(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分を封入する赤血球（ＲＢＣ）の安定化懸濁液を、前記活性成分を組み込んだ再封鎖されたＲＢＣから得るための方法であって、前記方法が、以下のステップ：
２８０〜３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で、３０分間以上、培養液において前記再封鎖されたＲＢＣを培養し、ここで前記培養液が、前記ＲＢＣの膜を変性させる化学物質を含まない溶液であり、
次に液体培地を、前記培養された懸濁液から取り除き、そして得られた前記ＲＢＣを、患者への前記懸濁液の注入を可能にする溶液における懸濁液中に置く
ことを含み、前記ＲＢＣの膜を変性させる化学物質が、任意でビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ３）、グルタルアルデヒド及びノイラミニダーゼから選択される、架橋剤（bridgingまたはcross-linking agent）である、方法。
【請求項２】
培養前に、溶解‐再封鎖により前記活性成分をＲＢＣ中に封入し、そして前記活性成分を含む再封鎖されたＲＢＣを得ることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養が、２９０〜３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で行われる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培養が、１時間以上の持続時間を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養前に、前記再封鎖されたＲＢＣを洗浄することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記洗浄が、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上の浸透圧で、溶液で懸濁液を希釈し、または前記再封鎖されたＲＢＣを溶液中に置き、次に分離することを含む少なくとも１回、２回又は３回の洗浄サイクルを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下のステップ：
（ａ）ＲＢＣを低張媒体と接触させ、活性成分と接触させ、前記ＲＢＣを再封鎖することを含む工程により、前記活性成分をＲＢＣ内部に封入し；
（ｂ）前記活性成分及び溶液を、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上の浸透圧で組み込んだＲＢＣを含む懸濁液または残渣を得て；
（ｃ）ステップ（ｂ）自体、または培養液の添加後の前記残渣または懸濁液を、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上の浸透圧で、３０分間以上培養し；
（ｄ）ステップ（ｃ）で培養した前記懸濁液から液体培地を除去し；
（ｅ）（ｄ）で得られた前記ＲＢＣを、患者への前記懸濁液の注入を可能にする溶液における懸濁液中に置く、ここで当該溶液は任意で保存溶液である、
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上の浸透圧での、（ａ）で得られた前記懸濁液または残渣の溶液中への希釈による、少なくとも１回の洗浄サイクル、次にＲＢＣの残渣または懸濁液を得ることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）で分離が行われるか、または分離前に希釈が行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養ステップが、２〜３９℃の温度で行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
−前記培養ステップが、２〜１０℃の低い温度で行われ、そして１時間〜７２時間持続し；または
−前記培養ステップが、２０〜３９℃の温度で行われ、そして３０分〜１時間持続する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
０．５以下、０．３以下、０．２以下、０．１５以下、又は０．１ｇ／ｄＬ以下で維持された細胞外ヘモグロビンレベル、及び／または２以下、１．５以下、又は１％以下で維持された溶血率を有する安定化ＲＢＣ懸濁液を、保存溶液における懸濁液中、２〜８℃の温度に置いた後、７２時間で回復させることを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
０．５以下、０．３以下、０．２以下、０．１５以下、又は０．１ｇ／ｄＬ以下で維持された細胞外ヘモグロビンレベル、及び／または２以下、１．５以下、又は１％以下で維持された溶血率を有する安定化ＲＢＣ懸濁液を、保存溶液における懸濁液中、２〜８℃の温度に置いた後、２４時間〜２０日間、又は２４時間〜７２時間で回復させることを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性成分が、Ｌ‐アスパラギナーゼ、イノシトール６リン酸（ＩＨＰ）、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）、因子VIII、因子IX、アルグルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、任意で第二世代及び第三世代のビスホスホネート、ウリカーゼ、チミジンホスホリラーゼ、アデノシンデアミナーゼから選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって生産された、活性成分を封入するＲＢＣの安定化懸濁液であって、保存溶液における懸濁液中、２〜８℃の温度に置いた後、７２時間の時点で、０．５以下、０．３以下、０．２以下、０．１５以下、又は０．１ｇ／ｄＬ以下の細胞外ヘモグロビンレベル、及び／または２以下、１．５以下、又は１％以下の溶血率により特徴付けられる、懸濁液。
【請求項１６】
保存溶液における懸濁液中、２〜８℃の温度に置いた後、２４時間〜２０日、又は２４〜７２時間の間に渡り、０．３以下、０．２以下、０．１５以下、又は０．１ｇ／ｄＬ以下で維持された細胞外ヘモグロビンレベル、及び／または２以下、１．５以下、又は１％以下で維持された溶血率により特徴付けられる、請求項１５に記載の懸濁液。
【請求項１７】
前記活性成分が、Ｌ‐アスパラギナーゼ、イノシトール６リン酸（ＩＨＰ）、アルギニンデイミナーゼ（ＡＤＩ）、因子VIII、因子IX、アルグルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、任意で第二世代及び第三世代のビスホスホネート、ウリカーゼ、チミジンホスホリラーゼ、アデノシンデアミナーゼの中から選択される、請求項１５又は１６に記載の懸濁液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性成分を封入する赤血球の懸濁液を安定化させるための方法に関する。さらに本発明は、かかる懸濁液を調製するための方法、これらの懸濁液を用いる処置方法、及び活性成分を封入する新規の赤血球の安定懸濁液に関する。
【背景技術】
【０００２】
赤血球中に活性成分を組み込むことを可能にする多様な方法が、発表されている。これらの方法の中でも、いわゆる溶解‐再封鎖技術は、最も広く受け入れられている。本技術は、全てが赤血球の内部と外部の間の浸透圧の差異に基づく、低張透析、低張前膨潤及び低張希釈の３つの変形を含んで成る。これらの変形は、共通して５つの以下のステップを有する：血液細胞残渣を洗浄し、そして１回以上、生理学的な緩衝剤中で遠心分離にかけ、赤血球を、低張液体培地と接触するように置いて、赤血球膜中での開孔を導き、活性成分を赤血球に入れ、高張緩衝剤を用いて孔を閉じる（再封鎖する）ことにより、赤血球内部に活性成分を包み込み、その後にそれを保存溶液における懸濁中に置く。低張透析法は、最も都合が良く、そして産業開発の主題である。欧州特許第１７７３４５２号において発表される方法は、現在、最高の成果を与えている方法であり、また再生可能であり、且つ活性成分の封入収率を改良する利点を有する。
【０００３】
したがって得られる産物の安定性は、ヒトでの治療におけるその使用のための鍵となる要素である。特にそれが患者に注入される時に産物中に含まれる細胞外ヘモグロビンの量は、既定の閾値よりも低くなくてはならない。例えば細胞外ヘモグロビンについて米国食品医薬品局ＦＤＡにより要求される閾値は、ヒトへの注入のために使用される最終産物において、０．２ｇ/ｄＬ以下である。
【０００４】
従来技術の方法により得られる産物は、注入前のそれらの貯蔵期間及び輸送の間に溶血を経る。最も壊れやすい赤血球の破裂のせいで、この溶血は、これらの産物が注入される時にはもはやそれらはＦＤＡの要求に合致しないという結果を伴い、細胞外培地中にヘモグロビンを放出してしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、活性成分を封入する赤血球懸濁液の安定性を改善することを可能にする方法を提案することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
詳細には本発明の一つの目的は、活性成分を組み込み、且つ貯蔵後に安定な細胞外ヘモグロビンレベルを有する、またはＦＤＡもしくは任意の他の保健当局により与えられる推奨に適合したままである赤血球の懸濁液を生産することを可能にする方法を提案することを目的とする。
【０００７】
詳細には溶解‐再封鎖方法を用いて、その調製のために使用される方法に関わりなく、前記方法が、活性成分を封入する赤血球の任意の懸濁液に適用できることを目的とすることが、本発明の他の目的である。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、前記方法が、安定化され、且つ高い細胞収率を有する活性成分を封入する赤血球の懸濁液の生産を可能にすることを目的とする。
【０００９】
これらの目的等は、可能な限り大きな比率で溶血‐耐性赤血球を含んで成る懸濁液を得るために、封入工程、すなわち後再封鎖から得られる懸濁液から、最も壊れやすい赤血球を除去することにより到達され得る。したがって赤血球の懸濁液は、懸濁液が著しい溶血を経ずに、それが患者に注入される時まで保存され得、注入の時間に低いレベルの細胞外ヘモグロビンを有する懸濁液を利用できることを可能にする。したがって本発明の方法は、最も壊れやすい赤血球、細胞外ヘモグロビン及び細胞外活性成分の除去を提供する。本出願人は、良好な細胞収率を維持し、最も壊れやすい赤血球の除去と最大限の数の赤血球の保持の間で良好な妥協点を見つけながら、これを達成することに成功した。本出願人は、驚くべきことに、細胞収率を改善しながら活性成分を封入する赤血球の懸濁液の安定化を可能にする条件を決定することさえ可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
（原文に記載なし）
【発明を実施するための形態】
【００１１】
「封入する（encapsulating）」とは、活性成分が本質的に、または完全に内部に含まれているということを意味する。「本質的に」とは、それでもなお少数比率の活性成分が、膜内でトラップされ得ることを意味する。
【００１２】
「活性成分を封入する（encapsulating an active ingredient）」とは、赤血球が、活性成分機能を有する分子を組み込むこと、または赤血球により集合的に形成され、且つそれを組み込む分子が、活性成分機能を有することを意味する。
【００１３】
「培養液（incubation solution）」とは、活性成分を封入する赤血球が、培養ステップの間に含まれている溶液を意味する。培養は、広いヘマトクリット範囲、詳細には１０〜８５％のヘマトクリットに渡り行われ得る。
【００１４】
「保存溶液（preservation solution）」とは、活性成分を封入する安定化された赤血球が、使用までの貯蔵に適したそれらの形態で、懸濁液中に置かれていることを意味する。好適には保存溶液は、特にグルコール、デキストロース、アデニン及びマンニトールの中から選択される赤血球の保存を促進する少なくとも１つの化学物質を含んで成る。
【００１５】
「壊れやすい赤血球（fragile red blood cells）」とは、懸濁液が２〜８℃で貯蔵される場合、詳細には１〜７２時間後に保存溶液における懸濁液中で一度溶解する可能性が高い、組み込み手順に由来する赤血球を意味する。
【００１６】
「初期ヘマトクリット（initial haematocrit）」とは、培養の間での壊れやすい赤血球の溶解による、細胞損失前のヘマトクリットを意味する。
【００１７】
「安定化（stabilisation）」の概念は、活性成分を組み込む赤血球の経時的な安定化により、特に細胞内ヘモグロビンまたは細胞外ヘモグロビンレベルの損失の観点から本質的に評価される。
【００１８】
「赤血球の安定化懸濁液（stabilised suspension of red blood cells）」とは、とりわけヒトにおけるその使用まで、活性成分を組み込む赤血球のバッチの生産後、１〜７２時間で恐らく生じるかかる使用までに、０．５ｇ／ｄＬ以下、詳細には０．３ｇ/ｄＬ以下、好適には０．２ｇ／ｄＬ以下で残存する細胞外ヘモグロビンレベルを有する懸濁液を意味する。さらにそれは、７２時間、且つ２〜８℃の温度での貯蔵で、２％以下、詳細には１．５％以下、好適には１％以下で維持される溶血率により特徴付けられ得る。
【００１９】
「すぐに使える赤血球の安定化懸濁液（ready-to-use stabilised suspension of red blood cells）」とは、患者への注入を可能にする溶液、特に保存溶液において安定化された懸濁液を意味する。そのヘマトクリットは、一般に４０％以上である。
【００２０】
「赤血球の残渣（residue of red blood cells）」または濃厚赤血球（packed red blood cell）とは、赤血球が予め懸濁液中にある液体培地からそれらの分離後に回収される、赤血球の濃縮物を意味する。分離は、ろ過または遠心分離により実施され得る。遠心分離は、一般にかかる分離のために使用される手段である。残渣は、特定の比率の液体培地を含んで成る。一般に残渣のヘマトクリットは、７０〜８５％である。
【００２１】
本方法は、活性成分を組み込む、または封入するために使用される技術とは関わりなく適用され得る。それは、とりわけ優れた溶解‐再封鎖技術、特に低張透析を用いる技術、好適には当業者が参照し得る欧州特許第１７７３４５２号において発表されている方法に適用され得る。欧州特許第１７７３４５２号の内容は、参照により本明細書に組み込まれている。以下の説明を読むことにより理解されるように、本発明の安定化方法は、活性成分を封入する再封鎖された赤血球の懸濁液もしくは残渣に適用され得、または再封鎖された赤血球の懸濁液または残渣が得られるまで実行される溶解及び再封鎖ステップを含め得る。
【００２２】
したがって本発明は、活性成分を組み込む再封鎖された赤血球から、活性成分を封入する赤血球（ＲＢＣ）の安定化懸濁液を得るための方法を目的として有している。本工程は、培養液において、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で再封鎖された赤血球の培養を含んで成る。とりわけ培養は、３０分間以上、詳細には１時間以上行われる。培養は、後‐再封鎖と呼ばれ、すなわちそれは、再封鎖されたＲＢＣで実行される。その後に液体培地は、培養された懸濁液から取り除かれ、そして得られたＲＢＣは、患者への懸濁液の注入を可能にする溶液、好適には患者への懸濁液の注入を可能にする保存溶液における懸濁液中に置かれる。
【００２３】
培養液は、典型的に浸透圧を調整することができる少なくともイオンを含んで成る生理食塩水である（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ及び／またはリン酸塩に基づく溶液）。それは、さらなる成分、特に炭水化物（carbon hydrate）、特にｐＨの調整を可能にする（詳細には約６〜約８．５、好適には約７〜約７．５）糖、並びに／或いは酸性及び／または塩基性添加剤を含んで成り得る。培養液は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ３）、グルタルアルデヒド及びノイラミニダーゼ等の架橋剤（bridgingまたはcross-linking chemical agent）等のＲＢＣ膜を変性させる任意の化学物質を含んで成らない。したがってそれは、不活性培養液、または再封鎖されたＲＢＣの膜を壊さない溶液である。
【００２４】
一つの態様では、本方法は、培養前に溶解‐再封鎖により活性成分をＲＢＣ中に封入すること、及び活性成分を含んで成る再封鎖されたＲＢＣを得ることを含んで成る。
【００２５】
好適には、再封鎖されたＲＢＣの洗浄（少なくとも１回の洗浄サイクル）は、培養前に成される。
【００２６】
本方法に適用される再封鎖されたＲＢＣは、保存溶液におけるＲＢＣの懸濁液であり得る。その後に、本発明に合致した値で浸透圧を得るために、培養液で保存溶液を希釈することは可能である。或いはＲＢＣは、例えば遠心分離またはろ過により保存溶液から分離され得、その後に培養液が添加される。さらに再封鎖されたＲＢＣを洗浄することも可能であり（後に発表する通り、少なくとも１サイクル）；洗浄サイクルは、好適には培養液における懸濁液中に置く前の懸濁液の希釈、その後の分離を含んで成る。さらに本方法に適用される再封鎖されたＲＢＣは、なお再封鎖している溶液中にある再封鎖されたＲＢＣの懸濁液であり得る。その後に例えば遠心分離もしくはろ過によりＲＢＣを再封鎖溶液から分離し、及び／または再封鎖したＲＢＣを洗浄することは可能であり（後に発表する通り、少なくとも１サイクル）；洗浄サイクルは、好適には培養液における懸濁液中に置く前の懸濁液の希釈、その後の分離を含んで成る。
【００２７】
したがって本方法は、培養液において、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で再封鎖されるＲＢＣを置くこと、及び培養することを含んで成る。
【００２８】
本発明の対象は、特に活性成分を封入する赤血球（ＲＢＣ）の安定化懸濁液を得るための方法であり、溶解‐再封鎖を介するＲＢＣ内部への活性成分の封入、活性成分を組み込む再封鎖されたＲＢＣを含む懸濁液または残渣の獲得、封鎖されたＲＢＣの洗浄（少なくとも１回の洗浄サイクル）、その後の培養液における２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧でのそれらの設置及び培養を含んで成る。培養は、とりわけ３０分間以上、詳細には１時間以上行われる。その後に液体培地は、培養された懸濁液から取り除かれ、そして得られたＲＢＣは、患者への懸濁液の注入を可能にする溶液、好適には患者への懸濁液の注入を可能にする保存溶液における懸濁液中に置かれる。示された浸透圧は、検討中の時間でＲＢＣが懸濁液中にある、または残渣中にある溶液のものである。
【００２９】
本発明にかかる方法は、特に以下のステップ：
（ａ）ＲＢＣを低張培地と接触させ（ＲＢＣの膜中の開孔を可能にし）、活性成分と接触させ（ＲＢＣ中へ入ることを可能にし）、特に等張または高張培地、好都合には高張培地を用いてＲＢＣを再封鎖する工程により、活性成分をＲＢＣ内部に封入し；
（ｂ）活性成分を組み込むＲＢＣ及び溶液を、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で含む懸濁液または残渣を取得し、または調製し；
（ｃ）ステップ（ｂ）自体の、または培養液添加後の残渣または懸濁液を、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で、３０分間以上、詳細には１時間以上培養し；
（ｄ）ステップ（Ｃ）で培養した懸濁液から液体培地を除去し；
（ｅ）（ｄ）で得られたＲＢＣを、患者への懸濁液の注入を可能にする溶液、好適には患者への懸濁液の注入を可能にする保存溶液における懸濁液中に置くことを含んで成る。
【００３０】
第一の様式によれば、溶解‐再封鎖による封入後、特にステップ（ｂ）に続くステップは、例えば溶解‐再封鎖ステップまたはステップ（ａ）の後に得られた再封鎖されたＲＢＣを、溶液において２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜３３０ ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で含んで成る残渣の懸濁液の希釈による、少なくとも１回の洗浄サイクル、好適には２または３回の洗浄ステップを含んで成り、その後にＲＢＣの残渣または懸濁液が得られる。本残渣または本懸濁液は、活性成分及び溶液を、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ/ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で組み込むＲＢＣを含む。後に続くステップ、例えば（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、その後に適用される。
【００３１】
溶解‐再封鎖、例えば（ｂ）〜（ｅ）の後に続くステップは、壊れやすい赤血球またはその大多数、詳細には５０、６０、７０、８０または９０％以上の数の溶解を導く条件下で行われる。本目的のために、それは、ＲＢＣが懸濁液中ある溶液の培養時間、培養温度、及び浸透圧で作用し得る。浸透圧が高ければ高いほど、培養時間はより長くなる。同一の効果を得るために、浸透圧が低ければ低いほど、培養時間はより短くなる。同様に、温度が高ければ高いほど、培養時間はより短くなり、またその逆も言える。その後の１回以上の洗浄サイクルは、細胞残屑及び細胞外ヘモグロビンの除去、並びに細胞外活性成分の除去を可能にするであろう。
【００３２】
本発明によれば、洗浄サイクルは、ＲＢＣの懸濁液または残渣の希釈、その後のＲＢＣ及び洗浄液の分離を含んで成る。好適には洗浄ステップは、２または３回の希釈‐分離サイクルを含んで成る。分離は、ろ過及び遠心分離等の任意の適切な手段を用いて実行され得る。遠心分離は、好適である。培養液による洗浄は、好適である。培養は、懸濁液のヘマトクリットにより制限されない。したがって一般に１０〜８５％、詳細には４０〜８０％の初期ヘマトクリットを有する懸濁液を培養することは可能である。用語残渣とは、以後７０％、及び本値を下回る懸濁液により使用される。
【００３３】
除去ステップまたはステップ（ｄ）は、培養された懸濁液または残渣から液体部分を「除去」すること、特に細胞残屑及び細胞外ヘモグロビンを取り除き、そしてその結果として細胞外活性成分を除去することが意図される。
【００３４】
除去ステップまたはステップ（ｄ）の第一の様式によれば、分離、特に遠心分離が実行され、これは特に懸濁液に適用可能である。この分離は、等張液中での希釈による１回以上、例えば２または３回の洗浄サイクルにかけられてから、次に分離、特に遠心分離され得る。
【００３５】
除去ステップまたはステップ（ｄ）の第二の様式によれば、希釈は、特に遠心分離による分離前に実行され、これは、懸濁液または残渣に適用で可能である。希釈は、特に等張洗浄液または保存溶液により実行され得る。
【００３６】
最終ステップまたはステップ（ｅ）での最終懸濁液は、任意の他の処理をせずに患者に投与され得るように調製される。
【００３７】
本ステップの第一の様式によれば、除去ステップまたはステップ（ｄ）から由来するＲＢＣの残渣は、注入溶液、特に保存溶液により希釈される。
【００３８】
本ステップの第二の様式によれば、１回以上の洗浄サイクルは、希釈、その後の分離による注入液、特に保存溶液を伴う除去ステップまたはステップ（ｄ）から由来するＲＢＣの残渣において実行される。洗浄後、ＲＢＣは、注入液、特に保存溶液における懸濁液中に置かれる。
【００３９】
本発明の方法は、１つ、いくつか、または全ての以下の特徴をさらに含んで成り得る：
−培養ステップまたはステップ（Ｃ）は、約２〜約３９℃の温度で、壊れやすいＲＢＣの溶解を確実にするのに十分な時間で行われる；
−培養ステップまたはステップ（Ｃ）は、低温で、とりわけ約２〜約１０℃、詳細には約２〜８℃で行われ、且つ約１時間〜約７２時間、詳細には約６時間〜約４８時間、好適には約１９時間〜約３０時間持続する；
−培養ステップまたはステップ（Ｃ）は、約２０〜約３９℃のより高い温度で、詳細には周囲温度（２５℃±５℃）で行われ、且つ約３０分〜約１０時間、詳細には約１時間〜約６時間、好適には約２時間〜約４時間持続する；周囲温度よりもさらに高い温度で機能することは可能であるが、これは、細胞収率、Ｐ５０及び／または２，３‐ＤＰＧ含有量に負の影響を有し得る；
−培養ステップまたはステップ（Ｃ）での懸濁液は、１０〜８５％、詳細には４０〜８０％の初期ヘマトクリットを有する；例えば７０〜約８５％のヘマトクリットを有する分離から由来する残渣、または約４０〜７０％のヘマトクリットを有する希釈された残渣を培養することは、可能である；
−培養ステップは、懸濁液の撹拌を含んで成る；
−培養ステップは、任意の撹拌を含んで成らない；
−洗浄及び／または培養のための溶液として、ＮａＣｌ水溶液は、所望される浸透圧を得るための濃度で使用される；例えば溶液は、０．９％のＮａＣｌを含んで成り得る；とりわけＮａＣｌまたは他の塩起源（例えばＫＣｌ、リン酸塩）に加えて、さらに本溶液は、グルコース、特にグルコース一水和物、一ナトリウムリン酸塩二水和物、二ナトリウム リン酸塩十二水和物を含み得る；例えば組成物は、０．９％のＮａＣｌ、０．２％のグルコース一水和物、０．０３４％の一ナトリウムリン酸塩二水和物、０．２％の二ナトリウムリン酸塩十二水和物を含んで成る；
−最終ステップまたはステップ（ｅ）での洗浄は、保存溶液により実行される；
−すぐに使える懸濁液、または患者に注入される懸濁液中の溶液の浸透圧（液体部分）は、約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである；
−すぐに使える懸濁液、または患者に注入され得る懸濁液のヘマトクリットは、４０％以上である；
−全ての洗浄、培養ステップは、保存溶液により行われる；
−ステップ（ｂ）の洗浄液及び／またはステップ（ｅ）の洗浄液並びに保存溶液は、同一の組成のものであり、且つ赤血球の保存を促す１つ以上の化合物を含んで成る；
−保存溶液（及び適用可能な洗浄または培養液の場合）は、ＮａＣｌ、アデニン、並びにグルコース、デキストロース及びマンニトールの中の少なくとも１つの化合物を含む水溶液である；
−保存溶液（及び適用可能な洗浄または培養液の場合）は、ＮａＣｌ、アデニン及びデキストロース、好適にはＡＳ３培地を含む；
−保存溶液（及び適用可能な洗浄または培養液の場合）は、ＮａＣｌ、アデニン、グルコース及びマンニトール、好適にはＳＡＧ‐マンニトールまたはＡＤｓｏｌ培地を含む。
【００４０】
さらに本発明は、活性成分を組み込むＲＢＣの安定化懸濁液を得るための方法により定義され得、特に以下のステップを含んで成る：
（ａ）ＲＢＣを、低張媒体と接触させ（ＲＢＣの膜中の開孔を可能にし）、活性成分と接触させ（ＲＢＣ中にそれが入ることを可能にし）、等張または高張培地によりＲＢＣを再封鎖することを含む工程により、活性成分をＲＢＣ内部に封入し、そしていわゆる壊れやすいＲＢＣ（すなわちそれは、懸濁液が２〜８℃で貯蔵された場合、詳細には１〜７２時間後に保存溶液における懸濁液中に一度溶解した可能性が高い）群を含むＲＢＣの懸濁液または残渣を採取し、
（ｂ〜ｃ）（ａ）で得られたＲＢＣを、溶液中で、且つ壊れやすいＲＢＣ、またはその大多数、特に５０、６０、７０、８０または９０％超の溶解を導く条件下で、洗浄及び培養し、
（ｄ）前ステップで培養した懸濁液から液体培地を除去し、
（ｅ）（ｄ）で得られたＲＢＣを、患者への懸濁液の注入を可能にする溶液、好適には患者への懸濁液の注入を可能にする保存溶液において懸濁させる。
【００４１】
一つの特徴によれば、ステップ（ｂ）は、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で活性成分及び溶液を含んで成る懸濁液または残渣の獲得または調製を含んで成る。
【００４２】
一つの特徴によれば、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｂ）自体の、または培養液の添加後、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、詳細には約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧で、３０分間以上、詳細には１時間以上の残渣または懸濁液の培養を含んで成る。
【００４３】
一つの特徴によれば、ステップ（ｄ）は、細胞残屑及び細胞外ヘモグロビンを除去するための（ｃ）で得られたＲＢＣの洗浄、特に２または３回の洗浄サイクルを含んで成る。
【００４４】
本方法は、本明細書において発表される２つの態様、並びにそれらの多様な様式及び特徴を再現し得る。
【００４５】
本発明の方法は、特に以下のステップを含んで成る：
（ａ）ＲＢＣの膜中の孔を開くために低張媒体と接触させ、活性成分と接触させて、それがＲＢＣ中へ入るのを可能にし、等張または高張培地を用いて、ＲＢＣを再封鎖すること含む工程により、活性成分をＲＢＣ内部に封入する。活性成分は、ＲＢＣの懸濁液中に、その溶解前に存在し得、またはそれは、常に再封鎖前を除き、溶解中もしくは溶解後に添加され得ることが留意される。
【００４６】
本ステップ（ａ）の一つの態様では、本方法は、以下のサブステップを含んで成る：
（ａ１）６０または６５％以上のヘマトクリットで赤血球の懸濁液を提供すること、
（ａ２）本懸濁液中のＲＢＣの浸透圧脆弱性を測定すること、
（ａ３）溶解溶液に対する向流の中で、透析デバイス、特に透析管におけるＲＢＣの懸濁液を流し、ＲＢＣの懸濁液の流速を調整し、もしくは溶解溶液の流速を調整し、または（ａ２）で測定される浸透圧脆弱性の機能として、溶解溶液の浸透圧を調整することを含む、活性成分の溶解及び内在化のための手順、
（ａ４）ＲＢＣの再封鎖のための手順。
【００４７】
本態様では、ステップ（ａ１）は、細胞残渣の洗浄／遠心分離、及び生理学的な緩衝剤における６０または６５％以上のヘマトクリットでの洗浄されたＲＢＣの懸濁を含んで成る。
【００４８】
好適にはステップ（ａ１）から（ａ３）を通して２〜８℃の温度が維持され、且つ好適には使用される産物の温度は、２〜８℃である。
【００４９】
好適にはＲＢＣの再封鎖工程は高張液を用いて、且つ好適には３０〜４０℃、詳細には約３７℃の温度で実行される。
【００５０】
再封鎖後、ＲＢＣは、分離手順、好適には遠心分離を用いて再封鎖培地から分離される。遠心分離後、遠心分離管または容器中にＲＢＣの残渣を回収する。本発明の好都合な特徴によれば、回収物は、ＲＢＣを含む可能性の高い全て、または実質的に全てのフラクションから成り、その後の壊れやすい細胞の除去後の最終的な細胞収率を高める。
【００５１】
一つの態様では、活性成分は、Ｌ‐アスパラギナーゼである。他の態様は、ＩＨＰ、ＡＤＩ、因子VIII、因子IX、アルグルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、ビスホスホネート、とりわけ第二世代及び第三世代、ウリカーゼ、チミジンホスホリラーゼ、アデノシンデイミナーゼ等の中から選択される活性成分の組み込み、好適には封入を含んで成る。 
【００５２】
ステップ（ａ）及び（ｂ）の間、またはステップ（ｃ）もしくは（ｄ）の後のＲＢＣは、ＲＢＣの表面を修飾するために追加の処理を受け得、或いはその特性を改善するために表面グラフティングまたはカップリングにより、そこに機能性が与えられ得る。特定の様式によれば、本処理は、後培養、特に培養ステップの後、または培養に続く洗浄後に成される。処理は、以下の一つであり得る：
−ＲＢＣの表面を修飾するための化学物質、特にビス（スルホスクシンイミジル）スベリン酸塩（ＢＳ３）、グルタルアルデヒド及びノイラミニダーゼ（変性剤）等の架橋剤（bridgingまたはcross-linking agent）を用いる化学的処理；
−例えば、以下の条件下で行われる熱処理：約１５分〜約９０分、好適には約２５〜約５０分、約４２〜約５５℃、好適には約４７〜約５１℃の温度でＲＢＣを加熱する；
−抗体、好適にはＩｇＧサブタイプ；例えば抗‐Ｒｈ抗体、抗‐グリコホリンＡ抗体及び抗‐ＣＲ１抗体（ＣＲ１＝タイプ１補体受容体）との免疫複合体を形成する。
【００５３】
本発明の他の対象は、ＲＢＣの懸濁液の培養ステップの使用であり、それは特にＲＢＣまたはＲＢＣの懸濁液を安定化させるために活性成分を封入し、その後に培養培地を除去し、好適には洗浄により培養培地を取り除く。好適には本使用は、ＲＢＣを保存溶液における懸濁液中に置く追加のステップをさらに含んで成る。多様な、より詳細な上記の特徴は、本発明の対象に適用される。
【００５４】
特に一つの特徴によれば、本培養ステップは、活性成分及び溶液を組み込む再封鎖されたＲＢＣを含む懸濁液または残渣の、２８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上、特に約２８０〜約３８０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、好適には約２９０〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧での３０分以上、特に１時間以上の培養を含んで成る。
【００５５】
さらに詳細には、本発明にかかる本培養は、１つ以上の以下の特徴を含んで成り得る：  −培養ステップは、約２〜約３９℃の温度で、壊れやすいＲＢＣの溶解を確実にするのに十分な時間で行われる；
−培養ステップは、低い温度、詳細には約２〜約１０℃、より詳細には約２〜約８℃で行われ、且つ約１時間〜約７２時間、詳細には約６時間〜約４８時間、好適には約１９時間〜約３０時間持続する；
−培養ステップは、約２０〜約３９℃、特に周囲温度（２５℃±５℃）のより高い温度で行われ、且つ約３０分から約１０時間、詳細には約１時間〜約６時間、好適には約２時間〜約４時間持続し；周囲温度よりも高い温度でさえ機能することは可能であるが、これは、細胞収率、Ｐ５０及び／または２，３‐ＤＰＧ含有量に負の影響を有し得る；
−培養ステップでは、懸濁液は、１０〜８５％、詳細には４０〜８０％の初期ヘマトクリットを有し；分離から得られる例えば７０〜８５％のヘマトクリットを有する残渣、または約４０〜７０％のヘマトクリットを有する希釈された残渣を培養することは、可能である；
−培養ステップは、懸濁液の撹拌を含んで成る；
−培養ステップは、任意の撹拌を含んで成らない。
【００５６】
本発明のさらなる対象は、活性成分を封入するＲＢＣの安定化懸濁液であり、本発明の方法を実行することにより獲得され得る。
【００５７】
詳細には保存溶液における懸濁液は、７２時間、且つ２〜８℃の温度での貯蔵で、０．５以下、詳細には０．３以下、より詳細には０．２以下、好適には０．１５以下、さらに好適には０．１ｇ／ｄＬ以下で残存する細胞外ヘモグロビンレベルにより特徴付けられる。
【００５８】
詳細には、保存溶液における懸濁液は、２４時間〜２０日間、詳細には２４〜７２時間、且つ２〜８℃の温度での貯蔵で、０．５以下、詳細には０．３以下、より詳細には０．２以下、好適には０．１５以下、さらに好適には０．１ｇ／ｄＬ以下で残存する細胞外ヘモグロビンレベルにより特徴付けられる。
【００５９】
細胞外ヘモグロビンレベルは、Clin. Biochem.8、96〜102、1975においてG.B.Blakney及びA.J.Dinwoodieにより発表された参照マニュアル方法を用いて都合良く測定される。さらに自動化装置が存在し、その独自の著しい感受性で本測定をそれぞれ可能にする。それにもかかわらず、それは、本発明の方法を伴う３つの異なる方法を用いる実施例において示され、合致するレベルを得ることは可能であり、またはその３つの方法は、本コントロールのために使用され得る。
【００６０】
詳細には、保存溶液における懸濁液は、７２時間、且つ２〜８℃の温度での貯蔵で、２以下、詳細には１．５以下、好適には１％以下で維持される溶血率により特徴付けられる。 
【００６１】
詳細には、保存溶液における懸濁液は、２４時間〜２０日間、詳細には２４〜７２時間、且つ２〜８℃の温度で、２以下、詳細には１．５以下、好適には１％以下で維持される溶血率により特徴付けられる。 
【００６２】
詳細には、懸濁液のヘマトクリットは、４０％以上でないものである。
【００６３】
一つの態様では、活性成分は、Ｌ‐アスパラギナーゼである。他の態様は、ＩＨＰ、ＡＤＩ、因子VIII、因子IX、アルグルコシダーゼ、β‐グルコシダーゼ、ビスホスホネート、詳細には第二世代及び第三世代、ウリカーゼ、チミジンホスホリラーゼ、アデノシンデイミナーゼ等の中から選択される活性成分の組み込み、好適には封入を含んで成る。
【００６４】
好都合には、保存溶液における懸濁液は、詳細にはＦＤＡの推奨と合致する低い細胞外ヘモグロビンレベルを有しながら、すぐに使用できる。
【００６５】
本発明のさらなる対象は、活性成分を封入するＲＢＣの懸濁液の注入による治療的な処置方法である。
【００６６】
本方法の第一の態様では、注入は、注入前の１〜７２時間、詳細には１０〜７２時間の間に調製された活性成分を封入するＲＢＣの懸濁液を患者に与える。本懸濁液のヘマトクリットは、４０％以上である。それは、保存溶液中に含まれる。細胞外ヘモグロビンレベルは、０．５以下、詳細には０．３以下、より詳細には０．２以下、好適には０．１５以下、さらに好適には０．１ｇ／ｄＬ以下、及び／または溶血率は、２以下、詳細には１．５以下、好適には１％以下である。懸濁液は、洗浄にかけられず、または注入前も同様である。
【００６７】
他の態様では、本方法は、細胞残渣を提供し、それを６０または６５％以上のヘマトクリットで、生理学的な緩衝剤における懸濁液中に置き、溶解及び再封鎖手順を用いて、これらのＲＢＣ中に活性成分を封入し、得られたＲＢＣを培養し、後者を洗浄し、そしてＲＢＣの最終懸濁液を回収するステップを含んで成る。懸濁液のヘマトクリットは、４０％以上である。それは、保存溶液中に含まれる。本懸濁液は、２〜８℃の温度で貯蔵される。本最終懸濁液は、懸濁液の調製後、１時間〜７２時間、好適には２４時間〜７２時間で患者に注入される。懸濁液の細胞外ヘモグロビンレベルは、０．５以下、詳細には０．３以下、より詳細には０．２以下、好適には０．１５以下、さらに好適には０．１ｇ／ｄＬ以下であり、及び／またはその溶血率は、２以下、詳細には１．５以下、好適には１％以下である。懸濁液は、注入前に洗浄、または類似の処理にかけられない。
【００６８】
本方法は、詳細には以下のステップを含んで成る：
（ａ１）６０または６５％以上のヘマトクリットでＲＢＣの懸濁液を提供すること、
（ａ２）本懸濁液中で、ＲＢＣの浸透圧脆弱性を測定すること、
（ａ３）溶解溶液に対する向流の中で、透析管におけるＲＢＣの懸濁液を流し、ＲＢＣの懸濁液の流速を調整し、もしくは溶解溶液の流速を調整し、または（ａ２）で測定される浸透圧脆弱性の機能として、溶解溶液の浸透圧を調整することを含む、溶解及び活性成分内在化手順、
（ａ４）ＲＢＣの再封鎖手順、
（ｂ）（ａ４）で溶液中に得られる懸濁液または残渣の希釈による任意の少なくとも１回の洗浄サイクル、洗浄液におけるＲＢＣの残渣または懸濁液の回収、
（ｃ）ステップ（ａ４）もしくは（ｂ）自体、または培養液の添加後に、残渣もしくは懸濁液を培養すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）で培養した懸濁液から、液体培地を除去すること、
（ｅ）患者への注入を可能にする溶液、特に保存溶液における懸濁液中に、（ｄ）で得られたＲＢＣを置くこと。
【００６９】
本方法の一つの態様では、ＲＢＣは、Ｌ‐アスパラギナーゼを包み込む。さらに活性成分は、上記の他の活性成分の一つであり得るが、それに限定されない。
【００７０】
本発明は、一つの図表が、欧州特許第１７７３４５２号において発表される方法、及び本発明の方法を図式化する図面を参照して、非限定的な実施例を取り上げる態様の助けにより、ここにより詳細に発表され、そして７２時間に渡る細胞外ヘモグロビンに関して、それぞれについて得られた結果を与える。
【実施例】
【００７１】
実施例１：ＮａＣｌ＋グルコース中、周囲温度での変動周期にわたる赤血球の培養
再封鎖の完了まで、欧州特許第１７７３４５２号において発表される方法に従い、活性成分（Ｌ‐アスパラギナーゼ）の不存在、または存在下で、ヒトＲＢＣの残渣を処理し、そしてＲＢＣの懸濁液を血液袋の中に回収した。ＲＢＣの袋を、洗浄機(Cobe 2991)に移した。０．９％のＮａＣｌ及び０．２％のグルコースにより懸濁液を予め希釈し、その後に遠心分離袋に移した。懸濁液を３０００ｒｐｍで２分間、遠心分離にかけた。その後に上清を、３５０ｍＬ／分で設定した上清放流率（outflow rate）で廃棄袋に向けた。希釈／遠心分離操作を２回以上繰り返し、洗浄サイクルを終わらせた。ＲＢＣを８０％のヘマトクリットで含む遠心分離袋を、周囲温度（２４±５℃）で、洗浄機中に３０分間、１時間、または３時間置いた。培養後、もう１回の洗浄サイクルを実行した。その後にＲＢＣを、１００ｍＬのＡＳ‐３（Caridian BCT）保存溶液を伴う懸濁液中に戻し、そして５±３℃で貯蔵した。製造日（Ｄ０）、その２４時間後（Ｄ１）、及び４８時間後（Ｄ２）等の細胞外ヘモグロビンを測定することにより産物の安定性を決定した。本測定は２つの方法：自動分析器（Cell Dyn Ruby:５５５ｎｍでの測定、ヘモグロビン線形性 ０．０〜２５．０ｇ/ｄＬ±０．３、変動係数＜２．０％ −ヘモグロビンの痕跡を測定するためのバックグラウンドノイズ機能の使用、±０．２ｇ/ｄＬに改善された感受性；またはExcell 2280自動分析器：５４０ｎｍでの測定、ヘモグロビン線形性 １．５〜３０．０ｇ/ｄＬ±０．１、変動係数 １％）、または本明細書中に参照により組み込まれているClin.Biochem.8、96〜102、1975において、G.B.Blakney及びA.J.Dinwoodieにより発表される参照マニュアル方法に従う５７７ｎｍでの可視分光光度法を用いて実行した。実施例では、製造者の推奨に従って自動分析器を使用した。結果を以下に示す。
【００７２】
１．１  Ｌ‐アスパラギナーゼを封入するＲＢＣの４つの懸濁液において、Ruby分析器を用いて実行した細胞外ヘモグロビンの測定（ｇ/ｄＬ）
【００７３】
【表１】
0006625970.tif 000002
【００７４】
１．２  Ｌ‐アスパラギナーゼを封入するＲＢＣ（ERY-ASP-121217-CG）、またはＬ-アスパラギナーゼを封入しないＲＢＣ（ERY-121210-MA及びERY-121217-QB）の３つの懸濁液における分光光度法による細胞外ヘモグロビンの測定(ｇ/ｄＬ)
【００７５】
【表２】
0006625970.tif 000003
【００７６】
１．３  ＲＢＣの２つの懸濁液；Ｌ‐アスパラギナーゼを封入する第一の懸濁液、活性成分を伴わない第二の懸濁液におけるExcel 2280分析器を用いる細胞外ヘモグロビンの測定(ｇ／ｄＬ)
【００７７】
【表３】
0006625970.tif 000004
【００７８】
ＮａＣｌ＋グルコースにおけるＲＢＣの培養ステップ（３０分〜３時間の経時的変化）を含んで成る本方法は、適切な産物が、Ｄ３（７２時間）で、且つＤ８までより長く、すなわち産物の製造後８日間まででさえ、０．２ｇ/ｄＬより低い細胞外ヘモグロビンレベルで得られることを可能にする。これらの結果は、３つの異なる方法を用いて実行した細胞外ヘモグロビンの測定により確認された。
【００７９】
実施例２：周囲温度での培養の間の細胞外ヘモグロビンレベルにおける変化
実施例１のように、任意の活性成分を含まないヒトＲＢＣの残渣を処理した。周囲温度での培養の間に一定分量を取り出し、１０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離にかけた。上清を回収し、そして５７７ｎｍでの可視分光光度法によりヘモグロビンレベルを決定した。結果を以下に示す。
【００８０】
【表４】
0006625970.tif 000005
【００８１】
結果は、ＲＢＣの溶血が３時間の培養の間で、ＮａＣｌ＋グルコース中、周囲温度で不変であったことを示す。したがって本培養ステップは、最も壊れやすいＲＢＣを除去することに対し著しい貢献を成すために、それは、安定な最終産物を得るために本方法には不可欠なものである。それにもかかわらず培養時間は、実施例１に示される通り、３０分まで短くなり得る。それでもなお培養ステップの間に壊れやすい非溶血ＲＢＣは、本ステップの間、及び最終洗浄の間に減退する。
【００８２】
実施例３：保存溶液（ＡＳ‐３またはＳＡＧ‐マンニトール）における、５±３℃での、２４時間のＲＢＣの培養
再封鎖の完了まで、欧州特許第１７７３４５２号において発表される方法に従いＲＢＣの残渣を処理し、そしてＬ‐アスパラギナーゼを組み込んだ。ＲＢＣの袋を洗浄機（Cobe 2991）に移した。０．９％のＮａＣｌ及び０．２％のグルコースにより懸濁液を予め希釈し、その後に遠心分離袋に移した。懸濁液を３０００ｒｐｍで、２分間、遠心分離にかけた。その後に上清を３５０ｍＬ／分の上清放流率で廃棄袋に向けた。希釈／遠心分離操作を２回以上繰り返し、洗浄サイクルを終わらせた。その後にＲＢＣの懸濁液を、８０％のヘマトクリットで、１００ｍＬのＡＳ‐３または８０ｍＬのＳＡＧ‐マンニトール保存溶液を伴う懸濁液中に再び置いた。その後にＲＢＣの袋を、〜５０％のヘマトクリットで、２４時間、５±３℃で貯蔵し、その後に１００ｍＬのＡＳ‐３保存溶液（Caridian BCT）中で再懸濁させる前に洗浄した。２〜８℃で、最終産物を貯蔵した。製造日（Ｄ０）、その後２４時間後（Ｄ１）、４８時間後（Ｄ２）等での細胞外ヘモグロビンを測定することにより、産物の安定性を決定した。本測定は、可視分光光度法を用いて、５７７ｎｍで実行した。結果を以下に示す。
【００８３】
【表５】
0006625970.tif 000006
【００８４】
ＡＳ‐３またはＳＡＧ‐マンニトールにおけるＲＢＣの培養は、同様の結果を生じた。産物は、少なくとも４８時間、０．２ｇ／ｄＬを下回る細胞外ヘモグロビンレベルで、非常に良好な安定性を示し、また同様な結果は、バッチERY-ASP-121211-CG-01について示されるように、Ｄ７で予期され得る。
【００８５】
実施例４：細胞収率における改善
実施例１に説明されるように、本方法は、改善された産物の安定性を導く。しかしながらこれは、本方法の細胞収率に負の影響を有する（欧州特許第１７７３４５２号において発表される方法で〜６５％であるのに対し、〜５５％)。産物の良好な安定性を維持しながらより良好な細胞収率を得るために、本方法の２つのサイクルに関して、一つの洗浄パラメーターを修正した。要するに細胞懸濁液の遠心分離の間に、３５０ｍＬ／分の代わりに１００ｍＬ／分で設定された上清の放流率の予測により、実施例１の条件下でバッチを生産した。これは、ＲＢＣ検出器が、上清とＲＢＣの間の境界のより早い検出を実行することを可能にした。廃棄袋へ送られるＲＢＣの量は減少し、また本方法の細胞収率は増加した。実施例４において発表される方法の平均収率は、実施例１の方法で５４％であったのに対し、７３％であった。産物の安定性は、実質的に同一である。
【００８６】
【表６】
0006625970.tif 000007
【００８７】
実施例５：生産方法の最適化後の細胞外ヘモグロビンレベルにおける減少
一つの図は、欧州特許第１７７３４５２号において発表される方法に従い生産された産物において見出される細胞外ヘモグロビンレベルを、実施例１における方法のものと比較する。７２時間の貯蔵後の細胞外ヘモグロビンにおける減少は、それが欧州特許第１７７３４５２号における方法の１．５ｇ/ｄＬから、最適化後には０．２ｇ／ｄＬを下回る値まで下がったので（すなわち７を超えるヘモグロビンレベルにおける減少）、有意である。
【図１】
0006625970.tif 000008