(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した生体試料から調製した1〜10ngのDNA又はRNAを鋳型とし、プライマー１（配列番号19）及びプライマー２（配列番号20）を用いてBCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅する工程と、  上記工程で増幅した核酸を用いて、上記BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位の遺伝子型を決定する工程と、を含むBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項２】
上記遺伝子型を決定する工程では、上記突然変異部位について野性型に対応する野性型プローブと変異型に対応する変異型プローブとを用い、上記増幅した核酸に含まれる野性型及び/又は変異型の存在割合を計算することを特徴とする請求項１記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項３】
上記存在割合は、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量と上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量との合計量に対する、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を野性型の存在割合とし、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を変異型の存在割合とすることを特徴とする請求項２記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項４】
上記存在割合は、上記突然変異部位を含まず、上記増幅した核酸に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて測定した核酸の量に対する、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を野性型の存在割合とし、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を変異型の存在割合とすることを特徴とする請求項２記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項５】
上記増幅する工程では、蛍光ラベルを有するプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量、及び上記増幅した核酸の量を、蛍光強度の絶対値に基づく値とすることを特徴とする請求項３又は４記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項６】
上記突然変異部位は、上記BCR-ABL融合遺伝子がコードするタンパク質のうち、BCR-ABLキナーゼドメインであることを特徴とする請求項１記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項７】
上記突然変異部位は、BCR-ABLキナーゼドメインの315番目のスレオニン（野性型）のイソロイシン（変異型）への置換変異部位及び当該BCR-ABLキナーゼドメインの253番目のチロシン（野性型）のヒスチジン（変異型）への置換変異部位のいずれか一方又は両方であることを特徴とする請求項１記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項８】
上記BCR-ABLキナーゼドメインの315番目の置換変異部位について、野性型に対応するCTATATCATCACTGAGTTCATG（配列番号１）を含む野性型プローブと、変異型に対応するCTATATCATCATTGAGTTCATG（配列番号２）を含む変異型プローブとを使用し、
上記BCR-ABLキナーゼドメインの253番目の置換変異部位について、野性型に対応するGCCAGTACGGGGAGGTGTAC（配列番号３）を含む野性型プローブと、変異型に対応するGCCAGCACGGGGAGGTGTAC（配列番号４）を含む変異型プローブとを使用することを特徴とする請求項７記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれか一項記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法により、被験者から採取した生体試料に含まれるBCR-ABL融合遺伝子について決定した遺伝子型に基づいて上記被験者のBCR-ABL阻害剤耐性に関連するデータを取得する工程とを含む、BCR-ABL阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病等におけるBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法及びこれを用いたBCR-ABL阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（CML）は、ほとんどのケースにおいて、フィラデルフィア染色体と呼ばれる遺伝子突然変異が認められる。フィラデルフィア染色体とは、9番染色体と22番染色体の各長腕が転座したものである。この転座により、22番染色体上のBCR (breakpoint cluster region)と9番染色体のABL遺伝子領域が複合し、BCR-ABL融合（キメラ）遺伝子を生じる。この融合遺伝子がコードする融合タンパクBCR-ABLは、チロシンキナーゼ活性を恒常的に亢進させており、慢性骨髄性白血病の鍵となる要因とされる。
【０００３】
一方、イマチニブに代表されるBCR-ABL阻害剤は、現在、融合タンパクBCR-ABLの分子標的治療薬として、慢性骨髄性白血病 (CML)、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病(Ph+ALL)、KIT (CD117) 陽性消化管間質腫瘍(GIST)に対する治療薬として用いられている。しかし、BCR-ABL阻害剤治療については、慢性骨髄性白血病における進行期の多くの患者が良好に応答し、BCR-ABL融合遺伝子の発現量が減少するものの、治療中にBCR-ABL融合遺伝子にある突然変異が生じると、治療抵抗性を示すことが知られている。この突然変異の例は、イマチニブ治療抵抗性を示す突然変異として、253番目のチロシン（野性型）がフェニルアラニン又はヒスチジン（変異型）への変異、255番目のグルタミン酸（野性型）がリシン又はバリン（変異型）への変異、315番目のチロシン（野性型）がイソロイシン（変異型）への変異が挙げられる（非特許文献１）。
【０００４】
非特許文献１によれば、上記変異のうち、315番目のチロシン（野性型）がイソロイシン（変異型）への変異以外のBCR-ABLキナーゼドメインの変異は、BCR-ABL阻害剤であるニロチニブやダサチニブには感受性を示すことが示されており、BCR-ABL阻害剤抵抗性に関与するBCR-ABLキナーゼドメインの突然変異の有無を一度に評価することができれば、治療戦略の策定や治療方法の変更を含む対策をとることが可能となる。よって、上述したようなBCR-ABL阻害剤耐性に関連する突然変異を簡易且つ正確に検出することが求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】O'Hare T、Eide CA、Deininger MW. Bcr-Abl kinase domain mutations、drug resistance、and the road to a cure for chronic myeloid leukemia. Blood 2007;110: 2242-2249.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、被験者から採取した生体試料には、BCR-ABL融合遺伝子が発現している細胞と、上述した転座は起こっていないがABL遺伝子が発現している（正常）細胞が混在していることがあるため、BCR-ABL阻害剤耐性に関連する突然変異を検出する場合、生体試料中に含まれる（正常）細胞由来の9番染色体上のABLキナーゼドメインに存在する同変異も検出することがあり、同ABLキナーゼドメインの上記変異はBCR-ABL阻害剤耐性に直接寄与しないことから、BCR-ABL阻害剤耐性に関連する突然変異を正確に検出できないといった問題があった。そこで、本発明は、慢性骨髄性白血病等におけるBCR-ABL阻害剤耐性に関連する突然変異をより高精度に検出することができる、BCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法、及びこれを用いたBCR-ABL阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、転座によって生じたBCR-ABL融合遺伝子を特異的に増幅し、増幅した核酸に含まれるBCR-ABL阻害剤耐性に関連する突然変異を検出することで、同突然変異を特異的に検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は以下を包含する。
（１）被験者から採取した生体試料を使用して、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅する工程と、
上記工程で増幅した核酸を用いて、上記BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位の遺伝子型を決定する工程と、を含むBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（２）上記遺伝子型を決定する工程では、上記突然変異部位について野性型に対応する野性型プローブと変異型に対応する変異型プローブとを用い、上記増幅した核酸に含まれる野性型及び/又は変異型の存在割合を計算することを特徴とする（１）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（３）上記存在割合は、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量と上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量との合計量に対する、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を野性型の存在割合とし、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を変異型の存在割合とすることを特徴とする（２）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（４）上記存在割合は、上記突然変異部位を含まず、上記増幅した核酸に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて測定した核酸の量に対する、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を野性型の存在割合とし、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を変異型の存在割合とすることを特徴とする（２）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（５）上記増幅する工程では、蛍光ラベルを有するプライマーを用いて核酸増幅反応を行い、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量、及び上記増幅した核酸の量を、蛍光強度の絶対値に基づく値とすることを特徴とする（３）又は（４）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（６）上記突然変異部位は、上記BCR-ABL融合遺伝子がコードするタンパク質のうち、BCR-ABLキナーゼドメインであることを特徴とする（１）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（７）上記突然変異部位は、BCR-ABLキナーゼドメインの315番目のスレオニン（野性型）のイソロイシン（変異型）への置換変異部位及び当該BCR-ABLキナーゼドメインの253番目のチロシン（野性型）のヒスチジン（変異型）への置換変異部位のいずれか一方又は両方であることを特徴とする（１）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（８）上記BCR-ABLキナーゼドメインの315番目の置換変異部位について、野性型に対応するCTATATCATCACTGAGTTCATG（配列番号１）を含む野性型プローブと、変異型に対応するCTATATCATCATTGAGTTCATG（配列番号２）を含む変異型プローブとを使用し、
上記BCR-ABLキナーゼドメインの253番目の置換変異部位について、野性型に対応するGCCAGTACGGGGAGGTGTAC（配列番号３）を含む野性型プローブと、変異型に対応するGCCAGCACGGGGAGGTGTAC（配列番号４）を含む変異型プローブとを使用することを特徴とする（７）記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法。
（９）上記（１）乃至（８）いずれか記載のBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法により、被験者から採取した生体試料に含まれるBCR-ABL融合遺伝子について決定した遺伝子型に基づいて上記被験者のBCR-ABL阻害剤耐性を判定する工程とを含む、BCR-ABL阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法は、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅し、増幅した核酸について遺伝子型を決定している。これにより、本発明に係るBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法によれば、上記突然変異部位の遺伝子型を高精度に決定できる。
【００１０】
また、本発明に係るBCR-ABL阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法によれば、上記BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位について高精度に決定された遺伝子型の情報を利用するため、BCR-ABL阻害剤耐性に関する予測を高精度に行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係るBCR-ABL阻害剤耐性関連変異の検出方法及びこれを用いたBCR-ABL阻害剤耐性を予測するためのデータ取得方法（以下、まとめて本方法と称する）では、先ず、被験者から採取した生体試料を使用して、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位（例えば、BCR-ABLキナーゼドメインの突然変異部位）を含む領域を増幅する。そして、本方法では、増幅した核酸を用いて、上記BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位の遺伝子型を決定し、決定した遺伝子型に基づいて上記被験者のBCR-ABL阻害剤耐性を判定する。
【００１２】
ここで、被験者とは、健常者であっても良いし、BCR-ABL阻害剤が適用される各種疾患に罹患した患者でもよい。BCR-ABL阻害剤が適用される各種疾患としては、特に限定されないが、例えばBCR-ABL阻害剤のうちイマチニブであれば、慢性骨髄性白血病（CML）、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ph+ALL）、KIT（CD117）陽性消化管間質腫瘍（GIST）を挙げることができる。特に慢性骨髄性白血病に罹患した患者を被験者とすることが好ましい。また、被験者としては、BCR-ABL阻害剤投与が開始された患者でも良いし、BCR-ABL阻害剤投与の開始前の患者でも良い。なお、BCR-ABL阻害剤としては、イマチニブに限定されず、例えばニロチニブ及びダサチニブ等を挙げることができる。
【００１３】
特に、本方法では、9番染色体と22番染色体の一部が転座してなるBCR-ABL融合遺伝子を有する被験者について、当該BCR-ABL融合遺伝子のうち、BCR-ABLキナーゼドメインの突然変異に起因するBCR-ABL阻害剤耐性を評価するものである。よって、被験者としては、9番染色体と22番染色体との転座によるBCR-ABL融合遺伝子を有するものとする。
【００１４】
また、被験者由来の生体試料としては、特に限定されないが、血液、血漿、血清、髄液、膵液、尿、糞便、組織液等が挙げられる。特に生体試料としては、血液、血漿、血清を使用することが好ましい。
【００１５】
「生体試料を使用して、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅」するとは、生体試料に含まれる細胞から、全RNA又はmRNAを抽出し、抽出した全RNA又はmRNAを逆転写してなるcDNAを鋳型として核酸増幅反応を行うことを意味している。核酸の抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたRNA抽出法を用いることができる。
【００１６】
この核酸増幅反応では、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅するが、同時に他の領域を増幅しても良い。核酸増幅反応としては、特に限定されず、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法やLAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、TMA（Transcription-Mediated Amplification）法、TRC（Transcription-Reverse Transcription Concerted Reaction）法、SDA（Strand Displacement Amplification）法、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適宜使用することができる。例えばPCR法では、増幅目的の領域を挟み込む一対のプライマーを設計し、ポリメラーゼ及び基質等を含む試薬を準備する。そして、上述した生体試料から抽出した全RNA又はmRNAから逆転写されたcDNAを鋳型として、所定の温度サイクル条件に従って核酸増幅反応を行い、一対のプライマーから目的の領域を特異的に増幅することができる。なお、核酸増幅反応は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
【００１７】
特に、核酸増幅反応では、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
【００１８】
すなわち、PCR法を適用する場合、「BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域」を挟み込むように設計した一対のプライマーを用いることで、当該領域を定法に従って特異的に増幅することができる。なお、PCR法以外の他の核酸増幅方法を適用しても、各核酸増幅反応の原理に従って当該領域を特異的に増幅できる。
【００１９】
より具体的に、PCR法に使用する一対のプライマーとしては、BCR-ABL融合遺伝子におけるBCR遺伝子に由来する領域と、BCR-ABL融合遺伝子におけるABL遺伝子に由来する領域とからそれぞれ設計すれば良い。なお、一対のプライマーには、いわゆるフォワードプライマーとリバースプライマー（二本鎖DNAにおける互いに異なる鎖にハイブリダイズする）が含まれるが、BCR-ABL融合遺伝子におけるBCR遺伝子に由来する領域及びABL遺伝子に由来する領域のいずれか一方からフォワードプライマーを設計し、他方からリバースプライマーを設計すれば良い。
【００２０】
また、BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位とは、例えばBCR-ABLキナーゼドメインに存在し、BCR-ABL阻害剤による治療効果が低減する現象に相関するアミノ酸変異を伴う突然変異の部位である。BCR-ABL阻害剤による治療効果が低減する現象とは、言い換えると、BCR-ABL阻害剤によるBCR-ABL融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性抑制効果が低減することを意味する。BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異としては、BCR-ABLキナーゼドメインのアミノ酸置換変異が挙げられる。具体的には、BCR-ABL阻害剤耐性に関与するBCR-ABLキナーゼドメインの突然変異としては、M237V、I242T、M244V、K247R、L248V、G250E/R、Q252R/H、Y253F/H、E255K/V、E258D、W261L、L273M、E275K/Q、D276G、T277A、E279K、V280A、V289A/I、E292V/Q、I293V、L298V、V299L、F311L/I、T315I、F317L/V/I/C、Y320C、L324Q、Y342H、M343T、A344V、A350V、M351T、E355D/G/A、F359V/I/C/L、D363Y、L364I、A365V、A366G、L370P、V371A、E373K、V379I、A380T、F382L、L384M、L387M/F/V、M388L、Y393C、H396P/R/A、A397P、S417F/Y、I418S/V、A433T、S438C、E450K/G/A/V、E453G/K/V/Q、E459K/V/G/Q、M472I、P480L、F486S、E507G等があげられる。なお、上記突然変異の記載において、数値は突然変異の部位を示しているが、BCR-ABL融合タンパク質のN末端のメチオニンを１として数えた値である。
【００２１】
特に、BCR-ABL阻害剤耐性に関与するBCR-ABLキナーゼドメインの突然変異部位としては、T315I及びY253Hを使用することが好ましい。言い換えると、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びイマチニブ耐性関与するT315I及び/又はY253Hを含む領域を挟み込むように一対のプライマーを設計することが好ましい。
【００２２】
なお、フィラデルフィア染色体は、t（9;22）（q34;q11）によって形成される小染色体で、22q11に座位するbcr（breakpoint cluster region）遺伝子に9q34座位するc-abl遺伝子が融合している。bcr 遺伝子の切断部位はintron 1（minor bcr、m-bcr）又はintron 2もしくは3（major bcr、M-bcr）に集中しており、c-ablの一部とhead to tailで融合する。M-bcrに切断点がある場合はbcr exon 2（b2）又はexon 3（b3）がa2に連結したb2-a2 mRNA又はb3-a2 mRNAが転写され、融合タンパク質p210BCR-ABLが産生される。一方、m-bcrに切断点がある場合は exon 1（B1）がc-ablのexon 2（a2）と連結したB1-a2 mRNAが転写され、融合タンパク質 p190BCR-ABLが産生される。
【００２３】
なお、b2-a2 mRNAの一部の配列をDNA配列として配列番号５に示し、b3-a2 mRNAの一部の配列をDNA配列として配列番号６に示し、B1-a2mRNAの一部の配列をDNA配列として配列番号７に示した。また、b2-a2 mRNAに含まれるBCR-ABL融合タンパク質をコードする領域を含むDNA配列を配列番号８に示した。
【００２４】
このような知見に基づけば、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅」するためのプライマーを適宜設計することができる。詳細には、例えば以下のようにしてプライマーを設計することができる。
【００２５】
まず、検出対象の変異を決める（例えばT315I）。次に、設計位置について、フォワードプライマーをBcr遺伝子配列（配列番号９又は１０）においてBCR-ABL融合遺伝子となる領域から設計する。なお、配列番号９及び１０においては５’末端から３３０４番目までがBCR-ABL融合遺伝子となる領域である。また、リバースプライマーは、Abl遺伝子配列（配列番号１１）においてBCR-ABL融合遺伝子となる領域で且つ変異部位（例えばT315I）よりも３’末端側に相補鎖として設計する。なお、配列番号１１において４４５番目から３’末端までがBCR-ABL融合遺伝子となる領域である。フォワードプライマーをAbl遺伝子配列から設計し、リバースプライマーをBcr遺伝子配列から設計しても良い。
【００２６】
プライマーの設計法としては塩基長、Tm及びGC含量等を指標として、一般的な設計手法を用いることができる。
【００２７】
なお、一対のプライマーにより増幅される領域の長さは、融合部位と変異部位を含めば特に限定されないが、例えば10〜10k塩基とすることができ、50〜6k塩基とすることが好ましく、500〜3k塩基とすることがより好ましく、800〜2k塩基とすることが最も好ましい。増幅する領域の長さをこの範囲とすることで、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含むことができる。
【００２８】
以上のように設計した一対のプライマーを使用することで、「BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域」を特異的に増幅することができる。言い換えると、以上のように設計した一対のプライマーを使用した場合、9番染色体と22番染色体との転座していなければ、核酸増幅反応が進行せず増幅断片は確認されない。
【００２９】
次に、本発明に係るデータ取得方法では、増幅した核酸を用いて、上記BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位の遺伝子型を決定する。遺伝子型の決定方法は、特に限定されず、如何なる方法、原理に基づいてもよい。例えば、遺伝子型の決定方法としては、突然変異部位について野生型アレル、変異型アレルに特異的にハイブリダイズするプローブを利用する方法が挙げられる。遺伝子型の決定方法としては、プローブを利用した方法に限定されず、例えば、増幅断片の塩基配列を決定する方法、PCR法等の核酸増幅反応を利用した方法等を挙げることができる。
【００３０】
特に、基板上にプローブを固定してなるDNAマイクロアレイ（DNAチップと称する場合もある）を使用して、増幅した核酸に含まれる上記BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位の遺伝子型を決定することが好ましい。プローブを固定してなるDNAマイクロアレイを利用することで、簡易且つ簡便な手順で遺伝子型を正確に決定できるからである。
【００３１】
より具体的に、突然変異部位としてT315Iの遺伝子型を決定するためのプローブとしては、野性型に対応するCTATATCATCACTGAGTTCATG（配列番号１）を含む野性型プローブと、変異型に対応するCTATATCATCATTGAGTTCATG（配列番号２）を含む変異型プローブとを例示できる。また、突然変異部位としてY253Hの遺伝子型を決定するためのプローブとしては、野性型に対応するGCCAGTACGGGGAGGTGTAC（配列番号３）を含む野性型プローブと、変異型に対応するGCCAGCACGGGGAGGTGTAC（配列番号４）を含む変異型プローブとを例示できる。なお、これら野性型プローブ及び変異型プローブは、22merあるいは20merとしたが、塩基長は何ら限定されない。プローブの長さとしては、例えば、10mer〜50merとすることができ、15mer〜40merとすることが好ましく、20mer〜30merとすることがより好ましく、20mer〜25merとすることが最も好ましい。このように、遺伝子型を決定するためのプローブは、如何なる長さであっても上述したAbl遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。
【００３２】
なお、遺伝子型を決定するためのプローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、好ましくは一本鎖DNAである。遺伝子型を決定するためのプローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
【００３３】
遺伝子型を決定するためのプローブは、その5'末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ（例えばDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。また、担体としては、表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いることが好ましい。
【００３４】
特に、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。
【００３５】
プローブを担体に固定するには、特に限定されないが、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングする方法を適用することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
【００３６】
スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００３７】
以上のように作製したDNAマイクロアレイを用いることで、被検者におけるBCR-ABL阻害剤耐性に関連する突然変異部位の遺伝子型を決定することができる。具体的には、上述のように増幅した核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定する。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、42〜54℃とすることができ、プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度を42〜48℃とすることがより好ましく、プローブの鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度を46〜54℃とすることがより好ましい。なお、塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなる。
【００３８】
また、このとき、DNAマイクロアレイには、突然変異部位の遺伝子型を決定するためのプローブのほかに、増幅した核酸におけるBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位以外の領域にハイブリダイズするプローブを固定しても良い。このプローブは、当該突然変異部位の遺伝子型に拘わらず、増幅した核酸にハイブリダイズすることができる。よって、このプローブを固定したDNAマイクロアレイを使用することで、核酸増幅反応により目的とする核酸が増幅できたか否か判定することができる。
【００３９】
本方法は、BCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位について設計したプローブにハイブリダイズした上記増幅核酸の量に基づいて、当該突然変異部位の遺伝子型を決定する。特に、本方法では、BCR-ABL融合遺伝子に含まれる融合部位及びBCR-ABL阻害剤耐性に関与する突然変異部位を含む領域を増幅しているため、9番染色体上のABL遺伝子における同突然変異部位の遺伝子型の影響を受けることなく、BCR-ABL融合遺伝子における突然変異部位の遺伝子型を決定することができる。
【００４０】
特に、被験者から採取した生体試料を使用し、mRNAを逆転写して得られるcDNAを鋳型として増幅した核酸について、突然変異部位の遺伝子型を決定することで、野生型のBCR-ABL融合遺伝子と変異型のBCR-ABL融合遺伝子について発現量の比率を求めることができる。言い換えると、この場合、被験者から採取した生体試料について、BCR-ABL阻害剤耐性を有する細胞（クローン）集団の、BCR-ABL阻害剤感受性の細胞に対する存在割合を推定することができる。これにより、BCR-ABL阻害剤が適用される各種疾患（CML、Ph+ALL及びGIST等）に対して、BCR-ABL阻害剤の投与の継続か他の治療薬への変更といった治療方針を適切に判断することができる。
【００４１】
より具体的には、上記突然変異部位について野性型に対応する野性型プローブと変異型に対応する変異型プローブとを用い、上記増幅した核酸に含まれる野性型及び/又は変異型の存在割合を計算する。そして、野性型の存在割合が一定の値以下、あるいは変異型の存在割合が一定の値以上であるときに、例えば、疾患の再発リスクが高いと判断することができる。このとき、変異型の存在割合の閾値として、例えば、疾患の再発リスクが高いと判断する値、BCR-ABL阻害剤の投与効果がないと判断する値、BCR-ABL阻害剤に替えて他の薬剤に切り替えると判断する値等を適宜設定することができる。
【００４２】
また、野性型あるいは変異型の存在割合は、一例として以下のように決定することができる。すなわち、野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量と変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量との合計量に対する、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を野性型の存在割合とし、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を変異型の存在割合とすることができる。或いは、上記存在割合は、突然変異部位以外に特異的にハイブリダイズするプローブを用いて測定した核酸の量に対する、上記野性型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を野性型の存在割合とし、上記変異型プローブに特異的にハイブリダイズする核酸の量の比を変異型の存在割合とすることもできる。
【００４３】
いずれの場合でも、増幅した核酸、すなわち野性型BCR-ABL融合遺伝子及び変異型BCR-ABL融合遺伝子の合計量に対する、野性型BCR-ABL融合遺伝子の量を野性型の存在割合とし、変異型BCR-ABL融合遺伝子の量を変異型の存在割合とする。これにより、被験者から採取した生体試料に含まれる、BCR-ABL阻害剤耐性クローンの存在割合を合理的に推定することができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕
＜検体の作製＞
本実施例では下記表にまとめた5種類の検体を準備した。
【００４６】
【表１】
0006531312.tif 000002
【００４７】
＜検体１の作製方法＞
細胞株K562を細胞培養し、細胞は1.25×106個/mLであることを、TC20全自動セルカウンター（バイオラッド社製）にて確認した。15mLファルコンチューブに10mLの培養液を分取し、300×gで5分間遠心操作しペレットにした。上清を注意深く完全に除去してから、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）にてRNAを抽出した。NanoDrop 2000（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて、RNA濃度を測定した。
【００４８】
＜検体２の作製方法＞
細胞株HL60を細胞培養し、検体１の作製と同様に、RNeasy Mini Kit（キアゲン社製）にてRNAを抽出した。NanoDrop 2000（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて、RNA濃度を測定した。
【００４９】
＜検体３の作製方法＞
細胞株K562から抽出した2mgの全RNAを対象にプライマー（プライマー配列５（CCGGAATTCTCCGCTGACCATCAATAAGGA：配列番号１２）、プライマー配列６（ATAAGAATGCGGCCGCACGTCGGACTTGATGGAGAACT：配列番号１３））を用いてRT-PCRを行った。1203bpのcDNA断片を、5’BCR特異的プライマー、および3’ABL特異的プライマーを用いたPCRで増幅した。
【００５０】
PCR産物をpcDNA3.1(+)クローニングベクター（インビトロジェン社製）にライゲーションし、大腸菌DH5αコンピテントセル（東洋紡）に形質転換した。挿入したPCR産物をシークエンスし、野生型配列が挿入されていることを確認した。
【００５１】
＜検体４の作製方法＞
検体３で得た野生型クローンベクターを対象に、Site-Directed. Mutagenesis（東洋紡社製）によって、315番目のスレオニンをイソロイシンとする点変異を導入した。PCRにはプライマー配列７（CCCCGTTCTATATCATCATTGAGTTCATGACCTACG：配列番号１４）及びプライマー配列８（CGTAGGTCATGAACTCAATGATGATATAGAACGGGG：配列番号１５）を使用した。反応液組成を下記表２（単位はμL）に示した。
【００５２】
【表２】
0006531312.tif 000003
【００５３】
PCRは以下の条件で行った。すなわち、95℃で2分の後、98℃で2min及び68℃で10分を１サイクルとして１０サイクル行った。
【００５４】
そして、制限酵素DpnI（東洋紡）にて、鋳型野生型クローンベクターを断片化し、目的の変異を導入したPCR産物を大腸菌DH5αコンピテントセル（東洋紡社製）に形質転換（トランスフォーメーション）した。挿入したPCR産物をシークエンスし、T315I変異型配列が挿入されていることを確認した。
【００５５】
＜検体５の作製方法＞
検体３で得た野生型クローンベクターを対象に、Site-Directed. Mutagenesis（東洋紡社製）によって、253番目のチロシンをヒスチジンとする点変異を導入した。PCRには、プライマー配列９（CAAGCTGGGCGGGGGCCAGCACGGGGAGGTGTACGAGG：配列番号１６）及びプライマー配列１０（CCTCGTACACCTCCCCGTGCTGGCCCCCGCCCAGCTTG：配列番号１７）を使用した。検体４を作製した条件と同様にPCRを行い、挿入したPCR産物をシークエンスし、Y253H変異型配列が挿入されていることを確認した。
【００５６】
＜チップの作製＞
BCR-ABL融合遺伝子の融合部位を検出するためのプローブ（プローブ１）BCR-ABL融合遺伝子の変異であるT315Iを検出するためのプローブ（プローブ２及び３）を作製した。各プローブの塩基配列は以下の通りである。
プローブ１（融合）：CCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGA（配列番号１８）
プローブ２（野生型）：CTATATCATCACTGAGTTCATG（配列番号１）
プローブ３（変異型）：CTATATCATCATTGAGTTCATG（配列番号２）
【００５７】
〔実施例１−１〕プライマーセットの評価
本実施例では、BCR-ABL融合遺伝子の融合部位及び突然変異部位を含む領域を特異的に増幅するプライマーセットA（プライマー１及び２）を使用した。プライマー１及びプライマー２の塩基配列は以下の通りである。なお、プライマー２にはCy5を付加した。
プライマー１：TCCGCTGACCATCAAYAAGGA（配列番号１９、Y=C or T）
プライマー２：ACGTCGGACTTGATGGAGAACT（配列番号２０）
【００５８】
プライマーセットAを用いて下記表３（単位はμL）の組成の反応液でRT-PCRを行い、BCR-ABL融合遺伝子の融合部位及び突然変異部位を含む領域を増幅した。このとき、本実施例では、鋳型として検体１から抽出したヒトRNAを使用した。
【００５９】
【表３】
0006531312.tif 000004
RT-PCRは、逆転写反応を42℃で15minの後95℃で10secとする条件で行い、その後、増幅反応を95℃で30sec、60℃で30sec及び72℃で3minを1サイクルとして33サイクル、その後72℃で5minとする条件で行った。
【００６０】
反応終了後、反応液とハイブリダイズ緩衝液（2×SSC/0.2%SDS/0.2 nM Cy5標識オリゴDNA（シグマアルドリッチ社製））を1：1で混合し、この溶液を3μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、48℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置（東洋鋼鈑社製）で１時間反応させた。
【００６１】
ハイブリダイズ反応終了後、洗浄用ステンレスホルダーを1×SSC/0.1% SDS溶液に浸し、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットした。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを1×SSC溶液（室温）に浸した。
【００６２】
カバーガラスとチップとを被せた後、FLA8000（富士フィルム社製）を用いてピクセルサイズ5μm、PMT80％で蛍光強度を検出した。FLA8000で得られたデータの解析は、ソフトウエア（ArrayGauge Ver 2.1、富士フィルム社製）で行っ        た。
【００６３】
なお、比較のため、プライマーセットAに替えて、BCR-ABL融合遺伝子の変異を増幅するプライマーセットB（プライマー３及び４）を使用して同様にRT-PCR、ハイブリダイズ反応及び蛍光検出を行った。プライマー３及びプライマー４の塩基配列は以下の通りである。
プライマー３：AAGACCTTGAAGGAGGACACCAT（配列番号２１）
プライマー４：ACGTCGGACTTGATGGAGAACT（配列番号２２）
【００６４】
プライマーセットAを用いた場合、プライマーセットBを用いた場合、それぞれにおいて蛍光強度を測定した結果を表４に示す。下記表４に示すように、プライマーセットAを使用した場合において、BCR-ABL融合遺伝子を有している検体１において、融合部位と変異部位の両方にシグナルが得られた。これに対して、プライマーセットBを使用した場合は、BCR-ABL融合遺伝子を有している検体１において、変異部位は検出できたものの、融合部位は検出できなかった。これにより、プライマーセットAを用いた場合、融合部位と変異部位を同時に検出することができることが明らかとなった。
なお、検出できないとする判定値を、４３以下とした。なお、当該判定値は、シグナルを含まないバックグラウンド領域における蛍光シグナルを解析した結果から算出した値である。
【００６５】
【表４】
0006531312.tif 000005
【００６６】
〔実施例１−２〕プライマーセットの評価
本実施例では、BCR-ABL融合遺伝子における突然変異部位として、T315I変異を検出するプローブに加えてY253H変異を検出するプローブを固定したDNAチップを用いて、検体に含まれるBCR-ABL融合遺伝子における突然変異部位を検出した。本例では、検体２の細胞株から抽出したヒトRNA 100ngと、検体５の細胞株から抽出したヒトDNA 1ngを鋳型として使用した。
【００６７】
本例では、プローブ１〜３に加えて、BCR-ABL融合遺伝子の変異であるY253Hを検出するためのプローブ（プローブ４及び５）を設計し、プローブ１〜５を固定化したDNAチップを作製した。
プローブ４（野生型）：GCCAGTACGGGGAGGTGTAC（配列番号３）
プローブ５（変異型）：GCCAGCACGGGGAGGTGTAC（配列番号４）
【００６８】
実施例１−１と同様に、プライマーセットAを用いた場合において蛍光強度を測定した結果を表５に示す。下記表５に示すように、プライマーセットAを用いた場合、融合部位と複数の変異部位（少なくともY253H及びT315I）を一括して検査することができる。
【００６９】
【表５】
0006531312.tif 000006
【００７０】
〔実施例２−１〕プライマーセットの評価
本実施例では、プライマーセットA及びプライマーセットBについて、BCR-ABL融合遺伝子を有する検体１及びBCR-ABL融合遺伝子を有しない検体２をそれぞれ区別できるか検証した。実際に被験者からの生体試料についてBCR-ABL融合遺伝子における突然変異部位の遺伝子型を決定する場合、正常細胞由来のc-ABL遺伝子における同部位の遺伝子型も同時に検出する結果、BCR-ABL融合遺伝子における変異割合が低く見積もられる可能性がある。本実施例では、プライマーセットA及びプライマーセットBを用いた場合にこのような不都合が生じるか検証した。
【００７１】
本実施例では、検体１及び２を使用して、実施例１−１と同様にしてDNAチップから蛍光強度を測定した。その結果を表６に示す。下記表６に示すように、プライマーセットAを使用した場合には、BCR-ABL融合遺伝子を有している検体１では、蛍光シグナルが測定され、変異部位において野生型の識別ができた。一方、プライマーセットAを使用した場合、BCR-ABL融合遺伝子を有していない検体２では、蛍光シグナルが測定されず、BCR-ABL融合遺伝子由来の変異はないことがわかる。以上のように、プライマーセットAを使用した場合には、検体１と検体２をはっきりと区別できることが示された。
【００７２】
これに対し、プライマーセットBを使用した場合は、BCR-ABL融合遺伝子を有していない検体２においても、変異部位に蛍光シグナルが測定され、検体１と検体２を区別できなかった。
【００７３】
【表６】
0006531312.tif 000007
【００７４】
〔実施例２−２〕プライマーセットの評価
本実施例では、検体３及び検体４の混合総量を10ngとし、１００：０、５０：５０及び０：１００の割合で混合したものをそれぞれ鋳型として使用した。なお、PCR、DNAチップを用いたハイブリダイズ反応、その後の蛍光検出等は実施例１−１と同様に行った。
【００７５】
正常細胞由来のc-ABL遺伝子を含まない検体３及び４において、プライマーセットA及びプライマーセットBを用いた場合、それぞれにおいて蛍光強度を測定した結果を表７に示す。下記表７に示すように、プライマーセットA及びプライマーセットBを使用した場合の両方で、鋳型として混合した検体の混合割合と、シグナル強度に基づく変異割合との間に相関が得られた。
【００７６】
【表７】
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【００７７】
〔実施例２−３〕プライマーセットの評価
本実施例では、検体４を1ngと検体２を100ng加えたものを鋳型として使用した。なお、PCR、DNAチップを用いたハイブリダイズ反応、その後の蛍光検出等は実施例１−１と同様に行った。
【００７８】
正常細胞由来のc-ABL遺伝子を有する検体２を含む場合において、プライマーセットA及びプライマーセットBを用いた場合、それぞれにおいて蛍光強度を測定した結果を表８に示す。下記表８に示したように、プライマーセットAを使用した場合において、鋳型として使用したBCR-ABL融合遺伝子の変異割合（変異型100％）と検出したシグナル強度相関が得られた。これに対して、プライマーセットBを使用した場合は、鋳型として混合した変異割合と検出したシグナル強度が逆転しており、BCR-ABL融合遺伝子を持たない検体２の影響を大きく受けていることがわかった。これにより、プライマーセットAを用いた場合、正常細胞由来のc-ABL遺伝子の影響を受けず、変異部位の変異を正しく判定できることが明らかとなった。
【００７９】
【表８】
0006531312.tif 000009
【配列表】
0006531312000001.app