つの測定三角波と比較されるＭ×Ｏの候補三角波を生成することができる。特定は、候補ＴＯＦループについてすでに説明されたようにループにおいて実行されてもよく、又はＭ×Ｒの候補三角形のグラフの全体性が算出された後に実行されてもよい。候補ＴＯＦのループに関しては、測定三角波に最も類似する候補三角波の特定は、（候補ＴＯＦ及び候補人工的オフセットに応じて）どの候補位相が測定された三角波又は経験的三角波（例えば、波６６１）に最も良く整合するか数的に決定することを含むことができる。特定された（「最も類似する」）候補三角波を算出するために使用される候補ＴＯＦ及び候補人工的オフセットは、「リアルな」又は「真の」ＴＯＦとして特定される。
【００９８】
[00102]例えば、Ｍ個の候補ＴＯＦが２５．０００個であり、Ｒ個の候補人工的オフセットが３６０個である場合、２５．０００×３６０＝９００．０００個の候補三角波が存在することができ、これらが測定三角波と比較される。
【００９９】
[00103]三角波の比較及び三角波についての誤差の算出は、個々の測定点ではなく三角波を比較することで、高い精度の誤差算出が実現されるという利点を有し得る。また、誤差を算出するためにより大量のデータが処理されるので、送受信変換器ペアによってサポートされるＮ個の周波数の部分セットについてのみ周波数スキャニング及び曲線算出又は測定を実行することが可能であり得る。送信された信号の特性を決定するときに生じ得る（「リアルな」位相オフセットをシミュレートする人工的オフセットを考慮に入れることで、ＴＯＦ決定の精度をさらに向上させ得るが、これは、「リアルな」実験的位相シフト決定を実行するときに不要な位相オフセットをもたらし得る任意の誤差を含む影響が、候補三角波を算出するときに人工的オフセットも考慮に入れることによって補償されるためである。
【０１００】
[00104]測定三角波と各候補三角波の比較は、測定三角波及び候補三角波の逐一二乗合計差を含む誤差関数を生成することを含むことができる。例えば、図６Ｂは、それぞれの候補（すなわち、シミュレートされた又はモデル化された）三角波の誤差関数対候補位相と候補ＴＯＦの三次元グラフを示す。全体最小値における周波数は、「最良整合の候補三角波（ｂｅｓｔ  ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔｒｉａｎｇｌｅ  ｗａｖｅ）」並びにそのそれぞれの候補ＴＯＦ及び候補人工的オフセットを特定するために使用される。３Ｄ誤差関数は、次元が減じられ、（理想的な人工的位相オフセットを含む）理想的な候補位相における候補ＴＯＦ（６６３）の関数としての二次元誤差関数及び理想的な候補ＴＯＦにおける（それぞれの候補人工的オフセットに応じた）候補位相（６６４）の関数としての二次元誤差関数を示す図６Ｃに示されるようにグラフに描かれ得る。
【０１０１】
[00105]図６Ｄは、１０００個のＴＯＦデータ点についてモデル化された周波数掃引アルゴリズムを用いて計算されたＴＯＦを示す。信号は、大きい不連続が取り除かれたのでとても安定しており、小さい標準偏差（σ≒０．５ｎｓ）をさらに示す。この方法は、１時間以上にわたってデータを取得した後に２ｎｓだけ変化したとっても安定したＴＯＦ信号をもたらした。
【０１０２】
[00106]各実施形態によれば、Ｂ１に記載されたエンベロープ法は、Ｂ２に開示された手法と組み合わせることができる。例えば、候補三角波及び測定三角波の距離は、距離関数又は「誤差関数」によってモデル化することができる。比較される候補及び測定三角波の個々のペアごとに誤差を算出することに代えて、誤差関数は、測定された三角関数に対する距離（又は「誤差」）の全体最小値に対応するＴＯＦ値及び／又は人工的オフセット値を記述することができる。特定の全体最小値におけるＴＯＦ値及びオフセット値は、候補ＴＯＦ及び候補オフセットの予め定められたセットに含まれても含まれなくてもよい。しかしながら、エンベロープ関数の全体最小値は、「推定された」候補ＴＯＦ及び／又は「推定された」位相シフトを推定するために使用することができ、その対応する推定された候補三角波は、候補ＴＯＦ及び候補オフセット値を最良整合する組み合わせよりもいっそう測定三角波に整合する。各実施形態では、エンベロープ関数から推定することができる特定のＴＯＦに対応する誤差関数の最小値は、候補ＴＯＦのうちの１つに代わって「真の」ＴＯＦとして使用される。
Ｂ３．ＴＯＦを計算する線形回帰法
[00107]図７は、本開示の１つの例示的な実施形態によるクラスタ化された複数の線形回帰を用いた音響ＴＯＦを正確に計算するための方法を示す。この方法は、超音波周波数掃引の個々の線形セクションを探し出し、各領域への線形回帰を実行し、各領域の勾配を平均して真のＴＯＦを決定することによってよりロバストなやり方でＴＯＦ信号を計算する。これは、周波数掃引の理想的な位相が理想的な周波数を見つけるために決定され、その周波数の勾配が再構築されＴＯＦに等しくさせられる前の実施形態と対照をなし得、これに対して本実施形態では、位相周波数掃引の勾配は、直接算出される。
【０１０３】
[00108]この方法は、周波数掃引における線形クラスタを決定する動作から開始する。本明細書中に説明されるように、周波数掃引は、三角波として現れることができる。したがって、任意の線形クラスタは、三角波の線の中心を表す潜在的なルート（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｏｔ）又はデータ点を見つけることによって決定することができる。周波数掃引データは、ｙ＝０などの点でｙ軸を中心とすることができる。例えば、図８Ａは、特定された線形クラスタごとに潜在的なルート８８２及び真のルート（ｔｒｕｅ  ｒｏｏｔ）８８１と共に超音波周波数掃引を示す。潜在的なルートは離散群の中へクラスタにされ得、真のルートはクラスタの中心を表す。図７に戻って参照すると、線形回帰は、各真のルートを中心にして実行される（Ｓ７７１）。図８Ｂは、線形クラスタ８８３ごとに計算されるとともに、それぞれのクラスタの真のルート８８１を中心とする線形回帰と共に超音波周波数掃引を示す。図７に戻って参照すると、各線形回帰の絶対値が得られ（Ｓ７７２）、絶対値のデータ点は平均と比較されて（Ｓ７７３）、誤差を決定し（Ｓ７７４）、真のＴＯＦを得る（Ｓ７７５）。例えば、図８Ｃは、左のグラフ８８４に各クラスタ８８３からの勾配を示すとともに、クラスタごとに回帰係数すなわちＲ２値８８５を示す。勾配グラフ８８４の低い標準偏差は好結果の周波数掃引を示し、大きいＲ２値は勾配値ごとの信頼度を示し、したがって好結果の周波数掃引も示す。
【０１０４】
[00109]上述したように、誤差は、測定された周波数掃引の中で特定することができる。例えば、個々の線形セクションについての低い信号対騒音値（悪いデータ点）は、ＴＯＦ計算の完全性を改善するためにデータを投げ捨てることができるように特定可能である。さらに、おそらくは周波数掃引中の流体内の物理的攪乱又は位相比較器の出力中の電子的な誤差から、大きい不連続が周波数掃引データの中で観測されている。例えば、組織試料は移動してしまう可能性があり、又は信号は測定に悪影響を与える誤差を有する。位相サイクルごとに個々の勾配を見つける例示的な方法は、誤差を含むとともにしたがって誤差をＴＯＦ計算に導入する離散的な周波数掃引値を見つけて排除又は報告することができるので有利である。例えば、図８Ｄは、４ＭＨｚの近くに大きい不連続を有する周波数掃引８８６を示す。図８Ｄでは、各直線領域からの掃引勾配８８７は、勾配の大きい（１０％）変化を示し、個々の勾配値の中の不連続を正確に特定する。各直線領域におけるＲ２値８８８は、このジャンプをさらに示す。本実施形態では、ＴＯＦ計算は、数多くの範囲外の値により不可能にさせられており、したがって出力は、再び掃引を実行するように推奨することを含み得る。図８Ｅは、下がる勾配の１つにいくつかの誤差を含む点を有する周波数掃引を上半分に示すとともに、矢印８８９によって示されるようなそれらの乏しい相関性によってはっきりと特定される誤差を含む点を有するＲ２値を掃引クラスタごとに下半分に示す。図８Ｄとは対照的に、ここで範囲外の値は、データの大部分が誤差を含んだ図８Ｄの実施形態に対して、真のＴＯＦ測定の前に処分することができる。
【０１０５】
[00110]したがって、この方法は、これらの状況を特定するために使用することができ、したがってデータを妥当でないと特定し、ＴＯＦ計算から除去することができる。例えば、線形を現さない任意の勾配は、処分することができる。さらに、大きい不連続の後に周波数掃引の再取得を推奨することによって品質保証がもたらされる。
【０１０６】
[00111]各実施形態によれば、ｂ３の手法は、（手法ｂ２のように）経験的な決定によって開始し、（例えば、３．７から４．３ＭＨｚの範囲にある）周波数掃引の複数のＮ個の周波数については、Ｎ個の位相シフトφｅｘｐの各セットが、経験的に決定される。
【０１０７】
[00112]次に、周波数掃引全体について、「測定三角波」又は「測定三角波」と以下呼ばれている三角波が生成される。測定三角波は、周波数掃引のＮ個の周波数をある（例えば、ｘ）軸上にグラフで描くとともに、位相比較器によって与えられる位相シフト信号φｅｘｐを別の（例えば、ｙ）軸上にグラフで描くことによって生成される。各実施形態によれば、位相シフト信号は、（例えば基準として働くｘ軸によって表される−例えば、図８ａの「位相＝０」参照）ゼロ位相シフト値を中心とする。例えば、センタリングは、検査された周波数範囲全体にわたって最小値の平均及び最大測定位相を特定することによって実行することができる。代替として、曲線をセンタリングするために、全てのデータ点の全ての位相値の平均が特定され、「ゼロ」基準として使用されてもよい。グラフに描かれたデータ点は、三角形の形態を有する曲線によって結ばれる。
【０１０８】
[00113]次に、測定三角波における複数の直線領域が特定され、それによって直線領域に属する曲線の全てのデータ点が、同じ直線領域に属するデータ点のクラスタ（すなわち、セット）とみなされる。測定三角波の「直線領域」は、一定の（又はほぼ一定の）勾配を有する曲線セクションである。例えば、図８Ａは、２０個の（完全な）直線領域を示し、そのうちの３個は、それぞれの直線８９０、８９２、８９４によって特定される。線８９０、８９２、８９４から空間的に近く（例えば、距離閾値内）にある又は空間的に近接している全てのデータ点は、直線によって特定される直線領域に対応するデータ点クラスタの構成要素として特定される。したがって、各クラスタは、測定三角波の位相サイクルのそれぞれの半分の個々の勾配に対応する。
【０１０９】
[00114]次に、候補ルート（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｒｏｏｔ）のセットは、クラスタごとに特定され、それによって候補ルートは、（絶対値として測定された）「０」位相シフト値までの距離が最大位相シフト差閾値よりも小さいデータ値である。図８Ａでは、全ての候補ルートは、四角の境界によって囲まれている。
【０１１０】
[00115]次に、クラスタごとに、「０」位相シフト値への最小値距離を有する候補ルートの１つが特定される。特定された候補ルートは、データ点のクラスタの「真のルート」として使用される。各クラスタの「真のルート」データ点は、星記号を用いて図８Ａに示される。いくつかの実施形態によれば、各クラスタの「真のルート」は、「０」位相シフト値への最小値距離を有するクラスタのデータ点の１つを特定することによって、直接、すなわち候補ルートを決定することなく特定される。
【０１１１】
[00116]次に、クラスタごとに、線形回帰ステップが、算出勾配
【０１１２】
【数１２】
0006618540.tif 000013
【０１１３】
を算出するためにクラスタのデータ点に関して選択的に実行される。データ点は測定値であるので、クラスタベースの線形回帰によって得られる算出勾配は、わずかに変化する可能性があり、測定誤差が生じる場合には、他のクラスタの算出勾配からかなり逸脱する場合がある。そして、クラスタごとに、クラスタの特定された真のルートを通過し算出勾配を有する線形回帰線をグラフに描くことができる。
【０１１４】
[00117]１つ又は複数のさらなるステップでは、低品質クラスタが特定される。低品質クラスタは、データ点又はデータ点から得られる何らかの他の特徴が少なくとも１つの品質基準を満たさないクラスタである。例えば、信号対雑音比が予め定められた最小信号対雑音比閾値未満であるデータ点の少なくとも予め定められた一部を含むクラスタは、フィルタで除外される。加えて又は代替として、特定されたクラスタの大部分（例えば、６０％、７０％、又は８０％）の平均勾配から予め定められた閾値（例えば、＞５°、＞１０°、＞１５°）よりも大きい分だけ算出勾配が逸脱するクラスタは、低品質クラスタとして特定することができる。加えて又は代替として、クラスタのデータ点の変動性は、例えば、クラスタの線形回帰線におけるその最も近い点からのクラスタの各データ点の距離（「誤差」）を決定するために誤差関数を用いることによって決定することができる。誤差関数によって与えられる合計誤差スコアが閾値を超えるクラスタは、低品質クラスタとして特定される。例えば、誤差スコアは、クラスタのデータ点ごとに得られる二乗誤差値の合計として算出することができる。
【０１１５】
[00118]さらなるステップにおいて、全ての特定された低品質クラスタは、さらなる解析によりフィルタで除外される。
[00119]最後のステップにおいて、選択的に「低品質クラスタ」として除外されないクラスタは、「真の」ＴＯＦ値を特定するために使用される。例えば、（十分な品質を有する）全ての残りのクラスタからの線形回帰線の平均勾配が算出される。クラスタの一方の半分の勾配がクラスタの他方の半分の勾配に対してミラー反転されるとき、このステップは、クラスタの半分の回帰線勾配に関して反転操作を伴うことができる。結果として得られる平均勾配は、真のＴＯＦを特定するために使用され、算出された平均勾配
【０１１６】
【数１３】
0006618540.tif 000014
【０１１７】
は、ＵＳ周波数の変化あたりの測定された位相シフトの変化を示す。周波数の変化は知られているので、高品質クラスタの全ての線形回帰線勾配の平均から得られる結果として得られる∂位相シフト値は、真のＴＯＦを特定するために使用することができる。
【０１１８】
[00120]例えば、平均勾配を用いた真のＴＯＦの特定は、以下の通りに行うことができる。
【０１１９】
【数１４】
0006618540.tif 000015
【０１２０】
[00121]したがって、
【０１２１】
【数１５】
0006618540.tif 000016
【０１２２】
である。
[00122]ＶＯは、電圧を表す。ＶＯｍａｘは、位相比較器の最大電圧出力である。三角波における各線形セクションは、半周期を表す。
【０１２３】
[00123]例えば、位相比較器の出力は、０Ｖと１．８Ｖの間で（位相比較器のタイプ及び構成に応じて）変化し得る。この式は、
dphase/dfreq = 2pi*TOF. 
TOF = (1/2pi rad)* X dphase/dfreq 
【０１２４】
によってＴＯＦ値を計算するために使用することができる。
[00124]それによって、「ｒａｄ」はラジアンを示し、ｄ位相／ｄ周波数（ｄｐｈａｓｅ／ｄｆｒｅｑ）は電圧／ＭＨｚの単位で測定される。次のステップでは、この単位は、ＴＯＦ値を得るためにｎｓに変換される。
【０１２５】
[00125]初めに、ＶＯｍａｘについて、すなわち１．８ボルトについてパイ・ラジアンあるので、ボルトがラジアンに変換される。
TOF = (1/2pi rad)*(pi rad/1.8 V)*(1000ns/1us)* X dphase/dfreq [in units of Volts/MHz]
【０１２６】
[00126]ラジアン及び電圧は相殺し、μｓ及びＭＨｚも相殺し、したがって残っているものは、
TOF(ns) = (1000 / 3.6) * X dphase/freq in V/MHz .
【０１２７】
である。
[00127]このようにして、ナノ秒単位のＴＯＦは、Ｖ／ＭＨｚを１０００／３．６で乗じた単位であるとき、位相周波数曲線の勾配に等しい。
例えば、１ナノ秒の変化は、次の通りである。
TOF = (1000/3.6)*X
X   = (3.6/1000)*1ns
X   = 0.0036 V/MHz
【０１２８】
したがって、ＴＯＦ１ｎｓを変化させるために、位相周波数掃引の勾配は３．６ｍＶ／ＭＨｚ変化する。
[00128]同様に、ＴＯＦは、
【０１２９】
【数１６】
0006618540.tif 000017
【０１３０】
から計算することができる。
[00129]したがって、
【０１３１】
【数１７】
0006618540.tif 000018
【０１３２】
である。
[00130]三角波の勾配は、使用されるＵＳ信号の波長に反比例する。三角波の波長は、ｘ軸が音響信号の周波数を表すので、ＭＨｚの単位を有する。
【０１３３】
[00131]各実施形態によれば、複数のＮ個の異なる周波数のうちの１つをそれぞれ有する音響信号のセットが、送信機から受信機へ送信される。送信機及び受信機は、受信機に遭遇する前に周波数が物質を通過するように配置される。Ｎ個の異なる周波数ごとの音響信号について、送信された音響信号の位相に対する受信機によって受信された音響信号の位相シフトφｅｘｐは経験的に決定され、対応する経験的ＴＯＦ値は、以下のようにして計算される。
−  複数のＮ個の周波数値ごとにそれぞれ測定された位相シフトφｅｘｐを示す測定三角波６６１を生成する。
−  データ点がデータ点のそれぞれのクラスタを構成する線形セクションにある又はそれに隣接している測定三角波における複数の線形セクション８９０、８９２、８９４を決定する。
−  クラスタについて回帰線を算出するとともに回帰線の勾配を決定するために各クラスタのデータ点に関する線形回帰を実行し、低品質クラスタを特定するために回帰線の勾配及び／又は回帰線からのクラスタのデータ点の距離を解析する。例えば、任意のユーザ定義された品質閾値は、特定のシステム及びアプリケーションに設定され得る。例えば、図８ｅに示された実施形態では、例えば、０．９９８未満のＲ２値を有する線形セクションは、「低品質クラスタ」とみなされ、平均勾配とそこから真のＴＯＦ値とを算出するのに使用されず、低品質クラスタでない全てのクラスタの回帰線の勾配から選択的に平均勾配を算出する。
−  平均勾配からＴＯＦを算出する。低品質クラスタとして特定されていない全てのクラスタの全ての回帰線の（例えば、全ての勾配の平均値（デルタ位相シフト／デルタＵＳ周波数）が算出される。この平均勾配は、例えば、
【０１３４】
【数１８】
0006618540.tif 000019
【０１３５】
に従って「真のＴＯＦ」値を算出するために使用される。したがって、
【０１３６】
【数１９】
0006618540.tif 000020
【０１３７】
である。
−  算出されたＴＯＦを戻す。
[00132]いくつかの実施形態によれば、周波数掃引測定から得られる測定値は、低品質クラスタとして特定されるクラスタの個数が予め定められた品質閾値を超える場合には完全に処分することができる。この場合には、警告メッセージがユーザへ出力されてもよく、又は新しい周波数掃引測定が自動的に実行されてもよい。
【０１３８】
[00133]上述のステップは、例えば、信号解析システムのプロセッサによって実行することができる。
[00134]特徴は、「真の」ＴＯＦがよりロバストなやり方で算出されるという利点を有し得る。「ベストフィット」したがって最も適切なＴＯＦ値を見つけるために周波数掃引全体を扱う代わりに、このアルゴリズムは、低品質を有する測定された位相周波数三角波の個々の線形セクションを特定しフィルタで除外し、それによって真のＴＯＦが算出されることに基づいてデータのデータ品質を改善する。この技法は、ＴＯＦ計算から悪い品質データを特定及び除去し、又は周波数掃引スキャン全体を特定するために使用することができ、これは低いデータ品質により処分されなければならない。
ＩＩＩ．本システム及び方法の応用
[00135]ＴＯＦ測定は、距離測定及び組成解析を含む多くの応用に役立つことが知られている。本システム及び方法は、例えば、ナノ秒からサブナノ秒の感度でＴＯＦ測定に頼る方法を含むＴＯＦ測定を利用する任意のシステムに使用されることが考えられる。１つの特定の実施形態では、本システム及び方法は、流体が多孔性物質の中へ拡散するのをモニタリングする分野に適用される。
【０１３９】
[00136]一態様では、本発明は、液体で十分に拡散される組織試料を得る方法に関する。この方法は、
（ａ）組織試料を液体の体積の中に浸漬するステップと、
（ｂ）組織試料を通じての液体の拡散を追跡するステップであって、
（ｂ１）組織試料が液体中に浸漬されるときに、音響信号を送信機から組織試料を通じて送信し、
（ｂ２）送信された音響信号が組織試料を通過した後に送信された音響信号を検出し、
（ｂ３）ＴＯＦ決定方法ｂ１、ｂ２、又はｂ３、あるいはそれらの組み合わせの実施形態のいずれかの方法を含む命令のセットをプロセッサ上で実行することによってプロセッサを備えたコンピューティングシステム上で音響信号の飛行時間（ＴｏＦ）を計算し、
（ｂ４）組織試料が液体で十分に拡散されることを示す予め定められた閾値に、計算されたＴｏＦが到達するまで（ｂ１）〜（ｂ３）を繰り返すことによって追跡するステップとを含む。
例えば、特定のサイズ、形状、組織源の組織試料であって、特定の液体（例えば、ホルマリンなどの固定液体）によって所与のパーセンテージまで拡散され、変換器の特定の構成を含む特定のシステムにおいて検査される組織試料について予期される典型的なＴＯＦ（ＵＳ信号周波数、変換器距離など）は、全ての特性が知られており、決定されるＴＯＦ値が基準値として使用することができる組織試料について経験的に決定することができる。例えば、参照表は、特定のサイズ及び形状（例えば、直径６ｍｍの円筒形）、特定の源（扁桃腺）、特定程度の体積又は重量分率のホルマリン（例えば、組織試料全体にわたって１０％のホルマリン）の特定の組織試料について、ＴＯＦ測定を実行している音響モニタリングシステムの特定の構成について予期されるＴＯＦ値を含むことができる。基準値は、音響モニタリングシステムの特定のセッティングにおける及び特定のプロトコルによって色付け又は固定される特定のタイプの試料が十分に拡散されているとみなされるかを識別するために閾値として使用することができる。
【０１４０】
[00137]例えば、組織試料は、対象から新たに得られる固定されていない組織試料とすることができ、液体は、固定剤溶液とすることができる。各実施形態によれば、固定剤溶液は架橋結合固定剤溶液である。
【０１４１】
[00138]各実施形態によれば、架橋結合固定剤は、０℃から１５℃の温度である。
[00139]各実施形態によれば、組織試料及び液体の温度は、少なくともステップａ）及びｂ１〜ｂ４）を実行している間、０℃から１５℃の温度に維持される。これは、十分な濃度の固定液体が試料の中に拡散したことをＴＯＦ測定が少なくとも示すまで、たんぱく質及び試料の他の成分が低温による腐敗から保護されることを確実にする。
【０１４２】
[00140]いくつかの実施形態では、試料は、十分な濃度の固定液に到達した後やはりある時間下げられた温度で維持することができる。例えば、室温又は２０〜５０℃の範囲内の高められた温度で固定ステップが開始する前に、いくつかの試料タイプは、冷蔵庫内で数時間又はさらには数日にわたって維持することができる。
【０１４３】
[00141]代替として、予め定められた閾値に到達すると直ぐに、組織試料及び液体の温度は、周囲温度まで上昇することが許可され得る（例えば、冷却設備のターンニング（ｔｕｒｎｉｎｇ）によって）、又は２０℃より高い温度まで能動的に加熱することができる。
【０１４４】
[00142]１つの特定の実施形態では、多孔性物質は組織試料である。多くの一般的な組織解析法では、組織試料は、流体溶液で拡散される。例えば、Ｈｉｎｅ（Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９８１  Ｍａｒ；５６（２）：１１９−２３）は、固定後又は埋め込み及び切断前に、ヘマトキシリン溶液及びエオシン溶液の中に組織試料を浸漬することによって組織ブロック全体を色付けする方法を開示する。さらに、固定は、固定されていない組織試料を固定剤溶液の体積の中に浸漬することによってしばしば実行され、固定剤溶液は、組織試料の中に拡散することが許可される。Ｃｈａｆｉｎら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（１）：ｅ５４１３８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．  ００５４１３８（２０１３年））によって示されるように、固定剤が組織の中に十分に拡散したことを確実にすることができないことは、組織試料の完全性を損ない得る。
【０１４５】
[00143]一実施形態では、本システム及び方法は、組織試料の中への固定剤の拡散をモニタするようになされている。固定剤溶液が組織を貫いて入るとき、それは細胞組織間にある流体にとって代わる。細胞組織間にある流体及び固定剤溶液が離散的な音速を有するので、この流体交換は、組織体積の組成をわずかに変化させる。したがって、出力超音波パルスは、より流体交換が生じるときに増加する通過時間微分を累積する。これは、組織試料の幾何学的形状に基づいて拡散によって累積された位相微分を決定すること、ＴＯＦを得ること、及び得られたＴＯＦにおける誤差及び他のアーティファクトを補正するように後処理アルゴリズムを使用すること、及び信頼できるＴＯＦを出力することなどの動作を可能にする。拡散速度は、固定剤に濡れた組織試料の異なる音響特性に基づいて音響プローブのシステムによってモニタすることができる。言い換えれば、固体組織試料は、組織試料を通じて移動する液体固定剤と接触することができ、組織試料の厚さほぼ全体じゅうにわたって拡散することができ、処理全体にわたって組織試料の状態及び条件を評価するように連続的又は定期的にモニタされる音響特性に基づいて解析された。例えば、細胞組織間にある流体より大きいバルクモジュールを有するホルマリンなどの固定剤は、それが細胞組織間にある流体を置き換えるので、ＴＯＦをかなり変え得る。固定プロセス（例えば、架橋結合プロセス）では、組織試料はより重く架橋結合されるので、音響エネルギーの伝達の速さは変化し得る。リアルタイムモニタリングは、試料を通じての固定剤の移動を正確に追跡するために使用することができる。例えば、生体試料の拡散又は固定のステータスは、音響波の飛行時間（ＴＯＦ）に基づいてモニタすることができる。測定の他の例には、音響信号振幅、減衰、散乱、吸収、音響波の位相シフト、又はそれらの組み合わせが挙げられる。組織試料を通じての固定剤の移動は、リアルタイムでモニタすることができる。得られた情報に基づいて、固定プロトコルは、処理の一貫性を高め、処理時間を減少させ、処理品質を改善するなどのように調整することができる。したがって、１つの実施形態では、本明細書中に実質的に記載されるような音響モニタリングシステムと、固定剤溶液中に浸漬された組織試料を保持するようになされた容器と、本明細書中に実質的に記載されるような信号解析器とを備えたシステムが提供される。音響モニタリングシステムは、受信機によって検出される前に（超音波音響信号を含む）音響信号が組織試料を通過させられるように容器の上、容器内、又は容器の周りに配置された少なくとも１つの送信機／受信機ペアを備える。別の実施形態では、少なくとも第２の送信機／受信機ペアが、受信機によって検出される前に、送信機から送信された音響信号が固定剤溶液を通過するが組織試料を通過しないように容器の上、容器内、又は容器の周りに配置される。この第２の送信機ペアは、固定剤溶液の変化をモニタするための基準として働き得る。さらに、システムは、温度制御要素等などの容器の環境的な変動を制御する要素を含むことができる。
【０１４６】
[00144]１つの実施形態では、前述の拡散モニタリングシステム及び方法は、組織試料に対して２つの温度浸漬固定法を実施するために使用される。本明細書中に使用されるとき、「２温度固定法」は、第１の期間の間に低温固定剤溶液中に組織がまず浸漬され、続いて第２の期間の間に組織を加熱する固定法である。低温ステップは、架橋結合を実質的に引き起こすことなく、固定剤溶液が組織全体を通じて拡散することを可能にする。次いで、組織が組織全体にわたって十分に拡散されると、加熱ステップは、固定剤によって架橋結合をもたらす。低温拡散、それに続く加熱ステップの組み合わせは、標準的な方法を用いるよりもより完全に固定される組織試料をもたらす。したがって、１つの実施形態では、組織試料は、（１）低温固定剤溶液中に固定されていない組織試料を浸漬するとともに、本明細書中に開示されたようなシステム及び方法を用いて組織試料におけるＴＯＦをモニタすることによって組織試料の中への固定剤の拡散をモニタする（拡散ステップ）、及び（２）閾値ＴＯＦが測定された後に、組織試料の温度が上昇することを可能にする（固定ステップ）ことによって固定される。例示的な各実施形態では、拡散ステップは、２０℃未満、１５℃未満、１２℃未満、１０℃未満、０℃から１０℃の範囲内、０℃から１２℃の範囲内、０℃から１５℃の範囲内、２℃から１０℃の範囲内、２℃から１２℃の範囲内、２℃から１５℃の範囲内、５℃から１０℃の範囲内、５℃から１２℃の範囲内、５℃から１５℃の範囲内である固定剤溶液中で実行される。例示的な各実施形態では、組織試料を囲む環境は、固定ステップ中に２０℃から５５℃の範囲内で上昇することが許容される。いくつかの実施形態では、固定剤は、グルタルアルデヒド及び／又はホルマリン基の溶液などのアルデヒド基の架橋結合固定剤である。浸漬固定にしばしば使用されるアルデヒドの例は、以下に挙げるものである。
【０１４７】
・  フォームアルデヒド（ほとんどの組織について、標準作用濃度５〜１０％ホルマリンであるが、いくつかの組織には２０％ホルマリンと同程度高さの濃度が使用されている）
・  グリオキサール（標準作用濃度１７から８６ｍＭ）
・  グルタルアルデヒド（標準作用濃度２００ｍＭ）
[00145]アルデヒドは、しばしば互いに組み合わされて使用される。標準的なアルデヒドの組み合わせは、１０％ホルマリン＋１％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒドを含む。典型的なアルデヒドがある特殊化された固定応用に使用されており、フマルアルデヒド、１２．５％ヒドロキシアジポアルデヒド（ｐＨ７．５）、１０％クロトンアルデヒド（ｐＨ７．４）、５％ピルビンアルデヒド（ｐＨ５．５）、１０％アセトアルデヒド（ｐＨ７．５）、１０％アクロレイン（ｐＨ７．６）、及び５％メタアクロレイン（ｐＨ７．６）を含む。免疫組織化学に使用されるアルデヒド基固定剤溶液の他の特定の例は、表１に記載されている。
【０１４８】
【表１】
0006618540.tif 000021
【０１４９】
いくつかの実施形態では、固定剤溶液は、表１から選択される。いくつかの実施形態では、使用されるアルデヒド濃度は、上述した標準的な濃度よりも高い。例えば、ほぼ同様の組成を有する免疫組織化学のために選択された組織を固定するために使用される標準的な濃度より少なくとも１．２５倍も高いアルデヒド濃度を有する高濃度アルデヒド基固定剤溶液が使用される。いくつかの例では、高濃度アルデヒド基の固定剤溶液は、２０％より多いホルマリン、約２５％以上のホルマリン、約２７．５％以上のホルマリン、約３０％以上のホルマリン、約２５％から約５０％ホルマリン、約２７．５％から約５０％ホルマリン、３０％から約５０％ホルマリン、約２５％から約４０％ホルマリン、約２７．５％から約４０％ホルマリン、及び約３０％から約４０％ホルマリンから選択される。この文脈で使用されるとき、用語「約」は、Ｂａｕｅｒら、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｕｂｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｕｌｔｒａ−ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（生物指標化合物保存の超精密拡散モニタリング及び最適化のための動的サブナノ秒飛行時間検出）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ，Ｖｏｌ．９０４０，９０４００Ｂ−１（２０１４年３月２０日）によって測定されるように、４℃における拡散において統計的にかなり大きい差とならない濃度を包含するものとする。
【０１５０】
[00146]２温度固定プロセスは、例えばリン酸化たんぱく質、ＤＮＡ、及び（ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡなどの）ＲＮＡ分子が含まれる組織試料中のある種の不安定生物指標化合物を検出する方法に特に役立つ。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５２８００（参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、これらの方法を用いて得られる固定された組織試料は、そのような不安定標識の存在について分析を受けることができる。したがって、１つの実施形態では、試料中の不安定標識を検出する方法が提供され、方法は、本明細書中に開示されたように２温度固定に従って組織を固定し、固定した組織試料を不安定標識に特に結合することができる分析物結合実体に接触させることを含む。分析物結合実体の例は、標的抗原に結合する抗体及び抗体フラグメント（一本鎖抗体を含む）、ＭＨＣ：抗原複合体に結合するＴ細胞受容体（単一鎖受容体を含む）、（特定のＴ細胞受容体に結合する）ＭＨＣ：ペプチドマルチマー、特定の核酸又はペプチドターゲットに結合するアプタマー、特定の核酸、ペプチド、及び他の分子に結合するジンクフィンガー、受容体リガンドに結合する（単一の鎖受容体及びキメラ受容体を含む）受容体複合体、受容体複合体に結合する受容体リガンド、及び特定の核酸に混成させる核酸プローブを含む。例えば、組織試料中のリン酸化たんぱく質を検出する免疫組織化学的方法が提供され、この方法は、前述の２温度固定法に従って得られた固定された組織をリン酸化たんぱく質に特有の抗体と接触させ、リン酸化たんぱく質への抗体の結合を検出することを含む。他の実施形態では、核酸分子を検出するｉｎ  ｓｉｔｕ混成法が提供され、方法は、前述の２温度固定法に従って得られた固定された組織を関心の核酸に特有の核酸プローブと接触させ、関心の核酸へのプローブの結合を検出することを含む。
【０１５１】
[00147]１つの特定の非限定の例では、システムは、組織試料の中への流体の拡散をモニタするために開発された。４ＭＨｚの集束変換器のペア（ＣＮＩＲＨｕｒｒｉｃａｎｅ  Ｔｅｃｈ（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）は空間的に配列され、試料はそれらの共通の焦点の近くに配置され、機械的ヘッドの設計は、Ｌｙｎｘ  ＩＩ  ｄｉｐ及びダンク組織プロセッサ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の標準的な試薬キャニスタにぴったり合いそれを封止するように、Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ（登録商標）に設計された。カセットホルダは、より小さい組織試料（直径≦４ｍｍ）をしっかりと保持しそれが滑るのを防ぐために、生検コンパチブルカセット（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣｅｌｌＳａｆｅ  Ｂｉｏｐｓｙ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ）と共に使用するために設計された。代替として、別個のホルダが直径７ｍｍまでのより大きい標本のために標準的なサイズのカセットに設計された。カセットホルダは、カセットを試薬キャニスタの中に移動し変換器の音響経路を通じて組織を通過する垂直並進運動アームに取り付けられた。２つの金属ブラケットが、送信変換器及び受信変換器を収容する組織カセットの両側にある。受けブラケットは、バルク流体だけを測定するために、他方の変換器に直交するように向けられた一対の変換器も保持する。これらの変換器は、バルク流体中に環境的に誘導された変動を補償するために参照チャンネルとして働く。送信機を指している各ペアの一方の変換器は、固定剤流体及び組織を横断する音響パルスを送出し、受信変換器によって検出される。初めに、送信変換器は、数百マイクロ秒間に正弦波を送信するために、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＴＲＭ）によってＡＤ５９３０などの波形発生器を用いてプログラムされ得る。次いで、そのパルス列は、流体及び組織を横断した後に受信変換器によって検出することができる。受信された超音波の正弦波及び送信された正弦波は、Ａｎａｌｏｇ  ＤｅｖｉｃｅｓによるＡＦ８３０２などの例えばデジタル位相比較器を用いて比較される。位相比較器の出力は、送信されたパルスと受信されたパルスの間に時間的重なりの領域中に有効な読取値をもたらす。位相比較器の出力は、Ａｔｍｅｌ（ＲＴＭ）によるＡＴｍｅｇａ２５６０などのマイクロコントローラ上の統合型アナログ／デジタル変換器で出力が照会される前に、安定することができる。次いで、プロセスは、周波数範囲にわたって入力正弦波と出力正弦波の間の位相関係を構築するために、変換器の帯域幅にわたって複数の音響周波数で繰り返され得る。この音響位相周波数掃引は、本明細書中に開示された後処理アルゴリズムを用いてＴＯＦを計算するのに直接使用される。さらに、流体中の音の速さは、絶対ＴＯＦは変換器の経路長にわたって統合された信号であるので、でこぼこしている大きい温度依存性（例えば、４℃でΔｔ水≒２．３ｎｓ／（℃・ｍｍ））を有する。温度制御ハードウェア上の比例積分微分（ＰＩＤ）アルゴリズム、及びバルク媒体を通じてのＴＯＦ基準補償という２つの機構がこれらの環境的な変動を静めるために使用され得る。ＰＩＤ温度制御は、Ｏｍｅｇａ  ｍｏｄｅｌ  ＴＨ−１０−４４００７などの）サーミスタから試薬の温度を連続的に読むとともに温度制御ハードウェアがオンである長さを調整する開発されたパルス幅変調（ＰＷＭ）アルゴリズムに基づいていた。最良の結果は、流体中の比較的遅い低振幅熱過度で実現された。ＰＷＭアルゴリズムは、設定点を中心にして約０．０５℃の標準偏差で流体の温度を正規化することが見つけられた。さらなる環境制御は、バルク固定剤を介してＴＯＦを読み取ることによって実現することができ、次いでこの読み取りは、流体中に環境的に誘導された変動からＴＯＦへの寄与を緩和するために、試薬及び組織からの信号から差し引かれる。
【０１５２】
[00148]本開示の例示的な各実施形態の前述の開示は、例示及び記述のために示された。網羅的であること又は開示された精密な形態に本開示を限定することは意図されていない。本明細書中に記載された実施形態の多くの変形形態及び修正形態は、上記の開示の観点で当業者に明らかであろう。本開示の範囲は、本明細書に添付された特許請求の範囲によって及びその均等物によってのみ定められるものである。
【０１５３】
[00149]さらに、本開示の説明している代表的な実施形態では、本明細書は、本開示の方法及び／又はプロセスを特定の一連のステップとして示すことができる。しかしながら、方法又はプロセスが本明細書中に記載されたステップの特定の順序に頼らない限りにおいては、方法又はプロセスに記載されたステップの特定の順番に限定されるべきではない。当業者は、他の順番のステップも可能であり得ることを理解されよう。したがって、本明細書中に記載されたステップの特定の順序は、特許請求の範囲の限定とみなされるべきではない。加えて、本開示の方法及び／又はプロセスに向けられた特許請求の範囲は、記載された順序のステップの実施に限定されるべきではなく、当業者は、順番は変更されてもよく、本開示の精神及び範囲内のままであり得ることを容易に理解できよう。
【図１Ａ】
0006618540.tif 000022
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
0006618540.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
0006618540.tif 000032
【図６Ｂ】
0006618540.tif 000033
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
0006618540.tif 000035
【図７】
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【図８Ａ】
0006618540.tif 000037
【図８Ｂ】
0006618540.tif 000038
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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