(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するためのデバイスであって、
ａ．筒（１２４）及びプランジャ（１２２）を含むシリンジ（１２０）であって、前記筒（１２４）が、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、ある量の無細胞液体混合液（１９０）を含む、シリンジ（１２０）と、
ｂ．ベッセル（１５８）内に配置された樹脂床（１６０）であって、これにより、前記筒（１２４）の内部が前記樹脂床（１６０）と流体連通しているときに、前記プランジャ（１２２）による前記筒（１２４）からの前記無細胞液体混合液（１９０）の圧出により、前記無細胞液体混合液（１９０）に力がかかって前記ベッセル（１５８）内の前記樹脂床（１６０）を通過させることで、（ｉ）前記無細胞液体混合液（１９０）中のフィブリン凝塊形成の阻害物質の濃度の減少、及び／又は（ｉｉ）前記無細胞液体混合液（１９０）中のフィブリン凝塊形成の誘発物質の濃度の増加をもたらし、
（Ａ）前記ベッセル（１５８）を通過した後、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、
（Ｂ）前記阻害物質及び前記誘発物質が、小分子である、樹脂床（１６０）と、
を備える、デバイス。
【請求項２】
前記無細胞液体混合液（１９０）を前記樹脂床（１６０）に通過させる前に、前記筒（１２４）中の前記無細胞液体混合液（１９０）が、少なくとも２週間安定である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記樹脂床（１６０）が充填床である、請求項１又は２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記ベッセル（１５８）の遠位端と流体連通可能な適用先端を更に備え、これにより、流体連通しているときに、前記フィブリンシーラントが、前記適用先端を通って前記表面に送達される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項５】
前記筒（１２４）と前記ベッセル（１５８）とが互いに機械的に連結されており、これによりそれらのそれぞれの内部は、着脱可能なバリア、及び／又は（ｉ）隔膜、（ｉｉ）一方向フィルタ、（ｉｉｉ）バルブ、及び（ｉｖ）ストップコックのうち少なくとも１つによって分離されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記無細胞液体混合液（１９０）を前記樹脂床（１６０）に通過させるのに必要な力の大半が、人間の親指の筋力によってもたらされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項７】
（ｉ）前記凝固時間（ＴＣＬＯＴ）が、最長５０分、若しくは最長４０分、若しくは最長３０分、若しくは最長２０分、及び／又は（ｉｉ）少なくとも５秒、若しくは少なくとも１０秒、若しくは少なくとも３０秒、若しくは少なくとも１分、若しくは少なくとも５分、若しくは少なくとも１０分、若しくは少なくとも１５分である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
ｉ．前記樹脂床（１６０）を通過する前の前記無細胞液体混合液（１９０）中の３０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質の濃度と、
ｉｉ．前記樹脂床（１６０）を通過した後の前記フィブリンシーラント中の３０ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質の濃度と、
の比が、約１である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記フィブリンシーラントが、最長１分、又は最長４５秒、又は最長３０秒、又は最長１５秒、又は最長１０秒、又は最長５秒、又は最長３秒、又は最長１秒の保留時間後に、前記無細胞液体混合液（１９０）から調製されるように構成された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記筒（１２４）からの前記無細胞液体混合液（１９０）の圧出により、前記無細胞液体混合液（１９０）に力がかかって、前記樹脂床（１６０）の断面にわたって実質的に均一な様相で、前記樹脂床（１６０）を通過させるように構成された、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記デバイスが少なくとも１つのメッシュを含み、該メッシュは、前記樹脂床（１６０）全体にわたって流れを分配し、かつ／又は前記樹脂床（１６０）内に樹脂ビーズを保持するように構成されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記樹脂床（１６０）が前記ベッセル（１５８）内にあり、これにより、前記無細胞液体混合液（１９０）が、前記樹脂床（１６０）に至る途中で、グリッドを通過し、次いで濾紙（１５０）を通過し、前記グリッドは、圧力印加中に機械的な支持を提供し、かつ前記濾紙全体にわたって流れを拡げるように構成されており、また前記濾紙は、前記樹脂床（１６０）全体にわたって流れを分配し、かつ前記樹脂床（１６０）内に樹脂ビーズを保持するように構成されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するためのシステムであって、
ａ．容器内に配置されたある量の無細胞液体混合液（１９０）であって、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、無細胞液体混合液（１９０）と、
ｂ．ベッセル（１５８）内に配置された樹脂床（１６０）であって、前記ベッセル（１５８）は前記容器と流体連通可能であり、流体連通しているときに、前記無細胞液体混合液（１９０）を前記ベッセル（１５８）に通過させることにより、（ｉ）前記無細胞液体混合液（１９０）中のフィブリン凝塊形成の阻害物質の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）前記無細胞液体混合液（１９０）中のフィブリン凝塊形成の誘発物質の濃度を増加させ、これにより、前記無細胞液体混合液（１９０）を前記ベッセル（１５８）に通過させた後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、前記阻害物質及び前記誘発物質が小分子である、樹脂床（１６０）と、
を含む、システム。
【請求項１４】
キットであって、
ａ．容器内に配置されたある量の無細胞液体混合液（１９０）であって、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、無細胞液体混合液（１９０）と、
ｂ．ベッセル（１５８）内に配置された樹脂床（１６０）であって、前記ベッセル（１５８）は前記容器と流体連通可能であり、これにより、前記容器と前記ベッセル（１５８）とが流体連通しているときに、前記無細胞液体混合液（１９０）を前記ベッセル（１５８）に通過させることにより、（ｉ）前記無細胞液体混合液（１９０）中のフィブリン凝塊形成の阻害物質の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）前記無細胞液体混合液（１９０）中のフィブリン凝塊形成の誘発物質の濃度を増加させ、これにより、前記無細胞液体混合液（１９０）を前記ベッセル（１５８）に通過させた後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、前記阻害物質及び前記誘発物質が小分子である、樹脂床（１６０）と、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本願は、ＥＦＳ−ウェブを介してＡＳＣＩＩフォーマットで本願と同時に提出された配列表を含み、参照することによりその全体を本願に援用する。２０１３年１２月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名で、サイズは８キロバイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、フィブリンシーラントを調製及び送達するためのデバイス、システム、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
フィブリンシーラントはフィブリン糊とも呼ばれ、何十年にもわたって使用されている（例えば、Ｔａｂｅｌｅら「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｇｌｕｅｓ  ｏｒ  Ｆｉｂｒｉｎ  Ｇｌｕｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｏｏｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ：Ｅｆｆｉｃａｃｙ，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ  Ｓｃｉ  ２０１２、１５：１２４〜１４０；Ｄｉｃｋｎｅｉｔｅ，Ｇら「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅａｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓ  ２００３、１１２：７３〜８２を参照）。
【０００４】
フィブリンシーラントはしばしば、フィブリノーゲン含有成分とトロンビン含有成分の２つの成分からなり、これらが、米国特許第４，８７４，３６８号、同第４，９７８，３３６号、同第５，１０４，３７５号、同第６，２３４，９９４号、及び欧州特許第Ｂ−０  ０３７  ３９３号、ＰＣＴ国際特許公開第２００７０５９８０１号、米国特許第６，６１３，０２０号、及び同第６，７８３，５１４号に記述されているように、二筒送達デバイスを用いることにより別々に標的領域に送達される。
【０００５】
典型的に、フィブリンシーラント凝塊は、フィブリノーゲン、トロンビン及び第ＸＩＩＩ因子が関与する酵素反応によって形成される。トロンビンは、トロンビンの濃度によって決まる速度での酵素作用により、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する。血液凝固系の酵素である第ＸＩＩＩ因子は、フィブリン凝塊を架橋させ、安定化させる。このプロセスは、通常の血液凝固の過程の多くを迂回し、その最終段階を模倣するものである。
【０００６】
一部の製造者は、フィブリン糊製剤に抗タンパク質分解剤を添加する（例えば、ＰＣＴ国際特許出願第９３／０５８２２号に記載される）か、又は、フィブリン溶解を停止若しくは遅らせるために特にプラスミノーゲンを除去することを行っている（例えば、米国特許第５，７９２，８３５号及び同第７，１２５，５６９号に記載される）。トロンビン成分は、酵素トロンビンを含み、これは、ヒト若しくは動物（例えばウシ若しくはブタ）由来であってよく、又は遺伝子組換え技術により製造することができる。フィブリノーゲン成分は、トロンビン基質であるフィブリノーゲンを含み、これは、ヒト若しくは動物（例えばウシ若しくはブタ）由来であってよく、又は遺伝子組換え技術により製造することができる。これら２つの成分を混合すると、トロンビンがフィブリノーゲンを開裂させ、これにより、フィブリノーゲンが重合してフィブリンとなることができ、シーラントを生成する。
【０００７】
従来技術のデバイスにおいて、それぞれが１つの接着／シーラント成分が入った２つの供給レザバーが、保持デバイスにより一緒に保持され、これにより、手指の間に適用デバイスを保持し、片手でデバイスを操作することが可能になる。
【０００８】
本明細書において「多成分」デバイスと呼ばれる従来技術のデバイスは、例えば２本のシリンジなどの複数のシリンジを含み得る。例えば、例えば米国特許第４，９７８，３３６号に記述されているように、第１のシリンジ内のフィブリノーゲン成分は第ＸＩＩＩ因子及びフィブリノーゲンを含み、第２のシリンジ内にトロンビン成分を有する。典型的に、第１及び第２のシリンジのプランジャは、例えばカップリング要素により同時に係合され、このカップリング要素の吐出方向への動きによって、係合している各プランジャを、それぞれのシリンジ筒中で長手方向にスライドさせ、これにより、プランジャが同時かつ同速度で押される。この二成分の混合により、フィブリン凝塊の自発的形成が生じ、これを外科用糊として使用することができる。
【０００９】
「多成分」デバイスと呼ぶとき、用語「成分」は、レザバー（例えばシリンジ）内に収容されるタンパク質混合液を指す。よって、「多成分」デバイスは複数のレザバーを必要とし、各レザバー内に、異なるタンパク質混合液がそれぞれ存在する。
【００１０】
しばしば、従来技術のデバイスは、デバイスの吐出端に装着された適用先端も含み、ここで、シリンジからのそれぞれの流出物が混合される。シリンジから出た後、この流出物は互いに別々に維持され、先端の出口でのみ混合される。それにもかかわらず、この二成分は混合されるとすぐに凝塊を形成するため、先端が塞がるのを防ぐために、デバイスからの安定した液体流出量を維持することが必須である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、樹脂床（例えばサイズ排除脱塩クロマトグラフィー媒体）に、（ｉ）フィブリン（例えばモノマー形態、ダイマー形態、及び／若しくはオリゴマー形態）又は（ｉｉ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液を通過させることにより、フィブリンシーラントを調製及び送達／投与するための「単成分」シリンジ系デバイスに関する。液体混合液を樹脂床に通過させることにより、（ｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の小分子の誘発物質（複数可）の濃度を増加させ、かつ／又は（ｉｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の小分子の阻害物質（複数可）の濃度を減少させる。
【００１２】
用語「増加」とは、混合液中の小分子の賦活物質（複数可）の濃度を、周辺温度２１℃〜２５℃において最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）でのフィブリン凝塊形成を開始、促進及び／又は加速する濃度に上昇させることを指す。一実施形態において、フィブリン凝塊は、温度約３７℃の温度で形成される。
【００１３】
用語「減少」とは、混合液中の小分子の阻害物質（複数可）の濃度を、周辺温度２１℃〜２５℃において最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）でのフィブリン凝塊形成を可能にする濃度に低下させることを指す。一実施形態において、フィブリン凝塊は、温度約３７℃の温度で形成される。
【００１４】
典型的に、混合液が、事前に平衡化された樹脂床（例えば、デバイスのパッケージング前に平衡化されたもの）を通過及び／又はこれと接触するとき、効果的な緩衝液交換により、少なくとも濃度９０％の事前に平衡化された緩衝液を含む混合溶離液（例えば、樹脂床を通過した後に得られる混合液）がもたらされ、かつ／又は、混合液中の小分子の阻害物質の濃度が、その混合液中の初期濃度と比較して１０％未満に減少している混合溶離液がもたらされる。小分子の阻害物質（複数可）及び／又は賦活物質（複数可）の濃度を変えることにより、緩衝液交換効率が低くなり、凝塊形成をもたらし得ることが、当業者には理解されよう。
【００１５】
一実施形態において、デバイスは、使用前に、適切な緩衝液（例えば、適用する混合液処方に応じて、樹脂床に含まれる緩衝液）でユーザーにより平衡化される。
【００１６】
したがって、一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させた後に、阻害物質（複数可）の濃度は、その混合液中の初期濃度と比較して５０％未満（例えば１０％未満）に減少している。一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させた後に、混合液中の賦活物質（複数可）の濃度は、事前に平衡化された緩衝液中の賦活物質（複数可）の濃度の少なくとも５０％（例えば少なくとも９０％）に増加している。フィブリンを含む液体混合液は、フィブリンモノマー、ダイマー、及び／又はたくさんのフィブリン単位を有するオリゴマーを含み得、これにより、フィブリンは、約２１、２２、２３、２４、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、水性溶液中の可溶性形態で維持される。一実施形態において、オリゴマーは、最高１０個のフィブリン単位を含む。
【００１７】
一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させた後に、フィブリンシーラントが表面に送達及び／又は適用され、フィブリン凝塊／ポリマーが形成される。
【００１８】
多くの意図及び目的について、用語「フィブリンシーラント」、「フィブリン糊」、「フィブリン接着剤」、「フィブリン凝塊」、及び「フィブリンポリマー」は、互換可能に使用され得る。本明細書で使用される用語「フィブリンポリマー」は、たくさんのフィブリン単位を有する複数のフィブリン単位を含み、これが、約２１、２２、２３、２４、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、水性溶液中のフィブリンの可溶性を制限する。
【００１９】
上述の従来の「多成分」デバイスとは対照的に、第１レザバー内に第１タンパク質混合液を、また第２レザバー内に第２タンパク質混合液を維持する必要がない。代わりに、単一のタンパク質含有レザバーのみを必要とする「単成分」スキームを採用することが可能である。後述のように、タンパク質含有混合液をこのレザバー／容器から樹脂床に通過させると、２１℃〜２５℃の周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される。
【００２０】
「周辺温度」は、混合液を取り巻く領域の温度である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、従来技術のデバイスにおいて形成される急速凝固フィブリンシーラントとは対照的に、液体混合液を樹脂床に通過させることにより形成されるフィブリンシーラントの凝固時間（ＴＣＬＯＴ）は、少なくとも３０秒又は少なくとも１分であってよく、これにより「詰まりの少ない」及び「閉塞の少ない」デバイスの提供が可能になる。すなわち、デバイスの通常の操作中に、凝塊形成によりデバイスが目詰まり又は塞がる危険性が、上述の従来技術のデバイスと比べて、低くなる。
【００２２】
複数のタンパク質混合液を互いに混合することによりフィブリン凝塊を形成する代わりに、単一のタンパク質混合液を樹脂床に通過させることにより、（ｉ）混合液中に存在するフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）混合液中に存在するフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させて、この混合液からフィブリン凝塊を達成することが可能である。この意味において、本開示のデバイスは、異なる複数種のタンパク質がこの単一のタンパク質混合液中に存在してもよいけれども、必要なのは単一のタンパク質混合液のみであるため、「単成分」デバイスと呼ぶことができる。用語「単成分」は、用語「一成分」と互換可能である。
【００２３】
よって、いくつかの実施形態において、混合液の樹脂床通過は、この混合液を緩衝液交換プロセスで処理するものであり、これにより、混合液の阻害性小分子の大半量が除去され、同時に、例えばＩ）フィブリン、又はＩＩ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子、などの賦活タンパク質が保持される。いくつかの実施形態において、混合液を樹脂床に通過させることにより、フィブリン凝塊形成を誘発及び／又は促進し得るカルシウムイオンなどの小分子の誘発物質（複数可）／賦活物質（複数可）を混合液に追加することができる。本明細書において、用語「誘発物質」は、用語「開始物質」及び「賦活物質」と互換可能である。
【００２４】
後述のように、シリンジ実装において、タンパク質混合液を樹脂床に通過させるのに必要な力の大きさは比較的小さく、人間の親指の力によって印加することができる。このように、本開示のデバイスは、いくつかの実施形態において、上述の従来技術の多成分デバイスに対する有用な代替選択肢を形成する。１つの非限定的な例において（例えば、シリンジ系実装に関連したもの）、本開示のデバイスは、例えば手術中に、片手を用いて操作し、外科用糊を生成することができる。
【００２５】
シリンジ系実装に関連したいくつかの実施形態において、（ｉ）液体混合液（すなわち、Ｉ−フィブリン又はＩＩ−フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む）がシリンジ筒中に配置／収容されており、（ｉｉ）シリンジ筒が、樹脂床が中に格納されているベッセルに取り付けられているか又は取り付け可能である。シリンジ筒の内部が樹脂床と流体連通しているとき、シリンジプランジャを押圧することによりシリンジ筒から液体混合液が放出され、液体混合液に力がかかって樹脂床を通過させる。混合液を樹脂床に通過させることで、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）でのフィブリン凝塊形成をもたらす。
【００２６】
一実施形態において、樹脂床を通過した後、約３７℃の周辺温度において、最長１時間の凝固時間を有してフィブリン凝塊が形成される。
【００２７】
一実施形態において、フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーを含む液体混合液は中性ｐＨに維持され、例えば下記に詳述されるＧＰＲＰペプチドなどの可逆性フィブリン重合遮断薬を含む。
【００２８】
別の実施形態において、フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーを含む液体混合液は、下記に詳述されるように酸性ｐＨに維持される。
【００２９】
「中性」ｐＨとは、例えば、ｐＨ約６〜８、又はｐＨ約６．５〜７．５、又はｐＨ約６．７〜７．２である。「酸性」ｐＨとは、例えば、ｐＨ４未満である。
【００３０】
従来の「多成分」デバイスとは対照的に、いくつかの実施形態において、フィブリンシーラントを生成するのに使用されるすべてのタンパク質が、単一シリンジ筒の内部から供給されてよく、これにより、複数の隔離されたタンパク質混合液を維持する必要も、またフィブリンシーラントを生成及び送達するために互いに混ぜ合わせる必要も無くすことができる。
【００３１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、（ｉ）フィブリン、又は（ｉｉ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含みかつシリンジ筒中に収容されている液体混合液は、樹脂床に通過させる前に、「安定」である。すなわち、少なくとも２週間の期間にわたって、自発的にフィブリンポリマー（「フィブリン凝塊」）を形成することができない。樹脂床を通過させることにより、凝塊形成がもたらされる。
【００３２】
上述のように、いくつかの実施形態において、混合液を樹脂床に通過させるには、「最小限」の力のみが必要である。これは、凝塊形成を開始するのに比較的短い樹脂床のみが必要であることから、真実であり得る。理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態において、樹脂床を通過させることにより、比較的大きなタンパク質（例えば２０ｋＤａを超えるタンパク質）と、フィブリン凝塊形成の小分子の阻害物質とを分離することができ、かつ／又は、フィブリン凝塊形成の小分子の誘発物質を追加することができる。タンパク質と阻害物質（例えばアルギニン及びクエン酸塩）との間にはかなりの分子量の相違があるため、このプロセスには比較的短い樹脂床のみが必要とされる。
【００３３】
一実施形態において、阻害物質（複数可）は可逆性阻害物質であり、例えば、永久的影響を有しない低親和性阻害物質である。よって、典型的に、希釈及び／又は小分子交換により阻害効果が除去される。
【００３４】
一態様において、本発明は、フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するためのデバイスに関するものであり、このデバイスは、ａ．筒及びプランジャを含むシリンジであって、この筒が、Ｉ．フィブリン、又はＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む、ある量の液体混合液（例えば無細胞）を含む、シリンジと、ｂ．ベッセル内に配置された樹脂床であって、これにより、シリンジ筒の内部が樹脂床と流体連通しているときに、プランジャによる筒からの混合液の圧出により、この混合液に力がかかってベッセル内の樹脂床を通過させることで、（ｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度の減少、及び／又は（ｉｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度の増加をもたらし、（Ａ）ベッセルを通過した後、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間（若しくは最長５０分、若しくは最長４０分、若しくは最長３０分、若しくは最長２０分及び／又は少なくとも５秒、若しくは少なくとも１０秒、若しくは少なくとも３０秒、若しくは少なくとも１分、若しくは少なくとも３分、若しくは少なくとも５分、若しくは少なくとも１０分、若しくは少なくとも１５分）の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、（Ｂ）阻害物質（複数可）及び誘発物質（複数可）が、小分子である、樹脂床と、を備える。
【００３５】
別の一態様において、本発明は、フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するためのシステムに関するものであり、このシステムは、ａ．容器（例えばシリンジの筒）内に配置されたある量の液体混合液（例えば無細胞）であって、Ｉ．フィブリン、又はＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む、液体混合液と、ｂ．ベッセル内に配置された樹脂床であって、このベッセルは容器と流体連通可能であり、流体連通しているときに、混合液をベッセルに通過させることにより、（ｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させ、これにより、混合液をベッセルに通過させた後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間（若しくは最長５０分、若しくは最長４０分、若しくは最長３０分、若しくは最長２０分、及び／又は少なくとも５秒、若しくは少なくとも１０秒、若しくは少なくとも３０秒、若しくは少なくとも１分、若しくは少なくとも３分、若しくは少なくとも５分、若しくは少なくとも１０分、若しくは少なくとも１５分）の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、阻害物質及び誘発物質（複数可）は小分子である、樹脂床と、を備える。
【００３６】
別の一態様において、本発明は、キットに関するものであり、このキットは、ａ．容器内に配置されたある量の液体混合液（例えば無細胞）であって、Ｉ．フィブリン、又はＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む、液体混合液と、ｂ．ベッセル内に配置された樹脂床であって、このベッセルは容器と流体連通可能であり、これにより、容器とベッセルとが流体連通しているときに、混合液をベッセルに通過させることにより、（ｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させて、これにより、混合液をベッセルに通過させた後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間（若しくは最長５０分、若しくは最長４０分、若しくは最長３０分、若しくは最長２０分、及び／又は少なくとも５秒、若しくは少なくとも１０秒、若しくは少なくとも３０秒、若しくは少なくとも１分、若しくは少なくとも３分、若しくは少なくとも５分、若しくは少なくとも１０分、若しくは少なくとも１５分）の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、阻害物質（複数可）及び誘発物質（複数可）は小分子である、樹脂床と、を含む。
【００３７】
別の一態様において、本発明は、フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するための方法に関するものであり、この方法は、ａ．ある量の液体混合液（例えば無細胞）を準備することであって、このある量の液体混合液は、Ｉ．フィブリン、又はＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む、準備することと、ｂ．混合液を樹脂床に通過させることであって、そうすることにより、（ｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させ、これにより、混合液の樹脂内通過後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される、通過させることと、を含み、阻害物質（複数可）及び誘発物質（複数可）は小分子である。
【００３８】
一実施形態において、フィブリン凝塊は、約２０℃〜４０℃、例えば２１℃〜３７℃の範囲の周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、形成される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液からフィブリンシーラントを生成するように構成されたデバイスに関するものであり、この混合液は、デバイスのレザバー内に格納され、
（ｉ）デバイスは、詰まりの少ない、かつ閉塞の少ないデバイスとして動作し、
（ｉｉ）２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長約１時間（例えば、約１０秒〜約１時間又は１０分〜約１時間）の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される。
【００４０】
一実施形態において、フィブリンシーラントが、組織因子及び／又はリン脂質を含む表面（例えば損傷組織）に適用される場合、フィブリン凝塊は、約１０秒〜約１０分の凝固時間で形成される。
【００４１】
別の態様において、本発明は、フィブリン及び可逆性フィブリン重合遮断薬を含む液体混合液からフィブリンシーラントを生成するように構成されたデバイスに関するものであり、この混合液は、デバイスのレザバー内に格納され、
（ｉ）液体混合液中のフィブリンは、モノマー及び／又はオリゴマーの形態であり、
（ｉｉ）デバイスは、詰まりの少ない、かつ閉塞の少ないデバイスとして動作し、
（ｉｉｉ）２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、約５秒〜約１時間の範囲の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される。
【００４２】
また、本明細書で開示されるのは、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液からフィブリンシーラントを生成するように構成された、詰まりの少ない、かつ閉塞の少ないデバイスであり、この混合液は、デバイスのレザバー／容器（例えばシリンジ筒）内に格納され、樹脂床を通過した後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長約１時間（例えば、約１０秒〜約１時間の範囲、又は約１０分〜約１時間の範囲）の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される。いくつかの実施形態において、液体混合液は、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び所望により関連する補因子（例えば第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子）を更に含む。
【００４３】
また、本明細書で開示されるのは、フィブリン（モノマー形態、ダイマー形態及び／又はオリゴマー形態）及び可逆性フィブリン重合遮断薬（例えばＧＰＲＰ）を含む液体混合液からフィブリンシーラントを生成するように構成された、詰まりの少ない、かつ閉塞の少ないデバイスであり、この混合液は、デバイスのレザバー内に格納され、樹脂床を通過した後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、約５秒〜約１時間の範囲の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、本発明によるデバイス、システム及び／又はキットは、フィブリンシーラントを表面に送達するのに使用される。
【００４５】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、混合液を樹脂床に通過させる前に、シリンジ筒中の液体混合液は、少なくとも２週間安定である。
【００４６】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は充填床である。
【００４７】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、このデバイスは、ベッセルの遠位端と流体連通可能な適用先端を更に備え、これにより、流体連通しているときに、フィブリンシーラントが、この適用先端を通って表面に送達される。液体混合液は、例えば、ドリップ、スプレー（例えば加圧気体容器を備えた共有ノズルを含めることによる）、及び／又は伸展により適用することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、容器（例えばシリンジ筒）とベッセルとは互いに機械的に連結されており、これによりそれらのそれぞれの内部は、着脱可能なバリア、及び／又は（ｉ）隔膜、（ｉｉ）一方向フィルタ、（ｉｉｉ）バルブ、及び（ｉｖ）ストップコックのうちの少なくとも１つによって分離されている。
【００４９】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、容器及びベッセルは、着脱自在に取り付け可能である。別の実施形態において、容器及びベッセルは、一体型ピースとして一体成形される。いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、容器及びベッセルは、一体型ピース（例えば可撓性一体型ピース）の一部である。
【００５０】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、液体混合液を樹脂床に通過させるのに必要な力の大半は、人間の親指の筋力によってもたらされる。
【００５１】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、（ｉ）凝固時間（ＴＣＬＯＴ）は、最長５０分、若しくは最長４０分、若しくは最長３０分、若しくは最長２０分、及び／又は（ｉｉ）少なくとも５秒、若しくは少なくとも１０秒、若しくは少なくとも３０秒、若しくは少なくとも１分、若しくは少なくとも５分、若しくは少なくとも１０分、若しくは少なくとも１５分である。
【００５２】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、ｉ．樹脂床を通過する前の混合液中の２０ｋＤａ以上のタンパク質の濃度と、ｉｉ．樹脂床を通過した後のフィブリンシーラント中の２０ｋＤａ以上のタンパク質の濃度との比は、約１である。
【００５３】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、ｉ．樹脂床を通過する前の混合液中の３０ｋＤａ以上のタンパク質の濃度と、ｉｉ．樹脂床を通過した後のフィブリンシーラント中の３０ｋＤａ以上のタンパク質の濃度との比は、約１である。
【００５４】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、フィブリンシーラントは、最長１分、又は最長４５秒、又は最長３０秒、又は最長１５秒、又は最長１０秒、又は最長５秒、又は最長３秒、又は最長１秒の保留時間後に、液体混合液から調製される。
【００５５】
用語「保留時間」は典型的に、所定条件下で、樹脂を含むベッセルを液体混合液が通過するのにかかる時間を指す。
【００５６】
メカニズムに束縛されるものではないが、この比較的短い保留時間は、樹脂床の特性、例えば、樹脂の体積、樹脂床の物理的寸法（例えば、長さ及び／又は幅／直径）、充填樹脂床の圧縮度などを含むがこれらに限定されない、要素によるものであり得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、容器からの（例えばシリンジ筒からの）液体混合液の圧出により、混合液に力がかかって、樹脂床の断面にわたって実質的に均一な様相で、樹脂床を通過させる。
【００５８】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、デバイスは少なくとも１つのメッシュを含み、このメッシュは、樹脂床全体にわたって流れを分配し（例えば、樹脂床の断面にわたって実質的に均一な様相で）、かつ／又は床内に樹脂ビーズを保持するように構成される。
【００５９】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、デバイスは２つのメッシュを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床はベッセル内にあり、これにより、混合液は、樹脂床に至る途中で、グリッドを通過し、次いで濾紙を通過し、このグリッドは、圧力印加中に機械的な支持を提供し、かつ濾紙全体にわたって流れを拡げるように構成されており、またこの濾紙は、樹脂床全体にわたって流れを分配し、かつ床内に樹脂ビーズを保持するように構成されている。
【００６１】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床の高さは、最大１０ｃｍ、又は最大７．５ｃｍ、又は最大５ｃｍ、又は最大２．５ｃｍ、又は最大２ｃｍ、又は最大１．５ｃｍ、又は最大１ｃｍである。
【００６２】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床の高さは、少なくとも０．５ｃｍである。
【００６３】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床の高さは、最大１０ｃｍ、若しくは最大７．５ｃｍ、若しくは最大５ｃｍ、若しくは最大２．５ｃｍ、若しくは最大２ｃｍ、若しくは最大１．５ｃｍ、若しくは最大１ｃｍ、及び／又は少なくとも０．５ｃｍである。
【００６４】
理論に束縛されるものではないが、いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、この床は比較的短いため、フィブリン凝塊形成を開始及び／又は促進するための十分な緩衝液交換を達成するには、比較的「広幅の床」が必要になり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床の幅は、最大５ｃｍ、又は最大２．５ｃｍ、又は最大１．３ｃｍである。
【００６６】
しばしば、「幅」という語は、「直径」と言う語と互換可能である。
【００６７】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床の高さとその特徴的幅との比は、最大２．５、若しくは最大２、若しくは最大１．５、若しくは最大１、若しくは最大０．７５、及び／又は少なくとも０．５である。
【００６８】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、容器（例えばシリンジ筒）中のある量の液体混合液は、少なくとも０．５ｍＬ、若しくは少なくとも１ｍＬ、及び／又は最大１５ｍＬ、若しくは最大１０ｍＬ、若しくは最大５ｍＬの体積を有する。
【００６９】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、この樹脂床は比較的「短い」ため、平均的なユーザーであっても、遠心分離の必要なしに力をかけて、液体混合液を床に通過させることができる。
【００７０】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、最長６０秒間にわたってプランジャに印加される、最大１００ニュートン、又は最大７５ニュートン、又は最大５０ニュートン、又は最大３０ニュートンの力は、最長６０秒の保留時間で、容器（例えばシリンジ筒）内に格納された液体混合液の大半に力をかけて樹脂床を通過させるのに十分である。
【００７１】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は、事前充填されている。
【００７２】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は、誘発物質（複数可）で事前に平衡化されている。
【００７３】
一実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は、例えば混合液中の阻害物質（複数可）の初期濃度よりも低い濃度で、阻害物質（複数可）の望ましい最終濃度で事前に平衡化される。メカニズムに束縛されるものではないが、樹脂床内に固定濃度の阻害物質を含めることにより、デバイスを通過した後の混合液中の阻害物質の濃度を制御することができるようになり、したがって、フィブリン重合速度を制御できるようになる。
【００７４】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、液相中にある樹脂床分画は、少なくとも１０％、若しくは少なくとも２０％、若しくは少なくとも３０％、及び／又は最大５０％、若しくは最大４０％である（パーセンテージはすべて体積／体積比）。
【００７５】
特定の一実施例において、樹脂床の液相は樹脂床全体積の３０〜４０％であり、容器（例えばシリンジ筒）内の液体混合液の体積にほぼ等しい。
【００７６】
一実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床の体積は、０．７ｍＬ〜２０ｍＬの範囲である。
【００７７】
一実施形態において、樹脂床の体積は６．４ｍＬである。別の実施形態において、樹脂床の体積は１２．３ｍＬである。
【００７８】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、（ｉ）シリンジ筒中の液体混合液の体積と、（ｉｉ）樹脂床の体積との体積比は、少なくとも０．１、若しくは少なくとも０．２、及び／又は最大１０、若しくは最大５である。
【００７９】
一実施形態において、（ｉ）シリンジ筒中の液体混合液の体積と、（ｉｉ）樹脂床の体積との体積比は、約０．１〜約１０の範囲である。別の実施形態において、（ｉ）シリンジ筒中の液体混合液の体積と、（ｉｉ）樹脂床の体積との体積比は、約０．２〜約５の範囲である。更に別の実施形態において、（ｉ）シリンジ筒中の液体混合液の体積と、（ｉｉ）樹脂床の体積との体積比は、約０．３〜約１の範囲である。
【００８０】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は滅菌可能であり、すなわち、滅菌後にこの樹脂床は依然として機能可能である。いくつかの実施形態において、デバイス及びその構成要素（液体混合液を含む）は、滅菌されている。
【００８１】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、液体混合液は、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、阻害物質（複数可）は、セリンプロテアーゼ活性部位阻害物質である。
【００８３】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、阻害物質（複数可）は、カルシウムキレート剤である。
【００８４】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、誘発物質（複数可）はカチオンであり、例えば、カルシウム陽イオン、又は他の二価陽イオン（例えばマグネシウム、鉄、若しくは亜鉛、又はこれらの組み合わせ）である。
【００８５】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、誘発物質（複数可）は、リン脂質、セファリン及び／又は二価陽イオンである。
【００８６】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は、ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体活性化緩衝溶液（例えば、カオリン粉末、リン脂質、セファリン、組織因子、トロンボプラスチン、適切なｐＨの緩衝液など）で事前に平衡化されている。
【００８７】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床はＣａＣｌ２を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、液体混合液は、モノマー形態、ダイマー形態及び／又はオリゴマー形態のフィブリンを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、液体混合液は中性ｐＨに維持され、阻害物質は、ＧＰＲＰペプチド又は他の可逆性フィブリン重合遮断薬である。
【００９０】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、液体混合液は酸性ｐＨに維持され、阻害物質は、ヒドロニウムイオン（Ｈ３Ｏ＋）である。
【００９１】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、誘発物質（複数可）は、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）である。
【００９２】
いくつかの実施形態において（例えば、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関して）、樹脂床は、アルギニンを含む。
【００９３】
実施形態はすべて、本明細書に開示される任意のデバイス、システム、キット及び／又は方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１Ａ】いくつかの実施形態によるフィブリンシーラントを調製及び送達するための代表的なデバイスの分解図及び正面図である。
【図１Ｂ】いくつかの実施形態によるフィブリンシーラントを調製及び送達するための代表的なデバイスの分解図及び正面図である。
【図２Ａ】ベッセル内の樹脂床を液体混合液が通過する様子を示す。
【図２Ｂ】ベッセル内に配置されたＯリング、近位側濾紙、濾紙、樹脂床、及び遠位側濾紙を示す。
【図３】本発明によるデバイスを使用することにより、フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するための一実施形態の方法のフローチャートである。
【図４Ａ】液体混合液をＣａＣｌ２で事前に平衡化された市販のカラム（使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム）に通過させることにより、小分子交換が行われている液体混合液を示す。交換の後、フィブリン凝塊が自発的に形成される。
【図４Ｂ】液体混合液をＣａＣｌ２を含まない緩衝液で事前に平衡化された市販のカラムに通過させることにより、小分子交換が行われている液体混合液を示す。数日経った後であっても凝固は生じていない。
【図５Ａ】ＧＰＲＰ阻害フィブリン溶液を示す。これには、緩衝液交換手順は行われず、試験条件下で試験時間中［周辺温度（約２２〜２４℃）で２４時間］、液体形状のままであった。
【図５Ｂ】カラムを用いて緩衝液交換手順によりＧＰＲＰ阻害物質を除去した後の、重合した液体混合液を示す。
【図６】組織因子とリン脂質を追加した酵素前駆体：フィブリノーゲン混合液の急速な凝固が、ＣａＣｌ２濃度に依存していることを示す。
【図７】フィブリン重合とＧＰＲＰ濃度との間に対数相関関係が存在していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
ここで、本発明をあくまで一例として添付図面を参照しつつ説明する。詳細図を具体的に参照してはいるが、図示されている詳細事項は例示のためのものであり、あくまで代表的なシステムの好ましい実施形態を具体的に検討するためのもので、本発明の原理及び概念的側面の有用かつ分かりやすい記述と考えられるものを提供するために提示されていることを、ここで強調しておく。この点において、本発明の基本的理解のために必要な程度を越えて、本発明の構造的詳細を示す試みは行われておらず、図に伴う記述は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように実施され得るか、及び実施形態をどのように作製及び使用するかが、当業者に明らかとなるように記載されている。
【００９６】
簡潔にするために、さまざまな特徴の一部の明確な組み合わせは、図又は記述中に明示的に詳述してはいない。ここで、本明細書に開示される方法又はデバイス特徴の任意の組み合わせは、特徴の任意の組み合わせを含め、任意の様相で組み合わせることができ、任意の特徴の組み合わせを、任意の実施形態に含めることができ、及び／又は任意の実施形態から除外することができる。
【００９７】
図１Ａ及び１Ｂは、フィブリンシーラントを調製及び送達するためのデバイスの分解図及び正面図である。図１Ａ〜１Ｂの非限定的な例により、このデバイスは、（ｉ）シリンジ１２０と、（ｉｉ）ベッセル１５８と、（ｉｉｉ）ベッセル１５８内に配置された樹脂床１６０と、を含む。シリンジ１２０は、（ｉ）プランジャ１２２と、（ｉｉ）シリンジのベッセルへの取り付けのための先端１２６（例えばオスルアーロック継手）を含む筒１２４と、を含む。先端１２６は、ソケット１２８と嵌合する（例えば液密シールを形成する）ような寸法にされ、これは、樹脂床１６０に対して遠位に配置される適用先端（図示なし）と混同しないようになっている。
【００９８】
図１の具体的な実施例において、ベッセル１５８は近位側１３０及び遠位側１８０のハウジング部分を含む。ベッセル１５８内に配置されているのは、（ｉ）Ｏリング１４０、（ｉｉ）近位側１５０及び遠位側１７０の濾紙、及び（ｉｉｉ）樹脂床１６０である。図１Ｂに示すように、ベッセル１５８はオスルアーロックアダプタを有し、これは遠位側ポート１９４である。
【００９９】
また図１Ｂには、（ｉ）フィブリン、又は（ｉｉ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む、ある量の液体混合液１９０（例えば、血液の無細胞血漿部分から調製された、又は遺伝子組換え技法により調製された、タンパク質混合液などの無細胞混合液）が示されている。この液体混合液は、シリンジ１２０の筒１２４中に配置される。いくつかの実施形態において、混合液１９０がシリンジ筒１２４中にあるとき、混合液１９０は「安定」であると見なされ、例えば、少なくとも２週間の期間にわたって、自発的にフィブリンポリマー（「フィブリン凝塊」）を形成することができない。
【０１００】
混合液１９０を樹脂床１６０に通過させることで（例えば、シリンジ１２０の筒１２４から押し出された後）、（ｉ）混合液中に存在するフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度の減少、及び／又は（ｉｉ）混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度の増加をもたらし、阻害物質（複数可）及び誘発物質（複数可）は小分子である。いくつかの実施形態において、プランジャ１２２の押圧により混合液１９０がシリンジ筒１２４から放出され（例えば先端１２６を介して）、この放出された混合液１９０に力がかかって樹脂床１６０を通過させる。
【０１０１】
図２Ａ〜２Ｂは、樹脂床１６０が中に配置されている、組み立てられたベッセル１５８の拡大図である。図２Ａは、混合液１９０がベッセル１５８内の樹脂床１６０を通過する様子を示す。図２Ｂは、ベッセル１５８内に配置されたＯリング１４０、近位側濾紙１５０、樹脂床１６０、及び遠位側濾紙１７０を示す。Ｏリング１４０は、漏れ、例えば、ねじ込み可能な要素を含む近位側１３０及び遠位側１８０ハウジング部分のらせん状エッチングの間の近接並置からの漏れを防止することができる。図２Ａ〜２Ｂの実施形態において、ベッセルは、互いにねじ込みにより取り付け可能な、近位側及び遠位側のハウジング部分から組み立てられる。別の実施形態において、このハウジングの近位側及び遠位側部分は、機械的に取り付け可能である。
【０１０２】
このハウジングは、例えばポリプロピレン、ポリカーボネート、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、及び同様物、並びにこれらの組み合わせなどの、プラスチック材料で構成され得る。Ｏリングは、シリコーン、ゴム及びフルオロポリマーエラストマー、ゴム、及び／又はニトリルブタジエンゴム（ＮＢＲ）、及び同様物などのエラストマーで構成され得る。
【０１０３】
一実施形態において、このデバイスは、フィルタ１５０及び１７０（例えばＷａｔｍａｎｎ  ＧＦ）を含み、この各面は支持グリッド（例えば内径２６ｍｍカラム用の支持スクリーン、製品コード：１８−９３７７−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））で支えられている。そのような一実施形態において、一方の支持グリッドは濾紙１５０の近位側にあり、もう一方は濾紙１７０の遠位側にある。支持グリッドは、フィルタに対する機械的支持を提供し得る。支持グリッドは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリアミド、テフロン、及び／又はステンレス鋼、及び同様物で構成され得る。
【０１０４】
図２Ａは、混合液１９０がベッセル１５８内の樹脂床１６０を通過する様子を示す。本発明による結果として、本発明によるデバイスは、ある高さ対幅比（例えば０．５２又は１）を有する樹脂床を含み、これにより、人間の親指筋力により印加される力で、有利に操作することができ、依然として、既知の市販ゲル濾過スピンカラム（例えば、使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム、製品コード：１７−０８５１−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））として効率的な緩衝液交換を提供することが示されている。典型的に、市販のゲル濾過スピンカラムは長くて細い（例えば、高さ：幅の比が約３超である）。混合液をそのような市販カラムに通過させるためには、長い処理時間（重力を利用する場合）又はかなりの力（例えば遠心力を用いる）のいずれかが必要になる。これらの市販のカラムは典型的に、手持ちデバイス（例えばシリンジ）には適合しない。したがって、いくつかの実施形態において、例えば、混合液１９０を樹脂床１６０に通過させるのに必要な力の大きさを最小限に抑えるために、最小限の高さの樹脂床を採用することが望ましい可能性がある。よって、（ｉ）樹脂床の高さ（図２Ｂの１６１）と（ｉｉ）その特性幅（図２Ｂの１６２）との比が、最大約２．５、若しくは最大約２、若しくは最大約１．５、若しくは最大約１、若しくは最大約０．７５、及び／又は少なくとも０．５である樹脂床を使用することが望ましい可能性がある。一実施形態において、樹脂床は直径（幅）２５ｍｍ、高さ１３ｍｍを有し、すなわち高さ対幅の比は０．５２である。別の実施形態において、樹脂床は直径（幅）２５ｍｍ、高さ２５ｍｍを有し、すなわち高さ対幅の比は１である。
【０１０５】
よって、混合液１９０が実質的に樹脂床全体と「相互作用」又は「接触」するためには、樹脂床１６０の断面にわたって比較的均一な流れを達成し、これにより、混合液が樹脂床全体を通過するようにすることが望ましい可能性がある。この流れプロフィルを図２Ａに示す。
【０１０６】
用語「接触」又は「相互作用」は、混合液を、樹脂床と十分に密接に接触させる、任意のタイプの組み合わせ操作を指し、この操作で、樹脂床を通過する際に、溶質／小分子が除去及び／又は交換される。混合液は、溶質／小分子を除去及び／又は交換できる十分な時間、樹脂床内でインキュベーションすることができる。混合液は、樹脂床を通過する間、２０℃〜４０℃の範囲の温度であってよく、デバイスから出る際にｐＨ６〜８の範囲であってよい。
【０１０７】
濾紙１５０は、樹脂床１６０全体にわたる流量分配を支援するように機能し得る。近位側濾紙１５０の別の機能として、遠位側濾紙１７０と合わせて、樹脂床１６０内のビーズ粒子を保持し得る。
【０１０８】
濾紙は、メッシュの一例であり、別の実施形態において、他のメッシュ構造（すなわち、濾紙以外）を使用して、樹脂床１６０の断面にわたる流量分配を補助し、かつ／又は樹脂床１６０内にビーズ粒子を保持することができる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、メッシュサイズ（すなわちその中の孔のサイズ）は、最小のビーズのサイズの２分の１以下である。一実施形態において、メッシュサイズは１０〜２０マイクロメートルである。「メッシュ」は、樹脂床１６０の断面にわたって流量分配を補助し、かつ／又は樹脂床１６０内にビーズ粒子を保持し得る、任意のタイプの多孔性マトリックスに関する。メッシュの非限定的な例としては、グリッド、エッチングされた材料、ポリマーネットワーク、フィルタ、及び同様物がある。メッシュは、任意の材料、例えばプラスチック、ナイロン、セルロース、合金、ガラス及び同様物などの生体互換性材料で構成され得る。デバイスは、複数のメッシュ要素を含み得る。
【０１１０】
典型的な充填樹脂床は、約６０〜７０％（ｖ／ｖ）の固形材料から構成されてよく、残りの３０〜４０％（ｖ／ｖ）は、小分子溶質を含む液状溶液、又は任意の他の比率の固形材料と液状溶液から構成されることが、当業者には理解されよう。一実施形態において、充填樹脂床は、約６０〜７０％（ｖ／ｖ）の固形材料から構成され、残りの３０〜４０％（ｖ／ｖ）は、小分子溶質を含む液状溶液から構成される。液体混合液中の小分子は、タンパク質を含むある量の液体混合液１９０が上述のようにデバイスに通されるときに、除去及び／又は交換される。よって、タンパク質溶液が、樹脂床１６０を通過してタンパク質組成が若干変化する前と実質的に同程度の量を有するデバイスから押し出され、一方、溶質／小分子は、樹脂を通過する際に除去及び／又は交換される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ベッセル１５８に入る前は、混合液１９０は「安定」であると見なされる。混合液１９０を樹脂床１６０に及びベッセル１５８に通過させることにより、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ、時間パラメータ）を有するシーラント形成が可能になる。いくつかの実施形態において、ＴＣＬＯＴの値は、最長１時間、又は最長５０分、又は最長４０分、又は最長３０分、又は最長２０分である。代替的又は追加的に、ＴＣＬＯＴの値は、少なくとも５秒、又は少なくとも１０秒、又は少なくとも３０秒、又は少なくとも１分、又は少なくとも３分、又は少なくとも５分、又は少なくとも１０分、又は少なくとも１５分である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、樹脂床１６０を通過した後、混合液１９０を外科用糊として使用することができる。
【０１１３】
便宜上、本明細書における説明の文脈で、さまざまな用語が本明細書中に提示される。定義が提供される範囲において、明示的又は暗示的に、本願の本明細書中又は他の場所で、そのような定義は、当該技術分野（複数可）の当業者による定義語の使用と首尾一貫しているものと理解される。更に、そのような定義は、そのような使用と首尾一貫して、可能な限り最も広義に解釈されるものとする。
【０１１４】
別途指定のない限り、本開示において、２つの量ＱＵＡＮＴ１及びＱＵＡＮＴ２が互いに「ほぼ」等しい、又は互いに「実質的に等しい」場合、これらの量は、厳密に等しいか、又は、（ｉ）２つの量のうち大きい方ＭＡＸ（ＱＵＡＮＴ１、ＱＵＡＮＴ２）と（ｉｉ）２つの量のうち小さい方ＭＩＮ（ＱＵＡＮＴ１、ＱＵＡＮＴ２）との間の「量比」が、最大１．３である。いくつかの実施形態において、この比は、最大１．２、又は最大１．１、又は最大１．０５である。本開示において、「ほぼ」等しい、及び「実質的に等しい」は、互換可能に使用され、同じ意味を有する。
【０１１５】
「小分子」の誘発物質／賦活物質又は阻害物質は、最大１，０００ダルトンの分子量を有する。「小分子」の非限定的な例としては、イオン、アミノ酸８個未満の短いペプチド、及び化合物が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、小分子の阻害物質は、分離ペプチド、その誘導体又は塩であり、これは、フィブリンモノマーと可逆的に結合することができ、フィブリン凝塊形成を防止する又は遅延させる。いくつかの実施形態において、小分子の阻害物質は、小さな化学分子である。小分子の阻害物質は、フィブリン重合に永久的な影響を与えない、フィブリンモノマーに対して低い親和性を有する結合剤であり得る。よって、典型的に、希釈及び／又は小分子の交換により重合が開始される。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、阻害物質は、カルシウムキレート剤、セリンプロテアーゼ活性部位阻害物質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、小分子の賦活物質／誘発物質は、例えばカルシウム陽イオンなどの二価の陽イオンである。いくつかの実施形態において、カルシウム陽イオンは、ＣａＣｌ２により提供される。
【０１１９】
「樹脂床」は、液体（例えば緩衝液）中に保持された、ポリマー基質（例えばセファロース、アガロース、アクリレート）からビーズの形態（例えばミリメートル以下〜マイクロメートルのサイズ）に製造された、複数のマトリックスを指す。樹脂は当該技術分野で周知であり、例えば、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｋａｓｔｎｅｒ編、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ−ｖｏｌｕｍｅ  ６１  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００；ｐ．９４〜１１４に記述されている。樹脂床は、小分子の交換体として使用され、「サイズ除外」樹脂とも呼ばれる。典型的に、小分子の交換は、小分子の１つのセットを別のセットと交換することである。しばしば、樹脂は、フィブリン凝塊形成を開始及び／又は促進する小分子で事前に平衡化される。樹脂床は、典型的に液相を指し、例えば溶質と固相（すなわち樹脂床の樹脂ビーズ）を含む。
【０１２０】
ビーズは、親水性材料（例えばアガロース、セファロース、アクリルビーズ、セルロース、コントロールドポアガラス、シリカゲル、デキストラン）、疎水性材料、又は、有機人工／合成ポリマー（例えばポリアクリルアミド又はポリスチレン系の材料）から構成され得る。一般的な材料／ポリマーは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）、Ｕｌｔｒａｇｅｌ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅｐａｒａ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）（Ｔｏｓｏｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｊａｐａｎ）、ＨＥＭＡ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓ．（Ｄｅｅｒ−ｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）（Ｒｏｈｍ  Ｐｈａｒｍａ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の商標名で市販されている。また、アズラクトン系材料（３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．，ＵＳＡ）。一実施形態において、ビーズは、Ａｇａｒｏｓｅ（登録商標）又はＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）又はＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）から構成される。これらの材料は市販されている。典型的に、樹脂は、有機ポリマー基質で製造される不溶性マトリックスである。理論に束縛されるものではないが、樹脂ビーズは典型的に多孔性であり、この孔は、交換される分子の分子量範囲内である。混合液中のタンパク質は、大きすぎて樹脂の孔に入ることができず、樹脂床を迅速に通過する。一方、混合液中の小分子（例えば阻害物質）は、樹脂の孔に出入りすることができるため、より蛇行した経路をたどり、よって樹脂床を通過する移動速度が大幅に遅くなる。樹脂を事前に平衡化するのに用いられるこれらの小分子（例えば誘発物質（複数可））は、大幅な「ヘッドスタート」を利用し、これによってタンパク質と一緒に樹脂から出る。よって、緩衝液の塩及びその他の小分子がこの工程で交換される。この技法は、例えば「ゲル濾過」、「脱塩」、及び「バッファー交換」など、具体的な用途に応じていくつかの名前で知られている。
【０１２１】
いくつかの好ましい実施形態において、この床は「充填床」である。典型的に、「充填床」は、ビーズが樹脂床内に、そのサイズに対して実質的に均一に分配されている状態を指す。この床は圧縮されており（圧力下で密になっており）、これにより、ビーズは、その構造を顕著に変形させることなく接触している。当業者には、最適圧縮比が実験的に決定され、既知であり、異なる樹脂間で異なることが理解されよう。いくつかの実施形態において、圧縮比は、（ｉ）少なくとも５％、若しくは少なくとも１０％、若しくは少なくとも２０％、及び／又は（ｉｉ）最大４０％である。一実施形態において、ビーズのサイズは、１５〜９０マイクロメートルのサイズ分布（超微粒子樹脂）、及び最大８０〜５００マイクロメートル（粗い樹脂）として与えられる。適切なビーズの例としては、セファロース、アガロース、アクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
本発明によるデバイスを、事前に平衡化された緩衝液で洗浄した後、２回目に混合液を通過させるのに使用した場合、フィブリン凝塊を形成する時間の短縮が観察された。理論に束縛されるものではないが、樹脂床に液体を通過させると、圧縮を生じ、フィブリン凝塊形成の時間に影響を及ぼす。
【０１２３】
一実施形態において、デバイスに使用される樹脂はＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｍｅｄｉｕｍ（製品コード：１７−００３３−０１；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））であり、これは次の特性を備えている：マトリックス：架橋デキストラン、分離メカニズム：サイズによる、湿潤粒子サイズ範囲：３８〜２３５μｍ、乾燥粒子サイズ：＞５０μｍ、排除限界（Ｍｒ）：５０００、化学的安定性：すべて一般的に使用されている緩衝液、使用ｐＨ範囲：２〜１３。
【０１２４】
用語「樹脂床」及び「ゲル濾過マトリックス」は，互換可能に使用され得る。
【０１２５】
「凝固時間」は、観察可能な凝塊を形成するのに必要な時間である。凝塊は、肉眼で観察してもよく、又は、機械的手段（例えば、混合液を含む試験管を倒置若しくは傾けたときの流れの中断を観察するか、又は、粘度を測定する）で観察してもよい。混合液がシーラントを形成する凝塊形成活性レベル又は能力は、インビトロ及び／又はインビボで測定することができる。
【０１２６】
用語「凝塊形成」は、必ずしも、「凝塊形成」を達成するのにトロンビンの存在を必要としない。用語「凝塊形成」には、フィブリンポリマー形成も含まれる。凝塊形成はまた、傾いた表面上での移動距離の測定（又はドロップテストモデル）によって、又は、Ｓｔａｒｔ４凝塊形成アナライザー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）などの凝塊形成アナライザーを用いることによって、又は、当該技術分野で周知の任意の他の方法によって、測定することができる。完全な凝塊形成は、例えば倒置時の、液体混合液の流れの中断によって評価することができる。迅速な重合は、Ｓｔａｔ４凝塊形成アナライザー（Ｓｔａｇｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）又は同等の凝固計を用いて測定することができる。いくつかの実施形態は、（ｉ）樹脂床を通過する前に「安定」であると見なされ、かつ（ｉｉ）樹脂床の通過後に、２１℃〜２５℃の周辺温度において、凝固時間が最長１時間である、液体混合液に関する。
【０１２７】
液体混合液に関する用語「安定」、及び「安定性」は、樹脂床を通過及び／又はこれに接触する前に、混合液中のフィブリン重合／凝塊形成が実質的にないことを意味する。
【０１２８】
例えば、（ｉ）フィブリンモノマー、ダイマー及び／若しくはオリゴマー、又は（ｉｉ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液は、樹脂床を通過する前に、安定であると見なされ得る。混合液（例えばシリンジ筒中又は別の好適な容器中に保管されている）は、小分子の阻害物質（複数可）の存在、及び／又は小分子の誘発物質（複数可）の欠如により、安定であり得る。低ｐＨ条件（例えば、０．１ｍＭを超える濃度のヒドロニウムイオン（Ｈ３Ｏ＋）を有する混合液／ｐＨ４未満）は、フィブリン重合を防止する小分子の阻害物質の一実施形態として見なすことができる。
【０１２９】
（ｉ）フィブリンモノマー、ダイマー及び／若しくはオリゴマー、又は（ｉｉ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子のうち少なくとも１つを含む、安定な液体混合液の非限定的な例：
第１の例は、第ＩＩ因子（ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体である、プロトロンビンとしても知られる）及び濃縮フィブリノーゲン、並びに所望により他のビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体（例えば第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子）、及び所望によりそれぞれの関連する補因子（例えば第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子）を含む混合液に関する。第ＩＩ因子又はビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体（Ｕ）とフィブリノーゲン（ｍｇ、凝固性タンパク質）との比は、第ＩＩ因子で正規化し、約０．０１〜約１．０であり得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、混合液は、約１〜２ｍｇ／ｍＬ、１〜１１０ｍｇ／ｍＬ、１０〜１１０ｍｇ／ｍＬ（例えば約４０ｍｇ／ｍＬ〜７０ｍｇ／ｍＬ）の有効量のフィブリノーゲンを含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、混合液は、約０．１ＩＵ／ｍＬ〜約２５ＩＵ／ｍＬ（例えば０．１４ＩＵ／ｍＬ）の最終濃度の第ＩＩ因子を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、混合液は、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体と、少なくとも１つのビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体の少なくとも１つの可逆性小分子の阻害物質と、を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、混合液は、追加の不可逆性トロンビン阻害物質（例えばヒルジン及び／又はアンチトロンビンＩＩＩ）を含まない。不可逆性トロンビン阻害物質は、トロンビンと共有結合するか、若しくは非常に高い親和性でトロンビンと結合する分子群、及び／又は、トロンビンの官能基を破壊するか、若しくはトロンビンを不活性化する分子群を含む。例えば、ヒルジン及びアンチトロンビンＩＩＩは、本明細書において、そのような不可逆性トロンビン阻害物質と見なされる。トロンビンはアンチトロンビンＩＩＩと結合し、これにより、トロンビンは複合体から放出されなくなる。本明細書で使用するとき、トロンビンと高い親和性（μＭ未満）で結合するトロンビン阻害物質は、不可逆性と見なされる。そのような例の１つがヒルジンであり、これは、トロンビンとピコＭの範囲で結合する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、混合液は第Ｖ因子を更に含む。混合液は、第ＶＩＩ因子及び／又は第ＩＸ因子を更に含み得る。いくつかの実施形態において、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、及び／又は第ＩＸ因子は、少なくとも部分的に、活動性形態にある。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、可逆性小分子の阻害物質は、カルシウムキレート剤、セリンプロテアーゼ活性部位阻害物質、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、混合液（例えば液体配合物）は、約２℃〜８℃の周辺温度において、少なくとも１４日間（例えば約１か月、３か月）安定なままである。いくつかの実施形態において、混合液は、約２℃から最高で室温までの周辺温度において、少なくとも７日間安定なままである。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、混合液は、室温（２０〜２５℃）において、約３０日間安定である。いくつかの実施形態において、混合液は、追加トロンビンを含まない。
【０１３７】
用語「追加トロンビンを含まない」及び「追加の不可逆性トロンビン阻害物質を含まない」に関連する用語「追加の〜を含まない」とは、その混合液に、トロンビン又は不可逆性トロンビン阻害物質が追加されていないことを意味する。ただし、混合液は、混合液中に元々存在する、少量のトロンビン（例えば１ＩＵ／混合液ｍＬ未満）及び／若しくは不可逆性トロンビン阻害物質（例えば５μＭ未満）を含むことがあり、並びに／又は混合液中で自然に形成されたトロンビンを含んでもよいことに留意すべきである。
【０１３８】
一実施形態において、混合液を調製するのに使用されるビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体は、濃縮液として提供され、これは、第ＩＩ因子で正規化したときに、血漿中の濃度と比べて約２〜５０倍に濃縮されている。
【０１３９】
一実施形態において、混合液を調製するために使用されるビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体濃縮液は、ＰＰＳＢ濃縮液［第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子（プロコンバーチン）、第Ｘ因子（スチュアート因子）、及び第ＩＸ因子（抗血友病Ｂ因子）の頭字語］である。
【０１４０】
一実施形態において、混合液は、ＰＣＣ濃縮液（第ＩＩ因子、第Ｖ因子、及び第Ｘ因子を指すプロトロンビナーゼ複合体濃縮液の頭字語）を含む。
【０１４１】
一実施形態において、そのような液体混合液は、約２、３、４、５、６、７、及び８℃からなる群から選択される周辺温度において、少なくとも１４日間安定である。いくつかの実施形態において、液体混合液は、約２℃〜８℃の温度において、３０、３５、４５日間、６０日間、最長９０日間又はそれ以上、安定なままである。
【０１４２】
ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体の供給源であるＰＰＳＢは、例えば「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ」、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ、Ｎｅｉｌ  Ｇｏｓｓ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｒｌｉｎｇ．２０１３  Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓに記述されているように、当該技術分野の記述に従って標準的に製造され得る。濃縮ＰＰＳＢは、クリオ除去ヒト血漿をＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに搭載し、濃い塩溶液（例えば０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）（これはクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ、例えば１０ｍＭ）も含む）で溶出させることによって製造することができる。ＰＰＳＢは、プロトロンビン濃度（第ＩＩ因子）によって測定した場合、血漿の４〜１６倍に濃縮することができる。典型的に、混合液は、陰イオン交換カラムに結合するビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体（例えばＦＶＩＩ、ＦＩＸ、タンパク質Ｃ及びタンパク質Ｓ、並びにＦＸ）、それらに関連する酵素前駆体補因子（ＦＶ及びＦＶＩＩＩ）、並びに共溶出される任意の他のタンパク質の、すべてを含む。混合液を調製するのに使用されるＰＰＳＢは、更に、例えば血漿の最大５０倍まで濃縮することができる。
【０１４３】
理論に束縛されるものではないが、ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体小分子の阻害物質（例えばＮａＣｉｔｒａｔｅ、ＥＤＴＡ）は、カルシウムイオンをキレート化する役割を果たし、ＦＩＩ、ＦＶ、及びＦＸを含むプロトロンビン複合体のいずれかの早期活性化を防止し、又は、例えばテナーゼ複合体活性化（ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ）若しくはＦＸＩＩＩ活性化などの任意の他のＣａ２＋依存性プロセスを防止する。
【０１４４】
「濃縮フィブリノーゲン」は、血中又は血漿中のフィブリノーゲン濃度よりも高いフィブリノーゲン濃度に関する（１ｍＬ当たりフィブリノーゲン約２〜４ｍｇ超、最高で１ｍＬ当たりフィブリノーゲン約２００ｍｇ）。濃縮フィブリノーゲンは、例えば、約２０〜４０ｍｇ／ｍＬ、約１５〜４０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜２００ｍｇ／ｍＬ、１０〜１５０ｍｇ／ｍＬ、２０〜１５０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、又は約２５〜１２０ｍｇ／ｍＬの濃度のフィブリノーゲンを含む。濃縮フィブリノーゲンは、例えば哺乳類由来（例えばヒト血漿又はブタ血漿）など、任意の由来で調製することができ、又は遺伝子組換えで調製することができる。いくつかの実施形態において、濃縮フィブリノーゲンはクリオプレシピテートである。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、このフィブリノーゲンは血漿が追加されており、例えば、濃縮フィブリノーゲン調製物と血漿供給源とが、約３：１〜約１：３（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、若しくはｗ／ｗ）、又は約２：１〜約１：２（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、若しくはｗ／ｗ）、又は約１：１（ｗ／ｖ、ｖ／ｖ、若しくはｗ／ｗ）の比で混合される。「血漿供給源」は、分画による血漿、蓄積血漿、クリオ除去血漿（cryo-poor plasma）、回収血漿（recovered plasma）、及び、血漿分離交換法により採取されたヒト血液の液体部分である血漿であり得る。一実施形態において、この血漿は、トロンビン除去及び／又は因子除去された血漿である。
【０１４６】
一実施形態において、この混合液は、混合液中に小分子の阻害物質を含めることによって安定化され、例えば、可逆性セリンプロテアーゼ活性部位阻害物質（アルギニン、リシン、ベンザミジン、又はこれらの組み合わせなど）、及び／又は、カルシウムキレート剤（例えばクエン酸イオン、シュウ酸イオン（例えば５〜２５ｍＭの濃度）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、又はこれらのカルシウムキレート剤の組み合わせ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、カルシウムキレート剤は、例えばクエン酸ナトリウムにより供給されるクエン酸イオンである。いくつかの実施形態において、混合液は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、又は５ｍＭ〜約２５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、混合液は、約０．１ｍＭ〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含む。いくつかの実施形態において、混合液は、約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）のアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、混合液は、約０．１％〜約５％（ｗ／ｖ）のリシンを含む。いくつかの実施形態において、混合液は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭのベンザミジンを含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、この混合液中の小分子の阻害物質は、１〜２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＣｉｔｒａｔｅ、及び１％（ｗ／ｖ）のアルギニン塩酸塩を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、樹脂床は、４０〜５０ｍＭ  ＣａＣｌ２で事前に平衡化される。したがって、一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させた後、混合液中のＣａＣｌ２濃度は、少なくとも９０％の緩衝液交換効率に基づいて、３５〜４５ｍＭの範囲である。
【０１４９】
別の実施形態において、混合液を樹脂床に通過させた後、混合液中の阻害物質（複数可）の濃度は、混合液の初期濃度と比べて１０％未満に低減され、例えば、０．１〜０．２ｍＭ未満のＥＤＴＡ、１ｍＭのＮａＣｉｔｒａｔｅ、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアルギニン塩酸塩となる。
【０１５０】
一実施形態において、本明細書で言及されている、混合液を樹脂床に通過させた後の他の小分子の可逆性阻害物質（複数可）の濃度は、混合液の初期濃度と比べて、１０％未満に低減される。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、混合液は、フィブリノーゲンと、少なくとも第ＩＩ因子、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子を含むビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体と、少なくとも１つのビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体の少なくとも１つの小分子の可逆性阻害物質とを含み、この混合液は、追加の不可逆性トロンビン阻害物質を含まない。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、混合液はカルシウムを含まず、かつ、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子及び所望により第Ｘ因子を含む。
【０１５３】
フィブリノーゲンは、初期血液組成物から調製することができる。血液組成物は、全血液、又は血液の一部、すなわち、血漿のような全血液の産物であり得る。フィブリノーゲンは、自家物、蓄積血漿を含むヒト供給源、又は非ヒトの供給源であり得る。また、フィブリノーゲンは遺伝子組換え方法によって調製することも可能であり、又は、化学的に修飾することも可能である。
【０１５４】
本発明の一実施形態において、フィブリノーゲン溶液は、血漿由来のタンパク質溶液である生物学的有効成分（ＢＡＣ）から構成され、これは、トラネキサム酸などの抗線維素溶解薬剤、及び／若しくはアルギニン、リシン、これらの製薬上許容される塩などの安定剤、又はこれらの混合物を更に含み得る。ＢＡＣは、クリオプレシピテート、特に濃縮クリオプレシピテート由来であり得る。
【０１５５】
用語「クリオプレシピテート」は、全血より調製した凍結血漿から得られ得る血液成分のことを指す。クリオプレシピテートは、凍結血漿を低温、通常は０〜４℃の温度で解凍すると、フィブリノーゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含む沈殿物が形成されることで得ることができる。沈殿物は、例えば、遠心分離によって収集し、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのグリシン、９５ｍＭのアルギニン塩酸塩を含む緩衝液などの好適な緩衝液に溶解することができる。ＢＡＣの溶液は、例えば、米国第６，１２１，２３２号及び国際公開第９８３３５３３号に記載されるように、例えば、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチン等の追加の因子を含み得る。ＢＡＣの組成は、トラネキサム酸及びアルギニン塩酸塩などの安定剤を含み得る。ＢＡＣの溶液中のトラネキサム酸の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬであり得る。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、クリオプレシピテートは、第ＶＩＩＩ因子が除去されたクリオプレシピテートである。
【０１５７】
別の実施形態において、ＢＡＣ組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度を、例えば、米国特許第７，１２５，５６９号、欧州特許第１，３９０，４８５号、及び国際特許出願公開０２０９５０１９号に述べられるような方法を用いて、１５μｇ／ｍＬ以下、例えば５μｇ／ｍＬ以下のプラスミノーゲンにまで低下させる。本発明の別の実施形態において、ＢＡＣ組成物中のプラスミノーゲン及びプラスミンの濃度が低減されているとき、この組成物は、トラネキサム酸又はアプロチニンを含まない。
【０１５８】
フィブリノーゲン溶液は、ＢＡＣ２成分（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標））又は任意の他のフィブリノーゲン含有溶液であってよく、例えば、精製された遺伝子組換えフィブリノーゲン、又は血漿から製造されたクリオプレシピテートであり得る。
【０１５９】
一実施形態において、酵素前駆体及びフィブリノーゲンを含む混合液が、多孔性樹脂が充填されたベッセルを通過する。混合液中の酵素前駆体及びフィブリノーゲンは、大きすぎて樹脂の孔に入ることができず、ベッセルを迅速に通過する。一方、混合液中の小分子（例えば阻害性小分子）は、樹脂の孔に出入りすることができるため、より蛇行した経路をたどり、よって樹脂床を通過する移動速度が大幅に遅くなる。樹脂は、例えばリン脂質、セファリン及び／又は二価の陽イオン（例えばカルシウム陽イオン）などの小分子の誘発物質で事前に平衡化することができる。樹脂を事前に平衡化するのに用いられるこれらの誘発物質は、大幅な「ヘッドスタート」を利用し、これによって、酵素前駆体及びフィブリノーゲンと一緒に樹脂から出る。
【０１６０】
この実施形態において、用語「誘発物質」は、酵素前駆体の活性な酵素への変換を開始、促進及び／又は加速する薬剤を指す。本明細書において、用語「誘発物質」は、用語「開始物質」及び「賦活物質」と互換可能である。
【０１６１】
一実施形態において、樹脂は、例えばシリカなどの凝固経路を活性化させることが知られる物質からなるビーズを含み得、かつ／又は、樹脂ビーズは、例えばリン脂質などの凝固経路を促進、加速し得る、及び／又は活性化させ得る分子に共有結合することができる。一実施形態において、上述のビーズの合計体積は（樹脂床全体の体積に対して）、最大１０％（ｖ／ｖ）である。
【０１６２】
第２の例は、フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーと、可逆性フィブリン重合遮断薬（本明細書において「阻害物質」と呼ばれる）（例えばＧＰＲＰペプチド）とを含む混合液に関する。一実施形態において、混合液のｐＨは中性であり、例えば、ｐＨ約６〜８、又はｐＨ約６．５〜７．５、又はｐＨ約６．７〜７．２である。この結果、フィブリンモノマー及び／又はオリゴマーに対して、約３４０モル過剰を超えるＧＰＲＰペプチドの濃度が、重合を防止するのに効果的であったことを示す。したがって、一実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーに対して、約３４０モル過剰を超える量で、混合液中に存在する。
【０１６３】
一実施形態において、そのような液体混合液は、約２０、２１、２２、２３、２４、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、少なくとも１４日間安定である。
【０１６４】
理論に束縛されるものではないが、ＧＰＲＰペプチドはフィブリン分子に結合することができ、これにより連結と重合を阻止する。
【０１６５】
可逆性フィブリン重合遮断薬は、大きさが約１，０００ダルトン未満の薬剤であり得る（本明細書において「小分子」として定義）。いくつかの実施形態において、この薬剤は、分離ペプチド、その誘導体又は塩であり、これは、フィブリン分子と可逆的に結合することができ、フィブリン重合を防止する又は遅延させる。いくつかの実施形態において、可逆性フィブリン重合遮断薬は、小化学分子又は分離ペプチドを含む。可逆性フィブリン重合遮断薬は、フィブリンに対して低い親和性を有する結合剤であり得、フィブリン重合に永久的な影響を与えない。よって、典型的に、混合液を樹脂床に通過させることによって、薬剤／阻害物質の濃度の減少、重合及び凝塊形成の開始及び／又は加速がもたらされる。
【０１６６】
「ＧＰＲＰペプチド」は、配列番号１に示す４つ以上の連続するアミノ酸配列のペプチドを意味し、具体的には配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを意味する。ＧＰＲＰペプチドは、テトラマー（ＧＰＲＰ、配列番号１）、その誘導体又は類似物を含み得る。ＧＰＲＰペプチドは、長さ４〜１２個のアミノ酸残基、又は４〜８個、好ましくは長さ４、５、６、７若しくは８個のアミノ酸であり得る。
【０１６７】
ＧＰＲＰペプチドのアミノ酸配列は、１つ若しくは２つ以上の置換、付加及び／又は欠損を有し得、これには、１つ又は２つ以上の非自然発生的なアミノ酸が含まれる。好ましくは、誘導体は、参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性、好ましくは本明細書に記載する参照配列に対して少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を示す。ペプチド誘導体は、ペプチドが、所望の活性、例えば、フィブリン重合の可逆的な阻害を維持する限り、ネイティブ配列に対する改変、例えば、欠失、付加、及び置換（一般的に、自然界では保存的）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏテトラペプチドアミノ酸配列を含む、ペプチド、その誘導体又は塩を含む。いくつかの実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するテトラペプチド、又はその誘導体若しくは塩である。いくつかの実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるテトラペプチド、又はその誘導体若しくは塩である。さまざまな実施形態において、用語「ＧＰＲＰペプチド」は、配列番号１〜配列番号４２（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、及び配列番号４２）又はその誘導体若しくは塩から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択されるペプチドを含む。さまざまな実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、配列番号１〜配列番号４２に示すアミノ酸配列又はその誘導体若しくは塩を含む。さまざまな実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、配列番号１〜配列番号４２から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド又はその誘導体若しくは塩からなる群から選択される。さまざまな実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、配列番号１〜配列番号４２から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド又はその誘導体若しくは塩からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、ＧＰＲＰペプチドアミドである。配列番号１〜４２に示す任意のペプチド配列が、ペプチドアミドであり得る。配列番号１〜４２に示す任意のペプチド配列のアミノ酸配列が、上記で定義されるように、１つ又は２つ以上の置換、付加及び／又は欠損を有し得る。一般的なアミノ酸の略称、組織名、及び化学式は当業者に周知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｄａｒｎｅｌｌ  Ｊａｍｅｓ編、Ｅ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋ��，Ｉｎｃ．１９８６、ｐ．５４）。
【０１６８】
この例のいくつかの実施形態において、混合液は、トロンビン活性化第ＸＩＩＩ因子（第ＸＩＩＩａ因子）を更に含む。そのような一実施形態において、混合液は、例えば、カルシウムの存在に依存する第ＸＩＩＩａ因子によるフィブリンの架橋を防ぐために、カルシウムキレート剤を更に含み得る。カルシウムキレート剤は、クエン酸イオン、シュウ酸イオン（例えば５〜２５ｍＭの濃度）、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、又はそのようなカルシウムキレート剤の組み合わせ）であり得る。さまざまな実施形態において、カルシウムキレート剤は、例えばクエン酸ナトリウムとして供給されるクエン酸イオンである。いくつかの実施形態において、混合液は、約１ｍＭ〜約５０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、混合液は、約０．１〜約２．５ｍＭのＥＤＴＡ及び／又はＥＧＴＡを含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーとＧＰＲＰペプチドとを含む混合液が、多孔性樹脂が充填されたベッセルを通過する。混合液中のフィブリン分子は、大きすぎて樹脂の孔に入ることができず、樹脂床を迅速に通過してデバイスから出る。一方、混合液中の小分子の阻害物質（例えばＧＰＲＰペプチド）は、樹脂の孔に出入りすることができるため、より蛇行した経路をたどり、よって樹脂床を通過する移動速度が大幅に遅くなる。
【０１７０】
一実施形態において、デバイスを通過した後の薬剤／阻害物質の濃度は、薬剤（例えばＧＰＲＰペプチド）の望ましい最終濃度で樹脂床を事前に平衡化することによって制御される。メカニズムに束縛されるものではないが、樹脂床内に一定濃度の薬剤を含めることにより、フィブリン重合又はフィブリン凝塊形成の速度を制御することができる。
【０１７１】
モノマー、ダイマー、及び／又はオリゴマーのフィブリンは、フィブリノーゲンを含む水溶液を、例えば、上述のように、フィブリノーゲンが開裂してフィブリンになる条件下で、トロンビン及び／又はトロンビン様酵素に接触させることにより、取得することができる。そのような酵素の例としては、バトロキソビンなどのフィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）を開裂させるヘビ毒酵素がある。そのような一実施形態において、フィブリンの調製は、フィブリン重合が阻害される条件下（例えば、ＧＰＲＰ又はその他の可逆性フィブリン重合遮断薬の存在下）で実施される。別の実施形態において、フィブリンは、重合を阻害する条件下で（例えば温度を下げることによる）フィブリノーゲンから得ることができ、後でＧＰＲＰペプチドが追加される。
【０１７２】
トロンビンは、溶液中で遊離していてよく、又はビーズ上に固定化されていてもよい。トロンビンがビーズ上に固定化されているとき、例えば、ビーズがバッチ形状又はカラム内にあり、フィブリノーゲン溶液がこのビーズを通過又はこれと接触し、結果として得られる混合液は、残留量のトロンビンを含み得る。いくつかの実施形態において、混合液はトロンビンを実質的に含まず、例えば、約１ＩＵ／ｍＬ未満のトロンビンを有する。一実施形態において、フィブリンを得るために使用するトロンビンは、ｐＨ６．８〜７．２の滅菌溶液であり、これは、高度に精製されたヒトトロンビンを含む。トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する、きわめて特異性の高いプロテアーゼである。トロンビン溶液は、ヒトトロンビン（８００〜１２００ＩＵ／ｍＬ）、塩化カルシウム、ヒトアルブミン、マンニトール、酢酸ナトリウム、及び注射用蒸留水を含み得る。一実施形態では、トロンビンは、例えば本明細書に援用する米国特許第５，１４３，８３８号に述べられるように、クリオ除去血漿からプロトロンビンをクロマトグラフィーにより精製した後、塩化カルシウムにより活性化することによって製造される。
【０１７３】
本発明に従って使用されるフィブリノーゲン及びトロンビン成分は、２液フィブリンシーラント構成成分の一部であり得る。この成分は、ヒト又は哺乳類の血漿から調製することができる。しかしながら、上記各成分は、組換え法によって調製することも可能である。
【０１７４】
一実施形態において、混合液は、アルギニン（例えばアルギニン塩酸塩）を最高４％（ｗ／ｖ）の濃度で更に含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、液体混合液は、１〜１３％（ｗ／ｖ）の濃度のフィブリンと、ＧＰＲＰペプチド又はその他の可逆性フィブリン重合遮断薬とを含み、ここにおいて遮断薬又はＧＰＲＰは、フィブリンに対して１００倍モル過剰を超える量で混合液中に存在する。さまざまな実施形態において、フィブリンは、１〜１３％（ｗ／ｖ）の濃度で混合液中に存在する。さまざまな実施形態において、フィブリンは、１〜４％（ｗ／ｖ）又は３．５〜１３％（ｗ／ｖ）の濃度で混合液中に存在する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、フィブリンに対して約３４０倍モル過剰を超える量で存在する。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、ＧＰＲＰペプチドは、フィブリンに対して約３４０〜４６０倍モル過剰の量で存在する。いくつかの実施形態において、混合液は、追加トロンビンを実質的に含まない。
【０１７８】
一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させることにより、フィブリンに関して、フィブリン重合遮断薬（例えばＧＰＲＰ）の濃度を減少させ、この比は３４０以下である。
【０１７９】
一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させることにより、フィブリンに対して、フィブリン重合遮断薬（例えばＧＰＲＰ）の濃度を減少させ、この比は１００以下、例えば１〜６０、例えば３、４、１１、１１．３、１７、２２．７、２３、３４、４５、５６．７、又は５７である。
【０１８０】
混合液を樹脂床と接触させた後、ＧＰＲＰの濃度は、意図された用途に応じて減少させることができる。典型的に、止血のためには、１分未満の凝固時間を得ることが有利である。一実施形態において、混合液を樹脂床に通過させることにより、混合液中のＧＰＲＰ濃度を、フィブリンに対して１００倍以下のモル過剰、又は３４倍以下のモル過剰まで減少させる。
【０１８１】
典型的に、移植片固定のためには、約１５分の凝固時間を得ることが有利である。一実施形態において、混合液中のＧＰＲＰ濃度を、フィブリンに対して１００倍以下のモル過剰、又は５６倍以下のモル過剰まで減少させる。
【０１８２】
他の除去又は希釈オプションとしては、樹脂床にＧＰＲＰ相補成分を追加することが挙げられる。樹脂床における相補成分は、本質的に親和性の方法であり得る。
【０１８３】
代替的又は追加的に、混合液中のＧＰＲＰは、ペプチド添加により中和及び／又は遮断され、例えば、ＧＰＲＰペプチドの相補成分、又はＧＰＲＰを置換することができる抗体が、フィブリンに結合する。
【０１８４】
第３の例は、例えば米国特許第８，３６７，８０２号に記述されているように、酸性媒体中にフィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーを含む混合液に関する。
【０１８５】
そのような一実施形態において、混合液は低ｐＨにより安定化され、阻害性小分子は、例えばヒドロニウムイオン（Ｈ３Ｏ＋）である。小分子の濃度は、本発明によるデバイス／システムを用いることにより、上述のように減少させることができる。代替的又は追加的に、本発明によるデバイス／システムを用いることにより、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）の濃度を増加させて、酸性ヒドロニウムイオンを中和することができる。
【０１８６】
図３は、本発明によるデバイスを用いることによる、フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するための代表的な一例のフローチャートであり、このデバイスは、混合液（例えば、安定な混合液、及び／又は、（ｉ）フィブリンモノマー、ダイマー及び／若しくはオリゴマー、又は（ｉｉ）フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む混合液）を含む。
【０１８７】
「表面」とは、凝塊を形成したい位置又は場所のことである。表面は、シーラントの用途に応じて異なる。フィブリンシーラントは、例えば、止血、組織固定、移植片固定、創傷治癒及び吻合に使用することができる。表面は、損傷表面であってよい。表面は、被験者の出血性又は非出血性部位であってよい。表面はまた、身体外の作業面であってよい。本明細書に開示されるデバイス、システム、方法、及びキットは、組織及び臓器移植片固定のためのフィブリンシーラントの送達、血管手術において止血提供を含む外科的創傷のシール、並びに、動脈、胃腸、及び気管の吻合などの吻合のために、体内及び体外で使用することができる。
【０１８８】
表面は、裸眼視力で見ることができる皮膚の外側表面、及び生物の内部構造の一部である内部身体部分の表面を指す。外側表面には、顔、のど、頭皮、胸、背中、耳、頸、手、肘、臀部、膝の皮膚、及びその他の皮膚部位が挙げられるが、これらに限定されない。内部身体部分の表面には、外部環境に曝されている体腔又は解剖学的開口部、外鼻孔、唇、耳、性器領域（子宮、膣及び卵巣を含む）、肺、肛門、脾臓、肝臓、及び心筋などの内部臓器が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
キットは、本発明によるデバイス／キットを形成するように組み立て可能な別個の要素として提供され得る。一実施形態において、樹脂を別個に提供し、次いで、使用される液体混合液の組成により示される要件に従って、ベッセル内に充填及び／又は平衡化させる。
【０１９０】
デバイスの組み立てのために、樹脂ビーズは、湿潤の事前に平衡化された粒子、又は乾燥粒子として提供することができる。後者の実施形態において、キットは平衡化緩衝液を含み、樹脂床は、緩衝液をデバイスに通過させることにより、樹脂床の３〜６倍量（例えば５倍量）の緩衝液で平衡化させることができる。
【０１９１】
一実施形態において、フィブリン混合液、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子混合液、及び／又は樹脂床の液相は、固体形状で提供され、デバイス／システムの組み立て前に水溶液に還元される。したがって、キットは、還元のための水溶液を備えた少なくとも１つの容器を含む。好適な容器として、例えば、アンプル、バイアル、シリンジ、及び試験管が挙げられる。容器は、例えば、ガラス、金属又はプラスチックで作製することができる。キットは、使用説明書を含んでもよい。
【０１９２】
フィブリン混合液又はフィブリノーゲン及び第ＩＩ因子混合液の還元は、さまざまな量の製薬上許容される担体を添加することによって実施することができる。樹脂床の液相の還元は、本明細書に記述される小分子溶質を含む溶液中で実施することができる。
【０１９３】
用語「還元」は、固体を液体状に転換するプロセスのことを指す。還元された製品は、予め液体を除去した乾燥固体に水性の液体を加えることによって調製される液体製品であってよい。
【０１９４】
あるいは、フィブリン混合液、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子混合液、及び／又は樹脂床の液相は、凍結形状（例えば−１８℃以下の温度）で提供することができ、デバイス／システムの組み立て前に融かすことができる。
【０１９５】
用語「製薬上許容される担体」は、ヒト又は他の動物における使用に適した任意の希釈剤又は溶媒のことを指す。担体は、これらに限定されるものではないが、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、生理食塩水、塩化ナトリウム溶液、塩化カルシウム溶液、乳酸リンゲル（ＬＲ）、通常の生理食塩水中の５％デキストロース溶液、及び注射用蒸留水などの当該技術分野では周知の任意の担体から選択することができる。
【０１９６】
一実施形態において、この方法は、混合液１９０を樹脂床１６０に通過させる工程を含む。工程１において、液体混合液が、例えば安定な混合液として容器（例えばシリンジ筒１２４）内に提供される。工程２において、容器（例えば１２４）の内部が、ベッセル１５８の内部と流体連通するよう、かつ／又は樹脂床１６０と連通するように配置される。
【０１９７】
非限定的な一例において、ベッセル１５８の近位側のメスポートが、カバー又はシールされており、工程２において、（ｉ）このカバー又はシールが除去され、（ｉｉ）シリンジ筒１２４の遠位側先端１２６が近位側のメスポート（例えばソケット１２８）に挿入され、これにより、シリンジ筒１２４とベッセル１５８のそれぞれの内側が、互いに流体連通状態になる。例えば、シリンジ筒１２４及びベッセル１５８は互いに取り付け可能（例えば、着脱自在に取り付け可能）であってよく、工程２において互いに取り付けることができる。工程３において、液体混合液は容器（例えばシリンジ筒）から放出され、力がかかって樹脂床１６０を通過させる。樹脂床１６０を通過させることで、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊形成をもたらす。
【０１９８】
遠位側ポート１９４を通って樹脂床を通過した後（例えばベッセル１５８を出る）、フィブリンシーラントを表面（例えば手術部位の表面）に適用することができる（工程４）。
【０１９９】
遠位側ポート１９４は、適用先端に取り付けることができ、これを通ってフィブリンシーラントが表面に送達され得る。
【０２００】
本発明によるデバイスは、（例えば適用する混合液に応じて）好適な事前に平衡化された緩衝液で洗った後、もう一度混合液を通過させるのに使用することができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、容器（例えばシリンジ筒１２４）及び／又はベッセル１５８は、さまざまな量、及び混合液：樹脂比の関係を可能にするように、可変寸法であり得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、顕著な緩衝液交換により、大半の小分子の除去と、他の小分子での置換が行われる場合、充填された樹脂床は、約６０〜７０％（ｖ／ｖ）の固体材料からなり、残りの３０〜４０％（ｖ／ｖ）は小分子溶質を含む溶液からなる。いくつかの実施形態において、樹脂床を通過する前の液体混合液の体積は、樹脂床の液相の体積に実質的に等しい。典型的に、小分子は、タンパク質を含むある量の液体混合液１９０が上述のようにデバイスに通されるときに、置換及び交換される。よって、タンパク質溶液が、樹脂床１６０を通過する前に、またタンパク質組成が若干変化するか又は無変化である時、実質的に同程度の量を有するデバイスから押し出され、一方、溶質／小分子は、樹脂を通過する際に交換される。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、樹脂は緩衝液で事前に平衡化される。この緩衝液は、酵素前駆体（例えば第ＩＩ因子）の活性化実現を支援するような性質のものであってよく、例えば、ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体及びフィブリノーゲンを含む混合液中で、トロンビン生成を引き起こす。一実施形態において、ベッセル１５８内の緩衝液は、例えば濃度範囲約８〜３０ｍＭで塩化カルシウムとして提供されるカルシウムイオン、リン脂質、セファリン、及びこれらの組み合わせを含む。
【０２０４】
一実施形態において、樹脂は、例えばシリカなどの凝固経路を活性化させることが知られる物質からなるビーズを含み、かつ／又は、樹脂ビーズは、例えばリン脂質などの凝固経路を促進、加速し得る、及び／又は活性化し得る分子に共有結合する。一実施形態において、上述のビーズの合計分画は、最大１０％（ｖ／ｖ）である。
【０２０５】
別の実施形態において、デバイスは、阻害性フィブリン重合遮断薬により安定化された、モノマー、ダイマー、及び／又はオリゴマーのフィブリンを含む、混合液１９０と共に使用される。一実施形態において、デバイス内の平衡化緩衝液は、ＣａＣｌ２、アルギニン、及び固定濃度の阻害性薬剤（例えばＧＰＲＰ）、これらの塩又は誘導体を、０〜２０ｍＭ、又は０．１〜５ｍＭ、又は１〜３ｍＭの範囲の濃度で含む。典型的に、「ゲル濾過」又は「緩衝液交換」は、固相（デバイス内の樹脂）がきわめて多孔性であるクロマトグラフィーのモードである。タンパク質などの大きな分子は、大きすぎて孔の中に入り込むことができない。一方、小分子の阻害物質は、結果として大幅に遅れ、樹脂に事前に平衡化されている小分子（例えばカルシウムイオン）に効果的に交換される。重大なこととして、タンパク質成分をデバイスに追加することができ、これはデバイスから迅速に排出されるが、タンパク質は典型的に、この方法により混合液から除去されない。一実施形態において、このデバイスを使用することにより、タンパク質を伴った高濃度のフィブリノーゲンを含む混合液の適用が可能になる。一実施形態において、混合液は、例えば第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ビトロネクチン、及びその他などの血漿タンパク質を含む。
【０２０６】
数値はすべて、＋／−１０％を含むことを意図する。
【０２０７】
数値の前に用語「約」が記載されている場合、用語「約」は、＋／−１０％を示すことを意図する。
【０２０８】
デバイスのいくつかの実施形態が記述される。
【実施例】
【０２０９】
実施例１及び２において、市販のゲル濾過スピンカラム（使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム、製品コード：１７−０８５１−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））を使用して、単成分フィブリンシーラント液体混合液に、緩衝液交換を使用して小分子の阻害物質（複数可）を除去し、かつ／又は小分子の賦活物質（複数可）を追加することにより、フィブリンシーラントを生成する、コンセプトを証明した。このカラムは、タンパク質の損失なしに小分子を交換する高効率カラムであることがメーカーにより保証されていたため、使用された（小分子交換９０％超）。典型的に、混合液が、事前に平衡化された脱塩カラムを通過するとき、効果的な緩衝液交換により、少なくとも濃度９０％の事前に平衡化された緩衝液を含む混合溶離液（例えば、カラムを通過した後に得られる混合液）がもたらされ、かつ／又は、混合液中の小分子の阻害物質濃度が、その混合液中の初期濃度と比較して１０％未満に減少している混合溶離液がもたらされる。
【０２１０】
しかしながら、このカラム及び他の周知のカラムは、長くて細い（この場合、高さ：幅の比は３を超える）。混合液をこのカラムに通過させるためには、長い処理時間（重力を利用する場合）又はかなりの力（例えば遠心力を用いる）のいずれかが必要になる。このカラムは典型的に、手持ちデバイス（例えばシリンジ）には適合しない。メカニズムに束縛されるものではないが、本発明のデバイスは、幾何学的に分配された樹脂床を含み、これにより、人間の親指筋力により印加される力で操作することができ、しかも効果的な緩衝液交換を提供することができる。
【０２１１】
市販のカラムを下記の実験で使用するとき、２．５ｍＬの液体混合液を通過させた。市販のカラムは、メーカーの使用説明書に従って準備及び平衡化が行われた。樹脂床の体積（メーカー提供値）は８．３ｍＬであった（本明細書において「樹脂床」と称する）。液体混合液の体積は、樹脂床の体積の３０．１％であった。
【０２１２】
使い捨てＰＤ−１０脱塩カラムに使用した樹脂は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｍｅｄｉｕｍ（製品コード：１７−００３３−０１；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））と同じものであり、これは次の特性を備えている：マトリックス：架橋デキストラン、分離メカニズム：サイズによる、湿潤粒子サイズ範囲：３８〜２３５μｍ、乾燥粒子サイズ：＞５０μｍ、排除限界（Ｍｒ）：５０００、化学的安定性：すべて一般的に使用されている緩衝液、使用ｐＨ範囲：２〜１３。
【０２１３】
下記の実施例すべてにおいて、混合液は、樹脂床の通過時に、２２〜３７℃の温度範囲、及びｐＨ約７．０であった。
【０２１４】
実施例１：ゲル濾過カラムを用いた、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液からのフィブリン凝塊形成
下記の実施例の目的は、フィブリン凝塊形成の開始及び／又は加速が、小分子（複数可）の濃度を変えることにより達成可能であることを示すことである。この目的のため、プロトロンビン濃度（第ＩＩ因子）（血漿と比較）により測定された、ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体の５倍濃縮抽出物を、当該技術分野の記述に従って調製した（「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅ」、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ、Ｎｅｉｌ  Ｇｏｓｓ、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｒｌｉｎｇ．２０１３  Ｗｉｌｅｙ  Ｐｒｅｓｓ）。この抽出物（ＰＰＳＢ濃縮）は、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子、並びに補因子の第Ｖ因子と、この方法により共溶出される追加タンパク質とを含んでいた。
【０２１５】
簡潔に述べると、濃縮ＰＰＳＢは、クリオ除去ヒト血漿をＤＥＡＥ陰イオン交換カラムに搭載し、濃い塩溶液（例えば０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）（これは１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ＮａＣｉｔｒａｔｅ）も含む）で溶出させることによって製造した。ＰＰＳＢは、プロトロンビン濃度（第ＩＩ因子）によって測定した場合、血漿の４〜１６倍に濃縮された。
【０２１６】
混合液は、典型的に陰イオン交換カラムに結合するビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体（例えばＦＶＩＩ、ＦＩＸ、タンパク質Ｃ及びタンパク質Ｓ、並びにＦＸ）、それらに関連する酵素前駆体補因子（ＦＶ及びＦＶＩＩＩ）、並びに共溶出される任意の他のタンパク質の、すべてを含んでいた。
【０２１７】
ビタミンＫ依存性凝固酵素前駆体阻害物質（例えばＮａＣｉｔｒａｔｅ、ＥＤＴＡ）は、カルシウムイオンをキレート化する役割を果たし、ＦＩＩ、ＦＶ、及びＦＸを含むプロトロンビン複合体のいずれかの早期活性化を防止し、又は、例えばテナーゼ複合体活性化（ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ）若しくはＦＸＩＩＩ活性化などの任意の他のＣａ２＋依存性プロセスを防止した。
【０２１８】
この抽出物を、１対１の体積比で、濃縮フィブリノーゲン溶液（ＢＡＣ２成分、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラント由来のフィブリノーゲンを含む成分）と混合し、最終的に約３．５％（ｗ／ｖ）のフィブリノーゲン、フィブリノーゲン１ｍｇ当たり約０．１４国際単位（ＩＵ）の第ＩＩ因子を得た。この混合液に含まれる小分子の阻害物質は、１〜２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＣｉｔｒａｔｅ、及び１％（ｗ／ｖ）のアルギニン塩酸塩であった。
【０２１９】
これらの小分子の阻害物質を効率的に除去し、カルシウムイオン誘発物質を追加するために、選択されたタンパク質混合液中の小分子（緩衝液）成分の９０％を効率的に置換すると特性付けられている、市販の緩衝液交換スピンカラム（使い捨てＰＤ−１０脱塩カラム、製品コード：１７−０８５１−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。カラムは、ＣａＣｌ２（４０〜５０ｍＭ）、又はカルシウムを含まない緩衝液で事前に平衡化した。
【０２２０】
混合液は、メーカーの使用説明書に従って、緩衝液交換手順を行った。凝塊形成は、緩衝液交換を行った抽出物が入った試験管を倒置することによって評価された。
【０２２１】
その結果、ＣａＣｌ２で事前に平衡化されたカラムを通過した混合液は３０分以内に自発的に凝固したが（図４Ａ）、ＣａＣｌ２を含まない緩衝液を通過させた溶液は、数日経っても凝固しなかった（図４Ｂ）。
【０２２２】
フィブリン凝塊形成はまた、小分子の阻害物質を除去することなく、また緩衝液交換技法を使用せずに、試験管中の同じ混合液にＣａＣｌ２を直接添加することによっても試験された。凝固までの時間は、１２０分超であった。
【０２２３】
この実験は、専用デバイスで緩衝液交換技法を用いることが、安定な液体混合液からフィブリン凝塊形成を開始及び／又は促進するのに使用し得ることを示している。
【０２２４】
実施例２：ゲル濾過カラムを用いた、フィブリン及びＧＰＲＰを含む液体混合液からのフィブリン凝塊形成
下記の実施例の目的は、フィブリン凝塊形成の開始及び／又は加速が、小分子の阻害物質を除去することにより達成可能であることを示すことである。
【０２２５】
フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーは、下記のように生成された。
最初に、３．５％（ｗ／ｖ）のフィブリノーゲンと４０ｍＭのＧＰＲＰ［フィブリノーゲンに対して大きなモル過剰量（＞３５０）］の混合液が調製された。このモル比は、混合液を安定に維持するのに十分であることが見出された。
【０２２６】
ＧＰＲＰ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｓｉｇｍａによるカスタムメード、このペプチドは凍結乾燥形態で供給され（２５０ｍｇ）、１００ｍＭのクエン酸三ナトリウム無水物に溶かし、ｐＨ＝７で、１ＭのＧＰＲＰを生成した）。
【０２２７】
次にトロンビン（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）フィブリンシーラント中のものとして）を加えて、ＧＰＲＰの存在下で、フィブリノーゲンからフィブリンを生成した（最終濃度は１０ＩＵ／ｍＬ又は１００ＩＵ／ｍＬ）。実施例１で使用した市販のカラム（ＰＤ−１０）をまた使用して、ＧＰＲＰペプチドを除去した。カラムは、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０、２５ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液で事前に平衡化された。
【０２２８】
フィブリン濃度は、フィブリノーゲン濃度に等しいものとして推定された。
【０２２９】
２．５ｍＬの液体混合液に、緩衝液交換手順を行い、フィブリン凝塊形成が、緩衝液交換された混合物を含む試験管を倒置することによって評価された。
【０２３０】
残りの液体混合液を、２４時間、周辺温度（約２２〜２４℃）において維持し、ＧＰＲＰを除去しない状態で凝塊が形成されるかどうかを評価した。
【０２３１】
図５Ａは、ＧＰＲＰ阻害フィブリン溶液を示す。これには、緩衝液交換手順は行われず、試験条件下で試験時間中、液体形状のままであった。図５Ｂは、カラムを通過させ、ＧＰＲＰ阻害物質を除去した後の、重合した混合液を示す。
【０２３２】
この実験は、専用デバイスで緩衝液交換技法を用いることが、阻害物質を除去することによって、フィブリン凝塊形成を開始及び／又は促進するのに使用し得ることも示している。
【０２３３】
実施例３：フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液を本発明によるデバイスに通過させる効果
この実施例では、混合液中の小分子の濃度を変化させることにおける、本発明のデバイスの効率を、９０％超の効率であることが知られており、フィブリン凝塊形成において効率的であることが実施例１及び２で示された、市販のカラムと比較した。
【０２３４】
このために、市販のＧＥ  ＰＤ−１０緩衝液交換カラムを、本発明によるデバイスの２つの実施形態と比較した。これは、市販のカラムと同じ緩衝液交換樹脂（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｍｅｄｉｕｍ、製品コード：１７−００３３−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））を利用し、下記の樹脂床形状を有していた。
１．直径（幅）２５ｍｍ、高さ１３ｍｍ（樹脂床体積６．４ｍＬ）−高さ対幅の比は０．５２。
２．直径（幅）２５ｍｍ、高さ２５ｍｍ（樹脂床体積１２．３ｍＬ）−高さ対幅の比は１。
【０２３５】
図１に示すデバイスを、上記の樹脂床体積を収容するのに好適な、２つの異なるベッセル１５８寸法で組み立てた。フィルタ１５０、１７０は、カラム用の支持スクリーン（内径２６ｍｍ、製品コード：１８−９３７７−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｓｗｅｄｅｎ））で各面を支えたワットマン紙であった。一方の支持スクリーンは濾紙１５０の近位側にあり、もう一方は濾紙１７０の遠位側にあった。
【０２３６】
一般的な１０ｍＬシリンジ１２０を使用した。市販のカラムは、メーカーの使用説明書に従って準備及び平衡化が行われた。
【０２３７】
樹脂床は、５０ｍＭのＣａＣｌ２、２０ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅを含むｐＨ７．０の緩衝液の樹脂床体積の５倍量で、緩衝液をデバイスに５回通過させることによって、平衡化された。
【０２３８】
２．５倍濃縮（血漿に比較して）の酵素前駆体抽出物と、３．５％（ｗ／ｖ）フィブリノーゲン［５倍濃縮の酵素前駆体抽出物と、濃縮フィブリノーゲン溶液（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）ＢＡＣ２成分）とを、１対１の体積比で混合することにより調製した］とを含む混合液を、カラム（２．５ｍＬ）に通過させ、デバイス（２ｍＬ、又は４ｍＬを通過させて、緩衝液を交換し、フィブリン凝塊形成を開始させた。
【０２３９】
使用した混合液の体積は、樹脂床体積の３０〜３５％に等しかった。フィブリン凝塊形成は、混合液の流れの中断により評価した。
【０２４０】
フィブリン凝塊形成の時間は、このカラム及びデバイスで２５〜３０分であった。本発明によるデバイスを、事前に平衡化された緩衝液で洗浄した後、２回目に混合液を通過させるのに使用した場合、フィブリン凝塊を形成する時間の短縮が観察された。理論に束縛されるものではないが、液体を樹脂床に通過させると、圧縮を生じる。
【０２４１】
表１は、本発明によるデバイス及び市販のカラムを使用した後の、フィブリン凝塊形成の時間を示す。
【０２４２】
【表１】
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【０２４３】
上記の結果は、本発明のデバイスの効率は、試験された市販のカラムの効率と同等であることを示している。加えて、この結果は、樹脂床の圧縮がフィブリン凝塊形成の時間に影響することを示している。
【０２４４】
実施例４：フィブリン凝塊形成の速度に対するカルシウムイオン誘発物質濃度の影響
下記の実験では、実施例１に記述されている酵素前駆体（ＰＰＳＢ濃縮物）とフィブリノーゲンとを含む混合液（ＢＡＣ２から調製）におけるフィブリン凝塊形成を促進する誘発物質としての、カルシウムイオン濃度（ＣａＣｌ２濃度）範囲について調べた。この実施例において、血漿と比べて１０倍の濃度（１０ＩＵ  ＦＩＩ／ｍＬ）で酵素前駆体混合液が調製され、上述と同じフィブリノーゲン溶液（最終濃度が血漿と比べて５倍濃縮の酵素前駆体と、３．５％（ｗ／ｖ）のフィブリノーゲン）と、同じ体積比で混合した。ＥＤＴＡは用いなかった。この実験において、組織因子（出血／損傷表面に典型的に存在する凝固開始物質）とリン脂質（活性化血小板の表面に典型的に存在する凝固開始物質）とを含むカルシウム除去ＰＴ（プロトロンビン時間）試薬を用いて、凝塊形成の開始が実施された。組織因子とリン脂質の両方を使用することによって、出血表面がシミュレーションされた。増加濃度のＣａＣｌ２を混合液に追加し、Ｓｔａｒｔ４凝塊形成アナライザー（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を使用して、凝固時間を測定した。
【０２４５】
図６は、約８ｍＭ〜約３０ｍＭのＣａＣｌ２濃度で、迅速な凝塊形成（２０秒未満）が得られたことを示す。割り当てられたパラメーター（凝塊測定に割り当てられた最長時間：９９９秒）の範囲内で、カルシウム追加なしでは凝塊形成は観察されなかった。
【０２４６】
これらの結果は、混合液中のカルシウムイオン濃度を有利に増加させることで、凝固形成の速度が加速されることを示している。
【０２４７】
この結果はまた、樹脂床を所定のカルシウムイオン濃度で事前に平衡化させることを、フィブリン凝塊形成速度の制御方法として利用できることを示している。
【０２４８】
実施例５：混合液中の小分子ＧＰＲＰ阻害物質濃度を調節することにより、フィブリン凝塊形成の速度を制御
下記の実験では、ＧＰＲＰ阻害物質の濃度調節の、フィブリン凝塊形成速度に対する影響を試験した。異なる濃度（０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、及び５ｍＭ）のＧＰＲＰを、フィブリノーゲン含有溶液（固定濃度３％  ｗ／ｖ、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のＢＡＣ２成分を４０ｍＭクエン酸緩衝液で希釈することにより調製された）に加えた。
【０２４９】
これらのすべて（最大約５７：１の比を有する）が、フィブリンモノマーの長期安定性（例えば、少なくとも１４日間にわたって、約２０、２１、２２、２３、２４、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において）に必要な最小比を下回っていた。長期間の安定性を得るためには、ＧＰＲＰが混合液中に、フィブリンモノマーに対して１００倍を超えるモル過剰の量（例えばフィブリンモノマーに対して約３４０倍、又は約３４０〜４６０倍のモル過剰の量）で存在することが示された。
【０２５０】
フィブリンモノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーを生成するために、トロンビンンが混合液に添加された。ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）のトロンビンン成分の１０％体積を添加し、最終濃度１００国際単位／ｍＬ（ＩＵ／ｍＬ）を得た。フィブリン凝塊形成の速度は、試験管を倒置したときの混合液の流れの中断によって測定した。結果を表２に示す。
【０２５１】
【表２】
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【０２５２】
図７は、フィブリン重合とＧＰＲＰ濃度との間に対数相関関係が存在していることを示す。ＧＰＲＰ：フィブリンのモル比が３４０：１を超えると、１４日を超えても重合は観察されなかった（試験されたフィブリノーゲン濃度において、４０ｍＭ  ＧＰＲＰ）。
【０２５３】
この結果は、樹脂床を所定のＧＰＲＰ濃度で事前に平衡化させることを、フィブリン凝塊形成速度の制御方法として利用できることを示している。
【０２５４】
引用した参照文献は全て、それらの全体が参考として組み込まれる。参照文献の引用は、その参照が従来技術であることの容認を構成するものではない。
【０２５５】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１つ又は１つを超える（即ち、少なくとも１つ）の目的語たる物品を指すものとして使用される。例えば「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素又は１つを超える要素を意味する。
【０２５６】
用語「含む」は本明細書において、表現「含むが、これらに限定されない」を意味するために使用され、この表現と互換可能に使用される。用語「含む」は本明細書において、表現「含むが、これらに限定されない」を意味するために使用され、この表現と互換可能に使用される。用語「又は」は本明細書において、文脈により明確に別途示されている場合を除き、用語「及び／又は」を意味するために使用され、この用語と互換可能に使用される。用語「例えば」は本明細書において、表現「例えば〜が挙げられるが、これらに限定されない」を意味するために使用され、この表現と互換可能に使用される。本明細書において使用するとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含有する」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、整数、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、１つ又は２つ以上の追加的特徴、整数、工程、構成要素、又はこれらの群の追加を排除するものではない。これらの用語は、用語「〜からなる」、及び「〜から本質的になる」を包含する。
【０２５７】
本発明は、実施例によって提供され、発明の範囲を制限することを意図しない、その実施形態の「発明を実施するための形態」を使用して説明されてきた。説明した実施形態は、異なる特徴を備えるが、そのすべてが本発明の実施形態すべてで必須というわけではない。本発明のいくつかの実施形態は、特徴のいくつかのみ又は特徴の可能な組み合わせを使用する。説明される本発明の実施形態の変形、及び説明した実施形態で述べられた特徴の異なる組み合わせを含む本発明の実施形態は、当業者が思いつくものであろう。
【０２５８】
〔実施の態様〕
（１）  フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するためのデバイスであって、
ａ．筒（１２４）及びプランジャ（１２２）を含むシリンジ（１２０）であって、前記筒が、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、ある量の無細胞液体混合液（１９０）を含む、シリンジ（１２０）と、
ｂ．ベッセル（１５８）内に配置された樹脂床（１６０）であって、これにより、前記シリンジ筒の内部が前記樹脂床と流体連通しているときに、前記プランジャによる前記筒からの前記混合液の圧出により、前記混合液に力がかかって前記ベッセル内の前記樹脂床を通過させることで、（ｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度の減少、及び／又は（ｉｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度の増加をもたらし、
（Ａ）前記ベッセルを通過した後、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、
（Ｂ）前記阻害物質（複数可）及び前記誘発物質（複数可）が、小分子である、樹脂床（１６０）と、
を備える、デバイス。
（２）  前記液体混合液を前記樹脂床に通過させる前に、前記シリンジ筒中の前記液体混合液が、少なくとも２週間安定である、実施態様１に記載のデバイス。
（３）  前記樹脂床が充填床（packed bed）である、実施態様１又は２に記載のデバイス。
（４）  前記ベッセルの遠位端と流体連通可能な適用先端を更に備え、これにより、流体連通しているときに、前記フィブリンシーラントが、前記適用先端を通って前記表面に送達される、実施態様１〜３のいずれかに記載のデバイス。
（５）  前記筒と前記ベッセルとが互いに機械的に連結されており、これによりそれらのそれぞれの内部は、着脱可能なバリア、及び／又は（ｉ）隔膜、（ｉｉ）一方向フィルタ、（ｉｉｉ）バルブ、及び（ｉｖ）ストップコックのうち少なくとも１つによって分離されている、実施態様１〜４のいずれかに記載のデバイス。
【０２５９】
（６）  前記液体混合液を前記樹脂床に通過させるのに必要な力の大半が、人間の親指の筋力によってもたらされる、実施態様１〜５のいずれかに記載のデバイス。
（７）  （ｉ）前記凝固時間（ＴＣＬＯＴ）が、最長５０分、若しくは最長４０分、若しくは最長３０分、若しくは最長２０分、及び／又は（ｉｉ）少なくとも５秒、若しくは少なくとも１０秒、若しくは少なくとも３０秒、若しくは少なくとも１分、若しくは少なくとも５分、若しくは少なくとも１０分、若しくは少なくとも１５分である、実施態様１〜６のいずれかに記載のデバイス。
（８）  ｉ．前記樹脂床を通過する前の前記混合液中の３０ｋＤａ以上のタンパク質の濃度と、
ｉｉ．前記樹脂床を通過した後の前記フィブリンシーラント中の３０ｋＤａ以上のタンパク質の濃度と、
の比が、約１である、実施態様１〜７のいずれかに記載のデバイス。
（９）  前記フィブリンシーラントが、最長１分、又は最長４５秒、又は最長３０秒、又は最長１５秒、又は最長１０秒、又は最長５秒、又は最長３秒、又は最長１秒の保留時間後に、前記液体混合液から調製されるように構成された、実施態様１〜８のいずれかに記載のデバイス。
（１０）  前記筒からの前記液体混合液の圧出により、前記混合液に力がかかって、前記樹脂床の断面にわたって実質的に均一な様相で、前記樹脂床を通過させるように構成された、実施態様１〜９のいずれかに記載のデバイス。
【０２６０】
（１１）  前記デバイスが少なくとも１つのメッシュを含み、該メッシュは、前記樹脂床全体にわたって流れを分配し、かつ／又は前記床内に樹脂ビーズを保持するように構成されている、実施態様１〜１０のいずれかに記載のデバイス。
（１２）  前記樹脂床が前記ベッセル内にあり、これにより、前記液体混合液が、前記樹脂床に至る途中で、グリッドを通過し、次いで濾紙（１５０）を通過し、前記グリッドは、圧力印加中に機械的な支持を提供し、かつ前記濾紙全体にわたって流れを拡げるように構成されており、また前記濾紙は、前記樹脂床全体にわたって流れを分配し、かつ前記床内に樹脂ビーズを保持するように構成されている、実施態様１〜１１のいずれかに記載のデバイス。
（１３）  前記樹脂床の高さ（１６１）が、最大１０ｃｍ、又は最大７．５ｃｍ、又は最大５ｃｍ、又は最大２．５ｃｍ、又は最大２ｃｍ、又は最大１．５ｃｍ、又は最大１ｃｍである、実施態様１〜１２のいずれかに記載のデバイス。
（１４）  前記樹脂床の高さ（１６１）が、少なくとも０．５ｃｍである、実施態様１〜１３のいずれかに記載のデバイス。
（１５）  前記樹脂床の幅（１６２）が、最大５ｃｍ、又は最大２．５ｃｍ、又は最大１．３ｃｍである、実施態様１〜１４のいずれかに記載のデバイス。
【０２６１】
（１６）  前記樹脂床の高さ（１６１）とその特徴的幅（１６２）との比は、最大２．５、若しくは最大２、若しくは最大１．５、若しくは最大１、若しくは最大０．７５、及び／又は少なくとも０．５である、実施態様１〜１５のいずれかに記載のデバイス。
（１７）  前記シリンジ筒中の前記ある量の前記液体混合液が、少なくとも０．５ｍＬ、若しくは少なくとも１ｍＬ、及び／又は最大１５ｍＬ、若しくは最大１０ｍＬ、若しくは最大５ｍＬの体積を有する、実施態様１〜１６のいずれかに記載のデバイス。
（１８）  最長６０秒間にわたって前記プランジャに印加される、最大３０ニュートンの力は、最長６０秒の保留時間で、前記筒内に格納された前記液体混合液の大半に力をかけて前記樹脂床を通過させるのに十分であるように構成された、実施態様１〜１７のいずれかに記載のデバイス。
（１９）  前記樹脂床が、前記誘発物質（複数可）で事前に平衡化されている、実施態様１〜１８のいずれかに記載のデバイス。
（２０）  （ｉ）前記シリンジ筒中の前記液体混合液の体積と、（ｉｉ）前記樹脂床の体積との体積比が、約０．１〜約１０の範囲である、実施態様１〜１９のいずれかに記載のデバイス。
【０２６２】
（２１）  （ｉ）前記シリンジ筒中の前記液体混合液の体積と、（ｉｉ）前記樹脂床の体積との体積比が、約０．２〜約５の範囲である、実施態様１〜２０のいずれかに記載のデバイス。
（２２）  （ｉ）前記シリンジ筒中の前記液体混合液の体積と、（ｉｉ）前記樹脂床の体積との体積比が、約０．３〜約１の範囲である、実施態様１〜２１のいずれかに記載のデバイス。
（２３）  前記液体混合液が、フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む、実施態様１〜２２のいずれかに記載のデバイス。
（２４）  前記阻害物質（複数可）が、セリンプロテアーゼ活性部位阻害物質である、実施態様２３に記載のデバイス。
（２５）  前記阻害物質（複数可）が、カルシウムキレート剤である、実施態様２３又は２４に記載のデバイス。
【０２６３】
（２６）  前記誘発物質（複数可）が、リン脂質、セファリン及び／又は二価陽イオンである、実施態様２３〜２５のいずれかに記載のデバイス。
（２７）  前記液体混合液が、モノマー形態、ダイマー形態及び／又はオリゴマー形態のフィブリンを含む、実施態様１〜２２のいずれかに記載のデバイス。
（２８）  前記液体混合液が中性ｐＨに維持され、前記阻害物質が、ＧＰＲＰペプチド又は他の可逆性フィブリン重合遮断薬である、実施態様２７に記載のデバイス。
（２９）  前記液体混合液が酸性ｐＨに維持され、前記阻害物質が、ヒドロニウムイオン（Ｈ３Ｏ＋）である、実施態様２７に記載のデバイス。
（３０）  前記誘発物質（複数可）が、ヒドロキシルイオン（ＯＨ−）である、実施態様２９に記載のデバイス。
【０２６４】
（３１）  フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するためのシステムであって、
ａ．容器内に配置されたある量の無細胞液体混合液（１９０）であって、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、無細胞液体混合液（１９０）と、
ｂ．ベッセル（１５８）内に配置された樹脂床（１６０）であって、前記ベッセルは前記容器と流体連通可能であり、流体連通しているときに、前記混合液を前記ベッセルに通過させることにより、（ｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させ、これにより、前記混合液を前記ベッセルに通過させた後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、前記阻害物質（複数可）及び前記誘発物質（複数可）が小分子である、樹脂床（１６０）と、
を含む、システム。
（３２）  前記容器が、シリンジの筒（１２４）である、実施態様３１に記載のシステム。
（３３）  キットであって、
ａ．容器内に配置されたある量の無細胞液体混合液（１９０）であって、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、無細胞液体混合液（１９０）と、
ｂ．ベッセル（１５８）内に配置された樹脂床（１６０）であって、前記ベッセルは前記容器と流体連通可能であり、これにより、前記容器と前記ベッセルとが流体連通しているときに、前記混合液を前記ベッセルに通過させることにより、（ｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させ、これにより、前記混合液を前記ベッセルに通過させた後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成され、前記阻害物質（複数可）及び前記誘発物質（複数可）が小分子である、樹脂床（１６０）と、
を含む、キット。
（３４）  フィブリンシーラントを調製し、表面に送達するための方法であって、
ａ．ある量の無細胞液体混合液（１９０）を準備することであって、該ある量の無細胞液体混合液（１９０）が、
Ｉ．フィブリン、又は
ＩＩ．フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子
を含む、準備することと、
ｂ．前記混合液を樹脂床（１６０）に通過させることであって、そうすることにより、（ｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の阻害物質（複数可）の濃度を減少させ、かつ／又は（ｉｉ）前記混合液中のフィブリン凝塊形成の誘発物質（複数可）の濃度を増加させ、これにより、前記混合液の前記樹脂内通過後に、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される、通過させることと、を含み、前記阻害物質（複数可）及び前記誘発物質（複数可）が小分子である、方法。
（３５）  フィブリノーゲン及び第ＩＩ因子を含む液体混合液からフィブリンシーラントを生成するように構成されたデバイスであって、前記混合液は、前記デバイスのレザバー内に格納され、
（ｉ）前記デバイスは、詰まりの少ない、かつ閉塞の少ないデバイスとして動作し、
（ｉｉ）２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、最長約１時間の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される、デバイス。
【０２６５】
（３６）  フィブリン及び可逆性フィブリン重合遮断薬を含む液体混合液からフィブリンシーラントを生成するように構成されたデバイスであって、前記混合液は、前記デバイスのレザバー内に格納され、
（ｉ）前記液体混合液中のフィブリンは、モノマー、ダイマー及び／又はオリゴマーの形態であり、
（ｉｉ）前記デバイスは、詰まりの少ない、かつ閉塞の少ないデバイスとして動作し、
（ｉｉｉ）２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、及び２５℃からなる群から選択される周辺温度において、約５秒〜約１時間の範囲の凝固時間（ＴＣＬＯＴ）で、フィブリン凝塊が形成される、デバイス。
【図１Ａ】
0006479846.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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