(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
寄託番号NITE ABP-01844を有する菌株。
【請求項２】
前記菌株が、バチルス アミロリキファシエンスである請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記菌株が、バシロマイシンLcを産出する請求項１又は２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載の菌株、及び／又は該菌株の培養物を有する組成物。
【請求項５】
抗菌組成物である請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
エドワジェラ症治療組成物である請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
クロストリジウム症治療組成物である請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項８】
家畜の生産性向上組成物である請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
植物病害カビ予防組成物である請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１に記載の菌株又は組成物を含む動物用医薬品、飼料、飼料添加物、又は飲料水。
【請求項１１】
請求項１０に記載の動物用医薬品、飼料、飼料添加物又は飲料水、並びに／又は、請求項１〜９のいずれか１に記載の菌株又は組成物を、ヒトを除く動物に投与することを特徴とするエドワジェラ症、クロストリジウム症、及び／又は植物病害カビを予防、抑制、軽減、緩和、及び／又は治療しながらヒトを除く動物を飼育する方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１に記載の菌株又は組成物を含む医薬品。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１に記載の菌株又は組成物を含む抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（現在の農畜産業の問題）
現在の農畜産業において、感染による問題は深刻である。畜産産業の経営の大型化や集団化などから合成抗菌剤及び抗生物質などの抗菌性物質の使用量が増加し、さらに微量の抗生物質が飼料効率を上げることもあって、抗生物質は1940年代以降広く使用されてきたが、それに伴い耐性菌の問題も深刻化した。
1976年の「飼料の安全性の確保及び品質の改善に関する法律」では、抗生物質を添加できる飼料や量が規定され、その適正使用の遵守が求められている。さらに、2006年に施行されたいわゆるポジティブリスト制度によって抗生物質の使用は厳しく制限されるようになった。
その一方、鶏及び豚におけるクロストリジウム症、水産業におけるエドワジェラ感染症、農作物又は家畜飼料における植物病害カビ汚染等は慢性的な問題として常に農畜産家の頭を悩ませている。
【０００３】
（微生物資材）
上記述べたように、抗生物質使用への規制が強まる中、各感染症を解決する代替品として期待されているのがワクチンや微生物製剤である。
ワクチンは、古くから臨床応用され鶏のサルモネラワクチン、イバラキ病ワクチン、牛伝染性鼻気管炎ワクチン、豚コレラワクチンなどが多くの感染症の予防に利用されてきた。
微生物製剤は、腸管内の環境改善のために種々開発されている。
微生物資材としては、バチルス属細菌を含有するものが複数報告されている。
【０００４】
（先行技術）
特許文献１では、「バチルスの胞子形成株を含む、水生動物のための飼料組成物」を開示している。しかし、本発明の寄託番号NITE ABP-01844を有するバチルス アミロリキファシエンスを開示又は示唆をしていない。
特許文献２では、「リポペプチドを生産する有効量のバチルス細菌をプロバイオティックとして含む、腸異常の予防のための医薬組成物」を開示している。しかし、本発明の寄託番号NITE ABP-01844を有するバチルス アミロリキファシエンスを開示又は示唆をしていない。
特許文献３では、「バチルス アミロリキファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を培養し、培養物よりイツリンＡを採取することを特徴とするイツリンＡの製造法」を開示している。しかし、本発明の寄託番号NITE ABP-01844を有するバチルス アミロリキファシエンスを開示又は示唆をしていない。
【０００５】
現在のバチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を使用した抗菌剤では、十分な抗菌活性及び抗菌スペクトルを有していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2014-519316号公報
【特許文献２】特開2013-173750号公報
【特許文献３】特開平07-143897号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新規なバチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、家畜糞便からの生菌分離において、平板培地上に抑止円を形成した菌株を得た。該菌株は、従来のバチルス アミロリキファシエンス菌株と比較して、多種の微生物、特にエドワジェラ タルダ、クロストリジウム パーフリンゲンス及び植物病害カビに対して顕著に生育を阻止することを見出して、本発明を完成した。
【０００９】
本発明は以下の通りである。
「１．寄託番号NITE ABP-01844を有する菌株。
２．前記菌株が、バチルス アミロリキファシエンスである前項１に記載の菌株。
３．前記菌株が、バシロマイシンLcを産出する前項１又は２に記載の菌株。
４．前項１〜３のいずれか１に記載の菌株、及び／又は該菌株の培養物を有する組成物。
５．抗菌組成物である前項４に記載の組成物。
６．エドワジェラ症治療組成物である前項４又は５に記載の組成物。
７．クロストリジウム症治療組成物である前項４又は５に記載の組成物。
８．家畜の生産性向上組成物である前項４に記載の組成物。
９．植物病害カビ予防組成物である前項４又は５に記載の組成物。
１０．バシロマイシンLcを含むエドワジェラ症治療組成物。
１１．バシロマイシンLcを含むクロストリジウム症治療組成物。
１２．前項１〜１１のいずれか１に記載の組成物を含む動物用医薬品、飼料、飼料添加物、又は飲料水。
１３．前項１２に記載の動物用医薬品、飼料、飼料添加物又は飲料水、並びに／又は、前項１〜１１のいずれか１に記載の組成物を、動物に投与することを特徴とするエドワジェラ症、クロストリジウム症、及び／又は植物病害カビを予防、抑制、軽減、緩和、及び／又は治療しながら動物を飼育する方法。」
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規なバチルス アミロリキファシエンス菌株は、従来のバチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物と比較して、以下の（１）〜（３）の顕著な効果を有することを確認した。
（１）エドワジェラ タルダに対する抗菌活性
（２）クロストリジウム パーフリンゲンスに対する抗菌活性
（３）植物病害カビに対する抗菌活性
さらに、本発明の新規なバチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物は、家畜の生産性向上効果、サイレージ中のカビ発生抑制効果及び病原菌と同時に培養しても該病原菌の生育を顕著に阻害できることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】１６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＡ、ｐｏｌＣ、ｐｕｒＨ、ｒｐｏＢのＤＮＡ配列を対象としたＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ Ｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ）解析に基づくバチルス属細菌系統樹
【図２】本発明の菌株が産出するペプチドのクロマトグラフ
【図３】本発明の菌株が産出するペプチドの各ピークの分子量及び分子式
【図４】ピークＸ１の質量分析結果
【図５】ピークＸ２の質量分析結果
【図６】ピークＸ３の質量分析結果
【図７】ピークＸ５の質量分析結果
【図８】ピークＸ６の質量分析結果
【図９】ピークＸ７の質量分析結果
【図１０】継続経口投与毒性試験結果
【図１１】エドワジェラ タルダ株に対する抗菌活性の結果
【図１２】本発明の菌体と公知のバチルス アミロリキファシエンスとのエドワジェラ タルダ株に対する抗菌活性の比較
【図１３】クロストリジウム パーフリンゲンス株に対する抗菌活性の結果
【図１４】本発明の菌体と公知のバチルス アミロリキファシエンスとのクロストリジウム パーフリンゲンス株に対する抗菌活性の比較
【図１５】本発明の菌体投与によるブロイラーの生産性向上の確認
【図１６】植物病害カビに対する抗菌活性の結果
【図１７】本発明の菌体と公知のバチルス アミロリキファシエンスとの植物病害カビに対する抗菌活性の比較
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、バチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物に関する。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
（本発明のバチルス アミロリキファシエンス菌株）
本発明のバチルス アミロリキファシエンス菌株（別名：ＴＯＡ５００１株、以下で、「本発明の菌株」と称する場合がある）は、家畜糞便からの生菌分離で得た。
該菌株は、下記実施例で詳細に述べるが、多種の微生物、特にエドワジェラ タルダ、クロストリジウム パーフリンゲンス及び植物病害カビに対し顕著にその生育を阻止することを確認している。
該菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ配列において９７％以上の相同性を示したこと、その生理生化学的性状からバチルス属細菌であると同定した。
さらに、１６Ｓ ｒＤＮＡ、ｇｒｏＥＬ、ｇｙｒＡ、ｐｏｌＣ、ｐｕｒＨ、ｒｐｏＢのＤＮＡ配列に基づくＭＬＳＴ（Ｍｕｌｔｉ Ｌｏｃｕｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔｙｐｉｎｇ）解析及びＤＮＡ-ＤＮＡ ハイブリダイゼーション試験の結果、該菌株はバチルス アミロリキファシエンスであると同定した（参照：図１）。
本発明のバチルス アミロリキファシエンス菌株は、寄託番号ＮＩＴＥ ＡＢＰ−０１８４４として寄託されている。
【００１４】
本発明の菌株（細菌）の菌学的性質は、以下の通りである。
グラム陽性、桿菌、好気性、芽胞形成能、運動性あり。
栄養要求性は低く、肉汁培地、SCD 培地、ブレインハートインフュジョン培地等の多様な培地に生育できる。
寒天平板培地上においては、周辺がラフの円形、黄白色を呈する。さらに、培地の種類 （ブレインハートインフュジョン培地）によっては内部に粘性を持つ隆起したコロニーを形成する。
【００１５】
本発明の菌株は、上記寄託した菌株に限定されるものではなく、バチルス アミロリキファシエンスに属し、下記で説明する抗菌リポペプチド（バシロマイシンLc）産出能を有し、かつ多種の微生物、特にエドワジェラ タルダ、クロストリジウム パーフリンゲンス及び植物病害カビに対し顕著にその生育を阻止する能力を有する限り、本発明の菌株として利用可能である。
すなわち、本発明のバチルス アミロリキファシエンス菌株は、寄託菌株自体はもちろん、上記した菌学的性質を有する菌株である変異体及び子孫まで意図する。なお、変異体作成方法は、従来公知の放射線照射及びニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸、メチルメタンスルホン酸などの化学物質処理によって得ることができる。
さらに、本発明の菌株は、下記の実施例で示されたように、生体内（特に、哺乳類の体内）に投与されても毒性がない。
【００１６】
（本発明の菌株が産出するペプチド）
本発明の菌株が産出するペプチド（特に、抗菌ペプチド）は、該菌株を培養して、カビであるアスペルギルス ニガーの生育抑制を指標にして、公知の方法（参照：Tetrahedron Lett. 23, 3065-3068）を基にして、分取し単離ピークとして得られた図２中のピークＸ１〜Ｘ３、Ｘ５〜Ｘ７の濃縮物のいずれもが抗菌性を有することを確認した。
さらに、分取したこれらのピークより精製した化合物に対するアミノ酸組成分析では、いずれも（Ａｓｎ＋Ａｓｐ）：（Ｇｌｎ＋Ｇｌｕ）：Ｓｅｒ：Ｔｙｒ：Ｔｈｒ＝２：１：２：１：１の組成比であることを確認し、さらに質量分析により、精製化合物それぞれの分子量及び分子式を得た（参照：図３〜９）。
上記の結果、並びに、過去の報告｛参照：J Antibiot (Tokyo). 1995 Oct;48(10):1095-103、薬学雑誌 122, 651-671、J Antibiot (Tokyo). 1995 Nov;48(11):1240-7｝を基にして、本発明の菌株が産出するペプチドは、バシロマイシンLc（バチロペプチン、参照；下記の化学式１）であることを同定した。
【００１７】
【化１】
0006595761.tif 000002
β―ＡＡは、Ｃ１４〜Ｃ１７からなる側鎖構造である。
【００１８】
（本発明の菌株の培養及び該菌株が産出するペプチドの培養）
本発明の菌株は、炭素源及び窒素源、さらに必要に応じて無機塩類を含む栄養培地に接種後、好気条件下で培養（例えば、振盪培養、通気撹拌培養）することにより、菌体を得ることができると同時に培地中にバシロマイシンLcが産生される。
培養液の場合は、濃縮させていない培養液のままでエドワジェラ タルダ、クロストリジウム パーフリンゲンス又は植物カビ病原菌の生育を抑制し、フィルター除菌後の培養液又はこれらの凍結乾燥若しくは噴霧乾燥後においても同等の活性を有する。
固体培養の場合は、本発明の菌株が生育した固体そのもの又はその混合物 （例えば、別の固体との接触又は混合物、又は本発明の菌株生育固体を浸漬した液体） を用いることでエドワジェラ タルダ、クロストリジウム パーフリンゲンス又は植物カビ病原菌の生育を抑制することができる。ここで、固体とは、本発明の菌株が生育できるものならばいずれでもよいが、例えば、寒天培地、サイレージ、納豆等の原料となる植物体、ヨーグルトに代表される凝乳を意味する。
【００１９】
炭素源としては、本発明の菌株が利用できるものならばいずれでもよく、好ましくはグルコース、シュークロース、デンプン類、セルロース混合物、その他の炭水化物を使用するのがよい。
窒素源としては、本発明の菌株が利用できるものならばいずれでもよいが、好ましくはペプトン、酵母エキス、肉汁エキスなどを使用するのがよい。
さらに、必要に応じて、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩類を培地に添加してもよい。
なお、本発明の菌株は、市販培地、例えばトリプトソイ培地、ブレインハートインフュジョン培地、肉汁培地に接種しての液体又は平板培養で生育可能である。
液体培養において少量で培養する場合は、試験管又はフラスコを用いる振盪培養が好ましい。大量に培養する場合は、他の発酵生産物の場合と同様に、通気撹拌培養するのが好適である。また、培養を大きなタンクで行う場合、はじめに前培養として比較的少量の培地に本発明の菌株を接種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者同一であってもよいし、必要ならば両者を変えてもよい。
培養条件としては、本発明の菌株が生育する範囲内で適宜変更しうるが、通常は好気条件下にて１５〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃で培養するのがよい。培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが、通常は約１日〜１週間である。
【００２０】
（本発明の菌株が産出するペプチドの精製方法）
上記培養によって産生されたバシロマイシンLcは、酸沈殿、ブタノール抽出、イオン交換樹脂又はゲル濾過等の公知の方法によって精製される。
必要に応じて、これらの精製法を一種用いるだけでもよいし、複数を組み合わせてもよい。さらには、同様の原理に基づく他の精製法であってもよい。また、ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣによって、バシロマイシンLcの側鎖の違いに伴う保持時間の差異を利用した分取が可能である。
【００２１】
（本発明の菌株の回収方法）
本発明の菌株を、上記培養によって得た培養液からは遠心分離及び/又は膜濃縮によって回収できる。回収した菌体をそのまま用いても良いし、必要に応じて凍結乾燥又は噴霧乾燥にかけた乾燥菌体を用いても良い。
【００２２】
（本発明の組成物の投与方法）
本発明の菌体を使用する場合は、所望の効果が発揮できる範囲内の濃度ならばいずれでもよいが、例えば、家畜への投与において、本発明の菌株が１キログラムあたり１０５〜１０９ＣＦＵ （Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ） となるよう添加した飼料の給餌で好ましい。
牧草、豆類、米、デントコーン、アルファルファ、ルーサン、及び乾草、または食物残渣やおからなどが利用されるサイレージにおいては、特に開封してからの再貯蔵の際の好気性条件下での真菌等の増殖、即ち二次発酵による発熱や変敗等の品質低下が問題となるが、サイレージの劣化を防ぐため真菌の発生を抑制するには、下記実施例より、本発明の菌株を乾草１ｇあたり約１０万〜１００万個存在する濃度で運用することが好ましい。
本発明の組成物の投与時期、投与方法及び投与量は特に限定されないが、通常、配合飼料に配合するか、混餌で投与すればよい。
例えば、配合飼料に配合する場合や混飼で投与（給与）する場合の投与（給与）量は0.005%〜1%(0.001g〜10.0g/1日）である。
【００２３】
（本発明のエドワジェラ症治療組成物）
本発明のエドワジェラ症治療組成物は、少なくとも、本発明の菌体（菌株も含む）、該菌体の培養物、及び／又はバシロマイシンLcを含み、エドワジェラ症の治療効果（予防、抑制、軽減、緩和及び完治を含む）を有する。
なお、エドワジェラ症とは、エドワジェラ タルダ（Edwardsiella tarda）感染を原因とする魚類の感染症である。
本発明のエドワジェラ症治療組成物の投与対象は、特に限定されないが、魚類、特に養殖魚（タイ、ヒラメ、ハマチ、アユ、ウナギ、マグロ）を対象とする。
本発明のエドワジェラ症治療組成物の投与量は、特に限定されないが、例えば、配合飼料へ0.2%〜1%添加し投与することが望ましい。
【００２４】
（本発明のクロストリジウム症治療組成物）
本発明のクロストリジウム症治療組成物は、少なくとも、本発明の菌体（菌株も含む）、該菌体の培養物、及び／又はバシロマイシンLcを含み、クロストリジウム症の治療効果（予防、抑制、軽減、緩和及び完治を含む）を有する。
なお、クロストリジウム症とは、クロストリジウム パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）感染を原因とする、家畜の腸炎等であり、特に、採卵鶏、ブロイラー、養豚で重大な被害を起こしている。
本発明のクロストリジウム症治療組成物の投与対象は、特に限定されないが、ヒトを除く動物（特に、哺乳動物）であるが、例えば、豚、犬、猫、魚、鶏（特に、雛、ブロイラー、採卵鶏）、乳牛、肉牛、Ｆ１（ホルスタインと和牛との交配種）等の肥育牛、搾乳牛、馬、マウスである。
本発明のクロストリジウム症治療組成物の投与量は、特に限定されないが、例えば、配合飼料へ0.005%〜1%添加し投与することが望ましい。
である。
【００２５】
（本発明の家畜の生産性向上組成物）
本発明の家畜の生産性向上組成物は、少なくとも、本発明の菌体（菌株も含む）、該菌体の培養物、及び／又はバシロマイシンLcを含み、日増体量、飼料要求率、及び／又は腹腔内脂肪／体重の比率の向上により家畜の生産性を向上させることができる。
本発明の家畜の生産性向上組成物の投与対象は、特に限定されないが、ヒトを除く動物（特に、哺乳動物）であるが、例えば、豚、犬、猫、魚、鶏（特に、雛、ブロイラー、採卵鶏）、乳牛、肉牛、Ｆ１（ホルスタインと和牛との交配種）等の肥育牛、搾乳牛、馬、マウスである。
本発明の家畜の生産性向上組成物の投与量は、特に限定されないが、例えば、配合飼料へ0.005%〜1%添加し投与することが望ましい。
【００２６】
（植物病害カビ予防組成物）
本発明の植物病害カビ予防組成物は、少なくとも、本発明の菌体（菌株も含む）、該菌体の培養物、及び／又はバシロマイシンLcを含み、植物病害カビの予防効果（治療、抑制、軽減、緩和及び完治を含む）を有する。
本発明の植物病害カビ予防組成物の投与対象（塗布対象）は、特に限定されないが、植物、食品（サイレージ）、動物である。
本発明の植物病害カビ予防組成物の投与量（塗布量）は、特に限定されないが、例えば、サイレージの植物病害カビ予防に使用する場合には、本発明の菌体を乾草１ｇあたり約１０万〜約１０００万、好ましくは約１００万個存在する濃度に調整するため、乾草へ0.0004%〜0.02%添加するような形態が望ましい。
【００２７】
（本発明の組成物の用途）
本発明の組成物の用途は、以下の通りである。
（１）エドワジェラ症治療
（２）クロストリジウム症治療
（３）家畜の生産性向上
（４）植物病害カビ予防
（５）動物用飼料、飼料添加物及び飲料水
加えて、本発明は、動物用医薬品、飼料、飼料添加物又は飲料水、並びに／又は、本発明の組成物を、ヒトを除く動物に投与することを特徴とするエドワジェラ症、クロストリジウム症、及び／又は植物病害カビを予防、抑制、軽減、緩和、及び／又は治療しながらヒトを除く動物を飼育する方法も対象とする。
特に、本発明の組成物には、上記用途を有する医薬、動物医薬、飲食品、飼料添加物、飼料（配合飼料、混合飼料）が広く包含される。
また、本発明の組成物を、デンプン、馬鈴薯澱粉、乳糖、大豆蛋白等の担体、賦形剤、結合材、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、懸濁剤等の添加剤を配合して、周知の方法で粉剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏、液剤等に製剤化することができる。
【００２８】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【実施例１】
【００２９】
（本発明の菌株の培養及び該菌株が産出するバシロマイシンLcの精製）
本発明の菌株を培養して、さらに培養した菌株が産出したバシロマイシンLcを精製した。詳細は、以下の通りである。
【００３０】
本発明の菌株であるバチルス アミロリキファシエンスＴＯＡ５００１株を、ブレインハートインフュジョン培地に２％のペプトン及び酵母エキスを添加した前培養用培地に、接種し、３０℃にて１６時間振盪培養して、前培養後の培養液を得た。
次に、該前培養後の培養液を、４％のグルコース、３％のペプトン及び２％の酵母エキスを含む本培養培地に、接種し、３０℃〜３７℃にて２〜３日間振盪培養して、本培養後の培養液を得た。該本培養後の培養液から、１４０００×g ２０分間の遠心分離にて菌体及び培養上清を得た。
該菌体は、凍結乾燥にかけ、乾燥粉末として、以下の実施例に使用した。
該培養上清からのバシロマイシンLc精製として、まず、酸沈殿として、塩酸でｐＨ２に調整した培養上清を４℃にて１２時間静置しバシロマイシンLcを含む沈殿を得た。該沈殿を、ろ紙上に回収し、これをメタノールにて再溶解させたものを粗精製バシロマイシンLcとして得た。粗精製バシロマイシンLcを、ロータリーエバポレーターにて乾固させ、その後４０％アセトニトリルと水からなる移動相に溶解させたものを分取用サンプルとして、ODSカラムを装着したＨＰＬＣシステムにて分取した。その後、ロータリーエバポレーター又は凍結乾燥機にて乾燥させた分取成分を精製バシロマイシンLcとして得た。この精製バシロマイシンLcは質量分析で十分な結果が得られる純度であることを確認した。
以上により、本発明の菌株の乾燥粉末の菌体及び本発明の菌株が産出する精製したバシロマイシンLcを得た。
【実施例２】
【００３１】
（本発明の菌体の毒性確認）
本発明の菌株であるバチルス アミロリキファシエンス ＴＯＡ５００１株の生体内毒性を単回経口投与毒性試験及び継続経口投与毒性試験により確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３２】
（単回投与毒性試験）
実施例１で得た乾燥菌体についてＧＬＰに準拠した単回経口投与毒性試験を実施した。詳しくは、６週齢ＳＤラット雌雄を、それぞれ５匹からなる群として、対照群（コーンスターチ投与）、低用量群（ラットの体重１キログラムあたり３Ｘ１０８ＣＦＵの投与）、中用量群（同３Ｘ１０９ＣＦＵの投与）及び高用量群（同３Ｘ１０１０ＣＦＵの投与）に対し、投与後１５日間観察した。
【００３３】
（単回投与毒性試験結果）
全群において死亡例及び剖検所見の異常は認められず、雌及び雄それぞれの体重も群間の有意差はなかった。
【００３４】
（継続経口投与毒性試験）
上記単回経口投与毒性試験の結果に基づき、４週齢ＳＤ雄ラットを、それぞれ、４匹からなる群として、対照群 （コーンスターチ投与）及び投与群 （本発明の乾燥菌体を１匹あたり１Ｘ１０８ＣＦＵ投与）に対し、１０日間毎日投与した。
【００３５】
（継続経口投与毒性試験結果）
全群において死亡例及び剖検所見の異常は認められず、体重増加は対照群と有意差がないこと、日ごとに全糞便を回収し培養法にて測定した投与した菌株数は、投与期間を通じて投与量とほぼ同じ１Ｘ１０８前後で検出されることを確認した（参照：図１０）。
【００３６】
以上の試験結果より、本発明の菌株を生体内（特に、哺乳類の生体内）に投与しても毒性がないことを確認した。
【実施例３】
【００３７】
（エドワジェラ症治療効果の確認）
本発明の菌体が、エドワジェラ症治療効果を有するかを確認した。より詳しくは、本発明の菌体が、エドワジェラ症の病原菌であるエドワジェラ タルダに対する抗菌活性を有するかどうか、さらには、公知のバチルス アミロリキファシエンスとの抗菌活性を比較した。
【００３８】
（本発明の菌体によるエドワジェラ タルダに対する抗菌活性の確認）
抗エドワジェラ タルダ活性を以下の手法で確認した。
ブレインハートインフュジョン（ＢＨＩ）液体培地に接種後３０℃にて１６時間振盪培養した本発明の菌株をＢＨＩ平板培地の中央に画線塗抹培養後、その周囲に同条件で培養したエドワジェラ タルダＳＵ２２６株、ＳＵ５３株又はＮＵＦ８０６株を塗抹し好気条件３０℃で培養した。
培養結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、それぞれのエドワジェラ タルダ株に対する明瞭な抑止円がバチルス アミロリキファシエンスＴＯＡ５００１株の周囲に形成された。
【００３９】
（本発明の菌体と公知のバチルス アミロリキファシエンスとの抗菌活性の比較）
本発明の菌体の抗菌活性を、同種他菌株の抗菌活性と比較した。詳細は、以下の通りである。
【００４０】
特許番号3560653に記載のバチルス アミロリキファシエンス ＩＡＭ１５２３株（現在のＪＣＭ２０１９７株）等のバチルス アミロリキファシエンス各菌株を菌株保存機関より入手し、いずれの菌株も実施例１に記載の方法に従い、同一の培養条件で培養した。
本培養開始から38時間、48時間、及び60時間後の時点で、バチルス アミロリキファシエンス各菌株の培養液を採取し、１５０００ｘｇ の遠心分離後、０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過した除菌培養上清を力価試験に供した。
力価試験では、除菌培養上清を等量の滅菌水で順次希釈し２倍希釈系列とした溶液を調製した。一方、エドワジェラ タルダ用力価試験培地として２倍濃度のＴＳＩ液体培地（調製時にろ紙にて寒天を除去したもの）を用意した。２倍濃度のＴＳＩ液体培地にエドワジェラ タルダ ＳＵ５３株を接種後、即座に上述の除菌培養上清２倍希釈系列溶液と等量混合し、３０℃好気条件にて静置培養した。
培養後の力価評価において、除菌培養上清の２倍希釈系列のうちエドワジェラ タルダ ＳＵ５３株の生育を抑止した最大の希釈倍率を本実験における便宜上の力価としてバチルス アミロリキファシエンス 各菌株の抗エドワジェラ タルダ活性を定量数値化した（エドワジェラ タルダの生育に伴い、ＴＳＩ培地は当初の赤橙色から黄変し、更には産生する硫化水素によって黒みを帯びる。観察時、培地が当初の赤色のままであった場合をエドワジェラ タルダの生育を抑止したと判断した。観察例として、除菌培養上清の４倍希釈液迄は赤橙色であったが８倍希釈液では濁りのある黄色を呈していた場合、４倍希釈液がエドワジェラ タルダの生育を抑止できる最小濃度として力価４とした）。
【００４１】
力価試験の結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、本発明の菌株の抗菌活性は、従来のバチルス アミロリキファシエンスの抗菌活性と比較して、３８時間では少なくとも１６倍（１６／１）、４８時間では少なくとも１６倍（３２／２）及び６０時間では少なくとも３２倍（６４／２）であることを確認した。
【実施例４】
【００４２】
（クロストリジウム症治療効果の確認）
本発明の菌体が、クロストリジウム症治療効果を有するかを確認した。より詳しくは、本発明の菌体が、クロストリジウム症の病原菌であるクロストリジウム パーフリンゲンスに対する抗菌活性を有するかどうか、さらには、公知のバチルス アミロリキファシエンスとの抗菌活性を比較した。
【００４３】
（本発明の菌体によるクロストリジウム パーフリンゲンスに対する抗菌活性の確認）
抗クロストリジウム活性を以下の手法で確認した。
ブレインハートインフュジョン（ＢＨＩ）液体培地に接種後３０℃にて１６時間振盪培養した本発明の菌株をＢＨＩ平板培地の中央に画線塗抹し好気培養した後、その周囲にBHI液体培地にて３７℃にて１６時間嫌気培養したクロストリジウム パーフリンゲンス ＡＴＣＣ１３１２４株を塗抹し嫌気条件３７℃で培養した。
培養結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、クロストリジウム パーフリンゲンス株に対する明瞭な抑止円がバチルス アミロリキファシエンス ＴＯＡ５００１株の周囲に形成された。
【００４４】
（本発明の菌体と公知のバチルス アミロリキファシエンスとの抗菌活性の比較）
本発明の菌体の抗菌活性を、同種他菌株の抗菌活性と比較した。詳細は、以下の通りである。
【００４５】
バチルス アミロリキファシエンス各菌株を菌株保存機関より入手し、いずれの菌株も実施例１に記載の方法に従い同一の培養条件で培養した。本培養開始から48時間及び60時間後の時点でバチルス アミロリキファシエンス各菌株の培養液を採取し、１５０００ｘｇ の遠心分離後、０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過した除菌培養上清を力価試験に供した。
力価試験では、除菌培養上清を等量の滅菌水で順次希釈し２倍希釈系列とした溶液を調製した。一方、クロストリジウム パーフリンゲンス用力価試験培地として２倍濃度のＧＡＭ液体培地を用意した。２倍濃度のＧＡＭ液体培地にクロストリジウム パーフリンゲンス ＡＴＣＣ１３１２４株を接種後、即座に上述の除菌培養上清２倍希釈系列溶液と等量混合し、嫌気条件３７℃にて静置培養した。
培養後の力価評価として、除菌培養上清の２倍希釈系列のうちクロストリジウム パーフリンゲンス ＡＴＣＣ１３１２４株の生育を抑止した最大の希釈倍率を当該実験における便宜上の力価として定義し、バチルス アミロリキファシエンス 各菌株の抗クロストリジウム パーフリンゲンス活性を定量数値化した。
【００４６】
力価試験の結果を図１４に示す。図１４から明らかなように、本発明の菌株の抗菌活性は、従来のバチルス アミロリキファシエンスの抗菌活性と比較して、４８時間では少なくとも８倍以上（１２８／１６）及び６０時間では少なくとも５．６倍以上（９０／１６）倍であることを確認した。
【実施例５】
【００４７】
（家畜のクロストリジウム汚染低減および生産性向上の確認）
本発明の菌体が、家畜のクロストリジウム感染汚染を低下させ、さらに生産性を向上させるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００４８】
試験区として、抗コクシジウム剤投与区、生ワクチン投与区、本発明の菌株投与区及び対照区を各区１８羽にて設けた。いずれの区もブロイラーの飼育開始から共通の組成の飼料を給餌したが、抗コクシジウム剤投与区では飼料にサリノマイシン ５０ｐｐｍを含有させ、本発明の菌株投与区ではバチルス アミロリキファシエンス ＴＯＡ５００１株を飼料１ｇあたり２×１０５となるよう含有させた。また、生ワクチン投与区では日生研鶏コクシ弱毒３価生ワクチン（TAM）（アイメリア テネラ、アイメリア アッセルブリーナ、アイメリア マキシマによる鶏コクシジウム症の発症抑制）を生後５日目に投与した。
全区共通の作業として、ブロイラーの２８日齢時、各区１８羽のうち１０羽に対しコクシジウムの強制投与、即ちアイメリア テネラ及びアイメリア マキシマそれぞれ５×１０３を経口投与した。コクジジウムを投与した１０羽のうち５羽を３６日齢時に、残りの５羽を４９日齢時に評価した。
【００４９】
試験結果を図１５に示す。
0〜28日齢における日増体量及び飼料要求率に関して、本発明の菌株投与区は、他のいずれの区と比較して、優れていた。
コクシジウムを強制投与しなかった各試験区の0〜49日齢における飼料効率に関して、本発明の菌株投与区は、他のいずれの区と比較して、同等又は優れていた。
コクシジウムを28日齢時に強制投与した各試験区の0〜49日齢における日増体重に関して、本発明の菌株投与区は、他のいずれの区と比較して、優れていた。
盲腸内容物中のアイメリアのオーシスト数に関し、本発明の菌株投与区は、他のいずれの区と比較して、優れていた。
盲腸の組織評価スコアに関し、本発明の菌株投与区は、他のいずれの区と比較して、同等又は優れていた。
小腸及び大腸のクロストリジウム パーフリンゲンスの菌数に関し、本発明の菌株投与区のみ検出限界以下であった。
体重に占める腹腔内脂肪の比率に関し、本発明の菌株投与区は、他のいずれの区と比較して、優れていた。これは可食部の割合が高いことを意味している。
以上より、本発明の菌株は、クロストリジウム症治療効果（クロストリジウム パーフリンゲンス汚染の低減効果）だけでなく、日増体量、飼料要求率及び腹腔内脂肪の比率の向上により、家畜の生産性を向上させることを確認した。
【実施例６】
【００５０】
（植物病害カビ予防効果の確認）
本発明の菌体が、植物病害カビ予防効果を有するかを確認した。より詳しくは、本発明の菌体が、植物病害カビの病原菌である各菌に対する抗菌活性を有するかどうか、さらには、公知のバチルス アミロリキファシエンスとの抗菌活性を比較した。
【００５１】
（植物病害カビの病原菌である各菌に対する抗菌活性の確認）
ブレインハートインフュジョン（ＢＨＩ）液体培地に接種後３０℃にて１６時間振盪培養した本発明の菌株をＢＨＩ平板培地の中央に画線塗抹培養後、その周囲に同条件で培養したアスペルギルス ニガー ＡＴＣＣ１６４０４株、フザリウム オキシスポラム ８７５７３株、フザリウム ニベール ８７２５３株又はジベレラ ゼアエ ＪＣＭ９８７３株を塗抹し好気条件３０℃で培養した。
培養結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、それぞれのカビに対する明瞭な抑止円、特にアスペルギルス ニガーに対しては培地周縁に至るまでの抑止円がバチルス アミロリキファシエンス ＴＯＡ５００１株の周囲に形成された。
【００５２】
（本発明の菌体と公知のバチルス アミロリキファシエンスとの抗菌活性の比較）
抗植物病害カビ活性を以下の手法で確認した。
バチルス アミロリキファシエンス各菌株を菌株保存機関より入手し、いずれの菌株も実施例１に記載の方法に従い同一の培養条件で培養した。本培養開始から48時間、及び60時間後の時点でバチルス アミロリキファシエンス各菌株の培養液を採取し、１５０００ｘｇ の遠心分離後、０．４５μｍのフィルターで除菌ろ過した除菌培養上清を下記の力価試験に供した。
力価試験では、除菌培養上清を等量の滅菌水で順次希釈し２倍希釈系列とした溶液を調製した。一方、カビ用力価試験培地として２倍濃度のPDA液体培地（調製時にろ紙にて寒天を除去したもの）を用意した。２倍濃度のPDA液体培地にアスペルギルス ニガー ＡＴＣＣ１６４０４株を接種後、即座に上述の除菌培養上清２倍希釈系列溶液と等量混合し、好気条件３０℃にて静置培養した。
培養後の力価評価として、除菌培養上清の２倍希釈系列のうちアスペルギルス ニガー ＡＴＣＣ１６４０４株の生育を抑止した最大の希釈倍率を当該実験における便宜上の力価として定義し、バチルス アミロリキファシエンス 各菌株の抗カビ活性を定量数値化した。
【００５３】
力価試験の結果を図１７に示す。図１７から明らかなように、本発明の菌株の抗菌活性は、従来のバチルス アミロリキファシエンスの抗菌活性と比較して、３８時間では少なくとも３２倍（３２／１）、４８時間では少なくとも６４倍（６４／１）及び６０時間では少なくとも３２倍（３２／１）倍であることを確認した。
【実施例７】
【００５４】
（サイレージ中の植物病害カビ予防効果の確認）
本発明の菌体が、サイレージ中の植物病害カビ予防効果を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５５】
試験用の牧草として、６０〜７０％程度の水分に予乾したイタリアンライグラスを使用した。基本的な動作として保存用のガラス瓶に、約１ｋｇのイタリアンライグラスを秤りとった。牧草をガラス容器内に詰め込む際には細い木製の丸太などを用い、空気が入らないように密集するように実施した。ガラス管を中央に突き刺したゴム栓をガラス瓶に密栓した。ガラス管の上部にはゴム管を装着し上部はクリップで密封した。ゴム管の中央部には、ナイフで上下２ｃｍほどに切れ目を入れ内部から発生するガス排出口を作成した。
試験区として、本発明の菌株乾燥粉末をイタリアンライグラス１ｋｇに対し１％の割合で混合した。この際、乾草１ｇあたりには本発明の菌株は約１００万個存在していた。対象区として本発明の菌株乾燥粉末に使用した賦形剤と同じバレイショデンプンをイタリアンライグラス１ｋｇに対して１％添加した。
試験品は２５℃の培養器内に保管し、１０日間後にゴム栓を外し、ガラス瓶内の試料をすべて新聞紙の上に出し再度、ガラス瓶に詰め直した。再度ゴム栓を装着し、密栓し再度２５℃にて保管した。さらに１０日間保存した後、すべての試料を出し、真菌の含有数を測定した。真菌の測定には、ポテトデキストロース寒天培地を用い、２５℃で７日間培養し真菌の出現集落を計測し菌数を算出した。
【００５６】
上記菌数の算出結果として、カビの菌数として対象区では１ｇあたり平均２００個以上であったのに対し、本発明の菌株含有試料では、１ｇあたり１０個であった。
以上により、本発明の菌株が、サイレージ中のカビの発生を抑制する作用があることが確認され、サイレージの二次発酵を抑制させる添加物としての有用性がある。
【実施例８】
【００５７】
（本発明の菌株による同時培養でのカビに対する抗菌活性の確認）
本発明の菌株を予め培養しているのではなく、カビと同時に接種した状況下であってもカビを抑制できるかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５８】
邪魔板付フラスコにて調製したブレインハートインフュジョン（ＢＨＩ）液体培地にフザリウム オキシスポラム ８７５７３株又はフザリウム ニベール ８７２５３株を接種すると同時に本発明の菌株を接種した試験群、各カビのみを接種した対照群を設け、好気条件３０℃にて振盪培養した。
振盪培養２日後に培養液を採取し、滅菌水で順次希釈した１０倍希釈系列溶液を用いてＭＰＮ菌数試験に供した。カビ用ＭＰＮ試験培地として各希釈段階に対し５本用意した２倍濃度のPDA液体培地（調製時にろ紙にて寒天を除去した後、カビのみを生育させるためクロラムフェニコールを添加したもの）に対し、上述の培養液の１０倍希釈系列溶液を等量混合後、好気条件３０℃にて静置培養した。
【００５９】
フザリウム オキシスポラム ８７５７３株に関し、当該菌株のみを接種し培養した対照群では培養液１ｍｌあたり１．６×１０１０より多い菌数となったのに対し、当該菌株及び本発明の菌株を同時接種し培養した試験群では培養液１ｍｌあたり７．０×１０３の菌数となり、当該カビの菌数は本発明の菌株の共存によって少なくとも１００万分の一以下に低減されることが確認された。
フザリウム ニベール ８７２５３株に関し、対照群では培養液１ｍｌあたり９．２×１０９の菌数となったのに対し、試験群では培養液１ｍｌあたり７．９×１０３の菌数となり、当該カビの菌数は本発明の菌株の共存によって少なくとも１００万分の一以下に低減されることが確認された。
以上により、本発明の菌株は、病原菌と同時に培養しても、該病原菌の生育を顕著に阻害できることを確認した。
【実施例９】
【００６０】
（本発明の菌株による同時培養でのエドワジェラ タルダに対する抗菌活性の確認）
本発明の菌株を予め培養しているのではなく、エドワジェラ タルダと同時に、しかもエドワジェラ タルダの方がより多い菌数となるよう接種した状況下であってもエドワジェラ タルダを抑制できるかを確認した。詳細は、以下の通りであり、本実施例にて示される菌数は全てＭＰＮ菌数試験法にて算出した。
【００６１】
邪魔板付フラスコにて調製した海水ミネラル添加サブロー液体培地にヒラメ腎臓より分離したエドワジェラ タルダ ＮＵＦ８０６株を培地１ｍｌあたり１．３×１０６（ＭＰＮ菌数試験法換算）となるよう接種すると同時に本発明の菌株を培地１ｍｌあたり１．７×１０４（以下、ＢＡ少数群）、１．７×１０２（以下、ＢＡ最少数群）又は無接種（以下、対照群）を設け、好気条件２５℃にて振盪培養した。
振盪培養２４、４８、７２時間後に培養液を採取し、滅菌生理食塩水で順次希釈した１０倍希釈系列溶液を用いてＭＰＮ菌数試験に供した。エドワジェラ タルダ用ＭＰＮ試験培地として各希釈段階に対し５本用意した２倍濃度のＴＳＩ液体培地（調製時にろ紙にて寒天を除去した後、エドワジェラ タルダのみを生育させるためバンコマイシンを添加したもの）に対し、上述の培養液の１０倍希釈系列溶液を等量混合後、好気条件３７℃にて静置培養した。
【００６２】
エドワジェラ タルダ ＮＵＦ８０６株のみを接種した対照群での培養液１ｍｌあたりの菌数は、振盪培養２４時間後で既に１．４×１０９に達し、４８時間後で２．２×１０９、７２時間後で７．０×１０９と漸次的に増加した。
一方、初期菌数においてエドワジェラ タルダの１％程度の菌数を接種したＢＡ少数群での培養液１ｍｌあたりのエドワジェラ タルダ ＮＵＦ８０６株菌数は、振盪培養２４時間後で２．０×１０５未満に減り、４８時間後で８０、７２時間後で検出限界の２０未満にまで減少した。
さらに、初期菌数においてエドワジェラ タルダの０．０１％程度の菌数を接種したＢＡ最少数群での培養液１ｍｌあたりのエドワジェラ タルダ ＮＵＦ８０６株菌数は、振盪培養２４時間後で１．３×１０７となったが、４８時間後で１３００と顕著に減少し、７２時間後で３３０とさらに減少した。
以上により、初期菌数の相対比において、本菌株の接種菌数がエドワジェラ タルダの１％程度の場合であれば、４８時間後にはエドワジェラ タルダの菌数は検出限界近くまで減少すること（同時期の対照群に比べて２０００万分の一以下の菌数）、また、０．０１％程度にしか過ぎない場合であっても、エドワジェラ タルダの菌数は７２時間のうちに顕著に減少すること（同時期の対照群に比べて２０００万分の一以下の菌数）を確認した。
【００６３】
（結論）
以上の実施例から、本発明の菌体（菌株）又は本発明の抗菌組成物は、以下の効果を有することを確認した。
（１）生体内に投与しても毒性がない。
（２）公知のバチルス アミロリキファシエンスと比較して、顕著なエドワジェラ タルダに対する抗菌活性。
（３）公知のバチルス アミロリキファシエンスと比較して、顕著なクロストリジウム パーフリンゲンスに対する抗菌活性。
（４）公知のバチルス アミロリキファシエンスと比較して、顕著な植物病害カビに対する抗菌活性。
（５）家畜の生産性の向上。
（６）サイレージ中の植物病害カビ予防効果。
（７）病原菌（例えば、カビ、エドワジェラ タルダ）と同時に培養しても、該病原菌の生育を顕著に阻害できる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、新規なバチルス アミロリキファシエンス菌株及び該菌株を含む抗菌組成物を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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