(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ａ）で表される化合物：
【化１】
0006501413.tif 000014
Ｒ１は、メチルを表し、
Ｒ２は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ３は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ４及びＲ５は、ともにメチルを表し、
Ｒ６は、炭素数１〜１２のアルキルを表し、
Ｒ７は、水素原子又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（式中、Ｒ９は、炭素数１〜３のアルキル、又は１−メチル−１−プロペニルを表す）を表し、
Ｒ８は、メチルを表し、
−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＲ１０＝ＣＨ−（式中、Ｒ１０は、ヒドロキシメチルを表す）、又は−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＨＲ１３−（式中、Ｒ１１は、ヒドロキシメチルを表し、Ｒ１２及びＲ１３は、一緒になって隣接する炭素原子と共にエポキシ基を形成している）を表す）、
次の構造式（１）で表される化合物：
【化２】
0006501413.tif 000015
、
次の構造式（２）で表される化合物：
【化３】
0006501413.tif 000016
、及び
次の構造式（３）で表される化合物：
【化４】
0006501413.tif 000017
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を含有することを特徴とする、多能性幹細胞培養用組成物。
【請求項２】
一般式（Ａ）で表される化合物が、次の構造式（４）〜（１０）のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載の多能性幹細胞培養用組成物。
【化５】
0006501413.tif 000018
【請求項３】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるために使用されるものである、請求項１又は２に記載の多能性幹細胞培養用組成物。
【請求項４】
多能性幹細胞がヒト由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多能性幹細胞培養用組成物。
【請求項５】
多能性幹細胞がＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多能性幹細胞培養用組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の多能性幹細胞培養用組成物を含むことを特徴とする多能性幹細胞維持培養用培地。
【請求項７】
血清を含まない、請求項６に記載の多能性幹細胞維持培養用培地。
【請求項８】
一般式（Ａ）で表される化合物、構造式（１）で表される化合物、構造式（２）で表される化合物、及び構造式（３）で表される化合物、並びにこれらの塩の合計濃度が、１０ｎＭ〜１μＭである請求項６又は７に記載の多能性幹細胞維持培養用培地。
【請求項９】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるための多能性幹細胞の培養方法であって、かかる培養を、次の一般式（Ａ）で表される化合物：
【化６】
0006501413.tif 000019
（式中、
Ｒ１は、メチルを表し、
Ｒ２は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ３は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ４及びＲ５は、ともにメチルを表し、
Ｒ６は、炭素数１〜１２のアルキルを表し、
Ｒ７は、水素原子又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（式中、Ｒ９は、炭素数１〜３のアルキル、又は１−メチル−１−プロペニルを表す）を表し、
Ｒ８は、メチルを表し、
−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＲ１０＝ＣＨ−（式中、Ｒ１０は、ヒドロキシメチルを表す）、又は−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＨＲ１３−（式中、Ｒ１１は、ヒドロキシメチルを表し、Ｒ１２及びＲ１３は、一緒になって隣接する炭素原子と共にエポキシ基を形成している）を表す）、
次の構造式（１）で表される化合物：
【化７】
0006501413.tif 000020
、
次の構造式（２）で表される化合物：
【化８】
0006501413.tif 000021
、及び
次の構造式（３）で表される化合物：
【化９】
0006501413.tif 000022
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の存在下で行うことを特徴とする、培養方法。
【請求項１０】
一般式（Ａ）で表される化合物が、次の構造式（４）〜（１０）のいずれかで表される化合物である、請求項９に記載の培養方法。
【化１０】
0006501413.tif 000023
【請求項１１】
多能性幹細胞がヒト由来の細胞である、請求項９又は１０に記載の培養方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞がＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞をフィーダー細胞を含まない条件で培養する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１４】
多能性幹細胞を血清の非存在下で培養する、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１５】
一般式（Ａ）で表される化合物、構造式（１）で表される化合物、構造式（２）で表される化合物、及び構造式（３）で表される化合物、並びにこれらの塩の合計濃度が１０ｎＭ〜１μＭの条件で培養を行う、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項１６】
多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるための、次の一般式（Ａ）で表される化合物：
【化１１】
0006501413.tif 000024
（式中、
Ｒ１は、メチルを表し、
Ｒ２は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ３は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ４及びＲ５は、ともにメチルを表し、
Ｒ６は、炭素数１〜１２のアルキルを表し、
Ｒ７は、水素原子又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（式中、Ｒ９は、炭素数１〜３のアルキル、又は１−メチル−１−プロペニルを表す）を表し、
Ｒ８は、メチルを表し、
−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＲ１０＝ＣＨ−（式中、Ｒ１０は、ヒドロキシメチルを表す）、又は−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＨＲ１３−（式中、Ｒ１１は、ヒドロキシメチルを表し、Ｒ１２及びＲ１３は、一緒になって隣接する炭素原子と共にエポキシ基を形成している）を表す）、
次の構造式（１）で表される化合物：
【化１２】
0006501413.tif 000025
、
次の構造式（２）で表される化合物：
【化１３】
0006501413.tif 000026
、及び
次の構造式（３）で表される化合物：
【化１４】
0006501413.tif 000027
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用組成物、特に多能性幹細胞の培養に適した組成物、該組成物を含む培地、及び多能性幹細胞の培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞は、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））と、ほぼ無限に増殖する能力を有する幹細胞であり、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）、ヒトＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などがある。多能性幹細胞は、様々な組織細胞へと誘導できることから、再生医療ないしその材料、創薬スクリーニングなど様々な分野への応用が期待されている。実際に、多能性幹細胞を分化させた組織細胞のヒトへの投与も行われている（非特許文献１参照）。【０００３】
多能性幹細胞を研究材料又は再生医療製品の作製のために使用する場合、当該細胞の多能性を保持したまま培養及び維持することが不可欠である。一方、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞では、継代を行うことによってそれら細胞の有する性状の一つである多能性を失う場合があることが知られている。【０００４】
そこで、多能性を保持したまま多能性幹細胞を培養及び維持するために、血清やマウス由来の線維芽細胞をフィーダー細胞と称される支持細胞層として用いて培養が行われていた（非特許文献２及び３参照）。しかしながら、フィーダー細胞の調製が煩雑であるという問題や、またかようなフィーダー細胞の調製には、ロットごとの未分化維持能が異なるため再現性が悪いという問題がある。また、多能性幹細胞を再生医療に応用するためには、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー（Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）条件を満たす培養環境も求められるが、マウス由来のフィーダー細胞を用いると異種由来のタンパク質が混在する可能性があることから、臨床応用に障害がある。【０００５】
このため、フィーダー細胞を用いないフィーダーフリー（フィーダーレス）の培養方法が提案されている。例えば、ＲｅｐｒｏＦＦ（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用フィーダーレス培地、リプロセル社製）やｍＴｅＳＲ（登録商標）（ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持用無血清培地、ステムセルテクノロジー社製）といったフィーダーレス培地が市販されている。また、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメント又はヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントをコーティングした培養基材を用いたフィーダーレス培養技術が開示されている（特許文献１参照）。【０００６】
上記のようにフィーダーフリーの条件で多能性幹細胞を維持培養するためには、通常、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）又はトランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−βともいう）（ＴＧＦ−β）を添加して培養することが必要である（特許文献２及び３、並びに非特許文献４及び５参照）。【０００７】
しかしながら、タンパク質であるｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βは高価であるため、培養液のコストが高くなるという問題があり、再生医療などで多能性幹細胞が大量に必要となる場合において、コスト面で実用化の障害となっている。さらに、ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βはロット間で品質に差がある場合があり、安定したヒト多能性幹細胞の培養・供給が困難であるという問題もある。
したがって、多能性幹細胞の実用化に向け、多能性幹細胞の未分化状態を保持したまま、簡便にかつ安定的に細胞を培養・維持することができる培地ないし方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４３４０５号
【特許文献２】国際公開第１９９９／０２０７４１号
【特許文献３】国際公開第２００４／０５５１５５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｓ．  Ｄ．ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３７９：７１３−７２０，  ２０１２
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  １３１：８６１−８７２，  ２００７
【非特許文献３】Ｔｈｏｍｓｏｎ，  Ｊ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７，  １９９８
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ８：４２４−４２９，  ２０１１
【非特許文献５】Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ４：３５９４，  ２０１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞培養などに使用できる組成物、特に未分化状態を保持したまま多能性幹細胞を維持培養可能な新たな培地を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、多能性幹細胞を維持培養するための培地に、次の一般式（Ａ）で表される化合物（以下「化合物Ａ」という）：【００１２】
【化１】
0006501413.tif 000002
【００１３】
（式中、
Ｒ１は、水素原子又は炭素数１〜５のアルキルを表し、
Ｒ２は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ３は、水素原子又は水酸基を表し、
Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって、水素原子又は炭素数１〜５のアルキルを表し、
Ｒ６は、水素原子又は炭素数１〜１５のアルキルを表し、
Ｒ７は、水素原子又は−Ｏ−ＣＯ−Ｒ９（式中、Ｒ９は、水素原子、炭素数１〜５のアルキル、又は炭素数２〜５のアルケニルを表す）を表し、
Ｒ８は、水素原子又は炭素数１〜５のアルキルを表し、
−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＲ１０＝ＣＨ−（式中、Ｒ１０は、水素原子又は炭素数１〜５のヒドロキシアルキルを表す）、又は−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＨＲ１３−（式中、Ｒ１１は、水素原子又は炭素数１〜５のヒドロキシアルキルを表し、Ｒ１２及びＲ１３は、一緒になって隣接する炭素原子と共にエポキシ基を形成している）を表す）、
次の構造式（１）で表される化合物（以下「化合物１」という）：【００１４】
【化２】
0006501413.tif 000003
【００１５】
、
次の構造式（２）で表される化合物（以下「化合物２」という）：【００１６】
【化３】
0006501413.tif 000004
【００１７】
、及び
次の構造式（３）で表される化合物（以下「化合物３」という）：【００１８】
【化４】
0006501413.tif 000005
【００１９】
からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を添加することにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成した。【００２０】
本発明として、例えば、下記のものを挙げることができる。
［１］化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を含有することを特徴とする細胞培養用組成物。
［２］上記［１］記載の細胞培養用組成物を含むことを特徴とする多能性幹細胞維持培養用培地。
［３］多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるための多能性幹細胞の培養方法であって、かかる培養を、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の存在下で行うことを特徴とする、培養方法。
［４］多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるための、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の使用。
［５］体細胞からｉＰＳ細胞を製造する方法であって、初期化因子を導入した体細胞を、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の存在下で培養することを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、フィーダー細胞を使わず、かつ動物由来の成分を含まないゼノフリーの条件で、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を、未分化状態を維持したまま、安定的に効率よく培養することができる。従って、本発明によれば、フィーダーフリーかつゼノフリーの条件で、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を、その未分化状態を維持したまま安定的に増殖又は樹立させることができる。また、本発明によれば、フィーダーフリーかつゼノフリーの条件で、ｂＦＧＦ及びＴＧＦ−βの代わりに低分子化合物を用いて多能性幹細胞の維持培養を行うことができる。このため、多能性幹細胞の維持培養をより簡便にかつ安定的に行うことができる。さらに、多能性幹細胞の維持培養のためのコストを低減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＴＧＦβ１及びｂＦＧＦの存在下（陽性対照）、又はＴＧＦβ１存在下（対照）で培養したｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。図中、「ｂＦＧＦ＋」は、陽性対照であり、「ｂＦＧＦ−」は、対照である。
【図２】各被験化合物を用いて培養した１週間後のｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。
【図３】各被験化合物を用いて培養した１週間後のｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。
【図４】各被験化合物を用いて培養した１週間後のｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。
【図５】図５のＡは、化合物１を１００ｎＭ又は１０ｎＭ用いて培養した１週間後のｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。図中、ＴＧＦβ１＋は、陽性対照を示し、ＴＧＦβ１−は、対照を示す。図５のＢは、化合物２を１μＭ、１００ｎＭ又は１０ｎＭ用いて培養した１週間後のｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。
【図６】各被験化合物を用いて培養した１週間後のｉＰＳ細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した蛍光顕微鏡像（上段）及び抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いて免疫染色した蛍光顕微鏡像（下段）を示す。図中「ｂＦＧＦ＋  ＴＧＦβ１＋」は、陽性対照を示し、「ｂＦＧＦ−  ＴＧＦβ１−」は、対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳述する。
（Ｉ）本発明に係る化合物について
化合物Ａ中の各用語の意義は下記の通りである。
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ８に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができ、具体的には例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピルを挙げることができる。
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ８は、好ましくは炭素数１〜５のアルキルであり、より好ましくは炭素数１〜３のアルキルであり、更に好ましくはメチルである。
【００２４】
Ｒ６に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜１５のアルキルを挙げることができ、好ましくは直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜１２のアルキルである。具体的には例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、１−エチル−２−メチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル、ｎ−デシル、ｎ−ウンデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ペンタデシルを挙げることができる。
【００２５】
Ｒ９に係る「アルキル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数１〜５のアルキルを挙げることができる。具体的には例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピルを挙げることができる。中でも、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルが好ましい。
【００２６】
Ｒ９に係る「アルケニル」としては、例えば、直鎖状又は分枝鎖状の炭素数２〜５のアルケニル、例えば、エテニル、１−メチルエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−１−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、１−ペンテニルを挙げることができる。中でも、炭素数４のアルケニルが好ましく、１−メチル−１−プロペニルがより好ましい。
【００２７】
Ｒ１０、及びＲ１１に係る「ヒドロキシアルキル」の「アルキル」としては、例えば、前記１〜５のアルキルと同じものを挙げることができる。「ヒドロキシアルキル」として具体的には例えば、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチルが挙げられ、好ましくはヒドロキシメチルである。
Ｒ１０は、好ましくは炭素数１〜３のヒドロキシアルキルであり、より好ましくはヒドロキシメチルである。Ｒ１１は、好ましくは炭素数１〜３のヒドロキシアルキルであり、より好ましくはヒドロキシメチルである。
【００２８】
−ＣＲ１１Ｒ１２−ＣＨＲ１３−（式中、Ｒ１１は、水素原子又は炭素数１〜５のヒドロキシアルキルを表し、Ｒ１２及びＲ１３は、一緒になって隣接する炭素原子と共にエポキシ基を形成している）で表される構造は、具体的には、以下に示される構造を挙げることができる。
【００２９】
【化５】
0006501413.tif 000006
【００３０】
上記式中、Ｒ１１は前記と同義である。
【００３１】
より具体的には、化合物Ａとして、次の構造式（４）〜（１０）で表される各化合物（以下、それぞれ「化合物４」〜「化合物１０」という）を挙げることができる。
【００３２】
【化６】
0006501413.tif 000007
【００３３】
本発明に係る化合物の中で、化合物１〜１０が好ましく、これらの立体異性体をも包含する。さらに好ましくは、化合物２、５及び１０である。化合物２、５及び１０の好ましい態様の一例として、それぞれ次の構造式（２−１）、構造式（５−１）及び構造式（１０−１）で表される構造を有する立体異性体が例示されるが、これらに限定されない。
【００３４】
【化７】
0006501413.tif 000008
【００３５】
【化８】
0006501413.tif 000009
【００３６】
【化９】
0006501413.tif 000010
【００３７】
前記化合物１〜１０はいずれも公知であり、市販されている。これらの化合物は、例えば、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＧｍｂＨ社から購入することができる。
化合物Ａの中、化合物４〜１０以外の化合物についても、化合物１〜１０の合成方法に準じて適宜製造することができる。
【００３８】
本発明に係る化合物の「塩」としては、該化合物が酸性を示す場合には、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩などの無機塩基の塩、又は、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニンなどの有機塩基の塩を挙げることができる。該化合物が塩基性を示す場合には、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸などの無機酸の塩、又は、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、カンファースルホン酸などの有機酸の塩を挙げることができる。このような塩は、自体公知の方法により得ることができる。
【００３９】
本発明に係る化合物又はその塩は、溶媒和物（水和物も含む）であってもよい。かかる溶媒和物は、通常、対応する溶媒又は対応する溶媒を含む適当な混合溶媒から被溶媒和物を再結晶することにより得ることができる。例えば、水和物は、本発明に係る化合物を含水アルコールから再結晶することにより得ることができる。
【００４０】
本発明に係る化合物及びその塩は、細胞を培養する際に好適に用いられるものであり、特に、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該細胞を培養するために好適に用いられる。具体的には、例えば、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖又は樹立させるために好適に使用することができ、特に、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるために好適に使用することができる。このため多能性幹細胞の維持培養等に好適に使用される。
【００４１】
（ＩＩ）本発明に係る細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地
本発明に係る細胞培養用組成物は、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を含有するものである。当該組成物は、そのまま細胞培養用の培地として使用することもできるが、培地補充物又は培地用添加物として使用することもできる。
【００４２】
本発明の細胞培養用組成物は、前記化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩からなるものであってもよく、本発明の効果を奏することになる限り、他の成分（例えば、後述する培地基礎成分、抗酸化剤、血清代替物）を含んでもよい。
【００４３】
本発明に係る細胞培養用組成物中におけるこれら本発明に係る化合物及びその塩の含有量は、特に限定されないが、例えば、培地へ添加した場合に本発明に係る化合物及びその塩の合計濃度が、１ｎＭ〜１０μＭの範囲内になる含有量であり、好ましくは、１０ｎＭ〜１μＭの範囲内になる含有量とすることができる。
【００４４】
培養対象の細胞は特に限定されないが、多能性幹細胞が好ましい。多能性幹細胞としては、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば特に限定されない。多能性幹細胞として、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、培養線維芽細胞又は骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍＧＳ細胞）、ヒトＥＳ細胞と体細胞との融合細胞、刺激惹起性多能性獲得細胞（ＳＴＡＰ細胞）（ＷＯ２０１３／１６３２９６）を挙げることができる。中でも、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞が好ましい。
【００４５】
多能性幹細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物由来の細胞；鳥類由来の細胞；爬虫類由来の細胞などの様々な動物に由来するものを用いることができる。好ましくは、哺乳動物に由来するものを用い、特に好ましくはヒト由来のものを用いる。
特に好ましい多能性幹細胞は、ヒト由来のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。
【００４６】
本発明の細胞培養用組成物は、多能性幹細胞培養のために好適に用いられるものである。例えば、未分化状態の多能性幹細胞を増殖又は樹立させるために用いることができる。特に、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるために好適に使用される。本明細書中、多能性幹細胞が「未分化状態」であるとは、多能性幹細胞が多能性及び増殖能を有している状態であることを意味する。多能性とは、上述したように分化能力を有していることである。多能性幹細胞が未分化状態を維持していることは、例えば、少なくともＯｃｔ−３／４の発現を指標として確認することができる。この他にも、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８１から成る群より選択される１又は２以上のマーカー遺伝子の発現を指標として確認することができる。なお、これらのマーカー遺伝子の測定は、市販のキット（例えば、ＥＳ／ｉＰＳ  Ｃｅｌｌ，  Ｈｕｍａｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＬＬＣ））を用いて適宜実施し得る。
【００４７】
本発明の細胞培養用組成物の使用方法は特に限定されず、例えば、多能性幹細胞の培養のために用いる場合には、培地に細胞培養用組成物を添加することができる。また、細胞培養用組成物をそのまま多能性幹細胞維持培養用培地として使用することもできる。
【００４８】
前記細胞培養用組成物を含む多能性幹細胞維持培養用培地は、本発明の好ましい実施態様の１つである。かかる多能性幹細胞維持培養用培地は、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩を含有するものである。
「多能性幹細胞維持培養用培地」とは、多能性幹細胞の培養に適した培養用培地又はその組成物をいい、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、その増殖を可能とするものである。
本発明の細胞培養用組成物又は多能性幹細胞維持培養用培地を用いることにより、フィーダーフリーで、かつ動物由来成分を含まないゼノフリーの条件で、多能性かつ増殖性の未分化状態で多能性幹細胞を維持培養することができる。
【００４９】
また、本発明の細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地は、多能性幹細胞を樹立するための培養においても好適に使用され得る。例えば、本発明の細胞培養用組成物又は多能性幹細胞維持培養用培地を用いることにより、フィーダーフリーで、かつ動物由来成分を含まないゼノフリーの条件で、多能性かつ増殖性の未分化状態の多能性幹細胞を樹立することができる。
【００５０】
多能性幹細胞維持培養用培地中の細胞培養用組成物の含有量は特に限定されない。例えば、化合物Ａ又はその塩、化合物１、化合物２、及び化合物３、並びにこれらの塩の合計濃度を、通常１ｎＭ〜１０μＭとすることができ、好ましくは、１０ｎＭ〜１μＭとすることができる。前記の合計濃度とは、本発明に係る化合物又はその塩を１種のみ使用する場合には、該化合物又はその塩の濃度である。
【００５１】
多能性幹細胞維持培養用培地は、通常、培地基礎成分を含むものである。培地基礎成分は、これに上記の細胞培養用組成物を含有させた場合に、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、増殖を可能にするものであればよく、特に限定されない。このような培地基礎成分は、通常細胞が同化し得る炭素源、窒素源及び無機塩を含むものである。具体的には、グルコース等の糖類、必須アミノ酸、無機塩類（亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム、カリウムなど）、及びビタミン類を含む。培地基礎成分には、必要に応じて緩衝剤成分を添加することもできる。
【００５２】
培地基礎成分としては、当業者に公知の基礎培地を使用することができる。基礎培地の具体例としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（αＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）などが挙げられ、市販のものを使用することができる。
また、培地基礎成分には、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム等の成分を加えることもできる。
【００５３】
多能性幹細胞維持培養用培地には、培地基礎成分に加えて、抗酸化剤、血清代替添加物を添加することが好ましい。
抗酸化剤は特に限定されず、例えば、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、アスコルビン酸又はそのエステルを用いることができる。アスコルビン酸又はそのエステルは、塩を形成していてもよい。中でも、アスコルビン酸又はそのエステルが好ましい。抗酸化剤の添加量は特に限定されず、抗酸化剤の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、培地中において、抗酸化剤の濃度が通常１０〜１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０〜７５ｍｇ／Ｌとなるように添加することができる。
【００５４】
血清代替添加物とは、通常、血清と類似した成分を含むように構成された人工的な液体組成物であって、それを添加することにより、血清が存在しなくても細胞の増殖が可能となるものである。血清代替添加物として、例えば、アミノ酸、無機塩類、ビタミン、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、抗酸化成分を使用することができる。アミノ酸として、例えば、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンが挙げられる。無機塩類として、例えば、ＡｇＮＯ３、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、Ｂａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、ＣｄＳＯ４・８Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、Ｃｒ２（ＳＯ４）３・１Ｈ２Ｏ、ＧｅＯ２、Ｎａ２ＳｅＯ３、Ｈ２ＳｅＯ３、ＫＢｒ、ＫＩ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＮａＦ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ、ＮａＶＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ２、ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏ、亜セレン酸ナトリウムが挙げられる。ビタミンとして、例えばチアミン、アスコルビン酸が挙げられる。抗酸化成分として、例えば還元型グルタチオンが挙げられる。これらは、１種のみ使用しもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
市販されているＥＳ細胞用の血清代替添加物、例えば、ノックアウト（登録商標）血清代替添加物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用することもできる。
【００５５】
血清代替添加物の添加量は特に限定されず、血清代替添加物の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、培地中において、血清代替添加物の濃度が通常５〜３０ｖ／ｖ％、好ましくは１０〜２０ｖ／ｖ％となるように添加することができる。
【００５６】
本発明に係る細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地は、例えば、多能性幹細胞の維持培養に使用されているフィーダー細胞、血清などの動物由来の成分を含むこともできるが、好ましくは、フィーダー細胞及び／又は血清を含まないものであり、より好ましくは、フィーダー細胞及び血清を含まないものである。また、特に好ましくは、動物由来の成分を含まないゼノフリーのものである。本発明に係る細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地は、フィーダーフリーで多能性幹細胞を維持培養する際などに使用されているｂＦＧＦ及び／又はＴＧＦβを含むこともできる。但し、好ましくは、ｂＦＧＦ及び／又はＴＧＦβを含まないものであり、より好ましくはｂＦＧＦ及びＴＧＦβを含まないものである。特に好ましくは、フィーダー細胞、血清などの動物由来の成分、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβを含まないものである。
【００５７】
本発明に係る細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地には、必要に応じて、ｐＨ調整剤、保湿剤、防腐剤、粘度調整剤等の任意成分を使用することもできる。このような任意成分の添加量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されず、適宜選択することができる。
【００５８】
本発明に係る細胞培養用組成物及び上述の各成分は、培地に対して最初から目的の濃度となるような量で添加されてもよく、２回又はそれ以上の回数に分けて添加し、最終的に目的の濃度となるような量で添加されてもよい。好ましくは、最初から目的の濃度となるような量で添加する。多能性幹細胞維持培養用培地のｐＨは、通常、６．５〜７．５に調整し、好ましくは６．８〜７．２に調整する。
【００５９】
本発明に係る細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地は、それぞれ溶液形態又は乾燥形態で調製されうる。溶液形態の場合、濃縮組成物（例えば、１〜１０００倍）として提供されてもよく、使用に際して、適宜に希釈されてもよい。溶液形態又は乾燥形態の組成物又は培地を希釈又は溶解するのに用いられる液体は特に限定されないが、通常、水、緩衝液、生理食塩水を使用することができ、必要に応じて適宜選択することができる。
【００６０】
本発明の好ましい態様においては、細胞培養用組成物及び多能性幹細胞維持培養用培地は滅菌され、コンタミネーションが防止されたものである。滅菌方法は特に限定されず、通常の方法を採用することができ、例えば、紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射、又は濾過により滅菌することができる。
【００６１】
（ＩＩＩ）培養方法
本発明は、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖又は樹立させるための多能性幹細胞の培養方法も包含する。本発明の培養方法においては、多能性幹細胞の培養を、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の存在下で行う。
本発明の培養方法は、好ましくは、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるための多能性幹細胞の培養方法である。
多能性幹細胞の培養を、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の存在下で行うことにより、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖又は樹立させることができる。
【００６２】
以下、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖させるための多能性幹細胞の培養方法について説明する。
本発明の方法は、フィーダーフリーかつゼノフリーの培養条件で多能性幹細胞（好ましくは、上述したヒトｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞）を維持培養する場合に使用することが好ましい。
【００６３】
本発明の方法における多能性幹細胞の培養は、上記の多能性幹細胞維持培養用培地を用いて行うことが好ましい。多能性幹細胞維持培養用培地の成分及びその好ましい態様は、上述したものと同様である。また、多能性幹細胞維持培養用培地は、溶液（培養液）の形態で用いることが好ましい。
例えば、上記多能性幹細胞維持培養用培地を培地として使用して、多能性幹細胞の維持培養に通常使用されている条件で培養を行うことにより、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を増殖させることができる。
【００６４】
多能性幹細胞維持培養用培地の各成分は、培地に対して最初から目的の濃度となるような量で添加されてもよく、培養中に２回又はそれ以上の回数に分けて添加し、最終的に目的の濃度となるような量で添加されてもよい。好ましくは、最初から目的の濃度となるような量で添加する。多能性幹細胞維持培養用培地のｐＨは、通常、６．５〜７．５に調整し、好ましくは６．８〜７．２に調整する。
【００６５】
本発明の方法においては、例えば、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３、並びにこれらの塩の培地中での合計濃度が、好ましくは１ｎＭ〜１０μＭとすることができ、より好ましくは、１０ｎＭ〜１μＭの条件で培養を行う。本発明に係る化合物及びその塩の濃度がこのような範囲であると、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、多能性幹細胞を効率よく増殖させることができる。本発明に係る化合物又はその塩は、培地に対して最初から目的の濃度となるような量で添加されてもよく、培養中に２回又はそれ以上の回数に分けて添加し、最終的に目的の濃度となるような量で添加されてもよい。
【００６６】
本発明の培養方法においては、多能性幹細胞をフィーダー細胞を含まない条件で培養することが好ましい。また、多能性幹細胞を血清の非存在下で培養することが好ましい。より好ましくは、フィーダー細胞及び血清の非存在下で多官能細胞の培養を行う。さらに、フィーダーフリーかつゼノフリーの条件で多能性幹細胞の培養を行うことが好ましい。また、本発明の培養方法においては、ｂＦＧＦ及び／又はＴＧＦβの非存在下で多官能細胞の培養を行うことが好ましく、より好ましくはｂＦＧＦ及びＴＧＦβの非存在下で培養を行う。
【００６７】
本発明において、フィーダーフリーの条件での培養方法の好ましい実施態様として、例えば、細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養する方法が例示される。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。本発明においては、このように細胞外基質によりコーティング処理された培養容器中で多能性幹細胞の培養を行うことが好ましい。
【００６８】
本発明において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質又はこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などの細胞からの調製物であってもよい。人工物としては、ラミニンの断片が例示される。本発明において、ラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４又はα５であり、β鎖は、β１、β２又はβ３であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２又はγ３が例示される。本発明において、ラミニンの断片とは、インテグリン結合活性を有しているラミニンの断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるＥ８フラグメントが例示される。
【００６９】
本発明において、培養する多能性幹細胞の数は特に限定されないが、例えば、溶液状態の培地（培養液）に、多能性幹細胞を通常５０〜５００００個／ｃｍ2、好ましくは、１００〜５０００個／ｃｍ2として培養を始めることができる。
また、本発明の培養方法は、例えば１個の多能性幹細胞を培養して増殖させることができるため、クローン細胞集団を形成させることを可能とするものである。
【００７０】
培養対象の多能性幹細胞は、上述したものと同様である。
培養に供する多能性幹細胞は、未分化状態のものである。培養する多能性幹細胞の調製方法は特に限定されず、例えば、フィーダーレスの条件で樹立された多能性幹細胞、フィーダー細胞との共培養系で樹立された多能性幹細胞のいずれも用いることができる。具体的には、例えば、公知の方法で樹立又は継代培養された多能性幹細胞を用いることができる。また、後述する本発明の方法により培養を行って樹立された多能性幹細胞を用いることができる。また、フィーダー細胞との共培養系から多能性幹細胞を回収し、回収した多能性幹細胞をそのまま培養に供することができるが、回収した多能性幹細胞を数次にわたって継代培養したものを培養に供することもできる。この場合の継代培養は、フィーダーフリーの条件で行うことが好ましい。
【００７１】
本発明の方法において、培養に供する多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（又は解離）することで単一細胞の状態としたものであってもよく、又は、細胞同士が接着した細胞塊の状態のものであってもよい。具体的には例えば、培養に供する前に、必要に応じて多能性幹細胞を分離させる処理を行い、単一細胞の状態又は細胞塊の状態で、新しい培養容器に移して培養を行い得る。ここで、分離の方法としては、例えば、力学的分離、プロテアーゼ活性及びコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシン及びコラゲナーゼを含有する溶液として、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）及びＡｃｃｕｍａｘ（登録商標（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
【００７２】
多能性幹細胞を単一細胞へ分散させる場合には、培地にＲＯＣＫ阻害剤が含まれていることが好ましい。
【００７３】
本発明において、ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（Ｃａｓ  Ｎｏ．：１４６９８６−５０−７）（例、Ｉｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５７，  ９７６−９８３  （２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３２５，２７３−２８４  （２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Ｕｅｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：  ９９０−９９４  （１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例、Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９３：  ２２５−２３２  （２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例、Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ５２（４）：  ３１９−３２４  （２００３）参照）及びそれらの誘導体、並びにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種又は２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本発明において用いられる好ましいＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２が挙げられる。本発明において、多能性幹細胞維持培養用培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者が適宜選択可能であるが、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を用いる場合、通常０．１μＭ〜１００μＭ、好ましくは、１μＭ〜５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭ〜２０μＭである。
【００７４】
本発明の多能性幹細胞の培養方法において、培養温度は、特に限定されないが、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。通常、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培地の交換は、通常１日〜２日ごと、好ましくは毎日行うことが好ましい。
また、多能性幹細胞は適宜継代することできる。例えばＥＳ細胞であれば、通常３〜４日おきに継代することが好ましい。継代は、公知の方法により行うことができる。
【００７５】
本発明の培養方法は、未分化状態の多能性幹細胞を樹立するための培養に使用され得る。例えば、未分化状態の多能性幹細胞を樹立するための培養において、該培養を化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３からなる群より選択される少なくとも１種の化合物又はその塩の存在下で行うことにより、多能性幹細胞を樹立することができる。本発明の方法は、例えば、フィーダーフリーかつゼノフリーの培養条件で多能性幹細胞を樹立する場合に好適に使用される。
多能性幹細胞は、上述したものと同様であり、ｉＰＳ細胞又はＥＳ細胞であることが好ましい。また、多能性幹細胞は哺乳動物由来のものであることが好ましく、さらに、多能性幹細胞はヒト由来のものであることが好ましい。中でも、ヒト由来のｉＰＳ細胞が特に好ましい。
【００７６】
例えば、多能性幹細胞を樹立する際に、上記細胞培養用組成物又は多能性幹細胞維持培養用培地を培地として使用して、多能性幹細胞の樹立に通常使用されている条件で多能性幹細胞の培養を行うことにより、未分化状態の多能性幹細胞を樹立させることができる。培地の好ましい態様等は、上述した通りである。未分化状態の多能性幹細胞を樹立するための培養条件等は、多能性幹細胞の種類により異なり、適宜選択することができる。
【００７７】
培地中の本発明にかかる化合物又はその塩の濃度は、上述した維持培養の場合と同様とすることができ、化合物Ａ、化合物１、化合物２、及び化合物３、並びにこれらの塩の培地中での合計濃度が、好ましくは１ｎＭ〜１０μＭ、より好ましくは、１０ｎＭ〜１μＭの条件で培養を行う。培養温度は、特に限定されないが、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。通常、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培地の交換は、通常１日〜２日ごと、好ましくは毎日行う。
【００７８】
例えばＥＳ細胞であれば、ヒト胚盤胞から単離された細胞塊を、本発明に係る化合物又はその塩の存在下で培養することにより、ヒトＥＳ細胞を樹立することができる。好ましくは、ＥＳ細胞作製のための培地（培養液）として上記細胞培養用組成物又は多能性幹細胞維持培養用培地を使用する。継代培養によるＥＳ細胞の維持は、例えば、上述した本発明の培養方法により行うことができる。
【００７９】
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．  Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６：４４３−４５２）。
【００８０】
また、例えばｉＰＳ細胞を樹立させるための培養においては、本発明にかかる化合物又はその塩の存在下で体細胞と初期化因子とを接触させ、培養を行うことによりｉＰＳ細胞を樹立することができる。また、初期化因子が導入された体細胞を本発明に係る化合物又はその塩の存在下で培養することにより、ｉＰＳ細胞を樹立することができる。
好ましくは、ｉＰＳ細胞誘導のための培地（培養液）として、上記細胞培養用組成物又は多能性幹細胞維持培養用培地を用いる。
【００８１】
ｉＰＳ細胞樹立のための培養方法の例としては、例えば、通常、培養温度が約３０〜４０℃、ＣＯ２濃度が約２〜５％の条件、好ましくは培養温度が約３７℃、約５％ＣＯ２存在下にて、体細胞と初期化因子とを接触させ、細胞外基質をコーティングしたディッシュに移し、その後、多能性幹細胞維持培養用培地で培養し、該接触から約２０〜約３０日又はそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。初期化因子を接触させた直後は、体細胞に適した培地で培養しても良い。
【００８２】
あるいは、通常培養温度が約３０〜４０℃、ＣＯ２濃度が約２〜５％の条件、好ましくは約３７℃、約５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（例えば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で多能性幹細胞維持培養用培地で培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。好ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．（２００９），  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）を用いる方法が例示される。
さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ５：２３７−２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。
【００８３】
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行うことが好ましい。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲とすることが好ましい。
【００８４】
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
【００８５】
なお、ｉＰＳ細胞の作製に使用される体細胞には、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を使用し得る。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、及び成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞及び脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００８６】
初期化因子は、公知のものを使用することができ、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２６：  ７９５−７９７、Ｓｈｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ２：  ５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３，  ５６８−５７４、Ｚｈａｏ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ  Ａ，  （２００８），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ３，  １３２−１３５、Ｆｅｎｇ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．  Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００９），  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ  ＣＡ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ  ＪＢ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ  ＪＫ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ  ＪＣ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ６：１６７−７４、Ｈａｎ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０），  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１），  Ｎａｔｕｒｅ．  ４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
【００８７】
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸  （ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ  １２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７及びＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（例えば、Ｂｉｏ及びＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌ及びＧ９ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｇｏｎｉｓｔ  （例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３及びＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５及びｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ  Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２及びプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
【００８８】
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴ及びポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
【００８９】
一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウィルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウィルスベクターとしては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，  １２６，  ｐｐ．６６３−６７６，  ２００６；  Ｃｅｌｌ，  １３１，  ｐｐ．８６１−８７２，  ２００７；  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８，  ｐｐ．１９１７−１９２０，  ２００７）、アデノウィルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２，  ９４５−９４９，  ２００８）、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクター（ＷＯ  ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３２２：９４９−９５３，  ２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
【００９０】
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジン及びｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ  （ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ  Ｌ，  （２０１０）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  ７：６１８−６３０）。
【００９１】
また、胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞を、本発明に係る化合物又はその塩の存在下、好ましくは多能性幹細胞維持培養用培地を用いて培養することにより、樹立される。
また、例えばnt ES細胞の作製のためには、通常、核移植技術（Ｊ．Ｂ．  Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８），  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），  ４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、本発明に係る化合物又はその塩の存在下、好ましくは多能性幹細胞維持培養用培地を用いて数時間培養することで初期化することができる。
【００９２】
なお、本発明に係る化合物又はその塩を用いた場合は、フィーダー細胞非存在下での培養においても、多能性幹細胞を樹立することができるため、フィーダー細胞非存在下の培養条件を用いることができる。
【００９３】
本発明の培養方法により培養された多能性幹細胞は、通常、多能性を有する未分化状態の多能性幹細胞である。このような多能性幹細胞は、そのまま、又は所望の細胞に分化させて、研究材料又は再生医療製品の作製のためなどに使用することができる。本発明の細胞培養用組成物、多能性幹細胞維持培養用培地、及び培養方法は、多能性幹細胞の未分化状態を維持させつつ、該多能性幹細胞を増殖又は樹立させるための組成物、培地及び方法としても好適に使用される。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。【００９５】
１．細胞
ヒトｉＰＳ細胞は、４因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ）をレトロウィルスを用いて、ヒト線維芽細胞へ導入することで作製した２０１Ｂ７株を次の条件で培養した後に用いた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ．  １３１：８６１−８７２，  ２００７．）。２０１Ｂ７株を、０．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１Ｅ８フラグメント（商品名「ｉＭａｔｒｉｘ−５１１」、ニッピ社）をコーティングしたディッシュに播種し、６４ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、１４μｇ／Ｌ  亜セレン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、１９．４ｍｇ／Ｌ  インスリン、５４３ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１０．７ｍｇ／Ｌ  トランスフェリン、１００μｇ／Ｌ  ｂＦＧＦ及び２μｇ／Ｌ  ＴＧＦβ１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養し、フィーダー細胞を用いない培養方法にて継代を続けた。【００９６】
２．化合物
本実施例で用いた化合物１〜１０の化学構造を表１〜表３に示す。化合物１〜１０は、ＡｎａｌｙｔｉＣｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＧｍｂＨから購入した。【００９７】
【表１】
0006501413.tif 000011
【００９８】
【表２】
0006501413.tif 000012
【００９９】
【表３】
0006501413.tif 000013
【０１００】
３．評価
ｉＰＳ細胞が未分化状態である（多能性を有している）ことの確認は、Ｏｃｔ−３／４の発現を確認することにより行った。
以下の実施例において、抗Ｏｃｔ３／４抗体を用いる免疫染色及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いての核染色は、Ｎａｋａｇａｗａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ４：３５９４，  ２０１４に記載の方法で行った。【０１０１】
＜実施例１＞
ｂＦＧＦの代替化合物の検討
０．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１Ｅ８フラグメント（商品名「ｉＭａｔｒｉｘ−５１１」、ニッピ社）をコーティングした９６ｗｅｌｌプレートへ、１，３００細胞／ｗｅｌｌにて前記ヒトｉＰＳ細胞を播種した。６４ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、１４μｇ／Ｌ  亜セレン酸ナトリウム、１９．４ｍｇ／Ｌ  インスリン、５４３ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１０．７ｍｇ／Ｌ  トランスフェリン、及び２μｇ／Ｌ  ＴＧＦβ１を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を、ｂＦＧＦの対照培地とした。この対照培地へ表１〜３に示す各被験化合物（化合物１、２、４、５、６、７、８、９及び１０）を１μＭ添加し、培地を調製した。得られた各培地を、播種したヒトｉＰＳ細胞に添加して３７℃で培養を行った。陽性対照には、対照培地に１００μｇ／ＬのｂＦＧＦを添加した培地を用いた。１週間後、細胞を固定し、抗Ｏｃｔ３／４抗体による免疫染色及び核染色を行った。【０１０２】
結果を図１〜３に示す。図１は、陽性対照（図中、「ｂＦＧＦ＋」で示す）及び対照培地（図中、「ｂＦＧＦ−」で示す）で培養したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡像である。
図２及び図３は、各被験化合物を添加した培地を用いて培養したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡像である。【０１０３】
その結果、いずれの化合物を用いた場合においても、核染色された細胞は、Ｏｃｔ３／４を発現していた。以上より、被験化合物（化合物１、２、４、５、６、７、８、９及び１０）は、ｂＦＧＦを用いた場合（図１の「ｂＦＧＦ＋」）と同様に、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能とすることが確認された。【０１０４】
＜実施例２＞
ＴＧＦβ１の代替化合物の検討
０．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１Ｅ８フラグメント（商品名「ｉＭａｔｒｉｘ−５１１」、ニッピ社）をコーティングした９６ｗｅｌｌプレートへ、１，３００細胞／ｗｅｌｌにて前記ヒトｉＰＳ細胞を播種した。６４ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、１４μｇ／Ｌ  亜セレン酸ナトリウム、１９．４ｍｇ／Ｌ  インスリン、５４３ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、１０．７ｍｇ／Ｌ  トランスフェリン、及び１００μｇ／Ｌ  ｂＦＧＦを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を、ＴＧＦβ１の対照培地とした。この対照培地へ、表１〜３に示す各被験化合物（１、２、４及び５）を１μＭ添加し、培地を調製した。得られた各培地を、播種したヒトｉＰＳ細胞に添加して３７℃で培養を行った。陽性対照として、対照培地に２μｇ／Ｌ  ＴＧＦβ１を添加した培地（実施例１で陽性対照として用いた培地と同じもの）を用いた。１週間後、細胞を固定し、抗Ｏｃｔ３／４抗体による免疫染色及び核染色を行った。【０１０５】
図４に、各被験化合物を添加した培地を用いて培養したヒトｉＰＳ細胞の蛍光顕微鏡像を示す。いずれの化合物を用いた場合においても、核染色された細胞は、Ｏｃｔ３／４を発現していた。以上より、各化合物（化合物１、２、４及び５）は、ＴＧＦβ１を用いた場合（図１の「ｂＦＧＦ＋」）と同様に、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能とすることが確認された。【０１０６】
＜実施例３＞
続いて、実施例２で用いた対照培地（ＴＧＦβ１の対照培地）を用いて、化合物１及び２について、有効な濃度を検討した。陽性対照として、実施例２で用いた対照培地にＴＧＦβ１を２μｇ／Ｌ添加した培地を使用し（図５のＡの「ＴＧＦβ１+」）、対照には、実施例２で用いた対照培地を使用した（図５のＡの「ＴＧＦβ１−」）。
実施例２と同条件にて、化合物１を１００ｎＭ又は１０ｎＭの濃度にして培養を行ったところ、ＴＧＦβ１を添加した場合（陽性対照）と同等の効果が得られることが確認された。これらの結果を、図５のＡに示す。【０１０７】
同様に、実施例２において化合物２を１００ｎＭ又は１０ｎＭの濃度にして培養を行ったところ、ＴＧＦβ１を添加した場合（陽性対照）と同等の効果が得られることが確認された。これらの結果を、図５のＢに示す。
以上より、化合物１及び化合物２については、培地中に１０ｎＭの濃度で添加すれば、多能性幹細胞を未分化状態で培養することができることが確認された。【０１０８】
＜実施例４＞
ｂＦＧＦ及びＴＧＦβ１の代替化合物の検討
０．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１Ｅ８フラグメント（商品名「ｉＭａｔｒｉｘ−５１１」、ニッピ社）をコーティングした９６ｗｅｌｌプレートへ、１，３００細胞／ｗｅｌｌにて前記ヒトｉＰＳ細胞を播種した。６４ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム、１４μｇ／Ｌ  亜セレン酸ナトリウム、１９．４ｍｇ／Ｌ  インスリン、５４３ｍｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３及び１０．７ｍｇ／Ｌ  トランスフェリンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２を、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβ１の対照培地とした。この対照培地へ各被験化合物（化合物３、６、７、８、９及び１０）１μＭを添加し、培地を調製した。得られた各培地を、播種したヒトｉＰＳ細胞に添加して３７℃で培養を行った。１週間後、細胞を固定し、抗Ｏｃｔ３／４抗体による免疫染色及び核染色を行った。なお、陽性対照として、対照培地にｂＦＧＦを１００μｇ／Ｌ及びＴＧＦβ１を２μｇ／Ｌを添加した培地を使用した（図６中の「ｂＦＧＦ＋  ＴＧＦβ１＋」）。対照には、上記のｂＦＧＦ及びＴＧＦβ１の対照培地（ｂＦＧＦ、ＴＧＦβ１及び各化合物を添加しない培地）を使用した（図６中の「ｂＦＧＦ−  ＴＧＦβ１−」）。【０１０９】
その結果を図６に示す。図６から、いずれの化合物を用いた場合においても、核染色された細胞は、Ｏｃｔ３／４を発現していた。以上より、各化合物（化合物３、６、７、８、９及び１０）は、ｂＦＧＦ及びＴＧＦβ１の２成分を用いた場合と同様に、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能とすることが確認された。
【図１】
0006501413.tif 000028
【図２】
0006501413.tif 000029
【図３】
0006501413.tif 000030
【図４】
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【図５】
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【図６】
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