(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１又は複数の多糖類分解酵素を発現する微生物を培養し、その培養物に賦形剤を添加して噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒を含み、
前記微生物は、パエニバチルス属細菌、アノキシバチルス属細菌、バチルス属細菌及びブレビバチルス属細菌を含む、菌核病防除用微生物農薬。
【請求項２】
前記アノキシバチルス属細菌は、アノキシバチルス・フラビサーマスを含み、
前記バチルス属細菌は、バチルス・コアグランス及びバチルス・メガテリウムを含み、
前記ブレビバチルス属細菌は、ブレビバチルス・ブレビスを含む、請求項１記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項３】
前記噴霧乾燥される培養物が、培養後の微生物菌体及び場合によりその培養上清を含む、請求項１又は２記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項４】
前記乾燥菌体が、核酸を転移し又は複製する能力を不活化した微生物死細胞からなる、請求項１〜３のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項５】
前記賦形剤が、乳糖、スキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス及びアラビアガムからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項６】
前記多糖類分解酵素が、遺伝子組み換え技術により基質特異性を改変したものであるか、及び／又は当該酵素の発現量を増強したものである、請求項１〜５のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項７】
前記微生物が、基質特異性の異なる複数の多糖類分解酵素を誘導発現させた複合酵素産生微生物である、請求項１〜６のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項８】
リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうる、請求項１〜７のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項９】
それぞれの微生物触媒が、他と異なる基質特異性の多糖類分解酵素を含む、複数の微生物触媒を組み合わせてなる複合微生物触媒からなる、請求項１〜８のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項１０】
他の殺菌性化合物をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【請求項１１】
前記菌核病は、トマト菌核病である、請求項１〜１０のいずれか一項記載の菌核病防除用微生物農薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型のみならず遺伝子組換え型の微生物触媒及びその使用に関し、より詳細には、野生型あるいは遺伝子組換え型、その両方に限定しない複数の微生物触媒を組み合わせてなる複合微生物触媒及びその微生物農薬としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の病害虫防除は、農作物の生産を効率よく行うために不可欠な作業であり、これまで植物病原性菌などの防除のために化学農薬が多く使用されてきた。しかし、近年では、化学農薬の濫用による生態系の破壊や汚染と安全な農産物に対する社会的関心が高まるにつれて、化学農薬の代替、あるいは化学農薬と併用すべき手段として、微生物を利用した農薬（いわゆる「微生物農薬」）を用いる、環境に調和した生物防除方法が求められている。
【０００３】
従来、主に作物病原菌に対する抗菌作用を有する微生物として、例えば、病原菌が付着する場所を先に占拠し、植物への感染が起こらないようにする拮抗性糸状菌であるタラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）や、害虫を対象とした微生物農薬として、昆虫病原性細菌であるバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）を利用したＢＴ剤などがあり、これは特にハエ目、チョウ目、甲虫目等の昆虫を対象に適用されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００４】
非特許文献１には、トマトの土壌障害を引き起こすリゾクトニア属の植物病原性糸状菌に対して、バチルス属の細菌培養液で発芽直後の根を処理すると、トマトの葉や根において、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ及びプロテアーゼ等の細胞壁分解酵素の活性が上がり、同時に菌核病感染の抑制作用を示すことが記載されている。しかしながら、この報告では、バチルス属の単独の細菌では最大で６９．７６％の感染抑制効果を示すに留まっている。一般的に、化学農薬では９５％以上の防除効果が求められるところ、微生物農薬にも同様な効果が期待されるが、現在上市されている微生物農薬製品は５０〜６０％の効果に留まる状況である。
【０００５】
一方、微生物農薬では、有効成分である微生物を生菌のまま安定に製剤化できるか、あるいは長期保管中に微生物の活力低下または細胞死を抑制できるかという課題がある。例えば、乾燥粉末である糸状菌胞子を有効成分とし、吸水能を有する吸着剤を必須成分として含むことを特徴とする農業用水和性組成物（特許文献２参照）、糸状菌を有効成分とする微生物農薬製剤に対して一定の乾燥剤を含有することを特徴とする微生物農薬製剤（特許文献３参照）、糸状菌胞子と界面活性剤とを含む混合物に対し、吸水能を有する吸着剤を配合したことを特徴とする農業用水和性組成物（特許文献４参照）などがある。しかしながら、現在のところ保存安定性が充分に達成されているとは必ずしもいえず、保存環境によっては、微生物の活力低下または細胞死が急激に進むため微生物農薬としての効果が低下するという問題点が指摘されている。
【０００６】
さらに、遺伝子組換え生物の使用による生物多様性への悪影響を防止することを目的とした「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書（カルタヘナ議定書）」による規制では、カルタヘナ第一種において、例えば、環境修復技術や金属回収・固定化技術、生物農薬などの分野で、その官庁などからの利用承認アセスメントを、カルタヘナ第二種では、例えば、試薬や工業用原料生産のために遺伝子組換え生物などの拡散防止処置を講ずることが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−００１２３７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２３６０６号公報
【特許文献３】特開２００４−３５４２１号公報
【特許文献４】特開２００２−３２２０１０号公報
【０００８】
【非特許文献１】Solanki MK, et al., Curr Microbiol. 2012, 65(3):330-336. Epub 2012 Jun 10.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、多様な多糖類で構成することによって不溶性を獲得し、難分解性である糸状菌細胞壁を、多糖分解酵素を発現する微生物を利用することで分解可能とした微生物触媒を提供することを課題とする。さらに、保存安定性に優れるとともに、散布後の環境拡散、生態系へ与える影響が少なく、とりわけ環境から新しく未知な能力を獲得することのない微生物農薬に使用可能な、新規な微生物触媒を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
カビに代表される糸状菌には、分枝しながら生長し無性胞子あるいは有性胞子形成などを行い分化することを特徴とするものが多い。その生長や分化においては細胞壁の合成や分解が重要な要素として考えられる。そこで本発明者らは、植物病原性糸状菌の細胞壁を構成するβ−グルカンやキチン、キトサン、マンナンなどの多様な多糖類を、生長や分化の過程において、病原性糸状菌自身を含む微生物が生産する多糖分解酵素を逆に利用し生物触媒化することで、植物病原菌の活動を抑制することを企図した。さらに、細胞壁の合成や分解の過程において、β−グルカンやキチン、キトサン、マンナンのみならず、様々な長さの糖鎖が出現することを鑑みるに、糸状菌細胞壁を単一の酵素で分解することは容易でないことから、多糖分解酵素を高発現させた微生物触媒を多彩に構成させた複合微生物触媒を応用することが効果的であろうとの仮説に基づいて検討を行った結果本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下の構成を含む。
【００１１】
［１］１又は複数の酵素を発現する微生物を培養し、その培養物に賦形剤を添加して噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。
［２］前記噴霧乾燥される培養物が、培養後の微生物菌体及び場合によりその培養上清を含む［１］記載の微生物触媒。
［３］前記乾燥菌体が、実質的に生細胞を含まない、すなわち、核酸を転移し又は複製する能力のない微生物死細胞からなる［１］又は［２］記載の微生物触媒。
［４］前記賦形剤が、乳糖、スキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス及びアラビアガムからなる群より選択される［１］〜［３］いずれか記載の微生物触媒。
［５］前記酵素が、多糖類分解酵素である［１］〜［４］いずれか記載の微生物触媒。
［６］前記多糖類分解酵素が、遺伝子組み換え技術により基質特異性を改変したものであるか、及び／又は当該酵素の発現量を増強したものである［５］記載の微生物触媒。
［７］前記微生物が、基質特異性の異なる複数の多糖類分解酵素を誘導発現させた複合酵素産生微生物である［１］〜［６］いずれか記載の微生物触媒。
［８］植物病原性微生物防除用である［１］〜［７］いずれか記載の微生物触媒。
［９］リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうる［１］〜［８］いずれか記載の微生物触媒。
［１０］［１］〜［９］いずれか記載の微生物触媒を含む微生物農薬。
［１１］それぞれの微生物触媒が、他と異なる基質特異性の多糖類分解酵素を含む、複数の微生物触媒を組み合わせてなる複合微生物触媒からなる、［９］記載の微生物農薬。
［１２］他の殺菌性化合物をさらに含む、［１０］又は［１１］記載の微生物農薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る微生物触媒は、生物多様性の保全から使用が困難であった微生物、例えば、産業上有用な微生物にもかかわらず、核酸を転移し又は複製する能力を有する細胞に該当したり、あるいは遺伝子組換え生物であったりして、その利用ができなかった微生物の利用を可能にすることを特徴とする。
また、本発明の好ましい実施形態では、基質特異性の異なる多糖分解酵素類、あるいはそれらを分泌する微生物、遺伝子組換えで基質特異性を改変した多糖分解酵素類、あるいはそれらを発現又は分泌する遺伝子組換え微生物を、多種複合することで、不溶性であったり、多様な糖鎖で構成されたりする難分解性の糸状菌細胞膜へ優位な破壊作用を示す複合微生物触媒として製造される微生物農薬を特徴とする。
これらにより、生物多様性の保全に影響を及ぼすと懸念される遺伝子組換え生物を含む細胞生物の農薬とした利用が簡便となり、したがって、世界における有用微生物の開放系での利用範囲も大きく拡がるであろうことから、産業の活性化が期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ビフェニル分解経路と関係する酵素を示す。
【図２】異なる賦形剤を用いて作製した微生物触媒の酵素活性の評価結果（ｎ＝３）である。
【図３】ＤＬＳ法による微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布を表わす。
【図４】凍結保存した生菌体（コントロール）の電顕像である。
【図５】酵素を誘導発現させた後に噴霧乾燥させ作製した微生物触媒の電顕像である。
【図６】リン酸塩緩衝液に再懸濁した微生物触媒の電顕像である。
【図７】単離源であるバイオマス材料に含まれる微生物群由来の遺伝子には、多糖分解酵素の一種であるキチナーゼ遺伝子が含まれていることを示す。
【図８】実施例７で行ったトマト病害抑制効果の試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の微生物触媒は、産業上有用となる微生物種において、必要とする単独の酵素や、代謝に関わる一連の酵素群を、あらかじめ高発現させた上で、細胞や酵素などの生体試料保護作用のある賦形剤、例えば、糖質類などを加えて希釈増量し、スプレードライヤーなどで強制乾燥させることで、微生物としては死滅している（すなわちカルタヘナ法での生物の定義として、核酸を転移し、または複製する能力を有しない生体由来物質となる）が、その細胞の形態や構造を維持させることで、細胞内あるいは細胞表面に存在する酵素活性を維持させる性質や、基質となる物質の細胞膜透過性を保存していることを特徴とする。
【００１５】
（植物病原性糸状菌とその細胞壁分解酵素）
本発明は、微生物に含まれる多糖類分解酵素により、植物病原性糸状菌の細胞壁を構成する多糖類を分解して溶菌させることを特徴とする。この溶菌作用を担っているのはβグルカナーゼやキチナーゼ、キトサナーゼ、マンマナーゼなどの溶菌酵素であり、例えば、微生物由来のキチン分解酵素が土壌伝搬性の病原菌(Rhizoctonia solani)の細胞壁に存在するキチンを分解することにより、その病原菌の増殖を抑制することが報告されている（Solanki MK, et al., Phytoparasitica. 2010, 39:471-481）。本発明の微生物触媒は、このような溶菌酵素活性の高い酵素を有する微生物が好ましい。これらの微生物触媒に用いる微生物もしくは溶菌酵素は、病原性糸状菌細胞壁に存在するキチンやキトサン、グルカンなどと特異なアフィニティを持ち、これにより溶菌酵素がキチンやキトサン、グルカンなどと接触して細胞壁が分解し、結果として病原性糸状菌が溶菌する。
具体的には、穀類や芋などの食用植物種子や苗へ感染している、あるいは感染するフザリウム属、ピシウム属、リゾプス属、トリコデルマ属、リゾクトニア属などの植物病原性糸状菌の菌糸などの細胞壁が生長・分化する過程を狙って破壊するという高活性型の複合微生物触媒を殺菌剤として用いる。
【００１６】
本発明の微生物触媒は、多糖類を加水分解する酵素を、例えば、糖鎖のグリコシド結合を加水分解するヒドロラーゼに属する酵素種などを、自らの細胞内に強発現させる、あるいは発現した酵素を細胞表面あるいは細胞外へ分泌することができる微生物種であることが好ましい。このような微生物を取得する方法としては、多糖類を豊富に含む甲殻類や海藻類などの天然バイオマス原料を、それぞれ０．１％から１％までを含む固相培地を用いて単離することができ、例えば、バシラス網細菌種やシュードモナス属細菌種等が得られる。具体的なバシラス網細菌種としては、パエニバチルス・ムシラギノサス、パエニバチルス・ポリミキサ、パエニバチルス・テラエなどを含むパエニバチルス属細菌や、バチルス・シュードファーマス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・コアグランス、バチルス・サイトトキシカス、バチルス・メガテリウムなどを含むバチルス属細菌、アノキシバチルス・フラビサーマスなどを含むアノキシバチルス属細菌、ブレビバチルス・ブレビスなどを含むブレビバチルス属細菌であり、一方のシュードモナス属細菌種としては、シュードモナス・デニトリフィカンスやシュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アエルギノーサなどを含む。これらの微生物種には、植物に感染する糸状菌などの細胞壁成分である多糖類を加水分解する酵素種が、その細胞内外に多く分布していると考えられる。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、基質特異性の異なる複数の多糖類分解酵素を誘導発現させた複合酵素産生微生物を用いることができる。本発明に用いる多糖類分解酵素は、セルラーゼやアミラーゼなどと共通の加水分解機構を持っており、触媒反応に関与する領域（触媒ドメイン）のアミノ酸配列は相同性を有する。また、触媒ドメインの他に、セルラーゼ等が有する糖質結合モジュール(CBM: carbohydrate binding module)と共存していてもよい。セルラーゼに存在するCBMは、不溶性の基質と結合して、隣接する触媒ドメインを不溶性基質へ結合させる。したがって、触媒ドメインの構造のみならず、糖質結合モジュールの構造が異なる複数の多糖類分解酵素を同時に発現させることにより、基質特異性の異なる複合酵素産生微生物を取得することができる。本発明に用いることのできるグリコシドヒドロラーゼは、アミノ酸配列の相同性に基づいて多くのファミリーに分類されており、例えば、ＣＡＺＹデータベース(Carbohydrate-Active enZYmes Database, http://www.cazy.org/)等を参照して所望の構造と機能を有するグリコシドヒドロラーゼを取得することができる。
【００１８】
また、グリコシドヒドロラーゼの一種であるセルロース分解性嫌気性細菌の中には、セルラーゼ複合体（セルロソーム）を形成して細胞外へ分泌することが知られている(Gilbert, H.J. Mol. Microbiol. 63:1568-1576, Bayer, E.A. et al., Chem. Rec. 8, 364-367)。嫌気性細菌のセルラーゼ複合体は、触媒活性のない骨格タンパク質(CBM)と、複数の触媒ドメインとが結合して形成される。両サブユニットは、それぞれの構造の中に存在するコヘシン−ドックリンドメイン間の特異的な相互作用によって複合体を形成していることが知られている。骨格タンパク質に存在する疎水性の高い繰り返しドメインはコヘシン（cohesin）と呼ばれ、酵素サブユニットがもつ２４アミノ酸の繰り返し配列からなるドックリン（dockerin）と結合して複合体を形成する。したがって、本発明の微生物触媒においても、このようなコヘシン−ドックリン様構造を導入することによって、触媒ドメインを特定の骨格ドメインに結合させたり、あるいはコヘシン−ドックリン様の結合を介して、細胞膜表面に触媒ドメインを固定化することも可能である。このような微生物触媒を用いることにより、分泌タンパク質である多糖類分解酵素類を微生物の細胞膜表面に固定化濃縮することができる。
【００１９】
本明細書において、酵素や微生物について言及する場合、用語「野生型」とは、自然界に存在する酵素又は微生物、又はそれらの天然の突然変異体を含む。一方、「遺伝子組み換え型」とは、クローン化した野生型の遺伝子を遺伝子組み換え技術により改変し、当該酵素の基質特異性等を改変したものをいう。なお遺伝子に変異を導入する方法には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えば、エラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A. L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001等に記載されている。これらの手法によって作製された突然変異遺伝子を、もとの微生物のゲノムＤＮＡと置換するか、プラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡにクローン化して宿主微生物に導入し、新規な微生物を作製することも可能である。本発明に使用しうる多糖類分解酵素、又はそれを産生する微生物は、このような方法により、当業者であれば容易に作製することができる。
【００２０】
（微生物の培養法）
次に、上記で示した多糖類分解酵素類を高発現する微生物菌体を、速やかに、高い回収率で得る培養法について述べる。
使用する培地は、多糖類を豊富に含む甲殻類や海藻類などの天然バイオマス原料を、それぞれ０．１％から１％までを含む、液体の栄養培地（以下、「多糖類含栄養培地」とする）を用いる。オートクレーブによる滅菌の後にｐＨ６．５〜７．５で調整したものが望ましい。
【００２１】
本培養に至る前に、微生物種の増殖速度にもよるが、多くとも２段階の前培養を行う事が望ましく、最初に培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、多糖類含栄養培地を２〜３ｍｌまで入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ、ＯＤ６６０＝０．０５〜０．９までとなるように微生物を混和させた溶液である−８０℃以上で凍結保存したワーキングセルを、解凍後、速やかに播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を摂氏３７〜５５度まで、ＯＤ６６０＝０．１〜０．９まで培養し、次に培地量に対し５倍程度の容積のフラスコなどに入れた同じく多糖類含栄養培地２７０〜３００ｍｌまでにその全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３７〜５５℃まで、ＯＤ６６０＝０．１〜０．９まで培養する。
【００２２】
本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型でも良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく多糖類含栄養培地２．７〜３Ｌまでへ、前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は５００〜７００ｒｐｍまでの範囲とし、空気の場合は３〜５Ｌ／ｍｉｎまでとし、温度は３７〜５５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は、排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。本方法で、最終的にＯＤ６６０＝０．３〜０．４までで、湿重量が０．５〜１ｇまでの多糖類分解酵素を高発現する微生物菌体が得られる。
【００２３】
（賦形剤の添加と乾燥方法）
前に述べた、それぞれの方法で得られた菌体及び／又はその培養液を、安定的に保存するために乾燥する。菌体は、重力あるいは遠心による回収時において、生理食塩水あるいは２０ｍＭのリン酸塩緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム塩を用いるのが良い。培養液は、そのまま又は濃縮して保存することもできる。その後、菌体や酵素などの生体由来材料に対し保護作用を示す賦形剤を添加する。例えば、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムなどの糖質を用い、菌体濃度５〜１５％（ｗ／ｖ）までに対し１〜３％（ｗ／ｖ）まで加えると、最終的に−２０〜−８０℃までに温度制御された冷凍庫などで保存できる。とりわけ乳糖は、費用対効果や生体由来材料の保護作用の面で優れているので、これを用いることが望ましい。
【００２４】
得られた多糖類分解酵素を高発現する微生物菌体及び場合によりその培養液の乾燥法、すなわち、本発明の最終形態となる微生物触媒の触媒化の方法について述べる。
賦形剤とした糖質類と混合した湿菌体の乾燥は、凍結乾燥機やドラムドライヤー、スプレードライヤーを用いることができるが、スプレードライヤーが望ましい。例えば、試作用としては、ＥＹＥＬＡ製ＳＤ−１０００型を用いる。本機は、乾燥経路において、蒸発缶とサイクロンを備える。乾燥に重要な入口温度として、蒸発缶前の吸気管に温度センサーが取り付けてあり、また出口温度として、蒸発缶とサイクロンの間に温度センサーが取り付けてある。本乾燥工程においては、本機の入口温度を１００〜１２０℃まで、出口温度を６０〜７０℃までの範囲で設定することが望ましい。その他に、ブロア風量は毎分０．７５立米までとし、噴霧圧力は７０〜９０ｋＰａ、送液量は毎分５〜１５ｍＬまでとする。
【００２５】
賦形剤とした糖質、０．４〜０．６ｇまでと混合して凍結した菌体、あるいは培養後、糖質と混合して凍結せず用意した湿菌体を２〜３ｇまでを用い、最終液量２２〜２８ｍＬまでに調製した試料を、上記に示す設定を施したスプレードライヤーなどが指定する試料容器に入れて、取り付ける。実際に乾燥作業に入る前に、蒸留水などを通液して、出口温度を適値へと調節してから行うことが望ましい。本乾燥工程から回収された乾燥菌体は０．２〜０．７ｇまでとなり、投入した原材料の重量に対する紛体の収率は３２〜４９％（ｗ／ｗ）までとなる。
【００２６】
他方で、菌体のみ、及び賦形剤を含む菌体原液両方を加温加熱、水分のみを蒸発させ、その残留固形分を秤量した結果から、原液固形分濃度（スラリー濃度）を導き出した結果、菌体のみで０．０３ｇ／ｍＬ、賦形剤とした糖質で、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを含む菌体の全てで０．０５ｇ／ｍＬであった。したがって、触媒中の菌体量は６０％（ｗ／ｗ）であり、賦形剤とした糖質は４０％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする微生物触媒が完成する。
【００２７】
（微生物の複合化）
本発明の微生物触媒に含まれる微生物は、植物病原性微生物の防除に有用な、１又は複数の酵素を発現しうる微生物であれば特に限定されないが、基質特異性の異なる複数の多糖類分解酵素を誘導発現させた複合微生物であることが好ましい。本発明において、「複合微生物」とは、基質特異性の異なる複数の酵素、特に，多糖類分解酵素を発現する複数の微生物群（集団）のことであって、個々の微生物に単離されることなく自然界に存在するままの不均一な微生物集団であってもよい。あるいは、その中から個々の微生物を単離し、それらを種菌として混合するか又は均一な微生物として増殖させた後、これらを任意の比率で混合し、複合化させたものであってもよい。
好ましい実施形態では、他の微生物とは異なる基質特異性を有する多糖類分解酵素を含むそれぞれの微生物を単離し、これら個々の微生物を用いて作製された複数の微生物触媒を組み合わせることで、防除対象とするそれぞれの植物病原性微生物に適した微生物農薬や、あるいは、多くの植物病原性微生物に対する幅広い抗菌スペクトルを有する微生物農薬を調製することができる。
【００２８】
（分散性）
本発明に係る微生物触媒は、リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうることが、その効果を十分に発揮する上で好ましい。本発明の微生物触媒は、その菌体表面で基質となる植物病原性微生物と接触する必要があることから、接触面積を増やすために、できるだけ小さな微粒子状の形態を有することが有利だからである。
【００２９】
（微生物農薬としての使用）
本発明に係る微生物触媒は、植物病原性微生物防除用、すなわち、微生物農薬としての使用に適しており、具体的にはイネいもち病；イネ紋枯病；イネ苗立枯病；イネ苗立枯細菌病；イネばか苗病；イネもみ枯細菌病；キュウリ炭そ病；キュウリ、メロン、キャベツ、ハクサイ、タマネギ、カボチャ、ブドウのべと病；小麦、大麦、キュウリうどんこ病；バレイショ、トウガラシ、ピーマン、スイカ、カボチャ、タバコ、トマトの疫病；小麦のセプトリア病；トマト輪紋病；柑橘類の黒点病；柑橘類のみどりかび病；ナシ黒星病；リンゴ斑点落葉病；タマネギの白色疫病；スイカの褐色腐敗病；各種の灰色かび病、菌核病、さび病、斑点細菌病などの病害；フザリウム菌、ピシウム菌、リゾクトニア菌、バーティシリウム菌などの植物病原性微生物によって引き起こされる各種土壌病害に対して優れた防除効果を示す。該微生物触媒は、さらに具体的にはバレイショ、トウガラシ、ピーマン、スイカ、カボチャ、タバコ、トマトの疫病；キュウリ、メロン、キャベツ、ハクサイ、タマネギ、カボチャ、ブドウのべと病；芝のピシウム病、赤焼病、葉腐病（ブラウンパッチ、ラージパッチ）などによる病害に対して特に優れた防除効果を示す。
【００３０】
本発明に係る微生物農薬を構成する有効成分は、従来の農薬製剤の場合と同様に、各種補助剤と配合し、乳剤、粉剤、水和剤、液剤、粒剤、懸濁製剤などの種々の形態に製剤化することができる。これら製剤品の実際の使用に際しては、そのまま使用するか、又は水等の希釈液で所定濃度に希釈して使用することができる。ここにいう補助剤としては、担体、乳化剤、懸濁剤、増粘剤、安定剤、分散剤、展着剤、湿潤剤、浸透剤、凍結防止剤、消泡剤などが挙げられ、必要により適宜添加すればよい。担体としては、固体担体と液体担体が挙げられ、固体担体としては、澱粉、砂糖、セルロース粉、シクロデキストリン、活性炭、大豆粉、小麦粉、もみがら粉、木粉、魚粉、粉乳などの動植物性粉末；タルク、カオリン、ベントナイト、有機ベントナイト、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、ゼオライト、ケイソウ土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ、シリカ、硫黄粉末、消石灰などの鉱物性粉末などが挙げられ、液体担体としては、水；大豆油、綿実油などの植物油；牛脂、鯨油などの動物油；エチルアルコール、エチレングリコールなどのアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、イソホロンなどのケトン類；ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類；ケロシン、灯油、流動パラフィンなどの脂肪族炭化水素類；トルエン、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、シクロヘキサン、ソルベントナフサなどの芳香族炭化水素類；クロロホルム、クロロベンゼンなどのハロゲン化炭化水素類；ジメチルホルムアミドなどの酸アミド類；酢酸エチルエステル、脂肪酸のグリセリンエステルなどのエステル類；アセトニトリルなどのニトリル類；ジメチルスルホキシドなどの含硫化合物類あるいはＮ−メチル−２−ピロリドン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどが挙げられる。展着剤としては、アルキル硫酸ソーダ、アルキルベンゼンスルホン酸ソーダ、リグニンスルホン酸ソーダ、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが挙げられる。
【００３１】
また、本発明において、他の農薬、例えば殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺土壌害虫剤、抗ウイルス剤、誘引剤、除草剤、植物生長調製剤等を混用することもでき、この場合には一層優れた効果を示すことがある。本発明の微生物触媒は、すでに死滅した微生物細胞であるため、他の殺菌性化合物と併用しても有効成分である酵素活性に影響がないため、生細胞を含む通常の微生物農薬よりも好ましい。
【００３２】
殺菌剤成分（殺菌性化合物）としては、例えば、ビテルタノール、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジニコナゾール、エニルコナゾール、エポキシコナゾール、フルキンコナゾール、フェンブコナゾール、フルシラゾール、フルトリアホール、ヘキサコナゾール、イミベンコナゾール、イプコナゾール、メトコナゾール、ミクロブタニル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、シメコナゾール、トリアジメホン、トリアジメノール、テブコナゾール、テトラコナゾール、トリチコナゾール、プロクロラズ、ペフラゾエート、イマザリル、トリフルミゾール、シアゾファミド、ベノミル、カルベンダジム、チアベンダゾール、フベリダゾール、エタボキサム、エトリジアゾール、オキスポコナゾールフマル酸、ヒメキサゾール、アゾキシストロビン、ジモキシストロビン、エネストロブリン、フルオキサストロビン、クレソキシムメチル、メトミノストロビン、オリザストロビン、ピコキシストロビン、ピラクロストロビン、トリフロキシストロビン、カルボキシン、ベナラキシル、ボスカリド、ビキサフェン、フェンヘキサミド、フルトラニル、フラメトピル、メプロニル、メタラキシル、メフェノキサム、オフラセ、オキサジキシル、オキシカルボキシン、ペンチオピラド、チフルザミド、チアジニル、ジメトモルフ、フルモルフ、フルメトベル、フルオピコリド、カルプロパミド、ジクロシメット、マンジプロパミド、フルアジナム、ピリフェノックス、ブピリメート、シプロジニル、フェナリモル、フェリムゾン、メパニピリム、ヌアリモール、ピリメタニル、トリホリン、フェンピクロニル、フルジオキソニル、アルジモルフ、ドデモルフ、フェンプロピモルフ、トリデモルフ、フェンプロピジン、イプロジオン、プロシミドン、ビンクロゾリン、ファモキサドン、フェナミドン、オクチリノン、プロベナゾール、アニラジン、ジクロメジン、ピロキロン、プロキナジド、トリシクラゾール、カプタホル、キャブタン、ダゾメット、ホルペット、フェノキサニル、キノキシフェン、アミスルブロム、マンゼブ、マンネブ、メタム、メチラム、ファーバム、プロピネブ、チウラム、ジネブ、ジラム、ジエトフェンカルブ、イプロバリカルブ、ベンチアバリカルブイソプロピル、プロパモカルブ塩酸塩、チオファネートメチル、ピリベンカルブ、ボルドー液、塩基性塩化銅、塩基性硫酸銅、水酸化第二銅、８−ヒドロキシキノリン銅、ドジン、イミノクタジンアルベシル酸塩、イミノクタジン酢酸塩、グアザチン、カスガマイシン、ストレプトマイシン、ポリオキシン、オキシテトラサイクリン、バリダマイシンＡ、ビナパクリル、ジノカップ、ジノブトン、ジチアノン、イソプロチオラン、エジフェンホス、イプロベンホス、ホセチル、ホセチルアルミニウム、ピラゾホス、トルクロホスメチル、クロロタロニル、ジクロフルアニド、フルスルファミド、ヘキサクロロベンゼン、フサライド、ペンシクロン、キントゼン、シフルフェナミド、シモキサニル、ジメチリモール、エチリモール、フララキシル、メトラフェノン、スピロキサミン、アンバム、硫黄、石灰硫黄合剤、エクロメゾール、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム、チアジアジン、チクロフタラム、トリアジン、ノニルフェノールスルホン酸銅、ヒドロキシイソキサゾール、フルオルイミド、ポリカ一バメート、メタスルホカルブ、ＥＤＤＰ、ＩＢＰ、トルフェンピラド、フルオピラム、イソチアニル、及びイソピラザムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
殺虫剤成分としては、例えば、アセタミプリド、ピメトロジン、フェニトロチオン、アセフェート、カルバリル、メソミル、カルタップ、シハロトリン、エトフェンプロックス、テフルベンズロン、フルベンジアミド、フルフェノクスロン、テブフェノジド、フェンピロキシメート、ピリダベン、イミダクロプリド、ブプロフェジン、ＢＰＭＣ、ＭＩＰＣ、マラチオン、メチダチオン、フェンチオン、ダイアジノン、オキシデプロホス、バミドチオン、エチオフェンカルブ、ピリミカーブ、ペルメトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ハルフェンプロックス、シラフルオフェン、ニテンピラム、クロルフルアズロン、メトキシフェノジド、テブフェンピラド、ピリミジフェン、ケルセン、プロパルギット、ヘキシチアゾクス、クロフェンテジン、スピノサド、ミルベメクチン、ＢＴ（バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis））、インドキサカルブ、メタフルミゾン、クロルフェナピル、フィプロニル、エトキサゾール、アセキノシル、ピリミホスメチル、アクリナトリン、キノメチオネート、クロルピリホス、アバメクチン、エマメクチン安息香酸塩、酸化フェンブタスズ、テルブホス、エトプロホス、カズサホス、フェナミフォス、フェンスルフォチオン、ＤＳＰ、ジクロフェンチオン、ホスチアゼート、オキサミル、イサミドホス、ホスチエタン、イサゾホス、チオナジン、ベンフラカルブ、スピロジクロフェン、エチオフェンカルブ、アジンホスメチル、ジスルホトン、メチオカルブ、オキシジメトン・メチル、パラチオン、シフルトリン、ベータ・シフルトリン、テブピリムホス、スピロメシフェン、エンドスルファン、アミトラズ、トラロメトリン、アセトプロール、エチプロール、エチオン、トリクロルホン、メタミドホス、ジクロルボス、メビンホス、モノクロトホス、ジメトエート、フォルメタネート、ホルモチオン、メカルバム、チオメトン、ジスルホトン、ナレッド、メチルパラチオン、シアノホス、ジアミダホス、アルベンダゾール、オキシベンダゾール、フェンベンダゾール、オクスフェンダゾール、プロパホス、スルプロホス、プロチオホス、プロフェノホス、イソフェンホス、テメホス、フェントエート、ジメチルビンホス、クロルフェビンホス、テトラクロルビンホス、ホキシム、インキサチオン、ピラクロホス、クロルピリホス、ピリダフェンチオン、ホサロン、ホスメット、ジオキサベンゾホス、キナルホス、ピレトリン、アレスリン、プラレトリン、レスメトリン、ペルメトリン、テフルトリン、フェンプロパトリン、アルファシペルメトリン、ラムダ・シハルトリン、デルタメトリン、フェンバレレート、エスフェンバレレート、フルシトリネート、フルバリネート、シクロプロトリン、チオジカルブ、アルジカルブ、アラニカルブ、メトルカルブ、キシリカルブ、プロポキスル、フェノキシカルブ、フェノチオカルブ、ビフェナゼート、カルボフラン、カルボスルファン、硫黄、ピリフルキナゾン、フラチオカルブ、ジアフェンチウロン、ジフルベンズロン、ヘキサフルムロン、ノバルロン、ルフェヌロン、クロルフルアズロン、水酸化トリシクロヘキシルスズ、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、メトプレン、ハイドロプレン、ビナパクリル、アミトラズ、��ロルベンジレート、フェニソブロモレート、テトラジホン、ベンスルタップ、ベンゾメート、クロマフェノジド、ハロフェノジド、エンドスルファン、ジオフェノラン、トルフェンピラド、トリアザメート、硫酸ニコチン、チアクロプリド、チアメトキサム、クロチアニジン、ジノテフラン、フルアジナム、ピリプロキシフェン、フルアクリピリム、ヒドラメチルノン、シロマジン、ＴＰＩＣ、チオシクラム、フェナザキン、ポリナクチン複合体、アザディラクチン、ロテノン、ヒドロキシプロピルデンプン、メスルフェンホス、ホスホカルブ、イソアミドホス、アルドキシカルブ、メタム・ナトリウム、酒石酸モランテル、ダゾメット、塩酸レバミゾール、トリクラミド、トルフェンピラド、ピリダリル、クロラントラニリプロール、シエノピラフェン、及びシフルメトフェンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明の微生物農薬の施用方法及び施用量は、病害の種類、適用植物の種類、防除剤の剤型等によって異なるため一概には規定できないが、例えば、適宜水に希釈した液剤や粉剤として地上散布することができる。
または、直接植物の茎や葉に塗布する方法、土壌に散布する方法、植物や土壌に添加する水や肥料に添加する方法、種子にコーティングする方法などが挙げられる。その他、微生物農薬の施用量は、対象病害、対象害虫、対象作物、施用方法、発生傾向、被害の程度、環境条件、使用する剤型などによって変動するので、適宜調整することが好ましい。
【実施例】
【００３５】
以下に本発明の詳細について、微生物触媒の典型的な製造方法及びその性質を確認するための試験方法等の実施例等を挙げて説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
[実施例１]  微生物触媒を用いた生存確認試験
本試験は微生物触媒中に生存する微生物が存在しないことを確認する目的で行った。
本試験には、本発明である触媒化処理を施したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種（ロット番号：ＹＵ１３０９２６ＳＤ−１）を用いた（以下、「本触媒」とする）。本触媒によるビフェニル分解メカニズムについては、図１へ示した。
【００３７】
本触媒は、ビフェニルに対し特異的に反応し、ビフェニルの一方のフェニル環を開裂させる際に、黄色を呈することが判っている。また、この反応の後に、ビフェニル環を二つのフェニル環へと分解するが、この反応に関わる酵素は、加水分解酵素、つまりヒドロラーゼであることが判っている。よって、本触媒はヒドロラーゼ活性も良く保存していることが容易に理解できる。
【００３８】
本触媒を無機液体培地に懸濁し、１４ｍｇ／ｍＬ（菌濁度において、ＯＤ６６０＝１０．８、細菌細胞にして約１×１０１０個／ｍＬに相当）に調製した。無機液体培地は、表１を成分で構成されるものを用いた。
上記懸濁液１０μＬ（約１×１０８個の細菌細胞を含む）を、０．１％ビフェニルを含む無機液体培地２ｍＬに添加し、温度３０℃、１２０ｒｐｍで、５日間振盪培養を行ったが、菌体の生育による顕著な濁度の上昇は確認されなかった。
また、無機培地を主成分とした固形培地が入った培養皿に、唯一の炭素源として、ビフェニルをその蓋に固定し、上記で調製した本触媒の懸濁液を無機培地で１×１０−４倍に希釈した溶液４０μＬ（約４０，０００個の細菌細胞を含む）を播種して、温度３０℃で一定とした環境で、５日間の培養を試みた。一方、ＬＢ培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）を１／５に希釈した栄養固形培地を用いて、上記同様の培養実験も試みた。その結果、両試験において、本触媒特有の、ビフェニル分解を示す黄色の呈色ならびに、菌コロニー形成・発育を認めなかった。
以上の結果から、本発明において作製した微生物触媒中に、生存する菌体は含まれていないことが示された。
【００３９】
【表１】
0006619557.tif 000002
【００４０】
[実施例２]  異なった糖質で作製した微生物触媒の活性確認試験
本試験では、微生物触媒中の酵素活性の残存評価を目的に試験を行った。
本試験には、本発明である触媒化処理を、賦形剤とした糖質である、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを用いて、それぞれスプレードライヤーで乾燥したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種（ロット番号：ＹＵ１２０９１７ＳＤ−１〜８）を用いた（以下、「本触媒」とする）。本触媒には、加水分解酵素、つまりヒドロラーゼも含まれていることが、実施例１からも、判っている。よって、本触媒はヒドロラーゼ活性も良く保存していることが容易に理解できる。
【００４１】
微生物触媒液の調整は、乾燥した本触媒を、適量の２０ｍＭリン酸塩緩衝液で再懸濁することで試験溶液を調製した。
次に、試験反応溶液を、材質が全てガラスか少なくとも容器の内面がガラスライナーとなった反応容器にて、前述の試験溶液をＯＤ６６０＝１０となるようこれへ投入し、基質としては、５ｍｇ／ＬのカネクロールＫＣ−３００を、反応液全量が５００μＬとなるように投入した。
反応は５０ｒｐｍで転倒撹拌し、反応温度は３０℃にて、全体の温度が均一となるよう、３時間または２４時間行った。分解反応後の、各反応溶液中の未分解のポリ塩化ビフェニルの残量とするガスクロマトグラフィー質量分析計（以下、ＧＣ／ＭＳとする）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ７８９０Ａ／５９７５Ｃ）で測定した結果を、以下の表２及び図２に示した。
【００４２】
ＧＣ／ＭＳへ導入する試料の調製法については、文献(Miyauchi et al. JOUNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING Vol.105, No.6, 628-635. 2008)を参考に、あらかじめポリ塩化ビフェニルの分析ピークに重ならない物質を内部標準物質としたアントラセンと塩酸を添加したポリ塩化ビフェニル抽出反応液にその倍量の酢酸エチルを加えて、遠心分離を２，７００〜６，４００×ｇまでで１０分間行い、有機相側の上清を回収した。遠心分離の際、有機相と水相の間にエマルジョンが解消されない場合は、少量のエタノールを添加すると良い。またポリ塩化ビフェニルの抽出効率を高めるために、この操作を２回繰り返した。抽出液を硫酸ナトリウムにて脱水後、適宜、酢酸エチルでＧＣ／ＭＳの感度に応じて希釈し、ＧＣ／ＭＳへ注入して計測した。
【００４３】
【表２】
0006619557.tif 000003
【００４４】
以上の結果から、表２ならびに図２が示したように、本触媒の酵素活性の低下は、コントロールである凍結菌体と比較して、およそ２０％〜３０％までの範囲で抑えることができると示された。また、糖質の中でも、最も高い活性保存性を示したのがショ糖であったが、活性が高く再現性にも優れ、リン酸緩衝液への溶解性、対費用効果に優れるなど、産業利用上、乳糖が賦形剤としては最も優れていると考えられた。
【００４５】
[実施例３]  微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布
微生物触媒の物理化学的特性を確認する目的で、乳糖を用いて微生物触媒化した試料の、粒子サイズとサイズ分布の確認を行った。
ドライスプレーでの乾燥工程において、糖質が細胞全体を均一に包み込みながら乾燥することで、複数の細胞が凝集することが懸念される。その結果、微生物触媒全体から見た、基質と細胞との接触面積が減少することから、触媒活性に大きな影響を及ぼすことが想定された。本試験では、微生物触媒が細胞ごとに均一に糖質で包含され乾燥し、反応時のリン酸塩緩衝液へ懸濁されても良く分散されているかを観察した。
【００４６】
本試験には、本発明である触媒化処理を施したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種（ロット番号：ＹＵ１３０９２６ＳＤ−１）を用いた（本触媒）。
試験懸濁液は、本触媒がＯＤ６６０＝０．１となるよう、適量の２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．５）を用い、再懸濁して調製した。
試験懸濁液内の微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布は、動的光散乱法(Dynamic Light Scattering法、以下、「ＤＬＳ法」とする)を用いて調べた。測定機器はＭａｌｖｅｒｎ社製、ゼータサイザーナノＺＳを使用した。本機器の設定パラメーターは、微生物細胞のＲｅｆｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘを、１．３７〜１．３９までの範囲（Katz et al. JOUNAL OF SELECTED TOPICS IN QUANTUM ELECTRONICS Vol.9, No.2, 277-287. 2003）で、１．３９が望ましく、蒸留水となる溶媒のＲｅｆｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘを１．３３、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｍｐｌｅを１Ｃｅｎｔｉｐｏｉｓｅ（ＣＰ）、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｔｉｍｅを１２０秒、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを２５℃として、計測を行った。
【００４７】
上記の結果から、図３に示すように、本触媒の平均粒子サイズは９０４．２ｎｍで、おおよそ一般的微生物細胞のサイズに近似であることが判った。
【００４８】
[実施例４]  微生物触媒の電顕像
微生物触媒の物理化学的特性を確認する目的で、乳糖を用いて微生物触媒化した試料の、細胞膜の形態や構造の保存性確認を行った。
本確認は、走査型電子顕微鏡を用いて行った。分析機器はキーエンス株式会社製、ＶＥ−９８００を用いた。微生物細胞の固定法は、最初に、適量の微生物触媒を懸濁した溶液を１ｍＬ用意し、これをメンブレン膜（メルクミリポア製、アイソポア０．２μｍ ＧＴＴＰ）で濾過して微生物細胞を固定する。次に、このメンブレン膜を２％グルタルアルデヒド溶液に１時間浸漬させた後、蒸留水で流洗し、５０％〜９０％まで１０％毎、最後は９８％の水エタノール溶液へ順次、３０分間、浸漬して脱水を完了させる。微生物触媒が固定されたメンブレン膜は、１００％エタノールで保存でき、あるいは脱水後速やかに、日本電子株式会社製、Fine coat ion sputter JFC-1100を用いて金を蒸着させた後、検鏡することができる。
【００４９】
コントロールとして凍結保存した生菌体の電顕像を図４に、乳糖を賦形剤として噴霧乾燥した微生物触媒の電顕像を図５に、そしてこれをリン酸塩緩衝液に再懸濁した微生物触媒の電顕像を図６に示す。図４ならびに図５、図６が示すように、最も酵素活性が高く凍結保存された菌体と同様に、乾燥状態の微生物触媒やリン酸塩緩衝液に再懸濁した微生物触媒も、微生物細胞全体の形態が良く保たれ、細胞膜の構造にも大きなダメージを受けていないことが確認できた。したがって、本発明によって作製された微生物触媒は、形態面や構造面から見た場合、細胞膜内外に適切に酵素を固定化できており、基質の細胞膜透過性を維持していることが、本試験から示唆された。
【００５０】
[実施例５]  農業用バイオマス資材（単離源）に含まれる多糖分解酵素遺伝子の確認
農業用バイオマスとして市販されている各種資材の中には、これを施用することによって、農作物の病気への耐性が向上する優れた効果を発揮するものがある。これらのバイオマスから有用微生物を単離するために、農作物が病気にかかりにくい兆候を示したバイオマス単離源に、あらかじめ多糖類分解酵素を発現する微生物が含まれているかを、キチナーゼ遺伝子を指標にＰＣＲ法で確認した。
バイオマス単離源を１．５ｍＬチューブに入れ、これを煮沸して含まれる総ゲノムＤＮＡを取得し鋳型とした。次に、以下のような配列のキチナーゼ遺伝子を増幅するためのプライマ―を作製し、ＰＣＲ法を用いてキチナーゼ遺伝子産物を取得した。その際に、文献；Ramaiah N, Hill RT, Chun J, Ravel J, Matte MH, Straube WL, Colwell RR (2000) Use of a chiA probe for detection of chitinase genes in bacteria from the Chesapeake Bay. FEMS Microb Ecol 34:63-71を参考にプライマーを作製した。
F(ChiA) : 5'- GA TAT CGA CTG GGA GTT CCC -3'（配列番号１）
R(ChiA) : 5'- CAT AGA AGT CGT AGG TCA TC -3'（配列番号２）
【００５１】
ＰＣＲ法は、サーマルサイキュラー（MultiGene Mini、Labnet International Inc.（米国、ニュージャージー州））を用いて、その反応条件を次のようにして行った。
９４℃（５分）の後、９８℃（１０秒）→５４℃（１５秒）→７２℃（４５秒）を３５回繰返し増殖反応させて、最後に７２℃（２分）→２２℃（１分）で酵素を失活させ反応を停止させた。
上記のＰＣＲ法で得られた遺伝子断片を電気泳動し、図７のような目的とするバンドが２７０ｂｐに出現し、糸状菌細胞膜の物理的強度を担う主要構成成分であるキチンを加水分解するキチナーゼ産生菌の存在が示された。
【００５２】
[実施例６]  バイオマス単離源からの有用微生物の単離と同定
本発明で用いたバイオマス単離源の農作物に対する病害防除性を検討する上で、実施例５のデータから、キチナーゼを含む多糖分解酵素を発現する微生物の存在が判った。本防除性については、多糖分解酵素を発現する微生物の関与が疑われたので、有用性のある微生物の単離を試みた。さらに単離した微生物種の同定を遺伝子レベルで行った。
【００５３】
１  培地の調製
培地成分は、以下の表のように天然由来原料を用いて作製した。
【表３】
0006619557.tif 000004
【００５４】
重量１００〜１３０ｍｇまでの培地を×１単位として、×５又は×２５を、それぞれ３００ｍＬの蒸留水が入ったビーカーに入れ、５分間煮沸することで各成分を溶出させた。このとき、溶出液に混じった不溶性の粒子は定性濾紙を用いて濾過して取り除き、さらにろ液をオートクレーブにて１２１℃、３０分間滅菌処理し、滅菌後の培地ｐＨを７．０とした。×５をＥ５培地と称し、×２５をＥ２５培地と称した。集積培養で用いる固形培地は、液体培地（Ｅ５培地又はＥ２５培地）に寒天を３％となるように加え、再度滅菌処理した後、プラスチック製培養プレートへ流し込み、固めて用いた。
【００５５】
２  微生物の単離
２０ｍＬの蒸留水を入れた１００ｍＬのフラスコに、バイオマス単離源を投入して４８℃、１２０ｒｐｍにて振盪培養を行った。同様に３０℃、１２０ｒｐｍの条件でも振盪培養を行った。２４時間培養後、単離源溶液とＥ寒天培地プレートによる集積培養法を用いてシングルコロニーを単離した。
【００５６】
３  微生物種の同定
単離した菌を、１．５ｍＬチューブに集菌し、これを煮沸してゲノムＤＮＡを取得した。このゲノムＤＮＡを鋳型とした。次に、以下のような配列の細菌リボソーム領域に関連するユニバーサルプライマ―を作製し、ＰＣＲ法を用いてリボソーム遺伝子産物を取得した。
F(Bact-8F)   : 5’- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’（配列番号３）
R(Bact-907R) : 5’- CCC CGT CAA TTC CTT TGA GTT T -3’（配列番号４）
ＰＣＲ法は、サーマルサイキュラー（MultiGene Mini、Labnet International Inc.（米国、ニュージャージー州））を用いて、その反応条件を次のようにして行った。
９４℃（３分）の後、９４℃（３０秒）→５０℃（３０秒）→７２℃（５４秒）を３０回繰返し増殖反応させて、最後に７２℃（２分）→２２℃（１分）で酵素を失活させ反応を停止させた。
上記のＰＣＲ法で得られた遺伝子断片を、電気泳動の後にゲル抽出法により精製してDNAシークエンス解析へ供した。シークエンスで得た遺伝子情報からBLAST解析を行い、単離菌種の推定を行った。
【００５７】
４  結果
表４へ単離・推定した微生物種を示した。
【表４】
0006619557.tif 000005
【００５８】
[実施例７]  単離微生物によるトマト病害抑制効果の評価
実施例５で単離したバシラス網を近縁とする細菌種から６種類の有用細菌株(Paenibacillus sp. YAE3株、Anoxybacillus fravithermus YAE4株、Bacillus coagulans YAE5株、Brevibacillus brevis YAE8株、Bacillus sp. YAE9株、Bacillus megaterium YAE12株)を選抜し、これらで再構成した微生物集団によってトマト病害防除ができるかどうか検討した。
【００５９】
１  複合微生物資材の製作
マスターセルバンク化した上記６種類の種菌の一部を、それぞれ適した種類の２ｍＬのＥ培地に播種して試験管で定常期まで増殖させて前培養した。続いてこれらの前培養液（２ｍＬ×６）を２８８ｍＬのＥ５培地へ播種し、２Ｌのフラスコで温度４８℃、振盪回転数１２０ｒｐｍにて１２時間培養した。本培養は、５Ｌスケールのジャー・ファーメンター（ＢＭＳ−Ｃ型、エイブル株式会社）を用い、実培養液量２．７ＬのＥ５培地に、先の前培養液３００ｍＬを投入、温度４８℃、通気量４Ｌ／分、回転撹拌６００ｒｐｍ（回転子、タービン型）、排圧０．０１ＭＰａにて２４時間培養した。
製剤化を想定し、上記培養液を、高速遠心機（ＳＰＲＥＭＡ２１、トミー精工株式会社）を用い、６０００×ｇ、４℃にて２０分間の遠心分離により菌体と培養液を分離した。回収した菌体は、液体窒素で急速凍結し、ディープフリーザー内で１週間以上保存した。一方、培養液上清は、４℃の冷蔵庫内で同じく１週間以上保存し、安定性を観察した。
【００６０】
２  複合微生物のトマト苗への散布
タキイミディ１９５（タキイ種苗）のトマト品種を被検体とし、散布群及び非散布群それぞれ３０苗のトマト幼苗（育苗開始４５〜５０日目を定植した）を準備した。上記ディープフリーザー保存した微生物複合細菌を氷上で解凍し、冷蔵庫で保存した培養液上清と再混合して複合微生物資材とした。
トマトへの散布は、最初に複合微生物資材を水道水で５００倍希釈し、直ちにトマトの葉の両面と、茎には滴るぐらいに、さらに土の表面も湿る程度散布した。散布間隔は１週間に１度とし、用いた複合微生物資材は引き続き冷蔵庫で保管して継続使用した。
【００６１】
３  結果
散布開始１か月後のトマトの葉の写真を図８に示す。非散布群では矢印で示したように、菌核病(Pestalotiopsis sp.)が発症した（３０／３０例、発症率１００％）が、散布群ではわずかに２例しか発生せず（２／３０例、発症率６．７％）、カビ由来の菌核病に対する感染防御あるいは既感染増殖の抑制効果が認められた。
【図１】
0006619557.tif 000006
【図２】
0006619557.tif 000007
【図３】
0006619557.tif 000008
【図４】
0006619557.tif 000009
【図５】
0006619557.tif 000010
【図６】
0006619557.tif 000011
【図７】
0006619557.tif 000012
【図８】
0006619557.tif 000013
【配列表】
0006619557000001.app