(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップと、
前記チップに光を照射する光源と、
前記光を照射されたチップ上における表面プラズモン共鳴による前記光の吸収を検出する検出器と、
を備え、
前記糖鎖又は前記アプタマーが、リンカーを介して前記基板上に固定され、
前記基板と前記糖鎖又は前記アプタマーとを結合する前記リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下である、
表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項２】
前記チップ上における前記光の吸収スペクトルの変化を検出して、前記チップ上におけるウイルスの存在を検出する、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項３】
前記アプタマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチドからなる群から選択される一つである、請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項４】
前記チップが、前記基板上に設けられた酸化膜と、前記酸化膜上に設けられた、金からなるパターン構造と、を更に備える、請求項１から３のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項５】
前記パターン構造が、格子状に配置されたパターン構造である、請求項４に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項６】
前記パターン構造が、格子状に配置されたドットパターン構造である、請求項４に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項７】
前記パターン構造の表面、及び前記パターン構造の開口から露出する前記酸化膜の表面に、前記リンカーを介して前記糖鎖又はアプタマーが配置されている、請求項４から６のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項８】
前記ウイルスを含み得る検査液が前記チップに接触するよう、前記検査液を貯蔵する検査液セルを更に備える、請求項１から７のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴測定装置。
【請求項９】
基板と、
前記基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーと、
を備え、
前記糖鎖又は前記アプタマーが、リンカーを介して前記基板上に固定され、
前記基板と前記糖鎖又は前記アプタマーとを結合する前記リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下である、
表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。
【請求項１０】
前記アプタマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチドからなる群から選択される一つである、請求項９に記載の表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。
【請求項１１】
前記基板上に設けられた酸化膜と、前記酸化膜上に設けられた、金からなるパターン構造と、を更に備える、請求項９又は１０に記載の表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。
【請求項１２】
前記パターン構造が、格子状に配置されたパターン構造である、請求項１１に記載の表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。
【請求項１３】
前記パターン構造が、格子状に配置されたドットパターン構造である、請求項１１に記載の表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。
【請求項１４】
前記パターン構造の表面、及び前記パターン構造の開口から露出する前記酸化膜の表面に、前記リンカーを介して前記糖鎖又はアプタマーが配置されている、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の表面プラズモン共鳴測定装置のチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は検出技術に関し、表面プラズモン共鳴測定装置及びそのチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、直径１００ｎｍのタンパク質に囲まれた球状ウイルスである。インフルエンザウイルス表面には、糖タンパク質であるヘマグルチニン（Ｈ）と、グリコシダーゼであるノイラミニダーゼ（Ｎ）と、が存在する。インフルエンザウイルスは、これらのタンパク質の種類の違いによって１４４の亜型に分類されている。例えば、鳥インフルエンザを起こすウイルスは、Ｈ５Ｎ１亜型と表記される。インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面のヘマグルチニン（Ｈ）が、細胞表面のシアル酸含有複合糖鎖を受容体として認識して結合することによると考えられている。
【０００３】
インフルエンザはインフルエンザウイルスに起因する急性呼吸器疾患である。インフルエンザは、突然現れる高熱、頭痛、関節痛、筋肉痛など全身の症状が強いのが特徴で、併せてのどの痛み、鼻汁、咳などの症状も見られる。さらに、気管支炎、肺炎、小児では中耳炎、熱性けいれんなどを併発し、重症になることがある。
【０００４】
また、Ｈ５Ｎ１亜型トリインフルエンザやエボラウイルス感染は、世界中でパンデミック（感染爆発）の発生が懸念されている。特に、強毒性であるＨ５Ｎ１亜型トリインフルエンザは、感染の拡大により日本だけで３２００万人が感染し、最悪の場合６４万人が死亡すると予測されている。実際、２００９年にパンデミックが発生した新型インフルエンザは、毒性が低いにもかかわらず、死者が世界中で２，１８５人にも上った。パンデミックの発生は、企業の生産能力の低下、交通、電力などの社会機能の麻痺など深刻な経済損失をもたらすものと予測されている。
【０００５】
したがって、ウイルスの脅威に対抗するためには、迅速検出法を用いた早期診断による感染者の封じ込めが不可欠である。早期診断は、感染者の封じ込めの効果が期待されるとともに、感染者への抗ウイルス薬投与などの適切な診療を早期に実施でき、感染者の生存確率を高める。例えば、タミフルやリレンザなどの抗ウイルス剤は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することができ、有効な手段といえるが、最適な効果を得るためには、抗ウイルス剤を感染から４８時間以内に投与しなければならない。特に致死率が高いエボラウイルスは、３〜４個程度のウイルスが体内に侵入するだけで、増殖すると考えられている。そのため、感染者の封じ込めのためには、高感度なウイルス検出システムが必要となる。
【０００６】
しかし、これまで実用化されている免疫クロマト診断キットは、数分以内にインフルエンザウイルスの診断結果が出るが、検出感度が十分でなく、ウイルスの亜型に関しての識別能力に乏しい。そのため、ウイルスに罹患しているにもかかわらず、適切な治療が受けられずに患者が重症化したり、ウイルスを拡散させたりする原因となっている。また、免疫クロマト法は抗原抗体反応を基本としているため、熱変性に弱く、長期間保存されている間に抗体の認識能力が低下するといった問題点が生じる。そのため、このような診断キットを一般家庭や発展途上国などにおいて用いることは難しい。
【０００７】
また、現状、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法によるウイルスのゲノム検出が、最も高感度な検出方法であるが、検出までに数時間かかり、サーマルサイクラーなどの特殊な装置が必要である。そのため、ＲＴ−ＰＣＲ法によるゲノム検出を迅速な感染者の封じ込めに利用するには、限界がある。さらに、表面プラズモン共鳴測定装置によりデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びタンパク質を検出した例はあるものの（例えば、特許文献１から３参照。）、ウイルスそのものを高感度かつ迅速に検出した例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００９−２２２４０１号公報
【特許文献２】特開２０１０−２１０２５３号公報
【特許文献３】特開２０１０−２５６１２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ウイルスを高感度かつ迅速に検出可能な装置を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様によれば、（ａ）基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップと、（ｂ）チップに光を照射する光源と、（ｃ）光を照射されたチップ上における表面プラズモン共鳴による光の吸収を検出する検出器と、を備える、表面プラズモン共鳴測定装置が提供される。
【００１１】
上記の表面プラズモン共鳴測定装置は、チップ上における光の吸収スペクトルの変化を検出して、チップ上におけるウイルスの存在を検出する。
【００１２】
上記の表面プラズモン共鳴測定装置において、アプタマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチドからなる群から選択される一つであってもよい。糖鎖又はアプタマーが、リンカーを介して基板上に固定されていてもよい。リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下であってもよい。
【００１３】
上記の表面プラズモン共鳴測定装置において、チップが、基板上に設けられた酸化膜と、酸化膜上に設けられた、金からなるパターン構造と、をさらに備えていてもよい。パターン構造が、格子状に配置されたドットパターン構造等のパターン構造であってもよい。
【００１４】
上記の表面プラズモン共鳴測定装置において、パターン構造の表面、及びパターン構造の開口から露出する酸化膜の表面の両方に、糖鎖又はアプタマーが配置されていてもよい。
【００１５】
上記の表面プラズモン共鳴測定装置が、ウイルスを含み得る検査液がチップに接触するよう、検査液を貯蔵する検査液セルをさらに備えていてもよい。
【００１６】
また、本発明の態様によれば、（ａ）基板と、（ｂ）基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーと、を備える、表面プラズモン共鳴測定装置のチップが提供される。
【００１７】
上記のチップにおいて、アプタマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及びペプチドからなる群から選択される一つであってもよい。糖鎖又はアプタマーが、リンカーを介して基板上に固定されていてもよい。リンカーが備えるアルキル鎖の炭素数が１以上５以下であってもよい。
【００１８】
上記のチップが、基板上に設けられた酸化膜と、酸化膜上に設けられた、金からなるパターン構造と、をさらに備えていてもよい。また、パターン構造が、格子状に配置されたドットパターン構造等のパターン構造であってもよい。
【００１９】
上記のチップにおいて、パターン構造の表面、及びパターン構造の開口から露出する酸化膜の表面の両方に、糖鎖又はアプタマーが配置されていてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ウイルスを高感度かつ迅速に検出可能な表面プラズモン共鳴測定装置及びそのチップを提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な斜視図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な透過上面図である。
【図３】図２のＩＩＩ−ＩＩＩ方向から見た、本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図４】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの模式的な拡大斜視図である。
【図５】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図６】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図７】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図８】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図９】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図１０】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の模式的な断面図である。
【図１１】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する上面図である。
【図１２】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１３】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１４】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１５】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１６】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１７】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１８】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図１９】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する断面図である。
【図２０】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する斜視図である。
【図２１】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する斜視図である。
【図２２】本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置のチップの製造方法を説明する化学式である。
【図２３】本発明の実施例１の結果を示すグラフである。
【図２４】本発明の実施例２の結果を示すグラフである。
【図２５】本発明の比較例１で用いられたリンカーの化学式である。
【図２６】本発明の比較例１で作製されたリンカーを固定されたチップの模式的斜視図である。
【図２７】本発明の比較例１の結果を示すグラフである。
【図２８】本発明の比較例１で作製された抗体を固定されたチップの模式的斜視図である。
【図２９】本発明の比較例１で作製された抗原を固定されたチップの模式的斜視図である。
【図３０】本発明の実施例３の結果を示すグラフである。
【図３１】本発明の比較例２の結果を示すグラフである。
【図３２】本発明の比較例２で作製されたチップの模式的斜視図である。
【図３３】本発明の実施例４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。但し、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。
【００２３】
本発明の実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置は、斜視図である図１、透過上面図である図２及びＩＩＩ−ＩＩＩ方向から見た断面図である図３に示すように、基板上に配置された、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップ１０と、チップ１０に光を照射する光源２０と、光を照射されたチップ１０上における表面プラズモン共鳴による光の吸収を検出する検出器３０と、を備える。
【００２４】
表面プラズモン共鳴測定装置は、さらに、光源２０、チップ１０、及び検出器３０を格納する筐体４０と、筐体４０内部に設けられた、検査液を格納する検査液セル４１と、検査液セル４１の導入口に設けられた漏斗状の導入ガイド４２と、を備える。チップ１０は、検査液セル４１内に配置される。検査液セル４１は、少なくとも一部が、光源２０が発する光に対して透明であり、光源２０が発した光がチップ１０に到達することと、チップ１０を透過した光が検出器３０に到達することを妨げない。
【００２５】
チップ１０は、図４に示すように、基板１１と、基板１１上に設けられた酸化膜１２と、酸化膜１２上に設けられた、金（Ａｕ）からなるパターン構造１３と、を備える。さらに、チップ１０は、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面に固定されたリンカー１４と、リンカー１４に接続された糖鎖又はアプタマー１５と、を備える。チップ１０は、基板１１が図３に示す光源２０と対向し、図４に示す糖鎖又はアプタマー１５が検査液と接するよう、図３に示す検査液セル４１内に配置される。
【００２６】
図４に示す基板１１は、光源２０が発する光に対して透明であり、例えば結晶石英等からなる。酸化膜１２は、例えば、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）、酸化クロム（Ｃｒ2Ｏ3）、酸化ニッケル（ＮｉＯ）、又は酸化チタン（ＴｉＯ2）等の誘電体からなる。金（Ａｕ）からなるパターン構造１３は、図３に示す光源２０が発する光に対して不透明であり、例えば斜方格子、六角格子、正方格子、矩形格子、及び平行格子等の格子状に規則的に配置されたドットパターンを備えるが、これに限定されない。図４に示すパターン構造１３の膜厚は、例えば１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、パターン構造１３の個々の円形のドットの直径は、例えば１００ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるが、特に限定されない。
【００２７】
パターン構造１３に固定されるリンカー１４は、パターン構造１３に固定される前において、一方端にパターン構造１３の金と反応する基と、他方端に糖鎖又はアプタマー１５の基と反応する基と、を備えていれば、特に限定されない。また、パターン構造１３で覆われていない酸化膜１２に固定されるリンカー１４は、酸化膜１２に固定される前において、一方端に酸化膜１２の表面に存在する水酸基（−ＯＨ）と反応する基と、他方端に糖鎖又はアプタマー１５の基と反応する基と、を備えていれば、特に限定されない。ただし、リンカー１４の長さが短いほど、表面プラズモン共鳴測定装置の感度が良くなる傾向にあるため、リンカー１４は有機低分子であることが好ましい。有機低分子が備えるアルキル鎖の炭素数は、例えば１以上５以下、４以下、３以下、又は２以下である。
【００２８】
金（Ａｕ）と反応する基としては、メルカプト基（−ＳＨ）等が挙げられる。糖鎖又はアプタマー１５の基と反応する基としては、アミノ基（−ＮＨ2）、アミノオキシ基（−ＯＮＨ2）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アセチレン基、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基、ハロゲン基（−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ，−Ｆ）、ニトロ基（−ＮＯ2）、及びアジド基（−Ｎ3）などが挙げられる。酸化膜１２の表面に存在する水酸基と反応する基としては、加水分解されて水酸基となるメトキシ基（−ＯＣＨ3）及びエトキシ基（−ＯＣ2Ｈ5）等が挙げられる。
【００２９】
パターン構造１３に固定されるリンカー１４の具体例としては、γアミノオキシプロピルメルカプタン、及び２−アミノエタンチオールが挙げられる。また、酸化膜１２に固定されるリンカー１４の具体例としては、γアミノオキシプロピルトリエトキシシラン、及びアミノプロピルトリエトキシシランが挙げられる。
【００３０】
糖鎖又はアプタマー１５は、ウイルスと特異的に結合する物質であれば、特に限定されない。アプタマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）アプタマー、リボ核酸（ＲＮＡ）アプタマー、及びペプチドアプタマーを含む。図４においては、糖鎖の一例として、インフルエンザウイルスと特異的に結合する６’−シアリルラクトースを示している。
【００３１】
なお、検査対象ウイルスが例えばインフルエンザウイルスである場合は、インフルエンザウイルスの亜型に応じて、糖鎖又はアプタマー１５の種類を変えることが好ましい。例えば、高病原性鳥インフルエンザを起こすインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１亜型）は、末端にＮ−アセチルノイラミン酸α２，３ガラクトースを有する糖鎖に高い結合親和性を示す。また、ヒトインフルエンザウイルスは、Ｎ−アセチルノイラミン酸α２，６ガラクトースを有する糖鎖に高い結合親和性を示す。したがって、インフルエンザウイルスの亜型による糖鎖の認識能力の違いにより、インフルエンザウイルスの亜型を識別することが可能である。インフルエンザウイルス以外のウイルスについても同様である。
【００３２】
また、リンカー１４及び糖鎖又はアプタマー１５を、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面の両方に固定することにより、酸化膜１２の表面への、検査非対象物質の非特異的な付着を抑制することが可能となる。
【００３３】
図２及び図３に示す光源２０が発する光は、例えば可視光又は近赤外光である。パターン構造１３を備えるチップ１０に光が照射されると、パターン構造１３において局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）が発生し、チップ１０を透過した光のスペクトルに吸収ピークが現れる。吸収ピークは、チップ１０の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合することによって、波長シフトする。波長シフトの大きさは、可視光領域よりも近赤外領域の方が大きい傾向にある。したがって、ウイルスが微量である場合は、例えば、近赤外光を発する光源２０を用いると、ウイルスを高感度に検出し得る。
【００３４】
チップ１０と検出器３０の間には、局在プラズモン共鳴による吸光度変化が大きい波長帯域の光を透過させるバンドパスフィルタ５０を配置してもよい。検出器３０としては、電荷結合素子（ＣＣＤ）等が使用可能である。検出器３０には、例えば処理装置３００が接続されている。処理装置３００は、チップ１０に検査液が接触する前後において、検出器３０が検出した、チップ１０を透過した光のスペクトルにおける吸収ピークの有意な波長シフトの有無を判定する。処理装置３００は、例えば、所定の波長帯域における光の強度が所定の値以上に変化した場合、チップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合したと判定する。また、処理装置３００は、所定の波長帯域における光の強度が所定の値以上に変化しなかった場合、チップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合しなかったと判定する。
【００３５】
筐体４０の外側には、例えば、検査液中のウイルスの有無を表示する表示部７０が設けられている。表示部７０は、処理装置３００に接続されている。例えば処理装置３００がチップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合したと判定した場合、表示部７０は赤色のライトを発光させ、処理装置３００がチップ１０表面の糖鎖又はアプタマー１５にウイルスが結合しなかったと判定した場合、表示部７０は青色のライトを発光させる。
【００３６】
筐体４０内の検査液セル４１の下方には、廃液タンク６０が設けられている。また、検査液セル４１と廃液タンク６０の間には、バルブ６１が設けられている。検査液セル４１内の検査液をチップ１０と所定の時間接触させた後、バルブ６１が開かれ、検査液セル４１内の検査液が、廃液タンク６０に流れ落ちる。
【００３７】
次に、実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置の使用方法を説明する。まず、図５に示すように、検査液セル４１に検査液を入れる前の状態で、光源２０から光を発して、チップ１０を透過した光を検出器３０で検出する。処理装置３００は、検出器３０が検出した光のスペクトルを、チップ１０に検査液が接触する前の光のスペクトルとして記憶する。
【００３８】
その後、図６に示すように、導入ガイド４２から検査液セル４１に、ウイルスを含有する可能性のある検査液を入れる。検査液の例としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による、被験者のうがい液、及び鼻液等の溶解液が挙げられる。図７に示すように、チップ１０が検査液に十分に浸ったら、例えば５分から１０分静置し、チップ１０上の糖鎖又はアプタマー１５と、検査液に含まれ得るウイルスと、を結合させる。
【００３９】
静置後、図８に示すように、バルブ６１を開いて、検査液セル４１中の検査液を、廃液タンク６０に落下させる。さらに、図９に示すように、導入ガイド４２から検査液セル４１に、水等の洗浄液を複数回流し込んで、チップ１０表面及び検査液セル４１の内壁を洗浄する。
【００４０】
チップ１０表面及び検査液セル４１の内壁が乾いた後、図１０に示すように、光源２０から光を発して、チップ１０を透過した光を検出器３０で検出する。処理装置３００は、検出器３０が検出した光のスペクトルを、チップ１０に検査液が接触した後の光のスペクトルとして記憶する。
【００４１】
さらに、処理装置３００は、チップ１０に検査液が接触する前の光のスペクトルと、チップ１０に検査液が接触した後の光のスペクトルと、を比較し、吸収ピークの有意な波長シフトがあれば、表示部７０に、ウイルスを検出したことを表示させる。また、吸収ピークの有意な波長シフトが無ければ、表示部７０に、ウイルスを検出しなかったことを表示させる。
【００４２】
次に、ナノインプリントリソグラフィー法を採用したチップ１０の製造方法について説明する。図１１に示すように、複数のウェルが設けられたモールド１００を用意する。モールド１００は、例えばニッケル（Ｎｉ）等の金属からなる。例えば、ウェルの径は５００ｎｍ、深さは５００ｎｍ、ピッチは１０００ｎｍであるが、これらに限定されない。モールド１００において、複数のウェルは格子状に配置されている。複数のウェルの配置の態様は、製造されるチップのパターン構造の態様に相似する。
【００４３】
紫外線（ＵＶ）硬化樹脂からなる樹脂シートの平坦な表面に、モールド１００を押しつけた後、樹脂シートにＵＶを照射し、図１２に示すように、反転レプリカモールド１１０を作製する。
【００４４】
図１３に示すように、表面に蒸着膜１１９が形成された基板１１を用意する。基板１１は、例えば結晶石英等からなる。蒸着膜１１９は、例えば、ケイ素（Ｓｉ）、クロム（Ｃｒ）、ニッケル（Ｎｉ）、又はチタン（Ｔｉ）等の、半金属又は金属からなる。さらに、図１４に示すように、下地層としての蒸着膜１１９上に樹脂をコーティングし、樹脂層１２０を形成する。樹脂層１２０は、例えば、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂からなる。
【００４５】
次に、図１５に示すように、加熱した樹脂層１２０に反転レプリカモールド１１０を押しつけ、樹脂層１２０に、格子状に配置された複数のウェルを形成する。さらに、樹脂層１２０を冷却後、樹脂層１２０をマスクとして、アルゴン（Ａｒ）ガス等により異方性エッチングを施し、図１６に示すように、樹脂層１２０に設けられた複数のウェルのそれぞれの底面から基板１１表面を露出される。またさらに、図１７に示すように、樹脂層１２０表面及び基板１１表面の露出した部分に、ケイ素、クロム、ニッケル、又はチタン等の、半金属又は金属を蒸着し、蒸着膜１２１を形成する。蒸着膜１２１の厚さは、例えば蒸着膜１１９の厚さと同じである。
【００４６】
その後、図１８に示すように、蒸着膜１２１上に金を蒸着して金からなる堆積膜１２２を形成する。さらに、図１９に示すように、樹脂層１２０をリフトオフすることにより、蒸着膜１２１上に、金からなるパターン構造１３を形成する。次に、基板１１、蒸着膜１１９、１２１、及びパターン構造１３を、４５０℃から１０００℃で加熱する。例えば蒸着膜１１９、１２１がケイ素からなる場合は、ガラスの軟化点（５００℃から６００℃）以上で加熱することが好ましい。加熱により、ケイ素、クロム、ニッケル、又はチタン等からなる蒸着膜１１９、１２１が酸化され、図２０に示すように、二酸化ケイ素、酸化クロム、酸化ニッケル、又は酸化チタンからなる酸化膜１２が、基板１１とパターン構造１３との間、及び基板１１上のパターン構造１３から露出する部分に形成される。
【００４７】
例えば、結晶石英からなる基板上に、熱酸化膜を介さずに、金からなるパターン構造を形成すると、アンモニア過酸化水素水による洗浄で、パターン構造が基板上から消失する場合がある。これに対し、実施の形態に係るチップの製造方法によれば、加熱により、酸化膜１２とパターン構造１３の界面が粗面化され、酸化膜１２とパターン構造１３の密着性が向上する。そのため、アンモニア過酸化水素水による洗浄で、基板１１表面からパターン構造１３が消失することを抑制することが可能となる。
【００４８】
また、ケイ素、クロム、ニッケル、又はチタン等の半金属又は金属は、屈折率が高いため、図１９に示す蒸着膜１１９、１２１の厚さが薄くても、局在プラズモン共鳴のスペクトル分解能を劣化させる。そのため、微量物質の検出が困難となる。これに対し、二酸化ケイ素、酸化クロム、酸化ニッケル、又は酸化チタンは、非酸化物よりも屈折率が低いため、局在プラズモン共鳴のスペクトル分解能を劣化させず、微量物質の検出を妨げない。
【００４９】
次に、図２１に示すように、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面にリンカー１４を固定する。パターン構造１３上において、リンカー１４は、金−硫黄（Ａｕ−Ｓ）結合により、パターン構造１３上に固定される。また、酸化膜１２上においては、リンカー１４は、ケイ素−酸素―ケイ素（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）結合により、酸化膜１２上に固定される。リンカー１４は、例えば、パターン構造１３の表面及びパターン構造１３で覆われていない酸化膜１２の表面上で、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成する。その後、図２２に示すように、開環した糖のアルデヒド基と、リンカーのアミノオキシ基と、を反応させて、リンカーに糖を結合し、図４に示すチップ１０が得られる。
【００５０】
従来、生体物質を基板上に捕捉するためには、標的となる生体物質と特異的に結合する抗体等のタンパク質を基板上に固定している。タンパク質と標的となる生体物質との特異的な結合は、タンパク質の三次元構造による。そのため、基板上にタンパク質を固定する際には、タンパク質の構造が変化しないようにする必要がある。したがって、基板に接触することによってタンパク質の構造が変化しないよう、基板とタンパク質の間に、長いリンカーを挟んでいる。
【００５１】
これに対し、本発明者は、鋭意研究の末、パターン構造を有する基板上に長いリンカーを挟んでタンパク質を固定したチップにおける局在プラズモン共鳴の分解能が低いことを見出した。さらに本発明者は、パターン構造を有する基板上に短いリンカーを挟んで糖鎖又はアプタマーを固定したチップにおける局在プラズモン共鳴の分解能が高いことを見出した。
【００５２】
理論に拘束されるものではないが、タンパク質のような複雑な三次元構造をとらない糖鎖又はアプタマーは、長いリンカーを用いずに基板上に固定しても、ウイルスとの特異性が失活しないものと考えることができる。また、抗体等のタンパク質は一般的に長さが１０ｎｍから１５ｎｍあるのに対し、糖鎖及びアプタマーは一般的に長さが１ｎｍから２ｎｍである。そのため、理論に拘束されるものではないが、リンカーと糖鎖又はアプタマーの合計長が短くなることにより、パターン構造近傍の局在プラズモン増強場に、糖鎖又はアプタマーに結合されたウイルスが近づくため、局在プラズモン共鳴の分解能が高くなるものと考えることができる。
【００５３】
よって、以上説明した実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置は、ウイルスと結合する糖鎖又はアプタマーを備えるチップを用いて、ウイルスを短時間で高感度に検出することが可能である。また、糖鎖及びアプタマーは、高温環境下でも変性しにくい。そのため、実施の形態に係る表面プラズモン共鳴測定装置は、高温環境下でもウイルスを短時間で高感度に検出することが可能である。
【００５４】
（実施例１）
石英基板、石英基板上に配置された酸化ケイ素膜、及び酸化ケイ素膜上に斜方格子上に配置された金からなるドットパターン構造を備えるチップを用意した。ドットパターン構造のぞれぞれのドットの厚さは４０ｎｍ、直径は４００ｎｍ、間隔は８００ｎｍであった。用意したチップを炉に入れ、室温から０．１時間で４５０℃まで昇温後、１時間４５０℃加熱した。次に、チップを１０分間オゾン酸化処理し、さらにチップを５分間、７５℃でアンモニア過水（ＮＨ3／Ｈ2Ｏ2／Ｈ2Ｏ＝１０／１０／５０ｍＬ）処理し、不純物を除去した。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータ（Ｓｌｏｐｅ  ０．１秒、回転数５０００ｒｐｍ、１０秒）で乾燥させた。
【００５５】
再度、チップを１０分間オゾン酸化処理した後、アミノオキシシランカップリング剤（３−ａｍｉｎｏｏｘｙｐｒｏｐｙｌ  ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ  ＨＣｌ  ｓａｌｔ、医化学創薬株式会社）０．１ｗ／ｗ％水溶液に室温で１時間浸漬させ、チップの酸化ケイ素膜表面の水酸基と、リンカーとしてのアミノオキシシランカップリング剤と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させ、さらに１００℃の恒温槽で１時間加熱した。
【００５６】
次に、チップをγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンＨＣｌ（Carbosynth Limited）０．１ｗ／ｗ％メタノール溶液に室温で４１時間浸漬させ、チップのパターン構造の金と、リンカーとしてのγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンと、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。
【００５７】
その後、チップを３’−シアリルラクトース酢酸水溶液（フナコシ、０．１ｍＭ、ｐＨ５．３）に６０℃で１．５時間浸漬させ、酸化ケイ素膜及びドットパターン構造上のリンカーのアミノオキシ基と、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスと結合する３’−シアリルラクトースと、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。
【００５８】
３’−シアリルラクトースが固定されたチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。次に、３’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを１ｐｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２３に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００５９】
次に、３’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１ｆｇ／ｍＬで含む検査液１０μＬをドットパターン構造上に滴下し、１０分間室温で放置した。当該検査液には、個数にして、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１０個程度含んでいるものと考えられる。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２３に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。
【００６０】
実施例１の結果は、実施例１に係る表面プラズモン共鳴測定装置が、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを短時間に高感度で検出可能であること、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを誤検出しないことを示している。
【００６１】
（実施例２）
糖鎖としてＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスと結合する６’−シアリルラクトースを固定した以外は、実施例１と同様のチップを用意した。用意したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。次に、ＰＢＳ１０μＬをドットパターン構造上に滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定したところ、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００６２】
また、６’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１ｐｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２４に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００６３】
次に、６’−シアリルラクトースが固定されたチップのドットパターン構造上に、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを１ｐｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２４に示すように、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。
【００６４】
実施例２の結果は、実施例２に係る表面プラズモン共鳴測定装置が、Ｈ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスを短時間に高感度で検出可能であること、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを誤検出しないことを示している。
【００６５】
（比較例１）
石英基板、石英基板上に配置された酸化ケイ素膜、及び酸化ケイ素膜上に斜方格子上に配置された金からなるドットパターン構造を備えるチップを用意した。ドットパターン構造のぞれぞれのドットの厚さは４０ｎｍ、直径は４００ｎｍであった。用意したチップを炉に入れ、室温から０．１時間で４５０℃まで昇温後、１時間４５０℃加熱した。次に、チップを１０分間オゾン酸化処理し、さらにチップを５分間、７５℃でアンモニア過水（ＮＨ3／Ｈ2Ｏ2／Ｈ2Ｏ＝１０／１０／５０ｍＬ）処理し、不純物を除去した。
【００６６】
再度、チップを１０分間オゾン酸化処理した後、チップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。
【００６７】
また、オゾン酸化処理されたチップを水ですすぎ、スピンコータ（Ｓｌｏｐｅ  ０．１秒、回転数５０００ｒｐｍ、１０秒）で乾燥させた。乾燥後、図２５に示すようにアルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオール（ProChimia Surfaces Sp. z o.o.）９９ｗ／ｗ％エタノール溶液に室温で１時間浸漬させ、図２６に示すようにチップのパターン構造の金と、リンカーとしてのＮＨＳチオールと、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。
【００６８】
アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階であるにもかかわらず、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。
【００６９】
次に、アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定したチップをＨ１抗体（アブカム）溶液に２５℃で約１０分間浸漬させ、図２８に示すように、ドットパターン構造上のリンカーのＮＨＳ基と、Ｈ１抗体のアミノ基と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。
【００７０】
Ｈ１抗体を固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階と比べて、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００７１】
次に、アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを介してＨ１抗体を固定したチップをＨ１抗原（アブカム）溶液に２５℃で約１０分間浸漬させ、図２９に示すように、Ｈ１抗体と、Ｈ１抗原と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。
【００７２】
Ｈ１抗原を固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階と比べて、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００７３】
別途、アルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定したチップをエタノールアミン（和光純薬工業）溶液に２５℃で約６０分間浸漬させ、ドットパターン構造上のリンカーのＮＨＳ基と、エタノールアミンのアミノ基と、を反応させた。その後、チップを水ですすぎ、スピンコータで乾燥させた。
【００７４】
エタノールアミンを固定したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図２７に示すように、ＮＨＳチオールのみが固定された段階と比べて、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００７５】
比較例１の結果から、リンカーとしてアルキル鎖の炭素数が１０であるＮＨＳチオールを固定すると、それだけでチップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークが大きくシフトしてしまい、その後、リンカーにさらに物質を固定しても、吸収ピークは大きくシフトしないことが明らかになった。
【００７６】
（実施例３）
実施例１と同様の方法で、リンカー及び糖鎖が固定される前のオゾン酸化処理されたチップを用意し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。次に、実施例１と同様の方法で、チップのパターン構造に、アルキル鎖の炭素数が３であるγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンを固定した。γ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンを固定したチップを透過した光のスペクトルを測定したところ、図３０に示すように、吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００７７】
次に、実施例１と同様の方法で、チップのパターン構造上のγ−（アミノオキシ）プロピルメルカプタンに、６’−シアリルラクトースを固定した。６’−シアリルラクトースを固定したチップを透過した光のスペクトルを測定したところ、図３０に示すように、吸収ピークは、ほとんどシフトしなかった。
【００７８】
実施例３の結果から、鎖長の短いリンカー及び糖鎖は、チップを透過した光のスペクトルに大きな影響を与えないことが示された。
【００７９】
（比較例２）
チップの酸化ケイ素膜表面をアミノオキシシランカップリング剤で修飾しなかった以外は、実施例２と同様のＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルスと結合する６’−シアリルラクトースを固定したチップを用意した。用意したチップに光を照射し、チップを透過した光のスペクトルを測定した。
【００８０】
次に、チップ上に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスを１０μｇ／ｍＬで含む検査液を滴下し、１０分間室温で放置した。その後、水ですすいで自然乾燥させ、チップを透過した光のスペクトルを測定した。その結果、図３１に示すように、６’−シアリルラクトースはＨ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスと結合しないにもかかわらず、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークは、高波長側にシフトした。
【００８１】
理論に拘束されるものではないが、比較例２の結果は、図３２に示すように、アミノオキシシランカップリング剤で修飾されずに露出したチップの酸化ケイ素膜表面に、Ｈ５Ｎ１亜型鳥インフルエンザウイルスが非特異的に吸着したことによると考えられる。
【００８２】
（実施例４）
実施例２と同様に、６’−シアリルラクトースを固定したチップを複数用意し、それぞれ、１μｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１ｐｇ／ｍＬ、１ｆｇ／ｍＬのＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルス検査液と反応させた。リンカーを結合する前のオゾン酸化処理した後のチップを透過した光のスペクトルに対する、１μｇ／ｍＬのＨ１Ｎ１亜型季節性インフルエンザウイルス検査液と反応した後のチップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークの波長シフトを１００％として、図３３に示すように、リンカーのみを結合した場合、リンカーに糖鎖のみを結合した場合、及び糖鎖に各濃度のウイルスを結合した場合における波長シフトをグラフにした。
【００８３】
実施例４の結果から、鎖長の短いリンカー及び糖鎖は、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークの波長シフトに大きな影響を与えないが、糖鎖に特異的なウイルスが結合すると、ウイルスの濃度が１ｆｇ／ｍＬのような極めて低い濃度でも、チップを透過した光のスペクトルにおける吸収ピークが大きく波長シフトすることが示された。
【００８４】
（その他の実施の形態）
上記のように本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、実施の形態では、ナノインプリントリソグラフィー法を用いたチップの製造方法を説明したが、電子線リソグラフィー法を用いてチップを製造してもよい。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。
【符号の説明】
【００８５】
１０   チップ
１１   基板
１２   酸化膜
１３   パターン構造
１４   リンカー
１５   アプタマー
２０   光源
３０   検出器
４０   筐体
４１   検査液セル
４２   導入ガイド
５０   バンドパスフィルタ
６０   廃液タンク
６１   バルブ
７０   表示部
１００ モールド
１１０ 反転レプリカモールド
１１９ 蒸着膜
１２０ 樹脂層
１２１ 蒸着膜
１２２ 堆積膜
３００ 処理装置
【図１】
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【図２】
0006548981.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006548981.tif 000009
【図９】
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【図１０】
0006548981.tif 000011
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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