(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその機能的に活性な断片を含む、肺線維症の処置及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体又はその断片が、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化又は二重特異性である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又はそのエピトープ結合断片である、請求項１又は請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体又はその断片が、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされている、請求項１から３までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記肺線維症が特発性肺線維症（ＩＰＦ）である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
肺線維症の処置及び又は予防のための医薬の製造のための、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体又はその機能的に活性な断片の使用。
【請求項７】
前記抗体又はその断片が、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化又は二重特異性である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ又はそのエピトープ結合断片である、請求項６又は請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体又はその断片が、１つ又は複数のエフェクター分子にコンジュゲートされている、請求項６から８までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記医薬が、１つ又は複数の他の治療活性化合物と一緒に投与される、請求項６から９までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
他の治療活性化合物が別の抗線維症治療剤である、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に線維性疾患の処置方法に、より詳細には線維性疾患の処置のための抗ＣＳＦ１−Ｒ抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）としても知られるコロニー刺激因子１（ＣＳＦ−１）は、内皮細胞及び線維芽細胞を含む様々な細胞によって生成されるサイトカインである。ＣＳＦ−１は２つの「単量体」ポリペプチドを含み、それらは生物学的に活性である二量体のＣＳＦ−１タンパク質を形成する。ＣＳＦ−１は、選択的ＲＮＡスプライシング、タンパク質前駆体のタンパク分解性プロセシング並びにグリコシル化及びプロテオグリカンの付加を含む翻訳後修飾のために、少なくとも３つの成熟形態で存在する（Ｃｅｒｒｅｔｔｉ  ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２５（８），７６１；Ｐｉｘｌｅｙ  ＦＪ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ  ＥＲ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１４（１１）６２８−３８；Ｄｏｕｇｌａｓｓ，ＴＧ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，８，１３５４−７６を参照）。ＣＳＦ−１タンパク質の様々な形態には２つの分泌された分子が含まれ、１方はグリコシル化され、他方はより長いアミノ末端配列及びプロテオグリカン修飾を含む。別の変異体は、グリコシル化されるがプロテオグリカン部分を有しない膜貫通（ＴＭ）分子である。この膜形態は、タンパク分解性切断により脱落し、活性な可溶性分子を放出することができる。全ての形態は、アミノ末端に３２個のアミノ酸シグナル配列、カルボキシル末端の近くにおよそ２３個のアミノ酸の推定上の膜貫通領域、及び短い細胞質のＣＯＯＨ末端テールを有する前駆体ポリペプチドとして生成される。前駆体ペプチドはアミノ末端及びカルボキシル末端のタンパク分解性切断によってその後プロセシングされてＣＳＦ−１の成熟形態を生成するが、残基１〜１４９は同一であり、受容体結合ドメインを構成する。ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＳＦ−１単量体はグリコシル化され、ジスルフィド結合を介して二量体化される。ＣＳＦ−１は、血液細胞の生成を促進する一群の生物学的アゴニストに属する。具体的には、それは単核食細胞系統の骨髄前駆細胞のための増殖、分化及び生存因子としての働きをする。さらに、ＣＳＦ−１は応答細胞上の特異的受容体を介してマクロファージの生存、増殖及び機能を刺激する。
【０００３】
ＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）は、ｃ−ｆｍｓ遺伝子生成物又はＣＤ１１５とも呼ばれる。ＣＳＦ−１Ｒは、ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼファミリーに属している１６５ｋＤａの１型ＴＭ糖タンパク質である。ＣＳＦ−１に加えて、構造的に類似しているが配列的に無関係な分子ＩＬ−３４も、ＣＳＦ−１Ｒのリガンドであることが示されている（Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：８０７−８１１）。ＣＳＦ−１Ｒの発現は、循環及び常在する組織集団である、破骨細胞を含む単球−マクロファージ系統の細胞に主に限定される。さらに、それは、卵母細胞、脱落膜細胞及び栄養芽細胞を含む雌性生殖器系のいくつかの細胞で発現される。（Ｐｏｌｌａｒｄ  ＪＷ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ  ＥＲ，１９９６，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ  ４，１９９６，Ｐａｇｅｓ  １５３−１９３「マウスの突然変異による大理石骨病により規定される発症におけるＣＳＦ−１の多面的役割（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ＣＳＦ−１  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｔｉｃ）」；Ａｒｃｅｃｉ  ＲＪ，ＰＮＡＳ  １９８９，８６（２２号），８８１８−８８２２「雌性生殖器官におけるＣＳＦ−１及びその受容体の一時的な発現及び位置はＣＳＦ−１によって調節される胎盤発生と一致する（Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＳＦ−１  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｒａｃｔ  ａｒｅ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＣＳＦ−１−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」；Ａｒｃｅｃｉ，ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，１５１（１），１−８；Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ；Ｒｅｇｅｎｓｔｒｅｉｆ  ＬＪ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓａｎｔ  Ｊ，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９８９  Ｍａｙ；１３３（１）：２８４−９４「マウスの胚形成中のｃ−ｆｍｓ発癌遺伝子及びサイトカイン、ＣＦＳ−１の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｍｓ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ，ＣＳＦ−１，ｄｕｒｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ）」，Ｐａｍｐｆｅｒ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  １９９２，４６（１），４８−５７「ヒトの子宮及び胎盤におけるＣＳＦ−１受容体（ｃ−ｆｍｓプロトオンコジーン生成物）の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＳＦ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｃ−ｆｍｓ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ）ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｕｓ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａ）」；Ｊｏｋｈｉ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９３，６８（３），３０８−３２０「ヒトの子宮胎盤の境界における細胞によるＣＳＦ−１受容体（ｃ−ｆｍｓ生成物）の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＳＦ−１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｃ−ｆｍｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ）ｂｙ  ｃｅｌｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｏｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）」；Ｋａｕｍａ  ＳＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９１，７３（４），７４６−７５１「月経周期及び妊娠初期の間のヒトの子宮内膜組織及び胎盤におけるＣＳＦ−１及びｃ−ｆｍｓの発現（ＣＳＦ−１  ａｎｄ  ｃ−ｆｍｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅｎｔａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｎｓｔｒｕａｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」，Ｂｙｒｎｅ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８１  ９１（３  Ｐｔ  １）  ８４８−５３，Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  １９９５，１７，（２），１４５−１５１；Ｔａｎａｋａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，９１：２５７−６３；Ｗｅｉｒ  ＥＣ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，８（１２）１５０７−１８。
【０００４】
ＣＳＦ−１受容体へのリガンドＣＳＦ−１の結合は、チロシンキナーゼドメインの作用を通して、１つ又は複数のチロシン残基上の受容体のリン酸化をもたらす。リン酸化の後にだけ受容体に結合する抗体が入手できるので、このリン酸化は検出することができる（例えばＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからのホスホ−Ｍ−ＣＳＦ−受容体（Ｔｙｒ５４６）抗体番号３０８３）。
【０００５】
ＣＳＦ−１Ｒに対する抗体は、当技術分野で公知である。Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７３（１９８９）１７８６−１７９３は、ＣＳＦ−１活性を阻害するＣＳＦ−１Ｒに対する抗体を記載する（Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ７３（１９８９）１７８６−１７９３）。ＷＯ０９／０２６３０３は、ヒトＣＳＦ−１Ｒに結合する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体及び抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体を使用するｉｎ  ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルを開示する。ＷＯ１１／１２３３８１は、ＣＳＦ−１Ｒを内在化し、ＡＤＣＣ活性を有する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ１１／１２３３８１は、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体を使用するｉｎ  ｖｉｖｏマウス腫瘍モデルを開示する。ＷＯ１１／１４０２４９は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合をブロックし、がんの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ０９／１１２２４５は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻害し、がん、炎症性腸疾患及び慢性関節リウマチの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ  ＩｇＧ１抗体を開示する。ＷＯ１１／１３１４０７は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻害し、骨量減少及びがんの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ１１／１０７５５３は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻害し、骨量減少及びがんの処置で有益であると明記されている抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。ＷＯ１１／０７００２４は、ヒトＣＳＦ−１Ｒ断片ｄｅｌＤ４に結合する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を開示する。
【０００６】
がん及び慢性関節リウマチの処置のために、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が現在開発中である。
【０００７】
用語「線維性疾患」は、過剰な線維結合組織が器官又は組織に形成される異常な創傷治癒応答を指す。コラーゲン及びフィブロネクチンなどの過剰な細胞外基質（ＥＣＭ）構成要素の沈着及び蓄積は、器官不全に最終的につながることがある組織の硬化及び瘢痕化をもたらす。
【０００８】
創傷は即時の凝集及び凝固応答をもたらし、暫定的な細胞外基質（ＥＣＭ）の発達を伴う。初期の血小板の凝集及び活性化は、創傷部位への好中球、マクロファージ、好酸球及びリンパ球を含む様々な免疫細胞の動員を可能にする、血管拡張及び血管透過性の増加によって特徴付けられる炎症性応答の促進を助ける。好中球及びマクロファージは創傷を鮮創し、それによって感染症の危険を低減し、活性化リンパ球と一緒に、炎症性応答をさらに増幅する役目をする様々な増殖因子及びサイトカインを分泌する。ＴＧＦβ、ＰＤＧＦ及びＩＬ−１３などの分子はマクロファージを活性化し、創傷部位で線維芽細胞の動員、増殖及び活性化に導く。活性化線維芽細胞又は筋線維芽細胞は、α平滑筋アクチンの発現によって特徴付けられ、コラーゲン及び他のＥＣＭ構成要素を分泌する。活性化線維芽細胞はコラーゲン格子を収縮させ、創傷の端を中央に引き寄せる。上皮及び内皮細胞は増殖し、一時的な基質の上を移動し、基質構成要素の溶解と連動して負傷組織を再生し、創傷修復を完了する。
【０００９】
しかし、持続的な組織の傷害若しくは損傷又は修復経路の調節解除は、不適当な創傷応答につながる。そして、コラーゲン及びＥＣＭの過剰な沈着及び高架橋が起こり、正常な組織構造の代わりに瘢痕組織の過剰な形成及び硬化をもたらす。
【００１０】
肺線維症のマウスモデルでマクロファージが消耗したときに疾患重症度が低減することを、いくつかのアプローチが示している（Ｚｈａｎｇ−Ｈｏｏｖｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１０１（４）：５０１−５１１；Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２０１１，１８４（５）；Ｍｕｒｒａｙ、ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，４３，１５４−６２）。リポソームクロドロナートの投与、又はジフテリア毒素分子の注入を介して単球／マクロファージ細胞が除去されたＣＤ１１ｃ−ジフテリア毒素受容体導入遺伝子マウスの使用を介して、消耗が達成された。同様に、肝臓線維症（Ｄｕｆｆｉｅｌｄ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２００５，１１５（１）：５６−６５）及び腎臓線維症（Ｌｉｎ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３，６７３３−４３）のモデルでは、マクロファージの消耗は病的傷害及びコラーゲン沈着を低減した。ｏｐ／ｏｐマウスは、トランケートされた非機能的タンパク質の発現をもたらす、ＣＳＦ−１リガンドＤＮＡ配列の突然変異を有する。これらのマウスは大理石骨病表現型を呈し、マクロファージが欠損している。肺線維症のブレオマイシンモデルで利用したとき、野生型マウスと比較して疾患重症度は大いに低減される（Ｂａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１７６、７８−８９）。
【００１１】
マクロファージは少なくとも２種の機能表現型、Ｍ１及びＭ２に分類することができるので、複雑性がそれらの役割に加えられ（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２５（１２），６７７−８６；Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，３７，１４−１６；Ｍｏｓｓｅｒ  ＤＭ  ａｎｄ  Ｅｄｗａｒｄｓ  ＪＰ，２００８，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，８，９５８−）、そこでＭ２マクロファージは線維症促進特性を有する（Ｌｕｐｈｅｒ，ＭＬ  ａｎｄ  Ｇａｌｌａｔｉｎ，ＷＭ，２００６，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，８９，２４５−８８；Ｐｒａｓｓｅ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１７３，７８１−９２；Ｐｅｃｈｋｏｖｓｋｙ，ＤＶ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３７（１），８９−１−１；Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１８４，５６９−８１）。
【００１２】
線維性疾患の例には、肺線維症、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）、珪肺症、嚢胞性線維症、腎臓線維症、肝臓線維症、肝硬変、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維化症、進行性の大規模な線維症、腎原性の全身性線維症、クローン病、ケロイド、心筋梗塞、全身性硬化症及び関節線維症が含まれる。
【００１３】
線維性疾患の原因は関与する器官及び組織に依存することができ、特発性肺線維症などの一部の疾患では未知である。肝臓線維症及び最終的に肝硬変は、環境及び食事性因子又は感染因子を含む様々な因子への曝露を通して持続する慢性肝傷害から生じる。長期のＢ型肝炎又はＣ型肝炎の感染は、肝臓線維症を引き起こす可能性がある。持続するアルコールの過剰摂取又は脂肪／糖分の高い食事も肝硬変をもたらす可能性がある。同様に、糖尿病は腎臓に損傷を与えて瘢痕化させ、機能の喪失をもたらす可能性がある。家族性肺線維症では、ファミリーメンバーは線維症感受性が増加しているが、原因となる遺伝要因（単数又は複数）は知られていない。
【００１４】
ＩＰＦは原因不明の慢性、進行性の疾患であり、７つの特発性間質性肺炎の１つである（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ／Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｍｕｌｔｉｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ、２００２、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６５：２７７−３０４）。肺胞上皮細胞への反復性の損傷は、ＩＰＦの典型的な組織病理学的特徴をもたらす線維症過程の促進で重要な役割を果たすと考えられている（Ｓｅｌｍａｎ  Ｍ，２００１，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ，１３４（２）：１３６−５１；Ｇｒｏｓｓ  ＴＪ  ａｎｄ  Ｈｕｎｎｉｎｇｈａｋｅ  ＧＷ，２００１）。いくつかの危険因子、特に吸入された毒素及び作用因子が上皮細胞損傷を引き起こすことができる。喫煙はそのような可能性がある因子として特定されているが、木材粉塵、金属粉塵、シリカ又は他の無機質粉塵への曝露がＩＰＦ発症の危険を増加させることが報告されている（Ｂｏｒｃｈｅｒｓ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｒｅｖ  Ａｌｌｅｒｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，４０：１１７−１３４；Ｍａｈｅｒ  ＴＭ，２０１２，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｓｔ  Ｍｅｄ，３３：６９−８３でレビューされている）。ＩＰＦ患者の予後は不良であり、生存期間範囲の中央値は診断後２〜５である（Ｇｒｉｂｂｉｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｔｈｏｒａｘ，６１：９８０−８５；Ｋｉｎｇ  ＴＥ  Ｊｒ，２００１，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，１６６４：１１７１−８１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｐｅｒｅｚ  ＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｈｅｓｔ，１３７：１２９−３７；Ｌｅｅ  ＨＬ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｈｅｓｔ，１２７：２０３４−４１）。
【００１５】
線維性疾患の処置は消炎剤及び免疫抑制剤を一般的に含むが、これらは患者のためにほとんど有益でない。これらの処置による効能の不足は、炎症性状態でなく創傷治癒への異常な応答として、ＩＰＦ及び線維性疾患一般の再考に寄与した。ピルフェニドンは２００８年に日本で、及び２０１１年に欧州で、ＩＰＦの処置で使用するために承認された小分子薬であり、それは、完全には理解されていない複数の作用機構を介して作用する傾向があるが、一部ＴＧＦ−βの下方調節を介して作用することができる。これまでに、線維症適応のための標的療法は未だ承認されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、現在、線維性疾患の改善された処置へのまだ満たされていない医学的な必要性がある。例えば、ＩＰＦについては、３年生存率は５０％であり、５年生存率はわずか２０％であり、症例の約２０％で移植が必要とされる。
【００１７】
したがって、本発明の目的は、線維性疾患の新しい処置方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
驚くべきことに、本発明者らは、ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤が線維性疾患の処置で活性であることを実証することができた。具体的には、本発明者らは、ＣＳＦ−１Ｒ活性を阻害する抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体が肺線維症のｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで活性であることを実証することができた。
【００１９】
したがって、本発明は、線維性疾患の処置及び／又は予防のためのＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤を提供する。本発明は、線維性疾患の処置及び／又は予防のための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤の使用も提供する。本発明は、ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤の治療有効量を投与するステップを含む、線維性疾患の処置及び／又は予防のための方法をさらに提供する。
【００２０】
本出願では、用語「線維性疾患」は、過剰な線維結合組織が器官又は組織に形成される創傷治癒への異常な応答によって特徴付けられる疾患を含む。例示的な線維性疾患には、肺線維症を含むことに限定されずに、例えば特発性肺線維症、珪肺症及び嚢胞性線維症、尿細管萎縮及び間質性線維症を含む腎臓線維症、肝臓線維症、及び肝硬変、原発性硬化性胆管炎、原発性胆汁性肝硬変、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維化症、進行性の大規模な線維症、腎原性の全身性線維症、クローン病、ケロイド、心筋梗塞、強皮症、全身性硬化症及び関節線維症が含まれる。
【００２１】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＳＦ−１Ｒ活性」は、ＣＳＦ−１Ｒについて当技術分野で理解されている活性スペクトル、特にヒトＣＳＦ−１Ｒ及びそのアイソフォーム、例えば１、２、３又は全てのアイソフォームの活性を指す。例えば、受容体へのリガンドの結合は特異的チロシン残基でＣＳＦ−１Ｒのリン酸化を誘導し（Ｂｏｕｒｅｔｔｅ  ＲＰ  ａｎｄ  Ｒｏｈｒｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＬＲ，２０００，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １７：１５５−１６６）、続いて起こるシグナル伝達事象のカスケードは、細胞の移動、生存、分化及び増殖を媒介することができる（Ｓｕｚｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５９，１８６０−７；Ｙｅｕｎｇ  Ｙ−Ｇ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ  ＥＲ，２００３，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，１１４３−５５；Ｙｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ８４（３），８５２−６３）。選択されたチロシン残基の代わりにフェニルアラニン残基を含む突然変異体ＣＳＦ−１Ｒ受容体分子のトランスフェクション細胞での発現は、特異的チロシン残基と生存、増殖及び形態などの細胞での結果との関連を明らかにした（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２００８  Ｓｅｐ  ８４（３）：８５２−８６３）。分子特異抗体と一緒に抗ホスホチロシン抗体を使用するプロテオームアプローチ及びイムノブロッティング技術では、受容体のリガンド刺激の後のこれらの細胞機能の媒介に関与するいくつかの細胞内分子を同定した（Ｙｅｕｎｇ  Ｙ−Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１３，２７３（４６）：１７１２８−３７；Ｈｕｓｓｏｎ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５，１４（１９）：２３３１−８。
【００２２】
一実施形態では、対象は哺乳動物、例えばヒトである。
【００２３】
本発明によるＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤は、ＣＳＦ−１Ｒの活性、特に線維性疾患でＣＳＦ−１Ｒの活性を妨害する、例えば低減／阻害又はブロックする薬剤である。ＩＰＦでＣＳＦ−１Ｒの活性を妨害する薬剤が特に好ましい。本発明による阻害剤は、ＣＳＦ−１Ｒ活性を部分的又は完全に阻害することができる。本発明で有用な阻害剤には、限定されずに、ＩＬ−３４、ＣＳＦ−１若しくはＣＳＦ−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）、又はＩＬ−３４、ＣＳＦ−１若しくはＣＳＦ−１Ｒをコードする核酸分子と相互作用すること（例えば、結合すること又は認識すること）が可能である、又はＩＬ−３４、ＣＳＦ−１若しくはＣＳＦ−１Ｒの発現を阻害することが可能である、又はＣＳＦ−１Ｒ及びＣＳＦ−１及び／又はＩＬ−３４の間の相互作用を阻害することが可能である阻害剤が含まれる。そのような阻害剤は、限定されずに、抗体、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド様物質、小分子及び他の薬物であってもよい。一実施形態では、阻害剤は、受容体ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合をブロックする。
【００２４】
適する阻害剤の例には、限定されずに、ＣＳＦ−１に結合して天然のＣＳＦ−１受容体への結合を妨害するＣＳＦ−１受容体の合成機能的断片、ＣＳＦ−１受容体に結合して天然のＣＳＦ−１受容体への結合を妨害するＣＳＦ−１の合成機能的断片、ＣＳＦ−１受容体に結合して天然のＣＳＦ−１受容体への結合を妨害するＩＬ−３４の合成機能的断片、ＣＳＦ−１若しくはＩＬ−３４若しくはＣＳＦ−１受容体に結合してＣＳＦ−１受容体−リガンド相互作用を妨害する抗体、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４若しくはＣＳＦ−１受容体をコードするｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸分子、又はＩＬ−３４、ＣＳＦ−１若しくはＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害する小分子若しくは他の薬物が含まれる。
【００２５】
ＣＳＦ−１受容体活性の阻害剤は、そのような阻害剤を同定して生成する方法と同様に当技術分野で公知である。抗ＣＳＦ−１抗体の中和が、例えば、Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１１，１４７４−１４８１によって、及び抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を同じく記載するＨａｒａｎ−Ｇｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ，８９，２５３７−２５４５によって記載されている。ＣＳＦ−１のアンチセンスアンタゴニストも記載されている（ＥＰ１２２３９８０）。
【００２６】
適する阻害剤であり得る薬剤は、多種多様の候補薬剤から選択することができる。候補薬剤の例には、限定されずに、核酸（例えばＤＮＡ及びＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチド様物質、小分子及び他の薬物が含まれる。薬剤は、以下を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法の中の多数のアプローチのいずれかを使用して得ることができる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相又は溶相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；及び親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー方法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに適し、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用できる（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５；Ｕ．Ｓ．５，７３８，９９６；及びＵ．Ｓ．５，８０７，６８３）。
【００２７】
分子ライブラリーの合成のための本明細書に基づく適する方法の例は、当技術分野で、例えば以下で見出すことができる：ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．ｈｉｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【００２８】
例えば、溶液状態の（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、又はビーズ（Ｌａｍ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（ＵＳ５，２２３，４０９）、胞子（ＵＳ５，５７１，６９８；５，４０３，４８４；及び５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）若しくはファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；及びＦｅｌｉｃｉ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）の上の化合物のライブラリーが提供されてもよい。
【００２９】
一例では、本発明で使用するための阻害剤は、核酸であってもよい。相補的核酸への結合によってそれらのそれぞれのポリペプチドの発現を変化させるために、特に、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ核酸分子をアンチセンス分子として使用することができる。ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ核酸は、標準のクローニング技術を用いて例えばゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡから得ることができるか、又は周知である市販の技術を用いて合成することができる。ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ核酸は、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ核酸のヌクレオチド配列に、１つ又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失を含有することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発を含む突然変異を導入するために、当業者に公知である標準の技術を使用することができる。本発明によるアンチセンス核酸には、それぞれのポリペプチドをコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部への多少の配列相補性によってハイブリダイズすることが可能な、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ核酸が含まれる。アンチセンス核酸は、そのようなポリペプチドをコードするｍＲＮＡのコード及び／又は非コード領域に相補的であってもよい。最も好ましくは、アンチセンス核酸は、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドの発現の阻害をもたらす。したがって、本発明は、線維性疾患の処置及び／又は予防のための方法であって、ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤の治療有効量を投与するステップを含み、阻害剤は、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドをコードする遺伝子又はｃＤＮＡにアンチセンスである少なくとも８種のヌクレオチド（例えば、１５〜２２ヌクレオチド、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド）を含む方法を提供する。本発明は、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドをコードする遺伝子又はｃＤＮＡにアンチセンスである少なくとも８種のヌクレオチド（例えば、１５〜２２ヌクレオチド、例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド）を含む核酸の使用も提供する。
【００３０】
一実施形態では、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための阻害剤は、ＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害する抗体である。したがって、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための医薬の製造のための、ＣＳＦ−１Ｒ活性を阻害する抗体の使用が提供される。対象での線維性疾患の処置及び又は予防の方法であって、前記対象にＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害する抗体の治療有効量を投与するステップを含む方法も提供される。
【００３１】
一実施形態では、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための阻害剤は、ＣＳＦ−１又はＩＬ−３４と相互作用する（すなわち、結合又は認識する）抗体である。一例では、抗体はＣＳＦ−１又はＩＬ−３４と選択的に相互作用する。選択的に相互作用する（例えば認識又は結合する）とは、抗体が他のポリペプチドよりＣＳＦ−１又はＩＬ−３４ポリペプチドにより大きな親和性を有することを意味する。適する抗体の例は、ＣＳＦ−１又はＩＬ−３４が生物学的に活性であるのを阻止するような方法でそれに結合することによって、例えばその受容体へのＣＳＦ−１又はＩＬ−３４の結合を阻止することによって、ＣＳＦ−１又はＩＬ−３４の活性を阻害するものである。したがって、本発明は、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための医薬の製造のための、抗ＣＳＦ−１抗体又は抗ＩＬ−３４抗体の使用を提供する。
【００３２】
最も好ましくは、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための阻害剤は、ＣＳＦ−１Ｒと相互作用して（すなわち、結合又は認識して）ＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害する抗体である。一例では、抗体はＣＳＦ−１Ｒと選択的に相互作用する。選択的に相互作用する（例えば認識又は結合する）とは、抗体が他のポリペプチドよりＣＳＦ−１Ｒポリペプチドにより大きな親和性を有することを意味する。適する抗体の例は、ＣＳＦ−１Ｒが生物学的に活性であるのを阻止するような方法でそれに結合することによって、ＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害するものである。
【００３３】
一実施形態では、抗体は、ＣＳＦ−１Ｒのアイソフォーム、例えばヒトＣＳＦ−１Ｒ及びそのアイソフォームを認識する。
【００３４】
一実施形態では、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ＣＳＦ−１Ｒに結合するリガンドをブロックすることが可能である。本明細書で用いるブロックは、受容体を閉塞することなどの物理的なブロックを指すが、抗体又は断片が、例えば受容体に対する天然リガンドがもはや結合しないことを意味する立体配置変化を引き起こすエピトープに結合する場合も含む。ＣＳＦ−１Ｒをブロックする抗体の能力を判定するのに適するアッセイは、本明細書の実施例に記載される、例２を参照されたい。ＢＩＡｃｏｒｅは、結合動態を測定するために用いられるアッセイの一例であり、ＥＬＩＳＡアッセイ又は単球若しくはＴＨＰ−１細胞を用いる細胞ベースのアッセイも有益であるかもしれない。ＣＳＦ−１及びＩＬ−３４の両方はＣＳＦ−１Ｒのリガンドであり、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体はＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１又はＩＬ−３４の結合をブロックすることができるが、好ましくはＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１及びＩＬ−３４の両方の結合をブロックする。さらに、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体は、ＣＳＦ−１Ｒ活性化又はＣＳＦ−１Ｒ内在化を好ましくは引き起こさない。ＣＳＦ−１Ｒ活性化又はＣＳＦ−１Ｒ内在化を引き起こす抗体の能力を判定するのに適するアッセイは実施例に記載され、ＣＳＦ−１依存性増殖を測定するアッセイを記載する例２を参照されたい。
【００３５】
したがって、線維性疾患の処置及び／又は予防で使用するための医薬の製造のための、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の使用が提供される。対象での線維性疾患の処置及び又は予防の方法であって、前記対象に抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の治療有効量を投与するステップを含む方法も提供される。
【００３６】
ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４若しくはＣＳＦ−１Ｒポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現する細胞は、前記ポリペプチドを特異的に認識する抗体を生成するために使用することができる。ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４及びＣＳＦ−１Ｒポリペプチドは、「成熟した」ポリペプチド、又はその生物学的に活性である断片若しくは誘導体であってもよい。好ましくは、ＣＳＦ−１ポリペプチドは、生物学的活性のために重要であると考えられているアミノ酸１〜１４９を含有する。
【００３７】
本明細書に用いられるＣＳＦ−１Ｒは、ＣＳＦ−１Ｒという名のタンパク質、そのアイソフォーム及び生物学的に活性なその断片を指す。一実施形態では、ＣＳＦ−１Ｒはヒトタンパク質又はそのアイソフォームである。
【００３８】
一般に、本発明で用いられる抗体は、ＣＳＦ−１Ｒの細胞外ドメインに向けられる。
【００３９】
図１Ａは、残基１〜１９が予測されたシグナルペプチドである、ヒトＣＳＦ１−Ｒの完全９７２アミノ酸配列を示す。好ましくは、ＣＳＦ−１Ｒポリペプチドは、図１Ａに示すヒトＣＳＦ−１Ｒ配列のアミノ酸２０〜５１７を含有する。アミノ酸２０〜５１７は、ＣＳＦ−１Ｒ配列の予測された細胞外領域を表す。図１Ｂは、ＣＳＦ−１Ｒの一部の代替形態(alternative form)を示す。
【００４０】
ヒトＣＳＦ−１Ｒは、Ｐ０７３３３の下でＵｎｉＰｒｏｔデータベースに登録されている。
【００４１】
ＣＳＦ−１及びＲＣＳＦ−１Ｒポリペプチドは、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から当技術分野で周知であるプロセスによって調製することができるか、又は天然の生物供給源からそれらを回収することができる。
【００４２】
一実施形態では、図１Ｃに示す配列を適する細胞系にトランスフェクトさせ、細胞表面でポリペプチドを発現させることができる。前記発現を促進するために、アミノ酸断片をＧＰＩアンカーに融合することができる。宿主を免疫化するために、細胞を次に用いることができる。
【００４３】
本出願では、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、特に明記しない限り互換的に使用される。一部の場合には、ＣＳＦ−１又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドは、例えば親和性タグに融合している融合タンパク質などのより大きなタンパク質の一部であってもよい。
【００４４】
これらのポリペプチドに対して生成される抗体は、周知の慣例的なプロトコールを使用して、ポリペプチド又はそれを発現する細胞を動物に、好ましくはヒト以外の動物に投与することによって得ることができ、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ  ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６を参照されたい。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ又はブタなどの多くの温血動物を免疫化することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般に好ましい。
【００４５】
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えばハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐ７７−９６，Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）によって調製することができる。
【００４６】
本発明で使用するための抗体は、例えばＢａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１５）：７８４３−７８４８、ＷＯ９２／０２５５１及びＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載される方法によって、特異抗体の生成のために選択される単一のリンパ球から生成される免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現させることによって、単一リンパ球抗体方法を使用して生成することもできる。
【００４７】
本明細書で用いられる特異的とは、それが特異的である抗原を認識するだけである抗体、又は、それが非特異的である抗原への結合と比較してそれが特異的である抗原に有意により高い結合親和性、例えば少なくとも、５、６、７、８、９、１０倍より高い結合親和性を有する抗体を指すものとする。
【００４８】
キメラ抗体とは、軽鎖及び重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。これらのキメラ抗体は、より抗原性でない可能性がある。当技術分野で公知の方法によって、二価抗体を作製することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９；ＷＯ９３／０８８２９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５−３６５９）。多価抗体は複数の特異性を含むことができるか、又は単一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３を参照する）。
【００４９】
一実施形態では、本発明で使用するための抗体は、ヒト化される。本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体分子」は、アクセプター抗体（例えばヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークに移植されたドナー抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）からの１つ又は複数のＣＤＲ（所望により、１つ又は複数の改変ＣＤＲを含む）を重鎖及び／又は軽鎖が含有する、抗体分子を指す（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照）。レビューについては、Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５−５３９，１９９８を参照する。
【００５０】
一実施形態では、全体のＣＤＲが移されるのではなく、本明細書の上記のＣＤＲのいずれか１つからの特異性決定残基の１つ又は複数だけがヒト抗体フレームワークに移される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５−３４を参照する）。一実施形態では、本明細書の上記のＣＤＲの１つ又は複数からの特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態では、本明細書の上記のＣＤＲの各々からの特異性決定残基だけがヒト抗体フレームワークに移される。
【００５１】
本発明のヒト化抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のそれらと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、通常でない残基は、そのアクセプター鎖のクラス又は型のより頻繁に出現する残基に変えることができる。或いは、アクセプターフレームワーク領域で選択される残基は、それらがドナー抗体の同じ位置で見出される残基に対応するように変えることができる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２４を参照する）。そのような変化は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に保つべきである。変える必要があるかもしれないアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７に示されている。
【００５２】
ＣＤＲ又は特異性決定残基を移植するとき、マウス、霊長類及びヒトのフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／型に関係する、任意の適当なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用することができる。
【００５３】
好適には、ヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域及びＣＤＲの１つ又は複数を含む可変ドメインを有する。したがって、一実施形態では、可変ドメインがヒトアクセプターフレームワーク領域及びヒト以外のドナーＣＤＲを含む、ヒトＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒに結合するヒト化抗体が提供される。
【００５４】
本発明で使用することができるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖のために使用することができ、ＲＥＩは軽鎖のために使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方のために使用することができる。或いは、ヒト生殖細胞系配列を使用することができる。これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／で入手できる。
【００５５】
本発明のヒト化抗体では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は同じ抗体に由来する必要があるとは限らず、所望により、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含むことができる。
【００５６】
本発明で使用するための抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ方法を使用して生成することもでき、例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１−５０）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７  １８７  ９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１−２８０）並びにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８に開示されるものが含まれる。ＵＳ４，９４６，７７８に記載されるものなどの単鎖抗体の生成のための技術を、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドに対する単鎖抗体を生成するために適合させることもできる。さらに、トランスジェニックマウス又は他の哺乳動物を含む他の生物を、ヒト化抗体の発現のために使用することができる。
【００５７】
本発明で使用する抗体は、完全長重鎖及び軽鎖又はその断片を有する完全な抗体分子を含むことができ、限定されずにＦａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二、三又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９号）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３号），２０９−２１７を参照する）。これらの抗体断片を作製及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えばＶｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照する）。本発明で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例えば二重特異性を含むことができるか、又は単一特異的であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２及びＷＯ２０１０／０３５０１２を参照する）。
【００５８】
一実施形態では、抗体は、例えば全て参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０４０５６２、ＷＯ２０１０／０３５０１２、ＷＯ２０１１／０３０１０７、ＷＯ２０１１／０６１４９２及びＷＯ２０１１／０８６０９１に記載されている通り、免疫グロブリン部分、例えばＦａｂ又はＦａｂ’断片及び直接的又は間接的にそれに連結される１つ又は２つの単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）を含むＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ結合抗体融合タンパク質として提供される。
【００５９】
一実施形態では、融合タンパク質は、例えばジスルフィド結合によって任意選択で連結される、重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）対形成として２つのドメイン抗体を含む。
【００６０】
一実施形態では、融合タンパク質のＦａｂ又はＦａｂ’エレメントは、単一ドメイン抗体（単数又は複数）への同じであるか又は類似の特異性を有する。一実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’は単一ドメイン抗体（単数又は複数）への異なる特異性を有する、すなわち融合タンパク質は多価性である。一実施形態では、本発明による多価融合タンパク質はアルブミン結合部位を有する、例えばその中のＶＨ／ＶＬ対はアルブミン結合部位を提供する。
【００６１】
抗体断片及びそれらを生成する方法は当技術分野で周知である、例えば、Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１を参照されたい。本発明で使用するための抗体断片の特定の例は、天然の又は改変されたヒンジ領域を有するＦａｂ’断片である。いくつかの改変されたヒンジ領域が、例えば、ＵＳ５，６７７，４２５、ＷＯ９９／１５５４９及びＷＯ９８／２５９７１で既に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。本発明で使用するための特定の抗体断片のさらなる例には、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８１０、ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８７０及びＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８７１（全て、２００４７月１日に出願された）に記載されるものが含まれる。特に、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８１０に記載される改変抗体Ｆａｂ断片が好ましい。
【００６２】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダのＣＬドメインを含む。
【００６３】
一実施形態では、抗体重鎖はＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、抗体軽鎖はカッパ又はラムダのＣＬドメインを含む。
【００６４】
抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスのものであってもよい。一実施形態では、本発明で使用するための抗体はＩｇＧクラスのものであり、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれかから選択することができる。異なるＩｇＧアイソタイプによる差別的ＡＤＣＣ誘導は、ＦｃγＲへのこれらの残基の親和性に依存する。ヒトでは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３はエフェクター機能を誘導することが知られ、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４はエフェクター機能を弱く誘導する。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明で使用するための抗体は、ＡＤＣＣを含むエフェクター機能を弱く誘導するＩｇＧ２又はＩｇＧ４抗体である。エフェクター機能を有する抗体の使用は患者で副作用を増幅する可能性を有するマクロファージを含む、ＣＳＦ−１Ｒを発現する細胞の消失増を引き起こすことができるので、本発明で線維性疾患の処置で使用するための抗体は、限定されたエフェクター機能を有することが特に好ましい。
【００６６】
本発明で使用するための抗体は、抗体の活性を変化させるために１つ又は複数の突然変異を含むことができる。Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｇａｌ，Ｓ．，Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｏｄｍｅｒ，Ｍ．Ｗ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ａ．，Ｌａｗｓｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｇ．，Ｐｅｄｌｅｙ，Ｂ．  ａｎｄ  Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｒ．１９９３。単一アミノ酸置換はキメラマウス／ヒト（ＩｇＧ４）抗体の不均質性をなくす（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｕｓｅ／ｈｕｍａｎ  （ＩｇＧ４）  ａｎｔｉｂｏｄｙ）．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８）は、ＩｇＧ４抗体の半分子形成を最小にする部位特異的突然変異誘発アプローチを記載する。この報告では、コアヒンジ内の単一アミノ酸置換Ｓ２４１Ｐは、実質的により少ない半分子形成をもたらした。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は突然変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。
【００６７】
抗体が様々な翻訳後修飾を受けることができることも、当業者に理解される。これらの修飾の型及び程度は、抗体を発現させるために使用される宿主細胞系及び培養条件にしばしば依存する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミドの変形を含めることができる。高頻度の修飾は、カルボキシペプチダーゼ作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リシン又はアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４、１９９５に記載される）。したがって、抗体重鎖のＣ末端のリシンは、不在であってもよい。
【００６８】
ヒトＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドのこの特異的領域又はエピトープは、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせた、当技術分野で公知の任意の適するエピトープマッピング方法によって同定することができる。そのような方法の例は、ＣＳＦ−１Ｒに由来する様々な長さのペプチドを、抗体によって認識されるエピトープの配列を含有する、抗体に特異的に結合することができる最小断片による本発明の抗体への結合についてスクリーニングすることを含む。ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒペプチドは、合成的に、或いはＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドのタンパク消化によって生成することができる。抗体に結合するペプチドは、例えば質量分析によって同定することができる。別の例では、本発明の抗体が結合するエピトープを同定するために、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を使用することができる。同定されると、必要ならば、本発明の抗体に結合するエピトープ断片は、同じエピトープに結合する追加の抗体を得るための免疫原として使用することができる。
【００６９】
生体分子、例えば抗体又は断片は、酸性及び／又は塩基性の官能基を含有し、それによってネットで正又は負の電荷を分子に与える。全体の「観察される」電荷の量は、実体の絶対的アミノ酸配列、３Ｄ構造での荷電基の局所の環境及び分子の環境条件に依存する。等電点（ｐＩ）は、特定の分子又はその溶媒アクセサブル表面がネットの電荷を有しないｐＨである。一例では、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ抗体及び断片は、適当な等電点を有するように操作することができる。これは、より頑強な特性、特に適する溶解性及び／又は安定性プロファイル及び／又は改善された精製特性を有する抗体及び／又は断片をもたらすことができる。
【００７０】
したがって一態様では、本発明は、当初同定された抗体の等電点と異なる等電点を有するように操作されるヒト化ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒ抗体を提供する。この抗体は、例えば、アミノ酸残基を置き換えることによって、例えば酸性アミノ酸残基を１つ又は複数の塩基性アミノ酸残基で置き換えることによって操作することができる。或いは、塩基性アミノ酸残基を導入することができるか、又は酸性アミノ酸残基を取り除くことができる。或いは、分子が容認できないほど高いｐＩ値を有する場合は、必要に応じてｐＩを下げるために酸性残基を導入することができる。ｐＩを操作するときには、抗体又は断片の望ましい活性を保持するように注意しなければならないことが重要である。したがって一実施形態では、操作された抗体又は断片は、「未改変の」抗体又は断片と同じか又は実質的に同じ活性を有する。
【００７１】
抗体又は断片の等電点を予測するために、＊＊ＥｘＰＡＳＹ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ、及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｕｔ−ａｒｌｅｓ．ｕｐ．ｕｎｉｖ−ｍｒｓ．ｆｒ／ｗ３ｂｂ／ｄ＿ａｂｉｍ／ｃｏｍｐｏ−ｐ．ｈｔｍｌなどのプログラムを使用することができる。
【００７２】
本発明により提供される抗体の親和性は、当技術分野で公知の任意の適する方法を使用して変更することができることが理解される。したがって、本発明は、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒへの改善された親和性を有する本発明の抗体分子の変異体にも関する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異させること（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のミューテーター株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５９−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，７７−８８，１９９６）及び有性ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（上記）は、親和性成熟のこれらの方法を議論する。
【００７３】
所望により、本発明で使用するための抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）にコンジュゲートされてもよい。したがって、エフェクター分子は、単一のエフェクター分子を、又は本発明の抗体に付着することができる単一部分を形成するように連結される２つ以上のそのような分子を含むことができることが理解される。エフェクター分子に連結される抗体断片を得るのが望まれる場合、これは、抗体断片が直接的に又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準の化学的又は組換えＤＮＡ方法によって調製することができる。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートする技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，１９８７，６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３、６７−１２３を参照する）。特定の化学的方法には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３／０３１５８１に記載されるものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合は、結合は組換えＤＮＡ方法、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載される方法を使用して達成することができる。
【００７４】
本明細書で使用される用語エフェクター分子には、例えば、抗腫瘍剤、薬物、毒素、生物活性タンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体断片、合成された若しくは天然に存在する重合体、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びその断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば蛍光性化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出することができる化合物が含まれる。
【００７５】
エフェクター分子の例には、細胞に有害である（例えば殺傷性の）任意の薬剤を含む細胞毒素又は細胞傷害剤を含めることができる。例には、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、マイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン、及びその類似体又は相同体が含まれる。
【００７６】
エフェクター分子には、限定されずに、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオテパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン又はデュオカルマイシン）、及び有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれる。
【００７７】
他のエフェクター分子には、キレート化放射性核種、例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８、又は、限定されずに、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物が含まれてもよい。
【００７８】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。目的の酵素には、限定されずに、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、転移酵素が含まれる。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されずに、免疫グロブリン、毒素、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えばインスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓性の薬剤又は抗血管新生薬剤、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又は生物学的応答修飾因子、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）又は他の増殖因子及び免疫グロブリンが含まれる。
【００７９】
他のエフェクター分子には、例えば診断で有益な検出可能な物質が含まれてもよい。検出可能な物質の例には、様々な酵素、接合団、蛍光性材料、発光性材料、生物発光材料、放射性核種、陽電子放射金属（陽電子放射断層撮影用）及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断薬として使用するための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、一般に、米国特許第４，７４１，９００号を参照する。適する酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適する接合団には、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが含まれ；適する蛍光性材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド及びフィコエリトリンが含まれ；適する発光性材料にはルミノールが含まれ；適する生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ；適する放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが含まれる。
【００８０】
別の例では、エフェクター分子はｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増加させること、及び／又は抗体の免疫原性を低減すること、及び／又は上皮障壁越しの免疫系への抗体の送達を増強することができる。このタイプの適するエフェクター分子の例には、重合体、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質又はアルブミン結合性化合物、例えばＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものが含まれる。
【００８１】
一実施形態では、ＣＳＦ−１Ｒから独立してエフェクター分子により提供される半減期は、有利である。
【００８２】
エフェクター分子が重合体である場合は、それは一般に、合成であるか又は天然に存在する重合体、例えば任意選択で置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレン重合体又は分枝状若しくは非分枝状の多糖、例えばホモ若しくはヘテロ多糖であってもよい。
【００８３】
前述の合成重合体に存在することができる具体的な任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。
【００８４】
合成重合体の具体例には、任意選択で置換された直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に任意選択で置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が含まれる。
【００８５】
具体的な天然に存在する重合体には、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が含まれる。
【００８６】
一実施形態では、重合体は、ヒト血清アルブミン又はその断片などの、アルブミン又はその断片である。
【００８７】
本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えばマレイミドなどのチオール選択的反応性基を含むものとする。反応性基は、直接的に又はリンカーセグメントを通して重合体に連結することができる。そのような基の残基は、一部の場合には抗体断片と重合体の間の連結基として生成物の一部を形成することが理解される。
【００８８】
重合体のサイズは所望により変更することができるが、一般には５００Ｄａから５００００Ｄａ、例えば５０００から４００００Ｄａ、例えば２００００から４００００Ｄａの平均分子量範囲内である。重合体サイズは、特に生成物の使用目的、例えば腫瘍などのある特定の組織に局在化させるか又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択することができる（レビューについては、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１−５４５を参照する）。したがって、例えば腫瘍の処置で使用するために、例えば、生成物が循環を離れ、組織を透過することを意図する場合は、小分子量、例えばおよそ５０００Ｄａの分子量の重合体を使用することが有利なことがある。生成物が循環中に残る適用のためには、より高い分子量、例えば２００００Ｄａから４００００Ｄａの範囲内の分子量を有する重合体を使用することが有利なことがある。
【００８９】
適する重合体には、ポリアルキレン重合体、例えばポリ（エチレングリコール）又は、特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、特に約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａの範囲内の分子量を有するものが含まれる。
【００９０】
一例では、本発明で使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に付着させる。１つの特定の例では、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端のアミノ酸官能基、例えば任意の遊離のアミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を通して付着させることができる。そのようなアミノ酸は抗体断片に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ方法を使用して断片に組み入れられてもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照する）。一例では、本発明の抗体分子は、改変がエフェクター分子の付着を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である、改変Ｆａｂ断片である。好適には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子を付着させることができる１つ又は複数のシステイン残基を含有する改変ヒンジ領域を形成する。２つ以上のＰＥＧ分子を付着させるために、複数の部位を使用することができる。
【００９１】
好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を通して共有結合する。改変抗体断片に付着する各重合体分子は、断片に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合又は、特に硫黄炭素結合である。チオール基が付着点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えばチオール選択的誘導体、例えばマレイミド及びシステイン誘導体を使用することができる。上記の重合体改変抗体断片の調製では、出発材料として活性化重合体を使用することができる。活性化重合体は、チオール反応性基、例えばハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドを含有する任意の重合体であってもよい。そのような出発材料は市販されている（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）か、又は従来の化学的方法を使用して市販の出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【００９２】
一実施形態では、抗体は改変されたＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片又はｄｉＦａｂであり、それはペグ化されている、すなわち、例えばＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７に開示される方法によりそれに共有結合されるＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する［「ポリエチレングリコールの化学的、生物工学的及び生物医学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，「ポリエチレングリコールの化学的及び生物学的適用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び「バイオメディカルサイエンスのためのバイオコンジュゲーションによるタンパク質のカップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，５４：５３１−５４５も参照する］。一例では、ＰＥＧはヒンジ領域のシステインに付着させる。一例では、ＰＥＧ改変Ｆａｂ断片は、改変ヒンジ領域の単一のチオール基に共有結合しているマレイミド基を有する。リシン残基をマレイミド基に共有結合することができ、リシン残基のアミン基の各々には、およそ２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）重合体を付着させることができる。したがって、Ｆａｂ断片に付着するＰＥＧの全分子量は、およそ４０，０００Ｄａであってもよい。
【００９３】
特定のＰＥＧ分子には、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、元Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）としても知られる、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）ＭＷ２０，０００）改変リシンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれる。
【００９４】
ＰＥＧリンカーの代替供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ３（下の構造でｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍは２である）を供給し、ｎはおよそ４５０であるＮＯＦが含まれる：
【化１】
0006618471.tif 000002
すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。
【００９５】
したがって一実施形態では、ＰＥＧは、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ３として知られる、２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−｛［３−（６−マレイミド−１−オキソヘキシル）アミノ］プロピルオキシ｝ヘキサン（２アーム分枝状ＰＥＧ、−ＣＨ２）３ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５−ＭＡＬ、Ｍｗ４０，０００である。
【００９６】
さらなる代替ＰＥＧエフェクター分子は、以下の型のものである：
【化２】
0006618471.tif 000003
【００９７】
一実施形態では、鎖の中のアミノ酸２２６、例えば重鎖のアミノ酸２２６（逐次的番号付けによる）あたりのシステインアミノ酸残基を通して付着している、ペグ化された（例えば本明細書に記載のＰＥＧで）完全長抗体などの抗体が提供される。
【００９８】
一実施形態では、本開示は、１つ又は複数のＰＥＧ重合体、例えば１つ又は２つの重合体、例えば４０ｋＤａの重合体（単数又は複数）を含むＦａｂ’ＰＥＧ分子を提供する。
【００９９】
本開示によるＦａｂ−ＰＥＧ分子は、それらがＦｃ断片とは無関係な半減期を有するという点で特に有利であるかもしれない。
【０１００】
一実施形態では、重合体、例えばＰＥＧ分子、デンプン分子又はアルブミン分子にコンジュゲートされるｓｃＦｖが提供される。
【０１０１】
一実施形態では、抗体又は断片は、例えば半減期を増加させるためにデンプン分子にコンジュゲートされる。タンパク質にデンプンをコンジュゲートする方法は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，０１７，７３９に記載される。
【０１０２】
ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤を同定するために、当業者はいくつかの異なるアプローチをとることができる。一例では、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒと相互作用する薬剤を先ず同定し、その後ＣＳＦ−１Ｒ活性を阻害するものを同定するためにそれらの薬剤を試験することによって阻害剤は同定される。そのような一例では、薬剤は抗体である。
【０１０３】
ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ１−Ｒと相互作用する薬剤は、任意の適する方法を使用して、例えば、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドを候補薬剤と接触させ、ポリペプチドと相互作用する候補薬剤の能力を判定する、無細胞又は細胞ベースのアッセイ系を使用して同定することができる。好ましくは、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドと相互作用する候補薬剤の能力を、参照範囲又は対照と比較する。所望により、このアッセイは、複数のＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチド試料を使用して複数の候補薬剤（例えばライブラリー）をスクリーニングするために使用することができる。無細胞アッセイの一例では、天然又は組換えのＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドを含む第１及び第２の試料を候補薬剤又は対照薬剤と接触させ、ポリペプチドと相互作用する候補薬剤の能力を候補薬剤と対照薬剤の間の相互作用の差を比較することによって判定する。好ましくは、例えば、それを特異的に認識して結合する固定化抗体とポリペプチドを接触させることによって、又はタンパク質に結合するように設計された表面とポリペプチドの精製調製物を接触させることによってポリペプチドを先ず固定化する。ポリペプチドは、部分的又は完全に精製すること（例えば、他のポリペプチドを部分的又は完全に含まない）ができるか、又は細胞溶解物の一部であってもよい。さらに、ポリペプチドは、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４若しくはＣＳＦ１−Ｒポリペプチド又はその生物学的に活性な部分、及びグルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）−Ｓ転移酵素などのドメイン又はＩｇＧ１のＦｃ領域を含む融合タンパク質であってもよい。或いは、ポリペプチドは、当業者に周知の技術を使用してビオチン化することができる（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。ポリペプチドと相互作用する候補薬剤の能力は、当業者に公知である方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、フローサイトメトリー又は蛍光微量アッセイ技術（ＦＭＡＴ）によって判定することができる。細胞ベースのアッセイを使用する別の例では、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒを発現する細胞の集団を候補薬剤と接触させ、ポリペプチドと相互作用する候補薬剤の能力を判定する。好ましくは、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒと相互作用する候補薬剤の能力を、参照範囲又は対照と比較する。細胞は、例えば、真核生物起源（例えば酵母又は哺乳動物）であってもよく、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドを内因的に発現することができるか、又はポリペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。いくつかの場合には、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチド又は候補薬剤は、ポリペプチドと候補薬剤の間の相互作用の検出を可能にするために、例えば放射性標識（Ｐ、Ｓ若しくはＩなど）又は蛍光性標識（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）若しくはフルオレサミンなど）で標識される。ＥＬＩＳＡ、フ���ーサイトメトリー及びＦＭＡＴなどの代替方法を使用することもできる。ＣＳＦ−１Ｒ活性を阻害する薬剤は、任意の適する方法によって、例えば以下によって同定することができる：（ｉ）候補薬剤の存在下のＣＳＦ−１Ｒの活性を、候補薬剤の非存在下又は対照薬剤の存在下の前記ポリペプチドの活性と比較すること；及び（ｉｉ）候補薬剤がＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害するかどうか判定すること。そのようなアッセイは、臨床モニタリングで又は薬剤開発で候補薬剤をスクリーニングするために使用することができる。上記のように、ＣＳＦ−１Ｒ活性を阻害するそれらの能力について結合するそれらの薬剤をスクリーニングする前に、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒと相互作用する薬剤を同定するために、薬剤（例えば抗体）を適宜事前にスクリーニングすることができる。一例では、ＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害することが可能な薬剤を同定するために、細胞ベースのアッセイ系が使用される。
【０１０４】
１つの特定の例では、ＣＳＦ−１活性又はＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤を同定するために使用されるアッセイは、ＣＳＦ−１がマクロファージコロニーの形成を刺激することが可能である、Ｍｅｔｃａｌｆ，１９７０，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７６−８９の標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏコロニー刺激アッセイである。潜在的阻害剤がアッセイに加えられ、マクロファージの増殖は３Ｈチミジン取込み又はホルマザン色素変換などの任意の適する方法によって測定される。したがって、阻害は対照と比較した増殖の低減として測定される。
【０１０５】
別の例では、ＣＳＦ−１Ｒの阻害剤は、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドの発現を下方調節することができ、例えばアンチセンス阻害剤がある。そのような阻害剤は、当技術分野で公知の任意の方法によって同定することができる。一例では、そのような阻害剤は、細胞ベースのアッセイ系で同定される。したがって、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒのポリペプチド又は核酸を発現する細胞の集団を候補薬剤と接触させ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒのポリペプチド又は核酸の発現を変化させる候補薬剤の能力を、参照範囲又は対照との比較によって判定する。一例では、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ１−Ｒポリペプチドを発現する細胞の集団を候補薬剤又は対照薬剤と接触させ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒのポリペプチド又は核酸の発現を変化させる候補薬剤の能力を、細胞の処置及び対照集団の間のＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ１−Ｒのポリペプチド又は核酸の発現レベルの差を比較することによって判定する。所望により、このアッセイは、複数の候補薬剤（例えばライブラリー）をスクリーニングするために使用することができる。細胞は、例えば、真核生物起源（例えば酵母又は哺乳動物）であってもよく、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドを内因的に発現することができるか、又はＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒポリペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。前記ポリペプチド又は核酸の発現を変化させる候補薬剤の能力は、当業者に公知の方法によって、例えば、限定されずに、フローサイトメトリー、放射能標識、シンチレーションアッセイ、免疫沈降、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析又はＲＴ−ＰＣＲによって判定することができる。
【０１０６】
ＣＳＦ−１Ｒの活性を阻害する薬剤を同定すること、又は例えば１つ又は複数の動物モデルで治療有効量を判定するためにさらに試験することができる。適する動物の例には、限定されずに、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ及びネコが含まれる。一例では、薬剤がＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒの発現を阻害する場合は、第１及び第２の哺乳動物群に候補薬剤又は対照薬剤を投与し、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒのポリペプチド又は核酸の発現を阻害する候補薬剤の能力を、第１及び第２の哺乳動物群の間の発現レベルの差を比較することによって判定する。所望の場合、第１及び第２の哺乳動物群におけるＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒのポリペプチド又は核酸の発現レベルは、対照哺乳動物群におけるＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−１Ｒのポリペプチド又は核酸のレベルと比較することができる。候補薬剤又は対照薬剤は、当技術分野で公知の手段によって投与することができる（例えば、経口、直腸又は非経口的に、例えば腹腔内若しくは静脈内に）。ポリペプチド又は核酸の発現の変化は、上で概説される方法によって評価することができる。別の例では、ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害は、疾患症状の寛解若しくは改善及び／又は発症遅延若しくは疾患進行の減速を監視することによって判定することができる。例えば、しかし限定されずに、ＩＰＦの場合、これは努力性肺活量によって測定される肺機能の減退の低減、ＤＬＣＯによって測定される拡散能力の減退の低減、又は６分歩行距離の減退の低減として明らかになることがある。ＩＰＦ患者でのＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害は、他の原因の非存在下での疾患活動の急速な悪化と規定される増悪などの臨床事象を監視することによって判定することもできる。肝線維症の場合、血清中のヒアルロン酸、ＩＩＩ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）及びメタロプロテイナーゼ組織インヒビター１（ＴＩＭＰ１）の量を定量的に測定し、その大きさは疾患重症度を示す単一のＥＬＦスコアを生成するアルゴリズムの使用を介してそれらを組み合わせることによって疾患を監視するために、強化された肝臓線維症（ＥＬＦ）試験を使用することができる。全身性硬化症に関して、ＣＳＦ−１Ｒ阻害の効果は、改変Ｒｏｄｎａｎ皮膚スコア及び／又はＭｅｄｓｇｅｒ重症度スケールの進行の低減として、又は個々の器官のレベルでは、例えば強皮症関連の間質性肺疾患の遅滞として明らかになることがある。慢性腎臓疾患及び移植後移植片線維症を非限定的に含む腎臓線維症の経過に及ぼすＣＳＦ−１Ｒ阻害の影響は、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）及び／又はタンパク尿症の減退又は改善の低減として明らかになることがある。
【０１０７】
したがって、一実施形態では、ＣＳＦ−１Ｒの阻害剤を用いることは、ＩＰＦ患者での努力性肺活量によって測定される肺機能の減退又は６分の歩行試験でカバーされる距離の減退の、１つ又は複数の低減を提供することができる。強化された肝臓線維症（ＥＬＦ）試験は、血清中のヒアルロン酸、ＩＩＩ型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）及びメタロプロテイナーゼ組織インヒビター１（ＴＩＭＰ１）の量を定量的に測定し、その大きさは疾患重症度を示す単一のＥＬＦスコアを生成するアルゴリズムの使用を介してそれらを組み合わせることによって、肝臓線維症を監視するために使用することができる。
【０１０８】
候補薬剤が疾患に伴う１つ又は複数の症状を変化させたかどうかについて判定するために、線維性疾患をよく知っている医師に公知である技術を使用することができる。線維性疾患のいくつかの異なるモデルが、当技術分野で公知である。これらには、以下でレビューされるブレオマイシン誘導肺線維症、Ｍｏｏｒｅ  ＢＢ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ，２００８，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９４，Ｌ１５２−６０；Ｓｃｏｔｔｏｎ  ＣＪ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＲＣ，２０１０  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９９，Ｌ４３９−４１、アデノシン誘導線維症のアデノシンデアミナーゼ欠損マウスモデル（Ｃｈｕｎｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：１９３７−４６；Ｓｕｎ  Ｃ＿Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１１６，２１７３−８２）、放射線誘導肺線維症（Ｓｈａｒｐｌｉｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｏ  ＡＪ，１９８９，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１９，１−１４；Ｓｈａｒｐｌｉｎ  Ｊ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋｏ  ＡＪ，１９８９，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１９，１５−３１；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＣＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｅｘｐ  Ｌｕｎｇ  Ｒｅｓ，２４、３２１−３７；Ｈａｓｔｏｎ  ＣＫ  ａｎｄ  Ｔｒａｖｉｓ  ＥＬ，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７，５２８６−９１；Ｋａｔｏｈ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ，５１，３２５−３３２）、ＦＩＴＣ誘導肺線維症（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＳＮ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１７６，３０９−１８；Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１５５，１７７３−７９）、マウスのシリカ誘導線維症（Ｄａｖｉｓ  ＧＳ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １７，８１−９７；Ｌａｋａｔｏｓ  ＨＦ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｘｐ  Ｌｕｎｇ  Ｒｅｓ  ３２，１８１−９９）、肝臓線維症の四塩化炭素（ＣＣｌ４）モデル（Ｉｒｅｄａｌｅ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０２，５３８−４９）、肝線維症の胆管ライゲーションモデル（Ｓｔａｈｅｌｉｎ  ＢＪ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ，４３４，３３３−３９；Ｉｓｓａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｇｕｔ，４８，５４８−５７）、腎臓線維症のＵＵＯ（片側性尿管閉塞）（Ｋｌａｈｒ  Ｓ  ａｎｄ  Ｐｕｋｅｒｓｏｎ  ＭＬ，１９９４，Ａｍ  Ｊ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ，２３，２１９−２３；Ｓａｔｏｈ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，１２，３１７−２５）、慢性腎臓疾患のアドリアマイシン誘導モデル（Ｔａｍａｋｉ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，４５，５２５−３６；Ｗａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，５８，１７９７−１８０４、及びＬｅｅ  ＶＷ及びＨａｒｒｉｓ  ＤＣ，２０１１，Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，１６，３０−３８によってレビューされる）、慢性腎臓疾患の５／６低減モデル（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａｅｔ  ａｌ．，１９９４年��Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，４，２０２３−３１；全身性硬化症の次亜塩素酸誘導モデル（Ｓｅｒｖｅｔｔａｚ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９年，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８２（９），５８５５−６４）、並びに全身性硬化症の代替モデル、例えばブレオマイシン誘導皮膚線維症、マウスがフィブリリン−１遺伝子の突然変異についてヘテロ接合であるタイトスキンマウスモデル、及びマウスが皮膚及び肺線維症を起こす強皮症様の移植片対宿主病モデル、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ，２０１０年，Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，３７，２６−４１でレビューされる、が含まれる。一般に、異なる動物モデルは、線維症の特質である、罹患器官又は組織でのコラーゲンを含む細胞外基質の過剰な生成及び沈着を示す。特定のモデルで異なる器官が侵されるので、線維性疾患の他の測定手段はモデルの間で異なる。尿中のタンパク質及びクレアチニン濃度の上昇は、腎臓線維症のモデルで測定することができるが、肺線維症のモデルでは、線維症の範囲及び重症度の組織病理学的スコア、例えば、改変Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアがしばしば使用される（Ｈｕｂｎｅｒ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４：５０７−１７）。
【０１０９】
線維症のモニタリング技術には、肺線維症のための肺機能試験、肝疾患／線維症のためのＥＬＦ試験、肝疾患のためのＦｉｂｒｏＴｅｓｔ（線維症マーカーの血液分析）、及び肝臓線維症の検出及び評価で有益である、肝臓硬直性の尺度を提供する画像化技術である一時的エラストグラフィー（Ｆｉｂｒｏｓｃａｎ（登録商標））が含まれる。生検からの組織試料の分析を、実施することもできる。
【０１１０】
本明細書で議論されるように、線維性疾患の処置及び／又は予防でＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤を使用することができる。そのような使用のために、薬剤は医薬組成物の形態で一般に投与される。ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤並びに薬学的に許容される希釈剤、賦形剤及び／又は担体を含む医薬組成物も提供される。用語「処置」には、治療的又は予防的療法が含まれる。本明細書において特定の阻害剤又は阻害剤の組合せを使用して疾患又は状態を処置又は予防する方法に言及するとき、そのような言及は、線維性疾患の処置及び／又は予防のための医薬の製造のためのその阻害剤又は阻害剤の組合せの使用を含むものと理解すべきである。組成物は、薬学的に許容される担体を通例含む、無菌の医薬組成物の一部として通常供給される。この組成物は、任意の適する形態であってもよい（患者にそれを投与する所望の方法による）。本発明で有用な阻害剤は、対象に対して好ましくは経口的又は直腸内に投与されるが、様々な他の経路によって、例えば経皮的、皮下、鼻腔内、静脈内及び筋肉内に投与することもできる。任意の所与の場合に最も適する投与経路は、特定の阻害剤、対象並びに疾患の性質及び重症度及び対象の身体状態に依存する。
【０１１１】
本発明で有用な阻害剤は、例えばペルフェニドン（Ｐｅｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）などの抗線維症療法又は抗がん療法であってもよい、１つ又は複数の他の治療的に活性な化合物と組み合わせて、例えば同時に、逐次的に又は別々に投与することができる。
【０１１２】
医薬組成物は、１用量につき本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位用量形態で便利に提供することができる。そのような単位は、処置する状態、投与経路並びに対象の年齢、体重及び状態によって、例えば、限定されずに、１０００ｍｇ／ｋｇ〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、例えば７５０ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇ、例えば１００ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇを含有することができる。
【０１１３】
本発明で使用するための薬学的に許容される担体は、例えば投与経路によって多種多様の形態をとることができる。
【０１１４】
経口投与のための組成物は、液体又は固体であってもよい。経口液体調製物は、例えば、水性若しくは油性の懸濁液、溶液、乳剤、シロップ剤若しくはエリキシル剤の形態であってもよいか、又は使用前に水若しくは他の適するビヒクルによって再構成するための乾燥製品として提供されてもよい。当技術分野で公知のように、経口液体調製物は懸濁剤を含有することができる。散剤、カプセル剤及び錠剤などの経口固体調製物の場合は、デンプン、糖、微晶質セルロース、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体が含まれてもよい。投与の容易さのために、錠剤及びカプセル剤が最も有利な経口投薬単位剤形になり、その場合固体の薬用担体が一般に用いられる。
【０１１５】
上に示す一般的な剤形に加えて、本発明の活性薬剤は制御放出型の手段及び／又は送達機器で投与されてもよい。錠剤及びカプセル剤は、従来の担体又は賦形剤、例えば結合剤、例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム若しくはポリビニルピロリドン；充填剤、例えばラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール若しくはグリシン；錠剤滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール若しくはシリカ；崩壊剤、例えばジャガイモデンプン；又はラウリル硫酸ナトリウムなどの許容される湿潤剤を含むことができる。錠剤は、正規の製薬慣行で周知の方法によって標準の水性又は非水性技術によってコーティングすることができる。経口投与に適する本発明の医薬組成物は、活性薬剤の所定量を各々含有するカプセル剤、カシェ剤若しくは錠剤などの個別の単位として、散剤若しくは顆粒剤として、又は水性液体、非水性液体、水中油型乳剤若しくは油中水型液体乳剤中の溶液若しくは懸濁液として提供することができる。そのような組成物は調剤方法のいずれかによって調製することができるが、全ての方法は活性薬剤を１つ又は複数の必要成分を構成する担体と合わせるステップを含む。一般に、組成物は、活性薬剤を液体担体又は微粉固体担体又は両方と均一及び緊密に混合し、次に、必要に応じて生成物を所望の提供品に成形することによって調製される。例えば、錠剤は、任意選択で１つ又は複数の副成分と一緒に、圧縮又は成形によって調製することができる。
【０１１６】
非経口投与に適する医薬組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合された水の中の、本発明の活性薬剤の溶液又は懸濁液として調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及び油中のそれらの混合物で分散液を調製することもできる。通常の貯蔵及び使用条件では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。注射用に適する薬剤形態には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び組成物を予定レシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性又は非水性の無菌注射溶液、並びに懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。即時使用の注射溶液、分散液及び懸濁液は、無菌の散剤、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。医薬組成物は、当技術分野で公知の医療機器で投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、無針皮下注射器具、例えばＵＳ５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４；又は４，５９６，５５６で開示される機器で投与することができる。本発明で有益な周知のインプラント及びモジュールの例には、以下のものが含まれる：制御された速度で医薬品を小出しするための植込み型マイクロ注入ポンプを開示するＵＳ４，４８７，６０３；皮膚を介して医薬を投与するための治療機器を開示するＵＳ４，４８６，１９４；正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示するＵＳ４，４４７，２３３；連続的薬物送達のための可変流量植込み型注入機器を開示するＵＳ４，４４７，２２４；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を開示するＵＳ４，４３９，１９６；及び浸透圧薬物送達系を開示するＵＳ４，４７５，１９６。他の多くのそのようなインプラント、送達系及びモジュールは、当業者に公知である。
【０１１７】
局所投与に適合する医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション剤、散剤、溶液、ペースト剤、ゲル剤、含浸包帯、噴霧剤、エアゾール剤又は油剤、経皮機器、散布剤などとして製剤化することができる。これらの組成物は、活性薬剤を含有する従来の方法を介して調製することができる。したがって、それらは、適合する従来の担体及び添加剤、例えば保存剤、薬物浸透を助ける溶媒、クリーム又は軟膏での緩和剤及びローション剤のためのエタノール又はオレイルアルコールを含むこともできる。そのような担体は、組成物の約１パーセントから最高約９８パーセントで存在することができる。より普通には、それらは組成物の最高約８０パーセントを構成する。例示としてだけであるが、クリーム又は軟膏は、所望の硬さを有するクリーム又は軟膏を生成するのに十分な量で、約５〜１０重量％の化合物を含有する十分な量の親水性材料及び水を混ぜることによって調製される。経皮投与に適合する医薬組成物は、長時間にわたってレシピエントの表皮と密接に接触し続けることを目的にした個別のパッチとして提供できる。例えば、活性薬剤は、パッチからイオントフォレシスによって送達することができる。外部組織、例えば口及び皮膚への適用のために、組成物は局所用の軟膏又はクリームとして好ましくは適用される。軟膏で製剤化される場合、活性薬剤はパラフィン又は水混和性の軟膏基材と一緒に使用されてもよい。或いは、活性薬剤は水中油型のクリーム基材又は油中水型の基材と一緒にクリームに製剤化されてもよい。口への局所投与に適合する医薬組成物には、ロゼンジ、トローチ及び洗口剤が含まれる。目への局所投与に適合する医薬組成物には、活性薬剤が適する担体、特に水性溶媒に溶解又は懸濁される点眼剤が含まれる。それらには、上記のような局所用の軟膏又はクリームも含まれる。担体が固体である直腸投与に適する医薬組成物は、最も好ましくは単位用量坐薬として提供される。適する担体にはカカオ脂又は他のグリセリド又は当技術分野で一般的に使用される材料が含まれ、坐薬は、軟化又は融解したｃａｐｉｅｒ（単数又は複数）との組合せの混合と、続いて冷却及び成形によって便利に形成することができる。それらは、浣腸として投与することもできる。
【０１１８】
ＣＳＦ−１Ｒ活性の阻害剤の投与薬量は、特定の阻害剤、線維性疾患の種類、対象並びに疾患の性質及び重症度、及び対象の身体的状態、及び選択される投与経路によって異なる。適当な投薬量は、当業者が容易に判定することができる。ヒト及び動物での線維性疾患の処置及び／又は予防のために、任意の適する投与経路、例えば注射及び当技術分野で公知である抗体ベースの臨床製品などの臨床製品のための他の投与経路を使用して、患者（例えば、ヒト対象）に抗体を含む医薬組成物を治療的又は予防的に有効な投薬量（例えば、線維性疾患の阻止及び／又は線維性疾患の症状の軽減をもたらす投薬量）で投与することができる。組成物は、投与方法により、少なくとも０．０５重量％、例えば０．５〜５０重量％、例えば１〜１０重量％、又はそれ以上の本発明の阻害剤を含有することができる。本発明の阻害剤の個々の投薬の最適な量及び間隔は、処置される状態の性質及び程度、投与の形態、経路及び部位、並びに処置される特定の対象の年齢及び状態によって決定されること、並びに使用する適当な投薬量を最終的に医師が決定することを当業者は認識する。この投薬は、適宜何回でも繰り返すことができる。副作用が生じる場合は、通常の臨床慣行に従って、投薬の量及び／又は頻度を変更又は低減することができる。
【０１１９】
別の例では、阻害剤が核酸である場合は、これは遺伝子療法を介して投与することができる（例えば、Ｈｏｓｈｉｄａ、Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐａｎｃｒｅａｓ，２５：１１１−１２１；Ｉｋｕｎｏ，Ｙ．２００２，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．２００２  ４３：２４０６−２４１１；Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｃ，２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９：３１７９−３１８７；Ｌｅｅ  Ｅ．，２００１，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７：７７３−７８２を参照）。遺伝子療法は、対象への発現された又は発現可能な核酸の投与を指し、一例では、これはＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−ＩＲ核酸又はその一部である。当技術分野で利用可能な遺伝子療法のための方法のいずれも、本発明によって使用することができる。患者への治療的核酸の送達は、直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法であってもよく（すなわち、患者は核酸又は核酸含有ベクターに直接的に曝露させられる）、又は間接的なｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法であってもよい（すなわち、先ず細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸によって形質転換され、次に患者に移植される）。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子療法については、例えば、ＵＳ４，９８０，２８６で、又はＲｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８０：３５−４７によって記載されるように、ＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−ＩＲ核酸を含有する発現ベクターは、それが細胞内になるように、すなわち欠陥のある若しくは弱毒化されたレトロウイルス又は他のウイルスベクターを使用する感染によって投与することができる。当技術分野で公知である様々なレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージング及び以降の宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要とされないレトロウイルスの配列を欠失するように改変された、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９）に記載されるものなどである。さらに、非分裂細胞に感染するそれらの能力のために有利であるアデノウイルスベクターを使用することができ、そのような高い能力のアデノウイルスベクターは、Ｋｏｃｈａｎｅｋ（１９９９，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０：２４５１−２４５９）に記載されている。使用することができるキメラウイルスベクターは、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ，１：２５−３１）によって記載されるものである。ハイブリッドベクターを使用することもでき、Ｊａｃｏｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４：１２８２−１２８３）によって記載されている。裸のＤＮＡの、又は微粒子銃の使用（例えばＧｅｎｅＧｕｎ（登録商標）；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）による、又は脂質によってそれをコーティングすることによる直接的な注射を遺伝子療法で使用することもできる。目的の受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするために、細胞表面受容体／トランスフェクション化合物、又はリポソーム、微粒子若しくはマイクロカプセルへの封入、又は核に入ることが知られているペプチドに連結して核酸を投与すること、又は受容体媒介エンドサイトーシスの傾向があるリガンドに連結し���それを投与すること（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２を参照）によるものを使用することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法では、組織培養を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子を細胞に移し、細胞は、様々な方法で、例えば皮下注射、皮膚移植片への細胞の適用、及び造血幹細胞又は前駆細胞などの組換え血液細胞の静脈内注射によって患者に送達される。遺伝子療法のためにＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−ＩＲ核酸を導入することができる細胞には、例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞及び血液細胞が含まれる。使用することができる血液細胞には、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、骨髄巨核球、顆粒球、造血細胞又は前駆細胞などが含まれる。
【０１２０】
一態様では、本発明の医薬組成物はＣＳＦ−１、ＩＬ−３４又はＣＳＦ−ＩＲ核酸を含み、前記核酸は適する宿主でＣＳＦ１、ＩＬ−３４若しくはＣＳＦ−ＩＲポリペプチド又はそのキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸はポリペプチドコード領域に作動可能に連結されるプロモーターを有し、前記プロモーターは誘導可能であるか又は構成的である（任意選択で、組織特異的である）。
【０１２１】
本発明は以下の実施例を参照して次に記載されるが、それらは単に例示であり、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１Ａ】ヒトＣＳＦ−１Ｒのアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｂ】ＣＳＦ−１Ｒのある特定の変異体のアミノ酸配列を示す図である。
【図１Ｃ】細胞表面での発現に適するＣＳＦ−１Ｒのアミノ酸配列を示す図である。
【図２】Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞上の受容体結合ＣＳＦ−１がこの方法によって検出可能であったことを確認するフローサイトメトリーデータを示す図である。
【図３】組織培養ウェルの表面に固定化されたか又は溶液中に遊離しているＡｂ５３５が、使用濃度においてＣＳＦ−１の非存在下でＭ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖を支持しなかったことを示す図である。
【図４ａ】Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ流体コラーゲンの量を低減したことを示す図である。
【図４ｂ】Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して試料のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの線維性病状が改善されたことを示す図である。
【図４ｃ】Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ流体中のアルブミンの量を低減し、したがってそれは、Ａｂ５３５で処置したマウスの肺障壁の完全性が改善されたことを示す図である。
【図４ｄ】Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、ＢＡＬ流体中のマクロファージ数を低減したことを示す図である。
【図５】食塩水対照、ブレオマイシンプラスアイソタイプ対照及びブレオマイシンプラスＡｂ５３５処置動物からの肺の組織病理学的分析の代表的画像を示す図である。Ａｂ５３５で処置した動物は、アイソタイプ対照、ブレオマイシン処置動物と比較して、肺線維症が大いに低減した。
【図６ａ】誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬＦコラーゲン濃度を低減したことを示す図である。
【図６ｂ】誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して試料のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの線維性病状が改善されたことを示す図である。
【図６ｃ】誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ中のアルブミン量を低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの肺障壁の完全性が改善されたことを示す図である。
【図６ｄ】誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、ＢＡＬ液中のマクロファージ数を低減したことを示す図である。
【図７】Ａｂ５３５又はアイソタイプ対照抗体（マウスＩｇＧ１）で処置したＡＤＡノックアウトマウス及び野生型マウスからの肺組織の組織病理学的分析の代表的画像を示す図である。肺組織切片は、マッソンのトリクロームで染色した。Ａｂ５３５によるＡＤＡノックアウトマウスの処置は、線維性組織及びコラーゲン沈着の量を大いに低減した。
【発明を実施するための形態】
【０１２３】
例１  抗マウスＣＳＦ−１Ｒ抗体の単離
２匹のウサギは、マウスＣＳＦ−１Ｒ（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録ｐ０９５８１）の残基１〜５１２を一時的に発現する細胞による５回の免疫化を受けた。２μｇ／ｍｌのマウスＣＳＦ−１Ｒ−ウサギＦｃをコーティングしたＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを使用して、ＥＬＩＳＡで抗体応答を監視した。１：１００，０００希釈までの血清力価を、両方のウサギで観察した。Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞（Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０）への血清の結合も、ＦＡＣＳによって判定した。ＦＬ１中央値を、抗体希釈に対してプロットした。１：１０，０００希釈までの結合を、観察した。
【０１２４】
ＣＳＦ−１依存性Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞系（Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０）を使用して、両方のウサギからの血清が、１：１００希釈までＣＳＦ−１依存性細胞生存をブロックすることができることが示された（データは示さず）。
【０１２５】
１００個の９６ウェルプレートに１ウェルにつき１０００〜５０００個のウサギＰＢＭＣを播種し、ＥＬ４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞及びウサギＴ細胞調整培地（ＴＳＮ）の存在下で３７℃で１週間増殖させた。Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞及び抗ウサギＦｃ特異的Ｃｙ５コンジュゲートを使用するＦＭＡＴアッセイで、抗体含有上清を次にスクリーニングした。６７８個のＣＳＦ−１Ｒ結合体を同定した。これらから、およそ３％は、細胞アッセイでＣＳＦ−１依存性Ｍ−ＮＦＳ−６０増殖をブロックした。結合剤は、２μｇ／ｍｌのＣＳＦ−１Ｒ−ウサギＦｃでコーティングしたプレートを使用するＥＬＩＳＡでもスクリーニングし、結合は抗ウサギＦ（ａｂ’）２−ＨＲＰコンジュゲートで現れた。結合剤は、ＥＬＩＳＡをベースとした固相ブロッキングアッセイでもスクリーニングした。このアッセイのために、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ３８４ウェルプレートを０．５μｇ／ｍｌのＣＳＦ−１Ｒ−ウサギＦｃでコーティングし、その後ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／１％ＰＥＧ２００００でブロックした。プレートを洗浄した後に培養上清を次にプレートに加え、室温で＞１時間インキュベートした。次に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＣＳＦ−１を上清に加え、室温でさらに１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次に０．５μｇ／ｍｌのビオチン化ヤギ抗マウスＣＳＦ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした。受容体へのＣＳＦ−１結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して明らかにされた。８ウェルを、進行のために選択した。全ては細胞及びタンパク質への結合を実証し、Ｍ−ＮＦＳ−６０アッセイ及びＥＬＩＳＡでブロックした。
【０１２６】
陽性ウェルから抗原特異的Ｂ細胞を同定するために、蛍光ベースの方法を使用した。陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、ビオチン化マウスＣＳＦ−１Ｒ−ウサギＦｃ及びヤギＦ（ａｂ’）２抗ウサギＦ（ａｂ’）２断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でコーティングしたストレプトアビジンビーズと混合した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、抗原特異的Ｂ細胞から分泌された抗体を、そのＢ細胞の近くのビーズ上で捕捉した。ＦＩＴＣコンジュゲートの存在は、抗体でコーティングされたビーズの標識及び抗原特異的Ｂ細胞周囲の蛍光焦点の形成をもたらした。蛍光顕微鏡を使用して同定されたこれらの個々のＢ細胞を次にミクロマニピュレーターで選び出し、ＰＣＲ管に置いた。抗体の可変領域遺伝子は、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって単細胞から回収した。次に、ＣＨＯ一時的発現系で、ウサギＶ領域をヒトＩｇＧ４キメラ抗体又はＦａｂとして発現させた。８ウェルのうちの４つは、組換え抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体を生成した。次に、組換え抗体による中和活性を、Ｍ−ＮＦＳ−６０アッセイで確認した。ＣＳＦ−１ＲウサギＦｃへの親和性を判定するために、Ｆａｂ分子を使用してＢＩＡｃｏｒｅも実施した（表１）。中和活性及び親和性に基づいて、抗マウスＣＳＦ−１Ｒ試薬としてＡｂ５３５を選択した。この抗体はその後マウス化し、完全長マウスＩｇＧ１として哺乳動物系で発現させ、精製した。
【０１２７】
ＢＩＡｃｏｒｅ方法
精製された組換えＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃ融合タンパク質への結合動態の測定によるＢＩＡｃｏｒｅアッセイで、ＣＳＦ−１Ｒに結合するそれらの能力について抗体を試験した。
【０１２８】
アッセイフォーマットは、固定化された抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２による抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の捕捉と、次に捕捉された表面でのｈＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃの滴定であった。ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を使用して、ＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。全ての実験は、２５℃で実施した。アミンカップリング化学により、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）の上に、Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２断片特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を約５０００応答単位（ＲＵ）のレベルまで固定化した。ランニングバッファとして、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）を１０μｌ／分の流量で使用した。固定化された抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２の上でおよそ１００ＲＵの捕捉レベルを与えるために、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の注入を実施した。
【０１２９】
倍加希釈により２．５ｎＭから７８ｐＭまで、捕捉した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の上で組換えヒトＣＳＦ−１Ｒ／Ｆｃを３０μｌ／分の流量で３分間滴定し（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、その後８分間の解離相が続いた。これらのセンサーグラムは、結合速度を生成するために使用した。４０ｍＭ  ＨＣｌの２回連続する１０μｌ注入と続いて１０ｍＭ  ＮａＯＨの５μｌ注入によって、表面を１０μｌ／分の流量で再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１）を標準の手順に従って使用して、二重参照バックグラウンド補正結合曲線を分析した。動力学的パラメータは、フィッティングアルゴリズムから判定した。
【０１３０】
Ａｂ５５３の結果を、表１に示す。
【表１】
0006618471.tif 000004
【０１３１】
例２  Ａｂ５３５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析
Ａｂ５３５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＳＦ−１受容体陽性細胞系へのマウスＣＳＦ−１の結合をブロックする
ＣＳＦ−１がＣＳＦ−１Ｒに結合するのを阻止する受容体結合Ａｂ５３５の能力を調査した。ＣＳＦ−１への曝露の前に細胞をＡｂ５３５又は対照抗体とプレインキュベートしたアッセイで、マウスＣＳＦ−１Ｒ陽性細胞系Ｍ−ＮＦＳ−６０を使用した。次に、蛍光標識抗体及びフローサイトメトリーを使用して受容体結合ＣＳＦ−１を検出した。細胞蛍光強度のＡｂ５３５依存性の減少は、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻止する受容体結合Ａｂ５３５の能力を示すものと解釈された。
【０１３２】
Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞（ＬＧＣ  Ｐｒｏｍｏｃｈｅｍ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）は、１０％ウシ胎仔血清（ＰＡＡ）、Ｈｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０ｍＭの最終濃度）、ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１ｍＭの最終濃度）、グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４．５ｇ／ｌの最終濃度）、炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１．５％の最終濃度）、ベータ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、０．０５ｍＭの最終濃度）、組換えマウスＣＳＦ−１（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ、３．３ｎｇ／ｍｌの最終濃度）を追加した基礎ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、懸濁状態で維持した。
【０１３３】
Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞は、０．２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０９％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加したフローバッファ（ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で、細胞数１×１０Ｅ６／ｍｌの濃度で調製した。Ａｂ５３５又はマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の連続希釈をフローバッファで調製し、１００μｌの一定分量の細胞に加えて２００μｌ容量に２０、５、１．２５、０．３２、０．０８μｇ／ｍｌの最終濃度を達成し、氷の上で１時間インキュベートした。その後、フローバッファで細胞を２回洗浄し、氷の上で０．５μｇ／ｍｌの組換えマウスＣＳＦ−１と３０分間インキュベートし、フローバッファで２回洗浄した。受容体結合ＣＳＦ−１を検出するために、細胞を氷の上でビオチン化抗マウスＣＳＦ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、５μｇ／ｍｌ）と３０分間インキュベートし、フローバッファで２回洗浄し、氷の上で１５分間のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲートストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：２００希釈）とのインキュベーションによって結合抗体を標識し、その後最終洗浄ステップ及び５００μｌフローバッファ中での細胞の再懸濁が続いた。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してフローサイトメトリーによって細胞を蛍光について評価し、ＷｉｎＭＤＩソフトウェアを使用してデータを分析した。
【０１３４】
フローサイトメトリーデータの分析は、Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞上の受容体結合ＣＳＦ−１がこの方法によって検出可能であることを確認した（図２ａ）。ＣＳＦ−１を添加する前の、使用した濃度のいずれかでのＡｂ５３５との細胞のインキュベーションは、ＣＳＦ−１ＲへのＣＳＦ−１の結合を阻止した（図２ｂ）。使用した濃度のいずれでのアイソタイプ対照抗体との細胞のインキュベーションも、ＣＳＦ−１結合及び検出に影響を及ぼさなかった（図２ｃ）。
【０１３５】
ＣＳＦ−１ＲへのＡｂ５３５の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＳＦ−１依存性細胞系の増殖及び生存でＣＳＦ−１の代わりをしない
ＣＳＦ−１依存性細胞の生存及び増殖の支持でＣＳＦ−１の代わりをするＡｂ５３５の能力を、溶液中に遊離している、及びプラスチックの上に固定化されたＡｂ５３５に細胞を曝露させることを含む細胞増殖アッセイでＭ−ＮＦＳ−６０細胞を使用して調査した。
【０１３６】
ＣＳＦ−１依存性細胞を支持する固定化Ａｂ５３５の能力を評価するために、９６ウェル丸底組織培養プレートのウェルをＡｂ５３５又は無関係のアイソタイプ対照抗体で２４時間プレコーティングし、その後ＰＢＳに１０μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌの抗体を含有する溶液を１ウェルにつき５０μｌ添加することによって細胞増殖アッセイを開始し、４℃でインキュベートした。ウェルを吸引し、１００μｌのＰＢＳで各ウェルを２回洗浄することによって未結合の抗体を除去した。
【０１３７】
上記のように維持した増殖Ｍ−ＮＦＳ−６０細胞を、ＣＳＦ−１なしの５０μｌの増殖培地に１ウェルにつき細胞数１０，０００の密度で、９６ウェル丸底組織培養プレートに播種した。組換えマウスＣＳＦ−１、Ａｂ５３５を追加した又は追加なしのさらなる５０μｌの増殖培地を、適当なウェルに加えた。プレートを７２時間インキュベートし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏキットを製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って使用して細胞数を判定し、試験した条件の各々について、ＡＴＰのレベル、したがって細胞数に比例する測定可能な発光の読出しを行った。全ての条件を、３連で実施した。
【０１３８】
データの分析は、ＣＳＦ−１なしの増殖培地で維持したものと比較してＣＳＦ−１を追加したウェルでの有意により高い細胞数によって反映されているように、Ｍ−ＮＦＳ−６０が増殖のためにＣＳＦ−１に依存することを確認した。さらに、組織培養ウェルの表面に固定化されたか又は溶液中に遊離しているＡｂ５３５は、使用濃度においてＣＳＦ−１の非存在下でＭ−ＮＦＳ−６０細胞の増殖を支持しなかった（図３）。
【０１３９】
例３：肺線維症のブレオマイシン誘導ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の効果
ブレオマイシンはストレプトミセス・ベルチシラタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔｕｓ）から最初に単離された抗生物質であり、様々ながんのための化学療法薬として使用されている。肺線維症のブレオマイシンモデルは確立されたモデルであり、本質的にＭａｄｔｅｓ、ＤＫ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０，９２４−３４に記載されているように使用された。詳細なプロトコールは、以下の参考文献Ｍｏｒｓｃｈｌ，Ｅ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｊ．Ｇ．，Ｖｏｌｍｅｒ，Ｊ．，Ｍｏｈｓｅｎｉｎ，Ａ．，Ｐｅｒｏ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｏｎｇ、Ｊ．Ｓ．，Ｋｈｅｒａｄｍａｎｄ，Ｆ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．及びＢｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｍ．Ｒ．（２００８）、Ａ３  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３９：６９７−７０５に見出すことができる。
【０１４０】
使用した全てのマウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｓから購入した野生型Ｃ５７Ｂｌｋ６雌マウス（２０ｇ）であった。気管内（ＩＴ）カットダウン点滴注入を使用し、そこでは、５０μｌの食塩水中の３．５単位用量のブレオマイシン又は対照として５０μｌの食塩水を単独で注入するために、マウスにアバーティンで麻酔をかけ、気管開口形成術を実施した。この方法での処置は、ブレオマイシン曝露後７日目にピークに到達する炎症段階、及び曝露後２１日目に最大である線維症段階をもたらす。抗体Ａｂ５３５の効果を調査し、そこでは、抗体をモデルの線維症段階だけで投与し、３０ｍｇ／ｋｇを９日目から２１日目まで１週につき３回皮下投与した。２１日目に動物を屠殺し、読出しは肺の組織病理学的分析、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）液細胞性及びＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの測定を含んだ。肺線維症の重症度を判定するための改変Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアリング系を使用して肺傷害を評価するために、組織病理学的分析を実行した（Ｈｕｂｎｅｒ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４：５０７−１７）。切除した肺を１０％ホルマリンで２５ｃｍ圧まで膨張させ、アルコール及びキシレンの系を通して処理し、パラフィンに包埋し、Ｍａｓｓｏｎのトリクロームによる処理及び染色の前に組織切片からパラフィンを除去した。
市販のＳｉｒｃｏｌアッセイキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、ＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの量を調べた。
ＢＡＬ液中のマクロファージ集団に及ぼす影響を、サイトスピン調製物を使用して判定した。ＢＡＬ細胞の一定分量を顕微鏡スライドの上で遠心し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋで染色し、マクロファージを計数した。
【０１４１】
９日目に投与を開始した抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体、Ａｂ５３５による治療的処置は、ブレオマイシン誘導肺線維症を大きく低減することが判明した。線維症の重症度及び範囲は、有意に低減された。処置マウスはコラーゲン産生が低減され、線維性病状が改善され、肺障壁保護が改善された。
図４ａは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ流体中のコラーゲンの量を低減したことを示す。
図４ｂは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して試料のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの線維性病状が改善されたことを実証することを示す。
図４ｃは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ流体中のアルブミンの量を低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの血管透過性及び肺障壁の完全性が改善されたことを実証することを示す。
図４ｄは、Ａｂ５３５によるブレオマイシン誘導肺線維症の処置が、ＢＡＬ流体中のマクロファージ数を低減したことを示す。
図５は、食塩水対照、ブレオマイシンプラスアイソタイプ対照及びブレオマイシンプラスＡｂ５３５処置動物からの肺の組織病理学的分析の代表的画像を示す。Ａｂ５３５で処置した動物は、アイソタイプ対照、ブレオマイシン処置動物と比較して、肺線維症が大いに低減した。
【０１４２】
例４：肺線維症のアデノシンデアミナーゼ欠損マウスモデルにおける抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体の効果
アデノシンは強力なシグナル伝達ヌクレオシドであり、そのレベルは細胞がストレスを受けるか又は傷害を受けるときに増加し、アデノシンがその特異的Ｇタンパク質結合受容体と係合するときに多種多様な応答が起こる。アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）は、アデノシンをイノシンに変換するプリン異化作用酵素である。ＡＤＡノックアウトマウスが作製され、血清並びに腎臓、肝臓及び肺などの組織でのアデノシンレベルの増加を有することが示された（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３（９）：５０９３−５１００）。これらのマウスは、肺でのアデノシンレベルの増加と関連する、慢性肺疾患、例えば肺胞破壊、気道炎症及び過剰な粘液生成の特徴を示す（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１９２：１５９−７０）。影響は、マウスが呼吸窮迫により３週齢までに死ぬというようなものである。低用量レジメンを用いた外因性ＡＤＡの投与は、アデノシンレベルを低減し、これらのマウスの寿命を延長し、肺線維症モデルの開発を可能にする（Ｃｈｕｎｎ  ＪＬ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５：１９３７−４６、Ｐｅｄｒｏｓａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６（７号）：ｅ２２６６７）。このモデルでは、アデノシンレベルの慢性的上昇は、肺でのＴＧＦβ−１を含む線維症促進媒介物の増加、肺組織でのコラーゲン沈着の増加及び線維性肺病状の増加と関連する。抗線維症能力を有する分子の効果を調査するために、ＡＤＡ欠損マウスを数週間低用量外因性ＡＤＡレジメンで維持し、その後ＡＤＡ処置を停止し、潜在的抗線維症剤を投与する。
【０１４３】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ５３５の効果を、肺線維症のＡＤＡノックアウトマウスモデルで調査した。このモデルでは、酵素欠損マウスを生後１日目から２１日目までＡＤＡ酵素療法で維持した。ＡＤＡ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲートを調製し（Ｙｏｕｎｇ  ＨＷ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：１３８０−８９）、出生後の１、５、９、１３及び１７日目に筋注を投与し（それぞれ０．６２５、１．２５、２．５、２．５及び２．５単位）、続いて２１日目に腹腔内に５単位を注射した。２１日目から後に、さらなる酵素は投与しなかった。２５日目（出生後）から４２日目に動物を屠殺した日まで週３回、１００μｌの容量でＡｂ５３５を３０ｍｇ／ｋｇで皮下投与した。
【０１４４】
４２日目に動物を屠殺し、読出しは肺の組織病理学的分析、ＢＡＬ液細胞性及びＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの定量を含んだ。肺線維症の重症度を判定するための改変Ａｓｈｃｒｏｆｔスコアリング系を使用して肺傷害を評価するために、組織病理学的分析を実行した（Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４４：５０７−１７）。切除した肺を１０％ホルマリンで２５ｃｍ圧まで膨張させ、アルコール及びキシレンの系を通して処理し、パラフィンに包埋し、Ｍａｓｓｏｎのトリクロームによる処理及び染色の前に組織切片からパラフィンを除去した。
【０１４５】
市販のＳｉｒｃｏｌアッセイキットを製造業者の使用説明書に従って使用して、ＢＡＬ液中の可溶性コラーゲンの量も調べた。
【０１４６】
ＢＡＬ液中のマクロファージ集団に及ぼす影響を、サイトスピン調製物を使用して判定した。ＢＡＬ細胞の一定分量を顕微鏡スライドの上で遠心し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋで染色し、マクロファージを計数した。
【０１４７】
抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体Ａｂ５３５による治療的処置は、ＡＤＡ欠損マウスで肺線維症を有意に低減することが判明した。処置マウスはコラーゲン産生が低減され、線維性病状が改善され、肺障壁の機能及び保護が改善された。
図６ａは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ流体のコラーゲン濃度を低減したことを示す。
図６ｂは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較して試料のＡｓｈｃｒｏｆｔスコアを低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの線維性病状が改善されたことを実証することを示す。
図６ｃは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、アイソタイプ対照による処置と比較してＢＡＬ流体中のアルブミン濃度を低減し、Ａｂ５３５で処置したマウスの血管透過性及び肺障壁の完全性が改善されたことを実証することを示す。
図６ｄは、誘導肺線維症を有するＡＤＡ欠損マウスのＡｂ５３５による処置が、ＢＡＬ流体中のマクロファージ数を低減したことを示す。
図７は、Ａｂ５３５又はアイソタイプ対照抗体（マウスＩｇＧ１）で処置したＡＤＡノックアウトマウス及び野生型マウスからの肺組織の組織病理学的分析の代表的画像を示す。肺組織切片は、マッソンのトリクロームで染色した。Ａｂ５３５によるＡＤＡノックアウトマウスの処置は、線維性組織及びコラーゲン沈着の量を大いに低減した。
【０１４８】
したがって、肺線維症の２つのマウスモデルにおいて、抗ＣＳＦ−１Ｒ抗体による処置が線維性疾患を効果的に処置することができることが示された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７】
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【配列表】
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