(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（ＩＩ）に対応する分子であって、
【化１】
0006595460.tif 000052
式中、
Ｋは、マンノース、ガラクトース、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース及びラクトースからなる群より選択される炭水化物を表し、
Ｐｈｏは、
【化２】
0006595460.tif 000053
からなる群より選択されるリン酸基を表し、
式中、ＸはＯ又はＳを表し、
リン酸基の１又は２個の酸素原子は、共有結合によってＬ１リンカーアームに結合しており、
Ｌ１は、
直鎖又は分岐Ｃ１‐Ｃ３アルキルジラジカル、直鎖、分岐又は環状Ｃ４‐Ｃ６アルキルジラジカル、１つ又は複数のエーテル架橋‐Ｏ‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状Ｃ７‐Ｃ１２アルキルジラジカル、
２、３、４、５又は６つのエチレングリコール単位を含むポリ（エチレングリコール）ジラジカル、
２、３、４、５又は６つのプロピレングリコール単位を含むポリピレングリコールジラジカル、
からなる群より選択されるリンカーアームを表す。）、
Ｔは、
トリアゾ−ルジラジカル
【化３】
0006595460.tif 000054
からなる群より選択される連結基を表し、
Ｌ２は、
【化４】
0006595460.tif 000055
式中、ｎ及びｍは、１、２、３、４又は５から選択される整数を表す。）
からなる群より選択されるリンカーアームを表し、
Ａｒは、フェニル、ナフタレニル及び１，４‐ビフェニル
【化５】
0006595460.tif 000056
からなる群より選択され、
Ｌ３はＯ、Ｓ又は‐ＣＨ２を表し、
Ｇａｌは、次式のβ‐Ｄ‐ガラクトピラノシル基を表し、
【化６】
0006595460.tif 000057
ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であることを特徴とする前記分子。
【請求項２】
Ｋが、Ｄ‐マンノピラノシル形態下のマンノースを表すことを特徴とする、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
Ｌ１が、Ｐｒｏ（１，３‐ｎ‐プロピル）基、ＥＧ２Ｍ（ジエチレングリコールメチレン）、ＥＧ３Ｍ（トリエチレングリコールメチレン）、ＥＧ４Ｍ（テトラエチレングリコールメチレン）を表すことを特徴とする、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
Ａｒがフェニル基であることを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
ｚが３又は４であることを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｇａｌ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｇｌｃ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ[ＰＯ（ＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２]４
Ｍａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＰｒｏＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＢｉｓＰｈｅ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＰｒｏＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＢｉｓＰｈｅ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＰｒｏＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＰｒｏＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
（式中、Ｍａｎはマンノースを表し、Ｇａｌはガラクトースを表し、Ｇｌｃはグルコースを表し、Ｐｈｅはフェニルを表し、Ｎａｐｈｔはナフチルを表し、ＢｉｓＰｈｅはビフェニルを表し、ＰＯはホスホジエステルを表し、ＰＳはホスホロチオアートを表し、Ｐｒｏは１，３‐ｎ‐プロピルを表し、ＴＨＭＥはトリス‐（ヒドロキシメチル）エタンを表し、Ｔｚはトリアゾール：
【化７】
0006595460.tif 000058
を表し、
ＥＧ２はジエチレングリコールを表し、ＥＧ３はトリエチレングリコールを表し、ＡｃＮＰｈｅはアセトアミドフェニル：
【化８】
0006595460.tif 000059
を表し、Ｍはメチレンを表す。）
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の少なくとも１つの分子、又は医薬として許容し得るその塩と、医薬として許容し得る担体及び／又は賦形剤と、を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
呼吸器官内に吸入又は滴下されるように製剤化されることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも１つ以上の他の抗菌剤、又は１つ以上の他の抗病原性剤、又は宿主の先天免疫を強化する１つ以上の薬剤を更に含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
微生物病原体、具体的には病原菌による感染の予防、遅延、弱化及び治療的処置に用いることを特徴とする、請求項７〜９のうちのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)からの感染を治療するか、遅延させるか、弱化させるか又は予防するための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
緑膿菌を捕捉することが可能な材料に用いることを特徴とする、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の少なくとも１つの分子を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、末端にガラクトース残基を有した糖鎖クラスター型の新規化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）に関する。かかる化合物は、緑膿菌（シュードモナス・エルギノーサ、Pseudomonas aeruginosa）の病原因子であるレクチン１と十分な親和性を示す。本発明は、これらの化合物を調製する簡単かつ効果的な方法を提供する。また、本発明は、緑膿菌による感染の阻害剤としての、具体的には緑膿菌による毒性の阻害剤としての、化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）の医薬の使用も対象とする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
緑膿菌（ＰＡ）は、院内感染に対するその影響とともに、嚢胞性線維症患者の死亡率に対する影響により、重大な公衆衛生問題である。緑膿菌（ＰＡ）は、グラム陰性で好気性のグルコース非発酵菌であり、極単毛(polar monotrichous flagellum)により移動性である。緑膿菌は、その長期間の生存能とともに、最小栄養要求及び環境変化に対する高い耐性により、院内感染に関係することが多い、臨床的に重要な日和見病原菌である。緑膿菌は、院内感染の１０〜３０％の原因である（Floret, N. et al., (2009), Pathol. Biol. 57, 9-12）。また、緑膿菌は、慢性炎症及び嚢胞性線維症患者の呼吸器官の低下を次第にもたらす、最も頻度の高い病原菌でもある（Lyczak, J. B. et al., (2002) Clinical Microbiology Reviews 15, 194-222）。現在、抗生物質の使用が、緑膿菌の感染に対して有効となり得る唯一の解決策である。しかしながら、この点で、バイオフィルム構造中の細菌増殖によって、病原体に選択的有利性をもたらすと考えられる（Stewart, P. S., and Costerton, J. W. (2001) Lancet 358, 135-138. Landry, R. M. et al., (2006) Mol. Microbiol. 59, 142-151）。
その結果、ほとんどの病原菌、特に緑膿菌の抗生物質に対する耐性の出現に関しては、耐性又は新しい作用形式のメカニズムを回避することができる新しい抗菌剤の開発が急務となっており、感染症を治療するか又は予防することが重大な研究課題である。したがって、緑膿菌に基づく感染に対処する代替戦略として、緑膿菌による毒性の阻害が提案されている。
【０００３】
緑膿菌由来のガラクトース結合レクチンであるＰＡ‐ＩＬは、その毒性に関与する。緑膿菌レクチン１（ＰＡ‐ＩＬ、Ｌｅｃ Ａ）は、長辺上に７１Å及び短辺上に３２Å離れた結合部位を有する、ほぼ矩形状の四価のレクチンである（Cioci, G. et al., (2003) FEBS Lett. 555, 297-301; Imberty, A., et al., (2004) Microb. Infect. 6, 221-228）。一価ガラクトシドに対するＰＡ‐ＩＬの結合は、マイクロモルの範囲に及び（フェニル‐β‐Ｇａｌに対して最も高い親和性を有する。）、アグリコンの構造による影響を受ける（Garber, N. et al., (1992) Biochim. Biophys. Acta 1116, 331-333; Chen, C. P. et al., (1998) Glycobiology 8, 7-16）。
いわゆるクラスター効果を利用する場合、ＰＡ‐ＩＬの結合はナノモル範囲に達し得る（Lis, H., and Sharon, N. (1998) Chem. Rev. 98, 637-674; Lundquist, J. J., and Toone, E. J. (2002) Chem. Rev. 102, 555-578; Lee, Y. C., and Lee, R. T. (1995) Acc. Chem. Res. 28, 321-327）。多価炭水化物リガンドは、一価リガンドと比較して、炭水化物残基ごとの標的レクチンに対して結合の増強を示し得る。この増強の程度は、とりわけ、残基がレクチンの複数の部位に適合する必要があるので、トポロジーの関数である。
【０００４】
S. Cecioniらの文献（Chem. Eur. J. 2009, 15, 13232-13240）には、ＰＡ‐ＩＬを標的とするカリックス［４］アレーン複合糖質が開示されている。しかしながら、カリックスアレーン複合体は、ジアステレオ異性体の潜在的な形成及びカリックスアレーンの潜在的な毒性により、調製するのが困難である。F. Perticiらの文献（Chem. Commun., 2012, 48, 4008-4010）には、緑膿菌レクチンLecAの強力な二価阻害剤として、ジガラクトース誘導体が開示されている。これらの化合物の調製方法は、長く複雑である。A. Imbertiらの文献（Chem. Eur. J. 2008, 14, 7490-7499）には、糖鎖クラスター、及び大腸菌(E. Coli)のFimH又は緑膿菌(Pseudomonas aeruginosea)のＰＡ‐ＩＩＬに対するその親和性が開示されている。I. Deguiseらの文献（New J. Chem., 2007, 31, 1321-1331）には、フコシド残基とガラクトシド残基をともに含有するグリコデンドリマーの合成、並びに、緑膿菌由来のＰＡ‐ＩＬ及びＰＡ‐ＩＩＬレクチンに対するその結合特性が開示されている。Angewの文献（Chem. Int. Ed. 2011, 50, 10631-10635）には、レクチンＬｅｃＡ及び緑膿菌のバイオフィルムの糖ペプチドデンドリマー阻害剤が開示されている。この文献には、ＰＡ‐ＩＬ接着の阻害は言及されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Cecioni et al., Chem .Eur. J. 2009, 15, 13232-13240
【非特許文献２】F. Pertici et al., Chem. Commun., 2012, 48, 4008-4010
【非特許文献３】A. Imberti et al., Chem. Eur. J. 2008, 14, 7490-7499
【非特許文献４】I. Deguise et al., New J. Chem., 2007, 31, 1321-1331
【非特許文献５】Angew., Chem. Int. Ed. 2011, 50, 10631-10635
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞表面複合糖質と有効に競合するために、擬似糖質(glycomimetic)は、その標的と強い親和性を示す必要がある。レクチン‐炭水化物相互作用の低い親和性は、生物学的に活性のある擬似糖化合物の開発における障壁であり、多価によって、この困難性を部分的に克服することができた。しかしながら、先行技術の結果は、緑膿菌接着の防止、並びに細菌感染の予防及び治療の使用に対する擬似糖質(glycomimetic)の大きな可能性を確認する場合には、ＰＡ‐ＩＬとの高い親和性を有する分子の必要性が依然として存在している。
【０００７】
かかる化合物の設計及び合成は容易ではなく、レクチンに対する擬似糖質(glycomimectic)の親和性は、分子によって示される炭水化物基の数だけでなく、レクチンＰＡ‐ＩＬと相互作用する可能性によって異なる。また、この擬似糖質の親和性は分子内のその配置、炭水化物基を分子の他の部分に結合するリンカーアームの性質、長さ及び柔軟性によっても異なる。さらに、複雑な合成により、多くの先行技術の擬似糖質は、少量のみで利用可能である。
【０００８】
病原菌レクチン、特にＰＡ‐ＩＬに対して強い親和性を示す分子の必要性が依然として存在している。特に、緑膿菌の接着を阻害することによって、緑膿菌のバイオフィルムの形成を阻害することができる分子の必要性が依然として存在している。かかる分子は、薬剤への利用を提供するために簡単かつ効果的な方法によって製造できる必要がある。
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、上述した欠点を少なくとも部分的に軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、病原菌レクチン、特にＰＡ‐ＩＬに対して強い親和性を示す分子を提供する。具体的には、本発明は、ＰＡ‐ＩＬを阻害するためのＰＡ‐ＩＬに対する合成リガンドを対象とする。具体的には、本発明は、ＰＡ接着の阻害を目的とする化合物を対象とする。単糖類が中心にあるクラスター及び櫛状クラスターは、コアとガラクトシル残基を分離するアリール基を有した種々のリンカーによって合成された。これらの化合物を調製する簡単かつ効果的な方法が開示される。かかる方法は、産業規模の場合を容易に推定することができた。
【００１１】
本目的は、次の式（Ｉ）に対応する分子によって達成される。
【化１】
0006595460.tif 000002
式中、
ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される整数であり、
Ｇａｌは、次式に示す、ガラクトピラノシル、１‐チオガラクトピラノシル、１‐メチレンガラクトピラノシル、１‐Ｎ‐アセチル‐ガラクトピラノシルから選択される基を表し、
【化２】
0006595460.tif 000003
Ｋは、次のものから選択される、３〜６個のリン酸基又はチオリン酸基又はホスホルアミダート基（Ｐｈｏ）を含む式（ＫＩ）又は（ＫＩＩ）の分子を表し、
【化３】
0006595460.tif 000004
式中、ＸはＯ若しくはＳを表し、
リン酸基の１若しくは２個の酸素原子は、共有結合によってＬ１リンカーアームに結合しており、
リン酸基若しくはチオリン酸基若しくはホスホルアミダート基Ｐｈｏのいずれかは、以下の式（ＫＩ）に表されているように、同一の中心Ｋ’にすべて結合しており、
【化４】
0006595460.tif 000005
Ｋ’は、４〜２４個の炭素原子と、０〜１２個の酸素原子と、対応する数の水素原子とを含む分子を表し、
Ｐｈｏの１個の酸素原子は、共有結合によってＫ’に結合しており、
ｘは１若しくは２であるか、
又は
リン酸基若しくはチオリン酸基若しくはホスホルアミダート基は、以下の式（ＫＩＩ）に表されているように、鎖を形成し
【化５】
0006595460.tif 000006
式中、Ｋ”は、４〜１２個の炭素原子と、０〜６個の酸素原子と、０〜６個の窒素原子と、対応する数の水素原子とを含む分子を表し、
Ｅは、０〜１２個の炭素原子と、０〜６個の酸素原子と、０〜６個の窒素原子と、対応する数の水素原子とを含む末端基を表し、
ｍは、２、３、４、５から選択される整数を表し、
Ｐｈｏの２個の酸素原子は、共有結合によってＫ”基若しくはＥに結合しており、
Ｌ１は、
１つ又は複数のエーテル架橋‐Ｏ‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状Ｃ１‐Ｃ１８アルキルジラジカル、
２〜６つのエチレングリコール単位を含むポリ（エチレングリコール）ジラジカル、
２〜６つのプロピレングリコール単位を含むポリピレングリコール(polypyleneglycol)ジラジカル
から選択されるリンカーアームを表し、
Ｔは、
トリアゾールジラジカル
【化６】
0006595460.tif 000007
チオ架橋‐Ｓ‐
から選択される連結基を表し、
Ｌ２は、以下の式に表される式‐Ｌ２１‐Ａｒ‐Ｌ２２‐に対応するリンカーアームを表す。
【化７】
0006595460.tif 000008
式中、
Ｌ２１は、アミド架橋‐ＣＯ‐ＮＨ‐、エーテル架橋‐Ｏ‐、チオ架橋‐Ｓ‐、アミン架橋‐ＮＨ‐から選択される１個又は複数の基を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状Ｃ１‐Ｃ１２アルキルジラジカルを表し、
Ａｒは、必要に応じて１〜６個のヘテロ原子を含むＣ６‐Ｃ１８芳香族ジラジカルを表し、
Ｌ２２は共有結合を表すか、又は、Ｇａｌがガラクトピラノシル、１‐チオガラクトピラノシルを表す場合、Ｌ２２は‐ＣＨ２‐基であり得る。
【００１２】
好適な実施形態は、次に示す特徴のうちの１つ以上を含む。
式（Ｉ）に対応する分子であって、次に示す条件のうちの１つ又は複数が確認される分子。
Ｇａｌが、β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル基、又はβ‐Ｄ‐チオ‐１‐ガラクトピラノシル基を表し、β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルを表すことが好ましく、
Ｔがトリアゾールジラジカルを表し、
Ｌ１が、直鎖Ｃ２‐Ｃ６アルキル鎖、１，１，１‐（トリスヒドロキシメチル）エタン、２〜４つのエチレングリコール単位を含むポリ（エチレングリコール）ジラジカルから選択されるリンカーアームを表し、
Ｌ２１が、末端においてＡｒ基に結合している１個のアミド官能基‐ＣＯ‐ＮＨ‐を含むＣ１‐Ｃ１２直鎖アルキル鎖を表し、
ＡｒがＣ６‐Ｃ１２の芳香族ジラジカルを表し、Ａｒは、フェニル、ナフタレニル、１，４‐ビフェニルから選択される基を表すことが好ましく、Ａｒはフェニルであることが更により好ましく、
Ｌ２２が共有結合を表す。
【００１３】
式（Ｉ）に対応する分子であって、Ｋが式（ＫＩ）によって表され、ｘが１であり、Ｋが、次式に示す３〜５個のＰｈｏ懸垂基(pending group)を含み、
【化８】
0006595460.tif 000009
Ｋ’が、ピラノース及びフラノースから選択される炭水化物を表す分子。
【００１４】
式（Ｉ）に対応する分子であって、Ｋ’が、マンノース、ガラクトース、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース及びラクトースから選択される炭水化物を表す分子。
【００１５】
式（Ｉ）に対応する分子であって、Ｋが式（ＫＩＩ）によって表され、Ｋ”が、４〜１０個の炭素原子を含む、直鎖、分岐又は環状アルカン(alcane)ジイル基を表し、Ｐｈｏが
【化９】
0006595460.tif 000010
である（式中、ＸがＯ、Ｓである。）分子。
【００１６】
式（Ｉ）に対応する分子であって、Ｋ”が、１，４‐ジメチルシクロヘキシル、１，４‐ジエチルシクロヘキシルを表す分子。
【００１７】
次のものから選択される式（Ｉ）に対応する分子。
（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）５
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｇａｌ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｇｌｃ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８
Ｍａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４
式中、ＤＭＣＨはジメチルシクロヘキサンを表し、Ｍａｎはマンノースを表し、Ｇａｌはガラクトースを表し、Ｇｌｃはグルコースを表し、
Ｐｒｏは１，３‐ｎ‐プロピルを表し、Ｈｅｘは１，６‐ｎ‐ヘキシルを表し、ＥＧ２Ｍはジエチレングリコールメチレンを表し、ＴＨＭＥはトリス‐（ヒドロキシメチル）エタンを表し、
Ｔｚはトリアゾール
【化１０】
0006595460.tif 000011
を表し、
ＥＧ２はジエチレングリコールを表し、
ＡｃＮＰｈｅはアセトアミドフェニル
【化１１】
0006595460.tif 000012
を表し、
Ｍはメチレンを表し、
Ｇａｌはガラクトピラノシルを表し、
ＰＮはホスホルアミダート結合を表し、
ＰＯはリン酸結合を表す。
【００１８】
また、本発明は、一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物、又は医薬として許容し得るその塩と、医薬として許容し得る担体及び／又は賦形剤と、を含む医薬組成物も対象とする。
【００１９】
好適な実施形態によれば、医薬組成物は、呼吸器官内に吸入又は滴下されるように製剤化される。
【００２０】
好適な実施形態によれば、医薬組成物は、少なくとも１つ以上の他の抗菌剤、又は１つ以上の他の抗病原性剤(antivirulence agent)、又は宿主の先天免疫を強化する１つ以上の薬剤を更に含む。
【００２１】
また、本発明は、微生物病原体、具体的には病原菌による感染の予防、遅延、弱化及び治療的処置に用いる、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）に対応する化合物も対象とする。
【００２２】
好適な実施形態によれば、化合物は、緑膿菌からの感染を治療するか、遅延させるか、弱化させるか又は予防するためのものである。
【００２３】
好適な実施形態によれば、化合物は、嚢胞性線維症患者又は呼吸補助下にある患者に投与するためのものである。
【００２４】
本発明の別の目的は、次の式（ＩＩ）に対応する分子である。
【化１２】
0006595460.tif 000013
式中、
Ｋ、ｎ、Ｇａｌ、Ｔ、Ｌ１、Ｌ２は請求項１と同じ定義を有し、ｙは、ＤＮＡ配列又は蛍光色素などのマーカーを表す。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、病原菌レクチン、特にＰＡ‐ＩＬに対して強い親和性を示す分子を提供することができる。具体的には、本発明は、ＰＡ‐ＩＬを阻害するためのＰＡ‐ＩＬに対する合成リガンドであって、ＰＡ接着の阻害を目的とする化合物を提供することができる。単糖類が中心にあるクラスター及び櫛状クラスターは、コアとガラクトシル残基を分離するアリール基を有した種々のリンカーによって合成された。これらの化合物を調製する簡単かつ効果的な方法を提供することができる。かかる方法は、産業規模の場合を容易に推定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】一部のマンノースが中心にあるガラクトクラスター(galactocluster)の一般的な構造と、そのリンカーの性質及び長さを示す。左側では、リンカーは足場に結合している。右側では、リンカーはガラクトシル残基に結合している。
【図２】ガラクトクラスターを合成するための構成単位の構造を示す。
【図３ａ】糖鎖クラスター１７ａ〜ｅ及び１８の合成を示すスキームである。Ｌ２は、図２の説明文中に説明されている。
【図３ｂ】糖鎖クラスター１７ａ〜ｅ及び１８の合成を示すスキームである。Ｌ２は、図２の説明文中に説明されている。
【図４】負の糖鎖クラスター対照（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｍａｎ）３ Ｃ１と、正の糖鎖クラスター対照（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｃ２の構造を示す。
【図５】マイクロアレイ上でAlexa 647‐ＰＡ‐ＩＬと結合した糖鎖クラスターＣ１、Ｃ２、１７ａ〜ｅ及び１８の蛍光強度（任意単位ｕ．ａ．）を示すグラフである。
【図６】式（ＫＩ）に対応するＫを有した構造（Ｉ）への合成経路を示すスキームである。
【図７ａ】式（ＫＩＩ）に対応するＫを有した構造（Ｉ）への合成経路を示すスキームである。ホスホルアミダート結合の構築を示す。
【図７ｂ】式（ＫＩＩ）に対応するＫを有した構造（Ｉ）への合成経路を示すスキームである。ホスホトリエステル結合又はチオノホスホトリエステル(thionophosphotriester)結合の構築を示す。
【図８】直鎖（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２‐５（２２〜２５）クラスター、及び（ｄＴ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２６）クラスターの合成を示すスキームである。
【図９】マンノースコア（１７ｄ、１８）、ガラクトースコア（２７、２９）及びグルコースコア（２８、３０）から合成されたヘキソースが中心にある６つのテトラガラクトクラスターと、モノ‐ＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐ガラクトース（３１）複合体の構造を表す。
【図１０】Alexa 647‐ＰＡ‐ＩＬと結合した、直鎖でヘキソースが中心にある糖鎖クラスター、（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｍａｎ）３ Ｃ１、（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｃ２、（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｎｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２‐５（２２〜２５）、（ｄＴ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２６）、Ｍａｎ‐（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（１７ｄ）、Ｇａｌ‐（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２７）、Ｇｌｃ‐（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２８）、Ｍａｎ‐（ＨｅｘＴｚＭ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（１８）、Ｇａｌ‐（ＨｅｘＴｚＭ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２９）、及びＧｌｃ‐（ＨｅｘＴｚＭ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３０）の蛍光任意単位（ａ．ｕ．）。
【図１１】プロパルギルジエチレングリコール又はプロパルギルテトラエチレングリコール１ａ、１ｂ、ビス‐ペント‐４‐イニル１ｃ、及び２，２‐（ビス‐プロパルギルオキシメチル）プロピル１ｄホスホラミダイトの構造。
【図１２ａ】Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３６）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３２）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３３）、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８（３４）、Ｍａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４（３５）、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）４（３７）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）４（３８）、及びＭａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）２］４（３９）の合成スキーム。
【図１２ｂ】Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３６）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３２）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３３）、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８（３４）、Ｍａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４（３５）、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）４（３７）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）４（３８）、及びＭａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）２］４（３９）の構造。
【図１３】Ｎ３‐（４‐アジド‐ブチル）‐Ｎ１‐（２’，３’，４’，６’‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐ガラクトース）‐チミン４ｆの合成スキーム。
【図１４】Alexa 647‐ＰＡ‐ＩＬと結合した直鎖でヘキソースが中心にある糖鎖クラスターの蛍光任意単位（ａ．ｕ．）。
【図１５】Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）、Ｇ２ （Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）、及びＧ３ （Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）の合成スキーム。
【図１６】擬似ガラクト(galactomimetic)Ｇ１（▲）、Ｇ２（●）、Ｇ３（×）、並びに単量体Ｇａｌ‐Ｏ‐Ｍｅ（■）及びＧａｌ‐Ｏ‐Ｐｈｅ‐ＮＯ２（◆）のＥＬＬＡ曲線。阻害％（縦軸）‐濃度（横軸、ｍＭ）。
【図１７ａ】マイクロカロリメトリーのデータ。ＩＴＣプロット（ＶＰ‐ＩＴＣ（Microcal社製）によって測定）は、擬似糖質Ｇ２〜３を含むＰＡ‐ＩＬの滴定から求めた。下のパネルのプロットは、上のパネルに示されている滴定に対する総リガンド濃度の関数としての、放出された総熱量を示す。実線は、１点モデルを用いた実験データに最良な最小二乗適合を表す。注入剤（縦軸）のｋｃａｌ／モル‐濃度（モル比）。
【図１７ｂ】マイクロカロリメトリーのデータ。ＩＴＣプロット（ＶＰ‐ＩＴＣ（Microcal社製）によって測定）は、擬似糖質Ｇ１を含むＰＡ‐ＩＬの滴定から求めた。下のパネルのプロットは、上のパネルに示されている滴定に対する総リガンド濃度の関数としての、放出された総熱量を示す。実線は、１点モデルを用いた実験データに最良な最小二乗適合を表す。注入剤（縦軸）のｋｃａｌ／モル‐濃度（モル比）。
【図１８】細菌接着アッセイ。擬似ガラクトＧ１（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）阻害剤の濃度変化に伴うＮＣＩ‐Ｈ２９２細胞に対する緑膿菌（ＰＡＯ１）接着の阻害率。阻害％（縦軸）‐濃度（横軸、μΜ）。
【図１９】Ｏ‐ビフェニル(biphenyle)、Ｏ‐ナフチル(naphthyle)ガラクトシド５及び６の合成を示すスキームである。
【図２０】Ｓ‐ビフェニル、Ｓ‐ナフチルガラクトシド５Ｓ及び６Ｓの合成を示すスキームである。
【図２１】糖鎖クラスターＧ１〜Ｇ２４の合成を示すスキームである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の更なる特徴及び利点は、以下に挙げられている添付図面を参照し、非限定的な例として示されている本発明の実施形態の次の説明から明らかになる。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、次の式（Ｉ）に対応する分子を提供する。
【化１３】
0006595460.tif 000014
式中、
ｎは、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される整数であり、
Ｇａｌは、次式に示す、ガラクトピラノシル、１‐チオガラクトピラノシル、１‐メチレンガラクトピラノシル、１‐Ｎ‐アセチル‐ガラクトピラノシルから選択される基を表し、
【化１４】
0006595460.tif 000015
Ｋは、次のものから選択される、３〜６個のリン酸基又はチオリン酸基又はホスホルアミダート基（Ｐｈｏ）を含む式（ＫＩ）又は（ＫＩＩ）の分子を表す。
【化１５】
0006595460.tif 000016
式中、ＸはＯ又はＳを表し、
リン酸基の１又は２個の酸素原子は、共有結合によってＬ１リンカーアームに結合しており、
第１の実施形態によれば、式（Ｉ）の分子はコアが中心にあるクラスターであり、
リン酸基又はチオリン酸基又はホスホルアミダート基Ｐｈｏのいずれかは、以下の式（ＫＩ）に表されているように、同一の中心Ｋ’にすべて結合しており、
【化１６】
0006595460.tif 000017
Ｋ’は、４〜２４個の炭素原子と、０〜１２個の酸素原子と、対応する数の水素原子とを含む分子を表し、
Ｐｈｏの１個の酸素原子は、共有結合によってＫ’に結合している。
【００２９】
Ｋ’に結合するＰｈｏ基の数は、１〜９に及び得る。例示のみの目的で、５個のＰｈｏ基が図（ＫＩ）に表されている。
【００３０】
（ＫＩ）では、Ｐｈｏ基は、１つのリン酸又はチオリン酸結合によってコアＫ’に結合し、次のものから選択される。
【化１７】
0006595460.tif 000018
【００３１】
（ＫＩ）では、リン酸基又はチオリン酸基は、リンカーアーム‐Ｌ１‐Ｔ‐Ｌ２‐を介して１又は２個のＧａｌ基に結合することができるので、ｘは１又は２であり、
第２の実施形態によれば、式（Ｉ）の分子は櫛状クラスターであり、
リン酸基若しくはチオリン酸基若しくはホスホルアミダート基は、以下の式（ＫＩＩ）に表されているように、鎖を形成する。
【化１８】
0006595460.tif 000019
式中、Ｋ”は、４〜１２個の炭素原子と、０〜６個の酸素原子と、０〜６個の窒素原子と、対応する数の水素原子とを含む分子を表し、
Ｅは、０〜１２個の炭素原子と、０〜６個の酸素原子と、０〜６個の窒素原子と、対応する数の水素原子とを含む末端基を表す。
【００３２】
本実施形態によれば、Ｋ”及びＥは、例えば、アルカン又はシクロアルカンジラジカル、アルキレングリコールジラジカル、炭水化物ジラジカル又はヌクレオチドジラジカル、芳香環とＰｈｏの‐Ｏ‐との間に少なくとも２個の‐ＣＨ２‐基を含むアラルキルジラジカルであってもよく、
ＥもＨであってもよく、
ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９から選択される整数を表し、
Ｐｈｏの２個の酸素原子は、共有結合によってＫ”基又はＥに結合しており、
Ｐｈｏは次のものから選択され、
【化１９】
0006595460.tif 000020
式中、ＸはＯ又はＳである。
Ｌ１は、
１つ又は複数のエーテル架橋‐Ｏ‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状Ｃ１‐Ｃ１８アルキルジラジカル、
２〜６つのエチレングリコール単位を含むポリ（エチレングリコール）ジラジカル、
２〜６つのプロピレングリコール単位を含むポリ（プロピレングリコール）ジラジカル
から選択されるリンカーアームを表し、
Ｔは、
トリアゾールジラジカル
【化２０】
0006595460.tif 000021
チオ架橋‐Ｓ‐
から選択される連結基を表し、
Ｌ２は、以下の式に表される式‐Ｌ２１‐Ａｒ‐Ｌ２２‐に対応するリンカーアームを表す。
【化２１】
0006595460.tif 000022
式中、
Ｌ２１は、アミド架橋‐ＣＯ‐ＮＨ‐、エーテル架橋‐Ｏ‐、チオ架橋‐Ｓ‐、アミン架橋‐ＮＨ‐から選択される１個又は複数の基を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状Ｃ１‐Ｃ１２アルキルジラジカルを表し、
Ａｒは、必要に応じて１〜６個のヘテロ原子を含むＣ６‐Ｃ１８芳香族ジラジカルを表し、
Ｌ２２は共有結合を表すか、又は、Ｇａｌがガラクトピラノシル、１‐チオガラクトピラノシルを表す場合、Ｌ２２は‐ＣＨ２‐基であり得る。
【００３３】
好適な変形例によれば、Ｇａｌは、β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル基、又はβ‐Ｄ‐チオ‐１‐ガラクトピラノシル基を表す。Ｇａｌは、式（Ｉ）において、β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルを表すことが好ましい。
【００３４】
好適な変形例によれば、Ｔはトリアゾールジラジカルを表す。
【００３５】
トリアゾール基は非対称である。式（Ｉ）において、トリアゾール環の窒素原子はＬ１に結合することができ、炭素原子はＬ２に結合しているか、又は、窒素原子はＬ２に結合することができ、炭素原子はＬ１に結合している。
【００３６】
実験の部に開示されている分子に示されているように、結合は、次に示すものであることが好ましい。
【化２２】
0006595460.tif 000023
【００３７】
好適な変形例によれば、Ｌ１は、直鎖Ｃ２‐Ｃ６アルキル鎖、２，２‐ビス（メチルオキシメチル）エチル、２〜４つのエチレングリコール単位を含むポリ（エチレングリコール）ジラジカルから選択されるリンカーアームを表す。
【００３８】
好適な変形例によれば、Ｌ２１は、末端においてＡｒ基に結合している１個のアミド官能基‐ＣＯ‐ＮＨ‐を含むＣ１‐Ｃ１２直鎖アルキル鎖を表す。アミド結合を介する結合は、アルキル‐ＣＯ‐ＮＨ‐Ａｒ又はＡｒ‐ＣＯ‐ＮＨ‐アルキルであり得る。実験の部に示されているように、結合はアルキル‐ＣＯ‐ＮＨ‐Ａｒであることが好ましい。
【００３９】
好適な変形例によれば、ＡｒはＣ６‐Ｃ１２芳香族ジラジカルを表し、Ａｒは、フェニル、ナフタレニル、１，４‐ビフェニルから選択される基を表すことが好ましく、Ａｒはフェニルであり、１，４位において置換されていることが更に好ましい。
【００４０】
好適な変形例によれば、Ｌ２２は共有結合を表す。
【００４１】
第１の実施形態によれば、Ｋは式（ＫＩ）によって表される。本変形例によれば、Ｋは、次に示すＰｈｏ懸垂基を３、４又は５個含むことが好ましい。
【化２３】
0006595460.tif 000024
【００４２】
本変形例によれば、ｘは１であり、Ｋは、次に示すＰｈｏ懸垂基を３、４又は５個含むことが更により好ましい。
【化２４】
0006595460.tif 000025
【００４３】
Ｋ’は、直鎖、分岐又は環状アルカンポリラジカルを表し得る。Ｋ’は、直鎖、分岐又は環状アルカノール(alcanol)ポリラジカルを表し得る。また、Ｋ’は、直鎖、分岐又は環状炭水化物ポリラジカルも表し得る。
【００４４】
本変形例によれば、Ｋ’は、ピラノース及びフラノースから選択される炭水化物を表すことが有利である。本変形例によれば、Ｋ’は、マンノース、ガラクトース、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース及びラクトースから選択される炭水化物を表すことが更により好ましい。
【００４５】
別の実施形態によれば、Ｋは式（ＫＩＩ）によって表される。本変形例によれば、Ｋ”は、４〜１０個の炭素原子を含む、直鎖、分岐又は環状アルカンジイル基を表し、Ｐｈｏは、
【化２５】
0006595460.tif 000026
であることが好ましい。
【００４６】
本変形例によれば、Ｋ”は、１，４‐ジメチルシクロヘキシル、１，４‐ジエチルシクロヘキシルから選択される基を表すことが更により好ましい。
【００４７】
本発明の目的は、次の式（ＩＩ）に対応する分子によっても達成される。
【化２６】
0006595460.tif 000027
式中、
Ｋは、マンノース、ガラクトース、グルコース、アラビノース、キシロース、リボース及びラクトースからなる群より選択される炭水化物を表し、
Ｐｈｏは、
【化２７】
0006595460.tif 000028
からなる群より選択されるリン酸基(phosphorous group)を表す。
式中、ＸはＯ又はＳを表し、
リン酸基の１又は２個の酸素原子は、共有結合によってＬ１リンカーアームに結合しており、
Ｌ１は、
直鎖又は分岐Ｃ１‐Ｃ３アルキルジラジカル、直鎖、分岐又は環状Ｃ４‐Ｃ６アルキルジラジカル、１つ又は複数のエーテル架橋‐Ｏ‐を含む可能性がある、直鎖、分岐又は環状Ｃ７‐Ｃ１２アルキルジラジカル、
２、３、４、５又は６つのエチレングリコール単位を含むポリ（エチレングリコール）ジラジカル、
２、３、４、５又は６つのプロピレングリコール単位を含むポリピレングリコールジラジカル、
からなる群より選択されるリンカーアームを表す。
Ｔは、
トリアゾ−ルジラジカル
【化２８】
0006595460.tif 000029
からなる群より選択される連結基を表し、
Ｌ２は、
【化２９】
0006595460.tif 000030
（式中、ｎ及びｍは、１、２、３、４又は５から選択される整数を表す。）
からなる群より選択されるリンカーアームを表し、
Ａｒは、フェニル、ナフタレニル及び１，４‐ビフェニル
【化３０】
0006595460.tif 000031
からなる群より選択され、
Ｌ３はＯ、Ｓ又は‐ＣＨ２を表し、
Ｇａｌは、次式のβ‐Ｄ‐ガラクトピラノシル基を表す。
【化３１】
0006595460.tif 000032
【００４８】
‐Ｏ‐基はＬ３に相当することに留意する必要がある。
ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数である。
【００４９】
好適な変形例によれば、Ｋは、Ｄ‐マンノピラノシル形態下のマンノースを表す。
【００５０】
好適な変形例によれば、Ｌ１は、Ｐｒｏ（１，３‐ｎ‐プロピル）基、ＥＧ２Ｍ（ジエチレングリコールメチレン）、ＥＧ３Ｍ（トリエチレングリコールメチレン）、ＥＧ４Ｍ（テトラエチレングリコールメチレン）を表す。
【００５１】
好適な変形例によれば、Ａｒはフェニル基である。
【００５２】
好適な変形例によれば、ｚは３又は４である。
【００５３】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）に対応する好ましい分子を以下に挙げる。
（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）５
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｇａｌ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｇｌｃ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８
Ｍａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４

Ｍａｎ（ＰＳＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４

Ｍａｎ（ＰＳＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｓ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌ）５
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）３
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌ）５
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＣＨ２‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈ‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈ‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈ‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ３ＭＴｚＡｃＮＰｈ‐ＳＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ３ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ３ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ２ＭＴｚ ＡｃＮＰｈ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ３ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ３ＭＴｚ ＡｃＮＰｈ‐Ｇａｌ）４
Ｍａｎ（ＰＳＥＧ２ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ２ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
Ｍａｎ（ＥＧ２ＭＴｚｐｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＤＭＣＨＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＤＭＣＨＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＤＭＣＨＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＤＭＣＨＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＢｉｓｐｈｅ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＯＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＰｒｏＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＯＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＳＧａｌ）４
（ＤＭＣＨ‐ＰＳＤＭＣＨＭＴｚＰｒｏＮＣＯＮａｐｈｔ‐ＳＧａｌ）４
式中、ＤＭＣＨは１，４‐ジメチルシクロヘキシルを表し、Ｍａｎはマンノースを表し、Ｇｌｃはグルコースを表し、
Ｐｒｏは１，３‐ｎ‐プロピルを表し、Ｈｅｘは１，６‐ｎ‐ヘキシルを表し、ＴＨＭＥはトリス‐（ヒドロキシメチル）エタンを表し、
Ｔｚはトリアゾールを表し、
【化３２】
0006595460.tif 000033
ＰＮはホスホルアミダート結合を表し、
ＰＯはリン酸結合を表し、
ＰＳはホスホロチオアート結合を表し、
ＥＧ２はジエチレングリコールを表し、
ＥＧ３はトリエチレングリコールを表し、
ＥＧ４はテトラエチレングリコールを表し、
ＡｃＮＰｈｅは次式のアセトアミドフェニルを表し、
【化３３】
0006595460.tif 000034
Ｍはメチレンを表し、
‐Ｏ‐Ｇａｌはガラクトピラノシルを表し、
Ｓ‐Ｇａｌは１‐チオガラクトピラノシルを表し、
‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌは、１‐メチレンガラクトピラノシルを表し、
‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌは、１‐メチレンチオガラクトピラノシルを表し、
‐ＮＡｃ‐Ｇａｌは、１‐Ｎ‐アセチルガラクトピラノシルを表す。
【００５４】
直鎖（ＤＭＣＨ）糖鎖クラスターはホスホルアミダート結合（ＰＮ）、ホスホトリエステル結合（ＰＯ）又はチオノホスホトリエステル結合（ＰＳ）を有し、また、ヘキソースが中心にある糖鎖クラスター（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）は、リン酸結合（ＰＯ）又はチオリン酸(thionophosphate)結合（ＰＳ）を有する。
【００５５】
これらの分子の調製は、以下の実験の部に詳細に開示されている。
【００５６】
図６は、Ｋが式（ＫＩ）によって表されているコア構造である式（Ｉ）に対応する分子の調製スキームを示している。概略的に、ＯＨ官能化コアＫ’は、工程１）において、固体支持体
【化３４】
0006595460.tif 000035
上にグラフト化される。ただし、この工程は必須ではなく、合成は溶液中で達成することができる。その後、工程２）において、ＨＣ≡Ｃ官能化リンカーＬ１Ｐｈｏ基は、Ｋ’が有するヒドロキシル官能基にグラフト化される。図６にはＰｈｏ基ごとに１つのみのグラフトが示されているが、１又は２つのグラフトをＰｈｏ上で操作することができる。工程３）において、
【化３５】
0006595460.tif 000036
によってクリック化学反応が達成される。
式中、Ｇａｌ＊は、ＯＨ官能基上に保護基を有するＧａｌ残基を表す。詳細な操作方式は、図１及び実験の部に示されている。あるいは、保護基のないＧａｌ残基を用いることができる。トリアゾールＴｚは、次に示す置換基とのこの反応によって形成される。
【化３６】
0006595460.tif 000037
【００５７】
逆の置換は、Ｎ３とアルキン(alcyne)残基の反転によって行うことができる。
【００５８】
チオエーテル結合は、チオールをハロゲン（特に、臭素）と反応させて、公知の方法でＴｚを置換することにより得ることができる。
【００５９】
工程５）において、保護基は、存在する場合、Ｇａｌから除去され、必要に応じて、固体支持体との結合が切断される。
【００６０】
図７ａ及び７ｂは、Ｋが式（ＫＩＩ）によって表されている櫛状構造である式（Ｉ）に対応する分子の調製スキームを示している。
【００６１】
図７ａでは、概略的に、Ｈ‐ホスホネート断片Ｋ”を、工程１）において、固体支持体
【化３７】
0006595460.tif 000038
の末端基Ｅと反応させる。その後、工程２）において、Ｋ”の保護基Ｒ（ジメトキシトリチル）が除去される。工程３）において、第２のＨ‐ホスホネート断片Ｋ”を反応させ、工程４）において、Ｒ基が除去される。工程３）、４）は、所望の（ｍ）値を得るように繰り返される。工程５）において、ＨＣ≡Ｃ官能化リンカーＬ１がＰｈｏ基上にグラフト化され、リン酸塩がホスホルアミダートに変換される。工程６）において、
【化３８】
0006595460.tif 000039
によってクリック化学反応が達成される。
式中、Ｇａｌ＊は、ＯＨ官能基上に保護基を有するＧａｌ残基を表す。あるいは、保護基のないＧａｌ残基を用いることができる。トリアゾールＴｚは、次に示す置換基とのこの反応によって形成される。
【化３９】
0006595460.tif 000040
【００６２】
逆の置換は、Ｎ３とアルキン残基の反転によって行うことができる。
【００６３】
あるいは(alternately)、チオエーテル結合は、チオールをハロゲン（特に、臭素）と反応させて、公知の方法でＴｚを置換することにより得ることができる。
【００６４】
工程７）において、保護基は、存在する場合、Ｇａｌから除去され、固体支持体との結合が加水分解される。
【００６５】
変形例によれば、図７ｂに記載されているように、Ｋ”アルキン‐Ｌ１官能化ホスホラミダイトを用いて、固体支持体上で合成を達成することができる。工程１）において、Ｋ”アルキン誘導体を末端基固体支持体と反応させ、リン酸トリエステル又はチオリン酸トリエステルに酸化させる。工程２）において、Ｒ保護基は除去され、工程３）において、第２のＫ”アルキン誘導体を加えて酸化させ、工程４）でのＲ除去後、工程３）及び４）は、所望の（ｍ）値を得るように繰り返される。工程５）において、
【化４０】
0006595460.tif 000041
によってクリック化学反応が達成される。
式中、Ｇａｌ＊は、ＯＨ官能基上に保護基を有するＧａｌ残基を表す。あるいは、保護基のないＧａｌ残基を用いることができる。トリアゾールＴｚは、次に示す置換基とのこの反応によって形成される。
【化４１】
0006595460.tif 000042
【００６６】
逆の置換は、Ｎ３とアルキン残基の反転によって行うことができる。この場合、ブロモホスホラミダイト又はトシルホスホラミダイトが最初に調製され、次いで、アジド反応物による置換によってアジドホスホラミダイトに変換される。
【００６７】
あるいは、チオエーテル結合は、チオールをハロゲン（特に、臭素）と反応させて、公知の方法でＴｚを置換することにより得ることができる。
【００６８】
工程６）において、保護基は、（必要に応じて）Ｇａｌから除去され、固体支持体との結合が加水分解される。
【００６９】
好適な変形例によれば、固体支持体上で鎖の第１のＫ”基を先にグラフト化することによって、固体支持体上で合成を達成することができる。
【００７０】
本発明は、次の式（ＩＩ）に対応する分子も提供する。
【化４２】
0006595460.tif 000043
式中、
Ｋ、ｎ、Ｇａｌ、Ｔ、Ｌ１、Ｌ２は、上述したものと同じ意味を有し、ｙはマーカーを表す。マーカーは、例えば、ＤＮＡ配列又は蛍光色素であってもよい。
【００７１】
かかる分子は、試験目的、特に診断目的に用いることができる。
【００７２】
本発明の別の目的は、一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物、又は医薬として許容し得るその塩と、医薬として許容し得る担体及び／又は賦形剤と、を含む医薬組成物である。
【００７３】
かかる賦形剤は、技能を有する専門家に周知であり、投与形式に応じて、幾つかあるパラメータの中で特に適している。
【００７４】
かかる医薬組成物は、経口、局所、経皮、舌下、直腸下で、静脈内、筋肉内、腹腔内及び皮下経路を含む非経口経路で、治療される患者に適切な個々の用量により投与されるように製剤化されることが有利である。薬剤は、呼吸器官又は肺を介して投与されることが好ましい。
【００７５】
これらの化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）及びこれらを含む医薬組成物は、特に嚢胞性線維症患者、又は院内感染の犠牲者であることが多い呼吸補助下にある患者において、緑膿菌からの感染を治療又は予防するために、呼吸器官内に吸入又は滴下されるように製剤化される。
【００７６】
あるいは、化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）及びこれらを含む医薬組成物は、特に熱傷又は褥瘡において、緑膿菌からの感染を予防又は治療するために、手当用品又は包帯の中か又はこれらの下に局所的に用いることができる。
【００７７】
本発明に係る組成物は、固体、溶液、エマルジョン若しくは懸濁液を含む液体、又はゲル／クリームの形態であり、ヒトの医学において一般に用いられる医薬の形態、例えば、溶液、エマルジョン、素錠又は糖衣錠、ゼラチンカプセル、顆粒、坐剤、注入可能な製剤、軟膏、クリーム、ゲルにより提供することができ、これらは、通常の方法によって調製される。有効成分は、これらの医薬組成物に通常用いられる賦形剤、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、水性又は非水性ビヒクル、動物又は植物由来の脂肪性物質、パラフィン誘導体、グリコール、種々の湿潤剤、分散剤又は乳化剤、保存剤を用いて、組み込むことができる。
【００７８】
単回用量又は分割用量により投与される、本発明に係る使用における化合物の総一日量は、例えば、毎日体重１ ｋｇ当たり０．００１からおよそ１００ ｍｇの量であってもよい。
【００７９】
特定の患者に対する特定の用量レベルは、体重、健康状態、性別、食事、投与時間及び経路、腸吸収及び再吸収及び排泄のレベル、他の薬剤との併用、並びに治療される特定の症状の重症度を含む、種々の要因によって異なる。
【００８０】
化合物（Ｉ）又は（ＩＩ）及びこれらを含む医薬組成物は、微生物病原体による感染、具体的には、感染の第一段階においてレクチンを利用する病原菌による感染、より具体的には細菌である緑膿菌による感染を予防し、遅延させ、弱化させ、治療的処置をする抗菌剤として有用である。
【００８１】
本発明は、緑膿菌による毒性を予防し、遅延させ、弱化させ及び／又は阻害するのに用いる、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はこれを含む医薬組成物を対象とする。
【００８２】
具体的には、本発明は、細菌である緑膿菌によるバイオフィルムの形成を予防し、遅延させ、弱化させ及び／又は阻害するのに用いる、式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の化合物又はこれを含む医薬組成物を対象とする。
【００８３】
さらに、本発明は、一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物、又は医薬として許容し得るその塩と、医薬として許容し得る担体及び／又は賦形剤と、少なくとも１つ以上の他の抗菌剤、又は１つ以上の他の抗病原性剤、又は宿主の先天免疫を強化する１つ以上の薬剤と、を含む医薬組成物を対象とする。
【００８４】
より具体的には、本発明は、一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物、又は医薬として許容し得るその塩と、医薬として許容し得る担体及び／又は賦形剤と、少なくとも１つの抗生物質と、を含む医薬組成物を更に対象とする。
【００８５】
本発明の別の目的は、１つ以上の薬剤、より具体的には１つ以上の抗菌剤、又は１つ以上の病原性剤、又は宿主の先天免疫を強化する１つ以上の薬剤と共同による、ヒト又は動物の細菌感染の予防、遅延、弱化及び治療における化合物（Ｉ）の使用である。
【００８６】
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）の少なくとも１つの化合物を含む組成物は、緑膿菌を捕捉することが可能な材料に用いることができる。
【実施例】
【００８７】
実験
命名法：
実験の部に示されている糖鎖クラスターに用いられる命名法：糖鎖クラスターはそれぞれ、足場（Ｋ）と、第１のリンカー（Ｌ１）と、連結基（Ｔ）と、第２のリンカー（Ｌ２）と、ガラクトース誘導体（Ｇａｌ）：Ｋ‐（‐Ｌ１‐Ｔ‐Ｌ２‐Ｇａｌ）ｎと、から構成される。
【００８８】
用いられる足場は、ＤＭＣＨ（ジメチルシクロヘキサン）、Ｍａｎ（マンノース）、Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｌｃ（グルコース）又はｄＴ（チミジン）であり、
ＰＮはホスホルアミダート結合を表し、
ＰＯはリン酸結合を表し、
ＰＳはホスホロチオアート結合を表す。
Ｌ１：Ｐｒｏ（１，３‐ｎ‐プロピル）、Ｈｅｘ（１，６‐ヘキシル）、ＥＧ２Ｍ（ジエチレングリコールメチレン）、ＥＧ３Ｍ（トリエチレングリコールメチレン）、ＥＧ４Ｍ（テトラエチレングリコールメチレン）、ＴＨＭＥ（トリス‐（ヒドロキシメチル）エタン）、
Ｔ：トリアゾールＴｚ、
Ｌ２：Ｐｒｏ（１，３‐ｎ‐プロピル）、ＥＧ２（ジエチレングリコール）、ＥＧ３（トリエチレングリコール）、ＤＭＣＨ（１，４‐ジメチルシクロヘキサン）、ＡｃＮＰｈｅ（アセトアミドフェニル(acetamidephenyl)）、Ｍ（メチレン）、ＢｕＴ（Ｎ３‐ブチル‐チミン）。
‐Ｏ‐Ｇａｌはガラクトピラノシルを表し、
‐Ｓ‐Ｇａｌは１‐チオガラクトピラノシルを表し、
‐ＣＨ２‐Ｏ‐Ｇａｌは、１‐メチレンガラクトピラノシルを表し、
‐ＣＨ２‐Ｓ‐Ｇａｌは、１‐メチレンチオガラクトピラノシルを表し、
‐ＮＡｃ‐Ｇａｌは、１‐Ｎ‐アセチルガラクトピラノシルを表す。
【００８９】
直鎖（ＤＭＣＨ）糖鎖クラスターはホスホルアミダート結合（ＰＮ）、ホスホトリエステル結合（ＰＯ）又はチオノホスホトリエステル結合（ＰＳ）を有し、また、ヘキソースが中心にある糖鎖クラスター（Ｍａｎ、Ｇａｌ、Ｇｌｃ）は、リン酸結合（ＰＯ）又はチオリン酸結合（ＰＳ）を有する。
【００９０】
Ｉ‐実験‐一般的手順
ホスホラミダイト１(Meyer, A. et al., (2010) J. Org. Chem. 75, 6689-6692)、２(Lietard, J. et al., (2008) J. Org. Chem. 73, 191-200; Lietard, J. et al., Meyer, A., Vasseur, J. J., and Morvan, F. (2007) Tetrahedron Lett. 48, 8795-8798)、１ａ及び１ｄ(Gerland, B. et al., (2012) Bioconjugate Chem. 23, 1534-1547)、並びに、１ｅ(Ligeour, C. et al., (2012) Eur. J. Org. Chem., 1851-1856)と、アジド固体支持体５(Pourceau, G. et al., (2009) J. Org. Chem. 74, 6837-6842)の合成は、過去に報告されている。炭水化物誘導体３(Hasegawa, T. et al., (2007) Org. Biomol. Chem. 5 (15), 2404-2412)、４ａ(Joosten, J. A. F. et al., (2004) J. Med. Chem. 47, 6499-6508)、４ｂ(Szurmai, Z. et al., (1989) Acta Chimica Hungarica-Models in Chemistry 126, 259-269)、４ｃ(Pourceau, G. et al., (2009) J. Org. Chem. 74, 1218-1222)、４ｄ(Cecioni, S. et al., (2012) Chem. Eur. J. 18, 6250-6263)、４ｅ(Szurmai, Z. et al., (1989))、６(Hasegawa, T., et al. (2007))、１‐プロパギル‐Ｏ‐ガラクトピラノース及びグルコピラノース(Mereyala, H. B., and Gurrala, S. R. (1998) Carbohydr. Res. 307, 351-354)は、文献に従って調製した。
【００９１】
３，６，９，１２‐テトラオキサ‐ペンタデカン‐１４‐イン‐１‐イル ２‐シアノエチルＮ，Ｎ‐ジイソプロピルホスホラミダイト(3,6,9,12-Tetraoxa-pentadecan-14-yn-1-yl 2-cyanoethyl N,N-diisopropyl phosphoramidite)1c：２‐シアノエチル‐Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（７２０ ｍｇ、３．０ ｍｍｏｌ）を、３，６，９，１２‐テトラオキサ‐ペンタデカン‐１４‐イン‐１‐オール（６００ ｍｇ、２．６ ｍｍｏｌ）の溶液、３Å分子ふるい、及び無水ジクロロメタン（４０ ｍＬ）中Ｎ，Ｎ’‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（１．３ ｍＬ、７．４ ｍｍｏｌ）に加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、２ ｍＬのＨ２Ｏを加えた後、この溶液を蒸発させた。乾燥した残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３％トリエチルアミンを含むシクロヘキサン中８０％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、透明な油として表題化合物１ｃ（９０１ ｍｇ、８１％）を得た。Ｒｆ：０．９（ＥｔＯＡｃ）。1H NMR 13C NMR 31P NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
【００９２】
（２’，３’，４’，６’‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐チミン２０：
Ｎ，Ｏ‐ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）（１．５ ｍＬ、６．１ ｍｍｏｌ）を、チミン（３２７ ｍｇ、２．６ ｍｍｏｌ）の懸濁液、及びジクロロエタン（２５ ｍＬ）中ガラクトースペンタ‐Ｏ‐アセテート（１．０９ｇ、２．５６ ｍｍｏｌ）に加えた。この混合物を、アルゴン下、常温で２０分間撹拌した。ＴＭＳＯＴｆ（２．２ ｍＬ、１２．１ ｍｍｏｌ）を加えた後、この反応混合物を還流下で２時間３０分加熱した。得られた混合物を常温まで冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させ油を得て、これを酢酸エチル（１００ ｍＬ）中で希釈し、ＮａＨＣＯ３（１００ ｍＬ）の飽和水溶液及びブライン（１００ ｍＬで２回）によって洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させた後、ろ過し濃縮し、得られた油をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン、８：２、ｖ／ｖ）によって精製し、白い泡としての所望の化合物２０（７８２ ｍｇ、６７％）を得た。1H NMR 13C NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
【００９３】
１‐（２’，３’，４’，６’‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐３‐（４‐ブロモブチル）チミン２１：
無水ジメチルホルムアミド（４ ｍＬ）中（２’，３’，４’，６’‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐チミン２０（３５０ ｍｇ、０．７７ ｍｍｏｌ）の溶液を、炭酸カリウム（３１８ ｍｇ、２．３０ ｍｍｏｌ）とともに、５分間撹拌した。次いで、１，４‐ジブロモブタン（９１９ μＬ、７．７０ ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を、還流下で４時間及び７０℃で一晩煮沸させた。その後、反応混合物を濃縮し油を得て、これをジクロロメタン（２０ ｍＬ）中で希釈し、ＮａＨＣＯ３（２０ ｍＬ）の飽和水溶液及びブライン（２０ ｍＬで２回）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／シクロヘキサン、４：６）によって精製し、淡黄色の泡として所望の化合物２１（２７０ ｍｇ、５９％）を得た。1H NMR  13C NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
【００９４】
１‐（２’，３’，４’，６’‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐３‐（４‐アジドブチル）チミン４ｆ：
無水ジメチルホルムアミド（３ ｍＬ）中化合物２１（２３１ ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液を、アジ化ナトリウム（２０３ ｍｇ、３．１２ ｍｍｏｌ）とともに、１００℃で２４時間撹拌した。ジクロロメタン（１０ ｍＬ）を加えた後、この反応物をブライン（２０ ｍＬで３回）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し濃縮し、無色の油として所望の生成物（２１４ ｍｇ、９９％）を得た。1H NMR 13C NMR及びHR-ESI-QToF MSが、その構造と一致している。
【００９５】
Ｃｕ（Ｉ）触媒アルキンアジド１，３‐双極環状付加による１‐Ｏ‐プロパルギルヘキソースのアジド固体支持体５への固定。１‐Ｏ‐プロパルギルヘキソース（α‐マンノース６、β‐ガラクトース、β‐グルコース）（１００ ｍＭ、１７５ μＬ）の水溶液、ＣｕＳＯ４の新たに調製した水溶液（１００ ｍＭ、１４ μＬ）及びアスコルビン酸ナトリウムの新たに調製した水溶液（５００ ｍＭ、１４ μＬ）、水（１４７ μＬ）、並びにＭｅＯＨ（３５０ μＬ）を、３．５ μｍｏｌのアジド固体支持体５に加えた。得られた混合物を、マイクロ波シンセサイザーによって６０℃で４５分間（予備混合時間：３０秒）、封管中で処理した。内部赤外線プローブによって温度をモニタリングした。溶液を除去し、ＣＰＧビーズを、Ｈ２Ｏ（２ ｍＬで３回）、ＭｅＯＨ（２ ｍＬで３回）及びＣＨ３ＣＮ（２ ｍＬで３回）によって洗浄し、乾燥させ、固体支持ヘキソースを得た。
【００９６】
ヘキソースヒドロキシルへのアルキニルホスホラミダイト又はブロモヘキシルホスホラミダイト導入の一般的手順。固体支持ヘキソース誘導体（１ μｍｏｌ規模）を、ホスホラミダイト化学作用によってＤＮＡシンセサイザーで、アルキニルホスホラミダイト又は６‐ブロモヘキシルホスホラミダイト２とともに処理した。カップリング工程及び酸化工程のみを実行した。カップリング工程では、ベンジルメルカプトテトラゾールを活性剤（無水ＣＨ３ＣＮ中０．３Ｍ）として用い、ホスホラミダイト１、２又は１ａ〜ｅ（無水ＣＨ３ＣＮ中０．２Ｍ）を、１８０秒のカップリング時間により３回（１２０ μｍｏｌ）導入した。市販ヨウ化物溶液（０．１Ｍ Ｉ２、ＴＨＦ／ピリジン／水９０：５：５）とともに１５秒間、酸化を実行した。
【００９７】
アジド化の一般的手順。テトラブロモヘキシルヘキソース（１ μｍｏｌ）を有する固体支持オリゴヌクレオチドを、ＴＭＧＮ３（３１．６ ｍｇ、２００当量）の溶液、ＤＭＦ（１ ｍＬ）中ＮａＩ（３０ ｍｇ、２００当量）によって、６５℃で１時間処理した。ビーズを、ＤＭＦ（２ ｍＬで３回）、Ｈ２Ｏ（２ ｍＬで３回）及びＣＨ３ＣＮ（２ ｍＬで３回）によって洗浄した後、アルゴンにより洗い流して乾燥させた。
【００９８】
ＤＮＡ配列の伸長及びＣｙ３による標識の一般的手順。ＤＮＡ配列を、標準ホスホラミダイト化学作用によって、ＤＮＡシンセサイザー(ABI 394)で、固体支持足場上で１ μｍｏｌ規模により合成した。カップリング工程では、活性剤としてベンジルメルカプトテトラゾール（無水ＣＨ３ＣＮ中０．３Ｍ）を用い、市販ヌクレオシドホスホラミダイト（無水ＣＨ３ＣＮ中０．０９Ｍ）を、２０秒のカップリング時間により導入し、また、Ｃｙ３アミダイト（無水ＣＨ３ＣＮ中０．０６Ｍ）を１８０秒のカップリング時間により導入した。市販溶液（キャップＡ：Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＴＨＦ、１０：１０：８０、及びキャップＢ：ＴＨＦ中１０％ Ｎ‐メチルイミダゾール）を用いて、無水酢酸とともに、キャッピング工程を１５秒間実行した。酸化をそれぞれ１５秒間実行した。ＣＨ２Ｃｌ２中２．５％ ＤＣＡとともに３５秒間、脱トリチル化を実行した。
【００９９】
固体支持オリゴヌクレオチド脱保護の一般的手順。修飾オリゴヌクレオチドを有するＣＰＧビーズを４ ｍＬのスクリュートップバイアルに移し、２ ｍＬの濃アンモニア水によって室温で１５時間処理し、５５℃まで２時間加温した。それぞれの化合物について、上清を回収し、蒸発させて乾燥させた。残渣を水中に溶解した。
【０１００】
水素ホスホネート(hydrogenophosphonate)化学作用による伸長の一般的手順
１，３‐プロパンジオール固体支持体（１ μｍｏｌ）から開始するＨ‐ホスホネート化学作用サイクルを用い、ＤＮＡシンセサイザー(ABI 394)で伸長を実行した。ＣＨ２Ｃｌ２中２．５％ ＤＣＡとともに３５秒間、脱トリチル化工程を実行した。次いで、ジメタノールシクロヘキサン（ＤＭＣＨ）Ｈ‐ホスホネートモノエステル９(Bouillon et al. (2006), J. Org. Chem. 71, 4700-4702)、又は市販チミジンＨ‐ホスホネートモノエステル（無水ＣＨ３ＣＮ／Ｃ５Ｈ５Ｎ １：１ ｖ／ｖ中６０ ｍＭ）、及び活性剤としての塩化ピバロイル（無水ＣＨ３ＣＮ／Ｃ５Ｈ５Ｎ １：１ ｖ／ｖ中２００ ｍＭ）を、カラムに６回又は５秒間（３０モル過剰）通した。必要に応じてサイクルを繰り返し、２〜５つのＤＭＣＨモチーフ又は４つのｄＴモチーフを有する所望の足場を得た。
【０１０１】
アミド化的酸化(amidative oxidation)の一般的手順
２つのシリンジを用いて、ＣＣｌ４／Ｃ５Ｈ５Ｎ（１：１ ｖ／ｖ）中１０％プロパルギルアミンの溶液２ ｍＬにより３０分間、固体支持Ｈ‐ホスホネートジエステル足場（１ μｍｏｌ）を端から端まで処理した。ＣＰＧビーズを、Ｃ５Ｈ５Ｎ（２ ｍＬで２回）及びＣＨ３ＣＮ（２ ｍＬで３回）によって洗浄し、次いで、アルゴンにより洗い流して乾燥させた。その後、上述したようにホスホラミダイト化学作用によって、オリゴヌクレオチドの伸長及びＣｙ３による標識を実行した。
【０１０２】
ＣｕＡＡＣ反応の一般的手順
アジドＤ‐ガラクトース誘導体４ａ〜ｆ導入の手順：５’‐蛍光‐３’‐アルキンオリゴヌクレオチド（１００ μＬのＨ２Ｏ中１００ ｎｍｏｌ）の溶液に、アジドガラクトース(azid galacose)４ａ〜ｆ（アルキン官能基当たり３当量、ＭｅＯＨ中１００ ｍＭ）、１ ｍｇのＣｕ（０）ナノ粉末、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．７）（２５ μＬ）、水及びＭｅＯＨを加え、２５０ μＬの最終量（水ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）を得た。得られた調製物を収容したチューブを密封し、Biotage社製のマイクロ波シンセサイザーイニシエーターに６０℃で６０分間（３０秒間の予備混合時間）置いた。
【０１０３】
１‐Ｏ‐プロパルギル‐Ｄ‐ガラクトース３導入の手順：５’‐蛍光‐３’‐ヘキソースが中心にあるテトラアジドヘキシルオリゴヌクレオチド（１００ μＬのＨ２Ｏ中１００ ｎｍｏｌ）の溶液に、１‐Ｏ‐プロパルギル２，３，４‐トリ‐Ｏ‐アセチル‐Ｄ‐ガラクトース３（アジド官能基当たり５当量、ＭｅＯＨ中１００ ｍＭ）、１ ｍｇのＣｕ（０）ナノ粉末、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．７）（２５ μＬ）、水及びＭｅＯＨを加え、２５０ μＬの最終量（水ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）を得た。得られた調製物を収容したチューブを密封し、油浴中に入れ、６０℃で６０分間磁気撹拌した。
【０１０４】
１‐（４‐ニトロ‐ベンジル）‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド８：窒素雰囲気下、０℃で、三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート（１．５ ｍＬ、１２ ｍｍｏｌ）を、β‐Ｄ‐ガラクトースペンタアセテート（１．５６１ｇ、４ ｍｍｏｌ）の溶液、及び２０ ｍＬ ＣＨ２Ｃｌ２中ｐ‐ニトロベンジルアルコール（１．２２５ｇ、８ ｍｍｏｌ）に滴下して加えた。数分後、この混合物を加熱して還流し、７時間撹拌し続けた。次いで、この反応物を水によってクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２によって抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２層を回収し、Ｎａ２ＳＯ４によって乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中０〜１５％のＡｃＯＥｔ）によって精製し、白色の固体としての生成物（１．１４８ｇ、５９％）を得た。Ｒｆ＝０．３６（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.21 (d, J = 8.9 Hz, 2H, H-10, H-12), 7.47 (d, J = 8.9 Hz, 2H, H-9, H-13), 5.42 (dd, J = 3.4 and 0.8 Hz, 1H, H-4), 5.32 (dd, J = 10.5 and 7.9 Hz, 1H, H-2), 5.04 (dd, J = 10.5 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 5.02-4.72 (2xd, J = 13.2 Hz, 2H, H-7), 4.60 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 4.21 (dd, J = 11.2 and 6.5 Hz, 1H, H-6), 4.15 (dd, J = 11.2 and 6.5 Hz, 1H, H-6), 3.94 (dt, J = 0.8 and 6.5 Hz, 1H, H-5), 2.17 (s, 3H, CH3CO), 2.06 (s, 6H, 2xCH3CO), 1.99 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.3, 170.2, 169.5 (4 x CO-Ac), 147.7 (C-11), 144.6 (C-8), 127.7 (C-9), 123.8 (C-10), 100.8 (C-1), 71.1 (C-5), 70.9 (C-3), 69.6 (C-7), 68.9 (C-2), 67.1 (C-4), 61.4 (C-6), 20.9, 20.8, 20.8, 20.7(4 x CH3-Ac). HRMS (ESI+) : calculated for C21H25NO12Na [M + Na]+ 506.1274, found 506.1282. [α]D20 = -19.1° (c 0.9, MeOH)。
【０１０５】
水素化分解の一般的手順（方法Ａ）。化合物８又は９１、２又は１０３、４を蒸留ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、これに、炭（１０％ ｗ／ｗ）上にある１０％パラジウムを加えた。ＴＬＣで判断されるように、出発物質が消失するまで、反応混合物に水素ガスをバブリングした。反応混合物をセライトパッド上でろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２によって洗浄した。粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物を得た。
【０１０６】
４‐ブロモアセトアミド‐アリール‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド合成の一般的手順（方法Ｂ）。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２中化合物１１又は１２（１当量）の溶液を、アルゴンにより洗い流し、０℃まで冷却し、Ｅｔ３Ｎ（１．４当量）を加えた。ブロモアセチルブロミド（１．３当量）を滴下して加え、この混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物を室温まで１時間加温した。ＣＨ２Ｃｌ２中粗混合物を、１Ｎ ＨＣｌ（２５ ｍＬで２回）、水（２５ ｍＬで２回）及びブライン（２５ ｍＬ）によって洗浄した。乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２を完全に除去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物を得た。
【０１０７】
４‐アジドアセトアミド(azidooacetamido)‐アリール‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド合成の一般的手順（方法Ｃ）。化合物１４、１５又は１６（１当量）の溶液及び無水ＣＨ３ＣＮ中ＴＭＧＮ３（３当量）を、マイクロ波支援下、８０℃で１５分間撹拌した。減圧下で濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物を得た。
【０１０８】
炭水化物脱アセチル化の一般的手順（方法Ｄ）。アセチル化されたグリコシド（４‐（アジドアセトアミド）フェニル‐β‐Ｄ‐ガラクトシド、５、１７〜１９及び２８〜２９）を、ＭｅＯＨ又は１，４‐ジオキサン中に懸濁させ、３０％アンモニア溶液を加えた（１：１、ｖ／ｖ）。この混合物を、アルゴン下、室温で６時間から１日撹拌した。減圧下で溶媒を蒸発させ、所望の生成物を得た。
【０１０９】
グリコシド化の一般的手順（方法Ｅ）。０℃で、化合物７（１当量）、２２又は２３（２当量）の溶液、及びＣＨ２Ｃｌ２中テトラブチルアンモニウム水素スルファート（１当量）に、１ＭのＮａＯＨ水溶液を加えた。二相混合物を室温で３６時間撹拌し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２によって希釈し、１Ｍ ＮａＯＨ（３０ ｍＬで２回）によって洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物を得た。
【０１１０】
ビアリールガラクトピラノシドアジド化の一般的手順（方法Ｆ）。化合物２６又は２７（１当量）を無水ＤＭＦ中に溶解し、続いて、１‐エチル‐３‐（３’‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（１．６当量）、及びヒドロキシベンゾトリアゾール（１．１当量）を加えた。３‐アジドプロピルアミン（２当量）を加え、この反応物を室温で１２時間撹拌した。反応物を濃縮した後、水によってクエンチし、ＤＣＭによって抽出した。有機層を硫酸ナトリウムによって乾燥させ、濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物を得た。
【０１１１】
１‐（４‐アミノ‐ベンジル）‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１１。白色の固体として（４１２ ｍｇ、４５％）次の方法Ａにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（３０ ｍＬ）中化合物８（９６８ ｍｇ、２．００ ｍｍｏｌ）、１０％のＰｄ／Ｃ（９６．８ ｍｇ）。この混合物を後処理し、水層をＣＨ２Ｃｌ２によって抽出し、粗生成物をシリカゲル（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５％のＭｅＯＨ）上で精製し、純粋な生成物を得た。Ｒｆ＝０．４３（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、６：４、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.02 (d, J = 8.1 Hz, 2H, H-10, H-12), 6.60 (d, J = 8.1, 2H, H-9, H-13), 5.32 (d, J = 3.3 Hz, 1H, H-4), 5.18 (dd, J = 10.4 and 8.3 Hz, 1H, H-2), 4.91 (dd, J = 10.4, 3.3, 1H, H-3), 4.71-4.46 (2xd, J = 11.9, 2H, H-7), 4.42 (d, J =7.9, 2H, H-1), 4.15 (dd, J = 11.2 and 6.5 Hz, 1H, H-6), 4.10 (dd, J = 11.2 and 6.5 Hz, 1H, H-6), 3.81 (t, J = 6.5, 1H, H-5), 2.09 (s, 3H, CH3CO), 2.01 (s, 3H, CH3CO), 1.94 (s, 3H, CH3CO), 1.91 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.4, 170.2, 169.5 (4 CO Ac), 146.6 (C-11), 129.8 (C-8), 126.3 (C-9), 115.0 (C-10), 99.2 (C-1), 71.1 (C-5), 70.8 (C-3), 70.7 (C-7), 69.0 (C-2), 67.3 (C-4), 61.5 (C-6), 20.8, 20.8, 20.7, 20.6 (4 CH3CO). HRMS (ESI+) : calculated for C21H28NO10 [M + H]+454.1713, found 454.1718. [α]D20 = -25.0° (c 0.4, MeOH)。
【０１１２】
４‐アミノ‐ベンジル‐１‐チオ‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１２。無色の油として（３１４ ｍｇ、７９％）次の方法Ａにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（１５ ｍＬ）中化合物９（４２５ ｍｇ、０．８５１ ｍｍｏｌ）、１０％のＰｄ／Ｃ（４２．５ ｍｇ）。この混合物を後処理し、水層をＣＨ２Ｃｌ２によって抽出し、粗生成物をシリカゲル（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５％のＭｅＯＨ）上で精製し、純粋な生成物を得た。Ｒｆ＝０．２６（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、６：４、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.08 (d, J = 8.1 Hz, 2H, H-9, H-13), 6.63 (d, J = 8.1 Hz, 2H, H-10, H-12), 5.40 (d, J = 3.3 Hz, 1H, H-4), 5.26 (t, J = 9.9 Hz, 1H, H2), 4.96 (dd, J = 9.9 and 3.3 Hz, 1H, H-3), 4.27 (d, J = 9.9 Hz, 1H, H-1), 4.17 (dd, J = 11.3 and 6.6 Hz, 1H, H-6), 4.11 (dd, J = 11.3 and 6.6 Hz, 1H, H-6), 3.86 (d, J = 12.9 Hz, 1H, H-7), 3.81 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-5), 3.75 (d, J = 12.9 Hz, 1H, H-7), 2.14 (s, 3H, CH3CO), 2.06 (s, 3H, CH3CO), 2.01 (s, 3H, CH3CO), 1.96 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.4, 170.2, 169.7 (4 CO Ac), 145.8 (C-11), 130.3 (C-9), 126.5 (C-8), 115.3 (C-10), 82.5 (C-1), 74.5 (C-5), 72.0 (C-3), 67.5 (C-4), 67.3 (C-2), 61.8 (C-6), 33.7 (7), 20.9, 20.8, 20.8, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated for C21H28NO9S [M + H]+ 470.1485, found 470.1489. [α]D20 = -73.8° (c 1.0, MeOH)
【０１１３】
４‐ブロモアセトアミドベンジル‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１４。淡黄色の油として（２３８ ｍｇ、７９％）次の方法Ｂにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（３０ ｍＬ）中化合物１１（２３９ ｍｇ、０．５２７ ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（０．１０３ ｍＬ、０．７３８ ｍｍｏｌ）、ブロモアセチルブロミド（０．０５９ ｍＬ、０．６８５ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜６０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３１（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、６：４、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.23 (s, 1H, H-14), 7.51 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-10, H-12), 7.26 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-9, H-13), 5.37 (dd, J = 3.4 and 0.9 Hz, 1H, H-4), 5.25 (dd, J = 10.4 and 7.9 Hz, 1H, H-2), 4.97 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 4.85-4.59 (2xd, J = 12.2 Hz, 2H, H-7), 4.50 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 4.19 (dd, J = 11.2 and 6.5 Hz, 1H, H-6), 4.13 (dd, J = 11.2 and 6.5 Hz, 1H, H-6), 3.99 (s, 2H, H-16), 3.88 (dt, J = 0.9 and 6.5 Hz, 1H, H-5), 2.13 (s, 3H, CH3CO), 2.04 (s, 3H, CH3CO), 2.00 (s, 3H, CH3CO), 1.96 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm : 170.6, 170.4, 170.3, 169.6 (4 x CO-Ac), 163.8 (C-15), 137.0 (C-11), 133.7 (C-8), 128.7 (C-9), 120.2 (C-10), 100.0 (C-1), 71.1 (C-3), 71.0 (C-5), 70.4 (C-7), 69.0 (C-2), 67.3 (C-4), 61.5 (C-6), 29.6 (C-16), 20.9, 20.8, 20.8, 20.7 (4 x CH3-Ac). HRMS (ESI+): calculated for C23H29BrNO11 [M + H]+ 574.0924, found 574.0933. [α]D20 = -13.1° (c 2.6, MeOH)。
【０１１４】
４‐ブロモアセトアミドベンジル‐１‐チオ‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１５：黄色の油として（３６７ ｍｇ、９３％）次の方法Ｂにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（１０ ｍＬ）中化合物１２（３１４ ｍｇ、０．６６９ ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（０．１３０ ｍＬ、０．９３７ ｍｍｏｌ）、ブロモアセチルブロミド（０．０７５ ｍＬ、０．８６９ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜４０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．２８（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.23 (s, 1H, H-14), 7.47 (d, J = 8.5 Hz, 2H, H-10, H-12), 7.26 (d, J = 8.5 Hz, 2H, H-9, H-13), 5.37 (dd, J = 3.3 and 0.8 Hz, 1H, H-4), 5.23 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H-2), 4.94 (dd, J = 10.0 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 4.25 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H-1), 4.12 (dd, J = 11.4 and 6.7 Hz, 1H, H-6), 4.05 (dd, J = 11.4 and 6.4 Hz, 1H, H-6), 3.98 (s, 2H, H-16), 3.90, 3.81 (2 x d, J = 13.0 Hz, each 1H, H-7), 3.78 (m, 1H, H-5), 2.12 (s, 3H, CH3CO), 2.03 (s, 3H, CH3CO), 1.99 (s, 3H, CH3CO), 1.93 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.6, 170.4, 170.2, 169.8 (4 CO Ac), 163.74 (C-15), 136.4 (C-11), 133.9 (C-8), 130.0 (C-9), 120.3 (C-10), 82.6 (C-1), 74.6 (C-5), 72.0 (C-3), 67.5 (C-4), 67.3 (C-2), 61.7 (C-6), 33.4 (C-7), 29.6 (C-16), 20.9, 20.8, 20.8, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated for C23H29NO10BrS [M + H]+ 590.0696, found 590.0688. [α]D20 = -56.7° (c 2.0, MeOH)。
【０１１５】
４‐ブロモアセトアミドフェニル‐１‐チオ‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１６：無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ ｍＬ）中化合物１０（４９７ ｍｇ、１．０２ ｍｍｏｌ）の溶液を脱気し、次いで、１０％のＰｄ／Ｃ（４９．７ ｍｇ）を加えた。この溶液を水素雰囲気に供し、室温で３日間撹拌した。出発物質が完全に消失した後、化合物１３の混合物をアルゴンにより洗い流し、０℃まで冷却し、Ｅｔ３Ｎ（０．０４３ ｍＬ、０．３０８ ｍｍｏｌ）を加えた。ブロモアセチルブロミド（０．０２５ ｍＬ、０．２８６ ｍｍｏｌ）を滴下して加え、この混合物を０℃で１時間撹拌した。混合物を室温まで１時間加温し、次いで、セライトのプラグを通してろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２によって洗浄した。粗混合物を、１Ｎ ＨＣｌ（２５ ｍＬで２回）、水（２５ ｍＬで２回）及びブライン（２５ ｍＬ）によって洗浄した。乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２を完全に除去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中０〜３０％のＡｃＯＥｔ）によって精製し、黄色の油としての生成物（全５０５．６ ｍｇ、８６％）を得た。Ｒｆ＝０．３３（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、６：４、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.15 (s, 1H, H-13), 7.52 (m, 2H, H-9, H-11), 7.51 (m, 2H, H-8, H-12), 5.40 (dd, J = 3.3 and 0.8 Hz, 1H, H-4), 5.19 (t, J = 9.9 Hz, 1H, H-2), 5.04 (dd, J = 9.9 and 3.3 Hz, 1H, H-3), 4.65 (d, J = 9.9 Hz, 1H, H-1), 4.17 (dd, J = 11.4 and 6.9 Hz, 1H, H-6), 4.11 (dd, J = 11.4 and 6.9 Hz, 1H, H-6), 4.01 (s, 2H, H-15), 3.91 (dt, J = 0.8 and 6.9 Hz 1H, H-5), 2.11 (s, 3H, CH3CO), 2.09 (s, 3H, CH3CO), 2.05 (s, 3H, CH3CO), 1.96 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.3, 170.2, 169.5 (4 CO Ac), 163.5 (C-14), 137.4 (C-10), 134.3 (C-8), 128.2 (C-7), 120.3 (C-9), 86.7 (C-1), 74.7 (C-5), 72.1 (C-3), 67.4 (C-4), 61.7 (C-6), 29.5 (C-15), 21.0, 20.8, 20.8, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated forC22H26NO10NaSBr [M + Na]+ 598.0358, found 598.0360. [α]D20 = -13.0° (c 2.2, MeOH)
【０１１６】
４‐アジドアセトアミドベンジル‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１７。白色の固体として（１４８ ｍｇ、９４％）次の方法Ｃにより得られた。無水ＣＨ３ＣＮ（４ ｍＬ）中化合物１４（１６８ ｍｇ、０．２９２ ｍｍｏｌ）、ＴＭＧＮ３（１３８．６ ｍｇ、０．８７６ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜４０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．２８（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.05 (s, 1H, H-14), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H-10, H-12), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H-9, H-13), 5.35 (d, J = 3.4 Hz, 1H, H-4), 5.23 (dd, J = 10.4 and 7.9 Hz, 1H, H-2), 4.95 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 4.83 (d, J = 12.2 Hz, 1H, H-7), 4.57 (d, J = 12.2 Hz, 1H, H-7), 4.48 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 4.17 (dd, J = 11.2 and 6.4 Hz, 1H, H-6), 4.13 (dd, J = 11.2 and 6.4 Hz, 1H, H-6), 4.10 (s, 2H, H-16), 3.85 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-5), 2.12 (s, 3H, CH3CO), 2.03 (s, 3H, CH3CO), 1.98 (s, 3H, CH3CO), 1.94 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.4, 170.3, 170.1, 169.4 (4 CO Ac), 164.6 (C-15), 136.6 (C-11), 133.4 (C-8), 128.6 (C-9), 120.0 (C-10), 99.8 (C-1)), 70.9 (C-3), 70.8 (C-5), 70.2 (C-7), 68.9 (C-2), 67.1 (C-4), 61.3 (C-6), 53.0 (C-16), 20.8, 20.7, 20.7, 20.6 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated for C23H29N4O11 [M + H]+ 537.1833, found 537.1840. [α]D20 = -18.0° (c 1.0, MeOH)。
【０１１７】
４‐アジドアセトアミドベンジル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド３。HRMS (ESI+): calculated for C15H21N4O7 [M + H]+ 369.1410, found 369.1411。
【０１１８】
４‐アジドアセトアミドベンジル‐１‐チオ‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド１８。淡褐色の結晶として（９９ ｍｇ、９４％）次の方法Ｃにより得られた。無水ＣＨ３ＣＮ（５ ｍＬ）中化合物１５（１１２ ｍｇ、０．１９０ ｍｍｏｌ）、ＴＭＧＮ３（９０．２ ｍｇ、０．５７０ ｍｍｏｌ）により開始する。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜４０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．２６（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.20 (s, 1H, H-14), 7.50 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-10, H-12), 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-9, H-13), 5.39 (d, J = 3.3 Hz, 1H, H-4), 5.25 (t, J = 10.0 Hz, 1H, H2), 4.96 (dd, J = 10.0 and 3.3 Hz, 1H, H-3), 4.28 (d, J = 10.0 Hz, 1H, H-1), 4.13 (dd, J = 11.4 and 6.7 Hz, 1H, H-6), 4.10 (s, 2H, H-16), 4.07 (dd, J = 11.4 and 6.7 Hz, 1H, H-6), 3.92, 3.81 (2xd, J = 13.0 Hz, each 1H, H-7), 3.80 (d, J = 6.7 Hz, 1H, H-5), 2.14 (s, 3H, CH3CO), 2.05 (s, 3H, CH3CO), 2.01 (s, 3H, CH3CO), 1.95 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.4, 170.3, 170.1, 169.7 (4CO Ac), 164.9 (C-15), 136.1 (C-11), 133.6 (C-8), 129.8 (C-9), 120.2 (C-10), 82.4 (C-1), 74.4 (C-5), 71.2 (C-3), 67.4 (C-4), 67.09 (C-2), 61.6 (C-6), 52.90 (C-16), 33.3 (C-7), 20.8, 20.7, 20.7, 20.6 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated for C23H29N4O10S [M + H]+ 553.1604, found 553.1621. [α]D20 = -53.4° (c 1.0, MeOH)。
【０１１９】
４‐アジドアセトアミドベンジル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド４。HRMS (ESI+): calculated for C15H21N4O6S [M + H]+ 385.1182, found 385.1185。
【０１２０】
４‐アジドアセトアミドフェニル‐１‐チオ‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド（１９）。無色の油として（５６ ｍｇ、５５％）次の方法Ｃにより得られた。無水ＣＨ３ＣＮ（４ ｍＬ）中化合物１６（１０９ ｍｇ、０．１８９ ｍｍｏｌ）、ＴＭＧＮ３（８９．７ ｍｇ、０．５６７ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜４０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．２８（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、６：４、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.08 (s, 1H, H-13), 7.51 (m, 2H, H-9, H-11), 7.49 (m, 2H, H-8, H-12), 5.39 (dd, J = 3.3 and 0.9 Hz, 1H, H-4), 5.18 (t, J = 9.9 Hz, 1H, H-2), 5.03 (dd, J = 9.9 and 3.3 Hz, 1H, H-3), 4.64 (d, J = 9.9 Hz, 1H, H-1), 4.16 (dd, J = 11.4 and 6.9 Hz, 1H, H-6), 4.13 (s, 2H, H-15), 4.09 (dd, J = 11.4 and 6.9 Hz, 1H, H-6), 3.90 (dt, J = 0.8 and 6.69 Hz, 1H, H-5), 2.10 (s, 3H, CH3CO), 2.08 (s, 3H, CH3CO), 2.03 (s, 3H, CH3CO), 1.95 (s, 3H, CH3CO). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.3, 170.1, 169.5 (4 CO Ac), 164.7 (C-14), 137.3 (C-10), 134.2 (C-8), 128.0 (C-7), 120.4 (C-9), 86.7 (C-1), 74.6 (C-5), 72.1 (C-3), 67.4 (C-4), 61.7 (C-6), 53.08 (C-15), 20.9, 20.8, 20.7, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated for C22H27N4O10S [M + H]+ 539.1448, found 539.1450. [α]D20 = -12.3° (c 1.3, MeOH)。
【０１２１】
４‐アジドアセトアミドフェニル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド２。HRMS (ESI+): calculated for C14H19N4O6S [M + H]+ 371.1025, found 371.1031。
【０１２２】
４’‐（２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐ビフェニル‐４‐カルボン酸ベンジル２４。白色の固体として（２．１８９ｇ、９９％）次の方法Ｅにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（１５ ｍＬ）、１ＭのＮａＯＨ水溶液（５ ｍＬ）中化合物７（１．４３９ｇ、３．５ ｍｍｏｌ）、４’‐ヒドロキシ‐ビフェニル‐４‐カルボン酸ベンジル２２６（２．４６４ｇ、７．０５ ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウム水素スルファート（１．１８８ｇ、３．５ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜３０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３９（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.13 (d, J = 8.5 Hz, 2H, H-13, H-15), 7.60 (d, J = 8.5 Hz, 2H, H-12, H-16), 7.56 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H-9, H-17), 7.46 (d, J = 7.2 Hz, 2H, H-22, H-26), 7.40 (t, J = 7.2 Hz, 2H, H-23, H-25), 7.34 (t, J = 7.2 Hz, 1H, H-24), 7.10 (d, J = 8.8 Hz, 2H, H-8, H-18), 5.52 (dd, J = 10.4 and 8.0 Hz, 1H, H-2), 5.48 (dd, J = 3.4 and 0.8 Hz, 1H, H-4), 5.39 (s, 2H, H-20), 5.14 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 5.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.25 (dd, J = 11.2 and 7.0 Hz, 1H, H-6), 4.18 (dd, J = 11.2 and 6.4 Hz, 1H, H-6), 4.09 (ddd, J = 7.0 and 6.4 and 0.8 Hz, 1H, H-5), 2.19 (s, 3H, COCH3), 2.08 (s, 3H, COCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 2.02 (s, 3H, COCH3). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm:170.4, 170.3, 170.2, 169.5 (4 CO Ac), 166.4 (C-19), 157.2 (C-7), 145.1 (C-11), 136.3 (C-21), 135.3 (C-10), 130.4 (C-13), 128.9 (C-14), 128.7 (C-23), 128.6 (C-9), 128.4 (C-24), 128.3 (C-22), 126.9 (C-12), 117.5 (C-8), 99.7 (C-1), 71.3 (C-5), 71.0 (C-3), 68.8 (C-2), 67.0 (C-4), 66.8 (C-20), 61.5 (C-6), 20.9, 20.8, 20.7, 20.6 (4 CH3CO). HRMS (ESI+) : calculated for C34H34O12Na [M + Na]+ 657.1948, found 657.1948. [α]D20 = +6.0° (c 1.2, 1,4-dioxane)。
【０１２３】
４’‐（２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐ビフェニル‐４‐カルボン酸２６。白色の固体として（６９１ ｍｇ、３７％）次の方法Ａにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（３０ ｍＬ）中化合物２４（２．１８９ｇ、３．４５ ｍｍｏｌ）、１０％のＰｄ／Ｃ（２１９ ｍｇ）。この混合物を後処理し、水層をＣＨ２Ｃｌ２によって抽出し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜５０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．４４（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、１：９、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.17 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-13, H-15), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-12, H-16), 7.58 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-9, H-17), 7.11 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-8, H-18), 5.53 (dd, J = 10.4 and 7.9 Hz, 1H, H-2), 5.48 (d, J = 3.4 Hz, 1H, H-4), 5.15 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 5.12 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 4.26 (dd, J = 11.4 and 7.0 Hz, 1H, H-6), 4.19 (dd, J = 11.4 and 6.4 Hz, 1H, H-6), 4.11 (m, 1H, H-5), 2.20 (s, 3H, COCH3), 2.09 (s, 3H, COCH3), 2.08 (s, 3H, COCH3), 2.03 (s, 3H, COCH3). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 171.3 (C-19), 170.5, 170.4, 170.3, 169.5 (4 CO Ac), 157.3 (C-7), 145.8 (C-11), 135.2 (C-10), 131.0 (C-13), 128.7 (C-9), 127.9 (C-14), 127.0 (C-12), 117.5 (C-8), 99.7 (C-1), 71.3 (C-5), 71.0 (C-3), 68.8 (C-2), 67.0 (C-4), 61.5 (C-6), 20.9, 20.8, 20.7, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+) : calculated for C27H28O12Na [M + Na]+ 567.1478, found 567.1489. [α]D20 = +6.6° (c 1.1, 1,4-dioxane)。
【０１２４】
４’‐（２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐ビフェニル‐４‐カルボン酸ベンジル３‐アジド‐プロピル‐アミド(Benzyl 4’-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)-biphenyl-4-carboxylic acid 3-azido-propyl-amide)２８。白色の固体として（４７ ｍｇ、７４％）次の方法Ｆにより得られた。無水ＤＭＦ（５ ｍＬ）中化合物２６（１３１ ｍｇ、０．１０２ ｍｍｏｌ）、１‐エチル‐３‐（３’‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２５．３ ｍｇ、０．１６３ ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（１５．１ ｍｇ、０．１１２ ｍｍｏｌ）、３‐アジドプロピルアミン（２０．４ ｍｇ、０．２０４ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜５０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３４（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、２：９８、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.81 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H-13, H-15), 7.58 (d, J = 8.2 Hz, 2H, H-12, H-16), 7.52 (d, J = 8.6 Hz, 2H, H-9, H-17), 7.06 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-8, H-18), 6.46 (t, J = 5.7 Hz, 1H, H-20), 5.49 (dd, J = 10.4 and 8.0 Hz, 1H, H-2), 5.45 (d, J = 3.4 Hz, 1H, H-4), 5.11 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 5.08 (d, J = 8.0, 1H, H-1), 4.22 (dd, J = 11.3 and 6.7 Hz, 1H, H-6), 4.15 (dd, J = 11.3 and 6.7 Hz, 1H, H-6), 4.08 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-5), 3.56 (q, J = 6.4 Hz, 2H, H-21), 3.44 (t, J = 6.4 Hz, 2H, H-23), 2.17 (s, 3H, COCH3), 2.06 (s, 3H, COCH3), 2.04 (s, 3H, COCH3), 2.00 (s, 3H, COCH3), 1.91 (p, J = 6.4 Hz, 2H, H-22). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.3, 170.2, 169.5(4 CO Ac), 167.4 (C-19), 157.1 (C-7), 143.6 (C-11), 135.3 (C-10), 133.0 (C-14), 128.5 (C-9), 127.6 (C-13), 127.1 (C-12), 117.4 (C-8), 99.7 (C-1), 71.2 (C-5), 70.9 (C-3), 68.8 (C-2), 67.0 (C-4), 61.5 (C-6), 49.8 (C-23), 38.0 (C-21), 28.9 (C-22), 20.9, 20.8, 20.8, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+): calculated for C30H35N4O11 [M + H]+ 627.2302, found 627.2304. [α]D20 = +3.8° (c 3.2, 1,4-dioxane)
【０１２５】
４’‐（β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐ビフェニル‐４‐カルボン酸ベンジル３‐アジドプロピル‐アミド(Benzyl 4’-(β-D-galactopyranosyloxy)-biphenyl-4-carboxylic acid 3-azidopropyl-amide)５。HRMS (ESI+) : calculated for C22H27N4O7 [M + H]+ 459.1880, found 459.1884。
【０１２６】
ベンジル‐６‐ヒドロキシ‐２‐ナフトアート２３：９０％水性メタノール（２０ ｍＬ）中６‐ヒドロキシ‐２‐ナフトエ酸（１．８８２ｇ、１０ ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（１．６２９ｇ、５ ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで、トルエン（１０ ｍＬで２回）によって共蒸発させた。得られたセシウム塩を無水ＤＭＦ（１０ ｍＬ）中に懸濁させ、０℃まで冷却し、ベンジルブロミド（１．１９ ｍＬ、１０ ｍｍｏｌ）を加えた。１時間撹拌した後、溶液を室温まで加温し、撹拌を更に１０時間続けた後、溶媒を減圧下で除去した。残渣に水（２０ ｍＬで２回）を吸収させた後、ＡｃＯＥｔ（２００ ｍＬ）によって抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中０〜３０％のＡｃＯＥｔ）によって精製し、白色の固体として生成物（２．０９５ｇ、７５％）を得た。Ｒｆ＝０．４７（シクロヘキサン／ＡｃＯＥｔ、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.57 (d, J = 1.7 Hz, 1H, H-5), 8.05 (dd, J = 8.6 and 1.7 Hz, 1H, H-7), 7.85 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-4), 7.69 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H-8), 7.50 (d, J = 7.3 Hz, 1H, H-14), 7.42 (t, J = 7.3 Hz, 1H, H-15), 7.36 (t, J = 7.3 Hz, 1H, H-16), 7.18 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 8.8 and 2.4 Hz, 1H, H-3), 5.63 (s, 1H, OH), 5.43 (s, 2H, H-12). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm : 167.1 (C-11), 155.9 (C-2), 137.4 (C-9), 136.3 (C-13), 131.7 (C-4), 131.4 (C-5), 128.8 (C-15), 128.4 (C-16), 128.4 (C-14), 128.0 (C-11), 126.7 (C-8), 126.2 (C-7), 125.2 (C-16), 118.9 (C-3), 109.7 (C-1), 67.1 (C-12). HRMS (ESI+) :calcd. for C18H15O3 [M + H]+ 279.1021; found 279.1024。
【０１２７】
ベンジル‐６‐（２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐２‐ナフトアート２５。白色の固体として（１．２３９ ｍｇ、７７％）次の方法Ｅにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（１５ ｍＬ）、１ＭのＮａＯＨ水溶液（５ ｍＬ）中化合物７（１．０８２ｇ、２．６３ ｍｍｏｌ）、化合物２３（１．４６４ｇ、５．２６ ｍｍｏｌ）、テトラブチルアンモニウム水素スルファート（０．８２３ｇ、２．６３ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜３０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３８（ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン、１：１、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm:8.59 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-12), 8.09 (dd, J = 8.7 and 1.6 Hz, 1H, H-10), 7.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-13), 7.76 (d, J = 8.7 Hz, 1H, H-9), 7.49 (d, J = 7.2 Hz, 2H, H-20, H-24), 7.41 (t, J = 7.2 Hz, 2H, H-21, H-23), 7.37 (d, J = 2.4, 1H, H-8), 7.36 (m, 1H, H-22), 7.24 (dd, J = 8.8 and 2.4 Hz, 1H, H-14), 5.56 (dd, J = 10.4 and 7.9, 1H, H-2), 5.50 (dd, J = 3.4 and 0.8 Hz, 1H, H-4), 5.42 (s, 2H, H-18), 5.24 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 5.17 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 4.27 (dd, J = 11.1 and 6.8 Hz, 2H, H-6), 4.18-4.15 (m, 1H, H-5), 2.20 (s, 3H, COCH3), 2.08 (s, 3H, COCH3), 2.07 (s, 3H, COCH3), 2.03 (s, 3H, COCH3). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 170.5, 170.4, 170.3, 169.6 (4 CO Ac), 166.70 (C-17), 156.7 (C-7), 136.9 (C-15), 136.3 (C-19), 131.5 (C-13), 131.2 (C-12), 129.3 (C-16), 128.9 (C-21), 128.50 (C-20), 127.5 (C-9), 126.6 (C-10), 126.5 (C-11), 119.8 (C-14), 111.2 (C-8), 99.5 (C-1), 71.5 (C-5), 71.0 (C-3), 68.9 (C-2), 67.1 (C-4), 67.1 (C-18), 61.8 (C-6), 20.9, 20.9, 20.9, 20.8 (4 CH3 CO). HRMS (ESI+) : calculated for C32H32O12Na [M + Na]+ 631.1791, found 631.1788. [α]D20 = -11.2° (c 1.1, MeOH)
【０１２８】
６‐（２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐２‐ナフトエ酸２７。白色の固体として（８０６ ｍｇ、７６％）次の方法Ａにより得られた。蒸留ＣＨ２Ｃｌ２（１５ ｍＬ）中化合物２５（１．２３９ｇ、２．０４ ｍｍｏｌ）、１０％のＰｄ／Ｃ（１２４ ｍｇ）。この混合物を後処理し、水層をＣＨ２Ｃｌ２によって抽出し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜５０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．４４（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、６：９４、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 8.66 (d, J = 1.6 Hz, 1H, H-12), 8.11 (dd, J = 8.6 and 1.6 Hz, 1H, H-10), 7.93 (d, J = 9.0 Hz, 1H, H-13), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H-9), 7.39 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-8), 7.27 (dd, J = 9.0 and 2.4 Hz, 1H, H-14), 5.57 (dd, J = 10.4 and 7.9 Hz, 1H, H-2), 5.51 (d, J = 3.5 Hz, 1H, H-4), 5.26 (d, J = 7.8 Hz, 1H, H-1), 5.18 (dd, J = 10.4 and 3.5 Hz, 1H, H-3), 4.30-4.19 (m, 2H, H-6), 4.19-4.17 (m, 1H, H-5), 2.20 (s, 3H, COCH3), 2.09 (s, 3H, COCH3), 2.08 (s, 3H, COCH3), 2.04 (s, 3H, COCH3). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm: 171.6 (C-17), 170.6, 170.4, 170.3, 169.6 (4 CO Ac), 157.0 (C-7), 137.3 (C-15), 132.14 (C-12), 131.7 (C-13), 129.3 (C-16), 127.6 (C-9), 126.6 (C-10), 125.6 (C-11), 119.9 (C-14), 111.2 (C-8), 99.5 (C-1), 71.6 (C-5), 71.1 (C-3), 68.9 (C-2), 67.2 (C-4), 61.8 (C-6), 21.0, 20.9, 20.9, 20.8 (4 CH3CO). HRMS (ESI-) : calculated for C25H25O12 [M - H]- 517.1346, found 517.1344. [α]D20 = -6.4° (c 1.1, MeOH)
【０１２９】
６‐（２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐２‐ナフトエ酸３‐アジド‐プロピル‐アミド(6-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosyloxy)-2-naphthoic acid 3-azido-propyl-amide)２９。白色の固体として（１８２ ｍｇ、７９％）次の方法Ｆにより得られた。無水ＤＭＦ（５ ｍＬ）中化合物２７（２００ ｍｇ、０．３８６ ｍｍｏｌ）、１‐エチル‐３‐（３’‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（９６ ｍｇ、０．６１８ ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（５７．４ ｍｇ、０．４２５ ｍｍｏｌ）、３‐アジドプロピルアミン（７７．３ ｍｇ、０．７７２ ｍｍｏｌ）。この混合物を後処理し、粗生成物をシリカゲル（シクロヘキサン中０〜５０％のＡｃＯＥｔ）上で精製し、所望の生成物を得た。Ｒｆ＝０．３２（ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２、２：９８、ｖ／ｖ）。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ ppm: 7.83 (d, J = 9.0 Hz, 1H, H-13), 7.80 (dd, J = 8.5 and 1.5 Hz, 1H, H-10), 7.76 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-9), 7.33 (d, J = 2.4 Hz, 1H, H-8), 7.22 (dd, J = 9.0 and 2.4 Hz, 1H, H-14), 6.52 (t, J = 5.7 Hz, 1H, NH), 5.53 (dd, J = 10.4 and 7.9 Hz, 1H, H-2), 5.47 (dd, J = 3.4 and 0.8 Hz, 1H, H-4), 5.19 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 5.13 (dd, J = 10.4 and 3.4 Hz, 1H, H-3), 4.24 (dd, J = 11.2 and 7.1 Hz, 1H, H-6), 4.16 (dd, J = 11.2 and 6.0 Hz, 1H, H-6), 4.14 (dd, J = 6.0 and 0.8 Hz, 1H, H-5), 3.59 (quad, J = 6.1 Hz, 2H, H-19), 3.46 (t, J = 6.1 Hz, 2H, H-21), 2.17 (s, 3H, COCH3), 2.05 (s, 3H, COCH3), 2.05 (s, 3H, COCH3), 2.01 (s, 3H, COCH3), 1.93 (p, J = 6.1 Hz, 2H, H-20). 13C NMR (151 MHz, CDCl3) δ ppm:170.5, 170.4, 170.3, 169.5 (5 CO ester), 167.6 (C-17), 156.1 (C-7), 135.9 (C-15), 130.9 (C-13), 130.7 (C-11), 129.4 (C-16), 127.7 (C-9), 127.4 (C-12), 124.5 (C-10), 119.9 (C-14), 111.1 (C-8), 99.5 (C-1), 71.4 (C-5), 71.0 (C-3), 68.8 (C-2), 67.0 (C-4), 61.6 (C-6), 49.8 (C-21), 38.1 (C-19), 29.0 (C-20), 20.9, 20.8, 20.8, 20.7 (4 CH3CO). HRMS (ESI+) : calculated for C28H33N4O11 [M + H]+ 601.2146, found 601.2150. [α]D20 = -7.0° (c 1.1, MeOH)
【０１３０】
６‐（β‐Ｄ‐ガラクトピラノシルオキシ）‐２‐ナフトエ酸３‐アジド‐プロピル‐アミド６。HRMS (ESI+) : calculated for C20H25N4O7 [M + H]+ 433.1723, found 433.1722。
【０１３１】
Ｏ‐２‐シアノエチル‐Ｏ’‐（３，６，９‐トリオキサドデカン‐１１‐イニル）‐Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルホスホラミダイト３３。
４Å分子ふるいの存在下及びアルゴン下で、乾燥ジクロロメタン（２０ ｍＬ）中３，６，９‐トリオキサドデカン‐１１‐イン‐１‐オール３１（３７６ ｍｇ、２ ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（５２０ μｌ、３ ｍｍｏｌ）を加え、次いで、Ｏ‐（２‐シアノエチル）‐Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル‐クロロホスホラミダイト（４８０ μｌ、２ ｍｍｏｌ）を滴下して加えた。室温で２時間撹拌した後、１ ｍＬの水を加えた。１０分後、溶液をジクロロメタン（４０ ｍＬ）によって希釈した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（７５ ｍＬ）によって洗浄した。有機層をジクロロメタン（１００ ｍＬで２回）によって抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、減圧下で蒸発させ乾燥させた。粗生成物をシリカゲル、４％ Ｅｔ３Ｎを含むシクロヘキサン中０〜５０％酢酸エチル上でクロマトグラフィーにかけ、無色のシロップとして５６３ ｍｇ、７３％の化合物３３を得た。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５５シクロ／ＡｃＯＥｔ／Ｅｔ３Ｎ ５：４：１、ｖ／ｖ／ｖ。1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.14 (dd, 12H, J = 6.8 Hz, Isopropyl), 2.36 (t, 1H, J = 2.4 Hz, -CCH), 2.59 (t, 2H, J = 6.5 Hz, -CH2-CN), 3.5-3.81 (m, 16H, -CH-, -O-CH2-CH2-O-, -O-CH2-P), 4.14 (d, 2H, J = 2.5 Hz, HCC-CH2). 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz): δ18.17, 18.26, 22.4, 22.4, 22.5, 22.6, 40.9, 41, 56.3, 56.5, 60.4, 60.6, 67, 68.3, 68.5, 68.6, 69, 69.2, 72.4, 77.5, 115.6. 31P-NMR (CDCl3, 121 MHz): δ148.67 ppm. HRMS TOF-ES positive mode calculated for C18H36N2O6P [M+H2O+H]+ 407.2311 found 407.2270。
【０１３２】
マンノースが中心にある芳香族ガラクトシドオリゴヌクレオチド複合体の合成
Ｃｕ（Ｉ）触媒アルキンアジド１，３‐双極環状付加によるプロパルギルマンノシドのアジド固体支持体３５への固定。プロパルギルα‐マンノピラノシド３４７（１００ ｍＭ、１７５ μＬ）の水溶液、ＣｕＳＯ４の新たに調製した水溶液（１００ ｍＭ、１４ μＬ）及びアスコルビン酸ナトリウムの新たに調製した水溶液（５００ ｍＭ、１４ μＬ）、水（１４７ μＬ）、並びにＭｅＯＨ（３５０ μＬ）を、３．５ μｍｏｌのアジド固体支持体３５．８に加えた。得られた混合物を、マイクロ波シンセサイザー（monowave 300、Anton Paar社製）を用いて６０℃で４５分間、封管中で加熱した。内部赤外線プローブによって温度をモニタリングした。溶液を除去し、ＣＰＧビーズを、Ｈ２Ｏ（２ ｍＬで３回）、ＭｅＯＨ（２ ｍＬで３回）及びＣＨ３ＣＮ（２ ｍＬで３回）によって洗浄し、乾燥させ、固体支持マンノシド３６を得た。
【０１３３】
マンノースヒドロキシルへのアルキニルホスホラミダイト導入の一般的手順。固体支持マンノシド３６（１ μｍｏｌ規模）を、ホスホラミダイト化学作用によってＤＮＡシンセサイザー(ABI 394)で、アルキニルホスホラミダイト３２９又は３３とともに処理した。カップリング工程及び酸化工程のみを実行した。カップリング工程では、ベンジルメルカプトテトラゾール（ＢＭＴ）を活性剤（無水ＣＨ３ＣＮ中０．３Ｍ）として用い、ホスホラミダイト×１又は×２（無水ＣＨ３ＣＮ中０．２Ｍ）を、１８０秒のカップリング時間（１８０秒で３回）により３回（４０ μｍｏｌで３回）導入した。市販ヨウ化物溶液（０．１Ｍ Ｉ２、ＴＨＦ／ピリジン／水９０：５：５）とともに１５秒間酸化を実行し、ホスホトリエステル(phophostriester)を形成し、又は３Ｈ‐１，２‐ベンゾジチオール‐３‐オン‐１，１‐ジオキシド（乾燥アセトニトリル中０．０５Ｍ Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）１０とともに６０秒間酸化を実行し、チオノホスホトリエステルを形成した。
【０１３４】
ＤＮＡ配列の伸長及びＣｙ３による標識の一般的手順。ＤＮＡ配列を、標準ホスホラミダイト化学作用によって、ＤＮＡシンセサイザー(ABI 394)で、固体支持テトラアルキニル足場上で１ μｍｏｌ規模により合成した。カップリング工程では、活性剤としてＢＭＴ（無水ＣＨ３ＣＮ中０．３Ｍ）を用い、市販ヌクレオシドホスホラミダイト（無水ＣＨ３ＣＮ中０．０７５Ｍ）を、２０秒のカップリング時間により導入し、また、Ｃｙ３アミダイト（無水ＣＨ３ＣＮ中０．０６７Ｍ）を１８０秒のカップリング時間により導入した。市販溶液（キャップＡ：Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＴＨＦ、１０：１０：８０、及びキャップＢ：ＴＨＦ中１０％ Ｎ‐メチルイミダゾール）を用いて、無水酢酸とともに、キャッピング工程を１５秒間実行した。０．１Ｍ Ｉ２、ＴＨＦ／ピリジン／水９０：５：５を用いて、酸化を１５秒間実行した。ＣＨ２Ｃｌ２中２．５％ ＤＣＡとともに３５秒間、脱トリチル化を実行した。
【０１３５】
固体支持オリゴヌクレオチド脱保護の一般的手順。修飾オリゴヌクレオチドを有するＣＰＧビーズを４ ｍＬのスクリュートップバイアルに移し、２ ｍＬの濃アンモニア水によって室温で１５時間処理し、５５℃まで２時間加温した。それぞれの化合物について、上清を回収し、蒸発させて乾燥させた。後の分析及び特性評価のために、残渣を水中に溶解した。
【０１３６】
ＣｕＡＡＣ反応の一般的手順
アジド官能化Ｄ‐ガラクトシド誘導体１〜６導入の手順：５’‐蛍光‐３’‐アルキンオリゴヌクレオチド（１００ μＬのＨ２Ｏ中１００ ｎｍｏｌ）の溶液に、アジド官能化ガラクトシド１〜６（アルキン官能基当たり３当量、ＭｅＯＨ中１００ ｍＭ）、〜０．１ ｍｇのＣｕ（０）ナノ粉末、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．７）（２５ μＬ）、水及びＭｅＯＨを加え、２５０ μＬの最終量（水ＭｅＯＨ、１：１、ｖ／ｖ）を得た。得られた調製物を収容したチューブを密封し、Anton Paar社製のマイクロ波シンセサイザーMonowave 300に６０℃で６０分間置いた。
【０１３７】
ＣｕＡＡＣ反応及びＨＰＬＣ精製の後処理
ＥＤＴＡ（４００ μＬ）を混合物に加え、遠心分離後、上清を回収しＣｕ（０）を除去し、ＮＡＰ１０上でサイズ排除クロマトグラフィーによって脱塩した。蒸発後、５’‐蛍光‐３’‐アセチル擬似糖質オリゴヌクレオチドを水中に溶解し、逆相分取ＨＰＬＣによって精製した。濃アンモニア水（３ ｍＬ）によって室温で２時間純粋な化合物を処理し、アセチル基を除去し、蒸発させ乾燥させた（純度９７％超）。ＴＥＡＡｃ緩衝液（ｐＨ７）中８％〜３２％のアセトニトリル直線勾配を用いる逆相分取ＨＰＬＣによって、２０分間、最終化合物を再度精製した。後の分析のために残渣を水中に溶解した。
【０１３８】
ＤＤＩマイクロアレイの作製
微細構造スライドの作製：微細構造スライドは、４０平方ウェル（３ ｍｍの幅、６０±１ μｍの深さ、それぞれのマイクロリアクター間で４．５ ｍｍの間隔）が特徴である。フォトリソグラフィ及びウェットエッチング法によって、マイクロリアクターを平らなガラススライド上に作製した。これらの方法は、他に詳述されている(Mazurczyk, R. et al., (2008) Sens. Actuators, B 128, 552-559; Vieillard, J. et al., (2007) J. Chromatogr. B 845, 218-225)。
【０１３９】
ガラススライドのシラン化：Dugasら((2003) J. Colloid Interface Sci. 264, 354-36; (2004) Sens. Actuators, B 101, 112-121; (2004) Sens. Actuators, B 101, 112-121)によって開発されたプロトコールに従って、スライドを次のように官能化した。ピラニア処理後、スライドを、１５０℃で２時間、乾燥窒素下で加熱した。次に、乾燥ペンタン及びｔｅｒｔ‐ブチル‐１１‐（ジメチルアミノ）シリルウンデカノアートを室温で加えた。２時間のインキュベーション後、ペンタンを蒸発させ、スライドを１５０℃で一晩加熱した。ＴＨＦ中で洗浄し水中で洗い流した後、官能化されたスライドを得た。室温で７時間、ギ酸を用いて、エステル官能基を対応する酸に変換させた。酸基を有するスライドを、乾燥ＴＨＦ中Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（０．１Ｍ）及びジ（イソプロピル）カルボジイミド（０．１Ｍ）とのアミンカップリングのために、室温で一晩活性化させた。そして、スライドを、ＴＨＦ及びジクロロメタン中で、超音波下で１０分間洗い流した。
【０１４０】
アミノ修飾オリゴヌクレオチドの固定：４つのアミノ修飾オリゴヌクレオチドをEurogentec社から購入した。スポット形成ロボット、Scienion社製sciFLEX ARRAYER s3を用いるそれぞれの反応器の底部における２５ μＭ ＰＢＳ１０Ｘ （ｐＨ８．５）の対応するオリゴヌクレオチドによる０．３ ｎＬのスポット形成（１ウェル当たり６４スポット）。置換反応を室温で一晩、水飽和雰囲気下で実行し、次いで、水を徐々に蒸発させた。ＳＤＳ０．１％によって７０℃で３０分間、そして脱イオン水によって簡単にスライドの洗浄を実行した。
【０１４１】
【表１】
0006595460.tif 000044
表１：ＤＮＡアンカープラットフォーム作製に用いられるＤＮＡ配列の主な特性。ＧＣ％及びＴｍは、オンラインソフトウェアDINAMeltウェブサーバ(http://mfold.rna.albany.edu/?q=DINAMelt/Two-state-melting)によってＰＢＳ１Ｘ中［Ｎａ＋］＝１３７ ｍＭ、［ＣＺｉｐ］＝１ μＭ及びＴ＝３７℃で算出した。
【数１】
0006595460.tif 000045
【０１４２】
ブロッキング工程：ハイブリダイゼーション工程時に非特異的吸着を防ぐために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によってすべてのスライドをブロッキングした。ブロッキングを、３７℃で２時間、ＰＢＳ１Ｘ（ｐＨ７．４）中ＢＳＡの４％溶液によって実行した。ＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ０．０５％中で３分３回、続いてＰＢＳ１Ｘ中で３分３回の洗浄工程を実行し、そして、ガラスを脱イオン水によって洗い流した後、遠心分離によって乾燥させた。
【０１４３】
擬似糖質のハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション工程：ＤＮＡタグを有するそれぞれの複合糖質の２μＬ溶液を、ＰＢＳ１Ｘ（ｐＨ７．４）中１ μＭで、対応するウェルの底部に入れ、水蒸気飽和室内で、室温で一晩ハイブリダイゼーションさせた。試料を塩水‐クエン酸ナトリウム中で２回（ＳＳＣ２Ｘ）、ＳＤＳ０．１％中で、５１℃で１分間洗浄し、続いて、ＳＳＣ２Ｘ中で、室温で更に５分間洗浄し、そして、脱イオン水によって洗い流した後、遠心分離によって乾燥させた。
【０１４４】
ブロッキング工程：ハイブリダイゼーション後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によってすべてのスライドを再度ブロッキングした。ブロッキングを、３７℃で１時間、ＰＢＳ１Ｘ（ｐＨ７．４）中ＢＳＡの４％溶液によって実行した。洗浄工程：ＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ０．０５％中で３分３回、続いてＰＢＳ１Ｘ中で３分３回実行し、脱イオン水によって簡単に洗い流した後、遠心分離によって乾燥させた。
【０１４５】
レクチン標識
ＰＡ‐ＩＬレクチンのAlexa 647標識：ＰＡ‐ＩＬレクチンを、Invitrogen社製のAlexa Fluor（登録商標）647マイクロスケールタンパク質標識キット(A30009)によって標識した。要約すると、１ ｍｇ／ｍｌのＰＡ‐ＩＬ溶液（ＭＷ：５１ ｋＤａ、ＰＡ‐ＩＬは、Anne Imberty博士(CERMAV、グルノーブル(Grenoble))により快く提供された。）をＰＢＳ１Ｘ（ｐＨ７．４）中で希釈し、この１００ μｌを、１０ μＬの１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．３）と混合した。７．９４ ｎｍｏｌ／μＬの反応性色素溶液の適切な量を、ｐＨ調整タンパク質を収容した反応チューブに移した。反応混合物を室温で１５分間混合した後、スピンカラム（ゲル樹脂容器）上で精製し、反応しない色素から標識されたタンパク質を分離した。
【０１４６】
レクチン濃度及びレクチンに対する色素の比率を、２８１ ｎｍ及び６５０ ｎｍの吸光度を読み取るSafas Monaco UV mc2分光光度計を組み合わせたトレイセル(tray cell)システムを用い、吸光度によって推定した。ＰＡ‐ＩＬの濃度は、四量体ＰＡ‐ＩＬに対する色素の標識度０．２０により、１３．５３ μΜと推定された。
【０１４７】
「オンチップ」生物学的認識によるＩＣ５０の決定
インキュベーション溶液の調製：レクチンＰＡ‐ＩＬ（最終濃度０．１２ μＭ）、ＢＳＡ（最終濃度２％）及びＣａＣｌ２（最終濃度１ μｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳ１Ｘ（ｐＨ＝７．４）中で希釈した。それぞれのマイクロチューブ内に、所望の最終濃度（０；１．１０−５；１．１０−４；５．１０−４；１．１０−３；５．１０−３；１．１０−２；５．１０−２；０．１；１；５；１０；５０；１０２；５．１０２；１０３；５．１０３；１０４；１０５；３．１０５）の阻害剤ラクトース乳糖を加えた。
【０１４８】
マイクロリアクターにおける複合糖質‐レクチン複合体のインキュベーション：それぞれの溶液の２ μＬを対応するマイクロウェルに入れ、スライドを水蒸気飽和室内で、３７℃で３時間インキュベートした。洗浄工程：ＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ０．０２％で、４℃で５分、次いで、脱イオン水中で簡単に実行した後、遠心分離によって乾燥させた。
【０１４９】
蛍光走査：マイクロアレイスキャナ、GenePix 4100Aソフトウェアパッケージ（Axon Instruments社製；λｅｘ ５３２／６３５ ｎｍ及びλｅｍ ５７５／６７０ ｎｍ）によって、スライドを５３２ ｎｍ、次いで６３５ ｎｍで走査した。６４のスポットの中間蛍光シグナルの平均値として、それぞれの複合体の蛍光シグナルを決定した。
【０１５０】
「BioDataFit 1.02プログラム」を用いてＩＣ５０値を決定した。選択されたモデルは、次式の「シグモイド(Sigmoidal)」であった。
Y=a+(b-a)/[1+10^(x-c)]
式中、a=FImin、b=FImax、x=log[PA-IL]及びc=log(IC50)。FImin/maxは、擬似ガラクトにおいてみられる最小／最大Alexa-647蛍光シグナルである。
【０１５１】
ＩＩ‐糖鎖クラスター１７ａ〜ｅ及び１８の合成、及びＰＡ‐ＩＬに対するこれらの結合効率の決定：
ＩＩ‐Ａ  合成：
マンノースが中心にある糖鎖クラスター１７ａ〜ｅ及び１８を合成し、ＰＡ‐ＩＬへの認識に対する擬似糖質における６つの異なるリンカーの影響を検討した。種々の長さ（９〜１４個の原子）及び溶媒和容量(solvation capacity)に及ぶ(spam)ように、リンカーを選択した（アルキル、芳香族又はエチレングリコール）（図１）。
【０１５２】
本目的を達成するために、ホスホラミダイト化学作用によって糖鎖クラスターを構築することが可能なプロパギルガラクトース３及び種々のガラクトアジド誘導体４ａ〜ｅと組み合わせて、２つのホスホラミダイト（すなわち、ペント‐４‐イニル１及び６‐ブロモヘキシル２）を用いた(Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H. (1981) Tetrahedron Lett. 22, 1859- 1862) and copper catalyzed azide alkyne cycloaddition (CuAAC) “click” chemistry (Rostovtsev, V. V. et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599; Tornoe, C. W., Christensen, C., and Meldal, M. (2002) J. Org. Chem. 67, 3057-3064)（図２）。
【０１５３】
文献のプロトコールに従って、プロパルギルガラクトース３及びガラクトースアジド誘導体４ａ〜ｅを調製した。Hasegawa, T. et al., (2007) Org. Biomol. Chem. 5 (15), 2404-2412; Joosten, J. A. F. et al., (2004) J. Med. Chem. 47, 6499-6508; Szurmai, Z. et al., (1989) Acta Chimica Hungarica-Models in Chemistry 126, 259-269; Pourceau, G. et al., (2009) J. Org. Chem. 74, 1218-1222; Mereyala, H. B., and Gurrala, S. R. (1998) Carbohydr. Res. 307, 351-354)。
【０１５４】
最近報告された戦略に従って、マンノースが中心にある糖鎖クラスター１７ａ〜ｅ及び１８を調製した(Pourceau, G. et al., (2010) Bioconjugate Chem. 21, 1520-1529)。基本的に、ＣｕＡＡＣによって、マンノースプロパルギル６をアジド固体支持体５上に固定し、次いで、リン酸化によって４つのヒドロキシルにペント‐４‐イニル１又はブロモヘキシル２ホスホラミダイトを導入し、４つのペンチニルホスファート又は４つのブロモヘキシルホスファート基を有するマンノースコアを得た（図３）。オリゴヌクレオチドを伸長させ、蛍光色素（Ｃｙ３）によって標識し、化合物８及び９を得た。化合物９については、４個の臭素原子をテトラメチルグアニジンアジド(tetramethylguanidine azide)（ＴＭＧ Ｎ３）と置換し、テトラアジドオリゴヌクレオチド１０を得た。アンモニア処理後、Ｃｕ（０）を用い溶液中ＣｕＡＡＣによって、化合物１１及び１２をそれぞれガラクトース誘導体４ａ〜ｅ及び３と結合させ、マンノースが中心にあるテトラ‐ガラクトースオリゴヌクレオチド複合体１５ａ〜ｅ及び１６を得た。逆相ＨＰＬＣ、及びガラクトース部分のアセチル基を加水分解するアンモニアによる最終的な処理によって、純粋な複合体を単離し、種々のリンカーの存在を示す６つの予想されたガラクトクラスター１７ａ〜ｅ及び１８を得た。
【０１５５】
ＩＩ‐Ｂ  生物学的試験プロトコール：
直接蛍光走査によるＤＮＡに基づくグリコアレイ(glycoarray)を用いて、ＰＡ‐ＩＬへの擬似ガラクト１７ａ〜ｅ及び１８の結合効率を決定／測定した(Chevolot, Y. et al., (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2398-2402)。ガラクトクラスターに対するＰＡ‐ＩＬの特異的な結合を示す負の対照として、直鎖トリマンノシルクラスター（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｍａｎ）３（Ｃ１、Chevolotらの文献（2007）に開示）を用い、直鎖テトラガラクトシルクラスター（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（Ｃ２、Chevolot, Y. et al., (2011) Chem. Comm. 47, 8826-8828）を正の対照及び比較に用いた（図４）。本目的上、糖鎖クラスターをすべて、ＤＮＡタグによるＤＮＡ指向固定(DNA directed Immobilisation)（ＤＤＩ）によってＤＮＡアレイ上に固定した。次いで、alexa 647‐ＰＡ‐ＩＬを加え、３時間インキュベートし、洗浄後、蛍光強度を６３５ ｎｍで読み取り、結合強度についての相対的情報を得た（図５）。
【０１５６】
ＩＩ‐Ｃ  試験結果：
直鎖トリマンノース（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｍａｎ）３ Ｃ１クラスターはＰＡ‐ＩＬに結合せず、選択的な認識、及びマイクロアレイ上での非特異結合の欠如を示した。直鎖テトラガラクトースクラスター（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｃ２は、３１００前後の任意単位（ａ．ｕ．）の蛍光を示した。
【０１５７】
データは、結合効率に対して、ガラクトース部分とマンノースコアとの間のリンカーの長さに明らかな相関が存在しないことを示した。
【０１５８】
これとは対照的に、ガラクトース部分付近の芳香族基を有する擬似ガラクト（１７ｄ及び１８）は、高い結合を示し、トリアゾールメチレン（ＴＺＭ）モチーフ（１８）と比較して、フェニル（ＡｃＮＰｈｅ）のもの（１７ｄ）が優位であると考えられた。１７ａ、１７ｂ、１７ｅ及び１７ｃ間の結合の差は有意ではなく、このことは、エチレングリコール（ＥＧ２若しくはＥＧ３）又は脂肪族（Ｐｒｏ若しくはＤＭＣＨ）リンカーが、さらに、ＰＡ‐ＩＬのアミノ酸残基と相互作用しないことを示唆していた。
【０１５９】
ＩＩＩ‐糖鎖クラスター２２〜３１の合成、及びＰＡ‐ＩＬに対するこれらの結合効率の決定：
一方では、種々の足場、２〜５個の残基（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２‐５の存在を示すＤＭＣＨ足場（化合物２２〜２５）などの直鎖足場、又は４個のガラクトース残基（ｄＴ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（図８）の存在を示すデオキシチミジン(desoxythymidine)足場（２６）への導入に対する、ＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐ガラクトース部分の影響を調査し、他方では、ＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐ガラクトース部分を、ガラクトースが中心にある足場（２７）及びグルコースが中心にある足場（２８）（図９）に導入した。比較のために、ガラクトースが中心にある足場（２９）及びグルコースが中心にある足場（３０）（図９）に構築されたガラクトクラスターによるＨｅｘＴｚＭガラクトース部分の影響も検討した。
【０１６０】
ＩＩＩ‐Ａ  合成：
活性剤として塩化ピバロイルを用いＨ‐ホスホネート化学作用によってＤＭＣＨ Ｈ‐ホスホネートモノエステル(Chevolot, Y. et al., (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2398-2402; Bouillon, C. et al, (2006) J. Org. Chem. 71, 4700-4702)が２〜５回結合した、プロパンジオール固体支持体から開始し、直鎖ＤＭＣＨガラクトクラスターを合成した（図８）。得られたＨ‐ホスホネートジエステル結合を、アルキン官能基を導入可能なプロパルギルアミンの存在下で四塩化炭素によって酸化した。次いで、オリゴヌクレオチドを集め、ホスホラミダイト化学作用によってＣｙ３標識した。アンモニア処理によって脱保護され固体支持体から放出された後、２〜５つのアルキンの存在を示す得られた修飾オリゴヌクレオチドを、ＣｕＡＡＣによって４ｄと結合させた。ＨＰＬＣ精製後、アンモニアによってアセチル基を加水分解し、これによって、直鎖ＤＭＣＨガラクトクラスター（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２‐５（２２〜２５）に結合したオリゴヌクレオチドが生じた。固体支持体上に４回導入した市販ＤＭＴｒ‐チミジンＨ‐ホスホネートを用いて、デオキシチミジン足場（ｄＴ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２６）上に直鎖テトラ‐ガラクトースを同様に合成した。
【０１６１】
ガラクトースが中心にある（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２７）及びグルコースが中心にある（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（２８）、ガラクトースが中心にある（ＨｅｘＴｚＭ‐Ｇａｌ）４（２９）、並びにグルコースが中心にある（ＨｅｘＴｚＭ‐Ｇａｌ）４（３０）の合成を、マンノース足場に関する上述したものと同じプロトコールであるがプロパルギル‐ガラクトース又はプロパルギル‐グルコースを用いて、進行させた。これらを、最初に、アジド固体支持体５上に固定した。比較目的で、１つのみのＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフの存在を示すオリゴヌクレオチド複合体（３１）を合成した（図９）。本目的を達成するために、ＣｕＡＡＣによって４ｄと結合したモノ‐アルキン固体支持体からＣｙ３オリゴヌクレオチドを合成した（ＳＩを参照）。
【０１６２】
ＩＩＩ‐Ｂ  生物学的試験プロトコール：
‐試験１：
ＰＡ‐ＩＬに対するこれらのガラクトクラスターの結合特性を、グリコアレイを提供するＤＤＩを用いて検討した。チップ上にこれらを固定した後、alexa 647‐ＰＡ‐ＩＬを加え、洗浄後、それぞれの糖鎖クラスターの蛍光強度を読み取った（図１０）。Alexa 647蛍光シグナル（励起６３５ ｎｍ及び発光６７５ ｎｍ）は、ＰＡ‐ＩＬ結合に相関していた。
【０１６３】
‐試験２：
既に報告されている(Moni, L. et al., (2009) ChemBioChem 10, 1369-1378; Zhang, J. et al., (2009) Biosens. Bioelectron. 24, 2515-2521)ように、蛍光強度のダイナミックレンジは幾分限定されているので、阻害剤としてラクトースを用いて糖鎖クラスターのＩＣ５０値を決定し（表１）、効力を算出した。本例では、ラクトース濃度に対応するＩＣ５０値は、糖鎖クラスターからＰＡ‐ＩＬの５０％を置換するのに必要である。したがって、最も高いＩＣ５０値は、ＰＡ‐ＩＬに対して最も高い糖鎖クラスターの親和性である。よって、ＩＣ５０値をＩＣ５０Ｌａｃと称した。
【０１６４】
ＩＩＩ‐Ｃ  試験結果：
‐試験１：
直鎖ＤＭＣＨ糖鎖クラスターの蛍光シグナルは、ガラクトース残基の数とともに上昇し、結合効率に対する糖モチーフの増加という利益を示した。ＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフを有するテトラクラスターは、ＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフを有するその類似体よりも約５倍低い蛍光シグナルを示し、芳香族ガラクトースの良好な結合を確認した。ＤＭＣＨ又はチミジン足場を有する両方の四量体直鎖糖鎖クラスターは、ＤＭＣＨ三量体クラスターよりも高い結合を示したが、ＤＭＣＨを有するクラスターが優位であった。ヘキソースが中心にあるテトラ‐ガラクトクラスターに関しては、データは、ヘキソースコアであればどれでも、ＨｅｘＴｚＭ‐Ｇａｌモチーフに対してＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフの存在を示すガラクトクラスターの良好な結合を確認した。両方のファミリーでは、マンノースコア及びグルコースコアから構築された糖鎖クラスターは、同様の蛍光シグナルを示し、ガラクトースコアから構築されたものは低いシグナルを示した（図１０）。
【０１６５】
４つのＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフを有する直鎖糖鎖クラスターとヘキソースが中心にある糖鎖クラスターとの比較は、次に示すように蛍光シグナルを増加させる。Ｇａｌ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４≦（ｄＴ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４＜（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４＜Ｇｌｃ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４≦Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４。このデータは、直鎖ＤＭＣＨペンタ‐ガラクトースよりも良好な全糖鎖クラスターのうち、マンノースが中心にある及びグルコースが中心にある糖鎖クラスターの良好な結合を示した。
【０１６６】
‐試験２：
５及び１６ ｍＭのＩＣ５０Ｌａｃ値をそれぞれ有する、モノガラクトースＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚ‐ＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ(Chevolot, Y. et al., (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 2398-2402)とＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌの比較は、芳香族ガラクトース（項目１及び２）に対する結合が３．２倍の増加を示し、これは、酵素結合レクチンアッセイによりCeccioniらによって行われた観察(Cecioni, S. et al., (2012) Chem. Eur. J. 18, 6250-6263)に類似していた。直鎖ガラクトクラスターでは、２〜３個の残基間の閾値効果による残基の数の増加とともに、ＰＡ‐ＩＬに対する良好な結合に対応するＩＣ５０Ｌａｃ値の増加がみられた（表１、項目４及び５）。ＭＴｚＥＧ３リンカーに対するＰＮＭＴｚＡｃＮＡｒリンカーの利益が確認された（（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｃ２、項目３：ＩＣ５０Ｌａｃ＝７７３ μＭに対して、（ＤＭＣＨ‐ＰＮＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ ２４、項目６：ＩＣ５０Ｌａｃ＝１０５６ μＭ）。この傾向は、マンノースが中心にある糖鎖クラスターにおいて強調された（項目９：１７ｄ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４においてＩＣ５０Ｌａｃ＝２８２６ μＭに対して、項目８：Ｇ３ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４においてＩＣ５０Ｌａｃ＝２９ μＭ）。結果は、マンノースが中心にあるトポロジーを有するＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフの優位性を示し、モノ芳香族ガラクトースと比較して１７７倍効力が増加し、ＥＧ３‐Ｏ‐ガラクトース（項目９）と比較して５６５倍効力が増加し、ＰＡ‐ＩＬに対する高い結合を獲得した。これらの結果は、リンカーの性質と空間的配置の組合せが親和性に対して強い影響があることを示す。
【０１６７】
データは、ＰＡ‐ＩＬへの結合に対するヘキソースコアの影響が、ガラクトース‐リンカーの性質によって異なることを示した（表２）。テトラガラクトクラスターに関しては、ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＡｒリンカーによって、最良の結合は、マンノースコア１７ｄ、次いで、グルコースコア及びガラクトースコアでみられた（項目９〜１１）。これとは対照的に、ＨｅｘＴｚＭリンカーによって、最良の結合は、グルコースコア、次いで、ガラクトースコア及びマンノースコアを有するクラスターでみられた（項目１２〜１４）。
【０１６８】
【表２】
0006595460.tif 000046
0006595460.tif 000047
表２：ラクトースとの競合によって決定された糖鎖クラスターのＩＣ５０Ｌａｃ値。
【０１６９】
ＩＶ‐糖鎖クラスター３２〜３９の合成、及びＰＡ‐ＩＬに対するこれらの結合効率の決定：
一部の変化を伴い、マンノースコアとＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフとを含む化合物を調製した。一方では、ペンチニルのものの代わりに、ジエチレングリコール又はテトラエチレングリコールプロパルギルホスホラミダイト１ａ〜ｂを用いて、マンノースコアとトリアゾールとの間の長さ／柔軟性を増加させ、他方では、ビス‐ペンチニルホスホラミダイト１ｃ、又は２，２‐（ビス‐プロパルギルオキシメチル）プロピルホスホラミダイト１ｄ（図１１）のいずれかを用いて、８個のアルキニル基を導入した。このように、マンノースが中心にある新しいテトラガラクトクラスター、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３２）、及びＭａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３３）は、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ １７ｄの１３個の原子というリンカー長さの代わりに、１７個の原子及び２３個の原子というリンカー長さをそれぞれ示す。マンノースが中心にあるオクタガラクトクラスター、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８（３４）及びＭａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４（３５）は、マンノースコアのそれぞれのヒドロキシル上に２個の残基の存在を示す（図１２）。このため、結合特性に対するリンカー長さの影響及び残基の数の影響を評価することができた。比較のために、ＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐ＧａｌモチーフがＥＧ３‐Ｇａｌモチーフに置換された類似体Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３６）も合成した（図１２）。
【０１７０】
そして、「芳香効果」のより多くの洞察を得るために、Ｏ‐フェニルがチミン（Ｔ‐Ｇａｌ）に置換されたガラクトースモチーフの存在を示す新しい糖鎖クラスター（３７、３８、３９）を合成した。これらの類似体は、チミンのヘテロ原子とレクチンのアミノ酸との水素結合を形成することができるように設計され、これによって、可能な限り良好な親和性がもたらされた。
【０１７１】
ＩＶ‐合成：
ＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフの存在を示す新しい糖鎖クラスターを合成するために、プロパルギルジエチレングリコール（１ａ）若しくはテトラエチレングリコール（１ｂ）ホスホラミダイト、ビス‐ペント‐４‐イニルホスホラミダイト（１ｃ）又は２，２‐（ビス‐プロパルギルオキシメチル）プロピルホスホラミダイト（１ｄ）によって、固体支持マンノース７をリン酸化した。そして、オリゴヌクレオチド伸長及び標識後、テトラ／オクタアルキン構造体（１９ａ〜ｄ）を化合物４ｄに結合させ、マンノースが中心にある予想されたテトラ／オクタガラクトクラスターオリゴヌクレオチド複合体、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３２）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ４ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３３）、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８（３４）、及びＭａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４（３５）をそれぞれ得た（図１２）。同様に、プロパルギルジエチレンエチレングリコールリンカーを有するテトラアルキン１９ａも４ｅに結合させ、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（３６）を得た。
【０１７２】
Ｔ‐Ｇａｌモチーフの存在を示す糖鎖クラスターの合成に関しては、アジド誘導体４ｆを、グルコース‐チミジンの合成について文献に記載されているプロトコール(Gillaizeau, I. et al., (2003) Eur. J. Org. Chem., 666-671)に従って調製した。本目的を達成するために、１，２，３，４，６‐ペンタ‐Ｏ‐アセチル‐ガラクトースを、２，４‐ビス‐Ｏ‐トリメチルシリル‐チミンによってグリコシル化し、２’，３’，４’，６’‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐ガラクトピラノース‐Ｎ１‐チミン２０（Ｔ‐Ｇａｌ）（又は２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐アセチル‐Ｎ１‐チミン‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド）を得た（図１３）。これを、炭酸カリウムの存在下で、チミン部分のＮ３上で１，４‐ジブロモブタンによってアルキル化し、そして、臭素原子をアジ化ナトリウムによって置換し、対応するアジドＮ‐チミン‐ガラクトース誘導体４ｆを得た。
【０１７３】
Ｇａｌ‐Ｔアジド誘導体４ｆを、ＰｒｏＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ又はＥＧ２ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌモチーフをそれぞれ有するテトラクラスター、及びＴＨＭＥＭＴｚＢｕＴＧａｌモチーフを有するオクタガラクトクラスターをもたらす、先に調製した、４つのペンチニル（１１）、４つのプロパルギルジエチレングリシル（１９ａ）又は４つのビス‐プロパルギル‐オキシメチルプロピル（１９ｄ）の存在を示すＣｙ３‐オリゴヌクレオチドマンノースコアに導入し、マンノースが中心にある予想されたテトラ／オクタガラクトクラスターオリゴヌクレオチド複合体、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）４（３７）、Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）４（３８）、及びＭａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＢｕＴ‐Ｇａｌ）２］４（３９）を得た（図１２）。
【０１７４】
ＩＶ‐Ｂ  生物学的試験プロトコール：
試験１：
得られた９つの糖鎖クラスターのＰＡ‐ＩＬに対する結合を、上述したように、ＤＤＩマイクロアレイによって決定した（ＩＩ‐Ｂを参照）。
【０１７５】
試験２：
結合特性についての十分な理解のために、糖鎖クラスターのＩＣ５０Ｌａｃ値を測定した（表１、項目１５〜１８に報告されている結果）。
【０１７６】
ＩＶ‐Ｃ  試験結果：
試験１の結果は図１４に示されており、ＰｒｏからＥＧ２Ｍまでのリンカー長さの増加によって、芳香族モチーフ（ＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）を有する糖鎖クラスターに対する良好な親和性を常に有する、ＴｚＥＧ３‐Ｏ‐ＧａｌモチーフとＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフの両方によって親和性が増加した。これとは対照的に、ＥＧ２ＭからＥＧ４Ｍまでのリンカー長さの増加によって、低い蛍光シグナルを有する糖鎖クラスターがもたらされ、このことは、非常に高い柔軟性を有し非常に長いリンカーが、ＰＡ‐ＩＬに対する結合に悪影響を及ぼすことを示唆していた。
【０１７７】
Ｍａｎ‐（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＡｒ）クラスターでは、４個から８個に残基の数が増加すると、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８ ３４に対してＭａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４又は１７ｄの蛍光シグナルが増加した。オクタクラスターの蛍光シグナルは、ＥＧ２Ｍリンカーを有するテトラクラスターの蛍光シグナルと類似していた。これとは対照的に、他のオクタクラスター、Ｍａｎ［ＰＯＴＨＭＥ（ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）２］４ ３５は、２つの最良のテトラクラスターよりも低い蛍光シグナルを示した。Ｇａｌ‐Ｔから製造されるガラクトクラスターに関しては、負の対照に非常に類似している、約４５ ａ．ｕ．の６３５の蛍光シグナルを観察した。ガラクトシド残基の数が８個まで増加すると、結合は改善しなかった。チミンがガラクトピラノースのＣ１に直接結合するので、チミンガラクトシドクラスターについてのＰＡ‐ＩＬに対する結合阻害の理由は、立体障害に関係していると考えられた。この知見は、ガラクトースクラスターに対するＰＡ‐ＩＬの結合がトリアゾール環付近で低下するというMoniらの知見に類似している。実際に、本研究では、トリアゾール環は、Ｃ‐ガラクトシドのアノマー炭素に直接結合した(Moni, L. et al., (2009) ChemBioChem 10, 1369-1378)。
【０１７８】
オクタガラクトクラスター、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）８ ３４は、多くのガラクトースモチーフによりこれまで良好なクラスター効果を示すことが報告されている、すべての構造のうちで最も高い結合を示した。
【０１７９】
試験２：
表１の項目１５〜１８に示されているように、それぞれのガラクトクラスターの効力を、モノ‐ＥＧ３‐Ｏ‐ガラクトース及びモノ‐芳香族ガラクトースによって算出した。ＩＣ５０Ｌａｃ値は、直接蛍光走査によってみられた傾向を確認し、ＴｚＥＧ３‐Ｏ‐ＧａｌからＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフ（項目１６に対して項目１５）が良好な結合であり、ＰｒｏからＥＧ２Ｍがリンカーの伸長により良好な結合であり（項目１５に対する項目８、及び項目１６に対する項目９）、ＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌモチーフを有するオクタ糖鎖クラスターに対する結合が最も高かった（ＩＣ５０Ｌａｃ＝６８０３、項目１７）。第２のオクタガラクトクラスターは、低いＩＣ５０Ｌａｃ値である１８０７ μＭを示し（項目１８）、空間的配置が結合に対して強い効果を有することを示した。
【０１８０】
Ｖ‐溶液中Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）Ｇ１及び（Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）Ｇ２の合成及び試験：
生物物理学及び生物学研究のために、優位な糖鎖クラスターＧ１及びＧ２、並びに、分子を含有する非芳香族のものとして、ＤＮＡタグのない擬似ガラクトに相当するＭａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３Ｇａｌ）４ Ｇ３を、〜１００ ｍｇ規模により溶液中で合成した（図１５）。血球凝集抑制アッセイ（ＨＩＡ）、酵素結合レクチンアッセイ(Enzyme Linked Lectin Assay)（ＥＬＬＡ）、等温熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及びＤＤＩグリコアレイを用いて、ＰＡ‐ＩＬに対するこれらの特性を評価した。これらのうち最も強力なものについて、上皮細胞系ＮＣＩ‐Ｈ２９２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １８４８）に対するＰＡ接着のこれらの阻害も決定した。
【０１８１】
Ｖ‐Ａ  合成：
糖鎖クラスターＧ１（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）、Ｇ２（Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）、及びＧ３（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）の合成
１‐Ｏ‐メチル‐α‐Ｄ‐マンノース：メタノール（３０ ｍＬ）中α‐Ｄ‐マンノース（２．０ｇ）の溶液を、DOWEX‐50W X8樹脂、Ｈ＋形態（４．０ｇ）の存在下で、還流下で２７時間煮沸させた。ろ過し濃縮して乾燥させた後、粗生成物をエタノール中で再結晶させ、白色の固体として１‐Ｏ‐メチル‐α‐Ｄ‐マンノース（１．５８ｇ、７３％）を得た。分析データは文献のデータ（Cadotte, J. E. et al., (1952) J. Am. Chem. Soc.74, 1501-1504）と一致していた。
【０１８２】
リン酸化の一般的手順：
無水ジメチルホルムアミド／アセトニトリル（１：１．５、ｖ／ｖ）中１‐Ｏ‐メチル‐α‐Ｄ‐マンノース（５０ ｍｇ、０．２６ ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を、分子ふるい（３Å）とともに１時間３０分撹拌した。次いで、アルキンホスホラミダイト４６ａ〜ｂ（１．３０ ｍｍｏｌ、５当量）、及びテトラゾール溶液（無水ＣＨ３ＣＮ中０．４Ｍ、６．４ ｍＬ、２．６０ ｍｍｏｌ、１０当量）を加えた。この混合物を３０℃で２時間撹拌し、Ｈ２Ｏによって反応を停止した。Ａ２６（ＩＯ４−）樹脂（１．０ｇ、２．５０ ｍｍｏｌ、９．６当量）を加え、この混合物を２時間撹拌した。樹脂をろ過し、ジクロロメタン（４０ ｍＬ）を加えた後、この反応物を、ＮａＨＣＯ３（６０ ｍＬ）の飽和水溶液及びブライン（６０ ｍＬ）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し濃縮し、所望のテトラアルキンマンノース誘導体４７ａ〜ｂを得た。
【０１８３】
４７ａ：淡黄色の油として得られた（２０８ ｍｇ、８１％）。1H NMR (300 MHz, D2O) δ4.98 (d, J=21.0 Hz, 1H, H-1), 4.87-4.57 (m, 3H, H-2, H-5, H-6), 4.37-4.12 (m, 16H, OCH2CH2CN, POCH2CH2), 3.94-3.89 (m, 1H, H-6), 3.45 (s, 4H, OCH3, H-3), 3.40 (m, 1H, H-4), 2.88-2.78 (m, 8H, CH2CN), 2.39-2.34 (m, 4H, CH2CH2CCH), 2.08-1.90 (m, 8H, POCH2CH2), 1.73-1.64 (m, 4H, CH2CCH).31P NMR (162 MHz, CDCl3)d -1.65-3.01 (m, 1P). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ115.5 (CN) 98.3 (C-1), 81.5 (OCH2CCH), 68.5 (CH2CCH, C-2, C-5, C-6), 65.6 (C-3, C-4), 60.9 (2s, POCH2), 55.7 (OCH3), 27.7 (POCH2CH2), 18.7 (CH2CN), 13.1 (CH2CH2CCH). MS MALDI-TOF+m/z calcd for C39H55N4O18P4[M+H]+= 991.76 found 991.86. HR-ESI-QToF MS (positive mode): m/z calcd for C39H55N4O18P4[M+H]+=991.2465 found 991.2462。
【０１８４】
４７ｂ：無色の油として得られた（２７９ ｍｇ、８７％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ4.93 (d, J=24.2 Hz, 1H, H-1), 4.84-4.79 (m, 1H, H-6), 4.73-4.59 (m, 2H, H-2, H-5), 4.37-4.18 (m, 16H, POCH2CH2CN, POCH2CH2), 4.17-4.12 (m, 8H, OCH2CCH), 3.86-3.80 (m, 1H, H-6), 3.68 (m, 8H, POCH2CH2), 3.63 (s, 17H, OCH2CH2O, H-3), 3.61-3.57 (m, 1H, H-4), 3.38 (s, 3H, OCH3), 2.82-2.74 (m, 8H, CH2CN), 2.46 (m, 4H, OCH2CCH).31P NMR (162 MHz, CDCl3)d -1.67--3.11 (m, 1P). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ117.1 (CN) 98.3 (C-1), 79.6 (OCH2CCH), 74.9 (CH2CCH, C-2, C-5, C-6), 70.2-69.7 (2m, POCH2CH2, C-3, C-4), 69.1 (OCH2CH2O), 67.8-62.3 (5m, POCH2), 58.3 (OCH2CCH), 55.7 (OCH3), 19.5 (CH2CN). MALDI-TOF+m/z calcd for C47H71N4O26P4[M+H]+= 1231.96 found 1231.19. HR-ESI-QToF MS (positive mode): m/z calcd for C47H71N4O26P4[M+H]+=1231.3297 found 1231.3307。
【０１８５】
１，３‐双極環状付加及び炭水化物脱アセチル化の一般的手順：
アルキン官能化化合物（４７ａ若しくは４７ｂ）１．０当量、及びアジドテトラアセチルガラクトース誘導体４８ａ(Bouillon, C. et al., (2006) J. Org. Chem.71, 4700-4702)又は化合物４８ｂ（４〜４．８当量）を、トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（１７５ μＬ、０．１Ｍ、ｐＨ７．７）及びナノ粉末銅（２ ｍｇ）を含むジオキサン中に溶解した。得られた混合物を７０℃で一晩撹拌した。次いで、この反応物をＣＨ２Ｃｌ２（１５ ｍＬ）中に希釈し、ブライン（１５ ｍＬで３回）によって洗浄した。有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し濃縮し乾燥させた。得られた生成物をアセトン（５ ｍＬ）中に溶解し、濃アンモニア溶液（３０％）を加えた（２０ ｍＬ）。この混合物を室温で１時間撹拌した。蒸発後、粗生成物をミリＱ水中に溶解し、この溶液を、DOWEX‐50W X8樹脂、Ｎａ＋形態を充填したカラムに通した。濃縮後、残渣を、Ｃ１８フラッシュカラムクロマトグラフィー（４０ｇ）（水(eau)／ＣＨ３ＣＮ／トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．７）、９７／０／３〜４７／５０／３）によって精製し、所望の複合糖質を得た。
【０１８６】
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｇ１：淡黄色の油として得られた（１４１ ｍｇ、６４％）：４７ａ（１００ ｍｇ、０．１ ｍｍｏｌ、１当量）、４８ａ（２１１ ｍｇ、０．４ ｍｍｏｌ、４当量）、ジオキサン（２．０ ｍＬ）。1H NMR (300 MHz, D2O) δ7.82-7.72 (4s, 4H, H-triaz), 7.34-7.27 (m, 8H, H-ar), 7.04-6.99 (m, 8H, H-ar), 5.30-5.19 (4s, 8H, C(O)CH2N-triaz), 4.92-4.89 (m, 5H, H-1 gal, H-1 man), 4.86-4.84 (m, 2H, H-2 man, H-3 man), 4.74-4.72 (m, 2H, H-4 man, H-5 man), 3.95-3.93 (m, 10H, H-6 man, OCH2CH2), 3.85-3.68 (m, 24H, H-2 gal, H-3 gal, H-4 gal, H-5 gal, H-6 gal), 3.30 (s, 3H, OCH3), 2.75-2.67 (m, 8H, CH2CH2C-triaz), 1.95-1.81 (m, 8H, CH2CH2CH2) ppm. 31P NMR (121 MHz, D2O)d 0.86 (s), -0.262 (t) ppm. 13C NMR (100 MHz, D2O) d 165.3 (C=O), 153.6 (Cq-ar), 147.2 (Cq-triaz), 130.8 (Cq-ar), 124.1 (CH-triaz), 122.5(C-ar), 116.4 (C-ar), 100.4 (C-1 gal), 98.3 (C-1 man), 74.78, 72.0, 70.0 (3s, 3C, C-2 gal, C-3 gal, C-4 gal, C-5 gal), 67.9 (OCH2CH2), 64.7, 64.1 (C-2 man, C-3 man, C-4 man, C-5 man, C-6 man), 60.1 (C6 gal), 51.3 (C(O)CH2N-triaz, OCH3), 29.5 (CH2CH2CH2), 28.8 (CH2C-triaz). HPLCtR= 11.25 min. MS MALDI-TOF-m/z calcd for C83H113N16O46P4[M-H]-= 2194.76 found 2194.84 HR-ESI-QToF MS (positive mode): m/z calcd for C83H116N16O46P4[M+2H]++=1098.3090 found 1098.3064。
【０１８７】
Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｇ２：淡い色の油として得られた（１９０ ｍｇ、９５％）：４７ｂ（１００ ｍｇ、０．０８２ ｍｍｏｌ、１当量）、４８ａ（２０４ ｍｇ、０．４ ｍｍｏｌ、４．８当量）、ジオキサン（２．８ ｍＬ）。1H NMR (600 MHz, D2O) δ8.19-8.15 (m, 4H, H-triaz), 7.46-7.44 (m, 8H, H-ar), 7.17-7.15 (m, 8H, H-ar), 5.45-5.43 (m, 8H, C(O)CH2N-triaz), 5.05-5.03 (m, 4H, H-1 gal), 4.99 (m, 1H, H-1 man), 4.74 (d, J= 2.4 Hz, 8H, OCH2C-triaz), 4.45-4.32 (m, 3H, H-2 man, H-3 man, H-5 man), 4.17-4.10 (m, 6H,3/4 POCH2CH2), 4.06 (d, J= 2.4 Hz, 1H, H-4 man), 4.04 (d, J= 2.0 Hz, 4H, H-4 gal), 3.89-3.74 (m, 50H, H-2 gal, H-3 gal, H-5 gal, H-6 gal,1/4 POCH2CH2, OCH2CH2), 3.69-3.67 (m, 2H, H-6 man), 3.39 (s, 3H, OCH3) ppm. 13C NMR (150 MHz, D2O) d 166.1 (C=O), 154.4 (Cq-ar), 144.4 (Cq-triaz), 131.6 (Cq-ar), 126.7 (CH-triaz), 123.4 (C-ar), 117.2 (C-ar), 101.1 (C-1 gal), 98.8 (C-1 man), 75.5, 72.7, 70.7 (3s, 3C, C-2 gal, C-3 gal, C-5 gal), 70.3, 69.7, (2m, 5C, C-2 man, C-3 man, C-4 man, C-5 man, C-6 man), 69.1 (C-4 gal), 68.6 (OCH2CH2), 64.9 (POCH2CH2), 63.2 (OCH2C-triaz), 60.9 (C6 gal), 52.6 (C(O)CH2N-triaz, OCH3). HPLCtR= 14.32 min. MS MALDI-TOF-m/z calcd for C91H129N16O54P4[M-H]-: 2431.95 found 2432.18. HR-ESI-QToF MS (positive mode): m/z calcd for C91H132N16O54P4[M+2H]++=1218.3513 found 1218.3436。
【０１８８】
Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｇ３：淡黄色の油として得られた（６６ ｍｇ、６２％）：４７ａ（５０ ｍｇ、０．０５０ ｍｍｏｌ、１当量）、４８ｂ（１０１ ｍｇ、０．２００ ｍｍｏｌ、４当量）、ジオキサン（１．５ ｍＬ）。1H NMR (600 MHz, D2O) δ8.00-7.92 (m, 4H, H-triaz), 5.01 (m, 1H, H-1 man), 4.62-4.64 (m, 8H, CH2N-triaz), 4.48 (dd, J=1.8 Hz, J=7.8 Hz, 3H, H-2 man, H-3 man, H-5 man), 4.45 (d, J=7.8 Hz, 4H, H-1 gal), 4.14-4.12 (m, 4H, 1/2 GalOCH2), 3.98 (m, 9H, H-6 man, OCH2CH2N-triaz), 3.91-3.88 (m, 5H, H-6 man, H-4 gal), 3.85-3.77 (m, 20H, 1/2 GalOCH2, POCH2CH2, H-6 gal), 3.76-3.67 (m, 32H, H-2 gal, H-5 gal, OCH2CH2O), 3.61-3.56 (m, 5H, H-3 gal, H-4 man), 3.47 (s, 3H, OCH3), 2.91-2.78 (m, 8H, CH2CH2C-triaz), 1.97 (CH2CH2C-triaz). 13C NMR (150 MHz, D2O) 103.7 (C-1 gal, C-1 man), 76.0 (POCH2CH2), 75.9, 73.6, 71.6 (3s, 3C, C-2 gal, C-3 gal, C-5 gal), 70.6, 70.5, 70.4, 70.3, 70.2 (C-2 man, C-3 man, C-4 man, C-5 man, C-6 man, OCH2CH2O), 70.0 (OCH2CH2N-triaz), 69.5 (C-4 gal, GalOCH2), 61.8 (d, C-6 gal)), 51.0 (CH2N-triaz), 44.0 (CH2CH2C-triaz), 30.4 (CH2CH2C-triaz). MS MALDI-TOF-m/z calcd for C75H133N12O50P4[M-H]-=2126.80 found 2126.54. HR-ESI-QToF MS (positive mode): m/z calcd for C75H136N12O50P4[M+2H]++= 1064.3709 found 1064.3835。
【０１８９】
Ｖ‐Ｂ  生物学的試験：
ウサギ赤血球に対するＰＡ‐ＩＬ結合のガラクトクラスターによる阻害能（血球凝集抑制アッセイ、ＨＩＡ）、又は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素結合アッセイ（ＥＬＬＡ）のいずれかによる、表面結合ガラクトシル修飾ポリアクリルアミドに対するＰＡ‐ＩＬ結合のガラクトクラスターによる阻害能として、ガラクトクラスターに対するＰＡ‐ＩＬの結合を調査した。阻害を競合アッセイによって測定した。ＨＩＡ実験では、最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、レクチンの存在下でウサギ赤血球の血球凝集を抑制する、ガラクトクラスターの最小濃度である。低いＭＩＣでは、レクチンに対するガラクトクラスターの結合が最も高かった。ＩＣ５０値を決定するのにＳＰＲ及びＥＬＬＡを用いた。ＩＣ５０は、表面結合ｇａｌ‐ＰＡＡに対するＰＡ‐ＩＬの結合を５０％阻害する、ガラクトクラスターの濃度である。ＳＰＲ（ＳＰＲＩＣ５０）及びＥＬＬＡ（ＥＬＬＡＩＣ５０）によって決定されるように、低いＩＣ５０値では、ガラクトクラスターに対するＰＡ‐ＩＬの結合が最も高かった。
【０１９０】
参照リガンドとして、１‐Ｏ‐メチル‐β‐Ｄ‐ガラクトシド（ＧａｌＯＭｅ）、及び１‐Ｏ‐ｐ‐ニトロフェニル‐β‐Ｄ‐ガラクトシド（ＧａｌＯＡｒＮＯ２）を用いた。これらの２つの参照リガンドによって、結合及びグルコシドクラスター効果に対するフェニルアグリコンの影響を分離することができる。βＭｅ及びβＡｒはそれぞれ、ＧａｌＯＭｅ及びＧａｌＯＡｒＮＯ２に対するガラクトクラスターの相対的効力である。
【０１９１】
血球凝集抑制アッセイ（ＨＩＡ）：血球凝集抑制アッセイ（ＨＩＡ）を、Ｕ字型９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて実行した。ウサギ赤血球をBiomerieux社から購入し、更なる洗浄をせずにこれを用いた。赤血球をＮａＣｌ（１００ ｍＭ）中８％溶液に希釈した。３ μＭのＰＡ‐ＩＬ溶液を、２０ ｍＭトリス‐ＨＣｌ（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、１００ ｍＭのＮａＣｌ及び１００ ｍＭのＣａＣｌ２中で調製した。一定分量（５０ μＬ）の連続（２回）レクチン希釈物に４％赤血球溶液（５０ μＬ）を加えて、血球凝集単位（ＨＵ）を最初に得た。この混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。血球凝集観察に必要な最小レクチン濃度として、ＨＵを測定した。レクチン阻害アッセイでは、４ ＨＵのレクチン濃度を用いた。ＰＡ‐ＩＬでは、この濃度は３ μＭであることが分かった。次いで、糖鎖クラスターの連続希釈物（５０ μＬ）、単量体分子及び対照にレクチン溶液（２５ μＬの必要濃度）を加えて、後の阻害アッセイを実行した。これらの溶液を３７℃で３０分間インキュベートした後、８％の赤血球溶液（２５ μＬ）を加え、続いて、３７℃で１時間更にインキュベートした。それぞれの分子の最小阻止濃度を反復して決定した。
【０１９２】
ＥＬＬＡを用いるレクチン濃度の決定：９６ウェルマイクロタイタープレート(Nunc Maxisorb)に、ＰＡ‐ＩＬ用のα‐ＰＡＡ‐Ｇａｌ（ＰＡＡ＝ポリアクリルアミド（Lectinity Holding, Inc.社製）：炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中５ μｇ．ｍＬ−１ １００ μＬを３７℃で１時間被覆し、次いで、１ウェル当たり、リン酸緩衝液溶液（ＰＢＳ）中３％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００ μＬによって、３７℃で１時間ブロッキングした。レクチン溶液（７５ μＬ）を３０ μｇ．ｍＬ−１から開始し希釈した（１：２）。３７℃で１時間インキュベートし、Ｔ‐ＰＢＳ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ）によって３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）‐ストレプトアビジン複合体（１００ μＬ；希釈２：８０００；Boehringer-Mannheim社製)を加え、３７℃で１時間放置した。１ウェル当たり、ｏ‐フェニレンジアミンジヒドロクロリド（０．４ μｇ．ｍＬ−１）及び尿素過酸化水素（０．４ ｍｇ．ｍＬ−１）を含む０．０５％リン酸／クエン酸緩衝液（ＯＰＤキット、Sigma-Aldrich社製)１００ μLを用いて、着色を１５分間進行させ、硫酸（５０ μＬ、３０％）によってこれを停止した。次いで、マイクロタイタープレートリーダー(BioRad 680)を用い、吸光度を４９０ ｎｍで読み取った。レクチン濃度に対する相対的吸光度をプロットすることによって、ビオチン化されたレクチンの濃度を決定した。後の阻害実験のために、標準レクチン濃度として、線形領域において最も高い応答をもたらす濃度を選択した。最終濃度は、ＰＡ‐ＩＬで０．５ μｇ．ｍＬ−１であった。
【０１９３】
等温滴定マイクロカロリメトリー（ＩＴＣ）：組換え凍結乾燥ＰＡ‐ＩＬを、緩衝液（０．１Ｍトリス‐ＨＣｌ、６ μＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）中に溶解し、脱気した。２８０００の理論モル吸光係数を用い吸光度を測定することによって、タンパク質濃度（リガンド親和性によって５０〜２７０ μＭ）を確認した。炭水化物リガンドを同じ緩衝液中に直接溶解し、脱気し、これを注入シリンジ（濃度：１７５ μＭ）に入れた。MicroCal Incorporated社製のVP-ITC MicroCalorimeterを用いて、ＩＴＣを実行した。ＰＡ‐ＩＬを、２５℃で１．４４７８ ｍＬの試料セルに入れた。３００秒ごとに炭水化物リガンドを１０ μＬ注入して滴定を実行した。標準手順に従って、MicroCal Origin 7ソフトウェアを用い、「１点モデル」を用いてデータを適合させた。適合させたデータによって、化学量論（ｎ）、結合定数（Ｋａ）及び結合のエンタルピー（ΔＨ）を得た。式ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳ＝−ＲＴｌｎＫａ（式中、Ｔは絶対温度であり、Ｒ＝８．３１４ Ｊ．ｍｏｌ−１．Ｋ−１である。）から、他の熱力学パラメータ（すなわち、自由エネルギーの変化ΔＧ及びエントロピーΔＳ）を算出した。試験したそれぞれのリガンドについて、２又は３つの独立した滴定を実行した。
【０１９４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）：２５℃でBiacore 3000機器を用いて、ＳＰＲ阻害実験を実行した。固定された２つの糖を備えた２つのチャネル、α‐Ｌ‐フコース（チャネル１）及びα‐Ｄ‐ガラクトース（チャネル２）において測定を実行した。５ ｍＬ．ｍｉｎ−１で泳動緩衝液（ＨＢＳ）を用いて、糖の固定を２５℃で実行した。それぞれのチャネル（ＣＭ５チップ）において、次に示すように、固定を独立して実行した。最初に、ＥＤＣ／ＮＨＳの新しい混合物を注入して（３５ μＬ、４２０秒）、チャネルを活性化させた。次いで、ストレプトアビジンの溶液（０．１ ｍＭ ＡｃＯＮａ緩衝液（ｐＨ５）中１００ ｍｇ．ｍＬ−１）を注入した（５０ μＬ、６００秒）。溶液にエタノールアミン（１Ｍ、３５ μＬ、４２０秒）を注入して、他の反応種をクエンチした。そして、所望のビオチン化ポリアクリルアミド‐糖の溶液（Lectinity社製、２００ ｍｇ．ｍＬ−１）を、ストレプトアビジン‐ビオチン相互作用によって表面に被覆した（５０ μＬ、６００秒）。この手順によって、チャネル１及び２に８０４ ＲＵ（共鳴単位）（フコシド）及び７９６ ＲＵ（ガラクトシド）の糖がそれぞれ固定された。ガラクトシル化チャネル２によって阻害実験を実行し、プロットは減算されたデータ（チャネル２−チャネル１）を表す。ＰＡ‐ＩＬ実験の泳動緩衝液は、１０ ｍｍ ＨＥＰＥＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＣａＣｌ２、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ Ｐ２０（ｐＨ７．４）であった。阻害試験は、ＰＡ‐ＩＬ（５ ｍｍ）のインキュベートされた（１時間超、室温）混合物の注入（１５０ μＬ、１０ μＬ．ｍｉｎ−１、解離１２０秒）と、種々の濃度の阻害剤（２倍のカスケード希釈物）と、からなる。それぞれの阻害アッセイでは、阻害剤を含まないＰＡ‐ＩＬ（５ μＭ）を注入し、糖被覆面に対するレクチンの十分な接着（０％阻害）がみられた。ｄ‐ガラクトースを連続的に注入して（泳動緩衝液中３０ μＬで２回、１００ ｍｍ）、完全にＣＭ５チップを再生した。ブランクの減算後、経時的にＲＵとして結合を測定し、その後、ＢＩＡ評価ソフトウェアバージョン４．１を用いてデータを評価した。ＩＣ５０評価では、応答（Ｒｅｑ適合）は、特定された濃度の阻害剤存在下で平衡状態において炭水化物被覆面に結合したレクチンの量であると考えられた。Origin 7.0ソフトウェア（OriginLab Corp.社製）を用い、阻害剤濃度（対数目盛で）に対する阻害割合をプロットすることによって、阻害曲線を求め、阻害曲線のシグモイド適合からＩＣ５０値を抽出した。
【０１９５】
マイクロアレイ
マイクロアレイの作製
他に詳述されている(Mazurczyk, R. et al., (2008) Sens. Actuators, B128, 552-559; Vieillard, J. et al., (2007) J. Chromatogr. B845, 218-225; Vieillard, J. et al., (2008) Microelectron. Eng.85, 465-469)標準フォトリソグラフィ及びウェットエッチング法を用いて、微細構造ホウケイ酸ガラススライド（NexterionガラスD、Schott社（ドイツ）製）を作製した。微細構造スライドは、４０平方ウェル（３ ｍｍの幅、６０±１ μｍの深さ）が特徴であった。
【０１９６】
Dugas, V., and Chevalier, Y. (2003) J. Colloid Interface Sci.264, 354-361; Dugas, V. et al, (2004) Sens. Actuators, B101, 112-121; Phaner-Goutorbe, M. et al., (2011) Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications 31, 384-390に報告されているプロトコールに従って、作製スライドを官能化した。スライドを、新たに調製したピラニア中で洗浄し、脱イオン（ＤＩ）水中で洗い流し、窒素下で、１５０℃で２時間乾燥させた。室温に戻した後、乾燥ペンタン中ｔｅｒｔ‐ブチル‐１１‐（ジメチルアミノ）シリルウンデカノアートを、ガラススライド表面と反応させた（室温）。ペンタン蒸発後、スライドを１５０℃で一晩加熱し、そして、ＴＨＦ及び水中で洗浄した。ｔｅｒｔ‐ブチルエステル官能基をＮＨＳエステルに変換させた。あるいは、スライドを気相中で官能化することができる。洗浄手順は同様である。
【０１９７】
アミノ修飾オリゴヌクレオチドをEurogentec社から購入した。それぞれの反応器の底部における２５ μＭ ＰＢＳ １０Ｘ （ｐＨ８．５）の種々のオリゴヌクレオチドによる０．３ ｎＬのスポット形成（１ウェル当たり６４スポット）。置換反応を室温で一晩、水飽和雰囲気下で実行し、次いで、水を徐々に蒸発させた。ＳＤＳ（０．１％）によって７０℃で３０分間、そして脱イオン水によって簡単にスライドの洗浄を実行した。
【０１９８】
スライドをすべて、ＰＢＳ １Ｘ中４％ ＢＳＡ溶液（ｐＨ７．４、３７℃、２時間）によってブロッキングし、ＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）、ＰＢＳ １Ｘ（ｐＨ７．４）及び脱イオン（ＤＩ）水中で連続的に洗浄した後、遠心分離によって乾燥させた。
【０１９９】
レクチン標識：ＰＡ‐ＩＬレクチンのAlexa 647標識：ＰＡ‐ＩＬレクチンを、Invitrogen社製のAlexa Fluor（登録商標）647マイクロスケールタンパク質標識キット(A30009)によって標識した。標識レクチンの濃度及びレクチンに対する色素の比率を、マイクロキュベット（Hellma社製、５ μｌ、１ ｍｍの光学距離）を備える二重ビーム分光計(Safas社製)を用いて読み取られた(reaud out)吸光度によって推定した。２８１ ｎｍ及び６５０ ｎｍの吸光度を測定した。ＰＡ‐ＩＬの濃度は、四量体ＰＡ‐ＩＬに対する色素の標識度０．５１により、１１．５８ μΜと推定された。
【０２００】
「インソリューション(In solution)」生物学的認識：Ｋｄ及びＩＣ５０値を決定する方法は、過去に報告されている(Gerland, B. et al., (2012) Bioconjugate Chem.23, 1534-1547; Zhang, J. et al., (2009) Chem. Comm., 6795-6797 ; Zhang, J. et al., (2009) Biosens. Bioelectron.24, 2515-2521)。
【０２０１】
Ｋｄの決定：擬似化合物Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４、又は３２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４（最終濃度１ μＭ）を、０．０２％ ＰＢＳ‐２％ Ｔｗｅｅｎ２０溶液中で希釈した。ＣａＣｌ２（最終濃度１ μｇ／ｍＬ）を加えた。次いで、所望の最終濃度のＰＡ‐ＩＬを加えた。２ μＬのそれぞれの溶液（所望のＰＡ‐ＩＬ濃度に相当）を、対応するマイクロウェル内に注入した。スライドを水蒸気飽和室内でインキュベートし（３時間、３７℃）、そして、ＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ ２０中で洗浄し（０．０２％、５分、４℃）、乾燥させた。マイクロアレイスキャナ、GenePix 4100Aソフトウェアパッケージ（Axon Instruments社製；λｅｘ ５３２／６３５ ｎｍ及びλｅｍ ５７５／６７０ ｎｍ）を、両方のフルオロフォア（Ｃｙ３とAlexa 647）の蛍光像に用いた。８つのスポットから中間蛍光シグナルの平均を算出した。スキャッチャードプロットを用いて、得られたラングミュア等温式を直線化し、縦軸切片(ordonnate intercept)でＫｄ値を得た。
【０２０２】
細胞への接着試験
細菌及び細胞培養。ヒト肺粘液性類表皮癌由来の上皮細胞系ＮＣＩ‐Ｈ２９２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １８４８）を、１０％ウシ胎児血清（Boehringer社製）を添加し抗生物質を含まないＲＰＭＩ １６４０培地（Gibco）を収容した２５ ｃｍ２組織培養フラスコ（Nunc）中に維持した。以下、この培地を維持培地と称する。細胞を１：６の分裂比で毎週２回継代した。すべての細胞培養物を、５％のＣＯ２を含む雰囲気下で、３７℃でインキュベートした。トリパンブルー染色後に光学顕微鏡によって、細胞数及び生存率を決定した。緑膿菌参照株ＰＡＯ１を、３７℃で１６時間、Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で増殖させた。細胞を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）溶液中で２回洗浄し、これを希釈し、およそ５．１０６ ＣＦＵ／ｍＬの細胞密度を得た。
【０２０３】
細菌接着アッセイ。細菌接着アッセイでは、ＮＣＩ‐Ｈ２９２細胞を、１ ｍＬの維持培地を収容した２４ウェルマイクロタイタープレートに、集密的な単層（１ウェル当たり５．１０５の細胞）まで培養した。あらかじめ３７℃まで加温した、１ ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（１３７ ｍＭ ＮａＣｌ、８ ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４、１．５ ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２．６ ｍＭ ＫＣｌ）によって、プレートを２回洗浄し、ＤＰＢＳ中０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミンとともに３７℃で１時間インキュベートすることによって、非特異的結合をブロックした。細菌と相互作用させる前に、調製物を、あらかじめ加温したＤＰＢＳによって再度２回洗い流した。次いで、１００ μＬの細菌懸濁液をそれぞれのウェルに加え、１のＭＯＩ（５．１０５ ＣＦＵ／ｍＬ／５．１０５細胞）を得た。その後、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。ＤＰＢＳによって調製物を５回洗い流すことによって、非接着細菌を除去した。０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００溶液により３７℃で３０分間インキュベートして、細胞を溶解した。ＤＰＢＳを用いて連続希釈物を調製し、１００ μＬの一定分量をＬＢプレートに３回反復してまき、３７℃で２４時間インキュベートした。
【０２０４】
接着阻害では、擬似ガラクトＧ１（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）のみ試験した。擬似ガラクトＧ１を０〜２ ｍＭの範囲の最終濃度でウェルに加えた。
【０２０５】
Ｖ‐Ｃ  結果
ＨＩＡアッセイでは、Ｇ２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４は、擬似化合物のうち最も低いＭＩＣを示し、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｇ３は最も高いＭＩＣを示した。擬似化合物Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４は、中間ＭＩＣを有していた（表３）。ＧａｌＯＭｅに対する擬似化合物Ｇ１、Ｇ２及びＧ３の相対的効力はそれぞれ、１２８、５１３及び４である。したがって、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４ Ｇ３の増加は、依然として制限される。実際に、ガラクトース残基当たりのＭＩＣは同じである。これとは対照的に、擬似化合物Ｇ１及びＧ２は、ガラクトース残基とマンノースコアとの間に最も長いリンカーを有するＧ２の顕著な利益によって、大きな効力の増加を示す。擬似化合物Ｇ１及びＧ２の１６及び６５のＧａｌ‐ＯＡｒＮＯ２に対する算出された効力はそれぞれ、４及び１６の残基当たりの増加によって、糖鎖クラスター効果を明らかに示していた。したがって、効力の増加は、芳香環の存在だけでなく、多価効果にも関連している。
【０２０６】
【表３】
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表３：血球凝集抑制アッセイ（ＨＩＡ）。ＭＩＣは最小阻止濃度を表す。効力（β）：βＭｅ又はβＡｒは、考慮される分子のＭＩＣに対するＧａｌ‐ＯＭｅ又はＧａｌ‐ＯＡｒＮＯ２のＭＩＣの比率に相当する。
【０２０７】
ＥＬＬＡＩＣ５０及びＳＰＲＩＣ５０では、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４の効力は、ＨＩＡとは逆に、Ｇａｌ‐Ａｒよりもわずかに良好である（表４）。これは、実際に、２つの分子の効力が類似していることを示唆する。ＥＬＬＡＩＣ５０とＳＰＲＩＣ５０はともに、Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４、及びＧ２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４が、一価のリガンド及びＭａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４と比較して、効力が向上していることを確認した。また、Ｇ２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４が最良のリガンドであることも確認した。ただし、これらの向上の範囲は、アッセイによって異なっていた。実際に、擬似化合物１〜３のＧａｌ‐ＡｒＮＯ２に対する効力は、ＥＬＬＡによって決定されたＩＣ５０値では１２７、５５０及び１．２であり、ＳＰＲによって決定されたＩＣ５０値では２．０、７．４及び１．７であった。したがって、ＳＰＲＩＣ５０の場合では、多価クラスターの明確な効力は、実証することができない。グリコシドによるクラスター効果範囲のかかる不一致は、文献に既に報告されている(Lundquist, J. J., and Toone, E. J. (2002) Chem. Rev.102, 555-578)。
【０２０８】
【表４】
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表４：酵素結合レクチン(Lectine)アッセイ（ＥＬＬＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定されたガラクトシル化リガンドのＩＣ５０値。βＭｅは、考慮される分子のＩＣ５０値に対するＧａｌ‐ＯＭｅのＩＣ５０値の比率である。同様に、βＡｒは、考慮される分子のＩＣ５０値に対するＧａｌ‐ＡｒＮＯ２のＩＣ５０値の比率である。
【０２０９】
マイクロタイタープレートをＰＡＡ‐ガラクトースによって修飾した。スライドを、ガラクトシル化リガンドの濃度を増加させながら、インキュベートした。ＩＣ５０は、ガラクトース‐ＰＡＡ修飾表面に対するＰＡ‐ＩＬの初期接着の５０％を置き換えることができる擬似ガラクトの濃度である。決定された最も低いＩＣ５０では、検討された分子のＰＡ‐ＩＬに対する結合が最も強い。ＥＬＬＡ：このＩＣ５０は、後述するＥＬＬＡＩＣ５０である。ＳＰＲ：このＩＣ５０は、後述するＳＰＲＩＣ５０である。
【０２１０】
３つの擬似化合物のＩＣ５０値は、参照一価リガンドとして用いた化合物３１と比較して、１７ｄ、３２及びＣ３を用いたＤＮＡ指向固定グリコアレイを用い、先に決定された（図６）(Zhang, J. et al., (2009) Biosens. Bioelectron.24, 2515-2521; Goudot, A. et al., (2013) Biosens. Bioelectron.40 153-160)。この場合、ＩＣ５０値は、表面結合クラスターとのＰＡ‐ＩＬ相互作用の５０％を阻害するのに必要なラクトース濃度に相当する。したがって、最も高いＩＣ５０値では、結合は良好である。１７７、２６４及び１．８の相対的効力を決定した。ＥＬＬＡによって決定された本ＩＣ５０値は、種々の擬似化合物間の同じ桁のグリコアレイによって決定されたものと一致している。
【０２１１】
【表５】
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表６：阻害剤としてラクトースを用いたＤＤＩ‐グリコアレイによって決定されたＤＮＡ‐擬似ガラクトのＩＣ５０値。
【０２１２】
ＰＡ‐ＩＬと３つのガラクトクラスターＧ１、Ｇ２、Ｇ３との間の相互作用の等温マイクロカロリメトリー測定を行い、ＧａｌＯＭｅによって先に得られたデータと比較した（表７）(Chabre, Y. M. et al., (2011) Chem. Eur. J.17, 6545-6562)。Ｇ３ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４の場合、８．５倍のＧａｌＯＭｅに対する効力の中程度の増加に対応する１１ μＭのＫｄ値が測定された。化学量論(stoechiometry)（０．２８）は、４個のガラクトース残基がＰＡ‐ＩＬ単量体に結合することを示唆する。したがって、本結果は、相互作用に対してエントロピー損失がエンタルピーの考慮によって償われず、これによって、多価Ｇ３ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４と一価のＧａｌ‐Ａｒの両方に同様のＫｄがもたらされることを示唆した。擬似ガラクトＧ１及びＧ２はそれぞれ、４８５倍及び５９９倍の効力の強い増加を示した。Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４、又はＧ２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４の化学量論は類似しており（それぞれ、０．４６及び０．５２）、このことは、２個のガラクトース残基がＰＡ‐ＩＬ単量体とともに同時に関与していることを示唆していた。両方の分子のエントロピー損失は、Ｇ３ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＥＧ３‐Ｏ‐Ｇａｌ）４でみられたものよりも約３〜４倍低い。両方の分子は同様のエンタルピー寄与をし、芳香族一価リガンドによるCeccioniらの文献(Cecioni, S. et al., (2012) Chem. Eur. J.18, 6250-6263)によってみられた−５３ ＫＪｍｏｌ−１とはそれほど異ならない。しかしながら、驚くべきことに、ジエチレングリコールアームによる、より柔軟なリンカーの存在にもかかわらず、Ｇ２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４のエントロピー損失は、Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４でみられたものよりも低かった。この理由は、Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４のリンカーの疎水性によるものであると考えられ、これによって、脱水エントロピー損失を非常に増加させる。
【０２１３】
並行して、１７ｄ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４のＫｄを、ラングミュア等温式を用いてマイクロアレイ上で測定し、ＩＴＣによって測定されたものと同様に１９６ ｎＭのＫｄ値が得られた。しかしながら、３２ Ｍａｎ（ＰＯＥＧ２ＭＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４の測定されたＫｄ値は、ＩＴＣによって測定されたものとは異なり、同じ桁の範囲内の８３であった。
【０２１４】
【表６】
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表７：ＰＡ‐ＩＬと擬似ガラクトＧ１、Ｇ２、Ｇ３との間の相互作用の滴定マイクロカロリメトリーデータ。ａＫｄ値は、１７ｄ、３２及びＣ３から決定した。
【０２１５】
物理化学(physic-chemical)特性評価実験によりＰＡ‐ＩＬに対して強い結合を示したので、細胞レベルにおいて、唯一の擬似ガラクトＧ１（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）の接着阻害効果を評価した。ＮＣＩ‐Ｈ２９２細胞に対する緑膿菌の接着は、擬似ガラクト阻害剤の有無による２時間のインキュベーション後に評価した（図１８）。
【０２１６】
接着細菌の数は、培地中の擬似ガラクト濃度の増加とともに徐々に減少する。５０ μＭ未満の濃度では有意な阻害はみられなかった。図１８は、培地中のＧ１（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）濃度の関数としての、ＮＣＩ‐Ｈ２９２細胞に対する緑膿菌の接着阻害割合を表す。接着ＩＣ５０（ａｄｈＩＣ５０）は、図に決定されているように９５．２５ μＭであった。
【０２１７】
細菌接着アッセイは、Ｇ１ Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４が細菌接着の阻害剤であることを示す。細菌接着アッセイは、宿主細胞に対するＰＡの接着をガラクトクラスターによって阻害できることを実証する。
【０２１８】
少量のレクチンのみが細菌細胞上に露出することは周知である(Glick and Garber et al., 1983)。それにもかかわらず、この接着におけるＰＡ‐ＩＬの直接的な意義がまだ実証されていなくても、この少量は宿主上皮細胞への細菌の接着を促進するのに十分である(Plotkowski et al., 1989; Laughlin et al., 2000; Chemani et al., 2009)。複数の研究グループは、宿主組織へのＰＡの接着阻害、ＰＡに感染させた動物モデルにおける肺コロニー形成の減少又は肺クリアランスの増加、及びＰＡ‐ＩＬを標的とする種々のガラクトシドによる連続的な処理について既に説明している(Chemani et al., 2009 ;Gilboa-Garber N, 2011 ; Gustke et al., 2012)。ＰＡ‐ＩＬに対する擬似ガラクトは、宿主組織へのＰＡ接着の新しいクラスの阻害剤に相当し、ＰＡ感染を予防する有望な将来に相当すると考えられる。
【０２１９】
ＰＡ‐ＩＬに対する糖鎖クラスターＧ２５〜Ｇ４８の親和性をグリコアレイによって評価した。
【０２２０】
化合物Ｇ２５〜Ｇ３０の予想されるＫｄ値は１〜５０ ｎＭであり、５０〜１００ ｎＭが好ましく、また、化合物Ｇ３１〜Ｇ４８では、Ｋｄ値は１〜５０ ｎＭであり、１〜１００ ｎＭが好ましい。
【０２２１】
ＶＩ‐結論：
宿主組織のＰＡコロニー形成、及びバイオフィルム形成によって、抗生物質治療に対して細菌に選択的有利性が提供される。ＰＡ‐ＩＬは、ＰＡ接着に関与することが疑われる病原因子である。多価のガラクトシル化分子によるＰＡ‐ＩＬ阻害は、ＰＡ接着を阻害する手段として予測される。本明細書において、ＰＡ‐ＩＬに対するガラクトースクラスターの親和性を、５つの異なる方法を用いて評価した。最終的に、５つの方法は、擬似ガラクトＧ１（Ｍａｎ（ＰＯＰｒｏＴｚＡｃＮＰｈｅ‐Ｏ‐Ｇａｌ）４）がＰＡ‐ＩＬに対して強い結合を有することを実証した。１００ μＭ未満のＩＣ５０によって、ＮＣＩ‐Ｈ２９２へのＰＡ接着を阻害することができた。
【０２２２】
両方の方法（ＩＣ５０とＫｄ）は、同様の親和性を提供した。最良の糖鎖クラスターは、１４〜４８ ｎＭのＫｄ値を示す、Ｏ‐ナフチル（Ｇ２１〜Ｇ２４）、Ｏ‐ビフェニル（Ｇ１７〜Ｇ２０）及びＯ‐フェニル（Ｇ１及びＧ３）を有するものであった。Ｓ‐ベンジル（Ｇ１３〜Ｇ１６）及びホスホロチオアートＥＧ２ Ｏ‐フェニル（Ｇ２）を有する糖鎖クラスターは低い親和性で、４９〜７０ ｎＭのＫｄ値であり、続いて、Ｓ‐ベンジル（Ｇ１３〜Ｇ１６）及びホスホロチオアートＥＧ３ Ｏ‐フェニル（Ｇ４）であり、７１〜８５ ｎＭのＫｄ値であった。そして、Ｏ‐ベンジル（Ｇ５〜Ｇ８）を有する糖鎖クラスターは最も低い親和性を示し、８５〜１７０ ｎＭのＫｄ値であった。
【０２２３】
本発明は、好適な実施形態を参照して説明してきた。ただし、本発明の範囲内で多くの変形が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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