(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜を透過して、そして細胞の細胞質に位置させる抗体を用いることによって、完全型免疫グロブリンタイプの抗体を細胞の細胞質に位置させる方法であって、前記抗体は、細胞を透過し、そして細胞質に位置する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
配列番号１、２、及び３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記方法。
【請求項２】
前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、エンドサイトーシス及びその後にエンドソームを脱出することにより細胞質に位置させる能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞膜を透過して、そして細胞の細胞質に位置する完全型免疫グロブリンタイプの抗体を誘導する軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、前記軽鎖可変領域（ＶＬ）が、
配列番号１、２、及び３からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、前記軽鎖可変領域。
【請求項４】
請求項３に記載の前記軽鎖可変領域を含む抗体。
【請求項５】
前記抗体が、重鎖可変領域（ＶＨ）によって、細胞の細胞質中のＧＴＰ結合活性化ＲＡＳ（ＲＡＳ−ＧＴＰ）に特異的に結合し、
前記重鎖可変領域は、
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、
を含む請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
疾患を予防又は治療する方法に用いる組成物であって、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗体を含む、前記組成物。
【請求項８】
前記抗体が、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される生体活性分子と融合している、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
癌のインビトロ診断の補助における組成物の使用であって、前記組成物が請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗体、又は抗体に融合している生体活性分子を有する請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗体を含み、前記生体活性分子がペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子、及びリポソームからなる群から選択される、前記使用。
【請求項１０】
請求項３に記載の軽鎖可変領域、または請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体を生きている細胞の細胞膜に能動的に浸透させて細胞質に位置させる方法に関する。
【０００２】
また、本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞膜を浸透して細胞質に位置することを誘導する軽鎖可変領域（ＶＬ）およびこれを含む抗体に関する。
【０００３】
また、本発明は、前記抗体に融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子に関する。
【０００４】
また、本発明は、前記抗体、またはこれに融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む、癌の予防、治療または診断用組成物に関する。
【０００５】
また、本発明は、前記軽鎖可変領域および抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。
また、本発明は、抗体の軽鎖可変領域を、生きている細胞の内部に浸透して細胞質に位置する特性を有する軽鎖可変領域で置き換える工程を含む、細胞の内部に浸透して細胞質に位置する抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体は、重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、５０ｋＤａ）タンパク質二つと、軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ、２５ｋＤａ）タンパク質二つで作られたＹ字形の非常に安定した構造（分子量、１５０ｋＤａ）を形成している。抗体の軽鎖と重鎖は、アミノ酸配列が抗体毎にそれぞれ異なる可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）とアミノ酸配列が同じ不変領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）に分けられていて、重鎖不変領域には、ＣＨ１、ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインが存在して、軽鎖不変領域には、ＣκまたはＣλドメインが存在する。抗体の重鎖および軽鎖可変領域の中には、抗体毎にアミノ酸配列が特に異なる部分があるが、抗原と結合する部位を構成しているため相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ，ＣＤＲｓ）とも呼ばれる。抗体の立体構造を調べると、これらのＣＤＲｓは、抗体の表面で輪（ｌｏｏｐ）の形状をしていて、輪の下にはこれを構造的に支持するＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）が存在する。重鎖と軽鎖には、それぞれ３個ずつ輪構造が存在して、これらの６個の輪地域の構造は互いに合わせて抗原と直接的に接触している。抗体の重鎖不変領域（Ｆｃ）は、ＦｃＲｎ（ｎｅｏｎａｔａｌ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合を介して血液内長い半減期を保障して、この特により小分子薬物とは異なり体内で長時間持続することができる。またＦｃγＲ（Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）等との結合を介して抗体−依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）および補体−依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を介して標識物質を過発現する細胞に対する特異的細胞死滅誘導が可能である。近年、ヒトの様々な疾病に対する治療目的でいくつかの種で開発された抗体の場合、免疫原性を克服するために、ヒト抗体ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）でＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇする方法など、多様なヒト化方法を介して向上した治療効果が期待できる。
【０００７】
既存抗体は、大きいサイズと親水性特徴により、生きている細胞の内部に直接浸透はできない。従って、既存の多くの抗体は、細胞外に分泌されたタンパク質または細胞膜タンパク質を特異的に標的している（Ｋｉｍ  ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。一般的抗体と高分子バイオ医薬品は、疏水性である細胞膜通過が不可能で、細胞質内部の多様な疾病関連物質と結合および阻害できない限界がある。一般に、細胞の生長、特異的抑制などのような機序の研究のための実験で使用される細胞の内部物質と特異的結合する商業的抗体は、生きている細胞に対して直接処理できず、細胞の内部物質と結合するためには、両親媒性グリコシドであるサポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）を利用した細胞膜透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）過程を介して細胞膜に穿孔を形成するための前処理過程が必ず必要である。低分子物質、核酸またはナノ粒子などの場合、種々の試薬、電気穿孔法または熱衝撃などの方法を使用して生きている細胞の内部に輸送が可能であるが、タンパク質および抗体の場合、前記した大部分の試薬と実験条件などが、固有な３次構造に悪影響を及ぼして活性を消失し得る。細胞の内部タンパク質を特異的結合して、活性を阻害する細胞内抗体（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）が開発されているが、これも生きている細胞の細胞膜を浸透する活性がなく遺伝子治療（ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）用途でだけ適用が可能で、今後応用の可能性が非常に制限される（Ｍａｎｉｋａｎｄａｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００８】
前記の通り、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）抗体を含む様々な形態の抗体切片、組換えタンパク質など高分子物質とは反対に小分子物質の場合、小さいサイズと疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）の特徴を利用して、効果的に生きている細胞の内部に浸透が容易である。しかし、小分子薬物は、細胞の内部の多様な疾病関連物質に対して特異的結合をするために標的物質表面に疏水性ポケット（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｏｃｋｅｔ）が必要で、このような疏水性ポケットを有する標的物質は、細胞の内部の全体疾患関連物質の約１０％内外であるため、多くの細胞の内部の病原性タンパク質を特異的に標的することができない（Ｉｍａｉ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００９】
癌を含む様々な疾患で細胞内タンパク質−タンパク質相互作用（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，ＰＰＩ）に重要な役割をする酵素または転写、信号伝達関連の様々なタンパク質の突然変異および非正常的過発現する現象が発生する。特に、このようなタンパク質中広いかつ扁平な表面を介して構造複合性相互作用を成している疾患関連物質に対しては前述した通り小分子薬物による特異的阻害が難しい（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。一例で、現在効果的な治療物質がない細胞質重要腫瘍関連因子中一つであるＲＡＳは、細胞膜受容体を介して細胞の外部の信号を細胞内信号伝達体系に伝達する分子的スイッチ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ）役割をして、ヒト癌の約３０％、主に大腸癌とすい臓癌で細胞内に発癌関連突然変異体による常時活性化していて、このような発癌関連突然変異は、既存の坑癌治療に対する強い耐性を与えて主要な腫瘍関連因子として知られている（Ｓｃｈｅｆｆｚｅｋ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１０】
現在技術的限界を克服するために、タンパク質−タンパク質相互作用を効果的に阻害できる抗体切片または組換えタンパク質のような高分子物質を生きている細胞の内部に浸透能を与えるための様々な研究が行われたが、塩基性アミノ酸配列および疏水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）、両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）の特性を有するタンパク質透過ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ，ＰＴＤ）が、生きている細胞に対して細胞浸透能を有することが明らかになり（Ｌｅｅｎａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、これを利用した細胞の内部特定タンパク質を認識するために、透過ドメインを遺伝工学的に様々な形態の抗体切片と融合する試みが多く行われた。しかし、融合タンパク質の場合、ほとんどの動物細胞で分泌されないか、ほんの少量だけ上澄み液として流出して（ＮａＫａｊｉｍａ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、アルギニンが豊富なタンパク質透過ドメインとの融合タンパク質は、宿主のプリンプロテアーゼ（Ｆｕｒｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）に脆弱である生産的問題を有している（Ｃｈａｕｈａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。また、融合タンパク質の細胞の内部に浸透効率が良くないため治療用抗体への開発が難しい問題がある（Ｆａｌｎｅｓ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。発現問題を克服するために、タンパク質を精製した後、細胞透過ドメインを化学的共有結合またはビオチン−ストレプトアビジン（ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）等の結合等を介して融合する研究が進行されているが、該当タンパク質の構造に変形を招いている。
【００１１】
その他一部自己抗体を利用した研究で抗体および単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）抗体切片がエンドサイトーシスを介して細胞の内部に浸透が可能であるとの報告がある。自己抗体（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ）は、自己免疫疾患を有するヒトとマウスで主に発見される抗−ＤＮＡ抗体（ａｎｔｉ−ＤＮＡ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり、この中の一部は生きている細胞に対して細胞の内部に浸透する特性を有する（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｊｅｓｋｅ  Ｚａｃｋ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。現在まで報告された細胞浸透自己抗体は、多くは細胞の内部に流入した後に核に位置して、核で活性を示す特定タンパク質との融合を介して効果をみるための研究が盛んに行われている（Ｗｅｉｓｂａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかし、自己抗体を利用した生きている細胞に対する細胞浸透は、最終的に核に位置して細胞の内部の細胞質にある様々な疾患関連物質を特異的結合および活性を阻害できない限界を有している。
【００１２】
自然界高分子物質中、細胞の内部に浸透する特性を有する代表物質としてウイルス（ＨＩＶ、ＨＳＶ）、毒素（コレラ毒素、ジフテリア毒素）がある。これらは、能動的細胞の内部輸送機序であるエンドサイトーシス（Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）により細胞内に浸透すると知られている。このようなエンドサイトーシスは、大きく三つの経路に分類されて、リガンド結合による受容体のエンドサイトーシスに関与するｃｌａｔｈｒｉｎによる内胞作用またはコレラ毒素などのような一部毒素で確認されるｃａｖｅｏｌａｅによる内胞作用、デキストリン、エボラウイルスなどで確認されるｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓがある。Ｃｌａｔｈｒｉｎとｃａｖｅｏｌａｅが関与する内胞作用は、主に膜に分布する受容体が特定リガンドと結合しながら始まる。Ｃｌａｔｈｒｉｎは、細胞膜内側表面に位置するが、物質が受容体と結合するとｃｌａｔｈｒｉｎタンパク質が繊維質の殻を作って小胞を形成して小胞が細胞質中に移動することになる。Ｃａｖｅｏｌａｅは、ｃａｖｅｏｌｉｎ−１タンパク質が作用して、オリゴマーを形成しながらｃａｖｅｏｓｏｍｅという安定した構造の小胞を作って、細胞質中に移動することになる。Ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓは、細胞膜の一部分が突出して物質を覆いｍａｃｒｏｐｉｎｏｓｏｍｅを形成して細胞質中に移動することになる（Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。このようなエンドサイトーシス経路を介して細胞質浸透した物質は、追加的なエンドソーム脱出機序がない場合、多くは、リソソーム経路を介して分解される。
【００１３】
前記のようなリソソーム経路を介して分解されることを避けるために、ウイルス、毒素などはエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）で細胞質に脱出する機序を有している。いまだにエンドソーム脱出機序（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ）については明らかになっていないが、現在までエンドソーム脱出機序に対する仮説は、大きく三つがある。最初の仮説は、エンドソーム膜に穴を形成する機序であり、エンドソーム膜に陽イオン両親媒性ペプチド（Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のような物質が負電荷の細胞二重脂質膜に結合して内部応力（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔｒｅｓｓ）または内膜収縮を起こして結果的に円筒形の穴（ｂａｒｒｅｌ−ｓｔａｖｅ  ｐｏｒｅ）またはドーナツ型の通路（ｔｏｒｏｉｄａｌ  ｃｈａｎｎｅｌ）を形成するものであり（Ｊｅｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、二番目の仮説は、陽子スポンジ効果によってエンドソームが裂ける機序で陽子化アミン基（ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ  ａｍｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ）によってアミン基を有する物質が高い緩衝効果を介してエンドソームの浸透圧増加でエンドソーム膜が崩壊され得るというものである（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｎｇｂｅｒｓｅｎ，２００８）。三番目は、中性で親水性コイル形を維持するが、エンドソームのような酸性では、疏水性螺旋形構造に変形される特定モチーフがエンドソーム膜との融合を介してエンドソームを脱出する仮説がある（Ｈｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかし、前記仮説で現在まで自然界に存在する様々な物質に対するエンドソーム脱出機序を証明するための研究結果が不足している。
【００１４】
従って、本発明者は、細胞の内部に浸透および細胞質に分布するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインを開発した。また、安定した完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体構築のため、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域単一ドメイン（ＶＬ）抗体切片を様々なヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と相互作用結合が容易でありかつ細胞の内部に浸透および細胞質に分布する活性を維持するように改良して、細胞の内部に浸透および細胞質に分布する完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体（Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ）を開発した。
【００１５】
また、本発明者は、重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーを選別を介して活性化されたＲＡＳに対して特異的結合能を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を選別して、これを前記細胞の内部に浸透および細胞質に分布する完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）と置き換えることによって、生きている細胞の内部に浸透して細胞質にある活性化されたＲＡＳに特異的に結合して細胞生長信号伝達を抑制できる完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗−ＲＡＳ細胞質浸透抗体（ｉＭａｂ：ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ＆  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を製作した。
【００１６】
さらに、本発明者は、前記抗−ＲＡＳ細胞質浸透単一クローン抗体が、多様なＲＡＳ突然変異依存的癌細胞株の内部に浸透して、細胞質にあるＲＡＳ突然変異特異的中和による細胞生長阻害を示すことを確認して、前記抗体が、腫瘍組織特異性を与えるためのペプチドを融合した形態でも細胞質浸透および活性化されたＲＡＳ中和能に対する悪影響なしに、ＲＡＳ突然変異依存的腫瘍で活性化されたＲＡＳを特異的抑制させる活性を発揮することを確認して本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体を生きている動物細胞の細胞膜にエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）過程を介して能動的に浸透した後エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）機序を利用して細胞質に位置させる方法を提供することを目的とする。
【００１８】
さらに本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が生きている動物細胞の細胞膜にエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）過程を介して能動的に浸透した後、エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）機序を利用して細胞質に位置するように誘導する軽鎖可変領域（ＶＬ）およびこれを含む抗体を提供することを目的とする。
【００１９】
さらに本発明は、前記抗体に融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を提供することを目的とする。
【００２０】
さらに本発明は、前記抗体、またはこれに融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む、癌の予防、治療または診断用組成物を提供することを目的とする。
【００２１】
さらに本発明は、前記軽鎖可変領域および抗体をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
【００２２】
さらに本発明は、抗体の軽鎖可変領域を、生きている細胞の内部に能動的に浸透およびエンドソーム脱出機序を誘導して細胞質に位置する特性を有する軽鎖可変領域に置き換える工程を含む、細胞の内部に浸透して細胞質に位置する抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
前記目的を達成するために本発明は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体を生きている細胞の細胞膜をエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介して能動的に浸透して細胞質に位置させる方法であり、前記抗体は、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むものである方法を提供する。
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の前記方法は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体をエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介して能動的に生きている細胞の細胞膜を浸透およびエンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）機序を誘導して細胞質に位置するように誘導できる軽鎖可変領域（ＶＬ）によって、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が生きている細胞の細胞膜を浸透して細胞質に位置することができる。
【００２５】
すなわち、本発明の抗体は、生きている細胞の細胞の内部に浸透できる能力および細胞質に位置できる能力を共に発揮する完全型免疫グロブリン形態の抗体であり、これの一部切片に該当する抗体軽鎖可変領域は、その自体で細胞の内部に浸透して細胞質に位置する能力を発揮する。
【００２６】
図１は、本発明の抗体または抗体軽鎖可変領域の細胞での活性を図式化したものである。
前記抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化された抗体であり得る。
【００２７】
また、前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥであってもよく、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ５、またはＩｇＤタイプであってもよく、最も好ましくはＩｇＧタイプのクローン性抗体であってもよい。
【００２８】
完全型免疫グロブリン形態の抗体は、二つの全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖および二つの全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ，ＳＳ−ｂｏｎｄ）（によって連結され、）抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有して、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する。
【００２９】
「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）」とは、抗原に特異性を与えるために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨおよび三つの不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む全長重鎖およびそれの断片を共に含む意味で解釈される。また、用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）」とは、抗原に特異性を与えるための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬおよび不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖およびその断片を共に含む意味で解釈される。
【００３０】
前記細胞質浸透能は、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介して能動的に生きている細胞に浸透した後、エンドソーム脱出（ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｅｓｃａｐｅ）によって細胞質に位置するものであってもよい。
【００３１】
本発明の一様態で、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域は、
配列番号４、７および１０からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；および
配列番号６、９および１２からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上である配列を含んでもよい。
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３の配列情報は下記のとおりである。
【００３２】
0006595592.tif 000002
【００３３】
前記軽鎖可変領域は、より好ましくは配列番号５、８および１１からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ２またはこれと相同性が９０％以上である配列をさらに含んでもよい。
本発明の一具体例で、前記軽鎖可変領域は、配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、および配列番号６のＣＤＲ３を含んでもよい。
また、本発明の他の具体例で、前記軽鎖可変領域は、配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２、および配列番号９のＣＤＲ３を含んでもよい。
また、本発明の他の様態で、前記軽鎖可変領域は、配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２、および配列番号１２のＣＤＲ３を含んでもよい。
【００３４】
本発明の一様態で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から２番目および４番目のアミノ酸がそれぞれロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）およびメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）で置き換えられたものであってもよい。
【００３５】
これはＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に位置しているＣＤＲ構造決定部位（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）に含まれる残基中細胞質浸透能が保存されたＣＤＲ構造を得るために重要な２番目、４番目の残基を置換させたものである。
【００３６】
また、本発明の一様態で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から９、１０、１３、１７、１９、２１、２２、４２、４５、５８、６０、７９、および８５番目のアミノ酸がそれぞれ
セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ｄ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）で置き換えられたものであってもよい。
【００３７】
これは、ＦＤＡ承認後、市場に販売されているヒト化治療用抗体中、安定性が非常に高くＶＨ３小グループの重鎖可変領域とＶκ１小グループの軽鎖可変領域からなるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖可変領域との配列分析を介してＦＲ（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に位置している計１４個の残基に差があることを確認してこれを置き換えたものである。
また、本発明の他の様態で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から８９番目および９１番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｙ）で置き換えられたものであってもよい。
【００３８】
これは、ヒト抗体可変領域間のインターフェース（ＶＨ−ＶＬ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）分析を介して、既存細胞質浸透軽鎖可変領域のマウス由来ＣＤＲ３に位置した２個の残基が差があることを確認してこれを置き換えたものである。
【００３９】
本発明の好ましい様態で、前記軽鎖可変領域は、配列番号１、２、および３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。
【００４０】
細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインの名称および配列
0006595592.tif 000003
【００４１】
但し、本明細書で提供する配列番号に明示されたすべての残基番号は、Ｋａｂａｔ番号を使用した（Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
本発明の一様態で、前記抗体が膜を透過して、細胞質に位置する細胞は、生きている動物細胞であり得る。すなわち、前記抗体は、生きている動物細胞に能動的に浸透するものであってもよい。
【００４２】
また、本発明の一様態で、前記抗体は、細胞質のみならず細胞質内に存在する様々な細胞小器官および細胞内存在する分子を標的することができ、その種類を制限しないが、例えば細胞質、核、ミトコンドリア、小胞体、および／または細胞内高分子（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を標的することができる。
【００４３】
また、本発明の一様態で、前記細胞内高分子は、タンパク質、脂質、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。より具体的に、前記タンパク質は、細胞成長、細胞増殖、細胞周期、ＤＮＡ修理、ＤＮＡ保全、転写、複製、翻訳または細胞内移動の制御と関連したものであってもよく、前記タンパク質は、リン酸基、カルボキシル酸基、メチル基、サルフェート基、脂質、水酸基、またはアミド基に変形または活性化されたり、突然変異されたものであってもよい。
【００４４】
本発明の最も好ましい具体例で、前記抗体は、細胞質内活性化されたＲＡＳを標的して特異的に結合するものであってもよい。前記活性化されたＲＡＳは、ＧＴＰが結合された腫瘍関連因子であって、前記ＲＡＳは、突然変異形態であってもよい。前記ＲＡＳの突然変異は、疾患と関係する様々な形態でその種類に制限はないが、例えば、ＫＲａｓ，ＨＲａｓ，ＮＲａｓの１２番Ｇｌｙｃｉｎｅ、１３番Ｇｌｙｃｉｎｅ、６１番ｇｌｕｔａｍｉｎｅ残基の置き換えられた突然変異であり得る。
【００４５】
本発明の一様態で、前記細胞質内活性化されたＲＡＳとの結合力は、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）によるものであり得る。
【００４６】
本発明の一様態で、前記重鎖可変領域は、
配列番号１４のＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上であるアミノ配列；
配列番号１１のＣＤＲ２またはこれと相同性が９０％以上であるアミノ配列；および
配列番号１２のＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上であるアミノ配列を含んでもよい。
【００４７】
前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。
0006595592.tif 000004
【００４８】
本発明のより好ましい具体例で、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸からなってもよい。
前記配列番号の配列情報は下記のとおりである。
【００４９】
0006595592.tif 000005
【００５０】
前記ＲＡＳに特異的に結合および阻害する重鎖可変領域は、下記のような方法によってスクリーニングした。
【００５１】
本発明の一具体例では、構築されたヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１）が融合している状態でＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３地域に計１８個の残基に対して人為的な突然変異が誘導されたライブラリーを利用して選別した。
【００５２】
また、本発明の一具体例では、前記ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１）が融合しているライブラリーを利用して細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）と結合された状態でも活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳに対して特異的に結合が可能な重鎖可変領域を選別した。
【００５３】
本発明の一具体例では、標的分子として活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳ突然変異体であるＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄを使用した。本発明の一具体例において、発癌関連ＲＡＳ突然変異は主に１２番、１３番、６１番残基で発生して、１２番、１３番残基は、ＲＡＳタンパク質のＰ−ｌｏｏｐに位置していて、ＲＡＳタンパク質と結合しているＧＴＰを加水分解して非活性化された形態でタンパク質構造変化を誘導するＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の結合に影響を与える。また、６１番残基は、ＧＡＰの加水分解活性部位と結合してＧＴＰ加水分解を防ぐ役割をするので、様々な発癌関連ＲＡＳ突然変異は、ＲＡＳ  Ｇ１２Ｄ突然変異と信号伝達に関連した地域（Ｓｗｉｔｃｈ  Ｉ、Ｓｗｉｔｃｈ  ＩＩ）が同じであるため、ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ突然変異に限定されない。
【００５４】
また、前記一具体例において、ＮＲａｓ、ＨＲａｓは、ＫＲａｓとＧドメインと呼ばれる触媒ドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）１番から１６５番残基までの類似度が８５％以上であり、この中で下位信号物質と結合する部位Ｓｗｉｔｃｈ  Ｉ（３２番〜３８番）、Ｓｗｉｔｃｈ  ＩＩ（５９番〜６７番）ドメインは１００％一致する。但し、１６５番から１８９番までのＣ−末端超可変形部位は、１５％の類似度を有しているが、構造的に下位信号伝達に影響を与えないので、標的分子で使用した活性化したＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに限定されない。
【００５５】
本発明の一具体例において、酵母細胞表面発現システムを利用して重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１）が発現した状態で活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳに対して初期選別以後、細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖を発現および分泌する酵母と酵母接合を介してこの結合されたＦａｂ形態で選別した。
【００５６】
また、本発明の一様態は、完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体が細胞膜を透過して細胞質に位置することを誘導する軽鎖可変領域（ＶＬ）を提供する。
【００５７】
本発明の一具体例において、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域は、
配列番号４、７および１０からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上である配列；
配列番号６、９および１２からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上である配列を含んでもよい。
【００５８】
本発明の一具体例において、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から２番目および４番目のアミノ酸がそれぞれロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ，Ｌ）およびメチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）で置き換えられたものであってもよい。
【００５９】
また、本発明の他の具体例で、前記軽鎖可変領域は、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から９、１０、１３、１７、１９、２１、２２、４２、４５、５８、６０、７９、および８５番目のアミノ酸がそれぞれセリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ，Ａ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ，Ｄ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ，Ｖ）、セリン（ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびトレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ，Ｔ）で置き換えられたものであってもよい。
【００６０】
本発明の他の具体例で、前記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域のＮ末端から８９番目および９１番目のアミノ酸がそれぞれグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）およびチロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｙ）で置き換えられたものであってもよい。
【００６１】
また、本発明の好ましい具体例で、前記軽鎖可変領域は、配列番号１、２、および３からなる群から選択されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００６２】
本発明に係る軽鎖可変領域の細胞浸透能は、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介して細胞内に浸透した後、エンドソーム脱出によるものであり得る。また、本発明の一様態は、前記軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
【００６３】
本発明の具体例で、前記抗体は、細胞膜を透過して細胞質に位置するものであってもよく、前記抗体は、キメラ、ヒト、またはヒト化された抗体であり得る。前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥからなる群から選択されてもよい。また、前記抗体は、細胞質、核、ミトコンドリア、小胞体、および／または細胞内高分子（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を標的するものであっでもよく、前記細胞内高分子は、タンパク質、脂質、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。前記タンパク質は、細胞成長、細胞増殖、細胞周期、ＤＮＡ修理、ＤＮＡ保全、転写、複製、翻訳または細胞内移動の制御と関連したものであってもよい。本発明の好ましい具体例で、前記抗体は、細胞質内活性化されたＲＡＳに特異的に結合するものであってもよく、前記細胞質内の活性化されたＲＡＳに特異的に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）によるものであり得る。前記活性化されたＲＡＳは、突然変異された形態であり得る。
【００６４】
また、本発明の具体例で、前記重鎖可変領域は、
配列番号１４のＣＤＲ１またはこれと相同性が９０％以上であるアミノ配列；
配列番号１１のＣＤＲ２またはこれと相同性が９０％以上であるアミノ配列；および
配列番号１２のＣＤＲ３またはこれと相同性が９０％以上であるアミノ配列を含んでもよい。
【００６５】
本発明のより好ましい具体例で、重鎖可変領域は、配列番号１３のアミノ酸からなってもよい。
【００６６】
また、本発明一様態は、前記抗体に融合されたペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を提供する。
【００６７】
前記タンパク質は、抗体、抗体の断片、免疫グロブリン、ペプチド、酵素、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、転写因子、毒素、抗原性ペプチド、ホルモン、運搬タンパク質、運動機能タンパク質、受容体、シグナル（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）タンパク質、貯蔵タンパク質、膜タンパク質、膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）タンパク質、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）タンパク質、分泌タンパク質、ウイルスタンパク質、糖タンパク質、切断されたタンパク質、タンパク質複合体、または化学的に改質されたタンパク質等であり得る。
【００６８】
本発明の具体的な実施例では、細胞質浸透を介して活性化された（ＧＴＰと結合する）ＲＡＳを特異的結合および阻害する完全型免疫グロブリン形態抗体の軽鎖可変領域のＮ−末端にＲＧＤ４Ｃペプチドを融合した形態を提供する。前記本発明の一具体例において、軽鎖可変領域Ｎ−末端とＲＧＤ４Ｃペプチドは（Ｇ４Ｓ）１連結子（ｌｉｎｋｅｒ）で融合することが好ましいが、これに制限されない。
【００６９】
本発明において、小分子薬物は、約１０００ダルトン未満の分子量を有して疾病の治療剤として活性度を有する有機化合物、無機化合物または有機金属化合物を示すもので、本願で広範囲に使用される。本願で小分子薬物は、オリゴペプチドおよび約１０００ダルトン未満の分子量を有するその他のバイオ分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）を含む。
【００７０】
本発明において、ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）は、直径１〜１０００ｎｍ大きさを有する物質からなる粒子を意味し、前記ナノ粒子は、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む金属シェルで構成される金属／金属コアシェル複合体、金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む非金属シェルで構成される金属／非金属コアシェルまたは非金属ナノ粒子コアおよび前記コアを囲む金属シェルで構成される非金属／金属コアシェル複合体であり得る。一具体例によると、前記金属は、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケル、パラジウム、白金、磁性鉄およびその酸化物から選択されるものであってもよいが、これに限定せず、前記非金属は、シリカ、ポリスチレン、ラテックスおよびアクリレート系列の物質から選択されてもよいが、これに限定しない。
【００７１】
本発明において、リポソームは、自己自ら会合できる、水性内部区画を囲む一つ以上の脂質二重層膜で構成される。リポソームは、膜タイプおよびその大きさによって特定することができる。小さいユニラメラ小胞（ＳＵＶ）は単一膜を有して２０ｎｍ〜５０ｎｍの直径を有することができる。大きいユニラメラ小胞（ＬＵＶ）は、５０ｎｍ以上の直径を有することができる。オリゴラメラ大きい小胞およびマルチラメラ大きい小胞は、多重、一般に同心円、膜層を有して直径が１００ｎｍ以上であり得る。多くの非同心円膜を有するリポソーム、すなわちより大きい小胞内で含まれた多くの小さい小胞は、マルチ小胞性小胞（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）という。
【００７２】
本発明において、「融合」とは、機能または構造が異なるか同じ二つの分子を一体化するもので、前記タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子またはリポソームに前記腫瘍浸透性ペプチドが結合できるいずれの物理、化学的または生物学的方法による融合であり得る。前記融合は、好ましくは連結子ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ）によって行われ、この連結子ペプチドは、本発明の抗体軽鎖可変領域、抗体、またはこれの切片の様々な位置で前記生体活性分子との融合を中継することができる。
【００７３】
また、本発明は、前記抗体、またはこれに融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００７４】
本発明に係る抗体、またはこれに融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を利用して、ヒト抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が有する抗原高特異性および高親和度に影響を与えずに細胞の内部に浸透および細胞質に残留する特性を付与することができ、これを介して現在の小分子薬物を利用した疾病治療に標的物質に分類されている細胞質内に存在しながらタンパク質とタンパク質との間に広くて平たい表面を介して構造複合性相互作用をなす腫瘍および疾患関連因子に対する治療および診断に高い効果を期待することができる。また、既存様々な腫瘍治療剤の主な薬物抵抗性関連因子であるＫＲａｓ突然変異を選択的阻害が可能でかつ既存治療剤との並行治療を介して効果的な坑癌活性を期待することができる。
【００７５】
前記癌は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼内黒色腫、直腸癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ球リンパ腫、肝細胞癌、胃癌、すい臓癌、膠芽腫、頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、および頭頸部癌からなる群から選択されるものであり得る。
【００７６】
前記組成物は、癌の予防または治療用薬学的組成物で製造されている場合、前記組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。前記組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常利用されるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されない。前記薬学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００７７】
前記癌の予防または治療用薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与および直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングしたり、胃腸からの分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。
【００７８】
前記癌の予防または治療用薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様に処方されることができる。前記組成物の好ましい投与量は、成人基準で０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ範囲内である。用語「薬学的有効量」とは、癌を予防または治療するのに、または血管新生による疾患の予防または治療するのに十分な量を意味する。
【００７９】
前記組成物は、当該当業者が容易に実施できる方法に従って、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を利用して製剤化することによって単位容量形態で製造されたり、または多用量容器内に取り込んで製造できる。この時、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳剤形態やエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。また、前記組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与されることができる。一方、前記組成物は、抗体また、抗原結合断片含むので、免疫リポソームで剤形化されることができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法により製造されることができる。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングルリコル−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物として逆相蒸発法によって製造されることができる。例えば、抗体のＦａｂ’断片はジスルフィド−交換反応を介してリポソームに接合されることができる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加でリポソーム内に含まれることができる。
【００８０】
また、本発明は、前記抗体、またはこれに融合された、ペプチド、タンパク質、小分子薬物、ナノ粒子およびリポソームからなる群から選択された生体活性分子を含む、癌の診断用組成物を提供する。
【００８１】
本明細書で使用された用語「診断」とは、病態生理の存在または特徴を確認することを意味する。本発明での診断は、癌の発病の有無および経過を確認するものである。
【００８２】
前記完全型免疫グロブリン形態の抗体およびこれの切片は、映像を介して癌を診断するために分子映像用蛍光体と結合することができる。
【００８３】
前記分子映像用蛍光体は、蛍光を発生させるあらゆる物質をいい、赤色や近赤外線（ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ）の蛍光を発光することが好ましく、量子収得量（ｑｕａｎｔａｕｍ  ｙｉｅｌｄ）が高い蛍光体がより好ましいが、これに限定されない。
【００８４】
前記分子映像用蛍光体は、前記完全型免疫グロブリン形態の抗体およびこれの切片に特異的に結合する腫瘍浸透性ペプチドと結合できる蛍光体、蛍光タンパク質または、その他映像用物質が好ましいがこれに限定されない。
【００８５】
蛍光体は、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ボディピー（ＢＯＤＹＰＹ）、テトラメチルローダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）、シアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）またはこれらの誘導体が好ましいが、これに限定されない。
【００８６】
蛍光タンパク質は、Ｄｒｏｎｐａタンパク質、蛍光発色遺伝子（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光プロテイン（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤｓＲＦＰ）、近赤外線蛍光を示すシアニン蛍光体であるＣｙ５．５またはその他蛍光タンパク質が好ましいがこれに限定されない。
【００８７】
その他映像用物質は、酸化鉄、放射性同位元素などが好ましいが、これに限定されず、ＭＲ、ＰＥＴのような映像装備に応用されることができる。
【００８８】
また、本発明は、前記軽鎖可変領域またはこれを含む抗体またはこれの切片をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００８９】
前記「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、一本鎖または二本鎖形態で存在するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの重合体である。ＲＮＡゲノム配列、ＤＮＡ（ｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ）およびこれから転写されるＲＮＡ配列を包括して、特に言及しない限り天然のポリヌクレオチドの類似体を含む。
【００９０】
前記ポリヌクレオチドは、前述した軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列だけでなく、その配列に相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）配列も含む。前記相補的な配列は完ぺきに相補的な配列だけでなく、実質的に相補的な配列も含む。これは当業界に公示された苛酷条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下で、例えば、配列番号１〜３中いずれか一つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と混成化できる配列を意味する。
【００９１】
また、前記ポリヌクレオチドは変形されることができる。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失または非保存的置換または保存的置換を含む。前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、前記ヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインメントして、当業界で通常利用されるアルゴリズムを利用してアラインメントされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、最小９０％の相同性または最小９５％の相同性を示す配列であり得る。
【００９２】
また、本発明の一様態は、抗体の軽鎖可変領域を、生きている細胞の内部に浸透して細胞質に位置する特性を有する軽鎖可変領域で置き換える工程を含む、生きている細胞の内部に浸透して細胞質に位置する抗体の製造方法を提供することができる。
【００９３】
また、本発明の一具体例は、既存の完全型免疫グロブリン形態の抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）と置き換えて、置き換えられた完全型免疫グロブリン形態の単一クローン抗体が前記細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の単一クローン抗体の細胞質浸透のような特性を有するようにする方法を提供することができる。
【００９４】
本発明の具体例で、細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）を利用した細胞の内部に浸透して細胞質に分布する完全型免疫グロブリン形態の抗体製造方法の例は下記のとおりである：
（１）前記ヒト軽鎖可変領域（ＶＬ）およびヒト軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖で軽鎖可変領域（ＶＬ）を細胞質に浸透するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）で置き換えられた核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）をクローニングある細胞質浸透軽鎖発現ベクターを製造する工程：
（２）前記製造された軽鎖と相互作用して完全型免疫グロブリン形態の抗体発現のための重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた重鎖をコードする核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｅｓ）をクローニングした重鎖発現ベクターを製造する工程；
（３）前記製造された軽鎖、重鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して細胞の内部浸透および細胞質残留ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む完全型免疫グロブリン形態の抗体を発現する工程；および
（４）前記発現した細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を精製および回収する工程。
【００９５】
前記方法は、軽鎖を発現するベクターと重鎖を発現するベクターを発現して細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を製造することができる。また、細胞の内部の特定タンパク質を認知できる重鎖可変領域を含む重鎖を発現するベクターと共に形質転換を介して、細胞の内部に浸透して細胞質に分布して特定タンパク質と結合することができる抗体を発現することができる。ベクターは、軽鎖と重鎖を一つのベクターで同時に発現するベクターシステム、またはそれぞれ別途のベクターで発現させるシステム共に可能である。後者の場合、二つのベクターは、同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ）および標的形質転換（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して宿主細胞に導入されることができる。
【００９６】
本発明で使用する用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段を意味する。例えば、プラスミドベクター、コスミドベクターおよびバクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記組換えベクターとして使用できるベクターは、当業界でたびたび使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６Ｍ、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズおよびｐＵＣ１９等）、ファージ（例えば、λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１およびＭ１３等）またはウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０等）を操作して製作されることができる。
【００９７】
前記組換えベクターで本発明で提供する軽鎖可変領域、および軽鎖不変領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、プロモーターに作動的に連結されることができる。用語「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、ヌクレオチド発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他のヌクレオチド配列との間の機能的な結合を意味する。従って、これによって前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写および／または、解読を調節することができる。
【００９８】
前記組換えベクターは、典型的にクローニングのためのベクターまたは発現のためのベクターとして構築されることができる。前記発現用ベクターは、当業界で植物、動物または微生物で外来のタンパク質を発現するのに使用される通常のものを使用することができる。前記組換えベクターは、当業界に公示された様々な方法を介して構築できる。
【００９９】
前記組換えベクターは、原核細胞または真核細胞を宿主にして構築されることができる。例えば、使用されるベクターが発現ベクターで、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｐＬλプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位および転写／解読終結配列を含むことが一般的である。ベクターが、真核細胞を宿主とする場合には、ベクターに含まれる真核細胞で作動する複製原点は、ｆ１複製原点、ＳＶ４０複製原点、ｐＭＢ１複製原点、アデノ複製原点、ＡＡＶ複製原点、ＣＭＶ複製原点およびＢＢＶ複製原点などを含むか、これに限定されない。また、ほ乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）またはほ乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＨＳＶのｔｋプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。）
【０１００】
本発明のさらに他の様態は、前記組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供することができる。
【０１０１】
宿主細胞は、当業界に公示されたいずれの宿主細胞も利用することができ、原核細胞では、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルス・サブチルスおよびバチルス・チューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、そしてサルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンスおよび種々のシュードモナス種のような腸内菌と菌株などがあって、ベクターを真核細胞に形質転換させる場合には宿主細胞として、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、植物細胞および動物細胞、例えば、ＳＰ２／０、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＰＥＲ．Ｃ６、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ７、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株などが利用されることができる。
【０１０２】
本発明のさらに他の様態は、前記宿主細胞を培養する工程を含む、細胞の内部に浸透して細胞質に位置する完全型免疫グロブリン形態の抗体製造方法を提供することができる。
【０１０３】
前記組換えベクターの宿主細胞内への挿入は、当業界に広く知られた挿入方法を使用することができる。前記運搬方法は、例えば、宿主細胞が原核細胞である場合、ＣａＣｌ２方法または、電気穿孔方法などが使用でき、宿主細胞が真核細胞である場合には、微細注入法、カルシウムホスフェート沈殿法、電気穿孔法、リポソーム−媒介形質感染法および遺伝子ボンバードメントなどを使用することができるが、これに限定しない。Ｅ．ｃｏｌｉなどの微生物を利用する場合、生産性は動物細胞などに比べて高い方であるが、糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の問題によってインタクト（ｉｎｔａｃｔ）なＩｇ形態の抗体生産には適さないが、ＦａｂおよびＦｖのような抗原結合断片の生産には使用されることができる。
【０１０４】
前記形質転換された宿主細胞を選別する方法は、選択標識によって発現する表現型を利用して、当業界に広く知られた方法により容易に実施することができる。例えば、前記選択標識が特定抗生剤耐性遺伝子である場合には、前記抗生剤が含まれた培地で形質転換体を培養することによって形質転換体を容易に選別することができる。
【０１０５】
また、本発明の一様態は、前記生きている細胞の内部に浸透して細胞質に分布する完全型免疫グロブリン形態の抗体を利用して細胞質浸透を介して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）腫瘍関連因子ＲＡＳに特異的結合および活性を阻害する完全型免疫グロブリン形態の抗体の製造方法を提供することができる。
【０１０６】
前記一様態具体例において、活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳ特異的結合能を有している重鎖可変領域（ＶＨ）を利用した動物細胞の内部に浸透して細胞質に分布して細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳと特異的結合する完全型免疫グロブリン形態の抗体は下記のような方法で製造されることができる：
（１）活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳと特異的結合するヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）が含まれた核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｅｓ）をクローニングした重鎖発現ベクターを製造する工程；
（２）前記製造された重鎖発現ベクターと細胞浸透軽鎖発現ベクターをタンパク質発現用動物細胞に同時形質転換して生きている細胞の内部に浸透および細胞質分布して活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知する完全型免疫グロブリン形態の抗体を発現する工程；および
（３）前記発現された活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知する細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を精製、回収する工程。
【発明の効果】
【０１０７】
本発明で提供する完全型免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）形態の抗体を能動的細胞浸透を介して細胞質に位置させる方法による場合、特別な外部タンパク質伝達システムなしに抗体を生きている細胞の内部に浸透させて細胞質に分布させることができる。
【０１０８】
特に、本発明で安定した細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を具現するために、種々のヒト重鎖可変領域（ＶＨ）との相互作用結合が容易でありかつ細胞質浸透を介して細胞質に残留可能な特性を有する抗体の軽鎖可変領域を提供していて、前記軽鎖可変領域を含む完全型免疫グロブリン形態の抗体は、細胞の内部浸透および細胞質に分布して、細胞に非特異的細胞毒性が見られない。前記抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを特異的認知が可能な重鎖可変領域（ＶＨ）で置換を介して生きている細胞の内部細胞質に位置している活性化された（ＧＴＰが結合された）ＲＡＳを標的およびその活性を阻害することができる。
【０１０９】
本発明に係る細胞質浸透能を有する完全型免疫グロブリン形態の抗体を利用して、ヒト抗体重鎖可変領域（ＶＨ）が有する抗原高特異性および高親和度に影響を与えずに細胞の内部に浸透および細胞質に残留する特性を付与することができ、これを介して現在の小分子薬物を利用した疾病治療に標的物質に分類されている細胞質内に存在しながらタンパク質とタンパク質との間に広くて平たい表面を介して構造複合性相互作用をなす腫瘍および疾患関連因子に対する治療および診断に高い効果を期待することができる。また、既存様々な腫瘍治療剤の主な薬物抵抗性関連因子であるＫＲａｓ突然変異を選択的阻害が可能でかつ既存治療剤との並行治療を介して効果的な坑癌活性を期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂと命名した細胞浸透を介して細胞質に位置する完全型免疫グロブリン形態の抗体の概念を示した模式図。
【図２Ａ】マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインであるｍ３Ｄ８  ＶＬから、ヒト化抗体重鎖可変領域と安定した結合となるように改良した細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ３  ＶＬまでの改良過程に利用されたクローンを含む配列分析資料。
【図２Ｂ】ｍ３Ｄ８  ＶＬとヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ０  ＶＬ、これの突然変異体ｈＴ２  ＶＬ、ｈＴ３  ＶＬのＷＡＭモデリングを利用したモデル構造を構造重なり（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｎｇ）方法を利用して比較した図。
【図３Ａ】軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透能を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果。
【図３Ｂ】軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透メカニズムを検証するために、共焦点顕微鏡で観察した結果。
【図４Ａ】ｈＴ３  ＶＬの様々なヒト抗体重鎖可変領域に対して適用可能の有無を確認するために既存のヒト抗体Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）とヒト化抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）とアミノ酸配列を分析した結果。
【図４Ｂ】追加的にヒト抗体重鎖可変領域と最適化された結合を介して安定的ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のための可変領域間のインターフェース残基を分析した結果。
【図５】ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のために細胞浸透能がない軽鎖可変領域を細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域で置き換える方法に対する全般的な模式図。
【図６Ａ】ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ精製後、還元性または非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。
【図６Ｂ】ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｔｈｅ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌｅｓ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介してｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂが自然な環境で単一体存在することを確認するためにサイズ排除クロマトグラフィーカラム（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００  １０／３００ＧＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を実験した結果。
【図６Ｃ】ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ（ＴＭａｂ４、ＨｕＴ４、ＡｖａＴ４）とＩｇＧ形態の抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖可変領域による標的分子に対する親和度を測定するためにＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を行った結果。
【図６Ｄ】自己免疫マウス由来抗体のＣＤＲをｇｒａｆｔｉｎｇした細胞浸透能を有するヒト軽鎖可変領域（ｈＴ４）の置換を介したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂでの核酸加水分解能を確認するためにアガロースゲル核酸加水分解検証実験を行った結果。
【図７Ａ】細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域ｈＴ４  ＶＬで軽鎖可変領域が置き換えられたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質浸透能を検証するために、様々な細胞株で１〜２個の細胞に焦点を合わせて共焦点顕微鏡で観察した結果。
【図７Ｂ】前記図７Ａの共焦点顕微鏡観察を介した細胞質浸透能検証実験で細胞浸透効率を確認するために、レンズ倍率を低くして多数の細胞に対する細胞質浸透能を確認した結果。
【図８Ａ】共焦点顕微鏡でＴＭａｂ４の濃度に応じた細胞浸透程度を観察した結果。
【図８Ｂ】ＴＭａｂ４を処理して時間帯に応じた細胞浸透程度を共焦点顕微鏡で観察した結果。
【図９Ａ】ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価してグラフで図式化したものである。
【図９Ｂ】ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した写真を示したものである。
【図１０】細胞中に流入したＴＭａｂ４の輸送過程と安定度を観察するために、パルス追跡実験（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）を行って共焦点顕微鏡で観察した結果。
【図１１Ａ】ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ  ＴＭａｂ４またはＨｕＴ４の細胞質への移動を間接的に確認するために、ｃａｌｃｅｉｎを利用して共焦点顕微鏡で観察した結果。
【図１１Ｂ】図１１Ａの共焦点顕微鏡写真のｃａｌｃｅｉｎ蛍光を定量した棒グラフ。
【図１２Ａ】ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂが細胞質に位置する場合、ｓｐｌｉｔ−ＧＦＰの相補的な結合によるＧＦＰ蛍光が観察される過程を示した模式図。
【図１２Ｂ】構築したｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅのｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＧＦＰ１−１０の発現程度をウェスタンブロットで確認したものである。
【図１２Ｃ】ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂのｓｐｌｉｔ  ＧＦＰ相補的な結合によるＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡を介して観察した結果。
【図１３】細胞質浸透能だけ有している完全ＩｇＧフォーマットＣｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置き換えを介して抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ構築を説明した模式図。
【図１４】細胞質浸透能だけ保有しているＩｇＧフォーマットｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの応用として、重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置き換えた細胞浸透および細胞内分布するＧＴＰが結合されたＲａｓに特異的に結合する単一クローン抗体（抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ：ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ＆  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を利用してＲａｓ突然変異細胞に対する特異的な細胞毒性を誘導する戦略に対する模式図。
【図１５】ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄタンパク質に対してだけ特異的に高親和度を有するヒト化抗体重鎖可変領域単一ドメインを得るためのライブラリー選別戦略を示した模式図。
【図１６】記述されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに特異的高親和度を得るための選別過程工程別ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ単独条件およびＧＤＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄとの競合条件での結合能をフローサイトメトリーで分析した資料。
【図１７】抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の精製後、還元性または非還元性条件で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。
【図１８】野生性ＫＲａｓおよびＫＲａｓ突然変異体ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ  Ｇ１３ＤのＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためのＥＬＩＳＡを行った結果。
【図１９】ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してＫＲＡＳ  Ｇ１２ＤにＧＴＰが結合形態に対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の親和度分析結果を示す。
【図２０】−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞質浸透能を確認するために共焦点顕微鏡で観察した結果。
【図２１】ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３  ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ細胞株で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果。
【図２２】ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ細胞株で非付着性細胞成長阻害を評価した結果。
【図２３】抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４と細胞内活性化したＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果。
【図２４】抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂと細胞内ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果。
【図２５】ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１細胞株でＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果。
【図２６Ａ】ＨＣＴ１１６細胞株を異種移植したマウスでＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の腫瘍成長抑制効果を確認した実験結果。
【図２６Ｂ】ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の非特異的副作用を確認するためにマウスの体重を測定したグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。しかし、これらの実施例は例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されない。
【０１１２】
実施例１．細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメイン開発論理
図１は、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂと命名した細胞浸透を介して、細胞質に位置する完全ＩｇＧ形態の単一クローン抗体の概念を示した模式図であり、これを具現するために、ヒト化抗体軽鎖可変領域の細胞質浸透能を理解するために、既存マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインｍ３Ｄ８  ＶＬの細胞質浸透性と軽鎖可変領域断片に属するＣＤＲの相関に対する研究を参照した（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１１３】
図２Ａは、マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインであるｍ３Ｄ８  ＶＬから、ヒト化抗体重鎖可変領域と安定した結合となるように改良した細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ３  ＶＬまでの改良過程に利用されたクローンを含む配列分析資料である。
【０１１４】
具体的には、マウス由来軽鎖可変領域単一ドメインであるｍ３Ｄ８  ＶＬとこれをＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ技術を利用してヒト化させたｈＴ０  ＶＬの細胞質浸透性を比較を介して、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１配列が保存されるにも関わらず細胞質浸透能を失った特性を確認した。
【０１１５】
そこで、ヒト化抗体軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透能を復元するために、ＣＤＲ１の構造をｍ３Ｄ８  ＶＬの構造と類似するように改良するために、軽鎖可変領域ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）でＣＤＲ構造決定部位（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）を比較分析した。その結果、２番、４番残基が、マウス由来細胞質浸透能を有するｍ３Ｄ８  ＶＬと差があることを確認した。特に２番、４番残基は、Ｖｅｒｎｉｚｅｒ  ｚｏｎｅでありながらＣＤＲ１構造に大きい影響を及ぼすＵｐｐｅｒ  ｃｏｒｅ役割をしているので、ｈＴ０  ＶＬに復帰突然変異を介してｍ３Ｄ８  ＶＬと類似するＣＤＲ１構造を誘導したｈＴ２  ＶＬを開発した（図２Ａ参照）。
【０１１６】
以後、安定したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のために、様々なヒト抗体重鎖可変領域と相補的に安定した結合をなして、細胞質浸透能を保存する軽鎖可変領域を開発しようと安定した抗体中高い割合を占めているＶＨ３とＶκ１小グループ間の対を模写するために、ＶＨ３とＶκ１小グループを有していながら非常に安定したヒト化治療用単一クローン抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖可変領域ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）とｈＴ２  ＶＬのＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）を比較分析して差がある１４個の残基をＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の軽鎖可変領域ＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）配列で突然変異させて、ｈＴ３  ＶＬを開発した（図２Ａ参照）。
【０１１７】
図２Ｂは、ｍ３Ｄ８  ＶＬとヒト化軽鎖可変領域単一ドメインｈＴ０  ＶＬ、これの突然変異体ｈＴ２  ＶＬ、ｈＴ３  ＶＬのＷＡＭモデリングを利用したモデル構造を構造重なり（ｓｕｐｅｒｉｍｐｏｓｉｎｇ）方法を利用して比較した図である。前述内容のように、ｈＴ０  ＶＬの２番、４番残基復帰突然変異を介して、ｍ３Ｄ８  ＶＬとのＣＤＲ１地域構造的差が減ることを確認した。
【０１１８】
実施例２．細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメイン発現および精製
前記実施例でデザインされたｈＴ２  ＶＬ、ｈＴ３  ＶＬの実際の細胞質浸透能を比較するために、ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインを精製した。
【０１１９】
具体的には、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域単一ドメインＮ−末端にＰｈｏ  ＡシグナルペプチドとＣ−末端にｐｒｏｔｅｉｎ  Ａタグが含まれたｐＩｇ２０ベクターでＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素を利用してクローニングして、タンパク質発現用大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＥに電気穿孔法を利用して形質転換した。１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンが含まれたＬＢＡ培地で１８０ｒｐｍ、３７℃条件で吸光度６００ｎｍで０．６〜０．８まで培養した後、終濃度０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｈｙβ−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒｏｎｏｓｉｄｅ）処理後２３℃で２０時間発現した。発現後高速遠心分離機を利用して８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄み液を取った後、ＩｇＧセファロース樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と反応させた。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４）５０ｍｌを利用して樹脂洗浄をした後、５ｍＭ  ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ５．０バッファー５ｍｌに追加的洗浄した。以後、０．１Ｍ  ＨＡｃ、ｐＨ３．０バッファーで樹脂でタンパク質を湧出して、透析方法を利用してＴＢＳ、ｐＨ７．４でバッファーを取り替えて、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ（Ｐｉｅｒｃｅ））分析方法を介してタンパク質濃度測定およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを介してタンパク質の純度を確認した。
【０１２０】
実施例３．細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメインの細胞質浸透能と細胞浸透機序検証
図３Ａは、軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透能を共焦点顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）で観察した結果である。
【０１２１】
具体的には、ｍ３Ｄ８  ＶＬ、ｈＴ０  ＶＬ、ｈＴ２  ＶＬ、ｈＴ３  ＶＬの細胞質浸透能を検証するために、２４ウェルプレートにカバースリップを入れて各ウェル当たり５ｘ１０４個のＨｅＬａ細胞株を１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）が含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにｍ３Ｄ８  ＶＬ、ｈＴ０  ＶＬ、ｈＴ２  ＶＬまたはｈＴ３  ＶＬを１０μＭ処理して３７℃、５％ＣＯ２条件で６時間培養した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去して、ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジド化ナトリウム、１％ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。再びＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するために、ＰＢＳに２％ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。軽鎖可変領域単一ドメインのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａタグを認知するＲａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を処理して２５℃で２時間染色して、ＰＢＳで３回洗浄後、赤色蛍光（ＴＲＩＴＣ）が連結された抗Ｒａｂｂｉｔ抗体（ｓｉｇｍａ）を処理して２５℃で１時間反応させた。最後にＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。ｈＴ０  ＶＬを除いたｍ３Ｄ８  ＶＬ、ｈＴ２  ＶＬ、ｈＴ３  ＶＬ共に細胞質浸透能を確認した。
【０１２２】
図３Ｂは、軽鎖可変領域単一ドメインの細胞質浸透メカニズムを検証するために、共焦点顕微鏡で観察した結果である。
具体的には、図３ＡのようにＨｅＬａ細胞株を準備して細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにｍ３Ｄ８  ＶＬ、ｈＴ２  ＶＬまたはｈＴ３  ＶＬ  １０μＭと緑色蛍光を帯びるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（ＴＦ、緑色蛍光）、ＦＩＴＣ−ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ（Ｃｔｘ−Ｂ、緑色蛍光）またはＯｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ−ｄｅｘｔｒａｎ（Ｄｅｘｔｒａｎ、緑色蛍光）１０ｕｇ／ｍｌで希釈して２時間３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。以後、軽鎖可変領域単一ドメイン染色方法は図３Ａのとおりである。図３Ｂに示された通り、軽鎖可変領域単一ドメイン共にｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ−Ｂと重なることによって、Ｃａｖｅｏｌａｅによって細胞質浸透することを確認した。
【０１２３】
実施例４．ヒト抗体重鎖可変領域と相互作用結合が容易な細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）単一ドメイン開発
図４Ａは、ｈＴ３  ＶＬの様々なヒト抗体重鎖可変領域に対して適用可能の有無を確認するために既存のヒト抗体Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）とヒト化抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）の軽鎖可変領域（ＶＬ）とアミノ酸配列を分析した結果である。
【０１２４】
具体的には、重鎖、鎖可変領域間の結合による関与するインターフェース（ＶＨ−ＶＬ  ｎｔｅｒｆａｃｅ）残基を分析した結果、ＶＬドメインのＣＤＲ３に位置している８９番目リジン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｋ）、９１番目セリン（Ｓｅｒｉｎｅ，Ｓ）がヒト抗体で８９番目グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，Ｑ）、９１番目チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ，Ｙ）で一致することを確認した。
【０１２５】
前記残基に対する改良戦略を構築するために、インターフェース（ＶＨ−ＶＬ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）残基重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＣＤＲに対する影響をさらに具体的に分析した。
【０１２６】
図４Ｂは、追加的にヒト抗体重鎖可変領域と最適化された結合を介して安定的ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のための可変領域間のインターフェース残基を分析した結果である。
具体的には、既存文献を介してヒト抗体可変領域間のインターフェース残基位置および反対側可変領域に位置した特定インターフェース残基と結合頻度、インターフェース残基のヒト抗体での使用頻度を資料を根拠に、ｈＴ３  ＶＬとＦＤＡに承認された治療用抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖、軽鎖可変領域間のインターフェースを分析した（Ｖａｒｇａｓ−Ｍａｄｒａｚｏ  ａｎｄ  Ｐａｚ−Ｇａｒｃｉａ，２００３）。分析結果、ｈＴ３  ＶＬのマウス由来ＣＤＲで可変領域間の結合に関与するＣＤＲ３に含まれた８９番、９１番残基がヒト抗体使用頻度が高い地域であり、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３の構造に影響を与え得ることを確認した。この二つの残基をヒト抗体で使用頻度が高いアミノ酸で突然変異してヒト抗体重鎖可変領域と最適化された結合ができるｈＴ４  ＶＬを開発した。
【０１２７】
下記の表１と２は、デザインされた細胞質浸透能を有するヒト抗体軽鎖可変領域配列を示す。表１は、ヒト抗体軽鎖可変領域全体配列をＫａｂａｔナンバリングに合うように示した表であり、表２は、前記表１の抗体配列でＣＤＲ配列だけ別に表記した内容である。
【０１２８】
【表１】
0006595592.tif 000006
【０１２９】
【表２】
0006595592.tif 000007
【０１３０】
実施例５．細胞質浸透ヒト化軽鎖可変領域（ＶＬ）置換を介したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ開発および発現精製
図５は、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ構築のために細胞浸透能がない軽鎖可変領域を細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域を置き換える方法に対する全般的な模式図である。
【０１３１】
具体的には、完全ＩｇＧ形態の単一クローン抗体形態で生産するための重鎖発現ベクターを構築するために、５’末端に分泌シグノルペプチドをコードするＤＮＡが融合した種々の抗体の重鎖可変領域（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ＶＨ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ  ＶＨ、ヒト化ｈＴ０  ＶＨ）と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。また、軽鎖を発現するベクターを構築するために、５’末端に分泌シグノルペプチドをコードするＤＮＡが融合した細胞質浸透軽鎖可変領域（ｈＴ４  ＶＬ）またはモデル抗体の軽鎖可変領域（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ＶＬ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ  ＶＬ）と軽鎖不変領域（ＣＬ）を含む軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。
【０１３２】
前記軽鎖、重鎖発現ベクターを一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を利用してタンパク質を発現および精製して収率を比較した。振とうフラスコで、無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で浮遊成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をプラスミドおよびポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）の混合物でトランスフェクションした。振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に２００ｍＬトランスフェクション時、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を２．０×１０６細胞／ｍｌの密度で培地１００ｍｌに播種して、１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養した。それぞれの単一クローン抗体を生産するために、適する重鎖と軽鎖プラスミドを１０ｍｌ  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に重鎖１２５μｇ、軽鎖１２５μｇの計２５０μｇ（２．５μｇ／ｍｌ）で希釈して、ＰＥＩ  ７５０μｇ（７．５μｇ／ｍｌ）を希釈した１０ｍｌの培地と混合して室温で１０分間反応させた。その後、反応させた混合培地を先の１００ｍｌで播種した細胞に入れて４時間１５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２で培養後、残りの１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地を追加して６日間培養した。標準プロトコルを参照して採取した細胞培養上澄み液からタンパク質を精製した。タンパク質Ａセファロースカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に抗体を適用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．１Ｍグリシン緩衝液を利用してｐＨ３．０で抗体を溶離したた後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液を利用してサンプルを直ちに中和した。溶離した抗体分画は、透析方法を介してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で緩衝液を取り替えて濃縮を進めた。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。
【０１３３】
下記の表３は、精製されたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂおよび単一クローン抗体の培養体積１リッター当り生産されるタンパク質の収率を示す。３回行って得られた結果を統計処理して、±は標準偏差値を示す。得られたタンパク質の収率は、ヒト重鎖可変領域（ＶＨ）と相互作用結合し易くするために改良されたｈＴ４  ＶＬを含んだｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの場合、野生型単一クローン抗体と大差はなかった。
【０１３４】
【表３】
0006595592.tif 000008
【０１３５】
これを介して、インターフェース残基を追加的に改良したヒト化軽鎖可変領域（ｈＴ４  ＶＬ）が、ヒト化抗体重鎖可変領域と最適化された結合を介して安定した発現および精製が可能であることを確認した。
【０１３６】
図６Ａは、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ精製後、還元性または非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。
【０１３７】
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認して、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量を示した。これは、発現精製されたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂおよび単一クローン抗体が、溶液状態で単一体存在して、非自然的ジスルフィド結合を介して二重体またはオリゴマーを形成しないことが示された。
【０１３８】
図６Ｂは、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（Ｔｈｅ  Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌｅｓ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を介してｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂが自然的環境で単一体存在することを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００  １０／３００ＧＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を実験した結果である。
具体的には、塩基性残基による電気的引力で樹脂と非特異的結合を抑制するために高い塩を有している湧出バッファー（１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）を使用して、流速は０．５ｍｌ／ｍｉｎである。タンパク質のサイズマーカーで使用されたタンパク質は、デヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、アルブミン（６６ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）を使用した。すべての単一クローン抗体およびｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂで１個の極点が測定されて、単一体で存在することを確認した。
【０１３９】
実施例６．Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域による抗体親和度分析および軽鎖可変領域（ＶＬ）によるＤＮＡ加水分解能分析
図６Ｃは、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ（ＴＭａｂ４、ＨｕＴ４、ＡｖａＴ４）と単一クローン抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）の重鎖可変領域による標的分子に対する親和度を測定するために、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）を行った結果である。
【０１４０】
具体的に標的分子ＶＥＧＦ−Ａ、ＴＮＦαを９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間３回洗浄した。５％ＰＢＳＳ（５％  Ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ，ｐＨ７．４，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，１２ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。以後ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂおよび単一クローン抗体ＴＭａｂ４、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＡｖａＴ４、ＨｕＴ４を結合させた後、０．１％ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体でヤギ由来ＡＰが接合された抗−ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）で結合させる。ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（ＳＩＧＭＡ）で反応させて４０５ｎｍ吸光度を定量した。
【０１４１】
図６Ｃに示したとおり、ＡｖａＴ４、ＨｕＴ４は、標的分子に対する親和度を無くすことを確認した。ＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＴＮＦαの場合、抗原認知部位が、重鎖、軽鎖に位置しているＣＤＲが共に関与することを確認した（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。また、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの場合、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ３が抗原と結合に重要な役割をしているが、図８Ｂで分析した時、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの場合、ＶＨ７小グループを有していると確認されて、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３に影響を大幅に与えるＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂの軽鎖可変領域の９６番残基がｈＴ４  ＶＬと大きな差を示すことを確認した（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１４２】
図６Ｄは、自己免疫マウス由来抗体のＣＤＲをｇｒａｆｔｉｎｇした細胞浸透能を有するヒト軽鎖可変領域（ｈＴ４）置換を介したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂでの核酸加水分解能を確認するためにアガロースゲル核酸加水分解検証実験を行った結果である。
具体的に、合計混合物体積１０μｌで精製されたｐＵＣ１９基質（２．２ｎＭ）と核酸加水分解能があると知られたｍ３Ｄ８  ｓｃＦｖタンパク質（０．５μＭと０．１μＭ）またはｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂおよび単一クローン抗体ＴＭａｂ４、ＡｖａＴ４、ＨｕＴ４（０．１μＭ）を共にＴＢＳ反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）（ＳＩＧＭＡ）に入れて反応させる。この時、ＴＢＳバッファーには２ｍＭ  ＭｇＣｌ２をいれて、また他のバッファーには５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ）をいれて対照群として使用した。このように製造した試料を３７℃で反応させて１時間後結果を観察した。
【０１４３】
図６Ｄに示されたとおり、観察結果、ＴＭａｂ４、ＡｖａＴ４、ＨｕＴ４は、０．１μＭで核酸加水分解能がないことを確認した。これは、細胞質浸透能を介して細胞質残留する場合、非特異的細胞毒性を誘発しないことがわかる。
【０１４４】
実施例７．Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質浸透能検証
図７Ａは、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域ｈＴ４  ＶＬで軽鎖可変領域が置き換えられたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質浸透能を検証するために、様々な細胞株で１〜２個の細胞に焦点を合わせて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
【０１４５】
具体的には、２４ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０４個のＨｅＬａ、ＰＡＮＣ−１、ＨＴ２９、ＭＣＦ−７細胞を１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ２、３７℃条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ（Ｈｕｍｉｒａ）、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（Ａｖａｓｔｉｎ）、ＨｕＴ４、ＡｖａＴ４  １μＭで希釈して６時間３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。以後、培地を除去してＰＢＳで洗浄した後、弱酸性溶液（２００ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎｅ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．５）で細胞表面についたタンパク質を除去した。ＰＢＳ洗浄後、４％パラホルムアルデヒド添加後、２５℃条件で１０分間細胞を固定した。以後、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに０．１％サポニン、０．１％アジド化ナトリウム、１％ＢＳＡが添加されている緩衝液で２５℃、１０分間培養して細胞膜に穴を形成する過程を経た。再びＰＢＳで洗浄後、非特異的結合を抑制するためにＰＢＳに２％ＢＳＡが添加された緩衝液で２５℃で１時間反応させた。次に、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）が結合されているヒトＦｃを特異的に認知する抗体（Ｓｉｇｍａ）で２５℃で１．５時間染色して、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。細胞外部分泌タンパク質を標的するＩｇＧ形態の単一クローン抗体ＡｄａｌｉｍｕｍａｂとＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂとは異なってＴＭａｂ４、ＨｕＴ４とＡｖａＴ４は、細胞の内部で緑色蛍光が観察された。
【０１４６】
図７Ａは、細胞質浸透能を有する軽鎖可変領域ｈＴ４  ＶＬで軽鎖可変領域が置き換えられたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質浸透能を検証するために、様々な細胞株で１〜２個の細胞に焦点を合わせて共焦点顕微鏡で観察した結果である。
細胞質浸透能を有するヒト化軽鎖可変領域が導入されたｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの場合、すべての細胞で細胞質浸透を介して細胞質に分布することを確認した。
【０１４７】
図８Ａは、共焦点顕微鏡でＴＭａｂ４の濃度に応じた細胞浸透程度を観察した結果である。ＨｅＬａ細胞株にＴＭａｂ４を１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ処理して３７℃で６時間培養する。前述した方法と同様に準備して共焦点顕微鏡で観察した。ＴＭａｂ４を６時間培養した時、１００ｎＭから緑色蛍光が細胞の内部で観察された。以後、濃度が高まるほど細胞の内部の緑色蛍光が増加した。
【０１４８】
図８Ｂは、ＴＭａｂ４を処理して時間帯に応じた細胞浸透程度を共焦点顕微鏡で観察した結果である。ＨｅＬａ細胞株にＴＭａｂ４  １μＭ処理して各１０分、３０分、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、３７℃で培養して前記実施例と同様の方法で染色して共焦点顕微鏡で観察した。
【０１４９】
３０分から弱く細胞の内部のＴＭａｂ４緑色蛍光が見えて、段々増加して６時間帯で最も蛍光が強く現れた。その後の時間帯には徐々に減少して４８時間帯では蛍光が非常に弱くなった。
【０１５０】
実施例８．Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞毒性評価
前記実施例１０で細胞質浸透能を有しているｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂがＩｎ  ｖｉｔｒｏ上で、細胞毒性を有するかを確認するために、ＨｅＬａ、ＰＡＮＣ−１細胞株にＴＭａｂ４、ＨｕＴ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＡｖａＴ４、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をＭＴＴ  ａｓｓａｙ（ｓｉｇｍａ）を介して確認した。
【０１５１】
具体的には、９６ウェルプレートにウェル当たり１ｘ１０４個の細胞（ＨｅＬａ、ＰＡＮＣ−１）をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．１ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。以後、１μＭのＴＭａｂ４、ＨｕＴ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＡｖａＴ４、Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂを２０時間または４４時間処理した後、ＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）２０ｕｌを添加して、さらに４時間培養した。形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を２００ｕｌのＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で溶解させて、吸光度計で５９５ｎｍで吸光度を測定することによって細胞生存率を求めた。
【０１５２】
図９Ａは、ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価してグラフで図式化したものである。図９Ｂは、ＨｅＬａとＰＡＮＣ−１細胞株でｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂを処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認した写真を示したものである。図９Ａ、および図９Ｂに示されたとおり、すべての抗体が細胞毒性を示さないことを確認した。前記実施例６で確認したように、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂがｍ３Ｄ８  ｓｃＦｖと異なるように核酸加水分解活性がないので、細胞毒性がないことを確認した。
【０１５３】
実施例９．Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞内輸送過程および分解機序検証
図１０は、細胞中に流入したＴＭａｂ４の輸送過程と安定度を観察するために、パルス追跡実験（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｅ）を行って共焦点顕微鏡で観察した結果である。
具体的には、前述した方法と同様にＨｅＬａ細胞株を準備してＴＭａｂ４  ３μＭを３７℃で３０分処理後、速くＰＢＳで３回洗浄して、培地を添加して２時間、６時間、１８時間、３７℃で培養した。前記例のような方法を介してＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄後、細胞固定、細胞穿孔、ブロッキング過程を経た。ＴＭａｂ４は、緑色蛍光（ＦＩＴＣ）または赤色蛍光（ＴＲＩＴＣ）が連結されたヒトＦｃを特異的に認知する抗体で染色した。尚、初期エンドソーム（ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）のマーカーであるＥＥＡ１（Ｅａｒｌｙ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ１）を標識するａｎｔｉ−ＥＥＡ１、カベオソーム（ｃａｖｅｏｓｏｍｅ）のマーカーであるｃａｖｅｏｌｉｎ−１を標識するａｎｔｉ−ｃａｖｅｏｌｉｎ−１、小胞体マーカーであるｃａｌｎｅｘｉｎを標識するａｎｔｉ−ｃａｌｎｅｘｉｎまたはゴルジ体マーカーである５８Ｋゴルジタンパク質を標識するａｎｔｉ−５８Ｋ  Ｇｏｌｇｉ（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）抗体を４℃、１２時間反応させて、赤色蛍光（ＴＲＩＴＣ）が連結された二次抗体を２５℃で１時間反応させた。Ｌｙｓｏｓｏｍｅとｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎは、細胞固定する３０分前に、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）  Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９  １μＭまたはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎを（１０μｇ／ｍｌ）培養中の細胞に直接処理した。染色過程を終えた後、共焦点顕微鏡で分析した。ＴＭａｂ４は、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎよりも安定的に細胞内に存在して、ｃｌａｔｈｒｉｎによって細胞質浸透されて２時間まで初期エンドソームに位置していて、以後リソソームに輸送されず、どの細胞小器官とも重なることはなかった。
【０１５４】
図１１Ａは、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ  ＴＭａｂ４またはＨｕＴ４の細胞質への移動を間接的に確認するために、ｃａｌｃｅｉｎを利用して共焦点顕微鏡で観察した結果である。
具体的には、前述した方法と同様にＨｅＬａ細胞株を準備して血清がない培養液にＰＢＳ、ＴＭａｂ４、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ、ＨｕＴ４  ５μＭを３７℃で４時間培養した。４時間が過ぎた後、ＰＢＳまたは抗体が含まれているウェルにｃａｌｃｅｉｎ  ５０μＭを処理して３７℃で２時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、前記実施例と同様に細胞固定して共焦点顕微鏡で観察した。ＴＭａｂ４とＨｕＴ４によってｃａｌｃｅｉｎがエンドソームから外れて細胞質に広まっている緑色ｃａｌｃｅｉｎ蛍光を示した。一方、ａｄａｌｉｍｕｍａｂは細胞質に広がった緑色蛍光が観察されなかった。
【０１５５】
図１１Ｂは、図１１Ａの共焦点顕微鏡写真のｃａｌｃｅｉｎ蛍光を定量した棒グラフである。
具体的には、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を利用して各条件で細胞１５個をそれぞれ指定した後、得られた蛍光の平均値（ｍｅａｎ）をグラフで示した。
【０１５６】
実施例１０．ＧＦＰ断片再結合能を介したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質残留能確認
図１２Ａは、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂが細胞質に位置する場合ｓｐｌｉｔ−ＧＦＰの相補的な結合によるＧＦＰ蛍光が観察される過程を説明する模式図である。
【０１５７】
具体的には、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂが細胞質に位置することを直接的に確認するために、ｓｐｌｉｔ−ＧＦＰ相補的システムを使用した。緑色蛍光タンパク質であるＧＦＰを１〜１０番、１１番の断片で分けると、蛍光を示す特性が除去されて、もし二つの断片の距離が近くなって結合すると、蛍光を示す特性を回復することができる（Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。このような特性を利用して、ＧＦＰ１〜１０番の断片は、細胞質に発現させて、ＧＦＰ１１番の断片は、Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖Ｃ−末端に融合させる。従って、ＧＦＰ蛍光が観察されることは、Ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂが細胞質に位置することを反証する。
【０１５８】
追加的に、ｓｐｌｉｔ  ＧＦＰの相補的な結合を補助するためにさらに高い親和度を有するｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＳＢＰ２（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ２）を利用した（Ｂａｒｒｅｔｔｅ−Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。サイズがさらに小さいＳＢＰ２をＧＦＰ１１番の断片Ｃ−末端にＧＧＧＧＳ３個のリンカーを使用して遺伝工学的に融合した。また、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎは、ＧＦＰ１〜１０断片のＮ−末端にＧＧＧＧＳ３個のリンカーを使用して遺伝工学的に融合して、前記システムを実現するために、ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＧＦＰ１〜１０を発現する安定した形質転換細胞株を開発した。
【０１５９】
具体的には、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＧＦＰ１〜１０をコードするＤＮＡをレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒｕｓ）ベクターであるｐＬＪＭ１（Ａｄｄｇｅｎｅ）ベクターにＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩでクローニングした。細胞培養皿に３ｘ１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳが含まれた培地１ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ２、３７℃条件で培養した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ）６００ｕｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）４０ｕｌを入れて、構築したレンチウイルスベクターとウイルスパッケージングベクターであるｐＭＤＬ、ｐＲＳＶ、ｐＶＳＶ−Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ）を注意しながら添加して２０分間常温で反応させた後、皿に添加した。追加的に抗生剤がないＤＭＥＭ  ｍｅｄｉａ  ９ｍｌを入れて６時間３７℃、５％ＣＯ２で培養後、１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地１０ｍｌに取り替えた後、７２時間培養した。６０時間後１ｘ１０５個のＨｅＬａ細胞を１０％ＦＢＳが含まれた培地１ｍｌに入れて１２時間３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。レンチウイルスベクターを一時的トランスフェクションさせた培地を全部フィルターして培地中のウイルス粒子を予め準備しておいたＨｅＬａ細胞がある細胞培養皿に添加する。抗生剤抵抗性は、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）抵抗性遺伝子を選択マーカーとして使用した。
【０１６０】
図１２Ｂは、構築したｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅのｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＧＦＰ１−１０の発現程度をウェスタンブロットで確認したものである。
具体的には、６ウェルプレートに各ウェル当たり１ｘ１０５個のＨｅＬａ細胞を１０％ＦＢＳが含まれた培地１ｍｌに入れて１２時間３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。培養後細胞溶解物を得るために、溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｓｉｇｍａ））をいれる。細胞溶解物は、ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を利用して定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったゲルをＰＶＤＦ膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移して、それぞれｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎとβ−ａｃｔｉｎを認知する抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）と２５℃２時間反応させて、ＨＲＰが結合された二次抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を２５℃１時間反応させた後検出した。分析はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用した。
【０１６１】
実施例１１．ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの発現および精製
ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ動物細胞発現のためにＧＦＰ１１−ＳＢＰ２を重鎖Ｃ−末端にＧＧＧＧＳ３個のリンカーを使用して遺伝工学的に融合した。以後、前記細胞質浸透軽鎖とエンドソーム脱出能向上細胞質浸透軽鎖をコードしている動物発現ベクターとＧＦＰ１１−ＳＢＰ２が融合した重鎖がコードされた動物発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以後、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合した細胞質浸透単一クローン抗体の精製は前記実施例５と同様に行った。
【０１６２】
実施例１２．ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの細胞質位置によるＧＦＰ蛍光確認
図１２Ｃは、ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２融合したｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂのｓｐｌｉｔ  ＧＦＰ相補的な結合によるＧＦＰ蛍光を共焦点顕微鏡を介して観察した結果である。
【０１６３】
具体的には、前記実施例７と同様にＨｅＬａ細胞株を準備して細胞が安定化されると、ＰＢＳ、ＴＭａｂ４−ＧＦＰ１１−ＳＢＰ２  ０．２、０．４、０．６、０．８、１μＭを３７℃で６時間培養した。前記実施例７のような方法を介してＰＢＳと弱酸性溶液で洗浄後、細胞固定した。尚、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を利用して核を染色（青色蛍光）して共焦点顕微鏡で観察した。ＴＭａｂ４は、０．８、１μＭ  ＧＦＰ蛍光が観察されることを確認した。
前記結果によりｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ  ＴＭａｂ４が細胞浸透を介して細胞質に位置することを明確に確認した。
【０１６４】
実施例１３．高い多様性ヒトＶＨライブラリーを介したＧＴＰが結合されたＫＲａｓ特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）選別
図１３は、細胞質浸透能だけ保有している完全ＩｇＧフォーマットＣｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置換を介して抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ構築を説明した模式図である。
【０１６５】
図１４は、細胞質浸透能だけ保有しているＩｇＧフォーマットｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの応用として重鎖可変領域（ＶＨ）をＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域（ＶＨ）で置き換えた細胞浸透および細胞内分布するＧＴＰが結合されたＲａｓに特異的に結合する単一クローン抗体（抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ：ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ＆  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を利用してＲａｓ突然変異細胞に対する特異的な細胞毒性を誘導する戦略に対する模式図である。
【０１６６】
前記の抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂに導入するためのＧＴＰが結合されたＫＲａｓ特異的に結合する安定したヒト化重鎖可変領域単一ドメイン（ＶＨ）抗体切片を選別するために、以前の研究を介して構築された酵母発現ＶＨライブラリーを使用した（Ｂａｅｋ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，２０１４）。
【０１６７】
具体的に使用したライブラリーのＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）は、従来抗体で最も普遍的に使用されたＶ遺伝子であるＩＧＨＶ３−２３＊０４，ＪＨ４を使用していて、ＣＤＲ３の長さは９個の残基を有するライブラリーを使用した。前記ライブラリーの構築および酵母表面発現方法は、すでに発表した論文で詳しく記述されている（Ｂａｅｋ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，２０１４）。
【０１６８】
実施例１４．ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄタンパク質準備
ライブラリー選別および親和度分析のためのＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ抗原を準備するために、大腸菌で発現精製した過程は、すでに発表した論文で詳しく記述されている（Ｔａｎａｋａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１６９】
具体的には、野生性ＫＲａｓと突然変異頻度が高い順で三つの突然変異ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ  Ｇ１３ＤのＣＡＡＸモチーフを含む１番〜１８８番をコードするＤＮＡを大腸菌発現ベクターであるｐＧＥＸ−３Ｘベクターに制限酵素ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを使用してクローニングした。この時、発現ベクターはＴ７プロモーター−ＧＳＴ−ＫＲａｓを有するようにデザインした。すべてのＫＲａｓ突然変異はｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ手法を利用して突然変異を誘導して、前記技術方法を使用して発現ベクターを構築して、ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＫＲａｓベクターを大腸菌に電気穿孔法を利用して形質転換して選択培地で選別した。選別された大腸菌をＬＢ培地で１００μｇ／ｍｌのアンピシリン抗生剤存在下に３７℃で６００ｎｍでの吸光度０．６まで培養後、タンパク質発現のために０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した後、３０℃で５時間をさらに培養した。以後、遠心分離機を利用して大腸菌を集めた後、超音波を利用して（ＳＯＮＩＣＳ）大腸菌を粉砕した。遠心分離機を使用して大腸菌粉砕物を除去した上澄み液のみを得てＧＳＴタグがあるタンパク質を特異的に精製するＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して精製した。Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ樹脂を洗浄するために、洗浄バッファー（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１．８ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ７．４）（ＳＩＧＭＡ）で５０ｍｌ洗浄後、湧出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ還元されたｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（ＳＩＧＭＡ）を利用してタンパク質を湧出した。湧出されたタンパク質は、透析法を利用して保存バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（ＳＩＧＭＡ）でバッファーを変えた。精製されたタンパク質は、２８０ｎｍ波長で吸光度と吸光係数を利用して定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して約９８％以上の純度を確認した。
【０１７０】
以後、ＫＲａｓタンパク質にＧＴＰλＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＧＤＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）基質を結合させるために、ＫＲａｓと基質の分子比率を１：２０にして反応バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ）（ＳＩＧＭＡ）で３０℃で３０分反応させた後、反応を止めるために６０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した後−８０℃で保管する。
【０１７１】
実施例１５．ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに特異的重鎖可変領域（ＶＨ）選別
図１５は、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄタンパク質に対してだけ特異的に高親和度を有するヒト化抗体重鎖可変領域単一ドメインを得るためのライブラリー選別戦略を示した模式図である。
【０１７２】
具体的には、実施例１４で精製したＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄをビオチン化させた後（ＥＺ−ＬＩＮＫＴＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））酵母細胞表面に発現した重鎖可変領域ライブラリーと常温で１時間反応させた。ビオチン化されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄと反応した酵母細胞表面に重鎖可変領域ライブラリーをストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）（ＥＺ−ＬＩＮＫＴＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））と４℃で２０分間反応させた後、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用してＧＴＰが結合されたＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｄに高親和度を有する重鎖可変領域を発現する酵母を浮遊化した（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）。選別されたライブラリーを発現する酵母を選択培地で培養およびＳＧ−ＣＡＡ＋ＵＲＡ（２０ｇ／Ｌ  Ｇａｌａｃｔｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、５．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．２ｍｇ／Ｌ  Ｕｒａｃｉｌ）（ＳＩＧＭＡ）培地でタンパク質発現を誘導した後、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ単独またはＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄより１０倍高い濃度のビオチン化されずにＧＤＰと結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ抗原を競合的にライブラリーが発現した酵母と１時間常温で反応させた後、ＰＥが接合されたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＳＡ−ＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と反応して、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ）（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を介して浮遊化を確認した。ＦＡＣＳ分析を介して次の選別条件選定以後、前記と同様の条件で浮遊化されたライブラリーを発現する酵母に抗原を結合させた後、ＦＡＣＳ  ａｒｉａＩＩ機器を使用して浮遊化させた。１次ＭＡＣＳ、１次ＦＡＣＳ選別を介して浮遊化されたヒト化重鎖可変鎖ライブラリーは、細胞質浸透軽鎖単一鎖（ｈＴ４  ＶＬ）を分泌する酵母と酵母接合してＦａｂ形態で酵母表面に発現させた後、２次ＦＡＣＳ、３次ＦＡＣＳ選別過程を進めた。
【０１７３】
具体的に重鎖可変領域（ＶＨ）ライブラリーと接合させる細胞質浸透軽鎖可変領域（ＶＬ）を分泌する酵母を構築するために、軽鎖可変領域酵母分泌ベクターであるｐＹＤＳ−Ｋに細胞質浸透能があるｈＴ４  ＶＬをコードするＤＮＡを制限酵素ＮｈｅＩとＢｓｉＷＩを使用してクローニングしたｐＹＤＳ−Ｋ−ｈＴ４  ＶＬを電気穿孔法で接合αタイプ（ｍａｔｉｎｇ  αｔｙｐｅ）の酵母接合菌株であるＹＶＨ１０菌株に形質転換して選択培地ＳＤ−ＣＡＡ＋Ｔｒｐ（２０ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、５．４ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、８．６ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｇ／Ｌ  ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．４ｍｇ／Ｌ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）（ＳＩＧＭＡ）で選別培養した酵母と酵母接合した。
【０１７４】
具体的に酵母接合の場合、６００ｎｍで吸光度が１である時、１Ｘ１０７の酵母がある。培養された酵母中ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに選別された重鎖可変領域ライブラリーが発現した酵母とｈＴ４  ＶＬを含んでいる酵母をそれぞれ１．５Ｘ１０７ずつ混ぜて、ＹＰＤ（２０ｇ／Ｌ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ、２０ｇ／Ｌ  ｐｅｐｔｏｎｅ、１０ｇ／Ｌ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１４．７ｇ／Ｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ、４．２９ｇ／Ｌ  ｃｉｔｒｉｃ  ａｃｉｄ、ｐＨ４．５）（ＳＩＧＭＡ）で３回洗浄後、ＹＰＤ１００μｌで再浮遊（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）して、ＹＰＤプレート上に広がらないようにドロップした後、乾燥して６時間３０℃で培養する。以後、ＹＰＤ培地で乾燥された酵母塗抹部位を３回洗浄後、最終酵母濃度１×１０６以下になるべく選択培地ＳＤ−ＣＡＡ培地で３０℃、２４時間培養して接合された酵母だけ選別する。選別された酵母に対してＳＧ−ＣＡＡ培地でヒト化抗体Ｆａｂ断片発現を誘導してＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ  １００ｎＭ濃度でＧＤＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ  １００倍競合して２、３次ＦＡＣＳを介して浮遊化した。
【０１７５】
図１６は、前述されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに特異的高親和度を得るための選別過程工程別ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ単独条件およびＧＤＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄとの競合条件での結合能をフローサイトメトリーで分析した資料である。これにより、重鎖可変領域（ＶＨ）依存的にＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに特異的結合が可能なライブラリー選別が可能であることを確認した。
【０１７６】
前記のような高速選別を介して、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄタンパク質に高親和度および特異性を有するライブラリーで個別クローン分析を介して最終的にＲＴ４クローンが選別された。
【０１７７】
下記の表４と５は、活性化されたＲＡＳと結合する重鎖可変領域ＲＴ４の配列情報および配列番号を示す。表４は、ＲＴ４全体配列をＫａｂａｔナンバリングに合わせて示した表であり、表５は、前記表４の抗体配列でＣＤＲ配列だけ別に表記した内容である。
【０１７８】
【表４】
0006595592.tif 000009
【０１７９】
【表５】
0006595592.tif 000010
【０１８０】
実施例１６．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ発現、精製およびＫＲａｓ突然変異との親和度分析
細胞浸透および細胞質に位置する特性を有するｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの重鎖可変領域（ＶＨ）を前記実施例１３番で選別されたＲＴ４  ＶＨで置き換えて細胞浸透を介して細胞内ＧＴＰが結合されたＲａｓを特異的に標的が可能な抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂを動物細胞発現するために前記実施例５のように５’末端に分泌シグノルペプチドをコードするＤＮＡが融合されてＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合するＲＴ４重鎖可変領域と重鎖不変領域（ＣＨ１−ｈｉｎｇｅ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでクローニングした。以後、前記細胞質浸透軽鎖をコードしている動物発現ベクターと構築されたＧＴＰが結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域を含む重鎖がコードされた動物発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆタンパク質発現細胞に同時に一時的トランスフェクション（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。以後、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂの精製は、前記実施例５と同様に進めた。
【０１８１】
図１７は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の精製後還元性または非還元性条件で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して分析したものである。
具体的には、非還元性条件で約１５０ｋＤａの分子量を確認して、還元性条件で重鎖５０ｋＤａの分子量および軽鎖２５ｋＤａの分子量が示された。これは、発現精製された抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂが、非共有結合を除去した溶液状態で単一体で存在して、非自然的ジスルフィド結合を介して二重体またはオリゴマーを形成しないことを示している。
【０１８２】
図１８は、野生性ＫＲａｓおよびＫＲａｓ突然変異体ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ、ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＫＲａｓ  Ｇ１３ＤのＧＴＰが結合された形態とＧＤＰが結合された形態での親和度を測定するためのＥＬＩＳＡを行った結果である。
具体的に標的分子ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ突然変異とＧＤＰが結合されたＫＲａｓ突然変異を９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（ＳＩＧＭＡ）で１０分間３回洗浄した。４％ＴＢＳＢ（４％ＢＳＡ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（ＳＩＧＭＡ）で１時間結合した後、０．１％ＴＢＳＴで１０分間３回洗浄した。以後、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４（およびＲａｓ結合能がなく細胞質浸透能だけあるｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂ  ＴＭａｂ４）を４％ＴＢＳＢで希釈して濃度別に結合させた後、０．１％ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄した。標識抗体でヤギ由来ＡＰが接合された抗−ヒト抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｍＡｂ）（ＳＩＧＭＡ）で結合させる。ｐＮＰＰ（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐａｌｍｉｔａｔｅ）（ＳＩＧＭＡ）で反応させて４０５ｎｍ吸光度を定量した。
【０１８３】
抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４のＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄに対する結合力をさらに定量的に分析するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機器（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用した。
【０１８４】
具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４を１０ｍＭ  Ｎａ−アセテート緩衝液（ｐＨ４．０）に希釈してＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約１１００ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔｓ（ＲＵ）固定化した。Ｔｒｉｓ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で分析して、ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄを１０００ｎＭで６２．５ｎＭの濃度で分析した。結合、解離分析後、ＣＭ５チップの再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ１０．０）を３０μｌ／ｍｉｎの流速で１．５分間流して行われた。結合３分、解離３分で得られた各センソグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）は、空白セル（Ｂｌａｎｋ  ｃｅｌｌ）と比較して正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）および削減（Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）して親和度を計算した。
【０１８５】
図１９は、ＳＰＲ（ＢＩＡＣＯＲＥ  ２０００）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用してＫＲＡＳ  Ｇ１２ＤにＧＴＰが結合形態に対する抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の親和度分析結果を示す。
【０１８６】
実施例１７．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞質浸透性確認
図２０は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞質浸透能を確認するために、共焦点顕微鏡で観察した結果である。ＫＲａｓ突然変異を有する細胞株（ＰＡＮＣ−１、ＨＣＴ１１６）とＫＲａｓ野生型を種々の細胞株を（ＨＴ２９、ＨｅＬａ）で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞浸透能を観察した。
【０１８７】
具体的には、それぞれの細胞株を２４ウェルプレートに各ウェル当たり５ｘ１０４個で１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに入れて１２時間５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。細胞が安定化されると、各ウェルに新しい培地０．５ｍｌにＴＭａｂ４、ＲＴ４を１μＭで希釈して６時間３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。以後の過程は、前記実施例７の染色過程と同様にした。抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂが、細胞内蛍光が観察されることから、ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂでＧＴＰと結合されたＫＲａｓに特異的結合する重鎖可変領域と置き換えた以後にも、細胞質浸透性を失わないことを確認した。
【０１８８】
実施例１８．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞毒性評価
（１）抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂの付着性細胞成長抑制評価
図２１は、ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３  ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ細胞株で抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果である。
【０１８９】
具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂがＩｎ  ｖｉｔｒｏ上で、ＫＲａｓ突然変異依存的細胞株に特異的な毒性を有するのか確認するために、野生性ＫＲａｓであるマウス繊維細胞株であるＮＩＨ３Ｔ３とＲａｓ突然変異を人為的に過発現させたＮＩＨ３Ｔ３  ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異細胞株、そしてＫＲａｓ  Ｇ１３Ｄ突然変異ヒトすい臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１にＴＭａｂ４、ＲＴ４  １μＭをそれぞれ処理して付着性細胞成長阻害程度を評価した。
【０１９０】
具体的には、２４ウェルプレートにウェル当たり２ｘ１０３個の細胞ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＡＮＣ−１をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。以後、１μＭのＴＭａｂ４、ＲＴ４を７２時間ずつ２回処理して計１４４時間観察した後、生きている細胞の個数を計数して細胞の成長程度を比較した。
【０１９１】
図２１に示された通り、ＴＭａｂ４では毒性を示さない反面、ＲＴ４はＫＲａｓ突然変異細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３  ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ）だけで細胞成長を抑制して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株では毒性を示さなかった。また、ＫＲａｓ  Ｇ１３Ｄ突然変異であるＰＡＮＣ−１細胞株で細胞成長阻害を確認した結果として、ＴＭａｂ４は毒性がない反面、ＲＴ４は細胞成長抑制を示した。
【０１９２】
（２）抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の非付着性細胞成長抑制評価
図２２は、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ細胞株で非付着性細胞成長阻害を評価した結果である。
【０１９３】
具体的には、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂがＫＲａｓ突然変異細胞株で非付着性細胞成長阻害を引き起こすのか確認するために、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異細胞株でコロニー形成能を測定（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）をした。具体的に、まず２ｘ  ＤＭＥＭ培地と０．５ｍｌと１％アガロース溶液０．５ｍｌを混ぜて１２ウェルプレートにプルーティングして０．５％アガロースゲルで固めた。以後２ｘ  ＤＭＥＭ培地０．４ｍｌ、０．７％  ａｇａｒｏｓｅ  ０．５ｍｌ、ＮＩＨ３Ｔ３  ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ細胞株１ｘ１０３個  ０．０５ｍｌをＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＲＴ４、Ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ（２０μＭ）０．０５ｍｌと混ぜて０．５％アガロースゲル上にプレーティングして固めた。その後、３日間隔で計２１日間、１ｘ  ＤＭＥＭ培地０．５ｍｌにＰＢＳ、ＴＭａｂ４、ＲＴ４、Ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ  １μＭで０．３５％アガロースゲル上に処理した。２１日にＮＢＴ（ｎｉｔｒｏ−ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）溶液で細胞を染色した後、コロニー数を計数した。
【０１９４】
前記付着性細胞成長阻害実験結果と同様に、ＲＴ４はコロニー形成が抑制した反面、ＴＭａｂ４ではコロニー形成抑制を示さなかった。
前記結果から、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４は、細胞質にあるＲａｓ突然変異に特異的に結合して付着性および非付着性細胞成長を抑制することを確認した。
【０１９５】
実施例１９．抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞内ＧＴＰが結合されたＫＲａｓと特異的結合確認
図２３は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４と細胞内活性化したＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果である。図２４は、抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂと細胞内ＧＴＰが結合されたＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖ突然変異との重なりの可否を共焦点顕微鏡で確認した結果である。
【０１９６】
具体的には、２４ウェルプレートにｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（ｓｉｇｍａ）をコーティングした後、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）ＨＲａｓ  Ｇ１２Ｖ、ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色蛍光）ＫＲａｓ  Ｇ１２Ｖが発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株をそれぞれウェル当たり２ｘ１０４個を０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した後、ＴＭａｂ４、ＲＴ４  ２μＭを処理して３７℃、１２時間培養した。以後、前記実施例７と同様の条件で染色して共焦点顕微鏡で観察した。
【０１９７】
図２３と２４に示されたとおり、赤色蛍光の活性化されたＲａｓが位置する細胞内膜の部分に緑色蛍光のＲＴ４が重なった反面、ＴＭａｂは重ならなかった。
前記実験結果により、細胞内のＧＴＰが結合されたＲａｓと抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４が特異的に結合することを確認した。
【０１９８】
実施例２０．ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の細胞毒性評価
Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のためには、腫瘍組織特異性を与える必要がある。既存ｃｙｔｏｔｒａｎｓｍａｂの場合、細胞表面にＨＳＰＧと結合して、その他のいかなる腫瘍組織特異性を有しないため、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験で腫瘍に対する特異的生長阻害ができない可能性が高い。これを改善するために、新生血管細胞および様々な腫瘍で過発現されるインテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αｖβ３）に特異性を有するＲＧＤ４Ｃペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ、配列番号１７）を軽鎖Ｎ−末端にＧＧＧＧＳ１個のリンカーを使用して遺伝工学的に融合した。ＲＧＤ４Ｃペプチドの場合、既存ＲＧＤペプチドよりも高い親和度を有していて、遺伝工学的融合が可能で、Ｎ−末端に融合時にもＲＧＤペプチドの特定構造を維持できる特徴がある（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１９９】
図２５は、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１細胞株でＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４を処理して細胞成長阻害程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した結果である。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上で、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４自体が細胞毒性を有するのか確認するために、ＫＲａｓ  Ｇ１３Ｄ突然変異を有しているヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６とＫＲａｓ  Ｇ１２Ｄ突然変異を有しているヒトすい臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１にＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４をそれぞれ処理して細胞成長阻害程度を評価した。
【０２００】
具体的には、２４ウェルプレートにウェル当たり５ｘ１０３個の細胞ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１をそれぞれ１０％ＦＢＳが含まれた培地０．５ｍｌに希釈して１２時間、３７℃、５％ＣＯ２条件で培養した。以後、１μＭのＲＧＤ−ＴＭａｂ４、ＲＧＤ−ＲＴ４を７２時間ずつ２回処理して計１４４時間観察した後、生きている細胞の個数を計数して細胞の成長程度を比較した。
【０２０１】
図２５に示されたとおり、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４は、ＨＣＴ１１６とＰＡＮＣ−１細胞株でそれぞれ約２０％、１５％ＲＧＤ−ＲＴ４はそれぞれ約４０％、５０％程度細胞成長を抑制した。既存研究でＲＧＤ４Ｃペプチドの場合、インテグリンαｖβ５に対してインテグリンαｖβ３と比較した時、約３倍程度親和度が低いが、インテグリンαｖβ３は、主に新生血管細胞に過発現して、インテグリンαｖβ５は、種々の腫瘍細胞で発現して、ＲＧＤ４Ｃペプチドは、ＨＣＴ１１６、ＰＡＮＣ−１細胞株のαｖβ５と結合して細胞付着を阻害する活性を示す（Ｃａｏ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２０２】
これにより、ＲＧＤ４Ｃペプチドが融合したＴＭａｂ４の場合、細胞毒性を示すとは確認し難い。追加的にＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４を比較した時、ＲＧＤペプチドが結合されていても、Ｒａｓ特異的細胞成長を抑制する可能性があることを間接的に確認した。
【０２０３】
実施例２１．ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂの腫瘍成長阻害確認
図２６Ａは、ＨＣＴ１１６細胞株を異種移植したマウスでＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の腫瘍成長抑制効果を確認した実験結果である。図２６Ｂは、ＲＧＤが融合した抗−Ｒａｓ・ＧＴＰ  ｉＭａｂ  ＲＴ４の非特異的副作用を確認するためにマウスの体重を測定したグラフである。
【０２０４】
具体的には、前記実施例２０のＩｎ  ｖｉｔｒｏ結果を基に、Ｉｎ  ｖｉｖｏ上でＲＧＤ−ＲＴ４の腫瘍成長阻害を確認するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにＫＲａｓ  Ｇ１３Ｄ突然変異ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６をマウス当たり５ｘ１０６個の細胞を皮下注射で注入させて、約６日後腫瘍の体積が約５０ｍｍ３程度になった時、それぞれＰＢＳ、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４、ＲＧＤ−ＲＴ４を２０ｍｇ／ｋｇで静脈注射した。２日間隔で計９回静脈注射して、キャリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ）を利用して１８日間腫瘍体積を測定した。
【０２０５】
図２６Ａに示されたとおり、対照群であるＰＢＳに比べてＲＧＤ−ＴＭａｂ４とＲＧＤ−ＲＴ４は、癌細胞の成長を抑制して、ＲＧＤ−ＴＭａｂ４よりＲＧＤ−ＲＴ４の方がより効果的に腫瘍成長を抑制することを確認した。また、図２６Ｂに示されたとおり、ＲＧＤ−ＲＴ４実験群マウスの体重の変化がないことを確認して、これにより、他の毒性はないことを確認した。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【配列表】
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