(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）アシネトバクター属微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAが導入されることによって非特異的付着性が付与又は増強された微生物を担体に接触させ、該微生物を該担体に付着させる工程；
（２）前記担体に付着した前記微生物を、以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）、即ち、
（Ａ）カザミノ酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｂ）乳酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｃ）酵母抽出物を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｄ）トリプトンを0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｅ）スキムミルクを0.1％（w/v）以上含有する；
（Ｆ）グルタミン酸を1mM以上含有する；
の中の少なくとも一つを満足する条件の溶液で処理し、前記担体から前記微生物を脱離させる工程、を含む、微生物の着脱方法であって、
前記DNAが、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA;
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA；又は
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列から、（ｉ）9517〜10611位のストークドメイン、（ｉｉ）8989〜9444位のヘッドドメイン、又は（ｉｉｉ）カルボキシ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域をコードする領域、を削った配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、である、前記方法。
【請求項２】
工程（１）と工程（２）の間に以下の工程（ｉ）を行う、請求項１に記載の方法：
（ｉ）前記担体に付着した前記微生物を被処理液に接触させ、接触状態を維持する工程。
【請求項３】
前記微生物が特定酵素の産生能を有し、前記被処理液が該特定酵素の基質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（２）の後に以下の工程（３−１）及び／又は工程（３−２）を行う、請求項１に記載の方法：
（３−１）脱離した前記微生物を回収する工程；
（３−２）前記担体を回収する工程。
【請求項５】
（Ｉ）アシネトバクター属微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAが導入されることによって非特異的付着性が付与又は増強された微生物であって、担体に付着したものを、以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）、即ち、
（Ａ）カザミノ酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｂ）乳酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｃ）酵母抽出物を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｄ）トリプトンを0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｅ）スキムミルクを0.1％（w/v）以上含有する；
（Ｆ）グルタミン酸を1mM以上含有する；
の中の少なくとも一つを満足する条件の溶液で処理する工程、を含む、微生物の着脱方法であって、
前記DNAが、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA;
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA；又は
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列から、（ｉ）9517〜10611位のストークドメイン、（ｉｉ）8989〜9444位のヘッドドメイン、又は（ｉｉｉ）カルボキシ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域をコードする領域、を削った配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、である、前記方法。
【請求項６】
工程（Ｉ）の後に以下の工程（３−１）及び／又は工程（３−２）を行う、請求項５に記載の方法：
（３−１）脱離した前記微生物を回収する工程；
（３−２）前記担体を回収する工程。
【請求項７】
前記条件（Ａ）におけるカザミノ酸の濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｂ）における乳酸の濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｃ）における酵母抽出物の濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｄ）におけるトリプトンの濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｆ）におけるグルタミン酸の濃度が10mM以上である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記DNAがataA遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAとともに、以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAが前記微生物に導入されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるDNA；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA。
【請求項１０】
前記DNAを包含する以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAが前記微生物に導入されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるDNA；
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有するDNA。
【請求項１１】
前記微生物がエシェリヒア属細菌である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の固定化技術に関する。詳細には、付着性を付与した微生物の着脱方法（担体への付着及びその後の脱離を伴う方法）及び脱離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素や微生物細胞などの生体触媒はファインケミカルや汎用化学品、医薬中間体、バイオ燃料などの生産に有用である。生体触媒は常温・常圧・中性といった温和な条件下で、効率的かつ高選択的な反応を触媒する。しかし、生体触媒を利用するバイオプロセスは生産コストが高く、このことが実用化の妨げとなっていた。
【０００３】
生体触媒の固定化は、触媒の繰返し使用や連続反応を可能にすること、反応器からの触媒や生産物の回収・分離を容易にすること、触媒の再生が容易になること、体積当たりの触媒濃度の高密度化が可能になることなどから、バイオプロセスの低コスト化における重要な戦略と考えられてきた。また微生物細胞を丸ごと使用する全細胞触媒の利用は、酵素の分離精製が不要になること、触媒としての安定性が分離した酵素より高いこと、増殖や再活性化が可能であること、高価なNADHなどの還元力を外部から供給する必要がないことなどの理由から、バイオプロセスの低コスト化に大きく寄与する。特に最近、全細胞利用の大きな問題点であった細胞表層における物質輸送律速や障害の問題も、微生物細胞の表層に酵素を局在させる表層提示技術の登場により、克服の道が開かれつつある。
【０００４】
微生物細胞の固定化の従来法として、ゲル包括法、架橋法、共有結合法、物理吸着法があった。最もよく使われてきたゲル包括法には、ゲル内部における物質輸送律速、ゲルからの細胞の漏出、ゲルの脆弱性などの問題があった。架橋法や共有結合法では、架橋剤による阻害や結合そのものによる細胞の不活性化などの問題があった。物理吸着法では、通常の微生物細胞を有効に固定するだけの吸着力は望めず、一部の糸状菌などにしか有効ではなかった。最近、バイオフィルムを天然の固定化法として利用する方法論も報告されているが（非特許文献１〜８）、バイオフィルム形成能力と目的の反応活性の双方を有する微生物をスクリーニングしてくるしか方法はなく、微生物や反応の種類について汎用性は低い。また、自然に形成されるバイオフィルムに頼るため効率的な方法とは言えず、実際の物質生産に適用できるレベルではない。よって、従来の固定化法は真に有効であるとは言えず、問題点も多いため、汎用的かつ有効な固定化法の開発が望まれていた。
【０００５】
本発明者が以前にバイオフィルターから単離したAcinetobacter sp. Tol 5（アシネトバクター属細菌Tol 5株）は、細胞自己凝集性が高く、また、疎水性の各種プラスチック担体から親水性のガラス、金属表面まで、様々な材料表面に対して高い付着性を示す非病原性のグラム陰性細菌である。他の微生物では報告例のないこのような付着特性をもたらす因子として、細菌細胞表層に存在する新規のバクテリオナノファイバーを発見し、さらにナノファイバーを構成する新しい蛋白質を同定した。この蛋白質は三量体型オートトランスポーターアドヘシン（TAA）ファミリーに属しており、本発明者がAtaAと名付けた（非特許文献９）。TAAは種々のグラム陰性病原性細菌が宿主の細胞やコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンといった細胞外マトリックスに特異的に接着し、宿主に感染するために有する病原性因子として知られている（非特許文献１０）。TAAファミリーに属する蛋白質はホモ三量体を形成し、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、頭部−柄（ストーク）−外膜結合部位という共通の全体構造をとる。しかし、シングルペプチド鎖のアミノ酸残基数が300ほどの小さなものから3000を超える大きなものまで存在し、アミノ酸配列も多様である。本発明者が見つけたAtaAのペプチド鎖は3630アミノ酸から成り、TAAの中でも最大級である。長いストークに複数の長い繰返し配列がモザイク状に並ぶユニークな一次構造をしている。AtaAのみが様々な表面に対し非特異的で高い接着性を示す。また、TAAの研究は病原性細菌に集中しており、Tol 5のような非病原性細菌についてのTAAの研究例は皆無である。以上の研究成果に基づき、本発明者は、AtaAをコードする遺伝子を導入することによって標的微生物に非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する方法を報告した（特許文献１）。尚、特許文献１ではAtaA及びそれをコードする遺伝子（ataA遺伝子）をそれぞれAadA及びaadA遺伝子と呼称していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００９／１０４２８１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１４／１５６７３６号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Junter, G. A.; Jouenne, T., Immobilized viable microbial cells: from the process to the proteome . . . or the cart before the horse. Biotechnol. Adv. 2004, 22, (8), 633-658.
【非特許文献２】Qureshi, N.; Annous, B. A.; Ezeji, T. C.; Karcher, P.; Maddox, I. S., Biofilm reactors for industrial bioconversion processes: employing potential of enhanced reaction rates. Microb. Cell. Fact. 2005, 4, 24.
【非特許文献３】Li, X. Z.; Webb, J. S.; Kjelleberg, S.; Rosche, B., Enhanced benzaldehyde tolerance in Zymomonas mobilis biofilms and the potential of biofilm applications in fine-chemical production. Applied and Environmental Microbiology 2006, 72, (2), 1639-1644.
【非特許文献４】Gross, R.; Hauer, B.; Otto, K.; Schmid, A., Microbial biofilms: new catalysts for maximizing productivity of long-term biotransformations. Biotechnology and Bioengineering 2007, 98, (6), 1123-1134.
【非特許文献５】Li, X. Z.; Hauer, B.; Rosche, B., Single-species microbial biofilm screening for industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 76, (6), 1255-1262.
【非特許文献６】Rosche, B.; Li, X. Z.; Hauer, B.; Schmid, A.; Buehler, K., Microbial biofilms: a concept for industrial catalysis? Trends Biotechnol 2009, 27, (11), 636-43.
【非特許文献７】Halan, B.; Buehler, K.; Schmid, A., Biofilms as living catalysts in continuous chemical syntheses. Trends Biotechnol 2012, 30, (9), 453-65.
【非特許文献８】Cheng, K. C.; Demirci, A.; Catchmark, J. M., Advances in biofilm reactors for production of value-added products. Appl Microbiol Biotechnol 2010, 87, (2), 445-56.
【非特許文献９】Ishikawa, M.; Nakatani, H.; Hori, K., AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces. PLoS One 2012, 7, (11), e48830.
【非特許文献１０】Linke, D.; Riess, T.; Autenrieth, I. B.; Lupas, A.; Kempf, V. A., Trimeric autotransporter adhesins: variable structure, common function. Trends Microbiol. 2006, 14, (6), 264-270.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の通り、本発明者は以前に、唯一無二な接着特性を示し、しかも構造が比較的単純であるAtaAを利用する新規の微生物固定化法を発明した（特許文献１）。即ち、ataA遺伝子を付着性や凝集性を有さない微生物に導入することにより、付着性や凝集性を付与することに成功した。この手法は物理吸着法の一つと言えるが、その吸着力はAtaAの高い接着力に基づくため、従来法とは比較にならないほどの高い固定化力を示す。しかもataA遺伝子を導入して発現させることができれば、いろいろな微生物に付着力を付与することができるので、汎用性が高い。また、細胞外多糖などのマトリックスによって付着しているバイオフィルムやゲル包括法とは異なり、細胞を表層蛋白質により直接的に表面に固定しているため、マトリックス中での物質輸送律速の問題はない。担体の材質や形状も自由に設計できる。まさに、唯一無二の有効で汎用的な微生物固定化法である。
【０００９】
本発明者が報告した方法（特許文献１）は、産業上有用な微生物の固定化を可能とする有用性の高い技術であり、そこで利用するAtaAは、従来の固定化技術における種々の課題を克服できる可能性を秘めている。本発明者はAtaAの利用・応用を進めるために、AtaAの付着特性を詳細に検討した。その結果、イオン強度を変更することによって標的微生物の付着性を操作できるという驚くべき事実を見出し、特許出願を行った（特許文献２）。イオン強度の変更という簡便な操作によって、微生物の担体への固定化及び担体からの脱離を行えることは、実用上、極めて有益である。しかしながら、利用形態によっては、イオン強度の変更が困難な場合がある。例えば、大規模で実施すると、着脱（又は脱離）の際に大量の溶液の交換が必要になり、場合によっては操作が煩雑化する。AtaAの有用性及び汎用性に鑑みると、今後、益々その用途は拡大すると考えられ、様々な利用形態に対応すべく、付着性を操作するための新たな手段の提供が望まれる。本発明の課題は、このような要望に応え、AtaAの一層の利用、応用を図ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題の下で本発明者はAtaAの付着特性を更に検討することにした。その結果、特定の物質／成分が濃度依存的にAtaAの付着を阻害するとともに、AtaAによる菌体の凝集も阻害する（換言すれば分散を促す）ことが判明した。後者の事実に関して特筆すべきは、形成された凝集塊を分散させる効果及び表面に固定された微生物凝集塊を表面から引き剥がす効果も認められた点である。
以上の成果に基づき、以下の発明が提供される。尚、本発明によれば、着脱又は脱離の条件として複数の選択肢が提供される。従って、使用する微生物への影響を考慮して最適な条件を選択することが可能となり、AtaAを利用した固定化技術の汎用性及び利用価値が高められる。
［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、微生物の着脱方法：
（１）アシネトバクター属微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAが導入されることによって非特異的付着性が付与又は増強された微生物を担体に接触させ、該微生物を該担体に付着させる工程；
（２）前記担体に付着した前記微生物を、以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）、即ち、
（Ａ）カザミノ酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｂ）乳酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｃ）酵母抽出物を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｄ）トリプトンを0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｅ）スキムミルクを0.1％（w/v）以上含有する；
（Ｆ）グルタミン酸を1mM以上含有する；
の中の少なくとも一つを満足する条件の溶液で処理し、前記担体から前記微生物を脱離させる工程。
［２］工程（１）と工程（２）の間に以下の工程（ｉ）を行う、［１］に記載の方法：
（ｉ）前記担体に付着した前記微生物を被処理液に接触させ、接触状態を維持する工程。
［３］前記微生物が特定酵素の産生能を有し、前記被処理液が該特定酵素の基質を含む、［２］に記載の方法。
［４］工程（２）の後に以下の工程（３−１）及び／又は工程（３−２）を行う、［１］に記載の方法：
（３−１）脱離した前記微生物を回収する工程；
（３−２）前記担体を回収する工程。
［５］以下の工程（Ｉ）を含む、微生物の脱離方法：
（Ｉ）アシネトバクター属微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAが導入されることによって非特異的付着性が付与又は増強された微生物であって、担体に付着したものを、以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）、即ち、
（Ａ）カザミノ酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｂ）乳酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｃ）酵母抽出物を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｄ）トリプトンを0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｅ）スキムミルクを0.1％（w/v）以上含有する；
（Ｆ）グルタミン酸を1mM以上含有する；
の中の少なくとも一つを満足する条件の溶液で処理する工程。
［６］工程（Ｉ）の後に以下の工程（３−１）及び／又は工程（３−２）を行う、請求項５に記載の方法：
（３−１）脱離した前記微生物を回収する工程；
（３−２）前記担体を回収する工程。
［７］前記条件（Ａ）におけるカザミノ酸の濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｂ）における乳酸の濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｃ）における酵母抽出物の濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｄ）におけるトリプトンの濃度が0.1％（w/v）以上であり、
前記条件（Ｆ）におけるグルタミン酸の濃度が10mM以上である、
［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］前記DNAがataA遺伝子である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］前記DNAが以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のDNAである、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなるDNA;
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA。
［１０］オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAとともに、以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAが前記微生物に導入されている、［９］に記載の方法：
（ａ）配列番号３で表される塩基配列からなるDNA；
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNA。
［１１］前記DNAを包含する以下の（ａ）又は（ｂ）のDNAが前記微生物に導入されている、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法：
（ａ）配列番号５で表される塩基配列からなるDNA；
（ｂ）配列番号５で表される塩基配列と90％以上の相同性を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有するDNA。
［１２］前記微生物がエシェリヒア属細菌である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】付着阻害試験の結果。アシネトバクター sp. Tol 5野生株のポリスチレンプレートへの付着に対する各種添加物（カザミノ酸、乳酸、酵母抽出物、トリプトン、スキムミルク、グルタミン酸、）の阻害能を評価した。グルコース及びセロビオースを比較対照とした。
【図２】図１の続き。
【図３】細胞自己凝集阻害試験の結果。アシネトバクター sp. Tol 5野生株の凝集に対する各種添加物（カザミノ酸、乳酸、グルタミン酸、酵母抽出物、トリプトン）の阻害能を評価した。グルコース及びグリセロールを比較対照とした。添加量は1%(w/v)又は100mMとした。
【図４】付着阻害試験の結果。アシネトバクター sp. Tol 5野生株のガラスプレートへの付着に対する各種添加物（カザミノ酸、乳酸）の阻害能を評価した。処理後のスライドガラスを共焦点レーザー顕微鏡で観察した。上段は上方からの観察、下段は側方からの観察。左：無添加の無機塩培地で処理、中央：カザミノ酸（2.5%（w/v））で処理、右：乳酸ナトリウム（2.5%（w/v））で処理。
【図５】ガラスプレートに付着した菌体の剥離試験の結果。ガラスプレートへ付着したアシネトバクター sp. Tol 5野生株に対する剥離効果をカザミノ酸及び乳酸について検討した。一連の処理後、スライドガラスに付着している菌体を蛍光染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。上段は上方からの観察、下段は側方からの観察。左：無添加の無機塩培地で処理、中央：カザミノ酸（2.5%（w/v））で処理、右：乳酸ナトリウム（2.5%（w/v））で処理。
【図６】ataA遺伝子の導入によって付着性を付与した微生物を用いた付着阻害試験の結果。ataA遺伝子を導入したアシネトバクター属細菌ADP1株のポリスチレンプレートへの付着に対するカザミノ酸と乳酸の阻害能を評価した。グルコースを比較対照とした。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明はアシネトバクター属微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンを利用した微生物の着脱方法に関する。本発明において「着脱方法」とは、微生物を担体に付着させる工程（操作）と、担体に付着した当該微生物を脱離させる工程（操作）を含む方法をいう。
【００１３】
オートトランスポーターアドヘシンとは、グラム陰性細菌の持つ接着性ナノファイバーとして報告されている蛋白質であり、宿主の組織や細胞表層分子、細胞外マトリックスと特異的に相互作用することが知られている。オートトランスポーターアドヘシンは、付着、浸入、細胞毒性、血清耐性、細胞間伝播といった機能を持つと言われている。オートトランスポーターアドヘシンは、N末端シグナルペプチド、内部パッセンジャードメイン、C末端トランスロケータードメインという共通の領域編成を持っている。その中でもC末端トランスロケータードメインはこの属を定義するドメインである。オートトランスポーターアドヘシンの分泌はシグナルペプチドによって開始され、Secシステムによる内膜の通過から始まる。続いて、トランスロケータードメインが外膜へ挿入され、βバレル構造を形成する。最終的にパッセンジャードメインはバレルで形成されたトンネル内を通過し菌体表面へその姿を現す。オートトランスポーターアドヘシンは、単量体オートトランスポーターアドヘシンと三量体オートトランスポーターアドヘシンに分類される（Shane E.Cotter,Neeraj K.Surana and Joseph W.St GemeIII 2005.Trimeric autotransporters:a distinct subfamily of Autotransporter proteins.TRENDS in Microbiology.13:199-205）。単量体オートトランスポーターアドヘシンのトランスロケータードメインは、１２の膜貫通逆平行βシートからなるβバレル構造を、一つのサブユニットから形成していると考えられている。しかし三量体オートトランスポーターアドヘシンのトランスロケータードメインは、外膜中で熱に安定でSDSに強い三量体を形成しており、４つのβシートを持つサブユニットがオリゴマー化し三つのサブユニットから１２ストランドのβバレル構造を形成していることが知られている。さらに、事実上全ての単量体オートトランスポーターアドヘシンのパッセンジャードメインはトランスロケータードメインと非共有結合でバクテリア表面につながれるか、細胞外に放出されるのに対し、全ての三量体オートトランスポーターアドヘシン蛋白質ではパッセンジャードメインはトランスロケータードメインと共有結合でつながれたままであると考えられている。
【００１４】
三量体オートトランスポーターアドヘシンは、TAA（トリメリックオートトランスポーターアドヘシン）と略称され、共通オリゴマー構造のコイルドコイルをつくる新しいクラスとしてOcaファミリー（Oligomeric Coiled-coil Adhesin Family）とも呼ばれている（Andreas Roggenkamp,Nikolaus Ackermann,Christoph A.Jacobi,Konrad Truelzsch,Harald Hoffmann,and Jurgen Heesemann 2003.Molecular analysis of transport and oligomerization of the Yersinia enterocolitica adhesin YadA.J Bacteriol.185:3735-3744）。
【００１５】
本発明の着脱方法は、後述の実施例に示す通り、特定の物質がAtaAの接着性をコントロールでき、しかも、凝集阻害効果も発揮するという、驚くべき知見に基づくものであり、以下の工程（１）及び（２）を含む。
（１）アシネトバクター属微生物由来のオートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAが導入されることによって非特異的付着性が付与又は増強された微生物を担体に接触させ、該微生物を該担体に付着させる工程
（２）前記担体に付着した前記微生物を、以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）、即ち、
（Ａ）カザミノ酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｂ）乳酸を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｃ）酵母抽出物を0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｄ）トリプトンを0.01％（w/v）以上含有する；
（Ｅ）スキムミルクを0.1％（w/v）以上含有する；
（Ｆ）グルタミン酸を1mM以上含有する；
の中の少なくとも一つを満足する条件の溶液で処理し、前記担体から前記微生物を脱離させる工程
【００１６】
工程（１）、即ち付着工程ではまず、アシネトバクター属微生物由来のTAAをコードするDNA（以下、「付着性付与DNA」と呼称する）が導入されることによって非特異的付着性が付与又は増強された微生物（以下、「付着性付与微生物」と呼称する）を用意する。
【００１７】
付着性付与DNAとしては、好ましくは、アシネトバクター sp.Tol5株から単離・同定されたataA遺伝子が用いられる。ataA遺伝子は配列番号１で表される塩基配列からなり、配列番号２で表される蛋白質AtaAをコードする。アシネトバクター sp.Tol5株は、排ガス処理リアクターから分離されたトルエン分解能を有する株であり、受託番号FERM P-17188として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ  ＩＰＯＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に寄託されている。
【００１８】
好ましい一態様では配列番号１で表される塩基配列からなるDNAが付着性付与DNAとして採用されるが、該DNAと機能的に同等のDNAを用いることにしてもよい。配列番号１で表される塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAとしては、配列番号１で表される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性（又は同一性）を有する塩基配列からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNAが挙げられる。あるいは、配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNAが挙げられる。さらに、配列番号１で表される塩基配列の一部からなり、微生物に対して非特異的付着性を付与又は増強する活性を有する蛋白質をコードするDNA、換言すれば、配列番号１で表される塩基配列から数十から数千の連続する塩基配列を１箇所又は数箇所削った塩基配列からなり、それによって翻訳される蛋白質が非特異的付着性を付与又は増強する活性が失われない欠損遺伝子のDNAが挙げられる。
【００１９】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件が挙げられるが、高ストリンジェントな条件が好ましい。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、0.1％  SDSで洗浄する条件であり、好ましくは50℃、5×SSC、0.1％  SDSで洗浄する条件である。高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば65℃、0.1×SSC及び0.1％  SDSで洗浄する条件である。
【００２０】
塩基配列における変異も、シグナルペプチド、ヘッドドメイン、ネックドメイン、ストークドメイン及びメンブレンアンカードメインからなる当該ドメイン構造を維持するものであることが好ましい。配列番号１で表される塩基配列において、シグナルペプチドは1〜171位の塩基に相当し、ヘッドドメインは322〜807位及び8989〜9444位の塩基に相当し、ネックドメインは886〜957位及び9445〜9516位の塩基に相当し、ストークドメインは1216〜8898位及び9517〜10611位の塩基に相当し、メンブレンアンカーはドメイン10612〜10890位の塩基に相当する。
【００２１】
配列番号１で表される塩基配列の一部からなるDNAにおいて、削ることが可能な数十から数百の連続する塩基配列とは、好ましくは片方あるいは両方のストークドメイン、片方のヘッドドメイン、片方のネックドメインをコードする配列部位で、そのうちの一つの連続配列又は複数の連続配列を削ってもよい。より好ましくは前述した各ドメインの部位のうちアミノ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域をコードする領域（322〜8898位）又はカルボキシ末端に近いヘッドドメインからストークドメインまでの全領域をコードする領域（8989〜10611位）を削るのが好ましい。さらに好ましくはストークドメインのコード領域に複数見られる繰り返し領域を、繰り返しがなくなって各一回ずつ出てくるように削るのが好ましい。最も好ましくはストークドメインのコード領域に複数見られる繰り返し領域のどれか一箇所削ることが好ましい。
【００２２】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAとともに、配列番号３で表される塩基配列からなるDNAを標的微生物に導入することにより、標的微生物の非特異的付着性をさらに向上させることができる。配列番号３で表される塩基配列からなるDNAと機能的に同等の遺伝子を導入してもよい。配列番号３で表される塩基配列からなるDNAと機能的に同等のDNAとしては、配列番号３で表される塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは98％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAが挙げられる。あるいは、配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAが挙げられる。尚、配列番号３で表される塩基配列は、Tol5株のAtaA遺伝子のすぐ下流に見出された配列であり、グラム陰性細菌が有する外膜蛋白質ompA遺伝子やBamE遺伝子、omlA遺伝子などと相同性を示す蛋白質のORFをコードする。当該ORFであるTol5-tpgA（特許文献１ではTol5-OmpAと呼称されていた）は795bpの遺伝子（配列番号３）でコードされる264アミノ酸（配列番号４）からなる。
【００２３】
オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAを含むオペロンを標的微生物に導入してもよい。例えば、配列番号５で表される塩基配列からなるDNAを標的微生物に導入することにより、オートトランスポーターアドヘシンをコードするDNAとともに上記外膜蛋白質をコードするDNAを標的微生物に導入することができる。該オペロンと機能的に同等のオペロンを導入してもよい。機能的に同等のオペロンとしては、配列番号５で表される塩基配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上の相同性を有する塩基配列からなり、宿主微生物に対して非特異的付着性及び／又は凝集性を付与又は増強する活性を有するDNAからなるオペロンが挙げられる。配列番号５で表される塩基配列はTol5株から単離・同定されたオペロン（ataA-tpgAオペロン）であり、プロモーター／リボソーム結合部位（1〜106位）、ataA遺伝子（107〜10999位）及びTol5のtpgA遺伝子（11064〜11858位）を含む。尚、当該オペロンを組込んだベクターで形質転換したE.coli DH5αは、「DH5α-XLTOPO::aadA-ompA」として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−４９０（受託日２００８年（平成２０年）２月１９日）として寄託されている。
【００２４】
付着性付与DNAを導入する微生物（標的微生物）には様々な微生物を用いることができる。標的微生物としては、特に制限されないが、例えば、非特異的付着性がない又は弱い微生物が挙げられる。標的微生物は野生株、変異株、遺伝子組換え株のいずれであってもよい。本発明の用途に応じて適切な微生物が選択される。標的微生物として利用し得る微生物を例示すると、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、例えば、エシェリヒア  コリ（Escherichia coli）、アシネトバクター（Acinetobacter）属細菌、例えばアシネトバクター  カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaceticus）、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、例えばラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌、例えばシュードモナス  プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス  フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、アエロモナス（Aeromonas）属細菌、例えばアエロモナス  キャビエ（Aeromonas caviae）、アルカリゲネス（Alcaligenes）属細菌、例えばアルカリゲネス  レータス（Alcaligenes latus）、ザントモナス（Xanthomonas）属細菌、例えばザントモナス  カンペストリス（Xanthomonas campestris）、デスルフォモナイル（Desulfomonile）属細菌、例えばデスルフォモナイル  ティージェイ（Desulfomonile tiedjei）、デスルフォモナス（Desulfuromonas）属細菌、例えばデスルフォモナス  クロロエテニカ（Desulfuromonas chloroethenica）、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属細菌、例えばクロモバクテリウム  チヨコラチウム（Chromobacterium chocolatum）、バークホルデリア（Burkholderia）属細菌、例えばバークホルデリア  アルボリス（Burkholderia arboris）、ロドバクター（Rhodobacter）属細菌、アシドボラックス（Acidovorax）属細菌、例えばアシドボラックス ファシリス(Acidovorax facilis）、ザイモモナス（Zymomonas）属細菌、例えばザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）である。
【００２５】
付着性付与DNAを標的微生物に導入して形質転換することにより、非特異的付着性が付与又は増強された微生物が得られる。典型的には、付着性付与DNAを適当なベクターに連結し、該ベクターで標的微生物（宿主微生物）を形質転換することにより、非特異的付着性が付与又は増強された微生物を得ることができる。具体的には、宿主微生物に該DNAを多コピーにて導入したり、構成的に発現するプロモーター支配下に該DNAを連結したり、又は誘導酵素系プロモーター支配下に該DNAを連結したりして、非特異的付着性が付与又は増強された微生物を得ることができる。
【００２６】
まず、目的のDNAをベクター中に連結し、組換えベクターを製造する。上記ベクターには、宿主細胞で自律的に増殖し得るファージ、コスミド、人工染色体又はプラスミドが使用されるほかに、例えば、プラスミドを発現カセットとして染色体に導入するような場合にはその発現カセットの構築に必要な宿主（例えば、大腸菌）での自律複製能は必要だが、その発現カセットを導入する宿主（例えば、アシネトバクター属細菌）での自律複製能は必ずしも必要でない。これらの組換えベクターは例えば、大腸菌とアシネトバクター属細菌の両方で使用可能なように設計したシャトルベクター等も使用可能である。
【００２７】
プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pET21a(+)、pET32a(+)、pET39b(+)、pET40b(+)、pET43.1a(+)、pET44a(+)、pKK223-3、pGEX4T、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、大腸菌-アシネトバクター間シャトルベクタープラスミドpARP3（非特許文献９）などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（λgt11、λZAP等）が挙げられる。また、クローニング、シークエンス確認用にpCR4-TOPO（登録商標）などの市販のクローニング用ベクターを用いてもよい。
【００２８】
ベクターにDNAを挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。例えば、目的のDNAは、通常知られている方法により合成することができ、ベクターに組み込むため、適当な制限酵素の切断部位を両末端に含むように、プライマーを用いてPCR法により増幅してもよい。PCR反応の条件は、当業者が適宜決定することができる。
【００２９】
その他、組換えベクターには、プロモーター及び本発明のDNAに加えて、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）などが連結されていてもよい。選択マーカーの例としては、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００３０】
プロモーターは、特に制限されず、宿主微生物に応じて当業者が適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、T7プロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、λ−PLプロモーター、アラビノースプロモーターなどが使用できる。
【００３１】
DNA断片とベクター断片とを連結させるには公知のDNAリガーゼを用いるとよい。そして、DNA断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作成する。好ましくは市販のライゲーションキット、例えば、ライゲーションhigh（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。
【００３２】
クローニング、連結反応、PCR等を含む組換えDNA技術は、例えば、Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nd ed.,9.47-9.58,Cold Spring Harbor Lab.press(1989)及びShort Protocols In Molecular Biology,Third Edition,A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.に記載されるものを利用することができる。
【００３３】
得られたベクターを、必要であればボイル法、アルカリSDS法、磁性ビーズ法及びそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらに例えばエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００３４】
標的微生物への組換えベクターの導入方法は、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いるヒートショック法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３５】
目的のDNAを含む形質転換微生物は、その組換えベクターが有するマーカー遺伝子により、例えば、アンピシリン、カナマイシンなどの抗生物質を含むＬＢ培地寒天プレート上でコロニーを形成することにより選抜することができるが、クローニングされた宿主微生物が組換えベクターにより形質転換されたものかどうかを確認するため、一部を用いて、PCR法によるインサートの増幅確認、又はシーケンサーを用いたダイデオキシ法による配列解析をしてもよい。自律複製可能なプラスミドを導入する形式の他に、染色体の遺伝子と相同な領域をベクター内に配置し、相同組換えを起こさせて目的遺伝子を導入させる染色体組み込み型の導入方法を使用してもよい。
【００３６】
得られた形質転換微生物を培地で培養する方法は、標的微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌等の微生物を宿主として得られた形質転換微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。具体的には、M9培地、M9G培地、BS培地、LB培地、Nutrient Broth培地、肉エキス培地、SOB培地、SOC培地等が挙げられる。
【００３７】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコースなどの糖類、グリセリンなどのポリオール類、メタノール、エタノールなどのアルコール類、又はピルビン酸、コハク酸、クエン酸若しくは乳酸等の有機酸類の他、脂肪酸類や油脂などを使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミンなどのアルキルアミン類、又はアンモニア若しくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００３８】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは0〜40℃、より好ましくは10〜37℃、特に好ましくは15〜37℃で行う。培養期間中、培地のｐＨは宿主の発育が可能で、オートトランスポーターアドヘシンの活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはpH4〜8程度の範囲である。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３９】
上記のようにして、非特異的付着性が付与又は増強された微生物を得ることができる。得られた微生物の非特異的付着性については、クリスタルバイオレット染色による付着試験（CV付着試験）を用いて評価することができる。具体的な手順の例としては、菌体培養液を遠心分離にかけ、培養上清を除き、炭素源も窒素源も含まない無機塩培地または塩溶液を菌体ペレットに加え、超音波処理により菌体懸濁液を得、菌体懸濁液の濁度OD660を一定（0.5付近）になるように培地または塩溶液で調整し、96穴のポリスチレン製プレートの各ウェルに懸濁液を200μlずつ添加し、微生物の至適温度で２時間インキュベートし、ウェル中の懸濁液をピペットで全て除き、200μlの無機塩培地または塩溶液でウェルを２回洗浄後、風乾し、1％のクリスタルバイオレット水溶液をウェルに加え、室温で15分間インキュベートし、ピペットでクリスタルバイオレットを除き、200μlの無機塩培地でウェルを３回洗浄後、70％エタノール水溶液で染色された付着菌体からクリスタルバイオレットを溶出させ、吸光度A590を測定する。そして、吸光度A590が0.6以上、好ましくは0.8以上、より好ましくは1.0以上の微生物は、非特異的付着性を有する微生物と評価することができる。適当な容器の内壁に微生物細胞を非増殖条件下で付着させ、付着した細胞を適当な染色剤を用いて染色し、染色剤または染色細胞数を定量することにより付着細胞量を定量するという原理に基づけば、上記の方法を改変した手法により付着試験を行ってもよい。例えばプレートの材質や容量、ウェルの数、染色剤や洗浄液の種類と量、染色時間と温度、懸濁細胞濃度、染色剤や染色細胞数の定量に使用する装置（吸光光度計、プレートリーダー、顕微鏡など）などは、適宜選択可能である。染色剤にはサフラニンや蛍光色素などを用いることも可能である。また、付着性は、付着性付与DNAを導入していない野生株（ネガティブコントロール）との比較により評価することができる。
【００４０】
本発明の工程（１）では、用意した付着性付与微生物を担体に接触させる。ここでの接触は、付着性付与微生物が担体に付着可能な条件下で行われる。付着性付与微生物は高い付着力を備え、通常の培養条件下では各種担体に対して付着性を発揮する。従って、特別な場合（典型的には、後述の工程（２）で採用する脱離処理液を媒体とした場合や低イオン強度下（上掲の国際公開第２０１４／１５６７３６号パンフレット）を参照）を除き、接触によって担体に付着する。付着可能な条件の具体例の一つとして、高イオン強度下を挙げることができる（上掲の国際公開第２０１４／１５６７３６号パンフレットを参照）。高イオン強度下では、付着性付与DNAの発現産物である付着性蛋白質が付着力を発揮する。高イオン強度を規定する基準（即ち高イオン強度と低イオン強度の境界）は、付着性の付与に利用するDNAによって変動し得るが、当業者であれば、本願明細書の開示事項及び国際公開第２０１４／１５６７３６号パンフレットの記載を参考にしつつ、予備実験により設定可能である。付着性が急激に変化するイオン強度をここでの「境界」として採用するとよい。例えば、高イオン強度と低イオン強度の境界をイオン強度5mM〜20mMの間に設定することができる。この場合、高イオン強度として例えば10mM〜500mM、好ましくは20mM〜200mMのイオン強度を採用する。必要以上に高いイオン強度を採用することは、付着性付与微生物の活性、生存などに影響を与えることから好ましくない。尚、具体的な境界として、5mM、7mM、10mM、15mMを例示できる。
【００４１】
工程（１）に使用する溶液の種類や組成に特段の制約はない。例えば、各種緩衝液、各種塩溶液、培養液等を用いることができる。
【００４２】
本発明で使用する微生物は非特異的付着性を示すことから様々な担体（固定化用担体）を用いることができる。担体の表面の特性（例えば親水性、疎水性）、材質、形状等は特に限定されない。材質の例はポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、キトサン、セルロース誘導体、ガラス、セラミック、金属であり、形状の例は板状、球状、粒状、不織布状、繊維状、膜状、スポンジ状（発泡体）である。
【００４３】
２種類以上の付着性付与微生物を併用することにしてもよい。このような態様は、例えば、工程（１）によって得られる、担体に付着した付着性付与微生物を利用して２段階以上の処理ないし反応を連続的に行う場合に有用である。
【００４４】
付着性付与微生物の懸濁液を担体に滴下ないし添加することや付着性付与微生物を含有する溶液中に担体を投入すること等によって、付着性付与微生物と担体との接触状態を形成することができる。このような操作の後、付着率を高めるために例えば1分〜３時間程度、インキュベートするとよい。あるいは、付着性付与微生物を、塩を含む培養液中、担体の存在下で増殖させることで、増殖と同時に担体に付着させることも可能である。
【００４５】
工程（１）によって担体に付着した付着性付与微生物は、通常、一又は二以上の処理ないし反応に供される（当該処理ないし反応の詳細は後述する）。本発明では、その後、工程（２）、即ち脱離工程を行う。工程（２）では、担体に付着した付着性付与微生物を所定の条件を満たす溶液で処理し、担体から付着性付与微生物を脱離させる。具体的には、以下の条件（Ａ）〜（Ｆ）の中の少なくとも一つを満足する条件の溶液が脱離処理液として用いられる。
（Ａ）カザミノ酸を0.01％（w/v）以上含有する
（Ｂ）乳酸を0.01％（w/v）以上含有する
（Ｃ）酵母抽出物を0.01％（w/v）以上含有する
（Ｄ）トリプトンを0.01％（w/v）以上含有する
（Ｅ）スキムミルクを0.1％（w/v）以上含有する
（Ｆ）グルタミン酸を1mM以上含有する
【００４６】
この工程で使用する溶液（説明の便宜上、以下では「脱離処理液」と呼ぶ）は、本発明者の検討によって付着阻害効果及び凝集阻害効果が認められた物質を一つ又は二以上、所定濃度で含有する。工程（２）は、別途用意した脱離処理液で処理すること（態様１）の他、担体に付着した付着性付与微生物を含んでいる溶液（工程（２）を実施する直前のもの）に必要な成分（即ち、カザミノ酸、乳酸、酵母抽出物、トリプトン、スキムミルク、及びグルタミン酸の中の少なくとも一つ）を添加すること（態様２）によって実施することができる。態様１の場合、例えば、担体に付着した付着性付与微生物を含んでいる溶液を脱離処理液に交換し、所定時間（例えば1分〜５時間）維持する。或いは、担体に付着した付着性付与微生物を回収し、脱離処理液中に移し、所定時間（例えば1分〜５時間）維持する。付着性付与微生物が付着した担体に対して脱離処理液を連続的又は間欠的に吹きかけるといった方法を採用することもできる。態様２は、溶液の交換に伴う廃棄の問題を解消できること、脱離処理液を別途用意する必要がないこと、操作がより簡便であること等、様々な利点を有し、より実用性が高いといえる。
【００４７】
上記の通り、脱離処理液では、カザミノ酸、乳酸、酵母抽出物、トリプトン、スキムミルク、及びグルタミン酸が有効成分として用いられる。各有効成分に濃度依存的な効果が認められた事実からすれば特に重要ではないものの、条件（Ａ）〜（Ｆ）における各有効成分の含有量の上限を例示すれば、カザミノ酸については、20％（w/v）であり、乳酸については、20％（w/v）であり、酵母抽出物については、20％（w/v）であり、トリプトンについては、20％（w/v）であり、スキムミルクについては20％(w/v)であり、グルタミン酸については2Mである。
【００４８】
濃度依存的に効果が高まることから、原則、効果の増大ないし向上のためには、有効成分が高濃度の脱離処理液を採用することが有利である。そこで、脱離処理液における有効成分の濃度は、カザミノ酸、乳酸、酵母抽出物、又はトリプトンの場合、好ましくは0.1％（w/v）以上（具体例としては0.2％（w/v）、0.3％（w/v）、0.4％（w/v）、0.5％（w/v）、0.6％（w/v）、0.7％（w/v）、0.8％（w/v）、0.9％（w/v））、更に好ましくは1％（w/v）以上（具体例としては1％（w/v）、1.5％（w/v）、2％（w/v）、2.5％（w/v）、3％（w/v）、3.5％（w/v）、4％（w/v）、4.5％（w/v））、より一層好ましくは5％（w/v）以上（具体例としては5％（w/v）、5.5％（w/v）、6％（w/v）、6.5％（w/v）、7％（w/v）、7.5％（w/v）、8％（w/v）、8.5％（w/v）、9％（w/v）、9.5％（w/v）、10％（w/v））である。スキムミルクの場合は0．1％(w/v）でも十分な効果が得られるが、1％（w/v）以上（具体例としては1％（w/v）、1.5％（w/v）、2％（w/v）、2.5％（w/v）、3％（w/v）、3.5％（w/v）、4％（w/v）、4.5％（w/v））加えてもよいし、更には5％（w/v）以上（具体例としては5％（w/v）、5.5％（w/v）、6％（w/v）、6.5％（w/v）、7％（w/v）、7.5％（w/v）、8％（w/v）、8.5％（w/v）、9％（w/v）、9.5％（w/v）、10％（w/v））として効果の増大を図ることもできる。グルタミン酸の場合、好ましくは10mM以上（具体例としては10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM）、更に好ましくは100mM以上（具体例としては100mM、200mM、300mM、400mM）、より一層好ましくは500mM以上（具体例としては（500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM）である。
【００４９】
条件（Ａ）に用いられるカザミノ酸はタンパク質の酸分解物であり、アミノ酸の含有量が高い。例えば、日本製薬株式会社が提供するカザミノ酸（製品名ハイカザミノ酸「ダイゴ」またはカザミノ酸「ダイゴ」）、ナカライテスクが提供するカザミノ酸（製品名カザミノ酸）を用いることができる。
【００５０】
条件（Ｂ）を満足する脱離処理液を調製するために、乳酸塩（例えば乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム）を用いることができる。乳酸及び乳酸塩は数多く市販されており（例えば和光純薬株式会社、ナカライテスクが提供する）、容易に入手可能である。
【００５１】
酵母抽出物（酵母エキス）は、酵母の有用な成分を自己消化や酵素、熱水などの処理によって抽出したものである。例えば、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニーが提供する酵母抽出物（製品名        Bacto Yeast Extract）、日本製薬株式会社が提供する酵母抽出物（製品名粉末酵母エキスSH）等を用いることができる。
【００５２】
トリプトンはタンパク質のトリプシン消化物である。例えば、ベクトン・ディッキンソンアンドカンパニーが提供するトリプトン（製品名Bacto Tryptone）、日本製薬株式会社が提供するトリプトン（製品名ハイポリペプトン）等を用いることができる。
【００５３】
スキムミルク（脱脂粉乳）は脱脂乳を濃縮・乾燥して粉末状にしたものである。例えば、和光純薬株式会社、ナカライテスクが提供するスキムミルクを用いることができる。
【００５４】
グルタミン酸はアミノ酸である。例えば、和光純薬株式会社、ナカライテスクが提供するL-グルタミン酸を用いることができる。
【００５５】
有効成分による脱離効果に影響のない限り、脱離処理液が他の成分（例えばLB培地などの培地成分、無機塩類等）を含んでいても良い。
【００５６】
工程（１）と工程（２）、即ち担体への付着と脱離を繰り返すことも可能である。この場合において、途中で付着性付与微生物及び／又は担体を新たなもの（同種のもの、類似のもの、異種のもの等）に変更してもよい。
【００５７】
一態様では、工程（２）の後、脱離した付着性付与微生物を回収する（工程（３−１））。回収した付着性付与微生物は本発明の方法又は別の用途に再利用できる。例えば、脱離処理液とともに回収した付着性付与微生物を、洗浄などによって脱離処理液を除去した後に新たな担体に接触させ、再度、付着性付与微生物を担体に付着させる（固定化する）ことが可能である。回収した付着性付与微生物を再生した後に、このような再利用に供してもよい。
【００５８】
別の一態様では、工程（２）の後、担体を回収する（工程（３−２））。回収した担体は本発明の方法又は別の用途に再利用できる。回収した担体を再生ないし活性化した後に、このような再利用に供してもよい。この態様は担体の耐久性が高い場合や担体が高価な場合等において特に有用である。
【００５９】
本発明の方法は、固定化微生物を利用した各種用途、例えば医薬品・医薬中間体・医薬原料の生産、農薬の生産、バイオエタノールの生産、バイオディーゼルの生産、化学品の合成、食品類（異性化糖、マルトデキストリン、オリゴ糖、合成甘味料、アミノ酸、ペプチド、ビタミン等）の製造、下水・排水・工業廃液・工業廃水の処理に適用可能である。そこで本発明の一態様では、工程（１）と工程（２）の間に以下の工程、即ち、担体に付着した付着性付与微生物を被処理液に接触させ、接触状態を維持する工程（工程（ｉ））を行う。用途に応じた被処理液が用いられる。例えば、酵素反応を伴う物質（例えば、上掲の医薬品、バイオエタノール、バイオディーゼル、化学品、食品）の製造又は合成を行うのであれば、酵素の基質を含有する溶液を被処理液として用いる。この場合、当該酵素反応を担う特定酵素の産生能を有する付着性付与微生物が用いられる。特定酵素の例としては、リパーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルカナーゼ、グルタミナーゼ、イソメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、ペルオキシダーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、脱塩素化酵素を挙げることができる。付着性付与微生物が産生する酵素は菌体内酵素であっても菌体外酵素であっても菌体表層局在酵素であっても、さらには表層提示酵素であってもよい。
【００６０】
工程（ｉ）の実施には例えば、連続式反応容器／反応槽、又は回分式（バッチ式）反応容器／反応槽を用いることができる。
【００６１】
本発明は一態様として、付着性付与微生物の脱離（剥離）方法も提供する。本発明の脱離方法は、例えば、固定化した付着性付与微生物の剥離に利用できる。例えば、担体に固定化した付着性付与微生物が凝集塊を形成し、凝集塊が発達して大きなバイオフィルムとなり、物質輸送律速などをもたらして所望の効果が得られなくなったときに当該バイオフィルムをそぎ落とすことに有用である。
【００６２】
付着性付与微生物を脱離させた後、担体を再利用することが可能である。即ち、必要に応じて担体は回収され、再利用に供される。脱離した付着性付与微生物についても、生存しており、且つ所望の特性（例えば、特定の反応に必要な酵素を発現していること）を維持している場合などには、再利用することが可能である。このように、当該態様においても、上記の工程（３−１）又は工程（３−２）、或いはこれらの工程の両方を行うことにしてもよい。
【実施例】
【００６３】
アシネトバクター属細菌Tol 5株由来の蛋白質AtaAの非特異的付着性、凝集性をコントロールできる物質を見出すべく、以下の実験を行った。
【００６４】
１．96穴ポリスチレンプレートへの付着阻害試験
接着タンパク質AtaAを発現しているアシネトバクター sp. Tol 5の野生株をLB培地に1/100量植菌し、115rpm、28℃にて8時間、振とう培養した。培養後、遠心分離により集菌し、脱イオン水で3回洗浄し、添加物（トリプトン、酵母抽出物、カザミノ酸、乳酸（DL乳酸ナトリウムを使用）、グルコース、セロビオース、スキムミルク、グルタミン酸）を所定量（トリプトン、酵母抽出物、カザミノ酸、乳酸、グルコース、セロビオース及びスキムミルクは0.01%(w/v)、0.1%(w/v)、1%(w/v)又は5%(w/v)、グルタミン酸は1mM、10mM、100mM又は500mM）含む、または含まない（0%）無機塩培地に再懸濁した。細胞濃度を示すOD660が0.5になるように、細胞懸濁液を調製し、200μLの懸濁液を96穴ポリスチレンプレート中に移した。4℃で2時間静置させることで微生物細胞をウェルの内壁に付着させた。ウェルを無機塩培地で2回洗浄後、付着した微生物細胞をクリスタルバイオレットで染色した。染色後、無機塩培地で3回洗浄し、クリスタルバイオレットを70%エタノールに溶出し、590nmの吸光度を測定することにより、付着した菌体量を定量した。結果を図１、２に示す。カザミノ酸、乳酸、酵母抽出物、トリプトン、スキムミルク、グルタミン酸は濃度依存的にAtaAの付着を阻害した。
【００６５】
２．細胞自己凝集阻害試験
接着タンパク質AtaAを発現しているアシネトバクター sp. Tol 5の野生株をLB培地に1/100量植菌し、115rpm、28℃にて8時間、振とう培養した。培養後、遠心分離により集菌し、脱イオン水で3回洗浄し、添加物（トリプトン、酵母抽出物、カザミノ酸、乳酸（DL乳酸ナトリウムを使用）、グルタミン酸、グルコース、グリセロース）を1%（但し、乳酸の場合は、正確には1.12%＝0.1 M）含むか又は添加物を含まない無機塩培地（全てに終濃度50μg/mlのカナマイシンを含む）に再懸濁した。細胞濃度を示すOD660が0.5になるように、細胞懸濁液を8 mL調製し、試験管中に移した。28℃で3時間静置させることで微生物細胞の細胞凝集塊を沈降させた後、上澄み液を採取してOD660で細胞懸濁液の濁度を測定した。静置前の0.5からの濁度の減少率により凝集率を算出した。結果を図３に示す。乳酸、グルタミン酸、酵母抽出物、トリプトン、カザミノ酸は凝集阻害効果も発揮した。カザミノ酸の凝集阻害効果は特に高い。
【００６６】
３．ガラスプレートへの付着阻害試験
接着タンパク質AtaAを発現しているアシネトバクター sp. Tol 5の野生株をLB培地に1/100量植菌し、115rpm、28℃にて8時間、振とう培養した。培養後、遠心分離により集菌し、脱イオン水で3回洗浄し、カザミノ酸（Casamino acid）または乳酸ナトリウム（Sodium Lactate）を2.5%(w/v)含むか又はこれらを含まない（−）無機塩培地に再懸濁したものをスライドガラス上に置いた。1時間静置させることでスライドガラス表面に微生物細胞を付着させた後、微生物細胞を懸濁させたものと同じ溶液中でスライドガラスを5回穏やかに上下して余分な菌体を洗浄除去した。残った付着菌体細胞を、1/1000量のSYTO 9を含む無機塩培地に漬し、30分間静置することで蛍光染色した。染色液を除去してから無機塩培地で洗浄後、染色された付着菌体を、共焦点レーザー顕微鏡（発振473 nm、検出520 nm）で観察した。結果を図４に示す。カザミノ酸及び乳酸ナトリウムは優れた付着阻害効果を発揮した。
【００６７】
４．ガラスプレートへの付着した菌体の剥離試験
接着タンパク質AtaAを発現しているアシネトバクター sp. Tol 5の野生株をLB培地に1/100量植菌し、115rpm、28℃にて8時間、振とう培養した。培養後、遠心分離により集菌し、脱イオン水で3回洗浄し、無機塩培地に再懸濁したものをスライドガラス上に置いた。1時間静置させることでスライドガラス表面に微生物細胞を付着させた後、カザミノ酸または乳酸ナトリウムを2.5%(w/v)含むか又はこれらを含まない（−）無機塩培地中でスライドガラスを5回穏やかに上下させることにより洗浄した。残った付着菌体細胞を、1/1000量のSYTO 9を含む無機塩培地に漬し、30分間静置することで蛍光染色した。染色液を除去してから無機塩培地で洗浄後、染色された付着菌体を、共焦点レーザー顕微鏡（発振473 nm、検出520 nm）で観察した。結果を図５に示す。カザミノ酸及び乳酸ナトリウムは付着した菌体を剥離させる効果も発揮した。特に、カザミノ酸の効果は高い。
【００６８】
５．付着性付与微生物の付着阻害試験
既報の方法（Appl Microbiol Biotechnol. 2015 Jun;99(12):5025-32.； PLoS One. 2012;7(11):e48830.）に従い、アシネトバクター属細菌ADP1株にataA遺伝子を導入し、発現させた。ADP1株は元来、ataA遺伝子を有さず付着性も示さないが、Tol 5株のataA遺伝子を導入することでTol 5株と同レベルの付着性を示すようになる（図６の添加物濃度0%の値を参照）。遺伝子導入後のADP1株を用い、上記１．と同様の方法で付着阻害試験を行った。結果を図６に示す。Tol 5株の場合（上記１．）と同様に、カザミノ酸及び乳酸によって濃度依存的に付着性が阻害された。しかし、グルコースには阻害効果が認められなかった（比較試験）
【００６９】
＜考察＞
AtaAの付着をコントロール可能な物質を同定することに成功した。AtaAの付着を阻害できることに加え、一旦付着した菌体を剥離させることも可能であったことは特筆に値する。カザミノ酸は特に優れた効果を発揮し、その有用性が高いと評価できる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の方法によれば、担体へ固定化（付着）した微生物を脱離させて回収したり、回収した微生物を再び担体へ固定したり、更には固定化と脱離を繰り返すことも可能である。このような微生物の利用形態を簡便な操作で実現する本発明は固定化微生物を用いたバイオプロセスに革新的な効果をもたらす。特筆すべきは、固定化した微生物を極めて簡便な操作で脱離できることである。例えば、担体に付着ないし固定化した標的微生物を含有する溶液に特定の物質を添加するという操作によって担体から標的微生物を脱着させることができる。本発明の方法を利用すれば、一度使用した固定化微生物を別の担体に固定化し直して使用することや、担体上の活性が弱った微生物を活性の高いフレッシュな細胞に交換すること、或いは脱離させた活性の低下した細胞を再活性化させて再び固定化するなど、微生物と担体の再利用が自在になる。本発明の用途は広く、例えば、伝統的な発酵産業や廃棄物処理に利用できるだけでなく、バイオマスエネルギーの生産や微生物細胞を用いるグリーンバイオテクノロジーにも極めて有効である。本発明を適用すれば、低コスト化、生産プロセスの効率化等を実現可能である。
【００７１】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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