(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体への経口投与のために処方される、有効量の複数種の精製された胞子形成細菌を含む組成物であって、前記細菌が、クロストリジウム・ヒレモネ、ブラウチア・プロヅクタおよびクロストリジウム・ブチリクム、ならびに、これらのいずれかの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌からなる群から選択される１種以上を含み、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の栄養物を有する栄養培地中で独立して増殖可能である、組成物。
【請求項２】
前記細菌が、クロストリジウム・ヒレモネ、ブラウチア・プロヅクタおよびクロストリジウム・ブチリクム、ならびに、これらのいずれかの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌からなる群から選択される２種以上を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細菌が、
クロストリジウム・ヒレモネまたはクロストリジウム・ヒレモネの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、ならびに、
クロストリジウム・ブチリクムまたはクロストリジウム・ブチリクムの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細菌が、
クロストリジウム・ヒレモネまたはクロストリジウム・ヒレモネの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
ブラウチア・プロヅクタまたはブラウチア・プロヅクタの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、ならびに
クロストリジウム・ブチリクムまたはクロストリジウム・ブチリクムの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌が、コリンセラ・アエロファシエンス、クロストリジウム・テルチウム、クロストリジウム・ディスポリクム、クロストリジウム・イノキュウム、クロストリジウム・マヨンベイ、コブロコッカス・コメス、クロストリジウム・ボルテエ、クロストリジウム・シンビオスム、クロストリジウム・オルビシンデンス、ルミノコッカス・グナブス、ルミノコッカス・ブロミイおよびオイバクテリウム・レクタレ、ならびに、これらのいずれかの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌からなる群から選択される１種以上をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌が、
ｉ）ブラウチア・プロヅクタもしくはブラウチア・プロヅクタの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、および、
クロストリジウム・ブチリクムもしくはクロストリジウム・ブチリクムの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
または
ｉｉ）クロストリジウム・ヒレモネもしくはクロストリジウム・ヒレモネの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
ブラウチア・プロヅクタもしくはブラウチア・プロヅクタの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
クロストリジウム・ブチリクムもしくはクロストリジウム・ブチリクムの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、および、
コリンセラ・アエロファシエンスもしくはコリンセラ・アエロファシエンスの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌
である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
哺乳動物被験体への経口投与のために処方される、有効量の複数種の精製された胞子形成細菌を含む組成物であって、
前記細菌が、クロストリジウム・オルビシンデンスもしくはクロストリジウム・オルビシンデンスの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
および
オイバクテリウム・レクタレもしくはオイバクテリウム・レクタレの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌を含み、
クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の栄養物を有する栄養培地中で独立して増殖可能である、組成物。
【請求項８】
哺乳動物被験体への経口投与のために処方される、有効量の複数種の精製された胞子形成細菌を含む組成物であって、
前記細菌が、コリンセラ・アエロファシエンスもしくはコリンセラ・アエロファシエンスの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
クロストリジウム・イノキュウムもしくはクロストリジウム・イノキュウムの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌、
コブロコッカス・コメスもしくはコブロコッカス・コメスの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌および
ルミノコッカス・ブロミイもしくはルミノコッカス・ブロミイの１６Ｓと少なくとも９７％の配列同一性を有する１６Ｓを有する細菌を含み、
クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の栄養物を有する栄養培地中で独立して増殖可能である、組成物。
【請求項９】
前記精製された胞子形成細菌が胞子である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記細菌が、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度のグルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮ)、または、ビオチン、パントテン酸塩およびピリドキシン、を有する栄養培地中で独立して増殖可能である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記閾値濃度が、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度の９０％以下、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度の５０％以下、またはクロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度の１０％、５％または１％である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細菌が、グルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮ)からなる群、またはビオチン、パントテン酸塩およびピリドキシンからなる群から選択される栄養物の濃度を有する栄養培地中でクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％または少なくとも５０％速い速度で独立して増殖可能である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細菌が、ビオチン、パントテン酸塩、ピリドキシン、グルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮ)の濃度を有する栄養培地中でクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で独立して増殖可能である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細菌が、１種以上の必須炭水化物栄養物、１種以上の必須アミノ酸栄養物、または１種以上の必須ビタミンまたはミネラル栄養物の限定濃度を有する栄養培地中でクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で独立して増殖可能である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細菌が、(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％または少なくとも５０％速い速度で独立して糖化することができる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細菌が、
(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で独立して糖化することができる細菌、ならびに
(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％より速い速度で、またはクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％低い濃度で、あるいはその組み合わせで、グルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮ)からなる群から選択される栄養物を独立して解糖することができる細菌
である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
哺乳動物被験体におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の処置のための方法に用いられる請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、該方法が、有効量の前記組成物を前記被検体に経口投与するステップを含み、
前記組成物が、
(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で独立して糖化することができる細菌、ならびに
(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)前記被験体の消化管に機能的に住み着き、且つクロストリジウム・ディフィシルによる消化管の個体群を防止するような条件下において、クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％より速い速度で、またはクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％低い濃度で、あるいはその組合せで、グルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮ)からなる群から選択される栄養物を独立して解糖することができる細菌を含む、組成物。
【請求項１８】
哺乳動物被験体におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の処置のための方法に用いられる請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、該方法が、有効量の前記組成物を前記被検体に経口投与するステップを含み、
前記組成物が、
(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)前記被験体の消化管に機能的に住み着き、且つクロストリジウム・ディフィシルによる消化管の個体群を防止するような条件下において、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の炭素含有栄養物を有する栄養培地中で増殖可能である細菌を含む、組成物。
【請求項１９】
哺乳動物被験体における細菌性病原体または細菌病原性片利共生菌の感染の処置のための方法に用いられる請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、該方法が、有効量の前記組成物を前記被検体に経口投与するステップを含み、
前記組成物が、
(ｉ)単離され、且つ(ｉｉ)被験体の消化管に機能的に住み着き、且つ前記細菌性病原体または前記細菌病原性片利共生菌による消化管の個体群を防止するような条件下において、前記細菌性病原体または前記細菌病原性片利共生菌のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の栄養物を有する栄養培地中で増殖可能である細菌を含む、組成物。
【請求項２０】
哺乳動物被験体におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の処置のための方法に用いられる、または哺乳動物被験体における細菌性病原体もしくは細菌病原性片利共生菌の感染の処置のための方法に用いられる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物であって、該方法が、有効量の前記組成物を被験体に経口投与するステップを含む、組成物。
【請求項２１】
前記胞子形成細菌が、糞便物質から精製および単離されたものである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許仮出願第６１／７６０，５８４号（２０１３年２月４日出願）および米国特許仮出願第６１／７６０，５８５号(２０１３年２月４日出願)および米国特許仮出願第６１／７６０，５７４号(２０１３年２月４日出願)および米国特許仮出願第６１／７６０，６０６号(２０１３年２月４日出願)および米国特許仮出願第６１／９２６，９１８号(２０１４年１月１３日出願)に対する優先権を主張する。これらの出願は、すべての目的のためにそれらの記載内容が参照により本明細書中にすべて組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、２５９６９ＰＣＴ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ（２０１４年３月２０日作成）と名付けられた４，１６３，５４９バイトのサイズのテキストファイルとして電子版配列表を含む。配列表は、参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
消化(ＧＩ)管中、皮膚上、ならびにその他の上皮および組織ニッチ、例えば口腔、眼表面および膣中で、微生物によりコロニー形成される。消化管は、豊富な、かつ多様な微生物コミュニティを保有する。それは複合系であり、多数の異なる種または生物体、例えば多様な菌株の細菌のコミュニティのための環境またはニッチを提供する。数百の異なる種が、健常者におけるＧＩ管中に片利共生コミュニティを形成し得るし、生物体のこの補完物は、誕生時から進化して、最終的には、約３年齢までに機能的に成熟した微生物集団を形成する。これらの集団における微生物株間の、ならびに微生物と宿主、例えば宿主免疫系との間の相互作用は、供給源の利用可能性および供給源に関する競合を有するコミュニティ構造を造形して、微生物の分布に影響を及ぼす。このような供給源は、生育のための食物、場所、空間の利用可能性、あるいは微生物が付着し得る物理的構造物であり得る。例えば宿主食餌は、ＧＩ管フローラを造形することに関与する。
【０００４】
健常微生物は、多重利益、例えば広範囲の病原体に対するコロニー形成耐性、必須栄養物生合成および吸収、ならびに健常腸上皮および適切に制御された全身免疫を保持する免疫刺激を宿主に提供する。「腸内菌共生バランス失調」または共生崩壊という状況で、微生物叢機能は、失われるかまたは狂わされて、病原体に対する感受性増大、代謝プロフィール変化、または前炎症性徴候の誘導を生じ、これらが局所的または全身的炎症または自己免疫を引き起こし得る。したがって、腸微生物叢は、多数の疾患および障害、例えば腸の種々の病原体感染の病因において有意の役割を果たす。例えば、正常な腸微生物叢が広範囲の抗生物質の使用のためにかき乱された場合、被験体は病原体感染に対してより感受性になる。これらの疾患および障害の多くは、被験体の生活の質を有意に減少する慢性症状であり、最終的には死をもたらし得る。
【０００５】
プロバイオティクスのメーカーは、細菌の彼らの製剤が、ＧＩ管中の天然微生物叢を防止し、異所性免疫応答における正常制御を補強することにより、哺乳動物の健康を促進する、と力説してきた。例えば、米国特許第８，０３４，６０１号を参照。しかしながら、プロバイオティクスは、属の非常に狭い群に、ならびに対応する限定数の種に限定されている。このようなものとして、それらは、無くなった天然微生物叢を適切に取り替えることも、多数の状況におけるＧＩ管の腸内菌共生バランス失調を矯正することもしない。さらに、このようなプロバイオティクスは、病原性細菌による消化管の集団を低減することにより、例えばクロストリジウム・ディフィシルによる消化管の病原性細菌感染を防止し、低減し、または処置するためには不十分である。
【０００６】
このように、開業医は、病原性細菌感染を防止するかまたは処置するための方法および組成物を必要としている。複数の有益な特性、例えばそれらの細菌株についての理解ならびに微生物性組成物の有用性および商業化を増強する特性の分析を基礎にして、病原性細菌よりも上の速度で、およびそれより低い濃度で、栄養物を代謝する能力を有する単離細菌株の細菌組成物をわれわれは設計している。
【０００７】
したがって、微生物叢機能を回復し、または増強する手段として、胃腸病の防止、診断および／または処置のための永続的、効率的かつ有効な組成物および方法に対する必要性に応答して、被験体を処置するための組成物および方法を提供することにより、従来技術のこれらのおよびその他の欠点に我々は取り組んでいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、病原性細菌生育、増殖および／またはコロニー形成を防止するかまたは低減し、それにより１つ以上の型の非病原性細菌を含有する細菌組成物が消化管中に導入され、単量体または高分子炭化水素栄養物および／またはアミノ酸栄養物および／またはビタミン栄養物に関して病原性細菌と有効に競合する有効な組成物および方法を実証する。あるいは、生物体は、病原性細菌により利用される利用可能な発芽物質を代謝することにより疾患を防止し、病原性胞子発芽を防止し得る。あるいは、消化管に導入される非病原性細菌の２つ以上の型の間で重複する栄養物に関する競合は、１つまたは多数の型の導入非病原性細菌による病原体および／または病原性片利共生菌に対して抑制性の分子の分泌をもたらし得る。ある場合には、抑制性化合物は、毒素、抗生物質またはバクテリオシンであり得る(Ｃｈｉｕｃｈｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｒｏｗｔｈ−ｐｈａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｃｉｎ  Ｊ２５  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００１  Ｍａｒ；１８３（５）：１７５５−６４参照)。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】１６ｓ配列上にマッピングされ(図１Ａ)、１６ｓ配列（配列番号：２０４３）に注釈を付した(図１Ｂ)可変領域を示し、本発明の一実施形態による太字可変領域を伴う。
【図２】他の物質からの胞子分離を実証するＣｓＣｌ勾配の写真である。
【図３】ＣｓＣｌ分離後(中央)、ならびにＣｓＣｌおよびスクロース勾配後(右)の糞便細菌細胞懸濁液(左)の集団を示し、胞子の濃化を実証する。
【図４】エタノール処理胞子製剤およびエタノール処理勾配精製胞子製剤を用いた予防モデルを示す。
【図５】エタノール処理胞子およびエタノール処理勾配精製胞子を用いた再発防止モデルを示す。
【図６】ＣＦＵ計数／ｍｌと比較したＤＰＡ検定の線形範囲を示す。
【図７】エタノール処理胞子処理試料ならびに患者前処置および後処置試料で測定された細菌多様性を示す。
【図８】腸内菌共生バランス失調状態から健常状態へのエタノール処理胞子処理での処置により、患者の細菌生態環境がシフトされることを示す。
【図９】患者におけるバクテロイデス種の増加を示す。
【図１０】エタノール処理胞子製剤での処置後の患者のマイクロバイオームにおける生着種対増加種を示す。
【図１１−１】クロストリジウム・ディフィシルおよび病原体の潜在的競合体を用いた栄養物利用検定の結果を示す。プラス(＋)は、それが試験された単離物に関する栄養物であることを示す。マイナス(−)は、それが試験された単離物に関する栄養物でないことを示す。
【図１１−２】クロストリジウム・ディフィシルおよび病原体の潜在的競合体を用いた栄養物利用検定の結果を示す。プラス(＋)は、それが試験された単離物に関する栄養物であることを示す。マイナス(−)は、それが試験された単離物に関する栄養物でないことを示す。
【図１１−３】クロストリジウム・ディフィシルおよび病原体の潜在的競合体を用いた栄養物利用検定の結果を示す。プラス(＋)は、それが試験された単離物に関する栄養物であることを示す。マイナス(−)は、それが試験された単離物に関する栄養物でないことを示す。
【図１１−４】クロストリジウム・ディフィシルおよび病原体の潜在的競合体を用いた栄養物利用検定の結果を示す。プラス(＋)は、それが試験された単離物に関する栄養物であることを示す。マイナス(−)は、それが試験された単離物に関する栄養物でないことを示す。
【００１０】
図面は、単に例示の目的のための本発明の種々の実施形態を示す。本明細書中に示される構造物および方法の代替的実施形態が本明細書中に委細される本発明の原理から逸脱しない限り用いられ得るということを、当業者は以下の考察から容易に理解するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
「微生物叢」は、動物被験体、典型的には哺乳動物、例えばヒトの体内および体表に生じる微生物、例えば真核生物、古細菌、細菌およびウィルス(細菌性ウィルス、すなわちファージを含む)のコミュニティを指す。
【００１２】
「マイクロバイオーム」は、持続的および一時的の両方で、ヒト身体の内外に棲む微生物、例えば真核生物、古細菌、細菌およびウィルス(細菌性ウィルス、すなわちファージを含む)のコミュニティの遺伝的内容物を指すが、この場合、「遺伝的内容物」は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、例えばリボソームＲＮＡ、エピゲノム、プラスミド、ならびにすべての他の型の遺伝子情報を含む。
【００１３】
「微生物キャリッジ」または単に「キャリッジ」は、ヒトの体内または体表のニッチに棲む微生物の集団を指す。キャリッジは、しばしば、相対的存在度に換算して定義される。例えば、ＯＴＵ１は、総微生物キャリッジの６０％を含み、測定がなされた試料中の他のＯＴＵと比較して、ＯＴＵ１が６０％の相対的存在度を有することを意味する。キャリッジは、ゲノムシーケンシングを基礎にすることが最も多いが、この場合、単一ＯＴＵまたはＯＴＵの群の相対的存在度またはキャリッジは、試料に関するシーケンシング読取値の総数に比してそのＯＴＵに割り当てられるシーケンシング読取値の数により定義される。
【００１４】
「微生物増加」または単に「増加」は、(ｉ)投与される治療用微生物性組成物からの非存在または非検出可能であり(標準ゲノムおよび微生物学的技法を用いて確定した場合)、(ｉｉ)宿主ニッチにおいて非存在、非検出可能または低頻度で存在し、ならびに(ｉｉｉ)微生物性組成物の投与後に見出されるか、または例えば、それらが低頻度で存在する場合、２倍、５倍、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７または１×１０８より大きく有意に増大する微生物の集団の確立または有意の増大を指す。拡大された生態環境を含む微生物は、外因性供給源、例えば食物および環境から獲得され得るし、あるいはそれらが低頻度で棲息する宿主内の微小ニッチから生じる。
【００１５】
治療用微生物性組成物の投与は、これらの共生微生物の生育のための好ましい条件を促進する標的ニッチにおける環境的シフトを誘導する。治療用微生物性組成物による処置の非存在下では、宿主は、これらの微生物に絶えず曝露され得る。しかしながら、持続的生育、ならびに生態環境拡大を含む増大レベルの微生物の安定集団に関連した陽性健康作用は、観察されない。
【００１６】
「微生物生着」または単に「生着」は、処置前に処置宿主中に存在しない標的ニッチにおける治療用微生物性組成物を含むＯＴＵの定着を指す。生着生態環境を含む微生物は、治療用微生物性組成物中に見出され、処置時の宿主微生物生体環境の構成成分として定着する。生着ＯＴＵは、一時的期間中に定着し得るし、または治療用微生物性組成物による処置後に宿主に住み着く微生物生態環境における長期安定性を実証する。生着生態環境は、腸内菌共生バランス失調生態環境から健常状態のうちの代表的な１つへのシフトを触媒し得る共生微生物の生育のための好ましい状態を促す標的ニッチにおける環境的シフトを誘導し得る。
【００１７】
「生態環境ニッチ」または単に「ニッチ」は、生物体または生物体群が占める生態環境空間を指す。ニッチは、生物体または生物体の集団が、供給源の分布、物理的パラメーター(例えば、宿主組織空間)および競合体(例えば、供給源が豊富である場合、ならびに捕食者、寄生生物および病原体が不十分である場合、生育することによる)に応答する方法を、ならびにそれが順次その同一因子を変更する(例えば、他の生物体による供給源へのアクセスを制限し、餌食の捕食者および消費者のための食物供給源として作用する)方法を説明する。
【００１８】
「腸内菌共生バランス失調」は、生態学的ネットワークの正常な多様性および／または機能が乱される腸または他の身体域、例えば粘膜または皮膚表面の微生物叢またはマイクロバイオームの状態を指す。このような腸内菌共生バランス失調が健康の検出可能な低下を生じない場合でも、微生物叢の好ましい(例えば、理想的)状態からのあらゆる崩壊は腸内菌共生バランス失調とみなされ得る。この状態の腸内菌共生バランス失調は不健康であり得るし、それはある条件下でのみ不健康であり得るし、またはそれは被験体がより健康になるのを妨げ得る。腸内菌共生バランス失調は、多様性の減少、１つ以上の病原体または病原性片利共生菌の過剰生育、ある遺伝的および／または環境的条件が患者に存在する場合にだけ、疾患を引き起こし得る共生生物体、あるいは宿主に有益な機能をもはや提供せず、したがって健康をもはや促進しない生態環境ネットワークへのシフトのためであり得る。
【００１９】
「病原性片利共生菌」という用語は、ある種の遺伝的または環境的因子に応答して免疫媒介性病態および／または疾患を誘発し得る健常宿主において見出される特定の細菌種を指す(Ｃｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．２３：４７３−８０）。したがって、病原性片利共生菌は、後天的感染性生物体とは機械論的に異なる病原体である。したがって、「病原体」という用語は、後天的感染性生物体および病原性片利共生菌の両方を包含する。
【００２０】
「病原体」、「病原性片利共生菌」および「病原性」という用語は、細菌または任意のその他の生物体または存在物と関連して、このような生物体または存在物を含有する宿主生物体の疾患、障害または症状を引き起こすかまたはそれに影響を及ぼし得る任意のこのような生物体または存在物を包含する。
【００２１】
「系統樹」は、限定組の系統的復元アルゴリズム(例えば、節減法、最尤法またはベイジアン法)を用いて生成されるある遺伝子配列と別のものとの進化的関係の図形表現を指す。系統樹の分岐点は、別個の先祖系列を表し、任意の分岐点の確実性は、分枝不確実性を測定するブートストラップまたはベイジアン事後確率により提供される。
【００２２】
操作的分類単位「ＯＴＵ」(または複数「ＯＴＵｓ」)は、系統樹における末端葉を指し、核酸配列、例えば全ゲノムまたは特定遺伝子配列、ならびに種のレベルでこの核酸配列と配列同一性を共有するすべての配列により定義される。いくつかの実施形態では、特定遺伝子配列は、１６Ｓ配列、または１６Ｓ配列の一部分であり得る。他の実施形態では、２つの存在物の全ゲノムは、シーケンシングされ、比較される。別の実施形態では、選定領域、例えば多遺伝子座配列タグ(ＭＬＳＴ)、特定遺伝子または遺伝子の組は、遺伝的に比較され得る。１６Ｓ実施形態では、全１６Ｓまたは１６Ｓのいくつかの可変領域を通して≧９７％の平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵｓは、同一ＯＴＵとみなされる(例えば、Ｃｌａｅｓｓｏｎ  ＭＪ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  Ｏ，Ｇｒｅｅｎｅ−Ｄｉｎｉｚ  Ｒ，Ｃｏｌｅ  ＪＲ，Ｒｏｓｓ  ＲＰ，ａｎｄ  Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  ＰＷ．２０１０．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍ  ｖａｒｉａｂｌｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８：  ｅ２００．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ  ＫＴ，Ｒａｍｅｔｔｅ  Ａ，ａｎｄ  Ｔｉｅｄｊｅ  ＪＭ．２００６．Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｒａ．Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３６１：１９２９-１９４０参照）。完全ゲノム、ＭＬＳＴ、特定遺伝子または遺伝子組を伴う実施形態では、≧９５％平均ヌクレオチド同一性を共有するＯＴＵｓは、同一ＯＴＵとみなされる(例えば、Ａｃｈｔｍａｎ  Ｍ，ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ  Ｍ．２００８．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：４３１-４４０．Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｉｓ  ＫＴ，Ｒａｍｅｔｔｅ  Ａ，ａｎｄ  Ｔｉｅｄｊｅ  ＪＭ．２００６．Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｒａ．Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３６１：１９２９-１９４０参照）。ＯＴＵｓは、生物体間の配列を比較することにより定義されることが多い。一般的に、９５％未満の配列同一性を有する配列は、同一ＯＴＵの一部を構成するとみなされない。ＯＴＵｓは、さらにまた、ヌクレオチドマーカーまたは遺伝子の任意の組合せ、特に高度保存遺伝子(例えば「ハウスキーピング」遺伝子)またはその組合せにより特性化され得る。このような特性化は、例えばＷＧＳデータまたは全ゲノム配列を用いる。
【００２３】
「残留棲息部位産物」は、ヒトまたは動物の体内または体表の微生物叢に関する棲息部位から得られる物質を指す。例えば、微生物叢は、消化管中の糞便中、皮膚それ自体のうえ、唾液中、気道の粘液中または泌尿生殖管の分泌物(すなわち、微生物コミュニティに関連した生物学的物質)中に棲息する。残留棲息部位産物を実質的に含有しないとは、細菌組成物が、ヒトまたは動物被験体の上または中の微生物環境に関連した生物学的物質をもはや含有しないということを意味し、微生物コミュニティに関連したあらゆる夾雑生物学的物質の１００％無含有、９９％無含有、９８％無含有、９７％無含有、９６％無含有または９５％無含有である。残留棲息部位産物は非生物物質(例えば未消化食物)を含み得るし、あるいはそれは、望ましくない微生物を含み得る。残留棲息部位産物の実質的無含有は、細菌組成物がヒトまたは動物からの検出可能細胞を含有しないということ、そして微生物細胞だけが検出可能であるということも意味し得る。一実施形態では、残留棲息部位産物の実質的無含有は、細菌組成物が検出可能なウィルス(細菌性ウィルス(すなわち、ファージ)を含む)、真菌、マイコプラズマ夾雑物を含有しない、ということも意味し得る。別の実施形態では、それは、微生物細胞と比較して、１ｘ１０−２％、１ｘ１０−３％、１ｘ１０−４％、１ｘ１０−５％、１ｘ１０−６％、１ｘ１０−７％、１ｘ１０−８より少ない細菌組成物中の生育可能細胞がヒトまたは動物である、ということを意味する。この純度を成し遂げるための多数の方法が存在するが、そのどれもが限定的でない。したがって、夾雑物は、連続単一コロニーからの反復(例えば、限定されないが、２回)画線が単一コロニー継代を示すまで、固体培地上で、多数の画線ステップを介して所望の構成成分を単一コロニーに単離することにより低減され得る。あるいは、夾雑物の低減は、多数回連続希釈して、多数回１０倍連続希釈により、単一所望細胞にすること(例えば、１０-８または１０-９の希釈液)により、成し遂げられ得る。これはさらに、多数の単離コロニーが同様の細胞形状およびグラム染色行動を有するということを示すことにより、確証され得る。適切な純度を確証するための他の方法としては、遺伝子分析(例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング)、血清学および抗原分析、酵素的および代謝的分析、ならびに所望の構成成分を夾雑物と区別する試薬を用いる、例えばフローサイトメトリーのような計器を用いる方法が挙げられる。
【００２４】
「クレード」は、系統樹の統計学的に妥当な分岐点の下流にある系統樹のＯＴＵまたは成員を指す。クレードは、別個の単系統進化単位であり、ある程度の配列類似性を共有する系統樹中の一組の末端葉を含む。
【００２５】
微生物学において、「１６Ｓシーケンシング」または「１６Ｓ−ｒＲＮＡ」または「１６Ｓ」は、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子(単数または複数)を含むヌクレオチドを特性化することにより得られる配列を指す。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡは、約１５００ヌクレオチド長であり、系統発生的アプローチを用いて、ある細菌単離物の、別のものとの進化的関係および配列類似性を再構築するに際して用いられる。１６Ｓ配列は、それらが概して高度保存されるが、しかし大半の細菌の属および種を識別するのに十分なヌクレオチド多様性を保有する特定の超可変領域を含有するので、系統的再構築のために用いられる。
【００２６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの「Ｖ１〜Ｖ９領域」は、細菌試料の遺伝子型分類のために用いられる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第１〜第９超可変領域を指す。細菌におけるこれらの領域は、大腸菌系の命名法を基礎にした番号付けを用いて、それぞれヌクレオチド６９〜９９、１３７〜２４２、４３３〜４９７、５７６〜６８２、８２２〜８７９、９８６〜１０４３、１１１７〜１１７３、１２４３〜１２９４および１４３５〜１４６５により限定される(Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  エシェリキア  コリ，ＰＮＡＳ  ７５（１０）：４８０１−４８０５（１９７８））。いくつかの実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８およびＶ９領域のうちの少なくとも１つが、ＯＴＵを特性化するために用いられる。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３領域が、ＯＴＵを特性化するために用いられる。別の実施形態では、Ｖ３、Ｖ４およびＶ５領域が、ＯＴＵを特性化するために用いられる。別の実施形態では、Ｖ４領域が、ＯＴＵを特性化するために用いられる。目的の候補配列を参照配列と比較し、参照長可変領域との類似性に基づいて超可変領域を同定することにより、当業者は候補１６Ｓ  ｒＲＮＡの超可変領域を同定し得るし、あるいは、微生物または微生物コミュニティの全ゲノムショットガン（ＷＧＳ）配列特性化を、当業者は用い得る。
【００２７】
「被験体」という用語は、任意の動物被験体、例えばヒト、実験室動物(例えば、霊長類、ラット、マウス)、家畜類(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウおよびニワトリ)、ならびに愛玩動物(例えば、イヌ、ネコおよび齧歯類)を指す。被験体は、腸内菌共生バランス失調、例えば、限定されないが、消化管病原体による感染に罹患していることがあるし、または消化管病原体による感染を発症するかまたは他のものに伝染する危険があり得る。
【００２８】
「表現型」という用語は、個々の存在物の一組の観察可能な特質を指す。例として、個々の被験体は、「健康」または「疾患」の表現型を有する。表現型は存在物の状態を説明し、一表現型内の全存在物は、その表現型を説明する同一組の特質を共有する。個体の表現型は、一部は、または全部が、存在物ゲノムおよび／またはマイクロバイオームと環境との相互作用に起因する。
【００２９】
「ネットワークエコロジー」という用語は、いくつかの数の被験体に同時に生じるＯＴＵのコンソーシアムを指す。本明細書中で用いる場合、「ネットワーク」は、特定の分岐点(すなわち、ＯＴＵ)および縁(特定ＯＴＵｓ間の連結)が別のものとどのように関連しているかを描き、ＯＴＵのコンソーシアムの構造的生態学を限定するグラフにより数学的に定義される。任意の所定のネットワークエコロジーは、固有の系統的多様性および機能的特性を保有する。ネットワークエコロジーは、例えば分岐点が、例えば、限定されないが、酵素、オルソログ群のクラスター（ＣＯＧＳ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ２１０９０）、またはＫＥＧＧ経路（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）のような素子からなる機能に関しても定義され得る。
【００３０】
「ネットワーククラス」、「コアネットワーク」および「コアネットワークエコロジー」という用語は、概して、類似の系統的および／または機能的特質を有する生態環境を含むようコンピューターで決定されるネットワークエコロジーの一群を指す。したがってコアネットワークは、関連ネットワークエコロジーの群(すなわち、クラスター)の、系統的にまたは機能的に限定される重要な生物学的特徴を含有する。コアネットワークエコロジーの一表示は、多数の異なる被験体で観察される一組の系統的または機能的に関連するネットワークエコロジーのコア特徴を表す微生物、典型的には病原性細菌の意図されたコンソーシアムである。多くの場合、コアネットワークは、本明細書中で記載されるように設計される一方で、１つ以上の被験体において観察されるネットワークエコロジーとして存在する。コアネットワークエコロジーは、基礎をなす関連ネットワークエコロジーが崩壊された被験体における腸内菌共生バランス失調を逆転するかまたは低減するために有用である。
【００３１】
「キーストーンＯＴＵ」という用語は、多数のネットワークエコロジーに共通であり、多数の被験体に生じる(すなわち広く行きわたる)ネットワークエコロジーの成員である１つ以上のＯＴＵを指す。キーストーンＯＴＵｓの普遍的性質のため、それらは健常被験体におけるネットワークエコロジーの機能の中心であり、しばしば、疾患を有する被験体において失われているか、または低減レベルで存在する。キーストーンＯＴＵｓは、被験体において、低、中等度または高存在度で存在し得る。
【００３２】
「非キーストーンＯＴＵ」という用語は、ネットワークエコロジーにおいて観察され、キーストーンＯＴＵではないＯＴＵを指す。
【００３３】
「系統的多様性」という用語は、ネットワークを含むＯＴＵに基づいた所定のネットワークエコロジーまたはコアネットワークエコロジーに存在する生物多様性を指す。系統的多様性は相対的用語であり、別のネットワークより比較的により系統学的に多用であるネットワークエコロジーまたはコアネットワークが、より多数の独特の種、属および分類学上の科を含有する、ということを意味する。種、属または分類学上の科の独自性は、一般的に、互いに関してすべての種、属または分類学上の科の遺伝的多様性を表す系統樹を用いて限定される。別の実施形態では、系統的多様性は、系統樹の総分枝長または平均分枝長を用いて測定され得る。
【００３４】
「胞子」または「胞子」の集団は、同一細菌の栄養型より、熱および静菌剤のような環境的影響に耐性であり、典型的には、発芽および伸長し得る細菌(または他の単細胞生物)を包含する。「胞子形成体」または「胞子を形成し得る」細菌は、適切な環境条件下で胞子を生成する遺伝子および生成するために必要な他の能力を含有する細菌である。
【００３５】
「胞子集団」は、組成物中に存在する複数の胞子を指す。本明細書中で用いられる同義語とし得は、胞子組成物、胞子製剤、エタノール処理胞子分画および胞子生態環境が挙げられる。胞子集団は、例えばエタノールまたは熱処理もしくは密度勾配分離、あるいは試料中の胞子の純度、効力および／または濃度を増大するための本明細書中に記載される方法により、提供糞便から精製され得る。代替的には、胞子集団は、栄養体または胞子形態で、単離胞子形成体種または胞子形成体ＯＴＵから、あるいはこのような種の混合物から出発する培養方法により得られる。
【００３６】
一実施形態では、胞子製剤は胞子形成種を含み、この場合、残留非胞子形成種は、化学的または物理的処理、例えばエタノール、洗剤、熱、音波処理等により不活性化されており、あるいは非胞子形成種は、種々の分離ステップ、例えば密度勾配、遠心分離、濾過および／またはクロマトグラフィーにより胞子製剤から除去されており、あるいは不活性化および分離方法が併用されて、胞子製剤を作る。さらに別の実施形態では、胞子製剤は、生育可能非胞子形成体または栄養型の胞子形成体を上回って濃化される胞子形成種を含む。この実施形態では、胞子は、すべての栄養型の細菌と比較して、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍または１０，０００倍より濃く濃化される。さらに別の実施形態では、最終組成物が胞子および胞子形成種由来の栄養細菌を含むよう、胞子製剤中の胞子は、加工および処方中に部分的発芽を経る。
【００３７】
「単離された」という用語は、(１)最初に生成された場合に(天然に、または実験状況で)、それが関連した構成成分のうちの少なくともいくつかから分離された、および／または(２)人の手により生成され、調製され、精製され、および／または製造された細菌または他の存在物または物質を包含する。単離細菌は、このような培養が単一栽培でない場合でも、培養される細菌を含む。単離細菌は、それらが最初に関連した他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％約９０％またはそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離細菌は、純度が８０％より高く、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％より高い。本明細書中で用いる場合、他の構成成分を実質的に含有しないならば、物質は「純粋」である。「精製する」、「精製している」および「精製される」という用語は、最初に産生されるかまたは生成された場合に(例えば、天然に、または実験状況で)、あるいはその初期生成後の任意の時機の間に、それが関連した構成成分のうちの少なくともいくつかから単離された細菌または他の物質を指す。細菌または細菌集団は、例えば細菌または細菌集団を含有する物質または環境から、もしくは培養を通すことにより、産生時または産生後にそれが単離される場合、精製されたとみなされ得るし、精製細菌または細菌集団は、約１０％まで、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９０％より以上に他の物質を含有し、さらに「単離された」とみなされ得る。いくつかの実施形態では、精製細菌および細菌集団は、純度が約８０％より高く、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％以上である。本明細書中で提供される細菌組成物の場合、組成物中に存在する１つ以上の細菌型は、独立して、細菌型を含有する物質または環境中に生成されるか、および／または存在する１つ以上の他の細菌から精製され得る。細菌組成物およびその細菌構成成分は、一般的に、残留棲息部位産物から精製される。
【００３８】
病原体の「抑制」は、本発明の細菌組成物の任意の所望の機能または活性の抑制を包含する。病原体抑制の実証、例えば病原性細菌の生育の減少、または病原性細菌のコロニー形成レベルの低減が本明細書中で提供されるか、そうでなければ、当業者により認識される。病原性細菌の「生育」の抑制は、病原性細菌のサイズの増大を抑制すること、および／または病原性細菌の増殖(または繁殖)を抑制することを包含する。病原性細菌のコロニー形成の抑制は、処理の前および後に、病原体の量または負荷を測定することにより実証され得る。「抑制」または「抑制すること」の作用は、病原体の１つ以上の活性、例えば生育、増殖、コロニー形成および機能の全体的停止および部分的低減を包含する。
【００３９】
「発芽物質」は、宿主生物体中で、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、直接または間接的に、優性胞子型または胞子型の細菌群で存在する細菌の栄養生育を誘導し得る物質または組成物または物理化学的工程である。
【００４０】
「胞子形成誘導剤」は、宿主生物体中で、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、直接または間接的に、細菌における胞子形成を誘導し得る物質または物理化学的工程である。
【００４１】
「細菌胞子の産生を増大する」ことは、活性または胞子形成誘導剤を包含する。「産生」は、栄養細菌細胞の胞子への変換、このような変換の速度の増大、ならびに胞子型の細菌の発芽を減少すること、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの胞子衰退の速度を減少すること、あるいは胞子の産出を増大すること(例えば、固体状排泄物の容積的算出の増大により)を包含する。
【００４２】
宿主生物体の「コロニー形成」は、細菌または他の顕微鏡的生物体の非一過性棲息を包含する。本明細書中で用いる場合、病原性細菌による宿主被験体の消化管(または任意の他の微生物叢ニッチ)の「コロニー形成を低減すること」は、消化管中の病原体の棲息時間の低減、ならびに消化管中の、または消化管の管腔面に接着される病原体の数(または濃度)の低減を含む。接着病原体の低減測定は、例えば生検試料により実証され得るし、あるいは低減は、間接的に、例えば哺乳動物宿主の大便中の病原体負荷を測定することにより測定され得る。
【００４３】
２つ以上の細菌の「組合せ」は、同一材料または生成物中の、あるいは物理的結合生成物中の２つの細菌の物理的共在、ならびに２つの細菌の一時的同時投与または同時局在化を包含する。
【００４４】
「細胞傷害性」活性または細菌は、細菌細胞、例えば病原性細菌細胞を死滅させる能力を包含する。「細胞増殖抑制性」活性または最近は、細菌細胞、例えば病原性細菌細胞の生育、代謝、および／または増殖を部分的にまたは完全に抑制する能力を包含する。
【００４５】
「非食用生成物」を含有しないことは、本明細書中で提供される細菌組成物または他の材料が、実質量の非食用生成物、例えばヒト被験体への投与、例えば経口投与に適した生成物中で、食べられない、有害で、またはそうでなければ望ましくない生成物または材料を有さない、ということを意味する。非食用生成物は、従来技術からの細菌の製剤中にしばしば見出される。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、「ビタミン」という用語は、身体の正常な生育および活性のために少量で不可欠な、ならびに植物および動物性食物から天然に得られるか合成される、種々の脂溶性または水溶性有機物質(非限定例としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３(ナイアシンまたはナイアシンアミド)、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサミンまたは塩酸ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、およびビタミンＢ１２（種々のコバラミン、一般的にビタミンサプリメント中のシアノコバラミン）、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、Ｋ１およびＫ２(すなわち、ＭＫ−４、ＭＫ−７)、葉酸およびビオチンが挙げられる)、プロビタミン、誘導体、類似体のいずれかを含むと理解される。
【００４７】
本明細書中で用いる場合、「ミネラル」という用語は、ホウ素、カルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ニッケル、リン、カリウム、セレン、ケイ素、スズ、バナジウム、亜鉛またはその組合せを含むと理解される。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、「酸化防止剤」という用語は、反応性酸素種(「ＲＯＳ」)ならびにその他のラジカルおよび非ラジカル種により促進される酸化または反応を抑制する種々の物質、例えばベータカロテン(ビタミンＡ前駆体)、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびセレンのうちのいずれか１つ以上を含むと理解される。さらに、酸化防止剤は、他の分子の酸化を遅くするかまたは防止することができる分子である。酸化防止剤の非限定例としては、アスタキサンチン、カロテノイド、コエンザイムＱ１０(「ＣｏＱ１０」)、フラボノイド、グルタチオン、ゴジ(クコの実)、ヘスペリジン、ラクトウォルフベリー、リグナン、ルテイン、リコペン、ポリフェノール、セレン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ゼアキサンチン、またはその組合せが挙げられる。
【００４９】
「発酵産物」は、炭水化物代謝過程を通して細菌または細菌集団により産生される化合物である。これらの代謝産物としては、限定されないが、乳酸塩、酪酸塩、酢酸塩、エタノール、コハク酸塩、蟻酸塩が挙げられる。
【００５０】
生物体が生存し、生育するために用いる物質。この状況において、その例としては、限定されないが、ビタミン、ミネラル、酸化防止剤、発酵産物、補因子、タンパク質、アミノ酸、ヌクレオチド、核酸、脂質、炭水化物およびこれらの分子の代謝産物が挙げられる。
【００５１】
本発明の組成物
細菌組成物
哺乳動物宿主に投与される場合、健常微生物叢の機能を有意義に提供する能力を有するヒト腸微生物叢の細菌および細菌の組合せが提供される。特定の機序に限定せずに考えると、このような組成物は、腸内菌共生バランス失調微生物叢ニッチ中の１つまたは複数の病原性細菌の生育、増殖、発芽および／またはコロニー形成を抑制し、したがって、健常で、多様な、かつ保護的微生物叢がコロニー形成し、腸管腔に棲みついて、病原体または潜在的病原体(例えば、いくつかの細菌は、腸内菌共生バランス失調環境中に存在する場合にのみ、病原性細菌である)を上回る生態学的制御を確立するかまたは再確立する。病原体の抑制は、例えばＣ.ディフィシル、サルモネラ種、腸病原性大腸菌、多剤耐性細菌、例えばクレブシエラおよび大腸菌、カルバぺネム耐性腸内細菌科(ＣＲＥ)、拡張型ベータラクタム耐性腸球菌(ＥＳＢＬ)およびバンコマイシン耐性腸球菌(ＶＲＥ)のような病原体を包含する。
【００５２】
本明細書中で用いる場合、細菌の「型」または１つより多い「型」は、遺伝子レベル、種レベル、亜種レベル、系統レベルで、あるいは本明細書中に記載されるような、そうでなければ当該技術分野で既知の任意の他の分類学的方法により、識別され得る。
【００５３】
本発明は、病原性細菌の生育、増殖および／またはコロニー形成を防止するかまたは低減し、それにより、１つ以上の型の非病原性細菌を含有する細菌組成物が消化管中に導入され、単量体または高分子炭水化物栄養物および／またはアミノ酸栄養物および／またはビタミン栄養物に関して病原性細菌と有効に競合する有効な方法を実証する。あるいは、生物体は、病原性細菌により用いられる利用可能な発芽物質を代謝することにより疾患を防止し、病原性胞子発芽を防止し得る。あるいは、消化管中に導入される２つ以上の型の非病原性細菌の間の重複栄養物に関する競合は、１つまたは多数の型の導入非病原性細菌による、病原体および／または病原性片利共生菌に対して阻害的な分子の分泌をもたらし得る。ある場合には、阻害性化合物は、毒素、抗生物質またはバクテリオシンであり得る(Ｃｈｉｕｃｈｉｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｏｗｔｈ−ｐｈａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｃｒｏｃｉｎ  Ｊ２５  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００１  Ｍａｒ；１８３（５）：１７５５−６４参照）。
【００５４】
ある場合に、腸内細菌クロストリジウム・ディフィシル(Ｃ．ディフィシル)は、その感染がしばしば抗生物質処置の後に起こる日和見病原体である。正常腸微生物叢は、腸がコロニー形成しないようにするＣ．ディフィシルを上回る生態学的制御を発揮し得ること、ならびにこの制御がしばしば、抗生物質処置後にかき乱されることを、動物モデルにおける多数の研究ならびに臨床的観察が実証している。抗生物質処置の注目すべき一作用は、腸微生物叢の変更の結果としての消化管中の組成物および利用可能性栄養物を変えることである。例えば、ストレプトマイシンによるＳＰＦマウスの処置は、抗生物質曝露の１日後にシアル酸の一過性４０倍増大をもたらすが、これは、３日目までに減少し、Ｃ．ディフィシル感染に対する感受性と一致する時間枠である(Ｎｇ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  （２０１３）５０２：９６−９）。Ｃ．ディフィシルは、シアル酸、例えばＮ−アセチル−ノイラミン酸を代謝することが知られているが、これは、腸上皮に沿って共生微生物によりムチンから酵素的に放出される。動物における対照を再確立する実験手段は、腸経路を介して健常動物の正常糞便フローラを移植することであった(例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｋ．Ｈ．，Ｊ  Ｓｉｌｖａ，ａｎｄ  ＦＲ  Ｆｅｋｅｔｙ（１９８１）Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｅｃａｌ  ｆｌｏｒａ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  コリｔｉｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３４（２）：６２６−８）。ヒトでは、糞便微生物叢移植(ＦＭＴ)は、同様の有益な結果を示している(例えば、Ｓｈａｈｉｎａｓ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１２）  Ｔｏｗａｒｄ  ａｎ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｅｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  １６ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ｍＢｉｏ  ３）。
【００５５】
哺乳動物被験体の消化管における定常状態濃度を保持するために（この場合、連続希釈が蠕動波の結果として生じる）、Ｃ．ディフィシルは、少数の栄養物、特に炭水化物、例えばグルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮ）、アミノ酸、ならびにビタミン、例えばビオチン、パントテン酸塩およびピリドキシンの利用可能性に頼っている。ＮＡＧおよびＮＡＮの遊離単糖レベルは、哺乳動物消化管中では低い。代わりに、ＮＡＧおよびＮＡＮは、より高次の炭水化物ポリマー、例えばムチンおよびイヌリン中に存在する。
【００５６】
本発明の一実施形態では、１つ以上の型の非病原性細菌を含有する細菌組成物は、Ｃ．ディフィシルに利用される栄養物を利用することにより、および／またはそれらに利用される発芽物質を代謝することにより、感染を防止するかまたは処置するために消化管に導入される。いくつかの実施形態では、後者は、導入細菌組成物が栄養物(例えば、炭水化物またはビタミン)のうちの１つ以上を導入細菌組成物が、Ｃ．ディフィシルのさらなる生育を抑制する濃度に枯渇するか、あるいは導入細菌および／またはその他の棲息細菌がＣ.ディフィシルを負かすよう、生育速度を低減する場合に達成される。
【００５７】
第一の態様において、Ｃ.ディフィシル栄養利用が重なるか、および／またはクロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の栄養物を有する栄養培地中で独立して増殖し得る有効量の第一型の細菌および第二型の細菌を含む組成物が提供される。ある実施形態では、第一および第二型の細菌は、例えば健常哺乳動物の消化管から単離され、互いに同一でない。
【００５８】
例示的栄養物としては、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、ならびに補因子、例えば発芽物質が挙げられる。例示的ミネラルとしては、鉄、リン、銅、ニッケルおよびマグネシウムが挙げられる。付加的栄養物としては、窒素源、例えばアンモニアまたは尿素が挙げられる。表ＸＸＸ５は、代表的窒素源を含有する。
【００５９】
例示的発酵産物としては、乳酸塩、酪酸塩、酢酸塩、エタノール、コハク酸塩および蟻酸塩が挙げられる。例示的炭水化物栄養物としては、グルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）およびＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮ）が挙げられる。細菌組成物は、Ｃ.ディフィシル栄養利用が重なるか、および／またはクロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度の、以下の：グルコース、マンニトール、フルクトース、ＮＡＧおよびＮＡＮのうちの少なくとも１つを有する栄養培地中で独立して増殖し得る細菌を含有する。ある実施形態では、細菌組成物は、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より各々が低い閾値濃度のグルコース、マンニトール、フルクトース、ＮＡＧおよびＮＡＮを有する栄養培地中で独立して増殖し得る細菌を含む。閾値濃度は、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる栄養の濃度の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約１０％以下であり得る。他の実施形態では、細菌組成物は、所定栄養濃度でＣ．ディフィシルより速く増殖して、限定供給源に関してＣ.ディフィシルを有効に負かし得る細菌を含有する。例えば、２つ以上の型の細菌を有する組成物では、これら２つの型は、独立して、栄養物、例えばグルコース、マンニトール、フルクトース、ＮＡＧおよびＮＡＮ、またはその組合せの濃度を有する栄養培地中で、クロストリジウム・ディフィシルの増殖速度より少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％または３００％より速い速度で増殖し得る。代替的には、例えば濁度、コロニー数、総バイオマス、あるいは本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野で既知の他の手段により確定されるように、Ｃ.ディフィシルにより可能である最大細菌濃度を超える最大細菌濃度に生育し得る２つ以上の型の細菌を有する組成物が提供される。さらに別の実施形態では、細菌組成物は、グルコース、マンニトール、フルクトース、ＮＡＧおよびＮＡＮならびにＣ.ディフィシル生育のために必要なその他の炭水化物を組成物中の細菌の集団が枯渇させるよう、所望の効果を生じる用量で送達される。
【００６０】
例示的ビタミン栄養物としては、ビオチン、パントテン酸塩、葉酸およびピリドキシンが挙げられる。表ＸＸＸ１は、代表的ビタミン、ミネラルおよび補因子を含有する。任意の特定機序に限定せずに、治療用組成物中に存在する細菌は、培地から細菌細胞に１つ以上のビタミンを良好に輸送し得るし、あるいはそれらは、一旦細胞内に存在すると、ビタミン(単数または複数)の利用時により効率的である。
【００６１】
細菌組成物は、Ｃ.ディフィシル栄養利用要件が重なるか、および／またはクロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度のビオチン、パントテン酸塩およびピリドキシンのうちの少なくとも１つを有する栄養培地中で独立して増殖し得る細菌を含む。ある実施形態では、細菌組成物は、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる濃度より低い閾値濃度のビオチン、パントテン酸塩およびピリドキシンの各々を有する栄養培地中で独立して増殖し得る細菌を含有する。閾値濃度は、クロストリジウム・ディフィシル増殖のために必要とされる栄養の濃度の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％または約１０％以下であり得る。他の実施形態では、細菌組成物は、所定栄養濃度でＣ．ディフィシルより速く増殖して、限定供給源に関してＣ.ディフィシルを有効に負かし得る細菌を含有する。例えば、２つ以上の型の細菌を有する組成物では、これら２つの型は、独立して、栄養物、例えばビオチン、パントテン酸塩、ピリドキシン、またはその組合せの濃度を有する栄養培地中で、クロストリジウム・ディフィシルの増殖速度より少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％または３００％より速い速度で増殖し得る。代替的には、例えば濁度、コロニー数、総バイオマス、あるいは本明細書中に記載されるか、またはそうでなければ当該技術分野で既知の他の手段により確定されるように、Ｃ.ディフィシルにより可能である最大細菌濃度を超える最大細菌濃度に生育し得る２つ以上の型の細菌を有する組成物が提供される。さらに別の実施形態では、細菌組成物は、ビオチン、パントテン酸塩およびピリドキシンならびにＣ.ディフィシル生育のために必要な他のビタミンを組成物中の細菌の集団が枯渇させるよう、所望の効果を生じる用量で送達される。
【００６２】
別の態様では、栄養物、例えば高分子炭水化物、グリコシル化タンパク質および／またはビタミンに関してＣ.ディフィシルと競合する有効量の１つ以上の型の細菌を含む組成物が提供される。さらなる態様では、消化管中で他の細菌種を上回る結果的に生じる生成物の糖化および消費の速度を有する有効量の１つ以上の型の細菌を含む組成物が提供される。これらの組成物は、局所的胃腸環境から高分子炭水化物を有効に排除し、これは、そうでなければ、棲息細菌種により加水分解されて、遊離グルコース、ＮＡＧおよび／またはＮＡＮを生じ得る。したがって、クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％早い速度で、独立して糖化し得る第一および第二型の細菌を含む細菌組成物が提供される。高分子炭水化物を消化し、例えばクロストリジウム・ディフィシルによる消費のために培地中に加水分解産物を放出する局所的環境において、他の細菌種より少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％または３００％より速い速度で、独立して糖化し得る第一および第二型の細菌を含む細菌組成物も提供される。選択的消化のために標的にされる適切な炭水化物ポリマーとしては、フルクタン、アラビノキシラン、ラクツロースおよびガラクトオリゴ糖、またはグリコシル化タンパク質、例えばムチンが挙げられる。
【００６３】
複合炭水化物の効率的糖化および単糖類の代謝が可能である細菌型を含む細菌組成物も提供される。例えば、哺乳動物被験体への経口投与のために処方される有効量の第一型の細菌および第二型の細菌を含む組成物であって、第一型の細菌が、(ｉ)単離され、(ｉｉ)第二型の細菌と同一でなく、(ｉｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で独立して糖化し得る、ならびに第二型の細菌が、(ｉ)単離され、(ｉｉ)第一型の細菌と同一でなく、(ｉｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で、またはクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％低い濃度で、またはその組合せで、グルコース、マンニトール、フルクトース、ＮＡＧおよびＮＡＮからなる群から選択される栄養物を独立して糖化し得る組成物が提供される。さらに、哺乳動物被験体への経口投与のために処方される有効量の第一型の細菌および第二型の細菌を含む組成物であって、第一型の細菌が、(ｉ)単離され、(ｉｉ)第二型の細菌と同一でなく、(ｉｉｉ)必要なＣ．ディフィシルを独立して糖化し得る、ならびに第二型の細菌が、(ｉ)単離され、(ｉｉ)第一型の細菌と同一でなく、(ｉｉｉ)グルコース、マンニトール、フルクトース、ＮＡＧおよびＮＡＮからなる群から選択される栄養物を独立して解糖し得る、そして送達細菌がＣ．ディフィシル生育のために必要とされるより低いレベルに栄養物を有効に代謝する組成物が提供される。
【００６４】
さらにまた、哺乳動物被験体への経口投与のために処方される有効量の第一型の細菌および第二型の細菌を含む組成物であって、第一型の細菌が、(ｉ)単離され、(ｉｉ)第二型の細菌と同一でなく、ならびに(ｉｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％速い速度で独立して糖化することができ、第二型の細菌が、(ｉ)単離され、(ｉｉ)第一型の細菌と同一でなく、ならびに(ｉｉｉ)クロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％より速い速度で、またはクロストリジウム・ディフィシルより少なくとも１０％低い濃度で、あるいはその組合せで、グルコース、マンニトール、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン(ＮＡＧ)およびＮ−アセチルノイラミン酸(ＮＡＮ)からなる群から選択される栄養物を独立して解糖することができる組成物を、第一型の細菌および第二型の細菌が被験体の消化管に機能的に住み着き、クロストリジウム・ディフィシルによる消化管の個体群を防止するような条件下で、被験体に経口投与することによる哺乳動物被験体におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の処置のための方法が提供される。
【００６５】
微生物性、例えば細菌組成物は、２つの型の細菌(「二元的組合せ」または「二元的対」と呼ばれる)または２つより多い型の細菌を含み得る。例えば、細菌組成物は、種または操作的分類単位(ＯＴＵ)により限定されるような、あるいはそうでなければ本明細書中で提供されるような、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０または少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または少なくとも４０、少なくとも５０または５０以上の型の細菌を含み得る。
【００６６】
別の実施形態では、細菌組成物中に存在する細胞の型の数は、既知の値またはそれより低い。例えば、このような実施形態では、細菌組成物は、５０またはそれより少ない型の細菌、例えば４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０以下、または９以下の型の細菌、８以下の型の細菌、７以下の型の細菌、６以下の型の細菌、５以下の型の細菌、４以下の型の細菌、または３以下の型の細菌を含む。別の実施形態では、細菌組成物は、２から４０以下まで、２から３０以下まで、２から２０以下まで、２から１５以下まで、２から１０以下まで、または２から５以下までの型の細菌を含む。
【００６７】
種により記述される細菌組成物
表１における種から選ばれる単離細菌の少なくとも２つの型を含む細菌組成物が調製され得る。
【００６８】
一実施形態では、微生物性、例えば細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：エンテロコッカス・フェカリス(以前は、ストレプトコッカス・フェカリスとして既知)、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ラモスム、バクテロイデス・オバツス、バクテロイデス・ブルガツス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、大腸菌(１１０９および１１０８-１)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、およびブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツスとして既知)。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００６９】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：エンテロコッカス・フェカリス(以前は、ストレプトコッカス・フェカリスとして既知)、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ラモスム、バクテロイデス・オバツス、バクテロイデス・ブルガツス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、大腸菌(１１０９および１１０８-１)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、およびブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツスとして既知)。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７０】
別の実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：アシダミノコッカス・インテスチナリス、バクテロイデス・オバツス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの２つの菌株、ビフィドバクテリウム・ロングムの２つの菌株、ブラウチア・プロヅクタ、クロストリジウム・コクレタム、コリンセラ・アエロファシエンス、ドレア・ロンギカテナの２つの菌株、大腸菌、オイバクテリウム・デスモランス、オイバクテリウム・エリゲンス、オイバクテリウム・リモスム、オイバクテリウム・レクタレの４つの菌株、オイバクテリウム・ベントリオスミ、フェカリバクテリウム・プラウスミチイ、ラクノスピラ・ペクチノシザ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・カゼイ／パラカゼイ、パラカテロイデス・ジスタソニス、ラオウルテラ種、ロセブリアの１つの菌株（ロセブリア・フェカリスまたはロセブリア・フェシスから選択）、ロセブリア・インテスティナリス、ルミノコッカス・トルクエスの２つの菌株、ルミノコッカス・オベウムの２つの菌株、およびストレプトコッカス・ミチス。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７１】
さらに別の実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：バルネシエラ・インテスティニホミニス、ラクトバシラス・ロイテリ、エンテロコッカス・ヒラエの１つとして特性化される種、エンテロコッカス・フェシウスまたはエンテロコッカス・デュラン、アネロスチペス・カッセまたはクロストリジウム・インドリス、スタフィロコッカス・ワルネリまたはスタフィロコッカス・パステウリの１つとして特性化される種、ならびにアドレルクロイチア・エクオリファシエンス。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７２】
他の実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：クロストリジウム・アブソヌム、クロストリジウム・アルガンチネンセ、クロストリジウム・バラチイ、クロストリジウム・バルトレッチイ、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ブチリクム、クロストリジウム・カダベリス、クロストリジウム・カミス、クロストリジウム・セラツム、クロストリジウム・カウボエイ、クロストリジウム・クロストリジオフォルメ、クロストリジウム・コレアリウム、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ファラックス、クロストリジウム・フェルシネウム、クロストリジウム・ゴニイ、クロストリジウム・グリコリクム、クロストリジウム・ヘモリチクム、クロストリジウム・ハスチフォルメ、クロストリジウム・ヒストリチクム、クロストリジウム・インドリス、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・イレグラレ、クロストリジウム・リモスム、クロストリジウム・マレノミナツム、クロストリジウム・ノブイ、クロストリジウム・オロチクム、クロストリジウム・パラプトリフィクム、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、クロストリジウム・ピリホルメ、クロストリジウム・プトレファシエンス、クロストリジウム・プトリフィクム、クロストリジウム・ラモスム、クロストリジウム・サルジニエンス、クロストリジウム・サルタゴフォルメ、クロストリジウム・シンデンス、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・ソルデリイ、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・スピロフォルメ、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スブテルミナレ、クロストリジウム・シンビオスム、クロストリジウム・テルチウム、クロストリジウム・テタニイ、クロストリジウム・ウェルキイおよびクロストリジウム・ビロスム。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７３】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・ブチリクム、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ユニフォルミス、大腸菌の３つの菌株、およびラクトバシラス種。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７４】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ブチリクム、大腸菌の３つの菌株、バクテロイデスの３つの菌株、およびブラウチア・プロヅクタ。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７５】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：バクテロイデス種、大腸菌、および非病原性クロストリジウム属、例えばクロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ビフェルメンタンスおよびクロストリジウム・ラモスム。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７６】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：バクテロイデス種、大腸菌、および非病原性クロストリジウム属、例えばクロストリジウム・ブチリクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンスおよびクロストリジウム・イノキューム。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７７】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：バクテロイデス・カッセ、バクテロイデス・カピロズス、バクテロイデス・コアグランス、バクテロイデス・ディスタソニス、バクテロイデス・エゲルチイ、バクテロイデス・フォルシツス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・フラギリス−リイム、バクテロイデス・グラシリス、バクテロイデス・レビイ、バクテロイデス・マカケ、バクテロイデス・メルデ、バクテロイデス・オバツス、バクテロイデス・ニューモシンテス、バクテロイデス・プトレディニス、バクテロイデス・ピロゲネス、バクテロイデス・スプランクニクス、バクテロイデス・ステルコリス、バクテロイデス・テクツム、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・ウレオリチクスおよびバクテロイデス・ブルガツス。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７８】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：バクテロイデス、オイバクテリア、フソバクテリア、プロピオニバクテリア、ラクトバシリ、嫌気性球菌、ルミノコッカス、大腸菌、ゲムニゲル、デスルフォモナスおよびペプトストレプトコッカス。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００７９】
一実施形態では、細菌組成物は、以下のうちの少なくとも１つ、好ましくは１つより多くを含む：バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．ブルガツス、オイバクテリウム・アエロファシエンス、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．  シータイオタオミクロン、ブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツス  ＩＩとして既知)、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．ディスタソニス、フソバクテリウム・プラウスニツィイ、コプロコッカス・オイタクツス、オイバクテリウム・アエロファシエンス  ＩＩＩ、ブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツスＩとして既知)、ルミノコッカス・ブロミイ、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス、ゲムニゲル・フォルミシリス、ビフィドバクテリウム・ロングム、オイバクテリウム・シレウム、ルミノコッカス・トルクエス、オイバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｈ、オイバクテリウム・レクタレＩＶ、オイバクテリウム・エリゲンス、バクテロイデス・エゲルシイ、クロストリジウム・レプツム、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．Ａ、オイバクテリウム・ビフォルメ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、オイバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｆ、コプロコッカス・コメス、バクテロイデス・カピロズス、ルミノコッカス・アルブス、オイバクテリウム・フォルミシゲネランス、オイバクテリウム・ハリイ、オイバクテリウム・ベントリオスムＩ、フソバクテリウム・ルシイ、ルミノコッカス・オベウム、オイバクテリウム・レクタレＩＩ、クロストリジウム・ラモスムＩ、ラクトバシラス・レイクマニイ、ルミノコッカス・カイリヅス、ブチリビブリオ・クロソツス、アシダミノコッカス・フェルメンタンス、オイバクテリウム・ベントリオスム、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．フラギリス、バクテロイデスＡＲ、コプロコッカス・カツス、オイバクテリウム・ハドルム、オイバクテリウム・シリンドイデス、オイバクテリウム・ルミナンチウム、オイバクテリウム  ＣＨ−１、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ペプトストレプトコッカス  ＢＬ、オイバクテリウム・リモスム、バクテロイデス・プレアクツス、バクテロイデス  Ｌ、フソバクテリウム・モルチフェルム  Ｉ、フソバクテリウム・ナビフォルメ、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ラモスム、プロピオニバクテリウム・アクネス、ルミノコッカス・フラベファシエンス、ルミノコッカス  ＡＴ、ペプトストレプトコッカス  ＡＵ−１、オイバクテリウム  ＡＧ、−ＡＫ、−ＡＬ−１、−ＡＮ、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．オバツス、−ｓｓ．ｄ、−ｓｓ．ｆ、バクテロイデス  Ｌ−１、Ｌ−５、フソバクテリウム・ヌクレアツム、フソバクテリウム・モルチフェルム、大腸菌、ストレプトコッカス・モルビリオルム、ペプトコッカス・マグヌス、ペプトコッカス  Ｇ、ＡＵ−２、ストレプトコッカス・インテルメディウス、ルミノコッカス・ラクタリス、ルミノコッカス  ＣＯ  ゲムニゲルＸ、コプロコッカス  ＢＨ、−ＣＣ、オイバクテリウム・テヌエ、オイバクテリウム・ラムルス、オイバクテリウム  ＡＥ、−ＡＧ−Ｈ、−ＡＧ−Ｍ、−ＡＪ、−ＢＮ−１、バクテロイデス・クロストリジフォルミス  ｓｓ．クロス���リジフォルミス、バクテロイデス・コアグランス、バクテロイデス・オラリス、バクテロイデス・ルミニコラ  ｓｓ．ブレビス、−ｓｓ．ルミニコラ、バクテロイデス・スプランキニクス、デスイフォルモナス・ピグラ、バクテロイデス  Ｌ−４、−Ｎ−ｉ、フソバクテリウム  Ｈ、ラクトバシラス  Ｇおよびスクシニビプリオ  Ａ。代替的実施形態では、前記の種のうちの少なくとも１つは、細菌組成物中に実質的に存在しない。
【００８０】
操作的分類単位(ＯＴＵｓ)により記述される細菌組成物
表１における種から選ばれる単離細菌の少なくとも２つの型を含む細菌組成物が、調製され得る。
【００８１】
一実施形態では、ＯＴＵｓは、１６Ｓ配列の１つ以上の可変領域（Ｖ１−Ｖ９）により特性化され得る。細菌におけるこれらの領域は、大腸菌系の命名法を基礎にした番号付けを用いて、それぞれ、ヌクレオチド６９−９９、１３７−２４２、４３３−４９７、５７６−６８２、８２２−８７９、９８６−１０４３、１１１７−１１７３、１２４３−１２９４および１４３５−１４６５により限定される（例えば、Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  エシェリキア  コリ，  ＰＮＡＳ  ７５（１０）：４８０１−４８０５（１９７８）参照）。いくつかの実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８およびＶ９領域のうちの少なくとも１つを用いて、ＯＴＵを特性化する。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３領域が、ＯＴＵを特性化するために用いられる。別の実施形態では、Ｖ３、Ｖ４およびＶ５領域が、ＯＴＵを特性化するために用いられる。
【００８２】
ある細菌種または菌株を排除する細菌組成物
一実施形態では、細菌組成物は、エンテロコッカス・フェカリス(以前は、ストレプトコッカス・フェカリスとして既知)、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ラモスム、バクテロイデス・オバツス、バクテロイデス・ブルガツス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、大腸菌(１１０９および１１０８-１)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、およびブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツスとして既知)のうちの少なくとも１つを含まない。
【００８３】
別の実施形態では、細菌組成物は、アシダミノコッカス・インテスチナリス、バクテロイデス・オバツス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティスの２つの菌株、ビフィドバクテリウム・ロングムの２つの菌株、コリンセラ・アエロファシエンス、ドレア・ロンギカテナの２つの菌株、大腸菌、オイバクテリウム・エリゲンス、オイバクテリウム・リモスム、オイバクテリウム・レクタレの４つの菌株、オイバクテリウム・ベントリオスミ、フェカリバクテリウム・プラウスミチイ、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・パラカゼイ、パラカテロイデス・ジスタソニス、ラオウルテラ種、ロセブリアの１つの菌株（ロセブリア・フェカリスまたはロセブリア・フェシスから選択）、ロセブリア・インテスティナリス、ルミノコッカス・トルクエスの２つの菌株、およびストレプトコッカス・ミチスのうちの少なくとも１つを含まない。
【００８４】
さらに別の実施形態では、細菌組成物は、バルネシエラ・インテスティニホミニス、ラクトバシラス・ロイテリ、エンテロコッカス・ヒラエの１つとして特性化される種、エンテロコッカス・フェシウスまたはエンテロコッカス・デュラン、アネロスチペス・カッセまたはクロストリジウム・インドリスの１つとして特性化される種、スタフィロコッカス・ワルネリまたはスタフィロコッカス・パステウリの１つとして特性化される種、ならびにアドレルクロイチア・エクオリファシエンスのうちの少なくとも１つを含まない。
【００８５】
他の実施形態では、細菌組成物は、クロストリジウム・アブソヌム、クロストリジウム・アルガンチネンセ、クロストリジウム・バラチイ、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ブチリクム、クロストリジウム・カダベリス、クロストリジウム・カミス、クロストリジウム・セラツム、クロストリジウム・カウボエイ、クロストリジウム・クロストリジオフォルメ、クロストリジウム・コレアリウム、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ファラックス、クロストリジウム・フェルシネウム、クロストリジウム・ゴニイ、クロストリジウム・グリコリクム、クロストリジウム・ヘモリチクム、クロストリジウム・ハスチフォルメ、クロストリジウム・ヒストリチクム、クロストリジウム・インドリス、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・イレグラレ、クロストリジウム・リモスム、クロストリジウム・マレノミナツム、クロストリジウム・ノブイ、クロストリジウム・オロチクム、クロストリジウム・パラプトリフィクム、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、クロストリジウム・ピリホルメ、クロストリジウム・プトレファシエンス、クロストリジウム・プトリフィクム、クロストリジウム・ラモスム、クロストリジウム・サルジニエンス、クロストリジウム・サルタゴフォルメ、クロストリジウム・シンデンス、クロストリジウム・セプチクム、クロストリジウム・ソルデリイ、クロストリジウム・スフェノイデス、クロストリジウム・スピロフォルメ、クロストリジウム・スポロゲネス、クロストリジウム・スブテルミナレ、クロストリジウム・シンビオスム、クロストリジウム・テルチウム、クロストリジウム・テタニイ、クロストリジウム・ウェルキイおよびクロストリジウム・ビロスムのうちの少なくとも１つを含まない。
【００８６】
別の実施形態では、細菌組成物は、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・ブチリクム、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ユニフォルミス、大腸菌の３つの菌株、およびラクトバシラス種のうちの少なくとも１つを含まない。
【００８７】
別の実施形態では、細菌組成物は、クロストリジウム・ビフェルメンタンス、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ブチリクム、大腸菌の３つの菌株、バクテロイデスの３つの菌株、およびブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツスとして既知)のうちの少なくとも１つを含まない。
【００８８】
別の実施形態では、細菌組成物は、バクテロイデス種、大腸菌、および非病原性クロストリジウム属、例えばクロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ビフェルメンタンスおよびクロストリジウム・ラモスムのうちの少なくとも１つを含まない。
【００８９】
別の実施形態では、細菌組成物は、バクテロイデス種、大腸菌、および非病原性クロストリジウム属、例えばクロストリジウム・ブチリクム、クロストリジウム・ビフェルメンタンスおよびクロストリジウム・イノキュームのうちの少なくとも１つを含まない。
【００９０】
別の実施形態では、細菌組成物は、バクテロイデス・カッセ、バクテロイデス・カピロズス、バクテロイデス・コアグランス、バクテロイデス・ディスタソニス、バクテロイデス・エゲルチイ、バクテロイデス・フォルシツス、バクテロイデス・フラギリス、バクテロイデス・フラギリス−リイム、バクテロイデス・グラシリス、バクテロイデス・レビイ、バクテロイデス・マカケ、バクテロイデス・メルデ、バクテロイデス・オバツス、バクテロイデス・ニューモシンテス、バクテロイデス・プトレディニス、バクテロイデス・ピロゲネス、バクテロイデス・スプランクニクス、バクテロイデス・ステルコリス、バクテロイデス・テクツム、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、バクテロイデス・ユニフォルミス、バクテロイデス・ウレオリチクスおよびバクテロイデス・ブルガツスのうちの少なくとも１つを含まない。
【００９１】
別の実施形態では、細菌組成物は、バクテロイデス、オイバクテリア、フソバクテリア、プロピオニバクテリア、ラクトバシリ、嫌気性球菌、ルミノコッカス、大腸菌、ゲムニゲル、デスルフォモナスおよびペプトストレプトコッカスのうちの少なくとも１つを含まない。
【００９２】
別の実施形態では、細菌組成物は、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．ブルガツス、オイバクテリウム・アエロファシエンス、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．  シータイオタオミクロン、ブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツス  ＩＩとして既知)、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．ディスタソニス、フソバクテリウム・プラウスニツィイ、コプロコッカス・オイタクツス、オイバクテリウム・アエロファシエンス  ＩＩＩ、ブラウチア・プロヅクタ(以前は、ペプトストレプトコッカス・プロヅクツスＩとして既知)、ルミノコッカス・ブロミイ、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス、ゲムニゲル・フォルミシリス、ビフィドバクテリウム・ロングム、オイバクテリウム・シレウム、ルミノコッカス・トルクエス、オイバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｈ、オイバクテリウム・レクタレＩＶ、オイバクテリウム・エリゲンス、バクテロイデス・エゲルシイ、クロストリジウム・レプツム、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．Ａ、オイバクテリウム・ビフォルメ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、オイバクテリウム・レクタレＩＩＩ−Ｆ、コプロコッカス・コメス、バクテロイデス・カピロズス、ルミノコッカス・アルブス、オイバクテリウム・フォルミシゲネランス、オイバクテリウム・ハリイ、オイバクテリウム・ベントリオスムＩ、フソバクテリウム・ルシイ、ルミノコッカス・オベウム、オイバクテリウム・レクタレＩＩ、クロストリジウム・ラモスムＩ、ラクトバシラス・レイクマニイ、ルミノコッカス・カイリヅス、ブチリビブリオ・クロソツス、アシダミノコッカス・フェルメンタンス、オイバクテリウム・ベントリオスム、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．フラギリス、バクテロイデスＡＲ、コプロコッカス・カツス、オイバクテリウム・ハドルム、オイバクテリウム・シリンドイデス、オイバクテリウム・ルミナンチウム、オイバクテリウム  ＣＨ−１、スタフィロコッカス・エピデルミディス、ペプトストレプトコッカス  ＢＬ、オイバクテリウム・リモスム、バクテロイデス・プレアクツス、バクテロイデス  Ｌ、フソバクテリウム・モルチフェルム  Ｉ、フソバクテリウム・ナビフォルメ、クロストリジウム・イノキューム、クロストリジウム・ラモスム、プロピオニバクテリウム・アクネス、ルミノコッカス・フラベファシエンス、ルミノコッカス  ＡＴ、ペプトストレプトコッカス  ＡＵ−１、オイバクテリウム  ＡＧ、−ＡＫ、−ＡＬ−１、−ＡＮ、バクテロイデス・フラギリス  ｓｓ．オバツス、−ｓｓ．ｄ、−ｓｓ．ｆ、バクテロイデス  Ｌ−１、Ｌ−５、フソバクテリウム・ヌクレアツム、フソバクテリウム・モルチフェルム、大腸菌、ストレプトコッカス・モルビリオルム、ペプトコッカス・マグヌス、ペプトコッカス  Ｇ、ＡＵ−２、ストレプトコッカス・インテルメディウス、ルミノコッカス・ラクタリス、ルミノコッカス  ＣＯ  ゲムニゲルＸ、コプロコッカス  ＢＨ、−ＣＣ、オイバクテリウム・テヌエ、オイバクテリウム・ラムルス、オイバクテリウム  ＡＥ、−ＡＧ−Ｈ、−ＡＧ−Ｍ、−ＡＪ、−ＢＮ−１、バクテロイデス・クロストリジフォルミス  ｓｓ．クロストリジフォルミス、バクテロイデス・コアグランス、バクテロ���デス・オラリス、バクテロイデス・ルミニコラ  ｓｓ．ブレビス、−ｓｓ．ルミニコラ、バクテロイデス・スプランキニクス、デスイフォルモナス・ピグラ、バクテロイデス  Ｌ−４、−Ｎ−ｉ、フソバクテリウム  Ｈ、ラクトバシラス  Ｇおよびスクシニビプリオ  Ａのうちの少なくとも１つを含まない。
【００９３】
細菌病原体の抑制
いくつかの実施形態では、細菌組成物は、１つ以上の当該ＧＩ病原体による感染に対する保護または治療効果を提供する。
【００９４】
例示的細菌病原体の一覧は、病原体状態により示した表１に提供されている。
【００９５】
いくつかの実施形態では、病原性細菌は、エルシニア、ビブリオ、トレポネマ、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、赤痢菌、サルモネラ、リケッチア、オリエンティア、シュードモナス、ネイセリア、マイコプラズマ、マイコバクテリウム、リステリア、レプトスピラ、レジオネラ、クレブシエラ、ヘリコバクター、ヘモフィルス、フランシセラ、エシェリキア、エーリキア、エンテロコッカス、コクシエラ、コリネバクテリウム、クロストリジウム、クラミジア、クラミドフィラ、カンピロバクター、バークホルデリア、ブルセラ、ボレリア、ボルデテラ、ビフィドバクテリウム、バシラス、多剤耐性細菌、拡張型ベータラクタム耐性腸球菌（ＥＳＢＬ）、カルバぺネム耐性エンテロバクター（ＣＲＥ）およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）からなる群から選択される。
【００９６】
いくつかの実施形態では、これらの病原体としては、限定されないが、アエロモナス・ハイドロフィラ、カンピロバクター・フェトゥス、プレシオモナス・シゲロイデス、バシラス・セレウス、カンピロバクター・ジェジュニ、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、腸管凝集性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管侵襲性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌（例えば、限定されないが、ＬＴおよび／またはＳＴ）、大腸菌０１５７：Ｈ７、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニア、リステリア・モノサイトゲネス、プレシオモナス・シゲロイデス、サルモネラ種、チフス菌、パラチフス菌、赤痢菌種、スタフィロコッカス種、黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性腸球菌種、ビブリオ種、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、および腸炎エルシニアが挙げられる。
【００９７】
一実施形態では、当該病原体は、クロストリジウム・ディフィシル、サルモネラ種、病原性大腸菌、バンコマイシン耐性腸球菌種、および拡張型ベータラクタム耐性腸球菌（ＥＳＢＬ）から選択される少なくとも１つの病原体である。
【００９８】
精製胞子集団
いくつかの実施形態では、細菌組成物は、精製胞子集団を含む。精製胞子集団は、哺乳動物被験体に投与された場合に健常微生物叢の機能を有意に提供する能力を有するヒト腸微生物叢の共生細菌の組合せを含有する。特定の機序に限定せずに考えると、このような組成物は、病原体、例えばＣ．ディフィシル、サルモネラ種、腸管病原性大腸菌およびバンコマイシン耐性腸球菌種の生育を抑制し、したがって、健常で、多様な、かつ防護的微生物叢が保持されるか、または病原性細菌感染、例えばＣ．ディフィシル感染の場合、腸管腔に再び棲みついて、潜在的病原体を上回る生態学的制御を再確立する。いくつかの実施形態では、酵母胞子およびその他の真菌胞子も精製され、治療的使用のために選択される。
【００９９】
胃腸疾患、障害および症状の防止、制御および処置のための、ならびに全身性栄養的健康のための、非病原性、発芽競合細菌胞子、生物体を形成する胞子、生物体を形成する非胞子を含有する治療用組成物が、本明細書中に開示される。これらの組成物は、ヒトおよびその他の哺乳動物被験体への安全投与に適している場合に有益であり、多数の胃腸疾患、障害および症状に、ならびに全身性栄養的健康に効果的である。
【０１００】
細菌胞子、生物体を形成する胞子、および生物体を形成する非胞子の精製集団を含有する治療用組成物が、本明細書中で提供される。本明細書中で用いる場合、「精製する」、「精製される」および「精製すること」という用語は、精製、例えば所望の細菌胞子の選択または濃化、あるいは本明細書中に記載されるような残存棲息部位生成物の除去または低減の１回以上の工程を経た、所望の細菌胞子または細菌の集団(例えば、複数の既知または未知量および／または濃度)の状態を指す。いくつかの実施形態では、精製集団は、検出可能な望ましくない活性を有さず、あるいは望ましくない活性のレベルまたは量は、許容可能なレベルまたは量であるかまたはそれより低い。他の実施形態では、精製集団は、許容可能な量および／または濃度またはそれ以上の量および／または濃度の所望の細菌胞子または細菌を有する。他の実施形態では、細菌胞子の精製集団は、集団が得られる出発物質(例えば、液体培養)と比較して、濃化される。この濃化は、出発物質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％または９９．９９９９％以上までであり得る。
【０１０１】
ある実施形態では、精製集団は、低減または非検出可能レベルの１つ以上の病原性活性、例えば毒性、哺乳動物レシピエント被験体の感染、免疫調節活性、自己免疫応答、代謝応答あるいは炎症性応答または神経学的応答を有する。病原性活性のこのような低減は、出発物質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％または９９．９９９９％以上である。他の実施形態では、細菌胞子の精製集団は、固体状排泄物と比較して、知覚成分低減、例えば臭い、味、外見および旨味低減を示す。
【０１０２】
残存棲息部位生成物を実質的に含有しない細菌胞子の精製集団が、提供される。ある実施形態では、これは、細菌胞子組成物が、ヒトまたは動物被験体の体表または体内で生存しながら、微生物コミュニティに関連した生物学的物質を実質量でもはや含有しない、ということを意味し、胞子の精製集団は、微生物コミュニティに関連した生物学的物質のあらゆる夾雑物を１００％含有しない、９９％含有しない、９８％含有しない、９７％含有しない、９６％含有しない、または９５％含有しないことがある。残存棲息部位生成物を実質的に含有しないということは、細菌胞子組成物が、ヒトまたは動物からの検出可能細胞を含有しないこと、ならびに、微生物細胞だけが検出可能であり、特に、所望の微生物細胞だけが検出可能であることも意味し得る。別の実施形態では、それは、微生物細胞と比較して、細菌組成物中の細胞が１ｘ１０−２％より少ない、１ｘ１０−３％、１ｘ１０−４％、１ｘ１０−５％、１ｘ１０−６％、１ｘ１０−７％、１ｘ１０−８％であることを意味する。別の実施形態では、精製集団中に存在する残存棲息部位生成物は、哺乳動物ドナー被験体から得られる固体状排泄物から、少なくとも一定レベルで低減され、例えば少なくとも約
１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％または９９．９９９９％以上低減される。
【０１０３】
一実施形態では、残存棲息部位生成物を実質的に含有しない、または検出可能レベルの病原性物質を実質的に含有しないとは、細菌組成物が検出可能なウィルス(細菌性ウィルス(すなわち、ファージ)を含む)、真菌、あるいはマイコプラズマまたはトキソプラズマ夾雑物、あるいは真核生物性寄生生物、例えば蠕虫を含有しない、ということを意味する。あるいは、精製胞子集団は、無細胞性物質、例えばＤＮＡ、ウィルス外被物質、または非生育可能細菌物質を実質的に含有しない。
【０１０４】
本明細書中に記載されるように、精製胞子集団は、遺伝子解析(例えば、ＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング)、血清学および抗原分析、ならびに計器を用いる方法、例えば所望の細菌胞子を非所望夾雑物質と区別する試薬を伴うフローサイトメトリーにより、実証され亜得る。
【０１０５】
例示的生物学的物質としては、固体状排泄物、例えば糞便または小腸および大腸の種々のセグメントから単離される物質が挙げられる。固体状排泄物は、哺乳動物ドナー被験体から得られるし、あるいは１つより多くのドナー被験体、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、７５０、１０００または１０００以上のドナーから獲得され得るが、このような物質は次に、プールされた後、所望の細菌胞子に精製される。
【０１０６】
代替的実施形態では、所望の細菌胞子は、単一ドナーから得られる単一糞便物質試料から精製され、このような精製後、他の精製からの、異なる時点で同一ドナーからの、または１つ以上の異なるドナーからの、または両方からの精製胞子集団と併合される。
【０１０７】
好ましい細菌属としては、アセトネマ、アルカリフィルス、アリシクロバシラス、アンフィバシリス、アンモニフェックス、アネロバクター、アネロフスティス、アネロスチペス、アネロトルンクス、アノキシバシラス、バシラス、ブラウチア、ブレビバシラス、ブリアンテラ、カルジセルロシルプトール、カロラマトール、カンジダツス、カルボキシジブラキウム、カルボキシドテルムス、クロストリジウム、コーネラ、コプロコッカス、デンドロスポロバクター、デスルフィトバクテリウム、デスルフォスポロシヌス、デスルフォトマクルム、ドレア、オイバクテリウム、フェカリバクテリウム、フィリファクトール、ゲオバシラス、ハロバクテロイデス、ヘリオバシラス、ヘリオバクテリウム、ヘリオフィルム、ヘリオレスチス、ラクノアネロバクルム、リシノバシラス、モーレラ、オセアノバシラス、オレニア（Ｓ．）、オキサロファグス、オキソバクター、ペニバシラス、ペロスポラ、ペロトマクルム、プロピオニスポラ、ロセブリア、ルミノコッカス、サルシナ、スポロバクテリウム、スポロハロバクター、スポロラクトバシラス、スポロムサ、スポロサルシナ、スポロトマクルム、スブドリグラヌルム、シンビオバクテリウム、シントロフォボツルス、シントロフォスポラ、テリバシラス、サーモアネロバクターおよびサーモシヌスが挙げられる。
【０１０８】
好ましい細菌種を、表Ｘ４に提示する。ある種の特定菌株が提示される場合、その種の他の菌株は命名された菌株に置換され得る、と当業者は理解する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、胞子形成細菌は、胞子形成を調整する核酸配列の存在により同定される。特に、署名胞子形成遺伝子は、遠縁の属、例えばクロストリジウムおよびバシラスの成員全体に高度に保存される。先進遺伝学の伝統的アプローチは、胞子形成に不可欠である多数の、しかしすべてというわけではない、遺伝子(ｓｐｏ)を同定している。胞子形成の発達プログラムは、一部は、４つの区画特異的シグマ因子(σＦ、σＥ、σＧおよびσＫの順序で出現する)の上首尾の作用により支配され、その活性は、前胞子(σＦおよびσＧ)または母細胞(σＥおよびσＫ)に限定される。
【０１１０】
１つより多い型の細菌を含有する胞子集団が提供される。本明細書中で用いる場合、細菌の「型」または１つより多い「型」は、属レベル、種レベル、亜種レベル、菌株レベルで、あるいは本明細書中に記載されるような、ならびにそうでなければ当該技術分野で既知の任意の他の分類方法により、識別され得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、精製集団中に存在する細菌種のすべて、または本質的にすべてが、本明細書中に記載されるように、またはそうでなければ当該技術分野で既知であるように処理された固体排出物から単離されるか、または最初は単離される。代替的実施形態では、１つまたは１つより多い細菌胞子または細菌の型は、培養中で生成され、併合されて、精製集団を形成する。他の代替的実施形態では、これらの培養生成集団のうちの１つ以上が、糞便物質由来集団と併合されて、ハイブリッド集団を生成する。細菌組成物は、同一種の菌株を含めてこれらの好ましい細菌の少なくとも２つの型を含有し得る。例えば、細菌組成物は、種により、またはこのような種を包含する操作的分類単位(ＯＴＵ)により定義されるような、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０または２０以上の型の細菌を含み得る。
【０１１２】
したがって、それを必要とする哺乳動物被験体に治療的投与に適した細菌胞子の集団を含有する組成物を生成するための方法が、本明細書中で提供される。そして、組成物は、一般的に以下の：(ａ)哺乳動物ドナー被験体から得られる糞便物質を提供すること;ならびに(ｂ)糞便物質を、細菌胞子の集団が糞便物質から精製されるような条件下で、少なくとも１つの精製処理またはステップに付すこと、というステップに従って生成される。単一経口用量が少なくとも約１×１０−４コロニー形成単位の細菌胞子を含有し、単一経口用量が、典型的には、約１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０、１ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１ｘ１０１３、１ｘ１０１４、１ｘ１０１５、または１ｘ１０１５ＣＦＵｓ以上の細菌胞子を含有する。所定の型の細菌胞子の存在および／または濃度は、所定の精製胞子集団中で既知であり得るし、または未知であり得る。例えば既知である場合、所定の菌株の、または全菌株の集合体の胞子の濃度は、例えば、１ｘ１０４、１ｘ１０５、１ｘ１０６、１ｘ１０７、１ｘ１０８、１ｘ１０９、１ｘ１０１０、１ｘ１０１１、１ｘ１０１２、１ｘ１０１３、１ｘ１０１４、１ｘ１０１５、または１ｘ１０１５以上の、組成物１グラム当たりの、または投与用量当たりの、生育可能細菌胞子である。
【０１１３】
いくつかの製剤では、組成物は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９０％以上の胞子を質量基準で含有する。いくつかの製剤では、投与用量は、質量で、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ミリグラム、または１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８または１．９グラムを超えない。
【０１１４】
細菌胞子組成物は、典型的には哺乳動物被験体への経口または胃投与のために、一般的に処方される。特定の実施形態では、組成物は、固体、半固体、ゲル、または液体形態として、例えばピル、錠剤、カプセルまたはロゼンジの形態で、経口投与のために処方される。いくつかの実施形態では、このような製剤は、胃および小腸を通して細菌を保護するための腸コーティングを含有するかまたはそれにより被覆されるが、しかし胞子は一般的に胃および小腸に対して耐性である。
【０１１５】
細菌胞子組成物は、単一回投与において、または多数回投与に亘って、所定の哺乳動物被験体において有効であるよう処方され得る。例えば、単一回投与は、組成物が投与される哺乳動物被験体においてＣｌ．ディフィシルおよび／またはＣｌ．ディフィシル毒素含量を低減するために実質的に有効である。実質的に有効とは、被験体におけるＣｌ．ディフィシルおよび／またはＣｌ．ディフィシル毒素含量が、組成物の投与後、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９％以上、低減されることを意味する。
【０１１６】
本発明の方法
１６Ｓ配列の決定方法
ＯＴＵｓは、ｒＲＮＡ遺伝子の完全１６Ｓシーケンシングにより、この遺伝子の特定超可変領域（すなわち、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８またはＶ９）のシーケンシングにより、あるいはこの遺伝子からの超可変領域の任意の組合せ（例えば、Ｖ１−３またはＶ３−５）のシーケンシングにより、限定され得る。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡは、およそ１５００ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを用いて、ある細菌単離物と別のものとの進化的関係および配列類似性を再構築するために用いられる。１６Ｓ配列は、それらが概して高度に保存されるが、しかし大半の微生物の属および種を識別するのに十分なヌクレオチド多様性を保有する特定の超可変領域を含有するので、系統学的再構築のために用いられる。
【０１１７】
周知の技法を用いて、完全１６Ｓ配列または１６Ｓ配列の任意の超可変領域の配列を決定するために、ゲノムＤＮＡが細菌試料から抽出され、１６Ｓ  ｒＤＮＡ(完全領域または特定超可変領域)がポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いて増幅され、ＰＣＲ産物が浄化され、ヌクレオチド配列が輪郭を描かれて、１６Ｓ遺伝子または遺伝子のサブドメインの遺伝子組成を決定する。完全１６Ｓシーケンシングが実施される場合、用いられるシーケンシング方法は、限定はされないが、サンガー・シーケンシングであり得る。１つ以上の超可変領域、例えばＶ４領域が用いられる場合、シーケンシングは、限定されないが、サンガー法を用いて、または次世代シーケンシング法、例えば多重反応を可能にするバーコード化プライマーを用いるイルミナ(合成によるシーケンシング)法を用いて、実施され得る。
【０１１８】
ＯＴＵｓは、ヌクレオチドマーカーまたは遺伝子の組合せ、特に高度保存遺伝子(例えば「ハウスキーピング」遺伝子)、またはその組合せ、増幅遺伝子産物を用いて生成される完全ゲノム配列または部分ゲノム配列、あるいは全ゲノム配列(ＷＧＳ)により、限定され得る。明確に定義された方法を用いて、細菌試料から抽出されるＤＮＡは、ＰＣＲを用いて増幅され、増幅産物のヌクレオチド配列を決定するためにシーケンシングされる特定ゲノム領域を有する。全ゲノムショットガン(ＷＧＳ)法では、抽出ＤＮＡは、増幅せずに直接シーケンシングされる。配列データは、任意のシーケンシング技法、例えば限定されないが、サンガー、イルミナ、４５４ライフサイエンス、イオントレント、ＡＢＩ、パシフィック・バイオサイエンスおよび／またはオックスフォード・ナノポア法を用いて作成され得る。
【０１１９】
被験体への投与のための細菌組成物の製造方法
細菌組成物の産生方法は、１つ以上の混合ステップと組み合わされる３つの主要加工処理ステップを包含し得る。ステップは、生物体バンキング、生物体産生および保存を包含する。
【０１２０】
バンキングに関しては、細菌組成物中に含まれる菌株は、(１)検体から直接単離されるか、またはバンキングされたストックから採取され、(２)任意に、生育可能なバイオマスを生成するために生育を支持する栄養寒天またはブロス上で培養され得るし、ならびに(３)バイオマスが、長期保存に際して多数のアリコート中に任意に保存され得る。
【０１２１】
培養ステップを用いる実施形態では、寒天またはブロスは、生育を可能にする必須要素および特定因子を提供する栄養物を含有し得る。一例は、２０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのダイズペプトン、２ｇ／Ｌのクエン酸、１．５ｇ／Ｌの一塩基性リン酸ナトリウム、１００ｍｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、８０ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍｇ／Ｌの塩化ヘミン、２ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム、１ｍｇ／Ｌのメナジオンからなる培地である。種々の微生物学的培地および変形が、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒ．Ｍ．Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（２０１０）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）。培地は、開始時に培養に添加され得るし、培養中に添加され得るし、あるいは間欠的に／連続的に、培養を通して流入され得る。細菌組成物中の菌株は、単独で、細菌組成物のサブセットとして、または細菌組成物を含む全収集物として、栽培され得る。一例として、第一菌株は、培養が栽培から洗い落とされないようにするために、どちらかの細胞の最大生育速度より遅い希釈速度で、混合連続培養中で、第二菌株と一緒に栽培され得る。
【０１２２】
接種済み培養は、好ましい条件下で、バイオマスを構築するのに十分な時間、インキュベートされる。ヒト使用のための細菌組成物に関しては、これは、３７℃の温度で、正常ヒトニッチと同様の値を有するｐＨおよびその他のパラメーターであることが多い。環境は、能動的に制御され、受動的に制御され(例えば緩衝液を介して)、または漂流させられ得る。例えば、嫌気性細菌組成物(例えば消化管微生物叢)に関しては、無酸素／還元環境が用いられ得る。これは、ブロスへの還元剤、例えばシステインの添加、および／または酸素の剥ぎ取りにより成し遂げられ得る。一例として、細菌組成物の培養は、１ｇ／Ｌの塩酸システインで予め還元された上記の培地中で、３７℃、ｐＨ７で生育され得る。
【０１２３】
培養が十分なバイオマスを生成したら、それはバンキングのために保存され得る。生物体は、凍結(「凍結保護剤」を添加する)、乾燥(「凍結乾燥保護剤」)および／または浸透ショック(「浸透圧保護剤」)から保護する化学的環境中に置かれ、多数の(任意に同一の)容器中に分配されて、均一バンクを作成し、次いで、保存のために培養を処理する。容器は、一般的に不浸透性であり、環境からの単離を保証するクロージャーを有する。凍結保存処理は、超低温に(例えば、−８０℃以下に)液体を凍結することにより成し遂げられる。乾燥保護は、蒸発により(噴霧乾燥または「冷却乾燥」の場合)、または昇華により(例えば、凍結乾燥、噴霧凍結乾燥のため)、培養から水を除去する。水の除去は、極低温より高い温度での長期細菌組成物貯蔵安定性を改善する。細菌組成物が胞子形成種を含み、胞子の産生を生じる場合、最終組成物は、付加的手段、例えば上記の技法を用いて保持される密度勾配遠心分離により精製され得る。細菌組成物バンキングは、菌株を独立して培養し、保存することにより、または菌株を一緒に混合して併合バンクを作成することにより実行され得る。極低温保存の一例として、細菌組成物培養は、遠心分離により収穫されて、培地からの細胞をペレットにして、上清をデカントし、１５％グリセロールを含有する新鮮な培養ブロスと取り替えられる。次に、培養は、１ｍＬクリオチューブ中にアリコート化され、密封され、長期生存能力保持のために−８０℃に置かれ得る。この手順は、凍結貯蔵からの回復時に許容可能な生存能力を達成する。
【０１２４】
生物体産生は、培地組成および培養条件を含めたバンキングと同様の培養ステップを用いて実行され得る。それは、特に臨床的開発または商業的生産のために、より大規模な操作で実行され得る。より大規模で、最終栽培前に、細菌組成物のいくつかのサブ栽培が存在し得る。栽培終了時に、培養は収穫されて、製剤をさらに投与のための剤形にさせる。これは、濃縮、望ましくない培地構成成分の除去、および／または細菌組成物を保存し、それを選定経路を介した投与のために許容可能にさせる化学的環境中への導入を伴い得る。例えば、細菌組成物は１０１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度に栽培し、次いで、接線流精密濾過により２０倍に濃縮される。使用済み培地は、２％ゼラチン、１００ｍＭトレハロースおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液からなる保存培地を用いた透析濾過により、交換され得る。次いで、懸濁液は凍結乾燥されて粉末となり、滴定され得る。
【０１２５】
乾燥後、粉末は適切な効能に配合され、粘稠性および取り扱いやすさのために他の培養および／または充填剤、例えば微晶質セルロースと混合され、そして本明細書中で提供されるような細菌組成物が処方される。
【０１２６】
被験体の処置方法
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される組成物は、患者または使用者(時として、集合的に「被験体」として言及される)に投与される。本明細書中で用いる場合、「投与する」および「投与」は、ある方法で、および／またはある目的のために、細菌組成物を消費するよう、ある人が別の人に指図する実施形態を、ならびに使用者が、第二の人から受けるあらゆる指示から独立して、または素の指示とは違って、ある方法で、および／またはある目的のために、細菌組成物を使用する状況も包含する。ある方法で、および／またはある目的のために、細菌組成物を消費するようある人が別の人に指図する実施形態の非限定例は、医者が患者に遂行および／または処置の過程を処方する場合、親が小さい使用者(例えば、小児)に細菌組成物を消費するよう命令する場合、トレーナーが使用者(例えば、アスリート)に遂行および／または処置の特別な過程に従うよう助言する場合、ならびにメーカー、販売者またはマーケティング担当者が、例えば製品の販売またはマーケティングに関連して提供されるパッケージ上または他の物質の上の広告または標識を介して、末端消費者に使用条件を推奨する場合を包含する。
【０１２７】
細菌組成物は、１つ以上の当該ＧＩ病原体による感染に対する保護および／または治療効果を提供し、再発を防止するために感染の急性症例が解消された後に、細菌組成物がＧＩ病原体と同一の抗生物質に対して感受性でない場合、抗生物質療法に対する補体として感染の急性症例中に、あるいは感染を防止するか、または疾患保菌者からの伝染を低減するために、投与され得る。
【０１２８】
本発明の細菌組成物は、種々の臨床状況において有用であり得る。例えば、細菌組成物は、患者が急性感染に罹患している場合、急性感染が治まった後の再発の危険を低減するために、抗生物質に対する補助的処置として投与され得るし、あるいは患者が他の人々に極近接していて、重篤な消化管感染を伴うかまたはその危険がある場合(医者、看護師、病院従業者、病気であるかまたは入院している人の家族)、投与され得る。
【０１２９】
本発明の細菌組成物は、動物、例えばヒト、実験室動物(例えば、霊長類、ラット、マウス)、家畜類(例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、シチメンチョウ、ニワトリ)、ならびに愛玩動物(例えば、イヌ、ネコ、齧歯類)に投与され得る。
【０１３０】
本発明の方法において、細菌組成物は、腸内に、言い換えれば、消化管への接近の経路により、投与され得る。これは、本明細書中でさらに詳述されるように、経口投与、直腸投与(例えば、浣腸、坐薬または結腸内視鏡検査)、経口または経鼻チューブによる投与(鼻胃、鼻空腸、口腔胃または口腔空腸)を包含する。
【０１３１】
前処置プロトコール
細菌組成物の投与の前に、細菌組成物を受容するために消化管の準備をするための前処置プロトコールを患者は任意に有し得る。ある実施形態では、例えば高度に回復力を有する病原体による急性感染を患者が有する場合、前処置プロトコールが得策である。他の実施形態では、例えば感染を引き起こす病原体が回復力を有さない場合、または首尾よく処置された急性感染を患者が有するが、しかし医者が感染再発の可能性を心配している場合、前処置プロトコールは完全に任意である。これらの場合、前処置プロトコールは、患者のマイクロバイオームに影響を及ぼす細菌組成物の能力を増強し得る。
【０１３２】
微生物生態系の投与のために患者の準備をする一方法として、少なくとも１つの抗生物質が、患者における細菌を変更するために投与され得る。微生物生態系の投与のために患者の準備をする別の方法として、標準結腸洗浄製剤が患者に投与されて、例えば結腸内視鏡検査のために患者の準備をするために用いられるように、結腸の内容物を実質的に空にする。「結腸の内容物を実質的に空にする」とは、この適用が、結腸内容物の普通の容積の内容物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または約１００％を除去することを意味する。抗生物質処置は、結腸洗浄プロトコールに先行し得る。
【０１３３】
患者が感染の処置のために抗生物質を受容した場合、または患者が特定前処置プロトコールの一部として抗生物質を受容した場合、一実施形態では、細菌組成物が投与される前に、抗生物質に腸内の濃度を実質的に低減させるのに十分な時間で抗生物質は停止され得る。一実施形態では、細菌組成物の投与前に、抗生物質は１、２または３日中断され得る。別の実施形態では、細菌組成物の投与前に、抗生物質は３、４、５、６または７抗生物質半減期、中断され得る。別の実施形態では、細菌組成物中の構成成分が、腸内の抗生物質の濃度より高いＭＩＣ５０を有するよう、抗生物質が選択され得る。
【０１３４】
細菌組成物のＭＩＣ５０またはその組成物中の要素は、当該技術分野で周知の方法により決定され得る(Ｒｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ４９（１１）：１７４９−１７５５  （２００９））。このような実施形態では、抗生物質投与と細菌組成物の投与との間の付加的時間は、必要でない。前処置プロトコールが急性感染の処置の一部である場合、感染が抗生物質に感受性であるが、しかし細菌組成物中の構成成分は抗生物質に感受性でないよう、抗生物質が選択され得る。
【０１３５】
投与経路
本発明の細菌組成物は、それを必要とする哺乳動物および非哺乳動物への投与に適している。ある実施形態では、哺乳動物被験体は、腸内菌共生バランス失調の１つ以上の症候を有するヒト被験体である。
【０１３６】
哺乳動物被験体が異所性微生物叢により特性化される疾患、障害または症状に罹患している場合、本明細書中に記載される細菌組成物がその処置に適している。いくつかの実施形態では、哺乳動物被験体は、細菌組成物による処置より前に抗生物質を受容していない。例えば、哺乳動物被験体は、バンコマイシン、メトロニダゾールおよび／または類似の抗生物質化合物のうちの少なくとも２用量を、治療用組成物の投与前１週間以内に投与されていない。他の実施形態では、哺乳動物被験体は、治療用組成物の投与前の１か月に、抗生物質化合物をあらかじめ受容していない。他の実施形態では、哺乳動物被験体は、１つ以上の処置を１つ以上の異なる抗生物質化合物とともに受容していないし、このような処置(単数または複数)は、症候の改善を生じないか、または悪化を生じた。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、胃腸疾患、障害または症状は、再発性Ｃ．ディフィシル感染を含めたＣ．ディフィシルにより引き起こされる下痢、潰瘍性結腸炎、結腸炎、クローン病または過敏性腸疾患である。有益であるのは、治療用組成物が、疾患、障害または症状の改善前に１回だけ投与されることである。いくつかの実施形態では、治療用組成物は、２日より長い間隔で、例えば３、４、５または６日ごとに１回、あるいは毎週、または毎週より低頻度で、投与される。他の実施形態では、製剤は、所定の計画に従って間欠的に、例えば週１回、または月１回、または被験体が原発性疾病から再発した場合に、投与される。別の実施形態では、製剤は、これらの病原体に感染する危険があるか、または保菌者であり得る被験体、例えば、侵襲性医学的手法(例えば、外科手術)を有するか、入院させられる、長期間、看護またはリハビリ施設に住む、彼らの職業(家畜類および動物処理従業者)により病原体に曝露される、あるいは病原体の保菌者である(例えば病院従業者、例えば医者、看護師、およびその他のヘルスケア専門職)被験体に、長期ベースで投与され得る。
【０１３８】
ある実施形態では、細菌組成物は、腸内に投与される。これは、好ましくは、経口投与、あるいは経口または経鼻チューブによる投与(鼻胃、鼻空腸、口腔胃または口腔空腸を含む)を包含する。他の実施形態では、投与は、直腸投与(例えば、浣腸、坐薬または結腸内視鏡検査)を包含する。細菌組成物は、消化管の少なくとも１領域、例えば口腔、食道、胃、小腸、大腸および直腸に投与され得る。いくつかの実施形態では、それは、消化管の全ての領域に投与される。細菌組成物は、医薬剤の形態で、例えば粉末、カプセル、錠剤、ゲルまたは液体の形態で、経口投与される。細菌組成物は、経口的に、または鼻胃チューブを通して、または直腸経路により、ゲルまたは液体形態で、浣腸または結腸内視鏡を介した点滴により、あるいは坐薬によっても投与され得る。
【０１３９】
組成物は結腸内視鏡的に投与され、任意に、細菌組成物は他の直腸経路(例えば、浣腸または坐薬)により投与され、あるいは被験体が経口投与を有する場合でさえ、被験体は結腸洗浄製剤を有し得る。結腸洗浄製剤は、結腸内視鏡または他の投与装置の適正な使用を助長し得るが、しかしそれが機械的目的に役立たない場合でも、被験体の消化管中に従来棲息している他の生物体に比して、細菌組成物の割合を最大化し得る。あらゆる通常許容可能な結腸洗浄製剤、例えば典型には被験体が結腸内視鏡検査を受ける場合に提供されるものが、用いられ得る。
【０１４０】
投与量および投与計画
いくつかの実施形態では、細菌および細菌組成物は、剤形で提供される。ある実施形態では、剤形は、本明細書中に開示される少なくとも１つのＯＴＵまたはその組合せの投与のために設計され、その場合、投与される細菌組成物の総量は、０．１ｎｇ〜１０ｇ、１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜０．１ｇ、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、または１０〜１５ｍｇから選択される。他の実施形態では、細菌組成物は、１日０．１ｎｇ〜１０ｇ、１日１０ｎｇ〜１ｇ、１日１００ｎｇ〜０．１ｇ、１日０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、１日１ｍｇ〜１００ｍｇ、または１日１０〜１５ｍｇまたはそれ以上の割合で消費される。
【０１４１】
ある実施形態では、処置期間は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１か月、少なくとも２か月、少なくとも３か月、少なくとも４か月、少なくとも５か月、少なくとも６か月または少なくとも１年である。いくつかの実施形態では、処置期間は、１日〜１週間、１週間〜４週間、１か月〜３か月、３か月〜６か月、６か月〜１年、または１年を上回る間である。
【０１４２】
一実施形態では、１０５および１０１２マイクログラムが合計で、所定の剤形で患者に投与され得る。別の実施形態では、有効量は、１０７〜１０１１細菌をｍｌ当たりまたはグラム当たりで有する細菌組成物、あるいは１０７〜１０１１細菌を有する凍結乾燥粉末１ｍｇ〜１０００ｍｇを有するカプセル、錠剤または坐薬が１〜５００ｍｌまたは１〜５００グラムで提供され得る。短期処置を受けている者は、長期投与を受けている者（例えば、病院従業者または長期介護施設の入所者）より高用量を受容し得る。
【０１４３】
本明細書中に記載される製剤のいずれかが、一時にまたは多数の機会に１回、例えば１日１回数日間、または投与当日１日１回より多く(１日２回、１日３回、または１日５回まで)、投与され得る。別の実施形態では、製剤は、所定の計画に従って間欠的に、例えば週１回、月１回、または患者が原発性疾病から再発する場合に投与され得る。一実施形態では、製剤は、これらの病原体に感染する危険があるか、または保菌者であり得る被験体、例えば、侵襲性医学的手法(例えば、外科手術)を有するか、入院させられる、長期間、看護またはリハビリ施設に住む、彼らの職業(家畜類および動物処理従業者)により病原体に曝露される、あるいは病原体の保菌者である(例えば病院従業者、例えば医者、看護師、およびその他のヘルスケア専門職)被験体に、長期ベースで投与され得る。
【０１４４】
患者選択
個々の患者のために、または特定プロフィールを有する患者のために、特定の細菌組成物が選択され得る。例えば、１６Ｓシーケンシングは、彼または彼女の微生物叢中に存在する細菌を同定するために、所定の患者に関して実施され得る。シーケンシングは、１６Ｓシーケンシングを用いて患者の全マイクロバイオーム(科、属または種レベル)を、１６Ｓシーケンシングを用いて患者のマイクロバイオームの一部分をプロファイルし得るし、あるいはそれを用いて、健康または特定の疾患状態に関するバイオマーカー、例えば多剤耐性生物体またはエシェリキアのような目的の具体的な属のマーカーである具体的候補細菌の存在または非存在を検出するために用いられ得る。バイオマーカーデータに基づいて、健康を回復するかあるいは疾患を処置し、または防止するために、特定組成物が患者への投与のために選択されて、患者の微生物叢を補充するかまたは捕捉し得る。別の実施形態では、上首尾の処置の見込みを確定するために患者の微生物叢の組成を決定するため、患者はスクリーニングされ得る。
【０１４５】
併用療法
細菌組成物は、併用療法方式で、他の作用物質、例えば抗菌剤およびプレバイオティクスとともに投与され得る。投与は、時間または日にちの一区切りに亘って逐次的、あるいは同時的であり得る。
【０１４６】
一実施形態では、細菌組成物は、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウィルス剤および抗寄生生物剤を含む１つ以上の抗微生物剤とともに併用療法に含まれる。
【０１４７】
抗細菌剤としては、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシメ、セファドロキシル、セファゾリン、セファロシン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジルおよびセフトビプローレ）；フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レバキン、フロキシン、テキン、アベロックスおよびノルフロックス）；テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリンおよびドキシサイクリン）；ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシンおよびメチシリン）；ならびにカルバぺネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチンおよびメロペネム）が挙げられ得る。
【０１４８】
抗ウィルス剤としては、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビエンツ、エリビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、フォスカルネット、フォミビルセン、ガンシクロビル、インジナビル、イドクスウリジン、ラミブジン、ロピナビル、マラビロック、ＭＫ−２０４８、ネルフィナビル、ネビラピン、ペンシクロビル、ラルテグラビル、リルピビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノフォビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビダラビン、イバシタビン、アマンタジン、オセルタミビル、リマンチジン、チプラナビル、ザルシタビン、ザナミビルおよびジドブジンが挙げられ得る。
【０１４９】
抗真菌化合物の例としては、限定されないが、ポリエン系抗真菌剤、例えばナタマイシン、リモシジン、フィリピン、ニスタチン、アンフォテリシンＢ、カンディシンおよびハミシン；イミダゾール系抗真菌剤、例えばミコナゾール、ケトコナゾール、シクロトリマゾール、エコナゾール、オモコナゾール、ビフォナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾールおよびチオコナゾール；トリアゾール系抗真菌剤、例えばフルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾールおよびアルバコナゾール；チアゾール系抗真菌剤、例えばアバフンギン；アリラミン系抗真菌剤、例えばテルビナフィン、ナフチフィンおよびブタナフィン；ならびにエキノカンジン系抗真菌剤、例えばアニデュラファンギン、カスポファンギンおよびミカファンギンが挙げられる。抗真菌特性を有するその他の化合物としては、限定されないが、ポリゴジアル、安息香酸、シクロピロックス、トルナフテート、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５−フルオロシトシン、グリセオフルビンおよびハロプロジンが挙げられる。
【０１５０】
一実施形態では、細菌組成物は、１つ以上のコルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニソン、メトトレキセート、抗ヒスタミン剤、グルココルチコイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモリンナトリウム、抗ロイコトリエン剤、鼻炎用の抗コリン作動性薬、抗コリン作動性充血緩和剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチンおよびその組合せとの併用療法に含まれる。
【０１５１】
プレバイオティックスは、宿主の福祉および健康に利益を付与する消化管微生物叢における組成物および／または活性の両方の具体的変化を可能にする選択的発酵成分である。プレバイオティックスは、複合炭水化物、アミノ酸、ペプチド、または細菌組成物の生存のためのその他の不可欠な栄養構成成分を包含し得る。プレバイオティックスとしては、限定されないが、アミノ酸、ビオチン、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イヌリン、ラクツロース、マンナンオリゴ糖、オリゴフルクトース濃化イヌリン、オリゴフルクトース、オリゴデキストロース、タガトース、トランス−ガラクトオリゴ糖およびキシロオリゴ糖が挙げられる。
【０１５２】
棲息作用に関する細菌組成物の試験方法
細菌組成物が被験体の消化管に棲息するか否かを確定するためのｉｎ  ｖｉｖｏ検定
細菌組成物が被験体の消化管に棲息することを確定するために、動物モデル、例えばマウスモデルが用いられ得る。モデルは、マウスの微生物叢を評価することにより開始し得る。定性的評価は、正常マウスの糞便中の微生物コミュニティの１６Ｓプロファイリングを用いて成し遂げられ得る。それは、完全ゲノムシーケンシング、全ゲノムショットガンシーケンシング(ＷＧＳ)、または伝統的微生物学的技法によっても成し遂げられ得る。定量的評価は、以下で記載される定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)を用いて、または伝統的微生物学的技法の使用およびコロニー形成の計数により、実行され得る。
【０１５３】
任意に、マウスは、細菌共生バランス失調の条件を模倣するために抗生物質処置を受容し得る。抗生物質処置は、有意数の細菌分類群の豊富さの低減を含めて、分類学的豊かさ、多様性、ならびにコミュニティの均一性を減少させ得る(Ｄｅｔｈｌｅｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｐｅｒｖａｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ，ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｄｅｅｐ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６（１１）：３２８０（２００８））。少なくとも１つの抗生物質が用いられ得るし、抗生物質は周知である。抗生物質としては、アミノグリコシド系抗生物質（アミカシン、アルベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシンおよびアプラマイシン）、アモキシシリン、アンピシリン、アウグメンチン、（アモキシシリン／クラブラン酸カリウムの組合せ）、セファロスポリン（セファクロル、デファドロキシル、セファゾリン、セフィキシメ、セフォキシチン、セフプロジル、セフタジムジメ、セフロキシメ、セファレキシン）、クラブラン酸カリウム、クリンダマイシン、コリスチン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メトロニダゾールまたはバンコマイシンが挙げられ得る。個々の非限定具体例として、マウスは、抗生物質のカナマイシン、コリスチン、ゲンタマイシン、メトロニダゾールおよびバンコマイシンの混合物をそれぞれ４０ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、２１．５ｍｇ／ｋｇおよび４．５ｍｇ／ｋｇ（平均マウス体重当たりのｍｇ）で含有する飲料水を、７日間提供され得る。あるいは、マウスは、シプロフロキサシンを１５〜２０ｍｇ／ｋｇ（平均マウス体重当たりのｍｇ）の用量で７日間投与され得る。
【０１５４】
マウスが抗生物質を提供される場合、１日〜３日の休薬期間が、抗生物質処置および細菌組成物処置を伴わずに提供される。
【０１５５】
その後、試験先組成物が経口強制飼養によりマウスに投与される。試験細菌組成物は、先組成物中に１０４ＣＦＵの各型の細菌を含有する０．２ｍｌの容積で投与され得る。用量-応答は、一連の用量、例えば、限定されないが、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９および／または１０１０の一連の用量を用いることにより、査定され得る。
【０１５６】
マウスは、試験細菌組成物がマウスの消化管に棲息していたか否かを確定するために、１６Ｓシーケンシング、完全ゲノムシーケンシング、全ゲノムショットガンシーケンシング（ＷＧＳ）または伝統的微生物学的技法を用いて評価され得る。例えば、マウスへの細菌組成物の投与後１日だけ、３日、１週間、２週間および１か月、１６Ｓプロファイリングが実行されて、試験細菌組成物がマウスの消化管に棲息していたか否かを確定する。定量的評価、例えばｑＰＣＲおよび伝統的微生物学的技法、例えばコロニー計数、が、付加的にまたは代替的に、同一時間間隔で実施され得る。
【０１５７】
さらに、経時的細菌組成物中の配列計数と正確に対応する配列計数の数が査定されて、細菌組成物のどの構成成分が特定時間に亘って消化管中に棲息するかを具体的に確定し得る。別の実施形態では、細菌組成物の構成成分は所望の時間の間存続するが、一方、消化管に棲息する他の微生物(例えば、環境、足などに存在するもの)の能力も増大し、さらに、以下で考察されるように、全体的多様性を増大する。
【０１５８】
消化管の異なる領域に棲息する細菌組成物の能力
本発明の細菌組成物は、消化管上の異なる領域に棲息するそれらの能力に関しても査定され得る。一実施形態では、細菌組成物は、消化管の１つ以上の領域、例えば、限定されないが、胃、小腸(十二指腸、空腸および回腸)、大腸(盲腸、結腸(上行、横行、下行およびＳ字状結腸)および直腸)および直腸に棲息するその能力に関して選択され得る。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験を実行して、消化管のどの領域に所定の細菌組成物が生息するかを確定し得る。上記のものと同様のマウスモデルを実行し得るが、但し、マウスにより産生される糞便を査定する代わりに、消化管の特定領域を取り出して、個別に試験し得る。例えば、消化管の少なくとも１つの特定領域を取り出し、定性的または定量的確定が、消化管のその量意味の内容物に関して実施され得る。別の実施形態では、内容物は、任意に取り出され、定性的または定量的確定が、マウスから取り出された組織に関して実行され得る。
【０１６０】
ｑＰＣＲ
細菌組成物が消化管に棲息するか否かを確定するための定量的一方法として、定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)が実施され得る。細菌組成物の構成成分のすべてに関して集合的に、独立して、またはサブセットで(適用可能な場合)、当該細菌組成物に関する標準曲線を作成するために、標準技法が次になされ得る。メーカーの使用説明書に従って、市販のキット、例えばＭｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ(登録商標)−ｈｔｐ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ(登録商標)ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ゲノムＤＮＡが試料から抽出され得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲは、ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）および当該細菌組成物に特異的なプライマーを用いて実行され得るし、バーコードを有するＭｉｃｒｏＡｍｐ(登録商標)Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６−ウェル反応プレート（０．１ｍＬ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）上で実行され、ＣＦＸ９６(商標)実時間システムを装備したＢｉｏＲａｄ  Ｃ１０００(商標)サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で、ＦＡＭおよびＲＯＸチャネルの蛍光読取で実施され得る。ＦＡＭチャネル上の各ウェルに関するＣｑ値は、ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ(商標)ソフトウェア、バージョン２．１により確定される。各実験試料のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）は、所定の試料のＣｑ値を標準曲線から作成される線形回帰モデルに入力して、標準曲線ウェルのＣｑ値をそれらの試料の既知のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍｌ）と比較することにより、算定される。当業者は、代替的ｑＰＣＲモードを用い得る。
【０１６２】
細菌組成物の特性化のための方法
ある実施形態では、細菌組成物のある特質を試験するための方法が提供される。例えば、所定の組成物、製剤および／または使用における特定の望ましい特質に関して選択するために、例えばある環境変数に対する細菌組成物の感受性が確定される。例えば、細菌組成物中の構成成分は、ｐＨ耐性、胆汁酸耐性、および／または抗生物質感受性に関して、抗生物質毎に独立して、または多数の細菌構成成分からなる細菌組成物として集合的に(集合的に、この節では、細菌組成物として言及される)、試験され得る。
【０１６３】
ｐＨ感受性試験
細菌組成物が結腸または直腸意外に投与される場合(すなわち、例えば経口投与)、任意に、ｐＨ耐性に関する試験は、ＧＩ管の異なる領域の種々のｐＨ環境を通して考え得る最高収率で生き残る細菌組成物の選択を増大する。細菌組成物がＧＩ管のｐＨに対して以下に反応するかを理解することは、処方においても助けとなり、したがって、有益である場合には剤形中の細菌の数は増大され得るし、および／または組成物は、腸溶性カプセルまたは錠剤中で、あるいは緩衝または保護組成物とともに投与され得る。胃のｐＨは高タンパク質食後、短時間の間、１〜２のｐＨに低下し、その後、生理学的機序がそれを３〜４のｐＨに調整し、しばしば４〜５の休止ｐＨで棲みつき、小腸のｐＨは６〜７．４のｐＨ範囲であり得るので、これらの種々のｐＨ範囲を生き残る細菌組成物が調製され得る（具体的には、この場合、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％モノ細菌が、種々のｐＨ範囲を通して腸通過時間を生き続け得る）。これは、これらのｐＨ範囲を通しての予測腸通過時間の間、種々のｐＨ範囲に細菌組成物を曝露することにより試験され得る。したがって、単なる非限定例として、細菌組成物の１８時間培養を、標準培地、例えば腸微生物叢培地（「ＧＭＭ」、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ａｎｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ  ｍｉｃｅ、ＰＮＡＳ  １０８（１５）：６２５２−６２５７（２０１１）参照）中で、または別の動物生成物無含有培地中で、ｐＨを１〜２に関しては３０分間、ｐＨ３〜４に関しては１時間、ｐＨ４〜５に関しては１〜２時間、ｐＨ６〜７．４に関しては２．５〜３時間、ｐＨ調整剤を添加して、生育され得る。酸に対する安定性を試験するための代替的方法は、米国特許第４，８３９，２８１号に記載されている。細菌の生存は、細菌を培養し、適切な選択または非選択培地上のコロニーを計数することにより確定され得る。
【０１６４】
胆汁酸感受性試験
さらに、いくつかの実施形態では、胆汁酸耐性に関する試験は、ＧＩ管を通過する間の胆汁酸への曝露を生き延びる細菌組成物の選択を強化する。胆汁酸は小腸に分泌され、ｐＨと同様に、細胞組成物の生存に影響を及ぼし得る。これは、胆汁酸に対する予測腸曝露時間の間、胆汁酸に細菌組成物を曝露することにより試験され得る。例えば、胆汁酸溶液は、溶媒としてｐＨ９で０．０５ｍＭトリスを用いて、所望の濃度で調製され得る。胆汁酸が溶解された後、溶液のｐＨは、１０％ＨＣｌで７．２に調整され得る。細菌組成物は、患者における胆汁酸の濃度および型を模倣する胆汁酸組成物  ２．２ｍｌ、１０％滅菌濾過糞便培地  １．０ｍｌ、および細菌の所定の菌株の１８時間培養  ０．１ｍｌ中で培養され得る。インキュベーションは、２．５〜３時間またはそれ以上、実行され得る。胆汁酸に対する安定性を試験するための代替的方法は、米国特許第４，８３９，２８１号に記載されている。細菌の生存は、細菌を培養し、適切な選択または非選択培地上のコロニーを計数することにより確定され得る。
【０１６５】
抗生物質感受性試験
さらに任意の感受性試験として、細菌組成物は、抗生物質に対する感受性に関して試験され得る。一実施形態では、必要な場合、細菌組成物をターゲッティングする少なくとも１つの抗生物質により患者の消化管から排除されるかまたは実質的に低減され得るよう、細菌組成物が選択され、したがって、細菌構成成分は抗生物質に対して感受性であり得る。
【０１６６】
胃腸細胞への接着
細菌組成物は、任意に、胃腸細胞に接着する能力に関して試験され得る。胃腸細胞への接着を試験するための方法は、米国特許第４，８３９，２８１号に記載されている。
【０１６７】
胞子を精製するための方法
溶媒処理
細菌胞子を精製するために、固体排出物が１つ以上の溶媒処理に付される。溶媒処理は、混和性溶媒処理(部分的混和性または完全混和性)または非混和性溶媒処理である。混和性は、各々と混合して均質溶液を生成する２つの液体の能力である。例えば水およびエタノールは完全混和性であり、したがって水およびエタノールを任意の比率で含有する混合物は、一相のみを示す。混和性は、ｗｔ／ｗｔ％、または最終溶液１００ｇ中のある一溶媒の重量として提示される。２つの溶媒がすべての割合で完全に混和性である場合、それらの混和性は１００％である。水との完全混和性溶液として提供されるのは、アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等である。アルコールは、水とすでに併合されて提供される。例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８９％、８５％、９０％、９５％または９５％以上の他の溶媒を含有する溶液は、部分的に混和性であるにすぎず、多少の部分だけが水中に溶解する、ということを意味する。例えばジエチルエーテルは、水と部分混和性である。７グラムまでのジエチルエーテルが、９３ｇの水中に溶解して、７％（ｗｔ／ｗｔ％）溶液を生じる。より多くのジエチルエーテルが添加される場合、水の上に別個のジエチルエーテル層を有する２相溶液が生じる。その他の混和性物質としては、エーテル、ジメトキシエタンまたはテトラヒドロフランが挙げられる。これに対比して、油、例えばアルカンと水とは、非混和性であり、２相を形成する。さらに、非混和性処理は、任意に、洗剤、イオン性洗剤または非イオン性洗剤と併合される。例示的洗剤としては、トリトンＸ−１００、トゥイーン２０、トゥイーン８０、ノニデットＰ４０、プルロニックまたはポリオールが挙げられる。
【０１６８】
クロマトグラフィー処理
胞子集団を精製するために、糞便物質は、逐次的に、または平行して、1つ以上のクロマトグラフィー処理に付される。クロマトグラフィー処理では、糞便物質を含有する溶液は、疎水性相互反応クロマトグラフィー(ＨＩＣ)培地または親和性クロマトグラフィー培地を含有する固形培地と接触される。代替的実施形態では、糞便物質中に存在する残留棲息部位生成物を吸収し得る固形培地は、残留棲息部位生成物を吸着する固形培地と接触される。ある実施形態では、ＨＩＣ培地は、セファロースまたは誘導体化セファロース、例えばブチルセファロース、オクチルセファロース、フェニルセファロースまたはブチル−セファロースを含有する。他の実施形態では、アフィニティークロマトグラフィー培地は、ムチン  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ型で誘導体化される物質、あるいは、ムチン  Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ型から誘導体化されるかまたはそれらのものと類似のオリゴ糖を含有する。あるいは、アフィニティークロマトグラフィー培地は、胞子形成細菌を認識する抗体で誘導体化される物質を含有する。
【０１６９】
機械的処理
特に1つ以上の機械的処理、例えば配合、混合、振盪、渦動、衝撃粉砕および音波処理による糞便物質の物理的崩壊が、本明細書中で提供される。本明細書中で提供される場合、機械的崩壊処理は、糞便物質中に存在する非胞子物質を実質的に崩壊し、糞便物質中に存在する胞子を実質的に崩壊しない。機械的処理は、任意に、濾過処理を包含し、この場合、所望の胞子集団はフィルター上に保持されるが、一方、望ましくない(非胞子)糞便構成成分は通過され、次いで、胞子分画がフィルター媒質から回収される。あるいは、望ましくない粒子および真核生物細胞がフィルター上に保持され、一方、胞子を含む細菌細胞は通過する。いくつかの実施形態では、フィルター上に保持される胞子分画は、透析濾過ステップに付され、ここで、望ましくない糞便構成成分を低減するかまたは除去するために、保持胞子は洗浄液、典型的には滅菌生理食塩水含有溶液または他の希釈液と接触される。
【０１７０】
熱処理
糞便物質の熱崩壊が、本明細書中で提供される。一般的には、糞便物質は、生理食塩水含有溶液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に混合され、そして効率的熱移動が加熱環境と糞便物質との間で起こるよう、加熱環境、例えば温室、インキュベータ、水浴等に付される。好ましくは、糞便物質溶液は、インキュベーション中に混合されて、熱伝導を増強し、粒子凝集物を崩壊する。熱処理は、環境の温度および／または熱処理の持続時間により調整され得る。例えば、糞便物質または糞便物質を含む液体は、熱環境、例えば少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００または１００℃以上の温水浴に、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、３０、４５秒、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０または５０分、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０時間以上の間、付される。ある実施形態では、熱処理は、2つの異なる温度で、例えば１００℃環境で３０秒、その後、５０℃環境で１０分間、起こる。好ましい実施形態では、温度および熱処理の持続時間は、病原性物質を死滅させるかまたは除去するのに十分であり、一方、胞子の発芽能力を実質的に損害または低減しない。
【０１７１】
照射処理
所望の胞子集団を実質的に損害することなく、病原性物質を死滅させるのに十分なエネルギーレベルで提供される電離放射線、典型的にはガンマ線照射、紫外線照射、または電子線照射で、糞便物質または糞便物質の分離内容物を処理する方法が、提供される。例えば、約２２，０００マイクロワット秒／ｃｍ２より低いエネルギーレベルで提供される２５４ｎｍでの紫外線照射は、一般的に所望の胞子を破壊しない。
【０１７２】
遠心分離および密度分離処理
遠心分離により糞便物質の他の構成成分から所望の胞子集団を分離する方法が、提供される。糞便物質を含有する溶液は、例えば約１０００×ｇ、２０００×ｇ、３０００×ｇ、４０００×ｇ、５０００×ｇ、６０００×ｇ、７０００×ｇ、８０００×ｇまたは８０００×ｇ以上で、１回以上の遠心分離処理に付される。分画遠心分離は、望ましくない非胞子物質から所望の胞子を分離する。低エネルギーで胞子は溶液中に保持され、一方、高エネルギーで、胞子はペレット化され、一方、より小さい不純物(例えば、ウィルス粒子、ファージ)は溶液中に保持される。例えば、第一の低エネルギー遠心分離は繊維性物質をペレット化する。第二の高エネルギー遠心分離は、望ましくない真核生物細胞をペレット化し、第三のさらに高いエネルギーの遠心分離は、所望の胞子をペレット化する一方、小夾雑物が懸濁液中に残存する。いくつかの実施形態では、密度または移動度の勾配またはクッション(例えば、ステップクッション)、例えばパーコール、フィコール、ニコデンツ、ヒストデンツまたはスクロース勾配が、糞便物質中の他の物質から所望の胞子集団を分離するために用いられる。
【０１７３】
胞子集団から望ましくない物質および／または活性を死滅させるかまたは除去しながら、所望の胞子を相乗的に精製するために、本明細書中に記載される処理のうちの２つ以上を組み合わせる胞子集団の産生方法も、本明細書中で提供される。胞子集団中に存在する病原性細菌の生育を最小限にするために、そして植物性細菌細胞への胞子の発芽を最小限にするために、非発芽および非生育促進条件および培地下で、胞子集団を保持することが一般的に望ましい。
【０１７４】
本発明の薬学的組成物および製剤
製剤
それを必要とするヒトおよびその他の被験体への投与のための製剤が、提供される。一般的に、単一回投与量単位で、または多数回投与フォーマットであり得る最終生成物を産生するために、細菌組成物は、付加的活性および／または非活性物質と組み合わされる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの炭水化物を含む。「炭水化物」は、糖または糖の重合体を指す。「糖類」、「多糖類」、「炭水化物」および「オリゴ糖」という用語は、互換的に用いられ得る。ほとんどの炭水化物は、通常は分子の各炭素原子上に１つのヒドロキシル基を多数有するアルデヒドまたはケトンである。炭水化物は、一般的に、分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖または多糖であり得る。ほとんどの基本炭水化物は、単糖、例えばグルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロースおよびフルクトースである。二糖は、２個の結合された単糖である。例示的に糖としては、スクロース、マルトース、セロビオースおよびラクトースが挙げられる。典型的には、オリゴ糖は、３〜６個の単糖単位（例えば、ラフィノース、スタキオース）を含み、多糖は、６個以上の単糖単位を含む。例示的多糖としては、デンプン、グリコーゲンおよびセルロースが挙げられる。炭水化物は、改質糖単位、例えば２’−デオキシリボース(この場合、ヒドロキシル基が除去される)、２’−フルオロリボース(この場合、ヒドロキシル基がフッ素と置き換えられる)、またはＮ−アセチルグルコサミン、窒素含有型のグルコース（例えば、２’−フルオロリボース、デオキシリボースおよびヘキソース）を含有し得る。炭水化物は、多数の異なる形態で、例えば配座異性体、環状型、非環状型、立体異性体、互変異性体、アノマーおよび異性体の形態で存在し得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。本明細書中で用いる場合、「脂質」は、脂肪、油、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、遊離脂肪酸を含めた任意の形態の脂肪酸を包含する。脂肪、油および脂肪酸は、飽和、不飽和(シスまたはトランス)または部分不飽和(シスまたはトランス)であり得る。いくつかの実施形態では、脂質は、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：４）、アラキジン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰＡ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）およびテトラコサン酸（２４：０）から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。他の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの改質脂質、例えば調理により改質された脂質を含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つの補助ミネラルまたはミネラル源を含む。ミネラルの例としては、限定されないが、塩化物、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウムおよびセレンが挙げられる。前記ミネラルのいずれかの適切な形態としては、ミネラル塩、わずかに可溶性のミネラル塩、不溶性ミネラル塩、キレート化ミネラル、ミネラル複合体、非反応性ミネラル、例えばカルボニルミネラルおよび還元ミネラル、ならびにその組合せが挙げられる。
【０１７８】
ある実施形態では、組成物は、少なくとも１つの補助ビタミンを含む。少なくとも１つのビタミンは、脂溶性または水溶性ビタミンであり得る。適切なビタミンとしては、限定されないが、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸およびビオチンが挙げられる。前記のいずれかの適切な形態は、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンの同一または類似の活性を有する化合物、およびビタミンの代謝産物である。
【０１７９】
他の実施形態では、組成物は賦形剤を含む。適切な賦形剤の非限定例としては、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、結合剤、圧縮剤、滑剤、分散増強剤、崩壊剤、風味剤、甘味剤および着色剤が挙げられる。
【０１８０】
別の実施形態では、賦形剤は緩衝剤である。適切な緩衝剤の非限定例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウムおよび重炭酸カルシウムが挙げられる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、賦形剤は防腐剤を含む。適切な防腐剤の非限定例としては、酸化防止剤、例えばアルファ−トコフェロールおよびアスコルビン酸塩、ならびに抗菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノールおよびフェノールが挙げられる。
【０１８２】
他の実施形態では、組成物は、賦形剤として結合剤を含む。適切な結合剤の非限定例としては、デンプン、アルファデンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ１２−Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖およびその組合せが挙げられる。
【０１８３】
別の実施形態では、組成物は、賦形剤として滑剤を含む。適切な滑剤の非限定例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウムおよび軽質鉱油が挙げられる。
【０１８４】
他の実施形態では、組成物は、賦形剤として分散増強剤を含む。適切な分散剤の非限定例としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーゴム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファス（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ）ケイ酸塩、および微晶質セルロース(高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤として)が挙げられる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、組成物は、賦形剤として崩壊剤を含む。他の実施形態では、崩壊剤は非発泡性崩壊剤である。適切な非発泡性崩壊剤の非限定例としては、デンプン、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、その糊化および改質デンプン、甘味剤、粘土、例えばベントナイト、微晶質セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、ゴム、例えばアガー、グアー、イナゴマメ、カラヤ、ペクチンおよびトラガカントゴムが挙げられる。別の実施形態では、崩壊剤は発泡性崩壊剤である。適切な発泡性崩壊剤の非限定例としては、クエン酸と組み合わせる重炭酸ナトリウム、ならびに酒石酸と組み合わせる重炭酸ナトリウムが挙げられる。
【０１８６】
別の実施形態では、賦形剤は風味剤を含む。風味剤は、合成風味油および風味芳香剤；天然油；植物体、葉、花および果実からの抽出物；ならびにその組合せから選択され得る。いくつかの実施形態では、風味剤は、シナモン油；冬緑樹の油；ペパーミント油；丁子油；干し草油；アニス油；ユーカリ；バニラ；柑橘油、例えばレモン油、オレンジ油、ブドウおよびグレープフルーツ油；ならびに果実精油、例えばリンゴ、モモ、ナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップルおよびアンズから選択される。
【０１８７】
他の実施形態では、賦形剤は甘味剤を含む。適切な甘味剤の非限定例としては、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトースおよびその混合物（担体として用いられない場合）；サッカリンおよびその種々の塩、例えばナトリウム塩；ジペプチド甘味剤、例えばアスパルテーム；ジヒドロカルコン化合物、グリシリジン；ステビア・レバウジアナ（ステビオシド）；スクロースのクロロ誘導体、例えばスクラロース；ならびに糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、シリトール等が挙げられる。加水分解水添デンプン、ならびに合成甘味剤３，６−ジヒドロ−６−メチル−１，２，３−オキサチアジン−４−オン−２，２−ジオキシド、特にカリウム塩（アセスルファムＫ）、ならびにそのナトリウムおよびカルシウム塩も意図される。
【０１８８】
さらに他の実施形態では、組成物は着色剤を含む。適切な着色剤の非限定例としては、食物、薬剤および化粧品用の色剤（ＦＤ＆Ｃ）、薬剤および化粧品用の色剤（Ｄ＆Ｃ）、ならびに外用薬および化粧品用の色剤（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。着色剤は、染料またはそれらの対応するレーキとして用いられ得る。
【０１８９】
製剤中の賦形剤または賦形剤の組合せの重量分率は、通常は、組成物の総重量の約９９％以下、例えば約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、または約１％以下である。
【０１９０】
本明細書中に開示される細菌組成物は、種々の形態に処方され、多数の異なる手段により投与され得る。組成物は、所望により慣用的に許容可能な担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する製剤中で、経口的に、直腸的に、または非経口的に投与され得る。「非経口的」という用語は、本明細書中で用いる場合、皮下、静脈内、筋肉内または胸骨内注射および注入技法を包含する。例示的一実施形態では、細菌組成物は経口的に投与される。
【０１９１】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル、錠剤、カプレット、ピル、トローチ、ロゼンジ、粉末、顆粒が挙げられる。カプセルは、典型的には、細菌組成物を含むコア物質、およびコア物質を封入する外殻壁からなる。いくつかの実施形態では、コア物質は、固体、液体および乳濁液のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、外殻壁物質は、軟質ゼラチン、硬質ゼラチンおよびポリマーのうちの少なくとも１つを含む。適切なポリマーとしては、限定されないが、セルロース系ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、トリメリト酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルローススクシネートおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム；アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、例えばアクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリレート、アンモニオメチルアクリレート、エチルアクリレートメチルメタクリレートおよび／またはエチルメタクリレートから形成されるもの（例えば、「オイドラギット」の商品名で販売されているコポリマー）；ビニルポリマーおよびコポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリビニルアセテート、ポリビニルアセテートフタレート、ビニルアセテートクロトン酸コポリマー、およびエチレン−ビニルアセテートコポリマー；ならびにシェラック（精製ラック）が挙げられる。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのポリマーは、矯味剤として機能する。
【０１９２】
錠剤、ピル等は、圧縮され、多重圧縮され、多重層化され、および／または被覆され得る。コーティングは、単一または多重であり得る。一実施形態では、コーティング物質は、植物、真菌および微生物のうちの少なくとも１つから抽出される糖、多糖および糖タンパク質のうちの少なくとも１つを含む。限定例としては、コーンスターチ、コムギデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチン、マンナン、アラビアゴム、イナゴマメゴム、メスキートゴム、グアーゴム、カラヤゴム、ガッチゴム、トラガカントゴム、フノリ、カラギーナン、寒天、アルギネート、キトサンまたはゲランゴムが挙げられる。いくつかの実施形態では、コーティング物質はタンパク質を含む。別の実施形態では、コーティング物質は、脂肪および油のうちの少なくとも１つを含む。他の実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、高温溶融性である。さらに別の実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、水素添加されるかまたは部分的に水素添加される。一実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、植物に由来する。他の実施形態では、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、グリセリド、遊離脂肪酸および脂肪酸エステルのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、コーティング物質は、少なくとも１つの食用蝋を含む。食用蝋は、動物、昆虫または植物に由来する。非限定例としては、蜜蝋、ラノリン、ヤマモモ蝋、カルナウバ蝋および米糠蝋が挙げられる。錠剤およびピルは、さらに、腸溶性コーティングを伴って調製され得る。
【０１９３】
あるいは、本明細書中に開示される細菌組成物を用いる粉末または顆粒は、食物製品中に組み入れられ得る。いくつかの実施形態では、食物製品、経口投与のための飲料である。適切な飲料の非限定例としては、フルーツジュース、フルーツ飲料、人工風味飲料、人工甘味飲料、炭酸飲料、スポーツドリンク、液体酪農製品、シェイク、アルコール飲料、カフェイン入り飲料、乳児用調整乳等が挙げられる。経口投与のためのその他の適切な手段としては、適切な溶媒、防腐剤、乳化剤、沈澱防止剤、希釈剤、甘味剤、着色剤および風味剤のうちの少なくとも１つを含有する、水性および非水性溶液、乳濁液、懸濁液および溶液および／または非発泡性顆粒から再構成される懸濁液が挙げられる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、食物製品は固体食料品であり得る。固体食料品の適切な例としては、限定されないが、食物バー、スナックバー、クッキー、ブラウニー、マフィン、クラッカー、アイスクリームバー、冷凍ヨーグルトバーなどが挙げられる。
【０１９５】
他の実施形態では、本明細書中に開示される組成物は、栄養治療食中に組み入れられる。いくつかの実施形態では、栄養治療食は、任意にいくつかのまたはすべての必須主要栄養素および微量栄養素を含有するそのまま食べられる食物である。別の実施形態では、本明細書中に開示される組成物は、既存の食事に配合されるよう意図された栄養補助食品中に組み入れられる。一実施形態では、栄養補助食品は、いくつかのまたはすべての必須主要栄養素および微量栄養素を含有する。別の実施形態では、本明細書中に開示される細菌組成物は、タンパク質栄養を強化するために既存の食物に配合されるかまたは添加される。例としては、必需食物（穀物、塩、砂糖、調理用油、マーガリン）、飲料（コーヒー、紅茶、ソーダ、ビール、アルコール飲料、スポーツドリンク）、スナック、スイーツおよびその他の食物が挙げられる。
【０１９６】
一実施形態では、製剤は、経口投与のためにゼラチンカプセル中に充填される。適切なカプセルの一例は、１０ｍｇから１００ｍｇまでの凍結乾燥粉末（１０８〜１０１１個の細菌）、１６０ｍｇの微晶質セルロース、７７．５ｍｇのゼラチンおよび２．５ｍｇのステアリン酸マグネシウムを含有する２５０ｍｇゼラチンカプセルである。代替的一実施形態では、１０５〜１０１２個の細菌が用いられ得るし、１０５〜１０７、１０６〜１０７個または１０８〜１０１０個の細菌が、必要な場合は賦形剤の付随アジュバントとともに用いられ得る。代替的一実施形態では、腸溶性カプセルまたは錠剤が、あるいは緩衝または保護組成物とともに、用いられ得る。
【実施例】
【０１９７】
以下は、本発明を実行するための具体的実施形態の実施例である。実施例は、説明目的のために提供されるにすぎず、いかなる点においても本発明の範囲を限定するものではない。用いられる数(例えば、量、温度等)に関して正確を保証するよう努力がなされてきたが、しかし実験誤差および偏差は、もちろん許されるべきである。
【０１９８】
本発明の実行は、別記しない限り、当業者の知識の範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の指示された、慣用的方法を用いる。このような技術は、文献中に詳細に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【０１９９】
実施例１:種同定
複合分画から生育する細菌種の同一性は、多数の方法で確定し得る。先ず、個々のコロニーを、９６ウェルフォーマット中の液体培地中に摘み取り、成長させて、−８０℃で１５％グリセロールストックとして保存する。培養のアリコートを細胞溶解緩衝液中に入れて、コロニーＰＣＲ法を用いて、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子を増幅し、シーケンシングし得る(実施例２)。あるいは、コロニーを固形培地上で画線培養し、数回継代接種して精製し得る。ウェル分離コロニーを同一種類の新たなプレート上で画線培養して、３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。純度を保証するために、工程を数回繰り返す。表現型または配列ベースの方法、例えば実施例２および３に記載されるような１６Ｓ  ｒＤＮＡ増幅およびシーケンシングにより、純粋な培養を分析し得る。純単離物または混合コミュニティ、例えばプレート掻取物および胞子分画の配列特性化は、全ゲノムショットガンシーケンシングも含み得る。後者は、胞子形成、抗生物質耐性、病原性および病毒性に関連した遺伝子の存在を確定するために有益である。コロニーは、さらにまた、個々の１６Ｓ署名が複合混合物中で同定され得るよう、プレートからひとまとめに掻き取り、実施例２および３に記載されるような大規模並列シーケンシング法を用いてシーケンシングし得る。任意に、発芽可能な種の多様性を胞子試料中の種の総数と比較するために、発芽前に試料をシーケンシングし得る(適切な場合は、ＤＮＡ単離手法を用いて胞子からＤＮＡを溶解し、放出する)。１６Ｓ分析に対する代替的または相補的アプローチとして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃも、種同定のために用い得る(Ａｎａｅｒｏｂｅ  ２２:１２３で検討されているように)。
【０２００】
実施例２：操作的分類単位(ＯＴＵ)を確定するための１６ｓシーケンシング
１６Ｓ配列の決定方法
ＯＴＵｓは、ｒＲＮＡ遺伝子の完全１６Ｓシーケンシングにより、この遺伝子の特定超可変領域（すなわち、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８またはＶ９）のシーケンシングにより、あるいはこの遺伝子の超可変領域の任意の組合せ（例えば、Ｖ１−３またはＶ３−５）のシーケンシングにより、限定され得る。細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡはおよそ１５００ヌクレオチド長であり、系統学的アプローチを用いて、ある細菌単離物と別のものとの進化的関係および配列類似性を再構築するのに用いられる。１６Ｓ配列は、それらが概して高度に保存されるが、しかし大半の微生物の属および種を識別するのに十分なヌクレオチド多様性を保有する特定の超可変領域を含有するので、系統学的再構築に用いられる。
【０２０１】
周知の技法を用いて、完全１６Ｓ配列または１６Ｓ配列の任意の超可変領域を決定するために、ゲノムＤＮＡを細菌試料から抽出し、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（完全領域または特定の超可変領域）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、ＰＣＲ産物を清浄して、ヌクレオチド配列を描いて、１６Ｓ遺伝子またはその遺伝子のサブドメインの遺伝子組成を決定する。完全１６Ｓシーケンシングが実施される場合、用いられるシーケンシング方法は、限定されないが、サンガー・シーケンシングであり得る。１つ以上の超可変領域、例えばＶ４領域が用いられる場合、シーケンシングは、限定されないが、サンガー法を用いて、または次世代シーケンシング法、例えば多重反応を可能にするバーコード化プライマーを用いるイルミナ(合成によるシーケンシング)法を用いて、実施され得る。
【０２０２】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のほかに、ＯＴＵｓの所定の種または分類群に関するマーカー遺伝子であることが既知の選定組の遺伝子をシーケンシングすることにより、ＯＴＵを限定し得る。これらの遺伝子は、代替的には、ＰＣＲベースのスクリーニング戦略を用いて検定され得る。例として、熱不安定性（ＬＴＩ、ＬＴＩＩａおよびＬＴＩＩｂ）および熱安定性（ＳＴＩおよびＳＴＩＩ）毒素、ベロ毒素１、２および２ｅ型（それぞれＶＴ１、ＶＴ２およびＶＴ２ｅ）、細胞傷害性壊死因子（ＣＮＦ１およびＣＮＦ２）、接着および消滅機序（ｅａｅＡ）、腸凝集性機序（Ｅａｇｇ）、ならびに腸侵襲性機序（Ｅｉｎｖ）をコードする遺伝子からのＤＮＡを用いて、病原性大腸菌の種々の菌株を識別し得る。マーカー遺伝子の使用によるＯＴＵｓの分類学的割り当てに関して利用するための最適遺伝子は、配列に基づいた分類学的同定の当業者によく知られている。
【０２０３】
ゲノムＤＮＡ抽出
熱アルカリ溶解法を用いて、純粋微生物培養からゲノムＤＮＡを抽出する。１μｌの微生物培養を、９μｌの溶解緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＯＨ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に添加し、混合物を９５℃で３０分間インキュベートする。その後、試料を４℃に冷却し、１０μｌの中和緩衝液（４０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ）の添加により中和して、次に、溶離緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ）中に１０倍希釈する。あるいは、市販のキット、例えばＭｏ  Ｂｉｏ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ(登録商標)微生物ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、または当業者に既知の標準方法により、純粋微生物培養からゲノムＤＮＡを抽出する。
【０２０４】
下流サンガー・シーケンシングのための１６Ｓ配列の増幅
細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡを増幅するために（図１Ａ）、２μｌの抽出ｇＤＮＡを２０μｌの最終容積ＰＣＲ反応に添加する。全長１６シーケンシングのために、ＰＣＲ反応は、さらにまた、１×ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、２５０ｎＭの２７ｆ（ＡＧＲＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ（配列番号：２０３３）、ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、および２５０ｎＭの１４９２ｒ（ＴＡＣＧＧＹＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＹＧＡＣＴＴ（配列番号：２０３４）、ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を、容積の平衡のためのＰＣＲ  Ｗａｔｅｒ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに含有する。あるいは、当業者に既知の他の普遍的細菌プライマーまたは熱安定性ポリメラーゼを用いる。例えば、プライマーは、１６Ｓ  ｒＲＮＡの「Ｖ１−Ｖ９領域」のシーケンシングのために当業者に利用可能である（図１Ａ）。これらの領域は、細菌試料の遺伝子類別のために用いられる１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の第１−第９超可変領域を指す。細菌におけるこれらの領域は、大腸菌系の命名法を基礎にした番号付けを用いて、それぞれヌクレオチド６９−９９、１３７−２４２、４３３−４９７、５７６−６８２、８２２−８７９、９８６−１０４３、１１１７−１１７３、１２４３−１２９４および１４３５−１４６５により限定される（Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  １６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  エシェリキア  コリ，ＰＮＡＳ  ７５（１０）：４８０１−４８０５（１９７８））。いくつかの実施形態では、Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ８およびＶ９領域のうちの少なくとも１つを用いて、ＯＴＵを特性化する。一実施形態では、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３領域を用いて、ＯＴＵを特性化する。別の実施形態では、Ｖ３、Ｖ４およびＶ５領域を用いて、ＯＴＵを特性化する。別の実施形態では、Ｖ４領域を用いて、ＯＴＵを特性化する。当業者は、配列中の候補配列を参照配列と比較し(図１Ｂ)、参照超可変領域との類似性に基づいて超可変領域を同定することにより、候補１６Ｓ  ｒＲＮＡの特定の超可変領域（図１Ａ）を同定し得る。
【０２０５】
市販のサーモサイクラー、例えばＢｉｏＲａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ(商標)サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で、ＰＣＲを実施する。反応を、９４℃で２分間、その後、９４℃で３０秒、５１℃で３０秒および６８℃で１分３０秒を３０回実行し、その後、７２℃で７分延長して、４℃で無期限保持する。ＰＣＲ後、反応生成物の一部分のゲル電気泳動を用いて、〜１．５ｋｂ生成物の増幅がうまくいったことを確証する。
【０２０６】
ＰＣＲ産物からヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを取り出すために、２μｌのＨＴ  ＥｘｏＳａｐ−ＩＴ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を５μｌのＰＣＲ産物に添加し、その後、３７℃で１５分間インキュベートし、次いで、８０℃で１５分間、不活性化する。
【０２０７】
大規模並列シーケンシング技法による下流特性化のための１６Ｓ配列の増幅
ショートリード技法、例えばイルミナによる下流シーケンシングのために実施される増幅は、配列ベースのバーコードタグを付加的に含む当業者に既知のプライマーを用いる増幅を必要とする。例として、細菌１６Ｓ  ｒＤＮＡの１６Ｓ超可変領域Ｖ４領域を増幅するために、２μｌの抽出ｇＤＮＡを２０μｌの最終容積ＰＣＲ反応に添加する。ＰＣＲ反応は、さらにまた、１×ＨｏｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、２００ｎＭのＶ４＿５１５ｆ＿ａｄａｐｔ（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ（配列番号：２０３５）、ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）および２００ｎＭのバーコード化８０６ｒｂｃ（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ＿１２ｂｐＧｏｌａｙＢａｒｃｏｄｅ＿ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ（記載順に、それぞれ、配列番号：２０３６及び配列番号：２０３７）、ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を、容積の平衡のためのＰＣＲ  Ｗａｔｅｒ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに含有する。これらのプライマーは、合成によりイルミナ・シーケンシングのためのバーコード化アダプターを組み入れる。任意に、同一の反復、三重反復または四重反復反応を実施し得る。あるいは、当業者に既知のその他の普遍的細菌プライマーまたは熱安定性ポリメラーゼを用いて、異なる増幅およびシーケンシング誤差率、ならびに代替的シーケンシング技法に関する結果を得る。
【０２０８】
市販のサーモサイクラー、例えばＢｉｏＲａｄ  ＭｙＣｙｃｌｅｒ(商標)サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で、ＰＣＲ増幅を実施する。反応を、９４℃で３分間、その後、９４℃で４５秒、５０℃で１分間および７２℃で１分３０秒を２５回実行し、その後、７２℃で１０分延長して、４℃で無期限保持する。ＰＣＲ後、反応生成物の一部分のゲル電気泳動を用いて、〜１．５ｋｂ生成物の増幅がうまくいったことを確証する。ＰＣＲ浄化を、前記実施例で明記したように実施する。
【０２０９】
純粋均質試料からの標的アンプリコンのサンガー・シーケンシング
各試料に関する核酸を検出するために、２つのシーケンシング反応を実施して、正および逆方向シーケンシング・リードを生成する。全長１６ｓシーケンシングのために、プライマー２７ｆおよび１４９２ｒを用いる。４０ｎｇのＥｘｏＳａｐ−ＩＴ−ｃｌｅａｎｅｄ  ＰＣＲ産物を、２５ｐｍｏｌのシーケンシングプライマーおよびＭｏ  Ｂｉｏ分子生物学等級水（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と混合して、総容積を１５μｌとする。この反応を、サンガー・シーケンシングのために商業的シーケンシング機構、例えばジーンウィズ（Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）に付託する。
【０２１０】
不均質試料からの標的アンプリコンの大規模並列シーケンシング
ＤＮＡ定量＆ライブラリー構築。    清浄化ＰＣＲ増幅産物を、メーカーの使用説明書に従って、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ(商標)ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ(登録商標)ｄｓＤＮＡ検定キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて定量する。定量後、各々の別個のＰＣＲ産物が等モル比になるよう、バーコード化清浄化ＰＣＲ産物を併合して、調製イルミナライブラリーを作成する
【０２１１】
核酸検出。    調製ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  イルミナＨｉＳｅｑまたはＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上でシーケンシングし、シーケンシングプライマーのクラスター生成、鋳型ハイブリダイゼーション、イソ−サーマル増幅、線状化、ブロッキングならびに変性化およびハイブリダイゼーションを、メーカーの使用説明書に従って実施する。１６ＳＶ４ＳｅｑＦｗ（ＴＡＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ（配列番号：２０３８））、１６ＳＶ４ＳｅｑＲｅｖ（ＡＧＴＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ（配列番号：２０３７））、および１６ＳＶ４Ｉｎｄｅｘ（ＡＴＴＡＧＡＷＡＣＣＣＢＤＧＴＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴ（配列番号：２０３９））（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を、シーケンシングのために用いる。他のシーケンシング技法、例えば、限定されないが、ゲノムシーケンシングの当該技術分野の当業者には標準であるプロトコールを用いる４５４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔおよびＮａｎｏｐｏｒｅが用いられ得る。
【０２１２】
実施例３：配列リード注釈付け
第一リード注釈付け
核酸配列を解析し、そして注釈付けは、配列類似性および系統学的配置法、または２つの戦略の組合せを用いて分類学的割り当てを明示することである。類似のアプローチを用いて、タンパク質名、転写因子名、ならびに核酸配列に関する任意の他の分類スキームを注釈付けし得る。配列類似性を基礎にした方法としては、当業者に既知のもの、例えば、限定されないが、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴｘ、ｔＢＬＡＳＴｎ、ｔＢＬＡＳＴｘ、ＲＤＰ−分類子、ＤＮＡｃｌｕｓｔ、ならびにこれらのアルゴリズムの種々の実装、例えばＱｉｉｍｅまたはＭｏｔｈｕｒが挙げられる。これらの方法は、参照データベースに対して配列リードをマッピングすること、そして最良スコアおよびｅ値を有する整合を選択することに頼っている。一般データベースとしては、限定されないが、ヒトマイクロバイオームプロジェクト、ＮＣＢＩ非冗長データベース、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ、ＲＤＰおよびＳｉｌｖａが挙げられる。系統学的方法は、配列類似性法と組み合わせて用いられて、注釈付けまたは分類学的割り当ての決定正確度を改善し得る。ここで、３つのトポロジーおよび節構造を用いて、解析の分解能を洗練する。このアプローチでは、当業者に周知である多数の配列類似性アプローチおよび影響力のある系統学的方法のうちの１つ、例えば、限定されないが、最尤系統樹再構築を用いて、核酸配列を解析した（例えば、Ｌｉｕ  Ｋ，Ｌｉｎｄｅｒ  ＣＲ，ａｎｄ  Ｗａｒｎｏｗ  Ｔ．２０１１．ＲＡｘＭＬ  ａｎｄ  ＦａｓｔＴｒｅｅ：Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  Ｔｗｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ２７７３１．ＭｃＧｕｉｒｅ  Ｇ，Ｄｅｎｈａｍ  ＭＣ，ａｎｄ  Ｂａｌｄｉｎｇ  ＤＪ．２００１．Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇａｐｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ  １８：４８１-４９０．Ｗｒoｂｅｌ  Ｂ．２００８．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｏｆ  ｕｎｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｆｏｒ  ｂｒａｎｃｈｅｓ  ｉｎ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒｅｅｓ  ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．４９：４９−６７参照）。配列リードを、適切な参照配列からなる参照系統発生に配置する。系統樹におけるそのリードの配置に基づいて、注釈付けを行なう。ＯＴＵ注釈付けの確実性または意義を、参照核酸配列とのＯＴＵの配列類似性、ならびに系統発生における１つ以上の参照配列と比較した場合のＯＴＵ配列の近接性に基づいて明示する。一例として、問われているＯＴＵ配列の配置と比較した場合の参照系統樹におけるブートストラップ支持分枝の位置を基礎にして決定される確実性で、分類学的割り当ての特異性を、科、属、種または系統のレベルで確実に明示する。
【０２１３】
クレード割り当て
特定の種としてＯＴＵを割り当てる１６Ｓ−Ｖ４  ＯＴＵ同定の能力は、一部は、特定種または種の群に関する１６Ｓ遺伝子の１６Ｓ−Ｖ４領域の分解能によって決まる。系統樹の異なる領域に関して利用可能な参照１６Ｓ配列の密度、ならびに異なる種間の１６Ｓ遺伝子における固有の変異性はともに、分類学的注釈付けの確定性を決定する。系統樹のトポロジカルな性質、ならびにそれらの配列類似性および基本的進化モデルに基づいた互いとのＯＴＵの階層的関係を系統樹が表しているという事実を考えると、リードの分類学的注釈付けは、クレードベースの割り当て手法を用いて高レベルに増やされ得る(表１)。
このアプローチを用いて、系統学の技術分野の当業者に既知の最大尤度またはその他の系統学的モデルを用いて、全長１６Ｓ配列から構築される系統樹のトポロジーを基礎にして、クレードを決定する。クレードを構築して、所定のクレードにおけるすべてのＯＴＵｓが、(ｉ)互いからの特定数のブートストラップ支持節内(一般的に、１〜５ブートストラップ)、ならびに(ｉｉ)５％遺伝子類似性内であることを保証する。同一クレード内であるＯＴＵｓは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて異なるクレードにおけるＯＴＵｓとは遺伝的および系統学的に異なるとして識別され得る。同一クレード内に入るＯＴＵは、進化的に密接に関連しており、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて互いから識別可能であることも、そうでないこともある。それらの進化的近縁性のために、同一クレードの成員であるクレードベースの解析の能力は、ヒト腸に見出されるもののような微生物生態構造において類似の機能的役割を果たすと思われる。ある種を同一クレードからの別のものに置換する組成物は、保存された生態学的機能を有すると思われ、したがって本発明において有用である。
【０２１４】
特に、所定のＯＴＵの単離物の１６Ｓ配列は、系統学的に、それらのそれぞれのクレード内に配置され、時として、先行する１６Ｓベースの割り当てを有し得る種および属の微生物学ベースの割り当てと矛盾する。微生物学的特質に基づく分類学的割り当て対遺伝子シーケンシングに基づくものとの間の不一致は、文献から存在することが知られている。
【０２１５】
実施例４:発芽胞子
細菌の混合物は、胞子形態である種を含み得る。胞子分画を発芽させることは、種々の培地型の上で生育する生存可能な細菌の数を増大する。胞子の集団を発芽させるために、試料を嫌気性小室に移して、予備還元ＰＢＳ中に再懸濁し、混合して、３７℃で１時間インキュベートして、発芽させる。発芽物質は、アミノ酸(例えば、アラニン、グリシン)、糖(例えば、フルクトース)、ヌクレオシド(例えば、イノシン)、胆汁酸塩(例えば、コール酸塩およびタウロコール酸塩)、金属陽イオン(例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋)、脂肪酸および長鎖アルキルアミン(例えば、ドデシルアミン、「アルキル第一級アミンを有する細菌胞子の発芽」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９６１)を含み得る。これらの混合物またはより多くの複合天然混合物、例えばルーメン液またはオックスゴールを用いて、発芽を誘導し得る。オックスゴールは、脂肪酸、胆汁酸、無機塩硫酸塩、胆汁色素、コレステロール、ムチン、レシチン、グルクロン酸、ポルフィリンおよび尿素からなる脱水ウシ胆汁である。発芽は、増殖培地、例えば予備還元ＢＨＩＳ／オックスゴール発芽培地中でも実施し得るが、この場合、ＢＨＩＳ(脳心臓浸出物粉末(３７ｇ／Ｌ)、酵母抽出物(５ｇ／Ｌ)、Ｌ−システインＨＣｌ(１ｇ／Ｌ))は複合ＢＨＩおよび酵母抽出混合物中のペプチド、アミノ酸、無機イオンおよび糖を提供し、オックスゴールは、付加的胆汁酸発芽物質を提供する。
【０２１６】
さらに、圧力を用いて胞子を発芽させることもある。発芽の選択は、探し出そうとしている微生物に伴って変わり得る。異なる種は異なる発芽物質を必要とし、同一種の異なる単離体は、最適発芽のために異なる発芽物質を必要とし得る。最後に、いくつかの発芽物質は植物状態微生物の生育に対して抑制的であるため、プレート化の前に混合物を希釈することが重要である。例えば、最適生育を促すために、アルキルアミンは陰イオン性親油性物質で中和されなければならない、ということが示されている。胆汁酸も、いくつかの生物体の発芽を促進するにもかかわらず、それらの生育を抑制し得るので、生育可能細胞に関するプレート化の前に、希釈されなければならない。
【０２１７】
例えばＢＨＩＳ／オックスゴール溶液は発芽物質として用いられ、０．２５％オックスゴール（脱水ウシ胆汁）を有する０．５×ＢＨＩＳ培地(ここで、１×ＢＨＩＳ培地は、溶液１Ｌ当たりで以下のものを含有する：６ｇの固体からの脳心臓浸出物、７ｇの動物組織のペプチン消化物、１４．５ｇのカゼインの膵臓消化物、５ｇの酵母抽出物、５ｇの塩化ナトリウム、２ｇのグルコース、２．５ｇのリン酸二ナトリウムおよび１ｇのシステイン。さらに、Ｃａ−ＤＰＡは発芽物質であり、４０ｍＭ  ＣａＣｌ２および４０ｍＭジピコリン酸（ＤＰＡ）を含有する。ルーメン液（Ｂａｒ  Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｉｎｃ．）もまた、発芽物質である。人工胃液（Ｒｉｃｃａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）は発芽物質であり、０．７％（ｖ／ｖ）塩酸中の０．２％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウムである。ムチン培地は発芽物質であり、以下の品目を１Ｌの蒸留滅菌水に添加することにより調製する：０．４ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５３ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．３ｇのＮＨ４Ｃｌ、０．３ｇのＮａＣｌ、０．１ｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．１１ｇのＣａＣｌ２、１ｍｌのアルカリ性微量元素溶液、１ｍｌの酸性微量元素溶液、１ｍｌのビタミン溶液、０．５ｍｇのレサズリン、４ｇのＮａＨＣＯ３、０．２５ｇのＮａ２Ｓ×９Ｈ２Ｏ。微量元素およびビタミン溶液は、以前に記載されたように調製される（Ｓｔａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。化合物はすべてオートクレーブ処理したが、但し、ビタミンは濾過滅菌した。基本培地に、０．７％（ｖ／ｖ）清澄化滅菌ルーメン液および０．２５％（ｖ／ｖ）市販ブタ胃ムチン（ＩＩＩ型；Ｓｉｇｍａ）（以前記載されたようにエタノール沈澱により精製）を補足した（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｈｏｓｋｉｎｓ，１９８１）。この培地は、本明細書中ではムチン培地として言及される。
【０２１８】
ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）は発芽物質として用いられ得るし、０．１３７Ｍ  塩化ナトリウム、０．００２７Ｍ  塩化カリウム、０．０１１９Ｍ  リン酸塩緩衝液を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の、熱不活性化された５％ＦＢＳを含有する。チオグリコール酸塩は以前に記載されたように発芽物質であり（Ｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８９）、０．２５Ｍ（ｐＨ１０）チオグリコール酸ナトリウムを含有する。ＰＢＳ中に１ｍＭドデシルアミンを含有するドデシルアミン溶液は、発芽物質である。糖溶液は発芽物質として用いられ得るし、０．２％フルクトース、０．２％グルコースおよび０．２％マンニトールを含有する。アミノ酸溶液も発芽物質として用いられ得るし、５ｍＭアラニン、１ｍＭアルギニン、１ｍＭヒスチジン、１ｍＭリシン、１ｍＭプロリン、１ｍＭアスパラギン、１ｍＭアスパラギン酸、１ｍＭフェニルアラニンを含有する。Ｇｅｒｍｉｘ３として本明細書中で言及される発芽物質混合物は発芽物質であり得るし、５ｍＭアラニン、１ｍＭアルギニン、１ｍＭヒスチジン、１ｍＭリシン、１ｍＭプロリン、１ｍＭアスパラギン、１ｍＭアスパラギン酸、１ｍＭフェニルアラニン、０．２％タウロコール酸塩、０．２％フルクトース、０．２％マンニトール、０．２％グルコース、１ｍＭイノシン、２．５ｍＭ  Ｃａ−ＤＰＡおよび５ｍＭ  ＫＣｌを含有する。ＢＨＩＳ培地＋ＤＰＡは発芽物質混合物であり、ＢＨＩＳ培地および２ｍＭ  Ｃａ−ＤＰＡを含有する。ＥｃＳＮとして本明細書中で言及される大腸菌使用済み培地上清は発芽物質であり、ＳｗｅｅｔＢ／Ｆｏｓイヌリン培地中で嫌気的に４８時間、大腸菌ＭＧ１６５５を生育させ、２０，０００ｒｃｆで２０分間、細胞を回転させて、上清を収集し、６０℃に４０分間加熱することにより、調製される。最後に、溶液を濾過滅菌して、発芽物質溶液として用いる。
【０２１９】
実施例５：糞便からの胞子形成分画の精製および単離
糞便物質から有効な胞子を精製し、選択的に単離するために、先ず、均質化装置（例えば、実験室配合機）を用いて提供糞便を生理食塩水と配合して、２０％スラリー（ｗ／ｖ）を生成する。１００％エタノールを、１０秒〜１時間持続する不活性化処理のために添加する。最終アルコール濃度は、３０〜９０％、好ましくは５０〜７０％の範囲であり得る。高速遠心分離（３２００ｒｃｆで１０分間）を実施して溶媒を除去し、ペレットを保持して、洗浄する。その後、一旦洗浄済みペレットを再懸濁し、低速遠心分離ステップ（２００ｒｃｆで４分間）を実施して、大型粒状植物物質を除去し、胞子を含有する上清を保持する。高速遠心分離（３２００ｒｃｆで１０分間）を上清に関して実施して、胞子物質を濃縮する。次に、ペレットを洗浄し、再懸濁して、２０％スラリーを生成する。これは、エタノール処理胞子調製物である。次いで、濃縮スラリーを密度ベースの勾配、例えばＣｓＣｌ勾配、スクロース勾配または２つの組合せで分離して、エタノール処理勾配精製胞子調製物を生成する。例えば、６４％、５０％、４０％ＣｓＣｌ（ｗ／ｖ）のステップを含有する段階的ＣｓＣｌ勾配(ｗ／ｖ)の上部８０％溶液上に２０％容積の胞子懸濁液を負荷して、３２００ｒｃｆで２０分間遠心分離することにより、ＣｓＣｌ勾配を実施する。次に、６７％、５０％、４０％および３０％（ｗ／ｖ）のステップを伴うスクロースステップ勾配で胞子分画を動かす。スイングバケットローター中で、３２００ｒｃｆで１０分間、遠心分離する場合、胞子は、概略で、３０％および４０％スクロース分画中で移動する。次に、より低部の胞子分画（図２）を取り出し、洗浄して、濃縮エタノール処理勾配精製胞子調製物を生成する。位相差顕微鏡により観察される胞子の屈折特性を利用して（胞子は明るく、屈折性であるが、一方、発芽胞子および植物細胞は暗い）、エタノール処理ＣｓＣｌ勾配精製胞子調製物（図３、中央）と、ならびにエタノール処理ＣｓＣｌ勾配精製スクロース勾配精製胞子調製物（図３、右）と比較した場合の糞便細菌細胞懸濁液からの胞子分画(図３、左)の濃化を観察し得る。
【０２２０】
さらに、発芽物質で処理後の胞子の生育も、生育可能な胞子集団を定量するために用い得る。要するに、試料を発芽物質とともにインキュベートし（オックスゴール、０．２５％、１時間までの間）、希釈して、ＢＢＡ（ブルセラ血液寒天）または類似の培地（例えば、実施例４および５参照）上に嫌気的に載せた。個々のコロニーを摘み取り、全長１６ＳシーケンシングのためにＤＮＡを単離して、種組成を同定した（例えば、実施例２および３参照）。勾配を用いて、および勾配を用いずに精製された両方の物質中に存在する大多数で、２２の種が全体で観察される（表２）、ということを解析は明示したが、これは、勾配精製の結果として、生態学におけるシフトが認められないかまたはわずかであるということを示している。胞子収率算定は、ＢＢＡ上での胞子の発芽およびプレート化、または試料中のＤＰＡ数の測定により測定した場合の初期糞便物質からの胞子の３８％の効率的回収率を実証する。
【０２２１】
実施例６：細菌組成物はマウスモデルにおけるＣ．ディフィシル感染を防止する
細菌組成物、例えば、限定されないが、胞子調製物の治療能力を試験するために、Ｃ．ディフィシル感染の予防的マウスモデル（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３５（６）：１９８４−１９９２に基づいたモデル）を用いた。２つのケージの各々５匹を、各アームの実験に関して試験した。マウスはすべて、１０％グルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍｌ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍｌ）からなる抗生物質カクテルをそれらの飲料水で−１４日目〜−５日目に、そして１０ｍｇ／ｋｇの用量のシリンダマイシンを−３日目に経口強制投与で摂取した。−１日目に、マウスは試験物またはビヒクル対照を経口強制投与により摂取した。０日目に、経口強制投与を介したおよそ４．５  ｌｏｇ１０ｃｆｕのＣ．ディフィシル（ＡＴＣＣ  ４３２５５）の投与により、マウスを負荷試験した。任意に、陽性対照群は、上記の抗生物質プロトコールおよびＣ．ディフィシル負荷試験のほかに、−１日目〜３日目にバンコマイシンを摂取した。保菌の分析のためにケージから糞便を収集し、０日目から６日目まで、毎日死亡率を査定して、動物の体重およびその後の体重変化を、Ｃ．ディフィシル感染に関連する体重減少を用いて査定した。ビヒクルと比較した場合の試験物の死亡率および重量減少低減を用いて、試験物の成功を査定した。さらに、Ｃ．ディフィシル症候スコアリングを、−１日間から６日目まで、毎日実施した。臨床スコアは、外見（正常、猫背、立毛または不活発に基づいて０〜２ポイント）、および臨床徴候（正常、湿った尾、触ると冷たい、または他の動物から孤立に基づいて０〜２ポイント）に関するスコアを併合することにより、０〜４スケールを基礎にした。
【０２２２】
未処置対照アームでは、動物をＣ．ディフィシルで攻撃誘発した。バンコマイシン陽性対照アームでは、動物にＣ．ディフィシルを用量投与し、−１日目〜３日目に、バンコマイシンで処置した。陰性対照を、ＰＢＳ単独で、細菌なしで経口強制投与した。実験の試験アームは、エタノール処理胞子の単一ドナー調製物（例えば、実施例５参照）、または８０℃で３０分間、２０％スラリーを処理することにより調製される熱処理糞便に由来する１×、０．１×、０．０１×希釈液を試験した。ＣＦＵ数に関する用量投与を、最終エタノール処理胞子から決定し、総胞子の希釈液を、エタノール処理分画に関しては１×、０．１×、０．０１×の胞子混合物で、熱処理分画に関しては１×用量で、投与した。
【０２２３】
３日目に、体重減少および死亡率を査定した。Ｃ．ディフィシルのみで処置した陰性対照は、３日目に２０％の死亡率および体重減少を示したが、一方、１０％ヒト糞便懸濁液の陽性対照は、３日目に死亡または体重減少を示さなかった（表３）。ＥｔＯＨ−処理糞便は、３つの希釈液で死亡および体重減少を防止するが、一方、熱処理分画は試験した用量唯一の用量で防御的であった。これらのデータは、胞子分画がマウスにおけるＣ．ディフィシル感染を防止するのに有効である、ということを示している。
【０２２４】
実施例７：予防および再発防止ハムスターモデル
Ｃ．ディフィシルの毒素原性および非毒素原性菌株を用いたハムスターでの従来の試験は、Ｃ．ディフィシル感染（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８１，Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｂｏｒｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８５）およびさらに広範には胃腸感染性疾患における抗生物質処置後の再発および盲腸フローラでの予防的処置の効果を検査するに際してのハムスターモデルの有用性を実証した。Ｃ．ディフィシル感染を改善するための細菌組成物、例えば、限定されないが、胞子集団、胞子調製物、植物細胞集団の予防的使用を実証するために、以下のハムスターモデルを用いる。予防的モデルでは、クリンダマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ皮下）は−５日目に与えられ、細菌組成物または対照は−３日目に投与され、Ｃ．ディフィシル攻撃誘発は０日目に生じる。陽性対照アームでは、次いでバンコマイシンが１〜５日目に投与され（ビヒクル対照は−３日目に送達される）。糞便を−５、−４、−１、１、３、５、７、９日目に収集し、微生物学的方法、１６Ｓシーケンシングアプローチ、または当業者に利用されるその他の方法により、糞便試料を病原体保菌および低減に関して査定する。Ｃ．ディフィシル攻撃誘発御の２１日間を通しての実験の間中、死亡率を査定する。生存率パーセンテージ曲線は、バンコマイシン対照およびビヒクル対照と比較して、エタノール処理胞子およびエタノール処理勾配精製胞子がハムスターをより良好に防護する、ということを示す。結果を図４に示すが、これは、エタノール処理胞子調製物およびエタノール処理勾配精製胞子調製物を用いた予防モデルを例示している。
【０２２５】
再発防止モデルでは、０日目に毒素原性Ｃ．ディフィシル菌株でハムスターを攻撃誘発し、１日目にクリンダマイシン経口強制投与により処置し、２〜６日目にバンコマイシンを用量投与する。次いで、７、８および９日目に試験または対照処置を施した。各アームに関するハムスターの群は、群当たり８匹のハムスターからなる。糞便物質を−１、１、３、５、７、１０および１３日目に収集し、全体を通してハムスター死亡率を査定する。生存曲線を用いて、ハムスター死亡防止に際して、試験物、例えばエタノール処理またはエタノール処理勾配精製胞子が対照処理に対して上首尾であったことを査定する。生存曲線は、エタノール処理勾配精製胞子に関する最大効力を、次にエタノール処理胞子の効力を実証する。両処理は、バンコマイシン処理単独を上回って、生存パーセンテージを改善した。
【０２２６】
結果を図５に示すが、これは、エタノール処理胞子およびエタノール処理勾配精製胞子による再発防止モデルを例示している。
【０２２７】
実施例８：患者における反復性Ｃ．ディフィシルの臨床処置
ヒト患者における反復性Ｃ．ディフィシルを処置するための細菌組成物のような試験物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子調製物（例えば、実施例５参照）の効力を査定するために、以下の手順を実施して、健常ドナーから糞便を採取し、下記のエタノール処理胞子調製プロトコールにより不活性化して、この適応症を提示している患者における反復性Ｃ．ディフィシルを処置した。慢性の医学的症状（例えば、炎症性腸疾患；過敏性腸症候群；腹腔疾患；あるいは消化管悪性疾患またはポリープの任意の病歴）の非存在、伝染性感染症に関する危険因子の非存在、過去６か月における抗生物質の非使用に関する全身健康歴、ならびに提供糞便の前の、血液由来病原体（ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、ＨＡＶおよびトレポネマ・パリヅム）、および糞便細菌性病原体（サルモネラ、赤痢菌、エルシニア、カンピロバクター、大腸菌Ｏ１５７）、卵および寄生生物、ならびにその他の感染性作因（ジアルジア、クリプトスポリジウム、シクロスポラ、イソスポラ）に関する実験室検定における陰性結果に関して、非関連ドナーをスクリーニングした。
【０２２８】
ドナー大便を糞便提供直後に凍結し、試験のために試料採取した。使用時に、およそ７５ｇのドナー大便を解凍し、５００ｍＬの非静菌性生理食塩水中に再懸濁して、単一回使用ガラスまたはプラスチック製ブレンダー中で混合した。その結果生じたスラリーを逐次、滅菌使い捨てメッシュスクリーンに通して、６００、３００および２００ミクロンサイズの粒子を取り出した。次にスラリーを手短に遠心分離して（２００ｒｃｆで４分間）、繊維性および粒状物質を分離し、上清（細菌細胞および胞子を含有する）を新たな容器に移した。エタノールを添加して、最終濃度を５０％とし、その結果生じた〜１５００ｍｌスラリーを、室温で１時間、連続混合しながらインキュベートして、植物性細菌細胞を不活性化した。不活性化の途中で、スラリーを新しいボトルに移して、エタノールとの完全接触を保証した。固形物質を遠心分離器でペレット化して、生理食塩水で３回洗浄して、残留エタノールを除去した。最終ペレットを最小容積での１００％滅菌ＵＳＰグリセロール中に再懸濁し、各々０．６５ｍＬ懸濁液で、およそ３０個のサイズ０遅延放出カプセル（ヒプロメロース、ＤＲｃａｐｓ，Ｃａｐｓｕｇｅｌ，Ｉｎｃ．）中に充填した。カプセルに直ちに蓋をして、ドライアイスで−８０℃に保持したアルミニウム凍結ブロック上に載せて、冷凍した。凍結カプセルを、順次、サイズ００ＤＲｃａｐｓでオーバーカプセル化してカプセル安定性を増強し、ラベルを貼って、直ちに−６５℃貯蔵下に置いた。使用日時まで、最終生成物を＜−６５℃で保存した。カプセル封入生成物は、＜−６５℃で無期限に保存し得る。用量投与日に、カプセルを湿潤氷上で１〜２時間温めて耐容性を改善し、次いで、水を随意に与えた。
【０２２９】
患者１は、処置前の少なくとも１年間、Ｃ．ディフィシル感染および下痢の病歴を有する４５歳の女性である。彼女は、以前に、多数回の抗生物質経過後に、毎度、Ｃ．ディフィシル関連下痢を繰り返していた。
【０２３０】
患者２は、処置前の６か月間、反復性Ｃ．ディフィシル感染を経験している８１歳女性で、適切な抗生物質療法にもかかわらず、その後、毎度再発していた。
【０２３１】
経口処置開始の２４時間前に、ＣＤＡＤ抗生物質療法を中断した。各患者は、消化管における競合微生物負荷を低減し、治験薬中の胞子形成生物体による再集団化を促すよう意図された結腸調製物手法を受けた。
【０２３２】
初回処置日の午前に、患者は、治験薬を含有する遅延放出カプセルの用量投与を受け、水を随意に摂取した。患者は、その後１時間は食物を摂取しないよう求められた。翌日、患者はクリニックに戻って、さらなる用量投与を受けた。２回目の用量投与前と投与後１時間は食物を摂取しないことを患者は求められた。
【０２３３】
処置後の再発性または悪性症候の証拠に関して、両患者を厳密に追跡調査した。２日目、４日目、ならびに１、２および４週間目に電話で患者と接触し、各々、彼女の全身状態、ＣＤＡＤの状態および関連症候について質問した。基線、処置後１、２、４および８週間目に大便試料を収集して、前に説明した方法(例えば、実施例２および３参照)で１６シーケンシングおよび胞子計数により腸微生物叢の変化を査定した。処置後４週間を通して、各患者は漸次改善し、Ｃ．ディフィシル再発の証拠は認められなかった。
【０２３４】
反復性Ｃ．ディフィシル関連下痢を有する６名の他の患者を、同様に処置し、ＣＤＩ反復も抗生物質の再消費も伴わなかった（合計８名の患者）。さらに、処置関連の重篤な悪性事象は認められなかった。
【０２３５】
上記プロトコールは、他の細菌組成物、例えば植物細胞、胞子調製物、その組合せを送達するよう修正し得る。
【０２３６】
実施例９：細菌の濃化および精製
個々の細菌株を精製するために、密度が単一コロニーの別個の分離を可能にする希釈プレートを選択した。コロニーを滅菌器具（滅菌ループまたは爪楊枝）で摘み取り、ＢＢＡまたは他の固形培地に再画線した。プレートを、３７℃で３〜７日間、インキュベートした。主要形態構造型のうちの１つ以上のウェル単離単一コロニーを、再画線した。この過程を、単一安定コロニー形態構造が観察されるまで、少なくとも３回繰り返した。次に、単離微生物を液体培地中で嫌気的に２４時間以上培養して、１０６〜１０１０ｃｆｕ／ｍｌの純粋培養を得た。液体増殖培地は、酵母抽出物、ヘミン、システインおよび炭水化物(例えば、マルトース、セロビオース、可溶性デンプン)を補足した脳心臓浸出物ベースの培地（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）、または前に記載された他の培地（例えば、実施例５参照）を包含し得た。培養を、１０，０００×ｇで５分間遠心分離して、細菌をペレット化し、使用済み培地を除去して、細菌を滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。滅菌７５％グリセロールを添加して、最終濃度を２０％とした。グリセロールストックのアリコートを、連続希釈およびプレート化により滴定した。ストックの残りをドライアイス上で１０〜１５分間凍結させて、次に、長期保存のために−８０℃に置いた。
【０２３７】
実施例１０：細胞バンク調製
細菌株の細胞バンク（ＲＣＢｓ）を、以下のように調製した。細菌株を、−８０℃凍結グリセロールストックから、ヘミンまたはビタミンＫを有するブルセラ血液寒天（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）、Ｍ２ＧＳＣ（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）またはその他の固形増殖培地に画線して、Ｈ２：ＣＯ２：Ｎ２の１０：１０：８０気体混合物とともに嫌気性小室中で３７℃で２４〜４８時間、インキュベートした。次に、単一コロニーを摘み取り、それを用いて、２５０ｍｌ〜１ＬのＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎブロス、脳心臓浸出物ブロス、Ｍ２ＧＳＣブロスまたはその他の増殖培地に接種し、増殖の中〜後期指数期に、または定常期に生育させた。あるいは、単一コロニーを用いて、１０ｍｌのパイロット培養に接種し、次いでこれを、大容量培養に接種するために用い得る。収穫時の増殖培養および増殖期は、関連し得る細胞力価、胞子形成（所望により）および表現型をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで所望されるよう増強するために選択した。任意に、どれが最大細胞力価を生じるかによって、培養を定常または振盪生育させた。次に、５０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離により、培養を１０倍以上に濃縮し、滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)＋１５％グリセロール中に再懸濁した。１ｍｌアリコートを１．８ｍｌクリオバイアル中に移し、これを次に、ドライアイス上で凍結させて、−８０℃で保存した。１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅と、その後のサンガー直接サイクルシーケンシング、ならびに精選ｒＤＮＡデータベースと比較して、分類学的ＩＤを決定することにより、所定の細胞バンクの同一性を確証した。ブルセラ血液寒天またはＭ２ＧＳＣ寒天への画線時に、単一形態構造のコロニーを産生するために、各バンクを確認した。１つより多い形態構造が観察される場合、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＰＣＲおよびシーケンシング解析により、コロニーは予測される種であると確証された。変異体コロニー形態構造は純粋培養内で観察され得るし、種々の細菌において、種々のコロニー形態構造の機序は、クロストリジウム種(Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ−ＫＴＬ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，６ｔｈ  Ｅｄ，Ｊｏｕｓｉｍｉｅ−Ｓｏｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ  ２００２)の場合を含めて、十分に記載されている（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｏｕｄｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１７：５１８，２００４）。絶対嫌気性生物に関しては、ＲＣＢｓは、１０ｃｆｕ／ｍｌの検出限界で、好気性コロニー形成単位を欠くことが確証された。
【０２３８】
実施例１１：力価決定
ＲＣＢの連続希釈液をブルセラ血液寒天またはその他の固形培地にプレート化して、１０６から１０１０ｃｆｕ／ｍｌに変えることにより、１ｍｌ当たりの生育可能細胞の数を、新たに収穫された洗浄および濃縮培養において確定した。ドライアイスまたは−８０℃での１回または２回の凍結−解凍サイクル後と、その後、室温で嫌気性小室で解凍した後のバンクを滴定することにより、生存能力に及ぼす凍結の影響を確定した。いくつかの菌株は、第１回および／または第２回の凍結解凍後に生育可能ｃｆｕの１〜３ｌｏｇ低下を示したが、一方、他の生存能力は影響を受けなかった。
【０２３９】
実施例１２：細菌組成物の調製
個々の菌株を、典型的には、氷上で解凍し、嫌気性小室中で併合して、混合物を作成し、その後、−８０℃で二次凍結させて、混合物試料を保存した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ検定のために菌株の組合せを作製する場合、最終混合物におけるｃｆｕを、個々の菌株の二次凍結−解凍力価に基づいて概算した。齧歯類における実験に関しては、菌株当たり１ｅ４〜１ｅ１０で送達するために、等数で菌株を併合し得る。さらに、いくつかの細菌は、すべての細菌が１ｅ１０で存在した組成物の産生を可能にする細胞バンクを産生するのに十分な力価に生育し得ない。
【０２４０】
実施例１３：腸マイクロバイオーム試料物質の提供
新鮮な腸マイクロバイオーム試料、例えば糞便試料を、全身の良好な健康に関して、ならびに感染性疾患の非存在に関してスクリーニングされており、含入および排除判定基準を満たす健常ヒトドナーから得た。この場合、含入判定基準は、全身健康状態が良好であること、有意の医療歴、身体検査知見または臨床実験室異常を有さないこと、典型的には、ブリストル便形状スケールで２、３、４、５または６型の便形状を有する規則正しい排便、ならびにＢＭＩ≧１８ｋｇ／ｍ２および≦２５ｋｇ／ｍ２を有することを包含する。排除判定基準は、一般的に、有意の慢性または急性の医学的症状、例えば腎臓、肝臓、肺、消化管、心臓血管、泌尿生殖器、内分泌、免疫学的、代謝的、神経学的または血液学的疾患、炎症性腸疾患、例えばクローン病および潰瘍性結腸炎、過敏性腸症候群、結腸、胃または他の消化管の悪性疾患、または消化管のポリープ症候群の家族歴、あるいは生物(単数または複数)が主成分であるヨーグルトまたは市販の生菌物質の最近の使用を包含する。便座の上に配置されるプラスチック製支持体および支持体の上に存在する収集容器を含有する便器検体収集システムを用いて、試料を直接収集した。腸マイクロバイオーム試料、例えば糞便を容器中に投入して、次に蓋を容器の上に置いて、ぴったり密封した。次に、加工処理のために１〜４時間以内に、試料を氷上に送達した。試料を滅菌使い捨て用具で混合し、２〜４ｇのアリコートを計量して、試験管中に入れ、ドライアイス／エタノール浴中で瞬間冷凍した。使用するまで、アリコートを−８０℃で凍結させた。
【０２４１】
任意に、マイクロバイオーム試料を溶液中に懸濁し、ならびに／あるいは繊維性および／または粒状物質を除去した。既知重量の試料を含有する凍結アリコートを、−８０℃での保存庫から取り出し、室温で解凍させた。滅菌１×ＰＢＳを添加して、１０％ｗ／ｖ懸濁液を作成し、物質が均質に見えるようになるまで、激しく撹拌して試料を懸濁した。次に試料を室温で１０分間放置して、繊維性および粒状物質を沈殿させた。次いで、沈殿物の上の懸濁液を新規の試験管に注意深く取り出したが、これは、精製胞子集団を含有する。任意に、次に懸濁液を低速で、例えば１０００×ｇで５分間、遠心分離して、繊維を含む粒状物質をペレット化した。ペレットを廃棄し、植物性生物体および胞子を含有する上清を新規の試験管中に取り出した。次に、上清を６０００×ｇで１０分間遠心分離して、植物性生物体および胞子をペレット化した。次いで、試料物質が均質に見えるようになるまで、激しく撹拌しながら、ペレットを１×ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２４２】
実施例１４:マウスモデルにおける腸に棲息する細菌組成物
２つの細菌組成物をマウスモデルで評価して、消化管中に棲息する能力を実証した。細菌を、実施例１２に記載したように生育させた。組成物を嫌気性条件下で再作製して、ＰＢＳ＋１５％グリセロール中に懸濁し、≧−７０℃で保存した後、使用した。
【０２４３】
マウスの群（雌１０匹／群；ケージ当たり５匹）を、−１４日目〜−５日目に、その飲料水中の１０％グルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍｌ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍｌ）からなる抗生物質カクテルで前処理した。−３日目に、マウスは、経口強制投与により１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシンを摂取した。−１日目に、マウスに、０．２ｍＬの容量で経口強制投与により微生物性組成物を用量投与した（表ＺＡ）。微生物性組成物は、ほぼ等数の各ＯＴＵを含み、各組成物に関してＯＴＵ当たりおよそ１×１０９、１×１０８および１×１０７で用量投与した（例えば、１５の菌株を含む微生物性組成物１を、およそ１．５×１０１０、１．５ｘ１０９および１．５×１０８の総ＣＦＵで用量投与した）。糞便試料を、用量投与後−１日目（用量投与のおよそ１時間前）ならびに２、３および４日目に各ケージから収集した。加工処理およびシーケンシングの前に、糞便を凍結保存した。いずれかの微生物性組成物で処置したマウスの体重増加は、未処置対照マウスの場合と同様であった。
【０２４４】
平行して、−１日目に同一微生物性組成物で処置した動物の群を、０日目に、経口強制投与により、クロストリジウム・ジフィシル(ＡＴＣＣ  ４３２５５)のおよそ１０４．５個の胞子で攻撃誘発した。Ｃ．ディフィシル攻撃誘発動物に関する死亡率を、０日目から６日目まで毎日査定し、動物の体重およびその後の体重変化を査定したが、体重減少はＣ．ディフィシル感染に関連した。エンプティビヒクルと比較した場合の試験動物の死亡率および重量減少低減を用いて、試験物の成否を査定した。
【０２４５】
【表１】
0006479685.tif 000002
【０２４６】
＊＊＊実施例２および３に従ってＤＮＡを単離し、シーケンシングすることにより、糞便試料を加工処理した。−１、２、３および４日目からの糞便試料のＯＴＵ割り当てを、＊＊＊実施例２に記載したように１６Ｓ−Ｖ４配列リードを解析し、ＯＴＵを割り当てることにより確定した。クレードを、＊＊＊実施例２に記載したように割り当てた。同一実験群のケージからの結果を合計することにより、各ＯＴＵに関して総リード数を確定した。処置のＯＴＵまたはクレードに関して１０以下の配列リードを有する試料は、バックグラウンドより低いとみなされ、合計プロセスに含まれなかった。結果はＯＴＵにより(表ＴＡＢ)、ならびにクレードにより(表ＴＡＣ)示される。
【０２４７】
【表２−１】
0006479685.tif 000003
【表２−２】
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【表２−３】
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【０２４８】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０２４９】
表ＴＡＢにおけるＯＴＵデータの検査時に、いくつかのパターンが出現する。先ず、−１日目に配列リードを有さないＯＴＵｓの一群が存在し、これは、その後の、且つ多数の配列リードを、２、３または４日目に示す；この群は、Ｃｌ．ブチリクム、Ｃｌ．ヒレモネ、Ｃｌ．オルビシンデンス、Ｃｌ．シンビオスムおよびＬ．バクテリウム＿５＿１＿５７ＦＡＡを含む。Ｃｌ．ディスポリクムは、バックグラウンドに非常に近い−１日目における配列リードを有するので、この群に匹敵し（組成物１および２においてそれぞれ１０および２９）、これはその後、２、３または４日目に１０００倍と大きく増大する。第二に、ＯＴＵｓ、例えばＣｏ．アエロファシエンス、Ｃ．コメス、Ｒ．ブロミイ、Ｂ．プロヅクタ、Ｃｌ．ボルテエ、Ｃｌ．マヨンベイ、Ｃｌ．イノキュウム、Ｃｌ．テルチウムおよびＲ．グナブスが存在し、これらは、−１日目試料において、またはその後の試料において、ＯＴＵレベルで検出可能でない。組成物２では、Ｃｏ．アエロファシエンスが、１×１０８および１×１０７用量群において２日目に一時的に検出される；同一実験群におけるＥ．レクタレは３日目に検出されたが、これは、マウスのこれらの群におけるＣｏ．アエロファシエンス、その後のＥ．レクタレによる一時的集団間の考え得る関係を示唆している。際立った観察は、ＯＴＵ配列リードの観察された数は、高度に用量依存的でない、というものである。全体的に、データは、経口投与後にＯＴＵｓが急速に棲息するモデルと一致する。
【０２５０】
表ＴＡＣにおけるクレードベースの解析を実施して、消化管の集団をさらに徹底的に評価した。クレードベースの解析は、ＯＴＵ解析によりもたらされる詳細のいくつかを分かりにくくする。例えば、Ｃｌ．テルチウムおよびＣｌ．ブチリクムは同一クレードの成員であり、したがって、クレードベースの解析はこれらの個々のＯＴＵｓの動力学を区別できない。しかしながら、クレードベースの解析は、ＯＴＵベースの解析により見落とされ得る集団変化の測定に対して感受性であるという補償的利益を有する。具体的な種としてＯＴＵを割り当てる１６Ｓ−Ｖ４  ＯＴＵ同定の能力は、一部は、特定の種または種の群に関する１６Ｓ−Ｖ４領域の分解能によって決まる。系統樹の異なる領域に関する利用可能な参照１６Ｓ配列の密度、ならびに異なる種アイサの１６Ｓ遺伝子における固有の変異性はともに、分類学的注釈付けの確定性を決定する。したがって、いくつかの場合、種の棲息度は、ＯＴＵベースの検出が複合集団において非感受性である場合、クレードベースの割り当てを用いて追跡調査され得る。例えば、表１におけるクレードベースの解析は、各ＯＴＵが微生物性組成物におけるクレードの単独成員であり、配列リードが−１日目に検出不可能から、２、３または４日目にバックグラウンドを上回って良好になったため、Ｒ．ブロミイ、Ｂ．プロヅクタ、Ｃｌ．イノキュウムおよびＲ．グナブスが生息し得たという場合を支持する。１６Ｓ  Ｖ４シーケンシングおよびクレードベースの解析は、Ｃｌ．テルチウムまたはＣｌ．ボルテエが棲息したか否かを決定できなかったが、それは、それらのクレードの他の成員（それぞれ、Ｃｌ．ブチリクムおよびＣｌ．シンビオスム）が存在し、マウスにおいてＯＴＵレベルで棲息することが示されたという事実のためであった。
【０２５１】
Ｃ．ディフィシルと平行して攻撃誘発されたマウスにおいて、動物は、表ＴＡＤに示したように、有意に防御された。ビヒクル（リン酸塩緩衝生理食塩水）を経口強制投与されたマウスは１００％死亡率を経験したが、一方、微生物性組成物１および２は、すべての用量レベルで防御し、実験最終日の６日目までの死亡率は０〜１０％であった。さらに、微生物性組成物１および２で処置された動物における体重減少は、ビヒクル経口強制投与を受けた動物と比較して、最小量であった。これらのデータは、微生物性組成物を伴う消化管の集団が、腸内菌共生バランス失調の状態を修復することにより臨床的利益を付与し、したがって動物は病原体による感染に抵抗し得る、ということを確証する。
【０２５２】
【表４】
0006479685.tif 000009
【０２５３】
実施例１５：細菌株栄養利用を確定するためのバイオログ検定の使用
１９０の異なる炭素源のパネルを利用するクロストリジウム・ディフィシルおよび潜在的競合体種の能力を試験するために、スクリーニングを実施した。ＰＭ１およびＰＭ２マイクロプレート（バイオログ＃１２１１１、＃１２１１２）、ＩＦ−０ａ基本培地（バイオログ＃７２２６８）およびバイオログ酸化還元染料Ｍｉｘ  Ｄ（バイオログ＃７４２２４）を用いて、スクリーニングを実行した。各菌株に関して、−８０℃グリセロールストックからの１ｕＬのアリコートを、単一コロニーのために固形ブルセラ血液寒天プレート（ＢＢＡ）（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＳ−１１１）に画線し、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートした。次に、単一コロニーをＢＢＡプレートに再画線し、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートした。使用前に水素無含有嫌気性環境中で少なくとも２４時間インキュベートすることにより、マイクロプレートを予備還元した。用いたすべての液体培地および補足物を、使用前に少なくとも２４時間、緩い蓋を有する嫌気性小室中に入れることにより、予備還元した。あるいは、細菌の組合せも試験され得る。
【０２５４】
０．０２９ｍＬの１Ｍフェリシアン化カリウムを０．２４０ｍＬの染料Ｍｉｘ  Ｄに添加し、その後、１９．７ｍＬのＩＦ−０ａ、４ｍＬの滅菌水および０．０２４ｍＬの０．５ｍＭメナジオンを添加することにより、接種のための基本培地を調製した。いくつかの種に関しては、フェリシアン化カリウムおよびメナジオンの濃度を、最適酸化還元平衡を達成するよう、または多重酸化還元条件を試験するよう、調整した。フェリシアン化カリウムを、０．３８、０．１２、０．０３８および０．０６ｍＭの最終濃度で試験した。メナジオンを、０．５、０．１６および０．０５μＭの最終濃度で試験した。全体で、これは試験のための９つの酸化還元条件を生じる。終点測定のための基礎を形成するテトラゾリウム染料の還元は、各細菌培養の酸化還元状態に対して、したがってメナジオン対フェリシアン化カリウムの比に対して感受性であった。したがって、各細菌単離物に関して種々の比率を試験することは重要であり、いくつかの場合には、潜在的栄養素利用が検出可能であるすべての条件を検出するために、多数のメナジオン／フェリシアン化カリウム比で種を試験することも重要であった。陽性結果を生じるすべての条件を検出するために、２０時間の時点を超えていくつかの種を試験した。これらの場合には、２０、４４または９６時間にプレートを読み取った。
【０２５５】
滅菌１μＬ微生物学的ループを用いて、ループいっぱいのバイオマスをＢＢＡプレートから掻き取り、撹拌しながら基本培地中に再懸濁した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレート読取機を用いて、ＯＤを６００ｎｍで０．１に調整した。次に、細菌懸濁液をＰＭ１およびＰＭ２プレートの各ウェル中にアリコート化した（１００μＬ／ウェル）。プレートを、３７℃で２０時間、３つの嫌気性水素無含有気体パック（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  ＡｎａｅｒｏＰａｃｋ）を有する長方形の嫌気性ジャー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）中で、インキュベートした。２０時間後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレート読取機を用いて、５５０ｎｍでＯＤを読み取った。値が陰性対照ウェルより１．５倍より大きい場合には弱ヒットとして、値が陰性対照ウェルの２倍より大きい場合には強ヒットとして、ウェルを採点した。結果を図１１の表に示す。
【０２５６】
栄養物源の以下の一覧を試験した：Ｌ−アラビノース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−糖酸、コハク酸、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−プロリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−トレハロース、Ｄ−マンノース、ズルシトール、Ｄ−セリン、Ｄ−ソルビトール、グリセロール、Ｌ−フコース、Ｄ−グルクロン酸、Ｄ−グルコン酸、Ｄ，Ｌ−アルファ−グリセロール−ホスフェート、Ｄ−キシロース、Ｌ−乳酸、蟻酸、Ｄ−マンニトール、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルコース−６−ホスフェート、Ｄ−ガラクトン酸−ガンマ−ラクトン、Ｄ，Ｌ−リンゴ酸、Ｄ−リボース、トゥイーン２０、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フルクトース、酢酸、アルファ−Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−メリビオース、チミジン、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルコサミン酸、１，２−プロパンジオール、トゥイーン４０、アルファ−ケト−グルタル酸、アルファ−ケト−酪酸、アルファ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、アルファ−Ｄ−ラクトース、ラクツロース、スクロース、ウリジン、Ｌ−グルタミン、Ｍ−酒石酸、Ｄ−グルコース−１−ホスフェート、Ｄ−フルクトース−６−ホスフェート、トゥイーン８０、アルファ−ヒドロキシ−グルタル酸−ガンマ−ラクトン、アルファ−ヒドロキシ酪酸、ベータ−メチル−Ｄ−グルコシド、アドニトール、マルトトリオース、２−デオキシアデノシン、アデノシン、グリシル−Ｌ−アスパラギン酸、クエン酸、Ｍ−イノシトール、Ｄ−トレオニン、フマル酸、ブロモコハク酸、プロピオン酸、ムチン酸、グリコール酸、グリオキシル酸、Ｄ−セロビオース、イノシン、グリシル−Ｌ−グルタミン酸、トリカルバリル酸、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−グリシン、アセト酢酸、Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−マンノサミン、モノメチルスクシネート、メチルピルベート、Ｄ−リンゴ酸、Ｌ−リンゴ酸、グリシル−Ｌ−プロリン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸、ｍ−ヒドロキシフェニル酢酸、チラミン、Ｄ−プシコース、Ｌ−リキソース、グルクロナミド、ピルビン酸、Ｌ−ガラクトン酸−ガンマ−ラクトン、Ｄ−ガラクツロン酸、フェニルエチル−アミン、２−アミノエタノール、エタノール、アセトアルデヒド、ホルメート、硫酸コンドロイチンＣ、アルファ−シクロデキストリン、ベータ−シクロデキストリン、ガンマ−シクロデキストリン、デキストリン、ゼラチン、グリコーゲン、イヌリン、ラミナリン、マンナン、ペクチン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、ベータ−Ｄ−アロース、アミグダリン、Ｄ−アラビノース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、アルブチン、２−デオキシ−Ｄ−リボース、Ｉ−エリトリトール、Ｄ−フコース、３−０−ベータ−Ｄ−ガラクト−ピラノシル−Ｄ−アラビノース、ゲンチビオース、Ｌ−グルコース、ラクチトール、Ｄ−メレジトース、マルチトール、アルファ−メチル−Ｄ−グルコシド、ベータ−メチル−Ｄ−ガラクトシド、３−メチルグルコース、ベータ−メチル−Ｄ−グルクロン酸、アルファ−メチル−Ｄ−マンノシド、ベータ−メチル−Ｄ−キシロシド、パラチノース、Ｄ−ラフィノース、サリシン、セドヘプツロサン、Ｌ−ソルボース、スタキオース、Ｄ−タガトース、ツラノース、キシリトール、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニトール、ガンマ−アミノ酪酸、デルタ−アミノ吉草酸、酪酸、カプリン酸、カプロン酸、シトラコン酸、シトラリンゴ酸、Ｄ−グルコサミン、２−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ベータ−ヒドロキシ酪酸、ガンマ−ヒドロキシ酪酸、アルファ−ケト吉草酸、イタコン酸、５−ケト−Ｄ−グルコン酸、Ｄ−乳酸メチルエステル、マロン酸、メリビオン酸、シュウ酸、オキサロリンゴ酸、キニン酸、Ｄ−リビノ−１，４−ラクトン、セバシン酸、ソルビン酸、スクシンアミン酸、Ｄ−酒石酸、Ｌ−酒石酸、アセトアミド、Ｌ−アラニンアミド、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アルギニン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ホムセリン、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ピログルタミン酸、Ｌ−バリン、Ｄ，Ｌ−カルニチン、Ｓｅｃ−ブチルアミン、Ｄ，Ｌ−オクトパミン、プトレシン、ジヒドロキシアセトン、２，３−ブタンジオール、２，３−ブタノンまたは３−ヒドロキシ２−ブタノン。
【０２５７】
さらに、当業者は、上記の使用方法を用いて、さらに広範な組の栄養物に関する栄養物利用を意図し得る。
【０２５８】
ビタミン、アミノ酸または補因子の利用を試験するために、同様のスクリーニングを実施し得る。これらの場合、目的のビタミン、アミノ酸または補因子のスクリーニングのためのバイオログマイクロプレート、例えばＰＭ５を、ＰＭ１およびＰＭ２プレートの代わりに用いる。表ＸＸＸ１は、代表的ビタミン、ミネラルおよび補因子の一覧を含有する。試験した各菌株に関して、普遍的炭素源、例えばグルコースを陽性対照として用いて、検定の具体的条件下でテトラゾリウム染料の還元を実証する。
【０２５９】
実施例１６：細菌株栄養物利用を確定するためのトランスクリトミクスの使用
あるいは、特定の炭素源を利用する菌株の能力を、トランスクリトミクスベースのアプローチにより確定し得る。
【０２６０】
この場合、クロストリジウム・ディフィシルの純粋培養をブルセラ血液寒天プレート（ＢＢＡ）（Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＳ−１１１）に画線し、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートした。次に、単一炭素源、例えばフルクトースまたはマンニトールで置換する最小限定基本培地（Ｋａｒａｓａｗａ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１４１：３７１−５に記載）中に単一コロニーを接種する。試験される炭素源を変えて、並行していくつかの培養を試験し得る。炭素源を欠く対照培養も、摂取され得る。８、１４および３８時間に、すべての培養からＲＮＡを抽出する。ＦａｓｔＰｒｅｐ機器およびＲＮＡ  ＰｒｏＢｌｕｅキット（ＱＢｉｏｇｅｎｅ）を用いて、総ＲＮＡの抽出を直ちに実施する。Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーでの分析により、ＲＮＡの品質を査定する。
【０２６１】
菌株６３０のゲノム配列を基礎にしたＣ．ディフィシルマイクロアレイは、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（寄託番号Ａ−ＢＵＧ−２０）において見出され得る。マイクロアレイは、３，６７９のコード配列（ＣＤＳｓ）を含有する。Ｇｅｎｉｓｐｈｅｒｅ  ３ＤＮＡアレイ９００ＭＰＸマイクロアレイキットを、ＤＮＡ合成、ラベリングおよびハイブリダイゼーションのために用いる。１０マイクログラムの出発ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成反応のために用いる。マイクロアレイスライドは、各ｃＤＮＡと競合的にハイブリダイズされる。
【０２６２】
ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００機器（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）を用いてマイクロアレイスライドをスキャンし、ＩｍａＧｅｎｅ（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ）ソフトウェアを用いて蛍光強度を定量する。アレイからの生発現データを、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクトからのＲ  ａｎｄ  Ｌｉｍｍａ（マイクロアレイデータに関する線形モデル）ソフトウェアで解析する。Ｎｏｒｍｅｘｐ法でバックグラウンドを補正して、厳密に陽性の値を生じ、低ハイブリダイズ信号を有する遺伝子に関する対数比における変動性を低減することにより、さらなるデータ処理および統計学的解析を実施する。次いで、Ｌｏｅｓｓ法を用いて、各菌株を正規化する。示差的発現遺伝子を同定するために、ベイジアン調整統計学分析を実施する。Ｐ値が＜０．０５である場合、遺伝子は示差的に発現されるとみなされる。８時間値は、実験の時間経過中に上方調節される遺伝子および経路を同定するために、後の時点からの値と比較するための参照として選択される。あるいは、その値は、無炭素源対照、または異化作用抑制により多数の細菌における炭素利用に関与する遺伝子の発現をグルコースが抑圧する場合は、グルコース対照に対して、比較され得る。
【０２６３】
各菌株または種に関する慣例的マイクロアレイスライドを用いて、単独で、または組み合わせて、同様の方法で、クロストリジウム・ディフィシルの潜在的競合体を試験する。あるいは、ＲＮＡ−ｓｅｑベースのアプローチを用いて、各試料中のｍＲＮＡの相対存在量を同定し、定量し得る［ＲＮＡ−ｓｅｑ実験を実施する方法に関する参照を挿入し得る？］。
【０２６４】
実施例１７Ａ：細菌株栄養物利用を確定するためのｉｎ  ｖｉｖｏトランスクリトミクスの使用
あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルにおけるｍＲＮＡレベルの存在を検出するトランスクリトミクスアプローチにより、クロストリジウム・ディフィシルおよび潜在的競合体の炭素源利用を確定し得る。例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３，５０２：７４６９）において、シアル酸およびフコースの異化作用に関するＣ．ディフィシル遺伝子は、増殖培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育した場合に比して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のレベル増大を示すことが見出されたし、Ｊａｎｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｉ＆Ｉ  ２０１３  ８１：３７５７）において、グルコース、ソルビトールおよびフルクトースの異化作用のために必要とされる遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに比してｉｎ  ｖｉｖｏで誘導され、これは、感染中のそれらの使用を示唆している。
【０２６５】
マウスの一群にクロストリジウム・ディフィシルを接種し、小群を、８、１２または２４時間後に屠殺して、この時点で、盲腸内容物を収集する。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  ＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、盲腸内容物の５０μｌアリコートから総核酸を抽出する。厳密なプロトコールを用いて、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ無含有キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いてＤＮＡを取り出す。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）で総ＲＮＡを定量し、ＲＮＡフラッシュゲル（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて完全性を解析する。ＭｉｃｒｏｂＥｘｐｒｅｓｓ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、ｍＲＮＡのために総ＲＮＡを濃化する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、濃化ＲＮＡを定量する。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびｍＲＮＡ−ｓｅｑキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、１００ナノグラムのｍＲＮＡ濃化ＲＮＡをライブラリー調製のために用いる。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをシーケンシングする。次に、適切なＣ．ディフィシル参照ゲノムに対して、リードをマッピングする。８時間時点を参照として用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで上方調節される遺伝子および経路を同定し得るし、あるいは、標準増殖培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育する対照試料を参照として用い得る。上方調節化異化遺伝子のパターンは、生物体の有効な抗Ｃ．ディフィシル共同体が競合する栄養物のマップを限定する。
【０２６６】
Ｃ．ディフィシルの潜在的競合体である細菌株に関して、同一工程を反復するか、または平行して実施する。代替的バージョンでは、細菌株の組合せをマウスに接種して、リードマッピングのためのヒトマイクロバイオームからの公的に利用可能な参照ゲノムを用いて、同一盲腸試料から同時に解析する。Ｃ．ディフィシルと競合する潜在的能力を有する種を、解析される炭素源に関するそれらの重複パターンに基づいて選択する。
【０２６７】
実施例１７Ｂ：細菌株栄養物利用を確定するための文献検索の使用
文献検索により、病原体の栄養物利用も確定する。Ｃ．ディフィシルの生育を支持し得る化合物を、生物体により利用される栄養物を記載している科学出版物から（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９８２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６：１０７）、生物体の生育を可能にする制限培地を記載している科学論文（例えば、Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９７９，９：２１４）、文献からのデータを編集する参照マニュアル、例えばＢｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ：Ｖｏｌ．３：Ｔｈｅ  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ  Ｂｙ  Ｐａｕｌ  Ｖｏｓ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｄｏｒｏｔｈｙ  Ｊｏｎｅｓ，Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｌｕｄｗｉｇ，Ｆｒｅｄ  Ａ．Ｒａｉｎｅｙ，Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．Ｗｈｉｔｍａｎ，２００９  Ｅｄ）またはＴｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ：Ｖｏｌ．４：Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ，Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，２００６  Ｅｄ、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｗｏｒｋｉｎ，Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｆａｌｋｏｗにより編集）から、確定した。例えば、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌは、Ｃ．ディフィシルにより典型的に用いられる炭素源：グルコース、セロビオース、フルクトース、マンニトール、マンノース、メレジトース、サリシン、ソルビトール、スクロース、トレハロース、キシロース、プロリン、アスパラギン酸、セリン、ロイシン、アラニン、トレオニン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシンを示す。注：すべての菌株が、これらの炭素源の全てを用いて、個々の菌株の試験を有用にするというわけではない。
【０２６８】
参照ゲノムの解析を説明するゲノム生物学試験は、所定の基質に関する代謝経路および輸送タンパク質の存在に基づいて、病原体により潜在的に用いられる栄養物を示唆し得る。例えば、病毒性クロストリジウム・ディフィシル菌株６３０に関するゲノムを提示するＳｅｂａｉｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６は、エタノールアミン分解に関する１９の遺伝子集団を記載し、エタノールアミンがＣ．ディフィシルにより用いられる炭素源であると思われる、ということを示唆している。
【０２６９】
ｍＲＮＡ転写体レベルがマイクロアレイまたはＲＮＡ−ｓｅｑ法により確定されるトランスクリトミクス試験は、別の条件に比してある条件で上方調節される代謝経路を明示し得る。例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３，５０２：７４６９）におけるクロストリジウム・ディフィシルに関しては、シアル酸およびフコースの異化作用に関する遺伝子は、増殖培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育した場合に比して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの発現のレベル増大を示すことが見出されたし、Ｊａｎｏｉｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｉ＆Ｉ  ２０１３  ８１：３７５７）において、グルコース、ソルビトールおよびフルクトースの異化作用のために必要とされる遺伝子の発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに比してｉｎ  ｖｉｖｏで誘導され、これは、感染中のそれらの使用を示唆している。
【０２７０】
Ｃ．ディフィシルに感染したマウスにおけるメタボロミクス試験は、抗生物質処置によりマウスがＣ．ディフィシル感染に感受性になると、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、キシリトール、グルコネート、スクロースおよびラクテートレベルが上昇し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの重要な栄養物としてそれらに影響を及ぼす、ということを示している（Ｔｈｅｒｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）。
【０２７１】
実施例１８：ＤＰＡ検定を用いた胞子濃度の定量
複合混合物中の胞子濃度を査定するための方法は、典型的には、胞子の分離および選択、ならびにその後、個々の種を生育させて、コロニー形成単位を確定することを必要とする。適切な発芽物質が同定されていない多数の種が存在するので、複合混合物中の全ての胞子を定量的に発芽させる方法を、当該技術分野は教示しない。さらに、進化的選択の結果として胞子形成は確率過程であると考えられ、単一種からの胞子の全てが、発芽物質濃度、時間およびその他の環境条件に対して同一に応答して発芽するわけではない、ということを意味する。あるいは、細菌胞子の重要な代謝産物であるジピコリン酸（ＤＰＡ）は、試料中の胞子粒子を定量し、糞便夾雑物からの妨害を回避するために開発された。検定は、ＤＰＡがテルビウム３＋をキレート化して、発酵複合体を形成する、という事実を利用する（Ｆｉｃｈｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，２００７；Ｋｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５；Ｓｈａｆａａｔ  ａｎｄ  Ｐｏｎｃｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６；Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｎｃｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９；Ｈｉｎｄｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ａｎａｌｙｓｔ，１９９９）。時間分解蛍光検定は、ＤＰＡの存在下でのテルビウム発酵を検出し、溶液中のＤＰＡ濃度の定量的測定値を提供する。
【０２７２】
検定を実施するために、測定されるべき胞子標準１ｍＬを２ｍＬ微量遠心分離管に移した。試料を、１３０００ＲＣＦで１０分間、遠心分離して、試料を１ｍＬの滅菌脱イオン水中で洗浄した。遠心分離を反復することにより、もう一度洗浄する。１ｍＬ溶液をｈｕｎｇａｔｅ管に移して、２５０℃で３０分間、水蒸気サイクルで試料をオートクレーブ処理する。１００ｕＬの３０ｕＭ  ＴｂＣｌ３溶液（４００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、３０μＭ  ＴｂＣｌ３）を試料に添加する。オートクレーブ処理物質の連続希釈を行なって、２７５ｎｍ光での励起により各試料の蛍光を測定し、１．２５ｍｓおよび０．１ｍｓ遅延の積分時間に関して５４３ｎｍの発光波長を測定する。
【０２７３】
以前記載されたように、精製胞子を生成する（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ／ｍｅｔｈｏｄｓ／ＭＢ−２８−００．ｐｄｆ参照）。Ｃ．ビフェルメンタンス、Ｃ．スポロゲネスおよびＣ．ブチリクム培養からの精製胞子の連続希釈液を調製し、ＢＢＡ培地上でプレート化し、３７℃で一晩インキュベートして、ＣＦＵ／ｍｌを確定することにより、測定した。図６は、いくつかのｌｏｇｓ全体の異なる胞子産生細菌全体における線形対応を示し、胞子含量を査定するための手段としてのＤＰＡ検定を実証する。
【０２７４】
発芽可能胞子ＣＦＵにより測定される胞子数と、ＤＰＡによるものとの間の複合胞子集団に関する不一致は、臨床的使用のためのエタノール処理胞子集団を確定するための重要な含蓄を有する。表ＡＣは、再発性Ｃ．ディフィシル感染に罹患している３名の患者を首尾よく処置するために用いられる３つの異なるエタノール処理胞子調製物からの胞子含量データを示す。各胞子調製物の胞子含量は、２つの記載された方法を用いて特性化される。
【０２７５】
【表５】
0006479685.tif 000010
【０２７６】
直ちに明らかであることは、胞子含量が３０カプセルあたりで大きく変わる、ということである。発芽可能ＳＣＦＵにより測定した場合、胞子含量は１０，０００倍より大きく変わる。ＤＰＡにより測定した場合、胞子含量は１００倍より大きく変わる。ＤＰＡ検定の非存在下では、患者への投与のための最小用量を設定することはむつかしい。例えば、ＤＰＡ検定からのデータなしで、ＳＣＦＵ検定を用いて、胞子の最小有効用量は４×１０５以下である、と結論する（例えば、調製物１、表ＡＣ）。しかしながら、そのＳＣＦＵ用量が臨床設定における用量投与を標準化するために用いられる場合には、患者に投与される実際の胞子用量は、ＤＰＡ検定により測定した場合、他のエタノール処理胞子調製物に関して非常に低い（表ＡＤ）。
【０２７７】
【表６】
0006479685.tif 000011
【０２７８】
効力の測定値としてのＳＣＦＵの使用が、ある症例において有意の過小量投与をもたらすということは、種々の糞便提供全体のＳＣＦＵおよびＤＰＡ計数の変異性からすぐに明らかになる。例えば、精製物である調製物３に関して、４×１０５ＳＣＦＵ（ドナー調製物１からの見かけの有効用量）という用量仕様の設定は、１００倍より多い潜在的過小量投与をもたらす。これは、エタノール処理胞子調製物における総胞子数をより良好に反映するＤＰＡ検定に基づいた効力仕様を設定することによってのみ、修正され得る。この研究の予期せぬ知見は、ＤＰＡ検定が、エタノール処理胞子調製物に関して、効力を設定し、用量投与を確定するのに独特に適合するということである。
【０２７９】
実施例１９：胞子組成物で処理された患者における保菌の移植、増強および低減
相補的ゲノムおよび微生物学的方法を用いて、処理前に(前処理)、ならびに処理後４週間までに、患者１、２、３、４および５、６、７、８、９および１０からの微生物叢の組成を特性化した。
【０２８０】
患者におけるエタノール処理胞子調製物による処置から移植するＯＴＵ、ならびにそれらのマイクロバイオームが応答においてどのように変化するかを確定するために、エタノール処理胞子調製物での処置の前に(前処置)、ならびに処置を受けた２５日後までに、１６Ｓ−Ｖ４シーケンシングにより、マイクロバイオームを特性化した。あるいは、植物状態での細菌組成物を、または植物性細菌および細菌胞子の混合物を用い得る。例として、エタノール処理胞子調製物による患者１の処置は、胞子処置からのＯＴＵの移植、および患者のマイクロバイオームにおける増強をもたらした（図７および図８）。処置後２５日までに、総保菌率は、以下の分類学的群の種により支配された：バクテロイデス、ステレラ、ルミノコッカス、ブラウチア、オイバクテリウム、ゲミガー／フェカリバクテリウムおよび非胞子形成性ラクトバシラス（具体的ＯＴＵに関しては、表１６および表１参照）。最初の２つの属は胞子を形成しないＯＴＵｓを表し、一方、後者分類学的群は胞子を形成すると考えられるＯＴＵを表す。
【０２８１】
エタノール処理胞子調製物による患者処置は、処置前より大きい多様性を有する微生物生態構造の確立をもたらす（図７）。ゲノムベースのマイクロバイオーム特性化は、患者まえ処置に存在しなかった一連のＯＴＵの増強を確証した（表１６）。これらのＯＴＵｓは、胞子を形成し得る細菌種と形成し得ない細菌種、ならびに多重系統学的クレードを表すＯＴＵｓを包含した。患者１前処置において存在しない生物体は、エタノール処理胞子分画から直接移植し、あるいは健常な多様な微生物叢に好都合な腸環境の作成により増強される。さらに、バクテロイデス・フラギリス群の種は、患者１および２において４および６ｌｏｇ増大された（図９）。
【０２８２】
結果を図７に示す：エタノール処理胞子処置試料および患者前および後処置試料で測定された微生物多様性。全体的微生物多様性は、Ｃｈａｏ１アルファ−多様性指数を用いて限定され、異なるゲノム試料採取深度で測定されて、標的試料におけるマイクロバイオームを検定するための配列適用範囲を確証する。患者前処置(紫色)は、エタノール処理胞子処置(赤色)、ならびに５日目(青色)、１４日目(橙色)および２５日目(緑色)での患者後処置と比較して、有意に低減されたマイクロバイオームを保有した。
【０２８３】
結果を、図８に示す。エタノール処理胞子処置を用いた処置により、患者の微生物生体構造を、腸内菌共生バランス失調状態から健常状態にシフトさせる。患者前および後処置のマイクロバイオームの全体的多様性および構造（Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ  Ｂｅｔａ−Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）に基づいた主座標分析は、胞子処理からのＯＴＵｓの移植および患者微生物生態構造の増強が、前処理マイクロバイオームおよびエタノール処理胞子処置の生態構造の両方と異なる微生物生態構造をもたらす、ということを概説する（表１６）。
【０２８４】
結果を図９に示すが、これは、患者におけるバクテロイデス種の増強を例証する。ｃｆｕ／ｇの糞便前処理当たりのバクテロイデス・フラギリス群の種の数を処置後４週目に比較した場合、４ｌｏｇｓ以上の増大が明示される。具体的種としてＯＴＵを割り当てる１６Ｓ−Ｖ４  ＯＴＵ同定の能力は、一部は、特定の種または種の群に関する１６Ｓ遺伝子の１６Ｓ−Ｖ４領域の分解能によって決まる。系統樹の異なる領域に関する利用可能な参照１６Ｓ配列の密度、ならびに異なる種間の１６Ｓ遺伝子における固有の変異性はともに、所定の配列リードに対する分類学的注釈付けの確実性を決定する。系統樹のトポロジカルな性質、ならびにそれらの配列類似性および基本的進化モデルに基づいた互いとのＯＴＵの階層的関係を系統樹が表しているとすると、リードの分類学的注釈付けは、クレードベースの割り当て手法を用いて高レベルに増やされ得る(表１)。このアプローチを用いて、系統学の技術分野の当業者に既知の最大尤度またはその他の系統学的モデルを用いて、全長１６Ｓ配列から構築される系統樹のトポロジーを基礎にして、クレードを決定する。クレードを構築して、所定のクレードにおけるすべてのＯＴＵｓが、(ｉ)互いからの特定数のブートストラップ支持節内(一般的に、１〜５ブートストラップ)、ならびに(ｉｉ)５％遺伝子類似性内であることを保証する。同一クレード内であるＯＴＵｓは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて異なるクレードにおけるＯＴＵｓとは遺伝的および系統学的に異なるとして識別され得る。同一クレード内に入るＯＴＵは、進化的に密接に関連しており、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて互いから識別可能であることも、そうでないこともある。それらの進化的近縁性のために、同一クレードの成員であるクレードベースの解析の能力は、ヒト腸に見出されるもののような微生物生態構造において類似の機能的役割を果たすと思われる。ある種を同一クレードからの別のものに置換する組成物は、保存された生態学的機能を有すると思われ、したがって本発明において有用である。
【０２８５】
大便試料をアリコート化して、１００％エタノール中(ゲノム特性化のため)、または１５％グリセロールを含有するＰＢＳ中(微生物の単離のため)に１０×ｖｏｌ／ｗｔで再懸濁し、次いで、使用のために必要とされるまで−８０℃で保存した。ゲノム１６Ｓ配列解析に関しては、プレート単離物から摘み取られたコロニーは、実施例２および３に記載したように特性化されたそれらの全長１６Ｓ配列を有した。実施例１０における不均質試料に関する方法を用いて、一次大便試料を調製して、１６Ｓ−Ｖ４をターゲッティングした。
【０２８６】
注目すべきは、種および属の実際の分類学的割り当てが、それらが入るクレードの他の成員と分類学的に異なると示唆し得るにもかかわらず、所定のＯＴＵの単離物の１６Ｓ配列がそれらのそれぞれのクレード内に系統学的に配置されることである。ＯＴＵに与えられる分類学的名称間の不一致は、文献から存在することが既知である遺伝子シーケンシングに対する微生物学的特質に基づいている。この表中に脚注されるＯＴＵｓは、分類学的名称を割り当てるための異なる方法間で一致しないことが知られている。
【０２８７】
エタノール処理胞子調製物処置からのＯＴＵの患者への移植、ならびにその結果生じる棲息微生物の増強は、患者におけるＣ．ディフィシル以外の病原性種の有意の減少および保菌の排除をもたらした。一次大便試料の１６Ｓ−Ｖ４シーケンシングは、前処置で、リードの２０％がクレブシエラ属からで、付加的１９％はフソバクテリウム属に割り当てられた。これらの顕著なデータは、反復性Ｃ．ディフィシル感染および長期抗生物質使用に関連した深刻な腸内菌共生バランス失調性微生物叢の証拠である。健常個体では、クレブシエラは、ＨＭＰデータベース（ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ）の解析に基づいて約２％に過ぎない被験体におけるヒトマイクロバイオームの居住者であり、クレブシエラの平均相対存在量は、これらの人々の大便中で約０．０９％に過ぎない。処置前の患者１における２０％相対存在量での存在が、腸に普通に見出される共生生物体を過剰増殖させ、負かす前炎症性腸環境の指標である、ということは意外である。同様に、フソバクテリウムの劇的過剰増殖は、顕著な腸内菌共生バランス失調性腸微生物叢を示す。フソバクテリウムの１つの種であるＦ．ヌクレアツム（１６Ｓ−Ｖ４を基礎にしてフソバクテリウム種３＿１＿３３からの系統学的に区別不可能なＯＴＵ）は、ヒトにおけるＩＢＤ、クローン病および結腸直腸癌とのその関連、ならびに動物モデルにおける結腸直腸癌の発症におけるその実証された原因的役割に基づいて、「出芽性腸病原体」と呼ばれている［Ａｌｌｅｎ−Ｖｅｒｃｏｅ，  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  （２０１１）２：２９４−８］。重要なことは、クレブシエラもフソバクテリウムも２５日目までに１６Ｓ−Ｖ４リード中で検出されなかったことである（表１８）。
【０２８８】
クレブシエラおよびその他の腸内細菌科による腸のコロニー形成をさらに特性化するために、そしてこれらの生物体を種形成するために、ＰＢＳ−グリセロール懸濁液として−８０℃で保存された前処理および２５日目糞便試料を、種々の選択培地、例えばマッコンキー・ラクトース培地（グラム陰性腸内細菌に関して選択的）およびシモンズ・クエン酸塩イノシトール培地（クレブシエラ種に関して選択的）［Ｖａｎ  Ｃｒｅｇｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８４）２０：９３６−４１］上に置いた。患者試料中で同定された腸内細菌は、Ｋ．ニューモニエ、クレブシエラ種Ｃｏ＿９９３５および大腸菌を包含した。著しくは、各クレブシエラ種は２〜４ｌｏｇｓ低減されたが、一方、健常微生物叢中に存在する通常共生生物体である大腸菌の低減は１ｌｏｇ未満であった（表１９）。クレブシエラ種保菌におけるこの減少は、多数の患者全体を通して一貫している。処置前および処置後４週間に、クレブシエラ種の存在に関して、４名の別個の患者を評価した。前記のような選択的シモンズ・クエン酸塩イノシトール培地上での増殖により、クレブシエラ種を検出した。形態学的に別個の種の連続希釈およびプレート化と、その後のｃｆｕ／ｍＬ力価の確定、ならびにそれら別個の形態学的クラスの代表の１６Ｓ全長配列同定は、具体的種の力価の算定を可能にした。
【０２８９】
バクテロイデス属は、消化管微生物叢の重要な成員である；ヒト微生物叢プロジェクトからの大便試料の１００％がバクテロイデスのうちの少なくとも１つの種を含有し、これらの試料中の総相対存在量は０．９６％から９３．９２％までの範囲で、中央値相対存在量は５２．６７％であった（ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ  参照データ組ＨＭＳＭＣＰ）。腸におけるバクテロイデスは、アミノ酸発酵および複合多糖の分解と関連付けられている。腸におけるその存在は、典型的西欧食にみられるような動物由来製品に富む食餌により増強される［Ｄａｖｉｄ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（２０１３）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２８２０］。著しくは、処置前に、バクテロイデス属にマッピングされた患者１からの０．００８％より少ない１６Ｓ−Ｖ４リードは、バクテリオイデス種が存在しないか、または生育可能バクテロイデスが、患者の腸マイクロバイオームの極端に小さい構成成分に低減された、ということを示唆している。処置後、≧４２％の１６Ｓ−Ｖ４リードが処置の５日以内にバクテロイデス属に割り当てられ、処置後２５日目までに、５９．４８％の患者の腸マイクロバイオームがバクテロイデスで構成された。これらの結果は、２つの異なるバクテロイデス選択性培地：バクテロイデス胆汁エスクリン（ＢＢＥ）寒天（これは、バクテロイデス・フラギリス群の種に関して選択的である［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９７８）．７：４４８−４５３］）およびポリアミン無含有アラビノース（ＰＦＡ）寒天［Ｎｏａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．（１９９８）１２８：１３８５−１３９１；グルコースをアラビノースに置き換えることにより改変］の上でプレート化された前処置試料中の検出可能バクテロイデスの非存在により微生物学的に確証された。高度選択性ＢＢＥ寒天は＜２×１０３ｃｆｕ／ｇの検出限界を有したが、一方、ＰＦＡ寒天上でのバクテロイデスに関する検出限界は、その培地上での前処置試料中の多重非バクテロイデス種の増殖のため、およそ２ｘ１０７ｃｆｕ／ｇであった。２５日目のバクテロイデス種のコロニー数は２×１０１０ｃｆｕ／ｇまでで、１６Ｓ−Ｖ４シーケンシングと一致し、患者１における腸微生物叢の大きな再構築を実証している（表２０）。
【０２９０】
２５日目(ならびに１６Ｓ−Ｖ４シーケンシングにより示されるように５日目という早期)の患者１におけるバクテロイデスの有意の存在量は、顕著である。生育可能なバクテロイデス・フラギリス群の種は、微生物学的プレート化を基礎にして、エタノール処理胞子集団中には存在しなかった（検出限界  １０ｃｆｕ／ｍｌ）。したがって、患者１へのエタノール処理胞子集団の投与は、細菌種、例えば、限定されないが、胞子形成種の移植だけでなく、バクテロイデス種の再集団化を可能にするニッチの作成を通して健常個体に一般に見出される高レベルの非胞子形成種の回復も生じた。これらの生物体は、患者１のＧＩ管中に極端に低い存在量で存在するか、またはそれらが高力価に跳ね上がり得るＧＩ管中のレザバー中に存在すると思われた。それらの種はさらにまた、処置後に食物から経口摂取により再接種され得る。胞子集団またはエタノール処理胞子集団に限定されないが、細菌組成物中に存在しないＯＴＵを伴う腸のこの健常再集団化を、「増強」と称する。増強は、それが、細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子集団それ自体における実際の構成成分生物体を超えた多様なアレイまたは共生生物体を播種することにより、健常微生物叢を回復するためにエタノール処理胞子生態構造またはその他の細菌組成物を用いる能力を示すという点で、重要な現象である；具体的には、胞子組成物処理それ自体、および胞子組成物からのＯＴＵの移植が、腸内菌共生バランス失調性マイクロバイオームを健康に関連する微生物生態構造にシフトするために必要とされるＯＴＵｓの過剰増殖を可能にするニッチを作成する。患者１の腸におけるバクテロイデス種の多様性、ならびにそれらのおよその相対存在量を表２１に示すが、これには、少なくとも８つの異なる種が含まれている。
【０２９１】
結果を図１０に示す。その図は、細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子集団で処置後の、患者マイクロバイオームにおける種移植対種増強を例証する。記載したように移植されるかまたは増強された種の相対存在量を、１６Ｓ配列リードの数に基づいて確定した。各プロットは、反復性Ｃ．ディフィシルのために、細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子集団で処置された異なる患者からである。
【０２９２】
イミペネム耐性腸内細菌科の保菌に及ぼす細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子集団処置の影響を、患者２、４および５からの前処置および２８日目臨床試料をマッコンキー・ラクトース＋１ｕｇ／ｍＬのイミペネム上でプレート化することにより査定した。耐性生物体を列挙した形態構造により採点し、ＤＮＡを上記のような全長１６Ｓ  ｒＤＮＡシーケンシングに付した。単離物を、モルガネラ・モルガニイ、プロビデンシア・レトゲリおよびプロテウス・ペネリイとして同定した。これらの各々は、腸共生生物体である。過剰増殖は、菌血症および／または尿路感染をもたらし、攻撃的抗生物質処置を、そしていくつかの症例では、入院を必要とする［Ｋｉｍ，Ｂ−Ｎ，ｅｔ  ａｌ  Ｓｃａｎ  Ｊ．Ｉｎｆ  Ｄｉｓ（２００３）３５：９８−１０３；Ｌｅｅ，Ｉ−Ｋ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｊ−Ｗ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ（２００６）３９：３２８−３３４；Ｏ’Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（２０００）１３：５３４］。患者による処置前および２８日目での生物体の力価を、表２２に示す。重要なことは、細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子調製物の投与が、多重イミペネム耐性生物体を伴う腸内細菌科保菌の５症例のうちの４つにおいて、１００倍より大きい低減を生じたことであった（表２２）。
【０２９３】
種形成および列挙のほかに、抗生物質の最小発育阻止濃度(ＭＩＣ)を定量的に決定するために、患者４からの各生物体の多重単離物を、イミペネムの２倍希釈シリーズを含有する９６ウェルトレー中で一晩、増殖させた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５ｅプレート読取機上の６００ｎｍでの光散乱により、生物体の増殖を検出した。臨床環境では、これらの種は、１ｕｇ／ｍＬ以上のＭＩＣを有する場合、イミペネムに耐性であるとみなされる。患者Ｄからの前処置試料からのＭ．モルガニイ単離物は２〜４ｕｇ／ｍＬのＭＩＣを有し、Ｐ．ペネリイ単離物は４〜８ｕｇ／ｍＬのＭＩＣを有した。したがって、患者４に投与される細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子は、２つのイミペネム耐性生物体のクリアランスを生じた（表１６）。この実施例は、具体的には胞子調製物を使用するが、本明細書中の方法は、同一効果を達成するために当業者がより一般的な細菌組成物を用いる方法を記載する。具体例は、本開示の範囲を限定するものと考えられるべきでない。
【０２９４】
実施例２０：細菌組合せからのコア生態構造の同定
６つの異なるドナーから、エタノール処理胞子調製物方法(本明細書中に記載)により、１０の異なる細菌組成物を作製した。胞子調製物を用いて、各々、反復性Ｃ．ディフィシル感染に罹患している１０名の患者を処置した。患者を、本明細書中に記載される含入／排除判定基準を用いて同定し、ドナーを、本明細書中に記載される判定基準を用いて同定した。処置後の４週間の追跡調査においてＣ．ディフィシルの再発を経験した患者はいなかったが、一方、被験体の７０〜８０％が抗生物質中断後に再発を経験する、と文献は予測している［Ｖａｎ  Ｎｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ，ＮＥＪＭ（２０１３）］。したがって、多数の異なるドナーおよび糞便提供由来のエタノール処理胞子調製物は、顕著な臨床効力を示した。これらのエタノール処理胞子調製物は、本明細書中に記載される細菌組成物の一部分であり、その結果は、より広範な細菌組成物組の範囲を限定すると考えるべきでない。
【０２９５】
細菌組成物、例えばエタノール処理胞子調製物の顕著な臨床効力の基礎をなすコア生態構造を明示するために、以下の解析を実行した。実施例１２に従って、胞子調製物のＯＴＵ組成を、１６Ｓ−Ｖ４  ｒＤＮＡシーケンシング、ならびにＯＴＵｓのコンピューター割り当てにより確定した。増幅またはシーケンシング中の誤差から生じるとはきわめて考えられないＯＴＵｓのみを限定するための保守的閾値として、エタノール処理胞子調製物中の少なくとも１０の配列リードを検出するための要件を設定した。ゲノムベースのマイクロバイオーム特性化の当業者により慣例的に用いられる方法は、０．００５％のリード相対存在量閾値を用いる（例えば、Ｂｏｋｕｌｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｑｕａｌｉｔｙ−ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ  ｖａｓｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ａｍｐｌｉｃｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：５７−５９参照）が、これは、この解析に用いられる≧１０リードより実質的に低いカットオフとして、この実施例で解析される試料に関して得られるシーケンシング深度を考えると、≧２リードと一致する。本明細書中に記載されるように、各ＯＴＵに関して、すべての分類学的およびクレード割り当てを行なった。その結果生じた胞子調製物におけるＯＴＵｓ、クレード割り当て、ならびに検出頻度の一覧を、表ＧＢに示す。処置患者に移植するＯＴＵｓ、ならびに患者が移植されるパーセンテージを、クレード、胞子形成状態、およびキーストーンＯＴＵ状態と同様に、示す。太字ＯＴＵｓはエタノール調製物の≧８０％で生じ、処置患者の≧５０％で移植される。
【０２９６】
【表７−１】
0006479685.tif 000012
【表７−２】
0006479685.tif 000013
【表７−３】
0006479685.tif 000014
【表７−４】
0006479685.tif 000015
【表７−５】
0006479685.tif 000016
【表７−６】
0006479685.tif 000017
【表７−７】
0006479685.tif 000018
【表７−８】
0006479685.tif 000019
【表７−９】
0006479685.tif 000020
【表７−１０】
0006479685.tif 000021
【表７−１１】
0006479685.tif 000022
【０２９７】
次に、細菌組成物のコア生態構造の一成員である考慮されるべきＯＴＵに関して、ＯＴＵが患者において移植されることを示さなければならない、との結論に至った。移植は、２つの理由のために重要である。第一に、移植は、マイクロバイオームを再成形し、Ｃ．ディフィシルコロニー形成を排除するための機序の必須条件である。高頻度で移植されるＯＴＵｓは、胞子調製物または大まかに言って一組の細菌組成物のコア生態構造の一構成成分であると大いに考えられる。第二に、細菌組成物をシーケンシングすることにより検出されるＯＴＵｓ（表ＧＢにおけるように）は、非生育可能細胞、または組成物と関係ないその他の夾雑物ＤＮＡ分子を含み得る。ＯＴＵが患者に移植されると示されなければならない要件は、非生育可能細胞または夾雑配列を表すＯＴＵｓを排除する。表ＧＢは、さらにまた、処置後に少なくとも１名の患者において移植されることも示された細菌組成物中で検出されるすべてのＯＴＵｓを同定する。解析される細菌組成物、例えばエタノール処理胞子調製物中に大きいパーセンテージで存在する、そして多数の患者において移植されるＯＴＵｓは、腸内菌共生バランス失調性疾患生態構造から健常マイクロバイオームへのシフトを触媒すると大いに考え等得るコア生態構造の小部分を表す。
【０２９８】
細菌組成物、例えば胞子調製物のコア生態構造に洞察を改良するために、第三のレンズを適用した。コンピューターベースのネットワーク解析は、広範な集団の健常個体の微生物叢中に存在する微生物生態構造の説明を可能にした。これらのネットワーク生態学は多重ＯＴＵｓからなり、そのいくつかは、キーストーンＯＴＵｓとして限定される。キーストーンＯＴＵは、本明細書中に記載されるようにコンピューター限定される。キーストーンＯＴＵは、それらが見出される微生物的生態構造に対する基礎を形成し、このようなものとして、健常被験体におけるネットワーク生態学の機能に対する中心である。健常被験体に伴う微生物生態構造に関連したキーストーンＯＴＵは、しばしば、疾患を有する被験体において欠けているか、または低減レベルで存在する。キーストーンＯＴＵは、被験体において、低、中、または高存在量で存在し得る。表ＧＢは、さらに、細菌組成物、例えば胞子調製物中のＯＴＵｓのうちのどれが、健常であり、疾患を保有しない個体ともっぱら関連するキーストーンＯＴＵであるかに注目する。
【０２９９】
このデータから、いくつかの重要な知見が認められる。全体で１６の、相対的に少数の胞子が、６名のドナーおよび１０の提供糞便からの胞子調製物の全てにおいて検出される。これは、ＨＭＰデータベース（ｗｗｗ．ｈｍｐｄａｃｃ．ｏｒｇ）が健常個体全体に亘る共生種の膨大な変異性を記載しているため、意外である。少数の一致するＯＴＵｓの存在は、コア生態構造の概念に対する支持を与える。移植データは、さらに、この結論を支持する。回帰分析は、胞子調製物における検出頻度とドナーにおける移植の頻度との間の有意の相関を示す：Ｒ＝０．４３（ｐ＜０．００１）。これは明らかであると思われるが、細菌組成物、例えば胞子調製物において頻繁に検出されるＯＴＵは移植されるかまたは移植されるべきであるという先験的要件は存在しない。例えば、１０の胞子調製物中すべてに見出される胞子形成体であるルチスポラ・サーモフィラは、患者のいずれにおいても移植されなかった。グラム陰性嫌気性菌であるビロフィラ・ワーズワーシアは、１０の提供糞便の９つにおいて存在し、さらにそれはいかなる患者においても移植されないが、これは、エタノール処理胞子調製物中の非生育可能夾雑物である、ということを示している。最後に、胞子調製物中の最高頻度ＯＴＵｓの間の前記のキーストーンＯＴＵの優勢は注目に値する。
【０３００】
これら３つの因子−−細菌組成物、例えば、限定されないが、胞子調製物中の優勢、移植の頻度、およびキーストーンＯＴＵｓとしての明示−−は、個々のＯＴＵｓを等級付けするための「コア生態構造スコア」（ＣＥＳ）の作成を可能にする。ＣＥＳは、以下のように定義される：
●          胞子調製物中のＯＴＵの存在に関する４０％荷重
○          １〜３つの胞子調製物中の存在に関する１の乗数
○          ４〜８個の胞子調製物中の存在に関する２．５の乗数
○          ≧９個の胞子調製物中の存在に関する５の乗数
●          患者における移植に関する４０％荷重
○          １〜４名の患者における移植に関する１の乗数
○          ５〜６名の患者における移植に関する２．５の乗数
○          ≧７名の患者における移植に関する５の乗数
●          キーストーンＯＴＵｓに対する２０％荷重
○          キーストーンＯＴＵに関する１の乗数
○          非キーストーンＯＴＵに関する０の乗数。
【０３０１】
この規準を用いて、ＣＥＳは、最大可能スコア５および最小可能スコア０．８を有する。一例として、３名の患者に移植された１０のうち８つの細菌組成物、例えば、限定されないが、胞子調製物中に見出されるＯＴＵは、以下のＣＥＳに割り当てられる：
【０３０２】
CES = (0.4 x 2.5) + (0.4 x 1) + (0.2 x 1) = 1.6
【０３０３】
表ＧＣは、ＯＴＵはコア生態構造の考え得る一要素であるために移植されることを示されなければならない、というさらなる要件で、ＣＥＳにより上位２０のＯＴＵｓを等級付けする。
【０３０４】
【表８−１】
0006479685.tif 000023
【表８−２】
0006479685.tif 000024
【０３０５】
実施例２１：コア生態構造の有効部分の限定
ヒト消化管中の生物体の数、ならびに健常個体間の多様性は、健常腸マイクロバイオーム生態構造の機能的冗長性を示している（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉａ．２０１２．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８６：２０７−２１４参照）。この冗長性は、コア生態構造の一部分が、細菌組成物、例えば、限定されないが、エタノール処理胞子調製物の治療上有益な構成成分を説明するように、そしてこのような一部分がそれ自体、生態構造に機能的特質を与えるＣ．ディフィシル感染のｌ処置のための有用な組成物であり得るようにする。ＣＥＳを用いて、個々のＯＴＵｓを、コア生態構造の有効部分としての評価のために優先順位づけし得る。
【０３０６】
機能的冗長性の別の態様は、進化的関連生物体（すなわち、系統樹上で互いに近いもの、例えば単一クレード中に群分けされるもの）が、さらにまた、Ｃ．ディフィシルを処理するためのコア生態構造またはそのサブセットにおける有効な置換物である、というものである。
【０３０７】
当業者にとって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで試験するための適切なＯＴＵサブセットの選択は、簡単である（例えば、実施例６または７参照）。サブセットは、表ＧＢから任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０以上のＯＴＵｓを精選することにより選択され得るし、より高いＣＥＳを有するもの、例えば表ＧＣに記載されたＯＴＵｓを特に重要視する。さらに、上記の実施例２および表１に明示されたクレード関係を用いて、許容可能なＣＥＳを有するＯＴＵｓの置換物として、関連ＯＴＵｓを選択し得る。これらの生物体は、適切な培地（上記の実施例５に記載されたものから選択される）を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで嫌気的に培養され、次いで、所望の比率で組み合わさる。マウスＣ．ディフィシルモデルにおける典型的実験は、少なくとも１０４、好ましくは少なくとも１０５、１０６、１０７、１０８、１０９または１０９以上のコロニー形成単位の各微生物を組み合わせて利用する。培養収率における変動は、時として、生物体が、異なる比率で、例えば１：１０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００または１：１００，０００以上で組み合わされる、ということを意味する。これらの組成物中で重要なことは、コア生態構造サブセットの効力に対する菌株の寄与が測定され得るよう、各菌株が最小量で提供されることである。本明細書中に記載される原理および指示を用いて、コア生態構造のサブセットの効力を試験するためにクレードベースの置換を行うことは、当業者には簡単なことである。表ＧＢは胞子調製物中で検出される各ＯＴＵに関するクレードを記載し、表１は、クレード関係に基づいた置換のために用いられ得るＯＴＵｓを記載する。
【０３０８】
実施例２２：バンコマイシン耐性エンテロコッカス(ＶＲＥ)コロニー形成のマウスモデルにおける予防的使用および処置
高度抗生物質耐性細菌の発芽および蔓延は、重大な臨床的攻撃誘発を表す（Ｓｎｉｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２）。近年、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、カルバペネム耐性腸内細菌科、バンコマイシン耐性エンテロコッカス（ＶＲＥ）およびクロストリジウム・ディフィシルのような生物体により引き起こされる感染の数は顕著に増大しており、これらの菌株の多くは、少数の残りの活性抗生物質に対する耐性を獲得しつつある。高度抗生物質耐性細菌により起こされるほとんどの感染が入院中に獲得され、これらの病原体の患者から患者への伝染防止は、病院およびクリニックに立ちはだかる重大な難題の１つである。ほとんどの高度抗生物質耐性細菌株は、通常は低密度で、粘膜表面にコロニー形成する属に属する。普通は粘膜表面にコロニー形成する高度複合微生物は、腸内細菌およびエンテロコッカスの科のような細菌による拡張および優勢を阻止する。しかしながら、抗生物質投与による正常フローラの破壊は、これらの細菌科の抗生物質耐性成員を脱制止して、それらを非常に高密度に拡張させる（Ｕｂｅｄａ  ｅｔ  ａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２０１０）。これらの生物体による高密度コロニー形成は、感受性患者にとって災難であり、菌血症および敗血症を引き起こし得る（Ｔａｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１２）。
【０３０９】
細菌組成物試験物の予防的使用および処置を試験するために、ＶＲＥ感染マウスモデルを、以前記載されたように用いる（Ｕｂｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１３，Ｕｂｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１０）。要するに、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した７週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを用いて実験を実行し、照射食餌とともに収容して、酸性化水を与えた。食糞性のためのマウス間の汚染を回避するために、マウスを個別に収容する。ＶＲＥによる実験的感染に関して、３日ごとに替える飲料水中のアンピシリン（０．５ｇ／リットル）でマウスを処置する。
【０３１０】
処置モデルにおいて、１日目に、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ７００２２１）から購入した１０８ＣＦＵのバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム菌株を経口強制投与によりマウスに感染させる。感染１日後（１日目）、抗生物質処置を中止し、バンコマイシン（８ｕｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を有するエンテロコッセル寒天プレート(Ｄｉｆｃｏ)上で糞便ペレットの連続希釈液をプレート化することにより、ＶＲＥレベルを異なる時点で確定する。外見により、ＶＲＥコロニーを同定し、グラム染色、または以前に記載されたその他の方法により確証する（例えば、実施例１、２および３参照）。さらに、以前に記載されたように（Ｕｂｅｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２０１０）、バンコマイシンに対する耐性を付与するｖａｎＡ遺伝子のＰＣＲは、感染マウスにおけるＶＲＥの存在を確証する。細菌組成物試験物、例えば、限定されないが、エタノール処理勾配精製胞子調製物（本明細書中に記載されるような）、糞便懸濁液または抗生物質処理をＰＢＳ中で１〜３日目に送達するが、一方、陰性対照は、ＰＢＳのみを含有し、これも１〜３日目に、経口強制投与により送達される。新たな糞便ペレットを、−７日目から１０日目までの実験期間中、毎日獲得する。試料を直ちに凍結し、−８０℃で保存する。標準技法を用いてＤＮＡを抽出し、１６Ｓまたは匹敵する方法で解析する（例えば、実施例２および３参照）。
【０３１１】
コロニー形成モデルにおいて、アンピシリンを上記のように−７日目から１日目までの間投与し、試験物またはビヒクル対照による処置を０日目〜２日目に施して、ＶＲＥ耐性細菌を１０８ＣＦＵで１４日目に投与する。−７日目から２１日目まで実験中毎日、糞便試料を採取し、前記のように１６Ｓシーケンシングに付す（例えば、実施例２および３参照）。
【０３１２】
両モデルにおいて、糞便中のＶＲＥの力価を用いて、陰性対照に対する試験物の上首尾を評価する。さらに、健常マイクロバイオームを誘導する細菌組成物試験物の能力に関して、微生物叢組成を査定する。
【０３１３】
実施例２３：カルバペネム耐性クレブシエラ(ＣＲＫＢ)コロニー形成のマウスモデルの予防的使用および処置
カルバペネムに対する感受性減少を示すクレブシエラ・ニューモニエ菌株の発芽は、入院患者にとって有意の脅威である。これらの生物体におけるカルバペネムに対する耐性は、Ｋ．ニューモニエカルバペネマーゼ（ＫＰＣ）、クラスＡベータ−ラクタマーゼ(これも、広範囲セファロスポリンに対する耐性を付与する)、ならびに市販のベータ−ラクタム／ベータ−ラクタマーゼ阻害薬組合せにより最も高頻度に媒介される（Ｑｕｅｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ，２００７）。ＫＰＣ−産生性Ｋ．ニューモニエ（ＫＰＣ−Ｋｐ）菌株は、しばしば、いくつかのその他のクラスの抗菌剤、例えばアミノグリコシドおよびフルオロキノロンに対する耐性決定因子を保有して、真の多剤耐性（ＭＤＲ）生物体を生じる（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００９）。限定された抗菌剤選択肢を考慮すると、ＫＰＣ−Ｋｐにより引き起こされる感染は、途方もない治療的難題を持ち掛けており、お粗末な臨床結果を伴う。
【０３１４】
以前に記載されたようなマウスモデルにおける処置プロトコール（例えば、Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１１）を用いて、カルバペネム耐性クレブシエラを処置するための細菌組成物(試験物)を評価して、消化管における保菌を低減する。雌ＣＦ１マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、個別に収容し、２５〜３０ｇで計量した。
【０３１５】
Ｋ．ニューモニエの十分に特性化された菌株ＶＡ−３６７（８、９、２５）を、この試験に用いる。この臨床単離物は、米国東部で流布しているＫＰＣ−Ｋｐ菌株と遺伝的に関連している。ＰＣＲおよびＤＮＡ配列解析を用いたＫ．ニューモニエＶＡ−３６７における耐性機序の特性化は、ｂｌａＫＰＣ−３、ｂｌａＴＥＭ−１、ｂｌａＳＨＶ−１１およびｂｌａＳＨＶ−１２、ならびにｑｎｒＢ１９およびａａｃ（６’）−ｌｂの存在を明示した。さらに、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンシングは、以下の外膜タンパク質遺伝子のコード配列の破壊を明示した：ｏｍｐＫ３５、ｏｍｐＫ３６およびｏｍｐＫ３７。抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）を、寒天希釈法を用いて実施し、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）からの最新推奨に従って解釈した。エルタペネム、メロペネムおよびイミペネムを用いて、以前に記載された方法に従って（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００７参照）、変法Ｈｏｄｇｅ試験を実施した。Ｅｔｅｓｔ感受性検定（ＡＢ  ｂｉｏＭ  ´ｅｒｉｅｕｘ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により、チゲサイクリンおよびポリミキシンＥを評価した。チゲサイクリンに関する結果を米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により示唆されたように解釈し、そしてポリミキシンＥに関してはＣＬＳＩ推奨（シュードモナスに関する判定基準）に従って、解釈した。
【０３１６】
マウス（１０匹／群）を、細菌組成物（試験物）、エタノール処理胞子調製物（例えば、本明細書中に記載されるような）、抗生物質クリンダマイシン、ピペラシリン−タゾバクタム、チゲサイクリン、エルタペネム、セフェピメ、シプロフロキサシン、またはその組合せ、あるいはビヒクルのみを摂取する対照群に割り当てる。それらに、−１０日目から０日目まで毎日、試験物を投与する。０．５ｍｌのリン酸塩緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に希釈した１０３ＣＦＵのＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７を、ステンレススチール給餌管（Ｐｅｒｆｅｋｔｕｍ；Ｐｏｐｐｅｒ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｈｙｄｅ  Ｐａｒｋ，ＮＹ）を用いて、経口強制投与により投与した。カルバペネム耐性Ｋ．ニューモニエの濃度を測定するために、大便試料をＫＰＣ−Ｋｐの投与後１、４、６および１１日に収集した。大便試料（１００ｍｇを８００ｍｌのＰＢＳ中に希釈）を、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上で、０．５ｕｇ／ｍｌのイミペネムを有する場合と有さない場合で、プレート化して、大便１グラム当たりのＣＦＵの数を確定した。あるいは、当業者が実施し得るようなその他の方法、例えばＰＣＲ、抗原試験を用いて、カルバペネム耐性Ｋ．ニューモニエのレベルを測定し得る。
【０３１７】
大便試料を処置の５日後に収集して、微生物フローラに及ぼす抗生物質の作用を査定し、大便中の抗生物質レベルを測定した。微生物フローラに及ぼす作用を査定するために、前記のように新たな大便試料を採取した（例えば、実施例２および３参照）。付加的実験を実施して、細菌組成物（試験物）の投与が、ＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７によるコロニー形成を排除するか、持続するかを調べた。
【０３１８】
マウスを皮下クリンダマイシンで処置して、正常腸フローラを低減した１日後に、経口強制投与により、１０４ＣＦＵのＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７を摂取させて、７日間、１日おきに皮下クリンダマイシンをマウスに摂取させ続けた。同時に、ＫＰＣ−Ｋｐによる経口強制投与後に７日間、通常生理食塩水（対照群）、または明記したような細菌組成物の経口強制投与をマウスに摂取させた。付加的用量の皮下クリンダマイシンを、ＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７の投与の２０日後に投与して、嫌気性微生物フローラの排除により増大され得るカルバペネム耐性Ｋ．ニューモニエが存在するか否かを査定した。基線で、ならびに経口強制投与によりＫＰＣ−Ｋｐ  ＶＡ−３６７が与えられた後３、６、８、１１、１６および２１日に、大便試料を収集した。糞便中のＣＲＫＢの低減により、細菌組成物を検査する。
【０３１９】
実施例２４：キーストーンＯＴＵの同定および機能
ヒト身体は、微生物叢およびマイクロバイオームがヒトシステムの基本的健康機能(例えば、代謝的、免疫学的および神経学的)において有意の役割を果たす生態系である。微生物叢およびその結果生じるマイクロバイオームは、単一被験体ないに共存して、互いと、およびそれらの宿主（すなわち、哺乳動物被験体）と相互作用して、固有の生物多様性および機能的特質を有する動的単位を形成する微生物の生態構造を含む。相互作用微生物のこれらのネットワーク(すなわち、生態構造)内で、特定の成員が、他のものより有意に寄与し得る；このようなものとして、これらの成員は、多数の異なる生態構造においても見出され、生態構造からのこれらの微生物の喪失は、具体的生態構造の機能的能力に及ぼす有意の影響を有し得る。ロバート・ペインは、「キーストーン種」という概念を、１９６９年に案出して（Ｐａｉｎｅ  ＲＴ．１９６９．Ａ  ｎｏｔｅ  ｏｎ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｕｒａｌｉｓｔ  １０３：９１-９３参照）、生態学的コミュニティにおけるそれらの存在量にもかかわらず、所定の生態系に不可欠であるこのようなかなめ種の存在を説明する。ペインは、元来、海洋系におけるヒトデのピサスター・オクラセウスの役割を説明し、その後、その概念は多数の生態系において経験的に正当性を立証された。
【０３２０】
キーストーンＯＴＵｓおよび／またはファンクションは、具体的表現型を共有する限定組の試料から解明されるネットワーク生態学の解析によりコンピューターで得られる。キーストーンＯＴＵおよび／またはファンクションは、以下の判定基準のうちの２つ以上を満たす限定組のネットワーク内のすべてのノードとして定義される。判定基準１を用いて、ノードはネットワークにおいて頻繁に観察され、ノードが観察されるネットワークは、多数の個々の被験体において見出される；ネットワークにおけるこれらのノードの発生頻度、ならびに個体におけるネットワークの普及は、これらのノードが多数の個体において重要な生物学的機能を実施することを示す。判定基準２を用いて、ノードはネットワークで頻繁に観察され、ノードが観察されるネットワークは各々、多数のノード  −−これらのノードは、したがって、「スーパー・コネクター」であり、これは、それらが大多数のネットワークの核を構成し、このようなものとして、所定の生態構造に対するそれらの機能的寄与に関して、高度の生物学的意義を有する、ということを意味する。判定基準３を用いて、ノードは、多数のノードを含有するネットワーク中に見出され（すなわち、それらは大型ネットワークである）、ノードが見出されるネットワークは、多数の被験体において生じる；多数の個体に生じる大型ネットワークが偶然だけで生じるとは思われず、生物学的関連性を強く示唆しているので、これらのネットワークは潜在的に高度の重要性を有する。任意に、ノードがネットワーク生態構造において観察される頻度に関して必要とされる閾値、所定のネットワークが被験体試料全体を通して観察される頻度、ならびにキーストーンノードを考察されるべき所定のネットワークのサイズは、これらの変数の分布の５０、７０、８０または９０パーセンタイルにより限定される。任意に、必要とされる閾値は、統計学的有意の標準パラメトリックまたは非パラメトリック測定を用いた所定の変数に関する平均または中央値とは有意に異なっている所定の変数に関する値により限定される。別の実施形態では、キーストーンノードは、目的の試料表現型、例えば、限定されないが、「健康」において生じる、そして同時に、目的の試料表現型、例えば、限定されないが、「疾患」において生じないもの、として定義される。任意に、キーストーンノードは、有意性を測定するための並べ替え検定データベースを用いて観察されるものと有意に異なっていることが示されるものとして定義される。
【０３２１】
実施例２５：患者への投与のための細菌組成物の製造方法
細菌組成物のための２つの菌株を、独立して培養し、投与前に一緒に混合する。両菌株を、独立して、１ｇ／ＬのシステインＹＨＣｌで予備還元されたＧＭＭまたはその他の動物生成物無含有培地中で、３７℃、ｐＨ７で増殖させる。各菌株が十分なバイオマスに到達した後、１５％グリセロールを添加し、次いで、１ｍｌクライオチューブ中で−８０℃で凍結させることにより、バンキングのためにそれを保存する。
【０３２２】
次に、各菌株を１０１０ＣＦＵ／ｍＬの濃度に培養し、次いで、接線流精密濾過により２０倍に濃縮する；２％ゼラチン、１００ｍＭトレハロースおよび１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液からなる保存培地、またはその他の適切な保存培地を用いて透析濾過することにより、使用済み培地を交換する。懸濁液を凍結乾燥して粉末にして、滴定する。
【０３２３】
乾燥後、粉末を微晶質セルロースおよびステアリン酸マグネシウムと配合し、１０ｍｇの凍結乾燥粉末（１０８〜１０１１個の細菌）、１６０ｍｇの微晶質セルロース、７７．５ｍｇのゼラチンおよび２．５ｍｇのステアリン酸マグネシウムを含有する２５０ｍｇゼラチンカプセルに処方する。
【０３２４】
実施例２６：細菌株発芽物質利用を確定するための微生物学的検定の使用
病原性胞子形成性細菌の場合、典型的には、疾患症候を誘発するために、細菌胞子は発芽し、植物細胞成長を開始しなければならない。一例はＣ．ディフィシルであり、これは休眠胞子期である場合、高度に感染性であるが、しかしクロストリジウム・ディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）の症候を引き起こすために、発芽し、生育しなければならない（Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６１，Ｉｓｓｕｅ  ９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１０，Ｐａｇｅｓ７３０−７３４）。利用可能な発芽物質を代謝するために菌株組を用いることにより病原性胞子発芽を防止することは、したがって、胞子形成性細菌により引き起こされる疾患を防止するための実行可能な戦略である。
【０３２５】
類似の栄養物および所定の病原体への発芽物質を利用する単一菌株または菌株の組を単離し、同定するための一方法は、細菌の複合コミュニティからこのような微生物を選択することを包含する。目的の病原性植物または胞子に関して選択的であるプレート上で細菌の複合コミュニティをプレート化することは、類似の栄養物および発芽物質利用プロフィールを有する種の単離をもたらす。
【０３２６】
Ｃ．ディフィシルの存在に関して陰性と試験された試料からの糞便懸濁液は、未処理のままにしておくか、または５０％エタノールで１時間処理して、細菌胞子に関して選択し、植物性細菌を排除した。次いで、これらの試料を、Ｃ．ディフィシルの選択的単離のために市販のプレート上でプレート化した（ｃｈｒｏｍＩＤ(登録商標)Ｃ．ディフィシルプレート（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘから）、またはクロストリジウム・ディフィシル選択性寒天（ＣＤＳＡ）プレート(ＢＤから)）。これらのプレートは、Ｃ．ディフィシル発芽を支持する発芽物質、およびＣ．ディフィシル植物性生育を支持する栄養物の混合物を含有する。これらのプレート上で生育した菌株の個々のコロニーを、１６Ｓリボソームシーケンシングによる同定のために摘み取った。これらの菌株は、必須栄養物、およびＣ．ディフィシル発芽および生育のために必要な発芽物質を利用し、したがって、ＣＤＡＤを処置し、防止するための多菌株細菌組成物中に使用するための候補を表す。
【０３２７】
処置３は、本発明の実施例におけるＣ．ディフィシルと類似の栄養物および発芽物質を各々が利用することが示されたＣ．ディスポリクム、Ｃ．マヨンベイ、Ｃ．テルチウム、Ｃ．イノキュウムおよびコリネスラ・アエロファシエンスを含む１５の生物体からなる（表Ｘ）。この処置は、当該病原体による攻撃誘発時にＣ．ディフィシル関連の死亡率、体重減少および臨床的症候を防止した。
【０３２８】
【表９】
0006479685.tif 000025
【０３２９】
実施例２７：再菌株発芽物質利用を確定するためのバイオログ検定の使用
発芽要件に関して重複する競合体種または抗合体種の組合せを見つけ出すことにより、病原体の胞子の発芽を抑制する細菌種を確定し得る。一例として、実施例１５に記載された方法を用いて、胞子形成性病原体に関する発芽要件の一覧を見出し得る。潜在的競合体を平行して試験し、細菌が胞子から生育される場合、発芽要件に関する重複のレベルに基づいて選択し得る。この検定に関しては、純粋胞子からなる培養を接種物質として用いる。胞子形成性種の培養を、混合しながら５０％エタノールで１時間処理することにより、純粋胞子試料を調製する。エタノール中でのインキュベーション後、懸濁液を、１２，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離器中でペレット化する。次いで、胞子をＰＢＳ中に再懸濁する。発芽物質を添加する場合としない場合とで、平行して、胞子からの発芽を試験する。１時間インキュベートして発芽させた後、各試料を連続希釈して、力価のためにプレート化する。力価が栄養物の存在下でより高い場合、栄養物は発芽物質として採点される。病原体の発芽要件と十分に重複する競合体の組合せを、病原体の発芽を防止する能力を有する一組として選択し得る。
【０３３０】
実施例２８：胞子形成に必要とされるその発芽物質を改質する組成物を同定することによる病原体の抑制
Ｃ．ディフィシルは、その発芽開始が一次胆汁酸塩、例えばコール酸塩、タウロコール酸塩、グリココール酸塩およびその他のタウロコール酸塩誘導体により誘導される胞子形成体である［Ｓｏｒｇ  ａｎｄ  Ｓｏｎｎｅｎｓｈｅｉｎ（２００８）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １９０：  ２５０５−２５１２；Ｔｈｅｒｉｏｔ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４１１４］。多数の共生生物体が、一次胆汁酸塩を二次胆汁酸塩、例えばリトコール酸塩、デオキシコール酸塩異性体、および種々の抱合型胆汁酸塩に脱ヒドロキシル化する酵素をコードする。付加タウロコール酸塩またはコール酸塩を含有する増殖培地中で、目的の共生生物の一夜培養をインキュベートする。目的の共生生物体の生育に対して抑制的でない各胆汁酸塩の濃度を見つけ出すために、９６ウェル中の各増殖培地を用いて、０．００１％〜０．１％の濃度を試験して、ＯＤ６００をモニタリングすることにより生育を測定する。生育が観察された各条件に関して、アリコートを分析する。遠心分離により微生物を取り出して、ＬＣ−エレクトロスプレー三重四極質量分光分析または等価の方法を用いて上清を試験して、タウロコール酸塩およびコール酸塩からの二次胆汁酸の生成を検出する。一組の参照標準、例えば市販の一次および二次胆汁酸を調製し、平行して実行する。次に、タウロコール酸塩およびコール酸塩を代謝し得る２つ以上の共生生物を組み合わせて、本明細書中の実施例に記載されるようにマウスにおけるＣ．ディフィシル感染を防止する能力に関して試験することにより、微生物組成を選択する。
【０３３１】
実施例２９:病原体による栄養物利用の確定
病原体の具体的栄養物利用能力を、上記の方法のうちの１つまたは組合せの使用により確定し得る。一例では、クロストリジウム・ディフィシルの生育を可能にし、増強し、またはそのために必要である化合物の一覧を、上記の実施例１５に記載された方法を用いて確定した。試験した条件のいずれかの下で１．５×陰性対照ウェルという最終値を有したウェルを、生育要件として採点した。種々の酸化還元緩衝液条件を用いて同一病原体種の３つの菌株を試験し、菌株のうちのいずれかの生育を支持した化合物は、病原体種のための生育基質とみなされた。
【０３３２】
実施例３０：潜在的競合体による栄養物利用の確定
上記の方法のうちの１つ、またはその組合せを用いることにより、潜在的病原体競合体である細菌種の具体的栄養物利用能力を確定し得る。一例では、潜在的病原体競合体種の生育を可能にし、増強し、またはそのために必要である化合物の一覧を、上記の実施例１５に記載された方法を用いて確定した。試験した条件のいずれかの下で１．５×陰性対照ウェルという最終存在量値を有したウェルを、競合体が利用し得る栄養物として採点した。病原体の栄養物利用能力との重複のレベルに基づいて、病原体の潜在的競合体または競合体の組合せを選択し得る。一般原則として、重複が大きいほど、単離物または単離物の組が病原体に対する競合体として有する能力は大きい。
【０３３３】
実施例３１：潜在的競合体を同定するための最小栄養物閾値定量の使用
生育に必要な栄養物の最終濃度またはその他の生育要件を、最小制限培地検定における生育により確定した。この検定では、生育に必要な少なくとも１つの構成成分を欠く最小制限培地を構築する。９６ウェルプレートの列に沿った２倍希釈により、具体的な欠けている栄養物を制限培地中で滴定する。次いで、特定の病原体の潜在的競合体をプレートの全てのウェルに接種し、試験栄養物濃度の一関数として生育速度を確定する。プレートを４８時間インキュベートして、６００ｎｍでの光学密度(ＯＤ)により生育を測定する。生育を可能にする最低濃度の栄養物を有するウェルを、最小閾値濃度であると決定する。病原体より低い最小閾値濃度を有することにより、病原体の潜在的競合体を選択する。
【０３３４】
実施例３２：潜在的競合体を同定するための増殖速度定量の使用
試験している種を制限培地に接種し、経時的にいくつかの時点で力価を測定することにより、細菌種の増殖速度を確定し得る。一例では、病原体または病原体の潜在的競合体を、試験している栄養物を含有する最小制限培地に接種する。例えば、単一炭素源を含有する制限培地中で、クロストリジウム・ディフィシル生育速度を確定し得る（Ｔｈｅｒｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ））。陽性対照としてグルコースを、陰性対照として無炭水化物培地を用いて、種々の炭素源を試験する。検定のために用いられる制限培地は、０．５％（重量／容量）の試験炭水化物(他の炭素源は含有しない)、ならびに０．１２５ｍｇ／ｌのビオチン、１ｍｇ／ｌのピリドキシンおよびパントテン酸塩、７５ｍｇ／ｌのヒスチジン、グリシンおよびトリプトファン、１５０ｍｇ／ｌのアルギニン、メチオニンおよびトレオニン、２２５ｍｇ／ｌのバリンおよびイソロイシン、３００ｍｇ／ｌのロイシン、４００ｍｇ／ｌのシステイン、ならびに４５０ｍｇ／ｌのプロリンを含有する。
【０３３５】
具体的には、試験される各炭素源に関して、Ｃ．ディフィシルを脳心臓浸出液中で３７℃で１４時間培養し、次いで、０．５％グルコースを、記載されたビタミンおよびアミノ酸とともに含有する制限培地中で１：３継代培養して、３時間生育させ、２０００×ｇで１０分間遠心分離して、等容量の嫌気的に平衡されたＰＢＳ緩衝液中に再懸濁する。１００μｌの懸濁液を用いて、０．５％試験炭水化物ならびに記載されたビタミンおよびアミノ酸を含有する制限培地に接種する。試料を、２００ｒ．ｐ．ｍで振盪しながらインキュベートする。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０Ｄ＋装置で、２４時間、毎時間ＯＤ６００をモニタリングする。具体的生育速度を、生育速度＝ｌｎ（Ｘ／Ｘｏ）／Ｔ（式中、Ｘは生育の線形部分の間のＯＤ６００値であり、Ｔは、時間（時間）である)として確定する。値を、２回実行した３つの個々の培養の平均として報告する（表ＸＸ参照）。
【０３３６】
【表１０】
0006479685.tif 000026
【０３３７】
あるいは、各時点で小アリコートを採取し、連続希釈して、栄養物濃化固形培地にプレート化して、コロニーを計数することにより、生育の進行を確定し得る。
【０３３８】
病原体および潜在的競合体種間で比較を行って、Ｃ．ディフィシルと競合する高い潜在力を有する競合体を限定し得る。高潜在性競合体候補は、病原体微生物よりも速い生育速度を有する。
【０３３９】
実施例３３：機能性に関して潜在的細菌競合体コンソーシアを試験するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定の使用
そうでなければ病原体の生育に適している培地中で、病原体、例えばクロストリジウム・ディフィシルの生育を抑制する選定種または種の組合せの能力を試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定を実施する。病原体の生育に適した液体培地、例えばＣ．ディフィシルのための脳心臓浸出液ブロス（ＢＨＩ）を選定する。潜在的競合体種または競合体種の組合せを、３ｍＬの培地に接種し、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートする。インキュベーション後、遠心分離器で、１０，０００ｒｃｆで５分間、細胞をペレット化する。上清を取り出し、０．２２μｍのフィルターを通して濾過して、すべての細胞を取り出す。次に、Ｃ．ディフィシルまたは別の当該病原体を濾過した使用済み上清に接種し、３７℃で２４時間、嫌気的に生育させる。新たな培地中の対照培養を、平行してインキュベートする。インキュベーション後、連続希釈し、ブルセラ血液寒天（ＢＢＡ）プレートにプレート化して、３７℃で２４時間、嫌気的にインキュベートすることにより、Ｃ．ディフィシルの力価を確定する。競合体状態調節培地および対照培地中でのインキュベーション後、コロニーを計数して、病原体の最終力価を確定する。最終力価における低減パーセントを算定し、生育における統計学的に有意の低減が測定される場合は、抑制性とみなされる。あるいは、試験および対照培養のＯＤ６００測定により、病原体生育の抑制をモニタリングする。
【０３４０】
実施例３４：病原体抑制に関してｉｎ  ｖｉｖｏで試験するための種の選択
病原体または病原性片利共生菌と資源に関して競合する種の細菌組成物を同定するという原理に基づいて、宿主の腸内の病原体または病原性片利共生菌に取って代わると思われる種の組を造り上げる。機序は、栄養物利用に基づいた生物体の組と病原体または病原性片利共生菌との競合、所定の重要栄養物または重要栄養物のサブセットに関する最小栄養物閾値、増殖速度、発芽要件、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合検定を通して理解される一般的機序を包含する。付加的なその他の機序は、本明細書中に記載される教示に鑑みて、当業者に理解され、したがって、記載される機序は、本発明の開示の範囲を限定するとみなされるべきでない。次いで、細菌組成物が記載されるように調製され、本明細書中に記載されるように適切な宿主においてｉｎ  ｖｉｖｏで試験され得る。
【０３４１】
実施例３５：機能性に関して潜在的細菌競合体コンソーシアを試験するためのｉｎ  ｖｉｖｏマウス検定の使用
本明細書中に記載される方法を用いる、病原体、および病原体の１７の潜在的競合体の両方の栄養物利用に関するスクリーンの使用により、クロストリジウム・ディフィシル関連疾患のマウスモデルにおいて試験するための細菌種の組合せを選定した。潜在的競合体の各々により用いられる栄養物の使用を、試験される任意の条件下で試験されるクロストリジウム・ディフィシル菌株のいずれかにより用いられる栄養物の一覧と相互参照した。クロストリジウム・ディフィシル栄養物の一覧との重複に関して、１７の菌株を順位分けした。クロストリジウム・ディフィシル栄養物との重複に関して等級付けされた上位３種（クロストリジウム・ヒレモネ、ブラウチア・プロヅクタ、クロストリジウム・ブチリクム）から、２および３種組合せを選定した。クロストリジウム・ディフィシル栄養物との重複に関して等級付けした場合、上位５０％に等級分けされる種から、４種組合せを選定した。クロストリジウム・ディフィシルによる栄養物利用の等級付けに基づいて、重複低減を示す３種組合せも選定した。
【０３４２】
細菌組成物の治療潜在力を試験するために、Ｃ．ディフィシル感染の予防用マウスモデル（Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３５（６）：１９８４−１９９２に基づいたモデル）を用いた。各々５匹の２つのケージを、実験の各アームに関して試験した。すべてのマウスが、それらの飲料水中の１０％グルコース、カナマイシン（０．５ｍｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（０．０４４ｍｇ／ｍｌ）、コリスチン（１０６２．５Ｕ／ｍｌ）、メトロニダゾール（０．２６９ｍｇ／ｍｌ）、シプロフロキサシン（０．１５６ｍｇ／ｍｌ）、アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびバンコマイシン（０．０５６ｍｇ／ｍｌ）からなる抗生物質カクテルを、−１４日目〜−５日目に、そして１０ｍｇ／ｋｇの用量のクリンダマイシンを経口強制投与により−３日目に摂取した。−１日目に、マウスは、経口強制投与により試験物またはビヒクル対照を摂取した。０日目に、経口強制投与を介したおよそ４．５  ｌｏｇ１０ｃｆｕのＣ．ディフィシル（ＡＴＣＣ  ４３２５５）の投与により、マウスを負荷試験した。陽性対照群は、上記の抗生物質プロトコールおよびＣ．ディフィシル負荷試験のほかに、−１日目〜３日目にバンコマイシンを摂取した。保菌の分析のためにケージから糞便を収集し、０日目から６日目まで、毎日死亡率を査定して、動物の体重およびその後の体重変化を、Ｃ．ディフィシル感染に関連する体重減少を用いて査定した。エンプティビヒクルと比較した場合の試験物の死亡率および重量減少低減を用いて、試験物の成功を査定した。さらに、Ｃ．ディフィシル症候スコアリングを、−１日間から６日目まで、毎日実施した。症候スコアリングは、外見（正常、猫背、立毛または不活発に基づいて０〜２ポイント）、呼吸(正常、速いまたは浅い、腹式呼吸を伴うに基づいて０〜２ポイント)、臨床徴候（正常、湿った尾、触ると冷たい、または他の動物から孤立に基づいて０〜２ポイント）を基礎にした。
【０３４３】
各アームに関する累積死亡率を編集することに加えて、平均最小相対体重を、−１日目と比較した場合の各マウスの最小体重の平均として算定し、平均最大臨床スコアを、死亡の場合に割り当てられる４のスコアを有する各マウスの最大併合臨床スコアの平均として算定する。処置を表Ｗに明示し、結果を表Ｙで報告する。
【０３４４】
【表１１】
0006479685.tif 000027
【０３４５】
【表１２】
0006479685.tif 000028
【０３４６】
実施例３６：生育のための培地の選択
好ましい炭素源を含む、生育を支持するための適切な培地を選択することは重要である。例えば、いくつかの生物体は、複合糖質、例えばセロビオースを、単純糖より好む。用いられる培地の例は、以下に示す。固形培地上でのプレート化の場合、多重希釈液をプレートアウトさせて、いくつかのプレートが分析のためにそれらの上に十分な単離物を有し、あるいは高密度コロニーを有するプレートは、掻きだされ、ＰＢＳ中に再懸濁されて、混合多様コミュニティを生成し得る、ということを保証する。液体培地は、以下のものを包含する（１．５％寒天の添加により、固形培地に改造され得る）：
・Ｇｉｆｕ嫌気性培地（ＧＡＭ、Ｎｉｓｓｕｉ）：デキストロースを伴わず、フルクトオリゴ糖／イヌリン（０．４％）、マンニトール（０．４％）、イヌリン（０．４％）、またはフルクトース（０．４％）、またはその組合せを補足。
・ＳｗｅｅｔＧＡＭ［Ｇｉｆｕ嫌気性培地（ＧＡＭ、Ｎｉｓｓｕｉ）］：グルコース、セロビオース、マルトース、Ｌ−アラビノース、フルクトース、フルクトオリゴ糖／イヌリン、マンニトールおよび乳酸ナトリウムで、改質、補足。
・ブルセラ血液ブロス（ＢＢＡ、Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）
・ＰＥＡヒツジ血液（嫌気性生物系；５％ヒツジ血液、フェニルエチルアルコールを伴う）
・卵黄ブロス（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）
・亜硫酸ポリミキシンミルク（Ｍｅｖｉｓｓｅｎ−Ｖｅｒｈａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：２８５−２８９（１９８７））
・ムチンブロス（Ｄｅｒｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩＪＳＥＭ  ５４：１４６９−１４７６（２００４））
・ポリガラクツロン酸塩ブロス（Ｊｅｎｓｅｎ＆Ｃａｎａｌｅ−Ｐａｒｏｌａ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２：８８０−９９７（１９８６））
・Ｍ２ＧＳＣ（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）
・Ｍ２ブロス（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）：デンプン（１％）、マンニトール（０．４％）、乳酸塩（１．５ｇ／Ｌ）またはラクトース（０．４％）を補足。
・ＳｗｅｅｔＢ−脳心臓浸出液ブロス（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）：酵母抽出物（０．５％）、ヘミン、システイン（０．１％）、マルトース（０．１％）、セロビオース（０．１％）、可溶性デンプン（ｓｉｇｍａ、１％）、ＭＯＰＳ（５０ｍＭ、ｐＨ７）を補足。
・ＰＹ−サリシン（ペプトン−酵母抽出物寒天：サリシンを補足）（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）。
・改質脳心臓浸出液（Ｍ−ＢＨＩ）［［甘味および酸味］］は、１Ｌ当たり以下のものを含有する：３７．５ｇの脳心臓浸出物粉末（Ｒｅｍｅｌ）、５ｇの酵母抽出物、２．２ｇの食肉抽出物、１．２ｇの肝臓抽出物、１ｇの塩酸システイン、０．３ｇのチオグリコール酸ナトリウム、１０ｍｇのヘミン、２ｇの可溶性デンプン、２ｇのＦＯＳ／イヌリン、１ｇのセロビオース、１ｇのＬ−アラビノース、１ｇのマンニトール、１  Ｎａ−乳酸塩、１ｍＬのトゥイーン８０、０．６ｇのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．６ｇのＣａＣｌ２、６ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＫ２ＨＰＯ４、３３ｍＭの酢酸、９ｍＭのプロピオン酸、１ｍＭのイソブチル酸、１ｍＭのイソ吉草酸、ならびにオートクレーブ処理後に、５０ｍＬの８％ＮａＨＣＯ３溶液および５０ｍＬの１Ｍ  ＭＯＰＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７）を添加する。
・Ｎｏａｃｋ−Ｂｌａｕｔオイバクテリウムブロス（Ｎｏａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．（１９９８）１２８：１３８５−１３９１参照）
・ＢＨＩＳ  ａｚ１／ｇｅ２−ＢＨＩＳ  ａｚ／ｇｅ寒天（Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ．ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．８０：３７８６−３７９４（２０１２））［脳心臓浸出液ブロス（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）：酵母抽出物  ０．５％、システイン  ０．１％、０．１％セロビオース、０．１％イヌリン、０．１％マルトース、アズトレオナム  １ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン  ２ｍｇ／Ｌを補足］
・ＢＨＩＳ  ＣＩｎＭ  ａｚ１／ｇｅ２−  ＢＨＩＳ  ＣＩｎＭ［脳心臓浸出液ブロス（Ａｔｌａｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，４ｔｈ  ｅｄ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）：酵母抽出物  ０．５％、システイン  ０．１％、０．１％セロビオース、０．１％イヌリン、０．１％マルトース、アズトレオナム  １ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン  ２ｍｇ／Ｌを補足］。
【０３４７】
実施例３７：二成分対の高処理量スクリーニング
高処理量９６−ウェルフォーマットにおける二成分対の構築。二成分対の高処理量スクリーニングを可能にするために、−８０℃グリセロールストックバンクのバイアルを解凍し、１ｅ８ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。次に、９６-ウェルプレートのウェル中の２００ｕＬのＰＢＳ＋１５％グリセロール中で各菌株を１０倍希釈した（各菌株の最終濃度１ｅ７ＣＦＵ／ｍＬ）。次いで、プレートを−８０℃に凍結した。必要な場合、プレートを−８０℃から取り出し、クロストリジウム・ディフィシルを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定で試験する場合は、嫌気性条件下で室温で解凍した。
【０３４８】
高処理量９６−ウェルフォーマットにおける三元性組合せの構築。三元性組合せの高処理量スクリーニングを可能にするために、−８０℃グリセロールストックバンクのバイアルを解凍し、１ｅ８ＣＦＵ／ｍＬに希釈した。次に、９６-ウェルプレートのウェル中の２００ｕＬのＰＢＳ＋１５％グリセロール中で各菌株を１０倍希釈した（各菌株の最終濃度１ｅ７ＣＦＵ／ｍＬ）。次いで、プレートを−８０℃に凍結した。必要な場合、プレートを−８０℃から取り出し、クロストリジウム・ディフィシルを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定で試験する場合は、嫌気性条件下で室温で解凍した。
【０３４９】
クロストリジウム・ディフィシルの生育に対して抑制的なＥｃｏｂｉｏｔｉｃ(商標)組成物に関してスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定の構築。この検定におけるＣ．ディフィシルの抑制は、栄養物に関する競合に起因し得る；検定は単一機序に限定されないので、抑制のその他の機序が寄与し得る。
【０３５０】
クロストリジウム・ディフィシルの一夜培養を、ＳｗｅｅｔＢ−ＦｏｓＩｎまたはＣ．ディフィシルの生育のためのその他の適切な培地中で嫌気性条件下で生育させた。ＳｗｅｅｔＢ−ＦｏｓＩｎは、脳心臓浸出液、酵母抽出物、システイン、セロビオース、マルトース、可溶性デンプンならびにフルクトオリゴ糖／イヌリンおよびヘミンからなる複合培地であり、ＭＯＰｓで緩衝する。２４時間生育後、培養を、広範な種々の嫌気性細菌種の生育に適している複合培地、例えばＳｗｅｅｔＢ−ＦｏｓＩｎ中で、１００，０００倍希釈した。次に、希釈Ｃ．ディフィシル混合物を、９６-ウェルプレートのウェルにアリコート化した（各ウェルに１８０ｕＬ）。次いで、潜在的抑制種の二成分対２０ｕＬを各ウェルに添加して、各種の最終濃度を１ｅ６ＣＦＵ／ｍＬとした。あるいは、異なる初期濃度での二成分対を用いて、検定を試験し得る（１ｅ９ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ８ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ７ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ５ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ４ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ３ＣＦＵ／ｍＬ、１ｅ２ＣＦＵ／ｍＬ）。Ｃ．ディフィシルを接種しただけの対照ウェルを、抑制を伴わないＣ．ディフィシルの生育との比較のために包含した。Ｃ．ディフィシルの生育を抑制するかまたは抑制しない付加的ウェルを、対照のために用いた。生育を抑制する陽性対照の一例は、ブラウチア・プロヅクタ、クロストリジウム・ビフェルメンタンスおよび大腸菌の組合せであった。Ｃ．ディフィシル生育の抑制低減を示す対称の一例は、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・オバツスおよびバクテロイデス・ブルガツスの組合せであった。プレートをパラフィルムで包み、嫌気性条件下で３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、Ｃ．ディフィシル単独を含有するウェルを連続希釈し、プレート化して、力価を確定した。次に、９６−ウェルプレート−８０℃で凍結した後、ｑＰＣＲ検定によりＣ．ディフィシルを定量した。
【０３５１】
拡散媒介性機序によりクロストリジウム・ディフィシルの生育に対して抑制的である細菌組成物に関してスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定の構築。０．２２ｕＭフィルター挿入物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ(商標)ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ(商標)９６−ウェル検定プレート  −  Ｉｔｅｍ  ＭＡＧＶＳ２２１０）を９６−ウェルフォーマットで用いて、細菌組成物からＣ．ディフィシルを物理的に分離することにより、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定を改変した。Ｃ．ディフィシルを９６−ウェルプレート中にアリコート化し、一方、細菌組成物をフィルター上張り上の培地中にアリコート化した。栄養培地を０．２２ｕＭフィルターの両側に接触させて、拡散による栄養物、小分子および多数の高分子物質（例えば、バクテリオシン、細胞表面タンパク質、または多糖）の交換を可能にした。この実施形態では、２４時間インキュベーション後、細菌組成物を含有するフィルター挿入物を取り出した。次に、Ｃ．ディフィシルを含有するプレートを、６００ｎｍで光学密度(ＯＤ)を測定するのに適した９６−ウェルプレート読取機に移した。異なる細菌組成物の存在下でのＣ．ディフィシルの生育を、ＯＤ測定値に基づいて比較した。
【０３５２】
定量のためのクロストリジウム・ディフィシル選択的培地を用いてクロストリジウム・ディフィシルの生育に対して抑制的な細菌組成物に関してスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定の構築。連続希釈し、Ｃ．ディフィシル選択性培地（Ｂｌｏｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）、例えばＣＣＦＡ（シクロセリンセフォキシチンフルクトース寒天、Ａｎａｅｒｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤＳＡ（クロストリジウム・ディフィシル選択性寒天。これは、シクロセリンセフォキシチンマンニトール寒天である。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にプレート化することにより、最終Ｃ．ディフィシル力価を確定するために、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定を改変し得る。
【０３５３】
実施例３７：定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)標準曲線調製を用いたＣ．ディフィシルの定量
本明細書中で提供されるようなＳｗｅｅｔＢ＋ＦｏｓＩｎ培地中で生育される病原性Ｃ．ディフィシルの実を含有する各検定プレート上のウェルから、標準曲線を作成し、選択的スポットプレート化により定量した。培養の連続希釈を、眼筋リン酸塩緩衝生理食塩水中で実施した。ゲノムＤＮＡを、他のウェルと一緒に標準曲線から抽出した。
【０３５４】
ゲノムＤＮＡ抽出
希釈、凍結／解凍、および加熱溶解プロトコールを用いて、５μｌの各試料からゲノムＤＮＡを抽出した。５μｌの解凍試料を４５μＬのＵｌｔｒａＰｕｒｅ水（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に添加し、ピペッティングにより混合した。希釈試料を有するプレートを、加熱溶解ステップとその後の増幅を包含するｑＰＣＲのために用いるまで、−２０℃で凍結した。あるいは、メーカーの使用説明書に従って、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ(登録商標)−ｈｔｐ  ９６ウェル土壌ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｐｏｗｅｒｓｏｉｌ(登録商標)ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、またはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ糞便ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、ゲノムＤＮＡを単離し得る。
【０３５５】
ｑＰＣＲ組成物および条件
ｑＰＣＲ反応混合物は、１×ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、９００ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｆプライマー（ＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＡＧＴＧＧＴＴＴＡＧＴＴＡＧＡＧＴＴＧ（配列番号：２０４０）、  ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、９００ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｒプライマー（ＣＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＧＡＡ（配列番号：２０４１）、  ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、２５０ｎＭのＷｒ−ｔｃｄＢ−Ｐプローブ（６ＦＡＭ−ＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＣＡＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＴＴＴＣＴＣＣＡ−ＭＧＢ（配列番号：２０４２）、  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、および分子生物学等級水（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１８μｌに（Ｗｒｏｂｌｅｗｓｋｉ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃ．  ディフィシル  ｉｎ  Ｓｔｏｏｌ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４７：２１４２-２１４８（２００９）から改造したプライマー）を含有した。この反応混合物を、硬質外殻低プロフィール薄壁９６−ウェルスカート処理ＰＣＲプレート（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のウェルにアリコート化した。この反応混合物に、２μｌの希釈、凍結および解凍試料を添加し、プレートをＭｉｃｒｏｓｅａｌ‘Ｂ’接着シール（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で密封した。ＣＦＸ９６(商標)実時間システムを装備したＢｉｏＲａｄ  Ｃ１０００(商標)サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上で、ｑＰＣＲを実施した。熱循環条件は、９５℃を１５分間、その後、９５℃で５秒間、６０℃で３０秒間を４５サイクル、ならびにＦＡＭチャネルの蛍光読取であった。あるいは、当業者に既知のその他の標準方法で、ｑＰＣＲを実施し得る。
【０３５６】
データ解析
ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ(商標)３．０ソフトウェアにより、ＦＡＭチャネル上の各ウェルに関するＣｑ値を確定した。所定の試料のＣｑ値を、標準曲線から作成した線形回帰モデルに入力し、標準曲線ウェルのＣｑ値をそれらの試料の既知のｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍＬ）と比較することにより、各実験試料のＣ．ディフィシルのｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍＬ）を算定した。添加される付加的細菌を有さない標準曲線の作成のために用いられる各検定プレートにおける試料中のＣ．ディフィシルのｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍＬ）から、試料中のＣ．ディフィシルのｌｏｇ１０（ｃｆｕ／ｍＬ）を差し引くことにより、各試料に関するｌｏｇ抑制を算定した。各組成物に関するすべての反復実験に関して、平均ｌｏｇ抑制を算定した。
【０３５７】
各組成物の範囲および標準偏差のヒストグラムを、プロットした。全体的分布と異なるｌｏｇ抑制の範囲および標準偏差を、考え得る外れ値として調べた。ヒストグラムにおいて同定された二成分対のうちの１つからの単一ｌｏｇ抑制ダータムの除去が試料の大多数からのものと一致する範囲または標準偏差をもたらす場合、そのダータムを外れ値として除去し、平均ｌｏｇ抑制を再算定した。
【０３５８】
検定で評価されるすべての試料のプール化分散を、試料の自由度により計量される試料分散の平均として概算した。次に、試料の数の平方根で割ったプール化分散の平方根として、プール化標準誤差を算定した。所定パーセンテージ閾値に対応するｚスコアに対してプール化標準誤差を掛けることにより、帰無仮説に関する信頼区間を確定した。信頼区間外の平均ｌｏｇ抑制は、陽性である場合は抑制性であると、または陰性である場合は刺激性であるとみなされ、用いられる区間に対応する信頼度％を有した。帰無仮説の９９％より大きい平均ｌｏｇ抑制信頼区間（Ｃ．Ｉ）を有する試料を、＋＋＋＋として、９５％＜Ｃ．Ｉ．＜９９％を＋＋＋として、９０％＜Ｃ．Ｉ．＜９５％を有するものを＋＋として、８０％＜Ｃ．Ｉ．＜９０％を有するものを＋として報告し、一方、帰無仮説の９９％未満の平均ｌｏｇ抑制信頼区間（Ｃ．Ｉ）を有する試料を、---、９５％＜Ｃ．Ｉ．＜９９％を有するものを---、９０％＜Ｃ．Ｉ．＜９５％を有するものを---、８０％＜Ｃ．Ｉ．＜９０％を有するものを-として報告する。
【０３５９】
多数の二成分対が、表５に示したようにＣ．ディフィシルを抑制する。９８９のうち６２２の組合せが、信頼区間＞８０％を示し；９８９のうち５４５がＣ．Ｉ．＞９０％を；９８９のうち５０７がＣ．Ｉ．＞９５％を；９８９のうち４３０がＣ．Ｉ．＞９９％を有する抑制を示す。二成分対の非限定例としては、０．３６６より大きい平均ｌｏｇ低減を有するもの、例えばブラウチア・プロヅクタ、クロストリジウム・ハサウェイまたはコリンセラ・アエロファシエンスと対合するアリスチペス・シャヒイ、あるいはＣ．イノキュウム、Ｃ．テルチウム、コリンセラ・アエロファシエンスまたは表５に示したその他の４２４の組合せのうちのいずれかと対合するクロストリジウム・マヨンベイが挙げられる。同時に重要なことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定が、Ｃ．ディフィシルを有効に抑制しない二成分対を記述することである。９８９のうち１８８の組合せが、＞８０％信頼度で生育を促進し；９８９のうち５２が＞９０％信頼度で抑制の欠如を示し；９８９のうち２２が＞９５％信頼度で抑制の欠如を示し；９８９のうち３が、コプロコッカス・カツスと組み合わされるＢ．プロヅクタ、ドレア・フォルミシゲネランスと組み合わされるアリスチペス・シャヒイ、およびロセブリア・インテスチナリスと組み合わされるオイバクテリウム・レクタレを含めて、＞９９％信頼度で抑制の欠如を示す。９８９のうち２４９の組合せが検定において中性であり、これは、測定の限界までＣ．ディフィシル生育を促進も抑制もしないことを意味する。
【０３６０】
０．３１２より大きい平均ｌｏｇ抑制を有する三元性組合せは、＋＋＋＋として報告され（帰無仮説の≧９９％信頼区間（Ｃ．Ｉ．））、０．２２１〜０．３１２の平均ｌｏｇ抑制を有するものは＋＋＋として（９５％＜Ｃ．Ｉ．＜９９％）、０．１７１〜０．２２１の平均ｌｏｇ抑制を有するものは＋＋として（９０％＜Ｃ．Ｉ．＜９５％）、０．１１３〜０．１７１の平均ｌｏｇ抑制を有するものは＋として（８０％＜Ｃ．Ｉ．＜９０％）、-０．１１３〜-０．１７１の平均ｌｏｇ抑制を有するものは‐として（８０％＜Ｃ．Ｉ．＜９０％）、-０．１７１〜-０．２２１の平均ｌｏｇ抑制を有するものは-として（９０％＜Ｃ．Ｉ．＜９５％）、-０．２２１〜-０．３１２の平均ｌｏｇ抑制を有するものは---として（９５％＜Ｃ．Ｉ．＜９９％）、ならびに-０．３１２未満の平均ｌｏｇ抑制を有するものは---として（９９％＜Ｃ．Ｉ．）報告される。
【０３６１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定は、多数の三元性組合せがＣ．ディフィシルを抑制することを示す。５６のうちの３９の組合せが、＞８０％の信頼区間で抑制を示し；５６のうちの３６がＣ．Ｉ．＞９０％で；５６のうちの３６がＣ．Ｉ．＞９５％で；５６のうちの２９がＣ．Ｉ．＞９９％で抑制を示す。三元性組合せの非限定例としては、０．１７１より大きい平均ｌｏｇ低減を有するもの、例えば＋＋＋＋のスコアで表６に示された任意の組合せ、例えばコリンセラ・アエロファシエンス、コプロコッカス・コメスおよびブラウチア・プロヅクタが挙げられる。同時に重要なことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制検定が、Ｃ．ディフィシルを有効に抑制しない三元性組合せを記述することである。５６のうちの５の組合せが＞８０％信頼度で生育を促進し；５６のうちの２が＞９０％信頼度で生育を促進し；５６のうちの１つの組合せ、コプロコッカス・コメス、クロストリジウム・シンビオスムおよびオイバクテリウム・レクタレが、＞９５％信頼度で生育を促進する。５６のうちの１２の組合せは検定において中性であり、それらが測定の限界までＣ．ディフィシル生育を促進も抑制もしないことを意味する。
【０３６２】
別記しない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書中で用いられる成分の量、反応条件等を表す数はすべて、「約」という用語により、すべての場合に修飾されるものであると理解されるべきである。したがって、そうでないと別記しない限り、数的パラメーターは近似値であり、獲得すべく追求される所望の特性によって変わり得る。最低に見積もっても、ならびに特許請求の範囲と等価の見解の適用を限定するものでなく、各数的パラメーターは有意の数字および通常の丸めアプローチの数に鑑みて解釈されるべきである。
【０３６３】
別記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一続きの全ての要素に言及すると理解されるべきである。
【０３６４】
好ましい実施形態および種々の代替的実施形態を特に参照しながら本発明を示してきたが、本発明の精神および範囲を逸脱しない限り、形式および詳細における種々の変更がなされ得ることを、関連技術分野の当業者は理解する。
【０３６５】
本明細書の主要部分内で引用される参考文献、発行済み特許および特許出願はすべて、それらの記載内容が参照によりすべての目的のために本明細書中に組み入れられる。
【０３６６】
表
表１：属、種および系統学的クレードに対してなされる分類学的割り当てを伴う操作的分類単位(ＯＴＵ)の一覧
細菌ＯＴＵのクレード構成員は、１６Ｓシーケンシングデータに基づいている。クレードは、系統学の当業者に既知の最尤法を用いて、全長１６Ｓ配列から構築される系統樹のトポロジーに基づいて限定される。クレードは、所定のクレードが：（ｉ）互いから特定数のブートストラップ指示ノード内、および（ｉｉ）５％遺伝子類似性内であることを保証するために構築される。同一クレード内にあるＯＴＵｓは、１６Ｓ−Ｖ４配列データに基づいて異なるクレードにおけるＯＴＵｓとは遺伝的および系統学的に異なるとして識別され得るが、一方、同一クレード内に入るＯＴＵｓは、密接に関連する。同一クレード内に入るＯＴＵｓは、進化的に密接に関連し、１６Ｓ−Ｖ４配列データを用いて、互いから区別されることもされないこともある。同一クレードの成員は、それらの進化的同類性のため、ヒト腸において見出されるような微生物生態構造において類似の機能的役割を果たす。ある種を同一クレード内の別の種に置換する組成物は、保存された生態学的機能を有すると考えられ、したがって、本発明において有用である。ＯＴＵｓはすべて、胞子を形成するそれらの推定上の能力、ならびにそれらが病原体または病原性片利共生菌であるか否かに関して示される（「病原性片利共生菌」の説明に関する定義を参照）。ＮＩＡＩＤ優先病原体は、「カテゴリーＡ」、「カテゴリーＢ」または「カテゴリーＣ」として表示され、日和見病原体は、「ＯＰ」として表示される。病原性でないか、または病原体として存在するそれらの能力が未知であるＯＴＵｓは、「Ｎ」として表示される。「配列番号」は、配列表ファイルにおけるＯＴＵの識別子を意味し、「公的ＤＢ寄託」は、公的配列保管庫におけるＯＴＵの識別子を意味する。
【０３６７】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【表１３−１６】
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【表１３−１７】
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【表１３−１８】
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【表１３−１９】
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【表１３−２０】
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【表１３−２１】
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【表１３−２２】
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【表１３−２３】
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【表１３−２４】
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【表１３−２５】
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【表１３−２６】
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【表１３−２７】
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【表１３−２８】
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【表１３−２９】
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【表１３−３０】
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【表１３−３１】
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【表１３−３２】
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【表１３−３３】
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【表１３−３４】
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【表１３−３５】
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【表１３−３６】
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【表１３−３７】
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【表１３−３８】
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【表１３−３９】
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【表１３−４０】
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【表１３−４１】
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【表１３−４２】
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【表１３−４３】
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【表１３−４４】
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【表１３−４５】
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【表１３−４６】
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【表１３−４８】
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【表１３−４９】
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【表１３−５０】
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【表１３−５１】
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【表１３−５２】
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【表１３−５４】
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【表１３−５５】
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【表１３−５６】
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【表１３−５７】
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【表１３−５８】
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【表１３−５９】
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【表１３−６０】
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【表１３−６１】
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【表１３−６２】
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【表１３−６３】
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【表１３−６４】
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【表１３−６５】
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【表１３−６６】
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【表１３−６７】
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【表１３−６８】
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【表１３−６９】
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【表１３−７０】
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【表１３−７１】
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【表１３−７２】
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【表１３−７３】
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【表１３−７４】
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【表１３−７５】
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【表１３−７６】
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【表１３−７８】
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【表１３−７９】
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【表１３−８０】
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【表１３−８１】
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【表１３−８２】
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【表１３−８３】
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【表１３−８４】
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【表１３−８５】
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【表１３−８６】
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【表１３−８７】
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【表１３−８８】
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【表１３−８９】
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【表１３−９０】
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【表１３−９１】
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【表１３−９２】
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【表１３−９３】
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【表１３−９４】
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【表１３−９５】
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【表１３−９６】
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【表１３−９７】
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【０３６８】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０３６９】
【表１５】
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【０３７０】
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【表１６−１０】
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【表１６−１１】
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【表１６−１２】
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【表１６−１３】
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【表１６−１４】
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【表１６−１５】
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【表１６−１６】
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【表１６−１７】
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【表１６−１８】
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【表１６−１９】
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【表１６−２０】
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【表１６−２１】
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【表１６−２２】
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【表１６−２３】
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【表１６−２４】
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【表１６−２５】
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【表１６−２６】
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【表１６−２７】
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【表１６−２８】
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【表１６−２９】
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【表１６−３０】
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【表１６−３１】
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【表１６−３２】
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【表１６−３３】
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【表１６−３４】
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【表１６−３５】
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【表１６−３６】
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【表１６−３７】
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【表１６−３８】
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【表１６−３９】
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【表１６−４０】
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【表１６−４１】
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【０３７１】
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【０３７２】
表１６：エタノール処理胞子調製物で処置した患者における移植および生態学的増強ならびにより多様な微生物生態構造の確立に関連した細菌ＯＴＵｓ
増強された生態構造を含むＯＴＵｓは、処置前には患者において存在しないし、および／またはそれらが有意の割合の全体的保菌を含まず、ゲノムおよび／または微生物学的検定方法により検出可能でないよう、極端に低い頻度で存在する。移植されており、増強された生態構造の成員であるＯＴＵｓは、処置後のそれらの相対存在量において増大する、そしてそれぞれ：（ｉ）エタノール処理胞子調製物中に存在し、処置前の患者に存在せず、あるいは（ｉｉ）エタノール処理胞子調製物中には存在しないが、しかし処置による好ましい生育条件の形成のため、調製物での処置後の時間全体を通してそれらの相対存在量において増大するＯＴＵｓを特性化することにより、同定される。注目すべきは、後者ＯＴＵｓは、患者における低頻度レザバーから生育し得るし、または外因性供給源、例えば食餌から導入され得る。「コア」増強化または移植化生態構造を含むＯＴＵｓは、それらが移植され、および／または増強されることが観察される総患者のパーセンテージにより限定され得る；このパーセンテージが大きいほど、それらが腸内菌共生バランス失調性生態構造からのシフトを触媒することに関与するコア生態構造の一部である可能性が大きい。生態構造における優勢ＯＴＵｓは、いくつかの方法、例えば、限定されないが、増強化または移植化生態構造における最大相対存在量を有するＯＴＵｓを限定すること、ならびに総相対存在量閾値を限定することを用いて同定され得る。例として、最大相対存在量を有するＯＴＵｓを限定することにより、患者１の増強化生態構造における優勢ＯＴＵｓを同定したが、これは同時に、この患者の増強化生態構造において６０％の保菌率を含む。
【０３７３】
【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１８−５】
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【表１８−６】
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【表１８−７】
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表１８：エタノール処理胞子による日和見病原体または病原性片利共生菌負荷における低減
【０３７４】
【表１９】
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【０３７５】
【表２０】
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【０３７６】
【表２１】
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【０３７７】
【表２２】
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【０３７８】
【表２３】
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【０３７９】
【表２４−１】
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【表２４−２】
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【表２４−３】
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【表２４−４】
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【０３８０】
【表２５−１】
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【表２５−２】
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【表２５−３】
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【０３８１】
【表２６−１】
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【表２６−２】
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【表２６−３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【配列表】
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