(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の末梢血またはリンパ組織にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含する、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法。
【請求項２】
抗ＤＯＣＫ８抗体を含む、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を誘導するＣＤ４ Ｔ細胞が被験体の末梢血またはリンパ組織に存在するか否かを判定するための組成物。
【請求項３】
ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を非ヒト哺乳動物へ移入する工程を包含する、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデルの非ヒト哺乳動物を作製する方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法によって作製した全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）モデルの非ヒト哺乳動物を用いる、自己抗体量を低減させる物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の発症に関与する細胞を判定する方法及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来、外界からの有害な異物の侵入に対する生体の防御機構として存在するものである。しかし、時にはこの免疫系の働きが、結果的に生体に有害であることがある。
【０００３】
生体は、外界からの異物に対してのみならず、自己の成分に対しても応答を起こすことが知られており、自己免疫現象と呼ばれている。そして、自己免疫によってある種の病態が生じた疾患は、自己免疫疾患と呼ばれている。
【０００４】
自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、臓器特異性のある疾患（臓器特異的自己免疫疾患）と、臓器特異性のない疾患（臓器非特異的自己免疫疾患）との２つに大別される。これら自己免疫疾患の多くは、組織に病変が認められるとともに、組織傷害を伴うものである。
【０００５】
臓器非特異的自己免疫疾患である全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、抗ｄｓＤＮＡ抗体などの自己抗体の産生の増加に起因することが知られているが、ＳＬＥを引き起こす過程の分子生物学的な研究、多様な病態との関連の解明、さらには治療法の開発が期待されている。
【０００６】
実験動物を同一の抗原で繰り返して免疫し続けると、免疫応答は極期をむかえ、やがて疲弊する。その結果として、組織傷害を伴う種々の自己免疫疾患（病態）が生じることが知られている（例えば、特許文献１参照および非特許文献１参照）。
【０００７】
自己免疫疾患による組織傷害に関する研究は現在進みつつあり、組織傷害に、抗原提示細胞による抗原のクロスプレゼンテーションが関わっていることが明らかにされている。具体的には、（１）自己免疫疾患を患うと、樹状細胞における抗原のクロスプレゼンテーションが増強されること、（２）樹状細胞におけるクロスプレゼンテーションが増強されるとＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化し、当該ＣＤ８＋Ｔ細胞によって細胞傷害が誘導されること、が明らかにされている（例えば、特許文献２および非特許文献１参照）。
【０００８】
本発明者らは、マウスに対して抗原による免疫操作を繰り返すことによって、自己応答性・自己抗体誘導性ＣＤ４ Ｔ細胞（autoantibody-inducing CD4 T cells；ａｉＣＤ４ Ｔ細胞）という新たなタイプのＴ細胞が末梢にて生成され、ａｉＣＤ４ Ｔ細胞が多様な自己抗体を誘導するとともに、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を成熟させて種々の臓器障害を惹起してＳＬＥを発症させる、ということをこれまでに報告し（非特許文献１）、さらに、ａｉＣＤ４ Ｔ細胞が、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏｗ１２２ｌｏｗ（ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏ）のＣＤ４ Ｔ細胞亜集団に存在すること、この細胞亜集団をナイーブなマウスに養子移入すると、移入２週間後のレシピエントマウスの血清中に自己抗体が観察されることを見出している（非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００６−２８８３８２号公報（２００６年１０月２６日公開）
【特許文献２】特開２０１０−００４７５０号公報（２０１０年  １月１４日公開）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tsumiyama K. et al., PLoS ONE, Vol.4, No.12, e8382, 2009
【非特許文献２】Miyazaki Y. et al., The Journal of Immunology vol.192, no.2, supplement 177.7、2014
【非特許文献３】Zhang Q et al., N Engl J Med 361(21): 2046-2055, 2009
【非特許文献４】Randall KL et al., Nat Immunol 10(12): 1283-1291, 2009
【非特許文献５】Randall KL et al. Disease Markers 29: 141-150, (2010)
【非特許文献６】Randall KL et al., J Exp Med 208(11): 2305-2320, 2011
【非特許文献７】Werner M and Jumaa H, Nat Immunol 13(6): 525-526, 2012
【非特許文献８】Jabara HH et al., Nat Immunol 13(6): 612-620, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞をより簡便に特定するためのマーカーを見出し、これに基づいて自己免疫疾患の客観的かつ正確な診断を可能とすることを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法を提供する。本方法は、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定する方法でもあり得る。本方法は、被験体の末梢血またはリンパ組織にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含する。また、本発明は、抗ＤＯＣＫ８抗体を含む、自己免疫疾患を誘導するＣＤ４ Ｔ細胞の有無を判定するための組成物を提供する。本組成物は、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定するための組成物でもあり得る。
【００１３】
さらに、本発明は、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を用いる、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を作製する方法、上記非ヒト哺乳動物を用いる、自己抗体量を低減させる物質のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を含む、非ヒト哺乳動物において自己抗体を産生させるための組成物を提供する。本組成物は、非ヒト哺乳動物において自己免疫疾患を誘導するための組成物でもあり得る。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を用いれば、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞をより簡便に特定することができる。本発明を用いれば、新たな自己免疫疾患モデル動物の作製が可能であり、作製したモデル動物を用いることによって、自己免疫疾患の処置（予防、改善または治療）に有用な物質をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】自己免疫疾患を発症したマウスにおいてＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞が増加することを示す図である。
【図２】抗原を繰り返し投与したマウスから得られたＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞が、自己抗体の産生を誘導することを示す図である。
【図３】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分にＤＯＣＫ８タンパク質が存在することを示す図である。
【図４】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在してコントロールの細胞亜集団の細胞膜画分に存在しないタンパク質が存在することを示す図である。
【図５Ａ】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在するタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図５Ｂ】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在するタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図５Ｃ】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在するタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図５Ｄ】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在するタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図５Ｅ】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在するタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【図５Ｆ】ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在するタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
【００１７】
〔１〕ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞
本発明者らは、独自の創意工夫に基づいて、自己免疫疾患を発症したマウスにおいてdedicator of cytokinesis protein 8（以下、ＤＯＣＫ８）を発現するＣＤ４ Ｔ細胞（ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞（ＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞ともいう。））が増加することを見出し、さらに、このＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞をナイーブなマウスへ養子移入することによって自己抗体が産生することを見出した。ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞による自己抗体産生のプロファイルは、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団による自己抗体産生のプロファイルと同様であった。さらに、本発明者らは、上記ＣＤ４ Ｔ細胞亜集団にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在することを確認し、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が、ＳＬＥ発症の原因となる細胞（ａｉＣＤ４ Ｔ細胞）であることを見出した。
【００１８】
ＤＯＣＫ８は、ＤＯＣＫファミリータンパク質のメンバーであり、グアニンヌクレオチド交換因子（guanine nucleotide exchange factor：ＧＥＦ）の機能を有する分子量２３８ｋＤａのタンパク質である。ＤＯＣＫ８は、Ｒｈｏファミリー低分子量Ｇタンパク質の活性化を介してアクチン細胞骨格の重合を制御することが知られている。アクチン細胞骨格の再構成は、細胞の分化・増殖、遊走、シグナル伝達など様々な細胞機能に関わっている。
【００１９】
近年、ヒトＤＯＣＫ８遺伝子の欠損が重症複合免疫不全症を引き起こすことが発見されたことをきっかけに、ＤＯＣＫ８の免疫学的な研究成果が複数報告されている（非特許文献３〜８参照）。
【００２０】
上述したように、ＤＯＣＫファミリー分子と免疫不全症との関係についての報告はあるが、細胞移動やＢ細胞活性化に関与する細胞内シグナル伝達に重要なアダプタータンパク質としての研究が進められており、ａｉＣＤ４ Ｔ細胞との関与を示唆する報告はない。
【００２１】
なお、本明細書において、「ＤＯＣＫ８」は、特に説明がない場合は、ＤＯＣＫ８タンパク質およびＤＯＣＫ８タンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）の両方が意図される。本発明にて使用されるＤＯＣＫ８は、哺乳動物に由来するものであれば特に限定されず、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、ヒトであり、より好ましくはヒトである。
【００２２】
ＤＯＣＫ８の塩基配列およびアミノ酸配列は、マウス（アクセッション番号：NM_028785.3）、ラット（アクセッション番号：NM_001037793.2）およびヒト（アクセッション番号：AB191037.1）のものが同定されており、それぞれがＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されている。
【００２３】
〔２〕ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の利用
〔２−１〕判定に用いるマーカー
被験体の末梢血またはリンパ組織に存在するＴ細胞において、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定することによって、被験体が、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを判定することができ、その結果、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定することができる。すなわち、本発明は、被験体が自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを判定する方法、および、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定する方法を提供する。
【００２４】
本発明において、被験体から取得したＴ細胞におけるＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の数が、健常者または自己免疫疾患に罹患していないことが明らかな患者から取得したＴ細胞におけるＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の数よりも増加していれば「ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在する」と判定する。なお、増加の程度は、統計的に有意差がある値よりも増加していれば特に限定されない。
【００２５】
本発明に係る判定方法は、被験体の末梢血またはリンパ組織にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含する方法であればよく、その他の具体的な工程、条件、材料等は特に限定されない。本発明に係る判定方法は、例えば、自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ））の産生量を測定する工程を包含してもよく、健常者と比較して上記自己抗体の産生が亢進しているか否かを確認する工程をさらに包含してもよい。なお、本発明に係る判定方法は、医師の行為および判断を排除した「判定を補助する方法」または「判定に用いられるデータを取得する方法」でもあり得る。
【００２６】
本明細書において、「自己免疫疾患」は、自己抗体の産生に起因する疾患が意図される。自己抗体としては、例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ）が挙げられるがこれに限定されない。本発明において、上記自己免疫疾患は、例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体の産生に起因する疾患であることが好ましく、具体的には、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）が好ましい。
【００２７】
本明細書において、「被験体」は哺乳動物が意図され、ヒトであってもヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）であってもよい。「非ヒト哺乳動物」は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられる。非ヒト哺乳動物のなかでも、個体発生及び生物サイクルが比較的短く、また繁殖が容易なげっ歯動物、特にマウス、ラット等が好ましい。
【００２８】
本明細書において、「リンパ組織」は、免疫反応の担い手であるリンパ球の発生、分化、増殖、および機能発現の場となる器官であるリンパ組織のうち、リンパ球の抗原依存性の増殖と反応の場となる器官が意図され、二次的（末梢性）リンパ器官（secondary lymphoid tissue）ともいう。すなわち、「リンパ組織」は、リンパ球の増殖、分化の場で、免疫応答の場でない一次（中枢性）リンパ器官（primary lymphoid tissue）である胸腺、哺乳類の骨髄、鳥類のファブリキウス嚢（bursa of Fabricius）以外のリンパ組織をいう。
【００２９】
このような「リンパ組織」としては、例えば、リンパ節、脾（臓）、腸リンパ組織（gut-associated lymphoid tissue（扁桃、Peyer板など））などが挙げられる。なかでも、リンパ組織として、脾臓を用いることが好ましい。
【００３０】
本発明に係る判定方法に末梢血または脾臓を用いることにより、簡便かつ正確に、本発明に係る判定方法を実施することができる。特に、末梢血を用いる場合は、生体から容易に検体を採取することができる点で、非常に有用である。
【００３１】
「Ｔ細胞」は、免疫応答の活性化（ヘルパーＴ細胞）、抑制（サプレッサーＴ細胞）など免疫応答の制御、および、ウイルスが感染した細胞および癌細胞の傷害（キラーＴ細胞）や遅延型アレルギーなどに関与するリンパ球亜群をいう。
【００３２】
ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かについては、例えば、抗ＤＯＣＫ８抗体を用いた免疫測定法によって確認することができる。ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の存在は、フローサイトメトリーを用いてＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞そのものの数（量）が確認されても、ＤＯＣＫ８タンパク質の発現量が確認されてもよい。
【００３３】
ＤＯＣＫ８タンパク質の発現量の確認は、測定対象のＤＯＣＫ８タンパク質と特異的に結合する抗体（抗ＤＯＣＫ８抗体）を用いる免疫測定法などによって行うことができる。免疫測定法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（ＦＩＡ）、免疫発光測定法、酵素免疫測定法（例えば、Enzyme Immunoassay（ＥＩＡ）、Enzyme-linked Immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ））、またはImmunoblottingなどが挙げられる。また、免疫組織化学により、ＤＯＣＫ８タンパク質の発現量を測定するようにしてもよい。免疫組織化学としては、具体的には、酵素標識抗体法または蛍光抗体法が挙げられる。
【００３４】
抗ＤＯＣＫ８抗体としては、すでに市販されている種々の抗体（11622-1-AP（proteintech社 ）、sc-292124（SANTA CRUZ社）等）が利用可能である。また、当業者は、上述したＤＯＣＫ８の配列情報に基づいてリコンビナントＤＯＣＫ８を容易に作製し、これを用いて抗ＤＯＣＫ８抗体を容易に作製し得る。
【００３５】
このように、本発明に係る判定方法は、抗ＤＯＣＫ８抗体を用いることによって行われる。すなわち、本発明は、上記判定方法における判定を実現するための抗ＤＯＣＫ８抗体の使用を提供する。この場合、抗ＤＯＣＫ８抗体は、化合物として用いられても、組成物形態で用いられてもよく、上記判定方法における判定を実現するための組成物もまた、本発明の範疇である。
【００３６】
本発明に係る組成物は、抗ＤＯＣＫ８抗体を含むことを特徴としており、末梢血またはリンパ組織にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定する用途に用いられても、被験体が自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを判定する用途に用いられても、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定する用途に用いられてもよい。一実施形態において、本発明に係る組成物は、自己免疫疾患を誘導するＣＤ４ Ｔ細胞の有無を判定するための組成物である。別の実施形態において、本発明に係る組成物は、被験体が自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを判定するための組成物である。さらなる実施形態において、本発明に係る組成物は、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定するための組成物である。
【００３７】
本発明に係る組成物はまた、キットの形態で提供され得る。すなわち、一実施形態において、本発明に係る組成物は、抗ＤＯＣＫ８抗体を備えた、上述した用途に用いられるキットであり得る。本発明に係るキットは、抗ＤＯＣＫ８抗体を内包した容器を備えていればよく、上記化合物を使用するための指示書をさらに備えていてもよい。「指示書」には、キット中の各構成を判定に適用する手順が示されている。なお、「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。さらに、本発明に係るキットは、判定を実行するために必要な器具および試薬をさらに備えていてもよい。一実施形態において、本発明に係るキットは、上述した構成を１つに梱包した包装体であり得る。別の実施形態において、本発明に係るキットは、複数の機器と連動して実行されるシステムの形態であり得る。
【００３８】
〔２−２〕疾患モデル動物の作製ツールおよびその利用
後述する実施例に示すように、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を非ヒト哺乳動物へ移入することによって、非ヒト哺乳動物の末梢血またはリンパ組織にて自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ））を産生させることができる。これらの自己抗体の産生はＳＬＥ発症と密接に関連していることがすでによく知られている。これらのことから、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を非ヒト哺乳動物へ移入することによって、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物（以下、自己免疫疾患モデル動物ともいう。）を作製することができるといえる。すなわち、非ヒト脊椎動物へＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を移入する工程を包含する、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物の作製方法もまた、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明は、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を作製する方法を提供する。本発明に係る作製方法は、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を非ヒト哺乳動物へ移入する工程を包含する方法であればよく、その他の具体的な工程、条件、材料等は特に限定されない。本発明に係る作製方法は、例えば、自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ））の産生量を測定する工程を包含してもよく、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を移入する前後において上記自己抗体の産生が亢進しているか否かを確認する工程をさらに包含してもよい。
【００４０】
非ヒト哺乳動物から血清を採取し、血清中における自己抗体の量を測定する。自己抗体の量の測定には、当該分野で周知の手法が用いられればよく、例えば、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＰＨＡ、二重免疫拡散法、ＦＡＴ、ＰＡ法、ＲＩＡ法等が挙げられる。なお、自己抗体の産生が亢進しているか否かの確認は、移入後の自己抗体量を、同一個体における移入前の自己抗体量と比較して行われても、同じ種類の正常動物個体における自己抗体量と比較して行われてもよい。
【００４１】
上述したように、本明細書において、「自己免疫疾患」は、自己抗体の産生に起因する疾患が意図され、具体的には、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）が好ましい。また、「非ヒト哺乳動物」としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなどが挙げられ、特にマウス、ラット等が好ましい。
【００４２】
ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞は、自己抗体（抗ｄｓＤＮＡ抗体、リウマチ因子（ＲＦ））の産生が亢進している被験体の末梢血またはリンパ組織から取得することができる。また、後述する実施例にて示すように、同一の抗原で繰り返して免疫した非ヒト哺乳動物の末梢血またはリンパ組織からＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を取得することができる。
【００４３】
非ヒト哺乳動物の免疫に用いられる抗原としては、実施例にて用いたオブアルブミン（ＯＶＡ）に限定されず、例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、キーホールリンペット ヘモシアニン（ＫＬＨ）等が挙げられる。抗原は、０．１μｇ〜１０ｍｇ／ｇ体重の範囲で用いられることが好ましく、１μｇ〜１ｍｇ／ｇ体重の範囲で用いられることがより好ましい。
【００４４】
免疫は３〜７日毎に行われることが好ましく、その頻度は、８回以上が好ましく、８〜２０回がさらに好ましい。免疫の際の投与経路としては、静脈注射、腹腔内投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明に係る作製方法は、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を用いることによって行われる。すなわち、本発明は、上記作製方法を実現するためのＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞の使用を提供する。この場合、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞は、化合物として用いられても、組成物形態で用いられてもよく、上記作製方法を実現するための組成物もまた、本発明の範疇である。
【００４６】
本発明に係る組成物は、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を含むことを特徴としており、非ヒト哺乳動物において自己抗体を産生させる用途に用いられても、非ヒト哺乳動物において自己免疫疾患を誘導する用途に用いられても、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を作製する用途に用いられてもよい。一実施形態において、本発明に係る組成物は、非ヒト哺乳動物において自己抗体を産生させるための組成物である。別の実施形態において、本発明に係る組成物は、非ヒト哺乳動物において自己免疫疾患を誘導するための組成物である。さらなる実施形態において、本発明に係る組成物は、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を作製するための組成物である。
【００４７】
上記組成物もまた、上述したように、キットまたはシステムの形態で提供されてもよい。すなわち、一実施形態において、本発明に係る組成物は、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を備えた、上述した用途に用いられるキットであり得る。
【００４８】
〔２−３〕疾患モデル動物の利用
上述したように、上記自己免疫疾患モデル動物において、疾患を誘導する自己抗体の産生が亢進している。よって、上記自己免疫疾患モデル動物の自己抗体量を低減させる物質は、上記自己免疫疾患に対する処置（予防、改善または治療）に有用である。すなわち、上記自己免疫疾患モデル動物は、自己抗体量を低減させる物質をスクリーニングする用途、自己免疫疾患に対する処置（予防、改善または治療）に有用な物質をスクリーニングする用途に利用可能である。
【００４９】
本発明は、上記自己免疫疾患モデル動物の自己抗体量を低減させる物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、上記自己免疫疾患モデル動物を用いる方法であればよく、その他の具体的な工程、条件、材料等は特に限定されない。
【００５０】
一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、被験物質を投与した後の上記自己免疫疾患モデル動物における第１の自己抗体量を測定する工程、被験物質を投与する前の上記自己免疫疾患モデル動物における第２の自己抗体量を測定する工程、および第１の自己抗体量と第２の自己抗体量とを比較する工程を包含し、比較した結果を指標として、用いられた被験物質を目的の医薬（予防薬、改善薬または治療薬）として選択する工程をさらに包含することが好ましい。
【００５１】
本明細書において、「被検物質」は、自己抗体量に何らかの影響を与える可能性がある物質をいい、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）およびこれを含むベクター、抗体、ペプチド、タンパク質、合成化合物などが挙げられる。
【００５２】
なお、被験物質を投与した動物における自己抗体量は、同じ個体の投与前の自己抗体量と比較するだけでなく、同じ種類の正常動物個体における自己抗体量と比較してもよい。すなわち、別の実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、被験物質を投与した後の上記自己免疫疾患モデル動物における第１の自己抗体量を測定する工程、被験物質を投与していない上記自己免疫疾患モデル動物における第３の自己抗体量を測定する工程、および第１の自己抗体量と第３の自己抗体量とを比較する工程を包含し、比較した結果を指標として、用いられた被験物質を目的の医薬（予防薬、改善薬または治療薬）として選択する工程をさらに包含することが好ましい。
【００５３】
本明細書において、「予防」は、疾患の発症前に医薬を被験者に適用することにより、適用しない場合と比べて、疾患の発症率を抑制（低下）させること、及び疾患の発症後の症状を軽減することが意図され、必ずしも発症を完全に抑制することが意図されるのではない。
【００５４】
また、本明細書において、「治療」は、疾患の発症後に医薬を被験者に適用することにより、適用しない場合と比べて、疾患の症状を軽減することが意図され、必ずしも疾患の症状を完全に抑制することが意図されるのではない。なお、疾患の発症は、疾患の症状が身体に現れることをいう。
【００５５】
被験物質を投与する前後に、自己免疫疾患モデル動物から血清を採取し、血清中の自己抗体の量を測定する。あるいは、被験物質を投与された自己免疫疾患モデル動物と、被験物質を投与されていない自己免疫疾患モデル動物とから血清を採取し、血清中の自己抗体の量を測定する。被験物質の投与によって自己抗体の量が減少しているかどうかを調べることによって、自己免疫疾患の処置（予防、改善または治療）に有用な物質を同定することができる。自己抗体の量の測定には、当該分野で周知の手法が用いられればよく、例えば、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＰＨＡ、二重免疫拡散法、ＦＡＴ、ＰＡ法、ＲＩＡ法等が挙げられる。
【００５６】
〔３〕本発明の一態様
上述したように、本発明は以下の態様を採り得る：
［１］被験体の末梢血またはリンパ組織にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含する、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を被験体が有しているか否かを判定する方法。
［２］被験体の末梢血またはリンパ組織にＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを判定する工程を包含する、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定する方法。
［３］上記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、１または２の方法。
［４］自己抗体の産生量を測定する工程をさらに包含する、１〜３の方法。
［５］健常者と比較して上記自己抗体の産生が亢進しているか否かを確認する工程をさらに包含する、４の方法。
［６］上記自己抗体が抗ｄｓＤＮＡ抗体および／またはリウマチ因子（ＲＦ）である、４または５の方法。
［７］抗ＤＯＣＫ８抗体を含む、自己免疫疾患を誘導するＣＤ４ Ｔ細胞が被験体の末梢血またはリンパ組織に存在するか否かを判定するための組成物。
［８］抗ＤＯＣＫ８抗体を含む、被験体が自己免疫疾患の発症の原因となる細胞を有しているか否かを判定するための組成物。
［９］抗ＤＯＣＫ８抗体を含む、被験体が自己免疫疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かを判定するための組成物。
［１０］上記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、７〜９の組成物。
［１１］ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を含む、非ヒト哺乳動物において自己抗体を産生させるための組成物。
［１２］ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を含む、非ヒト哺乳動物において自己免疫疾患を誘導するための組成物。
［１３］ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を含む、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を作製するための組成物。
［１４］上記自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である、１１〜１３の組成物。
［１５］ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を非ヒト哺乳動物へ移入する工程を包含する、自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を作製する方法。
［１６］自己抗体の産生量を測定する工程をさらに包含する、１５の方法。
［１７］ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を移入する前後において上記自己抗体の産生が亢進しているか否かを確認する工程をさらに包含する、１６の方法。
［１８］上記自己抗体が抗ｄｓＤＮＡ抗体および／またはリウマチ因子（ＲＦ）である、１６または１７の方法。
［１９］１５〜１８の方法によって作製した自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を用いる、自己抗体量を低減させる物質をスクリーニングする方法。
［２０］１５〜１８の方法によって作製した自己免疫疾患モデルの非ヒト哺乳動物を用いる、自己免疫疾患に対する処置に有用な物質をスクリーニングする方法。
［２１］被験物質を投与した後の上記非ヒト哺乳動物における第１の自己抗体量を測定する工程、被験物質を投与する前の上記非ヒト哺乳動物における第２の自己抗体量を測定する工程、および第１の自己抗体量と第２の自己抗体量とを比較する工程を包含し、比較した結果を指標として、用いられた被験物質を目的の医薬として選択する工程をさらに包含する、１９または２０の方法。
［２２］被験物質を投与した後の上記非ヒト哺乳動物における第１の自己抗体量を測定する工程、被験物質を投与していない上記非ヒト哺乳動物における第３の自己抗体量を測定する工程、および第１の自己抗体量と第３の自己抗体量とを比較する工程を包含し、比較した結果を指標として、用いられた被験物質を目的の医薬として選択する工程をさらに包含する、１９または２０の方法。
［２３］上記自己免疫疾患モデルが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルである、１９〜２２の方法。
【００５７】
〔実施例〕
〔１．ＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞〕
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc.）に０．５ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ；  grade V; Sigma）を５日毎に繰り返して腹腔内投与した。投与には、ＰＢＳに溶かしたＯＶＡ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を２５０μＬ用いた。ＯＶＡを１２回投与した後のマウスから脾細胞を単離し、抗ＤＯＣＫ８抗体（ウサギ由来、proteintech）、ＰＥ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（BioLegend）、allophycocyanin （ＡＰＣ）標識抗ＣＤ４抗体（BioLegend）と反応させ、フローサイトメーターFACS Calibur（BD bioscienses）を用いて、ＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞を検出した。
【００５８】
その結果、ＰＢＳを１２回繰り返して腹腔内投与した対照群と比較して、ＯＶＡ投与群ではＤＯＣＫ８陽性ＣＤ４ Ｔ細胞が増加していた（図１）。
【００５９】
〔２．ＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞の養子移入〕
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc., Yokohama, Japan）に０．５ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ；grade V; Sigma）を５日毎に繰り返して腹腔内投与した。ＯＶＡ１２回投与後のマウスの脾細胞から、磁気ビーズを含むCD4 T cell isolation kit（Miltenyi Biotec）とセルソーターautoMACS（Miltenyi Biotec）を用いて、ネガティブセレクションによって脾細胞からＣＤ４ Ｔ細胞を単離した。そして、ＣＤ４ Ｔ細胞を、抗ＤＯＣＫ８抗体（ウサギ由来、proteintech）およびphycoerythrin（ＰＥ）標識抗ウサギIgG抗体（BioLegend）と反応させ、続いて磁気ビーズ 抗ＰＥ microbeads（Miltenyi Biotec）と反応させた。その後、セルソーターautoMACS（Miltenyi Biotec）を用いて、ポジティブセレクションによってＤＯＣＫ８＋ 細胞を単離することにより、ＤＯＣＫ８−ＣＤ４ Ｔ細胞とＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞を得た。これらの細胞を、２．５×１０７個ずつ、ナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射によって養子移入した。ネガティブコントロールとして、ＰＢＳを１２回腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から、磁気ビーズを用いてＣＤ４ Ｔ細胞を単離し、２．５×１０７個の細胞をナイーブなＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射によって養子移入した。
【００６０】
細胞の移入から２４時間後に、ＯＶＡ  ０．５ｍｇをレシピエントマウスに腹腔内投与によって追加免疫した。細胞の移入から２週間後に、レシピエントマウスの尾静脈から採血し、非特許文献１に記載の手順に従って、血清中の自己抗体（リウマチ因子（ＲＦ）、抗ｄｓＤＮＡ抗体）をＥＬＩＳＡによって検出した。
【００６１】
図２に示されるように、ＯＶＡ投与マウスのＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞を移入した群では、ネガティブコントロールであるＰＢＳ投与マウスのＣＤ４ Ｔ細胞を移入した群と比較して、ＲＦおよび抗ｄｓＤＮＡ抗体が有意に増加していた。また、ＯＶＡ投与マウスのＤＯＣＫ８− ＣＤ４ Ｔ細胞を移入した群と比較した場合でも、ＤＯＣＫ８＋ＣＤ４ Ｔ細胞を移入した群では、ＲＦおよび抗ｄｓＤＮＡ抗体が有意に増加していた。ネガティブコントロール群とＯＶＡ投与マウスのＤＯＣＫ８−ＣＤ４ Ｔ細胞を移入した群との間には有意な差は見られなかった。
【００６２】
このように、ＯＶＡ１２回投与後のマウスから得られたＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞によって自己抗体（ＲＦおよび抗ｄｓＤＮＡ抗体）の産生が誘導されることがわかった。
【００６３】
〔３．ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団〕
本発明者らはこれまでに、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団をナイーブなマウスに養子移入すると、移入２週間後のレシピエントマウスの血清中に自己抗体（ＲＦおよび抗ｄｓＤＮＡ抗体）の増加が観察されることを見出している（非特許文献２参照）。そこで、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団にＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞が存在するか否かを調べた。
【００６４】
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River Japan Inc., Yokohama, Japan）に０．５ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ；grade V; Sigma）を５日毎に繰り返して腹腔内投与した。ＯＶＡ１２回投与後のマウスの脾細胞から、磁気ビーズ（MACS beads (Miltenyi Biotec, Germany)）を用いてＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団を単離した。
【００６５】
ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞質画分または細胞膜画分から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＤＯＣＫ８抗体（11622-1-AP）を用いたイムノブロッティングを行った。
【００６６】
図３に示されるように、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分にＤＯＣＫ８タンパク質が存在することがわかった。なお、図中レーン１〜４は細胞質画分のタンパク質、レーン５〜８は細胞膜画分のタンパク質であり、レーン１および５は、ＰＢＳを１２回腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から回収したＣＤ４ Ｔ細胞（ネガティブコントロール）を用い、レーン２および６は、ＯＶＡを１２回腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から回収したＣＤ４５ＲＢｈｉ１２２ｈｉのＣＤ４ Ｔ細胞を用い、レーン３および７は、ＯＶＡを１２回腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から回収したＰＤ−１−ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞を用い、レーン４および８は、ＯＶＡを１２回腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から回収したＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞を用いた。
【００６７】
続いて、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞質画分または細胞膜画分から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルの銀染色を行い、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分に存在してコントロールの細胞亜集団の細胞膜画分に存在しないタンパク質（図４の(a)〜(f)）をゲルから切り出して質量分析に供した。図中のレーン１〜８は、図３のレーン１〜８に対応している。
【００６８】
質量分析の結果から、ＤＯＣＫ８がＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団に存在してコントロールの細胞亜集団に存在しないタンパク質であることがわかった。また、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団に存在してコントロールの細胞亜集団に存在しないタンパク質として、ＤＯＣＫ８以外に、DNA topoisomerase 2-beta（ＴＯＰＯ  ＩＩβ，１８１ｋＤａ）、von Willebrand factor A domain-containing protein 5A（ＶＷＡ５Ａ，８７ｋＤａ）、signal transducer and activator of transcription 5B（ＳＴＡＴ５ｂ，８９ｋＤａ）、epidermal growth factor receptor substrate 15-like 1（ＥＰＳ１５Ｒ，９９ｋＤａ）、arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein（ＦＬＡＰ，１８ｋＤａ）が存在することがわかった。
【００６９】
これらのタンパク質についてのイムノブロッティングの結果を図５Ａ〜図５Ｆに示す。図中、目的のタンパク質泳動位置に＊を付している。また、図中のレーン１〜８は、図３および図４のレーン１〜８に対応している。
【００７０】
図５Ａには、抗ＶＷＡ５Ａ抗体（LS-C172383（LifeSpan BioSciences社）およびSc-137568（SANTA CRUZ社））を用いたイムノブロッティングの結果を示した。抗体LS-C172383を用いた場合、抗体に特異的なシグナル（バンド）が明瞭に観察された。
【００７１】
図５Ｂには、抗ＦＬＡＰ抗体（ab85227（abcam社）およびSc-28815（SANTA CRUZ社））を用いたイムノブロッティングの結果を示した。抗体Sc-28815を用いた場合は非特異的シグナルがマーカー部分に観察されたに過ぎないが、抗体ab85227を用いた場合、レーン１および３にて弱いシグナルが観察された。
【００７２】
図５Ｃには、抗ＤＯＣＫ８抗体（11622-1-AP（proteintech社）およびSc-292124（SANTA CRUZ社））を用いたイムノブロッティングの結果を示した。抗体11622-1-APおよび抗体Sc-292124のいずれを用いた場合にも、レーン１、４、５、８にて明瞭なシグナルが観察された。
【００７３】
図５Ｄには、抗ＴＯＰＯ  ＩＩβ抗体（ab58442（abcam社）およびSc-13059（SANTA CRUZ社））を用いたイムノブロッティングの結果を示した。抗体ab58442および抗体Sc-13059のいずれを用いた場合にも、シグナルを検出することができなかった。
【００７４】
図５Ｅには、抗ＥＰＳ１５Ｒ抗体（NBP1-40493（Novus Biologicals社）およびab177804（abcam社））を用いたイムノブロッティングの結果を示した。抗体NBP1-40493および抗体ab177804のいずれを用いた場合にも、目的のタンパク質泳動位置にシグナルを検出することができなかった。
【００７５】
図５Ｆには、抗ＳＴＡＴ５ｂ抗体（ab178941（abcam社）およびSc-1656（SANTA CRUZ社））を用いたイムノブロッティングの結果を示した。抗体ab178941を用いた場合、抗体に特異的なシグナル（バンド）が明瞭に観察された。抗体ab85227を用いた場合、微弱なシグナルではあるものの、抗体ab178941を用いた場合と同様のパターンでシグナルが観察された。
【００７６】
このように、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団の細胞膜画分におけるタンパク質量は、ＤＯＣＫ８タンパク質が最も多かった。
【００７７】
以上の結果から、ＰＤ−１＋ＣＤ４５ＲＢｌｏ１２２ｌｏのＣＤ４ Ｔ細胞亜集団に存在する自己応答性抗体誘導性ＣＤ４ Ｔ細胞（ａｉＣＤ４ Ｔ細胞）の本体がＤＯＣＫ８＋ ＣＤ４ Ｔ細胞であることが強く示唆された。そして、ＤＯＣＫ８タンパク質をマーカーに用いれば、自己免疫疾患（特にＳＬＥ）の原因となるａｉＣＤ４ Ｔ細胞を簡便に検出することができるとともに、疾患を発症しているか、または発症する可能性があるか否かの判定を客観的かつ正確に行うことができるといえる。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、自己免疫疾患の発症の原因となる細胞をより簡便に特定することができるので、本発明は、検査機器の開発に利用可能である。また、本発明によれば、非ヒト哺乳動物に自己免疫疾患を発症させることによって、自己免疫疾患モデル動物を作製し得るので、本発明は、自己免疫疾患の診断のための医薬品、自己免疫疾患の予防および／または治療のための医薬品のスクリーニング試験などに好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
0006536944.tif 000009
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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