(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する第１の被覆層と、該第１の被覆層の少なくとも一部を被覆する第２の被覆層と、を備え、
前記多孔質ポリマ粒子が、重合性二重結合を２個有するモノマに由来する構造単位を有するポリマを含み、
前記第１の被覆層が、重合性二重結合を３〜１５個有するモノマに由来する構造単位を有するポリマを含み、
前記第２の被覆層が、水酸基を有する高分子を含む、分離材。
【請求項２】
５％圧縮変形弾性率が３００〜１５００ＭＰａである、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
空隙率が４０％以上である、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記多孔質ポリマ粒子の５％圧縮変形弾性率が１００〜３００ＭＰａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
前記多孔質ポリマ粒子が、ジビニルベンゼンに由来する構造単位を有するポリマを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
前記多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍであり、粒径の変動係数が３〜１５％である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
前記多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、３０〜４００ｍｇの前記第２の被覆層を備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項９】
カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が１５００ｃｍ／ｈ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離材及びカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、タンパク質に代表される生体高分子を分離精製する場合、一般的には多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体、親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体等が用いられている。多孔質型の合成高分子を母体とするイオン交換体の場合、塩濃度による体積変化が小さいため、カラムに充填してクロマトグラフィーで用いると、通液時の耐圧性に優れる傾向にある。しかし、このイオン交換体を、タンパク質等の分離に用いると、疎水的相互作用に基づく不可逆吸着等の非特異吸着が起きるため、ピークの非対称化が発生する、又は、該疎水的相互作用でイオン交換体に吸着されたタンパク質が吸着されたまま回収できないという問題点がある。
【０００３】
一方、デキストラン、アガロース等の多糖に代表される親水性天然高分子の架橋ゲルを母体とするイオン交換体の場合、タンパク質の非特異吸着がほとんどないという利点がある。ところが、このイオン交換体は、水溶液中で著しく膨潤し、溶液のイオン強度による体積変化、及び、遊離酸形と負荷形との体積変化が大きく、機械的強度も十分ではないという欠点を有する。特に、架橋ゲルをクロマトグラフィーで使用する場合、通液時の圧力損失が大きく、通液によりゲルが圧密化するといった欠点がある。
【０００４】
特許文献１には、粒子の表面積の向上と、高流速での液体の移動との両立が可能なクロマトグラフィーカラム用担体に使用される多孔質粒子及びその製造方法が開示され、超音波処理により粒子の表面に存在する被膜を除去することで比表面積が大きな多孔質粒子を作製することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２４４０６７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の分離材では、タンパク質吸着量と耐圧性とを両立することが難しく、タンパク質吸着量を向上するために分離材の空隙率を高くすると、分離材の弾性率が低くなり、耐圧性が低下する傾向にある。そのため、分離材には、タンパク質吸着量を向上し、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れることが求められている。
【０００７】
本発明は、タンパク質等の生体高分子の分離に対して優れた分離能を有し、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材、及び、該分離材を用いたカラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、下記［１］〜［９］に記載の分離材を提供する。
［１］  多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する第１の被覆層と、該第１の被覆層の少なくとも一部を被覆する第２の被覆層と、を備え、多孔質ポリマ粒子が、重合性二重結合を２個有するモノマに由来する構造単位を有するポリマを含み、第１の被覆層が、重合性二重結合を３〜１５個有するモノマに由来する構造単位を有するポリマを含み、第２の被覆層が、水酸基を有する高分子を含む、分離材。
［２］  ５％圧縮変形弾性率が３００〜１５００ＭＰａである、［１］に記載の分離材。
［３］  空隙率が４０％以上である、［１］又は［２］に記載の分離材。
［４］  多孔質ポリマ粒子の５％圧縮変形弾性率が１００〜３００ＭＰａである、［１］〜［３］のいずれかに記載の分離材。
［５］  比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、［１］〜［４］のいずれかに記載の分離材。
［６］  多孔質ポリマ粒子が、ジビニルベンゼンに由来する構造単位を有するポリマを含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の分離材。
［７］  多孔質ポリマ粒子の平均粒径が１０〜３００μｍであり、粒径の変動係数が３〜１５％である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分離材。
［８］  多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり、３０〜４００ｍｇの第２の被覆層を備える、［１］〜［７］のいずれかに記載の分離材。
［９］  カラムに充填した場合、カラム圧が０．３ＭＰａのときに通液速度が１５００ｃｍ／ｈ以上である、［１］〜［８］のいずれかに記載の分離材。
［１０］［１］〜［９］のいずれかに記載の分離材を備えるカラム。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、タンパク質等の生体高分子の分離に対して優れた分離能を有し、カラムとして用いたときの通液性等のカラム特性に優れる分離材、及び、該分離材を用いたカラムを提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の好適な実施形態について説明をするが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではない。
【００１１】
＜分離材＞
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子と、該多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する第１の被覆層と、該第１の被覆層の少なくとも一部を被覆する第２の被覆層と、を備え、多孔質ポリマ粒子が、重合性二重結合を２個有するモノマに由来する構造単位を有するポリマを含み、第１の被覆層が、重合性二重結合を３〜１５個有するモノマに由来する構造単位を有するポリマを含み、第２の被覆層が、水酸基を有する高分子を含むものである。なお、本明細書中、「多孔質ポリマ粒子の表面」とは、多孔質ポリマ粒子の外側の表面のみでなく、多孔質ポリマ粒子の内部における細孔の表面を含むものとする。また、本明細書中、（メタ）アクリル酸とはアクリル酸又はメタクリル酸を意味し、（メタ）アクリレート等の他の類似の表現においても同様である。
【００１２】
（多孔質ポリマ粒子）
本実施形態に係る多孔質ポリマ粒子は、多孔質化剤の存在下でモノマを硬化させた粒子であり、従来の懸濁重合、乳化重合等により合成することができる。多孔質ポリマ粒子は、重合性二重結合を２個有するモノマ（以下、「２官能性モノマ」という。）に由来する構造単位を有するポリマを含んでいる。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、２官能性モノマを含有するモノマを重合させて得られるポリマを含んでいる。
【００１３】
２官能性モノマとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、ジビニルフェナントレン等のジビニル化合物；（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡ系ジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリレート；ジアリルフタレート及びその異性体が挙げられる。これらの２官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも、弾性率の観点より、モノマがジビニルベンゼンを含有することが好ましい。すなわち、多孔質ポリマ粒子は、ジビニルベンゼンに由来する構造単位を有するポリマを含むことが好ましい。
【００１４】
上記多孔質ポリマ粒子は、モノマ単位としてジビニルベンゼンを含む場合、ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含むことが好ましく、６０質量％以上含むことがより好ましく、７０質量％以上含むことが更に好ましい。ジビニルベンゼンをモノマ全質量基準で５０質量％以上含むことにより、耐アルカリ性及び耐圧性に優れる傾向にある。
【００１５】
多孔質ポリマ粒子を作製する際には、２官能性モノマと共に、単官能性モノマ及び／又は３官能性以上の多官能性モノマを併用してもよい。
【００１６】
単官能性モノマとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体；アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル；Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物；フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等の含フッ素化モノマ；ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンなどが挙げられる。これらの単官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。上記の中でも耐酸性及び耐アルカリ性に優れるという観点から、スチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００１７】
多官能性モノマとしては、例えば、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート等の３官能以上の（メタ）アクリレート；トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体が挙げられる。
【００１８】
多孔質化剤としては、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する有機溶媒である脂肪族又は芳香族の炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等が挙げられる。多孔質化剤として、具体的には、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられる。これらの多孔質化剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１９】
上記多孔質化剤は、モノマ全質量に対して０〜２００質量％使用できる。多孔質化剤の量によって、多孔質ポリマ粒子の空隙率をコントロールできる。さらに、多孔質化剤の種類によって、多孔質ポリマ粒子の細孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２０】
溶媒として使用する水を多孔質化剤とすることもできる。水を多孔質化剤とする場合は、モノマに油溶性界面活性剤を溶解させ、水を吸収することによって、粒子を多孔質化することが可能である。
【００２１】
多孔質化に使用される油溶性界面活性剤としては、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレテート、ソルビタンモノミリステート又はヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル、例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１（炭素数１８個、二重結合数１個）脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレート又はヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコール又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；及びこれらの混合物が挙げられる。
【００２２】
これらのうち、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）２０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（スパン、登録商標）８０、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（純度が好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、更に好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリル基、ミリストイル基等）エーテル、又は、これらの混合物が好ましい。
【００２３】
これらの油溶性界面活性剤は、モノマ全質量に対して５〜８０質量％の範囲で用いることが好ましい。油溶性界面活性剤の含有量が５質量％以上であると、水滴の安定性が充分となることから、大きな単一孔を形成し易くなる。また、油溶性界面活性剤の含有量が８０質量％以下であると、重合後に多孔質ポリマ粒子が形状をより保持し易くなる。
【００２４】
重合反応に用いられる水性媒体としては、水、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体等が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００２５】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩及びポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。
【００２６】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００２７】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００２８】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００２９】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、モノマの重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３０】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤は、モノマ１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲で使用することができる。
【００３１】
重合温度は、モノマ及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３２】
多孔質ポリマ粒子の合成において、粒子の分散安定性を向上させるために、高分子分散安定剤を添加してもよい。
【００３３】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の添加量は、モノマ１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３４】
モノマが単独で重合することを抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００３５】
多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、好ましくは３００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマ粒子の平均粒径は、通液性の向上の観点から、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。
【００３６】
多孔質ポリマ粒子の粒径の変動係数（Ｃ．Ｖ．）は、通液性の向上の観点から、３〜１５％であることが好ましく、５〜１５％であることがより好ましく、５〜１０％であることが更に好ましい。Ｃ．Ｖ．を低減する方法としては、マイクロプロセスサーバー（株式会社日立製作所製）等の乳化装置により単分散化することが挙げられる。
【００３７】
多孔質ポリマ粒子又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の多孔質ポリマ粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス株式会社製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．を測定する。
【００３８】
多孔質ポリマ粒子が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％圧縮変形弾性率又は５％Ｋ値ともいう）は、以下のようにして算出することができる。
微小圧縮試験機（Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いて、室温（２５℃）条件にて荷重負荷速度１ｍＮ／秒で、四角柱の平滑な端面（５０μｍ×５０μｍ）により粒子を５０ｍＮまで圧縮したときの荷重及び圧縮変位を測定する。得られた測定値から、粒子が５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）を下記式により求めることができる。また、上記測定中の変位量が最も大きく変化する点の荷重を破壊強度（ｍＮ）とする。
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２１／２）・Ｆ・Ｓ−３／２・Ｒ−１／２
５％Ｋ値（ＭＰａ）＝（３／２１／２）・Ｆ・Ｓ−３／２・Ｒ−１／２
Ｆ：多孔質ポリマ粒子が５％圧縮変形したときの荷重（ｍＮ）
Ｓ：多孔質ポリマ粒子が５％圧縮変形したときの圧縮変位（μｍ）
Ｒ：多孔質ポリマ粒子の半径（μｍ）
【００３９】
多孔質ポリマ粒子の５％圧縮変形弾性率（５％Ｋ値）は、１００〜３００ＭＰａであることが好ましい。
【００４０】
圧縮弾性率が小さすぎると、多孔質ポリマ粒子の柔軟性が高くなり、カラム内で液を流した際に変形し易くなり、カラム圧が高くなり易くなる。
【００４１】
多孔質ポリマ粒子の細孔容積は、多孔質ポリマ粒子の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。多孔質ポリマ粒子は、細孔径が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。多孔質ポリマ粒子の細孔径として、より好ましくは、０．２μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径が０．５μｍ未満であると、比表面積が充分なものになる。これらは上述の多孔質化剤により調整可能である。
【００４２】
多孔質ポリマ粒子の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。
【００４３】
（被覆層）
本実施形態に係る被覆層は、上記多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部を被覆する第１の被覆層と、第１の被覆層の少なくとも一部を被覆する第２の被覆層とを含む。これにより、弾性率と空隙率とを両立することができ、カラムとして用いたときのカラムの通液速度を損なわず、タンパク質吸着量が高い分離材を得ることができる。
【００４４】
（第１の被覆層）
第１の被覆層は、重合性二重結合を３〜１５個有する多官能性モノマに由来する構造単位を有するポリマを含んでいる。すなわち、第１の被覆層は、重合性二重結合を３〜１５個有する多官能性モノマを重合させて得られるポリマを含んでいる。これにより、本実施形態の分離材の弾性率を向上することが可能となる。
【００４５】
多官能性モノマとしては、例えば、トリメチロールエタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、グリセリントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート等の３官能性の（メタ）アクリレート；ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンヘキサ（メタ）アクリレート等の４官能性以上の（メタ）アクリレート；エポキシ（メタ）アクリレート；ポリエステル（メタ）アクリレート；ウレタン（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらの多官能性モノマは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４６】
多官能性モノマを用いて多孔質ポリマ粒子に第１の被覆層を形成する方法は特に限定されないが、例えば、以下のようにして行うことができる。
【００４７】
第１の被覆層は、多孔質ポリマ粒子の表面又は細孔内部に多官能性モノマをグラフト重合することにより形成することができる。グラフト重合法としては、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ）等のリビングラジカル重合法、放射線を利用した放射線グラフト重合法、開始剤を導入して溶液中で重合を行う方法等を用いることができる。中でも、被覆量及び密度の調整の観点から、リビングラジカル重合を使用することが好ましい。
【００４８】
溶媒を用いてグラフト重合を行う場合は、溶媒１ｍＬに対して、多官能性モノマが１〜５０ｍｇとなるように濃度を調整するとよい。使用できる溶媒としては、グラフト重合を阻害せず、多官能性モノマを均一に溶解できる溶媒であれば、特に限定されない。
【００４９】
多孔質ポリマ粒子を被覆する第１の被覆層の量としては、多孔質ポリマ粒子に対し、３〜２０質量％であることが好ましく、５〜１５質量％であることがより好ましい。第１の被覆層の量が３質量％以上であると、分離材の弾性率を向上し易くなり、２０質量％以下であると、多孔質ポリマ粒子の空隙率が低下し難いため、タンパク質等の吸着量が増える傾向にある。
【００５０】
（第２の被覆層）
第２の被覆層は、水酸基を有する高分子を含む。これにより、分離材をカラムとして用いたときのカラム圧の上昇を抑制することができると共に、タンパク質の非特異吸着を抑制することが可能となる。また、分離材のタンパク質吸着量を、天然高分子を用いた場合と同等又はそれ以上とすることが可能となる。さらに、水酸基を有する高分子が架橋されていると、カラム圧の上昇をより抑制することが可能となる。
【００５１】
水酸基を有する高分子は、１分子中に２個以上の水酸基を有することが好ましく、親水性高分子であることがより好ましい。水酸基を有する高分子としては、例えば、多糖類又はその変性体、及び、ポリビニルアルコール又はその変性体が挙げられる。多糖類としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース及びキトサンが挙げられる。水酸基を有する高分子としては、重量平均分子量（Ｍｗ）１万〜２０万程度のものが使用できる。
【００５２】
水酸基を有する高分子の分子量は、水を溶媒に用い、分子量の異なるプルランを標準物質としたＧＰＣ測定により測定することができる。
【００５３】
水酸基を有する高分子は、界面吸着能を向上させる観点から、疎水基により変性された変性体であってもよい。疎水基としては、例えば、炭素数１〜６のアルキル基及び炭素数６〜１０のアリール基が挙げられる。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基及びプロピル基が挙げられる。炭素数６〜１０のアリール基としては、例えば、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。疎水基は、水酸基と反応する官能基（例えば、エポキシ基）及び疎水基を有する化合物（例えば、グリシジルフェニルエーテル）を、水酸基を有する高分子と従来公知の方法で反応させることにより、導入することができる。
【００５４】
本実施形態に係る第２の被覆層は、例えば、以下に示す方法により形成することができる。
【００５５】
まず、水酸基を有する高分子の溶液を第１の被覆層が形成された多孔質ポリマ粒子表面に吸着させる。水酸基を有する高分子の溶液の溶媒としては、水酸基を有する高分子を溶解することのできるものであれば、特に限定されないが、水が最も一般的である。溶媒に溶解させる高分子の濃度は、５〜２０（ｍｇ／ｍＬ）が好ましい。
【００５６】
この溶液を、第１の被覆層が形成された多孔質ポリマ粒子に含浸させる。含浸方法は、水酸基を有する高分子の溶液に多孔質ポリマ粒子を加えて一定時間放置する。含浸時間は多孔質体の表面状態によっても変わるが、通常一昼夜含浸すれば高分子濃度が多孔質体の内部で外部濃度と平衡状態となる。その後、水、アルコール等の溶媒で洗浄し、未吸着分の水酸基を有する高分子を除去する。
【００５７】
次いで、架橋剤を加えて第１の被覆層が形成された多孔質ポリマ粒子表面に吸着された水酸基を有する高分子を架橋反応させて、架橋体を形成する。このとき、架橋体は、水酸基を有する３次元架橋網目構造を有する。
【００５８】
架橋剤としては、例えば、エピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン、グルタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物、メチレンジイソシアネート等のジイソシアネート化合物、エチレングリコールジグリシジルエーテル等のグリシジル化合物などのような水酸基に活性な官能基を２個以上有する化合物が挙げられる。また、水酸基を有する高分子としてキトサンのようなアミノ基を有する化合物を使用する場合には、ジクロロオクタンのようなジハライドも架橋剤として使用できる。
【００５９】
この架橋反応には通常触媒が用いられる。該触媒は架橋剤の種類に合わせて適宜従来公知のものを用いることができるが、例えば、架橋剤がエピクロルヒドリン等の場合には水酸化ナトリウム等のアルカリが有効であり、ジアルデヒド化合物の場合には塩酸等の鉱酸が有効である。
【００６０】
架橋剤による架橋反応は、通常、分離材を適当な媒体中に分散、懸濁させた系に架橋剤を添加することによって行われる。架橋剤の添加量は、水酸基を有する高分子として多糖類を使用した場合、単糖類の１単位を１モルとすると、それに対して０．１〜１００モル倍の範囲内で、分離材の性能に応じて選定することができる。一般に、架橋剤の添加量を少なくすると、被覆層が多孔質ポリマ粒子から剥離し易くなる傾向にある。また、架橋剤の添加量が過剰で、かつ、水酸基を有する高分子との反応率が高い場合、原料の水酸基を有する高分子の特性が損なわれる傾向にある。
【００６１】
触媒の使用量としては、架橋剤の種類により異なるが、通常、水酸基を有する高分子として多糖類を使用する場合に、多糖類を形成する単糖類の１単位を１モルとすると、これに対して０．０１〜１０モル倍の範囲、好ましくは０．１〜５モル倍で使用される。
【００６２】
例えば、架橋反応条件を温度条件とした場合、反応系の温度を上げ、その温度が反応温度以上に達すれば架橋反応が生起する。
【００６３】
水酸基を有する高分子の溶液等を含浸させた第１の被覆層が形成された多孔質ポリマ粒子を分散、懸濁させる媒体としては、含浸させた高分子溶液から高分子、架橋剤等を抽出してしまうことなく、かつ、架橋反応に不活性なものである必要がある。その具体例としては水、アルコール等が挙げられる。
【００６４】
架橋反応は、通常、５〜９０℃の範囲の温度で、１〜１０時間かけて行う。好ましくは、３０〜９０℃の範囲の温度である。
【００６５】
架橋反応終了後、生成した粒子を濾別し、次いで水、メタノール、エタノール等の親水性有機溶媒で洗浄し、未反応の高分子、懸濁用媒体等を除去すれば、第１の被覆層が形成された多孔質ポリマ粒子の表面の少なくとも一部が、水酸基を有する高分子を含む第２の被覆層により被覆された分離材が得られる。
【００６６】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子１ｇ当たり３０〜４００ｍｇの第２の被覆層を備えることが好ましく、５０〜４００ｍｇの被覆層を備えることがより好ましく、１００〜４００ｍｇの被覆層を備えることが更に好ましい。被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して４００ｍｇ以下であると、被覆層を薄膜とすることができ、カラムとして用いたときの通液性がより向上する傾向にある。また、被覆層の割合が多孔質ポリマ粒子１ｇに対して３０ｍｇ以上であると、タンパク質吸着量がより高まる傾向にある。被覆層の量は熱分解の重量減少等で測定することができる。
【００６７】
（イオン交換基の導入）
被覆層を備える分離材は、イオン交換基、リガンド（プロテインＡ）等を表面上の水酸基等を介して導入することによりイオン交換精製、アフィニティ精製等に使用することができる。イオン交換基の導入方法として、例えば、ハロゲン化アルキル化合物を用いる方法が挙げられる。
【００６８】
ハロゲン化アルキル化合物としては、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸及びそのナトリウム塩、ジエチルアミノエチルクロライド等のハロゲン化アルキル基を少なくとも１つ有する１級、２級又は３級アミン、ハロゲン化アルキル基を有する４級アンモニウムの塩酸塩等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物は、臭化物又は塩化物であることが好ましい。ハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、イオン交換基を付与する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００６９】
イオン交換基の導入には、反応を促進させるために、有機溶媒を用いることが有効である。有機溶媒としては、例えば、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、１−ペンタノール、イソペンタノール等のアルコール類が挙げられる。
【００７０】
通常、イオン交換基の導入は、分離材表面の水酸基に行われるので、湿潤状態の粒子を、ろ過等により水切りした後、所定濃度のアルカリ性水溶液に浸漬し、一定時間放置した後、水−有機溶媒混合系で、上記ハロゲン化アルキル化合物を添加して反応させる。この反応は温度４０〜９０℃で、還流下、０．５〜１２時間行うことが好ましい。上記の反応で使用されるハロゲン化アルキル化合物の種類により、付与されたイオン交換基が決定される。
【００７１】
イオン交換基として、弱塩基性基であるアミノ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物のうち、アルキル基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルキル基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルキルアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミン等を反応させる方法、又はアルカノール基のうちの少なくとも１つがハロゲン化アルカノール基で置換されている、モノ−、ジ−又はトリ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、ジ−アルキル−モノ−アルカノールアミン、モノ−アルキル−ジ−アルカノールアミンを反応させる方法等が挙げられる。これらのハロゲン化アルキル化合物の使用量としては、分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。反応条件としては、４０〜９０℃で、０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００７２】
イオン交換基として、強塩基性基の４級アンモニウム基を導入する方法としては、まず、３級アミノ基を導入し、該３級アミノ基にエピクロルヒドリン等のハロゲン化アルキル化合物を反応させ、４級アンモニウム基に変換させる方法が挙げられる。また、４級アンモニウムの塩酸塩等を分離材に反応させてもよい。
【００７３】
イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシ基を導入する方法としては、上記ハロゲン化アルキル化合物として、モノハロゲノ酢酸、モノハロゲノプロピオン酸等のモノハロゲノカルボン酸又はそのナトリウム塩を反応させる方法が挙げられる。これらハロゲン化アルキル化合物の使用量は、イオン交換基を導入する分離材の全質量に対して０．２質量％以上であることが好ましい。
【００７４】
イオン交換基として、強酸性基であるスルホン酸基の導入方法としては、分離材に対してエピクロロヒドリン等のグリシジル化合物を反応させ、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム等の亜硫酸塩又は重亜硫酸塩の飽和水溶液に分離材を添加する方法が挙げられる。反応条件は、３０〜９０℃で１〜１０時間であることが好ましい。
【００７５】
一方、イオン交換基の導入方法として、アルカリ性雰囲気下で、分離材に１，３−プロパンスルトンを反応させる方法も挙げられる。１，３−プロパンスルトンは、分離材の全質量に対して０．４質量％以上使用することが好ましい。反応条件は、０〜９０℃で０．５〜１２時間であることが好ましい。
【００７６】
本実施形態に係る分離材又は多孔質ポリマ粒子の平均細孔径、比表面積及び空隙率は、水銀圧入測定装置（株式会社島津製作所製、商品名「オートポア」）にて測定した値であり、以下のようにして測定する。試料約０．０５ｇを、標準５ｍＬ粉体用セル（ステム容積０．４ｍＬ）に加え、初期圧２１ｋＰａ（約３ｐｓｉａ、細孔直径約６０μｍ相当）の条件で測定する。水銀パラメータは、装置デフォルトの水銀接触角１３０°、水銀表面張力４８５ｄｙｎｅｓ／ｃｍに設定する。また、細孔径０．１〜３μｍの範囲に限定してそれぞれの値を算出する。
【００７７】
本実施形態の分離材は、タンパク質を静電的相互作用による分離、アフィニティ精製に用いるのに好適である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、静電的相互作用によりタンパク質だけを分離材に吸着させた後、該分離材を溶液からろ別し、塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材に吸着しているタンパク質を容易に脱離、回収できる。また、本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーにおいて、使用することも可能である。
【００７８】
本実施形態の分離材を用いて分離できる生体高分子としては、水溶性物質が好ましい。具体的には、血清アルブミン、免疫グロブリン等の血液タンパク質などのタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、生理活性をするペプチド等の生体高分子などであり、好ましくは分子量が２００万以下、より好ましくは５０万以下である。また、公知の方法に従い、タンパク質の等電点、イオン化状態等によって、分離材の性質、条件等を選ぶ必要がある。公知の方法としては、例えば、特開昭６０−１６９４２７号公報等に記載の方法が挙げられる。
【００７９】
本実施形態の分離材は、多孔質ポリマ粒子上の被覆層を架橋処理後、分離材の表面にイオン交換基、プロテインＡを導入することにより、タンパク質等の生体高分子の分離において、天然高分子からなる粒子又は合成ポリマからなる粒子のそれぞれの利点を有する。特に本実施形態の分離材における多孔質ポリマ粒子は、上述の方法で得られるものであるため、耐久性及び耐アルカリ性を有する。また、本実施形態の分離材は、タンパク質の非特異吸着を低減し、タンパク質の吸脱着が起こり易い傾向にある。さらに、本実施形態の分離材は、同一流速下でのタンパク質等の吸着量（動的吸着量）が大きい傾向にある。
【００８０】
本明細書における通液速度とは、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに本実施形態の分離材を充填し、液を通した際の通液速度を表す。本実施形態の分離材は、カラムに充填した場合、カラム圧０．３ＭＰａのときに通液速度が８００ｃｍ／ｈ以上であることが好ましく、１５００ｃｍ／ｈ以上であることがより好ましい。カラムクロマトグラフィーでタンパク質の分離を行う場合、タンパク質溶液等の通液速度としては、一般に４００ｃｍ／ｈ以下の範囲であるが、本実施形態の分離材を使用した場合は、通常のタンパク質分離用の分離材よりも速い通液速度１５００ｃｍ／ｈ以上で使用することができる。
【００８１】
本実施形態の分離材の平均粒径は、１０〜３００μｍであることが好ましい。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの使用には、カラム内圧の極端な増加を避けるために、５０〜１００μｍであることが好ましい。
【００８２】
本実施形態の分離材は、カラムクロマトグラフィーでカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化がほとんどないため、操作性に優れる。
【００８３】
本実施形態の分離材を５％圧縮変形したときの圧縮弾性率（５％Ｋ値）は、３００〜１５００ＭＰａであることが好ましく、４００〜１５００ＭＰａであることがより好ましく、５００〜１５００ＭＰａであることが更に好ましい。分離材の５％Ｋ値は、上述した多孔質ポリマ粒子の５％Ｋ値の測定と同様の方法を用いて算出することができる。
【００８４】
分離材の細孔容積は、分離材の全体積基準で３０体積％以上７０体積％以下であることが好ましく、４０体積％以上７０体積％以下であることがより好ましい。分離材は、平均細孔径が０．０５〜０．６μｍである細孔、すなわちマクロポアー（マクロ孔）を有することが好ましい。平均細孔径は、より好ましくは、０．１〜０．５μｍである。細孔径が０．１μｍ以上であると、細孔内に物質が入り易くなる傾向にあり、細孔径が０．５μｍ以下であると、比表面積が充分なものになる。
【００８５】
分離材の比表面積は、３０ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。より高い実用性の観点から、比表面積は３５ｍ２／ｇ以上であることがより好ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に好ましい。比表面積が３０ｍ２／ｇ以上であると、分離する物質の吸着量が大きくなる傾向にある。分離材の比表面積の上限値は、５００ｍ２／ｇ以下とすることができる。
【００８６】
分離材の平均細孔径、比表面積等は、多孔質ポリマ粒子の原料、多孔質化剤、水酸基を有する高分子等を適宜選択することによって、調整することができる。
【００８７】
分離材の空隙率は、４０％以上であることが好ましく、４５％以上であることがより好ましき、５０％以上であることがより好ましい。空隙率が４０％以上であると、タンパク質吸着量を多くすることができる。分離材の空隙率の上限値は、７０％以下とすることができる。
【００８８】
本実施形態の分離材は、カラムに用いることができる。すなわち、本実施形態のカラムは、上記分離材を備える。なお、本実施形態では、イオン交換基を導入する形態の分離材について説明したが、イオン交換基を導入しなくても分離材として用いることができる。このような分離材は、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーに利用することができる。
【実施例】
【００８９】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９０】
（多孔質ポリマ粒子ａ１の合成）
５００ｍＬの三口フラスコに、モノマとして純度９６％のジビニルベンゼン（新日鉄住金化学株式会社製、商品名「ＤＶＢ９６０」）１６ｇ、多孔質化剤としてヘキサノール１６ｇ及びジエチルベンゼン１６ｇ、開始剤として過酸化ベンゾイル０．６４ｇを加え、分散相とした。更にポリビニルアルコールを０．５質量％含む水溶液を連続相として使用した。これらの分散液をマイクロプロセスサーバーを使用して乳化後（モノマ濃度２５体積％）、得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌した。得られた粒子をろ過後、アセトンで洗浄を行い、多孔質ポリマ粒子ａ１を得た。多孔質ポリマ粒子ａ１の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。また、多孔質ポリマ粒子ａ１の５％圧縮変形弾性率を上述の方法で測定した。結果を表１に示す。
【００９１】
（多孔質ポリマ粒子ａ２の合成）
モノマとしてエチレングリコールジメタクリレート１６ｇを使用し、多孔質化剤としてヘキサノール８ｇ及びジエチルベンゼン２４ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子ａ１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子ａ２を合成した。
【００９２】
（多孔質ポリマ粒子ａ３の合成）
多孔質化剤としてヘキサノール１０ｇ及びジエチルベンゼン１０ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子ａ１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子ａ３を合成した。
【００９３】
（多孔質ポリマ粒子ａ４の合成）
多孔質化剤としてヘキサノール１８ｇ及びジエチルベンゼン１８ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子ａ１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子ａ４を合成した。
【００９４】
（ポリマ粒子ａ５の合成）
モノマとしてジトリメチロールプロパンテトラアクリレートを使用した以外は多孔質ポリマ粒子ａ２の合成と同様にして、ポリマ粒子ａ５を合成した。粒子ａ５は表面にポリマ被膜が形成されており、多孔質ではなかった。
【００９５】
（多孔質ポリマ粒子ａ６の合成）
モノマとして、ジビニルベンゼン４．８ｇ及びメタクリル酸グリシジル８ｇを使用した以外は多孔質ポリマ粒子ａ１の合成と同様にして、多孔質ポリマ粒子ａ６を合成した。
【００９６】
【表１】
0006610266.tif 000002
【００９７】
（実施例１）
＜第１の被覆層の形成＞
０．２ｇのドーパミン塩酸塩、２−ブロモイソブチルブロマイド０．４９ｇ及びトリエチルアミン０．２１ｇをＤＭＦ１０ｍＬ溶液中で３時間攪拌した後、多孔質ポリマ粒子ａ１を１ｇ添加し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）９０ｍＬを更に添加して、室温で２４時間攪拌した。その後、水で洗浄して、多孔質ポリマ粒子ａ１にリビング開始基が導入された粒子を得た。
【００９８】
リビング開始基が導入された粒子１ｇ、トリメチロールプロパントリアクリレート１．３ｇ、臭化銅（ＩＩ）６７ｍｇ、トリスジメチルアミノエチルアミン１３４ｍｇ及びＤＭＦ８０ｇを混合し、窒素バブリングを行った後、１１９ｍｇのアスコルビン酸を溶解したＤＭＦ２０ｇを添加し５時間重合を行った。重合後の粒子をろ過洗浄して、第１の被覆層が形成された粒子を得た。
【００９９】
＜第２の被覆層の形成及び架橋＞
アガロース（Ｍｗ１２万）を２質量％含有するアガロース水溶液１００ｍＬに水酸化ナトリウム４ｇ及びグリシジルフェニルエーテル０．１４ｇを投入して７０℃で１２時間反応させ、アガロースにフェニル基を導入した。フェニル基が導入されたアガロースをイソプロピルアルコールで３回再沈殿して洗浄し、変性アガロースを得た。次いで、水１ｍＬに対して変性アガロースを２０ｍｇ含有する変性アガロースの水溶液を調製した。この水溶液７０ｍＬに第１の被覆層が形成された粒子を１ｇの割合で投入し、５５℃で２４時間攪拌して、粒子に変性アガロース１を吸着させた。変性アガロースを吸着させた粒子をろ過し、熱水で洗浄した。
【０１００】
粒子に吸着した変性アガロースは次のようにして架橋した。エチレングリコールジグリシジルエーテル（濃度０．６４Ｍ）及び水酸化ナトリウム（濃度０．４Ｍ）を含む水溶液３５ｍＬに対して、変性アガロースが吸着した粒子を１ｇの割合で投入し、２４時間室温にて攪拌し、変性アガロースを架橋させた。その後、得られた粒子を２質量％の熱ドデシル硫酸ナトリウム水溶液で洗浄後、純水で洗浄して、多孔質ポリマ粒子ａ１と、第１の被覆層及び第２の被覆層と備える分離材の水懸濁液を得た。
【０１０１】
＜イオン交換基の導入＞
分離材を含む水懸濁液をろ過して得られた分離材（乾燥重量２０ｇ）を５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２００ｍＬに投入し、室温で１時間放置した。別途、ジエチルアミノエチルクロライド塩酸塩の所定量（６０ｇ）を水に溶解し１００ｇとした水溶液を添加し、水溶液の温度を７０℃まで上げ、撹拌しながら２時間反応させた。反応終了後、生成物をろ別して水洗し、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をイオン交換基として有するＤＥＡＥ変性分離剤を得た。得られたＤＥＡＥ変性分離材の平均孔径、比表面積及び空隙率を水銀圧入法にて測定した。結果を表２に示す。
【０１０２】
（５％圧縮変形弾性率）
得られたＤＥＡＥ変性分離材の５％圧縮変形弾性率を上述の方法で測定した。結果を表２に示す。
【０１０３】
（カラム特性評価）
ＤＥＡＥ変性分離材を濃度３０質量％のスラリー（溶媒：メタノール）としてφ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムにて１５分充填した。その後、カラムに流速を変えながら水を通し、流速とカラム圧との関係を測定し、０．３ＭＰａ時の通液速度（線流速）を測定した。
また、動的吸着量は以下のようにして測定した。２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）をカラムに１０カラム容量通した。その後、ＢＳＡ濃度２ｍｇ／ｍＬの２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−塩酸緩衝液を通し、ＵＶ測定によってカラム出口でのＢＳＡ濃度を測定した。カラム入口と出口のＢＳＡ濃度が一致するまで緩衝液を通し、５カラム容量分の１Ｍ  ＮａＣｌ  Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液で希釈した。１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量を以下の式を用いて算出した。結果を表２に示す。
ｑ１０＝ｃｆＦ（ｔ１０−ｔ０）／ＶＢ
ｑ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける動的吸着量（ｍｇ／ｍＬ  ｗｅｔ  ｒｅｓｉｎ）
ｃｆ：注入しているＢＳＡ濃度
Ｆ：流速（ｍＬ／ｍｉｎ）
ＶＢ：ベッド体積（ｍＬ）
ｔ１０：１０％ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈにおける時間（ｍｉｎ）
ｔ０：ＢＳＡ注入開始時間（ｍｉｎ）
【０１０４】
（実施例２）
多孔質ポリマ粒子ａ１を被覆するモノマとしてペンタエリスリトールテトラアクリレート（４官能）を使用した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０５】
（実施例３）
多孔質ポリマ粒子ａ１を被覆するモノマとしてジペンタエリスリトールヘキサアクリレート（６官能）を使用した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０６】
（実施例４）
多孔質ポリマ粒子ａ１を被覆するモノマとして９官能のウレタンアクリレート（新中村化学工業株式会社製、商品名「ＵＡ−３３Ｈ」、）を使用した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０７】
（実施例５）
多孔質ポリマ粒子ａ１を被覆するモノマとして１５官能のウレタンアクリレート（新中村化学工業株式会社製、商品名「ＵＡ−５３Ｈ」）を使用した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０８】
（実施例６）
多孔質ポリマ粒子ａ１を多孔質ポリマ粒子ａ２に変更した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１０９】
（実施例７）
多孔質ポリマ粒子ａ１を多孔質ポリマ粒子ａ３に変更した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１１０】
（実施例８）
多孔質ポリマ粒子ａ１を多孔質ポリマ粒子ａ４に変更した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１１１】
（比較例１）
トリメチロールプロパントリアクリレートをエチレングリコールジメタクリレートに変更した以外は実施例１と同様にして分離材を作製し、実施例１と同様に評価した。
【０１１２】
（比較例２）
ポリマ粒子ａ５をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に評価した。
【０１１３】
（比較例３）
多孔質ポリマ粒子ａ６  ６５ｇをジエチルアミン／水（体積比５０／５０）溶液に３０℃で２４時間浸漬し、エポキシ基をジエチルアミノ基に開環反応させた後、エタノールアミン／メタノール（体積比５０／５０）溶液に３０℃で２４時間浸漬し、残存しているエポキシ基をブロッキングして、多孔質ポリマ粒子ａ６にＤＥＡＥ基をイオン交換基として導入した。洗浄後、得られた粒子を分離材として用い、実施例１と同様に評価した。
【０１１４】
（比較例４）
市販のアガロース粒子（ＧＥヘルスケアジャパン株式会社、商品名「Ｃａｐｔｏ  ＤＥＡＥ」）をそのまま分離材として用い、実施例１と同様に評価した。
【０１１５】
【表２】
0006610266.tif 000003
【０１１６】
表２より、実施例１〜８の分離材は、弾性率が高く、空隙率が５０％以上であっても、０．３ＭＰａ時の通液速度が非常に速く、動的吸着量が１５００ｃｍ／ｈ以上でも高い値を保つことがわかる。