(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類体細胞集団を、（ａ）有効用量の約４０〜８０マイクログラム/mlの水酸化アルミニウム；及び（ｂ）リプログラミング因子のカクテルと；哺乳類体細胞を関心対象の所望の細胞型にリプログラミングするために十分な時間接触させることを含む、哺乳類体細胞の核リプログラミングを高める方法。
【請求項２】
水酸化アルミニウム及びリプログラミング因子が、順次又は同時に提供される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳類体細胞がヒト細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
リプログラミング因子のカクテルが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇをコードする核酸、又はその対応する細胞透過性ペプチドの使用を含み、細胞が多能性へとリプログラミングされる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
リプログラミング因子のカクテルが、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ４をコードする核酸、又はその対応する細胞透過性ペプチドの使用を含み、細胞が多能性へとリプログラミングされる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
哺乳類体細胞型が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞、又は線維芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
リプログラミング因子が、細胞透過性タンパク質として提供される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
リプログラミング因子が、タンパク質をコードする核酸として提供される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
関心対象の所望の細胞型が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
水酸化アルミニウムなしに実施された場合よりも大きな核リプログラミング効率を招く、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
核リプログラミング効率が、少なくとも１つの主要多能性マーカーの発現に関して約１〜約５倍である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
核リプログラミング効率が、生成された関心対象の所望の細胞型の量に関して約１〜約５倍である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列リスト
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列リストを含む。２０１３年９月２０日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、名称が０１３２−０００４ＰＲ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが３９，８６０バイトである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、幹細胞のリプログラミング方法に関する。
【０００３】
発明の背景
分化した細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への変換（transformation）は、再生療法用の多能性細胞のより扱いやすい供給源を提供することによって幹細胞生物学に革命を起こした。数多くの正常細胞源及び病的細胞源からのｉＰＳＣの誘導は、細胞療法及び再生医療での最終的な使用のための幹細胞の生成を可能にした。
【０００４】
山中及び共同研究者らによる独創性に富んだ研究は、ある種の転写因子の異所性発現が体細胞に多能性を誘導することができたことを明らかにした。これらの人工多能性幹細胞は、自己再生し、多種多様な細胞型に分化し、それらの幹細胞を疾患医療及び再生医療のための魅力的な選択肢にする。それらは、ヒト疾患をうまくモデル化するために使用されており、薬物スクリーニング及び細胞療法への使用に大きな潜在性を有する。さらに、病的細胞から生成されたｉＰＳＣは、疾患メカニズム及び潜在的治療法を研究するために有用なツールとして役立つことができる。しかし、体細胞からｉＰＳＣへのリプログラミングの根底にあるメカニズムについて理解すべきものがまだ多くあり、機械論的な洞察の不在下で潜在的臨床応用に関して懸念がある。
【０００５】
多能性へとリプログラミングするための因子の本来のセット（ＲＦ）は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇを含む。Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２は、胚性幹（ＥＳ）細胞における多能性を維持する転写因子であり、一方でＫｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃは、ｉＰＳＣ生成効率を高めると考えられる転写因子である。転写因子ｃ−Ｍｙｃは、クロマチン構造を改変して、リプログラミングに必要な遺伝子にＯｃｔ３／４及びＳｏｘ２をより効率的にアクセスさせると考えられ、一方でＫｌｆ４は、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２によるある種の遺伝子の活性化を高める。Ｎａｎｏｇは、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２のように、ＥＳ細胞における多能性を維持する転写因子であり、一方でＬｉｎ２８は、分化の途中に特異的ｍＲＮＡの翻訳及び安定性に影響すると考えられるｍＲＮＡ結合タンパク質である。バルプロ酸、クロマチン不安定化剤及びヒストンデアセチラーゼ阻害剤の同時投与と一緒になったＯｃｔ３／４及びＳｏｘ２のレトロウイルス発現が、線維芽細胞をｉＰＳＣにリプログラミングするために十分であることも示されている。
【０００６】
いくつかのクラスのベクターは、必要な遺伝子の組み合わせを過剰発現しているときに多能性を誘導することが示されている。最も初期のベクターは、核リプログラミングをＤＮＡ組み込み型レトロウイルス及びトランスポゾンに依存した。それらは有効であるものの、本質的に、挿入突然変異誘発又は発癌性リプログラミング因子の再発現のいずれかによる潜在的腫瘍形成能に関する懸念を引き起こす。Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ部位の遺伝子送達又はPiggyBacトランスポゾンアプローチが、遺伝子送達後の宿主ゲノムから外来ＤＮＡを切り取るために使用されているものの、どちらの戦略も残りの外来ＤＮＡの小さな挿入断片を残すので、突然変異誘発のリスクを排除しない。
【０００７】
遺伝子改変の一代替として、ｍＲＮＡ、エピソームＤＮＡプラスミド、及び細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）が、リプログラミング因子に有効であることが示された。
【０００８】
これらの非組み込み型ベクターは、機能性であるが、それらの特異的な作用機序の結果として、又はその実施が厄介な性質であるので、多くの場合にリプログラミング効率の低下を招く。ｉＰＳＣの生成又は異なる体細胞型への分化転換のための非組み込み型及び／又は小分子に基づくアプローチは、臨床的に重要なベクターであるので、そのような方法の頑健性、効率、及び使用の容易さを高めることが重要になる。本発明は、これらの問題に取り組む。
【０００９】
発明の概要
本発明の一態様は、哺乳類体細胞集団を、（ａ）有効用量の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）分子；及び（ｂ）リプログラミング因子のカクテルと；哺乳類体細胞を関心対象の所望の細胞型にリプログラミングするために十分な時間接触させることを含む、哺乳類体細胞の核リプログラミング方法に関する。
【００１０】
本発明のこの態様の一実施態様では、ＤＡＭＰはアルミニウム組成物である。別の実施態様では、アルミニウム組成物及び非組み込み型リプログラミング因子のカクテルは、同時に提供される。別の実施態様では、アルミニウム組成物及び非組み込み型リプログラミング因子のカクテルは、順次提供される。なおさらなる一実施態様では、アルミニウム組成物は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び硫酸アルミニウムからなる群より選択される。なお別の実施態様では、アルミニウム組成物は水酸化アルミニウムである。なお別の実施態様では、水酸化アルミニウムは、約又は少なくとも４０〜８０マイクログラム/mlの濃度で存在する。なおさらなる一実施態様では、水酸化アルミニウムの有効用量は、少なくとも又は約３０〜６０マイクログラム/mlである。なお別の実施態様では、アルミニウム組成物はリン酸アルミニウムである。なお別の実施態様では、アルミニウム組成物は硫酸アルミニウムである。
【００１１】
さらなる一実施態様では、哺乳類体細胞はヒト細胞である。なおさらなる一実施態様では、リプログラミング因子のカクテルは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、及びＮａｎｏｇの使用を含み、細胞は多能性へとリプログラミングされる。なお別の実施態様では、リプログラミング因子のカクテルは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４の使用を含み、細胞は多能性へとリプログラミングされる。なお別の実施態様では、体細胞型は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞、又は線維芽細胞である。なおさらなる一実施態様では、リプログラミング因子は、細胞透過性タンパク質として提供される。さらなる一実施態様では、リプログラミング因子は、リプログラミングタンパク質をコードする核酸として提供される。なお別の実施態様では、関心対象の所望の細胞型は、人工多能性（ｉＰＳ）細胞である。
【００１２】
本発明の別の態様は、核リプログラミングの方法であって、該方法がアルミニウム組成物なしに実施された場合よりも核リプログラミング効率がより高い方法を伴う。本発明の本態様の一実施態様では、核リプログラミング効率は、少なくとも１つの主要多能性マーカーの発現の約１〜約５倍である。別の実施態様では、核リプログラミング効率は、産生される関心対象の所望の細胞型の量の約１〜約５倍である。
【００１３】
本発明の別の態様は、本開示の任意の方法によって産生される人工多能性幹細胞の集団に関する。一実施態様では、人工多能性幹細胞はヒト細胞である。
【００１４】
本発明の別の態様は、本発明の方法を実施するためのキットに関する。一実施態様では、キットは、リプログラミング因子及びアルミニウム組成物を含む。別の実施態様では、キットは、さらに体細胞を含む。なおさらなる一態様は、インビボ投与用の、細胞及び／又は組織表現型の治療的モジュレーションのためのアルミニウム組成物などのＤＡＭＰ組成物並びに１つ以上のリプログラミング因子及び／又はそれをコードする核酸及び／又は小分子を含む治療用組成物に関する。別の態様は、処置を必要とする患者に本開示の治療用組成物の治療有効量を投与することによる、該患者を処置する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明のより完全な理解は、以下の詳細な説明と共に考慮するときに添付の図面を参照することによって得られ得る。図面に示された実施態様は、本発明を例示することだけが意図されており、例証された実施態様に本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図１】本明細書記載の方法を使用してｉＰＳＣを得る工程の概念を示す。
【図２】本明細書開示の方法を用いて低酸素及び正常酸素圧条件で様々なドナーからｉＰＳＣを得るために多様な水酸化アルミニウム濃度を使用する実験結果を示す。
【図３】本明細書開示の方法を用いて低酸素及び正常酸素圧条件で様々なドナーからｉＰＳＣを得るために多様な水酸化アルミニウム濃度を使用する実験結果を示す。
【図４】本明細書開示の方法を用いて低酸素及び正常酸素圧条件で様々なドナーからｉＰＳＣを得るために多様な水酸化アルミニウム濃度を使用する実験結果を示す。
【図５】本明細書開示の方法を用いて低酸素及び正常酸素圧条件で様々なドナーからｉＰＳＣを得るために多様な水酸化アルミニウム濃度を使用する実験結果を示す。
【００１６】
発明の詳細な説明
体細胞の核リプログラミングを高めて人工多能性幹細胞にするための方法を本明細書に記載する。特に、本明細書開示の方法は、損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）の使用を伴う。特定の実施態様では、ＤＡＭＰは、水酸化アルミニウムなどのアルミニウム組成物である。そのようなＤＡＭＰは、体細胞を誘導して人工多能性幹細胞にするために通常使用されるリプログラミング因子の核リプログラミング効率を高めることが予想外及び驚くことに見出された。したがって、本開示は、核リプログラミング方法及びそのような方法から得られた細胞、さらには幹細胞療法による処置を施すことのできる疾患の処置のためにそのような細胞を使用するための治療方法、並びにそのような使用のためのキットを記載する。
【００１７】
本発明は、記載された特定の方法論、プロトコール、細胞系、動物種又は属、及び試薬に限定されないことを理解すべきである。というのは、それらが変動し得るからである。本明細書において使用される用語は、特定の実施態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することが意図されず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００１８】
特許請求の範囲及び／又は明細書の中の用語「含んでいる（comprising）」と共に使用される場合の単語「a」又は「an」の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という意味とも合致する。
【００１９】
本出願にわたり、用語「約」は、値が、その値を決定するために採用された装置、方法についての誤差の固有変動又は被験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、本用語は、状況に応じて約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％、又はそれ未満の変動性を包含することが意味される。
【００２０】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、選択肢のみを表す又は選択肢が相互排他的であることが明示的に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるものの、本開示は、選択肢のみ並びに「及び／又は」を表す定義を支持する。
【００２１】
本明細書及び特許請求の範囲に使用される単語「含んでいる（comprising）」（及び「含む（comprise及びcomprises）」などのcomprisingの任意の形式)、「有している（having）」(及び「有する（have及びhas）」などのhavingの任意の形式)、「含んでいる（including）」（及び「含む（includes及びinclude）」などのincludingの任意の形式)又は「含有している（containing）」(及び「含有する（contains及びcontain）」などのcontainingの任意の形式）は、インクルーシブ（inclusive）又はオープンエンドであり、追加的な、列挙されていない要素又は方法段階を排除しない。本明細書に論じられた任意の実施態様を、本発明の任意の方法又は組成物に関して実行することができ、逆もまた同様と考えられている。さらに、本発明の組成物を、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【００２２】
「全能性」は、本明細書において、単一細胞が分裂及び／又は分化して、胚外組織を含めた生物内の分化済み細胞の全てを生成する能力と呼ばれる。全能細胞は、胞子及び接合子を含む。一部の生物では、細胞は脱分化し、全能性を再獲得することができる。
【００２３】
「多能性」は、本明細書において３つの胚葉：内胚葉（胃内面、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、又は外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかに分化する潜在性と呼ばれる。
【００２４】
「多能性幹細胞」は、天然多能性幹細胞及び人工多能性幹細胞を含む。それらは、任意の胎児細胞型又は成体細胞型を生じることができる。しかし、それらは、単独では一般的に胎児生物又は成体生物に発達することができない。それは、それらが胎盤などの胚体外組織に貢献する潜在性を欠如するからである。
【００２５】
「人工多能性幹細胞」又は（「ｉＰＳＣ」）は、ある種の幹細胞遺伝子及び／又はタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、並びに効力及び分化可能性（differentiability）などの多くの態様が、胚性幹（ＥＳ）細胞などの天然多能性幹細胞に類似している。人工多能性細胞は、例えば、成体の胃、肝臓、皮膚細胞及び血液細胞由来であり得る。ｉＰＳＣは、成体線維芽細胞などの非多能性細胞にある種の幹細胞関連遺伝子をトランスフェクションすることによって誘導され得る。特定の実施態様では、トランスフェクションは、例えばレトロウイルスなどのウイルスベクター、及び非ウイルス性ベクター又はエピソームベクターを介して達成してもよい。トランスフェクションされた遺伝子は、非限定的に、マスター転写因子Ｏｃｔ−３／４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｋｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８導入遺伝子を含むことができる。トランスフェクションされた細胞の亜集団は、多能性幹細胞に形態学的及び生化学的に類似になり始める場合があり、形態学的選択、倍加時間、又はレポーター遺伝子及び抗生物質選択を介して単離することができる。
【００２６】
当業者に公知の「主要多能性マーカー」は、非限定的に、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２の遺伝子及び／又はタンパク質発現を含む。
【００２７】
「マルチポテンシー」は、本明細書において、複数の細胞型を生じる潜在性を有するが、系譜数が多能性幹細胞よりも限定されるマルチポテント前駆細胞と呼ばれる。例えば、マルチポテント幹細胞は、いくつかの血液細胞型が発生できるが、脳細胞又は他の細胞型が発生できない造血細胞である。
【００２８】
本明細書に使用される「リプログラミング因子」は、生物学的活性ポリペプチド（又は核酸、例えばそれらをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又は小分子の１つ又はカクテルを表し、それらは、細胞に作用して転写を変化させ、またそれらは発現すると、体細胞を異なる細胞型、又はマルチポテンシー又は多能性へとリプログラミングする。一部の実施態様では、リプログラミング因子は、非組み込み性の場合があり、すなわちレシピエント細胞のゲノム内への外来ＤＮＡの組み込みを招かない形態でレシピエント体細胞に提供され得る。
【００２９】
一部の実施態様では、リプログラミング因子は、非限定的にＯｃｔ３／４；Ｓｏｘ２；Ｋｌｆ４；ｃ−Ｍｙｃ；及びＮａｎｏｇを含む転写因子である。同様にリプログラミング因子として関心対象であるのは、分化の途中に特異的ｍＲＮＡの翻訳又は安定性に影響すると考えられるｍＲＮＡ結合タンパク質であるＬｉｎ２８である。
【００３０】
関心対象のリプログラミング因子は、体細胞が異なる体細胞にリプログラミングされる分化転換に有用な因子も含む。ある体細胞から別の実質的に異なる体細胞型への分化転換のために、異なるセットのリプログラミング因子が用途を見つける。例えば、線維芽細胞を心筋細胞に分化転換させるために、細胞透過性ペプチドＧａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ及びＴｂｘ５が使用され得る（Leda et al., Cell, Volume 142, Issue 3, 375-386, 6 Aug. 2010、参照により本明細書に具体的に組み入れられる）。
【００３１】
リプログラミング因子は、単離されたポリペプチドの組成物、すなわち生物学的に活性な無細胞形態の組成物として、又はそれをコードする核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ）として提供され得る。特異的ＤＮＡ結合アッセイ法によって又は細胞転写の変化における因子の有効性を決定することによって、生物学的活性は決定され得る。本発明の組成物は、１つ以上の生物学的に活性なリプログラミング因子を提供し得る。組成物は、少なくとも約５０μg/ml、少なくとも約１００μg/ml；少なくとも約１５０μg/ml、少なくとも約２００μg/ml、少なくとも約２５０μg/ml、少なくとも約３００μg/ml、又はそれを超える可溶性リプログラミング因子を含み得る。
【００３２】
Ｋｌｆ４ポリペプチドは、配列がGenBankアクセッション番号ＮＰ＿００４２２６（配列番号：１）及びＮＭ＿００４２３５（配列番号：２）で見出され得るヒトＫｌｆ４、すなわちクルッペル様因子４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｋｌｆ４ポリペプチド、例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿００４２３５（配列番号：２）に提供される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％同一であるそれら、及びそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途を見出す。
【００３３】
ｃ−Ｍｙｃポリペプチドは、配列がGenBankアクセッション番号ＮＰ＿００２４５８（配列番号：３）及びＮＭ＿００２４６７（配列番号：４）で見出され得るヒトｃ−Ｍｙｃ、すなわち骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ｃ−Ｍｙｃポリペプチド、例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿００２４６７（配列番号：４）に提供される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％同一であるそれら、及びそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途を見出す。
【００３４】
Ｎａｎｏｇポリペプチドは、配列がGenBankアクセッション番号ＮＰ＿０７９１４１（配列番号：５）及びＮＭ＿０２４８６５（配列番号：６）で見出され得るヒトＮａｎｏｇ、すなわちＮａｎｏｇホメオボックスのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｎａｎｏｇポリペプチド、例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿０２４８６５（配列番号：６）に提供される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％同一であるそれら、及びそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途を見出す。
【００３５】
Ｌｉｎ−２８ポリペプチドは、ヒトＬｉｎ−２８、すなわち配列がGenBankアクセッション番号ＮＰ＿０７８９５０（配列番号：７）及びＮＭ＿０２４６７４（配列番号：８）で見出され得るＣ．エレガンス（C. elegans）のＬｉｎ−２８ホモログのアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｌｉｎ−２８ポリペプチド、例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿０２４６７４（配列番号：８）に提供される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％同一であるそれら、及びそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途を見出す。
【００３６】
Ｏｃｔ３／４ポリペプチドは、配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２６９２（配列番号：９）及びＮＭ＿００２７０１（配列番号：１０）で見出され得るホモ サピエンス（Homo sapiens）ＰＯＵクラス５ホメオボックス１（ＰＯＵ５Ｆ１）としても公知であるヒトＯｃｔ３／４のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｏｃｔ３／４ポリペプチド、例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿００２７０１（配列番号：１０）に提供される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％同一であるそれら、及びそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途を見出す。
【００３７】
Ｓｏｘ２ポリペプチドは、ヒトＳｏｘ２、すなわち、配列がGenBankアクセッション番号ＮＰ＿００３０９７（配列番号：１１）及びＮＭ＿００３１０６（配列番号：１２）で見出され得る性決定領域Ｙ−ボックス２タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｓｏｘ２ポリペプチド、例えばGenBankアクセッション番号ＮＭ＿００３１０６（配列番号：１２）に提供される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％同一であるそれら、及びそれらをコードする核酸は、本発明におけるリプログラミング因子としての用途を見出す。
【００３８】
非限定的にバルプロ酸、ヒドロキサム酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリドヒドロキサム酸、ＢＩＸ−０１２９４及びＢａｙＫ８６４４を含む小分子は、細胞のリプログラミングに有用と記載されている（それぞれ参照により本明細書に具体的に組み入れられるShi et al. (2008) Cell Stem Cell 6; 3(5):568-574及びHuangfu et al. (2008) Nature Biotechnology 26:795-797を参照されたい）。
【００３９】
本明細書使用の危険関連分子パターン分子としても公知の「損傷関連分子パターン分子」（ＤＡＭＰ）は、非感染性炎症応答における免疫応答を開始及び永続化できる分子である。対照的に、病原体関連分子パターン分子（ＰＡＭＰ）は、感染性病原体炎症応答を開始及び永続化する。ＤＡＭＰは、核タンパク質又はサイトソルタンパク質であり得る。組織損傷後に細胞外に放出又は細胞表面に露出されると、ＤＡＭＰは、還元環境から酸化環境に移動する場合があり、このことが、ＤＡＭＰの変性を招く可能性がある。壊死後に、腫瘍ＤＮＡは、核の外側及び細胞の外側に放出され、ＤＡＭＰになり得る。ＤＡＭＰの例は、非限定的に、ＨＭＧＢ１、ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｓ１００分子、プリン代謝物、尿酸、ナノパーティクル、アスベスト、アルミニウム塩などのアルミニウム組成物、β−アミロイド、シリカ、コレステロール結晶、ヘモゾイン、無水ピロリン酸カルシウムなどを含むことができる。特定の実施態様では、ＤＡＭＰの存在は、リプログラミング因子への曝露の結果としてリプログラミング効率を高めることができる。
【００４０】
本明細書に使用される「アルミニウム組成物」は、元素性アルミニウム、アルミニウム塩、アルミニウムイオン及び／又は別の元素と共有結合若しくはイオン結合しているアルミニウムを含有する分子を表す。一部の実施態様では、本用語は、アルミニウム塩、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム及びリン酸アルミニウムに関する。
【００４１】
「アルミニウム」は、記号Ａｌ及び原子番号１３のホウ素族化学元素である。アルミニウムは、銀白色の軟質延性金属である。アルミニウムは、地殻中で３番目に豊富な元素（酸素及びケイ素に続く）であり、最も豊富な金属である。全てのＡｌ含有鉱物及び全ての商業的に重要なアルミニウム化合物を含む大部分の化合物は、酸化状態３＋のアルミニウムを特色としている。そのような化合物の配位数は多様であるが、Ａｌ３＋は、一般的に６配位又は４配位である。アルミニウム（ＩＩＩ）のほぼ全ての化合物は無色である。アルミニウムは、その鉱物名コランダムによって知られる１種の安定な酸化物を形成する。サファイア及びルビーは、微量の他の金属が混入した不純なコランダムである。２種の水酸化酸化物ＡｌＯ（ＯＨ）は、ベーム石及びダイアスポアである。三水酸化物には３種：バイヤライト、ギブサイト、及びノルドストランダイト（nordstrandite）があり、それらは、結晶構造が異なる（多形）。大部分は、酸及び塩基を使用して多様な湿式工程により鉱石から生産される。水酸化物の加熱は、コランダムの形成に導く。
【００４２】
本明細書においてＡｌ（ＯＨ）３、ＡＴＨ、時に誤称してアルミナ水和物と呼ばれる「水酸化アルミニウム」は、自然界において鉱物ギブサイト（ヒドロアルギライト（hydrargillite）としても公知）及びその３種のより希少な多形：バイヤライト、ドイライト（doyleite）及びノルドストランダイトとして見出される。新鮮沈降した水酸化アルミニウムはゲルを形成し、これは、水精製に凝集剤としてアルミニウム塩を応用するための基礎である。このゲルは、時間と共に結晶化する。水酸化アルミニウムゲルは、脱水して（例えば、エタノールのような水混和性の非水性溶媒を使用）、酸に易溶性の非晶質水酸化アルミニウム粉末を形成することができる。慎重に制御された条件で高温に加熱された水酸化アルミニウム粉末は、活性アルミナとして公知であり、乾燥剤、吸着剤として、気体精製に、クラウス触媒の支持体として、水精製、及びSclairtech工程によるポリエチレンの製造時の触媒用吸着剤として使用される。ギブサイトは、水素結合を有する典型的な金属水酸化物の構造を有する。ギブサイトは、ヒドロキシル基の二重層から構築されており、アルミニウムイオンがその２層の間の八面体空孔の３分の２を占める。
【００４３】
水酸化アルミニウムは、最大２７０℃の温度でボーキサイトを水酸化ナトリウム中に溶解させることを含むバイヤー法によって工業的に製造され得る。赤泥である残りの固体が分離され、酸化アルミニウムが残りの溶液から沈殿される。生成した酸化アルミニウムは、水との反応を経て水酸化アルミニウムに変換させることができる。
【００４４】
「リン酸アルミニウム」（ＡｌＰＯ４）は、無水型が自然界で鉱物ベルリナイトとして見出される化学化合物である。無水リン酸アルミニウムの多数の合成型も公知である。それらは、ゼオライトに類似のフレームワーク構造をもち、一部は触媒又は分子ふるいとして使用される。水和型であるＡｌＰＯ４・１．５Ｈ２Ｏが公知である。リン酸アルミニウムゲルも市販されている。一般的に「ＡＬＰＯ」として公知の多数のリン酸アルミニウム分子ふるいがある。それらは、ＡｌＰＯ４と同じ化学組成を共有し、微孔性空洞を有するフレームワーク構造を有し、該フレームワークは、交互になったＡｌＯ４四面体とＰＯ４四面体から構成される。より密な無空洞の結晶性ＡｌＰＯ４鉱物であるベルリナイトは、同じ交互になったＡｌＯ４四面体及びＰＯ４四面体を共有する。アルミノリン酸塩フレームワーク構造は、ＡｌＯ４四面体及びＰＯ４四面体の配向が相互に様々であり、異なるサイズの空洞を形成し、この点でそれらは、荷電フレームワークを有することが異なるアルミノケイ酸ゼオライトと類似している。アルミノリン酸塩の典型的な調製は、有機アミン存在下における制御されたｐＨでのリン酸と、水酸化物の形態のアルミニウム、硝酸アルミニウム塩などのアルミニウム塩又はアルコキシドとの水熱反応を含む。これらの有機分子は、鋳型として作用する（今では、多孔質フレームワークの成長を指向するための構造指向剤と称される）。
【００４５】
「硫酸アルミニウム」は、式Ａｌ２（ＳＯ４）３を有する化学化合物である。それは水溶性であり、主に凝集剤として飲料水の精製に使用される。硫酸アルミニウムは、時にミョウバンの１種と呼ばれる。ミョウバンは、ＡＢ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏによって代表される関連化合物の一クラスである。無水型は、例えば火山環境内及び焼却中の炭鉱廃棄物処分場で見られる希少鉱物ミロセビッチ石（millosevichite）として天然に存在する。仮にあるとしても、無水塩として硫酸アルミニウムに出会うことはまれである。それは、いくつかの異なる水和物を形成し、そのうち十六水和物Ａｌ２（ＳＯ４）３・１６Ｈ２Ｏ及び十八水和物Ａｌ２（ＳＯ４）３・１８Ｈ２Ｏが最も一般的である。式を［Ａｌ（Ｈ２Ｏ）６］２（ＳＯ４）３・５Ｈ２Ｏと書くことができる十七水和物は、鉱物アルノーゲンとして天然に存在する。
【００４６】
本発明の方法に有効であるＤＡＭＰ（例えばアルミニウム組成物）の用量は、ＤＡＭＰの不在下で行われた同じ方法に比べて細胞又は細胞集団のリプログラミング効率を増加させる用量である。本明細書に使用される用語「リプログラミング」は、インビトロ又はインビボでの多能性細胞への体細胞の核リプログラミング（例えば人工多能性細胞への線維芽細胞）又は実質的に異なる体細胞への体細胞（例えば内皮細胞への線維芽細胞）の核リプログラミングを意味する。後者の過程は、分化転換としても公知である。
【００４７】
特定の実施態様では、リプログラミングされる予定の細胞は、細胞培地１mlあたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００ナノグラム、マイクログラム、ミリグラム又はグラムの約又は少なくとも又は正確に１、１０、１０２又は１０３倍の濃度を有する、アルミニウム組成物などのＤＡＭＰの濃度に曝露される。別の実施態様では、細胞は、リプログラミング因子への体細胞の曝露の前、後又は途中に、そのような濃度に、約又は少なくとも又は正確に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４分、時間又は日間曝露される。
【００４８】
用語「リプログラミング効率」は、細胞がリプログラミング因子と接触されたときにｉＰＳ細胞のコロニーを生じる能力を表すために使用され得る。多能性へとリプログラミングする効率の増強を示す体細胞は、リプログラミング因子と接触されたときに、対照よりも高いｉＰＳＣ生成能力を示す。用語「リプログラミング効率」は、体細胞が、実質的に異なる体細胞型にリプログラミングされる能力も表し得る。これは、分化転換として公知の過程である。本発明の方法を用いたリプログラミング効率は、体細胞の特定の組み合わせ、リプログラミング因子を導入する方法、及びリプログラミング誘導後の培養方法により変動する。
【００４９】
特定の実施態様では、ＤＡＭＰの存在は、同じリプログラミング方法であるがＤＡＭＰを欠如する方法（すなわち対照）に比べて、１）１つ以上の主要多能性マーカーの発現レベル；又は２）形成されたｉＰＳＣ数のそれぞれにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントの約又は少なくとも又は正確に１、１０、１０２又は１０３倍の増加を招く。
【００５０】
インビトロで多能性を誘導する方法
体細胞の出発集団は、有効用量のＤＡＭＰを用いた体細胞の活性化の前、同時又は後に、細胞を多能性へとリプログラミングするために十分な組み合わせ及び量の上記と同義のリプログラミング因子と接触させられる。本発明の一実施態様では、アルミニウム組成物は水酸化アルミニウムである。リプログラミング因子は、個別に又は単一組成物として、すなわちリプログラミング因子の予混合組成物として体細胞に提供され得る。別の実施態様では、体細胞の出発集団は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核細胞、又は線維芽細胞である。
【００５１】
一部の実施態様では、細胞の出発集団は、有効用量のＤＡＭＰと約１〜約１８日間、例えば約１〜約５日間接触させられ、それは約２〜３日であり得る。
【００５２】
リプログラミング因子を、対象細胞に同時に又は異なる時間に順次に添加してもよく、ＤＡＭＰと組み合わせて添加してもよい。一部の実施態様では、少なくとも３種の精製リプログラミング因子のセット、例えばＯｃｔ３／４ポリペプチド、Ｓｏｘ２ポリペプチド、及びＫｌｆ４、ｃ−ｍｙｃ、ｎａｎｏｇ又はｌｉｎ２８ポリペプチドが添加される。一部の実施態様では、４種の精製リプログラミング因子のセット、例えばＯｃｔ３／４ポリペプチド、Ｓｏｘ２ポリペプチド、Ｋｌｆ４ポリペプチド及びｃ−Ｍｙｃポリペプチド；又はＯｃｔ３／４ポリペプチド、Ｓｏｘ２ポリペプチド、ｌｉｎ２８ポリペプチド及びｎａｎｏｇポリペプチドが細胞に提供される。
【００５３】
体細胞にリプログラミング因子を導入するための方法は、細胞に精製タンパク質性因子又はそれらをコードする核酸を提供することを含む。一部の実施態様では、リプログラミング因子は、ポリペプチド透過性ドメインに融合されたリプログラミング因子のポリペプチド配列を含む。いくつかの透過性ドメインは、当技術分野において公知であり、ペプチド、ペプチド模倣体、及び非ペプチド性担体を含む、本発明の核作用性非組み込みポリペプチドに使用され得る。例えば、透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号：１３）を含む、ペネトラチンと呼ばれるドロソフィラ メラノガスター（Drosophila melanogaster）転写因子アンテナペディア第３αヘリックス由来であってもよい。別の例として、透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｔａｔの塩基性領域アミノ酸配列を含み、その配列は、例えば天然ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７番を含み得る。他の透過性ドメインは、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６番領域、ノナ−アルギニン（配列番号：１４）、オクタ−アルギニン（配列番号：１５）などを含む。（例えば、トランスロケーションペプチド及びペプトイドの教示のために参照により本明細書に具体的に組み入れられるFutaki et al. (2003) Curr Protein Pept Sci. 2003 April; 4(2): 87-96；及びWender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 2000 Nov. 21; 97(24):13003-8；米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号；同第２００３００８３２５６号；同第２００３００３２５９３号；及び同第２００３００２２８３１号を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）（配列番号：１４）配列は、特徴付けられた、より効率的なＰＴＤの１つである（Wender et al. 2000; Uemura et al. 2002）。
【００５４】
そのような実施態様では、細胞は、精製リプログラミング因子の存在下で約３０分〜約７２時間、例えば２時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、又は約３０分〜約７２時間の任意の他の期間インキュベートされる。典型的には、リプログラミング因子は、対象細胞に４回提供され、その細胞は、リプログラミング因子と共に４８時間インキュベートされ、その後、培地が新鮮培地と交換され、細胞がさらに培養される（例えば、Zhou et al. (2009) Cell Stem Cells 4(5); 381-384を参照されたい）。リプログラミング因子は、対象細胞に約１〜約４週間、例えば約２〜約３週間提供され得る。
【００５５】
リプログラミング因子の用量は、細胞の性質、因子、培養条件などと共に変動する。一部の実施態様では、用量は、各因子に対して約１nM〜約１μM、より通常には約１０nM〜約５００nM、又はおよそ約１００〜２００nMである。一部の実施態様では、細胞は、リプログラミング因子に少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約４日、少なくとも約６日又は１週間曝露される間に最初にアルミニウム組成物に曝露され、全リプログラミング過程又はそれ未満にわたり曝露され得る。用量は、特定のＤＡＭＰに依存するが、約１ng/ml〜約１μg/ml、約１０ng/ml〜約５００ng/mlであり得る。組み換え因子と共の２回の１６〜２４時間のインキュベーションが各供給に後続する場合があり、その後に培地が新鮮培地と交換され、細胞がさらに培養される。
【００５６】
一部の実施態様では、体細胞ゲノムに非組み込み型のベクターが使用される。標的哺乳類細胞に外来遺伝子を導入するために有用な多数のベクターが入手可能である。ベクターは、エピソームに、例えばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来ベクターとして維持され得る。リプログラミング因子を核酸として対象細胞に提供するために使用されるベクターは、典型的には、リプログラミング因子の核酸の転写活性化である発現を推進するために適切なプロモーターを含む。これは、遍在作用性プロモーター、例えばＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、又は誘導性プロモーター、例えば特定の細胞集団において活性な又はテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターを含み得る。転写活性化によって、標的細胞において転写が基礎レベルの少なくとも又は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１００又は１０００倍に増加することが意図される。
【００５７】
リプログラミング因子の導入後に、体細胞を、支持細胞層を含む従来培地中で維持してもよく、又は支持層の不在下で、すなわち多能性に誘導される予定の体細胞以外の体細胞を欠如して培養され得る。無支持層培養は、タンパク質をコーティングした表面、例えばmatrigelなどを利用してもよい。体細胞を、懸濁状態で維持しても、又はマイクロキャリアに接着させてもよい。
【００５８】
本発明の方法によってｉＰＳＣになるように誘導されたｉＰＳＣは、大きいな核−細胞質比、明確な境界及び隆起した核を有する扁平コロニーとして成長しているｈＥＳＣ様形態を有し得る。加えて、ｉＰＳＣは、非限定的にアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２を含む、当業者に公知の１つ以上の主要多能性マーカーを発現し得る。加えて、ｉＰＳＣは、奇形腫を形成する能力がある。加えて、ｉＰＳＣは、生きた生物において外胚葉、中胚葉、又は内胚葉組織を形成する、又はそれに貢献する能力がある。
【００５９】
多様な目的で、例えば機能欠失型変異を有する遺伝子を置換するため、マーカー遺伝子を提供するためなどに、体細胞又はそれから得られたｉＰＳＣに遺伝子が導入され得る。あるいは、アンチセンスｍＲＮＡ又はリボザイムを発現するベクターが導入されることによって、望まれない遺伝子の発現が遮断される。遺伝子療法の他の方法は、正常な前駆細胞が有利になるようにし、そして選択圧を受けられるようにする薬物耐性遺伝子、例えば多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）又はｂｃｌ−２などの抗アポトーシス遺伝子の導入である。標的細胞に核酸を導入するために、当技術分野において公知の様々な技法、例えば上述のエレクトロポレーション、カルシウム沈殿ＤＮＡ、融合、トランスフェクション、リポフェクション、感染などが使用され得る。ＤＮＡが導入される特定の方法は、本発明の実施に重要ではない。
【００６０】
上記方法によって生成されたｉＰＳＣは、分化途中の細胞又は分化した細胞をレシピエントにおいて再構成又は補充するために使用され得る。誘導された細胞は、様々な系譜の細胞型に分化し得る。分化した細胞の例は、外胚葉（例えばニューロン及び線維芽細胞）、中胚葉（例えば心筋細胞）、又は内胚葉（例えば膵臓細胞）系譜からの任意の分化した細胞を含む。分化した細胞は、膵β細胞、神経幹細胞、ニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆細胞、肝細胞、肝幹細胞、アストロサイト、筋細胞、造血細胞、又は心筋細胞の１つ以上であり得る。
【００６１】
誘導された細胞をより専門化された細胞型に分化させる数多くの方法がある。誘導された細胞を分化させる方法は、幹細胞、特にＥＳ細胞、ＭＳＣ、ＭＡＰＣ、ＭＩＡＭＩ、造血幹細胞（ＨＳＣ）を分化させるために使用される方法に類似する場合がある。場合により、分化はエクスビボで起こり；場合により、分化はインビボで起こる。
【００６２】
誘導された細胞、又は誘導された細胞から分化した細胞は、疾患（例えば遺伝的欠陥）を処置するための治療法として使用され得る。治療法は、疾患の原因を処置することに向けられる場合があり；又はその代わりに、治療法は、疾患若しくは状態の影響を処置するためであり得る。誘導された細胞は、対象における傷害部位若しくはその近くに移植される場合があり；又は細胞を傷害部位に遊走若しくは誘導させるように対象に細胞を導入することができる。移植された細胞は、損傷細胞又は傷害細胞を有利に置換してもよく、対象の全体的な状態を改善させてもよい。場合によっては、移植された細胞は、組織の再生又は修復を刺激し得る。
【００６３】
移植された細胞は、誘導された細胞から分化した細胞であり得る。移植された細胞は、また、誘導された細胞から分化したマルチポテント幹細胞であり得る。場合によっては、移植された細胞は、分化していない、誘導された細胞であり得る。
【００６４】
対象への処置の施行数は、変動し得る。誘導された細胞及び／又は分化した細胞の対象への導入は、１回限りの事象であり得るが、ある状況では、そのような処置は、限られた期間に改善を誘発し、持続的な一連の反復処置を必要とし得る。他の状況では、効果が観察される前に、細胞の複数回の施行が必要とされ得る。正確なプロトコールは、処置される予定の個別の対象の疾患又は状態、病期及びパラメーターに依存する。
【００６５】
細胞は、以下の任意の経路：非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、又は髄液内により対象に導入され得る。
【００６６】
ｉＰＳＣは、任意の生理学的に許容し得る培地に入れて投与され得る。それらは、単独で、又は例えばそれらが移植される予定の組織中でのそれらの成長及び／又は器質化を支持するために、適切な支持体若しくはマトリックスと共に提供され得る。通常、少なくとも細胞１×１０５個、好ましくは１×１０６個以上が投与される。細胞を、注射、カテーテルなどによって導入してもよい。細胞を、解凍して使用できるように、液体窒素の温度で凍結させ、長期間保存してもよい。凍結される場合、細胞は、通常、１０％ ＤＭＳＯ、５０％ ＦＣＳ、４０％ ＲＰＭＩ １６４０培地中で保存される。解凍後、前駆細胞の増殖及び分化に関連する成長因子及び／又は間質細胞の使用によって細胞を増大させてもよい。
【００６７】
アルミニウム組成物などのＤＡＭＰの有効用量を含むキットが提供され得る。一部の実施態様では、アルミニウム組成物は水酸化アルミニウムである。キットは、さらに、例えば透過性ドメインに融合したタンパク質の形態で、１つ以上のリプログラミング因子を含み得る。
【００６８】
「処置すること」又は「処置」は、本明細書において障害、障害の症状、障害に二次的な病状、又は障害の素因を治癒、緩和、軽減、治療、予防、又は改善することを目的とする、対象への物質の投与と呼ばれる。「有効量」は、処置された対象において本明細書に詳述された医学的に望ましい結果を生むことができる物質の量である。医学的に望ましい結果は、客観的（すなわち一部の検査若しくはマーカーによって測定可能）又は主観的（すなわち、対象が効果の徴候を示す又は効果を感じる）であり得る。
【００６９】
本明細書において言及される「幹細胞療法を用いた処置が容易な疾患」は、ｉＰＳＣなどの幹細胞の投与によって処置できる任意の進行、状態、障害、不快及び／又は病気を意味する。そのような疾患は、非限定的に、骨髄、皮膚、心臓、及び角膜の移植、移植片対宿主病、肝不全及び腎不全、肺傷害、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、ループス及び糖尿病などの自己免疫病の処置；同種移植片拒絶、神経障害及び心臓血管医学の予防；並びに急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨髄機能不全症候群、無巨核球性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症（重症）、先天性赤血球形成異常性貧血、周期性好中球減少症、ダイヤモンド−ブラックファン貧血、エヴァンス症候群、ファンコニー貧血、グランツマン病、若年性皮膚筋炎、コストマン症候群、赤血球無形成、シュワッハマン症候群、重症再生不良性貧血、先天性鉄芽球性貧血、血小板減少−橈骨欠損（ＴＡＲ症候群）、先天性角化異常症、血液障害、鎌状赤血球貧血（ヘモグロビンＳＳ）、ＨｂＳＣ疾患、鎌状βｏサラセミア、重症型α−サラセミア（胎児水腫）、重症型β−サラセミア（クーリー貧血）、中等症β−サラセミア、Ｅ−βｏサラセミア、Ｅ−β＋サラセミア、代謝障害、副腎白質ジストロフィー、ゴーシェ病（乳児）、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病（グロボイド細胞型白質ジストロフィー）、ギュンター病、ヘルマンスキー−パドラック症候群、ハーラー症候群、ハーラー−シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群、マロトー−ラミー症候群、ムコリピドーシスＩＩ、ＩＩＩ型、α−マンノシドーシス、ニーマン−ピック症候群Ａ及びＢ型、サンドホフ症候群、テイ−サックス病、バッテン病（遺伝性神経セロイドリポフスチン症）、レッシュ−ナイハン病、免疫不全症、毛細血管拡張性運動失調症、慢性肉芽腫症、ディジョージ症候群、ＩＫＫγ欠乏症、免疫調節異常性多腺性内分泌不全症、Ｘ連鎖型ムコリピドーシスＩＩ型、ミエロカテキシス（Myelokathexis）Ｘ連鎖型免疫不全症、重症複合免疫不全症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖型無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖型リンパ球増殖性疾患、オーメン症候群、細網異形成症、胸腺異形成症、白血球接着不全症、他の大理石骨病、ランゲルハンス細胞組織球症、血球貪食性リンパ組織球症、急性及び慢性腎疾患、アルツハイマー病、アンチエイジング、関節炎、喘息、心臓幹細胞療法、脳梗塞（卒中）、脳性麻痺（卒中）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、うっ血性心不全、糖尿病（Ｉ及びＩＩ型）、線維筋痛症、免疫不全症、虚血性心疾患、ループス、多発性硬化症、心筋梗塞、変形性関節症、骨粗鬆症、パーキンソン病、末梢動脈疾患、関節リウマチ、形成外科、外傷性脳損傷及び神経疾患における幹細胞療法を含む。
【００７０】
本明細書に使用される「患者」は、幹細胞療法が容易な疾患、例えば心血管疾患と診断された、又はその疾患を有する若しくは発症すると疑われる哺乳類対象を表す。例示的な患者は、幹細胞療法から利益を得ることができるヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類及び他の哺乳類であり得る。
【００７１】
「投与すること」は、本明細書において本発明のｉＰＳＣを患者に提供することと呼ばれる。例示的及び非限定的に、組成物の投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、又は筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって行われ得る。１つ以上のそのような経路が、採用され得る。非経口投与は、例えば、ボーラス注射又は経時的な緩徐灌流によることができる。代替的又は同時に、投与は、経口経路により得る。追加的に、投与は、細胞のボーラス若しくはペレットの外科的沈着、又は細胞を負荷した医療機器、例えばステントの留置にもより得る。好ましくは、本発明の組成物は、疾患部位に、例えば病変部位（例えば、血管狭窄症／血管閉塞、壊死組織又は壊疽性感染部位）又はその近く（例えば、病変部位から約又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０ミリメートル）に投与される。
【００７２】
「それを必要とする患者」は、本明細書において幹細胞療法が容易な疾患と診断された、又はそれを有する疑いがある患者と呼ばれる。
【００７３】
実施例
無支持細胞条件でエピソームプラスミド及び水酸化アルミニウムを用いたヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞又は末梢血単核細胞のリプログラミング。
【００７４】
本手順により、エピソームプラスミド、Lonza 4D-Nucleofector（商標）システム、Lonza #7 ＰＳＣ培地及びヒトビトロネクチンマトリックスを使用してヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞又はＰＢＭＣをリプログラミングすることによってヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が生成する。
【００７５】
使用される材料は、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（Lonza, Cat No. 2C-101）又はヒト末梢血単核細胞（Lonza, Cat No. CC-2702）；無血清基礎培地、５０％ ＩＭＤＭ（Invitrogen Cat No. 12440-053)、５０％ ＨａｍのＦ１２（Invitrogen Cat No. 11765054）、１×化学的に明確な脂質濃縮物（Invitrogen Cat No. 11905-031）、１×インスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ（ＩＴＳ−Ｘ）（Invitrogen Cat No. 51500）、５０μg/mL アスコルビン酸（Sigma-Aldrich Cat No. 49752）、５mg/mL ウシアルブミン画分Ｖ溶液（Invitrogen Cat No. 15260-037）、２mM GlutaMax（商標）-I（Invitrogen Cat No. 35050）並びに１００ng/mL 組み換えヒトＳＣＦ（Peprotech Cat No. AF-300-07）、１００ng/mL 組み換えヒトＦｌｔ３−リガンド（Peprotech Cat No. AF-300-19）、２０ng/mL 組み換えヒトＴＰＯ（Peprotech Cat No. 300-18）、及び１０ng/mL組み換えヒトＩＬ−３（Peprotech Cat No. 200-03）を含む臍帯血特異的成長因子並びにＰＢＭＣ特異的成長因子、例えば２００μM １−チオグリセロール（Sigma #M6145）、１００μg/mL ホロ−トランスフェリン（R&D Systems #2914-HT）、１μM デキサメタゾン（Sigma #D1756）、１００ng/mL（PeproTech #300-07）、２U/mL ＥＰＯ（R&D Systems #287-TC-500）、１０ng/mL ＩＬ−３（PeproTech #200-03）、及びまた４０ng/mL ＩＧＦ−１（Peprotech #100-11）を含有する血液細胞培地を含む。ｃＧＭＰ−グレードｐＥＢ−Ｃ５及びｐＥＢ−Ｔｇプラスミド；又はｐＣＥ−ＯＣＴ３／４、ｐＣＥ−ｈＳＫ、ｐＣＥ−ｈＵＬ、ｐＣＥ−ｐ５３ｍＤＤ、ｐＣＥ−ＥＢＮＡ１、アルハイドロゲル（Alhydrogel）２％（Invitrogen vac-alu-50）、Lonza #7多能性幹細胞（ＰＳＣ）培地、０．４％トリパンブルー溶液（Invitrogen cat No 15250061）、１×ＤＰＢＳ（Lonza Cat No. 17-512F）、１×ＤＰＢＳ＋＋（Lonza cat No 17-513F）及びP3 Primary Cell 4D-Nucleofector（商標）XキットL（Lonza Cat No. V4XP-3012）も使用される。
【００７６】
使用される装置は、Lonza 4D-Nucleofector（商標）システム（Lonza Cat No. AAF-1001B、AAF-1001X）、５％ ＣＯ２±２％、３．８％ Ｏ２を有する３７℃±２℃の加湿インキュベーター、バイオハザード用ゴミ箱、組織培養フード、血球計数器、顕微鏡、３７℃の水浴、１５mLチューブ用ローターを備える２００×ｇが可能な遠心分離機、Costar Stripette紙包装ディスポーザブルポリスチレン血清ピペット１０mL（Thermofisher Cat No. 07-200-574）、Costar Stripette紙包装ディスポーザブルポリスチレン血清ピペット１０mL（Thermofisher Cat No. 07-200-573）、Drummond Portable Pipet-Aid Filler/Dispenser XP（Thermofisher Cat No. 13-681-15E）、無菌Costarマイクロ遠心チューブＲＮａｓｅフリー証明済み１．７mLナチュラル（ThermoFisher Cat No. 07-200-534）、無菌１０００uLフィルターマイクロピペットチップ（Rainin Cat No. RT-1000F）、無菌２００μLフィルターマイクロピペットチップ（Rainin Cat No. RT-200F）、無菌２０μLフィルターマイクロピペットチップ（Rainin Cat No. RT-20F）、無菌１０μLフィルターマイクロピペットチップ（Rainin Cat No. RT-10GF）、Pipet-Lite XLS １０００μLマイクロピペット（Rainin Cat No. SL-STARTXLS）、Pipet-Lite XLS ２００μLマイクロピペット（Rainin Cat No. SL-STARTXLS）、Pipet-Lite XLS ２０μLマイクロピペット（Rainin Cat No. SL-STARTXLS）、RFID ０．１〜２μLマイクロピペット付きPipet-Lite XLS（Rainin Cat No. SL-2XLS）、Corning １２ウェル組織培養プレート（Corning Cat No. 3513）、６ウェル組織培養プレート（ThermoFisher Cat No. 08-772-1B）、Falcon １５mL尖形遠心チューブ（ThermoFisher Cat No. 14-959-70C）を含む。
【００７７】
０日目の手順は、以下の細胞ヌクレオフェクション（Cell Nucleofection）を含む：組織培養プレートに濃度１０μg/mLのビトロネクチン１mLをコーティングする（９．６cm2/ウェル）。コーティングを１時間インキュベートさせる。ボルテックス撹拌することによってアルハイドロゲルが均一に懸濁していることを確実にする。アルハイドロゲルとＳＦＭを、ＳＦＭ １mLに対して３μLの割合で混合する。各トランスフェクション試料に対して、６ウェルプレートのウェル１個にＳＦＭ ２mLを移す。３７℃の加湿インキュベーター中にプレートを入れ、培地を予備加温する。Falcon製１５mL尖形チューブ内にヒト血液細胞を収集する。細胞懸濁物を１０μL採取し、トリパンブルー１０μLとよく混合する。血球計数器を使用して、顕微鏡下で生存細胞を計数する。各トランスフェクション試料について、新しい１５mLチューブ内に生存細胞１０６個を入れ、２００ｇで５分間遠心分離する。上清を除去する。ドライアイス上で細胞を急速に凍結させ、将来的なＳＴＲ分析のために−８０℃で保存する。P3 Primary Cell 4D-Nucleofector（商標）XキットLからのＰ３溶液８２μLと補充液１８μLとを無菌マイクロ遠心チューブ中で混合する。ｐＥＢ−Ｃ５：ｐＥＢ−Ｔｇ又はｐＣＥ−ＯＣＴ３／４：ｐＣＥ−ｈＳＫ：ｐＣＥ−ｈＵＬ：ｐＣＥ−ｐ５３ｍＤＤ：ｐＣＥ−ＥＢＮＡ１プラスミドを、それぞれ８：２又は０．６３：０．６３：０．６３：０．６３：０．５μgの比で添加し、十分に混合する。細胞を、前もって調製した予混合Nucleofection（商標）溶液で再懸濁する。マイクロピペットを用いて十分に混合し、Nucleofection（商標）キュベット（キットに付属）に移す。プログラムEO-100を使用する4D-Nucleofector（商標）を使用して細胞をヌクレオフェクションする。ヌクレオフェクション後に、組織培養フード内でマイクロピペットを使用して予備加温ＳＦＭ ０．５mLを採取し、キュベット中に添加する。次に、Nucleofection（商標）キットに付属の移行ピペットを使用して、６ウェルプレートのウェル１個中の予備加温ＳＦＭに細胞を移す。プレートを加湿インキュベーター内に入れる。
【００７８】
２日目の手順は以下の通りである：２５０μg/mL ビトロネクチン４０μLを１×ＤＰＢＳ＋＋ １mL中に希釈し、６ウェルプレートのウェル１個に添加する。インキュベーター内でプレートを３時間コーティングする。ヌクレオフェクションされたＣＤ３４＋細胞を１５mLチューブ１本の中に移し、細胞を２００ｇで５分間遠心分離する。培地を除去し、細胞をLonza #7培地２mL中に再懸濁する。１０uM Ａ８３０１ ０．２uLを細胞懸濁物中に添加する（終濃度１μM）。ウェルからビトロネクチンを吸引し、その中に細胞を蒔く。プレートをインキュベーター内に入れる。
【００７９】
２及び４日目の手順は以下の段階を含む：ウェルの体積が５mLを超えるまで、Ｌ７ １．５mLを隔日で添加する。
【００８０】
６日目の手順は以下の通りである：ウェルの体積が６mLを超えたとき、上清を吸引して体積約１mLの培地を残す。ウェルの底を覆っている細胞を乱さないように静かに培養物を取り扱う。Lonza #7 ＰＳＣ １．５mLを添加する。
【００８１】
およそ１４日目から１８日目にコロニーが出現するまで２、４及び６日目の手順を繰り返す。
【００８２】
１６日目に、２４ウェルのビトロネクチンコーティング済みプレートを調製する。
【００８３】
１８〜２０日目の手順は、以下のコロニー釣り上げ段階を含む：１２ウェルプレートからビトロネクチンコーティングを吸引する。空のウェルに、Ｌ７培地２５０μLを添加する。位相差顕微鏡下で、釣り上げるためのコロニーを形態に基づきマークする。一度に１個のコロニーで以下の段階を行う。解剖顕微鏡下で、マイクロピペットのチップを用いてコロニーをウェルの表面から剥がす。コロニーをマイクロピペットのチップ内に体積およそ３０μL吸い込む。コロニーを２４ウェルプレートに移す。コロニーが収集された後に、２４ウェルプレートを５％ ＣＯ２、２０％ Ｏ２、３７℃の加湿インキュベーター内に入れる。
【００８４】
特に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語、科学用語及び任意の頭字語は、本発明の技術分野における当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は等価の任意の組成物、方法、キット、及び情報通信用手段を、本発明の実施のために使用することができるものの、好ましい組成物、方法、キット、及び情報通信用手段が、本明細書に記載されている。
【００８５】
本明細書に引用された全ての参考文献は、法律によって許される最大限まで参照により本明細書に組み入れられる。それらの参考文献の記述は、それらの著者によってなされた主張を単に要約することが意図される。任意の参考文献（又は任意の参考文献の一部）が関連する先行技術であるという承認はされていない。出願人は、任意の引用された参考文献の正確さ及び妥当性に異議申し立てする権利を留保する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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