(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８〜２９及び１０７〜１１０のいずれかのアミノ酸配列における６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の位置からなる群より選択される位置又は配列番号１２２〜１３７のいずれかのアミノ酸配列におけるこれらの位置と同等の位置からなる群より選択される位置で少なくとも１つのシステイン置換を含む、単離されたシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
【請求項２】
半減期延長部分を更に含む、請求項１に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
【請求項３】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項２に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
【請求項４】
（ｉ）配列番号１８〜２９、１０７〜１１０及び１２２〜１３７のいずれかのアミノ酸配列をコードする核酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、請求項１に記載のシステイン改変ＦＮ３ドメインをコードするようにシステインアミノ酸残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、前記核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを回収することと、
を含む、システイン改変ＦＮ３ドメインを調製する方法。
【請求項５】
前記変異させる工程が部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記システイン改変ＦＮ３ドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記回収する工程の後に、前記システイン改変ＦＮ３ドメインを、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインを生成することを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ結合を測定することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインの付加後のＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記マレイミド部分を含むチオール反応性試薬が、ＮＥＭ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインが、ＥＧＦＲ過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約１．７×１０-10Ｍ〜約１．３×１０-9Ｍの細胞増殖ＩＣ50を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１８９〜２１６及び２２７〜２５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
【請求項１４】
第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子であって、
前記第１のＦＮ３ドメインが、配列番号１８〜２９及び１０７〜１１０のアミノ酸配列における６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の位置からなる群から選択される位置または配列番号１２２〜１３７におけるこれらの位置と同等の位置からなる群から選択される位置でシステイン置換を含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、
前記第２のＦＮ３ドメインが、配列番号１１１〜１１４のアミノ酸配列における６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８３、８４、８５、８６、及び８８番目の位置からなる群から選択される位置でシステイン置換を含み、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
【請求項１５】
配列番号２１９〜２２６及び２５７〜２６４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
【請求項１６】
前記分子がチオール反応性試薬に化学的にコンジュゲートされている、請求項１４に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
【請求項１７】
前記チオール反応性試薬がマレイミド部分である、請求項１６に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
【請求項１８】
前記マレイミド部分が、ＮＥＭ、ＰＥＧ２４−マレイミド、フルオレセインマレイミド、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、請求項１７に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
【請求項１９】
前記第１のＦＮ３ドメインが、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において測定されるとき、約０．９×１０-9Ｍ〜約２．３×１０-9ＭのＩＣ50値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメインが、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において測定されるとき、約４×１０-10Ｍ〜約１．３×１０-9ＭのＩＣ50値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する、請求項１８に記載のシステイン改変二重特異性分子。
【請求項２０】
前記システイン改変二重特異性分子が、
（ｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約５．０×１０-11Ｍ〜約５．８×１０-10Ｍと、
（ｉｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ａ７３１細胞において測定されるとき、約７．８×１０-12Ｍ〜約１．１×１０-9Ｍと、
からなる群より選択される細胞増殖ＩＣ50値を有する、請求項１９に記載のシステイン改変二重特異性分子。
【請求項２１】
半減期延長部分を更に含む、請求項２０に記載のシステイン改変二重特異性分子。
【請求項２２】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、請求項２１に記載のシステイン改変二重特異性分子。
【請求項２３】
（ｉ）配列番号１８〜２９、１０７〜１１及び１２２〜１３７のいずれかのアミノ酸配列と配列番号１１１〜１１４のいずれかのアミノ酸配列とを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列において、１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、請求項１４に記載のシステイン改変二重特異性分子をコードするようにシステイン残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、前記核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を回収することと、
を含む、単離システイン改変二重特異性分子を調製する方法。
【請求項２４】
前記変異させる工程が、部位特異的変異誘発を行うことを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記システイン改変二重特異性分子を大腸菌において発現させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記回収する工程の後に、前記システイン改変二重特異性分子を、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子を生成することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子のＥＧＦＲ結合を測定することと、
（ｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細胞株におけるＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細胞株におけるＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｖ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子の添加後のＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の増殖阻害を測定することと、
からなる群より選択される工程を更に含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、システイン残基によって改変されている結合分子並びにそれらを作製及び使用する方法に関する。より詳しくは、本発明は、システインによって改変されているＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに結合し得るフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン分子に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）は、ｃ−ｅｒｂＢ１がん原遺伝子によってコードされる１７０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である。ＥＧＦＲは、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーメンバーである。これらのＲＴＫは、リガンド結合細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、１回膜貫通ドメイン、及び触媒キナーゼドメインとＣ−末端テールとを含む細胞内ドメインからなる相同な構造を共有する。ＥＧＦＲシグナリングは、リガンドの結合後に、受容体の立体構造の変化、二量体化、及びトランス自己リン酸化が誘導され（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，３７：３５３〜７３，２００８）、それによってシグナル伝達カスケードを開始することによって始まり、最終的に細胞増殖及び生存を含む広く多様な細胞機能に影響を及ぼす。ＥＧＦＲの発現又はキナーゼ活性の増加は、広範囲のヒトがんに関係しており、そのためＥＧＦＲは治療介入にとっての魅力的な標的となる（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：６５５０〜６５６５，２０００；Ｇｒｕｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ９５：８５１〜６７，２００３；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：３６９〜８５，２００６）。更に、ＥＧＦＲ遺伝子コピー数とタンパク質発現の両方の増加は、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤であるＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ）に対する小細胞肺がんの好ましい応答に関連している（Ｈｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８：７５２〜６０，２００７）。
【０００３】
ＥＧＦＲ治療は、低分子と抗ＥＧＦＲ抗体の両方を含み、結腸直腸がん、膵臓がん、頭頚部がん、及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の処置のために承認されている（Ｂａｓｅｌｇａ  ａｎｄ  Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２３：２４４５〜２４５９（２０００５；Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５９：７７５５〜７７６０，１９８４；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１：１３１  １〜１３１８；１９９５；Ｐｒｅｗｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，４：２９５７〜２９６６，１９９８）。
【０００４】
抗ＥＧＦＲ治療の効能は、腫瘍のタイプ及び腫瘍におけるＥＧＦＲの変異／増幅状態に依存し得るが、皮膚毒性が起こることがある（Ｄｅ  Ｒｏｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １１：７５３〜７６２，２０１０；Ｌｉｎａｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，６：３５２〜３６６，２００９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ，Ｔａｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ４：１０７〜１１９，２００９）。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の二次選択治療として一般的に用いられているが、耐性経路により投与は１２か月以内に中止されることが多い（Ｒｉｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：８３９〜４４，２００６）。
【０００５】
ｃ−Ｍｅｔは、チロシンキナーゼ受容体をコードする。ｃ−Ｍｅｔは、発がん物質による処置によって、構成的に活性な融合タンパク質であるＴＰＲ−ＭＥＴを生じることが見いだされたことから、１９８４年にがん原遺伝子として初めて同定された（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：２９〜３３，１９８４）。ｃ−ＭｅｔをそのリガンドであるＨＧＦを通して活性化すると、増殖、運動性、浸潤、転移、上皮−間葉転換、血管新生／創傷治癒、及び組織再生を含む多くの細胞プロセスを刺激する（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２２５：１〜２６，２００５；Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｄｊｅｉ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９：３１４〜２６，２０１２）。ｃ−Ｍｅｔは、一本鎖タンパク質として合成され、これはタンパク質分解によって、ジスルフィド結合で結合する５０ｋＤａのαサブユニットと１４０ｋＤａのβサブユニットに切断される（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。ｃ−Ｍｅｔは、Ｒｏｎ及びＳｅａなどの他の膜受容体と構造的に類似であり、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメイン（チロシンキナーゼドメインとＣ−末端テール領域とを含む）で構成される。ＨＧＦ：ｃ−Ｍｅｔ結合の正確な化学量論は不明であるが、一般的に、２つのＨＧＦ分子が２つのｃ−Ｍｅｔ分子に結合して、受容体の二量体化、並びに１２３０、１２３４、及び１２３５番目のチロシンで自己リン酸化が起こると考えられている（Ｓｔａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２３：２３２５〜２３３５，２００４）。リガンド非依存型のｃ−Ｍｅｔ自己リン酸化もまた、遺伝子の増幅、変異、又は受容体の過剰発現により起こり得る。
【０００６】
ｃ−Ｍｅｔは、胃がん、肺がん、結腸がん、乳がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、膵臓がん、及びＣＮＳのがんを含む多くのタイプのがんにおいて、しばしば増幅、変異、又は過剰発現されている。キナーゼドメインに典型的に局在するミスセンス変異は、遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）では共通して見いだされ、散発性のＰＲＣＣでは１３％に見いだされている（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２３４３〜２３５０，１９９９）。これに対し、ｃ−Ｍｅｔのセマフォリン又は膜近傍ドメインに局在するｃ−Ｍｅｔ変異は、胃がん、頭頚部がん、肝臓がん、卵巣がん、ＮＳＣＬＣ、及び甲状腺がんにおいてしばしば見出されている（（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３；Ｓａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５）。ｃ−Ｍｅｔの増幅は、脳がん、結腸直腸がん、胃がん、及び肺がんにおいて検出されており、しばしば疾患の進行度と相関する（Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２２：３０９〜３２５，２００３）。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）及び胃がんのそれぞれ、４％及び２０％までが、ｃ−Ｍｅｔの増幅を示す（Ｓａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９９．２４：２９９〜３０５：Ｓｉｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１）。遺伝子の増幅がない場合であっても、ｃ−Ｍｅｔ過剰発現は、肺がんにおいてしばしば観察される（Ｉｃｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，８７：１０６３〜９，１９９６）。その上、臨床試料において、ほぼ半数の肺腺がんが高レベルのｃ−Ｍｅｔ及びＨＧＦを示し、そのいずれも腫瘍の増殖速度の増強、転移、及び予後不良と相関した（Ｓｉｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｔｓａｏ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，３：Ｓ２１〜３５，２０１１；Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ６６：１９１５〜８，１９９８）。
【０００７】
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤に対して耐性となった全ての腫瘍のほぼ６０％が、ｃ−Ｍｅｔ発現を増加させ、ｃ−Ｍｅｔを増幅し、又はその唯一の公知のリガンドであるＨＧＦを増加させ（Ｔｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，１７：７７〜８８，２０１０）、このことは、ｃ−Ｍｅｔを通してのＥＧＦＲの代償的経路が存在することを示唆している。ｃ−Ｍｅｔの増幅は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブに対して耐性となり、Ｈｅｒ３経路を通して生存の増強を示す培養細胞において初めて同定された（Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１０３９〜４３，２００７）。これを、臨床試料において更にバリデートしたところ、ｃ−Ｍｅｔの増幅を示したのは、エルロチニブ又はゲフィチニブのいずれかに対する耐性を獲得した患者４３人中９人に対し、無処置患者では６２人中２人のみであった。興味深いことに、処置患者９人中４人はまた、ＥＧＦＲ活性化変異Ｔ７９０Ｍを獲得し、このことは、同時の耐性経路を証明している（Ｂｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０４：２０９３２〜７，２００７）。
【０００８】
がんにおけるＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔとの両方の個々の役割は、今では十分に確立されており、これらの標的は、併用治療にとって魅力的となる。いずれの受容体も、同じ生存及び抗アポトーシス経路（ＥＲＫ及びＡＫＴ）を通してシグナルを伝達し；このため、この経路対を共に阻害すると、代償経路が活性化される可能性を制限して、それによって全有効性を改善させ得る。ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔを標的とする併用治療は、ＮＳＣＬに対してＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）と抗ｃ−Ｍｅｔ一価抗体とを併用する臨床試験（Ｓｐｉｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  ＡＳＣＯ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．ｐ．７５０５）、及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）とｃ−Ｍｅｔの低分子阻害剤であるＡＲＱ−１９７とを併用する臨床試験（Ａｄｊｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１６：７８８〜９９，２０１１）において試験されている。併用治療又は二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、例えば、国際公開公報第２００８／１２７７１０号、米国特許出願公開第２００９／００４２９０６号、国際公開公報第２００９／１１１６９１号、国際公開公報第２００９／１２６８３４号、国際公開公報第２０１０／０３９２４８号、国際公開公報第２０１０／１１５５５１号に開示されている。
【０００９】
治療のためにＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリング経路に拮抗する現在の低分子及び高分子（すなわち、抗体）アプローチは、低分子ではおそらく特異性が欠如し、そのためオフターゲット活性の可能性及び低分子阻害剤で見られる用量制限毒性により、準最適であり得る。典型的な二価の抗体では、膜結合受容体のクラスタリング及び下流のシグナリング経路の望ましくない活性化が起こり得うるが、一価の抗体（半分のアーム）は、製造プロセスに顕著な複雑さ及び費用をもたらす。
【００１０】
したがって、更に細胞障害剤をコンジュゲートすることができ、このようにこれらの強力な化合物をＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞に標的化して、これらのＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ阻害剤の抗腫瘍活性を増強する、更なる単特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ阻害剤が必要である。抗体薬物コンジュゲートは、当技術分野に存在するものの、薬物部分を結合させる従来の手段では、一般的に、薬物部分が抗体上の多数の部位に結合した不均一な分子混合物を生じる。例えば、細胞障害剤は、典型的に、抗体にしばしば多数存在するリジン残基を通して抗体にコンジュゲートされており、そのため、不均一な抗体−薬物コンジュゲート混合物を生成する。反応条件に応じて、不均一な混合物は典型的に、０〜約８個、又はそれより多くの薬物部分が結合した抗体分布を含む。加えて、薬物部分対抗体の特定の整数比を有するコンジュゲートのそれぞれのサブグループには、薬物部分が抗体上の様々な部位に結合したおそらく不均一な混合物が存在する。分析及び調製方法は、コンジュゲーション反応により生じる不均一な混合物中の抗体−薬物コンジュゲート種分子を分離及び特徴付けするには不適切である。抗体は、大きく、複雑で、構造的に多様な生体分子であり、しばしば多くの反応性官能基を有する。抗体とリンカー試薬及び薬物−リンカー中間体との抗体の反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度、及び共溶媒などの要因に依存する。更に、多段階のコンジュゲーションプロセスは、反応条件を制御並びに反応物質及び中間体を特徴づけする際の難しさにより、再現性がないことがあり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
抗体に存在するシステインを介した化学的コンジュゲーションもまた、証明されている。しかし、タンパク質の様々なアミノ酸をシステインアミノ酸に変異させることによるシステインのチオール基の改変は、おそらく問題が多く、特に、不対（遊離のシステイン）残基又は反応若しくは酸化にとって比較的近づきやすい残基の場合には問題が多い。タンパク質表面上の不対システイン残基は、対を形成して酸化し、分子間ジスルフィドを形成することができ、それによってタンパク質の二量体又は多量体を形成することができる。ジスルフィド二量体形成により、新しいシステインは、薬物、リガンド、又は他の標識とのコンジュゲーションに関して非反応性となる。更に、タンパク質が、新たに改変されたシステインと既存のシステイン残基との間で酸化的に分子内ジスルフィド結合を形成すれば、いずれのシステイン基も、活性部位関与及び相互作用にとって利用できない。加えて、タンパク質は、三次構造のミスフォールディング又は喪失により、不活性又は非特異的となり得る（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１〜９）。
【００１２】
このため、均一な化学的コンジュゲーションを受けることができ、抗体コンジュゲートが直面する問題を回避することができる分子が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、配列番号２７に基づくＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基、並びに関連するＦＮ３ドメインにおける同等の位置からなる群より選択される位置で少なくとも１つのシステイン置換を含む、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。ドメイン又はタンパク質中のある位置でのシステイン置換は、既存のアミノ酸残基をシステイン残基に交換することを含む。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２７のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有する配列番号２７のアミノ酸配列を含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインも提供する。
【００１５】
本発明は更に、配列番号１１４のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有する配列番号１１４のアミノ酸配列を含み、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。
【００１６】
本発明は、システイン改変ＦＮ３ドメインを生成するためにシステイン置換が行われ得る新規位置を提供する。前記位置には、配列番号１１〜１１４及び／又は配列番号１２２〜１３７の６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、又は９３番目の残基の１つ又は２つ以上が挙げられる。
【００１７】
本発明の１つの態様は、システイン改変ＦＮ３ドメインをコードするように１つ又は２つ以上のアミノ酸残基をシステイン残基に交換することにより、親ＦＮ３ドメインの核酸配列を変異させること；システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させること；及びシステイン改変ＦＮ３ドメインを単離すること、によって単離システイン改変ＦＮ３ドメインを調製するプロセスである。
【００１８】
本発明のもう一つの態様は、ＦＮ３ドメインがマレイミド部分を含む化学試薬に共有結合している、化学的にコンジュゲートされた単離システイン改変ＦＮ３ドメインである。
【００１９】
本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲ過剰発現及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞株の増殖を阻害することができる、化学的にコンジュゲートされた単離システイン改変ＦＮ３ドメインである。
【００２０】
本出願はまた、第１及び第２のＦＮ３ドメインが、６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群から選択される位置でシステイン置換を含む、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインが肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子を提供する。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、二重特異性分子がマレイミド部分を含む化学試薬に共有結合している、化学的にコンジュゲートされた単離システイン改変二重特異性分子である。
【００２２】
本発明の更なる態様は、システイン改変二重特異性分子をコードするように、１つ又は２つ以上のアミノ酸残基をシステイン残基に交換することにより、親ＦＮ３二重特異性分子の核酸配列を変異させること；システイン改変分子を発現させること；及びシステイン改変二重特異性分子を単離すること、によって単離システイン改変二重特異性ＦＮ３を調製するプロセスである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントである。ＢＣ及びＦＧループを、配列番号１８の２２〜２８番目及び７５〜８６番目の残基を四角で囲んで示す。いくつかの変種は、熱安定性を改善するＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ、及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号はＴｅｎｃｏｎ配列番号１に従う）。
【図１Ｂ】ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのアミノ酸アライメントである。ＢＣ及びＦＧループを、配列番号１８の２２〜２８番目及び７５〜８６番目の残基を四角で囲んで示す。いくつかの変種は、熱安定性を改善するＬ１７Ａ、Ｎ４６Ｋ、及びＥ８６Ｉ置換を含む（残基の番号はＴｅｎｃｏｎ配列番号１に従う）。
【図２】細胞毒素／リンカー構造。
【図３】Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２タンパク質（配列番号２７）の結晶構造のリボン表示である。システイン置換に寛容な位置として同定された最終的な位置を、棒で示し、黒色で示す。結合ループＢＣ／ＦＧを薄い灰色で示す。
【図４】無作為化Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ交互表面を有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７足場構造（配列番号９９）とＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号１００）の配列アライメントである。ループ残基を四角で囲む。ループ及び鎖を配列の上に示す。
【図５Ａ】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アライメントである。ＣループとＣＤ鎖及びＦループとＦＧ鎖を四角で囲み、これらは２９〜４３番目の残基及び６５〜８１番目の残基に及ぶ。
【図５Ｂ】ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの配列アライメントである。ＣループとＣＤ鎖及びＦループとＦＧ鎖を四角で囲み、これらは２９〜４３番目の残基及び６５〜８１番目の残基に及ぶ。
【図６】単特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処置して、ＨＧＦで刺激したＨ２９２細胞におけるｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を示す。単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５、図でＡ５として示す）の単独又はＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、図で８３ｖ２として示す）との併用と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）の効力の実質的な増加が観察された。
【図７】単特異性又は二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子で前処置した細胞におけるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害である。高レベルのＥＧＦＲを発現する細胞株Ｈ２９２（Ａ）及びＨ５９６（Ｂ）において、抗ＥＧＦＲ単特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲリン酸化の減少において等しい効力を有する。ｃ−Ｍｅｔと比較して低レベルのＥＧＦＲを発現する細胞株Ｈ４４１（Ｃ）において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較してＥＧＦＲリン酸化阻害の効力を改善する。ＥＧＦＲと比較して低レベルのｃ−Ｍｅｔを有する細胞株Ｈ２９２（Ｄ）及びＨ５９６（Ｅ）において、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害は、単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン単独と比較して二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子では有意に増強される。試験で使用した分子は：二重特異性ＥＣＢ５（図で１７−Ａ３として示す）、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインＰ５３Ａ１Ｒ５−１７（図で「１７」として示す）、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子ＥＣＢ３（図で８３−Ｈ９として示す）、及び単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＰ１１４ＡＲ７Ｐ９３−Ｈ９（図においてＨ９として示す）であった。
【図８】二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を投与したマウスから単離した腫瘍における６時間又は７２時間の薬力学的シグナリングを示す。全ての分子は、６時間及び７２時間の両方でｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫリン酸化を有意に減少させ、阻害の程度は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＦＮ３ドメインの親和性に依存した。二重特異性分子は、高い（８３はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２である）又は中等度（図の「１７ｖ２」は、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２である）の親和性を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、高い（図の「Ａ３」はＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３である）又は中等度（図の「Ａ５」はＰ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５である）の親和性を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに連結させることによって作製された。
【図９】：アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）に結合した種々の親和性を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の血漿中（上）及び腫瘍（下）での蓄積を、ＩＰ投与後６時間（左）及び７２時間（右）で示す。投与後６時間で、中等度親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１７ｖ２）及び高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ドメイン（８３ｖ２）を有する二重特異性分子を投与したマウスにおいて腫瘍での蓄積は最大である。二重特異性分子は、以下の高親和性又は中等度親和性ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを組み入れた：８３ｖ２−Ａ５−ＡＢＤ（ＥＣＢ１８；ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔに関して高／中等度）８３ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８；高／高）１７ｖ２−Ａ５（ＥＣＢ２８；中等度／中等度）１７ｖ２−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３９；中等度／高）。８３ｖ２はｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２を意味し；１７ｖ２はｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２を意味し；Ａ３はｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３を意味し；Ａ５はｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５を意味する。
【図１０】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅマウスに植え込んだ。腫瘍の平均体積がおよそ８０ｍｍ３に達したとき、マウスに二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（２５ｍｇ／ｋｇ）又はＰＢＳビヒクルを１週間に３回投与した。二重特異性分子は全て、腫瘍の増殖を減少させ、腫瘍の増殖阻害（ＴＧＩ）は、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対する分子の親和性に依存した。（高ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３８）を意味し；高ＥＧＦＲ−中等度ｃＭｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ１８）を意味し；中等度ＥＧＦＲ−高ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３（ＥＣＢ３９）を意味し；中等度ＥＧＦＲ−中等度ｃＭｅｔは、ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７−ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５（ＥＣＢ２８）を意味する）。
【図１１】Ｈ２９２−ＨＧＦ腫瘍異種移植片をＳＣＩＤ  ｂｅｉｇｅマウスに植え込んでマウスを異なる治療によって処置した。治療の抗腫瘍活性を示す。（二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔは、ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３−ＡＢＤ（ＥＣＢ３８）を意味し；他の治療は、クリゾチニブ、エルロチニブ、セツキシマブ、及びクリゾチニブとエルロチニブの併用である）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で用いられる用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）は、フィブロネクチン、テナシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、及び原核細胞酵素を含むタンパク質においてしばしば存在するドメインを意味する（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）。例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテナシンＣに存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記述される非天然の合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質の名称で呼ばれ、例えばテナシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と呼ばれる。
【００２５】
本明細書で使用される用語「置換する」、又は「置換した」、又は「変異する」、又は「変異した」は、その配列の変種を生成するために、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列に１つ又は２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変化させること、欠失させること、又は挿入することを指す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「無作為化する」、又は「無作為化した」、又は「多様化した」、又は「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を作製することを指す。
【００２７】
本明細書で使用される用語「変種」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、置換、挿入、又は欠失によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なっている、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【００２８】
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、１×１０−６Ｍ若しくはそれより低い、例えば１×１０−７Ｍ若しくはそれより低い、１×１０−８Ｍ若しくはそれより低い、１×１０−９Ｍ若しくはそれより低い、１×１０−１０Ｍ若しくはそれより低い、１×１０−１１Ｍ若しくはそれより低い、１×１０−１２Ｍ若しくはそれより低い、又は１×１０−１３Ｍ若しくはそれより低い解離定数（ＫＤ）で、本発明のＦＮ３ドメインが既定の抗原に結合する能力を指す。典型的に、本発明のＦＮ３ドメインは、例えばＰｒｏｔｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる表面プラズモン共鳴によって測定した場合に非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ又はカゼイン）に対するそのＫＤより少なくとも１０倍低いＫＤで既定の抗原（すなわち、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ）に結合する。このように、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対して少なくとも１×１０−６Ｍ又はそれより低い結合親和性（ＫＤ）でそれぞれのＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する。しかし、既定の抗原に特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメインは、他の関連する抗原、例えば他の種からの同じ既定の抗原（ホモログ）に対して交叉反応性を有し得る。
【００２９】
用語「ライブラリ」は、変種のコレクションを指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌクレオチド変種で構成され得る。
【００３０】
本明細書で使用される用語「安定性」は、例えばＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔなどの既定の抗原に対する結合などの、その正常な機能活性のうちの少なくとも１つを保持するように、生理学的条件下で分子が折りたたみ状態を維持できること指す。
【００３１】
本明細書で使用される「上皮成長因子受容体」又は「ＥＧＦＲ」は、配列番号７３及びＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５２１９に示される配列を有するヒトＥＧＦＲ（ＨＥＲ−１又はＥｒｂ−Ｂ１としても知られる）（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４１８〜４２５，１９８４）、並びにその天然に存在する変種を意味する。そのような変種には、周知のＥＧＦＲｖＩＩＩ及び他の選択的スプライス変種（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ００５３３−１、Ｐ００５３３−２、Ｐ００５３３−３、Ｐ００５３３−４として同定される変種）、変種ＧＬＮ−９８、ＡＲＧ−２６６、Ｌｙｓ−５２１、ＩＬＥ−６７４、ＧＬＹ−９６２、及びＰＲＯ−９８８（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＩＥＨＳ−ＳＮＰｓ，ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｇｅｎｏｍｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ，ＮＩＥＨＳ  ＥＳ１５４７８）が挙げられる。
【００３２】
本明細書において使用される「ＥＧＦＲリガンド」は、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ヘパリン結合ＥＧＦ（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、及びエピレグリン（ＥＰＩ）を含むＥＧＦＲの全ての（例えば、生理的）リガンドを包含する。
【００３３】
本明細書において使用される「上皮成長因子」は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列を有する周知のアミノ酸５３個のヒトＥＧＦを指す。
【００３４】
本明細書で使用される「肝細胞増殖因子受容体」又は「ｃ−Ｍｅｔ」は、配列番号１０１又はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２０９７２に示されるアミノ酸配列を有するヒトｃ−Ｍｅｔ及びその天然の変種を指す。
【００３５】
本明細書で使用される「肝細胞増殖因子」は、切断されてジスルフィド結合で結合したα鎖とβ鎖の二量体を形成する、配列番号１０２に示されるアミノ酸配列を有する周知のヒトＨＧＦを指す。
【００３６】
本明細書で互換的に使用される「結合を遮断する」、又は「結合を阻害する」とは、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の本発明のＦＮ３ドメインが、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの結合を遮断できること又は阻害できることを指し、部分的及び完全な遮断／阻害の両方を包含する。本発明のＦＮ３ドメイン、又は本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子によるＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの遮断／阻害は、遮断又は阻害がない場合のＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンド結合及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ結合と比較して、正常レベルのＥＧＦＲシグナリング及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリングを部分的又は完全に減少させる。本発明のＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、阻害が少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であるとき、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦなどのＥＧＦＲリガンドの「結合を遮断する」。結合の阻害は、周知の方法、例えば本発明のＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子に暴露されたＥＧＦＲ発現Ａ４３１細胞でのビオチニル化ＥＧＦの結合の阻害をＦＡＣＳを用いて測定することによって、又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン上のビオチニル化ＨＧＦの結合の阻害を周知の方法及び本明細書に記述の方法を用いて測定することによって、測定することができる。
【００３７】
用語「ＥＧＦＲシグナリング」は、ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲリガンドの結合により誘発されるシグナル伝達を指し、それによってＥＧＦＲにおける少なくとも１つのチロシン残基の自己リン酸化が起こる。例示的なＥＧＦＲリガンドはＥＧＦである。
【００３８】
本明細書で使用される「ＥＧＦＲシグナリングを中和する」とは、ＥＧＦなどのＥＧＦＲリガンドによって誘発されるＥＧＦＲシグナリングを、本発明のＦＮ３ドメインが、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害できることを指す。
【００３９】
用語「ｃ−Ｍｅｔシグナリング」は、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合により誘発されるシグナル伝達を指し、それによってｃ−Ｍｅｔにおける少なくとも１つのチロシン残基の自己リン酸化が起こる。典型的に、ＨＧＦが結合すると、１２３０、１２３４、又は１２３５番目の位置で少なくとも１つのチロシン残基が自己リン酸化される。
【００４０】
本明細書で使用される「ｃ−Ｍｅｔシグナリングを中和する」とは、ＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔシグナリングを、本発明のＦＮ３ドメインが、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％阻害できることを指す。
【００４１】
本明細書で互換的に使用される「過剰発現する」、「過剰発現された」、及び「過剰発現している」は、同じ組織タイプの正常な細胞と比較して表面上に測定可能な高レベルのＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを有するがん細胞又は悪性細胞を指す。そのような過剰発現は、遺伝子増幅、又は転写若しくは翻訳の増加によって、引き起こされ得る。ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔの発現及び過剰発現は、周知のアッセイを用いて、例えば生存細胞又は溶解細胞におけるＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、又はラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。あるいは又は加えて、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔコード核酸分子のレベルは、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、又はＰＣＲ技術を用いて細胞中で測定され得る。ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔは、正常細胞と比較して、細胞表面上のＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔのレベルが少なくとも１．５倍高いとき、過剰発現されている。
【００４２】
本明細書で使用される「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号１に示され、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記述される合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
【００４３】
本明細書で使用される「がん細胞」又は「腫瘍細胞」は、インビボ、エクスビボ、及び組織培養のいずれかにおいて、新しい遺伝材料の取り込みを必ずしも伴わない自発的又は人為的な表現型の変化を有するがん様、前がん様、又は形質転換細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込みにより発生し得るが、自然に又は発がん物質に対する暴露後にも発生して、それによって内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／がんは、例えば、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性度、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、ヌードマウスなどの適した動物宿主における腫瘍の増殖又は抑制等によって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ  ｅｄ．１９９４））。
【００４４】
用語「ベクター」は、生物系の内部で複製され得る、又はこうした系の間を移動することができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用する再構成生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であり得る。
【００４５】
用語「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成生物系において利用することができるベクターを意味する。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有的に連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００４７】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
【００４８】
本明細書で使用される用語「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子」又は「二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子」は、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと、別個のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとで構成され、それらが直接又はリンカーを介して互いに共有結合している分子を意味する。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合分子は、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインとを含む。
【００４９】
本明細書で使用される「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記された数存在することを指す。そのため、用語「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。
【００５０】
本明細書で使用される「混合物」は、互いに共有結合していない２つ以上のＦＮ３ドメインの試料又は調製物を指す。混合物は、２つ以上の同一のＦＮ３ドメイン又は別個のＦＮ３ドメインからなり得る。
【００５１】
組成物
本発明は、システイン改変単特異性及び二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン含有分子並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
【００５２】
単特異性ＥＧＦＲ結合分子
本発明は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、それにより治療応用及び診断応用において広く使用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
【００５３】
本発明のＦＮ３ドメインは、高親和性でＥＧＦＲに結合して、ＥＧＦＲシグナリングを阻害することから、低分子ＥＧＦＲ阻害剤と比較して特異性及び減少したオフターゲット毒性の点で、並びに従来の抗体治療と比較して改善された組織浸透の点で恩典を提供し得る。
【００５４】
本発明の１つの実施形態は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。
【００５５】
本発明のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を使用して、本発明のＦＮ３ドメインの存在下又は非存在下でインキュベートしたＡ４３１細胞上で６００ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲートを用いて結合したビオチニル化ＥＧＦからの蛍光の量を検出する競合アッセイにおいて、約１×１０−７Ｍより低い、約１×１０−８Ｍより低い、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−１０Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い、又は約１×１０−１２Ｍより低いＩＣ５０値でＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し得る。例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインなどであり、約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−７ＭのＩＣ５０値でＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し得る。本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非存在下でのＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合と比較して、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。
【００５６】
本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非存在下でのシグナリングレベルと比較して、ＥＧＦＲシグナリングを少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。
【００５７】
ＥＧＦＲにＥＧＦなどのリガンドが結合すると、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成（遺伝子活性化）及び細胞周期進行又は分裂の調節に関係する多数のシグナル伝達及びトランス活性化経路の開始を刺激する。ＥＧＦＲシグナリングが阻害されると、１つ又は２つ以上の下流のＥＧＦＲシグナリング経路が阻害され、それによってＥＧＦＲの中和は、細胞増殖及び分化、血管新生、細胞運動性、及び転移の阻害を含む、様々な効果を有し得る。
【００５８】
ＥＧＦＲシグナリングは、様々な周知の方法を用いて、例えばチロシンＹ１０６８、Ｙ１１４８、及びＹ１１７３のいずれかでの受容体の自己リン酸化（Ｄｏｗｎｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１１：４８３〜５，１９８４）及び／又は天然若しくは合成基質のリン酸化を測定することにより測定され得る。リン酸化は、ホスホチロシン特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロットなどの周知の方法を用いて検出することができる。例示的なアッセイは、Ｐａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒａ  ２８３：１４３３〜４４，１９９７及びＢａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６２：１４３〜５０，１９９８において見いだされ得る。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約２．５×１０−６Ｍより低い、例えば約１×１０−６Ｍより低い、約１×１０−７Ｍより低い、約１×１０−８Ｍより低い、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−１０Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い、又は約１×１０−１２Ｍより低いＩＣ５０値で、ＥＧＦＲの１１７３番目の残基位置のチロシンでのＥＧＦ誘発ＥＧＦＲリン酸化を阻害する。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約１．８×１０−８Ｍ〜約２．５×１０−６ＭのＩＣ５０値で、ＥＧＦＲの１１７３番目の残基位置のチロシンでのＥＧＦ誘発ＥＧＦＲリン酸化を阻害する。そのような例示的なＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するドメインである。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実践される表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定する場合、約１×１０−８Ｍより低い、例えば、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−１０Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い未満、約１×１０−１２Ｍより低い、又は約１×１０−１３Ｍより低い解離定数（ＫＤ）でヒトＥＧＦＲに結合する。いくつかの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、約２×１０−１０Ｍ〜約１×１０−８ＭのＫＤでヒトＥＧＦＲに結合する。ＥＧＦＲに対するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適した方法を用いて実験により決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記述される方法を参照されたい）。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用に関して測定される親和性は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定すれば、異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、好ましくは、標準化された足場タンパク質及び抗原溶液、並びに本明細書で記載される緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。
【００６２】
ＥＧＦＲに結合する本発明の例示的なＦＮ３ドメインには、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のＦＮ３ドメインが挙げられる。
【００６３】
１つの実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
１つの実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、以下を含む：
Ｘ９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ；並びに
配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１８１）を含むＢＣループ；式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ８はＹ、Ｆ又はＬである。
【００６５】
ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメインは、構造の特徴として、Ｘ９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループを含み得る。そのようなＦＮ３ドメインは更に、長さがアミノ酸８又は９個で、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１８１）によって定義され、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約２．５×１０−６Ｍより低いのＩＣ５０値で、及び約１．８×１０−８Ｍ〜約２．５×１０−６ＭのＩＣ５０値で、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害するＢＣループを含み得る。
【００６６】
ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメインは、
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）の配列、又は
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）の配列を更に含み、
式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、
Ｘ８はＹ、Ｆ、又はＬであり、及び
Ｘ９はＭ又はＩである。
【００６７】
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを作製して、周知の方法及び本明細書に記述の方法を用いて、そのＥＧＦＲ自己リン酸化阻害能に関して試験することができる。
【００６８】
本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインであり、単離ＦＮ３ドメインは配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７に示される配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、例えば半減期延長分子の発現及び／又はコンジュゲーションを促進するために、特定のＦＮ３ドメインのＮ−末端に連結された開始メチオニン（Ｍｅｔ）又はＣ−末端に連結されたシステイン（Ｃｙｓ）を含む。
【００７０】
本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであり、ＦＮ３ドメインは配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される。
【００７１】
単特異性ｃ−Ｍｅｔ結合分子
本発明は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断し、それにより治療応用及び診断応用において広く使用することができるフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド又はその相補的核酸、ベクター、宿主細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を提供する。
【００７２】
本発明のＦＮ３ドメインは、高親和性でｃ−Ｍｅｔに結合して、ｃ−Ｍｅｔシグナリングを阻害することから、低分子ｃ−Ｍｅｔ阻害剤と比較して、特異性及び減少したオフターゲット毒性の点で、並びに従来の抗体治療と比較して改善された組織浸透の点で恩典を提供し得る。本発明のＦＮ３ドメインは、一価であり、それゆえ他の二価分子に関して起こりうる望ましくない受容体クラスタリング及び活性化を防止する。
【００７３】
本発明の１つの実施形態は、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである。
【００７４】
本発明のＦＮ３ドメインは、本発明のＦＮ３ドメインの存在下でｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質に対するビオチニル化ＨＧＦの結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約１×１０−７Ｍより低い、約１×１０−８Ｍより低い、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−１０Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い、又は約１×１０−１２Ｍより低いＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断し得る。例示的なＦＮ３ドメインは、約２×１０−１０Ｍ〜約６×１０−８ＭのＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧのＦ結合を遮断し得る。本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非存在下でのｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較して、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。
【００７５】
本発明のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、本発明のＦＮ３ドメインの非存在下でのシグナリングレベルと比較して、ｃ−Ｍｅｔシグナリングを少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害し得る。
【００７６】
ｃ−ＭｅｔにＨＧＦが結合すると、受容体の二量体化、自己リン酸化、受容体内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、並びにＤＮＡ合成（遺伝子活性化）及び細胞周期進行又は分裂の調節に関係する多数のシグナル伝達及びトランス活性化経路の開始を刺激する。ｃ−Ｍｅｔシグナリングが阻害されると、１つ又は２つ以上の下流のｃ−Ｍｅｔシグナリング経路が阻害され、そのためｃ−Ｍｅｔの中和は、細胞増殖及び分化、血管新生、細胞運動性、及び転移の阻害を含む、様々な効果を有し得る。
【００７７】
ｃ−Ｍｅｔシグナリングは、様々な周知の方法を用いて、例えば少なくとも１つのチロシン残基Ｙ１２３０、Ｙ１２３４、及びＩ１２３５での受容体の自己リン酸化及び／又は天然若しくは合成基質のリン酸化を測定することによって測定され得る。リン酸化は、例えばＥＬＩＳＡアッセイ又はウェスタンブロットにおいてホスホチロシンに対して特異的な抗体を用いて検出することができる。チロシンキナーゼ活性に関するいくつかのアッセイ（Ｐａｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒａ  ２８３：１４３３〜４４，１９９７；Ｂａｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６２：１４３〜５０，１９９８）。
【００７８】
１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約１×１０−６Ｍより低い、例えば約１×１０−７Ｍより低い、約１×１０−８Ｍより低い、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−１０Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い、又は約１×１０−１２Ｍより低いＩＣ５０値で、ｃ−Ｍｅｔの１３４９番目の残基位置でのＨＧＦ誘発ｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
【００７９】
１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約４×１０−９Ｍ〜約１×１０−６ＭのＩＣ５０値で、ｃ−ＭｅｔのＹ１３４９のチロシンでのＨＧＦ誘発ｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害する。
【００８０】
１つの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実践される表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定するとき、約１×１０−７Ｍ、約１×１０−８Ｍ、約１×１０−９Ｍ、約１×１０−１０Ｍ、約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１２Ｍ、約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−１４Ｍ、又は約１×１０−１５Ｍに等しいか又はそれより低い解離定数（ＫＤ）でヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。いくつかの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、約３×１０−１０Ｍ〜約５×１０−８ＭのＫＤでヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。ｃ−Ｍｅｔに関するＦＮ３ドメインの親和性は、任意の適した方法を用いて実験により決定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；及び本明細書に記述される方法を参照されたい）。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用に関して測定される親和性は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定すれば、異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、好ましくは、標準化された足場タンパク質及び抗原溶液、並びに本明細書で記載される緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。
【００８１】
ｃ−Ｍｅｔに結合する本発明の例示的なＦＮ３ドメインには、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４のアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインが挙げられる。
【００８２】
１つの実施形態において、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００８３】
１つの実施形態において、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、以下を含む：
配列ＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６（配列番号１８４）を含むＣ鎖及びＣＤループ、式中
Ｘ１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、
Ｘ１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、及び
Ｘ１６は、Ｅ、又はＤであり、及び
配列ＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３（配列番号１８５）を含むＦ鎖及びＦＧループ、式中
Ｘ１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
【００８４】
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害する本発明のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）を更に含み、
式中、
Ｘ１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、及び
Ｘ１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、
Ｘ１６はＥ、又はＤであり、
Ｘ１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ２０はＧ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
【００８５】
本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインであり、ＦＮ３ドメインは配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列を含む。
【００８６】
本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断する単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであり、ＦＮ３ドメインは配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される。
【００８７】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づくライブラリからのＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテナシン−Ｃからの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの特徴である７個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示し、β鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと呼ばれる（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するために無作為化することができ、これらを用いてＥＧＦＲに結合する新規分子を選択することができる。表１は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
【００８８】
これにより、以下に記述されるライブラリＴＣＬ１又はＴＣＬ２などの、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリは、無作為化ＦＧループ、又は無作為化ＢＣ及びＦＧループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ  ＢＣループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸を、ＢＣループで多様化させてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計したライブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎ  ＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸を、ＦＧループで多様化させてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計したライブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリにおけるループでの更なる多様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって達成され得る。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループを、アミノ酸１〜２２個伸長させてもよく、又はアミノ酸１〜３個減少させてもよい。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗体重鎖における対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を提供するために、ＦＧループを、残基４〜２８個の抗体ＣＤＲ３の長さの範囲に対応するように、配列並びに長さを多様化させてもよい。例えば、追加の１、２、３、４、又は５個のアミノ酸によってループを伸長させることにより、ＦＧループの長さを更に多様化させることができる。
【００８９】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形成する無作為化された代替表面を有してもよく、それらは２つ以上のβ鎖と少なくとも１つのループを含んでもよい。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。Ｔｅｎｃｏｎの代替Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づくライブラリの設計を図４に示し、そのようなライブラリの詳細な作製は米国特許出願第１３／８５２，９３０号に記述される。
【００９０】
Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリはまた、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６番目の位置（残基の番号付けは配列番号１に対応する）の残基で置換を有し、改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎ変種などのＴｅｎｃｏｎ変種に基づいて設計されたライブラリを含む。例示的なＴｅｎｃｏｎ変種は、米国特許出願第２０１１／０２７４６２３号に記述され、配列番号１のＴｅｎｃｏｎと比較してＥ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）を含む。
【００９１】
【表１】
0006585040.tif 000002
【００９２】
Ｔｅｎｃｏｎ及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリは、無作為又は既定の組のアミノ酸を用いて、選択された残基位置で無作為化することができる。例えば、ライブラリにおいて無作為置換を有する変種を、天然に存在する２０個全てのアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用いて作製することができる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができる。あるいは、２０個全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンを使用することができる。多様化させる位置で偏りのあるアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにとって十分な万能構築ブロックとして作用する、既製の二本鎖トリプレットのライブラリを使用する。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。
【００９３】
本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片に、足場タンパク質をコードするＤＮＡ断片をライゲートして、インビトロ翻訳後に形成される、それぞれのタンパク質がそれがコードするＤＮＡに安定に会合する（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１，２８０６〜２８１０，２００４）タンパク質−ＤＮＡ複合体のプールを作製するために、ＣＩＳディスプレイを用いてＴｅｎｃｏｎライブラリなどのＦＮ３ライブラリを作製すること、及び当技術分野で周知の及び実施例で記述される任意の方法によってＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対する特異的結合に関してライブラリをアッセイすることによって単離することができる。用いることができる例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合的及び非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する同定されたＦＮ３ドメインを、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合、又はｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合などのＥＧＦＲリガンドの遮断能に関して、及び本明細書に記述の方法を用いてＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリングの阻害能に関して更に特徴を調べる。
【００９４】
本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ライブラリを作製するために鋳型として任意のＦＮ３ドメインを用いること、及び本明細書に提供される方法を用いてＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する分子に関してライブラリをスクリーニングすることによって作製することができる。用いることができる例示的なＦＮ３ドメインは、テナシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）（配列番号７５）、フィブコン（配列番号７６）、及びフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）（配列番号７７）である。標準的なクローニング及び発現技術を用いて、インビトロでライブラリを発現又は翻訳させるために、ベクターにおいてライブラリをクローニングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成する。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４，１２２９７〜１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５，６４３，７６８号）を用いることができる。ＦＮ３ドメイン変種のライブラリは、例えば任意の適したバクテリオファージの表面上に表示された融合タンパク質として発現され得る。バクテリオファージの表面上に融合ポリペプチドを表示する方法は周知である（米国特許出願第２０１１／０１１８１４４号；国際公開公報第ＷＯ２００９／０８５４６２号米国特許第６，９６９，１０８号；米国特許第６，１７２，１９７号；米国特許第５，２２３，４０９号；米国特許第６，５８２，９１５号；米国特許第６，４７２，１４７号）。
【００９５】
本発明のＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性を改善するため、並びに熱フォールディング及びアンフォールディングの可逆性を改善するためなどの特性を改善するために改変することができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を増加させるために、類似の高熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋を安定化する設計、α−へリックス性向を増加させる変異、塩架橋の改変、タンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及びコンセンサス配列の組成を含むいくつかの方法が適用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１〜３７５，２００１）。高熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）の熱安定性を改善するために置換することができる残基は、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６番目の残基位置であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記述されている。これらの残基に対応する置換を、本発明の分子を含むＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＦＮ３ドメインに組み入れることができる。
【００９６】
本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合してＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、１２２〜１３７に示される配列を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６番目の位置に対応する１つ又は２つ以上の残基位置で置換を更に含む、単離ＦＮ３ドメインである。
【００９７】
本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合してｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断し、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列を含み、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６番目の位置に対応する１つ又は２つ以上の残基位置で置換を更に含む、単離ＦＮ３ドメインである。
【００９８】
例示的な置換は、Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ、及びＥ８６Ｉの置換である（番号付けは配列番号１に従う）。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を含む。
【０１００】
ＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメイン（図１）は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較して伸長したＦＧループを有する。それゆえ、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６番目の位置に対応する残基は、配列番号２４のＦＮ３ドメインを除き、図１Ａ及び１Ｂに示されるＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメインにおける１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び９１番目の残基であり、対応する残基は、ＢＣループにおける１つのアミノ酸の挿入により、１１、１４、１７、３８、７４、及び９２番目の残基である。
【０１０１】
本発明のもう一つの実施形態は、ＥＧＦＲに特異的に結合してＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７に示される配列を含み、任意でＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）における置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を有する、単離ＦＮ３ドメインである。
【０１０２】
本発明のもう一つの実施形態は、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合してｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断し、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を含み、任意でＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）における置換Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉに対応する置換を有する、単離ＦＮ３ドメインである。
【０１０３】
タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じ又は異なる態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって課される力学的剪断力、紫外線放射、γ線照射によるなどの電離放射線、化学的若しくは熱脱水、又はタンパク質構造の破壊を引き起こし得るその他の任意の作用若しくは力によって引き起こされる変性に対して感受性がある、又は「不安定」である。分子の安定性は、標準方法を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準方法を用いて、分子の半分がアンフォールドされるセ氏での温度である、熱融解（「ＴＭ」）温度を測定することによって決定することができる。典型的には、ＴＭが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特定の三次元構造を維持する能力を変化させる。
【０１０４】
１つの実施形態において、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに結合するＦＮ３ドメインは、ＴＭの増加によって測定した場合に、改変前の同じドメインと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％又はそれより高い安定性の増加を示す。
【０１０５】
化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学変性剤には、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、ジニトロベンゼン、及び水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性及びイオン性洗浄剤、酸（例えば、塩酸（ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、及び標的化変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子の結合能などの機能的特性の喪失、又は凝集傾向、これまで溶媒が到達できなかった残基の露出、若しくはジスルフィド結合の破壊若しくは形成などの物理化学的特性に依存し得る。
【０１０６】
１つの実施形態において、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔに結合する本発明のＦＮ３ドメインは、化学変性剤として塩酸グアニジニウムを用いることによって測定した場合に、改変前の同じ足場と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％又はそれより高い安定性の増加を示す。安定性の増加は、周知の方法を用いて、塩酸グアニジンの濃度を増加させた処置の際のトリプトファン蛍光の減少の関数として測定することができる。
【０１０７】
本発明のＦＮ３ドメインは、例えば、価数を増加させ、このため標的分子結合の結合力を増加させる手段として、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重特異性又は多重特異性の足場を作製する手段として、単量体、二量体、又は多量体として作製され得る。二量体及び多量体は、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーを含めることによって単特異性、二重特異性、又は多重特異性タンパク質足場を連結させることによって作製され得る。例示的なリンカーには、（ＧＳ）２、（配列番号７８）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号７９）、（ＡＰ）２（配列番号８０）、（ＡＰ）５（配列番号８１）、（ＡＰ）１０（配列番号８２）、（ＡＰ）２０（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号８４）リンカーが挙げられる。二量体及び多量体を、ＮからＣ−方向に互いに連結させてもよい。ポリペプチドを新規連結融合ポリペプチドに接続するために天然に存在する、並び人工のペプチドリンカーを用いることは、文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。
【０１０８】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ結合分子
本発明の分子を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインは、低分子ＥＧＦＲ阻害剤と比較して、特異性及び低減されたオフターゲット毒性の点で、通並びに常の抗体治療薬と比較して改善された組織浸透の点で恩典を提供し得る。本発明は、少なくとも部分的に、本発明の分子を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインが、ＥＧＦＲ結合及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較すると、有意に改善された相乗的阻害効果を提供するという意外な発見に基づいている。分子は、腫瘍への浸透及び保持を最大にするためにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対して特異的親和性となるように適合され得る。
【０１０９】
本発明の１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する。
【０１１０】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと本発明の任意のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを直接又はリンカーを介して共有的に連結させることによって作製され得る。したがって、二重特異性分子の第１のＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに関する上記の特徴を有し得て、二重特異性分子の第２のＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに関する上記の特徴を有し得る。
【０１１１】
１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約２．５×１０−６Ｍより低いＩＣ５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約１．５×１０−６Ｍより低いＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
【０１１２】
もう１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約１．８×１０−８Ｍ〜約２．５×１０−６ＭのＩＣ５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約４×１０−９Ｍ〜約１．５×１０−６ＭのＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する。
【０１１３】
もう一つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の第１のＦＮ３ドメインは、約１×１０−８Ｍより低い解離定数（ＫＤ）でヒトＥＧＦＲに結合し、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の第２のＦＮ３ドメインは、約５×１０−８Ｍより低いのＫＤでヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。
【０１１４】
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に結合する二重特異性分子において、第１のＦＮ３ドメインは、約２×１０−１０Ｍ〜約１×１０−８ＭのＫＤでヒトＥＧＦＲに結合し、第２のＦＮ３ドメインは、約３×１０−１０Ｍ〜約５×１０−８ＭのＫＤでヒトｃ−Ｍｅｔに結合する。
【０１１５】
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに関する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性は、単特異性分子に関して先に記述したように決定することができる。
【０１１６】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、Ａ４３１細胞を使用し、第１のＦＮ３ドメインの存在下又は非存在下でインキュベートしたＡ４３１細胞において６００ｎＭのストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲートを用いて結合したビオチニル化ＥＧＦからの蛍光量を検出するアッセイにおいて、約１×１０−９Ｍ〜約１．５×１０−７ＭのＩＣ５０値でＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断し得る。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第１のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、第１のＦＮ３ドメインの非存在下でのＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合と比較するとき、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。
【０１１７】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第２のＦＮ３ドメインは、第２のＦＮ３ドメインの存在下でｃ−Ｍｅｔ−Ｆｃ融合タンパク質に対するビオチニル化ＨＧＦの結合の阻害を検出するアッセイにおいて、約２×１０−１０Ｍ〜約６×１０−８ＭのＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断し得る。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の第２のＦＮ３ドメインは、同じアッセイ条件を用いて、第２のＦＮ３ドメインの非存在下でのｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合と比較するとき、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％遮断し得る。
【０１１８】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、同じアッセイ条件を用いて、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の非存在下でのシグナリングレベルと比較するとき、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナリングを少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％阻害し得る。
【０１１９】
ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナリングは、単特異性分子に関して先に記述した様々な周知の方法を用いて測定され得る。
【０１２０】
ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインとを含む本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１及び第２のＦＮ３ドメインの混合物によって観察される相乗的阻害と比較するとき、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔシグナリングの相乗的阻害及び腫瘍細胞増殖の有意な増加をもたらす。相乗的阻害は、例えば、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子による、及び１つがＥＧＦＲに結合し、他方がｃ−Ｍｅｔに結合する２つの単特異性分子の混合物によるＥＲＫリン酸化の阻害を測定することによって評価され得る。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、２つの単特異性ＦＮ３ドメインの混合物に関するＩＣ５０値と比較すると、少なくとも約１００倍小さい、例えば少なくとも５００、１０００、５０００、又は１０，０００倍小さいＩＣ５０でＥＲＫリン酸化を阻害し得るが、このことは、２つの単特異性ＦＮ３ドメインの混合物と比較して、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子では効力が少なくとも１００倍増加したことを示す。例示的な二重特異性ＥＧＦＲ−ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、約５×１０−９Ｍ又はそれより低いＩＣ５０値でＥＲＫリン酸化を阻害し得る。ＥＲＫのリン酸化は、標準的な方法及び本明細書に記述の方法を用いて測定することができる。
【０１２１】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、７．５ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦを添加した１０％ＦＢＳを含む培地によって細胞増殖が誘導される、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインとの混合物によるＨ２９２細胞増殖の阻害のＩＣ５０値と比較して、少なくとも３０倍低いＩＣ５０値でＨ２９２細胞増殖を阻害し得る。本発明の二重特性分子は、第１のＦＮ３ドメインと第２のＦＮ３ドメインの混合物による腫瘍細胞増殖阻害のＩＣ５０値と比較して、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又は約１０００倍低いＩＣ５０値で腫瘍細胞増殖を阻害し得る。腫瘍細胞増殖の阻害は、標準的な方法及び本明細書に記述される方法を用いて測定することができる。
【０１２２】
本発明のもう１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断し、
第１のＦＮ３ドメインは、
Ｘ９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含むＦＧループ；及び
配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１８１）を含むＢＣループであって；
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ８はＹ、Ｆ、又はＬであるＢＣループとを含み、並びに
第２のＦＮ３ドメインは、
配列ＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６（配列番号１８４）を含むＣ鎖及びＣＤループ、式中
Ｘ１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、
Ｘ１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、及び
Ｘ１６はＥ、又はＤであり、及び
配列ＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３（配列番号１８５）を含むＦ鎖及びＦＧループ、式中
Ｘ１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ２０はＧ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
【０１２３】
もう一つの実施形態において、二重特異性分子は、以下の配列を含む、ＥＧＦＲに結合する第１のＦＮ３ドメインを含む：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）の配列、又は
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）の配列であって
式中、配列番号Ｘ及びＸにおいて、
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、
Ｘ８はＹ、Ｆ、又はＬであり、及び
Ｘ９はＭ又はＩである。
【０１２４】
もう一つの実施形態において、二重特異性分子は、以下の配列を含む、ｃ−Ｍｅｔに結合する第２のＦＮ３ドメインを含む：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）であって、
式中、
Ｘ１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、及び
Ｘ１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、
Ｘ１６はＥ、又はＤであり、
Ｘ１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ２０はＧ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
【０１２５】
例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、又は１３８〜１６５に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、Ｘ９がＭ若しくはＩである、配列ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬ（配列番号１７９）、又は配列ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０）を含む、ＥＧＦＲに結合する第１のＦＮ３ドメインのＦＧループなどの、ＥＧＦＲ自己リン酸化の阻害などのその機能的特徴に関連する一定の構造的特徴を含む。
【０１２７】
１つの実施形態において、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約８×１０−７Ｍより低いＩＣ５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、
１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約８．４×１０−７Ｍより低いＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、
７．５ｎｇ  ＨＧＦを含む１０％ＦＢＳによって細胞増殖が誘導される、ＨＧＦによって誘発されるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を、約９．５×１０−６Ｍより低いＩＣ５０値で阻害し、
約２．０×１０−８Ｍより低いＫＤでＥＧＦＲに結合し、
約２．０×１０−８Ｍより低いＫＤでｃ−Ｍｅｔに結合する。
【０１２８】
もう１つの実施形態において、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、
５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＡ４３１細胞において測定されるとき、約４．２×１０−９Ｍ〜８×１０−７ＭのＩＣ５０値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、
１００ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において測定されるとき、約２．４×１０−８Ｍ〜約８．４×１０−７ＭのＩＣ５０値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し、
７．５ｎｇ  ＨＧＦを含む１０％ＦＢＳによって細胞増殖が誘導される、ＨＧＦによって誘発されるＮＣＩ−Ｈ２９２細胞増殖を、約２．３×１０−８Ｍ〜約９．５×１０−６ＭのＩＣ５０値で阻害し、
約２×１０−１０Ｍ〜約２．０×１０−８ＭのＫＤでＥＧＦＲに結合し、
約１×１０−９Ｍ〜約２．０×１０−８ＭのＫＤでｃ−Ｍｅｔに結合する。
【０１２９】
１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、以下の配列を含むＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２）であって、式中
Ｘ１は、Ｄであり、
Ｘ２は、Ｄであり、
Ｘ３は、Ｐであり、
Ｘ４は、存在せず、
Ｘ５は、Ｈ、又はＷであり、
Ｘ６は、Ａであり、
Ｘ７は、Ｆであり、
Ｘ８は、Ｙであり、及び
Ｘ９はＭ又はＩである、と、
以下の配列を含むｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、
ＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）であって
式中、
Ｘ１０は、Ｗであり、
Ｘ１１は、Ｆであり、
Ｘ１２は、Ｆであり、
Ｘ１３は、Ｖ、又はＬであり、
Ｘ１４は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ１５は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ１６は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ１７は、Ｖであり、
Ｘ１８は、Ｎであり、
Ｘ１９は、Ｌ、又はＭであり、
Ｘ２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ２２は、Ｉであり、及び
Ｘ２３が、Ｐである、とを含む。
【０１３０】
例示的な二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、配列番号５７、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、及び６８に示される配列を有する分子である。
【０１３１】
本発明の二重特異性分子は、上記のＴｅｎｃｏｎ（配列番号１）における１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び８６番目の位置に対応する、第１のＦＮ３ドメイン及び／又は第２のＦＮ３ドメインにおける１つ又は２つ以上の残基位置での置換と、２９番目の位置での置換とを更に含みうる。例示的な置換は、Ｅ１１Ｎ、Ｅ１４Ｐ、Ｌ１７Ａ、Ｅ３７Ｐ、Ｎ４６Ｖ、Ｇ７３Ｙ、Ｅ８６Ｉ、及びＤ２９Ｅの置換である（番号付けは配列番号１に従う）。当業者は、以下に記載されるその側鎖が関連するアミノ酸ファミリー内でのアミノ酸などの、他のアミノ酸を置換のために用いることができることを認識するであろう。作製された変種を、本明細書に記述の方法を用いて、その安定性及びＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔに対する結合に関して試験することができる。
【０１３２】
１つの実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲに特異的に結合する第１のＦＮ３ドメインと、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２のＦＮ３ドメインとを含み、第１のＦＮ３ドメインは、以下の配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ２４ＶＴＸ２５ＤＳＸ２６ＲＬＳＷＤＤＰＸ２７ＡＦＹＸ２８ＳＦＬＩＱＹＱＸ２９ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ３０ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＸ３１ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ３２ＲＧＬＰＬＳＡＸ３３ＦＴＴ（配列番号１８７）であって、式中
Ｘ２４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ２５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ２６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ２７は、Ｈ、又はＷであり、
Ｘ２８は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ２９は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ３０は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ３１はＧ、又はＹであり、
Ｘ３２は、Ｍ、又はＩであり、及び
Ｘ３３は、Ｅ、又はＩである、配列を含み、
及び第２のＦＮ３ドメインは、配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ３４ＶＴＸ３５ＤＳＸ３６ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＸ３７ＦＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ＧＸ４１ＡＩＸ４２ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ４３Ｘ４４ＶＫＧＧＸ４５ＩＳＰＰＬＳＡＸ４６ＦＴＴ（配列番号１８８）であって、式中、
Ｘ３４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ３５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ３６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ３７は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ３８は、Ｖ、又はＬであり、
Ｘ３９は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ４０は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ４１は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ４２は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ４３は、Ｌ、又はＭであり、
Ｘ４４は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ４５は、Ｓ、又はＫであり、及び
Ｘ４６は、Ｅ、又はＩである、配列を含む。
【０１３３】
他の実施形態において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも８７％同一であるアミノ酸配列を含む第１のＦＮ３ドメインと、配列番号４１のアミノ酸配列と少なくとも８３％同一であるアミノ酸配列を含む第２のＦＮ３ドメインとを含む。
【０１３４】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ、ＦＮ３ドメイン含有分子は、腫瘍での蓄積を最大にするためにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対する特異的親和性となるように適合され得る。
【０１３５】
本発明のもう１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む単離二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断し、第１のＦＮ３ドメイン及び第２のＦＮ３ドメインは、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリから単離される。
【０１３６】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと本発明のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを周知の方法を用いて共有的に連結させることによって作製され得る。ＦＮ３ドメインは、リンカー、例えばポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーによって連結され得る。例示的なリンカーには、（ＧＳ）２、（配列番号７８）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号７９）、（ＡＰ）２（配列番号８０）、（ＡＰ）５（配列番号８１）、（ＡＰ）１０（配列番号８２）、（ＡＰ）２０（配列番号８３）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）５ＡＡＡ（配列番号８４）リンカーが挙げられる。ポリペプチドを新規連結融合ポリペプチドに接続するために天然に存在する、並びに人工のペプチドリンカーを用いることは、文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，５２６０〜５２６８，１９８９；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８，７２５〜７３１，１９９５；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＆  Ｓａｕｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１０９〜１１６，１９９６；米国特許第５，８５６，４５６号）。本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、第１のＦＮ３ドメインのＣ−末端から第２のＦＮ３ドメインのＮ−末端に、又は第２のＦＮ３ドメインのＣ−末端から第１のＦＮ３ドメインのＮ−末端に共に連結され得る。任意のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインが、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに共有的に連結され得る。例示的なＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、及び１２２〜１３７に示されるアミノ酸配列を有するドメインであり、例示的なｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号３２〜４９、及び１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するドメインである。二重特異性分子に連結されるＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインは、そのＮ−末端で開始メチオニン（Ｍｅｔ）を更に含み得る。
【０１３７】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子の変種は、本発明の範囲内である。例えば、得られた変種が、親分子と比較して、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔに対して類似の選択性及び効力を保持する限り、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子に置換を行うことができる。例示的な改変は、例えば、結果として親分子の特徴と類似の特徴を有する変種が得られる保存的置換である。保存的置換とは、その側鎖が関連するアミノ酸ファミリー間で起こる置換である。遺伝子コードされるアミノ酸は、４つのファミリーに分類することができる：（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として共に分類される。又は、アミノ酸のレパートリーを、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン）、ただしセリン及びトレオニンは、任意で脂肪族−ヒドロキシルとして個別に分類される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）；（５）アミド（アスパラギン、グルタミン）；及び（６）イオウ含有（システイン及びメチオニン）（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１）として分類することができる。二重特異性分子の特性を改善するために、異なるクラス間のアミノ酸のアミノ酸残基の置換を伴う非保存的置換を、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子に行うことができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化が機能相同体をもたらすか否かは、本明細書に記載のアッセイを用いて、修飾ポリペプチド又は断片が、非修飾いポリペプチド又は断片と同様の様式で反応を生じる能力を評価することによって、容易に決定され得る。１つより多くの置換が起こっているペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、同様に容易に試験することができる。
【０１３８】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、例えば標的分子結合の価数及びその結果として結合力を増加させる手段として、二量体又は多量体として作製され得る。多量体は、例えば、周知の方法を用いてアミノ酸リンカーを含めることによって、１つ又は２つ以上のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと１つ又は２つ以上のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインとを連結して、ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔのいずれかに対して少なくとも二重特異性である少なくとも３つの個々のＦＮ３ドメインを含む分子を形成することによって作製され得る。
【０１３９】
本発明のもう１つの実施形態は、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む二重特異性ＦＮ３ドメイン含有分子であり、第１のＦＮ３ドメインは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、第２のＦＮ３ドメインは、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断し、配列番号５０〜７２、又は１０６に示されるアミノ酸配列を含む分子である。
【０１４０】
半減期延長部分
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子又は単特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインは、例えば共有的相互作用を介して、他のサブユニットを組み入れてもよい。本発明の１つの態様において、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、半減期延長部分を更に含む。例示的な半減期延長部分は、アルブミン、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン及びその断片及び類似体、並びにＦｃ領域である。例示的なアルブミン結合ドメインは、配列番号１１７に示される。
【０１４１】
抗体定常領域の全て又は一部を、本発明の分子に結合させて、抗体様特性、特にＣ１ｑ結合などのＦｃエフェクター機能、補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどの、Ｆｃ領域に関連する特性を付与してもよく、これらの活性に関与するＦｃにおける残基を修飾することによって更に修飾することができる（論評に関しては、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，６８５〜６９１，２００９を参照されたい）。
【０１４２】
本発明の二重特異性分子には、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖）などの更なる部分を、所望の特性を得るために組み込むことができる。これらの部分は、タンパク質足場コード配列との直接融合体であってもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって作製してもよい。あるいは、周知の化学カップリング方法を用いて、組み換え技術によって産生された本発明の分子にその部分を結合させることができる。
【０１４３】
周知の方法を用いて、システイン残基を分子のＣ−末端に組み入れて、ＰＥＧ化した基をシステインに結合させることによって、ＰＥＧ化部分を、例えば、本発明の二重特異性又は単特異性分子に付加してもよい。Ｃ−末端システインを有する例示的な二重特異性分子は、配列番号１７０〜１７８に示されるアミノ酸配列を有する分子である。
【０１４４】
追加の部分を組み入れた本発明の単特異性又は二重特異性分子を、いくつかの周知のアッセイによって、機能性に関して比較してもよい。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃドメイン変種を組み入れることにより変化した単特異性及び／又は二重特異性分子特性を、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、又はＦｃＲｎ受容体などの可溶性型受容体を用いるＦｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイしてもよく、又は例えばＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを測定する周知の細胞系アッセイを用いて、又はインビボモデルにおける本発明の分子の薬物動態特性を評価してアッセイしてもよい。
【０１４５】
ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、インビトロ転写／翻訳のために使用される直鎖ＤＮＡ配列、その組成物の真核、原核、又はフィラメントファージ発現、分泌及び／又はディスプレイと適合するベクター、又はその定方向変異原を含む、単離ポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖ＤＮＡ配列の一部として、本発明のＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする核酸を提供する。．特定の例示ポリヌクレオチドが本明細書で開示されるが、しかしながら、所与の発現システム中の遺伝コードの縮重又はコドン選択性を考えたときに、本発明の結合タンパク質をコードする他のポリヌクレオチド、及び本発明のタンパク質足場のライブラリも、また本発明の範囲内である。
【０１４６】
本発明の１つの実施形態は、配列番号１８〜２９、１０７〜１１０、又は１２２〜１３７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＲに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドである。
【０１４７】
本発明の１つの態様は、配列番号９７〜９８、又は１６８〜１６９のポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドである。
【０１４８】
本発明の１つの実施形態は、配列番号３２〜４９、又は１１１〜１１４に示される配列のアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドである。
【０１４９】
本発明の１つの実施形態は、配列番号５０〜７２、１０６、１１８〜１２１、又は１３８〜１６５のアミノ酸配列を有する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子をコードする単離ポリヌクレオチドである。
【０１５０】
本発明の１つの実施形態は、配列番号１１５〜１１６、又は１６６〜１６７のポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドである。
【０１５１】
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により作製され、完全な一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて慣用的なクローニングを行うなどの他の技術により作製され得る。所定の公知の配列のポリヌクレオチドを作製又は得る技術は、当技術分野で周知である。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター又はエンハンサー配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列等などの、少なくとも１つの非コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製又は検出を容易にするためのヘキサヒスチジンタグ又はＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃなどの融合タンパク質パートナー、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードする追加のアミノ酸をコードする追加の配列も含むことができる。
【０１５３】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１つ含むベクターである。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって所定の生物又は遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するのに適した他の任意のベクターであり得る。そのようなベクターは、そのようなベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御、調節、誘発、又は許容することができる核酸配列エレメントを含む発現ベクターであり得る。このようなエレメントは、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所定の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系は、当該技術分野において公知の細胞に基づく系、又は無細胞系であり得る。
【０１５４】
本発明のもう１つの実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。本発明の単特異性ＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、任意で、当技術分野で周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、又は不死化細胞のクローン集団によって作製することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７〜２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４〜２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７〜２００１）を参照されたい。
【０１５５】
発現のために選択される宿主細胞は、哺乳動物起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ  Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。あるいは、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することができない種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然若しくは改変大腸菌種（E. coli spp）、クレブシエラ種（Klebsiella spp）、又はシュードモナス種（Pseudomonas spp）の菌株などの原核細胞又は生物から選択され得る。
【０１５６】
本発明の別の実施形態は、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメイン、又は単離二重特異性ＥＧＦＲ−ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子が発現される条件で、本発明の単離宿主細胞を培養することと、ドメイン又は分子を精製することとを含む、ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する本発明の単離ＦＮ３ドメイン、又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子を作製する方法である。
【０１５７】
ＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔに特異的に結合するＦＮ３ドメイン又は本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、周知の方法、例えばプロテインＡ精製、硫酸アンモニウム、又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、組み換え型細胞培養から精製することができる。
【０１５８】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子及びＥＧＦＲ結合若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの使用
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ヒト疾患又は細胞、組織、臓器、体液、若しくは一般的に宿主における特定の病態を診断、モニター、調節、処置、軽減、発生を予防するために役立つ、又は症状を低減するために用いられ得る。本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【０１５９】
本発明の１つの態様は、本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに細胞を接触させることを含む、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを発現する細胞の増殖又は繁殖を阻害する方法である。
【０１６０】
本発明のもう１つの態様は、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又はがん細胞の増殖又は転移が阻害されるように、本発明の単離二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの有効量を対象に投与することを含む、対象におけるＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍又はがん細胞の増殖又は転移を阻害する方法である。
【０１６１】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン若しくはｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ、又は他のＥＧＦＲリガンド又はＨＧＦの異常な活性化又は産生を特徴とする任意の疾患若しくは障害、又は悪性疾患若しくはがんを伴ってもよく又は伴わなくてもよいＥＧＦＲ若しくはｃ−Ｍｅｔ発現に関連する障害、を処置するために用いることができ、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦ、又は他のＥＧＦＲリガンド、又はＨＧＦの異常な活性化及び／又は産生は、疾患又は障害を有する又はその素因を有する対象の細胞又は組織に存在する。
【０１６２】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子は、がん及び良性腫瘍を含む腫瘍の処置のために用いられ得る。本発明の二重特異性分子による処置に対して感受性があるがんには、ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔを過剰発現するがんが挙げられる。本発明の二重特異性分子による処置に対して感受性がある例示的ながんには、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺腺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、胃がん、胸腺のがん、結腸がん、甲状腺がん、肝臓がん、又は散発性若しくは遺伝性の乳頭状腎細胞がん（ＰＲＣＣ）が挙げられる。
【０１６３】
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を遮断する本発明のＦＮ３ドメインは、がん及び良性腫瘍を含む腫瘍の処置のためであり得る。本発明のｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性があるがんには、ｃ−Ｍｅｔを過剰発現するがんが挙げられる。本発明のＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性がある例示的ながんには、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、及び胸腺のがんが挙げられる。
【０１６４】
ＥＧＦＲに特異的に結合して、ＥＧＦＲに対するＥＧＦの結合を遮断する本発明のＦＮ３ドメインは、がん及び良性腫瘍を含む腫瘍の処置のために用いられ得る。本発明のＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性があるがんには、ＥＧＦＲ又は変種を過剰発現するがんが挙げられる。本発明のＦＮ３ドメインによる処置に対して感受性がある例示的ながんには、上皮細胞がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、結腸直腸がん、肛門がん、前立腺がん、腎臓がん、膀胱がん、頭頚部がん、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、口腔がん、食道がん、膣がん、子宮頚がん、脾臓のがん、精巣がん、及び胸腺のがんが挙げられる。
【０１６５】
投与／医薬組成物
治療的用途に関して、本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、医薬的に許容される担体中で活性成分としてドメイン又は分子の有効量を含む医薬組成物として調製され得る。用語「担体」は、それと共に活性化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑剤及び着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子の濃度は幅広く変化してよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は約１重量％又は少なくとも約１重量％から最大で１５又は２０重量％まで変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル、及び他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ  ２００６，Ｐａｒｔ  ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｐ  ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【０１６６】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの治療用途のための投与様式は、非経口投与、例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺、経粘膜（口腔、鼻内、膣内、直腸）などの、宿主に作用物質を送達する任意の適した経路であり得て、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル剤、粒剤中での製剤を用いて、シリンジ、植え込みデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ、又は当技術分野で周知の、当業者によって認識される他の手段に含まれ得る。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【０１６７】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＦＮ３ドメインを含むように調製することができる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リンゲル液と、約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、例えば約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法が周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに、より詳細に記載されている。
【０１６８】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、保存のために凍結乾燥して、使用前に適した担体中で溶解することができる。この技術は、通常のタンパク調製物に関して有効であることが示されており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解技術を用いることができる。
【０１６９】
本発明の二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを、対象に１回投与してもよく、又は投与を、例えば１日後、２日後、３日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、１か月後、５週間後、６週間後、７週間後、２か月後、又は３か月後に繰り返してもよい。反復投与は、同じ用量又は異なる用量で行うことができる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれより多く繰り返してもよい。
【０１７０】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、第２の治療物質と併用して、同時に、連続的に、又は個別に投与され得る。第２の治療物質は、化学療法剤、抗血管新生剤、又は細胞障害剤であり得る。がんを処置するために使用するとき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、手術、放射線療法、化学療法、又はその併用などの通常のがん治療と組み合わせて用いられ得る。本発明のＦＮ３ドメインと併用して用いることができる例示的な作用物質は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＶＥＧＦのアンタゴニスト、並びにＩｒｅｓｓａ（登録商標）（ゲフィチニブ）及びＴａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）などのタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤である。
【０１７１】
本発明は一般論として記述されてきているが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。
【実施例】
【０１７２】
実施例１．Ｔｅｎｃｏｎライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）は、ヒトテナシン−Ｃからの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様足場構造のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を無作為化して、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択することができる。
【０１７３】
Ｔｅｎｃｏｎ
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１）
【０１７４】
ＴＣＬ１ライブラリの構築
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のＦＧループのみを無作為化するように設計されたライブラリＴＣＬ１を、ｃｉｓディスプレイシステムで用いるために構築した（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２）。このシステムにおいて、Ｔａｃプロモーター、Ｔｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメント、及びｏｒｉエレメントの配列を組み入れる一本鎖ＤＮＡを作製する。インビトロ転写／翻訳系で発現させると、それがコードされるＤＮＡに対してｃｉｓで結合したＴｅｎｃｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、以下に記述されるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。
【０１７５】
ｃｉｓディスプレイで用いるためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲの連続ラウンドによって得られ、最終的に直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子が二等分して産生された；５’断片は、プロモーターとＴｅｎｃｏｎ配列とを含むが、３’断片はｒｅｐＡ遺伝子とｃｉｓ及びｏｒｉエレメントとを含む。これらの二等分分子を制限酵素消化によって結合させて、完全な構築物を産生する。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号８６）のみに無作為アミノ酸を組み入れるように設計された。このライブラリの構築にＮＮＳコドンを用い、それによって２０個全てのアミノ酸と１つの終止コドンがＦＧループにおそらく組み入れられた。ＴＣＬ１ライブラリは、多様性を更に増加させるために、それぞれが異なる長さの、７〜１２残基の無作為化ＦＧループを有する、６個の個別のサブライブラリを含む。Ｔｅｎｃｏｎに基づくライブラリの設計を表２に示す。
【０１７６】
【表２】
0006585040.tif 000003
＊ＴＡＰＤＡＡＦＤ：配列番号１の残基２２〜２８
＊＊ＫＧＧＨＲＳＮ：配列番号８６
Ｘは、ＮＮＳコドンによってコードされる縮重アミノ酸を指す。
＃は、本文に記述される「設計されたアミノ酸分布」を指す。
【０１７７】
ＴＣＬ１ライブラリを構築するために、連続ラウンドのＰＣＲを行ってＴａｃプロモーターを付加して、ＦＧループに縮重を作製し、最終的なアセンブリのために必要な制限部位を付加した。第一に、ＦＧループの５’でプロモーター配列及びＴｅｎｃｏｎ配列を含むＤＮＡ配列を、２段階のＰＣＲによって作製した。完全なＴｅｎｃｏｎ遺伝子配列に対応するＤＮＡをＰＣＲ鋳型として、プライマーＰＯＰ２２２０（配列番号２）及びＴＣ５’ｔｏＦＧ（配列番号３）と共に用いた。この反応から得られたＰＣＲ産物を、プライマー１３０ｍｅｒ（配列番号４）及びＴｃ５’ｔｏＦＧと共に次のラウンドのＰＣＲ増幅の鋳型として用いて、Ｔｅｎｃｏｎに対する５’及びプロモーターの付加を完了した。次に、第一段階で産生されたＤＮＡ産物を縮重ヌクレオチドを含むフォワードプライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）、及びリバースプライマーＴＣＦ７（配列番号６）、ＴＣＦ８（配列番号７）、ＴＣＦ９（配列番号８）、ＴＣＦ１０（配列番号９）、ＴＣＦ１１（配列番号１０）、又はＴＣＦ１２（配列番号１１）によって、増幅することによって、多様性をＦ：Ｇループに導入した。ＰＣＲサイクルを最少にして、ライブラリの多様性を最大にするために、それぞれのサブライブラリに関して、１００μＬのＰＣＲ反応を少なくとも８回実施した。このＰＣＲ産物少なくとも５μｇを、ゲル精製して、プライマーＰＯＰ２２２２（配列番号５）及びＰＯＰ２２３４（配列番号１２）による次のＰＣＲ段階に用い、Ｔｅｎｃｏｎ配列の３’末端に６×Ｈｉｓタグ及びＮｏｔＩ制限部位が付加された。このＰＣＲ反応は、わずか１５回のＰＣＲサイクル及び鋳型ＤＮＡ少なくとも５００ｎｇを用いて行われた。得られたＰＣＲ産物をゲル精製して、ＮｏｔＩ制限酵素によって消化して、Ｑｉａｇｅｎカラムで精製した。
【０１７８】
ライブラリの３’断片は、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含む一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応は、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーと共にこのＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物を、ＰｓｐＯＭＩで終夜消化して、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの５’部分をｒｅｐＡ遺伝子を含む３’ＤＮＡにライゲートするために、５’ＤＮＡの２ｐｍｏｌを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下で３’ｒｅｐＡ  ＤＮＡの等モル量にライゲートした。３７℃で終夜ライゲーション後、ライゲートしたＤＮＡの少量をゲルに載せてライゲーション効率をチェックした。ライゲートしたライブラリ産物を、１２のＰＣＲ増幅に分けて、プライマー対ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて１２サイクルのＰＣＲ反応を行った。ＴＣＬ１ライブラリの各サブライブラリに関するＤＮＡの収率は、３２〜３４μｇの範囲であった。
【０１７９】
ライブラリの品質を評価するために、ワーキングライブラリの少量を、プライマーＴｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）によって増幅して、リガーゼ非依存的クローニングにより改変ｐＥＴベクターにおいてクローニングした。プラスミドＤＮＡをＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）コンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換して、無作為に採取したコロニー９６個をＴ７プロモータープライマーを用いてシークエンシングした。同一の配列は認められなかった。全体的に、フレームシフト変異を有することなく完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を有したのは、クローンのおよそ７０〜８５％であった。終止コドンを有するクローンを除く機能的配列の割合は、５９％〜８０％であった。
【０１８０】
ＴＣＬ２ライブラリの構築
ＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループの両方が無作為化されて、それぞれの位置でのアミノ酸の分布が厳密に制御されているＴＣＬ２ライブラリを構築した。表３は、ＴＣＬ２ライブラリにおける所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は２つの目的を有した。第一に、ライブラリを、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析及び／又はホモロジーモデリングに基づいて、Ｔｅｎｃｏｎのフィールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予測される残基に向けて偏らせた。例えば、２９番目の位置は、Ｔｅｎｃｏｎが折り畳まれた際に疎水性コアの中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブセットのみとなるように固定した。第二の設計は、高親和性結合体を効率よく産生するために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に選択的に認められる残基の分布となるようにアミノ酸分布を偏らせることを含んだ（（Ｂｉｒｔａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７７：１５１８〜２８，２００８；Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １６：４７６〜８４，２００７）。この目標に向かって、表３の「設計された分布」は、以下の分布を指す：６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、及び４％バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び終止コドンが含まれない。
【０１８１】
【表３】
0006585040.tif 000004
＊残基の番号は、配列番号１のＴｅｎｃｏｎ配列に基づく。
【０１８２】
ＴＣＬ２ライブラリの５’断片は、プロモーターと、ライブラリのプールとして化学合成された（Ｓｌｏｎｉｎｇ  Ｂｉｏｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）のコード配列とを含んだ。このＤＮＡプールは、少なくとも１×１０１１個の異なるメンバーを含んだ。ＲｅｐＡとのライゲーションのために、断片の末端で、ＢｓａＩ制限部位を設計に含めた。
【０１８３】
ライブラリの３’断片は、６×Ｈｉｓタグ、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、及びｃｉｓエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含む一定のＤＮＡ配列であった。ＤＮＡを、既存のＤＮＡ鋳型（上記）及びプライマーＬＳ１００８（配列番号１７）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて、ＰＣＲ反応によって調製した。完全なＴＣＬ２ライブラリをアセンブルするために、ＢｓａＩ消化５’ＴｅｎｃｏｎライブラリＤＮＡの全体で１μｇを、同じ酵素による制限消化によって調製した３’断片３．５μｇにライゲートした。終夜ライゲーションの後、ＤＮＡをＱｉａｇｅｎカラムによって精製して、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによってＤＮＡを定量した。ライゲートしたライブラリ産物を、プライマー対ＰＯＰ２２５０（配列番号１３）及びＤｉｄＬｉｇＲｅｖ（配列番号１４）を用いて１２サイクルのＰＣＲ反応によって増幅した。それぞれがライゲートしたＤＮＡ産物５０ｎｇを鋳型として含む、全体で７２回の反応を行った。ＴＣＬ２ワーキングライブラリＤＮＡの総収率は、約１００μｇであった。ライブラリＴＣＬ１に関して先に記述したように、少量のワーキングライブラリをサブクローニングして、シークエンシングした。同一の配列は認められなかった。フレームシフト変異を有することなく完全なプロモーター及びＴｅｎｃｏｎコード配列を含んだのは、配列の約８０％であった。
【０１８４】
ＴＣＬ１４ライブラリの構築
上部（ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧ）及び下部（ＡＢ、ＣＤ、及びＥＦ）ループ、例えば、ＦＮ３ドメインにおける報告された結合表面は、ＦＮ３構造の中心を形成するβ鎖によって分離される。ループのみによって形成された表面とは異なる形状を有するＦＮ３ドメインの２つの「側面」に存在する代替表面を、ＦＮ３ドメインの１つの側面で２つの逆平行β鎖、すなわちＣ鎖とＦβ鎖、及びＣＤループとＦＧループによって形成して、本明細書において以降Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼ぶ。
【０１８５】
Ｔｅｎｃｏｎの代替表面を無作為化するライブラリは、図４に示されるように、Ｃ鎖とＦ鎖の表面露出残基並びにＣＤ及びＦＧループの一部を無作為に選択することによって作製した。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号１）と比較して以下の置換を有するＴｅｎｃｏｎ変種、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号９９）を用いて、ライブラリを作製した：Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉ。このライブラリを構築するために用いた方法の詳細な記述は、米国特許出願第１３／８５２，９３０号に記述される。
【０１８６】
実施例２：ＥＧＦＲに結合してＥＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ライブラリのスクリーニング
ｃｉｓディスプレイを用いて、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリからＥＧＦＲ結合ドメインを選択した。ＩｇＧ１  Ｆｃに融合したＥＧＦＲの組み換え型ヒト細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、標準的な方法を用いてビオチニル化して、これをパニングのために用いた（配列番号７３の完全長ＥＧＦＲの２５〜６４５番目の残基）。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）に関して、ライブラリＤＮＡ  ２〜６μｇを０．１ｍＭ  ｃｏｍｐｌｅｔｅアミノ酸、１×Ｓ３０プレミクス成分、及びＳ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）３０μＬと共に全量１００μＬ中で３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキング溶液（２％ウシ血清アルブミン、１００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、及び１ｍｇ／ｍＬヘパリンを添加したＰＢＳ、ｐＨ７．４）４５０μＬを添加して、反応を氷中で１５分間インキュベートした。ＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体は、ブロッキング溶液中で組み換え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）とビオチニル化組み換え型ＥＧＦＲ−Ｆｃとを、室温で１時間混合することによって、ＥＧＦＲ対ＥＧＦのモル比１：１及び１０：１でアセンブルされた。結合に関して、ブロックされたＩＴＴ反応物５００μＬをＥＧＦＲ−Ｆｃ：ＥＧＦ複合体１００μＬと混合して、室温で１時間インキュベートした後、結合した複合体をニュートラアビジン又はストレプトアビジン磁気ビーズによって吸引した。非結合ライブラリメンバーを、ＰＢＳＴ及びＰＢＳで連続的に洗浄することによって除去した。洗浄後、６５℃に１０分間加熱することによって、結合した複合体からＤＮＡを溶出させ、ＰＣＲによって増幅し、更なるパニングラウンドのために制限酵素消化及びライゲーションによってＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片に結合させた。各ラウンドにおいて、標的ＥＧＦＲ−Ｆｃの濃度を２００ｎＭから５０ｎＭへと連続的に低下させて、洗浄のストリンジェンシーを増加させることによって、高親和性結合体を単離した。ラウンド４及び５において、非結合及び弱く結合したＦＮ３ドメインを、ＰＢＳ中で１０倍モル過剰量の非ビオチニル化ＥＧＦＲ−Ｆｃの存在下で終夜洗浄することによって除去した。
【０１８７】
パニング後、選択したＦＮ３ドメインをオリゴＴｃｏｎ５ｎｅｗ２（配列番号１５）及びＴｃｏｎ６（配列番号１６）を用いてＰＣＲによって増幅し、リガーゼ非依存的クローニングサイトを含めるように改変されたｐＥＴベクターにサブクローニングして、標準的な分子生物学技術を用いて大腸菌において可溶性で発現させるためにＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換した。精製及び検出を可能にするために、Ｃ−末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインに付加した。１ｍＬの９６ウェルブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを添加した２ＹＴ培地中で、培養物を３７℃で吸光度が０．６〜０．８となるまで増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加し、その時点で温度を３０℃に低下させた。およそ１６時間後に細胞を遠心沈降させて回収し、−２０℃で凍結した。各ペレットをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で、室温で４５分間振とうさせながらインキュベートすることによって細胞溶解物を得た。
【０１８８】
細胞上でＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの選択
より生理的な意味で異なるＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ結合能を評価するために、そのＡ４３１細胞結合能を測定した。Ａ４３１細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，カタログ番号ＣＲＬ−１５５５）は、約２×１０６個の受容体／細胞でＥＧＦＲを過剰発現する。細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種して、３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で終夜接着させた。ＦＮ３ドメイン発現細菌溶解物をＦＡＣＳ染色緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で１，０００倍希釈して、同じプレートを３枚作製して室温で１時間インキュベートした。溶解物を除去して、細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ  ｅＸ３リーダーを用いて４８８ｎｍで蛍光を読み取った。ＦＮ３ドメインを含む細菌溶解物を、そのＡ４３１細胞結合能に関してスクリーニングし（ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリに関して１３２０個の粗細菌溶解物）、結合がバックグラウンドシグナルより１０倍以上高い陽性クローンが５１６個同定された。ＴＣＬ１４ライブラリからの溶解物３００個を、結合に関してスクリーニングし、ＥＧＦＲに結合する独自のＦＮ３ドメイン配列５８個が得られた。
【０１８９】
細胞上でＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインの選択
ＥＧＦＲ結合の作用機序の特徴をよりよく調べるために、同定された様々なＦＮ３ドメインクローンのＥＧＦＲ結合能を、Ａ４３１細胞を用いてＥＧＦ競合的に測定し、Ａ４３１結合アッセイスクリーニングと同時に行った。Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種して、３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で終夜接着させた。細胞を、５０μＬ／ウェルの１：１，０００倍希釈した細菌溶解物と共に、同じプレートを３枚作製して室温で１時間インキュベートした。ビオチニル化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｅ−３４７７）を、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加して、室温で１０分間インキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ  ｅＸ３リーダーを用いて６００ｎｍで蛍光を読み取った。
【０１９０】
ＦＮ３ドメインを含む細菌溶解物を、上記のＥＧＦ競合アッセイにおいてスクリーニングした。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリに関して１３２０個の粗細菌溶解物をスクリーニングして、ＥＧＦ結合を５０％超阻害する陽性クローンを４５１個同定した。
【０１９１】
同定されたＦＮ３ドメイン結合ＥＧＦＲの発現及び精製
ＨｉｓタグＦＮ３ドメインを  Ｈｉｓ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって澄明化大腸菌溶解物から精製して、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２５０ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液で溶出した。精製試料を、ＰＤ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる分析のために、ｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。
【０１９２】
サイズ排除クロマトグラフィー分析
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＥＧＦＲに結合するＦＮ３ドメインの凝集状態を決定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速０．３ｍＬ／分でｐＨ７．４のＰＢＳを移動相として注入した。カラムからの溶出を、２８０ｎｍの吸光度によってモニターした。ＳＥＣによって高レベルの凝集を示したセンチリンを更なる分析から除外した。
【０１９３】
ＥＧＦＲ−Ｆｃからの選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのオフレート
選択したＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインをスクリーニングして、高親和性結合体の選択を容易にするために、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ−３６機器（ＢｉｏＲａｄ）においてＥＧＦＲ−Ｆｃに対する結合の遅いオフレート（ｋｏｆｆ）を示すドメインを同定した。ヤギ抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、チップ上の水平方向の６本全てのリガンド流路において５μｇ／ｍＬの濃度で、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で流速３０μＬ／分でアミンカップリング（ｐＨ５．０）によって直接固定した。固定密度は、平均で約１５００応答単位（ＲＵ）であり、異なる流路間の変動は５％未満であった。ＥＧＦＲ−Ｆｃは、垂直のリガンド方向で、密度およそ６００ＲＵで抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ表面上で捕捉された。試験したＦＮ３ドメインを全て、１μＭの濃度に標準化して、その水平方向の結合に関して試験した。スクリーニングの処理能力を最大にするために、ＦＮ３ドメインに関して６本全てのアナライト流路を用いた。解離相を、１００μＬ／分の流速で１０分間モニターした。スポット間結合シグナルを、アナライトと固定されたＩｇＧ表面との間の非特異的結合をモニターするための参照として用いて、すべての結合反応から差し引いた。処理された結合データを１：１の単純なラングミュア結合モデルに局所的にフィットさせて、捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃに対するそれぞれのＦＮ３ドメインの結合のｋｏｆｆを引き出した。
【０１９４】
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害
精製ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して１つの濃度で試験した。ＥＧＦＲのリン酸化を、ＥＧＦＲ  ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１１７３）キット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いてモニターした。細胞を、透明な９６ウェル組織培養処置プレート（Ｎｕｎｃ）において１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）と共にＧｌｕｔａｍａｘ（商標）を含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００μＬ／ウェル中で２０，０００個／ウェルで播種し、３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で終夜接着させた。培養培地を完全に除去して、細胞を３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で、ＦＢＳを含まない培地１００μＬ／ウェル中で終夜枯渇させた。次に、細胞を、湿潤５％  ＣＯ２環境で、濃度２μＭのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む予め加温した（３７℃）枯渇培地１００μＬ／ウェルによって３７℃で１時間処置した。対照は、枯渇培地のみで処置した。最終濃度が５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦとなるように１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３６−ＥＧ）及び１μＭ  ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む予め加温した（３７℃）枯渇培地１００μＬ／ウェルを添加して軽く混合し、３７℃、５％  ＣＯ２で１５分間インキュベートすることにより、細胞を刺激した。一組の対照ウェルは、陰性対照として刺激しないままであった。培地を完全に除去して、細胞を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ溶解緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１００μＬ／ウェルによって、製造元の指示に従って、室温で振とうさせながら１０分間溶解した。１１７３番目のチロシンでリン酸化されたＥＧＦＲを測定するように構成されたアッセイプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、製造元の指示に従って提供されたブロッキング溶液によって室温で１．５〜２時間ブロックした。プレートを、１Ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２００μＬ／ウェルによって４回洗浄した。細胞溶解物のアリコート（３０μＬ／ウェル）をアッセイプレートに移し、これをプレート密封フィルム（ＶＷＲ）で覆い、振とうさせながら室温で１時間インキュベートした。アッセイプレートをＴｒｉｓ洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルで４回洗浄した後、氷冷検出抗体溶液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）２５μＬを、気泡を入れないように注意して各ウェルに添加した。プレートを振とうさせながら室温で１時間インキュベートした後、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液２００μＬ／ウェルによって４回洗浄した。読み取り緩衝液（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）１５０μＬ／ウェルを添加して、製造元がインストールしたアッセイ特異的デフォルト設定を用いてＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００機器（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で読み取ることにより、シグナルを検出した。ＥＧＦ刺激陽性対照シグナルの％阻害を、各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに関して計算した。
【０１９５】
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を、ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリから同定された２３２個のクローンに関して測定した。これらのクローンのうち２２個が、１μＭの濃度でＥＧＦＲのリン酸化を５０％以上阻害した。発現が不良であるか、又はサイズ排除クロマトグラフィーにより多量体であると判断されたクローンを除去した後、クローン９個を、更に物理学的に特徴を調べるために先に進めた。これらのクローンのＢＣ及びＦＧループ配列を表４に示す。選択された９個のクローン中８個が、共通のＦＧループ配列（ＨＮＶＹＫＤＴＮＭＲＧＬ；配列番号９５）を有し、いくつかのクローンではそのＢＣループ配列に有意な類似性領域が認められた。
【０１９６】
【表４】
0006585040.tif 000005
【０１９７】
実施例３：ＥＧＦ結合を阻害するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの特徴づけ
大規模発現、精製、及びエンドトキシンの除去
表４に示された９個のＦＮ３ドメインを、詳細な特徴づけのためにより多くの材料を提供するよう規模を拡大した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン変種を含む終夜培養物を用いて、終夜培養物を１／８０希釈して１００μｇ／ｍＬアンピシリンを添加したＴｅｒｒｉｆｉｃブロス培地０．８Ｌを新しい培地に接種して、振とうさせながら３７℃でインキュベートした。６００ｎｍでの吸光度が約１．２〜１．５に達すると、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭとなるように添加することによって培養物を誘導し、温度を３０℃に低下した。４時間後、遠心沈降によって細胞を回収して、細胞沈降物を必要となるまで−８０℃で保存した。
【０１９８】
細胞溶解に関して、融解した沈降物を、２５Ｕ／ｍＬ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１ｋＵ／ｍＬ  ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ（商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した１Ｘ  ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）に、沈降物１グラムあたりＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）５ｍＬの割合で浮遊させた。軽く撹拌しながら、溶解を室温で１時間進行させた後、４℃、５６，０００×ｇで５０分間遠心沈降させた。上清を回収して０．２μｍのフィルターで濾過した後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００ｓクロマトグラフィーシステムを用いて、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）によって予め平衡にした５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラムにロードした。カラムを、カラム容積の２０倍の緩衝液Ａによって洗浄し、カラム容積の６倍量の１６％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）によって更に洗浄した。ＦＮ３ドメインを、カラム容積の１０倍量の５０％  Ｂによって溶出した後、カラム容積の６倍量の５０〜１００％  Ｂの勾配によって溶出した。ＦＮ３ドメインタンパク質を含む分画をプールしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ濃縮器を用いて濃縮し、濾過後、ＰＢＳで予め平衡にしたＨｉＬｏａｄ（商標）１６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。サイズ排除カラムから溶出したタンパク質単量体のピークは保持された。
【０１９９】
エンドトキシンは、ＡｃｔｉＣｌｅａｎ  Ｅｔｏｘ樹脂（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）によるバッチアプローチを用いて除去した。エンドトキシンの除去前に、樹脂を１Ｎ  ＮａＯＨによって３７℃で２時間（又は４℃で終夜）前処置し、ｐＨ試験紙によって測定してｐＨが約７で安定化するまで、ＰＢＳによって十分に洗浄した。精製タンパク質を、０．２μｍフィルターで濾過したのち、Ｅｔｏｘ樹脂１ｍＬをタンパク質１０ｍＬ対樹脂１ｍＬの比率で添加した。樹脂に対するエンドトキシンの結合を、軽く回転させながら室温で少なくとも２時間進行させた。樹脂を、５００×ｇで２分間の遠心沈降によって除去して、タンパク質上清を保持した。エンドトキシンレベルを、ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳ（商標）カートリッジを用いて測定し、ＥｎｄｏＳａｆｅ（登録商標）−ＭＣＳリーダー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）で分析した。エンドトキシンレベルが、最初のＥｔｏｘ処置後に５ＥＵ／ｍｇを超える場合、エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇ以下に減少するまで上記の技法を繰り返した。エンドトキシンレベルが５ＥＵ／ｍｇを超え、Ｅｔｏｘによる２回連続の処置後に安定化された場合、残りのエンドトキシンを除去するために、そのタンパク質に関する陰イオン交換又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの条件が確立された。
【０２００】
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ−Ｆｃに対する親和性（ＥＧＦＲ−Ｆｃ親和性）の決定
組み換え型ＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの結合親和性を、Ｐｒｏｔｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて表面プラズモン共鳴法によって更に特徴を調べた。アッセイの設定（チップの調製、ＥＧＦＲ−Ｆｃ捕捉）は、オフレート分析に関して先に記述したものと類似であった。選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを、１μＭ濃度で水平方向に３倍連続希釈で試験した。緩衝液試料もまた、ベースラインでの安定性をモニターするために注入した。各ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの全ての濃度に関する解離相を、流速１００μＬ／分で３０分間（オフレートスクリーニングから約１０−２ｓ−１のｋｏｆｆを有するドメインに関して）、又は１時間（約１０−３ｓ−１又はそれより遅いｋｏｆｆを有するドメインに関して）モニターした。２組の参照データを、反応データから差し引いた：１）ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと固定したＩｇＧ表面との非特異的相互作用を修正するためのスポット間シグナル；２）捕捉されたＥＧＦＲ−Ｆｃ表面の経時的な解離によるベースラインの揺れを補正するための緩衝液チャネルシグナル。各ＦＮ３ドメインに関してすべての濃度での処理された結合データを１：１の単純なラングミュア結合モデルに全体的にフィットさせて、速度論（ｋｏｎ、ｋｏｆｆ）及び親和性（ＫＤ）定数の推定値を引き出した。表５は構築物のそれぞれに関する速度論定数を示し、親和性は２００ｐＭから９．６ｎＭまで変化する。
【０２０１】
細胞上でＥＧＦＲに対する選択されたＥＧＦＲ−結合ＦＮ３ドメインの結合（Ａ４３１細胞結合アッセイ）
Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種して、３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で終夜接着させた。精製ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．５ｎＭ〜３０μＭ）を、同じプレートを３枚ずつ作製して、細胞（５０μＬ）に室温で１時間添加した。上清を除去して、細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈した抗ペンタＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  ４８８抗体コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ  ｅＸ３リーダーを用いて４８８ｎｍで蛍光を読み取った。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、ＥＣ５０値を計算するためにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせた。表５は、構築物のそれぞれに関して、２．２〜２０μＭを超える範囲のＥＣ５０を報告する。
【０２０２】
選択されたＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いた細胞上のＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合の阻害（Ａ４３１細胞ＥＧＦ競合アッセイ）
Ａ４３１細胞を不透明な黒色９６ウェルプレートに５，０００個／ウェルで播種して、３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で終夜接着させた。精製ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．５ｎＭ〜３０μＭ）を、同じプレートを３枚ずつ作製して、細胞（５０μＬ／ウェル）に室温で１時間添加した。ビオチニル化ＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｅ−３４７７）を、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加して、室温で１０分間インキュベートした。細胞を、１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１００に希釈したストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５０μＬ／ウェルと共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を１５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳ染色緩衝液によって３回洗浄した後、ウェルにＦＡＣＳ染色緩衝液１００μＬを満たし、Ａｃｕｍｅｎ  ｅＸ３リーダーを用いて６００ｎｍで蛍光を読み取った。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、ＩＣ５０値を計算するためにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせた。表５は、１．８〜１２１ｎＭの範囲のＩＣ５０値を報告する。
【０２０３】
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害（ホスホ−ＥＧＦＲアッセイ）
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化を有意に阻害した選択されたＦＮ３ドメインを、阻害に関するＩＣ５０値を測定することによってより完全に評価した。ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を、「ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害」において先に記述したように、ＦＮ３ドメイン濃度を変化させて（０．５ｎＭ〜１０μＭ）評価した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対してエレクトロケミルミネッセンスシグナルとしてプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、ＩＣ５０値を決定した。表５は、１８ｎＭ〜＞２．５μＭの範囲のＩＣ５０値を報告する。
【０２０４】
ヒト腫瘍細胞の増殖の阻害（ＮＣＩ−Ｈ２９２増殖及びＮＣＩ−Ｈ３２２増殖アッセイ）
ＥＧＦＲ依存的細胞増殖の阻害を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインに対する暴露後のＥＧＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、それぞれカタログ番号ＣＲＬ−１８４８及びＣＲＬ−５８０６）の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不透明な白色９６ウェル組織培養処置プレート（Ｎｕｎｃ）において、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）、並びに１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）１００μＬ／ウェル中で５００個／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ２９２）又は１，０００個／ウェル（ＮＣＩ−Ｈ３２２）で播種し、３７℃の湿潤５％  ＣＯ２環境で終夜接着させた。細胞を、ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの濃度範囲を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５μＬ／ウェル添加することによって処置した。対照を５μＬ／ウェルのＰＢＳのみ、又は２５ｍＭエチレンジアミン四酢酸のＰＢＳ溶液によって処置した。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で１２０時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）７５μＬ／ウェルを添加した後、プレートシェーカー上で２分間混合し、室温の暗所で更に１０分間インキュベートすることによって生存細胞を検出した。プレートを、ルミネッセンスモードに設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取り、読み取り時間は、溶媒のみのブランクに対して０．５秒／ウェルであった。データをＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対するＰＢＳ処置細胞増殖の百分率としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式にデータをフィットさせることによって、ＩＣ５０値を決定した。表５は、ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ３２２細胞をそれぞれ用いて、５．９ｎＭ〜１．１５μＮ及び９．２ｎＭ〜３．１μＭ超の範囲のＩＣ５０値を示す。
【０２０５】
表５は、各アッセイのＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの生物特性の要約を示す。
【０２０６】
【表５】
0006585040.tif 000006
【０２０７】
実施例４：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの改変
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのサブセットを、各分子の立体構造の安定性を増加させるように、改変した。変異体Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉ（米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記述）をＤＮＡ合成によって、クローンＰ５４ＡＲ４−８３、Ｐ５４ＣＲ４−３１、及びＰ５４ＡＲ４−３７に組み入れた。新規変異体Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２、Ｐ５４ＣＲ４３１−ｖ２、及びＰ５４ＡＲ４−３７ｖ２を、上記のように発現させて精製した。ＰＢＳ中での示差走査熱量測定を用いて、対応する親分子の安定性と比較するために、各変異体の安定性を評価した。表６は、各クローンが有意に安定化され、Ｔｍの平均値は１８．５℃増加することを示す。
【０２０８】
【表６】
0006585040.tif 000007
【０２０９】
実施例５：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのシステイン改変と化学コンジュゲーション
ＦＮ３ドメインのシステイン変異体を、基礎となるＴｅｎｃｏｎ分子及びシステイン残基を有しないその変種から作製する。これらの変異は、低分子薬、蛍光タグ、ポリエチレングリコール、又は他の任意の数の化学実体を化学コンジュゲートするための部位として役立つように、独自のシステイン残基を、基礎となるＴｅｎｃｏｎ配列（配列番号１）又は他のＦＮ３ドメインに組み入れるために、当技術分野で公知の標準的な分子生物学技術を用いて作製され得る。選択される変異部位は、特定の基準を満たさなければならない。例えば、遊離のシステインを含むように変異させたＴｅｎｃｏｎ配列は、（ｉ）大腸菌において高度に発現され、（ｉｉ）高レベルの溶解度及び熱安定性を維持し、並びに（ｉｉｉ）コンジュゲーションの際に標的抗原に対する結合を維持しなければならない。Ｔｅｎｃｏｎ足場は、わずか約９０〜９５個のアミノ酸であることから、化学コンジュゲーションのための理想的な位置を厳密に決定するために、１システイン変種を、足場のあらゆる位置で容易に構築することができる。
【０２１０】
ＥＧＦＲに結合するＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２変異体（配列番号２７）の１〜９５番目（又はＮ−末端メチオニンが存在するときには２〜９６番目）の位置の各個々のアミノ酸残基をシステインに変異させて、最善の化学コンジュゲーション部位を評価した。
【０２１１】
構築、発現、及び精製
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２の各個々のシステイン変種のアミノ酸配列を、大腸菌発現のための選択的コドンを用いてタンパク質をコードする核酸配列に逆転写して、合成遺伝子を作製した（ＤＮＡ  ２．０）。これらの遺伝子を、Ｔ５プロモーター配列によって駆動される発現のために、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）にクローニングし、大腸菌株ＢＬ２１（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２「システインスキャン」ライブラリは、９６ウェルプレート上にアレイにしたグリセロールストックとして提供され、それぞれの発現及び精製は、実施例２に記述される同じ技法に従った。
【０２１２】
化学コンジュゲーション
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２「システインスキャン」ライブラリに関して、コンジュゲーションを精製プロセスに組み入れた。澄明化した溶解物中のシステイン変種は、溶解物をウェルに添加して、１００×ｇで５分間遠心沈降させることにより、Ｈｉｓ−ｔｒａｐ  ＨＰプレート（カタログ番号２８−４００８−２９、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて９６ウェルフォーマットでＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させた。樹脂を緩衝液Ａで３回洗浄した後、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を１．５ｍＭ溶液の５００μＬとして添加した。ロティサリーシェーカーで室温で１時間インキュベートした後、過剰量のＮＥＭを遠心沈降によって除去して、緩衝液Ａによって３回洗浄した。コンジュゲートされたシステイン変種を１５０μＬの緩衝液Ｂによって２回溶出し、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレン（カタログ番号ＭＡＵＦ１０１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を有するＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅｓ又は９６−ウェルＰＤ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐプレート（カタログ番号２８−９１８０−０６、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＰＢＳに交換した。コンジュゲートを質量分析によって特徴を調べた（表７）。発現が不良であるか（５ｍＬ培養物から得られたタンパク質が０．１ｍｇ未満、又は質量分析によって検出してタンパク質が得られない）又はＮＥＭに対するコンジュゲーションが不良である（質量分析によって測定してコンジュゲーションが８０％未満）システイン変種を、更なる分析から除外した。これによって、発現が不良であるためにＬ１Ｃ、Ｗ２１Ｃ、Ｑ３６Ｃ、Ｅ３７Ｃ、Ａ４４Ｃ、Ｄ５７Ｃ、Ｌ６１Ｃ、Ｙ６７Ｃ、及びＦ９２Ｃが除外され、コンジュゲーション効率が低いためにＡ１７Ｃ、Ｌ１９Ｃ、Ｉ３３Ｃ、Ｙ３５Ｃ、Ｙ５６Ｃ、Ｌ５８Ｃ、Ｔ６５Ｃ、Ｖ６９Ｃ、Ｉ７１Ｃ、及びＴ９４Ｃが除外された。
【０２１３】
【表７−１】
0006585040.tif 000008
【０２１４】
【表７−２】
0006585040.tif 000009
【表７−３】
0006585040.tif 000010
【０２１５】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２の各ＮＥＭコンジュゲートシステイン変種のサイズ排除クロマトグラフィーを、実施例２に記述されるように行った。表８は、結果を要約する。Ａｂｓ２８０シグナルを積分して、単量体領域のピーク（５．５〜６分）を、オリゴマー領域のピーク（４〜５．３分）と比較することにより、各タンパク質の％単量体を決定した。
【０２１６】
【表８−１】
0006585040.tif 000011
【０２１７】
【表８−２】
0006585040.tif 000012
【表８−３】
0006585040.tif 000013
【０２１８】
ＥＧＦＲ結合アッセイ
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２のＮＥＭコンジュゲートシステイン変種のＥＧＦＲに対する相対的結合親和性を、実施例２に記述されるように評価した。表９は、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２親タンパク質と比較した各システイン変種のＥＧＦＲ結合親和性の比率を示すデータを要約する。ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した場合に、ＥＧＦＲに対する結合が減少した（１０ｎＭタンパク質によって処置したとき、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２親に関して観察されたシグナルの６５％未満）システインコンジュゲートを更なる分析から除外した：Ｐ２Ｃ、Ａ３Ｃ、Ｐ４Ｃ、Ｋ５Ｃ、Ｌ７Ｃ、Ｄ２３Ｃ、Ｗ２５Ｃ、Ｆ２７Ｃ、Ｙ２８Ｃ、Ｆ３１Ｃ、Ｓ５５Ｃ、Ｇ７３Ｃ、Ｈ７５Ｃ、Ｖ７７Ｃ、Ｙ７８Ｃ、Ｔ８１Ｃ、Ｎ８２Ｃ、Ｍ８３Ｃ、及びＧ８５Ｃ。
【０２１９】
【表９−１】
0006585040.tif 000014
【０２２０】
【表９−２】
0006585040.tif 000015
【０２２１】
熱安定性
システイン−ＮＥＭコンジュゲートの熱安定性を、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価した。試験したコンジュゲートは、高レベルでコンジュゲートを効率よく発現し、ＥＧＦＲ結合を保持することが決定されたコンジュゲートであった。加えて、ＢＣ及びＦＧループ内のシステイン変種は除外した。安定性データは、ＶＰ−ＤＳＣ機器（ＭｉｃｒｏＣａｌ）で毎分１℃の走査速度で、変種のアリコート４００μＬを２５℃から１００℃まで加熱することによって得られた。その試料に関して、熱によるフォールディング／アンフォールディングの可逆性を評価するために、第２の同一の走査を行った。融解温度を計算するために、データを２状態アンフォールディングモデルにフィットさせた（表１０）。融解温度が低下した（６３℃以下又はＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２の親より８℃超下）、又は非可逆的アンフォールディングを示したシステイン変種を更なる分析から除外した：Ｖ９Ｃ、Ｖ１２Ｃ、Ｔ１３Ｃ、Ｒ１８Ｃ、Ｅ２９Ｃ、Ｅ３９Ｃ、Ｇ４２Ｃ、Ｖ４９Ｃ、Ｐ５０Ｃ、Ｇ５１Ｃ、Ｐ６３Ｃ。
【０２２２】
【表１０−１】
0006585040.tif 000016
【表１０−２】
0006585040.tif 000017
【０２２３】
細胞障害性アッセイ
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２システイン変種を、ＮＥＭコンジュゲーションに関して記述される方法論を用いて、酵素切断可能なＶａｌ−Ｃｉｔリンカー又は非切断型ＰＥＧ４リンカー（ＶＣ−ＭＭＡＦ７；図２を参照されたい）を介して、細胞障害性チューブリン阻害剤であるモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）にコンジュゲートした。先の段階で除外後に残っている３２個の変種を、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２親（配列番号２１７及び２５５）、及び陰性対照としてのＴｅｎｃｏｎ（配列番号２６５）と共にコンジュゲートした。
【０２２４】
殺細胞を、システイン変種−細胞毒素コンジュゲートに暴露後のＥＧＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株Ｈ１５７３の生存率を測定することによって評価した。細胞を黒色ウェルの透明底の組織培養処置プレート（Ｆａｌｃｃｏｎ  ３５３２１９）に、５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を含むフェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  １１８３５−０３０）１００μＬ／ウェル中で７０００個／ウェルで播種した。細胞を、３７℃の湿潤５％ＣＯ２環境で終夜接着させた。９６ウェルプレートから培地を吸引して、細胞を新しい培地５０μＬ、及び新しい培地中に溶解した２×阻害剤５０μＬで処置した。細胞の生存率を、７０時間でＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によるエンドポイントアッセイによって決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式にデータをフィットさせることによって、ＩＣ５０値を決定した。表１１は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏデータの分析から得られたＩＣ５０値を報告する。８３ｖ２−ｃｙｓ／ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの２つの複製物の平均ＩＣ５０値は、０．７ｎＭであった。試験したコンジュゲート３２個中４個が、親の値（約１．４ｎＭ）より２倍超高いＩＣ５０値を有したことから、廃棄した：Ｌ３２Ｃ、Ｔ６８Ｃ、Ｙ７２Ｃ、及びＶ７４Ｃ。加えて、３つのコンジュゲートが親より２倍超強力なＩＣ５０値を与え、薬物コンジュゲートに処方するために特に適切であり得る：Ｎ６Ｃ、Ｅ５３Ｃ、及びＴ９３Ｃ。
【０２２５】
【表１１】
0006585040.tif 000018
【０２２６】
最終的なシステイン変種
試験した９６個の位置の中で、システイン変種２８個が、大腸菌における高い発現レベルの保持、チオール−マレイミド化学を介した効率的なコンジュゲーション、標的抗原ＥＧＦＲに対する結合の保持、熱安定性の保持、及び可逆的アンフォールディング特性、並びにシステイン変種を細胞障害剤にコンジュゲートしたときに高いＥＧＦＲ発現を有する細胞の障害性の保持に関する基準を満たすことが判明した。これらの位置は、Ｎ６Ｃ（配列番号２１０及び２４８）、Ｖ８Ｃ（配列番号１８９及び２２７）、Ｓ１０Ｃ（配列番号１９０及び２２８）、Ｅ１１Ｃ（配列番号１９１及び２２９）、Ｅ１４Ｃ（配列番号１９２及び２３０）、Ｄ１５Ｃ（配列番号１９３及び２３１）、Ｓ１６Ｃ（配列番号１９４及び２３２）、Ｓ２０Ｃ（配列番号１９５及び２３３）、Ｓ３０Ｃ（配列番号１９６及び２３４）、Ｑ３４Ｃ（配列番号１９７及び２３５）、Ｓ３８Ｃ（配列番号１９８及び２３６）、Ｋ４０Ｃ（配列番号１９９及び２３７）、Ｖ４１Ｃ（配列番号２００及び２３８）、Ｉ４５Ｃ（配列番号２０１及び２３９）、Ｌ４７Ｃ（配列番号２０２及び２４０）、Ｔ４８Ｃ（配列番号２０３及び２４１）、Ｅ５３Ｃ（配列番号２０４及び２４２）、Ｒ５４Ｃ（配列番号２０５及び２４３）、Ｔ５９Ｃ（配列番号２０６及び２４４）、Ｇ６０Ｃ（配列番号２０７及び２４５）、Ｋ６２Ｃ（配列番号２０８及び２４６）、Ｇ６４Ｃ（配列番号２０９及び２４７）、Ｔ６８Ｃ（配列番号２１０及び２４８）、Ｓ７０Ｃ（配列番号２１１及び２４９）、Ｌ８８Ｃ（配列番号２１２及び２５０）、Ｓ８９Ｃ（配列番号２１３及び２５１）、Ａ９０Ｃ（配列番号２１４及び２５２）、Ｉ９１Ｃ（配列番号２１５及び２５３）、並びにＴ９３Ｃ（配列番号２１６及び２５４）である。８３ｖ２タンパク質の構造におけるこれらの２８の位置の場所を図３に示す。
【０２２７】
実施例６：ｃ−Ｍｅｔに結合してＨＧＦ結合を阻害するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ヒトｃ−Ｍｅｔに関するパニング
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合することができるＦＮ３ドメインを同定するために、ＴＣＬ１４ライブラリを、ビオチニル化ヒトｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメイン（ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔ）に対してスクリーニングした。選択するために、ＴＣＬ１４ライブラリ３μｇを、大腸菌Ｓ３０  Ｌｉｎｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）中でインビトロで転写及び翻訳し、発現させたライブラリをＣｉｓブロック（２％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１  ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））によってブロックした。選択するために、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔを４００ｎＭ（ラウンド１）、２００ｎＭ（ラウンド２及び３）、及び１００ｎＭ（ラウンド４及び５）の濃度で添加した。結合したライブラリメンバーを、ニュートラアビジン磁気ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（ラウンド１、３及び５）、又はストレプトアビジン磁気ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ラウンド２及び４）を用いて回収し、ビーズを５００μＬのＰＢＳ−Ｔで５〜１４回洗浄した後、５００μＬのＰＢＳで２回洗浄することによって、非結合ライブラリメンバーを除去した。
【０２２８】
改善された親和性を有するＦＮ３ドメイン分子を同定するために、追加の選択ラウンドを行った。簡単に説明すると、ラウンド５からの生成物を、上記のように調製して、以下の変更を加えて追加の反復選択ラウンドに供した：ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔとのインキュベーションを１時間から１５分に減少させて、ビーズ捕獲を２０分から１５分に減少させ、ｂｔ−ｃ−Ｍｅｔを２５ｎＭ（ラウンド６又は７）又は２．５ｎＭ（ラウンド８及び９）に減少させ、更に１時間の洗浄を過剰量の非ビオチニル化ｃ−Ｍｅｔの存在下で行った。これらの変更の目的は、おそらくより早いオンレートとより遅いオフレートを有する結合体を同時に選択して、実質的により低いＫＤを生じることであった。
【０２２９】
ラウンド５、７及び９の生成物を、ＴＣＯＮ６（配列番号３０）及びＴＣＯＮ５  Ｅ８６Ｉショート（配列番号３１）プライマーを用いてリガーゼ非依存的クローニングサイト（ｐＥＴ１５−ＬＩＣ）を含む改変ｐＥＴ１５ベクター（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）にＰＣＲクローニングして、標準的なプロトコールを用いて、形質転換及びＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ、３０°℃で１６時間）誘導後にＣ−末端Ｈｉｓ６タグタンパク質として、タンパク質を発現させた。細胞を遠心沈降によって回収した後、０．２ｍｇ／ｍＬニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＢｕｇｂｕｓｔｅｒ  ＨＴ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって溶解した。細菌溶解物を遠心沈降によって澄明化して、上清を新しい９６ウェル深底プレートに移した。
【０２３０】
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインのスクリーニング
大腸菌溶解物に存在するＦＮ３ドメインを、生化学フォーマットで精製ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対するＨＧＦ結合の阻害能に関してスクリーニングした。組み換え型ヒトｃ−Ｍｅｔ  Ｆｃキメラ（ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）を９６ウェル白色Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）にコーティングして、４℃で終夜インキュベートした。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレート洗浄器において、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水３００μＬ／ウェルによって２回洗浄した。アッセイプレートを、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（２００μＬ／ウェル、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＩＬ）によって振とうさせながら室温（ＲＴ）で１時間ブロックして、ＴＢＳ−Ｔ  ３００μＬによって２回洗浄した。ＦＮ３ドメイン溶解物を、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＳＴＡＲｐｌｕｓロボットシステムを用いて、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（１：１０〜１：１００，０００）中で希釈した。溶解物（５０μＬ／ウェル）を、アッセイプレートにおいてＲＴで振とうさせながら１時間インキュベートした。プレートを洗浄せずに、ｂｔ−ＨＧＦ（ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０中で１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル、ビオチニル化）を、振とうさせながらＲＴで３０分間プレートに添加した。Ｔｅｎｃｏｎ２７溶解物を含む対照ウェルに、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ  Ｔ２０又は希釈したｂｔ−ＨＧＦのいずれかを添加した。プレートを３００μＬ／ウェルのＴＢＳ−Ｔによって４回洗浄して、１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＴＢＳ−Ｔ中で１：２０００、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共に、ＲＴで振とうさせながら３０〜４０分間インキュベートした。再度、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄した。シグナルを発生させるために、製造元の指示に従って調製したＰＯＤケミルミネッセンス基質（５０μＬ／ウェル、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をプレートに添加して、およそ３分以内に、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ５において発光を読み取った。％阻害は、以下の計算式を用いて決定した：１００−（（ＲＬＵｓａｍｐｌｅ−ＲＬＵ平均値Ｎｏ  ｂｔ−ＨＧＦ  ｃｏｎｔｒｏｌ）／（ＲＬＵ平均値ｂｔ−ＨＧＦ  ｃｏｎｔｒｏｌ−ＲＬＵ平均値Ｎｏ  ｂｔ−ＨＧＦ  ｃｏｎｔｒｏｌ）＊１００）５０％又はそれより高い％阻害の値は、ヒットであると考えられた。
【０２３１】
ＦＮ３ドメインのハイスループット発現及び精製
ＨｉｓタグＦＮ３ドメインを  Ｈｉｓ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）ＨＰプレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって澄明化大腸菌溶解物から精製して、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、及び２５０ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４の緩衝液で溶出した。精製試料を、ＰＤ  ＭｕｌｔｉＴｒａｐ（商標）Ｇ−２５プレート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる分析のために、ｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。
【０２３２】
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦ結合の阻害のＩＣ５０決定
選択されたＦＮ３ドメインを、ＨＧＦ競合アッセイにおいて更に特徴を調べた。精製ＦＮ３ドメインの用量反応曲線を、上記のアッセイを利用して作製した（開始濃度５μＭ）。％阻害の値を計算した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対する％阻害としてプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、ＩＣ５０値を決定した。
【０２３３】
ラウンド５から、１：１０の希釈で活性を示す３５個のユニーク配列が同定され、ＩＣ５０値は、０．５〜１５００ｎＭの範囲であった。ラウンド７は、１：１００の希釈で活性を示す３９個のユニーク配列を生じ、ＩＣ５０値は、０．１６〜２．９ｎＭの範囲であった。ラウンド９からは６６個のユニーク配列が同定されたが、この場合、ヒットは、１：１０００の希釈で活性であると定義された。ラウンド９では、０．２ｎＭもの低いＩＣ５０値が観察された（表１３）。
【０２３４】
実施例７：ｃ−Ｍｅｔに結合して、ＨＧＦ結合を阻害するＦＮ３ドメインの特徴づけ
ＦＮ３ドメインを、実施例２において先に記述したように発現及び精製した。サイズ排除クロマトグラフィー及び速度論分析をそれぞれ、実施例１及び２において先に記述したように行った。表１２は、Ｃ鎖、ＣＤループ、Ｆ鎖、及びＦＧループの配列、並びに各ドメインに関する完全なアミノ酸配列の配列番号を示す。
【０２３５】
【表１２】
0006585040.tif 000019
Ｃループ残基は、表記の配列番号の２８〜３７番目の残基に対応する。
ＣＤ鎖残基は、表記の配列番号の３８〜４３番目の残基に対応する。
Ｆループ残基は、表記の配列番号の６５〜７４番目の残基に対応する。
ＦＧ鎖残基は、表記の配列番号の７５〜８１番目の残基に対応する。
【０２３６】
細胞におけるｃ−Ｍｅｔに対する選択されたｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの結合
ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞（カタログ番号ＨＴＢ−１７４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、２０，０００個／ウェルでポリ−Ｄ−リジンコーティングした黒色透明底の９６ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）に播種して、３７℃、５％  ＣＯ２で終夜接着させた。精製ＦＮ３ドメイン（５０μＬ／ウェル；０〜１０００ｎＭ）を、同じプレートを２枚ずつ作製して、４℃で１時間細胞に添加した。上清を除去して、細胞を、ＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号５５４６５７）によって３回洗浄した。細胞を、ビオチニル化抗ＨＩＳ抗体（ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：１６０倍希釈、５０μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＢＡＭ０５０）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル）で３回洗浄後、ウェルを抗マウスＩｇＧ１−Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲート抗体（ＦＡＣＳ染色緩衝液中で１：８０倍希釈、５０μＬ／ウェル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号Ａ２１１２１）と共に４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液（１５０μＬ／ウェル）によって３回洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（５０μＬ／ウェル）中で放置した。総蛍光を、Ａｃｕｍｅｎ  ｅＸ３リーダーを用いて決定した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対して未加工の蛍光シグナルとしてプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にフィットさせて、ＥＣ５０値を計算した。ＦＮ３ドメインは、結合活性の範囲を示すことが見いだされ、表１３に示されるようにＥＣ５０値は、１．４〜２２．０であった。
【０２３７】
ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
精製ＦＮ３ドメインを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ−Ｍｅｔ  ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４４１におけるｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して試験した。細胞を、透明な９６ウェル組織培養処置プレートにおいて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェル中で２０，０００個／ウェルで播種し、３７℃、５％  ＣＯ２で終夜接着させた。培養培地を完全に除去して、細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で、無血清ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）中で終夜枯渇させた。次に、細胞に、濃度２０μＭ以下のＦＮ３ドメインを含む新しい無血清ＲＰＭＩ培地（１００μＬ／ウェル）を、３７℃、５％  ＣＯ２で１時間添加した。対照は、培地のみで処置した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬ組み換え型ヒトＨＧＦ（１００μＬ／ウェル、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９４−ＨＧＮ）によって刺激して、３７℃、５％  ＣＯ２で１５分間インキュベートした。一組の対照ウェルは、陰性対照として刺激しないままであった。培地を完全に除去して、細胞を、製造元の指示に従って、ＲＴで振とうさせながらＣｏｍｐｌｅｔｅ溶解緩衝液（５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって１０分間溶解した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔを測定するように構成されたアッセイプレートを、製造元の指示に従って、提供されたブロッキング溶液によって室温で１時間ブロックした。次に、プレートを、Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（２００μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって３回洗浄した。細胞溶解物（３０μＬ／ウェル）をアッセイプレートに移して、振とうさせながらＲＴで１時間インキュベートした。次に、アッセイプレートをＴｒｉｓ洗浄緩衝液によって４回洗浄した後、氷冷の検出抗体溶液（２５μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を、振とうさせながらＲＴで各ウェルに１時間添加した。プレートをＴｒｉｓ洗浄緩衝液によって４回すすいだ。１５０読み取り緩衝液（１５０μＬ／ウェル、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を添加して、製造元のインストールしたアッセイ特異的デフォルト設定を用いて、ＳＥＣＴＯＲ（登録商標）Ｉｍａｇｅｒ  ６０００機器（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）において読み取ることにより、シグナルを検出した。データを、ＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対するエレクトロケミルミネッセンスシグナルとしてプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線にデータをフィットさせることによって、ＩＣ５０値を決定した。ＦＮ３ドメインは、表１３に示されるように、４．６〜１４１５ｎＭの範囲のＩＣ５０値でリン酸化ｃ−Ｍｅｔを阻害することが見いだされた。
【０２３８】
ヒト腫瘍細胞増殖の阻害
ｃ−Ｍｅｔ依存的細胞増殖の阻害を、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに対する暴露後のＵ８７−ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＨＴＢ−１４）の生存率を測定することによって評価した。細胞を、不透明な白色９６ウェル組織培養処置プレート（Ｎｕｎｃ）において１０％  ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地１００μＬ／ウェル中で８０００個／ウェルで播種し、３７℃、５％  ＣＯ２で終夜接着させた。播種後２４時間で、培地を吸引して、細胞に無血清ＲＰＭＩ培地を添加した。血清枯渇の２４時間後、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む無血清培地（３０μＬ／ウェル）を添加することによって、細胞を処置した。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２で７２時間インキュベートした。生存細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μＬ／ウェルを添加した後、プレートシェーカーにおいて１０分間混合することによって検出した。プレートを、ルミネッセンスモードに設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取り、読み取り時間は、０．５秒／ウェルであった。データをＦＮ３ドメインモル濃度の対数に対する未加工発光単位（ＲＬＵ）としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４を用いて、様々な勾配を有するシグモイド用量反応曲線の等式にデータをフィットさせることによって、ＩＣ５０値を決定した。表１３は、１ｎＭ〜１０００ｎＭ超の範囲のＩＣ５０値を報告する。
【０２３９】
【表１３】
0006585040.tif 000020
【０２４０】
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの熱安定性
【０２４１】
ＰＢＳ中での示差走査熱量測定を用いて、各ＦＮ３ドメインの安定性を評価した実験の結果を表１４に示す。
【０２４２】
【表１４】
0006585040.tif 000021
【０２４３】
実施例８二重特異性抗ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製及び特徴づけ
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製
実施例１〜６に記述したＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの多数の組み合わせを合わせて、ＥＧＦＲとｃ−Ｍｅｔの両方に結合することができる二重特異性分子を作製した。更に、配列番号１０７〜１１０に示されるアミノ酸配列を有するＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、及び配列番号１１１〜１１４に示されるアミノ酸配列を有するｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを作製して、二重特異性分子に結合した。以下のフォーマットが維持されるように配列番号５０〜７２、及び１０６（表１５）に記載のアミノ酸配列をコードするように、合成遺伝子を作製した：ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインの後にペプチドリンカー、その後にｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン。精製を助けるために、Ｃ−末端にポリヒスチジンタグを組み入れた。表１５に記述される分子に加えて、２つのＦＮ３ドメイン間のリンカーを、表１６に記載の内容に従って、長さ、配列組成、及び構造に従って変化させた。そのようなＦＮ３ドメインを連結させるために、多数の他のリンカーを用いることができると予想される。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を発現させて、単特異性ＥＧＦＲ又はｃ−ＭｅｔＦＮ３ドメインに関して記述したように、ＩＭＡＣ及びゲル濾過クロマトグラフィー工程を用いて、大腸菌から精製した。
【０２４４】
【表１５】
0006585040.tif 000022
【０２４５】
【表１６】
0006585040.tif 000023
【０２４６】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は単特異性分子単独と比較して効力を増強し、結合力を示唆する
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で播種した。２４時間後、培地を無血清ＲＰＭＩに交換した。血清枯渇の２４時間後、細胞を多様な濃度のＦＮ３ドメインによって処置した：高親和性単特異性ＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメイン（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２）、弱親和性単特異性ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５）、２つの単特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインの混合物、又は高親和性ＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメインに連結させた低親和性ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインからなる二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ１）。細胞を、単特異性又は二重特異性分子によって１時間処置した後、ＥＧＦ、ＨＧＦ、又はＥＧＦとＨＧＦの組み合わせによって３７℃、５％  ＣＯ２で１５分間刺激した。細胞をＭＳＤ溶解緩衝液によって溶解して、適当なＭＳＤアッセイプレートを用いて、上記のように製造元の指示に従って、細胞のシグナリングを評価した。
【０２４７】
低親和性ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインは、６１０ｎＭのＩＣ５０でｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害した（図６）。予想されるように、ＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメインは、ｃ−Ｍｅｔリン酸化を阻害することができず、単特異性分子の混合物は、ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン単独と同一であるように思われた。しかし、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、１ｎＭのＩＣ５０でｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害し（図６）、ｃ−Ｍｅｔ単特異性分子単独と比較して効力の改善の２対数を超えるシフトをもたらした。
【０２４８】
結合力の効果を通してｃ−Ｍｅｔ及び／又はＥＧＦＲリン酸化の阻害を増強する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の可能性を、多様なｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ密度及び比率を有する多数の細胞タイプにおいて評価した（図７）。ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ４４１、又はＮＣＩ−Ｈ５９６細胞を、９６ウェルプレートにおいて、１０％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で播種した。２４時間後、培地を無血清ＲＰＭＩに交換した。血清枯渇の２４時間後、細胞を多様な濃度の単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン、単特異性ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン、又は二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ５、Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３からなる）によって処置した。細胞を、単特異性又は二重特異性分子によって１時間処置した後、ＥＧＦ、ＨＧＦ、又はＥＧＦとＨＧＦの組み合わせによって３７℃、５％  ＣＯ２で１５分間刺激した。細胞をＭＳＤ溶解緩衝液によって溶解して、適当なＭＳＤアッセイプレートを用いて、上記のように製造元の指示に従って、細胞のシグナリングを評価した。
【０２４９】
図７（Ａ〜Ｃ）は、３つの異なる細胞株における二重特異性ＥＧＦＲ／ｃＭｅｔ分子と比較して、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを用いたＥＧＦＲの阻害を示す。ＥＧＦＲリン酸化アッセイにおける結合力を評価するために、中等度の親和性のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（１．９ｎＭ）（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２）を、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインに連結させた同じＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン（０．４ｎＭ）（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）を含む二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。Ｈ２９２及びＨ５９６細胞において、ＥＧＦＲのリン酸化の阻害は、単特異性分子と二重特異性分子とで同等であり（図７Ａ及び７Ｂ）、その理由はおそらく、これらの細胞株がＥＧＦＲ対ｃ−Ｍｅｔ受容体の高い比率を有するためであった。この理論を試験するために、ＥＧＦＲリン酸化の阻害を、ＥＧＦＲより多くのｃ−Ｍｅｔ受容体を示すＮＣＩ−Ｈ４４１細胞において評価した。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によって処置すると、単特異性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較してＥＧＦＲリン酸化の阻害に関するＩＣ５０を３０倍減少させた（図７Ｃ）。
【０２５０】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によって効力が増加する可能性を、ＥＧＦＲに対して高い親和性（０．２６ｎＭ）及びｃ−Ｍｅｔ（１０．１ｎＭ）に対して中等度の親和性を有する分子を用いて、ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイにおいて評価した。ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＮＣＩ−Ｈ５９６細胞の両方において、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害は、単特異的ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインと比較して二重特異性分子ではそれぞれ、１３４倍及び１０１２倍増強された（図７Ｄ及び７Ｅ）。
【０２５１】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によるＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害に関する効力の増加は、シグナリング及び増殖の阻害の増強に言い換えられることが確認された。これらの実験に関して、ＦＮ３  ＥＧＦＲ結合及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子と比較した。表１７及び１８に記述されるように、ＥＲＫリン酸化のＩＣ５０（表１７）及びＨ２９２細胞の増殖（表１８）は、単特異性結合体の混合物と比較して、細胞を二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子で処置すると、減少した。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子に関するＥＲＫリン酸化の阻害のＩＣ５０は、単特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメインの混合物と比較して１４３倍低く、このアッセイにおける分子の効力に対する結合力の効果を示した。表１７において、単特異性ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、完全に活性を阻害せず、それゆえ示されたＩＣ５０値は、下限であるとみなすべきである。増殖アッセイを、混合物又は二重特異性フォーマットで連結された形のいずれかとして、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの異なる組み合わせを用いて行った。二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の阻害又は増殖のＩＣ５０は、単特異性の親ＥＧＦＲ又はｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの混合物と比較して３４〜２３６倍低かった。このことは受容体のレベルで観察された結合力の効果（図６及び図７）が、細胞シグナリングの阻害（表１７）及び細胞増殖の阻害（表１８）の改善に言い換えられることを確認した。
【０２５２】
【表１７】
0006585040.tif 000024
【０２５３】
【表１８】
0006585040.tif 000025
【０２５４】
インビトロ腫瘍異種移植片：ＰＫ／ＰＤ
単特異性及び二重特異性ＦＮ３ドメイン分子のインビボでの効能を決定するために、腫瘍細胞を、ヒトＨＧＦを分泌するように改変した（マウスＨＧＦはヒトＨＧＦに結合しない）。ヒトＨＧＦを、レンチウイルス感染を用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において安定に発現させた（ヒトＨＧＦを発現するレンチウイルスＤＮＡベクター（受託番号Ｘ１６３２２）及びＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａからのレンチウイルスパッケージングキット）。感染後、ＨＧＦ発現細胞を４μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって選択した。ヒトＨＧＦタンパク質を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのアッセイプレートを用いてプールした細胞の条件培地で検出した。
【０２５５】
ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスに、ヒトＨＧＦを発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（容積２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中で２．０×１０６個）を各動物の背側脇腹に皮下接種した。腫瘍の測定は、腫瘍の体積が１５０〜２５０ｍｍ３の範囲となるまで週に２回行った。次に、マウスに、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（半減期を増加させるためにアルブミン結合ドメインに連結させた）又はＰＢＳビヒクルの１回腹腔内投与を行った。投与後６時間又は７２時間目に、腫瘍を摘出して、直ちに液体窒素中で凍結した。心穿刺により、血液試料を、プロテアーゼ阻害剤を含む３．８％クエン酸中に採取した。採取後直ちに、血液試料を遠心沈降させて、得られた血漿を試験管に移し、−８０℃で保存した。腫瘍の重量を測定し、小片に切断して、ＨＡＬＴプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）、５０ｍＭフッ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ活性化オルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を有するＲＩＰＡ緩衝液を含むＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａ試験管（ＬＭＡ）中で溶解した。溶解物をＬＭＡマトリクスから取り出して、遠心沈降して不溶性タンパク質を除去した。可溶性の腫瘍タンパク質を、ＢＣＡタンパク質アッセイによって定量して、腫瘍溶解緩衝液中で同等のタンパク質レベルに希釈した。リン酸化ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙのアッセイプレートを用いて測定した（製造元のプロトコルに従って、及び上記のように）。
【０２５６】
図８は、実験の結果を示す。各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子は、６時間及び７２時間の両方で、リン酸化ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、及びＥＲＫレベルを有意に減少させた。図８に示したデータは、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を同時に阻害する重要性、及び各受容体に関する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の親和性が下流のＥＲＫの阻害においてどのような役割を果たすかを示している。高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２；図において「８３」で示す、ＫＤ＝０．２６ｎＭ）は、６時間及び７２時間の両方で中等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２；図において「１７」で示す、ＫＤ＝１．９ｎＭ）と比較して大きい程度にＥＧＦＲのリン酸化を阻害した。試験した４つ全ての二重特異性分子は、親和性によらず、６時間の時点でＥＲＫのリン酸化を完全に阻害した。７２時間の時点で、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ドメインを含む分子（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３；図において「Ａ３」として示す、ＫＤ＝０．４ｎＭ）は、中等度親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを含む分子（Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５；図において「Ａ５」として示す、ＫＤ＝１０．１ｎＭ；Ｆｉｇｕｒｅ  ６）と比較してＥＲＫのリン酸化を有意に阻害した。
【０２５７】
各二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の濃度を、投与後６時間及び７２時間の血液中及び腫瘍中で測定した（図９）。興味深いことに、中等度親和性ＥＧＦＲ結合ドメイン（Ｐ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２；ＫＤ＝１．９ｎＭ）は、他の分子と比較して６時間で有意により多くの腫瘍での蓄積を示したが、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン（Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３；ＫＤ＝０．４ｎＭ）は示さず、その差は７２時間までに消失した。腫瘍外の細胞は、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ両方の表面発現レベルがより低く、それゆえ、中等度親和性ＥＧＦＲ分子は、高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して、正常組織に堅固に結合しないという仮説を立てることができる。それゆえ、より多くの遊離の中等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインが腫瘍との結合に利用できる。それゆえ、各受容体に対して適切な親和性を同定することにより、全身毒性の減少及び腫瘍蓄積の増加を有する治療薬を同定することができる。
【０２５８】
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子による腫瘍の効能試験
ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスに、ヒトＨＧＦを発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（２００μＬのＣｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）中で２．０×１０６個）を各動物の背側脇腹に皮下接種した。植え込みの１週間後、マウスを同等の腫瘍体積（平均腫瘍体積＝７７．９±１．７ｍｍ３）を有する群に分けた。マウスに、二重特異性分子を週に３回投与して、腫瘍の体積を週に２回記録した。腫瘍の増殖阻害（ＴＧＩ）を、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲに対して様々な親和性を有する４つの異なる二重特異性分子について観察した。図１０は、ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインが中等度親和性を有するとき、中等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインと比較して高親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインを含む分子で処置したマウスでは腫瘍増殖の遅れが観察されたことから、ｃ−Ｍｅｔ及びＥＧＦＲの両方を阻害する恩典を示す（△対▲、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５をＰ５３Ａ１Ｒ５−１７−Ｐ１１４ＡＲ５Ｐ７４−Ａ５と比較）。加えて、データは、高又は中等度親和性ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのいずれかを含む二重特異性分子として高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインを有する重要性を示しているが、高親和性ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインは、最も高い効能を示した（灰色の点線と黒色の実線、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３とＰ５３Ａ１Ｒ５−１７ｖ２−Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３）。
【０２５９】
二重特異性分子並びにＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの他の阻害剤の効能
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（ＥＣＢ３８）及び低分子阻害剤クリゾチニブ（ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）及びエルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）のそれぞれ単剤としての、並びにクリゾチニブとエルロチニブの併用のインビボ治療効能を、ＳＣＩＤ／ＢｅｉｇｅマウスにおけるＨ２９２−ＨＧＦヒト肺がん皮下異種移植片モデルの処置において評価した（図１１）。
【０２６０】
Ｈ２９２−ＨＧＦ細胞を、ウシ胎児血清（１０％ｖ／ｖ）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％  ＣＯ２を含む空気環境下で３７℃でインビトロで維持した。細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ処置によって週に２回サブクローニングした。指数増殖相で増殖する細胞を回収して、腫瘍接種のために計数した。
【０２６１】
各マウスの右脇腹領域に、腫瘍を発達させるためのｃｕｌｔｒｅｘを含むＰＢＳ（１：１）０．１ｍＬ中のＨ２９２−ＨＧＦ腫瘍細胞（２×１０６個）を皮下接種した。平均腫瘍サイズが１３９ｍｍ３に達したときに処置を開始した。各試験群における試験物質の投与及び動物番号を、以下の実験計画表に示す（表２６）。腫瘍細胞接種日を０日目とした。
【０２６２】
【表１９】
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Ｎ：動物数ｐ．ｏ．：経口投与ｉ．ｐ．：腹腔内注射を週に３回；用量は、週の１、３、及び５日目に投与する。
ＱＤ：１日１回。Ｑ４ｄ：４日ごとに１回クリゾチニブとエルロチニブの併用の間隔は０．５時間であった。投与体積は、体重に基づいて調節した（１０ｌ／ｇ）。ａ：群分け後の１４日目には投与を行わなかった。
【０２６３】
処置開始前、全ての動物の体重を測定して、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は任意の所定の処置の有効性に影響を及ぼし得ることから、その腫瘍体積に基づく無作為ブロックデザインを用いてマウスを群分けした。これによって、全ての群がベースラインで確実に同等となる。無作為化ブロックデザインを用いて、実験動物を群に割り付けした。第一に、実験動物をその初回腫瘍体積に従って均一ブロックに分けた。次に、各ブロック内で処置に対する実験動物の無作為化を行った。実験動物を割り付けするために無作為化ブロックデザインを用いることにより、各動物が、所定の処置に割り付けられる確率が同じであることが確保され、それゆえ、系統的誤差が減少した。
【０２６４】
通常のモニタリング時に、動物を、運動性、飼料及び水の摂取の目視での推定、体重増加／減少（体重は週に２回測定した）、つやのない眼／毛、及び他の任意の異常な効果などの、通常行動に及ぼす腫瘍増殖及び処置の任意の影響に関してチェックした。
【０２６５】
主要なエンドポイントは、腫瘍の増殖を遅らせることができるか否か、又は腫瘍を有するマウスを治癒できるか否かであった。腫瘍の大きさは、カリパスを用いて２つの寸法を週に２回測定して、ａ及びｂがそれぞれ、腫瘍の長径及び短径である、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２を用いて体積をｍｍ３で表記した。次に、腫瘍サイズをＴ−Ｃ及びＴ／Ｃ値の計算のために用いた。Ｔ−Ｃは、処置群の平均腫瘍サイズが１０００ｍｍ３に達するのに要する時間（日数）としてＴから計算され、Ｃは、対照群の平均腫瘍サイズが同じサイズに達するまでの時間（日数）であった。Ｔ／Ｃ値（％）は、抗腫瘍効能の指標であった。Ｔ及びＣはそれぞれ、所定の日の処置群及び対照群の平均体積であった。完全な腫瘍の退縮（ＣＲ）は、触診下限（６２．５ｍｍ３）より下まで低減された腫瘍として定義される。部分的な腫瘍退縮（ＰＲ）は、初回の腫瘍体積から低減された腫瘍として定義される。少なくとも３回以上連続した腫瘍測定でＣＲ又はＰＲが持続することは、ＣＰ又はＰＲが持続可能であると考えられるために必要である。
【０２６６】
体重減少が２０％を超える動物、又は群の平均腫瘍サイズが２０００ｍｍ３を超える動物は安楽死させた。最終投与後２週間の観察後に試験を終了した。
【０２６７】
各時点の各群の腫瘍体積に関して、平均値及び平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を含む要約統計量を提供する（以下の表１９に示す）。群における腫瘍体積の差の統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡの後にＧａｍｅｓ−Ｈｏｗｅｌｌ（等分散を仮定しない）を用いる個々の比較を用いることによって評価した。データは全て、ＳＰＳＳ  １８．０を用いて分析した。ｐ＜０．０５は、統計学的に有意であると考えられた。
【０２６８】
【表２０】
0006585040.tif 000027
【０２６９】
ビヒクル処置群（群１）の平均腫瘍サイズは、腫瘍接種後２３日目に１，７５８ｍｍ３に達した。用量レベル２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子によって処置すると（群２）、全てのマウスにおいて完全な腫瘍の退縮（ＣＲ）が起こり、これは３回より多くの連続腫瘍測定の間持続した（平均値ＴＶ＝２３ｍｍ３、Ｔ／Ｃ値＝１％、２３日目でのビヒクル群と比較してｐ＝０．００４）。
【０２７０】
用量レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としてのクリゾチニブによる処置（群３）は、抗腫瘍活性を示さなかった；平均腫瘍サイズは２３日目に２，１０２ｍｍ３であった（Ｔ／Ｃ値＝１２０％、ビヒクル群と比較してｐ＝０．９４４）。
【０２７１】
用量レベル５０ｍｇ／ｋｇの単剤としてのエルロチニブによる処置（群４）は、軽微な抗腫瘍活性を示したが、ビヒクル群と比較して有意差は認められなかった。平均腫瘍サイズは２３日目で１，１２２ｍｍ３であり（Ｔ／Ｃ値＝６４％、ビヒクル群と比較してｐ＝０．４２９）、１，０００ｍｍ３の腫瘍サイズではビヒクル群と比較して腫瘍増殖の４日間の遅れを示した。
【０２７２】
クリゾチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）とエルロチニブ（５０ｍｇ／ｋｇ、群５）の併用は、有意な抗腫瘍活性を示した。平均腫瘍サイズは２３日目で２６５ｍｍ３であり（Ｔ／Ｃ値＝１５％、ｐ＝０．００８）、１，０００ｍｍ３の腫瘍サイズではビヒクル群と比較して腫瘍増殖の１７日間の遅れを示した。
【０２７３】
単剤としての用量レベル１ｍｇ／マウスのセツキシマブ（群６）は、有意な抗腫瘍活性を示した。平均腫瘍サイズは２３日目で４８５ｍｍ３であり（Ｔ／Ｃ値＝２８％、ｐ＝０．０１８）、１，０００ｍｍ３の腫瘍サイズではビヒクル群と比較して腫瘍増殖の１７日間の遅れを示した。図１１は、様々な治療の抗腫瘍活性を示す。
【０２７４】
【表２１】
0006585040.tif 000028
【０２７５】
ビヒクル群では中等度から重度の体重減少が観察され、これは腫瘍の負荷の増加によるものであり得る。マウス３匹が死亡し、２３日目までにＢＷＬ＞２０％となったマウス１匹を安楽死させた。群２では二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の軽度の毒性が観察された。処置機関の間にＢＷＬ＞２０％となったマウス３匹を安楽死させた。２週間の観察期間の間処置を中止すると、体重は徐々に回復した。クリゾチニブ又はエルロチニブ単剤治療群では、ビヒクル群と比較してより重度の体重減少が観察され、処置関連毒性を示唆した。クリゾチニブとエルロチニブの併用は、投与相の間、一般的に認容されたが、試験終了時には重度の体重減少が観察され、これは非処置期間での急速な腫瘍増殖の再開によるものであり得る。セツキシマブの単剤治療は、試験において良好に認容された。腫瘍増殖の再開により、試験終了時に限って体重減少が観察された。
【０２７６】
要約すると、２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子（週に３回×３週間）は、ＳＣＩＤ／ＢｅｉｇｅマウスのＨ２９２−ＨＧＦヒト肺がん異種移植片モデルにおいて完全奏功をもたらした。処置は、マウス１０匹中７匹において認容され、マウス１０匹中３匹には重度の体重減少が起こった。図１１及び表２０は、処置後の時点での腫瘍サイズに及ぼす様々な治療の影響を示す。
【０２７７】
実施例９：二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期延長
タンパク質の腎臓での濾過を低減させ、このようにタンパク質の血清半減期を増加させるために様々な方法が記述されており、これには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は他のポリマーによる修飾、アルブミンとの結合、アルブミン又は他の血清タンパク質に結合するタンパク質ドメインとの融合、アルブミンとの遺伝的融合、ＩｇＧ  ｆｃドメインとの融合、及び長い非構造アミノ酸配列との融合が挙げられる。
【０２７８】
流体力学半径を増加させるために、分子のＣ−末端で遊離のシステインを組み入れることによって、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子をＰＥＧによって修飾した。最も一般的に、システイン残基の遊離のチオール基を用いて、標準的な方法を用いてマレイミド又はヨードアセテミド（iodoacetemide）基で官能化したＰＥＧ分子に結合させる。１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、又は４０，０００ｋＤａの直鎖状ＰＥＧを含む様々な型のＰＥＧを用いて、タンパク質を修飾することができる。これらの分子量の分枝状ＰＥＧもまた、修飾のために用いることができる。ＰＥＧ基はまた、いくつかの例において二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子中の一級アミンを通して結合させることもできる。
【０２７９】
ＰＥＧ化に加えて、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の半減期は、天然に存在する３−へリックスバンドルの血清アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はコンセンサスアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤＣｏｎ）との融合分子としてこれらのタンパク質を産生することによって延長した。これらのタンパク質ドメインを、表１６に記述される任意のリンカーを介してｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインのＣ−末端に連結させた。ＡＢＤ又はＡＢＤＣｏｎドメインもまた、一次配列のＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインとｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインの間に配置され得る。
【０２８０】
実施例１０：選択した二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の特徴づけ
選択したＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子を、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔの両方に対するその親和性、ＥＧＦＲ及びｃ−Ｍｅｔ自己リン酸化のその阻害能、並びにＨＧＦ細胞の増殖に及ぼすその効果に関して特徴を調べた。組み換え型ＥＧＦＲ及び／又はｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインに対する二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の結合親和性を、実施例３に記述されるプロトコルに従ってＰｒｏｔｅｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる表面プラズモン共鳴法によって調べた。特徴づけの結果を表２１に示す。
【０２８１】
【表２２】
0006585040.tif 000029
【０２８２】
実施例１１：システイン改変二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製及び特徴づけ
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子の作製
Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２変異体（実施例５）のシステインスキャニングから得られたデータに基づき、二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ分子において、Ｐ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）、ｃＭｅｔ結合体Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９５−Ｃ５ｖ２（配列番号１１４）、及び半減期延長のためのアルブミン結合ドメインからなるＥＣＢ１４７（配列番号２１８及び２５６）と表示されるシステイン変異体も設計した。これらの３つのドメインは、（Ａｌａ−Ｐｒｏ）５リンカー（配列番号８１）によって接続される。１個、２個、又は４個のシステインを有する変種を、ＦＮ３ドメインの１つのＣ−末端、リンカー領域、又はＬｙｓ−６２位置での置換によって設計した（配列番号２１９〜２２５及び２５７〜２６３）。別の二重特異性変種ＥＣＢ８２ｃｙｓ（配列番号２２６及び２６４）は、３つ全てのドメインがＡＰリンカーによって接続されたＰ５４ＡＲ４−８３ｖ２（配列番号２７）、Ｐ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３ｖ２２（配列番号１１１）、及びアルブミン結合ドメインの変種、並びに１つのＣ−末端システインからなる。非標的化Ｔｅｎｃｏｎ足場構造（配列番号２６５）の追加のシステイン変種もまた、対照コンジュゲートの構築のために用いた。変種は全て、先の実施例に記述されるように構築して、発現させ、精製した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ５／１５０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる分析的サイズ排除クロマトグラフィーは、ＦＮ３ドメイン調製物が凝集物を含まず、単量体タンパク質と一貫する時間で溶出することを示している。質量分析により、理論的質量と一致した質量が決定された（表２２）。
【０２８３】
【表２３】
0006585040.tif 000030
【０２８４】
化学コンジュゲーション
精製二重特異性システイン変種をマレイミド含有分子に化学的にコンジュゲートするために、タンパク質を最初にＴＣＥＰで還元して遊離のチオールを生成した。各二重特異性システイン変種１〜２ｍｇを、中性ｐＨで過剰量のＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号６４６５４７）と混合して、ＲＴで３０〜６０分間インキュベートした。３倍量の飽和硫酸アンモニウム溶液（４．０２Ｍ）を添加して、システイン変種を沈殿させることによって、ＴＣＥＰを除去した。１６０００〜２００００×ｇで４℃で２０分間遠心沈降して上清を除去後、タンパク質沈降物をＰＢＳ又はリン酸ナトリウム緩衝液に溶解して、マレイミド含有分子の５〜１０倍過剰量と直ちに混合した。反応を室温で３０〜６０分間インキュベートした後、過剰量のマレイミドを除去するために、システイン又はβ−メルカプトエタノールなどの過剰量の遊離のチオールによって停止させた。非結合マレイミドを、Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号８９８９０）で、Ｔｏｓｏｈ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（＃Ｐ４６１９−１４Ｎ；７．８ｍｍ×３０ｃｍ；５μｍ）を備えた分取用ＳＥＣによって、又はシステイン変種をＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合させて、洗浄して、本質的に上記のように溶出させることによって除去した。コンジュゲートの特徴を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析によって調べた。この一般法を用いて、二重特異性システイン変種を、蛍光マレイミド（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号６２２４５）、ＰＥＧ２４−マレイミド（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、カタログ番号１０３１９）、及びマレイミド−細胞毒素分子に、様々なリンカー（図２の構造を参照）によってコンジュゲートした。
【０２８５】
ＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害
精製二重特異性ＰＥＧ２４−マレイミドコンジュゲートを、ヒト腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、カタログ番号ＣＲＬ−１８４８）において、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のＥＧＦＲ  ｐｈｏｓｐｈｏ（Ｔｙｒ１１７３）キットを用いて、実施例３に記述されるように、ＥＧＦＲのＥＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して試験した。コンジュゲートを、ＥＣＢ１４７とはアミノ酸２個が異なる非修飾ＥＣＢ３８（配列番号１０９）と比較した。コンジュゲート及びＥＣＢ３８は、表２３に示されるように、類似のＩＣ５０値でＥＧＦＲを阻害し、設計された部位での修飾が標的の結合に有意に影響を及ぼさないことを証明した。
【０２８６】
【表２４】
0006585040.tif 000031
【０２８７】
ＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害
精製二重特異性ＰＥＧ２４−マレイミドコンジュゲートをまた、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のｃ−Ｍｅｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ（Ｔｙｒ１３４９）キットを用いて、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるｃ−ＭｅｔのＨＧＦ刺激リン酸化の阻害能に関して、実施例７に記述されるように試験した。コンジュゲート及びＥＣＢ３８は、表２４に示されるように、類似のＩＣ５０でｃＭｅｔを阻害し、これらの部位での修飾が標的の結合に有意に影響を及ぼさないことを証明した。
【０２８８】
【表２５】
0006585040.tif 000032
【０２８９】
細胞障害性アッセイ
ＥＣＢ１４７システイン変種、８３ｖ２−ｃｙｓ、又はアウリスタチンファミリーの細胞障害性チューブリン阻害剤に連結されたＴｅｎｃｏｎ−ｃｙｓからなるコンジュゲート（図２）を、がん細胞における標的依存的細胞障害性に関して試験した。阻害剤を、非切断型ＰＥＧ４リンカー、又は酵素切断型バリン−シトルリン又はバリン−リジンリンカーを介してシステイン含有タンパク質に連結させた。殺細胞を、実施例４に記述される技法を用いて、タンパク質−細胞毒素コンジュゲートに暴露後のＥＧＦＲ過剰発現ヒト腫瘍細胞株Ｈ１５７３及びＡ４３１並びにＥＧＦＲ陰性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の生存率を測定することによって評価した。表２５は、６６、７２、又は９０時間の時点で、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ又はＩｎｃｕＣｙｔｅオブジェクトカウントデータの分析から得られたＩＣ５０を報告する。タンパク質−薬物コンジュゲートは、標的抗原ＥＧＦＲを発現する細胞の強力な殺細胞を示した。多数の薬物のコンジュゲートもまた、調べた多くの細胞株において細胞障害性の増加を示した。
【０２９０】
【表２６】
0006585040.tif 000033
【０２９１】
【表２７−１】
0006585040.tif 000034
【０２９２】
【表２７−２】
0006585040.tif 000035
【０２９３】
【表２７−３】
0006585040.tif 000036
【０２９４】
【表２７−４】
0006585040.tif 000037
【０２９５】
【表２７−５】
0006585040.tif 000038
【０２９６】
【表２７−６】
0006585040.tif 000039
【０２９７】
配列番号７３，ＰＲＴ，ヒト，ＥＧＦＲ
１  ｍｒｐｓｇｔａｇａａ  ｌｌａｌｌａａｌｃｐ  ａｓｒａｌｅｅｋｋｖ  ｃｑｇｔｓｎｋｌｔｑ  ｌｇｔｆｅｄｈｆｌｓ  ｌｑｒｍｆｎｎｃｅｖ
６１  ｖｌｇｎｌｅｉｔｙｖ  ｑｒｎｙｄｌｓｆｌｋ  ｔｉｑｅｖａｇｙｖｌ  ｉａｌｎｔｖｅｒｉｐ  ｌｅｎｌｑｉｉｒｇｎ  ｍｙｙｅｎｓｙａｌａ
１２１  ｖｌｓｎｙｄａｎｋｔ  ｇｌｋｅｌｐｍｒｎｌ  ｑｅｉｌｈｇａｖｒｆ  ｓｎｎｐａｌｃｎｖｅ  ｓｉｑｗｒｄｉｖｓｓ  ｄｆｌｓｎｍｓｍｄｆ
１８１  ｑｎｈｌｇｓｃｑｋｃ  ｄｐｓｃｐｎｇｓｃｗ  ｇａｇｅｅｎｃｑｋｌ  ｔｋｉｉｃａｑｑｃｓ  ｇｒｃｒｇｋｓｐｓｄ  ｃｃｈｎｑｃａａｇｃ
２４１  ｔｇｐｒｅｓｄｃｌｖ  ｃｒｋｆｒｄｅａｔｃ  ｋｄｔｃｐｐｌｍｌｙ  ｎｐｔｔｙｑｍｄｖｎ  ｐｅｇｋｙｓｆｇａｔ  ｃｖｋｋｃｐｒｎｙｖ
３０１  ｖｔｄｈｇｓｃｖｒａ  ｃｇａｄｓｙｅｍｅｅ  ｄｇｖｒｋｃｋｋｃｅ  ｇｐｃｒｋｖｃｎｇｉ  ｇｉｇｅｆｋｄｓｌｓ  ｉｎａｔｎｉｋｈｆｋ
３６１  ｎｃｔｓｉｓｇｄｌｈ  ｉｌｐｖａｆｒｇｄｓ  ｆｔｈｔｐｐｌｄｐｑ  ｅｌｄｉｌｋｔｖｋｅ  ｉｔｇｆｌｌｉｑａｗ  ｐｅｎｒｔｄｌｈａｆ
４２１  ｅｎｌｅｉｉｒｇｒｔ  ｋｑｈｇｑｆｓｌａｖ  ｖｓｌｎｉｔｓｌｇｌ  ｒｓｌｋｅｉｓｄｇｄ  ｖｉｉｓｇｎｋｎｌｃ  ｙａｎｔｉｎｗｋｋｌ
４８１  ｆｇｔｓｇｑｋｔｋｉ  ｉｓｎｒｇｅｎｓｃｋ  ａｔｇｑｖｃｈａｌｃ  ｓｐｅｇｃｗｇｐｅｐ  ｒｄｃｖｓｃｒｎｖｓ  ｒｇｒｅｃｖｄｋｃｎ
５４１  ｌｌｅｇｅｐｒｅｆｖ  ｅｎｓｅｃｉｑｃｈｐ  ｅｃｌｐｑａｍｎｉｔ  ｃｔｇｒｇｐｄｎｃｉ  ｑｃａｈｙｉｄｇｐｈ  ｃｖｋｔｃｐａｇｖｍ
６０１  ｇｅｎｎｔｌｖｗｋｙ  ａｄａｇｈｖｃｈｌｃ  ｈｐｎｃｔｙｇｃｔｇ  ｐｇｌｅｇｃｐｔｎｇ  ｐｋｉｐｓｉａｔｇｍ  ｖｇａｌｌｌｌｌｖｖ
６６１  ａｌｇｉｇｌｆｍｒｒ  ｒｈｉｖｒｋｒｔｌｒ  ｒｌｌｑｅｒｅｌｖｅ  ｐｌｔｐｓｇｅａｐｎ  ｑａｌｌｒｉｌｋｅｔ  ｅｆｋｋｉｋｖｌｇｓ
７２１  ｇａｆｇｔｖｙｋｇｌ  ｗｉｐｅｇｅｋｖｋｉ  ｐｖａｉｋｅｌｒｅａ  ｔｓｐｋａｎｋｅｉｌ  ｄｅａｙｖｍａｓｖｄ  ｎｐｈｖｃｒｌｌｇｉ
７８１  ｃｌｔｓｔｖｑｌｉｔ  ｑｌｍｐｆｇｃｌｌｄ  ｙｖｒｅｈｋｄｎｉｇ  ｓｑｙｌｌｎｗｃｖｑ  ｉａｋｇｍｎｙｌｅｄ  ｒｒｌｖｈｒｄｌａａ
８４１  ｒｎｖｌｖｋｔｐｑｈ  ｖｋｉｔｄｆｇｌａｋ  ｌｌｇａｅｅｋｅｙｈ  ａｅｇｇｋｖｐｉｋｗ  ｍａｌｅｓｉｌｈｒｉ  ｙｔｈｑｓｄｖｗｓｙ
９０１  ｇｖｔｖｗｅｌｍｔｆ  ｇｓｋｐｙｄｇｉｐａ  ｓｅｉｓｓｉｌｅｋｇ  ｅｒｌｐｑｐｐｉｃｔ  ｉｄｖｙｍｉｍｖｋｃ  ｗｍｉｄａｄｓｒｐｋ
９６１  ｆｒｅｌｉｉｅｆｓｋ  ｍａｒｄｐｑｒｙｌｖ  ｉｑｇｄｅｒｍｈｌｐ  ｓｐｔｄｓｎｆｙｒａ  ｌｍｄｅｅｄｍｄｄｖ  ｖｄａｄｅｙｌｉｐｑ
１０２１  ｑｇｆｆｓｓｐｓｔｓ  ｒｔｐｌｌｓｓｌｓａ  ｔｓｎｎｓｔｖａｃｉ  ｄｒｎｇｌｑｓｃｐｉ  ｋｅｄｓｆｌｑｒｙｓ  ｓｄｐｔｇａｌｔｅｄ
１０８１  ｓｉｄｄｔｆｌｐｖｐ  ｅｙｉｎｑｓｖｐｋｒ  ｐａｇｓｖｑｎｐｖｙ  ｈｎｑｐｌｎｐａｐｓ  ｒｄｐｈｙｑｄｐｈｓ  ｔａｖｇｎｐｅｙｌｎ
１１４１  ｔｖｑｐｔｃｖｎｓｔ  ｆｄｓｐａｈｗａｑｋ  ｇｓｈｑｉｓｌｄｎｐ  ｄｙｑｑｄｆｆｐｋｅ  ａｋｐｎｇｉｆｋｇｓ  ｔａｅｎａｅｙｌｒｖ
１２０１  ａｐｑｓｓｅｆｉｇａ
【０２９８】
【表２８】
0006585040.tif 000040
【０２９９】
配列番号７５，ＰＲＴ，ヒト，テナシン−Ｃ
１  ｍｇａｍｔｑｌｌａｇ  ｖｆｌａｆｌａｌａｔ  ｅｇｇｖｌｋｋｖｉｒ  ｈｋｒｑｓｇｖｎａｔ  ｌｐｅｅｎｑｐｖｖｆ  ｎｈｖｙｎｉｋｌｐｖ
６１  ｇｓｑｃｓｖｄｌｅｓ  ａｓｇｅｋｄｌａｐｐ  ｓｅｐｓｅｓｆｑｅｈ  ｔｖｄｇｅｎｑｉｖｆ  ｔｈｒｉｎｉｐｒｒａ  ｃｇｃａａａｐｄｖｋ
１２１  ｅｌｌｓｒｌｅｅｌｅ  ｎｌｖｓｓｌｒｅｑｃ  ｔａｇａｇｃｃｌｑｐ  ａｔｇｒｌｄｔｒｐｆ  ｃｓｇｒｇｎｆｓｔｅ  ｇｃｇｃｖｃｅｐｇｗ
１８１ｋｇｐｎｃｓｅｐｅｃ  ｐｇｎｃｈｌｒｇｒｃ  ｉｄｇｑｃｉｃｄｄｇ  ｆｔｇｅｄｃｓｑｌａ  ｃｐｓｄｃｎｄｑｇｋ  ｃｖｎｇｖｃｉｃｆｅ
２４１  ｇｙａｇａｄｃｓｒｅ  ｉｃｐｖｐｃｓｅｅｈ  ｇｔｃｖｄｇｌｃｖｃ  ｈｄｇｆａｇｄｄｃｎ  ｋｐｌｃｌｎｎｃｙｎ  ｒｇｒｃｖｅｎｅｃｖ
３０１  ｃｄｅｇｆｔｇｅｄｃ  ｓｅｌｉｃｐｎｄｃｆ  ｄｒｇｒｃｉｎｇｔｃ  ｙｃｅｅｇｆｔｇｅｄ  ｃｇｋｐｔｃｐｈａｃ  ｈｔｑｇｒｃｅｅｇｑ
３６１  ｃｖｃｄｅｇｆａｇｖ  ｄｃｓｅｋｒｃｐａｄ  ｃｈｎｒｇｒｃｖｄｇ  ｒｃｅｃｄｄｇｆｔｇ  ａｄｃｇｅｌｋｃｐｎ  ｇｃｓｇｈｇｒｃｖｎ
４２１  ｇｑｃｖｃｄｅｇｙｔ  ｇｅｄｃｓｑｌｒｃｐ  ｎｄｃｈｓｒｇｒｃｖ  ｅｇｋｃｖｃｅｑｇｆ  ｋｇｙｄｃｓｄｍｓｃ  ｐｎｄｃｈｑｈｇｒｃ
４８１  ｖｎｇｍｃｖｃｄｄｇ  ｙｔｇｅｄｃｒｄｒｑ  ｃｐｒｄｃｓｎｒｇｌ  ｃｖｄｇｑｃｖｃｅｄ  ｇｆｔｇｐｄｃａｅｌ  ｓｃｐｎｄｃｈｇｑｇ
５４１  ｒｃｖｎｇｑｃｖｃｈ  ｅｇｆｍｇｋｄｃｋｅ  ｑｒｃｐｓｄｃｈｇｑ  ｇｒｃｖｄｇｑｃｉｃ  ｈｅｇｆｔｇｌｄｃｇ  ｑｈｓｃｐｓｄｃｎｎ
６０１  ｌｇｑｃｖｓｇｒｃｉ  ｃｎｅｇｙｓｇｅｄｃ  ｓｅｖｓｐｐｋｄｌｖ  ｖｔｅｖｔｅｅｔｖｎ  ｌａｗｄｎｅｍｒｖｔ  ｅｙｌｖｖｙｔｐｔｈ
６６１  ｅｇｇｌｅｍｑｆｒｖ  ｐｇｄｑｔｓｔｉｉｑ  ｅｌｅｐｇｖｅｙｆｉ  ｒｖｆａｉｌｅｎｋｋ  ｓｉｐｖｓａｒｖａｔ  ｙｌｐａｐｅｇｌｋｆ
７２１  ｋｓｉｋｅｔｓｖｅｖ  ｅｗｄｐｌｄｉａｆｅ  ｔｗｅｉｉｆｒｎｍｎ  ｋｅｄｅｇｅｉｔｋｓ  ｌｒｒｐｅｔｓｙｒｑ  ｔｇｌａｐｇｑｅｙｅ
７８１  ｉｓｌｈｉｖｋｎｎｔ  ｒｇｐｇｌｋｒｖｔｔ  ｔｒｌｄａｐｓｑｉｅ  ｖｋｄｖｔｄｔｔａｌ  ｉｔｗｆｋｐｌａｅｉ  ｄｇｉｅｌｔｙｇｉｋ
８４１  ｄｖｐｇｄｒｔｔｉｄ  ｌｔｅｄｅｎｑｙｓｉ  ｇｎｌｋｐｄｔｅｙｅ  ｖｓｌｉｓｒｒｇｄｍ  ｓｓｎｐａｋｅｔｆｔ  ｔｇｌｄａｐｒｎｌｒ
９０１  ｒｖｓｑｔｄｎｓｉｔ  ｌｅｗｒｎｇｋａａｉ  ｄｓｙｒｉｋｙａｐｉ  ｓｇｇｄｈａｅｖｄｖ  ｐｋｓｑｑａｔｔｋｔ  ｔｌｔｇｌｒｐｇｔｅ
９６１  ｙｇｉｇｖｓａｖｋｅ  ｄｋｅｓｎｐａｔｉｎ  ａａｔｅｌｄｔｐｋｄ  ｌｑｖｓｅｔａｅｔｓ  ｌｔｌｌｗｋｔｐｌａ  ｋｆｄｒｙｒｌｎｙｓ
１０２１  ｌｐｔｇｑｗｖｇｖｑ  ｌｐｒｎｔｔｓｙｖｌ  ｒｇｌｅｐｇｑｅｙｎ  ｖｌｌｔａｅｋｇｒｈ  ｋｓｋｐａｒｖｋａｓ  ｔｅｑａｐｅｌｅｎｌ
１０８１  ｔｖｔｅｖｇｗｄｇｌ  ｒｌｎｗｔａａｄｑａ  ｙｅｈｆｉｉｑｖｑｅ  ａｎｋｖｅａａｒｎｌ  ｔｖｐｇｓｌｒａｖｄ  ｉｐｇｌｋａａｔｐｙ
１１４１  ｔｖｓｉｙｇｖｉｑｇ  ｙｒｔｐｖｌｓａｅａ  ｓｔｇｅｔｐｎｌｇｅ  ｖｖｖａｅｖｇｗｄａ  ｌｋｌｎｗｔａｐｅｇ  ａｙｅｙｆｆｉｑｖｑ
１２０１  ｅａｄｔｖｅａａｑｎ  ｌｔｖｐｇｇｌｒｓｔ  ｄｌｐｇｌｋａａｔｈ  ｙｔｉｔｉｒｇｖｔｑ  ｄｆｓｔｔｐｌｓｖｅ  ｖｌｔｅｅｖｐｄｍｇ
１２６１  ｎｌｔｖｔｅｖｓｗｄ  ａｌｒｌｎｗｔｔｐｄ  ｇｔｙｄｑｆｔｉｑｖ  ｑｅａｄｑｖｅｅａｈ  ｎｌｔｖｐｇｓｌｒｓ  ｍｅｉｐｇｌｒａｇｔ
１３２１  ｐｙｔｖｔｌｈｇｅｖ  ｒｇｈｓｔｒｐｌａｖ  ｅｖｖｔｅｄｌｐｑｌ  ｇｄｌａｖｓｅｖｇｗ  ｄｇｌｒｌｎｗｔａａ  ｄｎａｙｅｈｆｖｉｑ
１３８１  ｖｑｅｖｎｋｖｅａａ  ｑｎｌｔｌｐｇｓｌｒ  ａｖｄｉｐｇｌｅａａ  ｔｐｙｒｖｓｉｙｇｖ  ｉｒｇｙｒｔｐｖｌｓ  ａｅａｓｔａｋｅｐｅ
１４４１  ｉｇｎｌｎｖｓｄｉｔ  ｐｅｓｆｎｌｓｗｍａ  ｔｄｇｉｆｅｔｆｔｉ  ｅｉｉｄｓｎｒｌｌｅ  ｔｖｅｙｎｉｓｇａｅ  ｒｔａｈｉｓｇｌｐｐ
１５０１  ｓｔｄｆｉｖｙｌｓｇ  ｌａｐｓｉｒｔｋｔｉ  ｓａｔａｔｔｅａｌｐ  ｌｌｅｎｌｔｉｓｄｉ  ｎｐｙｇｆｔｖｓｗｍ  ａｓｅｎａｆｄｓｆｌ
１５６１  ｖｔｖｖｄｓｇｋｌｌ  ｄｐｑｅｆｔｌｓｇｔ  ｑｒｋｌｅｌｒｇｌｉ  ｔｇｉｇｙｅｖｍｖｓ  ｇｆｔｑｇｈｑｔｋｐ  ｌｒａｅｉｖｔｅａｅ
１６２１  ｐｅｖｄｎｌｌｖｓｄ  ａｔｐｄｇｆｒｌｓｗ  ｔａｄｅｇｖｆｄｎｆ  ｖｌｋｉｒｄｔｋｋｑ  ｓｅｐｌｅｉｔｌｌａ  ｐｅｒｔｒｄｉｔｇｌ
１６８１  ｒｅａｔｅｙｅｉｅｌ  ｙｇｉｓｋｇｒｒｓｑ  ｔｖｓａｉａｔｔａｍ  ｇｓｐｋｅｖｉｆｓｄ  ｉｔｅｎｓａｔｖｓｗ  ｒａｐｔａｑｖｅｓｆ
１７４１  ｒｉｔｙｖｐｉｔｇｇ  ｔｐｓｍｖｔｖｄｇｔ  ｋｔｑｔｒｌｖｋｌｉ  ｐｇｖｅｙｌｖｓｉｉ  ａｍｋｇｆｅｅｓｅｐ  ｖｓｇｓｆｔｔａｌｄ
１８０１  ｇｐｓｇｌｖｔａｎｉ  ｔｄｓｅａｌａｒｗｑ  ｐａｉａｔｖｄｓｙｖ  ｉｓｙｔｇｅｋｖｐｅ  ｉｔｒｔｖｓｇｎｔｖ  ｅｙａｌｔｄｌｅｐａ
１８６１  ｔｅｙｔｌｒｉｆａｅ  ｋｇｐｑｋｓｓｔｉｔ  ａｋｆｔｔｄｌｄｓｐ  ｒｄｌｔａｔｅｖｑｓ  ｅｔａｌｌｔｗｒｐｐ  ｒａｓｖｔｇｙｌｌｖ
１９２１  ｙｅｓｖｄｇｔｖｋｅ  ｖｉｖｇｐｄｔｔｓｙ  ｓｌａｄｌｓｐｓｔｈ  ｙｔａｋｉｑａｌｎｇ  ｐｌｒｓｎｍｉｑｔｉ  ｆｔｔｉｇｌｌｙｐｆ
１９８１  ｐｋｄｃｓｑａｍｌｎ  ｇｄｔｔｓｇｌｙｔｉ  ｙｌｎｇｄｋａｅａｌ  ｅｖｆｃｄｍｔｓｄｇ  ｇｇｗｉｖｆｌｒｒｋ  ｎｇｒｅｎｆｙｑｎｗ
２０４１  ｋａｙａａｇｆｇｄｒ  ｒｅｅｆｗｌｇｌｄｎ  ｌｎｋｉｔａｑｇｑｙ  ｅｌｒｖｄｌｒｄｈｇ  ｅｔａｆａｖｙｄｋｆ  ｓｖｇｄａｋｔｒｙｋ
２１０１  ｌｋｖｅｇｙｓｇｔａ  ｇｄｓｍａｙｈｎｇｒ  ｓｆｓｔｆｄｋｄｔｄ  ｓａｉｔｎｃａｌｓｙ  ｋｇａｆｗｙｒｎｃｈ  ｒｖｎｌｍｇｒｙｇｄ
２１６１  ｎｎｈｓｑｇｖｎｗｆ  ｈｗｋｇｈｅｈｓｉｑ  ｆａｅｍｋｌｒｐｓｎ  ｆｒｎｌｅｇｒｒｋｒ  ａ
【０３００】
【表２９−１】
0006585040.tif 000041
【表２９−２】
0006585040.tif 000042
【０３０１】
＞配列番号１０１
ＰＲＴ
ヒト
ｃＭｅｔ
１  ｍｋａｐａｖｌａｐｇ  ｉｌｖｌｌｆｔｌｖｑ  ｒｓｎｇｅｃｋｅａｌ  ａｋｓｅｍｎｖｎｍｋ  ｙｑｌｐｎｆｔａｅｔ  ｐｉｑｎｖｉｌｈｅｈ
６１  ｈｉｆｌｇａｔｎｙｉ  ｙｖｌｎｅｅｄｌｑｋ  ｖａｅｙｋｔｇｐｖｌ  ｅｈｐｄｃｆｐｃｑｄ  ｃｓｓｋａｎｌｓｇｇ  ｖｗｋｄｎｉｎｍａｌ
１２１  ｖｖｄｔｙｙｄｄｑｌ  ｉｓｃｇｓｖｎｒｇｔ  ｃｑｒｈｖｆｐｈｎｈ  ｔａｄｉｑｓｅｖｈｃ  ｉｆｓｐｑｉｅｅｐｓ  ｑｃｐｄｃｖｖｓａｌ
１８１  ｇａｋｖｌｓｓｖｋｄ  ｒｆｉｎｆｆｖｇｎｔ  ｉｎｓｓｙｆｐｄｈｐ  ｌｈｓｉｓｖｒｒｌｋ  ｅｔｋｄｇｆｍｆｌｔ  ｄｑｓｙｉｄｖｌｐｅ
２４１  ｆｒｄｓｙｐｉｋｙｖ  ｈａｆｅｓｎｎｆｉｙ  ｆｌｔｖｑｒｅｔｌｄ  ａｑｔｆｈｔｒｉｉｒ  ｆｃｓｉｎｓｇｌｈｓ  ｙｍｅｍｐｌｅｃｉｌ
３０１  ｔｅｋｒｋｋｒｓｔｋ  ｋｅｖｆｎｉｌｑａａ  ｙｖｓｋｐｇａｑｌａ  ｒｑｉｇａｓｌｎｄｄ  ｉｌｆｇｖｆａｑｓｋ  ｐｄｓａｅｐｍｄｒｓ
３６１  ａｍｃａｆｐｉｋｙｖ  ｎｄｆｆｎｋｉｖｎｋ  ｎｎｖｒｃｌｑｈｆｙ  ｇｐｎｈｅｈｃｆｎｒ  ｔｌｌｒｎｓｓｇｃｅ  ａｒｒｄｅｙｒｔｅｆ
４２１  ｔｔａｌｑｒｖｄｌｆ  ｍｇｑｆｓｅｖｌｌｔ  ｓｉｓｔｆｉｋｇｄｌ  ｔｉａｎｌｇｔｓｅｇ  ｒｆｍｑｖｖｖｓｒｓ  ｇｐｓｔｐｈｖｎｆｌ
４８１  ｌｄｓｈｐｖｓｐｅｖ  ｉｖｅｈｔｌｎｑｎｇ  ｙｔｌｖｉｔｇｋｋｉ  ｔｋｉｐｌｎｇｌｇｃ  ｒｈｆｑｓｃｓｑｃｌ  ｓａｐｐｆｖｑｃｇｗ
５４１  ｃｈｄｋｃｖｒｓｅｅ  ｃｌｓｇｔｗｔｑｑｉ  ｃｌｐａｉｙｋｖｆｐ  ｎｓａｐｌｅｇｇｔｒ  ｌｔｉｃｇｗｄｆｇｆ  ｒｒｎｎｋｆｄｌｋｋ
６０１  ｔｒｖｌｌｇｎｅｓｃ  ｔｌｔｌｓｅｓｔｍｎ  ｔｌｋｃｔｖｇｐａｍ  ｎｋｈｆｎｍｓｉｉｉ  ｓｎｇｈｇｔｔｑｙｓ  ｔｆｓｙｖｄｐｖｉｔ
６６１  ｓｉｓｐｋｙｇｐｍａ  ｇｇｔｌｌｔｌｔｇｎ  ｙｌｎｓｇｎｓｒｈｉ  ｓｉｇｇｋｔｃｔｌｋ  ｓｖｓｎｓｉｌｅｃｙ  ｔｐａｑｔｉｓｔｅｆ
７２１  ａｖｋｌｋｉｄｌａｎ  ｒｅｔｓｉｆｓｙｒｅ  ｄｐｉｖｙｅｉｈｐｔ  ｋｓｆｉｓｔｗｗｋｅ  ｐｌｎｉｖｓｆｌｆｃ  ｆａｓｇｇｓｔｉｔｇ
７８１  ｖｇｋｎｌｎｓｖｓｖ  ｐｒｍｖｉｎｖｈｅａ  ｇｒｎｆｔｖａｃｑｈ  ｒｓｎｓｅｉｉｃｃｔ  ｔｐｓｌｑｑｌｎｌｑ  ｌｐｌｋｔｋａｆｆｍ
８４１  ｌｄｇｉｌｓｋｙｆｄ  ｌｉｙｖｈｎｐｖｆｋ  ｐｆｅｋｐｖｍｉｓｍ  ｇｎｅｎｖｌｅｉｋｇ  ｎｄｉｄｐｅａｖｋｇ  ｅｖｌｋｖｇｎｋｓｃ
９０１  ｅｎｉｈｌｈｓｅａｖ  ｌｃｔｖｐｎｄｌｌｋ  ｌｎｓｅｌｎｉｅｗｋ  ｑａｉｓｓｔｖｌｇｋ  ｖｉｖｑｐｄｑｎｆｔ  ｇｌｉａｇｖｖｓｉｓ
９６１  ｔａｌｌｌｌｌｇｆｆ  ｌｗｌｋｋｒｋｑｉｋ  ｄｌｇｓｅｌｖｒｙｄ  ａｒｖｈｔｐｈｌｄｒ  ｌｖｓａｒｓｖｓｐｔ  ｔｅｍｖｓｎｅｓｖｄ
１０２１  ｙｒａｔｆｐｅｄｑｆ  ｐｎｓｓｑｎｇｓｃｒ  ｑｖｑｙｐｌｔｄｍｓ  ｐｉｌｔｓｇｄｓｄｉ  ｓｓｐｌｌｑｎｔｖｈ  ｉｄｌｓａｌｎｐｅｌ
１０８１  ｖｑａｖｑｈｖｖｉｇ  ｐｓｓｌｉｖｈｆｎｅ  ｖｉｇｒｇｈｆｇｃｖ  ｙｈｇｔｌｌｄｎｄｇ  ｋｋｉｈｃａｖｋｓｌ  ｎｒｉｔｄｉｇｅｖｓ
１１４１  ｑｆｌｔｅｇｉｉｍｋ  ｄｆｓｈｐｎｖｌｓｌ  ｌｇｉｃｌｒｓｅｇｓ  ｐｌｖｖｌｐｙｍｋｈ  ｇｄｌｒｎｆｉｒｎｅ  ｔｈｎｐｔｖｋｄｌｉ
１２０１  ｇｆｇｌｑｖａｋｇｍ  ｋｙｌａｓｋｋｆｖｈ  ｒｄｌａａｒｎｃｍｌ  ｄｅｋｆｔｖｋｖａｄ  ｆｇｌａｒｄｍｙｄｋ  ｅｙｙｓｖｈｎｋｔｇ
１２６１  ａｋｌｐｖｋｗｍａｌ  ｅｓｌｑｔｑｋｆｔｔ  ｋｓｄｖｗｓｆｇｖｌ  ｌｗｅｌｍｔｒｇａｐ  ｐｙｐｄｖｎｔｆｄｉ  ｔｖｙｌｌｑｇｒｒｌ
１３２１  ｌｑｐｅｙｃｐｄｐｌ  ｙｅｖｍｌｋｃｗｈｐ  ｋａｅｍｒｐｓｆｓｅ  ｌｖｓｒｉｓａｉｆｓ  ｔｆｉｇｅｈｙｖｈｖ  ｎａｔｙｖｎｖｋｃｖ
１３８１  ａｐｙｐｓｌｌｓｓｅ  ｄｎａｄｄｅｖｄｔｒ  ｐａｓｆｗｅｔｓ
【０３０２】
【表３０−１】
0006585040.tif 000043
【０３０３】
【表３０−２】
0006585040.tif 000044
【０３０４】
【表３０−３】
0006585040.tif 000045
【０３０５】
【表３０−４】
0006585040.tif 000046
【０３０６】
【表３０−５】
0006585040.tif 000047
【０３０７】
【表３０−６】
0006585040.tif 000048
【０３０８】
【表３０−７】
0006585040.tif 000049
【０３０９】
【表３０−８】
0006585040.tif 000050
【０３１０】
【表３０−９】
0006585040.tif 000051
【０３１１】
＞配列番号１７９
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬ；
式中Ｘ９は、Ｍ又はＩである
＞配列番号１８０
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＦＧループ
ＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬ（配列番号１８０），
＞配列番号１８１
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメインのＢＣループ
Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８（配列番号１８１）；式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ８はＹ、Ｆ、又はＬである。
＞配列番号１８２
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ９ＲＧＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８２），
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、
Ｘ８はＹ、Ｆ、又はＬであり、及び
Ｘ９はＭ又はＩである。
＞配列番号１８３
ＰＲＴ
人工
ＥＧＦＲ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＬＧＳＹＶＦＥＨＤＶＭＬＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８３）の配列を更に含み、
式中、
Ｘ１はＡ、Ｔ、Ｇ、又はＤであり、
Ｘ２はＡ、Ｄ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ３はＰ、Ｄ、又はＮであり、
Ｘ４はＬであるか、又は存在せず、
Ｘ５はＤ、Ｈ、Ｒ、Ｇ、Ｙ、又はＷであり、
Ｘ６はＧ、Ｄ、又はＡであり、
Ｘ７はＡ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、又はＤであり、及び
Ｘ８はＹ、Ｆ、又はＬである。
＞配列番号１８４
ＰＲＴ
人工
Ｃ−ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＣ鎖及びＣＤループ配列
ＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６（配列番号１８４）、式中
Ｘ１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、
Ｘ１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、及び
Ｘ１６は、Ｅ、又はＤである。及び
＞配列番号１８５
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメインＦ鎖及びＦＧループ
ＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３（配列番号１８５）、式中
Ｘ１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
＞配列番号１８６
ＰＲＴ
人工
ｃ−Ｍｅｔ結合ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１０ＩＲＹＸ１１ＥＸ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５ＧＸ１６ＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１７ＶＸ１８ＩＸ１９Ｘ２０ＶＫＧＧＸ２１Ｘ２２ＳＸ２３ＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１８６）を更に含み、
式中
Ｘ１０はＷ、Ｆ、又はＶであり、及び
Ｘ１１はＤ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１２はＶ、Ｆ、又はＬであり、
Ｘ１３はＶ、Ｌ、又はＴであり、
Ｘ１４はＶ、Ｒ、Ｇ、Ｌ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ１５はＧ、Ｓ、Ａ、Ｔ、又はＫであり、
Ｘ１６は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ１７はＹ、Ｗ、Ｉ、Ｖ、Ｇ、又はＡであり、
Ｘ１８はＮ、Ｔ、Ｑ、又はＧであり、
Ｘ１９はＬ、Ｍ、Ｎ、又はＩであり、
Ｘ２０は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ２１は、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｙ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、又はＫであり、
Ｘ２２はＩ、Ｖ、又はＬであり、及び
Ｘ２３はＶ、Ｔ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｙ、Ｔ、又はＬである。
＞配列番号１８７
ＰＲＴ
人工
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子のＥＧＦＲ  ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ２４ＶＴＸ２５ＤＳＸ２６ＲＬＳＷＤＤＰＸ２７ＡＦＹＸ２８ＳＦＬＩＱＹＱＸ２９ＳＥＫＶＧＥＡＩＸ３０ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＸ３１ＶＨＮＶＹＫＤＴＮＸ３２ＲＧＬＰＬＳＡＸ３３ＦＴＴ（配列番号１８７）であって、式中
Ｘ２４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ２５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ２６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ２７は、Ｈ、又はＷであり、
Ｘ２８は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ２９は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ３０は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ３１はＧ、又はＹであり、
Ｘ３２は、Ｍ、又はＩであり、及び
Ｘ３３は、Ｅ、又はＩである
＞配列番号１８８
二重特異性ＥＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン含有分子のｃ−Ｍｅｔ  ＦＮ３ドメイン
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＸ３４ＶＴＸ３５ＤＳＸ３６ＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＲＹＦＸ３７ＦＸ３８Ｘ３９Ｘ４０ＧＸ４１ＡＩＸ４２ＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＶＶＮＩＸ４３Ｘ４４ＶＫＧＧＸ４５ＩＳＰＰＬＳＡＸ４６ＦＴＴ（配列番号１８８）であって、式中、
Ｘ３４は、Ｅ、Ｎ、又はＲであり、
Ｘ３５は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ３６は、Ｌ、又はＡであり、
Ｘ３７は、Ｅ、又はＰであり、
Ｘ３８は、Ｖ、又はＬであり、
Ｘ３９は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ４０は、Ｓ、又はＫであり、
Ｘ４１は、Ｅ、又はＤであり、
Ｘ４２は、Ｎ、又はＶであり、
Ｘ４３は、Ｌ、又はＭであり、
Ｘ４４は、Ｇ、又はＳであり、
Ｘ４５は、Ｓ、又はＫであり、及び
Ｘ４６は、Ｅ、又はＩである。
【０３１２】
【表３１−１】
0006585040.tif 000052
【０３１３】
【表３１−２】
0006585040.tif 000053
【０３１４】
【表３１−３】
0006585040.tif 000054
【０３１５】
【表３１−４】
0006585040.tif 000055
【０３１６】
【表３１−５】
0006585040.tif 000056
【０３１７】
【表３１−６】
0006585040.tif 000057
【表３１−７】
0006585040.tif 000058
【表３１−８】
0006585040.tif 000059
【表３１−９】
0006585040.tif 000060
本発明は次の実施態様を含む。
（１）配列番号１に基づくＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群より選択される位置で少なくとも１つのシステイン置換を含む、単離されたシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（２）システイン置換が、配列番号１１１〜１１４又は１２２〜１３７の６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群より選択される位置にある、上記（１）に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（３）配列番号２７のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有する配列番号２７のアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変ＦＮ３ドメイン。
（４）配列番号１１４のアミノ酸配列から少なくとも１つのシステイン置換を有する配列番号１１４のアミノ酸配列を含む単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインであって、肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変ＦＮ３ドメイン。
（５）半減期延長部分を更に含む、上記（１）に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（６）前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、上記（６）に記載のシステイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（７）（ｉ）１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、システイン改変ＦＮ３ドメインをコードするようにシステインアミノ酸残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、親ＦＮ３ドメインの核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを回収することと、
を含む、システイン改変ＦＮ３ドメインを調製する方法。
（８）前記ＦＮ３ドメインが配列番号１に基づくものであり、前記変異させる工程が部位特異的変異誘発を行うことを含む、上記（７）に記載の方法。
（９）前記システイン改変ＦＮ３ドメインを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させることを含む、上記（８）に記載の方法。
（１０）前記回収する工程の後に、前記システイン改変ＦＮ３ドメインを、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインを生成することを更に含む、上記（８）に記載の方法。
（１１）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインのＥＧＦＲ結合を測定することを更に含む、上記（１０）に記載の方法。
（１２）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインの付加後のＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含む、上記（１１）に記載の方法。
（１３）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインのｃ−Ｍｅｔ結合を測定することを更に含む、上記（１１）に記載の方法。
（１４）前記反応させる工程の後に、前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインの付加後のｃ−Ｍｅｔ発現腫瘍細胞株の細胞増殖阻害を測定することを更に含む、上記（１１）に記載の方法。
（１５）前記チオール反応性試薬がマレイミド部分を含む、上記（１１）に記載の方法。
（１６）前記マレイミド部分を含むチオール反応性試薬が、ＮＥＭ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、上記（１５）に記載の方法。
（１７）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変ＦＮ３ドメインが、ＥＧＦＲ過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約１．７×１０-10Ｍ〜約１．３×１０-9Ｍの細胞増殖ＩＣ50を有する、上記（１６）に記載の方法。
（１８）配列番号１８９〜２１６、及び２２７〜２５４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離システイン改変フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。
（１９）第１のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインと第２のＦＮ３ドメインとを含む、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子であって、前記第１のＦＮ３ドメインが、前記第１のＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群から選択される位置でシステイン置換を含み、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的に結合して、ＥＧＦＲに対する上皮成長因子（ＥＧＦ）の結合を遮断し、前記第２のＦＮ３ドメインが肝細胞増殖因子受容体（ｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合して、ｃ−Ｍｅｔに対する肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の結合を遮断する、単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
（２０）前記第２のＦＮ３ドメインが、前記第２のＦＮ３ドメインの６、８、１０、１１、１４、１５、１６、２０、３０、３４、３８、４０、４１、４５、４７、４８、５３、５４、５９、６０、６２、６４、７０、８８、８９、９０、９１、及び９３番目の残基からなる群より選択される位置でシステイン置換を含む、上記（１９）に記載の単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
（２１）配列番号２１９〜２２６、及び２５７〜２６４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記（２０）に記載の単離システイン改変二重特異性ＦＮ３分子。
（２２）前記分子がチオール反応性試薬に化学的にコンジュゲートされている、上記（２０）に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
（２３）前記チオール反応性試薬がマレイミド部分である、上記（２２）に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
（２４）前記マレイミド部分が、ＮＥＭ、ＰＥＧ２４−マレイミド、フルオレセインマレイミド、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦからなる群より選択される、上記（２３）に記載の単離システイン改変二重特異性分子。
（２５）前記第１のＦＮ３ドメインが、５０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において測定されるとき、約０．９×１０-9Ｍ〜約２．３×１０-9ＭのＩＣ50値でＥＧＦＲの１１７３番目のチロシン残基でＥＧＦによって誘発されるＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、前記第２のＦＮ３ドメインが、１００ｎｇ／ｍＬヒトＨＧＦを用いてＮＣＩ−Ｈ２９２細胞において測定されるとき、約４×１０-10Ｍ〜約１．３×１０-9ＭのＩＣ50値でｃ−Ｍｅｔの１３４９番目のチロシン残基でＨＧＦによって誘発されるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害する、上記（２４）に記載のシステイン改変二重特異性分子。
（２６）前記システイン改変二重特異性分子が、
（ｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ｈ１５７３細胞において測定されるとき、約５．０×１０-11Ｍ〜約５．８×１０-10Ｍと、
（ｉｉ）ＥＧＦＲ過剰発現Ａ７３１細胞において測定されるとき、約７．８×１０-12Ｍ〜約１．１×１０-9Ｍと、
からなる群より選択される細胞増殖ＩＣ50値を有する、上記（２５）に記載のシステイン改変二重特異性分子。
（２７）半減期延長部分を更に含む、上記（２６）に記載のシステイン改変二重特異性分子。
（２８）前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部である、上記（２７）に記載のシステイン改変二重特異性分子。
（２９）（ｉ）１つ又は２つ以上のヌクレオチド残基を、システイン改変二重特異性分子をコードするようにシステイン残基をコードするヌクレオチド残基に交換することによって、親二重特異性分子の核酸配列を変異させることと、
（ｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を発現させることと、
（ｉｉｉ）前記システイン改変二重特異性分子を回収することと、
を含む、単離システイン改変二重特異性分子を調製する方法。
（３０）前記変異させる工程が、部位特異的変異誘発を行うことを含む、上記（２９）に記載の方法。
（３１）前記システイン改変二重特異性分子を大腸菌において発現させることを含む、上記（３０）に記載の方法。
（３２）前記回収する工程の後に、前記システイン改変二重特異性分子を、チオール反応性化学試薬と反応させて、化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子を生成することを更に含む、上記（３０）に記載の方法。
（３３）（ｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子のＥＧＦＲ結合を測定することと、
（ｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細胞株におけるＥＧＦ刺激ＥＧＦＲリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｉｉ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子による、細胞株におけるＨＧＦ刺激ｃ−Ｍｅｔリン酸化の阻害を測定することと、
（ｉｖ）前記化学的にコンジュゲートされたシステイン改変二重特異性分子の添加後のＥＧＦＲ過剰発現腫瘍細胞株の増殖阻害を測定することと、
からなる群より選択される工程を更に含む、上記（３２）に記載の方法。
（３４）本明細書に記載されたいずれかの発明。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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