(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の1つまたは複数の標的核酸分子の存在を特定するための方法であって、
該1つまたは複数の標的核酸分子を潜在的に含有する試料を供給する工程と、
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)5'プライマー特異的部分および標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的ヌクレオチド配列、標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該5'非標的ヌクレオチド配列は、該3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、前記第2のプローブが標的核酸分子にハイブリダイズしない場合に該3'プライマー特異的部分の相補的部分にハイブリダイズしてヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成し、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、互いに隣接して、該標的核酸分子とハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する、工程と、
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的核酸分子が該試料中に存在する場合には該標的核酸分子と、隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程であって、ハイブリダイズすると、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドが、該重複する同一のヌクレオチドを含む該接合部においてフラップを形成する、工程と、
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるリン酸を遊離する、工程と、
連結オリゴヌクレオチド産物を形成するために、該接合部において該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結する工程であって、各連結オリゴヌクレオチド産物が、該オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'プライマー特異的部分、標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を含む、工程と、
該試料中の該連結産物配列を検出する工程と、
該検出する工程に基づいて、該試料中の1つまたは複数の標的核酸分子の存在を特定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
プローブセット中の前記オリゴヌクレオチドプローブの1つがジップコード部分をさらに含み、該ジップコード部分が、その相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドと、均一なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、前記方法が、
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程と、
最小限の非特異的ハイブリダイゼーションでそれぞれの連結産物配列の該ジップコード部分を該集団中のその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、かつ、均一なハイブリダイゼーション条件下で、該連結産物配列を該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触させる工程と、
をさらに含み、該連結産物配列とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に前記検出する工程が行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第2のオリゴヌクレオチドプローブがそれぞれ第1のタグ部分および第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、かつ、それぞれの異なるオリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が、異なるヌクレオチド配列を有し、前記方法が、   前記連結する工程の後に、前記試料を、特定の連結産物配列の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分がハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程であって、それによって、ヘアピン化連結産物配列を形成する、工程と、
該供する工程の後に、非連結オリゴヌクレオチドプローブを該試料から除去する工程と、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的標的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第3のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接触させる工程の間に、互いに隣接して、前記標的核酸分子とハイブリダイズするように構成され、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第3のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、プローブセット中の該第2のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有し、該重複する同一のヌクレオチドが前記切断する工程の間に除去されて、該接合部における該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間の連結が、プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、該第2のオリゴヌクレオチドプローブ、および該第3のオリゴヌクレオチドプローブを含む連結産物配列を形成することを可能にする、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
試料中の1つまたは複数の標的核酸分子の存在を特定するための方法であって、
該標的核酸分子を潜在的に含有する試料を供給する工程と、
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)5'プライマー特異的部分および標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的ヌクレオチド配列、1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該5'非標的ヌクレオチド配列は、該3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、前記第2のプローブが標的核酸分子にハイブリダイズしない場合に該3'プライマー特異的部分の相補的部分にハイブリダイズしてヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成し、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的核酸分子とハイブリダイズするように構成される、工程と、
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的核酸分子が該試料中に存在する場合には該標的核酸分子と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程と、
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該5'非標的特異的フラップ部分を切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドの該標的特異的部分の最初のヌクレオチド塩基にある5'リン酸を遊離する、工程と、
該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して連結オリゴヌクレオチド産物を形成する工程であって、各連結オリゴヌクレオチド産物が、オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'プライマー特異的部分、1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を含む、工程と、
該試料中の連結産物配列を検出する工程と、
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的核酸分子の存在を特定する工程と、
を含む方法。
【請求項６】
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも1つが、前記最初の標的特異的なヌクレオチド塩基の3'側にある、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記接触させる工程の前に前記試料中の前記標的核酸分子を増幅する工程
をさらに含む、請求項1または5に記載の方法。
【請求項８】
前記検出する工程が、
前記試料中の前記連結産物配列を配列決定する工程
を含む、請求項1または5に記載の方法。
【請求項９】
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズにより分離する工程
を含む、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１０】
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の前記5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の前記3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程と、
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程と、
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程と、
をさらに含み、前記検出する工程が該一次伸長産物の検出を含む、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームからなる群より選択される、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１２】
前記1つまたは複数の標的核酸分子が低含量核酸分子であり、該低含量核酸分子が、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を含む、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１３】
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する前記低含量核酸分子が、特定され、かつ、前記試料中の過剰量の核酸分子と区別され、該過剰量の核酸分子が、該低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、該1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基を有さない、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記1つまたは複数の標的核酸分子が定量される、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１５】
前記特定する工程に基づいて遺伝子型または疾患素因を区別する工程 をさらに含む、請求項1または5に記載の方法。
【請求項１６】
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット を含む、試料中の1つまたは複数の標的核酸分子の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)5'プライマー特異的部分および標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(b)5'非標的ヌクレオチド配列、標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該5非標的'ヌクレオチド配列は、該3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、互いに隣接して、該標的核酸分子とハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有する、キット。
【請求項１７】
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット を含む、試料中の1つまたは複数の標的核酸分子の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)5'プライマー特異的部分および標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(b)5'非標的ヌクレオチド配列、1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、該5'非標的ヌクレオチド配列は、該3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的核酸分子とハイブリダイズするように構成される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2012年2月14日に出願された米国特許仮出願第61/598,343号、2012年2月29日に出願された同第61/605,057号、および2012年5月8日に出願された同第61/644,405号の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/598,343号、同第61/605,057号、および同第61/644,405号は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組み合わせたヌクレアーゼ反応、連結反応、およびポリメラーゼ反応を用いて核酸の配列、発現、またはコピー変化を相対的に定量するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
連結ベースの核酸検出反応では、典型的に、相補的核酸標的とアニールする2種類またはそれ以上の核酸ベースオリゴヌクレオチドが用いられる。これらのオリゴヌクレオチドは直接互いに接し合っており、かつ、リガーゼを用いて、あるオリゴヌクレオチドの5'リン酸をすぐ隣にあるオリゴヌクレオチドの3'-OHと連結することによってニックをつなぐホスホジエステル結合が生成される。この連結アッセイ法は、通常、多重化されている。しかしながら、非特異的連結によって、特に、多重反応において第3のオリゴヌクレオチド上で2種類のオリゴヌクレオチドが連結する非特異的連結によって、望ましくない偽陽性結果が得られることがある。さらに、多重ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、連結鎖反応(LCR)、および連結検出反応(LDR)/PCR方法は、(i)オリゴヌクレオチドおよび標的の組み合わせが「プライマー-二量体」オフターゲット型複合体を形成する、傾向と、(ii)固有に異なるアニーリングバイアスおよび様々な標的特異性を有するプライマー配列を用いた増幅に由来する、PCR増幅バイアスと、(iii)LCRおよびLDR/PCRの場合、豊富な5'リン酸基によって、意図されたものでない連結の高バックグラウンドが生じ、その後に偽の増幅産物が産生されることと、(iv)多重標的数の増加に伴った増幅反応の拡大に関連する生化学、情報科学、および原材料費の問題とを含む様々な理由のために、組み合わせることができるプライマー数によって制限されている。
【０００４】
1つまたは複数の核酸標的を安価かつ頑健に特異的増幅する能力を改善するために、従来のシングルPCR/多重PCRまたはLCR以外の方法論を採用する必要がある。シングルプレックス使用および多重使用のために低頻度の変異(例えば、104個の正常バックグラウンド中の1個の変異分子)(類似配列を有するDNAの0.01％であるシグナルを検出する特異性)を確実に検出する能力があれば、特に、診断領域において極めて有用であろう。この特異性を実現できれば、少量/まれな量の腫瘍DNAを用いて、試料、例えば、循環腫瘍細胞および腫瘍細胞に由来する無細胞DNAを含有する試料中の癌シグネチャーを検出できる可能性がある。これを行うために簡単で特異的でかつ安価なアッセイ法が必要とされているが、存在しない。
【０００５】
本発明は、当技術分野におけるこの欠陥および他の欠陥を克服することに指向されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第1の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、第1のオリゴヌクレオチドプローブと第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、第1のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する。該方法は、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には標的ヌクレオチド配列と、隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程であって、ハイブリダイズすると、第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドが、重複する同一のヌクレオチドを含む接合部においてフラップを形成する、工程をさらに含む。5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドは切断され、それによって、第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるリン酸が遊離される。接合部においてプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結して、連結産物配列を形成する。試料中の連結産物配列は検出され、検出に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在が特定される。
【０００７】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが接触される。5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'非標的特異的フラップ部分は切断され、それによって、第2のオリゴヌクレオチドの標的特異的部分の最初のヌクレオチド塩基にある5'リン酸が遊離される。1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を有する標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。前記方法は、試料中の連結産物配列を検出する工程、およびこの検出に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程をさらに含む。
【０００８】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(ii)3'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する。オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のジップコード部分および第2のジップコード部分は、隣接して配置された場合に完全長ジップコード部分を形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のタグ部分および第2のタグ部分は互いに相補的である。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットは接触される。1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、連結産物配列を形成する。この方法は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)連結産物配列の5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)連結産物配列の3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程をさらに含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する、連結産物配列、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼが混ぜ合わせられる。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供され、それによって、一次伸長産物が形成される。第1のジップコード部分の一部および第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が提供される。それぞれの異なる一次伸長産物に対する、集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む。一次伸長産物および捕捉用オリゴヌクレオチドの集団は、(i)ある特定の一次伸長産物の第1のタグ部分および第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ(ii)集団の捕捉用オリゴヌクレオチドが、ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供される。ハイブリダイズされた捕捉用オリゴヌクレオチドからクエンチャー分子または検出可能な標識が切断され、クエンチャー分子から隔てられた検出可能な標識が検出される。この検出に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在が特定される。
【０００９】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(ii)3'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する。オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のジップコード部分および第2のジップコード部分は、隣接して配置された場合に完全長ジップコード部分を形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のタグ部分および第2のタグ部分は互いに相補的である。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットは接触される。1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、連結産物配列を形成する。該方法は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(i)(a)第1のオリゴヌクレオチドプローブの第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、(ii)連結産物配列の3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程をさらに含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、連結産物配列、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼが混ぜ合わせられる。ポリメラーゼ連鎖反応混合物は1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供され、それによって、一次伸長産物が形成される。一次伸長産物は、ある特定の一次伸長産物の第1のタグ部分および第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化一次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ(ii)ある特定のヘアピン化一次伸長産物の捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に、供される。ヘアピン化一次伸長産物のクエンチャー分子または検出可能な標識は切断され、クエンチャー分子から隔てられた検出可能な標識が検出される。この検出に��づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在が特定される。
【００１０】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットに関する。該キットは、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素、リガーゼ、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有する。オリゴヌクレオチドプローブセットはそれぞれ、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを有し、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、第1のオリゴヌクレオチドプローブと第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、第1のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する。
【００１１】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットに関する。このキットは、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素、リガーゼ、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有する。オリゴヌクレオチドプローブセットはそれぞれ、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを有し、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される。
【００１２】
多重増幅反応においてプライマー標的の入り交じった状態とプライマーペア間で増幅のバランスをとる上での困難さとを解決する方法が本明細書において説明される。本方法は、(a)基本的に、単一試料中で同時に調べることができる標的の数を増加し、(b)必要とされる試料の量を減少させ、(c)まれな核酸試料、または少量で/低品質で/分解された(例えば、単一細胞/ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)/母方循環胎児の核酸試料、または腫瘍に由来する核酸試料を調べるための方法を提供する。
[本発明1001]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程であって、ハイブリダイズすると、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドが、該重複する同一のヌクレオチドを含む該接合部においてフラップを形成する、工程;
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該重複する同一のヌクレオチドを切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるリン酸を遊離する、工程;
連結産物配列を形成するために、該接合部において該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結する工程;
該試料中の該連結産物配列を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1002]
前記接触させる工程の前に前記試料中の前記標的ヌクレオチド配列を増幅する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記検出する工程が、
前記試料中の前記連結産物配列を配列決定する工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズにより分離する工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
プローブセット中の前記オリゴヌクレオチドプローブの1つがジップコード部分をさらに含み、該ジップコード部分が、その相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドと、均一なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、前記方法が、
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程;および
最小限の非特異的ハイブリダイゼーションでそれぞれの連結産物配列の該ジップコード部分を該集団中のその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、かつ、均一なハイブリダイゼーション条件下で、該連結産物配列を該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触させる工程
をさらに含み、該連結産物配列とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に前記検出する工程が行われる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記集団中の捕捉用オリゴヌクレオチドの各タイプがヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、16ヌクレオチド超であり、かつ、互いにアライメントされた場合に該集団中の他のタイプの捕捉用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも25％異なる、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が固体支持体上に固定化されている、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記固体支持体が、ビーズ、スライド、ディスク、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、およびそれらの複合物からなる群より選択される形態をとる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記固体支持体が、位置のアレイを備え、前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が、該位置のアレイにおいて固定化されている、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、それぞれの連結産物配列が該5'プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、および該3'プライマー特異的部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の前記5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の前記3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該一次伸長産物の検出を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
プライマーセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーまたは前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方が、検出可能な標識を含み、前記検出する工程が、標識された一次伸長産物の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記検出する工程が、
前記供する工程の後に前記伸長産物を配列決定する工程
を含む、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズにより分離する工程
を含む、本発明1011の方法。
[本発明1015]
プローブセット中の前記第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの一方または両方が、ジップコードまたはその一部をさらに含み、該ジップコードが、均一なハイブリダイゼーション条件下で、相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、本発明1011の方法。
[本発明1016]
捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、それぞれの捕捉用オリゴヌクレオチドが、相補的なジップコード部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加する工程;ならびに
前記供する工程の間に、該集団の捕捉用オリゴヌクレオチドを、前記連結産物配列またはその相補鎖の該捕捉用オリゴヌクレオチドに相補的なジップコード部分にハイブリダイズさせる工程
をさらに含み、ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子および/または該検出可能な標識が前記伸長処理中に切断され、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、それぞれの捕捉用オリゴヌクレオチドが、相補的なジップコード部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
前記一次伸長産物にハイブリダイズすることができる1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程;
該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、該一次伸長産物、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、二次伸長産物を形成し、該集団の捕捉用オリゴヌクレオチドが、該一次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチドに相補的なジップコード部分にハイブリダイズし、かつ、二次オリゴヌクレオチドプライマーが該一次伸長産物にハイブリダイズし、ハイブリダイズされた該プライマーが伸長される、工程;ならびに
該伸長処理中に、ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子および/または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1018]
前記集団中の捕捉用オリゴヌクレオチドの各タイプがヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、互いにアライメントされた場合に該集団中の他のタイプの捕捉用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも25％異なる、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、相補的なジップコード部分にハイブリダイズする、工程;および
前記供する工程の後に、最小限の非特異的ハイブリダイゼーションでそれぞれの一次伸長産物の該ジップコード部分を該集団中のその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるのに有効な条件下で、かつ、均一なハイブリダイゼーション条件下で、該一次伸長産物を該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触させる工程
をさらに含み、該一次伸長産物とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション後に、前記検出する工程が行われる、本発明1015の方法。
[本発明1020]
前記集団中の捕捉用オリゴヌクレオチドの各タイプがヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列が、16ヌクレオチド超であり、かつ、互いにアライメントされた場合に該集団中の他のタイプの捕捉用オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列と少なくとも25％異なる、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットの前記オリゴヌクレオチドプライマーの1つが、検出可能な標識をさらに含み、それによって、標識された一次伸長産物を形成する、本発明1019の方法。
[本発明1022]
前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が固体支持体上に固定化されている、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記固体支持体が、ビーズ、スライド、ディスク、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、およびそれらの複合物からなる群より選択される形態をとる、本発明1023の方法。
[本発明1024]
前記固体支持体が、位置のアレイを備え、前記捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が該位置のアレイにおいて固定化されている、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、前記ジップコードの第1の部分、および、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分をさらに含み、かつ、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該ジップコードの第2の部分、および、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、前記方法が、
該第1のジップコード部分の一部および該第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
前記一次伸長産物および該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を、(i)ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)該集団の該捕捉用オリゴヌクレオチドが、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;ならびに
ハイブリダイズされた捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1026]
(i)前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、異なるオリゴヌクレオチドプローブセットごとに異なる第2のプライマー特異的部分、前記ジップコードの第1の部分、および、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分をさらに含み、かつ、(ii)前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該ジップコードの第2の部分、および、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、前記方法が、
(i)(a)該第1のオリゴヌクレオチドプローブの該第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1の二次オリゴヌクレオチドプライマーと、(ii)第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じヌクレオチド配列を有する、第2の二次オリゴヌクレオチドプライマーとを含む、1つまたは複数の二次プライマーセットを供給する工程;
該一次伸長産物、1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該第2のポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、二次伸長産物を形成する、工程;
該二次伸長産物を、ある特定の二次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化二次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)ある特定のヘアピン化二次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;ならびに
該ヘアピン化二次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分から該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識の検出を含む、本発明1015の方法。
[本発明1027]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、unitaq検出部分をさらに含み、それによって、前記5'プライマー特異的部分と、前記標的特異的部分と、該unitaq検出部分と、前記3'プライマー特異的部分とを含む連結産物配列を形成し、前記方法が、
1つまたは複数のunitaq検出プローブを供給する工程であって、それぞれのunitaq検出プローブが、相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該1つまたは複数のunitaq検出プローブを前記ポリメラーゼ連鎖反応混合物に添加する工程;ならびに
前記供する工程の間に、該1つまたは複数のunitaq検出プローブを、該連結産物配列上またはその相補鎖上にある相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズさせる工程
をさらに含み、該1つまたは複数のunitaq検出プローブから該クエンチャー分子および該検出可能な標識が前記伸長処理中に切断され、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1028]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブがunitaq検出部分をさらに含み、それによって、形成された前記一次伸長産物配列が、前記5'プライマー特異的部分、前記標的特異的部分、該unitaq検出部分、および前記3'プライマー特異的部分を含み、前記方法が、
1つまたは複数のunitaq検出プローブを供給する工程であって、それぞれのunitaq検出プローブが、相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズし、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該一次伸長産物にハイブリダイズすることができる1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程;
該1つまたは複数のunitaq検出プローブ、該1つまたは複数の二次オリゴヌクレオチドプライマーセット、該一次伸長産物、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該二次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、二次伸長産物を形成し、該1つまたは複数のunitaq検出プローブが、該伸長産物の該unitaq検出プローブに相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズし、かつ、該二次オリゴヌクレオチドプライマーが該一次伸長産物にハイブリダイズし、ハイブリダイズされた該プライマーが伸長される、工程;
該伸長処理中に、1つまたは複数のハイブリダイズされた該unitaq検出プローブから該クエンチャー分子および/または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1029]
前記unitaq検出プローブが、さらなる部分を介して前記二次オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端と結合されている、本発明1027または1028の方法。
[本発明1030]
(i)前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、unitaq検出部分をさらに含み、それによって、前記5'プライマー特異的部分と、前記標的特異的部分と、該unitaq検出部分と、前記3'プライマー特異的部分とを含む連結産物配列を形成し、(ii)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが、該連結産物配列の該unitaq検出部分に相補的なunitaq検出プローブと、該unitaq検出プローブによって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識とをさらに含み、かつ、(iii)前記供する工程の間に形成された前記一次伸長産物が、該検出可能な標識、該unitaq検出プローブ、該クエンチャー分子、該5'プライマー特異的部分、該標的特異的部分、該unitaq検出部分、および該3'プライマー特異的部分を含み、前記方法が、
一次伸長産物を、ある特定の伸長産物の該unitaq検出プローブがその相補的なunitaq検出部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程であって、それによって、ヘアピン化伸長産物を形成する、工程;および
該ヘアピン化伸長産物の該unitaq検出プローブから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程
をさらに含み、前記検出する工程が、標識された該ヘアピン化伸長産物または切断された該検出可能な標識の検出を含む、本発明1011の方法。
[本発明1031]
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび前記第2のオリゴヌクレオチドプローブがそれぞれ第1のタグ部分および第2のタグ部分をさらに含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的であり、かつ、それぞれの異なるオリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が、異なるヌクレオチド配列を有し、前記方法が、
前記連結する工程の後に、前記試料を、ある特定の連結産物配列の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分がハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程であって、それによって、ヘアピン化連結産物配列を形成する、工程;ならびに
該供する工程の後に、非連結オリゴヌクレオチドプローブを該試料から除去する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1032]
前記プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、前記方法が、
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
前記消化する工程の後に該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該一次伸長産物の検出を含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
プライマーセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーまたは前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方が、検出可能な標識を含み、前記検出する工程が、標識された一次伸長産物の検出を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記供する工程の前に、連結産物配列を含む前記試料から非連結オリゴヌクレオチドプローブを排除して(occlude)、非連結オリゴヌクレオチドプローブの伸長または増幅を阻止する工程
をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1035]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接合部において前記重複する同一のヌクレオチドの5'側にあるヌクレオチドフラップをさらに含み、該ヌクレオチドフラップの少なくとも一部が、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブの該ヌクレオチドフラップおよび該3'プライマー特異的部分の相補領域が互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記供する工程の間に、前記ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分を伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることができない伸長されヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端が、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端に結合されており、それによって、結合されたオリゴヌクレオチドプローブを形成し、該結合されたオリゴヌクレオチドプローブが、前記5'プライマー特異的部分と、前記標的特異的部分と、前記3'プライマー特異的部分とを含む環状連結産物配列を形成する、本発明1011の方法。
[本発明1038]
前記結合されたプローブが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端と前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端が結合されている部分内に、ポリメラーゼブロッカーをさらに含み、かつ、前記供する工程の間に非環状伸長産物が形成される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記結合されたプローブが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端と前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端が結合されている部分内に、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含み、かつ、前記供する工程の間に非環状伸長産物が形成される、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記結合されたオリゴヌクレオチドプローブが、前記3'標的特異的部分に相補的なセグメントをさらに含み、連結の非存在下では、該結合されたプローブの該3'標的特異的部分が該相補的なセグメントとハイブリダイズして、ヘアピン化し結合されたオリゴヌクレオチドプローブを形成する、本発明1037の方法。
[本発明1041]
前記供する工程の間に、結合されヘアピン化した前記オリゴヌクレオチドプローブの前記3'標的特異的部分を伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーとその相補配列との結合を妨げる伸長され結合されヘアピン化したオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが、標的特異的標的部分を有する第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み、プローブセットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第3のオリゴヌクレオチドプローブが、前記接触させる工程の間に前記標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第3のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、プローブセット中の該第2のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有し、該重複する同一のヌクレオチドが前記切断する工程の間に除去されて、該接合部における該第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第3のオリゴヌクレオチドプローブの間の連結が、プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、該第2のオリゴヌクレオチドプローブ、および該第3のオリゴヌクレオチドプローブを含む連結産物配列を形成することを可能にする、本発明1001の方法。
[本発明1043]
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームからなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1044]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が低含量核酸分子であり、該低含量核酸分子が、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1045]
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する前記低含量核酸分子が、特定され、かつ、前記試料中の過剰量の核酸分子と区別され、該過剰量の核酸分子が、該低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、該1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基を有さない、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブと該第1のオリゴヌクレオチドプローブの間の前記接合部から2塩基または3塩基である塩基位置においてミスマッチヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの間の前記接合部における前記重複する同一のヌクレオチドの3'側にある1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含む、本発明1045の方法。
[本発明1048]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第2のオリゴヌクレオチドプローブと前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの間の前記接合部における前記重複するヌクレオチドの5'側にある1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含む、本発明1045の方法。
[本発明1049]
前記試料中の過剰量の核酸分子に由来するコピー数と比較して1つまたは複数の低含量標的ヌクレオチド配列のコピー数が定量され、該過剰量の核酸分子が、前記低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有する、本発明1045の方法。
[本発明1050]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1001の方法。
[本発明1051]
前記試料中の他のヌクレオチド配列と比較して前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対的コピー数が定量される、本発明1050の方法。
[本発明1053]
前記特定する工程に基づいて疾患状態を診断または予後予測する(prognose)工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1054]
前記特定する工程に基づいて遺伝子型または疾患素因を区別する工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1055]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該5'非標的特異的フラップ部分を切断する工程であって、それによって、該第2のオリゴヌクレオチドの該標的特異的部分の最初のヌクレオチド塩基にある5'リン酸を遊離する、工程;
該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、該1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を有する該標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する工程;
該試料中の連結産物配列を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1056]
ポリメラーゼを用いて前記第1のオリゴヌクレオチドプローブを前記切断する工程の前に伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブとの接合部を形成する工程であって、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記標的特異的部分が、伸長された該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する、工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブまたは前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも1つが、検出可能な標識をさらに含み、前記検出する工程が、標識された前記連結産物配列の検出を含む、本発明1055の方法。
[本発明1058]
前記検出する工程が、
前記試料中の前記連結産物配列を配列決定する工程
を含む、本発明1055の方法。
[本発明1059]
前記検出する工程が、
前記連結産物配列をサイズで分離する工程
を含む、本発明1055の方法。
[本発明1060]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも1つが、標的特異的な前記最初のヌクレオチド塩基の3'側にある、本発明1055の方法。
[本発明1061]
プローブセットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが5'プライマー特異的部分をさらに含み、かつ、プローブセット中の前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが3'プライマー特異的部分をさらに含み、それぞれの連結産物配列が、該5'プライマー特異的部分、1つまたは複数のチオリン酸を有する前記標的特異的部分、および該3'プライマー特異的部分を含む、本発明1055の方法。
[本発明1062]
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)前記連結産物配列の前記5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および(b)該連結産物配列の前記3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;ならびに
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、伸長産物を形成する、工程
をさらに含み、前記検出する工程が該伸長産物の検出を含む、本発明1061の方法。
[本発明1063]
前記供する工程の前に、連結産物配列を含む前記試料から非連結オリゴヌクレオチドプローブを排除して、非連結プローブの伸長または増幅を阻止する工程
をさらに含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記5'ヌクレオチドフラップの少なくとも一部が、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、かつ、連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブの該5'ヌクレオチドフラップおよび該3'プライマー特異的部分の相補領域が互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する、本発明1062の方法。
[本発明1065]
前記ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブの前記3'プライマー特異的部分を前記供する工程の間に伸長させて、前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーとその相補配列との結合を妨げる伸長されヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する工程
をさらに含む、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記検出する工程が、
前記供する工程の後に前記伸長産物を配列決定する工程
を含む、本発明1062の方法。
[本発明1067]
前記試料が、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームからなる群より選択される、本発明1055の方法。
[本発明1068]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が低含量核酸分子であり、該低含量核酸分子が、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を含む、本発明1055の方法。
[本発明1069]
1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する前記低含量核酸分子が、特定され、かつ、前記試料中の過剰量の核酸分子と区別され、該過剰量の核酸分子が、該低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、該1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基を有さない、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1055の方法。
[本発明1071]
前記試料中の他のヌクレオチド配列と比較して前記1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される、本発明1070の方法。
[本発明1072]
1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対的コピー数が定量される、本発明1070の方法。
[本発明1073]
前記試料中の過剰量の核酸分子に由来するコピー数と比較して1つまたは複数の低含量標的ヌクレオチド配列のコピー数が定量され、該過剰量の核酸分子が、前記低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有する、本発明1069の方法。
[本発明1074]
前記特定する工程に基づいて疾患状態を診断または予後予測する工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1075]
前記特定する工程に基づいて遺伝子型または疾患素因を区別する工程
をさらに含む、本発明1055の方法。
[本発明1076]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(ii)3'プライマー特異的部分、該ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的である、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
該1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、連結産物配列を形成する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)該連結産物配列の該5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程;
該第1のジップコード部分の一部および該第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を供給する工程であって、該集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドが、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む、工程;
該一次伸長産物および該捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を、(i)ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)該集団の該捕捉用オリゴヌクレオチドが、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;
ハイブリダイズされた該捕捉用オリゴヌクレオチドから該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程;
該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1077]
以下の工程を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法:
該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程であって、各セットが、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(ii)3'プライマー特異的部分、該ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のジップコード部分および該第2のジップコード部分が、隣接して配置された場合に完全長ジップコードを形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いに相補的である、工程;
プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が該試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程;
該1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結して、連結産物配列を形成する工程;
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(i)(a)該第1のオリゴヌクレオチドプローブの第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、(ii)該連結産物配列の該3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程;
該連結産物配列、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼを混ぜ合わせて、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成する工程;
該ポリメラーゼ連鎖反応混合物を1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供する工程であって、それによって、一次伸長産物を形成する、工程;
該一次伸長産物を、ある特定の一次伸長産物の該第1のタグ部分および該第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化一次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ、(ii)ある特定のヘアピン化一次伸長産物の該捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、該ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に供する工程;
該ヘアピン化一次伸長産物の捕捉用オリゴヌクレオチド部分から該クエンチャー分子または該検出可能な標識を切断する工程;
該クエンチャー分子から隔てられた該検出可能な標識を検出する工程;ならびに
該検出する工程に基づいて、該試料中の該1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程。
[本発明1078]
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および、(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、該第1のオリゴヌクレオチドプローブと該第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、該第2のオリゴヌクレオチドプローブの該標的特異的部分が、該第1のオリゴヌクレオチドプローブとの該接合部に重複する同一のヌクレオチドを有する、キット。
[本発明1079]
5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素;
リガーゼ;および
1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセット
を含む、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットであって、各セットが、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに、(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの該第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび該第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される、キット。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1A〜1Dは、本発明の5'-ヌクレアーゼ(FEN)-連結プロセスを示す。図1Aにおいて、第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが標的ヌクレオチド配列上の隣接する位置でハイブリダイズした場合に、標的特異的部分を有し連結能力のある3'OHを有する、第1のオリゴヌクレオチドプローブは、これも標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブのすぐ隣にある5'OH末端と重複する。第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複するフラップヌクレオチドが、第1のオリゴヌクレオチドプローブ上にある終結3'ヌクレオチドと同じヌクレオチドである場合、FEN活性を有する酵素によって、第2のオリゴヌクレオチドプローブのマッチするヌクレオチドのすぐ上流にあるホスホジエステル結合を識別可能に切断することができる。両プローブにおいて、3'終結ヌクレオチドおよび5'終結ヌクレオチドは同じ「X」である。標的核酸分子上にある「X」は、可変ヌクレオチド、例えば、SNPでもよく、保存されたヌクレオチドでもよい。図1Bに示したように、ヌクレアーゼ型フラップ活性によって、連結能力のある5'PO4が生成され、フラップ切断産物(X)が放出される。第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは互いのすぐ隣にハイブリダイズするので、リガーゼはニックを塞ぐ(図1C)。複数回の熱、アニール、ヌクレアーゼ-連結作用を用いて、単一の標的上に複数の連結分子を作製することができる。連結産物(約70〜250ヌクレオチドの長さ)は、例えば、Sephadexを用いて低MW連結産物から容易に精製することができる。この図において、第1のオリゴヌクレオチドプローブは5'プライマー特異的部分を有し、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、連結産物の下流検出を助ける3'プライマー特異的部分を有する。オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に記載のように検出に関連した代替部分を含有してもよい。図1Dは、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、および第3のオリゴヌクレオチドプローブを用いた二重連結-ヌクレアーゼ反応を示す。
【図２】図2A〜2Cは、リガーゼ検出反応によって変異、挿入、および欠失を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ設計の例を示す。「Z」は、第1のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端から2番目または3番目(図示せず)の位置にある塩基を示し、dG、dA、イノシン、ニトロインドール、ニトロピロール、または他のヌクレオチド類似体を表す。さらなるプローブ設計は第2のオリゴヌクレオチドプローブにおけるチオリン酸の組み込みを伴う。チオリン酸は、第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチド塩基にあってもよく、第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複するヌクレオチド塩基の3'側または5'側にある塩基にあってもよい(図2Bおよび2C)。本明細書に記載のように、およびこの態様において図示したように、本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、後のポリメラーゼ連鎖反応において連結産物を増幅するのに有用な上流プライマー特異的部分および下流プライマー特異的部分を有してもよい。
【図３】標的ヌクレオチド配列における複数の一塩基変異を検出するための本発明のヌクレアーゼ-連結-ジップコードアレイ捕捉プロセスを示す。
【図４Ａ】非連結オリゴヌクレオチドプローブからの連結産物の分離を容易にする様々なオリゴヌクレオチドプローブ設計を示した図である。図4Aにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、第1のオリゴヌクレオチドプローブ上にあるC1'5'テールに相補的な3'テールC1を有する。正しい連結産物は、エキソヌクレアーゼI処理に用いられる温度でヘアピンを形成する。1本鎖特異的3'エキソヌクレアーゼによって非連結一本鎖オリゴヌクレオチドが切断されるが、ヘアピンを形成した連結産物は切断されない。
【図４Ｂ】非連結オリゴヌクレオチドプローブからの連結産物の分離を容易にする様々なオリゴヌクレオチドプローブ設計を示した図である。図4Bにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、第1のオリゴヌクレオチドプローブ上にあるA15'テールに相補的な3'テールA1'を有する。正しい連結産物は、エキソヌクレアーゼI処理に用いられる温度でヘアピンを形成する。1本鎖特異的3'エキソヌクレアーゼによって非連結一本鎖オリゴヌクレオチドが切断されるが、ヘアピンを形成した連結産物は切断されない。
【図４Ｃ】非連結オリゴヌクレオチドプローブからの連結産物の分離を容易にする様々なオリゴヌクレオチドプローブ設計を示した図である。第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブはアレル特異的相補的タグC1およびC1'を有する。さらに、第2のオリゴヌクレオチドプローブはユニバーサルタグL1を有する。連結後、C1およびC1'がハイブリダイズするとヘアピンが形成する。同じ反応において、ユニバーサルビオチン化オリゴヌクレオチド(L1')がヘアピン化産物に連結され、これにより、ビオチンを有する連結産物のストレプトアビジン選択が可能になる。
【図５】連結後、非連結オリゴヌクレオチドプローブが増幅期において伸長または増幅されるのを妨げるために、連結産物からの非連結オリゴヌクレオチドプローブの分離を容易にするオリゴヌクレオチドプローブ設計を示した図である。この設計において、第2のオリゴヌクレオチドプローブは相補的タグB1およびB1'を有する。ヌクレアーゼ-連結の間、アニーリング温度が高すぎて安定した分子内ステム形成を可能にしないので、相補的二次オリゴヌクレオチドプローブは有効なヘアピンを形成しない。ヌクレアーゼ-連結の後、温度を低下させる。これにより、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブはB1とB1'の間で分子内アニーリングを形成することが可能になる。非連結オリゴヌクレオチドB1の3'末端は伸長して、高度に熱力学的に安定したステムを形成する。非連結オリゴヌクレオチドは、もはやPCRプライマー伸長に関与できないフライパンの柄(panhandle)を形成する。
【図６】標的ヌクレオチド配列における複数の一塩基変異を検出するための本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスを示す。
【図７】多重LDR/PCR用の結合されたオリゴヌクレオチドプローブ(すなわち、環状化可能なプローブ)を用いた、FENによって作製された連結基質を示す。標的SNP(矢じり)とマッチするフラップ構造および3'OH終結ヌクレオチドを有する、結合されたオリゴヌクレオチドプローブによって、FENによって切断可能な基質が生成される。環状オリゴヌクレオチドプローブの3'OHは、FENによって作製された5'リン酸に連結して、環状連結産物を作製することができる。連結されなかった非環状オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、エキソヌクレアーゼI、III、V、および1を用いて消化することができる。任意で、オリゴヌクレオチドプローブの内部を切断ドメイン(星の記号)において切断することができる。例えば、UNGによって標的化されるdUトラクト+熱=不安定な脱塩基ホスホジエステル領域。環状プローブの白抜きの長方形および影付きの長方形は、連結産物をPCR増幅するためのユニバーサルPCRプライマー部位を表す。
【図８】結合されたプローブを用いる本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスの一例を示す。この例では、変異特異的塩基が上流プローブの3'末端および下流プローブの5'末端または5'末端付近にある、変異アレルに対するプローブのみを示した。ポリメラーゼ(◆)のFEN活性によって、マッチする5'重複塩基のみが切断されて、連結能力のある5'-リン酸が残る。リガーゼ(●)は、結合されたオリゴヌクレオチドプローブの2つの遊離末端を共有結合により塞ぐ。連結産物がPCR増幅される。この場合、変異連結産物のみが生成される(野生型連結産物は形成されない)。結合されたプローブは、3'標的特異的部分(Kr)の領域に相補的なセグメント(Kr')も含有する。連結の非存在下では、結合されたプローブの3'標的特異的部分は相補的なセグメント(Kr')にハイブリダイズして、ヘアピン化し結合されたオリゴヌクレオチドプローブを形成する。ヘアピン化し結合されたオリゴヌクレオチドプローブは、ポリメラーゼによって伸長されて、安定したヘアピンを形成し、それによって、後の伸長または増幅から排除される(occluded)。
【図９】図9A〜9Cは、結果として生じた産物の検出がジップコード部分によって容易になる本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスの一例を示す。図9Bは、捕捉用オリゴヌクレオチドがTaqman(登録商標)プローブとして働く、従来のTaqman(登録商標)(Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA)型アッセイ法におけるジップコードを用いた検出を示す。図9Cは、相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドを含有するユニバーサルアレイ上での産物のジップコードを介した産物の捕捉を示す。
【図１０】本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスを用いて形成された産物のユニバーサルTaqman(登録商標)スプリットジップコードヘアピン検出の一例を示す。
【図１１】本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスを用いて形成された産物のユニバーサルスプリットジップコードヘアピン検出の一例を示す。
【図１２】図12Aおよび12Bは、ヌクレアーゼ-連結プローブへのUniTaq検出配列の組み込み、および結果として生じた産物、ならびに多重検出のためのこれらの有用性を示す。図12A〜12Bは、UniTaq検出およびプライマー部分を含有するプローブとの連結のために、標的核酸のどちらの鎖も使用できることを示す。
【図１３】図13A〜13Cは、(a)UniTaqによって媒介されるヘアピン形成、(b)UniTaq 5'ヌクレアーゼ(AKA TaqMan)プローブ、および(c)UniTaq環の検出を用いた、本発明のヌクレアーゼ-リガーゼ産物のPCR検出の3つの例を示す。
【図１４】例えばSNPについての2つのアレル「X」および「O」の検出を示す。図14、工程1では、多重化ヌクレアーゼ-リガーゼ反応のために、5'テールAixおよびAioを有するアレル特異的な第1のオリゴヌクレオチドプローブならびにアレル特異的な第2のオリゴヌクレオチドプローブ、式中、i=1〜Nが用いられる。UniTaqによって媒介されるヘアピン形成を用いて、標的核酸中の2つのアレルの存在に応じてD1および/またはD2の色でシグナルを発生させるように(図14、工程3)、それぞれのアレルに特異的な色素D1&D2を有するユニバーサルプライマー(図14、工程2)が用いられる。
【図１５】図15A〜15Dは、例えば、一例としてT21の胎児異数性を対象にした2種類の標的セットの検出を示す。図15Aは、第21番染色体上にあるN個の標的について多重コードヌクレアーゼ-リガーゼコード反応を示す。全ての標的が短いユニバーサルタグB1を有するように選択されている。連結点は、タグの中のどこかに、または連結オリゴヌクレオチドの1つの中のどこかに選ばれる。対照領域については、中央オリゴヌクレオチドを用いた二重連結法を示した。すなわち、全ての連結産物はユニバーサルタグB2を有する。図15Bにおいて、連結産物は、末端にユニバーサルタグならびに短い中央タグB1およびB2を有する。図15Cおよび15Dでは、UniTaq法および短いユニバーサルタグを使用した検出例を示した。D1シグナルおよびD2シグナルを有するウェルのカウントを用いて胎児異数性を検出することができる。短いユニバーサルプローブも同様に使用することができる。例えば、図15B。C1およびC2は同じプライマーでもよい。
【図１６】プライマー伸長、一塩基鎖置換、5'リン酸を作製する5'-ヌクレアーゼ切断、連結、およびPCR増幅による未知変異の検出を示す。第2のオリゴヌクレオチドプローブは、5'ヌクレアーゼ切断耐性の1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド(「s」)を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明の第1の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、第1のオリゴヌクレオチドプローブと第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、第1のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する。該方法は、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には標的ヌクレオチド配列と、隣接する位置で塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを接触させる工程であって、ハイブリダイズすると、第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドが、重複する同一のヌクレオチドを含む接合部においてフラップを形成する、工程をさらに含む。5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複する同一のヌクレオチドは切断され、それによって、第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるリン酸が遊離される。接合部においてプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、連結産物配列を形成する。試料中の連結産物配列は検出され、検出に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在が特定される。
【００１５】
図1A〜1Dは、本発明の対になったヌクレアーゼ-リガーゼ反応を用いて標的核酸分子を検出するプロセスを示す。この反応では複数のプローブセットが用いられ、それぞれのプローブセットは、少なくとも、第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブからなる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸分子配列の領域に相補的な標的特異的部分を有する。第1のオリゴヌクレオチドプローブは、連結能力のある3'OH基を有するのに対して、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、連結能力のない5'末端を有する(すなわち、5'リン酸を有さないオリゴヌクレオチドプローブ)。本発明の方法によれば、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、第1のオリゴヌクレオチドプローブの最も3'側の塩基が、標的核酸分子に相補的な第2のオリゴヌクレオチドプローブのすぐ隣にある最も5'側の塩基と重複するように設計される。重複するヌクレオチドは「フラップ」と呼ばれる。第2のオリゴヌクレオチドプローブの重複するフラップヌクレオチドが標的核酸分子配列と相補的であり、第1のオリゴヌクレオチドプローブの終結3'ヌクレオチドと同じ配列である場合、第2のオリゴヌクレオチドプローブのフラップヌクレオチドのすぐ上流にあるホスホジエステル結合は、フラップエンドヌクレアーゼ(FEN)または5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって識別可能に切断される。この特異的FEN活性によって、第1のオリゴヌクレオチドプローブの隣接する3'OHに並んで正確に配置された、連結能力のある新規の5'リン酸末端が第2のオリゴヌクレオチドプローブ上に生じる。(a)互いに隣接するオリゴヌクレオチドプローブによる標的特異的アニーリング、(b)切断されるフラップヌクレオチドがテンプレートとマッチした場合のみの5'リン酸の選択的生成、および(c)第1のオリゴヌクレオチドプローブの3'-塩基に対する非ワトソン・クリック対形成を識別するリガーゼの添加の結果として、本発明の方法は極めて高い標的検出特異性および感度を達成することができる。サイクル時間および条件の変更などのキネティックアプローチを用いて、野生型標的核酸分子と変異標的核酸分子との識別を強化することもできる。
【００１６】
リガーゼ識別は、様々なプローブ設計特徴を使用することによってさらに強化することができる。例えば、3'末端において完全にマッチすれば3'末端のハイブリダイゼーションをわずかに不安定化するために、3'末端にミスマッチがあれば3'末端のハイブリダイゼーションを著しく不安定化するために、意図的なミスマッチまたはヌクレオチド類似体(例えば、イノシン、ニトロインドール、もしくはニトロピロール)を、第1のオリゴヌクレオチドプローブの3'接合末端から2番目または3番目の塩基に組み込むことができる(図2A)。この設計によって、変異プローブが野生型標的にハイブリダイズした場合の不適切な誤った連結が少なくなる。または、テンプレート依存的産物形成を確実なものにするために、RNアーゼによって切断することができるRNA塩基をオリゴヌクレオチドプローブに組み込むことができる。例えば、Dobosy et. al. 「RNase H-Dependent PCR (rhPCR): Improved Specificity and Single Nucleotide Polymorphism Detection Using B1ocked Cleavable Primers」, BMC Biotechnology 11(80): 1011 (2011)は、その全体が参照により本明細書に組み入れられ、3'ブロック末端を有するオリゴヌクレオチドプローブの3'末端に近いRNA塩基の使用、そのRNA塩基をRNアーゼH2で切断して、PCRによって伸長可能かつ連結可能な3'-OHを生成することについて説明する。5'-RNA塩基を連結することができるリガーゼが用いられるのであれば、このアプローチを用いて、連結能力のある3'OHもしくは5'-Pのいずれかまたはその両方を生成することができる。
【００１７】
挿入または欠失の場合、第1のオリゴヌクレオチドプローブの接合部から2番目または3番目に、対応する塩基またはヌクレオチド類似体(例えば、-アミノ-dAまたは5-プロピニル-dC)を組み込むことによって安定性が改善し、このようなフレームシフト変異と野生型配列との識別が改善され得る(図2Bおよび2C)。挿入の場合、第2のオリゴヌクレオチドプローブの望ましい切断しやすいリン酸結合から下流に1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチドを使用すると、プローブが野生型DNAとハイブリダイズされた場合に5'ヌクレアーゼ酵素による不適切な切断が阻止され、従って、野生型標的上での偽陽性連結が低下する(図2B)。同様に、欠失の場合、第2のオリゴヌクレオチドプローブの望ましい切断しやすいリン酸結合から上流に1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチドを使用すると、プローブが野生型DNAとハイブリダイズされた場合に5'ヌクレアーゼ酵素による不適切な切断が阻止され、従って、野生型標的上での偽陽性連結が低下する(図2C)。
【００１８】
他の可能性のある修飾には、脱塩基部位、例えば、dSpacer(別名、THFテトラヒドロフラン)またはオキソ-Gが含まれた。これらの異常「塩基」は、異常塩基を除去して、連結能力のある3'-OHまたは5'P部位を生成する、特異的酵素を有する。エンドヌクレアーゼIV、Tth EndoIV(NEB)は、連結オリゴヌクレオチドが標的核酸にアニールした後に脱塩基残基を除去するが、一本鎖DNAからは脱塩基残基を除去しない。同様に、オキソ-GとFpg、またはイノシン/ウラシルとEndoV、またはチミングリコールとEndoVIIIを使用することができる。
【００１９】
図1Dに示したように、本発明のプローブセットは、標的核酸分子の領域に相補的な標的特異的部分を同様に有する第3のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んでもよい。この態様において、プローブセットの第2のオリゴヌクレオチドプローブおよび第3のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、これらの間に接合部を有する。第3のオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、プローブセット中の第2のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドフラップを有する。この重複する同一のヌクレオチドフラップは、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、かつ第2のオリゴヌクレオチドプローブの終結3'ヌクレオチドと同じ配列である場合に、FEN活性を有する酵素によって除去される。フラップが切断されると、第3のオリゴヌクレオチドプローブ上にある連結能力のある5'リン酸が遊離され、これによって、接合部において第2のオリゴヌクレオチドプローブと第3のオリゴヌクレオチドプローブが連結されて、連結産物配列が形成される。プライマーセット中の3種類のプローブを用いると、高い特異性で、さらに長い標的領域を検出することが可能になる。
【００２０】
連結前に第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'フラップを切断するのに適したフラップエンドヌクレアーゼまたは5'ヌクレアーゼには、5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼ、ならびにTaqおよびT.サーモフィラス(T.thermophilus)に由来するポリメラーゼ、ならびにT4 RNアーゼHおよびTaqExoが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００２１】
本発明の方法において用いられる連結反応は当技術分野において周知である。第2のオリゴヌクレオチドプローブ上にある5'フラップを切断した後に、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブを一緒に連結するのに適したリガーゼには、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)リガーゼ、大腸菌リガーゼ、T4 DNAリガーゼ、T4 RNAリガーゼ、Taqリガーゼ、9N゜リガーゼ、およびパイロコッカス(Pyrococcus)リガーゼ、または当技術分野において公知の他の任意の耐熱性リガーゼが含まれるが、それに限定されるわけではない。本発明によれば、本発明のヌクレアーゼ-連結プロセスは、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA)反応(Landegren, et al., 「A Ligase-Mediated Gene Detection Technique」, Science 241: 1077-80 (1988); Landegren, et al., 「DNA Diagnostics--Molecular Techniques and Automation」, Science 242:229-37 (1988);およびLandegrenらに対する米国特許第4,988,617号を参照されたい)、一組の相補的オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結検出反応(LDR)(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Baranyらに対するWO90/17239を参照されたい)、または二組の相補的オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結鎖反応(LCR)(例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Baranyらに対するWO90/17239を参照されたい)を使用することによって実施することができる。
【００２２】
プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド類似体、修飾ペプチドヌクレオチド類似体、修飾リン酸-糖-バックボーンオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、およびそれらの混合物の形態をとってもよい。
【００２３】
リガーゼ検出反応におけるハイブリダイゼーション工程は、好ましくは、熱ハイブリダイゼーション処理であり、連結接合部における極めて特徴的なヌクレオチドに基づいてヌクレオチド配列を識別する。標的ヌクレオチド配列間の差は、例えば、一核酸塩基差、核酸欠失、核酸挿入、または再編成でもよい。複数の塩基が関与する、このような配列の違いも検出することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブセットは実質的に似たハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように実質的に同じ長さを有する。
【００２４】
本発明のヌクレアーゼ-連結産物は、当技術分野において公知の様々な検出方法を用いて検出することができる。例えば、連結産物は、当技術分野において周知の方法を用いて連結産物を配列決定することによって検出することができる。または、連結産物を、サイズにより分離し、かつ、検出することができる。配列決定またはサイズ分離を介した検出を容易にするために、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、1つまたは複数の検出可能な標識、プライマー部分、または他の検出部分をさらに含んでもよい。多数の適切な検出部分および検出方法が添付の図面において例示され、下記でさらに詳細に説明される。
【００２５】
本発明の1つの態様において、連結産物の検出はジップコード部分によって容易になる。この態様によれば、プローブセット中のオリゴヌクレオチドプローブの1つはジップコード部分をさらに含み、プローブセットの他のオリゴヌクレオチドプローブは検出可能な標識を含む。本明細書で使用するように、ジップコードは、標的ヌクレオチド配列と配列同一性を有さず、かつ好ましくは、任意のゲノムヌクレオチド配列との配列同一性がほとんどないかまたは全くない、短いヌクレオチド配列、例えば16〜24ヌクレオチド長のヌクレオチド配列である。ジップコードの集団において、それぞれのジップコードは集団中の他のジップコード配列と配列が少なくとも25％異なるが、集団の全てのジップコードは、非捕捉用オリゴヌクレオチド配列と非特異的にハイブリダイズすることがほとんどないかまたは全くなく、均一なハイブリダイゼーション条件下で、相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを容易にするように類似した融解温度を有するように設計されている。本発明の1つの態様において、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブのジップコード部分は試料中の個々の連結産物配列を特定および区別するために用いられる。従って、それぞれの異なる連結産物配列に対するジップコード部分は、異なるヌクレオチド配列を有する(すなわち、ジップコード部分はアレル特異的である)。この態様は、異なるアレル変異を検出および区別するのに特に有用である。別の態様において、単に遺伝子内の変異の存在または染色体コピー数を検出することが目的であり、変異または染色体領域の同一性は重要でない場合、異なる連結産物を検出するために同じジップコード部分が用いられてもよい。どちらの態様でも、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの1つにジップコードを組み込むと、同時に様々な標的配列を高度多重検出することが可能になる。ジップコード配列の集団およびその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド配列を設計する方法は、全てBaranyらに対する米国特許第6,852,487号、同第7,455,965号、および同第6,506,594号において詳述されている。米国特許第6,852,487号、同第7,455,965号、および同第6,506,594号は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２６】
ジップコード部分を含有する連結産物は、それぞれの連結産物配列のジップコード部分をその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるのに有効な均一なハイブリダイゼーション条件下で、固定化された捕捉用オリゴヌクレオチドの集団と接触する。集団中のジップコードは、アラインメントされた場合にヌクレオチド配列の点で、例えば、その配列の少なくとも25％異なるので、最小限の非特異的ハイブリダイゼーションで、複数の連結産物ジップコードとそれらの相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションが生じる。固定化された連結産物は、その検出可能な標識を介して検出される。
【００２７】
図3は、K-ras遺伝子内のG→A、T、C変異を検出するための本発明によるヌクレアーゼ-連結-ジップコード捕捉プロセスの流れ図である。この例に図示したように、前記方法は、4種類の5'-N第2のオリゴヌクレオチドプローブおよび4種類のN-3'第1のオリゴヌクレオチドプローブを必要とする。それぞれの第1のオリゴヌクレオチドプローブは異なるジップコード部分(すなわち、Z1、Z2、Z3、またはZ4)を含み、それぞれの第2のオリゴヌクレオチドプローブは検出可能な標識(F)を含む。工程2に示したように、5'-ヌクレアーゼ活性(◆)は、マッチしている5'-重複塩基およびさらなるフラップ、例えば、変異の場合、5'-D(D=A、GまたはT)(5'-Aを示す)のみを切断して、第2のオリゴヌクレオチドプローブ上に連結能力のある5'-リン酸を残す。リガーゼ(●)は、2種類のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合により一緒に塞ぐ(変異の場合のみを示す)。この例では、標的ヌクレオチド配列中に変異Tが存在すると、重複する同一の5'Aヌクレオチドがヌクレアーゼを介して切断された後に、3'Aおよびアドレス指定可能なアレイ特異的部分Z1を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブは、重複する同一の5'Aヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドプローブと連結する。標的ヌクレオチド配列におけるTアレルの存在は、連結産物配列の部分Z1に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドプローブを有する固体支持体上のアドレスにおいて検出される蛍光シグナル(F)によって示される。同様に、Z2、Z3、およびZ4ジップコードに相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体上の位置(互いに異なり、かつZ1の相補鎖とは異なる、固体支持体上の位置)における蛍光シグナル(F)の出現はそれぞれ標的ヌクレオチド配列におけるA、C、およびGアレルの存在を示す。
【００２８】
図3に示したように、ジップコード部分を含有する連結産物配列の検出は、ジップコード配列とその相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを伴う。本発明の1つの態様において、捕捉用オリゴヌクレオチドの集団は、固体支持体、例えば、アレイ、ビーズ、スライド、ディスク、膜、フィルム、マイクロタイタープレート、およびそれらの複合物に固定化されている。固体支持体は位置のアレイを備えてもよく、捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が、位置のアレイにおいて固定化されている。固体支持体上に捕捉用オリゴヌクレオチドアレイを形成する方法および標的核酸捕捉のためのその使用は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、全てBaranyらに対する米国特許第6,852,487号ならびにその継続出願および分割出願において十分に説明されている。
【００２９】
本発明のこの態様によれば、ヌクレアーゼ-連結反応の前に、初回標的核酸増幅手順を行うことが好ましい場合がある。これにより、ヌクレアーゼ-連結プロセスを使用する前に試料中の標的ヌクレオチド配列の量が増える。例えば、初回標的核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応プロセス、自家持続配列複製、またはQ-βレプリカーゼを介したRNA増幅を用いて達成されてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応プロセスは好ましい増幅手順であり、参照により本明細書に組み入れられる、H. Erlich, et. al., 「Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction」, Science 252: 1643-50 (1991); M. Innis, et. al, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: New York (1990); およびR. Saiki, et. al., 「Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase」, Science 239: 487-91 (1988)において十分に説明されている。参照により本明細書に組み入れられる、J. Guatelli, et. al., 「Isothermal, in vitro Amplification of Nucleic Acids by a Multienzyme Reaction Modeled After Retroviral Replication」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-78 (1990)は自家持続配列複製プロセスについて説明する。Q-βレプリカーゼを介したRNA増幅は、参照により本明細書に組み入れられる、F. Kramer, et. al., 「Replicatable RNA Reporters」, Nature 339: 401-02 (1989)に開示される。
【００３０】
本発明の別の態様において、ヌクレアーゼ-連結産物は次世代配列決定法を用いて検出される。この態様によれば、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、Illumina(登録商標)MiSeq(商標)またはHiSeq (商標) (San Diego, CA)プラットフォーム、Life Technologies(商標)Ion Torrent(商標)(Life Technologies, Carlsbad, CA)プラットフォーム、Roche(商標)454プラットフォーム、または他の次世代配列決定プラットフォーム(すなわち、ピロシーケンス、蛍光ベースの合成による配列決定(sequencing-by-synthesis)、蛍光ベースの連結による配列決定(sequencing-by-ligation)、イオンベースの合成による配列決定、およびイオンベースの連結による配列決定)に必要とされる適切な配列決定タグまたはアダプターをさらに含む。これらは全て当技術分野において周知である。配列そのものを、染色体の1つにあるヒトゲノムに明確に位置づけることができるので、異なる染色体に異なるタグを備える必要はない。配列決定は、標的核酸分子内の異なる一塩基多型(SNP)アレルを計数するのに特に適している。
【００３１】
本発明の別の態様において、ヌクレアーゼ-連結産物の検出はPCR増幅を伴う。この態様によれば、図1および図2に示したように、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブは5'プライマー特異的部分をさらに含み、プローブセット中の第2のオリゴヌクレオチドプローブは3'プライマー特異的部分をさらに含む。結果として生じた連結産物は、5'プライマー特異的部分、標的特異的部分、および3'プライマー特異的部分を含む。
【００３２】
第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブのプライマー特異的部分は、一組の条件下で形成された連結産物を全て後でユニバーサル増幅することを可能にするユニバーサルプライマー配列でもよい。これは、低含量の標的ヌクレオチド分子を検出する場合に特に有用である。従って、連結産物形成の後、試料中の全ての連結産物を比例して増幅するためにユニバーサルPCR増幅が行われる。ユニバーサルPCRの後、元の連結産物の伸長産物は検出および定量される。または、第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブのプライマー特異的部分は標的ヌクレオチド配列特異的(すなわち、アレル特異的)でもよい。さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、1つまたは複数の標的特異的プライマー特異的部分(すなわち、アレル特異的プライマー部分)と組み合わせて一組のユニバーサルプライマー特異的部分を含有するように設計される。
【００３３】
ヌクレアーゼ-連結反応後に、連結産物を含有する試料はポリメラーゼ連鎖反応に供される。ポリメラーゼ連鎖反応において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットが提供される。それぞれのプライマーセットは、連結産物配列の5'プライマー特異的部分と同じ配列を含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、連結産物配列の3'プライマー特異的部分に相補的な第2のオリゴヌクレオチドプライマーを有する。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、ヌクレアーゼ-リガーゼ反応混合物は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットおよびポリメラーゼと混ぜ合わさられる。
【００３４】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理、および伸長処理を含む1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供される。変性処理の間に、ハイブリダイズされた核酸配列は分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、プライマーは、連結産物配列のプライマーに相補的なプライマー特異的部分にハイブリダイズする。伸長処理中、ハイブリダイズされたプライマーは伸長されて、プライマーがハイブリダイズされた配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリメラーゼ連鎖反応期の第1のサイクルにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは連結産物配列の3'プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて、連結産物配列に相補的な伸長産物を形成する。後のサイクルにおいて、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは、連結産物配列に相補的な伸長産物の5'プライマー特異的部分にハイブリダイズし、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは連結産物配列の3'下流部分にハイブリダイズする。
【００３５】
ほぼ全ての場合において、偽陽性シグナルを発生し得る非連結プローブの伸長および/または増幅を阻止するために、PCR増幅前に、連結産物配列を含有する試料から非連結オリゴヌクレオチドプローブを排除することが望ましい。この目的を達成するためのいくつかの手段を以下で説明する。
【００３６】
あるアプローチでは、連結プロセス後に、増幅前にエキソヌクレアーゼ消化することによって試料から非連結プローブ配列を除去することを伴う(参照により本明細書に組み入れられる、L-H Guo and R. Wu, Methods in Enzymology 100:60-96 (1985)。エキソヌクレアーゼ消化を組み込むために、連結産物は消化から保護される必要がある。あるアプローチでは、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ相補的な第1のタグ部分および第2のタグ部分を含む。オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のタグ部分および第2のタグ部分は、好ましくは、他のオリゴヌクレオチドプローブセットのタグ部分と配列の点で異なる、すなわち、アレル特異的でもよいが、必ずしも異なるとは限らない。図4Aは、第1のオリゴヌクレオチドプローブがタグ部分C1'を含有し、第2のオリゴヌクレオチドプローブがタグ部分C1を含有し、C1'およびC1が互いに相補的である例を示す。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが連結された後に、第1のタグ部分および第2のタグ部分、すなわち、C1'およびC1はハイブリダイズして、エキソヌクレアーゼ消化耐性のあるヘアピン化連結産物配列を形成する(この図の中のA1およびB1は下流ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマー特異的部分を表す)。後のエキソヌクレアーゼ消化によって非連結プローブは除去される。さらに、ミスマッチのあるタグを有し、かつ全体的または部分的に一本鎖のままの非特異的に連結された分子も消化される。エキソヌクレアーゼ消化の後、ヘアピン化連結産物は変性され、連結産物の3'プライマー特異的部分(すなわち、B1)に相補的な第1のプライマーおよび連結産物の5'プライマー特異的部分(すなわち、A1)と同じヌクレオチド配列を有する第2のプライマーを有するオリゴヌクレオチドプライマーセットを用いてPCR増幅が行われる。
【００３７】
図4Bは、第2のオリゴヌクレオチドプローブが第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'プライマー特異的部分(A1)に相補的な領域(A1')を含有する代替のオリゴヌクレオチドプローブ設計を示す。このプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが連結された後に、A1およびA1'はハイブリダイズしてヘアピン化連結産物を形成する。これもまた、その後に、非連結オリゴヌクレオチドプローブ、およびミスマッチのあるタグを有し、かつ全体的または部分的に一本鎖のままの非特異的に連結された分子は、1本鎖特異的エキソヌクレアーゼ酵素、例えば、ExoIを用いて消化される。図4Aについて前述したように、エキソヌクレアーゼ消化の後、ヘアピン化連結産物は変性され、非連結プローブの非存在下で変性した連結産物を増幅するためにオリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼが添加される。
【００３８】
別の態様において、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、その末端に、連結に関与しないブロッキング部分を含んでもよい。適切なブロッキング部分には、検出可能な標識またはホスホロチオエート基が含まれる(Nikiforow, et al., 「The Use of Phosphorothioate Primers and Exonuclease Hydrolysis for the Preparation of Single-stranded PCR Products and their Detection by Solid-phase Hybridization」, PCR Methods and Applications, 3 :p.285-291 (1994)。これらは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。連結プロセスの後、反応混合物をエキソヌクレアーゼとインキュベートすることによって、非連結プローブは選択的に破壊されるのに対して、エキソヌクレアーゼ反応の開始に必要な遊離3'末端が脱離したために、連結されたプローブは保護される。
【００３９】
図4Cは、連結産物の選択に頼る、非連結オリゴヌクレオチドプローブから連結産物を分離するための別のアプローチを示す。この態様において、第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブはアレル特異的な相補的タグ、C1およびC1'を有し、さらに、第2のオリゴヌクレオチドプローブはユニバーサルタグL1を有する。連結後、C1およびC1'がハイブリダイズするとヘアピンが形成する。このヘアピンは、その末端に、突き出ているL1を有する。同じ反応においてユニバーサルビオチン化(●)オリゴヌクレオチド(L1')がヘアピン化産物に連結され、これによって、ストレプトアビジン選択によって、非連結オリゴヌクレオチドプローブから、ビオチンを有する連結産物が分離される。ビオチン化オリゴヌクレオチドが連結されると同時に、オリゴヌクレオチドプローブの部分が標的とアニールされるように、オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、オリゴヌクレオチドのタグ(C1/C1')とプライマー特異的部分(A1/B1)の間に、いわゆるスペーサーを含めることによって十分に長くすることもできる。または、連結産物を融解して標的から離すために温度を増加させ、次いで、産物のヘアピン形成およびビオチン化オリゴヌクレオチドとヘアピン化産物との連結を可能にするために温度を低下させることができる。どちらの事象でも、分離された連結産物は、その後に、前記のようにポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅される。
【００４０】
図4A〜4Cに示したオリゴヌクレオチドプローブ設計が働くための重要な特徴は、分子内ヘアピンが、オリゴヌクレオチドプローブ間の二分子相互作用より熱力学的にかなり安定しているということである。相補的タグを有する、非連結オリゴヌクレオチドプローブのごくわずかな割合しか互いにアニールされないが、連結された分子の100％近くがヘアピン構造を形成するように、温度および緩衝液が選択される。
【００４１】
本発明の別の態様では、短い非連結オリゴヌクレオチドプローブから高分子量の長い連結産物を分離するために、非連結オリゴヌクレオチドプローブはゲル濾過(例えば、Sephadex)または類似方法を用いて除去される。連結産物配列のPCR増幅の前に、非連結プローブを除去するためのさらに別のアプローチは、(例えば、前記のようにジップコード捕捉を用いて)固体支持体上に連結産物を固定化し、非連結オリゴヌクレオチドプローブを洗い流すことを伴う。
【００４２】
本発明のさらに別の態様では、連結の非存在下で安定したヘアピン構造を形成することができるプローブを設計することによって、非連結オリゴヌクレオチドプローブは後の伸長および増幅から排除される。この態様を図5に図示した。この態様によれば、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、接合部における重複する同一のヌクレオチドの5'側にヌクレオチドフラップをさらに含む。ヌクレオチドフラップ(図5の中のB1')の少なくとも一部は、第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'プライマー特異的部分(図5の中のB1)の少なくとも一部に相補的である。連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチドフラップ(B1')および3'プライマー特異的部分(B1)の相補領域は互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する(図5、右側)。第1のPCRサイクルの間に、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'プライマー特異的部分(B1)は伸長されて、第2のオリゴヌクレオチドプライマーとその相補配列との結合を妨げる伸長されヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブが、形成する。図5の左側に示したように、その後に、形成された連結産物は、非連結プローブから妨害されることなくPCRを用いて増幅される。
【００４３】
ヌクレアーゼ-連結プロセスの間、温度は比較的高い(50〜70℃)。このため、組み合わされた、または別々の5'ヌクレアーゼ活性およびリガーゼ活性を有する耐熱性酵素、例えば、それぞれ、TaqポリメラーゼおよびTaqリガーゼならびに不活化(伸長ブロック)dNTP(TriLink)を用いて、第2のオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ-連結反応に関与すること可能になる。連結が完了したら、温度は95℃まで上がって、dNTPおよび/またはポリメラーゼを不活化する。次に、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブがヘアピンを形成するように、温度は急速に下がる(図5、右側)。ヘアピン構造の3'末端はポリメラーゼによって伸長され、PCRの間に、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブ上でのプライマープライミング(priming)を阻止する、さらに長く、かつ極めて安定したヘアピンステムが形成する(図5、右側)。このアプローチの主な利点は、「閉じたチューブ(closed tube)」連結PCR検出、すなわち、試料DNA、ヌクレアーゼ-ポリメラーゼ、リガーゼ、オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー、dNTP、ならびにヌクレアーゼ、連結、およびPCRに必要な他の試薬をウェルまたは液滴の中に予め装填できることである。反応は、PCRに必要な1種類または数種類の試薬の熱活性化によってヌクレアーゼ-連結からPCR増幅に切り替わる。
【００４４】
図6は、K-ras遺伝子内のG→A、T、C変異を検出するための本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスを図示する。この反応は、4種類の5'-N第2のオリゴヌクレオチドプローブを伴う。5'-N第2のオリゴヌクレオチドプローブの中には、接合部における重複する同一のヌクレオチドの5'側にあるヌクレオチドフラップを含有するものもある。連結の非存在下でのヘアピン形成を容易にするために、第2のオリゴヌクレオチドプローブ上にあるヌクレオチドフラップの少なくとも一部は、プローブの3'プライマー特異的部分に相補的である。この反応はまた、4種類のN-3'第1のオリゴヌクレオチドプローブを伴う。この例では、変異特異的オリゴヌクレオチドプローブは、後の増幅のために3'プライマー特異的部分および5'プライマー特異的部分を含有するが、野生型特異的オリゴヌクレオチドプローブは、増幅しない短い配列を含有する。工程2に示したように、5'-ヌクレアーゼ活性(◆)は、マッチしている5'-重複塩基およびさらなるフラップ、例えば、野生型の場合、5'-C、変異の場合、5'-D(D=A、GまたはT)(5'-Aを示した)のみを切断して、第2のオリゴヌクレオチドプローブ上に連結能力のある5'-リン酸を残す。リガーゼ(●)は2種類のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合により一緒に塞ぐ(変異の場合のみを示す)。変異体の連結産物のみがPCR増幅され、野生型アレルはPCR増幅されない。図6の右側に示すように、切断および連結されなかった、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブはヘアピンを形成する。ヘアピンはポリメラーゼによって伸長されて、二次プライマーの結合をおよび二次プライマーによる後の伸長または増幅を妨げる。
【００４５】
K-ras変異は、コドン12の6つの変化およびコドン13の1つの変化を含み、全て間隔をあけて並んでおり、検出することが特に難しい。高忠実度識別を実現するために、変異オリゴヌクレオチドプローブと野生型配列の間のミスマッチは、少なくとも、最後の塩基についてはG:TではなくC:Aでなければならない。最後から2番目の位置にある塩基がC:AまたはG:Tミスマッチのいずれかである場合には、忠実度をさらに増強することができる。さらに、3'側から3番目の位置にミスマッチを有する、野生型配列に対する任意の上流プローブを含めることができる。さらに、3番目の位置にミスマッチを作ることによって、第1の変異オリゴヌクレオチドプローブは、3'側の最後の3つの位置にミスマッチがあり、その結果、残っている正常LDR連結産物を偶然にPCR増幅することができない。野生型配列に対する第2のオリゴヌクレオチドプローブは重要な塩基において野生型塩基を含有する。このプローブはプライマー特異的領域も欠いており、従って、増幅することができない。
【００４６】
異なるプローブが(まれな)変異配列との結合において互いに競合するので、全てのプローブが正しい配列にハイブリダイズすることが重要である。K-rasコドン12の1番目の位置の変異に対する4種類の上流プローブおよび4種類の下流プローブが存在し、16通りの可能性のある異なる組み合わせが得られる。変異プローブによる正常配列への間違った連結/間違ったシグナルを回避するが、変異配列の存在下で正しい連結も生じるように、「ミニサイクリング(mini-cycling)」アプローチを使用することができる。このアプローチでは、非連結プローブはテンプレートから外れ落ちるが、連結産物は外れ落ちないように、温度は連結の場合、60℃(10分)と75℃(1分)の間を変動する。
【００４７】
要約すると、それぞれの変異を検出するための、2種類のプライマーを用いたヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスにおいて使用することができる様々な識別レベルには、(i)第1のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する第2のオリゴヌクレオチドプローブのみを切断して、連結が生じるのを可能にする5'リン酸を遊離するためのポリメラーゼまたはFenヌクレアーゼの5'-3'ヌクレアーゼ活性の使用;(ii)第1のオリゴヌクレオチドプローブ上での耐熱性リガーゼの3'連結忠実度の使用;(iii)第1のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端から2番目または3番目の塩基におけるミスマッチまたはヌクレオチド類似体の使用;(iv)変異ヌクレオチド配列を検出するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブが野生型ヌクレオチド配列上で連結するのを抑制するための、野生型配列を有するオリゴヌクレオチドプローブの使用;(v)変異が存在した場合の産物の収率を改善するためのミニサイクリング条件の使用;ならびに(vi)連結の非存在下では、3'プライマー特異的部分にある相補領域に低温でハイブリダイズすることによってヘアピンを形成する、第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端におけるヌクレオチドフラップの使用が含まれる。ヘアピン伸長は、PCRプライマーが結合しない産物を形成し、従って、非連結オリゴヌクレオチドプローブの伸長または増幅は回避される。
【００４８】
本発明の別の態様では、図7に示したように、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、結合されたプローブを形成するように繋ぎ止められる。この態様によれば、第1のオリゴヌクレオチドプローブの5'末端は第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'末端に結合される。結合プローブの標的特異的部分がその標的核酸分子にハイブリダイズし、5'フラップヌクレオチドがヌクレアーゼによって切断された後に、結合されたプローブは連結されて、環状の連結産物配列を形成する。
【００４９】
本発明のこの態様によれば、識別力のある塩基は、3'末端上および5'末端上の同じ塩基または5'末端上のフラップ切断前の最後の塩基である。(i)ある特定の変異に対する下流プローブ部分が完全にマッチしたハイブリダイゼーションを有する場合の5'リン酸を遊離する効率的な5'ヌクレアーゼ切断、それに続く、(ii)再度、変異塩基と完全にマッチした場合の上流プローブ部分の3'末端への効率的な連結に最適な時間を求めるために、サイクル条件を変えることができる。同時に、両反応が生じるのを可能にする時間を短縮し、その後に、不正確なテンプレートからプライマーを変性させるように温度を上げることによって、非特異的な切断および連結は最小化される。
【００５０】
本発明の結合されたプローブは、結合されていないプローブについて本明細書において説明された特徴、例えば、上流/下流プライマー領域、ジップコード部分、UniTaq検出部分およびプライマー部分、タグ部分などの全てを含めるように設計することができる。さらに、結合されたプローブは以下の特徴の1つまたは複数を含むように設計することができる。1つの態様において、結合されたプローブは、その領域によってポリメラーゼ伸長をブロックし、それによって、環状化した連結産物全体の複製を阻止する配列または化学結合、すなわち、ポリメラーゼブロッカーを含有する。別の態様では、結合されたプローブは、連結後に切断される配列を含有するように設計される。その切断の前に、連結されなかった、結合されたプローブ(ならびにインプットテンプレートDNA)はエキソヌクレアーゼ消化によって除去される。別の態様では、連結されなかった、結合されたプライマーは低温でヘアピンを形成し、自己伸長して、増幅しない産物を形成する(図8を参照されたい)。ヘアピン形成を容易にするために、結合されたオリゴヌクレオチドプローブは、3'標的特異的部分に相補的なセグメントを含む。連結の非存在下では、結合されたプローブの3'標的特異的部分は相補的セグメントにハイブリダイズして、ヘアピン化し結合されたオリゴヌクレオチドプローブを形成する。1回目の後のPCRの間に、結合されヘアピン化したオリゴヌクレオチドプローブの3'標的特異的部分を伸長させると、第2のオリゴヌクレオチドプライマーとその相補配列との結合を妨げる伸長されヘアピン化し結合されたオリゴヌクレオチドプローブが形成される。このアプローチの利点は、さらなる消化(例えば、エキソヌクレアーゼ消化)工程を必要とすることなく、連結されなかった、結合されたプローブを下流増幅プロセスおよび検出プロセスから除去することである。
【００５１】
図8は、K-ras遺伝子内のG→A、T、C変異を検出するための本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスにおける、結合されたプローブの使用を示す。このアプローチでは、変異特異的塩基が上流プローブの3'末端および下流プローブの5'末端または5'末端付近にある、2種類の結合されたプローブを含有する3種類のオリゴヌクレオチドを用いる(「A」特異的オリゴヌクレオチドのみを示す)。変異特異的オリゴヌクレオチドは、後の増幅のためにプライマー特異的部分を含有する。例えば、変異の場合(5'-Aを示す)、マッチする5'-重複塩基のみが5'-ヌクレアーゼ活性によって切断されて、連結能力のある5'-リン酸が残る。切断によって、1個のマッチする5'-重複塩基(5'-Aを示す)だけが放出されてもよく、遊離された3'末端にその塩基を含有するフラップが放出されてもよい。リガーゼ(●)は、結合されたオリゴヌクレオチドプローブの2つの遊離末端を共有結合により一緒に塞いで、共有結合により閉環した環状連結産物を生成する。変異体の連結産物のみがPCR増幅され、野生型アレルはPCR増幅されない。図8の右側に示すように、連結されなかった、結合されたプローブはヘアピンを形成する。ヘアピンはポリメラーゼによって伸長されて、二次プライマーの結合および二次プライマーによる後の伸長または増幅を妨げる。
【００５２】
要約すると、結合されたプローブを用いて実現することができる識別レベルには、(i)下流プライマー部分に対するポリメラーゼまたはFenヌクレアーゼの5'-3'ヌクレアーゼ活性の使用;(ii)上流プライマー部分に対する耐熱性リガーゼの3'連結忠実度の使用;(iii)上流プライマー部分の3'末端から2番目または3番目の塩基におけるミスマッチまたはヌクレオチド類似体の使用;(iv)変異が存在した場合にだけ連結産物を生成する特異性を改善するためのサイクル条件の使用;(v)標的非依存的事象を最小限にするための低プライマー濃度の使用;および(vi)連結されなかった場合に低温でヘアピンを形成し、自己伸長して、増幅しない産物を形成するような、結合されたプライマーに対する配列の使用が含まれる。
【００５３】
PCR増幅された連結産物を検出する、いくつかの手段は下記のように使用することができる。
【００５４】
第1のアプローチにおいて、検出および特定することができる標識された一次伸長産物を生成するために、PCR増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーセット中のプライマーの1つは検出可能な標識をさらに含んでもよい。この検出方法は、連結産物のプライマー特異的部分がアレル特異的である場合に適している。全てBaranyに対する米国特許第6,027,889号、同第6,797,470号、同第7,312,039号、同第7,320,865号、同第7,332,285号、同第7,166,434号、同第7,429,453号、同第8,283,121号は、その全体が参照により本明細書に組み入れられ、対になった連結検出反応およびポリメラーゼ連鎖反応を用いて核酸配列の違いを検出する方法について説明する。
【００５５】
別のアプローチでは、プローブセット中の第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび/または第2のオリゴヌクレオチドプローブはジップコード部分を含む。前記のように、異なるオリゴヌクレオチドプローブセットに対するジップコードは異なるヌクレオチド配列を有し(すなわち、アレル特異的であり)、均一なハイブリダイゼーション条件下で、相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。図9Aは、K-ras遺伝子内のG→A、T、C変異を検出するための本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスを図示する。この反応は、4種類の5'-N第2のオリゴヌクレオチドプローブを伴う。5'-N第2のオリゴヌクレオチドプローブの中には、接合部における重複する同一のヌクレオチドの5'側にヌクレオチドフラップ、および3'プライマー特異的部分を含有するものもある。PCR増幅前に、非連結オリゴヌクレオチドプローブを除去するために、第2のオリゴヌクレオチドプローブ上にあるヌクレオチドフラップの少なくとも一部は、連結の非存在下でのヘアピン形成を容易にするようにプローブの3'プライマー特異的部分に相補的である。この反応は4種類のN-3'第1のオリゴヌクレオチドプローブも伴い、それぞれが異なるジップコードおよび5'プライマー特異的部分を含有する。この例では、変異特異的オリゴヌクレオチドプローブは後の増幅のために3'プライマー特異的部分および5'プライマー特異的部分を含有するが、野生型特異的オリゴヌクレオチドプローブは、増幅しない短い配列を含有する。工程2に示す通り、ポリメラーゼ(◆)の5'-ヌクレアーゼ活性は、マッチしている5'-重複塩基およびさらなるフラップ、例えば、野生型の場合、5'-C、変異の場合、5'-D(D=A、GまたはT)(5'-Aを示す)のみを切断して、第2のオリゴヌクレオチドプローブ上に連結能力のある5'-リン酸を残す。リガーゼ(●)は、2種類のオリゴヌクレオチドプローブを共有結合により一緒に塞ぐ(変異の場合のみを示す)。変異体の連結産物のみがPCR増幅され、野生型アレルはPCR増幅されない。切断および連結されなかった、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブはヘアピンを形成する。ヘアピンはポリメラーゼによって伸長されて、二次プライマーの結合をおよび二次プライマーによる後の伸長または増幅を妨げる。
【００５６】
ジップコードを用いた検出は、図9Bに示したように従来のTaqman(商標)検出を用いて行うことができる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Whitcombeらに対する米国特許第6,270,967号およびAndersonらに対する米国特許第7,601,821号を参照されたい)。Taqmanアッセイ法を用いた検出の場合、試料中の連結産物を比例して増加させるために、ユニバーサルPCRプライマーを用いた任意の第1のユニバーサル増幅反応を行うことができる(図9CにユニバーサルPCR工程は示していない)。これは低含量標的配列を検出する場合に特に適している。約8〜20サイクルのユニバーサル増幅の後、試料を10〜100倍に希釈し、それぞれの産物のユニークなジップコード配列の一部または全てと重複するユニークプライマーを添加する。Taqmanプローブは、ジップコードおよび標的DNA両方の接合配列(図9Cに示した)または標的DNAのみに対するものである(どちらの場合でもユニークプライマーの重複はない)。第2のプライマーはユニバーサル(U2)でもよく、さらなる特異性のために、いくつかのゲノム特異的塩基を含むように設計されてもよい(Taqmanプローブとの重複はない)。ポリメラーゼが第2のプライマーを伸長する場合に、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によってシグナルが発生する。プライマー伸長によって捕捉用オリゴヌクレオチドから検出可能な標識が切断され、クエンチャー分子から検出可能な標識が放出されて、検出が可能になる。
【００５７】
または、図9Cに示したように、ユニバーサル(ジップコード)アレイを用いた検出の場合、第2のオリゴヌクレオチドプライマー(U2)はレポーター標識、すなわち、蛍光基を含有するのに対して、第1のオリゴヌクレオチドプライマー(U1)は5'リン酸を含有し、増幅は合計約30〜40サイクル続く。これにより、図9Cに示したように、第2鎖を消化するλエキソヌクレアーゼの使用が可能になり、蛍光標識産物は一本鎖になり、かつユニバーサル(ジップコード)アレイ上でのハイブリダイゼーションに適するようになる。
【００５８】
さらに、前記の構築物は、以下の通りに示される、ユニバーサルプライマーの内側にあるユニーク配列(0〜10個の塩基)(ユニークAi、ユニークBi)を含んでもよい。
ユニバーサルプライマーU1-ユニークAi-ジップコードZi-標的DNA-ユニークBi-ユニバーサルプライマーU2'
【００５９】
ジップコードTaqmanアッセイ法を用いた検出の場合、8〜20サイクルのユニバーサル増幅の後に、試料を10〜100倍に希釈し、それぞれの産物についてユニークAiユニークBi配列と重複するユニークプライマーを添加する。Taqmanプローブはジップコード配列に対するものである。
【００６０】
ジップコード識別子と標的配列の間にある、それぞれの接合配列は独特であるので、初回ユニバーサル増幅の産物も次世代配列決定を用いて特定および定量され得る。
【００６１】
ジップコードを用いる別の検出アプローチは、分割された部分の両側にある相補配列の短い領域を用いて互いに近接され得る2つの部分に分割されたジップコード部分を備えることを伴う。特に、第1のオリゴヌクレオチドプローブは、ジップコードの第1の部分、および、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分を含み、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、ジップコードの第2の部分、および、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分を含む。オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のタグ部分および第2のタグ部分は互いに相補的であり、好ましくは、約5〜8塩基が相補的である。これは、2つのセクションが同じDNA一本鎖にある場合に短い領域において一過的ヘアピン形成を可能にする。一過的ヘアピン形成は、ジップコード配列の半分を両方とも、アレイ上の完全長の相補的なジップコード配列にハイブリダイズさせることによって、またはTaqmanアッセイ法の一環として安定化される。
【００６２】
図10は、ユニバーサルTaqmanスプリットジップコードヘアピン検出の一例を示す。この図において、および前記の方法によれば、連結産物は、(i)第1の5'ユニバーサルプライマー特異的部分(U1)、(ii)第1の短い(1〜10塩基)ユニークな特定用配列(A1)、(iii)ジップコード部分の第1の部分(Z1.1')、(iv)第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分(T1)、および(v)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブを含むオリゴヌクレオチドプローブセット(図示せず)を用いて既に形成されている。プローブセットの第2のオリゴヌクレオチドプローブは、(i)3'ユニバーサルプライマー特異的部分(U2')、(ii)第2の短いユニークな特定用配列(B1)、(iii)ジップコード部分の第2の部分(Z1.2')、(iv)第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分(T1')、および(v)標的特異的部分を有する。図10に示したように、A1ユニーク配列およびB1ユニーク配列は、使用されたPCRプライマーが、ユニバーサルプライマー部分ならびにそれぞれA1部分およびB1部分にまたがる場合に連結産物配列の標的特異的PCR増幅を容易にするのに役立つ。この標的特異的PCR増幅の前に、任意で、5'ユニバーサルプライマー特異的部分および3'ユニバーサルプライマー特異的部分にハイブリダイズするプライマーを用いたユニバーサルPCR増幅反応が行われてもよい。第1のユニバーサル増幅反応は、試料中の低含量標的核酸配列を検出する場合に特に適している。連結産物またはその伸長産物の標的特異的PCR増幅の後(図10、工程1)、二本鎖DNA産物は変性される(図10、工程2)。温度が下がるにつれて、第1のタグ部分および第2のタグ部分(T1およびT1')は一過的にハイブリダイズして、ジップコード配列の第1の部分(第1のオリゴヌクレオチドプローブに由来するZ1.1')は第2のジップコード配列(第2のオリゴヌクレオチドプローブに由来するZ1.2')に近接する。一過的ハイブリダイゼーションは、隣接して配置されたジップコード配列に相補的な標識捕捉用オリゴヌクレオチド(Z1)の同時ハイブリダイゼーションによって安定化される(図10、工程3)。1つの態様において、捕捉用オリゴヌクレオチドは、互いに隔てられたクエンチャー分子(Q)および検出可能な標識(F)を有する。検出可能な標識はクエンチャー分子の近くにある場合に消光される。ポリメラーゼが、ユニバーサルプライマー特異的部分(U2)、ユニークB1部分、またはその組み合わせに結合したプライマー(すなわち、「消化用プライマー」)を伸長し、ハイブリダイズされた捕捉用オリゴヌクレオチドを切断した場合に、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によってシグナルが発生する。プライマー伸長によって捕捉用オリゴヌクレオチドから検出可能な標識が切断されて、クエンチャー分子から検出可能な標識が放出され、検出が可能になる(図10、工程4)。ポリメラーゼがZ1.2'を横断したらすぐに、Z1.2'とZ1.1'の間にある短いステムはばらばらになり、ポリメラーゼは伸長を続けてdsDNA産物が生成される。多種多様な検出可能な標識、すなわち、蛍光色素、例えば、FAM、TET、JOE、VIC、HEX、CY3、TAMRA、TexasRed、CY5、ROXが当技術分野において公知であり、市販されている。同様に、クエンチャー分子、例えば、IDTのMGB-NFQ、BHQ-[0123]、ZENクエンチャーも当業者に周知である。
【００６３】
本発明の関連する局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(ii)3'プライマー特異的部分、ジップコードの第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する。オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のジップコード部分および第2のジップコード部分は、隣接して配置された場合に完全長ジップコード部分を形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のタグ部分および第2のタグ部分は互いに相補的である。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合に標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、該試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットは接触される、かつ、1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、連結産物配列を形成する。この方法は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(a)連結産物配列の5'プライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を含む、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、および、(b)連結産物配列の3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程をさらに含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、連結産物配列、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼが混ぜ合わさられ、ポリメラーゼ連鎖反応混合物は1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供され、それによって、一次伸長産物が形成される。第1のジップコード部分の一部および第2のジップコードの一部に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチドの集団が提供される。それぞれの異なる一次伸長産物に対する、集団の各捕捉用オリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ、互いに隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を含む。一次伸長産物および捕捉用オリゴヌクレオチドの集団は、(i)ある特定の一次伸長産物の第1のタグ部分および第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ(ii)集団の捕捉用オリゴヌクレオチドが、ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に、供される。ハイブリダイズされた捕捉用オリゴヌクレオチドからクエンチャー分子および/または検出可能な標識が切断され、��エンチャー分子から隔てられた検出可能な標識は検出される。この検出に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在が特定される。
【００６４】
本発明のこの局面によれば、連結反応プロセスは、本明細書に記載のように第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'ヌクレアーゼ切断が先に行われる連結反応でもよい。または、連結能力のあるオリゴヌクレオチドプローブを提供することができ、連結の前に5'ヌクレアーゼ切断が行われる必要はない。
【００６５】
図11は、ユニバーサルスプリットジップコードヘアピン検出の別の例を示す。この図では、連結産物は、(i)第1の5'ユニバーサルプライマー特異的部分(U1)、(ii)連結産物特異的プライマー部分である第2のプライマー特異的部分(A1)、(iii)ジップコード部分の第1の部分(Z1.1')、(iv)第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分(T1)、および(v)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット(図示せず)を用いて既に形成されている。プローブセットの第2のオリゴヌクレオチドプローブは、(i)3'ユニバーサルプライマー特異的部分(U2')、(ii)ジップコード部分の第2の部分(Z1.2')、(iii)第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分(T1')、および(iv)標的特異的部分を有する。図11の工程1では、任意で、連結産物は、最初に、ユニバーサルオリゴヌクレオチドプライマーセット、すなわち、連結産物の5'ユニバーサルプライマー特異的部分と同じ配列を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー(U1)、および連結産物の3'ユニバーサルプライマー特異的部分に相補的な第2のオリゴヌクレオチドプライマー(U2)を用いて増幅される。一次ユニバーサルPCR工程から形成された一次伸長産物は、(a)第1のオリゴヌクレオチドプローブの第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列(A1)、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分(Z1)、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子(Q)および検出可能な標識(F)を有する第1の二次オリゴヌクレオチドプライマーを含む二次プライマーセットを用いて二次PCR工程(図11、工程2)に供される。プライマーセットの第2の二次オリゴヌクレオチドプライマー(U2)は、一次PCRの第2の一次オリゴヌクレオチドプライマーと同じヌクレオチド配列を有する(すなわち、連結産物の3'ユニバーサルプライマー特異的部分に相補的である)。第1の二次プライマーのクエンチャー分子は、下の(bottom)鎖のポリメラーゼ伸長をブロックするためのポリメラーゼブロッカーとして役立つことができる。または、ポリメラーゼブロッカー、例えば、HEG(ヘキセチレン(hexethylene)グリコール)、THF(テトラヒドロフラン)、Sp-18、またはポリメラーゼ伸長を停止させるのに十分な当技術分野において公知の他の任意のブロッカーをクエンチャー部分の近位に配置することができる。二本鎖DNA産物(図11、工程3に示した)は変性され、Z1.1'とZ1.2'の間にステム(T1とT1'とのハイブリダイゼーションによって形成されるステム)、および捕捉用オリゴヌクレオチド部分(Z1)とZ1.1/Z1.2'の間にステムを有する二重ヘアピンを形成するために温度を低下させる(図11、工程4)。ポリメラーゼが、5'ユニバーサルプライマー特異的部分に相補的な「消化用プライマー」を伸長した場合に、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によってシグナルが発生する。プライマー伸長によって捕捉用オリゴヌクレオチドから検出可能な標識(F)またはクエンチャー分子(Q)が切断されて、クエンチャー分子(Q)から検出可能な標識(F)が放出され、検出が可能になる(図11、工程5)。ポリメラーゼがZ1.2'を横断したらすぐに、Z1.2'とZ1.1'の間にある短いステムはばらばらになり、ポリメラーゼはポリメラーゼブロッカーに達するまで伸長を続けて、工程1のdsDNA産物に似ているが、蛍光D1シグナルを欠くdsDNA産物が生成される。
【００６６】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列内の変異の存在および/または潜在的な変異を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。それぞれのプローブセットは、(i)5'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第1の部分、第1のジップコード部分の3'側にある第1のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(ii)3'プライマー特異的部分、ジップコード部分の第2の部分、第2のジップコード部分の5'側にある第2のタグ部分、および標的特異的部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを有する。オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のジップコード部分および第2のジップコード部分は、隣接して配置された場合に完全長ジップコード部分を形成し、かつ、オリゴヌクレオチドプローブセットの第1のタグ部分および第2のタグ部分は互いに相補的である。該試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットは、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、接触され、かつ1つまたは複数のプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、連結産物配列を形成する。該方法は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを供給する工程であって、各セットが、(i)(a)第1のオリゴヌクレオチドプローブの第2のプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列、(b)オリゴヌクレオチドプローブセットの隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分に相補的な捕捉用オリゴヌクレオチド部分、(c)該捕捉用オリゴヌクレオチド部分によって隔てられたクエンチャー分子および検出可能な標識を有する、第1のオリゴヌクレオチドプライマー、(ii)連結産物配列の3'プライマー特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、工程をさらに含む。ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成するために、連結産物配列、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセット、およびDNAポリメラーゼが混ぜ合わさられ、ポリメラーゼ連鎖反応混合物は1回または複数回のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに供され、それによって、一次伸長産物が形成される。一次伸長産物は、ある特定の一次伸長産物の第1のタグ部分および第2のタグ部分が互いにハイブリダイズして、隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分を有するヘアピン化一次伸長産物を形成するのに有効な条件に、かつ(ii)ある特定のヘアピン化一次伸長産物の捕捉用オリゴヌクレオチド部分が、ヘアピン化伸長産物の相補的な隣接して配置された第1のジップコード部分および第2のジップコード部分にハイブリダイズするのに有効な条件に、供される。ヘアピン化一次伸長産物のクエンチャー分子または検出可能な標識は切断され、クエンチャー分子から隔てられた検出���能な標識が検出される。この検出に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在が特定される。
【００６７】
本発明のこの局面によれば、連結反応プロセスは、本明細書に記載のように第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'ヌクレアーゼ切断によって進められる連結反応でもよい。または、連結能力のあるオリゴヌクレオチドプローブが提供されてもよく、連結の前に5'ヌクレアーゼ切断が行われる必要はない。
【００６８】
検出のためにジップコード/捕捉用オリゴヌクレオチド配列を用いる代替アプローチは、UniTaqアプローチを含む。UniTaqシステムは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Spierに対する米国特許出願公開第2011/0212846号において十分に説明されている。UniTaqシステムは、2〜3個の短い(1〜10ヌクレオチド)ユニーク「タグ」配列の使用を伴う。ここで、ユニークタグ配列(Ai)の少なくとも1つは第1のオリゴヌクレオチドプローブに存在し、第2のユニークタグ部分および第3のユニークタグ部分(BiおよびCi)は第2のオリゴヌクレオチドプローブ配列にある。プローブセット中のオリゴヌクレオチドプローブが連結されると、結果として生じた連結産物はAi配列-標的特異的配列-Bi配列-Ci配列を含有する。UniTaqアプローチの本質は、陽性シグナルを得るために、連結プローブセットの両オリゴヌクレオチドプローブが正確である必要があり、これによって、高度多重化核酸検出が可能になることである。例えば、本明細書に記載のように、これは、2つの部分、すなわち、タグのなかの2つが互いにハイブリダイズする必要があることによって達成される。
【００６９】
本発明の1つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブセットのUniTaqタグ部分は「アレル特異的」であり、試料中の個々の連結産物配列を特定および区別するのに用いられる。この態様によれば、異なる連結産物配列ごとにUniTaq部分は異なる。この態様は異なるアレル変異を検出および区別するのに特に有用である。別の態様では、単に、遺伝子における変異の存在または染色体コピー数を検出することが目的であり、変異または染色体領域の同一性が重要でない場合、同じUniTaqタグ部分を用いて異なる連結産物を検出することができる。どちらの場合でも、UniTaqタグ部分をプローブセットのオリゴヌクレオチドプローブの1つに組み込むと、同時に様々な標的配列を高度多重化検出することが可能になる。
【００７０】
図12Aおよび12Bは、オリゴヌクレオチド連結プローブおよび結果として生じた産物への異なるUnitaqタグセット、例えば、AiおよびBi-Ci、i=1-Nの組み込みを示した図である。図12Aおよび12Bに示したように、オリゴヌクレオチドプローブセットは、ゲノムDNAのワトソン・クリック鎖に相補的になるように設計することができる。
【００７１】
図13A〜13Cは、本発明のヌクレアーゼ-連結-PCRプロセスにUniTaqタグシステムを組み込むことができる様々な手法を示す。図13Aに示した第1のアプローチでは、Ai(第1のプライマー特異的部分)、B'i(UniTaq検出部分)、およびC'i(第2のプライマー特異的部分)を含有する連結産物は、両鎖上で、Aiと同じヌクレオチド配列を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー、およびC'iに相補的な第2のオリゴヌクレオチドプライマー(すなわち、Ci)を用いてプライミング(prime)される。第1のオリゴヌクレオチドプライマーはまた、一方の末端に検出可能な標識D1および他方の末端にクエンチャー分子(Q)を有するUniTaq検出プローブ(Bi)も含む(D1-Bi-Q-Ai)。任意で、ポリメラーゼブロッキングユニット、例えば、HEG、THF、Sp-18、またはポリメラーゼ伸長を停止させるのに十分な当技術分野において公知の他の任意のブロッカーがクエンチャーの近位に配置される。PCRの間に、DNAの反対の鎖によって形成されたヘアピン(3'末端がステムの末端にある)が伸長できないように、ステムに折り畳まれる5'-テールの5'末端が、中央ユニバーサルタグ配列に相補的でない1つまたは複数の塩基を有する場合には、ポリメラーゼブロッカーが必要とされないことがある。消光を改善し、バックグラウンド蛍光を低減するために「Sunrise」プライマーおよびプローブと同様に色素およびクエンチャーが近接されるように、プライマー100の5'部分に入り込む小さなヘアピンも設計することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,866,336号および同第6,270,967号を参照されたい。
【００７２】
PCR増幅によって二本鎖産物が生じる(図13A、工程2)。この例では、産物の下の鎖が一本鎖になった場合にヘアピンを形成できないように、ポリメラーゼブロッキングユニットはポリメラーゼが第1のユニバーサルプライマーの5'部分(Bi)をコピーするのを阻止する。このようなヘアピンが形成すると、この3'末端のポリメラーゼ伸長がPCR反応を終結するように、ステムの3'末端はアンプリコンにアニールする。
【００７３】
二本鎖PCR産物は(例えば、温度を約95℃まで上げて、下の鎖から上の鎖を分離することによって)融解され、その後に、温度を低下させた場合に、産物の上の鎖は、第1のオリゴヌクレオチドプライマーの5'部分(Bi)と鎖の反対側の末端における部分B'iの間にステムを有するヘアピンを形成する(図13A、工程3)。この工程の間でも、第2のオリゴヌクレオチドプライマーは5'-プライマー特異的部分(C'i)にアニールする。分子内ヘアピン形成は迅速に行われ、熱力学によって動かされる。すなわち、自由エネルギーはステム長さ、GC含量、およびループ長さによって決定される。ヘアピンの融解温度(Tm)は第2のオリゴヌクレオチドプライマーのTmより著しく高い(例えば、約10℃または約10℃超)ことが重要である。このように、温度を低下させた場合に、分子のほぼ100％がヘアピンを形成した後に、第2のユニバーサルプライマーはアニールし、伸長される。工程4において第2のユニバーサルプライマーが伸長されると、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性がアンプリコンの5'末端から検出可能な標識D1またはクエンチャー分子を切断し、それによって、標識と、クエンチャーまたはFRET色素の間の距離が長くなり、標識の検出が可能になる。多種多様な蛍光色素、例えば、FAM、TET、JOE、VIC、HEX、CY3、TAMRA、TexasRed、CY5、ROXが当技術分野において公知であり、市販されている。同様に、適切なクエンチャー分子、例えば、IDTのMGB-NFQ、BHQ-[0123]、ZENクエンチャーが当業者に周知である。
【００７４】
図13Bに示したアプローチでは、連結産物を検出するために従来のTaqman(商標)アッセイ法が用いられる。この方法は、UniTaq検出部分(B'i)に相補的なUniTaq検出プローブ(Bi)を供給する工程を含む。UniTaq検出プローブは、互いに隔てられたクエンチャー分子(Q)および検出可能な標識(D1)を含む。UniTaq検出プローブは、連結産物上にある、その相補的なUniTaq検出部分にハイブリダイズすると同時に、第2のオリゴヌクレオチドプライマー(Ci)はPCR増幅中に連結産物の5'C'iプライマー特異的部分にハイブリダイズする。第2のオリゴヌクレオチドプライマーが伸長すると、5'エキソヌクレアーゼによってD1が切断され、クエンチャーからD1が分離されることによってシグナルが発生する。
【００７５】
ユニバーサルサークルの形成が関与するさらなる例示的な検出形式を図13Cに模式的に示した。前記のように、図13Cの中の連結産物は、Ai(第1のプライマー特異的部分)、標的特異的部分、B'i(UniTaq検出部分)、およびC'i(第2のプライマー特異的部分)を含有する。連結産物は、連結産物のAiプライマー特異的部分と同じヌクレオチド配列を有する第1のオリゴヌクレオチドプライマー(Ai)、ならびに(i)連結産物の5'C'iプライマー特異的部分に相補的なプライマー部分(Ci)、(ii)ポリメラーゼブロッカー(x)を含有するスペーサー領域、(iii)クエンチャー分子(Q)、(iv)UniTaq検出プローブ(Bi)、および(v)クエンチャー分子の近くにある場合に消光される検出可能な標識(D1)を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。PCRの間に、第2のオリゴヌクレオチドプライマーのプライマー部分(Ci)は連結産物のプライマー特異的部分にアニールするのに対して、UniTaq検出プローブ(Bi)は連結産物のその相補的なUniTaq検出部分にハイブリダイズする(図13C、工程1)。この例では、第2のオリゴヌクレオチドプライマーが伸長すると(図13、工程2)、ハイブリダイズされたUniTaq検出プローブ(Bi)が切断され、それによって、検出可能な標識が放出される。クエンチャー分子から検出可能な標識が放出されると、検出可能なシグナルが発生する。
【００７６】
図14は、図13Aに図示したものと同じプロセスを用いて2つのアレルを検出する例を示す。2つのアレル「X」および「O」を示した。通常のLDR反応とは異なり、プローブセットの両オリゴヌクレオチドプローブはアレル特異的である。言い換えると、5'プライマー特異的部分(Aix)および標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに3'プライマー特異的部分(Ci)、UniTaq検出部分(Bix)、および標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含むプローブセットはアレルXの検出に特異的である。同様に、5'プライマー特異的部分(Aio)および標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに3'プライマー特異的部分(Ci)、UniTaq検出部分(Bio)、および標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを含むプローブセットはアレルOの検出に特異的である。図14の中の工程1は本発明のヌクレアーゼ-連結プロセスを示す。このオリゴヌクレオチドプローブ設計形式は検出特異性を高める。すなわち、第2のオリゴヌクレオチドプローブの中の5'-フラップ塩基は、その5'塩基がアレルと一致する場合にのみ切断され、両オリゴヌクレオチドプローブは、第1のオリゴヌクレオチドプローブの中の最も3'側の塩基がアレルと一致する場合にのみ連結される。この方法は、変異検出を検出するのに、例えば、極めて過剰な量の野生型分子中のまれな体細胞変異を検出するのに特に有利である。アレル特異的および変異特異的なヌクレアーゼ-リガーゼ反応は、ミスマッチオリゴヌクレオチドが融解してテンプレートから離れ、新たなオリゴヌクレオチドがアニールできるように、連結プローブTmと同様の温度、または連結プローブTmより高い温度で行うことができる。変異検出の場合、変異に特異的であるが、正常アレルに特異的でないオリゴヌクレオチドプローブのみを使用することができる。図14の工程2および3は、図13Aに図示した同じプロセスを示す。ここで、連結産物は、クエンチャー分子(Q)および検出可能な標識(D1またはD2)を含有するUniTaq検出プローブ部分(BixまたはBio)を含有する第1のオリゴヌクレオチドプライマーを有するプライマーセットを用いて増幅される(工程2)。結果として生じた伸長産物は、UniTaq検出プローブ部分(BixまたはBio)と相補的なUniTaq検出部分(それぞれB'ixおよびB'io)とのハイブリダイゼーションの結果としてヘアピンを形成する(工程3)。ポリメラーゼが、ハイブリダイズされたプライマー(Ci)を伸長する場合に、検出可能なシグナルは、ヘアピン化産物のUniTaq検出プローブ部分(BixまたはBio)から検出可能な標識(D1またはD2)を切断するポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって発生する(工程3)。
【００７７】
図15は、検出のためにユニバーサル天然「タグ」を用いた一例を示す。この方法は、検出標的を選ぶのに十分な自由があり、検出感度およびロバストネスを高める必要がある場合に使用することができる。ダウン症候群の胎児異数性検出は、21番染色体上にある、全て同じユニバーサル配列B1、例えば、8マーを有する複数の遺伝子座(図15Aの中のN)を選ぶことができる。任意で、全ての標的について同じユニバーサル8マー中央オリゴヌクレオチドを使用することができる。この場合、このユニバーサル中央オリゴヌクレオチド中の修飾塩基、例えば、LNAを安定化するハイブリダイゼーションを使用することができる。連結オリゴヌクレオチドプローブは、ユニバーサルタグの中央の近くにある連結点で連結するように設計されている。または、連結オリゴヌクレオチドは、ユニバーサルB1タグが連結産物のどこにでも生じるように設計することができる。図15Aの右側は、二重連結設計がどのように使用できるのかを示す。この場合、全てのN個の対照標的に異なるユニバーサルタグB2が存在する。二重標識プライマーを用いたユニバーサル検出は、色素D1にB1タグを有する全ての標的、および色素2にB2タグを有する全ての標的を検出する。第1の染色体(すなわち、21番染色体)を検出するために同じユニバーサル配列を使用し、第2の染色体(すなわち、対照2番染色体)を検出するために異なるユニバーサル配列を使用する、このアプローチは非侵襲的出生前診断に用いられ得る。個々の連結産物がデジタルPCR(dPCR)を用いて「カウント」される。dPCRの場合、D1シグナルおよびD2シグナルを有するウェルのカウントを用いて、胎児異数性を検出することができる。
【００７８】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するための方法に関する。この方法は、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列を潜在的に含有する試料を供給する工程、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを供給する工程を含む。各セットは、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを含み、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される。プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブが、これらの対応する標的ヌクレオチド配列が試料中に存在する場合には該標的ヌクレオチド配列と、塩基特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下で、試料および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが接触される。第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'非標的特異的フラップ部分は、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて切断され、それによって、第2のオリゴヌクレオチドの標的特異的部分の最初のヌクレオチド塩基にある5'リン酸が遊離される。1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは一緒に連結されて、1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を有する標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。該方法は、試料中の連結産物配列を検出する工程、および該検出する工程に基づいて、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定する工程をさらに含む。
【００７９】
本発明のこの局面によれば、第2のオリゴヌクレオチドプローブの1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基の少なくとも1つは、標的特異的な最初のヌクレオチド塩基に隣接する。
【００８０】
本発明のこの局面によれば、図1に示したように、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸分子上で互いの近くに存在し、かつ標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成された標的特異的部分を含んでもよく、標的特異的部分の間に接合部を有する。代わりにかつ図16に示した通り、プローブセットのオリゴヌクレオチドプローブは、互いに隣接しない標的特異的部分を含んでもよい。この態様によれば、ポリメラーゼを用いて第1のオリゴヌクレオチドプローブは伸長されて、第2のオリゴヌクレオチドプローブと接合部を形成した後に、第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'非標的特異的フラップ部分(フラップ)が切断される、すなわち、ギャップ-連結反応が起こる(その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Jou et al., 「Deletion Detection in Dystrophia Gene by Multiplex Gap Ligase Chain Reaction and Immunochromatographic Strip Technology」, Human Mutation 5:86-93 (1995))。第2のオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が、伸長された第1のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドを有するのであれば、切断が生じる。さらに、5'ヌクレアーゼ活性は、第2のオリゴヌクレオチドプローブのチオリン酸修飾ヌクレオチド(「S」)によって差し止められる。ポリメラーゼ(◆)の5'ヌクレアーゼ活性による切断の後、伸長された第1のオリゴヌクレオチドプローブはリガーゼ(●)によって第2のオリゴヌクレオチドプローブに連結される。図16に図示した態様では、第1のオリゴヌクレオチドプローブは5'プライマー特異的部分(P1)をさらに含み、第2のオリゴヌクレオチドプローブは3'プライマー特異的部分(P2)を含む。従って、連結後に、連結産物は後でPCR増幅される、および/または配列決定される。オリゴヌクレオチドプローブの5'フラップ部分が3'プライマー特異的部分の一部に相補的になるように設計することによって、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブ配列が連結産物のPCR増幅を妨害しないように排除することができる。図16(右側)に示したように、5'フラップ部分と、3'プライマー特異的部分中のその相補領域がハイブリダイズした結果として、非連結オリゴヌクレオチドプローブはヘアピンを形成する。ヘアピン化オリゴヌクレオチドプローブの3'プライマー特異的部分が伸長すると、PCRオリゴヌクレオチドプライマーが結合しない安定したヘアピンが形成される。
【００８１】
連結産物配列を検出するための様々な手段、例えば、標識連結プローブに基づく検出、次世代配列決定、PCR増幅、ならびに、ジップコード部分および/またはUniTaq検出部分を含有する標識伸長産物の検出は、前述されている。前記のように、非連結プローブの伸長および/または増幅を阻止するために、後の増幅に基づくアッセイ法を実施する前に、非連結オリゴヌクレオチドプローブを、連結産物配列を含有する試料から排除することが好ましい。第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'ヌクレオチドフラップは、第2のオリゴヌクレオチドプローブの3'プライマー特異的部分の少なくとも一部に相補的であり、連結の非存在下では、連結されなかった第2のオリゴヌクレオチドプローブの5'ヌクレオチドフラップおよび3'プライマー特異的部分の相補領域は互いにハイブリダイズして、ヘアピン化した第2のオリゴヌクレオチドプローブを形成する。
【００８２】
両カテゴリーにとって信頼性の高い診断検査およびスクリーニング検査を開発するための課題は、疾患(すなわち、早期癌)を示す、腫瘍由来マーカーまたは胎児由来マーカーと、正常組織に由来する同じマーカーの存在を区別することである。調査されるマーカーの数および検査コストをアッセイ法の特異性および感度と釣り合わせる必要もある。これは、癌などの疾患における生物学的なばらつきに対処する必要がある課題である。多くの場合、このアッセイ法は、二次的な診断フォローアップ(すなわち、結腸鏡検査、羊水穿刺)の有効性を必要とするスクリーニングツールとして役立つはずである。
【００８３】
生物学的問題を悪化させているのは、非常に少ない数の初期細胞から(すなわち、CTCから)、または、正常細胞から発生した大部分の核酸の存在下に癌特異的シグナルもしくは胎児特異的シグナルがある場合から、核酸配列変異を確実に検出する必要があること、またはDNAコピー数もしくはRNAコピー数を確実に定量する必要があることである。
【００８４】
最後に、望ましい疾患特異的核酸の違いを検出したことに起因する真のシグナルと、試料中に存在する正常核酸から発生した間違ったシグナルと、疾患特異的核酸の違いの非存在下で発生した間違ったシグナルを区別する技術的課題がある。
【００８５】
本明細書に記載の本発明の方法は、これらの課題に対する解決策を提供する。これらの解決策は、以下で強調されるいくつかの共通テーマを分かち合う。
【００８６】
第1のテーマは多重化である。PCRは、プライマー濃度が、多重化を制限する50nM〜500nMと比較的高い場合に最もよく働く。さらに、添加されるPCRプライマーペアが多ければ多いほど、不正確な産物を増幅する可能性、またはプライマー-二量体を生成する可能性は指数関数的に増加する。対照的に、LDRプローブの場合、おおよそ4nM〜20nMの低濃度が用いられ、プローブ-二量体は、連結事象を可能にするために標的上で隣り合ってハイブリダイズすることが必要なために限られている。ユニバーサルプライマー配列「テール」を有する低濃度の遺伝子特異的PCRプライマーまたはLDRプローブを使用すると、高濃度のユニバーサルプライマーを後で添加して初回PCR産物またはLDR産物を比例増幅することが可能になる。
【００８７】
第2のテーマは少ないインプット標的核酸によるシグナルの変動である。多くの場合、標的核酸は、CTCとして捕捉された小数の細胞に由来するか、またはアポトーシスを受け、そのDNAを小さな断片(200bp)として血清中に放出した腫瘍細胞に由来する。このような条件下で、シグナルを完全に見逃すのを回避するために、または少数の出発分子を個々のウェルに分配する場合に(リアルタイムPCRもしくはデジタルPCR定量の場合)変動により不正確なコピー数を報告するのを回避するために、ある程度の比例増幅を行うことが好ましい。これらの初回ユニバーサル増幅が妥当な程度(約8〜20サイクル)に保たれている限り、チューブを開封している間の、および(リアルタイムPCRまたはドロップレットPCRを用いて)後で検出/定量するためにアンプリコンを分配している間の持ち越し汚染のリスクが最小化される。必要であれば、持ち越し汚染シグナルは、ユニバーサル増幅工程の間の標準的なウラシル組み込みによって、ならびにプレ増幅ワークアップ手順においてUNGおよびAPエンドヌクレアーゼを用いて排除されてもよい。
【００８８】
第3のテーマは標的非依存的シグナルである。これは、正しい標的の非存在下で生じたポリメラーゼ反応またはリガーゼ反応のいずれかから発生する。このシグナルの一部は賢いプライマー設計によって最小化され得る。連結反応の場合、連結に適するように、(下流連結プライマーが標的にハイブリダイズされた場合にだけ)下流連結プライマーの5'リン酸を遊離するためにポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性が使用され得る。低レベル変異の存在を区別するためのさらなる特異性は、(i)3'OHから2番目または3番目の位置にミスマッチを含有する上流LDRプライマー、および(ii)連結するが、さらなる増幅を受けない、野生型配列に対するLDRプライマーを使用することによって達成され得る。
【００８９】
第4のテーマは、反応中の未使用プライマーによる抑制された(低減された)増幅または不正確な(間違った)増幅である。このような未使用プライマーを排除するアプローチの1つは、固体支持体上にゲノムDNAを捕捉し、連結プライマーがハイブリダイズおよび連結するのを可能にし、次いで、固体支持体上にあるゲノムDNAにハイブリダイズされなかったプライマーまたは産物を除去するアプローチである。別のアプローチは、下流連結プライマーの3'末端がそれ自身の5'末端の一部にハイブリダイズし、ヌクレアーゼ切断および後の連結工程が成功していればプライマーから無くなっている配列にハイブリダイズするアプローチである。切断されなかったプライマーは自己伸長して、さらなる増幅を受けない、さらに長いヘアピンループを形成する。さらに別のアプローチは、PCRゲノムプライマーまたはLDRゲノムプライマーのいずれかに、ユニバーサルプライマーよりわずかに短いユニバーサルプライマーテールを使用することである。これにより、(複合PCRプライマーまたはLDRプライマーが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーが優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。
【００９０】
本明細書に記載の本発明の方法は、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する1つまたは複数の低含量標的核酸分子を検出および定量することができる。本明細書で使用する「低含量標的核酸分子」とは、試料の1％〜0.01％と低いレベルで存在する標的核酸分子をいう。言い換えると、本発明の方法を用いて、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷ヌクレオチド塩基を有する低含量核酸分子は、試料中の100〜10,000倍過剰な量の核酸分子と区別することができ、該過剰な量の核酸分子は、低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有するが、1つまたは複数のヌクレオチド塩基の挿入、欠失、転座、変異、および/または損傷塩基の全核酸試料を有さない。本発明の一部の態様において、試料中の過剰量の核酸分子に由来するコピー数と比較して1つまたは複数の低含量標的ヌクレオチド配列のコピー数が定量され、該過剰量の核酸分子は、低含量核酸分子と類似のヌクレオチド配列を有する。本発明の他の態様において、試料中の他のヌクレオチド配列と比較して1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列が定量される。本発明の他の態様において、1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の相対的コピー数が定量される。
【００９１】
検出される低含量標的核酸分子は、組織、細胞、血清、血液、血漿、羊水、痰、尿、体液、身体分泌物、身体排泄物、無細胞循環核酸、妊婦における無細胞循環胎児核酸、循環腫瘍細胞、腫瘍、腫瘍生検材料、およびエキソソームを含むが、それに限定されるわけではない任意の生物学的試料に存在することができる。
【００９２】
早期癌検出に関して、本明細書の予言的な実施例に記載のように、本発明の方法は公知の遺伝子(例えば、Braf、K-ras)における繰り返し変異(repeat mutation)、および珍しい変異が試料の1％〜0.01％に存在する場合に、公知の遺伝子(例えば、p53)における珍しい変異を検出するのに適している。本発明の方法はまた、エキソソームから単離された腫瘍特異的mRNA(例えば、結腸腫瘍組織と対応する正常粘膜を区別する1ダースの発現マーカー)、およびエキソソームまたはアルゴノート(Argonaut)タンパク質から単離された腫瘍特異的miRNA(例えば、結腸腫瘍組織と対応する正常粘膜を区別する1ダースのマイクロRNAマーカー)の正確な定量を実現することができる。本発明の方法はまた、循環腫瘍細胞から単離されたDNAにおける腫瘍特異的コピー変化(例えば、結腸腫瘍組織と対応する正常粘膜を区別する1ダースのコピー変化)の正確な定量、および循環腫瘍細胞から単離されたDNA(例えば、K-ras、B-raf、AKT、p53、BRCA1遺伝子)における変異の検出も提供する。
【００９３】
本発明はまた、アウトカムを予測し得る、または治療の指針となり得る、(i)エキソソームまたは循環腫瘍細胞から単離された腫瘍特異的mRNA、(ii)エキソソームまたはアルゴノートタンパク質から単離された腫瘍特異的miRNA、および(iii)循環腫瘍細胞から単離されたDNAにおける腫瘍特異的コピー変化を正確に定量することもできる。本発明はまた、アウトカムを予測する、または治療の指針となる、循環腫瘍細胞から単離されたDNA、例えば、K-ras、B-raf、AKT、p53、BRCA1または他の遺伝子における変異も検出することもできる。
【００９４】
出生前診断に関して、本発明の方法は、コピー数を計数することによって異数性(例えば、21番染色体トリソミー)、公知の遺伝子における、ありふれた変異を含有する遺伝性疾患(例えば、鎌状赤血球性貧血、嚢胞性線維症)、公知の遺伝子において珍しい変異を含む遺伝性疾患(例えば、家族性腺腫性ポリポーシス)、公知の遺伝子における公知または孤発性のコピー数の減少または増加に起因する遺伝性疾患(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー)の検出、および父子鑑定が可能である。
【００９５】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットに関する。該キットは、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素、リガーゼ、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有する。オリゴヌクレオチドプローブセットはそれぞれ、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および(b)標的特異的部分を有する第2のオリゴヌクレオチドプローブを有し、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするように構成され、第1のオリゴヌクレオチドプローブと第2のオリゴヌクレオチドプローブの間に接合部を有し、かつ、プローブセットにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分は、第1のオリゴヌクレオチドプローブと接合部で重複する同一のヌクレオチドを有する。
【００９６】
本発明の別の局面は、試料中の1つまたは複数の標的ヌクレオチド配列の存在を特定するためのキットに関する。このキットは、5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素、リガーゼ、および1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有する。オリゴヌクレオチドプローブセットはそれぞれ、(a)標的特異的部分を有する第1のオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに(b)5'非標的特異的フラップ部分と1つまたは複数のチオリン酸修飾ヌクレオチド塩基を含有する標的特異的部分とを有する、第2のオリゴヌクレオチドプローブを有し、プローブセットの第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列上でハイブリダイズするように構成される。
【実施例】
【００９７】
予言的な実施例
以下の実施例は、本発明の予言的な態様を例示するために提供されるが、決して、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００９８】
予言的な実施例1-高感度変異マーカー(1％〜0.01％に存在する)の検出;公知の遺伝子における繰り返し変異
癌遺伝子における変異変化は、通常、別々の領域または位置にあり、多くの場合、腫瘍進行の駆動力となり得る。これらの遺伝子およびこれらの変異のリストはサンガーゲノムセンター(Sanger Genome Center)「COSMIC」データベースなどの公共データベースにおいて見つかる可能性がある。血清中のこのような変異の存在は体内にある何らかの腫瘍組織の強力な指標である。従来、このような変異はアレル特異的PCR増幅を用いて特定されてきた。このアプローチは、最初の間違った増幅と、それに続く間違った産物の増幅を受けやすい。血清中の変異DNAの定量を試みるためにデジタルPCRも用いられてきた。
【００９９】
アプローチの概略:このアプローチは、2種類の酵素の忠実度:(i)下流プライマーの5'側におけるマッチとミスマッチの識別ではポリメラーゼ5'→3'ヌクレアーゼまたはフラップ切断酵素、および(ii)上流プローブの3'側におけるマッチとミスマッチの識別ではリガーゼに依存する。後者は、3'末端において完全にマッチする場合には3'末端のハイブリダイゼーションをわずかに不安定化するが、3'末端においてミスマッチがある場合には3'末端のハイブリダイゼーションを著しく不安定化する、3'末端から2番目または3番目の塩基において意図的なミスマッチまたはヌクレオチド類似体を使用することによってさらに強化される。最後に、サイクル時間および条件の変更などのキネティックアプローチによって、野生型テンプレートと変異テンプレートとの識別を強化することができる。連結事象が起こると、これらの産物は後のPCR増幅工程において増幅される。従って、これは重要な識別工程である。
【０１００】
最も困難なケースは、コドン12の6つの変化およびコドン13の1つの変化が全て間隔をあけて並んでいるK-ras変異の場合である。一般的に、最も高い忠実度のために、変異プライマーと野生型配列の間のミスマッチは少なくとも、最後の塩基についてはG:TでなくC:Aでなければならない。従って、なんとしても、1回の反応につき上の鎖プライマーおよび下の鎖プライマーを両方とも、すなわち2つの初回連結チューブを走らせる必要がある。しかしながら、変異を見つけることが目的であり、異なる変異を互いに区別することが目的とは限らないので、複数の変異が同じUniTaq配列または他の検出可能な部分(ジップコード、検出可能な標識)に割り当てられてもよい。
【０１０１】
第2の問題は、最後から2番目の位置にある塩基がC:AまたはG:Tミスマッチである場合に、連結のために最も高い忠実度が実現するということである。これにより収率が下がる可能性があるが、忠実度は改善される。
【０１０２】
第3の問題は、3'側から3番目の位置にミスマッチを有する、野生型配列に対する任意の上流プローブも含めることである。しかしながら、この上流領域はUniTaqおよびユニバーサルプライマー領域を欠いており、従って、増幅することができない。さらに、3番目の位置にミスマッチを作ることによって、変異LDRプローブは3'側にある最後の3つの位置にミスマッチがあり、その結果、残っている正常LDR連結産物を偶然にPCR増幅することができない。野生型配列に対する下流プローブは、この重要な塩基に野生型塩基を含有する。このプライマーはUniTaqおよびユニバーサルプライマー領域も欠いており、従って、増幅することができない。
【０１０３】
異なるプライマーが(まれな)変異配列との結合において互いに競合するので、全てのプローブが正しい配列にハイブリダイズすることが重要である。K-rasコドン12の1番目の位置の変異に対する4種類の上流プローブおよび4種類の下流プローブが存在し、16通りの可能性のある異なる組み合わせが得られる。正常配列への変異プローブの間違った連結/間違ったシグナルを回避するが(従って、増幅をしない、UniTaqおよびユニバーサルプライマーテールを欠いている正常プローブ)、変異配列の存在下では正しい連結も生じることが目標である。従って、非連結プローブはテンプレートから外れ落ちるが、連結産物は外れ落ちないように、温度は連結の場合、60℃(10分)と75℃(1分)の間を変動する「ミニサイクリング」を組み込むことができる。
【０１０４】
要約すると、それぞれの変異を検出のための2種類のプローブを用いた前記アプローチの識別レベルは、
1.下流プローブに対するポリメラーゼまたはFenヌクレアーゼの5'-3'ヌクレアーゼ活性の使用、
2.上流プローブに対する耐熱性リガーゼの3'連結忠実度の使用、
3.上流プローブの3'末端から2番目または3番目の塩基におけるミスマッチまたはヌクレオチド類似体の使用、
4.変異プローブが野生型DNA上で連結するのを抑制するための、野生型配列を有するプローブの使用、
5.変異が存在した場合の産物の収率を改善するためのミニサイクリング条件の使用、
6.切断されなかった場合に低温でヘアピンを形成し、自己伸長して、増幅しない産物を形成するような、下流オリゴヌクレオチドプローブの5'末端における配列の使用
である。
【０１０５】
代替アプローチ(以下を参照されたい)、繋ぎ止められたかまたは結合された対応する上流および下流プライマーを使用することも可能である。この場合、識別力のある塩基は、3'末端上および5'末端上の同じ塩基または5'末端上のフラップ切断前の最後の塩基である。(i)ある特定の変異に対する下流プローブが完全にマッチしたハイブリダイゼーションを有する場合の5'リン酸を遊離する効率的なポリメラーゼ5'→3'ヌクレアーゼ切断と、それに続く、(ii)再度、変異塩基と完全にマッチする場合の上流プローブの3'末端への効率的な連結に最適な時間を求めるために、サイクル条件を変えることができる。同時に、不正確な塩基(すなわち、ミスマッチ)があった場合の下流プローブのポリメラーゼ5'→3'ヌクレアーゼ切断と、それに続く、リガーゼによる上流プローブの不正確な連結(これもミスマッチがあった場合)は、両反応が生じるのを可能にする時間を短縮し、その後に、不正確なテンプレートからプローブを変性させるように温度を上げることによって最小化することができる。
【０１０６】
考慮すべき、結合されたプローブの2つのバリエーションが存在する。(図8に示した)第1のバリエーションでは、結合されたプライマーは、(i)連結産物の周囲でのポリメラーゼ複製をブロックする配列を含有し、(ii)連結されなかった、結合されたプローブが低温でヘアピンを形成し、自己伸長して、増幅しない産物を形成する配列を形成するように設計される。
【０１０７】
要約すると、それぞれの変異を検出するために、結合されたオリゴヌクレオチドプローブを使用する第1のバリエーションの識別レベルは、
1.下流プローブ部分に対するポリメラーゼまたはFenヌクレアーゼの5'-3'ヌクレアーゼ活性の使用、
2.上流プローブ部分に対する耐熱性リガーゼの3'連結忠実度の使用、
3.上流プローブ部分の3'末端から2番目または3番目の塩基におけるミスマッチまたはヌクレオチド類似体の使用、
4.変異が存在した場合にだけ連結産物を生成する特異性を改善するためのサイクル条件の使用、
5.標的非依存的事象を最小限にするための低プライマー濃度の使用、
6.連結されなかった場合に、低温でヘアピンを形成し、自己伸長して、増幅しない産物を形成するような、結合されたプローブに対する配列の使用
である。
【０１０８】
第2のバリエーションでは、結合されたプローブは、図7に示したように連結工程の後に切断され得る配列(例えば、UNGによって標的化されるdUトラクト)を含有するように設計される。この切断の前に、連結されなかった、結合されたプライマー(ならびにインプットテンプレートDNA)はエキソヌクレアーゼ消化によって除去される。
【０１０９】
要約すると、それぞれの変異を検出するための、結合されたプライマーを使用する第1のバリエーションの識別レベルは、
1.下流プローブ部分に対するポリメラーゼまたはFenヌクレアーゼの5'-3'ヌクレアーゼ活性の使用、
2.上流プローブ部分に対する耐熱性リガーゼの3'連結忠実度の使用、
3.上流プローブ部分の3'末端から2番目または3番目の塩基におけるミスマッチまたはヌクレオチド類似体の使用、
4.変異が存在した場合にだけ連結産物を生成する特異性を改善するためのサイクル条件の使用、
5.標的非依存的事象を最小限にするための低プライマー濃度の使用、
6.連結されなかったプローブおよび標的を破壊するエキソヌクレアーゼの使用
である。
【０１１０】
存在するDNAの総量の対照として、近くの標的領域を選択することができる。下流に連結される上流オリゴヌクレオチドは、2種類のオリゴヌクレオチド:(i)1/100の割合で存在し、正しいUniTaq特異的配列を有する、オリゴヌクレオチド、および(ii)99/100の割合で存在し、その3'末端に相補的な約8〜10塩基を有する配列を有する、オリゴヌクレオチドの混合物である。UniTaq配列を含有する連結産物は増幅し、元のテンプレートの100分の1に等しいシグナルを発する。連結産物の大部分は5'末端にユニバーサル配列を欠き、指数関数的に増幅しない。非連結上流プライマーはそれ自身でヘアピンを形成し、その3'配列を自己伸長し、別のPCRアンプリコンの一部になる争いから脱落する。
【０１１１】
存在するDNAの総量の対照として、このアプローチは、再度、近くの標的領域の上で、結合されたプローブと共に使用することもできる。2種類のオリゴヌクレオチド:(i)1/100の割合で存在し、正しいUniTaqおよび/または他のタグ配列を有するオリゴヌクレオチド、ならびに(ii)99/100の割合で存在し、不正確なタグ配列を欠いている配列、または不正確なタグ配列を有する配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物を使用する。UniTaqおよび/またはタグ配列を含有する連結産物は増幅し、元のテンプレートの100分の1に等しいシグナルを発する。連結産物の大部分は不正確なタグ配列を欠いている、または不正確なタグ配列を有し、指数関数的に増幅しない。
【０１１２】
詳細なプロトコール:変異マーカー(1％〜0.01％に存在する場合)の高感度検出、公知の遺伝子における繰り返し変異(図6を参照されたい)
工程1:第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、UniTaq Aiと、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基を含有する「上流プローブ」)、第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的特異的配列--UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'が続く)、Taqポリメラーゼ、および耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)を含有する「下流プローブ」)の存在下で、血清由来ゲノムDNAを変性させる(94℃ 1分)。1回または複数回の連結検出反応を行う。ここで、アニーリング温度は、連結の場合、60℃(10分)と75℃(1分)の間で1回または複数回サイクルする。これにより、変異DNAが存在すれば連結事象が発生することが可能になる。
【０１１３】
工程2:ホットスタートdNTPのユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。非連結下流プローブが、3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成し、自己ヘアピンが伸長して、これらの下流プローブをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンを生成するように、55℃でインキュベートする(dNTPを活性化する)。次いで、PCR増幅を8〜20サイクル進める。理想的には、LDR複合プローブ上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。これにより、(LDRプローブが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーU1およびU2が優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０１１４】
工程3:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをTaqmanウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:ユニバーサルプライマーU2および形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq AiのUniTaq特異的プライマーを含有する(式中、F1は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)。これらの条件下で、以下の産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０１１５】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピンを形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、F1蛍光色素が遊離される。
【０１１６】
前記のように、ジップコードアレイ、ジップコードTaqman、または従来のTaqman検出を用いて高感度変異検出が行われてもよい。簡単に述べると、このアプローチでは、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、ジップコードZiと、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基が続く)、ならびに下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的特異的配列--ユニバーサルプライマーU2'が続く)が用いられる。ユニバーサルPCR増幅の後、これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-ジップコードZi-上流標的-変異-下流標的-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０１１７】
捕捉用オリゴヌクレオチドを含有するユニバーサルアレイを用いて検出するために、ユニバーサルプライマーU2はレポーター標識、すなわち、蛍光基を含有するのに対して、ユニバーサルプライマーU1は5'リン酸を含有し、増幅は合計約30〜40サイクル続く。これにより、第2鎖を消化するためにλエキソヌクレアーゼの使用が可能になり、蛍光標識産物は一本鎖になり、かつ捕捉用オリゴヌクレオチドを含有するユニバーサル(ジップコード)アレイ上でのハイブリダイゼーションに適するようになる。
【０１１８】
代替アプローチでは、スプリットジップコード配列を用いた高感度変異検出が行われてもよい。このアプローチでは、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1、第1の半分のジップコード配列Aiおよび短い配列Ciの後ろに、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基)、ならびに下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的特異的配列-短い配列の相補鎖Ci'、第2の半分のジップコード配列Ai-ユニバーサルプライマーU2'が続く)が用いられる。ユニバーサルPCR増幅の後、これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-変異-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０１１９】
短いCiが短いCi'と一過的にハイブリダイズした場合に、第1の1/2ジップコードZi配列は第2の1/2ジップコードZiに近接され、ジップコードZiの半分の配列が両方とも、ジップコードアレイ上にある完全長ジップコードZi'配列とハイブリダイズした場合に、一過的ハイブリダイゼーションは安定化され得る。
【０１２０】
さらに、前記の構築物は、以下の通りに示される、ユニバーサルプライマーの内側にユニーク配列(0〜10個の塩基)(ユニークAi、ユニークBi)を含んでもよい。
ユニバーサルプライマーU1-ユニークAi-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-変異-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニークBi-ユニバーサルプライマーU2'
【０１２１】
ジップコードTaqmanアッセイ法を用いて検出するために、8〜20サイクルのユニバーサル増幅の後、試料を10〜100倍に希釈し、それぞれの産物についてユニークAiユニークBi配列と重複するユニークプライマーを添加する。Taqmanプローブは完全長ジップコード配列に対するものである。
【０１２２】
標的配列間の各接合配列は独特であるので、初回ユニバーサル増幅の産物も次世代配列決定を用いて特定および定量することができる。(配列決定によって、不正確な断片の標的非依存的連結を特定することができるが、正常な標的上での変異連結プローブの誤った連結の場合は特定することができない。しかしながら、野生型配列に対する非増幅上流連結プローブを使用することによって、このような不正確な連結は大幅に最小化されるはずである)。
【０１２３】
この問題の代替アプローチは、野生型配列に対するプローブを使用せず、その代わりに、非連結末端を介して互いに結合された連結プローブを使用するアプローチである。これにより低いプライマー濃度の使用が可能になる。さらに、この代替アプローチは、連結後反応を受けないように、非連結の上流プライマーと下流プライマーの両方を除去する簡単なやり方を提供する。
【０１２４】
変異マーカー(1％〜0.01％に存在する場合)を高感度検出するための詳細なプロトコール、結合されたプローブを用いた公知の遺伝子における繰り返し変異(図8を参照されたい):
工程1:上流LDRプライマー部分(5'ユニバーサルプライマーU1--UniTaq Aiの後ろに、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基が続く)が、対応する下流LDRプライマー部分(同じ5'変異塩基または同じ変異塩基を含有するフラップの後ろに、標的特異的配列--UniTaqBI'--ユニバーサルプライマーU2'-および上流プライマー配列部分の遊離3'末端に相補的な8〜10塩基の標的特異的配列が続く)に結合された、結合されたオリゴヌクレオチドプローブ、Taqポリメラーゼ、ならびに耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)の存在下で、血清由来ゲノムDNAを変性させる(94℃ 1分)。このバリエーションでは、結合されたプローブはさらなる塩基またはスペーサーだけを含有してもよいが、ポリメラーゼがコピーしない領域を含有しなければならない。ミスマッチポリメラーゼ切断/連結と比較して、完全マッチポリメラーゼ切断/連結に最適化されている1回または複数回の連結反応を行う。これにより、変異DNAが存在すれば連結事象を発生することができる。
【０１２５】
工程2:ホットスタートdNTPのユニバーサルプライマーU1、およびユニバーサルプライマーU2を添加する。連結されなかった、結合されたプローブが、3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成し、自己ヘアピンが伸長して、これらの結合されたプライマーをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンを生成するように、55℃でインキュベートする(dNTPを活性化する)。次いで、PCR増幅を8〜20サイクル進める。理想的には、ブリッジ(bridge)プライマー上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。標的非依存的増幅を最小限にするための任意のバリエーションにおいて、ブリッジPCRプライマーはウラシル塩基およびブロックされた3'末端を含有する。ブロックされた3'末端は、プライマーがその標的にハイブリダイズされた場合にウラシル塩基を切断するRNアーゼ-Hによって遊離される。これらの条件によって、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
のユニバーサル増幅産物が生成される。
【０１２６】
工程3:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをTaqmanウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:ユニバーサルプライマーU2および形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq AiのUniTaq特異的プライマー (式中、F1は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)を含有する。これらの条件下で、以下の二次伸長産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０１２７】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピンを形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、F1蛍光色素が遊離される。
【０１２８】
前記の中の一バリエーションでは、対応する下流LDRプライマー部分、すなわち、同じ5'変異塩基または同じ変異塩基を含有するフラップの後ろに標的特異的配列--UniTaq BI'が続く、は、上流プライマー配列部分の遊離3'末端に相補的な標的特異的配列の8〜10塩基を含まない。代わりに、結合されたプローブは、エキソヌクレアーゼ消化を阻害せず、エキソヌクレアーゼ消化工程後およびポリメラーゼ増幅工程前に切断され得る内部配列を含有する。このような配列の一例は、ウラシルDNAグリコシラーゼによって後で切断され得るウラシル塩基の使用である。この例では、連結工程後に、連結されなかった、結合された全てのプローブ、ならびに全てのインプット標的DNAを消化するために、エキソヌクレアーゼIおよびエキソヌクレアーゼIIIが両方とも添加される。エキソヌクレアーゼを加熱死(heat kill)させた後、後のPCR増幅のために連結プローブを直線化するためにウラシルDNAグリコシラーゼが添加される。
【０１２９】
前記バリエーションの両方において、一方または両方のユニバーサルプライマーU1配列および/もしくはユニバーサルプライマーU2'配列またはその一部を使用せずに、結合されたプローブは合成されてもよく、従って、ユニバーサルPCR増幅工程の間に1つまたは2つのブリッジプライマー(ユニバーサルプライマーU1-UniTaq AiおよびユニバーサルプライマーU2-UniTaq Bi)が必要とされる。
【０１３０】
変異、挿入、および欠失を検出するための可能性のあるプライマー設計の概要を図2に示した。一塩基変異の場合、3'末端から2番目または3番目(図示せず)の位置にある「Z」塩基は、dG、dA、イノシン、ニトロインドール、ニトロピロール、または他のヌクレオチド類似体を表し、3'末端を不安定化することによって、変異プローブが野生型標的にハイブリダイズされた場合の不適切な誤った連結を低減する(図2A)。挿入または欠失の場合、安定性を改善する、2番目または3番目の位置に対応する塩基またはヌクレオチド類似体(例えば、2-アミノ-dAまたは5-プロピニル-dC)を使用すると、このようなフレームシフト変異と野生型配列との識別が改善され得る。挿入の場合、下流プローブの望ましい切断しやすいリン酸結合の下流に1つまたは複数のチオリン酸基を使用すると、プローブが野生型DNAにハイブリダイズされた場合に、ポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性による不適切な切断が阻止され、従って、野生型標的上での偽陽性連結が低減する(図2B)。同様に、欠失の場合、下流プローブの望ましい切断しやすいリン酸結合の上流に1つまたは複数のチオリン酸基を使用すると、プローブが野生型DNAにハイブリダイズされた場合に、ポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性による不適切な切断が阻止され、従って、野生型標的上での偽陽性連結が低減する(図2C)。図8に示したように、上流プローブおよび下流プローブからのタグも、これらの非連結末端を介して結合されてもよい。
【０１３１】
蛍光標識:5種類の蛍光シグナル、F1、F2、F3、F4、およびF5をそれぞれ検出することができる機器を考える。一例として、結腸癌の場合、K-ras、p53、APC、およびBRAFについて最高頻度の変異が見出される。これらの4つの遺伝子における変異は単一蛍光シグナル;F1、F2、F3、F4を用いて検出することができる。スケールが1000FUであれば、これらの遺伝子の変異標的上でLDR産物が増幅されることによって安定水準で約300FUが得られるような標識UniTaqプライマーおよび非標識UniTaqプライマーの比を用いてプライマーが添加される。対照のために、F5は、1:1,000希釈の定量対照については100FUのシグナルを発し、野生型対照上で変異プローブが連結された場合はさらに300FUのシグナルを発するように較正される(バックグラウンドシグナルを発してはならないか、または低バックグラウンドシグナルを発しなければならない)。
【０１３２】
以下で示したように結腸癌においてよく変異している他の遺伝子(またはp53遺伝子におけるさらに少ない量の変異)については、以下のコーディングシステムが用いられてもよい。すなわち、等モル量の2種類の蛍光シグナルが100 FUで安定水準に達するように、両蛍光シグナルが同じUniTaqの5'末端にあり、非標識プライマーは滴定される。蛍光シグナルがF1、F2、F3、F4であれば、単一蛍光シグナルを用いて4つの遺伝子における変異を検出する能力、および蛍光シグナルの組み合わせを用いて6つの遺伝子における変異を検出する能力が得られる。
遺伝子1=F1(300FU)(p53、ホットスポット)
遺伝子2=F2(300FU)(KRAS)
遺伝子3=F3(300FU)(APC)
遺伝子4=F4(300FU)(BRAF)
遺伝子5=F1(100FU)、F2(100FU)(PIK3CA)
遺伝子6=F1(100FU)、F3(100FU)(FBXW7)
遺伝子7=F1(100FU)、F4(100FU)(SMAD4)
遺伝子8=F2(100FU)、F3(100FU)(p53、その他)
遺伝子9=F2(100FU)、F4(100FU)(CTNNB1)
遺伝子10=F3(100FU)、F4(100FU)(NRAS)
【０１３３】
上位遺伝子の1つにおける変異と組み合わせて別の変異が存在すると仮定する。他の蛍光シグナルと重複しているかどうかに関係なく上位遺伝子の方が常に強いシグナルを発するので、これは区別することが容易である。例えば、蛍光シグナルがF1 100 FUおよび F2 400 FUである場合には、これは遺伝子2および遺伝子5における変異に対応し得る。
【０１３４】
まれに変異する遺伝子(遺伝子5〜遺伝子10)から2つの変異が存在する場合には、結果は蛍光シグナルの重複、すなわち、F1 200 FU、 F2 100 FU、 F4 100 FUとして、または4種類全ての蛍光シグナルとして現れ得る。蛍光シグナルが2:1:1の比であれば、2つの変異を理解することはかなり簡単である。すなわち、前記の例において、F1 200 FU、 F2 100 FU、 F4 100 FUは遺伝子5および遺伝子7における変異に対応し得る。
【０１３５】
4種類全ての蛍光シグナルの場合、変異の濃度がぴったり同一である、すなわち、4種類全ての蛍光シグナルが同じ時間で現れ始める、または同じCtを生じる可能性は極めて低い。変異検出の点で2種類の蛍光シグナルが互いに結び付けられていれば、これらのキネティクスは同じはずである。例えば、F1 100 FU およびF2 100 FUのCtが31であり、F3 100 FUおよびF4 100 FUのCtが31.8であル場合には、このパターンは遺伝子5および遺伝子10における変異に対応し得る。
【０１３６】
最後に、3種類または4種類の蛍光シグナルが現れたら、少なくとも2つの遺伝子が変異を含有することが分かる。このことから、変異がどういったものであるかに関係なくcDNAが腫瘍または癌の証拠を反映している可能性が極めて高い。
【０１３７】
代替アプローチでは、ジップコードアレイ、ジップコードTaqman、または従来のTaqman検出を用いて高感度変異検出が行われてもよい。このアプローチでは、上流第1のオリゴヌクレオチド連結プローブ(5'ジップコードZiの後ろに、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基が続く)が、対応する下流第2のオリゴヌクレオチド連結プローブ(同じ5'変異塩基の後ろに標的特異的配列--ユニバーサルプライマーU2'-および上流プライマー配列の遊離3'末端に相補的な8〜10塩基の標的特異的配列が続く)に結合されたものが用いられる。ユニバーサルPCR増幅の後、以下の増幅産物:
ユニバーサルプライマーU1-ジップコードZi-上流標的-変異-下流標的-ユニバーサルプライマーU2'
が形成される。
【０１３８】
捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を含むユニバーサル(ジップコード)アレイを用いて検出するために、ユニバーサルプライマーU2はレポーター標識、すなわち、蛍光基を含有するのに対して、ユニバーサルプライマーU1は5'リン酸を含有し、増幅は合計約30〜40サイクル続く。これにより、第2鎖を消化するλエキソヌクレアーゼの使用が可能になり、蛍光標識産物は一本鎖になり、かつユニバーサル(ジップコード)アレイ上でのハイブリダイゼーションに適するようになる。
【０１３９】
代替アプローチでは、スプリットジップコード配列を用いていかに高感度でも変異検出が行われてもよい。このアプローチでは、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1、第1の半分のジップコード配列Aiおよび短い配列Ciの後ろに、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基が続く)が、対応する下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(同じ5'変異塩基の後ろに標的特異的配列--短い配列の相補鎖Ci'、第2の半分のジップコード配列Ai-ユニバーサルプライマーU2'-および上流プライマー配列の遊離3'末端に相補的な8〜10塩基の標的特異的配列が続く)に結合されたものが用いられる。ユニバーサルPCR増幅の後、増幅産物は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-変異-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニバーサルプライマーU2'
を有する。
【０１４０】
短いCiが短いCi'と一過的にハイブリダイズすると第1の1/2ジップコードZi配列は第2の1/2ジップコードZiに近接され、ジップコードZiの半分の配列が両方とも、ジップコードアレイ上にある完全長ジップコードZi'配列とハイブリダイズすると一過的ハイブリダイゼーションは安定化され得る。
【０１４１】
さらに、前記の構築物は、以下の通りに示される、ユニバーサルプライマーの内側にユニーク配列(0〜10個の塩基)(ユニークAi、ユニークBi)を含んでもよい。
ユニバーサルプライマーU1-ユニークAi-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-変異-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニークBi-ユニバーサルプライマーU2'
【０１４２】
ジップコードTaqmanアッセイ法を用いた検出のために、8〜20サイクルのユニバーサル増幅の後、試料を10〜100倍に希釈し、それぞれの産物についてユニークAiユニークBi配列と重複するユニークプライマーを添加する。Taqmanプローブは完全長ジップコード配列に対するものである。
【０１４３】
予言的な実施例2-高感度変異マーカー(1％〜0.01％に存在する);公知の遺伝子における珍しい変異
p53およびAPCなどの腫瘍抑制遺伝子における変異変化は多すぎて、アレル特異的PCRアプローチを用いてカバーすることができない。従って、このアプローチは、タンパク質の全エキソンにわたるディープシークエンシングにシフトした。インプットDNAが限定的である場合、同じ全般的なカバレッジの深度(depth of coverage)を確実なものにするために異なる領域を均等に増幅することが重要である。
【０１４４】
アプローチの概略:この考えは、配列決定の前に、存在する全てのエキソンのコピーを忠実に作製し、全てを限定して均等に増幅することである。野生型断片を濃縮するためにコールドPCRのような、うまいやり方が用いられることもあるが、このようなアプローチは関心対象の遺伝子内にあるSNPに対して脆弱である。さらに、このような濃縮アプローチは断片を均等に増幅する可能性は低く、このため大規模シークエンシングのタスクは雑になる。
【０１４５】
全てのエキソンをコピーするために、上流連結プローブを、評価されているDNAの質に応じて約100〜160bp下流にある下流連結プローブと対にした。DNAが血清に由来するのであれば、この場合、腫瘍由来DNAの平均サイズは約160塩基であり、これより小さなサイズのアンプリコンが用いられ、チューブを順に交替させるために重複タイリング(overlapping tiling)戦略が用いられる。
【０１４６】
ここでの課題は、連結工程なしでポリメラーゼが下流プローブを破壊するように上流プライマーを伸長するのを回避することである。これは、(ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって遊離される)5'リン酸末端から2番目および3番目の位置にチオリン酸結合を組み込むことによって達成される。ポリメラーゼが1塩基だけ多すぎて伸長させる場合に(これにより下流プローブに連結することが不可能になる)、これらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限にするために、連結接合部における標的塩基は優先的に3'側ではATリッチであり、5'側ではGCリッチであると考えられる。
【０１４７】
代替アプローチは、望ましい5'リン酸に隣接した位置に脱プリン塩基(AP)部位を含有する下流連結プローブを使用するアプローチである。この5'リン酸は耐熱性EndoIII(例えば、Tma EndoIII)を用いて遊離される。この酵素は、プローブが標的に結合した場合にAP部位を切断して5'リン酸を残す。エンドヌクレアーゼも一本鎖プローブを切断するが、低い効率で切断し、従って、テンプレートにハイブリダイズされたプローブは好ましい基質である。耐熱性EndoIIIを使用する場合、使用するPCRポリメラーゼには5'→3'エキソヌクレアーゼ活性が無い。
【０１４８】
変異マーカー(1％〜0.01％に存在する)を高感度検出するための詳細なプロトコール;公知の遺伝子における珍しい変異(図14):
工程1:上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに3'末端における標的特異的配列が続く)、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的特異的配列--ユニバーサルプライマーU2'が続く)、ホットスタートTaqポリメラーゼ、dNTP、および耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)の存在下で、血清由来ゲノムDNAを変性させる(ホットスタートTaqポリメラーゼを活性化するために94℃、5分)。94℃から冷却する場合に、70℃で一時停止して、最初に下流プローブがアニールし、次いで、反応が65℃または60℃まで冷却された場合に、上流プローブがハイブリダイズし、ポリメラーゼが2つのプローブ間でDNAのコピーを作製し、下流プローブからの5'テールを切り取り、次いで、耐熱性リガーゼがニックを塞ぐことができるように、下流プローブは上流プローブより長く、高いTm値を有する。ポリメラーゼが下流プローブを消化せず、脱落して、連結工程を可能にするように、下流プローブは、(ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって遊離される)5'リン酸末端から2番目および3番目の位置にチオリン酸結合を有する。
【０１４９】
工程2:ユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。非連結下流プローブが、3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成するように、55℃でインキュベートする。自己ヘアピンは伸長して、これらの下流プローブをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンが生成される。次いで、PCR増幅を8〜20サイクル進める。理想的には、複合連結プローブ上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。これにより、(複合連結プローブが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーU1およびU2が優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。次いで、増幅を8〜20サイクル進める。これらのユニバーサルPCR条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-約100〜160塩基の標的-(おそらく変異を含有する)-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０１５０】
工程3:次いで、遺伝子における変異の存在は次世代配列決定技術を用いて特定することができる。
【０１５１】
変異を含有する少数のインプットDNA分子を過剰量の野生型DNAの存在下で扱う場合、ポリメラーゼエラーの可能性がある。その結果、複数の読み取りにおいて両鎖にある変異の存在を確認する必要がある。
【０１５２】
代替工程1では、上流連結プローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、3'末端における標的特異的配列が続く。3'→5'校正活性を有するポリメラーゼを使用した場合にプローブを消化するのを回避するために3'末端から1番目および2番目の位置にチオリン酸結合がある)、下流連結プローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。脱プリン塩基部位の後ろに標的特異的配列--ユニバーサルプライマーU2'が続く)、dNTP、耐熱性EndoIII(好ましくはTma EndoIII)、ならびに耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)の存在下で、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠く(好ましくは、3'→5'校正活性を含有する)耐熱性ポリメラーゼが用いられる。94℃から冷却する場合に、70℃で一時停止して、最初に下流プローブがアニールし、EndoIIIによって切り取られて5'末端を遊離し、次いで、反応が65℃または60℃まで冷却された場合に、上流プローブがハイブリダイズし、ポリメラーゼが2つのプライマー間でDNAのコピーを作製し、次いで、耐熱性リガーゼがニックを塞ぐように、下流プローブは上流プローブより長く、高いTm値を有する。
【０１５３】
予言的な実施例3-エキソソームから単離された腫瘍特異的mRNAの正確な定量
過去数年間に、いくつかのグループが、元の腫瘍細胞に特異的なmiRNAおよびmRNAを含有する腫瘍特異的エキソソームを捕捉している。これらのマーカーの正確な定量は、早期癌の特定、ならびにアウトカムを予測するためのシグネチャーの提供に役立つ可能性がある。従来、mRNA発現の相対的レベルは逆転写-リアルタイムPCRを用いて求められる。
【０１５４】
アプローチの概略:1ダース程度の遺伝子に由来するmRNAコピーが試料中にいくつ存在するかを数えるのが、ここでの考えである。初回逆転写工程によってmRNAの全ての望ましい領域のDNAコピーを作製し、次いで、1転写物当たり1つまたは2つの連結プローブペアを用いて関心対象のそれぞれの転写物の量を正確に定量することができる。
【０１５５】
ここでの課題も、連結工程なしでポリメラーゼが下流プローブを破壊するように上流プローブを伸長するのを回避することである。これは、(ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって遊離される)5'リン酸末端から2番目および3番目の位置にチオリン酸結合を組み込むことによって達成される。1ポリメラーゼが1塩基だけ多すぎて伸長させる場合に(これにより下流プライマーに連結することが不可能になる)、これらの塩基のポリメラーゼ置換を最小限にするために、連結接合部における標的塩基は優先的に3'側ではATリッチであり、5'側ではGCリッチであると考えられる。
【０１５６】
まれな変異を特定する場合と異なり、2つの連結プローブ間の配列情報を決定する必要はない。従って、これらは互いのすぐ隣になるように設計されてもよい。この代替アプローチでは、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブは、望ましい5'リン酸に隣接した位置に脱プリン塩基(AP)部位を含有する。この5'リン酸は耐熱性EndoIII(例えば、Tma EndoIII)を用いて遊離される。この酵素は、プローブが標的に結合した場合にAP部位を切断して5'リン酸を残す。このエンドヌクレアーゼは一本鎖プローブも切断するが、低い効率で切断し、従って、テンプレートにハイブリダイズされたプローブは好ましい基質である。5'リン酸を遊離するために耐熱性EndoIIIを使用する場合、リガーゼが接合部におけるニックをすぐに塞ぐことができるので、この工程において耐熱性ポリメラーゼを添加する必要はない。
【０１５７】
このプロトコールはコードmRNAについて書かれたが、非コードRNAを定量するのにも等しく効果がある。このような非コードRNAも腫瘍由来エキソソームに存在することがある。
【０１５８】
エキソソームから単離された腫瘍特異的mRNAを定量するための詳細なプロトコール:
工程1:逆転写酵素(RT)と、遺伝子特異的プライマーまたは非特異的dN-dT10プライミングを用いて、転写物の3'末端のcDNAコピーを作製する。37℃で1時間インキュベートし、次いで、RTを94℃で5分間加熱死させ、同時にホットスタートTaqポリメラーゼを活性化する。反応はまた、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、UniTaq Aiが続き、3'末端における標的遺伝子特異的配列が続く)、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的遺伝子特異的配列--UniTaq Bi'--ユニバーサルプライマーU2'が続く)、ホットスタートTaqポリメラーゼ、および耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)を含有する。ポリメラーゼが下流プローブを消化せず、脱落して、連結工程を可能にするように、下流プローブは、(ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって遊離される)5'リン酸末端から2番目および3番目の位置にチオリン酸結合を有する。
【０１５９】
工程2:ユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。非連結下流プローブが、3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成するように、55℃でインキュベートする。自己ヘアピンは伸長して、これらの下流プローブをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンが生成される。理想的には、複合連結プローブ上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。これにより、(複合LDRプライマーが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーU1およびU2が優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。次いで、増幅を8〜20サイクル進める。これらのユニバーサル増幅条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq Ai-遺伝子標的領域-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
の産物を増幅する。
【０１６０】
工程3:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをTaqmanウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:ユニバーサルプライマーU2および形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq AiのUniTaq特異的プライマーを含有する(式中、F1は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)。これらの条件下で、以下の産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-遺伝子標的領域-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０１６１】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピン形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、F1蛍光色素が遊離される。
【０１６２】
代替アプローチでは、ジップコードアレイ、ジップコードTaqman、または従来のTaqman検出を用いて腫瘍特異的mRNAの正確な定量が行われてもよい。このアプローチでは、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、ジップコードZiと、3'末端における標的遺伝子特異的配列が続く)、および下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的遺伝子特異的配列--ユニバーサルプライマーU2'が続く)が用いられる。ユニバーサルPCR増幅の後、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-ジップコードZi-遺伝子標的領域-ユニバーサルプライマーU2'
の産物が形成される。
【０１６３】
捕捉用オリゴヌクレオチドの集団を含有するユニバーサル(ジップコード)アレイを用いて検出するために、ユニバーサルプライマーU2はレポーター標識、すなわち、蛍光基を含有するのに対して、ユニバーサルプライマーU1は5'リン酸を含有し、増幅は合計約30〜40サイクル続く。これにより、第2鎖を消化するλエキソヌクレアーゼの使用が可能になり、蛍光標識産物は一本鎖になり、かつユニバーサル(ジップコード)アレイ上でのハイブリダイゼーションに適するようになる。
【０１６４】
さらに、前記の構築物は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-ユニークAi-ジップコードZi-遺伝子標的領域-ユニークBi-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅するために、ユニバーサルプライマーの内側にユニーク配列(0〜10個の塩基)(ユニークAi、ユニークBi)を含んでもよい。
【０１６５】
ジップコードTaqmanアッセイ法を用いた検出の場合、8〜20サイクルのユニバーサル増幅の後、試料を10〜100倍に希釈し、それぞれの産物についてユニークAiユニークBi配列と重複するユニークプライマーを添加する。Taqmanプローブはジップコード配列に対するものである。
【０１６６】
代替アプローチでは、スプリットジップコード配列を用いて腫瘍特異的mRNAの正確な定量が行われてもよい。このアプローチでは、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1、第1の半分のジップコード配列Aiおよび短い配列Ciの後ろに、3'末端における標的遺伝子特異的配列が続く)、ならびに下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的遺伝子特異的配列-短い配列の相補鎖Ci'、第2の半分のジップコード配列Ai-ユニバーサルプライマーU2'が続く)が用いられる。ユニバーサルPCR増幅の後、これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-遺伝子標的領域-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０１６７】
短いCiが短いCi'と一過的にハイブリダイズすると第1の1/2ジップコードZi配列は第2の1/2ジップコードZiに近接され、ジップコードZiの半分の配列が両方とも、ジップコードアレイ上にある完全長ジップコードZi'配列とハイブリダイズすると一過的ハイブリダイゼーションは安定化され得る。
【０１６８】
さらに、前記の構築物は、以下の通りに示される、ユニバーサルプライマーの内側にユニーク配列(0〜10個の塩基)(ユニークAi、ユニークBi)を含んでもよい。
ユニバーサルプライマーU1-ユニークAi-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-遺伝子標的領域-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニークBi-ユニバーサルプライマーU2'
【０１６９】
ジップコードTaqmanアッセイ法を用いて検出するために、8〜20サイクルのユニバーサル増幅の後、試料を10〜100倍に希釈し、それぞれの産物についてユニークAiユニークBi配列と重複するユニークプライマーを添加する。Taqmanプローブは完全長ジップコード配列に対するものである。
【０１７０】
標的配列間の各接合配列は独特であるので、初回ユニバーサル増幅の産物も次世代配列決定を用いて特定および定量されてもよい。これらの条件下で、LDRプローブは互いのすぐ隣にハイブリダイズされてもよく、または下流プライマーの5'末端を切り取って5'リン酸を遊離する前に、ポリメラーゼが2つのプライマー間の配列をフィルインするのを可能にする。
【０１７１】
対照として「低レベル」ハウスキーピング遺伝子を含めたい。または、発現/コピー数を増加させることが予測された遺伝子のCt値を、発現/コピー数を減少させることが予測された遺伝子のCt値と比較することができる。
【０１７２】
前記の工程1の代替では、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、3'末端における標的特異的配列が続く)、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。脱プリン塩基部位の後ろに標的特異的配列--ユニバーサルプライマーU2'が続く)、dNTP、および耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)の存在下で、耐熱性EndoIII(好ましくはTma EndoIII)が用いられる。94℃から冷却する場合に、70℃で一時停止して、最初に下流プローブがアニールし、EndoIIIによって切り取られて5'末端を遊離し、次いで、反応が65℃または60℃まで冷却された場合に、上流プローブが、5'リン酸が遊離した下流プローブのすぐ隣にハイブリダイズし、次いで、耐熱性リガーゼがニックを塞ぐように、下流プローブは上流プローブより長く、高いTm値を有する。
【０１７３】
予言的な実施例4-エキソソームまたはアルゴノートタンパク質から単離された腫瘍特異的miRNAの正確な定量
アプローチの概略:アプローチは、初回miRNA特異的プライマーが、低温で形成し、かつmiRNA標的上でのハイブリダイゼーションおよび伸長を可能にする小さなヘアピンを有する以外はmRNAの場合と同じである。LDR連結に適した高い温度では、ヘアピンは一本鎖であり、下流LDRプライマーがハイブリダイズできるようにさらなる塩基を提供する。小さなヘアピンを有するmiRNA特異的プライマーを使用するアプローチはABIで開発された。
【０１７４】
予言的な実施例5-循環腫瘍細胞から単離されたDNAにおける腫瘍特異的コピー変化の正確な定量
腫瘍DNAにおけるコピー変化はアウトカムの強力な予測因子となり得る。過去数年間にわたって、ほとんどのコピー数研究は、バイオインフォマティクスアプローチによって、ある領域全体にわたるシグナルが平均されて相対的コピー数が求められるSNPチップ上で行われてきた。少数の細胞の場合、出発分子の正確な数を得るためにデジタルPCRアプローチが用いられる。
【０１７５】
アプローチの概略:一般的に、コピー変化は染色体腕などの大きなDNA領域において生じる。本発明者らは極めて少ない数の腫瘍細胞を扱っているので、所定の染色体腕の複数領域を同時に調べ、結果として得られたシグナルを加算または平均することによって正確度を改善することができる。同様に、一部の腫瘍において、アウトカムを予測し得る、または治療の指針となり得る特定の遺伝子(すなわち、Her2-neu、IGF2)が増幅される。
【０１７６】
循環腫瘍細胞から単離されたDNAにおける腫瘍特異的コピー変化を定量するための詳細なプロトコール:
工程1:上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろにUniTaq Aiが続き、3'末端における標的特異的配列が続く)、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的遺伝子特異的配列--UniTaq Bi'--ユニバーサルプライマーU2'が続く)、ホットスタートTaqポリメラーゼ、および耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)の存在下で、血清由来ゲノムDNAを変性させる(ホットスタートTaqポリメラーゼを活性化するために94℃、5分)。
【０１７７】
工程2:ホットスタートdNTP、ユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。非連結下流プローブが、3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成するように、55℃でインキュベートする。自己ヘアピンは伸長して、これらの下流プローブをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンが生成される。理想的には、複合連結プローブ上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。これにより、(複合連結プローブが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーU1およびU2が優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。次いで、増幅を8〜20サイクル進める。これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq Ai-標的領域-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０１７８】
工程3:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをデジタルPCR用ウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:ユニバーサルプライマーU2および形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq AiのUniTaq特異的プライマーを含有する(式中、F1は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)。それぞれのウェルは、所定の染色体腕または遺伝子領域について一組の連結産物、ならびに対照領域について一組の連結産物を含有する。これらの条件下で、デジタルPCR後に、以下の産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-標的領域-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０１７９】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピン形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、F1蛍光色素が遊離される。相対的コピー数を求めるために、標的領域に対する蛍光シグナルを有する全液滴が、対照領域に対する蛍光シグナルを有する全液滴と比較される。
結腸癌においてコピー変化をまれに受ける染色体:2、11、16
結腸癌においてコピー増加をしばしば受ける染色体腕:7p、7q、8q、13q、20p、20q
結腸癌においてコピー減少をしばしば受ける染色体腕:1p、4p、4q、8p、14q、17p、18p、18q
8pおよび18qの消失は予後不良と相関する。
Her2-Neu増幅はハーセプチンによる治療を示唆する。
IGF2増幅はIGFRインヒビターによる治療を示唆する。
【０１８０】
デジタルPCRを使用する代替として、次世代配列決定を用いて連結産物を定量することができる。ゲノムDNA上で連結工程が起こることを確実なものにするために、連結プローブは約10〜20塩基離れてハイブリダイズし、予言的な実施例2に記載の手順と同様に、連結工程の前にポリメラーゼによってギャップが埋められる。このアプローチは、多くの領域を同時に調べ、集中した遺伝子特異的な欠失または増幅を探す場合に使用することができる。
【０１８１】
予言的な実施例6-循環腫瘍細胞から単離されたDNAにおける変異の検出
循環腫瘍細胞は変異含有DNAを濃縮しているという利点があるので、もはや過剰量の野生型配列中の低レベル変異を見つける必要性はない。しかしながら、出発DNA分子は小数であるので、全ての領域を正確に増幅し、変異が本当に存在することを確認することが重要である。
【０１８２】
アプローチの概略:ここでのアプローチは、前記の予言的な実施例2および3において概説されたように、公知のありふれた点変異を発見するためのアプローチまたは複数のエキソンを配列決定するためのアプローチと同じである。しかしながら、少量のインプットDNA分子を扱う場合、ポリメラーゼエラーの可能性がある。その結果、複数の読み取りにおいて両鎖にある変異の存在を確認する必要がある。
【０１８３】
DNAは小数の捕捉された腫瘍細胞から得られるので、変異が存在するのであれば、捕捉された細胞のほとんどではないが一部に存在するはずである。これはPCR-LDR-PCR(UniTaq)アッセイ法を行う見込みを切り開く。
【０１８４】
循環腫瘍細胞から単離されたDNAにおける変異を検出するための詳細なプロトコール
工程1:捕捉されたCTCからゲノムDNAを変性させて(94℃5分)、ウラシルを含有する遺伝子特異的プライマーの存在下でホットスタートTaqポリメラーゼを活性化する。DNAを10〜20サイクルPCR増幅する。99℃で30分間インキュベートすることによってTaqポリメラーゼを加熱死させる。限られたPCRサイクルの後にポリメラーゼを加熱死させる目的は、UNGおよびAPエンドヌクレアーゼを含有する混合物と30分間インキュベートする間に連結プローブの中の偽の伸長産物を回避するためである。
【０１８５】
工程2:UNGおよびAPエンドヌクレアーゼ、ホットスタートTaqポリメラーゼ、必要であれば新鮮なdNTP、ユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。元のプライマーを破壊するために37℃で30分間インキュベートする。ポリメラーゼを95℃で5分間、活性化する。反応は、上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、UniTaq Aiが続き、最後から2番目の塩基にC:AまたはG:Tミスマッチを有する標的特異的配列、および3'末端における変異塩基が続く)、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的特異的配列--UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'が続く)、Taqポリメラーゼ、ならびに耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)を含有する。1回または複数回の連結反応を行う。ここで、アニーリング温度は、連結の場合、60℃(10分)と75℃(1分)の間で1回または複数回サイクルする。これにより、変異DNAが存在すれば連結事象が発生することが可能になる。ポリメラーゼが下流プローブを消化せず、脱落して、連結工程が可能になるように、下流プローブは、(ポリメラーゼの5'→3'ヌクレアーゼ活性によって遊離される)5'リン酸末端から2番目および3番目の位置にチオリン酸結合を有する。さらなる選択肢は、94℃から冷却する場合に、70℃で一時停止して、最初に下流プローブがアニールし、次いで、反応が65℃または60℃まで冷却された場合に、上流プローブがハイブリダイズし、ポリメラーゼが下流プローブからの5'テールを切り取り、耐熱性リガーゼがニックを塞ぐように、下流プローブが上流プローブより長く、かつ高いTm値を有するように下流プローブを設計することである。これは、下流プローブがハイブリダイズする前の上流プローブのポリメラーゼ伸長を制限するはずである。
【０１８６】
工程3:ユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。非連結下流プローブが、3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成するように、55℃でインキュベートする。自己ヘアピンは伸長して、これらの下流プローブをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンが生成される。次いで、PCR増幅を0〜15サイクル進める。理想的には、複合連結プローブ上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。これにより、(複合LDRプライマーが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーU1およびU2が優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'の断片を増幅する。
【０１８７】
工程4:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをTaqmanウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:ユニバーサルプライマーU2および形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq AiのUniTaq特異的プライマーを含有する(式中、F1は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)。これらの条件下で、以下の産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０１８８】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピン形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、F1蛍光色素が遊離される。
【０１８９】
代替アプローチでは、予言的な実施例3に記載のように、ジップコードアレイ、ジップコードTaqman、または従来のTaqman検出を用いて高感度変異検出が行われてもよい。その結果、以下の産物:
ユニバーサルプライマーU1-ジップコードZi-上流標的-変異-下流標的-ユニバーサルプライマーU2'
が得られる。
【０１９０】
代替アプローチでは、前記の予言的な実施例3に記載のように、スプリットジップコード配列を用いて高感度変異検出が行われてもよい。その結果、以下の産物:
ユニバーサルプライマーU1-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-変異-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニバーサルプライマーU2'
が得られる。
【０１９１】
PCR産物の一次増幅があるので、工程3を飛ばして進むことが可能である。さらに、工程2からの連結産物が以下の形態:
UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
になるように、上流LDRプローブはユニバーサル配列を必要としない。これにより、工程4の連結産物は以下の形態:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-上流標的-変異-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
になることが依然として可能である。
【０１９２】
また、工程4のユニバーサルプライマーPCR増幅が飛ばして進められるのであれば、工程2においてUNGおよびAPエンドヌクレアーゼを用いて未使用PCRプライマーを除くことに取って代わる代案は、工程1の後および工程2の前に熱感受性ホスファターゼ(すなわち、CIAP)を用いてdNTPを破壊することである。新鮮なdNTPは工程3に必要とされないので工程2では添加されない。
【０１９３】
予言的な実施例7-エキソソームまたは循環腫瘍細胞から単離された腫瘍特異的mRNAの正確な定量
前記の予言的な実施例3において概説したアプローチを参照されたい。循環腫瘍細胞からmRNAを単離する場合に、総量は極めて少ない場合がある。従って、所定のmRNA転写物について複数の連結プローブセットを使用し、デジタルPCRにおいて測定することが賢明な場合がある。次いで、前記の予言的な実施例3の工程1および行程2について概説したように工程1および行程2を進める。
【０１９４】
工程3:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをデジタルPCR用ウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:
ユニバーサルプライマーU2および形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq AiのUniTaq特異的プライマーを含有する(式中、F1は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)。それぞれのウェルは、所定のmRNA領域について一組の連結産物、ならびに対照領域について一組の連結産物を含有する。これらの条件下で、デジタルPCR後に、以下の産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq Ai-標的領域-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０１９５】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピン形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、F1蛍光色素が遊離される。相対的mRNA発現レベルを求めるために、標的領域に対する蛍光シグナルを有する全液滴が、対照領域に対する蛍光シグナルを有する全液滴と比較される。
【０１９６】
予言的な実施例8-母方血清試料からの出生前診断用途
概略:最近の研究から、血清中にある母方DNAに対する胎児DNAのパーセントは、最初の三半期、2番目の三半期、および3番目の三半期においてそれぞれ約6％、20％、および26％であることが分かっている。DNAが分解される方法のために、母方DNAは通常、約160塩基であり、依然としてH1ヒストンに結合しているのに対して、胎児DNAは約140塩基であり、ヒストンに結合していない。臨床上の必要性に応じて、かつ知識によって最良のケアが提供される場合、適切な三半期において胎児DNAを検出するのに十分な感度をもつ検査が開発され得る。
【０１９７】
コピー数(例えば、21番染色体トリソミー)のカウントによる異数性。前記の予言的な実施例5のアプローチを参照されたい。21番染色体および対照染色体(例えば、2番染色体)を調べるために多数の領域を用いて、胎児21の染色体数が胎児対照(例えば、2番染色体)より統計学的に多いことを示すことが最も賢い。それぞれのデジタル増幅ウェルの中に内部対照染色体を使用することにより、前記方法は厳密な増幅条件または1サイクル当たりの効率に依存しない。
【０１９８】
代替アプローチは個々のSNPを調べることに依存し、以下で説明されるように疾患変異に適している。
【０１９９】
公知の遺伝子においてありふれた変異を含有する遺伝性疾患(例えば、鎌状赤血球性貧血、嚢胞性線維症)。配列分析によって、両親に劣性アレルが存在することが容易に確かめられる。両親にある変異が異なる場合、母方血清由来の無細胞DNAを評価することによって、子供が疾患について複合ヘテロ接合体であるかどうかを確かめることが可能である。母方血清中の胎児DNAの分析から完全な解答を得るには、このアッセイ法に対して2つの部分が必要とされる場合がある。第1の部分は、疾患遺伝子を取り囲む母方SNPの相(phase)を確かめることである。これは、WBCまたは中期染色体から高分子量DNAを単離し、1ウェル当たり1本未満の染色体になるように96ウェルプレートまたは384ウェルプレートに分配することによって達成され得る。その後に、どのウェルが染色体を含有するかを確かめるために全ゲノム増幅が用いられ、問題となっている遺伝子について母方疾患アレルに対する96個の隣接するSNPの相が確かめられる。これが達成されると、(前記の予言的な実施例2に記載のように)父親由来疾患アレルの存在をスコア付けする。デジタルPCRを使用すると、母親から遺伝した染色体は疾患アレルも含有することが検証される。
【０２００】
重要な問題点は、家族が正しい答えを得ることがどのくらい重要かということであろう。両親が保因者かどうか、変異が異なるかどうかを確かめるのは簡単であり、父親の疾患アレルが胎児に存在するかどうかを確かめるのは比較的簡単である。疾患アレルが存在しなければ、胎児は疾患がないか、または保因者である。疾患アレルが存在すれば、母方アレルを受け継ぎ、疾患になる確率は50％である。胎児DNA検査全体の誤り率が3％であれば、間違った答えを得ることは価値があるのであろうか？羊水穿刺を行い、母方アレルの存在を直接検査する方が賢明である可能性がある。
【０２０１】
その結果、前記の予言的な実施例2に記載のようにただ遺伝子を配列決定し、父方疾患アレルをスコア付けることが推奨される。疾患アレルが存在すれば、または父方および母方の疾患特異的変異が同一であれば、羊水穿刺が推奨される。
【０２０２】
公知の遺伝子において珍しい変異を含有する遺伝性疾患(例えば、家族性腺腫性ポリポーシス)。予言的な実施例2に記載のアプローチを用いて、これらの遺伝性疾患変異を検出することができる。
【０２０３】
公知の遺伝子における公知または孤発性のコピー数の減少または増加に起因する遺伝性疾患(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー)。前記の予言的な実施例5のアプローチを参照されたい。母親が保因者であり、コピー減少の領域が公知である場合、これは実施するのが簡単である。母親が保因者でない場合、配列決定を用いて、DMD遺伝子全体にわたって狭い間隔で並んだ複数の配列においてコピー数を数えることがおそらく最も良い。
【０２０４】
予言的な実施例9-父子鑑定
概略:基本的なアプローチは、父親に存在するが、母親には存在しないアレルの存在を探すことである。これに取り組むためには2種類の一般的なやり方がある。母親がメジャーアレルについてホモである確率が約50％になるように、コモンアレルの頻度が約70〜75％であるSNPから開始することができる。約48個のSNPから開始する。これらの約半分(24)において母親はコモンアレルについてホモであり、父親がマイナー(minority)アレルについてヘテロまたはホモである確率が50％である。変異を探す場合と同様に、単純に母体血中のマイナーアレルの存在をスコア付けするが、これが父親からのマイナーアレルであることを確認するために存在する量も定量する。別のアプローチは、頻度が約50％であり、母親がそのアレルの一方についてホモである確率が50％であり、父親がその位置において他方のアレルを有する確率が75％であるアレルから開始する。このアプローチは、父親を見分ける点であまり情報は得られないが、多数の位置により多くの情報が得られうる。
【０２０５】
SNPアレルマーカーを検出するための詳細なプロトコール:
工程1:2種類の上流第1のオリゴヌクレオチドプローブ(5'ユニバーサルプライマーU1の後ろに、UniTaq A1iが続き、標的特異的配列および3'末端におけるSNP1塩基が続くか、または、ユニバーサルプライマーU1の後ろにUniTaq A2iと標的特異的配列および3'末端におけるSNP2塩基が続く)、下流第2のオリゴヌクレオチドプローブ(5'側の20塩基の余分なオーバーハング。8〜10塩基はユニバーサルプライマーU2'配列の3'末端に相補的である。この後ろに、標的特異的配列--UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'が続く)、Taqポリメラーゼ、ならびに耐熱性リガーゼ(好ましくはAK16D株に由来する)の存在下で、血清由来ゲノムDNAを変性させる(94℃ 1分)。1回または複数回のLDR反応を行う。ここで、アニーリング温度は、連結の場合、60℃(10分)と75℃(1分)の間で1回または複数回サイクルする。これにより、存在する、それぞれのSNPについて連結事象が発生することが可能になる。
【０２０６】
工程2:ホットスタートdNTP、のユニバーサルプライマーU1、ユニバーサルプライマーU2を添加する。非連結下流プローブが3'末端に相補的な8〜10塩基と自己ヘアピンを形成するように55℃でインキュベートする(dNTPを活性化する)。自己ヘアピンは伸長して、これらの下流プローブをさらに増幅しにくくする、さらに長いヘアピンが生成される。次いで、PCR増幅を8〜20サイクル進める。理想的には、複合連結プローブ上にあるユニバーサルプライマーテールU1およびU2はユニバーサルプライマーU1およびU2よりわずかに短い。これにより、(複合連結プローブが不正確な産物に結合するのと比較して)ユニバーサルプライマーU1およびU2が優先的に望ましい産物に結合するように、低いサイクル温度(すなわち、55℃アニーリング)に続く高いサイクル温度(すなわち、65℃アニーリング)での初回ユニバーサル増幅が可能になる。さらに、ユニバーサルプライマーU1およびU2はプライマー二量体形成を回避するために共通して短い配列(すなわち、6〜10塩基)を含有する。これらの条件は、以下の配列:
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq A1i-上流標的-SNP1-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
ユニバーサルプライマーU1-UniTaq A2i-上流標的-SNP2-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
の断片を増幅する。
【０２０７】
工程3:チューブを開け、10〜100倍に希釈し、アリコートをTaqmanウェルに分配する。それぞれのウェルは、以下のプライマー:
ユニバーサルプライマーU2、ならびに形式F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq A1iおよびF2-UniTaq Bi-Q-UniTaq A2iのUniTaq特異的プライマーを含有する(F1およびF2は、クエンチャーQによって消光される蛍光色素である)。これらの条件下で、以下の産物:
F1-UniTaq Bi-Q-UniTaq A1i-上流標的-SNP1-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
F2-UniTaq Bi-Q-UniTaq A2i-上流標的-SNP2-下流標的-UniTaq Bi'-ユニバーサルプライマーU2'
が形成する。
【０２０８】
これは、UniTaq Bi配列がUniTaq Bi'配列と対になるようにヘアピン形成する。ユニバーサルプライマーU2がユニバーサルプライマーU2'配列に結合すると、ポリメラーゼの5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はUniTaq Bi配列を消化して、SNP1がもともと存在していればF1蛍光色素が遊離され、SNP2がもともと存在していればF2蛍光色素が遊離される。
【０２０９】
代替アプローチでは、以下の産物
ユニバーサルプライマーU1-ジップコードA1i-上流標的-SNP1-下流標的-ユニバーサルプライマーU2'
ユニバーサルプライマーU1-ジップコードA2i-上流標的-SNP2-下流標的-ユニバーサルプライマーU2'
を形成するように、ジップコードアレイ、ジップコードTaqman、または従来のTaqman検出(予言的な実施例1を参照されたい)を用いてSNP検出が行われてもよい。
【０２１０】
代替アプローチでは、以下の産物:
ユニバーサルプライマーU1-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-SNP1-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニバーサルプライマーU2'
ユニバーサルプライマーU1-第1の1/2ジップコードZi-短いCi-上流標的-SNP2-下流標的-短いCi'-第2の1/2ジップコードZi-ユニバーサルプライマーU2'
を形成するように、スプリットジップコード配列(予言的な実施例1を参照されたい)を用いてSNP検出が行われてもよい。
【０２１１】
例示目的で本発明が詳細に説明されたが、このような詳細はこの目的に限られ、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって変更できることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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