(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に液体を保持可能な、少なくとも一対のウェルを上面に有し、前記一対のウェル間が連通するようにウェルが配置されているプレートを、電極ベース上に配置して、前記ウェル内と前記プレートの底面とを連通する少なくとも一対の電極と、前記電極ベースが有する少なくとも一対の接点とを接するようにする配置ステップと、
前記接点を前記電極方向に付勢する付勢手段と、前記プレートと前記電極ベースとを固定する固定手段とを用いて、前記電極と前記接点が接した状態で、前記プレートと前記電極ベースとを固定する固定ステップと、
前記一対のウェル間にイオンチャネルを含む脂質二重膜を形成する注入ステップと、
前記一対の電極間に一定の電圧を印加し、前記一対の電極間の電流を、電流計を用いて計測する計測ステップと、
を備えるイオン透過性脂質二重膜形成方法であって、
少なくとも前記プレートと前記電極ベースは、筐体に格納されており、
前記筐体は、金属導体または導電性物質で塗装された樹脂を有し、
前記筐体内における、前記少なくとも一対の接点と、前記電流計との接続線が、ツイストペアケーブルであり、前記筐体外における前記接続線が、シールドケーブルであり、前記シールドケーブルのシールドが接地されているイオン透過性脂質二重膜形成方法。
【請求項２】
前記金属導体または前記導電性物質は、接地されている請求項１に記載のイオン透過性脂質二重膜形成方法。
【請求項３】
前記計測ステップにおいて計測した電流が所定の閾値以上である場合、イオンチャネルを包埋した脂質二重膜が形成されたと判定する判定ステップを備える請求項１または２に記載のイオン透過性脂質二重膜形成方法。
【請求項４】
前記少なくとも一対の接点と、前記電流計との接続線の少なくとも一部が、ツイストペアケーブルである請求項１から３のいずれかに記載のイオン透過性脂質二重膜形成方法。
【請求項５】
前記イオン透過性脂質二重膜は脂質二重膜にイオンチャネルを包埋した物質である請求項１から４のいずれかに記載のイオン透過性脂質二重膜形成方法。
【請求項６】
内部に液体を保持可能な、少なくとも一対のウェルを上面に有するプレートであって、一対のウェル間が連通するようにウェルが配置され、ウェル内とプレート底面とを連通する電極をウェル毎に有する前記プレートと、
前記電極と接する、少なくとも一対の接点を有する電極ベースと、
前記少なくとも一対の電極間に一定の電圧を印加し、電流を計測する電流計と、
前記接点を前記電極方向に付勢する付勢手段と、
前記電極と前記接点が接した状態で、前記プレートと前記電極ベースとを固定する固定手段と、
を備えるイオン透過性脂質二重膜形成のための電流計測装置であって、
少なくとも前記プレートと、前記電極ベースとを格納する筐体を備え、
前記筐体は、金属導体または導電性物質で塗装された樹脂を有し、
前記筐体内における、前記少なくとも一対の接点と、前記電流計との接続線が、ツイストペアケーブルであり、前記筐体外における前記接続線が、シールドケーブルであり、前記シールドケーブルのシールドが接地されているイオン透過性脂質二重膜形成のための電流計測装置。
【請求項７】
前記金属導体または前記導電性物質は、接地されている請求項６に記載のイオン透過性脂質二重膜形成のための電流計測装置。
【請求項８】
前記少なくとも一対の接点と、前記電流計との接続線の少なくとも一部が、ツイストペアケーブルである請求項６または７に記載のイオン透過性脂質二重膜形成のための電流計測装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はイオン透過性脂質二重膜形成方法及びイオン透過性脂質二重膜形成のための電流計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物を構成する細胞や、細胞内に存在するミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体等の各種オルガネラ、細胞核等は、外側が生体膜で覆われており、この生体膜は、基本的に脂質二重膜から構成されている。生理活性を有する様々なたんぱく質、すなわちレセプターや酵素等が、この脂質二重膜を貫通する形で脂質二重膜上に保持されている。これらの膜貫通たんぱく質は、生体内で重要な役割を果たしている。特に、細胞膜上に存在する各種レセプターは、生体内に存在するリガンドと結合することにより、様々な生理学的反応を引き起こす引き金になることがわかっている。このため、レセプターの機能を亢進する各種リガンドや、レセプターの機能を阻害する阻害剤等が医薬品として用いられており、また、新たな医薬品として利用可能な天然または人工のリガンドや阻害剤が研究されている。
【０００３】
これらの膜貫通たんぱく質やそのリガンド、阻害剤等を開発するためには、生体内と同じ状態、すなわち、膜貫通たんぱく質が生体膜に保持された状態で各種測定を行うことが望まれる。また、創薬スクリーニング等においては、自動化された装置を用いて、多数の脂質二重膜を同時に形成し、形成された多数の脂質二重膜を用いて同時並行的にスクリーニングを行うことにより、スクリーニングの効率を高めることが期待されている。このような自動測定に対応するためには、自動化された装置を用いた場合であっても、脂質二重膜が再現性よく形成され、かつ、ひとたび形成された脂質二重膜が、自動化装置内での移動や測定処理中に破壊されずに安定に存在する必要がある。
【０００４】
特許文献１には、孔径が５００ｎｍ〜５００μｍの１個、または複数の貫通孔を有する隔壁を介して隣接した、２つのウェルのそれぞれに脂質二重膜を形成する脂質溶液を添加する工程と、各ウェルに水または水溶液を添加して前記脂質溶液中に水または水溶液の液滴を形成させる工程と、この状態で放置することで前記貫通孔の部分に脂質二重膜を形成する工程とを含む、脂質二重膜の形成方法、およびこの方法に適した器具が記載されている。
【０００５】
また、特許文献２には、特許文献１に記載の器具をより廉価に製造することを可能にし、かつ計測の効率を高めることを目的として、特許文献１に記載の製法や構成法に検討を加え、隔壁部をカセット化することで、隔壁部のみの交換によって再度計測に供することのできる、改良された器具が記載されている。
【０００６】
このように、特許文献１、特許文献２に記載された器具を用いることで、特殊な技術の習得を必要とすることなく脂質二重膜の形成が可能となり、この二重膜内に膜たんぱく質を再現性よく再構成することが可能となっている。さらに、非特許文献１には、特許文献１に記載と同様の構成とし、かつ１６対のウェルを設けた場合であっても、全てのウェルからの信号が確認され、効率よくイオンチャネルの計測が行えることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−８１４０５号公報
【特許文献２】特開２０１５−７７５５９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】R.Kawano et.al., Scientific Reports 3, Article number: 1995 (2013)doi:10.1038/srep01995
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
脂質二重膜にイオンチャネルを包埋したイオン透過性脂質二重膜を形成する場合、イオンチャネルを通過する電流を計測することにより、イオンチャネルが形成されたことが確認できる。このイオンチャネルを通過する電流は、１ｐＡ（ピコアンペア）または１０ｐＡのオーダーであり、極めて微弱であるので、ノイズにより正確に計測することが困難であるという問題がある。
【００１０】
本発明は、イオン透過性脂質二重膜形成において、イオン透過性脂質二重膜のイオンチャネル電流をより正確に測定できる方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明にかかるイオン透過性脂質二重膜形成方法は、内部に液体を保持可能な、少なくとも一対のウェルを上面に有し、前記一対のウェル間が連通するようにウェルが配置されているプレートを、電極ベース上に配置して、前記ウェル内と前記プレートの底面とを連通する少なくとも一対の電極と、前記電極ベースが有する少なくとも一対の接点とを接するようにする配置ステップと、
前記接点を前記電極方向に付勢する付勢手段と、前記プレートと前記電極ベースとを固定する固定手段とを用いて、前記電極と前記接点が接した状態で、前記プレートと前記電極ベースとを固定する固定ステップと、
前記一対のウェル間にイオンチャネルを含む脂質二重膜を形成する注入ステップと、
前記一対の電極間に一定の電圧を印加し、前記一対の電極間の電流を、電流計を用いて計測する計測ステップと、
を備える。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ノイズを低減し、イオン透過性脂質二重膜のイオンチャネル電流をより正確に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施の形態１にかかる電流計測装置のプレートの概略構成を示す上面図である。
【図２】実施の形態１にかかる電流計測装置のプレートの概略構成を示す断面図である。
【図３】実施の形態１にかかる電流計測装置の隔壁カセットの概略構成を示す側面図である。
【図４】実施の形態１にかかる電流計測装置の電極ベースの概略構成を示す断面図である。
【図５】実施の形態１にかかる電流計測装置の概略構成を示す断面図である。
【図６】実施の形態１にかかる電流計測装置の概略構成を示す断面図である。
【図７】実施の形態１にかかるイオン透過性脂質二重膜形成方法の手順を示すフローチャートである。
【図８】実施例２におけるαＨＬの再構成前後の電流波形の一例を示すグラフである。
【図９】比較例１におけるベース板底面の引き出し配線の一例を示す図である。
【図１０】比較例１におけるケーブル付コネクタの外見を撮影した写真図である。
【図１１】比較例２におけるαＨＬの再構成前後の電流波形の一例を示すグラフである。
【図１２】別の実施の形態にかかる電流計測装置の概略構成を示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
実施の形態１
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。各図面では、構造の理解を得ることを目的とするため、各部は適宜拡大縮小されており、正確な寸法関係を表現しているものではない。
【００１５】
まず、イオン透過性脂質二重膜形成方法に用いる電流計測装置について、図１〜５を用いて説明する。実施の形態１の電流計測装置は、脂質二重膜を形成するためのプレートと、イオンチャネル電流を外部に出力するための電極ベースとを有する。
【００１６】
まず、図１及び図２を用いて、実施の形態１にかかる電流計測装置のプレートの各構成について説明する。図１は、実施の形態１にかかる電流計測装置のプレートの概略構成を示す上面図である。また、図２は、実施の形態１にかかる電流計測装置のプレートの概略構成を示す断面図である。
【００１７】
図１及び図２において、プレート１１０は、ウェル１１１と、ウェル１１２と、電極１１３と、電極１１４と、隔壁カセット１２０とを備える。また、隔壁カセット１２０は、隔壁１２１と、押さえ板１２２と、押さえ板１２３とを備える。
【００１８】
プレート１１０は、ウェル１１１及びウェル１１２を形成する主面と、主面と略平行であり、電極ベースと接続する底面とを有する板形状を有するプレートである。例えば、プレート１１０は、アクリル等のプラスチックベースが好適である。また、プレート１１０は、隔壁カセット１２０を挿入するための溝を有する。
【００１９】
ウェル１１１及びウェル１１２は、プレート１１０の主面に開口を有し、プレート１１０を貫通しない穴である。例えば、ウェル１１１及びウェル１１２は、アクリル等のプラスチックベースに切削加工を施すことにより形成される。このウェル１１１及びウェル１１２において、イオンチャネルを脂質二重膜に包埋したイオン透過性脂質二重膜が形成される。
【００２０】
ウェル１１１及びウェル１１２は、互いに側面の一部で連通する位置に形成されている。そして、ウェル１１１とウェル１１２は、側面の一部で連通する位置において隔壁カセット１２０により隔てられている。
【００２１】
電極１１３は、ウェル１１１内の底部と、プレート１１０の底面とを電気的に接続する電極である。電極１１３は、金属で構成されることが好適である。例えば電極１１３は、ウェル１１１の底部にプレート１１０との底面と連通する貫通孔を形成し、貫通孔に銀／塩化銀ペーストを充填することにより形成される。
【００２２】
電極１１４は、ウェル１１２内の底部と、プレート１１０の底面とを電気的に接続する電極である。電極１１３と同様に、電極１１４も、金属で構成されることが好適である。例えば電極１１４は、電極１１３と同様にウェル１１２の底部にプレート１１０との底面と連通する貫通孔を形成し、貫通孔に銀／塩化銀ペーストを充填することにより形成される。
【００２３】
次に、図１〜３を用いて、実施の形態１にかかる電流計測装置の電流計測装置の隔壁カセットの各構成について説明する。図３は、実施の形態１にかかる電流計測装置の隔壁カセットの概略構成を示す側面図である。図３において、隔壁カセット１２０は、隔壁１２１と、押さえ板１２２と、押さえ板１２３とを備える。
【００２４】
隔壁１２１は、貫通孔を有する板形状であり、ウェル１１１及びウェル１１２を隔てる隔壁である。そして、隔壁１２１は、１または複数の貫通孔を有する。この貫通孔には脂質二重膜を形成することができる。この脂質二重膜のイオンチャネルを介してウェル１１１とウェル１１２との間に電流が流れる。例えば、隔壁１２１は、５μｍ厚のパリレン（ポリ−ｐ−キシリレン）フィルムであり、フォトリソグラフィーによって形成された１００μｍ径の複数の貫通孔を有する。
【００２５】
押さえ板１２２及び押さえ板１２３は、隔壁１２１を挟持する押さえ板である。例えば、押さえ板１２２及び押さえ板１２３は、一定の厚さを有するアクリル製の板が好適である。押さえ板１２２及び押さえ板１２３は、隔壁１２１の両面を挟持した状態で、隔壁１２１の両面をそれぞれ露出することができる貫通孔を有する。この貫通孔は、押さえ板１２２及び押さえ板１２３が隔壁１２１の両面を挟持した状態で、隔壁１２１に形成された貫通孔を露出させる位置に形成される。
【００２６】
隔壁カセット１２０は、隔壁１２１の両面を押さえ板１２２及び押さえ板１２３で挟むことにより、形成される。そして、隔壁カセット１２０は、隔壁１２１、押さえ板１２２及び押さえ板１２３の貫通孔を介してウェル１１１とウェル１１２が連通するように、プレート１１０の溝に装着される。
【００２７】
次に、図４を用いて、実施の形態１にかかる電流計測装置の電極ベースの各構成について説明する。図４は、実施の形態１にかかる電流計測装置の電極ベースの概略構成を示す断面図である。
【００２８】
図４において、電極ベース２００は、ベース板２０１と、スペーサー２０２と、可動電極２０３と、可動電極２０４とを備える。そして、可動電極２０３は、接点２３１と、シャフト２３２と、付勢機構２３３と、ホルダー２３４と、接続端子２３５とを有する。同様に可動電極２０４は、接点２４１と、シャフト２４２と、付勢機構２４３と、ホルダー２４４と、接続端子２４５とを有する。
【００２９】
ベース板２０１は、板形状を有し、可動電極２０３及び可動電極２０４を収容する貫通孔を有する。ベース板２０１は、絶縁性物質からなり、プレート１１０を支持するに十分な強度を有することが望ましい。
【００３０】
スペーサー２０２は、ベース板２０１の上面に固定され、プレート１１０を支持する支持体である。スペーサー２０２において、プレート１１０と接触する面は、プレート１１０に対応する形状を有することが望ましい。例えば、プレート１１０の底面が平面形状である場合には、スペーサー２０２のプレート１１０と接触する面も平面形状であることが望ましい。スペーサー２０２も、ベース板２０１と同様に、絶縁性物質からなり、プレート１１０を支持するに十分な強度を有することが望ましい。スペーサー２０２は、可動電極２０３及び可動電極２０４のＺ軸方向の変位量を一定に保つ機能を有するために、一定の高さを有する構造体であれば良い。例えば、スペーサー２０２は、ブロック状、柱状あるいは筒状の形状とすることが好適である。
【００３１】
可動電極２０３は、ベース板２０１の貫通孔に収容され、Ｚ軸方向に可動する電極である。そして、可動電極２０３は、プレート１１０の底面に露出する電極１１３と接することにより、電極１１３と電気的に接続する電極である。
【００３２】
可動電極２０４は、可動電極２０３と同様に、ベース板２０１の貫通孔に収容され、Ｚ軸方向に可動する電極である。そして、可動電極２０４は、プレート１１０の底面に露出する電極１１４と接することにより、電極１１４と電気的に接続する電極である。
【００３３】
接点２３１は、プレート１１０の底面に露出する電極１１３と接する接点である。接点２３１は、電気伝導性を有する物質であることが望ましい。また、接点２３１及び電極１１３において、互いの接触面が平面であることが望ましい。
【００３４】
シャフト２３２は、一端に接点２３１を接続し、他端に接続端子２３５を接続する棒状の導電体であり、接点２３１と接続端子２３５とを電気的に接続する。シャフト２３２のＸＹ断面は、ベース板２０１の貫通孔に収容可能な形状及び大きさであれば良い。例えば、シャフト２３２のＸＹ断面は、円または四角形の形状が好適である。
【００３５】
付勢機構２３３は、可動電極２０３をＺ軸方向でプレート１１０に向かって付勢する構成である。例えば、付勢機構２３３は、弾性体で構成されることが望ましい。具体的には、付勢機構２３３は、コイルスプリングで構成されることが好適である。そして、コイルスプリングの内径がシャフト２３２の外径より大きく、コイルスプリングの外径が接点２３１の外径及びホルダー２３４の外径より小さいサイズとすることにより、ホルダー２３４を基点として、可動電極２０３の接点２３１をＺ軸方向でプレート１１０に向かって付勢することができる。
【００３６】
ホルダー２３４は、シャフト２３２を保持する中空筒形状の下部分と、付勢機構２３３を支持する中空平板形状の上部分とを接続した構造体である。ホルダー２３４の下部分は、外径をベース板２０１の貫通孔より小さくすることにより、ホルダー２３４の下部分をベース板２０１の貫通孔に収容することができる。ホルダー２３４の下部分の外径の形状は、ベース板２０１の貫通孔の形状に対応していることが望ましい。また、ホルダー２３４の下部分は、内径をシャフト２３２の外径より摺動可能な分、大きくすることにより、ホルダー２３４はシャフト２３２を保持することができる。ホルダー２３４の下部分の内径の形状は、シャフト２３２の外径の形状に対応していることが望ましい。
【００３７】
そして、ホルダー２３４の上部分は、外径をベース板２０１の貫通孔より大きく、且つコイルスプリングの外径より大きくすることにより、ホルダー２３４をベース板２０１の高さに保ちつつ、ホルダー２３４が、可動電極２０３の接点２３１をＺ軸方向でプレート１１０に向かって付勢する基点とすることができる。
【００３８】
接続端子２３５は、外部と電気的に接続する端子である。接続端子２３５は、電気伝導性を有する物質である。
【００３９】
接点２４１、シャフト２４２、付勢機構２４３、ホルダー２４４及び接続端子２４５とは、それぞれ、接点２３１、シャフト２３２、付勢機構２３３、ホルダー２３４及び接続端子２３５と同様の機能、構成を有する。
【００４０】
以上の構成により、電極ベース２００は、プレート１１０を支持し、プレート１１０の底面に露出する電極と電気的に接続することができる。
【００４１】
上述したプレート１１０と電極ベース２００とを組み合わせることにより電流計測装置が構成される。次に、電流計測装置の構成について説明する。
【００４２】
図５は、実施の形態１にかかる電流計測装置の概略構成を示す断面図である。図５において、図１〜４と同一の構成については、同一の番号を付し、説明を省略する。図５において、電流計測装置１００は、プレート１１０と、電極ベース２００と、固定機構３０１と、固定機構３０２とを備える。
【００４３】
固定機構３０１及び固定機構３０２は、可動電極２０３の接点２３１とプレート１１０の底面に露出する電極１１３とが接し、可動電極２０４の接点２４１とプレート１１０の底面に露出する電極１１４とが接した状態で、プレート１１０と電極ベース２００とを固定する。例えば、固定機構３０１及び固定機構３０２は、オスネジで構成される。そして、固定機構３０１及び固定機構３０２は、プレート１１０に設けられた貫通孔３１１及び３１２に挿入され、電極ベース２００に設けられたメスネジ３２１及び３２２と螺合する。
【００４４】
上述したように、可動電極２０３の接点２３１は、付勢機構２３３によりＺ軸方向でプレート１１０に向かって付勢される。一方、接点２３１と接触する電極１１３は、プレート１１０の底面に固定されており、また、プレート１１０は、固定機構３０１及び固定機構３０２により、電極ベース２００と固定されている。したがって、可動電極２０３の接点２３１は、Ｚ軸方向には変位しない状態で、プレート１１０の底面の電極１１３を押圧して接触する。
【００４５】
このように、実施の形態１の電流計測装置によれば、付勢機構により可動電極の接点をプレートの電極方向に付勢すると共に、プレートの電極と可動電極の接点が接した状態で、固定機構によりプレートと電極ベースとを固定することにより、可動電極の接点がプレートの電極を押圧した状態で接することができ、接触の不完全性に起因する接触性ノイズを低減させることができる。
【００４６】
次に、電磁ノイズを低減させる構成について説明する。図６は、実施の形態１にかかる電流計測装置の概略構成を示す断面図である。図６において、図１〜５と同一の構成については、同一の番号を付し、説明を省略する。
【００４７】
図６において、電流計測装置１００は、プレート１１０と、電極ベース２００と、固定機構３０１と、固定機構３０２と、ツイストペアケーブル４０１と、接続端子４０２と、シールドケーブル４０３と、筐体４０４とを備える。
【００４８】
ツイストペアケーブル４０１は、電線を２本対で撚り合わせたケーブルである。ツイストペアケーブル４０１は、２本対の電線の一端を接続端子２３５及び接続端子２４５にそれぞれ接続し、２本対の電線の他端を接続端子４０２に接続する。ツイストペアケーブル４０１は、一対のウェル１１１及び１１２に配置された一対の電極１１３及び１１４から信号を伝達する。したがって、電流計測装置１００が二対のウェルに配置された二対の電極を有する場合は、２つのツイストペアケーブル４０１を備えることにより、二対の電極からの信号を伝達することができる。すなわち、電流計測装置１００は、複数対の電極に対応した数のツイストペアケーブル４０１を有することが好適である。
【００４９】
接続端子４０２は、ツイストペアケーブル４０１とシールドケーブル４０３とに接続する端子である。接続端子４０２は、ツイストペアケーブル４０１の２本対の電線をそれぞれ、シールドケーブル４０３の芯線に接続する。
【００５０】
シールドケーブル４０３は、芯線及びシールドケーブルを有するケーブルである。例えば、シールドケーブル４０３は、２本の芯線を有し、接続端子４０２を介して、それぞれの芯線をツイストペアケーブル４０１の２本対の電線に接続する。
【００５１】
筐体４０４は、プレート１１０、電極ベース２００、固定機構３０１、固定機構３０２及びツイストペアケーブル４０１を内部に収容するケースである。筐体４０４は、全体を導電性の物質または導電性の物質を含む複合物で構成することにより、外部からの電磁波を遮断する電磁シールドとして機能する。筐体４０４は、例えば、アルミニウム等の導電性金属または導電性物質で塗装された樹脂で構成されることが好適である。また、筐体４０４は、接地することが好適である。また、筐体４０４は、プレート１１０の交換、プレート１１０への溶液の注入を行うための、開閉可能な蓋を備えるようにしてもよい。
【００５２】
このように、実施の形態１の電流計測装置によれば、ウェル内に配置された一対の電極を、電極ベースの可動電極を介してツイストペアケーブルで接続することにより、ツイストペアケーブルを貫通する磁束により発生する電流の向きは、隣同士で反転しているので互いに打ち消し合うことになり、外部からの磁束がツイストペアケーブルで伝達される信号に及ぼす影響が低減される。
【００５３】
また、実施の形態１の電流計測装置によれば、全体を導電性の物質または導電性の物質を含む複合物で構成する筐体内にプレート、電極ベース及びツイストペアケーブルを収容することにより、電流計測装置外からの電磁波は電磁シールドにより低減することができる。
【００５４】
また、実施の形態１の電流計測装置によれば、電磁シールドされた筐体を接地することにより、電磁シールドが吸収した電磁波のエネルギーを接地側に逃すことができ、筐体の電位を接地電位に保つことができ、筐体の電位変化によるノイズ発生を防ぐことができる。
【００５５】
次に、イオン透過性脂質二重膜形成方法について説明する。図７は、実施の形態１にかかるイオン透過性脂質二重膜形成方法の手順を示すフローチャートである。
【００５６】
まず、ステップＳ５０１において、プレート１１０を電極ベース２００上に配置して、プレート１１０の下面に露出する一対の電極１１３、１１４と、電極ベース２００に備えられた一対の接点２３１、２４１とを接するようにし、ステップＳ５０２に進む。
【００５７】
ステップＳ５０２において、接点２３１、２４１を電極方向に付勢する付勢機構２３３、２４３と、プレート１１０と電極ベース２００とを固定する固定機構とを用いて、電極１１３、１１４と接点２３１、２４１が接した状態で、プレート１１０と電極ベース２００とを固定し、ステップＳ５０３に進む。
【００５８】
ステップＳ５０３において、ウェル１１１、１１２内に、原料となる溶液（油系、水系）を注入し、両ウェル間に脂質二重膜を形成してステップＳ５０４に進む。具体的にはステップＳ５０３において、脂質二重膜形成性の脂質溶液を注入し、さらにイオンチャネルを形成するタンパク質、ペプチド及び有機金属錯体の少なくとも一種を含む溶液（緩衝液が好ましい）を両方のウェルに注入して、あるいは一方のウェルに当該溶液及び他方のウェルに緩衝液を注入して、脂質二重膜を形成し、ステップＳ５０４に進む。
【００５９】
ステップＳ５０４において、一対の電極１１３、１１４間に一定の電圧を印加し、一対の電極１１３、１１４間の電流を、電流計を用いて計測し、ステップＳ５０５に進む。
【００６０】
ステップＳ５０５において、計測した電流が所定の閾値以上であるか否か判断することにより、イオンチャネルが形成されたか否かを判定する。計測した電流が所定の閾値以上である場合、ステップＳ５０６に進む。計測した電流が所定の閾値未満である場合、ステップＳ５０４に戻る。
ステップＳ５０６において、イオンチャネルが形成されたと判定し、ステップＳ５０４に戻る。
【００６１】
以上の計測によりイオン透過性脂質二重膜の完成を確認することができ、当該イオン透過性脂質二重膜を測定に供することができる。
【００６２】
このように実施の形態１のイオン透過性脂質二重膜形成方法によれば、付勢機構により可動電極の接点をプレートの電極方向に付勢すると共に、プレートの電極と可動電極の接点が接した状態で、固定機構によりプレートと電極ベースとを固定することにより、可動電極の接点がプレートの電極を押圧した状態で接することができ、接触の不完全性に起因する接触性ノイズを低減させることができ、イオンチャネルが形成されたか否か精度良く判断できる。
【００６３】
次に、本発明による電流計測装置を用いた電流計測の事例を実施例に基づき、説明する。
【００６４】
（実施例１）電流検出ユニット（電流計測装置１００）の作製
１−１．
切削加工により、厚さ４ｍｍのアクリル板の一面に直径４ｍｍ深さ３ｍｍのウェル１１１、１１２を一対形成した。一対のウェル１１１、１１２の中心間距離は３．５ｍｍとした。そして、ウェル１１１、１１２の底部の中心に、アクリル板を貫通する直径１ｍｍの貫通孔を設けることにより、プレート１１０を形成した。
【００６５】
１−２．
ウェル１１１、１１２の底部の貫通孔にそれぞれ銀／塩化銀ペーストを充填し、乾燥固化させることにより、電極１１３、１１４を形成した。また、電極１１３、１１４は、プレート１１０の底部で対向する電極ベース２００の接点２３１、２４１と完全に接触させるために、適量のペーストを充填することによりプレート１１０の底部より僅かに凸状となるバンプを形成している。
【００６６】
１−３．
ウェル１１１とウェル１１２との当接部分に幅０．５ｍｍ、長さ４．４ｍｍ、深さ３．３ｍｍの溝を設け、この溝に押さえ板１２２、１２３によって挟持された５μｍ厚のパリレン製の隔壁１２１を配置した。隔壁１２１には、酸素プラズマエッチングにより、１００μｍ径の丸穴を１１ヶ所設けた。
【００６７】
１−４．
厚さ５ｍｍのアクリル板に所定の直径の孔をあけて、所定の個数の孔を形成した。そして、この孔に付勢機構２３３、２４３を介して伸縮する可動電極２０３、２０４を挿入し、電極ベース２００を作製した。可動電極２０３、２０４に用いた金属電極は直径約１．６ｍｍ、長さ約２８ｍｍであった。
【００６８】
１−５．
電極ベース２００をアルミニウム製の筐体４０４に納め、筐体４０４に取り付けた接続端子４０２と接続端子２３５、２４５を結線した。結線にはツイストペアケーブルを用いた。
【００６９】
１−６．
電極ベース２００とプレート１１０とをオスネジ（固定機構３０１、３０２）で固定し、電流検出ユニット（電流計測装置１００）を完成させた。
【００７０】
（実施例２）膜たんぱくイオンチャネル電流の計測
２−１．
市販のリン脂質ＤＰｈＰＣ（ジフィタノイルフォスファチジルコリン）をｎ−ｄｅｃａｎｅ（ノルマルデカン）に溶かし、２０ｍｇ／ｍｌ  ＤＰｈＰＣの溶液を調製した。
【００７１】
２−２．
この溶液を実施例１に記載のプレート１１０の各ウェル１１１、１１２内に５μＬずつ滴下した。好ましい滴下量は５μＬであるが、３〜１０μＬの範囲で滴下量を適宜選択してもよい。
【００７２】
２−３．
続いて一方のウェル１１１に２０μＬのリン酸カリウム緩衝液（ＫＣｌ  １Ｍ，  ＰＢ  １０ｍＭ，  ｐＨ＝７．４）を滴下し、さらに他方のウェル１１２に３ｎＭのαＨＬ（アルファヘモリシン）を混合した緩衝液を滴下した。好ましい滴下量は２０μＬであるが、１５〜３０μＬの間で滴下量を適宜選択してもよい。また好ましいαＨＬの混合量は３ｎＭであるが、目的に応じ０．１〜３００ｎＭの範囲で混合量を選択してもよい。
【００７３】
２−４．
実施例１に記載の電流計測装置１００にＴｅｃｅｌｌa社製微小電流計測増幅器（ＪＥＴ１６ｃｈ）を接続し、ウェル１１１の電極１１３と、ウェル１１２の電極１１４との間に５０ｍＶのクランプ電圧を印加して、ウェル１１１とウェル１１２との間の電流を計測した。増幅器の利得は１０ＧＯｈｍ（１ｐＡ＝１０ｍＶ）とし、サンプリングレートは５ｋＨ、１ｋＨｚのローパスフィルタを挿入した。
【００７４】
２−５．
この状態でしばらく放置することで、脂質二重膜が形成される。次いでαＨＬの再構成により、イオンチャネル電流が観測される。図８は、実施例２におけるαＨＬの再構成前後の電流波形の一例を示すグラフである。図８において縦軸は電流値であり、横軸は時間である。
【００７５】
（比較例１）  電流検出ユニットの作製
１−１．
実施例１の１−１から１−３に記載されていると同様な方法で、プレート１１０を作製した。なお、プレート１１０のベース板６０１には厚さ４ｍｍのアクリルを用い、８対ずつ２列、計１６対のウェルを備える構成とした。比較例１では実施例１に記載の方法とは異なり、ベース板底面に銀ペーストによる引き出し配線を設けている。図９は、比較例１におけるベース板底面の引き出し配線の一例を示す図である。所定の位置への銀ペーストの塗布にはスクリーン印刷法を用いた。なお、図９中６０２〜６０５の部分はコネクタ側の電極と接する接点として作用するよう印刷パターンが設計されている。
【００７６】
１−２．
比較例１の１−１で述べたプレート１１０に、ケーブル付コネクタ（Ｔｅｃｅｌｌａ社８チャンネル電極ホルダー：Ｔｅｒｒａｐｉｎ）２組を接続し、プレート１１０および電極ホルダーを外部からの電界変動を遮蔽するファラデーケージ内に収め、電流検出装置を完成させた。図１０は、比較例１におけるケーブル付コネクタの外見を撮影した写真図である。
【００７７】
（比較例２）  膜たんぱくイオンチャネル電流の検出
２−１．
比較例１の１−１に記載の電流検出ユニットを実施例２−４と同様の微小電流計測増幅器に接続し、実施例２に示したと同様の方法で、ウェル内に脂質溶液、リン酸カリウム緩衝液、αＨＬを混合した緩衝液を順次滴下した。測定条件は実施例２に記載と同様とした。
【００７８】
２−２．
この状態でしばらく放置することで、脂質二重膜が形成され、次いでαＨＬの再構成に伴うイオンチャネル電流が計測された。図１１にαＨＬ再構成前後の電流波形の一例を示す。図１１は、比較例２におけるαＨＬの再構成前後の電流波形の一例を示すグラフである。
【００７９】
実施例１に記載の装置とのノイズレベルの比較
３−１．
本発明に基づく実施例１に記載の電流計測装置および、比較例１に記載の電流計測装置による、それぞれのノイズレベルを比較した。
【００８０】
３−２．
ノイズの値は、両者ともαＨＬが再構成される前の、無信号時の状態の５〜１０秒間のノイズ電流の実効値をそれぞれ３回ずつ計測し、平均化処理を行ったものである。結果を表１に示す。
【表１】
0006619672.tif 000002
【００８１】
実施例１と比較例１とを比較すると、実施例１では、無信号時のノイズは１ｐＡを下回っており、比較例のノイズの１／５程度の値を示している。
【００８２】
比較例の電流検出チップでは、コネクタとの接続のために引き回し配線が印刷されており、不可避的にこの配線部分によりループが形成される。外部からの磁界の時間変動による誘導起電力の大きさは、鎖交するループの面積に比例する。比較例では金属筐体ではないが、ファラデーケージ内に電流検出装置を収めてあるため、電界の変動に対する耐ノイズ性は実施例に示した装置とほぼ同等と考えられる。したがって、引き回し配線によって形成されるループの面積が、比較例１の方が実施例１より大きく、このループ部分より誘起されるノイズが発生していると考えられる。
【００８３】
一方、実施例１では、ツイストペアケーブルを用いて接続することにより、ツイストペアケーブルを貫通する磁束により発生する電流の向きは、隣同士で反転しているので互いに打ち消し合うことになり、外部からの磁束がツイストペアケーブルで伝達される信号に及ぼす影響が低減される。
【００８４】
このように、本発明のイオン透過性脂質二重膜形成方法及びイオン透過性脂質二重膜形成のための電流計測装置によれば、従来困難であった１ｐＡオーダーのイオンチャネル電流を計測することができ、従来計測不可能であった膜たんぱく質のイオンチャネル電流測定に適用することができる。
【００８５】
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。例えば、上記実施の形態では、一対のウェル及び電極を用いる例について説明しているが、ウェル及び電極の数は特に限定されず、一対以上の数のウェル及び電極を備えても良い。
【００８６】
また、上記実施の形態では、プレート１１０と電極ベース２００とを固定する固定機構３０１、３０２の例としてネジを示しているが、固定機構はネジに限定されるものでなく、一般にパネルを固定するためのプッシユリベットやファスナー等を使用することもできる。また接点のバネ圧との関係から、ネジの代わりに摩擦ピン等を用いることもできる。
【００８７】
また、固定機構３０１、３０２は、Ｌ型ブラケットとしてもよい。図１２は、別の実施の形態にかかる電流計測装置の概略構成を示す断面図である。図１２において、図１〜６と同一の構成については、同一の番号を付し、説明を省略する。図１２において、固定機構３０１は、Ｌ型ブラケット７０１と、回転軸７０２とを備える。同様に、固定機構３０２は、Ｌ型ブラケット７０３と、回転軸７０４とを備える。
【００８８】
Ｌ型ブラケット７０１は、一端を回転軸７０２で回転自在となるように、電極ベース２００に備えられている。同様にＬ型ブラケット７０３も、一端を回転軸７０４で回転自在となるように、電極ベース２００に備えられている。
【００８９】
そして、電極ベース２００上にプレート１１０を配置した後、Ｌ型ブラケット７０１及び７０３を、プレート１１０上にＬ型ブラケット７０１及び７０３の一辺が位置するように回転させることにより、電極ベース２００とプレート１１０を固定しても良い。
【００９０】
また、隔壁１２１は、必ずしも備える必要はなく、ウェル１１１とウェル１１２が連通している構造であれば、イオン透過性脂質二重膜を形成することができる。また、隔壁１２１の貫通孔の径の大きさは、特に限定されない。また、隔壁１２１の貫通孔の数も特に限定されない。
【符号の説明】
【００９１】
１００  電流計測装置
１１０  プレート
１１１、１１２  ウェル
１１３、１１４  電極
１２０  隔壁カセット
１２１  隔壁
１２２、１２３  押さえ板
２００  電極ベース
２０１  ベース板
２０２  スペーサー
２０３、２０４  可動電極
２３１、２４１  接点
２３２、２４２  シャフト
２３３、２４３  付勢機構
２３４、２４４  ホルダー
２３５、２４５  接続端子
３０１、３０２  固定機構
３１１、３１２  貫通孔
３２１、３２２  メスネジ
４０１  ツイストペアケーブル
４０２  接続端子
４０３  シールドケーブル
４０４  筐体
７０１、７０３  Ｌ型ブラケット
７０２、７０４  回転軸
【図１】
0006619672.tif 000003
【図２】
0006619672.tif 000004
【図３】
0006619672.tif 000005
【図４】
0006619672.tif 000006
【図５】
0006619672.tif 000007
【図６】
0006619672.tif 000008
【図７】
0006619672.tif 000009
【図８】
0006619672.tif 000010
【図９】
0006619672.tif 000011
【図１０】
0006619672.tif 000012
【図１１】
0006619672.tif 000013
【図１２】
0006619672.tif 000014