(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養表皮を移植するための真皮再建用テンプレートであって、脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を含む真皮再建用テンプレート。
【請求項２】
培養表皮が自家培養表皮である、請求項１に記載の真皮再建用テンプレート。
【請求項３】
培養表皮を移植するために用いられる、ＤＦＡＴを有効成分として含む、培養表皮の生着率向上剤。
【請求項４】
培養表皮を移植するために用いられる、ＤＦＡＴを有効成分として含む、培養表皮と真皮の間の基底膜構築促進剤。
【請求項５】
基底膜構築促進作用が、ラミニン又はコラーゲンタイプＩＶの発現促進によるものである、請求項４に記載の基底膜構築促進剤。
【請求項６】
培養表皮を移植するために用いられる、ＤＦＡＴを有効成分として含む、培養表皮と真皮の間のＡＦ（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌ（係留線維））形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱分化脂肪細胞（Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｆａｔ  ｃｅｌｌｓ；ＤＦＡＴ（以下、単にＤＦＡＴと示す場合がある））を含むことを特徴とする真皮再建用テンプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、熱傷等による全層皮膚欠損創（脂肪が露出した創面）の治療において、同種皮膚あるいは人工真皮を用いて真皮再構築後に自家培養表皮を移植する手法が行われてきた。しかし、この方法では、自家培養表皮の生着が不安定であり、脱落しやすい等の問題があった。
【０００３】
熱傷等による皮膚欠損の治療には、様々な方法が開発されている。
例えば、特許文献１では、コラーゲンなどからなる人工真皮に、培養液および女性ホルモン様物質存在下で培養した間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含浸させた人工真皮シートが開示されている。そして、この文献では、じょく創を有する患者にこの人工真皮シートを移植したところ、まず肉芽細胞が形成され、さらに皮膚移植を追加したところ移植皮膚片が生着し、２か月後には肉芽組織および皮膚が再生され、じょく創が治癒したことが開示されている。
【０００４】
また、特許文献２では、脂肪細胞によって分泌される生物活性物質であるアディポカインを含む皮膚創傷治療用の医薬組成物が開示されている。この文献において、アディポカインには、脂肪細胞や脂肪細胞に分化することができる細胞としての形態も含まれており、治療の対象となる創傷の一つに熱傷が挙げられている。
さらに、特許文献３では、羊膜から産生されるコラーゲン膜を手術用移植片形成のための三次元足場として調製することが記載されており、該膜を用いた創傷、火傷等の皮膚症状の治療において、創傷部に適用される前に生存細胞（同種幹細胞、幹細胞、および自己成熟細胞等）を密集させておいても良いことが記載されている。
【０００５】
これらの人工真皮シートや皮膚創傷治療用の医薬組成物等は熱傷等による皮膚欠損の治療にあたり有用であるが、人工真皮シートは血管内皮細胞等への分化能を期待して、ＭＳＣを含浸させているだけであり、皮膚創傷治療用の医薬組成物もあくまでもアディポカインを分泌させるためのものであるため、再構築された真皮に移植される自家培養表皮の安定な生着について、十分な効果が得られるものとはいえない。
そこで、真皮の再構築が可能であり、再構築後の真皮に移植される自家培養表皮等の表皮が安定して生着でき、脱落しにくい真皮再建用テンプレート等の提供が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−２２２８３６号公報
【特許文献２】特表２００７−５１２２２６号公報
【特許文献３】特許第４６１５２２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
真皮の再構築が可能であり、再構築後の真皮に移植される自家培養表皮等の表皮が安定して生着でき、脱落しにくい真皮再建用テンプレートの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ＤＦＡＴを含ませることにより、真皮の再構築が可能であり、再構築後の真皮に移植される自家培養表皮等の表皮が安定して生着でき、脱落しにくい真皮再建用テンプレートが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明のＤＦＡＴを含む真皮再建用テンプレートは、これによって再構築された真皮と移植した表皮との間の接着層において基底膜の主要な構成成分であるラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）の発現を促進し得る効果があり、この効果によって、表皮の生着率を向上させ得る。
【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（９）の真皮再建用テンプレート、皮膚欠損創治療用医薬組成物等に関する。
（１）脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を含むことを特徴とする真皮再建用テンプレート。
（２）表皮を移植するための、前記（１）に記載の真皮再建用テンプレート。
（３）脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）が、真皮と表皮の接着層における基底膜のラミニンの発現を促進するものである前記（１）または（２）に記載の真皮再建用テンプレート。
（４）脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を有効成分として含む、皮膚欠損創治療用医薬組成物。
（５）脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を有効成分として含む、移植された表皮の生着率向上のための皮膚欠損創治療用医薬組成物であって、真皮と表皮の接着層における基底膜のラミニンの発現を促進する皮膚欠損創治療用医薬組成物。
（６）脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を添加する工程を含むことを特徴とする真皮再建用テンプレートの製造方法。
（７）熱傷創に前記（１）〜（３）のいずれかに記載の真皮再建用テンプレートを貼り付けるか、または前記（４）あるいは（５）に記載の皮膚欠損創治療用組成物を投与することを特徴とする熱傷創の治療方法。
（８）真皮欠損創に前記（１）〜（３）のいずれかに記載の真皮再建用テンプレートを貼り付けるか、または前記（４）あるいは（５）に記載の皮膚欠損創治療用組成物を投与することを特徴とする真皮欠損創の治療方法。
（９）表皮を前記（１）〜（３）のいずれかに記載の真皮再建用テンプレートの上部か、または前記（４）あるいは（５）に記載の皮膚欠損創治療用組成物を投与した上部に貼り付けることを特徴とする表皮の生着率向上方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を含有した真皮再建用テンプレートを用いることにより、熱傷等による皮膚欠損の治療にあたり、自家培養表皮等の表皮の生着率を向上することが可能となる。これにより、表皮の生着率を向上させることができ、広範囲熱傷に限らず、巨大母斑、外傷性皮膚欠損等の幅広い皮膚の疾患や症状の改善をすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】同種皮膚または真皮再建テンプレート移植後１０日目の結果を示した図である（実施例）。
【図２】各群の自家培養表皮移植後１４日目の結果を示した図である（実施例）。
【図３】分層皮膚欠損創群の電子顕微鏡写真を示した図である（実施例）。
【図４】同種皮膚移植群の電子顕微鏡写真を示した図である（実施例）。
【図５】同種皮膚＋ＤＦＡＴ移植群の電子顕微鏡写真を示した図である（実施例）。
【図６】人工真皮移植群の電子顕微鏡写真を示した図である（実施例）。
【図７】真皮再建用テンプレート移植群の電子顕微鏡写真を示した図である（実施例）。
【図８】コラーゲンタイプＩＶの免疫染色の写真を示した図である（実施例）。
【図９】ラミニンの免疫染色の写真を示した図である（実施例）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の「真皮再建用テンプレート」は、物理的、化学的な様々な原因により真皮を欠損したヒト等の哺乳類や、その他の皮膚を有する動物において、真皮を再建するためのテンプレートのことをいう。
本発明の「真皮再建用テンプレート」は真皮を再建するための足場となる自己の真皮、同種の個体の真皮、人工真皮等に、脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を含むものであれば良く、真皮を再建するために有用なその他の薬剤、薬学的に許容される担体等を含むものであっても良い。
人工真皮は、コラーゲンを主成分とする人工真皮等が挙げられ、医療用に使用できるものであればいずれのものであってもよく、市販のものであっても良い。
脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）は真皮を再建する対象から採取した自家成熟脂肪細胞を培養することによって得たものであることが好ましく、医療用に使用できるものであり、免疫上問題がないものであれば、同種のドナーから採取した成熟脂肪細胞を培養することによって得たものや、市販のものを用いることもできる。
【００１３】
本発明の「真皮再建用テンプレート」は、この真皮再建用テンプレート上に表皮を移植することができる「真皮再建用テンプレート」であることが好ましい。
移植する表皮は、自己の表皮、同種のドナーから採取した表皮、自己の表皮から得た細胞を培養して得た自家培養表皮、同種のドナーの表皮から得た細胞を培養して得た他家培養表皮等であれば良く、特に自己の表皮や自己の表皮から得た細胞を培養して得た自家培養表皮を用いることが好ましい。
このような本発明の「真皮再建用テンプレート」は、真皮と表皮の接着層における基底膜のラミニンの発現を促進するものであることが好ましい。
【００１４】
本発明の「皮膚欠損創治療用医薬組成物」は、物理的、化学的な様々な原因により皮膚を欠損したヒト等の哺乳類や、その他の皮膚を有する動物において、皮膚の欠損を治療するための組成物のことをいう。
本発明の「皮膚欠損創治療用医薬組成物」は脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を含むものであれば良く、皮膚の欠損を治療するために有用なその他の薬剤、薬学的に許容される担体等を含むものであっても良い。
このような本発明の「皮膚欠損創治療用医薬組成物」は、表皮を移植する際に、移植された表皮の生着率向上のためのものであり、真皮と表皮の接着層における基底膜のラミニンの発現を促進するものであることが好ましい。
【００１５】
本発明の「真皮再建用テンプレートの製造方法」は、前記の足場となる各素材に、脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を添加する工程を含むものであれば良く、真皮再建用テンプレートの製造に有用なその他の工程を含むものであっても良い。
足場となる素材が例えば、約２ｃｍ×３ｃｍの大きさの人工真皮である場合には、含まれる脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）が０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２〜１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２含まれるように添加することが好ましく、特に０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２含まれるように添加することが好ましい。
【００１６】
本発明の「熱傷創の治療方法」とは熱傷により皮膚や真皮を欠損したヒト等の動物に対して、その熱傷創の部位に前記真皮再建用テンプレートを貼り付けるか、または前記皮膚欠損創治療用組成物を投与することにより行う治療方法のことをいう。熱傷創の治療により有用なその他の方法を含む治療方法であっても良い。
【００１７】
本発明の「真皮欠損創の治療方法」とは、化学的、物理的な様々な原因により真皮を欠損したヒト等の動物に対して、その真皮欠損創の部位に前記真皮再建用テンプレートを貼り付けるか、または前記皮膚欠損創治療用組成物を投与することにより行う治療方法のことをいう。真皮欠損創の治療により有用なその他の方法を含む治療方法であっても良い。
【００１８】
本発明の「表皮の生着率向上方法」とは、自己の真皮、人工真皮等の移植した真皮等に対して表皮の生着率を向上させるための方法のことをいい、表皮を前記真皮再建用テンプレートの上部か、または皮膚欠損創治療用組成物を投与した上部に貼り付けることを含む方法のことをいう。この方法は、表皮の生着率を向上させるために有用なその他の方法を含んでいても良い。
【００１９】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
１．脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）の調整
（１）成熟脂肪細胞（単胞性脂肪細胞）を採取する工程
ブタ（ＬＷＤ系ＳＰＦブタ，１５ｋｇ，雄、埼玉実験動物）頸部から採取した皮下脂肪組織１ｇを０．１％の濃度となるようにコラゲナーゼ（ＴｙｐｅＩＩ；Ｃ６８８５−１Ｇ，ＳＩＧＭＡ）を添加したＮａＨＣＯ３含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＳＩＧＭＡ）に入れ、コラゲナーゼ処理を行った。
コラゲナーゼ処理を行った後、ナイロンメッシュにて濾過し、細胞懸濁液を得た。得られた細胞懸濁液を１３５×ｇ、３分間で遠心分離し、上層に分離される単胞性脂肪画分を新鮮な１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に加え、１３５×ｇ、３分間の遠心分離を３回繰り返すことで、単胞性脂肪細胞として成熟脂肪細胞を得た。
【００２１】
（２）成熟脂肪細胞より、脱分化脂肪細胞を取得する工程
前記（１）によって得られた単胞性脂肪細胞を組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ，３１０７）に移し、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地でフラスコ内を完全に満たし、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内にフラスコ底面が上となるように静置して７日間培養した。
培養４日後には大部分の細胞がフラスコ天井面にしっかりと接着し、大型の脂肪滴の周辺に種々の大きさの脂肪滴を有する多胞性脂肪細胞へと形態変化した。培養６日後には脂肪滴がさらに小さくなり、脂肪滴をまったく持たない線維芽細胞様の形態に変化する細胞が多数観察された。
培養７日後にフラスコ内の培地を２０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、細胞接着面が底面になるようにして炭酸ガス培養装置内で１０日間培養を続けた。培地交換は４日毎に行った。脂肪滴を持たない細胞は活発に増殖し、培養１０日後にはフラスコ内の細胞は線維芽細胞様の細胞のみとなり、コンフルエントに達した。
この線維芽細胞様の細胞は、活発な増殖能を有し、またデキサメタゾン、インスリン、ＩＢＭＸ等の分化誘導剤により、脂肪滴を有する脂肪細胞に再分化する分化能を有することから、前記工程を経て得られた単胞性脂肪細胞由来の脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）であった。
【００２２】
（３）作出された脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように２０％ＦＢＳ添加したＤＭＥＭ培地に再浮遊させた。その後、コラーゲンタイプIIを塗布した組織培養用の培養皿（Ｆａｌｃｏｎ，３００１）中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気の気相に調節した炭酸ガス培養装置内に静置して培養した。なお、培地の交換は４日ごとに行った。培養８日後、コンフレントに達した脱分化脂肪細胞を真皮再建用テンプレート等の作成に用いた。この脱分化脂肪細胞は必要に応じて継代を行ったものも真皮再建用テンプレート等の作成に用いた。
【００２３】
２．真皮再建用テンプレートの作成
約２ｃｍ×３ｃｍの大きさの人工真皮（ペルナック（登録商標）グンゼ株式会社）を滅菌生理食塩水に浸漬し、十分浸潤させた。
滅菌生理食塩水に懸濁した前記１．にて調整した脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を、この人工真皮あたり０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２含まれるように添加し真皮再建用テンプレートとした。
【００２４】
３．真皮再建方法
ブタ（ＬＷＤ系ＳＰＦブタ，１５ｋｇ，雄、埼玉実験動物）の背中に約２ｃｍ×３ｃｍの大きさの全層皮膚欠損創（脂肪露出創）を作成した。
この創に、滅菌生理食塩水に十分浸漬させておいた、この創とほぼ同じ大きさの人工真皮（ペルナック（登録商標）グンゼ株式会社）を貼付け、これに滅菌生理食塩水に懸濁した脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように添加し、真皮再建テンプレート移植群として真皮の再構築を行った。
真皮再建の対照として未治療群、比較として人工真皮のみを貼り付けた人工真皮移植群についても真皮の再構築を試みた。
さらに、比較として日本スキンバンクネットワークの凍結保存同種皮膚を模して凍結保存同種ブタ皮膚を作成した。凍結保存同種ブタ皮膚は、同種ブタから採取し、１５％ＦＢＳ、１０％グリセリン添加ＤＭＥＭ培地を凍結保存培地として、−８０℃で１ヶ月凍結保存した後に、３７℃温水に浸漬して急速解凍した後に滅菌生理食塩水で洗浄したものである。
この凍結保存同種ブタ皮膚を創に貼り付けた同種皮膚移植群、また、同種皮膚移植に際して移植床に脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を０．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように添加した同種皮膚＋ＤＦＡＴ移植群についても真皮の再構築を試みた。
【００２５】
移植した人工真皮内に移植床から組織や血管が侵入して真皮様組織が構築されるまで通常２−３週間を要するが、脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を添加するとそれが促進される。また、重症熱傷患者では免疫能が低下しているため、凍結保存同種皮膚の移植において、同種表皮が拒絶されるまで２−３週を要するが、本実験モデルのごとく健康なブタの場合には表皮拒絶も早まると想定される。そのため、本実施例において真皮再構築までの期間を移植後１０日と設定した。そして、真皮の再構築を開始してから１０日後に自家培養表皮移植を行った。この移植後１０日時点の各創（一部）の様子を図１に示した。
同種皮膚移植群においては、図１（Ａ）、（Ｃ）に示すように同種皮膚における真皮はこの時点では生着しており、図１（Ｃ）に示すように、移植時にこの真皮上に存在していた同種表皮は拒絶脱落したことが確認できた。これは、同種皮膚＋ＤＦＡＴ移植群でも同様であった。また、真皮再建テンプレート移植群においても、図１（Ｂ）に示すように、真皮様組織の構築が確認できた。これは、人工真皮移植群についても同様であった。
【００２６】
４．自家培養表皮の移植方法  真皮の再構築を開始してから１０日後の真皮再建テンプレート移植群、人工真皮移植群、同種皮膚移植群または同種皮膚＋ＤＦＡＴ移植群の各創、および対照として表皮のみ欠損させた分層皮膚欠損創（以下、分層皮膚欠損創群と示す場合がある）に自家培養表皮の移植を行った。
移植に使用する自家培養表皮は、前記１．にて成熟脂肪細胞を採取し、かつ前記３．にて全層皮膚欠損創（脂肪露出創）を作成したブタの頸部全層皮膚より作成したＧｒｅｅｎ型培養表皮（ＪＡＣＥ（登録商標）、株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング（Ｊ−ＴＥＣ））であった。ＪＡＣＥ（登録商標）は既に培養皿より酵素処理により剥離され、創面に接する面（培養皿に接着していた面）が上になってキャリアとなる不織布上に付着した状態で無菌的にパッケージされていた。本実施例では本発明のモデルに併せて２×３ｃｍ大の大きさに作成されたＪＡＣＥ（登録商標）（自家ブタ培養表皮）を使用した。
このパッケージを開封して創面に自家培養表皮を移植した。この際、自家培養表皮に対する処理は特に必要なく、また縫合などの固定も必要なかった。移植した培養表皮上のキャリアを除去して親水性ポリウレタンフォームドレッシング材（ＨｙｄｒｏＳｉｔｅ（登録商標），ｓｍｉｔｈ＆ｎｅｐｈｅｗ社製）で被覆した。
【００２７】
自家培養表皮を移植してから１４日後の各創（一部）の様子を図２に示した。また、各創の組織を採取し、電子顕微鏡にて観察した結果を図３〜７に示した。
その結果、図７に示されるように、人工真皮に脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）を添加した真皮再建テンプレート移植群は、対照である分層皮膚欠損創群と同様に、基底膜および係留線維（アンカリングフィブリル，ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｌ，ＡＦ（以下、単にＡＦと示す場合がある））が現れ、正常皮膚と同等の基底膜構築が起こっていることが確認できた。これは、図５に示される同種皮膚＋ＤＦＡＴ移植群も同様であった。
図４に示される同種皮膚移植群においても基底膜は現れているものの、ＡＦは非常に限局的に現れているだけであり、自家培養表皮の生着は図１、５、７に示されるよりも弱いことが示された。また、図６に示される人工真皮移植群においては、基底膜構築が断続的であり、ＡＦも現れていないことから自家培養表皮の生着がかなり弱いことが確認できた。
【００２８】
各群におけるコラーゲンタイプＩＶおよびラミニンの発現を、それぞれ、ウサギポロクローナル抗コラーゲンタイプＩＶ抗体（ａｂ６５８６，  ａｂｃａｍ社製）およびマウスモノクローナル抗ラミニン抗体（ａｂ４９７２６，  ａｂｃａｍ社製）を１次抗体として酵素抗体ＬＳＡＢ（Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔ  Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ）法により免疫染色した。
その結果を図８、図９に示した。
その結果、図８に示される様にいずれの群においてもコラーゲンタイプＩＶの発現が確認できたが、図９に示されるように、真皮再建テンプレート移植群、同種皮膚＋ＤＦＡＴ移植群ではいずれもラミニンの発現が確認できたが、同種皮膚移植群、人工真皮移植群においては、十分な発現が確認できなかった。
【００２９】
これらの結果を表１にまとめた。
表１に示されるように、人工真皮のみを移植した場合には、十分な自家培養表皮の生着が起こらないが、ＤＦＡＴとともに人工真皮を移植した場合には、基底膜、ＡＦ、コラーゲンタイプＩＶおよびラミニンのいずれにおいても発現が確認され、自家培養表皮の生着率が向上することが確認できた。
これは同種皮膚を移植した場合も同様であり、脱分化脂肪細胞（ＤＦＡＴ）とともに同種皮膚を移植した場合には、同種皮膚のみを移植した場合と比べてＡＦ、ラミニンの発現は向上し、自家培養表皮の生着率も向上することが確認できた。
従って、これらの結果より、本発明の真皮再建テンプレートは、真皮の再構築が可能であり、再構築後の真皮に移植される自家培養表皮が安定して生着でき、脱落しにくい、有用な真皮再建用テンプレートであることが確認できた。
【００３０】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明のＤＦＡＴ細胞を含有した真皮再建用テンプレートの提供により、熱傷等による皮膚欠損の治療にあたり、自家培養表皮等の表皮の生着率を向上することが可能となる。
本発明のＤＦＡＴ細胞を含有した真皮再建用テンプレートは、培養表皮や他の人工真皮と組み合わせてキットとして提供することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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