(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄代謝の疾患を治療するための医薬の製造における、ＥＲＦＥポリペプチドに対する抗体の使用であって、ＥＲＦＥポリペプチドが、配列番号１−１５から選択される少なくとも１つで表されるポリペプチドであり、Ｘは任意のアミノ酸である、使用。
【請求項２】
前記鉄代謝の疾患が、鉄過剰疾患、または異常に低レベルのヘプシジンに関連する疾患および／もしくは障害である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記鉄代謝の疾患が、異常に低レベルの鉄および／または異常に高レベルのヘプシジンに関連する疾患である、
請求項１に記載の使用。
【請求項４】
鉄代謝の疾患が、ヘモクロマトーシス、ＨＦＥ変異ヘモクロマトーシス、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２変異ヘモクロマトーシス、ヘモジュベリン（ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ）変異ヘモクロマトーシス、ヘプシジン変異ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、新生児ヘモクロマトーシス、ヘプシジン欠乏症、輸血鉄過剰、サラセミア、中間型サラセミア、αサラセミア、鉄芽球性貧血、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、アフリカ鉄過剰、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠乏症、無トランスフェリン血症、先天性赤血球異形成貧血、慢性疾患貧血、炎症性貧血、感染性貧血、低色素性小球性貧血、鉄欠乏症貧血、鉄難治性鉄欠乏症貧血、慢性腎臓疾病の貧血、エリスロポエチン耐性、肥満の鉄欠乏症、ヘプシジンを過剰産生するまたはその過剰産生を誘発する良性もしくは悪性腫瘤、ヘプシジン過剰を伴う状態、フリートライヒ運動失調症、グラシール症候群（ｇｒａｃｉｌｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ウィルソン病、肺ヘモジデリン沈着症、肝細胞癌、癌、肝炎、肝硬変、異食症、慢性腎不全、インスリン抵抗性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病からなる群から選択される、
請求項１に記載の使用。
【請求項５】
試薬、デバイス、指示書、またはこれらの組み合わせと一緒にパッケージングされた、ＥＲＦＥポリペプチドに対する少なくとも１つの抗体を含むキットであって、該ＥＲＦＥポリペプチドは配列番号３−１５から選択される少なくとも１つで表され、Ｘは任意のアミノ酸である、鉄代謝の疾患の診断、治療または監視において使用するための医薬を製造するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出された配列表への言及
【０００２】
２０１３年１０月２８日に作製され、本出願と共にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された、１４．３ｋｂのサイズの「２０１３１０３１＿０３４０４４＿１１９ＷＯ１＿ｓｅｑ＿ＳＴ２５」と称される配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
政府支援の承認
【０００４】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  （ＮＩＤＤＫ））により認められた、補助金番号Ｒ０１  ＤＫ  ０８２７１７およびＲＯ１  ＤＫ  ０６５０２９の政府支援により行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００５】
背景技術
【０００６】
１．技術分野
【０００７】
本発明は、鉄代謝を調節するポリペプチド、ならびにその作製および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００８】
２．背景技術
【０００９】
身体において鉄を消費するのは、主に赤血球産生である。赤血球産生の必要性に応答して鉄を調節するホルモンの存在は、特に、Ｆｉｎｃｈらによって５０年以上も前に提案されていた。Ｆｉｎｃｈ  １９９４を参照。残念なことに、Ｆｉｎｃｈらは、いずれのそのようなホルモンを発見しなかった。
【００１０】
他の研究者は、サラセミアにおける鉄吸収の増加の原因を検査し、ＧＤＦ１５およびＴＷＳＧ１の２つの物質がこの疾患におけるヘプシジン抑制および鉄過剰の原因である可能性を提案したが、これは鉄吸収の生理学的シグナルではないと結論付けた。Ｔａｎｎｏ  ２０１０ｂおよびＣａｓａｎｏｖａｓ  ２０１３を参照。サラセミアの鉄過剰におけるＧＤＦ１５またはＴＷＳＧ１の役割は、決して具体的には示されなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｔａｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０ｂ）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １５  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５０，１５３２−１５３５
【非特許文献２】Ｃａｓａｎｏｖａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １５  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｒｏｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９８（３）：４４４−４４７
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１６と約９５〜１００％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＣ末端配列を含む単離された、精製された、合成の、および／または組換えのポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１７と約７０〜１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有するＮ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１６と約９５〜１００％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するＣ末端配列、および配列番号１７と約７０〜１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有するＮ末端配列から本質的になる、またはそれらからなる単離された、精製された、合成の、および／または組換えのポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、または配列番号２と約７０〜１００％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の配列同一性を有する単離された、精製された、合成の、および／または組換えのポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、以下の配列：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５のうちの少なくとも１つを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる単離された、精製された、合成の、および／または組換えのポリペプチドを対象とし、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本発明は、以下の配列：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、および配列番号１５の全てを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる単離された、精製された、合成の、および／または組換えのポリペプチドを対象とし、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、ヒト対象に投与されるとき、それにおける肝ヘプシジンｍＲＮＡおよび／または血清ヘプシジンレベルを低減する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１または配列番号２と同一または実質的に類似するエリスロフェロン活性を呈する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１または配列番号２によって提供されるものの約６０〜１００％、約７０〜１００％、約８０〜１００％、約９０〜１００％、または約９５〜１００％であるエリスロフェロン活性を呈する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、または配列番号１６の少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、または少なくとも約２５の連続するアミノ酸残基を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる単離された、精製された、合成の、および／または組換えのポリペプチドを対象とする。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、合成法または組換え法を使用して作製される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離された、精製された、合成の、および／または組換え核酸分子を対象とする。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチドを発現することが可能である、および／または本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換え細胞を対象とする。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチドに対して産生された抗体を対象とする。抗体は、モノクローナル抗体であってよい。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはヒト抗体である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチド、および／または本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、および／または本発明によるポリペプチドに対して産生された抗体を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、組成物は、正常な対象において見られるよりも高い濃度で、本発明によるポリペプチド、および／または本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、および／または本発明によるポリペプチドに対して産生された抗体を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、本発明によるポリペプチドに対して産生される抗体、または本発明によるポリペプチドを含む組成物を投与することを含む、それから本質的になる、またはそれからなる、対象における鉄代謝の疾患を治療する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象はそれを必要とする。本明細書で使用される、「必要とする対象」は、鉄代謝の疾患を有する、またはそれに罹患すると診断された者である。いくつかの実施形態では、鉄代謝の疾患は、鉄過剰疾患、または異常に低レベルのヘプシジンに関連する疾患および／もしくは障害である。いくつかの実施形態では、鉄代謝の疾患は、異常に低レベルの鉄および／または異常に高レベルのヘプシジンに関連する疾患または障害である。いくつかの実施形態では、対象に投与されるポリペプチドは、−ＥＲＦＥポリペプチドである。いくつかの実施形態では、対象に投与されるポリペプチドは、＋ＥＲＦＥポリペプチドである。いくつかの実施形態では、１つ以上のポリペプチドは、有効量、好ましくは治療有効量で投与される。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に有効量、好ましくは治療有効量のＥＲＦＥポリペプチドを投与することにより、対象におけるヘプシジンの量を調節することを含む、それから本質的になる、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、本方法は、投与前、投与中、または投与後の対象の１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドおよび／またはヘプシジンの量を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥポリペプチドの量は、本発明によるポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子および／または本発明によるポリペプチドに対して産生される１つ以上の抗体を使用するアッセイにより測定される。いくつかの実施形態では、本方法は、ヘプシジンの測定値が正常を上回る場合は、１つ以上の＋ＥＲＦＥポリペプチド、またはヘプシジンの測定値が正常を下回る場合は、１つ以上の−ＥＲＦＥポリペプチドを対象に投与することを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料を本発明によるポリペプチドに対して産生される抗体と接触させることと、次いで、結合された抗体の存在を検出する、および／またはその量を測定することとを含む、試料中のＥＲＦＥポリペプチドの存在を検出する、および／またはその量を測定するためのアッセイを対象とする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、試薬、デバイス、指示書、またはこれらの組み合わせと一緒にパッケージングされる、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、本明細書に開示される組換え細胞、本発明によるポリペプチドに対して産生される抗体、または本明細書に開示される組成物を含むキットを対象とする。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明によるポリペプチドを特異的に認識するか、または本発明によるポリペプチドに対して産生される抗体を発現することが可能であるハイブリドーマ細胞系を対象とする。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、抗体に結合される本発明による少なくとも１つのポリペプチドを含む複合体を対象とし、少なくとも１つのポリペプチドおよび／または抗体は、組換え法によって作製される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、鉄代謝の疾患を治療するための薬剤を製造するための、本発明による１つ以上のポリペプチド、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、本発明によるポリペプチドに対して産生される抗体、またはポリペプチド、核酸分子、および抗体のうちの１つ以上を含む組成物の使用を対象とする。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、鉄代謝の疾患の治療に使用するための、本発明による１つ以上のポリペプチド、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子、本発明によるポリペプチドに対して産生される抗体、またはポリペプチド、核酸分子、および抗体のうちの１つ以上を含む組成物を対象とする。
【００２７】
発明の詳細な説明
【００２８】
前述の一般的な説明および以下の詳細の説明の両方は、単に例示的および説明的であり、特許請求される発明のさらなる説明を提供することが意図される。添付の図面は、本発明のさらなる理解を提供し、この明細書に組み込まれ、かつその一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を図示し、説明と共に本発明の原理を説明するのに役立つことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図面の簡単な説明
【００３０】
本発明は、図を参照することによってさらに理解される。
【００３１】
【図１】肝ＨａｍｐｍＲＮＡは、未処置動物と比較して、赤血球形成の刺激（静脈切開（実線）またはＥＰＯ注入（点線））後に抑制される。雄の６週齢のマウスを使用し、ｎ＝４／群であった。未処置の動物と比較した、スチューデントのｔ検定により、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜．０１、＊＊＊ｐ＜．００１。
【図２−１】２日目の９ＡＭに与えられたＥＰＯ  ５０００Ｕに対する健康なヒト志願者の応答（Ａｓｈｂｙ  ２０１０）。
【図２−２】２日目の９ＡＭに与えられたＥＰＯ  ５０００Ｕに対する健康なヒト志願者の応答（Ａｓｈｂｙ  ２０１０）。
【図３Ａ】ＥＲＦＥは、ＴＮＦ−αスーパーファミリーのメンバーである。マウス（配列番号２）およびヒトＥＲＦＥタンパク質（配列番号１）の整合。ハイライトされた配列は配列番号１６である。ヒトＥＲＦＥのＣ末端セグメントの、ＴＮＦファミリーの他のヒトメンバーおよびＥＲＦＥのヒトバリアントへの色付きＣＬＵＳＴＡＬ整合が行われた。ＥＲＦＥのヒトバリアントがシグナル配列において異なることが分かった。よって、本発明によるＥＲＦＥポリペプチドは、配列番号１６に記載されるＮ末端セグメントと９０〜１００％、好ましくは９５〜１００％、より好ましくは９８〜１００％、および最も好ましくは９９〜１００％の配列同一性を有する。
【図３Ｂ】ＥＲＦＥは、ＴＮＦ−αスーパーファミリーのメンバーである。ＴＮＦαスーパーファミリーの他のメンバーとの類似性に基づくＥＲＦＥの構造モデル。
【図４】未処置のマウスと比較した静脈切開（実線）またはＥＰＯ注入（点線）後の骨髄ＥｒｆｅｍＲＮＡにおける倍率増加。６週齢の雄を使用し、ｎ＝４／群であった。未処置の動物と比較したｔ検定により、＊ｐ＜．００１、＊＊ｐ＜．０１。
【図５Ａ】ヒトＥＲＦＥは、中間赤芽球において最大限に発現された赤血球系転写物である。様々な組織における相対的ヒトＥＲＦＥｍＲＮＡ発現を強度順に示す。高レベルでヒトＥＲＦＥｍＲＮＡを発現する胎児肝臓、および骨髄、臓器は、赤芽球を含む。
【図５Ｂ】ヒトＥＲＦＥは、中間赤芽球において最大限に発現された赤血球系転写物である。図５Ｂは、ヒト赤芽球成熟データベース（Ｍｅｒｒｙｗｅａｔｈｅｒ−Ｃｌａｒｋｅ  ２０１１）に基づく。赤血球系発達の非常に初期段階のコロニー形成単位−赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）から、前赤芽球（Ｐｒｏ−Ｅ）、中間赤芽球（Ｉｎｔ−Ｅ）を経て後期赤芽球（ＬａｔｅＥ）までの範囲のヒト赤芽球の成熟におけるヒトＥＲＦＥｍＲＮＡの相対的発現が示される。
【図６】Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙ法（Ｌｉｕ  ２００６）により前赤芽球（ＰｒｏＥ）および赤芽球ＥｒｙＡ、Ｂ、Ｃ段階に分類されるマウス骨髄赤芽球におけるＥｒｆｅ  ｍＲＮＡ発現。白棒は、０．５ｍｌの静脈切開１５時間後のＣ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄を表し、黒棒は、未操作対照マウスからの骨髄を表す。６週齢の雄のマウス、ｎ＝３／群、ｔ検定により＊ｐ＜０．０１。
【図７Ａ】静脈切開されたＥｒｆｅ＋／＋、Ｅｒｆｅ＋／−、およびＥｒｆｅ−／−マウスの肝臓におけるＨａｍｐｍＲＮＡの変化（ＷＴ（野生型）と標識される）。１群当りｎ＝３〜６マウス。非静脈切開された対照と比較したｔ検定により＊ｐ＜．００１、＊＊ｐ＜．０１。
【図７Ｂ】静脈切開されたＥｒｆｅ＋／＋、Ｅｒｆｅ＋／−、およびＥｒｆｅ−／−マウスの肝臓におけるＨａｍｐｍＲＮＡの変化（ＨＴ（ヘテロ接合体）と標識される）。１群当りｎ＝３〜６マウス。非静脈切開された対照と比較したｔ検定により＊ｐ＜．００１、＊＊ｐ＜．０１。
【図７Ｃ】静脈切開されたＥｒｆｅ＋／＋、Ｅｒｆｅ＋／−、およびＥｒｆｅ−／−マウスの肝臓におけるＨａｍｐｍＲＮＡの変化（ＫＯ（ノックアウト）と標識される）。１群当りｎ＝３〜６マウス。非静脈切開された対照と比較したｔ検定により＊ｐ＜．００１、＊＊ｐ＜．０１。
【図８】Ｅｒｆｅ欠乏マウスは、貧血症からの回復が遅いことを示す。（ＡおよびＢ）野生型マウス（点線）と比較した静脈切開されたＥｒｆｅ欠乏マウス（実線）は、ヘモグロビンの回復が遅く、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）が低いことを示した。血液学的パラメータ（Ａ、Ｂ）は、スチューデントｔ検定によるＷＴ（ｎ＝１７）とＫＯ（ｎ＝１５）との間の各測定値に関して比較された。性差の不在において、性別は各パラメータのために組み合わされた。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図９Ａ】Ｃ末端６Ｈｉｓタグに融合されたマウスＥｒｆｅｃＤＮＡをコードする０．５または１μｇのプラスミドＤＮＡを形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。抗６Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロットは、上清においてＥｒｆｅを主に検出し、Ｅｒｆｅが大量に分泌されることを示す。
【図９Ｂ】分泌されたＥｒｆｅは、ＮおよびＯグリコシル化される。
【図９Ｃ】内部ペプチド配列ＰＳＲＶＰＡＡＱＥＬ（配列番号１８）に対して産生されるウサギ抗マウス抗Ｅｒｆｅ抗体２は、ウエスタンブロットにおいて組換えタンパク質を検出し、＋／−はＥｒｆｅプラスミドの形質移入または形質移入なしを示す。
【図１０】Ｅｒｆｅは、ヘプシジンを抑制するために直接肝臓に作用する。（Ａ、Ｂ、Ｃ）６匹のＣ５７ＢＬ／６雄マウスは、マウス組換えＥｒｆｅ（２μｇ／ｇ）または生理食塩水のいずれかで腹腔内処置され、１５時間後に分析された。肝ヘプシジンｍＲＮＡ（Ａ）および血清ヘプシジン（Ｂ）レベルは、肝臓におけるＳａａ１  ｍＲＮＡ発現の増加によって示される炎症反応にも関わらず（Ｃ）、Ｅｒｆｅ処置により大幅に抑制された。（Ｄ、Ｅ、Ｆ）８匹の７週齢のＣ５７ＢＬ／６雄は、ＧＦＰまたはマウスＥｒｆｅｃＤＮＡ配列をコードするレンチウイルスを形質導入された。（Ｄ）ＥｒｆｅｍＲＮＡ発現は、Ｅｒｆｅレンチウイルスを形質導入されたマウスの肝臓において、穏やかに増加したが（赤血球形成刺激を伴うマウスの骨髄における３２倍上方調節と比較して基準の骨髄レベルより２倍高いのみ）、この増加は肝ヘプシジンｍＲＮＡ（Ｅ）および血清ヘプシジン（Ｆ）レベルを低減するのに十分であった。（Ｇ）組換えマウスＥｒｆｅは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットにより検出されるように、Ｅｒｆｅレンチウイルスで感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって分泌された。（Ｈ）マウス一次肝細胞の、対照細胞からの上清（５０％ｖ／ｖ）またはＥｒｆｅを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞による処置は、Ｅｒｆｅが、ヘプシジンｍＲＮＡ発現を抑制するために肝臓に直接作用することを示した。３つ組で１５時間処置した３つの独立した実験の平均±ＳＥＭが示される。ヘプシジン（Ｈａｍｐ）、血清アミロイド１（Ｓａａ１）、およびＥｒｆｅｍＲＮＡ（Ｅｒｆｅ）レベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された。−ΔＣｔの平均±ＳＥＭ（すなわち、Ｃｔ  Ｈｐｒｔ−ＣｔＨａｍｐ、Ｓａａ１またはＥｒｆｅ）が示される。血清ヘプシジンレベル（Ｂ、Ｆ）は、酵素結合免疫吸着測定法により測定された。平均値は、ｔ検定により、処置されたマウスと対照マウスとの間、またはＥｒｆｅ処置された試料と対照試料との間で比較された。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図１１】野生型マウス（ＷＴ）（ｎ＝５）と比較した、中間β−サラセミアｔｈ３／＋マウス（ｔｈａｌ）（ｎ＝４）の骨髄および脾臓におけるＥｒｆｅｍＲＮＡの増加。雄の６ヶ月齢のマウスが使用された。＊ｐ＝０．０１６、＊＊ｐ＜０．００１。Ｈｐｒｔは、参照遺伝子として使用された。
【図１２】Ｅｒｆｅの予測された構造ドメイン。ＳＰ＝シグナルペプチド、ＮＴＤ＝Ｎ末端ドメイン１および２。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明を実施するための形態
【００３３】
本発明は、本明細書において「エリスロフェロン」と称されるタンパク質の発見に基づく。エリスロフェロンは、対象における赤血球産生と鉄の吸収および分布との間を媒介する最初に特定された「ホルモン」である。エリスロフェロンは、対象の骨髄で作られ、その産生は、赤血球の産生が刺激されるとき、例えば、出血後または貧血からの回復中に大幅に増加する。エリスロフェロンは、骨髄において、赤血球産生の必要性に合致するように鉄の供給を調節する。具体的には、エリスロフェロンは、主要な鉄調節タンパク質であるヘプシジンの産生を抑制するために、肝臓に作用することが分かった。よって、エリスロフェロンの過剰産生は、β−サラセミア等の疾患において鉄過剰の原因となる場合があり、よって、拮抗エリスロフェロンがβ−サラセミアの治療に使用され得る。
【００３４】
エリスロフェロンは、ヘプシジン発現を抑制する因子の探索において発見された。肝臓によって合成された２５アミノ酸ペプチドホルモンであるヘプシジンは、鉄恒常性の中枢調節因子である。Ｇａｎｚ  ２０１１を参照。ヘプシジンは、唯一の鉄排出輸送体であるフェロポーチンに結合し、リソソームにおいてそのユビキチン化、内在化、および分解をもたらすことによって作用する。フェロポーチンが細胞膜から消失すると、食物吸収が阻害され、再利用された鉄は、マクロファージに隔離され、赤血球産生に利用可能な鉄を減少させる。対照的に、低ヘプシジンは、フェロポーチンが、鉄を血漿に輸送する細胞上で活性を維持することを可能にし、より多くの鉄がヘモグロビン合成に利用可能となる。鉄、炎症、またはＥＲストレスはヘプシジン産生を刺激し、一方、無酸素症、鉄欠乏症、および赤血球形成活性の増加はそれを抑制する。
【００３５】
ヘプシジンは、出血またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）投与後に抑制される。ヘプシジンは、出血、溶血、もしくは鉄欠乏によって生じる貧血において、または赤血球産生不良を伴う遺伝性貧血において減少する。ヘプシジンに対する赤血球産生の抑制作用は、赤血球前駆体が大量に拡大するが、大半が赤血球に成熟するよりも赤芽球段階でアポトーシスを受ける赤血球産生不良を伴う疾患において、特に顕著である。よって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、出血（５００μＬ）またはＥＰＯ注入（２００Ｕ）に応答するヘプシジンｍＲＮＡの時間的経過を検査し、９〜１５時間の肝ヘプシジンｍＲＮＡの大幅な抑制が観察された。赤血球形成刺激後１２〜１５時間で、阻害は約９０％で最大であった（図１）。応答のタイミングは、減少が９〜２４時間で生じるヒト志願者と類似する（図２）。
【００３６】
マウスにおける出血に応答する時間的経過のこのインビボデータは、観察可能な強力なヘプシジンの抑制があったにも関わらず、転写因子コア要素結合タンパク質であるα（Ｃ／ＥＢＰα）ｍＲＮＡまたは肝臓におけるタンパク質レベルのいずれも変化しないことを明らかにした。劇的なヘプシジンの減少はトランスフェリン飽和または他の既知の鉄関連パラメータにおける任意の変化に先行するため、鉄利用の増加により、どちらもＥＰＯ投与後にヘプシジンを抑制しない（図２）。よって、貧血または他の低酸素刺激に応答して、高レベルのＥＰＯは、同時に、ヘプシジンの発現を抑制し、食物吸収および貯蔵所からの鉄の送達を増加するように肝臓に作用する、骨髄からの１つ以上の赤血球系因子の分泌を誘発することにより、間接的にヘプシジンの抑制をもたらすように思われる。ＥＰＯ注入後のヘプシジンの早期抑制は、より多くの鉄が赤血球前駆体による迅速な取り込みに利用可能となり、赤血球産生を加速する。
【００３７】
よって、市販の遺伝子チップに基づく発現プロファイリング（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマウス遺伝子１．０ＳＴアレイ）を使用して、出血（０〜４８時間）に応答する骨髄における遺伝子発現プロファイルが研究された。発現プロファイリングは、当該技術分野において「ＲＮＡ  Ｓｅｑ」と称されるｃＤＮＡの次世代配列決定を含む代替法によっても達成できた可能性がある。発現がヘプシジンｍＲＮＡの抑制前に誘発され、ヘプシジンレベルが正常な基準に戻る前に高レベルを維持した赤血球系特異的転写物の１つは、分泌されたタンパク質をコードする、Ｆａｍ１３２ｂとして様々な公共の配列データベースに列記される、以前に特徴付けされなかったオーファン転写物であった。Ｆａｍ１３２ｂｍＲＮＡは、ヘプシジン抑制前の、出血後４時間以内に高度に誘発されることが分かった。エリスロフェロンは、Ｆａｍ１３２ｂｍＲＮＡによってコードされるタンパク質である。
【００３８】
「ＥＲＦＥポリペプチド」（＋ＥＲＦＥおよび−ＥＲＦＥポリペプチド）および「ＥＲＦＥポリヌクレオチド」に言及する場合を除き、本明細書で使用される、「ＥＲＦＥ」（全て大文字、イタリック体）は、エリスロフェロンをコードするヒト遺伝子を指し、「Ｅｒｆｅ」（最初の文字は大文字、イタリック体）は、エリスロフェロンをコードするマウス遺伝子を指し、「ＥＲＦＥ」（全て大文字、非イタリック体）は、ヒトタンパク質エリスロフェロンを指し、「Ｅｒｆｅ」（最初の文字は大文字、非イタリック体）は、マウスタンパク質エリスロフェロンを指す。
【００３９】
エリスロフェロンはＴＮＦαスーパーファミリーのメンバーである−エリスロフェロンホモログのアミノ酸配列は、マウスおよびヒトタンパク質がゼブラフィッシュホモログに約７１％同一であり（図３Ａ）、Ｃ末端半分が約４４％同一であるように、脊椎動物の進化を通して十分に保存されている。ドメイン分析は、Ｅｒｆｅが既知のサイトカインに適度の類似性のみを有するＴＮＦαスーパーファミリーのメンバーであることを示した。ＴＮＦαおよびＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）は、最も近い類縁物である。ゲノムおよびｍＲＮＡデータベースの検索により、シグナル配列のみが異なるヒトＥＲＦＥの２つのバリアントを特定した。これらの両方が骨髄において発現されるか、およびバリアントが異なるレベルの発現または異なる生物学的活性を有するタンパク質を生じさせるか否かはまだ決定されていない。ヒト胎児肝臓由来赤芽球からのｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡ配列決定により、Ｃ末端の２２０個のアミノ酸（図３Ａにおいてハイライトされる）が確認された。
【００４０】
ＨＨＰｒｅｄｉｃｔＢを使用した全タンパク質の構造モデル化（図３Ｂ）は、タンパク質のＮ末端部分（左）がシグナル配列、続いて、コラーゲン様セグメントを伴う解放領域からなり、Ｃ−末端部分がＴＮＦα／ＲＡＮＫＬに相同である（右）ことを示す。ＴＮＦαとの類似性は、ＴＮＦαが一次肝細胞培養においてヘプシジンｍＲＮＡを抑制するため、注目すべきである。ＴＮＦαとの類似性は、多量体を形成する傾向を予測する。
【００４１】
骨髄におけるエリスロフェロン発現はＥＰＯに応答する−ｑＰＣＲを使用して、骨髄において（図４）、ならびに脾臓において（データ図示せず）、静脈切開後のＥｒｆｅｍＲＮＡ発現の誘発が確認され、それによって、赤血球産生におけるその関与を支持する。マウスにおけるＥＰＯ注入は、振幅および時間的経過の両方において、静脈切開されたマウスと同程度のヘプシジン抑制をもたらす（図１）。同様に、骨髄および脾臓におけるＥｒｆｅｍＲＮＡのＥＰＯへの応答は、静脈切開によってもたらされるものと類似するが、Ｅｒｆｅ刺激は、ＥＰＯ注入されたマウスにおいて早く生じる（図４）。これは、静脈切開モデルにおけるＥＰＯの下流で作用するＥｒｆｅと一致する。
【００４２】
エリスロフェロンはおそらく赤芽球によって産生されたエリスロキン（ｅｒｙｔｈｒｏｋｉｎｅ）である−遺伝子発現データベースの検索により、ヒトＥＲＦＥがヒト骨髄および胎児肝臓において高度に発現され（例えば、図５Ａ）、「インビトロ」において、分化したヒトＣＤ３４＋細胞が中間赤芽球においてＣＦＵ−Ｅに対して約８倍増加の最大発現に達することが明らかとなった（図５Ｂ）。これは、赤芽球がエリスロフェロンの主な供給源であることを示唆する。これは、０．５ｍｌの静脈切開１５時間後に得たエクスビボマウス骨髄により直接検証され、これは、圧倒的に（初期および中間赤芽球）ＥｒｙＡおよびＢ段階において、対照マウスと比較して、赤芽球におけるＥｒｆｅ発現の大幅な増加を示した（図６、ｑＲＴ−ＰＣＲ、Ｈｐｒｔ参照）。ＥｒｙＢ段階の相対的存在量のため、これらの細胞は、おそらく、骨髄においてＥｒｆｅの主な供給源を構成する。
【００４３】
Ｅｒｆｅノックアウトおよびハプロ不全マウスにおける出血に対するヘプシジン応答−混合Ｓｖ１２９／Ｃ５７ＢＬ／６背景（Ｆａｍ１３２ｂｔｍ１Ｌｅｘ、Ｌｅｘｉｃｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）上のＥｒｆｅ＋／−マウス、ならびにマーカー補助された加速戻し交配を使用してＣ５７ＢＬ／６背景上に戻し交配されたものが、本発明によるＥｒｆｅポリペプチドをさらに分析するために使用され得る。いくつかの実験において、混合背景Ｅｒｆｅ−／−およびＥｒｆｅ＋／−は、それらの野生型（ＷＴ）同腹仔と比較された。Ｅｒｆｅノックアウト（ＫＯ）は、生存可能であり、表現型的には正常のように思われ、Ｌｅｘｉｃｏｎマウスデータベースで完全に正常で、非常に広範に標準化された検査が行われ、繁殖性である。自動血液分析器（Ｈｅｍａｖｅｔ  ８５０；Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＣＴ）を使用して、６週齢（３週齢、１２週齢、または６ヶ月齢ではない）で行われた全血球計算は、野生型およびヘテロ接合体と比較して、Ｅｒｆｅ欠乏動物において、基準でヘモグロビンレベルの減少を明らかにした。６週齢は、出血後のストレス赤血球産生と類似する、鉄の需要が高い急速な赤血球系拡大および成長の時期である。Ｅｒｆｅが出血によるヘプシジン抑制の重要な媒体であるか否かを試験するために、Ｅｒｆｅ−／−、Ｅｒｆｅ＋／−、およびＥｒｆｅ＋／＋同腹仔を静脈切開し（５００μＬ）、静脈切開１２、１５、２４、および４８時間後に分析した（図７Ａ〜７Ｃ）。Ｅｒｆｅ−／−マウスは、肝ヘプシジンｍＲＮＡ発現を低減することができず、Ｅｒｆｅが出血後の迅速なヘプシジン抑制に必須であることを示す（図７Ａ〜７Ｃ）。ハプロ不全マウスは、１２〜１５時間で部分的な応答のみを示し、ヘプシジンのＥｒｆｅへの用量依存応答を示唆する。
【００４４】
Ｅｒｆｅ欠乏マウスは出血誘発された貧血からの回復が遅いことを示す−１２週齢のＥｒｆｅ＋／＋およびＥｒｆｅ−／−を静脈切開し、それらの回復を９日間監視した。Ｅｒｆｅ欠乏マウスは、野生型対照と比較して低いヘモグロビンおよび平均赤血球ヘモグロビン量を呈し（図８）、出血誘発された貧血からのＥｒｆｅ欠乏マウスの回復は、数日遅かった。
【００４５】
組換えタンパク質の産生および分析−Ｃ末端Ｍｙｃ／Ｆｌａｇ、Ｖ５エピトープ／Ｈｉｓ、Ｍｙｃ／Ｈｉｓ、およびＦｌａｇ／Ｈｉｓを伴うマウスおよびヒトＥＲＦＥのｃＤＮＡをコードする複数の発現プラスミドが構築された。形質移入されたＨＥＫ２９３Ｔのウエスタンブロットは、タンパク質が分泌されることを確認した（図９Ａ）。タグ親和性クロマトグラフィーにより材料を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、特定された主バンドは、ウエスタンブロットにより検出されたものに対応する。Ｆａｍ１３２ｂ／Ｅｒｆｅとしてのバンドの同一性は、ＨＰＬＣ−ＭＳによりトリプトン処理された断片のプロテオミクス分析により確認された。興味深いことに、Ｅｒｆｅの分泌された形態は、細胞形態よりわずかに高い分子量を有し、両タンパク質は、予測された大きさの２倍であり、二量体化の可能性を示唆する。精製された分泌産物の脱グリコシル化は、ＥｒｆｅがＮおよびＯグリコシル化されることを示した（図９Ｂ）。ＥｒｆｅおよびＥｒｆｅポリペプチドの組換え形態は、インビトロおよびインビボでのそれらの活性を分析するために使用され得る。Ｅｒｆｅに対して産生された抗体が生成され、内因性タンパク質の検出（図９Ｃ）のため、および対象、例えばマウスモデルおよび鉄障害を有する患者における１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドの血清濃度を決定するために使用され得る。予備実験では、ＨＥＫ２９３細胞系のバリアント１つが高レベルでＥｒｆｅを発現するが、それを分泌できないことが分かり、それによって、分泌事象が細胞型特異的であるか、または細胞の特殊機能に依存し得ることを示す。
【００４６】
分泌されたエリスロフェロンタンパク質がヘプシジンの抑制因子であるか否かを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６の雄マウスは、マウス組換えＥｒｆｅ（２μｇ／ｇ）を注入された。ヘプシジンｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルは、Ｓａａ１ｍＲＮＡの発現の増加によって示される、組換えタンパク質により誘導された実質的な炎症応答にも関わらず（図１０Ｃ）、生理食塩水注入マウスと比較して、Ｅｒｆｅ処置１５時間後に大幅に低減することが分かった（図１０Ａ、１０Ｂ）。炎症は、ヘプシジンの発現を増加させるだろう。
【００４７】
組換えＥｒｆｅ調製物の急性炎症作用を避けるために、Ｃ５７ＢＬ／６の雄マウスは、Ｅｒｆｅをコードするレンチウイルス系ベクターを形質導入された。３週間後、対照レンチウイルスで処置されたマウスと比較して、Ｅｒｆｅ  ｍＲＮＡのわずかな増加がＥｒｆｅ−レンチウイルスで処置されたマウスの肝臓において（骨髄ではなく）観察された（図１０Ｄ）。それにも関わらず、ヘプシジンｍＲＮＡおよび血清レベルは、それぞれ、３０倍および１０倍大幅に減少し（図１０Ｅ、１０Ｆ）、肝臓における少量のＥｒｆｅでもヘプシジン転写に対するその阻害作用を及ぼすのに十分であったことを示唆する。したがって、Ｅｒｆｅがヘプシジンを調節するために肝臓に直接作用するか否かが試験された。マウス一次肝細胞は、対照ＨＥＫ２９３ＴまたはＥｒｆｅを過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔからの５０％（ｖ／ｖ）上清で１５時間処置され（図１０Ｇ）、Ｅｒｆｅ処置された細胞のヘプシジンｍＲＮＡレベルにおいて４倍の減少をもたらした（図１０Ｈ）。全体的に見て、これらの結果は、エリスロフェロンがヘプシジンｍＲＮＡ発現を抑制するために肝臓に直接作用することができるヘプシジンの潜在的な抑制因子であることを示す。
【００４８】
抗体の調製−エリスロフェロンの検出および特徴付けを容易にするために、エリスロフェロンおよびＥＲＦＥポリペプチドのマウスおよびヒト形態の両方におけるペプチド抗原に対して指向される一連の抗体が生成され、使用され得る。加えて、エリスロフェロンおよび／またはＥＲＦＥポリペプチドの内部およびＮ末端エピトープに対する抗体は、様々なアッセイおよび本発明による治療方法において使用することができる。
【００４９】
サラセミアマウスにおけるＥｒｆｅの大量増加−エリスロフェロンの過剰産生は、非輸血β−サラセミアの鉄過剰の一因となり得る。β−サラセミアのＨｂｂｔｈ３／＋マウスモデル（Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ  ２００７）の使用により、野生型対照と比較して、ＥｒｆｅｍＲＮＡがＨｂｂｔｈ３／＋マウスの骨髄および脾臓において大幅に増加することを示した（図１１）。それらが野生型マウスより拡大した骨髄および３倍大きい脾臓を有することを考慮する場合、Ｅｒｆｅの純発現は、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスにおいてさらに大きい。
【００５０】
ポリペプチドおよび組成物
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明は、エリスロフェロンならびにその類似体および断片を対象とする。本明細書で使用される、エリスロフェロン（ＥＲＦＥおよびＥｒｆｅを含む）ならびにその類似体および断片は、本明細書において、集合的に、「ＥＲＦＥポリペプチド」と称される。ＥＲＦＥポリペプチドは、エリスロフェロン活性を呈しても、呈さなくてもよい。本明細書で使用される、「エリスロフェロン活性」は、対照と比較して、物質が肝ヘプシジンｍＲＮＡまた血清ヘプシジンレベルを減少させる能力を指す。
【００５２】
本明細書で使用される、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、一緒に連結される２つ以上のアミノ酸を指すように互換的に使用される。アミノ酸の群または鎖の略語は、ペプチドを表すように使用される。特に示される場合を除き、ペプチドはＮ末端が左側に示され、配列は、Ｎ末端からＣ末端に記される。
【００５３】
本発明のＥＲＦＥポリペプチドは、化学合成、生合成、または組換えＤＮＡ法を使用するインビトロ合成、および固相合成を含む当該技術分野において既知の方法を使用して作製され得る。例えば、Ｋｅｌｌｙ＆Ｗｉｎｋｌｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１２，Ｊ．Ｋ．Ｓｅｔｌｏｗ  ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．１−１９、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６４）Ｊ  Ａｍｅｒ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５：２１４９、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９８５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５、およびＳｔｅｗａｒｔ＆Ｙｏｕｎｇ（１９８４）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。本発明のＥＲＦＥポリペプチドは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換もしくは免疫親和性クロマトグラフィー、濾過もしくはサイズ排除、または電気泳動等の当該技術分野において既知のタンパク質精製法を使用して精製され得る。Ｏｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｈｌ（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２（１６）：３１２１−３１２６、およびＳｃｏｐｅｓ（１９８２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。あるいは、本発明のＥＲＦＥポリペプチドは、当該技術分野において既知の組換えＤＮＡ法により作製され得る。よって、本発明のＥＲＦＥポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書において企図され、本明細書において、「ＥＲＦＥポリヌクレオチド」と称される。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥポリヌクレオチドは、単離される。本明細書で使用される、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが天然に存在する環境とは異なる環境にあるポリヌクレオチドを指す。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、天然に見られるように、ポリヌクレオチドの５’および／または３’端に通常隣接する塩基を有さないものである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明のＥＲＦＥポリペプチドは、実質的に精製される。本明細書で使用される、「実質的に精製される」化合物は、その天然環境から除去される、および／または化合物が自然界において関連する他の高分子成分もしくは化合物またはその合成を少なくとも約６０％含まない、好ましくは約７５％含まない、より好ましくは約９０％含まない、最も好ましくは約９５〜１００％含まない化合物を指す。
【００５５】
本明細書で使用される、「単離された」化合物は、その天然環境から単離される化合物を指す。例えば、単離されたポリペプチドは、完全長ポリペプチドに対応する、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方に隣接するその天然アミノ酸を有さないものである。例えば、エリスロフェロンまたはＥＲＦＥポリペプチドの単離された断片は、アミノ酸残基エリスロフェロンまたはＥＲＦＥポリペプチドの一部を含むが、その全てを含まず、しかしそのＮ末端、Ｃ末端、もしくはその両方に非天然のアミノ酸、すなわち、エリスロフェロンまたはＥＲＦＥポリペプチドの対応する位置でアミノ酸と同一性を有さない異なるアミノ酸を有してよい単離されたポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、本発明のＥＲＦＥポリペプチドは、合成法および／または組換え法を使用して作製される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドは、その意図される目的に好適な担体を含む組成物の形態で提供される。組成物は、その意図される目的に好適な１つ以上の追加の成分も含み得る。例えば、アッセイに関して、組成物は、リポソーム、ニクロサミド、ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ、日本）、クレモフォアＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、エタノール、およびＤＭＳＯを含み得る。鉄障害の治療に関して、組成物は、ペプチドカプセル封入（キトサンおよびヒドロゲル等）、高分子抱合、脂質化（ｌｉｐｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、および他の化学修飾のために、異なる吸収エンハンサーおよびプロテアーゼ阻害剤、固形微小粒子、またはナノ粒子を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、正常な対象に見られるよりも高い濃度で１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドを含む。
【００５７】
本発明による１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドまたはその組成物は、鉄代謝の疾患を治療するために使用され得る。本明細書に使用される、「鉄代謝の疾患」は、異常鉄代謝が疾患の直接的原因であるか、または鉄血液レベルが疾患の原因となる調節不全であるか、または鉄調節不全が別の疾患の結果であるか、または疾患が鉄レベルの調節により治療することができる等の疾患を含む。より具体的には、本開示による鉄代謝の疾患は、鉄過剰疾患、鉄欠乏障害、鉄体内分布の障害、鉄代謝の他の障害、および鉄代謝に潜在的に関連する他の障害等を含む。鉄代謝の疾患は、ヘモクロマトーシス、ＨＦＥ変異ヘモクロマトーシス、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２変異ヘモクロマトーシス、ヘモジュベリン（ｈｅｍｏｊｕｖｅｌｉｎ）変異ヘモクロマトーシス、ヘプシジン変異ヘモクロマトーシス、若年性ヘモクロマトーシス、新生児ヘモクロマトーシス、ヘプシジン欠乏症、輸血鉄過剰、サラセミア、中間型サラセミア、αサラセミア、鉄芽球性貧血、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、アフリカ鉄過剰、高フェリチン血症、セルロプラスミン欠乏症、無トランスフェリン血症、先天性赤血球異形成貧血、慢性疾患貧血、炎症性貧血、感染性貧血、低色素性小球性貧血、鉄欠乏症貧血、鉄難治性鉄欠乏症貧血、慢性腎臓疾病の貧血、エリスロポエチン耐性、肥満の鉄欠乏症、他の貧血、ヘプシジンを過剰産生するまたはその過剰産生を誘発する良性もしくは悪性腫瘤、ヘプシジン過剰を伴う状態、フリートライヒ運動失調症、グラシール症候群（ｇｒａｃｉｌｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ハラーホルデン・スパッツ症候群、ウィルソン病、肺ヘモジデリン沈着症、肝細胞癌、癌、肝炎、肝硬変、異食症、慢性腎不全、インスリン抵抗性、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、およびアルツハイマー病を含む。いくつかの実施形態では、鉄過剰疾患は、骨髄異形成症候群である。いくつかの場合では、「鉄代謝の疾患」の定義に含まれる疾患および障害は、典型的には、鉄関連として特定されない。例えば、ヘプシジンは、マウスの膵臓において高度に発現され、糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、インスリン抵抗性、グルコース不耐性、および他の障害は、根底にある鉄代謝障害を治療することにより寛解され得ることを示唆する。Ｉｌｙｉｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５４２  ２２−２６を参照（参照により本明細書に組み込まれる）。そのため、これらの疾患は、広範な定義により包含される。当業者は、国際公開第２００４０９２４０５号（参照により本明細書に組み込まれる）のアッセイ、および米国特許第７，５３４，７６４号に記載されるもの（参照により本明細書に組み込まれる）等の当該技術分野において既知であるヘプシジン、ヘモジュベリン、または鉄レベルおよび発現を監視するアッセイを含む、当該技術分野において既知の方法を使用して、所与の疾患が本発明による「疾患または鉄代謝」であるか否かを容易に決定することができる。本発明のいくつかの実施形態では、鉄代謝の疾患は、遺伝性ヘモクロマトーシス、鉄負荷貧血、アルコール性肝疾患、および慢性Ｃ型肝炎��含む鉄過剰疾患である。
【００５８】
本明細書で使用される、ヘプシジン過剰に関連する疾患および障害は、慢性疾患の貧血（炎症性貧血とも呼ばれる）、急性もしくは慢性感染に関連する貧血、慢性腎臓疾患の貧血、ヘプシジンを分泌する腫瘍による貧血、および鉄剤不応性鉄欠乏症貧血（ＩＲＩＤＡ）を含む。
【００５９】
本明細書で使用される、ヘプシジン欠乏に関連する疾患および障害は、成人および若年性形態の遺伝性ヘモクロマトーシス、α−サラセミア、β−サラセミア、および先天性赤血球異形成貧血、ならびにアルコール性肝疾患および慢性Ｂ型およびＣ型肝炎を含む慢性肝臓疾患を含む。
【００６０】
本明細書で使用される、「＋ＥＲＦＥポリペプチド」は、マウスおよび／またはヒトエリスロフェロンと同一または類似するエリスロフェロン活性を呈するＥＲＦＥポリペプチドを指す。エリスロフェロンは、＋ＥＲＦＥポリペプチドである。本明細書で使用される、「−ＥＲＦＥポリペプチド」は、エリスロフェロン活性を呈さず、いくつかの実施形態では、＋ＥＲＦＥポリペプチドの活性に干渉するＥＲＦＥポリペプチドを指す。エリスロフェロンは、−ＥＲＦＥポリペプチドではない。よって、用語「ＥＲＦＥポリペプチド」は、＋ＥＲＦＥポリペプチドと−ＥＲＦＥポリペプチドの両方を指すように使用される。換言すれば、ＥＲＦＥポリペプチドは、＋ＥＲＦＥポリペプチドまたは−ＥＲＦＥポリペプチドであってよい。
【００６１】
＋ＥＲＦＥポリペプチドおよび治療
【００６２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヘプシジン過剰および／または鉄欠乏、例えば、炎症性貧血および鉄剤不応性鉄欠乏症貧血（ＩＲＩＤＡ）に関連する疾患および障害を治療するために、１つ以上の＋ＥＲＦＥポリペプチドを単独で、またはエリスロフェロンの１つ以上の作動薬との組み合わせで使用する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明の＋ＥＲＦＥポリペプチドは、エリスロフェロンの作用を模倣する、すなわち、エリスロフェロンと同一または実質的に類似する活性を呈する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヘプシジン発現を阻害、抑制、もしくは低減する、またはさらなるヘプシジン発現を防止するために、１つ以上の＋ＥＲＦＥポリペプチドを使用する方法を対象とする。
【００６３】
−ＥＲＦＥポリペプチドおよび治療
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヘプシジン欠乏および／または鉄過剰に関連する疾患および障害を治療するために、１つ以上の−ＥＲＦＥポリペプチドを単独で、またはエリスロフェロンの１つ以上の拮抗薬との組み合わせで使用する方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、ヘプシジンの発現および／または量を増加するための、１つ以上の−ＥＲＦＥポリペプチドの使用を対象とする。いくつかの実施形態では、−ＥＲＦＥポリペプチドは、エリスロフェロンの受容体に関してエリスロフェロンと競合的に競合し、ヘプシジンの発現および／またはヘプシジンの量を増加するものを含む。よって、いくつかの実施形態では、本発明は、ヘプシジン欠乏によって生じる疾患および障害、例えば、β−サラセミアまたは先天性赤血球異形成貧血、および鉄毒性を治療するための、１つ以上の−ＥＲＦＥポリペプチドを単独で、またはエリスロフェロンの１つ以上の拮抗薬と組み合わせて使用する方法を対象とする。
【００６５】
よって、本発明の１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドは、対象、好ましくはヒト等の哺乳類に投与され得る。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥポリペプチドは、薬学的組成物の形態で投与される。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥポリペプチドは、有効量で投与される。本明細書で使用される、「治療有効量」は、プラセボ等の対照と比較して、鉄代謝の所与の疾患の症状および／または病態を寛解する量である。
【００６６】
治療有効量は、当該技術分野において既知の標準的な方法により容易に決定することができる。投与される投薬量は、疾患の臨床重症度、対象の年齢および体重、または対象の鉄への曝露により、当業者によって決定され得る。本発明の化合物の好ましい有効量は、非経口製剤に関して、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約３ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．５〜約２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。経口投与に関する好ましい有効量は、最大約１０倍高いだろう。さらに、本発明のＥＲＦＥポリペプチドまたは組成物を用いた対象の治療は、単一治療を含むか、または好ましくは一連の治療を含み得る。実際の投薬量は、特定のＥＲＦＥポリペプチドまたは組成物、特定の製剤、投与形態、および特定の部位、宿主、ならびに治療される疾患により変動することを理解する。治療に使用される有効投薬量は、特定の治療の経過にわたって増加または減少され得ることも理解する。所与の一連の状態に関する最適な投薬量は、所与のＥＲＦＥポリペプチドまたは組成物の実験データを考慮して、従来の投薬量決定試験を使用して、当業者によって確認され得る。投薬量の変更が生じ得、当該技術分野において既知の標準的な診断アッセイにより明らかとなる。いくつかの状態において、長期にわたる投与が必要とされ得る。
【００６７】
本発明の薬学的組成物は、所望の投与形態に適切な単位投薬形態に調製され得る。本発明の組成物は、経口、直腸、経鼻、局所（頬および舌下を含む）、腟、および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）任意の好適な経路により、療法のために投与され得る。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、治療される状態の性質、ならびに選択されたＥＲＦＥポリペプチドおよび組成物により変動することを理解する。
【００６８】
本発明の薬学的組成物は、治療有効量の本明細書に開示される少なくとも１つのＥＲＦＥポリペプチド、および不活性の薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。本明細書で使用される、用語「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合し、当該技術分野において既知の、任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含むことが意図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物におけるその使用は、企図される。
【００６９】
補助活性化合物も組成物中に組み込むことができる。補助活性化合物は、ニクロサミド、リポソーム、ＳＬ２２０可溶化剤（ＮＯＦ、日本）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（Ｓｉｇｍａ）、エタノール、およびＤＭＳＯを含む。
【００７０】
本発明のＥＲＦＥポリペプチドおよび組成物の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物において、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するために、標準的な薬学的手順により決定され得る。毒性作用と治療作用との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きい治療指数を呈するＥＲＦＥポリペプチドが好ましい。毒性副作用を呈するＥＲＦＥポリペプチドが使用される場合があるが、非感染細胞に損傷を与える可能性を最小にするために、そのようなＥＲＦＥポリペプチドが患部組織の部位を標的とし、それによって、副作用を低減する送達系を設計するよう注意が払われるべきである。
【００７１】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を定めるのに使用され得る。本発明のＥＲＦＥポリペプチドの投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される投薬形態および利用される投与経路によりこの範囲内で変動し得る。本発明の方法に使用される任意のＥＲＦＥポリペプチドに関して、治療有効量は、最初は、細胞培養アッセイから推定され得る。用量は、細胞培養物において決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて定められ得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【００７２】
本発明は、試薬、デバイス、指示書、またはこれらの組み合わせと一緒にパッケージングされた、本発明の１つ以上のＥＲＦＥポリペプチドおよび／または組成物を含むキットも提供する。例えば、キットは、アッセイを行うために使用される試薬、鉄代謝の障害を診断、治療、または監視するための薬物および組成物、アッセイされる試料を得るためのデバイス、試薬を混合し、アッセイを行うためのデバイス等を含み得る。
【００７３】
以下の例は、本発明を例示説明するが、制限しないことが意図される。
【００７４】
実験
【００７５】
１．鉄代謝のエリスロン依存調節におけるエリスロフェロンの役割
【００７６】
エリスロフェロン産生−予備データは、出血およびＥＰＯ注入後、Ｅｒｆｅ  ｍＲＮＡが骨髄および脾臓において大幅に増加したことを示す。正常な状態下で、およびストレス赤血球産生中にＥｒｆｅ転写物を発現する骨髄および脾臓の細胞型は、以下のように特定された：簡潔に、全脾臓および骨髄細胞は、対照マウスおよび静脈切開されたマウス（１５時間）から単離され、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ７１の発現レベル、および順方向散乱に基づくフローサイトメトリーにより選別された。例えば、Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙ  ２００７；Ｃｈｅｎ  ２００９を参照。ＥｒｆｅｍＲＮＡ発現は、２つのハウスキーピング遺伝子に対する各細胞集団において、ｑＰＣＲにより定量化された。Ｅｒｆｅ発現は、対照マウスと比較して、静脈切開後、全ての赤芽球段階において大量に増加した（図６）（ＰｒｏＥ、ＥｒｙＡ、Ｂ、およびＣ）。ＥｒｙＢ段階の相対的存在量のため、これらの細胞は、おそらく、骨髄においてエリスロフェロンの主な供給源を構成する。Ｅｒｆｅが実際に赤血球系特異的産物であるか否かを確認するために、基準および静脈切開後に、代表的なマウス組織のｑＰＣＲ分析を行うことができる。
【００７７】
造血細胞−生理活性エリスロフェロン産生に対する造血細胞の寄与を検査するために、骨髄破壊性照射後、対照として自家移植片を使用して、Ｅｒｆｅ−／−とＥｒｆｅ＋／＋マウスとの間で相互骨髄移植を行うことができる。そのような実験は、最近の獣医学のガイドラインに従い実施され得る。Ｄｕｒａｎ−Ｓｔｒｕｕｃｋ  ２００９を参照。３週間、赤血球形成を回復させ、照射および移植に対する炎症性反応を停止させた後、５００μｌの静脈切開１５時間後、ヘプシジンの抑制が表現型の読み出しとして使用することができる。移植およびドナー細胞の優性は、無傷対破壊されたＥｒｆｅ対立遺伝子に関する骨髄ＤＮＡのｑＰＣＲにより確認することができ、Ｅｒｆｅの産生は、ｑＲＴ−ＰＣＲ（またはＥＬＩＳＡ等）により評価することができる。表現型は骨髄により伝達されると予測される。可能性が低い代替的成果では、他の細胞型がエリスロフェロンの供給源として評価され得る。
【００７８】
ＥＰＯによる調節−ＥＰＯは、エリスロフェロン発現に対して２重作用を有し得る：１）前赤芽球−好塩基性赤芽球段階を通して前駆体の生存を促進することによるエリスロフェロンを発現する細胞（中間赤芽球）の数を増加させるか、または２）エリスロフェロンｍＲＮＡ濃度を直接的または間接的に調節することができる。Ｅｒｆｅは、マウスにおいて、脾臓または骨髄赤血球系前駆細胞の数がわずかに増加するのみであるＥＰＯ注入４時間後に既にほぼ最大の３０倍に増加するため（図４）、第２の機構が優勢であり、ＥＰＯに対する応答は、おそらく赤芽球自律性である。それにも関わらず、ＥＰＯによる調節は、以下により決定され得る：簡潔に、新しく採取されたマウス骨髄細胞は、培地を０〜２．５ｕ／ｍｌのＥＰＯの濃度で補足することにより４時間インキュベートされ、次いで、当該技術分野において既知の方法を使用して赤血球系細胞を選別する。各赤血球系成熟段階は、ＥＰＯ用量の関数としてＥｒｆｅ発現に関してｑＲＴ−ＰＣＲにより分析される。
【００７９】
エリスロフェロンは、基底の赤血球産生に必要ではないため、エリスロフェロンがＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）ストレス経路により調節されると予測される。Ｓｔａｔ５は、ストレス赤血球産生活性化遺伝子のＥＰＯ−ＥＰＯＲ／Ｊａｋ２経路の主な転写因子であり（Ｔｅｇｌｕｎｄ  １９９８；Ｍｅｎｏｎ  ２００６）、Ｇｅｎｏｍａｔｉｘソフトウェアを使用したマウスおよびヒトエリスロフェロンプロモーターの３キロベースの分析は、複数の潜在的なＳｔａｔ５（または他のＳｔａｔ）結合要素およびＧＡＴＡ結合モチーフを示した。したがって、Ｅｒｆｅ転写が以下によるＳｔａｔ経路により調節されるかを調べることができる：マウス胎仔肝臓およびマウス骨髄からの赤血球系前駆体が培養され（Ｅｎｇｌａｎｄ  ２０１１）、Ｓｔａｔ５阻害剤（ピモジドまたはＮ′−（（４−オキソ−４Ｈ−クロメン−３−イル）メチレン）ニコチノヒドラジド）と共に、またはそれを含まずに、４時間、ＥＰＯの段階的濃度で処理し、ＥｒｆｅｍＲＮＡレベルに対する作用がｑＰＣＲにより評価される。赤芽球がＳｔａｔ５阻害剤への短時間の曝露を十分に容認しない場合、ＥＰＯ処理下で赤血球系分化を受けるＵＴ７細胞系、または持続性ＣＤ３６Ｅ細胞系、ヘモグロビンを産生する能力を保有する赤血球系前駆細胞系（Ｗｏｎｇ  ２０１０）、またはＪ２Ｅ細胞系（Ｇｒｅｅｎｅ  ２００２）を使用することができる。これらの細胞系、および推定上のＳｔａｔ５結合部位のＥｒｆｅプロモータールシフェラーゼ構築物部位指向性変異は、ＥＰＯがＥｒｆｅプロモーターを調節する機構を試験するために行われる。最後に、これらのアプローチが、ＳＴＡＴ５経路がＥｒｆｅ発現を調節するか否かを決定できない場合、段階的ＳＴＡＴ５応答欠乏ＥＰＯＲ−ＨＭマウスであるマウスを得、これらのマウスがＥＰＯに応答してＥｒｆｅを調節するか否かを決定することができる。Ｐｏｒｐｉｇｌｉａ  ２０１２を参照。可能性は高くないが、ＥＰＯ受容体シグナル伝達の１つ以上の代替経路は、Ｅｒｆｅの調節において、ＳＴＡＴ５よりも重要であり得る。一般に、これらの経路は、あまりよく理解されていないが、ＰＩ３キナーゼおよびＭＡＰキナーゼ経路を含み、主に赤芽球生存および増殖の調節に関与する。Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ２００５；Ｂｏｕｓｃａｒｙ  ２００３を参照。
【００８０】
ＥＰＯ用量依存−ＥＰＯの治療用量は、正常または増加した内因性ＥＰＯ産生の状態下でも、および炎症および鉄過剰にもかかわらず、ヘプシジン濃度を低下させる。Ｈｕａｎｇ  ２００９を参照。ＥＰＯのこの重要な作用は理解されていないが、ヘプシジンが上昇し、鉄がマクロファージ内に隔離される炎症性貧血および癌の貧血においてその治療有効性に起因する可能性があるため、重要である。ＷＴ対照と比較したＥｒｆｅＫＯおよびヘテロ接合体動物における、肝臓ヘプシジンｍＲＮＡおよび血清ヘプシジンの、ＥＰＯ（単一注入、０．２〜２００Ｕ）の段階的用量に対する応答の用量依存を決定することができる。ＷＴマウスにおける予備データに示されるように、ＥＰＯ注入は、単一静脈切開のように、ヘプシジンまたはＥｒｆｅ  ｍＲＮＡ発現の時間経過に対して同一の作用を有したため、ＥＰＯ注入されたＥｒｆｅ−／−マウスは、静脈切開されたＥｒｆｅ−／−に類似してヘプシジンを抑制することができないと予測される。ヘプシジンを抑制する代替経路が高濃度のＥＰＯのＥｒｆｅ−／−ＫＯマウスにおいて明白となることは可能である。ＥＰＯのヘプシジン発現に対する直接作用が報告されたが（Ｐｉｎｔｏ  ２００８）、そのような抑制は、本発明者による実験において観察されなかった。高用量のＥＰＯがＥｒｆｅ−／−マウスにおいてヘプシジンを抑制する場合、おそらく一部の一次肝細胞培養物中にも混合される可能性がある非肝細胞集団に作用することによって、高濃度のＥＰＯが肝臓におけるヘプシジンｍＲＮＡを間接的に抑制することができるか否かを再検査することができる。
【００８１】
溶血からの貧血−フェニルヒドラジン誘発性溶血モデルは、従来、マウスにおけるストレス赤血球産生の研究用に使用され、貧血は、ヘプシジン抑制に関連する（Ｎｉｃｏｌａｓ  ２００２）。モデルは、回復がヘムおよび鉄再利用に依存するという点で、出血性貧血と異なる。フェニルヒドラジン１００ｍｇ／ｋｇの単一用量後の急性溶血性貧血からの回復に対するＥｒｆｅ消失の作用（Ｌｉｍ  １９９８）を分析することができる。全血球計算、フローサイトメトリーによる赤血球系成熟、ヘプシジン発現、および鉄パラメータに関して、マウスを２、４、および６日目に分析する。ヘプシジンはＥｒｆｅ−／−マウスにおいて抑制されず、マウスは赤血球系回復が遅れると予測される。
【００８２】
代償性食物鉄吸収および貯蔵所からの鉄放出−ヒトにおいて、食物鉄吸収は、１日に必要な鉄の合計の１０％未満を占め、大半の鉄は老化した赤血球を再利用するマクロファージから送達される。しかしながら、標準的な飼料を供給されたマウスにおいて、食物吸収は、１日の合計鉄必要量の５０％近くを提供する。Ｒａｍｏｓ  ２０１１を参照。よって、Ｅｒｆｅ消失が出血からの回復中の食物対再利用鉄の利用に対して個別の作用があるかを区別するために、マウスの鉄貯蔵および食物の鉄含量が操作され得る。食物鉄吸収に対するＥｒｆｅ欠乏の作用を評価するために、最初に、動物に、４ｐｐｍの食事を２週間供給することにより鉄貯蔵を激減させる。マウスの亜群の肝臓および脾臓の鉄の基準分析により確認される、鉄貯蔵が低くなったら、別の動物群を５００μｌ静脈切開し、鉄が豊富な（３００ｐｐｍ）食事にする。Ｅｒｆｅの鉄再利用および貯蔵からの動員に対する作用を評価するために、５００μｌの失血（３００μｇの鉄）を補うために十分な鉄貯蔵を提供するように、マウスを鉄デキストランで前処置し、１週間後に静脈切開し、４ｐｐｍの鉄欠乏食にする。ＥｒｆｅＫＯマウスにおけるヘプシジン抑制の欠如は、貯蔵された鉄の放出および食事からの鉄吸収の両方において代償的増加を損なうことが予測される。他の成果は、他者によって報告されるように（Ｃｈａｓｔｏｎ  ２００８）、腸対マクロファージの鉄輸送の差次的調節、またはそれらの調節の重複する経路の可能性を提示するだろう。
【００８３】
他の活性の可能性：Ｅｒｆｅが骨髄環境にある程度の影響を及ぼす可能性がある。主な作用を検出するために、Ｅｒｆｅ−過剰発現、Ｅｒｆｅ−／−、およびＷＴマウスにおける大腿骨部分の形態を比較することができる。これらのマウスの赤血球系系統を比較するために、ｃ−ｋｉｔ、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ７１および／またはＣＤ４４の発現レベルに基づき、フローサイトメトリーにより、全脾臓および骨髄の細胞を分析することができる。Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙ  ２００７；Ｃｈｅｎ  ２００９を参照。
【００８４】
２．エリスロフェロンの特徴付け、その活性および作用の機構
【００８５】
その細胞内および細胞外イソ型を含むエリスロフェロンの質量および組成、ならびにその機能成分を確立するためのドメイン欠失分析の実行が特徴付けされ得る。エリスロフェロンが循環内に分泌されるか否か、および肝臓に直接その作用を及ぼすか否かも決定することができる。エリスロフェロンの組換えおよび／または合成形態は、インビボおよびインビトロにおけるヘプシジン発現に対するその作用を検査するために使用され得る。赤血球系前駆体およびそれらの分化に対してエリスロフェロンならびにエリスロフェロンの受容体が有する影響が検査される。
【００８６】
物理化学および組成特徴−Ｃ末端ＦＬＡＧおよび６−ヒスチジンタグに融合されたマウスおよびヒトエリスロフェロンｃＤＮＡ配列をコードするプラスミドを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中規模の一過性の形質移入を行うことができる。哺乳類細胞における発現は、組換えタンパク質が実際に実現可能なほど未変性形態に近い可能性を増加させる。細胞可溶化物からの細胞内形態および培地からの分泌形態が精製され、アッセイされ得る。前の経験に基づき、２工程精製は、インビボおよびインビトロ治療に使用することができる満足のいく純タンパク質を得るために好ましい。したがって、組換えエリスロフェロンの最初の精製は、Ｃ末端タグのうちの１つに特異的な親和性ビーズを使用して主に行うことができ、最終精製は、ＨＰＬＣによって行うことができる。精製中またはタグによる活性の阻害の可能性を防ぐために、タグを除去するために部分的に精製された画分およびタンパク質の活性を試験することもできる。精製されたタンパク質は、ゲル透過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して大きさに応じて特徴付けることができ、次いで、配列は、Ｎ末端Ｅｄｍａｎ分解ならびにエンドプロテアーゼ切断および細分化質量分析により決定することができる。エリスロフェロンに対する抗体を用いたウエスタンブロットを使用して、組換えタンパク質の大きさを、培養物中のＥＰＯ刺激されたマウス赤芽球によって分泌されたＥｒｆｅと比較することができる。
【００８７】
ＥＲＦＥポリペプチドおよび活性−２つの相補的なアプローチによって、ＥＲＦＥポリペプチドの機能形態およびドメインを分析することができる。最初に、部分的または完全に精製された可溶性および細胞由来ＥＲＦＥは、マウスに注入することにより、生活性に関して試験される。第２のアプローチでは、タンパク質がその個々の構造ドメインの一部または全体を除去するために修飾されるＥｒｆｅバリアントを研究するために、レンチウイルス送達法が使用される。最初に、遺伝的シグナル配列を置換し、タンパク質をＮ末端切詰分析にかけ、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ１）および／またはコラーゲンドメインを、それらがインビボＥｒｆｅ活性に重要であるかを決定するために、除去する（図１２）。Ｎ末端ドメイン２（ＮＴＤ２）は、そのＣｙｓ１４２がジスルフィド対合に関与する可能性があるため、完全に除去することはより困難であり得るが、少なくともそのＮ末端半分は除去される。他のサイトカインに対するその相同性に基づき、ＴＮＦ様Ｃ末端は活性部分であり、他のドメインは、合成、分泌、またはＥｒｆｅの膜関連形態の細胞間シグナル伝達等の代替機能の可能性を容易にすることが予測される。両アプローチにおいて、４〜１５時間後の読み出しは、イムノアッセイおよび肝臓におけるヘプシジンｍＲＮＡ発現のｑＰＣＲ測定による血清ヘプシジンを含む。マウスが適度の鉄過剰をもたらす「標準的な」食事（典型的には、２７０〜３００ｐｐｍ）を取る場合、ヘプシジンを刺激する強い鉄シグナルからの干渉を防ぐために、マウスは、注入前に２週間、低（４ｐｐｍ  Ｆｅ）または十分な（５０ｐｐｍ  Ｆｅ）鉄食事を受けることができる。この事前調整は、正および負の刺激の両方に対するヘプシジンの応答性を確実にする。
【００８８】
赤血球系の成熟−エリスロフェロンは、直接または鉄送達に対するその作用を通してのいずれかで、赤血球系の拡大および成熟に対して作用を及ぼすこともできる。鉄欠乏による貧血後の鉄過剰は、有核赤血球系細胞を２．５倍増加させ、赤芽球を最大３．９倍増加させることが示され、鉄の利用可能性が赤芽球拡大を制限することを示す。予備研究では、フローサイトメトリー（Ｔｅｒ１１９、ＣＤ７１、ＣＤ４４マーカー）（Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙ  ２００７；Ｃｈｅｎ  ２００９）は、未処置の同腹仔対照と比較して、静脈切開された野生型、ヘテロ接合体、およびＫＯマウスの骨髄および脾臓における赤芽球成熟を分析するために使用された。静脈切開７２時間後、Ｅｒｆｅ−／−マウスの赤血球系細胞は、ＷＴおよびヘテロ接合体よりも成熟していないように思われたが、より多くの死滅細胞は観察されず、それによって、Ｅｒｆｅがアポトーシスに対する赤芽球保護において役割を果たさないことを示唆する。ＫＯマウスは、比較的少ない未熟前駆体（初期赤芽球）を有するように思え、アポトーシスはＥｒｆｅＫＯマウスにおいて変更されるようには思えないため、Ｅｒｆｅが初期前駆細胞増殖および分化の調節に役割を果たし得る可能性がある。
【００８９】
ＥｒｆｅＫＯマウスをＷＴマウスと比較することにより、赤血球形成誘発後に様々な間隔で収集された脾臓および骨髄の前駆細胞ならびに培養された胎仔肝臓前駆細胞のフローサイトメトリーにより赤血球産生におけるエリスロフェロンの役割を研究することができる。ＥｒｆｅＫＯおよびＷＴマウスの両方において、類似する方法を使用して、赤血球産生に対する注入されたエリスロフェロンの作用を研究することもできる。赤芽球分化は、Ｔｅｒ１１９、ＣＤ７１、および／またはＣＤ４４発現を特徴とし得る。アポトーシスシグナル伝達および細胞死は、それぞれ、ＡｎｎｅｘｉｎＶおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色することにより評価され得る。
【００９０】
インビボＥｒｆｅ処置、続いて、赤血球系前駆体数および成熟段階間の分布のフローサイトメトリー分析は、Ｅｒｆｅの赤血球系前駆体増殖または成熟に対する任意の有意な作用を示す。しかしながら、それらは、作用が鉄およびヘプシジンによって媒介されるか、Ｅｒｆｅの赤血球系前駆体に対する直接的作用によるものであるかを確立しない。この質問に答えるために、鉄（ホロトランスフェリン）が培地に存在し、ヘプシジン濃度が非常に低い胎仔肝臓赤血球系前駆体培養物に添加されるＥｒｆｅの作用を研究することができる。ＷＴおよびＥｒｆｅ−／−マウスからの１４．５〜１５．５日の胎仔肝臓赤血球系前駆体のインビトロ培養は、添加された組換えＥｒｆｅの存在下、または不在下で行うことができる。赤血球系前駆体の成熟は、前と同じように、フローサイトメトリーによって分析することができる。これら全ての研究において、ＥｒｆｅＫＯとＷＴマウスとの間、およびＥｒｆｅ処置と見かけ処置された状態との間の前駆体集団または細胞死／アポトーシスインデックスを比較することができる。
【００９１】
ＥＲＦＥの受容体−エリスロフェロンのＴＮＦαとの類似性に基づき、エリスロフェロン受容体は、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーに属し得る。このファミリーのいくつかの受容体は、オーファンである、つまり、任意の既知のリガンドを欠く。Ｂｏｓｓｅｎ  ２００６を参照。よって、フローサイトメトリーにより、既知のマウスおよびヒトＴＮＦＲファミリーの発現ライブラリをスクリーニングすることができる。受容体構築物は、ＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現され得（Ｂｏｓｓｅｎ  ２００６）、これらは、マウスまたはヒトエリスロフェロンのＦＬＡＧタグ付けされた形態で染色され得（図１０Ｇ）、続いて、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体およびＰＥ結合されたストレプトアビジンをビオチン化する。既知のＴＮＦＲファミリーのいずれもエリスロフェロンに結合しない場合、３８４ウェルプレートの付着細胞および高処理蛍光顕微鏡検査を使用して、マウスおよびヒトｃＤＮＡ発現ライブラリからの全ての受容体様分子のロボット形式の高処理スクリーニングを行うことができる。該当点はフローサイトメトリーによる確認を受けることができる。全ての特定された受容体の発現パターンは、受容体がエリスロフェロンの標的組織において発現される（媒体が直接作用する場合、肝細胞）ことを確認するため、およびエリスロフェロンの潜在的な追加の組織および臓器標的を特定するために、組織発現データベース（例えば、Ｎｅｘｔｂｉｏ  Ｂｏｄｙ  Ａｔｌａｓ）の検査によりスクリーニングすることができる。エリスロフェロンと相互作用するタンパク質を特定するために、生化学的アプローチを行うこともできる。エリスロフェロンおよび／またはＥＲＦＥポリペプチドは、磁気ビーズ上に固定化され、マウスの一次肝細胞（または先行する研究においてＥＲＦＥ標的として特定される他の細胞型）の膜または細胞可溶化物から任意の結合タンパク質を抽出するために使用され得る。複合体は、ＨＰＬＣ−質量分析を使用して特定され得る。エリスロフェロン受容体が特定されたら、その潜在的なシグナル伝達機構を正確に示すために、他の受容体（ある場合）とのその類似性を使用することができる。
【００９２】
３．エリスロフェロンがヘプシジン抑制に関連する鉄過剰障害において増加するか否か
【００９３】
健康な志願者および患者の血清試料ならびにマウスモデルにおけるエリスロフェロン濃度は、エリスロフェロンが赤血球形成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｉｓｉｓ）不良による貧血における病理学的ヘプシジン抑制因子として作用することを確認するために評価され得る。
【００９４】
正常および病理学的エリスロフェロン濃度−エリスロフェロンに対して指向される抗エリスロフェロン抗体、および／またはＥＲＦＥポリペプチドは対象において正常および異常なエリスロフェロン濃度を決定するために使用され得る。Ｅｒｆｅタンパク質の２つの異なるエピトープに対する抗マウスＥｒｆｅ抗体は、ウエスタンブロットにおいて組換えタンパク質と強く反応することが分かった（図９Ｃ）。ＥＬＩＳＡアッセイは、正常な対象、ならびに静脈切開後、溶血性貧血、または貧血からの回復中の対象、および鉄欠乏症貧血および中間サラセミアを含む様々な形態のサラセミアを含む鉄障害に罹患する対象を含む対象における循環レベルのＥＲＦＥを測定するために使用され得る。
【００９５】
エリスロフェロンの消失−ヘプシジンは、中間サラセミアを有する患者において欠乏し（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  ２００５；Ｏｒｉｇａ  ２００７）、これは、なぜこれらの患者が食物鉄を過剰吸収し、赤血球輸注または任意の他の非食物鉄の供給源がなくても鉄過剰を発達させるかを説明する。β−サラセミアにおける病原性ヘプシジン抑制因子としてのエリスロフェロンの役割を探求するために、Ｈｂｂｔｈ３／＋等の中間サラセミアのマウスモデルにおいて、ヘプシジン発現および肝鉄過剰に対するＥｒｆｅ消失の作用を分析することができる。Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスは、Ｈｂレベルが７〜９ｇ／ｄＬの、５〜１０倍増加した循環ＥＰＯ濃度、および髄外部位を含む赤血球産生不良である、中間β−サラセミアの２つの利用可能なモデルのうちでより重症である。低ヘプシジンを呈するが、これは、肝鉄過剰が６ヶ月齢までに株対照より３〜５倍増加すると、徐々に「正常」レベルに上昇する。Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ  ２００７；Ｎａｉ  ２０１２を参照。
【００９６】
例えば、Ｅｒｆｅレベルは、高濃度のＥｒｆｅが不適切に低レベルのヘプシジンに関与し得るか否かを決定するために、６ヶ月齢Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスおよびそれらのＷＴ株対照において測定された。ＥｒｆｅｍＲＮＡは、ＷＴマウスと比較して、Ｈｂｂｔｈ３／＋マウスの骨髄および脾臓において大幅に増加したことが示された（図１１）。増加したＥｒｆｅがこのモデルにおいて観察された鉄過剰に関与しているか否かを試験するために、Ｅｒｆｅ発現の消失の作用を確認することができる。Ｅｒｆｅ遺伝子はマウス染色体１上にあり、βグロビン遺伝子はマウス染色体７上にあり、したがって、中間サラセミアマウスの他の遺伝子に関して行われたように交配することにより、Ｈｂｂｔｈ３／＋Ｅｒｆｅ−／−マウスを生成することができる。Ｎａｉ  ２０１２；Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ  ２０１０を参照。Ｃ５７Ｂ／６Ｊ背景上のＨｂｂｔｈ３／＋マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｈｂｂ−ｂ１ｔｍ１Ｕｎｃ  Ｈｂｂ−ｂ２ｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ，ストック番号００２６８３）から得ることができる。
【００９７】
以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９８】
Ａｓｈｂｙ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｃａｕｓｅｓ  ａ  ｍａｒｋｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９５，５０５−５０８．
【００９９】
Ｂｏｓｓｅｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）ａｎｄ  ＴＮＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，１３９６４−１３９７１．
【０１００】
Ｂｏｕｓｃａｒｙ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＰＩ  ３−ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０１，３４３６−３４４３．
【０１０１】
Ｂｒａｍｅｙ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｎｏ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ａｌｐｈａ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９，２６．
【０１０２】
Ｃａｓａｎｏｖａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １５  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｒｏｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９８（３）：４４４−４４７．
【０１０３】
Ｃｅｎｔｉｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｍａｊｏｒ．Ｂｌｏｏｄ  ９６，３６２４−３６２９．
【０１０４】
Ｃｈａｓｔｏｎ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｕｔ  ５７，３７４−３８２．
【０１０５】
Ｃｈｅｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｔａｇｅｓ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０６，１７４１３−１７４１８．
【０１０６】
Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ  １８，３３６−３４３．
【０１０７】
Ｄｕｒａｎ−Ｓｔｒｕｕｃｋ  ａｎｄ  Ｄｙｓｋｏ（２００９）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＢＭＴ）：ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｎｄ  ｈｕｓｂａｎｄｒｙ  ｃａｒｅ  ｔｏ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｍｉｃｅ  ｉｎ  ＢＭＴ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ４８，１１−２２．
【０１０８】
Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｅｍｅｒｇｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｆｅｔｕｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１７，２７０８−２７１７．
【０１０９】
Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１４，４３７−４４３．
【０１１０】
Ｆｉｎｃｈ，Ｃ．（１９９４）．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｂａｌａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８４，１６９７−１７０２．
【０１１１】
Ｇａｎｚ  ａｎｄ  Ｎｅｍｅｔｈ（２０１１）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６２，３４７−３６０．
【０１１２】
Ｇａｎｚ  ａｎｄ  Ｎｅｍｅｔｈ（２０１２）．Ｉｒｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ．Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．２，ａ０１１６６８．
【０１１３】
Ｇａｎｚ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｎｉ−ｈｅｐｃｉｄｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅｒｅｏｆ．Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＵＳ  ２０１２／００４０８９４  Ａ１．６−１０−２０１０．
【０１１４】
Ｇａｎｚ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  １１２，４２９２−４２９７．
【０１１５】
Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｌｉｍｉｔ  ｉｒｏｎ  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ａｎｅｍｉａ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １２０，４４６６−４４７７．
【０１１６】
Ｇａｒｄｅｎｇｈｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  β−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｉｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｒｏｎ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ａｎｄ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０９，５０２７−５０３５．
【０１１７】
Ｇｈｏｔｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｅｒａｓｉｒｏｘ  ｉｎ  ｉｒｏｎ−ｏｖｅｒｌｏａｄｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５３，１１８−１２０．
【０１１８】
Ｇｏｏｄｎｏｕｇｈ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５６，２９１−２９９．
【０１１９】
Ｇｒｅｅｎｅ，Ｗ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｅｎｆｏｒｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＯＸ１１  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｊ２Ｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ  １１８，９０９−９１７．
【０１２０】
Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ＴＮＦ−α：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ａｇｅｎｔｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４９，１２１５−１２２８．
【０１２１】
Ｈｒｉｎｄａ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｗａｓｓｅｒ（１９６９）．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＶＩ．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｂｙ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９５，１６５−１７５．
【０１２２】
Ｈｕａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ａｎｄ  ＳＭＡＤ４  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｂｙ  ｏｐｐｏｓｉｎｇ  ｓｔｉｍｕｌｉ．Ｂｌｏｏｄ．１１３（１５）：３５９３−３５９９．
【０１２３】
Ｋａｒｕｒ，Ｖ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｌｙｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｂｌｏｏｄ  １０８，１５２４−１５３２．
【０１２４】
Ｋａｔｔａｍｉｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｎ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｍａｊｏｒ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９１，８０９−８１２．
【０１２５】
Ｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｅｍｉａ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２６，２９８−３０６．
【０１２６】
Ｌｉｍ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｐ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ９２，１８７０−１８７７．
【０１２７】
Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｓ−ＦａｓＬ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ  １０８，１２３−１３３．
【０１２８】
Ｍａｅｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｉｎ  ａｎｅｍｉａ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ，ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２．Ｂｌｏｏｄ  １１６，３６３５−３６４４．
【０１２９】
Ｍａｓｔｒｏｇｉａｎｎａｋｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｈｅｐａｔｉｃ  ＨＩＦ−２  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｐｏ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．
【０１３０】
Ｍｅｎｏｎ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｏｒ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ａｒｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｉａ  ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ-ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ−３４３-Ｓｔａｔ５  ａｘｉｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１６，６８３−６９４．
【０１３１】
Ｍｅｒｒｙｗｅａｔｈｅｒ−Ｃｌａｒｋｅ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１７，ｅ９６−ｅ１０８．
【０１３２】
Ｎａｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＭＰＲＳＳ６  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ  １１９，５０２１−５０２９．
【０１３３】
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ．Ｂｌｏｏｄ  １０７，３２８−３３３．
【０１３４】
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４ａ）．ＩＬ−６  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｙｐｏｆｅｒｒｅｍｉａ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１３，１２７１−１２７６．
【０１３５】
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｓ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ＴＦＲ２  ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０５，１８０３−１８０６．
【０１３６】
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４ｂ）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｒｏｎ  ｅｆｆｌｕｘ  ｂｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６，２０９０−２０９３．
【０１３７】
Ｎｅｍｅｔｈ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ，ａ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｅｍｉａ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｉｓ  ａ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｃｕｔｅ−ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｌｏｏｄ  １０１，２４６１−２４６３．
【０１３８】
Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．Ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｅｍｉａ，ｈｙｐｏｘｉａ，ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １１０，１０３７−１０４４．
【０１３９】
Ｏｒｉｇａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｌｉｖｅｒ  ｉｒｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９２，５８３−５８８．
【０１４０】
Ｐａｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｅｍｉａ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ  １０８，３７３０−３７３５．
【０１４１】
Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｉｎ  ｉｒｏｎ  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０５，４１０３−４１０５．
【０１４２】
Ｐａｒｋ，Ｃ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ，ａ  ｕｒｉｎａｒｙ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，７８０６−７８１０．
【０１４３】
Ｐｉｎｔｏ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＥＰＯＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃ／ＥＢＰａｌｐｈａ．Ｂｌｏｏｄ  １１１，５７２７−５７３３．
【０１４４】
Ｐｉｐｐａｒｄ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７９）．ＩＲＯＮ  ＡＢＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＬＯＡＤＩＮＧ  ＩＮ［ｂｅｔａ］−ＴＨＡＬＡＳＳＥＭＩＡ  ＩＮＴＥＲＭＥＤＩＡ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３１４，８１９−８２１．
【０１４５】
Ｐｏｒｐｉｇｌｉａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｓｔａｔ５  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  Ｂａｓａｌ  ｖｅｒｓｕｓ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｂｉｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｇｒａｄｅｄ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  １０，ｅ１００１３８３．
【０１４６】
Ｐｒｅｚａ，Ｇ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｍｉｎｉｈｅｐｃｉｄｉｎｓ  ａｒｅ  ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｍｉｍｉｃ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｂｅ  ｕｓｅｆｕｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ｏｖｅｒｌｏａｄ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １２１，４８８０−４８８８．
【０１４７】
Ｑｉａｏ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ  ｉｓ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  １５，９１８−９２４．
【０１４８】
Ｒａｍｏｓ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｒｏｎ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５３，１３３３−１３４１．
【０１４９】
Ｒａｍｏｓ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｍｉｎｉｈｅｐｃｉｄｉｎｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｉｒｏｎ  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ｉｎ  ａ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ．１２０（１８）：３８２９−３８３６．
【０１５０】
Ｒａｍｏｓ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｉｒｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２０２，２４−３０．
【０１５１】
Ｒａｖａｓｉ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｉｒｏｎ  ｏｖｅｒｌｏａｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｓ  ｖａｒｉａｂｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．７，ｅ３６４２５．
【０１５２】
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔｅｒｒｉ  Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｒｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｄ：ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５［３］，１４６−１５５．３−１−２００５．
【０１５３】
Ｒｉｖｅｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５ａ）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｃｅｓｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｒｏｎ  ａｎｄ  ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ  １０５，１７９７−１８０２．
【０１５４】
Ｒｉｖｅｒａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５ｂ）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｃａｕｓｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｙｐｏｆｅｒｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｉｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｒｇａｎｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０６，２１９６−２１９９．
【０１５５】
Ｓａｄａｈｉｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＬ２ＭＤＰ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ：ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ６８，４６４−４７０．
【０１５６】
Ｓｅｌｄｉｎ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．Ｍｙｏｎｅｃｔｉｎ（ＣＴＲＰ１５），ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｙｏｋｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｌｉｎｋｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｏ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７，１１９６８−１１９８０．
【０１５７】
Ｓｈａｍ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｈｅｍｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ：ｈｉｇｈ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｃ３２６Ｓ  ｆｅｒｒｏｐｏｒｔｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １１４，４９３−４９４．
【０１５８】
Ｓｏｃｏｌｏｖｓｋｙ，Ｍ．（２００７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｓｔｒｅｓｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１４，２１５−２２４．
【０１５９】
Ｔａｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＧＤＦ１５  ｉｎ  ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１３，１０９６−１１０１．
【０１６０】
Ｔａｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０ａ）．Ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １５  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１７，１８４−１９０．
【０１６１】
Ｔａｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＷＳＧ１  ａｓ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １１４，１８１−１８６．
【０１６２】
Ｔａｎｎｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０ｂ）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １５  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｔｏ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎａｔｉｏｎ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５０，１５３２−１５３５．
【０１６３】
Ｔｅｇｌｕｎｄ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）．Ｓｔａｔ５ａ  ａｎｄ  Ｓｔａｔ５ｂ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｈａｖｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎｅｓｓｅｎｔｉａｌ，ｏｒ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  ９３，８４１−８５０．
【０１６４】
Ｖｏｋｕｒｋａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．ｈｅｐｃｉｄｉｎ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｌｉｖｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｄ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｓ．５５，６６７−６７４．
【０１６５】
Ｗｏｎｇ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＣＤ３６＋  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３８，９９４−１００５．
【０１６６】
Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ-ｂａｓｅｄ  ｎｏｖｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｌｏｏｄ  １０２，３９３８−３９４６．
【０１６７】
本発明の開示を理解し、完全なものにするために必要な範囲で、本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々が個別に組み込まれるのと同程度に、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１６８】
よって、本発明の例示的実施形態を記載することにより、当業者は、 開示内においては単に例示であり、様々な他の代替え、適応、および修正は本発明の範囲で行うことができることに留意するべきである。したがって、本発明は、本明細書に図示される特定の実施形態に限定されないが、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
0006501362.tif 000002
【図２−１】
0006501362.tif 000003
【図２−２】
0006501362.tif 000004
【図３Ａ】
0006501362.tif 000005
【図３Ｂ】
0006501362.tif 000006
【図４】
0006501362.tif 000007
【図５Ａ】
0006501362.tif 000008
【図５Ｂ】
0006501362.tif 000009
【図６】
0006501362.tif 000010
【図７Ａ】
0006501362.tif 000011
【図７Ｂ】
0006501362.tif 000012
【図７Ｃ】
0006501362.tif 000013
【図８】
0006501362.tif 000014
【図９Ａ】
0006501362.tif 000015
【図９Ｂ】
0006501362.tif 000016
【図９Ｃ】
0006501362.tif 000017
【図１０】
0006501362.tif 000018
【図１１】
0006501362.tif 000019
【図１２】
0006501362.tif 000020
【配列表】
0006501362000001.app