(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
（式中、
Ａは、線維芽細胞活性化タンパク質αに選択的に結合する抗体であり；
Ｌはリンカーであり；
ｐは１〜１０であり；
Ｄは、式ＩＶ
【化１】
0006619743.tif 000025
の細胞溶解素を含む薬物であり；
式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
ｆは１又は２であり；
Ｒ１１は、以下の構造：
【化２】
0006619743.tif 000026
を有し、式中、
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
Ｒ１７は、リンカーＬに直接又は間接的に結合し；かつ
ｑは０、１、２又は３である）
を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
リンカーＬが、さらにスペーサーを含み、
前記スペーサーが、基Ｒ１７に直接結合しているか、又はカルボニル架橋基を介して基Ｒ１７に結合する、複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
Ａが、以下のアミノ酸配列：
（ｉ）ＣＤＲＨ１：配列番号７、又は配列番号７の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉ）ＣＤＲＨ２：配列番号８、又は配列番号８の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３：配列番号９、又は配列番号９の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｖ）ＣＤＲＬ１：配列番号１０、又は配列番号１０の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖ）ＣＤＲＬ２：配列番号１１、又は配列番号１１の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖｉ）ＣＤＲＬ３：配列番号１２、又は配列番号１２の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体、
を有する重鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＨ１〜３）及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＬ１〜３）を含む、請求項１に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項３】
Ａが、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項２に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項４】
Ａが、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項２に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項５】
Ｒ１７が、Ｃ（Ｏ）Ｘ、ＣＯＮＨＮＨＸ、ＯＸ、ＮＨＸ又はＳＸであり、Ｘが前記スペーサー又は前記カルボニル架橋基との結合である、請求項１に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項６】
前記スペーサーが２〜３０個の原子の鎖長を有する、請求項１に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項７】
前記スペーサーが、基−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１〜１０である、請求項６に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項８】
Ｒ１７がＣＯＮＨＮＨＸであり、前記スペーサーが、前記カルボニル架橋基を介して基Ｒ１７に結合した−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎ＝２、３又は４である、請求項５に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項９】
式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
（式中、
Ａは、線維芽細胞活性化タンパク質αに選択的に結合する抗体であり；
Ｌはリンカーであり；
ｐは１〜１０であり；
Ｄは、式ＩＶ
【化３】
0006619743.tif 000027
の細胞溶解素を含む薬物であり；
式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
ｆは１又は２であり；
Ｒ１１は、以下の構造：
【化４】
0006619743.tif 000028
を有し、式中、
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
Ｒ１７は、リンカーＬに直接又は間接的に結合し；かつ
ｑは０、１、２又は３である）
を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
Ｄが、以下の構造：
【化５】
0006619743.tif 000029
を有する細胞溶解素を含む、複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１０】
式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
（式中、
Ａは、線維芽細胞活性化タンパク質αに選択的に結合する抗体であり；
Ｌはリンカーであり；
ｐは１〜１０であり；
Ｄは、式ＩＶ
【化６】
0006619743.tif 000030
の細胞溶解素を含む薬物であり；
式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
ｆは１又は２であり；
Ｒ１１は、以下の構造：
【化７】
0006619743.tif 000031
を有し、式中、
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
Ｒ１７は、リンカーＬに直接又は間接的に結合し；かつ
ｑは０、１、２又は３である）
を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
Ｌが、Ａとの結合のための結合基及びプロテアーゼ切断可能な部分を含み、
Ｌが、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメートを含む、複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１１】
式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
（式中、
Ａは、線維芽細胞活性化タンパク質αに選択的に結合する抗体であり；
Ｌはリンカーであり；
ｐは１〜１０であり；
Ｄは、式ＩＶ
【化８】
0006619743.tif 000032
の細胞溶解素を含む薬物であり；
式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
ｆは１又は２であり；
Ｒ１１は、以下の構造：
【化９】
0006619743.tif 000033
を有し、式中、
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
Ｒ１７は、リンカーＬに直接又は間接的に結合し；かつ
ｑは０、１、２又は３である）
を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物であって、
Ｌ−Ｄが、
【化１０】
0006619743.tif 000034
からなる群から選択される構造を有する、複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１２】
医薬で使用するための、請求項１、９、１０、１１のいずれか一項に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１３】
哺乳動物対象の腫瘍の治療方法で使用するための、請求項１、９、１０、１１のいずれか一項に記載の複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１４】
前記複合体が、１種以上の他の抗腫瘍薬と同時投与、逐次投与又は別々の投与のためのものである、請求項１３に記載の使用のための複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１５】
前記１種以上の他の抗腫瘍薬が、細胞傷害性化学療法剤又は抗血管新生剤又は免疫療法剤を含む、請求項１４に記載の使用のための複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１６】
前記１種以上の他の抗腫瘍薬が、ゲムシタビン、アブラキサン、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子を含む、請求項１５に記載の使用のための複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１７】
前記抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子がニボルマブ又はペンブロリズマブを含む、請求項１６に記載の使用のための複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項１８】
前記腫瘍が膵臓癌、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌から選択される固形腫瘍である、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の使用のための複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）を標的とする抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）及び免疫毒素、並びに医薬、例えば、特定の癌の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性上皮性腫瘍は、人間の死の癌に関連する主な原因である。これらの固形腫瘍は、しばしば、全腫瘍質量の２０％〜６０％を占め、大量の間質細胞及び密な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の存在によって特徴づけられる、いわゆる「線維形成性間質」または「反応性間質」などの著しい間質反応を示す。最近の研究によって、血管細胞、免疫細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、脂肪細胞及び骨髄由来前駆細胞によって例示されるように、間質細胞の腫瘍促進の役割が示された（１〜６）。具体的には、かなりの数の癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）が、しばしば、乳癌、肺癌、結腸癌、及び膵臓癌（１４、１５）を含む様々なヒト癌の腫瘍関連間質内に観察される。間質の異なる構成要素と協調して相互作用するので、ＣＡＦは、血管新生及び腫瘍の成長を促進する能力を有する。ＣＡＦはまた、癌の進行中の攻撃的な腫瘍及び腫瘍侵襲性の発達に重要なものとして示されている（１６〜２５）。ＣＡＦは、離れた器官における腫瘍細胞の拡散及び浸潤を促進するので、転移形成に寄与している。重要なことには、腫瘍への全身薬物送達の失敗及び薬物耐性の発現と間質細胞の関連も示されている（７〜１１）。
【０００３】
間質−腫瘍細胞の相互作用を抑止することによって、腫瘍形成を減衰させる細胞及び分子標的の同定が、近年、トランスレーショナル腫瘍学における最も重要な課題の１つである。実際に、腫瘍周囲間質を標的とすることは、がん患者の死亡率の９０％超にのぼる転移性腫瘍を治療するためのかなり新しい戦略である。いくつかの製品のみがこれまでに治療承認を得ており、それらのほとんどは抗血管新生薬である（アバスチン（登録商標）；２６）。次いで、腫瘍微小環境内の他の新規分子を同定し、標的化することが、間質ベースの治療法と組み合わせた従来の治療の有効性を増大させるのに不可欠であり、癌及び転移の治療のための強力な方法を表す（１２、１３）。
【０００４】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ベースの薬物は、癌との闘いで非常に期待されている。理由は、それらの薬物が正確かつ特別な方法で、治療を分子レベルで標的化するのを可能にするからである。これらの利点は、それらの商業的な魅力（短い開発期間、制限された能力とそれらが承認された後、他の癌の種類に容易に利用可能であること）と共に、多くの製薬会社が新しい抗体ベースの分子の開発、及びバイオテクノロジー企業からの新しい分子又は技術のインライセンスに多額の投資を行うことを後押ししてきた。
【０００５】
しかしながら、治療抗体の臨床的成功にもかかわらず、細胞表面の腫瘍抗原を標的とするネイキッドＭＡｂは、それ自体で十分な効果をほとんど示さない。ＭＡｂの低活性を増大させるために、新たな戦略は、毒性分子へのそれらの結合に焦点を当てている。非常に強力で、極少量で活性があるために、植物及び細菌の毒素並びに小さな化学療法分子が良好な候補であり得る。
【０００６】
癌の治療のための免疫毒素（ＩＴ）及び抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）の分野は、免疫原性、望ましくない毒性、生成、半減期及び抵抗についての、製薬企業が最初に提示した問題の解決を目的として、過去数年間に行われた技術進歩により、近年、製薬企業による開発活動の成長を経験している。
【０００７】
免疫複合体は、細胞傷害薬と共有結合したヒトの抗体、ヒト化又はキメラ組換え抗体で作られている。このような構造の主な目的は、低分子（３００〜１０００Ｄａ）で細胞傷害性の能力と腫瘍関連抗原標的化（ＴＡＡ）ＭＡｂの高い特異性を組み合わせることである。
【０００８】
Ａｂは、抗原に到達するのに非常に選択的でなければならず、その発現は正常細胞内において制限されなければならない。Ａｂはまた、癌細胞内に効率的に内部移行しなければならない。
【０００９】
エフェクター部分として選択された細胞傷害薬は、内部移行及び細胞質への放出後にのみ細胞を死滅させなければならない。ＡＤＣの中で最も一般的に使用されるペイロードは、カリケアマイシン類、デュオカルマイシン類などのＤＮＡ損傷薬、又はアウリスタチン類及びマイタンシノイド類のような微小管標的化合物である。
【００１０】
Ａｂ−細胞傷害性リンカーは、全身的に安定であり、標的細胞内で細胞傷害薬を放出するように設計されている。
【００１１】
ＴＡＡは、しばしば疾患組織で過剰発現しているか、又は少なくとも内部移行によって活性化される細胞傷害を促進するのに十分に発現している細胞膜タンパク質である。理想的には、この抗原は、正常組織における発現は制限されており、重要な臓器においてほとんど発現していないか又は全く発現していない。その上、この腫瘍抗原は、Ａｂによって選択的かつ高親和性で認識されなければならない。
【００１２】
ヒト癌の多くの種類において、線維芽細胞の応答は、その発現が発達中の器官、創傷治癒及び組織リモデリングに高度に制限されている細胞表面タンパク質である線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰα）の９５ｋＤａのセリンプロテアーゼの誘導によって特徴付けられる。
【００１３】
ＦＡＰは、以下の特性を示す：
・ＳＥＲ−プロテアーゼ活性を有するＩＩ型膜糖タンパク質（コラゲナーゼ＋ＤＰＰ）
・８９％のヒト−マウス間のタンパク質相同性
・腫瘍間質−９０％超の癌（乳癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌及び結腸癌）での発現
・創傷治癒及び発達中の臓器の正常な成体組織における一過的でかつ高度に制限された発現
・腫瘍血管系に近接して位置するＦＡＰ（＋）線維芽細胞
・非常に局所的な発現
・内部移行
・細胞外マトリックスリモデリング、腫瘍の増殖及び転移における影響
【００１４】
ＦＡＰの発現は、最近、膵臓腫瘍細胞及び腫瘍関連間質線維芽細胞で見出された。ＦＡＰの発現は、患者の短い生存率及び予後不良と相関することから、この種の腫瘍のＦＡＰベースのオートクリン／パラクリンループの可能性が示唆される（３２）。
【００１５】
過去１０年の間に、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＰｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ（ＩＺＩ、シュトゥットガルト大学、ドイツ）は、ヒト及びマウスの両方のタンパク質に対する抗ＦＡＰ  ＭＡｂ誘導体を開発した（２７、２８）。彼らは、抗ＦＡＰ ｓｃＦｖ免疫リポソームが特異的にＦＡＰ＋細胞に結合し、内部移行することをインビトロで示した（２９）。最近の研究で、彼らは、脂質及び抗ＦＡＰ  ｓｃＦｖで覆われ、ＴＮＦαと共に添加されるナノ粒子の抗腫瘍効果を示した（３０）。
【００１６】
マウスＭＡｂ ＦＡＰ５−ＤＭ１免疫毒素での治療は、不寛容に関連するいかなる影響も受けず、膵臓及び肺癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖の長期的な阻害及び完全回帰をもたらした（３１）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
これらの進歩にもかかわらず、上皮腫瘍を含む腫瘍の治療のためのさらなる治療戦略の必要性、及びそのような治療戦略で使用するための成分の必要性は未だ満たされていない。本発明は、これら及び他の必要性に取り組むものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
概して、本発明は、抗ＦＡＰ抗体、それらの複合体及び抗体複合体戦略で使用するために最適化されたペイロードに関する。具体的には、本発明者らは、本明細書に記載の抗ＦＡＰ抗体が高度に特異的な結合、及び迅速かつ効率的な内部移行を示すことを見出した。さらに、本発明者らは、ニグリンｂのＡ鎖を単離し、それが、細菌宿主細胞中で生成でき、さらにニグリン−ｂのＢ鎖の非存在下でリボソーム不活性化活性をインビトロで保持し、抗体と複合化させた時だけ細胞内に移行する能力及びニグリン−ｂのＢ鎖が存在しなくても生じる細胞傷害活性の両方を示すことを見出した。
【００１９】
本明細書に記載のニグリン−ｂのＡ鎖及び／又は細胞溶解素誘導体は、腫瘍の治療に使用するための抗ＦＡＰ抗体と都合よく複合化される。
【発明の効果】
【００２０】
したがって、第１の態様において、本発明は、式Ｉ：
Ａ−（Ｌ−Ｄ）Ｐ（Ｉ）
（式中、
Ａは、ＦＡＰに選択的に結合する抗体であり；
Ｌはリンカーであり；
Ｄは、細胞溶解素又はニグリン−ｂのＡ鎖を含む薬物であり；
ｐは１〜１０である）
を有する複合体又はその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供する。
【００２１】
本発明のこの及び他の態様によるいくつかの場合において、Ａは、ヒトＦＡＰの細胞外領域に選択的に結合するモノクローナル抗体又はその結合断片である。場合によって、Ａは、ヒト及びマウスのＦＡＰの両方に交差反応し得る。特定の場合において、Ａは、以下のアミノ酸配列：
（ｉ）ＣＤＲＨ１：配列番号７、又は配列番号７の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉ）ＣＤＲＨ２：配列番号８、又は配列番号８の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ３：配列番号９、又は配列番号９の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｉｖ）ＣＤＲＬ１：配列番号１０、又は配列番号１０の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖ）ＣＤＲＬ２：配列番号１１、又は配列番号１１の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体；
（ｖｉ）ＣＤＲＬ３：配列番号１２、又は配列番号１２の配列と比較して最大１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその変異体、
を有する重鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＨ１〜３）及び軽鎖相補性決定領域１〜３（ＣＤＲＬ１〜３）を含み得る。
【００２２】
特定の場合において、ＣＤＲＨ１〜３は、それぞれ配列番号７〜９のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲＬ１〜３は、それぞれ配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
特定の場合において、Ａは、配列番号５の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００２４】
特定の場合において、Ａは、配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００２５】
特定の場合において、Ａは、配列番号６の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。具体的には、Ａは、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。
【００２６】
特定の場合において、Ａは、配列番号３の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖を含む。具体的には、Ａは、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖を含み得る。
【００２７】
特定の場合において、Ａは、配列番号４の全長配列と少なくとも９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。具体的には、Ａは、配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。
【００２８】
特定の場合において、Ａは、本明細書に例示する抗ＦＡＰ抗体分子と構造的に異なる競合的結合抗ＦＡＰ抗体であり得る。例えば、Ａは、固定化組換えヒトＦＡＰへの結合について、「ｈｕ３６」として本明細書で同定された抗ＦＡＰ ＩｇＧ１抗体と競合する抗ＦＡＰ抗体分子であり得る。ｈｕ３６は、配列番号３の重鎖アミノ酸配列及び配列番号４の軽鎖アミノ酸配列を有する。抗ＦＡＰ抗体は、場合によって、ｈｕ３６と同じエピトープに結合し得る。抗体結合の競合を決定する方法及びエピトープマッピングの方法は、当技術分野で周知であり、例えば、「競合アッセイによるエピトープマッピング」Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ及びＤａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ；２００６；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４２７７を参照されたい。
【００２９】
本発明のこの及び他の態様によれば、Ｄは細胞溶解素であり得る。この細胞溶解素は、いくつかの場合において、ＷＯ ２００８／１３８５６１に開示された化合物であり得、この特許公開の全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる（その中に開示される化合物はツブリシン（ＴｕｂｕｌｙＳｉｎｅ）誘導体とも呼ばれる）。この細胞溶解素は、ＷＯ ２００８／１３８５６１に記載のように合成してよい。特定の場合において、この細胞溶解素は、ＷＯ ２００８／１３８５６１の式Ｉ又は式ＩＶで定義されるとおりであり得る。特定の場合において、この細胞溶解素は、式ＩＶ：
【００３０】
【化１】
0006619743.tif 000002
（式中、
Ｒ２は、（ｉ）リンカーＬに直接又は間接的に結合しているか、又は（ｉｉ）Ｈであるか、もしくはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ６は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり;
Ｒ７は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＲ１９又はＣＨ２ＯＣＯＲ２０であり、式中、Ｒ１９はアルキルであり、Ｒ２０はＣ２〜Ｃ６アルケニル、フェニル、又はＣＨ２−フェニルであり；
Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１０は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル又はＯ−アセチルであり；
ｆは１又は２であり；
Ｒ１１は、以下の構造：
【００３１】
【化２】
0006619743.tif 000003
（式中、
Ｒ２１は、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、ＮＨ２、アルキルオキシ、フェニル、アルキルアミノ又はジアルキルアミノであり；
Ｒ１６は、Ｈ又はＣ１〜Ｃ６−アルキル基であり；
Ｒ１７は、（ｉ）リンカーＬに直接又は間接的に結合しているか、又は（ｉｉ）ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｒ１８、ＣＯＮＨＮＨ２、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、又は必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル又はヘテロシクロアルキルの基であり、式中、Ｒ１８は、必要に応じて置換されたアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルの基であり；かつ
ｑは０、１、２又は３である）を有し、その中の用語「必要に応じて置換された」は、１個又は複数個のＨ原子がＦ、Ｃ１、ＢｒもしくはＩ又はＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２もしくはＮＯ２で置換することができる基に関し、用語「必要に応じて置換された」は、さらに、非置換のＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ２〜Ｃ９ヘテロシクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ９ヘテロアリール、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル又はＣ２〜Ｃ１１ヘテロアラルキルの基で排他的に又は追加的に置換することができる基に関する）
のものであり得る。
【００３２】
いくつかの場合において、Ｒ２はリンカーＬとの結合である。
【００３３】
いくつかの場合において、Ｒ１７は、Ｃ（Ｏ）Ｘ、ＣＯＮＨＮＨＸ、ＯＸ、ＮＨＸ又はＳＸであり、ＸはリンカーＬとの結合である。
【００３４】
いくつかの場合において、リンカーＬは、さらにスペーサーを含み得る。
【００３５】
いくつかの場合において、スペーサーは２〜３０個の原子の鎖長を有する。
【００３６】
いくつかの場合において、スペーサーは、アルキレン（すなわち、二価アルキル）基もしくはヘテロアルキレン（すなわち、二価ヘテロアルキル）基を含むか、又はそれらからなる。いくつかの場合において、スペーサーは、アルキレン基もしくはオキシアルキレン基を含むか、又はそれらからなる。
【００３７】
いくつかの場合において、スペーサーは、基−（ＣＨ２）ｎ−もしくは−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１以上である。
【００３８】
いくつかの場合において、スペーサーは、基−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含むか、又はそれらからなり、式中、ｎは１以上である。具体的には、ｎは、１〜１５、１〜１０、１〜６、又は２〜５であり得る。例えば、ｎは、３又は４であり得る。
【００３９】
いくつかの場合において、スペーサーは、１〜６個のエチレングリコール単位、例えば、トリエチレングリコールを含む。
【００４０】
いくつかの場合において、スペーサーは、基Ｒ１７に直接結合しているか、又は架橋基を介して基Ｒ１７に結合していてよい。
【００４１】
いくつかの場合において、スペーサーは、−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合しており、ＸはＲ１７との結合である。
【００４２】
いくつかの場合において、Ｒ１７はＣＯＮＨＮＨＸであり、スペーサーは−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介して基Ｒ１７に結合しており、ＸはスペーサーとＲ１７の間の結合を表す。
【００４３】
いくつかの場合において、Ｒ１７はＣＯＮＨＮＨＸであり、スペーサーは−Ｃ（Ｏ）Ｘ架橋基を介してＲ１７に結合した−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−であり、式中、ｎ＝２、３又は４である。
【００４４】
いくつかの場合において、Ｄは、以下の構造：
【００４５】
【化３】
0006619743.tif 000004
を有する細胞溶解素を含む。
【００４６】
いくつかの場合において、Ｄは、以下の構造：
を有する細胞溶解素を含む。
【００４７】
【化４】
0006619743.tif 000005
【００４８】
特定の場合において、Ｌは、Ａとの結合のための結合基及びプロテアーゼ切断可能な部分を含む。例えば、Ｌは、バリン−シトルリン単位を含み得る。具体的には、Ｌは、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルバメートを含み得る。
【００４９】
いくつかの場合において、マレイミドの二重結合は、抗体ＡにリンカーＬを連結するために、抗体Ａのシステイン残基のチオール基と反応して、硫黄−炭素結合を形成する。
【００５０】
いくつかの場合において、−Ｌ−Ｄは、以下のものからなる群から選択される構造：
【００５１】
【化５】
0006619743.tif 000006
を有する。
【００５２】
特定の場合において、−Ｌ−Ｄは、以下の構造：
【００５３】
【化６】
0006619743.tif 000007
を有し得る。
【００５４】
特定の場合において、−Ｌ−Ｄは、以下の構造：
【００５５】
【化７】
0006619743.tif 000008
を有し得る。
【００５６】
本発明のこの及び他の態様によると、ｐは、いくつかの場合において、１〜５、例えば、１〜４、又は１〜３の範囲にあり得る。特定の場合において、ｐは１又は２であり得る。特定の場合において、ｐは３又は４であり得る。
【００５７】
本発明のこの及び他の態様によると、Ｄは、ニグリン−ｂのＡ鎖であり得る。好ましくは、ニグリン−ｂのＡ鎖は、ニグリン−ｂのＢ鎖を含まない。ニグリン−ｂのＡ鎖は、配列番号１３の配列を含むか、又はそれからなり得る。
【００５８】
特定の場合において、ニグリン−ｂのＡ鎖は、例えば、細菌宿主細胞内で組換え生成されるか、又はされていてよい。本発明者らは、驚くべきことに、ニグリン−ｂのＡ鎖が細菌宿主細胞内で組換え生成された場合のように、天然のグリコシル化が無いか又は変更されたにもかかわらず、ニグリン−ｂのＡ鎖がその活性（例えば、細胞傷害性及び／又はリボソーム阻害活性）を保持していることを見出した。
【００５９】
本発明の複合体が、毒性ペイロード（すなわち、Ｄ）としてニグリン−ｂのＡ鎖を含む場合に、Ｌは、単にＡ上の硫黄原子とＤ上の硫黄原子の間のジスルフィド結合であり得る。したがって、Ｌは、ジスルフィド結合を含むか、又はそれからなり得る。
【００６０】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に従って定義され、医薬において使用するための複合体を提供する。
【００６１】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様に従って定義され、哺乳動物対象の腫瘍の治療方法で使用するための複合体を提供する。
【００６２】
いくつかの場合において、該複合体は、１種以上の他の抗腫瘍薬と同時投与、逐次投与又は別々の投与のためのものである。１種以上の他の抗腫瘍薬は、細胞傷害性化学療法剤又は抗血管新生剤又は免疫療法剤を含む。いくつかの場合において、１種以上の他の抗腫瘍薬は、ゲムシタビン、アブラキサン、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、抗ＰＤ−１分子又は抗ＰＤ−Ｌ１分子（例えば、ニボルマブ又はペムブロリズマブ）を含む。
【００６３】
特定の場合において、該複合体は、固形腫瘍の治療に使用するためのものである。具体的には、該複合体は、膵臓癌、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌の治療に使用するためのものであり得る。
【００６４】
第４の態様において、本発明は、哺乳動物対象の腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の第１の態様に従って定義される治療有効量の複合体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの場合において、本方法は、固形腫瘍の治療のためのものであり得る。具体的には、本方法は、膵臓癌、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌を治療するためのものであり得る。
【００６５】
第５の態様において、本発明は、抗体−薬物複合体の調製における細胞溶解素の使用を提供し、その抗体は、ＦＡＰ特異的抗体、例えば、本発明の第８の態様によるＦＡＰ特異的抗体である。いくつかの場合において、この使用は、本発明の第１の態様に従って定義される抗体−薬物複合体の調製における細胞溶解素の使用であり得る。
【００６６】
第６の態様において、本発明は、炎症状態（例えば、関節リウマチ）の治療に使用するための、本発明の第１の態様の複合体を提供する。
【００６７】
第７の態様において、本発明は、哺乳動物対象における炎症状態（例えば、関節リウマチ）を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本発明の第１の態様の治療的有効量の複合体を投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
第８の態様において、本発明は、ニグリン−ｂのＢ鎖を含まない、単離したニグリン−ｂのＡ鎖を提供する。ニグリン−ｂのＡ鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３の配列を含むか、又はそれからなり得る。
【００６９】
第９の態様において、本発明は、免疫毒素の調製における、本発明の第８の態様による単離したニグリン−ｂのＡ鎖の使用を提供する。いくつかの場合において、この免疫毒素は、前記単離したニグリン−ｂのＡ鎖（ニグリン−ｂのＢ鎖は含まない）と複合化されるか、かつ／又は結合したモノクローナル抗体を含む。いくつかの場合において、この免疫毒素は、選択的にＦＡＰに結合するモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体などの抗体を含む。いくつかの場合において、この免疫毒素は、本発明の第１０の態様による抗体を含む。
【００７０】
第１０の態様において、本発明は、選択的にＦＡＰに結合し、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むモノクローナル抗体、例えば、ヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００７１】
第１１の態様において、本発明は、医薬において使用するための本発明の第１０の態様の抗体を提供する。本抗体は、炎症状態（例えば、関節リウマチ）の治療に使用するためのものであり得る。
【００７２】
第１２の態様において、本発明は、抗体−薬物複合体又は免疫毒素の調製における、本発明の第１０の態様によるモノクローナル抗体の使用を提供する。
【００７３】
第１３の態様において、本発明は、配列番号１〜６及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの場合において、このポリヌクレオチドは、配列番号１４の核酸配列を含み得る。
【００７４】
第１４の態様において、本発明は、
（ａ）少なくとも１個のスルフヒドリル基を導入するために、ＦＡＰに選択的に結合する抗体を誘導体化すること；かつ
（ｂ）抗体とニグリン−ｂのＡ鎖の間でジスルフィド結合の形成を可能にする条件下で、ニグリン−ｂのＡ鎖（ニグリンｂのＢ鎖を含まない）上の適切な残基（例えば、システインアミノ酸）と誘導体化抗体を反応させ、それにより複合体を生成すること、を含む、本発明の第１の態様による複合体の生成法を提供する。この方法は、さらに該複合体の精製及び／又は単離の工程（ｃ）を含み得る。
【００７５】
いくつかの場合において、工程（ａ）は、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−ジチオプロオピオネート）（ＳＰＤＰ）又はメチル−４−メルカプトブチルイミデートと本抗体を反応させることを含み得る。
【００７６】
第１５の態様において、本発明は、
（ａ）ＦＡＰに選択的に結合する抗体を、チオール基を介してリンカーに連結すること；かつ
（ｂ）細胞溶解素分子上の適切な基を介してこのリンカーに細胞溶解素を連結すること、を含む、本発明の第１の態様による複合体の生成方法を提供する。いくつかの場合において、細胞溶解素は、位置Ｒ２又は位置Ｒ１７を介してリンカーと連結している。工程（ａ）及び（ｂ）は、いずれの順序でも実行することができる。任意のさらなるステップ（ｃ）において、この方法は、該複合体の精製及び／又は単離を含み得る。
【００７７】
本発明は、かかる組み合わせが明確に許されないか、又ははっきりと回避すると記載されている場合を除き、記載の態様及び好ましい特徴の組み合わせを含む。本発明のこれらの及びさらなる態様並びに実施形態は、以下で、添付の実施例及び図面を参照してさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ヒト化ｓｃＦｖ  ｈｕ３３及びｈｕ３６の特徴を示す。Ａ）精製したｓｃＦｖ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。クマシー染色。Ｒ−還元、ＮＲ−非還元。Ｂ）ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰ細胞へのｈｕ３６（ヒト化）及びｍｏ３６（キメラ）の結合のフローサイトメトリー分析。結合抗体を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて検出した（ｎ＝２）。Ｃ）固定化した（１００ｎｇ／ｍｌでコーティングした）組換えヒトＦＡＰへのｈｕ３６ ｓｃＦｖ及びｍｏ３６  ｓｃＦｖの結合のＥＬＩＳＡ。結合抗体を、ＨＲＰ結合抗Ｍｙｃタグ抗体で検出した。
【図２】Ａ）組換えヒトＦＡＰ（ｒｈＦＡＰ）又は対照タンパク質（ＢＳＡ）（それぞれ三角形と逆三角形）への結合についての抗ＦＡＰ  ｍｏ３６−ＩｇＧ１（丸）及びｈｕ３６−ＩｇＧ１（四角）のＥＬＩＳＡを示す。１ウェルあたり５０ｎｇのタンパク質をコーティングした。結合抗体をＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃで検出した。Ｂ）ＨＴ１０８０−ＦＡＰへの結合についての抗ＦＡＰ  ｍｏ３６−ＩｇＧ１（三角形及び星）並びにｈｕ３６−ＩｇＧ１（四角及び丸）のフローサイトメトリー分析。結合タンパク質を、ＰＥ標識抗ｈｕ  ＩｇＧ Ｆｃ抗体で検出した。
【図３】Ａ）ヒトＦＡＰ（ＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰ）及びＢ）マウスＦＡＰ（ＨＴ１０８０−ｍｏＦＡＰ）を発現するように安定的にトランスフェクトしたＨＴ１０８０へのｈｕ３６−ＩｇＧ１の結合のフローサイトメトリー分析を示す。結合抗体をＰＥ標識抗ヒトＦｃ抗体で検出した。
【図４】種々の時間（０、３０及び６０分）、ｈｕ３６−ＩｇＧ１とインキュベートし、ＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体、ＷＧＡ−ＴＲｅｄ（膜染色）、及びＤＡＰＩ（核）で染色したＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞の共焦点顕微鏡写真である。右側のパネルは、３つの染色のマージ画像を示す。
【図５】膜のみの染色（ＰＭ；白棒）、ＰＭ及び細胞内染色（斜線棒）、又は細胞内染色のみ（黒棒）を示す細胞（ｎ＝１０〜３０）の識別によるｈｕ３６−ＩｇＧ１の内部移行の分析のグラフである。明確な時間依存的内部移行が実証されている。
【図６】組換えニグリン−ｂのＡ鎖のＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆプロファイルである。観察された質量（Ｄａ）：２８５４６．５５；予想質量（Ｄａ）：２８５４６．０９；質量偏差：０．５；質量精度：１６ｐｐｍ。
【図７】ウサギ網状赤血球の無細胞溶解物（ＲＲＬ）中で試験した組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ）対ネイティブ（ＷＴ）ニグリン−ｂのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）活性を示す。（３ａ、３ｂ、６ｃ、９ｃ）は、ｒｅｃＮｇＡの異なる製剤を表す。
【図８】クリスタルバイオレット生存率アッセイによりＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞株で試験したｒｅｃＮｇＡの細胞傷害を示す（天然ニグリン−菱形；組換えニグリン−ｂのＡ鎖−正方形）。
【図９】天然（ＷＴ）ニグリン（三角形）及び組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ；四角）と比較したＲＲＬアッセイでの抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ｒｅｃＮｇｂＡ免疫毒素複合体（ＨＳＰ１３１−００１；十字）のＲＩＰ活性を示す。
【図１０】Ａ）ＨＴ１０８０−ＷＴ細胞株；及びＢ）ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞株における抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ｒｅｃＮｇｂＡ免疫毒素複合体（ＨＳＰ１３１−００１；三角）、結合していない（ネイキッド）抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１（四角）及び組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ；菱形）の細胞傷害活性を示す。増殖の倍率変化を、抗体／免疫毒素濃度に対してプロットした。
【図１１】ｖｃＰＡＢＡリンカーを介した細胞溶解素結合抗体の一般的な抗体複合体の構造を示す。細胞溶解素の結合は、Ｒ１又はＲ４（矢印によって識別される）を介してよい。
【図１２】患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）マウス（膵臓腫瘍）の抗ＦＡＰ  ｈｕ３６腫瘍切片の免疫検出を示す。膵臓癌のＰＤＸマウスモデル（Ｐａｎｃ１８５）の皮下腫瘍において、間質の用量、時間依存的な特異的染色が観察される。抗ｈｕ／ｍｏＦＡＰ  ｈｕ３６  ＩｇＧ１の単回用量（１＆５ｍｇ／ｋｇ）をＰＤＸマウスＰａｎｃ−１８５の腹腔内に投与した。抗ヒトＩｇＧ１二次抗体で免疫検出を行った。２０倍スケール画像を示す。対照−４８時間：マウスにビヒクルを投与し、４８時間後に腫瘍を切除した。
【図１３】異なる用量（２．５、１、０．５、０．２５、０．１ｍｇ／ｋｇ）の抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素を週一回投与して治療した後に観察した動物の体重を示す。著しい体重減少及び毒性が、５ｍｇ／ｋｇでの治療（示さず）と同様に、グループ１及び２（それぞれ、２．５及び１ｍｇ／ｋｇ）で観察された。単剤として適用した場合に、０．５ｍｇ／ｋｇが最高耐量であった。
【図１４】未治療（ビヒクル；１０ｍｌ／ｋｇ／日；週に一回）、ゲムシタビン（ＧＥＭ；１５０ｍｇ／ｋｇ；週１回）、又は抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素（ＯＭＴＸ５０５；０．５／０．２５ｍｇ／ｋｇ、週１回）、又はその両方（ＯＭＴＸ５０５（０．２５ｍｇ／ｋｇ）：ＧＥＭ（１５０ｍｇ／ｋｇ）で４週間治療した（治療日１、８、１５、２２、２９）患者由来の異種移植片マウス（ＰＡＸＦ  ７３６）の測定した（Ａ）相対体重及び（Ｂ）腫瘍体積を示す。
【図１５】ＦＡＰ標的に結合したＡＤＣ４７１のＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を示す。（Ａ）ネイキッド抗ｈｕ／ｍｏ  ＦＡＰ  ｈｕ３６抗体と比較したｈｕＦＡＰ融合タンパク質へのＡＤＣ−４７１結合のＥＬＩＳＡ検出。ＤＡＲ＝３．４８でのＨＰＳ１２４−３ ＡＤＣ−４７１分子のＥＣ５０値を示す；（Ｂ）及び（Ｃ）：ＨＰＳ１３１−１４３−１（ＡＤＣ−４７１；ＤＡＲ  ４）、ＨＰＳ１３１−１２４−１（ＡＤＣ−４６７；ＤＡＲ １．２）及びＨＰＳ１３１−１２４−３（ＡＤＣ−４７１；ＤＡＲ ３．４８）のＡＤＣのＨＴ１０８０−ｈｕＦＡＰ、ＨＴ１０８０−ｗｔ及びＨＥＫ２９３細胞上での結合のＦＡＣＳ分析。この後者のＥＣ５０値を示す（Ｂ）。
【図１６】ＨＴ１０８０−ＦＡＰ生存細胞上の抗ＦＡＰ  ｈｕ３６：細胞溶解素ＡＤＣ（ＡＤＣ−４７１；ＨＰＳ１３１−１２４−３）の内部移行能のタイムラプス免疫蛍光分析を示す。左パネル：ネイキッド抗ｈｕ／ｍｏＦＡＰ  ｈｕ３６（ＦＩＴＣ−ＡＢ；緑色）とのインキュベーション；右パネル：ＡＤＣ−４７１（ＦＩＴＣ−ＡＤＣ；緑）とのインキュベーション。時間０、３０、６０、９０分（上のパネル）：ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞。時間３０分（下のパネル）：ＨＴ１０８０−野生型細胞。
【図１７】（Ａ）ＨＴ１０８０−ｗｔ及び（Ｂ）ＦＡＰ（＋）細胞上での抗ｈｕ／ｍｏＦＡＰ  ｈｕ３６：細胞溶解素ＡＤＣのインビトロでの細胞傷害性効果を示す。１０−６〜１０−１２Ｍの濃度範囲の各化合物の７２時間インキュベーション後にクリスタルバイオレット染色により細胞増殖停止を明らかにした。親ＴＡＭ３３４細胞溶解素を非特異的細胞傷害の陽性対照として使用した。
【図１８】抗ｈｕ／ｍｏＦＡＰ  ｈｕ３６：細胞溶解素ＡＤＣ候補の腫瘍増殖阻害効果を示す。（Ａ）ＡＤＣ４７１対ＡＤＣ５５１；（Ｂ）ＡＤＣ４７１及びＡＤＣ５５３（ＯＭＴＸ７０５−５５３）対ＡＤＣ５５８（ＯＭＴＸ７０５−５５８）。ビヒクル及びＧＥＭ（ゲムシタビン）：陰性対照群及び陽性対照群。
【発明を実行するための形態】
【００７９】
本発明の説明において、以下の用語が使用され、以下に示すように定義されることが意図される。
【００８０】
ＦＡＰ
本明細書で使用する「線維芽細胞活性化タンパク質（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「線維芽細胞活性化タンパク質（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ＦＡＰ」及び「ＦＡＰα」は互換的に使用される。ＦＡＰは、任意の哺乳動物種のＦＡＰであり得る。いくつかの場合において、ＦＡＰはヒトＦＡＰ（セプラーゼ、１７０ｋＤａのメラノーマ膜結合ゼラチナーゼ、線維芽細胞活性化タンパク質α又は膜内在性セリンプロテアーゼとしても知られる）であり、そのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４０、２０１３年１２月１１日付）で開示されている（配列番号１５）。いくつかの場合において、ＦＡＰに結合する分子（例えば、抗体分子又はその複合体）は、ＦＡＰの細胞外ドメイン領域に結合することができる。ヒトＦＡＰの細胞外ドメインは、全長ヒトＦＡＰタンパク質の残基２６〜７６０を含む。いくつかの場合において、ＦＡＰは、マウスＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質α又は膜内在性セリンプロテアーゼとしても知られている）であり、そのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ９７３２１（バージョン１１７、２０１３年１２月１１日付）で開示されている（配列番号１６）。マウスＦＡＰの細胞外ドメインは、全長マウスＦＡＰタンパク質の残基２６〜７６１を含む。
【００８１】
複合体
本明細書で使用する「複合体」は、連結分子により形成された結果の構造を含み、具体的には、抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）及び免疫毒素（ＩＴ）を含む。
【００８２】
選択的に結合する
選択的に結合する及び選択的結合という用語は、特定の方法で所定の分子（例えば、抗原）に、抗体又はその結合断片の結合を指す。例えば、抗体又はその結合断片は、少なくとも約１×１０７Ｍ−１の親和性で、ＦＡＰ、例えば、その細胞外部分に結合することができ、所定の分子以外の分子への結合の親和性よりも少なくとも２倍高い（例えば、５倍又は１０倍高い）親和性で所定の分子に結合することができる。
【００８３】
抗体分子
本発明の全ての態様に関連して本明細書で使用する場合、用語「抗体」又は「抗体分子」は、天然又は部分的もしくは完全に合成により生成された任意の免疫グロブリンを含む。用語「抗体」又は「抗体分子」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びポリクローナル抗体（ポリクローナル抗血清を含む）を含む。抗体は、無傷であるか、又は完全抗体由来の断片であり得る（下記を参照されたい）。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又は非ヒト起源の抗体であり得る。「モノクローナル抗体」は、標的分子の単一の抗原部位又は「決定基」に対して作られた均質な、高度に特異的な抗体集団である。「ポリクローナル抗体」は、標的分子の異なる抗原決定基に対して作られた不均質な抗体集団を含む。用語「抗血清（ａｎｔｉｓｅｒｕｍ）」又は「抗血清（ａｎｔｉｓｅｒａ）」は、免疫化した動物から得られた抗体を含む血清を指す。
【００８４】
全抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たすことができることが示されている。したがって、本明細書に記載の抗体への言及は、本発明の方法、アレイ及びキットを参照して、完全抗体を包含し、抗体結合断片を含む任意のポリペプチド又はタンパク質も包含する。結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；（ｖ）単離したＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、２つのドメインが抗原結合部位を形成するように会合することを可能にするペプチドリンカーによって連結している単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＷＯ ９３／１１１６１）及び（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築された多価断片又は多特異性断片（ＷＯ９４／１３８０４；５８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化され得る。ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる。
【００８５】
抗体分子に関連して、用語「選択的に結合する」は、特異的結合対の一方のメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子へのいかなる有意な結合も示さない状況を指すために本明細書で使用され得る。この用語は、例えば、抗原結合部位がいくつかの抗原によって保有される特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、そのような場合には、抗原結合部位を保有する特異的結合メンバーは、エピトープを保有する様々な抗原に結合することができる。
【００８６】
本発明によるいくつかの場合において、抗体は完全ヒト抗体であり得る。
【００８７】
細胞傷害性化学療法剤
本発明の任意の態様によるいくつかの場合において、本発明の複合体は、細胞傷害性化学療法剤もしくは抗血管新生剤もしくは免疫療法剤を含むが、これらに限定されない１種以上の他の抗腫瘍薬と共に投与するか、又は１種以上の他の抗腫瘍薬と共に投与（同時、逐次もしくは別々の投与）するためのものであり得る。
【００８８】
細胞傷害性化学療法剤は、当技術分野で周知であり、以下のものなどの抗癌薬を含む：メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤；ヘキサメチルメラミン、チオテパなどの１０種のエチレンイミン類及びメチルメラミン類；ブスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＬＪ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮ−Ｕ）及びストレプトゾエイン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｅｉｎ）（ストレプトゾトシン）などのニトロソ尿素；並びに、デカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）などのトリアゼン類；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含む代謝拮抗剤；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；並びにプリン類似体及びメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）及びペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）などの関連阻害剤。ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイド類；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン類；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＱ）などの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；並びにインターフェロンアルフェノム（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｐｈｅｎｏｍｅ）などの生体応答修飾物質を含む天然物。シスプラチン（シス−ＤＤＰ）及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ミトキサントロン及びアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；並びに、ミトタン（ｏ、Ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；タキソール及び類似体／誘導体；並びにフルタミド及びタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト／アンタゴニストを含む種々の薬剤。さらに好ましい細胞傷害薬は、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））である。さらに好ましい細胞傷害性剤は、ヒト血清アルブミンに結合したパクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標））である。
【００８９】
抗血管新生剤は、当該技術分野において周知であり、ベバシズマブ、イトラコナゾール、及びカルボキシアミドトリアゾールなどの抗癌剤を含む。
【００９０】
免疫療法剤は、当該技術分野で周知であり、例えば、ニボルマブ（ＭＤＸ１１０６）及びペムブロリズマブ（ＭＫ−３４７５）を含む抗プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）抗体及び抗プログラムデスリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）抗体を含む。
【００９１】
医薬組成物
本発明の複合体は、薬学的に許容される賦形剤と共に医薬組成物中に含まれてもよい。
【００９２】
薬学的に許容される賦形剤は、副反応を誘発せず、例えば、該複合体の投与の促進、体内でのその存続期間及び／もしくは有効性の増加、又は溶液中でのその溶解度の増加を可能にする医薬組成物中に入っている化合物又は化合物の組み合わせであり得る。これらの薬学的に許容されるビヒクルは、周知であり、該複合体の投与様式に応じて当業者によって適合される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明の複合体は、投与前に再構成するために凍結乾燥形態で提供されてもよい。例えば、凍結乾燥複合体は、個体に投与する前に滅菌水で再構成し、生理食塩水と混合してよい。
【００９４】
本発明の複合体は、通常、該複合体に加えて少なくとも１種類の成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。したがって、医薬組成物は、該複合体に加えて、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤又は他の材料を含んでもよい。かかる材料は非毒性であるべきであり、該複合体の有効性を妨げるべきでない。担体又は他の材料の正確な性質は投与経路に依存し、投与経路は、以下に説明するように、ボーラス、点滴、注射又は他の任意の適切な経路であり得る。
【００９５】
例えば、注射による静脈内投与では、該複合体を含む医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。当関連業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張性ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することが十分に可能である。必要に応じて、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸類；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、亜鉛タンパク質複合体）；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、プルロニック（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／又は他の添加剤を使用してよい。
【００９６】
対象
対象は、ヒト、コンパニオン動物（例えば、イヌ又はネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタもしくは非ヒト霊長類）、家畜又は農場動物（例えば、ブタ、ウシ、馬もしくは羊）であり得る。好ましくは、対象はヒトである。いくつかの場合において、対象は、癌、例えば、上皮性腫瘍と診断され得るか、又はそれを発症するリスクがあると分類されたヒトであり得る。特定の場合において、対象は、実験動物、例えば、癌のマウスモデルであり得る。特定の場合において、対象は、関節リウマチ（ＲＡ）などの炎症状態と診断されるか、又はそれを発症するリスクがあると分類された哺乳動物（例えば、ヒト）であり得る。具体的には、対象は、ＲＡを有するヒトであり得る。
【００９７】
癌
本明細書に記載の抗ＦＡＰ複合体は、哺乳動物対象の腫瘍の治療で使用される。腫瘍は固形腫瘍であり得る。具体的には、腫瘍は、膵臓癌、乳癌、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、卵巣癌、膀胱癌又は結腸癌であり得る。
【００９８】
炎症状態
本発明によるいくつかの場合において、抗ＦＡＰ抗体又は抗体薬物複合体は、炎症状態の治療に使用するためのものであり得る。ＦＡＰ発現は、関節リウマチ（ＲＡ）患者における線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）で報告されている（例えば、ＢａｕｅｒらのＡｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒｐ．（２００６）：８（６）；Ｒ１７１を参照されたい）。本発明者らは、本明細書に記載の抗ＦＡＰ抗体、及び／又は本明細書に記載のその複合体がＲＡ及び／又はＲＡの症状を改善することができると考えている。
【００９９】
以下は、例として提示されるものであり、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１００】
実施例
実施例１−抗ＦＡＰ抗体の生成
免疫化したＦＡＰ−／−ノックアウトマウスからファージディスプレイによって選択した抗ＦＡＰのｓｃＦｖについては以前に記載されている（２８）。ヒト及びマウスＦＡＰに交差反応性を示す２種類のｓｃＦｖ「ＭＯ３６」及び「ＭＯ３３」（２８）を、その後の特性評価研究並びに免疫毒素及びＡＤＣの作製のために全長ＩｇＧに変換した。これらのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ３３及びｓｃＦｖ３６）を用いて、ＶＨ及びＶＬにそれぞれ重鎖及び軽鎖の定常ドメインを融合させたキメラ抗体を作製した。さらに、両方ともＣＤＲ移植によりヒト化し、親ｓｃＦｖと比較してＦＡＰ発現細胞及び組換えＦＡＰへの結合について試験した。この比較から、最良の結合剤を用いて、全長ＩｇＧを作製した。全てのｓｃＦｖを大腸菌内で生成し、ＩＭＡＣにより精製し、抗体生成のために開発されたＬｏｎｚａ社製ＧＳ発現ベクターのｐＥＥ６．４及びｐＥＥ１４．４を用いて、ＩｇＧを哺乳動物細胞（ＣＨＯ）内で生成した。ｓｃＦｖの特徴を表１にまとめる。
【０１０１】
【表１】
0006619743.tif 000009
【０１０２】
全てのｓｃＦｖを大腸菌ＴＧ１で細菌生成し、ＩＭＡＣによって１Ｌ培養物のペリプラズム抽出物から精製した。両方のヒト化抗体（ｓｃＦｖ  ｈｕ３３及びｈｕ３６）を可溶性形態で精製し、培養液の収率は約０．６ｍｇ／Ｌであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質は移動し、予想サイズは約３０ｋＤａであった（図１Ａ）。純度は＞９０％であると推定された。ヒトＦＡＰを発現するＨＴ１０８０細胞（安定なトランスフェクタント）を用いたフローサイトメトリー実験において、細菌内で生成したｓｃＦｖ  ｈｕ３６及びｍｏ３６  ｓｃＦｖに対して同様の結合が観察された（示さず）。ＥＣ５０値は、低ナノモル範囲であった。いくつかの違いがより高い濃度で観察された（図１Ｂ）。ｓｃＦｖ  ｈｕ３３は、これらの実験では結合を全く示さなかったか、又はわずかしか結合を示さなかった。したがって、さらなる開発ではｈｕ３６に焦点を当てた。ｈｕ３６  ｓｃＦｖの結合は、組換えヒトＦＡＰ（細胞外領域のアミノ酸２６〜７６０；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いたＥＬＩＳＡによっても観察されたが、ｍｏ３６  ｓｃＦｖについて観察された結合よりもやや弱かった（図１Ｃ）。
【０１０３】
全長ＩｇＧ１抗体に対応するプラスミドを作製し、Ｌｏｎｚａ社製ＣＨＯ発現系での抗体生成のためにＣＨＯ細胞内にトランスフェクトし、細胞培養物の収率は約１ｍｇ／Ｌであった（実験室規模）。抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって特徴づけた。生物活性を、組換えＦＡＰ及びＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した抗体の検出を用いて、ＥＬＩＳＡによって分析した。細胞結合を、ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞株を用いてフローサイトメトリーによって分析した。
【０１０４】
結果：
作製（及び配列決定）したプラスミド：
ｍｏ３６ ＩｇＧ１：ｐＥＥ１４．４ ｍｏ３６−ＩｇＧ１    ＯＣＭＴＸ００１ｐ（キメラ抗ＦＡＰ ＩｇＧ１）
ｈｕ３６ ＩｇＧ１：ｐＥＥ１４．４ ｈｕ３６−ＩｇＧ１    ＯＣＭＴＸ００２ｐ（ヒト化抗ＦＡＰ ＩｇＧ１）
【０１０５】
実施例２−抗ＦＡＰ抗体の特徴
ヒト化抗ＦＡＰ  ＩｇＧ１ ｈｕ３６（ｈｕ３６−ＩｇＧ１）の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列をそれぞれ以下に示す：
抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ＨＣ：
【数１】
0006619743.tif 000010
ａａ                              ４４９
プロセシングしたＨＣのＭＷ        ４９，０６９
理論上のｐＩ                          ８．６９
潜在的なグリコシル化部位（二重下線）：Ｎ２９７
ＡＤＣＣ及びＣＤＣの欠乏につながる変異を太字イタリック体で示す（ＷＯ  ９９／５８５７２も参照されたい）。
シグナル配列を四角で示す。
ＶＨドメインに下線を引き；ＣＤＲＨ１−Ｈ３を太字の波線で示す。
【０１０６】
抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ＬＣ：
【数２】
0006619743.tif 000011
ａａ                              ２１８
プロセシングしたＨＣのＭＷ        ２３，９１９
理論上のｐＩ                          ７．７７
シグナル配列を四角で示す。
ＶＨドメインに下線を引き；ＣＤＲＬ１−Ｌ３を太字の波線で示す。
【０１０７】
ＨＵ３６−ＩｇＧ１−ＨＣ−シグナル配列なし：
【数３】
0006619743.tif 000012
【０１０８】
ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ＬＣ−シグナル配列なし：
【数４】
0006619743.tif 000013
【０１０９】
ｈｕ３６−ＶＨ：
【数５】
0006619743.tif 000014
【０１１０】
ｈｕ３６−ＶＬ：
【数６】
0006619743.tif 000015
【０１１１】
ｈｕ３６−ＣＤＲＨ１：
ＥＮＩＩＨ（配列番号７）
【０１１２】
ｈｕ３６−ＣＤＲＨ２：
ＷＦＨＰＧＳＧＳＩＫＹＮＥＫＦＫＤ（配列番号８）
【０１１３】
ｈｕ３６−ＣＤＲＨ３：
ＨＧＧＴＧＲＧＡＭＤＹ（配列番号９）
【０１１４】
ｈｕ３６−ＣＤＲＬ１：
ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＡＹＳＹＭＨ（配列番号１０）
【０１１５】
ｈｕ３６−ＣＤＲＬ２：
ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号１１）
【０１１６】
ｈｕ３６−ＣＤＲＬ３：
ＱＨＳＲＥＬＰＹＴ（配列番号１２）
【０１１７】
完全ｈｕ３６−ＩｇＧのパラメータは以下のとおりである：
全長ＩｇＧ（ａａ）の全長：１，３３４
全長ＩｇＧの計算した分子量：１４５，９２２
全長ＩｇＧの計算された吸光係数：２０９，４２０
Ａｂｓ ０．１％（＝１ｇ／ｌ）１．４３５
理論上のｐＩ：８．６０
潜在的なグリコシル化部位：Ｎ２９７
【０１１８】
精製したキメラ及びヒトの抗ＦＡＰ抗体のｍｏ３６並びにｈｕ３６を、組換えＦＡＰへの結合についてＥＬＩＳＡで分析した。両方の抗ＦＡＰ抗体は、同様のＥＣ５０値で組換えＦＡＰへの特異的でかつ強い結合を示した（約５ｎＭ）（図２Ａ）。さらに、両方の抗体は、それらの細胞表面上でヒトＦＡＰを発現しているＨＴＰ１０８０−ＦＡＰへの結合を示した（図２Ｂ）。ヒト化ＩｇＧは、キメラであるが同様のＥＣ５０値を有するＩｇＧと比較してより強いシグナルを与えた。ヒト化ｈｕ３６抗ＦＡＰ抗体は、ＦＡＣＳ分析により示されるように、ヒト及びマウスの両方のＦＡＰに交差反応することができた（図３Ａ及び３Ｂ）。ｈｕ３６−ＩｇＧ１は、ナノモル以下のＥＣ５０値（０．３３及び０．２５ｎＭ）で両方の細胞株に濃度依存的に結合した。
【０１１９】
スケールアップのために、抗体構築物をＧＳ二重ベクター（ｐＥＥ１４．４）にクローニングした。ＤＮＡプラスミドを形質転換して、増幅し、２００ｍＬの容積での発現評価のためにＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に一過的にトランスフェクトした。第２段階では、抗体を５〜１０Ｌの大規模培養で一過的に発現させた。清澄化培養上清を、一段階プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。対照試料として研究室内のヒト抗体と共に、１ｍｇ／ｍｌの濃度で精製物質を使用して、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＬＡＬを介した生成物の品質分析を行った。
【０１２０】
精製タンパク質試料を、０．２μｍフィルターを通して濾過し、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムにより分析した。抗体を＞９８．８％まで精製した。エンドトキシンレベルは＜０．５ＥＵ／ｍｇであった。
【０１２１】
全ての精製タンパク質を、還元及び非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（データは示さず）。
【０１２２】
精製タンパク質ｈｕ３６−ＩｇＧ及びｍｕ３６−ＩｇＧをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって特徴づけた。生物活性を、組換えＦＡＰ及びＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した抗体の検出を用いて、ＥＬＩＳＡにより分析した。細胞結合を、ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞株を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。融点を、ゼータサイザーナノを用いた動的光散乱によって測定した。親和性を、Ａｔｔａｎａ Ａ１００を用いるＱＣＭにより決定した。内部移行研究を、ＦＩＴＣ標識二次抗体と結合し、内部移行した抗体を検出するために、透過性細胞上での間接免疫蛍光共焦点顕微鏡法により行った。
【０１２３】
全長ＩｇＧ１精製抗体を、免疫複合体の作製のために、実験室規模及び大規模の両方で首尾よく生成した。抗体特性の概要を表２に示す。ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー実験によって示されるとおり、これらの抗体はその特異性を保持していた。これらの抗体は、ナノモル以下のＥＣ５０値でＦＡＰ発現細胞と結合した。ＱＣＭによって決定されるとおり、親和性は、親抗体のものと同等であった。ＱＣＭ測定は、高親和性結合に対するアビディティー効果の寄与を示した。熱的安定性は、異なるＩｇＧ間で異なっていた（７７〜８０℃）。
【０１２４】
急速な内部移行が、ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞にてｈｕ３６−ＩｇＧ１（ヒト化抗ＦＡＰ抗体）について示された（図４及び図５を参照されたい）。
【０１２５】
【表２】
0006619743.tif 000016
【０１２６】
抗ＦＡＰ  ＩｇＧ１のインビボ結合
抗ＦＡＰ  ＩｇＧ１ ｈｕ３６を、１及び５ｍｇ／ｋｇの単回用量で膵臓癌の患者由来異種移植マウスに腹腔内投与した。腫瘍を、投与の１２、２４、及び４８時間後に切除し、ホルマリン固定して、パラフィン包埋した。抗ＦＡＰ  ｈｕ３６の免疫検出を、抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて行った。図１２は、治療したマウスの腫瘍試料のみにおいて、特定の用量及び時間依存的な間質の染色を示す。
【０１２７】
実施例３−ニグリン−ｂのＡ鎖
血流中に放出することができた遊離毒素の副作用を回避し、ＲＩＰ毒素の潜在的な免疫原性を低減するために、リシンと共に広範に説明したとおり、ニグリン−ｂのＡ鎖の酵素ドメインをクローニングし、細菌内で発現させた。本発明者らは、細菌内で生成したＡ鎖がその活性を保持することができたならば、抗体などのビヒクル分子と複合化しない限り、細胞の中に入ることができないという仮説を立てた。
【０１２８】
生成
ニグリン−ｂのＡ鎖を、細菌発現のためにコドン最適化を考慮して合成し、合成した遺伝子を、２つの異なる大腸菌株である大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）及び大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）での発現のために、２つの異なるベクターのニグリン＿ｐＥＴ３０ｂ−３及びニグリン＿ｐＥＴ３３ｂ−１（＋／−  ＨｉＳタグ）にクローニングした。異なる培地を用いて、異なる発現状態を確認した。Ｃａｐｔｏ  Ｑクロマトグラフィー及びＳＰセファロース高性能を用いて、精製方法を確立した。精製した組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ）を１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０％グリセロール中５ｍｇ／ｍｌで製剤化した。ニグリンのエンドトキシンレベルは＜１ＥＵ／ｍｇであり、純度は単量体型で＞９９％であった。
【０１２９】
エドマンＮ末端配列決定により、ｒｅｃＮｇＡのＮ末端は期待される配列と一致することが明らかになった。
【０１３０】
組換えニグリン−ｂのＡ鎖のアミノ酸配列：
MIDYPSVSFNLDGAKSATYRDFLSNLRKTVATGTYEVNGLPVLRRESEVQVKSRFVLVPLTNYNGNTVTLAVDVTNLYVVAFSGNANSYFFKDATEVQKSNLFVGTKQNTLSFTGNYDNLETAANTRRESIELGPSPLDGAITSLYHGDSVARSLLVVIQMVSEAARFRYIEQEVRRSLQQATSFTPNALMLSMENNWSSMSLEIQQAGNNVSPFFGTVQLLNYDHTHRLVDNFEELYKITGIAILLFRCSSPSND（配列番号１３）
【０１３１】
組換えニグリン−ｂのＡ鎖は以下の特徴を有する：
アミノ酸の数：２５６
分子量：２８５４６．０
理論上のｐＩ：５．４５
【０１３２】
組換えニグリン−ｂのＡ鎖をコードするヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
【数７】
0006619743.tif 000017
【０１３３】
材料
−ニグリン＿ｐＥＴ３０ｂ−３遺伝子構築物
−大腸菌（Ｍｉｇｕｌａ）Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ａｎｄ Ｐａｌｍｅｒｓ ＢＬＲ（ＤＥ３）
−培地：自己誘導培地（ＡＩＭ）
−抽出培養緩衝液：１０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ、１μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌのペプスタチン、ｐＨ９．５
−抽出上清緩衝液：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１μｇｍｌ−１のロイペプチン、１μｇｍｌ−１のペプスタチン、０．１ｍｇｍｌ−１のリゾチーム、ｐＨ８．０
−透析容液：２５ｍＭのクエン酸／ＮａＯＨ、ｐＨ５．０−Ｃａｐｔｏ Ｑ ＦＰＬＣ：平衡緩衝液Ａ：５０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ９．５、溶出緩衝液Ｂ：５０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ９．５、１ＭのＮａＣｌ
−Ｃａｐｔｏ Ｑ工程からプールした画分（＋８０ｍｌ抽出）
−ＳＰセファロースＨＰ ＦＰＬＣ：平衡緩衝液Ａ：２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ４．０、溶出緩衝液Ｂ：２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ４．０、１ＭのＮａＣｌ
【０１３４】
方法
ニグリン＿ｐＥＴ３０ｂ−３発現を保持する大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を、３０μｇｍｌ−１のカナマイシンと共に自己誘導培地（ＡＩＭ）の１Ｌ形式で培養した。タンパク質発現は、増殖の約３〜７時間後に乳糖活性化及びグルコース枯渇によって引き起こされた。その後、温度を一晩中２０℃に下げた。抽出のために、各細胞ペレットを最初に培養物１リットル当たり抽出緩衝液８０ｍｌ中に再懸濁し、振盪しながら８℃でインキュベーションを３０分行った後に、１１００〜１１０バールでの７分の分解を３サイクル行った。その後、この抽出物を、１５，９００ｇ、８℃で６０分間の遠心分離を行った。上清は精製の出発物質であった。Ｃａｐｔｏ Ｑ ＦＰＬＣ：８１個の培養物からの抽出生成物１６０ｍｌを、１６０ｍｌのＣａｐｔｏ Ｑに添加し、平衡緩衝液４ＣＶを用いて平衡化し、平衡緩衝液１５ＣＶで洗浄した。溶出は３段階で行った：１．５ｍＳ／ｃｍで１５ＣＶ（７．６％  Ｂ）；２３．８ｍＳ／ｃｍで２０ＣＶ（１８．９％  Ｂ）；２０ＣＶ １００％  Ｂ。
【０１３５】
透析を以下の条件で行った：生成物６５０ｍｌを、２５ｍＭのクエン酸／ＮａＯＨ、ｐＨ５．０中４×５Ｌバス、カットオフ６〜８０００Ｄａで透析した。透析係数、約３５００、＜２４時間。透析後、２０，５００ｇ、８℃で３０分間遠心分離し、不溶性画分と可溶性画分を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、透析前後の両方の全画分及び可溶性画分で行った（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に１０μｌをロードした）。溶出液をＰＢＳ ｐＨ７．４の中で透析し、２×２０ｃｍ２  ＥＫＶフィルターを使用して、φ＝０．２２μｍでろ過した。
【０１３６】
ＳＰセファロースＨＰ：２５ｍＭのクエン酸、ｐＨ５．０中のＣａｐｔｏ Ｑ透析プール６１０ｍｌを、平衡化緩衝４ＣＶと共に２４０ｍｌのＳＰセファロース高性能にロードし、平衡緩衝液１５ＣＶで洗浄し、２０％Ｂまで２５Ｃｖ勾配；１００％Ｂの４ＣＶ工程で溶出した。ＳＰセファロースＨＰ工程からプールした画分を、ＰＢＳ ｐＨ７．４、０．５ｍＭのＤＴＴ（５×４Ｌバス、０．９７ｍｇ／ｍｌで９５０ｍＬのプール画分）中で透析した。カットオフは６〜８０００Ｄａであり、透析係数は約３１３０であり、時間＞２４時間であった。その後、３０分、２０，５５ｇ、８℃で遠心分離し、不溶性画分と可溶性画分を分離した。その後、１０％グリセロールを添加した。
【０１３７】
最後に、溶離液をＰＢＳ ｐＨ７．４（５バス、約３１００）中で透析し、φ＝０．２μｍで濾過し、次いで、ｒｅｃＮｇ  ｂ  Ａバッチを−８０℃で瞬間凍結した。その後、セミ分取Ｓ２００スーパーデックスでのＳＥＣを行った。
【０１３８】
サイズ排除クロマトグラフィー及び質量分析により、得られた組換えニグリン−ｂのＡ鎖（ｒｅｃＮｇＡ）のモノマーの精製状態が実証された（図６）。
【０１３９】
安定性研究を行い、ニグリン−ｂのＡ鎖タンパク質自体及びその活性に対するｐＨ及び温度の影響を評価した。ｒｅｃＮｇＡは、グリセロール（１０〜４５％）の有無に関わらず、５〜９の範囲のｐＨで安定である（データ示さず）。
【０１４０】
活性
組換えニグリン−ｂのＡ鎖のリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）活性を、ウサギ網状赤血球の無細胞溶解物中で試験した：得られたＩＣ５０値は、天然ニグリン−ｂに類似しており、２．５〜２５ｐＭの範囲内であった（図７を参照されたい）。したがって、ニグリン−ｂのＡ鎖を細菌中で組換えタンパク質として発現させると、その酵素活性を維持していることから、グリコシル化がニグリン−ｂのＡ鎖のＲＩＰ活性に必要とされないことが示唆される。
【０１４１】
（−８０℃）で凍結保存し、３回未満の凍結融解サイクルを行った場合に、ＲｅｃＮｇＡは、ウサギ網状赤血球の無細胞溶解物中でその活性を保持している（図示せず）。
【０１４２】
ｒｅｃＮｇＡの細胞傷害活性を、クリスタルバイオレットに基づく生存率アッセイによって細胞培養で試験した。図８に示すとおり、細胞内に移行するためのＢ鎖を欠くｒｅｃＮｇＡは、天然ニグリン−ｂよりも１００〜１０００低い毒性活性を示す。天然ニグリン−ｂは、約２×１０−８ＭのＩＣ５０（以前公開したデータと類似している；３３を参照されたい）を示したが、ｒｅｃＮｇＡは約２×１０−６ＭのＩＣ５０を示した。
【０１４３】
以前に発表された研究は、天然ニグリンｂがＲＲＬアッセイにおいてリシンよりも高いＲＩＰ活性を示すが、細胞内又はインビボでは毒性がはるかいに低い（約３０〜１０，０００倍）（表３のＩＣ５０及びＬＤ５０値を参照されたい）。
【０１４４】
Ｂ鎖の除去の際に、リシンＡ鎖はＲＲＬアッセイ及び細胞傷害性アッセイの両方で活性を失う。意外なことに、本発明で最初に作製したニグリンｂのＡ鎖のみが細胞傷害性アッセイで活性を失うが、天然ニグリンＢに関するＲＲＬアッセイでは活性はさらに増加した。これらのデータから、リシンの場合では、Ｂ鎖の除去がＡ鎖の結合及び移行だけでなく、そのＲＩＰ活性にも影響を与えるが、その天然対応物に関してそのＲＲＬ活性を保持し、さらに増加させるニグリンｂのＡ鎖についてはこの場合に当てはまらないことが示唆された。結果として、ニグリンｂのＡ鎖はＲＲＬにおいてリシンＡ鎖よりも５０倍活性が高い。
【０１４５】
その結果として、複合化の際に、ニグリンｂのＡ鎖複合体は、リシンＡ鎖複合体（ｎＭ範囲）よりも高い細胞傷害活性（ピコモル範囲内のＩＣ５０）を示す（データ示さず）。
【０１４６】
【表３】
0006619743.tif 000018
【０１４７】
実施例４−ニグリン−ｂのＡ鎖の抗ＦＡＰ抗体との複合化
最大細胞傷害を示すＲＩＰを含む免疫複合体については、ＲＩＰは、立体障害を回避することが必要である完全活性型で標的ビヒクルから放出されなければならない（３４）。ジスルフィド結合は、この基準に適合する連結の唯一の種類である（３５、３６）。この結合は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオプロピオネート）（ＳＰＤＰ）及び４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）などの遊離スルフヒドリル基を導入するための試薬を用いた複合化を可能にする。立体障害ジスルフィドリンカーによって毒素に共有結合したｍＡｂからなる免疫毒素は、第２世代の免疫毒素として標識される場合が多く、安定しており、長寿命で、標的細胞に対する強力な細胞傷害を示す（３７）。
【０１４８】
ＳＰＤＰは、ニグリン−ｂを含む免疫毒素（ＩＴ）の作製にすでに使用されている（３８、３９）。さらに、ＳＭＰＴは、チオラートアニオンによる攻撃からジスルフィド結合を保護し、連結のインビボ安定性を向上させる（４０、４１）。
【０１４９】
材料
−５℃で保存されている、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール、０．５ｍＭのＤＴＴ、４．９２ｇｌ−１中の組換えニグリンｂのＡ鎖
−５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）
−ＧＥ ＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ Ｇ−１０脱塩カラム
−０．２μｍ  ２８ｍｍの無菌のＭｉｎｉｓａｒｔ社製フィルター
−Ｓｃｉｃｌｏｎｅ社製ＡＬＨ ３０００ワークステーション
−Ｓａｒｓｔｅｄｔ社製マイクロテストプレート９６ウェル平底、参照番号８２．１５８１
【０１５０】
方法
ジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｃｌｅｌａｎｄの試薬）は、タンパク質試料中に存在するチオール基を遊離するために使用される還元剤である。前記基が解放されると、反応に利用可能になるので、５，５’−ジチオ−ビス−（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬）を添加する。エルマン試薬ジスルフィド架橋が切断されると、生じる２つのチオニトロ安息香酸分子（ＴＮＢ）は、チオール基の部位でタンパク質に結合する。ＴＮＢを滴定するために、ＤＴＴが吸収されず、チオール基の濃度をレンダリングする波長であるλ＝４１２ｎｍで吸光度の値を測定する。これらの割合と、λ＝２８０でその吸光度から測定されるタンパク質の濃度から、タンパク質分子あたりの遊離チオール基の数が得られる。
【０１５１】
直接チオール滴定を以下のように行った：
ｒｅｃＮｇ  ｂ  Ａ２０４μｌを２０ｍＭのリン酸、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．０（アッセイ緩衝液）７９６μｌに溶解した（１．００３３ｇｌ−１＝最終濃度）。エルマン試薬を、３ｇｌ−１で０．２Ｍのリン酸に溶解した。両方の緩衝液について、一塩基性と二塩基性のリン酸ナトリウムを１．６１：１の質量比で添加した。ｐＨを室温で調整し、緩衝液を濾過した。エルマン緩衝液１００ｍｌ及びアッセイ緩衝液５００ｍｌを調製した。エルマン試薬を、秤量よりむしろ完全に再懸濁させた。ｒｅｃＮｇＡ試料を、３０分間室温で４．８ｍＭのＤＴＴの存在下でインキュベートした。次いで、ｒｅｃＮｇｂ  Ａ試料をカラム内で精製し、溶離液の最初の１０ｍｌを一定分量取った（Ｖ＝０．５ｍｌ）。アリコートのＡ２８０を取得し、最も濃縮した２つのアリコートを混合した。Ａ２８０を再び取得した。３ｇｌ_１のＤＴＮＢ１０μｌを添加し、ブランクとして同じ濃度でアッセイ緩衝液中に希釈したエルマン（ｎｂ＝３）を使用して、２分後にＡ４１２を測定した（ｎ＝１）。読み取り値は０．１〜３ＡＵの線形範囲に属していた。タンパク質溶液を、ボルテックス後に、メニスカスの右下にピペットで移した。１ウェル当たり１００μｌをピペットで移した。この研究結果から、ｒｅｃＮｇＡの単一システイン残基に属するチオール基が遊離しており、その三次構造によってブロックされていないので反応に利用可能であることが示される。これは、ｒｅｃＮｇｂ  Ａが立体障害鎖間ジスルフィド結合を必要とするリンカーを用いて複合化されるのを可能にする。
【０１５２】
毒素分子が完全に活性型で標的化ビヒクルから放出された場合にのみ、リボソーム不活性化タンパク質を含有する免疫複合体は最大細胞傷害を示すことが十分に確立されている。ＲＩＰ分子と担体の分離は、立体障害を回避し、細胞質への毒素の効果的な移行を可能にするのに必要とされる（３４）。現時点では、ジスルフィド結合は、これらの基準に適合するように思われる連結の唯一の種類である（３６）。
【０１５３】
ヘテロ二量体形成につながる２つの異なるタンパク質の巨大分子の結合は、それぞれのタンパク質が混合されて、反応する前に修飾されることが必要である。２型のＲＩＰのＡ鎖の場合には、修飾は、分子の活性のある鎖（Ａ）及び結合鎖（Ｂ）を結ぶ天然システイン残基の還元的開裂に限定される。
【０１５４】
ＩｇＧ分子の場合には、システイン残基がタンパク質の三次及び／又は四次構造の維持に関与しているので修飾できず、その結果、特定のタンパク質の機能を失うことなく、システイン残基を還元することはできない。さらに、おそらくシステイン残基のいくつかは、活性化ＲＩＰとの最適複合化のために作製されなければならない、免疫グロブリン当たり１０個のチオール基によって実証されたように、立体的にアクセスできない（４２）。
【０１５５】
これらの理由から、ほとんどのＩｇＧ分子において、チオール基はヘテロ二官能性試薬を使用して化学的に挿入され、いくつかの方法が、ホモポリマーの形成を回避するか、又は最小限に低減するヘテロ複合体を作製するために開発されてきた。ほとんどの場合、チオール基を導入するために使用される試薬は、アミノ基と反応して、アミド又はアミジン結合を形成する。アミノ基は、反応性があり、豊富で、ほとんどのタンパク質について限定された方法で消費される。すなわち、限定された数のアミノ基は、タンパク質の生物学的活性を減少させることなく改変することができる（３６）。
【０１５６】
遊離スルフヒドリル基を導入するための最も一般的に使用される試薬は、アミノ基と反応して中性アミドを形成することによってタンパク質に２−ピリジルジスルフィド基を導入するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−ジチオプロピオネート）（ＳＰＤＰ）及び４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、並びにメルカプトブチルイミドイル（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄｏｙｌ）基を導入して、反応し、荷電アミジン類を形成することによって、誘導体化アミノ酸の正電荷を保存するメチル−４−メルカプトブチルイミデート（２−イミノチオラン、トラウトの試薬）である（３６、４１）。
【０１５７】
ＳＰＤＰ及びＳＭＰＴは、立体障害ジスルフィド結合を導入するが、２−イミノチオラン−ＳＨは、５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸（エルマン試薬）と反応することにより保護されなければならない。エルマン試薬との反応も、タンパク質のスルフヒドリル基の迅速な測定のために使用される（４３、４４）。
【０１５８】
ＳＭＰＴは、チオレートアニオンによる攻撃から保護するジスルフィド結合に隣接する炭素原子に結合しているメチル基及びベンゼン環を有することによって、連結のインビボ安定性を改善する（４０、４１）。
【０１５９】
これらのデータに基づいて、ＩｇＧタンパク質は、反応部位でタンパク質の電荷を変更する場合であっても、以下の条件で分子の抗原結合特性に著しく影響を与えないＳＭＰＴで修飾することができる。
【０１６０】
本研究において、本発明者らは、複合化プロトコルに従って、２．５及び３．５の２つの異なるｒｅｃＮｇＡ：ｍＡｂモル比を用い、誘導体化後は、６のＳＭＰＴ：ｍＡｂモル比を用いて、ヒト化抗ＦＡＰ−ＩｇＧ１とｒｅｃＮｇＡとの複合化を調べた（３６）。精製は、セファクリルＳ２００上のサイズ排除クロマトグラフィーにより行った（３７）。
【０１６１】
記載の条件下では、免疫毒素は、高分子量成分（いくつかのＲＩＰタンパク質に連結したＩｇＧ）だけでなく、遊離ＲＩＰ及びポリマーＲＩＰ（ｒｅｃＮｇＡの場合には二量体）並びに遊離抗体の存在と共に、主に、１つ又は２つの毒素分子に連結した抗体の混合物である。したがって、慎重な精製が、純粋な生成物を取得するのに望ましいと考えられる。
【０１６２】
生化学的特性評価
抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ＲｅｃＮｇＡ免疫毒素複合体を以下のように生成し、特徴付けた：
複合体ＨＰＳ１３１−００１−１
濃度０．２７７ｍｇ／ｍｌ
薬物：抗体比（ＤＡＲ）：１．８
ＰＭ：１８２ｋＤａ
純度：８７％（遊離ｍＡｂの１３％）
【０１６３】
インビトロ活性試験
ウサギ網状赤血球無細胞溶解物（ＲＲＬ）アッセイにおけるＲＩＰ活性（図９）、及び細胞培養物に対する細胞傷害性効果（図１０Ａ及び１０Ｂ）の評価を通して、上記のように調製した複合体の活性試験を行った。
【０１６４】
ＲＲＬアッセイの結果から、抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１−ＲｅｃＮｇＡ複合体（ＨＰＳ１３１−００１−１）が天然ニグリン−ｂ又はｒｅｃＮｇＡと同様のＩＣ５０値を示し、３ｐＭ範囲内にあることが示され、抗体複合化がｒｅｃＮｇＡの酵素活性を減少しなかったことが示された（図９を参照されたい）。
【０１６５】
細胞傷害の結果から、ＨＴ１０８０野生型細胞にて、複合化抗体ＨＰＳ１３１−００１−１が最高濃度でのみわずかな毒性（もしあれば）を示し、ネイキッド抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１はいかなる影響も与えず、ｒｅｃＮｇＡは１０−６Ｍでのみ、７２時間のインキュベーション後に細胞傷害性効果を示すことが示された（図１０Ａを参照されたい）。
【０１６６】
しかし、ＦＡＰ発現細胞であるＨＴ１０８０−ＦＡＰにおいて、ＨＰＳ１３１−００１−１結合抗ＦＡＰ抗体のみが、５ｐＭのＩＣ５０値で、ピコモル濃度範囲内でＨＴ−１０８０−ＦＡＰ細胞の生存率を強く減少させる（図１０Ｂを参照されたい）。
【０１６７】
これらの結果は以下のことを示す：１）抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素は、インビトロで高活性であり、ピコモル範囲で細胞傷害性があり；２）有意な効果がＨＴ１０８０−ＷＴでは観察されなかったので、活性はＦＡＰ発現に非常に特異的であり；３）その標的に対する抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１の特異性は、ｒｅｃＮｇＡとの複合化によって影響を受けず、ｒｅｃＮｇＡの酵素ＲＩＰ活性も影響を受けず；４）ネイキッドＩｇＧ１を用いた場合には効果が観察されなかったので、活性は複合化抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１に特異的であり；５）複合化していないｒｅｃＮｇＡ（膜結合ドメインを欠く）は、ほとんど細胞傷害作用を示さない（ＩＣ５０＞１μＭ）ので、抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素は内部移行する（図８を参照されたい）。
【０１６８】
要約すると、抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素は、インビトロで標的（ＦＡＰ）を特異的に認識し、細胞質ゾル内に内部移行して、ｒｅｃＮｇＡエフェクター部分を放出し、積極的にリボソームを阻害する能力を有し、細胞傷害ＩＣ５０値はピコモル範囲内になる。
【０１６９】
抗腫瘍効果のインビボ評価
免疫毒素抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡを、膵臓癌の細胞由来と患者由来の両方の異種移植マウスモデルにおいてインビボで試験した。正常マウス及びこれらのモデルの各々における最大耐量を定義するために、用量範囲研究を最初に行った：０．１〜５ｍｇ／ｋｇの用量を３週間、週に一度、腹腔内に投与し、免疫毒素の毒性効果に起因する可能性のある体重減少を検出するために、動物の体重を２日毎に監視した。結果を図１３に示す。
【０１７０】
高用量（＞０．５ｍｇ／ｋｇ）では正常マウスに肝毒性を誘導するが、ＦＡＰ発現が低いと説明されている子宮及び骨格筋（Ｄｏｌｚｎｉｇ Ｈ．らのＣａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎ．，５：１０，２００５；Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｅ．Ｗ．らのＪ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２１０：１１３７，２０１３）だけでなく、心臓及び腎臓においても病理学的分析後にはＦＡＰ依存的な毒性は観察されなかった。０．５ｍｇ／ｋｇよりも低い用量では、細胞株由来の同所性（図１３）異種移植及び患者由来の皮下（図１４Ａ）異種移植の膵臓癌マウスモデルにおいて検出可能な非特異的毒性は誘導されなかった。
【０１７１】
次いで、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇの非毒性用量で行った効力研究では、単剤として、又はゲムシタビン（２４０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて適用される抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素は、ＦＡＰ（−）細胞株由来の同所性異種移植マウスモデルにおいてインビボ抗腫瘍効力を示さなかったが（図示せず）、ＦＡＰ（＋）患者由来皮下異種移植膵臓癌マウスモデルにおいて０．５ｍｇ／ｋｇの用量で、高いインビボ抗腫瘍効力が明らかになった（図１４Ｂ）。ゲムシタビン（１５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた場合には、抗ＦＡＰ：ｒｅｃＮｇＡ免疫毒素はさらに１００％の腫瘍増殖阻害及び腫瘍退縮を示した。
【０１７２】
実施例５−細胞溶解素及び抗ＦＡＰ抗体とのそれらの複合化
チューブリシンは、最近発見された、粘液細菌から単離された天然化合物であり、チューブリン骨格を不安定化させることができ、非常に高い活性でアポトーシスを誘導する。細胞形態における高速で、不可逆的かつ強力な変化をもたすので、チューブリシン及びそれらの合成テトラペプチド類似体である細胞溶解素は、非常に強力な細胞殺傷薬である（ｐＭ〜ｎＭ活性）。チューブリシンＡは、０．７５〜１μΜのＩＣ５０でチューブリン重合をインビトロで阻害することにより、紡錘体の形成を阻止し、Ｇ２／Ｍ期における細胞周期停止を誘導する。チューブリシンは、チューブリンのビンブラスチン結合部位に結合することによりビンブラスチンと強く競合する。さらに、チューブリシンは、リソソームに富む細胞画分で安定している（４５〜４８）。
【０１７３】
複合化しやすいので、多くの異なるチューブリシン／細胞溶解素誘導体は、前臨床及び臨床開発に十分な量で全合成によって利用でき；その構造中の官能基は、いくつかの異なるリンカー技術に適合させることができる。
【０１７４】
複合化研究のために用いる細胞溶解素を、上記の一般構造（式ＩＶ）から選択した。これらの構造は、異なる癌細胞株に対する活性を示す（ｐＭ〜ｎＭ範囲）。
【０１７５】
様々なリンカーシステムを使用して、分子のＲ２又はＲ１７位のいずれかに結合させることができる。
【０１７６】
ｖｃＰＡＢＡリンカー及び抗ＦＡＰ抗体を含む細胞溶解素複合体の一般的な概要を図１１に示す（図１１に示す構造において、ｖｃＰＡＢＡリンカーへの細胞溶解素の付着部位は、位置Ｒ１又はＲ４であり、図１１で用いたＲ１又はＲ４ナンバリングシステムは、例えば、特許請求の範囲で使用されるＲ基のナンバリングシステムとは異なり、図１１のＲ１は、特許請求の範囲のＲ２に相当し、図１１のＲ４は、特許請求の範囲のＲ１７に相当する）。
【０１７７】
ｖｃＰＡＢＡ（バリン−シトルリン−ＰＡＢＣ）プロテアーゼ切断可能リンカーは、Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社と武田社が開発したＡＤＣ分子ブレンツキシマブベドチンで以前に使用されており、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）としてＦＤＡ及びＥＭＥＡによって最近承認された（それぞれ２０１１年、及び２０１２年１１月）。このＡＤＣにおいて、ｖｃＰＡＢＡは、ｍＡｂ（ｃＡＣ１０  抗ＣＤ３０抗体）上のチオールベースの複合化のためにマレイミドカプロイルにその遊離ＮＨ２で結合している）。他の側では、ｖｃＰＡＢＡは、そのＣＯＯＨを介してＳｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社のアウリスタチン細胞傷害薬（ＭＭＡＥ）と複合化されている（４９を参照されたい）。
【０１７８】
本発明者らは、このリンカー（マレイミドカプロイル−ｖｃＰＡＢＡ）を使用して、マレイミドカプロイルとのチオール系反応を介して抗ＦＡＰ抗体を、もう一方の端で、ｖｃＰＡＢＡと共にそのサイクリックピペリジンを介して細胞溶解素の細胞傷害分子と複合化した（図１１に示す細胞溶解素のＲ１又はＲ４位）。
【０１７９】
マレイミド−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＯＣＯ−チューブリシン／細胞溶解素−ＴＡＭ４６１の合成：
【０１８０】
【化８】
0006619743.tif 000019
ＴＡＭ４６１（ツブリシン／細胞溶解素）：３０．０ｍｇ（０．０４１ミリモル）
ＤＭＦ：３ｍＬ
ＴＡＭ４６５（リンカー）：３５ｍｇ（０．０４５ミリモル）
ＨＯＢｔ：１．４ｍｇ
ＤＩＰＥＡ：１０μＬ
【０１８１】
ＴＡＭ４６１及びＴＡＭ４６５を乾燥条件下で無水ＤＭＦに溶解し、得られた溶液をＨＯＢｔ及びＤＩＰＥＡで処理した。反応物を１８時間室温で攪拌した。この反応混合物を濃縮し、得られた油状物を、２〜６％のメタノール：ＤＣＭを用いてカラムクロマトグラフィーにより精製し、白色の固体としてＴＡＭ４６７を３５ｍｇ（６４％）得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１３７１［Ｍ＋Ｈ］。
【０１８２】
マレイミド−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢＯＣＱ−ツブリシン／細胞溶解素−ＴＡＭ４７０の合成：
【０１８３】
【化９】
0006619743.tif 000020
ＴＡＭ４７０（ツブリシン／細胞溶解素）：０．０７ミリモル
ＤＭＦ：５ｍＬ
ＴＡＭ４６６（リンカー）：５０ｍｇ（０．０６５ミリモル）
ＨＯＢｔ：２．４ｍｇ
ＤＩＰＥＡ：１８μｌ
【０１８４】
ＴＡＭ４７０及びＴＡＭ４６６を乾燥条件下で、無水ＤＭＦに溶解し、得られた溶液をＨＯＢｔ及びＤＩＰＥＡで処理した。反応物を１８時間室温で撹拌し、次いで、ＴＬＣで分析することにより、反応の完了が示された。この反応混合物を濃縮し、得られた油状物を、４〜１２％メタノール：ＤＣＭを用いてカラムクロマトグラフィーで精製し、ＴＡＭ４７１を５６ｍｇ（収率：６２％）得た。ＥＳＩ−ＭＳ：１３８４．６［Ｍ＋１］。
【０１８５】
インビトロ活性試験を行った。機能的活性は微小管阻害アッセイで評価し、細胞傷害活性はクリスタルバイオレット生存率アッセイにより決定する。
【０１８６】
細胞溶解素リンカー誘導体の作製
異なる細胞溶解素リンカー誘導体を図１１に示した一般構造に従って合成し、ｖｃＰＡＢＡリンカーを、単独で又はエチレングリコールスペーサー（ＥＧ；ｎ＝１〜３）を用いて、位置Ｒ１（ＴＡＭ４６７、ＴＡＭ５５１）もしくはＲ４（ＴＡＭ４７１、ＴＡＭ５５３、ＴＡＭ５５８）のいずれかに付加するか、又はエチレングリコール基（ｎ＝３）で置換した（ＴＡＭ５５２）。それぞれの化学構造を表４に示す。
【０１８７】
【表４】
0006619743.tif 000021
【０１８８】
各新規誘導体の微小管阻害活性及び細胞傷害活性を、チューブリン重合阻害アッセイ（ＴＰＩ；チューブリン重合アッセイキット；細胞骨格、カタログ番号ＢＫ０１１Ｐ）、及びＨＴ１０８０細胞の細胞増殖停止（ＣＰＡ；クリスタルバイオレット）により評価した。ＩＣ５０を計算し、結果を表５に示す。
【０１８９】
【表５】
0006619743.tif 000022
親の細胞溶解素ＴＡＭ３３４のインビトロ活性は、アウリスタチン（ＭＭＡＥ）又はメイタンシノイド（ＤＭ１−ＤＭ４）などの抗体−薬物複合体の作製に現在使用されている他のペイロードと同じ範囲内にある。ツブリシンＡファミリーの他の化合物について予想され、以前に記載されているように、リンカーを添加すると、細胞溶解素の細胞傷害活性は、親化合物ＴＡＭ３３４に対して減少した。さらに、ＴＡＭ４６７誘導体は、両方のアッセイにおいて最低の活性を有意に示した。全ての誘導体を複合化に使用して、ＡＤＣ分子を作製した。
【０１９０】
ＡＤＣの複合化及び化学的特性
新たに作製した誘導体のそれぞれを、システイン残基の非部位特異的複合化方法に従って、抗ＦＡＰ  ｈｕ３６と複合化した。この目的のために、抗体の１つのバッチを減らして、誘導体のそれぞれと反応させた。最適ＤＡＲが３〜４に達し、遊離抗体及び薬物が１０％未満になるように、異なるＴＣＥＰ比を試験した。最適複合化条件は以下の通りであった：ＴＣＥＰ＝２．５及び３．５７チオールレベルエルマン。次いで、複合体をＧ２５セファデックス上で精製し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析して、その純度を決定し、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及びポリマー液体逆相クロマトグラフィー（ＰＬＲＰ）により、異なるＡＤＣ種（０〜８種の薬物／ｍＡｂ）のＤＡＲ、遊離抗体含有量及び分布プロファイルを決定した。遊離薬物の含有量を２８０ｎｍでＵＶ検出法により評価した。化学分析（ＳＥＣ、ＨＩＣ及びＰＲＬＰプロファイル）の結果を、各ＡＤＣ及び遊離抗体について決定した（データ示さず）。ＡＤＣの生化学的特性を表６に示す。
【０１９１】
【表６】
0006619743.tif 000023
【０１９２】
様々な薬物が、異なるレベルの凝集をもたらした。具体的には、ＡＤＣ ＨＰＳ１５７−０３９−００２（ＴＡＭ５５１）が、ＤＡＲ＝３．０８で既に最高レベルの凝集を示し、非複合化抗体が２２．４％残った。ＴＡＭ４６７との予備複合化でも、高いレベルの凝集が示され：ＤＡＲ３．２７で、ＳＥＣ純度は既に６７％のみであり、遊離薬物は１６％であった（データ示さず）。これらのデータから、位置Ｒ１でのｖｃＰＡＢＡリンカーがこれらの条件下でこの種の細胞溶解素分子に明らかに最適ではないことが示唆された。
【０１９３】
複合体の標的結合
ｈｕＦＡＰ融合タンパク質への抗ＦＡＰ  ｈｕ３６：ＴＡＭ４７１ ＡＤＣ結合をＥＬＩＳＡによって分析し、ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞への結合をＦＡＣＳによって分析した（図１５）。ＦＡＣＳ分析のために、化合物を連続希釈（図１５Ｂ）又は１希釈（図１５Ｃ；１０ｎΜ）のいずれかでインキュベートし、抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（γ鎖特異的）で検出した。
【０１９４】
両方のアッセイにおいて得られたＥＣ５０値は、ネイキッド抗ｈｕ／ｍｏＦＡＰ  ｈｕ３６抗体に対して有意差を示さなかった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ＨＴ１０８０−ｗｔ及びＨＥＫ２９３細胞などのＦＡＰ（−）細胞においては、結合は観察されなかった（図１５Ｃ）。
【０１９５】
図１６は、ＡＤＣ−４７１（図１６Ｂ）が、ネイキッド抗ＦＡＰ抗体と同様に、ＨＴ１０８０−ＦＡＰ細胞において特異的に結合し、９０分後に完全に内部移行することを示している（図１６Ａ）。これらの結果から、複合化が、抗ＦＡＰ  ｈｕ３６−ＩｇＧ１の標的特異性及び親和性、又は内部移行能に影響を与えないことが明らかになった。
【０１９６】
実施例６−インビトロでの細胞傷害活性及びインビボ抗腫瘍効果の評価
抗ＦＡＰ：細胞溶解素ＡＤＣ候補を、増殖停止アッセイ（クリスタルバイオレット染色）によりインビトロで評価した。結果を図１７に示し、表７にＩＣ５０値を示す。各ＡＤＣ候補の抗腫瘍効果を、膵臓癌の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）マウスモデル（ＰＡＸＦ−７３６）において評価した。このモデルは、以前にＦＡＰ発現レベル及び間質の拡大のために選択された。ＡＤＣ化合物を、２．５ｍｇ／ｋｇで週に一回、腹腔内投与した。腫瘍体積及び体重を週２回測定した。ビヒクル治療及びゲムシタビン治療（１５０ｍｇ／ｋｇ）ＰＤＸマウスを、それぞれ陰性対照群及び陽性対照群として使用した。結果を図１８に示す。
【０１９７】
ｖｃＰＡＢＡリンカーのみをＲ１位（ＡＤＣ−５５１）内に位置付けて、作製した複合体は、Ｒ４位を利用する複合体（ＡＤＣ−４７１）と比較してインビトロで細胞傷害活性がはるかに低く（図１７；表７）、インビボで抗腫瘍活性を示さなかった（図１８）。
【０１９８】
Ｒ４位におけるｖｃＰＡＢＡリンカーに対するスペーサーとしてのエチレングリコール基の数を増加させると（ＡＤＣ−４７１（ｎ＝０）対ＡＤＣ−５５３（ｎ＝１）及びＡＤＣ−５５８（ｎ＝３））、インビトロでのＦＡＰ特異的な細胞傷害活性（図１７）及びインビボでの抗腫瘍作用が増加することが示された（図１８）。３エチレングリコールスペーサーを有するが、リンカー中にｖｃＰＡＢＡが存在しないＴＡＭ５５２複合体（ＡＤＣ−５５２）は、最小のインビボ抗腫瘍活性を示すか、又は全く示さないことが判明した（データ示さず）。ＡＤＣ−４７１及びＡＤＣ−５５３は、ＦＡＰ特異的な細胞傷害活性をほとんど又は全く示さず（それぞれ、１０ｎΜ及び１００ｎＭのＩＣ５０範囲）、ＨＴ１０８０−ＷＴとＦＡＰ細胞の間に差異がなく、インビボでの抗腫瘍効果も示さないが、ＡＤＣ−５５８は、１ｎＭ範囲のＦＡＰ特異的細胞傷害活性を示し、ＦＡＰ（＋）とＦＡＰ（−）のＨＴ１０８０細胞間の特異性の割合は５００であり、膵臓癌ＰＤＸマウスモデルにおける２．５ｍｇ／ｋｇ用量での腫瘍増殖阻害効果は４０％であった。この用量では、候補のいずれにおいても、体重減少も、毒性効果も観察されなかった（示さず）。
【０１９９】
【表７】
0006619743.tif 000024
【０２００】
ＡＤＣ−５５８を用いて、さらなる調査を行った。最大耐量（ＭＴＤ）を正常マウスで行い、２．５〜２５ｍｇ／ｋｇの用量範囲内で３週間、毎週治療を行ってもＡＤＣ−５５８が非毒性であることが判明した。次いで、２０、１０、及び５ｍｇ／ｋｇの用量で、高ＦＡＰ発現レベル及び間質拡大を有するＰＤＸマウスモデル（Ｐａｎｃ１８５）に４週間毎週投与し、ＡＤＣ−５５８複合体の腫瘍増殖阻害及び完全な退縮効果を確認した。
【０２０１】
本明細書で引用した全ての参考文献は、各個々の刊行物又は特許もしくは特許出願が参照によりその全体が具体的かつ個々に組み込まれることが示されるのと同程度に、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
本明細書に記載の具体的な実施形態は、限定するものではなく、例として提供される。本明細書の任意のサブタイトルは、便宜上含まれており、決して本開示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【参考文献】
【０２０３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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