(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸標的配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、下記の構造（Ｉ）：
５’−Ｓ−Ｌ−Ａ−Ｈ−３’  （Ｉ）
［式中、
Ｈは、ハイブリダイゼーションドメインであり、
Ａは、アダプターであり、
Ｌは、リンカーであり、および
Ｓは、シグナル伝達ドメインである。］
からなり、
前記ハイブリダイゼーションドメインが、前記核酸標的配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記アダプターが、核酸配列を含み、
前記リンカーが、少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックし、
前記シグナル伝達ドメインが、少なくとも１つの標識を有する核酸からなり、
構造（Ｉ）に存在する追加の標識が、前記シグナル伝達ドメインに存在し、
前記少なくとも１つの標識は、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質および抗体に対する抗原からなる群から選択される成員からなる、核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２】
リンカーが、ｉＳｐＣ３、ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８から成る群より選択される少なくとも１つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３】
リンカーがｉＳｐ９またはｉＳｐ１８を含む、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項４】
リンカーがｉＳｐ９を含む、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項５】
シグナル伝達ドメインが複数の標識をさらに含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項６】
複数の標識が、３−１２ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項５に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項７】
複数の標識が、６ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項５に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項８】
複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する２つ以上の標識を含む、請求項５に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項９】
少なくとも１つの標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１０】
少なくとも１つの標識が蛍光部分を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１１】
ハイブリダイゼーションドメインが、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１２】
シグナル伝達ドメインが複数の核酸結合ドメインをさらに含み、各々の核酸結合ドメインが、少なくとも１つの付加的な核酸に結合するために利用可能である、請求項１または２に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、少なくとも１つの付加的な核酸が、
別のハイブリダイゼーションドメイン、
別のアダプター、
別のリンカー、および
標識核酸
を含み、
前記別のハイブリダイゼーションドメインが、シグナル伝達ドメイン内の少なくとも１つの核酸配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記別のアダプターが核酸配列を含み、ならびに
前記別のリンカーが少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする、
核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１４】
請求項１２に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、少なくとも１つの付加的な核酸が、
別のハイブリダイゼーションドメイン、
別のアダプター、
別のリンカー、および
標識核酸
を含み、
前記別のハイブリダイゼーションドメインが、シグナル伝達ドメイン内の少なくとも１つの核酸配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記別のアダプターが核酸配列を含み、ならびに
前記別のリンカーが少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする、
核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１５】
別のリンカーが、ｉＳｐＣ３、ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８から成る群より選択される少なくとも１つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項１４に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１６】
別のリンカーがｉＳｐ９またはｉＳｐ１８を含む、請求項１４に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１７】
別のリンカーがｉＳｐ９を含む、請求項１４に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１８】
標識核酸が、複数の標識を有する核酸を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１９】
標識核酸が、複数の標識を有する二本鎖分子を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２０】
複数の標識が、３−１２ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項１８または１９に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２１】
複数の標識が、６ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項１８または１９に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２２】
複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する２つ以上の標識を含む、請求項１８または１９に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２３】
複数の標識が、放射性部分、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質、抗体に対する抗原、または少なくとも１つのリガンド結合分子に対するリガンドを含む、請求項１８または１９に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２４】
複数の標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項１８または１９に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２５】
複数の標識が蛍光部分を含む、請求項１８または１９に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２６】
核酸標的配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブであって、
シグナル伝達ドメイン、リンカー、アダプター、およびハイブリダイゼーションドメインを、５’から３’方向にこの順で含み、
前記ハイブリダイゼーションドメインが核酸標的配列に相補性を有する核酸配列を含み、
前記アダプターが核酸配列を含み、
前記リンカーが少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分が、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックし、ならびに
前記シグナル伝達ドメインが標識核酸を含む、
核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２７】
リンカーが、ｉＳｐＣ３、ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８から成る群より選択される少なくとも１つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２８】
リンカーがｉＳｐ９またはｉＳｐ１８を含む、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項２９】
リンカーがｉＳｐ９を含む、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３０】
標識核酸が、複数の標識を有する核酸を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３１】
標識核酸が、複数の標識を有する二本鎖分子を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３２】
複数の標識が、３−１２ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項３１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３３】
複数の標識が、６ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項３１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３４】
複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する２つ以上の標識を含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３５】
複数の標識が、放射性部分、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質、抗体に対する抗原、または少なくとも１つのリガンド結合分子に対するリガンドを含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３６】
複数の標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３７】
複数の標識が蛍光部分を含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３８】
ハイブリダイゼーションドメインが、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項３１〜３７のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３９】
核酸配列標的を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブを調製する方法であって、
前記核酸配列標的を含む核酸を断片化し、二本鎖フラグメントの群を生成する段階；
前記二本鎖フラグメントの群の末端を平滑化し、平滑末端フラグメントの群を生成する段階；
アダプターを含む配列を前記平滑末端フラグメントの群の各成員に連結し、末端アダプター配列を含むフラグメントの群を生成する段階；
任意選択により、ゲル電気泳動によって前記群をサイズ分画し、所望のサイズ範囲に限定された鋳型ライブラリを得る段階；
前記末端アダプター配列を含むフラグメントの群をプライマーによるＤＮＡ増幅に供し、５’一本鎖末端を有する二本鎖分子の群を生成する段階；および
前記５’一本鎖末端を有する二本鎖分子の群を変性させ、前記核酸ハイブリダイゼーションプローブを含む群を生成する段階
を含み、前記プライマーが、以下の構造：
５’−Ｓ−Ｌ−Ａ−３’
［式中、
Ｓは、シグナル伝達ドメインを含み、前記シグナル伝達ドメインは、蛍光部分、化学発光部分、酵素、酵素に対する基質および抗体に対する抗原からなる群から選択される成員からなる少なくとも１つの標識を有する核酸を含み；
Ｌは、リンカーを含み、前記リンカーは、少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、前記部分は、前記部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックし；ならびに
Ａは、前記末端アダプター配列を含むフラグメントの群の各成員の末端の前記アダプター配列に対応する核酸配列であって、およびＤＮＡ増幅を用いた前記末端アダプター配列を含むフラグメントの群でのプライマー伸長を許容する適切な鎖極性を有する核酸配列を含む。］
を有する一本鎖分子からなる、調製方法。
【請求項４０】
リンカーが、ｉＳｐＣ３、ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８から成る群より選択される少なくとも１つの成員またはこれらの組合せを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
リンカーがｉＳｐ９またはｉＳｐ１８を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
リンカーがｉＳｐ９を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
シグナル伝達ドメインが複数の標識をさらに含む、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
複数の標識が、３−１２ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
複数の標識が、６ヌクレオチドごとに配置された標識を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
複数の標識が、別々の光学特性または分光特性を有する２つ以上の標識を含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
標識が蛍光部分または化学発光部分を含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
標識が蛍光部分を含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
シグナル伝達ドメインが複数の核酸結合ドメインをさらに含み、各々の核酸結合ドメインが、少なくとも１つの付加的な核酸に結合するために利用可能である、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
核酸配列標的が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
核酸配列標的が、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
試料中の核酸配列標的を検出する方法であって、
前記核酸配列標的を含有する前記試料を得る段階；
前記試料を核酸ハイブリダイゼーションプローブと接触させる段階；および
ハイブリダイゼーションシグナルを視覚化する段階
を含み、前記核酸ハイブリダイゼーションプローブが、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて核酸標的配列に関してＤＮＡ増幅を実施する段階、および
定量ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＮＡクランプ媒介ＰＣＲまたはデジタルＰＣＲによってハイブリダイゼーションシグナルを視覚化する段階
をさらに含む、方法。
【請求項５４】
核酸配列標的が、反復配列エレメントを欠く核酸配列を含む、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
試料を基質上に固定化する段階をさらに含み、基質が、粒子、膜、マイクロアレイ基質またはＦＩＳＨアッセイ基質を含む、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
癌細胞の存在に関して試料をスクリーニングする方法であって、
染色体プローブのセットを、複数の細胞を含有する試料にハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階；および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記試料中の癌細胞の存在を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記染色体プローブのセットが、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、方法。
【請求項５７】
癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜（子宮）癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
試料が組織試料を含む、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な１つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項５６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
遺伝子座が、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）から成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
患者における癌の状態を予測および観測する方法であって、
患者から得られた複数の細胞を含有する試料に、染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階；および
前記試料中の複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記試料中の癌細胞の存在を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記試料中の癌細胞の割合の増加が前記患者における癌の進行または再発を示し、
前記試料中の癌細胞の減少が前記患者における癌の減少または寛解を示し、
前記染色体プローブのセットが、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、方法。
【請求項６７】
癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜（子宮）癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項６６または６７に記載の方法。
【請求項６９】
染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項６６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項６６〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
試料が組織試料を含む、請求項６６〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な１つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項６６〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
遺伝子座が、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）から成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
患者において癌を治療するための抗癌治療薬の有効性を観測する方法であって、
前記抗癌治療薬により治療する前と、治療した後に患者から得られた複数の細胞を含有する試料に染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階；および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記試料中の癌細胞の存在を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記患者を前記抗癌治療薬で治療する前の前記試料中の癌細胞の割合と比較して、前記患者を前記抗癌治療薬で治療した後の前記試料中の癌細胞の割合の増加が、前記抗癌治療薬が無効であることを示し、
前記患者を前記抗癌治療薬で治療する前の前記試料中の癌細胞の割合と比較して、前記患者を前記抗癌治療薬で治療した後の前記試料中の癌細胞の割合の減少が、前記抗癌治療薬が有効であることを示し、
前記染色体プローブのセットが、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、方法。
【請求項７７】
癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜（子宮）癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項７６〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
試料が組織試料を含む、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な１つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
遺伝子座が、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）から成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
患者における癌の存在に関して診断を補助する方法であって、
患者から得られた複数の細胞を含有する試料に、染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階；および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記患者に癌が存在することを示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記染色体プローブのセットが、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、方法。
【請求項８７】
癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜（子宮）癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項８６または８７に記載の方法。
【請求項８９】
染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項８６〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
試料が組織試料を含む、請求項８６〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な１つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項８６〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
遺伝子座が、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）から成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
癌を有することが疑われる患者の予後の情報を提供する方法であって、
患者から得られた複数の細胞を含有する試料に、染色体プローブのセットをハイブリダイズさせる段階であって、前記セットが、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む、段階；および
前記試料中の前記複数の細胞における前記染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階
を含み、
前記ハイブリダイゼーションパターンが、前記患者の予後不良を示す、前記試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、
前記染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、方法。
【請求項９７】
癌の型が、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜（子宮）癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌から成る群より選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
試料が、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物から成る群より選択される、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項９６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
染色体プローブのセットが蛍光標識されている、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
試料の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階が蛍光顕微鏡検査によって実施される、請求項９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
蛍光顕微鏡検査がデジタル画像を用いて実施される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
試料が組織試料を含む、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な１つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項９６〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
遺伝子座が、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）から成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
染色体プローブのセットならびに、場合により、スライドガラス、リン酸緩衝生理食塩水、ハイブリダイゼーション緩衝液、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド、塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム溶液、固定液、エタノール、非イオン性界面活性剤および変性緩衝液から成る群より選択される１つ以上の試薬で構成されるキットであって、
前記染色体プローブのセットが、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２６に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含み、
前記プローブが、各プローブが生物学的試料へのハイブリダイゼーション後に明瞭に視覚化され得るように標識されている、キット。
【請求項１０７】
染色体プローブのセットが、遺伝子座に特異的な１つ以上の単離された核酸配列を含む、請求項１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
遺伝子座が、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）から成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
染色体プローブのセットが、反復配列エレメントを欠く少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１０６〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＢＥＳ」と題する２０１１年１２月３０日出願の米国特許仮出願第６１／５８２，１３５号の優先権を主張する、Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．への「ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ  ＰＲＯＢＥＳ」と題する２０１２年１２月２７日出願の米国特許仮出願第１３／７２８，９７５号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９の下での優先権を主張するものであり、各々の出願の内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ほぼすべての核酸検出システムは核酸ハイブリダイゼーションプローブの使用に基づく。核酸ハイブリダイゼーションプローブの適用は、医療診断、分子医学、法科学、標本および生物目録作成ならびに微生物病原体疫学を含む数多くの分野で広く認められている。核酸ハイブリダイゼーションプローブを設計するうえでの課題は、ほとんどすべての適用において同じままであり、即ち所与の標的に対して高い親和性と特異性を有するプローブの設計を達成することおよび標的を同定するために高いシグナル特異的活性を示すことである。
【０００３】
これらの課題は、核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用した全ゲノムスクリーニング法に表れている。特に、核酸標的を配列特異的および染色体特異的な方法で同定する染色体スクリーニングが、核酸ハイブリダイゼーションプローブの設計における最大の課題となっている。このような方法の１つである蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、卓越した標的特異性および染色体スプレッド内の核酸標的の位置を視覚化する高いシグナル特異的活性の両方を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用する。従って、他のハイブリダイゼーション適用に適し得るプローブが、ＦＩＳＨ適用には必ずしも適切でないことがある。
【０００４】
ＦＩＳＨ適用のための核酸ハイブリダイゼーションプローブを調製する方法は当分野において周知である。化学合成を通して調製される短いプローブ（例えば２００ヌクレオチド未満の長さを有する１コピープローブ）に関しては、標識または後ほど標識と反応させ得る部分を含むプローブを合成する。または、このようなプローブは、任意の適切な酵素的または化学的手段を用いて合成後に標識される。
【０００５】
２００ｂｐから５００ｋｂｐの長さを有するような長いプローブは、多くの方法で調製されてきた。長いプローブについての核酸基質を、超音波処理または制限酵素消化を用いて断片化する。生じた断片群を、適切な標識を組み込むように化学修飾することができる。
【０００６】
または、断片群を、標識または標識と反応させるための部分を含むヌクレオチド三リン酸類似体で酵素的に標識することができる。適切な酵素標識化手順には、内部標識化法または末端標識化法が含まれる。内部標識化法の公知の例には、ポリメラーゼ媒介性技術、例えばニックトランスレーションプロトコル、ランダムプライミング法およびポリメラーゼ連鎖反応が含まれる。公知の末端標識化法には、ポリヌクレオチドキナーゼ法、リガーゼ技術および末端トランスフェラーゼ手法が含まれる。
【０００７】
核酸ハイブリダイゼーションプローブは、典型的にはＤＮＡまたはＤＮＡ類似体、例えばＰＮＡから成る。ＲＮＡも、ＲＮＡ転写産物が一本鎖分子として高い収率で生産され得るという事実により、核酸ハイブリダイゼーションプローブとしての役割を果たしてきた。しかし、ＲＮＡに基づくプローブは、ＦＩＳＨアッセイで使用される生物学的標本中での核酸分解に対するこれらの感受性のために、しばしば品質と再現性に問題がある。
【０００８】
長いプローブに使用される核酸は、通常はクローニングベクター中で維持される。例えば、ベクターが担持する核酸は、典型的には細菌培養物中で増殖する。このような核酸の典型的な収穫量は、このような培養物からは比較的効率が低い。従って、長いプローブのための材料の供給源を維持するにはかなりの時間と費用が必要である。
【０００９】
さらに、ＦＩＳＨ適用のための先行技術の核酸ハイブリダイゼーションプローブは、通常、堅固なシグナル生成能力を欠く。これは、一部にはＦＩＳＨアッセイにおけるハイブリダイゼーションのためのプローブの適合性に関連してプローブへの標識組込みの本質的に低い特異的活性に起因すると考えられる。所与の核酸に組み込まれた高い数の標識は、内部クエンチングによるシグナル低下ならびに生じるプローブのより低いハイブリダイゼーション特異性をもたらし得る。さらに、非常に長いプローブは、しばしば標的核酸上に十分なシグナルを置くことを必要とする。しかし、このようなプローブの長さが増大する（プローブの質量定数を保持しながら）につれて、各個別セグメントの濃度は低下する。従って、より長いプローブは、各ハイブリダイゼーションセグメントが核酸標的内の相補的配列にハイブリダイズするためにより長いインキュベーション時間を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、改善された生産収率および優れたシグナル生成能力を有するプローブ設計の両方の見地から、改善された核酸ハイブリダイゼーションプローブが当分野において求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
最初の態様では、本発明は、核酸標的配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブである。核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイゼーションドメイン、アダプター、リンカーおよびシグナル伝達ドメインを含む。ハイブリダイゼーションドメインは、核酸標的配列に相補性を有する核酸配列を含む。アダプターは核酸配列を含む。リンカーは、少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、この部分は、この部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする。シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの標識を有する核酸または少なくとも１つの付加的な核酸に結合するための少なくとも１つの核酸ドメインを有する核酸を含む。
【００１２】
２番目の態様では、本発明は、核酸標的配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブである。核酸ハイブリダイゼーションプローブは、ハイブリダイゼーションドメイン、アダプター、リンカーおよびシグナル伝達ドメインを含む。ハイブリダイゼーションドメインは、核酸標的配列に相補性を有する核酸配列を含む。アダプターは核酸配列を含む。リンカーは、少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、この部分は、この部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする。シグナル伝達ドメインは標識核酸を含む。
【００１３】
３番目の態様では、本発明は、核酸標的を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブ系である。核酸ハイブリダイゼーションプローブ系は、第１オリゴヌクレオチド、第２オリゴヌクレオチド、第３オリゴヌクレオチド、第４オリゴヌクレオチドおよびリガーゼを含む。第１オリゴヌクレオチドは、第１ハイブリダイゼーションサブドメインおよび第１シグナルアクセプターサブドメインを有する一本鎖分子を含む。第２オリゴヌクレオチドは、第２ハイブリダイゼーションサブドメインおよび第２シグナルアクセプターサブドメインを有する一本鎖分子を含む。第３オリゴヌクレオチドは、第１シグナルサブドメインを有する一本鎖分子を含む。第４オリゴヌクレオチドは、第２シグナルサブドメインを有する一本鎖分子を含む。第１ハイブリダイゼーションサブドメインおよび第２ハイブリダイゼーションドメインは、一緒になって核酸配列標的の連続する相補的配列に結合するための連続するハイブリダイゼーションドメインを含む。第１シグナルアクセプターサブドメインおよび第２シグナルアクセプターサブドメインは、一緒にアニーリングされた場合、シグナルアクセプタードメインの末端に一本鎖形態を含むシグナルドメイン結合部位を備えた二本鎖形態を有するシグナルアクセプタードメインを含む。第１シグナルサブドメインおよび第２シグナルサブドメインは、一緒にアニーリングされた場合、シグナルドメインの末端に一本鎖形態を含むシグナルアクセプタードメイン結合部位を備えた二本鎖形態を有するシグナルドメインを含む。シグナルアクセプタードメイン結合部位およびシグナルドメイン結合部位は各々、リガーゼの存在下で一緒に連結され得る相補的配列を含む。
【００１４】
４番目の態様では、本発明は、核酸配列標的を検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブを調製する方法である。前記方法は、以下の段階：核酸配列標的を含む核酸を断片化し、二本鎖フラグメントの群を生成する段階；二本鎖フラグメントの群の末端を平滑化し、平滑末端フラグメントの群を生成する段階；アダプターを含む配列を平滑末端フラグメントの群の各成員に連結し、末端アダプター配列を含むフラグメントの群を生成する段階；場合によりゲル電気泳動によって群をサイズ分画し、所望のサイズ範囲に限定された鋳型ライブラリを得る段階；末端アダプター配列を含むフラグメントの群をプライマーによるＤＮＡ増幅に供し、５’一本鎖末端を有する二本鎖分子の群を生成する段階；および５’一本鎖末端を有する二本鎖分子の群を変性させ、核酸ハイブリダイゼーションプローブを含む群を生成する段階を含む。プライマーは、以下の構造：５’−Ｓ−Ｌ−Ａ−３’［式中、Ｓはシグナル伝達ドメインを含み、Ｌはリンカーを含み、およびＡはアダプターを含む。］を有する一本鎖分子を含む。シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの標識を有する核酸または少なくとも１つの付加的な核酸に結合するための少なくとも１つの核酸ドメインを有する核酸を含む。リンカーは、少なくとも１つの脱塩基部位を有する部分を含み、この部分は、この部分を含む核酸鋳型上での伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックする。アダプターは、末端アダプター配列を含むフラグメントの群の各成員の末端のアダプター配列に対応する核酸配列であって、およびＤＮＡ増幅を用いた末端アダプター配列を含むフラグメントの群でのプライマー伸長を許容する適切な鎖極性を有する核酸配列を含む。
【００１５】
５番目の態様では、本発明は、試料中の核酸配列標的を検出する方法であって、以下の段階：核酸配列標的を含有する試料を得る段階；試料を核酸ハイブリダイゼーションプローブと接触させる段階；およびハイブリダイゼーションシグナルを視覚化する段階を含む方法である。核酸ハイブリダイゼーションプローブは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブおよびこれらの組合せから成る群より選択される。
【００１６】
６番目の態様では、本発明は、試料中の核酸配列標的を検出する方法であって、以下の段階：核酸配列標的を含有する試料を得る段階；試料を核酸ハイブリダイゼーションプローブ系と接触させる段階；試料をリガーゼ反応に供する段階；およびハイブリダイゼーションシグナルを視覚化する段階を含む方法である。核酸ハイブリダイゼーションプローブ系には、請求項３５に記載の系が含まれる。
【００１７】
７番目の態様では、本発明は、癌細胞の存在に関して試料をスクリーニングする方法である。この方法は幾つかの段階を含む。１番目の段階は、複数の細胞を含有する試料を得る段階である。２番目の段階は、染色体プローブのセットを試料にハイブリダイズさせる段階であり、このセットは、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む。３番目の段階は、試料中の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階である。ハイブリダイゼーションパターンは、試料中の癌細胞の存在を示す、試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにする。染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項４０に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ系およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む。
【００１８】
８番目の態様では、本発明は、患者における癌の状態を予測および観測する方法である。この方法は幾つかの段階を含む。１番目の段階は、患者から複数の細胞を含有する試料を得る段階である。２番目の段階は、染色体プローブのセットを試料にハイブリダイズさせる段階であり、このセットは、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む。３番目の段階は、試料中の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階である。ハイブリダイゼーションパターンは、試料中の癌細胞の存在を示す、試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、試料中の癌細胞の割合の増加は、患者における癌の進行または再発を示し、試料中の癌細胞の減少は、患者における癌の減少または寛解を示す。染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項４０に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ系およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む。
【００１９】
９番目の態様では、本発明は、患者において癌を治療するための抗癌治療薬の有効性を観測する方法である。この方法は幾つかの段階を含む。１番目の段階は、患者を抗癌治療薬で治療する前と治療後に患者から複数の細胞を含有する試料を得る段階である。２番目の段階は、染色体プローブのセットを試料にハイブリダイズさせる段階であり、このセットは、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む。３番目の段階は、試料中の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階である。ハイブリダイゼーションパターンは、試料中の癌細胞の存在を示す、試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにし、患者を抗癌治療薬で治療する前の試料中の癌細胞の割合と比較して、患者を抗癌治療薬で治療した後の試料中の癌細胞の割合の増加は、抗癌治療薬が無効であることを示し、患者を抗癌治療薬で治療する前の試料中の癌細胞の割合と比較して、患者を抗癌治療薬で治療した後の試料中の癌細胞の割合の減少は、抗癌治療薬が有効であることを示す。染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項４０に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ系およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む。
【００２０】
１０番目の態様では、本発明は、患者を癌の存在に関して診断する方法である。この方法は幾つかの段階を含む。１番目の段階は、複数の細胞を含有する試料を患者から得る段階である。２番目の段階は、染色体プローブのセットを試料にハイブリダイズさせる段階であり、このセットは、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む。３番目の段階は、試料中の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階である。ハイブリダイゼーションパターンは、試料中の癌細胞の存在を示す、試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにする。染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項４０に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ系およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む。
【００２１】
１１番目の態様では、本発明は、癌を有することが疑われる患者の予後を示す方法である。この方法は幾つかの段階を含む。１番目の段階は、複数の細胞を含有する試料を得る段階である。２番目の段階は、染色体プローブのセットを試料にハイブリダイズさせる段階であり、このセットは、１つ以上の染色体における特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む。３番目の段階は、試料中の複数の細胞における染色体プローブのセットのハイブリダイゼーションパターンを視覚化する段階である。ハイブリダイゼーションパターンは、試料中の癌細胞の存在を示す、試料中の特定の核酸配列標的の少なくとも１つの増幅、転座、欠失または再配置が存在することを明らかにする。染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項４０に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ系およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む。
【００２２】
１２番目の態様では、本発明は、染色体プローブのセットならびに、場合により、スライドガラス、リン酸緩衝生理食塩水、ハイブリダイゼーション緩衝液、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド、塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム溶液、固定液、エタノール、非イオン性界面活性剤および変性緩衝液から成る群より選択される１つ以上の試薬を含むキットである。染色体プローブのセットは、請求項１に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項２７に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ、請求項４０に記載の核酸ハイブリダイゼーションプローブ系およびこれらの組合せから成る群より選択される少なくとも１つの成員を含む。プローブは、各プローブが生物学的試料へのハイブリダイゼーション後に明瞭に視覚化され得るように標識されている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ａ：構造１００が核酸ハイブリダイゼーションプローブである、１つの実施形態を例示する。１００の３’部分は、標的核酸配列（示していない。）にハイブリダイズするハイブリダイゼーションドメインＨ（１０１）である。構造１００はまた、アダプターＡ（１０２）、リンカーＬ（１０３）およびシグナル伝達ドメインＳ（１０４）も含む。１０２および１０３の構造および機能は以下で詳述する。Ｂ：１０４に組み込まれた複数の標識（星印で表している。）を含む構造１００の１つの実施形態を例示する。Ｃ：場合により標識された（星印で表している。）別の核酸１０７への結合のための複数の結合部位１０６を含む構造１００の１つの実施形態を例示する。両端の矢印は、１０６と１０７の間でのハイブリダイゼーションのための核酸配列相補性を示す。
【図２】Ａ：構造１００の１つの実施形態ならびに付加的な核酸１０７および１１０との相互作用を例示する。１０７および１１０の各々は、標識（星印で表している。）を含むことができる。両端の矢印は、異なる分子鎖間でのハイブリダイゼーションのための核酸配列相補性を示す。Ｂ：１００が核酸配列標的にハイブリダイズした場合に１００、１０７および１１０の間で形成される枝分かれしたハイブリダイゼーションネットワークの１つの実施形態を例示する。小さな線は、異なる分子鎖間でのハイブリダイゼーションのための核酸配列相補性を示す。
【図３】Ａ：核酸ハイブリダイゼーションプローブ１１３を、５’一本鎖末端（１１７で表している。）を有する二本鎖形態として例示する、別の実施形態を示す。Ｂ：分子を、１１７によって１０４にハイブリダイズするまたは構造１００に関しては１０４中に存在する複数の１０６にハイブリダイズするために使用できる、１つの実施形態を例示する。図３Ｂでは、構造１００は標的ＤＮＡにハイブリダイズしている。Ｃ：構造１１３を、核酸配列標的を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして直接使用することができ、構造１１３内の１１７が標的ＤＮＡに相補的な配列を有する、選択的な実施形態を例示する。
【図４】Ａ：２０１および２０２を含む核酸ハイブリダイゼーションプローブ系２００の構成要素を例示する。Ｂ：２００が核酸標的Ｔ（２０７）と相互作用する１つの実施形態を例示する。構造２０４および２０６は、２００のＤ１：Ｄ２を含む二本鎖を形成し、構造２０３および２０５は、標的２０７とハイブリダイゼーション構造Ｈ１およびＨ２をそれぞれ形成する。Ｃ：２１０および２１１が標識されている、２１０および２１１を含むシグナル伝達ドメイン２０９を例示する。Ｄ：構造２０１、２０１’、２０２および２０２’が、それぞれ構造２００および２００’についての異なる核酸ハイブリダイゼーションプローブ成分を示す、２００の別の実施形態を例示する。オリゴヌクレオチド２０４ｃおよび２０６ｃは、構造２００および２００’の核酸配列標的Ｔ、２０７への初期アニーリングの間にそれぞれ構造２００および２００’の核酸ハイブリダイゼーションプローブ成分２０４および２０６（図４Ｄには表示していない。）の全部または一部にハイブリダイズする相補的な核酸である。Ｅ：２００、２０９、標的Ｔ（２０７）の間にリガーゼコンピテントな基質を含む系の成分についての作用の原理を例示し、核酸配列標的との最小塩基対合相互作用と共に例示される２０２などの、散在性結合プローブは、リガーゼのための必須の基質（例えば２０８と２１２の間で形成される雑種）を形成しない。
【図５】Ａ：シグナル増幅アダプター２１３およびこれのオリゴヌクレオチド成分、２１６、２１７および２１８を例示する。Ｂ：シグナルアダプター２１３の作用の原理を例示し、シグナル増幅アダプター２１３は２００と２０９の間で選択的な複合体を形成することができる。Ｃ：シグナルアダプター２１３の作用の原理を例示し、シグナル増幅アダプター２１３は２００と２０９の間で選択的な複合体を形成することができる。
【図６】構造１００の核酸ハイブリダイゼーションプローブを作製するための方法を例示する。
【図７】構造１１３の核酸ハイブリダイゼーションプローブを作製するための方法を例示する。星印は、ＤＮＡ増幅の間に組み込まれた内部標識を示す。
【図８】構造２００の核酸ハイブリダイゼーションプローブ（即ち２０１および２０２）を作製するための方法を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、改善された核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供する。本発明は、改善された生産収率を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブに関する。さらに、本発明は、優れたシグナル生成能力を有する堅固なプローブ設計を対象とする。本発明は、ＦＩＳＨ適用において使用するための核酸ハイブリダイゼーションプローブの例を提供する。当業者は、しかし、本発明が核酸ハイブリダイゼーションプローブを使用するすべての形態の核酸検出に幅広い適用性を有することを認識する。
【００２５】
プローブ設計および作用原理
図１Ａを参照すると、構造１００を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブは好ましい実施形態である。構造１００は、ハイブリダイゼーションドメインＨ（１０１）、アダプターＡ（１０２）、リンカーＬ（１０３）およびシグナル伝達ドメインＳ（１０４）を含む。ハイブリダイゼーションドメインＨは、所望標的部位にハイブリダイズする核酸配列である。アダプターＡは、ハイブリダイゼーションドメインＨの末端に共有結合的に連結されている人工核酸配列である。リンカーＬは、伸長ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を終結させるまたはブロックする働きをする部分である。シグナル伝達ドメインＳは、標識を含む、または標識を含む別の核酸にハイブリダイズする核酸配列である。
【００２６】
ハイブリダイゼーションドメインＨ（１０１）は、約５０ヌクレオチドから約５，０００ヌクレオチドの長さを有し得る。１０１の好ましい長さは、約１５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの範囲にわたる。１０１の極めて好ましい長さは、約２００ヌクレオチドから約３５０ヌクレオチドの範囲にわたる。以下でさらに詳細に説明するように、これらの範囲は、一部には１００が作製される方法に起因して、１０１に関して好ましい。
【００２７】
アダプターＡ（１０２）は、約１５ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの長さを有し得る。１０２の好ましい長さは、約１８ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドの範囲にわたる。１００の多くの実施形態に関して、１０２は１０１と無関係な核酸配列であり、これらの配列またはこれらの相補物が標的核酸中で見出される限り、天然では１０１の核酸配列に結合して見出されることはない。これに関して、１０２は、設計によって正確な配列を特定し得る人工核酸である。以下でさらに詳細に説明するように、１０２は、１００の特定の実施形態において１０１の配列に隣接する天然の核酸の配列と共通する配列を有し得る。
【００２８】
リンカーＬ（１０３）は、ポリメラーゼが１０３を含む鋳型から相補鎖核酸を合成する場合に、伸長ＤＮＡポリメラーゼによる伸長をブロックするまたは終結させる部分である。従って、ポリメラーゼは、鋳型鎖中で１０３に遭遇したときに相補鎖核酸の合成を終結する。生じた相補鎖生成物は、鋳型鎖中の１０３を含む部位に隣接する３’末端を有する。
【００２９】
相補鎖上で伸長ポリメラーゼによる伸長をブロックするまたは終結させることができるいずれの部分も、１０３における使用に適する。このような部分は当分野で周知であり、塩基を欠くスペーサー（例えば脱塩基部位）が含まれる。好ましい部分は、確立された合成核酸化学（例えばホスホルアミダイト化学）を用いた核酸の化学合成の間に組み込まれ得る部分である。好ましい部分の例には、ｉＳｐ１、ｉＳｐＣ３、ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）と称されるスペーサーが含まれる。より長いスペーサー、ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８で認められるのと同じポリメラーゼブロック作用を達成するために。複数のｉＳｐ１またはｉＳｐＣ３スペーサーを１０３のために使用し得る。以下で説明する理由から、１０３に含めるためにより長いスペーサー（ｉＳｐ９およびｉＳｐ１８）は短いスペーサー（ｉＳｐ１およびｉＳｐＣ３）よりも好ましい。１０３のための極めて好ましい部分はｉＳｐ９である。
【００３０】
シグナル伝達ドメインＳ（１０４）は、少なくとも１つの標識を含む（図１Ｂ参照）、または少なくとも１つの標識を含む別の核酸のためのハイブリダイゼーション部位として働く（図１Ｃ参照）核酸配列である。１０４の好ましい長さは、約１８ヌクレオチドから約１８０ヌクレオチドの範囲にわたる。１０４の極めて好ましい長さは、約２５ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００３１】
図１Ｂを参照すると、１０４の好ましい実施形態は、少なくとも１つの標識１０５を含む。より好ましくは、１０４は複数の標識を含む。具体的には、１０４は複数の標識を含み、標識は３−１２ヌクレオチドごとに分布している。最も好ましくは、１０４は複数の標識を含み、標識は６ヌクレオチドごとに分布している。
【００３２】
図１Ｃを参照すると、１０４の好ましい実施形態は、複数の結合部位１０６を含む。このような実施形態に関して、１０６は、標識されている少なくとも１つの他の核酸１０７のための結合部位としての役割を果たす。１０４が複数の１０６から成る場合、１０６の好ましい数は、１０６の長さおよび１０２と１０３の長さに依存して、２−１０の範囲にわたる。１０６の好ましい長さは、約１０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの範囲にわたる。１０６の極めて好ましい長さは、約１８ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００３３】
ヌクレオチド当量化学単位は、従来の核酸合成化学、例えばホスホルアミダイトに基づく化学を用いて合成オリゴヌクレオチドを化学合成するための個別の合成ビルディングブロック単位である。特定の実施形態では、構造１００は１０１、１０２、１０３および１０４を有し、１０２、１０３および１０４の合計は、好ましくは約２００ヌクレオチド当量化学単位未満である。
【００３４】
説明のために以下の例を検討する。２５ヌクレオチドの核酸配列を有する１０２は、２５ヌクレオチド当量化学単位に相当する。１個のｉＳｐ９部分を有する１０３は、１ヌクレオチド当量化学単位である。３コピーの１０６を有し、各々の１０６が２５ヌクレオチドを有する核酸配列から成る、１０４は、７５ヌクレオチド当量化学単位に相当する。前述した１０２、１０３および１０４を有する１００の例に関して、エレメント１０２、１０３および１０４の合計は１０１ヌクレオチド当量化学単位に相当する。核酸の化学合成を達成するための現在の技術水準の方法の実際的な限界は約２００ヌクレオチド当量化学単位であるので、エレメント１０２、１０３および１０４の合計は、好ましくはこの値未満である。
【００３５】
上述したように、エレメント１０３は、好ましくは１ヌクレオチド当量化学単位である。エレメント１０３は複数のｉＳｐ１またはｉＳｐＣ３スペーサーで構成され得るが、経済性およびプローブ設計を考慮するとより長いスペーサー（例えばｉＳｐ９またはｉＳｐ１８）を選択することが好ましい。
【００３６】
図２Ａを参照すると、１０７の好ましい実施形態は一本鎖核酸分子である。一般に、１０７は約２５ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの範囲にわたる長さを有する。この実施形態によれば、１０７は、１つ以上の１０６の特異的対合パートナーに対応する１０８を含む。１０８の好ましい長さは、約１０ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの範囲にわたる。１０８の極めて好ましい長さは、約１８ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００３７】
一部の実施形態では、１０７は直接標識されている。場合により、または、１０７は、直接標識されているかまたは標識された少なくとも１つの付加的な核酸（１１０）のための結合部位として働く、複数の１０９を含む。このような実施形態では、各々の１０９は、約２５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの好ましい長さを有する。
【００３８】
１１０は、１つ以上の１０９の対合パートナーに対応する１１１を含む。従って１１１は、１０９の長さと類似の好ましい長さ、または約２５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さを有する。エレメント１１０は直接標識され得る。場合により、または、１１０は、直接標識されているかまたは標識された少なくとも１つの付加的な核酸のための結合部位として働く、複数の配列１１２を含み得る。各々の１１２の好ましい長さは、約２５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００３９】
シグナル増幅は、１０６と１０８の間および１０９と１１１の間で形成される対合相互作用によって１００と複数の１０７および１１０の間で形成される枝分かれしたハイブリダイゼーションネットワークの形成を通して起こる。付加的な一本鎖核酸がこれらの対ハイブリダイゼーション相互作用に基づいて設計される場合はより広範なハイブリダイゼーションネットワーク形成が可能であり、これらの変形は本発明の範囲内である。
【００４０】
図３は、核酸ハイブリダイゼーションプローブの別の実施形態を提供する。図３Ａを参照すると、核酸ハイブリダイゼーションプローブは部分的二本鎖核酸１１３から成る。１１３は、二本鎖ＤＮＡ（１１４）、アダプター（１１５）、リンカー（１１６）および一本鎖結合領域（１１７）を含む。
【００４１】
１１４は、好ましくは内部標識されており、１１３のシグナル伝達部分としての役割を果たす。１１５は、１１４の末端に共有結合的に連結されている人工核酸配列である。１１６は、伸長ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を終結させるまたはブロックする働きをする部分である。一本鎖結合領域（１１７）は、別の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列である。
【００４２】
図３Ｂを参照すると、１１３は、１００に結合してシグナル検出を提供する、少なくとも１つの付加的な核酸である。この適用では、１１７は、１０４に、または構造１００の１０４中に位置する１以上のコピーの１０６に結合する。このような適用では、１１７は、約２５から４０ヌクレオチドの範囲にわたる好ましい長さを有する。
【００４３】
図３Ｃを参照すると、構造１１３は、核酸配列標的を直接検出するための核酸ハイブリダイゼーションプローブとして働く。この適用では、構造１１３が構造１００と同じ機能を果たすので、構造１００は必要ない。この実施形態では、構造１１３の１１７は、構造１００のハイブリダイゼーションドメインＨ（１０１）と同じ機能を果たす；即ち１１７は、所望の核酸配列標的にハイブリダイズする核酸配列である。このような適用では、１１７の好ましい長さは５０ヌクレオチドから１８０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００４４】
１１４は、１０１に関して先に述べたのと同じ長さ基準を有する。１１４は、天然配列または定義された配列組成を有する人工配列のいずれかであり得る。
【００４５】
１１５、１１６および１１７の設計基準は、それぞれ１０２、１０３および１０４に関して先に論じた設計上の配慮に従う。
【００４６】
核酸標的が１００および１１３を用いて検出される原理を図３Ｂに例示する。反応の順序についていかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、以下は作用原理を説明する。構造１００は、１０１との相互作用によって核酸標的領域にハイブリダイズする。少なくとも１つの１１３は、１１７と１０４の間の相互作用によって１００とハイブリダイズする。１０４が複数の１０６を含む場合、複数の１１３は各々の１０６と各々の１１７との相互作用によって１００にハイブリダイズする。この後者の例では、シグナル増幅は、複数の１１３が構造１００を介して核酸標的に結合したときに生じる。標的核酸は１１４中のシグナルによって検出される。
【００４７】
図４を参照すると、構造２００を有する核酸ハイブリダイゼーションプローブは好ましい実施形態である。図４Ａを参照すると、２００は、２０１および２０２を有する２つの部分に分かれた構造である。２０１は、ハイブリダイゼーションサブドメインＨ１（２０３）およびシグナル伝達アクセプターサブドメインＤ１（２０４）を含む。２０２は、ハイブリダイゼーションサブドメインＨ２（２０５）およびシグナル伝達アクセプターサブドメインＤ２（２０６）を含む。
【００４８】
２０３および２０５の供給源に依存して、これらの好ましい長さは約２５ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にわたる。２０３および２０５が、合成オリゴヌクレオチド化学を用いて、それぞれ２０１および２０２の一部として調製される場合は、２０３および２０５の好ましい長さは約２５ヌクレオチドから約１８０ヌクレオチドの範囲にわたる。２０３および２０５を、以下で述べる手順を用いて核酸配列標的の供給源から調製する場合は、２０３および２０５の好ましい長さは約１００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にわたる。２０３および２０５の好ましい長さは１８−４０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００４９】
図４Ｂを参照すると、２０３および２０５は核酸標的Ｔ（２０７）の連続するセグメントにハイブリダイズする。核酸２０４と２０６は、２０４と２０６の間で形成される二本鎖の末端に末端一本鎖配列（２０８）が存在することを除いて、相補的である。エレメント２０８は、１−６ヌクレオチドの好ましい長さを有する一本鎖配列に対応する。エレメント２０８は、シグナル伝達ドメインＳ（２０９）のための連結部位として働く。
【００５０】
図４Ｃを参照すると、２０９は２本の相補鎖（２１０および２１１）を有する。核酸２１０および２１１は、約２５ヌクレオチドから１０，０００ヌクレオチドの範囲にわたる好ましい長さを有する。２１０および２１１を、合成オリゴヌクレオチド化学を用いて調製する場合、２１０および２１１の長さは約２５ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドの範囲にわたる。合成オリゴヌクレオチドとしての２１０および２１１の極めて好ましい長さは、約５０ヌクレオチドから約１５０ヌクレオチドの範囲内にある。２１０および２１１をＰＣＲなどの酵素的手段によって調製する場合は、２１０および２１１の長さは約１００ヌクレオチドから約１０，０００ヌクレオチドの範囲にわたる。酵素的手段によって調製される２１０および２１１の極めて好ましい長さは、約２００から３５０ヌクレオチドの範囲内にある。２１０および２１１を一緒にアニーリングさせた場合、これらは、シグナル伝達アクセプタードメイン結合部位である一本鎖末端（２１２）を有する完全な二本鎖を形成する。２１２は、エレメント２０８と配列相補性を有する。
【００５１】
図４Ｄを参照すると、構造２００の特定の実施形態は、２０３および２０５のための供給源ＤＮＡから酵素的に調製される核酸配列を有する２０１および２０２のフラグメントライブラリで構成され得る。これらの実施形態に関して、多くの非生産的な２００の二分された構造は、フラグメントライブラリ中の２つの連続しない２０１および２０２構造をアニーリングさせることから生じる。２０３と２０５が最初に２０７の連続する配列にハイブリダイズした後、２０４と２０６が相互作用するようにハイブリダイゼーション工程を制御することが好ましい。この理由から、２０１、２０２および２０７を含む初期ハイブリダイゼーション反応に、２０４および／または２０６に相補的なオリゴヌクレオチドまたはこのサブ配列（例えば図４Ｅ、２０４ｃおよび２０６ｃ参照）を含めることが好ましい。２０３および２０５が２０７にハイブリダイズすれば、試料を適切なストリンジェンシー条件下で洗浄し、非結合配列（２０１、２０２ならびに２０４ｃおよび／または２０６ｃ）を除去する。この後、２０４と２０６のアニーリングおよび２０８の形成を許容するようにハイブリダイゼーション条件を調整する。
【００５２】
２０８および２１２の配列ならびに２０８および２１２に相補性を有する配列を有する本明細書で述べる他の核酸は、パリンドローム配列または非パリンドローム配列のいずれかとして化学設計により特定される。２０８および２１２についての両タイプの構造が、末端の化学設計を制御することによって形成される。この制御は、所望配列末端を作製するために適切な合成オリゴヌクレオチド化学配列を選択することによってまたは、特に二本鎖形態の２０９からこのような末端を生成するために、所望生成物配列末端を作製する適切な制限酵素を選択することによって達成される。
【００５３】
２０８および２１２についてのパリンドローム配列設計は、多数のコピーの２００および２０９が相互作用して、２００：２００、２００：２０９および２０９：２０９のハイブリダイゼーション対を形成することを可能にする。好ましい相互作用には、２００：２０９および２０９：２０９のハイブリダイゼーション対が含まれる。
【００５４】
２０８および２１２についての非パリンドローム配列設計は、多数のコピーの２００および２０９が相互作用して、２００：２０９の組合せを形成することを可能にする。
【００５５】
２０９は２つの２１２を有するので、１つのパリンドローム２１２および１つの非パリンドローム２１２を有する２０９を設計し得る。２０９のこのような設計は、２００を、２０９中の１つの２１２の非パリンドローム配列に相補的な２０８についての非パリンドローム配列を有するように設計した場合、２００：２０９のハイブリダイゼーション相互作用の形成を可能にする。
【００５６】
２０９は少なくとも１つの標識を含む。好ましくは、２０９は複数の標識を含む。このような標識は、２０９の内部または末端に組み込まれる。好ましくは、２１０および２１１をＰＣＲなどの酵素的手段によって生成する場合は、２０９を内部標識する。
【００５７】
図４Ｅを参照すると、所与の核酸標的についてのシグナル検出は、以下の方法で２００および２０９を用いて達成される。核酸２０１、２０２、２１０および２１１を、エレメント２０７を有する核酸標的を含む試料と接触させ、ハイブリダイゼーションを可能にする。反応の順序に関していかなる特定の理論にも限定されるものではないが、以下は作用原理を説明する。２０７は、２０３と２０５をアニーリングさせるためのハイブリダイゼーション基質として働く。２０４と２０６のハイブリダイゼーションによる２００の形成は、２０３と２０５が２０７にアニーリングする前またはアニーリング後のいずれかに起こる。好ましくは、２１０と２１１がハイブリダイズして２０９を形成する。２０９が形成されれば、２０９は、２１２と２０８の間の相補的塩基対合によって２００とハイブリッドを形成するために使用可能である。リガーゼを含む連結緩衝液を試料に添加して、２０８の２１２への連結を可能にし、２００と２０９の間で共有結合複合体形成を生じさせる。連結後、試料を洗浄して、ハイブリダイズしていない２０１、２０２、２１０および２１１ならびに複合体化していない２０９を除去する。２０７の検出は、２０９中に位置するシグナル伝達標識で達成される。
【００５８】
前記シグナル検出法の様々な置換および変更は、本開示に基づき当業者には明らかであり、これらは本発明の範囲に含まれる。例えば、２００の特定の実施形態を予備形成した後に、２０７を含む試料と接触させることが好ましいと考えられる。同様に、２０９を予備形成した後、試料と接触させることができる。同様に、２０７を含む試料への２００および２０９の添加の順序は、付加的な洗浄段階を含めることを可能にするように設定できる。例えば、接触させた試料混合物から非結合２００を、洗浄を用いて除去した後、２０９を接触試料混合物に添加することができる。
【００５９】
図５を参照すると、シグナル増幅はアダプター分子２１３を用いて達成される。２１３は複数のシグナルアクセプタードメイン（２１４）を含み、各々のシグナルアクセプタードメインは、シグナルドメインにハイブリダイズする部位（２１５）を含む。２１５は２１２および／または２０８に相補的である。
【００６０】
２０８および２１２と同様に、２１５の配列はパリンドロームまたは非パリンドロームであり得る。２１６、２１７および２１８を作製するには合成オリゴヌクレオチド化学を使用することが好ましいので、２１５の配列設計は正確に決定される。従って、２１５の設計は２０８および２１２について述べたのと同じ配慮に従う。
【００６１】
２１３についての複数の２１４は、少なくとも３コピーの２１４を指す。２１３についての複数の２１４は、好ましくは３−６の範囲である。最も好ましくは、３コピーの２１４が２１３中に存在する。
【００６２】
３コピーの２１４を有する２１３の一例を図５Ａに例示する。この構造を有する２１３を形成するには、３つの対の相補的一本鎖核酸、２１６、２１７および２１８が必要である。２１６は２１９および２２０を含む；２１７は２２１および２２２を含む；ならびに２１８は２２３および２２４を含む。
【００６３】
核酸２１６、２１７および２１８は、約３０ヌクレオチドから約１２０ヌクレオチドの長さを有し得る。２１６、２１７および２１８の好ましい長さは、約５０ヌクレオチドから約９０ヌクレオチドの範囲にわたる。２１６、２１７および２１８の対応する部分、即ち２１９から２２４までの好ましい長さは、２１６、２１７および２１８のそれぞれの長さのおよそ半分である。上記で説明したように、このような分子は、好ましくは合成オリゴヌクレオチド化学を用いることによって作製される。
【００６４】
２１６、２１７および２１８の配列組成に関して、各々の２１４の末端に存在する各々の生じた２１５は同じ一本鎖配列を有することが好ましい。これは、２１５が核酸ハイブリダイゼーションプローブアッセイ条件において２１２にハイブリダイズするという事実に起因する。２０９中の非パリンドローム２１２に相補的な同じ２１５モチーフを有する２０９構造に関して、２００：２０９：２１３：（２０９）２ハイブリダイゼーション複合体の形成が生じる。２１５が２０８ならびに２１２にハイブリダイズする場合、２１５の少なくとも１つは２０８に相補性を有するようにすることが好ましいと考えられる。このような設計は、２００：２１３：（２０９）２の複合体の形成を可能にする（例えば図５Ｂ参照）。２０８、２１２および２１５が共通のパリンドローム相補的配列を共有する場合、数ある中でも特に、２００：２１３：（２０９）２：［２１３：（２０９）２］ｎ［式中、ｎは１より大きい任意の整数である。］（例えば図５Ｂ参照）および２００：２０９：２１３：（２０９）２［２１３：（２０９）２］ｎ［式中、ｎは１より大きい任意の整数である。］（例えば図５Ｃ参照）を含む、多数の種類の複合体が生じる。
【００６５】
反応の順序に関していかなる特定の理論にも限定されるものではないが、以下は２１３についての構築原理を説明する。核酸２１６、２１７および２１８は、２１９を２２４にハイブリダイズし；２２０を２２１にハイブリダイズし；および２２２を２２３にハイブリダイズすることによって２１３を形成する。
【００６６】
複数の２１３モノマーを有するより高次の構造を形成することができる。このような構造は、所与の２１３モノマーについて少なくとも１つの２１４が形成できない場合に生じる。１つの不完全な２１３アセンブリの対合していない核酸は、同様に不完全な２１３アセンブリの非対合核酸との対合パートナーとして働く。
【００６７】
このような高次アセンブリは、核酸ハイブリダイゼーションプローブアッセイにおいて生産的反応ではなく沈殿を導き得るので、２１３を個別の単分子アセンブリ（２１３モノマー）として予備形成し、アッセイで使用する前にこれらを精製することが望ましい。２１３モノマーを精製する任意の適切な手段、例えばサイズ排除ゲルクロマトグラフィを使用し得る。
【００６８】
標識化の検討
本明細書で使用される場合、「標識」は、ある部分の固有の化学特性または別の分子と反応するこの部分の能力に基づき、検出可能なシグナルを生成することができる任意の部分を指す。標識の例には、放射性、蛍光または化学発光分子または酵素が含まれる。標識には、ビオチン−アビジン系および抗原−抗体系などの、容易に検出可能な他の分子に対して親和性を有する分子も含まれる。
【００６９】
好ましい化学発光標識にはアクリジニウム化合物が含まれる。例示的なアクリジニウム化合物には、アクリジニウム−９−カルボキサミドおよびアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルが含まれる。このような化合物は、例えば、ＣＨＥＭＩＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ  ＡＣＲＩＤＩＮＩＵＭ  ＳＡＬＴＳと題する、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ  ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，７８３，６９９号およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＫＩＴＳ  ＦＯＲ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＡＮＤ  ＱＵＡＮＴＩＦＹＩＮＧ  ＤＡＭＡＧＥ  ＣＡＵＳＥＤ  ＢＹ  Ａ  ＰＡＲＡＳＩＴＥと題する、Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ ａｌ．への米国特許出願公開第２０１０００１５６５５Ａ１号に記載されており、これらの内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７０】
ＦＩＳＨ検出系に関して、染色体プローブは、典型的には、低波長／高エネルギーの光を吸収した後蛍光を発する有機分子である、発蛍光団で直接標識される。発蛍光団は、二次検出分子なしでプローブを視覚化することを可能にする。発蛍光団をヌクレオチドに共有結合的に連結した後、ヌクレオチドを標準的な技術、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングおよびＰＣＲ標識化などでプローブに直接組み込むことができる。または、プローブ中のデオキシシチジンヌクレオチドを、リンカーを用いてアミノ基転移させることができる。発蛍光団は次に、アミノ基転移されたデオキシシチジンヌクレオチドに共有結合的に連結される。例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＤＩＲＥＣＴ  ＬＡＢＥＬ  ＴＲＡＮＳＡＭＩＮＡＴＥＤ  ＤＮＡ  ＰＲＯＢＥ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ  ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥＩＲ  ＭＡＮＵＦＡＣＴＵＲＥと題する、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４９１，２２４号参照。
【００７１】
例えば、セット中の各染色体プローブを明瞭に視覚化できるように、異なる色の発蛍光団を選択する。例えば、以下の発蛍光団の組合せを使用し得る：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネートおよびＣａｓｃａｄｅ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【００７２】
蛍光特性を有する他の分子も適切な標識である。例えば、２４０ｋＤａタンパク質であるフィコエリトリンのようなタンパク質は堅固な蛍光特性を示す。一本鎖オリゴヌクレオチドを、シグナル伝達物質としての役割を果たすようにタンパク質に結合することができる（例えば１０７または１１０の標識形態、例えば図２参照）。量子ドット、ナノ結晶および関連する半導体発蛍光団を含む、蛍光特性を有する他の標識も使用し得る。
【００７３】
複数の標識を含む核酸プローブの実施形態に関して、含有するために選択される標識は、単一の種類の標識または多数の種類の標識を含み得る。多数の種類の標識が、複数の標識を有する核酸プローブ中に含まれる場合、２から２０もの異なる種類の標識を使用することができる。これらの場合、複数の標識は、２から２０もの異なるハイブリダイゼーション事象（例えばＦＩＳＨ適用における１つ以上の遺伝子座）を視覚化する、識別するまたは定量化することを可能にする、異なる光学特性または分光特性を有し得る。極めて好ましい実施形態では、別々の識別可能な光学特性または分光特性を有する２から５の異なる標識に及ぶ複数の標識を核酸プローブにおいて使用することができる。複数の標識を含む核酸プローブの実施形態に関して、生じる複雑なハイブリダイゼーションシグナルの多重化分析は、特定のスペクトル特徴（帯域通過）の顕微鏡フィルタを用いて評価し得るか、または画像化し、画像を適切なソフトウェアで処理した後デコンボリューションすることができる。このような画像化ソフトウェア適用は当分野において一般的に使用可能である。
【００７４】
蛍光プローブは、蛍光顕微鏡および各々の発蛍光団について適切なフィルタを用いて、またはデュアルもしくはトリプル帯域通過フィルタセットを使用して多数の発蛍光団を観察することによって視覚化される。例えば米国特許第５，７７６，６８８号参照。または、フローサイトメトリなどの技術を使用して染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを検討することができる。
【００７５】
プローブはまた、ビオチンまたはジゴキシゲニンで間接的に標識するか、または３２Ｐおよび３Ｈなどの放射性同位体で標識することができるが、プローブを視覚化するために二次検出分子またはさらなる処理が必要である。例えば、ビオチンで間接的に標識されたプローブは、検出可能なマーカーに結合されたアビジンによって検出することができる。例えば、アビジンをアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素マーカーに結合することができる。酵素マーカーは、酵素の基質および／または触媒を使用して標準的な比色反応において検出することができる。アルカリホスファターゼの触媒には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムが含まれる。ジアミノベンゾエートはホースラディッシュペルオキシダーゼの触媒として使用することができる。
【００７６】
蛍光標識は、蛍光を検出する任意の適切な手段によって視覚化される。好ましくは、蛍光顕微鏡検査と適切なフィルタを用いて標識を視覚化する。このような技術および自動デジタル画像システムは当分野で周知である。
【００７７】
構造１００を標識することについて述べた標識手順は、１０７、１１０、１１２、１１３および２０９などの他のプローブにも適用できる。
【００７８】
プローブの調製
特定の実施形態では、エレメント１０１、１０２、１０３および１０４を有する構造１００は以下の方法で調製される（図６参照）。エレメント１０１の配列を含む核酸試料を断片化する。核酸を断片化する当分野で公知の任意の手段を用いることができる。核酸を断片化する好ましい手段には、超音波処理および制限酵素消化が含まれる。超音波処理は核酸を断片化するための最も好ましい手段である。超音波処理手順を核酸試料で実施し、約５０ヌクレオチドから約５，０００ヌクレオチドの長さを有する核酸フラグメントの群を得る。核酸フラグメントの好ましい長さは、約１５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチドの範囲にわたる。核酸フラグメントの極めて好ましい長さは、約２００ヌクレオチドから約３５０ヌクレオチドの範囲にわたる。
【００７９】
核酸フラグメントの群は、典型的には、超音波処理後は非平滑末端を有する。一本鎖基質に特異的なポリメラーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて末端を平滑化する。このような酵素および手順は当分野で周知である。
【００８０】
エレメント１０２の配列を有するアダプター（３００）およびこの相補物を核酸フラグメントの群の平滑末端に連結し、末端アダプターを担持する核酸フラグメントの群を生成する。場合により、しかし、核酸フラグメントの群の末端を含む相補的塩基突出部（例えばＡ突出部）に連結するための１塩基突出部（例えばＴ突出部）を有するアダプター（３００）も、末端アダプターを担持する核酸フラグメントの群を生成するために使用できる。１つの二本鎖アダプター配列がこの目的に十分であるが、配列組成が異なる２つの二本鎖アダプターを使用することが好ましい。アダプターは５’リン酸化分子として使用することができるが、非５’リン酸化分子を使用することが好ましい。連結反応は当分野で公知の任意の適切なリガーゼで触媒される。各アダプターの２本の鎖は、末端にアダプターの末端コンカテマーを生成することなく１つのアダプター末端だけがＤＮＡフラグメントの平滑末端に連結するために適合性であるように、長さが異なることも望ましい。
【００８１】
アダプターの目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてオリゴヌクレオチドプライマー（３０１）のためのプライマー結合部位として働くことである。３０１の設計は、１０４、１０３および１０２の配列（５’から３’へ）組成を有する。従って、３０１中に存在する１０２は、核酸フラグメントの群の各成員の３００にハイブリダイズし、ＰＣＲの間のポリメラーゼ媒介性伸長反応のためのプライマーとしての役割を果たす。ＰＣＲの最初のサイクル後、断片化した核酸の群を示すすべての増幅産物は、１０４、１０３および１０２を有する５’−３’末端構造を含む。１０３は、１０３に相補的な鎖上の部位でポリメラーゼの伸展または伸長をブロックする部分を含むので、ＰＣＲの２回目のサイクル後に生じた二本鎖ＰＣＲ産物は、１０４を含む一本鎖５’末端を有する。
【００８２】
アダプター（３００）が核酸フラグメントの群の末端に連結されれば、混合物をサイズによって分画する。サイズ分画法には、ゲル電気泳動、分別ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿またはクロマトグラフィサイジング（例えばＨＰＬＣ）の使用が含まれる。ゲル電気泳動によるサイズ分画の場合、２００ｂｐから３５０ｂｐの好ましい範囲内の核酸フラグメントの群を示すゲル画分をゲルから切り出す。核酸フラグメントの群を含むゲル切片を手早く加熱してゲルマトリックスを融解させ、混合物のアリコートを、適切な一本鎖型の３０１をプライマーとして用いるＰＣＲのために取り出す。
【００８３】
場合により、アダプター３００を含む核酸フラグメントの群の分取ＰＣＲをゲル電気泳動の前に実施することができる。分取ＰＣＲは、適切な一本鎖型の３０１をプライマーとして用いて達成される。
【００８４】
特定の実施形態では、構造１００はエレメント１０４中に標識シトシンを含む。このタイプの構造１００を調製する場合、ＰＣＲを開始する前に１０４のすべてのシトシンに標識を組み込むことが好ましい。この理由から、エレメント３００および３０１のための１０２の配列のプライマー設計にはシトシンを使用しないことが好ましい。この設計決定の理由は、３０１のすべてのシトシンの包括的な標識を１０４だけに局在させ、これにより３０１のプライマー部分、即ち１０２を未変化のまま残すことである。３０１は、同一の１０２（およびこの相補物）を含む３００および３０１の両方によって３００にハイブリダイズするので、これらのシトシン配列の必要性はプライマー配列鎖に対応するエレメント３００の設計にも当てはまる。
【００８５】
エレメント１０２の構造に対する前記の配列制約は、以下の状況では緩和され得るまたは適用する必要がない：（ａ）３０１の化学合成の間に標識を１０４に組み込む場合；または（ｂ）構造１００を調製するために標識された３０１を使用しない場合。非標識３０１を使用して構造１００を調製する場合は、構造１００を、調製に続いて後標識することができる。
【００８６】
１０４を、核酸塩基をアミノ化するためにビスルファイトを用いて後標識する場合、１０４を含む一本鎖５’末端が選択的にアミノ化されるように構造１００の未変性二本鎖形態を使用することが好ましい。構造１００の１０２は二本鎖であるので、１０２中に存在するいずれのシトシンも、一本鎖形態の３０１で認められる１０２の場合と同程度のアミノ化には供されることはない。
【００８７】
構造１００を、例えば１００全体にわたって核酸塩基をアミノ化するビスルファイト手法を用いることによって後標識する場合、分子全体が化学修飾のために利用可能であるように、変性した一本鎖形態の構造１００を使用することが好ましい。後標識手順は、構造１００全体にわたって標識含量の増加をもたらす。しかし、塩基特異的修飾試薬を使用する場合、特に１０４が別の核酸（例えば１０７；図１Ｃまたは２参照）のための結合部位として働く構造１００の実施形態に関しては、化学的に感受性の塩基を１０４から除外することが好ましい。例えば、構造１００の中のシトシンを修飾するためにビスルファイトを用いる後標識手順は、好ましくはシトシンが１０４から除外された構造１００を基質として用いて実施する。
【００８８】
構造１００を間接標識プローブとして使用する場合、１０４は標識されず、標識された少なくとも１つの他の核酸のための結合部位としての役割だけを果たす。これらの間接標識適用に使用される構造１００に関しては、１０２の配列は、シトシンを含む任意の配列組成を有することができる。
【００８９】
構造１００を調製するための基質である大部分の核酸は、ＤＮＡベクター（例えばプラスミド、ファージミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）において認められるクローン化された分子である。ほとんどのＦＩＳＨ適用に関して、ベクター配列は核酸標的にハイブリダイズしないので、構造１００を調製する前に所望核酸をベクター配列から精製する必要はない。ベクター配列が構造１００を調製するために使用される混合物中に含まれると、ベクター配列が陽性シグナルを同定するのを妨げる（または非特異的ハイブリダイゼーションバックグラウンドに寄与する。）場合が他の核酸検出システムに関しては存在する。特定のＦＩＳＨ適用に関しても、染色体中の遺伝子の一部だけを検出することが望ましい場合、遺伝子全体を含む供給源（即ちベクター）から遺伝子のこの部分に対応する核酸基質のサブセットを調製することが重要であり得る。さらに他の場合、所望核酸配列は、クローン化された分子と異なり、全ゲノムＤＮＡとしてのみ入手可能であり得る。これらの各々の場合に、所望核酸配列が公知である限り、所望核酸配列を増幅するために適切なＤＮＡおよびプライマーを用いて分取ＰＣＲを実施し得る。ひとたび得られれば、これらの配列を、上記で概説した方法に従って構造１００を調製するための基質として使用するために単離し、精製することができる。
【００９０】
ＦＩＳＨなどの一部のハイブリダイゼーション適用では、天然配列中に遍在的に認められる特定の反復配列エレメントを除外するように標的配列をさらに絞り込むことが重要であり得る。これに関して、生成されるＰＣＲ産物を特定するＰＣＲプライマー設計によって所望標的配列の正確な境界と組成を先験的に選択することができる。例えば、すべての染色体ＤＮＡ全体にわたって分散して認められる反復配列エレメント（例えばＳＩＮＥｓ、ＬＩＮＥｓおよびＬＴＲｓ）から非反復遺伝情報（例えば遺伝子コード情報）を描出するために、対象とする所与の染色体領域から１つの遺伝子座または複数の遺伝子座を分析することができる。描出されれば、次に非反復遺伝情報（即ち上記で定義した反復配列エレメントを持たない配列）だけを好ましい標的配列として増幅するために使用できるＰＣＲプライマーを設計することができる。多くの場合、好ましい標的配列は、サイズが約１００ｂｐから約６ｋｂｐまでの範囲にわたり得る。非反復配列エレメントＤＮＡから生成される生じたプローブは、ＦＩＳＨ適用において、シグナル強度および堅固さを低下させるＣｏｔ−１  ＤＮＡを含める必要性を取り除くまたは少なくとも実質的に低減するので、このような非反復配列物質はＦＩＳＨ適用における使用のために好ましい。これらの非反復配列が得られれば、上記で概説した方法に従って構造１００を調製するための基質として使用するために単離し、精製することができる。
【００９１】
１００ｂｐから５００ｂｐの好ましい範囲に含まれるサイズを有する核酸基質に関しては、超音波処理段階を省くことができる。これらの実施形態については、構造１００を、修飾形態の３０１をプライマーとして用いて適切な核酸基質から直接増幅し得る。３００をこのような核酸基質の末端に連結する必要がないので、３０１の構造は人工配列の形態の１０２を含まない。この場合は、１０２の人工配列を、核酸基質の天然配列にハイブリダイズする適切な配列に置き換える。このような適切なプライマー配列は、ＰＣＲの間に生成される構造１００のために１０１の境界を定義し、この境界を含む。特定の場合、所望核酸基質を増幅するために１０２配列だけを含むプライマーを用いて分取ＰＣＲを実施した後、構造１００を生成するために３０１配列を含むプライマーを用いてＰＣＲを実施することが好都合である。
【００９２】
構造１１３は、基質の選択、プライマーの選択およびＰＣＲを介した構造１１３の構築の設計における以下の変更を除き、構造１００に関して先に述べたのと同じ手順に従って調製される。１１３に関しては、断片化せずに単一の供給源ＤＮＡを使用することが好ましい。図７を参照して、末端にプライマー（４００）を含む供給源ＤＮＡを調製する。４００は、核酸配列標的中の部位に相補的であり、この部位からＤＮＡ合成を開始させる配列を有する３’領域を含む。好ましくは、４００は、核酸配列標的（１１５）に無関係の付加的な配列を有する５’領域を含み得る。１１７、１１６および１１５の配列（５’から３’へ）組成を有するオリゴヌクレオチドプライマー４０１を、化学合成法を用いて調製する。標的配列は、最初に、４００から成るプライマーのセットを用いたＤＮＡ増幅によって得られ、ここで各々のプライマー４００は、所望標的配列の境界を定義する配列に特異的である。構造１１３は、プライマー４０１によるＰＣＲを用いて末端配列４００を含むＤＮＡから調製することができる。
【００９３】
標識された１１３は様々な方法で調製できる。１つの実施形態では、発蛍光団で標識することができる（例えば活性化エステル形態の発蛍光団を使用して；内部標識は図７に例示されていない。）修飾ヌクレオチド（例えばアミノアリルｄＵＴＰ）を含むヌクレオチド三リン酸カクテルを使用して、ＤＮＡ増幅の間に１１３を標識する。または、例えばシトシン特異的標識化技術を使用することによって、１１３を調製できる。このような実施形態では、１１７だけに位置するシトシンを有する４０１を使用し、１１７のシトシン内容物を、例えば上記で述べたビスルフェート／アミノ化／発蛍光団結合手順を用いることによって標識する。または、適切な化学修飾後標識化手順を用いて１１３を分子全体にわたって後標識することができる。このようにして調製される１０１の特定の実施形態に関して上記で説明したように、構造１１３中の１１７から化学的に感受性の塩基を除外することが好ましい。
【００９４】
好ましくは、２０９は、当分野で公知の任意の技術を用いて少なくとも１つの内部標識と共に調製される。標識を、好ましくは、プライマーおよび修飾ヌクレオチド（例えばアミノアリルｄＵＴＰ）を含むｄＮＴＰカクテルを使用して、より長い供給源ＤＮＡのＰＣＲ増幅によって２０９に組み込む。修飾ヌクレオチドを含む増幅されたＤＮＡの調製後、ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、エレメント２１２の構造を有する産物を生成する。このような制限部位を、供給源ＤＮＡを増幅するのに使用されるプライマー中に設計することができる。または、このような制限部位は、もとの供給源ＤＮＡ中に存在してもよい。増幅されたＤＮＡを適切な制限酵素による消化に供した後すぐに、２０９についての適切なサイズクラスをゲル精製し、適切な標識に結合することができる（例えば発蛍光団の活性化エステルを使用して）。
【００９５】
２０１、２０２、２１６、２１７および２１８は、典型的には２００ヌクレオチド未満の長さであるので、合成オリゴヌクレオチド化学手順を用いてこれらの分子を調製することが好ましい。
【００９６】
特定の実施形態では、しかし、２０１および２０２は、それぞれ２０３および２０５についての核酸配列のセグメントを含み、２０３および２０５の長さは２００ヌクレオチド長よりかなり長くてもよい。２０１および２０２のこのような実施形態は、合成オリゴヌクレオチド化学および供給源ＤＮＡとしての核酸配列標的ＤＮＡの組合せを用いて標準的な分子生物学方法で調製される。
【００９７】
図８を参照すると、２０３および２０５の候補配列含む供給源ＤＮＡを第１制限エンドヌクレアーゼで消化して、定義された末端（５０１）を有する複数の制限フラグメントを形成する。このような５０１は、平滑末端化され得るかまたは一本鎖末端を有し得る。生じた制限フラグメントを、連結と適合性の適切な末端配列を有するアダプターに連結する。第１制限エンドヌクレアーゼが一本鎖末端５０１を有する産物を生成する場合は、５０３、５０２および５０１の配列（５’から３’へ）組成を第１鎖（５００）として、ならびに５０１が一本鎖であり、５０２と５０３が二本鎖である相補鎖を第２鎖として有する部分的二本鎖アダプターを使用することが適切である。第１制限エンドヌクレアーゼが平滑末端の５０１構造を有する産物を生成する場合は、５０３、５０２および５０１から成る完全な二本鎖アダプターが適切である。
【００９８】
場合により、第１制限エンドヌクレアーゼが一本鎖末端５０１を有する産物を生成する場合は、適切な酵素を用いてこのような産物を平滑末端化し得る。生じた平滑末端産物は、５０３、５０２および５０１から成る完全二本鎖アダプターで構成される平滑末端アダプターへの連結に適する。
【００９９】
構造５０２は、２つの目的に役立つ配列に対応する。第一に、５０２は、制限フラグメント群のＤＮＡ増幅を促進するためにプライマー（５００）の一部に結合する伸長配列である（図８）。第二に、５０２（およびこの相補物）は、５０１を核酸配列標的の制限フラグメント群の各成員の両端に連結する場合に２０４および２０６の等価物（即ち２０３および２０５の候補配列等価物）として働く。
【０１００】
構造５０３は、特定の好ましい基質認識配列基準を有する第２制限酵素の基質を含む。第一に、５０３は、第１制限酵素と同じ基質配列またはサブ配列を認識しない制限酵素の基質に対応する。第二に、５０３は、第２制限酵素によって切断されて、好ましくは１−６ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３ヌクレオチドを有する一本鎖産物末端（５０４）を生成する。好ましくは、第２制限エンドヌクレアーゼは、まれにしか切断されないように（例えば４，０００ヌクレオチドごとに１回未満）十分に長い認識配列を有する。場合により、５０３は、５’末端標識され得るかまたは一方の末端の制限酵素産物配列に対応する第２制限酵素切断部位の５’側に内部標識を有して調製され得る。好ましい標識は蛍光または化学発光である。
【０１０１】
生じたアダプター含有制限フラグメント群を、配列：（５’）５０３−５０２−５０１（３’）に対応する一本鎖プライマー５００を用いたＤＮＡ増幅に供する。場合により、５００は５’末端標識することができる。フラグメント群を増幅して増幅産物を生成した後、増幅産物の群を第２制限酵素で消化し、任意の結合した５’標識を遊離させ、一本鎖末端５０４を生成する。切断産物をさらなる精製に供するかまたは二本鎖フラグメント群の変性後に２０１および２０２の実施形態としてただちに使用することができる。
【０１０２】
一本鎖末端５０４は、５０２とこの相補物（即ち２０４および２０６の等価物）の間での二本鎖の形成後、シグナル伝達ドメインアダプター結合部位２０８になる。従って、５０４は、２０３および２０５が２０３および２０５の連続する配列相補物から成る２０７に結合した場合、２０８を形成することができる。
【０１０３】
核酸ハイブリダイゼーションプローブの適用
前述した核酸ハイブリダイゼーションプローブは、核酸ハイブリダイゼーションプローブの使用によって達成されるすべての形態の核酸検出において使用するための汎用性を有する。前記核酸ハイブリダイゼーションプローブは、溶液中のまたは固定化された支持体に結合した核酸配列標的を検出するために使用できる。本発明の組成物および方法が溶液中の核酸配列標的を検出するために使用できる適用の例には、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、ＰＮＡクランプ媒介ＰＣＲおよびデジタルＰＣＲが含まれる。本発明の組成物および方法が固体支持体に固定化された核酸配列標的を検出するために使用できる適用の例には、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、マイクロアレイ、粒子ベースのアッセイおよびＦＩＳＨアッセイが含まれる。このような適用は、医療診断、分子医学、法科学、標本および生物目録作成ならびに微生物病原体疫学を含む数多くの分野に適している。核酸ハイブリダイゼーションプローブの有用性の詳細な説明を、ＦＩＳＨ適用に関して以下に示す。
【０１０４】
本明細書で述べる核酸ハイブリダイゼーションプローブの優れた感受性は、染色体物質の増幅、欠失、再配置または転座に関連する癌の検出および観測に適する。本発明の方法および組成物の適用は、癌治療標的に対する治療効果を観測する有効な手段を提供する。例えば、この方法は、特に抗癌治療薬に対して耐性を発現しやすい癌に関して、医師が癌を有する患者を抗癌治療薬で処置するために治療結果を診断することを可能にする。この方法は、医師が癌細胞における特定の染色体異常の存在を確認することを可能にし、これにより当然の結果として医師は代替的な治療戦略を開発することができる。本発明の方法および組成物はまた、特定の遺伝子特異的なまたは染色体領域に関連する癌を有する患者における腫瘍の再発／進行を調査することも可能にする。さらに、この方法および組成物は、信頼できる癌の予後を提供することを可能にし、このことは治療する医師に、患者に最大の恩恵をもたらす決定的な治療のアドバイスを直接提供する。
【０１０５】
癌は多くの染色体異常（例えば１つ以上の染色体中の特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置）に関連する。このような異常が特定の癌に関して検出可能である限り、本発明の核酸プローブを、染色体プローブのセットを試料にハイブリダイズすることによって癌を検出する、診断する、予後を提供する、スクリーニングするまたはさもなければ検出するために使用することができ、前記セットは、１つ以上の染色体中の特定の核酸配列標的の増幅、転座、欠失または再配置に関連する癌の型に特異的なプローブを含む。
【０１０６】
本発明の核酸プローブ技術に関する使用に従う適切な癌には、前立腺癌、副腎皮質癌、胆道癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜（子宮）癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、神経膠腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌および唾液腺癌が含まれるが、これらに限定されない。本発明の核酸プローブ技術に関する使用に従う適切な試料には、尿、血液、脳脊髄液、胸膜液、痰、腹水、膀胱洗浄液、分泌物、口腔洗浄液、組織試料、タッチ標本および細針吸引物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明の核酸プローブ技術における使用に従う適切な染色体プローブには、染色体特異的マーカー、例えば染色体列挙プローブ（ＣＥＰｓ）、セントロメア特異的プローブ、テロメア特異的プローブおよび対立遺伝子特異的プローブが含まれるが、これらに限定されない。対立遺伝子特異的プローブに関して、欠失、重複、再配置、増幅等によって定義される対立遺伝子は本発明の範囲内である。同様に、癌のスクリーニング、診断、予後または治療（広く「癌診断」と定義する。）において有用な生物学的相関マーカーを有する任意の遺伝子座は本発明の範囲に含まれる。癌診断における適用を有する遺伝子座の例には、数ある中でも特に、ＥＧＦＲｖ３、ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６（９ｐ２１）およびｐ５３（１７ｐ１３．１）が含まれる。
【０１０８】
典型的なＦＩＳＨ適用に関して、以下は典型的な手順を示す。標本の細胞を採取し、洗浄して、ペレット化する。ペレットの細胞は通常、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄する。細胞をＰＢＳに懸濁し、遠心分離によって再収集する。細胞を、例えば酸アルコール溶液、酸アセトン溶液またはアルデヒド、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒド中で固定することができる。例えば、メタノールと氷酢酸をそれぞれ３：１の比率で含む固定液を固定液として使用することができる。中性緩衝ホルマリン溶液も使用することができ、この溶液はリン酸ナトリウムの水溶液中３７−４０％ホルムアルデヒドを約１％から１０％含有する。固定液の大部分を除去し、溶液の一部だけに懸濁した濃縮細胞を残すことにより、細胞を含むスライドガラスを調製することができる。
【０１０９】
細胞がスライドガラス上で重ならないように細胞懸濁液をスライドガラスに塗布する。光学または位相差顕微鏡によって細胞密度を測定することができる。例えば、２０から１００ｍｌの尿試料から採取した細胞を約１００から２００μｌの最終容量の固定液に懸濁する。次にこの懸濁液の３種類の容量（通常３、１０および３０μｌ）をスライドガラスの６ｍｍウェルに滴下する。次にこれらのウェル中の細胞の密度を位相差顕微鏡で評価する。最大容量の細胞懸濁液を含むウェルが十分な細胞を有していない場合は、細胞懸濁液を濃縮し、別のウェルに入れる。
【０１１０】
インサイチュハイブリダイゼーションの前に、染色体プローブおよび細胞中に含まれる染色体ＤＮＡをそれぞれ変性させる。変性工程は幾つかの方法で実施される。例えば、高いｐＨを有する緩衝液、高温（例えば約７０℃から約９５℃の温度）、またはホルムアミドおよびハロゲン化テトラアルキルアンモニウムなどの有機溶媒、またはこれらの組合せを用いて変性を生じさせることができる。例えば、染色体ＤＮＡを７０℃より上の温度（例えば約７３℃）ならびに７０％ホルムアミドおよび２×ＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を含む変性緩衝液の組合せによって変性させることができる。変性条件は、典型的には細胞の形態が保存されるように設定する。染色体プローブは熱によって変性させることができる。例えば、プローブを約５分間、約７３℃に加熱することができる。
【０１１１】
変性用の化学物質または条件を除去した後、ハイブリダイゼーション条件下でプローブを染色体ＤＮＡにアニーリングさせる。「ハイブリダイゼーション条件」とは、プローブと核酸配列標的の間のアニーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑度および長さ、ならびにインキュベーションの塩濃度、温度および時間の長さに依存して異なる。プローブの濃度が高いほど、ハイブリッドを形成する確率が高くなる。例えば、インサイチュハイブリダイゼーションは、典型的には１−２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミドおよび非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するブロッキングＤＮＡ（例えばＣｏｔ−１  ＤＮＡ）を含むハイブリダイゼーション緩衝液中で実施する。一般に、ハイブリダイゼーション条件には、前述したように、約２５℃から約５５℃の温度および約０．５時間から約９６時間のインキュベーション時間が含まれる。より特定すると、ハイブリダイゼーションは、約３７℃から約４０℃で約２から約１６時間実施することができる。
【０１１２】
標的領域外のＤＮＡへの染色体プローブの非特異的結合は、一連の洗浄によって除去することができる。各回の洗浄における温度および塩濃度は所望のストリンジェンシーに依存する。例えば、高ストリンジェンシー条件の場合は、０．２×ＳＳＣから約２×ＳＳＣおよび約０．１％から約１％の非イオン性界面活性剤、例えばＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）を用いて、約６５℃から約８０℃で洗浄を実施することができる。ストリンジェンシーは、洗浄液の温度を下げるかまたは洗浄液中の塩濃度を高めることによって低下させることができる。
【０１１３】
試料を含むスライドガラスを、典型的には２×ＳＳＣ中で３７℃にて１０−３０分間インキュベートする。次にスライドガラスを０．２ｍｇ／ｍｌペプシン中で３７℃にて２０分間インキュベートする。この後スライドガラスをＰＢＳ中で室温にて２分間ずつ２回洗浄する。細胞を２．５％中性緩衝ホルマリン中で室温にて５分間固定する。この後スライドガラスをＰＢＳ中で室温にて２分間ずつ２回洗浄する。７０％、８５％および１００％エタノールの溶液中で室温にて１分間連続的に接触させることによってスライドガラスを脱水に供する。スライドガラスをこの後ただちに使用するかまたは暗所に室温で保存する。
【０１１４】
ハイブリダイゼーションは、ＨＹＢｒｉｔｅ法または従来の方法で実施することができる。ＨＹＢｒｉｔｅ法では、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）からのＨＹＢｒｉｔｅ（商標）システムを使用する。スライドガラスをＨＹＢｒｉｔｅ上に置き、プローブセット約１０μｌを添加して、覆い、密封する。ＨＹＢｒｉｔｅを以下のようにプログラムする：７３℃、５分間、次に３７℃、１６時間。次にスライドガラスを０．４×ＳＳＣ（０．０６Ｍ塩化ナトリウム／０．００６Ｍクエン酸ナトリウム）／０．３％ＮＰ−４０で７３℃にて２分間洗浄し、２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０で室温にて２分間すすいで、空気乾燥させる。スライドガラスをＤＡＰＩ  ＩＩ（１２５ｎｇ／ｍｌの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド）約１０μｌで対比染色する。
【０１１５】
従来の方法（即ちコプリンジャー法）では、染色体プローブを含むマスターミックスを、５０％のホルムアルデヒド、２×ＳＳＣ、０．５μｇ／ｍｌ  Ｃｏｔ１  ＤＮＡおよび２μｇ／ｍｌ  ＨＰ  ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション緩衝液中で調製する。プローブミックスを７３℃で５分間変性させ、スライドガラスを７３℃のコプリンジャー中の変性緩衝液（７０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ）中で５分間変性させる（６−８スライドガラス／ジャー）。スライドガラスを７０％、８５％および１００％エタノールでそれぞれ１分間すすぐ。ハイブリダイゼーションミックス約１０μｌを各スライドガラスに塗布し、カバーガラスで覆って、ゴムのりで密封する。加湿チャンバにおいて３７℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。スライドガラスを０．４×ＳＳＣ／０．３％ＮＰ−４０中で７３℃にて２分間洗浄し、次に２×ＳＳＣ／０．１％ＮＰ−４０中で室温にて手早くすすぐ。スライドガラスを空気乾燥させた後、スライドガラスをＤＡＰＩ  ＩＩで対比染色する。１００個の連続する細胞中のＦＩＳＨシグナルの数を記録することによって試料を列挙する。
【０１１６】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらは特許請求の範囲で述べる本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１１７】
［実施例１］
核酸オリゴヌクレオチド試薬
この実施例のために使用するオリゴヌクレオチドを表１に示す。
【０１１８】
【表１】
0006479474.tif 000002
0006479474.tif 000003
【０１１９】
配列番号：１および２は、同じ５’シグナル伝達領域を含み、６塩基ごとにシトシンを有する。ｉＳｐ９スペーサーは、シグナル伝達領域をプライマー領域から隔てる。配列番号：１および２の両方について、プライマー領域はシトシン基を含まず、このためビスルファイト／エチレンジアミンによるオリゴヌクレオチドの修飾はこの部分に影響を及ぼさない。ＤＮＡ増幅の間に阻害性のステムループ構造が形成するのを回避するため、プライマー領域は配列番号：１と２で異なる。
【０１２０】
配列番号：３および４は、同一の３’プライマー領域を有するが、５’シグナル伝達領域が異なる。配列番号：３および４の両方において、５’シグナル伝達部分は３つの同一配列（表１ではピリオド記号によって分けている。）から成る。これらの配列は、構造１００の１つの好ましい実施形態についての１０６の例を示す。
【０１２１】
配列番号：５および６は、シグナル伝達物質を担持し、それぞれ配列番号：３および４に結合するように設計された１０７の例を示す。配列番号：５および６の３’末端は、配列番号：３および４のシグナル伝達ブロックに相補的である。配列番号：５および６の５’末端は、７つの同一ブロックの配列（表１ではピリオド記号によって分けている。）を含む。配列番号：５および６の各々について、シトシンはオリゴヌクレオチド全体にわたって６番目ごとの塩基として現れる。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドを標識するのに使用される手順は、シトシンにのみ発蛍光団を配置する。スペーシングは、発蛍光団を、発光の自己クエンチングを最小限に抑える距離に保持しつつ、高レベルの発蛍光団の組込みを可能にする。
【０１２３】
配列番号：７および８は、それぞれ配列番号：３および４で認められるシグナル伝達ブロックに結合する１１３の調製における中間体として設計される。配列番号：７および８の５’末端は、配列番号：３および４のシグナル伝達ブロックの配列に対して配列相補性を有する。配列番号：７および８の３’末端は、蛍光標識化のために選択されたＤＮＡ配列を増幅するためのプライマーとしての役割を果たす。配列番号：７および８はどちらも、各オリゴヌクレオチドについて５’領域から３’プライマー領域を隔てるｉＳｐ９基も含む。
【０１２４】
ｉＳｐ９基の３’側の配列番号：７および８のプライマー領域の配列は、標的物質についてのライブラリの調製において使用されるアダプターの対応する配列と同一である。
【０１２５】
［実施例２］
標識された配列番号：１および２の調製
Ａ．配列番号：１および２のアミノ化
配列番号：１および２（１０００μＭ）の個々の４０μＬ水溶液に、アミノ化試薬（水５００μＬ、ＴＦＡ  ３００μＬ、エチレンジアミン１７４μＬおよびＮａ２Ｓ２Ｏ３  ９５ｍｇ）１６０μＬを添加した。生じた混合物をボルテックスし、８０℃の水浴中に４０分間入れて、次いで水中に脱塩した。生成物をイソプロパノールと酢酸ナトリウムで沈殿させ、水１００μＬに再懸濁して、配列番号：１−ＡＭおよび配列番号：２−ＡＭを得た。配列番号：１−ＡＭおよび配列番号：２−ＡＭの濃度を、２６０ｎｍでの分光測光法によりそれぞれ９８１８μｇ／ｍＬおよび７４０９μｇ／ｍＬと決定した。
【０１２６】
Ｂ．配列番号：１−ＡＭおよび配列番号：２−ＡＭへの発蛍光団標識の結合
１Ｍ  ＮａＯＨの２μＬ容量を、配列番号：１−ＡＭまたは配列番号：２−ＡＭを含む個々の５０μＬ水性試料に添加した。１分後、ＤＭＳＯ／ＴＭＥＤＡ／ＮａＣｌ溶液の混合物（ＤＭＳＯ  ５０μＬ、５００ｍＭテトラメチルエチレンジアミンおよびｐＨ９．１の２Ｍ  ＮａＣｌの混合物５０μＬ）５０μＬを前記溶液に添加した。それぞれの混合物をボルテックスし、ＤＭＳＯ溶液中の１００ｍＭ  ＴＡＭＲＡ（５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ［ＳＯ］としても知られる。）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標），Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））３μＬを各混合物に添加した。混合物をボルテックスし、６０℃のオーブンに７５分間入れた。生成物をエタノールと酢酸ナトリウムで沈殿させた。沈殿物を８５％エタノールで洗浄し、乾燥して、水に再懸濁し、水に脱塩して、標識されたＳＯ部分を含む配列番号：１−ＳＯおよび配列番号：２−ＳＯの各々５００μＬを得た。各オリゴヌクレオチドに組み込まれた標識の量を、２６０ｎｍおよび５６０ｎｍでの吸光係数データを用いて分光測光法で決定した。標識された配列番号：１−ＳＯは、各オリゴヌクレオチドにつき約７．１色素分子で、３４１μｇの収量を有していた。標識された配列番号：２−ＳＯは、各オリゴヌクレオチドにつき約７．７色素分子で、２８５μｇの収量を有していた。
【０１２７】
［実施例３］
標識された配列番号：５および６（シグナル伝達物質）の調製
Ａ．配列番号：５および６のアミノ化
水中１０ｍｇ／ｍＬの配列番号：５または６の２０μＬ容量に、アミノ化試薬（水１．０ｍＬ、ＴＦＡ  ６００μＬ、エチレンジアミン３４８μＬおよびＮａ２Ｓ２Ｏ３  １９０ｍｇ）の１８０μＬ容量を添加した。各々の溶液を６５℃の水浴中に３０分間入れて、水中に脱塩し、限外ろ過によって１２０μＬの最終容量に濃縮した。配列番号：５−ＡＭおよび配列番号：６−ＡＭの濃度を分光測光法で決定した。配列番号：５−ＡＭおよび配列番号：６−ＡＭの濃度は、それぞれ８４０μｇ／ｍＬおよび１３２９μｇ／ｍＬであった。
【０１２８】
Ｂ．配列番号：５−ＡＭおよび配列番号：６−ＡＭへの発蛍光団標識の結合
配列番号：５−ＡＭおよび配列番号：６−ＡＭを活性化標識５（６）−ＳＦＸ（６−（フルオレセイン−５−（および−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸スクシンイミジルエステル）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｇｒｅｅｎ［ＳＧ］としても知られる。）および５（６）−ＴＡＭＲＡ，ＳＥ（５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ［ＳＯ］としても知られる）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標），Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に結合した。ＤＭＳＯ／ＴＭＥＤＡ／ＮａＣｌ（ＤＭＳＯ  ６０μＬ、５００ｍＭテトラメチルエチレンジアミンおよびｐＨ９．１の２Ｍ  ＮａＣｌの混合物６０μＬ）の３０μＬ容量を、各々の配列番号：５−ＡＭまたは配列番号：６−ＡＭの３０μＬ容量に添加した。各混合物をボルテックスし、ＤＭＳＯ中１００ｍＭで活性標識の２μＬ容量を添加した。混合物を再びボルテックスし、５６℃に２時間置いた。標識生成物をエタノール沈殿によって単離し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５クロマトグラフィによって脱塩して、各標識生成物３００μＬを得た。分光測定は、８−９％の標識組込みまたは１９５塩基オリゴヌクレオチドにつき約１６の発蛍光団を示した。
【０１２９】
［実施例４］
アダプター含有フラグメントライブラリの調製
ＢＡＣ（細菌人工染色体）を含む、ヒトゲノムの９ｐ２１遺伝子座に対応する２１２ｋｂｐのＤＮＡを有するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンを培養し、当分野で公知の方法によって前記ＤＮＡを単離した。
【０１３０】
単離したＤＮＡを超音波処理し、約１００ｂｐから６００ｂｐの範囲にわたるフラグメントを得た。Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ（商標）キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ））を製造者の指示に従って使用して、フラグメントの末端を平滑化した。
【０１３１】
所望のアダプターに対応する合成オリゴヌクレオチドおよびこれらの相補物を以下のようにして一緒にアニーリングさせた。配列番号：１７−２０の個々の１００μＭ溶液を水中で調製した。それぞれの生じた溶液の一定容量と２０×アニーリング緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭトリスおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）の一定容量を組み合わせて、１×アニーリング緩衝液中に配列番号：１７−２０  ２５μＭを含む単一溶液を得た。生じた混合物を１００℃に５分間加熱し、室温まで緩やかに放置冷却した。従って、配列番号：１７と１８はアニーリングして、ａｄＧａと称されるアダプターを形成し、配列番号：１９と２０はアニーリングして、ａｄＧｂと称されるアダプターを形成した。生じた部分的二本鎖アダプター、ａｄＧａおよびａｄＧｂは、平滑末端フラグメントライブラリに連結するのに適合性の１つの平滑末端を有し、他方の末端は、連結への関与を防ぐために非自己相補的一本鎖末端を有していた。
【０１３２】
平滑末端９ｐ２１  ＤＮＡライブラリフラグメント１μｇ（２００ヌクレオチドの平均フラグメント長に基づき８ｐｍｏｌｅまで）および各々のアダプターａｄＧａおよびａｄＧｂ  ５０ｐｍｏｌｅの混合物を、製造者の指示に従ってＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｋ１４２２；Ｆｅｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ））と共に合計２０μＬ容量でインキュベートした。連結後、反応混合物を７５℃で５分間加熱することによってリガーゼを不活性化し、連結していないアダプターを解離した。アダプター含有フラグメントライブラリ上の生じた突出部を、２×ＰＣＲマスターミックス（Ｋ１０７１；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ））１５μＬを添加し、反応混合物を７２℃で５分間加熱することによって充填した。
【０１３３】
同じ手順を、ヒトＥＧＦＲｖ３遺伝子座を含む約１５ｋｂｐを有するプラスミドから同様に調製したＥＧＦＲｖ３フラグメントライブラリを用いて同時に実施した。
【０１３４】
［実施例５］
アダプター含有フラグメントライブラリのサイズ選択
アダプターを含有する９ｐ２１およびＥＧＦＲｖ３フラグメントライブラリを、適切なＤＮＡサイズマーカーと共に、電気泳動によって３％アガロースゲル上で分離した。臭化エチジウムを使用してゲル中のＤＮＡを視覚化した。１２０ｂｐ、１５０ｂｐ、１８０ｂｐおよび２００ｂｐを中心とするフラグメントサイズに対応するゲル切片をゲルから取り、〜１０容量の水中で加熱して、フラグメントを放出させた（「ゲル溶解容量」）。
【０１３５】
［実施例６］
ｉＳｐ９結合部分を担持するプライマーによるフラグメントライブラリのＤＮＡ増幅
２×ＰＣＲマスターミックス（Ｋ１０７１；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ））２５μＬ、配列番号：１および２の各々０．５μＭおよび各々のゲル溶解容量３μＬを含む水性混合物５０μＬを調製した。これらの混合物を以下のプログラムでサーモサイクラー上に置いた：（ａ）９５℃、４分、（ｂ）２５サイクル（９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、１２０秒）および（ｃ）７２℃、５分。ＤＮＡ増幅後の電気泳動は、予想されたサイズに対応するＰＣＲ産物を示した。２つの狭い間隔のバンドが各反応について認められた：１つのバンドは二本鎖産物に対応し、わずかに高い分子量で出現するもう１つのバンドはアダプター末端においてのみ二本鎖の産物に対応した。
【０１３６】
［実施例７］
選択した９ｐ２１およびＥＧＦＲｖ３サイズ画分の分取ＰＣＲ
２×ＰＣＲマスターミックス２５μｌ、２μＭ最終濃度の各々の配列番号：１−ＳＯおよび配列番号：２−ＳＯならびに実施例６から得た鋳型（１ｐｍｏｌｅ）２μＬを含む、個々の１００μＬ水性反応混合物を調製した。反応混合物を以下のサーモサイクリングプログラムでサーモサイクラーセットに入れた：１５サイクル（９５℃、３０秒、６０℃、３０秒、７２℃、３分）。サーモサイクリングの完了後、反応産物を、ポリエチレングリコールを用いた沈殿によって単離し、ＴＥ緩衝液に再懸濁して、濃度を分光測光法によって測定した。
【０１３７】
［実施例８］
間接ＦＩＳＨのための標的化試薬の調製
配列番号：１１と１２は、リン酸化平滑末端を含む相補対を形成する。配列番号：１１と１２をアニーリングさせた場合、生じたアダプターａｄＨ１を別の平滑末端ＤＮＡ配列に連結することができる。配列番号：１４および１５を有するオリゴヌクレオチドは、異なる配列を有する類似のアダプター（ａｄＨ２）を形成する。配列番号：１３および１６を有するオリゴヌクレオチドは、５’ＴＥＴ発蛍光団の存在においてのみ配列番号：１４および１５と異なる。配列番号：１３および１６はアダプターを作製するために使用できるが、これらのオリゴヌクレオチドは、主として、５’−ＴＥＴ発蛍光団標識を有するＰＣＲ産物を生成するための予備ＰＣＲにおけるプライマーとしての役割を果たす。５’−ＴＥＴ発蛍光団標識の目的は、増幅産物の生成後の制限消化の進行を観測することである。生じたＰＣＲ産物がＨｉｎｆＩ制限酵素に暴露されることにより、アダプター中に設計されたＨｉｎｆｌ部位が切断され、５’−ＴＥＴ発蛍光団を放出して、増幅産物上にＨｉｎｆＩ適合性突出部を生成する。
【０１３８】
配列番号：１１、１３、１４および１６の個々の１０００μＭ水溶液を調製した。配列番号：１１および１３のそれぞれ個々の３０μｌ容量を２０×アニーリング緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭトリスおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）３μＬと組み合わせて、第１混合物を形成した。配列番号：１４および１６のそれぞれ個々の３０μｌ容量を２０×アニーリング緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭトリスおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）３μＬと組み合わせて、第２混合物を形成した。第１および第２混合物を１００℃で５分間インキュベートし、室温で緩やかに放置冷却して、それぞれａｄＨ１ＦおよびａｄＨ２Ｆを形成した。
【０１３９】
配列番号：１２および１３のそれぞれ個々の３０μｌ容量を２０×アニーリング緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭトリスおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）３μＬと組み合わせて、第１混合物を形成した。配列番号：１４および１５のそれぞれ個々の３０μｌ容量を２０×アニーリング緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭトリスおよび２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）３μＬと組み合わせて、第２混合物を形成した。第１および第２混合物を１００℃で５分間インキュベートし、室温で緩やかに放置冷却して、それぞれａｄＨ１およびａｄＨ２を形成した。
【０１４０】
ＥＧＦＲｖ３プローブの調製：
ＥＧＦＲｖ３  ＤＮＡを、当分野で公知の手段によってプラスミド供給源から調製した。このＤＮＡを超音波処理し、約１００ｂｐから約６００ｂｐの範囲にわたるフラグメントを得て、次に製造者の指示に従ってＨｉｎｆＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））で処理した。Ｑｕｉｃｋ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ（商標）キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ  ＭＡ））を使用して、超音波処理したＤＮＡの２０μｇ試料の末端を平滑化した。
【０１４１】
アダプターを、以下のようにして生じた平滑末端ＥＧＦＲｖ３フラグメントに連結した。１００μＭ  ａｄＨ１ＦおよびａｄＨ２Ｆ溶液の各々２μｌ、水６μＬ、１０×リガーゼ緩衝液２μＬおよび平滑末端ＥＧＦＲｖ３フラグメント１０μｇを含む水溶液を調製した。５Ｕ／μＬリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））の２μＬ容量をこの水溶液に添加した。生じた混合物をボルテックスし、室温で１時間インキュベートした。この後、２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（商標）緩衝液（ＰＥＧを含む；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））の１０μＬ容量を反応混合物に添加した。反応混合物をボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。この後、２×Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（商標）緩衝液の１０μＬ容量を混合物に添加した。混合物をボルテックスし、室温で３０分間インキュベートした。この後、水（６０μＬ）、３Ｍ  ＮａＡｃ（２０μＬ）およびＥｔＯＨ（３００μＬ）を混合物に添加した。混合物をボルテックスし、−２０℃でインキュベートした。ＤＮＡ沈殿物を遠心分離によって収集し、７０％ＥｔＯＨ水溶液で洗浄して、空気乾燥し、水（５０μＬ）に再懸濁した。生じたＤＮＡ試料を、製造者の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を用いて精製した。最終精製産物を８０μｇ／ｍＬの濃度で得た。
【０１４２】
最終精製産物を１．５％アガロース−ＥｔＢｒゲルに負荷し、電気泳動に供した。２００ｂｐ、２５０ｂｐおよび３００ｂｐを中心とするサイズに対応するゲルの切片を切り出し、ＴＡＥ緩衝液２０μＬおよび０．５Ｕ／μＬアガラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ））２μＬを含む個々のチューブに添加した。それぞれのゲル試料を溶液中で破砕し、ボルテックスして、４２℃のオーブン中で２４時間インキュベートした。これらの試料は、ＤＮＡ増幅手順に使用されるＥＧＦＲｖ３鋳型である。
【０１４３】
９ｐ２１プローブの調製：
９ｐ２１  ＤＮＡの試料を当分野で公知の手段によって超音波処理し、約８０ｂｐから約５００ｂｐの範囲にわたるフラグメントの分布を得た。超音波処理した物質の１００μｇ試料をポリエチレングリコールで分画し、より高い分子量の画分（９ＳＨ）とより低い分子量の画分（９ＳＬ）を得た。これらの画分をＴＥ緩衝液２０μＬに個別に再懸濁した。濃度を分光測光法で測定した；９ＳＨ画分および９ＳＬ画分は、それぞれ２９７５μｇ／ｍＬおよび８１５μｇ／ｍＬの濃度を有していた。電気泳動試験は、９ＳＨ画分が１２０ｂｐ−５００ｂｐの範囲にわたるサイズクラスを有し、９ＳＬ画分が８０ｂｐ−１５０ｂｐの範囲にわたるサイズクラスを有することを示した。
【０１４４】
各々の９ｐ２１超音波処理画分（９ＳＨおよび９ＳＬ）の試料（１０μｇ）をＱｕｉｃｋ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ（商標）キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ））で処理し、平滑末端を有する平滑末端画分（９ＳＨＢおよび９ＳＬＢ）を製造者の指示に従って生成した。次に９ＳＨＢおよび９ＳＬＢ試料を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を製造者の指示に従って使用して精製した。生じた９ＳＨＢおよび９ＳＬＢの濃度は、それぞれ１７３μｇ／ｍＬおよび１８２μｇ／ｍＬであった。
【０１４５】
平滑末端ＤＮＡフラグメント試料、９ＳＨＢおよび９ＳＬＢの各々５μｇに以下の成分を添加した：水（４２μＬ）、ａｄＨ１およびａｄＨ２  ５００μＭ（各アダプター溶液２μＬ）、１０×リガーゼ緩衝液（６μＬ）および５０％ＰＥＧ４０００水溶液（６μＬ）。反応混合物をボルテックスし、５Ｕ／μＬ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ））の２μＬ容量を添加した。連結混合物を室温で１時間インキュベートした。ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を製造者の指示に従って使用してＤＮＡを単離し、アダプター含有生成物サイズクラス（９ＳＨＡおよび９ＳＬＡ）を５０μＬ容量で得た。９ＳＨＡおよび９ＳＬＡの濃度は、それぞれ１６８μｇ／ｍＬおよび１７２μｇ／ｍＬであった。
【０１４６】
配列番号：３によるＥＧＦＲｖ３および配列番号：４による９ｐ２１の分取ＰＣＲ
２本のチューブの各々の水４００μＬに、１μＬの以下の鋳型の１つを添加した：アダプター含有ＥＧＦＲｖ３  ＤＮＡフラグメント（ＥＭ）またはアダプター含有９ｐ２１  ＤＮＡフラグメント（９ＳＬＡ）。配列番号：３（１０００μＭ）の８μＬ容量をＥＭチューブに添加した。配列番号：４（１０００μＭ）の８μＬ容量を９ＳＬＡチューブに添加した。２×ＰＣＲマスターミックス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．（Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ））の４００μＬ容量を両方のチューブに添加した。試料を２５サイクル（９５℃、３０秒、５３℃、３０秒、７３℃、６０秒）のサーモサイクリングプログラムセットによる増幅に供した。１０ｋＤａのカットオフ値を有する限外ろ過ユニット（Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標）；Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））を使用してＰＣＲ増幅後の試料を濃縮した。ＰＣＲ産物を洗浄し、水（２００μＬ）に再懸濁して、等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出した。水相をエタノール沈殿に供し、収集したＤＮＡ沈殿物を水（２００μＬ）に再懸濁した。生じた標識プローブ、ＥＧＦＲｖ３−ｂ１および９ｐ２１−ｂ２を、それぞれ９２９μｇ／ｍＬおよび７２４μｇ／ｍＬの濃度で得た。
【０１４７】
［実施例９］
ＦＩＳＨハイブリダイゼーション条件
標的化プローブを当分野で公知の方法によって顕微鏡のスライドガラスに結合したリンパ球中のヒト染色体ＤＮＡにハイブリダイズした。典型的な実験では、試薬混合物は、ＬＳＩ／ＷＣＰハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））７μＬおよび超音波処理したヒト胎盤ＤＮＡ２０００ｎｇを含む水３μＬ、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））５００ｎｇならびにＥＧＦＲｖ３−ｂ１および９ｐ２１−ｂ２の各々１００ｎｇから成る。
【０１４８】
顕微鏡のスライドガラスを７０％、８５％および１００％エタノール中に連続的に液浸することによって脱水し、次に空気乾燥した。試験溶液（１０μＬ）をスライドに載せ、２２×２２ｍｍのスリップで覆って、溶液を覆われた面積全体にわたって広げた。ゴムのりを塗布して端を密封し、スライドガラスを、温度を制御する装置に入れた。温度を３分間７３℃に上げて、試料と試薬の両方のＤＮＡを変性させ、次に試薬が標的にハイブリダイズする時間を与えるために長期間、典型的には１６−２０時間３７℃に低下させた。ハイブリダイゼーション時間の完了後、ゴムのりとスリップを取り除き、スライドガラスを０．４×ＳＳＣおよび０．３％ＮＰ４０の溶液中で７３℃にて、次に２×ＳＳＣ、０．１％ＮＰ４０中で室温にて２分間洗浄し、この後空気乾燥した。
【０１４９】
直接標識プローブを使用するために、前述した手順を用いて報告物質を結合した。間接標識プローブの使用のためには、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄段階を実施して、報告物質を標的化物質上の共通結合基に結合した。ハイブリダイゼーションプローブおよび報告物質は一本鎖ＤＮＡから成る；このため、変性段階は必要なかった。加えて、レポーター配列およびこれの相補物（シグナル伝達ブロック）は標的化物質のいずれの特定配列ストレッチよりもはるかに高い有効濃度で存在するので、ハイブリダイゼーションをはるかに短期間で完了することができる。
【０１５０】
直接標識プローブに関しては、ＤＡＰＩの溶液１０μＬを標的領域上に置き、スリップで覆うことによってスライドガラスを観察用に調製した。対象とする発蛍光団に適したフィルタを備える蛍光顕微鏡でスライドガラスを観察した。間接標識プローブを使用するＦＩＳＨハイブリダイゼーションアッセイ（間接ＦＩＳＨ）には以下の手順を用いた。
【０１５１】
Ａ．１回目のハイブリダイゼーション
以下の成分を含むハイブリダイゼーション試薬Ａを調製した：超音波処理したヒト胎盤ＤＮＡ  １６μｇ、Ｃｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））４．０μｇ、ＣＥＰ７−ＳＧ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））０．８μｇ、水２４μＬ中のＥＧＦＲｖ３−ｂ１および９ｐ２１−ｂ２の各々０．８μｇ、ならびにＬＳＩ／ＷＣＰハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））５６μＬ。
【０１５２】
４つのヒト男性リンパ球スライドガラス（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｄｅｓ  Ｐｌａｉｎｅｓ，ＩＬ））を、７０％、８５％および１００％エタノール中に連続的に液浸することによって脱水し、次に空気乾燥した。ハイブリダイゼーション試薬Ａの２０μＬ容量を各スライドガラスの中心に線条接種し、次に２２×５０ｍｍのスリップで覆って、ゴムのりで端を密封した。スライドガラスをＨｙｂｒｉｔｅハイブリダイゼーション装置に載せ、温度を７３℃、３分、次いで３７℃、１６時間にプログラムした。プログラムの完了後、スリップを取り除き、スライドガラスを０．４×ＳＳＣ−０．３％ＮＰ４０中で７３℃にて２分間洗浄し、次いで２×ＳＳＣ−０．１％ＮＰ４０中で室温にて１分間さらに洗浄した。次に試料を空気乾燥した。
【０１５３】
Ｂ．２回目のハイブリダイゼーション
間接ＦＩＳＨのために以下のシグナル伝達試薬を調製した：１０％デキストランスルフェート中の１０ｎＭ  配列番号：５−ＳＯおよび１０ｎＭ  配列番号：６−ＳＧ、１×ＳＳＣ、０．２％ＮＰ４０。
【０１５４】
シグナル伝達試薬の１０μＬ容量を試料に添加し、試料をカバーガラスで覆った。Ｈｙｂｒｉｔｅにて５５℃で１０分間のインキュベーション後、カバーガラスを取り除き、スライドガラスを０．４×ＳＳＣ−０．３％ＮＰ４０中で５５℃にて２分間洗浄し、次いで２×ＳＳＣ−０．１％ＮＰ４０中で室温にて１分間さらに洗浄して、空気乾燥した。２回目のハイブリダイゼーションに関連する短時間のゆえに、端をゴムのりで密封する必要がなかった。
【０１５５】
［実施例１０］
生じたハイブリダイゼーションパターンの蛍光顕微鏡検査
スライドガラスをＤＡＰＩ−ＩＩで処理し、２２×５０ｍｍスリップで覆って、ＤＡＰＩ、フルオレセイン（緑色）およびＴＡＭＲＡ（橙色）シグナルを同時視覚化できるフィルタを備えた蛍光顕微鏡下で観察した。写真は、ＣＥＰ７について予想されたのと一致する中期染色体上の予想された緑色シグナルを示した。ＥＧＦＲについての遺伝子座でのハイブリダイゼーションに一致する小さな橙色シグナルがこれらの１つに直接隣接していた。加えて、９ｐ２１遺伝子座でのハイブリダイゼーション（およびこれが通常、隣接して並んだ染色体上に一対のシグナルとして出現すること）と一致する緑色シグナルが中期スプレッド中に存在した。すぐ近くの核は、近接して位置するＥＧＦＲについての橙色シグナルに関連したＣＥＰ７−ＳＧについての２つのシグナルを示した。９ｐ２１遺伝子座へのハイブリダイゼーションに一致する１つの付加的な緑色シグナルだけが部分的画像で認められた。
【０１５６】
他の実施形態
本発明を、これについての詳細な説明と共に述べたが、前記説明は例示のためであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によって定義されることが理解される。他の態様、利点および変更は以下の特許請求の範囲内である。本発明の様々な実施形態を述べたが、他の実施形態および実行が本発明の範囲内で可能であることは当業者に明らかである。従って、本発明は、付属の特許請求の範囲およびこれらの等価物を考慮すること以外には限定されない。
【図１】
0006479474.tif 000004
【図２】
0006479474.tif 000005
【図３】
0006479474.tif 000006
【図４−１】
0006479474.tif 000007
【図４−２】
0006479474.tif 000008
【図４−３】
0006479474.tif 000009
【図５−１】
0006479474.tif 000010
【図５−２】
0006479474.tif 000011
【図６】
0006479474.tif 000012
【図７】
0006479474.tif 000013
【図８】
0006479474.tif 000014
【配列表】
0006479474000001.app