(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式：
【化１】
0006479818.tif 000034
（式中、
R1は水素およびハロゲンから選択される；ならびに
R2は、アリール部分および／またはアルキル部分において置換されうるアラルキル、あるいは
【化２】
0006479818.tif 000035
0006479818.tif 000036
から選択される基である）を有する化合物である、β-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物を含む、MPN（骨髄増殖性新生物）の治療および／または予防用の医薬品または医薬組成物。
【請求項２】
MPNが、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、特発性骨髄線維症、原因不明骨髄様化生、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬品または医薬組成物。
【請求項３】
ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物が選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物である、請求項１または２に記載の医薬品または医薬組成物。
【請求項４】
該選択的アゴニストが、
- BRL 37344;
- GW427353 (ソラベグロン（Solabegron）);
- YM178 (ミラベグロン（Mirabegron）／ミルベトリク（myrbetriq）); および
- SR 58611A (アミベグロン（Amibegron）);
ならびにそれらの医薬上許容される塩からなる群から選択される、請求項３に記載の医薬品または医薬組成物。
【請求項５】
式Iの化合物が、
【化３】
0006479818.tif 000037
0006479818.tif 000038
およびそれらの医薬上許容される塩からなる化合物の群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬品または医薬組成物。
【請求項６】
a．化合物を選択し、
b．該化合物が、他のベータアドレナリン受容体と比較して約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示すかどうか、およびそれがベータ-3受容体の基礎活性を、それが該受容体と接触した場合に増強するかどうかを決定し、
c．該化合物を、それが工程b）に記載の基準を満たしている場合には回収し、
d．該化合物を製造する工程を含む、MPNの治療に適した化合物のスクリーニングまたは製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野、特に、MPN（骨髄増殖性新生物）の治療に適した化合物、およびMPNの診断／予後のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨髄異形成／骨髄増殖性新生物（MPN）は、骨髄における正常な血液細胞の産生に悪影響を及ぼす疾患の一群である。この場合、骨髄は1以上の血液細胞型（赤血球、白血球または血小板）の過剰産生を引き起こす。異常に多数の血液細胞が骨髄内および循環血液中に蓄積するため、合併症が経時的に生じる。
【０００３】
種々のタイプのMPNが存在する。それらは一般に、例えば以下のとおり、最も影響を受ける細胞の型によって互いから区別される。   
- 真性赤血球増加症 - 赤血球の過剰産生。   
- 本態性血小板血症 - 血小板の過剰産生。   
- 慢性骨髄単球性白血病（CMML） - 白血球（顆粒球）の過剰産生。   
- 慢性好中球性白血病 - 好中球（白血球の一種）の過剰生産。   
- 慢性好酸球性白血病 - 好酸球（白血球の一種）の過剰産生。   
- 特発性骨髄線維症 - 骨髄組織が線維性瘢痕様組織により徐々に置換されて、正常な血液細胞の産生が破壊される病態。
【０００４】
多くの場合、これらの疾患はゆっくりと発生し、徐々に悪化する。幾つかの場合には、骨髄増殖性新生物は白血病へと進行しうる。
【０００５】
これらのタイプの疾患を予防し治療しうる化合物が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の簡潔な説明
本発明の第1の態様は、MPN（骨髄増殖性新生物）の治療および／または予防における使用のための、
- TrKもしくはRET受容体アゴニスト、好ましくは、β-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物、または
- 骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物に関する。
【０００７】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態においては、MPNは、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、特発性骨髄線維症、特発性骨髄異形成（原因不明骨髄様化生）、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症からなる群から選択される。
【０００８】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態またはその好ましい他の実施形態のいずれかにおいては、ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物は選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物である。より好ましくは、該選択的アゴニストは、以下のものからなる群から選択される：
- BRL 37344;
- CL 316243;
- AZ 002;
- BMS 187257;
- L-755507;
- L-750355;
- FR-149175;
- GW427353 (ソラベグロン（Solabegron）);
- YM178 (ミラベグロン（Mirabegron）／ミルベトリク（myrbetriq）);
- CR 58611 ;
- SR 58611A (アミベグロン（Amibegron）);
- SR 59104A;
- SR 59119A;
- SAR150640;
- L-796568; および
- CL-316243
ならびにそれらの医薬上許容される塩。
【０００９】
本発明の第1の態様の好ましい実施形態またはその好ましい他の実施形態のいずれかにおいては、該選択的アゴニストはフェニルエタノールアミンである。好ましくは、該選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物は、以下の一般式：
【００１０】
【化１】
0006479818.tif 000002
（式中、
R1は水素およびハロゲンから選択される；ならびに
R2は、アリール部分および／またはアルキル部分において置換されうるアルアルキル、あるいは
【００１１】
【化２】
0006479818.tif 000003
0006479818.tif 000004
から選択される基である）を有する化合物である。
【００１２】
好ましくは、式Iの化合物は、
【００１３】
【化３】
0006479818.tif 000005
0006479818.tif 000006
およびそれらの医薬上許容される塩からなる化合物の群から選択される。
【００１４】
本発明の第2の態様は、MPN（骨髄増殖性新生物）の治療および／または予防における使用のための、骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物に関する。
【００１５】
好ましくは、該化合物は、4-メチルカテコール；NGF（ニューロン成長因子）；ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）またはペルセフィン（PSPN）ファミリーに属するグリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）；ニューロトロフィン3およびニューロトロフィン4/5；インターロイキン6（IL-6）；インスリン様成長因子1（IGF-1）；ビタミンE、特に、ビタミンEのα-トコフェロール形態；N-アセチルシステインまたはN-アセチル-L-システイン（NAC）としても公知であるアセチルシステイン；アセチル-L-カルニチンまたはALCAR；アミホスチン（amifostine）および白血病抑制因子（LIF）からなる群から選択されうる。
【００１６】
より好ましくは、該神経保護化合物は、シタグリプチン（sitagliptin）、サクサグリプチン（saxagliptin）／オングリザ（Onglyza）、リナグリプチン（linagliptin）、デュトグリプチン（dutogliptin）、ジェミグリプチン（gemigliptin）、アログリプチン（alogliptin）およびビルダグリプチン（vildagliptin）／ガルブス（Galvus）からなる群から選択されうる。
【００１７】
本発明の第3の態様は、MPN（骨髄増殖性新生物）の治療および／または予防における使用のための、本発明の第1または第2の態様のいずれかにおいて定義されている化合物を含む医薬品または医薬組成物に関する。
【００１８】
本発明の第4の態様は、ヒト被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、該方法は、
a．該被験者から場合によっては経時的に採取された骨髄生検において存在するチロシンヒドロキシラーゼを免疫染色し、
b．工程a）の生検において存在する交感神経系線維が、正常被験者の骨髄に存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少しているかどうかを比較することにより、該被験者の骨髄における交感神経系線維の評価を指標として使用することを含み、
ここで、交感神経系線維が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少している場合には、ネスチン+ 間葉系幹細胞の減少に先行する骨髄神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて、チロシンヒドロキシラーゼ線維により占拠された骨髄面積における少なくとも3倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している。
【００１９】
好ましくは、交感神経線維により占拠された骨髄面積の参照または対照値は該区画における全骨髄面積の0.15±0.09%である。
【００２０】
本発明の第5の態様は、
a．被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b．工程a）のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を、正常被験者におけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、
ここで、工程a）のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現が参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比べて低減している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の値の少なくとも160倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している。
【００２１】
好ましくは、グリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照または対照値は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA発現に対して正規化された0.48±0.03である。
【００２２】
本発明の第6の態様は、以下の工程、すなわち、
a．被験者の骨髄から生物学的サンプルを経時的に得、
b．工程a）のサンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、ネスチンの免疫染色、およびそれに続く、骨髄サンプル（平均7.2mm2のBMが評価され、結果は1mm2まで外挿されるべきである）におけるネスチン+ 血管周囲ニッチ（niche）（単細胞または3個までの細胞のクラスター）の数を考慮した評価により、この指標を測定し、
c．工程a）の生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの総数の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、
ここで、細胞数が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの数と比べて減少している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該被験者において存在し、かつ
ここで、該被験者が正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの数の少なくとも6倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している。
【００２３】
好ましくは、正常被験者におけるBMネスチン+細胞の総数の参照または対照値は1.15±0.3ニッチ/mm2（それぞれのものは少なくとも1つの陽性細胞を含有する）である。
【００２４】
本発明の第7の態様は、以下の工程、すなわち、
a．被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b．工程a）のサンプルにおいてqRT-PCRによりネスチンのmRNA発現を測定することにより、工程a）のサンプルにおけるネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、
d．工程a）のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現を、正常被験者におけるネスチンのmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法に関するものであり、
ここで、工程a）のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比べて低減している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在し、かつ、
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたネスチンのmRNA発現の値の少なくとも13倍の減少を示す場合。
【００２５】
好ましくは、ネスチンのmRNA発現の参照または対照値は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA発現に対して正規化された4.86±4.55である。
【００２６】
本発明の第8の態様は前記方法のいずれかの実施に適したキットに関する。
【００２７】
本発明の第9の態様は、
a．化合物を選択し、
b．該化合物が、他のベータアドレナリン受容体と比較して約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示すかどうか、およびそれがベータ-3受容体の基礎活性を、それが該受容体と接触した場合に増強するかどうかを決定し、
c．該化合物を、それが工程b）に記載の基準を満たしている場合には回収し、
d．該化合物を製造する工程を含む、MPNの治療に適した化合物のスクリーニングまたは製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】BM（骨髄）ネスチン+ HSC（造血幹細胞）ニッチ細胞のアポトーシスはMPN（骨髄増殖性新生物）の進行に関与している。a, ネスチン（褐色、矢印；全パネル）およびCD34（赤色、下パネル；倍率200倍）で免疫染色された、対照（左）およびMPN患者（右）のBM切片（BM断面）。1mm2当たりのネスチン+ニッチの数（平均±SD）は1.15±0.3（対照）および0.17±0.18（MPN；n=40；p=10-6、マンホイットニーのU検定）。b〜c, BM細胞対照、MPN患者およびマウスにおけるネスチンMrna発現（n=2〜11）。d, 対照（左）およびMPNマウス（右；n=10）における頭蓋BMにおけるNes-GFP+細胞。e〜g, CD45-CD31-Ter119-11 Nes-GFP+細胞（e）、メセンスフェア（mesensphere）形成細胞（f）、および線維芽細胞コロニー形成単位（CFU-F, g）（対照またはMPN BM細胞が移植されてから30週間後のWTマウスからのBM細胞におけるもの）（n=6〜12）。h〜i, ネスチン+細胞の系統追跡研究。（h）対照または（i）MPN BM細胞が移植されてから28週間後のタモキシフェン処理Nes-creERT2; RCE:loxPマウスの大腿切片であり、これらは、DAPIで対比染色された核およびGFPからの蛍光シグナルを示している（n=4）。j, 対照またはMPNマウスからの、生きた、初期および後期アポトーシスBM間質Nes-GFP+細胞の画分（n=5〜7）。k〜m, 血球数（k）、MPN BM細胞が移植されてから20週間後のNes-creERT2;iDTAおよび対照マウスの大腿三色（l）および脾臓ヘマトキシリン-エオシン染色（m）（n=3）。n, MPN BM細胞が移植されてから30週間後およびタモキシフェン処理の24週間後のNes-creERT2;Cxcl12fl/flおよび対照同腹子のBM有核細胞（BMNC）におけるlin-sca-1+c-kit+（LSK）造血前駆体の度数（n=5〜7）。c〜e, j, plpC処理の6〜8週間後。スケールバー（d, h）200μm。倍率（l, m）100倍。データは平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01（独立両側t検定）。BM, 骨髄。C, 対照（疾患非含有）マウス。
【図２】HSPC由来インターロイキン-1βにより誘発されるBMシュワン細胞死はMPNにおけるネスチン+ MSCアポトーシスに先行する。a, 間葉系間質（成体BM Pdgfrα+Sca1+および新生児BM Pdgfrα+Nes-GFP+/-細胞; 紫色陰影領域）およびシュワン細胞（E12.5シュワン細胞前駆体および新生児シュワン細胞; 緑色陰影領域; 「方法」を参照されたい）と比較された、対照およびMPN BM CD45-CD31-Ter119-Nes-GFP+細胞の主要成分分析。b, QPCR検証。c, 対照またはMPN BM細胞が移植されてから5週間後のNes-gfp頭蓋BM; 抗チロシンヒドロキシラーゼ（Th）抗体で検出されたGFPおよび交感神経線維の蛍光シグナル。d, 対照およびMPN BMにおいてシュワン細胞を可視化するためのグリア線維酸性タンパク質（Gfap）の免疫染色。スケールバー, 200μm（c）、100μm（d）。e, 対照およびMPN患者からのBMにおけるTh+線維の定量（n=2〜16）。f, 対照、MPN患者およびマウスにおけるBM細胞におけるGFAP mRNA発現（n=2〜11）。g, シュワン細胞（Gfap）、交感神経線維（Th）、およびNes-GFP+細胞アポトーシス（plpC処理の2〜8週間後のNes-gfp;Mx1-cre;JAK2V617F+および対照マウスにおけるもの）の時間経過分析（n=3〜7）。h, 18週間のインターロイキン1受容体アンタゴニスト（IL1ra）処理の後のBM CD45-CD31-Ter119-CD105+細胞の度数（n=4〜5）。i, 新生児BM Nes-GFP+細胞からインビトロで誘導され、対照またはMPN成体BM lin-sca-1+c-kit+ (LSK)細胞（±200 ng ml-1 IL1ra)と共に24時間共培養されたMSCおよびシュワン細胞のアポトーシス率。シュワン細胞のTUNEL染色（桃色）; 核をDAPI（青色）で対比染色した。スケールバー, 100μm。平均±SEM。* p < 0.05; *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図３】β3アドレナリンアゴニストまたは神経保護薬での処理はMPNの進行を阻止する。a〜b, BMシュワン細胞の神経栄養レスキューはMPNの進行を阻止する。MPN BM細胞が移植されたWTマウスをBRL37344、神経保護薬4-メチルカテコールまたはビヒクルで1カ月にわたって処理した。a, シュワン細胞を可視化するためのグリア線維酸性タンパク質の頭蓋BM免疫染色（n=4〜5）; スケールバー, 100μm。b, 循環好中球（n=5〜9）。c, β3-アドレナリン受容体欠損（KO）およびWTマウス内へのMPN BM細胞の移植の16週間後の循環赤血球、好中球および血小板（n=7〜8）。d, （c）におけるマウスの大腿BMのヴァンギーソン染色。e〜g, 選択的交感神経模倣薬によるBM交感神経損傷の補償はMPNの進行を阻止し、線維症を予防する。e, MPN BM細胞が移植され選択的β3-アドレナリンアゴニスト（BRL37344）またはビヒクルで慢性的に処理されたWTマウスの血球数（n=4〜5）。f, （e）におけるマウスの大腿BMのレチクリンおよびヴァンギーソン染色（倍率200倍）。g, ネスチン+細胞のインビボ枯渇はBRL37344の治療効果を低減する。Nes13 creERT2; iDTA、およびビヒクルまたはBRL37344で6週間処理された対照マウスの血球数（n=4〜5）。a〜b、e〜fにおける薬物処理は移植の4週間後に開始され、gにおける処理はタモキシフェンと共に移植の2週間後に開始された（4週間）。平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図４−１】BM神経障害の補償はMSCを救助（レスキュー）し、MPNにおける突然変異HSCの増殖を妨げる。a〜d, 進行したMPNにおけるBRL37344処理の効力; 対照またはMPN BM細胞が移植されたWTマウスを血小板増加時（血液1ml当たりそれぞれ血小板869±23および1968±264×106個; n = 4〜5）にBRL37344またはビヒクルで処理した。a, 血球数; ビヒクル処理対照マウスに対して・p < 0.05; ・・p < 0.01, ・・・p < 0.001。b, BM上清におけるIL-1β含量。c, 大腿BM切片のヴァンギーソン染色（倍率100倍）。d, BMグリア線維酸性タンパク質（Gfap）免疫染色の定量。e〜l, 交感神経模倣薬はBM Cxcl12レベルを回復させ、HSCの増殖および動員を妨げる。対照またはMPN BM細胞が移植されたWTマウスを4週間にわたりBRL37344で、4-メチルカテコールでまたはビヒクルで（e, h）4、（f）8または（g, i, j）16週間にわたって処理した。e, BM上清におけるIL-1β含量（n=5〜11）。f, BM CD45-CD31-Ter119-Nes-GFP+細胞（n = 8〜10）。g, BM上清におけるCxcl12含量。h〜j, （h, j）BM有核細胞（BMNC）および（i）血液、ならびに（j）lin-sca-1+c-kit+（LSK）細胞のBM画分におけるコロニー形成単位（CFU-C）の度数（n=3〜5）。
【図４−２】k, （a〜d）におけるマウスにおけるLSK細胞、長期（LT-）および短期（ST-）HSC（n=4〜5）。l, BRL37344処理マウスにおける白血病幹細胞の減少。CD45.1マウスからのBM細胞、およびビヒクルまたはBRL37344で処理されたMPNマウスからの限られたBM細胞をCD45.2 WTマウスに移植した（n=5）。移植の16週間後に< 50%のドナーLSK細胞のキメラ率を有するマウスの度数が被検細胞数に対してプロットされている。MPN開始細胞頻度が示されている。* p < 0.05, ピアソン カイ二乗t検定。m, HSCニッチ改変およびMPNにおけるレスキューを例示するモデル。MPN, 骨髄増殖性新生物; HSC, 造血幹細胞; SNS, 交感神経系; MSC, 間葉系幹細胞; NA, ノルアドレナリン; AR, アドレナリン受容体; C, 対照（疾患非含有マウス）。a〜k, 平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図５】複合突然変異マウスおよび突然変異造血細胞の被投与体におけるBM MSCの減少は細胞分化によるものではない。a〜b, （a）plpC処理の4〜8週間後のNes-gfp;Mx1-cre;JAK2-V617Fおよび対照マウス、ならびに（b）MPNからのBM細胞が移植されてから10〜12週間後のNes-gfpマウスおよび対照マウスの血球数。複合突然変異マウスおよび突然変異細胞が移植されたNes-gfpマウスにおける類似した赤血球増加、好中球増加および血小板増加に注目されたい。各点はマウスを表す。c, MPNおよび対照BM細胞が移植されてから6〜8週間後のNes-gfpマウスの頭蓋BMにおけるGFP蛍光（スケールバー, 100μm）。d, plpC誘導の6〜8週間後のMPNおよび対照マウスにおけるCD45-CD31-Ter119-Nes-GFP+ BM細胞の度数（n=7〜9）。e, MPNおよび対照BM細胞が移植されてから30週間後の免疫磁気的に富むBM CD45-Ter119細胞からのギムザ染色線維芽細胞コロニー形成単位（CFU-F）。f. plpC処理の8週間後のMPNおよび対照マウスからのBM CD45-CD31- Ter119-細胞のFACS分析（n=3）。特定されているMSCマーカーを使用した。平均±SEM。g, BMレチクリン染色; MPNマウスはplpC処理の6週間後に初期線維症（矢印）を示した（倍率200倍）。h〜i, MPNにおけるBMネスチン+細胞の系統追跡研究。h, 実験計画。NescreERT2; RCE:loxPマウスにMPNおよび対照細胞を移植し、それにタモキシフェン食を与えた。疾患発生を28週間にわたって監視した。i, MPN BM細胞の被投与者において進行性好中球増加および血小板増加を示す血球数（n=3）。j, MPN BM細胞の被投与者において異常な骨形成を示す大腿ヘマトキシリンおよびエオシン染色（倍率100倍）。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図６】JAK1/2インヒビターであるルクソリチニブ（ruxolitinib）での処理はMPNにおける造血細胞増殖を低減するが、BM MSCをレスキューしない。Nes-gfpマウスにpIpC誘発性Mx1-cre;JAK2-V617FマウスからのBM細胞を移植し、それを移植の2週間後からルクソリチニブまたはビヒクルで8週間処理した（n=4〜6）。a, 末梢血球数。b, 免疫表現型が定められたBM CD45- CD31- Ter119-細胞の度数。平均±SEM。* p < 0.05（独立両側t検定）。
【図７】ネスチン+細胞またはそれらのCxcl12産生の枯渇はMPNを加速する。a, インビボネスチン+細胞枯渇のための実験設計。NescreERT2; iDTAおよび対照iDTAマウスにplp処理Mx1-cre;JAK2-V617Fおよび対照マウスからのBM細胞を移植し、それをタモキシフェンで処理した（n=4〜5）。b〜e, シュワン細胞とは異なり、MSCはNes-creERT2;iDTA BMにおいて減少する。b〜c, （b）BM CD45-CD31-Ter119-CD90+細胞および（c）線維芽細胞コロニー形成単位（CFU-F）（タモキシフェン処理の4週間後のNes-creERT2;iDTAおよび対照マウスからのBM CD45-Ter119-細胞におけるもの）の度数。d, （a）におけるマウスのBMにおけるグリア線維酸性タンパク質（Gfap）mRNAの発現（Gapdhに対して正規化）。e, （b〜c）におけるマウスからの大腿BMのGfap免疫染色の定量。f〜k, 初期突然変異HSCの増殖および動員はBMネスチン+細胞におけるCxcl12発現の低減と相関する。f〜g, BM lin-sca-1+c-kit+ (f) CD34-Flt3- 長期 (LT) およびCD34+Flt3- 短期 (ST) HSCならびにCD34-Flt3-多能性前駆体（MPP）、ならびに（g）plpC処理の6週間後のNes-Gfp;Mx1-cre;JAK2-V617Fおよび対照マウスからのBM有核細胞、脾臓または末梢血からの培養内の造血コロニー形成単位（CFU-C）の頻度（n=3〜11）。h, 脾臓の外観（挿入図; スケールバー, 1cm）ならびにヘマトキシリンおよびエオシン染色（倍率100倍）。i〜k, （i〜j）plpC処理の6週間後のMx1-cre;JAK2-V617Fおよび対照マウスまたは（k）突然変異BMもしくは対照細胞が移植されてから10週間後のNes-gfpマウスのBM（i）細胞外液、（j）有核細胞および（k）間質Nes-GFP+細胞におけるCxcl12（i）タンパク質および（j〜k）mRNAレベル（n=4〜7）。l, MPNマウスからのBM細胞が移植されてから18週間後かつタモキシフェン処理の12週間後のNes-creERT2;Cxcl12fl/flおよび対照Cxcl12fl/fl同腹子における循環血小板（n=11〜14）。平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01（独立両側t検定）。
【図８】MPN罹患BM基質における神経膠損傷。a〜d, MPN BM Nes-GFP+細胞における神経膠遺伝子セットの発現。a〜c, （a）間葉遺伝子、（b）HSC-ニッチ関連遺伝子および（c）神経関連遺伝子のマップ化断片100万個の当たりのエキソン1キロベースの当たりの断片（FPKM）として表された選択された転写産物発現。plpC処理の6週間後の複合MPNおよび対照マウスから単離されたCD45-CD31-Ter119-GFP+細胞におけるRNAseq（3匹のマウスからプール化されたサンプル）。d, RNAseqデータの遺伝子セット富化分析（GSEA）。e〜f, （e）向神経活性リガンド-受容体相互作用および（f）ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトのトランスクリプトームにおける協同的変化の富化プロット。g〜h, BM Nes-GFP+細胞は交感神経線維および成熟シュワン細胞とは異なる。（g）交感神経線維を可視化するためのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）および（h）成熟シュワン細胞に関するグリア線維酸性タンパク質（GFAP）（Nes-gfp BMにおけるもの）の免疫染色。特有のTH+またはGFAP+細胞に対するNes-GFP+細胞の密接な関連性に注目されたい。i, （左）陰性対照としての二次Abまたは（中央および右）抗TH抗体で免疫染色された（左および中央）対照または（右）MPN患者からのBM生検。核をDAPIで対比染色した。スケールバー, （g）75μm、（h）50μm、（i）100μm。
【図９】初期MPN発病に対するIL-1βの寄与。a, MPNの初期におけるBM IL-1βレベルの上昇。plpC処理の4〜8週間後の対照およびMx1-cre;JAK2-V617Fマウスからの血漿（n=13〜16）およびBM細胞外液サンプル（n=6〜11; IL-1βおよびTNF-αのみが検出可能であった）における炎症誘発性（IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6）、調節性（IL-17）および抗炎症性（IL-10）メディエーターの多重ELISA分析。b〜f, Nes-gfpマウスにMPNおよび対照マウスからのBM細胞を移植し、それを2週間後に分析した（n=3〜6）。b〜d, （b）IL-1βおよび（c）その活性化酵素カスパーゼ-1（Casp1）のmRNA発現ならびに（d）lin-sca-1+c-kit+造血前駆体およびCD11b+Ly-6G(1A8)-単球のBM頻度。e〜f, BM CD45-CD31-Ter119-Nes-GFP+/-細胞における（e）IL-1受容体（IL1r）およびそのアンタゴニスト（IL1ra）のmRNA発現。g, MPNおよび対照BM細胞が移植され移植の2週間後からIL1raで18週間処理されたWTマウスにおける循環血小板の数。h, （g）におけるマウスにおけるBM CD45-CD31-Ter119-CD90+細胞の度数。i〜j, （g）におけるマウスのBMから単離された造血前駆体および単球における（i）IL-1βおよび（j）Casp1 mRNA発現のqPCR分析。Gapdhをハウスキーピング遺伝子として使用した（n=4〜5）。平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図１０】β3-アドレナリンアゴニストBRL37344の補償処理はMPNの進行を阻止する。a, 対照およびplpC誘発性Mx1-cre;JAK2-V617Fマウスからの免疫磁気的に富化したCD45+およびCD45- BM細胞におけるβ2-およびβ3-アドレナリン受容体の発現（n=3）。b〜c, （b）MPNまたは対照BM細胞が移植されてから4週間後（n=11〜13）、および（c）慢性BRL37344（2mg kg-1）またはビヒクル処理（i.p., 10〜12時間の間隔で1日2回; n=4〜5）の4〜12週間後のWTマウスの血球数。CD11b+単球および顆粒球、B220+ B細胞およびCD3+ T細胞をフローサイトメトリーにより決定した。d, 対照BM細胞が移植され前記のとおりにBRL37344またはビヒクルで処理されたWTマウスの血球数（n=4〜6）。平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図１１】β3-アドレナリンアゴニストまたは神経保護薬はネスチン+細胞における神経膠遺伝子誘導を妨げ、突然変異造血細胞に間接的な影響を及ぼす。a, β3-アドレナリンアゴニストまたは神経保護薬による突然変異HSC増殖の抑制はHSC-ニッチ依存的である。plpC処理の16週間後のNes-gfp;Mx1-cre;JAK2- V617Fマウスおよび対照同腹子のBMから、免疫磁気的に富化したCD45+造血細胞を得た（n=3）。BRL37344（BRL）および4-メチルカテコール（4MC）を、示されている濃度でインビトロで加え、培養内コロニー形成単位（CFU-C）の度数を1週間の培養後に評価した。b, ヒトβ3-アドレナリンアゴニストであるミラベグロン（Mirabegron）での補償処理はマウスにおけるMPNを遅らせる。MPNまたは対照BM細胞が移植されてから8週間後のWTマウスの血球数。ミラベグロン（2mg kg-1）またはビヒクル処理（i.p., 10〜12時間の間隔で1日2回）を最後の2週間に投与した（n=5〜8）。c, BRL37344で処理されたMPNマウスからのBM Nes-GFP+細胞は神経膠遺伝子を発現しない; MPNまたは対照BM細胞が移植されてから4週間後からBRL37344またはビヒクルで8週間にわたって処理されたNes-gfpマウスから選別されたBM CD45- CD31-Ter119-GFP+細胞におけるシュワン細胞マーカー ミエリン塩基性タンパク質（Mbp）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（Mobp）およびプレクストリン相同性ドメイン含有ファミリーB（エベクチン）メンバー1（Pleckhb1）のmRNA発現（n=4）。平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図１２】初期MPN徴候はBRL37344または4-メチルカテコールにより改善される。a〜b, plpC処理対照およびMx1-cre;JAK2-V617FマウスからのBM細胞が移植されてから8週間後のWTマウスの血液パラメータ。後者には最後の4週間に神経保護薬4-メチルカテコール（10μg kg-1、1日1回）、BRL37344（2mg kg-1）またはビヒクル注射（10〜12時間間隔で1日2回）が投与された（i.p.; n=4〜5）。MPNの進行を末梢血において監視し、マウスが初期症状のみを示した際に該マウスを犠死させた。a, 血球数、脾臓サイズ、体重および有核細胞数、BM有核細胞（肢および胸骨）、CD11b+骨髄、B220+ B-リンパ球およびCD3+ T細胞。b, BM lin-sca-1+c-kit+（LSK）造血前駆体、Ter119+CD71-成熟赤芽球およびCD41+/CD42+巨核球前駆体。平均±SEM。* p < 0.05; ** p < 0.01, *** p < 0.001（独立両側t検定）。
【図１３】長期BRL37344処理はJAK2-V617F+ HSC増殖を抑制するが、正常造血を損なわない。BRL37344（2mg kg-1）またはビヒクル注射（10〜12時間間隔で1日2回; i.p.; n=3）の16週間後の（a）MPNおよび（b）WT BM細胞が移植されてから12〜16週間後のWTマウスのBMおよび血液において（a）FACSまたは（b）コロニー形成単位（CFU-C）により定量された造血前駆体。平均±SEM。* p < 0.05（独立両側t検定）。c, BRL37344処理は正常HSC BM数を変化させない。移植の11週間後からビヒクル/BRL37344で4週間処理されたCD45.2対照マウスからの一定数のBM細胞と共にコンジェニックCD45.1 WTマウスからのBM細胞をCD45.2 WTマウスに移植した（n=5）。移植の16週間後に再構成できなかったマウスの度数が被検細胞の数に対してプロットされている。HSC度数が示されている; n.s., 非有意; ピアソン カイ二乗t検定。
【図１４−１】胎児BMネスチン+ 細胞はゆっくり増殖し、骨軟骨細胞から区別される。a〜c, 軟骨内骨化を受けている胎児骨におけるNes-GFP+ 細胞。内皮を標識するためにCD31（マゼンタ）で染色されたE18.5 Nes-Gfp大腿BMのホールマウント（全載）共焦点投射。細動脈（b）および一次海綿質に侵入する小血管（c）におけるGFP+ 細胞の血管周囲の分布に注目されたい。d〜e, Nes-GfpトランスジーンはBM内皮細胞のサブセットにより発現される。FACSヒストグラムは、CD31を発現するCD45- Nes-GFP+ 細胞の度数を示している。f, 示されている段階のNes-Gfpマウスから単離された間質集団におけるqPCRにより測定された内因性ネスチンmRNA発現（平均±SD, n=3〜5）。g, 細動脈を表示するために平滑筋アクチン抗体（αSMA、アスタリスク）で染色されたNes-Gfp BM切片。
【図１４−２】h, α1(l)-コラーゲンプロモーターの2.3kbの近位断片により駆動されるカツシュカ（Katushka）タンパク質に対する抗体で特定されたNes-GFP+および骨芽細胞を示すE17.5 Nes-Gfp;Col2.3-Cre;Kfp胚の肢切片。矢尻, 骨内膜表面。i, S100+ 軟骨細胞を示すE17.5 Nes-Gfp胚の骨幹。j, 拡大詳細。k, 初期生後段階のBM間質Nes-GFP+/- 細胞の代表的細胞周期プロファイル。G2/S-Mにおける細胞の度数（%）が示されている。l, 生後BMにおける間質Nes-GFP+/- 細胞の数（平均±SEM, n=3〜4）。スケールバー: 500μm（A〜A'）、200μm（g〜h）、100μm（b〜c, i〜j）。（g〜h, j）破線は骨の輪郭を示す。BM, 骨; C, 軟骨; PS, 一次海綿質。
【図１５−１】BMネスチン+ 細胞は中胚葉骨-軟骨前駆体とは異なる。a〜b, 骨前駆細胞を標識するためにオステリックス（Osterix）抗体（Osx, 赤色）で免疫染色されたP1 Nes-GfpおよびE18.5 Hoxb6-CreERT2;RCE（E10.5におけるタモキシフェン誘導）からの大腿BM切片。RCE+ Osx+ 中胚葉骨前駆体がアスタリクスで示されている。c, Nes-CreERT2マウスにおける周産期組換えはBM間質Nes-GFP+ 細胞を効率的に標的化する。Nes-GFP+細胞（緑色）、Nes由来後代および二重陽性細胞（アスタリスク）を示す、出生時にタモキシフェンが投与されたP7 Nes-Gfp;Nes-CreERT2;R26-TomatoマウスのBM切片。d, E13.5においてタモキシフェンで処理されたP7 Nes-GFP;Nes-CreERT2;KFPマウスからのBM切片の高倍率像。抗KFP抗体（赤色）で染色されたNes-GFP+ 細胞が示されている（**）。
【図１５−２】e〜g, それぞれE18.5/19.5 (e, g) Nes-CreERT2;RCEよび (f) Hoxb6-CreER;RCE大腿BMにおける肢中胚葉およびネスチン+ 細胞の後代の予定運命図。e, E13.5においてタモキシフェンで処理されたマウスにおけるGFPおよびdapi対比染色核。増殖性軟骨細胞（*）も肥大性軟骨細胞（**）もGFP蛍光を示さなかった（挿入図1）。（e'〜e''）Nes-GFP+細胞に類似した形態および分布を示すNes由来細胞が軟骨-軟骨膜境界付近（矢印）および軟骨-骨接合部内（矢尻）で検出された。（F〜G）f〜g, 軟骨細胞を標識するためにS100抗体で染色された、それぞれE10.5/8.5においてタモキシフェンで処理された（f）Hoxb6-CreER;RCEおよび（g）Nes-CreERT2;RCEマウスの大腿BM切片。（f'〜f''）豊富な二重陽性軟骨細胞（矢尻）を示す、軟骨の高倍率像（挿入図1）。g, Nes由来細胞は軟骨細胞ではなかったが（赤色, *）、軟骨-骨接合部および海綿骨（矢尻）に浸潤した。スケールバー: 200μm（a〜b, f）、100μm（c〜e, g）。BM, 骨髄; C, 軟骨; GIFM, 遺伝誘導性予定運命図。
【図１６−１】BMネスチン+ 細胞におけるMSC活性の周産期富化。a, MSC活性はBM Nes-GFP+ 細胞に徐々に限局される。示されている齢のNes-GfpマウスのBMから単離された間質（CD45-CD31-Ter119-）GFP+/- 細胞における線維芽細胞コロニー形成単位（CFU-F）の度数。若いマウスからの細胞集団における代表的CFU-F（右パネル）。b, 示されている齢のBM間質GFP+/- 細胞における骨芽細胞コロニー形成単位（CFU-OB）の度数。
【図１６−２】c, 3日齢および10日齢のBM亜集団からの代表的なギムザ染色CFU-F。d, E18.5（アルカリホスファターゼ染色、左パネル）および1週齢（アリザリン染色、右パネル）BM亜集団からの染色CFU-OB。e, 胎児（E18.5）または1週齢（P7）Nes-Gfpマウスから単離されたBM間質集団における間葉系遺伝子のQPCR分析。f〜g, CFU-Fおよびメセンスフェア（mesensphere）形成活性はそれぞれ胎児BM Nes-GFP-およびNes-GFP+細胞において分離する。E17.5 Nes-Gfp胚におけるCFU-Fおよびメセンスフェア形成効率。a〜g, 平均±SD, n=3〜6; *p < 0.05, 独立両側t検定。h〜l, 両方の間葉系亜集団からの代表的な球体（スフェア）。GFP+線維芽細胞様細胞の存在に注目されたい。
【図１７】生理的骨格ターンオーバーに対する成体ネスチン+ MSCの低い寄与。a, 成体ネスチン+細胞を欠失させるための2つの実験法を例示する図（TM, タモキシフェン; DT, ジフテリア毒素）。a〜c, Nes-CreERT2;iDTR二重トランスジェニックマウス（赤色バー）およびiDTR対照同腹子にタモキシフェンおよびジフテリア毒素を反復的に注射してネスチン+細胞を欠失させた。b, 処理開始の1〜10カ月後に脊柱の骨塩量（BMD）を測定した。c, 線維芽細胞コロニー形成単位（CFU-F）。d, アリザリン、アルカリホスファターゼ（ALP）およびフォン-コッサ染色に関して陽性の骨芽細胞コロニー形成単位（CFU-OB）の度数。E〜F, 代表的な対照（e）および実験（f）マウスの大腿における酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色。g, 骨周囲長当たりに対して正規化されたTRAP+ 破骨細胞の数。（h〜l）（h）ミネラル化（石灰化）表面、（l）ミネラル・アポジション（aposition）および（j）骨形成速度の骨組織形態計測分析。（k〜l）それぞれ犠死の6日前および3日前にカルセイン（緑色、10mg/kg、i.p.）およびキシレノールオレンジ（オレンジ色、90mg/kg、i.p.）が注射された対照（k）および実験（l）マウスからの代表的な椎骨切片。実験マウスにおけるカルシウム沈着層間の距離の減少は造骨活性の低下を示す。（m〜o）ネスチン+細胞を欠失させるために成体期にタモキシフェンが注射されタモキシフェン食が6カ月間与えられたNes-CreERT2;iDTA二重トランスジェニックマウスおよびNes-CreERT2対照同腹子のμCT。実験マウスの頭蓋骨における（n）溶骨性病変および（o）左右非対称性に注目されたい。
【図１８−１】長骨における間葉系統への体幹神経堤細胞の寄与。a〜f, 新生児Wnt1-Cre2;R26-Tomatoマウスの大腿BMにおけるNC誘導チアの予定運命図。a, 石灰化領域におけるWnt1-Cre2-由来Tomato+骨芽細胞（アスタリスク）を示すカルシウム沈着を標識するためにカルセインで染色されたBM切片。スケールバー = 100μm）。b, 皮質NC由来軟骨細胞（矢尻）を示す大腿骨頭の断面。スケールバー = 200μm）。核をdapiで対比染色した。
【図１８−２】c〜e, グリア線維酸性タンパク質に対する抗体で染色された骨幹切片（Gfap、シアン）。NC由来細胞はGfap+シュワン細胞（挿入図1、矢尻）およびgfap-推定BMSC（挿入図2、アスタリスク）を含んでいた。f, 血管とのNC由来細胞の密接な関連を示す、コラーゲンIV抗体での基底板の染色。g, 骨内膜表面付近およびカルセイン染色石灰化領域内のNC由来骨芽細胞。h〜k, NCは長骨におけるPDGFRα+BMSCに寄与する。PDGFRα抗体で染色された新生児（h）Nes-Gfpまたは（i）Wnt1-Cre2;R26-Tomatoマウスおよび胎児（j）Nes-Gfpまたは（k）Nes-Gfp;Sox10-CreERT2;R26-Tomato三重トランスジェニックマウスからのCD45-CD31-Ter119-BM細胞の代表的なFACS。（l,k）NC由来BMSCの度数が示されている。スケールバー: 200μm（b,b1,c）、100μm（a,f,g）、50μm（d〜e）。
【図１９−１】BM ネスチン-GFP+ 細胞はPDGFR + MSCおよびPDGFR - シュワン細胞前駆体を含有する。a, 生後BMSCのNes-GFPおよびPDGFRα発現の代表的FACSプロファイル。b, （a）に記載されている単離されたNes-GFP++/-PDGFRα+/- BMSCの選択された転写産物発現。b〜c, GFP+PDGFRα+またはGFP+PDGFRα- BMSCによる（b）HSCニッチ関連および（c）シュワン細胞前駆体遺伝子の相対的発現レベル。RNAseqデータは、マッピングされた100万個の断片当たりのエキソン1キロベース当たりの断片数として表されている（FPKM; n=2 プール化新生児からの独立サンプル）。新生児GFP+ PDGRα- 亜集団はシュワン細胞前駆体シグネチャを有し（c）、一方、GFP+ PDGFRα+ 細胞はHSC維持遺伝子に富むことに注目されたい。
【図１９−２】d, 代表的NC由来集団および初代成体マウスBMSCと比較される新生児Nes-Gfp BM間質サブセットの主成分分析（表S3に詳細に示されている）。
【図１９−３】e〜f, （a）の場合と同様に単離され間葉系（+PDGF）およびシュワン細胞（+Nrg-1）分化培地において培養された新生児亜集団のインビトロ分化。脂肪細胞をオイルレッドOで染色し、ヘマトキシリンで対比染色し（左パネル）、シュワン細胞をグリア線維酸性タンパク質（Gfap）に対する抗体で染色し、内因性GFP蛍光をオーバーレイ（重ね合せ）した（右パネル）。PDGF, 組換えマウス血小板由来増殖因子A-B; Nrg-1, 組換えマウスニューレグリン-1。スケールバー: 200μm（右上挿入図: 50μm）。
【図２０】長骨へのNC細胞の神経周囲遊走は、専門化されたHSCニッチ機能を有するネスチン+ MSCを与える。a, 成熟造血系統およびc-kit抗体で染色されたwtおよびErbb3-null胚からの胎児肝臓（FL）切片。b, Nes-GFP+ 細胞における発現富化を示す、間葉マーカーCD90で染色された2週齢のNes-GfpマウスからのCD45-CD31-Ter119- BM細胞の代表的FACS。c, Nes-GFP+ 細胞を標識した抗CD90抗体で染色された新生児BM切片。スケールバー: 50μm。d, 抗CD90で免疫染色されたErbb3 wtおよびヌル（null）E17.5/18.5マウスからの代表的BM切片。e, （d）におけるサンプルのCD90免疫染色の定量; n=3。f, 成熟造血系統およびc-kit抗体をでのwtおよびErbb3-null胚からのBM切片の染色。g, E17.5/18.5 wtおよびErbb3-nullマウスにおけるBM Lin-c-kit+造血前駆体の定量（n=3）。平均±SD, *p < 0.05, 独立両側t検定。
【図２１】ネスチン+ MSCにより産生されるCXCL12は、BMにおけるHSCニッチを確立することに寄与する。a〜b,HSCは新生児BMにおけるNes-GFP+ 細胞の付近に局在している。Nes-Gfpマウスからの新生児大腿骨切片を造血系統、CD48およびCD150抗体で免疫染色した。（A）Lin-CD48-CD150+のHSCに富む細胞からNes-GFP+ 細胞までの距離の定量（平均±SEM, n=41）。b, Nes-GFP+ 細胞付近の代表的推定HSC（アスタリスク）。（C〜F）ネスチン+ 細胞の枯渇はBMへの発生HSC遊走を損なう。c〜d, E14.5においてタモキシフェンで、そしてE15.5においてジフテリア毒素で処理されたNes-CreERT2;iDTR（赤色点）および対照iDTR（黒色点）マウスからのE17.5（c）肝臓および（d）BM細胞からの長期培養開始細胞アッセイ（n=5〜6）。培養内造血コロニー形成単位（CFU-C）を示さなかった培養皿の百分率が（c）胎児肝臓Lin- Sca1+ および（d）BM有核細胞の5系列希釈に対してプロットされている。HSC度数およびp値が示されている。ピアソン カイ二乗検定。e, （c）におけるマウスにおけるLin-Sca-1+ E17.5肝細胞の度数。f, 出生時にタモキシフェンで処理された1週齢のNes-CreER;R26-DTAおよび対照同腹子におけるBM CFU-C含量（n=3〜7）。g, コアHSC維持遺伝子の発現は周産期Nes-GFP+ BMSCにおいて増強する。E18.5およびP7 Nes-Gfp BMから単離されたCD45-CD31-Ter119-GFP+/-細胞におけるCxcl12、幹細胞因子/kitリガンド（Kitl）、アンジオポエチン-1（Angpt1）および血管細胞接着分子-1（Vcam1）mRNAのQPCR分析。h, 1週齢のマウスから単離された内皮細胞およびNes-GFP+/- BMSCにおける相対的Cxcl12 mRNA発現レベル（qPCR; n=2）。i, 出生時にタモキシフェンで処理された1週齢のNes-Gfp;Nes-CreERT2;R26-TomatoマウスのBM切片の代表的共焦点像。細動脈および洞様毛細血管（アスタリスク）GFP+細胞は共に、Nes-CreERT2-由来Tomatoレポーターをも発現する。j〜k, P7 BMから単離された（j）間質および（k）内皮細胞におけるNes-CreERT2駆動体による周産期Cxcl12切除効率。出生時にタモキシフェンで処理されたCxcl12f/f;Nes-CreERT2（e）および対照（c）同腹子から単離されたCD45-Ter119-CD31-細胞におけるQPCR（n=2〜3）。（l）出生時にタモキシフェンで処理されたP7 Cxcl12f/f;Nes-CreERT2 および対照同腹子におけるBM CFU-C含量。（e,l）各点はマウスである。（f,h〜j）平均±SD, *p < 0.05, 独立両側t検定。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
幹細胞ニッチは、HSC（造血幹細胞）を含む癌幹細胞の調節における重要な要素および発癌単位として最近明らかになった。BCR-ABL融合を有さないほとんどのMPN（骨髄増殖性新生物）患者は、構成的キナーゼ活性をもたらすHSCにおけるJanus（ジャヌス）キナーゼ2における獲得突然変異（JAK2V617F）を有していて、HSCならびに赤血球性、巨核球性および骨髄性前駆体の無制御増殖を招く。トロンボポエチン受容体またはカルレチクリン遺伝子における体細胞突然変異が幾つかのMPN患者において見出され、追加的なHSC突然変異も疾患の進行に影響を及ぼす。HSC微小環境における変化もMPNの発生に寄与している可能性があり、BM線維芽細胞および骨形成細胞の増殖はMSCの関与を示唆している。
【００３０】
本発明者らは、マウスBM（骨髄）ネスチン+ MSCがHSCの維持に要求されること、およびヒトBMネスチン+ 細胞がHSCを増殖させうることを既に報告した。本発明において、本発明者らは、MPN患者におけるBM血管密度の増加にもかかわらず、ネスチン+ 細胞数およびネスチンmRNA発現が顕著に低減することを見出した（図1a〜b）。これは、plpC処理後にMPNを発生したMx1-cre; JAK2V617Fマウスにおいて再現された（図1c）。MPNマウスをNes-gfp系統と交雑させて、MSCを標識した。複合突然変異マウスおよび突然変異BM細胞が移植されたNes-gfp動物は共にMPNを発生し、GFP、表面マーカー発現および機能分析により定められる、より低いBM MSCを示した（図1d〜gおよび図5a〜f）。MSC喪失は初期BM線維症に付随したため、本発明者らは、ネスチン+ MSCがMPNにおいて線維芽細胞または骨芽細胞へと分化し、それによりこれらのマウスにおける間質変化に寄与するかどうかを判定するために、長期インビボ系統追跡研究を行った（図5g〜j）。
【００３１】
意外にも、GFP+ 細胞の血管パターンは、非罹患Nes-gfpマウスにおけるものに類似していた（図1h〜i）。ネスチン+ MSCの減少は、むしろ、突然変異マウスにおけるアポトーシス率の3倍の増加により説明され（図1j）、これは、JAKインヒビターであるルクソリチニブ（ruxolitinib）によっては妨げられなかった（図6）。ネスチン+ MSCの死が今度はMPNの進行を刺激しうるのかどうかを判定するために、本発明者らはネスチン+ 細胞をインビボで選択的に枯渇させた。この枯渇は、ネスチンを発現することが報告されている成熟BMシュワン細胞に影響を及ぼさなかったが、白血球および赤血球の増加に関連しているMSCの減少をもたらした（図1kおよび図7a〜e）。MPNにおいて線維芽細胞も骨細胞も産生しないネスチン+ 細胞と合致して、対照マウス（図1l）においては未だ検出不可能である過剰な線維芽細胞および骨形成をBM切片は明らかにした。
【００３２】
また、ネスチン+細胞枯渇後の疾患加速が重篤な脾臓浸潤として生じ、これは対照マウスにおいては尚も生じていない（図1m）。初期疾患段階において、最も原始的なHSCが最高の増殖を示して、BM、末梢血および脾臓において造血前駆体の増加を招いた。ケモカインCxcl12はHSCの遊走および静止を調節し、ネスチン+ MSCにより高発現される。初期HSC動員は、MSCの減少と合致して、BM Cxcl12の減少と相関した。また、Cxcl12の発現はMPN BM Nes-GFP+ 細胞において70倍低下した（図7f〜k）。インビボにおいてネスチン+ 細胞におけるCxcl12REF24の欠失はBM造血前駆体および循環血小板を増加させた（図1nおよび図7l）。したがって、MSC由来Cxcl12はJAK2V617F+ HSCの増殖を負に調節しうる。
【００３３】
BMネスチン+ 細胞の変化をより良く理解するために、次世代配列決定によりゲノムワイド発現をプロファイリングした。MSCおよびHSC関連遺伝子の発現はMPN Nes-GFP+ 細胞においてはより低かったが、これはシュワン細胞遺伝子および神経関連機能的範疇においてはむしろ富化を示した（図8a〜dおよび表1）。公的に入手可能なデータと比較された場合の、独立した生物学的サンプルの主成分分析が示したところによると、対照Nes-GFP+ 細胞は間葉前駆体に最も近く、一方、MPN Nes-GFP+はそれらから離れシュワン細胞に接近して密集していた（図2a）。qPCR（図2b）により確認されたこれらの変化はMPNにおけるHSCニッチ神経成分の変化を示唆した。
【００３４】
交感神経線維および鞘被覆シュワン細胞（特有のNes-GFP+ 細胞に隣接しているもの）ならびにGFAP mRNA発現はMPN患者およびマウスのBMにおいて顕著に低減した（図2c〜gおよび図8g〜i）。経時的分析は、BM神経損傷がNes-GFP+ 細胞のアポトーシスに先行することを示しており（図2g）、このことは、交感神経ニューロパシーが、突然変異細胞により誘発される細胞死に対してネスチン+ 細胞を感作することを示唆している。多重ELISAはMPN BMにおいて初期上昇インターロイキン-1βを検出した（図9a）。このサイトカインおよびその活性化酵素カスパーゼ-1は単球により発現されたが、造血前駆体によっても発現された（図9b〜d）。BM Nes-GFP- 間質細胞と比較して、インターロイキン-1受容体およびそのアンタゴニストのmRNAレベルはそれぞれ10倍および1000倍高く、MPNにおけるNes-GFP+ 細胞において特異的にアップレギュレーションされた（図9e〜f）。
【００３５】
したがって、本発明者らはインターロイキン-1受容体のアンタゴニストでマウスを慢性的に処理した。この処理は血小板数を減少させ、BM MSC度数を増加させ、これは造血前駆体におけるカスパーゼ-1 mRNA発現の低減に関連していた（図2hおよび図9g〜j）。本発明者らは、JAK2V617F+ HSCがBMシュワン細胞死を直接的に引き起こしうるかどうかを調べた。MSCとは異なり、JAK2V617F+ 造血前駆体と共培養されたBM由来シュワン細胞は3倍高いアポトーシス率を示し、これはインターロイキン-1受容体アンタゴニストにより阻止された（図2i）。
【００３６】
総合すると、これらのデータは、HSC由来インターロイキン-1βが、MSC生存を損なう神経膠損傷に寄与することを示唆している。したがって、本発明者らは、交感神経ニューロパシーがHSCニッチ変化の根底にあり、したがってMPNにおける治療標的となりうるかどうかを調べた。この場合、本発明者らは、化学療法中にBM交感神経線維を保護しうる神経保護物質4-メチルカテコールで症候性MPNマウスを処理した。シュワン細胞は4-メチルカテコール処理マウスにおいて維持され、好中球増加の予防も伴っていた（図3a〜b）。交感神経線維はネスチン+ MSCにおけるβ3-アドレナリン受容体活性化によりBM HSCトラフィックを調節する。この受容体は正常またはJAK2V617F+ 造血細胞においては発現されない（図10a）。β3-アドレナリン受容体を欠くマウスにおいては疾患発生が加速した（図3c〜d）。このことはMPNにおけるこの受容体の防御的役割を明らかに示している。ネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激を補償するために、症候性マウスを選択的β3-アドレナリンアゴニスト（BRL37344）で慢性的に処理した。顕著に、BRL37344処理はMPN関連好中球増加および血小板増加を妨げ、赤血球減少を遅延させたが、野生型マウスにおいては血球数に影響を及ぼさなかった（図3b, eおよび図10b〜d）。ビヒクル注射マウスにおける重篤な線維症とは対照的に、BRL37344処理動物のBMは過剰な骨および線維芽細胞組織を実質的に欠いていた（図3f）。
【００３７】
これらの効果はHSCニッチ依存的であった。なぜなら、4-メチルカテコールもBRL37344も培養造血前駆体の増殖に影響を及ぼさず、ネスチン+ 細胞が枯渇したマウスにおいて白血球増加はBRL37344によってはレスキューされなかったからである（図3gおよび図11a）。同様に、幾つかのMPNマーカーが、臨床的に承認されたβ3-アドレナリンアゴニストであるミラベグロンでの処理により改善された（図11b）。尤も、おらくその難溶解性およびマウス受容体に対する比較的低いアフィニティゆえに、その度合はより低かった。
【００３８】
より進行した段階で投与された場合の潜在的な治療利益を調べるために、血小板増加および対照マウスをBRL37344で処理した。この処理は好中球増加、赤血球増加、血小板増加、BMインターロイキン-1β、線維症および骨硬化を低減し、BMシュワン細胞をレスキューし（図4a〜d）、BMネスチン+ 細胞におけるシュワン細胞プログラム活性化を阻止した（図11c）。したがって、MPNの進行は、β3-アドレナリンアゴニストによるネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激の補償によって、およびBM神経膠の保護またはレスキューによって阻止されうる。
【００３９】
つぎに、本発明者らは、MPNの阻止がMSCおよびそれらのHSC調節機能の維持によりもたらされうるかどうかを問うた。BRL37344はBMにおけるIL-1βを低下させ、Nes-GFP+ 細胞数を回復させ、Cxcl12レベルを増加させた（図4e〜g）。初期BRL37344または4-メチルカテコール処理は突然変異造血前駆体の増殖を妨げた（図4hおよび図12）。長期BRL37344処理は正常HSCを損なわなかったが、突然変異造血前駆体を効率的に減少させ（図4i〜jおよび図13）、これは、血小板増加段階で投与された場合でさえもそうであった（図4k）。更に、BRL37344処理MPNマウスは白血病幹細胞における4.5倍の減少を示した（図4l）。
【００４０】
したがって、この知見は、MPNの病因に決定的に寄与する、MSCの生存および機能を損なうBM神経膠損傷の原因として、突然変異HSCを指摘している（図4m）。この意味において、本発明は、突然変異HSCにより誘発されるニッチ損傷が、HSCのみによって引き起こされると従来考えられていた造血悪性疾患の発生に必須であることを示している。HSCニッチ形成MSCおよびそれらの神経調節への標的化はより効率的なMPN治療戦略への道を開く。この目的のために、本発明は、MPNの治療のための効率的な治療戦略が、BM交感神経線維を保護しうる神経保護化合物、例えば4-メチルカテコールの投与にかかっていることを示す。また、もう1つの効率的な治療戦略が選択的β3-アドレナリンアゴニスト、例えばBRL37344またはミラベグロン（Mirabegron）の投与として本明細書に示されている。なぜなら、この戦略はネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激を補償するからである。
【００４１】
したがって、本発明の第1の態様は、骨髄増殖性新生物の治療における使用のための、TrKもしくはRET受容体アゴニスト、好ましくはβ-3アドレナリンアゴニスト、より好ましくは選択的β3-アドレナリンアゴニスト、またはBM交感神経線維を保護しうる神経保護化合物、またはそれらの組合せに関する。好ましくは、骨髄増殖性新生物は、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、特発性骨髄線維症、特発性骨髄異形成、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症からなる群から選択される。
【００４２】
便宜上、「選択的β3アゴニスト」、「選択的ベータ-3アゴニスト」または類似表現は、本明細書においては、「選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト」を意味するものとして用いられている。
【００４３】
一般に、アゴニストは、それが受容体と接触した場合に受容体に結合し、受容体の本質的効果をもたらし、したがって受容体の基礎活性を増強する分子である。本発明においては、選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニストは、ベータ-1およびベータ-2受容体と比較してベータ-3受容体に対する優先的アゴニズムを示す化合物として理解される。したがって、選択的ベータ-3アゴニストはベータ-1およびベータ-2受容体の場合より低い濃度でベータ-3受容体アゴニストと同様に挙動する。選択的ベータ-3アゴニストは、ベータ-3受容体アゴニストと同様に、そしてベータ-1およびベータ-2受容体アンタゴニストと同様に挙動する化合物をも含む。
【００４４】
好ましくは、ベータ-3受容体に対する本発明における有用な化合物の選択性はベータ-1およびベータ-2受容体に対するより明らかに高い。好ましい実施形態においては、本発明の選択的β3アゴニストは、他のベータアドレナリン受容体と比較して、25の約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示す。より一層好ましくは、本発明の目的においては、選択的β3アゴニストは、他のベータアドレナリン受容体と比較して「無限に」高い（約30の≧10000倍）、ベータ-3受容体に対する選択性を示す。
【００４５】
好ましい特定の実施形態においては、選択的β3アゴニストは、Ki約287/1750/1120 nMおよび／またはEC50 18/>10000/>10000 nMの、それぞれβ3、β1およびβ2受容体に対する阻害定数および／または平均有効濃度値を示す。選択的ベータ-3アゴニズムを達成する特定の化合物の能力は通常の技術により容易に評価されうる。受容体リガンド結合アッセイに関する一般的な参考文献には、例えば、Masood N. Khan, John W. Findlay (2010). Ligand-Binding Assays: Development, Validation, and Implementation in the Drug Development Arena: John Wiley & Sons; Assay Guidance Manual Version 5.0, 2008: Eli Lilly and CompanyおよびNIH Chemical Genomics Center（http://ncgcweb.nhgri.nih.gov/guidance/manual_toc.htmlにおいて入手可能）が含まれる。
【００４６】
本発明において有用な選択的ベータ-3アゴニストの代表例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：
- BRL 37344;
- CL 316243;
- AZ 002;
- BMS 187257;
- L-755507;
- L-750355;
- FR-149175;
- GW427353 (ソラベグロン（Solabegron）);
- YM178 (ミラベグロン（Mirabegron）／ミルベトリク（myrbetriq）);
- CR 58611;
- SR 58611A (アミベグロン（Amibegron）);
- SR 59104a;
- SR 59119A;
- SAR150640;
- L-796568;
- CL-316243
およびそれらの医薬上許容される塩。
【００４７】
本明細書中で言及されている化合物はいずれも、そのような具体的な化合物および或る変型または形態を表すものである。したがって、本発明における有用な化合物は、例えば、中性形態、塩基もしくは酸の形態、塩、好ましくは生理的に許容される塩の形態、溶媒和物の形態、多型の形態、および／または種々の異性体でありうる。
【００４８】
「塩」なる語は、イオン形態である又は荷電しており対イオン（カチオンまたはアニオン）と結合している又は溶解状態である本発明において使用される活性化合物のいずれかの形態として理解される必要がある。この定義はまた、第四級アンモニウム塩、ならびに他の分子およびイオンとの活性分子複合体、特に、イオン相互作用により生じる複合体を含む。この定義は特に、生理的に許容される塩を含み、この語は「薬理学的に許容される塩」または「医薬上許容される塩」と同等であると理解される必要がある。
【００４９】
「生理的に許容される塩」または「医薬上許容される塩」なる表現は特に、本発明の場合には、生理的に許容される酸と共に形成される塩（前記のとおり）、すなわち、それらがヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合には特に、生理的に許容される有機または無機酸との、あるいはそれらがヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合には特に、生理的に許容される少なくとも1つのカチオン、好ましくは無機カチオンとの、個々の活性化合物の塩として理解される。生理的に許容される特定の酸塩の例としては以下のものが挙げられる：塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヒドロブロミド、モノヒドロブロミド、一塩酸塩または塩酸塩、メチオジド、メタンスルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、マンデル酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、馬尿酸塩、ピクリン酸塩および／またはアスパラギン酸塩。生理的に許容される特定の塩基塩の例としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびNH4との塩が挙げられる。
【００５０】
本発明においては、「溶媒和物」なる語は、非共有結合により別の分子（通常は極性溶媒）と結合する本発明の活性化合物の任意の形態（特に、水和物、およびアルコラート、例えばメタノラートを含む）を意味するものとして理解される必要がある。
【００５１】
選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニストのプロドラッグである任意の化合物も本発明の範囲内である。「プロドラッグ」なる語はその語の最も広い意味で用いられ、インビボで本発明の化合物に変換される誘導体を包含する。プロドラッグの例には、生物加水分解性（biohydrolyzable）残基、例えば生物加水分解性アミド、生物加水分解性エステル、生物加水分解性カルバマート、生物加水分解性カルボナート、生物加水分解性ウレイドおよび生物加水分解性ホスファート類似体を含む選択的ベータ-3アゴニスト化合物の誘導体および代謝産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。機能的カルボキシル基を有する化合物のプロドラッグは、好ましくは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。カルボキシラートエステルは、適切には、分子内に存在するカルボン酸残基のいずれかをエステル化することにより形成される。プロドラッグは通常、よく知られた方法、例えば、Burguer “Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed.” (Donald J. Abraham編. 2001, Wiley)、“Design and Applications of Prodrugs” (H. Bundgaard編, 1985, Harwood Academic Publishers) およびKrogsgaard-Larsenら “Textbook of Drug Design and Discovery” Taylor & Francis (April 2002)に記載されている方法を用いて製造されうる。
【００５２】
本発明において有用な選択的ベータ-3アゴニストは、キラル中心の存在に応じて光学異性体を、そして多重結合の存在に応じて幾何異性体（例えば、Z、E）を含みうる。個々の異性体、エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらの混合物、例えばラセミ混合物が本発明の範囲内である。
【００５３】
更に、本明細書中で言及されているいずれかの化合物は互変異性体として存在しうる。特に、互変異性体なる語は、平衡状態にあり1つの異性体形態から別の異性体形態へと容易に変換される化合物の、2以上の構造異性体の1つを意味する。一般的な互変異性ペアとしては、アミン-イミン、アミド-イミド酸、ケト-エノール、ラクタム-ラクチムなどが挙げられる。
【００５４】
また、特に示されていない限り、本発明の化合物は同位体標識形態、すなわち、1以上の同位体濃縮原子の存在によってのみ異なる化合物を含むと理解される。例えば、少なくとも1つの水素原子が重水素または三重水素原子で置換されていること、あるいは少なくとも1つの炭素が13C-または14C-濃縮炭素で置換されていること、あるいは少なくとも1つの窒素が15N濃縮窒素で置換されていること以外は本構造を有する化合物が、本発明の範囲内に含まれる。
【００５５】
本発明の場合の選択的ベータ-3アゴニストは、好ましくは、医薬上許容される又は実質的に純粋な形態である。医薬上許容される形態は、とりわけ、希釈剤およびビヒクルのような典型的な医薬添加物を除いて、医薬上許容される純度レベルを有し、通常の投与レベルで毒性だとみなされるいずれの物質をも含まないと理解される。有効成分に関する純度レベルは、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、最も好ましくは90%以上である。好ましい実施形態においては、それは95%以上の選択的ベータ-3アゴニストである。
【００５６】
前記のとおり、「医薬上許容されるプロドラッグ、溶媒和物または塩」なる表現は、被投与者への投与の後で（直接的または間接的に）選択的ベータ-3アゴニストを与える任意の塩、溶媒和物または任意の他の化合物を意味する。医薬上許容されないプロドラッグ、溶媒和物および塩も、それらが医薬上許容されるプロドラッグ、溶媒和物および塩の製造において有用でありうる場合には、本発明の範囲内であると認識されるであろう。プロドラッグ、溶媒和物および塩は、当技術分野で公知の方法により製造されうる。
【００５７】
本発明の特定の実施形態においては、該選択的ベータ-3アゴニストは、フェニルエタノールアミン（2-アミノ-1-フェニルエタノール）
【００５８】
【化４】
0006479818.tif 000007
（式中、R1およびR2は、後記のとおり、種々の意味を表しうる）から誘導される化合物から選択される。より詳細な実施形態においては、R1は、水素およびハロゲン（F、CI、BrまたはI）から選択され、該ハロゲンは、好ましくは塩素である。R1は任意の位置（オルト、メタまたはパラ）に存在することが可能であり、好ましい実施形態においては、R1はメタ位に存在する。
【００５９】
もう1つのより詳細な実施形態においては、R2は、アリール部分および／またはアルキル部分において置換されうるアルアルキル、あるいは
【００６０】
【化５】
0006479818.tif 000008
から選択される基である。
【００６１】
特定のR2基を以下に示す。
【００６２】
【化６】
0006479818.tif 000009
好ましい実施形態においては、R1はメタ位における塩素を表し、R2は、所望によりフェニルにおいて置換されていてもよい1-メチル-2-フェニルエチル基である。もう1つの好ましい実施形態において、R1は水素を表し、R2は、所望によりフェニルにおいて置換されていてもよい2-フェニルエチル基である。好ましい実施形態においては、本発明において使用されるアゴニストは、BRL37344（[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-クロロフェニル)-2-ヒドロキシエチル]アミノ]プロピル]フェノキシ]酢酸）として特定される化合物であり、これは文書EP 023 385およびDrugs of the Future, Vol. 16, 797-800 (1991)に記載されており、それは以下の分子式を有する。
【００６３】
【化７】
0006479818.tif 000010
【００６４】
化合物BRL37344は強力かつ選択的なベータ-3アドレナリン受容体アゴニストであり（Ki値はβ3、β1およびβ2受容体に対してそれぞれ287、1750および1120 nMである）、ナトリウム塩の形態で商業的に入手可能である（CAS番号5 127299-93-8）。
【００６５】
【化８】
0006479818.tif 000011
【００６６】
本発明のもう1つの実施形態においては、CL316243として公知の化合物が好ましく、該化合物は文書EP 0 455 006およびJ. Med. Chem., Vol. 35, 3081-3084 (1992)に記載されており、以下の分子式を有する。
【００６７】
【化９】
0006479818.tif 000012
【００６８】
化合物CL 316243は強力かつ選択的なベータ-3アドレナリン受容体アゴニストであり（EC50 = 3 nM; 選択性:β1およびβ2より10000オーダー大きい）、二ナトリウム塩の形態で商業的に入手可能である（151126-84-0）。
【００６９】
【化１０】
0006479818.tif 000013
【００７０】
もう1つの好ましい実施形態においては、本発明において使用されるアゴニストはYM178（ミラベグロン（Mirabegron））またはその塩である。ミラベグロンは、過活動膀胱の治療用に販売されている化合物であり、以下の分子式を有する。
【００７１】
【化１１】
0006479818.tif 000014
【００７２】
もう1つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるアゴニストはGW427353（ソラベグロン（Solabegron））またはその塩、例えばその塩酸塩である。ソラベグロンは以下の分子式を有する。
【００７３】
【化１２】
0006479818.tif 000015
【００７４】
もう1つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるアゴニストはSR 58611A（アミベグロン（Amibegron））またはその塩である。アミベグロン、以下の分子式を有する抗うつ剤である。
【００７５】
【化１３】
0006479818.tif 000016
【００７６】
ベータ-3アドレナリン受容体に対するアゴニズムを示す化合物BRL 37344および更なる化合物を記載している他の文書としては、US20040242485A1、US4873240、US4880834、US5002946、US5087626、US5236951、US5578638、US6172099、US6187809が挙げられる。ベータ-3アドレナリン受容体に対する選択的アゴニスト活性を示すことが知られている追加的化合物は、例えば、特許文書US4396627、US4478849、US4999377、US5153210、WO98/32753、WO97/46556、WO97/37646、WO97/15549、WO97/25311、WO96/16938、WO95/29159、WO02/06276、EP427480、EP659737、EP801060、EP714883、EP764632、EP764640、EP827746、US5561142、US5705515、US5436257、US5578620およびUS6537994に記載されている。
【００７７】
ある化合物が本発明の目的に有用であるかどうかを当業者は容易に決定することが可能である。したがって、前記のとおり、ある化合物が良好な選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニストであるかどうかを評価するのに適した通常の方法が存在する。更に、ベータ-3アゴニスト活性の決定、およびベータ-1／ベータ-2受容体との比較におけるベータ-3受容体選択性の決定は共に、既に確立されている特定の機能アッセイ、例えば、前記特許および出願、特にWO98/32753、WO97/46556、EP764632、EP764640およびEP827746に記載されているアッセイに従い評価されうる。前記のとおり、選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニストは商業的に入手可能であり、ならびに／または例えば前記特許および出願に記載されている方法のような公知方法により製造されうる。
【００７８】
また、本発明の第1の態様はまた、骨髄増殖性新生物の治療における使用のための、BM交感神経線維を保護しうる神経保護化合物またはそれらの組合せに関する。
【００７９】
該神経保護化合物は、4-メチルカテコール；NGF（ニューロン成長因子）；ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）またはペルセフィン（PSPN）ファミリーに属するグリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）；ニューロトロフィン3およびニューロトロフィン4/5；インターロイキン6（IL-6）；インスリン様成長因子1（IGF-1）；ビタミンE、特に、ビタミンEのα-トコフェロール形態；N-アセチルシステインまたはN-アセチル-L-システイン（略称NAC）としても公知であるアセチルシステイン；アセチル-L-カルニチンまたはALCAR；アミホスチン（amifostine）および白血病抑制因子またはLIFからなる群から選択されうる。
【００８０】
あるいは、神経保護化合物は、糖尿病性神経障害の治療において有用な化合物から選択される。そのような化合物は、インクレチンとして公知の消化管ホルモンの群から選択されうる。インクレチンは、血中グルコースレベルの低下を刺激する消化管ホルモンの一群である。血中グルコースレベルが上昇する前に、インクレチンは、食後にランゲルハンス島のベータ細胞から放出されるインスリンの量の増加を引き起こすことにより、それを行う。それはまた、胃内容排出を減少させることによって、血流内への栄養素の吸収の速度を遅くし、食物摂取を直接的に減少させうる。予想されるとおり、それはまた、ランゲルハンス島のアルファ細胞からのグルカゴン放出を抑制する。インクレチンの基準を満たす2つの主要候補分子はグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）および胃抑制ペプチド（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドまたはGIPとしても公知）である。GLP-1およびGIPは共に、酵素ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）により迅速に不活性化される。したがって、神経保護化合物として有用な他の物質は、酵素ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）を不活性化しうるものであろう。
【００８１】
更に、本発明のもう1つの好ましい態様においては、該神経保護化合物は、シタグリプチン（sitagliptin）（Merck）、サクサグリプチン（saxagliptin）／オングリザ（Onglyza）（Bristol-Myers Squibb/AstraZeneca）、リナグリプチン（linagliptin）（Boehringer Ingelheim）、デュトグリプチン（dutogliptin）（Phenomix Corporation）、ジェミグリプチン（gemigliptin）（LG Life Sciences, Korea）、アログリプチン（alogliptin）（Takeda）、ビルダグリプチン（vildagliptin）／ガルブス（Galvus）（Novartis）およびベルベリン（Berberine）から得られる栄養補助食品からなる群から選択されうる。
【００８２】
本明細書中で言及されている神経保護化合物はいずれも、そのような具体的な化合物および或る変型または形態を表すものである。したがって、本発明における有用な化合物は、例えば、中性形態、塩基もしくは酸の形態、塩、好ましくは生理的に許容される塩の形態、溶媒和物の形態、多型の形態、および／または種々の異性体でありうる。
【００８３】
「塩」なる語は、イオン形態である又は荷電しており対イオン（カチオンまたはアニオン）と結合している又は溶解状態である本発明において使用される活性化合物のいずれかの形態として理解される必要がある。この定義はまた、第四級アンモニウム塩、ならびに他の分子およびイオンとの活性分子複合体、特に、イオン相互作用により生じる複合体を含む。この定義は特に、生理的に許容される塩を含み、この語は「薬理学的に許容される塩」または「医薬上許容される塩」と同等であると理解される必要がある。
【００８４】
「生理的に許容される塩」または「医薬上許容される塩」なる表現は特に、本発明の場合には、生理的に許容される酸と共に形成される塩（前記のとおり）、すなわち、それらがヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合には特に、生理的に許容される有機または無機酸との、あるいはそれらがヒトおよび／または哺乳動物において使用される場合には特に、生理的に許容される少なくとも1つのカチオン、好ましくは無機カチオンとの、個々の活性化合物の塩として理解される。生理的に許容される特定の酸塩の例としては以下のものが挙げられる：塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ヒドロブロミド、モノヒドロブロミド、一塩酸塩または塩酸塩、メチオジド、メタンスルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、マンデル酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、馬尿酸塩、ピクリン酸塩および／またはアスパラギン酸塩。生理的に許容される特定の塩基塩の例としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩およびNH4との塩が挙げられる。
【００８５】
本発明においては、「溶媒和物」なる語は、非共有結合により別の分子（通常は極性溶媒）と結合する本発明の活性化合物の任意の形態（特に、水和物、およびアルコラート、例えばメタノラートを含む）を意味するものとして理解される必要がある。
【００８６】
本明細書中で言及されている神経保護化合物のプロドラッグである任意の化合物も本発明の範囲内である。「プロドラッグ」なる語はその語の最も広い意味で用いられ、インビボで本発明の化合物に変換される誘導体を包含する。プロドラッグの例には、生物加水分解性（biohydrolyzable）残基、例えば生物加水分解性アミド、生物加水分解性エステル、生物加水分解性カルバマート、生物加水分解性カルボナート、生物加水分解性ウレイドおよび生物加水分解性ホスファート類似体を含む、本明細書中で言及されている神経保護物質の誘導体および代謝産物が含まれるが、これらに限定されるものではない。機能的カルボキシル基を有する化合物のプロドラッグは、好ましくは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。カルボキシラートエステルは、適切には、分子内に存在するカルボン酸残基のいずれかをエステル化することにより形成される。プロドラッグは通常、よく知られた方法、例えば、Burguer “Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed.” (Donald J. Abraham編. 2001, Wiley)、“Design and Applications of Prodrugs” (H. Bundgaard編, 1985, Harwood Academic Publishers) およびKrogsgaard-Larsenら “Textbook of Drug Design and Discovery” Taylor & Francis (April 2002)に記載されている方法を用いて製造されうる。
【００８７】
本明細書中で言及されている神経保護化合物は、キラル中心の存在に応じて光学異性体を、そして多重結合の存在に応じて幾何異性体（例えば、Z、E）を含みうる。個々の異性体、エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらの混合物、例えばラセミ混合物が本発明の範囲内である。
【００８８】
更に、本明細書中で言及されているいずれかの化合物は互変異性体として存在しうる。特に、互変異性体なる語は、平衡状態にあり1つの異性体形態から別の異性体形態へと容易に変換される化合物の、2以上の構造異性体の1つを意味する。一般的な互変異性ペアとしては、アミン-イミン、アミド-イミド酸、ケト-エノール、ラクタム-ラクチムなどが挙げられる。
【００８９】
また、特に示されていない限り、本発明の化合物は同位体標識形態、すなわち、1以上の同位体濃縮原子の存在によってのみ異なる化合物を含むと理解される。例えば、少なくとも1つの水素原子が重水素または三重水素原子で置換されていること、あるいは少なくとも1つの炭素が13C-または14C-濃縮炭素で置換されていること、あるいは少なくとも1つの窒素が15N濃縮窒素で置換されていること以外は本構造を有する化合物が、本発明の範囲内に含まれる。
【００９０】
本明細書中で言及されている神経保護化合物は、好ましくは、医薬上許容される又は実質的に純粋な形態である。医薬上許容される形態は、とりわけ、希釈剤およびビヒクルのような典型的な医薬添加物を除いて、医薬上許容される純度レベルを有し、通常の投与レベルで毒性だとみなされるいずれの物質をも含まないと理解される。有効成分に関する純度レベルは、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、最も好ましくは90%以上である。好ましい実施形態においては、それは95%以上の選択的ベータ-3アゴニストである。
【００９１】
本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、4-メチルカテコールとして公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【００９２】
【化１４】
0006479818.tif 000017
【００９３】
本発明のこの態様のもう1つの好ましい実施形態においては、シタグリプチン（sitagliptin）（INN; 以前はMK-0432として特定され、ジャヌビア（Januvia）なる商品名のリン酸塩として販売）として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【００９４】
【化１５】
0006479818.tif 000018
【００９５】
本発明のこの態様のもう1つの好ましい実施形態においては、サクサグリプチン（saxagliptin）（rINN）（以前はBMS-477118として特定されていた）として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【００９６】
【化１６】
0006479818.tif 000019
【００９７】
本発明のこの態様のもう1つの好ましい実施形態においては、リナグリプチン（linagliptin）（Bl-1356, 商品名トラドジェンタ（Tradjenta）およびトラジェンタ（Trajenta））として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【００９８】
【化１７】
0006479818.tif 000020
【００９９】
本発明のこの態様のもう1つの好ましい実施形態においては、デュトグリプチン（dutogliptin）として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【０１００】
【化１８】
0006479818.tif 000021
【０１０１】
本発明のこの態様のもう1つの好ましい実施形態においては、ジェミグリプチン（gemigliptin）（rINN）（以前はLC15-0444として特定されていた）として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【０１０２】
【化１９】
0006479818.tif 000022
【０１０３】
本発明のこの態様の更にもう1つの好ましい実施形態においては、アログリプチン（alogliptin）（コード名SYR-322、商品名ネシナ（Nesina））として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【０１０４】
【化２０】
0006479818.tif 000023
【０１０５】
本発明のこの態様の更にもう1つの好ましい実施形態においては、ビルダグリプチン（vildagliptin）（旧称LAF237、商品名ガルブス（Galvus）、ゾメリス（Zomelis）、ジャルラ（Jalra））として公知の化合物が好ましく、該化合物は以下の分子式を有する。
【０１０６】
【化２１】
0006479818.tif 000024
【０１０７】
したがって、本発明者らは、選択的ベータ-3アゴニストまたは神経保護化合物の投与が、MPNにおける、より効率的な治療戦略への道を開くことを、種々の筋書きにおいて本発明において実証した。この目的において、本発明は、MPNの治療のための効率的な治療戦略が、BM交感神経線維および付随シュワン細胞を保護しうる神経保護化合物、例えば4-メチルカテコールの投与に基づくことを示している。また、もう1つの効率的な治療戦略は選択的β3-アドレナリンアゴニスト、例えばBRL37344またはミラベグロンの投与として本明細書において示されている。なぜなら、この戦略はネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激を補償し、BMシュワン細胞をレスキューするからである。
【０１０８】
したがって、本発明は、MPNに対する広域スペクトル治療物質としてBM交感神経線維を保護しうる神経保護化合物およびベータ-3アドレナリン受容体アゴニストの使用を提示する。したがって、得られた結果はMPNの治療および／または予防におけるこれらの化合物の多大な有用性を証明している。
【０１０９】
選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニストおよび／または神経保護化合物と医薬上許容される賦形剤とを含む、MPNの治療および／または予防における使用のための医薬品または医薬組成物を本発明において提供する。
【０１１０】
医薬組成物の例には、経口、局所または非経口投与のための任意の固体（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤など）または液体（溶液、懸濁剤または乳剤）組成物が含まれる。
【０１１１】
「賦形剤」なる語は有効成分以外の薬理学的化合物の成分を意味する（European Medicines Agency - EMAから得た定義）。それらは、好ましくは、「担体、補助物質（アジュバント）および／またはビヒクル」を含む。担体は、薬物投与および有効性を改善するために物質が取り込まれる形態である。薬物担体は、インビボでの薬物の作用を延長させ薬物代謝を低減し薬物毒性を低減するためのコントロールリリース（制御放出）技術のような薬物投与系において使用される。担体は、薬理学的標的作用部位に対する薬物投与の有効性を増強するための設計において使用される（U.S. National Library of Medicine. National Institutes of Health）。
【０１１２】
補助物質（アジュバント）は、予測可能な様態で有効成分の作用に影響を及ぼす、医薬品製剤に加えられる物質である。
【０１１３】
ビヒクルは、医薬品の投与のための体積を付与するための手段として使用される、いずれの治療作用をも伴わない賦形剤または物質である（Stedman's Medical Spellchecker, (商標) 2006 Lippincott Williams & Wilkins）。
【０１１４】
そのような医薬担体、補助物質またはビヒクルは、無菌液体、例えば水および油、例えば石油または動物、植物もしくは合成由来の油、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤または希釈剤でありうる。適当な医薬担体はE.W. Martinにより“Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載されている。これらの賦形剤および使用量の選択は医薬組成物の適用の形態に左右されるであろう。
【０１１５】
ヒトおよび動物のための1日量は、それぞれの種に基づく要因、または年齢、性別、体重もしくは疾患の程度などのような他の要因によって変動しうる。
【０１１６】
該製剤は、通常の方法、例えば、スペイン国、欧州もしくは米国薬局方、または類似参考書、例えば“Tratado de Farmacia Galenica”（C. Fauli i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones）に記載されている方法に従い製造されうる。
【０１１７】
本発明の化合物および組成物は、併用療法をもたらす他の薬物と共に使用されうる。そのような他の薬物は同一組成物の一部であることが可能であり、あるいは同じ時点または異なる時点での投与のための別々の組成物として提供されうる。
【０１１８】
本明細書中で用いる「治療する」、「治療し」および「治療」なる語は、一般に、対象におけるMPNの根絶、排除、逆転、緩和、修飾または抑制を含む。
【０１１９】
本明細書中で用いる「予防」、「予防し」、「予防的」、「予防する」および「妨げる」なる語は、対象におけるMPNの開始または発生を阻止、最小化または複雑化する、与えられた物質の能力を意味する。
【０１２０】
本発明の文脈における「対象（被験者）」または「患者」なる語は、任意の動物、特に脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、ブタ、ウサギ、ネコ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヒトなどを含む。好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトである。
【０１２１】
本発明はまた、慢性骨髄性白血病（CML）、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、骨髄線維症、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症の患者におけるMPNの診断または予後の方法を提供する。この場合、MPNの予後は、経時的なBM生検におけるチロシンヒドロキシラーゼの免疫染色による患者のBMにおける交感神経系線維の評価を含む方法により実施可能であり、ここで、交感神経系線維が、正常被験者における交感神経系線維と比べて、および／または同じ患者において経時的に減少している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行している。
【０１２２】
典型的に、MPNを有する患者は、チロシンヒドロキシラーゼ線維により占拠されたBM面積における3倍の減少を示すであろう。
【０１２３】
本発明の場合、交感神経線維により占拠されたBM面積の参照または対照値は該区画における全BM面積の0.15±0.09%である。
【０１２４】
本発明の場合、「正常」なる語は健康な被験者（対象）を指す。
【０１２５】
もう1つの好ましい実施形態においては、被験者におけるMPNの予測または予後は、以下の工程、すなわち、
a．被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b．所望により、標準的な方法により赤血球溶解を行い、遠心分離により残存骨髄有核細胞を得、ここで、qRT-PCRによるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を工程a）のサンプルにおけるグリア細胞の総数の指標として使用することが可能であり、
c．工程a）のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を正常被験者におけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照または対照値と、あるいは正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比較することを含む方法により実施可能であり、ここで、工程a）のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現が参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から若しくは経時的に得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比べて低減している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行している。
【０１２６】
本発明の場合、グリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照または対照値は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA発現に対して正規化された0.48±0.03である。
【０１２７】
本発明の実施形態の場合、「低減（減少）」なる語は、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の値の160倍の低減（減少）を意味する。
【０１２８】
本発明の場合、「対照」なる語は健康な被験者（対象）を指す。
【０１２９】
また、図1に示されているとおり、BMネスチン+ 間葉幹細胞ニッチ細胞のアポトーシスはMPNの進行に寄与する。したがって、好ましい実施形態においては、被験者におけるMPNの予測または予後は、以下の工程、すなわち、
a．被験者の骨髄から生物学的サンプルを経時的に得、
b．ネスチンの免疫染色、およびそれに続く、BMサンプル（平均7.2mm2のBMが評価され、結果は1mm2まで外挿されるべきである）におけるネスチン+ 血管周囲ニッチ（単細胞または3個までの細胞のクラスター）の数を考慮した評価により測定した、工程a）のサンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、
c．工程a）の生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの総数の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数と比較することを含む方法により実施可能であり、ここで、細胞数が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から若しくは経時的に得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの数と比べて減少している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在する。
【０１３０】
本発明の場合、正常被験者におけるBMネスチン+細胞の総数の参照または対照値は1.15±0.3ニッチ/mm2（それぞれのものは少なくとも1つの陽性細胞を含有する）である。
【０１３１】
本発明のこの実施形態の場合、「低減（減少）」なる語は正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの数の6倍の低減（減少）である。
【０１３２】
本発明の場合、「正常」なる語は健康な被験者（対象）を指す。
【０１３３】
もう1つの好ましい実施形態においては、被験者におけるMPNの予測または予後は、以下の工程、すなわち、
a．被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
b．標準的な方法により赤血球溶解を行い、遠心分離により残存骨髄有核細胞を得、ここで、qRT-PCRによるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を工程a）のサンプルにおけるネスチン+ MSCの総数の指標として使用することが可能であり、
d．工程a）のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現を、正常被験者におけるネスチンのmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比較することを含む方法により実施可能であり、ここで、工程a）のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から若しくは経時的に得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比べて低減している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在する。
【０１３４】
本発明の場合、ネスチンのmRNA発現の参照または対照値は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA発現に対して正規化された4.86±4.55である。
【０１３５】
本発明の実施形態の場合、「低減（減少）」なる語は、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたネスチンのmRNA発現の値の13倍の低減（減少）を意味する。
【０１３６】
本発明の場合、「対照（コントロール）」なる語は健康な被験者（対象）を指す。
【０１３７】
本発明のもう1つの態様は、前記方法のいずれかの実施に適したキットに関する。
【０１３８】
つぎに以下の実施例により本発明を説明するが、これらの実施例はその非限定的な単なる例示とみなされなければならない。
（実施例）
実施例1．図1〜13の材料および方法
1.1. ヒトにおける研究
この研究は治験審査委員会により承認された。ヘルシンキ宣言に従い、書面によるインフォームドコンセントを全患者から得た。世界保健機関（WHO）の改訂基準に従い、MPNの診断を確定した。
【０１３９】
1.2. インビボ薬理学的処理
Mx1-cr;JAK2-V617F二重トランスジェニックマウスにおいて、ヒトJAK2-V617F突然変異の発現は内因性Jak2プロモーターにより駆動され、ポリイノシン-ポリシトシン（plpC）によるミクソウイルス耐性-1（Mx1）駆動Creリコンビナーゼ活性化に際して造血細胞において条件つきで発現されうる。PlpC誘導性トランスジェニックマウス、およびこれらのマウスからのBM細胞が移植された野生型マウスはPV19,20の進行性症状を発生する。
【０１４０】
年齢が釣り合わされた雌野生型C57BL/6JまたはNes-gfpマウスを骨髄（BM）移植アッセイにおけるレシピエントとして及びインビボ薬理学的処理のために使用した。致死照射（12Gy）レシピエントマウスに、8週間前にplpCで誘導されたMx1-Cre;JAK2V617Fマウスからの、または疾患非含有対照としてのCre陰性マウスからの2×106 BM細胞を移植した。選択的β3アドレナリンアゴニストBRL37344（Sigma, St. Louis, MO）を2mg kg-1で腹腔内（i.p.）注射により1日2回（10〜12時間ごと）投与した。ビヒクル（食塩水溶液）の毎日の注射を同様に行った。特に示されていない限り、動物がMPNの末梢血徴候を示した、移植の4週間後に、処理を開始した。処理開始前にマウスをランダムに分配し、自動血球計算機を使用して疾患発生を末梢血サンプルにおいて経時的に監視した。選択的ベータ3アドレナリンアゴニストであるミラベグロン（2mg kg-1, i.p., 10〜12時間間隔で1日2回の注射）を使用して、類似した処理法を行った。神経保護薬4-メチルカテコール（10μg kg-1, i.p.）を1日1回注射した。JAKインヒビターINCB018424（S-Ruxilitinib, Abmole Bioscience）をDMSO中の可溶化後に0.5% ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Sigma）中で経口胃管栄養法（30mg kg-1, 10〜12時間間隔で1日2回）により投与した。IL-1受容体アンタゴニスト（Kineret, Sobi, Stockholm, Sweden）を、40mg kg-1/日の連続投与量を注入する皮下浸透ポンプ（Alzet）により投与した。マウスを種々の時点で犠死させ、完全な剖検にふし、BMおよび脾臓を組織学的方法およびフローサイトメトリーにより分析し、大腿および頭蓋を免疫染色に使用し、更に、造血細胞および間質細胞をエクスビボの機能アッセイに使用した。
【０１４１】
HSCの定量のために、処理マウスからのBM細胞を、限界細胞希釈を用いる競合再増殖アッセイに使用した。簡潔に説明すると、CD45.1+競合BM細胞（2×106）を、4×105、4×104および4×103個のドナーBM細胞との混合の後、致死照射CD45.2+レシピエントマウス内に移植した。末梢血キメラ性をフローサイトメトリーにより2〜4週間ごとに評価した。マウスを該移植の16週間後に犠死させ、BM LSK細胞キメラ性をフローサイトメトリーにより評価した。LSK細胞区画における少なくとも5%のCD45.2+キメラ率を対照BM細胞のレシピエントにおける陽性とみなした。突然変異BMのレシピエントにおいては、50%を超えるCD45.2+キメラ率を示すマウスを陽性（「白血病」）とみなした。それぞれ対照および突然変異ドナーBMにおけるHSCおよびMPN開始細胞の定量のために、ソフトウェアLCalc（StemCell Technologies）を使用した。
【０１４２】
Nes-creERT2マウスを、示されている時間にわたり、タモキシフェン（Sigma）で誘導した。対照および実験マウスに140mg kg-1のタモキシフェン（トウモロコシ油中、14mg ml-1溶液）を代替日に3回i.p.注射し、植物エストロゲン非含有食を同時に1週間与え、ついでタモキシフェン含有食TM400（Harlan）を与えた。Nes-creERT2;RCE:loxPマウスをインビボ系統追跡研究に使用した。ネスチン+細胞を選択的に枯渇させるために、Nes-creERT2マウスをCreリコンビナーゼ誘導性ジフテリア毒素マウス系統（iDTA）と交配させた。更に、タモキシフェン誘導に際してネスチン+細胞におけるCxcl12を選択的に欠失させるために、Nes-creERT2マウスを条件的Cxcl12欠損マウスと交配させた。
【０１４３】
BM細胞抽出、フローサイトメトリーおよび蛍光標識細胞分取。造血細胞の回収のために、骨を乳鉢内で破砕し、40μmメッシュで濾過して単個細胞浮遊液を得、0.15M NH4Cl中、4℃で10分間の細胞溶解により赤血球を枯渇させた。脾臓サンプルをホモジネートし、細胞溶解前に濾過した。血液サンプルを直接的に細胞溶解した。細胞（1〜2×106細胞/サンプル）を適当な希釈度（2〜5μg ml-1）の蛍光抗体コンジュゲートおよび4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）と共に死細胞除去のためにインキュベートし、FACSDivaソフトウェア（BD Biosciences）を備えたLSRFortessaフローサイトメーター（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）で分析した。以下の抗体を使用した: 蛍光CD45.1 (A20), CD45.2 (104), B220 (RA3-6B2), CD11b (M1/70), CD3ε(145-2C11), Ly-6G (1A8), Sca1 (E13-161.7), CD34 (RAM34), CD135/Flt3 (A2F10.1)およびビオチン化系統抗体（CD11b, Gr-1, Ter119, B220, CD3ε）（全てBD Biosciencesからのもの）; c-kit (2B8)（eBioscience (San Diego, CA)からのもの）。ビオチン化抗体を蛍光色素結合ストレプトアビジン（BD Biosciences）で検出した。HSCの表現型集団は長期造血幹細胞（HSC）（lin- Sca1+ c-kit+ (LSK) CD34- Flt3-）、短期HSC（LSK CD34+ Flt3-）および多能性前駆体（MPP）（LSK CD34+ Flt3+）として定められた。
【０１４４】
ネスチン+細胞の単離のために、骨を周辺組織から取り出し、乳鉢内で乳棒で破砕し、振とう水浴内で37℃で45分間、コラゲナーゼで消化した（カタログ番号07902, StemCell Technologies）。細胞を40μmメッシュで濾過し、既に記載されているとおりに赤血球を細胞溶解した。得られた骨髄富化細胞懸濁液をペレット化し、洗浄し、更なる分析のために、2% ウシ胎児血清（FCS）を含有するPBSバッファーに再懸濁させた。細胞分取のために、ビオチン化CD45 (104)、CD31 (MEC13.3)およびTer119抗体を使用する免疫磁気的枯渇およびそれに続くストレプトアビジン磁気ビーズ（BD Biosciences）の添加により（該製造業者の推奨に従った）、細胞を富化（濃縮）した。BM間質 CD45- CD31- Ter119-細胞は、GFP蛍光によると、FACS Aria細胞分取器（BD Bioscience）を使用して更に精製された。アポトーシス細胞の決定のために、サンプルを表面抗体染色後にPBSで洗浄し、ついでAnnexin V-Pacific BlueおよびSYTOX AADvanced（Invitrogen, Life Technologies, Paisley, UK）で染色した。機能アッセイのために、ビオチン化CD45およびTer119を使用する免疫磁気的枯渇により細胞を富化した。免疫表現型特徴づけのために、以下の追加的抗体を使用するフローサイトメトリーにより全BMサンプルを調べた：CD63 (NVG-2), CD105 (MJ7/18), CD140a (APA5), Vcam, CD51 (RMV-7)（全てBiolegendからのもの）; およびCD90.2（BD Biosciences）。
【０１４５】
1.3. 細胞培養
培養内コロニー形成単位（CFU-C）アッセイを行った。BRL37344および4-メチルカテコールを、特定されている濃度でメチルセルロースに加えた。水ジャケット付きインキュベーター内での37℃、5% CO2、20% O2における7日間のインキュベーションの後、50細胞を超えるコロニーを評価した。CFU-Fアッセイのために、BM CD45- Ter119-細胞を6ウェルディッシュ内にプレーティングし、維持培地（α-MEM、15% FCS、抗生物質含有）内で培養した。10〜12日間の培養の後、接着細胞を100% メタノールで固定し、ギムザ染料（Sigma）で染色して線維芽細胞塊を明らかに示した。50細胞を超えるコロニーをCFU-Fとして評価した。
【０１４６】
メセンスフェア（mesensphere）形成のために、超低接着性35mmディッシュ（StemCell Technologies）内で細胞をプレーティングした。増殖培地は、32,33,33に記載されているとおりに調製された15% ニワトリ胚抽出物；0.1mM β-メルカプトエタノール；1% 非必須アミノ酸（Sigma）；1% N2および2% B27サプリメント（Invitrogen）；組換えヒト線維芽細胞増殖因子（FGF）塩基性、組換えヒト上皮増殖因子（EGF）、組換えヒト血小板由来増殖因子（PDGF-AB）、組換えヒトオンコスタチンM（227 a.a. OSM）（20 ng ml-1）および組換えヒトインスリン様増殖因子-1（IGF-1; 40 ng ml-1）（Peprotech）をDMEM/F12 (1:1) / ヒト内皮 (1:2) 無血清培地 (Invitrogen)内に含有していた。該培養を水ジャケット付きインキュベーター内で37℃、5% CO2、20% O2で維持した。半分の培地の交換を毎週行った。メセンスフェアを第10日に評価した。
【０１４７】
BM由来シュワン細胞およびMSCと対照および突然変異マウスからのBM LSK細胞との共培養のために、それぞれシュワン細胞前駆体およびMSCを含有する新生児BM CD45- CD31- Ter119- Nes-GFP+ Pdgfrα-/+ 細胞（Isern Jら, 提出済み）を選別し、既に記載されているとおり（34）のシュワン細胞分化条件または間葉培養条件下、10ng ml-1 PDGFAB、15% FBSで補足されたMEMα内で培養した。両方を、対照または突然変異マウスからFACSにより単離された初代BM LSK細胞と共に24時間共培養した。選別GFP+ Pdgfrα- BM前駆体に由来するシュワン細胞を更に、IL1ra（200ng ml-1）と共に該共培養時間にわたってインキュベートした。24時間の共培養の後、造血細胞を洗浄除去し、残存接着シュワン細胞を固定し、TUNELによりアポトーシスに関して分析した。
【０１４８】
組織学的分析、免疫組織学的検査および通常の免疫蛍光ヘマトキシリンおよびエオシン染色を脱パラフィン化切片において行い、ついで再水和を行った。ハリス（Harris）ヘマトキシリン溶液を染色に使用し、エオシンY溶液を対比染色に使用した。蒸留水中でスライドを手短に洗浄した後、70%、95%、無水エチルアルコール中で脱水を迅速に行った。切片をキシレンで綺麗にし、DPX中でマウントした。
【０１４９】
コラーゲンのマッソン三色染色のために、切片をブアン固定液中で56℃で1時間にわたって再び固定し、ヴァイゲルト鉄ヘマトキシリン実施溶液で10分間染色し、ついでビーブリッヒ緋色酸フクシン溶液で10〜15分間染色した。リンモリブデン-リンタングステン酸溶液を10〜15分間またはコラーゲンが赤色染色を消失するまで加えた。切片を直接的にファストグリーン溶液に移し、1分間染色し、手短に洗浄し、1% 酢酸溶液と共に2〜5分間インキュベートした。蒸留水中の手短な洗浄の後、70%、95%および無水エチルアルコール中で脱水を迅速に行った。切片をキシレンで綺麗にし、DPXでマウントした。
【０１５０】
レチクリン線維を可視化するためにゴードン・スウィートの染色法を用いた。簡潔に説明すると、脱パラフィン化切片を1% 酸性過マンガン酸カリウムで5分間酸化し、ついで脱色のための1% シュウ酸および2.5% 鉄ミョウバン中の媒染剤で15分間酸化した。切片をアンモニア銀溶液中に2分間含浸させ、10% 水性ホルマリンで2分間還元した。ついで該切片を塩化金で2分間インキュベートし、5% 水性チオ硫酸ナトリウムで固定した。ファストグリーン中での15秒間のインキュベーションを対比染色のために用いた。蒸留水中の手短な洗浄の後、70%、95%および無水エチルアルコール中で脱水を迅速に行った。切片をキシレンで綺麗にし、DPXでマウントした。
【０１５１】
コラーゲンのヴァンギーソン染色のために、核をセレスチンブルーで2分間染色し、蒸留水中で手短に洗浄し、ハリス（Harris）ヘマトキシリン溶液と共に2分間インキュベートし、水道流水下で5分間洗浄した。カーチス（Curtis）染色（飽和水性ピクリン酸、1% ポンソーSおよび氷酢酸混合物）をコラーゲンが桃色になるまで5分間行った。蒸留水中の手短な洗浄の後、70%、95%および無水エチルアルコール中で脱水を迅速に行った。切片をキシレンで綺麗にし、DPXでマウントした。
【０１５２】
クリオスタット切片の免疫蛍光染色を行った。頭蓋冠のホールマウント染色のために、全てのインキュベーション時間を延長した。使用した抗体はTH（ウサギpAb, Millipore）およびGFAP（ウサギpAb, Dako）であった。レーザー走査共焦点（Zeiss LSM 700）を用いて共焦点イメージを得た。ImageJソフトウェアを使用する定量のために、少なくとも3つの異なる切片を使用した。
【０１５３】
ヒトBMサンプルのNESTIN/CD34免疫組織化学検査のために、12個の対照BM生検体（健常ドナーからの2個、反応性末梢白血球増加を示す患者からの2個、およびリンパ腫の病期分類のために使用されたがリンパ腫に罹患していなかった8個）および28個のMPN（それらのうちの13個はJAK2-V617F+であった）を、AbD Serotecのモノクローナル抗体10C2（OBT1610）を1:50の希釈度で適用し自動免疫染色装置（Benchmark, Ventana/Roche）を使用してネスチンに関して染色した。細胞馴化（Ventana/RocheからのCC1）処理により60分間にわたって抗原回収を行った。ついで60分間のインキュベーション、シグナル増幅および可視化（増幅器および色素原ウルトラビュー（ultraview）汎用ジアミノベンジジン（Ventana/Rocheからのもの））を行った。NESTIN/CD34二重染色のために、ネスチン可視化後にVentana/Roche (790- 2927)からの既製モノクローナル抗体QBEnd/10を適用し、代替色素原検出キット（Ventana/Rocheからの塩基性アミノエチルカルバゾール）を使用して可視化した。BMサンプルにおけるネスチン+血管周囲ニッチ（単細胞または3個までの細胞の塊）の数を考慮して評価を行った。平均7.2mm2/ケースを評価し、結果を1mm2に外挿した。ヒトBMサンプルのTH免疫蛍光のために、2個の対照および16個のMPN（5個は本態性血小板血症、4個は慢性骨髄性白血病、および7個は原発性骨髄線維症）BM生検体を使用した。切片を脱パラフィン化し、EDTA（pH9）を使用して抗原回収を行った。メタノール中の30分間の透過性促進の後、免疫蛍光染色および定量を前記のとおりに行った。
【０１５４】
1.4. ELISA
Bio-Plex ProマウスTh17サイトカインパネルA 6-plex（M60-00007NY, Bio-Rad）を製造業者のプロトコールに従い実施した。Cxcl12タンパク質レベルを通常のELISAにより測定した。簡潔に説明すると、96ウェルプレートを2μg ml-1のモノクローナル抗ヒトおよびマウスCXCL12/SDF-1抗体（MAB350, R&D Systems）で4℃で一晩コートした。ブロッキング後、骨髄細胞外液を室温で2時間インキュベートし、ついでビオチン化抗ヒトおよびマウスCXCL12/SDF-1抗体（BAF310, RD）を加えた。ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（RPN1231V, Dako）をシグナル表示のために使用し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質（TMB, ES001-500ML, Chemicon, Millipore）で反応を停止させた。
【０１５５】
ヒト、ネコ、アカゲザルSDF-1アルファ（350-NS, R&D）を使用して標準曲線を作成した。Dynabeads（登録商標）mRNA DIRECT（商標）マイクロキット（Micro Kit）（Invitrogen）を使用してRNA単離およびqPCR RNA単離を行った。逆転写系（Reverse Transcription System）（Promega）を該製造業者の推奨に従い使用して逆転写を行った。相対的標準曲線法を用いて各遺伝子の発現レベルを決定した。簡潔に説明すると、マウスまたはヒト参照全RNA（Clontech）の系列希釈を行うことにより標準曲線を作成した。各遺伝子の発現レベルを該標準曲線からの内挿により計算した。全ての値を内因性対照としてのGapdhで正規化した。表に示されているプライマーを使用した。
【０１５６】
表：RNA配列およびマイクロアレイ
【表１】
0006479818.tif 000025
次世代配列決定のために、Arcturus Picopure RNA単離キット（Life Technologies）を使用して、plpC処理の6週間後のNes-gfp;Mx1-cre;JAK2-V617Fマウスおよび対照同腹子のBMから得られた少数のFACS選別CD45- CD31- Ter119- GFP+細胞から全RNAを単離した。各サンプルは3つの異なる動物からのプールであった。Ovation RNA-Seq System v2 (NuGEN)を該製造業者の推奨に従い使用して、RNA-SeqのためにRNAを増幅し、調製した。インデックスタグ付きcDNAを構築するためにTruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit (Illumina, San Diego, CA)でRNA配列決定ライブラリーを調製した。DNA-1000 Kit (Agilent Bioanalyzer)を使用してイルミナ（Illumina）ライブラリーの質、量およびサイズ分布を決定した。TruSeq SBS Kit v5を使用して、標準的なRNA配列決定プロトコールに従い、Genome Analyzer IIx (Illumina)でライブラリーを配列決定した。各ライブラリーのリード（read、読取り）を含有するFastqファイルを抽出し、Casava v1.8.2パイプライン（pipeline）を使用してデマルチプレクスに付した。カットアダプト（cutadapt）ソフトウェアツール（MIT）を使用して配列決定アダプターの汚染をリードから除去し、得られたリードを、RSEM v1.1734を使用するトランスクリプトーム（NCBIM37 Ensembl gene-build 65）でマッピングし、定量した。
【０１５７】
差次的発現に関する個々の選択遺伝子の分析により、およびパスウェイ（経路）、機能的シグネチャまたは転写因子標的を表す遺伝子のセットにおける協同的変化を検出するための遺伝子セット富化分析（gene-set enrichment analyses; GSEA）により、発現データを両サンプル間で比較した。加重統計、倍率変化順位、1000遺伝子セット順列および幾つかの遺伝子セットデータベースを使用して、記載されているとおりに（http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）、GSEAを行った。
【０１５８】
1.5. 分子シグネチャデータベース
マイクロアレイ分析のために、既に記載されているとおりに、対照細胞（n=1）またはMx1-cre;JAK2-V617F（n=3）が移植されてから10日後のNes-gfpマウスから得られたBM CD45- CD31- Ter119- Nes-GFP+細胞から全RNAを単離した。RNAを、NuGen Ovation系を使用して増幅し、Affymetrix MoGene 1.0 STアレイにハイブリダイズさせた。ロバストマルチアレイ平均（Robust Multi-array Average）(RMA)アルゴリズムを使用して、データの正規化を行った。既に公開されているデータとの主成分分析（PCA）比較を行うために、GEOデータセットをダウンロードし、GEOqueryバイオコンダクター（Bioconductor）パッケージ35を使用して前処理した。正規化データセットを同じ強度範囲に調節し、ComBat36を使用してバッチ効果補正を行った。
【０１５９】
1.6. 統計分析
GraphPad Prism 5ソフトウェアおよびマイクロソフト・エクセル（Microsoft Excel）で統計分析およびグラフィックスを行った。特に示されていない限り、独立両側t検定によりデータセットを比較した。0.05未満のp値を統計的に有意とみなした。
【０１６０】
実施例2. 胎児BMネスチン+ 細胞は静止状態にあり、骨軟骨細胞から区別される
本発明者らは、成体マウスBMにおいて、ネスチンプロモーター（Nes-GFP+）の調節要素下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する間質細胞がHSC-ニッチおよびMSCの特徴の両方を示したことを既に示している（Mendez-Ferrerら, 2010）。本発明者らは、まず、肢BM発生中のNes-GFP+ 細胞を特徴づけした。E18.5 Nes-GFP+細胞は、しばしば、骨軟骨接合部内の発芽内皮細胞および細動脈に結合していた（図14a〜c）。大腿BM Nes-GFP+ 細胞をは不均一であり、BMSCの大部分だけでなく、生後期に増加するCD31+ 推定内皮細胞の小サブユニットをも含んでいた（図14d〜e）。Nes-GFP-BMSCと比較して、Nes-GFP+ 細胞集団は内因性ネスチンmRNA発現に富んでいた（図14f）。蛍光顕微鏡検査によれば、細動脈はGFPに関して、より明るく見えた。なぜなら、それらは、平滑筋アクチンを発現した外層および内皮細胞の内層を含む幾つかの同心円状GFP+ 細胞を含有していたからである（図14g）。胎児BM Nes-GFP+ 細胞は、S100を発現する骨軟骨、およびα1(I)-コラーゲンプロモーターの2.3キロベースの近位断片により遺伝的に標識された骨芽細胞から区別された（Dacquinら, 2002）（図14H〜J）。周産期におけるNes-GFP-BMSCの顕著な増殖とは対照的に、Nes-GFP+ 細胞は大部分が静止状態のままであった（図14k）。その結果、Nes-GFP- BMSCは絶えず増殖し、一方、Nes-GFP+ BMSC数は有意には変化しなかった（図14l）。
【０１６１】
実施例3. BMネスチン+ 細胞は胎児軟骨形成に寄与しない。
【０１６２】
軸方向および四肢の骨格は中胚葉のみに由来すると考えられている。軟骨内骨化中に、軟骨細胞により構成される軟骨は、侵入血管に結合した軟骨膜に浸潤する、転写因子オステリックスを発現する骨芽細胞前駆体によって徐々に置換される（Maesら, 2010）。本発明者らは、側板中胚葉において発現される（Nguyenら, 2009）、Hoxb6遺伝子の調節要素下の誘導性Creリコンビナーゼを発現するマウスと、RCEレポーターマウス（Sousaら, 2009）を交配させることにより、系統追跡研究を行った。得られた二重トランスジェニックマウスにE10.5においてタモキシフェンを投与し、E18.5におけるオステリックスの発現に関して胚を分析した。側板中胚葉に由来する細胞とは異なり、胎児肢BM Nes-GFP+ 細胞はオステリックスタンパク質を発現しなかったため（図15a〜b）、骨芽細胞前駆体とはみなされ得なかった。
【０１６３】
本発明者らは次に、Nes-CreERT2マウス（BalordiおよびFishell, 2007）を使用して、遺伝誘導性予定運命図作成を行った。ここでは、タモキシフェン投与に際してNes-GFP+ 細胞およびそれらの後代が標識される（図15c〜d）。E13.5（この時、一次骨化中心が形成し始める）（Maesら, 2010）およびE8.5（初期ネスチン+ 胚前駆体を標識するため）において、タモキシフェンを投与した。Hoxb6由来中胚葉誘導体とは異なり、ネスチン+ 細胞はこの期間中に軟骨の形成に寄与しなかった。これとは対照的に、Nes-GFP+細胞に類似した形態学的特徴および分布を示すNes由来細胞が軟骨-骨接合部で観察された（図15e〜g）。
【０１６４】
実施例4. BMSC前駆体活性はネスチン+ 細胞に徐々に限局される
胎児軟骨形成に対するネスチン+ 細胞の寄与の欠如は胎児BMにおけるそれらのMSC特性に関する問題を提起した。したがって、本発明者らは、線維芽細胞コロニー形態単位（Cfu-f）（Friedensteinら, 1970）およびメセンスフェア形成（Mendez-Ferrerら, 2010）アッセイを用いて、精製BM間質サブセットにおける中胚葉前駆体活性を測定した。Nes-GFP発現によりBMSCを単離した。後期発生中および生後第1週に、Cfu-f度数は、GFP- 間質集団においては、GFP+ 細胞より6倍高かった（図16a）。顕著なことに、より後の生後段階においては、Cfu-f活性は、GFP- BMSCにおけるその劇的な低下ゆえに、Nes-GFP+細胞に徐々に限局された（E18.5-P14中のそれぞれ>100倍対0.5倍の低下）。P7において、Nes-GFP-細胞に由来するCfu-fは大部分が前骨芽細胞を含有していた（図16b〜d）。軟骨細胞発生に関連した遺伝子の発現はE18.5において、Nes-GFP+ BMSCよりNes-GFP-においては高かった。これとは対照的に、軟骨形成、骨形成および脂肪形成のマスター調節因子の発現は、漸増MSC富化と合致して、生後Nes-GFP+ BMSCにおいて徐々に富化された（図16e）。総合すると、これらの結果が示唆するところによると、ほとんどの胎児BMSCはネスチンを発現せず、決定づけられた骨格前駆体へと急速に分化して、生後第2週までにMSC活性を喪失する。これとは対照的に、ネスチン+ 細胞は一生を通じて、保存されたMSC活性を示す。
【０１６５】
実施例5. 胎児BM Nes-GFP+ 細胞はメセンスフェア形成細胞において富化される
本発明者らは、NC細胞を増殖させるために使用した類似培養条件下、成体マウスBM Nes-GFP+細胞は、連続移植中に異所性部位に造血活性を伝達しうる自己再生かつ多能性の間葉スフェアを形成しうることを既に示している（Mendez-Ferrerら, 2010）。また、本発明者らは、ヒトBM由来メセンスフェアが分泌因子によりヒト臍帯血HSCを増殖させうることを示している（Isernら, 2013b）。本発明者らは胎児BMSCにおける間葉前駆体活性を測定した。Cfu-f効率はE17.5において、Nes-GFP+ 細胞におけるよりNes-GFP- においては約3倍高かった（図3f）。逆に、非接着性スフェア形成はGFP+ 細胞においては顕著に富化されたが、GFP- 細胞に由来するほとんどのスフェアはプラスチックに迅速に接着し、自然に分化した（図16g〜h）。BM Nes-GFP+細胞により形成されたスフェアは間葉様紡錘形GFP+ 細胞を含有していた（図16i〜l）。
【０１６６】
実施例6. 成体骨格ターンオーバーに対するネスチン+ MSCの最小寄与
Mx1-cre駆動体を発現するBMSCは骨ターンオーバーに寄与するが（Parkら, 2012）、ネスチン+ MSCとのそれらの重複は依然として明らかでない。本発明者らの結果は、MSC活性が、生後段階で骨形成に関与する遺伝子を高発現したBM Nes-GFP+細胞に徐々に限局することを示している（図16e）。また、本発明者らの研究は成体骨軟骨系統に対するネスチン+ 細胞の低い寄与を示唆している（Mendez-Ferrerら, 2010）。本発明者らは、2つの独立した機能喪失モデルを用いて、縦方向の骨成長の後の骨格リモデリングを研究した。Nes-CreERT2マウスを、ジフテリア毒素（iDTA）（Brockschniederら, 2006）またはその受容体（iDTR）を発現するCre-リコンビナーゼ誘導性系統と交雑させた。二重トランスジェニックおよび対照同腹子マウスに成体時にジフテリア毒素および／またはタモキシフェンを慢性的に投与した（図17a）。骨デンシトメトリーは、ネスチン+ 細胞の枯渇の6カ月後に椎骨密度（BMD）における一過性の低減を示したに過ぎなかった（図17b）。これと合致して、満期に犠死させた実験マウスは間葉または骨芽細胞活性における相違を示さなかった（図17c〜d）。これとは対照的に、組織形態計測は破骨細胞数の増加および石灰化活性の低下を示した（図17e〜l）。全ての脊椎（中胚葉由来）骨格パラメータは正常であったが（データ非表示）、NC由来骨において幾つかの異常が認められた。これらの欠損は鼻骨および前上顎骨の骨化の低下、骨溶解性頭蓋骨病変ならびに左右非対称を含んでいた（図17m〜o）。総合すると、これらの結果は、ネスチン+ 細胞が遺伝的に除去された成体マウスにおける軽度の骨格欠損を示している。したがって、MSC活性は大部分が成体ネスチン+ 細胞内に限局しているが、それらは中軸骨格の生理的ターンオーバーに対する比較的僅かな寄与を示し、したがってMx1-cre由来間葉誘導体とは異なる様態で挙動する（Parkら, 2012）。
【０１６７】
実施例7. 体幹神経堤細胞はBMネスチン+ MSCに寄与する
NC細胞はネスチン発現およびスフェア形成能によって特徴づけられる。NC由来細胞は成体マウスBMにおいて既に報告されているが（Glejzerら, 2011; Komadaら, 2012; Morikawaら, 2009b; Nagoshiら, 2008）、それらの厳密な正体、発生動態および機能は依然として把握困難である。また、これらの研究において使用されたWnt1-Creマウスにおいて、異所性Wnt1活性化が報告されている（Lewisら, 2013）。本発明者らは、異所性Wnt1活性を誘導しない最近のWnt1-Cre2系統で遺伝的予定運命決定研究を行った（Lewisら, 2013）。意外にも、新生Wnt1-Cre2;R26-Tomato二重トランスジェニックマウスからの肢骨は、骨沈着の最も最近の層を構成するNC由来骨芽細胞および破骨細胞、ならびに大腿骨頭の最外層に同様に分布した軟骨細胞を示した（図18a〜b）。予想どおり、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）を発現するNC由来シュワン細胞も1週齢BMにおいて検出された（図18c〜d）。興味深いことに、Nes-GFP+ 細胞に類似した形態学的特徴および分布を有するGFAP- 血管周囲細胞もWnt1+ 細胞から誘導された（図18e〜f）。NC由来骨軟骨細胞数は生後第1週に増加したが（図18g）、このことは、NCが発生後期における肢骨に寄与することを示唆している。確認として、広く使用されているWnt1-Cre系統は成体BMにおけるNC由来細胞の維持をも示した。注目すべきことに、ほとんどの成体NC予定運命決定細胞はネスチンを発現し、多数は交感神経線維に結合しており（データ非表示）、後者はもう1つのNC誘導体に相当し、これを本発明者らはネスチン+ MSCの調節による概日HSCトラフィック（Mendez-Ferrerら, 2008）の制御に既に関連づけている（Mendez-Ferrerら, 2010）。
【０１６８】
マウスPDGFRα+BMSCはCFU-F活性に非常に富んでおり（Morikawaら, 2009a; Takashimaら, 2007）、ほとんどの成体マウスBMネスチン+ 細胞もPDGFRαである（Pinhoら, 2013; Yamazakiら, 2011）。本発明者らは、胎児PDGFRα+ BMSCもCfu-f活性に富むことを見出した。新生間質Nes-GFP+ およびWnt1-Cre2由来細胞は共にPDGFRα+およびPDGFRα- 細胞を含有していたが（図18h〜i）、このことはこれらの細胞集団間の相当な重複を示唆している。確認のために、本発明者らは、Nes-Gfp;R26-Tomatoマウスを、NC転写因子Sox10の調節要素下でタモキシフェン誘導性Creリコンビナーゼを発現する系統と交雑させた。遊走性NCを標識するために、Nes-Gfp;Sox10-CreERT2;R26-TomatoマウスにE9.5においてタモキシフェンを投与した。段階が釣り合わされたNes-Gfpマウスに類似して、2つのE18.5 BM集団はNC誘導体においてPDGFRα発現によって分離した（図18j〜k）。したがって、これらの結果は、NCがネスチン+ BMSCに寄与することを決定的に示している。
【０１６９】
実施例8. BM Nes-GFP+ 細胞はPDGFRα+ MSCおよびPDGFRα- シュワン細胞前駆体を含む
本発明者らは胎児BM Nes-GFP+ 細胞の考えられうる不均一性を調べた。ほとんどの成体BMネスチン+ 細胞はPDGFRαであるが、ネスチン+ PDGFRαシュワン細胞はHSCの維持に寄与することも最近見出された（Yamazakiら, 2011）。本発明者らは、BM Nes-GFP- 細胞が特徴的なGFAP+シュワン細胞と密接に関連していることを見出した（データ非表示）。本発明者らは新生GFP/-PDGFRα/- BMSCにおいて次世代配列決定を行った（図19a）。内因性PdgfrαおよびNes転写産物は、その単離法が有効であることを証明した。興味深いことに、Ly6a/Sca1発現はGFP-PDGFR +細胞において、より高かったが（非表示）、HSCニッチ形成間葉細胞を特徴づけるレプチン受容体およびHSC維持遺伝子（Cxcl12, Kitl, Angpt1）の発現（Dingら, 2012）はGFP+PDGFRα+ 細胞において非常に富んでいた（図19b）。この集団においては他のMSC遺伝子も豊富に発現された（図S5C）。これとは対照的に、Nes-GFP+ PDGFRα- 細胞は、シュワン細胞前駆体に特徴的な遺伝子（SCPs; Sox10, Plp1, Erbb3, Dhh）を発現したが、Gfapのような成熟シュワン細胞遺伝子を発現しなかった（図19C）。
【０１７０】
ネスチン+ 亜集団を更に特徴づけるために、新生Nes-GFP+/-PDGFRα+/- BMSCのトランスクリプトームワイドプロファイルを、初代成体BMSCまたはNC誘導体からの公に入手可能なマイクロアレイ発現データセットと比較した。不偏性階層的クラスタリングおよび主成分分析は、Nes-GFP+ PDGFRα+ 細胞が、成体原始的BMSCに、より類似しており、より分化した骨芽細胞とは異なることを明らかにした（Nakamuraら, 2010）。生後BMにおいては大部分がNes-GFP+ 細胞に限局されるPDGFRαと合致して、PDGFRα+Nes-GFP+/- 細胞はすぐ近くで塊化した（図19a）。また、Nes-GFP+ PDGFRα+ 細胞はNes-GFP+PDGFRα- 細胞から離れて塊化し、そのゲノムプロファイルはE12.5 SCPに最も近かった。MSC様およびNC幹細胞様由来クローン（Glejzerら, 2011）は著しく異なっているが、これは恐らく、それらが培養細胞であったからであろう。興味深いことに、本発明者らは、未分化細胞（図19dの下の隅）からより成熟した系統（図19d、反対側の上の隅）にわたる、シュワンおよび骨系統細胞の成熟階層を認めた。成体BM CD45-Nes-GFP+ 細胞（Mendez-Ferrerら, 2010）は、これらの分化波状曲線の交点において、幹細胞因子の発現により特定されるBM HSCニッチ細胞（Dingら, 2012）に収束した（図19d）。これらの結果は、非重複のMSCおよびSCPの特徴を有する2つのネスチン+ 集団を支持した。この仮説を機能的に検証するために、新生児Nes-GFP+/-PDGFRα+/- BMSCを分化培地内で培養した。顕著なことに、間葉およびグリア分化はそれぞれPDGFRα+/-細胞において分離した（図19e〜f）。総合すると、これらの結果は、生後BM、HSC支持遺伝子に富むPDGFRα+ MSC、およびPDGFRα- SCPにおける2つのNes-GFP+ NC誘導体を示している。
【０１７１】
実施例9. 欠損神経周囲NC遊走はBMSCを減少させ、発生HSC BMコロニー形成を損なう
神経周囲SCP遊走は、発生中の神経により産生されるニューレグリン-1リガンドと受容体チロシン-プロテインキナーゼErbB3の相互作用を要する（JessenおよびMirsky, 2005）。本発明者らはErbb3欠損マウス（Riethmacherら, 1997）の胎児肝臓およびBMを分析した。胎児肝臓造血前駆体は不変であった（図20a）。これとは対照的に、Nes-GFP+ 細胞に富むMSCマーカーCD90の発現（図20b〜c）はErbb3+/- 肢BMにおいて2倍低減し、これはBM造血前駆体5倍の低減に関連づけられた（図20d〜g）。胎児造血に対するNCの寄与を更に精査するために、本発明者らは、シュワン前駆細胞においてErbb3を欠くマウスにおいて類似分析を行った。デザートヘッジホッグ（Dhh）プロモーター（Jaegleら, 2003）の調節要素下でcreリコンビナーゼを発現する系統と交雑させたR26-Tomatoレポーターマウスは標識シュワン細胞を有していた。Dhh-CreマウスをErbB3条件的欠損マウスと交雑させた。構成的KOと同様に、Dhh-Cre;Erbb3fl/fl マウスはシュワン細胞を実質的に欠いている（Sheeanら, 2014）。これとは対照的に、Dhh-Cre;Erbb3fl/fl マウスはBM造血前駆体の正常頻度を示した。これらの結果は、シュワン細胞系統に未だ運命づけられていないNC細胞が、発生中の神経に沿ってBMへと遊走し、HSCニッチ形成MSCに寄与することを示唆している。
【０１７２】
実施例10. NC由来ネスチン+ 細胞は発生HSC遊走をBMへと導く
詳細な免疫蛍光分析は新生児BMにおけるNes-GFP+ 細胞へのHSCの有意な接近性を示した（図21a〜b）。本発明者らは、ネスチン+ 細胞においてジフテリア毒素（iDTA）またはその受容体（iDTR）を発現するマウスを使用して、胎児肝臓からBMへのHSC遊走に対するネスチン+ 細胞の寄与を調べた。Nes-CreERT2;iDTRマウスにおけるE15.5におけるネスチン+ 細胞の枯渇は48時間以内に胎児BM HSC活性における〜4倍の低減を引き起こし、これは胎児肝臓HSC活性における〜8倍の増加と逆相関した（図21c〜d）。造血前駆体の細胞周期プロファイルまたはアポトーシスは不変であったが（図S7A）、胎児肝臓におけるそれらの数は40%増加した（図21e）。ネスチン+ 細胞の枯渇を、それを行わなければ正常BM組織学的特徴を示したNes-CreERT2;iDTAマウスの生後第1週で行うことにより、類似した結果が得られた（図21f）。BMへの発生HSC遊走は生後2週まで進行したが（DzierzakおよびSpeck, 2008）、このことは、HSCを順応させるためにBM環境がこの期間中に尚も成熟しうることを示唆している。したがって、E18.5およびP7のNes-Gfp BMからGFP+/-BMSCを単離した。HSC支持遺伝子の発現は顕著に、より高く、GFP+細胞において徐々にアップレギュレーションされたが（図21g）、このことは、ネスチン+ MSCがBMにおけるHSCニッチの形成に寄与しうることを示唆している。
【０１７３】
実施例11. ネスチン+MSC由来CXCL12はBMにおけるHSCニッチの確立に寄与する
胎児BMへのHSC遊走はCxcl12および幹細胞因子により増強され（Christensenら, 2004）、これらは周産期のBMネスチン+ 細胞において高発現され、次第にアップレギュレーションされる。Cxcl12は種々の間質細胞により産生され、HSCによる発生BMコロニー形成に要求される（Araら, 2003）。内皮細胞およびネスチン- 間葉系前駆体によっては産生されるがネスチン+ 細胞によっては産生されないCxcl12は成体HSCの維持に必要であると主張されている（DingおよびMorrison, 2013; Greenbaumら, 2013）。本発明者らは、出生の1週間後、Cxcl12 mRNAレベルがNes-GFP+BMSCにおいてはそれぞれBM内皮およびNes-GFP-BMSCより>20〜80倍高いことを見出した（図21h）。本発明者らは、Cxcl12flマウス（Tzengら, 2010）を使用して、生後第1週に、ネスチン+細胞におけるCxcl12を条件的に欠失させた。該マウスは、この期間中に大部分がNes-GFP+ 細胞を標識している、Nes-CreERT2マウスと交雑させたものである（図21i）。タモキシフェン投与はBM内皮細胞におけるCxcl12 mRNAレベルを有意には変化させず、むしろBMSCにおけるこれらのレベルを5倍減少させた（図21j〜k）。これはBM造血前駆体の〜30%の減少に関連づけられた（図21l）。これらの結果は、ネスチン+ MSCが、Cxcl12産生により、発生中のBMにおけるHSCニッチ形成に寄与することを示している。
【０１７４】
実施例12. 図14〜12および実施例1〜11に関する材料および方法
12.1. 動物
本研究において使用したマウス系統には以下のものが含まれた: Nes-Gfp (Mignoneら, 2004), Nes-CreERT2(BalordiおよびFishell, 2007), Sox10-CreERT2(Matsuokaら, 2005), Col2.3-Cre (Dacquinら, 2002), Dhh-Cre  (Jaegleら, 2003), RCE-loxP (Sousaら, 2009), LSL-KFP (Dieguez-Hurtadoら, 2011), R26-DTA (Brockschniederら, 2006), Cxcl12floxed (Tzengら, 2010), Erbb3floxed (Sheeanら, 2014), Erbb3-null (Riethmacherら, 1997), Tg(Wnt1-cre/ERT)1Alj/J, 129S4.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J, C57BL/6-Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/J, B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J, CD1およびC57BL/6Jマウス (Jackson Laboratories)。実験手法はSpanish National Center for Cardiovascular Research、Icahn School of Medicine at New YorkおよびKarolinska Instituteの動物管理使用委員会により承認された。
【０１７５】
12.2. 胚分析および遺伝的誘導性予定運命決定
既に記載されているとおりに（Isernら, 2008）、胚を解剖した。簡潔に説明すると、関心のある対立遺伝子を保有するマウス間の選択された交雑を準備し、膣栓の検出の日の朝を妊娠0.5日とみなした。本発明者らは、複合または単純トランスジェニック雄を野生型バックグラウンド（C57BL/6またはCD1）の雌と交配させることにより、父系トランスジーン伝達を優先的に用いた。誘導性系統追跡研究を以下のとおりに行った。タモキシフェン（Sigma,T-5648）を20mg/mLの最終濃度でトウモロコシ油に溶解し、示されている段階の朝に妊娠雌親に経口胃管栄養法（100〜150 mg/Kg）により投与した。新生児の誘導のために、運搬後第1日および第3日に新生仔の母にタモキシフェン（経口胃管栄養法, 4mg）を投与した。
【０１７６】
12.3. 組織学的および細胞学的検査
組織学的検査用の解剖された組織をパラホルムアルデヒド2%中、4℃で固定し、15%および30% スクロース中の連続的平衡化により凍結保存し、OCT化合物（Tissue-Tek）内に瞬間凍結包埋した。幾つかの場合には、固定され凍結された肢または胸骨を、中央髄腔が露出するまで両側から連続的に切断し、ホールマウント蛍光染色のために更に加工した。厚さ15 mのクリオスタット切片を調製し、免疫染色または通常のヘマトキシリン-エオシン染色のために加工した。記載されているとおりに（Isernら, 2013a）、オイルレッドO染色を行った。
【０１７７】
12.4. 免疫組織化学
クリオスタット切片の染色を標準的な方法により行った。簡潔に説明すると、組織を室温（RT）で5〜10分間、0.1% Triton X-100で透過性促進させ、TNBバッファー（0.1M Tris-HCl, pH 7.5, 0.15M NaCl, 0.5% ブロッキング試薬, Perkin Elmer）で室温で1時間ブロッキングした。一次抗体を室温で1〜2時間または4℃で一晩インキュベートし、二次抗体を室温で1時間インキュベートした。PBS + 0.05% Tween-20で反復洗浄を行った。染色組織切片を5 M DAPIで5分間、対比染色し、PBSで洗浄した。スライドを、ベクタシールド（Vectashield）ハードセットマウンティング媒体（Vector Labs）を使用してマウントし、マニキュア液で密封した。
【０１７８】
厚切片化組織片のホールマウント染色には、透過性促進およびブロッキングを含む、インキュベーションの全てを、穏やかに撹拌しながら4℃で行い、洗浄工程を延長した。試料のマウンティングは、ガラス底ディッシュ（Mat-Tek）上に行った。成体試料研究の場合、2月齢のWnt1-Cre;Rosa26-Tomato二重トランスジェニックマウスを4% パラホルムアルデヒドで潅流した。ついで付着軟組織から大腿骨を洗浄し、両方の洗浄末端を切断し、5mlシリンジおよび25G注射針を使用して骨髄を通して固定溶液に通過させることにより、骨髄を押し出した。
【０１７９】
胚を妊娠雌から取り出し、ついで冷4% パラホルムアルデヒド中に一晩浸漬し、ついでPBS中の10〜20% スクロース中に配置した。組織をOCT包埋し、切片化（厚さ14μm）した。免疫組織化学的方法は既に記載されている（Aquinoら, 2006）。
【０１８０】
12.5. 免疫蛍光
胎児BMおよび胎児肝臓切片の染色を標準的な方法に従い行った。使用した抗体を表（後記を参照されたい）に示す。新生マウスからの骨髄切片において、SLAM染色を行った。まず、スライドをPBS中の20% ヤギ血清中で45分間ブロッキングした。内因性アビジンおよびビオチンをアビジン／ビオチンブロッキングキット（Vector Laboratories）で各試薬につき30分間ブロッキングし、それらの間にPBSでの3回の洗浄を行った。ついでスライドをヤギブロッキングバッファー中の1:50の希釈度のラット抗マウスCD150抗体（Biolegend）中で2時間インキュベートした。Alexa555（Molecular Probes）に結合したヤギ抗ラットIgGをPBS中の20% ヤギ血清中の1:200の希釈度で1時間加えた。ついでスライドをPBS中の20% ラット血清中で10分間ブロッキングした。ついでそれらをハムスター抗マウスビオチン結合CD48（Abcam）中ならびにラット抗マウスB220、ラット抗マウスCD3、ラット抗マウスGr1、ラット抗マウスMac-1およびラット抗マウスTer119抗体（それぞれはラットブロッキングバッファー中で1:200の希釈度）を含むBiotin Mouse Lineage Panel (BD Pharmingen)中で1時間インキュベートした。Cy5結合ストレプトアビジン（Molecular Probes）をラットブロッキングバッファー中の1:200で30分間加えた。最後に、スライドをDAPI（5mg/ml ストックの1:1000希釈）と共に室温で10分間インキュベートし、Vectashield Mounting Medium (Vector)を使用してマウントした。
【０１８１】
【表２】
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12.6. イメージング
蛍光染色からの共焦点イメージを、レーザー走査共焦点（Zeiss LSM 700, 10X/0.45, 25X/0.85）または多光子Zeiss LSM 780顕微鏡（20X/1.0）のいずれかを使用して得た。最大強度アルゴリズムを使用してZen2011ソフトウェアパッケージ（Zeiss）で光学的z-スタック投射を生成させた。ホールマウント試料の広視野イメージを、Olympus DP71カラーカメラを備えたLeica MZFLIII実体顕微鏡でイメージングした。イメージを後処理し、ImageJ（Schneiderら, 2012）およびPhotoshop（Adobe）を使用して定量した。
【０１８２】
12.7. 胎児および乳児BM細胞懸濁液の調製
胎児の骨格要素を胎児から部分解剖し、切断によりホモジナイズし、0.25% コラゲナーゼ（StemCell Technologies, Cat. # 07902）中、振とうしながら37℃で15〜30分間消化した。生後骨試料を周辺組織から綺麗にし、乳鉢内で乳棒で破砕し、37℃で45〜60分間、一定の撹拌を行いながらコラゲナーゼ消化した。酵素処理後、骨格調製物を40 m細胞ストレーナーで濾過し、未消化骨材を廃棄した。得られた骨髄富化細胞懸濁液をペレット化し、2回洗浄し、更なる分析のためにFACS染色バッファー（PBS中の2% FCS）に再懸濁させた。
【０１８３】
12.8. フローサイトメトリー
分散骨髄細胞調製物をFACSバッファー中、氷上で、選択された多色抗体カクテル（後記を参照されたい）で15〜30分間染色し、洗浄し、必要に応じてストレプトアビジン結合体と共に再懸濁させた。染色された細胞をペレット化し、死細胞を排除するためにDAPI含有バッファーに再懸濁させた。まず、定められた間質集団をFACS選別により単離し、ついで該選別集団をHoescht 33342で染色した後で細胞周期プロファイルを得ることにより、FACSによる細胞周期分析を行った。Diva Software（BD Biosciences）を備えたFACS CantoIIまたはLSRFortessa装置（BD Biosciences）において、あるいはFACS AriaII細胞選別機（BD Biosciences）において、FACS分析および選別を行った。Diva and FlowJo（Tree Star, Inc）を使用してデータを分析した。
【０１８４】
【表３】
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12.9. CFU-FおよびCFU-OBアッセイ
CFU-Fアッセイのために、BM細胞懸濁液を100〜500細胞/cm2の細胞密度で6ウェルプレート内に直接的にFACS選別し、維持培地（α-MEM/15% FCS, 抗生物質含有）内で培養した。10〜12日間の培養の後、接着細胞を100% メタノールで固定し、ギムザ染料（Sigma）で染色して線維芽細胞塊を明らかに示した。50細胞を超えるコロニーをCFU-Fとして評価した。CFU-OBアッセイのために、プレーティングされた細胞を、1mM L-アスコルバート-2-ホスファートの存在下、維持培地内で培養した。全ての培養を37℃の水ジャケット付きインキュベーター内で5% CO2で維持し、培地交換を毎週行った。25日間の培養の後、細胞を固定し、既に記載されているとおり（Isernら, 2013a）にアリザリンレッドまたはアルカリホスファターゼで染色した。
【０１８５】
12.10. 造血前駆体アッセイ
単個細胞浮遊液をBMから調製し、サイトカインを含有するメチルセルロース含有培地と混合した（Casanova-Acebesら, 2013）。細胞（5〜7.5×104個）を35mmディッシュ（Falcon, BD）内に二重に重複してプレーティングし、20% O2および5% CO2下、水ジャケット付きインキュベーター内でインキュベートした。6〜7日間の培養の後、造血コロニー（CFU-C）を評価した。
【０１８６】
12.11. 長期培養開始細胞アッセイ
長期培養開始細胞アッセイ（long-term culture-initiating cell assay）を、記載されているとおり（Woehrerら, 2013）に行った。簡潔に説明すると、フィーダー胎児間質細胞AFT024（K. Moore博士により快く提供されたもの）を、既に記載されているとおり（Noltaら, 2002）に維持した。使用の1週間前に、該フィーダーを137Cs照射器で照射し、96ウェルプレート内にコンフルエンシーで播いた。7〜10日後、選別された胎児肝臓Lin- Sca1+細胞およびBM有核細胞の5つの系列希釈物（それぞれは16個の重複体を有する）を照射フィーダー上に播き、10-6 M ヒドロコルチゾン（StemCell Technologies）および1% ペニシリン-ストレプトマイシン（Invitrogen）で補足されたMyelocult M5300で培養した。培養を水ジャケット付きインキュベーター内で20% O2および5% CO2下、33℃で4週間維持した。半分の培地の交換を毎週行った。ついで各ウェルを10分間トリプシン処理し、PBSで洗浄し、造血前駆体アッセイにおいてプレーティングした。プレーティングの12日後、CFU-Cを生成しなかった、各実験群における培養皿の百分率を試験細胞数に対してプロットした。長期培養開始細胞の度数を、37%の陰性応答を示した試験ウェルの数の逆数としてのポアソン統計および最大尤度のニュートン-ラプソン法により、L-CalcTMソフトウェア（StemCell Technologies）を使用して計算した。
【０１８７】
12.12. 成体骨格表現型分析
ELISA
BM細胞外液のサンプルおよび血漿における酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）活性を、マウスTRAP SB-TR103キット（Immuno Diagnostics Systems）を該製造業者の推奨に従い使用して測定した。骨再吸収率を測定するためのデオキシピリジノリン（DPD）架橋尿検査を、MicroVueDPD 8007キット（Quidel Corporation）を該供給業者の推奨どおりに使用して行った。Dimension RxL Max分析装置においてALP-アルカリホスファターゼFlex試薬（Siemens）を該製造業者の説明に従い使用して、血漿およびBM細胞外液においてアルカリホスファターゼレベルを決定した。
【０１８８】
細胞培養およびインビトロ分化
乳棒を使用して、解剖した骨から初代BM細胞を得た。全ての培養を水ジャケット付きインキュベーター内で20% O2および5% CO2下、37℃で維持した。線維芽細胞（CFU-F）および骨芽細胞コロニー形成単位（CFU-OB）を得るために、0.5×106個のBM有核細胞を、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、15% FBS（Invitrogen）および1mM L-アスコルビン酸2-ホスファート（Sigma）で補足されたα-MEM培地を含有する12ウェルプレートの各ウェル内に播いた。半分の培地を5日ごとに交換した。10および28日間の培養の後、それぞれCFU-FおよびCFU-OBの数を評価した。CFU-F培養物を、メタノールを使用して室温で10分間固定した。リン酸バッファー（pH 6.8）中で1:10希釈されたギムザで染色を37℃で10分間行った。CFU-Fコロニー（50個を超える細胞を含有するもの）を後日計数した。CFU-OB培養物を4% パラホルムアルデヒド（PFA）で室温で5分間固定した。該培養物に5% AgNO3を加えて、フォン・コッサ染色を行い、プレートをUV照射に20分間曝露した。その後、細胞を蒸留水中の5% (NH4)2S2O3と共に5分間インキュベートした。細胞を2% エオシンで対比染色した。アリザリンレッド染色のために、細胞を蒸留水中の2% アリザリンレッド試薬（Sigma）と共に15分間インキュベートした。アルカリホスファターゼ染色のために、Sigma Fast BCIP/NBT基質（Sigma）を細胞培養に加え、暗所中で15分間インキュベートした。インビトロ分化破骨細胞を、10% FBS、1% P/S（Invitrogen）および5 n/g hM-CSF（Peprotech）で補足されたα-MEM培地を含有する6ウェルプレートの1ウェル内で2日間にわたって、播かれたBM有核細胞から誘導した。2日後、間質プラスチック接着細胞を廃棄し、50万個の非接着細胞を、10% FBS（Invitrogen）、30 n/g hM-CSFおよび60 n/g shRANK（Peprotech）で補足されたα-MEMを含有する12ウェルプレートの各ウェル内に播いた。培地は2日ごとに交換した。細胞分化状態に応じて6〜8日後に培養を停止させた。細胞を、シトラートおよびアセトンで補足された37% ホルムアルデヒド中で1分間固定した。破骨細胞を染色するために、TRAP染色キット（Biocat）を該製造業者の推奨に従い使用した。
【０１８９】
組織学的方法
大腿骨をOCT内に包埋し、10μm切片を得た。酸性ホスファターゼ、白血球（TRAP）キット（Sigma）を該製造業者の説明に従い使用して、切片を染色した。
【０１９０】
核酸精製およびqPCR
CFU-Fおよび骨芽細胞培養からのRNAを、Trizol試薬（Sigma-Aldrich）を該製造業者の説明に従い使用して抽出し、RNeasyミニカラム（Qiagen）で精製した。残留ゲノムDNAを除去するために、クリーンアップ工程の前に、オンカラムDNアーゼ消化（Qiagen）を行った。破骨細胞培養の場合、Dynabeads mRNA Directキット（Invitrogen）を使用して、mRNAを抽出した。どちらの場合も、最終的に、Hight Capacity cDNA逆転写試薬（Applied Biosystems）を使用してcDNAを作製した。SYBRgreen Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）を使用して、三重重複でqPCRを行った。各標的遺伝子に対して最適化されたプライマーを使用した。標準曲線法を用いてGapdh転写産物存在量に対して正規化することにより、各転写産物に関する相対的定量を得た。既に記載されているとおりに（Sunら, 2013）、骨組織形態計測研究を行った。
【０１９１】
12.13. 初代スフェア形成培養
スフェア（sphere; 球状物）形成のために、超低接着性35mmディッシュ（StemCell Technologies）内で細胞をクローン密度（< 1,000細胞/cm2）でプレーティングした。増殖培地は、記載されているとおり（Pajtlerら, 2010; StempleおよびAnderson, 1992）に調製された15% ニワトリ胚抽出物；0.1mM β-メルカプトエタノール；1% 非必須アミノ酸（Sigma）；1% N2および2% B27サプリメント（Invitrogen）；組換えヒト線維芽細胞増殖因子（FGF）塩基性、組換えヒト上皮増殖因子（EGF）、組換えヒト血小板由来増殖因子（PDGF-AB）、組換えヒトオンコスタチンM（227 a.a. OSM）（20 ng/ml）および組換えヒトインスリン様増殖因子-1（IGF-1; 40 ng/ml）（Peprotech）をDMEM/F12 (1:1) / ヒト内皮 (1:2) 無血清培地 (Invitrogen)内に含有していた。該培養を水ジャケット付きインキュベーター内で37℃、5% CO2、20% O2で維持し、細胞凝集を防ぐために、触らずに低密度培養内で1週間放置した。半分の培地の交換を毎週行った。メセンスフェアを第10〜14日に評価した。
【０１９２】
12.14. BM前駆体からのシュワン細胞のインビトロ分化
本発明者らは、Biernaskieら, Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat Protoc (2006) vol. 1 (6) pp. 2803-12の原型法を、幾つかの修飾を加えて応用した。Nes-Gfp新生児のコラゲナーゼ処理BMから、GFPおよびPDGFR 発現に基づいて、一定の間質集団を単離した。選別細胞をラミニン／ポリリジン被覆チャンバースライドディッシュ（Labtek）上にプレーティングし、SKP培地I内で接着させ増殖させた。3日後、細胞をSKP培地II（50 ng/mLのニューレグリン-1を含有）と交換し、>10日間にわたって更に分化させた。インビトロ産生シュワン細胞は厚い伸長細胞として形態学的に定められた。分化後、細胞をPFA 4%で固定し、Triton X-100で穏やかに透過性促進させ、抗グリア線維酸性タンパク質（GFAP）抗体（Dako）で免疫蛍光用に染色した。
【０１９３】
【表４】
0006479818.tif 000028
12.15. BM間葉系細胞のインビトロ分化
Nes-Gfp新生児のコラゲナーゼ処理BMから、GFPおよびPDGFR 発現に基づいて、一定の間質集団を単離し、プラスチックディッシュ内に直接的にプレーティングして線維芽細胞を付着させた。接着細胞を、15% FBSで補足された通常のa-MEM培地内で7〜14日間培養した。幾つかの場合には、組換えPDGFを20 ng/mLの濃度で加えた。培養期後、細胞を固定し、脂肪細胞を明らかに示すためにオイルレッドOで更に染色し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１９４】
12.16. RNA単離および定量リアルタイムRT-PCR
Dynabeads（登録商標）mRNA DIRECT（商標）マイクロキット（Micro Kit）（Invitrogen）を使用してRNA単離を行った。逆転写系（Reverse Transcription System）（Promega）を該製造業者の推奨に従い使用して逆転写を行った。既に記載されているとおりに（Mendez-Ferrerら, 2008）、定量リアルタイムRT-PCRを行った。相対的標準曲線法を用いて各遺伝子の発現レベルを決定した。簡潔に説明すると、ヒト参照全RNA（Clontech）の系列希釈を行うことにより標準曲線を作成した。各遺伝子の発現レベルを該標準曲線からの内挿により計算した。全ての値を内因性対照としてのGAPDHで正規化した。qPCR用のオリゴヌクレオチドの配列は後記に記載されている。
【０１９５】
12.17. RNA-Seq
次世代配列決定のために、Arcturus Picopure RNA単離キット（Life Technologies）を使用して、新生児Nes-Gfp骨髄調製物（2つの生物学的重複体）から得られた少数のFACS選別細胞（15,000〜80,000個）から全RNAを単離した。それぞれの独立したサンプルセットを複数の同腹子からのプール化骨格要素（長骨および胸骨）から得た。
【０１９６】
RNA-Seqライブラリーの作製
インデックスタグ付きcDNAを構築するためにTruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit (Illumina, San Diego, CA)でRNA配列決定ライブラリーを調製した。DNA-1000 Kit (Agilent Bioanalyzer)を使用してイルミナ（Illumina）ライブラリーの質、量およびサイズ分布を決定した。TruSeq SBS Kit v5を使用して、標準的なRNA配列決定プロトコールに従い、Genome Analyzer IIx (Illumina)でライブラリーを配列決定した。各ライブラリーのリード（read、読取り）を含有するFastqファイルを抽出し、Casava v1.8.2パイプライン（pipeline）を使用してデマルチプレクスに付した。
【０１９７】
RNA-Seq分析
カットアダプト（cutadapt）ソフトウェアツール（MIT）を使用して配列決定アダプターの汚染をリードから除去し、得られたリードを、RSEM v1.1734（LiおよびDewey, 2011）を使用するトランスクリプトーム（NCBIM37 Ensembl gene-build 65）でマッピングし、定量した。≧2つのサンプルにおいて> 2カウント毎百万（counts per million）を有する遺伝子のみを統計分析のために考慮した。ついでデータを正規化し、差次的発現を評価した（バイオコンダクター（bioconductor）パッケージEdgeR（Robinsonら, 2010）を使用して行った）。各RNA-Seq実験からのlog2正規化カウントと共にlog2-正規化GEOデータセットに関して、ComBat（Johnsonら, 2007）を使用してバッチ補正を行った。≦0.05のベンジャミニ-ホッホバーグ（Benjamini-Hochberg）補正p値を有する遺伝子を、差次的に発現されたものとみなした。
【０１９８】
既に公開されているデータとの主成分分析（PCA）比較
正規化RNA-Seqデータを主成分分析（PCA）により、既に公開されているアレイ発現データと比較した（表S3を参照されたい）。GEOデータセットをダウンロードし、GEOqueryバイオコンダクター（Bioconductor）パッケージ（DavisおよびMeltzer, 2007）を使用して前処理した。既に記載されているとおりに（HeiderおよびAlt, 2013）、正規化データセットを同じ強度範囲に調節した。ComBat（Johnsonら, 2007）を使用してバッチ効果補正を行った。
【０１９９】
12.18. 参考文献
Ara, T., Tokoyoda, K., Sugiyama, T., Egawa, T., Kawabata, K., and Nagasawa, T. (2003). Long-term hematopoietic stem cells require stromal cell-derived factor-1 for colonizing bone marrow during ontogeny. Immunity 19, 257-267.
Arai, F., Hirao, A., Ohmura, M., Sato, H., Matsuoka, S., Takubo, K., Ito, K., Koh, G.Y., and Suda, T. (2004). Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell 778, 149-161.
Avecilla, ST., Hattori, K., Heissig, B., Tejada, R., Liao, F., Shido, K., Jin, D.K., Dias, S., Zhang, F., Hartman, T.E., et al. (2004). Chemokine-mediated interaction of hematopoietic progenitors with the bone marrow vascular niche is required for thrombopoiesis. Nat Med 10, 64-71.
Balordi, F., and Fishell, G. (2007). Mosaic removal of hedgehog signaling in the adult SVZ reveals that the residual wild-type stem cells have a limited capacity for self-renewal. J Neurosci 27, 14248-14259.
Brockschnieder, D., Pechmann, Y., Sonnenberg-Riethmacher, E., and Riethmacher, D. (2006). An improved mouse line for Cre-induced cell ablation due to diphtheria toxin A, expressed from the Rosa26 locus. Genesis 44, 322-327.
Calvi, L.M., Adams, G.B., Weibrecht, K.W., Weber, J.M., Olson, D.P., Knight, M.C., Martin, R.P., Schipani, E., Divieti, P., Bringhurst, F.R., et al. (2003). Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature 425, 841 -846.
Caplan, A.I. (1991 ). Mesenchymal stem cells. Journal of orthopaedic research : official publication of the Orthopaedic Research Society 9, 641 -650.
Chan, C.K., Chen, CO, Luppen, OA., Kim, J.B., Deboer, AT., Wei, K., Helms, J.A., Kuo, C.J., Kraft, D.L., and Weissman, I.L. (2008). Endochondral ossification is required for haematopoietic stem-cell niche formation. Nature.
Chan, C.K., Lindau, P., Jiang, W., Chen, J.Y., Zhang, L.F., Chen, CO, Seita, J., Sahoo, D., Kim, J.B., Lee, A., et al. (2013). Clonal precursor of bone, cartilage, and hematopoietic niche stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 12643-12648.
Christensen, J.L., Wright, D.E., Wagers, A.J., and Weissman, I.L. (2004). Circulation and chemotaxis of fetal hematopoietic stem cells. PLoS Biol 2, E75.
Crisan, M., Yap, S., Casteilla, L., Chen, C.W., Corselli, M., Park, T.S., Andriolo, G., Sun, B., Zheng, B., Zhang, L et al. (2008). A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell 3, 301-313.
Dacquin, R., Starbuck, M., Schinke, T., and Karsenty, G. (2002). Mouse alpha1 (l)-collagen promoter is the best known promoter to drive efficient Cre recombinase expression in osteoblast. Dev Dyn 224, 245-251.
Dieguez-Hurtado, R., Martin, J., Martinez-Corral, I., Martinez, M.D., Megias, D., Olmeda, D., and Ortega, S. (201 1 ). A Cre-reporter transgenic mouse expressing the far-red fluorescent protein Katushka. Genesis 49, 36-45.
Ding, L., and Morrison, S.J. (2013). Haematopoietic stem cells and early lymphoid progenitors occupy distinct bone marrow niches. Nature 495, 231-235.
Ding, L., Saunders, T.L., Enikolopov, G., and Morrison, S.J. (2012). Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature 481, 457-462.
Dzierzak, E., and Speck, N.A. (2008). Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol 9, 129-136.
Friedenstein, A.J., Chailakhjan, R.K., and Lalykina, K.S. (1970). The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet 3, 393-403.
Glejzer, A., Laudet, E., Leprince, P., Hennuy, B., Poulet, C, Shakhova, O., Sommer, L, Rogister, B., and Wislet-Gendebien, S. (201 1 ). Wnt1 and BMP2: two factors recruiting multipotent neural crest progenitors isolated from adult bone marrow. Cell Mol Life Sci 68, 2101 -21 14.
Greenbaum, A., Hsu, Y.M., Day, R.B., Schuettpelz, L.G., Christopher, M.J., Borgerding, J.N., Nagasawa, T., and Link, D.C. (2013). CXCL12 in early mesenchymal progenitors is required for haematopoietic stem-cell maintenance. Nature 495, 227-230.
Isern, J., Martin-Antonio, B., Ghazanfari, R., Martin, A.M., Lopez, J.A., del Toro, R., Sanchez-Aguilera, A., Arranz, L., Martin-Perez, D., Suarez-Lledo, M et al. (2013). Self-renewing human bone marrow mesenspheres promote hematopoietic stem cell expansion. Cell Rep 3, 1714-1724.
Jaegle, M., Ghazvini, M., Mandemakers, W., Piirsoo, M., Driegen, S., Levavasseur, F., Raghoenath, S., Grosveld, F., and Meijer, D. (2003). The POU proteins Brn-2 and Oct-6 share important functions in Schwann cell development. Genes Dev 17, 1380-1391.
Jessen, K.R., and Mirsky, R. (2005). The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci 6, 671-682.
John, N., Cinelli, P., Wegner, M., and Sommer, L. (201 1 ). Transforming growth factor beta-mediated Sox10 suppression controls mesenchymal progenitor generation in neural crest stem cells. Stem Cells 29, 689-699.
Katayama, Y., Battista, M., Kao, W.M., Hidalgo, A., Peired, A.J., Thomas, S.A., and Frenette, P.S. (2006). Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell 124, 407-421.
Kiel, M.J., Yilmaz, O.H., Iwashita, T., Terhorst, C, and Morrison, S.J. (2005). SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell 121, 1 109-1 121.
Komada, Y., Yamane, T., Kadota, D., Isono, K., Takakura, N., Hayashi, S., and Yamazaki, H. (2012). Origins and properties of dental, thymic, and bone marrow mesenchymal cells and their stem cells. PloS one 7, e46436.
Kunisaki, Y., Bruns, I., Scheiermann, O, Ahmed, J., Pinho, S., Zhang, D., Mizoguchi, T., Wei, Q., Lucas, D., Ito, K., et al. (2013). Arteriolar niches maintain haematopoietic stem cell quiescence. Nature 502, 637-643.
Lewis, A.E., Vasudevan, H.N., O'Neill, A.K., Soriano, P., and Bush, J.O. (2013). The widely used Wnt1 -Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. Dev Biol 379, 229-234.
Liu, Y., Strecker, S., Wang, L., Kronenberg, M.S., Wang, W., Rowe, D.W., and Maye, P. (2013). Osterix-cre labeled progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the bone marrow stroma. PloS one 8, e71318.
Maes, C, Kobayashi, T., Selig, M.K., Torrekens, S., Roth, S.I., Mackem, S., Carmeliet, G., and Kronenberg, H.M. (2010). Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Dev Cell 19, 329-344.
Matsuoka, T., Ahlberg, P.E., Kessaris, N., lannarelli, P., Dennehy, U., Richardson, W.D., McMahon, A.P., and Koentges, G. (2005). Neural crest origins of the neck and shoulder. Nature 436, 347-355.
Mendez-Ferrer, S., Lucas, D., Battista, M., and Frenette, P.S. (2008). Haematopoietic stem cell release is regulated by circadian oscillations. Nature 452, 442-447.
Mendez-Ferrer, S., Michurina, T.V., Ferraro, F., Mazloom, A.R., Macarthur, B.D., Lira, S.A., Scadden, D.T., Ma'ayan, A., Enikolopov, G.N., and Frenette, P.S. (2010). Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466, 829-834. Mignone, J.L., Kukekov, V., Chiang, A.S., Steindler, D., and Enikolopov, G. (2004). Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of comparative neurology 469, 31 1 -324.
Morikawa, S., Mabuchi, Y., Kubota, Y., Nagai, Y., Niibe, K., Hiratsu, E., Suzuki, S., Miyauchi-Hara, O, Nagoshi, N., Sunabori, T et al. (2009a). Prospective identification, isolation, and systemic transplantation of multipotent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med 206, 2483-2496.
Morikawa, S., Mabuchi, Y., Niibe, K., Suzuki, S., Nagoshi, N., Sunabori, T., Shimmura, S., Nagai, Y., Nakagawa, T., Okano, H., et al. (2009b). Development of mesenchymal stem cells partially originate from the neural crest. Biochem Biophys Res Commun 379, 1 1 14-1 1 19.
Nagoshi, N., Shibata, S., Kubota, Y., Nakamura, M., Nagai, Y., Satoh, E., Morikawa, S., Okada, Y., Mabuchi, Y., Katoh, H., et al. (2008). Ontogeny and multipotency of neural crest-derived stem cells in mouse bone marrow, dorsal root ganglia, and whisker pad. Cell stem cell 2, 392-403.
Nakamura, Y., Arai, F., Iwasaki, H., Hosokawa, K., Kobayashi, I., Gomei, Y., Matsumoto, Y., Yoshihara, H., and Suda, T. (2010). Isolation and characterization of endosteal niche cell populations that regulate hematopoietic stem cells. Blood 116, 1422-1432.
Naveiras, O., Nardi, V., Wenzel, P.L., Hauschka, P.V., Fahey, F., and Daley, G.Q. (2009). Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature 460, 259-263.
Nguyen, M.T., Zhu, J., Nakamura, E., Bao, X., and Mackem, S. (2009). Tamoxifen-dependent, inducible Hoxb6CreERT recombinase function in lateral plate and limb mesoderm, CNS isthmic organizer, posterior trunk neural crest, hindgut, and tailbud. Dev Dyn 238, 467-474.
Olsen, B.R., Reginato, A.M., and Wang, W. (2000). Bone development. Annu Rev Cell Dev Biol 16, 191 -220.
Omatsu, Y., Sugiyama, T., Kohara, H., Kondoh, G., Fujii, N., Kohno, K., and Nagasawa, T. (2010). The essential functions of adipo-osteogenic progenitors as the hematopoietic stem and progenitor cell niche. Immunity 33, 387-399.
Park, D., Spencer, J.A., Koh, B.I., Kobayashi, T., Fujisaki, J., Clemens, T.L., Lin, C.P., Kronenberg, H.M., and Scadden, D.T. (2012). Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell stem cell 10, 259-272.
Pinho, S., Lacombe, J., Hanoun, M., Mizoguchi, T., Bruns, I., Kunisaki, Y., and Frenette, P.S. (2013). PDGFRalpha and CD51 mark human Nestin+ sphere-forming mesenchymal stem cells capable of hematopoietic progenitor cell expansion. J Exp Med 210, 1351 -1367.
Raaijmakers, M.H., Mukherjee, S., Guo, S., Zhang, S., Kobayashi, T., Schoonmaker, J.A., Ebert, B.L., Al-Shahrour, F., Hasserjian, R.P., Scadden, E.O., et al. (2010). Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature 464, 852-857.
Riethmacher, D., Sonnenberg-Riethmacher, E., Brinkmann, V., Yamaai, T., Lewin, G.R., and Birchmeier, C. (1997). Severe neuropathies in mice with targeted mutations in the ErbB3 receptor. Nature 389, 725-730.
Sacchetti, B., Funari, A., Michienzi, S., Di Cesare, S., Piersanti, S., Saggio, I., Tagliafico, E., Ferrari, S., Robey, P.G., Riminucci, M et al. (2007). Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell 131, 324-336.
Schatteman, G.C., Morrison-Graham, K., van Koppen, A., Weston, J.A., and Bowen-Pope, D.F. (1992). Regulation and role of PDGF receptor alpha-subunit expression during embryogenesis. Development 115, 123-131.
Sheean, M.E., McShane, E., Cheret, C, Walcher, J., Muller, T., Wulf-Goldenberg, A., Hoelper, S., Garratt, A.N., Kruger, M., Rajewsky, K., et al. (2014). Activation of MAPK overrides the termination of myelin growth and replaces Nrg1/ErbB3 signals during Schwann cell development and myelination. Genes Dev 28, 290-303.
Soriano, P. (1997). The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites. Development 124, 2691 -2700.
Sousa, V.H., Miyoshi, G., Hjerling-Leffler, J., Karayannis, T., and Fishell, G. (2009). Characterization of Nkx6-2 -derived neocortical interneuron lineages. Cereb Cortex 19 Suppl 1, i1 -10.
Spiegel, A., Shivtiel, S., Kalinkovich, A., Ludin, A., Netzer, N., Goichberg, P., Azaria, Y., Resnick, I., Hardan, I., Ben-Hur, H et al. (2007). Catecholaminergic neurotransmitters regulate migration and repopulation of immature human CD34+ cells through Wnt signaling. Nat Immunol 8, 1 123-1 131.
Takashima, Y., Era, T., Nakao, K., Kondo, S., Kasuga, M., Smith, A.G., and Nishikawa, S. (2007). Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell 129, 1377-1388.
Tzeng, Y.S., Li, H., Kang, Y.L., Chen, W.C., Cheng, W.C., and Lai, D.M. (2010). Loss of Cxcl12/Sdf-1 in adult mice decreases the quiescent state of hematopoietic stem/progenitor cells and alters the pattern of hematopoietic regeneration after myelosuppression. Blood 117, 429-439.
Yamazaki, S., Ema, H., Karlsson, G., Yamaguchi, T., Miyoshi, H., Shioda, S., Taketo, M.M., Karlsson, S., Iwama, A., and Nakauchi, H. (201 1 ). Nonmyelinating Schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell 147, 1 146-1 158.
Yang, W., Wang, J., Moore, D.C., Liang, H., Dooner, M., Wu, Q., Terek, R., Chen, Q., Ehrlich, M.G., Quesenberry, P. J., et al. (2013). Ptpn1 1 deletion in a novel progenitor causes metachondromatosis by inducing hedgehog signalling. Nature 499, 491 -495.
Zaidi, M., and Mendez-Ferrer, S. (2013). Cell biology: tumour stem cells in bone. Nature 499, 414-416.
Zhang, J., Niu, C, Ye, L., Huang, H., He, X., Tong, W.G., Ross, J., Haug, J., Johnson, T., Feng, J.Q., et al. (2003). Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature 425, 836-841.
Aquino, J.B., Hjerling-Leffler, J., Koltzenburg, M., Edlund, T., Villar, M.J., and Ernfors, P. (2006). In vitro and in vivo differentiation of boundary cap neural crest stem cells into mature Schwann cells. Exp Neurol 198, 438-449.
Casanova-Acebes, M., Pitaval, C, Weiss, L.A., Nombela-Arrieta, C, Chevre, R., N, A.G., Kunisaki, Y., Zhang, D., van Rooijen, N., Silberstein, L.E., et al. (2013). Rhythmic Modulation of the Hematopoietic Niche through Neutrophil Clearance. Cell 153, 1025-1035.
Davis, S., and Meltzer, P.S. (2007). GEOquery: a bridge between the Gene Expression Omnibus (GEO) and BioConductor. Bioinformatics 23, 1846-1847.
Heider, A., and Alt, R. (2013). virtualArray: a R/bioconductor package to merge raw data from different microarray platforms. BMC bioinformatics 14, 75.
Isern, J., Fraser, ST., He, Z., and Baron, M.H. (2008). The fetal liver is a niche for maturation of primitive erythroid cells. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 6662-6667.
Johnson, W.E., Li, C, and Rabinovic, A. (2007). Adjusting batch effects in microarray expression data using empirical Bayes methods. Biostatistics 8, 118-127.
Mignone, J.L., Kukekov, V., Chiang, A.S., Steindler, D., and Enikolopov, G. (2004). Neural stem and progenitor cells in nestin-GFP transgenic mice. The Journal of comparative neurology 469, 311-324。
【０２００】
実施例13. MPNの発生病理に対する骨髄ニッチ間葉幹細胞の寄与
本発明者らは、マウスBMネスチン+MSCがHSCの維持に要求されること5、およびヒトBMネスチン+ 細胞がHSCを増殖させうること18を既に報告した。本発明において、本発明者らは、MPN患者におけるBM血管密度の増加にもかかわらず、ネスチン+ 細胞数およびネスチンmRNA発現が顕著に低減することを見出した（図1a〜b）。これは、plpC処理後にMPNを発生したMx1-cre; JAK2V617Fマウスにおいて再現された（図1c）。MPNマウスをNes-gfp系統と交雑させて、MSCを標識した5。複合突然変異マウスおよび突然変異BM細胞が移植されたNes-gfp動物は共にMPNを発生し、GFP、表面マーカー発現および機能分析により定められる、より低いBM MSCを示した（図1d〜gおよび図5a〜f）。MSC喪失は初期BM線維症に付随したため、本発明者らは、ネスチン+ MSCがMPNにおいて線維芽細胞または骨芽細胞へと分化し、それによりこれらのマウスにおける間質変化に寄与するかどうかを判定するために、長期インビボ系統追跡研究を行った19, 20（図5g〜j）。意外にも、GFP+ 細胞の血管パターンは、非罹患Nes-gfpマウスにおけるものに類似していた（図1h〜i）。したがって、BCR-ABL+MPNにおいて最近報告されたように21、Nes-GFP-細胞は過剰な線維芽細胞および骨芽細胞を産生しうるであろう。ネスチン+ MSCの減少は、むしろ、突然変異マウスにおけるアポトーシス率の3倍の増加により説明され（図1j）、これは、JAKインヒビターであるルクソリチニブ（ruxolitinib）によっては妨げられなかった（図6）。
【０２０１】
ネスチン+ MSCの死が今度はMPNの進行を刺激しうるのかどうかを判定するために、本発明者らはネスチン+ 細胞をインビボで選択的に枯渇させた。この枯渇は、ネスチンを発現することが報告されている成熟BMシュワン細胞22に影響を及ぼさなかったが、白血球および赤血球の増加に関連しているMSCの減少をもたらした（図1kおよび図7a〜e）。MPNにおいて線維芽細胞も骨細胞も産生しないネスチン+ 細胞と合致して、対照マウス（図1l）においては未だ検出不可能である過剰な線維芽細胞および骨形成をBM切片は明らかにした。また、ネスチン+細胞枯渇後の疾患加速が重篤な脾臓浸潤として生じ、これは対照マウスにおいては尚も生じていない（図1m）。
【０２０２】
初期疾患段階において、最も原始的なHSCが最高の増殖を示して、BM、末梢血および脾臓において造血前駆体の増加を招いた。ケモカインCxcl12はHSCの遊走および静止を調節し23, 24、ネスチン+ MSCにより高発現される5。初期HSC動員は、MSCの減少と合致して、BM Cxcl12の減少と相関した。また、Cxcl12の発現はMPN BM Nes-GFP+ 細胞において70倍低下した（図7f〜k）。インビボにおいてネスチン+ 細胞におけるCxcl12REF24の欠失はBM造血前駆体および循環血小板を増加させた（図1nおよび図7l）。したがって、MSC由来Cxcl12はJAK2V617F+ HSCの増殖を負に調節しうる。
【０２０３】
実施例14. MPNにおける骨髄ニッチの交感神経支配に対する変化は間質MSCにおける変化に関連している。
【０２０４】
BMネスチン+ 細胞の変化をより良く理解するために、次世代配列決定によりゲノムワイド発現をプロファイリングした。MSCおよびHSC関連遺伝子の発現はMPN Nes-GFP+ 細胞においてはより低かったが、これはシュワン細胞遺伝子および神経関連機能的範疇においてはむしろ富化を示した（図8a〜dおよび補助データ）。公的に入手可能なデータと比較された場合の、独立した生物学的サンプルの主成分分析が示したところによると、対照Nes-GFP+ 細胞は間葉前駆体に最も近く、一方、MPN Nes-GFP+はそれらから離れシュワン細胞に接近して密集していた（図2a）。qPCR（図2b）により確認されたこれらの変化はMPNにおけるHSCニッチ神経成分の変化を示唆した。
【０２０５】
交感神経線維および鞘被覆シュワン細胞（特有のNes-GFP+ 細胞に隣接しているもの）ならびにGFAP mRNA発現はMPN患者およびマウスのBMにおいて顕著に低減した（図2c〜gおよび図8g〜i）。経時的分析は、BM神経損傷がNes-GFP+細胞のアポトーシスに先行することを示しており（図2g）、このことは、交感神経ニューロパシーが、突然変異細胞により誘発される細胞死に対してネスチン+ 細胞を感作することを示唆している。多重ELISAはMPN BMにおいて初期上昇インターロイキン-1 を検出した（図9a）。このサイトカインおよびその活性化酵素カスパーゼ-1は、既に報告されているとおり25、単球により発現されたが、造血前駆体によっても発現された（図9b〜d）。BM Nes-GFP-間質細胞と比較して、インターロイキン-1受容体およびそのアンタゴニストのmRNAレベルはそれぞれ10倍および1000倍高く、MPNにおけるNes-GFP+ 細胞において特異的にアップレギュレーションされた（図9e〜f）。したがって、本発明者らはインターロイキン-1受容体のアンタゴニストでマウスを慢性的に処理した。この処理は血小板数を減少させ、BM MSC度数を増加させ、これは造血前駆体におけるカスパーゼ-1 mRNA発現の低減に関連していた（図2hおよび図9g〜j）。本発明者らは、JAK2V617F+ HSCがBMシュワン細胞死を直接的に引き起こしうるかどうかを調べた。MSCとは異なり、JAK2V617F+ 造血前駆体と共培養されたBM由来シュワン細胞は3倍高いアポトーシス率を示し、これはインターロイキン-1受容体アンタゴニストにより阻止された（図2i）。総合すると、これらのデータは、HSC由来インターロイキン-1 が、MSC生存を損なう神経膠損傷に寄与することを示唆している。したがって、本発明者らは、交感神経ニューロパシーがHSCニッチ変化の根底にあり、したがってMPNにおける治療標的となりうるかどうかを調べた。
【０２０６】
実施例15. レスキューまたは補償による骨髄ニッチ交感神経支配に対する変化を標的化するMPNに対する効率的治療戦略
本発明者らは、化学療法中にBM交感神経線維を保護しうる神経保護物質4-メチルカテコール26で症候性MPNマウスを処理した。シュワン細胞は4-メチルカテコール処理マウスにおいて維持され、好中球増加の予防も伴っていた（図3a〜b）。交感神経線維はネスチン+ MSCにおける 3-アドレナリン受容体活性化によりBM HSCトラフィックを調節する5,6。この受容体は正常またはJAK2V617F+ 造血細胞においては発現されない（図10a）。 3-アドレナリン受容体を欠くマウスにおいては疾患発生が加速した（図3c〜d）。このことはMPNにおけるこの受容体の防御的役割を明らかに示している。ネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激を補償するために、症候性マウスを選択的 3-アドレナリンアゴニスト（BRL37344）で慢性的に処理した。顕著に、BRL37344処理はMPN関連好中球増加および血小板増加を妨げ、赤血球減少を遅延させたが、野生型マウスにおいては血球数に影響を及ぼさなかった（図3b, eおよび図10b〜d）。ビヒクル注射マウスにおける重篤な線維症とは対照的に、BRL37344処理動物のBMは過剰な骨および線維芽細胞組織を実質的に欠いていた（図3f）。これらの効果はHSCニッチ依存的であった。なぜなら、4-メチルカテコールもBRL37344も培養造血前駆体の増殖に影響を及ぼさず、ネスチン+ 細胞が枯渇したマウスにおいて白血球増加はBRL37344によってはレスキューされなかったからである（図3gおよび図11a）。同様に、幾つかのMPNマーカーが、臨床的に承認されたβ3-アドレナリンアゴニストであるミラベグロンでの処理により改善された（図11b）。尤も、おらくその難溶解性およびマウス受容体に対する比較的低いアフィニティゆえに、その度合はより低かった。
【０２０７】
実施例16. 交感神経レスキューまたは補償は、進行した血小板増加MPN段階において投与された場合に有効であり、正常造血に対して有害な効果を及ぼさない。
【０２０８】
より進行した段階で投与された場合の潜在的な治療利益を調べるために、血小板増加および対照マウスをBRL37344で処理した。この処理は好中球増加、赤血球増加、血小板増加、BMインターロイキン-1β、線維症および骨硬化を低減し、BMシュワン細胞をレスキューし（図4a〜d）、BMネスチン+ 細胞におけるシュワン細胞プログラム活性化を阻止した（図11c）。したがって、MPNの進行は、β3-アドレナリンアゴニストによるネスチン+ MSCの欠損交感神経刺激の補償によって、およびBM神経膠の保護またはレスキューによって阻止されうる。
【０２０９】
つぎに、本発明者らは、MPNの阻止がMSCおよびそれらのHSC調節機能の維持によりもたらされうるかどうかを問うた。BRL37344はBMにおけるIL-1βを低下させ、Nes-GFP+ 細胞数を回復させ、Cxcl12レベルを増加させた（図4e〜g）。初期BRL37344または4-メチルカテコール処理は突然変異造血前駆体の増殖を妨げた（図4hおよび図12）。長期BRL37344処理は正常HSCを損なわなかったが、突然変異造血前駆体を効率的に減少させ（図4i〜jおよび図13）、これは、血小板増加段階で投与された場合でさえもそうであった（図4k）。更に、BRL37344処理MPNマウスは白血病幹細胞における4.5倍の減少を示した（図4l）。
【０２１０】
本発明者らの知見は、MPNの病因に決定的に寄与する、MSCの生存および機能を損なうBM神経膠損傷の原因として、突然変異HSCを指摘している（図4m）。本研究は、突然変異HSCにより誘発されるニッチ損傷が、HSCのみによって引き起こされると従来考えられていた造血悪性疾患の発生に必須であることを示している。HSCニッチ形成MSCおよびそれらの神経調節への標的化はより効率的なMPN治療戦略への道を切り開きうる。
本発明は以下の実施形態を包含する：
[１]  MPN（骨髄増殖性新生物）の治療および／または予防における使用のための、β-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物、または骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物。   
[２]  MPNが、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性骨髄単球性白血病（CMML）、真正赤血球増加症、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、特発性骨髄線維症、特発性骨髄異形成、慢性好中球性白血病、慢性好酸球性白血病および肥満細胞症からなる群から選択される、実施形態1記載の使用のための化合物。   
[３]  ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物が選択的ベータ-3アドレナリン受容体アゴニスト化合物である、実施形態1または2記載の使用のための化合物。   
[４]  該選択的アゴニストが、
- BRL 37344;
- CL 316243;
- AZ 002;
- BMS 187257;
- L-755507;
- L-750355;
- FR-149175;
- GW427353 (ソラベグロン（Solabegron）);
- YM178 (ミラベグロン（Mirabegron）／ミルベトリク（myrbetriq）);
- CR 58611 ;
- SR 58611A (アミベグロン（Amibegron）);
- SR 59104A;
- SR 59119A;
- SAR150640;
- L-796568; および
- CL-316243
ならびにそれらの医薬上許容される塩からなる群から選択される、実施形態3記載の使用のための化合物。   
[５]  該選択的アゴニストがフェニルエタノールアミンである、実施形態3記載の使用のための化合物。   
[６]  該選択的アゴニストが、以下の一般式：
0006479818.tif 000029
（式中、
R1は水素およびハロゲンから選択される；ならびに
R2は、アリール部分および／またはアルキル部分において置換されうるアラルキル、あるいは
0006479818.tif 000030
0006479818.tif 000031
から選択される基である）を有する化合物である、実施形態5記載の使用のための化合物。   
[７]  式Iの化合物が、
0006479818.tif 000032
0006479818.tif 000033
およびそれらの医薬上許容される塩からなる化合物の群から選択される、実施形態6記載の使用のための化合物。   
[８]  該化合物が、骨髄交感神経線維を保護しうる神経保護化合物である、実施形態1または2記載の使用のための化合物。   
[９]  該神経保護化合物が、4-メチルカテコール；NGF（ニューロン成長因子）；ニュールツリン（NRTN）、アルテミン（ARTN）またはペルセフィン（PSPN）ファミリーに属するグリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）；ニューロトロフィン3およびニューロトロフィン4/5；インターロイキン6（IL-6）；インスリン様成長因子1（IGF-1）；ビタミンE、特に、ビタミンEのα-トコフェロール形態；N-アセチルシステインまたはN-アセチル-L-システイン（略称NAC）としても公知であるアセチルシステイン；アセチル-L-カルニチンまたはALCAR；アミホスチン（amifostine）および白血病抑制因子（LIF）からなる群から選択されうる、実施形態8記載の使用のための化合物。   
[１０]  該神経保護物質が、シタグリプチン（sitagliptin）、サクサグリプチン（saxagliptin）／オングリザ（Onglyza）、リナグリプチン（linagliptin）、デュトグリプチン（dutogliptin）、ジェミグリプチン（gemigliptin）、アログリプチン（alogliptin）およびビルダグリプチン（vildagliptin）／ガルブス（Galvus）からなる群から選択されうる、実施形態8記載の使用のための化合物。   
[１１]  MPN（骨髄増殖性新生物）の治療および／または予防における使用のための、実施形態1〜10のいずれか1項記載の化合物を含む医薬品または医薬組成物。   
[１２]  a．被験者から場合によっては経時的に採取された骨髄生検において存在するチロシンヒドロキシラーゼを免疫染色し、
b．工程a）の生検において存在する交感神経系線維が、正常被験者の骨髄に存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少しているかどうかを比較することにより、被験者の骨髄における交感神経系線維の評価を指標として使用することを含む、ヒト被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、交感神経系線維が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて減少している場合には、ネスチン+ 間葉系幹細胞の減少に先行する骨髄神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、正常被験者において存在する交感神経系線維と比べて、または参照もしくは対照値と比べて、チロシンヒドロキシラーゼ線維により占拠された骨髄面積における少なくとも3倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している、方法。   
[１３]  交感神経線維により占拠された骨髄面積の参照または対照値が該区画における全骨髄面積の0.15±0.09%である、実施形態12記載の方法。   
[１４]  c．被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
d．工程a）のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現を、正常被験者におけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、工程a）のサンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現が参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現と比べて低減している場合には、ネスチン+ MSCの減少に先行するBM神経損傷が該被験者において進行しており、かつ
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたグリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の値の少なくとも160倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している、方法。   
[１５]  グリア線維酸性タンパク質のmRNA発現の参照または対照値が、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA発現に対して正規化された0.48±0.03である、実施形態14記載の方法。   
[１６]  以下の工程、すなわち、
e．被験者の骨髄から生物学的サンプルを経時的に得、
f．工程a）のサンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、ネスチンの免疫染色、およびそれに続く、骨髄サンプル（平均7.2mm2のBMが評価され、結果は1mm2まで外挿されるべきである）におけるネスチン+ 血管周囲ニッチ（単細胞または3個までの細胞のクラスター）の数を考慮した評価により、この指標を測定し、
g．工程a）の生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数を正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの総数の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの総数と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、細胞数が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるBMネスチン+ MSCの数と比べて減少している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該被験者において存在し、かつ
ここで、該被験者が正常被験者におけるBMネスチン+ MSCの数の少なくとも6倍の減少を示す場合には、該被験者はMPNに罹患している、方法。   
[１７]  正常被験者におけるBMネスチン+細胞の総数の参照または対照値が1.15±0.3ニッチ/mm2（それぞれのものは少なくとも1つの陽性細胞を含有する）である、実施形態16記載の方法。   
[１８]  以下の工程、すなわち、
c．被験者の骨髄から生物学的サンプルを得、
d．工程a）のサンプルにおいてqRT-PCRによりネスチンのmRNA発現を測定することにより、工程a）のサンプルにおけるネスチン+ MSCの総数を指標として使用し、
h．工程a）のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現を、正常被験者におけるネスチンのmRNA発現の参照もしくは対照値と、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比較することを含む、被験者におけるMPNの診断または予後の方法であって、
ここで、工程a）のサンプルにおけるネスチンのmRNA発現が該参照もしくは対照値と比べて、または正常被験者から得られた生物学的サンプルにおけるネスチンのmRNA発現と比べて低減している場合には、骨髄線維症に先行するニッチの損傷が該患者において存在し、かつ、
ここで、該被験者が、対照におけるハウスキーピング遺伝子GAPDHのmRNA発現に対して正規化されたネスチンのmRNA発現の値の少なくとも13倍の減少を示す場合、方法。   
[１９]  ネスチンのmRNA発現の参照または対照値が、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のmRNA発現に対して正規化された4.86±4.55である、実施形態18記載の方法。   
[２０]  実施形態１２−１９のいずれかに記載の方法のいずれかの実施に適したキット。[２１]  a．化合物を選択し、
b．該化合物が、他のベータアドレナリン受容体と比較して約≧10倍高い、より好ましくは約≧100倍高い、より一層好ましくは約≧1000倍高い、ベータ-3受容体に対する選択性を示すかどうか、およびそれがベータ-3受容体の基礎活性を、それが該受容体と接触した場合に増強するかどうかを決定し、
c．該化合物を、それが工程b）に記載の基準を満たしている場合には回収し、
d．該化合物を製造する工程を含む、MPNの治療に適した化合物のスクリーニングまたは製造方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006479818.tif 000049
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
0006479818.tif 000065
【図２１】
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【配列表】
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