(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部から照射される光と酸素の作用によって化学作用を引き起こす光感作剤を使用して、治療が要求される特定の組織の細胞を選択して殺すことにより病気を治療するための光力学的自己組立型薬学の組成物であって、
光感作剤と、特定の範囲の水素イオン濃度（ｐＨ）条件でｐＨ依存的に分離されるリガンドＡと、特定範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢと、を含み、
前記光感作剤が、クロリンＥ６（Ｃｅ６）であり、
前記光感作剤は、前記リガンドＡ及び前記リガンドＢに結合されており、
前記リガンドＡは、下記の式（Ｉ）で表され、
【化１】
0006618680.tif 000008
（式（Ｉ）中、Ｘは、以下の式（Ｉ−１）及び式（Ｉ−２）の中から選ばれる。式（Ｉ）において、少なくとも１つのＸは式（Ｉ−１）であり、少なくとも他の１つのＸは式（Ｉ−２）である。ｎは５〜５００であり、ｍは１０〜１０００である。）
【化１−１】
0006618680.tif 000009
【化１−２】
0006618680.tif 000010
前記リガンドＢは、下記の式（ＩＩ）で表され、
【化２】
0006618680.tif 000011
（式（ＩＩ）中、Ｙは、以下の式（ＩＩ−１）及び式（ＩＩ−２）の中から選ばれる。式（ＩＩ）において、少なくとも１つのＹは式（ＩＩ−１）であり、少なくとも他の１つのＹは式（ＩＩ−２）である。ｎは５〜５００であり、ｍは１０〜１０００である。）
【化２−１】
0006618680.tif 000012
【化２−２】
0006618680.tif 000013
前記特定の範囲の水素イオン濃度（ｐＨ）条件は、４〜７．２であり、
前記ｐＨ依存的に分離されるとは、前記特定の範囲の水素イオン濃度（ｐＨ）条件において、前記リガンドＡ及び前記リガンドＢの疎水性相互作用が弱まることにより、自己組み立てされた状態から分離されることである、光力学的自己組立型薬学の組成物。
【請求項２】
ＭＲＩ造影用ナノ粒子を追加で含めることを特徴とする、請求項１に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物。
【請求項３】
前記ＭＲＩ造影用ナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子であることを特徴とする、請求項２に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物。
【請求項４】
前記酸化鉄ナノ粒子の大きさが１ｎｍないし１００ｎｍであることを特徴とする、請求項３に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物。
【請求項５】
外部から照射される光と酸素の作用によって化学作用を引き起こす光感作剤を使用して、治療が要求される特定の組織の細胞を選択して殺すことにより病気を治療するための光力学的自己組立型薬学の組成物の製造方法であって、
（ｉ）特定の範囲の水素イオン濃度(ｐＨ)条件でｐＨ依存的に分離されるリガンドＡと、特定の範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢと、を含有する混合溶液をクロロホルムに添加してリガンドの組成物を製造する段階と、
（ｉｉ）前記リガンドの組成物からナノ製剤化された光力学的治療用薬学の組成物を分離する段階と、を含み
前記光感作剤が、クロリンＥ６（Ｃｅ６）であり、
前記光感作剤は、前記リガンドＡ及び前記リガンドＢに結合されており、
前記リガンドＡは、下記の式（Ｉ）で表され、
【化３】
0006618680.tif 000014
（式（Ｉ）中、Ｘは、以下の式（Ｉ−１）及び式（Ｉ−２）の中から選ばれる。式（Ｉ）において、少なくとも１つのＸは式（Ｉ−１）であり、少なくとも他の１つのＸは式（Ｉ−２）である。ｎは５〜５００であり、ｍは１０〜１０００である。）
【化３−１】
0006618680.tif 000015
【化３−２】
0006618680.tif 000016
前記リガンドＢは、下記の式（ＩＩ）で表され、
【化４】
0006618680.tif 000017
（式（ＩＩ）中、Ｙは、以下の式（ＩＩ−１）及び式（ＩＩ−２）の中から選ばれる。式（ＩＩ）において、少なくとも１つのＹは式（ＩＩ−１）であり、少なくとも他の１つのＹは式（ＩＩ−２）である。ｎは５〜５００であり、ｍは１０〜１０００である。）
【化４−１】
0006618680.tif 000018
【化４−２】
0006618680.tif 000019
前記特定の範囲の水素イオン濃度（ｐＨ）条件は、４〜７．２であり、
前記ｐＨ依存的に分離されるとは、前記特定の範囲の水素イオン濃度（ｐＨ）条件において、前記リガンドＡ及び前記リガンドＢの疎水性相互作用が弱まることにより、自己組み立てされた状態から分離されることである、光力学的自己組立型薬学の組成物の製造方法。
【請求項６】
前記（ｉ）段階の混合溶液の溶媒がＤＭＳＯ、ＤＭＦ及びＴＨＦよりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法。
【請求項７】
前記（ｉ）段階の有機溶媒がクロロホルム、ジクロロメタン及び１、２―ジクロロエタンよりなる群から選ばれるのを特徴とする、請求項５に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法。
【請求項８】
前記リガンドＡが
（ｉ）ＤＭＦとＣＨ２Ｃｌ２の混合物内でβ-ベンジル-L-アスパルテートN-カルボキシ無水物（ＢＬＡ―ＮＣＡ）を重合してポリ(エチレングリコール)-ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)（ＰＥＧ―ＰＢＬＡ）を製造する段階と、
（ｉｉ）前記（ｉ）段階で製造されたＰＥＧ―ＰＢＬＡにクロリンｅ６（Ｃｅ６）を結合させ、プラットフォームのリガンドを製造する段階と、
（ｉｉｉ）前記プラットフォームリガンドを１―（３―アミノプロピル)イミダゾール及びドーパミンを使用してアミノ分解させてリガンドＡを製造する段階を含める方法によって製造されたものであることを特徴とする、請求項５に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法 。
【請求項９】
前記リガンドＢが
（ｉ）ＤＭＦとＣＨ２Ｃｌ２の混合物内でβ-ベンジル-L-アスパルテートＮ―カルボキシ無水物（ＢＬＡ―ＮＣＡ）を重合してポリ(エチレングリコール)-ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)（ＰＥＧ―ＰＢＬＡ）を製造する段階と、
（ｉｉ）前記（ｉ）段階で製造されたＰＥＧ―ＰＢＬＡにクロリンｅ６（Ｃｅ６）を結合させ、プラットフォームのリガンドを製造する段階と、
（ｉｉｉ）前記プラットフォームリガンドを１―（３―アミノプロピル)イミダゾール及び３―フェニル―１―プロピルアミンを使用してアミノ分解させてリガンドＢを製造する段階を含める方法によって製造されたものであることを特徴とする、請求項５に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法 。
【請求項１０】
前記（ｉ）段階のリガンド組成物とＭＲＩ造影剤用ナノ粒子を混合する段階を追加で含めることを特徴とする、請求項５に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法 。
【請求項１１】
前記ＭＲＩ造影剤用ナノ粒子が酸化鉄ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１０に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記酸化鉄ナノ粒子の大きさが１ｎｍないし１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１１に記載の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法 。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ製剤化された光力学的治療用自己組立型薬学の組成物に関する。より詳細には、本発明は光感作剤、特定の範囲の水素イオン濃度（ｐＨ）条件から分離されるリガンドＡ、及び特定の範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢを含む、光力学的治療用自己組立型薬学の組成物、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌と通称される疾病は、主に統制できない細胞の成長（ｎｅｏｐｌａｓｉａ）により発生する現象として１００種類以上の疾患である。非正常的な細胞の成長が細胞の塊（ｔｕｍｏｒ）を成して、こうした細胞の塊が周りの組織に浸透し、次いで、身体の他の部位に転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）する現象を含む。
【０００３】
疾病の治療または疾病の部位の診断効果を発揮する有効薬物の成分を人体に投与することにおいて特に考慮しなければならない問題は、投与された有効成分がある程度疾病の部位に伝わっているかどうか、つまり伝達の効率の問題である。有効成分が望んでいない正常な組織に到達して作用して薬物副作用を発生させる結果を引き起こすことがあり、また、薬物が必要な疾病の部位に伝達した薬物の量が減って治療効果を上げられない問題が発生する。
【０００４】
一部の疾病について治療効果を持つ薬物の中には、正常な組織や細胞に強い毒性を示し、疾病の治療効果より薬物の副作用や細胞毒性が大きすぎて問題になる場合が多い。抗癌治療剤が正常な組織細胞にも作用して、癌組職の除去や治療効果より正常な組織細胞に悪い影響を与える。
【０００５】
抗癌効果を持つ薬物はおよそ１，３００種以上のものとされている。しかし、このように抗癌効果を生ずる薬物は正常な組織細胞にも毒性を出す場合が多く、抗癌剤の副作用原因となり、癌細胞組織の特徴によって抗癌剤の有効成分が癌組織への伝達の効率が低くなって、副作用対比治療効果が大きくないという問題点をもたらす。
【０００６】
特に、癌組織細胞の特性が異なる様々な種類の複製腫瘍細胞を生成する現象である異質性によって、ナノ薬物剤型で頻繁に主に活用して、癌細胞組織のレセプターとナノ製剤のリガンドの間の親和性を利用した癌細胞追跡投与方法が厳しくなっていることで、ナノ製剤の抗癌剤を使用した癌治療を困難にする。また、このような癌組織の異質性細胞外部基質は薬物の浸透を妨害する薬物への露出を減少させ、徐々に薬物抵抗性を誘発する。このような特徴を有する癌組職は、細胞の異質性の特性のため、抗体標識子による標的治療の限界がある。
【０００７】
しかし、以上のような癌組織は、細胞の分裂速度が非正常的に早まり、組織の成長速度が早く行われるため、正常組織に比べて癌組職はやや空いていて、癌組織内部の細胞間空隙が増加する。また、ガン組織の表面には１００ｎｍほどの大きさの穴が多数存在し、癌組織の表面はｐＨ６．０以下の酸性を示しているという特徴があり、表面が負電荷に荷電されている特徴も現れている。
【０００８】
患者たちの腫瘍は一般的に異質（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）細胞群を含めて、腫瘍の異質性は、最も一般的にガンのナノ技術に使用される受容体-リガンド標的化戦略の効果に大きく影響を及ぼす。また、異質腫瘍の細胞外基質は、薬物の露出を減少させて、次第に薬物耐性を誘発し、薬物の浸透を遅延させる。腫瘍微細環境は穴の開いた血管系、リンパ液の排出不良、細胞及び関連された基質の高い密度による腫瘍内の間質液の圧力増加を生じさせている。
【０００９】
したがって、ナノ粒子ベースの薬剤の浸透は、腫瘍細胞の間の空間で治療用ナノ粒子がほとんど拡散しないながら、腫瘍周辺領域に制限される。薬物耐性の生理学的、物理的メカニズムは全体として大部分のガン治療が失敗する主な原因である。小さな大きさと多様な機能性のナノ粒子が、次世代抗癌剤として浮上しているが、前述した腫瘍の壁を克服するため、腫瘍-関連刺激にのみ特異的に反応できるスマートナノ粒子の開発が大きな課題として残っている。
【００１０】
自己組立は、制御可能な方式で、独特なプラズモニ(ック)、光ルミネセンス及び磁気的性質を持つナノ粒子アンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）を簡単に再生可能で、安価に生産する方法を提供する。いろいろの刺激反応性（ｓｔｉｍｕｌｕｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）ナノ構造体が生物学または化学センサーとして試験管内で徹底的に研究された（Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００５，１０５，１５４７；Ｃａｏ，Ｙ．Ｃ．；Ｊｉｎ，Ｒ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９７，１５３６；Ｚａｇｏｒｏｖｓｋｙ，Ｋ．；Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｗ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１３，５２，３１６８；Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８９，１７５７；Ｐａｎ，Ｙ．；Ｄｕ，Ｘ．；Ｚｈａｏ，Ｆ．；Ｘｕ，Ｂ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１２，４１，２９１２）。
【００１１】
しかし、現在まで、主にこれらの本質的な生理学的難関性のために、このようなタイプの「スマート」アンサンブルは生体内でほとんど研究されたことはない。腫瘍が持っている一つの共通点は酸性度である;微細環境は普通約6.8以下のｐＨを持ち、エンドソーム/リソソーム（ｅｎｄｏ／ｒｅｓｏｓｏｍｅ）は５．０ないし５．５よりももっともっと低いｐＨを経験する。
【００１２】
磁気共鳴映像（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ、ＭＲＩ）は現在生きている人や動物の身体機関を非侵襲的にリアルタイムで映像化できる現在まで最も優れた映像診断装備の一つである。ＭＲＩ造影剤はＭＲＩ映像でそれぞれの組織と血管をさらに明確に現れるようにすることにより正確な診断が可能である。
【００１３】
ＭＲＩ造影剤は希望する部分が明るく見えるＴ１の造影剤と暗く見えるＴ２の造影剤に区分される。Ｔ１造影剤で常磁性のガドリニウム錯体が広く使用されているものの、一般ガドリニウム錯体の小さな分子量によって血管や生体内に滞在時間が短く、血管疾患などで正確な診断が難しい場合があり、腎臓の機能が低下した人には全身性線維症を誘発しかねない危険性が報告されている。
【００１４】
光力学的治療とは、外部から照射される光と酸素の作用によって化学作用を引き起こす光感作剤を使用して、治療が要求される特定の組織の細胞を選択して殺す方法で病気を治療することを意味する。正常な組織細胞にも影響を及ぼすこととなる一般抗癌剤や放射線治療とは異なり、光力学的治療は疾病組織細胞を標的に選択して殺すという点が、薬物や放射線治療の副作用が大きく減るという長所がある。
【００１５】
本発明は、光力学的治療薬剤の組成物の大きさが、前記で説明した癌組織表面に現れる１００ｎｍの大きさの穴より小さく、癌組織に到達すれば、薬剤の組成物の表面の荷電状態がマイナスからプラスに変わったことで、薬剤の組成物の癌組織への接近や侵入を容易にしながら、癌組織の酸性条件で分離されるリンカ部位を包含していて、光力学的治療効果を発生させる光感作剤を選択的に、そして効果的に癌組織に浸透させ、癌組織内部で光感作剤が光によって活性化されて、多量の活性酸素を形成して癌組織細胞を殺す効果を発揮できるようにする薬剤の組成物を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の基本的な目的は、光感作剤、特定の範囲の水素イオン濃度(ｐＨ)条件から分離されるリガンドＡ、及び特定の範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢを含む、光力学的治療用自己組立型薬学の組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、（ｉ）光感作剤が結合されており、特定の範囲の水素イオン濃度(ｐＨ)条件から分離されるリガンドＡと、光感作剤が結合されており、特定の範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢを含有する混合溶液をクロロホルムに添加してリガンドの組成物を製造する段階；及び（ｉｉ）前記リガンドの組成物からナノ製剤化された光力学的治療用薬学の組成物を分離する段階を含む、光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前述した本発明の基本的な目的は、光感作剤、特定の範囲の水素イオン濃度(ｐＨ)条件から分離されるリガンドＡ、及び特定の範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢを含む、光力学的治療用自己組立型薬学の組成物を提供することによって達成されることができる。
【００１９】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物において、前記光感作剤として、クロリンｅ６（Ｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ６（Ｃｅ６））を用いることができる。また、前記光感作剤が前記リガンドＡまたは前記リガンドＢに結合されていてもよい。
【００２０】
前記リガンドＡはＰＥＧ、イミダゾールラジカル基、カテコール及びクロリンｅ６（Ｃｅ６）を含有することができる。前記ＰＥＧはその親水性により本発明のリガンド組成物の形状を維持させて、前記イミダゾール基は本発明のリガンド組成物がｐＨの変化によって形状が変わるようにして、前記カテコールは極微細の酸化鉄ナノ粒子（ＥＳＩＯＮ）と結合して、前記Ｃｅ６は適切な光線が照射される時、癌細胞を破壊する反応性の酸素分子種（ＲＯＳ）を放出する。
【００２１】
また、前記リガンドＢはＰＥＧ、イミダゾールラジカル基、フェニル基、及びＣｅ６を含有することができる。前記ＰＥＧはその親水性により本発明のリガンド組成物の形状を維持して、前記イミダゾールラジカル基は、本発明のリガンド組成物がｐＨの変化によって形状が変わるようにして、前記フェニル基はその親油性により、本発明のリガンド組成物の形状を維持させて、前記Ｃｅ６は適切な光線が照射される時、癌細胞を破壊する反応性の酸素分子種（ＲＯＳ）を放出する。
【００２２】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物において、前記リガンドＡは次の化学式（Ｉ）の化合物であってもよい。
【００２３】
【化１】
0006618680.tif 000002
前記化学式（Ｉ）でｎ及びｍはそれぞれ独立的に５−５００である。また、前記化学式（Ｉ）のイミダゾール基はトリアゾール基（ｔｒｉａｚｏｌｅ）またはピペラジン基（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）に置換されることができる。
【００２４】
また、本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物において、前記リガンドＢは、次の化学式（ＩＩ）の化合物であってもよい。
【００２５】
【化２】
0006618680.tif 000003
前記化学式（ＩＩ）でｎ及びｍはそれぞれ独立的に５−５００である。また、前記化学式（ＩＩ）のイミダゾール基はトリアゾール基（ｔｒｉａｚｏｌｅ）またはピペラジン基（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）に置換されることができる。さらに、前記化学式（ＩＩ）のフェニル基はビフェニル基（ｂｉｐＨｅｎｙｌ）、ナフチル基（ｎａｐＨｔｈｙｌ）またはインドール基（ｉｎｄｏｌｅ）に置換されることができる。
【００２６】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物において、前記リガンドＡが分離されるｐＨまたはリガンドＢの表面電荷が変化するｐＨは４ないし７．２であってもよい。
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物において、ＭＲＩ造影用ナノ粒子を追加で含めることができる。前記ＭＲＩ造影用ナノ粒子は酸化鉄ナノ粒子であることができる。また、前記酸化鉄ナノ粒子の大きさは１ｎｍないし１００ｎｍであってもよい。
【００２７】
本発明のもう一つの目的は、（ｉ）光感作剤が結合されており、特定の範囲の水素イオン濃度(ｐＨ)条件から分離されるリガンドＡと、光感作剤が結合されており、特定の範囲の水素イオン濃度条件で表面電荷が変わるリガンドＢを含有する混合溶液を有機溶媒に添加してリガンドの組成物を製造する段階；及び（ｉｉ）前記リガンドの組成物からナノ製剤化された光力学的治療用薬学の組成物を分離する段階を含む、光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法を提供することによって達成されることができる。
【００２８】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法において、前記光感作剤としてクロリンｅ６（ｃｈｌｏｒｉｎ ｅ６（Ｃｅ６））を用いることができる。また、前記光感作剤が前記リガンドＡ及び前記リガンドＢに結合されていてもよい。
【００２９】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法において、前記リガンドＡは、前記化学式（Ｉ）の化合物であり、前記リガンドＢは、前記化学式（ＩＩ）の化合物であってもよい。
【００３０】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法において、前記リガンドＡが分離されるｐＨまたはリガンドＢの表面電荷が変化するｐＨは、４ないし７．２であってもよい。
【００３１】
本発明の光線力学治療用自己組立型薬学の組成物製造方法において、前記混合溶液の溶媒として、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）またはＴＨＦ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）を用いることができる。また、前記有機溶媒は、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）、ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）または１、２-ジクロロエタン（１、２−ｄｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｎｅ）であってもよい。
【００３２】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物製造方法において、前記リガンドＡが、（ｉ）ＤＭＦとＣＨ２Ｃｌ２の混合物内でβ-ベンジル-L-アスパルテートN-カルボキシ無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を重合してポリ(エチレングリコール)-ポリ(β-ベンジル-L-アスパルテート)（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を製造する段階：（ｉｉ）前記（ｉ）段階で製造されたＰＥＧ−ＰＢＬＡにクロリンＥ６（Ｃｅ６）を結合させ、プラットフォームのリガンドを製造する段階；及び（ｉｉｉ）前記プラットフォームリガンドを１−（３−アミノプロピル)イミダゾールやドーパミンを使用してアミノ分解させてリガンドＡを製造する段階を含める方法によって製造されことができる。
【００３３】
また、本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物製造方法において、前記リガンドＢが、（ｉ）ＤＭＦとＣＨ２Ｃｌ２の混合物内でβ-ベンジル-L-アスパルテートN-カルボキシ無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）を重合してポリ(エチレングリコール)-ポリ(β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート)（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を製造する段階：（ｉｉ）前記（ｉ）段階で製造されたＰＥＧ−ＰＢＬＡにクロリンＥ６（Ｃｅ６）を結合させ、プラットフォームのリガンドを製造する段階；及び（ｉｉｉ）前記プラットフォームリガンドを1−(３−アミノプロピル)イミダゾールや３−フェニル−１−プロピルアミンを使用してアミノ分解させてリガンドＢを製造する段階を含める方法によって製造されることができる。
【００３４】
本発明の光力学的治療用自己組立型薬学の組成物の製造方法において、前記（ｉ）段階のリガンドの組成物とＭＲＩ造影劑用ナノ粒子を混合する段階を追加で含めることができる。前記ＭＲＩ造影用ナノ粒子は酸化鉄ナノ粒子であってもよい。また、前記酸化鉄ナノ粒子の大きさは１ｎｍないし１００ｎｍであってもよい。
【発明の効果】
【００３５】
本発明の光力学的治療用ナノ薬剤の組成物は、腫瘍の酸性の刺激に反応する自己組み立て、ナノ構造で癌細胞にだけ選択的に薬剤の組成物を伝達する機能を発揮する。したがって、本発明の光力学的治療用ナノ薬剤の組成物は、初期段階の異質性、薬物耐性の腫瘍にきわめて効果的な光力学的治療が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の実施例１で合成されたプラットフォームリガンド（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｅ６）の１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果である。
【図２】本発明の実施例１で合成されたリガンドＡ（ＰＥＧ−ｐ（ＡＰＩ＆ＤＯＰＡ−Ｌ−Ａｓｐ）−Ｃｅ６）の１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果である。
【図３】本発明の実施例１で合成されたリガンドＢ（ＰＥＧ−ｐ（ＡＰＩ＆ＰＰＡ−Ｌ−Ａｓｐ）−Ｃｅ６）の１Ｈ−ＮＭＲ分析の結果である。
【図４】本発明の実施例１で合成されたプラットフォームリガンド、リガンドＡ及びリガンドＢのＧＰＣ曲線である。
【図５】（ａ）は、本発明のｐＨ−感応性の磁気のナノ組成物（ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ（ＰＭＮ）：酸化鉄のナノ粒子とｐＨ−感応性リガンド（リガンドＡ及びリガンドＢ）の自己組立体）でのｐＨ−依存的構造の変化挙動を示しており（挿入図：ｐＨ７．４、６．８及び５．５でのＰＭＮのＴＥＭと、平均直径が約７０ｎｍのｐＨ７．４でのＰＭＮのコロイド状の分散液に対するＤＬＳの測定値）、（ｂ）はＰＭＮでのｐＨ−依存的構造の変化及び関連する磁気／光活動性の変化を示す概念図であり、（ｃ）は１時間の培養後にＰＭＮ（０．１ｍｇ／ｍＬ）のゼ−タ電位やＤＬＳの測定値をｐＨの関数として示したものである（ＤＬＳの測定は、材料の屈折率２．４２、溶媒の屈折率１．３３（水）及び粘度０．８８７２を使用して実行された）。
【図６】ｐＨ−非感応性のナノ粒子の組立体（ｐＨ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＩｎＳ−ＮＰ））の数に応じた大きさの分布（図６（ａ））や強さ（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）による大きさの分布（図６（ｂ））及びｐＨ７．４でのＩｎＳ−ＮＰの相関関係のデ−タ（図６（ｃ））を示している。
【図７】（ａ）は、選択されたｐＨ値で測定されたＰＭＮ懸濁液の透過率を示し（挿入図は転移ｐＨが約６．０のＰＭＮ溶液のｐＨ−依存的濁度に対するデ−タを示している。ｐＨを４．０で７．５まで（●）、そして７．５で４．０まで（○）漸進的に変化させた）、（ｂ）は、自己組立されたリガンド（１）及びＰＭＮ（２）のｐＨ−依存的蛍光強度や近赤外線の蛍光写真であり、（ｃ）は、自己組立されたリガンド（１）及びＰＭＮ（２）のｐＨ−依存的一重項酸素発生を示し、（ｄ）は、３つの異なったｐＨ値でＰＭＮの濃度勾配による光学、蛍光及びＭＲ（臨床１．５  Ｔ  ＭＲＩスキャナーで検出）写真であり、（ｅ）は、ＰＭＮのｐＨ−依存的な自己弛緩特性を見せている。
【図８】ＰＭＮ及び３ｎｍ−の大きさのＥＳＩＯＮ（ｅｘｔｒｅａｍｅｌｙ  ｓｍａｌｌ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に対するＸＲＤ（Ｘ線回折）パタ−ンを示す。
【図９】ＰＭＮの磁気的特性を示す。（ａ）は、２０ｋＯｅないし−２０ｋＯｅの磁場の間でのＰＭＮのＭ−Ｈ曲線であり、（ｂ）は、１００Ｏｅの下で温度が３００Ｋないし４Ｋまで変わるときのＰＭＮのＭ−Ｔ曲線である。
【図１０】３つの異なるｐＨ値でＩｎＳ−ＮＰの濃度勾配に対するＭＲファントム映像である。
【図１１】（ａ）は、ｐＨ７．４または６．８で（４時間培養）流動細胞分析法と分析したＨＣＴ１１６の癌細胞に対するＰＭＮ（１μｇ／ｍＬ  Ｃｅ６（ｃｈｌｏｒｉｎＥ６）と同等）の細胞の吸収を示し（挿入図はｐＨ７．４及び６．８で（４時間培養）他の濃度のＰＭＮで処理したＨＣＴ１１６癌細胞の近赤外線蛍光映像を示す）、（ｂ）はＨＣＴ１１６癌細胞内で活性化されたＰＭＮの共焦点顕微鏡の写真（エンドソームソ−ム／リソソームは、選択的にリソソームを標識したリソトゥ・ラッカーグリーンで染めた）であり、（ｃ）は、ＨＣＴ１１６癌細胞によるＰＭＮの吸収に対するバイオＴＥＭ（ＢｉｏＴＥＭ）の写真であり、（ｄ）及び（ｅ）はそれぞれレーザー調査がない場合（ｄ）、レーザー調査がある場合（ｅ）のＰＭＮと遊離されたＣｅ６に露出されたＨＣＴ１１６細胞のＭＴＴ分析結果であり、（ｆ）は、多様なＰＭＮの濃度（０、１２．５、２５、または５０ｇＦｅ／ｍＬ）のＰＭＮに４時間培養されたＨＣＴ１１６癌細胞ペレット（１×１０６ｃｅｌｌｓ）の蛍光（上部）及びＭＲ（下部）写真である。
【図１２】（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＨＣＴ１１６腫瘍を含むヌ−ドマウスにＰＭＮまたはＩｎＳ−ＮＰを静脈注射（２ｍｇＦｅ／ｋｇ）する前及び１時間後、又は２時間後の腫瘍部位の生体内Ｔ１−加重ＭＲ写真やカラーマップされた（ｃｏｌｏｒ−ｍａｐｐｅｄ）写真であり、（点線領域は腫瘍の位置を示す）、（ｃ）は、ＰＭＮ及びＩｎＳ−ＮＰの注射後、信号強度の向上（ＲＯＩｉ／ＲＯＩ０）対時間のプロットであり、（ｄ）は、ヌ−ド・マウスでＰＭＮ及びＩｎＳ−ＮＰに対する血液循環デ−タ（プラズマ鉄の濃度ｖｓ時間）、（挿入図を参照：各グループ当たりｎ＝３）で、（ｅ）は、静脈注射１２時間後ＨＣＴ１１６腫瘍内で、ＰＭＮがＩｎＳ−ＮＰに比べて２倍以上増加することを示すＩＣＰ−ＡＥＳ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ａｔｏｍｉｃ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＩＣＰ−ＡＥＳ）分析結果であり、（ｆ）は、ＰＭＮ、ＩｎＳ−ＮＰまたは遊離されたＣｅ６（０．２ｍｇ／ｋｇＣｅ６と同等）の静脈注射後ＨＣＴ１１６腫瘍を含むヌ−ド・マウスの生体内ＮＩＲ映像であり、（ｇ）は、ＰＭＮの静脈注射後、ヌ−ド・マウスの腫瘍組織で腫瘍細胞によるＣｅ６の吸収を示す共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）の写真である（点線領域は腫瘍の位置を示す）。
【図１３】（ａ）は、治療してから２４時間後に抽出された長期の蛍光写真であり、（ｂ）は、これに相応する測定された信号強度である。
【図１４】（ａ）は、ＰＭＮ-ベースの標的化された光力学的治療を示す写真であり、（ｂ）は、同種 及び異質の腫瘍でＰＭＮ及びＩｎｓ―ＮＰのＰＤＴ効能についての例示及び比較であり、（ｃ）は、ＳＤＦ―１、Ｐ―ｇｐ及びＣＤ３１についた異質の腫瘍の免疫組織化学的染色を示し、（ｄ）は、ＰＤＴ活性化前及び後の同種ＨＣＴ１１６腫瘍を含むマウスの写真(上部)と細胞自滅による腫瘍細胞の死滅の側面で治療効果を決定するための腫瘍の組織断面に対するＨ＆Ｅ染色やＴＵＮＥＬ染色(下部)を示し、（ｅ）は、治療後4つの群での同種のＨＣＴ１１６腫瘍の嵩を示し、（ｆ）は、ＰＤＴ活性化前及び後の異質の腫瘍を含むマウスの写真(上部)と細胞自滅による腫瘍の細胞死滅の側面で治療効果を決定するためのＨ＆Ｅ染色やＴＵＮＥＬの染色を示し、（ｇ）は、治療後4つの軍での異質の腫瘍の嵩を示す。
【図１５】ＨＣＴ１１６腫瘍を含むマウス（１５ａ）や異質のＣＴ２６腫瘍を含むマウス（１５ｂ）に対するＰＤＴ治療をしている間の体重測定の結果を示す。
【図１６】（ａ）は、ＰＭＮまたはＰＢＳの緩衝液が投与されたヌードマウス（ｎ＝４）からアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギンさんアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、塩基性リン酸塩（ＡＬＰ）及びD-ラクテートジヒドロゼナーゼ（Ｄ−ＬＤＨ）に対する血清生化学の結果で、（ｂ）は、Ｈ＆Ｅで染色された心臓、腎臓、肝臓、肺や脾臓の組織学的検査の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、次の実施例または図面で発明をより具体的に説明する。しかし、次の実施例または図面に対する説明は本発明の具体的な実施態樣を特定して説明することを意図するのみであり、本発明の権利範囲をこれらに記載された内容に限定したり、制限解釈することを意図するものではない。
（実施例１．リガンドの合成）
ポリ（エチレングリコール）−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を鋳型として使用して、リガンドＡ及びリガンドＢを合成した（化３）。
【００３８】
【化３】
0006618680.tif 000004
ＰＥＧ−ＰＢＬＡを製造するために、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテートＮ−カルボキシ無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）（３ｇ、１２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）及びＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）混合物内、４０℃で末端の１級アミノ基のα−メトキシ−ω−アミノ−ポリ（エチレングリコール）（ＭＷ＝２，０００Ｄａ、２４０ｍｇ、１２０ｍｏｌ）から開始して重合した。ＰＥＧ−ＰＢＬＡをエーテル（３Ｌ）で３回沈殿させて精製した。ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｅ６（プラットフォームリガンド）を合成するために、Ｃｅ６を従来のカルボジイミド反応を通じて、ＰＥＧ−ＰＢＬＡのアミン基に付着した。前記ＰＥＧ−ＰＢＬＡ（０．５ｇ、３２．５ｍｏｌ）と、Ｃｅ６（２３．４ｍｇ、３９．０μｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（９．６ｍｇ、４６．８μｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５．４ｍｇ、４６．８μｍｏｌ）の混合物をＤＭＳＯ（５ｍＬ）にそれぞれ独立的に溶解し、前記溶液を縮合反応の前に３時間十分に撹拌した。次に前記二つの反応溶液を混合して室温で撹拌した。２４時間後、前記反応混合物を濾過して不溶性副産物（例えば、ジシクロヘキシルウレア）を除去し、２日間にわたって脱イオン水に透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ：分子量遮断の大きさ、ＭＷＣＯ：１，０００Ｄａ）。前記最終的な溶液を凍結乾燥し、プラットフォームのリガンドを得た。
【００３９】
１−（３−アミノプロピル）イミダゾール（ＡＰＩ）及びドーパミンとともに前記プラットフォームリガンドをアミノ分解してリガンドＡを合成した。ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｅ６（０．５g、１８．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させた後、２５℃の窒素雰囲気下で１時間ドーパミン（０．１ｇ、０．７ｍｍｏｌ）と反応させた。次に、ＡＰＩ（０．５ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を２５℃の窒素の下で添加し、４時間撹拌した。前記反応混合物を冷却された０．１Ｎ  ＨＣｌ（２０ｍＬ）の水溶液に滴下して、０．０１Ｎ  ＨＣｌ溶液に３回透析した（ＳｐｅＣＴｒａ／Ｐｏｒ；ＭＷＣＯ：１，０００Ｄａ）。前記最終的な溶液を凍結乾燥してリガンドＡを得た。
【００４０】
ＡＰＩ及び３−フェニル−１−プロピルアミン（ＰＰＡ）とともに前記プラットフォームリガンドをアミノ分解してリガンドＢを合成した。ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｅ６（０．５ｇ、１８．５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解した後、１時間２５℃の窒素の下でＰＰＡ（０．１ｇ、０．９ｍｍｏｌ）と反応させた。次に、ＡＰＩ（０．５ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を２５℃で窒素の下で添加し、４時間撹拌した。反応の後に、前記混合物を冷却された０．１Ｎ  ＨＣｌの水溶液（２０ｍＬ）を滴下して、０．０１Ｎ  ＨＣｌの水溶液に３回透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；ＭＷＣＯ：１，０００Ｄａ）。前記最終的な溶液を凍結乾燥してリガンドＢを得た。
【００４１】
プラットフォームリガンドについて１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）（図１）:δ＝９．７ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＣＨ＝  ｏｆ  Ｃｅ６），８．１ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＮＨ−），７．３ｐｐｍ（５Ｈ，ｓ，−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５−），５．０ｐｐｍ（２Ｈ，−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５−），４．６ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣ＝Ｏ），３．５ｐｐｍ（１８２Ｈ，ｓ，−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−  ｏｆ  ｍＰＥＧ），３．２ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３−  ｏｆ  ｍＰＥＧ）及び２．９−２．５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ２Ｃ＝Ｏ）。
【００４２】
リガンドＡについて１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）（図２）：δ＝７．８ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ＝Ｎ−  ｏｆ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ），７．７ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ＝ＣＨ−  ｏｆ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ），７．３ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＣＨＣＨ＝Ｎ−  ｏｆ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ），６．６−６．５ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，−ＣＨ２＝ＣＨＣＨ−  ａｎｄ  −ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−  ｏｆ  ｄｏｐａ），６．４ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，＝ＣＨＣＯ−  ｏｆ  ｄｏｐａ），４．５ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨＣ＝Ｏ−），４．２ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，＝ＮＣＨ２ＣＨ２），３．５ｐｐｍ（１８２Ｈ，ｓ，−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−  ｏｆ  ｍＰＥＧ  ｃｈａｉｎ），３．０ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−），及び２．８−２．５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ２Ｃ＝Ｏ）。
【００４３】
リガンドＢについて１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）（図３）：δ＝７．８ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＮＣＨ＝Ｎ−  ｏｆ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ），７．７ｐｐｍ（１Ｈ，s，−ＮＣＨ＝ＣＨ−  ｏｆ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ），７．３ｐｐｍ（１Ｈ，ｓ，−ＣＨＣＨ＝Ｎ−  ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｉｎｇ），７．３−７．２（５Ｈ，ｍ，−ＣＨ２Ｃ６Ｈ５−  ｏｆ  ＰＰＡ），４．５ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ， −ＮＨＣＨＣ＝Ｏ−），４．２ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，＝ＮＣＨ２ＣＨ２），３．５ｐｐｍ（１８２Ｈ，ｓ，−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−  ｏｆ  ｍＰＥＧ  ｃｈａｉｎ），３．０ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−），及び２．８−２．５ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ，ＣＨＣＨ２Ｃ＝Ｏ）。
【００４４】
ＧＰＣ測定で（図４）、すべての高分子リガンドは単峰形（ｕｎｉｍｏｄａｌ）の分子量分布を示したが、これは共重合体生成物内に同種の重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）残基がないことを示す。前記リガンドのＣｅ６の含有量を蛍光分光法（λｅｘ＝６５０ｎｍ及びλｅｍ＝６７５ｎｍ、表１）で確認した。
【００４５】
【表１】
0006618680.tif 000005
（実施例２．ＥＳＩＯＮの合成）
ＥＳＩＯＮを、以前に報告された方法（Ｋｉｍ，Ｂ．Ｈ．；Ｌｅｅ，Ｎ．；Ｋｉｍ，Ｈ．；Ａｎ，Ｋ．；Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｉ．；Ｃｈｏｉ，Ｙ．；Ｓｈｉｎ，Ｋ．；Ｌｅｅ，Ｙ．；Ｋｗｏｎ，Ｓ．Ｇ．；Ｎａ，Ｈ．Ｂ．；Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｇ．；Ａｈｎ，Ｔ．Ｙ．；Ｋｉｍ，Ｙ．Ｗ．；Ｍｏｏｎ，Ｗ．Ｋ．；Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｈ．；Ｈｙｅｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１、１３３、１２６２４）を使用してオレイルアルコール存在下でアイロン−オレアート錯化合物の熱分解を通じて合成した。簡単に、１．８ｇのアイロン−オレアート錯化合物（２ｍｍｏｌ）、０．５７ｇのオレイン酸（２ｍｍｏｌ）及び１．６１ｇのオレイルアルコール（６ｍｍｏｌ）を室温で１０gのジフェニルエーテルに溶解させた。前記混合物を１０℃／ｍｉｎの一定の昇温速度で２５０℃に加熱した上で、不活性大気の下で３０分間、前記温度を維持した。前記反応が進むことによって、初期の褐色透明な溶液が黒い色に変わった。前記反応後、ナノ粒子を含有する前記混合物を加熱器から外して室温で冷却した後、５０ｍＬのアセトンを添加し、前記ナノ粒子を沈殿させた。前記ナノ粒子を４時間４０，０００ｒｐｍで遠心分離してペレット化し、前記上澄液をデカント（ｄｅｃａｎｔ）しており、前記ナノ粒子をｎ−ヘキサンまたはクロロホルムに再分散させた。
（実施例３．ＰＭＮの製造）
自己組立のために、１５ｍｇのリガンドＡ及び１５ｍｇのリガンドＢをＤＭＳＯ３ｍＬ内で混合して製造した溶液を、５ｍＬのクロロホルム内のコロイド状のＥＳＩＯＮ（０．４ｍｇのＦｅ／ｍＬ）にゆっくりと添加した。前記混合物を３０分間、室温で振盪培養（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ  ｏｎ  ａ  ｓｈａｋｅｒ）した。次に、クロロホルムを真空下に蒸発させて完全に除去し、全体量が５ｍＬになるまでＤＭＳＯ内の前記コロイド状の懸濁液に脱イオン水を添加した。透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；ＭＷＣＯ：１２，０００Ｄａ）を使用し、前記ＤＭＳＯを脱イオン水に完全に置換させた。余剰のリガンドを遠心分離して除去し、スピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ:１００，０００Ｄａ、１０，０００、１０分）で３回ないし５回洗浄した。こうして生成されたナノ粒子を水に再分散させた。
（実施例４．自己組立リガンドの製造）
３ｍＬのＤＭＳＯに１５ｍｇのリガンドＡ及び１５ｍｇのリガンドＢの混合溶液を５ｍＬのクロロホルムにゆっくりと添加した。前記混合物を３０分間、室温で振盪培養した。以後、クロロホルムを真空下で蒸発させて完全に除去した。その後、全体量が５ｍＬになるまでＤＭＳＯ内のコロイド状の溶液に脱イオン水を添加した。ＤＭＳＯを透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；ＭＷＣＯ：１２，０００Ｄａ）を使用して脱イオン水に完全に置換させた。余剰のリガンドを遠心分離して除去し、スピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ：１００，０００Ｄａ、１０，０００、１０ｍｉｎ）で３回ないし５回洗浄した。こうして生成されたナノ粒子を水に再分散させた。
（実施例５．ｐＨ−非感応性ナノ粒子組立体（ＩｎＳ−ＮＰ）の製造）
３ｍＬのＤＭＳＯに３０ｍｇのプラットフォームリガンドを混合して製造された溶液を、５ｍＬのクロロホルム内のコロイド状のＥＳＩＯＮ（０．４ｍｇのＦｅ／ｍＬ）懸濁液にゆっくりと添加した。前記混合物を３０分間、室温で振盪培養した。次に、クロロホルムを真空下に蒸発させて完全に除去した。その後、全体量が５ｍＬになるまでＤＭＳＯ内のコロイド状の溶液に脱イオン水を添加した。ＤＭＳＯを透析膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ；ＭＷＣＯ：１２，０００Ｄａ）を使用して脱イオン水に完全に置換させた。余剰のリガンドを遠心分離して除去し、スピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＷＣＯ：１００，０００Ｄａ、１０，０００、１０分）で３回ないし５回洗浄した。こうして生成されたナノ粒子を水に再分散させた。
（実施例６．材料の特性分析）
ＴＥＭ測定は２００ｋＶで作動するＪＥＯＬ  ＥＭ−２０１０顕微鏡で遂行した。粉末Ｘ線回折パタ−ンを回転陽極及びＣｕ  Ｋα放射線源（λ＝０．１５４１８ｎｍ）を備えたＲｉｇａｋｕ  Ｄ／Ｍａｘ−３Ｃ回折分析器で得た。本発明者たちはＩＣＰＳ−７５００分光器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を使用する誘導結合プラズマ発光分光分析（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ａｔｏｍｉｃ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、ＩＣＰ−ＡＥＳ）及び誘導結合プラズマ光学的放出分光計（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ＩＣＰ−ＯＥＳ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  ４３００  ＤＶ）で元素分析を遂行した。ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ吸収スペクトルはＵＶ−２４５０分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）で収集した。粒径及びゼ−タ電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）で測定した。大きさデ−タ分析のために、素材屈折率（２．４２）、素材の吸光度（０．２）、分散剤屈折率（１．３３）、及び分散剤粘度（０．８８７２）を使用した。磁気的特性は超伝導光子干渉法（ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｄｅｖｉｃｅ、ＳＱＵＩＤ）磁力計（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｅｓｉｇｎ  ＭＰＭＳ  ＸＬ）を使用して調査した。水力学的大きさは２５℃で動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）機器を使用して、獲得した。
（実施例７．臨界凝集濃度（CAC）の測定）
２回蒸留された蒸留水内のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２保存液（１．４×１０−３Ｍ）を製造し、４℃で保存した。１．０×１０−３ｍｇ／ｍＬないし１．０ｍｇ／ｍＬの濃度で前記Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を試料を含有する溶液と混合した。各試料溶液内のＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２の最終濃度は７．０×１０−４Ｍだった。それぞれλｅｘ＝３５５ｎｍ及びλｅｍ＝４５７ｎｍのＲＦ−５３１０ＰＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｊａｐａｎ）を使用して蛍光を測定し、スリット幅はそれぞれｅｘ＝３ｎｍ及びｅｍ＝３ｎｍだった。
（実施例８．他のｐＨでＰＭＮの透過率の測定）
ＰＭＮ溶液（２ｍｇ／ｍＬ、Ｃｅ６付着なし）の光透過率の測定値を５００ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を使用して獲得し、そのとき０．１Ｎ塩酸を添加して溶液のｐＨ値が７．５から４．０に徐々に減少し、０．１Ｎ  ＮａＯＨの溶液を添加し、前記溶液のｐＨを４．０から７．５に増加させた。
（実施例９．ｐＨ−依存的蛍光強度の測定）
ＰＭＮまたは自己組立リガンド（２ｍｇ／ｍＬ、６５０ｎｍの励起及び６７５ｎｍの放出）の蛍光強度を、０．１Ｎ塩酸溶液を添加して溶液のｐＨを７．５から４．０に徐々に減少させながら、蛍光プレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ））を使用して測定した。
（実施例１０．ｐＨ−依存的一重項酸素の生成（ＳＯＧ）の測定）
ＳＯＧ（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を評価するため、他のｐＨの試料（２ｍｇ／ｍＬ、１００μＬ）を一重項酸素センサーグリーン（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｅｎｓｏｒ  ｇｒｅｅｎ（ＳＯＳＧ）、２．０μＭ、１００μＬ）と混合した。４分間５ｍＷ／ｃｍ２強度で、６７０ｎｍのレーザー源（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）してＳＯＧを誘導した。試料のＳＯＧを決定するための照射後ＳＯＳＧ蛍光を検出した（λｅｘ＝４９４ｎｍ、λｅｍ＝５３４ｎｍ）。ＳＯＳＧ蛍光の増加とバックグラウンドの比較により、ＳＯＧを評価した。
（実施例１１．細胞培養）
ＨＣＴ１１６（人間の結腸癌、ＫＣＬＢ  Ｎｏ．１０２４７）細胞、ＣＴ２６（マウスの結腸直腸癌種の細胞、ＫＣＬＢ  Ｎｏ．８０００９）及びＭ２−１０Ｂ４（マウスの骨髄間質細胞、ＫＣＬＢ  Ｎｏ．２１９７２）を韓国細胞銀行（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）から得た。ＨＣＴ１１６細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加された１０ｍＬのＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ−１６４０）培地で培養した。ＣＴ２６細胞を、１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で培養した。Ｍ２−１０Ｂ４を、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０の培地で培養した。すべての細胞の培養条件は３７℃、湿度１００％及びＣＯ２５％だった。２４時間、ＣＴ２６細胞に露出されるＤＯＸの投与量を増加（１、５、１０、２５、５０、１００、５００、１０００、及び５０００ｎｇ／ｍＬ）した後、次の投与量に露出される前に３日ないし４日の回復期間を与え、薬物耐性ＣＴ２６細胞（ＣＴ２６／ＭＤＲ）を成長させた。次に、ＣＴ２６／ＭＤＲを冷凍させ、液体窒素に保存した。ＣＴ２６／ＭＤＲの新しい分割量（ｆｒｅｓｈ  ａｌｉｑｕｏｔｓ）を全ての実験に使用して薬物敏感性表現型（ｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に転換されないようにした。
（実施例１２．ｐＨ−依存的細胞吸収（cell uptake））
ＨＣＴ１１６細胞を他のｐＨでＰＭＮ、ＩｎＳ−ＮＰ及びＣｅ６に露出させ、それぞれの細胞の吸収を確認した。前記細胞を２時間培養し、洗浄し、収穫した後、ＤＰＢＳに再懸濁させた。試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞の吸収を流動細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して定量した。各試料１０，０００細胞（ゲ−トイベント（ｇａｔｅｄ  ｅｖｅｎｔｓ））を計数し、遊離したＣｅ６の蛍光をログ設定（ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ  ｓｅｔｔｉｎｇ）（ＦＬ４；λｅｍ＝６７０ｎｍ）で検出した。これらの蛍光（ＦＬ４）が非処理細胞の懸濁液の細胞蛍光に比べて高いと、細胞を陽性と計数した。各実験をＣＸＰ分析プログラムを使用して統計的に分析した。
（実施例１３．共焦点レーザー走査顕微鏡）
共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ；Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して蛍光映像化を遂行した。１２０μｍの最適のピンホ−ル（ｐｉｎｈｏｌｅ）サイズを選定して、焦点平面の上と下の焦点はずれ（ｏｕｔ−ｏｆ−ｆｏｃｕｓ）平面で放出された蛍光を排除した。励起／放出、波紋はＤＡＰＩについて３４０／４８８ｎｍ、ＦＩＴＣについて４９０／５２０ＮＭ、ＲＩＴＣについて５５５／５７８ｎｍそしてＣｅ６について６５０／６７０ｎｍであった。蛍光映像をＬＳＭ  Ｉｍａｇｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｚｅｉｓｓ）を使用して分析した。
（実施例１４．細胞ＭＲ映像化）
ＰＭＮによって細胞を標識するために、ＨＣＴ１１６細胞を１０ｍＬの培地の培養皿に接種し、一夜にかけて成長させた。次いで、０、１２．５、２５及び５０ｍｇ／ｍＬのＰＭＮを添加した。４時間後、前記細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡを添加して分離させた。遠心分離後、細胞を培養培地に分散させ、１．５ｍＬの試験管に移した。５分間、１，０００ｒｐｍで遠心分離して細胞ペレットを製造した。Ｔ１−加重ＭＲ映像を１．５  Ｔ  ＭＲスキャナー（Ｓｉｇｎａ  Ｅｘｃｉｔｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のヘッドコイルを使用して、獲得した。
（実施例１５． 薬物動態分析）
血漿濃度−時間の実験のため、マウスの尾静脈を通じてＰＭＮ及びＩｎＳ−ＮＰをそれぞれ（２ｍｇのＦｅ／ｋｇ）注射した。前記注射後１分、３０分、１時間、３時間、８時間及び２０時間で血液を収集した。１０分間、１，０００ｒｐｍで遠心分離して赤血球から血漿を分離した。その後、各血液試料用血漿（１００μＬ）を１２時間室温で７０％硝酸（１ｍＬ）と混合した後、遠心分離（５分、１０，０００ｒｐｍ）し、上澄液を２％硝酸で５倍希釈した後に誘導結合プラズマ発光分光分析（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＩＣＰ−ＯＥＳ、Ｏｐｔｉｍａ  ４３００  ＤＶ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に使用した。ＰＭＮまたはＩｎＳ−ＮＰ（２ｍｇＦｅ／ｋｇ）を注射してから１２時間後に前記腫瘍の鉄の吸収を測定した。切開した腫瘍組織の重さを測定して、均質化しており、シンチレーション混合物（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅ）で処理した。多量の６０％硝酸を各試料に添加し、組織を６０℃で２４時間培養した後、前記溶液を３０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄液を２％硝酸で１０倍希釈した。腫瘍内鉄吸収量の測定をＩＣＰ−ＯＥＳで遂行し、腫瘍内の前記ナノ粒子の吸収をｇＦｅ／ｇ組織で計算した。
（実施例１６．免疫組織化学）
腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリンに固定し、５ミクロンの厚さでスライスして冷凍切開した。ＳＤＦ−１及びＰ−ｇｐを抗−ＳＤＦ−１抗体（ａｂｃａｍ）及び抗−Ｐ−糖蛋白質抗体（ａｂｃａｍ）で免疫標識（ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌ）し、以後、追加で共焦点レーザー走査顕微鏡の分析をするため、前記試料をＲＩＴＣ（λｅｘ／λｅｍ、５５５／５７８ｎｍ）またはＦＩＴＣ（λｅｘ／λｅｍ、４９０／５２０ｎｍ）が接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）二次抗体を使用して室温で６０分間、培養した。
（実施例１７．腫瘍組織学）
組織学的分析のために、対照群及び処理されたマウスの腫瘍組織を１０％中性緩衝ホルマリンに固定し、５ミクロンの厚さでスライスして冷凍切開し、ヘマトキシリン・エオシン（ｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ）で染色し、ＴＵＮＥＬ法で標識化し、デジタル顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＱＷｉｎ）及び共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ；Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査した。
（実施例１８．ＰＭＮの生体内での毒性評価）
健康なヌ−ドマウスにＰＭＮまたは生理食塩水（対照群）の懸濁液を静脈注射した。２週間後、前記マウスを犠牲にし、主要臓器を収集した。心臓、肝臓、脾臓、腎臓 及び肺をＨ＆Ｅで染色した。ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ及びＤ−ＬＤＨの試薬キットを、眼球摘出によって採取した血液から分離した血清を分析するために使用した。
（実施例１９．試験管内での細胞吸収）
腫瘍細胞のＰＭＮの吸収を、他のｐＨ条件（ｐＨ７．４及び６．８）で、ＫＯＤＡＫ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４０００  ＭＭ；Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡ）及び流動細胞分析機（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してモニタリングした。ＨＣＴ１１６細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を３７℃、ＲＰＭＩ−１６４０の培地（ｐＨ７．４または６．８、１％のペニシリンとストレプトマイシン添加）で２時間の間、各試料と一緒に培養した上で分析した。顕微鏡観察中の光脱色（ｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ）を改善するために、アンチ−フェードマウンティングソリューション（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（５％Ｎ−プロピルガレート、４７．５％グリセリン、及び４７．５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４）の一滴を前記細胞に添加した。
（実施例２０．生体内での研究）
すべての生体研究はアメリカ合衆国国立保健院（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が出版したｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．８５−２３、１９８５、ｒｅｖｉｓｅｄ  １９９６）を受けて、韓国カトリック大学（Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ｏｆ  Ｋｏｒｅａ）のＩＡＣＵＣ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）から承認されたプロトコルのガイドラインのもとにマウスを保存した。
（実施例２１．ｐＨ−感応性磁気ナノ組成物（ＰＭＮ）の特性）
本発明はＣｅ６がグラフティングされたポリ（エチレングリコール）−ポリ（−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ｃｅ６）を合成して、側面のベンジルエステル基が求核攻撃を通じて第一級アミンと直ちに反応するプラットフォームリガンドを提供した。イミダゾール（ｐＫａ＝約６．８）はイオン化される官能基として容易に統合され、腫瘍の微細環境にｐＨ感応性を付与した。このようなプラットフォームに基づいて、二つのリガンド誘導体：リガンドＡ及びＢを追加で設計した。リガンドＡについて、カテコール基 （ｃａｔｅｃｈｏｌ  ｇｒｏｕｐ）を追加することによって自己組立（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を容易にしたが、これは前記カテコール基が酸化鉄ナノ粒子に対する高親和力アンカー（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｃｈｏｒ）として作用することができるからである。これと対照的に、３−フェニル−１−プロピルアミンを使用してリガンドＢの疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を調節して、約５．５の腫瘍エンドソーム／リソソームのｐＨによって活性化されるＰＭＮの臨界相転移（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｐｈａｓｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を生成した。ＥＳＩＯＮ、リガンドＡ及びリガンドＢの共組立（ｃｏａｓｓｅｍｂｌｙ）によって前記ＰＭＮを製造した（化４）。
【００４６】
【化４】
0006618680.tif 000006
ＥＳＩＯＮ（約３ｎｍ）が前記リガンドのペプチドブロックの水力学的大きさ（約６０個の残基；約２０ｎｍ長さ）より非常に小さいために、カテコールが固定された（ｃａｔｅｃｈｏｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）リガンドＡがＥＳＩＯＮの側面を取り囲むことが可能だった。したがって、前記機能化がＥＳＩＯＮをコロイド状のマグネト−コアシェル（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｍａｇｎｅｔｏ−ｃｏｒｅ  ｓｈｅｌｌ）構造体の内部に誘導し自己組立されることを可能にするために、このような機能化されたＥＳＩＯＮは従来の両親媒性二重ブロック共重合体（ｄｉｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）の高分子−金属類似体（ｐｏｌｙｍｅｒ−ｍｅｔａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅ）として見なしうる（化５）。そして、前記疎水性コアはＥＳＩＯＮと、腫瘍−感知高分子リガンドの疎水性ブロックで構成される。
【００４７】
【化５】
0006618680.tif 000007
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）の写真（図５ａ）によると前記ＰＭＮの粒子の大きさは約６０ｎｍだった。前記ＰＭＮは水によく分散されており、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定された水力学的直径は７０±５ｎｍであることが明らかになっており（図５ａ）、これは受動性腫瘍標的化（ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）のための透過度の増加及び保有の効果（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ）ｅｆｆｅｃｔ）に適合する。対照群として、ＥＳＩＯＮ及びプラットフォームリガンドを組み立ててｐＨ−非感応性ナノ粒子組立体（ｐＨ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＩｎＳ−ＮＰ）を製造し、（図６）、これはＰＭＮと大きさが類似した。
【００４８】
本発明の新たなリガンド設計は、細胞吸着及び侵入の増加だけでなく、ＰＭＮのエンドソーム／リソソームのｐＨ依存的治療診断活動のために、２段階のｐＨ活性化を可能にして腫瘍の周辺で表面電荷逆転（ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｈａｎｇｅ  ｒｅｖｅｒｓａｌ）を誘導した。このようなｐＨ依存的構造的変化（ｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を図５ｂに概略的に示した。まず、ＰＭＮはｐＨ７．４に弱い陰電荷を出す。前記腫瘍環境内のｐＨの低下は、膨潤の原因となる前記錯化合物の極性を逆転させるイミダゾールのイオン化を増加させ（図５ｃ）、これで隣接したアニオン性細胞との静電気的相互作用によってペイロ−ド伝達（ｐａｙｌｏａｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）及び細胞内在化（ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が向上する。内在化が起きると、エンドソームのｐＨが５．５ないし６．０に減少することによって、粒子がさらにイオン化される。この時点でＰＭＮのコアの疎水性相互作用は弱まり、前記イオン化されたユニマー（ｕｎｉｍｅｒ）は、互いに反発して、ＤＬＳ（図５ｃ）及びＴＥＭ（図５ａ）で確認されたとおり、完全に分離される。酸塩基滴定は（図７ａ）ｐＨ５．５ないし６．０の臨界のｐＨ区間で透過率（％Ｔ）の急激な下落を見せた。ｐＨが再び増加した時、％Tの回復はヒステリシス現象を見せ（ｈｙｓｔｅｒｅｔｉｃ）、したがってこれは可逆的なｐＨ依存的組み立て／分離（ａｓｓｅｍｂｌｙ／ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）過程を見せてくれる。結論的に、ＰＭＮの光活動性（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｉｔｙ）、つまり一重項酸素の発生（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＳＯＧ）及び蛍光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）によってｐＨ７．４で消滅される。ｐＨ＜６で、分離されれば、前記光活動性は急激に回復し、これは他の自己組立された高分子リガンドで観察されたところと似ている（図７ｂ及び７ｃ）。興味深いことに、ＰＭＮは自己組立高分子リガンドより２倍もっと低い臨界凝集濃度（約０．０１ｍｇ／ｍＬ）を示したが、これは改善されたコロイド安定性を示す高分子鎖エンタングルメント（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎ  ｅｎｔａｎｇｌｅｍｅｎｔ）のためのものとみられる。
【００４９】
ＰＭＮのＸ線回折（Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＸＲＤ）のパタ−ンはＥＳＩＯＮと類似し、（図８）、ＰＭＮはスピン傾斜効果（ｓｐｉｎ−ｃａｎｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）のために弱い磁化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）を見せている（図９）。水でＰＭＮのｐＨ−依存的構造の変化は、量子の緩みに影響を与えるものと予想される。ＥＳＩＯＮの表面上の五つの─電子（Ｓ＝５／２）を持った多数の高スピン鉄イオン（ｈｉｇｈ−ｓｐｉｎ  Ｆｅ（ＩＩＩ）を考慮すると、Ｆｅ３＋種と水の直接的な配位（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）はＰＭＮの垂直弛緩度（ｒ１）に対する主な原因である。他のｐＨ値（同じ鉄の濃度）で、ＰＭＮのＴ１  ＭＲファントム（ｐｈａｎｔｏｍ）の強度変化は対応する蛍光映像化の結果とよく合った（図７ｄ）。ＰＭＮはｐＨ７．４で、４３．９５ｍＭ−１・ｓ−１の水平弛緩度（ｒ２）と３．３０ｍＭ−１・ｓ−１のｒ１を示し、ｐＨが７．４から５．５に減少することによってｒ１−増加及びｒ２−減少を伴うことが観察された（図７ｅ）。これはｐＨが減少し、リガンドが量子化されて親水性を得たと推定される。結果的に、配位された水分子数とＦｅ３＋との配位持続時間は増加する。さらに、ｐＨ−誘導分離（ｐＨ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）が起きつつ、分離されたＥＳＩＯＮは、初期のＰＭＮに比べてさらに低いｒ２を見せている。造影効果（ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｅｆｆｅｃｔ）の効率が弛緩度（ｒ１）を通じて評価されるが、過度に高いｒ２がＴ１の造影剤としての使用を排除させることができるため、前記ｒ２／ｒ１の比率も陽性Ｔ１映像化（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ１  ｉｍａｇｉｎｇ）で重要な役割を果たす。ｐＨが減少することによって、ＰＭＮのｒ２／ｒ１の比率はｒ２によって著しく減少する。最後に、ＰＭＮはｐＨ５．５で、３．８７ｍＭ−１・ｓ−１の特定ｒ１値及び５．８の低いｒ２／ｒ１の比率を持ち、これはＴ１−加重映像化（Ｔ１−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）で明るい信号（ｂｒｉｇｈｔ  ｓｉｇｎａｌ）に表示される。したがって、ｐＨ７．４でＰＭＮの陽性Ｔ１  ＭＲ造影（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ１  ＭＲ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）は暗光となったが、ｐＨ５．５で大きく回復しており、これはＰＭＮが酸性腫瘍領域に対する敏感なＴ１  ＭＲ映像化（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｔ１  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ）に使用することができることを意味する。反面、ＩｎＳ−ＮＰのＭＲ造影はｐＨに依存しなかった（図１０）。本発明者らが知っていることによると、これは腫瘍ｐＨ−感応性Ｔ１  ＭＲ映像化に使用されるｐＨ−感応性Ｔ１の造影を示す生体適合性酸化鉄ナノ粒子に対する最初の実例である。Ｇｄ３＋−ベースＴ１造影剤もｐＨ刺激に反応するよう設計される可能性はあるが、Ｇｄ３＋は一般的に短かった血液半減期を持って、高解像度の腫瘍映像化のための腫瘍内の蓄積を妨害する。さらに、Ｇｄ３＋−ベースの造影剤は潜在的に毒性がありうるし；ガドリニウム含有の造影剤を使用した心不全患者から深刻な副作用が観察されたことによって、米国ＦＤＡは最近、Ｇｄ３＋−ベースのＭＲの造影剤と腎性全身性線維症（ｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＮＳＦ）について警告した。このような副作用が患者の５％未満で発生する非常にまれな場合にも、本発明者たちは酸化鉄ナノ粒子が生物学的及び代謝的にさらに親和的な代案を提供できると信じている。酸化鉄ベースのＰＭＮの製造に生分解性高分子ペプチドを使用すると、最終生成物がもっと長い血液半減期を持って、臨床的な翻訳（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）のため、さらに大きな生体適合性を持つようにする。
（実施例２２．試験管内及び生体内でのＭＲＩ）
Ｌｉｔｚ  Ｃｏｉｌ（直径、１００ｍｍ；長さ、８５ｍｍ;ＤＯＴＹ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用する１．５  Ｔ  ＭＲスキャナー（Ｓｉｇｎａ  Ｅｘｃｉｔｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＭＲＩ検査を遂行した。室温の他のｐＨ値の培地内で、他の濃度のＰＭＮに対して、高速スピンエコー（ｆａｓｔ  ｓｐｉｎ  ｅｃｈｏ、ＦＳＥ）シークエンスを使用してスピン−格子及びスピン−スピンの弛緩時間（Ｔ１及びＴ２）を測定した。Ｔ１を測定するために、、視界（Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｖｉｅｗ、ＦＯＶ）は７５×７５ｍｍ、スライス厚（ＳＬ）＝３ｍｍ、エコー時間（ＴＥ）＝９．３ｍｓそして反復時間（ＴＲ）＝５０５．２、５２５．０、５４５．０、５６５．０、５８５．０、６０５．０、６２５．０、６４５．０、６６５．０、６８５．０、７０５．０、７３０．０、７５５．０、８０５．０、８５５．０、９０５．０、９５５．０、１００５．０、１０５５．０、１１０５．０ｍｓに設定した。Ｔ２測定のため、次のようなパラメータが使用された：ＦＯＶ＝１００ｍｍ＊１００ｍｍ、ＳＬ＝３ｍｍ、ＴＲ＝４０００ｍｓ、ＴＥ＝１０．９、２１．７、４３．５、５４．４、６５．２、８７．０、１１９．６、１４１．３、１６３．１、１７４．０ｍｓ。垂直弛緩度（ｒｅｌａｘｉｖｉｔｉｙ）（Ｒ１）及び水平弛緩度（Ｒ２）をｒｉ＝（１／Ｔｉ１／Ｔｉ０）／ｃから計算し、前記ｃはｍＭ単位のＰＭＮの鉄の濃度であり、Ｔｉは、濃度ｃでの弛緩時間であり、Ｔｉ０は水の弛緩の時間で、Ｔ１及びＴ２についてｉは１及び２である。ＦＳＥシークエンス（ＦＯＶ＝１００ｍｍ＊１００ｍｍ、ＳＬ＝３ｍｍ）を使用して細胞ＭＲ映像を得た。Ｔ１を測定するために、ＴＲ＝４００ｍｓ及びＴＥ＝１０ｍｓが使用されたが、Ｔ２測定のためにはＴＲ＝４０００ｍｓ及びＴＥ＝８６．７２ｍｓが使用された。生体内での腫瘍のＭＲ診断のため、２ｍｇＦｅ／ｋｇ体重の投与量でＰＭＮを尾静脈に注射した。次に、マウスを１．５  Ｔ  ＭＲスキャナー（Ｓｉｇｎａ  Ｅｘｃｉｔｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に位置させており、ＦＳＥシークエンスは、次のパラメータを使用した：ＦＯＶ＝９０ｍｍ×９０ｍｍ、ＳＬ＝２ｍｍ、フリップ角（ＦＡ）＝９０°、Ｔ１  ＭＲ映像化についてＴＲ＝４００ｍｓ、ＴＥ＝１０ｍｓ、及びＴ２  ＭＲ映像化についてＴＲ＝３０００ｍｓ、ＴＥ＝１０１ｍｓ。横断面の映像を得、Ｏｎｉｓ  Ｄｉｃｏｍ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＤｉｇｉｔａｌＣｏｒｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用して分析した。
【００５０】
ＰＭＮは、蛍光及び流動細胞計測法（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によって立証（１１ａ）されたとおり、ｐＨ７．４よりｐＨ６．８でより高い細胞の吸収を示した。これと対照的に、Ｃｅ６及びＩｎＳ−ＮＰはｐＨ変化に影響を受けなかった。細胞の吸収のために、ＴＥＭ（１１ｃ）で酸化鉄ナノ粒子を調査し、前記酸化鉄ナノ粒子はエンドソームに吸収された。また、共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）を使用してＣｅ６染料を調査しており、（図１１ｂ）、ＰＭＮの蛍光はリソトラッカーグリーン（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ）の蛍光と完璧に融合された。前記Ｃｅ６信号の存在は、ＰＭＮがエンドソーム内で蛍光非消失（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）のために実際に分離されたということを暗示する。
【００５１】
結果的に、ＰＭＮは闇の中では細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を見せなかったが、（図１１ｄ）、ｐＨ６．８で照明の下ではＣｅ６に比べてより効率的に細胞死滅を誘導した（図１１ｅ）。ＰＭＮに表示できた人間の大腸癌（ＨＣＴ１１６）のＭＲの造影及び蛍光（図１１ｆ）はデュアルモーダルイメージング（ｄｕａｌ−ｍｏｄａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ）能力を追加で確認することができた。
【００５２】
生体内でＰＭＮを使用し、初期段階の腫瘍の診断を遂行した。どのような腫瘍−標的化の部分（ｍｏｉｅｔｙ）の結合もなく、ＩｎＳ−ＮＰの注入とは対照的に、ＰＭＮ注入によって約３ｍｍの直径の超小型ＨＣＴ１１６腫瘍で顕著なＴ１向上が現れ、（図１２ａないし１２ｃ）、したがってこれらの成功的な腫瘍標的化及びｐＨ依存的Ｔ１  ＭＲの造影効果を確認した。薬物動態研究によると、ＰＭＮ（ｔ１／２，ＰＭＮ＝２．９０ｈ）及びＩｎＳ−ＮＰ（ｔ１／２，ＩｎＳ−ＮＰ＝２．１９ｈ）は長い血液循環時間（ｂｌｏｏｄ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）を見せた（図１２ｄ）。しかし、特に、腫瘍でのＰＭＮ蓄積はＩｎＳ−ＮＰに比べて２倍以上高かった（図１２ｅ）。さらに、ＰＭＮはマウスの腫瘍の高解像度の蛍光映像化を可能にした（図１２ｆ）。切断された臓器の巨視的な蛍光映像化はＰＭＮの相当した腫瘍の蓄積を見せ、（図１３）、細胞レベル以下のＣＬＳＭ（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＣＬＳＭ）は腫瘍細胞によるＰＭＮの吸収を確認することができた（図１２ｇ）。このような結果はＰＭＮが非常に効率的な癌の早期診断のための有望な候補物質であることを示す。
（実施例２３．試験管内及び生体内での光力学治療（ＰＤＴ））
試験管内でのＰＤＴのため、ＨＣＴ１１６細胞（５×１０４／ｗｅｌｌ）を前述した材料とともに培養した。以後、２分間６７０ｎｍのレーザーの供給源（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）で前記細胞を調査することによって光感作の実験を実施した。細胞レベルでの出力を５ｍＷ／ｃｍ２で固定した。細胞生存率をＭＴＴ分析を用いて評価した。吸光度強度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用して５９５ｎｍで測定した。
【００５３】
また、対照群細胞のパラレルセット（ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｅｔ）を使用したのだが、前記各物質と一緒に培養された細胞をレーザー照射に露出させなかった。生体内でのＰＤＴのために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）と無血清培地の１：１混合物１００μＬ内にＨＣＴ１１６細胞を皮下移植することで、６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの脇（ｆｌａｎｋ）内でＨＣＴ１１６腫瘍を成長させた。１００μＬの無血清培地内でＣＴ２６（１×１０５ｃｅｌｌｓ）、ＣＴ２６／ＭＤＲ（１×１０５ｃｅｌｌｓ）、及びＭ２−１０Ｂ４細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ）の混合物を皮下注入することで、６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの脇で異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＣＴ２６腫瘍を成長させた。前記腫瘍細胞を接種してから１０日後、次のようにＰＤＴ治療をした:１群、食塩水だけ；２群、遊離したＣｅ６だけ；３群、ＩｎＳ−ＮＰｓ；及び４群、ＰＭＮ（Ｃｅ６ ２ ｍｇ／ｋｇ体重に該当)。注射してから、２時間後にＫＯＤＡＫ  ｉｍａｇｅ  ｓｔａｔｉｏｎ（Ｉｍａｇｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４０００  ＭＭ；Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）を使用して近赤外線（ＮＩＲ）の画像を得た。注射してから１２時間後に６７０ｎｍのレーザー（２５０ｍＷ／ｃｍ２、２０分)で腫瘍部位を照射することによって１群ないし４群でレーザー治療をした。上述したＰＤＴ治療を５日後繰り返した。バーニヤカリパスを使用して初のＰＤＴ治療１週間後に腫瘍の大きさを３回測定し、腫瘍体積を幅（ａ）と高さ（ｂ）測定値から計算した（Ｖ＝ａ２×ｂ／２、前記式からａ≦ｂ）。腫瘍の大きさが１，０００ｍｍ３と測定されたり、苦痛の初の兆候が現れたり、または、移植から１５日ないし２１日の間に、すべてのマウスを犠牲にした。
【００５４】
ＰＭＮの治療効果を探索するために、生体内の光力学治療(ｐＨｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＤＴ)を実施した（図１４)。ＰＤＴは臨床的に承認されており、光を照射受ければ細胞毒性がある一重項酸素の発生（ｓｉｎｇｌｅｔ  ｏｘｙｇｅｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、ＳＯＧ）をもたらす光感作剤(ｐＨｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ)に依存する、癌治療用最小侵襲手術である。しかし、現在利用可能な光感作剤は腫瘍選択性が欠如されていて、正常組織に望まない損傷を招く。本発明のＰＭＮシステムでは、前記光感作剤の活性が標的腫瘍部位に到達するまで自己消滅『ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ』することがあって、前記腫瘍部位でこのような抑制が腫瘍ｐＨ刺激、具体的に細胞内のｐＨ刺激によって急激に逆転することがあるので、非常に特異的な効能部位に導く。ＰＭＮを注射されて光を照射受けたＨＣＴ１１６腫瘍を含むマウス（ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ）は、ＩｎＳ−ＮＰまたは遊離したＣｅ６（ｆｒｅｅ Ｃｅ６）で処理されたマウスに比べて、相当な腫瘍の退化を見せてくれた（図１４（ｄ）及び１４（ｅ））。詳しくは、注射後１週間で、前記腫瘍は瘢痕組織だけを残してほぼ完全に破壊された。向上された抗腫瘍効果はヘマトキシリン・エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）の染色と終端のデオキシヌクレオチジル転移酵素ｄＵＴＰニック端部標識化（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ−ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ、ＴＵＮＥＬ）染色によって確認された。このような結果は、ＰＭＮを使用するｐＨ−標的化されたＰＤＴが同種（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）ＨＣＴ１１６の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）で成功したことを明確に示した。
【００５５】
臨床、癌治療にさらに符合するように、さらに異質性で（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）薬物耐性を持った腫瘍でのＰＭＮの治療効果を追加で立証した。本発明者たちは、ＰＭＮのｐＨ―標的化方式が腫瘍の異質性によって影響されず、ＰＤＴが非特異的メカニズムで殺すために、薬物耐性細胞がその単純な対応する物（ｎａｉｖｅ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）と同様に敏感になっていると仮定した。このような仮説を試験するために、本発明者らはマウスで非常に異種的であり、薬物耐性を持ったＣＴ２６腫瘍を開発した。前記異種ＣＴ２６腫瘍は、抗癌剤の活発な流出（ａｃｔｉｖｅ ｅｆｆｌｕｘ）に関連されたＰ―糖蛋白質（Ｐ―ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｐ―ｇｐ）と、新生血管生成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、ＣＤ３１）を誘導するストロマ細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１、ＳＤＦ−１）を過発現させている(図１４（ｃ）)。結果的に、ＣＴ２６腫瘍は、同種ＨＣＴ１１６腫瘍に比べて非常に速い成長速度を持つ臨床腫瘍に対する生理学的関連モデルを提供した。特に、ＩｎＳＮＰは、非処理された対照群と対比して、同種ＨＣＴ１１６及び異種ＣＴ２６腫瘍の両方で若干の腫瘍の成長抑制を起こした（図１４（ｆ）及び１４（ｇ）)。しかし、前記異種モデルが非常に攻撃的に成長してＩｎＳ―ＮＰで観察された肯定的効果が弱いほどだった。これと対比して、ＣＴ２６腫瘍を含むマウス及び同種ＨＣＴ１１６腫瘍を含むマウスの両方でＰＭＮは、同一として劇的な腫瘍の破壊を見せてくれた（図１４（ｆ）及び１４（ｇ））。ＰＭＮで処理された群では、腫瘍組織及び微細血管だけでなく、繊維芽細胞内の多くの細胞がかなり破壊された反面、ＩｎＳ―ＮＰまたはＣｅ６で処理された群では、明白な損傷が観察されていなかった（図１４（ｆ）及び１４（ｇ））。したがって、ｐＨ標的化は、前記ＰＭＮの向上された抗癌治療効能に重要な役割を果たすものと見られる。結果的に、最初に、本発明者たちはｐＨ―感応性ＰＤＴを通じて薬物耐性の異種腫瘍の治療を成功的に立証しており、これはＰＭＮを高い薬物耐性の異種腫瘍を含む多様な腫瘍の治療に適用できることを示してくれる。また、ＰＤＴ治療を通じて、体重の大きな損失がないことが観察され、（図１５）、組織病理検査及び血清化学検査（図１６）を含む一連の生体内での生体適合性テストでＰＭＮが高い生体適合性があることが証明された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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