(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４６８）。
【請求項２】
請求項１に記載のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株が添加された組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体におけるポリアミン産生促進作用を有する新規ラクトバチラス・パラカゼイ株（WON0604株：FERM  BP-11468）及びその応用、並びに、これらに関連した技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリアミンは、第一級アミノ基が２個以上結合した脂肪族炭化水素の総称であり、プトレシン、スペルミジン、スペルミン等が代表例である。ポリアミンは、以下を含む全ての生物の細胞内で合成され、細胞の分化や増殖に関与している。これらの作用の他に、近年、ポリアミンは、アンチエイジング作用（非特許文献１）、動脈硬化の進行遅延作用（非特許文献２）、急性及び慢性炎症を抑制する作用（非特許文献３）、中性脂肪低減作用、インスリン抵抗性改善作用、抗肥満作用、コレステロール値低減作用、基礎代謝向上作用（非特許文献４）、抗アレルギー作用（非特許文献５）などの種々の有益な生理作用を有することが報告されている。【０００３】
ポリアミンは、ヒトを含む全ての動物が生合成するが、その能力は加齢に伴って低下する。そこで、ポリアミンによる種々の有益な生理作用を生涯に亘って享受するために、外的にポリアミンを投与又は摂取するか、或いは、生体内でのポリアミン合成能を賦活化させることが検討されている。【０００４】
これまでに幾つかのポリアミンを含有する飲食品が提案されている。例えば、特許文献１には、種々の動植物素材から抽出したポリアミンを含有する飲食品が開示されている。このような飲食品は、生体（特にヒト）におけるポリアミン合成を促進することで、前記のアンチエイジング作用、動脈硬化の進行遅延作用、急性及び慢性炎症を抑制する作用、中性脂肪低減作用、インスリン抵抗性改善作用、抗肥満作用、コレステロール値低減作用、基礎代謝向上作用、抗アレルギー作用などの種々の有益な生理作用を提供することが期待される。また、このような飲食品は、前記生理作用に関連するバイオマーカー等の改善や維持、恒常性に向けて作用すること、或いは病気の進展予防に寄与することが期待出来る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−２６３８１６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９；  １１  （１１）：  １３０５−１３１４
【非特許文献２】Ｓｏｄａ  Ｋ．，  Ｍｅｄ．  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，  ２０１０；  ７５  （３）：  ２９９−３０１
【非特許文献３】Ｌａｇｉｓｈｅｔｔｙ  Ｃ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００８；  ４０  （３）：  １２１−１２５
【非特許文献４】Ｋｏｐｏｎｅｎ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ２０１２；  ４２  （２−３）：  ４２７−４０．
【非特許文献５】Ｐｅｕｌｅｎ  Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｕｔｒ．  １９９８；  １  （３）：  １８１−１８４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明が解決しようとする課題は、生体（特にヒトの生体内）におけるポリアミン合成を促進するための有効な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決すべく、本発明者らは、ラクトバチルス・パラカゼイに属する微生物の中に、ヒト又は動物の生体内でポリアミン産生を促進する作用を有する微生物が存在することを見出した。本発明者等は、当該微生物が小腸においてポリアミン産生を促進し、更には肝臓中性脂肪低減作用及び/又はエネルギー代謝促進作用を兼ね備えることを見出した。【０００９】
本発明の代表例は、以下の通りである。
項１．
ラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４６８）。
項２．
更に、肝臓中性脂肪低減作用を有する、項１に記載のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株。
項３．
更に、エネルギー代謝促進作用を有する、項１又は２に記載のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株。
項４．
項１〜３のいずれかに記載のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株が添加された組成物。
項５．
ポリアミン産生促進剤である、項４に記載の組成物。
項６．
項２に記載のラクトバチラス・パラカゼイを含有する、脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎、及び肝硬変から成る群より選択される一種以上の疾患の予防及び／又は治療剤。
項７．
項２に記載のラクトバチラス・パラカゼイを含有する、肝臓中性脂肪の低減剤。
項８．
項１〜３のいずれかに記載のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株をポリアミン産生の増強が必要なヒトに投与することを含む、ヒト体内のポリアミン産生の促進方法。
項９．
項２に記載のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株を脂肪肝の患者に投与することを含む、脂肪肝患者の治療又は緩和方法。
項１０．
脂肪肝の予防及び／又は治療剤を製造するための項２に記載のラクトバチラス・パラカゼイの使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４６８（以下、「本発明の微生物」と略する場合もある。）は、ヒトや他の動物等の生体内でのポリアミン産生を促進する作用を有する。本発明では、この作用を「ポリアミン産生促進作用」とする。本発明の微生物を利用（例えば摂取・投与）することにより、ヒト又は動物の生体内でのポリアミン産生を促進させることができる。その結果、ポリアミンによる有益な生理作用（例えば、アンチエイジング作用、動脈硬化の進行遅延作用、急性及び慢性炎症を抑制する作用、中性脂肪低減作用、インスリン抵抗性改善作用、抗肥満作用、コレステロール値低減作用、基礎代謝向上作用、抗アレルギー作用、及び／又は免疫賦活作用等）を効果的にヒト又は動物に享受させることができる。【００１１】
また、本発明の微生物は、肝臓中性脂肪低減作用を有する。よって、本発明の微生物を利用することにより、肝臓中性脂肪レベル（例えば、肝臓に蓄積した中性脂肪の量）を低下できる。本発明の微生物は肝の脂質代謝異常の維持、改善、或いは脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び／又は肝硬変の予防ないし治療に有効である。更に、本発明の微生物は、前記疾患の肝癌への進行予防、並びに、心血管疾患の進展予防に有用であることが期待される。【００１２】
本発明の微生物は、生体におけるエネルギー代謝促進作用を有する。よって、本発明の微生物の利用により、ヒト又は動物の体重増加抑制、肥満抑制、体脂肪の低減、内臓脂肪の低減、及び／又はメタボリックシンドローム予防等の健康維持に有用である。また本発明の微生物は、前記生理作用に関連するバイオマーカー等の改善や維持に有用であることが期待される。【００１３】
加えて、本発明の微生物は、食品の分野で利用されているラクトバチラス・パラカゼイに属するため、食品組成物の添加剤としての安全性にも優れていると考えられる。このように、本発明の微生物は、ヒト又はその他の動物が摂取する飲食品及び／又は医薬品の分野における利用に適している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．微生物
１−１．ポリアミン産生促進作用
本発明の微生物は、ポリアミン産生促進作用を有する。ポリアミン産生促進作用とは、上述の通り、ヒト又はその他の動物の生体内におけるポリアミン産生を促進する作用である。
【００１５】
本発明におけるポリアミンとは、一般に第一級アミノ基が２個以上結合した脂肪族炭化水素の総称であり、ポリアミンとして認識される物質であって、例えばプトレシン、スペルミジン及びスペルミン等を挙げることができる。本発明の微生物によるポリアミン産生促進作用によって、これらのポリアミンの少なくとも１種、又は２種、より好ましくは全てのポリアミンの産生が促進される。本発明の微生物によって、ポリアミン産生（即ち、生体内のポリアミンの合成）が促進される細胞、組織、及び器官等は特に制限されない。例えば、そのような器官は、経口投与された微生物が直接作用し得る器官である、口腔、食道、胃、十二指腸、盲腸、小腸、大腸が例示され、特に小腸が好ましい。
【００１６】
本発明の微生物によるポリアミン産生促進作用は、公知の分析技術を利用して測定することが可能である。具体的には、モデル動物（例えば、マウス）を用いて次のような手順で測定することができる。即ち、マウスに本発明の微生物を一定期間摂取させた後、内臓組織を摘出し、この組織中のポリアミンの量を測定する。そして、本発明の微生物を摂取させていないマウスから摘出した内臓組織中のポリアミン量と比較し、本発明の微生物による相対的な増加を測定することができる。この際、ポリアミン量を測定するサンプルの種類は特に制限されない。小腸の組織及び盲腸内容物のポリアミン量を測定し、比較することが好ましい。測定の結果、例えば、小腸におけるポリアミン量が増加し、盲腸内容物におけるポリアミン量が増加していない場合、当該微生物には、生体のポリアミン産生を促進する作用があると判定できる。
【００１７】
本発明の微生物をヒト又は他の動物に投与することにより、これらの生体におけるポリアミン量は投与前の１．１〜１．５倍に増加することが好ましい。これは、例えば、過剰な脂質蓄積の抑制や生体における脂質代謝亢進による肝臓中性脂肪増加を低減する作用を享受するためである。
【００１８】
１−２．菌学的特性
本発明の微生物は、ラクトバチラス・パラカゼイに属し、その好適な菌学的性質は以下の表１に示す通りである。
【００１９】
【表１】
0006479768.tif 000002
【００２０】
１−３．コロニー形成に関する特徴
本発明の微生物は、好ましくは、下記組成の寒天培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ａｇａｒ♯２８８２１０）上で、３７℃で１６時間、嫌気的条件下で培養した場合に、下記の特徴を有するコロニーを形成する。
＜培地組成＞（ｐＨ６．５±０．２）
プロテオースペプトンＮｏ．３    １０ｇ
牛肉エキス                      １０ｇ
酵母エキス                        ５ｇ
ブドウ糖                        ２０ｇ
ポリソルベート８０                １ｇ
クエン酸アンモニウム              ２ｇ
酢酸ナトリウム                    ５ｇ
硫酸マグネシウム              ０．１ｇ
硫酸マンガン                ０．０５ｇ
リン酸二カリウム                １５ｇ
寒天                            １５ｇ
水                        １０００ｍｌ
【００２１】
＜コロニーの形状＞
直径：１〜２ｍｍ
色調：白色
形：円形
隆起状態：半レンズ状
周縁：全縁
表面の形状：スムーズ
透明度：半透明
粘ちょう度：バター様
【００２２】
１−４．炭化水素資化性に関する特徴
本発明の微生物の炭化水素資化性は、好ましくは、下記の表２の通りである。
【００２３】
【表２】
0006479768.tif 000003
【００２４】
表中「＋」は陽性、「−」は陰性を意味する。
【００２５】
１−５．肝臓中性脂肪低減作用
本発明の微生物は、好ましくは、それがヒト又は他の動物に摂取或いは投与された場合に、肝臓中性脂肪を低減する作用を有する。中性脂肪の種類は、特に制限されないが、通常トリグリセリド（Ｔｒｉ−Ｇｒｉｃｅｒｉｄｅ）である。本発明の微生物の肝臓中性脂肪低減作用により、肝臓中に既に蓄積した中性脂肪の量を減らすことが可能であるため、本発明の微生物は、例えば、脂肪肝を伴うヒトの治療、若しくは緩和に有用であり、脂肪肝の危険性のあるヒトの脂肪肝への進行予防、又は健康維持にも有用である。また、肝臓中性脂肪の蓄積のＮＡＳＨ、肝硬変、肝癌、及び／又は心疾患への進行予防にも有用である。
【００２６】
本発明の微生物が有する肝臓中性脂肪低減作用は、公知の分析技術を用いて測定することが出来る。具体的には、モデル動物（例えば、マウス）を用いて以下の手順に従って測定することができる。即ち、マウスに一定期間本発明の微生物を摂取させ、その後肝臓を摘出し、Ｆｏｌｃｈらの方法（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９５７；  ２２６  （１）：４９７−５０９）に従って中性脂肪を抽出し、市販のキットを用いてその量を測定する。同様の手順で、本発明の微生物を摂取させていないマウスから摘出した肝臓における中性脂肪の量を測定し、これと本発明の微生物を摂取させたマウスの肝臓における中性脂肪の量とを比較することにより、肝臓中性脂肪低減作用を測定することができる。
【００２７】
１−６．エネルギー代謝促進作用
本発明の微生物は、好ましくは、ヒト又は他の動物に摂取、又は投与された場合、その生体におけるエネルギー代謝促進作用を有する。具体的には、本発明の微生物は、腸内組織（特に、小腸組織）及び／又は肝臓におけるエネルギー代謝促進作用を有する。本発明の微生物を利用することにより、エネルギー代謝促進が望ましいヒト又は他の動物の体質の改善、或いは、メタボリック症候群、及び／又は肥満症等の改善を図ることができる。
【００２８】
本発明の微生物によるエネルギー代謝促進作用は、実施例に示されるように、エネルギー代謝関連酵素をコードするｍＲＮＡの発現量の変化を測定することで確認することができる（Kondo et al., Am. J. Physiol. Endocrinol Metab, 291, E1092-E1099, 2006）。その他、本発明の微生物の摂取前後のヒト又は他の動物において産生される熱量の測定(Sasaki, Measurement of resting energy expenditure and substrates expenditure using Indirect Calorimetry, 24, 5, 1021-1025; Kaiyala et al., Comparative Biochemistry and Physiology, Part A 158, 252-264, 2011)、酸素摂取量と二酸化炭素放出量の測定(Klaus et al., International Journal of Obesity, 29, 615-623, 2005)、及び／又は代謝関連酵素活性の測定で確認することも可能である。
【００２９】
１−７．その他の作用
上記の他、本発明の微生物は、好ましくは、血糖値低減作用、血中中性脂肪低減作用、血中エンドトキシン低減作用、選択的飽和脂肪酸低減作用、小腸及び肝臓における脂肪酸β酸化促進作用、並びに／或いは、小腸におけるＴＬＲ−２mRNAの発現促進作用等も有する。よって、本発明の微生物は、その血糖値低減作用に基づいて糖尿病患者の治療に有用であり、その血中エンドトキシン低減作用に基づき、敗血症の治療に有用である。また、小腸及び肝臓における脂肪酸β酸化促進作用は、上述するエネルギー代謝促進に資する。更に、小腸におけるＴＬＲ−２ｍＲＮＡの発現は、小腸粘膜のバリア機能の向上、続く免疫賦活作用をもたらすため（Cario et al., Gastroenterology, 132, 4, 1359-1374, 2007）、炎症性腸疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、エンドトキシン血症、心臓疾患、アテローム性動脈硬化症、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎等の予防又は治療に有効であることが期待される。
【００３０】
１−８．代表菌株
代表的な本発明の微生物はＷＯＮ０６０４株であり、この菌株は、２０１２年２月２０日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国際寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４６８である。ＷＯＮ０６０４株は、上記１−１〜１−７の特徴を全て満たす。尚、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターは、２０１２年４月に独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センターと統合され、現在、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター特許生物寄託センター（NITE-IPOD）（〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）にてその微生物寄託業務は承継されている。
【００３１】
本発明の微生物は、単離された状態であることが好ましい。また、本発明の微生物は、上述するポリアミン産生促進作用、並びに肝臓中性脂肪低減作用及びエネルギー代謝促進作用を有する限り、生菌であっても死菌であってもよく、精製菌、粗精製菌、未精製の培地との混合状態、又は細胞抽出物の状態であってもよい。本発明の微生物は、生体内で継続的且つ効果的にポリアミン産生促進作用を発揮するという点から、生菌であることが好ましい。また生菌は通常用いられる凍結乾燥保存剤を加え、凍結乾燥を行った凍結乾燥物を冷蔵あるいは冷凍保存することで長期保存が可能となる。一実施形態において、本発明の微生物は凍結乾燥された状態にある。
【００３２】
１−９．本発明の微生物の取得方法
本発明の微生物の単離源は、特に制限されず、例えば、ラクトバチラス・パラカゼイが存在することが知られている食品（例えば、各種漬物、キムチ、牛乳、及びチーズ等）を単離源として取得することができる。本発明の微生物であるラクトバチラス・パラカゼイＷＯＮ０６０４株は鮒寿司から単離されたため、例えば、鮒寿司を単離源として本発明の微生物を単離することができる。鮒寿司とは、日本の琵琶湖周辺で生産される魚と米飯を乳酸発酵させた食品である。鮒寿司からの乳酸菌の単離は、例えば、Tuda et al.（Food Sci. Technol. Res., 18 (1), 77-82, 2012）に記載される方法に準じて行うことができる。
【００３３】
本発明の微生物の単離は、上述するポリアミン産生促進作用、肝臓中性脂肪低減作用、及びエネルギー代謝促進作用等を指標にして、公知のスクリーニング方法を利用して実施することが可能である。例えば、本発明の微生物は、（１）単離源となる食品等にポリアミン産生促進作用が存在するかどうかを確認し、（２）ポリアミン産生促進作用が確認された単離源を適当な緩衝液で希釈し、それを寒天地上に塗布して培養してコロニーを形成させ、（３）コロニーの中からポリアミン産性促進作用を有するコロニーを同定し、（４）そのコロニーから１６ＳｒＤＮＡを抽出して、配列を決定しラクトバチラス・パラカゼイに属するかどうか判別することによって単離することができる。
【００３４】
２．組成物
本発明の組成物は、上記本発明の微生物が添加された組成物である。組成物の種類及び形態は、本発明の微生物のポリアミン産生促進作用、及び、好ましくは肝臓中性脂肪低減作用やエネルギー代謝促進作用が阻害されない限り、特に制限されないが、これらの機能を動物、特にヒトの生体内で好適に発揮させる観点から、飲食品組成物や医薬組成物であることが好ましい。
【００３５】
本発明の組成物は、本発明の微生物が添加されていることにより、ポリアミン産生促進作用、肝臓中性脂肪低減作用及び／又はエネルギー代謝促進作用等を有する。よって、好適な一実施形態において、本発明の組成物をポリアミン産生促進剤、肝臓中性脂肪低減剤、及び／又はエネルギー代謝促進剤として利用することが可能である。尚、前記ポリアミン産生促進剤等は、組成物の形態でも良いが、本発明の微生物のみから成っていてもよい。
【００３６】
本発明の組成物は、本発明の微生物のポリアミン産生促進作用等を阻害しない限り、その形態や使用目的に応じて任意の他の成分を含むことができる。例えば、本発明の組成物には、本発明の微生物の生育を維持するという観点から、例えばスキムミルク及びデキストリン等のような本発明の微生物の生育に適した栄養成分が配合されていることが好ましい。
【００３７】
本発明の組成物に添加される本発明の微生物の量は、微生物によるポリアミン産生促進作用等が動物、特にヒトの生体内で発揮される限り特に制限されず、適宜設定することができる。例えば生菌換算で１．０×１０4〜１．０×１０16ＣＦＵ／ｇ組成物、好ましくは１．０×１０6〜１．０×１０１4ＣＦＵ／ｇ組成物、より好ましくは、１.０×１０８〜１．０×１０１２CFU/ｇ組成物程度の微生物を本発明の組成物に含有させることができる。
【００３８】
本発明の微生物が添加された飲食品組成物の種類や形態は、特に制限されず、一般的な食品及び飲料のほか、各種機能性食品（例えば、特定保健用食品、栄養補助食品、サプリメント、病者用食品、健康食品）が含まれる。このような食品に本発明の微生物を添加することにより、そのポリアミン産生促進作用等を更に高め、より効率的に生体内でのポリアミン産生を促進することが可能である改良型の飲食品組成物とすることができる。このような改良型の飲食品組成物は、生体の恒常性維持のために使用することもできる。
【００３９】
本発明の組成物が飲食品組成物である場合、その形態は、本発明の微生物によるポリアミン産生促進作用等が阻害されない限り特に制限されない。食品組成物としては、例えば、顆粒、細粒、粉末、カプセル、タブレット、ガム、ゼリー、グミ、プディング、バー、チップス、フレーク、及びその他一般食品を挙げることができる。一般食品としては、例えば、チョコレート、ビスケット、キャンディー、クッキー、打錠菓子類、アイスクリーム、シャーベット、うどん、そば、パスタ、そうめん等を挙げることができる。飲料組成物としては、粉末飲料、清涼飲料、乳飲料、栄養飲料、炭酸飲料、ゼリー飲料等の各種の飲料とすることができる。機能性食品の形態としては、例えば、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット、糖衣錠、舌下錠等の形状のものを挙げることができる。
【００４０】
飲食品組成物に本発明の微生物を添加する手段は特に制限されず、例えば、飲食品組成物の製造過程加工過程又は最終過程において、添加、混和、浸潤などの方法で実施することができる。また、本発明の微生物は、飲食品を摂取する際に、粉末、顆粒、カプセル、シロップ、タブレット等の形状で添加することも可能である。
【００４１】
本発明の組成物が医薬組成物である場合、本発明の微生物を薬学的に許容される担体と配合することによって、各種の医薬形態とすることが可能である。薬学的に許容される担体は、本発明の微生物のポリアミン産生促進作用等が阻害されない限り特に制限されず、例えば、医薬の分野で通常用いられる、各種の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、希釈剤等を挙げることができる。本発明の微生物が添加された医薬組成物の形態は、特に制限されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤とすることができる。経口投与に適した剤形であることが好ましい。
【００４２】
本発明の医薬組成物は、本発明の微生物を含有することにより、ポリアミン産生促進作用、並びに、好ましくは、肝臓中性脂肪低減作用及びエネルギー代謝促進作用を発揮する。従って、本発明の医薬組成物は、生体内のポリアミン産生促進用、肝臓中性脂肪低減用及び／又はエネルギー代謝促進用等の医薬組成物として利用することができる。また、本発明の微生物による肝臓中性脂肪低減作用に基づいて、本発明の医薬品組成物を脂肪肝の予防及び／又は治療用、ＮＡＳＨ、肝硬変、及び／又は肝癌の進行予防、又は治療のための医薬品組成物として利用することも可能である。さらに本発明の微生物によるエネルギー代謝促進作用に基づいて、本発明の医薬品組成物をメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療用の医薬品組成物として利用することも可能である。
【００４３】
本発明の医薬組成物に添加される本発明の微生物の量は、上記組成物一般について規定した量と同様である。本発明に医薬組成物の投与量は、それを摂取するヒト又は動物の症状、年齢、体重等を考慮して適宜設定することが可能である。
【００４４】
本発明の医薬組成物の投与形態は、本発明の微生物によるポリアミン産性促進作用等が体内で発揮される限り特に制限されないが、好ましくは経口投与である。
【００４５】
３．治療及び緩和方法
本発明の微生物は、動物、特にヒトの生体におけるポリアミン産生促進作用を有するところ、ポリアミンには、アンチエンジング作用、動脈硬化の進行遅延作用、抗急性炎症や慢性炎症を抑制する作用、中性脂肪低減作用、インスリン抵抗性改善作用、抗肥満作用、コレステロール値低減作用、基礎代謝向上作用、抗アレルギー作用、免疫賦活作用等が知られている。よって、本発明の微生物を投与することを含む、これらの作用を利用した各種疾患を予防、治療、又は改善する方法を提供することができる。また、好適な一実施形態において、本発明の微生物は肝臓中性脂肪低減作用を有する。よって、本発明の微生物を肝臓中性脂肪の低減が必要であるヒト又は動物に投与することにより、当該肝臓中性脂肪を低減することができる。更に、好適な一実施形態において、本発明は生体におけるエネルギー代謝促進作用を有する。よって、本発明の微生物をエネルギー代謝の促進が必要なヒトや動物に投与することにより、体重増加抑制、肥満抑制、体脂肪の低減、内臓脂肪の低減、メタボリックシンドローム予防、改善又は治療を図ることができる。
【００４６】
上記の方法を実施するための本発明の微生物又はそれが添加された本発明の医薬組成物の投与量は、患者の症状などに応じて適宜設定する事が可能であるが、例えば、１．０×１０５〜１．０〜１０１５ＣＦＵ／ｋｇ／日とすることができる。
【実施例】
【００４７】
実施例１  微生物の単離
鮒寿司をホモジナイズして０．８〜１．０ｇ秤量し、１５ｍｌの遠沈管に入れ、１０倍量の生理食塩水を加えて攪拌した。攪拌した懸濁液１ｍｌを採取し、１５ｍｌ遠沈管に生理的食塩水９ｍｌと共に加え段階的に希釈した。各希釈液から１００μｌを採取し、ＭＲＳ寒天培地に接種し、２４時間３７℃で嫌気的条件下で培養した。培養後、単一コロニーになるまで純化した。なお一連の操作は無菌操作で行った。【００４８】
単離されたＷＯＮ０６０４株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１−１−１）に寄託した。その寄託番号は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４６８である。【００４９】
実施例２  ポリアミン産生促進作用
４週齢のＫＫ−Ａｙマウス（２型糖尿病モデル、雄性）を１６時間絶食し、尾静脈より毛細血管１本にて採血した（約７５μｌ）。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ（１５，０００×ｇ）×５分）で血漿を調製し、血中グルコース濃度、血中中性脂肪濃度を測定した。健康状態に異常を認めないマウスを、体重（群分け前日）及び血中グルコース濃度に偏りがないように、ＳＡＳソフトウェア（Ｒ９．１ＳＡＳ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ）を用いた層別無作為抽出法によりコントロール群と試験群に分けた。コントロール群には対照食（ＡＩＮ−９３Ｇ）を、試験群にはＷＯＮ０６０４株を１．０×１０９ＣＦＵ／日量（生菌）の割合で混合した試験食を、２８日間自由摂取させた。その後、盲腸と小腸組織の解剖を行い、盲腸内容物及び小腸組織のポリアミン濃度を測定した。コントロール群のポリアミン濃度を１として試験群の相対値を表３に示した。ｎ数は、盲腸内容物および小腸組織ともに３である。盲腸内腰物中のポリアミン濃度は、Ｏ−フタルアルデヒドを用いたオンカラム誘導法で測定した。小腸組織内のポリアミン濃度は、ＣＥ−ＴＯＦＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて測定した。有意差検定はWelchのt-検定を用いて行った。【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【００５２】
表４に示す通り、ＷＯＮ０６０４株を摂取することにより、盲腸内でのポリアミン濃度は増加しなかった。一方、表３に示す通り、小腸内ではプトレシンは有意に増加し、スペルミジン、スペルミンも増加傾向が認められたことから、WON０６０４株の摂取により、小腸内でポリアミンが増加することが判明した。これにより、本発明の微生物は小腸におけるポリアミン合成能自体を促進させる作用（即ち、ポリアミン合成促進作用）を有することが明らかとなった。【００５３】
実施例３  エネルギー代謝促進作用
実施例２と同様にコントロール群と試験食群に4週齢のKK-Ayマウス（2型糖尿病モデル、雄性）を分け、コントロール群には対照食（AIN-93G）,試験食群にはWON0604株を1，0×109CFU/日（生菌）を混合した試験食を28日間自由摂取させた後、肝臓及び小腸での各種エネルギー代謝関連酵素のmRNA発現レベルを測定した。mRNAの抽出及び精製は、RioPure(登録商標)キット（Ambion社製）を用いて実施した。その結果を、コントロール群の値を1とした試験食群の相対値を下記の表5に示した。尚、n数は13であり、相対値は平均値を用いて算出した。【００５４】
【表５】
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【００５５】
【表６】
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【００５６】
[表５]及び[表６]で示されるように、本発明の微生物を摂取することで、肝臓及び小腸におけるAcox1,Ucp2及びAcot2のmRNA発現量が増加することが確認された。これらの遺伝子発現とエネルギー代謝促進との関係性はKondo等によって報告されている（Kondo H, et. al.,  Am J Physiol.Endocrinol Metab 2006;291(5):E1092-9）。この結果から、本発明の微生物の摂取によって、ポリアミンの産生促進効果と相俟って、肝臓及び小腸におけるエネルギー代謝の促進の可能性が確認された。【００５７】
実施例4  肝臓中性脂肪低減作用
実施例２と同様にコントロール群と試験群に４週齢のＫＫ−Ａｙマウス（２型糖尿病モデル、雄性）を分け、コントロールには対照食（ＡＩＮ−９３Ｇ）を２８日間自由摂取させた。試験群にはＷＯＮ０６０４株、ＷＯＮ１０５２株、ＷＯＮ１０８１株、ＷＯＮ１０３３株を１．０×１０９ＣＦＵ／日量（生菌）の割合で配合した試験食を３％混餌した試験食を２８日間自由摂取させた。これらのＷＯＮ０６０４株以外の乳酸菌株は、胃酸および胆汁酸に耐性のある菌株をin vitro試験にて選抜し、さらに血中および肝臓中性脂肪に対して有効性を見込めるものをＫＫ−Ａｙマウスを用いた探索的な動物試験にて選抜した。その後、絶食条件にて各マウスから肝臓を摘出した。肝臓左葉の外側領域を秤量し、Ｆｏｌｃｈらの方法（Ｆｏｌｃｈ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９５７；  ２２６（１）：４９７−５０９）で脂質画分を抽出してイソプロパノールにて可溶化させた後、市販の測定キット（トリグリセライド  Ｅ−テストワコー：和光純薬工業（株））を用いて中性脂肪濃度を測定した。測定結果の平均値を表７に示す。尚、各試験群のマウスの数は８である。有意差検定はｔ検定を用いて行った。【００５８】
表７に示されるように、ＷＯＮ０６０４株を摂取させたマウスのみ、コントロール群と比較して有意差をもって肝臓ＴＧ濃度が低減され、ＷＯＮ０６０４株以外の乳酸菌を摂取させた比較試験群では、肝臓TG濃度低下作用を示さなかった。この結果から本発明の微生物が、ポリアミン産生促進効果と相俟って、肝臓中性脂肪低減作用を有することが確認された。【００５９】
【表７】
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【受託番号】
【００６０】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４６８