(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規発症糖尿病を有する哺乳動物において血中グルコース濃度を低下させるための組成物であって、寛容原性樹状細胞を含み、
前記新規発症糖尿病を有する哺乳動物の膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に前記組成物の注射が２回またはそれ超投与されることを特徴とし、
前記血中グルコースが、少なくとも２４時間の期間にわたって正常な血中グルコース濃度まで低下する、組成物。
【請求項２】
前記寛容原性樹状細胞が、前記哺乳動物から、または同じ種の異なる哺乳動物から単離されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記寛容原性樹状細胞が、予め凍結されている、請求項１から２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所が、
（１）前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であるか、
（２）前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であるか、
（３）前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であるか、または
（４）前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部である、
請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記投与が、少なくとも４カ所の注射部位を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
第１の注射部位が、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であり、第２の注射部位が前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であり、第３の注射部位が前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であり、第４の注射部位が前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物の前記注射が少なくとも３回、４回または５回投与されることをさらに特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記血中グルコースが、正常な血中グルコース濃度まで低下し、少なくとも約７日の間にわたって前記正常な血中グルコース濃度まで回復する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記投与が、追加的な免疫抑制療法の投与を含まない、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
２回またはそれ超の前記組成物の前記注射が、少なくとも１つの粒子を含み、前記粒子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７として記載されている核酸配列、またはそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
（１）前記少なくとも１つの粒子が少なくとも１つのマーカーで標識されており、任意選択で、前記マーカーが蛍光マーカーであり、好ましくはｐＨ指示薬であるか、または
（２）前記少なくとも１つの粒子の全てがマーカーで標識されているわけではなく、任意選択で、前記マーカーが蛍光マーカーであり、好ましくはｐＨ指示薬である、
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記哺乳動物が、最大で１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記臨床発症が、（ｉ）高血糖、（ｉｉ）前記哺乳動物の前記血中グルコース濃度の制御の不能、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記寛容原性樹状細胞がオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７として記載されている核酸、あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項１から９および１２から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
この出願は、２０１３年１１月１８日に出願された米国仮出願第６１／９０５，７８７号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
連邦政府より資金提供を受けた研究についての声明
本発明は、ともにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＮＩＤＤＫ  ＤＫ０６３４９９およびＮＩＤＤＫ  ＤＫ４９８３５−０１の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
真性糖尿病は、インスリンの内因的欠乏またはインスリン受容体欠損のいずれかに起因して、細胞が内在性グルコースをそれらの膜を横断して輸送できないことにより生じる。１型糖尿病は、ベータ細胞が破壊され、それにより内在性インスリンが不十分なレベルになることによって引き起こされる。１型糖尿病では、膵臓のインスリン産生ベータ細胞が選択的に損なわれ、破壊される。その後のインスリンの欠如により、血中グルコースレベルの上昇が導かれる。２型糖尿病は、インスリン受容体自体または存在するインスリン受容体の数またはインスリンシグナルとグルカゴンシグナルのバランスのいずれかの欠損として始まり得るが、最終的には、機能性β細胞の喪失によって引き起こされる。糖尿病の臨床症状発現を有する個体の現行の処置は、非糖尿病個体における膵β細胞の役割を真似ようとするものである。そのような介入にもかかわらず、多くの場合、糖尿病患者の健康は徐々に減退する。米国のみで何百万もの人が糖尿病に苦しめられており、１型糖尿病を処置するための追加的な方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、疾患を有する哺乳動物を処置するための方法、組成物、およびキットを提供する。当該方法、組成物、およびキットは、糖尿病が発症しているまたは発症している可能性がある哺乳動物の処置に特に有用である。
【０００５】
一部の態様では、小児哺乳動物において血中グルコースを前糖尿病レベルまで回復させるための方法であって、哺乳動物の膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に寛容原性（tolerogenic）樹状細胞の皮下注射を２回またはそれ超投与するステップを含み、前記血中グルコースを少なくとも２４時間の期間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、前記哺乳動物から、または異なる哺乳動物から単離されていてもよい。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、予め凍結されていてよい。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
小児哺乳動物において血中グルコースを前糖尿病レベルまで回復させるための、寛容原性樹状細胞の使用であって、
前記小児哺乳動物の膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に前記寛容原性樹状細胞の皮下注射を２回またはそれ超投与するステップを含み、
前記血中グルコースが、少なくとも２４時間の期間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復する、使用。
（項目２）
前記寛容原性樹状細胞が、前記小児哺乳動物から、または同じ種の異なる哺乳動物から単離される、項目１に記載の使用。
（項目３）
前記寛容原性樹状細胞が、予め凍結されている、項目１から２のいずれか一項に記載の使用。
（項目４）
前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所が、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部である、項目１から３のいずれか一項に記載の使用。
（項目５）
前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所が、前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部である、項目１から３のいずれか一項に記載の使用。
（項目６）
前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所が、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部である、項目１から３のいずれか一項に記載の使用。
（項目７）
前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所が、前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部である、項目１から３のいずれか一項に記載の使用。
（項目８）
前記投与が、少なくとも４カ所の注射部位を含む、項目１から３のいずれか一項に記載の使用。
（項目９）
第１の注射部位が、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であり、第２の注射部位が前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であり、第３の注射部位が前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であり、第４の注射部位が前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部である、項目８に記載の使用。
（項目１０）
前記寛容原性樹状細胞の皮下注射を少なくとも３回、４回または５回投与するステップをさらに含む、項目１から３のいずれか一項に記載の使用。
（項目１１）
前記血中グルコースが、約２５日から約３５日の間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復する、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目１２）
前記血中グルコースが、約６５週間から７５週間の間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復する、項目１から１０のいずれか一項に記載の使用。
（項目１３）
前記小児哺乳動物がヒトである、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目１４）
前記投与が、追加的な免疫抑制療法を投与することを含まない、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目１５）
前記投与により、前記注射部位まで３細胞長の半径距離内にあるＴ細胞の同時刺激が妨げられる、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目１６）
前記寛容原性樹状細胞が少なくとも１つのマーカーで標識されている、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目１７）
前記マーカーが蛍光マーカーである、項目１６に記載の使用。
（項目１８）
前記蛍光マーカーが生存能力の指標である、項目１７に記載の使用。
（項目１９）
前記寛容原性樹状細胞の全てがマーカーで標識されているわけではない、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目２０）
２回またはそれ超の前記寛容原性樹状細胞の皮下注射が、少なくとも１つの粒子を含み、前記粒子が、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７として記載されている核酸配列、またはそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチドを含む、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目２１）
前記粒子が少なくとも１つのマーカーで標識されている、項目２０に記載の使用。
（項目２２）
前記粒子の全てがマーカーで標識されているわけではない、項目２０に記載の使用。
（項目２３）
前記マーカーが蛍光マーカーである、項目２１から２２のいずれか一項に記載の使用。
（項目２４）
前記蛍光マーカーがｐＨ指示薬である、項目２３に記載の使用。
（項目２５）
前記寛容原性樹状細胞を投与した後に前記マーカーを追跡するステップをさらに含む、項目１６に記載の使用。
（項目２６）
所定の解剖学的位置における前記少なくとも１つのマーカーの蓄積を定量化するステップをさらに含む、項目１６に記載の使用。
（項目２７）
前記小児哺乳動物が、少なくとも１カ月にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目２８）
前記小児哺乳動物が、少なくとも１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、項目１から２６のいずれか一項に記載の使用。
（項目２９）
前記小児哺乳動物が、少なくとも５年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、項目１から２６のいずれか一項に記載の使用。
（項目３０）
前記小児哺乳動物がヒトである、前記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目３１）
前記小児哺乳動物が、マウスまたは非ヒト霊長類である、項目１から２９のいずれか一項に記載の使用。
（項目３２）
前記ヒトが、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１０歳の間、または約１１歳から約１８歳の間である、項目３０に記載の使用。
（項目３３）
前記ヒトが、糖尿病を小児期発症している、項目３０に記載の使用。
（項目３４）
前記小児哺乳動物における抑制性Ｂ細胞集団を増大させるステップであって、全身的な抑制性Ｂ細胞増大と比較してより大きな抑制性Ｂ細胞の局所的増大が前記膵臓の近くで起こる、ステップをさらに含む、項目１に記載の使用。
（項目３５）
追加的な免疫抑制療法を施さない、項目３４に記載の使用。
（項目３６）
前記小児哺乳動物がヒトである、項目３４に記載の使用。
（項目３７）
前記小児哺乳動物がマウスまたは非ヒト霊長類である、項目３４に記載の使用。
（項目３８）
前記ヒトが、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１０歳の間、または約１１歳から約１８歳の間である、項目３６に記載の使用。
（項目３９）
前記小児哺乳動物が、最大で１カ月にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、項目３４から３８のいずれか一項に記載の使用。
（項目４０）
前記小児哺乳動物が、最大で１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、項目３４から３８のいずれか一項に記載の使用。
（項目４１）
前記小児哺乳動物が、最大で５年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有する、項目３４から３８のいずれか一項に記載の使用。
（項目４２）
前記抑制性Ｂ細胞集団が、以下のマーカー：ＣＤ１９、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＩＬ−１０、およびＣＤ４０を発現する、項目３４から４１のいずれか一項に記載の使用。
（項目４３）
前記抑制性Ｂ細胞集団が、以下のマーカー：ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ２４を発現する、項目３４から４１のいずれか一項に記載の使用。
（項目４４）
前記抑制性Ｂ細胞集団が、以下のマーカー：ＣＤ１Ｂ、ＣＤ５、ＣＤ１９、およびＩＬ１０を発現する、項目３４から４１のいずれか一項に記載の使用。
（項目４５）
前記抑制性Ｂ細胞集団が、ＣＤ１１ｃマーカーを発現しない、項目３４から４４のいずれか一項に記載の使用。
（項目４６）
前記抑制性Ｂ細胞集団が、メモリーＢ細胞集団を含む、項目３４から４５のいずれか一項に記載の使用。
（項目４７）
前記メモリーＢ細胞集団が、以下のマーカー：ＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ４０を発現する、項目４６に記載の使用。
（項目４８）
前記抑制性Ｂ細胞集団が増殖する、項目３４から４７のいずれか一項に記載の使用。
（項目４９）
前記抑制性Ｂ細胞集団が分化する、項目３４から４８のいずれか一項に記載の使用。
（項目５０）
Ｔ細胞集団の増殖を抑制するステップをさらに含む、項目３４から４９のいずれか一項に記載の使用。
（項目５１）
前記抑制性Ｂ細胞集団からの抑制性Ｂ細胞と前記Ｔ細胞集団からのＴ細胞を接触させるステップをさらに含む、項目５０に記載の使用。
（項目５２）
前記抑制性Ｂ細胞集団が、寛容原性樹状細胞、ナノ粒子、微小粒子、またはそれらの組合せを含む皮下注射を２回またはそれ超投与することによって誘導される、項目３４から５１のいずれか一項に記載の使用。
（項目５３）
２回またはそれ超の前記皮下注射を、前記膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与する、項目５２に記載の使用。
（項目５４）
２回またはそれ超の前記皮下注射が、４カ所の注射部位を含む、項目５３に記載の使用。
（項目５５）
前記ナノ粒子が、オリゴヌクレオチドを含む、項目５２に記載の使用。
（項目５６）
前記微小粒子が、オリゴヌクレオチドを含む、項目５２に記載の使用。
（項目５７）
前記抑制性Ｂ細胞集団の表面上の生存促進性シグナルの発現を非抑制性細胞集団と比較して増加させるステップをさらに含む、項目３４から５６のいずれか一項に記載の使用。
（項目５８）
少なくとも１つの寛容原性樹状細胞を投与することによって非抑制性Ｂ細胞集団におけるアポトーシスを誘導するステップをさらに含む、項目３４から５６のいずれか一項に記載の使用。
（項目５９）
小児哺乳動物における１型糖尿病に対する処置である抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比を変更するための、寛容原性樹状細胞の使用であって、
寛容原性樹状細胞を前記哺乳動物に送達するステップを含み、前記変更が、前記抑制性Ｂ細胞を増加させ、かつ前記Ｔ細胞を減少させることを含む、使用。
（項目６０）
前記寛容原性樹状細胞を前記哺乳動物の膵臓の近位にある部位に注射するステップをさらに含む、項目５９に記載の使用。
（項目６１）
前記抑制性Ｂ細胞を増大させるステップをさらに含む、項目５９から６０のいずれか一項に記載の使用。
（項目６２）
前記Ｔ細胞の増殖を抑制するステップをさらに含む、項目５９から６１のいずれか一項に記載の使用。
（項目６３）
前記抑制性Ｂ細胞が、以下のマーカー：Ｂ２２０、ＣＤ１９、およびＩＬ１０を発現する、項目５９から６２のいずれか一項に記載の使用。
（項目６４）
前記抑制性Ｂ細胞が、ＣＤ１１ｃマーカーを発現しない、項目５９から６３のいずれか一項に記載の使用。
（項目６５）
前記抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比が約１：１０である、項目５９から６４のいずれか一項に記載の使用。
（項目６６）
前記Ｔ細胞の前記増殖を約４０％〜約５５％低下させることによって前記比を変更する、項目６３に記載の使用。
（項目６７）
前記Ｔ細胞の前記増殖を約６５％〜約８０％低下させることによって前記比を変更する、項目６５に記載の使用。
（項目６８）
前記抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比が約１：１である、項目５９に記載の使用。
（項目６９）
前記抑制性Ｂ細胞の少なくとも１つと前記Ｔ細胞の少なくとも１つを接触させるステップをさらに含む、項目５９に記載の使用。
（項目７０）
哺乳動物における炎症応答を低減するための、寛容原性樹状細胞の使用であって、
前記哺乳動物の膵臓内またはその近くに寛容原性樹状細胞を導入し、それにより、前記哺乳動物においてレチノイン酸を産生させるステップを含み、
前記レチノイン酸の産生により、少なくとも１つのレチノイン酸受容体および少なくとも１つのレチノイドＸ受容体を発現する抑制性Ｂ細胞集団の増加がもたらされる、使用。
（項目７１）
前記哺乳動物がヒトである、項目７０に記載の使用。
（項目７２）
前記哺乳動物がマウスまたは非ヒト霊長類である、項目７０に記載の使用。
（項目７３）
前記ヒトが、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１９歳の間、または約１１歳から約１８歳の間である、項目７０に記載の使用。
（項目７４）
前記哺乳動物が過敏性腸疾患（ＩＢＤ）を有する、項目７０から７３のいずれか一項に記載の使用。
（項目７５）
前記哺乳動物が１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有する、項目７０から７３のいずれか一項に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンポリカチオンのマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真である。
【図２】図２Ａは、マイクロスフェアの調製物のサイズ分布を要約したグラフである。図２Ｂは、マイクロスフェアの調製物の表面電荷を要約したグラフである。
【図３】図３は、マイクロスフェアの脱製剤化（ｄｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）後のオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４Ａ】図４Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェアの自己集合系の概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、コーティングされていないマイクロスフェアの平均粒子サイズ分布を要約したグラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェアの平均粒子サイズ分布を要約したグラフである。
【図５】図５は、ＦＩＴＣとコンジュゲートしたＮＦ−ｋＢ  ＯＤＮを含む樹状細胞（ＤＣ）の２つの顕微鏡画像を含有する。左側のパネルは位相差画像であり、右側のパネルは蛍光画像である。
【図６Ａ】図６は、ＮＯＤマウス由来のＤＣの免疫賦活性能がＮＦ−ｋ  ＯＤＮによって有意に阻害されることを示すグラフである。
【図６Ｂ】図６は、ＮＯＤマウス由来のＤＣの免疫賦活性能がＮＦ−ｋ  ＯＤＮによって有意に阻害されることを示すグラフである。
【図７】図７は、ＮＯＤマウスにおいて、ＮＦ−ｋＢ  ＯＤＮ  ＤＣ投与により１型糖尿病発生の開始が予防されることを示すグラフである。
【図８】図８Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアを用いて処置した新規発症糖尿病マウスの血中グルコースレベルを要約したグラフである。図８Ｂは、スクランブルオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアを用いて処置した新規発症糖尿病マウスの血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【図９−１】図９Ａは、新規発症糖尿病を有するマウスを用いた実験についての時系列である。
【図９−２】図９Ｂ〜図９Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰまたは対照のいずれかを用いて処置した新規発症糖尿病マウスの平均血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【図１０−１】図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰの投与後１５日以内のＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示すグラフである。
【図１０−２】図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰの投与後１５日以内のＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示すグラフである。
【図１１】図１１は、自己免疫性糖尿病の治療的逆転を示す流れ図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａワークステーションにおける生動物イメージングを要約する図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、マウスへの膵臓を覆う注射後の蛍光標識されたマイクロスフェアの局在蓄積を要約する図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、２日にわたる、マウスにおける蛍光標識されたマイクロスフェアの蛍光蓄積を要約したグラフである。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、２日にわたる、異なるマウスにおける蛍光標識されたマイクロスフェアの蛍光蓄積を要約したグラフである。
【図１３】図１３は、マウスへの膵臓より遠位への注射後の蛍光標識されたマイクロスフェアの局在蓄積を要約する図である。
【図１４】図１４は、非ヒト霊長類における蛍光標識されたマイクロスフェアの注射部位の位置を要約する図である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｃは、非ヒト霊長類の膵臓リンパ節の内側への蛍光標識されたマイクロスフェアの優先的蓄積を要約する図である。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｃは、非ヒト霊長類の膵臓リンパ節の内側への蛍光標識されたマイクロスフェアの優先的蓄積を要約する図である。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｃは、非ヒト霊長類の膵臓リンパ節の内側への蛍光標識されたマイクロスフェアの優先的蓄積を要約する図である。
【図１６】図１６は、マウスにおける注射後の蛍光標識された寛容原性樹状細胞（ｉＤＣ）の局在蓄積を要約する図である。
【図１７】図１７は、非ヒト霊長類における蛍光標識されたｉＤＣの注射部位の位置を要約する図である。
【図１８】図１８は、非ヒト霊長類における注射後の蛍光標識されたｉＤＣの局在蓄積を要約する図である。
【図１９】図１９は、ヒトにおける注射部位の位置を要約する図である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、マウスにおける１型糖尿病の新規発症後の数週間の血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、新規発症糖尿病マウスにおけるインスリン中止後の血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｂ細胞集団の頻度を同定および測定するために使用するフローサイトメトリー手法である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、新たに採取した膵臓リンパ節細胞のフローサイトメトリーデータである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、フローサイトメトリーによるＤＣ−Ｂｒｅｇの頻度を総脾細胞に対する％として要約したグラフである。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、無処置のマウス、対照樹状細胞（ｃＤＣ）を注射したマウスおよびｉＤＣを注射したマウスの脾臓における、フローサイトメトリーによって測定されたＤＣ−Ｂｒｅｇの絶対数を要約したグラフである。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、フローサイトメトリーによって測定されたＢ１０  Ｂｒｅｇの頻度を総脾細胞に対する％として要約したグラフである。
【図２１Ｆ】図２１Ｆは、無処置のマウス、ｃＤＣを注射したマウスおよびｉＤＣを注射したマウスの脾臓における、フローサイトメトリーによって測定されたＢ１０  Ｂｒｅｇの絶対数を要約したグラフである。
【図２１Ｇ】図２１Ｇは、ヘマトキシリン／エオシン染色したＢ１０  Ｂｒｅｇの顕微鏡画像である。
【図２１Ｈ】図２１Ｈである。
【図２１Ｉ】図２１Ｉである。
【図２１Ｊ】図２１Ｊである。
【図２１Ｋ】図２１Ｋである。
【図２２Ａ】図２２Ａは、抑制性Ｂ細胞集団の不在下または存在下で共培養したＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、中和ＩＬ−１０抗体を伴って、または伴わずに、抑制性Ｂ細胞集団と共培養したＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、同種異系ＭＬＲにおいて、トランスウェルインサートによって物理的に分離された抑制性Ｂ細胞集団と共培養したＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ｃＤＣと５日間共培養した後、ｉＤＣと一緒に５日間共培養した後および培地と一緒に５日間共培養した後のＤＣ−Ｂｒｅｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光を測定したフローサイトメトリーデータである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは高度に精製されたＧＦＰ−出発集団を培地、ｃＤＣ、またはｉＤＣと共培養した後の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＦＰ＋  ＤＣ−Ｂｒｅｇの実数値を要約したグラフである。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、高度に精製されたＧＦＰ＋出発集団を培地、ｃＤＣ、またはｉＤＣと共培養した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＦＰ＋  ＤＣ−Ｂｒｅｇの実数値を要約したグラフである。
【図２３Ｄ】図２３Ｄである。
【図２３Ｅ】図２３Ｅである。
【図２４Ａ】図２４は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス由来の脾臓ＤＣ−Ｂｒｅｇのフローサイトメトリーデータである。
【図２４Ｂ】図２４は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス由来の脾臓ＤＣ−Ｂｒｅｇのフローサイトメトリーデータである。
【図２５】図２５は、フローサイトメトリーによって測定された、同系Ｂ細胞および同種異系脾細胞の存在下または不在下でのＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【図２６Ａ】図２６Ａは、Ｂ１０  Ｂｒｅｇにおける発現に対するレチノイン酸受容体（ＲＡＲアルファ）の発現を要約したグラフである。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、Ｂ１０  Ｂｒｅｇにおける発現に対するレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の発現を要約したグラフである。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ｃＤＣおよびｉＤＣを含めたＲＡ産生細胞のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ蛍光を測定したフローサイトメトリー分析を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ｃＤＣおよびｉＤＣの存在下で培養した、ＲＡ応答エレメント（ＲＡＲＥ）−Ｌｕｃプラスミドを形質導入したＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性の発光検出を要約したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
配列表
付随する配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、適切な場合、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解される。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル［９２１９８−０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ、２０１４年１１月１８日、１２．０ＫＢ］として提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００８】
一般的な概要
米国特許第８，０２２，０４６号、同第７，９６４，５７４号、同第８，３８９，４９３号、および同第７，８８４，０８５号および米国特許出願第１２／８２２，７７４号は、参照により組み込まれる。本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００９】
本開示は、状態、特に、自己免疫性疾患および炎症性疾患を処置するための方法、組成物、およびキットを提供する。オリゴヌクレオチドの修飾、粒子を作出する方法、寛容原性ＤＣ集団を作出する方法、送達の組成、送達経路、送達頻度を含めた送達方法、状態を処置する方法、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の位置を評価する方法などが本開示に含まれる。
【００１０】
本開示の方法は、これだけに限定されないが、臨床発症後に存在する状態の処置、慢性の状態の処置、または状態の予防を含めた種々の適用に対して有用であり得る。状態は、自己免疫障害および炎症性の状態、例えば、１型糖尿病などの疾患を含んでよい。本開示の方法は、慢性の状態に対するワクチン戦略、制御された薬物送達の適用、処置の選択肢（例えば、ナノ粒子の共送達により、オリゴヌクレオチドの内在性ＤＣ集団への送達が増強され得る）の生物学的利用能の改善、内因性組織応答の変更、および他の適用にも有用であり得る。
【００１１】
処置の方法
本開示の方法、組成物、およびキットは、状態を予防する、阻止する、逆転させる、または低減するための処置方法を含んでよい。いくつかの場合には、状態は、自己免疫性疾患であってよい。自己免疫性疾患は、円形脱毛症、強直性脊椎炎（anklosing spondylitis）、抗リン脂質症候群、喘息、関節炎、自己免疫性アジソン病、自己免疫不全症候群（autoimmune deficiency syndrome）（ＡＩＤＳ）、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー−皮膚炎（celiac sprue-dermatitis）、慢性疲労症候群免疫不全症候群（chronic fatigue syndrome immune deficiencysyndrome）（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、瘢痕性類天疱瘡、寒冷凝集素症、限局型強皮症（ＣＲＥＳＴ症候群）、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、円板状ループス、本態性混合性クリオグロブリン血症、線維筋痛症、線維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、インスリン依存性糖尿病（１型）、若年性関節炎、肺線維症、ループス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（polyglancular syndrome）、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症性ショック、シェーグレン症候群、スティフ・マン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症、およびその他を含んでよい。
【００１２】
自己免疫性疾患は、１型糖尿病であってよい。１型糖尿病は、膵臓の進行性炎症がある自己免疫障害である。炎症により、膵ベータ細胞が機能障害性になる。処置せずにいると、１型糖尿病により慢性炎症および機能性膵ベータ細胞塊の減少が生じる。
【００１３】
状態は、炎症性疾患であってよい。炎症性疾患としては、尋常性ざ瘡、アルツハイマー病、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、がん、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、クローン病（crown's disease）、皮膚炎、肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、多発性硬化症、腎炎、パーキンソン病、骨盤腹膜炎、再灌流傷害、関節リウマチ、サルコイドーシス、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、血管炎およびその他を挙げることができる。
【００１４】
状態（例えば、自己免疫性疾患、炎症性疾患）の発症を予防することができる保存方法を有することが望ましい。状態（例えば、自己免疫性疾患、炎症性疾患）を臨床発症後に阻止することができる保存を有することが望ましい。状態（例えば、自己免疫性疾患、炎症性疾患）を臨床発症後に逆転させることができる保存を有することが望ましい。状態（例えば、自己免疫性疾患、炎症性疾患）を臨床発症後に低減することができる保存を有することが望ましい。状態（例えば、１型糖尿病）を予防する、阻止する、逆転させる、または低減することができる保存方法は、残存するベータ細胞集団の生存能力を保存すること、残存するベータ細胞集団を回復または増大させること、炎症を低減すること、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで低下させること、抑制性Ｂ細胞集団を増大させること、Ｔ細胞集団を減少させること、樹状細胞（ＤＣ）集団におけるレチノイン酸（ＲＡ）産生を誘導すること、寛容原性ＤＣ集団を増大させること、またはそれらの組合せを含んでよい。状態（例えば、炎症性腸疾患）を予防する、阻止する、逆転させる、または低減することができる保存は、炎症を低減すること、抑制性Ｂ細胞集団を増大させること、Ｔ細胞集団を減少させること、ＤＣ集団におけるＲＡ産生を誘導すること、寛容原性ＤＣ集団を増大させること、またはそれらの組合せを含んでよい。
【００１５】
処置方法は、被験体（例えば、状態を有する患者および／または状態を有する実験動物）を処置することを含んでよい。状態は、自己免疫性疾患であってよい。状態は、炎症性疾患であってよい。被験体は、哺乳動物であってよい。哺乳動物は、ＮＯＤマウス、ＮＯＤ／ＬｔＪマウス、ＮＯＤ−ｓｃｉｄマウス、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｈ２ｋ）マウス、Ｃ５７ＢＬ６マウス、Ｂａｌｂ／ｃマウス、糖尿病を有さないマウス、新規発症糖尿病マウス、およびその他を含めたマウスであってよい。哺乳動物は、Ｍａｃｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓサル、アカゲザル、およびその他を含めた非ヒト霊長類であってよい。哺乳動物は、ヒトであってよい。ヒトは、乳児、小児、青年、成人、およびその他であってよい。
【００１６】
被験体は、小児哺乳動物であってよい。被験体は、新生児哺乳動物であってよい。被験体は、老齢哺乳動物であってよい。被験体は、状態（例えば、１型糖尿病）が発生するリスクがある小児哺乳動物であってよい。被験体は、状態（例えば、１型糖尿病）を有する小児哺乳動物であってよい。小児哺乳動物に対する処置方法が好ましい場合がある。いくつかの場合には、注射の組成、注射のタイミング、注射の量、注射の解剖学的位置を、小児哺乳動物に適応するように変更することができる。いくつかの場合には、注射の組成、注射のタイミング、注射の量、注射の解剖学的位置を、体が小さい患者または体が大きい患者に適応するように変更することができる。
【００１７】
小児哺乳動物は、ヒトであってよい。小児哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。小児哺乳動物は、１８歳未満のヒトであってよい。小児哺乳動物は、１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳であってよい。小児哺乳動物は、約１歳未満の小児などの乳児であってよい。小児哺乳動物は、約１歳から約２歳の間、約１歳から約３歳の間、または約１歳から約５歳の間などの若年小児であってよい。小児哺乳動物は、約６歳から１０歳の間、約６歳から約１２歳の間などの小児であってよい。小児哺乳動物は、約１１歳から１３歳の間であってよい。小児哺乳動物は、約１１歳から１８歳の間であってよい。小児哺乳動物は、約１３歳から１８歳の間などの青年であってよい。
【００１８】
処置は、被験体に、状態（例えば、１型糖尿病）が臨床発症する前にもたらすことができる。処置は、状態が発症する前に、約１日、約１週間、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１年、約１．５年、約２年、約３年、約４年、約５年、約１０年、約１５年にわたってもたらすことができる。処置は、状態が臨床発症する前に、約１日超、約１週間超、約１カ月超、約２カ月超、約３カ月超、約４カ月超、約５カ月超、約６カ月超、約７カ月超、約８カ月超、約９カ月超、約１０カ月超、約１１カ月超、約１年超、約１．５年超、約２年超、約３年超、約４年超、約５年超、約１０年超、約１５年超にわたってもたらすことができる。処置は、状態が臨床発症する前に、約１日未満、約１週間未満、約１カ月未満、約２カ月未満、約３カ月未満、約４カ月未満、約５カ月未満、約６カ月未満、約７カ月未満、約８カ月未満、約９カ月未満、約１０カ月未満、約１１カ月未満、約１年未満、約１．５年未満、約２年未満、約３年未満、約４年未満、約５年未満、約１０年未満、約１５年未満にわたってもたらすことができる。
【００１９】
処置は、被験体に、状態（例えば、１型糖尿病）が臨床発症した後にもたらすことができる。１型糖尿病の臨床発症は、被験体が、インスリン注射を利用して血糖レベルを調節する必要があることであり得る。小児患者では、７０ｍｇ／ｄｌ未満の血糖レベルを低いとみなすことができ、いくつかの場合には、例えば、発汗、空腹および／または震えなどの症状を特徴とし得る。小児患者では、２００ｍｇ／ｄｌ超の血糖レベルを高いとみなすことができ、いくつかの場合には、低エネルギー、胃痛、および／または呼吸困難を特徴とし得る。小児患者では、約７０〜約１２０ｍｇ／ｄｌの血糖レベルが正常とみなされる。小児患者では、約１２０〜約２００ｍｇ／ｄｌの血糖レベルは、正常範囲外であるが、血糖レベルを維持しようと試みる小児患者にとって目標または標的範囲内であるとみなされる。約１２歳またはそれ超の小児患者については、約７０ｍｇ／ｄｌから約１５０ｍｇ／ｄｌまでの血糖レベルを維持することが目標であってよい（例えば、糖尿病を有する小児患者について）。約５歳〜約１１歳の小児患者については、約７０ｍｇ／ｄｌから約１８０ｍｇ／ｄｌまでの血糖レベルを維持することが目標であってよい（例えば、糖尿病を有する小児患者について）。約５歳またはそれ未満の小児患者については、約８０ｍｇ／ｄｌから約２００ｍｇ／ｄｌまでの血糖レベルを維持することが目標であってよい（例えば、糖尿病を有する小児患者について）。これらの範囲は標準のガイドラインであり、例えば、個々の標的範囲は、患者の年齢、体のサイズ、発達などに基づいて変動し得ることは当業者には理解されよう。
【００２０】
１型糖尿病の臨床発症は高血糖であり得る。１型糖尿病の臨床発症は、被験体が、血中グルコースレベルを調節できないことであり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵臓の炎症であり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵ベータ細胞自己免疫であり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵ベータ細胞塊の部分的な破壊であり得る。膵ベータ細胞塊の破壊は、組織の炎症、線維性領域の増大、細胞アポトーシス、細胞壊死、細胞機能喪失（例えば、インスリンを産生できないこと、インスリン産生の減少）であり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵ベータ細胞塊が約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％破壊されることであり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵ベータ細胞塊の約９９％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超、約８０％超、約７５％超、約７０％超、約６５％超、約６０％超、約５５％超、約５０％超、約４５％超、約４０％超、約３５％超、約３０％超、約２５％超、約２０％超、約１５％超、約１０％超、約５％超が破壊されることであり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵ベータ細胞塊の約９９％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満が破壊されることであり得る。１型糖尿病の臨床発症は、膵ベータ細胞塊が完全に破壊されることであり得る。１型糖尿病の臨床発症は、霧視、悪心、高血糖、疲労、衰弱、筋痙攣、末梢性ニューロパチー、網膜症、腎症、潰瘍、他の症状、およびそれらの組合せなどの、１型糖尿病の１つまたは複数の症状の発症を含み得る。
【００２１】
臨床発症後の処置は、臨床発症後、約１時間、約６時間、約１２時間、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約２週間、約３週間、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、または約２０年であり得る。臨床発症後の処置は、臨床発症後、約１時間超、約６時間超、約１２時間超、約１日超、約２日超、約３日超、約４日超、約５日超、約６日超、約１週間超、約２週間超、約３週間超、約１カ月超、約２カ月超、約３カ月超、約４カ月超、約５カ月超、約６カ月超、約７カ月超、約８カ月超、約９カ月超、約１０カ月超、約１１カ月超、約１年超、約２年超、約３年超、約４年超、約５年超、約６年超、約７年超、約８年超、約９年超、約１０年超、約２０年超であり得る。臨床発症後の処置は、臨床発症後、約１時間未満、約６時間未満、約１２時間未満、約１日未満、約２日未満、約３日未満、約４日未満、約５日未満、約６日未満、約１週間未満、約２週間未満、約３週間未満、約１カ月未満、約２カ月未満、約３カ月未満、約４カ月未満、約５カ月未満、約６カ月未満、約７カ月未満、約８カ月未満、約９カ月未満、約１０カ月未満、約１１カ月未満、約１年未満、約２年未満、約３年未満、約４年未満、約５年未満、約６年未満、約７年未満、約８年未満、約９年未満、約１０年未満、約２０年未満であり得る。いくつかの場合には、処置は、臨床発症して５年以内に提供され得る。いくつかの場合には、処置は、臨床発症して約５年経つ前に提供され得る。いくつかの場合には、処置は、臨床発症して約５年以内に開始され得る。いくつかの場合には、処置は、臨床発症して約４年以内に開始され得る。いくつかの場合には、処置は、臨床発症して約３年以内に開始され得る。いくつかの場合には、処置は、臨床発症して約２年以内に開始され得る。処置は、被験体に、所与の濃度（例えば、２５０ｍｇ／ｄｌ、３００ｍｇ／ｄｌ）を超える非空腹時血中グルコースレベルが２回、３回、４回、またはそれ超連続して測定された後にもたらすことができる。処置は、臨床試験における哺乳動物の処置も含んでよい。
【００２２】
「有効量」の処置は、細胞（例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、粒子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むマイクロスフェアまたはナノスフェア）のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、物質（例えば、緩衝塩などの化学物質；小分子などの薬物化合物；増殖因子、サイトカイン、ケモカインなどのタンパク質；ホルモン、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその他）のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、内在性細胞集団の動員またはそれらの組合せを含めた、本開示全体を通して記載されている種々の組成物を含んでよい。「有効量」の処置は、本開示全体を通して記載されている通り、特定の解剖学的位置における、１回または複数回の反復投薬での、特定の量または特定の濃度の、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、物質のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、内在性細胞集団の動員またはそれらの組合せを含んでよい。「有効量」の処置は、状態（例えば、１型糖尿病）を予防する、阻止する、逆転させる、または低減することができ、残存するベータ細胞集団の生存能力を保存すること、炎症を低減すること、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで低下させること、抑制性Ｂ細胞集団を増大させること、Ｔ細胞集団を減少させること、樹状細胞（ＤＣ）集団におけるレチノイン酸（ＲＡ）産生を誘導すること、寛容原性ＤＣ集団を増大させること、またはそれらの組合せを含んでよい。
【００２３】
細胞
細胞とは、ヒト細胞、マウス細胞、および非ヒト霊長類細胞を含めた哺乳動物細胞を指し得る。細胞とは、内在性細胞、初代細胞または新たに単離された細胞、および細胞株も指し得る。１つの非限定的な例では、細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞を含み得る。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＴＣＣ）により提供される任意の細胞株を含み得る。いくつかの場合には、初代細胞または新たに単離された細胞は、様々な組織から単離することができる。初代細胞は、骨髄、リンパ節、皮膚、膵臓、末梢血または他のものから単離することができる。細胞は、継代細胞、凍結細胞、解凍された細胞、トランスフェクトされた細胞、選別された細胞、および標識された細胞であり得る。細胞とは、免疫細胞を指し得る。免疫細胞は、抑制性または寛容原性であり得る。免疫細胞とは、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）または白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）を指し得る。白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）は、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、および単球を含み得る。白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）は、樹状細胞などの抗原提示細胞も含み得る。リンパ球は、Ｔ細胞およびＢ細胞を含み得る。いくつかの場合には、Ｂ細胞は、抑制性Ｂ細胞、ＤＣ−Ｂｒｅｇ、Ｂ１０  Ｂｒｅｇであり得る。いくつかの場合には、Ｂ細胞は、マーカーの組合せ、例えば、Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−；ＣＤ１ｄＨＩＧＨ、ＣＤ５＋、ＩＬ−１０＋；Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１ｄ＋、ＣＤ５＋、ＩＬ−１０＋；Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１ｄ＋、ＣＤ５、ＣＤ１１ｃ−、ＩＬ−１０＋；ＣＤ１９＋、ＣＤ２４ＨＩＧＨ、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８ＨＩＧＨ；ＣＤ１９＋、ＣＤ２４ＨＩＧＨ、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８ＨＩＧＨ、ＩＬ−１０＋；Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋、ＩＬ−１０＋；Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１１ｃ−、ＩＬ−１０＋；Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１１ｃ−；Ｂ２２０＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ１１ｃ−、ＩｇＤＨＩＧＨ、ＩｇＭ＋、ＣＤ１０ＬＯＷ、ＣＤ２１＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ４０ＨＩＧＨ、ＩＬ−１０＋；ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ４０＋；およびその他を発現し得る。いくつかの場合には、樹状細胞は、寛容原性樹状細胞（ｉＤＣ）または対照樹状細胞（ｃＤＣ）であり得る。いくつかの場合には、ＤＣは、マーカーの組合せ、例えば、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４５＋；ＣＤ８３＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋；ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ８６＋；ＣＤ１Ｂ＋、ＣＤ５＋、ＣＤ１９＋、ＩＬ１０＋；ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８、ＣＤ２４＋；または他のものを発現し得る。メモリー集団は、ＣＤ２７＋をさらに発現し得る。細胞マーカーの陽性発現レベルは、実験試料間で変動し得る、細胞集団間で変動し得る、それを単離する被験体間で変動し得る、亜集団内で変動し得る、またはそれらの組合せである。いくつかの場合には、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＩｇＤ、またはＣＤ４０などの１つまたは複数のマーカーの陽性発現レベルが高い可能性がある。いくつかの場合には、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＩｇＤ、またはＣＤ４０などの１つまたは複数のマーカーの陽性発現レベルが中程度である可能性がある。いくつかの場合には、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＩｇＤ、またはＣＤ４０などの１つまたは複数のマーカーの陽性発現レベルが低い可能性がある。いくつかの場合には、ＣＤ１０などの１つまたは複数のマーカーの陽性発現レベルが低い可能性がある。マーカーの発現は、当業者に公知の任意の方法によって決定することができる。いくつかの非限定的な例では、発現は、高発現細胞および低発現細胞についてゲーティングするための標準方法を使用した蛍光活性化細胞選別によって決定することができる。
【００２４】
一部の実施形態では、寛容原性樹状細胞は、以下の性質の少なくとも１つを有する：ｉ）ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ナイーブなＴ細胞をＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞に変換する（例えば、ナイーブなＴ細胞においてＦｏｘＰ３の発現を誘導する）ことができる；ナイーブなＴ細胞のＴＨ１７  Ｔ細胞への変換を遮断する；ｉｉｉ）ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてエフェクターＴ細胞を欠失させることができる；ｉｖ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて少なくとも１つのＴＬＲアゴニストで刺激された際にそれらの寛容原性表現型を保持する（そして、一部の実施形態では、そのような刺激に応答して共刺激分子の発現を増加させる）；かつ／またはｖ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて少なくとも１つのＴＬＲアゴニストで刺激された際にそれらの酸素消費速度が一過性に上昇しない；かつ／またはｖｉ）ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｂ細胞を調節性Ｂ細胞に変換することができる。一部の実施形態では、ｉＤＣは、上記の性質の少なくとも２つ、少なくとも３つ、４つ、または５つ全てを有する。寛容原性ＤＣは、一般に、哺乳動物ＤＣに由来する。寛容原性ＤＣは、ドナー哺乳動物から得ることができる。ドナー哺乳動物は、投与を受けるのと同じ被験体哺乳動物（すなわち、自己由来）であってよい。ドナー哺乳動物は、投与を受ける哺乳動物とは異なるが、同じ種である（すなわち、同種異系）の哺乳動物であってよい。ドナー哺乳動物は、投与を受ける哺乳動物とは異なり、由来する種も異なる（すなわち、異種）哺乳動物であってよい。治療有効量の寛容原性ＤＣは、被験体に、１型糖尿病などの予防および／または処置のために投与することができる。一部の実施形態では、ＤＣをドナーから単離し、レシピエントに移植する。ドナーとレシピエントは同じ被験体であってよく、したがって、細胞は自己由来のものであってよい。ドナーとレシピエントは異なる被験体に由来してよく、したがって、細胞は同種異系のものであってよい。一部の実施形態では、寛容原性ＤＣを作製するためにＤＣを単離することができる組織としては、これだけに限定されないが、肝臓、脾臓、骨髄、末梢血、胸腺またはリンパ節が挙げられる。一実施形態では、ＤＣの供給源は骨髄である。
【００２５】
寛容原性ＤＣは、公知の細胞と混合することができる。公知の細胞は、フィーダー層由来の細胞などの、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて寛容原性ＤＣの生存および成長を促進することができる細胞であってよい。公知の細胞は、間質細胞などの、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて寛容原性ＤＣの生存および成長を促進することができる細胞であってよい。公知の細胞は、非寛容原性ＤＣなどの、陽性対照集団または陰性対照集団である細胞であってよい。陽性対照細胞または陰性対照細胞は、脾臓または骨髄などの公知の起源の細胞であってよい。対照細胞は機能性部分を含有してよい。機能性部分はマーカーであってよい。マーカーは、認識することができる抗原であってよい。部分は蛍光タンパク質であってよい。
【００２６】
細胞は、１つまたは複数のマーカーを含有してよい。マーカーは、抗原、蛍光タンパク質、蛍光量子ドット、放射性同位元素、およびその他であってよい。マーカーを使用して、細胞の生存能力を示すことができる。マーカーを使用して、表面マーカーの組合せ、細胞サイズ、および他の特性に基づいて、別個の細胞集団と区別することができる。マーカーを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達の前に細胞の亜集団を選別することができる。細胞は、生存能力によって選別することができる。細胞は、表面マーカー発現によって選別することができる。細胞は、サイズによって選別することができる。マーカーを使用して、送達後に細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて追跡することができる。マーカーを検出して、送達後の細胞の位置または生存能力を決定するために、イメージングを使用することができる。
【００２７】
本明細書に記載の細胞を選別するために使用することができる選別方法の非限定的な例としては、サイズ特異的細胞ストレーナー、陽性磁気選別カラム（例えば、磁気活性化細胞選別、ＭＡＣＳ）、陰性磁気選別カラム、サイズ排除カラム、マイクロ流体デバイス、レーザー選別、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリーによるＦＡＣＳ、フローサイトメトリーによる単色ＦＡＣＳ、フローサイトメトリーによる多色ＦＡＣＳ、ＩｓｏＲａｆｔアレイ、ＤＥＰＡｒｒａｙラボオンチップ、密度勾配遠心分離およびその他が挙げられる。
【００２８】
１つの非限定的な例では、本発明は、寛容原性ＤＣを作製する方法であって、ａ）哺乳動物ドナー由来の未成熟哺乳動物ＤＣを増殖させるステップと、ｂ）ＤＣを、ＣＤ４０の結合部位を少なくとも１つ有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＤ８０の結合部位を少なくとも１つ有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＣＤ８６の結合部位を少なくとも１つ有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒に、ＤＣが１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを内部移行させることができる条件下でインキュベートするステップと、ｃ）前記ＤＣを培養するステップとを含む方法を提供する。
【００２９】
ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、全てのオリゴヌクレオチドを内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、全てのＣＤ４０オリゴヌクレオチドを内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、全てのＣＤ８０オリゴヌクレオチドを内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、全てのＣＤ８６オリゴヌクレオチドを内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、オリゴヌクレオチドの一部を内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、オリゴヌクレオチドの約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、または約１０％を内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、オリゴヌクレオチドの約９９％超、約９８％超、約９７％超、約９６％超、約９５％超、約９０％超、約８５％超、約８０％超、約７５％超、約７０％超、約６５％超、約６０％超、約５５％超、約５０％超、約４５％超、約４０％超、約３５％超、約３０％超、約２５％超、約２０％超、約１５％超、約１０％超を内部移行させることができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣは、オリゴヌクレオチドの約９９％未満、約９８％未満、約９７％未満、約９６％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満を内部移行させることができる。内部移行しなかったオリゴヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｖｏ送達の前に除去してもよい。内部移行しなかったオリゴヌクレオチドはｉｎ  ｖｉｖｏ送達前に除去しなくてもよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の細胞の表面に付着し得る。オリゴヌクレオチドは、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ以外の細胞により内部移行され得る。
【００３０】
１つの非限定的な例では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号４として記載されているヌクレオチド配列を有してよい。１つの非限定的な例では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号５として記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。１つの非限定的な例では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号６として記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。１つの非限定的な例では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号７として記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。１つの非限定的な例では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号４、５、６、および７として記載されているヌクレオチド配列の組合せを含んでよい。当該方法は、ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、またはそれらの組合せを含めた、小分子、ホルモン、ケモカイン、増殖因子、サイトカインなどの１つまたは複数の物質の存在下でインキュベートするステップをさらに含んでよい。サイトカインなどの１つまたは複数の物質とＤＣのインキュベーションは、ＣＤ４０の結合部位を少なくとも１つ、ＣＤ８０の結合部位を少なくとも１つ、およびＣＤ８６の結合部位を少なくとも１つ含有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドとのインキュベーションの前に、またはそれと同時に行うことができる。ＤＣなどの細胞におけるＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６などのマーカーの発現は、１つまたは複数の結合部位に阻害性ＲＮＡが結合すると阻害され得る。下記のオリゴヌクレオチドのいずれも、開示されている方法で使用することができる。
【００３１】
増殖ステップ、インキュベーションステップ、および培養ステップは、培養デバイスで行うことができる。培養デバイスは、開放系であってよい。培養デバイスは、閉鎖系であってよい。培養デバイスは、自動系であってよい。培養デバイスは自動系でなくてよい。培養デバイスは滅菌条件で保持することができる。培養デバイスは、臨床の状況下であってよい。自動培養系としては、例えば、ＴＡＰ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＳｅｌｅｃｔ、Ｃｅｌｌｏ、Ｐｉｃｃｏｌｏ、およびＣｅｌｌｍａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＨａｍｉｌｔｏｎのＣｅｌｌ  Ｈｏｓｔ、ＴｅｒｕｍｏＢＣＴのＱｕａｎｔｕｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ、Ｌｏｇｏｓ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＣＥＬＦ、Ａａｓｔｒｏｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＲｅｐｌｉｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ、およびその他を挙げることができる。非自動培養系としては、組織培養プレート、処理済みペトリ皿、およびその他を挙げることができる。
【００３２】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、約０．００１μＭ〜約２０μＭ、例えば、約１〜約１５μＭなど、例えば、約１μＭ〜約５μＭなど、例えば、約３μＭ〜約４μＭなど、例えば、約０．００１μＭ、約０．０１μＭ、約０．１μＭ、約０．５μＭ、約１．０μＭ、約１．５μＭ、約２．０μＭ、約２．５μＭ、約３．０μＭ、約３．１μＭ、約３．２μＭ、約３．３μＭ、約３．４μＭ、約３．５μＭ、約４．０μＭ、約４．５μＭ、約５．０μＭ、約６．０μＭ、約７．０μＭ、約８．０μＭ、約９．０μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、または約２０μＭなどの濃度でＤＣ培養物に添加することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、約０．００１μＭ超、約０．０１μＭ超、約０．１μＭ超、約０．５μＭ超、約１．０μＭ超、約１．５μＭ超、約２．０μＭ超、約２．５μＭ超、約３．０μＭ超、約３．１μＭ超、約３．２μＭ超、約３．３μＭ超、約３．４μＭ超、約３．５μＭ超、約４．０μＭ超、約４．５μＭ超、約５．０μＭ超、約６．０μＭ超、約７．０μＭ超、約８．０μＭ超、約９．０μＭ超、約１０μＭ超、約１５μＭ超、または約２０μＭ超の濃度でＤＣ培養物に添加することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、約０．００１μＭ未満、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ未満、約０．５μＭ未満、約１．０μＭ未満、約１．５μＭ未満、約２．０μＭ未満、約２．５μＭ未満、約３．０μＭ未満、約３．１μＭ未満、約３．２μＭ未満、約３．３μＭ未満、約３．４μＭ未満、約３．５μＭ未満、約４．０μＭ未満、約４．５μＭ未満、約５．０μＭ未満、約６．０μＭ未満、約７．０μＭ未満、約８．０μＭ未満、約９．０μＭ未満、約１０μＭ未満、約１５μＭ未満、または約２０μＭ未満の濃度でＤＣ培養物に添加することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、同じ濃度でＤＣ培養物に添加することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドについて異なる濃度でＤＣ培養物に添加することができる。
【００３３】
ＤＣは、組織から単離することができる。ＤＣを単離するための組織のいくつかの非限定的な例としては、肝臓、脾臓、骨髄、末梢血、胸腺、リンパ節、膵臓、およびその他の組織またはそれらの任意の組合せを挙げることができる。組織、例えば、末梢血は、注射器によって採取することができる。組織、例えば、骨髄は、組織生検によって採取することができる。組織、例えば、膵臓は、完全な器官切除によって採取することができる。
【００３４】
ＤＣの単離は、当業者に公知の任意の技法によって達成することができる。例えば、ＤＣは、前駆体から生成することができる。ＤＣは、実施例の節に記載の方法に従って被験体またはドナーから単離することができる。生成したら、ＤＣを当業者に公知の任意の適切な細胞培養技法によって増殖させることができる。例えば、ＤＣは、本明細書の実施例の節の方法に従って増殖させることができる。
【００３５】
宿主における寛容原性を増強するための方法は、ａ）単離された組織由来の未成熟ＤＣを増殖させるステップと、ｂ）ＤＣを、ＣＤ４０の結合部位を少なくとも１つ有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＤ８０の結合部位を少なくとも１つ有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＣＤ８６の結合部位を少なくとも１つ有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒に、ＤＣが１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを内部移行させる条件下でインキュベートするステップと、ｃ）オリゴヌクレオチドを含むＤＣを培養するステップと、ｄ）オリゴヌクレオチドを含むＤＣを哺乳動物宿主に有効量で投与するステップとを含んでよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号４で記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号５で記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号６で記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、配列番号７で記載されているヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。当該方法は、ＤＣを、ＣＤ４０の結合部位を少なくとも１つ、ＣＤ８０の結合部位を少なくとも１つ、およびＣＤ８６の結合部位を少なくとも１つ含有する１つまたは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートする前に、またはそれと同時に、１つまたは複数の小分子、ホルモン、タンパク質、ペプチド、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４、またはそれらの組合せなどの存在下でインキュベートするステップをさらに含んでよい。
【００３６】
宿主における寛容原性の増強は、１つまたは複数の実体（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、レチノイン酸（ＲＡ）、トランスホーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β））を、その後に被験体に有効量で注射することができる集団であるｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ集団に送達することを含んでよい。１つまたは複数の実体は、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ集団における前記実体の受容体媒介性内部移行を増強するように改変され得る。１つまたは複数の実体は、粒子にコーティングするか、粒子に付着させるか、粒子中に包埋するか、粒子全体を覆わせるか、粒子に共有結合により連結するか、または粒子に物理的に封入し、そしてｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ集団に送達することができる。粒子は、リポソーム、マイクロスフェア、ナノスフェアなどであってよい。一部の実施形態では、粒子および内部移行した実体を含有するＤＣ集団を被験体に有効量で同時注射することができる。粒子および内部移行した粒子を含有するＤＣ集団を被験体に有効量で同時注射することができる。粒子および寛容原性ＤＣ集団を被験体に有効量で同時注射することができる。粒子および未成熟ＤＣ集団を被験体に有効量で同時注射することができる。粒子およびｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣ集団を被験体に有効量で同時注射することができる。
【００３７】
「約」という用語は、本明細書で使用される場合および本開示全体を通して、一般に、別段の指定がない限り、特定の使用の状況の中で、規定された数値を１５％上回るまたは１５％下回る範囲を指す。例えば、「約１０」は、８．５から１１．５までの範囲を含むことになる。
【００３８】
オリゴヌクレオチド
本開示の方法、組成物、およびキットは、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６一次転写産物ならびにそれらの組合せからなる群より選択される一次転写産物に対してアンチセンスであり、それへの結合に標的化されるオリゴヌクレオチド、またはＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６を標的化する実際にあらゆる他のオリゴヌクレオチドなどの実体を含んでよい。ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）に特異的に結合する任意の型のアンチセンス化合物の使用が意図されている。いくつかの例では、薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子阻害（ｓｉ）ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、またはＣＤ４０、ＣＤ８０、もしくはＣＤ８６をコードするＲＮＡに特異的なリボザイム、またはそれらの組合せから選択されるアンチセンス化合物である。
【００３９】
アンチセンス化合物は、標的ヌクレオチド配列と相補的であり、それに特異的に結合する化合物を設計することによって調製することができる。アンチセンス化合物は、標的核酸分子と特異的に結合するのに標的核酸分子と１００％相補的である必要はない。例えば、アンチセンス化合物、または二本鎖化合物の場合は化合物のアンチセンス鎖は、選択された標的核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％相補的であってよい。アンチセンス化合物、または化合物のアンチセンス鎖は、選択された標的核酸配列よりもわずかに長くてよい、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０塩基対（ｂｐ）長くてよい。アンチセンス化合物、または化合物のアンチセンス鎖は、選択された標的核酸配列よりもわずかに短くてよい、例えば、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０塩基対（ｂｐ）短くてよい。アンチセンス化合物を特異性についてスクリーニングする方法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許出願公開第２００３−０２２８６８９号を参照されたい）。
【００４０】
ヒトＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードする例示的な核酸配列が以下に提供される：
【００４１】
【化１】
0006595469.tif 000002
【００４２】
【化２】
0006595469.tif 000003
【００４３】
【化３】
0006595469.tif 000004
【００４４】
【化４】
0006595469.tif 000005
ヒトＣＤ４０、ヒトＣＤ８０、およびヒトＣＤ８６をコードする例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に提供される：
【００４５】
【化５】
0006595469.tif 000006
一部の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的への特異的な結合、および遺伝子発現の調節を可能にするための任意の適切な長さであってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、変動し得るが、一般には、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０ヌクレオチドを含めた、約１５〜約４０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約２０〜約３５ヌクレオチドの長さである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその類似体であってよい。さらに、本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは修飾されていないものであってもよく、修飾されたヌクレオシド間結合、修飾された糖部分、修飾された塩基、またはそれらの組合せなどの１つまたは複数の修飾を含んでもよい。オリゴヌクレオチド修飾は、下で詳述されている。
【００４６】
他の実施形態では、アンチセンス化合物は、ｓｉＲＮＡ分子である。開示されている方法に有用なｓｉＲＮＡとしては、約１７ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドまでの長さ、好ましくは約２０ヌクレオチドから約３５ヌクレオチドまでの長さ、例えば、約２５〜約３２ヌクレオチドの長さなどの短い二本鎖ＲＮＡが挙げられる。この文脈では、「約」とは、１ヌクレオチド以内を示す。ｓｉＲＮＡは、標準のワトソン−クリック塩基対合相互作用によって一緒にアニーリングしたセンスＲＮＡ鎖と、相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖で構成される。センス鎖は、標的ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６遺伝子産物に含有される核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。いくつかの非限定的な例では、標的配列と「実質的に同一」であるｓｉＲＮＡ核酸配列とは、標的配列と同一である核酸配列、または標的配列と１ヌクレオチド、２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドが異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含んでもよく、一本鎖「ヘアピン」領域で分離された２つの相補的な部分（これらは塩基対合している）を有する単一分子であってもよい。
【００４７】
ｓｉＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡとは１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更によって異なる、変更されたＲＮＡであってもよい。そのような変更は、ｓｉＲＮＡの末端の一方もしくは両方への、またはｓｉＲＮＡの１つもしくは複数の内部ヌクレオチドへの非ヌクレオチド材料の付加；ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して抵抗性にする修飾；またはｓｉＲＮＡ内の１つまたは複数のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドでの置換を含んでよい。ｓｉＲＮＡの一方の鎖または両方の鎖は、３’突出部も含んでよい。本明細書で使用される場合、「３’突出部」とは、２重鎖ＲＮＡ鎖の３’末端から伸びた少なくとも１つの対合していないヌクレオチドを指す。したがって、ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１ヌクレオチドから約６ヌクレオチドまで（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む）の長さ、１ヌクレオチドから約５ヌクレオチドまでの長さ、１ヌクレオチドから約４ヌクレオチドまでの長さ、または約２ヌクレオチドから約４ヌクレオチドまでの長さの３’突出部を少なくとも１つ含む。特定の実施形態では、３’突出部はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチドの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）またはジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’突出部を含んでよい。
【００４８】
他の実施形態では、アンチセンス化合物は、リボザイムである。リボザイムは、ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６遺伝子産物の連続した核酸配列と相補的であり、この遺伝子産物を特異的に切断することができる基質結合性領域を有する核酸分子である。基質結合性領域は、標的ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６遺伝子産物と１００％相補的である必要はない。例えば、基質結合性領域は、ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６遺伝子産物内の連続した核酸配列と、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９５％相補的であってよい。酵素の核酸も、塩基、糖、および／またはリン酸基に修飾を含んでよい。
【００４９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびリボザイムなどのアンチセンス化合物は、化学的または生物学的に作製することもでき、組換えプラスミドまたはウイルスベクターから発現させることもできる。アンチセンス化合物を作製し、試験するための例示的な方法は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号および同第４，９８７，０７１号；米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号および同第２００４／００１８１７６号；SteinおよびCheng、Science２６１巻：１００４頁、１９９３年；WernerおよびUhlenbeck、Nucl. Acids Res. ２３巻：２０９２〜２０９６頁、１９９５年；Hammannら、AntisenseおよびNucleic Acid Drug Dev. ９巻：２５〜３１頁を参照されたい）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０、ＣＤ８０またはＣＤ８６のｍＲＮＡ発現を、ビヒクルで処理した対照、すなわち、トランスフェクション用薬剤およびＰＢＳビヒクルのみに曝露したが、アンチセンスオリゴヌクレオチドには曝露していない細胞を用いて見られるものに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％，７５％、８０％、９０％または９５％、特異的に阻害することができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７として記載されている核酸配列およびそれらの組合せからなる群より選択することができる。ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に対して約１５ヌクレオチドの配列にわたって約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％配列相同性を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドも本開示の方法、組成物、およびキットに使用することができる。ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に対して約１５ヌクレオチドの配列にわたって約７０％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、または約９９％超の配列相同性を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドも本開示の方法、組成物、およびキットに使用することができる。ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に対して約１５ヌクレオチドの配列にわたって約７０％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９６％未満、約９７％未満、約９８％未満、または約９９％配列相同性を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドも本開示の方法、組成物、およびキットに使用することができる。
【００５１】
本開示の種々の態様では、寛容原性を誘導するための樹状細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、樹状細胞をアンチセンス転写産物と接触させることによって、または樹状細胞を、アンチセンス転写産物を含有する粒子と接触させることによって行うことができる。受容体エンドサイトーシスにより、樹状細胞による裸のアンチセンスまたは粒子の取り込みが媒介され得る。オリゴヌクレオチドは、受容体媒介性エンドサイトーシスを増強するように修飾することができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、樹状細胞が食作用を行う粒子の表面に結合させること、コーティングすること、または封入することができる。
【００５２】
ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６の転写産物を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの特定の例は、本明細書における実施例に開示されている。追加的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の効果を達成するためにＣＤ４０、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６転写産物の結合において有効であるように設計することができる。そのようなオリゴヌクレオチドには、これだけに限定されないが、チオ化（ｔｈｉｏａｔｉｏｎ）、メチル化およびメトキシエチル化を含めた、当技術分野で公知の修飾を組み入れることができ、そのような修飾の位置および数は、最適な効果を達成するために変動させることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、樹状細胞集団において免疫寛容を誘導するように設計することができる。
【００５３】
オリゴヌクレオチドは、短い一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよい。オリゴヌクレオチドはＤＮＡの断片であってよい。オリゴヌクレオチドは、プライマー配列であってよい。オリゴヌクレオチドは、特異的な配列と相補的であってよい。オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、アプタマーであってよい。オリゴヌクレオチドは、修飾されていないものであってよい。修飾された形態のオリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド間結合を少なくとも１つ有するオリゴヌクレオチドを含んでよい。「修飾された形態」のオリゴヌクレオチドとしては、限定することなく、修飾されたヌクレオシド間結合および／または修飾塩基が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、非天然骨格を有するモルホリノであってよい。
【００５４】
オリゴヌクレオチドは、全てまたは一部ペプチド核酸であってよい。他の修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート連結を少なくとも１つを含んでよい。さらに他の修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のユニバーサル塩基を有するものを含んでよい。「ユニバーサル塩基」とは、著しく構造を不安定化することなく水素結合を形成することによって、核酸におけるＡ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵのいずれか１つとの結合を置換することができる分子を指し得る。
【００５５】
オリゴヌクレオチドの特定の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するものを挙げることができる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格内にリン原子を保持するもの、および骨格内にリン原子を含まない可能性があるものを含んでよい。それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない可能性がある修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内に入るとみなすことができる。
【００５６】
修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネートおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めた他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよび通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、および、１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’−３’連結、５’−５’連結または２’−２’連結である、逆極性を有するものを含めた、リン原子を含有してよい。最も３’末端側にある（3'-most）ヌクレオチド間結合における単一の３’−３’連結、すなわち、脱塩基であってよい（ヌクレオチドが欠けているまたはその位置にヒドロキシル基を有する）単一の逆位ヌクレオシド残基を含む逆極性を有するオリゴヌクレオチドも意図され得る。塩、混合塩および遊離酸の形態も意図され得る。
【００５７】
修飾オリゴヌクレオチドは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されていてよい骨格を有してよい。これらは、モルホリノ連結；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成部分を有するその他を有するものを含んでよい。
【００５８】
修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド単位の１つもしくは複数の糖および／または１つもしくは複数のヌクレオチド間結合の両方を「天然に存在しない」基で置き換えることができる、オリゴヌクレオチド模倣物を含んでよい。オリゴヌクレオチドの塩基は、標的ポリヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））とのハイブリダイゼーションのために維持することができる。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格をアミド含有骨格で置き換えることができる。
【００５９】
ホスホロチオエート骨格、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドを有し、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含むオリゴヌクレオチドをもたらすことができる。様々な形態で、オリゴヌクレオチド内の２つの連続した単量体間の連結は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、Ｓｉ（Ｒ’’）２−、−ＳＯ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｐ（Ｏ）２−、−ＰＯ（ＢＨ３）−、−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−、−Ｐ（Ｓ）２−、−ＰＯ（Ｒ’’）−、−ＰＯ（ＯＣＨ３）−、および−ＰＯ（ＮＨＲＨ）（式中、ＲＨは、水素およびＣ１〜４アルキルから選択され、Ｒ’’はＣ１〜６アルキルおよびフェニルから選択される）から選択される２つ〜４つ、いくつかの場合には３つの基／原子からなってよい。そのような連結の実例は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−、Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝（後続の単量体との連結として使用される場合、Ｒ５を含める）、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＮＲＨ−ＣＯ−Ｏ−、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＮＲＨ、ＮＲＨ−ＣＳ−ＮＲＨ、ＮＲＨ−Ｃ（＝ＮＲＨ）−ＮＲＨ、ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＯ−ＮＲＨ、−ＮＲＨ−ＣＯ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲＨ、ＣＨ＝ＮＨ、ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ＝（後続の単量体との連結として使用される場合、Ｒ５を含める）、−ＣＨ２−Ｏ−ＮＲＨ−、−ＣＯ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＮＲＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲＨ、−Ｏ−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ＝（後続の単量体との連結として使用される場合、Ｒ５を含める）、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＳＯ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＳＯ−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＮＲＨ−、−ＮＲＨ−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２−；−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）２−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ，Ｓ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）２−Ｓ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＯＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｒ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＢＨ３）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−、��Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−ＮＲＨＨ−、−ＮＲＨ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ’’）２−Ｏ−；中でも、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＲＨ−、−ＣＨ２−ＮＲＨ−Ｏ−、−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）２−Ｏ−Ｐ（−Ｏ，Ｓ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）２−Ｏ−、−ＮＲＨＰ（Ｏ）２−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ，ＮＲＨ）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（Ｒ’’）−Ｏ−、−Ｏ−ＰＯ（ＣＨ３）−Ｏ−、および−Ｏ−ＰＯ（ＮＨＲＮ）−Ｏ−（式中、ＲＨは、水素およびＣ１〜４アルキルから選択することができ、Ｒ’’は、Ｃ１〜６アルキルおよびフェニルから選択することができる）である。
【００６０】
修飾オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の置換された糖部分も含有してよい。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含んでよい：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されていても置換されていなくてもよいＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである。他の実施形態は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２（式中、ｎおよびｍは１から約１０までであってよい）を含んでよい。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含んでよい：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール（ａｌｋａｒｙｌ）、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、および同様の性質を有する他の置換基。一態様では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含んでよい。他の修飾は、本明細書の実施例にも記載されている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含んでよい。
【００６１】
さらに他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含んでよい。２’−修飾は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位のものであってよい。一態様では、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾をオリゴヌクレオチド上の他の位置において、例えば、３’末端ヌクレオチドまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチドの糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位において行うこともできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有してもよい。
【００６２】
一態様では、糖の修飾は、２’−ヒドロキシル基を糖環の３’または４’炭素原子に連結し、それにより、二環性糖部分を形成することができる、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでよい。ある特定の態様では、連結は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であってよく、ここで、ｎは１または２であってよい。
【００６３】
オリゴヌクレオチドは、塩基の修飾または置換も含んでよい。本明細書で使用される場合、「修飾されていない」または「天然の」塩基としては、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を挙げることができる。修飾塩基としては、他の合成塩基および天然塩基、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよび他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−プロピルおよび他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンならびに他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、６−アゾシトシンおよび６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどを挙げることができる。さらなる修飾塩基としては、三環ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシン）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などを挙げることができる。修飾塩基は、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置き換えられたものも含んでよい。ある特定のこれらの塩基は、結合親和性を増大させることに有用であってよく、それらとして、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めた、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２置換プリン、Ｎ−６置換プリンおよびＯ−６置換プリンを挙げることができる。５−メチルシトシン置換により、核酸２重鎖安定性が０．６〜１．２℃増大することが示されており、ある特定の態様では、この置換を２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせることができる。
【００６４】
「修飾塩基」または他の同様の用語は、天然の塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、および／またはチミン）と対合することが可能であり、かつ／または、天然に存在しない塩基と対合することが可能な組成物を示し得る。ある特定の態様では、修飾塩基により、１５、１２、１０、８、６、４、または２℃またはそれ未満の示差的なＴｍがもたらされ得る。
【００６５】
「核酸塩基」とは、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）ならびに、天然に存在しない核酸塩基、例えば、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび「天然に存在しない」核酸塩基などを指し得る。したがって、核酸塩基という用語は、公知のプリン複素環およびピリミジン複素環だけでなく、それらの複素環類似体および互変異性体も包含する。さらなる天然に存在する核酸塩基および天然に存在しない核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号（Meriganら）、第１５章、Sanghvi、Antisense Research and Application、S. T.CrookeおよびB. Lebleu編、CRC Press、１９９３年、Englischら、Angewandte Chemie、International Edition、１９９１年、３０巻、６１３〜７２２頁に開示されているものが挙げられる。「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」という用語は、さらに、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基としての機能を果たし得るある特定の「ユニバーサル塩基」を含めた、核酸塩基として機能し得る複素環化合物などの化合物を含むことが意図されている場合がある。特に、ユニバーサル塩基として言及されるものは、３−ニトロピロール、任意選択で置換されているインドール（例えば、５−ニトロインドール）、および任意選択で置換されているヒポキサンチンであってよい。他の望ましいユニバーサル塩基としては、当技術分野で公知のユニバーサル塩基を含めた、ピロール誘導体、ジアゾール誘導体またはトリアゾール誘導体を挙げることができる。
【００６６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１カ所の塩基の位置において修飾されたものであってよい。オリゴヌクレオチドは、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、８カ所、９カ所、１０カ所またはそれ超の塩基の位置において修飾されたものであってよい。本発明では、結果生じるオリゴヌクレオチドがその標的転写産物に結合する能力を保持することができる限りは、あらゆる修飾を意図することができる。
【００６７】
粒子
本開示の方法、組成物、デバイス、およびキットは、ポリマー性マイクロスフェアおよびポリマー性ナノスフェアおよび他の型の粒子を含めた任意の適切な粒子と一緒に使用することができる。粒子は、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞、染色体、オリゴヌクレオチド、生体分子、ＤＮＡ、ＲＮＡなどを含めた種々の実体を局在化させるまたは分配するために役立ち得る。オリゴヌクレオチドとしては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどを挙げることができる。タンパク質としては、増殖因子、サイトカイン（例えば、トランスホーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β））、ケモカインなどを挙げることができる。生体分子としては、細胞培地成分、血清、抗生物質、抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）、標識部分（例えば、蛍光、磁気）などを挙げることができる。種々の実体は、粒子の表面に付随させることもでき、粒子の表面に直接張り付けることもでき、粒子の表面に他のオリゴヌクレオチド配列を通じて張り付けることもでき、粒子の表面にペプチド配列を通じて張り付けることもでき、粒子全体を覆わせることもでき、化学結合を通じて粒子に直接カップリングすることもできる。培地成分、血清、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、生体分子などを含めた他の実体は、粒子全体を覆わせることができる。
【００６８】
粒子は、固体表面としての機能を果たし得る。固体表面は、剛性であっても可撓性であってもよい。固体表面は多孔質であっても非多孔質であってもよい。固体表面は固体であっても半固体であってもよい。
【００６９】
粒子は、試料を局在化させるために役立ち得る。実体（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、細胞など）は、粒子の表面に付随させることができる。実体は、粒子全体に位置してよい。実体は、粒子に直接付着させることができる。直接付着は、吸着または共有結合もしくはイオン結合などの化学結合を含んでよい。実体は、表面全体、表面の半分、または表面の一部に付随させることができる。実体は、粒子全体に位置してもよく、粒子の半分に位置してもよく、粒子の一部に位置してもよい。
【００７０】
粒子の特性
本開示の方法、組成物、およびキットは、任意の適切な粒子と一緒に使用することができる。粒子とは、担体、カプセル剤、小胞、ミセル、マイクロスフェア、微小粒子、ナノスフェア、ナノ粒子などを指し得る。粒子は、多孔質、非多孔質、固体、または中空であってよい。
【００７１】
粒子は、可溶性、破壊可能、または分解可能であってよい。粒子は、可溶性でも分解可能でもなくてもよい。温度またはｐＨの変化により、粒子の破壊または分解が誘発され得る。いくつかの場合には、低ｐＨ酸性条件（例えば、細胞内リソソーム区画およびエンドソーム区画）に曝露された粒子は分解され得る。いくつかの場合には、水溶液に曝露することにより、粒子の破壊または分解が誘発され得る。いくつかの場合には、水溶液に曝露された粒子は、加水分解によって分解され得る。
【００７２】
粒子は、ビーズ（例えば、ゲルビーズ、固体ビーズ、または半固体ビーズ）であってよい。ゲルビーズは、ヒドロゲルビーズであってよい。ゲルビーズは、ポリマー単量体などの分子単量体から形成することができる。半固体ビーズは、リポソームビーズであってよい。半固体ビーズは、脂質などの分子成分から形成することができる。固体ビーズは、金ビーズであってよい。固体ビーズは、ポリスチレンビーズであってよい。ゲルビーズは、材料硬度の範囲内のものであってよい。１つの非限定的な例では、ポリ−エチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー単量体から形成されたゲルビーズは、ＰＥＧビーズよりも硬いビーズであり得るシリカまたはポリスチレンのポリマー単量体から形成されたビーズよりも軟らかい可能性がある。固体ビーズは、酸化鉄、金、および銀を含めた金属から形成されたものであってもよい。
【００７３】
粒子は、個々の単量体の共重合によるポリマーネットワークから形成することができる分子単量体を含有してよい。いくつかの場合には、粒子は、さらに重合させることが可能なプレポリマー、オリゴマーを含有してよい。例えば、プレポリマーを使用してポリウレタンビーズを調製することができる。粒子は、さらに一緒に重合することができる個々のポリマーを含有してよい。
【００７４】
天然のポリマーの例としては、キトサン、デキストラン、コラーゲン、カラギーナン、アガロース、アルギネート、またはその天然のポリマーなどのタンパク質および糖が挙げられる。合成ポリマーの例としては、カルボン酸、酢酸ビニル、アクリルアミド、アクリレート、エチレングリコール、ウレタン、乳酸、シリカ、ポリスチレン、ならびにそのオリゴマーおよびポリマーが挙げられる。粒子は、Ｎ−ビニルピロリドンの単量体から形成することができる。粒子は、ポリビニルピロリドンのポリマーから形成することができる。粒子は、ポリエチレングリコールを含めたエチレンオキシドのポリマーから形成することができる。粒子は、種々の重量比および体積比のポリエチレングリコールおよびポリビニルピロリドンポリマーから形成することができる。粒子は、脂質、ミセル、セラミック、ガラス−セラミック、複合材、金属およびその他を含めた、ポリマー以外の材料から形成することもできる。
【００７５】
分子単量体は、二重結合部位で反応させてオリゴマーまたはポリマーを形成することによってそれら自体と組み合わせることができる。あるいは、分子単量体（例えば、アクリル酸などのポリマー単量体）は、チオール基などの化学修飾可能な基を相当数有する。したがって、ポリマー単量体を化学架橋剤と一緒に特異的に接続してオリゴマーまたはポリマーを形成することができる。
【００７６】
粒子の表面は、修飾を有し得る。粒子の表面は、疎水性、親水性、正荷電、負荷電、非荷電などになるように修飾することができる。粒子の表面は、化学基（例えば、カルボキシル基、チオール基、ジスルフィド基など）が付加されるように化学修飾することができる。
【００７７】
粒子の表面に実体を付着させることができる。実体としては、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞、染色体、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または生体分子（例えば、トランスホーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、レチノイン酸（ＲＡ））を挙げることができる。そのような実体は、共有結合により付着させることもでき、吸着などの他の手段によって付着させることもできる。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドなどの実体は、粒子に物理的に封入することもでき、粒子に包埋することもでき、実体が粒子全体を覆うように個々のポリマー単量体などの粒子成分に直接付着させることもできる。
【００７８】
粒子の作出
被験体における自己免疫性または炎症性の状態を処置するために使用する粒子の作出では、１つ、２つ、３つまたはそれ超の実体（例えば、オリゴヌクレオチド、サイトカイン、生体分子）を、水溶液に溶解させることができ、１つまたは複数の分子単量体（例えば、１つまたは複数の水溶性ポリマー（複数可））および任意選択でポリカチオンと組み合わせることができる。いくつかの場合には、１つ、２つ、３つまたはそれ超のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの場合には、個々のオリゴヌクレオチドを水溶液に溶解させ、各溶液はオリゴヌクレオチドのうちの１つを含有する。次いで、各オリゴヌクレオチドからの個々のアリコートを組み合わせることができる。
【００７９】
１つの非限定的な例では、オリゴヌクレオチドを含有する最終的な溶液は、約１０ｍｇ／ｍｌの各オリゴヌクレオチドを含有してよい。その後、１つ、２つ、３つ、またはそれ超のオリゴヌクレオチドを含有する水溶液を、１つまたは複数の分子単量体（例えば、水溶性ポリマー（複数可））および任意選択でポリカチオンと組み合わせることができる。この溶液をインキュベートすることができ（例えば、約６０〜７０℃で）、冷却することができ（例えば約２３℃に）、過剰なポリマーを除去することができる。
【００８０】
粒子は単分散粒子であってよい。粒子は多分散粒子であってよい。粒子は、分散が約１％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％未満である単分散粒子であってよい。粒子は、分散が約１％、５％、１０％、１５％、２０％、または２５％の単分散粒子であってよい。粒子は、分散が約１０％の単分散粒子であってよい。
【００８１】
マイクロスフェアに関して、核酸は、マイクロスフェアの約３０重量パーセントから約１００重量パーセントを含んでよい。マイクロスフェアの平均粒子サイズは、約０．００１μｍ、約０．０１μｍ、約０．１μｍ、約０．２５μｍ、約０．５μｍ、約０．７５μｍ、約１μｍ、約１．５μｍ、約２μｍ、約２．５μｍ、約３μｍ、約３．５μｍ、約４μｍ、約４．５μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、または約５０μｍであってよい。マイクロスフェアの平均粒子サイズは、約０．００１μｍ超、約０．０１μｍ超、約０．１μｍ超、約０．２５μｍ超、約０．５μｍ超、約０．７５μｍ超、約１μｍ超、約１．５μｍ超、約２μｍ超、約２．５μｍ超、約３μｍ超、約３．５μｍ超、約４μｍ超、約４．５μｍ超、約５μｍ超、約１０μｍ超、約２０μｍ超、約２５μｍ超、約５０μｍまたはそれ超であってよい。マイクロスフェアの平均粒子サイズは、約０．００１μｍ未満、約０．０１μｍ未満、約０．１μｍ未満、約０．２５μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．７５μｍ未満、約１μｍ未満、約１．５μｍ未満、約２μｍ未満、約２．５μｍ未満、約３μｍ未満、約３．５μｍ未満、約４μｍ未満、約４．５μｍ未満、約５μｍ未満、約１０μｍ未満、約２０μｍ未満、約２５μｍ未満、または約５０μｍ未満であってよい。マイクロスフェアの平均粒子サイズは、約２μｍ超でなくてもよい。マイクロスフェアの平均粒子サイズは、約０．５μｍから約２．５μｍの間であってよい。マイクロスフェアの平均粒子サイズは、約１μｍから約１０μｍの間であってよい。
【００８２】
ナノスフェアに関しては、核酸は、典型的には、ナノスフェアの約３０重量パーセントから約１００重量パーセントの間を構成する。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約０．１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７１０ｎｍ、約７２０ｎｍ、約７３０ｎｍ、約７４０ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７６０ｎｍ、約７７０ｎｍ、約７８０ｎｍ、約７９０ｎｍ、約８００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ、または約１０００ｎｍであってよい。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約０．１ｎｍ超、約０．５ｎｍ超、約１ｎｍ超、約５ｎｍ超、約１０ｎｍ超、約１５ｎｍ超、約２０ｎｍ超、約２５ｎｍ超、約３０ｎｍ超、約３５ｎｍ超、約４０ｎｍ超、約４５ｎｍ超、約５０ｎｍ超、約５５ｎｍ超、約６０ｎｍ超、約６５ｎｍ超、約７０ｎｍ超、約７５ｎｍ超、約８０ｎｍ超、約８５ｎｍ超、約９０ｎｍ超、約９５ｎｍ超、約１００ｎｍ超、約１５０ｎｍ超、約２００ｎｍ超、約２５０ｎｍ超、約３００ｎｍ超、約３５０ｎｍ超、約４００ｎｍ超、約４５０ｎｍ超、約５００ｎｍ超、約６００ｎｍ超、約６５０ｎｍ超、約７００ｎｍ超、約７１０ｎｍ超、約７２０ｎｍ超、約７３０ｎｍ超、約７４０ｎｍ超、約７５０ｎｍ超、約７６０ｎｍ超、約７７０ｎｍ超、約７８０ｎｍ超、約７９０ｎｍ超、約８００ｎｍ超、約８５０ｎｍ超、約９００ｎｍ超、約１０００ｎｍまたはそれ超であってよい。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約０．１ｎｍ未満、約０．５ｎｍ未満、約１ｎｍ未満、約５ｎｍ未満、約１０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約８５ｎｍ未満、約９０ｎｍ未満、約９５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約３５０ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約４５０ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約６５０ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約７１０ｎｍ未満、約７２０ｎｍ未満、約７３０ｎｍ未満、約７４０ｎｍ未満、約７５０ｎｍ未満、約７６０ｎｍ未満、約７７０ｎｍ未満、約７８０ｎｍ未満、約７９０ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約８５０ｎｍ未満、約９００ｎｍ未満、または約１０００ｎｍ未満であってよい。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約１０００ｎｍを超えなくてもよい。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約１ｎｍから約５００ｎｍの間であってよい。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約５０ｎｍから約１０００ｎｍの間であってよい。ナノスフェアの平均粒子サイズは、約６５０ｎｍから約９００ｎｍの間、約７００ｎｍから約８５０ｎｍの間、約７１０ｎｍから約８２０ｎｍの間、または約７１６ｎｍから約８１８ｎｍの間であってよい。
【００８３】
粒子製剤は、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％（ｗ／ｗ）またはそれ超の負荷量のオリゴヌクレオチドを含んでよい。そのような実施形態では、組成物のポリ−Ｌ−リシン含有量は、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、または約１０％（ｗ／ｗ）であってよい。さらに、粒子の含水量は変動し得る。いくつかの場合には、含水量は、およそ４％であってよい。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が約１：１：１で存在してよい。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が約１．５：１：１または１：１．５：１または１：１：１．５で存在してよい。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が約２：１：１または１：２：１または１：１：２で存在してよい。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が約３：１：１または１：３：１または１：１：３で存在してよい。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＣＤ４０：アンチセンスＣＤ８０：アンチセンスＣＤ８６の比が約１〜３：１〜３：１〜３で存在してよい。
【００８４】
１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの水溶液は、１つまたは複数のポリカチオンと組み合わせることができる。いくつかの場合には、１つまたは複数のポリカチオンとして、ポリ−リシンおよびポリ−オルニチンを挙げることができる。その他のポリカチオンとして、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、プロラミン、プロタミン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアルギニン、ビニルアミン、および、正荷電キトサンなどの正荷電多糖の誘導体、ならびにそれらの組合せを挙げることができる。ポリカチオン溶液は、ポリカチオン：オリゴヌクレオチドの体積比が約１：１から約４：１までであってよい。一般に使用されるポリカチオンとしては、ポリ−Ｌ−リシン．ＨＢｒ（例えば、最大で約７０，０００ダルトン）およびポリ−Ｌ−オルニチン．ＨＢｒ（例えば、最大で約１１，９００ダルトン）が挙げられる。ポリカチオンは、約１０ｍｇ／ｍｌのストック溶液から１つまたは複数のオリゴヌクレオチドの水溶液に添加することができる。
【００８５】
粒子成分（例えば、ポリマー）は、相分離増強剤として機能し得る。適切なポリマーの例としては、直鎖または分枝ポリマー、コポリマーおよびブロックコポリマーを挙げることができる。これらのポリマーは、水溶性、半水溶性、水混和性、または水混和性溶媒に可溶性であってよい。ポリマーの例としては、種々の分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、およびその他など、ならびに種々の分子量のポロキサマー、例えばポロキサマー１８８およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８などの薬学的に許容される添加剤を挙げることができる。いくつかの場合には、ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）であってよい。他の場合では、ポリマーは、ヒドロキシエチルデンプンであってよい。他の両親媒性のポリマーを単独でまたは組み合わせて使用することができる。相分離増強剤は、プロピレングリコールとエタノールの混合物などの非ポリマーであってもよい。
【００８６】
ポリビニルピロリドンのポリマー溶液および／またはポリエチレングリコールのポリマー溶液を調製し、他の溶液と組み合わせることができる。加熱、冷却、遠心分離および洗浄の個々のステップを１回または複数回繰り返して水性懸濁液をもたらすことができる。生じた水性懸濁液を凍結させ、凍結乾燥して、１つまたは複数の実体（例えば、オリゴヌクレオチド）および１つまたは複数のポリカチオンを含んでもよく、または含まなくてもよい粒子の乾燥粉末を形成することができる。
【００８７】
いくつかの場合には、粒子はすでに形成されていてよい。予め形成された粒子（例えば、カルボキシレートポリスチレンマイクロスフェア、シリカビーズ、ガラスビーズなど）を、表面修飾（例えば、正電荷の付加、負電荷の付加など）に供することができる。表面修飾は、粒子を、全体的な正味の電荷が特異的なペプチドと一緒に、ＤＮＡ分子と一緒に、または他のものと一緒にインキュベートして、全体的な正味の電荷を変更することを含んでよい。その後、実体を粒子に、吸着によって、共有結合もしくはイオン結合によって直接付着させるか、またはペプチド（例えば、Ｏ１０Ｈ６ペプチド）との連結もしくは粒子表面に予め付着させたＤＮＡ分子を介して間接的に付着させることができる。
【００８８】
送達用の粒子
粒子は、注射可能な経路によるｉｎ  ｖｉｖｏ送達に適し得る。注射可能な経路としては、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、硬膜外、動脈内、関節内などを挙げることができる。実施することができる他の送達経路としては、局部、経口、直腸、鼻、肺、膣、頬側、舌下、経皮、経粘膜、眼または眼内が挙げられる。送達経路は、注射器による（ｓｙｒｉｎｇａｂｌｅ）送達であってよい。したがって、いくつかの場合には、粒子を注射器に吸引し、細い針を通じて注射することができる。
【００８９】
いかなる特定の理論にも縛られることなく、本明細書において例示されている１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含有する粒子により、樹状細胞集団における特異的な細胞表面分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）を下方制御することができると考えられる。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養した未成熟ＤＣは、ＤＣ培養物に添加された粒子を能動的に取り込み得る。いくつかの場合には、粒子を、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養したＤＣ（例えば、未成熟ＤＣ、対照ＤＣ、寛容原性ＤＣ、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを用いて処理したＤＣ、１つまたは複数の粒子を用いて処理したＤＣ、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せを用いて処理したＤＣ）と共送達し、共送達されたＤＣは、粒子を、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達（例えば、注射器による注射）の前に、その間に、その後に、またはそれらの任意の組合せで能動的に取り込み得る。いくつかの場合には、内在性樹状細胞集団は、オリゴヌクレオチドを含有する粒子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達（例えば、注射器による注射）後に能動的に取り込み得る。いくつかの場合には、共送達されたＤＣおよび内在性ＤＣの両方が、粒子を、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達（例えば、注射器による注射）後に能動的に取り込み得る。そのような実施形態では、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドにより、内在性樹状細胞集団および共送達された樹状細胞集団における細胞表面細胞分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）の発現を抑制することができる。哺乳動物において１型糖尿病発生後にこれらのオリゴヌクレオチドを含有する粒子を投与することにより、糖尿病を逆転させることができる、糖尿病を低減することができる、残存するベータ細胞の生存を促進することができる、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで低下させることができる、抑制性Ｂ細胞集団を増大させることができる、寛容原性ＤＣ集団を増大させることができる、Ｔ細胞集団を減少させることができる、ＤＣ集団におけるＲＡ産生を増加させることができるなどである。
【００９０】
注射
本開示の方法、組成物、およびキットでは、樹状細胞および／または粒子を注射によって送達することができる。これらの注射は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、硬膜外、動脈内、関節内、結節内（例えば、流入領域リンパ節に直接）などを含めた任意の経路によって行うことができる。
【００９１】
注射は、流動相を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相内に固体懸濁液を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相内に半固体懸濁液を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相内にゲル懸濁液を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相に懸濁させた１つまたは複数の細胞を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相に懸濁させた１つまたは複数の粒子を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相に懸濁させた１つまたは複数の粒子および１つまたは複数の細胞を含んでよい。いくつかの場合には、注射は、流動相内に溶液中の１つまたは複数の実体（例えば、細胞、培地、血清、増殖因子、サイトカイン、生体分子など）を含んでよい。
【００９２】
被験体は、各注射部位において約０．０５×１０６個、約０．１×１０６個、約０．１５×１０６個、約０．２×１０６個、約０．２５×１０６個、約０．３×１０６個、約０．４×１０６個、約０．５×１０６個、約０．６×１０６個、約０．７×１０６個、約０．８×１０６個、約０．９×１０６個、約０．０５×１０７個、約０．１×１０７個、約０．１５×１０７個、約０．２×１０７個、約０．２５×１０７個、約０．３×１０７個、約０．４×１０７個、約０．５×１０７個、約０．６×１０７個、約０．７×１０７個、約０．８×１０７個、約０．９×１０７個、約０．０５×１０８個、約０．１×１０８個、約０．１５×１０８個、約０．２×１０８個、約０．２５×１０８個、約０．３×１０８個、約０．４×１０８個、約０．５×１０８個、約０．６×１０８個、約０．７×１０８個、約０．８×１０８個、または約０．９×１０８個の細胞を受けることができる。被験体は、各注射部位において、約０．０５×１０６個超、約０．１×１０６個超、約０．１５×１０６個超、約０．２×１０６個超、約０．２５×１０６個超、約０．３×１０６個超、約０．４×１０６個超、約０．５×１０６個超、約０．６×１０６個超、約０．７×１０６個超、約０．８×１０６個超、約０．９×１０６個超、約０．０５×１０７個超、約０．１×１０７個超、約０．１５×１０７個超、約０．２×１０７個超、約０．２５×１０７個超、約０．３×１０７個超、約０．４×１０７個超、約０．５×１０７個超、約０．６×１０７個超、約０．７×１０７個超、約０．８×１０７個超、約０．９×１０７個超、約０．０５×１０８個超、約０．１×１０８個超、約０．１５×１０８個超、約０．２×１０８個超、約０．２５×１０８個超、約０．３×１０８個超、約０．４×１０８個超、約０．５×１０８個超、約０．６×１０８個超、約０．７×１０８個超、約０．８×１０８個超、約０．９×１０８個超の細胞を受けることができる。被験体は、各注射部位において、約０．０５×１０６個未満、約０．１×１０６個未満、約０．１５×１０６個未満、約０．２×１０６個未満、約０．２５×１０６個未満、約０．３×１０６個未満、約０．４×１０６個未満、約０．５×１０６個未満、約０．６×１０６個未満、約０．７×１０６個未満、約０．８×１０６個未満、約０．９×１０６個未満、約０．０５×１０７個未満、約０．１×１０７個未満、約０．１５×１０７個未満、約０．２×１０７個未満、約０．２５×１０７個未満、約０．３×１０７個未満、約０．４×１０７個未満、約０．５×１０７個未満、約０．６×１０７個未満、約０．７×１０７個未満、約０．８×１０７個未満、約０．９×１０７個未満、約０．０５×１０８個未満、約０．１×１０８個未満、約０．１５×１０８個未満、約０．２×１０８個未満、約０．２５×１０８個未満、約０．３×１０８個未満、約０．４×１０８個未満、約０．５×１０８個未満、約０．６×１０８個未満、約０．７×１０８個未満、約０．８×１０８個未満、約０．９×１０８個未満の細胞を受けることができる。
【００９３】
被験体は、１回または複数回の処置のそれぞれにおいて、約０．５×１０７個、約０．１×１０７個、約０．１５×１０７個、約０．２×１０７個、約０．２５×１０７個、約０．３×１０７個、約０．４×１０７個、約０．４５×１０７個、約０．５×１０７個、約０．６×１０７個、約０．７５×１０７個、約０．８×１０７個、約０．９×１０７個、約１．０×１０７個、約１．２×１０７個、または約１．６×１０７個の細胞を受けることができる。被験体は、１回または複数回の処置のそれぞれにおいて、約０．５×１０７個超、約０．１×１０７個超、約０．１５×１０７個超、約０．２×１０７個超、約０．２５×１０７個超、約０．３×１０７個超、約０．４×１０７個超、約０．４５×１０７個超、約０．５×１０７個超、約０．６×１０７個超、約０．７５×１０７個超、約０．８×１０７個超、約０．９×１０７個超、約１．０×１０７個超、約１．２×１０７個超、または約１．６×１０７個超の細胞を受けることができる。被験体は、１回または複数回の処置のそれぞれにおいて、約０．５×１０７個未満、約０．１×１０７個未満、約０．１５×１０７個未満、約０．２×１０７個未満、約０．２５×１０７個未満、約０．３×１０７個未満、約０．４×１０７個未満、約０．４５×１０７個未満、約０．５×１０７個未満、約０．６×１０７個未満、約０．７５×１０７個未満、約０．８×１０７個未満、約０．９×１０７個未満、約１．０×１０７個未満、約１．２×１０７個未満、または約１．６×１０７個未満の細胞を受けることができる。
【００９４】
被験体は、約１×１０５個から約６．４×１０７個の間の総細胞数を受けることができる。被験体は、約１×１０５個から約６．４×１０７個の間よりも多くの総細胞数を受けることができる。被験体は、約１×１０５個から約６．４×１０７個の間よりも少ない総細胞数を受けることができる。いくつかの非限定的な例では、被験体は、１回または複数回の処置のそれぞれにおいて、約１×１０６個から約３×１０６個の間の細胞、または約１×１０６個から約５×１０６個の間の細胞、または約８×１０５個から約４×１０６個の間の細胞を受けることができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、処置の過程にわたるその後の細胞の注射の回数を決定することができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、処置の過程にわたる細胞の注射の回数を変更することができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、注射当たりの細胞の総量、処置の過程にわたる細胞の注射の頻度、注射当たりの細胞の濃度、または被験体が受ける細胞の注射の解剖学的位置を変更することができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、注射の組成を変更することができる。
【００９５】
被験体は、注射当たり約０．００００１ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．７５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．２５ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２．７５ｍｇ／ｋｇ、約３．０ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４．０ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、または約５．０ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）の粒子を受けることができる。被験体は、注射当たり約０．００００１ｍｇ／ｋｇ超、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ超、約０．００１ｍｇ／ｋｇ超、約０．０１ｍｇ／ｋｇ超、約０．１ｍｇ／ｋｇ超、約０．２５ｍｇ／ｋｇ超、約０．５ｍｇ／ｋｇ超、約０．７５ｍｇ／ｋｇ超、約１．０ｍｇ／ｋｇ超、約１．２５ｍｇ／ｋｇ超、約１．５ｍｇ／ｋｇ超、約１．７５ｍｇ／ｋｇ超、約２ｍｇ／ｋｇ超、約２．２５ｍｇ／ｋｇ超、約２．５ｍｇ／ｋｇ超、約２．７５ｍｇ／ｋｇ超、約３．０ｍｇ／ｋｇ超、約３．５ｍｇ／ｋｇ超、約４．０ｍｇ／ｋｇ超、約４．５ｍｇ／ｋｇ超、約５．０ｍｇ／ｋｇ超（乾燥重量）の粒子を受けることができる。被験体は、注射当たり約０．００００１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．００１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．０１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．２５ｍｇ／ｋｇ未満、約０．５ｍｇ／ｋｇ未満、約０．７５ｍｇ／ｋｇ未満、約１．０ｍｇ／ｋｇ未満、約１．２５ｍｇ／ｋｇ未満、約１．５ｍｇ／ｋｇ未満、約１．７５ｍｇ／ｋｇ未満、約２ｍｇ／ｋｇ未満、約２．２５ｍｇ／ｋｇ未満、約２．５ｍｇ／ｋｇ未満、約２．７５ｍｇ／ｋｇ未満、約３．０ｍｇ／ｋｇ未満、約３．５ｍｇ／ｋｇ未満、約４．０ｍｇ／ｋｇ未満、約４．５ｍｇ／ｋｇ未満、または約５．０ｍｇ／ｋｇ未満（乾燥重量）の粒子を受けることができる。被験体は、注射当たり約２ｍｇ／ｋｇ（乾燥重量）の粒子を受けることができる。
【００９６】
被験体は、粒子の注射を１週間当たり約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回受けることができる。被験体は、粒子の注射を１週間当たり約１回超、約２回超、約３回超、約４回超、約５回超、約６回超、約７回超受けることができる。被験体は、粒子の注射を１週間当たり約１回未満、約２回未満、約３回未満、約４回未満、約５回未満、約６回未満、約７回未満受けることができる。被験体は、粒子を細胞の注射のそれぞれと共に受けることができる。この場合、被験体は、粒子を上に開示されている細胞の注射スケジュールと同等の頻度で受けることができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、処置の過程にわたるその後の粒子の注射の回数を決定することができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、処置の過程にわたる粒子の注射の回数を変更することができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、注射当たりの粒子の総量、処置の過程にわたる粒子の注射の頻度、注射当たりの粒子の濃度、または被験体が受ける粒子の注射の解剖学的位置を変更することができる。いくつかの場合には、蛍光イメージング結果により、注射の組成を変更することができる。
【００９７】
粒子は、これだけに限定されないが、少なくとも注射される組成物１ｍＬ当たり１つまたは複数のオリゴヌクレオチド約１０μｇの濃度で注射することができる。例えば、１つまたは複数のオリゴヌクレオチド約１５０ｍｇから約５００ｍｇまでを、約１ｍＬを超えない送達体積、一般に多くの適用に対して約２ｍＬ未満の送達体積で注射することができる。投与量は、１日にわたって２または３またはそれ超の用量に分けることもでき、単一の１日用量でもたらすこともできる。
【００９８】
種々の態様では、粒子は、これだけに限定されないが、少なくとも注射される組成物１ｍＬ当たり約０．０１〜約１０００ｍｇの濃度で注射することができ得る。さらなる態様では、粒子は、注射される組成物１ｍＬ当たり少なくとも約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１０ｍｇ、約０．１５ｍｇ、約０．２０ｍｇ、約０．２５ｍｇ、約０．３０ｍｇ、約０．３５ｍｇ、約０．４０ｍｇ、約０．４５ｍｇ、約０．５０ｍｇ、約０．５５ｍｇ、約０．６０ｍｇ、約０．６５ｍｇ、約０．７０ｍｇ、約０．７５ｍｇ、約０．８０ｍｇ、約０．８５ｍｇ、約０．９０ｍｇ、約０．９５ｍｇ、約１ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４ｍｇ、約４．５ｍｇ、約５ｍｇ、約５．５ｍｇ、約６ｍｇ、約６．５ｍｇ、約７ｍｇ、約７．５ｍｇ、約８ｍｇ、約８．５ｍｇ、約９ｍｇ、約９．５ｍｇ、約１０ｍｇ、約１０．５ｍｇ、約１１ｍｇ、約１１．５ｍｇ、約１２ｍｇ、約１２．５ｍｇ、約１３ｍｇ、約１３．５ｍｇ、約１４ｍｇ、約１４．５ｍｇ、約１５ｍｇ、約１５．５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１６．５ｍｇ、約１７ｍｇ、約１７．５ｍｇ、約１８ｍｇ、約１８．５ｍｇ、約１９ｍｇ、約１９．５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、または約５０ｍｇまたはそれ超の濃度で注射することができ得る。関連する態様では、粒子は、注射される組成物１ｍＬ当たり少なくとも約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１１５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１３５ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１４５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１５５ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１６５ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１８５ｍｇ、約１９０ｍｇ、約１９５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２０５ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２１５ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２３５ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２４５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２８５ｍｇ、約２９０ｍｇ、約２９５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３０５ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３１５ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３２５ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３３５ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３４５ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３５５ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３６５ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３７５ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３８５ｍｇ、約３９０ｍｇ、約３９５ｍｇ、約４００ｍｇ、約４０５ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４１５ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４２５ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４３５ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４４５ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４５５ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４６５ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４７５ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４８５ｍｇ、約４９０ｍｇ、約４９５ｍｇ、約５００ｍｇ、約５０５ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５１５ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５２５ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５３５ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５４５ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５５５ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５６５ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５７５ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５８５ｍｇ、約５９０ｍｇ、約５９５ｍｇ、約６００ｍｇ、約６０５ｍｇ、約６１０ｍｇ、約６１５ｍｇ、約６２０ｍｇ、約６２５ｍｇ、約６３０ｍｇ、約６３５ｍｇ、約６４０ｍｇ、約６４５ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６５５ｍｇ、約６６０ｍｇ、約６６５ｍｇ、約６７０ｍｇ、約６７５ｍｇ、約６８０ｍｇ、約６８５ｍｇ、約６９０ｍｇ、約６９５ｍｇ、約７００ｍｇ、約７０５ｍｇ、約７１０ｍｇ、約７１５ｍｇ、約７２０ｍｇ、約７２５ｍｇ、約７３０ｍｇ、約７３５ｍｇ、約７４０ｍｇ、約７４５ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７５５ｍｇ、約７６０ｍｇ、約７６５ｍｇ、約７７０ｍｇ、約７７５ｍｇ、約７８０ｍｇ、約７８５ｍｇ、約７９０ｍｇ、約７９５ｍｇ、約８００ｍｇ、約８０５ｍｇ、約８１０ｍｇ、約８１５ｍｇ、約８２０ｍｇ、約８２５ｍｇ、約８３０ｍｇ、約８３５ｍｇ、約８４０ｍｇ、約８４５ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８５５ｍｇ、約８６０ｍｇ、約８６５ｍｇ、約８７０ｍｇ、約８７５ｍｇ、約８８０ｍｇ、約８８５ｍｇ、約８９０ｍｇ、約８９５ｍｇ、約９００ｍｇ、約９０５ｍｇ、約９１０ｍｇ、約９１５ｍｇ、約９２０ｍｇ、約９２５ｍｇ、約９３０ｍｇ、約９３５ｍｇ、約９４０ｍｇ、約９４５ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９５５ｍｇ、約９６０ｍｇ、約９６５ｍｇ、約９７０ｍｇ、約９７５ｍｇ、約９８０ｍｇ、約９８５ｍｇ、約９９０ｍｇ、約９９５ｍｇ、または約１０００ｍｇの濃度で注射することができ得る。
【００９９】
単回注射の体積は、約０．０５ｍＬ、約０．０７５ｍＬ、約０．１ｍＬ、約０．１２５ｍＬ、約０．１５ｍＬ、約０．１７５ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．２５ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．７５ｍＬ、約１ｍＬ、約１．２５ｍＬ、約１．５ｍＬ、約１．７５ｍＬ、約２ｍＬ、約２．５ｍＬ、約３ｍＬ、または約３．５ｍＬであってよい。単回注射の体積は、約０．０５ｍＬ超、約０．０７５ｍＬ超、約０．１ｍＬ超、約０．１２５ｍＬ超、約０．１５ｍＬ超、約０．１７５ｍＬ超、約０．２ｍＬ超、約０．２５ｍＬ超、約０．５ｍＬ超、約０．７５ｍＬ超、約１ｍＬ超、約１．２５ｍＬ超、約１．５ｍＬ超、約１．７５ｍＬ超、約２ｍＬ超、約２．５ｍＬ超、約３ｍＬ超、または約３．５ｍＬ超であってよい。注射の体積は、約０．０５ｍＬ未満、約０．０７５ｍＬ未満、約０．１ｍＬ未満、約０．１２５ｍＬ未満、約０．１５ｍＬ未満、約０．１７５ｍＬ未満、約０．２ｍＬ未満、約０．２５ｍＬ未満、約０．５ｍＬ未満、約０．７５ｍＬ未満、約１ｍＬ未満、約１．２５ｍＬ未満、約１．５ｍＬ未満、約１．７５ｍＬ未満、約２ｍＬ未満、約２．５ｍＬ未満、約３ｍＬ未満、または約３．５ｍＬ未満であってよい。注射の体積は、約０．１５ｍＬから約０．２ｍＬの間であってよい。注射の体積は約０．５ｍＬから約２ｍＬの間であってよい。
【０１００】
一部の実施形態では、単一の被験体に対する注射部位の数は、約１カ所、約２カ所、約３カ所、約４カ所、または約５カ所であってよい。一部の実施形態では、単一の被験体に対する注射部位の数は、１カ所超、２カ所超、３カ所超、４カ所超、５カ所またはそれ超であってよい。一部の実施形態では、単一の被験体に対する注射部位の数は、１カ所未満、２カ所未満、３カ所未満、４カ所未満、または５カ所未満であってよい。一部の実施形態では、単一の被験体に対する注射部位の数は４カ所であってよい。
【０１０１】
独立した送達処置の数は、約１回、約２回、約３回、約４回、または約５回であってよい。独立した送達処置の数は、１回超、２回超、３回超、４回超、５回またはそれ超であってよい。独立した送達処置の数は、１回未満、２回未満、３回未満、４回未満、または５回未満であってよい。２回の独立した送達処置間の時間は、約１時間、約２時間、約６時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約７日、約１４日、約３週間、または約１カ月であってよい。２回の独立した送達処置間の時間は、１時間超、２時間超、６時間超、１２時間超、２４時間超、２日超、７日超、１４日超、３週間超、または１カ月超であってよい。２回の独立した送達処置間の時間は、１時間未満、２時間未満、６時間未満、１２時間未満、２４時間未満、２日未満、７日未満、１４日未満、３週間未満、または１カ月未満であってよい。独立した送達処置間の時間は、１時間から２４時間にわたってよい。独立した送達処置間の時間は、２日から１カ月の間であってよい。独立した送達処置間の時間は、１週間から３週間の間であってよい。独立した送達処置間の時間は、１週間から２週間の間であってよい。独立した送達処置間の時間は、２週間から３週間の間であってよい。
【０１０２】
本開示の方法、組成物、およびキットでは、１回または複数回の注射を体内の任意の位置にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、胸腔、腹腔などにもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓の近位、例えば、リンパ排出が膵臓リンパ節、例えば、優先的に膵臓リンパ節に通じる部位にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、１つまたは複数の流入領域リンパ節の近位にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、腹腔に位置する１つまたは複数の流入領域リンパ節の近位にもたらすことができる。「近位」という用語は、体のサイズに応じて尺度が変動し得る。例えば、ヒト成人における「近位」の解剖学的位置は、目的の標的部位または器官から最大で５．５インチである。例えば、ヒト小児における「近位」の解剖学的位置は、目的の標的部位または器官から最大で２．７５インチである。１回または複数回の注射は、腹腔の腹側におけるものであってよい。注射は、膵臓の「上方」の位置にもたらすこともできる。「上方」とは、足から頭部に向かう方向を指す。対照的に、「下方」とは、頭部から足に向かう方向を指す。注射は、膵臓の「外側」（すなわち、正中線から離れる方向）の位置においてもたらすこともできる。体の正中線は、体の矢状面に沿って走り、膵臓は体の左側に位置する。したがって、膵臓リンパ節の「左外側」の位置においてもたらされる注射は、被験体の体の左側にもたらされる。稀な場合では、個体は、体の器官が逆転したまたは鏡に映した位置にある状態（すなわち、時には、内臓逆位（ｏｒｇａｎ  ｒｅｖｅｒｓａｌ、ｓｉｔｕｓ  ｉｎｖｅｒｓｕｓ、ｓｉｔｕｓ  ｔｒａｎｓｖｅｒｓｕｓ、またはｏｐｐｏｓｉｔｕｓ）と呼ばれる）を有し得る。鏡に映した状態の器官を有する個体では、個体の鏡に映した状態の器官の形態に関して必要に応じて、本明細書で使用される右および左という用語（例えば、「左外側」）を逆転させる必要がある（例えば、「右外側」）ことが当業者には理解されよう。
【０１０３】
投与のうちの１回または複数回は皮下または皮内投与であってよい。投与のうちの１回または複数回は、膵臓リンパ節の上方および／または外側にもたらすことができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約６インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約４〜約６インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約４．５〜５．５インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約５インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約６インチ、約５．７５インチ、約５．５インチ、約５．２５インチ、約５インチ、約４．７５インチ、約４．５インチ、約４．２５インチ、または約４インチ上部にもたらされる。
【０１０５】
一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約３インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２〜約３インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．２５〜２．７５インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．５インチ上部にもたらされる。一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約３インチ、約２．８７５インチ、約２．７５インチ、約２．６２５インチ、約２．５インチ、約２．３７５インチ、約２．２５インチ、約２．１２５インチ、または約２インチ上部にもたらされる。
【０１０６】
追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約４インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約２インチ〜約４インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約２．５〜３．５インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約３インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約４インチ、約３．７５インチ、約３．５インチ、約３．２５インチ、約３インチ、約２．７５インチ、約２．５インチ、約２．２５インチ、または約２インチ上部にもたらされる。
【０１０７】
追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約２インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約１インチ〜約２インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約１．２５〜１．７５インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約１．５インチ上部にもたらされる。追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓リンパ節から最大で約２インチ、約１．８７５インチ、約１．７５インチ、約１．６２５インチ、約１．５インチ、約１．３７５インチ、約１．２５インチ、約１．１２５インチ、または約１インチ上部にもたらされる。
【０１０８】
さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約１．５〜約３．５インチ左外側にもたらされる。さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２〜約３インチ左外側にもたらされる。さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．５インチ左外側にもたらされる。さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約１．５インチ、約１．７５インチ、約２インチ、約２．２５インチ、約２．５インチ、約２．７５インチ、約３インチ、約３．２５インチ、または約３．５インチ左外側にもたらされる。
【０１０９】
さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約０．７５〜約１．７５インチ左外側にもたらされる。さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約１〜約１．５インチ左外側にもたらされる。さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約１．２５インチ左外側にもたらされる。さらなる実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約０．７５インチ、約０．８７５インチ、約１インチ、約１．１２５インチ、約１．２５インチ、約１．３７５インチ、約１．５インチ、約１．６２５インチ、または約１．７５インチ左外側にもたらされる。
【０１１０】
さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約４．５〜約６．５インチ左外側にもたらされる。さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約５〜約６インチ左外側にもたらされる。さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約５．５インチ左外側にもたらされる。さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約４．５インチ、約４．７５インチ、約５インチ、約５．２５インチ、約５．５インチ、約５．７５インチ、約６インチ、約６．２５インチ、または約６．５インチ左外側にもたらされる。
【０１１１】
さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．２５〜約３．２５インチ左外側にもたらされる。さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．５〜約３インチ左外側にもたらされる。さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．７５インチ左外側にもたらされる。さらに他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．２５インチ、約２．３７５インチ、約２．５インチ、約２．６２５インチ、約２．７５インチ、約２．８７５インチ、約３インチ、約３．１２５インチ、または約３．２５インチ左外側にもたらされる。
【０１１２】
いくつかの場合には、１回または複数回の投与は、ヒトに対するものである。いくつかの場合には、被験体は、小児哺乳動物である。いくつかの場合には、被験体は、ヒトではない（例えば、マウス、非ヒト霊長類）。いくつかの場合には、１回または複数回の投与の位置を体のサイズに対して調整する。いくつかの場合には、１回または複数回の投与の位置を患者の体のサイズに対して調整する。いくつかの場合には、１回または複数回の投与の位置を患者の膵臓のサイズに対して調整する。
【０１１３】
一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓リンパ節から最大で約６インチ上部、例えば、膵臓から約４〜約６インチ上部など、例えば、膵臓から約４．５〜約５．５インチ上部など、例えば、膵臓から約５インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約１．５〜約３．５インチ左外側、例えば、膵臓から約２〜約３インチ左外側など、例えば、膵臓から約２．５インチ左外側などへのものでもある。
【０１１４】
一部の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓リンパ節から最大で約３インチ上部、例えば、膵臓から約２〜約３インチ上部など、例えば、膵臓から約２．２５〜約２．７５インチ上部など、例えば、膵臓から約２．５インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約０．７５〜約１．７５インチ左外側、例えば、膵臓から約１〜約１．５インチ左外側など、例えば、膵臓から約１．２５インチ左外側などへのものでもある。
【０１１５】
追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓リンパ節から最大で約６インチ上部に、例えば、膵臓から約４〜約６インチ上部など、例えば、膵臓から約４．５〜約５．５インチ上部など、例えば、膵臓から約５インチ上部などもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約４．５〜約６．５インチ左外側、例えば、膵臓から約５〜約６インチ左外側など、例えば、膵臓から約５．５インチ左外側などにもたらされるものでもある。
【０１１６】
追加的な実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓リンパ節から最大で約３インチ上部、例えば、膵臓から約２〜約３インチ上部など、例えば、膵臓リンパ節から約２．２５〜約２．７５インチ上部など、例えば、膵臓リンパ節から約２．５インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．２５〜約３．２５インチ左外側、例えば、膵臓から約２．５〜約３インチ左外側など、例えば、膵臓から約２．７５インチ左外側などにもたらされるものでもある。
【０１１７】
他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約４インチ上部、例えば、膵臓から約２インチ〜約４インチ上部など、例えば、膵臓から約２．５〜約３．５インチ上部など、例えば、膵臓から約３インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約４．５〜約６．５インチ左外側、例えば、膵臓から約５〜約６インチ左外側など、例えば、膵臓から約５．５インチ左外側などへのものでもある。
【０１１８】
他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約２インチ上部、例えば、膵臓リンパ節から約１インチ〜約２インチ上部など、例えば、膵臓から約１．２５〜約１．７５インチ上部など、例えば、膵臓から約１．５インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約２．２５〜約３．２５インチ左外側、例えば、膵臓から約２．５〜約３インチ左外側など、例えば、膵臓から約２．７５インチ左外側などへのものでもある。
【０１１９】
他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約４インチ上部、例えば、膵臓から約２インチ〜約４インチ上部など、例えば、膵臓から約２．５〜約３．５インチ上部など、例えば、膵臓から約３インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約１．５〜約３．５インチ左外側、例えば、膵臓から約２〜約３インチ左外側など、例えば、膵臓から約２．５インチ左外側などへのものでもある。
【０１２０】
他の実施形態では、１回または複数回の投与は、膵臓から最大で約２インチ上部、例えば、膵臓リンパ節から約１インチ〜約２インチ上部など、例えば、膵臓から約１．２５〜約１．７５インチ上部など、例えば、膵臓から約１．５インチ上部などにもたらされ、ここで、１回または複数回の投与は、膵臓から約０．７５〜約１．７５インチ左外側、例えば、膵臓から約１〜約１．５インチ左外側など、例えば、膵臓から約１．２５インチ左外側などへのものでもある。
【０１２１】
投与は組み合わせて使用することができる。いくつかの非限定的な例では、１回、２回、３回または４回の投与を被験体にもたらし、各投与は、膵臓に対して他の投与とは異なる位置におけるものである。いくつかの非限定的な例では、注射は皮下注射である。さらなる特定の非限定的な例では、注射は皮下注射である。１つの例示的な非限定的な投与プロトコールを示す図が図１９に提供される。いくつかの場合には、１回または複数回の投与は、ヒトに対するものである。いくつかの場合には、１回または複数回の投与は小児患者に対するものである。いくつかの場合には、被験体は、ヒトではない（例えば、マウス、非ヒト霊長類）。いくつかの場合には、１回または複数回の投与の位置は、体のサイズに対して調整される。
【０１２２】
１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約５．５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約３インチ上部にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約２．５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約３インチ上部にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約５．５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約５インチ上部にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約２．５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約５インチ上部にもたらすことができる。
【０１２３】
１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約２．７５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約１．５インチ上部にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約１．２５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約１．５インチ上部にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約２．７５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約２．５インチ上部にもたらすことができる。１回または複数回の注射は、膵臓リンパ節から約１．２５インチ左外側かつ膵臓リンパ節から約２．５インチ上部にもたらすことができる。
【０１２４】
膵臓リンパ節の位置は、当業者には容易に決定することが可能である。特定の非限定的な例では、イメージングを使用する、例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を使用するなどである。さらなる非限定的な例では、多検出器コンピュータ断層撮影法（ＭＤＣＴ）、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、放射性ヌクレオチドイメージング（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）、［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影法（ＦＤＧ−ＰＥＴ）走査、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）を使用して膵臓および膵臓の位置を決定することができる。しかし、イメージングを使用する必要はなく、膵臓リンパ節が代表的に位置する場所を示す腹部の解剖学的ランドマークによって予測される膵臓リンパ節の解剖学的位置を決定することができる。いくつかの例では、注射は、正中線の左側かつ臍の上方へのものである。
【０１２５】
コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）などのイメージングを使用して、体内に注射するオリゴヌクレオチド、粒子、細胞、またはそれらの組合せの位置に関するイメージングデータを収集することができる。１型糖尿病への適用では、イメージングを使用して、注射されたオリゴヌクレオチド、粒子、細胞、またはそれらの組合せが、膵臓の近くに留まるか、腸間膜リンパ節、脾臓、大腸、肝臓、脂肪組織、胸腺、肺、腎臓、または他のものなどの他の器官に移動するかに関するイメージングデータを収集することができる。イメージングを使用して、注射されたオリゴヌクレオチド、粒子、細胞またはそれらの組合せが、膵臓などの目的の組織の近くに留まるかどうかに関するイメージングデータを収集することができる。イメージングを使用して、注射された細胞が、注射後に生存可能なままであるかどうかに関するイメージングデータを収集することができる。イメージングを使用して、注射後の特定の時間におけるオリゴヌクレオチド、粒子、細胞またはそれらの組合せの位置に関するイメージングデータを収集することができる。イメージングデータを使用して、その後の注射のタイミングを決定することができる。イメージングデータを使用して、その後の注射の位置を決定することができる。イメージングデータを使用して、その後の注射の組成を決定することができる。イメージングデータを使用して、その後の注射の量を決定することができる。イメージングデータを使用して、現行の注射の有効性を決定することができる。イメージングデータを使用して、膵臓などの特定の器官に蓄積するオリゴヌクレオチド、粒子、細胞、またはそれらの組合せの百分率を決定することができる。イメージングデータを使用して、所与の組織におけるオリゴヌクレオチド、粒子、細胞またはそれらの組合せの蓄積の速度または分散の速度を決定することができる。
【０１２６】
イメージングは、連続的にリアルタイムで収集することができる。イメージングは、特定の時間に取得された１つまたは複数の別個の画像であってよい。さらなる非限定的なイメージング例としては、多検出器コンピュータ断層撮影法（ＭＤＣＴ）、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、放射性ヌクレオチドイメージング、［１８Ｆ］−フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影法（ＦＤＧ−ＰＥＴ）走査、または光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）が挙げられる。
【０１２７】
画像の追跡を可能にするために、１つまたは複数の粒子を１つまたは複数の部分で標識することができる。１つまたは複数の粒子は、色追跡マーカー（color tracking marker）、放射性追跡マーカー、ｐＨ指示薬、またはそれらの組合せで標識することができる。１つまたは複数の粒子は、１つまたは複数の蛍光部分で標識することができる。１つまたは複数の粒子は、放射性部分で標識することができる。全ての粒子を標識することができる。粒子のサブセットを標識することができる。粒子のサブセットを異なって標識することができる。注射後の回収および分析を可能にするために粒子を標識することができる。
【０１２８】
画像の追跡を可能にするために、１つまたは複数の細胞を１つまたは複数の部分で標識することができる。１つまたは複数の細胞を、色追跡マーカー、放射性追跡マーカー、生存能力マーカー、表面マーカー、抗原、またはそれらの組合せで標識することができる。１つまたは複数の細胞を、１つまたは複数の蛍光部分で標識することができる。１つまたは複数の細胞を、１つまたは複数の放射性部分で標識することができる。全ての細胞を標識することができる。細胞のサブセットを標識することができる。細胞のサブセットを異なって標識することができる。細胞を、標識された粒子の取り込みによって標識されるようにすることができる。注射後の回収および分析を可能にするために細胞を標識することができる。
【０１２９】
画像の追跡を可能にするために、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを１つまたは複数の部分で標識することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、色追跡マーカー、放射性追跡マーカー、またはそれらの組合せで標識することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の蛍光部分で標識することができる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の放射性部分で標識することができる。全てのオリゴヌクレオチドを標識することができる。オリゴヌクレオチドのサブセットを標識することができる。オリゴヌクレオチドのサブセットを異なって標識することができる。
【０１３０】
適切な送達経路は、皮下注射、眼への注射などを含めた、微細口径針（fine bore needle）を用いた注射であってよい。「微細口径針」という用語は、少なくとも２０ゲージサイズ、一般には約２２ゲージから約３０ゲージおよびそれ超の間の針を意味し得る。いくつかの場合には、微細口径針は、少なくとも２４ゲージと同程度に微細であり、少なくとも２６ゲージと同程度に微細な口径であり、少なくとも２８ゲージと同程度に微細である。
【０１３１】
注射送達は、通常の注射期間中に行う。いくつかの場合には、そのような期間は、約５秒、約１０秒、約１５秒、約２０秒、または約２５秒であってよい。いくつかの場合には、そのような期間は、約５秒未満、約１０秒未満、約１５秒未満、約２０秒未満、約２５秒またはそれ未満であってよい。いくつかの場合には、そのような期間は、約５秒超、約１０秒超、約１５秒超、約２０秒超、約２５秒またはそれ超であってよい。
【０１３２】
注射の組成
自己免疫性疾患（例えば、１型糖尿病）または炎症性疾患（例えば、過敏性腸症候群）などの状態を処置するための、被験体への注射器による注射は、細胞、粒子またはその両方の組合せを含んでよい。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣ（例えば、寛容原性ＤＣ）を注射することができる。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されていないＤＣを注射することができる。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された異なる型のＤＣの混合物、例えば、継代１細胞と継代２細胞の混合物または凍結した細胞と新鮮な細胞の混合物またはドナー１細胞とドナー２細胞の混合物または被験体細胞とドナー細胞の混合物などを注射することができる。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣを、支持細胞集団などの他の細胞集団と一緒に注射することができる。
【０１３３】
いくつかの場合には、粒子を単独で注射することができる。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含有する粒子を単独で注射することができる。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドを単独で注射することができる。いくつかの場合には、細胞、オリゴヌクレオチド、および粒子の組合せを同時注射することができる。いくつかの場合には、小分子、ホルモン、脂質、タンパク質、例えば、増殖因子、サイトカイン、ケモカインまたはそれらの組合せなどを、細胞、オリゴヌクレオチド、粒子またはそれらの組合せと同時注射することができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、有効量により、産生されるＢｒｅｇ細胞の数が増加する。Ｂ細胞の集団を単離し、定量化するための方法は当技術分野で周知であり、調節性Ｂ細胞の単離および／または定量化は、当業者に公知の任意の手段によって達成することができる。例えば、特許出願公開第２０１３／３６７５４号を参照されたい。一部の実施形態では、調節性Ｂ細胞は、インターロイキン−１０を産生し、ＣＤ２４ＨＩＧＨＣＤ２７＋である。追加的な実施形態では、調節性Ｂ細胞は、ＣＤ１ｄ、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ７２、およびＣＤ１４８のうちの１つまたは複数を発現し、ＩＬ−１０を産生する。特定の非限定的な例では、調節性Ｂ細胞は、ＣＤ１ｄｈｉＣＤ５＋ＣＤ１９ｈｉであり、ＩＬ−１０を産生する。一部の実施形態では、開示されている方法により、目的の被験体における調節性Ｂ細胞が少なくとも約３０％、例えば、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、または約２００％など増加する。追加的な実施形態では方法は、被験体由来の試料中のＢｒｅｇ細胞を測定することを含む。
【０１３５】
いくつかの場合には、粒子とｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣの共送達は、ともに１つの注射可能なアリコートに組み合わせることによってもたらされ得る。いくつかの場合には、粒子とｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣの共送達は、粒子で処理したｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ集団におけるエンドサイトーシスされなかった粒子の不完全な除去によってもたらされ得る。いくつかの場合には、粒子とｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣの共送達は、粒子で処理したｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣにおける粒子の不完全な細胞内分解によってもたらされ得る。
【０１３６】
いくつかの場合には、共送達は、同時に行うことができる。いくつかの場合には、共送達は、逐次的に行うことができる。いくつかの場合には、逐次的な共送達は、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、または約６０分にわたってよい。いくつかの場合には、逐次的な共送達は、約１分超、約２分超、約３分超、約４分超、約５分超、約１０分超、約２０分超、約３０分超、または約６０分超にわたってよい。いくつかの場合には、逐次的な共送達は、約１分未満、約２分未満、約３分未満、約４分未満、約５分未満、約１０分未満、約２０分未満、約３０分未満、または約６０分未満にわたってよい。
【０１３７】
いくつかの場合には、粒子は、ポリマー性マイクロスフェアであってよい。いくつかの場合には、粒子はポリマー性ナノスフェアであってよい。いくつかの場合には、粒子は、水溶液に曝露されると分解し得るポリマー単量体を含んでよい。いくつかの場合には、粒子は、酸性ｐＨに曝露されると分解し得るポリマー単量体を含んでよい。いくつかの場合には、分解により、粒子からのそれらの内容物（例えば、オリゴヌクレオチド）の放出が引き起こされ得る。
【０１３８】
いくつかの場合には、粒子（例えば、ナノスフェア）は、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ、内在性ＤＣ、他の内在性細胞型、またはそれらの組合せによってエンドサイトーシスされ得る。いくつかの場合には、粒子（例えば、マイクロスフェア）は、エンドサイトーシスされないかもしれない。いくつかの場合には、粒子は分解性であってよい。いくつかの場合には、分解性粒子（例えば、マイクロスフェア）は、分解の際に１つまたは複数のオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を放出し得、そのような放出されたオリゴヌクレオチドは、その後、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ、内在性ＤＣ、他の内在性細胞型、およびそれらの組合せによりエンドサイトーシスされ得る。
【０１３９】
状態（例えば、１型糖尿病）を有する被験体（例えば、小児患者）に送達される細胞は、送達前にｅｘ  ｖｉｖｏで操作することができる。細胞は臨床の状況下で操作することができる。例えば、細胞の操作は、細胞数を増大させること、細胞を凍結および解凍すること、細胞をアリコートにすること、細胞を粒子と接触させること、細胞をオリゴヌクレオチドと接触させること、細胞を増殖因子、血清、サイトカインなどと接触させること、ならびに細胞を生存能力、内毒素レベル、および／またはマーカー発現に基づいて精製することを含んでよい。細胞は、操作しなくてもよい。
【０１４０】
注射体積内の細胞の生存能力の許容されるレベルは、注射体積内の総細胞の約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％であってよい。注射体積内の細胞の生存能力の許容されるレベルは、注射体積内の総細胞の約５０％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超であってよい。注射体積内の細胞の生存能力の許容されるレベルは、注射体積内の総細胞の約５０％未満、約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９６％未満、約９７％未満、約９８％未満、または約９９％未満であってよい。いくつかの場合には、注射体積内の細胞の生存能力は、注射体積内の総細胞の約７０％超であってよい。細胞の生存能力は不明であってよい。
【０１４１】
細胞の注射体積内の内毒素の許容されるレベルは、体重１ｋｇ当たり約１ＥＵ、約２ＥＵ、約３ＥＵ、約４ＥＵ、約５ＥＵ、約６ＥＵ、約７ＥＵ、約８ＥＵ、約９ＥＵ、約１０ＥＵであってよい。細胞の注射体積内の内毒素の許容されるレベルは、体重１ｋｇ当たり約１ＥＵ未満、約２ＥＵ未満、約３ＥＵ未満、約４ＥＵ未満、約５ＥＵ未満、約６ＥＵ未満、約７ＥＵ未満、約８ＥＵ未満、約９ＥＵ未満、約１０ＥＵ未満であってよい。いくつかの場合には、内毒素レベルは、体重１ｋｇ当たり約５ＥＵ未満であってよい。内毒素レベルは不明であってよい。
【０１４２】
被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作されたＤＣ集団の純度は、マーカー発現に基づいてよい。マーカー発現は、ＦＡＣＳ分析によって確認することができる。いくつかの場合には、ＤＣの純度を定義するために、以下のマーカーの陽性発現を使用することができる：ＣＤ１９＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ２４＋。他の場合では、ＤＣの純度を定義するために、以下のマーカーの陽性発現を使用することもできる：ＣＤ１Ｂ＋、ＣＤ５＋、ＣＤ１９＋、ＩＬ１０＋。ＤＣの純度を定義するために、例えば、ＭＨＣＩＩ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ４０＋、ＣＤ８６＋を含めた他のマーカーの組合せを使用することができる。被験体に注射するＤＣの許容される純度は、体積内の総細胞の約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％であってよい。被験体に注射するＤＣの許容される純度は、体積内の総細胞の約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超であってよい。被験体に注射するＤＣの許容される純度は、体積内の総細胞の約６０％未満、約６５％未満、約７０％未満、約７５％未満、約８０％未満、約８５％未満、約９０％未満、約９５％未満、約９６％未満、約９７％未満、約９８％未満、または約９９％未満であってよい。いくつかの場合には、被験体に注射するＤＣの純度は、体積内の総細胞の約７０％超であってよい。被験体に注射するＤＣの純度は不明であってよい。
【０１４３】
いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、被験体に送達する前に、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２５回、または約３０回の継代数まで増大させることができる。いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、被験体に送達する前に、約１回超、約２回超、約３回超、約４回超、約５回超、約６回超、約７回超、約８回超、約９回超、約１０回超、約１１回超、約１２回超、約１３回超、約１４回超、約１５回超、約１６回超、約１７回超、約１８回超、約１９回超、約２０回超、約２５回超、約３０回超の継代数、またはそれ超まで増大させることができる。いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、被験体に送達する前に、約１回未満、約２回未満、約３回未満、約４回未満、約５回未満、約６回未満、約７回未満、約８回未満、約９回未満、約１０回未満、約１１回未満、約１２回未満、約１３回未満、約１４回未満、約１５回未満、約１６回未満、約１７回未満、約１８回未満、約１９回未満、約２０回未満、約２５回未満、または約３０回未満の継代数まで増大させることができる。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏ樹状細胞は継代しなくてもよい。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏ樹状細胞は、１回の細胞継代（例えば、細胞培養物または組織ディッシュにおける）前に単離し、投与することができる。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏ樹状細胞は、選別することができる、マーカーを用いてタグ付けすることができる、計数することができる、表面または別の細胞型と接触させることができる、刺激に曝露させることができる、または別の様式で操作することができる。
【０１４４】
いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、新たに単離することができる。いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、予め凍結されていてよい。いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、約１日、約１週間、約１カ月、約１年、約２年、または約３年にわたって予め凍結されていてよい。いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、約１日超、約１週間超、約１カ月超、約１年超、約２年超、約３年またはそれ超にわたって予め凍結されていてよい。いくつかの場合には、被験体に注射する、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団は、約１日未満、約１週間未満、約１カ月未満、約１年未満、約２年未満、または約３年未満にわたって予め凍結されていてよい。
【０１４５】
いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団を同じレシピエントから単離し、そして注射して戻す。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団を１個体から単離し、異なる個体に注射する。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団を１個体から単離し、異なる個体に注射し、ここで、当該２個体は、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＲに関して同一にマッチする個体である。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団を１個体から単離し、異なる個体に注射し、ここで、当該２個体は、以下の対立遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤＲのうち１つのみがミスマッチである。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団を家族構成員（同胞、親、祖父母、いとこ、おば、おじ）から単離する。いくつかの場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞集団を無関係の被験体から単離する。
【０１４６】
多数回注射
１型糖尿病の被験体における非空腹時血中グルコースレベルは、約１８０ｍｇ／ｄＬから約６５０ｍｇ／ｄＬの間であり得る。正常な被験体における非空腹時血中グルコースレベルは、約８０ｍｇ／ｄＬから約１２０ｍｇ／ｄＬの間であり得る。本開示の方法およびキットでは、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで回復させることにより、血中グルコースレベルが約８０ｍｇ／ｄＬ、約８５ｍｇ／ｄＬ、約９０ｍｇ／ｄＬ、約９５ｍｇ／ｄＬ、約１００ｍｇ／ｄＬ、約１０５ｍｇ／ｄＬ、約１１０ｍｇ／ｄＬ、約１１５ｍｇ／ｄＬ、または約１２０ｍｇ／ｄＬに回復し得る。いくつかの場合には、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで回復させることにより、血中グルコースレベルが約８０ｍｇ／ｄＬ未満、約８５ｍｇ／ｄＬ未満、約９０ｍｇ／ｄＬ未満、約９５ｍｇ／ｄＬ未満、約１００ｍｇ／ｄＬ未満、約１０５ｍｇ／ｄＬ未満、約１１０ｍｇ／ｄＬ未満、約１１５ｍｇ／ｄＬ未満、または約１２０ｍｇ／ｄＬ未満に回復し得る。
【０１４７】
膵臓の近位の１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約１日、約７日、約２１日、約３０日、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、または約２０カ月にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。一部の実施形態では、血中グルコースレベルを、少なくとも約１日、約７日、約２１日、約３０日、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、約２０カ月またはそれ超にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。一部の実施形態では、血中グルコースレベルを、最大で約１日、約７日、約２１日、約３０日、約１カ月、約２カ月、約３カ月、または約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、または約２０カ月にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約２５日から約３５日の間にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約２８日から約３２日の間にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約２０日から約４０日の間にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約６５週間から約７５週間の間にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約６８週間から約７２週間の間にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約６０週間から約８０週間の間にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。膵臓リンパ節の近位の４カ所の注射部位に投与される４回の皮下注射により、血中グルコースレベルを、約７０週間またはそれ超にわたって前糖尿病レベルに近づけることができる。血中グルコースレベルを前糖尿病レベルに近づけることは、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで回復させ得る。
【０１４８】
膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、残存する膵ベータ細胞の生存能力を、約７日、約２１日、約３０日、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、または約２０カ月にわたって保存することができる。一部の実施形態では、残存する膵ベータ細胞を、少なくとも約７日、約２１日、約３０日、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、約２０カ月またはそれ超にわたって保存することができる。一部の実施形態では、残存する膵ベータ細胞を、最大で約７日、約２１日、約３０日、約１カ月、約２カ月、約３カ月、または約４カ月、約５カ月、約６カ月、約７カ月、約８カ月、約９カ月、約１０カ月、約１１カ月、約１２カ月、約１３カ月、約１４カ月、約１５カ月、約１６カ月、約１７カ月、約１８カ月、約１９カ月、または約２０カ月にわたって保存することができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、残存する膵ベータ細胞の生存能力を、約２５日から約３５日の間にわたって保存することができる。膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与される２回またはそれ超の皮下注射により、残存する膵ベータ細胞の生存能力を、約６５週間から約７５週間の間にわたって保存することができる。膵臓リンパ節の近位の４カ所の注射部位に投与される４回の皮下注射により、残存する膵ベータ細胞の生存能力を、約７０週間またはそれ超にわたって保存することができる。
【０１４９】
細胞集団の量の変更
本開示の方法およびキットは、被験体（例えば、小児患者）を処置して状態を逆転させるまたは低減することを含む。いくつかの場合には、状態は、自己免疫性疾患であってよい。いくつかの場合には、状態は、炎症性疾患であってよい。自己免疫性疾患は、１型糖尿病、関節炎、喘息、敗血症性ショック、肺線維症、糸球体腎炎、ＡＩＤＳなどを含んでよい。炎症性疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含んでよい。いくつかの場合には、疾患は、１型糖尿病であってよい。１型糖尿病を逆転させるまたは低減することは、血中グルコースレベルを前糖尿病レベルまで低下させること、抑制性Ｂ細胞集団を増大させること、Ｔ細胞集団を減少させること、ＤＣ集団におけるＲＡ産生を誘導することなどを含んでよい。
【０１５０】
いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、被験体全体を通して全身的に生じさせることができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、循環している集団内で生じさせることができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、１つまたは複数の流入領域リンパ節において選択的に生じさせることができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、１つまたは複数の膵臓リンパ節において選択的に生じさせることができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、膵臓リンパ節内の総Ｂ細胞集団に対して生じさせることができる。
【０１５１】
いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、被験体全体を通して全身的に生じさせることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、循環している集団内で生じさせることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、１つまたは複数の流入領域リンパ節において選択的に生じさせることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、１つまたは複数の膵臓リンパ節において選択的に生じさせることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、脾臓Ｔ細胞集団において生じさせることができる。
【０１５２】
本開示の方法およびキットは、被験体における炎症性疾患（例えば、ＩＢＤ）または自己免疫性疾患（例えば、１型糖尿病）などの状態を処置するために、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比を変更することができる種々の方法を提供する。いくつかの場合には方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞（例えば、寛容原性ＤＣ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ送達、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する粒子とｅｘ  ｖｉｖｏで操作された樹状細胞（例えば、寛容原性のまたは未成熟ＤＣ）の共送達、またはそれらの組合せを含んでよく、前記比の変更は、抑制性Ｂ細胞集団を増大させ、Ｔ細胞集団を減少させ得る。
【０１５３】
いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加により、抑制性Ｂ細胞集団とＴ細胞集団の間の比の変更をもたらすことができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少により、抑制性Ｂ細胞集団とＴ細胞集団の間の比の変更をもたらすことができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加およびＴ細胞集団の減少により、抑制性Ｂ細胞集団とＴ細胞集団の間の比の変更をもたらすことができる。
【０１５４】
いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、抑制性Ｂ細胞集団の選択的な増殖によってもたらすことができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、他のＢ細胞集団から抑制性Ｂ細胞型への分化によってもたらすことができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、抑制性Ｂ細胞集団に対して選択的に作用する生存促進性シグナルによってもたらすことができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、抑制性Ｂ細胞集団に対して選択的に作用する抗アポトーシスシグナル（例えば、Ｂｃｌ−２、ＰＩ３Ｋ、ＣＤ４０など）によってもたらすことができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、他の細胞集団におけるアポトーシス促進性シグナル（例えば、カスパーゼ（capase）、Ａｐａｆ複合体、Ｆａｓライゲーションなど）によってもたらすことができる。いくつかの場合には、非抑制性細胞集団と比較した抑制性Ｂ細胞集団の表面上の生存促進性シグナルの発現を増加させることができる。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団の増加は、非抑制性Ｂ細胞集団におけるアポトーシスによってもたらすことができる。いくつかの場合には、このアポトーシスは、少なくとも１つの寛容原性樹状細胞を投与することによって誘導することができる。
【０１５５】
いくつかの場合には、変更された比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０、約１：１１、約１：１２、約１：１３、約１：１４、約１：１５、約１：２０、または約１：２５の抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比であってよい。いくつかの場合には、変更された比は、約１：１超、約１：２超、約１：３超、約１：４超、約１：５超、約１：６超、約１：７超、約１：８超、約１：９超、約１：１０超、約１：１１超、約１：１２超、約１：１３超、約１：１４超、約１：１５超、約１：２０超、または約１：２５超の抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比であってよい。いくつかの場合には、変更された比は、約１：１未満、約１：２未満、約１：３未満、約１：４未満、約１：５未満、約１：６未満、約１：７未満、約１：８未満、約１：９未満、約１：１０未満、約１：１１未満、約１：１２未満、約１：１３未満、約１：１４未満、約１：１５未満、約１：２０未満、または約１：２５未満の抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比であってよい。
【０１５６】
いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、Ｔ細胞増殖の減少によってもたらすことができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖を、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、または約７５％減少させることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖を、約４５％超、約４６％超、約４７％超、約４８％超、約４９％超、約５０％超、約５１％超、約５２％超、約５３％超、約５４％超、約５５％超、約５６％超、約５７％超、約５８％超、約５９％超、約６０％超、約６１％超、約６２％超、約６３％超、約６４％超、約６５％超、約６６％超、約６７％超、約６８％超、約６９％超、約７０％超、約７１％超、約７２％超、約７３％超、約７４％超、または約７５％超減少させることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖を、約４５％未満、約４６％未満、約４７％未満、約４８％未満、約４９％未満、約５０％未満、約５１％未満、約５２％未満、約５３％未満、約５４％未満、約５５％未満、約５６％未満、約５７％未満、約５８％未満、約５９％未満、約６０％未満、約６１％未満、約６２％未満、約６３％未満、約６４％未満、約６５％未満、約６６％未満、約６７％未満、約６８％未満、約６９％未満、約７０％未満、約７１％未満、約７２％未満、約７３％未満、約７４％未満、または約７５％未満減少させることができる。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖を、約５０％から約７０％の間減少させることができる。
【０１５７】
いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比の変更は、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞を接触させることを含んでよい。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比の変更は、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞を接触させることを含まなくてもよい。いくつかの場合には、抑制性Ｂ細胞集団を増大させることは、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞を接触させることを含んでよい。いくつかの場合には、Ｔ細胞集団の減少は、抑制性Ｂ細胞とＴ細胞を接触させることを含んでよい。
【０１５８】
レチノイン酸媒介性処置
レチノイン酸（ＲＡ）は、ビタミンＡ（レチノール）の水溶性代謝産物である。ＲＡは、抑制性細胞集団（例えば、抑制性Ｂ細胞集団）に適応性、生存促進性、および安定性を付与することが可能な、寛容性に関連する分子である。本開示の方法およびキットでは、抑制性Ｂ細胞集団の増加をもたらす有効量の処置は、局所的な可溶性ＲＡ産生の増加によってもたらすことができる。さらに、いくつかの場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＲＡ産生により、細胞集団（例えば、抑制性Ｂ細胞）のホーミングをもたらすことができる。抑制性Ｂ細胞は、１つまたは複数のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）および１つまたは複数のレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を発現し得る。抑制性Ｂ細胞は、ＲＡＲを他の細胞集団よりも高レベルで発現し得る。抑制性Ｂ細胞は、ＲＸＲを他の細胞集団よりも高レベルで発現し得る。
【０１５９】
樹状細胞集団（例えば、ｃＤＣ、ｉＤＣ、寛容原性ＤＣ、内在性ＤＣ）は、ＲＡ生合成の律速酵素を発現し得る。そのような酵素の例としては、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenease）１（ＡＬＤＨ１）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ＡＬＤＨ２）を挙げることができる。寛容原性ＤＣは、特定の酵素アイソフォームを他の細胞集団と比較して多量に発現し得る。寛容原性ＤＣは、１Ａ２アイソフォームを対照樹状集団と比較して多量に発現し得る。
【０１６０】
樹状細胞集団（例えば、ｃＤＣ、ｉＤＣ、寛容原性ＤＣ、内在性ＤＣ）は、ＲＡを産生し得る。いくつかの場合には、寛容原性ＤＣは、ＲＡを他の細胞集団と比較して多量に産生し得る。いくつかの場合には、有効量の処置を被験体に送達することができた後、寛容原性ＤＣにより、ＲＡの産生が増加し得る。いくつかの場合には、寛容原性ＤＣは、膵臓リンパ節などの特定の場所においてＲＡを産生し得る。いくつかの場合には、寛容原性ＤＣはＲＡを産生し得、それにより抑制性Ｂ細胞集団の産生供給源（例えば、膵臓リンパ節）への移動が引き起こされ得る。
【０１６１】
いくつかの場合には、ＲＡを含む粒子を樹状細胞集団（例えば、ｃＤＣ、ｉＤＣ、寛容原性ＤＣ、内在性ＤＣ）に送達することができる。ＲＡを含む粒子をｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ集団に送達し、その後、そのｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣ集団をｉｎ  ｖｉｖｏに送達することができる。ＲＡを含む粒子は、直接、注射器による注射によって、被験体における種々のｉｎ  ｖｉｖｏ位置に送達することができる。
【０１６２】
寛容原性ＤＣは、細胞当たりのＡＬＤＨ酵素の量が他の集団（例えば、ｃＤＣ）と比較して多い、ＲＡ生合成に対する触媒速度が他の集団（例えば、ｃＤＣ）と比較して早い、またはその両方であり得る。ＲＡ産生ＤＣは、免疫抑制性であり得る。寛容原性ＤＣは、免疫抑制性であり得る。ＲＡ産生ＤＣは、免疫抑制性であってよく、したがって、炎症性疾患または自己免疫性疾患が停止、逆転、または減弱する。寛容原性ＤＣは、免疫抑制性であってよく、したがって、炎症性疾患または自己免疫性疾患が停止、逆転、または減弱する。ＲＡ産生ＤＣは、３細胞長の半径距離内にあるＴ細胞の同時刺激を妨げることによって免疫抑制性であり得る。寛容原性ＤＣは、３細胞長の半径距離内にあるＴ細胞の同時刺激を妨げることによって免疫抑制性であり得る。寛容原性ＤＣは、投与時または後のいかなる時点においても、免疫抑制薬（例えば、グルココルチコイド、細胞増殖抑制薬、抗体、または他のものなど）を伴わずに患者に投与することができる。寛容原性ＤＣ、微小粒子、ナノ粒子、またはそれらの組合せは、投与時または後のいかなる時点においても、免疫抑制療法を伴わずに患者に投与することができる。ＲＡ産生ＤＣは、炎症性疾患および自己免疫性疾患において、炎症の局所的な領域（例えば、膵臓リンパ節）において抑制性Ｂ細胞集団の増加を引き起こすことによって治療的であり得る。
【０１６３】
キット
いくつかの場合には、本開示は、複数の粒子（例えば、マイクロスフェア）および１つまたは複数の実体（例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、生体分子）、ならびに、１つまたは複数の実体（例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、生体分子）を粒子（例えば、マイクロスフェア）に付着させるかまたはその中に封入するための説明書を含むキットを提供する。前記粒子（例えば、マイクロスフェア）と任意の適切な細胞集団を接触させるための説明書も含まれていてよい。本開示全体を通して明記されている通り、任意の適切な実体を、粒子（例えば、マイクロスフェア）に付着させるまたは封入することができる。本開示を通して記載されている通り、粒子は、ＰＥＧポリマーおよびＰＶＰポリマーから形成することができる。この場合、キットは、ＰＥＧポリマーおよびＰＶＰポリマーを含んでも含まなくてもよい。
【０１６４】
いくつかの場合には、本開示は、複数の粒子（例えば、ナノスフェア）および１つまたは複数の実体（例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、生体分子）、ならびに１つまたは複数の実体（例えば、オリゴヌクレオチド、タンパク質、生体分子）を粒子（例えば、ナノスフェア）に付着させるかまたはその中に封入するための説明書を含むキットを提供する。前記粒子（例えば、ナノスフェア）と任意の適切な細胞集団を接触させるための説明書も含まれていてよい。本開示全体を通して明記されている通り、任意の適切な実体を粒子（例えば、ナノスフェア）に付着させるまたは封入することができる。本開示を通して記載されている通り、粒子は、ＰＥＧポリマーおよびＰＶＰポリマーから形成することができる。この場合、キットは、ＰＥＧポリマーおよびＰＶＰポリマーを含んでも含まなくてもよい。
【０１６５】
いくつかの場合には、キットは、注射用のオリゴヌクレオチドを含んでよい。オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている特徴のいずれかを有するものであってよい。オリゴヌクレオチドは、ヒト患者における使用に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。オリゴヌクレオチドは、ヒト小児患者における使用に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。オリゴヌクレオチドは、ヒト患者における１型糖尿病の予防、処置、または逆転に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。オリゴヌクレオチドは、膵臓の近位への注射に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。キットは、注射前に１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを適切なｅｘ  ｖｉｖｏ細胞集団と接触させるための説明書を含んでよい。キットは、注射前に緩衝液（buffering liquid）中オリゴヌクレオチド溶液を作製するための説明書を含んでよい。キットは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを注射する解剖学的部位についての説明書を含んでよい。キットは、本明細書に記載の１つまたは複数の注射用注射器を含んでよい。キットは、オリゴヌクレオチド溶液を作製するための量の緩衝液を含んでよい。キットは、冷蔵する必要がない場合がある。キットは、最大２４時間、冷蔵しなくてもよい。キットは、臨床の状況下で使用することができる。キットは実験室の状況下で使用することができる。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチド、緩衝液、および注射器は滅菌されたものである。いくつかの場合には、オリゴヌクレオチドは、体重１ｋｇ当たり５ＥＵ未満の内毒素を含有する。
【０１６６】
いくつかの場合には、キットは、注射用の粒子を含んでよい。粒子は、本明細書に記載されている特徴のいずれかを有するものであってよい。粒子は、オリゴヌクレオチドを含んでよい。粒子は、ヒト患者における使用に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。粒子は、ヒト小児患者における使用に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。粒子は、ヒト患者における１型糖尿病の予防、処置、または逆転に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。粒子は、膵臓の近位への注射に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。キットは、注射前に１つまたは複数の粒子を適切なｅｘ  ｖｉｖｏ細胞集団と接触させるための説明書を含んでよい。キットは、注射前に緩衝液を用いて粒子懸濁液を作製するための説明書を含んでよい。キットは、１つまたは複数の粒子を注射する解剖学的部位についての説明書を含んでよい。キットは、本明細書に記載の１つまたは複数の注射用注射器を含んでよい。キットは、粒子懸濁液を作製するための量の緩衝液を含んでよい。キットは、冷蔵する必要がない場合がある。キットは、最大２４時間、冷蔵しなくてもよい。キットは、臨床の状況下で使用することができる。キットは実験室の状況下で使用することができる。いくつかの場合には、粒子、緩衝液、および注射器は滅菌されたものである。いくつかの場合には、粒子は、体重１ｋｇ当たり５ＥＵ未満の内毒素を含有する。
【０１６７】
いくつかの場合には、キットは、患者に注射するためのｅｘ  ｖｉｖｏ寛容原性ＤＣを調製するための成分を含んでよい。キットは、本明細書に記載の粒子を含んでよい。キットは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含んでよい。キットは、１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４）を含んでよい。キットは、細胞、オリゴヌクレオチド、粒子、またはそれらの組合せを標識するための、本明細書に記載のマーカーを含んでよい。マーカーは蛍光性であってよい。１つまたは複数のマーカーは、細胞表面マーカーであってよい。１つまたは複数のマーカーは、生存能力の指標であってよい。キットは、細胞を、付着した１つまたは複数のマーカーに基づいて選別するための成分（例えば、磁気選別カラム）を含んでよい。キットは、遊離の粒子を細胞から選別するための成分（例えば、サイズ排除カラム）を含んでよい。キットを使用して作製された、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された細胞は、ヒト患者における使用に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。キットを使用して作製された、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された細胞は、ヒト小児患者における使用に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。キットを使用して作製された、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された細胞は、ヒト患者における１型糖尿病の予防、処置、または逆転に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。キットを使用して作製された、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作された細胞は、膵臓の近位への注射に関してＦＤＡにより認可されたものであってよい。キットは、注射前に１つまたは複数の粒子を適切なｅｘ  ｖｉｖｏ細胞集団と接触させるための説明書を含んでよい。キットは、注射前に緩衝液を用いて細胞の懸濁液または細胞と粒子の懸濁液を作製するための説明書を含んでよい。キットは、注射する解剖学的部位についての説明書を含んでよい。キットは、本明細書に記載の１つまたは複数の注射用注射器を含んでよい。キットは、細胞の懸濁液または細胞と粒子の懸濁液を作製するための量の緩衝液を含んでよい。キットは、冷蔵する必要がない場合がある。キットは、最大２４時間、冷蔵しなくてもよい。キットは、臨床の状況下で使用することができる。キットは実験室の状況下で使用することができる。いくつかの場合には、細胞、粒子、緩衝液、および注射器は滅菌されたものである。いくつかの場合には、細胞は、体重１ｋｇ当たり５ＥＵ未満の内毒素を含有する。
【０１６８】
条項
一部の態様では、小児哺乳動物において血中グルコースを前糖尿病レベルまで回復させるための方法であって、哺乳動物において膵臓リンパ節の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に寛容原性樹状細胞の皮下注射を２回またはそれ超投与するステップを含み、前記血中グルコースを少なくとも２４時間の期間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、前記哺乳動物から、または異なる哺乳動物から単離されていてもよい。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、予め凍結されていてよい。
【０１６９】
本開示は、疾患を有する哺乳動物を処置するための方法、組成物、およびキットを提供する。当該方法、組成物、およびキットは、糖尿病が発症しているまたは発症している可能性がある哺乳動物の処置に特に有用である。
【０１７０】
一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓リンパ節から約３．５〜約２．２５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約２〜約１インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓リンパ節から約１．７５〜約０．７５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約２〜約１インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓リンパ節から約３．２５〜約２．２５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約３〜約２インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓リンパ節から約１．７５〜約０．７５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約３〜約２インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記投与するステップは、少なくとも４カ所の注射部位を含んでよい。一部の実施形態では、前記第１の注射部位は、前記膵臓リンパ節から約３．２５〜約２．２５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約２〜約１インチ上部であってよく、前記第２の注射部位は、前記膵臓リンパ節から約１．７５〜約０．７５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約２〜約１インチ上部であってよく、前記第３の注射部位は、前記膵臓リンパ節から約３．２５〜約２．２５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約３〜約２インチ上部であってよく、前記第４の注射部位は、前記膵臓リンパ節から約１．７５〜約０．７５インチ外側かつ前記膵臓リンパ節から約３〜約２インチ上部であってよい。
【０１７１】
一部の実施形態は、前記寛容原性樹状細胞の皮下注射を少なくとも３回、４回または５回投与するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態では、前記血中グルコースを約２５日から約３５日の間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる。一部の実施形態では、前記血中グルコースを約６５週間から約７５週間の間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる。
【０１７２】
一部の実施形態では、前記哺乳動物は、ヒト、マウス、または非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記投与するステップは、免疫抑制療法を含まなくてもよい。一部の実施形態では、前記投与するステップにより、前記注射部位まで３細胞長の半径距離内にあるＴ細胞の同時刺激を妨げることができる。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞を少なくとも１つのマーカーで標識することができる。一部の実施形態では、前記マーカーは、蛍光マーカーであってよい。一部の実施形態では、前記蛍光マーカーは、生存能力の指標であってよい。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞の全てをマーカーで標識しなくてもよい。
【０１７３】
一部の実施形態では、前記２回またはそれ超の寛容原性樹状細胞の皮下注射は、少なくとも１つの粒子を含んでよく、前記粒子は、配列番号４、５、６、もしくは７に記載されている核酸配列、またはそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、前記粒子を少なくとも１つのマーカーで標識することができる。一部の実施形態では、前記粒子の全てをマーカーで標識しなくてもよい。一部の実施形態では、前記マーカーは、蛍光マーカーであってよい。一部の実施形態では、前記蛍光マーカーは、ｐＨ指示薬であってよい。
【０１７４】
一部の実施形態は、投与後に前記マーカーを追跡するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、所定の解剖学的位置における１つまたは複数のマーカーの蓄積を定量化するステップをさらに含んでよい。
【０１７５】
一部の実施形態では、前記哺乳動物は、少なくとも１カ月にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、少なくとも１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、少なくとも５年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１０歳の間、または約１１歳から約１８歳の間であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、糖尿病の小児期発症を有し得る。
【０１７６】
一部の態様では、前記小児哺乳動物における１型糖尿病を処置するための方法であって、哺乳動物における抑制性Ｂ細胞集団を増大させるステップを含み、全身的な抑制性Ｂ細胞集団と比較してより大きな前記抑制性Ｂ細胞集団の増大が前記膵臓リンパ節の近くで起こり得る方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、追加的な免疫抑制療法を投与しなくてもよい。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１０歳の間、または約１１歳から約１８歳の間であってよい。
【０１７７】
一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で１カ月にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で５年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ１９、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＩＬ−１０、および／またはＣＤ４０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ２４を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ１Ｂ、ＣＤ５、ＣＤ１９、およびＩＬ１０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、ＣＤ１１ｃマーカーを発現しない可能性がある。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、メモリーＢ細胞集団を含んでよい。一部の実施形態では、前記メモリーＢ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ４０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、増殖し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、分化し得る。一部の実施形態は、Ｔ細胞集団の増殖を抑制するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞集団からの抑制性Ｂ細胞と前記Ｔ細胞集団からのＴ細胞を接触させるステップをさらに含んでよい。
一部の実施形態では、寛容原性樹状細胞、ナノ粒子、微小粒子、またはそれらの組合せを含む皮下注射を２回またはそれ超投与することによって、前記抑制性Ｂ細胞集団を誘導することができる。一部の実施形態では、前記２回またはそれ超の皮下注射は、前記膵臓リンパ節の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与することができる。一部の実施形態では、前記２回またはそれ超の皮下注射は、４カ所の注射部位を含んでよい。一部の実施形態では、前記ナノ粒子は、オリゴヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、前記微小粒子は、オリゴヌクレオチドを含んでよい。
【０１７９】
一部の実施形態は、少なくとも１つの寛容原性樹状細胞を投与することによって前記抑制性Ｂ細胞集団に生存の増加を付与するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞集団の表面上の生存促進性シグナルの発現を非抑制性細胞集団と比較して増加させるステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、少なくとも１つの寛容原性樹状細胞を投与することによって非抑制性Ｂ細胞集団におけるアポトーシスを誘導するステップをさらに含んでよい。
【０１８０】
一部の態様では、哺乳動物における１型糖尿病を処置するために抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比を変更するための方法であって、寛容原性樹状細胞を哺乳動物に送達するステップを含み、前記変更が、前記抑制性Ｂ細胞を増加させ、前記Ｔ細胞を減少させることを含み得る方法が本明細書において提供される。一部の実施形態は、前記哺乳動物において膵臓リンパ節または膵臓の近位にある部位に前記寛容原性樹状細胞を注射するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞を増大させるステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記Ｔ細胞の増殖を抑制するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞は、以下のマーカー：Ｂ２２０、ＣＤ１９、およびＩＬ１０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞は、ＣＤ１１ｃマーカーを発現しない可能性がある。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比は約１：１０であってよい。一部の実施形態では、前記比は、前記Ｔ細胞の前記増殖を約４０％〜約５５％、例えば、約５０％など低下させることによって変更することができる。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比は約１：１であってよい。一部の実施形態では、前記比は、前記Ｔ細胞の前記増殖を約６５％〜約８０％、例えば、約６７％など低下させることによって変更することができる。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞の少なくとも１つと前記Ｔ細胞の少なくとも１つを接触させるステップをさらに含んでよい。
【０１８１】
一部の態様では、哺乳動物における炎症応答を低減するための方法であって、哺乳動物において生物活性のレチノイン酸を産生させるステップを含み、前記生物活性のレチノイン酸は、寛容原性樹状細胞を前記哺乳動物の膵臓リンパ節または膵臓またはその近くに導入することによって産生させることができ、前記生物活性のレチノイン酸により、少なくとも１つのレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）および少なくとも１つのレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）を発現する抑制性Ｂ細胞集団の増加が引き起こされ得る方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、青年、小児、または１８歳未満のヒトであってよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）を有してよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有してよい。
【０１８２】
一部の態様では、小児哺乳動物において血中グルコースを前糖尿病レベルまで回復させるための方法であって、前記小児哺乳動物の膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に寛容原性樹状細胞の皮下注射を２回またはそれ超投与するステップを含み、前記血中グルコースを少なくとも２４時間の期間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、前記小児哺乳動物から、または同じ種の異なる哺乳動物から単離されていてもよい。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、予め凍結されていてよい。
【０１８３】
一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位は、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記１カ所または複数カ所の注射部位のうちの１カ所は、前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であってよい。一部の実施形態では、前記投与するステップは、少なくとも４カ所の注射部位を含んでよい。一部の実施形態では、前記第１の注射部位は、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であってよく、前記第２の注射部位は、前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約２〜約１インチ上部であってよく、前記第３の注射部位は、前記膵臓から約３．２５〜約２．２５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であってよく、前記第４の注射部位は、前記膵臓から約１．７５〜約０．７５インチ左外側かつ前記膵臓から約３〜約２インチ上部であってよい。
【０１８４】
一部の実施形態は、前記寛容原性樹状細胞の皮下注射を少なくとも３回、４回または５回投与するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態では、前記血中グルコースを約２５日から約３５日の間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる。一部の実施形態では、前記血中グルコースを約６５週間から７５週間の間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる。
【０１８５】
一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記投与するステップは、追加的な免疫抑制療法を投与することを含まなくてもよい。一部の実施形態では、前記投与するステップにより、前記注射部位まで３細胞長の半径距離内にあるＴ細胞の同時刺激を妨げることができる。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞を少なくとも１つのマーカーで標識することができる。一部の実施形態では、前記マーカーは、蛍光マーカーであってよい。一部の実施形態では、前記蛍光マーカーは、生存能力の指標であってよい。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞の全てをマーカーで標識しなくてもよい。
【０１８６】
一部の実施形態では、前記２回またはそれ超の寛容原性樹状細胞の皮下注射は、少なくとも１つの粒子を含んでよく、前記粒子は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、もしくは配列番号７として記載されている核酸配列、またはそれらの組合せを含むオリゴヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、前記粒子を少なくとも１つのマーカーで標識することができる。一部の実施形態では、前記粒子の全てをマーカーで標識しなくてもよい。一部の実施形態では、前記マーカーは、蛍光マーカーであってよい。一部の実施形態では、前記蛍光マーカーは、ｐＨ指示薬であってよい。
【０１８７】
一部の実施形態は、前記寛容原性樹状細胞を投与した後に前記マーカーを追跡するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、所定の解剖学的位置における前記少なくとも１つのマーカーの蓄積を定量化するステップをさらに含んでよい。
【０１８８】
一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で１カ月にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で５年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１０歳の間、または約１１歳から約１８歳の間であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、糖尿病の小児期発症を有し得る。
【０１８９】
一部の実施形態は、前記小児哺乳動物における抑制性Ｂ細胞集団を増大させるステップをさらに含んでよく、ここで全身的な抑制性Ｂ細胞増大と比較してより大きな抑制性Ｂ細胞の局所的な増大が前記膵臓の近くで起こり得る。一部の実施形態では、追加的な免疫抑制療法を投与しなくてもよい。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１０歳の間、または約１１歳から約１８歳の間であってよい。
【０１９０】
一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で１カ月にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で１年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。一部の実施形態では、前記小児哺乳動物は、最大で５年にわたって１型糖尿病の臨床発症を有し得る。
【０１９１】
一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ１９、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＩＬ−１０、およびＣＤ４０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ２４を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ１Ｂ、ＣＤ５、ＣＤ１９、およびＩＬ１０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、ＣＤ１１ｃマーカーを発現しない可能性がある。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、メモリーＢ細胞集団を含んでよい。一部の実施形態では、前記メモリーＢ細胞集団は、以下のマーカー：ＣＤ２７、ＣＤ３８、およびＣＤ４０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、増殖し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞集団は、分化し得る。一部の実施形態は、Ｔ細胞集団の増殖を抑制するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞集団からの抑制性Ｂ細胞と前記Ｔ細胞集団からのＴ細胞を接触させるステップをさらに含んでよい。
【０１９２】
一部の実施形態では、寛容原性樹状細胞、ナノ粒子、微小粒子、またはそれらの組合せを含む皮下注射を２回またはそれ超投与することによって、前記抑制性Ｂ細胞集団を誘導することができる。一部の実施形態では、前記２回またはそれ超の皮下注射は、前記膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位に投与することができる。一部の実施形態では、前記２回またはそれ超の皮下注射は、４カ所の注射部位を含んでよい。一部の実施形態では、前記ナノ粒子は、オリゴヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、前記微小粒子は、オリゴヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態は、少なくとも１つの寛容原性樹状細胞を投与することによって前記抑制性Ｂ細胞集団に生存の増加を付与するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞集団の表面上の生存促進性シグナルの発現を非抑制性細胞集団と比較して増加させるステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、少なくとも１つの寛容原性樹状細胞を投与することによって非抑制性Ｂ細胞集団におけるアポトーシスを誘導するステップをさらに含んでよい。
【０１９３】
一部の態様では、小児哺乳動物における１型糖尿病を処置するために抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比を変更するための方法であって、前記小児哺乳動物の膵臓の近位にある部位に寛容原性樹状細胞を注射するステップを含み、前記変更が、前記抑制性Ｂ細胞を増加させ、前記Ｔ細胞を減少させることを含み得る方法が本明細書において提供される。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞を増大させるステップをさらに含んでよい。一部の実施形態は、前記Ｔ細胞の増殖を抑制するステップをさらに含んでよい。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞は、以下のマーカー：Ｂ２２０、ＣＤ１９、およびＩＬ１０を発現し得る。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞は、ＣＤ１１ｃマーカーを発現しない可能性がある。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比は約１：１０であってよい。一部の実施形態では、前記比は、前記Ｔ細胞の前記増殖を約４０％〜約５５％低下させることによって変更することができる。一部の実施形態では、前記比は、前記Ｔ細胞の前記増殖を約６５％〜約８０％低下させることによって変更することができる。一部の実施形態では、前記抑制性Ｂ細胞とＴ細胞の比は約１：１であってよい。一部の実施形態は、前記抑制性Ｂ細胞の少なくとも１つと前記Ｔ細胞の少なくとも１つを接触させるステップをさらに含んでよい。
【０１９４】
一部の態様では、哺乳動物における炎症応答を低減するための方法であって、前記哺乳動物の膵臓内またはその近くに寛容原性樹状細胞を導入し、それにより、前記哺乳動物においてレチノイン酸を産生させるステップを含み、前記レチノイン酸の産生により、少なくとも１つのレチノイン酸受容体および少なくとも１つのレチノイドＸ受容体を発現する抑制性Ｂ細胞集団の増加がもたらされ得る方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、マウスまたは非ヒト霊長類であってよい。一部の実施形態では、前記ヒトは、約１歳から約５歳の間、約６歳から約１９歳の間、または約１１歳から約１８歳の間であってよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、過敏性腸疾患（ＩＢＤ）を有してよい。一部の実施形態では、前記哺乳動物は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）を有してよい。
【実施例】
【０１９５】
（実施例１）
アンチセンスオリゴヌクレオチドをローディングしたマイクロスフェア
本実施例で使用する、ＣＤ４０、ＣＤ８０、およびＣＤ８６転写産物に標的化するＡＳ−オリゴヌクレオチド配列は以下の通りであり、アスタリスクは骨格内のチオ化の部位を示す：
【０１９６】
【化６】
0006595469.tif 000007
オリゴヌクレオチド混合物の水溶液を、それぞれが１種類のオリゴヌクレオチドを含有する３つのオリゴヌクレオチド溶液のアリコートを組み合わせて、３種類のオリゴヌクレオチドの１０ｍｇ／ｍｌ溶液を形成することによって調製した。脱イオン水中ポリ−Ｌ−リシン．ＨＢｒの１０ｍｇ／ｍｌ溶液（最大７０，０００ダルトンのポリ−Ｌ−リシン．ＨＢｒ）を調製した。ポリ−Ｌ−リシン．ＨＢｒをオリゴヌクレオチド溶液に体積比１：１で添加した。混合物を穏やかにボルテックスした。１Ｍの酢酸ナトリウム中１２．５％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、４０，０００ダルトン）および１２．５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、３，３５０ダルトン）を含有する２５％ポリマー溶液、ｐＨ５．５を以下の通り２：１  ５０体積比で添加した：ＡＳ−オリゴヌクレオチド０．７５ｍｌ、ポリ−Ｌ−リシン．ＨＢｒ  ０．７５ｍｌ、ＰＥＧ／ＰＶＰ  ３．０ｍｌ、総体積４．５０ｍｌ。
【０１９７】
バッチを７０℃で３０分インキュベートし、次いで、２３℃まで冷却した。冷却すると溶液は混濁し、マイクロスフェアが形成された。次いで、懸濁液を遠心分離し、過剰なＰＥＧ／ＰＶＰを除去した。生じたペレットを、ペレットを脱イオン水中に再懸濁させ、その後、遠心分離し、上清を除去することによって洗浄した。洗浄プロセスを３回繰り返した。水性懸濁液を凍結および凍結乾燥してオリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンを含むマイクロスフェアの乾燥粉末を形成した。
【０１９８】
図１Ａおよび図１Ｂは、ポリ−Ｌ−リシン：オリゴヌクレオチド比が１：１のマイクロスフェアの、２つの異なる拡大率の代表的な走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）を示す。サイズが０．５〜４ミクロンであり、平均粒子サイズがおよそ２．５ミクロンであるマイクロスフェアを製作した。図２Ａは、レーザー光散乱によって明らかになった、本開示に従って作出した１つのマイクロスフェアの調製物のサイズ分布を示す。図２Ｂは、光散乱による、マイクロスフェア調製物の表面電荷（ゼータ電位）の決定を示す。図３は、脱製剤化後のマイクロスフェアのアンチセンスオリゴヌクレオチド成分のローディングを定量化し、その完全性を評価するために使用した逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ方法を示す。ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ８０オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ；ＭＷ３０〜７０ｋＤ）を使用してマイクロスフェアを製剤化した。次いで、ＰＬＬ由来のＤＮＡオリゴヌクレオチドのポリ−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＡ）による競合置換を使用してマイクロスフェアを脱製剤化した。ＰＡＡは、２６０ｎｍにおける吸収がなく、２６０ｎｍにおけるオリゴヌクレオチドの定量化に干渉しないポリアミノ酸試薬であるので、これを選択した。図３などのＲＰ−ＨＰＬＣプロファイルでは、各ピーク下面積はマイクロスフェアにローディングされた各オリゴヌクレオチドの量に比例した。図３に示されている通り、ピークの高さにより、各オリゴヌクレオチドがマイクロスフェアにほぼ同等にローディングされたことが示された。マイクロスフェアへのオリゴヌクレオチドのローディングは、約６５重量％〜約８０重量％であると算出された。図３では、脱製剤化後のピークの分布が狭いことによって示される通り、オリゴヌクレオチドの完全性はマイクロスフェア製剤化プロセスの影響を受けないことも示された。
【０１９９】
（実施例２）
アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェア
ペプチドＯ１０Ｈ６でコーティングされたカルボキシレートポリスチレンマイクロスフェア。当該マイクロスフェアは、分散１０％未満で０．１μｍの平均直径を有する。
【０２００】
分散１０％未満の平均直径が０．１μｍであるカルボキシレートポリスチレンマイクロスフェア３マイクロリットルを、まず、ペプチドＯ１０Ｈ６２００μｇを用い、ｄｄＨ２Ｏ  ３００μＬ中、室温で２時間穏やかに振盪することによってコーティングした（ｄｄＨ２Ｏに対して２．５％ｗ／ｖのマイクロスフェア；１ｍｌ当たり粒子４．５５×１０１３個）。次いで、生じた正荷電粒子を、アンチセンスオリゴヌクレオチド（総重量１８．７ｎｇ）を用いて室温で３０分、平衡化した。結合していないアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＯ１０Ｈ６ペプチドを、Ｎａｎｏｓｅｐデバイスを１０Ｋの分子量カットオフで用いて膜濾過し、その後、室温で５分、５００ｇで遠心分離することによって除去した。遠心分離後に、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェアを回収し、ＯｐｔｉＭＥＭ培地１．５ｍＬ中、マウス脾臓集団から単離したｅｘ  ｖｉｖｏ樹状細胞３．０×１０６個に添加し、それにより、樹状細胞による取り込みのために最終的なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を１．５５ｎＭにした。
【０２０１】
概略図は、Ｏ１０Ｈ６およびアンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたカルボキシレートポリスチレンマイクロスフェアの自己集合系を示す（図４Ａ）。コーティングされていないマイクロスフェア（図４Ｂ）、ならびにＯ１０Ｈ６およびアンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェア（図４Ｃ）を、平均マイクロスフェアサイズについて、Ｎｉｃｏｍｐ  ３８０  ＺＬＳ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して分析した。コーティングされたマイクロスフェア試料は、ｄｄＨ２Ｏ  ３００μｌ中、マイクロスフェア１．３７×１０１１個、Ｏ１０Ｈ６２００μｇ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド１８．７ｎｇを含有した。アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェアの平均粒子サイズは、標準偏差３８．７で１１８ｎｍであると決定された。
【０２０２】
（実施例３）
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたｅｘ  ｖｉｖｏ寛容原性ＤＣの作出
ＮＦ−ＫＢ結合部位を伴うセンスオリゴヌクレオチド配列：
配列番号１１：５’ＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ３’
ＮＦ−ＫＢ結合部位を伴うアンチセンスオリゴヌクレオチド配列：
配列番号１２：５’ＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＣＡＧＣＧＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴ３’  。
【０２０３】
特異的なデコイにおけるＧＧＧＧカルテットによって誘導されている可能性がある非特異的配列の影響ならびにアプタマーの影響についての対照として、ランダムな配列からなる二本鎖オリゴヌクレオチドを使用し、本明細書ではＯＤＮ１と名付けた。
【０２０４】
ＯＤＮ１のセンスオリゴヌクレオチド配列：
配列番号１３：５’ＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＡ３’
ＯＤＮ１のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列：
配列番号１４：５’ＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＴ５’
さらに、本明細書ではＯＤＮ２と名付けた、不完全なＮＦ−ＫＢコンセンサス配列を含有する対照配列を使用した。
【０２０５】
不完全なＮＦ−ＫＢ部位を伴うＯＤＮ２のセンスオリゴヌクレオチド配列：
配列番号１５：５’ＡＧＧＴＡＣＴＧＴＣＣＧＣＧＴＴＡＧＡＣＧＴＧＣＣ３’
不完全なＮＦ−ＫＢ部位を伴うＯＤＮ２のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列：
配列番号１６：５’ＧＧＣＡＣＧＴＣＴＡＡＣＧＣＧＧＡＣＡＧＴＡＣＣＴ３’  。
【０２０６】
各オリゴヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖を、１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下で混合し、１００℃まで加熱し、室温まで冷まして二本鎖ＤＮＡを得た。ＦＩＴＣとコンジュゲートした二本鎖デコイを同様に調製した。
【０２０７】
雄Ｃ５７ＢＬ／１０Ｊ（Ｂ１０；Ｈ２ｂ；Ｉａｂ）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｃ３Ｈ；Ｈ２ｋ；Ｉａｋ；Ｉｅｋ）マウスおよび雌ＮＯＤマウスを病原体が存在しない特別な設備において維持した。動物に標準の固形飼料を自由に摂取させ、８〜１２週齢で使用した。
【０２０８】
正常なＢ１０マウスまたはＮＯＤマウスの大腿骨から骨髄（ＢＭ）細胞を採取し、２４ウェルプレート（ウェル当たり２×１０６個）において、抗生物質および１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地２ｍｌ中で培養した。４ｎｇ／ｍｌの組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を添加して未成熟ＤＣを増殖させた。ＧＭ−ＣＳＦに加えて、１０００単位／ｍｌの組換えＩＬ−４をＤＣの培養開始時に添加した。サイトカイン富化培地を２日ごとに新しくした；プレートを穏やかに旋回させた後、古い培地の半分を吸引し、同体積の新鮮なサイトカイン補充培地ならびにＩＬ−４を添加した。したがって、プラスチック接着性マクロファージの単層に緩く付着した発達中のＤＣのクラスターを取り除かずに非接着性顆粒球を枯渇させた。非接着性細胞はクラスターから自然に放出され、５〜７日後に回収した。
【０２０９】
ＤＣが二本鎖ＯＤＮを効率的に取り込むことができることを実証するために、マウス骨髄（ＢＭ）由来ＤＣをＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４（ＩＬ−４ＤＣ）中で４〜５日にわたって増殖させ、ＦＩＴＣとコンジュゲートしたＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮに２時間から３６時間までにわたる期間、曝露させた。図５に示されている通り、大多数のＤＣ（＞８０％）が蛍光を示し、これにより、ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮが存在することが示された。培養物において細胞内ＯＤＮは少なくとも１４日にわたって検出された。この期間中、ＤＣは生存可能なままであり、毒性の証拠はなかった。ピーク蛍光はＤＣをＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮに１８時間曝露させた後に認められた。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４と一緒に６〜７日にわたって培養したＤＣは、それらの食作用能が失われる完全な成熟細胞に発達した。完全な成熟ＤＣ（ＣＤ４０＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＭＨＣクラスおよびＭＨＣクラスＩＩＩ）をＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮに曝露させたところ、細胞において蛍光は観察されず、これにより、ＦＩＴＣとコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを取り込むことができないことが示され、これは、これらの細胞が外因性抗原をプロセシングできないことと一致した。
【０２１０】
（実施例４）
ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮで処理したｅｘ  ｖｉｖｏ  ＤＣを用いた１型糖尿病の処置
ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮ  ＤＣにより１型糖尿病発生を阻害することができるかどうかを決定するために、糖尿病発生に関して当技術分野において認められているモデルである非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスを使用した。雌ＮＯＤマウスを７週齢でＤＣを用いて処置した。上記の実施例３に記載の方法に従ってＮＯＤマウスからＤＣを単離した。示されている場合では、次いで、ＤＣを、ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮまたはＩＬ−４の存在下で５日にわたって増殖させ、次いで、島抗原（ＡＧ）を用いてパルスした。マウスにＤＣ２×１０６個を注射し、電子グルコメーターによって糖尿病発生をモニターした。血清中グルコースレベルが３５０ｍｇ／ｍｌを上回ることにより、糖尿病発生が示された。
【０２１１】
ＮＯＤマウス（４〜５週齢）由来のインタクトな島を、灌流した膵臓の制御コラゲナーゼ消化によって単離した。島を、あらゆる非内分泌性組織に対する純度が確実になるように精選してリン酸緩衝食塩水中に採取し、５サイクルの凍結融解（３７℃で５分間、−８０℃で５分間）に供した。次いで、溶解物をＰＢＳで調整してＤＣ１０個当たり膵島細胞１個をもたらした。次いで、ＤＣを、適切な体積の島溶解物を用いて終夜パルスし、広範囲に洗浄し、ＮＯＤマウスに注射した。
【０２１２】
図６Ａには、島抗原溶解物を用いてパルスした、ＮＯＤ骨髄由来ＩＬ−４ＤＣによりＴ細胞増殖を強力に誘導されるが、ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮ  ＤＣではＴ細胞増殖が誘導されないことが示されている。さらに、ＮＯＤ骨髄由来ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮは、表面上に高レベルの共刺激分子を発現するＮＯＤ骨髄由来ＩＬ−４  ＤＣと比較して、ＣＤ８０およびＣＤ８６を有意に阻害した（図６Ｂを参照されたい）。さらに、ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮ  ＤＣにより、ＮＯＤマウスにおける糖尿病発生が劇的に阻害された。図７には、ＮＦ−ＫＢ  ＯＤＮ  ＤＣを用いて処置したＮＯＤマウスの１００％が３２週齢時に正常レベルの血清グルコースを有したが、無処置マウスの１００％で１７週齢になる前に糖尿病が発生したことが示されている。
【０２１３】
（実施例５）
アンチセンスオリゴヌクレオチドをローディングしたマイクロスフェアを用いた１型糖尿病の処置
アンチセンスオリゴヌクレオチドマイクロスフェアの、早発性ＮＯＤマウスにおける糖尿病の症状を逆転させる能力を試験した。これらの実験の時系列が図９Ａに示されている。早発性糖尿病のＮＯＤマウスを、血中グルコースレベルを試験し、血中グルコースレベルが４００ｍｇ／ｄＬを超えている動物を同定することによって選択した。選択された動物にインスリンペレットを与えて血中グルコースレベルを３００ｍｇ／ｄＬ未満まで正常化した。インスリンを中止し、次いで、マイクロスフェアの一連の非経口注射を開始した。動物６匹に、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアを週２回注射した。さらなる１０匹の動物に、ＣＤ４０、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６を対象としないスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を含有するマイクロスフェアを注射した。両群の動物に対する各注射は、注射体積１００μＬのオリゴヌクレオチドをローディングしたマイクロスフェアを含む。注射プロトコールの開始後に、血中グルコースレベルを週２回サンプリングし、動物は実験中絶食させない。結果が図８Ａにプロットされており、指標（１）はインスリンペレットの導入を示し、指標（２）はインスリンペレットの除去および週２回のＭＳＰ注射の開始を示す。図８Ｂにおいて報告されている最大血中グルコース値は７００ｍｇ／ｄＬであり、これは、使用したメーターの最大読み取りに対応することに留意する。したがって、７００ｍｇ／ｄＬデータ点により、７００ｍｇ／ｄＬまたはそれ超の血中グルコース読み取りが示される。ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチド混合物を含有するマイクロスフェアを受けた群内の全ての動物（ＡＳ−ＭＳＰ１〜ＡＳ−ＭＳＰ６）で、スクランブルオリゴヌクレオチドを有するマイクロスフェアを受けた動物（ＳＣＲ−ＭＳＰ１〜ＳＣＲ−ＭＳＰ１０）よりも有意に低いグルコースレベルが示された。さらに、このＡＳ−ＭＳＰ群の動物６匹のうち４匹で、一般に糖尿病発症の閾値指標とみなされる、４００ｍｇ／ｄＬ未満の血中グルコースレベルが示された。図９Ａに実験の時系列が示されている。各群についての平均非空腹時血中グルコース（図９Ｂ）および平均空腹時血中グルコースレベルをプロットした（図９Ｃ）（＋／−ＳＥＭ）。血中グルコースが３００ｍｇ／ｄＬ未満に下がるまでインスリンを毎日投与した。次いで、インスリンを停止し、そこでＡＳ−ＭＳＰを皮下投与した。動物に、体重１ｋｇ当たり２ｍｇのＡＳ−ＭＳＰを週２回、３〜４週間与えた。図９Ａに示されている通り、一部のマウスではＡＳ−ＭＳＰ投与を中止した。新規発症糖尿病ＮＯＤ雌マウスにおける多数回のＡＳ−ＭＳＰ投与（図９Ｂおよび図９Ｃ）により、無処置の動物（対照）、ＰＢＳを用いて処置した動物またはスクランブルオリゴヌクレオチド（ＳＣＲ−ＭＳＰ）マイクロスフェアを用いて処置した動物と比較して、ＡＳ−ＭＳＰを中止した後であっても、血中グルコースレベルが改善され、安定な空腹時正常血糖がもたらされた。
【０２１４】
ＮＯＤマウスへのＡＳ−ＭＳＰの投与（図１０Ａ〜Ｃ）により、前記マウスの血中グルコースレベルが正常なレベルに戻り、前記血中グルコースレベルの正常化は長期間にわたって維持された。図１０Ｂおよび図１０Ｃに示されている通り、インスリン投与を停止後０〜３０日にＡＳ−ＭＳＰを投与した。血中グルコースレベルはインスリン停止後１５日目までに正常に戻り、モニタリング期間の終了（５５日目）まで正常なレベルのままであった。自己免疫性糖尿病の治療的逆転の影響を示す図が図１１に示されている。
【０２１５】
（実施例６）
ヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドをローディングしたマイクロスフェア
下記の実施例では以下のヒトアンチセンス配列を使用する：
【０２１６】
【化７】
0006595469.tif 000008
水溶液中およそ６．０ｍｇのポリ−Ｌ−リシンを１５ｍｌの円錐管に入れてウォーターバスで７０℃まで加熱した。水溶液中ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６アンチセンスオリゴヌクレオチド（上記の配列番号１７、１８および１９）の混合物６．９ｍｇを１５ｍｌの円錐管に入れてウォーターバスで７０℃まで加熱した。１２．５％ＰＥＧ／１２．５％ＰＶＰ溶液もウォーターバスで７０℃まで加熱した。ポリ−Ｌ−リシンをアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液中にピペットで入れ、生じた懸濁液をピペットの先端で旋回させることによって軽く混合した。次に、チューブをすぐに７０℃のウォーターバスに戻し、５分インキュベートした。次いで、ＰＥＧ／ＰＶＰ溶液をＡＳＯ／ＰＬＬ溶液に添加し、ピペットの先端で旋回させることによって軽く混合した。
【０２１７】
次いで、チューブをすぐに７０℃のウォーターバスに戻し、５〜１０分インキュベートした。次に、１℃／分の冷却速度を使用して製剤を４℃まで冷却した。次いで、試料を氷上で水洗浄した。
【０２１８】
次いで、試料を４℃、４７５０ｒｐｍで１０〜３０分遠心分離した。次いで、上清を除去し、マイクロスフェアを４℃で等体積のＨ２Ｏに再懸濁させた。次いで、マイクロスフェアをさらに３回、４℃、４７５０ｒｐｍで５〜１０分の遠心分離、洗浄および再懸濁によって、上清を除去し、マイクロスフェアを再懸濁させ、４℃で等体積のＨ２Ｏに再懸濁させることによって洗浄した。
【０２１９】
４回目の遠心分離ステップの後、マイクロスフェアを再懸濁させておよそ１０ｍｇ／ｍｌの濃度にした。次いで、試料をドライアイス上または−８０℃の冷凍装置中で３０分にわたって凍結させ、およそ２４時間にわたって凍結乾燥して乾燥状態にした。
【０２２０】
（実施例７）
膵臓リンパ節へのマイクロスフェアの蓄積
２ｍｇ／ｋｇの、蛍光タグを付けたオリゴヌクレオチドをローディングしたマイクロスフェアをマウスに注射した後、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａワークステーションにおける生動物イメージングを収集した（図１２Ａ；ＣＮは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを伴わない対照マイクロスフェアを指し、ＡＳは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを伴う特定の糖尿病抑制性マイクロスフェアを指す）。マウスを安楽死させた後、種々の器官およびリンパ節を採取し、別々に可視化した（図１２Ｂ）。示されている通り、蛍光は膵臓の内側に濃縮され、脾臓では非常にわずかな程度までしか濃縮されなかった。図１２Ｃおよび図１２Ｄに、２つの異なるマウスレシピエントの膵臓における２日にわたる蛍光蓄積が要約されている。マイクロスフェアを膵臓より遠位の部位に注射したところ、膵臓の内側にも膵臓リンパ節にも蓄積しなかった（図１３；ＩＰは、腹腔内注射を指し、Ｓｕｂ  Ｑは、示されている部位における皮下注射を指す）。
【０２２１】
２ｍｇ／ｋｇの、蛍光タグを付けたオリゴヌクレオチドをローディングしたマイクロスフェアを非ヒト霊長類に、図１４に示されている位置に注射した後。これらのマイクロスフェアは、膵臓リンパ節の内側に優先的に蓄積し、肝臓の内側への蓄積は非常にわずかであったが、他の器官には蓄積しなかった（図１５Ａ〜Ｃ）。蛍光は、定義によれば樹状細胞である、膵臓リンパ節由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ４５＋細胞の内側に濃縮された。
【０２２２】
（実施例８）
膵臓リンパ節への寛容原性ＤＣの蓄積
ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて骨髄前駆細胞から生成した２×１０６個細胞を、蛍光タグを付けたスフェアと一緒に注射した後、マウスを安楽死させ、リンパ節を含めた種々の器官を採取した。器官を、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａワークステーションの下で可視化し（図１６）、それにより、ｅｘ  ｖｉｖｏ寛容原性樹状細胞が膵臓および膵臓リンパ節に優先的に蓄積することが示された。
【０２２３】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて末梢血単核前駆細胞から生成した細胞２×１０６個を、蛍光タグを付けたスフェアと一緒に注射した後、非ヒト霊長類を安楽死させ、リンパ節を含めた種々の器官を採取した。ｅｘ  ｖｉｖｏ寛容原性樹状細胞の蓄積は、膵臓の内側および膵臓リンパ節で優先的に起こったが、他の器官では起こらなかった（図１６）。結果は、２種の関連しない非ヒト霊長類において同等であった（図１８）。注射は、予測される膵臓の位置を覆う四角形の縁において行った（図１７）。
【０２２４】
（実施例９）
寛容原性ヒトＤＣの調製、投薬量および投与
微生物感染／汚染が存在しないこと、内毒素が体重１ｋｇ当たり５ＥＵ未満であること、生存能力が７０％超であることの確認、およびＤＣの純度の確認（フローサイトメトリーによる）を得た後、細胞を、３８０×ｇで１０分遠心分離し、次いで、体積０．５ｍＬ〜１．０ｍＬの滅菌した５％ヒト血清アルブミンに再懸濁させ、滅菌した３ｍＬの注射器中に吸引した。針を、２７ゲージ５／８’’針と交換してリキャップ（recap）した。注射器をヒト被験体に関するコード化された情報で標識し、投与のために、被験体がいる場所に２４時間以内に送達した。その後の注射のため、ならびに離れた場所での細胞送達のために、凍結保存チューブ当たり２．５×１０６個の細胞をアリコートにし、チューブを液体窒素条件下で保管した。最初の用量として使用する細胞は２時間以内に注射した。
【０２２５】
投薬計画が図１９に示されている。被験体に投与した細胞の最大総量は、４回の処置のそれぞれについて２．５×１０６個であり（２週間ごとに１回）、合計で最大細胞４０×１０６個であった。被験体は、樹状細胞１×１０５〜４×１０７個を皮下に受けた（まとめた量が所望の総用量になる同等数の細胞を、解剖学的に膵臓の近位の別個の４カ所の部位に４回注射）。投与当たり、独特の注射部位４カ所は、胃／膵臓の身体の位置から垂直上部の前側腹壁の内側に指定した。これらの４部位は３〜４平方インチの四分円内であった。
【０２２６】
細胞を、４カ所の個々の注射部位それぞれにおいて、皮膚の隆起した「ブレブ」の下に、２７ｇ−１／２’’針を付着させたツベルクリン注射器によって送達した。注射は、身体の腹部の部位のそれぞれにおいて２０秒にわたってゆっくりと行った。
【０２２７】
（実施例１０）
１型糖尿病の安定した処置は寛容原性ＤＣの多数回注射によって達成される
多数回の寛容原性ＤＣ注射（ｎ＝８）により、大多数の新規発症糖尿病ＮＯＤマウスにおけるグルコースレベルが１００〜２８０ｍｇ／ｄＬ範囲内に安定に維持された（図２０Ａ）。多数回の対照ＤＣ注射（ｎ＝８）では、少数のレシピエントにおいて、一過性にではあるが、１型糖尿病が一過性に逆転した。単回の寛容原性ＤＣ注射は、多数回注射と比較して、血中グルコース安定性の回復に有効ではなかった。線は、個々のＮＯＤマウスにおける非空腹時血中グルコースレベルを示す。糖尿病性高血糖が確認されたら、マウスに、グルコースレベルが２８０ｍｇ／ｄＬ未満に低下するまでインスリンを投与した（平均で５〜８日）。この時点で、インスリンを中止した。次いで、ＤＣ（対照または寛容原性）２×１０６個を、胃腸器官を覆う側腹部に皮下注射した。０時間は、糖尿病が確認された時点を表した。ｘ軸の下の黒い矢印は、インスリンを中止し、同時に１回目のＤＣ注射を行った時点を示した。灰色の矢印は、ＤＣを投与した時点を示した（単回または多数回）。グラフ内の破線は、逆転したｉＤＣ処置群において測定された最小および最大非空腹時血中グルコースレベルを示した。新規発症糖尿病ＮＯＤマウスを他のいかなる処置にも供さなかった場合、血中グルコースはインスリンを中止してから１日以内に２８０ｍｇ／ｄＬ閾値を超えた（図２０Ｂ）。
【０２２８】
（実施例１１）
寛容原性ＤＣ送達により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抑制性Ｂ細胞の頻度の上昇が促進される
ＤＣ（対照または寛容原性）２×１０６個を、ＮＯＤ雌マウスにおいて胃腸器官を覆う側腹部に皮下注射した。３日後、脾臓を採取し、ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＩＬ−１０＋Ｂ細胞ならびにＢ１０  Ｂｒｅｇの頻度をフローサイトメトリーによって測定した。絶対数を、組織から回収された生存可能な単一細胞の総数のヘマトクリット測定値に基づいて算出した。
【０２２９】
各型のＤＣ集団（およびＰＢＳビヒクル対照）の少なくとも４つの異なるＮＯＤレシピエントの新たに採取した脾細胞（図２１Ａ）および同じマウスから取得した新たに採取した膵臓リンパ節単一細胞（図２１Ｂ）における、ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＩＬ−１０＋細胞（ＤＣ−Ｂｒｅｇ；上の２つのヒストグラム）およびＢ１０  Ｂｒｅｇ（下の２つのヒストグラム）の頻度を同定および測定するために使用したフローサイトメトリー手法を示した。
【０２３０】
フローサイトメトリーによって総脾細胞に対する％として測定されたＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＩＬ−１０＋Ｂ細胞（ＤＣ−Ｂｒｅｇ）の頻度のグラフによる要約を図２１Ｃに示した。処置の種類ごとの、組織を採取したマウスの番号を、中央値を表すバーの上に示した。エラーバーに標準偏差を反映させた。ｉＤＣとｃＤＣ／無処置の対照の差異は統計学的に有意であった（ｐ＜０．００５、分散のクラスカル−ワリス検定）。
【０２３１】
フローサイトメトリーによって測定された、無処置のＮＯＤマウス、ｃＤＣを注射したＮＯＤマウスおよびｉＤＣを注射したＮＯＤマウスの新たに採取した脾臓におけるＤＣ−Ｂｒｅｇの絶対数のグラフによる要約を図２１Ｄに示した。バーは中央値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。中央値の間の差異は統計学的に有意であった（分散のクラスカル−ワリス検定）。
【０２３２】
図２１Ｅに示されている通り、Ｂ１０  Ｂｒｅｇ（ＣＤ１９＋ＣＤ１ｄ＋ＣＤ５＋Ｉｌ−１０＋細胞）の頻度のグラフによる要約をフローサイトメトリーによって総脾細胞に対する％として測定した。治療の種類ごとの、組織を採取したマウスの番号を、中央値を表すバーの上に示した。エラーバーに標準偏差を反映させた。ｉＤＣとｃＤＣ／無処置の対照の差異は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５、分散のクラスカル−ワリス検定）。
【０２３３】
フローサイトメトリーによって測定された、無処置のＮＯＤマウス、ｃＤＣを注射したＮＯＤマウスおよびｉＤＣを注射したＮＯＤマウスの新たに採取した脾臓におけるＢ１０  Ｂｒｅｇの絶対数のグラフによる要約を図２１Ｆに示した。バーは中央値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。中央値の間の差異は統計学的に有意であった（ｐ＜０．００５、分散のクラスカル−ワリス検定）。
【０２３４】
１０週齢の雌非糖尿病ＮＯＤマウスの新たに単離した脾細胞から選別したＢ１０  Ｂｒｅｇのヘマトキシリン／エオシン染色したサイトスピン（cytospin）を図２１Ｇに示した。形態は、年齢が一致した別の５匹の雌ＮＯＤマウスからのサイトスピンの間で同一であった。
【０２３５】
（実施例１２）
抑制性Ｂ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける同種異系混合リンパ球反応において機能的に抑制性である
脾臓Ｔ細胞、照射した脾細胞（単独で、ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＩＬ−１０＋Ｂ細胞と一緒に、またはその存在下で）の５連ウェルを５日間インキュベートした（図２２Ａ）。最終日にＢｒｄＵを添加した。６日目にＢｒｄＵ＋細胞の数をフローサイトメトリーによって測定した。培養物は、１×１０５個の、ＮＯＤ雌マウス（８週齢）の脾臓由来のＴ細胞、照射した同種異系脾細胞（Ｃ５７ＢＬ／６雄、８週齢）および精製したＢ２２０＋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｃ−ＩＬ−１０＋Ｂ細胞からなった。Ｔ細胞または脾細胞のみの増殖をこれらの分析における１００％増殖を表すものとみなした。バーは、ｎ＝５ウェルの平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＩＬ−１０＋Ｂ細胞の、ｃＤＣまたはｉＤＣの不在下での共培養物における増殖のＤＣの存在下での共培養物における増殖と比較した差異は統計学的に有意であった（ｐ値がグラフのバーの上に単一のアスタリスク、２重のアスタリスク（ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）または３重のアスタリスク（ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）で示されている）。バーの最後の２つのセットは、ＤＣ−Ｂｒｅｇ：Ｔ細胞数の比１：１０と１：１でのＴ細胞の増殖を比較したものである。
【０２３６】
脾臓Ｔ細胞、照射した脾細胞（単独で、ＤＣ−Ｂｒｅｇと一緒に、またはその存在下で）の５連ウェルを５日間インキュベートした（図２２Ｂ）。ＤＣ−Ｂｒｅｇ：Ｔ細胞数の比は、全ての共培養物において１：１０であった。最終日にＢｒｄＵを添加した。示されている場合限りでは、抗ＩＬ−１０抗体を１μｇ／ｍＬで添加した。照射した脾細胞の存在下でのＴ細胞の増殖を、１００％増殖を表すものとみなした。バーは、ＢｒｄＵ＋細胞の平均を対照Ｔ細胞：脾細胞共培養物（ｎ＝５ウェル）におけるＢｒｄＵ＋に対する％として表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＤＣ−Ｂｒｅｇの不在下での共培養物におけるＴ細胞増殖とＤＣの存在下での共培養物におけるＴ細胞増殖の差異は統計学的に有意であった（グラフに示されているｐ値、ＡＮＯＶＡ）。
【０２３７】
Ｔ細胞および同種異系の照射した脾細胞の共培養物を分離するトランスウェルインサートの上部にＤＣ−Ｂｒｅｇを添加して混合リンパ球反応を行った（図２２Ｃ）。ＤＣ−Ｂｒｅｇ：Ｔ細胞数の比は全ての共培養物において１：１０であった。示されている場合では、抗ＩＬ−１０抗体を１μｇ／ｍＬでトランスウェルインサートの上部（ＤＣ−Ｂｒｅｇを伴う）に添加する。ＤＣ−Ｂｒｅｇの不在下でのディッシュ（Ｔ細胞：脾細胞共培養物）の底部における細胞の増殖を、これらの分析における１００％増殖を表すものとみなした。Ｎ．Ｓ．＝平均間の差異は有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。
【０２３８】
（実施例１３）
寛容原性ＤＣにより、抑制性Ｂ細胞の増殖が促進される
野生型マウス系統から新たに採取した脾細胞からフロー選別されたＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−細胞の蛍光特性に基づいて自己蛍光性細胞を排除するための非常にストリンジェントなゲーティングを用いて、ＩＬ１０ｇｆｐトランスジェニックマウスから新たに採取した脾細胞をフロー選別して、ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＧＦＰ＋またはＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−ＧＦＰ−集団にした（右側のパネルの挿入図）（図２３Ａ）。本実験において実施した全ての選別の転帰を表す、選別後のＧＦＰ＋の純度（一番上の四分円プロットにおけるＩＬ−１０対ＦＳＣで示される）ならびに細胞の生存能力（一番上の四分円プロットの隣のヒストグラムの生／死染色）を示した。選別された細胞（ＧＦＰ＋またはＧＦＰ−）５×１０４個をＰＢＳ、または同数のｃＤＣまたはｉＤＣとの共培養物に入れた。ｃＤＣ、ｉＤＣおよび培地を伴う共培養物における５日後のＢ細胞の代表的なＧＦＰ蛍光をヒストグラムに示し、ＧＦＰ＋細胞を培養物中の総細胞に対する％として表した（３回の別々に行った実験を表すこの特定の実験の値がヒストグラムの中に示されている）。
【０２３９】
グラフによる要約に、高度に精製されたＧＦＰ−出発集団（細胞５×１０４個）を培地、ｃＤＣまたはｉＤＣと共培養した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＦＰ＋  ＤＣ−Ｂｒｅｇの実数値が示されている（図２３Ｂ）。バーは、３連のウェルの平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。ｐ＜０．０５がアスタリスクで示されている（ＡＮＯＶＡ）。
【０２４０】
グラフによる要約に、高度に精製されたＧＦＰ＋出発集団（細胞５×１０４個）を培地、ｃＤＣまたはｉＤＣと共培養した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＦＰ＋ＤＣ−Ｂｒｅｇの実数値が示されている（図２３Ｃ）。バーは３連のウェルの平均を示し、エラーバーはＳＥＭを示す。ｐ＜０．０５がアスタリスクで示されている（ＡＮＯＶＡ）。
【０２４１】
（実施例１４）
抑制性Ｂ細胞の表面マーカーの特徴付け
ゲーティングを示されている通り確立した（ＣＤ１９＋Ｂ２２０＋ＣＤ１１ｃ−）（図２４）。このゲーティング内のヒストグラムに示されている表面タンパク質のそれぞれを発現する細胞の頻度により、ＮＯＤ雌マウス（１０週齢）の新たに単離した脾臓におけるＤＣ−Ｂｒｅｇの表現型をさらに確立した。示されているデータは、年齢が一致した３匹の異なるＮＯＤマウスから新たに得た脾細胞のフローサイトメトリー分析を表す。表面マーカーにはＩｇＤ、ＩｇＭ、ＣＤ１０、ＣＤ２１、ＣＤ２７、ＣＤ３８およびＣＤ４０を含めた。
【０２４２】
（実施例１５）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における抑制性Ｂ細胞
ＢｒｄＵ＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーによって測定した（図２５）。詳細には、ＩＬ１０ｇｆｐトランスジェニックマウスの脾臓から新たに単離したＩＬ１０ｇｆｐＴ細胞を、同系のＣＤ１ｄ、ＣＤ５、ＩＬ−１０枯渇Ｂ細胞（グラフ中に「ＩＬ−１０−ＣＤ１ｄ−ＣＤ５−Ｂ細胞」と示されている）および同種異系の照射した脾細胞（Ｓｐｌ）の存在下または不在下で培養した。データは、ＢｒｄＵ＋Ｔ細胞の対照に対する％として示されており、ここで、対照とは、照射した同種異系脾細胞のみの存在下でのＴ細胞増殖の頻度を指す（１００％とみなす）。Ｂ細胞を、Ｂ細胞：Ｔ細胞の比１：１または１：１０で添加した。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。共培養物間のＴ細胞の増殖の差異は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．１１８、ＡＮＯＶＡ）。
【０２４３】
（実施例１６）
抑制性Ｂ細胞は、レチノイン酸（ＲＡ）受容体を発現する
リアルタイム半定量ＲＴ−ＰＣＲにより、高度に精製された（フロー選別した）ＤＣ−ＢｒｅｇおよびＩＬ１０ｇｆｐトランスジェニックマウスの新たに単離した脾臓由来のＢ１０  Ｂｒｅｇにおいて、ＲＡ受容体アルファ（図２６Ａ）ならびに低レベルのレチノイドＸ受容体（図２６Ｂ）の定常状態ｍＲＮＡの存在が確認された。図２６Ａおよび図２６Ｂのゲル画像にフロー選別したＢ１０  ＢｒｅｇからのＲＴ−ＰＣＲ産物が示されている。Ｂ１０  Ｂｒｅｇ由来のＲＡＲアルファおよびＲＸＲの定常状態ｍＲＮＡレベルを対照として使用し、値を、１００％受容体発現を表すものとみなした。非Ｂ１０  Ｂｒｅｇ集団におけるＲＡＲアルファおよびＲＸＲの定常状態ｍＲＮＡレベルをゲル画像の下のグラフに示し、Ｂ１０  Ｂｒｅｇ値に対して正規化し、過少発現または過剰発現の倍率として示した。定常状態ＲＡＲアルファｍＲＮＡはＢ１０  Ｂｒｅｇ（グラフ中の最初のバー；左端）、ＩＬ−１０−ＣＤ１９＋ＣＤ５＋ＣＤ１ｄ＋細胞（グラフ中の２番目のバー）、ＤＣ−Ｂｒｅｇ（グラフ中の３番目のバー）、およびＩＬ−１０−ＤＣ−Ｂｒｅｇ（グラフ中の最後のバー；右端）において検出された。バーは中央値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。これらのデータは、年齢が一致したマウス（１０週齢、雌）の２つの異なる脾臓由来のフロー選別された細胞からの定常状態ｍＲＮＡを示す。
【０２４４】
（実施例１７）
樹状細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生物活性のＲＡを産生する
ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ試薬は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ発現細胞、したがって、ＲＡ産生細胞を染色するものである。ｃＤＣはＡＬＤＥＦＬＵＯＲ＋であり、ＣＤ１１ｃ＋ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ＋ｃＤＣの頻度がＣＤ１１ｃ＋ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ＋ｉＤＣと同様であった（ｃＤＣ：８．７％の細胞がＣＤ１１ｃ＋ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ＋、それに対してｉＤＣでは９．５％）にもかかわらず、１細胞あたりのベースでは（平均蛍光強度；ＭＦＩ）、ｉＤＣのＡＬＤＥＦＬＵＯＲとの反応性はｃＤＣの２倍であった（８４３７４と比較して４４１８６）（図２７Ａ）。示されているフローサイトメトリー分析は、年齢および性別が一致したＮＯＤ雌マウス（７週齢）４匹の２連の培養物を表す。
【０２４５】
ＲＡ応答エレメント（ＲＡＲＥ）に駆動されるルシフェラーゼ活性は、ｃＤＣまたはｉＤＣの存在下で培養したＲＡＲＥ−Ｌｕｃプラスミドを形質導入したＨＥＫ２９３細胞において検出可能であり、ここで、ＤＣは、それらをＲＡＲＥ−Ｌｕｃを形質導入した２９３細胞から分離するトランスウェル障壁の上に置いた（図２７Ｂ）。２４時間培養した後にルシフェラーゼ活性を測定した。バーは、３連の培養物の平均相対発光（任意の単位）を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。ｃＤＣ平均とｉＤＣ平均の差異は有意ではなかった（スチューデントのｔ検定）。トランスフェクション効率を制御するために、ＨＥＫ２９３細胞にＣＭＶ−ウミシイタケルシフェラーゼ対照プラスミドとＲＡＲＥ−Ｌｕｃ（ホタル）を同時トランスフェクトした。
【０２４６】
記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載されている発明の精神から逸脱することなく変更または改変できることが明らかになろう。出願人らは、以下の特許請求の範囲の範囲および精神の範囲内に入るそのような改変および変形の全てを特許請求する。
【０２４７】
哺乳動物の膵臓リンパ節または膵臓の近位にある１カ所または複数カ所の注射部位での寛容原性樹状細胞の注射、前記血中グルコースを少なくとも２４時間の期間にわたって前記前糖尿病レベルまで回復させることができる。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、前記哺乳動物から、または異なる哺乳動物から単離されていてもよい。一部の実施形態では、前記寛容原性樹状細胞は、予め凍結されていてよい。
【０２４８】
図面の簡単な説明
図１Ａおよび図１Ｂは、ＡＳ−オリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｌ−リシンポリカチオンのマイクロスフェアの走査電子顕微鏡写真である。
【０２４９】
図２Ａは、マイクロスフェアの調製物のサイズ分布を要約したグラフである。
【０２５０】
図２Ｂは、マイクロスフェアの調製物の表面電荷を要約したグラフである。
【０２５１】
図３は、マイクロスフェアの脱製剤化後のオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【０２５２】
図４Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェアの自己集合系の概略図である。
【０２５３】
図４Ｂは、コーティングされていないマイクロスフェアの平均粒子サイズ分布を要約したグラフである。
【０２５４】
図４Ｃは、アンチセンスオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロスフェアの平均粒子サイズ分布を要約したグラフである。
【０２５５】
図５は、ＦＩＴＣとコンジュゲートしたＮＦ−ｋＢ  ＯＤＮを含む樹状細胞（ＤＣ）の２つの顕微鏡画像を含有する。左側のパネルは位相差画像であり、右側のパネルは蛍光画像である。
【０２５６】
図６Ａおよび図６Ｂは、ＮＯＤマウス由来のＤＣの免疫賦活性能がＮＦ−ｋ  ＯＤＮによって有意に阻害されることを示すグラフである。
【０２５７】
図７は、ＮＯＤマウスにおいて、ＮＦ−ｋＢ  ＯＤＮ  ＤＣ投与により１型糖尿病発生の開始が予防されることを示すグラフである。
【０２５８】
図８Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアを用いて処置した新規発症糖尿病マウスの血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【０２５９】
図８Ｂは、スクランブルオリゴヌクレオチドを含有するマイクロスフェアを用いて処置した新規発症糖尿病マウスの血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【０２６０】
図９Ａは、新規発症糖尿病を有するマウスを用いた実験についての時系列である。
【０２６１】
図９Ｂ〜図９Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰまたは対照のいずれかを用いて処置した新規発症糖尿病マウスの平均血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【０２６２】
図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＡＳ−ＭＳＰの投与後１５日以内のＮＯＤマウスにおける１型糖尿病表現型の逆転を示すグラフである。
【０２６３】
図１１は、自己免疫性糖尿病の治療的逆転を示す流れ図である。
【０２６４】
図１２Ａは、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａワークステーションにおける生動物イメージングを要約する図である。
【０２６５】
図１２Ｂは、マウスへの膵臓を覆う注射後の蛍光標識されたマイクロスフェアの局在蓄積を要約する図である。
【０２６６】
図１２Ｃは、２日にわたる、マウスにおける蛍光標識されたマイクロスフェアの蛍光蓄積を要約したグラフである。
【０２６７】
図１２Ｄは、２日にわたる、異なるマウスにおける蛍光標識されたマイクロスフェアの蛍光蓄積を要約したグラフである。
【０２６８】
図１３は、マウスへの膵臓より遠位への注射後の蛍光標識されたマイクロスフェアの局在蓄積を要約する図である。
【０２６９】
図１４は、非ヒト霊長類における蛍光標識されたマイクロスフェアの注射部位の位置を要約する図である。
【０２７０】
図１５Ａ〜Ｃは、非ヒト霊長類の膵臓リンパ節の内側への蛍光標識されたマイクロスフェアの優先的蓄積を要約する図である。
【０２７１】
図１６は、マウスにおける注射後の蛍光標識された寛容原性樹状細胞（ｉＤＣ）の局在蓄積を要約する図である。
【０２７２】
図１７は、非ヒト霊長類における蛍光標識されたｉＤＣの注射部位の位置を要約する図である。
【０２７３】
図１８は、非ヒト霊長類における注射後の蛍光標識されたｉＤＣの局在蓄積を要約する図である。
【０２７４】
図１９は、ヒトにおける注射部位の位置を要約する図である。
【０２７５】
図２０Ａは、マウスにおける１型糖尿病の新規発症後の数週間の血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【０２７６】
図２０Ｂは、新規発症糖尿病マウスにおけるインスリン中止後の血中グルコースレベルを要約したグラフである。
【０２７７】
図２１Ａ〜図２１Ｃは、Ｂ細胞集団の頻度を同定および測定するために使用するフローサイトメトリー手法である。
【０２７８】
図２１Ｄ〜図２１Ｆは、新たに採取した膵臓リンパ節細胞のフローサイトメトリーデータである。
【０２７９】
図２１Ｇは、フローサイトメトリーによるＤＣ−Ｂｒｅｇの頻度を総脾細胞に対する％として要約したグラフである。
【０２８０】
図２１Ｈは、無処置のマウス、対照樹状細胞（ｃＤＣ）を注射したマウスおよびｉＤＣを注射したマウスの脾臓における、フローサイトメトリーによって測定されたＤＣ−Ｂｒｅｇの絶対数を要約したグラフである。
【０２８１】
図２１Ｉは、フローサイトメトリーによって測定されたＢ１０  Ｂｒｅｇの頻度を総脾細胞に対する％として要約したグラフである。
【０２８２】
図２１Ｊは、無処置のマウス、ｃＤＣを注射したマウスおよびｉＤＣを注射したマウスの脾臓における、フローサイトメトリーによって測定されたＢ１０  Ｂｒｅｇの絶対数を要約したグラフである。
【０２８３】
図２１Ｋは、ヘマトキシリン／エオシン染色したＢ１０  Ｂｒｅｇの顕微鏡画像である。
【０２８４】
図２２Ａは、抑制性Ｂ細胞集団の不在下または存在下で共培養したＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【０２８５】
図２２Ｂは、同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において、中和ＩＬ−１０抗体を伴って、または伴わずに、抑制性Ｂ細胞集団と共培養したＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【０２８６】
図２２Ｃは、同種異系ＭＬＲにおいて、トランスウェルインサートによって物理的に分離された抑制性Ｂ細胞集団と共培養したＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【０２８７】
図２３Ａ〜図２３Ｃは、ｃＤＣと５日間共培養した後、ｉＤＣと一緒に５日間共培養した後および培地と一緒に５日間共培養した後のＤＣ−Ｂｒｅｇの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光を測定したフローサイトメトリーデータである。
【０２８８】
図２３Ｄは高度に精製されたＧＦＰ−出発集団を培地、ｃＤＣ、またはｉＤＣと共培養した後の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＦＰ＋  ＤＣ−Ｂｒｅｇの実数値を要約したグラフである。
【０２８９】
図２３Ｅは、高度に精製されたＧＦＰ＋出発集団を培地、ｃＤＣ、またはｉＤＣと共培養した後のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＦＰ＋  ＤＣ−Ｂｒｅｇの実数値を要約したグラフである。
【０２９０】
図２４Ａ〜図２４Ｂは、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス由来の脾臓ＤＣ−Ｂｒｅｇのフローサイトメトリーデータである。
【０２９１】
図２５は、フローサイトメトリーによって測定された、同系Ｂ細胞および同種異系脾細胞の存在下または不在下でのＢｒｄＵ陽性Ｔ細胞の頻度を要約したグラフである。
【０２９２】
図２６Ａは、Ｂ１０  Ｂｒｅｇにおける発現に対するレチノイン酸受容体（ＲＡＲアルファ）の発現を要約したグラフである。
【０２９３】
図２６Ｂは、Ｂ１０  Ｂｒｅｇにおける発現に対するレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の発現を要約したグラフである。
【０２９４】
図２７Ａは、ｃＤＣおよびｉＤＣを含めたＲＡ産生細胞のＡＬＤＥＦＬＵＯＲ蛍光を測定したフローサイトメトリー分析を示す。
【０２９５】
図２７Ｂは、ｃＤＣおよびｉＤＣの存在下で培養した、ＲＡ応答エレメント（ＲＡＲＥ）−Ｌｕｃプラスミドを形質導入したＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼ活性の発光検出を要約したグラフである。
【０２９６】
配列表
付随する配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２１Ｈ】
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【図２１Ｉ】
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【図２１Ｊ】
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【図２１Ｋ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【配列表】
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