(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において眼圧を低下させるための医薬組成物であって、当該医薬組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、ならびに、ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂質を前記対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ前記対象において眼圧を低下させるための治療有効量で含み、当該医薬組成物は前記対象に投与される、医薬組成物。
【請求項２】
前記対象が、緑内障を有しており、前記組成物の投与が、前記対象において失明を低減または防止する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記緑内障が、原発性開放隅角緑内障または正常眼圧緑内障である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記組成物が、局所投与用に製剤化され、少なくとも１日１回、局所的に患者に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物が、ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸からなる群から選択される２つ以上の脂質を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記薬学的に許容されるビヒクルが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール４００、及びｄ−α−トコフェロールプロピレングリコール１０００スクシネートからなる群より選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
プロスタグランジンをさらに含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
プロスタグランジンを含む第２組成物を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの脂質と前記第２組成物とを含む組成物が、同時にまたは第１及び第２時点において前記対象に投与される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
対象において眼圧を低下させるためのキットであって：
ｉ）薬学的に許容されるビヒクル、ならびに、ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸からなる群から選択される少なくとも１つの脂質を前記対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ前記対象において眼圧を低下させるための治療有効量で含む組成物と；
ｉｉ）使用説明書と；
ｉｉｉ）包装材と
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、眼科及び生化学の分野に関する。より詳細には、本発明は、眼圧を低下させるための脂質を含む組成物及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＮＩＨ  ＥＹ０１６１１２Ｓ１及びＮＩＨ  Ｒ０１  ＥＹ０１６１１２の下で政府支援によってなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
関連出願の参照
本出願は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月５日に提出された米国仮特許出願第６１／９１２，０７０号の優先権を主張する。
【０００４】
背景
緑内障は、房水流出が妨げられて眼圧（ＩＯＰ）の上昇を引き起こす原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、及び圧力は正常範囲内にとどまるが進行性の視力低下が起こる正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）を含めた、失明に至る神経障害群を称する。世界中で、緑内障は、６，０５０万人超の人々に影響しており、莫大な健康問題となっている。高ＩＯＰは、視神経を損傷し、緑内障において進行性かつ不可逆性の失明を引き起こすと考えられている。ＩＯＰの低下は、依然として、緑内障に対する唯一の実績のある治療である。高ＩＯＰの原因は、前眼部内の小さなフィルタ様領域である線維柱帯（ＴＭ）において前者に対する耐性の増大に起因して房水（ＡＨ）流出が低下することである。プロスタグランジン（ＰＧ）は、平滑筋刺激物質として１９５５年に虹彩において確認され、１９９７年以降、局所適用として緑内障に有効な治療である依然として唯一の脂質クラスである。正常な房水流出経路は、ＴＭを通るものであり、従来経路と呼ばれている。異常な高圧が急増する事象においては、ぶどう膜強膜経路と呼ばれる補助経路が一時的に選ばれる場合が多い。プロスタグランジンアナログは、ぶどう膜強膜経路を介して房水流出を増大させる。従来の流出経路を増大させる公知の薬は、緑内障薬としての効能がプロスタグランジンより劣っていてかなりの副作用を伴うピロカルピンを除いて存在しない。このように、従来経路を標的とした新規の治療法の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書において、対象（例えば、ヒト）においてＩＯＰを低下させるための組成物、キット、及び方法を開示する。組成物は、対象において非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しないまたは低レベル（典型的には、例えば、ＡＨタンパク質１μｇあたり１５ｆｍｏｌ以下）で存在しかつ緑内障対象においてＩＯＰを低下させる脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基もしくはスフィンゴイド塩基−１−リン酸、サイコシンまたは他の糖脂質）の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログを、緑内障対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進させかつ緑内障対象においてＩＯＰを低下させるための治療有効量で含む。組成物は、例えば、ＰＯＡＧ及びＮＴＧを含めた緑内障を処置するために使用され得る。本明細書において、非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しないまたは低い（減少された）レベルで存在しかつ哺乳動物においてＩＯＰ調節を可能にする新規の脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基またはスフィンゴイド塩基−１−リン酸、サイコシン及び他の糖脂質）の発見を記載する。
【０００６】
ＡＨ中の内在性脂質の同定及び緑内障に関連する脂質変化の同定は、本明細書に記載のように、ＩＯＰのホメオスタティック制御及びそれに向けた線維柱帯細胞の役割に新規の見識を提供する。ＡＨ中の内在性脂質の同定及び定量化は、多様な分子を同定するために異常に多種多様な化学が必要であること、ならびに通常のクロマトグラフィ及び／または核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術によって多量の精製された脂質種（≧０．５μｇの個々の種）が必要とされることに起因して、以前は難題であった。本明細書に記載の発見は、これらの障壁の両方を取り除く。中程度分解能質量分析を使用した、両方のヒト（対照の非緑内障及びＰＯＡＧの間）ならびにＤＢＡ／２Ｊマウス（正常眼圧、高眼圧及び圧上昇後状態の間）におけるＡＨ及びＴＭの脂質のクラス特異的分析は、対照及び緑内障間で重要な差異を明らかにした。ＤＢＡ／２Ｊは、８ヶ月付近でＩＯＰの自発的上昇を生じる緑内障のマウスモデルであり、したがって、ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて、８ヶ月未満の年齢では正常眼圧、８〜１２ヶ月では高眼圧状態であると考えることができる。１２ヶ月を超えると、ＩＯＰは、ＡＨの産生の減少に起因するとされる自然な低下を経る。ＤＢＡ／２Ｊマウスは、色素散乱を示す場合が多いが、自発的なＩＯＰ上昇及びＩＯＰ上昇度は色素散乱の程度と相関していない。ヒトにおいて、色素散乱は、ＩＯＰ上昇を誘発することなくクリアになる場合が多く、死体の眼内への散乱した色素物質の注入は、有意なＩＯＰ上昇を生じない。ＤＢＡ／２Ｊマウスの多くのコホートは、色素散乱とＩＯＰ上昇との間の相関に欠いている。ＤＢＡ／２−Ｇｐｎｍｂ＋−Ｓｊ／Ｊマウスと呼ばれる、ＤＢＡ／２Ｊの遺伝的に同一の系列においては、６６ｋＤａのタンパク質ｃｏｃｈｌｉｎの過剰発現がＩＯＰ上昇を引き起こすが、約６６ｋＤａの血清アルブミンまたはＲＰＥ６５タンパク質では引き起こさず、このことは、ＩＯＰの上昇が、タンパク質によるまたは色素散乱によるＴＭの単純な閉塞よりもさらに複雑であることを示唆している。本明細書において、ＡＨにおいて同定された内在性脂質の生物学的アッセイの結果（表１（図１１））を記載しており、これらの結果は、４の異なるマウスモデルにおける局所適用後のＩＯＰの低下を実証している。以下の生物学的アッセイを、これら内在性脂質の特性決定に使用した：（１）初代線維柱帯細胞の移動度及び形状の役割、（２）包埋された初代ＴＭ細胞によるゲルマトリクスの拡大及び／または収縮、（３）Ｕｓｓｉｎｇ型チャンバにおける透過性濾紙上の初代細胞集合層を横切るフルオレシンの輸送、ならびに（４）４の異なる緑内障マウスモデル（（ａ）ＤＢＡ／２Ｊ、（ｂ）ｃｏｃｈｌｉｎ−過剰発現、（ｃ）ＣＴＧＦ−過剰発現及び最終的には（ｄ）トランスジェニックミオシリン変異マウス［Ｔｇ−ＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）］）においてＩＯＰを低下させ失明を食い止める能力のアセスメント。
【０００７】
したがって、本明細書において、対象において眼圧（ＩＯＰ）を低下させるための組成物を記載する。組成物は、薬学的に許容されるビヒクルと、対象において非緑内障房水に内在する脂質の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログとを含む。種々の実施形態において、脂質は、対象においてＩＯＰを低下させる、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１−リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質である。脂質は、対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ対象においてＩＯＰを低下させるための治療有効量で付与される。
【０００８】
本明細書において、対象において眼圧を低下させるための組成物も記載する。組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、ならびに、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の少なくとも１つを対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ対象において眼圧を低下させるための治療有効量で含む。組成物は、典型的には、局所投与用に製剤化される。一実施形態において、組成物は、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の２つ以上を含む。組成物は、プロスタグランジン及び／またはプロスタグランジンアナログをさらに含むことができる。薬学的に許容されるビヒクルは、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール４００またはｄ−α−トコフェロールプロピレングリコール１０００スクシネートであってよい。
【０００９】
本明細書において、対象において眼圧を低下させるための組成物をさらに記載する。組成物は、薬学的に許容されるビヒクル、ならびに、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の少なくとも１つのアナログを対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ対象において眼圧を低下させるための治療有効量で含む。組成物は、典型的には、局所投与用に製剤化される。組成物は、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の２つ以上の、２つ以上のアナログを含むことができる。組成物は、プロスタグランジン及び／またはプロスタグランジンアナログをさらに含むことができる。薬学的に許容されるビヒクルは、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール４００またはｄ−α−トコフェロールプロピレングリコール１０００スクシネートであってよい。
【００１０】
本明細書において、対象において眼圧を低下させる方法をさらに記載する。方法は、対象に、薬学的に許容されるビヒクルと、対象においてＩＯＰを低下させかつ非緑内障ＡＨに存在するが緑内障ＡＨでは存在しないまたは非常に低レベル（例えば、非緑内障ＡＨと比較して緑内障ＡＨにおいて少なくとも１／１０００未満、またはＡＨタンパク質１μｇあたり１５ｆｍｏｌ以下）でのみ存在するホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１−リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質とを含む組成物を投与することを含む。眼圧を低下させかつ本明細書に記載の組成物及び方法の種々の態様において好適である脂質種の例を実施例２において提供する。種々の実施形態において、方法は、対象に、薬学的に許容されるビヒクル、ならびに、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の少なくとも１つまたはそのアナログを対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ対象において眼圧を低下させるための治療有効量で含む組成物を投与することを含む。典型的な実施形態において、対象は、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障または正常眼圧緑内障）を有しており、組成物の投与は、対象における失明を低減または防止する。これに関して、緑内障を処置または防止する方法も提供され、本明細書に記載の組成物が、緑内障を処置または防止するのに有効な量で対象に投与される。
【００１１】
一実施形態において、組成物は、局所投与用に製剤化され、少なくとも１日１回、局所的に患者に投与される。本明細書に記載の方法の任意の実施形態において、組成物は、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の２つ以上を含むことができる。同様に、組成物は、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の２つ以上の、２つ以上のアナログを含むことができる。方法において、組成物は、プロスタグランジン及び／またはプロスタグランジンアナログをさらに含むことができる。方法は、プロスタグランジン及び／またはプロスタグランジンアナログを含む第２組成物を対象に投与することをさらに含むことができる。かかる実施形態において、少なくとも１つの脂質またはそのアナログを含む組成物及び第２組成物は、対象に同時にまたは異なるときに（例えば、第１及び第２時点で）投与される。
【００１２】
本明細書において、対象において眼圧を低下させるためのキットをさらに記載する。典型的なキットは：ｉ）薬学的に許容されるビヒクル、ならびに、以下の脂質：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸；の少なくとも１つまたはそのアナログを対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ対象において眼圧を低下させるための治療有効量で含む組成物と；ｉｉ）使用説明書と；ｉｉｉ）包装材とを含む。組成物は、好ましくは無菌であり投与準備ができている。
【００１３】
別途定義されない限り、本明細書において使用されている全ての技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００１４】
用語「脂質」は、脂肪酸及びこれらの誘導体、ならびにかかる化合物に生合成的かつ機能的に関係する物質を意味する。該用語は、天然ならびに合成脂質を包含する。該用語は、天然及び合成脂質のアナログも包含する。
【００１５】
用語「アナログ」及び「誘導体」は、親分子と比較して修飾されており、親分子の少なくともいくつかの部分構造及び生体機能（または改良された生体機能）を保持する任意の分子を意味する。生体機能は、例えば、ＩＯＰを低下させる能力である。
【００１６】
本明細書において使用されているとき、「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、同義的に使用されて、長さまたは翻訳後修飾、例えばグリコシル化もしくはリン酸化に関わらず、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。
【００１７】
本明細書において使用されているとき、用語「処置」は、疾患、疾患の症状、または疾患になりやすい傾向を治療する、治癒する、緩和する、軽減する、改変する、改善する、寛解する、改良する、またはこれに影響する目的での、疾患、疾患の症状または疾患になりやすい傾向を有する対象または患者への治療剤の適用または投与、あるいは該対象または患者から単離した組織または細胞への治療剤の適用または投与として定義される。
【００１８】
本明細書において使用されているとき、句「安全・有効量」は、本発明の様式で使用されるとき、妥当なベネフィット／リスク比に相応した、適切でない副作用（例えば、毒性、炎症、またはアレルギー反応）を伴わない所望の治療反応を得るのに十分である成分の量を称する。「治療有効量」は、所望の治療反応を得るのに有効な本発明の組成物の量、例えば、個体において、ＴＭを通る房水流出を増大させかつＩＯＰを低下させるのに有用な量を意味する。具体的な安全・有効量または治療有効量は、例えば、処置される特定の状態、患者の身体状態、処置される哺乳動物または動物の種類、処置の持続時間、並行する治療（存在する場合）の性質、及び使用される具体的な製剤などの因子によって変動する。
【００１９】
用語「患者」、「対象」及び「個体」は、本明細書において互換的に使用され、処置される、処置された、または処置すること及び／もしくは生体サンプルを得ることが考えられる脊椎動物対象、典型的には、哺乳動物対象（例えば、ヒト、齧歯動物、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコなど）を意味し、ヒト患者が好ましい。いくつかの場合において、本明細書に記載の方法、キット、及び組成物は、限定されないが、マウス、ラット及びハムスターを含めた齧歯動物ならびに非ヒト霊長類を含めた、実験動物における、獣医用途における、ならびに、疾患の動物モデルの開発における使用を見出す。
【００２０】
本明細書に記載のものと同様または等価の組成物、キット、及び方法を本発明の実用または試験において使用することができるが、好適な組成物、キット、及び方法を以下に記載する。本明細書において言及されている全ての公報、特許出願、及び特許は、これらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が支配する。以下に議論する特定の実施形態は、説明目的のみであり、限定的であることは意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、緑内障ＡＨにおけるＰＣ種の消失を正常対照と比較して実証する代表的な質量分析データを示す。陽イオンモードにおけるヒト房水（ＡＱＨ）中のホスファチジルコリン（ＰＣ）クラス脂質のエレクトロスプレーイオン化質量分析。Ａ及びＢは、示されているようにヒト緑内障及び正常ＡＨの代表的な分析であり、内部標準（矢印；ｍ／ｚ比６５０．６）をレシオメトリック定量化に使用したものである。親イオン走査をｍ／ｚ：６００〜９００で実施した。矢印は、正常ＡＨにおける特有の種の存在を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、線維柱帯初代細胞への脂質の影響の代表的な画像を示す。表示の時間間隔での細胞の時間経過画像。Ａ．対照ＴＭ細胞をリン酸緩衝生理食塩水中のビヒクル（５％ＤＭＳＯ）に供した。対照群におけるほとんどの細胞は、丸いままであるか、または、いくつかが突出部を有することを示してほんのいくらかだけ細長くなった。細胞内の糸状仮足の突出部を太い矢印によって示す。ビヒクルの添加後２分〜１６分では、突出部は変化しないままであった。Ｂ．１０ｐｍｏｌの脂質で処理したＴＭ細胞。ほとんどの細胞が突出部を有し、ほんの数細胞が突出部を有していない。脂質処理細胞における糸状仮足は、動的であり、矢印で示すように、これらは、血清不含培地において脂質の添加後１または２分で活動の後退の開始を経る。１６分で、糸状仮足は大幅に後退する。
【図３】図３は、包埋されたコラーゲンゲルの拡大及び／または収縮アッセイからの結果を示す。約１０，０００個の初代ＴＭ細胞を、１０ｐｍｏｌの表示の脂質で処理せず（対照）または処理した後にラットコラーゲンを含む毛細管に入れた。コラーゲンのカラム長さの変化を２４時間終了後に測定した。３つの独立実験からの平均及び標準偏差を提示する。黄色／灰色ゾーンによって示すように、拡大を４つのゾーン（２、３及び４が同定されている）：１＝＞１．０ｍｍ；２＝１．０〜１．４ｍｍ；３＝＞１．４ｍｍであるが＜２．０ｍｍ；４＝２．０かつ＞２．０ｍｍ；に分類した。
【図４】図４は、Ｕｓｓｉｎｇ型チャンバにおける多層の初代ＴＭ細胞を横切るフルオレセイン輸送のアッセイからの結果を示す。５層の細胞を０．４５μｍのポアサイズのＰＶＤＦフィルタにキャストし、第２〜第４層には上部にラットコラーゲンを付した。対照（脂質処理なし）または１０ｐｍｏｌの表示の脂質で処理した細胞をこれらの測定に使用した。一度でサンプルを導入した後１５秒での対向端からのフルオレセインの輸送を推定した。３つの独立実験からの平均及び標準偏差を提示する。相対輸送を２つのゾーン（黄色でマーキング）に分割しており、示すように、輸送が０．４８超であるが０．６２未満であるとき＝１；０．６２超＝２である。
【図５Ａ−５Ｃ】図５は、午後１〜４時の間に投与した１μｌ中５％ＤＭＳＯ（ビヒクル）中１０ｐｍｏｌの表示の脂質の局所適用を使用したマウスにおける眼圧の測定を示す。右眼をビヒクル単独で処置し、左目を脂質で処置した。対照は、両眼をビヒクルで処理した。Ａ．ＤＢＡ／２Ｊマウスにおいて、ビヒクルまたは対照（ビヒクルのみ）中の表示の脂質を、ＩＯＰ≧１８ｍｍＨｇ（１５ｍｍＨｇの平均ベースラインから２０％の増大を処置点として使用した）を有すると記されている約７．５ヶ月齢のマウスに毎日１回投与した。表示の脂質についての平均ＩＯＰの記録を示す。Ｂ．６つのＰＣ（１３：０／１３：０；ＰＥ（１８：０／１８：０）、Ｌｙｓｏ−ＰＳ１８：０、ＰＳ１８：１、スフィンガニン及びＣ１７Ｓ１Ｐ）のそれぞれ１０ｐｍｏｌを組み合わせ、５％ＤＭＳＯ（ビヒクル）中で、ＤＢＡ／２Ｊマウスの眼に最大７日まで１日１回、局所投薬として適用した。他方の眼はビヒクルのみを受け、ＩＯＰの低下を示さなかった。これらの脂質の組み合わせは、対照、または市販薬Ｘａｌａｔａｎ、Ｔｉｍｏｌｏｌ（図５Ｂ）もしくはＤｏｒｚｏｌａｍｉｄｅ（示していないが、Ｔｉｍｏｌｏｌと同レベルのＩＯＰ低下を有する）を含めた他の個々の薬と比較して、かなり良好なＩＯＰ低下を示した。上記のように表示の脂質の局所投与に供したトランスジェニックミオシリンマウス［Ｔｇ−ＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）］（図５Ｃ）。示すように４及び６日目で対照と比較してＩＯＰ低下が認められた。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、脂質のタンパク質標的を同定するためのアプローチの概略図を示す。Ａ．５％ＤＭＳＯ（ビヒクル）中１０ｐｍｏｌの同定された脂質を４０％の融合性初代ＴＭ細胞に適用し、１分のインキュベーション後、約１分間、ＵＶＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ１８００クロスリンカーにおいてＵＶ架橋に供した。
【図７】図７は、架橋及びメカニズムの検討に使用したホスファチジルセリン（ＰＳ）脂質、ＰＳ（１８：１）の選択蛍光アナログを示す。４つのアナログ：１８：１−０．６：０ＮＢＤ  ＰＳ、１８：１ＮＢＤ  ＰＳ、１８：１−１２：０ＮＢＤ  ＰＳ及び１８：１Ｄａｎｓｙｌ  ＰＳを示す。骨格はＰＳ（１８：１）と同様であり、それぞれの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を有する蛍光部分を各化合物の下に示す。これらの親エンティティのそれぞれの下の化合物のｍ／ｚは、これらへのＣ−１３種の組み込みに起因する種々の同位体変種の存在度を意味する。
【図８Ａ】図８Ａは、ヒトＴＭ組織におけるチャネルの同定を示す一連の顕微鏡写真である。約１１のこれらのチャネルを、ＰＳ（１８：１）脂質アナログによるＴＭ細胞のインキュベーションの最初の２分以内に、１つ以上の脂質への架橋タンパク質として最初に同定した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ヒトＴＭ組織におけるチャネルの同定を示す一連の顕微鏡写真である。約１１のこれらのチャネルを、ＰＳ（１８：１）脂質アナログによるＴＭ細胞のインキュベーションの最初の２分以内に、１つ以上の脂質への架橋タンパク質として最初に同定した。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ヒトＴＭ由来初代細胞におけるチャネルの同定を示す一連の顕微鏡写真である。約１１のこれらのチャネルを、ＰＳ（１８：１）脂質アナログによるＴＭ細胞のインキュベーションの最初の２分以内に、１つ以上の脂質への架橋タンパク質として最初に同定した。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ヒトＴＭ由来初代細胞におけるチャネルの同定を示す一連の顕微鏡写真である。約１１のこれらのチャネルを、ＰＳ（１８：１）脂質アナログによるＴＭ細胞のインキュベーションの最初の２分以内に、１つ以上の脂質への架橋タンパク質として最初に同定した。
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜９Ｃは、毛様体の混合培養における脂質産生を示す。Ａ．摘出、切除及び十分な洗浄後の毛様体（ＣＢ）の器官培養であり、ＣＢを血清不含培地に入れた。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｂは、（Ａ）従来経路及び（Ｂ）ぶどう膜強膜経路を示す、眼の前房の概略図である。
【図１１】図１１は、緑内障ＡＨと比較した両方の対照ＤＢＡ２Ｊ及びヒト（すなわち、非緑内障ＤＢＡ２Ｊ及びヒト）において特有の房水（ＡＨ）脂質を列挙する表１である。
【図１２】図１２は、対照及びＰＯＡＧの房水の２つの電子顕微鏡写真を含む。対照（５３歳）及びＰＯＡＧ（６６歳）由来の房水（ＡＨ）を遠心分離に供し、低相（ペレット）を銅グリッド上で電子顕微鏡に供した。条件は、０．１Ｍリン酸緩衝液及び２％リンタングステン酸（ＰＡＴ）であった。グリッドは、２％ＰＴＡ中４％の水性ＯｓＯ４蒸気に供した。
【図１３】図１３は、正常眼圧のカニクイザルの眼圧（ｍｍＨｇ、ｙ軸）に対する６つの脂質（ｘ軸）の影響を実証する棒グラフである。午後の１時頃に１μｌの体積で脂質を局所投与した。右眼をビヒクル単独で処置し、左目を脂質で処置した。カニクイザル（ｎ＝４）を１０ｐＭ脂質（５０ｎＭであるＣ１７Ｓ１Ｐを除く）で５日間処置した。サルを処置の前後に細隙灯検査及びＩＯＰ測定に供した。処置５日目に処置後３〜６時間で測定したＩＯＰを中実棒で示す。中空棒は対照（ビヒクルのみ（５％ＤＭＳＯ））である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
対象（例えば、ヒト）においてＩＯＰを低下させるための組成物及びキットは、非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しないまたは低レベルで存在する、また、緑内障対象に投与（例えば、局所付与）されたとき、対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進する脂質（例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１−リン酸、サイコシンまたは他の糖脂質）の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログを含む。対象においてＩＯＰを低下させる方法及び対象において緑内障を処置する方法は、かかる組成物を投与することを含む。組成物、キット及び方法は、例えば、ＰＯＡＧ及びＮＴＧを含めた任意のタイプの緑内障を処置するのに使用され得る。
【００２３】
以下に記載の好ましい実施形態は、これらの組成物、キット、及び方法の適応を示す。にもかかわらず、これらの実施形態の記載から、本発明の他の態様が、以下に提供する記載に基づいて作成及び／または実行されてよく、本発明の部分として企図される。
生物学的方法
【００２４】
従来の分子生物学技術を含む方法を本明細書に記載する。かかる技術は、当該分野において一般に知られており、方法に関する論文、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９２）（定期的に更新されている）に詳細に記載されている。生化学技術は、当該分野において一般に知られており、方法に関する論文、例えば、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｕａｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｎｋ，Ａ．Ｚ．Ｆｅｒｎａｎｄｉｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００７年３月３０日）に詳細に記載されている。脂質の合成方法もまた、当該分野において周知されており、方法に関する論文、例えば、Ｌｉｐｉｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ，ｂｙ  Ｆｒａｎｋ  Ｄ  Ｇｕｎｓｔｏｎｅ  Ｅｄ．，Ａｌｍｏｎｄ  Ｐｒ（１９９９）に詳細に記載されている。
対象において眼圧を低下させるための組成物
【００２５】
本明細書において、眼圧を低下させるために対象（例えば、緑内障を有するヒト）に投与される脂質及び脂質含有組成物を記載する。典型的な実施形態において、対象において眼圧を低下させるための組成物は、薬学的に許容されるビヒクルと、非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しないまたは低（減少した）レベルで存在し、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質であり、また、対象においてＩＯＰを低下させる脂質の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログとを含む。少なくとも１つの天然もしくは合成された脂質またはそのアナログは、対象の少なくとも一方の眼においてＴＭを通る房水流出を促進しかつ対象においてＩＯＰを低下させるための治療有効量である。対象においてＩＯＰを低下させる任意の好適なホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質が使用されてよい。かかる脂質の例として、表１（図１１）に列挙されているもの（すなわち、ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、ＰＳ：１８：１、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸）が挙げられる。天然脂質及びそのアナログ誘導体の合成バージョンが、ＩＯＰを低下させ緑内障を処置するために本明細書に記載の組成物において使用され得る。表１（図１１）を参照すると、列挙されている全ての脂質は、ＰＳのアナログ（１８：０／０：０）であるＰＳ（１８：１）を除いて、非緑内障ＡＨに内在する天然脂質である。アナログは、感知できる毒性を示さず、また、ＩＯＰを低下させる生体機能を失わないように設計される。図７及び８を参照すると、ＰＳの蛍光アナログ（１８：１）が生成及び試験されている。
【００２６】
ＩＯＰを低下させるための組成物は、非緑内障ＡＨに内在する１つまたは２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７など）の天然もしくは合成脂質またはそのアナログを含むことができる。組成物は、例えば、表１（図１１）に列挙されている脂質の１つまたは２つ以上を含むことができる。別の例として、組成物は、表１（図１１）に列挙されている１つまたは２つ以上の脂質のアナログを、２つ以上含むことができる。ＩＯＰを低下させるための組成物は、プロスタグランジン及び／またはプロスタグランジンアナログをさらに含むことができる。
【００２７】
本明細書に記載の天然脂質、合成脂質、及びそのアナログは、任意の好適な方法によって調製され得る。天然脂質は、例えば、植物源からクロマトグラフィ分離によって得られ得る（例えば、天然脂質は、からし種の油から分離され得る）。代替的には、脂質は、標準の有機化学合成を含めた公知の技術を使用して合成され得る。大規模な植物油または家畜（ブタもしくはウシ）の眼からの脂質の有機相抽出は、有機相抽出（例えば、クロロホルム及びメタノール混合物を使用したＢｌｉｇｈ・Ｄｙｅｒ法またはＦｏｌｃｈ法）において抽出される混合物からの特定の脂質のクロマトグラフィ分離を可能にする。有機合成では、容易に入手可能な前駆体分子が標準の有機化学合成手順に従って修飾されてよい。天然脂質、合成脂質またはそのアナログは、一旦得られまたは合成されたら、薬学的に許容されるビヒクルと共に典型的には製剤化されて局所投与される。任意の好適な薬学的に許容されるビヒクルが使用されてよい（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール４００またはｄ−α−トコフェロールプロピレングリコール１０００スクシネート）。
対照において眼圧を低下させる方法
【００２８】
対象において眼圧を低下させる方法を本明細書に記載する。一実施形態において、方法は、対象に、薬学的に許容されるビヒクルと、対象において非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しない脂質の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログとを含む組成物を投与することを含む。脂質は、種々の実施形態において、対象においてＩＯＰを低下させる、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１−リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質である。対象が緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障または正常眼圧緑内障）を有するとき、組成物は、対象において、緑内障を処置し、失明を防止または軽減するための治療有効量である。方法の一実施形態において、組成物は、局所投与用に製剤化され、対象（例えば、緑内障を有するヒト患者）に少なくとも１日１回、局所的に投与される。例えば、１０〜２０ｐｍｏｌの脂質混合物は、５％ＤＭＳＯと共に添加され、液滴（または複数の液滴）が点眼器を使用して眼に局所的に適用される。方法において、組成物は、プロスタグランジンまたはプロスタグランジンアナログを含むこともできる。別の実施形態において、対象において非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しない、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１−リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質であり、また、対象においてＩＯＰを低下させる脂質の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログを含む第１組成物が対象に投与され、プロスタグランジンまたはプロスタグランジンアナログを含む第２組成物が対象に投与される。この実施形態において、第１及び第２組成物は、同時にまたは異なる（例えば、第１及び第２）時点で対象に投与され得る。
対象において眼圧を低下させるためのキット
【００２９】
本明細書において、対象において眼圧を低下させかつ緑内障を処置するためのキットを記載する。一実施形態において、対象において眼圧を低下させるためのキットは、薬学的に許容されるビヒクルと、対象において非緑内障ＡＨに内在するが緑内障ＡＨでは存在しない、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、スフィンゴイド塩基、スフィンゴイド塩基−１−リン酸、セラミド、コレステロール、サイコシンまたは他の糖脂質であり、ＩＯＰを低下させる脂質の少なくとも１つの天然もしくは合成されたバージョンまたはそのアナログとを含む組成物、ならびに使用説明書を含む。キットは、第２のかかる脂質、及び場合によりプロスタグランジンまたはプロスタグランジンアナログをさらに含むことができる。キットにおいて、説明書は、組成物の説明；緑内障の処置のための処方計画及び投与；注意事項；警告；適応症；禁忌；過用量情報；有害反応；動物薬物動態；臨床研究；ならびに／または参考文献の１つ以上を一般に含む。説明書は、容器（存在する場合）に直接、容器に適用されるラベルとして、または容器内にもしくは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カードもしくはフォルダとして印刷されていてよい。一般に、本明細書に記載のキットは、包装材も含む。いくつかの実施形態において、キットは、治療または予防組成物を含有する無菌容器を含み；かかる容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野において公知の他の好適な容器であってよい。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、または細胞もしくは医薬を保持するのに好適な他の材料から作製されていてよい。
有効用量
【００３０】
上記の組成物は、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類、ウシ、イヌ、齧歯動物、ヒト）に、有効量、すなわち、処置される対象において望ましい結果（例えば、対象において失明を遅延、軽減または防止する）をもたらすことが可能である量で好ましくは投与される。本明細書に記載の方法で利用される組成物の毒性及び治療効能は、標準の薬学的手順によって決定され得る。医薬及び獣医分野において周知されているように、任意の一動物への投薬量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、投与の時間及び経路、全身の健康、ならびに並行して投与される他の薬物を含めた多くの因子に依る。
【００３１】
投与される治療剤（例えば、脂質）の量は、投与様式、患者の年齢及び体重に応じて、ならびに疾患の病状によって変動する。本明細書に記載の組成物は、１０ｐｍｏｌ〜１０μｍｏｌの用量で典型的には投与される。
【００３２】
本明細書に記載の治療組成物は、任意の好適な経路によって対象に投与され得る。組成物は、局部、局所、経口または全身投与に好適である投薬形態で付与されてよい。組成物は、局所的に適用されるとき、角膜に典型的には局所的に適用され、そこから線維柱帯に容易に浸透する。組成物は、非毒性の薬学的に許容される担体を典型的には含み、従来の薬務（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２０００）及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８−１９９９）を参照されたい）によって製剤化されてよい。
【実施例】
【００３３】
本発明を以下の具体例によってさらに説明する。以下の例は、単に説明目的で提供されるものであり、決して、本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
実施例１−眼圧の内在性脂質調節剤
【００３４】
本明細書において、脂質のプロファイリングのための質量分析方法及び同定された脂質を用いたその後の生物学的アッセイの第１の使用を記載する。内在性脂質［１４の特異的脂質、すなわち：ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））；ＰＥ（１８：０／１８：０）；ＰＳ（１４：０／０：０）；ＰＳ（１８：０／０：０）；ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ；１８：１ＰＳ；ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））；ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））；Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））；Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）；Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））；ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）；スフィンガニン及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸］を、ヒト対照及び緑内障患者のＡＨのスクリーニングから、対照においてのみ存在するが緑内障ＡＨにおいては存在しないと同定した。以下のアッセイにおいて、（１）脂質への暴露に起因した線維柱帯（ＴＭ）初代細胞の移動度及び細胞形状変化、（２）人工包埋において細胞のアンサンブルを含むゲル拡大アッセイ／収縮アッセイ、及び（３）初代ＴＭ細胞の集合層におけるフルオレセインの輸送を実証するためのアッセイが、ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））を除く上記に列挙した脂質に関する影響を示した。非哺乳動物脂質の１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンＰＣ（１３：０／１３：０）もまた、これらのアッセイにおける任意の影響の欠失を示した。およそ８ヶ月齢で自発的に高ＩＯＰを発症するＤＢＡ／２Ｊマウスを用いたスクリーニングにおいて、ＰＥ（１８：０／１８：０）；ＰＳ（１４：０／０：０）；ＰＳ（１８：０／０：０）；ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ；１８：１ＰＳ；ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））；ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））；Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））；Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）；Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））；ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）；スフィンガニン及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸によってはＩＯＰの低下が示されたが、ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））及びＰＣ（１３：０／１３：０）によっては示されなかった。同様の結果が、ｃｏｃｈｌｉｎ−過剰発現によって、ＣＴＧＦ−過剰発現によって、及びトランスジェニックミオシリン変異マウス［Ｔｇ−ＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）］においても見出された。
結果
【００３５】
緑内障房水中の脂質の排除及び実質的低下。中解像度質量分析計（ＴＳＱ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍａｘ）からの房水の広範な分析は、緑内障において大幅な減少を経た、対照ＡＨにおける多数の特有の種を示している（図１）。広範な分析により、１４エンティティ（ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））、ＰＥ（１８：０／１８：０）、ＰＳ（１４：０／０：０）、ＰＳ（１８：０／０：０）、ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ、１８：１ＰＳ、ＰＩ（１２：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））、ＰＩ（１８：０／２０：４（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ））、Ｃｅｒ（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））、Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、Ｃｅｒ（ｄ１８：１／２６：１（１７Ｚ））、ＳＭ（ｄ１６：１／２５：０）、スフィンガニン、及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸）のレベルが、機器の検出限界未満に大幅に低下したことが見出された（表１）。
【００３６】
細胞の運動性及び形状の調節。初代ＴＭ細胞の対照（ビヒクル−１０％ＤＭＳＯのみで処理した）形状（図２Ａ）と比較して、脂質への暴露が細胞の形状を変化させ、糸状仮足及び運動性を促進させた（図２Ｂ）。これらの脂質は全て、糸状仮足の収縮を促進し（図２Ｂ、矢印）、また、拡大も同様であった。これらの画像は、初代ＴＭ細胞の時間経過のビデオ画像及びいくつかのドナー由来細胞からの要約データに由来した。脂質への暴露により、細胞が糸状仮足形成に関してより動的になり、動的に拡大−収縮した（表１（図１１）に要約）。運動性及び糸状仮足形成は、種々の内部及び外部要因、例えば、細胞が由来するドナーの年齢、細胞密度、培地の組成、環境温度及びインキュベーションガスの組成に影響される。ドナーの年齢及び細胞密度は、最も顕著な因子である。表１（図１１）に記述されている全ての脂質［ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））及び１，２−ジトリデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンＰＣ（１３：０／１３：０）を除く］への暴露は、糸状仮足形成の動態の大幅な増大を生じさせた。このことは、糸状仮足形成の動態が大幅に低下する高齢ドナー由来のＴＭ細胞において最も顕著であるが、より若年ドナーに由来するＴＭ細胞においても認識される。
【００３７】
フィルタ膜上での細胞の包埋マトリクス及び集合層における細胞アンサンブルの特性。毛細管中の、コラーゲンマトリクス中のゲル包埋初代ＴＭ細胞を、確立されたプロトコル（Ｉｌａｇａｎ，Ｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２０１０；４８：１５３−５）に従って用意し、これらが、ゲル（対照）またはゲル包埋前に血清不含培地において脂質による処理に１時間供された細胞を最初の２４時間以内に拡大または収縮させる能力を決定した。マトリクス包埋アッセイシステムにおいて細胞拡大を調節する脂質（図３）が見出された。脂質がゲル包埋細胞拡大に影響する能力を表１（図１１）に要約する。僅かに異なる設定、例えば、より長期間のインキュベーションを使用したこれらの実験は、拡大の代わりにゲル収縮を実証することができる。これらのアッセイにおいて、ゲルの拡大を生じさせるが収縮を生じさせない全ての条件を選択した（ゲルの収縮を示し得る条件を使用しなかった）。拡大の程度を４ゾーン（１、２、３、及び４）に分割した（図３）。数字が大きいほど、拡大が大きい。
【００３８】
細胞集合層状ＴＭ細胞を横切るフルオレセインの輸送をＵｓｓｉｎｇ型チャンバにおいて決定した（図４）。第１層の後の層間にコラーゲンマトリクスを含む５層の初代ＴＭ細胞層を無菌ＰＶＤＦ膜（０．４５μｍポア）上に置いた。フルオレセインをポートの片側（細胞側）から導入し、導入の１５秒以内に別の側（膜側）からサンプリングした。細胞のみの対照と、複数層を形成する前に１〜３時間脂質で処理した細胞との間の輸送の差（図４）を観察した。フルオレセイン輸送を定量化し、１及び２として２つのカテゴリー（黄色ゾーンでマーキング）に分割した（図４）。表１（図１１）は、細胞の集合層を使用した輸送データの要約を提示する。
【００３９】
数字で表示した細胞移動度、ゲル拡大及びフルオレセイン輸送と一緒に（範囲１〜４、数字が大きいほど、測定した特性の強度が高い）、総合指数を作成した（表１（図１１））。本明細書に記載の脂質は、単離された細胞レベルで、または細胞アンサンブルレベルで、ＴＭ細胞挙動を調節することができる。
【００４０】
マウスモデルにおける眼圧低下。内在性脂質は、緑内障のＤＢＡ／２ＪマウスモデルにおいてＩＯＰを低下させた（図５Ａ）。ＤＢＡ／２Ｊは、ＩＯＰの上昇が自発的に起こる唯一の公知のマウス動物である。このマウスは色素散乱にも罹患しているが、しかし、ＩＯＰの上昇はＩＯＰ上昇とは相関しないようである。表示されている脂質を局所投薬として適用した（ビヒクルとしての５％ＤＭＳＯ中１０ｐｍｏｌ）。５％ＤＭＳＯのみのビヒクルは対照として機能した（図５Ａ）。短期適用後のＤＢＡ／２ＪにおけるＩＯＰの上昇後のＩＯＰの低下も測定した（図５Ｂ）。６つ：ＰＣ（１３：０／１３：０；ＰＥ（１８：０／１８：０）、Ｌｙｓｏ−ＰＳ１８：０、ＰＳ１８：１、スフィンガニン、及びＣ１７Ｓ１Ｐ）；の各々の１０ｐｍｏｌを組み合わせ、５％ＤＭＳＯ（ビヒクル）中（つまり、１０ｐｍｏｌの各ＰＣが含まれている）、ＤＢＡ／２Ｊマウスの眼に１日１回、最大７日まで局所投薬として適用した。他方の眼はビヒクルのみを受けており、ＩＯＰの低下を示さなかった。図５Ｂに示すように、これらの脂質の組み合わせは、対照または市販薬Ｔｉｍｏｌｏｌ及びＤｏｒｚｏｌａｍｉｄｅを含む他の個々の薬物と比較して、かなり良好なＩＯＰ低下を示した。約３５ｍｍＨｇのＩＯＰを示した８ヶ月齢のＤＢＡ／２Ｊマウスを選択した。代表的なデータを図５Ｂに提示する。３ヶ月で高ＩＯＰを示すトランスジェニックミオシリン変異マウス［Ｔｇ  ＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）］もまた、これらの脂質によるＩＯＰ低下の決定に使用した（図５Ｃ）。概して、これらのマウスは、２４ｍｍＨｇのＩＯＰを示し、脂質は、このモデルにおいてもまた、ＩＯＰの低下を示した（図５Ｃ）。ここに記載のＤＢＡ／２Ｊモデルに加えて、これらの内在性脂質は、ｃｏｃｈｌｉｎ及び結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）過剰発現モデルにおいてＩＯＰを低下させた。これらのマウスにおける過剰発現を、レンチウイルスベクター媒介過剰発現を使用して達成した。このように、ここで評価される内在性脂質は、非常に様々なＤＢＡ／２Ｊ及びＭＹＯＣ（Ｙ４３７Ｈ）マウスモデルならびに誘発された及び自発的なＩＯＰ上昇を包含する広範な４の齧歯動物緑内障モデルをカバーするｃｏｃｈｌｉｎ及びＣＴＧＦ過剰発現モデルにおいてＩＯＰを低下させた。
【００４１】
脂質のタンパク質標的は、機械受容チャネルを含む。図６に示すように、ＰＳ（１８：１）のアナログのＵＶ架橋戦略及び蛍光バンドの直接質量分析をタンパク質標的の同定に用いた（図６）。ＰＳ（１８：１）の種々の蛍光アナログを図７に示す。非特異的アナログとしてＰＣ１３：０／１３：０も使用したため、この非特異的アナログとの架橋を示すタンパク質バンドを質量分析に供さなかった。ＰＳ（１８：１）により架橋したいくつかのメカノトランスダクションチャネル（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）を同定した。先に、架橋から独立して、ＴＭ及び初代ＴＭ細胞におけるこれらのチャネルのいくつかの存在を検出した。多くのこれらのチャネルが従来の流出経路において局在化していることが見出され（図８Ａ）、このことは、従来経路を介しての内在性脂質の影響の可能性を示唆した。脂質によって架橋すると同定されたチャネルは、ＴＭに存在するとしてｍＲＮＡ（ＧＥＯデータベース）においてタンパク質レベルで検出された。
【００４２】
内在性脂質は毛様体（ＣＢ）において発生する。緑内障において、ＣＢ及び疾患におけるその異常は、依然として、不十分な調査領域である。ＣＢは、ＡＨの産生を低下させることを除いて十分に標的化されなかった。ＡＨは、ＣＢにおいて産生されると考えられる。これらの脂質のいくつかの産生がＡＨにおいて起こるか否かを決定した。このことは、脂質によるＡＨの動態のホメオスタティック制御を示唆することができ、将来において、特異的な標的化に使用され得る。血清不含培養の、毛様体の器官培養（図９Ａ、Ｂ）において、これらの脂質の大部分（表１（図１１）；図９Ｃ）が発生することを質量分析によって見出した。換言すると、ＣＢの器官培養により、これらの内在性脂質の発生が示され、マウスモデルにおける生物学的活性及び眼圧低下が示された（図５）。このように、毛様体は、緑内障の処置に関して潜在的な特異的標的であり得た。
【００４３】
データの解明の概要。対照のヒトＡＨには存在するが緑内障には存在しない内在性脂質（表１（図１１））を同定した。これらの脂質もまた、全てが、高眼圧状態のＤＢＡ／２Ｊマウスの線維柱帯には存在しないが正常眼圧状態においてはそうではないことが示された。これらの脂質への暴露は、細胞特性及びゲル包埋細胞の細胞集合層の特性の変化を示した（図１〜４）。これらの挙動への影響と高ＩＯＰの低下との間の相関（図５；表１（図１１））が見出された。ＩＯＰ低下は、（ａ）ＰＳ１８：０Ｌｙｓｏ−ＰＳ及びＰＳ：１８：１による；（ｂ）Ｃ１８：１ジヒドロセラミド（ｄ１８：０／１８：１（９Ｚ））（Ｎ−オレオイル−Ｄ−エリトロ−スフィンガニン）、スフィンガニン及びＣ１７スフィンガニン−１−リン酸による、ならびに（ｃ）ＰＥ（１８：０／１８：０）による、３つの違った動力学を示した。ＩＯＰ低下の動力学の差に基づいて、作用機構が、これらの３つの異なるタイプの脂質種で異なることが予期される。房水流出は、従来経路（ＴＭ）、及び非従来またはぶどう膜強膜経路を介して起こり得る（図１０）（Ｇｏｅｌ，Ｍ．，Ｐｉｃｃｉａｎｉ，Ｒ．Ｇ．，Ｌｅｅ，Ｒ．Ｋ．＆  Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋ．Ｏｐｅｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｊ．２０１０；４：５２−５９）。緑内障においてこの流出が従来経路によって減少されるという証拠にも関わらず、この経路を介して流出を増大させる有効な薬物が欠失している。メカノトランスダクションチャネル（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）及び従来経路におけるこれらのいくつかの顕著な存在の同定により、これらの内在性脂質がこの経路を利用したＩＯＰ低下を発揮し得ることが示唆される。最終的に、これらの脂質は毛様体によって発生する。このように、これらの発生プロセスは、緑内障治療の改良のための将来的な薬物標的であり得る。
方法
【００４４】
ＴＭ細胞培養実験：初代ヒトＴＭ細胞を死体の強角膜切片から培養した。細胞を、シュレム管を含み隣接する領域の鈍的切開によって単離し、続いて、２０％の０．０１μｇ／μＬコラゲナーゼ−Ａ（カタログ番号ＬＳ００４１９４、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ  ＮＪ）のＤＰＢＳ（カタログ番号２１−０３０−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）懸濁液中で２時間消化させた。鈍的切開及びタンパク質分解処理を１２ウエル培養プレート（カタログ番号６６５−１８０Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｎｅｕｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で実施した。［ＤＭＥＭ  １Ｘ（カタログ番号１０−０１７−ＣＭ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）、１０％の熱不活性化ＦＢＳ（カタログ番号３５−０１６−ＣＶ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、０．５％の１．７ｍＭ  Ｌ−グルタミン（カタログ番号Ｇ６３９２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％の抗生抗菌溶液（カタログ番号３０−００４−ＣＬ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）］を含む培養培地を２時間後に添加し、消化を終了させた。無菌の顕微鏡スライド（カタログ番号５６７００−１９４、ＶＭＲ）を組織断片の上部に置き、培地ウエル内での底面接触及び固定を確保した。切片を細胞培養インキュベータ内で５％ＣＯ2中３７℃にて培養した。培地を７日後に１Ｘ  ＤＰＢＳで洗浄して組織デブリを除去し；培地変更を３〜４日毎に行った。こうして得られた細胞をトリプシン処理し（カタログ番号２５−０５０−Ｃｌ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、その結果、０．４μｇ／ｕＬの各ベクターＤＮＡ対トランスフェクション剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、カタログ番号１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（各ウエルへの添加後に製造者の説明書に従って調製）比を使用してトランスフェクション複合体を作り出す前日に分布させ、トランスフェクション反応を２．５時間のスパンにわたって起こさせ、その後、細胞培養培地の添加によって終了させた。細胞アッセイ及び免疫組織化学的分析は、形態学的変化に対するベクター発現の影響を観察かつ追跡するために、２４時間のタイムマーク内で実施した。経時的顕微鏡法は、トランスフェクション後２４時間で開始して１５分毎のスナップショットによって２０時間の持続時間で、ガラスボトムチャンバースライド（カタログ番号１５４５３４、Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ  ＮＹ）において成長した細胞、及びＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｅｒｔ  ２００Ｍを使用して実施した。免疫組織化学的分析は、トランスフェクション後０、２４、及び２９時間の時間間隔で、４％ＰＦＡ（カタログ番号１９９４３、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）によって固定した細胞において実施した。固定した細胞を、原発性抗体（カタログ番号５３７０、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ；カタログ番号ａｂ８３９３２、Ａｂｃａｍ；カタログ番号Ｒ４１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号ｓｃ−１９２４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．；カタログ番号ｓｃ−１８０３５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，カタログ番号ＨＰＡ００４９１６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ｃｏｃｈｌｉｎ、ＫＣＮＫ２（ＴＲＥＫ１）、アクチン、アネキシンＡ２、α−ＴＥＣＴ及びＤＩＡＰＨ−１についてプローブし、油浸によって４０×／６３×の倍率にて共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ６０００Ｂ）で撮像した。排泄されたタンパク質の分析用の培地をトランスフェクション後２４時間で収集し、ｃｏｃｈｌｉｎ及びアネキシンＡ２（カタログ番号ｓｃ−１９２４、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）に関するＥＬＩＳＡプロービングに供した。
【００４５】
ＨＥＫ−２９３Ｔ及びＣＯＳ−７細胞をプラスミド発現ｃｏｃｈｌｉｎまたはアネキシンＡ２によってトランスフェクトした。トランスフェクション後２４時間で培地を収集し、ｃｏｃｈｌｉｎ及びアネキシンＡ２に関するウエスタンブロット分析プロービングに供した。細胞をトリプシン処理し（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１，０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上澄みを廃棄し、タンパク質抽出緩衝液（ＴＭタンパク質抽出について記載されている）を添加した。細胞を１０，０００ＲＰＭで１０分間再び遠心分離した。次いで、得られた上澄みを保存し、ウエスタンブロット分析に使用した。
【００４６】
Ｕｓｓｉｎｇ型チャンバ実験：Ｕｓｓｉｎｇ型チャンバ（カタログ番号ＵＳＳ１Ｌ、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を使用してＰＶＤＦ膜（カタログ番号７５６９６Ｅ、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｅｎｓａｃｏｌａ  ＦＬ）を横断するフルオレセイン流（フルオレセインナトリウム染料）を測定した。線維柱帯細胞をＰＶＤＦ膜にて上記のように培養した。細胞をプレーティングする前に、コラーゲンマトリクス（Ｒａｔ  Ｔａｉｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ、カタログ番号ＢＤ３５４２４９）の層を膜上に形成し、膜へのＴＭ細胞の付着を促進した。細胞に、１６〜２４時間にわたって融合性単層を形成させ、次いで、別の細胞層をこの単層上にプレーティングした。このプロセスを繰り返し、細胞の融合性の三層を最終的に得た。細胞を対象のＤＮＡ［ＴＲＥＫ−１＋ｃｏｃｈｌｉｎ、ＴＲＥＫ−１及びＲＰＥ６５、ＴＲＥＫ−１、トランスフェクション剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］によってトランスフェクトするか、またはトランスフェクトしないままにした。トランスフェクション後２４〜３６時間で、膜を、１ＸＤＰＢＳ中の膜浴を横切る流れを作り出す蠕動ポンプに接続された装置の半チャンバ間に置いた。膜を横切る流れを測定するために、フルオレセインナトリウム染料を使用した（１ｍｇ／ｍｌの１：１００希釈）。染料を一方の半チャンバに導入し、等量（１００μｌ）を注入後５分で他方の半チャンバから吸引した。フルオレセイン強度を、分光光度計を使用して測定した。
【００４７】
インビトロでのｃｏｃｈｌｉｎ析出物の形成を実証するために、ｃｏｃｈｌｉｎ処理ＴＭ細胞を、上記のように一連の３層の融合層において、.４５μＭのポアサイズを有するＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で培養した。次いで、膜を、重力によって膜を通過させる血清不含細胞培養培地（ＤＭＥＭ  １Ｘ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）の静止カラムに接続されたＵｓｓｉｎｇ型チャンバの２つの半容器間に置き、通過の結果として細胞層上に剪断応力を生じさせた。このように配置したセットアップを１２時間維持し、この後、膜をＯ．Ｃ．Ｔに包埋し、液体窒素を使用して固化させて切開を可能にした。得られた切片を、ｃｏｃｈｌｉｎ原発性抗体（Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）を使用し、また、共焦点セットアップ（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ６０００Ｂ）を使用して撮像する、ｃｏｃｈｌｉｎタンパク質に関する免疫組織化学的分析プロービングに供した。
【００４８】
コラーゲンゲルの拡大及び／または収縮アッセイ：ヒドロゲル溶液を、１０Ｘ  ＭＥＭ（カタログ番号１１４３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ５７６１  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＨＥＰＥＳ（カタログ番号１５６３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して調製した。以下の溶液を各トランスフェクションタイプについて別個のチューブに等分した。トランスフェクション複合体を、製造者の調製ガイドラインに従って、トランスフェクション剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び所望のＤＮＡベクターの０．４ｕｇ／ｕＬの比の混合物を含む個々のチューブにおいて調製した。線維柱帯細胞をトリプシン処理した融合層から得、２５ｃｍ2細胞培養フラスコ（カタログ番号３５３１０９、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）において８００ＲＰＭで５分間沈殿させた。次いで、細胞ペレットを血清不含ＤＭＥＭ１Ｘ、（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）培地において再懸濁させ、十分混合し、最終的に、それぞれ各トランスフェクション−複合体含有容器内に等しく等分した。反応を４５分間生じさせ、その後、細胞培養培地及びラット尾コラーゲン（カタログ番号３５４２４９、ＢＤ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の添加によって終了させ、ゲル重合を開始した。懸濁液を吸引によって穏やかに混合し、１ｍＬの単回使用の針シリンジ内に吸引し、ホウケイ酸ガラス毛管（Ｏ．Ｄ−１．０ｍｍ、ＩＮ．Ｄ−０．７５ｍｍ）（カタログ番号ＴＷ１００−６、ＷＰＩ）内に注入して、その体積のおよそ半分にした。調製した全ての毛管のデジタル写真のスナップショットをブランク背景に対してミリメートルスケールで撮り、２４及び４８時間で繰り返した。ヒドロゲル含有毛管を湿気チャンバ内でインキュベートし、３７℃及び５％ＣＯ2において細胞株のインキュベータにおける脱水を防止した。得られた写真を、ゲルの対向端における選択された点の間で測定するＩｍａｇｅＪ（ｖ．１．４３ｕ）を使用して分析した。集積された長さデータを、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（ＸＰ）を使用して統計的に分析した。
【００４９】
弾性率の決定：ヒトドナーの眼または角膜ボタンを種々のアイバンクから得た。ドナーの年齢の範囲は３７〜８０歳であった。組織を角膜保存培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓ  Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）において４℃で維持した後、解剖してＴＭを除去した。サンプルを、眼科ナイフ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｉｎｃ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）による虹彩及びブドウ膜組織の解剖によって調製した。ヒトＴＭをかみそりによって切開して長さ１ｃｍ未満のサンプルを与え、切片を鉗子によって角から除去した。組織を、ＪＣＴのシュレム管ＳＣ側をプローブしてステンレス鋼ＡＦＭディスクの中心でシアノアクリレート膠によって線維柱帯領域に固定するようにして、配向した。ＡＦＭ分析を１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施した。供与から分析までの平均時間は正常で９±２日、緑内障サンプルで１０±４日であった（表１（図１１））。
【００５０】
ＡＦＭによって調査した組織の領域の特性決定のために、複数の正常角膜ボタンを種々の調製段階で組織病理用に処理した。ドナー組織を、損傷していない縁の楔状物、ブドウ膜組織の鋭的剥離後の縁の楔状物、単離したヒトＴＭ（縦断面及び横断面）、ならびにＨＴＭ単離後の縁の楔状物として、常套の組織学用に処理した。全てのサンプルを２４〜４８時間固定して常套的に処理し、単離したヒトＴＭの切片を縦断面または横断面サンプリングのいずれかに配向した。これらを包埋した後、サンプルを４μｍで切開し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００５１】
力曲線を走査プローブ顕微鏡（Ｎａｎｏｓｃｏｐｅ  ＩＩＩａ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ；Ｖｅｅｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって取得した。サンプルを乾燥することなくＡＦＭに移し、市販の液体セル（Ｖｅｅｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）に入れた。先端としてホウケイ酸球（１μｍ半径；Ｎｏｖａｓｃａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｍｅｓ，ＩＡ）を有する窒化ケイ素カンチレバーを使用してヒトＴＭの広範囲をサンプリングした。カンチレバーの公称ばね定数は０．０６Ｎ／ｍであった。力曲線を、少なくとも１０の異なる箇所で、サンプル上のランダムな各箇所でまたは各測定箇所がおよそ５０μｍ離れているラインにおいて得た。本発明者らは、各箇所における２μｍ／ｓの速度で取った各力曲線及び最小の３つの力曲線による、ランダムな箇所でのデータを取得した。非線形挙動を示すデータを分析に含めなかった。表面との広い接着を経験したデータも分析から除外した。最小の３箇所を使用して平均弾性率を算出した。データの分析をＬａｓｔら（２０１１）によって記載されている手順を利用して実施した。
【００５２】
弾性率の決定を、確立されたプロトコル（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｐ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５３：１１７，２０１２）に従った原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して実施した。各群（対照及びＰＯＡＧ）においてｎ＝６でドナーを利用した。最大６時間以内に摘出し、摘出の７日以内に得た全てのドナーの眼が許容可能であった。測定の前に、ＴＭ組織を注意深く解剖し、弾性率の決定に使用した。簡潔には、サンプルを含むペトリ皿を、ＡＦＭカンチレバーを含むポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）ブロックの下に置いた。ＡＦＭホウケイ酸ガラス粒子カンチレバー先端（２ｕｍの先端半径、０．０６Ｎ／ｍのばね定数、Ｎｏｖａｓｃａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｍｅｓ，ＩＡ）を、先端が組織の表面に接触するまで、圧電機構（６０μｍの最大拡大、Ｐ−８４１．４０，Ｐｈｙｓｉｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してサンプル上に位置付けた。サンプルの下方のカメラに接続した顕微鏡対物を使用してカンチレバーを観察した。全ての実験を室温で実施した。ヤング率を、球状圧子についてＨｅｒｔｚモデルを利用して特注開発のＭａｔｌａｂソフトウエアを使用して決定した。平均及び標準偏差を、取得したデータを使用して算出した。
【００５３】
脂質の局所適用及びＩＯＰの測定：脂質を１０ｐｍｏｌの脂質を含む１μｌの液滴として局所適用した。圧力を、トノラボ（Ｃｏｌｏｎｉａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ，ＮＨ）を用いてまたは本研究室で使用されている組立挿管デバイスを用いて測定した。初期アセスメントは、１０％ＤＭＳＯをビヒクルとして利用した。しかし、ここでの全ての報告データは５％ＤＭＳＯを利用した。
実施例２−ＩＯＰを調節するまたは低下させる脂質種の例
【００５４】
ホスファチジルコリン：
ＰＣ（２２：１（１１Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））；１−（１１Ｚ−ドコセノイル）−２−（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚドコサヘキサエノイル）−グリセロ−３−ホスホコリン；ＣＳ２ＨｇｏＮＯａＰ
ＰＣ（１２：０／１４：１（９Ｚ））
ＰＣ（１３：０／２０：５（５Ｚ，ＳＺ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ））
ＰＣ（１７：１（９Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））
ＰＣ（Ｏ−１６：０／１７：０）
ＰＣ（Ｏ−１６：０／０−１６：０）
ＰＣ（Ｐ−１Ｓ：０／１７：２（９Ｚ，１２Ｚ））
ＰＣ（１３：０／２０：４（５Ｚ，ＳＺ，１１Ｚ，１４Ｚ））
ＰＣ（１５：０／１Ｓ：２（９Ｚ，１２Ｚ））
ＰＣ（１６：０／２０：５（５Ｚ，ＳＺ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ））
ＰＣ（１６：１（９Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））
ＰＣ（１７：０／１Ｓ：１（９Ｚ））
ＰＣ（１７：１（１ＯＺ）／Ｏ：Ｏ）
ＰＣ（１Ｓ：１（１１Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））
ＰＣ（１Ｓ：３（９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）／Ｏ：Ｏ）
ＰＣ（１Ｓ：４（９Ｅ，１１Ｅ，１３Ｅ，１５Ｅ）／Ｏ：Ｏ）
ＰＣ（２０：３（ＳＺ，１１Ｚ，１４Ｚ）／Ｏ：Ｏ）
ＰＣ（２１：４（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ，１５Ｚ）／Ｏ：Ｏ）
ＰＣ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１  ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））；１，２−ジ−（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；ＣＳ２ＨａｏＮＯａＰ
ＰＣ（２５：０／１Ｓ：０）
ＰＣ（Ｏ−１２：０／０−１２：０）
ＰＣ（Ｐ−１５：０／０：０）
【００５５】
ホスファチジルセリン−調査した中で、マウスモデルにおけるＩＯＰの低下において最も有効：
ＰＳ（１Ｓ：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）／２０：５（５Ｚ，ＳＺ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ））；１−（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ−オクタデカトリエノイル）−２−（５Ｚ，ＳＺ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル）−グリセロ−３−ホスホセリン；Ｃ４４Ｈ７０ＮＯｌＯＰ
ＰＳ（１４：０／０：０）
ＰＳ（１７：０／０：０）
ＰＳ（１４：０／１２：０）
ＰＳ（Ｐ−１６：０／１４：１（９Ｚ））
ＰＳ（Ｏ−１６：０／１５：０）
ＰＳ（１５：０／２２：０）
ＰＳ（１９：０／２１：０）
ＰＳ（２０：０／２２：４（７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ））
ＰＳ（２０：２（１１Ｚ，１４Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１  ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））；１−（１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサジエノイル）−２−（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサヘキサエノイル）−グリセロ−３−ホスホセリン；Ｃ４８Ｈ７８Ｎ０１ＱＰ
ＰＳ（２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）／２０：５（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ））；１−（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚドコサヘキサエノイル）−２−（５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ，１７Ｚ−エイコサペンタエノイル）−グリセロ−３−ホスホセリン；
Ｃ４８Ｈ７２Ｎ０１ＱＰ
ＰＳ（Ｏ−１６：０／１２：０）
【００５６】
ホスファチジルエタノールアミン：
ＰＥ（１８：１（９Ｅ）／１８：１（９Ｅ））
ＰＥ（１８：３（６Ｚ，９Ｚ，１２Ｚ）／２２：６（４Ｚ，７Ｚ，１ＯＺ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ））
実施例３−電子顕微鏡法及び関連方法による、非緑内障対緑内障ＡＨにおけるより高いＰＳレベルの実証
【００５７】
電子顕微鏡法：対照及びＰＯＡＧドナーからのヒト房水を１５，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠心分離した。上方の水相及び下方のペレットを電子顕微鏡（ＥＭ）の銅またはニッケルグリッド上で別々に浮揚または沈没させた。ＯｓＯ４蒸気を使用して、もしくは２％のリンタングステン酸（ＰＴＡ）によって、または両方によって、若干変更されている、以前に公開された方法に従って染色を実施した。簡単には、ニッケルグリッドを上相の液滴または下方の房水ペレットにおいて１０分間浮揚させた。銅グリッドを房水の下相ペレットにおいて２０分間沈没させた。ニッケルグリッドを４％の水性ＯｓＯ４蒸気に３０分間暴露させた。銅グリッドを、ニッケルグリッドと同じく、０．１Ｍリン酸緩衝液において浮揚させ、排出させて、４％の水性ＯｓＯ４及び２％のリンタングステン酸に供した。一部のグリッドもまた、２％のグルタルアルデヒドによって５分間固定し、０．１Ｍリン酸緩衝液で濯ぎ、４％の酢酸ウラニルによって８分間染色した。全てのグリッドをＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１０電子顕微鏡で検査した。電子顕微鏡法の倍率は、個々の場合において記述しているように３００，０００×または２００，０００×であった。
【００５８】
結果：ＰＯＡＧ房水ではなく対照が脂質ベシクル様構造を示し、これは、ＰＯＡＧ患者と比較して正常の対照においてより高レベルのホスファチジルセリン（ＰＳ）を示す、質量分析による房水の分析と一致していた。これらの結果を図１２に示す。
実施例４−インビボでの霊長類における本開示のＩＯＰ低下の組成物。
【００５９】
実験設計：６つの脂質のＩＯＰ低下活性をカニクイザル（各脂質についてｎ＝４動物）の眼において試験した。各動物群について、基準値の細隙灯顕微鏡検査（ＳＬＥ）及びＩＯＰを脂質の局所適用の前に測定した。次いで、ＳＬＥ及びＩＯＰを処置後３〜６時間で測定した。各サルの一方の眼はビヒクル（１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））に懸濁させた脂質による局所適用を受け、反対側の眼をビヒクルのみで処置した。全ての局所適用は１０ｐｍｏｌの脂質を含有した（５０ｎＭであるＣ１７Ｓ１Ｐを除く）。選択範囲が、正常個体における健康な眼において、ならびに正常眼圧のマウスの眼において自然に生じたことが見出された。ＩＯＰを小型のゴールドマン圧平眼圧計を使用して測定した。
【００６０】
結果：結果を図１３に要約する。Ｌｙｓｏ−ＰＳ、Ｃ１７Ｓ１Ｐ及びＰＳ（１８：１）は、さらなる副作用または毒性なしに、正常眼圧のサルにおけるＩＯＰを有意に低下させた。
他の実施形態
【００６１】
組成物、キット、及び方法工程の一部または全てにおいて任意の改良がなされてよい。本明細書において列挙されている公報、特許出願及び特許を含めた全ての参考文献が、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において提供されている任意及び全ての例または例示的用語（例えば、「など」）の使用は、本発明の理解を容易にすることが意図されており、別途特許請求されていない限り本発明の範囲の限定を提起していない。本発明または好ましい実施形態の性質または利益についてのいずれの記述も限定的であることは意図されておらず、添付の特許請求の範囲は、かかる記述によって限定されると見なされるべきではない。より一般的には、本明細書におけるいずれの用語も、任意の特許請求されていない要素が本発明の実施に必須であるとして示していると解釈されるべきではない。本発明は、適用法によって許可される本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更及び等価物を含む。さらに、上記要素の、その全ての起こり得る変形における任意の組み合わせが、本明細書において別途示されない限りまたは文脈によって明らかに禁忌であるとされない限り、本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図１０Ａ−１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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