(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルス株ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）、ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）、ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）、及びＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）からなる群から選択される、生物学的に純粋な細菌単離株。
【請求項２】
前記生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）である、請求項１に記載の生物学的に純粋な細菌単離株。
【請求項３】
前記生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）である、請求項１に記載の生物学的に純粋な細菌単離株。
【請求項４】
前記生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）である、請求項１に記載の生物学的に純粋な細菌単離株。
【請求項５】
前記生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）である、請求項１に記載の生物学的に純粋な細菌単離株。
【請求項６】
請求項１に記載の細菌単離株と許容可能な担体とを含む組成物。
【請求項７】
前記担体が農業的に許容可能な担体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記担体がプロバイオティクス投与に適している、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記担体が、清掃製品、ドレインクリーナー、生物学的消化槽、廃水処理における使用、又は廃水池、グリーストラップ、若しくは給排水設備における使用に適している、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が少なくとも一つの追加の細菌又は真菌を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも一つの追加の細菌が、バチルス種、クロストリジウム種、パスツリア種、シュードモナス種、及びアクチノミセス種からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも一つの追加の細菌が、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・アルベイ、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・アネウリノリティカス、バチルス・アンスラシス、バチルス・アクイマリス、バチルス・アトロファエウス、バチルス・ボロニフィルス、バチルス・ブレビス、バチルス・カルドリティクス、バチルス・セントロスポルス、バチルス・セレウス、バチルス・シルクランス、バチルス・コアグランス、バチルス・フィルムス、バチルス・フラビサーマス、バチルス・フシフォルミス、バチルス・グロビギ、バチルス・インフェルナス、バチルス・ラルバエ、バチルス・ラテロスポルス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・メセンテリカス、バチルス・ムシラギノサス、バチルス・ミコイデス、バチルス・ナットー、バチルス・パントテンチクス、バチルス・ポピリエ、バチルス・ポリミクサ、バチルス・シュードアンスラシス、バチルス・プミルス、バチルス・シュレゲリイ、バチルス・シンプレックス、バチルス・スファエリカス、バチルス・スポロサーモデュランス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブティリス、バチルス・サーモグルコシデイジアス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・ブルガリス、バチルス・ウェイヘンステファネンシス、バチルス・マセランス、バチルス・ブタノリボランス；ブラディリゾビウム、リゾビウム；クロストリジウム・サーモセラム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・ブチリカム；パスツリア・ペネトランス、パスツリア・ユーセジ、パスツリア・ニシザワエ、パスツリア・レニフォルミス；シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・クロロラフィス、シュードモナス・シリンガエ；ストレプトミセス・グリセオフルビン、ストレプトミセス・グリセオビリディス、ストレプトミセス・シンデネウシス、及びサッカロポリスポラ・スピノサからなる群から選択され、前記少なくとも一つの追加の真菌がメタリジウム・アニソプリエ、ボーベリア・バッシアナ、ペシロミセス・リラシヌス、トリコデルマ・リーゼイ、ファネロケーテ・クリソスポリウム、及びペニシリウム・ビライからなる群から選択されるか、又はグロムス属、アカウロスポラ属、エントロホスホラ属、ギガスポラ属、スクテロスポラ属、及びスクレロサイティス属からなる群から選択される属に由来する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の単離株と許容可能な担体とを混合して組成物を形成することを含む、請求項１に記載の細菌単離株を含む組成物を調製する方法。
【請求項１４】
植物増殖材料の成長を促進する方法であって、植物増殖材料を請求項１に記載の細菌単離株を含む組成物で被覆することを含み、前記細菌単離株で被覆されていない対応する対照植物増殖材料と比較して、前記植物増殖材料の成長が促進されている、植物増殖材料の成長を促進する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の細菌単離株を含む組成物を廃水に添加することを含む、廃水を処理する方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の細菌単離株を土壌又は水に適用することを含む、環境修復方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の細菌単離株と水産養殖業設備の水とを接触させることを含む、水産養殖業設備において水を処理する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす、２０１３年４月１７日付出願の米国仮出願第６１／８５４，０６２号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
一態様では、本発明は、新規なバチルス株ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）、ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）、ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）、及びＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）に関する。これらの株は、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）及びバチルス・ブタノリボランス（Bacillus butanolivorans）の両方と高度な相同性を有するが、予想外に所望の高耐塩性、また同様に低温成長及びウレアーゼ産生を呈する。別の態様では、本発明は、かかる株の少なくとも一つと許容可能な担体とを含む組成物に関する。かかる組成物は、工業、農業、水産養殖業、環境、廃水処理及び／又はプロバイオティクスの用途における使用に適している。
【背景技術】
【０００３】
バチルス（Bacillus）種は、複数の酵素を合成する能力及び環境適合能力のため、多くの商業用途に採用されている。これらの用途として、清掃製品；ドレインクリーナー；生物学的消化槽；廃水処理；廃液池、グリーストラップ、及び給排水設備における使用；農業設備及び水産養殖業設備；また同様に、プロバイオティクスの投与における活性が挙げられる。かかる使用において遭遇し得る材料及び環境条件の幅により、複数の酵素を産生し、幅広い範囲の環境条件に亘り成長可能な細菌株を所有することが望ましい。
【０００４】
バチルス種の中でも商業的有用性を有することが知られているのはバチルス・シンプレックスである。この種は、プロテアーゼ（タンパク質を分解する）、リパーゼ（脂質を分解する）、エステラーゼ（エステルを分解する）、及びアミラーゼ（デンプンを分解する）を産生することが知られている。非特許文献１によって記載されるように、Ｂ．シンプレックス（B. simplex）株は有用な温度範囲（成長は、２０℃及び３０℃で観察されるが、４５℃では観察されない）、ｐＨ（株はｐＨ９及びｐＨ７で「豊富に」成長するが、ｐＨ５において成長は「変動的」である）で成長し、多様な基質と反応する。しかしながら、非特許文献１は、「７％ＮａＣｌで補足された培地中で成長は起こらなかった」と教示し、ウレアーゼ産生は「陰性」であることを教示する。上記に引用される非特許文献１の１２９頁を参照されたい。
【０００５】
また、かかる高塩濃度での成長能力の欠如は、他のＢ．シンプレックス株についても報告されている。例えば、非特許文献２は、バチルス・シンプレックスＴＷＷ−０４の凍結試料が、５ｍＭ  ＮａＣｌにおいてわずかな成長を示し、一方、３６ヶ月間継代培養した試料はかかる条件下で何らの成長も示さなかったことを開示している。
【０００６】
バチルス・ブタノリボランスは、Ｂ．シンプレックスと密接に関連し（バチルス・シンプレックスＤＳＭ  １３２１と９８．３％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ相同性を有する）、リトアニアの土壌から単離された。Ｂ．ブタノリボランス（B. butanolivorans）は、工場廃水流に存在するｎ−ブタノールを分解するのに特に有効である。非特許文献３を参照されたい。しかしながら、Ｂ．シンプレックスと同様、Ｂ．ブタノリボランスは高塩（例えば、７％ｗ／ｖ）環境において成長しない。上記に引用される非特許文献３を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Heyrman et al. (2005, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 55: 119-131)
【非特許文献２】Gomaa et al. (2007, Arab J. Biotech. 10(1): 107-116)
【非特許文献３】Kuisiene et al. 2008, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58: 505-509
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、高塩環境で成長し、ウレアーゼ活性を含む所望の酵素活性を呈するバチルス株が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、バチルス（Bacillus）株ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）、ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）、ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）、及びＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）からなる群から選択される細菌の全ての識別特性を有する、生物学的に純粋な細菌単離株に関する。
【００１０】
一実施の形態では、生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）である。別の実施の形態では、生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）である。別の実施の形態では、生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）である。更なる実施の形態では、生物学的に純粋な細菌単離株がバチルス株ＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）である。
【００１１】
本発明は、上述の細菌単離株のいずれかと許容可能な担体とを含む組成物を更に提供する。いくつかの実施の形態では、担体が農業的に許容可能な担体である。いくつかの実施の形態では、担体がプロバイオティクス投与に適している。更なる実施の形態では、担体が、清掃製品、ドレインクリーナー、生物学的消化槽、廃水処理における使用、又は廃水池、グリーストラップ、若しくは給排水設備における使用に適している。
【００１２】
いくつかの実施の形態では、上記組成物が少なくとも一つの追加の細菌又は真菌を含む。いくつかの実施の形態では、少なくとも一つの追加の細菌が、バチルス種、クロストリジウム（Clostridium）種、パスツリア（Pasteuria）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、及びアクチノミセス（Actinomycetes）種からなる群から選択される。他の実施の形態では、少なくとも一つの追加の細菌が、バチルス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）、バチルス・アルベイ（Bacillus alvei）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・アネウリノリティカス（Bacillus aneurinolyticus）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・アクイマリス（Bacillus aquimaris）、バチルス・アトロファエウス（Bacillus atrophaeus）、バチルス・ボロニフィルス（Bacillus boroniphilus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・カルドリティクス（Bacillus caldolyticus）、バチルス・セントロスポルス（Bacillus centrosporus）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・シルクランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus）、バチルス・フラビサーマス（Bacillus flavothermus）、バチルス・フシフォルミス（Bacillus fusiformis）、バチルス・グロビギ（Bacillus globigii）、バチルス・インフェルナス（Bacillus infernus）、バチルス・ラルバエ（Bacillus larvae）、バチルス・ラテロスポルス（Bacillus laterosporus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・メセンテリカス（Bacillus mesentericus）、バチルス・ムシラギノサス（Bacillus mucilaginosus）、バチルス・ミコイデス（Bacillus mycoides）、バチルス・ナットー（Bacillus natto）、バチルス・パントテンチクス（Bacillus pantothenticus）、バチルス・ポピリエ（Bacillus popilliae）、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）、バチルス・シュードアンスラシス（Bacillus pseudoanthracis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・シュレゲリイ（Bacillus schlegelii）、バチルス・シンプレックス（Bacillus simplex）、バチルス・スファエリカス（Bacillus sphaericus）、バチルス・スポロサーモデュランス（Bacillus sporothermodurans）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サーモグルコシデイジアス（Bacillusthermoglucosidasius）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・ブルガリス（Bacillus vulgaris）、バチルス・ウェイヘンステファネンシス（Bacillus weihenstephanensis）、バチルス・マセランス（Bacillus macerans）、バチルス・ブタノリボランス（Bacillus butanolivorans）；ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）、リゾビウム（Rhizobium）；クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium. beijerinckii）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）；パスツリア・ペネトランス（Pasteuria penetrans）、パスツリア・ユーセジ（Pasteuria usagae）、パスツリア・ニシザワエ（Pasteuria. nishizawae）、パスツリア・レニフォル���ス（Pasteuria reniformis）；シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）；ストレプトミセス・グリセオフルビン（Streptomyces griseofulvin）、ストレプトミセス・グリセオビリディス（Streptomyces griseoviridis）、ストレプトミセス・シンデネウシス（Streptomyces sindeneusis）、及びサッカロポリスポラ・スピノサ（Saccharopolyspora spinosa）からなる群から選択され、少なくとも一つの追加の真菌がメタリジウム・アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）、ボーベリア・バッシアナ（Beauveria bassiana）、ペシロミセス・リラシヌス（Paecilomyces lilacinus）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、及びペニシリウム・ビライ（Penicillium bilaii）からなる群から選択されるか、又はグロムス属（Glomus）、アカウロスポラ属（Acaulospora）、エントロホスホラ属（Entrophosphora）、ギガスポラ属（Gigaspora）、スクテロスポラ属（Scutellospora）、及びスクレロサイティス属（Scierocytis）からなる群から選択される属に由来する。
【００１３】
また、本発明は、上述の細菌単離株のいずれかを含む組成物を調製する方法であって、上記単離株と許容可能な担体とを混合して組成物を形成することを含む、方法を提供する。
【００１４】
他の実施の形態では、本発明は、植物増殖材料の成長を促進する方法であって、植物増殖材料を上述の細菌単離株のいずれかを含む組成物で被覆することを含み、細菌単離株で被覆されていない対応する対照植物増殖材料と比較して、植物増殖材料の成長が促進されている、植物増殖材料の成長を促進する方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、上述の細菌単離株のいずれかを含む組成物を廃水に添加することを含む、廃水を処理する方法を提供する。
【００１６】
更なる実施の形態では、本発明は、上述の細菌単離株のいずれかを土壌又は水に適用することを含む、環境修復方法を提供する。
【００１７】
別の実施の形態では、本発明は、上述の細菌単離株のいずれかと水産養殖業設備の水とを接触させることを含む、水産養殖業設備において水を処理する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一態様では、本発明は、バチルス株ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）、ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）、ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）、及びＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）からなる群から選択される細菌の全ての識別特性を有する、生物学的に純粋な細菌単離株に関する。
【００１９】
ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７をアメリカ合衆国ペンシルベニア州の河川水から単離した。これらの株の試料は、２０１３年１月２２日付で米国６１６０４イリノイ州、ピオリア、ノースユニバーシティストリート、１８１５のAgricultural Research Service Culture Collection（ＮＲＲＬ）の収集物に寄託され、以下のアクセッション番号で指定された。
株                            アクセッション番号
ＥＮＶ  ７３４                ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００
ＥＮＶ  ７３５                ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１
ＥＮＶ  ７３６                ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２
ＥＮＶ  ７３７                ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３
【００２０】
分類を確立するため、各単離株の試料を１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をシークエンシングすることによって分析した。試験したコンセンサス配列に基づき、４つ全ての株がバチルス・シンプレックスと９９％超の配列相同性を有し、バチルス・ブタノリボランスと９９．９％超のＤＮＡ配列相同性を有することがわかった。
【００２１】
本発明の細菌株の増殖は、任意の従来の条件のもと、それらの成長を促進する培地中で培養することにより達成され得る。トリプチックソイブロス等の様々な既知の培養培地が本発明の株の産生に対する使用に適している。実際に、また限定されることなく、上記細菌を、典型的には、微生物によって同化可能であり、効率的な細胞成長を支持する炭素、窒素、及び無機塩の供給源を含有する培地上で好気性の液体培養液において成長させる。好ましい炭素源は、グルコース等の六炭糖であるが、他の同化源としてグリセロール、アミノ酸、キシロース等が挙げられる。多くの無機材料及びタンパク質性材料が、成長プロセスにおいて窒素源として使用され得る。好ましい窒素源はアミノ酸及び尿素であるが、その他として、気体アンモニア、硝酸塩及びアンモニウムの無機塩、ビタミン、プリン、ピリミジン、酵母エキス、牛肉エキス、プロテオースペプトン、大豆ミール、カゼインの加水分解物、蒸留器の可溶分（distiller's solubles）等が挙げられる。栄養培地中に組込まれ得る無機材料のうち、通例の塩は、カルシウム、亜鉛、鉄、マンガン、マグネシウム、銅、コバルト、カリウム、ナトリウム、モリブデン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、ホウ酸塩等のイオンを生じることができる。同様に、好適なｐＨ及び温度の条件もまた可変的であり、最適条件は特定の株により変化する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、上述の生物学的に純粋な細菌単離株の識別特性は、ウレアーゼ活性、リパーゼ活性、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）活性、４℃での成長、４５℃で成長しないこと、ｐＨ５．５での成長、ｐＨ９．０での成長、７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌでの成長、及び抗真菌活性を含む。いくつかの実施形態では、１又は複数の識別特性は、ウレアーゼ活性、リパーゼ活性、４℃での成長、４５℃で成長しないこと、ｐＨ５．５での成長、ｐＨ９．０での成長、７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌでの成長、及び抗真菌活性を含む。他の実施形態では、１又は複数の識別特性は、ウレアーゼ活性、４℃での成長、及び少なくとも７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む培地中での成長を含む。好ましい実施形態では、１又は複数の識別特性は、ウレアーゼ活性、４℃での成長、少なくとも７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含む培地での成長、及びｐＨ５．５での成長を含む。別の好ましい実施形態では、１又は複数の識別特性はウレアーゼ活性を含む。更に別の好ましい実施形態では、１又は複数の識別特性は４℃での成長を含む。更に好ましい実施形態では、１又は複数の識別特性は、７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌでの成長を含む。
【００２３】
上述の生物学的に純粋な細菌単離株の好ましい実施形態では、抗真菌活性は、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、ピシウム・アファニデルマータム（Pythium aphanidermatum）、ピシウム・イレグラレ（Pythium irregulare）、フィトフトラ・パラジチカ（Phytophthora parasitica）、及びフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）からなる群から選択される真菌の成長を阻害することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、上述の生物学的に純粋な細菌単離株は、４℃〜３７℃の温度で成長することができる。更なる実施形態では、上記細菌単離株は、４５℃以上の温度で成長することができない。更なる実施形態では、上記細菌単離株は、５．５〜９．０のｐＨ範囲に亘り成長することができる。更なる実施形態では、上記細菌単離株は、７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌまでを含むＮａＣｌ濃度で成長することができる。好ましい実施形態では、上記細菌単離株は、４℃〜３７℃の温度で成長することができ、４５℃以上の温度で成長することができず、５．５〜９．０のｐＨ範囲に亘って成長することができ、７％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌまでを含むＮａＣｌ濃度で成長することができる。
【００２５】
本発明の組成物は、ＥＮＶ  ７３４（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８００）、ＥＮＶ  ７３５（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０１）、ＥＮＶ  ７３６（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０２）、及びＥＮＶ  ７３７（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０８０３）の少なくとも１つと、許容可能な担体とを含んでもよい。本明細書で採用される、「許容可能な担体」の用語は、関与する細菌株に悪影響を及ぼさない、関与する分野で典型的に採用される担体（例えば、工業、農業、水産養殖業、環境、及び／又はプロバイオティクスの用途に典型的に採用される担体）を指す。かかる担体は、当業者によく知られている。
【００２６】
好ましい実施形態では、上記担体は農業的に許容可能な担体である。別の好ましい実施形態では、上記担体は水産養殖業的に許容可能な担体である。更に好ましい実施形態では、上記担体は環境投与に適している。更に別の好ましい実施形態では、上記担体は、プロバイオティクス投与に適している。多くの工業及び／又は農業の用途に対して、担体として、タルク、ベントナイト、クレイ、カオリン、珪藻土、ホワイトカーボン、バーミキュライト、消石灰、珪砂、硫酸アンモニウム等の多孔質固体担体、また同じく、水、イソプロピルアルコール、キシレン、シクロヘキサノン、メチルナフタレン、及びアルキルグリコール等の液体担体が挙げられる。プロバイオティクス用途に対して、典型的に採用される糖及びデンプン等の薬学的担体を利用してもよい。
【００２７】
上記組成物は、関連のある用途において典型的に採用される量の担体及びバチルスを含んでもよく、その量はよく知られている及び／又は容易に決定可能である。
【００２８】
本発明の組成物は、それらの有効性及び／又は作用範囲を増すため、１又は複数の追加の細菌株又は真菌株を更に含んでもよい。一般に、任意の有用な細菌生物又は真菌生物を挙げることができる。かかる細菌の例は、Ｂ．アルカロフィルス（B. alcalophilus）、Ｂ．アルベイ（B. alvei）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．アネウリノリティカス（B. aneurinolyticus）、Ｂ．アンスラシス（B. anthracis）、Ｂ．アクイマリス（：B. aquimaris）、Ｂ．アトロファエウス（B. atrophaeus）、Ｂ．ボロニフィルス（：B. boroniphilus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．カルドリティクス（：B. caldolyticus）、Ｂ．セントロスポルス（B. centrosporus）、Ｂ．セレウス（B. cereus）、Ｂ．シルクランス（：B. circulans）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．フィルムス（B. firmus）、Ｂ．フラビサーマス（B. flavothermus）、Ｂ．フシフォルミス（B. fusiformis）、Ｂ．グロビギ（B. globigii）、Ｂ．インフェルナス（B. infernus）、Ｂ．ラルバエ（B. larvae）、Ｂ．ラテロスポルス（B. laterosporus）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．メセンテリカス（B. mesentericus）、Ｂ．ムシラギノサス（B. mucilaginosus）、Ｂ．ミコイデス（B. mycoides）、Ｂ．ナットー（B. natto）、Ｂ．パントテンチクス（：B. pantothenticus）、Ｂ．ポピリエ（：B. popilliae）、Ｂ．ポリミクサ（B. polymyxa）、Ｂ．シュードアンスラシス（B. pseudoanthracis）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．シュレゲリイ（B. schlegelii）、Ｂ．シンプレックス（B. simplex）、Ｂ．スファエリカス（B. sphaericus）、Ｂ．スポロサーモデュランス（B. sporothermodurans）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．サブティリス（B. subtilis）、Ｂ．サーモグルコシデイジアス（B. thermoglucosidasius）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｂ．ブルガリス（：B. vulgaris）、Ｂ．ウェイヘンステファネンシス（B. weihenstephanensis）、Ｂ．マセランス（B. macerans）、及びＢ．ブタノリボランス（B.butanolivorans）等のバチルス種；ブラディリゾビウム（Bradyrhizobium）及びリゾビウム（Rhizobium）；Ｃ．サーモセラム（C.thermocellum）、Ｃ．リュングダリイ（C. ljungdahlii）、Ｃ．アセトブチリカム（C. acetobutylicum）、Ｃ．ベイジェリンキ（C. beijerinckii）、及びＣ．ブチリカム（C. butyricum）等のクロストリジウム種；Ｐ．ペネトランス（P. penetrans）、Ｐ．ユーセジ（P. usagae）、Ｐ．ニシザワエ（P. nishizawae）、及びＰ．レニフォルミス（P. reniformis）等のパスツリア種；Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．クロロラフィス（P. chlororaphis）、及びＰ．シリンガエ（P. syringae）等のシュードモナス種；ストレプトミセス・グリセオフルビン（Streptomyces griseofulvin）、ストレプトミセス・グリセオビリディス（Streptomyces griseoviridis）、ストレプトミセス・シンデネウシス（Streptomyces sindeneusis）、及びサッカロポリスポラ・スピノサ（Saccharopolyspora spinosa）等のアクチノミセス種、また同じく、上述の細菌種のいずれかの遺伝的修飾変異体である。上記組成物に使用され得る真菌として、限定されないが、メタリジウム・アニソプリエ（Metarhizium anisopliae）、ボーベリア・バッシアナ（Beauveria bassiana）、ペシロミセス・リラシヌス（Paecilomyces lilacinus）、トリコデルマ・���ーゼイ（Trichoderma reesei）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、ペニシリウム・ビライ（Penicillium bilaii）；グロムス（Glomus）属、アカウロスポラ（Acaulospora）属、エントロホスホラ（Entrophosphora）属、ギガスポラ（Gigaspora）属、スクテロスポラ（Scutellospora）属、及びスクレロサイティス（Scierocytis）属から選択されるミコリザの株、また同様に、かかる真菌の遺伝的修飾変異体が挙げられる。
【００２９】
また、本発明は、上述の生物学的に純粋な細菌単離株と許容可能な担体とを混合することを含む、上述の組成物を調製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記組成物は、乾燥混合物であり、噴霧乾燥、凍結乾燥、風乾、又はドラム乾燥等のプロセスによって産生され得る。他の実施形態では、上記組成物は液体製剤である。
【００３０】
また、本発明は、植物増殖材料の成長を促進する方法であって、植物増殖材料を上述の生物学的に純粋な細菌単離株のいずれかで被覆することを含み、上記細菌単離株で被覆されていない対応する対照植物増殖材料と比較して、上記植物増殖材料の成長が促進されている、植物増殖材料の成長を促進する方法を提供する。
【００３１】
本明細書で採用される「植物増殖材料」の用語は、種子等の植物の生殖力のある部分全て、及び植物の繁殖に使用され得る挿し木及び塊茎（例えば、ジャガイモ）等の生長する植物材料を含むことを意図する。これは、発芽後又は土壌から出芽した後に移植される、苗及び若木を含む、種子、根、果実、塊茎、球根、根茎、苗条、芽、及び植物の他の部分を含む。また、これらの若木は、浸漬又は流し込み（pouring）によって全体的又は部分的に処理されることにより移植前に保護されてもよい。植物増殖材料の用語は、種子を示すことが好ましい。
【００３２】
成長の促進としては、限定されないが、１又は複数の以下のパラメーター、すなわち発芽率、発芽速度、出芽率、苗のバイオマス、苗の高さ、根の長さ、根のバイオマス、苗条のバイオマス、花の数、花の大きさ、収量、及び種子収量の増加が挙げられる。
【００３３】
本発明において特に有用な植物として、限定されないが、アセル種（Acer spp.）、アリウム種（Allium spp.）、アマランサス種（Amaranthus spp.）、アナナス・コモスス（Ananas comosus）、アピウム・グラウェオレーンス（Apium graveolens）、アラキス種（Arachis spp）、アスパラガス・オフィシナリス（Asparagus officinalis）、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）、ブラシカ種（Brassica spp.）（例えば、ブラシカ・ナプス（Brassica napus）、ブラシカ・ラパ亜種（Brassica rapa ssp.）［キャノーラ、アブラナ（oilseed rape, turnip rape）］）、カメリア・シネンシス（Camellia sinensis）、カンナ・インディカ（Canna indica）、カンナビス・サティバ（Cannabis sativa）、カプシクム種（Capsicum spp.）、カスタニア種（Castanea spp.）、チコリウム・エンディヴィア（Cichorium endivia）、シトルラス・ラナタス（Citrullus lanatus）、シトラス種（Citrus spp.）、ココス種（Cocos spp.）、コフィア種（Coffea spp.）、コリアンドラム・サティヴァム（Coriandrum sativum）、コリラス種（Corylus spp.）、クラタエグス種（Crataegus spp.）、ククルビタ種（Cucurbita spp.）、ククミス種（Cucumis spp.）、ダウクス・カロタ（Daucus carota）、ファグス種（Fagus spp.）、フィクス・カリカ（Ficus carica）、フラガリア種（Fragaria spp.）、ギンクゴ・ビロバ（Ginkgo biloba）、グリシン種（Glycine spp.）（例えば、グリシン・マックス（Glycine max）、ソーヤ・ヒスピダ（Soja hispida）、又はソーヤ・マックス（Soja max））、ゴシピウム・ヒルスツム（Gossypium hirsutum）、ヘリアンタス種（Helianthus spp.）（例えば、ヘリアンタス・アンヌス（Helianthus annuus））、ハイビスカス種（Hibiscus spp.）、ホルデウム種（Hordeum spp.）（例えば、ホルデウム・ウルガレ（Hordeum vulgare））、イポメア・バタタス（Ipomoea batatas）、ジュグランス種（Juglans spp.）、ラクツカ・サティバ（Lactuca sativa）、リナム・ウシタチシム（Linum usitatissimum）、リッチ・チネンシス（Litchi chinensis）、ロータス種（Lotus spp.）、ルッファ・アクタングラ（Luffa acutangula）、ルピナス種（Lupinus spp.）、リコペルシコン種（Lycopersicon spp.）（例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculenturn）、リコペルシコン・ リコペルシカム（Lycopersicon lycopersicum）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Lycopersicon pyriforme））、マルス種（Malus spp.）、メディカゴ・サティバ（Medicago sativa）、メンタ種（Mentha spp.）、ミスカンサス・シネンシス（Miscanthus sinensis）、モルス・ニグラ（Morus nigra）、ムサ種（Musa spp.）、ニコチアナ種（Nicotiana spp.）、オレア種（Olea spp.）、オリザ種（Oryza spp.）（例えば、オリザ・サティバ（Oryza sativa）、オリザ・ラチフォリア（Oryza latifolia）、パニカム・ミリアセウム（Panicum miliaceum）、パニカム・ヴィルガツム（Panicum virgatum）、パッシフロラ・エドゥリス（Passiflora edulis）、ペトローズリヌム・クリスプム（Petroselinum crispum）、ファセオルス種（Phaseolus spp.）、ピヌス種（Pinus spp.）、ピスタシア・ヴェラ（Pistacia vera）、ピスム種（Pisum spp.）、ポア種（Poa spp.）、ポプルス種（Populus spp.）、プルヌス種（Prunus spp.）、ピルス・コムニス（Pyrus communis）、ケルクス種（Quercus spp.）、ラファヌス・サティバス（Raphanus sativus）、レウム・ラバルバルム（Rheum rhabarbarum）、リベス種（Ribes spp.）、リシナス・コムニス（Ricinus communis）、ルブス種（Rubus spp.）、サッカルム種（Saccharum spp.）、サ���クス種（Salix sp.）、サンブクス種（Sambucus spp.）、セカレ・セレアレ（Secale cereale）、セサマム種（Sesamum spp.）、シナピス種（Sinapis sp.）、ソラナム種（Solanum spp.）（例えば、ソラナム・トゥーベロースム（Solanum tuberosum）、ソラナム・インテグリフォリウム（Solanum integrifolium）又はソラナム・リコペルシコン（Solanum lycopersicum））、ソルガム・バイカラー（Sorghum bicolor）、ソルガム・ハレペンス（Sorghum halepense）、スピナシア種（Spinacia spp.）、タマリンヅス・インディカ（Tamarindus indica）、テオブロマ・カカオ（Theobroma cacao）、トリフォリウム種（Trifolium spp.）、トリチコセケル・リンパウイ（Triticosecale rimpaui）、トリチカム種（Triticum spp.）（例えば、トリチカム・エスチバム（Triticum aestivum）、トリチカム・デュラム（Triticum durum）、トリチカム・ツルギダム（Triticum turgidum）、トリチカム・ハイベルナム（Triticum hybernum）、トリチカム・マチャ（Triticum macha）、トリチカム・サティヴァム（Triticum sativum）又はトリチカム・バルガレ（Triticum vulgare））、バクシニウム種（Vaccinium spp.）、ビキア種（Vicia spp.）、ビグナ種（Vigna spp.）、ビオラ・オダラータ（Viola odorata）、ビチス種（Vitis spp.）及びゼア・マイス（Zea mays）から選択される飼料若しくはマメ科牧草、観賞用植物、食用作物、樹木、又は低木を含む単子葉植物及び双子葉植物が挙げられる。コメ、アブラナ、カノーラ、ダイズ、トウモロコシ（corn）（トウモロコシ（maize））、綿、サトウキビ、アルファルファ、モロコシ、及びコムギが特に好ましい。
【００３４】
いくつかの実施形態では、植物増殖材料は、かかる手段が細菌の生存能力に悪影響を及ぼさない限り、種子又は他の発芽材料を被覆するため典型的に採用される任意の従来の手段によって、生物学的に純粋な細菌単離株で被覆される。採用され得る従来の手段として、噴霧処理、滴下処理、浸漬処理、塗装処理、フィルムコート処理、ペレットコート処理等が挙げられる。種子を被覆する方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第７，９８９，３９１号、及び米国特許第５，８４９，３２０号に記載される。
【００３５】
生物学的有効成分に加えて、種子コーティング組成物は、有効成分の処方の一部であるか、又は種子コーティングの取り扱い性若しくは種子に対するその機能性及び耐久性に寄与するいずれかである任意の材料及び添加剤を含んでもよい。コーティング添加剤の例は、種子に有効成分を結合するコーティングポリマーである。種子コーティングポリマーとして、限定されないが、タンパク質、多糖、ポリエステル、ポリウレタン、不飽和モノマーから調製されたポリマー、及びそれらの組み合せが挙げられる。
【００３６】
種子コーティングの取り扱い性又は種子に対するその機能性及び耐久性に寄与する他の添加剤として、限定されないが、界面活性剤、金属イオン封鎖剤、可塑剤、着色剤及び染料、光沢剤、乳化剤、フロー剤、融合助剤、消泡剤、増粘剤、ワックス、殺菌剤、充填剤、ポリマー、湿潤剤及び凍結防止剤が挙げられる。かかる添加剤の特徴及び作用は製剤化分野の当業者によく知られている。添加剤は、細菌の作用を干渉してはならない。
【００３７】
本発明において有用な結合剤は、天然であっても合成であってもよく、被覆される種子に対して植物毒性を有しない接着性ポリマーを含むことが好ましい。上記結合剤は、ポリ酢酸ビニル；ポリ酢酸ビニルコポリマー；エチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）コポリマー；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールコポリマー；エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むセルロース；ポリビニルピロリドン；デンプン、修飾デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、アルギン酸塩及びキトサンを含む多糖；脂肪；油；ゼラチン及びゼインを含むタンパク質；アラビアガム；シェラック；塩化ビニリデン及び塩化ビニリデンコポリマー；リグノスルホン酸カルシウム；アクリルコポリマー；ポリビニルアクリレート；ポリエチレンオキシド；アクリルアミドポリマー及びコポリマー；ポリヒドロキシエチルアクリレート、メチルアクリルアミドモノマー；並びにポリクロロプレンから選択されてもよい。
【００３８】
コーティング中の結合剤の量は変化してもよいが、種子の重量の約０．０１％〜約２５％、より好ましくは約０．０５％〜約１５％、更に好ましくは約０．１％〜約１０％の範囲である。
【００３９】
増殖材料のコーティングは、任意に充填剤を含んでもよい。充填剤は、当該技術分野で知られているような吸収剤又は不活性な充填剤であってもよく、木粉、クレイ、活性炭、糖、珪藻土、穀粉、微粒子無機固体、炭酸カルシウム等が挙げられる。使用され得るクレイ及び無機固体として、カルシウムベントナイト、カオリン、陶土、タルク、パーライト、雲母、バーミキュライト、シリカ、石英粉末、モンモリロナイト、及びそれらの混合物が挙げられる。糖は有用な場合があり、デキストラン及びマルトデキストリンが挙げられる。穀粉として小麦粉、オート麦粉及び大麦粉が挙げられる。
【００４０】
種子に適切な微小環境を提供するように充填剤を選択し、例えば、充填剤を有効成分の負荷速度を増すため、また有効成分の制御放出を調整するために使用される。充填剤は種子の生産又は被覆過程を補助し得る。充填剤の量は変化し得るが、一般的に充填剤成分の重量は種子重量の約０．０５％〜約７５％、より好ましくは約０．１％〜約５０％、更に好ましくは約０．５％〜１５％の範囲である。
【００４１】
任意に、コーティング製剤に可塑剤を使用してもよい。可塑剤は、典型的には、コーティング層によって形成されるフィルムをより柔軟にして接着及び延展性を改善し、加工速度を改善するため使用される。改善されたフィルム柔軟性は、保存、作業又は播種の過程の間チッピング、破損、又は剥離を最小化すために重要である。多くの可塑剤が使用され得るが、有用な可塑剤として、ポリエチレングリコール、グリセロール、ブチルベンジルナフタレート、安息香酸グリコール、及び関連する化合物が挙げられる。コーティング層における可塑剤の範囲は、約０．１重量％〜約２０重量％の範囲である。
【００４２】
また、処理した種子は、有効成分のコーティングを保護するためフィルムオーバーコートで覆われてもよい。かかるオーバーコートは当該技術分野で知られており、従来の流動床及びドラムフィルムコーティング法を使用して適用されてもよい。
【００４３】
また、植付けの前又は後に植物成長培地に上記組成物を適用することによって、生物学的に純粋な細菌単離株を含む組成物で植物増殖材料を処理してもよい。例えば、上記組成物は、噴霧により又は灌漑装置を通して土壌に適用されてもよい。また、上記組成物は、例えば、乾燥粉末として土壌形態の植物成長培地に適用されてもよい。
【００４４】
また、本発明は、上述の生物学的に純粋な細菌単離株を含む組成物を廃水に添加することを含む、廃水を処理する方法を提供する。上記組成物は、都市下水、工業廃水、又は農業廃水、ポンプ場、パルプ及び紙の廃水、食品加工廃水、石油化学廃水、及び動物廃水を含む任意の廃水の処理に使用され得る。また、上記組成物は、浄化槽、グリーストラップ、及び汚物集合タンクにおける現地での廃水処理に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、上記組成物は、レストラン及び業務用厨房により生じた廃水中の脂肪、油、及びグリースの分解に使用されてもよい。また、上記組成物は、ボート、ポータブルトイレ及び他の小型の汚物収集装置において廃棄物を分解するため、小規模の汚物収集タンクに添加されてもよい。
【００４５】
また、本発明の廃水処理方法は、様々な反応器システムにおいて行われてもよい。例えば、廃水処理が典型的にはタンク内で行われるのに対し、反応は、上記組成物中の細菌の成長及び生物学的活性を支持するのに適した環境を維持するため好適な条件が提供される限り、廃水の保存に使用される任意の容器又は貯水槽において行われてもよい。好適な廃水処理反応器システムとして、限定されないが、懸濁成長バイオリアクター及び付着成長バイオリアクターが挙げられる。懸濁成長バイオリアクターでは、上記組成物は液体の撹拌によって排水と混合されてもよい。付着成長バイオリアクターでは、様々な固体（solid）支持媒体が提供され、上記組成物中の細菌がその表面に付着することを可能とする。好適な媒体として、限定されないが、散水濾床、回転生物接触装置、充填床反応器、及びその他当該技術分野で既知のものが挙げられる。本明細書における使用に適した更に別の付着成長バイオリアクターは、流動床及び移動床の反応器である。このシステムでは、細菌を含むバイオキャリアは処理されている廃水中に懸濁されたままであり、その水の混合と関連する抗力によって流動化される。上記細菌は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の粒子、又はアルギン酸カルシウム等の他のポリマーゲルの粒子等の高分子多孔質材料中に捕捉され得る。上記細菌は付着して、Ｋ１、Ｋ３、ＭｉｎｉＣｈｉｐ、及びＢｉｏｆｉｌｍＣｈｉｐプラスチックキャリア（スウェーデンのAnoxKaldnes）等の懸濁された担体中でバイオフィルムを形成し得る。流動床反応器は、微生物集団が急速に増加することを可能とし、それによって廃水処理に要する時間を減少する。細菌株を使用する廃水処理の方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００００８４９号、及び同第２０１１／０１８０４７６号に記載される。
【００４６】
また、本発明は、上述の細菌単離株のいずれかを土壌又は水に適用することを含む、環境修復方法を提供する。バチルス種を水及び土壌の両方の環境修復に使用してもよい。土壌修復の作用様式は、廃水処理について上記に記載されるものとほぼ同じである。上記細菌は、汚染物質を更に分解するか、又はより不活性な形態にそれを結合する酵素及び酸の発生を介して化学物質及び汚染物質を分解する。
【００４７】
また、本発明は、上述の細菌単離株のいずれかと水産養殖業設備中の水とを接触させることを含む、水産養殖業設備において廃水を処理する方法を提供する。上記細菌単離株を直接水に添加してもよく、又は例えば、米国特許第７，０８２，８９３号に記載されるバイオフィルター設備において使用してもよい。上記細菌単離株を、水産養殖業設備において、エビ及び魚等の食用に飼育される水生動物種によって生じる廃棄物を修復及び分解するために使用してもよい。また、上記細菌単離株を、栄養を循環するため、脂質、タンパク質、デンプンを分解するため、また同じく、飼料効率を高めるアミノ酸及び酵素を産生するため水産養殖業において利用してもよい。また、上記細菌単離株を使用して天然の抗生物質を作製し、上記環境、また同じく動物の消化管において病原体から保護するため競争排除を提供してもよい。また、この天然の抗生物質及び病原体に対する競争排除の発生をヒトのプロバイオティクスにおいて利用してもよく、又は生産動物及び伴侶動物に直接給餌される微生物において利用されてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、本発明を更に解説することを意図するものであって、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【００４９】
実施例１−種々の温度における成長
ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７の試料を、プレートカウントアガー（ＰＣＡ）プレート上で画線培養により種々の温度でそれらの成長について評価した。プレートを試験温度において予めインキュベートした。バチルス・シンプレックス株ＤＳＭ  １３２１をDSMZ collectionから得て、対照として試験した。かかる試験の結果を下記表１に要約する。
【００５０】
【表１】
0006531308.tif 000002
【００５１】
これらの結果は、ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７が４℃の低温で成長するが、４５℃の高温では成長しないことを示す。バチルス・シンプレックス株ＤＳＭ  １２３１は、同様の温度成長パターンを示した。
【００５２】
実施例２−酵素活性
ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７の試料を、ウレアーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、及びカルボキシメチルセルラーゼ（「ＣＭＣ」）の産生について評価した。寒天、消化について試験される特定の基質、及び適切な量の無機窒素、並びに微量栄養素を含むペトリ皿を無菌的に調製した。例えば、乳をプロテアーゼアッセイの基質とし、尿素をウレアーゼアッセイの基質とし、Difcoリパーゼ試薬（参照番号２１５３５５）をリパーゼアッセイの基質とし、トウモロコシデンプンをアミラーゼアッセイの基質とし、カルボキシメチルセルロースをＣＭＣアーゼアッセイの基質とした。プレートを調製した後、各細菌株をトリプチックソイブロス中で終夜個別に成長させ、酵素試験プレートの接種に使用した。各プレートを、少量の終夜培養物で４つの４等分試料（quadrants）の各々において１回接種した。細菌に対する陽性及び陰性の対照株を含めてアッセイが正しく行われていることを確認した。接種したプレートを３０℃で４８時間インキュベートし、コロニー周辺の透明帯又は変色について観察した。コロニー周辺の透明帯又は変色ハローの大きさを、対照のものと比較して記録した。バチルス・シンプレックス株ＤＳＭ  １３２１をDSMZコレクションから得て、対照として試験した。かかる試験の結果を下記表２に要約する。
【００５３】
【表２】
0006531308.tif 000003
【００５４】
株ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７は高レベルのウレアーゼ活性を呈したのに対し、バチルス・シンプレックス対照はウレアーゼ活性を呈しなかった。
【００５５】
実施例３−成長特性及びウレアーゼ活性に関するＢ．シンプレックス及びＢ．ブタノリボランスとＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７との比較
ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７の以下の生物学的特性を、バチルス・シンプレックス株ＤＳＭ  １３２１と比較して評価した。ｐＨを５．５、７．０、及び９．０に調整したトリプチックソイブロスを含む試験チューブを調製し、オートクレーブに供した。７％塩化ナトリウムの添加を伴うｐＨ７．０のチューブも調製した。各試験パラメーターについて２つのチューブを１０マイクロリットルの試験される個々の株の終夜培養物で接種した。これを試験される全ての株について繰り返し、そのアッセイが正しく作用していることを保証するため、陽性及び陰性の対照株を含めた。ｐＨ５．５、ｐＨ９．０、及び７％塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の接種されたチューブを３０℃でインキュベートし、及びｐＨ７．０のチューブを４５℃でインキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、チューブを移し、培養物の濁度の目視評価によって成長を確認し、成長を陽性又は陰性と記録した。陽性の成長を示す各チューブを新しいトリプチックソイアガープレートに画線培養して、コロニーの形態に基づいてチューブで正しい株が成長していることを確認した。
【００５６】
バチルス・ブタノリボランス（上記に引用されるKusiene et al.,）に関する報告された結果も表３に提示する。
【００５７】
【表３】
0006531308.tif 000004
【００５８】
上記結果は、本発明の株と、Ｂ．シンプレックス株及びＢ．ブタノリボランス株のいずれとの間の高い相同性にもかかわらず、ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７の株はそれらの属性のいくつか、最も顕著には、高塩環境における成長能力において予想外の差異を呈したことを示す。
【００５９】
実施例４−抗真菌活性
ＰＣＡプレートに細菌をスポットし、３０℃で２日間、４日間、又は７日間プレートをインキュベートした後、これらのプレートに真菌培養物片を置き、細菌の真菌の成長を干渉する能力を観察することにより抗真菌活性を試験した。試験した真菌は、リゾクトニア・ソラニ、ピシウム・アファニデルマータム（「Ｐ．ａｐｈａｎ．」）、ピシウム・イレグラレ、フィトフトラ・パラジチカ、及びフザリウム・オキシスポラムであった。かかる試験の結果を下記表４に要約する。
【００６０】
【表４】
0006531308.tif 000005
【００６１】
上記表４において、
＋＋＋  最良の抗真菌活性−非常にわずかな真菌成長又は真菌が成長しない
＋＋＋−  ＋＋＋未満であるが、＋＋を超える抗真菌活性
＋＋  より少ない抗真菌活性−約半分のプレートが真菌で覆われる
＋  わずかな真菌活性−ほとんどのプレートが真菌で覆われる
＋−  ＋未満であるが−を超える抗真菌活性
−  抗真菌活性なし−プレートが真菌で覆われる
【００６２】
上記結果は、ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、及びＥＮＶ  ７３７が所望の抗真菌活性を呈することを示す。
【００６３】
実施例５−ＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、又はＥＮＶ  ７３７を含む組成物で被覆されたトウモロコシ種子の植物成長の評価
トウモロコシ種子をＥＮＶ  ７３４、ＥＮＶ  ７３５、ＥＮＶ  ７３６、又はＥＮＶ  ７３７と農業的に許容可能な担体とを含む組成物で被覆する。細菌を含まない農業的に許容可能な担体で被覆されたトウモロコシ種子を対照として使用する。種子の被覆は従来の手段により行われる。温室試験及び野外試験において、植物が出芽する最初の日から開始して出芽初日から３週間に亘り、定期的に苗の出芽を測定することによって、種子の発芽率を測定する。また、苗の高さ、新鮮重量、及び乾燥重量を出芽初日の１週間後から開始して定期的に測定することにより育苗速度を特定する。