(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイドロゲルとマイクロスフェアとを含む組織スキャフォールド材料であって、前記ハイドロゲルは第１のポリマーを含み、前記マイクロスフェアは第２のポリマーを含み、前記マイクロスフェアは前記ハイドロゲルに包埋され、前記マイクロスフェアは前記ハイドロゲルの密度よりも少なくとも２５％大きい密度を有し、前記マイクロスフェアは０．６〜１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを含み、前記ハイドロゲルは０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを含む、前記組織スキャフォールド材料。
【請求項２】
前記マイクロスフェアは、直径５０〜２５０μｍの間である、請求項１に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項３】
前記マイクロスフェアは、組織スキャフォールド材料の体積の少なくとも約７０％を占める、請求項１または２に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項４】
前記マイクロスフェアは生物活性因子をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項５】
前記マイクロスフェアはさらなる生物活性因子を含まない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項６】
シートの形態または流動性形態である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項７】
深さ０．５〜３．０ｍｍのシートの形態である、請求項６に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項８】
深さ約１．０〜２．０ｍｍのシートの形態である、請求項７に記載の組織スキャフォールド材料。
【請求項９】
創傷治癒または組織再生に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組織スキャフォールド材料を含む医薬品。
【請求項１０】
必要とする対象における創傷治癒または組織再生の促進に使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組織スキャフォールド材料を含む医薬品。
【請求項１１】
前記組織スキャフォールド材料は、露出した骨、金属類、または壊死組織を有する前記対象の部位に適用される、請求項１０に記載の医薬品。
【請求項１２】
組織スキャフォールド材料を作製する方法であって、
ａ．マイクロスフェアを含む第１の組成物、およびポリマー材料を含む第２の組成物を用意する工程であり、該第１の組成物が該第２の組成物の密度より少なくとも２５％大きい密度を有し、前記マイクロスフェアは０．６〜１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを含み、前記第２の組成物は０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを含む、工程；
ｂ．第１および第２の組成物を混合する工程；ならびに
ｃ．混合物中のポリマー材料を架橋させ、マイクロスフェアが包埋されたハイドロゲルを形成する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記コラーゲンは、ヒトまたはウシコラーゲンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記コラーゲンは、中和されている、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記架橋は、熱による方法によって達成される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組織スキャフォールド材料を含む包帯。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１１月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／９０６，１３１号の優先権を主張するものであり、参照によりその仮出願の全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
自家組織または人工組織スキャフォールド全体にわたる細胞ガイダンス（ｃｅｌｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ）の最適化は、長い間、関心の高い事項であり続けている。最も普及している、したがって極めてうまく適用されている既成の「組織工学」製品は全て、当初は、皮膚代用スキャフォールドとして役立てることを意図したものであった。市販のスキャフォールドは非細胞性であることから、永続的な組込みを達成するためには、宿主細胞の侵入と血管新生という共通の要件を有する。この過程は長期にわたり、完了までに最低でも数週間を要し、包帯交換、傷の固定、および看護が必須となるため、細胞侵入の速度を最適化することができる良好なスキャフォールドの開発には非常に高い関心がある。（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００３】
現在利用可能な非細胞性の皮膚代用品は、脱細胞化真皮に由来する製品と、天然由来のハイドロゲルに基づく合成製品との２つのグループに大きく分類することができる（非特許文献３）。
【０００４】
市販の脱細胞化皮膚製品は、屍体のブタまたはヒトの脱細胞化真皮で作られている。脱細胞化過程の結果として、これらの製品は、天然の皮膚微小血管系の残留物である無傷の基底膜を含むマイクロチャネルの内部ネットワークを含む。
【０００５】
別の一般に適用されている皮膚再生テンプレートであるＩＮＴＥＧＲＡ（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、プレインズボロ、ニュージャージー州）は、「上皮」半浸透性シリコーンシートによって被覆された、架橋Ｉ型ウシコラーゲンとコンドロイチン−６硫酸との合成「皮膚」多孔質層で構成されている。埋め込み後、皮膚層に新血管が形成されたら、シリコーンシートが分層自家移植片（ｓｐｌｉｔ−ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ａｕｔｏｇｒａｆｔ）にとって代わる（非特許文献４）。脱細胞化皮膚製品と異なり、ＩＮＴＥＧＲＡは、内部血管構造を有しない製品の代表例であり、代わりに、その無秩序な多孔性（平均孔径３０〜１２０μｍ）を特徴とする（非特許文献５）。
【０００６】
現在利用可能な組織代用スキャフォールドの使用は、相当の関連費用がかかる。例えば、脱細胞化皮膚製品の製造には、組織獲得および収集ならびに脱細胞化および滅菌過程を必要とする（非特許文献６）。さらに、市販の組織スキャフォールドは無血管性で、放射線照射された傷または金属類もしくは骨が露出した傷などの複雑な条件下で使用されるときは、高い割合で壊れやすい。そのような複雑な状況では、既存の組織代用製品の使用は、新血管新生には不十分である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｅｐｐｌｅｙ、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．、１０７：７５７−７６２（２００１）
【非特許文献２】Ｗｏｎｇら、Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．、１２１：１１４４−１１５２（２００８）
【非特許文献３】Ｔｒｕｏｎｇら、Ｊ．Ｂｕｒｎｓ  Ｗｏｕｎｄｓ、４：ｅ４（２００５）
【非特許文献４】Ｙａｎｎａｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１５：１７４−１７６（１９８２）
【非特許文献５】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｅｎら、Ｂｕｒｎｓ、３６：３０５−３２１（２０１０）
【非特許文献６】Ｎｇら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２５：２８０７−２８１８（２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最適な細胞侵入ならびに新組織および周囲組織の血管新生を促進させる改善された組織スキャフォールドが、当該技術分野において強く求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本明細書において、マイクロスフェアが包埋されたハイドロゲルで構成された組織スキャフォールド材料の一種が開示される。開示された組織スキャフォールドにおいて、マイクロスフェアは、ハイドロゲルの密度と比較して異なるまたはより大きい密度（ｗ／ｖ）のポリマーを有し、密度の違いにより、組織スキャフォールドへの細胞侵入が容易になる。一実施形態において、ハイドロゲルは第１のポリマーを含み、マイクロスフェアは第２のポリマーを含み、マイクロスフェアはハイドロゲルに包埋され、マイクロスフェアはハイドロゲルよりも大きい密度を有する。
【００１０】
第１および第２のポリマーは、独立して、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロネート、セルロース、フィブリノーゲン、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、およびポリ（ブチレンテレフタレート）；ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸］、ポリ［ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−エチルオルトホスホリレート／塩化テレフタロイル］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（エチレングリコール）、微生物ポリエステル、ポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）、ならびにチロシン由来ポリカーボネートからなる群から選択することができる。いくつかの例において、マイクロスフェアは、０．２〜２．０％、０．４〜１．２％、０．６〜１．０％、または１．０％ｗ／ｖの第２のポリマーを含む。特定の例において、第２のポリマーはコラーゲンである。マイクロスフェアは、直径５０〜２５０μｍの間であることができる。マイクロスフェアは、組織スキャフォールド材料の体積の少なくとも約５０％、６０％または７０％を占めることもある。マイクロスフェアは、生物活性因子を含むことができるが、いくつかの実施形態において、マイクロスフェアは生物活性因子を含まない。生物活性因子は、細胞侵入、細胞成長または血管新生の１つまたはそれ以上を促進することができる。
【００１１】
一例において、ハイドロゲルは、コラーゲンを含有する。いくつかの例において、ハイドロゲルは、コラーゲンを、０．１％〜０．６％、０．２〜０．４％、または０．３％ｗ／ｖの量で含有する。組織スキャフォールド材料は、０．１％〜０．６％、０．２〜０．４％または０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを有するハイドロゲルに包埋された０．２％〜２．０％、０．４％〜１．２％、０．６％〜１．０％または１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを有するマイクロスフェアを有する場合がある。一実施形態において、組織スキャフォールド材料は、０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを含有するハイドロゲルに包埋された０．６〜１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを有するマイクロスフェアを有する。
【００１２】
上記の実施形態のいずれかの組織スキャフォールド材料は、シートの形態または流動性形態であることができる。材料は、例えば、０．５〜３．０ｍｍ、または約１．０〜２．０ｍｍの深さを備えたシートの形態である。開示された組織スキャフォールド材料は、対象における創傷治癒または組織再生の方法において使用することができる。
【００１３】
さらに本明細書において、上記または本明細書に開示の組織スキャフォールド材料を前記対象の傷または組織に適用することによって、必要とする対象における創傷治癒または組織再生を促進する方法が開示される。組織スキャフォールド材料は、例えば、露出した骨、金属類、または壊死組織を有する対象の一部位に適用することができる。
【００１４】
さらに、組織スキャフォールド材料を作製する方法が開示される。本方法は、（ａ）マイクロスフェアを有する第１の組成物、ポリマー材料を有する第２の組成物を用意する工程であり、該第１の組成物が該第２の組成物と異なる密度を有する、工程；（ｂ）第１および第２の組成物を混合する工程；ならびに（ｃ）混合物中のポリマー材料を架橋させ、マイクロスフェアが包埋されたハイドロゲルを形成する工程、を含む。第１および第２の組成物は、ポリマーとして、コラーゲン、例えばヒトまたはウシコラーゲンを含むことができる。コラーゲンは、中和されているコラーゲンであってもよい。マイクロスフェアは、０．４〜１．２％、または０．６〜１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを含むことができる。マイクロスフェアは生物活性因子をさらに含むことができる。第２の組成物は、０．１〜０．６％、または０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを含むことができる。架橋は、例えば、熱による方法によって達成することができる。
【００１５】
上記に提供される方法および本明細書にさらに開示される方法によって製造される組織スキャフォールド材料ならびにそのような組織スキャフォールド材料を含む創傷包帯も開示される。
【００１６】
特許または出願ファイルには、カラーで示された少なくとも一つの図面が含まれている。カラー図面を伴ったこの特許または特許出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払いにより特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ａ〜Ｃは、埋め込み後７日目に、細胞は、ＭＳＳスキャフォールドに浸潤するが（Ｃ）、１％バルクのみの場合は浸潤せず（Ａ）、０．３％バルクでは浸潤が乏しかった（Ｂ）ことを示す写真である。
【図２】Ａ〜Ｃは、埋め込み後１４日目に、細胞はＭＳＳスキャフォールドへの優れた浸潤を示すが（Ｃ）、１％バルクの外側の部分を越えては浸潤せず（Ａ）０．３％バルクにはわずかな浸潤を示すにすぎない（Ｂ）ことを示す写真である。
【図３】Ａ〜Ｄは、図埋め込み後７日目に、細胞は、１％マイクロスフェア含有０．３％バルク（Ｃ）および０．６％マイクロスフェア含有０．３％バルク（Ｄ）を有するＭＳＳスキャフォールドへのより完全な浸潤を示すが、０．４％マイクロスフェア含有０．６％バルク（Ａ）および０．４％マイクロスフェア含有０．２％バルク（Ｂ）を有するＭＳＳスキャフォールドでは浸潤はより少ないことを示す写真である。
【図４】Ａ〜Ｂは、埋め込み後７日目および１４日目に、１％マイクロスフェア含有０．３％バルクの細胞浸潤（青色染色、ＤＡＰＩ）は、内皮前駆体ＣＤ３１＋（赤色染色）を含むことを示す写真である。
【図５】Ａ〜Ｄは、埋め込み後７日目を示す写真である。（Ａ〜Ｃ）マウスにおけるＭＳＳ、０．３％バルク、１％バルクおよびＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドの同定。（Ｄ）埋め込み後のスキャフォールドの相対的サイズ。
【図６】Ａ〜Ｃは、埋め込み後７日目に、細胞は、スキャフォールドの中心まで全体にわたってＭＳＳスキャフォールドに浸潤しているが（Ａ）、１％バルクではスキャフォールドが割れているところを除いて浸潤しておらず（Ｂ）、３％バルクでは浸潤が乏しかった（Ｃ）ことを示す写真である。
【図７】埋め込み後７日目の写真である。ＭＳＳの中心への細胞浸潤を示すＤＡＰＩ核染色（青色）およびＣＤ３１＋内皮前駆体（赤色）。
【図８】Ａ〜Ｅは、埋め込み後１４日目の写真である。（Ａ〜Ｄ）マウスにおけるＭＳＳ、０．３％バルク、１％バルクおよびＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドの同定。（Ｅ）埋め込み後のスキャフォールドの相対的サイズ。
【図９】Ａ〜Ｄは、埋め込み後１４日目の写真である。（Ａ）ＭＳＳスキャフォールドにおける顕著な細胞侵入。（Ｂ）１％コラーゲンは侵入が最少（裂け目沿いを除く）。（Ｃ）０．３％コラーゲンスキャフォールドは侵入がわずかである。（Ｄ）１４日目のＩＮＴＥＧＲＡも強健に見える侵入が少ない。
【図１０】スキャフォールド単位面積あたりの細胞数は、７日目および１４日目のＭＳＳスキャフォールド（それぞれ、面積あたりおよそ７細胞および１０細胞）が、１％ハイドロゲル（単位面積あたりおよそ３および５細胞）ならびに０．３％ハイドロゲル（単位面積あたりおよそ３および７細胞）と比較して、より顕著に細胞侵入していることを示すグラフである。
【図１１】Ａ〜Ｄは、埋め込み後２８日目の写真である。（Ａ〜Ｃ）マウスにおけるＭＳＳ、０．３％バルク、１％バルクおよびＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドの同定。（Ｄ）埋め込み後のスキャフォールドの相対的サイズ。０．３％ハイドロゲルが著しく縮んでいることに留意のこと。
【図１２】Ａ〜Ｄは、埋め込み後２８日目の写真である。（Ａ）ＭＳＳスキャフォールドにおける優れた細胞侵入。（Ｂ）１％コラーゲンは最少の浸潤のままである（裂け目沿いを除く）。（Ｃ）０．３％コラーゲンスキャフォールドは、均一な中程度の侵入を示す。（Ｄ）ＩＮＴＥＧＲＡも合理的な侵入を示す。
【図１３】マイクロスフェアの走査型電子顕微鏡検査写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書において、創傷治癒および組織再生のための細胞侵入および血管新生を促進させる能力が向上した組織スキャフォールド材料が開示される。本発明者らは、異なる密度を有する構成成分を有する材料が、細胞、例えば線維芽細胞および内皮前駆細胞などの所望の細胞の、材料への侵入を促進させることを見出した。
【００１９】
用語「組織スキャフォールド」、「組織スキャフォールド材料」、「皮膚置換品」、「皮膚置換材料」および「材料」は、生体適合ポリマーで作られた細胞成長支持構造に関して本明細書で相互に交換可能に使用される。これらの材料は、細胞侵入および組織再生を促進させる生体適合テンプレートを提供することにより、損傷組織の再生を可能にする。
【００２０】
本明細書に開示された組織スキャフォールド材料は、マイクロスフェアが充填されているハイドロゲル支持体で構成されている。マイクロスフェアが有する密度（重量／体積またはｗ／ｖによって測られる密度）は、マイクロスフェアが包埋されたハイドロゲルの密度とは異なる。好ましい実施形態において、マイクロスフェアは、ハイドロゲルよりも大きい密度を有する。しかしながら、マイクロスフェアは、ハイドロゲルよりも低い密度を有することもある。
【００２１】
本出願を通じて、用語「約」および「およそ」は、値が、装置、値を決定するために用いられる方法、または試験対象の間に存在する多様性に固有の誤差変動を含むことを示す。一つの非制限的実施形態において、用語は１０％以内、好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内、最も好ましくは０．５％以内であるとして定義される。
【００２２】
ポリマー
本明細書に開示されたマイクロスフェア、ハイドロゲルおよび組成物は、ポリマーを含有する。マイクロスフェアおよびハイドロゲルは、同じポリマーを含有することも、互いに異なったポリマーを含有することもある。「ポリマー」は、繰り返しサブユニットで構成されている巨大分子である。組織工学のための適切なポリマー材料としては、天然ポリマー、例えば、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロネート、およびセルロース；フィブリノーゲン；ならびに合成ポリマー、例えば、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、およびポリ（ブチレンテレフタレート）等のポリエステル；ポリエステルアミド、例えばＨＹＢＲＡＮＥ  Ｓ１２００（ＤＳＭ、オランダ）；ポリウレタン、例えばＤＥＧＲＡＰＯＬ（Ａｂｍｅｄｉｃａ、イタリア）；ポリ酸無水物、例えばポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸］；ポリホスホエステル、例えばポリ［ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−エチルオルトホスホリレート／塩化テレフタロイル］；ポリ（オルトエステル）；ポリ（アルキルシアノアクリレート）；ポリエーテル、例えばポリ（エチレングリコール）；微生物ポリエステル、例えばポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）；ならびにポリ（アミノ酸）、例えばチロシン由来ポリカーボネート（詳細に関しては、Ｍａｒｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．、８：３０７１−３０９１（２０１３）を参照）が挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、コラーゲン、ヒアルロン酸、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）から成る群から選択される。好ましいポリマーは、コラーゲンおよびコラーゲン系生体材料であり、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コラーゲンである。ヒト対象における使用では、ヒトおよびウシコラーゲンが特に好ましく、例えば、ヒトまたはウシのＩ型コラーゲンが好ましい。
【００２３】
マイクロスフェア
「マイクロスフェア」は、ポリマーで作られた小粒子である。本明細書で使用するとき、用語「マイクロスフェア」は、球状または非球状である小粒子を包含する；従って、本出願における「マイクロスフェア」に関する任意の言及は、本明細書に開示されるマイクロスフェアが球状および非球状の両方の小粒子を含んでいるので、用語「微小構造」と相互に交換可能に使用することができる。マイクロスフェアは、１μｍ〜１ｍｍの任意の直径を包含するものであるが、本明細書に開示のマイクロスフェアは、通常、直径１０〜５００μｍの間、例えば、直径５０〜２５０μｍの間、直径５０〜１５０μｍの間、または直径１００〜２００μｍの間である。一実施形態において、組織スキャフォールド材料のマイクロスフェアは大きさと形状がかなり均一であり、例えば、所与のスキャフォールドの全てのマイクロスフェアがほぼ球状であり、約５０〜１５０μｍまたは約１００〜２００μｍの直径を有する。別の実施形態において、所与のスキャフォールドにおけるマイクロスフェアは、形状が様々であり、例えば、平べったいもの、湾曲しているもの、横長であるもの、または不規則な形状のものがあれば、球状であるものもある。別の実施形態において、所与のスキャフォールドのマイクロスフェアは大きさが様々であり、例えば、直径１０〜５００μｍ、さらに１〜１０００μｍの様々な大きさである。
【００２４】
いくつかの例において、マイクロスフェアは、０．２％〜２．０％、０．４％〜１．２％、０．４％〜０．８％、または０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１．０％ｗ／ｖのポリマーで作られ、ポリマーはコラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロネート、セルロース、フィブリノーゲン、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、およびポリ（ブチレンテレフタレート）；ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸］、ポリ［ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−エチルオルトホスホリレート／塩化テレフタロイル］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（エチレングリコール）、微生物ポリエステル、ポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）、ならびにチロシン由来ポリカーボネートから選択される。特別な実施形態において、ポリマーはコラーゲンである。
【００２５】
マイクロスフェアは、ポリマーに加えて、さらに生物活性因子を含むことができる。「生物活性因子」は、細胞侵入、細胞成長、血管形成、血管新生、神経再生、または細胞分化の１つまたはそれ以上を刺激または促進することができる有機小分子、核酸またはポリペプチドであることができる。生物活性因子は、例えば、マイクロスフェア内に含有されたまたは組織スキャフォールド材料を製造する前にマイクロスフェアのポリマーマトリックスに混合された成長因子である。一実施例において、生物活性因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、アンギオポイエチンおよびエリトロポイエチン（ＥＰＯ）からなる群から選択される成長因子である。別の例において、生物活性因子は、核酸、例えばアンチセンスｓｉＲＮＡ分子である。他の実施形態において、マイクロスフェアは他の生物活性因子を含まない。
【００２６】
ハイドロゲル
用語「ハイドロゲル」は、水中で大規模に膨張するが水中に溶解しない、多種類にわたるポリマー材料を指す。一般的に、ハイドロゲルは、ポリマーが架橋する条件下で水溶液中の親水性モノマーを重合することにより形成され、溶液のゲル化に十分な三次元ポリマーネットワークが形成される。ハイドロゲルは、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｄ．Ｓ．、「Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３−４４ページ（１９７４）により詳細に記載されている。
【００２７】
本明細書に開示されるハイドロゲルは、上記で提示されたポリマーで構成することができる。いくつかの例において、ハイドロゲルは、０．１〜０．６％、０．２〜０．４％または０．３％ｗ／ｖのポリマーを含有し、ポリマーは、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロネート、セルロース、フィブリノーゲン、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、およびポリ（ブチレンテレフタレート）；ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸］、ポリ［ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−エチルオルトホスホリレート／塩化テレフタロイル］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（エチレングリコール）、微生物ポリエステル、ポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）、ならびにチロシン由来ポリカーボネートから選択される。一例において、ハイドロゲルは、コラーゲンを含有する。いくつかの例において、ハイドロゲルは、コラーゲンを、０．１〜０．６％、０．２〜０．４％、または０．３％ｗ／ｖの量で含有する。
【００２８】
組織スキャフォールド材料を作製する方法
さらに、組織スキャフォールド材料を作製する方法が開示される。方法は、以下の工程：（ａ）マイクロスフェアを有する第１の組成物、ポリマー材料を有する第２の組成物を用意する工程であり、該第１の組成物が該第２の組成物と異なる密度を有する、工程；（ｂ）第１および第２の組成物を混合する工程；ならびに（ｃ）混合物中のポリマー材料を架橋させ、マイクロスフェアが包埋されたハイドロゲルを形成する工程、を含む。
【００２９】
スキャフォールドを作製するために、適切なポリマーを、製造のための組成物に組み込む。適切なポリマーとしては、天然ポリマー、例えば、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロネート、およびセルロース；フィブリノーゲン；ならびに合成ポリマー、例えば、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、およびポリ（ブチレンテレフタレート）等のポリエステル；ポリエステルアミド、例えばＨＹＢＲＡＮＥ  Ｓ１２００（ＤＳＭ、オランダ）；ポリウレタン、例えばＤＥＧＲＡＰＯＬ（Ａｂｍｅｄｉｃａ、イタリア）；ポリ酸無水物、例えばポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸］；ポリホスホエステル、例えばポリ［ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−エチルオルトホスホリレート／塩化テレフタロイル］；ポリ（オルトエステル）；ポリ（アルキルシアノアクリレート）；ポリエーテル、例えばポリ（エチレングリコール）；微生物ポリエステル、例えばポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）；ならびにポリ（アミノ酸）、例えばチロシン由来ポリカーボネート（詳細に関しては、Ｍａｒｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．、８：３０７１−３０９１（２０１３）を参照）が挙げられる。一実施形態において、ポリマーは、コラーゲン、ヒアルロン酸、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）およびポリ（乳酸）（ＰＬＡ）から成る群から選択される。好ましいポリマーは、コラーゲンおよびコラーゲン系生体材料であり、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コラーゲンである。特にヒトおよびウシコラーゲンが好ましい。ウシＩ型コラーゲンは、市販されており、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．から入手可能である。ヒトＩ型コラーゲンは、例えば、凍結乾燥形態または溶液で、ＶＩＴＲＯＣＯＬ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ，  Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォリニア州）として市販されている。組み換えヒトコラーゲンは、例えば、ＣＯＬＬＡＧＥ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＣｏｌｌＰｌａｎｔ  Ｌｔｄ．、ネス・ジヨナ、イスラエル）として市販されている。
【００３０】
コラーゲンは、様々な原料に由来することができ、例えば、ヒトまたはウシ組織に由来する。コラーゲンは、組織スキャフォールドを適用予定の対象の自家性のものであることができ、例えば、その対象の皮膚から抽出される。適切な生体サンプル（例えば、皮膚、胎盤、腱、または培養細胞）が調達されたら、コラーゲンをサンプルから既知の技術により抽出して原液を形成することができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９：３２２５−３２３１（１９７４）を参照。コラーゲンの原液は、コラーゲンを適切な溶液に含むものであり、例えば、０．１％酢酸、またはアールもしくはハンクス塩、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳおよび重炭酸ナトリウムを含有する溶液である。適切な培地は、例えば、Ｍｅｄｉｕｍ１９９（Ｍ１９９）系培地である。そのような培地は市販されており、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよび他の細胞培養培地供給業者から入手可能である。コラーゲンは、一般に最終濃度よりも高い原液濃度で保存され、例えば、０．２〜１．６％の濃度のコラーゲン、好ましくは、ハイドロゲルに対して０．３〜０．５％のコラーゲン、およびマイクロスフェアに対して０．６〜２．０％のコラーゲンで保存される。開示の方法における使用に適したコラーゲンは、市販もされている。
【００３１】
いくつかの実施形態において、コラーゲンは使用前に中和される。コラーゲンは、コラーゲンの原液を水酸化ナトリウムと混合させて、ｐＨ７．２〜７．６、好ましくはｐＨ７．４に到達させることにより中和することができる。この混合物は、油、例えばミネラルオイルを、好ましくはコラーゲン１体積あたり少なくとも５体積でＮａＯＨと共に重ね、使用まで冷蔵で保存することができる。
【００３２】
マイクロスフェアを作製するためには、油を重ねたポリマー（例えば、コラーゲン）組成物を、高速で混合し、水中油型エマルジョンを形成する。ポリマー組成物は、さらに本明細書に開示される少なくとも１種の生物活性因子を含むことができる。次いで、エマルジョンに、エタノールの濃度を増加させながら洗浄を繰り返し施し、例えば、１回目の洗浄では５０％のエタノール、２回目の洗浄では８０％のエタノール、３〜５回目の洗浄では１００％のエタノールを用いる。１回目の洗浄は、コラーゲン溶液１体積あたり少なくとも５体積のエタノールと混合させること（例えば、８００〜１５００ｒｐｍで２０〜４０分間撹拌させる）、混合物を２５００〜３５００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離すること、ならびに油層およびアルコール層を除去することを含む。その後の洗浄は、コラーゲン溶液１体積あたり少なくとも５体積のエタノールと混合させること、混合物を２５００〜３５００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離すること、ならびにアルコール層を除去することを含む。アルコール洗浄後、次いで、コラーゲンを、少なくとも５体積の冷生理食塩水、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、３〜５回洗浄することを含む。最後の生理食塩水洗浄を取り出した後、洗浄によって形成されたコラーゲンマイクロスフェア組成物は、使用できる状態になっている。
【００３３】
ハイドロゲルに使用されるポリマーは、マイクロスフェアを作製するために使用したポリマーと同じであるまたは異なる。いくつかの実施形態において、ハイドロゲルに用いるポリマーは、マイクロスフェアに用いるポリマーと同じである。他の実施形態において、ハイドロゲルに用いるポリマーは、マイクロスフェアに用いるポリマーと異なる。好ましい実施形態において、マイクロスフェアおよびハイドロゲルの両方に使用されるポリマーは、コラーゲンである。しかしながら、マイクロスフェアとハイドロゲルのポリマーが同じ場合も異なる場合も、マイクロスフェアにおけるポリマー密度（ｗ／ｖ）とハイドロゲル「バルク」におけるポリマー密度（ｗ／ｖ）とは異なっている。
【００３４】
コラーゲンハイドロゲル「バルク」スキャフォールドを作製するために、コラーゲン原液を水酸化ナトリウムと混合させて、ｐＨ７．２〜７．６、好ましくはｐＨ７．４に到達させる。これにより、コラーゲン組成物は、使用できる状態になる。
【００３５】
組織スキャフォールド材料を作製するために、マイクロスフェアを含有する第１の組成物を、型または成形プラットフォームに加える。ポリマー材料を含んだ、ハイドロゲルを形成する第２の組成物を、前記第１の組成物に加える。組成物を、撹拌または分注などにより混合し、均一な混合を達成させる。混合物を、次いで、ポリマーを架橋するために適切な標準方法、例えば、熱による方法（３５〜４５℃、好ましくは３７℃で、２０〜４０分間インキュベートする）または化学的方法により架橋させる。架橋後、組織スキャフォールド材料は、直ちに使用されるか、または後で使用するために保存される。
【００３６】
組織スキャフォールドおよび包帯
さらに、本明細書で提供される方法によって製造される組織スキャフォールド材料が開示される。組織スキャフォールドを構成するマイクロスフェアおよびハイドロゲルは、それぞれ、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、ヒアルロネート、セルロース、フィブリノーゲン、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、およびポリ（ブチレンテレフタレート）；ポリエステルアミド、ポリウレタン、ポリ［（カルボキシフェノキシ）プロパン−セバシン酸］、ポリ［ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート−エチルオルトホスホリレート／塩化テレフタロイル］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（エチレングリコール）、微生物ポリエステル、ポリ（β−ヒドロキシアルカノエート）、ならびにチロシン由来ポリカーボネートからなる群から選択されるポリマーを含有する。一実施形態において、開示された組織スキャフォールド材料のマイクロスフェアおよびハイドロゲルは、ポリマーとしてコラーゲン、例えばヒトまたはウシコラーゲンをそれぞれ含む。コラーゲンは、中和されているコラーゲンであることができる。組織スキャフォールド材料は、対象への注射に適した流動性形態であることもでき、またはシートの形態、例えば、深さが０．５〜３．０ｍｍもしくは１〜２ｍｍのシートであることもできる。
【００３７】
特定の例において、組織スキャフォールド材料は、０．１〜０．６％、０．２〜０．４％または０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを有するハイドロゲルに包埋された０．２〜２．０％、０．４％〜１．２％、０．６〜１．０％または１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを有するマイクロスフェアを有する。マイクロスフェアは、ハイドロゲルと異なる密度、通常はより大きい密度を有する。密度の差異は、少なくとも２５％であるべきである。いくつかの実施形態において、マイクロスフェアの密度とコラーゲンの密度とを比較するとき、差異は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％，またはそれより大きい。一実施形態において、組織スキャフォールド材料は、０．３％ｗ／ｖのコラーゲンを含有するハイドロゲルに包埋された、０．６〜１．０％ｗ／ｖのコラーゲンを有するマイクロスフェアを有する。別の実施形態において、マイクロスフェアは、組織スキャフォールド材料の体積の少なくとも約５０％、６０％または７０％を占める。さらなる実施形態において、マイクロスフェアは、生物活性因子、例えば成長因子を含有している。
【００３８】
さらに、開示された組織スキャフォールド材料が組み込まれた創傷包帯または医薬品が開示される。組織スキャフォールド材料は、包帯に包埋することもでき、包帯の一側面に配置することもできる。包帯は、さらに、シリコーン、ガーゼ、もしくは他の被覆剤、および／または抗生物質、抗炎症剤もしくは鎮痛剤、または治癒を促進もしくは痛みを軽減するための他の軟膏の１つまたはそれ以上を含むこともできる。
【００３９】
組織スキャフォールド製品は、創傷治癒または組織再生に使用するために、滅菌包装などで、さらに適切にパッケージすることもできる。
【００４０】
処置方法
本明細書においてさらに、本明細書に開示の組織スキャフォールド材料を前記対象の創傷または組織に適用することによって、必要とする対象における創傷治癒または組織再生を促進する方法が開示される。組織スキャフォールド材料は、例えば、組織再生が望まれる対象の任意の部位に適用することができ、例えば、開いた傷にまたは外科的処置の間に適用される。好ましい実施形態において、開示された組織スキャフォールドは、露出した骨、金属類、または壊死組織を有する身体の部位に適用される。
【００４１】
本明細書に開示の組織スキャフォールドは、取り出すことも、またはその場に残しておくこともできる。ポリマーは生分解性であることもでき、その場合、ポリマーは徐々に溶けて、対象の細胞から形成される細胞と血管の新しいネットワークを後に残す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、用語「対象」および「患者」は相互に交換可能に使用され、動物、例えば哺乳類、例えば非霊長動物（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長動物（例えば、サルおよびヒト）を含む。
【００４３】
本開示を、以下の非限定的実施例によって、さらに例証する。
【実施例１】
【００４４】
マイクロスフェア／ハイドロゲルスキャフォールドの製造。
Ｉ型コラーゲンを、標準技術を使用してラット尾サンプルから抽出した。皮膚をラット尾から鋭利に切開して除去し、廃棄した。次いで、尾の遠位端から開始して、腱が付着した遠位脊椎骨が残りの近位の尾から分離されるまで、脊椎骨内の関節を破壊し、遠位の脊椎骨上で上方に引っ張ることによって、腱を抜き取った。その後、脊椎骨を腱から鋭利に切開し、廃棄した。次いで、腱を７０％エタノール中に入れた。尾内の全ての関節が壊されるまでこの技術を繰り返し、腱を抜き取った。抜き取った腱を回収し、秤量し、１Ｌの滅菌容器内に入れた。その後、０．１％酢酸を腱に加えて、腱１ｇあたり酢酸７５ｍＬの最終濃度に到達させ、１５ｍｇ／ｍＬ（１．５％ｗ／ｖ）Ｉ型コラーゲンのコラーゲン原液を達成させた。その後、コラーゲン原液を４℃で毎日およそ１分間撹拌して、少なくとも７２時間撹拌させた。
【００４５】
７２時間後、コラーゲン原液を５０ｍＬの円錐管へ等分し、４℃および８８００ｒｐｍで９０分間遠心分離し、あらゆる小片を除去し、廃棄した。次いで、最終１５ｍｇ／ｍＬ（１．５％ｗ／ｖ）コラーゲン原液を標準凍結乾燥装置に入れ、少なくとも７２時間にわたり凍結乾燥した。凍結乾燥後、コラーゲン原液を、使用まで−４℃で保存した。使用に際して、この凍結乾燥コラーゲンを、０．１％酢酸に再懸濁し、濃度を１０ｍｇ／ｍＬ（１％ｗ／ｖ）にした。この再懸濁したコラーゲンを、使用前の３日間、毎日（約１分間）撹拌した。１．５％（ｗ／ｖ）コラーゲン原液および０．３８４％（ｗ／ｖ）コラーゲン原液を使用して、それぞれマイクロスフェアおよび０．３％ハイドロゲルを作製した。
【００４６】
コラーゲンを中和して１％のマイクロスフェアを作製するために、１．５％コラーゲン２ｍＬを、１×Ｍ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）６５６μＬ、１０×Ｍ１９９培地３００μＬ、およびＮａＯＨ４４μＬ（またはｐＨを７．４に調節するために必要に応じてより多くのＮａＯＨ）と氷上で混合させた。この混合物に、少なくとも５倍体積（例えば、１５ｍＬ）のミネラルオイルを重ね、使用まで４℃で保存した。
【００４７】
マイクロスフェアを製造するために、油を重ねた中和コラーゲンを、約５分間、高速でボルテックスにより混合し、油中水型エマルジョンを作製した。エマルジョンをフラスコに注ぎ、コラーゲン溶液から油を引いた１体積あたり少なくとも５体積の５０％エタノールを組み合わせ、撹拌棒を用いて１１００ｒｐｍで３０分間撹拌した。撹拌した混合物を次いで５０ｍＬチューブに注ぎ、３２００ｒｐｍで、４℃で７分間遠心分離して、油およびエタノールの層ならびにその油とアルコールの層間のコラーゲンの薄層を形成した。油およびアルコールの層を除去し、コラーゲン層を５体積の８０％エタノールで洗浄し、上記のようにボルテックスして遠心分離し、アルコール層を除去し、５体積の１００％エタノールで洗浄し、撹拌し、遠心分離し、アルコール層を除去した。次いで、コラーゲンを、５体積の冷ＰＢＳで３回洗浄し、撹拌し、遠心分離し、ＰＢＳを除去した。この過程の間に、コラーゲンマイクロスフェアが形成された。
【００４８】
ハイドロゲルのためのコラーゲン「バルク」を製造するために、０．３８４％コラーゲン３９１μＬを、１×Ｍ１９９培地５０．８μＬ、１０×Ｍ１９９培地５０μＬ、およびＮａＯＨ８．６μＬ（またはｐＨを７．４に調節するために必要に応じてより多くのＮａＯＨ）と氷上で混合させた。次いで、この混合物を使用して、以下のように、スキャフォールドを作製することができた。
【００４９】
スキャフォールドを作製するために、直径７ｍｍおよび深さ２．５ｍｍの型を使用して、およそ９６ｍｍ３のスキャフォールドを作製した。マイクロスフェアスキャフォールドを作製するために、上記の方法で製造されたマイクロスフェアを各ウェルに分注し、各ウェルを約半分まで満たした。１滴のコラーゲンバルクを各ウェルに添加し、撹拌によってマイクロスフェアと混合し、マイクロスフェアが包埋されたハイドロゲルを形成した。スキャフォールドを３７℃で３０分間、硬化させた。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、硬化したスキャフォールド上に重ね、さらなる乾燥を防いだ。「バルク」スキャフォールドを作製するために、コラーゲンバルクをマイクロスフェアなしで、マイクロスフェアを有するスキャフォールドとほぼ同じレベルまで、型に添加した。スキャフォールドを上記のように硬化させ、ＰＢＳを重ねた。
【００５０】
最密充填球に関するケプラー予想によれば、スキャフォールドの体積のおよそ７４％は、高密度のマイクロスフェアで構成され、残りの体積はバルクのコラーゲンハイドロゲルで占められているはずである。
【実施例２】
【００５１】
マイクロスフェア含有スキャフォールドは、細胞浸潤を促進させる。
スキャフォールドを、埋め込み１日前に製造した。スキャフォールドを、８週齢の野生型Ｃ５７ｂｌ／６マウスの背部に皮下的に埋め込んだ。３匹のマウスに、以下の合計４つのスキャフォールド：２つの１％マイクロスフェア含有０．３％バルクスキャフォールド；１つのコントロールとしての１％バルクスキャフォールド；１つのコントロールとしての０．３％バルクスキャフォールド、を埋め込んだ。全てのマウスを屠殺し、７または１４日後に組織学的解析のために収集した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、最適切削温度化合物（ＯＣＴ）培地に包埋された組織サンプルに施し、スキャフォールドへの細胞浸潤を同定した。
【００５２】
埋め込み後７日目に、マイクロスフェアスキャフォールド（ＭＳＳ）は、スキャフォールドの深さ全体にわたって実質的で均質な細胞侵入を示した（図１Ｃ）。比較して、細胞は、０．３％コントロールスキャフォールドに散在的に部分的にしか侵入せず（図１Ｂ）、１％コントロールスキャフォールドには侵入することができず、スキャフォールドの周辺にそってのみ増殖した（図１Ａ）。
【００５３】
埋め込み後１４日目に、ＭＳＳは、スキャフォールドの深さ全体にわたり強健な細胞侵入を示した（図２Ｃ）。対照的に、細胞は、０．３％（ｗ／ｖ）コラーゲンスキャフォールドに散在的に侵入し（図２Ｂ）、１％（ｗ／ｖ）コラーゲンスキャフォールドには侵入することが全くできず、周囲にのみ存在した（図２Ａ）。
【実施例３】
【００５４】
ハイドロゲル密度に対するマイクロスフェアの密度の違いにより細胞浸潤が促進される。
マイクロスフェア（ＭＳ）およびハイドロゲル（Ｈ）におけるコラーゲンの密度（ｗ／ｖ）が異なるマイクロスフェアスキャフォールドを、以下のように製造した。（Ａ）１％コラーゲンＭＳ含有０．３％Ｈ；（Ｂ）０．６％ＭＳ／０．３％Ｈ；（Ｃ）０．４％ＭＳ／０．２％Ｈ；（Ｄ）０．４％ＭＳ／０．６％Ｈ。表１参照。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
ＭＳＳを成体マウスの背部に皮下的に埋め込み、埋め込み後７および１４日目に免疫組織化学的に回収した。免疫組織化学的解析により、全てのＭＳＳで細胞浸潤が同定され（図３Ａ〜３Ｄ）、１％ＭＳ／０．３％Ｈおよび０．６％ＭＳ／０．３％Ｈで最大の浸潤が見られた（図３Ｃ〜３Ｄ）。さらに、ＣＤ３１発現が、埋め込み後７および１４日目に全てのＭＳＳで見られ（図４Ａ〜４Ｂ）、内皮前駆体の侵入および新血管の形成が示された。
【実施例４】
【００５７】
ＭＳＳは、２８日間の埋め込みにわたり、細胞浸潤を促進する。
１８匹のマウスに、一匹あたり４つの以下の皮下埋め込み（Ａ〜Ｄ）を施した：（Ａ）ＭＳＳ（１％コラーゲンマイクロスフェア含有０．３％コラーゲンバルク）、（Ｂ）１％バルクコラーゲンハイドロゲルコントロール、（Ｃ）０．３％コラーゲンハイドロゲルコントロール、および（Ｄ）ＩＮＴＥＧＲＡ皮膚再生テンプレートの直径７ｍｍ切片（Ｉｎｔｅｇｒａ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、プレインズボロ、ニュージャージー州）。マウスを、埋め込み後７、１４および２８日目に屠殺した（１時間点あたり６匹のマウス）。
【００５８】
埋め込み後７日目（図５Ａ〜５Ｄ）に、ＭＳＳ、１％コラーゲンコントロールおよびＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドは、埋め込み前と比較して同様のサイズおよび形態を保持していたが、０．３％コラーゲンコントロールは顕著にサイズが減少していた（図５Ｄ）。埋め込み後１週間のＭＳＳのＨ＆Ｅ染色により、スキャフォールドの中心までの全体にわたって細胞が侵入していることが明らかになった（図６Ａ）。それに比べて、１％コラーゲンスキャフォールド（図６Ｂ）は、分割した材料の割れ目沿いを除いて侵入は無かった。さらに０．３％コラーゲンスキャフォールドは縮小し、侵入は最小であった（図６Ｃ）。ＣＤ３１抗体（内皮前駆体を同定するための抗体）およびＤＡＰＩ抗体（浸潤細胞を同定するための抗体）を有するＭＳＳテンプレートの蛍光染色により、内皮前駆体を含む複数の種類の細胞が、７日目に既にＭＳＳスキャフォールドに浸潤していることが示された（図７）。ＣＤ３１＋細胞は、１％および０．３％ハイドロゲルコントロール内では観察されなかった（データ示さず）。
【００５９】
１４日後（図８Ａ〜８Ｅ）、ＭＳＳ、１％コラーゲンコントロール、およびＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドは、依然として埋め込み前の大きさに近いが、０．３％コラーゲンコントロールは劇的に大きさが減少していた（図８Ｅ）。ＭＳＳスキャフォールドは、顕著な細胞侵入を示し（図９Ａ）、１％コラーゲンは、割れ目沿いを除いて最少の侵入を示し（図９Ｂ）、０．３％コラーゲンスキャフォールドは侵入がわずかであった（図９Ｃ）。ＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドは、ＭＳＳスキャフォールドよりも強健な侵入が少ないことが示された（図９Ｄ）；ＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドの密な構造により、Ｈ＆Ｅ染色のための分割の間にスキャフォールドのせん断が生じた。
【００６０】
スキャフォールドの単位面積あたりの細胞数を比較すると（図１０）、７日目および１４日目のＭＳＳスキャフォールド（それぞれ、面積あたりおよそ７細胞および１０細胞）に、１％ハイドロゲル（単位面積あたりおよそ３および５細胞）ならびに０．３％ハイドロゲル（単位面積あたりおよそ３および７細胞）と比較して、より顕著に細胞が侵入していることが示された。
【００６１】
埋め込み後２８日目（図１１Ａ〜１１Ｄ）において、ＭＳＳ、１％コラーゲンコントロールおよびＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドは、埋め込み前のサイズよりわずかに小さかった。一方、０．３％コラーゲンコントロールは、７または１４日目において、より小さかった（図１１Ｄ）。２８日目のＭＳＳスキャフォールドは、良好な細胞侵入を示し（図１２Ａ）、１％コラーゲンは本質的に侵入を示さず（図１２Ｂ）、０．３％コラーゲンスキャフォールドは侵入を示すが、サイズが小さかった（図１２Ｃ）。ＩＮＴＥＧＲＡスキャフォールドは同様にいくらかの侵入を示した（図１２Ｄ）。
【実施例５】
【００６２】
マイクロスフェアの走査型電子顕微鏡検査
マイクロスフェアを実施例１に記載のように製造し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）検査のために準備した。図１３に示されるように、マイクロスフェアは、様々な大きさ（５０〜３００μｍの間）および形状であってもよい（一部は非常に球状であり、他のものは形態学的に不規則である）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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