(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線に対する癌細胞の応答を評価するために、放射線治療された癌細胞サンプルにおいて、ＲＮＡプロファイルを決定する方法であって、
・１回もしくは複数回の放射線線量の照射を受けている患者から得られた癌細胞サンプルからＲＮＡを単離すること、ここで、この単離されたＲＮＡは、１回もしくは複数回の照射によって誘導された分解されたＲＮＡおよび／または無傷のＲＮＡを含み；
・前記単離された照射誘導により分解されたＲＮＡを無傷のＲＮＡから分離すること；
・照射誘導により分解されたＲＮＡの量を測定し、かつ／または無傷のＲＮＡの量を測定する電気泳動図データセットを得て、これにより、前記放射線治療された癌細胞サンプルのＲＮＡプロファイルを提供すること、
・前記ＲＮＡプロファイルから癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値を決定すること、
・前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値を応答閾値と比較すること、ここで前記応答閾値は、複数の不応性サンプルおよび応答性サンプルから決定される標準であり；
・前記応答閾値に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加もしくは減少もしくは不変を確認すること、ここで、前記応答閾値と比べて減少しているＲＮＡ完全性を示すＲＮＡインテグリティー値である場合、前記癌細胞が前記放射線療法に応答性であることが予測され、かつ、前記応答閾値と比べて、同等または増加しているＲＮＡ完全性を示すＲＮＡインテグリティー値である場合、前記癌細胞が前記放射線治療に不応性であることが予測される、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ＲＮＡ濃度を測定することをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡインテグリティー値の増加、減少または不変から導かれる放射線応答スコアを決定することを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌細胞サンプルが乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記癌細胞サンプルが１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える放射線線量の照射を受けた癌細胞を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞サンプルが、前記放射線治療の前に、それと同時にまたはその後に、化学療法薬によって処理された癌細胞を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化学療法薬が、アントラサイクリン、タキサンおよびそれらの組合せから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル、パクリタキセル・ポリグルメックス、オルタタキセル、ゼネキソール、パクリタキセル内包リポソーム、およびパクリタキセルのビタミンＥエマルションから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞サンプルが、前記放射線治療の前に放射線増感化合物によって処理された癌細胞を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌細胞サンプルがｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで放射線に曝露された癌細胞を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記応答閾値が、前記複数の不応性サンプルおよび応答性サンプルから導かれる１以上の応答閾値を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
放射線照射に対する癌の応答をインビトロで決定する方法であって、
・１回もしくは複数回の放射線線量の照射を受けている患者から得られた癌細胞サンプルからＲＮＡを単離すること、ここで、この単離されたＲＮＡは、１回もしくは複数回の照射によって誘導された分解されたＲＮＡおよび／または無傷のＲＮＡを含み；
・前記単離された照射誘導により分解されたＲＮＡを無傷のＲＮＡから分離すること；
・照射誘導により分解されたＲＮＡの量を測定し、かつ／または無傷のＲＮＡの量を測定する電気泳動図データセットを得て、これにより、前記放射線治療された癌細胞サンプルのＲＮＡプロファイルを提供すること、
・化学療法薬による前治療または同時治療を行ってまたは行わずに、前記患者が一定の放射線量に曝露された後、前記患者から得られる前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値を決定すること、
・前記ＲＮＡインテグリティー値を応答閾値と比較すること、ここで前記応答閾値は、複数の不応性患者の癌細胞サンプルおよび複数の応答性患者の癌細胞サンプルから導かれる標準であり；
および
・前記患者が、前記応答閾値に対して、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加、減少または不変を有するかどうかを確認すること、を含んでなり、
ここで、前記応答閾値と比べて、前記患者癌細胞サンプルのＲＮＡ完全性の減少を示すＲＮＡインテグリティー値により、前記患者が前記放射線療法に応答性であることが予測され、前記応答閾値と比べて、前記患者癌細胞サンプルのＲＮＡ完全性の安定または増加を示すＲＮＡインテグリティー値により、前記患者が前記放射線治療に不応性であることが予測される、方法。
【請求項１３】
前記癌細胞サンプルのＲＮＡ濃度が測定され、かつ放射線応答スコアを決定するために用いられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
不応患者を特定するための方法であって、
ここで、前記癌細胞サンプルが、細胞傷害性薬剤または化学療法薬による前治療または同時治療を行ってまたは行わずに、前記患者が放射線治療線量に曝露された後の前記患者から得られた乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルであり、
ここで、前記ＲＮＡインテグリティー値から導かれる放射線応答スコアを決定し、前記１以上の応答閾値と比較することによって、前記ＲＮＡインテグリティー値が前記１以上の応答閾値と比較され、および
ここで、ＲＮＡ完全性の安定または増加を示すＲＮＡインテグリティー値および／または前記応答閾値を上回る放射線応答スコアを有する患者が不応患者と特定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
癌を有する患者の治療転帰を予測するための方法であって、ここで、応答閾値を下回るＲＮＡ完全性の減少を示すＲＮＡインテグリティー値により、前記放射線治療に対する応答および進行のリスクの減少が予測され、応答閾値を上回るＲＮＡ完全性の安定または増加を示すＲＮＡインテグリティー値により、前記放射線治療に対する癌の耐性および疾患進行のリスクの増加が予測される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
放射線治療を中止すべきか継続すべきかを決定するための指標を提供する方法であって、
ａ）癌を有する患者であって、一定の放射線量に曝露された患者から得られる癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値を得ること；および
ｂ）前記ＲＮＡインテグリティー値により、前記ＲＮＡ完全性が応答閾値と比べて安定および／または増加していることが示される場合には前記治療を中止すべきか、あるいは増強させるべきことを示すこと、前記ＲＮＡインテグリティー値により、前記ＲＮＡ完全性が前記応答閾値と比べて減少していることが示される場合には前記治療を続けること、ここで前記応答閾値は、複数の不応性患者の癌細胞サンプルおよび複数の応答性患者の癌細胞サンプルから導かれる標準であり；
を含んでなる、方法。
【請求項１７】
前記癌細胞サンプルが、乳癌患者から得られる乳癌細胞サンプルである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記乳癌がＨｅｒ２＋、基底型サブタイプまたは管腔型Ｂサブタイプである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記乳癌患者が局所進行性乳癌（ＬＡＢＣ）を有する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記癌細胞サンプルが、卵巣癌患者から得られる卵巣癌細胞サンプルである、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
応答性予測指標のＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度の減少が、治療前値を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％下回る減少である、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が化学療法薬によってさらに治療される、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学療法薬が、タキサン、アントラサイクリンおよびそれらの組合せから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タキサンが、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル、パクリタキセル・ポリグルメックス、オルタタキセル、ゼネキソール、パクリタキセル内包リポソーム、およびパクリタキセルのビタミンＥエマルションから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える放射線線量の照射を受けた後に前記癌細胞サンプルを得る、請求項１２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上の癌細胞サンプルを得る、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記単離されたＲＮＡが全ＲＮＡまたはリボソームＲＮＡである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡインテグリティー値の測定が、２８Ｓ：１８Ｓリボソーム（ｒＲＮＡ）比を算出することを含んでなる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＲＮＡインテグリティー値がＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌細胞サンプルからＲＮＡが単離され、前記単離されたＲＮＡにおいて前記ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度が測定される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
マイクロキャピラリー電気泳動により前記ＲＮＡを分離し、蛍光色素を用いてＲＮＡ完全性を検出することによって、前記ＲＮＡインテグリティー値が測定される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ濃度が測定される、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞サンプルの前記ＲＮＡ濃度および前記ＲＮＡインテグリティー値が放射線応答スコアを決定するために使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ある薬剤が放射線増感剤であるかまたは放射線防護剤であるかを判定する方法であって、
ａ．インビトロで、または試験薬剤を非ヒト対象に投与することにより、細胞源を試験薬剤とともにインキュベートすること、
ｂ．前記細胞源を一定の放射線量に曝露すること、
ｃ．前記試験薬剤とともにインキュベートされた前記細胞源のサンプルのＲＮＡインテグリティー値を測定すること、
ｄ．前記ＲＮＡインテグリティー値を試験薬剤の不在下でインキュベートされかつ前記放射線量に曝露された参照サンプルと比較すること、および
ｅ．前記ＲＮＡインテグリティー値が、前記細胞源のサンプルのＲＮＡ完全性が前記参照サンプルと比べて減少していることを示しているならば、前記試験薬剤を放射線増感剤と特定し、前記ＲＮＡインテグリティー値が、前記細胞源のサンプルのＲＮＡ完全性が前記参照サンプルと比べて増加していることを示しているならば、前記薬剤を放射線防護剤と特定すること
を含んでなる、方法。
【請求項３５】
前記サンプルの前記ＲＮＡインテグリティー値を用いて、放射線応答スコアを決定し、前記放射線応答スコアが前記参照サンプルと比べて減少しているならば、前記試験薬剤が放射線増感剤であると特定され、前記放射線応答スコアが前記参照サンプルと比べて増加しているならば、放射線防護剤であると特定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞源が癌細胞源である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
癌に罹患している非ヒト対象に前記試験薬剤を投与することにより、前記癌細胞源が試験薬剤とともにインキュベートされる、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１２年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／７３２，６９７号、２０１３年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／８０６，２２２号、および２０１３年４月２４日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００４０８号の優先権に基づいて米国特許法第１１９条の利益を主張する特許協力条約出願であり、前記出願はそれぞれ、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、癌細胞および組織における放射線に対する応答を評価するための方法およびキット、ならびに放射線療法を含んでなる様式によって治療された癌、具体的には乳房および卵巣の癌を有する対象の応答のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００３】
緒論
引用することにより本明細書の一部とされる「Method of Using Tumour RNA Integrity to Measure Response to Chemotherapy in Cancer Patients」と題されるＰＣＴ出願（第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１５６１号）には、局所進行性乳癌を有する患者における化学療法に対する応答をモニタリングするための方法が開示されており、その方法は、ＲＮＡインテグリティーナンバー(the RNA integrity number)（ＲＩＮ）を含む、ＲＮＡ品質の既知測定基準の低下を通じて示される、ＲＮＡ分解（ＲＮＡ完全性の喪失）を誘導する化学療法薬の能力をモニタリングすることによる方法である５２。
【０００４】
カナダ国家臨床試験（ＣＡＮ−ＮＣＩＣ−ＣＴＧ−ＭＡ．２２）に関連して、エピルビシン／ドセタキセル化学療法を用いた局所進行性乳癌患者の治療により、腫瘍のＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）値は有意に低下し、この応答がレジメンの用量レベルと有意に相関関係があることが示された（ｐ＝０．０５）５３。エピルビシンは、ドキソルビシンのエピマーであり、両化合物（アントラサイクリン類として知られている）は細胞内のＤＮＡ鎖の間に挿入される５４。それらの薬物はまた、トポイソメラーゼＩＩ５５およびＤＮＡヘリカーゼ５６も阻害し、その結果、ＤＮＡ複製が遮断される。さらに、それらの薬物は、フリーラジカルの発生を通じて細胞傷害性であり、ＤＮＡおよび脂質を含む様々な高分子に損傷を与える５７。これに対し、ドセタキセルは、パクリタキセルの類似体である。両薬物（タキサン類として知られている）は微小管と結合し、微小管の脱重合を妨げる５８。これにより、細胞周期の進行が分裂期で停止し、分裂期崩壊が起こり５９、最終的には、アポトーシスが誘導される６０。前記ＭＡ．２２臨床試験では、治療中間期の腫瘍範囲（細胞充実性）とは違って、低い治療中間期の腫瘍ＲＩＮ値が、これらの患者における治療後の病理学的完全寛解の予測指標であることが認められた（ｐ＝０．０５）５３。
【発明の概要】
【０００５】
ある態様には、放射線治療された癌細胞サンプルにおいて、ＲＮＡプロファイルを決定する方法であって、１回もしくは複数回線量の照射を受けている癌細胞サンプルを得ること、前記サンプルからＲＮＡを単離すること、なお、前記単離されたＲＮＡは、１回もしくは複数回の照射によって誘導された分解されたＲＮＡ（例えば、破壊されたＲＮＡ）および／または無傷のＲＮＡを含んでなる、前記単離されたＲＮＡの、照射誘導により分解されたＲＮＡを無傷のＲＮＡと分離すること、および照射誘導により分解されたＲＮＡの量を測定しかつ／または無傷のＲＮＡの量を測定して、前記放射線治療された癌細胞サンプルのＲＮＡプロファイルを提供することを含んでなる方法が含まれる。
【０００６】
一つの実施態様では、照射誘導により分解されたＲＮＡの量を測定しかつ／または無傷のＲＮＡの量を測定して、前記放射線治療された癌細胞サンプルのＲＮＡプロファイルを提供することは、電気泳動図データセットを得ることを含んでなり、このデータセットからＲＮＡプロファイルが決定される。前記プロファイルは、前記電気泳動図の特徴を含んでなり得る。一つの実施態様では、前記ＲＮＡプロファイルは、ＲＮＡインテグリティー値(an RNA integrity value)を決定するために用いられる。前記ＲＮＡインテグリティー値は、前記電気泳動図の異なる領域から決定される複合値であり得る。
【０００７】
別の態様には、乳癌細胞サンプルおよび卵巣癌細胞サンプルから任意に選択される癌細胞サンプルを評価する方法であって、
ａ．一定の放射線量に曝露された、癌細胞サンプル、場合により乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルをアッセイして、ＲＮＡインテグリティー値を得、かつ場合により前記癌細胞サンプルのＲＮＡ濃度を得ること、
ｂ．対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加、減少または不変および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加または減少または不変を特定すること、および
ｃ．場合により、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加、減少または不変および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加、減少または不変から導かれる放射線応答スコアを決定すること、
を含んでなる方法が含まれる。
【０００８】
一つの実施態様では、前記対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加または減少および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加または減少または不変は、放射線応答スコアを算出するために用いられ、前記癌細胞サンプルが前記放射線量に応答しているかどうかを示す。
【０００９】
一つの実施態様では、前記方法は、前記癌細胞サンプルをアッセイする前に一定の放射線量に曝露された癌細胞源から前記癌細胞サンプル、場合により乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルを得ることを含んでなる。
【００１０】
別の態様は、乳癌細胞サンプルおよび卵巣癌細胞サンプルから任意に選択される癌細胞サンプルを評価する方法であって、
ａ．一定の放射線量に曝露されたものから、前記癌細胞サンプル場合により前記乳癌細胞サンプルまたは前記卵巣癌細胞サンプルを得ること、
ｂ．前記癌細胞サンプルをアッセイして、ＲＮＡインテグリティー値を得かつ場合により前記癌細胞サンプルのＲＮＡ濃度を測定すること、
ｃ．前記ＲＮＡインテグリティー値および場合により前記ＲＮＡ濃度を対照と比較すること、および
ｄ．前記対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加、減少または不変を特定すること
を含んでなる方法を提供する。
【００１１】
一つの実施態様では、前記方法は、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加、減少または不変および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加、減少または不変から導かれる放射線応答スコアを決定することをさらに含んでなる。
【００１２】
さらなる態様は、癌細胞サンプルの放射線応答を評価する方法であって、
ａ．一定の放射線量に曝露された、癌細胞サンプル、場合により乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルを得ること、
ｂ．前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること、
ｃ．前記ＲＮＡインテグリティー値および場合により前記ＲＮＡ濃度を対照と比較すること、
ｄ．前記対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度の増加、減少または不変を特定すること、および
ｅ．前記対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加、減少または不変から導かれる放射線応答スコアを決定すること
を含んでなる方法を提供する。
【００１３】
一つの実施態様では、前記対照は、例えば、治療前サンプルもしくは治療初期サンプルから導かれるか、または、例えば、臨床試験の、患者群から導かれる、１以上の予め決定された参照値である。一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、前記癌サンプルにおけるＲＮＡ分解の程度に比例する。一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、前記癌サンプルにおけるＲＮＡ分解の程度に反比例する。
【００１４】
癌細胞サンプルにおけるＲＮＡのＲＮＡ完全性は、例えば、ＲＮＡインテグリティー値を測定することによって測定することができる。一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、前記サンプルのＲＮＡ完全性に比例し、例えば、そのようなケースでは、高いまたは増加しているＲＮＡインテグリティー値は、ＲＮＡ完全性が高いことまたは増加していることに相当する。一つの実施態様では、前記方法は、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を、１以上の応答閾値などの対照と比較することをさらに含んでなり、前記応答閾値と比べて、前記癌細胞サンプルの、減少しているＲＮＡインテグリティー値（例えば、ＲＮＡ分解の増加）および場合により減少しているＲＮＡ濃度により、前記癌細胞または対象が前記放射線療法に応答性であることが予測され／示され、前記応答閾値と比べて、前記癌細胞サンプルの、同等または増加しているＲＮＡインテグリティー値および場合により濃度により、前記癌細胞が前記放射線治療に不応性であることが予測され／示される。
【００１５】
一つの実施態様では、前記比較は、参照電気泳動図またはそれから導かれた、例えば、参照放射線治療によって治療された参照患者／癌細胞から導かれた、参照ＲＮＡインテグリティー値と比較することを含んでなる。それぞれの参照電気泳動図または参照ＲＮＡインテグリティー値に対応する放射線治療は異なる（例えば、化学療法などの細胞傷害性療法の有無、細胞傷害性療法の種類、異なる用量、異なるスケジュールなど）。
【００１６】
前記ＲＮＡインテグリティー値が反比例する実施態様では、例えば、ＲＤＩによって測定された、高いＲＮＡインテグリティー値はＲＮＡ完全性の低下または低さを示し、前記対照（場合により１以上の応答閾値）と比べて減少しているＲＮＡインテグリティー値により、前記癌細胞が（または前記対象が）前記放射線治療に不応性であることが予測され／示され、前記対照（例えば、１以上の応答閾値）と比べて増加しているＲＮＡインテグリティー値により、前記癌細胞が（または前記対象が）前記放射線治療に応答性であることが予測され／示される。
【００１７】
一つの実施態様では、前記癌細胞（および／または前記患者）は、１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える線量の照射を受けている。
【００１８】
別の実施態様では、前記癌細胞（および／または前記患者）は、放射線治療の前におよび／またはそれと同時に、化学療法薬の投与によって治療される。
【００１９】
一つの実施態様では、前記化学療法薬は、タキサン系化学療法薬、アントラサイクリン類およびそれらの組合せから選択される。
【００２０】
さらなる実施態様では、前記タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル(larotaxel)、アブラキサン(Abraxane)、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル(docoxahexaenoic acid-linked paclitaxel)、パクリタキセル・ポリグルメックス(paclitaxel polyglumex)、オルタタキセル(Ortataxel)、ゼネキソール(Genexol)、パクリタキセル内包リポソーム(liposomal-encapsulated paclitaxel)、およびパクリタキセルのビタミンＥエマルション(paclitaxel in a Vitamin E emulsion)から選択される。
【００２１】
一つの実施態様では、前記癌細胞サンプルは、間に、例えば、初回線量の照射後または治療後に得る。
【００２２】
別の実施態様では、前記対象に放射線増感性または放射線防護性の化合物が、例えば、前記癌細胞サンプルを得る前に投与される。例えば、前記対象に、タキサンおよび／または白金化合物などの放射線増感化合物を、場合により全身的にまたは遠隔で、投与することができる。典型的には、タキサンなどの放射線増感剤の用量は、照射を行わない場合と比べて減少される。
【００２３】
一つの実施態様では、前記癌細胞（例えば、前記癌源）をある化合物と接触させて、前記細胞を場合により放射線増感するかもしくは放射線防護し、または前記化合物が放射線増感剤であるかもしくは放射線防護剤であるかを判定する。
【００２４】
従って、別の態様には、癌細胞が放射線感受性であるかどうかを判定する方法であって、場合により放射線増感剤(radiosentizing agent)と組み合わせて、一定の線量の放射線で細胞を十分な時間治療すること、ＲＮＡを単離すること、ＲＮＡインテグリティー値を測定すること、場合により治療されていないまたは一定の線量の放射線単独もしくは放射線増感剤単独で治療された対照と比較することを含んでなり、ＲＮＡ完全性の減少により、前記癌細胞が放射線感受性であることが示され、安定しているまたは対照と同等のＲＮＡ完全性により、前記癌細胞が放射線耐性であることが示される、方法が含まれる。
【００２５】
前記癌細胞は、場合によりｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏであってよい。
【００２６】
一つの実施態様では、前記放射線増感剤は、酸素増加剤、低酸素細胞増感剤、ハロゲン化ピリミジン、および／または生体還元剤から選択される。
【００２７】
別の態様には、ある薬剤が放射線増感剤であるかまたは放射線防護剤であるかを判定する方法であって、
ａ．細胞源を試験薬剤とともにインキュベートすること、
ｂ．前記細胞源を一定の放射線量に曝露すること、
ｃ．前記細胞源のサンプルをアッセイして、前記試験薬剤とともにインキュベートされた前記細胞源のサンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること、
ｄ．前記ＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を、例えば、前記試験薬剤の不在下でインキュベートされ、前記放射線量に曝露されたサンプルに相当する、対照参照サンプルと比較すること、および
ｅ．前記ＲＮＡインテグリティー値が、前記細胞源のサンプルのＲＮＡ完全性および場合によりＲＮＡ濃度が前記対照参照サンプル値と比べて減少していることを示しているならば、前記試験薬剤を放射線増感剤と特定し、前記ＲＮＡインテグリティー値が、前記細胞源のサンプルのＲＮＡ完全性および場合によりＲＮＡ濃度が前記対照参照サンプルと比べて増加していることを示しているならば、前記薬剤を放射線防護剤と特定すること
を含んでなる方法が含まれる。
【００２８】
一つの実施態様では、前記方法は、前記対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加、減少または不変から導かれる放射線応答スコアを決定することを含んでなる。前記放射線応答スコアは、例えば、様々な試験薬剤の放射線防護または放射線増感効果をランク付けまたはグループ化するために用いることができる。
【００２９】
一つの実施態様では、前記サンプルのＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度の測定前に少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも６０時間または少なくとも７２時間、前記細胞源を前記試験薬剤とともにインキュベートする（または前記試験薬剤を非ヒト動物に投与する）。
【００３０】
前記試験薬剤はまた、一つの実施態様では、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象にも投与することができる。例えば、前記試験薬剤は、タキサンなどの放射線増感剤であってよく、放射線に対する腫瘍感受性を決定するために照射前に前記対象に投与される。
【００３１】
一つの実施態様では、前記試験薬剤に関して使用される細胞は癌細胞である。
【００３２】
別の実施態様では、前記癌細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで前記放射線量に曝露される。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで曝露される癌細胞には、前記対象が前記放射線量に曝露されかつ／または放射線を含んでなる治療レジメンを受ける場合のものが含まれる。
【００３３】
一つの実施態様では、前記対照は応答閾値または１以上の応答閾値である。
【００３４】
別の実施態様では、前記応答閾値は、１つの未治療サンプルから導かれ、および／または複数の未治療サンプルから導かれる標準である。
【００３５】
さらに別の実施態様では、前記応答閾値は、１つの不応性サンプルおよび／もしくは１つの応答性サンプルから導かれ、ならびに／または複数の不応性サンプルおよび／もしくは応答性サンプルから導かれる標準である。
【００３６】
さらなる態様には、乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルから任意に選択される患者由来癌細胞サンプルを評価するための方法であって、
ａ．化学療法薬による前治療または同時治療を行ってまたは行わずに、対象が一定の放射線量に曝露された後、前記対象から得られる前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること、
ｂ．対照に対する、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加、または減少または不変および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加、減少または不変を特定すること、および
ｃ．場合により、前記ＲＮＡインテグリティー値の増加または減少または不変および場合により前記ＲＮＡ濃度の増加または減少から導かれる応答スコアを決定すること
を含んでなる方法が含まれる。
【００３７】
一つの実施態様では、乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルから任意に選択される患者由来癌細胞サンプルを評価するための方法であって、
ａ．細胞傷害性薬剤、場合により化学療法薬による前治療または同時治療を行ってまたは行わずに、対象が一定の放射線量に曝露された後、前記対象から癌細胞サンプル、場合により乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルを得ること、および
ｂ．前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること
を含んでなる方法。
【００３８】
一つの実施態様では、前記方法は、前記患者癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を、応答閾値などの対照と比較することをさらに含んでなり、ここで、前記応答閾値と比べて、前記患者癌細胞サンプルの、低下している、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および／または減少しているＲＮＡ濃度により、前記患者が前記放射線療法に応答性であることが予測され、前記応答閾値と比べて、前記患者癌細胞サンプルの、同等（例えば、不変）または増加している、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および／または増加しているＲＮＡ濃度により、前記患者が前記放射線治療に不応性であることが予測され／示される。
【００３９】
別の態様には、不応患者を同定する方法であって、
ａ．前記患者が１回以上の放射線量に曝露された後、前記患者から癌細胞サンプルを得ること、
ｂ．前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を得ること、
ｃ．応答閾値と比較すること、および
ｄ．前記応答閾値を上回る、ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度を有する患者を同定すること
を含んでなる方法が含まれる。
【００４０】
さらなる態様には、癌、場合により乳癌または卵巣癌を有する患者の治療転帰を予測する方法であって、前記対象から得られる癌細胞サンプルをアッセイして、ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を得ることを含んでなり、ここで、前記対象は、一定の放射線量によって治療されており、応答閾値を下回る、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性により、前記放射線治療に対する対象／癌の応答および進行のリスクの減少が予測され、前記応答閾値より高い、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度により、前記放射線治療に対する対象／癌の耐性および疾患進行のリスクの増加が予測される方法が含まれる。
【００４１】
ＲＮＡインテグリティー値および／もしくはＲＮＡ濃度を得るまたはＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得るとは、ＲＮＡインテグリティー値が単独でまたはＲＮＡ濃度と組み合わせて得られることを意味する。
【００４２】
一つの実施態様では、前記対象／癌が進行のリスクが高いと予測される場合には前記方法は、前記治療を変更し、前記対象／癌が進行のリスクが低いと予測される場合には前記治療を続けることをさらに含んでなる。
【００４３】
一つの実施態様では、前記放射線量および／または化学療法は術前に投与される。
【００４４】
さらなる態様には、
ａ）癌を有する患者を一定の放射線量に曝露すること、
ｂ）前記放射線量の投与後に前記患者から癌細胞サンプルを得ること、
ｃ）前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること、および
ｄ）応答閾値などの対照と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および場合により前記ＲＮＡ濃度が減少している場合には前記治療を続け、前記対照、場合により応答閾値と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および場合により前記ＲＮＡ濃度が同等（例えば、不変）または増加している場合には前記治療を変更すること
を含んでなる治療方法が含まれる。
【００４５】
また、別の態様では、癌を有する対象を治療するための、本明細書で記載する方法使用も提供され(is use a method described herein)、その使用は、ａ）癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること、ここで、前記患者は一定の放射線量に曝露されている、ｂ）応答閾値などの対照と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および場合により前記ＲＮＡ濃度が減少している場合には前記患者の治療を続け、前記対照、場合により応答閾値と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および場合により前記ＲＮＡ濃度が同等（例えば、不変）または増加している場合には前記治療を変更することを含んでなる。
【００４６】
一つの実施態様では、工程ｂは、応答閾値などの対照と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および場合により前記ＲＮＡ濃度が減少している場合には前記治療を続けるように前記患者を割り当て、前記対照、場合により応答閾値と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および場合により前記ＲＮＡ濃度が同等（例えば、不変）または増加している場合には前記治療を変更するように前記患者を割り当てることを含んでなる。
【００４７】
一つの実施態様では、前記癌細胞サンプルは、乳癌患者から得られる乳癌細胞サンプルである。
【００４８】
別の実施態様では、前記乳癌は、Ｈｅｒ２、基底型、管腔型Ａ、管腔型Ｂ、または「ノーマル」サブタイプのものである。
【００４９】
別の実施態様では、前記乳癌患者は、局所進行性または炎症性乳癌(locally advanced or inflammatory breast cancer)（ＬＡＢＣ）を含む進行性疾患を有する。
【００５０】
別の実施態様では、前記癌細胞サンプルは、卵巣癌患者から得られる卵巣癌細胞サンプルである。
【００５１】
さらに別の実施態様では、前記応答閾値は、１名の未治療癌、場合により乳癌もしくは卵巣癌患者から導かれるか、または複数の未治療癌、場合により乳癌もしくは卵巣癌患者から導かれる標準である。
【００５２】
別の実施態様では、未治療癌患者から導かれる前記応答閾値または複数の未治療癌患者から導かれる前記標準は、１以上の治療前サンプルから導かれる。
【００５３】
一つの実施態様では、応答性予測指標の前記応答閾値は、治療前値などの未治療対照を下回って少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下したＲＮＡ完全性および／または濃度である。
【００５４】
さらに別の実施態様では、前記応答閾値は、１つの不応性患者癌細胞サンプルおよび／もしくは１つの応答性患者癌細胞サンプルから導かれ、ならびに／または複数の不応性患者癌細胞サンプルおよび／もしくは複数の応答性患者癌細胞サンプルから導かれる標準である。
【００５５】
一つの実施態様では、前記患者は、化学療法薬の投与によってさらに治療される。
【００５６】
さらなる実施態様では、前記化学療法薬は、タキサン系化学療法薬、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル、パクリタキセル・ポリグルメックス(paclitaxel polyglumex)、オルタタキセル、ゼネキソール、パクリタキセル内包リポソーム、およびパクリタキセルのビタミンＥエマルションから選択される。
【００５７】
一つの実施態様では、前記タキサンはドセタキセルまたはパクリタキセルである。
【００５８】
別の実施態様では、前記患者が１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える線量の放射線治療を受けた後に前記癌細胞サンプルを得る。
【００５９】
別の実施態様では、２つ以上の癌細胞サンプルを得る。
【００６０】
別の実施態様では、前記ＲＮＡ完全性は、ＲＮＡ、場合により全ＲＮＡまたはリボソームＲＮＡの電気泳動分離によって測定される。
【００６１】
さらに別の実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値の測定は、２８Ｓ：１８Ｓリボソーム（ｒＲＮＡ）比を算出することを含んでなる。
【００６２】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡ完全性は、例えば、ＲＩＮを算出することによって測定され、前記ＲＮＡインテグリティー値は、ＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）であり、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用して評価される。ＲＩＮは、Schroeder, A., O. Mueller, et al. 2006；Mueller 2004；Vespucci 2005に記載されているアルゴリズム、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔエキスパートを用いて算出され、これはＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーで使用される。その方法により、シグナル測定から特徴が自動選択され、ベイズ学習手法(a Bayesian learning technique)に基づき回帰モデルが構築される。異なる次元の特徴空間がベイズ理論(the Bayesian framework)により比較され、それによって、事後確率の高いモデルに対応する最終的な特徴組合せの選択が可能である。このアプローチを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いて記録された多数のＲＮＡの電気泳動測定値に適用して、ＲＮＡ完全性を説明するアルゴリズムを開発した。得られたアルゴリズムは、特定の条件下でかつ／または特定のサンプルについて、ＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）の算出を可能にするＲＮＡ品質管理の標準化のための、ユーザーに依存しない、自動化された、信頼性の高い手法である。
【００６３】
さらに別の実施態様では、前記ＲＮＡ完全性は、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるＷＯ２０１３／１５９２００に記載されているＲＮＡ破壊アッセイ(an RNA Disruption Assay)を用いて測定される。前記ＲＮＡインテグリティー値は、一つの実施態様では、ＲＮＡ破壊指数(a RNA disruption index)（ＲＤＩ）値である。前記サンプルが患者サンプルである別の実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、ＲＤＡゾーンを含んでなる。
【００６４】
さらなる実施態様では、ＲＮＡは前記癌細胞サンプルから単離され、単離されたＲＮＡにおいて前記ＲＮＡインテグリティー値および／または前記ＲＮＡ濃度が測定される。
【００６５】
別の実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、マイクロキャピラリー電気泳動により前記ＲＮＡを分離し、蛍光色素を用いてＲＮＡ完全性を検出することによって測定される。
【００６６】
別の実施態様では、前記ＲＮＡ濃度が測定される。
【００６７】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値が測定される。
【００６８】
別の実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値はＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）である。別の実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値はＲＮＡ破壊アッセイ値、例えば、ＲＤＩまたはＲＤＡゾーンである。照射誘導による効果の測定ではＲＩＮよりもＲＤＩの感度が高いことがある。細胞傷害性の、例えば、照射および／または化学療法によって誘導されるＲＮＡ分解は、ＲＤＩによる方が正確に捕捉される。
【００６９】
別の実施態様では、前記ＲＮＡ濃度および前記ＲＮＡ完全性の両方が測定される。
【００７０】
さらに別の態様では、癌細胞サンプルのＲＮＡ完全性を遠隔解釈するための方法であって、
ａ．遠隔地にて一定の放射線量を受けた患者から、乳癌および卵巣癌から任意に選択される癌細胞サンプルを得ること、
ｂ．前記遠隔地にて、前記癌細胞サンプルをアッセイして、電気泳動図データセット、ＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度から選択される１以上のデータセットを得ること、
ｃ．インターネットによって、１以上のデータセットを中央側へ送信すること、
ｄ．前記中央側にて、コンピューターを使用して前記１以上のデータセットから１以上の解釈データセットを作成すること、
ｅ．ｉ．コンピューターを使用して、１名以上のエキスパートレビューアの管理下で１以上のテストレポートを作成すること、および
ｆ．前記１以上のテストレポートを前記遠隔地または別のサイトへインターネットによって送信すること
を含んでなる方法が提供される。
【００７１】
さらに別の態様では、癌細胞サンプルのＲＮＡ完全性を遠隔解釈するための方法であって、
ａ．遠隔地にて一定の放射線量を受けた患者から、乳癌および卵巣癌から任意に選択される癌細胞サンプルを得ること、
ｂ．前記癌細胞サンプルを前記中央側へ送ること、
ｃ．前記中央側にて、受け取った前記癌細胞サンプルをアッセイして、電気泳動図データセット、ＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度から選択される１以上のデータセットを得ること、
ｄ．前記中央側にて、コンピューターを使用して前記１以上のデータセットから１以上の解釈データセットを作成すること、
ｅ．コンピューターを使用して、１名または複数名のエキスパートレビューアの管理下で１以上のテストレポートを作成すること、および
ｆ．前記１以上のテストレポートを前記遠隔地または別のサイトへインターネットによって送信すること、
を含んでなる方法が提供される。
【００７２】
前記電気泳動図データセットおよび前記１以上の解釈データセットを含む前記１以上のデータセットは、例えば、データ通信ネットワークまたは無線通信を介して取得および送信することができる。
【００７３】
一つの実施態様では、前記癌細胞サンプル、例えば、前記対象から得られたものは、アッセイする前に、ＲＮＡ単離または安定化組成物に入れられる。
【００７４】
さらなる態様には、本明細書で記載する方法に用いるキットであって、ＲＮＡ単離組成物と、前記癌細胞サンプルおよび／またはＲＮＡサンプルを入れるためのＲＮアーゼフリーの容器とを含んでなり、前記容器は、場合により識別子を用いて表示され、場合により匿名検査が可能である、キットが含まれる。
【００７５】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい実施態様を示しているが、本開示の趣旨および範囲内の様々な変更および修飾がこの詳細な説明から当業者には明らかになることから、単に例示として示されていると理解されるべきである。
【００７６】
次に、本開示の実施態様を図面に関連して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ロンドン地域健康科学センター(the London Regional Health Sciences Centre)で実施した臨床試験の概略を示す図であり、そこで、局所進行性乳癌を有する患者に、第１に、５’フオロウラシル(5’Fuorouracil)、エピルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＥＣ）、続いて、週１回のドセタキセルと１日１回の照射の併用、その後、週１回のドセタキセルを含む化学療法レジメンによって治療を行った。
【図２】図１に示したロンドン臨床試験(the London Clinical Trial)における患者に対するＦＥＣ治療および／またはドセタキセル治療と照射の併用の効果を示す図である。様々な治療時間における平均腫瘍ＲＮＡ濃度±標準誤差を上のパネルに示し、下のパネルには各患者の生検材料ＲＮＡ濃度を示している。
【図３】治療前、治療中間期、または治療後の腫瘍ＲＮＡ濃度値だけではロンドン臨床試験における臨床応答の程度を示すことができないことを示す図であり、治療後の病理学的完全寛解（ｐＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、または安定もしくは進行（ｐｒｏｇ）の存在を含む応答なし（ＮＲ）が含まれていた。
【図４】ロンドン臨床試験においてｐＣＲに達した患者（応答者）およびｐＣＲに達しなかった患者（不応者）についてのＲＩＮ値とＲＮＡ濃度のグラフを示す図である。図４Ａでは、治療中（ＦＥＣ後）に腫瘍サンプルを採取し、３つの応答者サンプルのうち１つが低ＲＮＡ濃度および低ＲＩＮ値を示した。図４Ｂでは、照射およびドセタキセル後に腫瘍サンプルを採取し、両方の応答者サンプルが低ＲＮＡ濃度および低ＲＩＮ値を示した。
【図５】Ａ２７８０卵巣腫瘍細胞におけるＲＮＡ含量（濃度）（パネルＡ）またはＲＮＡ完全性（パネルＢ）に対する様々な線量の照射の効果を示す図である。０．１μＭドセタキセル処理と１０グレイ照射の併用の効果も示している。放射線処理単独ではＲＮＡ含量および完全性が明らかに用量依存的に低下し、これは、０．１μＭドセタキセル処理の併用によって強く増強された。
【図６】Ｈｅｒ２＋ＳＫＢＲ３乳房腫瘍細胞におけるＲＮＡ含量（濃度）（パネルＡ）またはＲＮＡ完全性（パネルＢ）に対する様々な線量の照射の効果を示す図である。０．１μＭドセタキセル処理と１０グレイ照射の併用の効果も示している。１０グレイ放射線処理単独ではＲＮＡ含量がわずかに減少し、ＲＮＡ完全性に対して明らかな効果はなかった。ＲＮＡ含量およびＲＮＡ完全性に対する１０グレイ照射の効果は、０．１μＭドセタキセル処理の併用によって、特にＲＮＡ完全性について強く増強された。
【図７】ＭＣＦ−７乳房腫瘍細胞［乳房腫瘍のサブタイプ（管腔型Ａ）］におけるＲＮＡ含量（濃度）（パネルＡ）またはＲＮＡ完全性（パネルＢ）に対する様々な線量の照射の効果を示す図である。０．１μＭドセタキセル処理と１０グレイ照射の併用の効果も示している。放射線処理単独ではＲＮＡ含量および完全性に対してほとんど効果がなく、これは、０．１μＭドセタキセル処理の併用によってほんのわずかに増強された。
【図８】１０Ｇｙ照射を行っておよび行わずに、漸増用量のエピルビシンによって処理したＡ２７８０細胞についてのグラフを示す図である。Ａ）エピルビシン用量に対するＲＩＮ値；Ｂ）エピルビシン用量に対するＲＤＩ値；Ｃ）エピルビシン用量に対するＲＮＡ濃度。
【図９】１０Ｇｙ照射を行っておよび行わずに、漸増用量のエピルビシンによって処理したＭＣＦ−７細胞についてのグラフを示す図である。Ａ）エピルビシン用量に対するＲＩＮ値；Ｂ）エピルビシン用量に対するＲＤＩ値；Ｃ）エピルビシン用量に対するＲＮＡ濃度。
【図１０】７２時間および９６時間における、５ｎＭドセタキセル、１０Ｇｙ照射および１０Ｇｙ照射＋５ｎＭドセタキセルによって処理したＡ２７８０細胞についてのグラフを示す図である。Ａ）薬物および放射線処理を行った場合の平均ＲＩＮ値（ｎ＝３）。エラーバーは標準偏差を表す；Ｂ）ドセタキセルおよび放射線処理を行った場合の平均ＲＤＩ値（ｎ＝３）は、９６時間において、照射＋ドセタキセルを行った場合のＲＤＩ値がドセタキセル単独の場合と比べて増加していることを示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１】（Ａ）療法中間期および（Ｂ）療法後に採取したサンプルについてのｐＣＲ応答者およびｐＣＲ不応者のＲＤＩとＲＮＡ濃度のグラフを示す図である。
【図１２】電気泳動図例のグラフである。この図において、１８Ｓピーク、２８Ｓピーク、中間バンド領域、低Ｃバンド領域、低Ｂバンド領域、低Ａバンド領域およびマーカー領域を定義している。
【図１３】電気泳動により分離されたＲＮＡサンプルのゲルの画像、ならびに各サンプルについての対応するＲＩＮ値およびＲＤＩ値を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００７８】
Ｉ．定義
ＲＮＡ分解に関して本明細書で使用する用語「量」とは、サンプルから単離されたＲＮＡにおいて検出可能または測定可能なＲＮＡ分解の量（例えば、相対量または絶対量）を意味する。例えば、前記量は、絶対値（例えば、ＲＤＩ値もしくはＲＩＮ値）または相対量、例えば、対照量の１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．２倍、２．４倍、２．６倍、２．８倍、３．０倍、３．２倍、３．４倍、３．６倍、３．８倍、４．０倍、４．２倍、４．４倍、４．６倍、４．８倍、５．０倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、６０倍、８０倍および／または１００倍などを用いて表すことができ、その場合、例えば、前記対照量は、例えば、治療前量または、例えば、未治療または治療前サンプルにおける平均値または中央値レベルに対応する参照値である。前記量は、例えば、前記治療に応答する可能性を有する対象を特定する１以上の閾値の値と比較することができる。
【００７９】
本明細書で使用する用語「ベースライン量」とは、後の時点で、例えば、治療中またはその後に、例えば、放射線および場合により化学療法、細胞傷害性抗体および／または他の治療を含んでなる治療レジメン中またはその後に、採取された試験サンプルとの比較（例えば、細胞集団および／または腫瘍との比較）のために使用することができる、治療前サンプルなどのサンプルにおけるＲＮＡ分解量（例えば、ＲＮＡがいかに無傷であるか）を意味する。例えば、治療に対する応答のモニタリングに関連する方法では、「ベースライン量」とは、後のサンプルより前に採取されたサンプルにおけるＲＮＡ分解のレベルを意味することがあり、例えば、ベースラインサンプルは治療前に採取され、それとの比較は治療に対する応答の指標となる。
【００８０】
本明細書で使用する用語「癌細胞サンプルをアッセイして、ＲＮＡインテグリティー値を得ること」とは、癌細胞サンプルのＲＮＡサンプルにおいて、ＲＮＡまたはその一部の分解および／または無傷の程度を定量的または半定量的に確認または測定するためにアッセイを実施して、アッセイ結果を表す値を提供することを意味する。例えば、ＲＮＡインテグリティー値は、マイクロキャピラリー電気泳動を含む複数の方法により、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、それと同等のＲＮＡ品質指標(RNA Quality Index)（ＲＱＩ）を示すＥｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）キャピラリー電気泳動システム、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）または他の同等のシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｕｍｅｘ、もしくはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造のものまたは同様のシステムなど）を使用して、例えば、ＲＮＡインテグリティーナンバーを決定することにより、かつ／ならびに、例えば、ＲＮＡインテグリティー値が、ゲルアガロース電気泳動および／または分光法を用いて決定される２８Ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡ比である場合には、例えば、２８０：２６０でのＵＶ吸光度を評価することによって、決定することができる。引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる、２０１３年４月２４日に出願された「ＲＮＡ破壊を評価するためのアッセイ、方法および装置(ASSAYS, METHODS AND APPARATUS FOR ASSESSING RNA DISRUPTION)」と題する特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００４０８号に開示されている方法を含む、ＲＮＡ完全性を決定する他の方法には、ＲＮＡ完全性を評価するためのアッセイが記載されており、これらのアッセイを本明細書で使用してよい。実施態様では、電気泳動図データセットが得られ（例えば、その特徴にはＲＮＡプロファイルが含まれる）、ＲＮＡインテグリティー値を算出するためにそのデータセットが使用される。
【００８１】
本明細書で使用する用語「癌細胞サンプルをアッセイして、ＲＮＡ濃度を得ること」とは、ＲＮＡサンプルにおいて、ＲＮＡまたはその一部の量を定量的に確認または測定するためにアッセイを実施して、アッセイ結果を表す値を提供することを意味する。例えば、ＲＮＡ濃度は、例えば、マイクロキャピラリー電気泳動を含む複数の方法により、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、それと同等のＲＮＡ品質指標（ＲＱＩ）を示すＥｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）キャピラリー電気泳動システム、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）または他の同等のシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｕｍｅｘ、もしくはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造のものまたは同様のシステムなど）の使用などによって、決定することができる。ＲＮＡ濃度はＵＶ吸光度に基づいてよく、例えば、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度を評価することによるものであり得る。
【００８２】
本明細書で使用する用語「乳癌」とは、乳癌のＨＥＲ２、基底型、管腔型Ａ、管腔型Ｂ、および「ノーマル」サブタイプを含む、乳癌の総てのサブタイプ、ならびに局所進行性乳癌（ＬＡＢＣ）を含む。
【００８３】
本明細書で使用する用語「癌細胞サンプル」とは、例えば、癌細胞および／または癌ベッド細胞(cancer bed cells)を含んでなる任意のサンプルを意味し、例えば、腫瘍組織またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物などの癌細胞源から得られる細胞が含まれる。癌細胞は、例えば、乳癌細胞、卵巣癌細胞、非黒色腫皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌細胞、例えば、非小細胞肺癌、子宮頸癌、肛門癌、前立腺癌、リンパ腫癌細胞、脂肪肉腫癌細胞、または放射線を含んでなるレジメンによって治療可能であるかまたは放射線を含んでなるレジメンによる治療可能性について試験されている任意の癌細胞であり得る。
【００８４】
本明細書で使用する用語「癌ベッド細胞」とは、これまで癌が占有していた部位に（例えば、腫瘍病変部位に）浸潤している修復組織細胞を意味し、その腫瘍の周囲の間質性結合組織を含み得る。これらは、放射線治療に応答した患者において、場合により治療後にまたは迅速に応答した患者において治療中に得ることができる。例えば、ＭＡ２２研究において治療後にｐＣＲを示した一部の腫瘍は、腫瘍細胞が存在しなくても腫瘍病変部位で得られたサンプルにおいて強いＲＮＡ分解を示し、ＭＡ２２研究においてｐＣＲを示すようになった一部のサンプルは、療法中に腫瘍細胞充実性を示さなかったが、高いＲＤＩ値（低ＲＩＮ）を示し、この時点においてＲＮＡを提供する細胞は修復組織細胞である可能性が高かったことが示されている。これらの癌ベッド細胞はその部位の周囲の非腫瘍細胞よりも代謝活性が高い。
【００８５】
本明細書で使用する用語「癌治療を変更すること」とは、例えば、放射線もしくは化学療法薬の投与量レベルおよび／もしくはスケジュールの変更、治療の中止、治療への化学療法薬、生物製剤もしくは放射線増感剤の追加、または薬物療法もしくは外科手術などの代替癌治療への変更（例えば、放射線治療の中止）のうちの１以上を含む。
【００８６】
ＲＮＡインテグリティー値またはＲＮＡ濃度に関連して本明細書で使用する用語「対照と同等の」または「参照閾値と同等の」または「不変」とは、３０％未満の減少または増加を意味し、場合により、この減少は、例えば、治療前の対照などの対照から２５％未満の減少、２０％未満の減少、もしくは１０％未満の減少であってよく、または増加は、治療前の対照などの対照から２５％未満の増加、２０％未満の増加、もしくは１０％未満の増加であってよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法において、「対照と同等の」「参照閾値と同等の」または「不変」とは、１０％または５％の減少または増加より小さくてよい。ｉｎ  ｖｉｖｏ法において、「対照と同等の」、「参照閾値と同等の」または「不変」とは、３０％または２５％の増加または減少より小さくてよい。
【００８７】
本明細書で使用する用語「対照」とは、無傷のＲＮＡおよび／または不応者および／もしくは応答者として知られている対象もしくは個体群から得られるＲＮＡなどの比較サンプル、ならびに／あるいは被験個体の治療前サンプルもしくは初期サンプルなどの参照サンプルを意味する。例えば、対照は、乳癌または卵巣癌細胞ＲＮＡなどの癌細胞ＲＮＡを含んでなる対象からのサンプル、例えば、対象の治療前または初期サンプルなどであり得る。対照はまた、未治療癌組織または癌細胞ＲＮＡサンプル（例えば、無傷のＲＮＡ）について予測または予め決定されたＲＮＡインテグリティー値であってよい。例えば、未治療癌組織または未治療癌細胞ＲＮＡサンプルは、決定することができ、「無傷」である、例えば、ＲＩＮ値は７より大きく、または８より大きく、または９より大きいと予測される（特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物の場合には、ＲＩＮ  ９を使用することができる）。例えば、患者の応答をモニタリングする場合または細胞株に基づいた試験では、対照を参照閾値として使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の細胞に見られるベースラインまたは治療前レベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏよりもＲＮＡ分解レベルがずっと低く、腫瘍のＲＮＡ分解のベースライン値は著しく高い。実験室での細胞培養物は、増殖因子、栄養素、バッファー、適当な酸素供給、ＲＯＳスカベンジャー、ビタミンなどを含む、細胞生存力を促進する理想的な条件下にある。一つの実施態様では、前記対照は陽性対照であり、例えば、細胞／腫瘍は放射線によって治療されている。別の実施態様では、前記対照は陰性対照であり、例えば、細胞／腫瘍は放射線治療を受けておらず、場合によりいかなる治療も受けていない。
【００８８】
本明細書で使用する用語「細胞傷害性治療」とは、癌の治療に使用され、細胞死を誘導することができ、放射線とともに、逐次におよび／または同時に使用することができる任意の薬剤を意味し、これらには、例えば、従来型および非従来型化学療法（例えば、標的療法）、放射線治療、ホルモン治療（例えば、応答する癌に対するもの）およびそれらの組合せが挙げられる。そのような薬剤としては、限定されるものではないが、ドセタキセルおよびパクリタキセルなどの微小管安定化剤、エピルビシンなどのＤＮＡ合成阻害剤、トラスツズマブなどのＨｅｒ２受容体の阻害剤、マホスファミド、カルボプラチンおよびシスプラチンなどのＤＮＡ架橋剤、ベバシズマブなどのＶＥＧＦＡ阻害剤、スニチニブおよびトセラニブなどの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ゾレドロン酸などのビスホスホネート、５−フルオロウラシルなどのチミジル酸シンターゼ阻害剤が挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用する用語「化学療法薬」とは、癌、例えば、放射線を含んでなるレジメンによって治療可能な乳癌または卵巣癌または他の癌、例えば、非黒色腫皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、非小細胞肺癌、子宮頸癌、肛門癌、前立腺癌などの治療に使用される任意の薬物または薬物組合せを意味し、これらには、例えば、一次化学療法に使用される薬物（例えば、白金製剤（例えば、シスプラチンおよび／もしくはカルボプラチン）ならびに／またはタキサン（例えば、パクリタキセルおよび／もしくはドセタキセル）を含む）、再発性卵巣癌の治療において典型的に使用される薬物（例えば、アントラサイクリン類、例えば、ドキソルビシンまたはエピルビシンまたはそれらのペグ化形態など）、トポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤（例えば、それぞれ、トポテカンおよびエトポシド）、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルなどのヌクレオシド類似体、マホスファミドなどのＤＮＡ架橋剤、エストロゲン受容体遮断薬タモキシフェン、ならびに／あるいはＨｅｒ−２／Ｎｅｕ遮断薬ベバシズマブが挙げられる。一つの実施態様では、前記化学療法薬はスニチニブである。
【００９０】
放射線に関連して本明細書で使用する用語「線量」とは、スケジュール内での各時点で投与された個別放射線曝露量またはスケジュール内での放射線曝露の総量を意味する。化学療法による治療に関連して、用量とは、スケジュール内での各時点で投与された個別薬物の量またはスケジュール内で投与された各薬物の総量または化学療法のコース中に投与された薬物の総量を意味する。
【００９１】
患者サンプルに関する応答を判定するために本明細書で使用する用語「低下しているＲＮＡ完全性」とは、対照または対応する値、例えば、治療前サンプルまたは例えば、最大値（例えば、最大ＲＩＮ）よりも少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低いＲＮＡ完全性を意味する。細胞培養物サンプルに関して、対照に対する少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２５％の低下は、ＲＮＡ完全性が低下していることを示している。
【００９２】
本明細書で使用する用語「減少しているＲＮＡ濃度」とは、対照または対応する参照値、例えば、治療前サンプルまたは例えば、最大値よりも少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低いＲＮＡ完全性を意味する。
【００９３】
本明細書で使用する、患者に関連する用語「陽性治療転帰」とは、治療に対する陽性治療応答、例えば、検出できるまたは検出できないに関わらず、１以上の症状または状態の緩和または改善、疾患の程度の軽減、病状の安定（すなわち、悪化していない）、疾病拡大の予防または疾患進行の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、疾病の好転、病状の改善または一時的緩和、および寛解（部分的または完全に関わらない）を意味する。「陽性治療転帰」はまた、治療を受けていない場合に予測される生存と比較したときの、全生存期間、安定および／または無病／進行生存期間の延長（例えば、治療後の病理学的完全寛解を含む）も意味し得る。陽性治療転帰の程度は、例えば、治療中に得られた癌サンプルについて決定されたＲＮＡ分解および／またはＲＮＡ濃度減少の程度と関連し得る。
【００９４】
本明細書で使用する用語「治療後」とは、放射線レジメンを含んでなる治療の完了後、場合により治療レジメンの総ての治療群の完了後、例えば、照射後の任意の化学療法または他の治療の完了後を意味する。
【００９５】
本明細書で使用する、患者に関連する用語「陰性治療転帰」とは、前記治療に対する治療応答の欠如、例えば、不応、疾患の再発、または疾病の拡大（疾患進行）を意味する。
【００９６】
本明細書で使用する用語「応答者」とは、陽性治療または治療転帰（例えば、測定可能な治療応答など）を示す患者を意味する。応答者には、場合により、同様に治療を受けた患者の群の平均値と比較して増加している無病生存期間（ＤＦＳ）または全生存期間（ＯＳ）、病理学的完全寛解（ｐＣＲ）または部分寛解を示す患者が含まれる。
【００９７】
本明細書で使用する用語「不応者」とは、陽性治療転帰を示さない（例えば、測定可能な治療応答がないなど）、例えば、同様に治療を受けた患者の群の平均値と比較して減少しているＤＳＦまたはＯＳなどの陰性治療転帰を示す患者（例えば、無応答者）を意味する。
【００９８】
用語「ＲＮＡサンプル」とは、任意の精製および／または単離ＲＮＡ画分、例えば、全ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡを含む、精製されかつ／または単離されたＲＮＡを含んでなる任意のサンプルを意味する。一つの実施態様では、前記ＲＮＡサンプルはｒＲＮＡを含んでなる。ＲＮＡサンプルは、例えば、ＲＮＡの単離についての当技術分野で公知の複数の方法を用いることなどによって得ることができる。
【００９９】
本明細書で使用する用語「卵巣癌」とは、漿液性、明細胞性、類内膜性、および粘液性のサブタイプを含む、卵巣癌の総てのサブタイプを意味する［１０］。
【０１００】
治療に関連する用語「放射線」とは、腫瘍に提供される任意のエネルギー、光子または粒子を意味し、例えば、電離放射線が含まれる。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「放射線増感剤」とは、腫瘍細胞の、放射線療法に対する感受性を高める、小分子薬または生物製剤などの薬剤を意味する。前記放射線増感剤(The radiosensitiver)は、酸素増加剤、低酸素細胞増感剤、ハロゲン化ピリミジン、または生体還元剤であってよい。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「酸素増加剤」とは、腫瘍酸素化を増加させかつ／または腫瘍低酸素症を減少させる、小分子薬または生物製剤などの薬剤を意味し、例えば、酸素が含まれる。本明細書で使用する用語「低酸素細胞増感剤」とは、酸素を模倣することができ（しかし、酸素レベルを高めない）、典型的に腫瘍細胞によって代謝されず、腫瘍に浸透可能な、小分子薬などの薬剤を意味する。例としては、ニトロイミダゾールが挙げられる。２−ニトロイミアゾール(2-nitroimiazole)などの低酸素細胞増感剤は、典型的に放射線耐性である低酸素細胞の死滅を増大させる。
【０１０３】
本明細書で使用する用語「生体還元剤」とは、例えば、腫瘍の低酸素領域において、細胞傷害性種に還元され得る、小分子薬などの薬剤を意味する。例としては、マイトマイシンＣなどのキノン系抗生物質(quinone antiobiotics)、芳香族ニトロ化合物(niroaromatics)、およびジ−Ｎオキシドが挙げられる。
【０１０４】
本明細書で使用する用語「放射線防護剤」とは、腫瘍細胞の、放射線療法に対する感受性を低下させる、小分子薬または生物製剤などの薬剤を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用する用語「ＲＮＡ分解」とは、未治療の癌細胞もしくは組織のＲＮＡ、または癌細胞について予測されるＲＮＡ完全性と比較した、単離された癌細胞もしくは組織のＲＮＡのＲＮＡ完全性の低下を意味する。例えば、ヒトＲＮＡ（例えば、一次細胞および／または組織から単離されたもの）は、ＲＩＮが＜７、および／または場合により＜７、６．８未満、６．６未満、６．４未満、６．２未満、６．０未満、５．８未満、５．６未満、５．４未満、５．２未満または５．０未満である場合に、細胞株については、ＲＩＮが例えば、≦８、場合により＜９である場合に、分解されたと一般に認められる。前記ＲＮＡ分解には、治療によって誘導されるＲＮＡ分解および自己溶解型ＲＮＡ分解が含まれ得る。
【０１０６】
本明細書で使用する用語「自己溶解型ＲＮＡ分解」とは、自己溶解型細胞破壊中に起こるＲＮＡ分解を意味する。自己溶解は、例えば、活発な生理学的または病態生理学的プロセスではなく細胞内での能動的プロセスの停止に起因する、細胞のリソソームからの細胞質への消化酵素の放出によって開始される。サンプルにおける自己溶解型ＲＮＡ分解は、生理学的環境からの長時間の細胞の移動（例えば、生理食塩水中でのインキュベーション）および／または生理学的プロセスの非特異的停止、例えば、熱処理によって誘導され得る。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「治療によって誘導されるＲＮＡ分解」とは、放射線治療、化学療法治療および／または細胞傷害性抗体治療（例えば、トラスツズマブ）などの細胞傷害性治療に応答して誘導されるシグナルである、ばらばらに断片化されかつ／または分解されたＲＮＡを意味する。細胞傷害性シグナルによって誘導されるＲＮＡ分解には、特に、例えば、後の段階での、自己溶解型分解に似たいくつかの特徴を有するＲＮＡ分解が含まれ得る。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「ＲＮＡ完全性」とは、細胞または組織サンプルからの抽出または単離後のＲＮＡの無傷の程度で、例えば、単離されたＲＮＡが分解されているかどうかを意味する。ＲＮＡ完全性には、ＲＮＡの無傷および／または分解の程度に、例えば、比例してまたは反比例して対応する値（例えば、ＲＮＡインテグリティー値）を割り当てることができる。高ＲＮＡ完全性は、分解がほとんどまたは全くないこと、例えば、最大のＲＮＡインテグリティー値（例えば、ＲＮＡインテグリティー値がＲＩＮを用いて測定される場合、例えば、ＲＩＮ＝１０またはＲＮＡインテグリティー値がサンプルのＲＮＡ完全性に比例する他のスケール）から３０％未満の減少、２５％未満の減少、２０％未満の減少、または例えば、ＲＮＡインテグリティー値がサンプルのＲＮＡ完全性に反比例する、例えば、ＲＤＩの場合のベースラインおよび／もしくは治療前の対照などの対照に対応するＲＮＡインテグリティー値からの３０％未満の増加、２０％未満の増加（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏサンプルの場合、場合によりｉｎ  ｖｉｔｒｏサンプルの場合では１０％または５％未満の減少または増加）、ならびに抽出または単離後に対象となるｍＲＮＡを増幅する能力を保持することを意味すると一般的に解釈される。ＲＤＩを用いると、高ＲＮＡ完全性は、例えば、１０未満、または３未満であり、ＲＩＮを用いると、高ＲＮＡ完全性は、７より大きく、８より大きくまたは９より大きい。低ＲＮＡ完全性は、例えば、最大ＲＩＮ＝１０のＲＩＮ（またはＲＮＡインテグリティー値がＲＮＡ完全性に比例する他のスケール）を用いて、最大から２０％を上回る、２５％を上回る、３０％を上回る、３５％を上回る、４０％を上回る、４５％を上回る、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、もしくは７５％を上回る減少などを示すか、または例えば、ＲＤＩ（またはＲＮＡインテグリティー値がＲＮＡ完全性に反比例する他のスケール）を用いて、例えば、ベースライン、治療前の対照などの対照から２０％を上回る、２５％を上回る、３０％を上回る、３５％を上回る、４０％を上回る、４５％を上回る、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、もしくは７５％を上回るＲＮＡインテグリティー値の増加または抽出もしくは単離後にＲＮＡ中の対照において存在することが分かっている場合に対象となるｍＲＮＡを増幅する能力の低下を示すＲＮＡである。
【０１０９】
本明細書で使用する用語「ＲＮＡインテグリティー値」とは、細胞または組織サンプルからの抽出または単離後のサンプルのＲＮＡの無傷または分解の程度の尺度である。例えば、ＲＮＡインテグリティー値は、分光光度計強度測定値、および／または２８Ｓ：１８ＳリボソームＲＮＡ比であってよい。ＲＮＡインテグリティー値は、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、ＲＩＮアルゴリズムの出力を使用して決定されるＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）であってよく、この場合、一般的には、ＲＩＮ値が高いほどＲＮＡ完全性が高く、ＲＩＮ値が低いほどＲＮＡ分解が多い。例えば、ＲＩＮ０は完全に加水分解されたＲＮＡを表し、ＲＩＮ１０は全く分解されていないＲＮＡを表す。当業者ならば、ＲＮＡインテグリティー値が低いほどＲＮＡ完全性が高く、ＲＮＡインテグリティー値が高いほどＲＮＡ完全性が低いように、スケールの逆数（例えば、１をその値で割ることにより、例えば、１／ＲＮＡインテグリティー値）を求めてもよいことは分かるであろう。例えば、ＲＮＡインテグリティー値は、２０１３年４月２４日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００４０８号「ＲＮＡ破壊を評価するためのアッセイ、方法および装置(ASSAYS, METHODS AND APPARATUS FOR ASSESSING RNA DISRUPTION)」に記載されているように、電気泳動図の特徴に基づいた計算の出力であってよく、例えば、ＲＮＡ破壊指数（ＲＤＩ）として表されるか、または変換されたスケールであってよい。例えば、患者サンプルの場合、スケールはカットオフまたは応答閾値に基づいた臨床ＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）ゾーンによって定義されたものでよく、この場合、各スコアまたはＲＤＡゾーンは、応答の可能性と関連し、例えば、ＮＰＶおよび／またはＰＰＶによって定義される、治療に対して応答する可能性などと関連する。ＲＤＩまたはＲＤＡゾーンを採用する実施態様では、（例えば、ベースラインサンプルまたは対照との比較で）ＲＮＡインテグリティー値が高いことまたは増加していることはＲＮＡ分解が多いことまたは増加していることを示す。例えば、そのような実施態様では、ＲＮＡインテグリティー値が高いほど、誘導されたＲＮＡ分解が多い（ＲＮＡ完全性の低下）。任意のスケールを採用してよい、例えば、３、１０、または６００。従って、ＲＮＡインテグリティー値が、サンプルのＲＮＡ完全性に比例する場合、ＲＮＡインテグリティー値が高いことまたは増加していることはＲＮＡ完全性が高いことまたは増加していることに相当し、ＲＮＡインテグリティー値が、サンプルのＲＮＡ完全性に反比例する場合、ＲＮＡインテグリティー値が高いことまたは増加していることはＲＮＡ完全性が低いことまたは低下していることに相当する。ＲＮＡインテグリティー値は、１以上の特徴を用いて算出することができる。また、採用するスケールは線形スケールまたは対数スケールであってよい。
【０１１０】
本明細書で使用する用語「ＲＮＡ単離または安定化組成物」とは、ＲＮアーゼ活性を阻害し、かつ／またはＲＮＡを安定させて、ＲＮＡ分解を妨げる任意の組成物を意味する。
【０１１１】
本明細書で使用する用語「安定しているＲＮＡ完全性」とは、例えば、適当な比較サンプルまたは組織の細胞種について予測されるＲＮＡ完全性と比べたときに、あまり分解されていないＲＮＡを意味する。典型的には、ヒトの場合、これはＲＩＮ≧７の単離ＲＮＡであり、例えば、腫瘍細胞ＲＮＡに関しては≧６．８、≧６．６、≧６．４、≧６．２、≧６．０、または≧５．８であり得る。細胞株の場合、例えばＲＩＮ≧９。ＲＤＩを含む他の尺度も用いることができる。
【０１１２】
本明細書で同義的に使用する用語「患者」および「対象」とは、哺乳類、例えば、イヌ、齧歯類、例えば、ラットおよびマウス、好ましくは、ヒトを含む、動物界の任意のメンバーを意味し、例えば、癌、場合により乳癌または卵巣癌を有するまたは有することが疑われる対象が含まれる。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「ＲＮＡ」とは、任意のＲＮＡまたはＲＮＡ画分を含み、限定されるものではないが、ＲＮＡのサブセットの、全ＲＮＡ、ｒＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡが含まれ、例えば、ＲＮＡには、ＲＮＡ単離後に存在し得るＲＮＡの種類および成分の総て、例えば、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、または例えば、少なくともｒＲＮＡを含んでなる画分が含まれ得る。例として、本明細書で記載する方法で全ＲＮＡを使用することができるし、ＲＮＡのクラスまたはサブセットも使用することができる。例えば、記載する方法を用いてアッセイすることができるＲＮＡサブセットとしては、例えば、ｒＲＮＡ、および／またはｍＲＮＡを含んでなるサブセットが挙げられる。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「耐性」とは、放射線単独または細胞傷害性薬剤、場合により化学療法薬もしくはレジメンとの併用に対する癌細胞または腫瘍の応答を意味し、この場合、腫瘍内の癌細胞または癌細胞のサブセットは、ＲＮＡ分解の観点から、その治療に対して全く応答を示さないかまたは応答が不十分であることを示し（例えば、臨床研究により判定可能）、これは、例えば、陰性治療転帰と関連付けられる。
【０１１５】
本明細書で使用する用語「応答」とは、放射線単独または細胞傷害性薬剤、場合により化学療法薬および／もしくはレジメンとの併用に対する癌細胞または腫瘍の応答を意味し、この場合、腫瘍内の癌細胞または癌細胞のサブセットは、ＲＮＡ分解の観点から、その治療に応答する、例えば、著しいおよび／または十分なＲＮＡ分解を示し（例えば、臨床研究により判定可能）、これは、例えば、陽性治療転帰と関連付けられる。
【０１１６】
進行に関連して使用する用語「低リスク」とは、同様に治療を受けた同じ癌を有する患者の群で算出された平均的なリスクよりも低いこと（例えば、確率の低下）を意味し、進行の高リスクとは、前記患者群と比べて平均的なリスクより高いこと（例えば、確率の上昇）を意味する。
【０１１７】
用語「ＲＮＡ破壊指数」または「ＲＤＩ」は、２０１３年４月２４日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００４０８号において使用されているように、本明細書で使用され、ＲＮＡ破壊アッセイ（ＲＤＡ）を用いて作成された値であり、本明細書で記載する特徴の線形判別分析(linear discriminant analysis)（ＬＤＡ）または二次判別分析(quadratic discriminant analysis)の出力の、定義された特徴（例えば、図１２に示される特徴）の比であってよい。ＲＤＩは、対数スケールであり、例えば、図１２に示される特徴を用いて、場合により例えば、（中間面積＋低Ｃ面積）／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）に基づいて算出することができる。ＲＤＩスケールは、破壊されたＲＮＡ／正常ＲＮＡの絶対比を反映している。既知応答転帰の患者の群（例えば、特定のＮＰＶまたはＰＰＶと関連すると判定されている）から決定されたＲＤＩ値を用いて、ＲＤＡゾーンの境界である閾値を定義することができる。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「ＲＤＡゾーン」とは、ある範囲のＲＤＩ値を含んでなる治療応答転帰と関連する臨床ゾーンを意味する。各ＲＤＡゾーンは１つまたは２つの境界によって定義され、各境界は選択された閾値に対応する（例えば、所望のＮＰＶまたはＰＰＶに対応する）。臨床ゾーンの範囲内にある対象のＲＤＩ値は、治療応答、例えば、ｐＣＲおよび／またはＤＦＳの増加と関連するかまたはそれを予測する。一つの実施態様では、３つのＲＮＡ破壊アッセイゾーン、選択されたＮＰＶおよび／またはＰＰＶによって定義される、ＲＤＡゾーン１、ＲＤＡゾーン２およびＲＤＡゾーン３を用いることができる。当業者ならば、任意の数のゾーンを異なる選択された閾値でそれぞれ用いることができることを容易に理解するであろう。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「ＲＤＡゾーン１」とは、陰性的中率(negative predictive value)（ＮＰＶ）が少なくとも０．８、少なくとも０．８５、少なくとも０．９、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７、少なくとも０．９８またはそれより大きいＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ値）の範囲を意味する。これらの数字および関連する閾値は、例えば、特定の治療、例えば、患者が増加された実施例１に記載する臨床試験など、についてのＤＦＳおよび／またはｐＣＲ臨床試験結果に基づく。実施態様例では、ＲＤＡゾーン１は、中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ面積）という特徴を用いて算出されたＲＤＩ１０以下に等しい。他の実施態様では、他の特徴または特徴組合せを使用することができる。「ＲＤＡゾーン１」は、所望のＮＰＶを選択することによって、スコアの任意のセットを含むように定義することができる。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「ＲＤＡゾーン２」とは、ＲＤＡゾーン１とＲＤＡゾーン３との間に位置するＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ値）の範囲を指し、中間または不明ゾーンと考えることができる。
【０１２１】
本明細書で使用する用語「ＲＤＡゾーン３」とは、陽性的中率(positive predictive value)（ＰＰＶ）が少なくとも０．１５、少なくとも０．１６、少なくとも０．１７、少なくとも０．１８、少なくとも０．１９、少なくとも０．２またはそれより大きいＲＤＡスコア（例えば、ＲＤＩ値）の範囲を意味する。これらの数字および関連する閾値は、例えば、所定の治療、例えば、患者が追加された実施例１に記載の臨床試験、についてのｐＣＲおよび／またはＤＦＳ臨床試験結果に基づく。「ＲＤＡゾーン３」は、所望のＰＰＶを選択することによって、スコアの任意のセットを含むように定義することができる。
【０１２２】
一つの実施態様では、前記放射線応答スコアはＲＤＡゾーン１、２または３である。前記放射線応答スコアはまた、耐性、応答および不明であってもよい。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「応答閾値」または「参照閾値」とは、予め決定されたサンプルまたはサンプル群におけるＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度の表示またはカットオフ値であり得、この値を上回るおよび／または下回ると、癌細胞種もしくは腫瘍は、治療に対して耐性である可能性が高いまたは応答性である可能性が高いと特定され、例えば、患者転帰が示される。例えば、ＲＮＡ完全性指標のＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度がカットオフまたは応答閾値を下回る患者は、放射線治療および／またはレジメンに応答性である可能性が高いことが示され、かつ／または陽性治療転帰が予測される。前記応答閾値は、例えば、治療前もしくは未治療サンプルなどの対照から導くことができるし、または既知の応答者および／もしくは不応者である対象の集団から導かれる値であってよく、この値は、予め選択された特異性および感受性の程度について、応答者でありそうな患者と不応者でありそうな患者とを分類する値である。治療前対照または未治療対照などの対照の場合、前記応答閾値は、例えば、細胞集団、治療などに基づいて予測されたＲＮＡ完全性であってよい（例えば、ＲＩＮ値の場合、場合により７、８、９または１０）。当業者ならば、使用するスケールによって、転帰の悪化または好転を示す変化の方向が変わることが分かるであろう。
【０１２４】
本明細書で使用する用語「サンプル」とは、１）対象（例えば、被験者）の任意の体液、細胞もしくは組織サンプルもしくは細胞ＲＮＡを含んでなる細胞株、場合により腫瘍組織／細胞および／もしくは癌ベッド細胞、ならびに／または２）そのようなサンプルから得られるＲＮＡを意味する。例えば、前記サンプルは、生検材料であってよく、細針吸引、コア生検、ブラシ生検および／または腹腔鏡下生検などの針吸引が含まれる。前記サンプルは、例えば、１回以上の線量の照射または細胞傷害性癌治療後に得られる「治療後の」サンプル、あるいは場合により治療前であるかまたは治療後サンプルよりも早い時点で採取された「ベースラインサンプル」であってよく、例えば、放射線、場合により細胞傷害性治療との併用に対する応答を評価しまたはモニタリングするためのベースラインとして使用される。
【０１２５】
本明細書で使用し、当技術分野で十分理解されているように、「治療」とは、臨床結果を含む有益または所望の結果を得るためのアプローチである。有益または所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出できるまたは検出できないに関わらず、１以上の症状または状態の緩和または改善、疾患の程度の軽減、病状の安定（すなわち、悪化していない）、疾病拡大の予防、疾患進行の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、疾病の好転、病状の改善または一時的緩和、および寛解（部分的または完全に関わらない）を挙げることができる。「治療」はまた、治療を受けていない場合に予測される生存と比較したときの生存の延長も意味し得る。
【０１２６】
本開示の範囲を理解する上で、本明細書で使用する用語「含んでなる(comprising)」およびその派生語は、記述される特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を明記するオープンエンドの用語であることが意図されているが、他の記述されていない特徴、要素、成分、群、整数、および／または工程の存在を排除するものではない。上記は、また、「含む(including)」、「有する(having)」という用語およびそれらの派生語などの同様の意味を有する語にも当てはまる。最後に、本明細書で使用する「実質的に(substantially)」、「約(about)」および「およそ(approximately)」などの程度に関する用語は、最終結果が著しく変わらない、修飾された用語の妥当な偏差量を意味する。これらの程度の用語は、この偏差によって修飾された語の意味がなくならないならば、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。
【０１２７】
本明細書における端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される総ての数および端数を含む（例えば、１〜５は１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５を含む）。また、総ての数およびそれらの端数は、用語「約(about)」によって修飾されると推定されるものと理解されるべきである。さらに、「１つ(a)」、「１つ(an)」および「その(the)」は、別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことは当然理解される。
【０１２８】
さらに、特定のセクションで記載する定義および実施態様は、当業者に理解されるように、それらが適している、本明細書に記載する他の実施態様に適用できることが意図されている。例えば、次の節では、本発明の異なる態様をより詳細に定義する。そのように定義される各態様は、反対の意思が明確に示されない限り、任意の他の１または複数の態様と組み合わせてよい。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の１または複数の特徴と組み合わせてよい。
【０１２９】
ＩＩ．方法
放射線治療に対する応答について、例えば、乳癌細胞および卵巣癌細胞を含む、癌細胞を評価するための方法を本明細書で記載する。
【０１３０】
臨床研究は、引用することにより本明細書の一部とされる第ＰＣＴ／ＣＡ２００８／００１５６１号に記載されており、これにより、乳癌細胞は、化学療法薬によって治療された場合にＲＮＡ完全性の低下を示すことが示されている。本発明者らによって、卵巣癌細胞株が、化学療法治療に応答して、ＲＮＡ含量（例えば、濃度）および／または完全性の喪失を示すことも示されている。
【０１３１】
引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる、２０１３年４月２４日に出願された「ＲＮＡ破壊を評価するためのアッセイ、方法および装置(ASSAYS, METHODS AND APPARATUS FOR ASSESSING RNA DISRUPTION)」と題する特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０００４０８号には、ＲＮＡ完全性を評価するためのアッセイが記載されており、これを本明細書で使用することができる。
【０１３２】
従って、態様には、乳癌細胞サンプルおよび卵巣癌細胞サンプルから任意に選択される癌細胞サンプルを評価する方法であって、
ａ）癌細胞が一定の放射線量に曝露された後、癌細胞サンプル、場合により乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルを得ること、
ｂ）前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を得ること
を含んでなる方法が含まれる。
【０１３３】
ＲＮＡインテグリティー値の減少は、ＲＮＡ分解および治療に対する応答性を反映している。
【０１３４】
一つの実施態様では、前記方法は、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を、応答閾値と比較することをさらに含み、前記応答閾値と比べて、前記癌細胞サンプルの、減少しているＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度により、前記癌細胞が前記放射線療法に応答性であることが予測され、前記応答閾値と比べて、前記癌細胞サンプルの、同等または増加しているＲＮＡインテグリティー値（すなわち、同等または増加しているＲＮＡ完全性を示す）および／またはＲＮＡ濃度により、前記癌細胞が前記放射線治療に不応性であることが予測される。
【０１３５】
放射線曝露に応答して、乳癌細胞および卵巣癌細胞においてＲＮＡ分解を検出することができることを本明細書において示す。一つの実施態様では、前記癌細胞サンプルは乳癌細胞サンプルである。別の実施態様では、前記癌細胞サンプルは卵巣癌細胞サンプルである。
【０１３６】
ＲＮＡ分解は、卵巣癌細胞株において、例えば、１投与後に検出された。一つの実施態様では、前記癌細胞は、１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える線量の照射治療を受けている。
【０１３７】
ＲＮＡ分解は、放射線および化学療法薬などの細胞傷害性薬剤によって治療された、乳癌および卵巣癌細胞などの癌細胞において検出された。一つの実施態様では、前記細胞は、癌細胞傷害性薬剤(a cancer cytoxic agent)、場合により化学療法薬の投与によってさらに治療される。一つの実施態様では、前記化学療法薬は、アントラサイクリン類、タキサン類およびそれらの組合せから選択され、好ましくは、前記化学療法薬は、エピルビシン、ドセタキセルまたはそれらの組合せを含んでなる。別の実施態様では、前記タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル、パクリタキセル・ポリグルメックス、オルタタキセル、ゼネキソール、パクリタキセル内包リポソーム、およびパクリタキセルのビタミンＥエマルションである。さらなる実施態様では、前記タキサンはドセタキセルまたはパクリタキセルである。
【０１３８】
一つの実施態様では、前記患者に、放射線増感剤で投与する。一つの実施態様では、前記放射線増感剤は、酸素、低酸素細胞増感剤、ハロゲン化ピリミジン、および生体還元剤を含む、様々な種類の化合物から選択される。
【０１３９】
ＲＮＡインテグリティー値の減少は、ＲＮＡ分解、主として、非常に豊富なｒＲＮＡの分解を反映している。一つの実施態様では、前記ＲＮＡサンプルは全ＲＮＡである。別の実施態様では、前記ＲＮＡサンプルはｒＲＮＡでありかつ／またはｒＲＮＡを含んでなる。別の実施態様では、前記ＲＮＡサンプルはｍＲＮＡでありかつ／またはｍＲＮＡを含んでなる。
【０１４０】
前記方法を用いて、例えば、腫瘍の、放射線増感剤に対する感受性を試験しかつ／または癌細胞を放射線増感するか、あるいは放射線治療に対する応答を改善する化合物についてスクリーニングすることができる。例えば、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏである化合物で予め処理し、その後、放射線に曝露することができる。ＲＮＡ完全性および濃度の変化の程度を用いて、化合物をスクリーニングすることができる。従って、別の実施態様では、前記細胞をある化合物と接触させて、その化合物が放射線増感剤および／または放射線防護剤であるかを判定する。実施例で示すように、化学療法と放射線の組合せは、化学療法治療または放射線治療単独と比べて、ＲＮＡ分解の著しい増加をもたらし得る。従って、一つの実施態様では、前記方法は、試験薬剤と放射線の相乗的組合せの同定に向けられる。
【０１４１】
一つの実施態様では、前記方法は、ｉ）細胞を固定線量または放射線および漸増用量の前記試験薬剤に曝露すること、およびｉｉ）前記細胞のＲＮＡ完全性を評価することを含んでなり、対照と比べて前記ＲＮＡ完全性を低下させる試験化合物が放射線増感剤であり、前記ＲＮＡ完全性が放射線防護剤である。
【０１４２】
スクリーニングの一例は、固定放射線量でＲＮＡ完全性アッセイを実施すること、およびＲＮＡ分解の程度を低下または増大させる放射線防護剤または放射線増感剤の能力それぞれを評価することであろう。放射線増感剤または放射線防護剤の存在下または不在下、様々な放射線量でのＲＮＡ分解の程度を用い、前記薬剤の存在下または不在下でのＬＤ５０を決定して、保護／増感の程度を定量することができる。
【０１４３】
応答の程度は、例えば、応答閾値と比較することによって評価することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実施態様での応答閾値は、未治療対照またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ対照に対応する値を含んでなってよい。例えば、当技術分野で公知の方法を用いて適切に取り扱うならば、細胞株では、一般的に、ＲＮＡ分解が起こったとしてもほとんどない。そのため、前記応答閾値は、選択された値、例えば、９、８または７であってよい。一つの実施態様では、前記応答閾値は、１つの未治療サンプルから導かれ、ならびに／または複数の未治療サンプルから導かれる標準である。
【０１４４】
前記応答閾値はまた、例えば、治療サンプルまたは未治療サンプルから、導かれた予め選択された閾値、例えば、中央値または平均値であってもよい。さらに別の実施態様では、前記応答閾値は、１つの不応性サンプルおよび／もしくは１つの応答性サンプルから導かれ、ならびに／または複数の不応性サンプルおよび／もしくは応答性サンプルから導かれる標準である。
【０１４５】
上述の通り、乳癌および卵巣癌細胞などの癌細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒoでスクリーニングすることができる。また、試験はｉｎ  ｖｉｖｏでも、例えば、癌細胞が移植された動物モデルを用いて、実施することができ、その動物には、放射線単独または試験薬剤との組合せを投与し、応答をモニタリングする。従って、別の実施態様では、前記癌細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで放射線に曝露される。
【０１４６】
前記癌細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの一つの実施態様では、患者内にある。
【０１４７】
一つの実施態様では、前記患者は、外科手術の前に放射線および／または化学療法によって治療される。術後に投与する場合、本明細書に記載する(dexcribed herein)方法を用いて、例えば、任意の再発性腫瘍における化学療法／放射線療法に対する応答をモニタリングすることができる。
【０１４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、細胞に、シグナル誘導によるＲＮＡ分解の増加が起こり得る。培養細胞は、例えば、ＲＮＡ完全性を低下させると思われる放射線の抗血管効果を受けない(Fenton et al., 2001; El Kaffas et al., 2013)。
【０１４９】
例えば、図４ｂに示されるように、病理学的完全寛解（ｐＣＲ）を示した患者は、ＦＥＣ−Ｄおよび放射線によって治療すると、治療後にＲＮＡ完全性の低下およびＲＮＡ濃度の減少を示した。
【０１５０】
さらなる態様には、患者由来の癌細胞サンプルを評価するための方法であって、
ａ）対象が一定の放射線量に曝露された後、前記対象から癌細胞サンプルを得ること、
ｂ）前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得ること
を含む方法が含まれる。
【０１５１】
一つの実施態様では、前記方法は、前記患者癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を、応答閾値と比較することをさらに含んでなり、前記応答閾値と比べて、前記患者癌細胞サンプルの、低下しているＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度により、前記患者が前記放射線療法に応答性であることが予測され、前記応答閾値と比べて、前記患者癌細胞サンプルの、同等または増加しているＲＮＡ完全性および場合によりＲＮＡ濃度により、前記患者が前記放射線治療に不応性であることが予測される。
【０１５２】
一つの実施態様では、前記癌細胞サンプルは、乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルから選択される。
【０１５３】
前記癌細胞サンプルは、細胞株から得ることができかつ／または患者から得ることができる。例えば、前記癌細胞サンプルは、細胞学的または組織学的生検で得ることができる。前記生検は、例えば、針コア生検もしくは細針吸引、または外科手術中に行われる生検もしくは切除であってよい。
【０１５４】
例えば、卵巣癌細胞サンプルについては、腹水を含んでなってよく、かつ／または細胞掻爬、腫瘍細針吸引（ＦＮＡ）および／またはコア生検であってよい。
【０１５５】
一つの実施態様では、前記応答は治療応答であり、例えば、前記放射線治療および／またはレジメンに対する乳癌または卵巣癌細胞の応答は、前記対象に治療的有用性を提供するのに十分である。治療応答により、例えば、治療後の臨床転帰が予測される。
【０１５６】
一つの実施態様では、前記臨床転帰は陽性治療転帰である。別の実施態様では、前記治療転帰は陰性治療転帰である。
【０１５７】
ＲＮＡ分解の程度は、治療応答に関連付けることができる。大規模な分解は、例えば、病理学的完全寛解に関連付けることができる。分解の程度の低さは、病理学的完全寛解より劣っていることに関連付けることができる。例えば、対象は、病理学的完全寛解(pathological complete)に達しないかもしれないが治療中および／またはその後に一部のＲＮＡ分解を示すことができる。そのような対象は、例えば、後の治療レジメンで治療することができるが応答なしを示す対象ほど積極的に行わなくてよい。
【０１５８】
一つの実施態様では、予測される陽性治療転帰は、治療後の病理学的完全寛解である。一つの実施態様では、予測される陽性治療転帰は、疾患進行のリスクの低下、無病生存期間の可能性の上昇および／または全生存期間の増加である。一つの実施態様では、予測される陰性治療転帰は、疾患進行のリスクの増加、生存期間の短縮および／または再発である。疾患進行のリスク、無病生存期間の長さおよび／または他の転帰は、例えば、同じ疾患および／または治療に関する患者の応答者および／または不応者の進行のリスクの平均値または中央値との比較である。
【０１５９】
例えば、図４ｂに示されるように、非ＰＣＲ応答者は、ＲＮＡ完全性単独またはＲＮＡ濃度と組み合わせての観点から、病理学的完全応答者(pathological complete responders)から分離することができた。
【０１６０】
別の態様には、不応患者を同定する方法であって、
ａ）前記患者が一定の放射線量に曝露された後、前記患者から癌細胞サンプルを得ること、
ｂ）前記癌細胞サンプルをアッセイして、ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を得ること、
ｃ）応答閾値と比較すること、および
ｃ）前記応答閾値を上回る、ＲＮＡ完全性指標のＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を有する患者を同定すること
を含んでなる方法が含まれる。
【０１６１】
一つの実施態様では、前記癌は、乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルから選択される。
【０１６２】
さらなる態様には、乳癌または卵巣癌などの癌を有する患者の治療転帰を予測する方法であって、前記対象から得られる癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルについてのＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を得ることを含んでなり、
ここで、前記対象は、一定の放射線量によって治療されており、応答閾値を下回る、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性により、前記放射線治療に対する対象／癌の応答および進行のリスクの減少が予測され、前記応答閾値より高い、前記ＲＮＡインテグリティー値で示されるＲＮＡ完全性および／またはＲＮＡ濃度により、前記放射線治療に対する対象／癌の耐性および疾患進行のリスクの増加が予測される、方法が含まれる。
【０１６３】
一つの実施態様では、ＲＤＩ値３以下は放射線に対する無応答を示し、例えば、ＲＤＩは（中間面積＋低Ｃ面積）／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）に基づいて算出される。
【０１６４】
前記方法は、例えば、治療方法において、採用することができる。
【０１６５】
従って、さらなる態様には、
ａ）癌、場合により乳癌または卵巣癌を有する患者を一定の放射線量に曝露すること、
ｂ）前記放射線量の投与後に前記患者から癌細胞サンプルを得ること、
ｃ）前記癌細胞サンプルをアッセイして、前記癌細胞サンプルのＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度を得ること、および
ｄ）応答閾値と比べて、前記ＲＮＡ完全性（例えば、前記ＲＮＡインテグリティー値で示される）および／または前記ＲＮＡ濃度が減少している場合には前記治療を続け、前記応答閾値と比べて、前記ＲＮＡインテグリティー値および／または前記ＲＮＡ濃度が同等または増加している場合には前記治療を変更すること
を含んでなる治療方法が含まれる。
【０１６６】
前記治療は、例えば、放射線療法中の放射線増感剤の採用、放射線および／もしくは化学療法の投与量および／もしくはスケジュールの変更、ならびに／または前記化学療法の追加もしくは変更によって変更することができる。
【０１６７】
一つの実施態様では、前記癌細胞サンプルは、乳癌患者から得られる乳癌細胞サンプルである。別の実施態様では、前記乳癌はＨｅｒ２＋、基底型サブタイプまたは管腔型Ｂサブタイプである。別の実施態様では、前記乳癌患者は、局所進行性乳癌（ＬＡＢＣ）を有する。
【０１６８】
別の実施態様では、前記癌細胞サンプルは、卵巣癌患者から得られる卵巣癌細胞サンプルである。
【０１６９】
別の実施態様では、前記癌細胞は、子宮内膜癌、非黒色腫皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、例えば、非小細胞肺癌、子宮頸癌、肛門癌または前立腺癌から選択される癌である。放射線感受性は、例えば、肺癌(Johung et al. 2013 Clin Cancer Res. 19(22))および子宮内膜癌(Ruyck et al. Int. J. Radiation Oncol.Biol Phys. 65: 1240)ならびに乳癌(Djuzenova et al, Radiation Oncology 8:98)の場合のように、腫瘍サブタイプによって変化し得る。
【０１７０】
放射線は、例えば、リンパ腫、脂肪肉腫を含む放射線感受性腫瘍に対して、多くの場合、化学療法と組み合わせて使用することができる。放射線は、外科手術が利用できない限局性癌に対して、また、広がっている、化学療法に耐性がある低放射線感受性癌の局所緩和のために使用されることが多い。従って、一つの実施態様では、前記癌細胞は、リンパ腫および脂肪肉腫から選択される（selected）癌である。
【０１７１】
患者における応答を予測するために、ＲＮＡ完全性を用いることができる。乳癌および卵巣癌細胞は、薬物の不在下でもＲＮＡ分解が増加しており、これは、例えば、実施例に記載するＭＣＦ−７細胞およびＡ２７８０細胞において見られる。
【０１７２】
ＭＣＦ−７細胞およびＳｋＢｒ３細胞はどちらもシグナル誘導によるＲＮＡ分解効果を示し、この効果は、ＲＤＩによって検出される。ＭＣＦ−７細胞はまた、エピルビシンおよび／またはドセタキセルに起因する同等のＲＮＡ分解効果も有する。
【０１７３】
乳癌腫瘍は、放射線療法に対して様々な応答を示す６３。分子署名／熱ショックタンパク質発現は放射線応答の指標として現在研究中である。腫瘍が応答していることを識別することができるマーカーが有用であろう。
【０１７４】
放射線は、ＤＮＡ損傷およびＲＮＡ損傷を引き起こす可能性がある６４，６５。
【０１７５】
照射によって誘導されるＲＮＡ損傷は、リンパ球６５、ＭＣＦ−７細胞６６、およびＨｅＬａ細胞６７において確認されている。
【０１７６】
一つの実施態様では、前記応答閾値は、ＲＮＡインテグリティー値を含んでなる。さらなる実施態様では、前記応答閾値は、ＲＮＡインテグリティー値および濃度値の両方を含んでなる。
【０１７７】
前記応答閾値は、１名の未治療癌患者、例えば、１名の乳癌もしくは卵巣癌患者から導いてよく、または複数の未治療癌患者から導かれる標準であってよい（例えば、未治療の乳癌もしくは卵巣癌患者から導かれた、または、例えば、治療前に１以上の治療前サンプル、例えば、対照から、得られた細胞）。
【０１７８】
例えば、前記応答閾値は、治療前のＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度に相当する。例えば、前記応答閾値は、療法開始前に前記対象または２つ以上の対象から採取された生検材料ＲＮＡサンプルのＲＮＡインテグリティー値または療法前の同様の患者の腫瘍からの参照値に対応してよい。治療前ＲＮＡインテグリティー値と比べてのＲＮＡ完全性の低下は、例えば、治療応答および／または陽性治療転帰を示し、例えば、治療前ＲＮＡインテグリティー値に対する前記癌細胞ＲＮＡの同等のＲＮＡインテグリティー値は、耐性  陰性治療転帰を示すであろう。
【０１７９】
前記応答閾値はまた、応答が分かっている１患者（例えば、応答者または不応者）から導いてよくまたは応答が分かっている複数の患者から導かれる標準であってよい。
【０１８０】
一つの実施態様では、前記応答閾値は、１つの不応性患者癌細胞サンプルおよび／もしくは１つの応答性患者癌細胞サンプルから導かれ、ならびに／または複数の不応性患者癌細胞サンプルおよび／もしくは複数の応答性患者癌細胞サンプルから導かれる標準である。
【０１８１】
実施態様では、応答閾値を下回る、患者のＲＮＡ完全性指標のＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度により、前記癌が前記放射線治療（および／もしくは放射線と化学療法薬および／もしくはレジメン）に応答していることが示され、かつ／または陽性治療転帰が予測され、ならびに／あるいは応答閾値より高い、患者のＲＮＡ完全性指標のＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度により、前記癌が前記放射線治療（および／もしくは放射線と化学療法薬および／もしくはレジメン）に耐性があることが示され、かつ／または陰性治療転帰が予測される。
【０１８２】
一つの実施態様では、前記応答閾値は、同じまたは同様の腫瘍タイプおよび／または放射線を含んでなる治療レジメンの対象からの参照またはカットオフＲＮＡインテグリティー値であり、前記応答閾値を下回るもしくはより小さいＲＮＡ完全性指標のＲＮＡインテグリティー値および／もしくはＲＮＡ濃度を示す対象は、陽性治療応答を示すと予測され（例えば、確率が高まっている）、ならびに／または前記応答閾値を上回るもしくはより高い、ＲＮＡ完全性指標のＲＮＡインテグリティー値および／もしくはＲＮＡ濃度を示す対象は、陰性治療応答を示すと予測される。
【０１８３】
別の実施態様では、前記応答閾値は、例えば、応答者および／または不応者についての平均（例えば、平均値）ＲＮＡインテグリティー値および／または平均ＲＮＡ濃度に相当する。一つの実施態様では、前記平均ＲＮＡインテグリティー値は、放射線治療（単独または化学療法薬との併用）に応答する癌対象それぞれからの癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルにおける平均ＲＮＡ完全性の平均値であり、および／または前記平均ＲＮＡインテグリティー値は、治療に応答しない癌対象からの癌細胞サンプルにおける平均ＲＮＡ完全性の平均値である。別の実施態様では、前記応答閾値は、受信者動作特性曲線分析法または他の確率分析方法による高陰性または陽性的中率または高曲線下面積の閾値に相当する。
【０１８４】
一つの実施態様では、２つ以上の応答閾値を使用することができる。例えば、ＲＤＡをＲＮＡ濃度と一緒にまたは別個に用いて測定されたＲＮＡインテグリティー値は、複数のゾーン、例えば、３つのゾーン、例えば、ゾーン１：不応者、高陰性的中率、ゾーン２：部分応答者を含む中間ゾーン（何らかの薬物効果はあるが応答に達するには不十分であり、このゾーンには、例えば、応答者の最大１５％が含まれ得る）、およびゾーン３：例えば、応答者、例えば、病理学的完全応答者および無病生存期間（ＤＦＳ）、高陽性的中率が高められた対象、の８５％を含むように選択されるゾーン、に層別することができる。例えば、化学療法による治療を受け、シグナル誘導によるＲＮＡ分解がゾーン３の範囲内にあることが示された患者は、ｐＣＲを示していなくてもＤＦＳが増加することが見出されている。このＤＦＳの増加はｐＣＲ集団と同様である。前記ＲＮＡインテグリティー値によって患者がゾーン３の範囲内にある(falling with)と同様に識別される、放射線を含んでなるレジメン(radiation comprising regiments)により、同様のＤＦＳの利益が得られると予測される。当業者によって理解されるように、ＲＮＡ完全性データに基づいたリスク評価のための他のスケールおよび／または形式を使用することができる。
【０１８５】
照射誘導によるＲＮＡ完全性の変化を評価するために使用することができるＲＤＡは、少なくとも１つ実施態様では、場合により前記治療の前、その間またはその後の時点の、細胞のＲＮＡを含んでなる癌細胞サンプルに対応する少なくとも１つの電気泳動図データセットを得ること、前記少なくとも１つの電気泳動図データセットから、２つの識別範囲を用いて、１８Ｓおよび２８Ｓのピークの起こり得るシフトを調節し、１８Ｓおよび２８Ｓのピークを検出し、位置する１８Ｓおよび２８Ｓのピークに少なくとも部分的に基づいて導かれる特徴を算出することによって、特徴についての値を決定すること、および場合により、前記特徴の値の組合せに基づいて、ＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【０１８６】
一つの実施態様では、前記方法は、前記治療の前、その間またはその後の時点の、細胞のＲＮＡを含んでなる癌細胞サンプルに対応する少なくとも１つの電気泳動図データセットを得ること、前記少なくとも１つの電気泳動図データセットの少なくとも２つのシフトした領域から特徴についての値を決定すること、ここで、前記シフトは記治療に起因する、および場合により、前記特徴の値の組合せに基づいて、ＲＤＡスコアを決定すること含んでなる。
【０１８７】
一つの実施態様では、前記ＲＤＡは、前記治療の前、その間またはその後の時点の、細胞ＲＮＡを含んでなるユニークな生体サンプルに対応する少なくとも１つの電気泳動図データセットにアクセスすること、前記少なくとも１つの電気泳動図データセットから、２つの識別領域を用いて、１８Ｓおよび２８Ｓのピークの起こり得るシフトを調節し、１８Ｓおよび２８Ｓのピークを検出し、位置する１８Ｓおよび２８Ｓのピークに部分的に基づいて導かれる特徴を算出することによって、特徴についての値を決定すること、および場合により、前記特徴の値の組合せに基づいて、ＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【０１８８】
別の実施態様では、前記ＲＤＡ方法は、ある時点の、細胞のＲＮＡを含んでなる癌細胞サンプルに対応する少なくとも１つの電気泳動図データセットを得ること、前記少なくとも１つの電気泳動図データセットから１８Ｓピークおよび２８Ｓピークを定義すること、前記１８Ｓピークおよび前記２８Ｓピークの両方についての少なくとも１つのパラメーター値を決定すること、前記少なくとも１つのパラメーター値に適用される１以上の公式に従って必要な場合に前記１８Ｓピークおよび前記２８Ｓピークの少なくとも１つを再定義することと、１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積を決定すること、および前記１８Ｓピーク面積および２８Ｓピーク面積の少なくとも１つに基づいてＲＤＡスコアを決定することを含んでなる。
【０１８９】
図１２は、前記ＲＤＩ値の算出に使用することができる電気泳動図の異なる特徴を示している。
【０１９０】
例えば、前記特徴としては、１８Ｓピークの面積、２８Ｓピークの面積、中間バンド領域の面積、低バンド領域の面積、１以上のバンド小領域の面積、および面積の総和のうちの１以上を挙げることができる。面積の総和は、１８Ｓピーク、２８Ｓピーク、中間バンド領域および低バンド領域の面積の合計である。他の特徴としては、１８Ｓピークの幅および２８Ｓピークの幅のうちの１以上を挙げることができる。これらのピークおよび領域の面積は、一般的に、数値積分についての周知の数学的手法、例えば、台形公式を用いて計算することができる(Atkinson, 1989)。
【０１９１】
前記低バンド領域はまた、一部のＲＤＡ方法に用いられる、図１２に示される「低Ｃ」、「低Ｂ」および「低Ａ」小領域またはバンド領域に分割することもできる。低Ａバンド領域は、自己溶解型分解に起因するだけでなく他の効果に起因するＲＮＡも含む可能性があること、低Ｃバンド領域は、例えば、細胞傷害性治療などの様々な外部刺激に起因するＲＮＡに対する効果の評価において重要な領域であることは判明している。また、特定の薬物に応答して、ＲＮＡは、低Ｃバンド領域、次に、低Ｂバンド領域、その後、低Ａバンド領域へと広がり始めることも判明している。
【０１９２】
一つの実施態様では、前記特徴組合せは、１８Ｓピーク面積に対する２８Ｓピーク面積の比率を含んでなり、これは、表現「２８Ｓ面積／１８Ｓ面積」または「２８Ｓ：１８Ｓ」によって表すことができる。
【０１９３】
一つの実施態様では、ＲＤＡについての前記特徴組合せは、シフトした１８Ｓ領域における１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域における２８Ｓピーク面積との和に対する中間バンド領域面積の比率を含んでなり、これは、表現「中間面積／（１８Ｓ面積＋２８Ｓ面積）」によって表すことができる。一つの実施態様では、前記特徴組合せは（中間面積＋低Ｃ面積）／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）である。
【０１９４】
別の実施態様では、ＲＤＡについての前記特徴組合せは、シフトした１８Ｓ領域における１８Ｓピーク面積とシフトした２８Ｓ領域における２８Ｓピーク面積との和に対する低バンド領域面積の比率を含んでなり、これは、表現「低バンド面積／（１８Ｓ＋２８Ｓ）」によって表すことができる。
【０１９５】
一つの実施態様では、ＲＤＩは、３つのゾーンに層別される。
【０１９６】
ＲＮＡ濃度を、ＲＤＩ値などのＲＮＡインテグリティー値に対してプロットした場合、追加情報を得ることができる。例えば、所定のＲＤＩでは、前記サンプルのＲＮＡ濃度が低いほど、残存する正常ＲＮＡの絶対量は少ない。
【０１９７】
別の実施態様では、前記応答閾値は、応答者および／または不応者の平均最大ＲＮＡ完全性、最大ＲＮＡ完全性中央値、平均ＲＮＡ完全性、ＲＮＡ完全性中央値、平均最小ＲＮＡ完全性、および最小ＲＮＡ完全性中央値から選択される。
【０１９８】
別の実施態様では、前記応答閾値は、応答者および／または不応者の平均最大ＲＮＡ濃度、最大ＲＮＡ濃度中央値、平均ＲＮＡ完全性、ＲＮＡ濃度中央値、平均最小ＲＮＡ濃度、および最小ＲＮＡ濃度中央値から選択される。
【０１９９】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は応答閾値と比較され、その際、例えば、前記応答閾値は、例えば、１以上の確率分析方法によって、治療前対照または未治療対照などの対照から導かれる。例えば、前記対照は、対象対照、例えば、前記対象からの治療前サンプルであってよい。一つの実施態様では、前記対照が治療前対象対照である場合、前記治療前対象対照と比べた、前記ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度の減少により、癌応答性および／または陽性治療転帰が示される(is indicative or)。別の実施態様では、前記対照が治療前対象対照である場合、前記治療前対象対照と比べた、同等のＲＮＡインテグリティー値および／もしくはＲＮＡ濃度ならびに／または安定しているＲＮＡインテグリティー値および／もしくはＲＮＡ濃度により、前記放射線治療に対する癌の耐性および／または治療後の陰性治療転帰が示される。前記対照は、治療前対照集団、例えば、治療前の、癌、場合により乳癌または卵巣癌を有する２以上の対象についてのＲＮＡインテグリティー値またはＲＮＡ濃度の平均値、最小もしくは最大または参照範囲であってよい。
【０２００】
一つの実施態様では、応答性予測指標の前記応答閾値は、治療前値などの未治療対照を下回って少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低下したＲＮＡ完全性および／または濃度を含んでなる。
【０２０１】
一つの実施態様では、応答性および／または陽性治療転帰を示す前記ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度は、治療前サンプルなどの対照を下回って少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％減少している。
【０２０２】
一つの実施態様では、耐性（例えば、または不応者）および／または陰性治療転帰を示す前記ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度は、対照と比べて、減少が４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、もしくは１０％未満であるかまたは増加しているかまたは同等である。
【０２０３】
別の実施態様では、前記患者が１回、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える線量の放射線治療を受けた後に前記癌細胞サンプルを得る。一つの実施態様では、前記患者が前記放射線治療、および場合により任意の補助治療を完了した後に前記癌細胞サンプルを得る。
【０２０４】
一つの実施態様では、前記患者の治療は、化学療法薬の投与を含んでなる。
【０２０５】
実際の臨床では、放射線は、化学療法の後に続けることができる。この組合せは、逐次または同時に関わらず、シグナル誘導によるＲＮＡ分解の増加をもたらす可能性がある。
【０２０６】
さらなる実施態様では、前記化学療法薬は、アントラサイクリン類、タキサン類およびそれらの組合せから選択され、好ましくは、前記化学療法薬は、エピルビシン、ドセタキセル、スニチニブまたはそれらの組合せを含んでなる。別の実施態様では、前記タキサンは、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、アブラキサン、ドコサヘキサエン酸結合パクリタキセル、パクリタキセル・ポリグルメックス、オルタタキセル、ゼネキソール、パクリタキセル内包リポソーム、およびパクリタキセルのビタミンＥエマルションである。
【０２０７】
一つの実施態様では、前記タキサンはドセタキセルまたはパクリタキセルである。
【０２０８】
一つの実施態様では、前記化学療法薬は、化学療法レジメンで、例えば、１回以上の線量の照射に続いて、投与される。別の実施態様では、化学療法中の１または複数の時点において（１サイクル、２サイクル、３サイクル、または４サイクル、および／または任意の回数のサイクルの投与(or doses)後に）および／または化学療法レジメンの完了後に、癌細胞ＲＮＡを含んでなる１以上の癌細胞サンプルを得る。別の実施態様では、１以上のＲＮＡサンプルは、化学療法中の１以上の時点において（１サイクル、２サイクル、３サイクル、または４サイクル、および／または任意の回数のサイクルの投与(or doses)後に）および／または化学療法レジメンの完了後に得られる乳癌または卵巣癌細胞サンプルに相当する。
【０２０９】
癌細胞サンプルは、ＲＮアーゼ活性を最小限に抑えるように処理される。例えば、癌細胞サンプルを、ＲＮＡ保存剤、例えば、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）または他のＲＮＡ安定化試薬またはＲＮアーゼ阻害剤を含むＲＮＡ保存剤中にすぐ入れるか、または例えば、液体窒素を使用して、例えば、−８０℃に、急速冷凍する。当業者ならば、癌細胞およびＲＮＡサンプルを得て、保存するために採る手段を熟知しているであろう。
【０２１０】
一つの実施態様では、前記癌細胞サンプルからＲＮＡが単離され、前記単離されたＲＮＡにおいて前記ＲＮＡインテグリティー値および／またはＲＮＡ濃度が測定される。
【０２１１】
一つの実施態様では、ＲＮＡは、前記患者から得られる前記癌細胞サンプル、場合により前記乳癌細胞サンプルまたは前記卵巣癌細胞サンプルから単離／精製される。例えば、ＲＮＡは、当技術分野で公知の方法およびキットを用いて単離することができ、それらには、例えば、Ｔｒｉｚｏｌに基づく単離、カラムに基づくキット、例えば、全ＲＮＡ抽出カラムおよびキットが含まれる。ＲＮＡ単離方法の例を実施例１に示す。別の実施態様では、前記方法は、予め単離／精製されたＲＮＡにおいて行われる。
【０２１２】
一つの実施態様では、前記方法は、前記患者（または細胞）が一定の放射線量を受けた後、癌細胞サンプル、場合により乳癌細胞サンプルまたは卵巣癌細胞サンプルを得ること、前記癌細胞サンプルからＲＮＡを単離および／または精製して、癌細胞ＲＮＡを含んでなる、単離／精製されたＲＮＡサンプルを提供することを含んでなる。前記ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡ完全性および場合によりＲＮＡ濃度についてアッセイする。
【０２１３】
前記ＲＮＡインテグリティー値は、例えば、癌細胞ＲＮＡにおけるＲＮＡ分解の状態を評価する任意の方法によって、決定することができる。
【０２１４】
一つの実施態様では、評価されるＲＮＡは変性している。一つの実施態様では、評価されるＲＮＡは未変性のものである。
【０２１５】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、ＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）を、例えば、マイクロフルイディクス、マイクロキャピラリー電気泳動、および蛍光色素の使用を含む方法を使用して、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、それと同等のＲＮＡ品質指標（ＲＱＩ）を示すＥｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）キャピラリー電気泳動システム、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）または他の同等のシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｕｍｅｘ、もしくはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造のものまたは同様のシステムなど）を使用して、算出することにより決定される。一つの実施態様では、前記方法は、マイクロキャピラリー電気泳動により前記ＲＮＡを分離し、例えば、蛍光色素を用いてＲＮＡを検出し、ＲＮＡ完全性を定量することを含んでなる。
【０２１６】
近年、マイクロキャピラリー電気泳動は、特に、必要であるのがナノグラム量のＲＮＡだけであることから、ＲＮＡ完全性を評価するために使用されることが多くなってきている。そのような１つのプラットフォーム、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）は、自動化された、再現可能な方法でＲＮＡの電気泳動分離を実施するためにマイクロフルイディクス技術を利用する(Mueller, O. et al., Electrophoresis 21 (2000) 128-134)。Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００バイオアナライザーは、現在、多くの研究室でＲＮＡの完全性を評価するために使用されている。Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）バイオアナライザー用のソフトウェアの開発によって、キャピラリー電気泳動後に各サンプルのＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）の計算が可能になっている。(Schroeder, A. et al., BMC. Mol. Biol. 7 (2006) 3; Imbeaud, S. et al. Nucl. Acids Res. (2005), 33, 6, e56, 1-12)。このソフトウェアには、与えられたＲＮＡサンプルの電気泳動図において複数のＲＮＡの量を定量し、この評価に基づいてＲＩＮ値を割り当てるアルゴリズムが組み込まれている。
【０２１７】
例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーは、核酸と結合する蛍光色素を使用して、ＲＮＡ濃度および完全性を評価する。ＲＮＡは、ＲＮＡチップの分離チャネルを通って移動し、インターカレーティング色素がそのＲＮＡと結合する。これらの分子が検出器を通過するときに蛍光が測定される。
【０２１８】
一つの実施態様では、２０〜２５０ｎｇの間またはその間の任意の数のＲＮＡを評価する。別の実施態様では、約０．５ｎｇ、約１ｎｇ、約５ｎｇ、約１０ｎｇ、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇを評価する。別の実施態様では、前記ＲＮＡサンプルの濃度は、場合により少なくとも５ｎｇ／μＬ、少なくとも６ｎｇ／μＬ、少なくとも７ｎｇ／μＬまたは少なくとも８ｎｇ／μＬである。
【０２１９】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値はＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）として表され、前記ＲＩＮは、複数のＲＮＡのＲＮＡ完全性の計算結果を含んでなり、好ましくは、前記ＲＩＮは、１以上のＲＩＮアルゴリズム、電気泳動分析システム、またはＲＮＡチップを用いて算出される。
【０２２０】
一つの実施態様では、癌応答性および／または陽性治療転帰を示すＲＩＮは、４．５未満、３．５未満、３未満、２．５未満、２未満、１．５未満および／または１未満である。従って、一つの実施態様では、前記応答閾値は、約４．５、約４．０、約３．９、約３．８、約３．７、約３．６、約３．５、約３、約２．５、約２、約１．５または約１であり、前記応答閾値を下回る癌細胞ＲＩＮにより、応答および／または陽性治療転帰が示される。
【０２２１】
一つの実施態様では、癌耐性および／または陰性治療転帰を示すＲＩＮは、５より大きく、５．５より大きく、６より大きく、６．１より大きく、６．２より大きく、６．３より大きく、６．４より大きく、６．５より大きく、７より大きく、７．５より大きくまたは８より大きく、応答閾値約５、約５．５、約６、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約７、約７．５または約８より大きい癌細胞ＲＩＮにより、耐性および／または陰性治療転帰が示される。
【０２２２】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡ完全性は、２８Ｓ：１８Ｓリボソーム（ｒＲＮＡ）比（例えば、２８Ｓ／１８Ｓ  ｒＲＮＡ比）を算出することによって測定される。
【０２２３】
２８Ｓ  ｒＲＮＡ：１８Ｓ  ｒＲＮＡ比は、例えば、前記ＲＮＡを変性させて分子をサイズによって泳動させるために、例えば、ローディングバッファー中にホルムアルデヒドおよびＭＯＰｓバッファー、またはグリオキサルのいずれかを含むことができる変性アガロースゲルシステムを使用するなどによって、決定することができる。２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドは、例えば、臭化エチジウム染色またはより感受性が高い他の色素、例えば、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(登録商標)によって可視化することができる。
【０２２４】
例えば、ＲＮＡ完全性は、ゲル電気泳動および臭化エチジウムによるゲルの染色後の紫外線下でのＲＮＡバンドの可視化により評価することができる。典型的には、２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの強度値は、フィルム濃度測定および計算された２８Ｓ／１８Ｓ  ｒＲＮＡ比によって決定される。２８Ｓ／１８Ｓ  ｒＲＮＡ比が約２．０以上であるならば、ＲＮＡは高品質と考えられる。
【０２２５】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値および／または前記２８Ｓ：１８ｓ  ｒＲＮＡ比は、分光法を用いて、例えば、２８０：２６０でのＵＶ吸光度を評価することによって決定される。一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、２８Ｓ  ｒＲＮＡおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡの比率である。
【０２２６】
さらなる実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値は、ＲＮＡのサブセットまたは全ＲＮＡの一部のＲＮＡ完全性を評価することによって決定される。一つの実施態様では、前記ＲＮＡは、全ＲＮＡ、リボソームＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
【０２２７】
ＲＮＡ濃度は、例えば、マイクロキャピラリー電気泳動を含む複数の方法により、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー、それと同等のＲＮＡ品質指標（ＲＱＩ）を示すＥｘｐｅｒｉｏｎ（登録商標）キャピラリー電気泳動システム、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）または他の同等のシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｕｍｅｘ、もしくはＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製造のものまたは同様のシステムなど）の使用などによって、決定することができる。前記ＲＮＡ濃度はＵＶ吸光度に基づいてよく、例えば、２８０：２６０でのＵＶ吸光度を評価することによってよい。一方および／または両方のＲＮＡ濃度を評価することができる。
【０２２８】
一つの実施態様では、前記ＲＮＡインテグリティー値が測定される。別の実施態様では、前記ＲＮＡ濃度および前記ＲＮＡ完全性の両方が測定される。
【０２２９】
加えて、１以上の癌サンプルを評価することができる。例えば、放射線治療開始前、１回以上の投与後および／または完了時に、サンプルを得ることができる。
【０２３０】
別の実施態様では、２つ以上の癌細胞サンプルを得る。例えば、前記サンプルは、異なる時点で、例えば、１回投与後、３回線量の照射および／または細胞傷害性治療、場合により化学療法治療との併用後に、採取することができる。
【０２３１】
一つの実施態様では、前記生検材料を２つ以上の癌細胞サンプルに分け、前記癌サンプルから２つ以上のＲＮＡサンプルを単離／精製し、各々について、ＲＮＡインテグリティー値および場合によりＲＮＡ濃度を得る。一つの実施態様では、２つ以上のＲＮＡサンプルのＲＮＡインテグリティー値またはＲＮＡ濃度の平均値を用いる。別の実施態様では、前記２つ以上のＲＮＡサンプルの最高または最大のＲＮＡインテグリティー値を用いる。
【０２３２】
治療応答のモニタリングへのこのアプローチにより、例えば、不応患者（例えば、治療開始後にＲＮＡ完全性が中程度〜高であると確認されている）は、効果のないレジメンの残りのサイクルを完了せずに、他の治療（外科手術、他の放射線量、追加または他の薬物への切り換え）へ切り換えることが可能になると予想される。これにより、患者の癌が応答していないレジメンの毒性副作用を患者に与えないでおくことができる。
【０２３３】
本明細書で記載する方法は、例えば、臨床試験において対象を評価しかつ／または層別するために使用することができる。
【０２３４】
さらなる態様には、癌細胞サンプル、場合により乳癌もしくは卵巣癌細胞サンプルまたはそれから得られるＲＮＡサンプルを試験サイトへ送ること、ここで、前記サンプルは、例えば、ＲＮアーゼフリーの容器に充填され、かつ場合により、溶解バッファー、ＲＮアーゼ阻害剤を場合により含んでなるＲＮＡ単離および／または安定化組成物中に再懸濁され、識別子を用いて表示された前記容器により、例えば、匿名検査が可能である、および前記試験サイトから、治療不成功のリスクを示すスコア（例えば、ゾーン１、ゾーン２またはゾーン３）または他の指標を含む、前記サンプルのＲＮＡ完全性の評価を受け取ること含んでなる方法が含まれる。前記リスク評価は、例えば、医師に提供されてよく、この医師によって、ＲＮＡ品質データ（他のデータに加えて）に基づくリスク評価が使用され、患者に推奨する最良の治療選択肢が決定される。
【０２３５】
ＩＩＩ．キット
さらなる態様には、本明細書で記載する方法に用いるキットであって、ＲＮＡ単離組成物と、前記腫瘍および／またはＲＮＡサンプルを入れるためのＲＮアーゼフリーの容器とを含んでなり、前記容器は、場合により識別子を用いて表示され、場合により匿名検査が可能である、キットが含まれる。
【０２３６】
上記開示は、本出願を一般的に記載している。次の具体的な実施例を参照することによってより完全な理解を得ることができる。これらの実施例は、例示の目的のために記載したに過ぎず、本出願の範囲を限定するものではない。状況が方策を示唆または提供し得る場合、形態の変更および等価物の置換が意図される。本明細書において特定の用語を使用しているが、そのような用語は記述的な意味で意図され、限定を目的としていない。
【０２３７】
以下、限定されない例により本開示を例示する。
【実施例】
【０２３８】
実施例１
乳癌の発生率、死亡率、および治療
乳癌は、女性において最もよく見られる癌診断であり、２００７年にカナダ人女性の２２，３００人が診断を受け、５，３００人がその疾患で死亡している１。早期および転移性の乳癌患者では、治療により生存および無進行生存期間の両方が向上しているが、局所進行性乳癌（ＬＡＢＣ）を有する患者の治療転帰は著しく不良であった。ＬＡＢＣは、ＴＭＮ分類によりＩＩＢ期（Ｔ３Ｎ０）およびＩＩＩＡ／Ｂ期と伝統的に定義されている。臨床的には、これらの腫瘍は、大きさが５ｃｍより大きくかつ／または乳房組織を超えて周囲の皮膚または筋肉に広がっており、固定された腋窩リンパ節（Ｎ２）、内部乳腺リンパ節（Ｎ３）または同側鎖骨上リンパ節転移を含むまたは含まない。ＬＡＢＣは全乳癌症例のおよそ１０〜１５％に相当し、５年生存率は３０〜４２％と推定され１、生存者の大部分は転移性疾患を抱えて生きている。しかしながら、ネオアジュバント化学療法を受け、病理学的完全寛解（ｐＣＲ）（ネオアジュバント治療後に微視的残存浸潤乳癌はないと定義される）に達している女性のごく一部は、大幅に向上した５年無病生存率８７％２および５年全生存率８９％２および９０％３を示す。従って、ｐＣＲ率は、ネオアジュバント治療を含む試験での良好な長期転帰の代替尺度となっており、これは、特に、ｐＣＲが、この値を測定することができる唯一の部分群であることからである。局所進行性乳癌の生存の向上とｐＣＲとの相関関係は、アントラサイクリン類を主として使用する他の研究において確認されている６−８。
【０２３９】
タキサン類の使用による乳癌の生存の向上
乳癌の生存を向上させるために、アントラサイクリン化学療法の後またはそれと同時に新規細胞傷害性薬剤、特にタキサン類を試験した。ドセタキセルは、分裂期での細胞周期停止およびアポトーシスを誘導する微小管安定化剤である９，１０。ドセタキセルは、アントラサイクリン耐性転移性乳癌において最大５０％の応答率を示し１１−１３、転移を有する状況で無作為化試験において一次使用した場合に優れた生存を示した１４，１５。ドセタキセルは、３週ごとに静脈内に与えられることが最も一般的である。しかしながら、転移を有する状況での無作為化第３相試験では、ドセタキセル  ３週ごとに１００ｍｇ／ｍ２と、４週ごとに週１回３週間にわたって３５ｍｇ／ｍ２とを比較した１６。応答率は週１回治療群の方が低いが、無進行生存期間（５．７ヶ月に対して５．５ヶ月；ｐ＝．４６）でも全生存期間（ＯＳ）（１８．３ヶ月に対して１８．６ヶ月；ｐ＝．３４）でも差はなかった。全重症毒性(overall serious toxicity)はＱ３週治療群(the Q 3-week arm)の方が高かった（５５．９％に対して８８．１％；ｐ＝．０００１）。
【０２４０】
ネオアジュバント状況でのタキサン類の使用
ドセタキセルを、転移を有する状況でのその活性に基づいて、早期乳癌において無作為化試験で試験したところ、アントラサイクリンに基づくレジメンに追加した場合に、これらのレジメン単独と比べて優れた生存が示された１７−１８。ＦＥＣ−Ｄ、（フルオロウラシル  ５００ｍｇ／ｍ２  ＩＶ、エピルビシン１００ｍｇ／ｍ２、シクロホスファミド５００ｍｇ／ｍ２  ＩＶ  ３週ごと×３サイクル、その後、ドセタキセル１００ｍｇ／ｍ２  ＩＶ  ３週ごと×３）が、現在、アジュバント術後状況で最もよく使用されるレジメンの１つである。
【０２４１】
また、ドセタキセルの複数の非無作為化試験では、局所進行状況において、単一薬剤として、他の薬剤と同時または逐次にて、活性が示された１９−２３。術前状況においてドセタキセルの追加により転帰が改善されるか否かを判定するために、複数の無作為化試験を行った。最大規模のＮＳＡＢＰ−２７試験では、Ｔ１ｃ〜Ｔ３  Ｎ０〜Ｎ１の疾患を有する女性２４１１人を、術前にＡＣ４サイクル、それに対して、ＡＣ４サイクル、その後、術前にドセタキセル４サイクル、または術前にＡＣ４サイクル、その後、外科手術および術後ドセタキセル４サイクルを受けるように無作為化した。ドセタキセルを追加すると、術前ＡＣ単独と比べて、臨床的完全寛解（ｃＣＲ）（４０．１％に対して６３．６％；ｐ＜．００１）、ｐＣＲ（１３．７％に対して２６．１％；ｐ＜．００１）およびリンパ節転移陰性を示す患者の割合（５０．８％に対して５８．２％；ｐ＜．００１）が著しく向上した２４。８．５年の追跡調査では、３群総てにおいて、無病生存期間（ＤＦＳ）でも全生存期間（ＯＳ）でも差はなかった（２）。しかしながら、ｐＣＲに達している患者では、ＤＦＳの著しい向上があった（ＨＲ＝０．４９、ｐ＜．０００１）およびＯＳ（ＨＲ＝０．３６、ｐ＜．０００１）。
【０２４２】
Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｇｒｏｕｐもまた、術前状況におけるアントラサイクリンに基づくレジメンへのドセタキセル追加の効力を試験した２５。Ｔ３、Ｔ４またはＴｘＮ２の疾患と新たに診断された女性１４５人が、ＣＶＡＰ（シクロホスファミド１，０００ｍｇ／ｍ２、ドキソルビシン５０ｍｇ／ｍ２、ビンクリスチン１．５ｍｇ／ｍ２およびプレドニゾン４０ｍｇ）４サイクルを受けた。その後、部分または完全臨床応答に達した人を、ＣＶＡＰ  ５サイクル以上またはドセタキセル（１００ｍｇ／ｍ２）４サイクルに無作為化した。最初の４サイクルの化学療法に応答しなかった人を、非無作為化方法でドセタキセルによって治療した。全例解析により、ドセタキセルを追加した場合には、ＣＶＡＰ  ５サイクル以上と比べて高いｃＣＲ（６６％に対して９４％、ｐ＝．０３）およびｐＣＲ（１６％に対して３１％  ｐ＝．０４）が示された。追跡調査中央値３８ヶ月の時点では、ドセタキセルによりＤＦＳ（７７％に対して９０％；ｐ＝．０３）およびＯＳ（８４％に対して９７％；ｐ＝．０５）が著しく向上した２６。３番目の試験である、ＧＥＰＡＲＤＵＯ試験では、Ｔ１−３  Ｎ０−２乳癌を有する女性９１３人において術前に、ＡＣ（ドキソルビシンおよびシクロホスファミド）４サイクル、その後、ドセタキセル４サイクルの実施（ＡＣ−ＤＯＣ）と、ドーズデンス型、ドキソルビシン５０ｍｇ／ｍ２＋ドセタキセル７５ｍｇ／ｍ２  １４日に１回４サイクルとフィルガストリム(filgastrim)によるサポート実施（ＡＤＯＣ）とを比較した２７。臨床応答、ｐＣＲおよび乳房温存手術の割合を含む総てのエンドポイントは、ドーズデンス型治療群と比べて、逐次ＡＣ−Ｔ（ドキソルビシンおよびシクロホスファミド、その後、タキサン）治療群で著しく向上した。生存エンドポイントの報告はまだない。
【０２４３】
局所進行性乳癌患者におけるネオアジュバント化学療法応答をさらに向上させるための放射線の使用？
ネオアジュバント化学療法レジメンへのタキサン追加に関連した転帰の向上にもかかわらず、これらの利益は大きくなかった。アントラサイクリン類およびタキサン類の両方を使用するトラスツズマブ(trastuzumb)を含まないレジメンのｐＣＲ率はまだかなり低い（１５〜３０％）。患者におけるｐＣＲ達成は、生存の強い向上と関連していることから、乳癌患者、特に局所進行性疾患を有する患者におけるｐＣＲ率向上に尽力する必要がある。乳癌患者のｐＣＲ率向上のための１つの可能性は、ネオアジュバント状況において化学療法と放射線療法とを組み合わせることである。他の腫瘍部位では、転帰を改善するために、放射線増感化学療法または他の薬剤と同時に与えられる局所照射の組合せ治療アプローチが使用されてきた。これらには、フルオロピリミジン、白金およびより最近ではタキサン類などの薬剤が含まれる。術後同時化学放射線療法は、局所進行性直腸癌において長い間標準治療であった。術前化学放射線療法と術後化学放射線療法とを比較する最近の試験では、術前アプローチに関して局所制御の向上が示されている２８，２９。さらに、術前化学／放射線療法によるｐＣＲおよびＤＦＳの著しい向上も報告されている３０。化学／放射線療法はまた、切除不能な頭頸部癌を有する患者の標準治療でもある。同時アプローチでは、複数の無作為化試験において、放射線単独と比べて臓器保存および生存の向上が示されている３１−３４。局所進行性非小細胞肺癌では、複数の無作為化試験により、同時化学放射線療法と逐次化学放射線療法とを用いて、最も一般的には白金に基づく化学療法を用いて、局所制御および生存の向上が示されている３５−３８。さらに、この患者集団において、放射線増感剤としてドセタキセルを追加して、複数の小規模な試験が行われている３９−４４。
【０２４４】
局所進行性乳癌におけるネオアジュバント化学／放射線療法の使用のために、限定公開データが存在する。Ｉ期〜ＩＶ期乳癌についてのタキサン類による同時化学放射線療法を受けた患者４４人の回顧的検討が報告されている４５。この研究では、局所進行性乳癌における安全性および実現可能性またはタキサン類による同時化学放射線療法(the safety and feasibility or concurrent chemoradiation with taxanes)が示されたが、応答率および生存転帰は報告されていない。
【０２４５】
ＩＩＢ期〜ＩＩＩ期局所進行性乳癌の女性４４人についての第２の研究が報告されており、この研究で患者は、総線量４５Ｇｙまでの放射線と同時に、週２回静脈内パクリタキセル３０ｍｇ／ｍ２を８〜１０週間、続いて、外科手術を受けた４６。術前化学放射線療法期ではグレード４毒性は認められなかった。術後期では、唯一のグレード４毒性は白血球減少であった（１０％）。患者の１６％はｐＣＲに達し、１８％はｐＰＲに達した。術前化学療法の総線量とｐＣＲとの間に関連性はなかった。第２の研究（抄録としてのみ）では、６週間にわたって５０．４Ｇｙ、同時に、１日目にパクリタキセル  １７５ｍｇ／ｍ２、および１〜３日目に５ＦＵ  １０００ｍｇ／ｍ２／日の持続注入、３週間ごとに３サイクルを受けた患者２３人について報告された４８。この後、３週間ごとにＦＥＣ  ３サイクル、その後、外科手術を行った。グレード３毒性には、放射線皮膚炎、食道炎、嘔吐、粘膜炎および好中球減少が含まれた。臨床的ＣＲは８２．６％であり、ｐＣＲは５２．２％であった。２年全生存率は８０．７％である。
【０２４６】
上記の有望な研究結果を考慮して、最近になって、ＦＥＣ−Ｄレジメンを評価する第ＩＩ相試験４９を、ネオアジュバント状況において投与を受ける局所進行性非炎症性乳癌患者に対して行い、その際、９週間のドセタキセルのうち最初の６週間に同時照射を追加し、続いて、５週間後に非定型的乳房切除術（依然としてＬＡＢＣ患者の外科的標準治療となっている）を行った。この化学療法の副作用を最小限に抑え、その放射線忍容性を最適にするために５０，５１、ドセタキセルを、ｑ３週ごと×３サイクルではなく、週１回×９週間投与した（用量は３５ｍｇ／ｍ２に調整）。腫瘍がＨｅｒ２−ｎｅｕ遺伝子増幅陽性であった患者については、ハーセプチン(Herceptin)を１年間にわたってｑ３週ごとにＩＶ投与した。次いで、毒性を評価し、この治療レジメンに対する応答率を評価した。
【０２４７】
さらに、局所進行性乳癌患者についての最近の臨床試験（ＮＣＩＣ−ＣＴＧ−ＭＡ．２２）において、腫瘍ＲＮＡ品質とエピルビシン／ドセタキセル化学療法に対する応答との関係を評価した。化学療法投与の前、その間、およびその直後に患者から３つの画像誘導コア生検材料を得、液体窒素中でのその後の保存のために直ちにドライアイス上で急速冷凍した。ＲＮＡを生検材料から単離し、ＲＮＡの量および品質をＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを使用して評価した。ＲＮＡ品質を前記バイオアナライザー(the bioanlayzer)によってＲＮＡインテグリティーナンバー（ＲＩＮ）に関して定量し、この場合、ＲＩＮ０は完全に加水分解されたＲＮＡを表し、ＲＩＮ１０は全く分解されていないＲＮＡを表す。この試験は、化学療法治療によって治療中および治療後の腫瘍ＲＩＮ値に用量依存的低下がもたらされることを示した。さらに、腫瘍範囲／細胞充実性とは違い、低い治療中腫瘍ＲＩＮ値は、治療後の患者におけるｐＣＲの達成と相関することが見出された。化学療法後にｐＣＲを示した総ての患者は、最大治療中腫瘍ＲＩＮの低下を示した（上記の場合の治療中は化学療法３サイクルまたは４サイクルの後であった）。ＦＥＣ−Ｄ化学療法と照射の併用についての今回の試験では、前記レジメンに応答して腫瘍ＲＮＡ量および品質の変化が起こったか否かも評価した。
【０２４８】
方法
ＦＥＣ−Ｄレジメンと照射との併用投与
上記試験の概略を図１に記載する。ＩＩＩ期非転移性、非炎症性の局所進行性乳癌の患者３２人に対して、ネオアジュバント、５−フルオロウラシル、エピルビシン、およびシクロホスファミド（ＦＥＣはＣＥＦとも呼ばれる）ｑ３週ごと４サイクル、次に、局所照射（４５Ｇｙと１６Ｇｙの追加照射を２５＆５分割して行う）６週間と併用して週１回ドセタキセル（３５ｍｇ／ｍ２）、その後、照射を行わずにさらに３週間のドセタキセル化学療法によって治療した。この後、非定型的乳房切除術を行った。患者および腫瘍の特性をベースライン時および治療後に記録し、臨床応答および治療関連毒性を記した（表１）。治療前、治療中間期および治療後に、画像誘導連続１４ゲージ腫瘍コア生検材料を前記患者から採取し、その生検材料から直ちに１ｍｍ３切片を作製し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）に浸漬し、凍結保存した。この試験において、「前(pre)」は任意のＦＥＣの前であり、中間期はＦＥＣ後であり、治療中間期はＦＥＣ後でドセタキセルと放射線療法の併用前であり、後(post)は照射／ドセタキセル後である。
【０２４９】
腫瘍コア生検材料からのＲＮＡの単離
Ｑｉａｇｅｎ社ｍｉＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  ｋｉｔを用い、製造業者のウェブサイト、http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/ literature.aspx?id=1000291上で公開されているプロトコールの変更に従って、治療前、治療中間期および治療後の患者の画像誘導腫瘍コア生検材料からＲＮＡを単離した。様々なアッセイ用に、生検材料を複数の切片に切断し、ＲＮＡ完全性解析に用いる切片をＲＮＡｌａｔｅｒに入れた。ＲＮＡｌａｔｅｒ中の生検材料を直ちに、１．５ｍｌチューブに入っているβ−ＭＥ含有（１ｍｌ中に１０μｌ）ＲＬＴバッファー０．５ｍｌ中へ落とし入れた。ＲＬＴバッファー中の生検材料をコアレスモーターホモジナイザー（ｔｈｅ  Ｋｏｎｔｅｓ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）で５分間ホモジナイズした。溶解物を、次に、ＲＮアーゼフリーのシリンジに備え付けた２０ゲージ針（０．９ｍｍ径）に少なくとも５回通した。サンプルを、次に、冷却微量遠心機にて４℃で３分間高速遠心分離し、上清を新たなチューブへ移した。次に、１容量（５００μｌ）の７０％エタノールを上清に加え、ピペット操作を繰り返すことによりサンプルを十分に混合した。ホモジナイゼーション中に溶解物が減った場合には、それに応じてエタノール量で調整した。一部のサンプルへのエタノール添加後に形成された目に見える沈殿物は、ＲＮＡ単離手順に影響を与えなかった。沈殿物を含むサンプル最大７００μｌを、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ミニカラムに加え、２ｍｌのコレクションチューブに入れた。カラムを≧８０００×ｇ（≧１０，０００ｒｐｍ）で１５秒間遠心分離し、フロースルー液を捨てた。残りのサンプルを、次に、カラムに加え、再びカラムを遠心分離した。これ以降、製造業者のプロトコールの通りに、カラムをＲＰＥバッファーで２回洗浄し、遠心分離によって乾燥させた。次に、ＲＮアーゼフリー水３０μｌでカラムからＲＮＡを溶出し、得られるＲＮＡの収量および濃度を高めるために、溶出液を再添加し、カラムから溶出した。
【０２５０】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いたＲＮＡ品質の評価
上記ＲＮＡサンプルを、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  Ｌａｐｃｈｉｐｓ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．から購入）に加え、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００バイオアナライザーを用いるキャピラリー電気泳動に供した。従ったプロトコールは、http://www.chem.agilent.com/scripts/LiteraturePDF.asp?iWHID=36225：で入手可能なＡｇｉｌｅｎｔ（登録商標）２１００バイオアナライザーに関するAgilent Biotechnologies, Inc.の技術パンフレットに記載されているものと同じであった。その後、各コア生検材料のＲＮＡの量および品質（ＲＩＮ値）を前記バイオアナライザーによって決定した。
【０２５１】
結果
ＦＥＣ−Ｄ化学療法と照射との併用に対する臨床応答および毒性
患者３２人のうち３０人（９４％）は上記治療プロトコールを完了したが、患者は著しい毒性を受けた。患者２７人（８４％）はグレード３以上の毒性があり、グレード３の寛解性肺炎（患者６人）、グレード３の皮膚炎（患者６人）および治療関連死１人が含まれた。表１に示すように、これらの患者のうちの８人（２５％）は、治療に対して病理学的完全寛解（ｐＣＲ）を示し、これは、局所進行性乳癌に関するオンタリオ州ｐＣＲ率のおよそ２倍であった。さらに、平均２１ヶ月の追跡調査時点で、無再発生存率は、ｐＣＲコホートで１００％、部分応答者（ＰＲ）の間では６５％であった。これは、前記レジメンは、強い毒性を示すが、局所進行性乳癌のｐＣＲおよび生存率を高めると思われることを示唆している。ｐＣＲを示した腫瘍は、基底型サブタイプ（腫瘍５つのうち２つ＝４０％）、Ｈｅｒ２（腫瘍３つのうち３つ＝１００％）、および管腔型Ｂ（腫瘍６つのうち３つ＝５０％）の間でほぼ均等に分布していた。管腔型Ａ腫瘍を有する患者１１人の間ではｐＣＲは見られなかった（０％）。数は少ないが、これらのデータによって、ＦＥＣ−Ｄレジメンと照射との併用は様々な乳癌サブタイプ総てにおいてｐＣＲを誘導することができると思われることが示唆される
【０２５２】
【表１】
0006479672.tif 000002
【０２５３】
【表２】
0006479672.tif 000003
【０２５４】
ＦＥＣ化学療法と、その後のドセタキセル化学療法と放射線治療の併用に応答した腫瘍ＲＮＡ含量の変化
次に、ＮＣＩＣ−ＣＴＧ−ＭＡ．２２臨床試験と同様に、治療中または治療に応答した腫瘍ＲＮＡの品質または量の変化が観察できるか否かと、低いＲＮＡ品質が治療完了時の強い臨床応答（ｐＣＲ）と関連があるか否かを評価した。図２は、治療前、治療中間期、および治療後に単離した総ての患者の生検材料についてのＲＮＡ濃度値を示している。このプロットは、治療前生検材料を含む、治療期間中の生検材料から単離したＲＮＡの量にかなりの変動があったことを明らかにしている。これは、採取した生検材料でのＲＮＡの保存に変化が起こった可能性を示唆している。さらに、データは、治療前生検材料とＦＥＣ化学療法後に採取した生検材料との間ではＲＮＡ濃度にほとんど差がないことを示唆している。（平均腫瘍ＲＮＡ濃度はそれぞれ５０．０±１５．１ｎｇ／μｌと５０．０±１１．９ｎｇ／μｌ）。対照的に、平均腫瘍ＲＮＡ濃度は、ＦＥＣ−Ｄレジメンと照射との併用の完了後に大きく減少し、１０．６±２．１ｎｇ／μｌであった。これらの研究結果によって、ＦＥＣ化学療法単独では、腫瘍ＲＮＡ濃度の減少を誘導するのに不十分であるが、放射線療法とドセタキセルとの併用治療後に、腫瘍ＲＮＡ含量が劇的に減少することが示唆される。この治療効果にもかかわらず、治療後に病理学的完全寛解（ｐＣＲ）を示した患者、治療に対して部分寛解（ＰＲ）を示した患者、および治療後に安定または進行（ＳＤまたはＰＤ）を示した患者の間では腫瘍ＲＮＡ濃度における有意差は認められなかった（図３）。ＦＥＣ化学療法と、その後のドセタキセル化学療法と放射線治療との併用に応答した腫瘍ＲＩＮ値の変化。
【０２５５】
ＦＥＣ−Ｄ化学療法と放射線治療との併用中の腫瘍ＲＮＡ含量の変化を評価するために、数学的解析には「不十分なシグナル」と記した総てのサンプルを除外した。不十分なシグナルとは、バックグラウンドを超える検出可能なピークがないものである。図４Ａに示すように、治療終了時にｐＣＲに達していたＦＥＣ化学療法後、ドセタキセル／放射線治療前の３つのサンプルでは、３つのサンプルのうち２つが高ＲＮＡ完全性または最小ＲＮＡ分解を示すＲＩＮ値を示した（例えば、ベースライン値と同等のＲＩＮ＞７）。１つの患者サンプルは、ＲＮＡ完全性の著しい喪失を示唆する非常に低いＲＩＮ値を示した（ＲＩＮ値＝ｎ／ａまたは０）。不応患者（治療後にｐＣＲに達しなかった患者）のサンプルでは、治療前サンプルと比較した場合に、腫瘍ＲＮＡ量または完全性に対するＦＥＣ治療の効果はほとんど認められなかった。
【０２５６】
ＦＥＣ化学療法とドセタキセル／放射線治療の両方の後に腫瘍ＲＮＡ完全性を評価した場合、治療後にｐＣＲに達していた患者の２つのサンプルだけが数学的解析に十分なＲＮＡを有していた（図４Ｂ）。これら２つのサンプルはどちらも、ＲＮＡ完全性の非常に大きな喪失を示すＲＩＮ値  ｎ／ａまたは０を示した。治療に対するこれら２つの応答者は、ＲＮＡ濃度およびＲＩＮ値に基づいて、不応者と全く異なっていた。低ＲＩＮ値は正常（例えば、断片化されていない）ＲＮＡの喪失を示す。不応答者では、高度断片化から高度無傷まで腫瘍ＲＮＡの様々な変化を示す広範囲のＲＩＮ値が記されている。これらの結果は、ＲＮＡ完全性の喪失が放射線とドセタキセルによって起こり、その結果として、ＲＩＮ値の減少およびＲＮＡ濃度の喪失がもたらされることを示唆している。このＲＮＡ完全性喪失は治療に対する強い応答（ｐＣＲ）と相関した。高ＲＮＡ濃度および高ＲＩＮは、臨床のデータに基づいた無応答を示唆する。
【０２５７】
実施例２
ドセタキセル治療実施または不実施での照射に応答した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞ＲＮＡ完全性の変化
卵巣癌と乳癌の間にはゲノム類似性があり(Nature 490:67-70, 4 October、2012)、同様の応答を示す可能性がある。この目的を達成するために、本発明者らは卵巣癌株を、放射線療法に対するそのＲＮＡ応答について調べた。
【０２５８】
ドセタキセル治療実施または不実施での照射によって、Ａ２７８０卵巣腫瘍細胞において細胞ＲＮＡ濃度および／またはＲＩＮ値の変化を誘導することができるか否かを評価するために試験を行った。図５Ａに示すように、放射線治療は、Ａ２７８０細胞のＲＮＡ含量において用量依存的な変化を誘導し、１０グレイ照射はＲＮＡ濃度レベルのほぼ５倍の減少を誘導した。興味深いことに、細胞を０．１μＭドセタキセルとともにプレインキュベーションすると細胞のＲＮＡ濃度はさらに６．５倍に減少し、細胞からほぼ総てのＲＮＡが消失した。対照的に、試験条件下では、５グレイまでの放射線量は細胞のＲＮＡ完全性に対して影響を及ぼさず、放射線治療前のサンプルと比較して、ＲＩＮ値の変化は認められなかった、（図５Ｂ）。１０グレイの放射線治療の前に細胞を０．１μＭドセタキセルとともに２４時間プレインキュベートした場合、細胞のＲＩＮ値は治療前の値の７５％まで減少した。放射線と化学療法を同時に使用すると、ＲＩＮはさらに減少した。まとめると、これらの研究結果によって、放射線は、細胞のＲＮＡ含量の減少とＲＮＡ完全性の低下を誘導することができることが示唆される。さらに、放射線とドセタキセル治療の両方を組み合わせることで細胞のＲＮＡ含量とＲＮＡ完全性の両方のさらに強い減少が誘導される。これらの観察は、局所進行性乳癌患者の腫瘍について、特に、ＦＥＣ−Ｄ化学療法と放射線療法との併用に応答してＲＮＡ濃度が劇的に低下し、かつ、治療後に応答患者（ｐＣＲ）と無応答患者（ｐＣＲなし）との間に差が認められると思われた、治療後の併用療法について上に記載したことと一致する。
【０２５９】
次に、特定の乳房腫瘍細胞株についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、同様の結果が観察できるか否かを調べた。図６Ａに示すように、１０グレイまでの照射によって処理すると、培養ＳＫＢＲ３乳房腫瘍細胞では約７％のＲＮＡ濃度の変化が認められた。１０グレイ照射の前に細胞を０．１μＭドセタキセルによって前処理すると、細胞のＲＮＡ濃度の５倍減少が認められた（未治療細胞の１９％）。ＢＴ−２０細胞、Ａ２７８０細胞およびＭＢ−４６８細胞では放射線だけでＲＮＡ濃度は２倍（またはそれ以上）減少する。これらの研究結果によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの乳房腫瘍細胞では（場合によって乳癌患者の腫瘍では）、放射線治療単独で細胞のＲＮＡ濃度の変化を観察することができることが示唆される。ドセタキセル治療と放射線療法との併用で細胞のＲＮＡ含量は劇的に減少し、これは、ＦＥＣ−Ｄ化学療法、続いて放射線治療によって治療した局所進行性乳癌患者での観察結果と一致する。上記治療のＲＩＮ値に対する効果をＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋、ＥＲ−）細胞において調べると、同様の結果が認められた（図６Ｂ）。細胞をドセタキセルによって前処理した場合、放射線に応答して細胞ＲＩＮ値の測定可能な（９％）減少が認められた。
【０２６０】
上記治療のＭＣＦ−７（ＥＲ＋、ＨＥＲ２−）細胞に対する効果（図７Ａおよび図７Ｂ）を調べた。結果はＳＫＢＲ３細胞と同様であり、１０グレイおよび１０グレイ／０．１μＭドセタキセル治療についてそれぞれＲＮＡレベルの４％および７３％の減少が認められた。同様に、ＭＣＦ−７細胞では、最高放射線量（１０グレイ）でも、細胞ＲＩＮ値において有意な減少は認められなかった。さらに、１０グレイ照射の前に細胞を０．１μＭドセタキセルで前処理した場合には、細胞ＲＩＮ値の４％減少しか認められなかった。
【０２６１】
実施例３
Ａ２７８０細胞を、１０Ｇｙ照射を行っておよび行わずに、漸増用量のエピルビシンによって処理した。Ａ２７８０細胞を６ｃｍプレートの４ｍｌのＲＰＭＩ培養培地に播種した。これらのプレートをインキュベーターに入れ、細胞を一晩接着させた。翌日、総てのプレートから培地を除き、それらのプレートに適当なエピルビシン濃度（１ｐＭ、５ｐＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭ）を含有する新たな培地を加えた。照射処理を施す前に、細胞をエピルビシンで２４時間前処理した。翌日（エピルビシン薬物処理の２４時間後）、ＲＳ３２０照射システム（Ｇｕｌｍａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用い、およそ４．３分のｘ線暴露で１０Ｇｙのｘ線処理（３００ｋＶ、９ｍＡ）を細胞に施した。これらの細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、放射線処理の９６時間後（エピルビシン処理の１２０時間後に相当する）にそれらの細胞からＲＮＡを抽出した。
【０２６２】
図８Ａは、エピルビシン用量に対するＲＩＮ値を示している。低エピルビシン用量で、照射によりＲＩＮ値の低下が見られる。
【０２６３】
図８Ｂは、エピルビシン用量に対するＲＤＩ値を示している。ＲＤＩ値は低薬物用量で、照射により増加する。
【０２６４】
図８Ｃは、エピルビシン用量に対するＲＮＡ濃度を示し、低薬物用量で、照射によるＲＮＡ濃度の低下の増大を示す。
【０２６５】
同様の試験をＭＣＦ−７乳癌細胞で行った。ＭＣＦ−７細胞を、１０Ｇｙ照射を行っておよび行わずに、漸増用量のエピルビシンで処理した。ＭＣＦ−７細胞を６ｃｍプレートの４ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に播種した。これらのプレートをインキュベーターに入れ、細胞を一晩接着させた。翌日、総てのプレートから培地を除き、それらのプレートに適当なエピルビシン濃度（１ｐＭ、５ｐＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、および１００ｎＭ）を含有する新たな培地を加えた。照射処理を施す前に、細胞をエピルビシンで２４時間前処理した。翌日（エピルビシン薬物処理の２４時間後）、ＲＳ３２０照射システム（Ｇｕｌｍａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用い、およそ４．３分のｘ線暴露で１０Ｇｙのｘ線処理（３００ｋＶ、９ｍＡ）を細胞に施した。これらの細胞を細胞培養インキュベーターに戻し、放射線処理の９６時間後（エピルビシン処理の１２０時間後に相当する）にそれらの細胞からＲＮＡを抽出した。
【０２６６】
図９Ａは、エピルビシン用量に対するＲＩＮ値を示し、照射と組み合わせた場合のＲＩＮ値の低下を示す。
【０２６７】
ＭＣＦ−７細胞およびＳｋＢｒ３細胞は両方とも、２Ｇｙの放射線のみでＲＤＩに４５％の増加を示した。ＲＤＩはより感受性が高く、ＲＮＡ分解効果はＲＩＮ値の変化としてあまり明らかでない。
【０２６８】
図９Ｂは、エピルビシン用量に対するＲＤＩ値を示し、１００μＭのエピルビシンまで、照射によるＲＤＩ値の増加を示す。図９Ｃは、エピルビシン用量に対するＲＮＡ濃度を示し、漸増用量のエピルビシンによるＲＮＡ濃度の低下を示す。ＲＤＩは、照射によって誘導された効果の測定においてＲＩＮより感受性が高い。
【０２６９】
別の試験では、Ａ２７８０細胞を５ｎＭドセタキセル、１０Ｇｙ照射および１０Ｇｙ照射＋５ｎＭドセタキセルで７２時間または９６時間処理した。結果は、シグナルによって誘導されるＲＮＡ分解が時間依存性であることを示す。
【０２７０】
図１０Ａは、薬物および放射線処理に対する平均ＲＩＮ値を示す（ｎ＝３）。エラーバーは標準偏差を表す。図１０Ａは、７２時間における照射＋ドセタキセルによるＲＩＮ値の低下の増大を示す。
【０２７１】
図１０Ｂは、ドセタキセルおよび放射線治療に対する平均ＲＤＩ値を示す（ｎ＝３）。これらの結果は、９６時間における、ドセタキセル単独に比べた照射＋ドセタキセルのよるＲＤＩ値の増加を示唆する。エラーバーは標準偏差を表す。
【０２７２】
実施例４
実施例１で患者から得られた電気泳動図データを、ＲＤＩ値を算出することにより再分析した。ＲＤＩ値を、特徴（中間面積＋低Ｃ面積）／（２８Ｓ面積＋１８Ｓ面積）を用いて算出した。
【０２７３】
図１１は、Ａ）治療中間期（照射前）サンプルおよびＢ）治療後（照射後）サンプルに関するＲＤＩ値に対してＲＮＡ濃度をプロットしている。
【０２７４】
上記に基づき、ＲＤＩ値３以下は放射線に対する無応答を示し得る。例えば、図１１ｂは、ＲＤＩ値が３以下の治療後サンプルは、照射／ドセタキセルの組合せに対する不応者を示す。高いＲＮＡ濃度および低いＲＤＩは、治療後不応者を示唆する。
【０２７５】
実施例５
Ａ２７８０卵巣癌細胞を、Ｇｕｌｍａｙ  ＲＳ３２０照射システムを用い、２〜１０グレイの放射線により処理した後、２４、４８および７２時間後に採取した。ＲＮＡを単離し、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーにかけた。電気泳動図を解析したところ、放射線処理細胞では７２時間で中間面積／（２８Ｓ＋１８Ｓ面積）比の増加が検出可能であることが示された。例えば、１０グレイで７２時間処理した細胞は、中間バンド領域および低バンド領域に照射によって誘導されたＲＮＡ分解を示すが、自己溶解ピークが存在する電気泳動図の領域では大きな違いはない。照射によって誘導されるＲＮＡ分解は、両用量レベルとも７２時間で明らかである。
【０２７６】
本出願は、現在のところ好ましい例であると考えられるものに関して記載されているが、本出願は開示されている例に限定されないと理解されるべきである。対照的に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内に含まれる様々な改変および等価の構成を包含することが意図される。
【０２７７】
総ての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許および特許出願が引用することによりその全内容が本明細書の一部とされることが具体的かつ個々に示される場合と同程度に、引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる。特に、例えば、表または他所に示されている受託番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含め、本明細書に示される各受託番号に関連する配列は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０２７８】
参照文献
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0006479672.tif 000005
0006479672.tif 000006
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006479672.tif 000013
【図８−１】
0006479672.tif 000014
【図８−２】
0006479672.tif 000015
【図９−１】
0006479672.tif 000016
【図９−２】
0006479672.tif 000017
【図１０−１】
0006479672.tif 000018
【図１０−２】
0006479672.tif 000019
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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