(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して５％以下であり、且つ、糸引きが良好であると共に、菌膜が均一に広がっている納豆を製造できる性質を有する、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株を、ジピコリン酸を含有する液体培地にて培養して胞子懸濁液を調製し、得られた胞子懸濁液を、蒸煮大豆又は煮大豆に植菌し発酵させて製造されたことを特徴とする納豆。
【請求項２】
請求項１に記載の納豆であって、発酵後、５５〜１００℃で３０〜２００分加熱殺菌されたことを特徴とする納豆。
【請求項３】
請求項２に記載の納豆であって、胞子数が１０５/納豆ｇ以下であり、総菌数が１０６/納豆ｇ以下である納豆。
【請求項４】
納豆を製造するにあたり、ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して５％以下であり、且つ、糸引きが良好であると共に、菌膜が均一に広がっている納豆を製造できる性質を有する、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株を、ジピコリン酸を含有する液体培地にて培養して胞子懸濁液を調製し、得られた胞子懸濁液を、蒸煮大豆又は煮大豆に植菌し発酵させることを特徴とする、納豆の製造方法。
【請求項５】
発酵後、５５〜１００℃で３０〜２００分加熱殺菌する、請求項４に記載の納豆の製造方法。
【請求項６】
納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞を低減するにあたり、ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して５％以下であり、且つ、糸引きが良好であると共に、菌膜が均一に広がっている納豆を製造できる性質を有する、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株を、ジピコリン酸を含有する液体培地にて培養して胞子懸濁液を調製し、得られた胞子懸濁液を、蒸煮大豆又は煮大豆に植菌し発酵させ、納豆を製造することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
【請求項７】
発酵後、５５〜１００℃で３０〜２００分加熱殺菌する、請求項６に記載の納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、納豆上での胞子形成能を低下させた納豆菌変異株、及び、当該変異株を用いて製造された加熱殺菌が可能な納豆に関する。より詳しくは、ジピコリン酸合成酵素遺伝子が欠損されているために、納豆発酵時には胞子形成能が低下しているが、ジピコリン酸を添加した培地での培養時には正常な胞子形成能を有する納豆菌変異株、当該変異株を用いて製造された納豆、その製造方法、並びに、当該変異株を用いる納豆の胞子及び栄養細胞の低減方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品の消費又は賞味期限内において、一般的な加工食品１ｇあたりの生菌数は１×１０５から１×１０６以下に抑える必要がある。
【０００３】
納豆菌の胞子は、物理的、化学的に安定である。従って、納豆を加工食品に利用する場合は、当該加工食品はもとより、当該食品の製造ラインにおいても納豆菌胞子の付着が問題となる。例えば、納豆菌胞子の除菌・殺菌が不十分であると、上記加工食品の製造ラインにおいて納豆を利用しない加工食品を製造する場合、納豆菌胞子の混入の危険性が生じ、その結果納豆の加工食品への利用は限られることになる。
【０００４】
納豆中の胞子を減らすためには１２０℃程度の加熱が必要であるが、当該加熱条件では納豆の品質を保持することは困難である。胞子を形成し難い納豆菌の使用により、あるいは、胞子を形成させない発酵条件によって、納豆中の胞子数を減らすことは可能であっても、納豆の品質は十分には確保し難い。
【０００５】
従来、納豆中の胞子数が少ない納豆を製造する方法としては、胞子形成率の低い納豆菌を利用した乾燥納豆に殺菌処理を施すという方法（特許文献１参照）や、胞子形成率の低いタイミングで殺菌を施すという方法（特許文献２参照）が報告されている。乾燥納豆を利用した方法では、生の納豆ではないため、食感の違いが出てしまい、また、胞子形成率の低いタイミングでの殺菌は、栄養細胞の殺菌を主とするものであることから、胞子数を減少させるのには不十分であった。
【０００６】
さらに、ｓｉｇＫ遺伝子などの胞子形成遺伝子が欠損されており、該欠損が、該遺伝子の薬剤耐性遺伝子での置換によるものである納豆菌変異株を用いて製造される納豆が報告されている（特許文献３参照）。しかしながら、これらの遺伝子はコート形成など多くの胞子形成期特異的遺伝子の発現制御に関与するため、当該遺伝子破壊株では正常な胞子形成能を回復することができない、というのが当業者の一般常識であり、純粋培養において胞子を調製することが困難である。
【０００７】
一般的な納豆製造法では、蒸煮工程後の高温の大豆に、純粋培養した納豆菌胞子を植菌する盛り込み工程を行い、納豆菌による発酵工程を行う。ここで、純粋培養した上記納豆菌変異株を高温条件で植菌すると、耐熱性の低い栄養細胞が死滅してしまい納豆発酵ができない。そのため、蒸煮した大豆の温度を下げて低温条件にする工程を追加しなければ盛り込みができず、さらに低温条件であるために雑菌汚染が生じやすいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００６−６１１７号公報
【特許文献２】特開２００６−１４１２０９号公報
【特許文献３】特開２０１１−１０６３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
通常の納豆菌を用いて製造した納豆中には耐熱性のある胞子が多く含まれているため、既存の設備においては納豆の加熱殺菌（胞子数の低減）は不可能な状況にある。また、通常の納豆製造法では盛り込みに胞子を用いる。蒸煮した熱い大豆に栄養細胞の納豆菌を噴霧すると、納豆菌が死んでしまい良好な発酵が得られない。そのため、従来の胞子化しない納豆菌株を用いると、盛り込みを低い温度で行う必要が生じるため、雑菌汚染の問題が生じ、衛生的な納豆を製造できない、などの課題があった。
【００１０】
そこで、本発明は、培地では胞子化して胞子液を調製することができ、かつ納豆上では胞子化しにくい納豆菌を取得することにより、上記の従来技術の問題を解決することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するには、通常の培地では胞子化するが、納豆中では胞子化しない変異株を作製し、納豆を殺菌すればよいと考えた。
【００１２】
納豆菌の胞子に含まれるジピコリン酸は耐熱性を生じる成分であり、これを欠くと耐熱性が低下する（胞子ができにくい）。それゆえ、納豆菌のジピコリン酸合成酵素遺伝子(spoVFAまたはspoVFB)を破壊すれば、自分でジピコリン酸を合成できなくなり、胞子化がジピコリン酸の存在下でのみ起こるようになると考えられた。
【００１３】
そこで、本発明者は納豆菌のspoVFA遺伝子破壊株を作製し、それを用いて納豆を製造したところ、納豆にはジピコリン酸が含まれていないため、納豆発酵中に新たに胞子形成されず、胞子の少ない納豆が得られた。
【００１４】
一方、上述の株をジピコリン酸を含有する培地で培養すると、通常の納豆菌と同様に胞子形成能を有しており、従来の納豆製造法に用いうる植菌用納豆菌を調製することができた。この植菌用納豆菌は胞子化しているため、高温で盛り込みを行っても十分に発酵の進んだ納豆ができ、豆を低温化する工程を追加する必要がなく、雑菌汚染の問題もない。
【００１５】
本発明は、当該知見に基づいてなされたものである。
すなわち、請求項１に係る本発明は、ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して５％以下であり、且つ、糸引きが良好であると共に、菌膜が均一に広がっている納豆を製造できる性質を有する、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株を、ジピコリン酸を含有する液体培地にて培養して胞子懸濁液を調製し、得られた胞子懸濁液を、蒸煮大豆又は煮大豆に植菌し発酵させて製造されたことを特徴とする納豆に関する。
請求項２に係る本発明は、請求項１に記載の納豆であって、発酵後、５５〜１００℃で３０〜２００分加熱殺菌されたことを特徴とする納豆に関する。
請求項３に係る本発明は、請求項２に記載の納豆であって、胞子数が１０５/納豆ｇ以下であり、総菌数が１０６/納豆ｇ以下である納豆に関する。
請求項４に係る本発明は、納豆を製造するにあたり、ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して５％以下であり、且つ、糸引きが良好であると共に、菌膜が均一に広がっている納豆を製造できる性質を有する、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株を、ジピコリン酸を含有する液体培地にて培養して胞子懸濁液を調製し、得られた胞子懸濁液を、蒸煮大豆又は煮大豆に植菌し発酵させることを特徴とする、納豆の製造方法に関する。
請求項５に係る本発明は、発酵後、５５〜１００℃で３０〜２００分加熱殺菌する、請求項４に記載の納豆の製造方法に関する。
請求項６に係る本発明は、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞を低減するにあたり、ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して５％以下であり、且つ、糸引きが良好であると共に、菌膜が均一に広がっている納豆を製造できる性質を有する、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）変異株を、ジピコリン酸を含有する液体培地にて培養して胞子懸濁液を調製し、得られた胞子懸濁液を、蒸煮大豆又は煮大豆に植菌し発酵させ、納豆を製造することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法に関する。
請求項７に係る本発明は、発酵後、５５〜１００℃で３０〜２００分加熱殺菌する、請求項６に記載の納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によって、発酵不良や雑菌汚染といった問題がなく、既存の設備、工程によって容易に胞子の含有量が少ない納豆を提供することができる。
また、本発明の納豆は胞子が少ないため、栄養細胞が死滅する温度で加熱殺菌（胞子数の低減）が可能である。それゆえ、本発明の納豆は、納豆以外の製造ラインなどにおいて納豆菌胞子の混入の危険性が少なく、各種加工食品の製造に供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、具体的な実施形態を挙げて本発明を詳細に説明する。
本発明は、納豆発酵時には胞子形成能が低下しているが、ジピコリン酸を添加した培地での培養時には胞子形成が正常な納豆菌変異株に関する。
【００１８】
［新規納豆菌変異株の菌学的性質］
本発明の新規納豆菌変異株は、ジピコリン酸を含まない納豆上では胞子形成能が著しく低下しているが、ジピコリン酸を添加した培地では正常な胞子形成能を有する納豆菌変異株である。
【００１９】
本発明の新規納豆菌変異株は、胞子形成能以外の点においては、以下に示す通り、親株である納豆菌と同等の菌学的性質を有している。したがって、通常の納豆菌と同様に、糸引き及び外観が良好な納豆を製造できる性質を有している。
【００２０】
ここで納豆菌とは、枯草菌バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）の変種（B. subtilis var.natto、B. subtilis (natto)）に分類される細菌である。分類体系によっては、枯草菌の近縁種バチルス・ナットウ（B. natto）として分類される場合もある。
【００２１】
・形態的特徴
当該新規納豆菌変異株の栄養細胞は、大きさ2〜3μm程度の桿菌であり運動性を有する。また、グラム染色性を有する。胞子の形状は楕円形であり、大きさは1.12〜1.28μm程度である。
【００２２】
・培養的性質
当該新規納豆菌変異株の寒天平板培地上でのコロニーの形状は環状である。当該コロニーは、表面に皺があり、光沢が無く、色調が不透明〜乳白色であり、中央部の隆起がない特徴を有する。なお、グルタミン酸に富む培地上でのコロニーは粘調性を有する。
当該新規納豆菌変異株を液体培地で培養すると、培養後の培地表面に菌膜が形成される。また、培養液は混濁する。
【００２３】
・炭素源資化性
当該新規納豆菌変異株は、グルコース, シュクロースに対する資化性を有する。一方、ラクトース, アラビノースに対する資化性を有さない。
【００２４】
・生理学的性質
当該新規納豆菌変異株は、好気性細菌であり、ビオチン要求性を示し、最少培地での生育が可能である。また、プロテアーゼ活性を有する。また、クエン酸塩を利用して生育が可能である。胞子形成にジピコリン酸を要求する。
【００２５】
・温度特性
当該新規納豆菌変異株は、通常の納豆菌の生育温度帯である37〜40℃付近で好適な生育能を有し、通常の納豆菌と同等の増殖速度により増殖する。
【００２６】
［胞子形成能］
当該新規納豆菌変異株の胞子形成能は、培養液中の胞子数の測定結果を指標として判定することができる。胞子数の測定は、培養液を加熱処理した後、寒天培地を用いて耐熱性菌数を求めることにより行うことができる。
具体的には、胞子を形成しうる液体培地（例えば後述の実施例１（表４）に記載の胞子形成培地）に植菌し、液相温度37℃にて24時間振盪培養して得られた培養液を、７５℃で１５分間加熱処理した後、LB寒天培地に塗末培養して出現したコロニー数から算出することができる。
【００２７】
当該新規納豆菌変異株は、胞子形成にジピコリン酸を必要とし、ジピコリン酸不存在下では胞子形成能が著しく低下する。具体的には、ジピコリン酸を含まない培地での胞子形成能が、ジピコリン酸を２００μｇ／ｍＬ以上含む培地での胞子形成能に対して、好ましくは５％以下、より好ましくは４％以下、さらに好ましくは３％以下、特に好ましくは２％以下、最も好ましくは１％以下である。
【００２８】
また、当該新規納豆菌変異株は、ジピコリン酸を添加した培地では正常な胞子形成能を有する。ここで「正常な胞子形成能」とは、通常の納豆菌と同等の胞子形成能を指し、具体的には培養液中の胞子数を総菌数で割ることにより算出される胞子形成率（％）が好ましくは７０％以上、より好ましくは７３％以上、特に好ましくは７５％以上であることを指す。
【００２９】
ここで、総菌数（胞子と栄養細胞の総和）の測定は、培養液を適切に希釈した後、寒天培地に塗抹培養することにより行うことができる。具体的には、液体培地（例えば胞子形成培地）に植菌し、液相温度37℃にて24時間振盪培養して得られた培養液を、リン酸緩衝液にて希釈し、LB寒天培地に塗抹培養して出現したコロニー数から算出することができる。
【００３０】
［選抜菌株］
本発明の納豆上での胞子形成能が低下した新規納豆菌変異株は、上記のような胞子数の測定法により自然界からスクリーニングすることができる。また、人為的に変異を導入することによっても得ることができる。人為的に変異を導入する方法としては、例えばニトロソグアニジン（NTG）処理、エチルメタンスルホン酸（EMS）処理などの化学的手法、紫外線処理などの物理的手法、後述する実施例1に記載の方法のような遺伝子工学的手法を採用することができ、特に限定されるものではない。
【００３１】
遺伝子工学的手法において、ターゲットとなる遺伝子としては、ジピコリン酸合成酵素（spoVFA及び／またはspoVFB）遺伝子を用いることが好ましい。ジピコリン酸は納豆菌の胞子に含まれ、耐熱性を生じる成分であり、この遺伝子が欠損されると耐熱性が低下する（胞子ができにくい）。spoVFA及び／またはspoVFB遺伝子を破壊すると、自身でジピコリン酸を合成できないため、胞子化がジピコリン酸の存在下でのみ起こるようになる。
【００３２】
遺伝子工学的手法においてターゲット遺伝子に変異を導入する方法としては、ポイントミューテーションや、欠失、置換、挿入失活など遺伝子産物の活性を低下させ得る方法であれば何でもよく、特に限定されるものではない。
【００３３】
遺伝子置換又は挿入による変異導入法において、ターゲット遺伝子を置換する又はターゲット遺伝子に挿入する変異用遺伝子としては、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子を用いることが好ましい。
【００３４】
また、遺伝子工学的手法を納豆菌に利用するためには、納豆菌への変異用遺伝子の導入が必要であるが、そのような方法としては、自然形質転換能を利用したコンピテンス法や、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ファージを利用した形質導入法などがあるが、変異用遺伝子を導入することが可能な方法であれば何であっても良く、特に限定されるものではない。
【００３５】
当該新規納豆菌変異株の親株としては、如何なる納豆菌も採用することができる。例えば、一般的な市販菌である宮城野菌、高橋菌、成瀬菌等を用いることができるが、特定の性質を有する突然変異株、遺伝子組み換え株などの各種菌株を利用することもできる。なお、後述する実施例で例示したr22/pDG-comK株は、正常な胞子形成能を有する菌株であり、出願人が自社開発した菌株である。
【００３６】
本発明の新規納豆菌変異株として具体的な菌株としては、DPA2株,DPA3株,DPA6株を挙げることができる。これらの菌株は、コンピテンス法を利用して、後述する実施例1に記載の方法により、納豆菌r22/pDG-comK株のspoVFA遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換した納豆菌変異株の中から、胞子形成能及び発酵品質を指標として何段階もの選抜を経て選抜された菌株である。当該選抜株は、納豆上での胞子形成能が極めて低く、且つ納豆の品質特性が優れた新規納豆菌変異株である。
【００３７】
当該選抜株のうち、特にDPA6株は総合的に最も優れた性質を有する菌株であったため、本願出願人は、当該菌株を独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託申請した。当該菌株は、受託番号 NITE BP-02166としてDPA6の名称で2015年11月27日付で国際寄託が認められている。
【００３８】
また、本発明の納豆上での胞子形成能低下納豆菌変異株としては、前記選抜菌に由来する納豆菌変異株、又は、前記選抜菌を突然変異させて作出した納豆菌変異株、又は、前記選抜菌に遺伝子導入し形質転換して作出した納豆菌変異株であって、；胞子形成能及び発酵品質に関する上記性質を有する納豆菌株であれば、；本発明の新規納豆菌変異株に該当する。
【００３９】
［納豆の製造］
本発明では、上記納豆菌変異株を用いて納豆を製造することによって、加熱処理による殺菌又は滅菌が可能な納豆を製造することが可能となる。ここで、殺菌、滅菌とは、納豆菌胞子数及び栄養細胞数の低減を意味する。
本発明において、納豆の製造方法としては、納豆菌として上記納豆菌変異株を用いることを除いては、常法に従って納豆を製造することができる。
【００４０】
・原料大豆
本発明の納豆の製造方法では、通常の納豆の製造に用いることができる如何なる原料をも用いることができる。例えば、丸大豆、半割大豆、割砕大豆（引き割り納豆の原料）、脱脂大豆などを使用できる。特に高品質の納豆製造時に使用される中粒や大粒のものが好適である。これらの大豆は、生のまま用いることもできるが、乾燥処理を行ったもの（乾燥品）を用いることが一般的である。
【００４１】
本発明では、原料の大豆を常法により蒸煮大豆又は煮大豆にして用いる。成分の流亡を防ぐ意味では、蒸煮大豆が好適である。なお、蒸煮や煮る操作を行う前には、原料大豆を水に浸漬し、膨潤させて用いることが望ましい。
ここで、蒸煮大豆の具体的な調製手順としては、大豆を水中に6〜24時間程度浸漬した後、水切りして、100〜135℃の蒸気で10〜30分の蒸煮処理する方法を採用することができる。また、0.12〜0.22Mpaの高圧条件にて、加圧蒸煮する方法を採用することもできる。
また、煮大豆の具体的な調製手順としては、大豆を水中に6〜24時間程度浸漬した後、90〜100℃の湯で20〜50分間煮込む方法を採用することができる。
【００４２】
・植菌（盛り込み）
本発明の納豆の製造方法において、上記納豆菌変異株の接種に用いる納豆菌の状態としては、胞子状態のものを用いることが好適である。胞子状態の納豆菌は、安定保存が可能で取扱いが容易であり、熱い煮豆等への接種の際にも死滅しないため、豆の雑菌汚染を防ぐことができる。また、胞子状態の納豆菌は、熱によるヒートショックにより、大豆への接種後速やかに発芽させることが可能となる。
【００４３】
大豆等への上記納豆菌変異株の植菌は、発酵を均一に行うため、大豆等と納豆菌が均一になるように添加（又は、接種, 散布など）した後、混合等を行うことが望ましい。好ましくは、上記納豆菌変異株の胞子懸濁液を調製し、液体状態にて添加して用いることが好適である。
【００４４】
ここで胞子懸濁液としては、ジピコリン酸を含有する液体培地（例えばグルタミン酸やグルコースを主原料とした合成培地、大豆煮汁、豆乳、酵母エキスなどを含む液体培地等）にて上記納豆菌変異株を培養した培養液を用いることができる。
【００４５】
植菌する納豆菌の数としては、常法に準じた菌濃度で特に限定はないが、蒸煮大豆1gあたり10３〜10６個、好ましくは10３〜10５個、最も好ましくは10３〜10４個であることが望ましい。
【００４６】
植菌する際の大豆の品温としては、55〜95℃、好ましくは60〜95℃、より好ましくは65〜95℃、さらに好ましくは70〜90℃、特に好ましくは75〜90℃とすることができる。上記範囲より大豆の品温が低い場合は雑菌汚染が生じる恐れがあり、また上記範囲より大豆の品温が高い場合は納豆菌胞子が死滅してしまい発酵不良となる恐れがある。
【００４７】
上記納豆菌変異株を植菌した大豆は、1〜数食分用の個容器に充填した後、個容器内にて後述する発酵を行うことが好適である。また、伝統的な方法として、煮沸した藁苞に充填して行うことも可能である。
また、数リットル体積容の容器等にて発酵を行うことも可能であるが、表面積に対する体積の値が大きくなると、中央部の豆に温度変化が伝わりにくくなることを考慮すると、大きめの容器を用いることは望ましくない。
【００４８】
ここで個容器としては、豆の充填が可能であれば、どんな容器を用いることもできる。また、後述する加熱殺菌を行う場合は、その加熱処理に耐えうる容器を用いる。具体的には納豆で一般に用いられるようなオパレイ(非塩ビ系ポリオレフィン樹脂)、PP、PSP、PS等を用いた合成樹脂性の容器や、カップ状の紙製の容器を用いることができる。
また、容器の形状として、当該容器を用いて直接、喫食のための掻き混ぜ（攪拌）ができるような形状のものが好適である。
また、発酵後は、蓋やシーリングによる封を行うことができる態様のものが好適である。
【００４９】
・発酵
本発明の納豆の製造方法において、納豆の発酵は、豆の品温を実質的に37〜53℃（好ましくは40〜50℃）である通常の納豆発酵温度帯に維持することで行うことが可能である。
また、本発明においては、室温を30〜50℃（好ましくは35〜45℃）の温度帯に維持することによって、発酵中の豆の品温を上記温度帯に維持することが可能となる。発酵熱によって豆の品温が上昇し、上記温度帯に維持されるためである。
豆の品温を、当該発酵温度帯に維持する所定時間（発酵時間）としては、特に制限はないが、12〜24時間、好ましくは16〜20時間を挙げることができる。
当該温度帯で発酵が進行することによって、納豆らしい風味の付与、柔らかい納豆らしい食感の付与、菌膜形成により白みがかった色調の付与、糸引き性の付与（ネバの付与）などが促進される。
【００５０】
なお、当該発酵において「実質的に温度帯に維持する」とは、完全に当該温度帯を外れないことを意味するものではなく、例えば、若干の温度範囲（例えば、2℃以内、好ましくは1℃以内）で、若干の時間（例えば、10分以内、好ましくは5分以内）であれば、当該温度帯を外れた品温となった場合も、当該発酵条件を満たすことを意味する。
【００５１】
・加熱殺菌
上述の納豆菌変異株はジピコリン酸を含まない納豆上では新たに胞子形成できないことから、上記発酵後に納豆菌栄養細胞を死滅させうる条件で加熱処理することにより、効果的に納豆を殺菌又は滅菌することが可能である。従って、本発明の納豆の製造方法においては、上記発酵後に加熱殺菌処理を行うことが好ましい。
【００５２】
本発明の加熱殺菌における処理条件は、通常の納豆菌（親株）の栄養細胞を死滅させ得る条件とすることができる。具体的な処理条件としては55〜100℃、好ましくは60〜90℃、より好ましくは60〜75℃で、30〜200分間、好ましくは60〜180分間、より好ましくは90〜150分間、特に好ましくは110〜130分間である。このとき、湿度は相対湿度で0〜60％とすることができる。
【００５３】
当該加熱殺菌は、処理条件を変えて2段階で行ってもよい。例えば、1段階目の加熱殺菌処理を55〜75℃、好ましくは60〜70℃、より好ましくは65±3℃で、相対湿度30〜90％、好ましくは40〜80％、より好ましくは50〜70％、さらに好ましくは55〜65％、特に好ましくは60±3％で、60〜120分間、好ましくは70〜110分間、より好ましくは80〜100分間、さらに好ましくは85〜95分間の条件で行った後に、2段階目の加熱殺菌処理を60〜100℃、65〜90℃、好ましくは70〜80℃、より好ましくは75±3℃で、相対湿度0〜20％、好ましくは0〜10％、より好ましくは0％で、10〜80分間、好ましくは20〜70分間、より好ましくは30〜60分間、さらに好ましくは40〜50分間の条件で行うことができる。
【００５４】
・熟成
上記の加熱殺菌処理終了後、二次発酵を抑制するために、通常、3℃以上10℃未満、好ましくは3℃以上8℃未満、より好ましくは3℃以上6℃未満の低温になるようにして6時間〜3日間、好ましくは8時間〜2日間、より好ましくは24時間程度、熟成を行い、製造は完了する。
【００５５】
［製造された納豆の性質］
・胞子含有量
上記の方法により製造された本発明の納豆は、通常の納豆と比べて納豆菌胞子含有量が少ないものである。なぜなら、納豆にはジピコリン酸が含まれていないため、発酵工程中に当該納豆菌変異株が新たに胞子形成できない（胞子形成能が極めて低い）ためである。通常の納豆中の納豆菌胞子数は納豆１ｇ当たり１０７個から１０９個程度であるが、本発明の納豆中の納豆菌胞子数は納豆１ｇ当たり１０５個以下、好ましくは５×１０４個以下、より好ましくは３×１０４個以下とすることができる。また、上記納豆菌変異株は新たに胞子形成できない（胞子形成能が極めて低い）ため、本発明の納豆中の胞子数は納豆の賞味又は消費期限内を通じて上記範囲内に維持される。
従って、本発明の納豆は、加工食品の原料として利用した場合でも、工場の製造ラインを胞子で汚染するおそれが少ないため、幅広い加工食品に適用可能である。
【００５６】
なお、納豆中の胞子数の測定は、例えば納豆懸濁液を加熱処理した後、寒天培地を用いて耐熱性菌数を求めることにより行うことができる。具体的には、納豆をストマッカー袋と呼ばれるフィルターの付いた袋に入れてリン酸緩衝液を注入し、ストマッカーと呼ばれる機器にて懸濁した納豆懸濁液をさらにリン酸緩衝液にて希釈し、それを75℃で15分間加熱処理した後、LB寒天培地に塗抹培養して、そこに出現したコロニー数から算出することができる。
【００５７】
・栄養細胞含有量
上記の製造方法において発酵後に加熱殺菌工程を行った場合に製造される本発明の納豆は、発酵後に加熱殺菌を行わない通常の納豆と比べて、納豆菌栄養細胞含有量が少ないものである。具体的には、加熱殺菌処理条件によって異なるが、納豆製造直後の総菌数として、納豆１ｇ当たり１０６個以下、好ましくは５×１０５個以下、より好ましくは３×１０５個以下、さらに好ましくは１０５個以下、特に好ましくは８×１０４個以下とすることができる。
【００５８】
ここで、総菌数（胞子と栄養細胞の総和）の測定は、納豆懸濁液の菌数を寒天培地を用いて求めることにより行うことができる。具体的には、納豆をストマッカー袋に入れてリン酸緩衝液を注入し、ストマッカーにて懸濁した納豆懸濁液をさらにリン酸緩衝液にて希釈した後、LB寒天培地に塗抹培養して、そこに出現したコロニー数から算出することができる。
【００５９】
・納豆の品質
上記の方法により製造された本発明の納豆は、十分な糸引き性（ネバ）を有し、菌膜が均一に広がって納豆らしい良好な外観を有する納豆となる。
【００６０】
［胞子及び栄養細胞の低減方法］
本発明においては、上記の方法に従い納豆を製造することによって、納豆菌の胞子及び栄養細胞の含有量が低減された納豆を製造することができる。従って、本発明は、上記納豆菌変異株を用いて納豆を製造することを特徴とする、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞の低減方法を提供するものである。
【００６１】
本発明においては、納豆発酵後に上記の加熱殺菌工程を行うことで、納豆における納豆菌の胞子及び栄養細胞（特に栄養細胞）の含有量を顕著に低減することができる。当該加熱殺菌における処理条件は上述の通りであるが、例えば55〜100℃、好ましくは60〜90℃、より好ましくは60〜75℃で、30〜200分間、好ましくは60〜180分間、より好ましくは90〜150分間、特に好ましくは110〜130分間とすることができる。このとき、湿度は相対湿度で0〜60％とすることができる。また、上述したように、当該加熱殺菌は処理条件を変えて2段階で行うこともできる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。
【００６３】
実施例１（ジピコリン酸合成能欠損納豆菌の作成）
出願人が自社開発した納豆菌r22/pDG-comK株を宿主に用いて、相同組換えによりspoVFA遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換したspoVFA遺伝子破壊株を作製した。
【００６４】
１．spoVFA遺伝子破壊株の作製
（1）核酸供与体の調製
まず、定法に従いr22/pDG-comK株ゲノムDNAを調製した。次に、spoVFA遺伝子上流部（約2.5kb）を配列表の配列番号1、2に記載のプライマーを用いて、spoVFA遺伝子下流部（約3.0kb）を配列番号3、4に記載のプライマーを用いて、r22/pDG-comK株ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅した。また、クロラムフェニコール耐性遺伝子（約0.7kbp）は、pC194（ATCC 37128株保有のプラスミド）を鋳型として、配列番号5、6に記載のプライマーを用いてPCRにより増幅した。尚、PCRはTakara ExTaq（タカラバイオ）を用いて添付のマニュアルの推奨条件にて行った（以下同様）。
【００６５】
得られたPCR産物はGenElute PCR Clean-Up Kit（シグマ）を用いて精製を行い、FusionPCRに供した。尚、非特異増幅が見られたPCR産物は、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社製）を用いて精製を行い、FusionPCRに供した。当該FusionPCRにより、spoVFA遺伝子の代わりとしてクロラムフェニコール耐性遺伝子を挟むように、それぞれ増幅したspoVFA遺伝子の上流、クロラムフェニコール耐性遺伝子、およびspoVFA遺伝子の下流を連結した。
【００６６】
（FusionPCR条件）
・組成：×10ExTaqBuffer 10μL、dNTP 8μL、各100μM Primer 1μL、鋳型2.5μL、ExTaq 0.5μL／100μL
・PCRサイクル：95℃、5min.→（95℃、0.5min.→55℃、0.5min.→72℃、7min.）×30→72℃、7min.
【００６７】
次いで、FusionPCRにより得られたPCR産物を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、ゲル中の目的のバンド（約6.2kbp）を切り出してQIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン）で精製を行った。さらに、得られた精製物を鋳型として、配列番号7、8に記載のプライマーを用いて以下の条件でnested  PCRを行うことにより、遺伝子破壊用の核酸供与体を調製した。
【００６８】
（nested PCR条件）
・組成：×10ExTaqBuffer 10μL、dNTP 8μL、各100μM Primer 1μL、鋳型1μL、ExTaq 0.5μL／100μL
・PCRサイクル：95℃、5min.→（95℃、0.5min.→55℃、0.5min.→72℃、7min.)×30→72℃、7min.
【００６９】
（2）spoVFA遺伝子破壊株の取得
r22/pDG-comK株からCI培地を用いてコンピテントセルを調製し、上記(1)で調製した核酸供与体を使用して形質転換を行った。
【００７０】
すなわち、r22/pDG-comK株をカナマイシン（7.5μg/ml）入りLB寒天培地に植菌し、28℃、16hr培養し、出現したコロニーを再度カナマイシン入りLB寒天培地6枚に植菌し28℃、16hr培養した。LB寒天培地に出現したコロニーのうち若いコロニーを選び、白金耳でカナマイシン（7.5μg/ml）入りCI培地 5.5ml（MM培地 10ml、50％(w/v)グルコース水溶液 0.1ml、1M硫酸マグネシウム7水和物水溶液 0.1ml、5％(w/v)酵母エキス水溶液 0.1ml、0.1g/lビオチン水溶液 0.01ml）に懸濁し、ボルテックスミキサーにて激しく攪拌した。2〜3分間自然沈降させ不溶物を取り除いて得られた懸濁液を、カナマイシン入りCI培地44.5mlを含む坂口フラスコに添加し37℃、120rpmで振盪培養した。
尚、懸濁液の添加量は濁度がOD660＝0.04〜0.06となるように調整し、濁度は分光光度計（HITACHI U-2000）を用い660nmにて測定した。
【００７１】
【表１】
0006618792.tif 000002
寒天培地には寒天15g/lを加える。
【００７２】
【表２】
0006618792.tif 000003
【００７３】
培養液は経時的にその濁度を測定し、対数増殖期から定常期になった時点から１時間後に、培養液から菌体を集菌した。尚、集菌は培養液0.5mlをエッペンドルフチューブに分取し、遠心分離（10,000rpm、4℃、1min.）し、上清の一部を除いた後、再度同条件で遠心分離し上清を完全に除去し、コンピテントセルを沈殿として得た。
【００７４】
次に、得られたコンピテントセルにカナマイシン（7.5μg/ml）入りCII培地（MM培地 10ml、50％グルコース水溶液 0.1ml、1M硫酸マグネシウム7水和物水溶液 0.1ml、5％酵母エキス水溶液 0.05ml、0.1g/lビオチン水溶液 0.01ml）1.0mlを加え穏やかに懸濁した。この懸濁液0.1mlに上記(1)で調製した供与DNA1μgを加え、37℃、150rpm、1.5hr振盪培養しコンピテントセルにDNAを取り込ませた。さらに、この培養液にLB培地0．3mlを加え、37℃、150rpm、2hr振盪培養し、カナマイシン及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を発現させた後、カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に塗抹培養（37℃、一夜）した。
【００７５】
（3）形質転換体の確認
カナマイシン及びクロラムフェニコールを含むLB寒天培地にて単一コロニー分離後、クロラムフェニコールを含むLB培地5mlに植菌し、37℃、150rpm、一夜振盪培養した。得られた培養液約0.3mlから遠心分離（12000rpm、4℃、1min.）により菌体を取得し、DNeasy Tissue Kit(キアゲン製)を用いてゲノムを抽出した。このゲノムを鋳型として、配列番号9、10に記載のプライマーを用いてPCR増幅を行い、目的とする0.75kbpのPCR産物の増幅の有無で組換えを確認した。
得られた形質転換体20株の中から、ジピコリン酸非添加培地での胞子形成能が低く、且つ、納豆の製造が可能であった６株（DAP1〜6）を選抜し、以下の試験に供試した。
【００７６】
（3）他の遺伝子破壊株
なお、比較例として、上記と同様の方法により、r22/pDG-comK株を宿主とし、sigK（胞子形成後期に作用するシグマ因子）遺伝子をエリスロマイシン耐性遺伝子（pE194由来）により置換した遺伝子破壊株（sigK2〜4）、dacB（胞子の耐熱性に関与するペニシリン結合蛋白質）遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子（pC194由来）により置換した遺伝子破壊株（dacB1〜4）、およびasnO（胞子形成期に作用するアスパラギン合成酵素）遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子（pC194由来）により置換した遺伝子破壊株（asnO3,6）を作製し、以下の試験に供試した。
【００７７】
２．胞子液の調製と耐熱性評価
作製した遺伝子破壊株を5ml酵母エキス培地に植菌し37℃、150rpm、一夜振盪培養した。次に酵母エキス培養液0.1mlを10ml胞子形成培地（Y入り）／試験管に植菌し37℃、150rpm、24hr振盪培養することで胞子液を調製した。また、r22/pDG-comK株についても同様の手順で胞子液を調製した。
【００７８】
【表３】
0006618792.tif 000004
*ミーストP2G（アサヒフード アンド ヘルスケア（株））
【００７９】
【表４】
0006618792.tif 000005
*ミーストP2G（アサヒフード アンド ヘルスケア（株））
【００８０】
調製した胞子液について、75℃での耐熱性を評価した。
胞子液中に含まれる胞子数は、適切に50mM燐酸Na緩衝液（pH7）で希釈した胞子液を75℃、15min.加熱した後、LB寒天培地に塗抹培養し出現したコロニー数から算出した。それぞれの胞子数測定結果を表５、６に示す。
【００８１】
【表５】
0006618792.tif 000006
「全菌数」及び「胞子数」の単位は胞子液1mlあたりの菌数。
【００８２】
【表６】
0006618792.tif 000007
「全菌数」及び「胞子数」の単位は胞子液1mlあたりの菌数。
【００８３】
表５、６から、sigK破壊株、dacB破壊株、asnO破壊株およびspoVFA破壊株において、リン酸緩衝液での胞子の耐熱性低下が確認できた。
【００８４】
３．耐熱性評価（ジピコリン酸の有無の影響）
上記のspoVFA破壊株のうち、最も胞子形成率が低かったDPA2株、最も胞子形成率が高かったDPA3株、及び胞子形成率が最も平均値に近かったDPA6株について、ジピコリン酸（DPA）存在下で胞子形成が復帰するかどうか調べた。
spoVFA破壊株を5ml酵母エキス培地に植菌し37℃、150rpm、一夜振盪培養した。次に終夜培養液0.1mlを200μg/mLのDPAを含む10ml胞子形成培地に植菌し37℃、150rpm、24hr振盪培養することで胞子液を調製した。
調製した胞子液を4℃にて4日間保存した後、胞子液中に含まれる胞子数は、適当に50mMリン酸Na緩衝液（pH7）で希釈した胞子液を75℃、15min.加熱した後、LB寒天培地に塗抹培養し出現したコロニー数から算出した。胞子数測定結果を表７に示す。
【００８５】
【表７】
0006618792.tif 000008
単位は胞子液1mlあたりの菌数。
【００８６】
表７から、spoVFA破壊株のDPA非添加の胞子形成培地での胞子数はいずれも10の6乗オーダーであったが、DPAを添加した胞子形成培地では10の8乗オーダーに回復し、親株と同等の胞子数であった。中でも、DPA6株は、DPA添加時と比較したDPA無添加での胞子形成能の低下率が最も高かったことから、以降の実施例ではこの菌株を使用した。なお、この菌株は、受託番号 NITE BP-02166として「DPA6」の名称で国際寄託されている。
また、今回は4℃で4日間保存した胞子液を用いており、DPA添加培地で大量生産した胞子を長期保存しておけば、納豆の製造において植菌用胞子として利用可能であると考えられた。
【００８７】
なお、胞子形成に関与するsigK遺伝子、asnO遺伝子を破壊した枯草菌株については、不可逆的に胞子形成が阻害されるということが、当業者の一般常識となっている。従って、上記２．でspoVFA破壊株と同様に胞子の耐熱性低下が認められたsigK破壊株及びasnO破壊株についても、これらはいずれも胞子形成に関与する遺伝子破壊株であることから、胞子形成の復帰は不可能であると考えられる。
【００８８】
実施例２（ジピコリン酸合成能欠損納豆菌を用いた納豆製造試験）
(1)納豆の製造
実施例１の３．に記載の方法（DPA添加）で調製したspoVFA破壊株の胞子液を添加して納豆を製造した。
乾燥大豆を水に終夜浸漬し、水切りした後、1.65kg/cm２で30分間加圧蒸煮した。蒸煮した大豆（75℃）50gあたり、胞子液1ml（蒸煮大豆1gあたり納豆菌胞子数５０００個）を添加し、軽く均一化した。その後、50gずつ個容器に入れて蓋をし、46℃ 16時間の温度条件にて発酵させた。発酵後、65℃ 1.5時間 湿度60％の条件で加熱処理し、さらに75℃ 30分〜1時間 湿度0％の条件で加熱処理を行うことで、納豆を製造した。
また、比較例として、r22/pDG-comK株（親株）の胞子液を用いて上記と同様に納豆を製造した。
【００８９】
(2)胞子数、総菌数の測定
各加熱条件における納豆中の胞子数、総菌数を測定した。
胞子数の測定は、納豆50gをストマッカー袋に入れて、50mMリン酸緩衝液(pH7.0)を150gを投入し、ストマッカーで1分懸濁することにより納豆懸濁液を調製した。この納豆懸濁液中の胞子数を実施例１の３．と同様にして測定した。
総菌数の測定は、上記納豆懸濁液を75℃で15分処理する前に、適切に希釈しLB寒天培地に塗抹培養することにより行った。
胞子数、総菌数の測定結果を表８に示す。
【００９０】
【表８】
0006618792.tif 000009
単位は納豆1gあたりの菌数。
【００９１】
表８から、DPA6株を用いた納豆は、65℃1.5時間加熱後でも、親株を用いた納豆と比べて胞子数が約1/1000であり、胞子数が顕著に少ないことがわかった。総菌数においても、親株と比べてDPA6株の納豆は1/10未満と非常に少なかった。また、さらに75℃30分〜1時間加熱することにより、親株と比べて総菌数を1/100〜1/1000低減することができた。
【００９２】
(3)納豆の品質評価
以下の評価基準に基づいて、各加熱条件における納豆の品質（糸引き、外観）を評価した。評価結果を表９、１０に示す。
【００９３】
［糸引きの評価基準］
◎：非常に強い
○：強い
△：普通（混ぜた塊を薬さじで持ち上げても空中で保持できずに粒が落ちる）
×：弱い（混ぜても塊が形成されない）
【００９４】
［外観の評価基準］
○：菌膜が均一に広がっている
△：菌膜は認められるがごく一部であり不均一
【００９５】
【表９】
0006618792.tif 000010
【００９６】
【表１０】
0006618792.tif 000011
【００９７】
表９、１０から、DPA6株を用いた納豆は、親株を用いた納豆と同様に、納豆らしい良好な糸引き、外観を有していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、納豆中では胞子を形成しないが、ジピコリン酸を含有する培地では通常の納豆菌と同様に胞子形成可能である、新規な納豆菌株が提供される。本発明の納豆菌株によれば、従来の納豆製造工程によって、胞子数は少ないが、その他の点においては従来の一般的な納豆と同等の品質を備えた納豆を製造することができる。
また、本発明の納豆は、納豆の品質を損なわない程度の加熱条件による殺菌が可能であるため、納豆を利用した各種加工食品の開発を促進することが期待される。
従って、本発明は、納豆およびそれを利用した加工食品の製造において利用可能である。
【受託番号】
【００９９】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１６６
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１：spoVFA遺伝子の上流のDNA断片を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号２：spoVFA遺伝子の上流のDNA断片を増幅するためのリバースプライマー
配列番号３：spoVFA遺伝子の下流のDNA断片を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号４：spoVFA遺伝子の下流のDNA断片を増幅するためのリバースプライマー
配列番号５：クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号６：クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むDNA断片を増幅するためのリバースプライマー
配列番号７：spoVFA遺伝子破壊用のDNA断片を増幅するためのフォワードプライマー
配列番号８：spoVFA遺伝子破壊用のDNA断片を増幅するためのリバースプライマー
配列番号９：spoVFA遺伝子破壊を確認するためのフォワードプライマー
配列番号１０：spoVFA遺伝子破壊を確認するためのリバースプライマー
【配列表】
0006618792000001.app