(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化抗体、又はその結合フラグメントであって、このヒト化抗体又はその結合フラグメントはヒトＥＮＯ１に結合すること、この抗体又はその結合フラグメントは、アミノ酸配列ＬＣＤＲ１（ＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴ;配列番号６）を有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＬＣＤＲ２（ＮＡＫＴＬＰＥ；配列番号７）を有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＬＣＤＲ３（ＱＨＨＹＧＴＰＹＴ；配列番号８）を有するＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメイン、及びアミノ酸配列ＨＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳＣＶＭＮ；配列番号３）を有するＣＤＲ１と、アミノ酸配列ＨＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ；配列番号４）を有するＣＤＲ２と、アミノ酸配列ＨＣＤＲ３（ＥＧＦＹＹＧＮＦＤＮ；配列番号５）を有するＣＤＲ３とを含む抗体重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインを含むこと、この軽鎖可変領域（ＶＬ）ドメイン及びこの重鎖可変領域（ＶＨ）ドメインのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸配列を含むこと、を特徴とする、ヒト化抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項２】
前記ＶＬドメインが、配列番号９のアミノ酸残基１〜１１０を含む、請求項１記載の抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項３】
前記ＶＨドメインが、配列番号１０又は１１のアミノ酸残基１〜１２０を含む、請求項１又は２記載の抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体が、ＩｇＧ１タイプの定常領域を有し、前記その結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、又はｓｃＦｖフラグメントである、請求項１〜３のいずれか１項記載の抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体、又は前記その結合フラグメントが、ＥＮＯ１のプラスミノーゲン受容体活性を阻害することができる、請求項１〜４のいずれか１項記載の抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体、又は前記その結合フラグメントが、１０nM以下の解離定数（Ｋｄ）でヒトＥＮＯ１に結合することができる、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜６のいずれか１項記載の抗体、又はその結合フラグメント。
【請求項８】
肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、結腸直腸がん、又は前立腺がんの治療における使用のための医薬組成物であって、請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体、又はその結合フラグメント、を含む医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載の抗体、又はその結合フラグメント、をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１１】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１０記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒトα−エノラーゼタンパク質（ＥＮＯ１）に特異的に結合するヒト化抗体の作製方法に関する。本発明はまた、ヒト化抗α−エノラーゼ抗体産生細胞株を開発する方法及びがん細胞においてα−エノラーゼタンパク質（ＥＮＯ１）に結合するヒト化抗体を用いて腫瘍の増殖及び転移を抑制する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍は、単一細胞の異常な無制限の増殖から、形質転換した細胞のクローンが生成されてもたらされる。がんは、腫瘍細胞の自律的増殖及び遠隔部位に転移する能力を特徴とする。
【０００３】
腫瘍細胞は、免疫系によって認識され得る特有の抗原を発現し得る。腫瘍関連抗原としては、突然変異したがん遺伝子、突然変異した正常細胞タンパク、異常に発現される細胞タンパク、異常な細胞表面タンパク、及び発がん性ウイルスタンパクが挙げられるが、これらに限らない。免疫系は、これらの腫瘍関連抗原を非自己と認め、健康な細胞を温存しつつ、これらの外来抗原を担持する腫瘍細胞を根絶するために抗体を生成することができる。したがって、免疫原性腫瘍関連抗原の同定は、がん治療において臨床的な予後又は治療の適用のための標的として使用され得る。
【０００４】
ある種の悪性腫瘍は、肺と胸壁との間の空間における過剰な液体である胸膜滲出液によって同定され得る。肺がん、乳がん、及びリンパ腫は、すべての悪性胸膜滲出液の約７５％を引き起こす。悪性胸膜滲出液は、リンパ球性浸潤物及び腫瘍細胞に富んでいることがある。抗ｐ５３、抗核、及び抗ｃ−Ｍｙｃ抗体のような腫瘍関連免疫複合体又は自己抗体は、滲出液中に見出され、予後不良と関連付けられている。いくつかの肺腫瘍関連抗原もまた、悪性滲出液中に同定されており、これらとしては、サイトケラチン１９フラグメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＥＮＯ２）、扁平上皮細胞がん抗原、及び可溶性ＨＬＡ−Ｉ等が挙げられる。
【０００５】
α−エノラーゼ（エノラーゼ−１、ＥＮＯ１）は、多機能タンパクであり、最初は解糖系の重要酵素として見出された。正常条件下で、ＥＮＯ１は細胞質ゾル中に発現される。しかし、ＥＮＯ１は、多くのがん細胞の細胞表面上にプラスミノーゲン受容体として、また、好中球、リンパ球及び単球のような活性化造血細胞上にも、発現されることが見出されている。プラスミノーゲン受容体タンパクの発現上昇は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化系（ｕＰＡＳ）のカスケード応答を誘導することができることが知られている。
【０００６】
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子系（ｕＰＡＳ）は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、その同族受容体（ｕＰＡＲ）、及び２つの特異的阻害因子であるプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ−１）及びプラスミノーゲン活性化因子阻害因子２（ＰＡＩ−２）から構成される。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子は、プラスミノーゲンプロ酵素を活性セリンプロテアーゼであるプラスミンに変換する。プラスミンは、腫瘍の進行及び転移に必要とされる基底膜（ＢＭ）及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）リモデリングのような多数の組織リモデリングプロセスに関与する。さらに、ｕＰＡＳは、腫瘍血管新生、悪性細胞の増殖、接着及び遊走に影響する新生物の進化、内部血管新生及び転移部位での増殖に関与する可能性があることも示されている。
【０００７】
具体的には、プラスミノーゲンの活性化は、細胞外マトリックスの分解をもたらし、それが次にがん細胞の転移及び免疫細胞の浸潤（infiltration）の増大を導き得る。言い換えれば、プラスミノーゲン受容体としてのがん細胞表面上でのＥＮＯ１発現は、がん細胞の侵襲（invasion）活性を増大し得る。したがって、ＥＮＯ１はがん治療の潜在的な標的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明の態様は、ヒトＥＮＯ１に特異的に結合し、それによってＥＮＯ１に結合するリガンド（たとえば、プラスミノーゲン）を阻害する、標的化された結合因子（たとえば、抗体、又はその結合フラグメント）に関する。ＥＮＯ１に対するプラスミノーゲンの結合を阻害することにより、本発明の標的化された結合因子は、プラスミノーゲン活性化を阻害することができ、細胞外マトリックスの低減した分解をもたらし、それが次に細胞外マトリックスからのがん細胞の解離を防止又は低減する。したがって、本発明の態様に従った標的化された結合因子は、腫瘍の増殖及び転移を阻害するために使用することができる。これが達成され得る機序としては、その受容体ＥＮＯ１に対するリガンド（プラスミノーゲンなど）の結合の阻害、又は受容体ＥＮＯ１及びそのリガンド間の相互反応の抑止、それによる有効濃度のＥＮＯ１の低減が挙げられるが、これらに限らない。
【０００９】
本発明の１つの態様によれば、標的化された結合因子は、ヒトＥＮＯ１に結合することができ、そのリガンド（たとえば、プラスミノーゲン）がＥＮＯ１に対し結合することを防ぐヒト化抗体である。受容体に対するプラスミノーゲンの結合の防止は、プラスミノーゲン活性化を防止することができる。これは、がん細胞の細胞外マトリックスにおけるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化系（ｕＰＡＳ）の阻害をもたらす。
【００１０】
本発明のいくつかの態様によれば、このヒト化抗体は、０．３ｎＭ未満のＫｄのような、高いアフィニティでＥＮＯ１に結合することができる。このような強固な結合因子は、高効率でＥＮＯ１を阻害することができる。
【００１１】
本発明のいくつかの態様によれば、標的化された結合因子は、ヒトＥＮＯ１に結合し、がん細胞で誘導されるプラスミン活性を、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％阻害のような、高い効率で阻害することができるヒト化抗体である。阻害アッセイは、ＥＮＯ１発現（それゆえプラスミノーゲン活性化）をがん細胞（Ｕ９３７ヒトリンパ腫細胞など）において、リポ多糖（ＬＰＳ）のような誘導剤で処理（たとえば、１０μg/mL、５時間）して誘導することによって、実施してもよい。このような誘導されたプラスミン活性の阻害は、好適な濃度の抗体を用いてアッセイしてもよい。本発明の抗体を用いて、このような阻害は、２０μg/mL以下の低い抗体濃度で検出することができる。
【００１２】
本発明のいくつかの態様によれば、標的化された結合因子は、ヒトＥＮＯ１に結合することができる抗体である。このような抗体は、がん細胞の侵襲活性を阻害するために使用することができる。たとえば、本発明の抗体は、５０μg/mL以下の低い抗体濃度でＵ９３７ヒトリンパ腫細胞の侵襲活性の４０％、５０％、６０％、又は７０％超を阻害することができる。
【００１３】
本発明のいくつかの態様によれば、標的化された結合因子は、ヒトＥＮＯ１に結合して、細胞外マトリックス分解を阻害し、それによって細胞外マトリックスからのがん細胞解離を阻害することができる抗体である。たとえば、本発明の抗体は、５０μg/mL以下の低い抗体濃度でコラーゲン又はフィブロネクチンからのＣＬ１−５細胞のプラスミノーゲン媒介性解離の４０％、５０％又は６０％超を阻害することができる。
【００１４】
本発明の態様によれば、標的化された結合因子（すなわちヒト化抗体）は、配列番号１、１０又は１１の重鎖可変領域アミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１５】
本発明の態様によれば、標的化された結合因子（すなわちヒト化抗体）は、配列番号２又は９の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明の態様によれば、標的化された結合因子（すなわち抗体）は、配列１、１０又は１１に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）のひとつを含むＣＤＲを有する重鎖アミノ酸配列を含んでいてもよい。当業者は、容易にＣＤＲの決定を為すことができることは留意されたい。たとえば、Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.(1991), vols. 1-3を参照されたい。
【００１７】
本発明のいくつかの態様によれば、標的化された結合因子（すなわち抗体）は、配列２又は９に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）のひとつを含むＣＤＲを有する軽鎖アミノ酸配列を含んでいてもよい（図６Ｂ）。
【００１８】
本発明のいくつかの態様によれば、標的化された結合因子は、抗体がモノクローナル抗体であってもよいヒト化抗体、又はその結合フラグメントである。
【００１９】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列番号９に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２又はＬＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む軽鎖アミノ酸配列を含む（図６Ｂ）。
【００２０】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列２又は９に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２又はＬＣＤＲ３配列の任意の２つ（つまり、ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１及びＬＣＤＲ３、又はＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）を含む軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列２又は９に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む軽鎖アミノ酸配列を含む（図６Ｂ）。本発明のある態様によれば、抗体は、ヒト化抗体又は完全にヒトのモノクローナル抗体であることができる。
【００２２】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列１、１０又は１１に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３配列のいずれか１つを含む重鎖アミノ酸配列を含む（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００２３】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列１、１０又は１１に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２又はＨＣＤＲ３配列の任意の２つを含む重鎖アミノ酸配列を含む（図６Ａ及び図６Ｂ）。（つまり、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ３、又はＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）。
【００２４】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列１、１０又は１１に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列を含む重鎖アミノ酸配列を含む（図６Ａ及び図６Ｂ）。
【００２５】
本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列２又は９に含まれるＣＤＲ配列の１つを含むＣＤＲを有する軽鎖アミノ酸配列を含む（図６Ｂ）。本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列１、１０又は１１に示される配列の１つを含むＣＤＲを有する重鎖アミノ酸配列を含む。本発明のいくつかの態様によれば、ヒトＥＮＯ１タンパクに結合することができるヒト化抗体は、配列１、１０又は１１に含まれるＣＤＲ配列の１つを有する重鎖アミノ酸配列、及び配列２又は９に含まれるＣＤＲ配列の１つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの態様によれば、標的化された結合因子（すなわち抗体）は、ヒトＥＮＯ１タンパクに対するプラスミノーゲンの結合に関して競合することができる。本発明のいくつかの態様によれば、この標的化された結合因子は、配列１、１０又は１１に含まれるＣＤＲ配列の少なくとも１つを有する重鎖アミノ酸配列、及び配列２又は９に含まれるＣＤＲ配列の少なくとも１つを有する軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの態様は、患者試料又は患者中のヒトＥＮＯ１タンパクのレベルをアッセイする方法に関する。本発明の方法は、ヒト化抗ＥＮＯ１抗体を患者由来の生物学的試料と接触させ、前記抗体と前記試料中のヒトＥＮＯ１タンパクとの間の結合のレベルを検出することを含む。さらに具体的な態様において、この生物学的試料は血液又は血漿である。
【００２８】
本発明の他の態様は、標的化された結合因子を含む組成物に関し、これはヒト化抗体又はその機能的フラグメント、及び医薬的に許容され得る担体を含んでいることができる。
【００２９】
本発明のさらに別の態様は、ＥＮＯ１疾患又は障害を患う対象（たとえばヒト又は動物）を効果的に治療する方法に関する。この方法は、新生物又は非新生物疾患の治療を必要とする対象を選択し、ＥＮＯ１タンパクに特異的に結合する抗体（ヒト化された又は完全にヒトのモノクローナル抗体であってもよい）の治療的有効量をその対象に投与することを含んでいることができる。
【００３０】
本発明のヒト化抗体は、ヒトＥＮＯ１タンパク関連疾患又は障害を治療するために使用することができる。ヒトＥＮＯ１タンパク関連疾患又は障害は、ヒトＥＮＯ１タンパクの異常な活性化又は発現に起因する任意の状態であることができる。このような疾患の例としては、ヒトＥＮＯ１タンパクが異常にそのリガンドと相互作用し、それによって細胞接着又は細胞シグナル伝達特性が変更される場合が挙げられる。この細胞接着又は細胞シグナル伝達特性の変更は、新生物疾患又はいくつかの免疫疾患をもたらし得る。
【００３１】
たとえば、ヒトＥＮＯ１タンパク関連疾患は、肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、直腸結腸がん、及び前立腺がんのような新生物疾患であることができる。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、対象におけるがんの細胞外マトリックスからのＥＮＯ１誘導性細胞解離を阻害する方法に関する。これらの方法は、ＥＮＯ１誘導性細胞解離の治療を必要とする対象（たとえばヒト又は動物）を選択し、治療的有効量の抗体でありＥＮＯ１に特異的に結合する抗体をその対象に投与することを含むことができる。この抗体は、ヒト化された又は完全にヒトのモノクローナル抗体である。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、対象（たとえばヒト又は動物）におけるＥＮＯ１関連疾患又は障害の治療のための医薬の調製におけるヒト化抗体の用途に関し、ここで、この抗体は、ＥＮＯ１に特異的に結合する。この抗体は、ヒト化された又は完全にヒトのモノクローナル抗体である。
【００３４】
本発明のいくつかの態様によれば、本明細書において記載される標的化された結合因子は、動物における細胞外マトリックスからのＥＮＯ１タンパク誘導性細胞解離の治療のための医薬の調製のために使用することができ、ここで、この抗体は、ＥＮＯ１に特異的に結合する。この抗体は、ヒト化された又は完全にヒトのモノクローナル抗体である。
【００３５】
本明細書において記載される本発明のいくつかの態様は、ヒトＥＮＯ１に結合しヒトＥＮＯ１機能に影響を与えるモノクローナル抗体に関する。本発明の他の態様は、治療適用のために望ましい特性を持つ抗ＥＮＯ１抗体調製物に関する。このような特性は、ＥＮＯ１に対する高い結合アフィニティ、インビトロ及びインビボでＥＮＯ１活性を中和する能力、及び腫瘍のＥＮＯ１誘導性細胞解離、増殖及び転移を阻害する能力を含むことができる。
【００３６】
いくつかの態様において、本発明は、非常に高いアフィニティ（すなわち低いＫｄ）でヒトＥＮＯ１に結合することができるヒト化抗体に関する。たとえば、ヒト化抗体は、約１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０又は約１０−１１M未満のＫｄで、あるいはそれらの間の任意の範囲又は数値のＫｄで、ＥＮＯ１に結合することができる。アフィニティ及び／又はアビディティ測定は、当業界で公知の技術に従って、又は本明細書で記載されたとおりに、ＥＬＩＳＡ及び／又はＢＩＡＣＯＲＥを用いて実施することができる。
【００３７】
本発明の態様は、抗体又は生成もしくは製造の方法のいかなる特定の形態にも限定されないことは認められるであろう。たとえば抗ＥＮＯ１抗体は全長抗体（たとえばインタクトなヒトＦｃ領域を有するもの）又は抗体フラグメント（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２、ＦＶ又はＤａｂ（Ｄａｂはヒト抗体の最小機能的結合単位である）であることができる。さらに、この抗体は、ヒト化抗体をコードする遺伝子又は遺伝子群で形質転換又は遺伝子導入されている組換え法で産生された細胞から製造されてもよい。
【００３８】
本発明の他の態様は、本明細書において記載される任意のヒト化抗体をコードする単離された核酸分子、ヒト化抗ＥＮＯ１抗体をコードする単離された核酸分子を有するベクター、又はこのような任意の核酸分子で形質転換された宿主細胞に関する。
【００３９】
さらに、本発明のいくつかの態様は、抗体を産生するために核酸分子が発現される条件下で宿主細胞を培養し、その抗体を回収することにより、ヒト化抗ＥＮＯ１抗体を産生する方法に関する。本発明の態様は、抗体産生のために宿主細胞中に遺伝子導入した場合抗体又はそのフラグメントの収量を増大するために最適化された核酸配列を含む本発明のヒト化抗体又はヒト化抗体のフラグメントをコードする任意の核酸分子を含んでいてもよいことは認識されるべきである。
【００４０】
他の態様は、ヒトＥＮＯ１に特異的に結合することができる単離されたヒト化抗体の生成及び同定に関する。ＥＮＯ１の生物学的活性の阻害は、これらの抗体によって実行され、がんのＥＮＯ１誘導性細胞解離、侵襲及び他の所望の作用を防止することができる。
【００４１】
本発明の他の態様は、ヒト化抗ＥＮＯ１抗体の有効量を有する医薬組成物に関する。この組成物は、さらに、医薬的に許容され得る担体又は希釈剤を含んでいてもよい。さらに別の態様において、抗ＥＮＯ１抗体、又はそのフラグメントは、治療剤とコンジュゲート化される。この治療剤は、たとえば、毒素又は放射性同位元素であることができる。
【００４２】
本発明のさらに別の態様は、患者におけるＥＮＯ１の発現と関連する疾患又は障害を治療するための方法に関する。この方法は、ヒト化抗ＥＮＯ１抗体の有効量を患者に投与することを含むことができる。このヒト化抗ＥＮＯ１抗体は、単独で投与されることもでき、あるいは、さらなる抗体又は化学療法薬又は放射線療法と組み合わせて投与されることもできる。たとえば、細胞解離をブロックするＥＮＯ１抗体のモノクローナル、オリゴクローナル又はポリクローナル混合物は、腫瘍細胞増殖を直接的に阻害することが示されている薬剤と組み合わせて投与されることができる。この方法は、インビボで実施することができ、患者は好ましくはヒト患者である。好ましい態様において、この方法は、肺がん、乳がん、膵臓がん、肝臓がん、直腸結腸がん、前立腺がん及び／又は固形腫瘍のような新生物疾患を含むがこれらに限らないＥＮＯ１関連疾患又は障害の治療に関係する。
【００４３】
本発明のいくつかの態様は、がん発症をモニタリングする方法に関する。この方法は、試料（たとえばがん細胞）中のα−エノラーゼタンパク（ＥＮＯ１）の豊富さを決定することを含むことができ、ここで、ＥＮＯ１の増大レベルはがん重症度と相関する。本発明の態様によれば、その豊富さは、ＥＮＯ１タンパクに対するＥＮＯ１特異的抗体の結合を測定することにより決定してもよい。
【００４４】
本発明のいくつかの態様は、がんを検出する方法に関する。このような方法は、血清試料中のＥＮＯ１特異的抗体の豊富さを決定することを含んでいてもよく、ここで、ＥＮＯ１特異的抗体の低レベルは悪性腫瘍の存在を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ハイブリドーマの腹水から単離されたＥＮ１０ ｍＡｂによるＥＮＯ１結合のＥＬＩＳＡの結果を示す。硫酸アンモニウム精製、プロテインＡカラム精製、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製は、実施例１に記載したとおりに実施した。これらのデータは、抗ヒトＥＮＯ１抗体ＥＮ１０ ｍＡｂのＫｄを示す。
【００４６】
【図２】図２は、ＥＮ１０ ｍＡｂのＵ９３７線維素溶解アッセイの結果を示す。ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株におけるＬＰＳによるＥＮＯ１発現の誘導及びプラスミン活性アッセイは、実施例２に記載したとおりに実施した。これらの結果は、ＥＮ１０ ｍＡｂが誘導可能なＥＮＯ１タンパクのプラスミノーゲン受容体活性を軽減することを示す。
【００４７】
【図３】図３は、細胞の表面ＥＮＯ１発現がＬＰＳによって誘導された後の、ハイブリドーマから単離された異なる濃度のＥＮ１０ ｍＡｂで処理されたＵ９３７細胞の侵襲活性の結果を示す。詳細な手順は、実施例３に記載されたとおりに実施した。これらのデータは、ＥＮ１０ ｍＡｂがＵ９３７細胞の侵襲活性を用量依存的に阻害することを示す。
【００４８】
【図４】図４は、ＥＮ１０ ｍＡｂがＬＰＳで処理されたＵ９３７細胞の細胞表面ＥＮＯ１を認識することを示す。詳細な手順は、実施例４に記載されたとおりに実施した。このヒストグラムは、細胞にＬＰＳが投与された後Ｕ９３７の表面にＥＮＯ１が高度に発現されることを示す。
【００４９】
【図５Ａ】図５Ａは、ＥＮ１０ ｍＡｂの可変重鎖領域アミノ酸配列を描いたものである（配列番号１）。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）が示されている。ＥＮ１０ ｍＡｂのクローニングは実施例５に記載されたとおりに実施した。
【００５０】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＥＮ１０ ｍＡｂの可変軽鎖領域アミノ酸配列を描いたものである（配列番号２）。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）が示されている。ＥＮ１０ ｍＡｂのクローニングは実施例５に記載されたとおりに実施した。
【００５１】
【図６Ａ】図６Ａは、ｈｕｍ ＥＮＯ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５のＶＬ（配列番号９）及びＶＨ(配列番号１０）配列のヒト化のために行われた配列解析を示す。カバット（Kabat）スキームに従った残基ナンバリングの下に示される最初のラインには、マスクが下線とともに示されており、Ｋａｂａ ＣＤＲは線の下に示されている。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５のＶＬ及びＶＨのフレームワークを決定するために、実施例６に記載されたとおりに実施した。
【００５２】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｈｕｍ ＥＮＯ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴのＶＬ（配列番号９）及びＶＨ（配列番号１１）配列のヒト化のために行われた配列解析を示す。カバット（Kabat）スキームに従った残基ナンバリングの下に示されている最初のラインにおいて、マスクが下線とともに示されており、Ｋａｂａ ＣＤＲは線の下に示されている。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴのＶＬ及びＶＨのフレームワークを決定するために、実施例６に記載されたとおりに実施した。
【００５３】
【図７Ａ】図７Ａは、ＥＮ１０ ｍＡｂのマウス−ヒトキメラ編及びヒト化編の作製のための発現ベクターを示す。抗体の異なるＥＮ１０ ｍＡｂの編成の精製のための詳細な手順は、実施例７に記載されている。
【００５４】
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＥＮ１０ ｍＡｂの結合アフィニティ及び動態定数を決定するためにキメラＥＮ１０、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体を用いた結果を描いたものである。キメラ抗体発現、精製及びＫｄ解析の詳細な手順は、実施例７に記載されたとおりに実施した。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの結果Ｋｄは、マウス−ヒトキメラＥＮ１０ｍＡｂのそれに対して有意ではない。
【００５５】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ及び図８Ｂは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体のＵ９３７線維素溶解アッセイの結果を描いたものである。ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株におけるＬＰＳによるＥＮＯ１発現の誘導及びプラスミン活性アッセイは、実施例２に記載されたとおりに実施した。データは、ＥＮ１０ ｍＡｂと同じようにｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの両方が誘導可能なＥＮＯ１タンパクのプラスミノーゲン受容体活性を軽減することを示す。
【００５６】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ及び図９Ｂは、細胞の表面ＥＮＯ１発現がＬＰＳで誘導された後の、異なる濃度のｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体のそれぞれで処理されたＵ９３７細胞の侵襲活性の結果を示す。詳細な手順は、実施例９に記載されたとおりに実施した。これらのデータは、ヒト化後、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体が用量依存的にＵ９３７細胞の侵襲活性を阻害する活性を有することを示す。
【００５７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、マトリックスタンパクに対するＣＬ１−５肺がん細胞の接着活性を示す。接着アッセイは、実施例１０に記載されたとおりに実施した。これらのデータは、ＣＬ１−５細胞がコラーゲン及びフィブロネクチンに対してより高い接着活性を有することを示す。
【００５８】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５で処理されたフィブロネクチンからのＣＬ１−５細胞解離の阻害の結果を示す。細胞関連接着アッセイは、実施例１０に記載されたとおりに実施した。これらのデータは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５がフィブロネクチンからのＣＬ１−５の細胞解離活性を用量依存的に阻害することを示す。
【００５９】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５で処理されたコラーゲンからのＣＬ１-５細胞解離の阻害の結果を示す。細胞関連接着アッセイは実施例１０に記載されたとおりに実施した。これらのデータは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５がコラーゲンからのＣＬ１−５の細胞解離活性を用量依存的に阻害することを示す。
【００６０】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ及び図１１Ｂは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞毒性効果を描いたものである。ヒト化抗体の投与及びＣＬ１-５の肺がん細胞株の細胞溶解効果は、実施例１１に記載されたとおりに実施した。このデータは、両方のヒト化ＥＮ１０抗体が新規なＡＤＣＣ活性を生み出すことを示す。
【００６１】
【図１２】図１２は、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体の阻害効果を示す。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの投与及び抗体処理による腫瘍増殖の遅延は、実施例１２に記載されたとおりに実施した。データは、週に２回の両ヒト化ＥＮ１０ ｍＡｂsの投与が、ＣＬ１-５異種移植マウスモデルにおいて有効性を有することを示す。
【００６２】
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＣＨＯＳ細胞株において発現されたｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴのＶＬ（配列番号９）及びＶＨ（配列番号１０）配列のコドン最適化のために行われた配列解析を示す。詳細な手順は、実施例１３に記載されたとおりに実施した。
【００６３】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＣＨＯＳ安定細胞株におけるｈｕｍ ＥＮ１０ ＩＭＧＴのヒト化抗体の作製のための発現ベクターを描いたものである。詳細な手順は、実施例１３に記載されたとおりに実施した。
【００６４】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ＩＭＧＴ ｍＡｂ抗体を発現したトップ６ＣＨＯＳ安定クローンの生産性を示す。詳細な手順は、実施例１３に記載されたとおりに実施した。我々のデータは、コドン最適化及び単一コロニー選択の後、これらの６種のトップクローンの生産率は１g/L/１５日に近いことを示す。
【００６５】
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体を発現したトップ１５安定クローンの抗体力価を示す。詳細な手順は、実施例１３に記載されたとおりに実施した。
【００６６】
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体を発現したトップ６安定クローンの力価を示す。詳細な手順は、実施例１３に記載されたとおりに実施した。
【００６７】
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体を発現したトップ６安定クローンから単離された抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。詳細な手順は、実施例１３に記載されたとおりに実施した。我々のデータは、これらのクローンのすべてがインタクトなｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴを発現することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
定義
別途定義していない限り、本明細書において使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数の用語は複数を包含し、複数の用語は単数を包含する。一般に、本明細書において記載される細胞及び組織培養、分子生物学、及びタンパク及びオリゴ又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法及びそれらの技術は、当業界において周知であり、通常使用されている。
【００６９】
標準的な技術が組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（たとえば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用される。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様に従って又は当業界において通常行われるようにもしくは本明細書において記載されるとおりに、実施される。前述の技術及び手順は、当業界において周知の従来法に従って、及び本明細書全体を通じて引用され論じられている種々の一般的もしくはより具体的な参考書に記載されたとおりに、一般に実施される。たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual（3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)）を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において記載される分析化学、合成有機化学、及び医学及び製薬化学に関連して用いられる命名法、及びこれらの実験室手順及び技術は、周知であり、当業界において通常用いられる。標準的技術は、化学合成、化学分析、製薬調製、処方、及び送達、ならびに患者の治療のために用いられる。
【００７０】
本開示に従って用いられるように、以下の用語は、別途示されていない限り、以下の意味を有するものと理解される：本明細書において使用される「及び／又は」の用語は、２つの特定された特徴又は成分の各々の、他方が存在する又は存在しない、具体的開示として受け取られる。たとえば、「Ａ及び／又はＢ」は、（i）Ａ、（ii）Ｂ、及び（iii）Ａ及びＢ、の各々の具体的開示として、その各々が個別にここに記載されているかのように受け取られる。
【００７１】
アンタゴニストは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、アンチセンス、組換えタンパク、抗体、又はそれらのコンジュゲートもしくは融合タンパクであってもよい。ＲＮＡｉの総説については、Milhavet O, Gary D S, Mattson M P.（Pharmacol Rev. 2003 December; 55(4):629-48. 総説。）を、アンチセンスアプローチについては、Opalinska J B, Gewirtz A M.（Sci STKE. 2003 Oct. 28; 2003(206): pe47）を参照されたい。
【００７２】
「ＥＮＯ１」の疾患関連の異常な活性化又は発現は、任意の異常な、望ましくない、又は病理学的な細胞接着、たとえば、腫瘍関連細胞接着であることができる。細胞接着関連疾患としては、白血病のような非固形腫瘍、又はリンパ腫、さらにまた、メラノーマ、非小細胞肺がん、肝細胞（肝臓）がん、胃、頭頚部、肝系、胃、乳、卵巣、肺、子宮、外陰、結腸直腸、及び膵臓のような固形腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。
【００７３】
ＥＮＯ１という用語は、ＥＮＯ１及びＥＮＯ２又はＥＮＯ３からなるヘテロダイマーエノラーゼ分子をいう。
【００７４】
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、一般的に及び広範に、免疫グロブリン、自己抗体、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体、ならびにそれらの活性フラグメントをいう。フラグメントは、同族抗原に結合することにおいて活性であってもよく、生物学的に機能的であることにおいて活性であってもよい。本発明の抗体は、当業界において公知の技術を用いて、キメラであってもよく、ヒト化されていてもよく、あるいはヒトのものであってもよい。
【００７５】
本明細書において使用する場合、「モノクローナル抗体」という用語は、一般にハイブリドーマによって産生される、化学的及び免疫学的に均質な抗体をいう。A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)を参照されたい。
【００７６】
本明細書において使用する場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、同じ抗原に応答して抗体を合成する形質細胞（Ｂリンパ球）の２以上のクローンによって産生される抗体をいう。それらは、一般に、抗原で免疫された後の動物によって産生される。
【００７７】
本明細書において使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、２以上の供給源からの配列を含む抗体をいう。たとえば、このような抗体は、ヒト配列を導入することによりその後改変される非ヒト供給源由来の配列を含んでいてもよい。
【００７８】
本明細書において使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、それ以外はヒト抗体である抗体に最小限の非ヒト抗体部分が導入されている抗体をいう。
【００７９】
本明細書において使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、わずかな配列変化又は変動のみを有し、タンパクの実質的にすべての部分がヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体をいう。
【００８０】
本明細書において使用する場合、「α−エノラーゼ特異的抗体」という用語は、哺乳類ＥＮＯ１に対する高い特異性を有するが、ＥＮＯ２又はＥＮＯ３に対しては有さない抗体をいう。
【００８１】
本明細書において使用する場合、「ＥＮＯ１特異的抗体」という用語は、α−エノラーゼタンパクに結合する抗体をいう。
【００８２】
「中和（性）」という用語は、抗体のような標的化された結合因子に関して言及される場合、その標的化された結合因子が標的抗原の活性を排除するか又は有意に低減する能力に関する。したがって、「中和（性）」ＥＮＯ１抗体は、ＥＮＯ１の活性を排除又は有意に低減することができる。中和ＥＮＯ１抗体は、たとえば、プラスミノーゲンに対するＥＮＯ１の結合をブロックすることによって作用してもよい。この結合をブロックすることによって、プラスミノーゲン媒介性細胞解離は、有意に又は完全に排除される。理想的には、ＥＮＯ１に対する中和抗体は細胞接着を強化する。
【００８３】
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用される場合、その天然の環境から単離されているポリヌクレオチドを意味する。このようなポリヌクレオチドは、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成であってもよい。単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは自然界において関連しているポリヌクレオチドのすべて又は一部と関連していない。単離されたポリヌクレオチドは、自然界では連結していない別のポリヌクレオチドに作動可能に連結されていてもよい。さらに、単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは、より大きい配列の一部として天然に存在しない。
【００８４】
本明細書において言及される「単離されたタンパク（質）」という用語は、その天然環境から単離されているタンパクを意味する。このようなタンパクは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源のもの、あるいはそれらの何らかの組み合わせから誘導されてもよく、その起源又は誘導の供給源により、「単離されたタンパク」は、（１）自然界に見いだされるタンパクと関連していない、（２）同じ供給源からの他のタンパクを含まない、たとえばマウスタンパクを含まない、（３）異なる種由来の細胞によって発現される、又は（４）自然界に生じない。
【００８５】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、ネイティブなタンパク、フラグメント、又はポリペプチド配列のアナログを指す一般的な用語として使用される。それゆえ、ネイティブなタンパク、フラグメント、及びアナログは、ポリペプチド属の種である。本発明に従った好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子及びヒトカッパ（kappa）軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子をたとえばカッパもしくはラムダ（lambda）軽鎖免疫グロブリン分子のような軽鎖免疫グロブリン分子とともに含む組み合わせによって形成された抗体分子、及びその逆、ならびにそれらのフラグメント及びアナログを含む。本発明に従った好ましいポリペプチドはまた、ヒト重鎖免疫グロブリン分子又はそのフラグメントのみを含んでいてもよい。
【００８６】
「天然の（天然に存在する）」という用語は、本明細書において使用される場合、ある対象物に対して適用される場合、対象物が自然界に見出され得る事実をいう。たとえば、自然界の供給源から単離され得る生物（ウイルスを含む）に存在する、実験室その他で人間によって意図的に改変されていない、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００８７】
「作動可能に連結される」という用語は、本明細書において使用される場合、複数の成分が意図されたように機能することを可能にする関係にある、そのように記載された成分の位置をいう。たとえば、コード配列に「作動可能に連結された」コントロール配列は、コントロール配列と適合性の条件下でコード配列の発現が達成されるような方法で繋がれている。
【００８８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用される場合、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味し、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの改変された形態、又はＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二量体である。この用語は、一本鎖又は二本鎖形態のＤＮＡを含む。
【００８９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において使用される場合、天然の連結及び非天然の連結によって一緒に連結された、天然の、又は改変されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのサブセットであり、一般に２００塩基以下の長さを含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基の長さであり、最も好ましくは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、通常、たとえばプローブ用に、一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、たとえば遺伝子突然変異体の構築における用途のために、二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスのどちらのオリゴヌクレオチドであることもできる。
【００９０】
「天然のヌクレオチド」という用語は、本明細書において言及される場合、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。「改変されたヌクレオチド」という用語は、本明細書において言及される場合、改変された又は置換された糖基等を有するヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド連結部（linkages）」という用語は、本明細書において言及される場合、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロジセレノエート（phosphoroselenoate）、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）、ホスホラニラデート(phosphoraniladate)、ホスホロアミデート（phosphoroamidate）等のオリゴヌクレオチド連結部を含む。たとえば、LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec et al., 米国特許第５,１５１,５１０号; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に取り込まれる。オリゴヌクレオチドは、所望の場合、検出のための標識を含むことができる。
【００９１】
「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲｓ」という用語は、Kabat et al., 1991（Kabat, E. A. et al., （1991） Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition. US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington）及びそれ以降の版により定義されるとおりの免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の高頻度可変領域を示すことを意図される。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲ又はＣＤＲｓという用語は、抗原に対する抗体又はそれが認識するエピトープのアフィニティによる結合の原因となるアミノ酸残基の大部分を含む、場合によってこれらの領域の１つ又はいくつか、又はこれらの領域の全体を示すために、ここで使用される。
【００９２】
６つの短いＣＤＲ配列のうちで、重鎖の三番目のＣＤＲ（ＨＣＤＲ３）は、より大きいサイズ可変性（本質的にそれが生じる遺伝子のアレンジメント（配置）の機序によるより大きい多様性）を有する。それは２アミノ酸の短いものであり得るが、知られているその最長サイズは２６である。ＣＤＲ長は、特定の基礎フレームワークによって順応され得る長さによっても変わり得る。機能的には、ＨＣＤＲ３は、抗体の特異性の決定において部分的にある役割を果たす（Segal et al., PNAS, 71:4298-4302, 1974, Amit et al., Science, 233:747-753, 1986, Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987, Chothia et al., Nature, 342:877-883, 1989, Caton et al., J. Immunol., 144:1965-1968, 1990, Sharon et al., PNAS, 87:4814-4817, 1990, Sharon et al., J. Immunol., 144:4863-4869, 1990, Kabat et al., J. Immunol., 147:1709-1719, 1991）。
【００９３】
「ＣＤＲ（の）セット」という用語は、本明細書において使用される場合、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲのセットとは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３（ＨＣＤＲは可変重鎖ＣＤＲを指す）をいい、ＬＣＤＲのセットは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ＬＣＤＲは可変軽鎖ＣＤＲを指す）をいう。別途記載されていない限り、「ＣＤＲのセット」はＨＣＤＲ及びＬＣＤＲを含む。
【００９４】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的又は完全に同一性がある場合、「ホモロガス（相同）」である。たとえば、８５％相同性は、２つの配列をマッチングが最大になるよう整列させたときに、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。ギャップ（マッチさせる２つの配列のいずれかにおける）は、マッチングを最大にする際に許容される；ギャップの長さは５以下であることが好ましく、２以下であることがさらに好ましい。あるいは、及び好ましくは、２つのタンパク配列（又は少なくとも約３０アミノ酸の長さの、それらから誘導されたポリペプチド配列）は、突然変異データマトリックス及び６以上のギャップペナルティーでプログラムＡＬＩＧＮを用いて、それらが（標準偏差単位で）５より高いアラインメントスコアを有する場合、この用語が本明細書において使用されるとおりに、ホモロガスである。Dayhoff, M. O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation(1972))及びSupplement 2 to this volume, pp. 1-10を参照されたい。その２つの配列又はそれらの部分は、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列させた場合、それらのアミノ酸が５０％以上の同一性であるならば、より好ましくホモロガスである。２つのオルソロガス（orthologous）配列内の異なる領域の相同性であることができることは認められるべきである。たとえば、マウス及びヒトのオルソログの機能的部位は、非機能的領域よりも高い度合いの相同性を有する可能性がある。
【００９５】
「（〜に）相当する」という用語は、あるポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の一部又は全部に対してホモロガスであること（すなわち、同一であり、厳密に進化的に関連していない）、又はあるポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と同一であること、を意味するために本明細書で使用される。
【００９６】
それに対比して、「（〜に）相補的」という用語は、その相補的配列が、参照ポリヌクレオチド配列の一部又は全部に対してホモロガスであることを意味するために本明細書で使用される。説明として、「ＴＡＴＡＣ」というヌクレオチド配列は、参照配列「ＴＡＴＡＣ」に相当し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００９７】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、比較ウインドウにわたって（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチド又は残基対残基ベースで）同一であることを意味する。「配列相同性のパーセンテージ」という用語は、２つの最適に整列させた配列を比較ウインドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（たとえばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）又はアミノ酸残基が両配列に出現する位置の数を決定してマッチした位置数を求め、そのマッチした位置数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で割り算し、その結果に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出する。
【００９８】
「実質的な同一性」又は「実質的に同一」という用語は、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の特徴を意味し、ここで、そのポリヌクレオチド又はアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置のウインドウにわたって、しばしば少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウインドウにわたって、参照配列と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、ここで、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにわたって参照配列の合計２０％以下の欠失又は付加を含んでいてもよい配列と参照配列とを比較することにより算出される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであってもよい。
【００９９】
本明細書において使用する場合、２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略称は従来の使用法に従う。Immunology--A Synthesis（2.sup.nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991))を参照されたい。これは参照により本明細書に取り込まれる。これらの２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（たとえばＤ−アミノ酸類）、α,α−二置換アミノ酸類のような非天然アミノ酸類、Ｎ−アルキルアミノ酸類、乳酸、及びその他の非従来型アミノ酸類もまた、本発明のポリペプチドの好適な成分であることができる。非従来型アミノ酸類の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の同様のアミノ酸類及びイミノ酸類（たとえば４-ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において使用されるポリペプチドの表記法において、標準的な使用法及び慣習に従い、左手の方向はアミノ末端の方向であり、右手の方向はカルボキシ末端の方向である。
【０１００】
同様に、別途記載されていない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側末端は、５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。５’から３’方向への新生ＲＮＡ転写物の付加は、転写方向と呼ばれる；ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域であって、ＲＮＡ転写物の５’末端の５’側にある配列領域は、「上流配列」と呼ばれる；ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域であって、ＲＮＡ転写物の３’末端の３’側にある配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【０１０１】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップウェイトを用いてＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどによって、最適に整列された場合に、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも９０％配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって相違する。保存的アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性をいう。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンである；脂肪族−ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸群は、セリン及びスレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンである；及び、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下のとおりである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、及びアスパラギン−グルタミン。
【０１０２】
本明細書において論じられるように、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列中のわずかな変動は、本発明に包含されることが考慮されており、アミノ酸配列中の変動は、本明細書において記載される抗体又は免疫グロブリン分子に対し、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、及び最も好ましくは約９９％配列同一性を維持することが提供される。特に、保存的アミノ酸の置き換えが考慮される。保存的な置き換えは、関連する側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で起こる置き換えである。遺伝子にコードされたアミノ酸は、一般に以下のファミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは、以下のとおりである：セリン及びスレオニンは脂肪族−ヒドロキシファミリー；アスパラギン及びグルタミンはアミド含有ファミリー；アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは脂肪族ファミリー；及び、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは芳香族ファミリー。たとえば、イソロイシン又はバリンとロイシン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンの単離された置き換え、あるいは、構造的に関連するアミノ酸でのあるアミノ酸の同様の置き換えは、特にその置き換えがフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合は、結果として生じる分子の結合機能又は特性に大きな影響を与えないであろうことを期待することは、合理的である。
【０１０３】
あるアミノ酸変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、そのポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより容易に決定することができる。アッセイは、本明細書において詳細に記載される。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又はアナログは、当業者は容易に調製することができる。好ましいフラグメント又はアナログのアミノ及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に生じる。構造的及び機能的ドメインは、公的又は専売配列データベースに対してそのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを比較することにより同定することができる。好ましくは、コンピュータによる比較法が、公知の構造及び／又は機能の他のタンパクに存する配列モチーフ又は予測タンパクコンフォメーションドメインを同定するために使用される。公知の三次元構造に折りたたまれるタンパク配列を同定する方法は公知である。Bowie et al., (1991) Science 253:164。したがって、前出の例は、当業者が、本明細書において記載される抗体に従って構造的及び機能的ドメインを定義するために使用してもよい配列モチーフ及び構造的コンフォメーションを認識することができることを明らかにする。
【０１０４】
本発明のさらなる側面は、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を、配列１に示される抗体、添付の配列表、本明細書に記載される抗体の任意のＶＨドメインに対して、又は配列１に示されるＨＣＤＲ（たとえば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）に対して有するＶＨドメインを含む、標的化結合因子又抗体分子である。標的化結合因子又は抗体分子は、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を、配列２に示される抗体、添付の配列表、本明細書において記載される抗体の任意のＶＬドメインに対して、又は配列２に示されるＬＣＤＲ（たとえば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）に対して有するＶＬドメインをも、付加的に含んでいてもよい。２つのアミノ酸配列の％同一性を算出するために使用することができるアルゴリズムは、たとえばデフォルトパラメータを用いる、たとえば、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448）、又はスミス−ウォーターマンアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197）を含む。いくつかの態様においては、上記のとおりのアミノ酸配列同一性を共有する標的化結合因子又は抗体は、参照される抗体と実質的に同じ活性を呈する。たとえば、実質的に同じ活性は、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％又はそれ未満を超えないだけしか参照抗体の活性と相違しない少なくとも１つの活性を含む。
【０１０５】
抗原結合部位は、一般に、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）免疫グロブリンドメインから形成され、その抗原結合インターフェースは相補性決定領域（ＣＤＲs）と名付けられた６つの表面ポリペプチドループによって形成される。各ＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及び各ＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）には３つのＣＤＲsが、フレームワーク領域（ＦＲｓ）とともに存在する。
【０１０６】
ＶＨ又はＶＬドメインは単独で抗原を結合するために使用され得るが、典型的には、ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対を作って抗体抗原結合部位を提供する。ＶＨドメイン（たとえば配列１の）は、ＶＬドメイン（たとえば配列２の）と対合してもよく、これらのＶＨ及びＶＬドメインの両方を含む抗体抗原結合部位が形成される。類似の態様は、本明細書において開示されるその他のＶＨ及びＶＬドメインについても提供される。他の態様においては、配列１のＶＨ鎖は、異種性ＶＬドメインと対を作る。軽鎖乱交雑は、当業界において十分に確立されている。繰り返すが、類似の態様は、本明細書において開示されるその他のＶＨ及びＶＬドメインについて、本発明によって提供される。したがって、配列２の任意の抗体鎖の又は親のＶＨは、配列１、及び２又は他の抗体の任意の抗体の又は親のＶＬと対を作ってもよい。
【０１０７】
抗原結合部位は、親抗体又は配列１及び２の任意の抗体のＨ及び／又はＬＣＤＲsのセットを含んでいてもよく、Ｈ及び／又はＬＣＤＲsの開示されたセット内に２０、１６、１０、９又はより少数、たとえば１、２、３、４又は５個の、アミノ酸付加、置換、欠失、及び／又は挿入を有していてもよい。このような改変は、潜在的にＣＤＲsのセット内の任意の残基で生じさせてよい。
【０１０８】
好ましいアミノ酸置換は、（１）タンパク分解に対する感受性を低減する、（２）酸化に対する感受性を低減する、（３）タンパク複合体を形成するための結合アフィニティを変更する、（４）結合アフィニティを変更する、及び（４）そのようなアナログの他の物理化学的又は機能的特性を付与又は改変する、置換である。アナログは、天然ペプチド配列以外の配列の種々の変異体タンパクを含むことができる。たとえば、単一又は複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は、天然配列（好ましくは分子間コンタクトを形成するドメインの外のポリペプチドの部分内の）に作製してもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させるべきではない（たとえば、置き換えアミノ酸は親配列に生じるヘリックスを壊したり、親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を妨害するような傾向を持つべきではない）。当業界で認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles（Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1984)）; Introduction to Protein Structure（C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)）;及びThornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載されており、これらは、参照により本明細書に取り込まれる。
【０１０９】
本発明のさらなる側面は、配列１に示される抗体、添付の配列表、又は本明細書において記載されている任意の抗体のＶＨドメインに対して、又は配列１に示すＨＣＤＲ（たとえば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）に対して、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨドメインを含む抗体分子である。この抗体分子は、配列２に示される抗体、添付の配列表又は本明細書において記載されている任意の抗体のＶＬドメインに対して、又は配列２に示されるＬＣＤＲ（たとえば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＬＣＤＲ３）に対して、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するＶＬドメインをも、付加的に含んでいてもよい。２つのアミノ酸配列の％同一性を算出するために使用することができるアルゴリズムは、たとえばデフォルトパラメーターを用いる、たとえばＢＬＡＳＴ（Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410)、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448)、又はスミス−ウォーターマンアルゴリズム(Smith and Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147: 195-197)を含む。
【０１１０】
本発明のさらなる側面は、少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は約９９％のアミノ酸配列同一性を、配列１に掲載される任意の抗体のＶＨドメインに対して、又は配列１に示されるＨＣＤＲ（たとえば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、又はＨＣＤＲ３）に対して有するＶＨドメインを含む抗体分子である。抗体分子は、少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸配列同一性を、配列２に示される抗体、添付の配列表又は本明細書において記載される抗体の任意のＶＬドメインに対して、又は配列２に示されるＬＣＤＲ（たとえば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、又はＣＤＲ３）に対して有するＶＬドメインをも、付加的に含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明のＶＨ及びＶＬドメイン、及びＣＤＲの変異体は、そのアミノ酸配列が本明細書に記載されているもの及びヒトＥＮＯ１タンパクのための抗体及び標的化因子に用いることができるものを含め、配列変更又は突然変異、及び所望の特徴を標的とする抗原についてのスクリーニングの方法によって取得することができる。所望の特徴の例としては、抗原に対して特異的な公知の抗体に関して増大したその抗原に対する結合アフィニティ；活性が公知の場合、抗原に対して特異的な公知の抗体に関して増大した抗原の中和活性；特異的なモル比で抗原に対する公知の抗体又はリガンドとの特定の競合能力；複合体を免疫沈降する能力；特定のエピトープに結合する能力；リニアエピトープ、たとえば本明細書において記載されるペプチド結合スキャンを用いて、たとえばリニア及び／又は束縛されたコンフォメーションにおいてスクリーニングされたペプチドを用いて、特定されたペプチド配列；不連続な残基によって形成される、コンフォメーションエピトープ；ヒトＥＮＯ１タンパク又は下流分子の新規な生物学的活性を調節する能力、が挙げられるが、それらに限らない。このような方法もまた提供される。
【０１１２】
本発明のさらなる側面は、ヒトＥＮＯ１タンパク上の配列９又は１０に掲載された少なくとも約６０、７０、８０、８５、９０、又は約９２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むエピトープペプチドに結合するアミノ酸配列を有するものを含み、ヒトＥＮＯ１タンパク疾患又は障害を治療するために使用することができる、標的化された結合因子（すなわち抗体）に関する。ヒトＥＮＯ１タンパク関連疾患又は障害は、ヒトＥＮＯ１タンパクの異常な活性化又は発現によって生じるあらゆる状態であることができる。１つの例において、ヒトＥＮＯ１タンパク関連疾患は、非小細胞肺がん、肝細胞（肝臓）がん、胃（胃）がん、乳がん、膵管腺がんのような新生物疾患である。
【０１１３】
本明細書において開示される抗体分子の変異体は、本発明において製造され、使用されてもよい。構造／特性活性関係に多変量データ解析技術を適用することにおける計算化学の手本にならって（Wold, et al., Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics--Mathematics and Statistics in Chemistry （Ed.: B. Kowalski）, D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holland, 1984）、抗体の定量的活性−特性関係は、周知の数学的技術、たとえば統計的回帰、パターン認識及び分類を用いて導き出すことができる（Norman et al., Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3rd edition (April 1998); Kandel, Abraham & Backer, Eric. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR, (May 11、1995); Krzanowski, Wojtek. Principles of Multivariate Analysis: A User’s Perspective (Oxford Statistical Science Series, No 22 (Paper)) Oxford University Press;(December 2000); Witten, Ian H. & Frank, Eibe. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann;（Oct. 11, 1999); Denison David G. T. (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons;(July 2002）; Ghose, Amp K. & Viswanadhan, Vellarkad N. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery）。抗体の特性は、抗体配列、機能的及び三次元構造の経験的及び理論的モデル（たとえば、可能性のある接触残基又は算出される物理化学的特性の解析）から導き出すことができ、これらの特性は単独で及び組み合わせで考慮することができる。
【０１１４】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインから構成される抗体抗原結合部位は、典型的にはポリペプチドの６つのループから形成される：３つは軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）由来及び３つは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）由来である。公知の原子構造の抗体の解析は、抗体結合部位の三次元構造及び配列の間の関係を解明した。これらの関係は、ＶＨドメインの第三の領域（ループ）を除いて、結合部位ループが少数の主鎖コンフォメーションの１つを有すること（カノニカル構造）を意味する。特定のループに形成されるカノニカル構造は、そのサイズ、及びループ領域及びフレームワーク領域の両方における重要部位へのある残基の存在によって決定されることが示されている。
【０１１５】
この配列−構造関係の研究は、公知の配列の、しかし三次元構造が未知の抗体におけるこれらの残基の予測のために用いることができ、それらは、そのＣＤＲループの三次元構造を維持し、それゆえ結合特異性を維持することにおいて重要である。これらの予測は、リード最適化実験からのアウトプットに対する予測の比較によって裏付けられることができる。構造アプローチにおいて、抗体分子のモデルは、ＷＡＭのような、任意の自由に利用可能な又は商業的なパッケージを用いて創出することができる。タンパク視覚化及び解析ソフトウェアパッケージ、たとえばＩｎｓｉｇｈｔ  II（Accelrys, Inc.）又はＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗは、次にＣＤＲ内の各位置での可能な置換を評価するために用いてもよい。この情報は、次に活性に最小限又は有益な効果を有するであろう置換を作製するために使用してもよい。
【０１１６】
ＣＤＲｓ、抗体ＶＨもしくはＶＬドメイン及び／又は結合因子のアミノ酸配列内の置換を作製するために必要な技術は、一般に当該技術分野において利用可能である。変異体配列は、活性に対して最小限又は有益な効果を有すると予測される又はされない置換を伴って、作製することができ、結合及び／又は中和する能力について及び／又は他の任意の所望の特性について試験することができる。
【０１１７】
その配列が具体的に本明細書において開示される任意のＶＨ及びＶＬドメインの可変ドメインアミノ酸配列変異体は、論じたように、本発明に従って用いてもよい。
【０１１８】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチドフラグメント」という用語は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端欠失を有するものの、残りのアミノ酸配列は、たとえば全長ｃＤＮＡ配列から、推定される天然配列における相当する位置と同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは、典型的には少なくとも約５、６、８又は１０アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも約１４アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸の長さ、通常少なくとも約５０アミノ酸の長さ、そしてなおさらに好ましくは少なくとも約７０アミノ酸の長さである。本明細書において使用される場合、「アナログ」という用語は、推定アミノ酸配列の一部に対し実質的同一性を有する少なくとも約２５アミノ酸のセグメントから構成されており、以下の特性の少なくとも１つを有するポリペプチドをいう：（１）好適な条件下でのヒトＥＮＯ１タンパクに対する特異的結合、（２）適切なリガンド／ＥＮＯ１タンパク結合をブロックする能力、又は（３）ＥＮＯ１タンパク活性を阻害する能力。典型的には、ポリペプチドアナログは、天然の配列に関して保存的アミノ酸置換（又は付加もしくは欠失）を含む。アナログは、典型的には少なくとも２０アミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５０アミノ酸の長さ又はそれより長く、しばしば全長の天然ポリペプチドと同等の長さであることができる。
【０１１９】
本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、抗原の抗原性決定基の特徴に相補的な内部表面形態及び電荷分布をもつ三次元結合空間を有するポリペプチド鎖のフォールディングから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含む、ポリペプチド又はポリペプチド群を指す。抗体は、典型的には、四量体形態を有し、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は、１つの「軽」及び１つの「重」鎖を有する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０１２０】
本明細書において使用する場合、「標的化された結合因子」は、標的部位に優先的に結合する、因子、たとえば抗体、又はその結合フラグメントである。ひとつの態様において、標的化された結合因子は、唯一の標的部位に対して特異的である。他の態様においては、標的化された結合因子は、２以上の標的部位に対して特異的である。ひとつの態様において、標的化された結合因子は、モノクローナル抗体であってもよく、標的部位はエピトープであってもよい。以下に記載されるように、標的化された結合因子は、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、ここで、このドメインは、異種性タンパクに融合されているか、包含されている。
【０１２１】
抗体の「結合フラグメント」は、組換えＤＮＡ技術によって、又はインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、作製される。結合フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び単鎖（一本鎖）抗体が挙げられる。「二特異性」又は「二機能性（二官能性）」抗体以外の抗体は、同一の各々の結合部位を有すると理解される。抗体は、過剰の抗体が対抗受容体に結合した受容体の量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％又は８０％、及びより通常は約８５％超（インビトロ競合結合アッセイで測定した場合）低減する場合、対抗受容体に対する受容体の接着を実質的に阻害する。
【０１２２】
抗体は、単独で又は公知の技術で提供される他のアミノ酸配列との組み合わせで、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多特異性抗体、二特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全（fully）ヒト抗体、抗イディオタイプ抗体及び可溶性もしくな結合形態で標識され得る抗体、ならびにそれらのフラグメント、変異体又は誘導体、であることができる。抗体は、任意の種由来であることができる。抗体という用語は、本発明の抗体の結合フラグメントをも含む；例示的なフラグメントとしては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖抗体（ｓｖＦＣ）、二量体可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）及びジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）が挙げられる。
【０１２３】
全体の抗体のフラグメントは抗原を結合するという機能を実行することができることが示されている。結合フラグメントの例は、（Ward, E. S. et al., (1989) Nature 341, 544-546)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント;（McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント;（Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント;（iv）ｄＡｂフラグメント（Ward, E. S. et al., Nature 341, 544-546(1989), McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554, Holt et al., (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490]、これはＶＨ又はＶＬドメインからなる;（v）単離されたＣＤＲ領域;（vi）Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２フラグメント、２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（vii）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここではＶＨドメイン及びＶＬドメインは２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されている（Bird et al., (1988) Science, 242, 423-426, Huston et al., （1988) PNAS USA, 85, 5879-5883);（viii）二特異性単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）及び（ix）「ダイアボディ」、遺伝子融合によって構築された多価又は多特異性フラグメント（ＷＯ９４／１３８０４; Holliger, P. (1993) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448)、である。Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の取り込みによって安定化されていてもよい（Reiter, Y. et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996）。ＣＨ３ドメインに接続されたｓｃＦｖを含むミニボディも作製することができる（Hu, S. et al., (1996) Cancer Res., 56, 3055-3061）。結合フラグメントの他の例としては、抗体ヒンジ領域由来の１個又はそれ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での少数の残基の付加によってＦａｂフラグメントと相違するＦａｂ’、及びその定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’フラグメントであるＦａｂ’−ＳＨ、がある。
【０１２４】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的結合することができる任意のタンパク決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸又は糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、常にではないものの、特異的三次元構造的特徴、ならびに特異的電荷特徴を有していてもよい。抗体は、解離定数が１μM以下、好ましくは１００nM以下、及び最も好ましくは１０nM以下である場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【０１２５】
「因子（剤）」という用語は、本明細書において、化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子、又は生物学的材料から作製された抽出物を意味するために使用される。
【０１２６】
ＥＮＯ１ポリペプチドに関する「活性な（の）」又は「活性」は、ネイティブなＥＮＯ１ポリペプチドの生物学的又は免疫学的活性を有するＥＮＯ１ポリペプチドの部分をいう。「生物学的」は、本明細書において使用される場合、ネイティブなＥＮＯ１ポリペプチドの活性からもたらされる生物学的機能をいう。好ましいＥＮＯ１生物学的活性としては、たとえば、ＥＮＯ１誘導性プラスミノーゲン活性が挙げられる。
【０１２７】
「哺乳類」は、本明細書において使用される場合、哺乳類と考えられる任意の動物をいう。好ましくは、この哺乳類はヒトである。
【０１２８】
酵素パパインでの抗体の消化は、２つの同一の抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントとしても知られる）と、抗原結合活性を持たないが結晶化する能力を有する「Ｆｃ」フラグメントとをもたらす。酵素ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままで２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントをもたらす。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗原をクロスリンクする能力を有する。
【０１２９】
「Ｆｖ」は、本明細書において使用される場合、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小フラグメントをいう。「Ｆａｂ」は、本明細書において使用される場合、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体のフラグメントをいう。「ｍＡｂ」という用語はモノクローナル抗体を指す。
【０１３０】
本明細書において使用される「医薬（剤）又は薬剤」という用語は、適正に患者に投与された場合、所望の治療効果を誘導することができる化合物又は組成物をいう。本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms （Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)）（参照により本明細書に取り込まれる）に例示されるような、当業界における慣習的な用語法に従って用いられる。
【０１３１】
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋」は、対象種が存在する優勢種であること（すなわち、モルベースで、それが組成物中で他のいかなる個別の種よりも豊富であること）を意味し、好ましくは、実質的に精製された画分（フラクション）は、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０％（分子ベースで）を対象種が構成する組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、及び９９％超で含む。最も好ましくは、対象種は本質的に均質になるまで精製され（夾雑種は従来の検出法により組成物中に検出され得ない）、組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。
【０１３２】
「患者」という用語は、ヒト及び獣医学的対象を含む。
【０１３３】
本明細書において使用する場合、「モニタリング」という用語は、がん細胞におけるＥＮＯ１タンパクの存在量を決定することによりがんの発症を検出する及び／又は観察するプロセスをいう。
【０１３４】
ＥＮＯ１の存在量を決定するための方法としては、ＥＮＯ１タンパク及びＥＮＯ１特異的抗体の結合の測定、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ、及び／又はマイクロアレイ解析が挙げられるが、これらに限らない。
【実施例】
【０１３５】
本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、抗体技術、及び遺伝子工学の従来技術を含む技術を用いてもよく、それらは当業者の通常の技能の範囲内である。このような技術は、文献において十分に説明されている。
【０１３６】
以下の例は、抗ＥＮＯ１免疫応答を誘導することにより腫瘍増殖を抑制するためのＥＮＯ１特異的抗体の開発及び使用を説明する。
実施例１
ＥＮ１０ ｍＡｂ抗体のＥＮＯ１結合ＥＬＩＳＡ
【０１３７】
抗ヒトＥＮＯ１抗体ＥＮ１０ ｍＡｂのＥＮＯ１結合アフィニティを評価するために、ハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩで増殖させた。１週間の培養の後、１×１０６個の細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、２００μLのＲＰＭＩ培地中に再懸濁させ、ＩＰ注射により重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入した。３週間後、マウスの腹水を回収し、１５mLに希釈した。抗体は、４０％硫酸アンモニウム及びプロテインＡカラム（Ｍｏｎｔａｇｅ抗体精製キット、Millipore）によりさらに精製した。精製された抗体は、アミコンウルトラ（Amicon Ultra）−１５遠心式フィルターデバイスを用いて、製造業者（Millpore）提供のプロトコールに従って濃縮した。抗体の純度は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。
【０１３８】
４００ngのヒトＥＮＯ１タンパクを、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、プレートをＰＢＳでさらに洗浄した。１×１０-１２から１×１０-８MのＥＮ１０ ｍＡｂ抗体の段階希釈をプレートに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）とコンジュゲート化されたヤギ抗マウスＩｇＧを添加した。１時間後、３,３’,５,５’-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し、ＯＤ４０５を読み取った。各研究を３回繰り返した。データは、平均±ＳＤで示した。ＯＤの読み取り及び抗体濃度を用いて、シグマプロット（Sigmaplot）を用いる多重散布図（multiple scatter plot）を作製した。Ｋｄ値は、４パラメーターロジスティックフィット（four parameter logistic fit）により予測した。
【０１３９】
この実験の結果を、図１に示す。抗体ＥＮ１０ ｍＡｂは、マウス１匹あたり２０.４mgから４.６mgの生産性であった。ＥＮ１０ ｍＡｂ抗体のＫｄ値は、２.０３±０.１２×１０-１０M（Ｎ＝３）であった。この結果は、ＥＮ１０ ｍＡｂ抗体がヒトＥＮＯ１タンパクを認識することができ、約２.０３±０.１２×１０-１０M（Ｎ＝３）のＫｄ値の好都合なアフィニティを有することを示す。
実施例２
【０１４０】
がん細胞のＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害するＥＮ１０ ｍＡｂの能力を評価するために、ヒトリンパ腫Ｕ９３７細胞株を１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖させた。細胞を、１０μg/mLのＬＰＳで６時間処理し、細胞表面のＥＮＯ１タンパク発現を誘導した。ＰＢＳ中の１.５×１０６細胞/mLを、次に１μg/mLのヒトＬｙｓ−プラスミノーゲン及び１０μg/mLのＥＮ１０ ｍＡｂとともにそれぞれ１時間プレインキュベートした。サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、３nMの組織特異的プラスミノーゲン活性化因子及び０.５mMの色原性基質Ｓ−２２５１を添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、ＯＤ４０５を読み取った。各研究は３回繰り返し、アンタゴニスト活性を解析した。データは平均±ＳＤとして示した。Ｔテストを用いて各群を比較した。Ｐ値＜０.０５を統計学的に有意と考えた。
【０１４１】
この実験の結果を図２に示す。ＥＮ１０ ｍＡｂは、高いＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体アンタゴニスト活性を有し、ＬＰＳ誘導性特異的ＥＮＯ１活性の１００％阻害を達成することができた。したがって、ＥＮ１０ ｍＡｂは、標的器官へのがん細胞の遊出を阻害する良好な潜在能力を有するであろうとされた。
実施例３
【０１４２】
実施例２の結果は、ＥＮ１０ ｍＡｂがＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害することができることを示唆する。ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性の阻害は、ＬＰＳ刺激ヒトＵ９３７リンパ腫細胞株における遊出活性及びプラスミノーゲン活性化の阻害をもたらし得る。
【０１４３】
ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を損なうことががん細胞の侵襲活性の軽減をもたらすか否かを評価するために、ヒトリンパ腫Ｕ９３７細胞株を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖させた。細胞を、１０μg/mLのＬＰＳで６時間処理し、細胞表面のＥＮＯ１タンパク発現を誘導した。５〜５０μg/mLのＥＮ１０ ｍＡｂと混合した後、２×１０４個の細胞を、１５μMのＬｙｓ−プラスミノーゲンを含有する２チャンバーアッセイシステムのトップチャンバーに播種し、下のチャンバーに１０％ＦＢＳ及び１０nM ＭＣＰ−１を含有する培地を用いて２４時間インキュベートした。抗マウスＩｇＧを陰性コントロール群として用いた。２つのチャンバーは、マトリゲルでコーティングされたマイクロポアフィルター（８μm孔サイズ）によって分離されていた。インキュベーション期間の後、下チャンバーの細胞を、顕微鏡下で血球計によってカウントした。各研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤで示す。Ｔテストを用いて各群を比較した。Ｐ値＜０.０５を、統計学的に有意と考えた。
【０１４４】
結果を図３に示す。ＬＰＳ処理されたＵ９３７細胞が５〜５０μg/mLのＥＮ１０ ｍＡｂで処理された場合、Ｕ９３７の侵襲活性はコントロールＩｇＧの９０．２±２％から４９．１±１％（Ｎ＝３）であった。これらの結果は、ＥＮ１０ ｍＡｂが、ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を用量依存的に低減することにより、活性化されたＵ９３７の侵襲能力を軽減することができることを示す。リンパ腫の表面のＥＮＯ１タンパクを標的化することにより、ＥＮ１０ ｍＡｂを用いて、影響を受けた部位に侵入する細胞を阻害することが可能である。
実施例４
ＥＮ１０ ｍＡｂはＬＰＳで刺激されたＵ９３７リンパ腫細胞株の表面ＥＮＯ１を認識する
【０１４５】
ヒトＵ９３７リンパ腫細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ中で増殖させた。細胞を、１０μg/mLのＬＰＳで６時間処理し、細胞表面のＥＮＯ１タンパク発現を誘導した。フローサイトメトリー解析のために、インタクトな全細胞を、ＥＮ１０ ｍＡｂ（１:３００希釈）の存在下又は不存在下で染色し、ＦＩＴＣコンジュゲート化ヤギ抗血清（Jackson Lab）を用いて視覚化し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて解析した。ＥＮＯ１発現は、生じた蛍光強度によって測定した。
【０１４６】
これらの実験の結果を図４に示す。ＬＰＳ及びＥＮ１０ ｍＡｂとのＵ９３７のインキュベーションは、ＬＰＳなしでＥＮ１０ ｍＡｂを用いて細胞をインキュベートした場合と比較して、ヒストグラムを右にシフトさせる。この結果は、Ｕ９３７細胞が、細胞がＬＰＳで処理された場合に細胞表面のＥＮＯ１発現を増大させることを示す。これらのデータは、ＥＮ１０ ｍＡｂがリンパ腫細胞のＬＰＳに誘導される表面ＥＮＯ１を認識するという考えを支持する。
実施例５
抗体ＥＮ１０ ｍＡｂをコードする遺伝子のクローニングは以下に記載する方法に従って実施した。
（１）  抗体遺伝子のｃＤＮＡクローニング及び調製
【０１４７】
ハイブリドーマを、１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ培地（Gibco製）中で培養した。細胞数が約１０×１０６個/mLに達した後、遠心分離により細胞を回収し、次いでＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Invitrogen製）を添加して指示書マニュアルに従って総ＲＮＡを抽出した。抗体ｃＤＮＡの可変領域のクローニングは、マウスＩｇ−プライマーセット（Novagen製）を用いて、添付の指示書マニュアルに従って実施した。
【０１４８】
（ａ）  第１鎖ｃＤＮＡの合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III 第１鎖合成システム（Invitrogen製）の指示書マニュアルに従って実施した。
【０１４９】
第１鎖ｃＤＮＡは、５μgの総ＲＮＡを鋳型として用いて調製した。５μgの総ハイブリドーマＲＮＡ、１μLの５０ng/μLのランダムプライマー、及び１μLの１０mM  ｄＮＴＰを混合し、２００μL ＰＣＲチューブ内でＤＥＰＣ処理水を添加して１０μLにした。この反応混合物を、６５℃で５分間インキュベートし、次に、少なくとも１分間氷上に静置した。２μLの１０×ＲＴバッファー、４μLの２５mM ＭｇＣｌ２、２μLのＤＴＴ、１μLの４ユニットＲＮａｓｅＯＵＴ（登録商標）、及び１μLの２００ユニット  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標） III ＲＴを含む１０μLのｃＤＮＡ合成混合物を添加し、穏やかに混合し、短時間遠心分離して回収した。反応チューブは１０分間２５℃でインキュベートし、続いて５０分間５０℃でインキュベートした。反応は、８５℃で５分間で停止させ、氷上で冷却した。チューブを短時間遠心分離して反応物を回収し、１μLのＲＮａｓｅ Ｈを添加して、２０分間３７℃でインキュベートした。
【０１５０】
（ｂ）  ＰＣＲによる重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の増幅
【０１５１】
５μLのｃＤＮＡ、５μLの１０×反応バッファー、１μLの１０mM ｄＮＴＰミックス、１μLの２.５ユニット Ｔａｑポリメラーゼ、及びプライマーセットにより提供された１μLのフォワードプライマー１及び１μLのリバースプライマー２の組成を有する反応溶液は、２回蒸留水を用いて最終容量５０μLで調製し、ＰＣＲに供した。
【０１５２】
抗体の軽鎖及び重鎖の増幅のため、９４℃で１０分間のサイクルを用い、次いで、９４℃で１分間、５２℃で１分間、及び７２℃で１分間のサイクルを３５回繰り返し、反応物を７２℃でさらに１０分間インキュベートした。この反応溶液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、反応生成物を解析した。正しい分子量、すなわち重鎖について約４６３bps及び軽鎖について４５１bps、を有する生成物を、サブクローニングのために添付の指示書マニュアルに従ってｐＣＲ  ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen製）に連結した。Ｍ１３フォワード（５’−ＧＴＡＡＡＣＡＡＣ  ＧＡＣＧＧＣＧＡＧ−−３’（配列番号１２）及びＭ１３リバース（５’−ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＡＴＧ  ＡＣ−−３’（配列番号１３））プライマーを次に用いてヌクレオチド配列を決定した。配列情報に基づいて、抗体配列をＥｘＰＡＳＹ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌによってタンパク配列に翻訳した。ＥＮ１０ ｍＡｂの得られた配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖アミノ酸配列及び軽鎖配列を含み、これらの領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md.(1991) vols. 1-31に公開された方法によって決定された。
【０１５３】
図５Ａは、ＥＮ１０ ｍＡｂの可変重鎖領域／ドメインアミノ酸配列（配列番号１）を描写する。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲｓ（ＨＣＤＲ１（配列番号３）、ＨＣＤＲ２（配列番号４）、及びＨＣＤＲ３（配列番号５））が示されている。
【０１５４】
図５Ｂは、ＥＮ１０ ｍＡｂの可変軽鎖領域／ドメインアミノ酸配列（配列番号２）を描写する。フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）及びＣＤＲｓ（ＬＣＤＲ１（配列番号６）、ＬＣＤＲ２（配列番号７）、及びＬＣＤＲ３（配列番号８））が示されている。
実施例６
ＥＮ１０ ｍＡｂのヒト化
ヒトＶ領域フレームワーク配列の選択:
【０１５５】
マウスモノクローナル抗体ＥＮ１０ ｍＡｂを親抗体として用いて、Kabatの定義に従ったＥＮ１０ ｍＡｂ ＣＤＲ配列が、図５Ａ及び５Ｂ（配列番号１及び配列番号２）に記載されている。
【０１５６】
ヒト化ＥＮ１０（ｈｕｍ ＥＮ１０と略称される）ｍＡｂ ４Ｄ５のために、ヒトアクセプターフレームワークを、データベースから又はクリニックで検証されたフレームワークを用いて選択した。ＶＨサブグループIII、ＩＧＨＶ３−６６＊０４（配列番号１０）及びＶＬκサブグループＩ、ＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号９）内のヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列（図６Ａ）は、クリニックにおいて検証され、多くのヒト化抗体に使用されて成功している。
【０１５７】
ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴのために、ＥＮ１０ ｍＡｂフレームワーク領域と最も高いホモロジー度を有するヒト生殖系列ＶＬ及びＶＨ配列を、ＩＭＧＴデータベース（the International immunogenetics Information System（登録商標））から同定した。ホモロジーサーチは、ＢＬＡＳＴ又は同様の方法を用いて実施してもよい。クエリー配列として使用したＥＮ１０ ｍＡｂ可変領域配列は、米国特許出願第１４/１４２,１８６号のような文献から入手可能である。
【０１５８】
ＶＨサブグループIII（ＶＨ３）内のヒト重鎖フレームワーク配列は、多くのヒト化抗体に使用されて成功しており、ＶＬκサブグループII（Ｖκ２）のヒト軽鎖フレームワーク配列もまた、良好な候補であることが示されている。したがって、ＶＨIII及びＶκ２サブグループのフレームワーク配列は、それぞれＶＨ及びＶＬフレームワークの検索のために選択された。これらの検索により、ＩＧＨＶ３−７２＊０１及びＩＧＫＶ２Ｄ−２９＊０２が、それぞれＥＮ１０ ｍＡｂの相当する重鎖及び軽鎖フレームワーク配列に最も相同性の高いＶＨ及びＶＬ配列として同定された。
【０１５９】
図６Ｂに示すように、ＩＧＨＶ１−１８＊０１ヒト重鎖フレームワーク領域の配列は、ＥＮ１０ ｍＡｂのものと１９アミノ酸が相違し（下線を付した残基）、それは２４.６９％（フレームワーク領域の２０／８１総残基）変動に相当する。図６Ｂに示すように、ヒト軽鎖（kappa Iサブタイプ）フレームワーク配列は、ＥＮ１０ ｍＡｂのＩＧＫＶ１２-４４＊０１における配列と１５アミノ酸が相違し（下線を付した残基）、それは１９.７３％（フレームワーク領域の１５／７６総残基）変動に相当する。
【０１６０】
フレームワーク領域内のこれらの程度の変動を伴っても、同定されたヒト重鎖及び軽鎖フレームワーク配列内にＥＮ１０ ｍＡｂ由来のＣＤＲ配列を移植することによって生成されたｓｃＦｖフラグメントは、ＥＮＯ１に対して比較的良好なアフィニティ（ＫＤ＝約１０−１１M）（以下の表Ｉ参照）を有する。これらの結果は、フレームワーク領域が、ＣＤＲ領域コンフォメーションに影響を与えることなしに比較的高度の変動を許容することができることを示唆する。
表Ｉ:  ＥＮ１０キメラ及びＨｕｍ ＥＮ１０ ＩＭＧＴのＥＮＯ１結合ＥＬＩＳＡ
【表１】
0006585721.tif 000002
【０１６１】
これらの２対の軽鎖及び重鎖配列（ｈｕｍ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＩＭＧＴ）は、ヒトＥＮＯ１に対するヒト化抗体の構築のための例として使用することになる。
実施例７
ヒト化抗体の結合アフィニティ解析
【０１６２】
マウス抗体がヒト化された後のアフィニティ変化を確認するために、ＩＭＧＴ及び４Ｄ５バージョンのヒト化軽鎖及びヒト化重鎖の可変領域を、それぞれヌクレオチド合成法によって直接生成した。図７Ａに示すように、マウス可変領域、ＩＭＧＴ及び４Ｄ５可変領域のヒト化エディション及びヒトＦｃキメラ抗体発現ベクターｐＴＣＡＥ８-ＥＮＯ１を、宿主細胞に導入して、組換え抗体発現細胞を調製した。発現のための宿主細胞として、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３細胞（Invitrogen製）を使用した。ベクターは、添付の指示書マニュアルに従って、リポフェクタミン（lipofectamine）２０００（Invitrogen製）によって宿主細胞に導入した。約２.５μgの抗体発現ベクターを、制限酵素によって線状化し、遺伝子を、４×１０６個の細胞に導入し、細胞を、６ウェル培養プレートに播種した。発現ベクターの選択マーカーに相当する薬剤を添加し、安定なプールを形成するために細胞を連続的に培養した。
【０１６３】
ヒトＩｇＧ抗体を含有する培養上清は、以下に記載する方法によって調製した。抗体産生細胞は、Ｆｒｅｅ  ｓｔｙｌｅ（登録商標）２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（GIBCO）に順化させた。細胞は、組織培養フラスコ中で培養し、培養上清は、細胞の生存率が９０％のときに回収した。回収された上清を、１０μm及び０.２μmのフィルター（Millpore製）を通してろ過し、夾雑物を除去した。抗体を含有する培養上清は、プロテインＡ（Millipore製）、吸収バッファーとしてＰＢＳ、及び溶出バッファーとして２０mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ３.０）を使用して、アフィニティ精製した。溶出画分は、５０mMリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７.０）を添加することによりｐＨ６.０近辺に調整した。調製された抗体溶液を、透析膜（１０,０００ ＭＷカット、Spectrum Laboratories製）を用いてＰＢＳに置き換え、０.２２μmの孔サイズを有するメンブレンフィルター（Millpore製）を通過させてフィルター滅菌して、精製抗体を得た。精製抗体の濃度は、２８０nmの吸光度を測定し、吸光度１.４５が１mg/mLに等しいことに基づいて測定値を変換することにより決定した。
【０１６４】
個々の抗体間の結合動態学の違いを知るために、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００（BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を以前記載されたとおりに使用した（Karlsson & Falt, (1997) J. Immunol Methods 200:121-133）。カルボキシメチル化されたデキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIAcore Inc.）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて供給業者の指示書に従って活性化した。キメラＥＮ１０ ｍＡｂは、１０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ４.８で５μg/mLに希釈し、その後、流速２０μL/分でインジェクションし、カップリングしたタンパクの約１００レスポンスユニット（ＲＵ）を達成し、続いて１Ｍエタノールアミンをインジェクションし、未反応の基をブロックした。動態学の測定のために、ＥＮＯ１（０.３１２５nM〜４０nM）の２倍段階希釈を、製造業者（BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.）によって提供されるＨＢＳ−Ｐ Ｂｉａｃｏｒｅランニングバッファー中で、２５℃で流速２５μL/分でインジェクションし、ＥＮ１０ ｍＡｂ上の結合レスポンスは、ブランクフロー細胞上のレスポンスを引き算することにより訂正した。会合率（association rates）（ｋｏｎ又はｋａ）及び解離率（dissociation rates）（ｋｏｆｆ又はｋｄ）は、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの分離したフィッティングを用いる単純一対一ラングミュア結合モデルを使用して算出した（BIAcore.TM. Evaluation Software バージョン３.２）。
【０１６５】
結果を図７Ｂ及び表IIに示す。ＥＮＯ１とのキメラＥＮ１０ ｍＡｂの結合のｋｏｎ及びｋｏｆｆは、それぞれ３.５７×１０５及び８.２７１×１０−５であり、Ｋｄは、２.３１３×１０-１０mol/Lであった。ＥＮＯ１とのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ結合のｋｏｎ及びｋｏｆｆは、それぞれ５.３１×１０５及び１.１６２×１０−５であり、Ｋｄは２.１８８×１０−１０mol/Lであった。４Ｄ５ヒト化エディションについては、ｋｏｎ及びｋｏｆｆはそれぞれ３．５１１×１０５及び１．７５５×１０−５であり、Ｋｄは４．９９７×１０−１０mol/Lであった。
【０１６６】
図７Ｂ及び表IIから、結果は、すべてのヒト化ＥＮ１０抗体がヒトＥＮＯ１タンパクを認識することができ、ヒト化後、ＩＭＧＴエディションのアフィニティはマウスキメラ抗体のそれと同等であり、約２．１８８±０．１２×１０−１０M（Ｎ＝３）のＫｄ値の好ましいアフィニティを有することを示唆する。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５もまた、同様のアフィニティ、４．９９７×１０−１０Mを有する。
実施例８
ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体はＵ９３７のＬＰＳにより誘導されるプラスミノーゲン受容体活性を阻害する
【０１６７】
ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５ ｍＡｂ及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴががん細胞のＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を阻害する能力を評価するために、ヒトリンパ腫Ｕ９３７細胞株を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ中で増殖させた。細胞を、１０μg/mLのＬＰＳで６時間処理し、細胞表面のＥＮＯ１タンパク発現を誘導した。ＰＢＳ中の１.５×１０６細胞/mLを、次に１μg/mLのヒトＬｙｓ−プラスミノーゲン及び異なる濃度のｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴを用いてそれぞれ１時間プレインキュベーションした。サンプルを、ＰＢＳで２回洗浄し、３nMの組織特異的プラスミノーゲン活性化因子及び０.５mMの色原性基質Ｓ−２２５１を添加した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、ＯＤ４０５を読み取った。各研究は３回繰り返し、アンタゴニスト活性を解析した。データは平均±ＳＤとして表した。Ｔテストを用いて各群を比較した。Ｐ値＜０.０５を統計学的に有意と考えた。
【０１６８】
この実験の結果を図８Ａ及び図８Ｂに示す。親抗体ＥＮ１０ ｍＡｂと同様、５０μgのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの両方が、高いＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体アンタゴニスト活性を有しており、ＬＰＳ誘導性特異的ＥＮＯ１活性の５０％及び５６％阻害を達成することができ、この阻害パーセンテージは用量依存性である。したがって、両ヒト化抗体は、標的器官へのがん細胞の遊出を阻害する良好な潜在能力を有すると思われた。
実施例９
ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体はＵ９３７の侵襲活性を阻害する
【０１６９】
実施例８の結果として、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体は、Ｕ９３７の誘導性ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性を軽減する。これは、それらの患者抗体として、がん細胞の侵襲活性の阻害をもたらし得る。
【０１７０】
ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの抗遊出活性を評価するために、３×１０６個のマウス脳内皮ｂＥｎｄ.３細胞を、Ｃｙｔｏｓｅｌｅｃｔ（登録商標）２４ウェル細胞遊走及び侵襲アッセイキットの上チャンバーのマトリックスゲルで、１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で２４時間プレコーティングした。上チャンバーをＰＢＳで２回洗浄した。２％及び１０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地を、上及び下のチャンバーにそれぞれ添加した。１０、５０、及び１００μg/mLのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴとそれぞれ混合した後、２×１０４細胞のＵ９３７を、２チャンバーアッセイシステムのトップチャンバーに播種し、２４時間インキュベートした。抗ヒトＩｇＧを陰性コントロールとして使用した。２つのチャンバーは、マトリゲルでコーティングされたマイクロポアフィルター（８μmの孔サイズ）で分離されていた。インキュベーション期間の後、下のチャンバーの細胞を、顕微鏡下で血球計によってカウントした。各研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして表した。Ｔテストを用いて各群間の活性を比較した。Ｐ値＜０.０５は統計学的に有意と考えられる。
【０１７１】
結果を図９Ａ及び９Ｂに示す。Wangらによる研究におけるのと同様に、ｔＰＡはＵ９３７のバックグラウンド侵襲を刺激した（図８Ａ及び８Ｂ）。Ｕ９３７の侵襲活性は、細胞に５０μg/mLのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体が投与された場合、それぞれ約４１．８±１１％（Ｎ＝３）及び３３±１１％（Ｎ＝３）、阻害された（図９Ａ及び９Ｂ）。これらの結果は、実施例４の結果と同様である。両ヒト化抗体は、Ｕ９３７細胞の遊出活性を阻害する能力を有する。
実施例１０
ヒト化ＥＮ１０ ｍＡｂはコラーゲン及びフィブロネクチンからのＣＬ１-５細胞の解離を阻害する
【０１７２】
ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体−プラスミン及び細胞外基質の間のシグナル伝達経路を評価するために、１mg/mLのゼラチン、１００μg/mLのフィブリノーゲン、１０μg/mLのコラーゲン及び１０μg/mLのフィブロネクチンを、それぞれ非処理ＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングした。ＣＬ１-５細胞（４×１０４個の細胞）をプレートに播種し、５０μg/mLのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５を、２００μLの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに添加した。細胞を、３７℃で２４時間インキュベートし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。１０％ＷＳＴを添加し、反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。プレート内の相対的細胞数は、ＯＤ４５０の読み取りによって概算した。各研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤで表す。Ｔテストを使用して各群間の活性を比較した。Ｐ値＜０.０５を統計学的に有意と考える。
【０１７３】
これらの実験の結果を図１０Ａに示す。これらのデータは、コラーゲン及びフィブロネクチンをコーティングしたプレートのＯＤ４５０読み取りは２．４５±０．３７（Ｎ＝３）及び１．８３±０．４４（Ｎ＝３）であることを示す。これらの読み取りは、バックグラウンドの読み取りと有意差がないゼラチン及びフィブリノーゲンのプレートのものよりもはるかに高い。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５処理群及び非処理群の間には有意差はない。これらの結果は、ＣＬ１-５細胞はフィブロネクチン及びコラーゲンへの結合を支持し、細胞が下流のプロテアーゼ、たとえばプラスミノーゲン及びｔＰＡなしの培地中でインキュベートされる場合、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５は細胞会合経路に関与していないことを示唆する。図１０Ａのデータは、ＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体活性は細胞外マトリックスにおける細胞会合経路に関与していないことを示唆する。我々は、ＥＮＯ１が細胞外マトリックスにおける細胞解離経路において役割を有するか否かをさらに試験した。１μg/mLのフィブロネクチン及び１０μg/mLのコラーゲンを、それぞれ非処理ＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングした。ＣＬ１-５細胞（４×１０４個の細胞）をプレートに播種し、０、６.２５、１２.５、２５、及び５０・μg/mLのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５を、それぞれ、２００μLの１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭに添加した。さらに、１０μg/mLのＧｌｕ−プラスミノーゲン及び２nM  ｔＰＡを添加した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した。次に、１０％ＷＳＴを添加し、反応混合物を３７℃で４時間インキュベートした。プレート内の相対的細胞数は、ＯＤ４５０の読み取りによって概算した。各研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして表す。Ｔテストを使用して各群間の活性を比較した。Ｐ値＜０.０５は統計学的に有意と考える。
【０１７４】
これらの実験の結果を図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。データは、培地がＥＮＯ１受容体下流プロテアーゼのプラスミノーゲン及びｔＰＡを含有する場合、細胞数が両細胞外マトリックス中の処理されたｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５の濃度に正比例することを示す。両細胞外マトリックス研究において５０μgのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５処理群及びコントロールＩｇＧ群の間には有意差が存在する（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＥＮＯ１が細胞外マトリックスからのＣＬ１-５細胞の解離経路に、おそらくはプラスミン及びｔＰＡプロテアーゼ 活性を強化することにより、関与することを示唆する。ＥＮＯ１のアンタゴニストとして機能するｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５は、ＥＮＯ１の受容体活性をブロックし、プラスミン及びｔＰＡ活性化の阻害をもたらし、したがって、細胞外マトリックスからのＣＬ１-５細胞の解離活性及び侵襲を阻害する。
実施例１１
【０１７５】
ヒト化ＥＮＯ１抗体は、肺がん細胞株に対してＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）効果を示す。抗増殖阻害に加えて、ハーセプチンのＡＤＣＣはその抗腫瘍効果に非常に重要であることが知られている。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体はハーセプチンと同じＦｃフラグメントを有するので、我々は、両抗体はＡＤＣＣ活性を有すると合理的に説明した。
【０１７６】
がん細胞に対するｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体のＡＤＣＣ効果を試験するために、２×１０４個のヒト肺ＣＬ１-５がん細胞を、９６ＥＬＩＳＡプレートで増殖させた。一晩のインキュベーションの後、異なる濃度のｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ及びコントロールＩｇＧ１抗体を添加した。５人のボランティアからの新鮮血液サンプルを、ＤＣＢのＩＲＢ（機関審査委員会）ガイドラインに沿って集めた。ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を、血液：ＰＢＳ：フィコール（FICOLL）＝１：１：１溶液により３０００rpm、３０分間の遠心分離で調製した。得られたＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣは、５％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、２.５×１０７細胞/mLの濃度に希釈した。次に、５０μLのＰＢＭＣを、ＣＬ１-５を含むＥＬＩＳＡプレートに添加した。細胞を、３０００rpmで５分間遠心し、３７℃で４時間インキュベートした。サンプルをＰＢＳで２回洗浄し、ＡＤＣＣ検出キットを製造業者提供のプロトコールに沿って添加し、室温で３０分間インキュベートした。プレート内の細胞溶解のパーセンテージは、ＯＤ５３０／５９０の読み取りによって概算した。各研究は３回繰り返した。データは平均±ＳＤとして表す。
【０１７７】
これらの実験の結果を図１１Ａ及び１１Ｂに示す。細胞溶解パーセンテージは、細胞がエフェクター／標的比４０:１及び１:１５の研究で異なる濃度のコントロールヒトＩｇＧ抗体とともに投与された場合、有意な増大を示さない。エフェクター／標的比４０:１の研究において、１×１０-９Mのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５抗体で処理された細胞は、同じ濃度のヒトＩｇＧで処理された細胞と比較して有意な溶解差を見せ始めた。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体の両方は、細胞に１０-６Mの抗体が投与された場合、約４２％の最大溶解活性を示した。低エフェクター／標的比（１５:１）の研究において、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体群の両方は、１×１０-８Mで有意な溶解を見せ始め、１０-６Mで最大溶解に到達する。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体のＡＤＣＣ  ＥＣ５０は、それぞれ約８×１０-９M及び１×１０-８Mと概算される。両ヒト化ＥＮ１０抗体は、ＡＤＣＣ活性を有する。我々の結果は、抗遊走活性に加えて、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体は抗がん剤としてＡＤＣＣ活性を提供することができることを示唆する。
実施例１２
腫瘍増殖に対するヒト化ＥＮ１０抗体の阻害効果
【０１７８】
ヒト化ＥＮ１０抗体は、約２．３１１±０．００３×１０−１０mol/LのＫｄをもつ良好なアフィニティ及びさらなる開発のための潜在能力を有する。ヒト化ＥＮ１０抗体の治療効果を評価するために、ＣＬ１-５マウス異種移植モデルを実施した。ＣＬ１-５Ｆ４肺腺癌細胞（１×１０６細胞／マウス；５マウス／群）を、第０日に皮下接種した。治療手順は、腫瘍接種の２日後に、１０mpk（mg/Kg）のアイソタイプコントロール（ＣＴＬ）ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５又はｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ抗体を週２回投与することにより実施した。各マウスの腫瘍体積及び体重は毎週測定した。データは、個々の群について平均±ＳＤとして表す。
【０１７９】
結果を図１２に表す。２日後、コントロール、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ群の間で、有意な腫瘍サイズの差はない。第２３日の後、コントロール群のマウスの腫瘍は指数関数的に増殖し始め、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ処理マウスにおいては有意な腫瘍増殖はない。第３０日の後、コントロール群マウスの平均腫瘍サイズは１６００±２００mm３（Ｎ＝５）であり、１０mpkのｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴで処理されたマウスについては、平均腫瘍サイズはそれぞれ５０５±２４mm３（Ｎ＝５）及び３３０±１１mm３（Ｎ＝５）であった。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ処理群の両方の平均腫瘍サイズはコントロール群のそれと比較して有意に小さく、Ｐ値はそれぞれ０.００４及び０.００３であった。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴ処理群の間で有意な腫瘍サイズ差はない。この結果は、マウス異種移植モデルにおいてｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴはＣＬ１-５細胞に対して腫瘍増殖阻害活性を有すること、及びＥＮ１０ ｍＡｂはがん療法のための試薬として良好な有効性を有することを示す。
実施例１３
ＣＨＯ細胞コドン最適化
【０１８０】
上記の例から、我々は、ＥＮＯ１モノクローナル抗体は治療抗体として開発される潜在能力を有する見通しを持つ。
【０１８１】
ＣＨＯ細胞株においてヒト化治療抗体を大量生産するために、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェアツール（http://www.lifetechnologies.com/tw/zt/home/life -science /cloning /gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html）を用いて、コドン最適化を実施した。ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの可変領域は、最適化されたコドンを得るために対象とされた。パラメーターは、コドン質分布（codon quality distribution）（所望の発現系について最も頻繁に使用されるコドンの質値）及びＧＣ含量（ＧＣ含量が望ましい範囲内になるようにコドンを最適化すること）を含む。ＣＨＯ細胞株についてコドン最適化された軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、図１３Ａ及び図１３Ｂ（配列番号１４及び配列番号１６）にそれぞれ表す。
【０１８２】
ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの軽鎖及び重鎖のＣＨＯ細胞コドン最適化された可変領域は、それぞれヌクレオチド合成法によって直接生成された。次いで、ｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの可変領域及びヒトハーセプチン（Herceptin）（登録商標）Ｆｃ抗体発現ベクターｐＣＨＯ-ＥＮＯ１を、図１３Ａに示すように、宿主細胞に導入して、組換え抗体発現細胞を調製した。発現のための宿主細胞として、ＣＨＯＳ細胞（Life-Technology Inc.）を用いた。ベクターは、添付の指示書マニュアルに従ってリポフェクタミン２０００（Invitrogen製）によって宿主細胞に導入した。約２.５μgの抗体発現ベクターを制限酵素で線状化し、遺伝子を４×１０６個の細胞に導入し、細胞を６ウェル培養プレートに播種した。低濃度選択のために、得られた細胞プールを１０μg/mLのピューロマイシン及び１００nMのメトトレキセート又は２０μg/mLのピューロマイシン及び２００nMのメトトレキセートを含有する選択培地中で増殖させた。さらなる選択を行うために、別のステージの高濃度選択を実施した。一次選択プールを、３０μg/mLのピューロマイシン及び５００nMのメトトレキセートを含有する培地中又は５０μg/mLのピューロマイシン及び１０００nMのメトトレキセートを含有する培地中で、さらに増殖させた。最終抗体産生細胞株を生成するために、二次ステージプールの９６,０００個の細胞を半固体培地に播種し、指示書マニュアルプロトコールに従ってＣｌｏｎｅＰｉｘ２（Molecular Device Inc.製）で実施する蛍光強度によって７６８個の高抗体発現細胞を決定して拾い上げた。トップの１０個の高リード細胞株を、増殖率、５日バッチ産生率及び１４日シンプル流加（simple-fed batch）産生率を含むパラメーターを用いて選択した。６０世代の安定性試験の後、候補の産生細胞株を決定した。
【０１８３】
結果を図１３Ａに示す。ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェツールによってコドンがＣＨＯ細胞発現系に最適化されたｈｕｍ ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの核酸を、ヒトオリジナルのそれと整列させた場合、２つのエディション間の可変軽鎖及び可変重鎖のホモロジーは、それぞれ７４.５％及び８４％であった。この結果は、コードされる抗体が同じタンパク配列を有していてもヒト細胞及びＣＨＯ細胞間のコドンの好み（codon favor）は異なることを示す。両エディションの抗体遺伝子がｐＣＨＯ１.０に構築され、ＣＨＯ細胞において一過性発現される場合、ＣＨＯ細胞コドンエディションの抗体産生率は、ヒトオリジナルのそれの約３.１倍である（データは示していない）。我々の結果は、抗体の高収率産生のためにはコドン最適化が非常に重要であることを示唆する。ＣＨＯ最適化ｈｕｍ ＥＮＯ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴの細胞プールを、ＦｏｒｉＣＨＯ培地（Life Technology Inc.）中でさらに選択し、高抗体産生細胞株を、ＣｌｏｎｅＰｉｘ２を用いて拾い上げた。第５日及び第１４日にトップ１５クローンの産生率を解析した場合、結果を図１３Ｂに示す。産生率は、第５日に１５５mg/L〜９１.３mg/L及び第１４日に３５８.７mg/L〜２４７.５mg/Lの範囲にわたる。これらのすべてのクローンは、このシンプルな培地中で良好な生存性及び増殖率を有する。これらの結果は、すべてのクローンは培地の最適化の後にその抗体産生能力を改善し得ることを示す。これらのクローンの抗体生産性をさらに調べるために、異なる組合せのグルコース及びフィード培地研究を実施し、第１５日にトップ６クローンにおいて抗体産生率を解析した。結果を図１３Ｃに示す。トップ６クローンの最大産生率は、１５日間のインキュベーション後に０.７g/L〜０.８１g/Lの範囲にわたる。すべてのクローンは、６０世代の解析の後、良好な安定性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって抗体を解析した場合、インタクトな抗体を産生する（図１３Ｄ）。我々の研究は、これらのクローンがＥＮＯ１治療抗体産生細胞株として良好な潜在能力を有することを示唆する。
【０１８４】
要約すると、抗体ＥＮ１０ ｍＡｂのように、ヒト化ＥＮ１０ ｍＡｂ ４Ｄ５及びヒト化ＥＮ１０ ｍＡｂ ＩＭＧＴは、そのＥＮＯ１プラスミノーゲン受容体アンタゴニスト活性を用いてプラスミノーゲン活性化を阻害し、それによって細胞表面のプロテアーゼ活性の下方調節を誘導し、それが細胞外マトリックスからのがん細胞の解離の阻害をもたらす。結果として、ＥＮＯ１に対する抗体は、がん細胞の侵襲能力を阻害することができる。これらのデータは、ＥＮＯ１抗体（たとえば、ＥＮ１０ ｍＡｂ）ががんの治療のための治療抗体として望ましいアフィニティ、効率及び潜在能力を有することを示す。
【０１８５】
本発明は、限られた数の態様に関して記載されているが、当業者は、本開示の利益をもって、本明細書において開示された本発明の範囲を逸脱しない他の態様を考案することができることを認めるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【配列表】
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