(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖移転酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位あるいはC-3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記の糖移転酵素のアミノ酸配列は、
配列番号：22、24、26、28、41、43、55、57、59および61からなる群から選ばれる、
インビトログリコシル化方法。
【請求項２】
分離されたポリペプチドであって、
（a）配列番号：26、28、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b）配列番号：26、28、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチドが1つまたは2つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入、あるいはシグナルペプチド配列の挿入によって形成したもので、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチドであって、前記誘導体ポリペプチドの置換、欠失または挿入がC末端および/またはN末端での10個以内のアミノ酸によるものである、
からなる群から選ばれるポリペプチド。
【請求項３】
分離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの配列が
（A）請求項2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（B）配列番号： 26、28、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（C）配列番号： 25、27、42、54、56、58または60のうちのいずれかで表されるヌクレオチド配列、
（F）（A）〜（C）のいずれかに記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、
からなる群から選ばれる、前記ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
下記の1種類または2種類以上の反応の触媒、あるいは下記の1種類または2種類以上の反応を触媒する触媒製剤の製造に用いられる、請求項2に記載の分離されたポリペプチドの使用。
（iii）糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位の水酸基に転移させる反応、
（iv）糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位の1番目のグリコシル基に転移させ、糖鎖を伸長させる反応。
【請求項６】
前記分離されたポリペプチドは、下記の1種類または2種類以上の反応の触媒、あるいは下記の1種類または2種類以上の反応を触媒する触媒製剤の製造に用いられる、請求項５に記載の使用。
【化１】
0006479084.tif 000030
（ただし、R1はHまたはOHで、R2はHまたはOHで、R3はHまたはグリコシル基で、R4はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：43あるいはその誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【化２】
0006479084.tif 000031
（ただし、R1はOHまたはOCH3で、R2はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：43あるいはその誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【化３】
0006479084.tif 000032
（ただし、R1はグリコシル基で、R2およびR3はOHまたはHで、R4はグリコシル基またはHで、R5はグリコシル基で、R5-R1-OはC3の1番目のグリコシル基から誘導されたグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：26、28、55、57、59または61あるいはそれらの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【請求項７】
請求項2に記載のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドの存在下で、グリコシル触媒反応を行う工程を含む、グリコシル触媒反応を行う方法。
【請求項８】
前記グリコシル触媒反応の基質は、式(V)、(VII)、(IX)または(XI)化合物で、かつ前記の基質は(VI)、(VIII)、(X)または(XII)化合物で、好ましくは、前記の式（V）化合物はプロトパナキサジオールで、かつ式（VI）化合物はギンセノシドRh2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
あるいは、前記の式（V）化合物はCKで、かつ式（VI）化合物はギンセノシドF2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
あるいは、前記の式（V）化合物はプロトパナキサトリオールPPTで、かつ式（VI）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol）で、
あるいは、前記の式（V）化合物はギンセノシドF1で、かつ式（VI）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1）で、
あるいは、前記の式（V）化合物はダンマレンジオールDMで、かつ式（VI）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-Dammarenediol II）で、
あるいは、前記の式（VII）化合物は25-OH-プロトパナキサジオール（25-OH- protopanaxadiol）で、かつ式（VIII）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-protopanaxadiol）で、
あるいは、前記の式（VII）化合物は25-OCH3-プロトパナキサジオール（25-OCH3- protopanaxadiol）で、かつ式（VIII）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OCH3-protopanaxadiol）で、
あるいは、前記の式（IX）化合物はギンセノシドRh2で、かつ式（X）化合物はギンセノシドRg3で、
あるいは、前記の式（IX）化合物はギンセノシドF2で、かつ式（X）化合物はギンセノシドRdで、
あるいは、前記の式（XI）化合物はラノステロール（lanosterol）で、かつ式（XII）化合物は3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ラノステロール（3-O-β-(D- glucopyranosyl)-lanosterol）である、
ここで式(V)、(VII)、(IX)、(XI)、(VI)、(VIII)、(X)または(XII)は以下の通りである、
0006479084.tif 000033
0006479084.tif 000034
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子工学化された宿主細胞であって、前記の宿主細胞は、請求項４に記載のベクターを含むか、或いはゲノムに請求項３に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている、宿主細胞。
【請求項１０】
酵素触媒試薬の製造、あるいは糖転移酵素の生産、あるいは触媒細胞、あるいはグリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物の生成に用いられる、請求項９に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１１】
遺伝子組み換え植物を生成する方法であって、請求項１０に記載の遺伝子工学化された宿主細胞を植物に再生させ、かつ前記の遺伝子工学化された宿主細胞が植物細胞である工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術および植物生物学の分野に関し、具体的に、糖転移酵素およびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ギンセノシドは、オタネニンジンおよび同属の植物(例えばサンシチニンジン、アメリカニンジン等)から分離されたサポニンの総称で、トリテルペン系サポニンに属し、オタネニンジンにおける主な有効成分である。現在、オタネニンジンから既に60種類以上のサポニンが分離され、一部のギンセノシドは、抗腫瘍、免疫調節、抗疲労、心臓保護、肝臓保護などの機能を含む幅広い生理機能と薬用価値を有することが実証された。
【０００３】
構造からみると、ギンセノシドは、サポゲニンがグリコシル化によって形成する生物活性小分子である。ギンセノシドのサポゲニンは種類が限られ、主にダンマラン型のプロトパナキサジオールとプロトパナキサトリオール、およびオレアノール酸である。近年、サンシチニンジンから新しいサポゲニンである25-OH-PPDと25-OCH3-PPDが分離され、これらはいずれも優れた抗腫瘍活性を有する。
【０００４】
サポゲニンは、グリコシル化によって、水溶性が向上し、かつ異なる生理活性が生じる。プロトパナキサジオール型サポニンの糖鎖は、通常、サポゲニンのC3および/またはC20の水酸基に結合している。プロトパナキサトリオールのサポニンは、プロトパナキサジオールのサポニンと比較すると、C6に水酸基がもう一つあり、現在発見されたプロトパナキサトリオール型サポニンはいずれもC6および/またはC20の水酸基に結合してグリコシル化するもので、C3にグリコシル基が結合したプロトパナキサトリオール型サポニンはまだ報告されていない。グリコシル基は、グルコース、ラムノース、キシロースやアラビノースでもよい。
【０００５】
異なるグリコシル基の結合部位、糖鎖の組成および長さによって、ギンセノシドは生理機能や薬用価値で大きく異なる。例えば、ギンセノシドRb1、RdおよびRcは、いずれもプロトパナキサジオールをサポゲニンとするサポニンで、これらの差はグリコシル基による修飾の差だけであるが、生理機能では大きく異なる。Rb1は、中枢神経系を安定化する機能を有するが、Rcの機能は中枢神経系を抑制することである。Rb1の生理機能は幅広いが、Rdは限られたいくつかの機能しかない。
【０００６】
ギンセノシドのサポゲニンとサポニンの間の構造の多様性は、空間立体構造にも現れ、テトラシクロトリテルペンの骨格にキラル炭素原子が多く存在するが、空間立体構造が生じるものは主にC20位にある。ギンセノシドとサポゲニンのほとんどは、C20位のエピマーが存在する。オタネニンジンにおいて、C20位がS配置のギンセノシドとサポゲニンの含有量はC20位がR配置のギンセノシドとサポゲニンよりも遥かに多いため、通常、ギンセノシドとサポゲニンとはC20位がS配置のギンセノシドとサポゲニンのことである。しかし、ギンセノシドとサポゲニンのC20位のエピマーは、明らかに異なる生理活性を有する。例えば、S配置のギンセノシドRh2（3-O-β-(D-グルコピラノシル) -20(S)-プロトパナキサジオール）は顕著に前立腺癌細胞を抑制することができるが、R配置のギンセノシドRh2（3-O-β-(D-グルコピラノシル) -20(R)-プロトパナキサジオール）の抑制効果は低い。R配置のギンセノシドRh2は、選択的に破骨細胞の生成を抑制することができ、かつ細胞毒性がぜんぜんないが、S配置のギンセノシドRh2は、破骨細胞の生成を抑制する作用が弱いが、破骨細胞に強い細胞毒性作用を有する。そして、S配置とR配置のギンセノシドRh2は、P-糖タンパク質に対する調節作用も大きく異なる。
【０００７】
糖転移酵素の機能は、糖ドナー（ヌクレオシド二リン酸糖、例えばUDP-グリコース）におけるグリコシル基を別の糖アクセプターに転移させることである。アミノ酸配列の違いによって、現在、糖転移酵素は94のファミリーがある。配列決定された植物ゲノムにおいて、100種類以上の異なる糖転移酵素が発見された。これらの糖転移酵素の糖ドナーは、糖、脂肪、タンパク質、核酸、抗生物質やほかの小分子を含む。オタネニンジンにおけるサポニンのグリコシル化に参与する糖転移酵素の作用は、糖ドナーにおけるグリコシル基をサポゲニンまたはアグリコンのC-3、C-6またはC-20の水酸基に転移させることによって、異なる薬用価値を有するサポニンを形成させることである。
【０００８】
現在、オタネニンジン、サンシチニンジンおよびアメリカニンジンに対するトランスクリプトーム分析によって、研究者らは既に大量の糖転移酵素の遺伝子を発見したが、どの糖転移酵素がギンセノシドの合成に参与することがまだ明らかではない。オタネニンジンに糖転移酵素が数多く存在し、かつこれらの含有量がいずれも低いため、これらの分離精製の研究の進展が遅い。
【０００９】
希少ギンセノシドとは、オタネニンジンにおける含有量が非常に低いサポニンである。ギンセノシドCK（20-O-β-(D-グルコピラノシル)-20(S)-プロトパナキサジオール）は、プロトパナキサジオール系サポニンに属し、サポゲニンのC-20位の水酸基にグルコシル基が1つ結合している。ギンセノシドCKのオタネニンジンにおける含有量が非常に低く、プロトパナキサジオール型サポニンが人体の腸管内で微生物によって加水分解されて生成する主な代謝産物である。研究によると、プロトパナキサジオール型サポニンの多くはCKに代謝されなければ人体に吸収されないため、ギンセノシドCKは直接体内で吸収されて作用を発揮する正体で、ほかのサポニンは薬物の前駆体だけである。ギンセノシドCKは、優れた抗腫瘍活性を有し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞の転移を抑制することができる。それを放射線治療や化学治療と併せて試験すると、放射線治療や化学治療の効果を向上させることができる。そのほか、ギンセノシドCKは、さらに、抗アレルギー活性、抗炎症活性を有し、かつ神経保護作用、抗糖尿病作用および抗皮膚老化作用を発揮する。ギンセノシドCKの薬理活性は、多標的、高活性および低毒性という特徴がある。
【００１０】
ギンセノシドF1（20-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）は、プロトパナキサトリオール型サポニンに属し、オタネニンジンにおける含有量が非常に低く、希少ギンセノシドである。ギンセノシドF1の構造はCKと非常に近く、サポゲニンのC-20位の水酸基にグルコシル基が1つ結合している。ギンセノシドF1も独特な薬用価値を有する。ギンセノシドF1は抗老化および抗酸化の機能を有する。
【００１１】
ギンセノシドRh1（6-O-β-D-グルコピラノシル-20(S)-プロトパナキサトリオール）は、プロトパナキサトリオール型サポニンに属し、オタネニンジンにおける含有量が非常に低く、希少ギンセノシドである。ギンセノシドRh1の構造はF1と非常に近いが、そのグリコシル化の部位はC6位における水酸基である。ギンセノシドRh1も特殊な生理機能を有し、抗アレルギーおよび抗炎症が可能である。
【００１２】
ギンセノシドRh2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-20(S)-プロトパナキサジオール）は、オタネニンジンにおける含有量が非常に低く、その含有量がオタネニンジンの乾燥重量の一万分の一くらいで、希少ギンセノシドである。しかし、ギンセノシドRh2は優れた抗腫瘍活性を有し、オタネニンジンにおける最も主要な抗腫瘍活性成分の一つで、腫瘍細胞の生長を抑制し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、腫瘍転移を抑制することができる。研究によると、ギンセノシドRh2は、肺癌細胞3LL(マウス)、Morris肝癌細胞(ラット)、B-16黒色腫細胞(マウス)、およびHeLa細胞(ヒト)の増殖を抑制することができる。臨床では、ギンセノシドRh2を放射線治療または化学治療と併せて治療すると、放射線治療および化学治療の効果を向上させることができる。また、ギンセノシドRh2は、さらに、抗アレルギー、生体の免疫力を向上させる機能、NOやPGEによる炎症を抑制するなどの作用を有する。
【００１３】
ギンセノシドRg3もオタネニンジンにおける含有量が低く、顕著な抗腫瘍作用を有し、ギンセノシドRh2と抗腫瘍機能で相補性があり、臨床使用によって、Rg3とRh2を併用すると腫瘍を治療する効果増加作用がさらに向上することが証明された。
希少ギンセノシドCK、F1、Rh1、Rh2およびRg3は、含有量が非常に低いため、現在、生産方法はオタネニンジンにおける大量のサポニンから、グリコシル基を選択的に加水分解する方法によって転化させた後、抽出・精製するものである。トチバニンジン属の植物の全サポニンまたはプロトパナキサジオール系サポニンを原料とし、転化、分離および抽出によって20(S)-ギンセノシド-Rh2を得る。この製造方法の利点は、大量のジオール系サポニンを利用することであるが、高温高圧で反応する必要がある（宋長春ら、20(S)-ギンセノシド-Rh2の製造方法およびその薬物組成物と応用[P].  中国特許: 1225366、1999年）。韓国人参煙草研究所によって、オタネニンジンから20(R＆S)-ギンセノシド-Rh2を製造する2種類の方法が公開された。その特徴は、まず、プロトパナキサジオールのサポニン成分を得、さらに酸加水分解処理で20(R＆S)-ギンセノシド-Rg3を得た後、ギンセノシドRg3を処理してギンセノシドRh2を得ることにある。以上のこれらの方法の主な欠点は、産物の出発材料にプロトパナキサジオール系の単量体のサポニンが必要で、反応の工程が煩雑で、原料の損失が大きく、操作が複雑で、コストが増加し、収率を向上させるのが困難であることにある。CKおよびF1はC-20位のグリコシル基が加水分解過程で破壊されやすいため、化学法はCKおよびF1の生産に適しない。一方、酸法およびアルカリ法でサポニンを加水分解してRh1製造する収率が低く、かつ多くの副産物が存在する。
【００１４】
酵素転化法は、条件が穏やかで、特異性が高く、産物が分離精製しやすいという特徴で、現在、CK、F1およびRh1を生産する主な方法である。ギンセノシドCK、F1、Rh1およびRh2の製造に使用される酵素は、主にナリンギナーゼ、ペクターゼ、セルラーゼやラクターゼなどである。ギンセノシドCKは、微生物転化の方法でも得られるが、主に腸管由来の嫌気菌を利用するものである。生物転化法（酵素法および微生物法）による希少ギンセノシドCK、F1、Rh1およびRh2の製造は大きく進歩したが、その原料がギンセノシドであるため、CK、F1、Rh1およびRh2の製造コストがまだ高く、かつその収量も相当限られる（中国特許:CN1105781C、金東史ら、大連軽工業学院学報、2001年）。
【００１５】
ギンセノシドRｈ2の重要な生物活性および巨大な経済価値のため、この数十年、ずっと化学合成の方法でこのサポニンを生産することを試みているが、その基本的な考えはプロトパナキサジオールと相応のグリコシルから縮合してなる方法、すなわち半合成法である（日本特許:特開平8-208688、1996年）。この方法は、プロトパナキサジオールを原料として20(S)-プロトパナキサジオール-Rｈ2を半合成するもので、その合成工程は6工程に分かれ、かつグリコシド化反応に当量の炭酸銀を触媒として使用し、高価なのでこの方法のコストが高く、そしてこの触媒の立体選択性が高くなく、産物の収率が低い。もう一つの方法は、芳香族炭化水素類のアシル基またはアルキル基でプロトパナキサジオールのC-12位の水酸基を置換し、さらに有機溶媒および不活性ガスの保護で、活性化されたC-1が水酸基のグルコシル基ドナーを入れ、分子篩の存在下でルイス酸による触媒で縮合反応し、生成した産物はカラムクロマトグラフィーまたは再結晶による精製を経て保護基が脱去し、20(S)-ギンセノシド-Rh2を得るものである（惠永正ら、20(S)-ギンセノシド-Rh2 の製造方法、中国特許:CN 1587273A、2005年）。
【００１６】
現在、本分野では、希少ギンセノシドCK、F1、Rh1、Rh2およびRg3を生産する有効な方法がまだないため、多くの特異的で効率的な糖転移酵素の開発が切望されている。
【発明の概要】
【００１７】
本発明の目的は、一連の糖転移酵素およびその応用を提供することである。
本発明の第一は、
糖移転酵素の存在下で、糖ドナーのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-20位、C-6位、C-3位あるいはC-3位の1番目のグリコシル基に転移させ、
グリコシル化されたテトラシクロトリテルペン系化合物を形成する工程を含み、
ここで、前記の糖移転酵素は、
配列番号：2、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表される糖移転酵素から選ばれる、
インビトログリコシル化方法を提供する。
【００１８】
本発明の第二は、分離されたポリペプチドであって、
（a）配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b）配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチドが1つまたは2つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入、あるいはシグナルペプチド配列の付加によって形成したもので、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
（c）配列に（a）または（b）に記載のポリペプチド配列が含まれる誘導体ポリペプチド、
（d）アミノ酸配列の配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が≧85％または≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
から選ばれるポリペプチドを提供する。
【００１９】
もう一つの好適な例において、前記の配列（c）は、（a）または（b）にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列が付加されて形成した融合タンパク質である。
もう一つの好適な例において、前記のポリペプチドは、配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61で表されるアミノ酸配列のポリペプチドである。
【００２０】
本発明の第三は、分離されたポリペプチドであって、
（a1）配列番号：22、24のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b1）配列に（a1）に記載のポリペプチド配列が含まれるポリペプチド、
から選ばれるポリペプチド、および/または
（a2）配列番号：4または6のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b2）配列番号：4または6のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチドが1つまたは2つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入、あるいはシグナルペプチド配列の付加によって形成したもので、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
（c2）配列に（b2）に記載のポリペプチド配列が含まれる誘導体ポリペプチド、
（d2）アミノ酸配列の配列番号：4または6のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が≧85％（好ましくは≧95％）で、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
から選ばれるポリペプチドを提供する。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の配列（c2）は、（a2）または（b2）にタグ配列、シグナル配列または分泌シグナル配列が付加されて形成した融合タンパク質である。
【００２２】
本発明の第四は、分離されたポリヌクレオチドであって、
（A）第一または第二に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（B）配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（C）配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表されるヌクレオチド配列、
（D）配列番号：1、3、5、15、17、19、21、27、40、42、54、56、58または60で表される配列との相同性が≧95％（好ましくは≧98％）のヌクレオチド配列、
（E）配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表されるヌクレオチド配列の5’末端および/または3’末端において1〜60個（好ましくは1〜30、より好ましくは1〜10個）のヌクレオチドが削除または付加されて形成したヌクレオチド配列、
（F）（A）〜（E）のいずれかに記載のヌクレオチド配列と相補的（好ましくは完全相補的）なヌクレオチド配列、
から選ばれるポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記のヌクレオチドの配列は、配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表される。
もう一つの好適な例において、配列が配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表されるポリヌクレオチドはアミノ酸配列がそれぞれ配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表されるポリペプチドをコードする。
【００２４】
本発明の第五は、第三に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクター、シャトルベクター、組込みベクターを含む。
本発明の第五は、糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-20位および/またはC-6位および/またはC-3位の水酸基に転移させて前記水酸基のHを置換する反応、および糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位の1番目のグリコシル基に転移させて糖鎖を伸長させる反応のうちの1種類または2種類以上の反応の触媒、あるいはその1種類または2種類以上の反応を触媒する触媒製剤の製造に用いられる、本発明の第一または第二に記載の分離されたポリペプチドの使用を提供する。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記の糖ドナーは、UDP-グルコース、ADP-グルコース、TDP-グルコース、CDP-グルコース、GDP-グルコース、UDP-アセチルグルコース、ADP-アセチルグルコース、TDP-アセチルグルコース、CDP-アセチルグルコース、GDP-アセチルグルコース、UDP-キシロース、ADP-キシロース、TDP-キシロース、CDP-キシロース、GDP-キシロース、UDP-ガラクツロン酸、ADP-ガラクツロン酸、TDP-ガラクツロン酸、CDP-ガラクツロン酸、GDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、ADP-ガラクトース、TDP-ガラクトース、CDP-ガラクトース、GDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、ADP-アラビノース、TDP-アラビノース、CDP-アラビノース、GDP-アラビノース、UDP-ラムノース、ADP-ラムノース、TDP-ラムノース、CDP-ラムノース、GDP-ラムノース、あるいはほかのヌクレオシド二リン酸六炭糖またはヌクレオシド二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるヌクレオシド二リン酸糖を含む。
【００２６】
もう一つの好適な例において、前記の糖ドナーは、UDP-グルコース、UDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、UDP-ラムノース、あるいはほかのウリジン二リン酸六炭糖またはウリジン二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるウリジン二リン酸（UDP）糖を含む。
もう一つの好適な例において、前記分離されたポリペプチドは、下記の1種類または2種類以上の反応の触媒、あるいは下記の1種類または2種類以上の反応を触媒する触媒製剤の製造に用いられる。
【００２７】
【化１】
0006479084.tif 000002
【００２８】
（ただし、R1はH、単糖のグリコシル基または多糖のグリコシル基で、R2およびR3はHまたはOHで、R4はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：2、16または18あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記の単糖は、グルコース（Glc）、ラムノース（Rha）、アセチルグルコース（Glc(6)Ac）、アラビノフラノース（Araf）、アラビノピラノース（Arap）、キシロース（Xyl）などを含む。
もう一つの好適な例において、前記の多糖は、Glc(2-1)Glc、Glc(6-1)Glc、Glc(6)Ac、Glc(2-1)Rha、Glc(6-1)Arap、Glc(6-1)Xyl、Glc(6-1)Araf、Glc(3-1)Glc(3-1)、Glc(2-1) Glu(6)Ac、Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl、Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl、またはGlc(6-1)Arap(3-1)Xylなどの2〜4個の単糖からなる多糖を含む。
【００３０】
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ａ】
0006479084.tif 000003
【００３１】
すなわち、前記のR1、R2がいずれもHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はプロトパナキサジオール（PPD）である。
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はギンセノシドRH2である。
R1がグルコシル基2つで、R2がHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はギンセノシドRG3である。
R1がHで、R2がOHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はプロトパナキサトリオール（PPT）である。
R1がHで、R2がHで、R3がHである場合、前記の式（I）化合物はダンマレンジオール（DM）である。
【００３２】
【化２】
0006479084.tif 000004
【００３３】
（ただし、R1はHまたはグリコシル基で、R2はグリコシル基で、R3はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：2、16、18または20あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
あるいは、R1はHまたはグリコシル基で、R2はHで、R3はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：20あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【００３４】
R1〜R3が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｂ】
0006479084.tif 000005
【００３５】
すなわち、R1、R2がいずれもHである場合、前記の式（III）化合物はプロトパナキサトリオール（PPT）である。
R1がHで、R2がグルコシル基である場合、前記の式（III）化合物はギンセノシドF1である。
【００３６】
【化３】
0006479084.tif 000006
【００３７】
（ただし、R1はHまたはOHで、R2はHまたはOHで、R3はHまたはグリコシル基で、R4はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：22、24、41または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【００３８】
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｃ】
0006479084.tif 000007
【００３９】
すなわち、R1およびR3がいずれもHで、R2がOHである場合、前記の式（V）化合物はプロトパナキサジオール（PPD）である。
R1がHで、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式（V）化合物はギンセノシドCKである。
R1がOHで、R2がOHで、R3がHである場合、前記の式（V）化合物はプロトパナキサトリオール（PPT）である。
R1がOHで、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式（V）化合物はギンセノシドF1である。
R1がHで、R2がOHで、R3がHである場合、前記の式（V）化合物はダンマレンジオール（DM）である。
【００４０】
基質がPPDである場合、前記のポリペプチドは、配列番号：22、24、41または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。基質がCKである場合、前記のポリペプチドは、配列番号：22、24または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。基質がPPTである場合、前記のポリペプチドは、配列番号：22、24または41あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。基質がF1およびDMである場合、前記のポリペプチドは、配列番号：22または24あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
【００４１】
【化４】
0006479084.tif 000008
【００４２】
（ただし、R1はOHまたはOCH3で、R2はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：22、24、41または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【００４３】
R1〜R2が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｄ】
0006479084.tif 000009
すなわち、R1がOHである場合、前記の式（VII）化合物は25-OH-PPDである。
R1がOCHである場合、前記の式（VII）化合物は25-OCH3-PPDである。
【００４４】
【化５】
0006479084.tif 000010
【００４５】
（ただし、R1はグリコシル基で、R2およびR3はOHまたはHで、R4はグリコシル基またはHで、R5はグリコシル基で、R5-R1-OはC3の1番目のグリコシル基から誘導されたグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：26、28、55、57、59または61あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【００４６】
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｅ】
0006479084.tif 000011
【００４７】
すなわち、R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がHである場合、式（IX）化合物はRh2である。
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がグルコシル基である場合、式（IX）化合物はF2である。
【００４８】
【化６】
0006479084.tif 000012
【００４９】
（前記のポリペプチドは、配列番号：22または配列番号：24あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）式（XI）化合物はラノステロール（lanosterol）で、かつ式（XII）化合物は3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ラノステロールである。
【００５０】
もう一つの好適な例において、前記のグリコシル基は、グルコシル基、ガラクツロン酸基、ガラクトシル基、アラビノシル基、ラムノシル基、およびほかの六炭糖または五炭糖から選ばれる。
【００５１】
もう一つの好適な例において、前記反応の式（I）、（III）、（V）、（VII）、（IX）または（XI）化合物は、S配置またはR配置のダンマラン型テトラシクロトリテルペン系化合物、ラノスタン型テトラシクロトリテルペン系化合物、チルカラン型テトラシクロトリテルペン系化合物、シクロアルタン型テトラシクロトリテルペン系化合物、ククルビタン型テトラシクロトリテルペン系化合物、またはメリアカン型テトラシクロトリテルペン系化合物を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
もう一つの好適な例において、前記のポリペプチドは、
（a）配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b）配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチドが1つまたは2つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入、あるいはシグナルペプチド配列の付加によって形成したもので、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
（c）配列に（a）または（b）に記載のポリペプチド配列が含まれる誘導体ポリペプチド、
（d）アミノ酸配列の配列番号：2、16、18、20、26、28、41、43、55、57、59または61のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が≧85％または≧90％（好ましくは≧95％）で、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
からなる群から選ばれる。
【００５３】
もう一つの好適な例において、前記のポリペプチドは、
（a1）配列番号：22、24のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b1）配列に（a1）に記載のポリペプチド配列が含まれるポリペプチド、
からなる群から選ばれ、かつ/または
（a2）配列番号：4または6のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチド、
（b2）配列番号：4または6のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列のポリペプチドが1つまたは2つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入、あるいはシグナルペプチド配列の付加によって形成したもので、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
（c2）配列に（b2）に記載のポリペプチド配列が含まれる誘導体ポリペプチド、
（d2）アミノ酸配列の配列番号：4または6のうちのいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が≧85％（好ましくは≧95％）で、かつ糖転移酵素活性を有す誘導体ポリペプチド、
からなる群から選ばれる。
【００５４】
もう一つの好適な例において、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドであるポリヌクレオチドは、
（A）本発明の第一または第二に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（B）配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
（C）配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表されるヌクレオチド配列、
（D）配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表される配列との相同性が≧95％（好ましくは≧98％）のヌクレオチド配列、
（E）配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表されるヌクレオチド配列の5’末端および/または3’末端において1〜60個（好ましくは1〜30、より好ましくは1〜10個）のヌクレオチドが削除または付加されて形成したヌクレオチド配列、
（F）（A）〜（E）のいずれかに記載のヌクレオチド配列と相補的（好ましくは完全相補的）なヌクレオチド配列、
からなる群から選ばれる配列である。
【００５５】
もう一つの好適な例において、前記のヌクレオチドの配列は、配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表される。
もう一つの好適な例において、配列が配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表されるポリヌクレオチドはアミノ酸配列がそれぞれ配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表されるポリペプチドをコードする。
【００５６】
本発明の第六は、本発明の第二または第三に記載のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドの存在下で、糖転移触媒反応を行う工程を含む、糖転移触媒反応を行う方法を提供する。
【００５７】
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、
糖ドナーおよび本発明の第二または第三に記載のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドの存在下で、前記の式（I）化合物を前記の式（II）化合物に、あるいは前記の式（III）化合物を前記の式（IV）化合物に、あるいは前記の式（V）化合物を前記の式（VI）化合物に、あるいは前記の式（VII）化合物を前記の式（VIII）化合物に、あるいは前記の式（IX）化合物を前記の式（X）化合物に、あるいは前記の式（XI）化合物を前記の式（XII）化合物に転化する工程を含む。
【００５８】
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、前記のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドをそれぞれ触媒反応に入れること、および/または
前記のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドを同時に触媒反応に入れることを含む。
【００５９】
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、糖ドナーならびに本発明の第二および第三に記載のポリペプチドおよびその誘導体ポリペプチドのうちの2種類以上のポリペプチドの共存下で、式（I）化合物を前記の式（IV）、（VI）、（VIII）、（X）の化合物に、あるいは式（III）化合物を前記の式（II）、（VI）、（VIII）、（X）の化合物に、あるいは式（V）化合物を前記の式（II）、（IV）、（VIII）、（X）の化合物に、あるいは式（VII）化合物を前記の式（II）、（IV）、（VI）、（X）の化合物に、あるいは式（IX）化合物を前記の式（II）、（IV）、（VI）、（VIII）の化合物に転化することを含む。
【００６０】
もう一つの好適な例において、前記の方法は、さらに、糖転移酵素をコードするヌクレオチド配列をダンマレンジオールおよび/またはプロトパナキサジオールおよび/またはプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵遺伝子と宿主細胞において共発現させ、前記の式（II）、（IV）、（VI）、（VIII）、（X）または（XII）の化合物を得ることを含む。
【００６１】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は酵母菌または大腸菌である。
もう一つの好適な例において、前記のポリペプチドは、配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその誘導体ポリペプチドである。
【００６２】
もう一つの好適な例において、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列は、配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23、25、27、40、42、54、56、58または60で表される。
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、反応系に酵素活性を調節する添加物を提供することを含む。
【００６３】
もう一つの好適な例において、前記の酵素活性を調節する添加物は、酵素活性を向上するか、あるいは酵素活性を抑制する添加物である。
もう一つの好適な例において、前記の酵素活性を調節する添加物は、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、またはFe2+からなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の酵素活性を調節する添加物は、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、またはFe2+を生成することができる物質である。
【００６４】
もう一つの好適な例において、前記の糖ドナーはヌクレオシド二リン酸糖で、UDP-グルコース、ADP-グルコース、TDP-グルコース、CDP-グルコース、GDP-グルコース、UDP-アセチルグルコース、ADP-アセチルグルコース、TDP-アセチルグルコース、CDP-アセチルグルコース、GDP-アセチルグルコース、UDP-キシロース、ADP-キシロース、TDP-キシロース、CDP-キシロース、GDP-キシロース、UDP-ガラクツロン酸、ADP-ガラクツロン酸、TDP-ガラクツロン酸、CDP-ガラクツロン酸、GDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、ADP-ガラクトース、TDP-ガラクトース、CDP-ガラクトース、GDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、ADP-アラビノース、TDP-アラビノース、CDP-アラビノース、GDP-アラビノース、UDP-ラムノース、ADP-ラムノース、TDP-ラムノース、CDP-ラムノース、GDP-ラムノース、あるいはほかのヌクレオシド二リン酸六炭糖またはヌクレオシド二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００６５】
もう一つの好適な例において、前記の糖ドナーはウリジン二リン酸糖で、UDP-グルコース、UDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、UDP-ラムノース、あるいはほかのウリジン二リン酸六炭糖またはウリジン二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００６６】
もう一つの好適な例において、反応系のpHは、pH4.0〜10.0で、好ましくはpH5.5〜9.0である。
もう一つの好適な例において、反応系の温度は、10℃〜105℃で、好ましくは20℃〜50℃である。
【００６７】
もう一つの好適な例において、前記のダンマレンジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子を含むが、これに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記のプロトパナキサジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子およびP450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００６８】
もう一つの好適な例において、前記のプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子、P450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、ならびにシトクロムP450 CYP716A53V2遺伝子およびその還元酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
もう一つの好適な例において、前記グリコシル触媒反応の基質は、式(I)、(III)、(V)、(VII)、(IX)または(XI)化合物で、かつ前記の基質は(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、(X)または(XII)化合物である。
もう一つの好適な例において、前記の式（I）化合物はプロトパナキサジオールPPD（Protopanaxadiol）で、かつ式（II）化合物はギンセノシドCK（20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
【００７０】
あるいは、前記の式（I）化合物はギンセノシドRh2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、かつ式（II）化合物はギンセノシドF2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
あるいは、前記の式（I）化合物はギンセノシドRg3で、かつ式（II）化合物はギンセノシドRdで、
【００７１】
あるいは、前記の式（I）化合物はプロトパナキサトリオールPPT（Protopanaxatriol）で、かつ式（II）化合物はギンセノシドF1（20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール（20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol））で、
あるいは、前記の式（I）化合物はダンマレンジオールDM（Dammarenediol II）で、かつ式（II）化合物はギンセノシド20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール（20-O-β-(D-glucopyranosyl)-Dammarenediol II）で、
【００７２】
あるいは、前記の式（III）化合物はプロトパナキサトリオールPPTで、かつ式（IV）化合物はギンセノシドRh1（6-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール（6-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol））で、
あるいは、前記の式（III）化合物はギンセノシドF1で、かつ式（IV）化合物はギンセノシドRg1（6-O-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（6-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
【００７３】
あるいは、前記の式（V）化合物はプロトパナキサジオールで、かつ式（VI）化合物はギンセノシドRh2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
あるいは、前記の式（V）化合物はCKで、かつ式（VI）化合物はギンセノシドF2（3-O-β-(D-グルコピラノシル)-20-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol））で、
【００７４】
あるいは、前記の式（V）化合物はプロトパナキサトリオールPPTで、かつ式（VI）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol）で、
あるいは、前記の式（V）化合物はギンセノシドF1で、かつ式（VI）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1）で、
【００７５】
あるいは、前記の式（V）化合物はダンマレンジオールDMで、かつ式（VI）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-Dammarenediol II）で、
あるいは、前記の式（VII）化合物は25-OH-プロトパナキサジオール（25-OH- protopanaxadiol）で、かつ式（VIII）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-protopanaxadiol）で、
【００７６】
あるいは、前記の式（VII）化合物は25-OCH3-プロトパナキサジオール（25-OCH3- protopanaxadiol）で、かつ式（VIII）化合物はギンセノシド3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-プロトパナキサジオール（3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OCH3-protopanaxadiol）で、
あるいは、前記の式（IX）化合物はギンセノシドRh2で、かつ式（X）化合物はギンセノシドRg3で、
【００７７】
あるいは、前記の式（IX）化合物はギンセノシドF2で、かつ式（X）化合物はギンセノシドRdで、
あるいは、前記の式（XI）化合物はラノステロール（lanosterol）で、かつ式（XII）化合物は3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ラノステロール（3-O-β-(D- glucopyranosyl)-lanosterol）である。
【００７８】
本発明の第七は、遺伝子工学化された宿主細胞であって、本発明の第五に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第四に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の糖転移酵素は、本発明の第二または第三に記載のポリペプチドまたはその誘導体ポリペプチドである。
【００７９】
もう一つの好適な例において、前記糖転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、本発明の第四に記載のようである。
もう一つの好適な例において、前記の細胞は、原核細胞または真核細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は真核細胞で、例えば酵母細胞または植物細胞である。
【００８０】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、出芽酵母細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は原核細胞で、例えば大腸菌である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、オタネニンジン細胞である。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、自然で式(II) 、(IV)、(VI)、(VIII)、(X) または(XII)化合物を生成する細胞ではない。
【００８１】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、自然で希少ギンセノシドCKおよび/または希少ギンセノシドF1および/または希少ギンセノシドRh2および/またはRg3および/またはRh1、および/または新たなギンセノシド20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-DM、3-O-β- D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-PPD、および/またはRh1、F2、RdおよびRg1などを生成する細胞である。
【００８２】
もう一つの好適な例において、前記のダンマレンジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子を含むが、これに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞に含まれるプロトパナキサジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子、およびP450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００８３】
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞に含まれるプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子、P450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、ならびにシトクロムP450 CYP716A53V2遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の第八は、酵素触媒試薬の製造、あるいは糖転移酵素の生産、あるいは触媒細胞、あるいは式(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、(X)または(XII)化合物に用いられる、第七に記載の宿主細胞の使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の宿主細胞は、ダンマレンジオール（DM）および/またはプロトパナキサジオール（PPD）および/またはプロトパナキサトリオール（PPT）に対するグリコシル化反応による、新たなサポニン20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオールおよび/または3-O-β- (D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)?プロトパナキサトリオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1および/または希少ギンセノシドCKおよび/または希少ギンセノシドF1および/または希少ギンセノシドRh1および/または希少ギンセノシドRh2および/または希少ギンセノシドRg3の生産に用いられる。
【００８５】
本発明の第九は、遺伝子組み換え植物を生成する方法であって、第七に記載の遺伝子工学化された宿主細胞を植物に再生させ、かつ前記の遺伝子工学化された宿主細胞が植物細胞である工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の遺伝子工学化された宿主細胞は、オタネニンジン細胞である。
【００８６】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上述の各技術特徴および下述（例えば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好ましい技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
以下の図面は本発明の具体的な実施方案を説明するためのもので、請求の範囲で決められる本発明の範囲を限定するものではない。
【図１】図1は、gGT25遺伝子、gGT25-1遺伝子、gGT25-3およびgGT25-5遺伝子のPCR産物のアガロースゲル電気泳動パターンである。
【００８８】
【図２】図2は、SDS-PAGEによって検出されたgGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5の出芽酵母における発現である。レーン1は、タンパク質マーカーの電気泳動の結果（分子量は上から下まで順に200、116、97.2、66.4、44.3kDaである。）で、レーン2は、gt25-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン3は、gt25-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン4は、gt25-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン5は、gt25-5-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン6は、pYES2ブランクベクター組換え体の分解液の上清である。
【００８９】
【図３】図3は、Western Blotによって検出されたgGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5遺伝子の出芽酵母における発現である。レーン1は、gt25-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン2は、gt25-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン4は、gt25-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン5は、gt25-5-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン3は、pYES2ブランクベクター組換え体の分解液の上清である。
【００９０】
【図４】図4は、SDS-PAGEによって検出されたgGT13およびgGT30の出芽酵母における発現である。レーン1は、gt30-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン2は、gt13-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン3は、ブランクベクターpYES2組換え体の分解液の上清である。
【００９１】
【図５】図5は、Western Blotによって検出されたgGT13およびgGT30の出芽酵母における発現を示す。レーン1は、gt30-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン2は、gt13-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン3は、ブランクベクターpYES2組換え体の分解液の上清である。
【００９２】
【図６】図6は、糖転移酵素gGT25、gGT25-1およびgGT25-3によって触媒されたプロトパナキサジオールおよびプロトパナキサジオール型サポニンの産物のTLC検出グラフを示す。レーン25は、gGT25粗製酵素液(gt25-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-1は、gGT25-1粗製酵素液(gt25-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-3は、gGT25-3粗製酵素液(gt25-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン「-」は、陰性対照で、酵素液の代わりにブランクベクター酵母の分解液の上清で、レーンMは、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサジオール型サポニンの混合標準サンプルである。
【００９３】
【図７】図7は、糖転移酵素gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5によって触媒されたプロトパナキサトリオールおよびプロトパナキサトリオール型サポニンの産物のTLC検出グラフを示す。レーンMは、プロトパナキサトリオール（PPT）およびプロトパナキサトリオール型サポニンの混合標準サンプルで、レーン25は、gGT25粗製酵素液(gt25-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-1は、gGT25-1粗製酵素液(gt25-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-3は、gGT25-3粗製酵素液(gt25-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-5は、gGT25-5粗製酵素液(gt25-5-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン「-」は、陰性対照で、酵素液の代わりにブランクベクター組換え酵母の分解液である。
【００９４】
【図８】図8は、糖転移酵素gGT25、gGT25-1およびgGT25-3によって触媒されたダンマレンジオールの産物のTLC検出グラフを示す。レーン25は、gGT25粗製酵素液(gt25-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-1は、gGT25-1粗製酵素液(gt25-1-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン25-3は、gGT25-3粗製酵素液(gt25-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清)で、レーン「-」は、陰性対照で、酵素液の代わりにブランクベクター酵母の分解液の上清で、レーンMは、ダンマレンジオール（DM）の標準サンプルである。
【００９５】
【図９】図9は、糖転移酵素gGT13およびgGT30によって触媒されたプロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールの産物のTLC検出グラフを示す。レーンM1は、プロトパナキサジオール型サポニンの混合標準サンプルで、レーンM2は、プロトパナキサトリオール型サポニンの混合標準サンプルで、レーン1は、gGT13粗製酵素液によって触媒されたプロトパナキサジオールで、レーン2は、gGT30粗製酵素液によって触媒されたプロトパナキサジオールで、レーン3は、陰性対照で、酵素液の代わりにddH20で、レーン4は、gGT13粗製酵素液によって触媒されたプロトパナキサトリオールで、レーン5は、gGT30粗製酵素液によって触媒されたプロトパナキサトリオールで、レーン6は、陰性対照で、酵素液の代わりにddH20である。
【００９６】
【図１０】図10は、糖転移酵素gGT25によって触媒されたプロトパナキサジオールの産物のHPLC検出を示す。2行目のサンプルは、プロトパナキサジオール（PPD）と数種類のサポニン（CK、Rh2、F2、Rg3）の混合標準サンプルで、1行目のサンプルは、gGT25粗製酵素液によって触媒されたPPDで、3行目のサンプルは、陰性対照1で、ブランクベクター組換え酵母の分解液によって触媒されたPPDで、4行目のサンプルは、陰性対照2で、dH20である。
【００９７】
【図１１】図11は、糖転移酵素gGT25によって触媒されたプロトパナキサトリオールの産物のHPLC検出を示す。2行目のサンプルは、プロトパナキサトリオール（PPT）と数種類のサポニン（F1、Rh1、Rg1）の混合標準サンプルで、1行目のサンプルは、gGT25粗製酵素液によって触媒されたPPTで、3行目のサンプルは、陰性対照1で、ブランクベクター組換え酵母の分解液によって触媒されたPPTである。
【００９８】
【図１２】図12は、糖転移酵素gGT25によって触媒されたプロトパナキサジオールの産物のLC/MS検出を示し、図10におけるピーク2（産物ピーク）および標準CKサンプルの質量分析グラフを示す。
【００９９】
【図１３】図13は、糖転移酵素gGT25によって触媒されたプロトパナキサトリオールの産物のLC/MS検出を示し、図11におけるピーク1（産物ピーク）および標準F1サンプルの質量分析グラフを示す。
【０１００】
【図１４】図14は、Western Blotによって検出されたgGT25-pET28aのE. coliにおける発現を示す。レーン1〜3は、それぞれ50 μMのIPTGによって誘導された全タンパク質、上清および沈殿である。
【０１０１】
【図１５】図15は、gGT25-pET28a組換え大腸菌の分解液によって体外で触媒されたPPDの産物のTLC検出グラフを示す。レーン1は、PPDおよびCKの標準サンプル混合物で、レーン2は、gGT25-pET28a組換え大腸菌によって誘導された（50 μMのIPTG）細胞分解液の上清によって触媒されたPPDである。
【０１０２】
【図１６】図16は、CK生産酵母工学菌Aの細胞分解液の抽出物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、プロトパナキサジオール（PPD）、ダンマレンジオールおよびCKの混合標準サンプルで、2行目のサンプルは、CK生産酵母工学菌Aの細胞分解液で、3行目のサンプルは、陰性対照1で、酵母出発菌株の分解液である。
【０１０３】
【図１７】図17は、糖転移酵素gGT25-5によって触媒されたプロトパナキサトリオールの産物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、プロトパナキサトリオール（PPT）と数種類のサポニン（F1、Rh1、Rg1およびRe）の混合標準サンプルで、2行目のサンプルは、gGT25-5粗製酵素液によって触媒されたPPTの産物である。
【０１０４】
【図１８】図18は、糖転移酵素gGT25-5によって触媒されたプロトパナキサトリオールの産物のLC/MS検出を示し、図17におけP1ピーク（産物Rh1ピーク）およびRh1標準サンプルの質量分析グラフを示す。
【０１０５】
【図１９】図19は、(a)3GT1および3GT2、(b)3GT3および(c)3GT4遺伝子のPCR産物のアガロースゲル電気泳動検出パターンである。
【０１０６】
【図２０】図20は、SDS-PAGEによって検出された(a)3GT1および3GT2、(b)3GT3および(c)3GT4遺伝子の大腸菌における発現である。（a）レーン1は、pet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の全タンパク質で、レーン2は、3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン3は、3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン4は、3GT1-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質で、レーン5は、3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン6は、3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン7は、3GT2-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質で、レーン8は、タンパク質の分子量マーカーである。（b）レーン1は、タンパク質の分子量マーカーで、レーン2は、3GT3-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン3は、3GT3-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン4は、3GT3-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質である。（c）レーン1は、3GT4-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質で、レーン2は、3GT4-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン3は、3GT4-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン4は、pet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液で、レーン5は、タンパク質の分子量マーカーである。矢印は、標的タンパク質の位置を指す。
【０１０７】
【図２１】図21は、Western Blotによって検出された(a)3GT1および3GT2、(b)3GT3および(c)3GT4遺伝子の大腸菌における発現である。（a）レーン1は、pet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の全タンパク質で、レーン2は、3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン3は、3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン4は、3GT1-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質で、レーン5は、3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン6は、3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン7は、3GT2-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質である。（b）レーン1は、3GT3-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン2は、3GT3-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン3は、3GT3-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質である。（c）レーン1は、3GT4-pet28a大腸菌組換え体の全タンパク質で、レーン2は、3GT4-pet28a大腸菌組換え体の分解液の沈殿で、レーン3は、3GT4-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン4は、pet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液である。
【０１０８】
【図２２】図22は、糖転移酵素3GT1および3GT2によって触媒されたプロトパナキサジオールおよびCKの産物のTLC検出グラフを示す。レーン1は、プロトパナキサジオール型サポニンの標準サンプルで、レーン2は、糖転移酵素3GT1によってプロトパナキサジオールが触媒されて生成したRh2で、レーン3は、糖転移酵素3GT1によってギンセノシドCKが触媒されて生成したF2で、レーン4は、糖転移酵素3GT2によってプロトパナキサジオールが触媒されて生成したRh2で、レーン5は、糖転移酵素3GT2によってギンセノシドCKが触媒されて生成したF2である。
【０１０９】
【図２３】図23は、糖転移酵素3GT1および3GT2によって触媒されたダンマレンジオール（DM）および25-OH-PPDの産物のTLC検出グラフを示す。（A）3GT1粗製酵素液（3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によって触媒されたダンマレンジオール（DM）および25-OH-PPD。レーン1は、25-OH-PPDの標準サンプルで、レーン2は、3GT1粗製酵素液によって25-OH-PPDが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-プロトパナキサジオールで、レーン3は、ダンマレンジオールの標準サンプルで、レーン4は、3GT1粗製酵素液によってダンマレンジオールが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオールである。（B）3GT2粗製酵素液（3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によって触媒されたダンマレンジオール（DM）および25-OH-PPD。レーン1は、25-OH-PPDの標準サンプルで、レーン2は、3GT2粗製酵素液によって25-OH-PPDが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-プロトパナキサジオールで、レーン3は、ダンマレンジオールの標準サンプルで、レーン4は、3GT2粗製酵素液によってダンマレンジオールが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオールである。
【０１１０】
【図２４】図24は、糖転移酵素3GT1および3GT2によって触媒されたPPTおよびF1の産物のTLC検出を示す。レーン1は、3GT1粗製酵素液（3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってPPTが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサジオールで、レーン2は、3GT1粗製酵素液によってF1が触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1で、レーン3は、3GT2粗製酵素液（3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってPPTが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-プロトパナキサトリオールで、レーン4は、3GT2粗製酵素液によってF1が触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1である。
【０１１１】
【図２５】図25は、糖転移酵素3GT1および3GT2によって触媒された20(R)-PPDの産物のTLC検出を示す。レーン1は、20(R)-PPDの標準サンプルで、レーン2は、3GT1粗製酵素液（3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によって20(R)-PPDが触媒されて生成した20(R)-Rh2で、レーン3は、3GT2粗製酵素液（3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によって20(R)-PPDが触媒されて生成した20(R)-Rh2で、レーン4は、対照で、酵素液の代わりにpet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の上清で、レーン5は、20(R)-Rh2の標準サンプルである。
【０１１２】
【図２６】図26は、糖転移酵素3GT1によって触媒されたラノステロール（lanosterol）の産物のTLC検出を示す。レーン1は、3GT1粗製酵素液（3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によって触媒されたラノステロールで、レーン2は、3GT2粗製酵素液（3GT2-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によって触媒されたラノステロールで、レーン3は、対照で、酵素液の代わりにpet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の上清である。
【０１１３】
【図２７】図27は、糖転移酵素3GT3によって触媒されたプロトパナキサジオール、プロトパナキサトリオールおよび25-OH-PPDの産物のTLC検出グラフを示す。（a）3GT3粗製酵素液（3GT3-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってプロトパナキサジオールが触媒されて生成したRh2で、Mはプロトパナキサジオール型サポニンの混合標準サンプルで、（b）3GT3粗製酵素液によってプロトパナキサトリオールが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT（3-G-PPT）で、（c）3GT3粗製酵素液によって25-OH-PPDが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD（3-G-25-OH-PPD）である。
【０１１４】
【図２８】図28は、糖転移酵素3GT4によって触媒されたプロトパナキサジオール、CKおよび25-OH-PPDの産物のTLC検出グラフを示す。（a）3GT4粗製酵素液（3GT4-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってプロトパナキサジオールが触媒されて生成したRh2で、Mはプロトパナキサジオール型サポニンの混合標準サンプルで、「+」は3GT4粗製酵素液を入れたサンプルで、「-」は対照で、すなわち酵素液の代わりにpet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の上清を使用し、（b）3GT4粗製酵素液によってCKが触媒されて生成したF2で、「+」は3GT4粗製酵素液を入れたサンプルで、「-」は対照で、すなわち酵素液の代わりにpet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の上清を使用し、（c）3GT4粗製酵素液によって25-OH-PPDが触媒されて生成した3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD（3-G-25-OH-PPD）で、「+」は3GT4粗製酵素液を入れたサンプルで、「-」は対照で、すなわち酵素液の代わりにpet28aブランクベクター大腸菌組換え体の分解液の上清を使用した。
【０１１５】
【図２９】図29は、糖転移酵素3GT1、3GT3および3GT4によってプロトパナキサジオールが触媒されて生成したRh2のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、ギンセノシドCK、Rh2およびF2の混合標準サンプルで、2行目のサンプルは、3GT1粗製酵素液（3GT1-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってPPDが触媒されて生成した産物で、3行目のサンプルは、3GT3粗製酵素液（3GT3-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってPPDが触媒されて生成した産物で、4行目のサンプルは、3GT4粗製酵素液（3GT4-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってPPDが触媒されて生成した産物である。
【０１１６】
【図３０】図30は、糖転移酵素3GT1、3GT3および3GT4によって触媒されたプロトパナキサジオールの産物のLC/MS検出を示す。Rh2の標準サンプルの質量分析グラフおよび図29におけるP1ピーク（3GT1の産物ピーク）、P2ピーク（3GT2の産物ピーク）およびP3ピーク（3GT4の産物ピーク）の質量分析グラフを示す。
【０１１７】
【図３１】図31は、（a）gGT29/gGT29-3遺伝子および（b）gGT29-4/gGT29-5/gGT29-6およびgGT29-7遺伝子のPCR産物のアガロースゲル電気泳動パターンを示す。（b）レーン1は、核酸のマーカーで、レーン2は、gGT29/gGT29-3遺伝子のPCR産物で、（b）レーン1は、gGT29-4/gGT29-5/gGT29-6遺伝子のPCR産物で、レーン2は、gGT29-7遺伝子のPCR産物で、レーン3は、核酸のマーカーである。
【０１１８】
【図３２】図32は、SDS-PAGEによって検出されたgGT29およびgGT29-3の出芽酵母における発現を示す。レーン1は、ブランクベクターpYES2組換え体の分解液の上清で、レーン2は、gGT29-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン3は、gGT29-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清である。
【０１１９】
【図３３】図33は、Western Blotによって検出されたgGT29およびgGT29-3の出芽酵母における発現を示す。レーン1は、ブランクベクターpYES2組換え体の分解液の上清で、レーン2は、gGT29-pYES2酵母組換え体の分解液の上清で、レーン3は、gGT29-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清である。
【０１２０】
【図３４】図34は、糖転移酵素gGT29およびgGT29-3によって触媒されたギンセノシドRh2およびF2の産物のTLC検出グラフを示す。レーン1は、PPDおよびPPD型サポニンの混合標準サンプルで、レーン2は、gGT29粗製酵素液（gGT29-pet28a大腸菌組換え体の分解液の上清）によってRh2が触媒されて生成したRg3で、レーン3は、gGT29粗製酵素液によるRh2の触媒の対照で、酵素液の代わりにpYES2ブランクプラスミド酵母組換え体の分解液を入れ、レーン4は、gGT29によってF2が触媒されて生成したRdで、レーン5は、gGT29によるF2の触媒の対照で、酵素液の代わりにpYES2ブランクプラスミド酵母組換え体の分解液を入れ、レーン6は、gGT29-3粗製酵素液（gGT29-3-pYES2酵母組換え体の分解液の上清）によってRh2が触媒されて生成したRg3で、レーン7は、gGT29-3粗製酵素液によってF2が触媒されて生成したRdである。
【０１２１】
【図３５】図35は、糖転移酵素gGT29および3GT1またはgGT29および3GT4の併用によって触媒されたPPDの産物のTLC検出を示す。（a）gGT29および3GT1の併用によって触媒されたPPDで、レーン1は、PPDおよびPPD型サポニンの混合標準サンプルで、レーン2は、3GT1によってPPDが触媒されて生成したRh2で、レーン3は、gGT29によってRh2が触媒されて生成したRg3で、レーン4は、3GT1およびgGT29の併用によってPPDが触媒されて生成したRg3である。（b）gGT29および3GT4の併用によって触媒されたPPDで、レーン1は、PPDおよびPPD型サポニンの混合標準サンプルで、レーン2は、3GT4によってPPDが触媒されて生成したRh2で、レーン3は、PPDで、レーン4は、3GT4およびgGT29の併用によってPPDが触媒されて生成したRg3である。
【０１２２】
【図３６】図36は、それぞれ糖転移酵素3GT1およびgGT29によって触媒された20(R)-PPDおよび20(R)-PPDならびに糖転移酵素3GT1およびgGT29の併用によって触媒された20(R)-PPDの産物のTLC検出グラフを示す。レーン1は、3GT1によっ20(R)-PPDが触媒されて生成した20(R)-Rh2で、レーン2は、gGT29によって20(R)-Rh2が触媒されて生成した20(R)-Rg3で、レーン3は、3GT1およびgGT29の併用によって20(R)-PPDが触媒されて生成した20(R)-Rg3である。
【０１２３】
【図３７】図37は、糖転移酵素gGT29および3GT1またはgGT29および3GT4の併用によって触媒されたPPDの産物のHPLC検出結果を示す。1行目は、Rg3、Rh2およびPPDの混合標準サンプルで、2行目は、gGT29および3GT1の併用によって触媒されたPPDで、3行目は、gGT29および3GT4の併用によって触媒されたPPDである。
【０１２４】
【図３８】図38は、糖転移酵素gGT29および3GT1またはgGT29および3GT4の併用によって触媒されたPPDの産物のLC/MS検出結果を示す。標準サンプルRg3の質量分析グラフおよび図37におけるP1ピーク（gGT29および3GT1の併用によって触媒されたPPDの産物）およびP2ピーク（gGT29および3GT4の併用によって触媒されたPPDの産物）の質量分析グラフを示す。
【０１２５】
【図３９】図39は、Rh2生産酵母工学菌A1の細胞分解液の抽出物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、プロトパナキサジオール（PPD）、ダンマレンジオール（DM）、ギンセノシドRh2およびRg3の混合標準サンプルで、2行目のサンプルは、Rh2生産酵母工学菌A1の細胞分解液の抽出物である。
【０１２６】
【図４０】図40は、Rg3生産酵母工学菌A2の細胞分解液の抽出物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、プロトパナキサジオール（PPD）、ダンマレンジオール（DM）、ギンセノシドRh2およびRg3の混合標準サンプルで、2行目のサンプルは、Rg3生産酵母工学菌A2の細胞分解液の抽出物である。
【０１２７】
【図４１】図41は、Rh1生産酵母工学菌A3の細胞分解液の抽出物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、プロトパナキサトリオール（PPT）およびギンセノシドRh1の標準サンプルで、2行目のサンプルは、Rh1生産酵母工学菌A3の細胞分解液の抽出物である。
【０１２８】
【図４２】図42は、F1生産酵母工学菌A4の細胞分解液の抽出物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、プロトパナキサトリオール（PPT）およびギンセノシドF1の標準サンプルで、2行目のサンプルは、F1生産酵母工学菌A4の細胞分解液の抽出物である。
【０１２９】
【図４３】図43は、Rh2生産酵母工学菌A5の細胞分解液の抽出物のHPLC検出を示す。1行目のサンプルは、ダンマレンジオール（DM）、プロトパナキサジオール（PPD）、ギンセノシドRh2およびギンセノシドRg3の標準サンプルで、2行目のサンプルは、Rh2生産酵母工学菌A5の細胞分解液の抽出物である。
【０１３０】
【図４４】図44は、SDS-PAGEによって検出されたgGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7の組換え大腸菌における発現を示す。レーン1は、gGT29-4-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン2は、gGT29-4-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン3は、gGT29-5-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン4は、gGT29-5-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン5は、gGT29-6-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン6は、gGT29-6-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン7は、gGT29-7-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン8は、gGT29-7-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン9は、タンパク質の分子量マーカーである。
【０１３１】
【図４５】図45は、Western Blotによって検出されたgGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7の組換え大腸菌における発現を示す。レーン1は、gGT29-4-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン2は、gGT29-4-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン3は、gGT29-5-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン4は、gGT29-5-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン5は、gGT29-6-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン6は、gGT29-6-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清で、レーン7は、gGT29-7-pET28a組換え大腸菌の分解液の全タンパク質で、レーン8は、gGT29-7-pET28a組換え大腸菌の分解液の上清である。
【０１３２】
【図４６】図46は、それぞれ糖転移酵素gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7によって触媒されたRh2およびF2の産物のTLC検出グラフを示す。レーンRh2は、サポニンRh2を基質として使用したことを、レーンF2は、サポニンF2を基質として使用したことを示す。gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7は、異なる酵素液で触媒反応を行ったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３３】
具体的な実施形態
本発明者は、幅広く深く研究したところ、初めて、テルペン系化合物のグリコシル化の触媒および新たなサポニンの合成における糖転移酵素gGT25(配列番号: 2)、gGT25-1(配列番号: 16)、gGT25-3(配列番号: 18)、gGT25-5(配列番号: 20)、gGT29(配列番号: 26)、gGT29-3配列番号: 28)、gGT29-4（配列番号:55）、gGT29-5（配列番号:57）、gGT29-6（配列番号:59）、gGT29-7（配列番号:61）および3GT1(配列番号: 22)、3GT2配列番号: 24)、3GT3(配列番号: 41)、3GT4(配列番号: 43)、gGT13(配列番号: 4)、gGT30(配列番号: 6)の応用を提供する。具体的に、本発明の糖転移酵素は、特異的にかつ効率的にテトラシクロトリテルペン化合物の基質のC-20位および/またはC-6位および/またはC-3位の水酸基のグリコシル化、および/または糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位の1番目のグルコシル基に転移させて糖鎖を伸長させるのを触媒することができる。特にプロトパナキサジオールを、抗癌活性を有する希少ギンセノシドCKおよびRh2に転化させ、プロトパナキサトリオールを、抗老化活性を有する希少ギンセノシドF1および抗アレルギー作用を有する希少ギンセノシドRh1に転化させ、Rh2を抗癌活性が優れた希少ギンセノシドRg3に転化させることができる。本発明の糖転移酵素は、さらに、ダンマレンジオール、プロトパナキサトリオール、F1、25-OH-PPD、25-OCH3-PPDから今まで報告されていない新たなサポニンである20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-PPDを合成することができる。
【０１３４】
本発明の糖転移酵素は、さらに、Rh2、CK、Rg3をそれぞれギンセノシドF2、RdおよびRg1などに転化させることができる。また、本発明は転化および触媒の方法も提供する。本発明の糖転移酵素は、さらに、ダンマレンジオールおよび/またはプロトパナキサジオールまたはプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵酵素と宿主細胞において共発現することができ、あるいはダンマレンジオール（DM）、プロトパナキサジオール（PPD）およびプロトパナキサトリオール（PPT）の遺伝子工学細胞の製造、希少ギンセノシドCK、F1、Rh1、Rｈ2およびRg3、ならびに新たなギンセノシドである20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-PPDおよびF2、RdおよびRg1などを人工合成する代謝経路の構築に使用することができ、これに基づき、本発明を完成させた。
【０１３５】
定義
ここで用いられるように、用語「活性ポリペプチド」、「本発明のポリペプチドおよびその誘導体ポリペプチド」、「本発明の酵素」、「糖転移酵素」、「本発明のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、3GT1、3GT2、3GT3、3GT4タンパク質」または「本発明の糖転移酵素」とは、いずれも糖転移酵素gGT25(配列番号: 2)、gGT13(配列番号: 4)、gGT30(配列番号: 6)、gGT25-1(配列番号: 16)、gGT25-3(配列番号: 18)、gGT25-5(配列番号: 20)、gGT29(配列番号: 26)、gGT29-3配列番号: 28)、gGT29-4（配列番号:55）、gGT29-5（配列番号:57）、gGT29-6（配列番号:59）、gGT29-7（配列番号:61）および3GT1(配列番号: 22)、3GT2配列番号: 24)、3GT3(配列番号: 41)、3GT4(配列番号: 43)のポリペプチドおよびその誘導体ポリペプチドである。
【０１３６】
特別に説明しない限り、ここに記載のギンセノシドとサポゲニンは、C20位がS配置であるギンセノシドとサポゲニンである。
ここで用いられるように、「分離されたポリペプチド」とは、ポリペプチドに実質的に自然でそれに関連するほかのタンパク質、脂質、糖類またはほかの物質が含まれないことである。当業者は標準のタンパク質精製技術によって前記ポリペプチドを精製することができる。実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲルでは単一のメインバンドが現れる。前記ポリペプチドの純度は、アミノ酸配列でさらに分析することもできる。
【０１３７】
本発明の活性ポリペプチドは、組み換えポリペプチド、天然ポリペプチド、合成ポリペプチドでもよい。本発明のポリペプチドは、天然精製の産物、あるいは化学合成の産物、あるいは組換え技術で原核または真核宿主（例えば、細菌、酵母、植物）から生成するものでもよい。組み換え生産プロセスで用いられる宿主にによって、本発明のポリペプチドは、グリコシル化されたものでもよく、又はグリコシル化されていないものでもよい。また、本発明のポリペプチドは、開始のメチオニン残基を含有してもよく、含有しなくてもよい。
【０１３８】
本発明は、さらに、前記ポリペプチドの断片、誘導体および類似物を含む。ここで用いられるように、用語の「断片」、「誘導体」および「類似物」とは、実質的に前記ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を維持するポリペプチドである。
【０１３９】
本発明のポリペプチドの断片、誘導体や類似物は、（i）1個または複数個の保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）が置換されたポリペプチドでもよく、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードでコードされてもされていなくてもよく、または（ii）1個または複数個のアミノ酸残基に置換基があるポリペプチドでもよく、、または（iii）成熟のポリペプチドと他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールようなポリペプチドの半減期を延ばす化合物）と融合したポリペプチドでもよく、または（iv）付加のアミノ酸配列がこのポリペプチドに融合したポリペプチド（例えばリーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列または蛋白質前駆体配列、或いは抗原IgG断片と形成した融合蛋白質）でもよい。本明細書の開示に基づき、これらの断片、誘導体および類似物は当業者に公知の範囲に入っている。
【０１４０】
本発明の活性ポリペプチドは、糖転移酵素活性を有し、かつ以下の1種類または2種類以上の反応を触媒することができる。
【化７】
0006479084.tif 000013
【０１４１】
（ただし、R1はH、単糖のグリコシル基または多糖のグリコシル基で、R2およびR3はHまたはOHで、R4はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：2、16または18あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【０１４２】
もう一つの好適な例において、前記の単糖は、グルコース（Glc）、ラムノース（Rha）、アセチルグルコース（Glc(6)Ac）、アラビノフラノース（Araf）、アラビノピラノース（Arap）、キシロース（Xyl）などを含む。
もう一つの好適な例において、前記の多糖は、Glc(2-1)Glc、Glc(6-1)Glc、Glc(6)Ac、Glc(2-1)Rha、Glc(6-1)Arap、Glc(6-1)Xyl、Glc(6-1)Araf、Glc(3-1)Glc(3-1)、Glc(2-1) Glu(6)Ac、Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl、Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl、Glc(6-1)Arap(3-1)Xylなどの2〜4個の単糖からなる多糖を含む。
【０１４３】
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｆ】
0006479084.tif 000014
【０１４４】
すなわち、前記のR1、R2がいずれもHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はプロトパナキサジオール（PPD）である。
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はギンセノシドRH2である。
R1がグルコシル基2つで、R2がHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はギンセノシドRG3である。
R1がHで、R2がOHで、R3がOHである場合、前記の式（I）化合物はプロトパナキサトリオール（PPT）である。
R1がHで、R2がHで、R3がHである場合、前記の式（I）化合物はダンマレンジオール（DM）である。
【０１４５】
【化８】
0006479084.tif 000015
【０１４６】
（ただし、R1はHまたはグリコシル基で、R2はグリコシル基で、R3はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：2、16、18または20あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
あるいは、R1はHまたはグリコシル基で、R2はHまたはグリコシル基で、R3はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：20あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【０１４７】
R1〜R3が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｇ】
0006479084.tif 000016
【０１４８】
すなわち、R1、R2がいずれもHである場合、前記の式（III）化合物はプロトパナキサトリオール（PPT）である。
R1がHで、R2がグルコシル基である場合、前記の式（III）化合物はギンセノシドF1である。 
【０１４９】
【化９】
0006479084.tif 000017
【０１５０】
（ただし、R1はHまたはOHで、R2はHまたはOHで、R3はHまたはグリコシル基で、R4はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：22、24、41または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｈ】
0006479084.tif 000018
【０１５１】
すなわち、R1およびR3がいずれもHで、R2がOHである場合、前記の式（V）化合物はプロトパナキサジオール（PPD）で、前記のポリペプチドは配列番号：22、24、41または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
R1がHで、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式（V）化合物はギンセノシドCKで、前記のポリペプチドは配列番号：22、24または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
R1がOHで、R2がOHで、R3がHである場合、前記の式（V）化合物はプロトパナキサトリオール（PPT）で、前記のポリペプチドは配列番号：22、24または41あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
【０１５２】
R1がOHで、R2がOHで、R3がグルコシル基である場合、前記の式（V）化合物はギンセノシドF1で、前記のポリペプチドは配列番号：22または24あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
R1がHで、R2がOHで、R3がHである場合、前記の式（V）化合物はダンマレンジオール（DM）で、前記のポリペプチドは配列番号：22または24あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。
【０１５３】
【化１０】
0006479084.tif 000019
【０１５４】
（ただし、R1はOHまたはOCH3で、R2はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：22、24、41または43あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
R1〜R2が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｉ】
0006479084.tif 000020
【０１５５】
すなわち、R1がOHである場合、前記の式（VII）化合物は25-OH-PPDである。
R1がOCHである場合、前記の式（VII）化合物は25-OCH3-PPDである。
【化１１】
0006479084.tif 000021
（ただし、R1はグリコシル基で、R2およびR3はOHまたはHで、R4はグリコシル基またはHで、R5はグリコシル基である。前記のポリペプチドは、配列番号：26、28、55、57、59または61あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【０１５６】
R1〜R4が置換された化合物は、下記の表に示す。
【表Ｊ】
0006479084.tif 000022
すなわち、R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がHである場合、式（IX）化合物はRh2である。
R1がグルコシル基で、R2がHで、R3がOHで、R4がグルコシル基である場合、式（IX）化合物はF2である。
【０１５７】
【化１２】
0006479084.tif 000023
【０１５８】
（前記のポリペプチドは、配列番号：22または24あるいはほかの誘導体ポリペプチドから選ばれる。）
【０１５９】
前記のポリペプチドは、好ましくは配列が配列番号：2、16、18、20、22、24、41、26、28、43、55、57、59または61で表されるポリペプチドで、この用語はさらに示されたポリペプチドと同じ機能を有する配列番号：2、16、18、20、22、24、41、26、28、43、55、57、59または61配列の変異形態および誘導体ポリペプチドを含む。これらの変異形態は、1つまたは2つ以上（通常は1〜50個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜20個、最も好ましくは1〜10個）のアミノ酸の欠失、挿入および/または置換、ならびにC末端および/またはN末端への1つまたは2つ以上（通常は20個以内、好ましくは10個以内、より好ましくは5個以内）のアミノ酸の付加を含むが、これらに限定されない。例えば、本分野において、性状が近い、または類似のアミノ酸で置換する場合、通常、蛋白質の機能を変えることがない。また、C末端および/またはN末端への1つまたは2つ以上のアミノ酸の付加も、通常、蛋白質の機能を変えることはない。この用語は、さらに、EGFRvA蛋白の活性断片と活性誘導体を含む。また、本発明は前記ポリペプチドの類似物も提供する。これらの類似物と天然のヒトEGFRvAポリペプチドの違いは、アミノ酸配列の違いでもよく、配列に影響を与えない修飾形態の違いでもよく、あるいは両者でもよい。これらのポリペプチドは、天然の突然変異体または誘導された突然変異体を含む。誘導突然変異体は、様々な技術、例えば放射または突然変異原への露出によるランダム突然変異、また部位特異的変異法またはほかの既知の分子生物学の技術によって得られる。類似物は、さらに、天然L-アミノ酸と異なる残基（例えばD-アミノ酸）を有する類似物、および非天然または合成のアミノ酸（例えばβ、γ-アミノ酸）を有する類似物を含む。もちろん、本発明のポリペプチドは、上記で挙げられた代表的なポリペプチドに限定されない。
【０１６０】
修飾（通常は一次構造が変わらない）形態は、体内または体外のポリペプチドの化学的に誘導された形態、例えばアセチル化またはカルボキシ化を含む。修飾は、さらにグリコシル化、たとえばポリペプチドの合成および加工でまたはさらなる加工の工程でグリコシル化修飾を行ったポリペプチドも含む。このような修飾は、ポリペプチドをグルコシル化する酵素（たとえば哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させることによって完成する。修飾形態は、さらにリン酸化アミノ酸残基（例えばリン酸チロシン、リン酸セリン、リン酸トレオニン）を有する配列を含む。さらに、修飾によって抗タンパク質加水分解性を向上させたポリペプチドまたは溶解性を改善したポリペプチドを含む。
【０１６１】
本発明のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端にさらに1つまたは2つ以上のポリペプチド断片がタンパク質タグとして含まれてもよい。適切なタグであればどんなものでも本発明に使用できる。例えば、前記のタグは、FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly?His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、およびTy1でもよい。これらのタグはタンパク質に対する精製に使用することができる。表1にその一部のタグおよびその配列を示す。
【０１６２】
【表１】
0006479084.tif 000024
【０１６３】
翻訳されたタンパク質が分泌される（例えば細胞外に分泌される）ように、前記gGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4のアミノ酸のアミノ末端にシグナルペプチド配列、例えばpelBシグナルペプチドを付加してもよい。シグナルペプチドは、ポリペプチドが細胞内から分泌される過程で切り取られてもよい。
【０１６４】
本発明のポリヌクレオチドは、DNA形態でもRNA形態でもよい。DNA形態は、cDNA、ゲノムDNAまたは人工合成のDNAを含む。DNAは、一本鎖でも二本鎖でもよい。DNAは、コード鎖でも非コード鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード領域の配列は、配列番号：1で表されるコード領域の配列と同様でもよく、あるいは縮重変異体でもよい。ここで用いられるように、本発明において「縮重変異体」とは、配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61を有するタンパク質をコードするが、配列番号：1、3、5、15、17、19、21、23 、25、27、40 、42、54、56、58または60で表されるコード領域の配列と異なる核酸配列である。
【０１６５】
配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドだけをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な付加コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の付加コード配列）および非コード配列を含む。
【０１６６】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでもよく、さらに付加のコードおよび/または非コード配列を含むポリヌクレオチドでもよい。
【０１６７】
本発明は、さらに、本発明と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはポリペプチドの断片、類似物および誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。このポリヌクレオチドの変異体は、天然に発生した対立遺伝子変異体でも非天然に発生した変異体でもよい。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの代替形態で、1つまたは2つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または挿入でもよいが、実質的にコードするポリペプチドの機能を変えることはない。
【０１６８】
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズし、かつ2つの配列の間に少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳格な条件で本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳格な条件」とは、（1）低いイオン強度および高い温度、例えば0.2×SSC、0.1％SDS、60℃でのハイブリダイズおよび溶離、あるいは（2）ハイブリダイズ時変性剤、例えば42℃で50％（v/v）ホルムアミド、0.1％ウシ胎児血清/0.1％ Ficollなどを入れること、あるいは（3）2つの配列の間の相同性が少なくとも90％以上、好ましくは95％以上の時だけハイブリダイズすることである。そして、ハイブリダイズできるポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、配列番号：2、4、6、16、18、20、22、24、26、28、41、43、55、57、59または61で表される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【０１６９】
本発明は、さらに、上記の配列とハイブリダイズする核酸断片に関する。ここで用いられるように、「核酸断片」の長さは、少なくとも15個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも30個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも100個のヌクレオチド以上を含む。核酸断片は、核酸の増幅技術（例えばPCR）に使用し、gGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4タンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定および/または分離することができる。
【０１７０】
本発明におけるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは分離された形態で提供し、より好ましくは均質に精製される。
本発明のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4のヌクレオチド全長配列あるいはの断片は、通常、PCR増幅法、組換え法又は人工合成の方法で得られる。PCR増幅法について、本発明で公開された関連のヌクレオチド配列、特に読み枠によってプライマーを設計し、市販のcDNAライブラリーまたは当業者に既知の通常の方法によって調製されるcDNAライブラリーを鋳型とし、増幅して関連配列を得る。配列が長い場合、通常、2回または2回以上のPCR増幅を行った後、各回の増幅で得られた断片を正確な順でつなげる必要がある。
【０１７１】
関連の配列を獲得すれば、組換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を分離して得る。
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。
【０１７２】
現在、本発明のタンパク質（又はその断片、或いはその誘導体）をコードするDNA配列を全部化学合成で獲得することがすでに可能である。さらに、このDNA配列を本分野で周知の各種の既知のDNA分子（或いはベクターなど）や細胞に導入してもよい。また、化学合成で本発明のタンパク質配列に変異を導入することもできる。
【０１７３】
本発明の遺伝子を得るには、PCR技術でDNA/RNAを増幅する方法が好適に使用される。特にライブラリーから全長のcDNAを得ることが困難な場合、好適にRACE法（RACE-cDNA末端快速増幅法）を使用し、PCRに使用されるプライマーはここで公開された本発明の配列情報によって適切に選択し、かつ通常の方法で合成することができる。通常の方法、例えばゲル電気泳動によって増幅されたDNA/RNA断片を分離、精製することができる。
【０１７４】
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および本発明のベクターまたはgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4タンパク質のコード配列を使用して遺伝子工学によって生成した宿主細胞、ならびに組換え技術によって本発明に係るポリペプチドを生成する方法に関する。
【０１７５】
通常の組換えDNA技術によって、本発明のポリヌクレオチド配列を使用し、組換えたgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4のポリペプチドを発現または生産することができる。一般的に、以下の工程を含む。
【０１７６】
（1）本発明のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4のポリペプチドをコードするポロヌクレオチド（または変異体）を使用し、あるいはこのポロヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを使用し、適切な宿主細胞を形質転換または形質導入する。
（2）適切な培地において宿主細胞を培養する。
（3）培地または細胞からタンパク質を分離し、精製する。
【０１７７】
本発明において、gGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4のポリヌクレオチド配列は組換え発現ベクターに挿入してもよい。用語「組換え発現ベクター」とは、本分野でよく知られている細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルスまたはほかのベクターである。宿主体内で安定して複製することができれば、どんなプラスミドおよびベクターでも使用できる。発現ベクターの重要な特徴の一つは、通常、複製起点、プロモーター、マーカー遺伝子および翻訳制御エレメントを含むことである。
【０１７８】
gGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4のコードDNA配列および適切な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの構築に当業者によく知られている方法を使用することができる。これらの方法は、体外組換えDNA技術、DNA合成技術、体内組換え技術などを含む。前記のDNA配列は、有効に発現ベクターにおける適切なプロモーターに連結し、mRNA合成を指導することができる。これらのプロモーターの代表的な例として、大腸菌のlacまたはtrpプロモーター、λファージのPLプロモーター、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期SV40プロモーターを含む真核プロモーター、レトロウイルスのLTRsやほかの既知の制御可能な遺伝子の原核または真核細胞あるいはそのウイルスにおける発現されるプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、さらに、翻訳開始用リボゾーム結合部位および転写ターミネーターを含む。
【０１７９】
また、発現ベクターは、好ましくは1つまたは2つ以上の選択性マーカー遺伝子を含み、形質転換された宿主細胞を選択するための形質、たとえば真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性および緑色蛍光タンパク質（GFP）、あるいは大腸菌用のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を提供する。
上記の適切なDNA配列及び適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターは、適切な宿主細胞を形質転換し、タンパク質を発現するようにすることができる。
【０１８０】
宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌細胞、或いは、低等真核細胞、例えば酵母細胞、或いは、高等真核細胞、例えば哺乳動物細胞でもよい。代表例として、大腸菌、ストレプトマイセス属、ネズミチフス菌のような細菌細胞、酵母のような真菌細胞、植物細胞、ミバエS2若しくはSf9のような昆虫細胞、CHO、COS、293細胞またはBowesメラノーマ細胞のような動物細胞などがある。
【０１８１】
本発明のポリヌクレオチドが高等真核細胞において発現される場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入すると転写が強化される。エンハンサーは、DNAのシスエレメントで、通常、約10〜300bpで、プロモーターに作用して遺伝子の転写を強化する。例を挙げると、複製起点の後期側にある100〜270bpのSV40エンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーなどを含む。
【０１８２】
当業者は、どうやって適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび宿主細胞を選択するか、よくわかる。
DNA組換えによる宿主細胞の形質転換は当業者に熟知の通常の技術で行っても良い。宿主が原核細胞、例えば大腸菌である場合、DNAを吸収できるコンピテントセルは指数成長期後収集でき、CaCl2法で処理し、用いられる工程は本分野では周知のものである。もう一つの方法は、MgCl2を使用する。必要により、転化はエレクトロポレーションの方法でもよい。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションのような通常の機械方法、リポフェクションなどのDNAトランスフェクションの方法が用いられる。
【０１８３】
得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することが出来る。用いられる宿主細胞によって、培養に用いられる培地は通常の培地を選んでも良い。宿主細胞の成長に適する条件で培養する。宿主細胞が適当の細胞密度に成長したら、適切な方法（例えば温度転換もしくは化学誘導）で選んだプロモーターを誘導し、さらに細胞を培養する。
【０１８４】
上述の方法における組換えポリペプチドは細胞内または細胞膜で発現し、或いは細胞外に分泌することが出来る。必要であれば、その物理・化学的特性及び他の特性を利用して各種の分離方法で組換えタンパク質を分離・精製することができる。これらの方法は、本分野の技術者に熟知である。これらの方法の例として、通用の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心、浸透圧ショック、超音波処理、超遠心、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）及び他の各種の液体クロマトグラフィー技術、並びにこれらの方法の組合せを含むが、これらに限定されない。
【０１８５】
応用
本発明に係る活性ポリペプチドまたはペプチジルトランスフェラーゼgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4の用途は、特異的にかつ効率的にテトラシクロトリテルペン化合物の基質のC-20位および/またはC-6位および/またはC-3位の水酸基のグリコシル化、あるいは糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位の1番目のグルコシル基に転移させて糖鎖を伸長させるのを触媒すること含むが、これらに限定されない。特にプロトパナキサジオールを、抗癌活性を有する希少ギンセノシドCKおよびRh2に転化させ、プロトパナキサトリオールを、抗老化活性を有する希少ギンセノシドF1および抗アレルギー作用を有する希少ギンセノシドRh1に転化させ、Rh2を抗癌活性がより優れた希少ギンセノシドRg3に転化させることができる。本発明の糖転移酵素は、さらに、ダンマレンジオール、プロトパナキサトリオール、F1、25-OH-PPD、25-OCH3-PPDから今まで報告されていない新たなサポニンである20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-PPDを合成することができる。本発明の糖転移酵素は、さらに、Rh2、CK、Rg3をギンセノシドF2、RdおよびRg1などに転化させることができる。
【０１８６】
前記のテトラシクロトリテルペン系化合物は、S配置またはR配置のダンマラン型、ラノスタン型、チルカラン型、シクロアルタン型、ククルビタン型、メリアカン型などのテトラシクロトリテルペン系化合物を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
本発明は、糖ドナーを提供する条件で、本発明のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7、3GT1、3GT2、3GT3および/または3GT4の活性ポリペプチドまたはペプチジルトランスフェラーゼを使用して(II)、(IV)、(VI)、(VIII)、(X)および（XII）化合物を得ることを含む、工業触媒方法を提供する。具体的に、前記の（a）反応に使用されるポリペプチドは配列番号：2、16または18から、前記の（b）反応に使用されるポリペプチドは配列番号：20、2、16または18から、前記の（c）および（d）反応に使用されるポリペプチドは配列番号：22、24、41または43から、前記の（e）反応に使用されるポリペプチドは配列番号：26、28、55、57、59または61で表されるアミノ酸配列の活性ポリペプチドから、前記の（a）反応に使用されるポリペプチドは配列番号：2、16または18で、前記の（F）反応に使用されるポリペプチドは配列番号：22または24で表されるアミノ酸配列の活性ポリペプチドから選ばれる。
【０１８８】
前記の糖ドナーはヌクレオシド二リン酸糖で、UDP-グルコース、ADP-グルコース、TDP-グルコース、CDP-グルコース、GDP-グルコース、UDP-アセチルグルコース、ADP-アセチルグルコース、TDP-アセチルグルコース、CDP-アセチルグルコース、GDP-アセチルグルコース、UDP-キシロース、ADP-キシロース、TDP-キシロース、CDP-キシロース、GDP-キシロース、UDP-ガラクツロン酸、ADP-ガラクツロン酸、TDP-ガラクツロン酸、CDP-ガラクツロン酸、GDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、ADP-ガラクトース、TDP-ガラクトース、CDP-ガラクトース、GDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、ADP-アラビノース、TDP-アラビノース、CDP-アラビノース、GDP-アラビノース、UDP-ラムノース、ADP-ラムノース、TDP-ラムノース、CDP-ラムノース、GDP-ラムノース、あるいはほかのヌクレオシド二リン酸六炭糖またはヌクレオシド二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１８９】
前記の糖ドナーは好ましくはウリジン二リン酸糖で、UDP-グルコース、UDP-ガラクツロン酸、UDP-ガラクトース、UDP-アラビノース、UDP-ラムノース、あるいはほかのウリジン二リン酸六炭糖またはウリジン二リン酸五炭糖、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０１９０】
前記方法において、さらに酵素活性添加物（酵素活性を向上するか、あるいは酵素活性を抑制する添加物）を添加してもよい。前記酵素活性添加物は、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、またはFe2+からなる群から選ばれてもよく、あるいはCa2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+、または或Fe2+を生成することができる物質である。
【０１９１】
前記方法のpH条件は、pH4.0〜10.0で、好ましくはpH6.0〜pH8.5で、より好ましくは8.5である。
前記方法の温度条件は、10℃〜105℃で、好ましくは25℃〜35℃で、より好ましくは35℃である。
【０１９２】
また、本発明は、有効量の本発明の活性ポリペプチドまたはペプチジルトランスフェラーゼgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7、3GT1、3GT2、3GT3および3GT4、ならびに食品学的にまたは工業的に許容される担体または賦形剤を含む、組成物を提供する。このような担体は、水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、及びその組合せを含むが、これらに限定されない。
【０１９３】
前記の組成物に、さらに、本発明のgGT25の酵素活性を調節する物質を添加してもよい。酵素活性を向上させる機能を有すれば、どうな物質でも使用できる。好ましくは、前記の本発明のgGT25の酵素活性を向上させる物質は、メルカプトエタノールから選ばれる。また、酵素活性を低下させる物質が多く、Ca2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+およびFe2+、あるいは基質に添加すると加水分解してCa2+、Co2+、Mn2+、Ba2+、Al3+、Ni2+、Zn2+およびFe2+を形成することができる物質を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
本発明のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4を得た後、当業者は簡単にこの酵素を使用して糖転移作用、特にダンマレンジオール、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールに対する糖転移作用を発揮させることができる。本発明の好適な形態として、希少ギンセノシドを形成する2種類の方法を提供し、その一つは、本発明に係るgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7、3GT1および/または3GT2の酵素で糖転移される基質を処理することを含み、前記の基質はダンマレンジオール、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールおよびその誘導体などのテトラシクロトリテルペン系化合物を含む。好ましくは、pH3.5〜10の条件で、前記のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、 gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4の酵素で糖転移される基質を処理する好ましくは、温度30〜105℃の条件で、前記のgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、 gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4、gGT29-3、3GT1および/または3GT2の酵素で糖転移される基質を処理する
【０１９５】
そのもう一つは、本発明に係るgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、 gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4の遺伝子をダンマレンジオール、プロトパナキサジオールまたはプロトパナキサトリオールを合成することができる工学菌（例えば、酵母または大腸菌の工学菌）に導入するか、あるいはgGT25、gGT13、gGT30、gGT25-1、gGT25-3、gGT25-5、gGT29、gGT29-3、 gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6、gGT29-7および3GT1、3GT2、3GT3、3GT4の遺伝子をダンマレンジオール、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵遺伝子と宿主細胞（例えば、酵母または大腸菌）において共発現させ、直接希少ギンセノシドCK、Rh2、Rg3、Rh1またはF1の組換え菌を得ることを含む。
【０１９６】
前記のダンマレンジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子を含むが、これに限定されない。
もう一つの好適な例において、前記のプロトパナキサジオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子およびP450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。 あるいは以上の各酵素の同位酵素およびその組み合わせである。ここで、ダンマレンジオール合成酵素はオキシドスクアレン（出芽酵母自身で合成）をダンマレンジオールに転化させ、シトクロムP450 CYP716A47およびその還元酵素をダンマレンジオールをさらにプロトパナキサジオールに転化させる。（Hanら，plant & cell physiology，2011，52.2062-73）
【０１９７】
もう一つの好適な例において、前記のプロトパナキサトリオールの合成代謝経路における鍵遺伝子は、ダンマレンジオール合成酵素遺伝子、シトクロムP450 CYP716A47遺伝子、P450 CYP716A47の還元酵素遺伝子、ならびにシトクロムP450 CYP716A53V2遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。あるいは以上の各酵素の同位酵素およびその組み合わせである。ここで、ダンマレンジオール合成酵素はオキシドスクアレン（出芽酵母自身で合成）をダンマレンジオールに転化させ、シトクロムP450 CYP716A47およびその還元酵素をダンマレンジオールをさらにプロトパナキサジオールに還元し、シトクロムP450 CYP716A53v2（JX036031）およびP450 CYP716A47の還元酵素はさらにプロトパナキサジオールをプロトパナキサトリオールに転化させる。（Hanら，plant & cell physiology，2012，53. 1535-45）
【０１９８】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明の糖転移酵素は、特異的にかつ効率的にグルコースをテトラシクロトリテルペン系化合物の基質のC-20位および/またはC-6位および/またはC-3位の水酸基に転移させることができる。
（2）本発明の糖転移酵素gGT29およびgGT29-3は、糖ドナーからのグリコシル基をテトラシクロトリテルペン系化合物のC-3位の1番目のグルコシル基に転移させて糖鎖を伸長させることができる。
【０１９９】
(3)本発明の糖転移酵素は、特にそれぞれプロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールを抗癌活性を有する希少ギンセノシドCK、Rh2またはRg3および抗老化活性を有する希少ギンセノシドF1、抗アレルギー作用を有する希少ギンセノシドRh1に転化させることができる。
（4）本発明の糖転移酵素は、さらに、ダンマレンジオール、プロトパナキサトリオール、F1、25-OH-PPD、25-OCH3-PPDから今まで報告されていない新たな化合物である20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPD、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OCH3-PPD、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ラノステロールを合成することができる。
【０２００】
（5）3GT1、3GT2、gGT29、gGT29-3およびgGT25-5の触媒活性は、テトラシクロトリテルペン系化合物における20位の水酸基またはグルコシル基の空間配置の影響を受けず、20(S)配置のギンセノシド（サポゲニン）も20(R)配置のギンセノシド（サポゲニン）も触媒することができる。
（6）酵母でギンセノシドのサポゲニン（ダンマレンジオール、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオール）の合成経路を構築することによって、グルコースなどの単糖を基質とし、酵母で発酵して新たな化合物である20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオール、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPT、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1、3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ラノステロールをなどおよび希少ギンセノシドCK、F1、Rh1、Rh2およびRg3を生産することを実現させ、サポニン生産の原料源の問題を解決するだけでなく、希少ギンセノシドCK、F1、Rh1、Rh2およびRg3の生産コストを大幅に減少することもできる。
【０２０１】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。下述実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従う。
【実施例】
【０２０２】
実施例1
糖転移酵素およびそのコード遺伝子の分離
発表されたトチバニンジン属の植物の発現プロファイルのデータから100本以上の糖転移酵素を予測するcDNA配列をピックアップし、その中から60本のcDNA全長配列をクローニングして発現および糖転移反応の分析を行ったところ、その中では11種類の発現産物がギンセノシドのサポゲニンおよびサポニンに対して糖転移活性を有する。
【０２０３】
オタネニンジンのRNAを抽出して逆転写を行い、オタネニンジンのcDNAを得た。このcDNAを鋳型としてPCR増幅を行い、プライマー対1（配列番号：7、8）、プライマー対2（配列番号：9、10）、プライマー対3（配列番号：11、12）、プライマー対5（配列番号：34、35）、プライマー対7（配列番号：46、47）、プライマー対8（配列番号：62、63）、プライマー対9（配列番号：64、65）を使用し、全て増幅産物を得た。DNAポリメラーゼは、タカラバイオ株式会社の高正確性のKOD DNAポリメラーゼを使用した。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動によって検出した（図1、19（c）および31）。紫外線の照射で、標的DNAバンドを切り取った。さらに、Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN社)でアガロースゲルから、DNA、すなわち増幅されたDNA断片を回収した。このDNA断片をタカラバイオ株式会社のrTaq DNAポリメラーゼで末端にAを付加した後、市販のクローンベクターpMD18-Tに連結し、連結産物を市販の大腸菌EPI300感受性細胞に形質転換し、形質転換した大腸菌液をアンピシリン50μg/mL、IPTG 0.5mM、X-Gal 25μg/mLを入れたLBプレートに塗布し、さらにPCRおよび酵素切断によって組換えクローンを検証した。それぞれその中の一つのクローンから組換えプラスミドを抽出して配列決定した。ソフトBESTORFによって読み枠（ORF）を探した。配列アラインメントしたところ、ORFは糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域をコードするので、糖転移酵素の遺伝子であると証明された。
【０２０４】
プライマー対1（配列番号：7、8）で得られた遺伝子は、配列番号：1、15、17および19で表されるヌクレオチド配列を有し、それぞれgGT25，gGT25-1，gGT25-3およびgGT25-5とした。配列表における配列番号：1の5’末端から1〜1425番目のヌクレオチドはgGT25のタンパク質コード配列（CDS）で、配列表における配列番号：1の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT25遺伝子の開始コドンATGである。配列表における配列番号：15の5’末端から1〜1428番目のヌクレオチドはgGT25-1の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：15の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT25-1遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：15の5’末端から1426〜1428番目のヌクレオチドはgGT25-1遺伝子の終止コドンTAAである。配列表における配列番号：17の5’末端から1〜1428番目のヌクレオチドはgGT25-3の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：17の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT25-3遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：17の5’末端から1426〜1428番目のヌクレオチドはgGT25-3遺伝子の終止コドンTAAである。配列表における配列番号：19の5’末端から1〜1419番目のヌクレオチドはgGT25-5の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：19の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT25-5遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：19の5’末端から1426〜1428番目のヌクレオチドはgGT25-5遺伝子の終止コドンTAAである。
【０２０５】
プライマー対2（配列番号：9、10）で得られた遺伝子は、配列番号：3で表されるヌクレオチド配列を有し、gGT13とした。配列表における配列番号：3の5’末端から1〜1431番目のヌクレオチドはgGT13の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：3の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT13遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：1の5’末端から1429〜1431番目のヌクレオチドはgGT13遺伝子の終止コドンTAAである。
【０２０６】
プライマー対3（配列番号：11、12）で得られた遺伝子は、配列番号：5で表されるヌクレオチド配列を有し、gGT30とした。配列表における配列番号：5の5’末端から1〜1353番目のヌクレオチドはgGT30の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：5の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT30遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：5の5’末端から1351〜1353番目のヌクレオチドはgGT30遺伝子の終止コドンTAAである。
【０２０７】
プライマー対5（配列番号：34、35）で得られた遺伝子は、配列番号：25、27で表されるヌクレオチド配列を有し、それぞれgGT29およびgGT29-3とした。配列表における配列番号：25の5’末端から1〜1329番目のヌクレオチドはgGT29の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：25の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT29遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：25の5’末端から1327〜1329番目のヌクレオチドはgGT29遺伝子の終止コドンTAGである。配列表における配列番号：27の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT29-3遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：27の5’末端から1327〜1329番目のヌクレオチドはgGT29-3遺伝子の終止コドンTAGである。
【０２０８】
プライマー対6（配列番号：46、47）で得られた遺伝子は、配列番号：42で表されるヌクレオチド配列を有し、3GT4とした。配列表における配列番号：42の5’末端から1〜1374番目のヌクレオチドは3GT4の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：42の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドは3GT4遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：42の5’末端から1372〜1374番目のヌクレオチドは3GT4遺伝子の終止コドンTAGである。
【０２０９】
プライマー対7（配列番号：62、63）で得られた遺伝子は、配列番号：54、56、58で表されるヌクレオチド配列を有し、それぞれgGT29-4、gGT29-5およびgGT29-6とした。配列表における配列番号：54の5’末端から1〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-4の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：54の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT29-4遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：54の5’末端から1339〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-4遺伝子の終止コドンTAGである。配列表における配列番号：56の5’末端から1〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-5の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：56の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT29-5遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：56の5’末端から1339〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-5遺伝子の終止コドンTAGである。配列表における配列番号：58の5’末端から1〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-6の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：58の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT29-6遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：58の5’末端から1339〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-6遺伝子の終止コドンTAGである。
【０２１０】
プライマー対8（配列番号：64、65）で得られた遺伝子は、配列番号：60で表されるヌクレオチド配列を有し、gGT29-7とした。配列表における配列番号：60の5’末端から1〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-7の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：60の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドはgGT29-7遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：60の5’末端から1339〜1341番目のヌクレオチドはgGT29-7遺伝子の終止コドンTAGである。配列番号：21、23および40で表されるヌクレオチド配列を有するものを人工合成し、それぞれ3GT1、3GT2および3GT3とした。配列表における配列番号：21の5’末端から1〜1488番目のヌクレオチドは3GT1の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：21の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドは3GT1遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：21の5’末端から1486〜1488番目のヌクレオチドは3GT1遺伝子の終止コドンTAAである。配列表における配列番号：23の5’末端から1〜1488番目のヌクレオチドは3GT2の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：23の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドは3GT2遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：23の5’末端から1486〜1488番目のヌクレオチドは3GT2遺伝子の終止コドンTAAである。配列表における配列番号：40の5’末端から1〜1494番目のヌクレオチドは3GT3の読み枠（ORF）で、配列表における配列番号：40の5’末端から1〜3番目のヌクレオチドは3GT3遺伝子の開始コドンATGで、配列表における配列番号：40の5’末端から1492〜1494番目のヌクレオチドは3GT3遺伝子の終止コドンTAAである。プライマー対4（配列番号：29、30）でその中の2本の人工合成の遺伝子（配列番号：21および配列番号：23）をPCR増幅し、得られたPCR産物は、配列番号：21および配列番号：23で表されるヌクレオチド配列を有する（図19（a））。プライマー対6（配列番号：44、45）でもう1本の人工合成の遺伝子（配列番号：40）をPCR増幅し、得られたPCR産物は、配列番号：40で表されるヌクレオチド配列を有する（図19（b））。
【０２１１】
糖転移酵素遺伝子gGT25は、475個のアミノ酸を含むタンパク質gGT25をコードし、配列表における配列番号：2で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、53kDaで、等電点pIが5.14である。配列番号：2のアミノ末端から344〜387番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、オタネニンジンのトランスクリプトームで予測したサポニンの糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列との同一性が52％未満である。
【０２１２】
糖転移酵素遺伝子gGT25-1は、475個のアミノ酸を含むタンパク質gGT25-1をコードし、配列表における配列番号：16で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、53kDaで、等電点pIが4.91である。配列番号：16のアミノ末端から344〜387番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、オタネニンジンのトランスクリプトームで予測したサポニンの糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列との同一性が52％未満である。
【０２１３】
糖転移酵素遺伝子gGT25-3は、475個のアミノ酸を含むタンパク質gGT25-3をコードし、配列表における配列番号：18で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、53kDaで、等電点pIが5.05である。配列番号：18のアミノ末端から344〜387番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、オタネニンジンのトランスクリプトームで予測したサポニンの糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列との同一性が52％未満である。
【０２１４】
糖転移酵素遺伝子gGT25-5は、472個のアミノ酸を含むタンパク質gGT25-5をコードし、配列表における配列番号：20で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、53kDaで、等電点pIが4.98である。配列番号：20のアミノ末端から343〜386番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、オタネニンジンのトランスクリプトームで予測したサポニンの糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列との同一性が52％未満である。
【０２１５】
糖転移酵素遺伝子gGT13は、476個のアミノ酸を含むタンパク質gGT13をコードし、配列表における配列番号：4で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、53kDaで、等電点pIが4.91である。配列番号：4のアミノ末端から343〜386番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、オタネニンジンのトランスクリプトームで予測したサポニンの糖転移酵素遺伝子のアミノ酸配列との同一性が99.5％と最高である。
【０２１６】
糖転移酵素遺伝子gGT30は、451個のアミノ酸を含むタンパク質gGT30をコードし、配列表における配列番号：6で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、51kDaで、等電点pIが6.79である。配列番号：6のアミノ末端から318〜361番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）の糖転移酵素（XP_002271587）との類似性が最高（53％）、新しい酵素であることが示された。
【０２１７】
糖転移酵素遺伝子3GT1は、495個のアミノ酸を含むタンパク質3GT1をコードし、配列表における配列番号：22で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、56kDaで、等電点pIが5.52である。配列番号：22のアミノ末端から355〜398番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ハルザキヤマガラシ（Barbarea vulgaris）由来の糖転移酵素UGT73C10との相同性が＞99％である。
【０２１８】
糖転移酵素遺伝子3GT2は、495個のアミノ酸を含むタンパク質3GT2をコードし、配列表における配列番号：24で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、56kDaで、等電点pIが5.62である。配列番号：24のアミノ末端から355〜398番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ハルザキヤマガラシ（Barbarea vulgaris）由来の糖転移酵素UGT73C12との相同性が＞99％である。
【０２１９】
糖転移酵素遺伝子gGT29は、442個のアミノ酸を含むタンパク質gGT29をコードし、配列表における配列番号：26で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49kDaで、等電点pIが5.93である。配列番号：26のアミノ末端から317〜360番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）由来の糖転移酵素との配列類似性が56％未満である。
【０２２０】
糖転移酵素遺伝子gGT29-3は、442個のアミノ酸を含むタンパク質gGT29-3をコードし、配列表における配列番号：28で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、49kDaで、等電点pIが5.48である。配列番号：28のアミノ末端から317〜360番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）由来の糖転移酵素との配列類似性が56％未満である。
【０２２１】
糖転移酵素遺伝子3GT3は、497個のアミノ酸を含むタンパク質3GT3をコードし、配列表における配列番号：41で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、55kDaで、等電点pIが5.50である。配列番号：41のアミノ末端から350〜393番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）由来の糖転移酵素との相同性が＞99％である。
【０２２２】
糖転移酵素遺伝子3GT4は、458個のアミノ酸を含むタンパク質3GT4をコードし、配列表における配列番号：43で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、51kDaで、等電点pIが5.10である。配列番号：43のアミノ末端から333〜376番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）由来の糖転移酵素との配列相同性が50％未満である。
【０２２３】
糖転移酵素遺伝子gGT29-4は、446個のアミノ酸を含むタンパク質gGT29-4をコードし、配列表における配列番号：55で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、50kDaで、等電点pIが5.78である。配列番号：55のアミノ末端から321〜364番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ミシマサイコ（Bupleurum chinense）由来の糖転移酵素との配列類似性が57％未満である。
【０２２４】
糖転移酵素遺伝子gGT29-5は、446個のアミノ酸を含むタンパク質gGT29-5をコードし、配列表における配列番号：57で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、50kDaで、等電点pIが5.93である。配列番号：57のアミノ末端から321〜364番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ミシマサイコ（Bupleurum chinense）由来の糖転移酵素との配列類似性が58%未満である。
【０２２５】
糖転移酵素遺伝子gGT29-6は、446個のアミノ酸を含むタンパク質gGT29-6をコードし、配列表における配列番号：59で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、50kDaで、等電点pIが6.03である。配列番号：59のアミノ末端から321〜364番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ミシマサイコ（Bupleurum chinense）由来の糖転移酵素との配列類似性が59%未満である。
【０２２６】
糖転移酵素遺伝子gGT29-7は、446個のアミノ酸を含むタンパク質gGT29-7をコードし、配列表における配列番号：61で表されるアミノ酸配列を有する。ソフトでこのタンパク質の理論分子量を予測したところ、50kDaで、等電点pIが5.80である。配列番号：61のアミノ末端から321〜364番目は糖転移酵素の第一ファミリーの保存的な機能領域である。この糖転移酵素は、ミシマサイコ（Bupleurum chinense）由来の糖転移酵素との配列類似性が57％未満である。
【０２２７】
【表２】
0006479084.tif 000025
【０２２８】
実施例2
糖転移酵素遺伝子gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5の酵母組換え発現ベクターの構築
実施例1で構築されたgGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5遺伝子を含むプラスミドgGT25-pMD18T、gGT25-1-pMD18T、gGT25-3-pMD18TおよびgGT25-5-pMD18Tを鋳型として標的遺伝子を増幅した。
【０２２９】
使用されたフォワードプライマーはいずれも
5’- GCCGGAGCTCATGAAGTCAGAATTGATATTC - 3’(配列番号：13)で、その5’末端にSacI識別部位：GAGCTCが加えられ、
使用されたリバースプライマーはいずれも
5’-GCCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCATAATTTCCTCAAATAGCTTC-3’(配列番号：14)で、その5’末端にXholI識別部位：CTCGAGが加えられ、Western Blotによる発現および精製の検出のために、リバースプライマーに6×His Tagが導入された。
【０２３０】
上記プライマーおよび鋳型を使用してPCR法によってgGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5遺伝子を増幅した。DNAポリメラーゼはToyobo社の高正確性DNAポリメラーゼkodを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを94℃ 2 min；94℃ 15s、58℃ 30s、68℃ 1.5min、計30サイクル；68℃ 10min；10℃保温と設定した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって検出し、紫外線の照射で、大きさが標的DNAと一致するバンドを切り取った。さらに、AEYGEN社のAxyPrep DNA Gel Extraction KitでアガロースゲルからDNA断片を回収した。Takara社のQuickCut制限酵素Kpn IおよびXba Iで回収したDNA断片を30min切断し、AXYGEN社のAxyPrep PCR Cleanup Kitで酵素切断産物を洗浄して回収した。NEB社のT4 DNAリガーゼで酵素切断産物を出芽酵母発現プラスミドpYES2（同様にKpn IおよびXba Iで切断してゲルから切り取って回収したもの）と25℃で2h連結した。連結産物でE. coli TOP 10感受性細胞を形質転換し、かつ100μg/mLのアンピシリンを入れたLBプレートに塗布した。集落PCRで陽性形質転換体を検証し、かつ配列決定でさらに検証したところ、発現プラスミドgt25-pYES2、gt25-1-pYES2、gt25-3-pYES2およびgt25-5-pYES2の構築に成功したことがわかった。
【０２３１】
実施例3
糖転移酵素遺伝子gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5の出芽酵母における発現
電気的形質転換法によって構築した発現プラスミドgt25-pYES2を出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に形質転換し、スクリーニングプレートSC-Ura（0.67％酵母無アミノ酸基本窒素源、2％グルコース）に塗布した。集落PCRで酵母の組換え体を検証した。酵母の組換え体を10 mLのSC-Ura（2％グルコース）培地に取り、30℃、200rpmで20h培養した。4℃で3500gで遠心して菌体を収集し、無菌脱イオン水で菌体を2回洗浄し、誘導培地SC-Ura（2％ガラクトース）で菌体を再懸濁させ、かつ50 mLの誘導培地に接種し、OD600が約0.4になるようにし、30℃、200rpmで誘導発現を開始した。4℃で3500gで遠心して12h誘導発現させた菌体を収集し、無菌脱イオン水で菌体を2回洗浄し、酵母分解緩衝液に菌体を再懸濁させ、OD600が50〜100になるようにした。Fastprep細胞破砕装置で酵母細胞を振とう破砕し、4℃で12000 gで10min遠心して細胞の破片を除去し、細胞分裂液の上清を収集した。適量の分解液の上清を取ってSDS-PAGE電気泳動検出を行ったところ、pYES2ブランクベクターの組換え体と比較すると、gt25-pYES2、gt25-1-pYES2、gt25-3-pYES2、gt25-5-pYES2の組換え体は、図2のように、顕著なバンド特徴がなかった。anti-6×His Tag Western Blotで発現の状況を検出したところ、図3に示すように、gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5を発現する出芽酵母組換え体は強いWestern Blot信号を示し、gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5が酵母において溶解可能に発現されたことが示され、pYES2ブランクベクターの組換え体ではanti-6×His Tag Western Blot信号がなかった。
【０２３２】
実施例4
酵母発現産物gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5の糖転移反応および産物の同定
gGT25、gGT25-1、gGT25-3およびgGT25-5を発現する組換え酵母の分解液の上清を酵素液として基質であるプロトパナキサジオール(Protopanoxadiol PPD)、プロトパナキサトリオール(Protopanaxatriol PPT)およびダンマレンジオール（Dammarenediol II，DM）の糖転移反応を触媒し、発現ブランクベクターの組換え酵母の分解液の上清を対照とした。100μL反応系は表3に示す。
【０２３３】
【表３】
0006479084.tif 000026
【０２３４】
反応は35℃で12h行い、さらに100μLブタノールを入れて反応を中止させ、かつ産物を抽出した。産物を真空乾燥した後、メタノールで溶解させた。
反応産物は、まず薄層クロマトグラフィー（TLC）で検出したところ、gGT25またはgGT25-1またはgGT25-3を発現する組換え酵母の分解上清の酵素液は、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールの20位の水酸基をグリコシル化し、それぞれ希少ギンセノシドCKおよびF1に転化させることができた（図6および図7）。3位の水酸基が六炭糖基化されたプロトパナキサジオール型サポニン（Rh2およびRg3）は、gGT25、gGT25-1およびgGT25-3の触媒で、20位の水酸基をさらにグリコシル化し、それぞれF2およびRdを生成することができた（図6）。gGT25、gGT25-1およびgGT25-3は、PPTの20位の水酸基をグリコシル化してF1を生成することだけでなく、さらに6位の水酸基ををグリコシル化してRg1を生成することもできた（図7）。gGT25、gGT25-1およびgGT25-3は、さらに、PPDの前駆体であるダンマレンジオールの20位の水酸基ををグリコシル化し、報告されていなかったサポニンである20-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオールを得ることができた（図8）。しかし、6位の水酸基が既にグリコシル化されたプロトパナキサトリオール型サポニン（Rh1、Rg2およびRf）はgGT25、gGT25-1およびgGT25-3の触媒で20位の水酸基をグリコシル化することができない。同時に、gGT25、gGT25-1およびgGT25-3は、糖鎖の伸長も触媒することができない。gGT25-5は、gGT25、gGT25-1およびgGT25-3と触媒活性が違い、gGT25、gGT25-1およびgGT25-3のように、PPD、PPTまたはダンマレンジオールの20位の水酸基をグリコシル化することができず、PPTの6位の水酸基をグリコシル化して希少ギンセノシドRh1に転化させることしかできなかった（図7）。
【０２３５】
さらにgGT25の転化産物をHPLCで同定した（図10および図11）。図10では、3つのピークが現れ、中では、ピーク2はサンプルにおけるCKの保持時間と、ピーク3はプロトパナキサジオールのピークと一致した。ピーク3はかなり小さくなったことは、プロトパナキサジオールがほとんどCKに転化されたことを示した。ピーク1は、陰性対照のグラフにも現れたため、プロトパナキサジオールの転化とは無関係のはずである。図11でも、3つのピークが現れ、ピーク1はサンプルにおけるF1の保持時間と、ピーク3はプロトパナキサトリオールのピークと一致した。ピーク3はかなり小さくなったことは、プロトパナキサトリオールがほとんどF1に転化されたことを示した。ピーク2は、陰性対照のグラフにも現れたため、プロトパナキサトリオールの転化とは無関係のはずである。
【０２３６】
最後に、LC/MSで産物に対してさらなる同定を行った（図12および図13）。図12はプロトパナキサジオールの転化産物におけるCKピーク（図10におけるピーク2）に対する質量分析グラフで、標準CKサンプルの質量分析グラフと完全に一致した。図13はプロトパナキサトリオールの転化産物におけるF1ピーク（図11におけるピーク1）に対する質量分析グラフで、標準サンプルF1の質量分析グラフと完全に一致した。これらの結果から、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサトリオールのgGT25転化産物がそれぞれCKおよびF1であることがさらに実証された。
【０２３７】
実施例5
糖転移酵素遺伝子gGT13およびgGT30のクローニング、発現およびその発現産物の糖転移反応
実施例2と同じ方法で、gGT13およびgGT30のクローンを得、これらの酵母組換え発現ベクターを構築して出芽酵母を形質転化した。実施例3と同じ工程で糖転移酵素の発現を誘導したところ、SDS-PAGEゲルには顕著な標的タンパク質のバンドがなかったが（図4）、Western Blotで顕著なハイブリダイズの信号が検出されたため、gGT13およびgGT30はいずれも酵母において発現されたことが示された（図5）。
【０２３８】
実施例4と同じ方法で、gGT13およびgGT30を発現する組換え酵母細胞分解液でそれぞれプロトパナキサジオール(PPD)およびプロトパナキサトリオール(PPT)を触媒した。
【０２３９】
結果、gGT13およびgGT30のタンパク質発現産物はいずれもPPDまたはPPTを転換させることができず（図9）、かつgGT13およびgGT30はプロトパナキサジオール型サポニンRh2、CK、F2およびRg3ならびにプロトパナキサトリオール型のF1、Rh1およびRg1も転化することができなかったことがわかった。
以上の結果から、gGT13はオタネニンジンのトランスクリプトームで予測したギンセノシドの糖転移酵素のアミノ酸配列との一致性が高いが（99.5％）、gGT13およびgGT30は上記の基質のいずれにも糖転移作用がないことが示された。
【０２４０】
実施例6
糖転移酵素遺伝子gGT25の大腸菌における発現およびその発現産物の糖転移反応
実施例1で構築されたgGT25遺伝子を含むプラスミドgGT25-pMD18Tを鋳型として標的遺伝子gGT25を増幅し、かつそれを大腸菌発現ベクターpet28a（Merck社から購入）にクローニングし、大腸菌発現ベクターgt25-pet28aを構築し、市販のE. coli BL21を形質転換した。組換え体をLB培地に接種し、30℃、200rpmでOD600が約0.6〜0.8になるまで培養し、菌液の温度を4℃に下げ、最終濃度が50 μMになるようにIPTGを入れ、18℃、200rpmで15 h誘導発現させた。4℃で遠心して菌体を収集し、超音波で細胞を破砕し、4℃、12000 gで遠心して細胞分解液の上清を収集し、サンプルを取ってSDS-PAGE電気泳動を行った。
【０２４１】
Western Blot（図14）では、50 μMのIPTGの誘導条件で、糖転移酵素gGT25は大腸菌においても発現することができることが示された。この組換え大腸菌の細胞分解液の上清を粗製酵素液として糖転移反応を行い、反応の条件は実施例4におけるものと同じであった。
反応は35℃で12h行い、さらに100μLブタノールを入れて反応を中止させ、かつ産物を抽出した。産物を真空乾燥した後、メタノールで溶解させた。反応産物は、まず薄層クロマトグラフィー（TLC）で検出したところ、図15ではgGT25粗製酵素液はPPDをCKに転化させることができたことがわかる。
【０２４２】
実施例7
CK生産酵母工学菌の構築および産物の同定
pESC-HISプラスミド((Stratagene，Agilent)には、同時にダンマレンジオール合成酵素(Dammarenediol synthase)（ACZ71036.1）(GAL1/GAL10 GAL10側プロモーター、ADH1ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A47（AEY75213.1）(FBA1プロモーター、CYC1ターミネーター)および糖転移酵素GT25(GAL1/GAL10 GAL1側プロモーター、TDH2ターミネーター)を取り付け、遊離型プラスミドを構成し、出芽酵母BY4742を形質転換し、かつシロイヌナズナ由来のシトクロムP450還元酵素ATR2-1（NP_849472.2）を出芽酵母BY4742染色体における染色体trp1遺伝子部位(GAL1プロモーター、trp1本来のターミネーターを利用する)に取り込み、組換え酵母Aを構築した。同じ方法で組換え酵母Bを構築し、その違いは、シロイヌナズナ由来の還元酵素ATR2-1をダンマレンジオール合成酵素、シトクロムP450 CYP716A47および糖転移酵素GT25を含む組換えプラスミドに取り込み、ATR2-1のプロモーターおよびターミネーターはそれぞれTEF2プロモーターおよびTPI1ターミネーターとし、ほかの3つの遺伝子のプロモーターおよびターミネーターは組換え菌Aの相応の遺伝子と同様である。
【０２４３】
組換え酵母Bと同じ方法で組換え酵母菌Cを構築したが、表4のように各遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを変更した。
【０２４４】
【表４】
0006479084.tif 000027
【０２４５】
組換え酵母菌株A、B、CをSC-Ura（0.67％酵母無アミノ酸基本窒素源、2％ガラクトース）培地で発酵させ、各組換え菌の別途に添加する必要のあるアミノ酸またはウラシルを表5に示し、50mLの組換え酵母の発酵液を取り、遠心して沈殿した菌体を5mLNo酵母分解緩衝液(50mM Tris-Hcl、1mM EDTA、1mM PMSF、5％グリセリン、pH 7.5)で再懸濁させた後、Fastprepで分解酵母を振とうし、出力を6M/Sとし、7〜8回振とうして酵母を十分に分解した。分解液を2mLのEP管に1mLずつ移し、等体積（1mL）のn-ブタノールを入れて30min抽出した後、12000gで10min遠心した。上清を吸い取って新しいEP管に移した。45℃かつ真空の条件で、n-ブタノールを蒸発させて乾燥した。100μLのメタノールで溶解させた後、HPLCで検出した。
【０２４６】
HPLC分析の結果、組換え酵母Aの細胞分解液にダンマレンジオール、プロトパナキサジオール（PPD）およびギンセノシド活性代謝物CKが含まれ（図16）、酵母Aで合成されたCKの収量が0.6mg/Lに達した。HPLC分析によって組換え酵母BおよびCの細胞分解液にも微量のCKが見られた。
【０２４７】
【表５】
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【０２４８】
実施例8
Rh1生産酵母工学菌の構築および産物の同定
pESC-HISプラスミド((Stratagene，Agilent)には、同時にダンマレンジオール合成酵素(Dammarenediol synthase)（ACZ71036.1）(GAL1/GAL10 GAL10側プロモーター、ADH1ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A47（AEY75213.1）(FBA1プロモーター、CYC1ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A53V2基因（ENO2プロモーター、CYC1ターミネーター）および糖転移酵素gGT25-5(GAL1/GAL10 GAL1側プロモーター、TDH2ターミネーター)を取り付け、遊離型プラスミドを構成し、出芽酵母BY4742を形質転換し、かつシロイヌナズナ由来のシトクロムP450還元酵素ATR2-1（NP_849472.2）を出芽酵母BY4742染色体における染色体trp1遺伝子部位(GAL1プロモーター、trp1本来のターミネーターを利用する)に取り込み、組換え酵母A3を構築した。組換え酵母菌に別途に添加する相応のアミノ酸またはウラシルを表5に示す。
【０２４９】
組換え酵母A3の分解液を2mLのEP管に1mLずつ移し、等体積（1mL）のn-ブタノールを入れて30min抽出した後、12000gで10min遠心した。上清を吸い取って新しいEP管に移した。45℃かつ真空の条件で、n-ブタノールを蒸発させて乾燥した。100μLのメタノールで溶解させた後、HPLCで検出した。
HPLC分析の結果、組換え酵母A3の細胞分解液にプロトパナキサトリオール（PPT）およびギンセノシド活性代謝物Rh1が含まれた（図41）。
【０２５０】
実施例9
糖転移酵素遺伝子3GT1、3GT2、3GT3および3GT4の大腸菌組換え発現ベクターの構築
実施例1で構築された3GT1および3GT2遺伝子を含むプラスミド3GT1-pMD18T、3GT2-pMD18Tを鋳型として標的遺伝子を増幅した。
3GT1および3GT2に使用されたフォワードプライマーはいずれも配列番号：31で、その5’末端にBamH I識別部位：GGATCCが付加され、3GT1に使用されたリバースプライマーは配列番号：32で、その5’末端にSal I識別部位：CTCGAGが付加され、3GT2に使用されたリバースプライマーは配列番号：33で、その5’末端にSal I識別部位：CTCGAGが付加された。
【０２５１】
上記プライマーおよび鋳型を使用してPCR法によって3GT1および3GT2遺伝子を増幅した。DNAポリメラーゼはToyobo社の高正確性DNAポリメラーゼKODを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを94℃ 2 min；94℃ 15s、58℃ 30s、68℃ 1.5min、計35サイクル；68℃ 10min；10℃保温と設定した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって検出し、紫外線の照射で、大きさが標的DNAと一致するバンドを切り取った。さらに、AEYGEN社のAxyPrep DNA Gel Extraction KitでアガロースゲルからDNA断片を回収した。Takara社のQuickCut制限酵素Kpn IおよびXba Iで回収したDNA断片を30min切断し、AXYGEN社のAxyPrep PCR Cleanup Kitで酵素切断産物を洗浄して回収した。NEB社のT4 DNAリガーゼで酵素切断産物を大腸菌発現プラスミドpET28a（同様にBamH IおよびSal Iで切断してゲルから切り取って回収したもの）と16℃で4h連結した。連結産物でE. coli EPI300感受性細胞を形質転換し、かつ50μg/mLのカナマイシンを入れたLBプレートに塗布した。集落PCRで陽性形質転換体を検証し、かつ配列決定でさらに検証したところ、発現プラスミド3GT1-pET28aおよび3GT2-pET28aの構築に成功したことがわかった。
【０２５２】
実施例1で構築された3GT3および3GT4遺伝子を含むプラスミド3GT3-pMD18T、3GT4-pMD18Tを鋳型として標的遺伝子を増幅した。
3GT3に使用されたフォワードプライマーは配列番号：48で表され、その5’末端にベクターpET28aと相同の配列：ACTTTAAGAAGGAGATATACCが付加され、3GT3に使用されたリバースプライマーは配列番号：49で表され、その5’末端にベクターpET28aと相同の配列：CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTが付加された。
【０２５３】
3GT4に使用されたフォワードプライマーは配列番号：50で、その5’末端にベクターpET28aと相同の配列：ACTTTAAGAAGGAGATATACCが付加され、3GT4に使用されたリバースプライマーは配列番号：51で、その5’末端にベクターpET28aと相同の塩基18個の断片：CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTが付加された。
【０２５４】
上記プライマーおよび鋳型を使用してPCR法によって3GT3および3GT4遺伝子を増幅した。遺伝子の増幅はNEB社のQ5高正確性DNAポリメラーゼを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを98℃ 30s；98℃ 15s、58℃ 30s、72℃ 1min、計35サイクル；72℃ 2min；10℃保温と設定した。
【０２５５】
同時に、配列番号：52および配列番号：53をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用してベクターpET28aを増幅し、線状化したベクターpET28aを得た。pET28a線状化ベクターの増幅もNEB社のQ5高正確性DNAポリメラーゼを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを98℃ 30s；98℃ 15s、58℃ 30s、72℃ 3min、計35サイクル；72℃ 2min；10℃保温と設定した。
【０２５６】
上記3GT3および3GT4遺伝子のPCR産物および線状化したベクターpET28aをアガロースゲル電気泳動によって検出した後、紫外線の照射で、大きさが標的DNAと一致するバンドを切り取った。さらに、AEYGEN社のAxyPrep DNA Gel Extraction KitでアガロースゲルからDNA断片を回収した。諾晶生物科技有限公司のBGclonartシームレスクローニングキットの説明書を参照し、回収した線状化したpET28aベクター断片、回収した3GT3または3GT4遺伝子断片および諾晶生物科技有限公司のBGclonartシームレスクローニング反応液を適切な比率で混合し、計20μlとした。均一に混合した後、50℃で30分間インキュベートし、さらに混合反応液を氷の上に移した。5μlの反応液でE. coli EPI300感受性細胞を形質転換し、かつ50μg/mLのカナマイシンを入れたLBプレートに塗布した。集落PCRで陽性形質転換体を検証し、かつ配列決定でさらに検証したところ、発現プラスミド3GT3-pET28aおよび3GT4-pET28aの構築に成功したことがわかった。
【０２５７】
実施例10
糖転移酵素遺伝子3GT1、3GT2、3GT3および3GT4の大腸菌における発現
実施例9で構築された大腸菌発現ベクター3GT1-pET28a、3GT2-pET28a、3GT3-pET28aおよび3GT4-pET28aで、市販のE. coli BL21を形質転換した。組換え体をLB培地に接種し、30℃、200rpmでOD600が約0.6〜0.8になるまで培養し、菌液の温度を4℃に下げ、最終濃度が50 μMになるようにIPTGを入れ、18℃、200rpmで15 h誘導発現させた。4℃で遠心して菌体を収集し、超音波で細胞を破砕し、4℃、12000 gで遠心して細胞分解液の上清を収集し、サンプルを取ってSDS-PAGE電気泳動を行った（図20）。pet28aブランクベクターの組換え体と比較すると、3GT1-pET28a、3GT2-pET28a、3GT3-pET28aおよび3GT4-pET28aの組換え体に顕著なバンドがあって（約55KD）3GT1、3GT2、3GT3および3GT4を特徴づける。Western Blotの結果からも（図21）、標的タンパク質3GT1、3GT2、3GT3および3GT4は宿主において溶解可能に発現が実現したことが証明された。
【０２５８】
実施例11
大腸菌発現産物3GT1、3GT2、3GT3および3GT4の糖転移反応および産物の同定
3GT1、3GT2、3GT3および3GT4を発現する組換え大腸菌分解上清を粗製酵素液としてギンセノシドおよびサポゲニンの糖転移反応を触媒し、発現ブランクベクターの組換え大腸菌分解上清を対照とした。100μL反応系は表3に示す。反応は35℃で12h行い、さらに100μLブタノールを入れて反応を中止させ、かつ産物を抽出した。産物を真空乾燥した後、メタノールで溶解させた。
【０２５９】
反応産物は、まず薄層クロマトグラフィー（TLC）で検出したところ（図22〜28）、3GT1、3GT2、3GT3および3GT4の粗製酵素液は、プロトパナキサジオール（PPD）のC3位の水酸基をグリコシル化し、それぞれ希少ギンセノシドRh2に転化させることができた（図22、27（a）および図28（a））。20位の水酸基が六炭糖基化されたプロトパナキサジオール型サポニン（CK）は、3GT1、3GT2および3GT4の触媒で、3位の水酸基をさらにグリコシル化し、それぞれF2を生成することができた（図22および図28（b））。糖転移酵素3GT1および3GT2gは、さらに、それぞれダンマレンジオールDMのC3位の水酸基をグリコシル化し、新たな化合物である3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ダンマレンジオールに転化させることができた（図23）。糖転移酵素3GT1、3GT2、3GT3および3GT4は、25-OH-PPDのC3位の水酸基をグリコシル化し、新たな化合物である3-O-β-(D-グルコピラノシル)-25-OH-PPDに転化させることができた（図23、図27（c）および図28（c））。3GT1、3GT2および3GT3は、さらに、ダンマレントリオール（PPT）のC3位の水酸基をグリコシル化し、報告されていなかった新たなサポニンである3-O-β-(D-グルコピラノシル)-PPTに転化させることができた（図24および図27（b））。3GT1および3GT2は、さらに、F1のC3位の水酸基をグリコシル化し、報告されていなかった新たなサポニンである3-O-β-(D-グルコピラノシル)-F1に転化させることができた（図24）。3GT1および3GT2は、さらに、ラノステロール（lanosterol）のC3位の水酸基をグリコシル化し、新たな化合物である3-O-β-(D-グルコピラノシル)-ラノステロールに転化させることができた（図26）。同時に、3GT1および3GT2の触媒活性は、20位の水酸基またはグリコシル基の空間配置の影響を受けず、例えば、20(S)-PPDを触媒するだけでなく、20(R)-PPDを触媒して希少ギンセノシドである20(R)-ギンセノシドRh2を生成することもできた（図25）。3GT1、3GT2、3GT3および3GT4の4種類の糖転移酵素はいずれもテトラシクロトリテルペンのサポゲニンの3位にグリコシル基を導入することができたが、触媒できる基質の種類は大きく異なる。表6に示すように、3GT1および3GT2が触媒できる基質は最も多く、3GT3が触媒できる基質は最も少ないが、3GT4の特異性が最も良く、プロトパナキサジオールおよびプロトパナキサジオール型（CK）サポニンしか触媒することができない。
【０２６０】
さらにHPLCで3GT1、3GT3および3GT4によってPPDが触媒されて生成した産物を検出した（図29）。図29では、糖転移酵素3GT1、3GT3および3GT4によってPPDが触媒されて生成した産物にはいずれも同じ保持時間のピーク（P1、P2およびP3）が現れ、サンプルにおけるギンセノシドRh2の保持時間と一致し、糖転移酵素3GT1、3GT3および3GT4によってPPDが触媒されてギンセノシドRh2が生成したことが示された。最後に、LC/MSで図29におけるP1、P2およびP3の3つのサンプルピークを質量分析した（図30）ところ、標準サンプルのギンセノシドRh2の質量分析グラフと完全に一致し、さらに糖転移酵素3GT1、3GT3および3GT4によってPPDが触媒されて生成した産物はRh2であったことが示された。
【０２６１】
糖転移酵素3GT1、3GT2、3GT3および3GT4が触媒できる基質の比較は表6に示す。
【表６】
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【０２６２】
実施例12
Rh2生産酵母工学菌の構築および産物の同定
12.1  pESC-HISプラスミド((Stratagene，Agilent)には、同時にダンマレンジオール合成酵素(Dammarenediol synthase)（ACZ71036.1）(GAL1/GAL10 GAL10側プロモーター、ADH1ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A47（AEY75213.1）(FBA1プロモーター、CYC1ターミネーター)および糖転移酵素3GT4(GAL1/GAL10 GAL1側プロモーター、TDH2ターミネーター)を取り付け、遊離型プラスミドを構成し、出芽酵母BY4742を形質転換し、かつシロイヌナズナ由来のシトクロムP450還元酵素ATR2-1（NP_849472.2）を出芽酵母BY4742染色体における染色体trp1遺伝子部位(GAL1プロモーター、trp1本来のターミネーターを利用する)に取り込み、組換え酵母A1を構築した。組換え酵母菌に別途に添加する相応のアミノ酸またはウラシルを表5に示す。
【０２６３】
組換え酵母A1の分解液を2mLのEP管に1mLずつ移し、等体積（1mL）のn-ブタノールを入れて30min抽出した後、12000gで10min遠心した。上清を吸い取って新しいEP管に移した。45℃かつ真空の条件で、n-ブタノールを蒸発させて乾燥した。100μLのメタノールで溶解させた後、HPLCで検出した。
HPLC分析の結果（図39）、組換え酵母Aの細胞分解液にダンマレンジオール、プロトパナキサジオール（PPD）およびギンセノシド活性代謝物Rh2が含まれた。
【０２６４】
12.2  方法は12.1と同様で、その違いは3GT4の代わりに糖転移酵素3GT1を使用し、組換え酵母A5を得た。
結果は、図43のように、HPLC分析によって、組換え酵母A5の細胞分解液にダンマレンジオール、プロトパナキサジオール（PPD）およびギンセノシド活性代謝物Rh2が含まれた。
【０２６５】
実施例13
糖転移酵素遺伝子gGT29およびgGT29-3の酵母組換え発現ベクターの構築
それぞれ実施例1で構築されたgGT29およびgGT29-3遺伝子を含むプラスミドgGT29-pMD18TおよびgGT29-3-pMD18Tを鋳型として標的遺伝子を増幅した。
gGT29に使用されたフォワードプライマーはいずれも配列番号：36で、その5’末端にKpn I識別部位：GGATCCが加えられ、使用されたリバースプライマーはいずれも配列番号：37で、その5’末端にXho I識別部位：CTCGAGが加えられ、Western Blotによる発現および精製の検出のために、リバースプライマーに6×His Tagが導入された。
【０２６６】
gGT29-3に使用されたフォワードプライマーはいずれも配列番号：38で、その5’末端にKpn I識別部位：GGATCCが加えられ、使用されたリバースプライマーはいずれも配列番号：39で、その5’末端にXho I識別部位：CTCGAGが加えられ、Western Blotによる発現および精製の検出のために、リバースプライマーに6×His Tagが導入された。
【０２６７】
プラスミドgGT29-pMD18TおよびgGT29-3-pMD18Tを鋳型とし、上記プライマーでPCR方法によってgGT29およびgGT29-3の遺伝子を増幅した。DNAポリメラーゼはToyobo社の高正確性DNAポリメラーゼkodを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを94℃ 2 min；94℃ 15s、58℃ 30s、68℃ 1.5min、計30サイクル；68℃ 10min；10℃保温と設定した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって検出し、紫外線の照射で、大きさが標的DNAと一致するバンドを切り取った。さらに、AEYGEN社のAxyPrep DNA Gel Extraction KitでアガロースゲルからDNA断片を回収した。Takara社のQuickCut制限酵素Kpn IおよびXba Iで回収したDNA断片を30min切断し、AXYGEN社のAxyPrep PCR Cleanup Kitで酵素切断産物を洗浄して回収した。NEB社のT4 DNAリガーゼで酵素切断産物を出芽酵母発現プラスミドpYES2（同様にKpn IおよびXba Iで切断してゲルから切り取って回収したもの）と25℃で2h連結した。連結産物でE. coli TOP 10感受性細胞を形質転換し、かつ100μg/mLのアンピシリンを入れたLBプレートに塗布した。集落PCRで陽性形質転換体を検証し、かつ配列決定でさらに検証したところ、発現プラスミドgGT29-pYES2およびgGT29-3-pYES2の構築に成功したことがわかった。
【０２６８】
実施例14
糖転移酵素遺伝子gGT29およびgGT29-3の出芽酵母における発現
電気的形質転換法によって構築した発現プラスミドgGT29-pYES2およびgGT29-3-pYES2を出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）に形質転換し、スクリーニングプレートSC-Ura（0.67％酵母無アミノ酸基本窒素源、2％グルコース）に塗布した。集落PCRで酵母の組換え体を検証した。酵母の組換え体を10 mLのSC-Ura（2％グルコース）培地に取り、30℃、200rpmで20h培養した。4℃で3500gで遠心して菌体を収集し、無菌脱イオン水で菌体を2回洗浄し、誘導培地SC-Ura（2％ガラクトース）で菌体を再懸濁させ、かつ50 mLの誘導培地に接種し、OD600が約0.4になるようにし、30℃、200rpmで誘導発現を開始した。4℃で3500gで遠心して12h誘導発現させた菌体を収集し、無菌脱イオン水で菌体を2回洗浄し、酵母分解緩衝液に菌体を再懸濁させ、OD600が50〜100になるようにした。Fastprep細胞破砕装置で酵母細胞を振とう破砕し、4℃で12000 gで10min遠心して細胞の破片を除去し、細胞分裂液の上清を収集した。適量の分解液の上清を取ってSDS-PAGE電気泳動検出を行ったところ、pYES2ブランクベクターの組換え体と比較すると、gGT29-pYES2およびgGT29-3-pYES2の組換え体は、顕著なバンド特徴がなかった（図32）。anti-6×His Tag Western Blotで発現の状況を検出したところ、gGT29およびgGT29-3を発現する出芽酵母組換え体は強いWestern Blot信号を示し、gGT29およびgGT29-3がいずれも酵母において溶解可能に発現されたことが示され、pYES2ブランクベクターの組換え体ではanti-6×His Tag Western Blot信号がなかった（図33）。
【０２６９】
実施例15
酵母発現産物gGT29およびgGT29-3の糖転移反応および産物の同定
gGT29およびgGT29-3を発現する組換え酵母分解上清を酵素液としてギンセノシドRh2およびF2の糖転移反応を触媒し、発現ブランクベクターの組換え酵母分解上清を対照とした。100μL反応系は表3に示す。反応は35℃で12h行い、さらに100μLブタノールを入れて反応を中止させ、かつ産物を抽出した。産物を真空乾燥した後、メタノールで溶解させた。
【０２７０】
反応産物は、まず薄層クロマトグラフィー（TLC）で検出したところ、gGT29およびgGT29-3を発現する酵母宿主の分解上清の酵素液は、ギンセノシドRh2およびF2の3位のグリコシル基をさらに1個のグリコシル基で伸長させ、ギンセノシドRg3およびRdに転化させた（図34）。gGT29およびgGT29-3の触媒活性は、ギンセノシドの20位のグリコシル基または水酸基の配置の影響を受けず、20(R)-Rh2を20(R)-Rg3に転化させることができた（図36）。
【０２７１】
実施例16
糖転移酵素3GT1/3GT4およびgGT29の共同糖転移反応および産物の同定
3GT1または3GT4を発現する大腸菌宿主の分解上清およびgGT29を発言する酵母宿主の分解上清を酵素液として共同にプロトパナキサジオール（PPD）を触媒した。100μL反応系は表3に示す。73.4μLの酵素液には、40μLは3GT1の大腸菌宿主の分解上清で、残りの33.4μLはgGT29を発現する酵母宿主の分解上清であった。反応は35℃で12h行い、さらに100μLブタノールを入れて反応を中止させ、かつ産物を抽出した。産物を真空乾燥した後、メタノールで溶解させた。反応産物は、まず薄層クロマトグラフィー（TLC）で検出した（図35）ところ、糖転移酵素3GT1およびgGT29あるいは3GT4およびgGT29を併用するといずれもPPDをRg3に転化させることができたことがわかる。
【０２７２】
糖転移酵素3GT1およびgGT29あるいは3GT4およびgGT29を併用すると、いずれも20(R)-PPDを触媒して20(R)-Rg3を生成した（図36）。
【０２７３】
実施例17
Rg3生産酵母工学菌の構築および産物の同定
17.1  pESC-HISプラスミド((Stratagene，Agilent)には、同時にダンマレンジオール合成酵素(Dammarenediol synthase)（ACZ71036.1）(GAL1/GAL10 GAL10側プロモーター、ADH1ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A47（AEY75213.1）(FBA1プロモーター、CYC1ターミネーター)および糖転移酵素3GT4およびgGT29(GAL1/GAL10 GAL1側プロモーター、TDH2ターミネーター)を取り付け、遊離型プラスミドを構成し、出芽酵母BY4742を形質転換し、かつシロイヌナズナ由来のシトクロムP450還元酵素ATR2-1（NP_849472.2）を出芽酵母BY4742染色体における染色体trp1遺伝子部位(GAL1プロモーター、trp1本来のターミネーターを利用する)に取り込み、組換え酵母A2を構築した。組換え酵母菌に別途に添加する相応のアミノ酸またはウラシルを表5に示す。
【０２７４】
組換え酵母A2の分解液を2mLのEP管に1mLずつ移し、等体積（1mL）のn-ブタノールを入れて30min抽出した後、12000gで10min遠心した。上清を吸い取って新しいEP管に移した。45℃かつ真空の条件で、n-ブタノールを蒸発させて乾燥した。100μLのメタノールで溶解させた後、HPLCで検出した。
HPLC分析の結果、組換え酵母A2の細胞分解液にダンマレンジオール、プロトパナキサジオール（PPD）およびギンセノシド活性代謝物Rg3が含まれた（図40）。
【０２７５】
17.2  方法は17.1と同様で、その違いは3GT4の代わりに糖転移酵素3GT1を使用し、組換え酵母A6を得た。HPLC分析の結果、組換え酵母A6の細胞分解液にもダンマレンジオール、プロトパナキサジオール（PPD）およびギンセノシド活性代謝物Rg3が含まれた。
【０２７６】
実施例18
F1生産酵母工学菌の構築および産物の同定
pESC-HISプラスミド((Stratagene，Agilent)には、同時にダンマレンジオール合成酵素(Dammarenediol synthase)（ACZ71036.1）(GAL1/GAL10 GAL10側プロモーター、ADH1ターミネーター)、糖転移酵素gGT25(GAL1/GAL10 GAL1側プロモーター、TDH2ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A47（AEY75213.1）(FBA1プロモーター、FBA1ターミネーター)、シトクロムP450 CYP716A53V2（ENO2プロモーター、CYC1ターミネーター)を取り付けて遊離型プラスミドを構成し、出芽酵母BY4742を形質転換し、かつシロイヌナズナ由来のシトクロムP450還元酵素ATR2-1（NP_849472.2）を出芽酵母BY4742染色体における染色体trp1遺伝子部位(GAL1プロモーター、trp1本来のターミネーターを利用する)に取り込み、組換え酵母A4を構築した。組換え酵母菌に別途に添加する相応のアミノ酸またはウラシルを表5に示す。
【０２７７】
組換え酵母A4の分解液を2mLのEP管に1mLずつ移し、等体積（1mL）のn-ブタノールを入れて30min抽出した後、12000gで10min遠心した。上清を吸い取って新しいEP管に移した。45℃かつ真空の条件で、n-ブタノールを蒸発させて乾燥した。100μLのメタノールで溶解させた後、HPLCで検出した。
HPLC分析の結果、組換え酵母A4の細胞分解液にプロトパナキサトリオール（PPT）およびギンセノシド活性代謝物F1が含まれた（図42）。
【０２７８】
実施例19
糖転移酵素遺伝子gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7の大腸菌組換え発現ベクターの構築
実施例1で構築されたgGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7遺伝子を含むプラスミドgGT29-4-pMD18T、gGT29-5-pMD18T、gGT29-6-pMD18TおよびgGT29-7-pMD18Tを鋳型として標的遺伝子を増幅した。
【０２７９】
gGT29-5およびgGT29-6遺伝子に使用されたフォワードプライマーは配列番号：66で表され、その5’末端にベクターpET28aと相同の配列：CTGGTGCCGCGCGGCAGCが付加され、使用されたリバースプライマーは配列番号：68で表され、その5’末端にベクターpET28aと相同の配列：TGCGGCCGCAAGCTTGTCが付加された。
gGT29-4およびgGT29-7遺伝子に使用されたフォワードプライマーは配列番号：67で、その5’末端にベクターpET28aと相同の配列：CTGGTGCCGCGCGGCAGCが付加され、使用されたリバースプライマーは配列番号：68で、その5’末端にベクターpET28aと相同の塩基18個の断片：TGCGGCCGCAAGCTTGTCが付加された。
【０２８０】
上記プライマーおよび鋳型を使用してPCR法によってgGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7遺伝子を増幅した。遺伝子の増幅はNEB社のQ5高正確性DNAポリメラーゼを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを98℃ 30s；98℃ 15s、58℃ 30s、72℃ 1min、計35サイクル；72℃ 2min；10℃保温と設定した。
【０２８１】
同時に、配列番号：69および配列番号：70をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして使用してベクターpET28aを増幅し、線状化したベクターpET28aを得た。pET28a線状化ベクターの増幅もNEB社のQ5高正確性DNAポリメラーゼを使用し、その説明書を参照してPCRプログラムを98℃ 30s；98℃ 15s、58℃ 30s、72℃ 3min、計35サイクル；72℃ 2min；10℃保温と設定した。
【０２８２】
上記gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7遺伝子のPCR産物および線状化したベクターpET28aをアガロースゲル電気泳動によって検出した後、紫外線の照射で、大きさが標的DNAと一致するバンドを切り取った。さらに、AEYGEN社のAxyPrep DNA Gel Extraction KitでアガロースゲルからDNA断片を回収した。諾晶生物科技有限公司のBGclonartシームレスクローニングキットの説明書を参照し、回収した線状化したpET28aベクター断片、回収したgGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7遺伝子断片および諾晶生物科技有限公司のBGclonartシームレスクローニング反応液を適切な比率で混合し、計20μlとした。均一に混合した後、50℃で30分間インキュベートし、さらに混合反応液を氷の上に移した。5μlの反応液でE. coli EPI300感受性細胞を形質転換し、かつ50μg/mLのカナマイシンを入れたLBプレートに塗布した。集落PCRで陽性形質転換体を検証し、かつ配列決定でさらに検証したところ、発現プラスミドgGT29-4-pET28a，gGT29-5-pET28a，gGT29-6-pET28a和gGT29-7-pET28aの構築に成功したことがわかった。
【０２８３】
実施例20
糖転移酵素遺伝子gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7の大腸菌における発現
実施例19で構築された大腸菌発現ベクターgGT29-4-pET28a、gGT29-5-pET28a、gGT29-6-pET28aおよびgGT29-7-pET28aで、市販のE. coli BL21を形質転換した。組換え体をLB培地に接種し、30℃、200rpmでOD600が約0.6〜0.8になるまで培養し、菌液の温度を4℃に下げ、最終濃度が50 μMになるようにIPTGを入れ、18℃、200rpmで15 h誘導発現させた。4℃で遠心して菌体を収集し、超音波で細胞を破砕し、4℃、12000 gで遠心して細胞分解液の上清を収集し、サンプルを取ってSDS-PAGE電気泳動を行った（図44）。gGT29-4-pET28a、gGT29-5-pET28a、gGT29-6-pET28aおよびgGT29-7-pET28a組換え体の分解液および全タンパク質および上清のいずれにも顕著な目標タンパク質のバンド（約50KD）があり、それぞれ糖転移酵素gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7を特徴づけた。Western Blotの結果からも（図45）、標的タンパク質gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7は宿主において溶解可能に発現が実現したことが証明された。
【０２８４】
実施例21
大腸菌発現産物gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7の糖転移反応および産物の同定
gGT29-4、gGT29-5、gGT29-6およびgGT29-7を発現する組換え酵母分解上清を酵素液としてギンセノシドRh2およびF2の糖転移反応を触媒した。100μL反応系は表3に示す。反応は35℃で12h行い、さらに100μLブタノールを入れて反応を中止させ、かつ産物を抽出した。産物を真空乾燥した後、メタノールで溶解させた。
【０２８５】
反応産物は、薄層クロマトグラフィー（TLC）で検出したところ、gGT29-6を発現する粗製酵素液は、ギンセノシドRh2およびF2の3位のグリコシル基をさらに1個のグリコシル基で伸長させ、それぞれギンセノシドRg3およびRdを生成することができた（図46）。gGT29-4、gGT29-5およびgGT29-7を発現する粗製酵素液は、ギンセノシドF2の3位のグリコシル基をさらに1個のグリコシル基で伸長させてギンセノシドRdを生成することができたが、サポニンRh2を触媒することができなかった（図46）。
【０２８６】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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