(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の検出方法であって、
被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１１０塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、
前記増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
【請求項２】
前記第一工程において用いるプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第二のプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のプライマーが配列番号４から８に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含み、前記第二のプライマーが配列番号９又は１０に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第二工程において、配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブを用いて、前記増幅産物を検出する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の検出に用いられるキットであって、
配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第一のプライマー及び配列番号３に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第二のプライマーと、
配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブと、を含み、
前記第一のプライマー及び第二のプライマーは、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１１０塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能である、
キット。
【請求項６】
ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の検出に用いられるキットであって、
配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第一のプライマー及び配列番号３に記載の塩基配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第二のプライマーと、
配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブと、を含むキット。
【請求項７】
前記第一のプライマーが配列番号４から８に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含み、前記第二のプライマーが配列番号９又は１０に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、請求項５又は６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
硝化細菌としては、アンモニアを亜硝酸に酸化するアンモニア酸化細菌（亜硝酸菌）及び亜硝酸を硝酸に酸化する亜硝酸酸化細菌（硝酸菌）が知られている。これらの硝化細菌は自然界における窒素循環反応を担っている。一方産業上では、硝化細菌は例えば活性汚泥法に代表される排水の生物処理プロセスにおける窒素除去において重要な役割を担っており、窒素塩の流出による自然水域の富栄養化の防止に関与している。
【０００３】
排水処理に用いられる活性汚泥には様々な種類の微生物が含まれており、その中でも、ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌は窒素除去において重要な役割を果たしている亜硝酸酸化細菌の一種である。このとき、排水中の窒素の量及び排水処理に要求される処理スピードに応じて、活性汚泥中のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の量をモニタリングし、調節することが望まれている。そのためには、複数の微生物種が存在する活性汚泥からＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のみを迅速に検出及び定量することが課題となる。
【０００４】
非特許文献１及び２には、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出のための所定のプライマー及び蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄａｖｉｄ  Ｗ  Ｇｒａｈａｍら、Ｔｈｅ  ＩＳＭＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｖｏｌ．１（２００７），ｐ３８５−３９３
【非特許文献２】Ｊｏｋｅ  Ｇｅｅｋｓら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ｖｏｌ．７５（２００７），ｐ２１１−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、本発明者らが非特許文献１及び２に記載のプライマー及び蛍光標識プローブを用いて、活性汚泥からＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出を試みたところ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌以外の細菌を検出してしまうか、又は、一部のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出できない、といった問題が生じた。このような問題が生じると、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の定量性にも影響が生じ、排水中の窒素除去反応を制御することが難しくなる。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑み、複数の微生物種が存在する系においてもＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出し、定量することができるＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、活性汚泥に存在するＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１８）をクローニングし、特定の領域が、複数の微生物種が存在する系におけるＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の特異的検出及び定量に有用であることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］から［６］に関する。
［１］ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の検出方法であって、被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１１０塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
［２］第一工程において用いるプライマーが、配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号３に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第二のプライマーである、［１］に記載の方法。
［３］第一のプライマーが配列番号４から８に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含み、第二のプライマーが配列番号９又は１０に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、［２］に記載の方法。
［４］第二工程において、配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブを用いて、増幅産物を検出する、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］ニトロバクター（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌の検出に用いられるキットであって、配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第一のプライマー及び配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第二のプライマーと、配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブと、を含むキット。
［６］第一のプライマーが配列番号４から８に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含み、第二のプライマーが配列番号９又は１０に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、［５］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、複数の微生物種が存在する系においてもＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出し、定量することができるＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することが可能になる。これにより、例えば、排水処理において、活性汚泥中のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出量に基づき、排水中の窒素除去反応を制御することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
＜Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法＞
本実施形態のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出方法は、被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１１０塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する。
【００１３】
本実施形態に係る被検ＤＮＡとしては、例えば、プラスミド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、活性汚泥から調製したＤＮＡが挙げられる。これらの被検ＤＮＡは、複数種類の微生物種由来のＤＮＡを含むものであってもよい。これらの被検ＤＮＡの調製方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。被検ＤＮＡとしては、排水中の窒素除去反応を制御する観点から、活性汚泥から調製したＤＮＡが好ましい。活性汚泥からＤＮＡを調製する方法としては、例えば、市販されているＤＮＡ抽出キット等を用いることができる。
【００１４】
［第一工程］
配列番号１は、配列番号１８の９０１番目から１０５７番目の塩基配列を示す。配列番号１８は、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子には、遺伝子上に種間に共通な配列を含む保存領域、及び種・属等によって異なる配列を含む９つの可変領域（Ｖ１からＶ９）が存在する。配列番号１８中、７４７番目から７７４番目の塩基配列がＶ５領域であり、９２０番目から９６６番目の塩基配列がＶ６領域であり、１０３８番目から１０７４番目の塩基配列がＶ７領域である。
【００１５】
配列番号１に記載の塩基配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ６及びＶ７領域を含む領域である。本実施形態に係る第一工程において、増幅産物は、配列番号１の塩基配列内の連続した１１０塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製される。増幅産物は、連続した１２０塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよく、連続した１２５塩基以上１５７塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよい。このようなプライマーにより増幅して調製される増幅産物であれば、配列番号１に記載の塩基配列の対応領域に対して、１個から２個の相違するヌクレオチドを有する塩基配列であってもよく、同一のヌクレオチドを有する塩基配列であってもよい。上記増幅産物を用いることで、続く第二工程において、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出することができる。
【００１６】
第一工程において、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法が挙げられる。これらの方法の中でも、増幅と同時に、第二工程における検出を行えること、及び、増幅産物の定量を行えることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００１７】
増幅産物を得るために用いるプライマーは、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ６領域からＶ７領域までの一部を含む領域（配列番号１８の９０１番目から１０５７番目の塩基配列領域）を増幅できるように設計することができる。プライマーとしては、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー（フォワードプライマー）及びセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー（リバースプライマー）がある。
【００１８】
第一のプライマーとしては、配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが好ましい。プライマーの長さは、より十分な特異性を得る観点から、１８塩基以上が好ましい。プライマーの長さの上限としては、よりアニーリング効率を高める観点から、２８塩基以下が好ましく、２７塩基以下がより好ましく、２５塩基以下が更に好ましい。第一のプライマーとして、具体的には、配列番号４から８に記載の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。
配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーとしては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が２である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が１である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、配列番号２に記載の塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
【００１９】
第二のプライマーとしては、配列番号３に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが好ましい。プライマーの長さは、より十分な特異性を得る観点から、１８塩基以上が好ましく、１９塩基以上がより好ましく、２０塩基以上が更に好ましい。プライマーの長さの上限としては、よりアニーリング効率を高める観点から、２８塩基以下が好ましく、２７塩基以下がより好ましく、２５塩基以下が更に好ましい。第二のプライマーとして、具体的には、配列番号９又は１０に記載の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。
配列番号３に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーとしては、例えば、配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が２である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が１である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、配列番号３に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
【００２０】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を含むヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、及びＤＮＡ濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むプライマー」としては、例えば、目的とするヌクレオチドと高イオン濃度下［例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズすることにより、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、低イオン濃度下［例えば、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に６５℃の温度条件で３０分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるプライマーをあげることができる。
【００２１】
［第二工程］
第二工程において、増幅産物を検出する方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。増幅産物を検出する方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法、シークエンス解析法、サザンブロッティング法が挙げられる。これらの方法の中でも、特異性に優れるという観点から、プローブを用いる検出方法が好ましい。プローブを用いる検出方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法又はサザンブロッティング法が挙げられ、中でも、第一工程の増幅が同時に行え、且つ、特異的に検出でき、定量性にも優れるという観点から、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２２】
検出に用いられるプローブは、第一工程で得られた増幅産物のセンス鎖又はアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好ましい。プローブの長さとしては、より特異的に増幅産物を検出する観点から、１５塩基以上３０塩基以下が好ましく、１５塩基以上２５塩基以下がより好ましく、１５塩基以上２０塩基以下が更に好ましい。プローブとして、具体的には、配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブが挙げられる。
【００２３】
上記プローブをリアルタイムＰＣＲ法に用いる場合、プローブは、５’末端を蛍光物質で、３’末端を蛍光物質が発する蛍光を抑制するためのクエンチャーで、それぞれ修飾される。蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙａｎｉｎｅ５が挙げられる。クエンチャーとしては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３が挙げられる。プローブの修飾に用いられる蛍光物質及びクエンチャーは、使用するリアルタイムＰＣＲ装置の励起波長及び測定波長に合わせて、適宜選択することができる。
【００２４】
リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるサーマルサイクラーと、増幅産物を検出するための分光蛍光光度計と、を備えていれば、特に制限されるものではない。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）が挙げられる。
【００２５】
第二工程で検出した増幅サンプルは定量することもできる。そのため、本実施形態の検出方法は、被検ＤＮＡからＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出するだけでなく、被検ＤＮＡに含まれるＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の量を定量することもできる。例えば、第二工程で増幅産物の検出にリアルタイムＰＣＲを用いた場合、スタンダードサンプルを用いて得られる検量線から、被検ＤＮＡの量を定量することができる。検量線は、増幅産物がある一定値に達した時のサイクル数を示すＣｔ値及び初期鋳型量に基づき、作成することができる。
【００２６】
本実施形態の検出方法において、第一工程で被検ＤＮＡから増幅産物が得られ、第二工程でその増幅産物を検出することができた場合、その被検ＤＮＡには、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来のＤＮＡが含まれると判定することができる。
【００２７】
＜Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌のキット＞
本実施形態のＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出に用いられるキットは、配列番号２に記載の塩基配列に対して相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第一のプライマー及び配列番号３に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする１８塩基以上の塩基配列を含む第二のプライマーと、配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブと、を含む。
【００２８】
第一のプライマー、第二のプライマー及びプローブは、上述した検出方法で用いたものと同様のものを用いることができる。
【００２９】
本実施形態のキットには、第一のプライマー、第二のプライマー及び配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブ以外に、必要に応じて、その他の試薬等を添付してもよい。その他の試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ）、緩衝液、滅菌水、コントロール用ＤＮＡが挙げられる。
【００３０】
本実施形態のキットに緩衝液を添付する場合、緩衝液としては、例えば、一般的なＰＣＲ法で使用する緩衝液が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
［実施例１：プライマー及びプローブの選抜］
（材料）
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させるため、プライマーとプローブを設計した。１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ６−Ｖ７領域を増幅するためのプライマー及びプローブを表１に、Ｖ５−Ｖ７領域を増幅するためのプライマー及びプローブを表２にそれぞれ示す。また、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させるプライマーとして非特許文献２に記載されている、配列番号１９及び配列番号２０に記載の塩基配列を有するプライマーも用いた。鋳型ＤＮＡは、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１８）を導入したプラスミドを用いた。鋳型ＤＮＡは、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌から抽出したＤＮＡを鋳型に、配列番号２１及び２２に記載の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅産物を調製し、その後増幅産物をプラスミドに導入したものである。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃→４０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。
【００３２】
【表１】
0006501594.tif 000002
【００３３】
【表２】
0006501594.tif 000003
【００３４】
（方法）
表１及び２に示すプライマー及びプローブを用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を行った。
【００３５】
１０μＬの２×ＴａｑＭａｎ  ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．３６μＬのフォワードプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．３６μＬのリバースプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５０μＬのプローブ、６．７８μＬの滅菌水、２．００μＬの鋳型ＤＮＡを、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをリアルタイムＰＣＲ装置に設置し、増幅反応を行った。反応は（１）９５℃、２０秒、（２）９５℃、１秒、（３）６０℃、２０秒で行い、（２）及び（３）の工程は５０サイクル繰り返し行った。反応は、４９２ｎｍの励起光を照射し、蛍光物質である６−ＦＡＭの蛍光（５１５ｎｍ）を測定することで、リアルタイムで進行を確認した。
【００３６】
（結果）
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することができたプライマー及びプローブの組み合わせを表３及び４に示す。Ｖ６−Ｖ７領域に設計したプライマー及びプローブでは１０組、Ｖ５−Ｖ７領域に設計したプライマー及びプローブでは１１組が、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１８）を導入したプラスミドを検出することができ、１ｐｇ／μＬから０．００１ｐｇ／μＬまでのプラスミドを検出することができた。一方、配列番号１９及び配列番号２０に記載の塩基配列を有するプライマー並びにプローブ１の組み合わせでは、配列番号１８の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドを検出することはできなかった。
【００３７】
【表３】
0006501594.tif 000004
【００３８】
【表４】
0006501594.tif 000005
【００３９】
［実施例２：一種類のプラスミドを用いた特異性試験］
（材料）
・１−２、１−４、１−５、１−７、１−９、１−１０又は２−５の組み合わせのプライマー及びプローブ
・各種細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミド（表５に記載の細菌由来）
【００４０】
（方法）
上記プライマー、プローブを用いたこと及び上記プラスミドのいずれか一種を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００４１】
（結果）
表５には、試験に用いたプラスミドに導入された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の由来となる細菌と、それらのプラスミドの検出結果を示す。Ｖ６−Ｖ７領域で設計したプライマー及びプローブの組み合わせ（１−２、１−４、１−５、１−７、１−９、１−１０）、並びにＶ５−Ｖ７領域で設計したプライマー及びプローブの組み合わせ（２−５）によれば、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌以外の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドは検出限界（０．００１ｐｇ／μＬ）以下であった。また、これらプライマー及びプローブセットは、Ｎｉｔｏｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の近縁種であるＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属細菌に対しても検出性を示さなかった。したがって、これらのプライマー及びプローブはＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出できることが示された。
【００４２】
【表５】
0006501594.tif 000006
【００４３】
［実施例３：複数種の混合プラスミドを用いた特異性試験及び定量性試験］
（材料）
・１−２、１−４、１−５、１−７、１−９、１−１０、２−５の組み合わせのプライマー及びプローブ
・Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号１８）を導入したプラスミド
・各種細菌由来１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミド（表５に記載の細菌由来）
【００４４】
（方法）
表５に記載の細菌中、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を除く１２種の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドを混合した混合液（各種プラスミドの終濃度はそれぞれ１ｐｇ／μＬ）に、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドを終濃度１ｐｇ／μＬ、０．１ｐｇ／μＬ、０．０１ｐｇ／μＬ又は０．００１ｐｇ／μＬとなるように混合し、プラスミド混合液を調製した。上記の組み合わせのプライマー及びプローブを用いたこと、並びに、調製したプラスミド混合液を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００４５】
（結果）
表６には、リアルタイムＰＣＲにより定量したＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドの測定値（ｐｇ／μＬ）を示す。Ｖ６−Ｖ７領域で設計したプライマーによる１−２、１−４、１−５、１−７、１−９及び１−１０のプライマー・プローブの組み合わせを用いた場合、複数種の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドを鋳型ＤＮＡとしても、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属由来のもののみを特異的に検出することができ、且つ、０．００１ｐｇ／μＬの濃度まで定量することができた。このとき、他種の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を導入したプラスミドは、検出限界（０．００１ｐｇ／μＬ）以下だった。一方、Ｖ５−Ｖ７領域で設計したプライマーによる２−５のプライマー・プローブの組み合わせを用いた場合、１ｐｇ／μＬの濃度までは、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属由来のもののみを特異的に検出することができたが、０．１ｐｇ／μＬ以下では、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属由来のものを検出及び定量することができなかった。
【００４６】
【表６】
0006501594.tif 000007
【００４７】
［実施例４：一種類のゲノムＤＮＡを用いた特異性試験］
（材料）
・１−９の組み合わせのプライマー及びプローブ
・各種細菌由来ゲノムＤＮＡ（表７に記載の細菌由来）
【００４８】
（方法）
１−９の組み合わせのプライマー及びプローブを用いたこと、並びに、表７に記載の細菌由来のゲノムＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ）を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００４９】
表７には、試験に用いたゲノムＤＮＡの由来となる細菌と、それらのゲノムＤＮＡの検出結果を示す。１−９の組み合わせのプライマー及びプローブによれば、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌であるＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ  ＮＢＲＣ１４２９７のゲノムＤＮＡを０．００１ｎｇ／μＬの濃度まで検出することができた。一方で、それ以外の細菌由来のゲノムＤＮＡは検出限界（０．００１ｎｇ／μＬ）以下であった。そのため、このプライマー及びプローブは、ゲノムＤＮＡを用いたとしても、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出できることが示された。
【００５０】
【表７】
0006501594.tif 000008
【００５１】
［実施例５：複数種の混合ゲノムＤＮＡを用いた定量性試験］
（材料）
・１−９の組み合わせのプライマー及びプローブ
・Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ  ＮＢＲＣ１４２９７由来ゲノムＤＮＡ
・各種細菌由来ゲノムＤＮＡ（表８に記載の細菌由来）
【００５２】
（方法）
表８に記載の細菌由来のゲノムＤＮＡを混合した混合液（各種ゲノムＤＮＡの終濃度はそれぞれ１００ｐｇ／μＬ）に、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ  ＮＢＲＣ１４２９７由来のゲノムＤＮＡを終濃度１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬ又は０．１ｐｇ／μＬとなるように混合し、ゲノムＤＮＡ混合液を調製した。１−９の組み合わせのプライマー及びプローブを用いたこと、並びに、調製したゲノムＤＮＡ混合液を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１を同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００５３】
【表８】
0006501594.tif 000009
【００５４】
（結果）
表９に、１−９の組み合わせのプライマー及びプローブを用いて、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ  ＮＢＲＣ１４２９７由来のゲノムＤＮＡを定量した結果を示す。表９に示すゲノムＤＮＡの測定値は、３サンプルについて測定を行った結果の平均値である。１−９の組み合わせのプライマー及びプローブを用いた場合、複数種の細菌由来のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡとしても、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｗｉｎｏｇｒａｄｓｋｙｉ  ＮＢＲＣ１４２９７由来のゲノムＤＮＡのみを特異的に検出することができ、且つ、０．１ｐｇ／μＬの濃度まで定量することができた。このとき、他種の細菌由来のゲノムＤＮＡは、検出限界（０．１ｐｇ／μＬ）以下だった。
【００５５】
【表９】
0006501594.tif 000010
【００５６】
［実施例６：活性汚泥を用いたＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌の検出及び定量］
（材料）
・１−９の組み合わせのプライマー及びプローブ
・活性汚泥サンプル１から１１由来のゲノムＤＮＡ（活性汚泥のサンプリング量１．５ｍＬ、溶出量１５０μＬ）
【００５７】
（方法）
１−９の組み合わせのプライマー及びプローブを用いたこと、並びに、活性汚泥サンプル１から１１由来のゲノムＤＮＡ（２μＬ）を鋳型ＤＮＡとして用いたこと以外は、実施例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。
【００５８】
（結果）
表１０に、１−９の組み合わせのプライマー及びプローブを用いて、活性汚泥サンプル１〜１１由来のゲノムＤＮＡをプラスミド濃度に換算した際の定量結果を示す。この結果から、１−９の組み合わせのプライマー及びプローブによれば、活性汚泥由来のゲノムＤＮＡから直接Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を検出することができることが示された。
【００５９】
【表１０】
0006501594.tif 000011
【００６０】
これらの結果から、Ｖ６−Ｖ７領域で設計したプライマー及びプローブを用いることで、複数の細菌種が存在する系においてもＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属細菌を特異的に検出することができ、且つ、正確に定量することができた。
【配列表】
0006501594000001.app