(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアポリプレックスと、その上のシリカコーティングとを含むナノ粒子であって；
前記コアポリプレックスが、１種以上のアニオン性ポリマー、１種以上のカチオン性ポリマー、カチオン性ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
を含み、
前記の１種以上のアニオン性ポリマーが、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、多糖、ポリ（マンヌロン酸）、ポリ（グルロン酸）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、アグリカン、およびその２種以上の任意の組み合わせからなる群から選択され；そして、
前記の１種以上のカチオン性ポリマーが、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アスパルタミド）、カチオン性ポリペプトイド、電荷官能化ポリエステル、カチオン性多糖、アセチル化アミノ糖、キトサン、およびその２種以上の任意の組み合わせからなる群から選択される、前記ナノ粒子。
【請求項２】
前記アニオン性ポリマーが、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記カチオン性ポリマーが、ポリ（エチレンイミン）およびポリ（Ｌ−アルギニン）からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記カチオン性ポリペプチドが、ヒストンテールペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ヒストンテールペプチドが、ヒトＨ３ヒストンテールペプチドである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記アニオン性ポリマーが、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）であり、前記カチオン性ポリマーが、ポリ（エチレンイミン）およびポリ（Ｌ−アルギニン）からなる群から選択され、前記カチオン性ポリペプチドが、ヒストンテールペプチドである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮである、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ＴＡＬＥＮがＤＮＡの部位特異的遺伝子座で破壊を誘導することができ、前記破壊が、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化をもたらす、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記変化が、低下であり、前記遺伝子が、スクレロスチンタンパク質をコードする、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記シリカコーティングの外表面と結合したポリマーをさらに含む、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記シリカコーティングの外表面と結合した前記ポリマーが、ポリ（Ｌ−アルギニン）または血管作動性内皮増殖因子ペプチドを含む、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
細胞内ポリヌクレオチドの修飾において使用するための、請求項１に記載のナノ粒子であって、
前記ポリヌクレオチドが、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、前記ナノ粒子。
【請求項１４】
前記アニオン性ポリマーが、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）である、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
前記カチオン性ポリマーが、ポリ（エチレンイミン）およびポリ（Ｌ−アルギニン）からなる群から選択される、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記カチオン性ポリペプチドが、ヒストンテールペプチドである、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
前記ヒストンテールペプチドが、ヒトＨ３ヒストンテールペプチドである、請求項１６に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
前記アニオン性ポリマーが、ポリ（Ｄ−グルタミン酸）であり、前記カチオン性ポリマーがポリ（エチレンイミン）およびポリ（Ｌ−アルギニン）からなる群から選択され、前記カチオン性ポリペプチドがヒストンテールペプチドである、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼが、ＴＡＬＥＮである、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
前記ＴＡＬＥＮが、ＤＮＡの部位特異的遺伝子座で破壊を誘導することができ、前記破壊が遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化をもたらす、請求項１９に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
前記変化が、低下であり、前記遺伝子がスクレロスチンタンパク質をコードする、請求項２０に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記シリカコーティングが、前記シリカコーティングの外表面と結合したポリマーをさらに含む、請求項１８に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記シリカコーティングの外表面と結合した前記ポリマーが、ポリ（Ｌ−アルギニン）または血管作動性内皮増殖因子ペプチドを含む、請求項２２に記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条の下で、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年９月２３日出願の米国仮特許出願第６１／８８１０７２号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
≪政府権利の陳述≫
本発明は、国立衛生研究所によって拠出されたＲ０１  ＡＧ０３０６３７の下で米国政府支援によりなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【発明の背景】
【０００３】
≪技術分野≫
本発明は、概して細胞をトランスフェクトするためのナノ粒子の使用に関する。より具体的には、本発明は、遺伝子発現を修飾するためのポリヌクレオチドの細胞内送達のためのポリプレックスコアでコーティングしたナノ粒子に関する。
【０００４】
≪背景技術≫
ポリヌクレオチドを細胞に導入して遺伝子発現を変化させることは、ポリヌクレオチドを適当にパッケージングしてポリヌクレオチドを細胞移入前の分解から保護し、細胞への移入を可能にし、適当な細胞内区画への送達を指示することを要する。発現を変化させることにおける有効性はまた、細胞移入後にポリヌクレオチドをパッケージングから放出する時間枠にも依存する可能性がある。遺伝子発現を修飾するために利用可能なナノ粒子ベースの技術は、少なくとも一部は前記要件を満たすことの限界のために、低レベルの細胞トランスフェクションおよびトランスフェクションの限られた有効性に悩まされている。そのため、これらの要件の全てに対処して有効性を増強させるナノ粒子ベースのトランスフェクション剤およびその使用方法を得ることが望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、ナノ粒子の提供を通して、先行技術の欠点が克服され、さらなる利点が提供される。ナノ粒子は、コアポリプレックスと、コアポリプレックス上のシリカコーティングとを含み、ポリプレックスはアニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、カチオン性ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ナノ粒子がシリカコーティングの外表面と結合したポリマーも含むことができる。
【０００６】
細胞内ポリヌクレオチドを修飾する方法も提供される。本方法は、細胞を、コアポリプレックスと、コアポリプレックス上のシリカコーティングとを含むナノ粒子と接触させるステップを含み、ポリプレックスはアニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、カチオン性ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む。別の態様では、ナノ粒子がシリカコーティングの外表面と結合したポリマーも含むことができる。
【０００７】
さらなる特徴および利点は、本発明の技術を通して理解される。本発明のこれらのおよび他の目的、特徴および利点は、添付の図面と合わせた本発明の種々の態様の以下の詳細な説明から明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明の１つまたは複数の態様は、明細書の結びの特許請求の範囲で例として具体的に指摘され、明確に請求される。本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付の図面と合わせた以下の詳細な説明から明らかになる。
【０００９】
【図１Ａ】本発明の態様によるナノ粒子およびその成分のいくつかの実施形態の図表示である。
【図１Ｂ】本発明の態様によるナノ粒子およびその成分のいくつかの実施形態の図表示である。
【００１０】
【図２Ａ】本発明の態様によりどのようにナノ粒子を製造することができるかの図表示である。
【００１１】
【図２Ｂ】本発明の態様による、細胞がナノ粒子を取り込み、細胞内でプロセシングすることができる手段の図表示である。
【００１２】
【図３】本発明の態様による、異なる比の種々の帯電ポリマーとポリヌクレオチドを含めることのポリプレックス複合体形成に対する効果を示すグラフである。
【００１３】
【図４】本発明の態様による、ポリプレックス中にアニオン性ポリマーを含むまたは含まない、異なる比の種々の帯電ポリマーとポリヌクレオチドを含めることのポリプレックス複合体形成に対する効果を示すグラフである。
【００１４】
【図５】本発明の態様による、カチオン性ポリペプチドの存在または非存在下で、アニオン性ポリマーの量を増加させることを含めることのポリプレックスに対する不安定化効果を示すグラフである。
【００１５】
【図６】本発明の態様による種々の層を有するナノ粒子の大きさを示すグラフである。
【００１６】
【図７】本発明の態様による、トランスフェクション後のナノ粒子の細胞取り込みおよび細胞内局在を示す種々のナノ粒子でトランスフェクトした細胞の顕微鏡写真である。
【００１７】
【図８】本発明の態様による、トランスフェクション後の細胞内のナノ粒子の滞留期間を示すナノ粒子でトランスフェクトした細胞の顕微鏡写真である。
【００１８】
【図９Ａ】本発明の態様による、ポリプレックスのシリカコーティングの外側と結合したポリマーの層を有するナノ粒子の細胞取り込みを示す顕微鏡写真である。
【図９Ｂ】本発明の態様による、ポリプレックスのシリカコーティングの外側と結合したポリマーの層を有するナノ粒子の細胞取り込みを示す顕微鏡写真である。
【００１９】
【図１０】本発明の態様による、スクレロスチンの発現のノックダウンを引き起こすナノ粒子に含まれる核酸によってコードされるＴＡＬＥＮペプチドの図表示である。
【００２０】
【図１１Ａ】本発明の態様による、スクレロスチンおよびβ−カテニン発現に対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】本発明の態様による、スクレロスチンおよびβ−カテニン発現に対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１１Ｃ】本発明の態様による、スクレロスチンおよびβ−カテニン発現に対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【００２１】
【図１２Ａ】本発明の態様による、種々の細胞シグナル伝達ペプチドの発現レベルに対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】本発明の態様による、種々の細胞シグナル伝達ペプチドの発現レベルに対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１２Ｃ】本発明の態様による、種々の細胞シグナル伝達ペプチドの発現レベルに対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１２Ｄ】本発明の態様による、種々の細胞シグナル伝達ペプチドの発現レベルに対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１２Ｅ】本発明の態様による、種々の細胞シグナル伝達ペプチドの発現レベルに対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【図１２Ｆ】本発明の態様による、種々の細胞シグナル伝達ペプチドの発現レベルに対する、スクレロスチン発現を標的化する異なる量のナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示すグラフである。
【００２２】
【図１３】本発明の態様による、スクレロスチン媒介シグナル伝達によってその活性が阻害される転写因子に応答性のコトランスフェクトしたレポーター遺伝子の発現に対する、スクレロスチン発現を標的化するナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示す顕微鏡写真である。
【００２３】
【図１４Ａ】本発明の態様による、石灰化に対する、スクレロスチン発現を標的化するナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示す顕微鏡写真である。
【図１４Ｂ】本発明の態様による、石灰化に対する、スクレロスチン発現を標的化するナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示す顕微鏡写真である。
【図１４Ｃ】本発明の態様による、石灰化に対する、スクレロスチン発現を標的化するナノ粒子で細胞をトランスフェクトする効果を示す顕微鏡写真である。
【発明の詳細な説明】
【００２４】
本発明の態様ならびにその一定の特徴、利点および詳細を、添付の図面に示される非限定的な実施形態を参照して以下でさらに十分に説明する。本発明を詳細に不必要に不明瞭にしないために、周知の材料、製作ツール、処理技術等の説明を省略する。しかしながら、詳細な説明および具体的な実施例が、本発明の実施形態を示しながら、単なる例示として示され、限定として示されるわけではないことを理解すべきである。基礎をなす発明の概念の精神および／または範囲内の種々の置換、修正、付加および／または配置が、本開示から当業者に明らかになるだろう。
【００２５】
本開示は、一部は、遺伝子発現を修飾するための剤で細胞をトランスフェクトするための多層ナノ粒子を提供する。改善した血清安定性、特異的細胞型への標的化送達、より大きな核特異性および区画特異的アンパッケージング、内部移行の初期段階中の有意なペイロードレベルを保持する改善した能力、および内部移行後の種々の持続期間ペイロードの放出を維持する能力のために設計されたナノ粒子、およびその使用方法が提供される。
【００２６】
一態様では、アニオン性ポリマーの存在下でカチオン性ポリマーとポリヌクレオチドの縮合によって作製されたポリヌクレオチドとポリマーの複合体、すなわちポリプレックスが、ポリヌクレオチド−カチオン性ポリマー結合体に対して増加したトランスフェクション効率を媒介することができる。この方法はより多くの粒子を生成し、細胞取り込みにさらされるナノ粒子の正味の表面積を増加させることができるが、改善した静電反発要素もこの技術を通して核酸放出で効果を現すことができる。驚くべきことに、既存の文献に基づいて予想されたようなアニオン性ポリマーを含むナノ粒子ポリプレックスからのヌクレオチドの速い離解と対照的に、本発明の一態様では、アニオン性ポリマーをナノ粒子ポリプレックスコアに含めることによって、ナノ粒子の細胞内滞留の持続時間、および遺伝子発現に影響を及ぼすまたは細胞機能もしくはペイロードを調節する剤の放出が延長されることができる。
【００２７】
別の態様では、ナノ粒子中のカチオン性ポリペプチドの存在が、安定性、細胞内区画化およびペイロード放出を媒介することができる。一例として、種々のポリプレックス内の、一般的にヒストンテールペプチドと呼ばれる、ヒストンペプチドのＮ末端の断片が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ媒介アセチル化の場合など、種々のヒストン修飾によって脱プロトン化されることができるだけでなく、ポリプレックスの成分として有効な核特異的アンパッケージングを媒介することもできる。その輸送は、ゴルジおよび小胞体を通した逆行性輸送を利用する代替エンドサイトーシス経路に依存し、核膜の内側に存在するヒストンの性質は、ヒストンテールペプチド上の生得的な核局在配列を示唆している。本発明の一態様では、ヒストンテールペプチドを含めることによって、ナノ粒子の核局在が促進され、そこからのポリヌクレオチドペイロードの酵素媒介放出がもたらされることができる。
【００２８】
別の態様では、ポリプレックスのシリカコーティングが、初期細胞取り込み前および初期細胞取り込み中のそのペイロードを密閉することができる。ポリ（エチレンイミン）およびＤＮＡからなる一般的に使用されるポリプレックスは、細胞内部移行中にペイロードの大部分（約９０％）を流す傾向があり、残りのペイロードは通常、そのカチオン性ナノ担体のポリマーの残骸に結合したままである。シリカの一過的安定化中間層により、細胞取り込みの確率低下にもかかわらず、より大きな細胞内送達効率が観察されることができる。本発明の別の態様では、ナノ粒子ポリプレックスをシリカコーティングでコーティングすることによって、ポリプレックスが密閉され、意図した細胞内区画中でのプロセシングで放出されるまで、ポリプレックスを安定化することができる。
【００２９】
本発明の別の態様では、おそらくはオリゴマーシリカコーティングのアニオン性の性質が細胞反発的であるために、カチオン性ポリマーの別の層を付加することによって、トランスフェクション効率がさらに増加され、送達効率が裸のポリプレックスまたはシリカコーティングポリプレックスよりも２桁も大きくなることができる。さらなる態様では、シリカコーティングポリプレックスおよびそのさらに積層した誘導体が血清中で安定であり、カチオン性ポリマー／核酸結合体だけとは異なり、インビボ実験に適している。
【００３０】
図１Ａ〜図１Ｂは、本発明によるナノ粒子の成分の例を示している。本発明によると、ナノ粒子ポリプレックスコアは、ポリヌクレオチド、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマーおよびカチオン性ポリペプチドを含むことができる。次いで、シリカコーティングをポリプレックスコアに施し、次いで、ポリマーをシリカコーティングの外表面と結合することができる。ポリヌクレオチドは、自身が含む核酸配列の細胞内発現を駆動するＤＮＡベクターであってもよい。しかしながら、ナノ粒子が他の型のポリヌクレオチド、例えば、線状ＤＮＡまたは種々の型のＲＮＡ（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列などを含む）、あるいは前記の組み合わせを含んでもよい。ナノ粒子が、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸の前記例のいずれかに加えてまたはその代わりに、大きさが５０〜１０００Ｄａの間、あるいは２００〜１０ｋＤａの間の他の帯電または極性小分子、例えば、２〜１００ｋＤａの間の環状ヌクレオチド（ｃＡＭＰなど）、ＤＮＡ折り紙鋳型（DNA origami templates）、アプタマー、帯電ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質断片、ペプトイド、リン酸化または硫酸化成分、アニオン修飾成分、および前記の多量体またはオリゴマー組み合わせを含んでもよい。当業者であれば、前記のいずれも、またはそのいずれの組み合わせも本発明に含まれることを理解するだろう。
【００３１】
図１Ａを続けると、本発明の一態様では、ポリプレックス内のカチオン性ポリマーがカチオン性アミノ酸を含有するポリペプチドであることができ、例えば、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（シトルリン）または前記の２つ以上の任意の組み合わせを含むポリペプチドであることができる。ナノ粒子が、カチオン性ポリマーの前記例のいずれかに加えてまたはその代わりに、直鎖型または分岐型の、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アスパルタミド）、ポリペプトイド、電荷官能化ポリエステル、カチオン性多糖、アセチル化アミノ糖、キトサン、または前記の２つ以上の任意の組み合わせを含む変異形（複数可）を含んでもよい。
【００３２】
一例では、カチオン性ポリマーがポリ（アルギニン）、例えば、ポリ（Ｌ−アルギニン）を含むことができる。ポリプレックス内のカチオン性ポリマーは、１ｋＤａ〜２００ｋＤａの間の分子量を有することができる。ポリプレックス内のカチオン性ポリマーはまた、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの間の分子量を有することができる。ポリプレックス内のカチオン性ポリマーはまた、１５ｋＤａ〜５０ｋＤａの間の分子量を有することができる。一例では、カチオン性ポリマーが、配列番号１によって表される、約２９ｋＤａの分子量を有するポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＬＲ）を含む。別の例では、カチオン性ポリマーが、２５ｋＤａの分子量を有する直鎖ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を含むことができる。別の例では、カチオン性ポリマーが、１０ｋＤａの分子量を有する分岐ポリ（エチレンイミン）を含むことができる。別の例では、カチオン性ポリマーが、７０ｋＤａの分子量を有する分岐ポリ（エチレンイミン）を含むことができる。別の例では、Ｄ−異性体を含有するポリペプチドなどのポリマーは、細胞内での分解を受けにくく、それゆえ時間と共にペイロード放出およびその速度に影響を及ぼすことへの長期の効果を有することができるので、カチオン性ポリマーが、特に有利となることができるポリ（アルギニン）または前記ポリマー、例えば、ポリペプチドのいずれかのＤ−異性体を含んでもよい。
【００３３】
図１Ａを続けると、本発明のさらなる態様では、ポリプレックス内のアニオン性ポリマーがアニオン性アミノ酸を含有するポリペプチドであることができ、例えば、ポリ−グルタミン酸またはポリ−アスパラギン酸または前記の任意の組み合わせを含むポリペプチドであることができる。ナノ粒子が、アニオン性ポリマーの前記例のいずれかに加えてまたはその代わりに、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、多糖、ポリ（マンヌロン酸）、ポリ（グルロン酸）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、ケラタン、ケラタン硫酸、アグリカン、ポリ（グルコサミン）、または前記の任意の組み合わせを含むアニオン性ポリマーを含んでもよい。一例では、アニオン性ポリマーがポリ−グルタミン酸を含むことができる。ポリプレックス内のアニオン性ポリマーは、１ｋＤａ〜２００ｋＤａの間の分子量を有することができる。ポリプレックス内のアニオン性ポリマーはまた、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａの間の分子量を有することができる。ポリプレックス内のアニオン性ポリマーはまた、１５ｋＤａ〜５０ｋＤａの間の分子量を有することができる。一例では、アニオン性ポリマーが、約１５ｋＤａの分子量を有するポリ（グルタミン酸）である。グルタミン酸のＤ−異性体からなる、またはグルタミン酸のＤ−異性体を含むポリマーは、細胞内での分解を受けにくく、それゆえ時間と共にペイロード放出およびその速度に影響を及ぼすことへの長期の効果を有することができるので、特に有利となることができる。例えば、ポリプレックス内のアニオン性ポリマーは、配列番号２によって表される配列（ＰＤＧＡ）を有することができる。別の例では、Ｄ−異性体を含有するポリペプチドなどのポリマーは、細胞内での分解を受けにくく、それゆえ時間と共にペイロード放出およびその速度に影響を及ぼすことへの長期の効果を有することができるので、アニオン性ポリマーが、特に有利となることができる前記ポリマーまたはポリペプチドのいずれかのＤ−異性体を含んでもよい。
図１Ａを続けると、本発明の別の態様では、ナノ粒子のポリプレックスコア中のカチオン性ペプチドが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３またはＨ４タンパク質などのヒストンペプチドの断片であることができる。断片は、その配列がヒストンタンパク質のＮ末端に相当するアミノ酸を含むことができる。例えば、断片は、ヒストンタンパク質の最大で最初の５個（配列番号９）、１０個（配列番号１０）、１５個（配列番号１１）、２０個（配列番号１２）、２５個（配列番号１３）またはそれ以上のＮ末端アミノ酸を含むことができる。断片がそのＣ末端上でアミド化されていてもよい。断片が、１個または複数のリジン残基がメチル化される、１個または複数のヒスチジン、リジン、アルギニンまたは他の相補的残基がヒストンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルＣｏＡ基質としてアセチル化されるまたはアセチル化を受けやすい、または前記の任意の組み合わせになるように修飾されていてもよい。例えば、本発明によると、ナノ粒子ポリプレックスコア中のカチオン性ペプチドは、そのＣ末端でアミド化され、リジン４でトリメチル化された、ヒトヒストン３タンパク質の最初の２５個のアミノ酸を含む配列番号３によって表される配列を有することができる（ＨＴＰ）。
【００３４】
別の実施形態では、ナノ粒子が、前記カチオン性ポリペプチドのいずれかに加えてまたはその代わりに、核局在配列を含むまたは含有することができる。カチオン性ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端上に核局在配列を含むことができる。核局在配列はインポーチンもしくはカリオフェリン基質を含むことができる、または配列番号８に相当する配列を有するもしくは含有することができる。別の実施形態では、ナノ粒子が、前記カチオン性ポリペプチドのいずれかに加えてまたはその代わりに、ミトコンドリア局在化シグナルまたはｍｔＨＳＰ７０のペプチド断片を含むことができる。
【００３５】
図１Ｂを続けると、本発明の別の態様では、ナノ粒子が、細胞または区画内部移行の前にポリプレックスコアに安定性を提供し、早すぎる分解または不安定化を防ぐ可逆性コーティングを含むことができる。例えば、シリカコーティングをポリプレックスコアに施すことができる。別の例では、リン酸カルシウムまたはヒドロキシアパタイトをポリプレックスコアに施すことができる。別の例では、分岐カチオン性ポリマー、ポリペプチドまたはペプトイドを、アニオン性電荷過剰でポリプレックスコアに施すことができる。シリカコーティングなどのコーティングは、エンドソームの微小環境にさらされる前の分解からポリプレックスを保護することができる。
【００３６】
別の態様では、ナノ粒子が、シリカコーティングの外表面などのコーティングポリプレックスの外表面と結合したまたは静電的に結合したポリマーの層を含むことができる。このような外部ポリマーは、細胞との接触および細胞による取り込みを促進するためにコーティングポリプレックスの細胞反発を防ぐのに役立つことができる。外部ポリマー層はまた、外部結合ポリマーが、トランスフェクションを望まれる細胞型によって発現される受容体に対するリガンドであるまたはこれを模倣する場合などに、特異的細胞型による内部移行を促進するのにも役立つことができる。ポリプレックス上のコーティングの外表面と結合したポリマー層中のポリマーは、大きさが０．１〜２０ｋＤａの間であることができる、または大きさが最大４０もしくは５０ｋＤａであることができる。
【００３７】
本発明によると、コーティングコアポリプレックスの外表面と結合したポリマー層を含むポリマーの例としては、約１０ｋＤａポリ（アルギニン）ポリマーである配列番号４、およびヒト血管作動性内皮増殖因子タンパク質である配列番号５によって表されるものが挙げられる。別の例では、コーティングコアポリプレックスの外表面と結合した層を含むポリマーが、ポリマー、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド中に含有される標的モチーフとコーティングポリプレックスコアの静電結合を提供するために、ポリマー、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのＮ末端、Ｃ末端、５’または３’末端に１〜２５個の間の反復アニオン性またはカチオン性部分のアンカー基質を含むことができる。別の例では、コーティングコアポリプレックスの外表面と結合した層を含むポリマーが、上に付加されることができるさらなる層と結合するためのアミノ酸配列結合モチーフとの塩基対相補性または結合親和性を示すポリマー、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を含むことができる。
【００３８】
図２Ａに示される本発明の別の態様では、カチオン性ポリプレックスを作製し、次いで、シリカコーティングでコーティングする。ナノ粒子のポリプレックスコアを、縮合をもたらす静電相互作用を介して作製することができる。一方は水中０．１％ｗ／ｖカチオン性ポリマーおよびカチオン性ポリペプチドと合わせたｐＨ未調整４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（約ｐＨ５．５）であり、他方は水中０．１％ｗ／ｖアニオン性ポリマーおよびポリヌクレオチドと合わせた３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（約ｐＨ７．４）である２つの等体積溶液を作製することができる。一実施形態では、カチオン性ポリマーが配列番号１を含み、アニオン性ポリマーが配列番号２を含み、カチオン性ポリペプチドが配列番号３を含む。これらの溶液を、攪拌しないで、カチオン性溶液のアニオン性溶液への滴加を介して合わせることができる。室温で３０分のインキュベーション後、ポリプレックス内の核酸１０μｇを含有する溶液２００μＬを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）中４５ｍＭケイ酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）溶液に滴加し、室温で８〜２４時間の間インキュベートさせることができる。未結合シリカ種およびポリマーから複合体を単離するために、シリカコーティングポリプレックスを、３０００ｇで３００ｋＤａ  Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）フィルタ（Ｐａｌｌ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）による遠心分離を介して単離することができる。ナノ粒子を、シリカコーティングの外表面と結合させるポリマーを含有する溶液にさらに再懸濁することができる。例えば、これらを、０．１％ｗ／ｖの配列番号４または配列番号５によって表されるポリマーを含む溶液に１時間再懸濁することができる。次いで、ナノ粒子を、トランスフェクション媒体に再懸濁する前に、再度遠心分離することができる。この方法は、本発明によるナノ粒子を製造する一例にすぎない。
【００３９】
図２Ｂは、細胞を本発明によるナノ粒子と接触させて、カベオラ媒介エンドサイトーシスまたはマクロピノサイトーシスなどにより、ナノ粒子の細胞内部移行をもたらすことの図表示である。ナノ粒子が、ゴルジおよび小胞体を通してさらに逆行性輸送またはリソソーム経路を通してプロセシングされ、シリカコーティングなどのコーティングの喪失およびポリプレックスコアの露出がもたらされることができる。本発明によると、ポリプレックスコアは細胞核へさらに移動させられ、ここで酵素的プロセシングによって、カチオン性ポリマーが分解されることができる（例えば、アルギナーゼの活性を通して）、またはポリプレックスコアのアンパッケージング（unpackaging）が促進されることができ（例えば、ポリプレックス内のヒストンテールペプチドのアセチル化を通して）、ポリプレックスコアからのプラスミドＤＮＡなどのポリヌクレオチドの放出がもたらされる。本発明によると、ナノ粒子の成分およびそのポリプレックスコアまたはそのコーティングまたはコーティングと結合したポリマー層を修飾する他の細胞内プロセシングステップも起こることができる。
【００４０】
さらなる態様では、本発明は、ナノ粒子の一部として、ポリプレックスコアの複合体形成のために最適化比のアニオン性およびカチオン性ポリマー、カチオン性ポリペプチド、ならびにポリヌクレオチドを含む。一例では、モル［１（陽性）］：［１（陰性）］比の［アミン（ｎ）］：［リン酸（ｐ）＋カルボキシレート（ｃ）］の種々のポリマー成分の添加、または例ではｃ：ｐのポリ（Ｄ−グルタミン酸）（ＰＤＧＡ；配列番号２）添加前に、プラスミドＤＮＡを臭化エチジウム（４０ｎｇ  ＥｔＢｒ／μｇ  ＤＮＡ）で蛍光タグ化した。二元複合体（すなわち、ＰＥＩ＋ＤＮＡまたはＰＥＩ＋ＤＮＡ）または三元複合体（ＨＴＰ＋ＰＥＩ＋ＤＮＡまたはＨＴＰ＋ＰＬＲ＋ＤＮＡ）の一部としての２つのポリマー間の類似の複合体形成挙動を定量化するために、直鎖ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ、２５ｋＤａ）の添加を、ポリ（Ｌ−アルギニン）（ＰＬＲ、２９ｋＤａ；配列番号１）の単独でのならびにＨ３Ｋ４（Ｍｅ３）ヒストンテールペプチド（ＨＴＰ；配列番号３）と合わせた添加と比較した。カチオン性ポリマーとカチオン性ポリペプチドが共に存在する場合、各成分の相対モル比はそれぞれ、６０％：４０％であった。Ｚｅｉｓｓフィルタおよび分光光度計を使用して５９５ｎｍでの発光について５１０ｎｍでＥｔＢｒタグ化ＤＮＡを励起して、結果を、陰性対照として未結合ＥｔＢｒを用いて種々の配合物間で比較した。
【００４１】
図３は、アニオン性またはカチオン性のポリマーまたはポリペプチドとポリヌクレオチドの比を変化させることの効果を示すグラフである。Ｘ軸は帯電ポリマー対リン酸の比を示し、Ｙ軸は示される成分の組み合わせに従う相対蛍光を示す。相対蛍光の減少は、ＤＮＡからのＥｔＢｒの移動およびポリプレックス形成を示す。カチオン性ポリマー、またはカチオン性ポリマーおよびカチオン性ポリペプチドとＤＮＡの比が約５：１以上であると、ＤＮＡとポリマーのポリプレックスへの複合体形成を示す蛍光の約４０％の減少を示した。カチオン性ポリマーまたはカチオン性ポリペプチドの非存在下でのＰＤＧＡの添加は、複合体形成に影響を及ぼさなかった。
【００４２】
ＰＬＲ−ＨＴＰ−ＤＮＡ、ＰＥＩ−ＨＴＰ−ＤＮＡ、ＰＬＲ−ＤＮＡおよびＰＥＩ−ＤＮＡポリプレックスを複合体形成し、ＰＤＧＡがポリヌクレオチドの複合体形成を引き起こす能力を有さないことを決定した後、形成速度論に対するＰＤＧＡの影響を、過剰なカチオン性電荷と均等な電荷の比のナノ粒子複合体形成に対する効果を決定するために、複合体形成効率における［５．５（陽性）］：［１（陰性）］および［１０（陽性）］：［１（陰性）］モル比の［アミン（ｎ）］：［リン酸（ｐ）］および［アミン（ｎ）］：［リン酸（ｐ）＋カルボキシレート（ｃ）］の比較によって確立した。ＰＤＧＡからのカルボキシレート基の包含は、ＤＮＡからのリン酸基の包含に匹敵する全生成速度論に対する効果を有すると予想された。相対蛍光を、対照としてのポリマーもしくはポリペプチドを添加しないＤＮＡ、またはＤＮＡの非存在下でのＥｔＢｒと比較した。
【００４３】
図４は、ＰＤＧＡをカチオン性ポリマーおよびカチオン性ポリペプチドに添加することのポリプレックス複合体形成速度論に対する効果を示している。ＤＮＡを、ＰＤＧＡを添加してまたは添加しないで、ＨＴＰ、ＰＬＲまたはＰＥＩと複合体形成させた。ＨＴＰを添加したまたは添加しない、カチオン性ポリマー（ＰＬＲまたはＰＥＩ）対ポリヌクレオチドモル比５．５：１（ｎ／ｐ＝５．５の表示がある棒に示される）ならびにカチオン性ポリマー（ＰＬＲまたはＰＥＩ）対ポリヌクレオチド＋アニオン性ポリマーモル比５．５：１および１０：１（ｎ／（ｐ＋２ｃ）＝５．５または１０の表示がある棒に示される）を用いた実験を示す。ＰＤＧＡの添加は、試験したモル比のいずれでも複合体形成速度論を損なわなかった。
【００４４】
カチオン性ポリマーおよびカチオン性ポリペプチドを含めることのポリプレックス不安定化に対する効果も、図５に示されるように決定した。［（ＰＤＧＡ）カルボキシレート（ｃ）：（ＤＮＡ）リン酸（ｐ）］モル比が０〜１００で変わる、ＤＮＡとカチオン性ポリペプチド（ＨＴＰを含むもしくは含まないＰＬＲ、またはＨＴＰを含むＰＥＩ）のポリプレックスナノ粒子を記載の通り複合体形成し、対照としてのＤＮＡまたはＥｔＢｒ単独と比較し、不安定化（蛍光増加によって示される）の効果を決定した。ＨＴＰの非存在下では、ＰＤＧＡの添加がポリプレックス不安定化をもたらさなかった。しかしながら、ＨＴＰの存在下では、ＰＤＧＡとＤＮＡの添加モル比が２０以上であるとポリプレックス不安定化がもたらされた。これらの結果は、カチオン性ポリペプチドとアニオン性ポリマーの複合体不安定化に対する驚くべき相乗効果を示している。ナノ粒子ポリプレックスへのカチオン性ポリペプチド組み込みおよび／または異なる分子量もしくは大きさのカチオン性成分の包含によって、カチオン性ポリマーがポリプレックスおよびその他の成分からのポリヌクレオチドペイロードの解離および放出を促進する能力が有利に増強されることができる。
【００４５】
動的光散乱（ＢＲＡＮＤ）を使用して、形成の種々の段階でナノ粒子の流体力学半径を測定した。５．５：１の［アミド］：［（リン酸）］のモル比でコアポリプレックスとプラスミドＤＮＡ、ＰＬＲ、ＰＤＧＡおよびＨＴＰを含有するナノ粒子を記載の通り複合体形成した。いくつかのポリプレックスコアを記載の通りシリカでさらにコーティングした。そして、いくつかのシリカコーティングポリプレックスを、記載の通りカチオン性ポリマー（配列番号４）でさらに積層した。三元複合体の最初のコア形成、コアのシリカコーティング、およびシリカコーティングコアのカチオン性ポリマーコーティングの後、３０〜６０分の測定を行った。図６は、ナノ粒子の直径を示すグラフである。非コーティングポリプレックスコアおよびシリカでコーティングされたポリプレックスコアは、直径が平均で約７０〜１５０ｎｍであった。他の実施形態では、ポリプレックスコアおよびシリカコーティングポリプレックスコアが、平均直径が１００〜１７０ｎｍの範囲内にあることができる。カチオン性ポリマーコーティングをシリカコーティングに付加することによって、平均直径が約１７０ｎｍのナノ粒子が得られた。他の実施形態では、シリカの外層と結合したカチオン性ポリマーのさらなる層を有するシリカコーティングポリプレックスコアが、平均直径が約８０〜２００ｎｍの範囲内にあることができる。
【００４６】
ナノ粒子の細胞取り込みも測定した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を、アミンとＦＩＴＣのモル比が１００：１となるように、ＰＥＩ（２５ｋＤａ直鎖）およびＰＬＲ（２９ｋＤａ）のアミンと共有結合的に結合した。反応を、等体積の水とＤＭＳＯ中、室温で４時間、暗所で行った。結合を確立するために、各蛍光修飾ポリマーの０．０５％ｗ／ｖ５００μＬ溶液を１０ｋＤａ  Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）フィルタで遠心分離し、溶離液の蛍光強度（４８５励起／５２０発光）を未濾過ポリマー溶液ならびに水と比較した。ｍＣｈｅｒｒｙプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ）をナノ粒子に含めて、プラスミド駆動発現の蛍光検出を可能にした。
【００４７】
ＭＣ３Ｔ３マウス骨芽細胞をポリスチレンＴ−７５組織培養プラスチックフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＡ、米国）で培養した。１０％ウシ胎児血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶＡ、米国）を補足したダルベッコ変法イーグル培地を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ、米国）と一緒に骨芽細胞のために使用した。キシレノールオレンジを、細胞培養開始後１５日目から２５日目に細胞培養培地に添加した。２５日目に、細胞を固定し、石灰化について分析した。ＦＩＴＣ修飾ナノ粒子を用いたｍＣｈｅｒｒｙプラスミド送達のために、骨芽細胞を９６ウェルプレートに１０００個細胞／ウェルで蒔き、１０％ＦＢＳを含有する抗生物質を含まないＤＭＥＭ中で１２〜１６時間接着させた。トランスフェクションの直前に、培地を等体積のＯｐｔｉＭＥＭ懸濁ナノ粒子と１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭと交換した。
【００４８】
全ての複合体をＦＩＴＣ標識化し、トランスフェクション前に蛍光強度（４８８／５２０励起／発光）の定性的観察に供した。９６ウェルプレート骨芽細胞（１０００個細胞／ウェル）を、合計で１対照および８実験セット（ｎ＝３）により、各二元（プラスミドおよびカチオン性ポリマー）、三元（プラスミドおよびカチオン性ポリマー＋アニオン性ポリマーまたはカチオン性ポリペプチド）および四元（プラスミド、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリペプチド）複合体ならびにそのシリカコーティング対応物について３連で、プラスミド２００ｎｇでトランスフェクトした。凝集の細胞外特性に対する血清の効果を試験するために、５％血清を用いた。
【００４９】
トランスフェクション３０時間後、バイモーダル蛍光イメージング（bimodal fluorescent imaging）によって、ＦＩＴＣ標識ナノ粒子（４８８励起／５２０発光）およびこれらが原因であるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子発現（６３３励起／６８０発光）の同時観察を可能にした。最小２０個の細胞を各ウェルの異なる位置で観察し、代表的な画像を得た。画像Ｊを用いて重ね合わさった画像を処理し、位相差、４８８／５２０および６３３／６８０チャネルを合わせた。
【００５０】
細胞取り込みを示す顕微鏡写真を図７に示す。図７の円は、高レベルの核局在が明らかなところを示している。シリカコーティング二元ナノ粒子は、突発放出特性を示す（すなわち、核局在がＤＮＡ−ＰＬＲ＋シリカ試料では明らかでない）。ＰＤＧＡのポリプレックスコアへの包含によって、細胞核内へのプラスミドの放出延長が引き起こされる。ＰＤＧＡが放出延長を引き起こすこの効果は、正反対：カチオン性ポリマーをナノ粒子ポリプレックスに含めることは、他のポリプレックス成分からのポリヌクレオチドペイロードの持続時間、解離を促進し、短縮する、を示唆している文献に照らして驚くべきものであった。ＨＴＰの添加も大規模な核局在を引き起こす。
【００５１】
シリカコーティングナノ粒子（ＤＮＡ−ＨＴＰ−ＰＤＧＡ−ＰＬＲ＋Ｓｉ）をポリ（アルギニン）（配列番号４）でさらにコーティングすることによって、ナノ粒子が血清中で安定にされ、細胞内でのナノ粒子ペイロードの滞留延長がもたらされる。図８は、本発明による、ＭＣ３Ｔ３マウス骨芽細胞による、ポリ（Ｌ−アルギニン）（配列番号４）のさらなる層を付加したシリカコーティングＦＩＴＣ結合ポリプレックスコアの細胞取り込みおよび保持を示す顕微鏡写真である。図７に示されるシリカコーティングナノ粒子と異なり、シリカコーティングの外側にカチオン性ポリマーのさらなる層を含有するナノ粒子の凝集は図８では観察可能ではなく、このようなナノ粒子が血清中で安定なままであることを示している。さらに、蛍光が約１．５日以内に定性的にピークになり、検出可能な蛍光が１４日間を通して維持されるように、これらのナノ粒子が細胞核内で滞留延長を示すことが認められる。
【００５２】
特定の細胞型と結合するよう特異的に指向したポリマーでシリカコーティングポリプレックスコアを積層することによって、取り込みをさらに増強することができる。細胞受容体のリガンドをナノ粒子の表面と会合することによって、ナノ粒子のこのような受容体を発現する細胞との親和性が増強され、このような細胞のトランスフェクションを増加することができる。本発明による一例として、シリカコーティングポリプレックスを、ＶＥＧＦ（配列番号５）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）によって高レベルで発現されるＶＥＧＦ受容体の高親和性リガンドでコーティングした。ＨＵＶＥＣを、ＰＢＳで２回洗浄する前に４０分間、シリカコーティングの外表面と結合したポリ（Ｌ−アルギニン）（配列番号４）またはヒト（ＶＥＧＦ）（配列番号５）を含むシリカコーティングＦＩＴＣ結合ポリプレックスと共にインキュベートし、次いで、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）に再懸濁した。細胞を４時間後に画像化した。この短いインキュベーション期間後に、外シリカ表面と結合したポリ（Ｌ−アルギニン）層を含有するナノ粒子（図９Ａ）による低レベルのトランスフェクションのみが観察された一方、ポリ（Ｌ−アルギニン）の代わりにＶＥＧＦでコーティングすると、この４時間の時点で有意に高い細胞内部移行が得られた。当業者であれば、実質的にいずれの他の細胞型も本発明によるナノ粒子によってトランスフェクトすることができ、ポリマーの層をシリカコーティングポリプレックスコアの外層と結合させてこの効果を促進またはこの効果に影響を及ぼすことができることを認識するだろう。このような当業者であれば、細胞をナノ粒子と接触させてこのような結果をもたらす他の手段、例えば、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｍ．もしくはｓ．ｃ．または他の注射もしくは経皮投与もしくは坐剤、またはヒトもしくは動物による消化もしくは経口もしくは経鼻吸入、または移植組織もしくは細胞もしくは幹細胞との接触を介することも本発明に含まれることを理解するだろう。
【００５３】
本発明の別の態様では、ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをナノ粒子ポリプレックスコアに組み込むことができる。１つの非限定的な例として、ＴＡＬＥＮ（転写因子様エフェクターヌクレアーゼ）の発現をコードおよび駆動するポリヌクレオチドをナノ粒子に含めることができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼのように、ＴＡＬＥＮは、新たなＤＮＡ結合特異性を導入するために修飾されることができるモジュラーＤＮＡ結合モチーフ（ＴＡＬＥ）およびヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）さえも利用する。ＴＡＬＥはそれぞれ単一ヌクレオチドとの結合を指定する複数の反復可変二残基（repeat variable diresidues）（ＲＶＤ）からなる。ＴＡＬＥアレイは、所望のＤＮＡ配列に対する特異性および結合親和性を提供する特異的な順序でＲＶＤをつなぎ合わせることによって作製される。一般的に、これらのゲノムスプライシンングツールは、ＦｏｋＩヌクレアーゼなどの非特異的開裂ドメインをＴＡＬＥと融合することによって設計される。Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅとして知られているオーブンソースアセンブリ法を含む、これらの反復配列のアセンブリを可能にするＴＡＬＥＮアセンブリプロトコルが入手可能である。
【００５４】
本発明の別の態様では、ナノ粒子を、シグナル伝達分子の発現を調節して細胞機能を変化させるように設計および使用することができる。例えば、染色体ＤＮＡの配列を欠失または変化させて疾患状態またはその治療の細胞または動物モデルを作製する、あるいは疾患状態を治療するまたはヒトの健康を増強させることができる。その発現を本発明により修飾することができるタンパク質の１つの非限定的な例にスクレロスチン（ＳＯＳＴ）がある。ＬＲＰ５／６受容体と結合しているＳＯＳＴは、おそらくＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ１０Ａ、スクレロスチン、β−カテニン、ＬＥＦ１およびＴＣＦ１の間のフィードバック系を介して、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する。スクレロスチンの除去を介したこれらのカスケードの抑制低下（Desuppressing）は、石灰化活性の有意な増加をもたらすことができる。
【００５５】
骨前駆細胞（ＯＰＧ）およびＲＡＮＫＬもＳＯＳＴ欠失に対して反応性の役割を果たすと予想され、ＲＡＮＫＬはそれ自体、破骨細胞結合ＲＡＮＫまたはＯＤＦ（破骨細胞分化因子）結合を介して破骨細胞形成を促進するための受容体として発現し、ＯＰＧはＲＡＮＫＬと拮抗的に結合する。したがって、ＯＰＧとＲＡＮＫＬの比が、骨形成と骨吸収との間の関係の決定因子となる。しかしながら、骨芽細胞の単一培養物は、パラ分泌シグナル伝達の他の形態を通して情報交換するので、この比は破骨細胞との共培養またはインビボにおいて変化した細胞の挙動をより反映するはずである。
【００５６】
本発明の別の態様では、ナノ粒子を、ＳＯＳＴの発現を妨害し、結果として高骨量表現型を生み出すことができるＴＡＬＥＮによるトランスフェクションを可能にするように設計することができる。一例として、ＴＡＬＥＮを、ＳＯＳＴ遺伝子中の遺伝子座と特異的に結合するよう操作し、ゲノム中の二本鎖破壊を作り出して転写または翻訳を妨害し、ＳＯＳＴ発現を低下させることができる。さらなる例として、ナノ粒子が、ＳＯＳＴの開始コドンの染色体座の両側二本鎖破壊を作り出す２つのＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを含有してもよい。開始コドンをコードする配列の切除後の内因性ゲノムＤＮＡの修復により、ＳＯＳＴタンパク質に適当に翻訳することができない開始コドンを欠いたスクレロスチンｍＲＮＡの転写がもたらされ、それによってＳＯＳＴ発現および活性低下が駆動されることができる。このモデルの図表示を図１０に示し、ここでは「左」ＴＡＬＥＮおよび「右」ＴＡＬＥＮがＳＯＳＴ開始コドン遺伝子座の反対側に結合しその部位を切断する。一例として、左ＴＡＬＥＮは配列番号６によって表される配列を有し、右ＴＡＬＥＮは配列番号７によって表される配列を有することができる。ナノ粒子は、右または左ＴＡＬＥＮ、例えば、配列番号６および配列番号７によって表されるものをコードするヌクレオチド配列が、コードされたＴＡＬＥＮの細胞発現を駆動するためにサブクローニングされたｐＵＣ１９（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０９１３７Ｘ０２５１４）などの発現プラスミドを含んでもよい。ナノ粒子はまた、左および右ＴＡＬＥＮをコードする配列を含む発現プラスミドの組み合わせを含んでもよい。
【００５７】
本発明によると、ナノ粒子はまた、他のＴＡＬＥＮ配列、標的ＳＯＳＴまたは対象となる他の任意の遺伝子を含んでもよく、また他の発現ベクターを含んでもよい。本発明によると、ナノ粒子は、他の型のポリヌクレオチドまたはその類似体、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡの種（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、ｓｈＲＮＡ、ＡＡＶ由来核酸、モルフォレノＲＮＡ（morpholeno RNA）、ペプトイドおよびペプチド核酸、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ折り紙、合成ヌクレオチドを含むＤＮＡおよびＲＮＡ、予め定義された二次構造を有するＤＮＡおよびＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ配列、ならびにマルチマーおよびオリゴマー、ならびに前記の任意の組み合わせを含む）を含んでもよい。別の例では、ナノ粒子が、その配列が、発現が望まれている任意のタンパク質またはポリペプチドなどの他の産物をコードすることができるポリヌクレオチドを含んでもよい。当業者であれば、前記例が本発明によるものであり、その特許請求の範囲に包含されることができることを認識するだろう。
【００５８】
本発明により、ＳＯＳＴ発現をノックダウンするよう設計されたナノ粒子でＭＣ３Ｔ３マウス骨芽細胞をトランスフェクションした後、細胞溶解液および上清分画にＥＬＩＳＡおよび定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイを行った。図１１Ａ〜図１１Ｃは、トランスフェクション後最大２０日の期間にわたってＳＯＳＴ発現およびβ−カテニン発現を調節することにおける、本発明による左（配列番号６）および右（配列番号７）ＳＯＳＴ  ＴＡＬＥＮをコードするヌクレオチド配列を含む発現プラスミドを含有する異なる量（８００ｎｇ、１６００ｎｇまたは２５００ｎｇ）のナノ粒子（ＮＰ）の有効性を示すグラフである。比較のために、他の細胞を、リポフェクタミン、細胞トランスフェクションのための既知の剤を用いて同じＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。図１１Ａ〜図１１Ｃに示されるように、細胞内および細胞外ＳＯＳＴレベルは、本発明によるナノ粒子によるトランスフェクション後少なくとも数週間抑制された一方で、β−カテニン発現は、同時に上方制御され、ＳＯＳＴ発現および活性の下方制御におけるナノ粒子の有効性を示した。
【００５９】
ｑＰＣＲも行って、本発明によるナノ粒子によるＳＯＳＴ発現の下方制御が、関連するシグナル伝達カスケードの他の成分に対する下流の効果を有することができるかどうかを決定した。細胞を上記のようにトランスフェクトした。示される異なる量のナノ粒子によるトランスフェクションの５、１４および２１日後のシグナル伝達経路の多数の成分（ＳＯＳＴ、β−カテニン、ＴＣＦ１、ＬＥＦ１、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ１０ｂ、ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬ）の発現に関する結果を図１２Ａ〜図１２Ｆに示す。比較のために、他の細胞を、リポフェクタミンを用いて同じＴＡＬＥＮをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。リアルタイムＰＣＲの結果は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤スクレロスチンのノックダウンに対する反応として、リポフェクタミンによって送達されるＳＯＳＴ  ＴＡＬＥＮと比べて最大２〜６倍大きなＳＯＳＴ  ＴＡＬＥＮを送達するナノ粒子でトランスフェクトした細胞株におけるＷｎｔ応答性遺伝子の上方制御を示した。
【００６０】
本発明によると、ＴＣＦ／ＬＥＦ−１媒介転写も、ＳＯＳＴ発現のノックダウン後に上方制御されることができる。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、ＴＣＦ／ＬＥＦ−１結合部位を含有するＴＯＰｆｌａｓｈおよび対照ＦＯＰｆｌａｓｈルシフェラーゼレポータープラスミド構築物（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１２４５６および１２４５７）でトランスフェクトした。細胞を、８ウェルｌａｂｔｅｋチャンバースライドの１ウェル当たり５０００個の細胞の密度で蒔き、ＴＯＰｆｌａｓｈおよびＦＯＰｆｌａｓｈプラスミドそれぞれ１μｇでトランスフェクトした。トランスフェクション効率の対照に、対照プラスミドＲｅｎｉｌｌａ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。図１３は、本発明のナノ粒子によるトランスフェクション後のＴＣＦ／ＬＥＦ−１発現および活性の上方制御と一致した、本発明によるＳＯＳＴ指向ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを含有するナノ粒子によるトランスフェクション後２１日間のＴＣＦ／ＬＥＦ−１媒介転写の上方制御を示す顕微鏡写真である。
【００６１】
本発明によるＳＯＳＴ発現のノックダウンはまた、間質骨髄細胞および骨芽細胞における石灰化を増加させることができる。石灰化は、２つの別個の方法（第１はＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ）を用いたキシレノールオレンジ標識生培養物の画像の二値化に基づき、第２は原子吸光分析（ＡＡＳ）による）によって定量化した。キシレノールオレンジ閾値について、位相と蛍光の両方の画像（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｓｅｔによる）をウェルの５個の隣接領域で取り、次いで、より大きな８ビット画像（４ｘ、Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−１００）に縫合した。位相チャネルを蛍光から減じ、閾値を背景とシグナルとの間のレベル（−６ｄＢ）の半分に設定した。閾値より上の画素数を計数し、各ウェルの石灰化面積の割合を表すために使用した。位相と蛍光の組み合わせによって未結合キシレノールオレンジを区別することが可能になった一方で、デシベルレベルの使用によって各画像中で異なる背景レベルの補正が可能になった。
【００６２】
石灰化を、原子吸光分析装置（ＡＡ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ）を用いて原子吸光によっても定量化した。各ウェルを、１０％硝酸０．５ｍＬを添加して調製し、得られたカルシウム含量を標準曲線に対して測定し、群間で比較した。リン酸相で沈殿しているイオン化カルシウムによる干渉を最小化するよう注意したので、大過剰のカリウムおよびランタンイオンを各ウェルに添加した。
【００６３】
図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＳＯＳＴノックダウン後の石灰化に対する本発明によるナノ粒子によるトランスフェクションの効果を示している。図１４Ａは、ＳＯＳＴノックダウンの２５日後に形成された石灰化マトリックスの染色の顕微鏡写真である。間質細胞をパネルＡ〜パネルＣに示す（パネルＡは対照細胞を示し、パネルＢはリポフェクタミンを介してトランスフェクトした細胞を示し、パネルＣは本発明に記載され、本発明によるＳＯＳＴ指向ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを含有するナノ粒子でトランスフェクトした細胞を示す）。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞をパネルＤ〜パネルＧに示す（パネルＤは対照細胞を示し、パネルＥ〜Ｇはそれぞれ、本発明による、８００ｎｇ、１６００ｎｇおよび２５００ｎｇの用量で記載されるＳＯＳＴ指向ＴＡＬＥＮをコードするプラスミドを含有するナノ粒子でトランスフェクトした細胞を示す）。図１４Ｂおよび図１４Ｃは、石灰化の定量化を示すグラフである。図１４Ａ〜図１４Ｃは、本発明によるナノ粒子を介したＳＯＳＴ標的化ＴＡＬＥＮのトランスフェクション後の間質骨髄細胞および骨芽細胞中のカルシウム濃度の増加を示しており、遺伝子の細胞発現および活性ならびに下流のシグナル伝達経路を修飾するこの技術の有効性をさらに確認している。
【００６４】
本発明のいくつかの態様を本明細書において記載し、示してきたが、同じ目的を達成するために当業者が代わりの態様を行うこともできる。したがって、添付の特許請求の範囲によって、本発明の真の精神および範囲に入る全てのこのような代わりの態様を網羅することを意図している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
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