(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対して２００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を示す結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ａ）配列番号１に示される塩基配列を含む、又は
Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、ＲＮＡアプタマー。
【請求項２】
ヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対して２００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を示す結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
Ａ）配列番号２に示される塩基配列を含む、又は
Ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、ＲＮＡアプタマー。
【請求項３】
化学修飾したヌクレオチドを有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項４】
各ピリミジンヌクレオチドにおけるリボース部位の２’位は、同一又は異なって、無置換であるか、又はフッ素原子、メトキシ基、アミノ基、２’,４’−ＢＮＡ基、及び水素原子からなる群のいずれかの原子又は基で置換されていることを特徴とする、請求項３に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項５】
３’末端及び／又は５’末端がインバーストデオキシチミジン（ｉｄＴ）又はポリエチ レングリコールにより修飾されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項６】
標識化されたものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項７】
機能性化合物が結合されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマーを固定してなる担体。
【請求項９】
転写によって請求項１又は２に記載のＲＮＡアプタマーに変換可能なＤＮＡ。
【請求項１０】
３’末端にＲＮＡポリメラーゼ認識配列が付加されている、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
ＲＮＡポリメラーゼ認識配列がＴ７プロモーター配列である、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマーを含む、ＫＰＮＡ２タンパク質検出用試薬。
【請求項１３】
生体由来のサンプルに対して、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー、請求項８記載の担体、又は請求項１２記載の試薬を接触させる工程を含む、ＫＰＮＡ２タンパク質の検出方法。
【請求項１４】
生体由来のサンプルに対して、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー、又は請求項１２記載の試薬を適用することを特徴とする、ＫＰＮＡ２タンパク質を発現する細胞の検出方法。
【請求項１５】
癌細胞の検出方法である、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項１７】
癌治療用組成物である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する、ＫＰＮＡ２タンパク質発現細胞に対する細胞増殖阻害剤。
【請求項１９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する、ＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤。
【請求項２０】
ＫＰＮＡ２タンパク質の核移行能を阻害するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、生体由来のサンプルに対して請求項１〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡアプタマー、又は請求項１９記載のＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤を適用する工程を含む、方法。
【請求項２１】
ＫＰＮＡ２タンパク質を発現する細胞の増殖を抑制するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、生体由来のサンプルに対して請求項１〜７のいずれか一 項に記載のＲＮＡアプタマー、又は請求項１９記載のＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤を適用する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞に高発現する細胞核輸送受容体ＫＰＮＡ２タンパク質の検出、濃縮、精製、定量及び機能阻害に効果的な新規物質に関する。具体的には、本発明は、核輸送受容体ＫＰＮＡ２タンパク質と高親和性で結合する新規ＲＮＡアプタマーに関する。さらには、当該ＲＮＡアプタマーを含有してなる検出用試薬、担体、阻害剤及び医薬組成物、並びに、当該ＲＮＡアプタマーを用いたＫＰＮＡ２タンパク質の検出方法、濃縮方法、精製方法、細胞核輸送機能阻害方法、及びＫＰＮＡ２タンパク質発現細胞の増殖抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物の細胞核は核膜で覆われ、細胞質と細胞核の間の分子輸送は制限される。細胞核には遺伝子が収納されており、適切なタイミングで必要な機能性分子を細胞質から細胞核へと運び入れて遺伝子に作用させることが、様々な細胞の活動に必須である。
【０００３】
核膜には核膜孔が存在し、分子サイズ４０ｋＤａを超えるタンパク質の多くは特異的な輸送受容体を介した選択的な分子輸送により細胞核の内外を行き来する。このような選択的輸送を担う輸送受容体はインポーチン、エクスポーチンと呼ばれる。このうちインポーチンは、タンパク質が持つ核移行シグナル(Nuclear Localization Signal, 以下、ＮＬＳという)と呼ばれるアミノ酸配列を認識して当該タンパク質と結合し、細胞質から細胞核内へと当該タンパク質を輸送する。なお、核移行シグナルは、核局在シグナル、又は核局在化シグナルと呼ばれることもあるが、当業者によって使用されるこれらの用語は本明細書において同義のものとみなす。
【０００４】
核輸送受容体の一つであるインポーチンα(importin α、Karyopherin α、ＫＰＮＡ)は塩基性アミノ酸に富んだＮＬＳを認識し、インポーチンβ(importin β)と共に３種類のタンパク質の複合体を形成する。この複合体はインポーチンβと核膜孔の構成タンパク質との親和性により核膜孔を通過する（図１に模式図を示す）。細胞核内部に入った複合体は解離し、インポーチンαおよびインポーチンβはそれぞれ細胞質へと移動して再利用される。
【０００５】
インポーチンαには複数種のファミリー分子が存在し、ヒトでは７種類の遺伝子が同定されている（ＫＰＮＡ１（インポーチンα５）、ＫＰＮＡ２（インポーチンα１）、ＫＰＮＡ３（インポーチンα４）、ＫＰＮＡ４（インポーチンα３）、ＫＰＮＡ５（インポーチンα６）、ＫＰＮＡ６（インポーチンα７）、及びＫＰＮＡ７（インポーチンα８））。これらファミリー分子は細胞種に応じてそれぞれ発現量が異なる。また、これらファミリー分子は、それぞれＮＬＳの配列に応じた基質特異性を示す。インポーチンαにより細胞核へと輸送されるタンパク質は少なくとも７５種類が報告されている（非特許文献１）。また、核タンパク質には、インポーチンαにより輸送されることが予想されるＮＬＳ配列を含むものが多数含まれる。これらを考慮すると、高々７種類のファミリー分子を使用することにより、多様なタンパク質の運び分けがなされていることになる。それゆえ、インポーチンαの細胞種特異的発現、及び各種インポーチンα分子種と輸送基質となるタンパク質が有するＮＬＳとの特異性は、いずれも細胞機能の維持や調節のために重要な性質であると考えられる。
なお、インポーチン分子種は、インポーチンα１、インポーチン−α１、及びインポーチンα−１のように、ハイフンを付して示される場合と付さずに示される場合とがあるが、いずれも同義である。
【０００６】
インポーチンαはマウス胚性幹細胞の分化に際し、転写因子の細胞核への輸送を担って細胞運命の決定に働くことが報告されている。特に、インポーチンαファミリーのうちＫＰＮＡ２タンパク質は未分化な胚性幹細胞において高く発現し、細胞分化の進行と共に発現量が低下することが知られている。そして、この低下を阻害すると細胞分化も抑制されることから、ＫＰＮＡ２タンパク質は幹細胞の未分化性の維持に必要であることが示唆されている（非特許文献２）。
【０００７】
さらに、ＫＰＮＡ２はヒトの腫瘍や癌組織（例えば、悪性黒色腫、子宮頸癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳腫瘍、肝臓癌、及び膀胱癌）において高く発現することから、癌マーカーとなることが知られている（非特許文献３）。
【０００８】
インポーチンαをターゲットとした阻害剤として、現在のところ、インポーチンα特異的抗体やインポーチンα特異的基質のＮＬＳ部分に対応するペプチドなどが報告されている（非特許文献４及び５）。しかしながら、インポーチンαファミリー間の相同性が高いため、複数分子種のインポーチンαファミリーが混在する条件下において、抗インポーチンα抗体を用いて分子種特異的な検出を行うことは困難であった。例えば、ＫＰＮＡ２タンパク質に対する抗体として、厳密に分子種特異的であるといえるものはほとんど存在しないと言える。また、インポーチンα特異的基質のＮＬＳ部分に対応するペプチドとして、ＫＰＮＡ１タンパク質に対して結合性を示すペプチドについて報告があるものの、当該ペプチドは他のインポーチンα分子種に対しても弱い結合性を示した。十分に厳密な分子種特異的な反応が見出されないことにおいて、抗体の場合と同様である。また、ＫＰＮＡ遺伝子の発現をＳｉＲＮＡによって分子種特異的に抑制する試みもなされている。しかしながら、ＳｉＲＮＡはＫＰＮＡタンパク質の分子種特異的な発現の検出に使用することはできず、ＫＰＮＡタンパク質の発現レベルを指標とした診断薬に利用することもできない。これらの理由から、より分子種特異性が高いインポーチンα結合性物質の開発が求められていた。また、特異性の高い結合特性を利用して、インポーチンα結合性物質を含む分子種特異的なインポーチンα機能阻害剤の開発が求められていた。
【０００９】
一方、機能性核酸であるアプタマーは、基質と特異的に結合するという点において抗体と類似の機能を有する。両者を比較すると、イオンのような小さい分子から、巨大なタンパク質複合体やウイルス粒子のような大きな標的までを結合の対象とすることができる点で、アプタマーは抗体よりも利用範囲が広い。特にＲＮＡアプタマーは複雑な３次構造をとり、標的化合物を高度に識別して結合することができる（非特許文献６）。したがって、アプタマーの高識別機能は近縁のタンパク質を識別するために大変有効な道具として使用できる可能性がある。しかしながら、インポーチンαファミリーのタンパク質に対する特異的なアプタマーに関する報告はなく、アプタマーの利用によりインポーチンα分子種を厳密に区別できるかどうか明らかではなかった。そして、アプタマーと特定のインポーチンα分子種との結合を利用して、当該特定の分子種のインポーチンαの機能を阻害することや、当該阻害によって細胞の生理機能を調節することが可能であるか否かも明らかでなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Pumroy RA, Cingolani G. Diversification of importin-alpha isoforms in cellular trafficking and disease states. Biochem. J. (2015.2) 466: 13-28.
【非特許文献２】Yasuhara N, Shibazaki, N, Tanaka S, Nagai M, Kamikawa Y, Oe S, Asally M, Kamachi Y, Kondoh H, Yoneda Y. Triggering neural differentiation of ES cells by subtype switching of importin-alpha. Nat. Cell Biol. (2007) 9:72-79.
【非特許文献３】Christiansen A, Dyrskjot L. The functional role of the novel biomarker karyopherin alpha-2 (KPNA2) in cancer. Cancer Lett. (2013) 331: 18-23.
【非特許文献４】Lin YZ, Yao SY, Veach RA, Torgerson TR, Hawiger J. Inhibition of nuclear translocation of transcription factor NF-kappa B by a synthetic peptide containing a cell membrane-permeable motif and nuclear localization sequence. J. Biol. Chem. (1995) 270: 14255-14258.
【非特許文献５】Zienkiewicz J, Armitage A, Hawiger J. Targeting nuclear import shuttles, importins/karyopherins alpha by a peptide mimicking the NFkappaB1/p50 nuclear localization sequence. J. Am. Heart Assoc. (2013) 2: e000386.
【非特許文献６】Jenison R.D., Gill S.C., Pardi A., and Polisky B. High-resolution molecular discrimination by RNA. Science (1994) 263: 1425-1429.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の課題は、細胞核輸送受容体インポーチンαのうち、特に腫瘍や癌組織において高く発現するＫＰＮＡ２タンパク質に注目し、ＫＰＮＡ２タンパク質の検出、濃縮、精製、定量及び機能阻害に効果的な新規物質を提供することにある。より具体的には、本発明は、第一に核輸送受容体ＫＰＮＡ２タンパク質と高親和性で結合する新規ＲＮＡアプタマーの提供を課題とする。そして、当該ＲＮＡアプタマーを含有してなる検出用試薬、担体、阻害剤及び医薬組成物、並びに、当該ＲＮＡアプタマーを用いたＫＰＮＡ２タンパク質の検出方法、濃縮方法、精製方法、細胞核輸送機能阻害方法、及びＫＰＮＡ２タンパク質発現細胞の増殖抑制方法の提供を本発明の課題とする。さらには、ＫＰＮＡ２タンパク質の腫瘍や癌組織における高発現に鑑み、当該ＲＮＡアプタマーを含む癌検査薬、及び当該ＲＮＡアプタマーを含むＫＰＮＡ２タンパク質機能阻害性の抗癌薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を行った結果、細胞核輸送受容体インポーチンαのうち、ＫＰＮＡ２タンパク質に結合するＲＮＡアプタマーを複数種類取得した。そして、当該ＲＮＡアプタマーがＫＰＮＡ２タンパク質と高親和性で結合すること、ＫＰＮＡ１タンパク質に対しては実質的な結合能を有しないこと、当該アプタマーによりＫＰＮＡ２タンパク質の発現が検出できること、及び、当該ＲＮＡアプタマーの投与によりＫＰＮＡ２タンパク質発現細胞におけるＫＰＮＡ２タンパク質依存的な細胞核への物質（ＮＬＳ含有タンパク質）の輸送機能が阻害されることを見出し、これらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、ＫＰＮＡ２タンパク質に対して結合能を有するＲＮＡアプタマーに関する。その具体例としては、アプタマー７６、及びアプタマー７２、並びにこれらの修飾体、又はこれらと構造（配列）上極めて類似し、かつ機能的に同等なＲＮＡアプタマーに関する。また、当該ＲＮＡアプタマーを固定してなる担体、当該ＲＮＡアプタマーを含む試薬、医薬組成物、又はＫＰＮＡ２タンパク質の機能阻害剤、当該ＲＮＡアプタマーを使用した検出方法、濃縮方法、精製方法、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＫＰＮＡ２タンパク質の機能の阻害方法に関する。さらに、転写により当該ＲＮＡアプタマーに変換可能なＤＮＡに関する。
【００１４】
より詳細には、以下の（１）〜（５４）に関する。
（１）ヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対して２００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を示す結合能を有するＲＮＡアプタマー。
（２）Ａ）配列番号１に示される塩基配列を含む、又は  Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、前記（１）に記載のＲＮＡアプタマー。
（３）配列番号１に示される塩基配列からなる、前記（１）に記載のＲＮＡアプタマー。
（４）Ａ）配列番号２に示される塩基配列を含む、又は  Ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、前記（１）に記載のＲＮＡアプタマー。
（５）配列番号２に示される塩基配列からなる、前記（１）に記載のＲＮＡアプタマー。
（６）化学修飾したヌクレオチドを有することを特徴とする、前記（１）〜（５）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
（７）各ピリミジンヌクレオチドにおけるリボース部位の２’位は、同一又は異なって、無置換であるか、又はフッ素原子、メトキシ基、アミノ基、２’,４’−ＢＮＡ基、及び水素原子からなる群のいずれかの原子又は基で置換されていることを特徴とする、前記（６）に記載のＲＮＡアプタマー。
（８）３’末端及び／又は５’末端がインバーストデオキシチミジン（ｉｄＴ）又はポリエチレングリコールにより修飾されていることを特徴とする、前記（１）〜（７）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
（９）標識化されたものである、前記（１）〜（８）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
（１０）機能性化合物が結合されている、前記（１）〜（８）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
【００１５】
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーを固定してなる担体。
（１２）転写によって前記（１）〜（５）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーに変換可能なＤＮＡ。
（１３）Ａ）配列番号７に示される塩基配列を含む、又は  Ｂ）配列番号７に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、前記（１２）に記載のＤＮＡ。
（１４）Ａ）配列番号８に示される塩基配列を含む、又は  Ｂ）配列番号８に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、前記（１２）に記載のＤＮＡ。
（１５）３’末端にＲＮＡポリメラーゼ認識配列が付加されている、前記（１２）〜（１４）のいずれか一に記載のＤＮＡ。
（１６）ＲＮＡポリメラーゼ認識配列がＴ７プロモーター配列である、前記（１５）に記載のＤＮＡ。
（１７）前記（１２）〜（１６）のいずれか一に記載のＤＮＡと相補の塩基配列を有する相補鎖ＤＮＡ。
（１８）前記（１２）〜（１６）のいずれか一に記載のＤＮＡとその相補鎖ＤＮＡとが相補的にハイブリダイズした２本鎖ＤＮＡ。
【００１６】
（１９）前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーを含む、ＫＰＮＡ２タンパク質検出用試薬。
（２０）生体由来のサンプルに対して、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、前記（１１）記載の担体、又は前記（１９）記載の試薬を接触させる工程を含む、ＫＰＮＡ２タンパク質の検出方法。
（２１）生体由来のサンプルに対して、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、又は前記（１９）記載の試薬を適用することを特徴とする、ＫＰＮＡ２タンパク質を発現する細胞の検出方法。
（２２）癌細胞の検出方法である、前記（２１）に記載の検出方法。
（２３）生体由来のサンプルに対して、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、又は前記（１９）記載の試薬を接触させる工程を含む、細胞におけるＫＰＮＡ２タンパク質の検出方法。
（２４）細胞が癌細胞である、前記（２３）に記載の検出方法。
（２５）癌の診断のための検出方法であって、Ａ）生体由来のサンプルに対して、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、又は前記（１９）記載の試薬を接触させる工程、及び  Ｂ）サンプルと特異的に結合したＲＮＡアプタマーを検出する工程を含む、方法。
【００１７】
（２６）前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する医薬組成物。
（２７）癌治療用組成物である、前記（２６）に記載の医薬組成物。
（２８）前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する、ＫＰＮＡ２タンパク質発現細胞に対する細胞増殖阻害剤。
（２９）前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する、ＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤。
（３０）ＫＰＮＡ２タンパク質の核移行能を阻害するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、生体由来のサンプルに対して前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、又は前記（２９）に記載のＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤を適用する工程を含む、方法。
（３１）ＫＰＮＡ２タンパク質を発現する細胞の増殖を抑制するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法であって、生体由来のサンプルに対して前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、又は前記（２９）に記載のＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤を適用する工程を含む、方法。
【００１８】
（３２）生体由来のサンプルと、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー、又は前記（１１）に記載の担体とを接触させる工程を含む、生体サンプル中のＫＰＮＡ２タンパク質の定量方法。
（３３）生体由来のサンプルと、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマーを接触させる工程、及び、該ＲＮＡアプタマーと該サンプル中のＫＰＮＡ２タンパク質との相互作用を測定する工程含む、ＫＰＮＡ２タンパク質の検出方法。
（３４）相互作用の測定を表面プラズモン共鳴法で行うことを特徴とする、前記（３３）に記載の検出方法。
（３５）機能性化合物が酵素、薬物送達媒体、薬物、又はタグ物質である、前記（１０）に記載のＲＮＡアプタマー。
（３６）タグ物質がビオチンである、前記（３５）記載のＲＮＡアプタマー。
（３７）ＫＰＮＡ２タンパク質の濃縮用、又は精製用である、前記（１１）記載の担体。
（３８）担体がカラムである、前記（１１）又は（３６）のいずれか一に記載の担体。
（３９）前記（１１）、（３７）又は（３８）のいずれか一に記載の担体に対して生体由来のサンプルを適用する工程を含む、ＫＰＮＡ２タンパク質を分離及び／又は濃縮及び／又は精製する方法。
（４０）、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のアプタマー、又は前記（１９）に記載の試薬を含む、癌診断用キット。
（４１）機能阻害が、ＫＰＮＡ２タンパク質−ＫＰＮＡ２タンパク質結合性物質複合体の細胞核内への輸送阻害である、前記（２９）記載の機能阻害剤。
（４２）前記（１８）記載の２本鎖ＤＮＡを含むベクター。
（４３）前記（４２）記載のベクターで形質転換された細胞。
【００１９】
（４４）癌の治療及び／又は転移防止方法における使用のための、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のアプタマー。
（４５）癌の治療及び／又は転移防止のための医薬の製造における、前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のアプタマーの使用。
（４６）癌の治療及び／又は転移防止が必要な患者に対して前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のアプタマー、又は前記（２７）記載の医薬組成物を投与する工程を含む、癌の治療及び／又は転移防止方法。
（４７）ＫＰＮＡ２タンパク質の発現が亢進した細胞を含む癌患者に対し前記（１）〜（１０）のいずれか一に記載のアプタマー、又は前記（２７）記載の医薬組成物を投与する工程を含む、癌細胞の増殖防止及び／又は転移防止方法。
【００２０】
（４８）ＫＰＮＡ２タンパク質に対して結合能を有し、かつＫＰＮＡ１タンパク質に対して実質的な結合能を有しないＲＮＡアプタマー。
（４９）ＫＰＮＡ２タンパク質に対して結合能を有し、かつＮＬＳ含有タンパク質のＫＰＮＡ２タンパク質を介した細胞核輸送に関して阻害活性を有するＲＮＡアプタマー。
（５０）ＫＰＮＡ１タンパク質に対して実質的な結合能を有しない、前記（４９）記載のＲＮＡアプタマー。
（５１）ヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対して２００ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を示す結合能を有する前記（４８）〜（５０）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
（５２）Ａ）配列番号１に示される塩基配列を含む、又は  Ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、前記（４８）〜（５１）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
（５３）Ａ）配列番号２に示される塩基配列を含む、又は  Ｂ）配列番号２に示される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含むものである、前記（４８）〜（５１）のいずれか一に記載のＲＮＡアプタマー。
（５４）ＮＬＳ含有タンパク質のＫＰＮＡ１タンパク質を介した細胞核輸送に関して実質的な阻害活性を有しない、前記（４８）〜（５３）のいずれか一にＲＮＡアプタマー。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のＲＮＡアプタマーによれば、ＫＰＮＡ２タンパク質の特異的な検出、濃縮、精製、定量、及びＫＰＮＡ２タンパク質を介したＮＬＳ含有物質の細胞核への輸送阻害が可能になる。また、ＫＰＮＡ２タンパク質が癌マーカーであることから癌細胞の検出が可能となる。言い換えれば、本発明のＲＮＡアプタマーを用いることにより、癌の検査用試薬やキットを提供することができる。さらに、前記阻害作用を利用することにより、本発明のＲＮＡアプタマーまたはそれを含む組成物は、細胞増殖阻害剤として用いることができる。ここで標的細胞が癌細胞であれば、前記細胞増殖阻害剤は、癌の治療薬又は癌の転移抑制用医薬組成物として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＮＬＳ含有物質の核膜孔を介した核内への輸送メカニズムを模式的に表した図である。核輸送受容体の一つであるインポーチンα−１(ＫＰＮＡ２)は、塩基性アミノ酸に富んだＮＬＳを認識し、インポーチンβと共に３種類のタンパク質の複合体を形成する（Importin-beta-KPNA2-NLS Cargo complex）。この複合体はインポーチンβと核膜孔の構成タンパク質との親和性により核膜孔を通過する。
【図２】図２は、本発明により得られたＲＮＡアプタマーであるアプタマー７６、７２及び２１の配列、並びにBayesFoldプログラムにより計算したそれぞれのＲＮＡアプタマー分子の二次構造モデルを示す図である。
【図３】図３は、ＫＰＮＡ２タンパク質とアプタマー７６、７２又は２１との相互作用を解析した結果を示す図である。タンパク質無添加、マウスＫＰＮＡ２タンパク質２４６ｎＭ、４９２ｎＭ、又は９８４ｎＭ添加の場合について、各種アプタマーとの相互作用を膜上のフィルター結合アッセイで確認した。アプタマー７６又は７２を使用した場合、ＫＰＮＡ２タンパク質の添加量に依存したシグナルの増強が認められた。
【図４ａ）】図４ａ）は、ＫＰＮＡ２タンパク質とアプタマー７６、又は７２との相互作用を解析した結果を示す図である。タンパク質無添加、マウスＫＰＮＡ２タンパク質３７ｎＭ、７４ｎＭ、１４８ｎＭ、２９６ｎＭ、又は５９２ｎＭ添加の場合について、各種アプタマーとの相互作用をフィルター結合アッセイにより膜上で確認した。アプタマー７６又は７２のいずれのＲＮＡアプタマーを使用した場合でも、ＫＰＮＡ２タンパク質の添加量に依存したシグナルの増強が認められた。一方、マウスＫＰＮＡ１タンパク質を７２ｎＭ、１４４ｎＭ、２８８ｎＭ又は５７６ｎＭ添加した場合、アプタマーとタンパク質との結合のシグナルはバックグラウンドとほぼ同レベルであるか、又は全く認められなかった。
【図４ｂ）】図４ｂ）は、図４ａ）に示す結果に基づき、そのシグナル強度からＫＰＮＡ２タンパク質中におけるアプタマーと結合したタンパク質の割合（％ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ）算出し、添加したＫＰＮＡ２タンパク質の濃度との関係をプロットしたものである。左側の図はアプタマー７６を使用した場合の結果を、右側の図はアプタマー７２を使用した場合の結果を、それぞれ示す。
【００２３】
【図５】図５は、ＮＬＳ含有物質のＫＰＮＡ２タンパク質を用いた核輸送能を解析する実験、及び、同核輸送能をアプタマーを用いて阻害する実験を模式的に表した図である。上段は、核輸送能を解析する実験を示す。培養細胞は、ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）投与により可溶化された後、ＮＬＳタンパク質（ＧＳＴ−ＮＬＳ−ＧＦＰ）、インポーチンβ−１、及びインポーチンα−１（ＫＰＮＡ２）が添加された状態でインキュベートされる。ＮＬＳタンパク質は核輸送され、その核内局在性はＧＦＰの蛍光が核に局在することにより確認される。下段は、上段に示される実験系において、さらにインポーチンα−１と特異的に結合するアプタマーを添加することにより、核輸送能が阻害されることを解析する実験を示す。インポーチンα−１に代えてインポーチンα−１−アプタマー複合体が添加された場合には、ＮＬＳタンパク質の核輸送能は阻害される。この場合、同タンパク質の細胞内の分布を示すＧＦＰの蛍光は、低減した核局在性を示す。
【図６ａ）】図６ａ）は、図５上段に示すＮＬＳタンパク質の核輸送能の解析実験を実際に行った結果を示す図である。ＫＰＮＡ２タンパク質、インポーチンβ−１及びＮＬＳタンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）を添加した場合、ＮＬＳタンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示す。
【図６ｂ）】図６ｂ）は、図６ａ）の対照となるバッファーコントロールでの結果を示す。
【図６ｃ）】図６ｃ）は、図５下段に示すＮＬＳタンパク質の核輸送能をアプタマーにより阻害する解析実験を実際に行った結果を示す図である。ＫＰＮＡ２タンパク質、インポーチンβ−１、ＮＬＳタンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）、及びアプタマー７６を添加した場合、ＮＬＳタンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は低減した核局在性を示す。
【図６ｄ）】図６ｄ）は、図５下段に示すＮＬＳタンパク質の核輸送能をアプタマーにより阻害する解析実験を実際に行った結果を示す図である。ＫＰＮＡ２タンパク質、インポーチンβ−１、ＮＬＳタンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）、及びアプタマー７２を添加した場合、ＮＬＳタンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は低減した核局在性を示す。
【図６ｅ）】図６ｅ）は、図６ｃ）及びｄ）の対照となる実験であり、アプタマー７６又は７２に代えてｔＲＮＡを添加した実験の結果を示す。ＮＬＳタンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示す。
【図７ａ）】図７ａ）は、図５上段に示すＮＬＳタンパク質の核輸送能の解析実験を実際に行った結果を示す図である。ＫＰＮＡ１タンパク質、インポーチンβ−１及びＮＬＳタンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）を添加した場合、ＮＬＳタンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示す。
【図７ｂ）】図７ｂ）は、図７ａ）の対照となるバッファーコントロールでの結果を示す。
【図７ｃ）】図７ｃ）は、図５下段に示すＮＬＳタンパク質の核輸送能をアプタマーにより阻害する解析実験を実際に行った結果を示す図である。ＫＰＮＡ１タンパク質、インポーチンβ−１、ＮＬＳタンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）、及びアプタマー７６を添加した場合、図６ｃ）の場合とは異なり、ＮＬＳタンパク質の核輸送能は阻害されず、同タンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示す。
【図７ｄ）】図７ｄ）は、図５下段に示すＮＬＳタンパク質の核輸送能をアプタマーにより阻害する解析実験を実際に行った結果を示す図である。ＫＰＮＡ１タンパク質、インポーチンβ−１、ＮＬＳタンパク質（ＮＬＳ−ＧＦＰ）、及びアプタマー７２を添加した場合、図６ｄ）の場合とは異なり、ＮＬＳタンパク質の核輸送能は阻害されず、同タンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示す。
【図７ｅ）】図７ｅ）は、図７ｃ）及びｄ）の対照となる実験であり、アプタマー７６又は７２に代えてｔＲＮＡを添加した実験の結果を示す。ＮＬＳタンパク質の存在を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示す。
【図８ａ）】図８ａ）は、図６に示す実験で観察された核移行能を、細胞核部分のＧＦＰ蛍光の蛍光強度で定量化し、かつ、コントロールとの相対値で表したものである。図６ａ）の実験系（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるＮＬＳタンパク質に由来する細胞核部分のＧＦＰ蛍光を１として表す。図中、アプタマー７６、アプタマー７２、及びｔＲＮＡは、それぞれ、図６ｃ）、図６ｄ）及び図６ｅ）の実験系における細胞核部分のＧＦＰ蛍光をコントロールとの相対値で示したものである。バーの高さで相対値を示し、併せて標準偏差もそれぞれ図示した。アプタマー７６及び７２を使用した場合には、ＮＬＳタンパク質の核輸送能が顕著に阻害されていたことが示される。
【図８ｂ）】図８ｂ）は、図７に示す実験で観察された核移行能を、細胞核部分のＧＦＰ蛍光の蛍光強度で定量化し、かつ、コントロールとの相対値で表したものである。図７ａ）の実験系（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるＮＬＳタンパク質に由来する細胞核部分のＧＦＰ蛍光を１として表す。図中、アプタマー７６、アプタマー７２、及びｔＲＮＡは、それぞれ、図７ｃ）、図７ｄ）及び図７ｅ）の実験系における細胞核部分のＧＦＰ蛍光をコントロールとの相対値で示したものである。バーの高さで相対値を示し、併せて標準偏差もそれぞれ図示した。アプタマー７６、７２、及びｔＲＮＡのいずれを使用した場合にも、コントロールの場合と比して、ＮＬＳタンパク質の核輸送能に有意な変化が認められない。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（１）核酸アプタマーの取得法
機能性核酸であるアプタマーは、無数の分子種を含む核酸ライブラリーの中から、「ＳＥＬＥＸ」と呼ばれる方法など、「選択と増幅」を含む一連の過程をｉｎ  ｖｉｔｒｏで繰り返す公知の方法を適用することにより、標的化合物に特異的に結合する物質として取得することができる（例えば、特開２００６−３２０２８９号公報、特開２００９−２０７４９１号公報、又は特開２００９−１６５３９４号公報参照）。
（２）ＲＮＡアプタマーの調製方法
ＲＮＡアプタマーは、化学合成法、又は鋳型ＤＮＡの転写により適宜調製することができる。
核酸の化学合成法は当業者に周知の技法であり、所望の配列からなるＲＮＡを人工的に合成することができる。また、企業の提供する受託合成サービスを利用することもできる。
転写により所望のＲＮＡアプタマーを生じる配列からなるＤＮＡは、その相補鎖ＤＮＡと共に２本鎖ＤＮＡとしてベクターにクローニングすることができる。ベクターには、Ｔ７ＲＮＡプロモーターなど、ＲＮＡ転写のために使用される配列を含めることができる。所望のＲＮＡアプタマーは、ベクターとＴ７ポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼとを使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで適宜調製することができる。
ベクターは、乾燥状態、又は適切な緩衝液に溶解した状態で安定に保存することができる。また、宿主細胞をベクターで形質転換し、形質転換細胞の形としてベクターを長期間安定に保存することも可能である。
【００２５】
（３）インポーチンαタンパク質、インポーチンα遺伝子
ＫＰＮＡ２（インポーチンα−１）タンパク質のアミノ酸配列、及び同タンパク質をコードする核酸の塩基配列に関する情報は公知であり、当業者はデータベースにアクセスすることにより適宜入手できる。例えば、ヒトＫＰＮＡ２（別名ＱＩＰ２、ＲＣＨ１、ＩＰＯＡ１又はＳＲＰ１ａｌｐｈａ）の配列情報は、アクセッション番号ＮＭ＿００２２６６、及びＮＰ＿００２２５７としてＮＣＢＩに登録されている。
ＫＰＮＡ１タンパク質、インポーチンβ−１等のＫＰＮＡ２タンパク質以外のタンパク質に関する配列情報、及び、それらのタンパク質をコードする核酸の塩基配列の情報も、ＫＰＮＡ２の場合と同様にデータベースから適宜入手できる。
ＫＰＮＡ２遺伝子などの本発明に関係する各種核酸は、当業者に周知の遺伝子クローニング技術によって適宜調製できる。
ＫＰＮＡ２タンパク質などの本発明に関係する各種タンパク質は、組換え体タンパク質として、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって調製できる。
【００２６】
（４）本発明のＲＮＡアプタマー
本発明のＲＮＡアプタマーは、ＳＥＬＥＸ法により得られたクローン由来のものであって、ＫＰＮＡ２タンパク質に特異的に結合する能力を有する。
（４−１）
本発明のＲＮＡアプタマーは、その一態様として、ヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対して２μＭ以下、好ましくは６００ｎＭ以下、更に好ましくは２００ｎＭ以下、最も好ましくは１５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）を示す結合能を有するＲＮＡアプタマーである。ここで、本発明のＲＮＡアプタマーは、ヒト以外の哺乳動物種由来のＫＰＮＡ２タンパク質、例えばマウス又はラット由来のＫＰＮＡ２タンパク質に対してもヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対する親和性と同等の親和性で結合できるものであって良い。また、別の好ましい態様としては、本発明のＲＮＡアプタマーは、ＫＰＮＡ２タンパク質の分子種の中でも、ヒトＫＰＮＡ２タンパク質に対して特に高い結合親和性を有するものであってよい。本発明のＲＮＡアプタマーの具体例として後述するアプタマー７６及び７２は、いずれもヒトＫＰＮＡ２タンパク質及びマウスＫＰＮＡ２タンパク質のいずれに対しても高い結合親和性を示し、前記タンパク質との間のＫＤ値は約１５０ｎＭを示すものである。
【００２７】
ここで、解離定数（ＫＤ）という用語は、本明細書で用いる場合、ＫｄとＫａとの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られる解離定数のことを指すものとし、これはモル濃度（Ｍ）として表現される。核酸アプタマーのＫＤ値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。核酸アプタマーのＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いて、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることが挙げられる。なお、Ｋａという用語は、本明細書で用いる場合、特定のＲＮＡアプタマー−基質（インポーチン−αタンパク質）相互作用の会合速度を指すものとする。一方、Ｋｄという用語は、本明細書で用いる場合、特定のＲＮＡアプタマー−基質（インポーチン−αタンパク質）相互作用の解離速度を指すものとする。
【００２８】
（４−２）
本発明のＲＮＡアプタマーは、その一態様として、ＫＰＮＡ２タンパク質に対して結合能を有し、かつＫＰＮＡ１タンパク質に対して実質的な結合能を有しないＲＮＡアプタマーである。
ＫＰＮＡ２タンパク質に対して所望される結合能は、前記（４−１）に例示される親和性を挙げることができる。
【００２９】
ここで、「実質的に結合しない」とは、ＲＮＡアプタマーとＫＰＮＡ１タンパク質とが結合しないか、または高い親和性で結合しないことを意味する。例えば、ＫＰＮＡ１タンパク質とは検出可能なレベルで結合しない（すなわち、ＫＰＮＡ１タンパク質との結合がバックグラウンド以下である）か、又は検出し得るレベルで結合しても、その結合の程度がごく微弱であってＫＰＮＡ２タンパク質との結合よりも明らかに少なく、当業者であればＫＰＮＡ１タンパク質とは結合していないと判断する程度にしか結合しないことを意味する。好ましくは、本発明のＲＮＡアプタマーは、ＫＰＮＡ２タンパク質とのみ結合し、ＫＰＮＡ１タンパク質とは検出可能なレベルで結合しないＲＮＡアプタマーである。例えば、下記実施例では放射性ラベルした本発明のＲＮＡアプタマーとＫＰＮＡ１タンパク質又はＫＰＮＡ２タンパク質とをフィルター上で相互作用させ、フィルター上のカウントを測定することにより結合親和性を調べているが、このような方法で調べた場合にバックグラウンド程度のレベルでしか結合を検出できなければ、検出可能なレベルで結合していないと判断することができる。本発明のＲＮＡアプタマーは、ＫＰＮＡ１タンパク質に限らず、ＫＰＮＡ２タンパク質以外のＫＰＮＡタンパク質分子種とも実質的に結合せず、好ましくは検出可能なレベルで結合しない。
【００３０】
（４−３）
本発明のＲＮＡアプタマーは、その一態様として、ＫＰＮＡ２タンパク質に対して結合能を有し、かつＮＬＳ含有タンパク質のＫＰＮＡ２タンパク質を介した細胞核輸送に関して阻害活性を有するＲＮＡアプタマーである。
ＫＰＮＡ２タンパク質に対して所望される結合能は、前記（４−１）に例示される親和性を挙げることができる。
細胞核輸送に関する阻害活性は、モデル輸送基質であるＧＳＴ−ＮＬＳ（ＳＶ４０由来）−ＧＦＰのＫＰＮＡ２タンパク質を介した細胞核輸送をどれだけの割合で阻害するかによって評価することができる。例えば、系内に十分量のＲＮＡアプタマーを添加した場合に、ＲＮＡアプタマー無添加又は対照のｔＲＮＡ添加時と比して、モデル輸送基質の核内輸送量が少なくとも１２％以上、好ましくは２４％以上減少する場合、「阻害活性を有する」と言うことができる。ここで、細胞核輸送は、例えば可溶化ＨｅＬａ細胞を材料に試験することができる。また、核内輸送量は、当該モデル輸送基質のＧＦＰ部分に由来する蛍光レベルの測定値から換算又は比較可能である。
【００３１】
ＮＬＳとは、核内に選択的に輸送されるタンパク質が有する特異的なアミノ酸配列のことである。１９８４年にＳＶ４０Ｔ抗原に存在するアミノ酸配列として最初に明らかにされた。ＮＬＳの代表的な例としては、ＳＶ４０Ｔ抗原のように１つの塩基性アミノ酸クラスターからなる単極（モノパータイト）型、ヌクレオプラスミンのように十数個のアミノ酸を２つの塩基性アミノ酸クラスターが挟む形で存在する双極（バイパーパイト）型、並びに、Ｎ末端及びＣ末端モチーフが挙げられる。これらのＮＬＳの多くは、インポーチンβファミリーの特異的な受容体により直接的に認識されると考えられている。ＮＬＳのアミノ酸配列の具体例は総説等に纏められているので、当業者に周知である。
本発明のＲＮＡアプタマーは、ＫＰＮＡ２タンパク質と高親和性で結合すると共に、好ましくはＫＰＮＡ２タンパク質、インポーチンβ−１と共に複合体として細胞核内に輸送されるＮＬＳ含有タンパク質の核輸送能を阻害する活性を有するものである。
【００３２】
（４−４）
本発明のＲＮＡアプタマーは、その一態様として、ＫＰＮＡ２タンパク質に対して結合能を有し、かつＮＬＳ含有タンパク質のＫＰＮＡ１タンパク質を介した細胞核輸送に関して実質的な阻害活性を有しないＲＮＡアプタマーである。
ＫＰＮＡ２タンパク質に対して所望される結合能は、前記（４−１）に例示される親和性を挙げることができる。
細胞核輸送に関する阻害活性は、モデル輸送基質であるＧＳＴ−ＮＬＳ（ＳＶ４０由来）−ＧＦＰのＫＰＮＡ２タンパク質を介した細胞核輸送をどれだけの割合で阻害するかによって評価することができる。例えば、系内に十分量のＲＮＡアプタマーを添加した場合に、ＲＮＡアプタマー無添加又は対照のｔＲＮＡ添加時と比して、モデル輸送基質の核内輸送量の減少が１２％未満、好ましくは６％未満である場合（いずれの場合も核内輸送量が増加するものであっても良い）、「実質的な阻害活性を有しない」と言うことができる。
【００３３】
（４−５）
本発明のＲＮＡアプタマーは、上記（４−１）〜（４−４）のうち、任意の１又は複数の性質を有するＲＮＡアプタマーである。
【００３４】
（４−６）
本発明のＲＮＡアプタマーの具体的な例は、配列番号１の塩基配列を含むＲＮＡアプタマー、又は配列番号１の塩基配列からなるＲＮＡアプタマー（アプタマー７６）である。
〔アプタマー７６〕
5’- ggauccugagcuacugacggguuaugugucaguccccagguaaugcugaggcuuuugguucauuuggccgguuguggcaccacuacugaccauacac -3’（配列番号１）
上記のＲＮＡアプタマーの同等物として、配列番号１の塩基配列に対して１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されたことにおいて上記ＲＮＡアプタマーと相違するものの、ＫＰＮＡ２タンパク質との結合能を有し、かつ上記（４−１）〜（４−４）のうち、任意の１又は複数の性質を有するものもまた、本発明のＲＮＡアプタマーに包含される。
ここで、「１又は数個の塩基」とは、１〜９塩基、１〜８塩基、１〜７塩基、１〜６塩基、１〜５塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１〜２塩基、又は１塩基のいずれかを意味する。
【００３５】
（４−７）
本発明のＲＮＡアプタマーの別の具体的な例は、配列番号２の塩基配列を含むＲＮＡアプタマー、又は配列番号２の塩基配列からなるＲＮＡアプタマー（アプタマー７２）である。
〔アプタマー７２〕
5’- ggauccugagcuacugacuuugggucgaauugguuggcucgcccucuucuuggaauucaggagggcgauugaacggacaccacuacugaccauacac -3’（配列番号２）
上記のＲＮＡアプタマーの同等物として、配列番号２の塩基配列に対して１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されたことにおいて上記ＲＮＡアプタマーと相違するものの、ＫＰＮＡ２タンパク質との結合能を有し、かつ上記（４−１）〜（４−４）のうち、任意の１又は複数の性質を有するものもまた、本発明のＲＮＡアプタマーに包含される。
ここで、「１又は数個の塩基」とは、１〜９塩基、１〜８塩基、１〜７塩基、１〜６塩基、１〜５塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１〜２塩基、又は１塩基のいずれかを意味する。
【００３６】
（４−８）
本発明のＲＮＡアプタマーは、上記の少なくとも一の所望の性質を維持する限り、その配列中のヌクレオチドは化学修飾されたものであって良い。
化学修飾の例として、ピリミジンヌクレオチドにおけるリボース部位の２’位（−０Ｈ基）がフッ素原子、メトキシ基、アミノ基、２’,４’−ＢＮＡ基（２’位と４’位との架橋基）、及び水素原子からなる群のいずれかの原子又は基で置換されていることが挙げられる。ＲＮＡはリボヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、ピリミジンヌクレオチドにおける２’位の一部又は全部を上記の原子又は基で置換する（各ピリミジンヌクレオチドにおける化学修飾の態様は同一又は異なっていて良い）ことは、ＲＮＡアプタマーをリボヌクレアーゼによる分解から保護する上で有利である。
化学修飾のまた一つの例として、３’末端及び／又は５’末端がインバーストデオキシチミジン（ｉｄＴ）又はポリエチレングリコールにより修飾されていることが挙げられる。当該修飾も、ＲＮＡアプタマーをリボヌクレアーゼによる分解から保護する上で有利である。
ピリミジンヌクレオチドにおける２’位の修飾と、３’末端及び／又は５’末端における修飾とは、一のＲＮＡアプタマー分子種において併存していても良い。
核酸の化学修飾は公知の手法により当業者が適宜実施できる。また、化学合成時に修飾ヌクレオチドを使用することも可能である。例えば、シチジン残基やウリジン残基の２’位をフッ素原子で置換する（フルオロ化）については、Suenaga E and Kumar P K R, Acta Biomaterialia (2014) vol. 10, pp. 1314-1323に記載された手法を採用することができる。
【００３７】
（４−９）
本発明のＲＮＡアプタマーは、標識化することができる。標識としては、放射性同位元素（ＲＩ）による標識や蛍光標識が挙げられる。ＲＩ標識としては、３２Ｐを含むヌクレオチドを用いた標識が好ましく例示される。蛍光標識としては、フルオロセイン、ローダミン、テキサスレッド、又はそれらの誘導体などの蛍光物質を用いた標識が好ましく例示される。また、本発明のＲＮＡアプタマーは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）結合ヌクレオチドを使用することにより標識化することもできる。
【００３８】
（４−１０）
本発明のＲＮＡアプタマーは、分子中の任意の位置に機能性化合物を結合させることができる。本発明のＲＮＡアプタマーと機能性化合物との間の結合は、共有結合、又は非共有結合のいずれであっても良い。本発明のＲＮＡアプタマーは、１以上の同種又は異種の機能性化合物と結合した複合体であって良い。ここで、機能性化合物は、本発明のＲＮＡアプタマーに何らかの機能を新たに付加するものである限り特に限定されない。機能性化合物としては、ビオチン、マルトースなどのタグ分子が好ましく例示される。ビオチンは、アビジンやストレプトアビジンと特異的に結合する性質があるため、アビジン又はストレプトアビジンにアルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素を結合することによって、適当な基質の存在下で結合活性の測定に利用できる。ビオチンは、リンカーを介してＲＮＡアプタマーの５’末端部位等に結合させることができる。機能性化合物の他の例として、ステロイド、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ポリエチレングリコール、リポソーム、ミクロスフェア等の薬物送達媒体、カフェイン、ビタミン、薬剤、毒素、又は酵素を挙げることができる。機能性化合物は、好ましくはＲＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端部位等に結合される。
【００３９】
（５）本発明のＲＮＡアプタマーを含んでなる担体
本発明は、本発明のＲＮＡアプタマーを含んでなる担体を提供する。ここで、ＲＮＡアプタマーは、未修飾のものであっても良く、上記のような化学修飾を受けたものであっても良く、標識化されたものでも良く、また上記のように機能性化合物と結合した複合体であっても良い。担体は固相担体であって、例えば、カラム、多孔質材、フィルター、基板、樹脂、プレート、フィルターなどが例示される。本発明の担体は、例えば、ＫＰＮＡ２タンパク質の濃縮、精製、並びにＫＰＮＡ２タンパク質の検出及び定量に用いることができる。本発明のＲＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含む複合体は、公知の方法により担体に固定することができる。例えば、機能性化合物や所定の官能基を本発明のＲＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含む複合体に導入し、次いで当該機能性化合物や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。
【００４０】
（６）本発明のＲＮＡアプタマーに変換可能なＤＮＡ
本発明のＲＮＡアプタマーを転写によって生ぜしめるＤＮＡが、本発明の一態様として提供される。
本発明のＤＮＡの具体的な例は、配列番号７の塩基配列を含むＤＮＡ、又は配列番号７の塩基配列からなるＤＮＡである。転写によって、配列番号７の塩基配列に対応するＤＮＡの領域から配列番号１の塩基配列からなるＲＮＡアプタマー７６を調製することができる。
上記のＤＮＡの同等物として、配列番号７の塩基配列に対して１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されたことにおいて上記ＤＮＡと相違するものの、ＫＰＮＡ２タンパク質との結合能を有し、かつ上記（４−１）〜（４−４）のうち、任意の１又は複数の性質を有する本発明のＲＮＡアプタマーを転写によって生じるＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明のＤＮＡの別の具体的な例は、配列番号８の塩基配列を含むＤＮＡ、又は配列番号８の塩基配列からなるＤＮＡである。転写によって、配列番号８の塩基配列に対応するＤＮＡの領域から配列番号２の塩基配列からなるＲＮＡアプタマー７２を調製することができる。
上記のＤＮＡの同等物として、配列番号８の塩基配列に対して１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されたことにおいて上記ＤＮＡと相違するものの、ＫＰＮＡ２タンパク質との結合能を有し、かつ上記（４−１）〜（４−４）のうち、任意の１又は複数の性質を有する本発明のＲＮＡアプタマーを転写によって生じるＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
ここで、「１又は数個の塩基」とは、１〜９塩基、１〜８塩基、１〜７塩基、１〜６塩基、１〜５塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１〜２塩基、又は１塩基のいずれかを意味する。
また、本発明のＤＮＡは、転写によって本発明のＲＮＡアプタマーを調製するために、その３’末端にＲＮＡポリメラーゼ認識配列を有していても良い。当該ＲＮＡポリメラーゼ認識配列として、Ｔ７プロモーター配列が好ましく例示される。
【００４１】
（７）本発明の他のＤＮＡ
上記（６）のＤＮＡに対応し、それと相補する塩基配列を有する相補鎖ＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡの他の態様として提供される。
さらに、上記（６）のＤＮＡと、それと対応する前記相補鎖ＤＮＡとが相補的にハイブリダイズした二本鎖ＤＮＡが、本発明のＤＮＡの他の態様として提供される。
前記二本鎖ＤＮＡは、クローニングベクターにクローニングすることにより、適宜増幅や改変等を行うことができる。また、乾燥形態又は適切な緩衝液に溶解させた状態で長期間安定に保存させることができる。
また、宿主細胞を形質転換することによって、上記クローニングしたベクターは形質転換細胞に包含させた形で保持することもできる。形質転換細胞は公知の手法で維持、増幅、又は保存することができる。
【００４２】
（８）ＫＰＮＡ２タンパク質の検出
本発明のＲＮＡアプタマーはＫＰＮＡ２タンパク質に対して特異的に、高親和性で結合する能力を有することから、当該ＲＮＡアプタマーを含む組成物がＫＰＮＡ２タンパク質検出用の試薬として提供される。ここで、試薬に含まれるＲＮＡアプタマーは、前記（４−１）〜（４−１０）に記載されたいずれの態様のＲＮＡアプタマーであっても良い。試薬中で溶液として本発明のＲＮＡアプタマーが包含される場合、その濃度は目的や使用態様に応じて適宜決定できるが、例えば１ｎＭ〜１０ｍＭ、０．１μＭ〜１ｍＭ、１μＭ〜０．１ｍＭの範囲で決定することが挙げられる。溶媒は水であっても緩衝液であっても良い。当該試薬は、標準試料としてのＫＰＮＡ２タンパク質、検出用プローブ又は基質等の補助成分、ネガティブコントロール用のｔＲＮＡ、緩衝液、保存料、希釈剤、使用説明書等の構成要素を適宜組み合わせることにより、ＫＰＮＡ２タンパク質の検出用キットとすることもできる。
生体由来のサンプルに対して前記試薬を適用することにより、サンプル中のＫＰＮＡ２タンパク質を検出することができる。検出の具体的な方法は、ＲＮＡアプタマーが放射性同位元素等で標識化されている場合、蛍光物質で標識化されている場合、タグ物質が結合している場合などに応じて適切な検出手段を組み合わせることで実施できる。この際、標識化アプタマーあるいは被験試料のいずれかを固定化した基板を用いて行うことも可能である。検出を定量的に行いたい場合は、定量的測定が可能なシグナルの種類と検出器の組合せを採用するとともに、含有量既知の標準ＫＰＮＡ２タンパク質を用いて前記シグナルと検出器との組合せにおいて予め検量線を作成し、サンプルに由来するシグナル量を当該検量線と照合することにより実施することができる。例えば、メンブレンフィルター又はプレート上にサンプルを吸着又は固定し、放射性ラベルしたＲＮＡアプタマーを含む本発明の試薬を適用し、洗浄後の放射性シグナルを測定することにより検出が可能である。なお、検出は細胞に対して、又は細胞を含む組織に対して、ｉｎ  ｓｉｔｕで実施することもできる。
前記検出又は定量方法において、本発明のＲＮＡアプタマーとサンプル中のＫＰＮＡ２タンパク質との相互作用を測定する工程を含めることができる。相互作用の測定においては、表面プラズモン共鳴を用いること、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（ＧＥヘルスケア社）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることが挙げられる。相互作用解析のための測定は、センサーチップの金薄膜表面に本発明のアプタマーあるいは被験試料のいずれかを周知の方法で固定化し、これに被験試料あるいはアプタマーを添加することで行うことができる。
【００４３】
（９）ＫＰＮＡ２タンパク質を指標とした癌の検出
ＫＰＮＡ２はヒトの腫瘍や癌組織（例えば、悪性黒色腫、子宮頸癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳腫瘍、肝臓癌、及び膀胱癌）において高く発現することから、上記の本発明の試薬、及び当該試薬を用いた検出方法を、それぞれ癌の検出用試薬、及び癌細胞の検出方法として用いることもできる。また、前記キットを癌細胞の検出用キットとすることもできる。癌細胞であるか否かの判定を補助するために、サンプルの由来する組織に応じて陰性対照として非癌正常組織を予め用意し、サンプルと共に併せて試験することができる。また、陽性対照として、サンプルの組織に応じて予め癌化したことが確認済の組織も更に並行して使用することができる。陽性対照及び／又は陰性対照と適宜組み合わせることにより、本発明の検出方法を癌の診断のための検出方法とすることができる。
【００４４】
（１０）本発明のＲＮＡアプタマーを含有するＫＰＮＡ２タンパク質の機能阻害剤
本発明のＲＮＡアプタマーは、例えば（４−１）〜（４−１０）に記載されるように、ＫＰＮＡ２タンパク質に対して高い親和性で結合能を有し、その好ましい一態様は、（４−３）に記載のように、ＮＬＳ含有タンパク質のＫＰＮＡ２タンパク質を介した細胞核輸送に関して阻害活性を有するものである。当該阻害活性を有するＲＮＡアプタマーを有効成分とする組成物は、ＫＰＮＡ２タンパク質に対する機能阻害剤として提供される。ここで、機能阻害とは、ＫＰＮＡ２タンパク質−ＫＰＮＡ２タンパク質結合性物質複合体の細胞核内への輸送阻害と言うことができる。所望される機能阻害の程度の例は、（４−３）に記載される阻害の割合が挙げられる。当該機能阻害剤に含まれる本発明のＲＮＡアプタマーの濃度は、（８）に記載の試薬における濃度範囲と同じ範囲から適宜決定することができる。当該阻害剤には、ｐＨ緩衝剤等、必要に応じて補助成分を包含させることができる。当該機能阻害剤を生体から取り出した細胞又は組織に対して適用することにより、ＫＰＮＡ２タンパク質の細胞核内への輸送機能（核移行能）を阻害するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法とすることができる。適用量は、細胞や組織の形状、性状、ＫＰＮＡ２タンパク質の想定発現レベル等に応じて適宜調製できる。例えば、生重量１ｇに対して、本発明の機能阻害剤を１〜３００μＬ、３〜１００μＬ、又は１０〜３０μＬの範囲で適用することができる。
【００４５】
（１１）本発明のＲＮＡアプタマーを含有する細胞増殖阻害剤
本発明のＲＮＡアプタマーを有効成分としてＮＬＳ含有タンパク質のＫＰＮＡ２タンパク質を介した細胞核輸送を阻害した場合、アプタマー以外の手段によってＮＬＳ含有タンパク質の核輸送の選択的阻害を行った研究例の結果から類推して、細胞の恒常性維持が不可能となり、細胞増殖が阻害され、場合によっては完全に増殖が停止することが合理的に予想される。それゆえ、前記本発明のＫＰＮＡ２タンパク質の機能阻害剤は、ＫＰＮＡ２タンパク質発現細胞に対する細胞増殖阻害剤とすることができる。また、前記機能阻害剤を用いたＫＰＮＡ２タンパク質の細胞核内への輸送機能（核移行能）を阻害する方法は、ＫＰＮＡ２タンパク質を発現する細胞の増殖を抑制するためのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの方法とすることができる。
【００４６】
（１２）本発明のＲＮＡアプタマーを有効成分として含有する医薬組成物
ＫＰＮＡ２はヒトの腫瘍や癌組織（例えば、悪性黒色腫、子宮頸癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、脳腫瘍、肝臓癌、及び膀胱癌）において高く発現することから、上記の本発明の細胞増殖阻害剤を癌の治療及び／又は転移防止用等のための医薬組成物とすることができる。また、前記の細胞増殖阻害方法を生体に対して実施することによって、癌等の増殖性疾患の治療及び／又は癌の転移防止のための方法として用いることもできる。
本発明の医薬組成物は、注射剤、座剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末剤等の剤型とすることができる。癌の治療及び／又は転移防止を目的とする場合、標的特異的に作用させるために注射剤とするか、又はＤＤＳ技術を適用した製剤化をすることが望ましい。これらの製剤は、公知の方法で製造することができる。例えば、注射用の製剤とする場合は、無菌的に保存した本発明のＲＮＡアプタマーの乾燥物又は保存溶液を、注射用の生理食塩水又は緩衝液によって溶解又は希釈して調製することができる。
本発明の癌の治療及び／又は転移防止用の医薬組成物としての有効成分となるＲＮＡアプタマーの有効投与量は、患者の状態、症状など諸事情により適宜変更される。通常は０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．００３〜１ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは０．００３〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．００３〜０．０３ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられる。これを１日１〜数回に分けて投与することができるが、逆に数日分の用量を１回に投与することにより投与間隔を２日〜４週間以内の範囲とすることもできる。
本発明の医薬の投与方法としては、特に限定されるものではない。投与方法としては注射剤を患部に直接注射することが好ましいが、これに限定されるものでは無い。ＤＤＳ製剤を静脈注射することも可能である。
投与期間は、患者の病状に応じて適宜調整できる。ただし、癌等の細胞増殖性疾患は継続的なコントロールを要する疾患であるので、継続的な投与を行うことが適切であり、２週間以上、好ましくは４週間以上、より好ましくは８週間以上の期間を単位として投与が行われる。
投与期間中の投与用量は適宜調整できるが、継続的に一定量を投与するか、又は投与当初のみ比較的高用量で投与した後により少ない維持量の一定投与に移行する投与形態とすることが好ましい。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例により何ら限定されるものではない。
【００４８】
実施例１  インポーチンタンパク質、及びＮＬＳタンパク質
インポーチンαファミリーであるＫＰＮＡ２タンパク質、ＫＰＮＡ１タンパク質、及び、インポーチン−β１タンパク質は、Imamotoら（Imamoto et al., EMBO J. (1995) vol. 14, pp. 3617-3626）、O'Neillら（O'Neill et al., Virology (1995) vol. 206, pp. 116-125）、Koseら（Kose et al., J. Cell Biol. (1997) vol. 139, pp. 841-849）の記載に沿って組換え体タンパク質として製造し、精製した。
細胞核輸送のモデル基質であるＮＬＳタンパク質（ＧＳＴ−ＮＬＳ−ＧＦＰ）は、Nagoshiら（Nagoshi et al., Mol. Biol. Cell (1999) vol. 10, pp. 2221-2233）の記載に沿って組換え体タンパク質として製造し、精製した。
【００４９】
実施例２  ＲＮＡランダムライブラリーの作成
中央の６０塩基をランダム領域とする一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のランダムライブラリーをＤＮＡ自動合成機を用いて合成し、テンプレートＤＮＡとした。同様に、ＤＮＡ自動合成機を用いて以下の配列を有するＤＮＡを合成し、５’プライマー及び３’プライマーとした。これらのプライマー、及びテンプレートＤＮＡを使用して核酸をＰＣＲ法により増幅させた。
【００５０】
〔テンプレートＤＮＡ〕
5’- agtaatacgactcactataggatcctgagctactgac-N60-caccactactgaccatacac -3’（配列番号３）
（ここで、Ｎ６０は、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴのいずれかの塩基がランダムに配置された６０ｍｅｒの配列であることを示す。）
〔５’末端プライマー〕
5’- agtaatacgactcactataggatcctgagctactgac -3’（配列番号４）
〔３’末端プライマー〕
5’- gtgtatggtcagtagtggtg -3’（配列番号５）
なお、上記配列中、下線部分はいずれもＴ７プロモーター領域である。
【００５１】
ＰＣＲは、上記一本鎖ＤＮＡランダムライブラリー（約１０１４分子種）、５’末端プライマー及び３’末端プライマー各０．２５μＭを用いて行った。最初のライブラリーのDNA組成を維持して増幅させるため、ＰＣＲは８サイクルに限定した。
次いでT7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies)を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写を行い、増幅されたＤＮＡランダムライブラリーをＲＮＡランダムライブラリーに変換した。
【００５２】
実施例３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける選別
選別は、実施例２で得られたＲＮＡランダムライブラリー１６μg（約１０１４分子種）を用い、ＲＮＡランダムライブラリーと組換え体ＫＰＮＡ２タンパク質とをモル比で７：１の割合で含むＲＮＡ結合用緩衝液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4）中で行った。選別サイクルの間、タンパク質濃度は、高い親和性を有するＲＮＡ分子を選別するためにサイクルの後になるほど減少させた。ＲＮＡは、選別サイクルの後、９５℃に加熱し、次いで安定な構造を形成させるため室温に冷却した。選別サイクルにおいては、非特異的に結合するＲＮＡを除去するためコンペティターとしてｔＲＮＡ（大腸菌の全ｔＲＮＡ（ロシュ社））を用いた。
【００５３】
室温で１０分間、ＲＮＡとＫＰＮＡ２タンパク質とインキュベートさせた後、タンパク質−ＲＮＡ複合体を含む反応液を、“Pop-top”フィルターホルダー (Nucleopore社)中に固定化された予め湿されたニトロセルロース酢酸フィルター（HAWPフィルター、ポアサイズ0.45μｍ, Merck Millipore社）にアプライし、通過させた。次いで、フィルターを上記ＲＮＡ結合用緩衝液１ｍｌで洗浄した後、フィルター上に残ったＲＮＡを溶出させ、従来法に従い回収した。回収されたＲＮＡは、50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM Spermidine, 10 mM DTT, 0.4 mM dNTPs, 0.4μM プライマー及び AMV 逆転写酵素 (WAKO) 25Uを含む反応混合物20μＬ中で逆転写させた。ヌクレオチドと酵素は、変性及びアニーリングステップ（室温で１０分インキュベートに引き続き、９０℃で２分）の後加えられた。逆転写は、３７℃で４５分行われた。
【００５４】
得られたｃＤＮＡはＰＣＲにより増幅され、次の選別ラウンドにおけるＲＮＡを得るための鋳型として用いられた。ＰＣＲによる増幅のために、逆転写後の混合物（ｃＤＮＡ反応産物）の20μＬは、ＰＣＲ用混合物（PrimeSTAR Max Premix (Takara, Japan), and 1 μM of each primer）80 μＬで希釈された。反応混合物は、正しい分子サイズで結合する生産物を得るために、95°C for 20 s, 54°C for 10 s, and 72°C for 20 sの各サイクル後に電気泳動にて検出を試みた。
【００５５】
ＰＣＲ産物は、一旦エタノール沈殿させた後に溶解させ、転写に用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写は、T7 Ampliscribe kit (Epicentre Technologies)を用いて、３７℃、３時間行った。ＤＮａｓｅＩで処理した後、８％変性ポリアクリルアミドゲルで分画された。ＲＮＡを上記ゲルから抽出してエタノール沈殿により精製した後に、定量し、次回の選別及び増幅サイクルに用いた。
選抜工程の中で、非特異的に結合するＲＮＡの濃縮を避けるために、各世代の選別においてpre-filtrationが行われた。
【００５６】
実施例４  アプタマーの単離、及び配列同定
選抜されたアプタマーを単離するために、サイクル８で得られたＰＣＲ産物を、直接ベクターpCRII(Invitrogen社)にクローニングした。ＤＮＡは、アルカリミニプレップ法により個別のクローンから分離され、ＤＮＡシークエンサーを用いてその塩基配列が決定された。アプタマーの二次構造は、MFoldプログラムにより予想した。
上記取得したクローンの配列解析により、アプタマーは主にアプタマー７６（配列番号１）及びアプタマー７２（配列番号２）に大別された。
アプタマー７６及びアプタマー７２の配列は以下に示される。
〔アプタマー７６〕
5’- ggauccugagcuacugacggguuaugugucaguccccagguaaugcugaggcuuuugguucauuuggccgguuguggcaccacuacugaccauacac -3’（配列番号１）
〔アプタマー７２〕
5’- ggauccugagcuacugacuuugggucgaauugguuggcucgcccucuucuuggaauucaggagggcgauugaacggacaccacuacugaccauacac -3’（配列番号２）
アプタマー７６とアプタマー７２のプール中の存在比率は、それぞれ２２％と４％であった。また、配列決定されたクローンの中で、マイナーな分子種としてアプタマー２１（配列番号６）が同定された。
上記 MFoldプログラムにより計算したこれらアプタマーの二次構造モデルは、図２に示される。
【００５７】
実施例５  ＲＮＡアプタマーとＫＰＮＡ２タンパク質との相互作用
ＫＰＮＡ２タンパク質とＲＮＡアプタマーとの親和性をフィルター結合アッセイによって測定した。ＫＰＮＡ２タンパク質は実施例１の組換え体タンパク質を、ＲＮＡアプタマー（アプタマー７６、７２及び２１）は実施例４のベクターにクローン化したＤＮＡからＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写させた（手法は実施例３と同様）ＲＮＡを、それぞれ用いた。
解析は、Kumarらの方法（Kumar et al., Virology (1997) vol. 237, pp. 270-282）と同様の手法を用いた。同手法において、ＲＮＡアプタマーは0.5mCi/ml［α-32P］ATPにより標識して使用した。
結合反応では、モル濃度で１０倍過剰の大腸菌ｔＲＮＡを非特異的競争阻害剤として加え、２０ｎＭの標識化ＲＮＡアプタマーとマウスＫＰＮＡ２タンパク質（２４６ｎＭ、４９２ｎＭ又は９８４ｎＭ）とを混合し結合させた。結合後、反応液をフィルターを通した。フィルターは１ｍＬの上記ＲＮＡ結合用緩衝液で洗浄し、空気中で乾燥させた後、フィルターに残留した標識ＲＮＡの放射活性を画像解析装置（BAS2000, 富士フイルム社製）で検出、定量化した（図３）。
アプタマー７６とアプタマー７２はともにＫＰＮＡ２タンパク質と高い親和性を示し、その解離定数（ＫＤ）はいずれも１５０ｎＭであった。
さらに、ヒトＫＰＮＡ２の組換え体タンパク質を用いて同様の実験を行ったところ、アプタマー７６とアプタマー７２はともにヒトＫＰＮＡ２タンパク質とも高い親和性を示した。その解離定数（ＫＤ）は、前記とほぼ同等であり、いずれも１５０ｎＭであった。マウスＫＰＮＡ２タンパク質と、ヒトＫＰＮＡ２タンパク質とのアミノ酸配列を比較すると、その同一性は約９４％である（Tsuji et al., FEBS Lett. (1997) vol. 416, pp. 30-34）。本発明のＲＮＡアプタマーであるアプタマー７６及び７２は、いずれも、マウス及びヒト由来のＫＰＮＡ２タンパク質に対して同程度の、高い結合親和性を示す。
一方、アプタマー２１はＫＰＮＡ２タンパク質との間に高い結合親和性が認められなかった。
【００５８】
実施例６  ＲＮＡアプタマーとＫＰＮＡ１タンパク質又はＫＰＮＡ２タンパク質との相互作用
前記実施例５と同様に、フィルター結合アッセイを行い、本発明のＲＮＡアプタマーとＫＰＮＡタンパク質との相互作用を試験した。ＫＰＮＡタンパク質としては、前記のＫＰＮＡ２タンパク質のみならず、ＫＰＮＡ１タンパク質も用いた。２０ｎＭの標識化ＲＮＡアプタマーと反応させたＫＰＮＡタンパク質の濃度は、ＫＰＮＡ２タンパク質の場合に３７、７４、１４８、２９６又は５９２ｎＭであり、ＫＰＮＡ１タンパク質の場合に７２、１４４、２８８又は５７６ｎＭであった。フィルター上で検出されたシグナルを図４ａ）に示す。
図示されるシグナル量から明らかなように、アプタマー７６、アプタマー７２はいずれもマウスＫＰＮＡ１タンパク質との間で高い結合親和性を示さず、実質的にＫＰＮＡ１タンパク質と結合能を有しないものと認められた。
また、ＫＰＮＡ２タンパク質を用いた場合について、検出されたシグナル強度から結合率を算出し、各ＫＰＮＡ２タンパク質濃度と結合率との関係を図４ｂ）にプロットした。
なお、実施例５でアプタマー２１についてＫＰＮＡ２タンパク質との間で実質的な結合活性が認められなかったので、アプタマー２１については本実施例以降の実施例で試験を行っていない。
【００５９】
実施例７  ＮＬＳ含有タンパク質の細胞核内への輸送
ＮＬＳ含有タンパク質の細胞核内への輸送は、ＨｅＬａ細胞等の培養細胞を薬物で可溶化させ、標識化したモデル基質を添加した上でインキュベートし、当該モデル基質の細胞核内への輸送を確認する手法により試験できる（例えば、Adamら（Adam et al., J. Cell Biol. (1990) vol. 111, pp. 807-816）の方法）。本試験系の模式図が図５上段に示される。培養細胞（ＨｅＬａ細胞等）は、ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）投与により可溶化された後、ＮＬＳタンパク質（ＧＳＴ−ＮＬＳ−ＧＦＰ）、インポーチンβ−１、及びインポーチンα−１（ＫＰＮＡ２）が添加された状態でインキュベートされる。ここで、ＧＳＴ−ＮＬＳ−ＧＦＰはモデル基質であり、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のＮＬＳを包含するものである（実施例１）。ＮＬＳタンパク質は核輸送され、その核内局在性はＧＦＰの蛍光が核に局在することにより確認される。
前記の実験系において、さらにインポーチンα−１と特異的に結合するアプタマーを添加することにより、核輸送能が阻害されるか否かを解析する実験が図５の下段において模式的に示される。インポーチンα−１に代えてインポーチンα−１−アプタマー複合体が添加された場合に、ＮＬＳタンパク質の核輸送能は阻害されれば、同タンパク質の細胞内の分布を示すＧＦＰの蛍光は核局在性を示さなくなるか、低減した核局在性を示すようになる。
図６及び図７は、図５の模式図に示される実験系の具体的な結果を示す。各図において、ＨｅＬａ細胞はスライドグラス上に播種された後、４０μＭ／ｍＬのジギトニン（ナカライテスク社）で５分間処理することにより可溶化された。可溶化細胞は、バッファーコントロールとなる実験（図６ｂ）、及び図７ｂ））を除き、インポーチンβ−１（６００ｎＭ）及びＮＬＳタンパク質（図中ではＮＬＳ−ＧＦＰと示す）（４００ｎＭ）、及び、ＫＰＮＡ２タンパク質（４００ｎＭ）（図６）又はＫＰＮＡ１タンパク質（４００ｎＭ）（図７）が添加された。さらに、図６ｃ）及び図７ｃ）の系ではアプタマー７６（５μＭ）が、図６ｄ）及び図７ｄ）の系ではアプタマー７２（５μＭ）が、図６ｅ）及び図７ｅ）の系では大腸菌のｔＲＮＡ（５μＭ）が、それぞれ添加された。ＲＮＡアプタマー又はｔＲＮＡが添加される系においては、ＫＰＮＡタンパク質とアプタマー又はｔＲＮＡとを予め５分間室温でインキュベートしたものが添加に用いられた。それぞれの系には、さらに、Ｒａｎタンパク質（４μＭ）、ＮＴＦ２タンパク質（３５０ｎＭ）、ＧＴＰ（０．５ｍＭ）及びＡＴＰ再生系を添加されている。諸要素の添加後、３７℃で８分間のインキュベートが行われ、次いで試料は５分間のホルムアルデヒド溶液（３．７％濃度）処理によって固定された。固定後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）による２回の洗浄を行い、ＮＬＳタンパク質の局在性が倒立型蛍光顕微鏡で観察された。また、核内のＧＦＰシグナルについて蛍光強度の測定も併せて行った。
図６では、ａ）とｅ）のパネルでのみＧＦＰの蛍光シグナルの細胞核局在性が認められた。一方、ｃ）とｄ）のパネルでは細胞核部分の蛍光シグナルが比較的弱く、細胞核局在性の低下が認められたことから、アプタマー７６及び７２には、それぞれ、ＫＰＮＡ２タンパク質の存在下で、ＮＬＳ含有タンパク質のＮＬＳを介した細胞核輸送を阻害する活性があることが確認された。
一方、図７では、バッファーコントロールであるｂ）のパネルを除き、全てのパネルでＧＦＰ蛍光シグナルの細胞核局在性が認められた。このことから、アプタマー７６及び７２には、ＫＰＮＡ１タンパク質の存在下で、ＮＬＳ含有タンパク質のＮＬＳを介した細胞核輸送を阻害する活性が確認されなかった。
【００６０】
実施例８  アプタマーによる細胞核輸送機能の定量化
アプタマーによるＫＰＮＡ２タンパク質およびＫＰＮＡ１タンパク質の核輸送能の阻害を定量化した。実施例７を通じて得られた蛍光顕微鏡画像についてimageJ解析ソフトウエア（Schneider et al.,  NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Meth. (2012) vol. 9, pp. 671-675）を用い、細胞核の核質部分のヒストグラム解析により輝度の平均値を求め、コントロールであるアプタマーを加えない場合の平均値を１として換算した数値を求めた（図８ａ）及び図８ｂ））。
その結果、ＫＰＮＡ２タンパク質に対してアプタマー７６添加時は０．６６５（６６．５％）（標準偏差０．０５６）に、アプタマー７２添加時は０．７１４（７１．４％）（標準偏差０．０５１）に、それぞれ輸送が低下した。前記コントロールにおける測定値のばらつきは標準偏差０．１２程度であったので、アプタマー７６又は７２添加時に認められたこれらの低下は明らかな細胞核輸送機能の低下を示すものと言える。一方、ＫＰＮＡ２タンパク質に結合しないｔＲＮＡ添加時は１．０９６（標準偏差０．１３）であり、低下がみられなかった（図８ａ））。
また、ＫＰＮＡ１タンパク質に対しては、アプタマー７６（１．０７９（標準偏差０．１７））、アプタマー７２（１．０７７（標準偏差０．２０））及びｔＲＮＡ（１．１３８（標準偏差０．１４））のいずれの添加時にも低下は見られなかった（図８ｂ））。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のＲＮＡアプタマーは、ＫＰＮＡ２タンパク質に対して特異的な結合能を有し、ＫＰＮＡ２タンパク質の検出、濃縮、精製、定量に使用できること、ＫＰＮＡ２タンパク質のＮＬＳを介したＮＬＳ含有タンパク質の細胞核輸送活性を阻害できること、当該阻害作用によって細胞や組織の生理機能を調節できることから、生化学的試験における有用性はもちろんのこと、生理学的及び／又は薬理学的な有用性を有しており、さらに癌治療薬等の医薬としての有用性も備えている。よって、本発明は産業上利用可能性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ）】
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【図４ｂ）】
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【図５】
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【図６ａ）】
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【図６ｂ）】
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【図６ｃ）】
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【図６ｄ）】
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【図６ｅ）】
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【図７ａ）】
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【図７ｂ）】
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【図７ｃ）】
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【図７ｄ）】
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【図７ｅ）】
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【図８ａ）】
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【図８ｂ）】
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【配列表】
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