(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プトレシン生産能を有するテトラジェノコッカス属に属する微生物である、テトラジェノコッカス・ハロフィラス(Tetragenococcus halophilus) PAM-26株（寄託番号：NITE P-01873）、またはその継代株であって、継代株が下記の菌学的及び生理学的性質を有する上記微生物：
（Ａ）菌学的性質（６重量/容量％食塩含有加糖ブイヨン培地、初発ｐＨ７、30℃で5日間培養）
（ａ）形態的性質
(1)細胞の形及び大きさ：直径0.8〜1μmの2連または4連球菌
(2)細胞の多形性の有無：なし
(3)運動性の有無：なし
(4)胞子の有無：なし
(ｂ）培養的性質
(1)平板培養
コロニー形態
直径：0.5〜1.5mm
色調：白色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：スムーズ
表面の形状：スムーズ
光沢：なし
(2)液体培養：白濁
（Ｂ）生理学的性質
(1)グラム染色性：陽性
(2)MRテスト：陽性
(3) VP テスト：陰性
(4)インドールの生成：陰性
(5)硝酸塩の還元：陰性
(6)デンプンの加水分解：なし
(7)色素の生成：なし
(8)オキシダーゼ：陰性
(9)カタラーゼ：陰性
(10)グルコースからL-乳酸を生成する
(11)グルコースからのガス生産性：陰性
(12)オルニチン脱炭酸酵素を有する
(13)生育の範囲：
温度：１５℃〜４０℃条件下で増殖する、４５℃条件下で増殖しない
ｐＨ：ｐＨ５条件下で増殖しない、ｐＨ５.７〜９条件下で増殖する
NaCl：０％条件下で５日より遅れて増殖する、５〜２０重量/容量％条件下で増殖する
(14)酸素に対する態度
好気的増殖：陽性
嫌気的増殖：陽性
(15)O-Fテスト：F
(16)プトレシン産生能：陽性。
【請求項２】
請求項１に記載する微生物を、プトレシン生成基質を含有する培地にて培養し、プトレシンを含有する培養物を得る工程を有する、プトレシンの製造方法。
【請求項３】
プトレシン生成基質がオルニチンである、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
食塩含有発酵食品の原料混合物を、プトレシン生成基質の存在下、請求項１に記載する微生物を用いて発酵させる工程を有する、プトレシンを含有する食塩含有発酵食品の製造方法。
【請求項５】
食塩含有発酵食品が醤油、味噌、及び漬け物からなる群から選択されるいずれかである、請求項４に記載する製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載する微生物及び当該微生物に由来するプトレシンを含有する食塩含有発酵食品。
【請求項７】
醤油、味噌、及び漬け物からなる群から選択されるいずれかである、請求項６に記載する食塩含有発酵食品。
【請求項８】
食塩含有発酵食品がプトレシンを１０００ｍｇ／Ｌ以上含有する醤油である、請求項６または７に記載する食塩含有発酵食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プトレシン生産能を有する微生物およびそれを用いたプトレシンの製造方法に関する。また、本発明はプトレシンを含有する食塩含有発酵食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プトレシンは生体に含まれるポリアミンの一種である。その機能として、核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化、核酸合成系の促進作用、タンパク質合成系の活性化、ヒストンのアセチル化、非ヒストンクロマチン蛋白質のリン酸化の促進、細胞膜の安定化及び物質の透過性の強化、及び二価金属に影響を受ける酵素の活性化などの生理的作用、並びに油脂に対する抗酸化作用などが知られている。また、高ポリアミン食を与えたマウスは与えなかったマウスよりも著しく長生きをすることから、ポリアミンがアンチエージングファクターとして働くことが知られている（非特許文献１）。こうしたことから、近年、プトレシンは健康食品をはじめとする飲食品、化粧品、医薬品、及び医薬部外品に使用されつつある。
【０００３】
また、プトレシンは、従来よりプラスティック素材であるナイロン46の原料として用いられているが、その化学合成は、猛毒性のシアン化水素を使用することから環境負荷が大きく、製造コストも高いとされている。
【０００４】
一方、プトレシンの製造方法として、ポリアミンを多く含む魚類の白子、乳素材、酵母、または植物等からプトレシンを抽出し精製する方法；ポリアミンを生産する微生物は多く存在することから、微生物を用いてプトレシンを生産する方法も報告されている。具体的には、微生物として大腸菌（非特許文献２）、乳酸菌（非特許文献３）、腸内細菌科（エンテロバクター属（特許文献１）、シトロバクター属（特許文献２））に属する菌を用いてプトレシンを生産する方法が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ali,M.A.,et al.,Food and Nutrition Research,55,5572 (2011)
【非特許文献２】Donald T. Dubin et al., ”The Acetulation of Polyamines in Escherichia coli.”  The Journal of Biological Chemistry Vol. 235, No.3, March 1960
【非特許文献３】M.E. Arena, et al., Journal of Applied Microbiology 2001, 90(2), 158-162
【非特許文献４】Coton  M. etc: Food Microbiology, 27, 1078-1085 (2010)（Fig1参照）
【非特許文献５】浜名康栄: Microbiol. Cult. Coll., June, 17-43 (2002) 表3に記載
【非特許文献６】Okamoto A, et al., Biosci Biotechnol Biochem; 61: 1582_4. (1997)
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１９１８０８号公報
【特許文献２】特開２０１０−５７３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述するように、ポリアミンを生産する微生物は多く存在しており、さらに生産性の高い微生物の探索も行われているが、より生産効率のよい微生物が望まれている。一つの方法として、微生物を用いて高い食塩濃度下でプトレシンを生産することができれば、培養中に他の微生物が増殖する危険性が大幅に低下するため、簡易な培養方法で効率的かつ安価にプトレシンを製造することが可能になると考えられる。
【０００８】
こうした考えのもと、本発明は、食塩存在下、特に３％以上もの高濃度の食塩存在下でプトレシンを生産する能力を有する微生物（プトレシン生産耐塩性微生物）を提供すること、また当該微生物を用いてプトレシンを製造する方法を提供することを主な目的とする。また、本発明はプトレシンを含有する食塩含有食品、特に３％以上もの高濃度で食塩を含有する食品（高濃度食塩含有食品）、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
ちなみに、醤油乳酸菌として知られるテトラジェノコッカス属に属する微生物は高濃度の食塩の存在下で増殖することが知られているが、プトレシンを生産するという報告はされていない。また、プトレシンを生産するための酵素であるオルニチン脱炭酸酵素(ODC)の遺伝子は、テトラジェノコッカスから見出されていない（非特許文献４及び５）。また、醤油中には、プトレシンが多い場合に５００ｍｇ／Ｌ程度含まれているとの報告があるが(非特許文献６及び１)、それ以上含有している醤油は知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべき、鋭意検討を重ねた結果、耐塩性乳酸菌であるテトラジェノコッカスに属する微生物の中に、高い食塩濃度下でプトレシンを生産する能力を有する微生物（テトラジェノコッカス・ハロフィラス：Tetragenococcus halophilus）を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は下記の実施態様を有する。
【００１２】
（Ｉ）プトレシン生産能を有する微生物
（Ｉ−１）配列番号１に示す塩基配列と90％以上相同な16S rRNA遺伝子（16S rDNA）の塩基配列を有し、かつ、プトレシン生産能を有するテトラジェノコッカス属に属する微生物。
（Ｉ−２）上記テトラジェノコッカス属に属する微生物がテトラジェノコッカス・ハロフィラス(Tetragenococcus halophilus)である、（Ｉ−１）に記載する微生物。
【００１３】
（Ｉ−３）下記の菌学的及び生理学的性質を有する、（Ｉ−１）または（Ｉ−２）に記載する微生物：
（Ａ）菌学的性質（６重量/容量％食塩含有加糖ブイヨン培地、初発ｐＨ７、30℃で5日間培養）
（ａ）形態的性質
(1)細胞の形及び大きさ：直径0.8〜1μmの2連または4連球菌
(2)細胞の多形性の有無：なし
(3)運動性の有無：なし
(4)胞子の有無：なし
(ｂ）培養的性質
(1)平板培養
コロニー形態
直径：0.5〜1.5mm
色調：白色  
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：スムーズ
表面の形状：スムーズ
光沢：なし
(2)液体培養：白濁
（Ｂ）生理学的性質
(1)グラム染色性：陽性
(2)MRテスト：陽性
(3) VP テスト：陰性
(4)インドールの生成：陰性
(5)硝酸塩の還元：陰性
(6)デンプンの加水分解：なし
(7)色素の生成：なし
(8)オキシダーゼ：陰性
(9)カタラーゼ：陰性
(10)グルコースからL-乳酸を生成する
(11)グルコースからのガス生産性：陰性
(12)オルニチン脱炭酸酵素を有する
(13)生育の範囲：
温度：１５℃〜４０℃条件下で増殖する、４５℃条件下で増殖しない
pH：pH5条件下で増殖しない、pH5.7〜9条件下で増殖する
NaCl：0%条件下で5日より遅れて増殖する、5〜20重量/容量％条件下で増殖する
(14)酸素に対する態度
好気的増殖：陽性
嫌気的増殖：陽性
(15)O-Fテスト：F。
【００１４】
（Ｉ−４）上記（I−３）に記載の性質に加えて表1に記載する生理学的性質(糖の資化性)を有する、（Ｉ−１）または（Ｉ−３）に記載する微生物：
【００１５】
【表１】
0006479396.tif 000002
【００１６】
（Ｉ−５）上記テトラジェノコッカス属に属する微生物がテトラジェノコッカス・ハロフィラス(Tetragenococcus halophilus) PAM-26株（寄託番号：NITE P-01873）、またはその継代株である、（Ｉ−１）〜（Ｉ−４）のいずれかに記載する微生物。
【００１７】
（II）プトレシンの製造方法
（II−１）（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）のいずれかに記載する微生物を、プトレシン生成基質を含有する培地にて培養し、プトレシンを含有する培養物を得る工程を有する、プトレシンの製造方法。
（II−２）（II−１）記載の製造方法で得られる培養物からプトレシンを採取する工程を有する、プトレシンの製造方法。
（II−３）プトレシン生成基質がオルニチンである、（II−１）または（II−２）記載の製造方法。
（II−４）培地の食塩濃度が、３〜２０重量/容量％であることを特徴とする（II−１）〜（II−３）のいずれかに記載する製造方法。
【００１８】
（III）プトレシンを含有する食塩含有発酵食品の製造方法
（III−１）食塩含有発酵食品の原料混合物を、プトレシン生成基質の存在下、（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）のいずれかに記載する微生物を用いて発酵させる工程を有する、プトレシンを含有する食塩含有発酵食品の製造方法。
（III−２）食塩含有発酵食品の原料混合物の食塩濃度が３〜２０重量/容量％(または重量/重量%)である、（III−１）に記載する製造方法。
（III−３）高塩分発酵食品が醤油、味噌、及び漬け物からなる群から選択されるいずれかである、（III−１）または（III−２）に記載する製造方法。
【００１９】
（IV）プトレシンを含有する食塩含有発酵食品
（IV−１）（Ｉ−１）〜（Ｉ−５）のいずれかに記載する微生物を用いて製造される、当該微生物及びプトレシンを含有する食塩含有発酵食品。
（IV−２）食塩濃度が３〜２０重量/容量％(または重量/重量%)である（IV−１）に記載する食塩含有発酵食品。
（IV−３）醤油、味噌、及び漬け物からなる群から選択されるいずれかである（IV−１）または（IV−２）に記載する食塩含有発酵食品。
（IV−４）食塩含有発酵食品がプトレシンを１０００ｍｇ／Ｌ以上含有する醤油である（IV−１）〜（IV−３）のいずれかに記載する食塩含有発酵食品。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、食塩含有培地中でプトレシンを生産する能力を有する新規微生物である耐塩性乳酸菌を提供することができる。当該微生物を利用することで、発酵工程によりプトレシンを製造することができる。また当該微生物は耐塩性であるため、食塩濃度を高めた培地を用いて培養することで、他の微生物による汚染を抑制することができるので、簡易な設備で効率よく、且つ安価に目的のプトレシンを製造することができる。
【００２１】
また、本発明の微生物（耐塩性乳酸菌）によれば、３％以上の食塩の存在下でもプトレシンを産生し、発酵食品を製造することができるため、例えば、醤油、味噌及び漬け物など、食塩を比較的高濃度含む発酵食品（高濃度食塩含有発酵食品）についても、プトレシン含有発酵食品として提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の微生物（PAM-26株）を３〜２０重量/容量％の食塩（NaCl）存在下で培養したときのプトレシンの生産量を経時的に測定した結果を示す（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｉ．プトレシン生産能を有する微生物
本発明の微生物は、テトラジェノコッカス属に属する乳酸菌であって、耐塩性及びプトレシン生産能を有することを特徴とする。
【００２４】
具体的には、当該微生物は、配列番号1に示す塩基配列と９０％以上相同な16Sr DNAの塩基配列を有し、かつ、オルニチンからプトレシンを生産する能力を有する微生物である。好ましくは、配列番号1に示す塩基配列と９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上が相同な16S rRNA遺伝子を有する微生物である。
【００２５】
ここで「相同」とは、配列番号1に示す塩基配列に対する同一性を意味する。一般に同一性（％）は、比較する２つの分子（基準配列を有するオリゴヌクレオチドと基準配列に対する同一性が未知である配列を有するオリゴヌクレオチド）間の配列を並べて比較する工程、２つの分子の配列間の適合数を計数する工程、基準配列の長さで除算する工程、及びこの結果に１００を掛ける工程によって決定することができる。簡便には、当該塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるmBLASTアルゴリズム(Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。なお、BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムも開発されている（Altschul, SF., et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www. ncbi. nlm. Nih. gov/）。
【００２６】
当該微生物として、好ましくはテトラジェノコッカス・ハロフィラス(Tetragenococcus halophilus)を挙げることができる。配列番号1で示される塩基配列を、BLASTを用いてGenBankデータベース（Non-reducdant nucleotide database）に対して相同性検索すると、その９９％がテトラジェノコッカス・ハロフィラスの16SγDNAの塩基配列と一致する（99％の相同）。
【００２７】
さらに本発明の微生物は、好ましくは下記の菌学的及び生理学的性質を有する。
（Ａ）菌学的性質（６重量/容量％食塩含有加糖ブイヨン培地、初発ｐＨ７、30℃で5日間培養）
（ａ）形態的性質
(1)細胞の形及び大きさ：直径0.8〜1μmの2連または4連球菌
(2)細胞の多形性の有無：なし
(3)運動性の有無：なし
(4)胞子の有無：なし
(ｂ）培養的性質
(1)平板培養
コロニー形態
直径：0.5〜1.5mm
色調：白色  
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：スムーズ
表面の形状：スムーズ
光沢：なし
(2)液体培養：白濁
（Ｂ）生理学的性質
(1)グラム染色性：陽性
(2)MRテスト：陽性
(3) VP テスト：陰性
(4)インドールの生成：陰性
(5)硝酸塩の還元：陰性
(6)デンプンの加水分解：なし
(7)色素の生成：なし
(8)オキシダーゼ：陰性
(9)カタラーゼ：陰性
(10)グルコースからL-乳酸を生成する
(11)グルコースからガスを生成しない
(12)オルニチン脱炭酸酵素を有する
(13)生育の範囲：
温度：１５℃〜４０℃で増殖する、４５℃で増殖しない
ｐＨ：ｐＨ５で増殖しない、ｐＨ５.７〜９で増殖する
NaCl：０％で５日より遅れて増殖する、５〜２０重量/容量％で増殖する
(14)酸素に対する態度
好気的増殖：陽性
嫌気的増殖：陽性
(15)O-Fテスト：F
(16)糖の資化性
【００２８】
【表２】
0006479396.tif 000003
【００２９】
以上の耐塩性、プトレシン生産能、並びに菌学的及び生理学的性質を有するテトラジェノコッカス・ハロフィラスとして、好ましくはPAM-26株を挙げることができる。当該PAM-26株は、本出願人（ヒガシマル醤油株式会社）が保存していた菌株の中に含まれていた微生物であり、2014年6月30日付で、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに「受託番号：NITE P-01873」として国内寄託されている。
【００３０】
なお、本発明の微生物には、上記PAM-26株の他、前述するように、配列番号1に示す塩基配列と９０％以上相同な塩基配列を有する16S rRNA遺伝子（16S rDNA）を有し、かつ、前述する耐塩性及びプトレシン生産能を有する限り、PAM-26株の類縁微生物も含まれる。当該類縁微生物には、上記するPAM-26株の菌学的及び生理学的性質と同一または同等の性質を有する微生物も含まれる。PAM-26株の類縁微生物は、配列番号1記載の塩基配列（16S rDNA配列）、プトレシン生産能、及び耐塩性を指標にして単離することができる。例えば、被験サンプルを、オルニチンを含む、好ましくは食塩濃度が６〜１５重量/容量％の培地に添加して培養し、培養液をHPLC分析し、プトレシンの高生産が認められたサンプルを選抜する（一次スクリーニング）。次に、選抜した被験サンプルの培養液を食塩濃度が６〜１５重量/容量％のプレート上で培養し、コロニーを形成させて微生物を単離し、次いで単離した微生物を培養し、HPLC分析し、プトレシン高生産が認められた微生物を選抜する（二次スクリーニング）。得られた微生物菌株の16SγDNAの塩基配列について、BLASTの塩基配列データベースに対して相同性検索を行い、配列番号１に示す塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の16S rDNA を有する微生物を選抜する。
【００３１】
本発明の微生物は、テトラジェノコッカス属に属する公知の微生物、好ましくは耐塩性の乳酸菌であるテトラジェノコッカス・ハロフィラスの培養に使用される方法と同様の方法によって培養（生育、増殖）することができる。
【００３２】
培地としては、テトラジェノコッカス属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類などの必要な栄養源を含有する培地を挙げることができる。この限りにおいて、培地は特に制限されず、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。培地に使用する炭素源としては、テトラジェノコッカス属に属する微生物が資化し得るものであればよく、好適にはグルコース、フラクトース、マルトース、等の炭水化物が用いられる。窒素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、好適にはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、等の含窒素化合物が用いられる。簡便には、市販されている乳酸菌用培地を使用することができるが、これに食塩を加えれば好適な培地として利用できる。一般細菌用の培地も使用することができるが、好ましくは、これにグルコース等の炭素源及び食塩を追加するのがよい。さらに望ましくは、培地に醤油麹の抽出液を添加すると増殖を促進することができ、また醤油麹の抽出液を主体とした培地を使用することもできる。培地の食塩濃度は５〜１５％が好ましく、より好ましくは１０〜１５％である。
【００３３】
培養温度は、本発明の微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定すればよく、例えば２０℃〜４０℃の範囲を挙げることができ、好ましくは２５〜３０℃程度である。培養時間は、通常、３〜６日程度である。また、培養期間中、培地のｐＨは６〜７程度に保持していることが好ましい。培地のｐＨの調整は、無機酸若しくは有機酸の水溶液、またはアルカリ水溶液等を用いて行うことができる。
【００３４】
（II）プトレシンの製造方法
前述する本発明の微生物を用いることでプトレシンを製造することができる。当該本発明のプトレシン製造方法は、上記本発明の微生物をプトレシン生成基質を含有する培地で培養することを特徴とする。具体的には、本発明のプトレシン製造方法は、上記微生物をプトレシン生成基質を含有する培地にて培養する工程、及び当該培養物からプトレシンを採取する工程を有する。
【００３５】
(II-1) 培養工程
培養に使用する培地としては、テトラジェノコッカス属に属する微生物が資化可能な炭素源、窒素源、または無機塩類などの必要な栄養源に加えて、プトレシン生成基質、及び塩化ナトリウム（食塩）を含有する培地を挙げることができる。ここでプトレシン生成基質としては、好ましくはオル二チンを挙げることができる。この限りにおいて、培地は、特に制限されず、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３６】
培地に含まれるプトレシン生成基質の濃度としては、特に制限されないものの、通常０．０１〜５重量/容量％、好ましくは０.２〜２重量/容量％程度を挙げることができる。また培地中の食塩濃度は、本発明の微生物が増殖し得る範囲であればよく、特に制限されないものの、５〜２０重量/容量％程度の範囲を挙げることができる。５重量/容量％以上であれば、耐熱性細菌の増殖が抑制され、さらに１５重量/容量％以上であれば増殖可能な微生物が大幅に限定される。従って、食塩濃度として、好ましくは５〜２０重量/容量％の範囲であり、かかる範囲のなかで１０〜２０重量/容量％、１５〜２０重量/容量％など、適宜濃度を設定することができる。
【００３７】
また培地に配合する炭素源、窒素源及び無機塩類などについては（I）で前述した通りである。培地のｐＨは特に制限されないものの、通常ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ６〜７の範囲を挙げることができる。なお、培地や培養装置は１００℃以下の低温で殺菌して利用することができる。
【００３８】
培養温度は、本発明の微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定すればよく、例えば２０℃〜４０℃の範囲を挙げることができ、好ましくは２５〜３０℃程度である。培養時間は、制限はされないものの、例えば３〜６日程度を挙げることができる。しかし培地中にプトレシンを高生産させるために、半年間以上培養(醸造)することもできる。
【００３９】
なお、培養に際して、酸素は特に遮断する必要も供給する必要もない。このため、培養器を簡易の蓋で覆うことによって、プトレシンの生産が可能である。なお、培養中に緩やかな撹拌を行うことによって、菌体の沈降を抑制することが生産性向上につながる。
【００４０】
培養は、本発明の微生物を固定化して行うこともできる。固定化方法としては、公知の技術である担体結合法、架橋化法、包括法などがあげられる。
【００４１】
(II-2) プトレシン採取工程
上記する培養工程によって、培養液中に蓄積されたプトレシンは、常法により培養液から採取することができる。また、必要に応じて、さらに精製することもできる。精製方法としては、通常利用されている手段、例えば、濾過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどの操作を、必要に応じて適宜組み合わせて行えばよい。
【００４２】
（III）プトレシンを含有する食塩含有発酵食品、及びその製造方法
本発明が対象とする食品は、プトレシンを含有する食塩含有発酵食品である。
【００４３】
ここで食塩含有発酵食品は、食塩を含有する発酵食品であればよいが、好ましくは食塩濃度が３〜２０％である発酵食品である。かかる範囲で食塩を含有する発酵食品としては、醤油、味噌、漬け物を挙げることができる。好ましくは醤油及び味噌、特に好ましくは醤油である。
【００４４】
なお、醤油には、濃口醤油、淡口醤油、溜醤油、再仕込醤油、白醤油、生揚醤油、減塩醤油、及び粉末醤油があるが、これらはいずれも本発明の醤油に含まれる。また味噌には、使用する原料に応じて、米味噌、麦味噌、豆味噌、及び合わせ味噌があるが、これらはいずれも本発明の味噌に含まれる。また本発明が対象とする漬け物には、、すぐき漬、白菜キムチ、サワークラウト等の乳酸発酵を利用した漬け物を挙げることができる。
【００４５】
これら本発明の発酵食品は、プトレシンを含有することを特徴とする。プトレシンの含有量は、発酵食品によって異なるものの、醤油、漬け物で５００ｍｇ／Ｌ（ｍｇ／Ｋｇ）以上、好ましくは６００ｍｇ／Ｌ以上を、味噌で２００ｍｇ／Kg以上を挙げることができる。なかでも醤油はプトレシンを１０００ｍｇ／Ｌ以上の割合で含むものであることが好ましい。
【００４６】
このようなプトレシンを含有する食塩含有発酵食品は、食塩含有発酵食品の原料混合物を、プトレシン生成基質の存在下、前述する本発明の微生物を用いて発酵させる工程を有する方法で製造することができる。
【００４７】
食塩含有発酵食品の原料混合物中の食塩濃度は、食塩含有発酵食品の種類に応じて、３〜２５％の範囲になるように調整する。例えば食塩含有発酵食品が醤油である場合は、１５〜２５重量/容量％の範囲、味噌である場合は１０〜１５重量/重量％の範囲、漬け物である場合は、３〜１０重量/重量％の範囲を挙げることができるが、これらに制限されることはない。
【００４８】
なお、プトレシン生成基質は前述する通りであり、好ましくはオルニチンである。食塩含有発酵食品の原料混合物に配合するプトレシン生成基質の濃度としては、特に制限されないものの、通常０．０１〜２重量/容量％(または重量/重量％)、好ましくは０.２〜１重量/容量％(または重量/重量％)程度を挙げることができる。
【００４９】
以下に、例示として食塩含有発酵食品が醤油、味噌、及び漬け物であるそれぞれ場合について、その製造方法を簡単に説明する。
【００５０】
（III-1）醤油の製造方法
本発明の醤油は、醤油を製造するための原料混合物（醤油仕込）に、プトレシン生成基質を配合し、これを前述する本発明の微生物を用いて発酵、熟成させる工程を有する方法で製造することができる。この醤油仕込の食塩濃度は、醤油の種類によっても異なるが、通常１５〜２５重量/容量％の範囲である。プトレシン生成基質の含有量は、前述する通りである。これを１５℃〜３０℃で数ヶ月かけて発酵熟成する。発酵熟成工程により得られた醤油諸味は、ナイロン製濾布などを用いて圧搾し、得られた圧搾液は油分分離後、規格調製、火入れ、及びオリ引き等をして醤油として調製される。
【００５１】
（III-2）味噌の製造方法
本発明の味噌は、味噌を製造するための原料混合物（味噌仕込）に、プトレシン生成基質を配合し、これを前述する本発明の微生物を用いて発酵させる工程を有する方法で製造することができる。この味噌仕込の食塩濃度は、味噌の種類によっても異なるが、通常１０〜１５重量/重量％の範囲である。プトレシン生成基質の含有量は、前述する通りである。これを２５〜３０℃程度で１〜１２ヶ月間保持して発酵熟成させる。発酵途中、１〜２回味噌を掘り起こして味噌を均一化することが好ましい（切り返し）。発酵熟成が完了した味噌は、掘り起こし、必要に応じて品質調整のため、２種以上をブレンドし、そのまま粒味噌として製品化するか、またはチョッパーで漉して漉味噌として製品化する。
【００５２】
（III-3）漬け物の製造方法
本発明の漬け物は、漬け物原料（例えばぬか漬けの場合、米ぬか、野菜及び調味料の混合物）に、プトレシン生成基質を配合し、これを前述する本発明の微生物を用いて発酵させる工程を有する方法で製造することができる。この漬け物原料の食塩濃度は、漬け物の種類や嗜好によっても異なるが、通常３〜１０重量/重量％の範囲である。プトレシン生成基質の含有量は、前述する通りである。これを１０〜３０℃程度で５〜３０日間保持して発酵させて、漬け物とする。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５４】
実施例１
1)  微生物の取得
各種市販のぬか漬けや醤油諸味並びに本出願人が保有する醤油諸味等の高濃度食塩含有食品から採取した菌株の中からプトレシンを高生産する菌株をスクリーニングした。
【００５５】
具体的には、まず、各種の高濃度食塩含有食品から採取した菌株(出願人保存菌株を含む)を、それぞれ表３に記載する組成からなる滅菌培地（食塩濃度：１０重量/容量％、ｐＨ６.５に調整）に接種し、３０℃で１週間培養した。なお、表３中、醤油麹抽出液は、醤油麹１ｋｇに２０重量/容量％の食塩水１.５Ｌを加えて室温に置き、３週間後に濾過して調製したものである。
【００５６】
【表３】
0006479396.tif 000004
【００５７】
培養後、各培養液に含まれるプトレシンの量を下記条件のＨＰＬＣにより定量分析した。なお、分析に使用する試料は、培養液を０.１Ｎ塩酸で１００倍希釈し、０.４５μｍフィルターでろ過して調製した。
【００５８】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム：Shodex Asahipak ODP-50 4D (4.6mm×150mm)
移動相：50mM ホウ酸塩緩衝液（pH9.9）：アセトニトリル（2mM  o-フタルアルデヒドおよび2mM  N-アセチル-L-システインを含む）＝７７：２３（容量比）
カラム温度：４０℃
流速：０.５ml/min
検出器：蛍光検出器（励起波長330nm、蛍光波長430nm）。
【００５９】
各培養液中のプトレシン濃度は、プトレシンを０〜２５ｍｇ／Ｌの範囲で含む０.１Ｎ塩酸溶液を用いて作成した標準検量線から算出した。測定値が検量線の上限を超えるときは、さらに０．１N塩酸で希釈した。
【００６０】
その結果、出願人が保存していた菌株の中から、プトレシン生産能を有する耐塩性の菌株を見出し、これをPAM-26と命名した。当該PAM-26株は、2014年6月30日に、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室に住所を有する独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに「受託番号：NITE P-01873」として国内寄託されている。
【００６１】
2)  PAM-26株の同定
PAM-26株の16S リボソームRNA（rRNA）遺伝子（16S rDNA）の塩基配列を決定し、相同性検索を行った。具体的には、PAM-26株を滅菌した加糖ブイヨン培地（表４）（食塩濃度：10％、オルニチン塩酸塩0.5%、 pH6.5に調整）に植菌し、３０℃で５日間培養し、次いで遠心分離により菌体を回収し、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAの抽出にはMarmur法を使用した。抽出したゲノムDNAを鋳型として、日本薬局方記載の方法に準じたPCRにより16S rRNA遺伝子（16S rDNA）のうち5’末端側500bpの領域を増幅した。その後、増幅した塩基配列をDNAシークエンサー（ABI3730xl：アプライドバイオシステム社製）を用いてシークエンスし、PAM-26株の16S rDNAの塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示す。
【００６２】
得られた16S rDNAの塩基配列を、BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて、GenBankデータベース（Non-redundant nucleotide database）に対して相同性検索したところ、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Tetragenococcus halophilus）種の16S rDNAの塩基配列と９９％の相同性を示した。このことから、PAM-26株は、テトラジェノコッカス属ハロフィラスに属する耐塩性乳酸菌であることが判明した。
【００６３】
【表４】
0006479396.tif 000005
【００６４】
3)  PAM-26株の菌学的及び生理・生化学的性質
PAM-26の菌学的性質および生理学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,Volume2,Williams & Wilkins, 1986）にほぼ従って行った。培地は菌学的性質および生理学的性質試験において特に指定がない場合は、加糖ブイヨン培地(表４)を基本として用いた。各試験に於いて特記しない限り、培地の食塩濃度は6重量/容量％、初発ｐH7、培養温度は30℃、培養期間は5日間とした。その結果得られた菌学的性質及び生理・生化学的性質は下記の通りであり、テトラジェノコッカス・ハロフィラスと一致する。
【００６５】
（Ａ）菌学的性質
（ａ）形態的性質
(1)細胞の形及び大きさ：直径0.8〜1μmの2連または4連球菌
(2)細胞の多形性の有無：なし
(3)運動性の有無：なし
(4)胞子の有無：なし。
【００６６】
(ｂ）培養的性質
(1)平板培養
コロニー形態
直径：0.5〜1.5mm
色調：白色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：スムーズ
表面の形状：スムーズ
光沢：なし
(2)液体培養：白濁
（Ｂ）生理学的性質
(1)グラム染色性：陽性
(2)MRテスト：陽性
(3) VP テスト：陰性
(4)インドールの生成：陰性
(5)硝酸塩の還元：陰性
(6)デンプンの加水分解：なし
(7)色素の生成：なし
(8)オキシダーゼ：陰性
(9)カタラーゼ：陰性
(10)グルコースからL-乳酸を生成する
(11)グルコースからガスを生成しない
(12)オルニチン脱炭酸酵素を有する
(13)生育の範囲：
温度：１５℃〜４０℃条件下で増殖する、４５℃条件下で増殖しない
pH：pH5条件下で増殖しない、pH5.7〜9条件下で増殖する
NaCl：0%条件下で5日より遅れて増殖する、5〜20重量/容量％条件下で増殖する
(14)酸素に対する態度
好気的増殖：陽性
嫌気的増殖：陽性
(15)O-Fテスト：F。
【００６７】
(Ｃ)生理学的性質（糖の資化性）
糖の資化性はAPI API50CHL（シスメックス・ビオメリュー株式会社）を用いて行った。培地には食塩を6重量/容量％になるように追加して用いた。
【００６８】
表５に結果を示した。3日後および7日後に観察し、3日後に陽性の場合「＋」、7日後に陽性になった場合に「＋s」と表示した。なお、いずれの糖からもガス産生はなかった。この結果は、テトラジェノコッカス・ハロフィラスと矛盾しない。
【００６９】
【表５】
0006479396.tif 000006
【００７０】
実施例２  PAM-26株を用いたプトレシンの製造
食塩濃度を３重量/容量％、６重量/容量％、１０重量/容量％、１５重量/容量％及び２０重量/容量％の５種に調製した表３記載の培地のそれぞれにPAM-26株を接種して、３０℃で３０日間培養した。培養期間中、経時的にサンプリングして培養液中に含まれるプトレシン濃度を測定した。また対照として、出願人が乳酸発酵スターターとして用いているテトラジェノコッカス属ハロフィラスに属する乳酸菌株３種を、上記と同条件で培養し、培養液中のプトレシン濃度を測定した。
【００７１】
PAM-26株培養による培養液中のプトレシン濃度の経時的変化を図１に示す。図１に示すように、PAM-26株はいずれの食塩濃度でもプトレシンを生産することが確認された。特に食塩濃度６〜１５重量/容量％での成績がよかった。一方、対照として用いた他のテトラジェノコッカス培養による培養液（食塩濃度３〜２０重量/容量％）中のプトレシン濃度は、いずれも検出レベル以下(20ppm)であり、プトレシン産生能は認められなかった。
【００７２】
実施例３  プトレシンを含む醤油の製造
出願人の工場に於いて通常通り製造された脱脂加工大豆と小麦を等量とアスペルギルス・オリゼーを使用した醤油麹と、本発明の乳酸菌を用いて、プトレシンを含む醤油を製造した。
【００７３】
すなわち、醤油麹1.8kgと食塩水(食塩濃度22.5%)3Lとオルニチン塩酸塩19gを5L容のガラス容器に仕込んだ。仕込室の温度は、15℃で2週間、25℃で4週間、30℃で2週間、その後25℃で保持した。仕込後1週間後に、醤油麹抽出液を培地としてあらかじめ培養した乳酸菌PAM26株を105個/mlになるように添加した。また、仕込後6週間後に酵母を105個/mlになるように添加した。対照区として、乳酸菌PAM26株に変えて、出願人が乳酸発酵スターターとして用いているテトラジェノコッカス・ハロフィラスH10株を添加して同様の醤油醸造を行った。仕込期間中、概ね2週間に1回程度の撹拌を行い、仕込後20週間後に圧搾、濾過して生揚げ醤油を得て、これを分析した。
【００７４】
この醤油の一般成分は表６に示す通りであり、試験区と対照区に差はなく、また風味は良好であった。
【００７５】
乳殺菌PAM26株を用いた試験区のプトレシンは1,550ppm、その他のアミン類である、ヒスタミン、チラミン、スペルミジン、スペルミンはいずれも20ppm未満であった。通常の乳酸菌を用いた対照区のプトレシンは20ppm未満であった。
【００７６】
【表６】
0006479396.tif 000007
【００７７】
実施例４  基質量とプトレシン生産量
基質であるオルニチンの添加量とプトレシン生産量の関係を見た。食塩濃度１０重量/容量％に調整した表３の培地に、オルニチン塩酸塩を追加して、オルニチン塩酸塩０．５、１．０、２．０重量/容量％の培地（ｐH7）を調製した。これを９５℃の湯浴で１０分間加熱後冷却して、それぞれに，PAM26株を105/ｍｌになるように接種し、30℃で5日間または15日間培養後、遠心分離してプトレシン含有培養物を得た。
【００７８】
表７に示した結果のように、基質の添加量と正比例してプトレシン生産量は増加した。オルニチンのプトレシンへの変換率はおよそ７５％で一定していた。
【００７９】
【表７】
0006479396.tif 000008
【受託番号】
【００８０】
NITE P-01873
【図１】
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【配列表】
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