(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
3つの融合ポリペプチドを含む三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、ヒト軟骨基質タンパク質（CMP、SEQ ID NO:1）に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部分を含み、該三量体化ドメインが、三量体型抗原結合分子の安定な会合を媒介する能力を有し、三量体化ドメインがSEQ ID NO:2の配列からなり、融合ポリペプチドがそれぞれ、三量体化ドメインに融合された1つの抗原結合部分を含み、抗原結合部分がFab分子であり、Fab分子が細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有し、細胞表面抗原が腫瘍細胞抗原である、三量体型抗原結合分子。
【請求項２】
3つの融合ポリペプチドがジスルフィド結合によって連結されている、請求項1に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項３】
Fab分子が、Fab重鎖のC末端アミノ酸において三量体化ドメインのN末端アミノ酸に融合されている、請求項1または2に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項４】
Fab分子が、Fab重鎖のC末端アミノ酸において三量体化ドメインのN末端アミノ酸にペプチドリンカーを介して融合されている、請求項1または2に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項５】
融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインに融合された2つの抗原結合部分を含み、第1抗原結合部分がFab分子であり、第2抗原結合部分がscFv分子もしくはクロスオーバーFab分子である、請求項1または2に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項６】
Fab分子が三量体化ドメインのN末端アミノ酸に融合されており、かつscFvもしくはクロスオーバーFab分子が該三量体化ドメインのC末端アミノ酸に融合されている、請求項5に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項７】
Fab分子が三量体化ドメインのN末端アミノ酸にペプチドリンカーを介して融合されており、かつscFvもしくはクロスオーバーFab分子が該三量体化ドメインのC末端アミノ酸にペプチドリンカーを介して融合されている、請求項5に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項８】
Fab分子がFab重鎖のN末端アミノ酸において三量体化ドメインのC末端アミノ酸に融合されている、請求項5〜7のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項９】
Fab分子がFab重鎖のN末端アミノ酸において三量体化ドメインのC末端アミノ酸にペプチドリンカーを介して融合されている、請求項5〜7のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１０】
(i) Fab分子が細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有するか、または(ii) scFvもしくはクロスオーバーFab分子が細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有する、請求項5〜9のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１１】
(i) Fab分子がハプテンに特異的に結合する能力を有するか、または(ii) scFvもしくはクロスオーバーFab分子がハプテンに特異的に結合する能力を有する、請求項5〜9のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１２】
本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインに融合されたFab分子からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１３】
本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合されたFab分子からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１４】
本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインに融合された(i) Fab分子および(ii) scFvもしくはクロスオーバーFab分子からなる、請求項5〜11のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１５】
本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合された(i) Fab分子および(ii) scFvもしくはクロスオーバーFab分子からなる、請求項5〜11のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１６】
3つの融合ポリペプチドが同一である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子。
【請求項１７】
請求項1〜16のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項17に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１９】
請求項17に記載のポリヌクレオチドまたは請求項18に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
以下の工程を含む、三量体型抗原結合分子を産生する方法:
請求項19に記載の宿主細胞を、該三量体型抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、および
該三量体型抗原結合分子を単離する工程。
【請求項２１】
請求項1〜16のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
医薬として使用するための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子、または請求項21に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
がんの処置に使用するための、請求項1〜16のいずれか一項に記載の三量体型抗原結合分子、または請求項21に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、3つの融合ポリペプチドを含む三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、ヒト軟骨基質タンパク質に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部分を含むもの、その組成物、および医薬としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
明確な化学量論を持つ組換え抗体または他のタンパク質の人工的オリゴマーを作製するためのアプローチはいくつか記載されている。これが望まれるのは、所与のタンパク質のそのターゲットに対する結合アフィニティーを多量体化によって増加させることができるからであるか、または一定の生物学的効果が活性化合物の一定のオリゴマー化度（oligomerization grade）でしか達成できないからである（Crothers, D. M. & Metzger, H. (1972). The influence of polyvalency on the binding properties of antibodies. Immunochemistry, 9, 341-357（非特許文献1））。より新しい別の総説には、機能的アフィニティーに対する結合価の効果だけでなく、最適化された分子量による薬物動態に対する結合価の効果も記載されている（Deyev S.M. & Lebedenko E.N. 2008, BioEssays 30:904-918（非特許文献2））。
【０００３】
Shuとその共同研究者らは、本来は二量体であるが工学的改変を加えたバージョンでは三量体型コイルドコイル構造を形成するGCN4ロイシンジッパーの変異体を作製しており、それを使って、HIV-1タンパク質gp41の三量体集合の性質を分析した（Chemistry. 1999 Apr 27;38(17):5378-85（非特許文献3））。
【０００４】
Wyzgolとその共同研究者らは、ニワトリタンパク質テネイシン由来の三量体化ドメイン（UniProtエントリ:P10039のアミノ酸110-139、J Immunol 2009; 183:1851-1861（非特許文献4））を利用したTNF受容体スーパーファミリーのリガンドの人工的三量体化を記載している。彼らの例の一部では生物学的活性を著しく増強することができた。
【０００５】
Krammerとその共同研究者らは、T4ファージフィブリチンの天然三量体化ドメインに基づくカルボキシ末端三量体化ドメインを伴う分泌型ヘマグルチニン、またはそのようなカルボキシ末端三量体化ドメインを伴わない分泌型ヘマグルチニンを発現させた（PLOS ONE 2012, Volume 7, Issue 8, e43603（非特許文献5））。彼らは、抗原がこの三量体化によってネイティブ様の構造に保たれ、いくつかのエピトープ特異的抗体によって認識されることを実証した。
【０００６】
二量体型抗体または三量体型抗体の最初の例はダイアボディまたはトリアボディであった（Biomol Eng. 2001 Oct 15;18(3):95-108（非特許文献6）にKorttとその共同研究者らによる総説がある）。これらの集合体は本質的にscFvフラグメントから構成され、1つのポリペプチドのVHドメインは同じポリペプチドのVLドメインとは機能的Fvを形成することができないが、鎖間でなら機能的Fvを形成することができるように、ドメイン間リンカーが短縮されている。
【０００７】
Pluckthunのグループによる初期の総説には、二量体型または四量体型scFv抗体フラグメント融合物を作製するための異なるアプローチが要約されている（Immunotechnology 3 (1997) 83-105（非特許文献7））。ここで著者らは、コイルドコイルロイシンジッパードメインであるか、またはヒトp53腫瘍抑制因子タンパク質の四量体化ドメインに由来する、オリゴマー化ドメインを使用している。また、所与の結合ドメインの多量体化による結合強度の増強に関して、定量的な見積もりもなされている。繊維状ファージ上に抗体フラグメントの二価ディスプレイを生じさせる目的で、Leeのグループは同様のホモ二量体化ロイシンジッパーを使用した。二価ディスプレイは、IgG1ヒンジ領域とホモ二量体化GCN4ロイシンジッパーとからなる二量体化ドメインを、FabとM13遺伝子3マイナーコートタンパク質のC末端ドメインとの間に挿入することによって、初めて達成された。2つのジッパードメインの共有結合による連結はヒンジ領域がもたらすジスルフィド結合によって得られ、これにより、抗体ライブラリーのスクリーニングのためにFabがファージ上にディスプレイされる（J Immunol Methods. 2004 Jan;284(1-2):119-32（非特許文献8））。
【０００８】
Cuestaとその共同研究者らは、コラーゲンXVまたはコラーゲンXVIIIのどちらかの三量体化ドメインを利用する、トリマーボディ（trimerbody）と名付けられた三量体型scFv分子の作製を記載している（2012, mAbs 4:2, 226-232（非特許文献9））。三量体化されたコンストラクトは、同じ特異性の一価scFvと比較して、機能的アフィニティーのほぼ100倍の増加を示した。どちらの三量体化ドメインも非共有結合的三量体を形成する（Boudko et al; J. Mol. Biol. (2009) 392, 787-802（非特許文献10）、およびWirz et al; Matrix Biology 30 (2011) 9-15（非特許文献11））。
【０００９】
ある一定の受容体に三量体型のリガンドまたは抗体が結合することには、単量体型分子または（IgGのような）二量体型分子の結合と比較して、著しい利点がありうる。とりわけ、三量体化が誘導されることでターゲット細胞におけるアポトーシスを誘導する、TNFRファミリーの受容体への結合は、治療上の利益を生じることができると考えられる。Allenとその共同研究者らは、テトラネクチンC型レクチンドメインに基づいてデス（Death）受容体4へのバインダーを作製した（Mol Cancer Ther 2012;11:2087-2095（非特許文献12））。この結合ドメインは、同じテトラネクチンタンパク質から得られたコイルドコイルモチーフによって三量体化された。このタンパク質は、非共有結合的ホモ三量体を形成する。これらの三量体型分子のうちの1つは、天然の三量体型TRAILリガンドと同様に、DR4発現細胞においてアポトーシスを誘導した。この新規な分子クラスは、著者らによってアトリマー（atrimer）と名付けられた（Mol Cancer Ther 2012;11:2087-2095（非特許文献12））。
【００１０】
ヒト転写因子ATFαまたはCREBPaのどちらかに由来する多量体化ドメインを使って、抗ICAM-1抗体のFabフラグメントが、二量体型、三量体型または四量体型フォーマットに組み立てられた（Charles et al; Journal of Immunological Methods 284 (2004) 119-132（非特許文献8））。ここで使用されたオリゴマー化ドメインはいずれも共通するコイルドコイルモチーフを有し、共有結合的オリゴマーの形成を伴わずに集合する。これらのタンパク質は、ライノウイルス感染をインビトロで遮断することに成功し、その効率は、単量体から二量体、三量体、および四量体へと増加した。
【００１１】
Terskikhのグループにより、いわゆる「ペプタボディ（peptabody）」が作製された（Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Mar 4;94(5):1663-8（非特許文献13））。半剛体ヒンジ領域を介して短いペプチドリガンドを軟骨オリゴマー基質タンパク質（COMP）のコイルドコイル集合ドメインと融合することで、五量体型多価結合分子が得られた。
【００１２】
古細菌RNA結合タンパク質Sm1の七量体化ドメインにより、フレキシブルなヒンジペプチドを介して、プロテインZ由来の結合ドメインの七量体化がなされた（Kim et al; PLoS One. 2012;7(8):e43077（非特許文献14））。表面プラズモン共鳴（SPR）分析により、七量体型の抗EGFRバインダーと抗HER2バインダーはどちらも、それぞれのターゲット受容体への結合強度が著しく増強されており、その増加は単量体型リガンドとの比較でほぼ100倍〜1000倍であることが示された。
【００１３】
多価を生じさせるための別のアプローチがLiらによって記載され、「化学的自己集合抗体ナノリング（chemically self-assembled antibody nanorings）（CSANs）」と名付けられている（J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 17247-17257（非特許文献15））。著者らは、これを、二量体バージョンのメトトレキサート（MTX2-C9と呼ばれるもの）を添加した時にリング状の構造に集合するいくつかの大腸菌（E. coli）DHFR人工二量体で各ナノリングサブユニットが構成されるように設計した。
【００１４】
二重特異性抗体は、工学的に改変された抗体の新しい応用に関して、ユニークな機会を与えてくれる。しかし、理想的な二重特異性抗体を設計することは今なお難題である。
【００１５】
Fickとその共同研究者らは、TNFファミリーのリガンドに融合されたテネイシンの三量体化ドメインに融合されたscFvフラグメントを含むさまざまな二重特異性試薬の作製を概説している（Patrick Chames (ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 907, 597-609（非特許文献16））。三量体化は天然の鎖間ジスルフィド結合によって安定化される。これらの分子は、活性な三量体型アポトーシス誘導因子がscFvフラグメントの抗腫瘍結合能によって腫瘍細胞に送達されるターゲティングアプローチに有用である。
【００１６】
Stoneとその共同研究者らは、5つの単一ドメイン抗体（sdAb）が、リンカー配列を介して、五量体化ドメインであるベロ毒素B（VTB）サブユニットのN末端に融合され、5つのsdAbがリンカー配列を介してVTBのC末端に融合される、新規な二重特異性抗体モデルを記載している（Journal of Immunological Methods, (2007) 318 (1-2) pp.88-94（非特許文献17））。デカボディ（decabody）と名付けられたこれらの十価二重特異性分子のいくつかが構築され、特徴づけられた。興味深いコンセプトではあるが、これらの分子の物理化学的性質には、まだ最適化の余地がある。
【００１７】
Kashentsevaとその共同研究者らは、ファージT4のフィブリチンドメインを使って、アデノウイルスの指向性を腫瘍細胞に変更するであろう二重特異性三量体型融合タンパク質を作製した（Cancer Res January 15, 2002 62; 609（非特許文献18））。
【００１８】
ヒト軟骨基質タンパク質由来の三量体化ドメインを含む新規三量体型抗原結合分子を本明細書に提供する。三量体化ドメインがヒト起源のタンパク質に由来するので、この三量体型抗原結合分子が免疫原性を示す可能性は、非ヒト起源の多量化ドメインを持つ分子と比べると低い。加えて、ヒト軟骨基質タンパク質に由来する三量体化ドメインは、天然のジスルフィド結合によって、コイルドコイル構造へと三量体化し、それが、単一特異性フォーマットでも二重特異性フォーマットでも使用することができる安定な三量体型抗原結合分子をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Crothers, D. M. & Metzger, H. (1972). The influence of polyvalency on the binding properties of antibodies. Immunochemistry, 9, 341-357
【非特許文献２】Deyev S.M. & Lebedenko E.N. 2008, BioEssays 30:904-918
【非特許文献３】Chemistry. 1999 Apr 27;38(17):5378-85
【非特許文献４】J Immunol 2009; 183:1851-1861
【非特許文献５】PLOS ONE 2012, Volume 7, Issue 8, e43603
【非特許文献６】Biomol Eng. 2001 Oct 15;18(3):95-108
【非特許文献７】Immunotechnology 3 (1997) 83-105
【非特許文献８】J Immunol Methods. 2004 Jan;284(1-2):119-32
【非特許文献９】2012, mAbs 4:2, 226-232
【非特許文献１０】Boudko et al; J. Mol. Biol. (2009) 392, 787-802
【非特許文献１１】Wirz et al; Matrix Biology 30 (2011) 9-15
【非特許文献１２】Mol Cancer Ther 2012;11:2087-2095
【非特許文献１３】Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Mar 4;94(5):1663-8
【非特許文献１４】Kim et al; PLoS One. 2012;7(8):e43077
【非特許文献１５】J. AM. CHEM. SOC. 2010, 132, 17247-17257
【非特許文献１６】Patrick Chames (ed.), Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 907, 597-609
【非特許文献１７】Journal of Immunological Methods, (2007) 318 (1-2) pp.88-94
【非特許文献１８】Cancer Res January 15, 2002 62; 609
【発明の概要】
【００２０】
第1の局面において、本発明は、3つの融合ポリペプチドを含む三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、ヒト軟骨基質タンパク質（CMP、SEQ ID NO:1）に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部分を含み、該三量体化ドメインが三量体型抗原結合分子の安定な会合を媒介する能力を有するものを提供する。
【００２１】
一態様において、前記三量体型抗原結合分子の三量体化ドメインは、SEQ ID NO:2に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む。一態様において、前記三量体型抗原結合分子の三量体化ドメインは、SEQ ID NO:2の配列を含む。
【００２２】
一態様では、前記三量体型抗原結合分子の3つの融合ポリペプチドはジスルフィド結合によって連結されている。一態様では、抗原結合部分は抗体または抗体フラグメントである。一態様では、抗原結合部分は、Fab分子、クロスオーバーFab（Crossover Fab）分子、一本鎖Fab分子、Fv分子、scFv分子、および単一ドメイン抗体からなる群より選択される抗体フラグメントである。
【００２３】
一態様では、前記三量体型抗原結合分子の3つの融合ポリペプチドは、それぞれ1つの抗原結合部分を含む。一態様では、該抗原結合部分はFab分子である。一態様では、該Fab分子は、Fab重鎖のC末端アミノ酸において、該三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されている。一態様では、抗原結合部分は細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有する。一態様では、該細胞表面抗原は腫瘍細胞抗原である。
【００２４】
一態様では、前記三量体型抗原結合分子の3つの融合ポリペプチドは、それぞれ2つの抗原結合部分を含む。そのような一態様では、第1抗原結合部分が該三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合され、第2抗原結合部分が該三量体化ドメインのC末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されている。
【００２５】
一態様では、該第1抗原結合部分がFab分子であり、該第2抗原結合部分がscFv分子またはクロスオーバーFab分子である。
【００２６】
一態様では、該第1抗原結合部分は、Fab重鎖のN末端アミノ酸において、該三量体化ドメインのC末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されたFab分子である。
【００２７】
一態様では、該第1または第2抗原結合部分は、細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有する。
【００２８】
一態様では、該第1または第2抗原結合部分は、ハプテンに特異的に結合する能力を有する。
【００２９】
一態様では、本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、前記三量体化ドメインに任意でペプチドリンカーを介して融合された抗原結合部分からなるものが提供される。
【００３０】
一態様では、本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、前記三量体化ドメインに任意でペプチドリンカーを介して融合された第1および第2抗原結合部分からなるものが提供される。
【００３１】
一態様では、上記の態様のいずれかの前記3つの融合ポリペプチドは同一である。
【００３２】
一態様では、ヒト軟骨基質タンパク質（CMP、SEQ ID NO:1）に由来する三量体化ドメインに融合された抗原結合部分を含む融合ポリペプチドであって、該三量体化ドメインが、該融合ポリペプチドとさらに2つの同様の融合ポリペプチドとの安定な会合を媒介する能力を有するものが提供される。
【００３３】
本発明の別の局面によれば、本発明の三量体型抗原結合分子またはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドも包含する。さらに本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物細胞である。別の局面では、本発明の三量体型抗原結合分子を産生する方法であって、a）本発明の宿主細胞を、三量体型抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、およびb）三量体型抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。本発明は、本発明の方法によって産生される三量体型抗原結合分子も包含する。
【００３４】
さらに本発明は、本発明の三量体型抗原結合分子と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００３５】
本発明は、本発明の三量体型抗原結合分子および薬学的組成物を使用する方法も包含する。一局面において、本発明は、医薬として使用するための本発明の三量体型抗原結合分子または薬学的組成物を提供する。一局面では、疾患の処置を必要とする個体における疾患の処置に使用するための本発明の三量体型抗原結合分子または薬学的組成物が提供される。具体的な一態様では、疾患はがんである。
【００３６】
疾患の処置を必要とする個体における疾患を処置するための医薬を製造するための本発明の三量体型抗原結合分子の使用、ならびに個体における疾患を処置する方法であって、薬学的に許容される形態にある本発明の三量体型抗原結合分子を含む治療有効量の組成物を該個体に投与する工程を含む方法も提供される。具体的な一態様では、疾患はがんである。上記の態様のいずれにおいても、個体は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
[本発明1001]
3つの融合ポリペプチドを含む三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、ヒト軟骨基質タンパク質（CMP、SEQ ID NO:1）に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部分を含み、該三量体化ドメインが、三量体型抗原結合分子の安定な会合を媒介する能力を有する、三量体型抗原結合分子。
[本発明1002]
三量体化ドメインが、SEQ ID NO:2に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、本発明1001の三量体型抗原結合分子。
[本発明1003]
三量体化ドメインがSEQ ID NO:2の配列を含む、本発明1001または本発明1002の三量体型抗原結合分子。
[本発明1004]
3つの融合ポリペプチドがジスルフィド結合によって連結されている、前記本発明のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1005]
抗原結合部分が抗体または抗体フラグメントである、前記本発明のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1006]
抗原結合部分が、Fab分子、クロスオーバーFab分子、一本鎖Fab分子、Fv分子、scFv分子および単一ドメイン抗体からなる群より選択される抗体フラグメントである、前記本発明のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1007]
融合ポリペプチドがそれぞれ、三量体化ドメインに融合された1つの抗原結合部分を含む、前記本発明のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1008]
抗原結合部分がFab分子である、本発明1007の三量体型抗原結合分子。
[本発明1009]
Fab分子が、Fab重鎖のC末端アミノ酸において三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されている、本発明1008の三量体型抗原結合分子。
[本発明1010]
抗原結合部分が、細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有する、本発明1007〜1009のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1011]
細胞表面抗原が腫瘍細胞抗原である、本発明1010の三量体型抗原結合分子。
[本発明1012]
融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインに融合された2つの抗原結合部分を含む、本発明1001〜1006のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1013]
第1抗原結合部分が三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されており、かつ第2抗原結合部分が該三量体化ドメインのC末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されている、本発明1012の三量体型抗原結合分子。
[本発明1014]
第1抗原結合部分がFab分子であり、かつ第2抗原結合部分がscFv分子またはクロスオーバーFab分子である、本発明1012または本発明1013の三量体型抗原結合分子。
[本発明1015]
Fab分子がFab重鎖のN末端アミノ酸において三量体化ドメインのC末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合されている、本発明1014の三量体型抗原結合分子。
[本発明1016]
第1抗原結合部分または第2抗原結合部分が、細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有する、本発明1012〜1015のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1017]
第1抗原結合部分または第2抗原結合部分が、ハプテンに特異的に結合する能力を有する、本発明1012〜1015のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1018]
本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインに任意でペプチドリンカーを介して融合された抗原結合部分からなる、本発明1007〜1011のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1019]
本質的に3つの融合ポリペプチドからなる三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、三量体化ドメインに任意でペプチドリンカーを介して融合された第1抗原結合部分および第2抗原結合部分からなる、本発明1012〜1018のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1020]
3つの融合ポリペプチドが同一である、前記本発明のいずれかの三量体型抗原結合分子。
[本発明1021]
ヒト軟骨基質タンパク質（CMP、SEQ ID NO:1）に由来する三量体化ドメインに融合された抗原結合部分を含む融合ポリペプチドであって、該三量体化ドメインが、該融合ポリペプチドと2つのさらなる同様の融合ポリペプチドとの安定な会合を媒介する能力を有する、融合ポリペプチド。
[本発明1022]
本発明1001〜1020のいずれかの三量体型抗原結合分子または本発明1021の融合ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1023]
本発明1022のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1024]
本発明1022のポリヌクレオチドまたは本発明1023の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1025]
以下の工程を含む、三量体型抗原結合分子を産生する方法:
本発明1024の宿主細胞を、該三量体型抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、および
該三量体型抗原結合分子を単離する工程。
[本発明1026]
本発明1025の方法によって産生された、三量体型抗原結合分子。
[本発明1027]
本発明1001〜1020または本発明1026のいずれかの三量体型抗原結合分子と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1028]
医薬として使用するための、本発明1001〜1020もしくは本発明1026のいずれかの三量体型抗原結合分子、または本発明1027の薬学的組成物。
[本発明1029]
がんの処置に使用するための、本発明1001〜1020もしくは本発明1026のいずれかの三量体型抗原結合分子、または本発明1027の薬学的組成物。
[本発明1030]
上述した発明。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】a）CMPペプチドに結合したFabアームによって例示される三量体型単一特異性抗原結合分子の略図。b）CrossMabフォーマットのFabフラグメントをFab-CMP融合物に融合することによって例示される二重特異性六価抗原結合分子の略図。
【図２】SDS-PAGE。a）三量体化huCMP抗DR5（5E11）Fab、b）三量体化huCMP抗DR5（2A11）Fab。1:分子量マーカー; 2:非還元試料; 3:還元試料。
【図３】CE-SDS分析。三量体化huCMP抗DR5（5E11）Fabおよび三量体化huCMP抗DR5（2A11）のSDS-Pageとして示す電気泳動図。
【図４】TagLite。三量体化抗DR5 Fab 5E11と、二価IgGフォーマットの同じバインダーとの、DR5過剰発現ターゲット細胞における競合の比較。蛍光標識5E11 IgGを細胞に加え、非標識の二量体型（IgG）または三量体型5E11抗体をタイトレートして、蛍光シグナルと競合させた。三量体型コンストラクトはIgGコンストラクトの約10分の1の濃度で50％競合を示した。
【図５】細胞死検出ELISAにおいてDNA断片化によって決定した、MDA-MB-231乳がん細胞でのアポトーシスの誘導。三量体型分子のハイパー架橋（hyper-cross-linking）のためのFAP発現線維芽細胞（GM05389）の非存在下または存在下でアッセイを行った。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において、用語は、以下に別段の定義がある場合を除き、当技術分野において一般に使用されているとおりに使用する。
【００３９】
本明細書において使用する用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリンおよびその誘導体、例えばフラグメントである。
【００４０】
用語「CMP」または「軟骨基質タンパク質」は、マトリリン1としても知られているタンパク質を指す。MATN1同義語:例えばUniprotエントリP21941に記載のCMP、CRTM。
【００４１】
用語「CMP三量体化ドメイン」または「ヒト軟骨基質タンパク質（CMP）に由来する三量体化ドメイン」は、本明細書では可換的に使用され、2つの類似ポリペプチドまたは同一ポリペプチドと会合して安定な三量体を形成する能力を有するポリペプチド構造を指す。この三量体化は、ポリペプチド鎖の隣接する荷電アミノ酸間に形成されるイオン結合その他の非共有結合的結合によって媒介される。CMP三量体化ドメインは、例えばBeck et al, J. Mol. Biol. (1996) 256, 909-923に記載されている。本発明において有用なCMP三量体化ドメインはヒト軟骨タンパク質（SEQ ID NO:1）に由来し、一態様では、SEQ ID NO:2に対して少なくとも95％の同一性を有し、最も好ましくは少なくとも98％の同一性を有する配列を含む。一態様では、前記三量体化ドメインは、SEQ ID NO:2の配列を含む。
【００４２】
本明細書において使用する用語「単一特異性」抗体は、1つまたは複数の結合部位を有し、そのそれぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する抗体を表す。本発明の三量体型抗原結合分子は一般に単一特異性であるが、二重特異性であることもできる。
【００４３】
用語「二重特異性」は、抗原結合分子が、少なくとも2つの異なる抗原決定基に特異的に結合できることを意味する。典型的には、二重特異性抗原結合分子は2つの抗原結合部位を含み、そのそれぞれが異なる抗原決定基に特異的である。一定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、2つの抗原決定基、特に2つの異なる細胞上に発現した2つの抗原決定基に、同時に結合する能力を有する。本発明の三量体型抗原結合分子は二重特異性であることができる。
【００４４】
本願において使用する用語「価」は、抗体分子中に、指定した数の結合部位が存在することを表す。したがって用語「二価」、「四価」、および「六価」は、抗体分子中にそれぞれ2つの結合部位、4つの結合部位、および6つの結合部位が存在することを表す。本発明の三量体型抗原結合分子は、少なくとも「三価」であり、「六価」であることもできる。
【００４５】
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用をもたらす抗原結合分子の部位、すなわち1つまたは複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（CDR）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は典型的には2つの抗原結合部位を有し、Fab分子は典型的には単一の抗原結合部位を有する。
【００４６】
本明細書において使用する用語「抗原結合部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様において、抗原結合部分は、そのターゲット抗原によるシグナリングを活性化することができる。一態様において、抗原結合部分は、それが取り付けられている実体（例えば第2抗原結合部分）を、ターゲット部位に、例えば抗原決定基を保持する特定タイプの腫瘍細胞または腫瘍間質などに、向かわせることができる。抗原結合部分には、本明細書でさらに定義する抗体およびそのフラグメントが含まれる。加えて、抗原結合部分には、デザインドリピートタンパク質（designed repeat protein）またはデザインドリピートドメイン（designed repeat domain）に基づく結合ドメインも含まれる（例えばWO 2002/020565参照）。
【００４７】
本明細書において使用する用語「抗原決定基」は「抗原」および「エピトープ」と同義であり、ポリペプチド高分子上の部位（例えば一続きの連続するアミノ酸、またはアミノ酸が連続していない異なる領域から構成されるコンフォメーション構成）であって、そこに抗原結合部分が結合して抗原結合部分-抗原複合体を形成する部位を指す。有用な抗原決定基は、例えば腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、遊離した状態で血清中に、かつ/または細胞外基質（ECM）中に、見いだすことができる。本明細書において抗原として有用なタンパク質は、別段の表示がある場合を除き、霊長類（例えばヒト）および齧歯類（例えばマウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からのタンパク質の任意のネイティブ型であることができる。特定の態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において具体的なタンパク質に言及する場合、この用語は、プロセシングされていない「完全長」タンパク質だけでなく、細胞内でのプロセシングがもたらす任意の形態のタンパク質を包含する。この用語は、そのタンパク質の天然変異体、例えばスプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。
【００４８】
「特異的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、不要な相互作用または非特異的相互作用とは区別できることを意味する。特異的抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって、または当業者によく知られている他の技法、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）技法（BIAcore計器で分析される）（Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)）や伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）によって、測定することができる。一態様では、無関係なタンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばSPRによる測定で、抗原に対する抗原結合部分の結合の約10％未満である。一定の態様では、抗原に結合する抗原結合部分、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例えば10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）の解離定数（KD）を有する。
【００４９】
「アフィニティー」とは、分子（例えば受容体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有結合的相互作用の総和の強さを指す。別段の表示がある場合を除き、本明細書にいう「結合アフィニティー」は、結合ペア（例えば抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド）のメンバー間の1:1相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。分子Xの、そのパートナーYに対するアフィニティーは、一般に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれkoffおよびkon）の比である解離定数（KD）によって表すことができる。したがって、等しいアフィニティーであっても、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含みうる。アフィニティーは、本明細書において記載する方法を含む、当技術分野において公知の確立された方法によって測定することができる。アフィニティーを測定するための特定の方法は表面プラズモン共鳴（SPR）である。
【００５０】
「結合の低減」、例えばFc受容体への結合の低減とは、例えばSPRによって測定される各相互作用に関するアフィニティーの減少を指す。明快になるように述べると、この用語は、アフィニティーのゼロ（または分析方法の検出限界未満）への低減、すなわち相互作用の完全な消失も包含する。逆に「結合の増加」とは、各相互作用に関する結合アフィニティーの増加を指す。
【００５１】
本明細書にいう「ターゲット細胞抗原」とは、ターゲット細胞、例えば腫瘍中の細胞、例えばがん細胞または腫瘍間質の細胞などの表面に提示された抗原決定基を指す。抗原結合部分などに関して本明細書において使用する用語「第1」および「第2」は、各タイプの部分が2つ以上存在する場合に、識別の便宜上使用される。これらの用語の使用は、明示的にそうであると言明する場合を除き、三量体型抗原結合分子に特定の順序または配向を付与することを意図するものではない。
【００５２】
「Fab分子」または「Fabフラグメント」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Fab重鎖」）のVHドメインおよびCH1ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Fab軽鎖」）のVLドメインおよびCLドメインとからなるタンパク質を指す。
【００５３】
「融合された」または「接続された」とは、構成要素（例えばFab分子とCMP三量体化ドメイン）がペプチド結合によって、直接的に、または1つもしくは複数のペプチドリンカーを介して、連結されていることを意味する。
【００５４】
用語「免疫グロブリン分子」は、天然抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えばIgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合した2本の軽鎖と2本の重鎖とから構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VH）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、それに続く3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）（重鎖定常領域とも呼ばれる）とを有する。同様に各軽鎖は、N末端からC末端に向かって、可変領域（VL）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、それに続く定常軽鎖（CL）ドメイン（軽鎖定常領域とも呼ばれる）とを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、またはμ（IgM）と呼ばれる5タイプのうちの1つに割り当てることができ、それらの一部はさらに、例えばγ1（IgG1）、γ2（IgG2）、γ3（IgG3）、γ4（IgG4）、α1（IgA1）およびα2（IgA2）などのサブタイプに分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2タイプのうちの1つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域によって連結された2つのFab分子とFcドメインとからなる。
【００５５】
用語「抗体」は、本明細書では最も広い意味で使用され、例えば限定するわけではないがモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体フラグメントなど、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、さまざまな抗体構造を包含する。
【００５６】
「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体以外の分子であって、インタクト抗体のうち、インタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む分子を指す。抗体フラグメントの例としては、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばscFv）、および単一ドメイン抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。一定の抗体フラグメントの概説については、Hudson et al, Nat Med 9, 129-134 (2003)を参照されたい。scFvフラグメントの概説については、例えばPluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照されたい。また、WO 93/16185および米国特許第5,571,894号および同第5,587,458号も参照されたい。サルベージ受容体結合性エピトープ残基を含み増大したインビボ半減期を有するFabおよびF(ab')2フラグメントに関する議論については、米国特許第5,869,046号を参照されたい。ダイアボディは、二価であっても二重特異性であってもよい2つの抗原結合部位を持つ抗体フラグメントである。例えばEP 404,097、WO 1993/01161、Hudson et al, Nat Med 9, 129-134 (2003)、およびHollinger et al, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディもHudson et al, Nat Med 9, 129-134 (2003)に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む抗体フラグメントである。一定の態様では、単一ドメイン抗体がヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA、例えば米国特許第6,248,516号B1を参照されたい）。抗体フラグメントは、例えば限定するわけではないが、インタクト抗体のタンパク質分解消化や、本明細書に記載する組換え宿主細胞（例えば大腸菌またはファージ）による産生など、さまざまな技法で作ることができる。
【００５７】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗体のうち、抗原の一部または全部に特異的に結合し相補的である区域を含む部分を指す。抗原結合ドメインは、例えば1つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供されうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。
【００５８】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または抗体軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は一般に類似する構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）と3つの超可変領域（HVR）とを含む。例えばKindt et al, Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のVHドメインまたはVLドメインで足りうる。
【００５９】
本明細書において使用する用語「超可変領域」または「HVR」は、抗体可変ドメインのうち、配列が超可変的であり、かつ/または構造上明確なループ（「超可変ループ」）を形成する領域のそれぞれを指す。一般に、ネイティブ4本鎖抗体は6つのHVRを含み、3つはVHに（H1、H2、H3）、そして3つはVL（L1、L2、L3）にある。HVRは、一般に、超可変ループおよび/または相補性決定領域（CDR）からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最も高く、かつ/または抗原認識に関与する領域である。VHのCDR1を除くと、CDRは一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（HVR）は「相補性決定領域」（CDR）ともいい、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、これらの用語は本明細書では可換的に使用される。この特定領域は、Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)と、Chothia et al, J Mol Biol 196:901-917 (1987)に記載されており、これらの定義は、互いに比較すると、アミノ酸残基のオーバーラップまたはアミノ酸残基のサブセットを含んでいる。それでもなお、抗体のCDRまたはその変異体を指すためのどちらかの定義の適用は、本明細書において定義し使用する用語の範囲内であるものとする。上述の文献のそれぞれによって定義されるCDRを包含する適当なアミノ酸残基を、下記表Aに対比して示す。特定のCDRを包含する正確な残基番号は、そのCDRの配列およびサイズに依存して変動する。抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、当業者は、特定のCDRを構成する残基をルーチン的に決定することができる。
【００６０】
（表Ａ）CDR定義1
0006618463.tif 000002
1表Aにおいて、全てのCDR定義のナンバリングは、Kabatらが示したナンバリング規則（下記参照）に従う。
【００６１】
Kabatらは、任意の抗体に適用することができる可変領域配列のためのナンバリングシステムも定義した。当業者は、配列そのもの以外の実験データには一切頼ることなく、任意の可変領域配列に、この「Kabatナンバリング」のシステムを明確に割り当てることができる。本明細書にいう「Kabatナンバリング」とは、Kabat et al, U.S. Dept. of Health and Human Services「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983）に示されているナンバリングシステムを指す。別段の指定がある場合を除き、抗体可変領域中の具体的なアミノ酸残基位置のナンバリングへの言及は、Kabatナンバリングシステムに従う。
【００６２】
配列表のポリペプチド配列はKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされていない。しかし、配列表の配列のナンバリングをKabatナンバリングに変換することは、十分に、当業者の通常の技能の範囲内である。
【００６３】
「フレームワーク」または「FR」とは、超可変領域（HVR）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのFRは、一般に、4つのFRドメインFR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。したがって、HVR配列とFR配列は一般にVH（またはVL）中に、以下の順序で現れる: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
【００６４】
本明細書において使用する用語「工学的に改変する」、「工学的に改変された」、「工学的改変」は、天然ポリペプチドもしくは組換えポリペプチドまたはそのフラグメントのペプチド主鎖または翻訳後修飾の任意の操作を包含すると見なされる。工学的改変には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびにこれらのアプローチの任意の組み合わせが含まれる。
【００６５】
本明細書において使用する用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および修飾を包含するものとする。最終コンストラクトが所望の特徴、例えば増大した三量体型抗原結合分子の安定性などを有する限り、置換、欠失、挿入、および修飾を任意に組み合わせて、最終コンストラクトを達成することができる。アミノ酸配列の欠失および挿入は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端でのアミノ酸の欠失および挿入を包含する。特別なアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば三量体型抗原結合分子の安定性などを改変するには、非保存的アミノ酸置換（すなわち、あるアミノ酸を構造的性質および/または化学的性質が異なる別のアミノ酸で置き換えること）が、とりわけ好ましい。アミノ酸置換には、非天然アミノ酸による置き換え、または20種類の標準アミノ酸の天然アミノ酸誘導体（例えば4-ヒドロキシプロリン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、5-ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野において周知の遺伝学的方法または化学的方法を使って生じさせることができる。遺伝学的方法としては、部位特異的変異誘発、PCR、遺伝子合成などを挙げることができる。遺伝子工学以外の方法でアミノ酸の側鎖基を改変する方法、例えば化学修飾も、役立ちうると考えられる。同じアミノ酸変異を示すために、本明細書では、さまざまな名称を使用する場合がある。
【００６６】
本明細書において使用する用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指すわけではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または2つ以上のアミノ酸でできた鎖を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義に包含され、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと可換的に、使用することができる。用語「ポリペプチド」は、ポリペプチドの発現後修飾（グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非天然アミノ酸による修飾を含むが、それらに限定されるわけではない）の産物も指すものとする。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、組換え技術によって産生することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。これは、化学合成による方法を含む任意の方法で作製することができる。本発明のポリペプチドは、約3アミノ酸以上、5アミノ酸以上、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、25アミノ酸以上、50アミノ酸以上、75アミノ酸以上、100アミノ酸以上、200アミノ酸以上、500アミノ酸以上、1,000アミノ酸以上、または2,000アミノ酸以上のサイズを有しうる。ポリペプチドは、必ずしも明確な三次元構造を有するわけではないが、そのような構造を有する場合もある。明確な三次元構造を有するポリペプチドを、折りたたまれているといい、明確な三次元構造を有さず、むしろ多数の異なるコンフォメーションをとることができるポリペプチドを、折りたたまれていないという。
【００６７】
本明細書にいう「融合ポリペプチド」とは、CMP三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部位から構成されるポリペプチドを指す。融合は、抗原結合部位のN末端アミノ酸またはC末端アミノ酸をペプチド結合によってCMP三量体化ドメインのC末端アミノ酸またはN末端アミノ酸に直接連結することによって行うことができる。別の態様では、ペプチドリンカーを介して融合を達成することができる。
【００６８】
「単離された」ポリペプチドまたはその変異体もしくは誘導体とは、その天然環境にないポリペプチドを意味する。特定の精製レベルが要求されることはない。例えば単離されたポリペプチドは、そのネイティブ環境または天然環境から取り出すことができる。宿主細胞において発現する組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明においては単離されていると見なされ、何らかの適切な技法で分離され、分画され、または部分的もしくは実質的に精製されたネイティブポリペプチドまたは組換えポリペプチドも同様である。
【００６９】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、保存的置換を配列同一性の一部とは見なさずに、パーセント配列同一性が最大になるように配列を整列し、必要であればギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一な候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列は、当技術分野の技能の範囲内にあるさまざまな方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、SAWIまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどといった公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使って達成することができる。当業者は、配列を整列するための適当なパラメータを、比較する配列の全長にわたって最大の整列を得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、決定することができる。ただし、本明細書における目的には、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使って、％アミノ酸配列同一性値を生成させる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.によって作成されたものであり、米国著作権局（ワシントンD.C.、20559）に利用者向け文書と共に登録申請され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc.（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手するか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX V4.0DなどのUNIXオペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Bに対する、または所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bと対比した、所与のアミノ酸配列Aの％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Bに対して、または所与のアミノ酸配列Bと、または所与のアミノ酸配列Bと対比して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Aと、言い換えることもできる）は、次のように計算される。
分率X/Y×100
ここで、Xは、配列整列プログラムALIGN-2が、そのプログラムによるAとBとの整列において、完全一致（identical match）と記録したアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合に、Bに対するAの％アミノ酸配列同一性が、Aに対するBの％アミノ酸配列同一性と一致しなくなることは、理解されるであろう。別段の具体的な言明がある場合を除き、本明細書において使用する％アミノ酸配列同一性値は全て、すぐ上の段落で説明したように、ALIGN-2コンピュータプログラムを使って得られる。
【００７０】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子または核酸コンストラクト、例えばメッセンジャーRNA（mRNA）、ウイルス由来のRNA、またはプラスミドDNA（pDNA）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスホジエステル結合または非通常型の結合（例えばアミド結合、例えばペプチド核酸（PNA）に見いだされるもの）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えばDNAフラグメントまたはRNAフラグメントを指す。
【００７１】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、そのネイティブ環境から取り出された核酸分子、DNAまたはRNAを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドであってベクターに含まれているものは、本発明においては単離されていると見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例として、異種宿主細胞中に維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液の状態にある（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドには、細胞内に含有されているポリヌクレオチド分子であって、その細胞は当該ポリヌクレオチド分子を通常含有するが、当該ポリヌクレオチド分子が染色体外に存在するか、またはその天然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在するものが含まれる。単離されたRNA分子には、本発明のインビボまたはインビトロRNA転写産物の他、プラス鎖型およびマイナス鎖型、ならびに二本鎖型が含まれる。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に産生された上述の分子も含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントであるか、そのような調節エレメントを含んでもよい。
【００７２】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば95％「同一な」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり5個までの点突然変異を含みうる点以外は、参照配列と同一であることを意味する。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの5％までを、欠失させるか、もしくは別のヌクレオチドで置換するか、または参照配列中の全ヌクレオチドの5％までの数のヌクレオチドを参照配列中に挿入することができる。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の5'末端位置もしくは3'末端位置にあってもよいし、これら末端位置の間のどこにあってもよく、参照配列内の残基間または参照配列中の1つまたは複数の連続する群内の残基間に、個別に散在していてもよい。実際問題として、任意の特定ポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるかどうかは、公知のコンピュータプログラム、例えばポリペプチドに関して上で述べたもの（例えばALIGN-2）を使って、従来法で決定することができる。
【００７３】
用語「発現カセット」は、ターゲット細胞において特定の核酸の転写を可能にする指定された一連の核酸エレメントを持つ、組換え的または合成的に作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、ウイルス、または核酸フラグメントに組み入れることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、なかんずく、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。一定の態様において、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
用語「ベクター」または「発現ベクター」は「発現コンストラクト」と同義であり、それが機能的に関連付けられた特定の遺伝子を、ターゲット細胞に導入し、ターゲット細胞におけるその発現を指示するために使用されるDNA分子を指す。この用語は、自己複製性核酸構造としてのベクターも、宿主細胞に導入されるとその宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターも包含する。本発明の発現ベクターは発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なmRNAの転写を可能にする。発現ベクターがターゲット細胞の内部に入れば、当該遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞の転写および/または翻訳機構によって産生される。一態様において、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【００７５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養」は可換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞には「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これには初代形質転換細胞とそこから派生する子孫とが継代数を問わずに含まれる。子孫は、核酸内容物が親細胞と完全には同一でなくて、変異を含有する可能性がある。最初に形質転換された細胞において選別または選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異型子孫は、ここに含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞として、培養細胞、例えば限定するわけではないが、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞などの哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞などが挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物組織もしくは培養動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。
【００７６】
作用物質の「有効量」とは、それを投与された細胞または組織における生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【００７７】
作用物質（例えば薬学的組成物）の「治療有効量」とは、所望の治療結果または予防結果を達成するのに、必要な投薬量および必要な期間で、有効な量を指す。作用物質の治療有効量は、例えば、疾患の有害効果を排除し、減少させ、遅延させ、最小限に抑え、または防止する。
【００７８】
「個体」または「対照」は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えばヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯類（例えばマウスおよびラット）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特に個体または対照はヒトである。
【００７９】
用語「薬学的組成物」は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効でありうるような形態にあり、かつその製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の構成要素を含有しない、調製物を指す。
【００８０】
「薬学的に許容される担体」とは、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指し、これは対照にとって無毒性である。薬学的に許容される担体として、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００８１】
本明細書にいう「処置」（およびその文法上の異形、例えば「処置する」または「処置すること」）は、処置される個体における疾患の自然経過を改変しようとする臨床的介入を指し、臨床的病態を予防するために行うか、または臨床的病態の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果として、疾患の発生または再発を防止すること、症状の緩和、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的帰結の縮減、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の改善または一時的緩和（palliation）、および寛解または予後の向上が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、本発明の三量体型結合分子を使って、疾患の発生を遅延させるか、疾患の進行を減速する。
【００８２】
用語「添付文書」は、治療製品の市販パッケージに通例含まれていて、適応症、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌症および/または前記治療製品の使用に関する警告についての情報を含む説明書を指すために使用される。
【００８３】
態様の詳細な説明
本発明の目的は、少なくとも3つの抗原結合部分を含む新規三量体型抗原結合分子を提供することである。
【００８４】
本発明は、3つの融合ポリペプチドを含む三量体型抗原結合分子であって、融合ポリペプチドのそれぞれが、ヒト軟骨基質タンパク質（CMP、SEQ ID NO:1）に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部分を含み、該三量体化ドメインが三量体型抗原結合分子の安定な会合を媒介する能力を有するものに関する。前記3つの融合ポリペプチドはイオン結合その他の非共有結合的結合によって互いに結合し、したがって少なくとも3つの抗原結合部分を持つ三量体型分子を形成する。三量体化すると、融合ポリペプチドは安定なコイルドコイル構造を形成し、それが三量体型抗原結合分子に安定性を与える。
【００８５】
本発明の一態様では、3つの隣接する融合ポリペプチドが、三量体化ドメイン間の鎖間ジスルフィド結合によって三量体に会合する。本願に関して「鎖間ジスルフィド結合」という用語は、2つの融合ポリペプチドが、融合ポリペプチドのアミノ酸配列中の2つのシステイン残基間に形成されるジスルフィド結合によって、それぞれ接続されていることを意味する。したがって、三量体型抗原結合分子の3つの融合ポリペプチドは3つのジスルフィド結合を形成し、その結合のそれぞれが2つの三量体化ドメインを接続している。そのような鎖間ジスルフィド結合は一般にヒト軟骨基質タンパク質に由来する三量体化ドメインでは自然に生じるが、それらを三量体型結合分子に代替的にまたは付加的に導入することもできる。付加的ジスルフィド結合は、ヒト軟骨基質タンパク質に由来する三量体化ドメインのアミノ酸配列のN端および/またはC端、好ましくはN端にシステインを付加することによって、作出することができる。付加的ジスルフィド結合は、三量体化ドメイン中のアミノ酸残基のうちの1つまたは複数をシステインで置換することによって導入することもできる。付加的ジスルフィド結合は三量体型結合分子の安定性の増加につながりうる。
【００８６】
ヒト軟骨基質タンパク質（CMP）に由来する三量体化ドメインは、SEQ ID NO:1の少なくとも一部を含む。一態様では、三量体化ドメインが、SEQ ID NO:2に対して少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも98％の同一性を有する配列を含む。一態様では、該三量体化ドメインがSEQ ID NO:2の配列を含む。ヒト軟骨基質タンパク質（CMP）に由来する三量体化ドメインを、本明細書では、さらに「CMP三量体化ドメイン」ともいう。
【００８７】
本発明の一態様では、CMP三量体化ドメインが、UniprotエントリP21941のヒトCMPのアミノ酸454〜496を含む。別の態様では、CMP三量体化ドメインが、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）（ref: XP_002750612.1）、アカゲザル（Macaca mulatta）（ref: XP_001094970.1)）およびマウス（Mus musculus）（Gene ID:17180 Matn1）から選択される群の軟骨基質タンパク質に由来する。
【００８８】
一態様では、融合ポリペプチドが、CMP三量体化ドメインに融合された抗原結合部分をそれぞれ1つ含む。これら3つの融合ポリペプチドの三量体化は、3つの抗原結合部分を持つ三量体型抗原結合分子への集合をもたらす。したがって、この三量体型抗原結合分子は三価抗原結合分子である。一態様では、3つの抗原結合部分がそれぞれ同じ抗原に特異的である。すなわち、この三量体型抗原結合分子は単一特異性かつ三価である。
【００８９】
各三量体型抗原結合分子には3つの抗原結合部分が存在するので、各抗原結合部分の、そのターゲットに対する相乗的アフィニティーは増加する。
【００９０】
それゆえに、三量体型抗原結合分子は、従来の二価IgG系抗体と比較して、高いアビディティーで抗原に結合する。したがって三量体型結合分子は、従来のIgG系抗体と比較して、低い濃度で効果的に結合していると考えられる。これにより、抗原に対するアフィニティーが低い抗原結合部分を含む多種多様な抗原結合部分の使用が可能になる。加えて、抗原結合部分がそのターゲットに多量体として結合することにより、シグナリングの増強をもたらすこともできる。組換え抗体を多価フォーマットに変換すると、細胞表面からの解離速度が減少することによって、生体内分布が最適化される可能性がある。
【００９１】
小サイズの抗体フラグメント、例えば約25kDaサイズのscFvは、かなり大きな血清中半減期が要求される応用にとっては最適ではない。というのも、それらは比較的速い腎クリアランスを示すからである。タンパク質分子のクリアランスに関する半減時間は、そのサイズと相関し、糸球体濾過の閾値は60〜65kDaであると推定される（Trejtnar et al; 2002, Q J Nucl Med 46:181-194に概説されている）。したがって、そのような小さいドメインのオリゴマー化は、質量を、糸球体濾過の臨界的閾値より大きく増加させることができ、それゆえに血清中半減期を増加させることができる。
【００９２】
一態様では、三量体型抗原結合分子の抗原結合部分は、細胞表面抗原に特異的に結合する能力を有する。一態様では、該細胞表面抗原が腫瘍細胞抗原である。
【００９３】
一態様では、融合ポリペプチドはそれぞれ、CMP三量体化ドメインに融合された2つの抗原結合部分を含む。一態様では、三量体型抗原結合分子は3つの融合ポリペプチドを含み、第1抗原結合部分はCMP三量体化ドメインのN末端に融合され、第2抗原結合部分はCMP三量体化ドメインのC末端に融合されている。それら3つの融合ポリペプチドの三量体化は、各末端に3つの抗原結合部分を持つ三量体型抗原結合分子への集合をもたらす。したがって、この三量体型抗原結合分子は六価抗原結合分子である。一態様では、N末端に融合された3つの抗原結合部分がそれぞれ同じ抗原に特異的であり、C末端に融合された3つの抗原結合部分がそれぞれもう一つの異なる抗原に特異的である。すなわち、この三量体型抗原結合分子は二重特異性であり、かつ各特異性に関して三価である。上に概略を述べたように、この三価性は各抗原結合部分の相乗的アフィニティーをもたらし、それが三量体型抗原結合分子のアビディティーの増加をもたらす。したがって、この二重特異性三量体型抗原分子は、従来のIgG系二重特異性抗体と比較して、どちらの抗原にも高いアフィニティーで結合する。
【００９４】
一態様では、二重特異性三量体型抗原結合分子は、第1の細胞表面抗原に第1抗原結合部分で結合する能力を有し、かつ第2の異なる細胞表面抗原に第2抗原結合部分で結合する能力を有する。一態様では、前記細胞表面抗原の少なくとも1つが腫瘍細胞抗原である。一態様では、二重特異性三量体型抗原結合分子は、細胞表面抗原に第1抗原結合部分で結合する能力を有し、かつハプテンに第2抗原結合部分で結合する能力を有する。したがって、この二重特異性三量体型抗原結合分子は、第2抗原結合部分に結合したハプテンをターゲット部位に、例えば抗原決定基を保持する特定タイプの腫瘍細胞または腫瘍間質に向かわせることができる。二重特異性三量体型抗原結合分子をターゲット細胞まで追跡することができるように、ハプテンを蛍光その他の方法で標識することができる。したがって、この二重特異性三量体型抗原結合分子は、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞を診断または同定するために使用することができる。
【００９５】
この関連において有用なハプテンは、ジゴキシゲニン（DIG）、ビオチン、またはジニトロフェノールである。
【００９６】
本発明の三量体型抗原結合分子は3つの融合ポリペプチドを含み、融合ポリペプチドのそれぞれが、ヒト軟骨基質タンパク質に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも1つの抗原結合部分を含む。融合は三量体化ドメインと抗原結合部分との間の直接結合であってもよいし、リンカーを介して三量体化ドメインと抗原結合部分とを接続することもできる。好ましい一態様では、三量体化ドメインと抗原結合部分とがペプチドリンカーを介して接続される。
【００９７】
本明細書において使用する用語「リンカー」はペプチドリンカーを指し、好ましくは少なくとも5アミノ酸の長さ、好ましくは5〜100アミノ酸の長さ、より好ましくは10〜50アミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を持つペプチドである。一態様では、該ペプチドリンカーは(GxS)nまたは(GxS)nGmであり、ここで、G＝グリシン、S＝セリンであり、かつ（x＝3、n＝3、4、5または6、かつm＝0、1、2または3）または（x＝4、n＝2、3、4または5、かつm＝0、1、2または3）、好ましくはx＝4かつn＝2または3、より好ましくはx＝4、n＝2である。一態様では、該ペプチドリンカーは(G4S)2である。
【００９８】
本発明の抗原結合部分は抗体または抗体フラグメントでありうる。
【００９９】
一態様では、該抗原結合部分は、Fab分子、クロスオーバーFab分子、一本鎖Fab分子、Fv分子、scFv分子および単一ドメイン抗体からなる群より選択される抗体フラグメントである。
【０１００】
一態様では、抗原結合部分は、そのC末端アミノ酸において、該三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。
【０１０１】
一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分はFab分子である。本明細書にいう「Fab分子」または「Fabフラグメント」は、軽鎖のVLドメインと定常ドメイン（CL）とを含む軽鎖フラグメントならびに重鎖のVHドメインおよび第1定常ドメイン（CH1）を含む抗体フラグメントを指す。一態様では、3つの融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインと少なくとも1つのFab分子とを含む。一態様では、3つの融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインと1つのFab分子とを含む。Fab分子はCMP三量体化ドメインのN末端またはC末端に融合することができる。Fab分子はその重鎖または軽鎖においてCMP三量体化ドメインに融合することができる。一態様では、Fab分子は、CMP三量体化ドメインに、ペプチドリンカーを介して融合される。一態様では、Fab分子は、そのFab重鎖のC末端またはN末端アミノ酸において、CMP三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。その結果生じる融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する:（CMP三量体化ドメイン）-（CH1VH）または（CMP三量体化ドメイン）-（VHCH1）。一態様では、該Fab分子はCMP三量体化ドメインにリンカーを介して融合され、融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する:（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（CH1VH）または（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VHCH1）。一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドの重鎖VHCH1とペアを形成する3つのFab分子軽鎖（VLCL）とを含む。
【０１０２】
本発明の一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分はFab分子であって、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のどちらかが交換されている。該Fab分子は、可変領域または定常領域のどちらかが交換されているので、「cross-Fab分子」または「xFab分子」または「クロスオーバーFab分子」とも呼ばれる。クロスオーバーFab分子には2つの異なる鎖組成が考えられ、それらは本発明の三量体型抗原結合分子において有用な抗原結合部分に含まれる。一方では、Fab重鎖とFab軽鎖の可変領域が交換される。すなわち、このクロスオーバーFab分子は、軽鎖可変領域（VL）と重鎖定常領域（CH1）とから構成されるペプチド鎖、および重鎖可変領域（VH）および軽鎖定常領域（CL）とから構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーFab分子はCrossFab（VLVH）とも呼ばれる。他方、Fab重鎖およびFab軽鎖の定常領域を交換した場合、クロスオーバーFab分子は、重鎖可変領域（VH）と軽鎖定常領域（CL）とから構成されるペプチド鎖、および軽鎖可変領域（VL）と重鎖定常領域（CH1）とから構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーFab分子はCrossFab（CLCH1）とも呼ばれる。明快になるように述べると、Fab軽鎖とFab重鎖の可変領域が交換されたクロスオーバーFab分子（すなわちCrossFab（VLVH））では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖が、本明細書においては、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Fab軽鎖とFab重鎖の定常領域が交換されたクロスオーバーFab分子（すなわちCrossFab（CLCH1））では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖が、本明細書においては、クロスオーバーFab分子の「重鎖」と呼ばれる。
【０１０３】
一態様では、3つの融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインと少なくとも1つのcross-Fab分子とを含む。一態様では、3つの融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインと1つのcross-Fab分子とを含む。cross-Fab分子はCMP三量体化ドメインのN末端またはC末端に融合することができる。cross-Fab分子はその重鎖または軽鎖においてCMP三量体化ドメインに融合することができる。一態様では、cross-Fab分子はCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合される。一態様では、cross-Fab分子はそのcross-Fab重鎖のC末端アミノ酸またはN末端アミノ酸において、CMP三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。CrossFab（VLVH）の場合、その結果生じる融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する:（CMP三量体化ドメイン）-（VLCH1）または（CMP三量体化ドメイン）-（CH1VL）。一態様では、該Fab分子はリンカーを介してCMP三量体化ドメインに融合され、融合ポリペプチドがそれぞれ次の構造を有する:（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VLCH1）または（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（CH1VL）。
【０１０４】
一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドの重鎖VLCH1とペアを形成する3つのCrossFab（VLVH）分子軽鎖（VHCL）とを含む。
【０１０５】
CrossFab（CLCH1）の場合、結果として生じる融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する:（CMP三量体化ドメイン）-（VHCL）または（CMP三量体化ドメイン）-（CLVH）。一態様では、該Fab分子はリンカーを介してCMP三量体化ドメインに融合され、融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する:（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VHCL）または（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（CLVH）。
【０１０６】
一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドの重鎖VHCLとペアを形成する3つのCrossFab(CLCH1)分子軽鎖（VLCH1）とを含む。
【０１０７】
本発明の一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分は一本鎖Fab分子である。「一本鎖Fab分子」または「scFab」は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常ドメイン1（CH1）、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、抗体軽鎖定常ドメイン（CL）およびリンカーからなるポリペプチドであって、該抗体ドメインと該リンカーとがN末端からC末端に向かって次の順序の1つを有し:a）VH-CH1-リンカー-VL-CL、b）VL-CL-リンカー-VH-CH1、c）VH-CL-リンカー-VL-CH1、またはd）VL-CH1-リンカー-VH-CL;かつ該リンカーは少なくとも30アミノ酸、好ましくは32〜50アミノ酸のポリペプチドである。該一本鎖Fab分子、a）VH-CH1-リンカー-VL-CL、b）VL-CL-リンカー-VH-CH1、c）VH-CL-リンカー-VL-CH1、およびd）VL-CH1-リンカー-VH-CLは、CLドメインとCH1ドメインとの間の天然のジスルフィド結合によって安定化される。加えて、これらの一本鎖Fab分子は、システイン残基の挿入（例えばKabatナンバリングで可変重鎖の44位と可変軽鎖の100位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されうる。「N末端」という用語は、アミノ酸配列のN端の最後のアミノ酸を表す。「C末端」という用語は、アミノ酸配列のC端の最後のアミノ酸を表す。一態様では、3つの融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインと少なくとも1つの一本鎖Fab分子とを含む。一態様では、3つの融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインと1つの一本鎖Fab分子とを含む。一本鎖Fab分子はCMP三量体化ドメインのN末端またはC末端に融合することができる。一態様では、一本鎖Fab分子はペプチドリンカーを介してCMP三量体化ドメインに融合される。一態様では、Fab分子は、そのFab重鎖のC末端アミノ酸またはN末端アミノ酸において、CMP三量体化ドメインのN末端アミノ酸に、任意でペプチドリンカーを介して融合される。その結果生じる融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する:a）（CMP三量体化ドメイン）-（VH-CH1-リンカー-VL-CL）またはb）（CMP三量体化ドメイン）-（VL-CL-リンカー-VH-CH1）またはc）（CMP三量体化ドメイン）-（VH-CL-リンカー-VL-CH1）またはd）(CMP三量体化ドメイン）-（VL-CH1-リンカー-VH-CL）。一態様では、該Fab分子はリンカーを介してCMP三量体化ドメインに融合され、融合ポリペプチドはそれぞれ次の構造を有する: a）（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VH-CH1-リンカー-VL-CL）またはb）（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VL-CL-リンカー-VH-CH1）またはc）（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VH-CL-リンカー-VL-CH1）またはd）（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VL-CH1-リンカー-VH-CL）。
【０１０８】
本発明の一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分はFv分子である。
【０１０９】
本発明の一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分は一本鎖Fv分子である。
【０１１０】
上に概略を述べた抗体フラグメントに加えて、重鎖だけから構成される抗原結合部分も、本発明の三量体型抗原結合分子に使用することができる。これら珍しい重鎖抗体の抗原結合部位は、VHHまたはaVH（自律的可変重鎖（autonomous variable heavy chain））または単一ドメイン可変重鎖と呼ばれる単一のドメインのみによって形成される。単一ドメイン可変重鎖は組換えタンパク質として容易に産生される。単一ドメイン可変重鎖の他の有利な特徴として、その小さなサイズ、高い溶解度、熱安定性、リフォールディング能、および良好な組織浸透性が挙げられる。単一ドメイン抗体は、例えばWesolowski et al, Med Microbiol Immunol (2009) 198:157-174に記載されている。単一ドメイン可変重鎖抗体を産生する方法は、例えばWO2012152823およびWO2012056000に記載されており、これらは参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。これら単一ドメイン可変重鎖抗体は軽鎖を欠き、CH1ドメインも欠くことができる。したがって、単一ドメイン可変重鎖抗体の抗原結合部位は、単一のドメインのみによって形成される。
【０１１１】
本発明の一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分は単一ドメイン抗体である。
【０１１２】
抗体の他にも、ターゲット分子に特異的に結合させるために使用することができる他の結合タンパク質または結合ドメインがある（例えばBinz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005）。結合タンパク質または結合ドメインのそのような新規クラスの1つは、デザインドリピートタンパク質またはデザインドリピートドメインに基づく（WO 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C, Forrer, P., Grutter, M.G., and Pluckthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008）。
【０１１３】
アンキリンリピートタンパク質は、サッカロミセス・セレビシア（Saccharomyces cerevisiae）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびエレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）におけるそのような4つのタンパク質間の配列比較によって、1987年に同定された。BreedenとNasmythは、swi6p、cdc10p、notchおよびlin-12の配列中に、およそ33残基の反復単位の多重コピーを報告した（Breeden and Nasmyth, 1987）。その後、アンキリンタンパク質中に24コピーのこの反復単位が発見されたことから、この反復単位はアンキリンリピートと命名されることになった（Lux et al, 1990）。後に、この反復単位はさまざまな生物およびウイルスの数百のタンパク質において同定された（Bork, 1993; SMARTデータベース, Schultz et al, 2000）。これらのタンパク質は核内、細胞質または細胞外間隙に位置する。このことは、これらのタンパク質のアンキリンリピートドメインがジスルフィド架橋に依存せず、したがって環境の酸化状態にも依存しないという事実と合致している。1タンパク質あたりの反復単位の数は、2から20超までさまざまである（SMARTデータベース, Schultz et al, 2000）。折りたたまれた安定なドメインを形成するには、最小数の反復単位が必要とされるようである（Zhang and Peng, 2000）。他方、折りたたまれた1つのドメインに存在する反復単位数の上限は6であるという証拠もいくつかある（Michaely and Bennet, 1993）。
【０１１４】
WO 2002/020565には、どのくらい大きなアンキリンリピートタンパク質のライブラリーを構築することができるかと、それらの一般的応用が記載されている。これらのデザインドリピートドメインはリピートタンパク質のモジュール性を利用しており、デザインドリピートドメインが凝集するのを、ドメインの疎水性コアをシールドすることによって防止するために、N末端およびC末端キャッピングモジュールを有する（Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. and Pluckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003）。WO 2012069655には、デザインドアンキリンリピートドメインのC末端もしくはN末端キャッピングモジュールまたはC末端もしくはN末端キャッピングリピートを改良することによって最適化されたリピートタンパク質が記載されている。
【０１１５】
本発明の一態様では、三量体型抗原結合分子の少なくとも1つの抗原結合部分は、少なくとも1つのアンキリンリピートモチーフを含む結合タンパク質である。
【０１１６】
一態様では、三量体型抗原結合分子は3つの融合ポリペプチドを含み、融合ポリペプチドのそれぞれが、CMP三量体化ドメインに融合された2つの抗原結合部分を含む。一態様では、三量体型抗原結合分子は3つの融合ペプチドを含み、ここでは、第1抗原結合部分がCMP三量体化ドメインのN末端に融合され、第2抗原結合部分がCMP三量体化ドメインのC末端に融合されている。第2抗原結合部分は抗体または抗体フラグメントであることができる。一態様では、該第2抗原結合部分は、Fab分子、クロスオーバーFab分子、一本鎖Fab分子、Fv分子、scFv分子および単一ドメイン抗体からなる群より選択される抗体フラグメントである。一態様では、該第1抗原結合部分が抗体フラグメントであり、該第2抗原結合部分が抗体フラグメントである。好ましくは、第2抗原結合部分は第1抗原結合部分とは異なる抗体フラグメントである。
【０１１７】
一態様では、該第1抗原結合部分がFab分子であり、該第2抗原結合部分が一本鎖Fv分子である。
【０１１８】
一態様では、三量体型抗原結合分子は3つの融合ポリペプチドを含み、融合ポリペプチドのそれぞれが、第1抗原に特異的に結合する能力を有するFab分子と第2抗原に特異的に結合する能力を有する一本鎖Fv分子とを含む。
【０１１９】
一態様では、各融合ポリペプチドは、Fab重鎖のC末端においてCMP三量体化ドメインのN末端に任意でペプチドリンカーを介して融合されたFab分子と、N末端においてCMP三量体化ドメインのC末端に任意でペプチドリンカーを介して融合された一本鎖Fv分子とを含む。したがって、3つの融合ポリペプチドのそれぞれは例えば次の構造を有しうる:（VHCH1）-（CMP三量体化ドメイン）-scFv。抗原結合ドメインがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合されている態様では、融合ポリペプチドは例えば次の構造を有しうる:（VHCH1）-リンカー-（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-scFv。別の態様では、Fab分子だけがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合され、scFv分子はCMP三量体化ドメインに直接融合されるか、またはその逆である。一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドの重鎖（VHCH1）鎖とペアを形成する3つの軽鎖（VLCL）とを含む。
【０１２０】
一態様では、各融合ポリペプチドは、Fab軽鎖のC末端においてCMP三量体化ドメインのN末端に任意でペプチドリンカーを介して融合されたFab分子と、N末端においてCMP三量体化ドメインのC末端に任意でペプチドリンカーを介して融合された一本鎖Fv分子とを含む。したがって、3つの融合ポリペプチドのそれぞれは例えば次の構造を有しうる:（VLCL）-（CMP三量体化ドメイン）-scFv。抗原結合ドメインがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合されている態様では、融合ポリペプチドは例えば次の構造を有しうる:（VLCL）-リンカー-（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-scFv。別の態様では、Fab分子だけがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合され、scFv分子はCMP三量体化ドメインに直接融合されるか、またはその逆である。一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチドと、融合ポリペプチドの軽（VLCL）鎖とペアを形成する3つの重鎖（VHCH1）とを含む。
【０１２１】
一態様では、三量体型抗原結合分子は3つの融合ポリペプチドを含み、融合ポリペプチドのそれぞれが、第1抗原に特異的に結合する能力を有するFab分子と第2抗原に特異的に結合する能力を有するcrossFab分子とを含む。
【０１２２】
一態様では、各融合ポリペプチドは、Fab重鎖のC末端においてCMP三量体化ドメインのN末端に任意でペプチドリンカーを介して融合されたFab分子と、CMP三量体化ドメインのC末端に任意でペプチドリンカーを介して融合されたcrossFab分子とを含む。
【０１２３】
したがって、3つの融合ポリペプチドのそれぞれは例えば次の構造を有しうる:（VHCH1）-（CMP三量体化ドメイン）-（VLCH1）または（VHCH1）-（CMP三量体化ドメイン）-（CLVH）。抗原結合ドメインがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合されている態様では、融合ポリペプチドは例えば次の構造を有しうる:（VHCH1）-リンカー-（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VLCH1）または（VHCH1）-リンカー-（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（CLVH）。別の態様では、Fab分子だけがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合され、cross-Fab分子はCMP三量体化ドメインに直接融合されるか、またはその逆である。一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの重（VHCH1）鎖とペアを形成する3つの軽鎖（VLCL）、および融合ポリペプチドのCrossfab部分とペアを形成する3つの（CLVH）鎖または（VHCH1）鎖を含む。
【０１２４】
一態様では、各融合ポリペプチドは、Fab軽鎖のC末端においてCMP三量体化ドメインのN末端に任意でペプチドリンカーを介して融合されたFab分子と、CMP三量体化ドメインのC末端に任意でペプチドリンカーを介して融合されたcross-Fab分子とを含む。したがって3つの融合ポリペプチドのそれぞれは例えば次の構造を有しうる:（VLCL）-（CMP三量体化ドメイン）-（VLCH1）または（VLCL）-（CMP三量体化ドメイン）-（VHCL）。抗原結合ドメインがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合されている態様では、融合ポリペプチドが例えば次の構造を有しうる:（VLCL）-リンカー-（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VLCH1）または（VLCL）-リンカー-（CMP三量体化ドメイン）-リンカー-（VHCL）。別の態様では、Fab分子だけがCMP三量体化ドメインにペプチドリンカーを介して融合され、cross-Fab分子はCMP三量体化ドメインに直接融合されるか、またはその逆である。一態様では、三量体型抗原結合分子は、上述した3つの融合ポリペプチド、融合ポリペプチドの軽（VLCL）鎖とペアを形成する3つの重鎖（VHCH1）、および融合ポリペプチドのCrossfab部分とペアを形成する3つの（CLVH）鎖または（VHCH1）鎖を含む。
【０１２５】
一態様では、三量体型抗原結合分子は、SEQ ID NO:4の配列を含む3つの融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:9を含む。
【０１２６】
一態様では、三量体型抗原結合分子は、SEQ ID NO:5の配列を含む3つの融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10を含む。
【０１２７】
一態様では、三量体型抗原結合分子は、SEQ ID NO:6の配列を含む3つの融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:9を含む。
【０１２８】
一態様では、三量体型抗原結合分子は、SEQ ID NO:19の配列を含む3つの融合ポリペプチドと、SEQ ID NO:20を含む。
【０１２９】
組換え法
本発明の三量体型二重特異性抗原結合分子は、例えば固体（solid-state）ペプチド合成（例えばMerrifield固相合成）または組換え産生によって得ることができる。組換え産生の場合は、例えば上述の三量体型抗原結合分子（フラグメント）をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニングおよび/または宿主細胞における発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのようなポリヌクレオチドは従来の手法を使って容易に単離し、配列決定することができる。一態様では、1つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者には周知の方法を使って、三量体型抗原結合分子（フラグメント）のコード配列を適当な転写/翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法として、インビトロ組換えDNA技法、合成技法、およびインビボ組換え/遺伝子組換えが挙げられる。例えばManiatis et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)やAusubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載の技法を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であることができ、あるいは核酸フラグメントであってもよい。発現ベクターは、三量体型抗原結合分子（フラグメント）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコード領域）がプロモーターおよび/または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと機能的に関連してクローニングされている発現カセットを含む。本明細書にいう「コード領域」とは、核酸のうち、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる部分である。「停止コドン」（TAG、TGA、またはTAA）はアミノ酸には翻訳されないものの、停止コドンが存在する場合は、それをコード領域の一部と見なしてよいが、フランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5'および3'非翻訳領域などはいずれも、コード領域の一部ではない。2つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に（例えば単一のベクター上に）存在するか、別々のポリヌクレオチドコンストラクト中に（例えば別々の（異なる）ベクター上に）存在することができる。さらにまた、どのベクターも、単一のコード領域を含有するか、2つ以上のコード領域を含有することができ、例えば本発明のベクターは、翻訳後または翻訳と同時にタンパク質加水分解的切断によって最終タンパク質に分離される1つまたは複数のポリペプチドをコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、本発明の三量体型抗原結合分子（フラグメント）、またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合された、または融合されていない、異種コード領域をコードしてもよい。異種コード領域としては、特殊化したエレメントまたはモチーフ、例えば分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。機能的な関連とは、ある遺伝子産物（例えばポリペプチド）のコード領域が1つまたは複数の調節配列と、その遺伝子産物の発現がその調節配列の影響下または制御下に置かれるような形で関連している場合をいう。2つのDNAフラグメント（例えばポリペプチドコード領域およびそれと関連するプロモーター）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらすのであれば、また、2つのDNAフラグメント間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨害せず、DNAテンプレートの被転写能力も妨害しないのであれば、「機能的に関連している」。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を達成する能力を有するのであれば、そのプロモーター領域は、その核酸と機能的に関連している。プロモーターは、前もって決定された細胞でのみDNAの実質的転写を指示する細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルも、細胞特異的転写を指示するために、ポリヌクレオチドに機能的に関連させることができる。適切なプロモーターおよび他の転写制御領域を本明細書に開示する。さまざまな転写制御領域が当業者には公知である。それらには、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば限定するわけではないが、サイトメガロウイルス（例えば前初期プロモーター、イントロンAを含むもの）、シミアンウイルス40（例えば初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどがあるが、それらに限定されるわけではない。他の転写制御領域として、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギα-グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御する能力を有する他の配列が挙げられる。その他の適切な転写制御領域として、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン類で誘導されるプロモーター）が挙げられる。同様に、さまざまな翻訳制御エレメントも、当業者には公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント（特に配列内リボソーム進入部位、すなわちIRES、CITE配列ともいう）などがあるが、それらに限定されるわけではない。発現カセットは、複製起点、および/またはレトロウイル末端反復配列（LTR）もしくはアデノ随伴ウイルス（AAV）末端逆位配列（ITR）などの染色体組込みエレメントなどといった、他の特徴も含みうる。
【０１３０】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域を伴っていてもよい。例えば、三量体型抗原結合分子の分泌が望ましい場合は、本発明の三量体型抗原結合分子またはそのフラグメントをコードする核酸の上流に、シグナル配列をコードするDNAを置くことができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、それは、粗面小胞体を横切る成長中のタンパク質鎖の輸送が開始されると、成熟タンパク質から切り離される。脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般にポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切り離されることで、分泌型または「成熟」型のポリペプチドが産生されることは、当業者に知られている。一定の態様では、ネイティブのシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、またはその配列の機能的誘導体であって、それに機能的に関連しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持しているものが使用される。あるいは、異種哺乳類シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【０１３１】
後に行う精製を容易にするために使用することができる（例えばヒスチジンタグ）または三量体型抗原結合分子の標識を助けるために使用することができる短いタンパク質配列をコードするDNAを、三量体型抗原結合分子（フラグメント）をコードするポリヌクレオチドの内部または末端に含めてもよい。
【０１３２】
さらなる態様では、1つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。一定の態様では、1つまたは複数の本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。これらのポリヌクレオチドおよびベクターには、それぞれポリヌクレオチドおよびベクターに関連して本明細書に記載した特徴をどれでも、単独でまたは組み合わせて、組み入れることができる。そのような一態様において、宿主細胞は、本発明の三量体型抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、前記ベクターで形質転換されている、または前記ベクターがトランスフェクトされている）。本明細書において使用する用語「宿主細胞」は、本発明の三量体型抗原結合分子またはそのフラグメントを作製するために工学的に改変することができるあらゆる種類の細胞系を指す。三量体型抗原結合分子を複製し、その発現を支えるのに適した宿主細胞は、当技術分野において周知である。そのような細胞に特定の発現ベクターを適宜トランスフェクトまたは形質導入し、大規模発酵槽への接種用に大量のベクター含有細胞を成長させることで、臨床応用のために十分な量の三量体型抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物、例えば大腸菌、またはさまざまな真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、昆虫細胞などが挙げられる。例えばポリペプチドは細菌中で産生することができ、グリコシル化が必要でない場合は特にそうである。発現後にポリペプチドは細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離してもよく、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌や酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的にヒトまたは完全にヒトのグリコシル化パターンを持つポリペプチドの産生をもたらす真菌株および酵母株を含めて、ポリペプチドコードベクターの適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)、およびLi et al, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドを発現させるための適切な宿主細胞は多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）からも得られる。無脊椎生物細胞の例として植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用することができるバキュロウイルス株、とりわけヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用することができるバキュロウイルス株は、数多く同定されている。植物細胞培養も宿主として利用することができる。例えば米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号を参照されたい（トランスジェニック植物中で抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）。脊椎動物細胞も宿主として使用しうる。例えば、懸濁状態での成長に適応させた哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（例えばGraham et al, J Gen Virol 36, 59 (1977)に記載されている293細胞または293T細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（例えばMather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞��VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK）、バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍細胞（MMT060562）、TRI細胞（例えばMather et al, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載されている）、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、dhfr- CHO細胞（Urlaub et al, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、および骨髄腫細胞株、例えばYO、NS0、P3X63およびSp2/0が挙げられる。タンパク質産生に適した一定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えばYazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248（B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp.255-268 (2003)を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞などだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物組織もしくは培養動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。一態様では、宿主細胞が真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ヒト胎児腎臓（HEK）細胞またはリンパ系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。
【０１３３】
これらの系で外来遺伝子を発現させるための標準的技術は当技術分野において公知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖のどちらか一方を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が重鎖と軽鎖の両方を持つ抗体になるような形で、他方の抗体鎖も発現するように工学的に改変することができる。
【０１３４】
一態様では、本発明の三量体型抗原結合分子を産生する方法であって、本明細書に提供する三量体型抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、三量体型抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、および宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から三量体型抗原結合分子を回収する工程を含む方法が提供される。
【０１３５】
三量体型抗原結合分子の構成要素は互いに遺伝子的に融合される。三量体型抗原結合分子は、その構成要素が互いに直接融合されるように、またはリンカー配列を介して間接的に融合されるように、設計することができる。リンカーの組成と長さは、当技術分野において周知の方法に従って決定することができ、その効力を試験することができる。三量体型抗原結合分子の異なる構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に提供する配列中に見いだされる。所望であれば、融合物の個々の構成要素を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み入れるために、追加配列も含めることができる。
【０１３６】
一定の態様では、三量体型抗原結合分子の1つまたは複数の抗原結合部分が、少なくとも、抗原決定基に結合する能力を有する抗体可変領域を含む。可変領域は、天然抗体または非天然抗体およびそのフラグメントの一部を形成するか、または天然抗体もしくは非天然抗体およびそのフラグメントに由来しうる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための方法は当技術分野において周知である（例えばHarlow and Lane「Antibodies, a laboratory manual」Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい）。非天然抗体は固相ペプチド合成を使って構築するか、（例えば米国特許第4,186,567号に記載されているように）組換え産生するか、または例えば可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすること（例えばMcCaffertyの米国特許第5,969,108号を参照されたい）などによって得ることができる。
【０１３７】
本発明の三量体型抗原結合分子には、どの動物種の抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメインまたは可変領域でも使用することができる。本発明において有用な抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメインまたは可変領域は、限定するわけではないが、マウス、霊長類、またはヒト起源のものであることができる。三量体型抗原結合分子をヒトに使用するつもりである場合は、抗体の定常領域がヒトに由来するキメラ型の抗体を使用することができる。ヒト化型または完全ヒト型の抗体も、当技術分野において周知の方法で調製することができる（例えばWinterの米国特許第5,565,332号を参照されたい）。ヒト化は、限定するわけではないが（a）非ヒト（例えばドナー抗体）CDRをヒト（例えばレシピエント抗体）フレームワークおよび定常領域に、決定的フレームワーク残基（例えば良好な抗原結合アフィニティーまたは抗体機能を保持するために重要なもの）を保って、または保たずに、移植すること、（b）非ヒト特異性決定領域（SDRまたはa-CDR;抗体-抗原相互作用にとって決定的な残基）だけをヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること、または（c）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってそれらをヒト様セクションで「覆い隠す（cloaking）」ことを含む、さまざまな方法によって達成することができる。ヒト化抗体とそれらを製作する方法は、例えばAlmagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)に概説されており、さらに例えばRiechmann et al, Nature 332, 323-329 (1988)、Queen et al, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)、米国特許第5,821,337号、同第7,527,791号、同第6,982,321号、および同第7,087,409号、Jones et al, Nature 321, 522-525 (1986)、Morrison et al, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)、Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)、Verhoeyen et al, Science 239, 1534-1536 (1988)、Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)、Kashmiri et al, Methods 36, 25-34 (2005)（SDR（a-CDR）移植が記載されている）、Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)（「リサーフェイシング（resurfacing）」が記載されている）、Dall'Acqua et al, Methods 36, 43-60 (2005)（「FRシャフリング」が記載されている）、ならびにOsbourn et al, Methods 36, 61-68 (2005)およびKlimka et al, Br J Cancer 83, 252-260 (2000)（FRシャフリングのための「誘導選択（guided selection）」アプローチが記載されている）にも記載されている。ヒト抗体およびヒト可変領域は、当技術分野において公知のさまざまな技法を使って産生することができる。ヒト抗体はvan Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)およびLonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)に概説されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作られたヒトモノクローナル抗体の一部を形成するか、そのようなヒトモノクローナル抗体に由来しうる（例えばMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照されたい）。ヒト抗体およびヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答してインタクトヒト抗体またはヒト可変領域を持つインタクト抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することもできる（例えばLonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい）。ヒト抗体およびヒト可変領域は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変領域配列を単離することによって作製することもできる（例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37（O'Brien et al, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)、およびMcCafferty et al, Nature 348, 552-554、Clackson et al, Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい）。ファージは、典型的には、抗体フラグメントを、一本鎖Fv（scFv）フラグメントとして、あるいはFabフラグメントとして、ディスプレイする。
【０１３８】
一定の態様では、本発明において有用な抗原結合部分を、結合アフィニティーが増強されるように、例えば米国特許出願公開第2004/0132066号（その内容は全て参照により本明細書に組み入れられる）に開示されている方法に従って工学的に改変する。特異的抗原決定基に結合する本発明の三量体型抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）または当業者によく知られている他の技法、例えば表面プラズモン共鳴技法（BIACORE T100システムでの分析）（Liljeblad, et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、および伝統的な結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）によって測定することができる。競合アッセイを使って、特定抗原への結合に関して参照抗体と競合する抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメインまたは可変ドメイン、例えばCD3への結合に関してV9抗体と競合する抗体を同定することができる。一定の態様では、そのような競合抗体が、参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープ（例えば線状エピトープまたはコンフォメーショナルエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法はMorris (1996)「Epitope Mapping Protocols」in Methods in Molecular Biology vol. 66（Humana Press, Totowa, NJ）に掲載されている。例示的な競合アッセイでは、抗原に結合する標識された第1の抗体（例えばV9抗体）と、抗原への結合に関して第1抗体と競合するその能力について試験される非標識の第2の抗体とを含む溶液中で、固定化抗原（例えばCD3）をインキュベートする。第2抗体はハイブリドーマ上清中に存在していてもよい。対照として、標識された第1の抗体を含むが非標識の第2の抗体を含まない溶液中で、固定化抗原をインキュベートする。抗原への第1抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後に、過剰な未結合抗体を除去し、固定化抗原に会合しているラベルの量を測定する。固定化抗原と会合しているラベルの量が、対照試料と比較して試験試料において実質的に低減していれば、それは、その第2抗体が抗原への結合に関して第1抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照されたい。
【０１３９】
本明細書に記載するように調製されたT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当技術分野において公知の技法、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一つには、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明白であるだろう。アフィニティークロマトグラフィー精製には、三量体型抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体または抗原を使用することができる。例えば、本発明の三量体型抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製には、プロテインAまたはプロテインGを持つマトリックスを使用することができる。逐次的なプロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとを使って、本質的に実施例で述べるように、三量体型抗原結合分子を単離することができる。三量体型抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含むさまざまな周知の分析方法のどれによっても決定することができる。例えば、実施例で述べるように発現させた重鎖融合タンパク質は、還元SDS-PAGEで実証されるとおり、インタクトかつ適正に組み立てられていることが示された。3本のバンドが、三量体型抗原結合分子の軽鎖、重鎖および重鎖/軽鎖融合タンパク質の予想分子量に一致するおよそMr25,000、Mr50,000およびMr75,000に分離された。
【０１４０】
アッセイ
本明細書に提供するT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、当技術分野において公知のさまざまなアッセイによって同定し、スクリーニングし、またはその物理的/化学的性質および/もしくは生物学的活性について特徴づけることができる。
【０１４１】
アフィニティアッセイ
Fc受容体またはターゲット抗原に対する三量体型抗原結合分子のアフィニティーは、実施例に示す方法に従って、表面プラズモン共鳴（SPR）により、BIAcore計器（GE Healthcare）などの標準的計測手段と、例えば組換え発現によって得ることができるような受容体またはターゲットタンパク質とを使って決定することができる。あるいは、さまざまな受容体またはターゲット抗原に対する三量体型抗原結合分子の結合を、その特定受容体またはターゲット抗原を発現する細胞株を使って、例えばフローサイトメトリー（FACS）によって評価することもできる。結合アフィニティーの測定に関する説明的かつ例示的な具体的態様を以下に述べ、下記実施例に記載する。
【０１４２】
一態様では、BIACORE（登録商標）T100機器（GE Healthcare）を使用し、25℃において、表面プラズモン共鳴によって、KDが測定される。
【０１４３】
Fc部分とFc受容体の間の相互作用を分析するために、Hisタグ付き組換えFc受容体を、CM5チップ上に固定化された抗Penta His抗体（Qiagen）によって捕捉し、二重特異性コンストラクトを分析物として使用する。簡単に述べると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5、GE Healthcare）をN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩（EDC）とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で供給者の説明書に従って活性化する。抗Penta-His抗体を10mM酢酸ナトリウム、pH5.0で、40μg/mlに希釈してから、5μl/分の流量で注入することで、カップリングしたタンパク質をおよそ6500レスポンスユニット（response unit）（RU）にする。リガンドの注入に続いて、未反応基をブロッキングするために、1Mエタノールアミンを注入する。次に、Fc受容体を4nMまたは10nMで60秒間捕捉する。速度論的測定のために、二重特異性コンストラクトの4倍段階希釈液（範囲500nM〜4000nM）を、HBS-EP（GE Healthcare、10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％サーファクタントP20、pH7.4）溶液として、25℃において30μl/分の流量で120秒間、注入する。
【０１４４】
ターゲット抗原に対するアフィニティーを決定するために、抗Penta-His抗体について述べたように活性化CM5センサーチップ表面に固定化した抗ヒトFab特異的抗体（GE Healthcare）で、二重特異性コンストラクトを捕捉する。カップリングしたタンパク質の最終量はおよそ12000RUである。二重特異性コンストラクトを300nMで90秒間捕捉する。ターゲット抗原を、250〜1000nMの濃度範囲、30μl/分の流量で、180秒間、フローセルに通す。解離を180秒間モニターする。
【０１４５】
参照フローセルで得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正する。定常状態応答を使って、ラングミュア結合等温線の非線形カーブフィッティングにより、解離定数KDを得た。単純な1対1ラングミュア結合モデル（BIACORE（登録商標）T100評価ソフトウェア・バージョン1.1.1）を使用し、会合センサーグラムと解離センサーグラムの同時フィッティングによって、会合速度（kon）と解離速度（koff）を算出する。平衡解離定数（KD）は比koff/konとして算出される。例えばChen et al, J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照されたい。
【０１４６】
活性アッセイ
本発明の三量体型抗原結合分子の生物学的活性は、実施例に記載するように、さまざまなアッセイによって測定することができる。生物学的活性としては、例えば腫瘍細胞などのターゲット細胞の溶解の誘導、ならびに腫瘍退縮および/または生存率の改善の誘導を挙げることができる。
【０１４７】
組成物、製剤、および投与経路
さらなる局面において、本発明は、例えば後述する治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供する三量体型抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供する三量体型抗原結合分子のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供する三量体型結合分子のいずれかと、後述するような少なくとも1つの追加治療剤とを含む。
【０１４８】
さらに、本発明の三量体型抗原結合分子をインビボ投与に適した形態で産生する方法であって、（a）本発明の三量体型抗原結合分子を得る工程、および（b）前記三量体型抗原結合分子を少なくとも1つの薬学的に許容される担体と共に製剤化することによって、三量体型抗原結合分子の調製物がインビボ投与用に製剤化される工程を含む方法も提供する。
【０１４９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散した治療有効量の1つまたは複数の三量体型抗原結合分子を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という表現は、使用する投薬量および濃度において受容者にとって概して非毒性である、すなわち適宜、動物、例えばヒトなどに投与した時に、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない、分子実体および組成物を指す。少なくとも1つの三量体型抗原結合分子と任意で追加活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990によって例示されるように、本開示に照らせば、当業者にはわかるであろう。さらにまた、動物（例えばヒト）に投与するには、調製物が、FDA Office of Biological Standardsまたは他国の対応する官庁が要求する滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の規格を満たすべきであることは理解されるであろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書にいう「薬学的に許容される担体」には、当業者には公知であるとおり、ありとあらゆる溶媒、緩衝剤、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、その他同様の材料およびそれらの組み合わせが包含される（例えば参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。従来の担体は、それが活性成分と適合しない場合を除いて、いずれも本治療組成物または薬学的組成物におけるその使用が考えられる。
【０１５０】
本組成物は、それが固形、液状またはエアロゾル状で投与されるかどうか、また注射のような投与経路のために滅菌を必要とするかどうかに依存して異なるタイプの担体を含みうる。本発明の三量体型抗原結合分子（および任意の追加治療剤）は、当業者には公知であるとおり、静脈内投与、皮内投与、動脈内投与、腹腔内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、関節内投与、前立腺内投与、脾臓内投与、腎臓内投与、胸膜内投与、気管内投与、鼻腔内投与、硝子体内投与、腟内投与、直腸内投与、腫瘍内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、結膜下投与、小嚢内（intravesicularlly）投与、粘膜投与、心膜内投与、臍帯内投与、眼内投与、経口投与、外用、局所投与、吸入（例えばエアロゾル吸入）による投与、注射による投与、注入による投与、持続注入による投与、ターゲット細胞を直接浸す局所潅流による投与、カテーテルによる投与、洗浄（lavage）による投与、クリーム剤としての投与、脂質組成物（例えばリポソーム）としての投与、または他の方法もしくは前述の方法の任意の組み合わせによって投与することができる（例えば参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照されたい）。本発明の三量体型抗原結合分子などのポリペプチド分子の投与には、非経口投与、特に静脈内注射が最もよく使用される。
【０１５１】
非経口組成物には、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内または腹腔内注射による投与のために設計されたものが含まれる。注射のために、本発明の三量体型抗原結合分子を、水溶液に、好ましくは生理的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液に製剤化することができる。溶液は、懸濁剤、安定剤および/または分散剤などの製剤用薬剤を含有しうる。あるいは、三量体型抗原結合分子は、使用前に適切な媒体、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末状であってもよい。滅菌注射用溶液は、必要量の本発明の三量体型抗原結合分子を適当な溶媒に、必要に応じて以下に列挙するさまざまな他の成分と一緒に組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過で容易に達成することができる。一般に、分散系は、基礎分散媒および/または他の成分を含有する滅菌媒体にさまざまな滅菌活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液またはエマルションを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前もって滅菌濾過した液状媒質から活性成分と所望する任意の追加成分との粉末を与える、真空乾燥技法または凍結乾燥技法である。液状媒質は必要であれば適切に緩衝化されているべきであり、液状希釈剤は、注射に先だって、まず、十分な食塩水またはグルコースで等張にすべきである。組成物は、製造条件下および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染が安全なレベル、例えば0.5ng/mgタンパク質未満で、最小限に保たれるべきであることは理解されるであろう。適切な薬学的に許容される担体には次に挙げるものがあるが、それらに限定されるわけではない:緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満の）ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる化合物、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどを含有しうる。任意で、懸濁液は、高濃度な溶液の調製が可能になるように、適切な安定剤、または化合物の溶解度を増加させる作用物質も含有し���る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射用懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒または媒体として、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル（ethyl cleats）もしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。
【０１５２】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences（18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にあるものが挙げられる。特定の態様では、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはその組み合わせを組成物中に使用することによって、注射用組成物の持続的吸収を引き起こすことができる。
【０１５３】
前述の組成物に加えて、三量体型抗原結合分子をデポー調製物として製剤化することもできる。これらの長時間作用性製剤は、植え込みによって（例えば皮下または筋肉内に）投与するか、筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば三量体型抗原結合分子は、適切なポリマー材料または疎水性材料（例えば許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を使って製剤化するか、やや溶けにくい誘導体として、例えばやや溶けにくい塩として、製剤化することができる。
【０１５４】
本発明の三量体型抗原結合分子を含む薬学的組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。薬学的組成物は、薬学的に使用することができる調製物へのタンパク質の加工を容易にする1つまたは複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使って、従来の方法で製剤化することができる。適正な製剤化は、選んだ投与経路に依存する。
【０１５５】
三量体型抗原結合分子は、遊離酸型または遊離塩基型、中性型または塩型で、組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸または遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持している塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基を使って形成されるもの、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸で形成されるものなどがある。遊離カルボキシル基を使って形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基型よりも水性溶媒および他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向がある。
【０１５６】
治療方法および治療組成物
本明細書に提供する三量体型抗原結合分子はいずれも治療方法に使用することができる。本発明の三量体型抗原結合分子は免疫治療剤として、例えばがんの処置に使用することができる。
【０１５７】
治療方法において使用するために、本発明の三量体型抗原結合分子は、良質な医療慣行（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、用量決定され、投与される。これに関連して考慮すべき因子には、処置される特定障害、処置される特定哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用物質の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の因子が含まれる。
【０１５８】
一局面では、医薬として使用するための本発明の三量体型抗原結合分子が提供される。さらなる局面では、疾患の処置に使用するための本発明の三量体型抗原結合分子が提供される。一定の態様では、処置の方法に使用するための本発明の三量体型抗原結合分子が提供される。一態様において本発明は、処置を必要とする個体における疾患の処置に使用するための本明細書に記載の三量体型抗原結合分子を提供する。一定の態様において、本発明は、疾患を有する個体に治療有効量の三量体型抗原結合分子を投与する工程を含む、疾患を有する個体の処置方法において使用するための三量体型抗原結合分子を提供する。一定の態様では、処置される疾患は増殖性障害である。特定の態様では、疾患はがんである。一定の態様では、前記方法はさらに、治療有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば処置される疾患ががんであるなら抗がん剤などを、前記個体に投与する工程を含む。さらなる態様において、本発明は、ターゲット細胞、特に腫瘍細胞の溶解の誘導において使用するための、本明細書に記載の三量体型抗原結合分子を提供する。一定の態様において、本発明は、ターゲット細胞の溶解を誘導するために有効量の三量体型抗原結合分子を個体に投与する工程を含む、個体におけるターゲット細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法において使用するための、三量体型抗原結合分子を提供する。上記の態様のいずれにおいても「個体」は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【０１５９】
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本発明の三量体型抗原結合分子の使用を提供する。一態様において、医薬は、処置を必要とする個体における疾患を処置するための医薬である。さらなる態様において、医薬は、疾患を有する個体に治療有効量の医薬を投与する工程を含む、疾患を処置する方法において使用するための医薬である。一定の態様では、処置される疾患は増殖性障害である。特定の態様では、疾患はがんである。一態様では、前記方法はさらに、治療有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば処置される疾患ががんであるなら抗がん剤などを、前記個体に投与する工程を含む。さらなる態様において、医薬は、ターゲット細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための医薬である。さらなる態様において、医薬は、ターゲット細胞の溶解を誘導するために有効量の医薬を個体に投与する工程を含む、個体におけるターゲット細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法において使用するための医薬である。上記の態様のいずれにおいても「個体」は哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
【０１６０】
さらなる局面において、本発明は、疾患を処置するための方法を提供する。一態様において、本方法は、当該疾患を有する個体に治療有効量の本発明の三量体型抗原結合分子を投与する工程を含む。一態様では、本発明の三量体型抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物が、該個体に投与される。一定の態様では、処置される疾患は増殖性障害である。特定の態様では、疾患はがんである。一定の態様において、本方法はさらに、治療有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば処置される疾患ががんであるなら抗がん剤などを、前記個体に投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」は哺乳動物、好ましくはヒトでありうる。
【０１６１】
一定の態様では、処置される疾患は増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例として、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、直腸結腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、および腎がんが挙げられる。本発明の三量体型抗原結合分子を使って処置することができる他の細胞増殖障害には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系に位置する新生物などがあるが、それらに限定されるわけではない。前がん状態または前がん病変およびがん転移も含まれる。一定の態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、直腸結腸がん、乳がん、脳がん、頭頚部がんからなる群より選ばれる。多くの場合、三量体型抗原結合分子は治癒をもたらすわけではなく、部分的な利益を与えるに過ぎないであろうことは、当業者には容易にわかる。いくつかの態様では、何らかの利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると見なされる。したがっていくつかの態様では、生理学的変化をもたらす三量体型抗原結合分子の量を、「有効量」または「治療有効量」と見なす。処置を必要とする対象、患者、または個体は、典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０１６２】
いくつかの態様では、有効量の本発明の三量体型抗原結合分子は細胞に投与される。別の態様では、治療有効量の本発明の三量体型抗原結合分子は、疾患の処置のために、個体に投与される。
【０１６３】
疾患の防止または処置に関して、本発明の三量体型抗原結合分子（単独で使用する場合、または1つもしくは複数の他の追加治療剤と組み合わせて使用する場合）の適当な投薬量は、処置される疾患のタイプ、投与経路、患者の体重、三量体型抗原結合分子のタイプ、疾患の重症度および経過、三量体型抗原結合分子が防止を目的として投与されるのか治療を目的として投与されるのか、既往または併用治療介入、患者の病歴および三量体型抗原結合分子に対する応答、ならびに担当医の判断に依存する。いずれにせよ、投与を担当する実務者が、組成物中の活性成分濃度および個々の対象に適当な用量を決定することになる。限定するわけではないが、さまざまな時点にわたる単回投与または複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入など、さまざまな投薬スケジュールが、ここでは考えられる。
【０１６４】
三量体型抗原結合分子は、1回の処置で、または一連の処置で、患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、約1μg/kg〜15mg/kg（例えば0.1mg/kg〜10mg/kg）の三量体型抗原結合分子を、例えば1回または複数回の個別投与によるか、持続注入によるかを問わず、患者への投与の初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量の一つは、上述した因子に依存して、約1μg/kgから100mg/kg以上までの範囲に及ぶ可能性がある。状態に依存して数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで続けられる。三量体型抗原結合分子の例示的投薬量の一つは約0.005mg/kg〜約10mg/kgの範囲にある。他の非限定的な例では、用量は、1回の投与につき、約1マイクログラム/kg体重、約5マイクログラム/kg体重、約10マイクログラム/kg体重、約50マイクログラム/kg体重、約100マイクログラム/kg体重、約200マイクログラム/kg体重、約350マイクログラム/kg体重、約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約350ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重から、約1000mg/kg体重またはそれ以上まで、およびその中で導き出せる任意の範囲も含みうる。本明細書に列挙した数字から導き出せる範囲の非限定的な例では、上記の数字に基づいて、約5mg/kg体重〜約100mg/kg体重、約5マイクログラム/kg体重〜約500ミリグラム/kg体重などの範囲を投与することができる。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kgまたは10mg/kg（またはそれらの任意の組み合わせ）を1回または複数回、患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週または3週間ごとに（例えば、患者が三量体型抗原結合分子を約2回〜約20回、または例えば約6回、投与されることになるように）投与することができる。最初の高い負荷用量に続けて、それより低い用量で1回または複数回投与することができる。ただし、他の投薬レジメンも有用でありうる。この治療の進行は従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０１６５】
本発明の三量体型抗原結合分子は、一般に、意図した目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を処置または防止するために使用する場合、本発明の三量体型抗原結合分子またはその薬学的組成物は、治療有効量で投与または適用される。治療有効量の決定は、とりわけ本明細書に提供する詳細な開示に照らせば、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１６６】
全身性投与の場合、最初は治療有効量を細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイで見積もることができる。次に、細胞培養で決定されたIC50を含む循環濃度範囲が達成されるように、動物モデルにおいて、用量を策定することができる。そのような情報を使って、ヒトにおける有用な用量を、より正確に決定することができる。
【０１６７】
初回投薬量も、当技術分野において周知の技法を使って、インビボデータ、例えば動物モデルから見積もることができる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化することができる。
【０１６８】
投薬量と投薬間隔は、治療効果を維持するのに足りる三量体型抗原結合分子の血漿中レベルが得られるように、個別に調節することができる。注射による投与の場合、通常の患者の投薬量は約0.1〜50mg/kg/日、典型的には約0.5〜1mg/kg/日の範囲である。治療的に有効な血漿中レベルは、毎日複数回の投薬を行うことによって達成することができる。血漿中のレベルは、例えばHPLCによって測定することができる。
【０１６９】
局所投与または選択的取り込みの場合、三量体型抗原結合分子の有効局所濃度は血漿中濃度と関係しない。当業者は、治療的に有効な局所投薬量を、過度の実験を行わずに最適化することができる。
【０１７０】
本明細書に記載する三量体型抗原結合分子の治療有効用量は、一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく、治療上の利益を与える。三量体型抗原結合分子の毒性と治療効力は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手法で決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物研究を使って、LD50（集団の50％にとって致死的な用量）とED50（集団の50％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療係数であり、これは比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療係数を呈する三量体型抗原結合分子が好ましい。一態様では、本発明の三量体型抗原結合分子は高い治療係数を呈する。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータは、ヒトにおける使用に適した投薬量の範囲を策定する際に使用することができる。投薬量は、ED50を含み毒性がほとんどまたは全くない循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、例えば使用する剤形、利用する投与経路、対象の状態などといったさまざまな因子に依存して、この範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路および投薬量は、個々の医師が、患者の状態を考慮して選びうる（例えば参照によりそのまま本明細書に組み入れられるFingl et al, 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1を参照されたい）。
【０１７１】
毒性や臓器機能障害などのために投与を終結、中断、または調節する方法および時期は、本発明の三量体型抗原結合分子で処置される患者の担当医にはわかるであろう。逆に、臨床的応答が十分でなかった場合は、（毒性を防ぎつつ）処置を高レベル側に調節することも、担当医にはわかるであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、処置される状態の重症度、投与経路などによって変動する。状態の重症度は、例えば、標準的予後評価方法によって、部分的に評価することができる。さらに、用量と、おそらく投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重、および応答に応じて変動する。
【０１７２】
他の作用物質および処置
本発明の三量体型抗原結合分子は、治療において、1つまたは複数の他の作用物質と組み合わせて投与することができる。例えば本発明の三量体型抗原結合分子は少なくとも1つの追加治療剤と同時投与することができる。用語「治療剤」は、症状または疾患の処置を必要とする個体に、その症状または疾患を処置するために投与される、任意の薬剤を包含する。そのような追加治療剤は、処置される特定適応症に適した任意の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含みうる。一定の態様では、追加治療剤は、免疫調節剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着の阻害薬、細胞毒性剤、細胞アポトーシスの活性化薬、またはアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を増加させる薬剤である。特定の態様では、追加治療剤は、抗がん剤、例えば微小管破壊薬、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害薬、DNAインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法薬、キナーゼ阻害薬、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化薬、または抗血管新生剤である。そのような他の薬剤は、意図した目的に有効な量で組み合わされて、適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用する三量体型抗原結合分子の量、障害または処置のタイプ、および上述した他の因子に依存する。三量体型抗原結合分子は一般に本明細書に記載したものと同じ投薬量および投与経路で使用されるか、本明細書に記載した投薬量の約1〜99％の投薬量で使用されるか、または経験的/臨床的に適当であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。
【０１７３】
上で言及したような併用療法には、併用投与（2つ以上の治療剤が同じ組成物または別々の組成物に含まれている）と、個別投与（この場合は、本発明の三量体型抗原結合分子の投与を、追加治療剤および/または補助剤の投与に先だって、同時に、かつ/またはその後に行うことができる）が包含される。本発明の三量体型抗原結合分子は放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０１７４】
製造品
本発明の別の局面では、上述の障害の処置、防止および/または診断に有用な材料が入っている製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどがある。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成されうる。容器は、組成物を単独で、または当該状態を処置、防止および/または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は本発明の三量体型抗原結合分子である。ラベルまたは添付文書は、その組成物が、選ばれた状態の処置に使用されることを示す。さらにまた、製造品は、（a）本発明の三量体型抗原結合分子を含む組成物が入っている第1容器と、（b）さらなる細胞毒性剤または他の治療剤を含む組成物が入っている第2容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造品は、さらに、特定の状態を処置するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えて、またはこれに加えて、製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液を含む第2（または第3）の容器を含みうる。さらに、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジも含みうる。
【実施例】
【０１７５】
以下に本発明の方法および組成物の実施例を挙げる。上記の一般的説明を考慮すれば、他にもさまざまな態様を実施することができると理解される。
【０１７６】
一般的方法
組換えDNA技法
DNAの操作には、Sambrook et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的方法を使用した。分子生物学用試薬は製造者の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A. et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242に掲載されている。
【０１７７】
DNA配列決定
DNA配列はジデオキシ配列決定法によって決定した。
【０１７８】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、必要であれば、適当なテンプレートを使ってPCRによって作製するか、またはGeneart AG（ドイツ国レーゲンスブルク）により、合成オリゴヌクレオチドとPCR産物とから自動遺伝子合成法で合成された。正確な遺伝子配列を入手できない場合は、最も近いホモログからの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適当な組織に由来するRNAからRT-PCRによって遺伝子を単離した。唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた遺伝子セグメントを標準的なクローニング/配列決定用ベクターにクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光法で濃度を決定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列をDNA配列決定によって確認した。各発現ベクターへのサブクローニングが可能になるように、適切な制限部位を持つ遺伝子セグメントを設計した。全てのコンストラクトは、真核細胞においてタンパク質を分泌の対象にするリーダーペプチドをコードする5'末端DNA配列を持つように設計した。
【０１７９】
実施例1: CMP由来の三量体化ドメインを含む三量体型単一特異性抗原結合分子の産生および精製
特異的ターゲット（とりわけTNFRスーパーファミリーのメンバー）に対するFab分子の結合を増強し、それによってこれらの受容体の架橋を増強するために、ヒトデス（death）受容体5（DR5、TRAIL-R2）をターゲットとする三量体化Fab分子を作製した。標準的組換えDNA技術によって、Fab遺伝子（VHCH1）を、ヒトCMPに由来する短い三量体化ドメイン（Uniprotアクセッション:P21941;残基454〜496、SEQ ID NO:2）に融合した。458位と460位に鎖間ジスルフィド架橋を形成するシステイン残基を、残基467〜495を含むコイルドコイルドメインと一緒に使用した。
【０１８０】
タンパク質の検出が容易になるように、このドメインの下流に短いFLAGタグ配列を付加した。Fab分子を三量体化ドメインと接続するために、共通の(Gly4Ser)2リンカーを使用した。この設計の概要を図1a）に示す。
【０１８１】
VHCH1-CMP-FLAG配列（および対応するFabのVLCL配列）は、哺乳動物細胞における発現のために、組換えキメラMPSVプロモーターに機能的に融合されている。使用した発現ベクターは、エプスタイン・バー大核抗原（Epstein Barr large nuclear antigen）（EBNA）を与える細胞におけるプラスミドの安定な維持のために、oriP配列も含有している。加えて、合成ポリAシグナル配列がCDSの3'末端に位置している。
【０１８２】
抗体発現ベクターは全て、Sambrook, J. et al, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の標準的組換えDNA技術を使って作製した。分子生物学用試薬は製造者の推奨に従って使用した。遺伝子または遺伝子フラグメントはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅するか、Geneart AG（ドイツ国レーゲンスブルク）において自動遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドから作製された。PCR増幅したDNAフラグメントまたはサブクローニングしたDNAフラグメントはDNA配列決定（Synergene GmbH、スイス）によって確認した。標準的なMaxiprepキット（Qiagen）を使ってトランスフェクション用のプラスミドDNAを調製するために、プラスミドDNAを適切な大腸菌宿主株に形質転換し、増幅した。三量体型分子を産生するために、ポリエチレンイミン（polyethlenimine）（PEI）に基づく標準的な方法を使って、個々の遺伝子をコードするプラスミドをHEK293 EBNA細胞にトランスフェクトした。使用した2つの発現ベクターのプラスミド比は1:1であった。トランスフェクト細胞を7日間培養してから、精製のために上清を収穫した。500ml振とうフラスコにおける産生のために、4億個のHEK293 EBNA細胞を、トランスフェクションの24時間前に接種した。トランスフェクションのために、細胞を210×gで5分間遠心分離し、上清を、予め温めておいたCD CHO培地で置き換えた。発現ベクターを20mlのCD CHO培地中で混合して、DNAの最終量を200μgにした。540μlのPEIを添加した後、その溶液を15秒間ボルテックスし、室温で10分間インキュベートした。次に、細胞をDNA/PEI溶液と混合し、500ml振とうフラスコに移し、5％CO2雰囲気の湿潤インキュベーター中、37℃で3時間インキュベートした。このインキュベーション時間後に、160mlのF17培地を加え、細胞を24時間培養した。産生培地に5μMキフネシンを補足した。トランスフェクションの1日後に1mMバルプロ酸および7％フィード1（Feed 1）（Lonza）を加えた。7日間の培養後に、精製のために、210gで15分間の遠心分離によって、上清を収集した。その溶液を滅菌濾過し（0.22μmフィルタ）、アジ化ナトリウムを最終濃度が0.01％w/vになるように補足し、4℃に保った。
【０１８３】
分泌タンパク質をまず、ヒトIgG抗体のCH1ドメインによるアフィニティークロマトグラフィーで、細胞培養上清から精製した。第2のクロマトグラフィー工程はサイズ排除クロマトグラフィーとした。アフィニティークロマトグラフィーのために、CaptureSelect IgG-CH1マトリックスを充填したカラム（カラム体積＝1ml; BAC、オランダ）に上清をローディングし、5mlの50mMトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン（TRIS）、100mMグリシン、150mM塩化ナトリウム、pH8.0で平衡化した。少なくとも10カラム体積の50mM TRIS、100mMグリシン、150mM塩化ナトリウム、pH8.0で洗浄することによって、未結合のタンパク質を除去した。50mM TRIS、100mMグリシン、150mM塩化ナトリウム、pH8.0からpH2.0への20カラム体積にわたる直線的pH勾配で、ターゲットタンパク質を溶出させた。次にカラムを10カラム体積の50mM TRIS、100mMグリシン、150mM塩化ナトリウム、pH2.0で洗浄した。
【０１８４】
1/40（v/v）の2M Tris、pH8.0を加えることによってタンパク質溶液を中和してから、濃縮工程を行った。最後に、タンパク質を濾過してから、pH6.0の20mMヒスチジン、140mM塩化ナトリウム、0.01％（v/v）Tween-20溶液で平衡化したHiLoad Superdex 200カラム（GE Healthcare）にローディングした。
【０１８５】
実施例2: CMP由来の三量体化ドメインを含む三量体型単一特異性抗原結合分子の特徴づけ
精製huCMP融合タンパク質のタンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用し、280nmにおける光学密度（OD）を測定することによって決定した。
【０１８６】
huCMP含有コンストラクトの純度と分子量は、還元剤（5mM 1,4-ジチオスレイトール（dithiotreitol）、DTT）の存在下および非存在下でSDS-PAGEを行い、クマシー（InvitrogenのSimpleBlue（商標）SafeStain）で染色することによって分析した（図2）。NuPAGE（登録商標）プレキャストゲルシステム（Invitrogen、米国）を製造者の説明書に従って使用した（4-12％Tris-アセテートゲルまたは4-12％Bis-Tris）。huCMP含有コンストラクトの純度と分子量は、LabChipGXII（Caliper）を使って、還元剤の存在下および非存在下でのCE-SDS（Invitrogen）でも分析した（図3）。
【０１８７】
試料の凝集物含有量は、25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-アルギニン一塩酸塩、0.02％（w/v）NaN3、pH6.7ランニング緩衝液中、25℃で平衡化したTSKgel G3000 SW XL分析用サイズ排除カラム（Tosoh）を使って分析した。
【０１８８】
TOF 6441質量分析計（Agilent）に接続したAgilent HPLC 1200を使用するLC-MSにより、非還元条件下および還元条件下で、huCMP含有コンストラクトの分子量を決定した。還元条件下で分析する場合は、試料を、10μlの8Mグアニジン-HClおよび4Mグアニジン-HClに希釈した10μlの0.5mM TCEP中、37℃で30分間インキュベートした。非還元試料はそのままLC-MS分析に使用した。クロマトグラフィー分離は、Macherey Nagelポリスチレン（Polysterene）カラム、RP1000-8（粒径8μm、4.6×250mm;カタログ番号719510）で、表1に示すプログラムを使って行った。溶離液Aは、水中の5％アセトニトリルおよび0.05％（v/v）ギ酸とし、溶離液Bは95％アセトニトリル、5％水および0.05％ギ酸とした。分離は流量を1ml/分にして40℃で行い、7μg（15μl）の試料を注入した。
【０１８９】
質量分析計の塩汚染を防ぐために、最初の4分間は溶出物を廃棄物に送る。ESI源は、乾燥ガス流12リットル/分、温度350℃、およびネブライザ圧60psiで作動させていた。350Vのフラグメンター電圧および質量範囲700〜3200m/zを使用し、正イオンモードで、MSスペクトルを取得する。計器ソフトウェアによって4分から17分までMSデータを取得する。
【０１９０】
（表１）質量分析法による分析用に個々の化合物を分離するためのHPLCクロマトグラフィーにおける溶媒の混合物
0006618463.tif 000003
溶媒Aは水中の5％アセトニトリルおよび0.05％(v/v）ギ酸であり、溶媒Bは95％アセトニトリル、5％水および0.05％ギ酸である。
【０１９１】
使用した分析方法の全てで、三量体化分子の均一な調製が確認された。表2に、huCMP含有コンストラクトの純度、最終モノマー含有量および質量を示す。表3に、二重特異性huCMP含有コンストラクトと比較した収量および熱安定性を示す。
【０１９２】
（表２）単一特異性huCMP含有コンストラクトの生化学的分析
0006618463.tif 000004
精製分子の三量体含有量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）またはSDSゲルにおけるキャピラリー電気泳動（CE SDS）によって決定した。個々の構成要素のクロマトグラフィー分離後に、質量分析（LC/MS）によって分子の質量を決定した。
【０１９３】
実施例3:三量体型単一特異性抗原結合分子の結合
三量体化抗DR5 Fabの結合能の評価は、細胞に基づくFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ（TagLite）を使って行った。huDR5発現細胞を調製するために、Lipofectamineを使って、付着性HEK293 EBNA細胞に、PDGFR膜貫通ドメインを含有するhuDR5-SNAPコンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの1日前に4×106細胞をT75フラスコに接種し、湿潤インキュベーター中、5％CO2雰囲気下、37℃で一晩成長させた。トランスフェクションのために、2μgのプラスミドDNAを30μlのLipofectamine 2000（Invitrogen、カタログ番号11668-019）および4mlのOptiMEM培地（Gibco）と混合し、室温で20分間インキュベートした。細胞をD-PBS（Gibco）で1回洗浄し、トランスフェクション混合物を、6mlの培養培地（Glutamax、10％FCSおよびNEAAを含有するDMEM）と一緒に細胞に加えた。5℃ CO2雰囲気の湿潤インキュベーター中、37℃で20時間のインキュベーション後に、インキュベーターにおいて、細胞を、1×TagLite緩衝液（Cisbio）中、100nM Lumi4-Tb（Cisbio）と共に、37℃で1時間インキュベートすることにより、発現した抗原をFRETドナーで標識した。TagLite緩衝液による4回の洗浄工程後に、細胞解離緩衝液を使って細胞を剥離させ、TagLite緩衝液中で洗浄し、384ウェルプレート中で10000細胞/ウェルからのTbの発光を、Victor3蛍光リーダーにおいて620nmで測定した。励起波長は343nmとした。細胞を小分けし、凍結培地（10％DMSOを補足した培養培地）に入れて-80℃で保存した。アッセイを行うには、細胞を融解し、TagLite緩衝液で1回洗浄し、適当な細胞数になるようにTagLite緩衝液に再懸濁し、そのままピペットでアッセイウェルに入れる必要がある。
【０１９４】
競合アッセイを行うために、d2ラベリングキット（Cisbio）を製造者のマニュアルに従って使用することにより、DR5バインダー（IgGとして）をFRETアクセプター（d2）で標識した。
【０１９５】
競合アッセイは、最終濃度25nMのd2標識抗DR5を1ウェルあたり1000個のDR5-Tb発現HEK293 EBNA細胞に加え、次に、ウェル中での最終濃度が750nMから5.8nMまでの非標識の抗DR5または抗DR5三量体化Fabを1:2の希釈度で加えることにより、384ウェルフォーマットで行った。細胞のみをブランク対照とした。全ての試料を二つ一組にして分析した。プレートを室温で2時間インキュベートし、620nmにおけるTbの発光シグナルおよび665nmにおけるd2の発光シグナルを、Tecan Infinite 200（Tecan）で測定した。各ウェルからの665nmシグナルを同じウェルからの620nmシグナルに対して標準化し、ブランク対照を差し引いた。
【０１９６】
競合アッセイは、三量体化Fabが、細胞上のhuDR5への標識IgGの結合に関して、非標識IgGよりはるかに強く競合することを示していることから、機能的な三量体型のコンストラクトが確認される（図4）。
【０１９７】
実施例4:コラーゲンXV由来の三量体化ドメインを含む三量体型単一特異性抗原結合分子の産生および精製
CMPドメインによる三量体化に取り組む実験と並行して、本発明者らは、コラーゲンXV三量体化ドメイン（Cuesta et al; 2012, mAbs, Volume 4, Issue 2, 226-232）を使ったFabの三量体化を試験した。設計はCMPの場合と本質的に同じとし、N末端にFabがあって、その次が短いGly-Serリンカーであり、その後に三量体化ドメインがあって、その次にFLAGタグが続いている。発現は上述のようにHEK293-EBNA細胞において行った。残念なことに、収量は極めて低く、生成物は主として凝集物からなった（データ未掲載）。
【０１９８】
実施例5: DR5の標的架橋（targeted cross-linking）のための二重特異性六価DR5-FAP分子の産生および精製
第2の三量体型ターゲティング部分によるDR5のハイパー架橋の効果を評価するために、FAP（線維芽細胞活性化タンパク質）特異的バインダーを三量体化DR5 Fab（5E11）コンストラクトのC末端に融合した。この設計の概要を図1b）に示す。三量体型DR5 VHCH1鎖に(G4S)4リンカーを介して融合されたCrossFab（VHCL）として、またはジスルフィド安定化scFv（H44/L100）として、同じFAP抗体（28H1）を使用することにより、2つの異なる分子を作製した。これらの分子をHEK293 EBNA細胞中で一過性に産生し（400ml規模、PEIに基づくトランスフェクション）、次のように精製した。Capture Select IgG CH1カラム後に、溶出した抗体をサイズ排除クロマトグラフィー（Superose 6 10/300 GL）でさらに精製した。CMP三量体化ドメインのC末端に融合された三量体型FAP（28H1）CrossFabを含む対照分子も、HEK293 EBNA細胞中で産生した。全ての分子を、生成物の収量、品質および活性について、実施例2で述べたように特徴づけた。結果を表3に示す。
【０１９９】
（表３）単一特異性三量体型分子または二重特異性三量体型分子の分析
0006618463.tif 000005
【０２００】
分子の熱安定性を動的光散乱（DLS）実験で分析したところ、単一特異性分子と比較して二重特異性分子の安定性にわずかな減少が示された。簡単に述べると、タンパク質濃度が1mg/mlである30μgの濾過済みタンパク質試料を、二つ一組にしてDynaproプレートリーダー（Wyatt Technology Corporation;米国）に適用する。半径および全散乱強度を収集しながら、温度を25℃から75℃まで0.05℃/分の速度で上昇させる。
【０２０１】
実施例6:単一特異性および二重特異性三量体型抗原結合分子の細胞に基づくターゲット結合
さまざまな分子の細胞に基づくターゲット結合を評価するために、SNAPタグと細胞外ディスプレイのためのPDGFR膜貫通領域（TM）とを持つDR5またはFAPのどちらかを発現させるFRETアッセイ（TagLite、CisBio）を使用した。結合は、FRETシグナルの低減を引き起こす標識抗DR5 IgGまたは標識抗FAP IgGとの競合として決定した。DR5特異的二価IgG抗体（「5E11 IgG」）と、DR5に特異的な2つの結合部位を持つIgG抗体であってFAPに特異的な2つのクロスオーバーFabフラグメントがC末端に融合されているもの（5E11_28H1（2＋2））を、対照分子とした。表4に要約するように、5E11 IgGと5E11_28H1二重特異性分子（2＋2フォーマット）は、予想どおり、類似する競合挙動を示す。一方、三量体型5E11 Fabと、scFvを含有する二重特異性DR5-FAP三量体も、非常によく似た競合結果を示すが、それがはるかに低い抗体濃度で既に起こっていることから、これらの分子は、より高いアビディティーでDR5に結合することが示される。これに対して、二重特異性三量体型Crossfab分子は、これら2つのグループのおよそ中間にある競合挙動を示すことから、二価DR5結合の分子よりは高いアビディティーで結合するが、前記三量体型コンストラクトよりは低いアビディティーで結合することが示される。
【０２０２】
（表４）DR5結合に関するEC50値
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【０２０３】
二重特異性三量体化DR5-FAP分子の機能的活性を評価するために、MDA-MB-231乳がん細胞のアポトーシスの誘導を、FAP発現線維芽細胞株GM05389を使った共培養アッセイで決定した。ターゲット細胞のアポトーシスはデス受容体DR5の架橋によって誘導され、アゴニスト性DR5抗体によって達成することができる。アポトーシスの程度は、DR5のハイパー架橋に直接依存するので、DR5と第2の細胞上に発現した抗原（この場合は線維芽細胞株）へのそれぞれ三価型での結合は、アポトーシス誘導を著しく増加させるであろうと考えた。図5に、アポトーシス活性に関するDR5-FAP二重特異性二量体型分子とDR5-FAP二重特異性三量体型分子との比較を要約する。対照分子として、対応する単一特異性三量体型DR5およびFAPバインダーを使用した。線維芽細胞株GM05389を104細胞/ウェルの密度で接種し、一晩インキュベートしてから、二重特異性コンストラクト（および対照分子）をさまざまな濃度で加えた。コンストラクトをFAPに結合させるためにさらに10分間インキュベートしてから、104個のMDA-MB-231細胞を加え、24時間インキュベートした後、細胞死検出ELISAアッセイを使ってアポトーシスを決定した。FAP発現線維芽細胞の存在下または非存在下でコンストラクトをアッセイした。2＋2フォーマットのDR5-FA二重特異性分子は、広い濃度範囲（7.0〜0.07nM）にわたって、線維芽細胞の存在下でのみ、ほどほどのアポトーシス誘導活性を示し、0.007nMでは活性が著しく低下した。これに対し、高濃度では、二重特異性三量体型分子は（DR5三量体に融合されたCrossFabまたはscFvのどちらの場合も）、FAPを発現するGM05389の非存在下でも既に明確なアポトーシス活性を呈した。線維芽細胞によるさらなる架橋は、アポトーシス誘導を著しく増加させ、最も低い濃度（0.007nM）でさえ、DR5とFAPに結合する三量体化コンストラクトは極めて高い活性を示した。対照分子（三量体型5E11および三量体型28H1）はそれぞれ、低いアポトーシス活性しか示さないか、アポトーシス活性がなかった。
【０２０４】
実施例7:診断設定おける三量体型抗原結合分子の使用
ジゴキシゲニンに結合するFabフラグメント（Metz et al; 2011, Proc Natl Acad Sci U S A. 108(20):8194-8199に記載されている）をCMP三量体化ドメインのN末端に融合することによって、別の三量体化分子を作製した。そのC末端には、腫瘍ターゲティング用に、CEA（がん胎児性抗原）に特異的に結合する能力を有するscFv分子を使用した。その結果得られた分子はSEQ ID NO:19およびSEQ ID NO:20を持っていた。最終分子は2本の鎖だけからなり、実施例6に記載したCrossMab技術の導入および最適化は必要ない。この分子を上述のようにクローニングし、発現させ、精製した。表5に精製後の分析用SECの結果を示す。＞98％の物質が単量体画分にあり、何らかのオリゴマー種は＜2％でしかないことが明確にわかる。これは、Fab-CMP-scFvフォーマットの安定な6価コンストラクトを作出するためにも、CMPドメインを使用できることを示している。
【０２０５】
（表５）抗ジゴキシゲニン（Fab-HC）-CMP-抗CEA（scFv）ジゴキシゲニンの分析用SEC
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【０２０６】
以下の配列は、本発明の抗原結合分子に含まれるアミノ酸配列である。
【０２０７】
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【０２０８】
以下の配列は、本発明の抗原結合分子に含まれるアミノ酸配列をコードする本発明のポリヌクレオチドである。
【０２０９】
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【０２１０】
上記の発明を、明快に理解されるように、例示と実施例によって多少詳しく説明したが、これらの説明と実施例が本発明の範囲を限定していると解釈してはならない。本明細書において言及した全ての特許文献および科学文献の開示は、明示的に、参照によりそのまま本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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