(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）を有効成分とする濾胞性ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項２】
加齢により免疫機能が低下した対象に投与される、請求項１に記載の濾胞性ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項３】
末梢血中のCXCR5陽性Ｔ細胞数が低下した対象に投与される、請求項１又は２に記載の濾胞性ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項４】
血清中のガンマグロブリン値が低下した対象に投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の濾胞性ヘルパーＴ細胞増加剤。
【請求項５】
前記ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）が生菌体又は死菌体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の濾胞性ヘルパーＴ細胞増加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、濾胞性ヘルパーＴ細胞増加剤、及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫は、生体を脅かす細菌やウイルスなどの外来異物（抗原）に対抗するため、多くの動物に備わっている生体防御機構である。免疫細胞の一種であるB細胞が産生する抗体は
、こうした防御機構の一つである。B細胞が抗原を特異的に認識する抗体を産生するため
には、CD4陽性で特徴づけられるヘルパーT細胞（Th細胞）が主要な役割を担っている。B
細胞からの抗体産生に関しては、B細胞の局在領域であるリンパ節濾胞の中の胚中心と呼
ばれる場所で、抗原の再侵入時に迅速に反応できるように備える胚中心反応と呼ばれる反応が起こり、抗原に対して親和性の高い抗体を産生するB細胞が選択されることが知られ
ている（非特許文献１）。こうしたB細胞の胚中心反応には、Th細胞の一種である濾胞性
ヘルパーT細胞（Tfh細胞：Follicular Helper T Cell）の関与が示されている。
【０００３】
Tfh細胞は、近年になって確認されたTh細胞の一種で、細胞表面にCXCR5、PD-1（Programmed Cell Death 1）、ICOS（Inducible T-cell Co-Stimulator）、CD40Lを発現することを特徴とするCD4陽性のTh細胞である。通常、T細胞は免疫組織の中でT細胞領域に局在し
ており、B細胞が局在する濾胞とは別の場所に存在している。しかし抗原が侵入すると、
活性化したT細胞の一部がTfh細胞となって多くのB細胞が局在する胚中心へと移動し、B細胞を成熟化させ抗原特異的な抗体の産生を促進する（非特許文献２、３）。Tfh細胞は、
樹状細胞などからの抗原提示やIL-21などのサイトカインのほか、CD28、CD40L、及びICOSといった共刺激分子を介した相互作用によって、ナイーブT細胞から分化誘導され、その
分化誘導にはシグナル伝達性転写因子STAT3が必要とされる（非特許文献２）。また胚中
心へと移動したTfh細胞が産生するIL-21やTfh細胞のCD40Lを介した刺激が、胚中心反応において重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１）。従って、B細胞からの
抗原特異的な良質な抗体を産生させる胚中心反応には、Tfh細胞の機能が必須であり、効
率的な抗体の誘導にはTfh細胞の数的又は機能的な向上が重要となる。
【０００４】
Tfh細胞の機能を含む抗体産生に関わる胚中心反応は、加齢とともに低下することが知
られている（非特許文献４）。Tfh細胞の誘導に必須であるCD40LやICOSに遺伝的な変異を持つ患者では、末梢血中のCD4陽性CXCR5陽性T細胞数が減少することから（非特許文献２
、５）、末梢血中のCD4陽性CXCR5陽性T細胞数はTfh細胞の数又は機能を反映すると考えられ、健常者では末梢血中のCD45RO陽性CD4陽性T細胞の中に5〜15%のCXCR5陽性T細胞が含まれると報告されている（非特許文献６）。低ガンマグロブリン血症（血清IgG<250 mg/dl
、IgA<5 mg/dl）に分類される分類不能型低ガンマグロブリン血症（common variable immunodeficiency）や、IgM増加を伴う高IgM症候群、及び、常染色体優性型高IgE症候群（autosomal dominat hyper IgE symdrome）は、免疫グロブリンのクラススイッチ機構に欠陥がある疾患であり、選択的IgA欠損やIgGサブクラス欠損などの症状を示す。これらの疾患は、それぞれTfh細胞の分化誘導に必要とされるICOSやCD40L、STAT3の機能不全が病因と
して示唆されており（非特許文献５）、Tfh細胞の機能低下は血清中のガンマグロブリン
値の低下をもたらすと考えられる。これらのTfh細胞の機能が低下した人、例えば加齢に
より免疫機能が低下した人、末梢血中CD4陽性CXCR5陽性T細胞数の少ない人、及び、血清
中のガンマグロブリン値が低い人のTfh細胞の機能を向上する手段が求められるが、安全
性が高く有効な手段は未だ提供されていない。
【０００５】
近年、生体の免疫機能を調節する食品成分として、乳酸菌、麹カビ、酵母などが報告されている。これまでに一部の乳酸菌はTh1細胞やTh2細胞、制御性T細胞などの免疫機能を
調節することが報告されているが（非特許文献７）、乳酸菌を含む食品成分がTfh細胞を
誘導しその細胞数を増加させることは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vinuesa, C.G. et al., Immunol. Rev. (2010) 237: 72-89
【非特許文献２】Ma, C.S. et al., J. Exp. Med. (2012) 209: 1241-1253
【非特許文献３】Kerfoot, S.M., Immunity. (2011) 34: 947-960.
【非特許文献４】Linterman, M.A., Immunol. Cell Biol. (2014) 92:72-79.
【非特許文献５】Ma, C.S. et al., Immunol. Cell Biol. (2014) 92:64-71.
【非特許文献６】Bossaller, L. et al., J. Immunol. (2006) 177:4927-4932.
【非特許文献７】Shida, K. et al., Gut. Microbes. (2011) 2:109-114.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性の高い、Tfh細胞を増加させる手段、例えば、加齢により免疫機能が
低下した対象に投与されるTfh細胞増加剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らはTfh細胞を誘導しうる因子を食品素材から鋭
意探索し、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌の摂取がTfh細胞を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を有効成分とする濾胞性ヘルパーＴ細胞（Tfh細胞）増加剤を提供する。
前記Tfh細胞増加剤は、前記乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）であることを好ましい態様としている。
また前記Tfh細胞増加剤は、前記乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）であることを好ましい態様としている。
また前記Tfh細胞増加剤は、加齢により免疫機能が低下した対象に投与されることを好
ましい態様としている。
また前記Tfh細胞増加剤は、末梢血中のCXCR5陽性Ｔ細胞数が低下した対象に投与されることを好ましい態様としている。
また前記Tfh細胞増加剤は、血清中のガンマグロブリン値が低下した対象に投与される
ことを好ましい態様としている。
また前記Tfh細胞増加剤は、前記乳酸菌が生菌体又は死菌体であることを好ましい態様
としている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、効果的にTfh細胞を増加させる手段が提供される。本発明のTfh細胞増加剤は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を有効成分としており、安全性が高く、医薬品、飲食品、及び飼料等として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
本発明のTfh細胞増加剤は、乳酸菌を有効成分とする。乳酸菌としては、例えば、ラク
トバチルス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、メリソコッカス（Melissococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、トリココッカス（Trichococcus
）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属、
バゴコッカス（Vagococcus）属、テトラゲノコッカス（Tetragenococcus）属、アトポビ
ウム（Atopobium）属、ワイセラ（Weissella）属、オエノコッカス（Oenococcus）属、アビオトロフィア（Abiotrophia）属、デスメジア（Desemzia）属、パララクトバチルス（Paralactobacillus）属、グラヌリカテラ（Granulicatella）属、アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属、オルセネラ（Olsenella）属、イソバキュラム（Isobaculum）属、マリニラクチバチルス（Marinilactibacillus）属、アトポスタイペス（Atopostipes）属、ラクトバム（Lactovum）属、ピリバクター（Pilibacter）属、フルクトバチルス（Fructobacillus）属、ラクチシゲミウム（Lacticigemium）属、ババリコッカス（Bavariicoccus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属等に属する乳酸菌が好ましく、ラ
クトバチルス属がより好ましい。
【００１２】
ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aquaticus、Lactobacillus aviaries、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus bobalius、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus cacaonum、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus capilatus、Lactobacillus casei、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacillus collinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp.
delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus dextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus farciminis、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis。Lactobacillus gallinarum。Lactobacillus gasseri。Lactobacillus gastricus。Lactobacillus ghanensis。Lactobacillus graminis。Lactobacillus hammesii、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus hordei、Lactobacillus iners、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii
、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus oris、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rapi、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus sakei、Lactobacillus 
salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus satsumensis、Lactobacillus secaliphilus、Lactobacillus senmaizukei、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus sunkii、Lactobacillus susicola、Lactobacillus taiwanensis、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus tucceti、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus uvarum、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、Lactobacillus zymae等が好ましく、ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）、及び、MCC1849と実質的に同等の細菌がより好ましい。以下、本明細書においては、ラクトバチルス
属に属する乳酸菌を、単に乳酸菌と記載することがある。
MCC1849は、ヒト糞便を分離源として分離された菌株である。同菌株の菌学的性質は、
後述の実施例１に示す。同菌株は、2013年6月6日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、NITE P-01633の受託番号で寄託され、2014年1月31日にブダペスト条約に基づく
国際寄託に移管され、NITE BP-01633の受託番号が付与されている
【００１３】
MCC1849と実質的に同等の細菌とは、ラクトバチルス・パラカゼイに属する菌株であっ
て、MCC1849と同程度のTfh細胞増加作用を有する細菌をいう。また、実質的に同等の細菌は、さらに、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、MCC1849の16S rRNA遺伝子の塩基配列と
９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくはMCC1849と同一の菌学的性質を有する。さらに、MCC1849又はそれと実質的に同等の細菌は、本発明の効果が損なわれない限り、それらの細菌から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。
【００１４】
MCC1849等の乳酸菌は、それらを培養することにより容易に増殖させることができる。
培養する方法は、乳酸菌が増殖できる限り特に限定されず、乳酸菌の培養に通常用いられる方法を必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培養温度は２５〜５０℃でよく、３５〜４２℃であることが好ましい。また培養は好気条件下、及び嫌気条件下のいずれで行ってもよいが、嫌気条件下で行うことが好ましく、例えば、炭酸ガス等の嫌気ガスを通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養してもよい。
【００１５】
乳酸菌を培養する培地としては、特に限定されず、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を必要により適宜修正して用いることができる。すなわち、炭素源としては、例えば、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デンプン、デンプン加水分解物、廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。また、調製済みの培地としては、例えばＭＲＳ培地を好適に用いることができる。
【００１６】
乳酸菌は、培養後、得られた培養物をそのまま用いてもよく、希釈又は濃縮して用いてもよく、培養物から回収した菌体を用いてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、培養後に加熱、及び凍結乾燥等の種々の追加操作を行うことができる。追加の操作は、生菌の生残性が高いものであることが好ましい。尚、実施例に示すように、乳酸菌の加熱殺菌菌体はTfh細胞増加作用を有する。したがって、生菌であっても同様に、Tfh細胞増加作用を示すと考えられる。すなわち、本発明のTfh細胞増加剤においては、乳酸菌の菌体
は、生菌であっても死菌であってもよく、生菌及び死菌の両方であってもよい。死菌は、破砕物であってもよい。
【００１７】
上記のような乳酸菌は、Tfh細胞増加剤の有効成分として用いることができる。本発明
において、「Tfh細胞増加」とは、Tfh細胞の細胞数の増加、又はリンパ球画分中のTfh細
胞の割合の増加を意味する。Tfh細胞増加剤を摂取した対象が、摂取していない場合に比
べてTfh細胞の細胞数が増加するか、又はリンパ球画分中のTfh細胞の割合が増加すれば、Tfh細胞は増加したといえる。
MCC1849等の乳酸菌、又は本発明のTfh細胞増加剤を含む組成物は、医薬、飲食品、及び飼料として広く用いることができる。たとえば、Tfh細胞増加用医薬、Tfh細胞増加用飲食品、Tfh細胞増加用飼料を提供することができる。
【００１８】
本発明のTfh細胞増加剤は、乳酸菌を含有する限り特に制限されない。本発明のTfh細胞増加剤は、乳酸菌をそのまま使用してもよく、生理的に許容される液体又は固体の製剤担体を配合し製剤化して使用してもよい。
【００１９】
本発明のTfh細胞増加剤の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液
剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。
【００２０】
本発明のTfh細胞増加剤における乳酸菌の含有量は、剤形、用法、対象の年齢、性別、
疾患の種類、疾患の程度、及びその他の条件等により適宜設定されるが、通常、１×１０6〜１×１０12ｃｆｕ／ｇまたは１×１０6〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０7〜１×１０11ｃｆｕ／ｇまたは１×１０7〜１×１０11ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌の場合、ｃｆｕ／ｇまたはｃｆｕ／ｍｌは、個細胞／ｇまたは個細胞／ｍｌと置き換えることができる。
【００２１】
また、本発明の効果を損なわない限り、本発明のTfh細胞増加剤と、乳酸菌以外の成分
を有効成分とするTfh細胞増加剤、免疫賦活剤等を併用してもよい。
【００２２】
本発明のTfh細胞増加剤の投与時期は特に限定されず、対象となる疾患の治療方法に従
って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、予防的に投与してもよく、維持療法に用いてもよい。また、投与形態は製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定されることが好ましい。なお、本発明のTfh細胞増加剤は
、いずれの場合も１日１回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に１回の投与としてもよい。
【００２３】
本発明のTfh細胞増加剤は、Tfh細胞を増加させることが有効な対象、例えば、加齢により免疫機能が低下した対象、末梢血中のCXCR5陽性Ｔ細胞数が低下した対象、又は、血清
中のガンマグロブリン値、例えばIgG値が低下した対象に投与される。対象は、例えばヒ
トである。これらの対象は、Tfh細胞を増加させることによって、CXCR5陽性Ｔ細胞数の低下、又はガンマグロブリン値の低下が改善し、免疫機能が向上することが期待される。また、本発明のTfh細胞増加剤は、Tfh細胞の減少によって引き起こされる疾患又は症状、例えば、加齢による免疫機能の低下、末梢血中のCXCR5陽性Ｔ細胞数の低下、もしくは、血
清中のガンマグロブリン値の低下を改善すること、又は、Tfh細胞を増加させることによ
って、予防又は治療され得る疾患又は症状の予防又は治療に使用することができる。このような疾患又は症状として具体的には、例えば、無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、及び、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、並びに、悪性腫瘍、放射線
照射、抗がん剤投与及び、免疫抑制剤投与による続発性低ガンマグロブリン血症等が挙げられる。
尚、ラクトバチルス・パラカゼイは、IL-12産生誘導能を有することが知られているが
（国際公開2012/133827号）、本発明のTfh細胞増加剤は、IL-12産生促進を目的とする用
途を除くことが好ましい。
【００２４】
本発明の他の形態は、Tfh細胞増加剤の製造における、乳酸菌の使用である。また、本
発明の他の形態は、乳酸菌又は本発明のTfh細胞増加剤を適用対象に投与する工程を含む
、Tfh細胞増加によって予防又は治療され得る疾患の予防又は治療方法である。
【００２５】
本発明のTfh細胞増加剤を含む飲食品は、乳酸菌を含有する限り特に制限されず、飲食
品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、及び乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子等の菓子類；加工乳、乳飲料、発酵乳、ドリンクヨーグルト、及びバター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。また、飲食品は、サプリメントであってもよく、例えばタブレット状のサプリメントであってもよい。サプリメントである場合には、一日当りの食事量及び摂取カロリーについて他の食品に影響されることなく、乳酸菌を摂取できる。
【００２６】
上記のような飲食品は、飲食品の原料に乳酸菌を添加することにより製造することができ、乳酸菌を添加すること以外は、通常の飲食品と同様にして製造することができる。乳酸菌の添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行ってもよい。また、添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飲食品が製造されてもよい。そのような飲食品としては、乳酸菌飲料、及び発酵乳等が挙げられる。
食品又は飲料の原料としては、通常の飲料や食品に用いられている原料を使用することができる。製造された飲食品は、経口的に摂取することが可能である。
【００２７】
本発明の飲食品には、飲食品製造のための原料、及び食品添加物等、飲食品の製造工程又は製造後に飲食品に添加されるものも含まれる。例えば、本発明の乳酸菌は、発酵乳製造用スターターとして使用することができる。また、本発明の乳酸菌を、製造された発酵乳に後から添加することもできる。
【００２８】
飲食品における乳酸菌の含有量は、飲食品の態様によって適宜設定されるが、通常、飲食品中に、１×１０6〜１×１０12ｃｆｕ／ｇまたは１×１０6〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０7〜１×１０11ｃｆｕ／ｇまたは１×１０7〜１×１０11ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。
【００２９】
本発明のTfh細胞増加剤を含む飲食品は、Tfh細胞増加、免疫機能改善等の効果を利用する種々の用途に用いることができる。すなわち、乳酸菌を含有し、かつ、飲食品の形態である、Tfh細胞増加剤、免疫機能改善剤を提供することができる。
【００３０】
本発明のTfh細胞増加剤を含む飲食品は、Tfh細胞増加用、免疫機能改善用との用途が表示された飲食品として販売することができる。また、そのような飲食品には、「Tfh細胞
増加用」、「免疫機能改善用」等の表示をすることができる。また、これ以外でも、Tfh
細胞増加によって二次的に生じる効果を表す文言であれば、使用できることはいうまでもない。
【００３１】
前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、
上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物及び媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。
具体的には、本発明の飲食品に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が例示でき、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。
【００３２】
また、表示としては、行政等によって許可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましい。例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができる。さらに詳細には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示等を例示することができる。
【００３３】
本発明のTfh細胞増加剤を含む飼料としては、ペットフード、家畜飼料、及び養魚飼料
等が例示される。そのような飼料は、一般的な飼料、例えば、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、又は酵母類等に乳酸菌を混合することにより製造することができる。また、例えばサイレージの様に、添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飼料が製造されてもよい。製造された飼料は、一般的な哺乳動物、家畜類、養魚類、及び愛玩動物等に経口的に投与することが可能である。
【００３４】
飼料における乳酸菌の含有量は、飼料の態様や投与対象によって適宜設定されるが、１×１０6〜１×１０12ｃｆｕ／ｇまたは１×１０6〜１×１０12ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０7〜１×１０11ｃｆｕ／ｇまたは１×１０7〜１×１０11ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３６】
〔実施例１〕MCC1849の菌学的性質
MCC1849は、ヒト糞便サンプルから分離した。同細菌の菌学的性質として、細胞の形態
、運動性、胞子形成、グラム染色性、カタラーゼ、グルコースからのガスの産生、及び、糖の発酵性を表１に示す。糖の発酵性は、細菌同定キットAPI 50CH（シスメックス・ビオメリュー社）を用いて調べた。キットに付属のマニュアル記載の方法にしたがって一晩培養後の菌液を各基質を含む培地に接種し、これを３７℃のインキュベーターで培養し、培養１日目および２日目に各基質の糖発酵性状を評価した。
これらの菌学的性質を表１に示す。この結果から、MCC1849はラクトバチルス・パラカ
ゼイと判定された。
【００３７】
【表１】
0006531893.tif 000002
【００３８】
また、MCC1849の16S rRNA遺伝子塩基配列の解析からは、MCC1849はラクトバチルス・パラカゼイまたはラクトバチルス・カゼイであると判断された。ラクトバチルス・パラカゼイとラクトバチルス・カゼイは近縁種であり、標準株間の16S rRNA遺伝子塩基配列の相同性は９９％以上であることが示されている（Huang CH, and Lee FL., Antonie Van Leeuwenhoek, 2011, 99(2):319-27）。MCC1849のゲノム配列を決定し、リードをラクトバチル
ス・パラカゼイ標準株(ATCC25302)またはラクトバチルス・カゼイ標準株(ATCC393)をリファレンスゲノムとしてマッピングすることで相同性を確認した。
【００３９】
その結果、MCC1849はラクトバチルス・パラカゼイ標準株との相同性が８５％であった
のに対し、ラクトバチルス・カゼイ標準株との相同性は４５％であった。
したがって、MCC1849はラクトバチルス・パラカゼイであることが確認された。
【００４０】
〔実施例２〕MCC1849によるTfh細胞増加作用
MCC1849をマウスに摂取させ、小腸パイエル板細胞のTfh細胞のポピュレーションを測定した。
【００４１】
（１）MCC1849加熱殺菌体の調製
MCC1849をMRS（de Man Rogasa Sharpe）培地（Difco）で16時間培養した菌体を、PBSで2回洗浄し、さらに蒸留水で1回洗浄した後に蒸留水に懸濁し、100℃30分間の加熱処理を
行った。加熱処理後、菌体を蒸留水で2回洗浄した後に蒸留水に懸濁し、凍結乾燥を行い
、MCC1849加熱殺菌体とした。
【００４２】
（２）マウスでの経口摂取試験
30匹のBALB/cマウス（6週齢、雄性、日本SLC社）にAIN93-G精製飼料を自由摂取させ、1週間予備飼育した。予備飼育後、マウスをコントロール群とMCC1849摂取群の2群に各15匹ずつ分け、各群ともAIN93-Gを5週間自由摂取させた。自由摂取とは別に、コントロール群にはAIN93-G精製飼料を0.5g、MCC1849摂取群にはAIN93-G精製飼料0.5g中に40mgのMCC1849加熱殺菌体を添加した飼料を、各々一日一回、試験終了時まで摂取させた。各群とも試験飼料の投与開始2週間後から1週間毎に、1mgのオボアルブミン（OVA）（Sigma社）と40μgのコレラトキシン（Sigma社）を含む0.25 mLのPBS（Sigma社）を計3回経口投与すること
で免疫した。最終免疫の1週間後に各々のマウスを解剖し、小腸パイエル板を摘出した。
【００４３】
（３）マウスパイエル板細胞の調製
上記パイエル板組織を培養液中で破砕して、組織懸濁液を調製した。組織懸濁液を70 
μmのセルストレーナーで濾し、培養液で3回遠心洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁してパイエル板細胞浮遊液を調製した。
【００４４】
（４）Tfh細胞の測定
上記マウスパイエル板細胞を、FITC標識抗マウスCD4抗体（eBioscience社）とAPC標識
抗マウスPD-1抗体（eBioscience社）で染色した。染色した細胞はFACSCanto（BD Bioscience社、FACSCantoは同社の商標）で解析し、CD4陽性PD-1陽性細胞をTfh細胞として、リンパ球画分におけるTfh細胞の割合を測定した。結果は、平均値±標準偏差で示し、*印は両群間の統計学的危険率が5％以下であることを示す。また、統計解析はStudent's t-test
を用いた。
【００４５】
（５）結果
コントロール群およびMCC1849摂取群の小腸パイエル板におけるTfh細胞（CD4陽性の細
胞、及びPD-1陽性の細胞）の割合を表２に示す。MCC1849摂取群では、コントロール群と
比べて小腸パイエル板中のTfh細胞の割合の有意な増加が認められた。
この結果から、乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849の摂取はTfh細胞を増加させることが示された。
【００４６】
【表２】
0006531893.tif 000003