(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原性標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するための方法であって、
非ヒト哺乳動物である宿主に前記抗原性標的タンパク質を組み込んだ小胞体由来膜小胞を含む免疫原性組成物を適用することによって、前記宿主において免疫応答を誘導することと、前記宿主由来の前記標的タンパク質に対する抗体を得ることと、を含み、
少なくとも下記の工程、
ａ）前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体におけるインビトロ翻訳反応によって前記標的タンパク質を合成する工程と、
ｂ）前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を、前記媒体から分離する工程と、
ｃ）生理学的に適合可能な媒体において、前記合成された標的タンパク質を含む前記膜小胞を提供する工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記膜小胞を、宿主に適用する工程と、
ｅ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答に対して、前記宿主の血清サンプルを試験する工程と、
ｆ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答を示す宿主の血清から、前記標的タンパク質に対する特異的抗体を得る工程と、
を含み、
前記細胞溶解物は、昆虫細胞溶解物である、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記昆虫細胞溶解物は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞溶解物である、
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記昆虫細胞溶解物は、Ｓｆ２ｌ細胞溶解物である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記膜小胞および前記昆虫細胞溶解物は、同じ細胞株由来である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記合成された標的タンパク質を含む前記膜小胞は、遠心分離によって前記媒体から分離される、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、前記膜小胞において前記合成されたタンパク質の濃縮を促進する条件下で成立する、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程ｂ）の後に、前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有しない細胞溶解物と、を含む第二の反応媒体に、前記分離された膜小胞を移すことと、前記第二の反応媒体においてインビトロ翻訳反応を行うことと、前記第二の反応媒体から、増加した量の前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離することと、を含む付加的な工程ｂ’）をさらに含み、
工程ｂ’）は、１回又は複数回繰り返され得る、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、前記翻訳反応の過程における反応物または生成物の添加および／または排出を含む連続的な透析に基づく方法によって行われる、
ことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、カスパーゼ阻害剤の存在下で行われる、
ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主に適用されたタンパク質含有膜小胞を有する前記免疫原性組成物は、任意の追加の免疫賦活アジュバントを含まない、
ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
抗体は、診断および治療における強力かつ非常に貴重なツールである。高度に特異的な抗体の需要の高まりに応じて、いくつかの異なる戦略が、十分な量での抗体の確実な産生を得るために、長い間開発されてきた（例えば、非特許文献１を参照）。この内容において、１９７５年のハイブリドーマ技術の発見は、マウスハイブリドーマがモノクローナル抗体の最初の確実なソースであったため、重要な突破口を表す。
【０００２】
理論的には、モノクローナル抗体は、選択した任意の標的に対して開発され得る。選択したターゲットの提供は、絶対不可欠である。遺伝子免疫の場合でさえ、抗原は、スクリーニングおよび確認の目的のために必要とされる。不幸なことに、いくつかのケースでは、細胞ベースのアッセイにおける抗原の分離も産生も失敗した場合、抗原の提供が問題となる可能性がある。
【０００３】
通常、抗原は、タンパク質およびペプチドのクラスに属するが、基本的には、他の物質のクラスもまた、例えば、多糖類、脂質およびポリヌクレオチドのような免疫原として使用され得る。ほとんどの場合において、抗体は、天然の抗原に対して生成されるべきである。抗原が組換えＤＮＡ技術によって産生される場合、組換えタンパク質またはペプチドの特性と天然の対応物を比較することは非常に重要である。タンパク質の構造の違いが、免疫原性の違いにつながる可能性があるためである。タンパク質およびペプチドは、抗体産生のための非常に興味深い標的である。ペプチド合成は、免疫原性エピトープが直鎖であり、完全なタンパク質の三次構造に依存しないという事実を前提として、細胞ベースの発現に対する代替性を表す。一方、ペプチド合成は、三次元エピトープの一部である翻訳後修飾（ＰＴＭ）を有するタンパク質およびペプチドに対して限界を有する。さらに、抗原などのペプチドおよびペプチドの混合物の使用は、交差反応性抗体の産生を誘導し得る。
【０００４】
膜タンパク質は、すべての配列決定されたゲノムの３分の１近くを占めている。シグナル伝達、代謝、輸送および認識といった細胞プロセスにおけるその重要な関与とは対照的に、膜タンパク質の構造および機能についての情報はほとんどない。ｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの生物学的活性の非規則化は、重篤な疾患を引き起こし得、それらを非常に興味深い薬理学的な標的とする。この開発は、膜タンパク質に特異的な抗体の需要の増加を引き起こした。
【０００５】
膜タンパク質に対する特異的抗体の生成は、多くの場合、所定の標的膜タンパク質を生成または単離できないことによって制限される。ｉｎ  ｖｉｖｏでの膜タンパク質の過剰発現は、多くの場合、タンパク質のミスフォールディング、不溶化、凝集、低生成収率および細胞毒性によって妨げられる。しかし、膜タンパク質の無細胞発現は、これらの障害を克服することがでる。
【０００６】
過去１０年間、無細胞タンパク質合成は、膜タンパク質、サイトゾルまたは毒性タンパク質を含む異なるタンパク質のクラスの産生に対する価値あるツールとなってきた（例えば、非特許文献２を参照）。効率的な無細胞発現系の基本は、翻訳活性を有する細胞抽出物であり、それは、リボソーム、翻訳因子および酵素といった翻訳のために必須の成分を含む。また、細胞溶解物は、アミノ酸、ＡＴＰおよびＧＴＰ、エネルギー再生系（例えば、クレアチンリン酸／クレアチンキナーゼエネルギー再生系）が補充されている。標的タンパク質の合成は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかの形態での適切な鋳型を添加することにより開始される。今まで、多くの異なるタイプの機能的に活性な標的タンパク質が、原核生物および真核生物の無細胞系において発現されてきた。原核細胞抽出物に比べて、真核細胞溶解物は、翻訳後修飾を必要とする複雑なタンパク質の発現において、いくつかの利点を提供する。
【０００７】
それにもかかわらず、先行技術の従来の方法に従って、特異的抗体の産生のための原核生物および真核生物の細胞溶解物を用いて合成されたタンパク質の使用は、免疫原性物質としての使用に適した形態における所望の標的タンパク質を提供するための、追加の労力を要する精製および／または単離工程を依然として含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｓ．Ｈａｕｒｕｍ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，２００６．１１（１３−１４），６５５−６６０
【非特許文献２】Ｋａｔｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５．２３（３），１５０−１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来技術の問題点に鑑みて、本発明の主な目的は、特定の標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するための改良された方法および手段を提供することである。
【００１０】
この目的は、本発明の第１及び第２の態様に係るタンパク質含有膜小胞を含む抗原性組成物を使用した、特定の標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するための新規な方法を提供することによって達成された。本発明の追加の態様及びより具体的な実施形態は、追加の請求項の事項である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様に係る抗原性標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するための方法は、宿主に前記抗原性標的タンパク質を組み込んだ膜小胞を含む免疫原性組成物を適用することによって、前記宿主において免疫応答を誘導することと、前記宿主由来の前記抗原性標的タンパク質に対する抗体を得ることと、を含む。
【００１２】
本発明の第２の態様に係るより具体的な方法は、
少なくとも下記の工程、
ａ）標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体におけるインビトロ翻訳反応によって標的タンパク質を合成する工程と、
ｂ）前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を、前記媒体から分離する工程と、
ｃ）生理学的に適合可能な媒体において、合成された標的タンパク質を含む膜小胞を提供する工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記膜小胞を、宿主に適用する工程と、
ｅ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答に対して、前記宿主の血清サンプルを試験する工程と、
ｆ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答を示す宿主の血清から、前記標的タンパク質に対する特異的抗体を得る工程と、
を含む。
【００１３】
本発明者らの研究は、驚くべきことに、宿主における標的タンパク質に対して特異的な抗体を惹起するための免疫原性組成物として直接的に、組み込まれた少なくとも１つの標的タンパク質を有する膜小胞の調製を用いることが可能であることを実証した。このような膜小胞調製物は、本質的に、宿主に対して非毒性であり、さらなる免疫刺激剤を添加することなく強力な免疫応答を誘導するために効果的に使用され得る。
【００１４】
適切な膜小胞調製物は、例えば、標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体における無細胞翻訳反応を行うことと、媒体から、翻訳反応後にタンパク質含有小胞を分離することと、の後に得られる。
【００１５】
好ましくは、細胞溶解物は、真核細胞溶解物である。
【００１６】
前記真核細胞溶解物は、特に限定されるものではなく、基本的に任意の細胞溶解物であってもよく、それは、用いられる核酸鋳型のインビトロ翻訳、および任意に、合成された標的タンパク質の修飾に対して必要とされるすべての成分を含む。
【００１７】
より具体的には、真核細胞溶解物は、コムギ胚芽溶解物と、昆虫細胞溶解物、特に、Ｓｆ２ｌ細胞溶解物と、網状赤血球溶解物と、ケラチノサイト溶解物と、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞又は培養リンパ腫細胞からの細胞抽出物と、を含む群から選択される。
【００１８】
これらの細胞溶解物は、特定の成分を添加または除去することにより、それらの天然の形態または変性された形態で用いられ得る。
【００１９】
以下の例で使用される無細胞系は、培養された昆虫細胞（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｓｆ２１）から生成された翻訳活性を有する溶解物に基づく。細胞内成分の完全性を維持する非常に穏やかな溶解物の調製手順によって、小胞体（ＥＲ）の重要な部分は、機能的に活性な膜小胞として溶解物中で維持され得る。小胞含有種の溶解物を使用して、グリコシル化、シグナルペプチド切断、脂質化、リン酸化およびジスルフィド結合形成といった翻訳後修飾（ＰＴＭ）が、標的タンパク質において行われ得る。
【００２０】
特定の細胞株から得られた一次細胞溶解物が、膜小胞（例えば、網状赤血球溶解物など）を含まない場合、小胞は、異なるソースから、例えば、異なる細胞株の溶解物から加えられ得る。
【００２１】
好ましくは、膜小胞および細胞溶解物は、同じ細胞株由来である。
【００２２】
さらに、一つ以上の成分が合成的に調製された人工細胞溶解物も同様に、使用され得る。
【００２３】
インビトロ翻訳反応に対する反応媒体は、リボソーム、翻訳因子および酵素といった翻訳のために必須成分を含む細胞溶解物を含む。さらに、培地または細胞溶解物は、アミノ酸、ＡＴＰおよびＧＴＰ、エネルギー再生系（例えば、クレアチンリン酸／クレアチンキナーゼ−エネルギー−再生系）が補充されている。標的タンパク質の合成は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれかの形態において、標的タンパク質のための適切な核酸鋳型の添加により開始される。
【００２４】
合成された標的タンパク質を含む膜小胞は、特に、遠心分離または濾過によって、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって反応媒体から分離され得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、膜小胞における合成された標的タンパク質の濃縮を促進する条件下で成立する。
【００２６】
膜小胞における合成された標的タンパク質のこのような濃縮を得るための一つの例示的なアプローチは、本発明の第２の態様に係る方法の変形を含み、それにおいては、本発明の第２の態様に係る方法の工程ｂ）の後に付加的な工程ｂ’）が行われ、それは、標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有しない細胞溶解物と、を含む第二の反応媒体に、前記分離された膜小胞を移すことと、前記第二の反応媒体においてインビトロ翻訳反応を行うことと、前記第二の反応媒体から、増加した量の前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離することと、を含み、  工程ｂ’）は、１回又は複数回繰り返され得る。
【００２７】
代替的な実施形態では、工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、翻訳反応の過程で、反応物または生成物の添加および／または排出を含む連続的な透析ベースの方法によって行われる。この反応形式は、反応の寿命を延長させ、それゆえ、全体的なタンパク質収量を増加させる。
【００２８】
典型的には、この実施形態は、透析膜によって分離された少なくとも２つのコンパートメントを含む装置で実現され、それにおいて、翻訳反応は、少なくとも１つの第一のコンパートメント、反応コンパートメントで起こり、翻訳反応の過程で、少なくとも１つのさらなるコンパートメント、給排コンパートメントからの反応物は、反応コンパートメントに拡散し、反応副産物は、反応コンパートメントから給排コンパートメントに拡散する。
【００２９】
好ましくは、カスパーゼ阻害剤は、少なくとも反応室中に存在する。同時係属中の特許出願で２０１３年９月２５日に出願されたＤＥ１０２０１３０１５９７７．６に示されるように、インビトロ翻訳反応中のカスパーゼ阻害剤の存在は、無細胞翻訳系におけるタンパク質収量を顕著に増加させ、それにおいては、真核細胞溶解物が使用される。
【００３０】
本発明の方法の典型的な実施形態では、宿主に適用されるタンパク質含有膜小胞を有する免疫原性組成物は、付加的な免疫刺激性のアジュバントを含まない。既に述べたように、本発明において使用される免疫原性組成物は、有利には、さらなる助剤を省略することができる。
【００３１】
前記免疫原性組成物において、小胞は、当技術分野で公知の、任意の適切な生理学的に適合可能な媒体または緩衝液において提供され得る。具体的には、「生理学的に適合可能な」媒体または緩衝液のｐＨおよび塩濃度は、意図される宿主の身体に対して生理学的に適合性を有していなければならない。生理学的に適合可能な媒体は、例えば、ＰＢＳであってよいが、適切な代替物は当技術分野の当業者により容易に認識されるであろう。
【００３２】
免疫化および特異的なポリクローナル抗体を得るために使用される宿主は、当該技術分野においてそのような目的のために使用される任意の宿主動物であってもよい。典型的には、それは、マウスまたはラットを含む齧歯動物、ヤギ、ヒツジ、ウシ等といった非ヒト哺乳動物である。
【００３３】
本発明の密接に関連する態様は、膜小胞の調製の小胞において標的タンパク質を蓄積するための方法に関し、それは、少なくとも下記の工程、
ａ）標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体におけるインビトロ翻訳反応によって標的タンパク質を合成する工程と、
ｂ）前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を、前記媒体から分離する工程と、
ｃ）標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有しない細胞溶解物と、を含む第二の反応媒体に、前記分離された膜小胞を移し、前記第二の反応媒体においてインビトロ翻訳反応を行い、および前記第二の反応媒体から、増加した量の前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離する工程と、
を含み、
工程ｃ）は、１回又は複数回繰り返され得る。
【００３４】
本出願は、迅速かつ効率的な態様における、発現が困難なタンパク質抗原、例えば、膜タンパク質および翻訳後修飾を有するタンパク質に対するポリクローナル抗体の生成を可能にする新規な方法を開示する。この方法の基本は、溶解物中に存在するＥＲ由来膜性小胞への、標的タンパク質の合成、移転および埋め込みに対する真核生物無細胞翻訳系の使用である。無細胞タンパク質合成に続いて、それらの埋め込まれた標的タンパク質を有する小胞は、溶解物の細胞質画分から分離され得、その後、埋め込まれた抗原のプロセッシングのために貨物車として用いられ得る。
【００３５】
全体の方法は、標的膜タンパク質に対する図１で示されるような５つの主要な工程において説明され得る。
【００３６】
１．標的タンパク質の無細胞合成。標的タンパク質の無細胞合成は、可溶性かつ正しく折り畳まれた状態の所定の標的タンパク質の合成を可能にする翻訳系において行われるべきである。膜タンパク質の場合には、合成または天然の脂質または界面活性剤の足場の存在が必要である。標的タンパク質の小胞の内腔への翻訳に伴う移行または新たに合成された標的膜タンパク質の脂質二重層への組み込みは、それぞれのタンパク質配列中の１つ以上のシグナル配列によって開始される。
【００３７】
この最初の工程はまた、ＥＲ由来小胞の膜または内腔における標的（膜）タンパク質の累積的な濃縮を含み得る。内因性タンパク質の画分と比較して新たに合成されたタンパク質の画分を濃縮するために、反復的な合成が行われ得る。ここでは、標的タンパク質は、同じバッチの昆虫小胞への複数回、続いて行われる無細胞反応において合成される。各合成工程の後、小胞が回収され、次の合成工程に適用されて、小胞体膜において存在する外因性膜タンパク質の継続的な増加がもたらされる。したがって、タンパク質の収率を、標準的なバッチ反応で得られるような典型的には１から１０μｇ／ｍｌから、約２０から３０μｇ／ｍｌに増加させることが可能である。
【００３８】
２．好ましくは遠心分離による、新たに合成された（膜）タンパク質を含む、ＥＲ由来小胞の回収。ＥＲ由来小胞は、単一の遠心分離工程によって溶解物の細胞質の部分から分離され得る。遠心の小胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）といった生理学的なｐＨおよび塩濃度を有する媒体または緩衝液において再懸濁され、小胞に付着され得るサイトゾルタンパク質を除去するために、この培体／緩衝液で洗浄する。
【００３９】
３．回収され洗浄された、その組み込まれた標的タンパク質を有する小胞は、免疫原として使用され得る。小胞−緩衝液は、直接、実験動物に注入される。
【００４０】
４．好ましくは適切な休眠期間、例えば、４週間の後の採血。
【００４１】
５．抗原認識に対するポリクローナルマウス抗血清の性能は、例えば、ウェスタンブロットによって評価される。
【００４２】
肯定的な結果の場合には、対応する血液ドナーは、モノクローナル抗体の産生のための供給源とみなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】真核生物の小胞ベースの翻訳システムを用いて無細胞合成された膜タンパク質によるマウスの免疫化を介した特異的抗体産生の概略図である。
【図２】昆虫小胞でのマウスの免疫前後に得られたマウスポリクローナル抗血清のウェスタンブロット分析の図である。
【図３】ＴＣＡ沈殿、その後の液体シンチレーション計数およびオートラジオグラフィーによる無細胞合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの分析の図である。
【図４】昆虫溶解物を用いた無細胞合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−ＨｉｓのＨｉｓタグ精製の図である。（Ａ）は、ゲル電気泳動後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色の図であり、（Ｂ）は、一次抗体として市販の抗ＥＧＦ受容体抗体（抗ＥＧＦ受容体Ｄ３８Ｂ１  ＸＰ）、および二次抗体としてＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ）を用いたウェスタンブロットによるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの検出の図である。
【図５】新たに合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを含む昆虫小胞を用いたマウスの免疫化前後に得られたマウスポリクローナル抗血清のウェスタンブロット分析の図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
以下の非限定的な例は、より詳細に本発明を例示するために提供されるが、特定の特徴およびパラメータに限定されることはない。
【００４５】
（参考例）
内因性タンパク質を回収した膜小胞を有するマウス宿主の免疫化および抗血清の分析
【００４６】
これらの実験で使用された真核生物の翻訳系は、培養されたツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（のＳｆ２１）細胞由来の翻訳活性を有する溶解物に基づいており、Ｓｆ２１昆虫細胞の小胞体（ＥＲ）にその起源を有する機能的な内因性膜小胞を含む。
【００４７】
最初の工程では、昆虫小胞および組み入まれた内因性タンパク質のマウスへの注射が、免疫応答を引き起こし得るかを調べた。第二に、昆虫小胞が、フロイントアジュバントを添加せずとも免疫応答を引き起こし得るかを調べた。
【００４８】
この目的のために、８匹の実験用マウスに、昆虫小胞、フロイントアジュバントおよびＰＢＳの異なる混合物を注射した（表１）。８匹の動物のうち７匹は、最終的な採血まで生存した。１回目の免疫の直前および２回目および最終の免疫１週間後、全ての動物から採血を行った。
【００４９】
表１：適用された免疫原の概要。すべての実験用マウスは、全容量１２０μｌの抗原溶液で免疫された。
【００５０】
【表１】
0006625528.tif 000002
【００５１】
免疫の前に、膜小胞を、次のように調製した：昆虫小胞を、１６．０００ｇ（１０分、４℃）の遠心分離工程によって、溶解物の可溶性画分から分離した。上清（ＳＮ）を廃棄し、得られた小胞フラクション（ＶＦ）を、２倍量のＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。第三の洗浄工程の後、ＶＦを、元の容量の昆虫溶解物に再懸濁した。この溶液を、ＰＢＳ緩衝液において、１：２に希釈した。この溶液の１２０μｌを、２匹の実験用マウス（ＢＡＬＢ／ｃの系統）の腹腔内免疫のために使用した。６匹の追加の実験用マウスに、以下の溶液を注射した：２匹の動物には、１２０μｌ  ＰＢＳ、２匹の動物には、ＰＢＳ中に再懸濁し、フロイントアジュバントと混合された（１：１の比）昆虫小胞、２匹の動物には、ＰＢＳ緩衝液とフロイントアジュバントとの混合物（１：１の比）を注射した。休眠期間の２週間後、第二の免疫（「ブースト」）を、第一のそれと同様に行った。第二の免疫の１週間後、生存していたすべての動物から採血した。得られた抗血清を、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【００５２】
（抗血清の分析）
得られたポリクローナルマウス抗血清を、ウェスタンブロットによって分析した。通常、ポリクローナル抗血清は、ＥＬＩＳＡよって分析され、これは、免疫化に使用された抗原がマイクロタイタープレート上にコーティングされている試験方法である。ここでは、抗原が、標準的な手順を使用して固定化することができない脂質−タンパク質−混合物を表すため、他のストラテジーを採用する。それゆえ、抗体と抗原との間の相互作用を、ウェスタンブロットによって分析した。
【００５３】
この目的のために、免疫に用いた抗原を、以下のように調製した：昆虫小胞を、前述の遠心分離により溶解物の細胞質画分から分離し、ＰＢＳ中で３回洗浄した。その後、ＳＮおよびＶＦをアセトン中で沈殿させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）、１０％ビス−トリスゲルＭＥＳ  ＳＤＳ緩衝液、ライフテクノロジーズ社）。
【００５４】
タンパク質を、半乾燥ブロット技術（セミドライブロッティング、ｉＢｌｏｔシステム、ライフテクノロジーズ社、プログラム３）を用いて、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ライフテクノロジーズ社）に移した。ブロッティング後、膜を室温で５分間、２５ｍｌのＴＢＳ緩衝液で被覆し、室温で１時間または４℃で一晩、２５ｍｌのブロッキング溶液（１×ロティブロック、ロス）においてインキュベーションした。。ブロッキング後、膜を１５ｍｌのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。その後、膜を、溶解物画分であるＳＮおよびＶＦを含む部分にスライスした。
【００５５】
膜スライスを、ブロッキング緩衝液において１：２０００に希釈された、異なるポリクローナルマウス抗血清を用いて室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、膜スライスを、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウス抗体（ＩｇＧにコンジュゲートされた抗マウス、ブロッキング緩衝液において１：１０００）とともにインキュベートした。ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、二次抗体を、化学発光検出試薬（ＥＣＬプラスウェスタンブロッティング検出試薬、ＧＥヘルスケア社）とともに膜スライスをインキュベーションすることで検出し、それは５分間インキュベートされた。放出された光を、ホスホイメージャーシステム（Ｔｙｈｏｏｍ  ＴＲＩＯ＋Ｉｍａｇｅｒ、ＧＥヘルスケア社）（発光最大４２５ｎｍ）を用いて検出した。
【００５６】
得られたウェスタンブロットを図２に示す：昆虫小胞でのマウスの免疫化前後に得られたマウスポリクローナル抗血清のウェスタンブロット分析。動物の免疫化は、１２０μｌのＰＢＳ（Ａ）、１２０μｌのＰＢＳ中の小胞（Ｂ）、フロイントアジュバントが補充された同様に１２０μｌのＰＢＳ中の小胞で行われた。免疫原Ａは、Ｂ）およびＣ）に対するコントロールを表し、免疫原Ｄは、Ｃ）に対するコントロールを表す。膜スライスを、ポリクローナルマウス血清（ブロッキング緩衝液において１：２０００で希釈）と共に室温で１時間インキュベートし、続いてＨＲＰ結合抗マウス抗体（ＩｇＧにコンジュゲートされた抗マウス、ブロッキング緩衝液において１：１０００）とともにインキュベーションした。Ｍ＝タンパク質マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）、Ｐｌｕｓ２、ライフテクノロジーズ社）である。Ｃ＝二次ＨＲＰ結合抗マウス抗体に対する特異性コントロールである。この膜スライスは、それがポリクローナルマウス血清とともにインキュベートされなかったことのみを除いて、他と同様に処理された。
【００５７】
免疫前に得られたマウス抗血清の適用は、２つの分析された溶解物画分ＳＮおよびＶＦにおける昆虫のタンパク質の特異的検出を可能にしなかった。単に、ＳＮ由来のタンパク質を有する二次抗体の非特異的な反応が、観察された（図２、レーンＣ、膜スライスをマウス血清とともにインキュベートせず、二次抗体とともにインキュベートした）。
【００５８】
ＳＮおよびＶＦ膜スライスの免疫後得られたマウス血清との共インキュベーションは、ＶＦにおける広い範囲の異なるタンパク質の検出をもたらしたが、ＳＮではみられなかった。これに関連して、昆虫小胞のフロイントアジュバントによる補充は、免疫反応の強度に正の効果を有してなかったことが観察された。
【００５９】
図２に示される結果は、埋め込まれた内因性タンパク質を有する昆虫小胞が、マウスにおいて十分な免疫反応を誘導することが可能であったことを示す。コントロールとして、２匹のマウスに、ＰＢＳおよびフロイントアジュバント単独で免役した。予想されたように、これらのマウスから得られた血清は、タンパク質の検出を可能にしなかった。
【００６０】
（実施例）
異種の標的タンパク質を回収する膜小胞でのマウス宿主の免疫化および抗血清の分析
【００６１】
（昆虫溶解物における膜タンパク質の無細胞合成）
本発明の主な目的は、迅速かつ効率的な態様において発現困難な膜タンパク質に対する抗体の産生を可能にする新しい方法を開発することであった。モデルタンパク質として、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の切断型変異体（ｖＩＩＩ−欠失）を選択した。この膜タンパク質、以下、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲと称する、は、特定の癌のサブタイプの発達に関与するタンパク質である全長のＥＧＦＲの永久的に活性的な変異体であるため、興味深い試験候補を表す。
【００６２】
昆虫小胞の膜における標的タンパク質の画分を増加させるために、５回の反復のタンパク質合成を、小胞の同じセットにおいて行った。１４Ｃ−ロイシンの存在下での無細胞タンパク質合成を以下のように行った：実験は、バッチ形式の翻訳反応とともに開始され（１．５時間、６００ｒｐｍ）、続いて、翻訳混合物（ＴＭ）の遠心分離（１６，０００ｇ、１０分間、４℃）およびＳＮおよびＶＦへの分離を行った。ＳＮを廃棄し、ＶＦを、新鮮な、小胞は含まないが標的核酸（ここではｍＲＮＡ）で補充された翻訳活性を有する溶解液中に再懸濁させた。この手順は、４回まで繰り返され、完全な５回の連続的なタンパク質の合成がもたらされた。この方法において、標的タンパク質であるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲは、手順全体を通して、同じセットの小胞内に移行された。
【００６３】
最初および最後の合成工程のＴＭ、ＳＮおよびＶＦから５μＬを取り、タンパク質収率、タンパク質のサイズおよび均質性に関して分析した。
【００６４】
図３：ＴＣＡ沈殿による無細胞で合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの分析、ならびにその後の液体シンチレーション計数およびオートラジオグラフィー。無細胞タンパク質の合成は、昆虫溶解物に基づく真核生物翻訳系を用いて、１４Ｃ−ロイシンの存在下で行った。遠心分離後の翻訳混合物（ＴＭ）、上清画分（ＳＮ）および小胞画分（ＶＦ）におけるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの分析を、１回の合成（１×合成）後および５回繰り返した合成（５×合成）後に行った。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲは、約９８ｋＤａの見かけの分子量（算出された分子量１０５ｋＤａ）を示す。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの非放射性サンプルを並行して調製し、免疫化のために適用した。
【００６５】
図３に示された結果は、５回の繰り返しの合成の後、ＶＦにおけるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲのタンパク質収量は、７．８μｇｍｌから２０．１μｇ／ｍｌ（免疫１）および６．７μｇ／ｍｌから１５．６μｇ／ｍｌ（免疫２）へと増加し、ＶＦにおける１回の合成から５回の合成ではＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの２．５倍の増加がもたらされたことを示す。１４Ｃ−ロイシンの存在下での合成に並行して、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの非放射性サンプルを調製した。昆虫小胞を５回の繰り返し合成後に採取し、上記のように処理した。含有される外因性標的タンパク質を有する昆虫小胞を、２匹の実験用マウスの免疫化に使用した。免疫手順は、前述のように行われた。
【００６６】
（昆虫小胞由来のＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの精製）
得られたポリクローナルマウス血清におけるＥＧＦＲ特異的抗体の存在を実証するために、ウェスタンブロットによる分析を行った。
【００６７】
その目的のために、抗原（無細胞で合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、その後、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。抗原であるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの無細胞合成を、１．５時間、５００ｒｐｍ、２７℃で、１回の合成工程で行った。その後、昆虫小胞を回収し、上記のようにＰＢＳで３回洗浄した。
【００６８】
また、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを、Ｈｉｓ−タグ精製によって、小胞から精製した。このために、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲのＤＮＡ鋳型を、Ｃ末端で結合されたＨｉｓタグを示して用いた。Ｃ末端にＨｉｓ−タグ（Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓ）を有するＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの精製を、以下に記載のように行った：Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの無細胞合成を、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲと同様の方法で１回の合成工程で行った。合成後、翻訳混合物を、溶解物画分のＳＮとＶＦとに分離した。
【００６９】
昆虫小胞由来の膜タンパク質を放出するために、ＶＦをマイルドな洗浄力を有するドデシルβ−Ｄ−マルトシド（ＤＤＭ）を１％含むＰＢＳにおいて再懸濁し、４℃で一晩インキュベートした。その後、溶液を遠心分離し（２０．０００ｇ、１時間、４℃）、可溶化された膜タンパク質を含有する上清を、ニッケル−ＮＴＡマトリックス上にアプライした。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの精製を、キアゲン（登録商標）のＮｉ−ＮＴＡ膜タンパク質キットを用いて、その使用説明書に従って行った。全ての異なる画分のサンプルを、一次抗体として市販の抗ＥＧＦＲ抗体（抗ＥＧＦ受容体Ｄ３８Ｂ１  ＸＰ、ウサギモノクローナル抗体、ブロッキング緩衝液において１：１０００）、および二次抗体としてＨＲＰ結合抗体（ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ、ブロッキング緩衝液において１：２０００）を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって分析した。抗原の検出を、化学発光検出試薬（ＥＣＬプラスウェスタンブロッティング検出試薬、ＧＥヘルスケア社）を用いて行った。
【００７０】
図４：Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−ＨｉｓのＨｉｓタグ精製。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの無細胞合成を、昆虫溶解物に基づく真核生物の翻訳系を用いて行った。
Ａ）ゲル電気泳動後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色。
Ｂ）一次抗体として市販の抗ＥＧＦ受容体抗体（抗ＥＧＦレセプターＤ３８Ｂ１  ＸＰ、ウサギモノクローナル抗体、ブロッキング緩衝液において１：１０００）、および二次抗体としてＨＲＰ結合抗ウサギ抗体（ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ、ブロッキング緩衝液において１：２０００）を用いたウェスタンブロットによるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの検出。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓは、約９８ｋＤａの見かけの分子量を示す（分子量１０５ｋＤａと算出される）。マーカー＝タンパク質マーカー  ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２、ライフテクノロジーズ社。
【００７１】
図４に示されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色は、天然の翻訳混合物（ＴＭ）に比べて、溶出画分１〜５において内因性の溶解物タンパク質の良好な減少を示す。標的タンパク質であるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓは、洗浄画分２ならびに溶出画分１および２を除いて、全ての試験された画分に検出された。
【００７２】
（Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲでの免疫化後のポリクローナルマウス血清の分析）
次の工程において、新たに合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを含む昆虫小胞によるマウスの免疫化後に得られたポリクローナルマウス血清を、ウェスタンブロットで、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの検出のために試験した。その目的のために、３つの異なる抗原を調製した：（ｉ）未処理の昆虫小胞、（ｉｉ）無細胞合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを含む昆虫小胞、および（ｉｉｉ）精製されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓ。抗原を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした。ウェスタンブロットの膜スライスを、異なる３つのタイプのマウス血清とインキュベートした：（ａ）免疫前に得られたマウス血清（ネガティブコントロール）、（ｂ）外因性膜タンパク質無しの昆虫小胞単独での免疫後に得られたマウス血清、および（ｃ）無細胞合成され、膜に埋め込まれたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを含む昆虫小胞での免疫後に得られた血清。
【００７３】
対応する結果を、図５および表２に示す。
【００７４】
図５：新たに合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを含む昆虫小胞でのマウスの免疫化前後に得られたマウスポリクローナル抗血清のウェスタンブロットの分析。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ無しの昆虫小胞および外因性の無細胞合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ（「ＥＧＦＲ」）を有する昆虫小胞を、アセトンで沈殿させ、包埋されたタンパク質−外因性標的タンパク質と同様に内因性タンパク質−を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。また、無細胞合成され、精製されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓ（「ＥＧＦＲ−Ｈｉｓ」）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにアプライした。セミドライウェスタンブロットによるＰＶＤＦ膜上のタンパク質の正常な転写後、膜スライスをポリクローナルマウス抗血清と共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰ結合抗マウス抗体とのインキュベーションを行った（抗マウスコンジュゲートＩｇＧ、ブロッキング緩衝液において１：１０００）。矢印は、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓを検出したことを示す。Ｍ＝タンパク質マーカー（ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）、Ｐｌｕｓ２、ライフテクノロジーズ社）。
【００７５】
表２：ウェスタンブロットによって分析されたポリクローナルマウス抗血清の性能に関する概要。異なる抗原（未処理の昆虫小胞、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦおよび精製されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦ−Ｈｉｓを含む昆虫小胞）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜上にブロットした（セミドライブロッティング法）。昆虫小胞単独または包埋されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを有する昆虫小胞による免疫後に得られたマウス抗血清を、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓの各々の検出のために使用した。マイナス（−）＝反応無し。プラス（＋）＝タンパク質の検出。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
予想されたように、免疫前に得られたマウス血清の適用は、タンパク質バンドの検出をもたらさなかった。これとは対照的に、昆虫小胞で免疫した後に得られたマウス抗血清は、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ無しおよびＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ有りでブロットされた昆虫小胞を有するレーンにおいて、多くの異なるサイズのタンパク質の検出をもたらした。この観察結果は、昆虫小胞が、実験動物において免疫反応を潜在的に誘導することのできる多くの異なる内在性膜タンパク質を含有するという予想に従う。昆虫小胞および含まれるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲで免疫した後に得られたマウス血清の使用は、同様の検出パターンをもたらした。予想されたように、精製されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲは、昆虫小胞および含まれるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲで免疫した後に得られたマウス血清を用いることのみによって検出された。この観察結果は、ポリクローナルマウス血清の使用（無細胞合成されたＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲを含む昆虫小胞での免疫）によるＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの特異的検出の仮定をサポートする。
【００７８】
ポリクローナルマウス抗血清の使用に加えて、市販の抗ＥＧＦＲ抗体が、得られた結果を検証するために、Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲの正常なブロッティングを示すように使用された。
【００７９】
その目的のために、一次および二次抗体を、過酷な緩衝液条件下での処理によってＰＶＤＦ膜から除去した（「膜ストリッピング」）。ストリッピングの後、続いて、膜を、一次抗体として市販の抗ＥＧＦＲ抗体（抗ＥＧＦ受容体Ｄ３８Ｂ１  ＸＰ、ウサギモノクローナル抗体、ブロッキング緩衝液において１：１０００）、および二次抗体としてＨＲＰ結合抗体（ＨＲＰコンジュゲート抗ウサギＩｇＧ、ブロッキング緩衝液において１：２０００）とともにインキュベートした。Ｍｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲおよびＭｅｌ−ｔｒｕｎｃ−ＥＧＦＲ−Ｈｉｓは、分析された膜ストライプにおける無細胞合成されたタンパク質の存在を示す明確なタンパク質バンドとして検出された。
【００８０】
（付記）
（付記１）
抗原性標的タンパク質に対するポリクローナル抗体を産生するための方法であって、
宿主に前記抗原性標的タンパク質を組み込んだ膜小胞を含む免疫原性組成物を適用することによって、前記宿主において免疫応答を誘導することと、前記宿主由来の前記標的タンパク質に対する抗体を得ることと、を含む方法。
【００８１】
（付記２）
少なくとも下記の工程、
ａ）前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体におけるインビトロ翻訳反応によって前記標的タンパク質を合成する工程と、
ｂ）前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を、前記媒体から分離する工程と、
ｃ）生理学的に適合可能な媒体において、前記合成された標的タンパク質を含む前記膜小胞を提供する工程と、
ｄ）工程ｃ）の前記膜小胞を、宿主に適用する工程と、
ｅ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答に対して、前記宿主の血清サンプルを試験する工程と、
ｆ）前記標的タンパク質に対する特異的免疫応答を示す宿主の血清から、前記標的タンパク質に対する特異的抗体を得る工程と、
を含む付記１に記載の方法。
【００８２】
（付記３）
前記細胞溶解物は、真核細胞溶解物である、
ことを特徴とする付記２に記載の方法。
【００８３】
（付記４）
前記細胞溶解物は、コムギ胚芽溶解物と、昆虫細胞溶解物、特に、Ｓｆ２ｌ細胞溶解物と、網状赤血球溶解物と、ケラチノサイト溶解物と、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞、ハイブリドーマ細胞又は培養リンパ腫細胞からの細胞抽出物と、を含む群から選択される、
ことを特徴とする付記３に記載の方法。
【００８４】
（付記５）
前記膜小胞および前記細胞溶解物は、同じ細胞株由来である、
ことを特徴とする付記２乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【００８５】
（付記６）
前記合成された標的タンパク質を含む前記膜小胞は、遠心分離によって前記媒体から分離される、
ことを特徴とする付記２乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【００８６】
（付記７）
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、前記膜小胞において前記合成されたタンパク質の濃縮を促進する条件下で成立する、
ことを特徴とする付記２乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【００８７】
（付記８）
付記２に記載の工程ｂ）の後に、前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有しない細胞溶解物と、を含む第二の反応媒体に、前記分離された膜小胞を移すことと、前記第二の反応媒体においてインビトロ翻訳反応を行うことと、前記第二の反応媒体から、増加した量の前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離することと、を含む付加的な工程ｂ’）をさらに含み、
工程ｂ’）は、１回又は複数回繰り返され得る、
ことを特徴とする付記７に記載の方法。
【００８８】
（付記９）
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、前記翻訳反応の過程における反応物または生成物の添加および／または排出を含む連続的な透析に基づく方法によって行われる、
ことを特徴とする付記７に記載の方法。
【００８９】
（付記１０）
工程ａ）におけるインビトロ翻訳反応は、カスパーゼ阻害剤の存在下で行われる、
ことを特徴とする付記９に記載の方法。
【００９０】
（付記１１）
前記宿主に適用されたタンパク質含有膜小胞を有する前記免疫原性組成物は、任意の追加の免疫賦活アジュバントを含まない、
ことを特徴とする付記１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【００９１】
（付記１２）
前記宿主は、非ヒト哺乳動物である、
ことを特徴とする付記１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【００９２】
（付記１３）
膜小胞調製の小胞において標的タンパク質を蓄積するための方法であって、
少なくとも下記の工程、
ａ）前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有する細胞溶解物と、を含む反応媒体におけるインビトロ翻訳反応によって前記標的タンパク質を合成する工程と、
ｂ）前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を、前記媒体から分離する工程と、
ｃ）前記標的タンパク質をコードする核酸鋳型と、膜小胞を含有しない細胞溶解物と、を含む第二の反応媒体に、前記分離された膜小胞を移し、前記第二の反応媒体においてインビトロ翻訳反応を行い、および前記第二の反応媒体から、増加した量の前記合成された標的タンパク質を含む膜小胞を分離する工程と、
を含み、
工程ｃ）は、１回又は複数回繰り返され得る、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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