(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ及びポナチニブから成る群より選択される少なくとも２種類の抗がん剤（ただし、イマチニブとニロチニブの２種類のみである場合を除く）の血中濃度を連続的に測定する方法であって、
患者から採取された各血漿試料を高速液体クロマトグラフィーにかけ、各血漿試料中の抗がん剤を定量する工程を含み、
前記高速液体クロマトグラフィーの移動相として、各抗がん剤について、下記表１に示す成分を同表に示す含有量（容量％）含む（ただし、成分の合計が１００容量％を超えることはない）混合溶媒を移動相として用いる、抗がん剤の血中濃度を連続的に測定する方法。
【表１】
0006531247.tif 000006
【請求項２】
前記混合溶媒中の各成分の含有量が、前記表１に示す各中心値である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液のpHが、表１に示す各中心値である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
血漿試料中に、濃度を測定すべき被検抗がん剤と併用されることがない抗がん剤を内部標準として添加し、被検抗がん剤と内部標準の両者の濃度を測定する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
被検抗がん剤がイマチニブの場合には内部標準としてダサチニブを用い、被検抗がん剤がニロチニブの場合には内部標準としてダサチニブを用い、被検抗がん剤がダサチニブの場合には内部標準としてイマチニブを用い、被検抗がん剤がポナチニブの場合には内部標準としてニロチニブを用い、被検抗がん剤がゲフィチニブの場合には内部標準としてエルロチニブを用い、被検抗がん剤がエルロチニブの場合には内部標準としてゲフィチニブを用い、被検抗がん剤がクリゾチニブの場合には内部標準としてエルロチニブを用い、被検抗がん剤がソラフェニブの場合には内部標準としてレゴラフェニブを用い、被検抗がん剤がレゴラフェニブの場合には内部標準としてソラフェニブを用いる請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記高速液体クロマトグラフィーが、ODSカラムを用いて行う高速液体クロマトグラフィーである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
異なる抗がん剤の濃度測定を連続的に行う際に、高速液体クロマトグラフィーのカラムを洗浄することなく、移動相のみを変えて連続的に行う請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
高速液体クロマトグラフィーにかける前記血漿試料が、サンプル前処理カラムにより予備精製したものである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル前処理カラムが、親水性基と疎水性基を持つ充填剤を含む逆相カラムであり、血漿を水で希釈した血漿希釈液を該逆相カラムにかけ、水で洗浄し、次いで濃度１９〜６１容量％のメタノール水溶液で洗浄し、次に濃度９９容量％以上のメタノールで溶出した溶出液を前記高速液体クロマトグラフィーにかける前記血漿試料として用いる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
血漿の希釈倍率（容量基準）が９倍〜１０倍であり、洗浄に用いるメタノール水溶液の濃度がソラフェニブ又はレゴラフェニブの場合に２０±0.5容量％、これら以外の抗がん剤の場合に６０±0.5容量％である請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィーを用いた複数種類の抗がん剤の血中濃度の連続測定方法に関する。
【０００２】
現在、抗がん剤による治療は、副作用発現と腫瘍縮小効果を診ながら行われ、結果を見てから抗がん剤の投与量を調整したり、次の治療戦略が立てられている。一方で、がん治療は、がん細胞の増殖・進行を早く抑制するという時間との戦いである。近年、経口抗がん剤の薬理効果は血中濃度と相関することが報告されている。すなわち、血中濃度が高ければ副作用が発現し、低ければ腫瘍縮小効果が得られない。これは、患者の血中抗がん剤濃度を測定し、この値をマーカーにすることで、リアルタイムに抗がん剤の投与量を調整でき、副作用の未然防止と、それに伴う治療中断の回避、そしてより早い効果獲得を示している。
【０００３】
経口抗がん剤は、腸管からの吸収能に個人差があり、同じ量の抗がん剤を投与しても患者ごとに抗がん剤の血中濃度は異なることが知られている。血中濃度が所定濃度よりも低い場合には抗がん剤の薬理効果も低くなり、一方、血中濃度が所定濃度よりも高い場合には、抗がん剤の副作用が強くなり、強い副作用の故に患者が抗がん剤を飲むのを中止する恐れもあり、また、高価な抗がん剤も一部が無駄になっていることになる。
【０００４】
したがって、血液中の抗がん剤の濃度を短時間で簡便に測定する方法が望まれる。本願発明者らは、先に、抗がん剤であるイマチニブとニロチニブの血中濃度を、高速液体クロマトグラフィーで測定する方法を開示した（非特許文献１及び２）。しかしながら、市販されている経口抗がん剤はこれら２種の他にも種々の抗がん剤があり、主な経口抗がん剤はこれら２種を含めて９種類ある。また、経口抗がん剤を投与されている患者数は多いので、簡便に短時間で血中濃度を測定することが望まれる。これらの９種類の経口抗がん剤の血中濃度を簡便に短時間で連続的に測定することができる方法が望まれるが、そのような方法は全く知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Miura M, Takahashi N, Sawada K. Quantitative determination of imatinib in human plasma with high-performance liquid chromatography and ultraviolet detection. J Chromatogr Sci. 2011;49(5):412-5.
【非特許文献２】Miura M, Takahashi N, Sawada K. High-performance liquid chromatography with solid-phase extraction for the quantitative determination of nilotinib in human plasma. Biomed Chromatogr. 2010;24(7):789-93.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ポナチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ及びレゴラフェニブの９種類の抗がん剤の血中濃度を、簡便に短時間で連続的に測定することが可能な、抗がん剤の血中濃度の測定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、各抗がん剤の定量手段として、高速液体クロマトグラフィーを採用し、高速液体クロマトグラフィーの移動相として、各抗がん剤についてそれぞれ特定の移動相を採用することにより、同一のカラムを用いて連続的に、簡便に短時間で異なる種類の抗がん剤の血中濃度を測定可能であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ及びポナチニブから成る群より選択される少なくとも２種類の抗がん剤（ただし、イマチニブとニロチニブの２種類のみである場合を除く）の血中濃度を連続的に測定する方法であって、
患者から採取された各血漿試料を高速液体クロマトグラフィーにかけ、各血漿試料中の抗がん剤を定量する工程を含み、
前記高速液体クロマトグラフィーの移動相として、各抗がん剤について、下記表１に示す成分を同表に示す含有量（容量％）含む（ただし、成分の合計が１００容量％を超えることはない）混合溶媒を移動相として用いる、抗がん剤の血中濃度を連続的に測定する方法を提供する。
【０００９】
【表１】
0006531247.tif 000002
【００１０】
本発明の方法によれば、９種類の抗がん剤の血中濃度を、簡便に短時間で連続的に測定することが可能である。すなわち、液体クロマトグラフィーの系を一旦組んでしまえば、あとは移動相として使用する溶媒のみを変更することにより、カラムの洗浄を行うことなく、血漿試料中の異なる抗がん剤を次々と定量することができるので、効率的に抗がん剤の血中濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】下記実施例で得られた、イマチニブの定量結果（左図）及びダサチニブの定量結果（右図）を示す高速液体クロマトグラムである。
【図２】下記実施例で得られた、ニロチニブの定量結果を示す高速液体クロマトグラムである。
【図３】下記実施例で得られた、ポマチニブの定量結果を示す高速液体クロマトグラムである。
【図４】下記実施例で得られた、ゲフィチニブの定量結果（左図）及びエルロチニブの定量結果（右図）を示す高速液体クロマトグラムである。
【図５】下記実施例で得られた、クリゾチニブの定量結果を示す高速液体クロマトグラムである。
【図６】下記実施例で得られた、レゴラフェニブ並びにそのＭ２及びＭ５代謝物、及びソラフェニブの定量結果を示す高速液体クロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の方法は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、レゴラフェニブ及びポナチニブから成る群より選択される少なくとも２種類の抗がん剤（ただし、イマチニブとニロチニブの２種類のみである場合を除く）の血中濃度を連続的に測定する方法である。これらの９種類の抗がん剤の全てについて測定する必要はなく、これらのうちの任意の２種類以上（ただし、イマチニブとニロチニブの２種類のみである場合を除く）を連続的に測定する。
【００１３】
本発明の方法では、高速液体クロマトグラフィーにより抗がん剤を定量する。高速液体クロマトグラフィーのカラムとしては、特に限定されないが、ODS（オクタデシルシリル）カラムが好ましい。ODSカラムは種々のものが市販されており、市販品を好ましく用いることができる。例えば、多孔性のシリカゲルの孔表面をポリシリコーンの膜で被覆し、このポリシリコーンにODS基を結合したカラムである、CAPCELL PAK MG II（商品名、資生堂社製）を好ましく用いることができる。
【００１４】
高速液体クロマトグラフィーに供する試料は、患者から採取された血漿試料である。血漿試料は、血漿又はその希釈物でもよいが、高速液体クロマトグラフィーカラムかける前に予備精製したものが好ましい。市販のサンプル前処理カラムで血液成分を除去し、メタノール等の極性溶媒で抗がん剤を抽出することにより血漿試料を予備精製することができる（下記実施例参照）。ここで、前処理カラムは、ピロリジル−２−オン基のような親水性基と、フェニル基のような疎水性基を持つ、両新媒性充填剤を含む逆相カラムが好ましい。このような、両新媒性充填剤を含む逆相カラムは市販されており（例えば、Waters社製のOasis HLBカートリッジ）、市販のカラムを好適に利用することができる。
【００１５】
血漿を水で希釈した血漿希釈液をこのような逆相カラムにかけ、水で洗浄し、次いで濃度１９〜６１容量％のメタノール水溶液で洗浄し、次に濃度９９容量％以上のメタノールで溶出した溶出液を前記高速液体クロマトグラフィーにかける前記血漿試料として用いることが好ましい。特に、血漿の希釈倍率（容量基準）が９倍〜１０倍であり、洗浄に用いるメタノール水溶液の濃度がソラフェニブ又はレゴラフェニブの場合に２０±0.5容量％、これら以外の抗がん剤の場合に６０±0.5容量％であることが好ましい。Waters社製のOasis HLBカートリッジを用いた予備精製方法の条件の好ましい例を下記表２に示す。
【００１６】
【表２】
0006531247.tif 000003
注：％は容量％
【００１７】
本発明の方法では、高速液体クロマトグラフィーの移動相として、上記表１に示す特定の混合溶媒を用いる。表１中、例えば、「55±0.5」という表示は、54.5％以上55.5％以下を示す。例えばこの場合の「５５」を本発明において、便宜的に「中心値」と呼ぶ。移動相に用いる混合溶媒の組成は表１に示す通りである。ただし、当然ながら、成分の合計が１００容量％を超えることは理論的にあり得ない。混合溶媒中の各成分の含有量は、表１に示す通りであるが、各成分の含有量が、前記表１に示す各中心値であるものが好ましい。また、緩衝液のpHは、表１に示す各中心値であることが好ましい。なお、レゴラフェニブについては、そのＭ２代謝物及びＭ５代謝物もレゴラフェニブ定量用の移動相を用いてレゴラフェニブと同時に定量可能である。
【００１８】
測定を正確に行うために、血漿試料に既知濃度の内部標準を添加し、測定すべき被検抗がん剤と共に内部標準も定量して、測定の正確さを確保することが好ましい。内部標準としては、被検抗がん剤と併用されることがない抗がん剤を選択することが好ましい。例えば、被検抗がん剤がニロチニブの場合には内部標準としてダサチニブを用い、被検抗がん剤がダサチニブの場合には内部標準としてイマチニブを用い、被検抗がん剤がポナチニブの場合には内部標準としてニロチニブを用い、被検抗がん剤がゲフィチニブの場合には内部標準としてエルロチニブを用い、被検抗がん剤がエルロチニブの場合には内部標準としてゲフィチニブを用い、被検抗がん剤がクリゾチニブの場合には内部標準としてエルロチニブを用い、被検抗がん剤がソラフェニブの場合には内部標準としてレゴラフェニブを用い、被検抗がん剤がレゴラフェニブの場合には内部標準としてソラフェニブを用いることが可能である。なお、内部標準の添加量は、被検抗がん剤の通常の血中濃度と同程度でよく、採取した血漿の量が１００μLの場合には、通常、20ng〜100ng程度を加える。
【００１９】
好ましくは内部標準を添加し、予備精製した血漿試料を、高速液体クロマトグラフィーのカラムに注入すると共に、移動相を流して高速液体クロマトグラフィーを行う。移動相の流速は、適宜選択できるが、好ましくは、0.5mL/分である。定量は、常法により各フラクションの紫外線の吸光度を測定することにより行うことができる。紫外線の波長は、全抗がん剤について250nmでよいが、測定の正確性をさらに高めるために、イマチニブについては波長265nm、ソラフェニブとレゴラフェ二ブについては波長260nm、これら以外の抗がん剤については波長250nmが好ましい。
【００２０】
各血漿試料中の抗がん剤を上記した高速液体クロマトグラフィーにより定量する。１つの血漿試料中に含まれる被検抗がん剤は通常、１種類である。本発明の方法では、各血漿試料中の被検抗がん剤を定量し、次に、同じカラムで、別の血漿試料中の被検抗がん剤を定量し、この定量を連続的に繰り返していく。ある血漿試料の定量操作が完了し、次の血漿試料の定量操作を行う際に高速液体クロマトグラフィーカラムを洗浄する操作は不要であり、移動相のみを変更して、次の血漿試料を注入することにより、多数の血漿試料について、次々と連続的に定量操作を行うことができる。洗浄操作が不要であり、移動相を変更して血漿試料を注入するのみであるので、非常に効率的に簡便に多数の血漿試料中の抗がん剤濃度を次々と連続的に測定していくことができる。１つの血漿試料についての定量に要する時間は１１分〜４２分、平均して２０分程度である。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２２】
１．血漿の予備精製
患者から採血し、3000回転で１０分間遠心し、上清である血漿100μLを採取した。これに水900μLと、表３の内部標準物質濃度のメタノール溶液10μLを加え、市販のサンプル前処理カラムであるOasis HLB（商品名、WATERS社製）カートリッジ(1mL)に加えた。カラムを1mLの水で洗浄し、次いで、60容量％メタノール1mLで洗浄して血液成分を除去した。最後に100%メタノール(1mL)で抗がん剤と内部標準物質を溶出させ、これを高速液体クロマトグラフィーにかけた。
【００２３】
【表３】
0006531247.tif 000004
【００２４】
２．高速液体クロマトグラフィー
高速液体クロマトグラフィーカラムは、市販のODSカラムである(CAPCELL PAK MG II (250 mm ×内径4.6 mm、資生堂社製）を用いた。９種類の被検抗がん剤のそれぞれについて、下記表４に示す組成の移動相（リン酸緩衝液は、0.5%リン酸緩衝液(KH2PO4))を0.5mL/分の流速で流した。１種類の被検抗がん剤の定量が完了すると、同一のカラムを用い、定量操作と定量操作の間で洗浄を行うことなく、必要に応じて移動相のみを変更し、連続的に測定を行った。各抗がん剤について用いた内部標準物質及び測定に用いた紫外線(UV)の波長も下記表３に併せて示す。
【００２５】
【表４】
0006531247.tif 000005
【００２６】
各抗がん剤について、１１分〜４２分（平均２０分）で定量が可能であった。得られたクロマトグラムを図１〜図６に示す。図１〜図６に示されるように、いずれの抗がん剤についてもシャープなピークが得られており、高精度な定量が可能であることがわかる。
【図１】
0006531247.tif 000007
【図２】
0006531247.tif 000008
【図３】
0006531247.tif 000009
【図４】
0006531247.tif 000010
【図５】
0006531247.tif 000011
【図６】
0006531247.tif 000012