(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡウイルスに対するワクチンを製造する方法であって、
ａ）ＢＡＣ（細菌人工染色体）がトランスフェクトされる細菌宿主を提供するステップを備え、前記ＢＡＣは、
−細菌細胞ごとに１０より大きい数のコピーに前記ＢＡＣを増幅させるための誘導性細菌ｏｒｉ配列と、
−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写および転写されたＲＮＡから感染性ウイルスＲＮＡへのプロセシングのためのシス調節因子とを含むウイルス発現カセットとを含み、方法はさらに、
ｂ）前記誘導性ｏｒｉを活性化させる化合物を加えることによって前記ＢＡＣを増幅させるステップと、
ｃ）前記増幅されたＢＡＣを単離するステップと、
ｄ）前記ＢＡＣをワクチンに形成するステップとを備える、方法。
【請求項２】
弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムの前記ｃＤＮＡは、ＲＮＡウイルスゲノムのキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物であり、異種のＤＮＡ塩基配列が挿入される、または生来ウイルス配列が削除、短縮、もしくは変異される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス発現カセットは、
正鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡと、
前記ｃＤＮＡの転写を開始するための前記ｃＤＮＡの５′末端に先行するＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターと、
設定位置における前記ウイルスｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物を開裂するための前記ｃＤＮＡの３′末端に続く自己開裂用要素とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記正鎖ＲＮＡウイルスは、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペスチウイルス、トガウイルス、ピコルナウイルス、コロナウイルス、ヘペウイルス、およびカリチウイルスから構成されるグループから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルス発現カセットは、黄熱ウイルスのｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス発現カセットは、負鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、またはアンビセンスＲＮＡウイルスのグループに属するウイルスのｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌人工染色体は、酵母と細菌宿主との間を往復するための酵母自己複製配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス発現カセットは、弱毒化ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含み、ビリオン表面蛋白質のためのｃＤＮＡコードのうちの１つ以上が欠失、短縮、または変異され、ＹＦＶ−１７Ｄのこのような機能的ビリオン表面蛋白質が発現されず、異種の蛋白質についてのｃＤＮＡ配列コードがＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡに挿入される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種の蛋白質は、フラビウイルスのビリオン表面蛋白質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルス発現カセットは、弱毒化ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含み、１つ以上の外部のｃＤＮＡ配列が、１つ以上の異種の蛋白質として発現されるように挿入される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス発現カセットは、異種のＤＮＡ配列が挿入されるウイルスｃＤＮＡを含み、前記異種のＤＮＡ配列が異種に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＡＣを含むワクチンであって、前記ＢＡＣは、
−細菌細胞ごとに１０より大きい数のコピーに前記ＢＡＣを増幅させるための誘導性細菌ｏｒｉ配列と、
−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写および転写されたＲＮＡから感染性ウイルスＲＮＡへのプロセシングのためのシス調節因子とを含むウイルス発現カセットとを備える、ワクチン。
【請求項１４】
ＲＮＡウイルス感染の予防のためのワクチンであって、ＢＡＣを含み、前記ＢＡＣは、
−細菌細胞ごとに１０より大きい数のコピーに前記ＢＡＣを増幅させるための誘導性細菌ｏｒｉ配列と、
−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセット、または 
−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写および転写されたＲＮＡから感染性ウイルスＲＮＡへのプロセシングのためのシス調節因子とを含むウイルス発現カセットとを備える、ワクチン。
【請求項１５】
ＲＮＡウイルス感染の予防のためのＤＮＡワクチンである、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
生来もしくは組み換えＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡの維持、および前記ｃＤＮＡからの生来もしくは組み換えウイルスの増殖のための方法であって、方法は細菌宿主においてＢＡＣを増殖させるステップを備え、前記ＢＡＣは、
−細菌細胞ごとに１０より大きい数のコピーに前記ＢＡＣを増幅させるための誘導性細菌ｏｒｉ配列と、 
−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写および転写されたＲＮＡから感染性ウイルスＲＮＡへのプロセシングのためのシス調節因子とを含むウイルス発現カセットとを備える、方法。
【請求項１７】
ワクチンの製造のための細菌人工染色体（ＢＡＣ）であって、前記ＢＡＣは、
−細菌細胞ごとに１０より大きい数のコピーに前記ＢＡＣを増幅させるための誘導性細菌ｏｒｉ配列と、 
−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写および転写されたＲＮＡから感染性ウイルスＲＮＡへのプロセシングのためのシス調節因子とを含むウイルス発現カセットとを備える、細菌人工染色体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＲＮＡウイルスゲノムの感染性ｃＤＮＡの操作、維持、および繁殖に適したプラスミドベクター系、ならびにこのようなベクター系の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景 
以前は、いくつかのフラビウイルスおよび他のＲＮＡウイルスのコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が異なる低コピー細菌ベクターにおいてクローン化され、内部毒性が克服されてきた（ウイルス配列の大型かつ潜在発現による）（Bredenbeek et al.(2003) J. Gen. Virol. 84, 1261-1268；Durbin et al.(2006) Hum Vaccin. 2, 255- 260；Fan and Bird (2008) J. Virol. Methods. 149, 309-315；Li et al. (2011) PLoS One 6, el8197; Pu et al. (2011) J. Virol. 85, 2927-2941； Rice et al. (1989) New Biol. 1, 285-296）Almazan et al. (2008) Methods Mol Biol. 454, 275-91）。クローン化されたｃＤＮＡは、ＲＮＡゲノムのインビトロ合成およびトランスフェクション（Bredenbeek et al. (2003)上記）、またはウイルスｃＤＮＡへの発現カセットの組み込みによる、感染性組み換えウイルスの産生のための鋳型として使用されてきた。発現カセットは、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡからウイルスＲＮＡを転写させるＣＭＶ−ＩＥ（サイトメガロウイルス最初期）プロモーターなどのプロモーターを含む（Enjuanes et al. (2001) J. Biotechnol. 88, 183- 204；Hall et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 10460-10464）。弱毒化された口蹄疫（Ward et al. (1997) J. Virol. 71, 7442-7447）およびクンジンウイルス（Hall et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100, 10460-10464）を発現させるこのようなウイルス発現カセットは、実験的なＤＮＡワクチンとして使用されてきた。ウイルス発現カセットを含む低コピー数ベクター系は安定した態様で細菌宿主細胞内に維持され得るが、これらには、単に小規模な実験的使用に十分な量の感染性ウイルスｃＤＮＡを精製するのみであるという重大な欠点がある。このため、たとえば生体ｃＤＮＡワクチンの製造にそれらを感染性ウイルスｃＤＮＡの定常的なソースとして使用することは不可能である。
【０００３】
ウイルスＤＮＡワクチンの製造には、クローニングベクターを実質的に増幅させて十分なＤＮＡを得る必要があるが、これらの増幅方法は厳しい制約の対象となっている。変異を避けるために、変異を起こし得る事象（組み換え、変異、ミスマッチ修復の向上など）を防止する条件下において、ウイルスＤＮＡを含むベクターが増殖される。細菌人工染色体（ＢＡＣ）は、その安定性が知られており、５００ｋｂ以上に至る挿入断片を含み得る。
【０００４】
しかしながら、外来性ＤＮＡを有するこのようなベクターのサイズは、バクテリアにとって深刻な負荷であり、その複製には実質的な代謝努力が必要である。さらに、ヌクレオチドの消耗により、変異が増加し得る。最後に、望まれない外来性ＤＮＡの発現（いわゆる潜在発現）が起こり得て、毒性の組み換え型蛋白質が生じ得る。潜在転写による毒性蛋白質の産生は、フラビウイルスＤＮＡに固有であり、プラスミドのコピー数を小さくすることによってのみ解決することができる。実際、ベクターのコピー数が大きければ、毒性蛋白質の濃度が高くなる。結果として、細菌宿主はこれらの蛋白質は発現しない変異体を対抗選択し得る。
【０００５】
Pu et al. (2011) J. Virol. 85, 2927-2941は、細菌におけるフラビウイルスの内因性の毒性を解決するためのさまざまな試みについて詳細に記載している。これらは、ウイルスゲノム、特定の宿主、変異体の一部を含むプラスミドのインビボの連結反応を含み、潜在発現および低コピー数プラスミドを回避する。
【０００６】
細菌内において単一のコピーとして生じるＢＡＣの使用は、これらの問題に対する解決策を提供する。
【０００７】
ＢＡＣ ＤＮＡが後にサブクローン化または増殖されて濃度を高める施用、および想定される実験においてこれらの技術によって一部の変異を導くことが危険でない施用については、低コピー数は欠点ではない。しかしながら、このような増幅方法は、ＤＮＡワクチンの製造に適用することができず、ＤＮＡワクチンのための大規模なプラスミド製造においてＢＡＣが好ましくないビヒクルとなる。大量のＢＡＣを得るためには、非常に大規模な培養が必要となる。
【０００８】
誘導性ＢＡＣベクターの使用が、Wild et al. (2002) Genome Res.12, 1434-1444から知られており、ＢＡＣのコピー数が細胞あたり１コピーから細胞あたり１００コピーもしくはそれ以上に増加する。この系は、ＢＡＣ ＤＮＡの収率を増加させる方法を提供するものであるが、誘導により複製系の活動が大きく増加すると変異頻度が高まるという正当な懸念がある。したがって、ＤＮＡワクチンの製造には、大きなベクターのコピー数が得られるが変異の耐え難い導入なくしてベクターの複製が行なわれる系が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要 
本発明は、低コピー数で宿主細胞内に安定して維持され得るが望まれない変異誘発事象なくして宿主の培養条件を変更することで大きく増幅され得る、ベクターを提供することによって、先行技術のベクター系におけるワクチンの製造のためのウイルス性ｃＤＮＡの増幅の問題を解決するものである。本発明のさらなる目的は、イースト菌および細菌宿主の両方に対して往復され得るベクターを提供し、酵母および細菌の両方の遺伝子系においてベクターを操作することが可能な非常に用途の広い系を提供することにある。
【００１０】
本発明は、期待されるものに対して、ＢＡＣベクターのコピー数の誘導性増加によって驚くほど低い変異率を有するＤＮＡが提供されることを示す。さらに驚くべきことに、生じる少ない変異は大部分がフレームシフト変異または停止コドンであり、発現時には短縮（truncated）バージョンとなる。効果の無い、またはアミノ酸の変形を生じる点変異は、提示が不足している。
【００１１】
この予期しなかった効果により、大量のベクターが得られるとともに、生じる限られた量の誤差によって元のクローン化された構築物と比較して毒性が高まる変異のウイルスゲノムではなく機能を持たないウイルスゲノムに至るという有利な結果につながる。
【００１２】
本発明は、誘導性細菌ｏｒｉ配列を備える細菌人工染色体を提供し、誘導性細菌ｏｒｉ配列は、たとえば細菌宿主の培養条件を変更することによって大きなコピー数への細菌人工染色体の増幅を誘導することを可能にする。ここで使用される細菌人工染色体は、シス調節因子に隣接するＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットをさらに備え、シス調節因子は、哺乳動物細胞に細菌人工染色体を導入すると、ウイルス性ｃＤＮＡの転写を促進し、転写されたＲＮＡを感染性ウイルスＲＮＡにするプロセシングを可能にする。ウイルス発現カセットに含まれるウイルスｃＤＮＡは、野生型ＲＮＡウイルスゲノムのものに対応し得る、またはキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物となり得て、異種ＤＮＡ塩基配列が挿入される、および／または生来ウイルス配列が欠失、短縮、もしくは変異する。典型的に、異種ＤＮＡ塩基配列は１つ以上のペプチド／蛋白質をコードし、これらはこのようなキメラ型ウイルスｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む本発明に係る細菌人工染色体を哺乳動物細胞に導入した後に組み換えウイルスによって異種に発現される。細菌人工染色体は、酵母内において細菌人工染色体に対して往復するとともに細菌人工染色体を維持する酵母自己複製配列をさらに備える。酵母内において本発明に係る細菌人工染色体に対して往復するとともに細菌人工染色体を維持する可能性により、酵母および細菌遺伝子系の両方において遺伝子操作が可能となるという利点が提供される。このため、本発明は、ＲＮＡウイルスゲノムの感染性ｃＤＮＡの操作、維持、および繁殖に適した単一ベクター系を提供する。誘導可能ｏｒｉの刺激がない場合、本発明に係る細菌人工染色体は、細菌宿主における感染性ウイルスｃＤＮＡの記録および安定したクローン化のために使用され得て、このような刺激がある場合には、ｃＤＮＡは容易に増幅され、その後に使用のために単離される。本発明に係る細菌人工染色体は、ＲＮＡウイルス性病原体に対する生ワクチンとして使用されるウイルスｃＤＮＡの開発、安定維持、および産生において特に有用である。代替的に、細菌人工染色体は、たとえば研究目的のために、ｃＤＮＡからの生来もしくは組み換えウイルスの維持および増殖に使用される。
【００１３】
本発明において、誘導性細菌ｏｒｉを有するＢＡＣは、ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡと哺乳動物細部におけるウイルスｃＤＮＡの転写および転写されたＲＮＡを感染性ウイルスＲＮＡにするプロセシングのためのシス調節因子とを含むウイルス発現カセットのワクチンを製造するために使用される。
【００１４】
驚くべきことに、ウイルスＤＮＡを含むＢＡＣの複数のコピーの産生は、大きなコピー数の系によって引き起こされるものとして知られる欠点にはつながらない。
【００１５】
概して、毒性蛋白質は、ウイルス配列の潜在発現によって細菌系において生産される。実際に、フラビウイルス感染クローンの産生は、細菌における全長ｃＤＮＡの毒性によって従来より妨げられてきた。この課題を克服するためにさまざまな手法が採用されており、この手法には、非常に小さいコピー数のプラスミドおよび細菌人工染色体の使用が含まれる（Edmonds (2013) J. Virol. 87, 2367-2372において論じられている）。これは、ＢＡＣ内にクローン化される挿入断片に関連し、細菌の成長および代謝を妨げる現象である。潜在発現が行なわれない変異体を有する細菌は、増殖の利点があり、元の個体群を過度に成長させる。先行技術においては、これは細菌コロニーのサイズによって反映される。変異の生じていない構築物は、毒性蛋白質を生成し、典型的に小さいコロニーが得られる。変異構築物は、より少ない毒性蛋白質を生成する、または毒性蛋白質を生成せず、より大きなコロニーが生じる結果となる。
【００１６】
この先行技術の知識に基づき、プラスミド複製の導入によって毒性の転写が増加すること、および潜在発現が行なわれない変異体が同時に増加することが予期された。
【００１７】
驚くべきことに、誘導複製系は潜在蛋白質の毒性に対して無反応であるように思われる。実際に、先行技術における大きなコピー数の系と比較すると、細菌コロニーはいくぶん大きく、最終的な毒性蛋白質に対して細菌宿主の反応が小さいことを示している。より重要なことに、変異プラスミドを表わす非常に大きいコロニーには遭遇しなかった。
【００１８】
誘導系が毒性蛋白質に対して無反応であるという発見は、予期されていなかった。この系が毒性蛋白質に対して反応しない（または恐らく毒性蛋白質が生成されない）ことは先行技術には示されていなかった。
【００１９】
誘導系のさらなる欠点は、ＢＡＣの複数コピーの産生に固有である。実際に、誘導系の命名者は、ＢＡＣクローンの最も重要な特徴は、その小さいコピー数から生じる安定性であると説明している。上で参照したWild et al. (2002)は、ブドウ糖を加えることによってコピー数がさらに低下し得ることを示した。この単一のコピー状態は、クローン間の細胞組み換えの機会を減少させることによってＢＡＣライブラリーの維持の安定性を向上させる。これは、Wild et al.によって公開された誘導系が、宿主細胞内にＢＡＣの複数コピーが存在するとすぐに引き起こされる望ましくない組み換え事象の変化を低下させないことを示している。誘導およびそれに続く大きなコピー数は組み換え事象を再び誘導することが当業者によって理解される。従って、当業者は、ワクチン接種を目的とした使用が意図されるＤＮＡ製造にこのような系を使用することを差し控え得る。
【００２０】
本発明において、ＢＡＣは誘導ｏｒｉ系において増幅され、増幅されたＢＡＣは組み替え事象について試験される。予期されるものとは対照的に、組み換え事象は稀である。
【００２１】
さらに、組み換え事象についての試験とは別に、増幅されたＢＡＣは、他の変異の存在についても試験された。遭遇した変異頻度は非常に低く、さらに、ミスセンスの割合は理論上予期されたものよりも驚くほど低かった。変異は、生じている場合、主にナンセンスである、または機能を持たないウイルスＲＮＡにつながるフレームシフト変異である。
【００２２】
本発明は、かなり大規模のＤＮＡワクチン生産を可能にする。たとえば、現時点において弱毒化黄熱ワクチンの主な製造者は、既存の需要を満たすことができない。本発明の技術を用いることにより、現在の弱毒化ワクチンをより大幅に低いコストおよび高い品質でＤＮＡワクチンを製造することが可能となり、長年の要望を達成することができる。
【００２３】
ＪＥＶ、ＷＮＶ、嚢虫症、風疹、およびＨＩＶワクチンなどの他のウイルス症についても、十分な量のＤＮＡを提供することができるワクチン製造プラットフォームが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の第１の局面は、ワクチンの製造のための細菌人工染色体（ＢＡＣ）の使用に関し、ＢＡＣは、−細菌細胞ごとに１０より大きい数のコピーに前記ＢＡＣを増幅させるための誘導性細菌ｏｒｉ配列と、−弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むとともに、哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写および感染性ＲＮＡウイルスへの転写されたＲＮＡのプロセシングのためのシス調節因子を含むウイルス発現カセットとを含む。
【００２５】
弱毒化ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡの実施形態は、ＲＮＡウイルスゲノムのキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物であり、異種のＤＮＡ塩基配列が挿入される、または生来ウイルス配列が欠失、短縮、もしくは変異される。
【００２６】
ウイルス発現カセットの実施形態は、
−正鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡと、
−前記ｃＤＮＡの転写を開始するための前記ｃＤＮＡの５′末端に先行するＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターと、
−設定位置における前記ウイルスｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物を開裂するための前記ｃＤＮＡの３′末端に続くＲＮＡ自己開裂用要素とを含む。
【００２７】
正鎖ＲＮＡウイルスの実施形態は、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペスチウイルス、トガウイルス、ピコルナウイルス、コロナウイルス、ヘペウイルス、カリチウイルスである。
【００２８】
典型的な実施形態において、ウイルス発現カセットは、たとえば弱毒化ＹＦＶ−１７Ｄ黄熱ウイルスワクチンのｃＤＮＡなど、黄熱ウイルスのｃＤＮＡを含む。
【００２９】
他の実施形態において、ウイルス発現カセットは、負鎖ＲＮＡウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルス、またはアンビセンスＲＮＡウイルスのグループに属するウイルスのｃＤＮＡを含む。
【００３０】
特定の実施形態において、細菌人工染色体は、酵母において前記細菌人工染色体に対して往復するまたはこれを維持するための酵母自己複製配列をさらに含む。
【００３１】
酵母ｏｒｉ配列の例は、２μプラスミド起点またはＡＲＳ１（自己複製配列１）またはその機能的に同種の誘導体である。
【００３２】
特定の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーター、シミアンウイルス４０プロモーター、またはその機能的に同種の誘導体など、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターである。
【００３３】
他の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩもしくはＩＩＩプロモーターである。
【００３４】
自己開裂用要素の例は、デルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイムのｃＤＮＡまたは機能的に同種のＲＮＡ要素である。
【００３５】
特定の実施形態において、ウイルス発現カセットは、弱毒化ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含み、ビリオン表面蛋白質のためのｃＤＮＡコードのうちの１つ以上は、ＹＦＶ−１７Ｄのこのような機能的ビリオン表面蛋白質が発現しないように欠失、短縮、または変異され、異種の蛋白質のためのｃＤＮＡ配列コードは、ＹＦＶ−１７ＤｃＤＮＡに挿入される。このような異種の蛋白質の例は、フラビウイルスのビリオン表面蛋白質である。
【００３６】
ウイルス発現カセットの実施形態は、弱毒化ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含み、１つ以上の無関係のｃＤＮＡ配列は、ウイルス性ポリ蛋白質内で１つ以上の異種の蛋白質として発現されるように挿入される。
【００３７】
他の実施形態において、ウイルス発現カセットはウイルスｃＤＮＡを含み、外部ｃＤＮＡ配列が前記組み換えウイルスによって異種で発現するように挿入される。
【００３８】
さらなる局面は、ＲＮＡウイルスに対するウイルスを製造する方法に関し、方法は、ａ）第１の局面およびさまざまな実施形態において記載されるＢＡＣでトランスフェクトされた細菌宿主を提供するステップと、ｂ）誘導性ｏｒｉを活性化させる化合物を加えることによってＢＡＣを増幅させるステップと、ｃ）増幅されたＢＡＣを単離するステップと、ｄ）ＢＡＣをワクチンするステップとを含む。
【００３９】
さらなる局面は、ワクチンとして使用される第１の局面およびそのさまざまな実施形態に記載されるＢＡＣに関する。
【００４０】
本発明の他の局面は、ＲＮＡウイルス感染の予防に使用される第１の局面およびそのさまざまな実施形態に記載されるＢＡＣに関する。
【００４１】
さらなる局面は、生ＤＮＡワクチンとしての第１の局面およびそのさまざまな実施形態に記載されるＢＡＣの使用に関する。
【００４２】
他の局面は、前記ｃＤＮＡからの生来もしくは組み換えウイルスの増殖のための第１の局面およびそのさまざまな実施形態に記載されるＢＡＣの使用に関する。
【００４３】
さらなる局面は、ワクチンの製造のための第１の局面およびそのさまざまな実施形態に記載されるＢＡＣとしての細菌人工染色体（ＢＡＣ）に関する。
【００４４】
発明の詳細な説明
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＲＮＡウイルス発現プラスミドのｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣシリーズの産生を示す。（Ａ）図は、ベクター構築物が開始するときのｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅの構築物を示す。（Ｂ）図は、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０ｐ）とＨＤＶリボザイム（ＨＤｒｚ）との相同組み換えによるウイルスｃＤＮＡの挿入によるｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅ由来のフラビウイルス性発現ベクターの構造を示す。
【図２】図２は、大腸菌におけるｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣの向上したプラスミド安定性を示す。総括的プラスミドマップは、先行技術のフラビウイルスｃＤＮＡプラスミド（Ａ）および新しいベクターのｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣシリーズ（Ｂ，ＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）の原理レイアウトを示す。大腸菌の形質転換により、各（Ａ）および（Ｂ）の単一コロニーは３７℃で一夜で成長して選択培地で平板培養される。概してタイプＡの構築物はタイプＢのコロニーサイズのようにかなり小さいコロニーサイズに成長する（それぞれ図２ＣおよびＤ）。さらに、タイプＡの構築物は、広範囲のコロニーサイズの後代を生じさせ（平均化されたコロニー直径についてのヒストグラム、図２Ｃの右側）、大腸菌に対するｃＤＮＡの毒性を弱める変異体プラスミドクローンの選択および分離を示す。クローン分析により、ウイルスE/NS1領域へのトランスポゾン挿入を含む、複数の可能な内在する変異が識別された。対照的に、ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣシリーズのタイプＢの構築物を含むプラスミドクローンは、高い遺伝子安定性を示す大腸菌における繰り返しの通過後であっても、分離せず、同種のコロニーサイズを示す。
【図３】図３Ａは、ノーザン法によるｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（野性型、ＷＴ）およびその複製欠陥性ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤΔＧＤＤ（ΔＧＤＤ）へのＶｅｒｏ−Ｂ細胞のトランスフェクション後のＹＦＶ−１７Ｄ ＲＮＡ複製の複製中間体の検出を示す。アンチセンス適応アンチゲノム（−）−ＲＮＡ（上方パネル、１１ｋｂ）、およびセンス適応ウイルス-ゲノム（＋）−ＲＮＡ（下方パネル、１１ｋｂ）は、野生型のトランスフェクトされた細胞のみにおけるトランスフェクションの５日後に検出される。ＤＮＡ指向性ＲＮＡ合成の抑制因子であるアクチノマイシンＤ（ＡＣＤ）がある場合における進行中の複製は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤからのＹＦＶ−１７Ｄゲノム転写の最初の開始後にウイルス複製がプラスミドとは独立した態様で自律的に継続されることを確認する。図３Ｂは、５′および３′ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の急速増幅）による適切なＹＦＶ−１７Ｄ ＲＮＡ転写産物プロセシングの検出を示す。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄは、発生期のＹＦＶ−７Ｄ ＲＮＡ（図３Ｂにおいて太字）の転写を開始し、これは、ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）によって確認されたように適切な５′および３′末端（それぞれ、上方および下方パネル）で開始および終了する。
【図４】図４Ａから図４Ｃは、異なる起点のＹＦＶ−１７Ｄによって誘導される同様のＣＰＥを示す。鋳型としてｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩを使用してインビトロで転写およびキャッピングされたＲＮＡに由来する（Ａ）、またはｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤのプラスミドＤＮＡトランスフェクション後に採取された（Ｂ）ＹＦＶ−１７Ｄウイルスは、感染から５日後（ｄ ｐ.ｉ）にＢＨＫ−２１細胞に対する同一のウイルス誘導細胞変性効果（ＣＰＥ）をもたらす。Ｃは比較のための非感染細胞である。図４Ｄから図４Ｅは、異なる起点のＹＦＶ−１７Ｄの同様の溶菌プラーク表現型を示す。鋳型としてｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩを使用してインビトロで転写およびキャッピングされたＲＮＡに由来するＹＦＶ−１７Ｄウイルス（Ｄ）、またはｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤのプラスミドＤＮＡトランスフェクション後に採取された（Ｅ）は、ＢＨＫ−２１細胞に対して同等の数（感染から５日後に３×１０５溶菌プラーク形成単位（ｐｆｕ）ｍＬ−１対２×１０５ｐｆｕ ｍＬ−１）および同一のプラークの形態（ｔ検定により直径６，４±０，７ｍＭ対６，１±１，１ｍＭ；ｎ＝８，ｐ値＝０，６ｔ）をもたらす。
【図５】図５は、免疫蛍光測定法（ＩＦＡ）による感染組み換えＤＥＮＶ２の検出を示す。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＤＶ２でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞によって産生された組み換えＤＥＮＶ２ ＮＧＣは、Ｖｅｒｏ−Ｂ細胞の用量依存的な感染を示し、感染から５日後のウイルスＥ蛋白質について蛍光抗体法によるウイルス焦点として視覚化される（Ａは純粋な上澄み、Ｂは１００倍に薄めた浮遊物、Ｃは非感染細胞制御）。
【図６】図６は、スタマリルに感染した（白抜きの正方形）、またはｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄがトランスフェクトされた（十字）ＡＧ１２９マウスの生存を示す。腹腔内投与後の約１０日から１２日において、インターフェロンタイプＩおよびＩＩレセプタ欠損（ＡＧ１２９）マウスは、体重が落ち始め、一様な症状の集合、すなわち毛の波打ち、震え、および弛緩性の後脚麻痺が生じる。複製欠損ＮＳ５ΔＧＤＤプラスミド変種（ΔＧＤＤ、白抜きの円）でトランスフェクトされた対照動物は、病理発生を示さない。しかしながら、最初のトランスフェクション後２０日における第２のスタマリル（登録商標）投与（黒塗りの三角形）を受け、同様の時間枠内に死亡し、同様の症状を示した。プラスミドＤＮＡは、キャリアとしての３３％プロピレングリコールにおいて炭酸カルシウムマイクロフラワーを使用して腹腔内にトランスフェクトされる。
【図７】図７は、感染したＡＧ１２９マウスからの罹患率（Ａ）およびＹＦＶ−１７ＤＲＮＡの検出（Ｂ）。（Ａ）スタマリル（登録商標）によって、またはｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（ｐＹＦ１７Ｄ）でのトランスフェクションによって感染した場合、ＡＧ１２９マウスは、平均で１２日から１３日（ＭＭＤ、死亡への平均日数）後に、安楽死させる前に体重が約２０％落ちる。対照的に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤΔＧＤＤ（ΔＧＤＤ）がトランスフェクトされたマウスは、スタマリル（登録商標）（ΔＧＤＤ＋２°スタマリル）が投与される前に体重が増加し、約２週間以内にＹＦＶ−１７Ｄ感染によって死亡する。（Ｂ）同等の量のＹＦＶ−１７ＤＲＮＡが、死亡時に収集された（Ａ）からのＡＧ１２９マウスの脳のサンプルにおいてｑＲＴ−ＰＣＲによって検出され得る。
【図８】図８は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄのマップ（合成構築物＃１）を示す。説明：ＳＶ４０ｐ：シミアンウイルス４０プロモーター／起点、ＹＦＶ−１７Ｄ：黄熱ウイルスワクチン株１７Ｄ ｃＤＮＡ，ＨＤＶｒｚ：デルタ肝炎ウイルスリボザイムｃＤＮＡ；２μ：サッカロマイセスセレビシエ２ミクロン起点；ＴＲＰ１：トリプトファンに対して原栄養成長を与えるＴＲＰ１遺伝子；ｐａｒＡＢＣ：Ｆプラスミドの分節遺伝子；ｒｅｐＥ:ＦプラスミドのｒｅｐＥ遺伝子；ｏｒｉＳ：Ｆプラスミドの起点；ｏｒｉＶ：プラスミドＲＫ２の起点；ＣｍＲ：クロラムフェニコール耐性遺伝子。
【図９】図９は、異なるＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡベクターを用いた形質転換後の大腸菌コロニー成長を示す。（Ａ）ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩを用いた形質転換および３７℃で１６時間にわたる成長後の大腸菌ＥＰＩ−３００Ｔコロニーを示す。ミクロコロニー（０．２ｍｍ未満の直径）およびマクロコロニー（約０．４ｍｍの直径）というサイズに差がある２つの部分母集団を有するコロニーサイズ分布が観察され得る。ミクロコロニーは多数を占める。（Ｂ＋Ｃ）ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ１７Ｄを用いた形質転換後の大腸菌ＥＰＩ−３００Ｔコロニーを示す。誘導物質のない場合（Ｂ）、または誘導性高コピー起点が介在する高コピー複製の誘導のための０．０１％Ｌ−アラビノースを有する場合（Ｃ）のプレート上での平板培養を示す。大きな黒い円は、寒天培地に埋め込まれた直径２．５ｍｍのジルコニアビーズであり、較正物質として機能する。差し込み図は、各設定において観察されるコロニーの外形を表わす概略的な線図である。
【図１０】図１０は、異なるＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡベクターを用いた形質転換後の大腸菌コロニーのサイズ分布を示す。（Ａ）ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩを用いた形質転換後の大腸菌ＥＰＩ−３００Ｔコロニーを示す。（Ｂ＋Ｃ）ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ１７Ｄを用いた形質転換後の大腸菌ＥＰＩ−３００Ｔを示す。誘導物質のない場合（Ｂ）、または誘導性高コピー起点が介在する高コピー複製の誘導のための０．０１％ Ｌ−アラビノースを有する場合（Ｃ）のプレート上での平板培養を示す。
【図１１】図１１ａは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥのマップを示す。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥは、ＳＶ４０プロモーター／起点の後に、ＹＦＶ−１７Ｄのｎｔ１−４８１および２４５２−１０８６２を含み、ここに神経弱毒化ＪＥＶワクチン株ＪＥ ＳＡ１４−１４−２の４７７−２４７７が挿入される。ＪＥＶ Ｅ−ＯＲＦの第２の最後の２つの最後のアミノ酸は、ヒスチジンからグリシンコドンに変異してＫａｓＩサイトを生成し、ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ｂ−ＯＲＦは、Ｉｍｏｊｅｖ（登録商標）に見つけられる２つの順応性Ｇ４０５５ａおよびＧ７３４９ａ変異を含み、それぞれＹＦＶ−１７Ｄ ＮＳ２Ａにおいてメチオニンをバリンに変化させ、ＮＳ４Ｂ ＯＲＦにおいてリシンをグルタミンに変化させる。付加的な沈黙変異により、制限マーカーが位置４０６（ＸｈｏＩ）、４００９（ＢｓｔＥＩＩ）、および７３１５（ＮｈｅＩ）に生成される。図１１ｂは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＷＮのマップを示す。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＷＮは、ＳＶ４０プロモーター／起点の後に、ＹＦＶ−１７Ｄのｎｔ１−４８１および２４５２−１０８６２を含み、ここにＷＮＶ株ＮＹ−９９の神経弱毒化誘導体の４７７−２４７７が挿入される。ＷＮ Ｅ−ＯＲＦの第２の最後の２つの最後のアミノ酸は、ヒスチジンからグリシンコドンに変異してＫａｓＩサイトを生成し、ＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ｂ−ＯＲＦは、Ｉｍｏｊｅｖ（登録商標）に見つけられる２つの順応性Ｇ４０５５ａおよびＧ７３４９ａ変異を含み、それぞれＹＦＶ−１７Ｄ ＮＳ２Ａにおいてメチオニンをバリンに変化させ、ＮＳ４Ｂ ＯＲＦにおいてリシンをグルタミンに変化させる。付加的な沈黙変異により、制限マーカーが位置４０６（ＸｈｏＩ）、４００９（ＢｓｔＥＩＩ）、および７３１５（ＮｈｅＩ）に生成される。
【図１２】図１２は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＥＶ７１のマップを示す。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＥＶ７１は、その５′末端のＳＶ４０プロモーター／起点とその３′末端の３０ｎｔ長のポリＡ反復およびデルタ肝炎ウイルスリボザイムとの間に挿入されるＥＶ７１株ＢｒＣｒ−ＴＲ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ２０４８５２．１）のｃＤＮＡを含む。
【図１３】図１３は、配列番号１〜７を有する配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
定義 
「細菌人工染色体（ＢＡＣ）」の用語は、大腸菌などの細菌細胞内にＤＮＡ塩基配列をクローン化するために使用されるプラスミドＤＮＡ構築物を言う。典型的に、３０，０００個から約３００，０００個にわたる塩基対のＤＮＡ塩基配列が、ＢＡＣに挿入され得る。挿入されたＤＮＡを有するＢＡＣは、細菌細胞によって取り込まれ得る。細菌細胞が成長して分裂するにつれ、ＢＡＣ ＤＮＡは、細菌細胞内において、非常に低い細菌細胞ごとのコピー数、好ましくは細胞毎に３コピーを超えない数、たとえば細胞毎に単一のコピーで安定して維持される。ＢＡＣの複製は、複製起点（ｏｒｉ）配列、典型的にはｏｒｉＳ配列において開始される。この複製は、ＢＡＣによってコードされる、概してｒｅｐＥおよび／またはｒｅｐＦという、遺伝子産物によって厳重に規制される。ＢＡＣはさらに、ｐａｒＡ、Ｂ、およびＣなどの蛋白質をコードし、分裂時におけるＢＡＣコピーの配分を娘細胞に指示する。典型的に、ＢＡＣベクターは、青色選択を可能にするｌａｃＺなど、抗生物質耐性またはリポーター酵素マーカーなどの選択可能マーカーをさらに含む。一般に使用されるＢＡＣの例はｐＢｅｌｏＢａｃ１１（Shizuya et al. (1992) Proc. Natl . Acad. Sci. USA 89, 8794-8797）である。このベクターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ５１１１３において報告された。ｐＢｅｌｏＢａｃ１１は、円形のプラスミドであって、ｏｒｉＳと、ｏｒｉＳにおける複製を開始および規制する蛋白質を産生するｒｅｐＥ遺伝子と、配分遺伝子ｐａｒＡ、Ｂ、およびＣとを含む。選択のために、ｐＢｅｌｏＢａｃ１１は、クロラムフェニコール抵抗コード遺伝子を含む。また、ベクターは、挿入断片がＢＡＣにおいてクローン化された時に妨害され得るもしくはベクターから除去されるｌａｃＺａ遺伝子を含む。
【００４７】
「誘導性細菌ｏｒｉ配列」の用語は、細菌宿主細胞において機能し、増幅媒介蛋白質に対して反応するプラスミドｏｒｉ配列を言う。好ましくは、前記の増幅媒介蛋白質が無い場合、誘導性ｏｒｉの複製機能は厳しく抑制される、または存在しない。前記の増幅媒介蛋白質が存在する場合、誘導性ｏｒｉは、プラスミドを大きなコピー数、好ましくは細胞毎に２０コピーより大きい数、より好ましくは１００より大きい数、たとえば細胞ごとに５００もしくは１００コピーを超える数に増幅させるのが好ましい。本発明での使用のために、誘導性ｏｒｉが単一の増幅媒介蛋白質に反応するのが好ましいが、これは必須ではない。
【００４８】
ｏｒｉＶは、本発明における誘導性細菌ｏｒｉとしての使用に特に有用であり、これは、その広い宿主領域、１００ｋｂ以上のＤＮＡ断片を複製するという知られた能力、その大きなコピー数、および１つの誘導性蛋白質のみを必要とする点に起因する。誘導性ｏｒｉＶを含む細菌人工染色体の例は、ｐＢｅｌｏＢＡＣ／ｏｒｉＶ（Wild et al.(2002) Genome Res. 12, 1434-1444）およびｐＢＡＣ−ＬａｃＺ（Addgene plasmid 13422: pBAC-lacZ,, Adgene, Cambridge MA, USA）である。ｐＢＡＣ−ｌａｃＺプラスミドは、標準的な大腸菌株において複製され得るミニＦ′であるが、単一コピーのエピソームとして維持されることから、低いＤＮＡ収率を与える。また、ｐＢＡＣ−ｌａｃＺは、ｔｒｆＡ遺伝子によってコードされるトランス作用因子が存在する場合のみにおいて活性化される第２の高コピー数起点を含む。誘導性プロモーターからのｔｒｆＡを発現する大腸菌細胞におけるこのプラスミドの形質転換により、ｔｒｆＡ発現を誘導することによってｐＢＡＣ−ｌａｃＺのコピー数を増加させることができる。ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ（商標）ＥＰＩ３００（商標）大腸菌細胞（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、マディソン郡、ウィスコンシン州、米国）は、誘導性変異体ｔｒｆＡ遺伝子を含み、この誘導性変異体ｔｒｆＡ遺伝子の遺伝子産物は、複製のｏｒｉＶ起点からの複製の開始に必要となる。ｔｒｆＡの発現は、Ｌ−アラビノースを培地に加えてｏｒｉＶを活性化させることによって誘導され得る。
【００４９】
「酵母複製起点」は、細菌人工染色体などのプラスミド内の配列をいい、酵母細胞内におけるこのプラスミドの複製および維持を可能とする。２μプラスミドにある複製起点（Huberman et al. (1987) Cell 51, 473-481; Brewer and Fangman (1987) Cell 51, 463-471; Hartley and Donelson (1980) Nature 286, 860-865.）は、本発明に係る細菌人工染色体を酵母に対して往復させるのに適したｏｒｉであるものとして示される。他の適した酵母ＯＲＩが記載され（Liachko et al. (2013) Genome Res. 23, 698-704）、たとえば、酵母動原体性プラスミド（ＹＣｐ）において使用されるＡＲＳ１（自己複製配列１）およびその機能的に同種の誘導体、または合成ＣＥＮ６／ＡＲＳＨ４起点（Frazer and O'Keefe (2007) Yeast. 24, 777-789）などがある。
【００５０】
本発明の文脈における「ウイルス発現カセット」は、シス調節因子に隣接するＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを言い、シス調節因子は、前記細菌人工染色体が哺乳動物細胞に導入されると、前記ウイルスｃＤＮＡの転写を促進し、感染性ウイルスＲＮＡへの転写されたＲＮＡのプロセシングを可能とし、これは以下により詳細に記載される。
【００５１】
「感染性ウイルスＲＮＡ」は、哺乳動物宿主に導入された時に、ウイルス複製および感染性ウイルス後代の産生に必要なすべてのウイルス機能を提供するのに十分なウイルスＲＮＡを言う。これは、（ｉ）ウイルスＲＮＡの合成およびゲノムの増幅のための転写鋳型として機能すること、および（ｉｉ）ウイルス複製に必要なウイルス蛋白質の合成のための転写鋳型として機能することを含む。たとえば生得の抗ウイルス反応に関連する宿主細胞因子の囮（Moon et al.(2012) RNA. 18, 2029-40）などの他の補助的な機能が同じく感染性ウイルスＲＮＡによって提供され得る。
【００５２】
本発明の文脈における「弱毒化」は、病原体の毒性の変化に関連し、これによって病原有機体の有害な性質が弱まる（または減衰される）。弱毒化された病原体は、生ワクチンとして使用され得る。弱毒化ワクチンは、弱められた生体からいくつかの方法で取り出され得て、通常は、最適以下の条件下での培養（弱毒化とも言われる）、または遺伝子変化によって行われ、病気を引き起こす能力を減少させる効果がある。
【００５３】
第１の局面において、本発明は、誘導性細菌ｏｒｉ配列を含む細菌人工染色体を提供し、誘導性細菌ｏｒｉ配列は、刺激がある場合において、細菌細胞内の前記細菌人工染色体を大きなコピー数、好ましくは細胞毎に１０コピーを超え、より好ましくは１００を超え、たとえば、細胞毎に５００もしくは１０００を超える数へ増幅させることを誘導する。概して、前記刺激による前記細菌人工染色体の増幅は、１０，０００を超えず、たとえば細胞毎に５０００コピー以下となる。本発明に係る細菌人工染色体は、ウイルス発現カセットをさらに含み、ウイルス発現カセットは、シス調節因子に隣接するＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、シス調節因子は、前記細菌人工染色体が哺乳動物細胞に導入されると、前記ウイルスｃＤＮＡの転写を促進するとともに、感染性ウイルスＲＮＡへの転写されたＲＮＡのプロセシングを可能とする。本発明に係る細菌人工染色体のウイルス発現カセットに含まれるウイルスｃＤＮＡは、正鎖ウイルス、負鎖ウイルス、二本鎖ＲＮＡウイルスのグループに属するウイルス、または複製のためにアンビセンスＲＮＡストラテジーを使用するウイルスから取り出され得る。ウイルス発現カセットに含まれる前記ウイルスｃＤＮＡは、野生型ＲＮＡウイルスゲノムのものに対応し得る、または異種ＤＮＡ塩基配列が挿入される、および／もしくは生来ウイルス配列が欠失されるキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物であり得る。好ましくは、前記異種ＤＮＡ塩基配列は、哺乳動物細胞に導入された後に組み換えウイルスによって異種に発現される、このようなキメラ型ウイルスｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む本発明に係る細菌人工染色体の１つ以上の蛋白質をコードする。選択的に、本発明に係る細菌人工染色体は、酵母において前記細菌人工染色体に対して往復するまたはこれを維持するための酵母自己複製配列をさらに含む。酵母細胞において本発明に係る細菌人工染色体に対して往復することおよびこれを維持する可能性により、酵母および細菌遺伝子系の両方において遺伝子操作が可能であるという利点がもたらされる。
【００５４】
誘導性ｏｒｉの刺激がない場合において、本発明に係る細菌人工染色体は、細菌宿主における感染性ウイルスｃＤＮＡの記録および安定的なクローン化に使用することができ、このような刺激が存在する場合においては、前記ｃＤＮＡは増幅され、その後に使用のために単離され得る。本発明に係る細菌人工染色体は、ＲＮＡウイルス性病原体に対する生ワクチンとして使用されるウイルスｃＤＮＡの成長、安定的な維持、および産生に特に有用である。代替的に、前記細菌人工染色体は、たとえば研究目的のために、ｃＤＮＡからの生来もしくは組み換えウイルスの維持および増殖のために使用される。本発明に係る細菌人工染色体、特に酵母複製起点を含むものは、ウイルスｃＤＮＡを遺伝子的に操作するための多用途系を提供するというさらなる利点を有する。この多用途性は、たとえばＲＮＡウイルス性病原体に対するｃＤＮＡ生ワクチンの設計、または逆遺伝学的手法を使用した特定の遺伝子産物の役割および機能の解明を目的とした研究など、前記細菌人工染色体の研究開発用途において特に重要である。
【００５５】
本発明に係る細菌人工染色体が正鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む場合、哺乳動物細胞への導入時にウイルスｃＤＮＡの転写を開始するＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターによって前記ウイルスｃＤＮＡがその５′末端において先行するのが好ましく、その一方で、その３′末端において、設定位置で前記ウイルスｃＤＮＡのＲＮＡ転写産物を開裂するための自己開裂用要素が続くのが好ましい。合わせてこれらのシス調節因子は、哺乳動物細胞に細菌人工染色体を導入する時に、感染性ウイルスＲＮＡへの前記ウイルスｃＤＮＡの転写およびプロセシングを可能とする。好ましくは、前記ＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターは、たとえばサイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ−ＩＥ）プロモーター (Thomsen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 659-663）、シミアンウイルス４０プロモーター（Deboist and Chambon (1981) Nature 290, 304-310）、もしくはＣＭＶ−ＩＥチキンベータアクチンキメラ型（ＣＡＧ）プロモーター（Niwa et al. (1991) Gene 108, 193-199）などのその機能的に同種の誘導体などのＲＮＡポリメラーゼＩＩ作用プロモーターである、またはテトラサイクリンオペレーター最小ＣＭＶ−ＩＥプロモーター（Gossen e t al. (1995) Science. 268, 1766-1769；Baron and Bujard (2000) Methods Enzymol. 327, 401-421）などの前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ作用プロモーターの誘導性バージョンである。代替的に、前記ＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩ（Russel and Zomerdijk (2006) Biochem. Soc. Symp. 73, 203-216）、またはＵ６もしくはＨ１プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。前記ＲＮＡ自己開裂用要素は、デルタ肝炎ウイルスのゲノムリボザイムのｃＤＮＡ（Chadalavada et al.(2007) RNA 13, 2189-2201)、またはWebb and Luptak (2011) RNA Biol. 8, 719-727に記載されるような機能的に同種のデルタ肝炎ウイルスのような自己開裂リボザイムＲＮＡ要素のｃＤＮＡであることがさらに好ましい。好ましくは、前記ウイルス発現カセットに含まれる正鎖ＲＮＡウイルスのウイルスｃＤＮＡは、黄熱ウイルスと他のフラビウイルスとを含むフラビウイルス科、Ｃ型肝炎ウイルスを含むヘパシウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルスと豚コレラウイルスとを含むペスチウイルス、アルファウイルス属チクングニヤとルビウイルス属風疹ウイルスとを含むトガウイルス科、ポリオウイルスおよびライノウイルスなどのエンテロウイルス属とアルトウイルス族とを含むピコルナウイルス科、ＨＣｏＶ−２２９ＥとＳＡＲＳ−ＣｏＶとＭＥＲＳ−ＣｏＶ（当初はノーベルコロナウイルス２０１２／ロンドン１ノーベルＣｏｖ２０１２と記載）とネココロナウイルスとを含むコロナウイルス科、Ｅ型肝炎ウイルスを含むヘペウイルス、およびノーウォークウイルスとノロウイルスとを含むカリシウイルス科のうちのいずれか１つのウイルス科に属するウイルスに由来する。ウイルス発現カセットに含まれる前記ウイルスｃＤＮＡは、野生型ＲＮＡウイルスゲノムのものに対応し得る、または異種のＤＮＡ塩基配列が挿入される、および／もしくは生来ウイルス配列が欠失、短縮、または変異されるキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物であり得る。好ましくは、前記異種のＤＮＡ塩基配列は、組み換えウイルスによって哺乳動物への導入時に異種に発現される、このようなキメラ型ウイルスｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む本発明に係る細菌人工染色体の１つ以上の蛋白質／ペプチドをコードする。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、本発明に係る細菌人工染色体は、正鎖弱毒化黄熱ウイルス（ＹＦＶ）−１７Ｄワクチン（図６）のｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む。この特定の実施形態に係る細菌人工染色体は、ＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡの安定的なクローン化および増殖のために使用され得る。加えて、このような細菌人工染色体は、現在使用されている弱毒化ＹＦＶ−１７Ｄウイルスワクチン（スタマリル（登録商標）およびＹＦ−ＶａｘＲなどの同様の製造物）に代わる生ＹＦＶ−１７Ｄに対するＤＮＡワクチンとして機能し得る。既存のＹＦＶ−１７Ｄウイルスワクチンに対し、本発明に係るＹＦＶ−１７ ＤＮＡワクチンは、真核細胞培養または有胚鶏卵を必要とすることなく低コストで製造することができるという利点を有する。さらに、その流通にはコールドチェーンが必要ではなく、針を使用せずに投与することができる。
【００５７】
より特定的な実施形態において、本発明に係る細菌人工染色体は、異種のＤＮＡ塩基配列が挿入された、および／または生来のウイルス配列が欠失された弱毒化ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む。たとえば、米国特許第６９６２７０８を参照すると、ＹＦＶ−１７ＤのｃＤＮＡにおけるｐｒＭ−Ｅ蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、ＹＦＶ−１７Ｄの機能性ｐｒＭ−Ｅ蛋白質が発現されないように欠失、短縮、または変異され得て、一方で、ヌクレオチド配列は第２の異なるウイルスのウイルスエンベロープ蛋白質をコードし、第２のウイルスのウイルスエンベロープ蛋白質は、ＹＦＶ−１７Ｄワクチンの組み換えゲノムから発現される。好ましくは、前記第２のウイルスは、日本脳炎（ＪＥ、たとえばＪＥ ＳＡ１４−１４−２）、デング熱（ＤＥＮ、たとえばデング熱タイプ１〜４のいずれか；たとえばデング熱二本鎖ＰＵＯ−２１８）（Gruenberg et at. (1988) J. Gen. Virol. 67, 1391-1398.）、マーレーバレー脳炎（ＭＶＥ）、セントルイス脳炎（ＳＬＥ）、西ナイル熱（ＷＮ）、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）（すなわち、中央ヨーロッパ脳炎（ＣＥＥ）およびロシア春夏脳炎（ＲＲＳＥ）ウイルス）、およびＣ型肝炎Ｃ（ＨＣＶ）ウイルスなどのフラビウイルスでもある。第２のフラビウイルスとして使用される追加のフラビウイルスは、クンジンウイルス、ポワサンウイルス、キャサヌール森林熱ウイルス、ジカウイルス、ウスツウイルス、およびオムスク出血熱ウイルスを含む。キメラ型ＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡを含むこのような細菌人工染色体を哺乳動物細胞に導入することにより、ＹＦＶ−１７Ｄに属する細胞内複製の要因となる遺伝子および遺伝子産物と第２のウイルスのエンベロープの遺伝子および遺伝子産物とから構成されるキメラウイルスが産生される。ウイルスエンベロープは中和抗体の誘発に応答性を有する抗原決定基群を含むことから、キメラウイルスに感染する結果として、このような抗体が第２のウイルスに対して生成される。代替的に、ＹＦＶ−１７ＤのｃＤＮＡにおけるｐｒＭ−Ｅおよび／またはＮＳ１蛋白質をコードするヌクレオチド配列は、ＹＦＶ−１７Ｄの機能性ｐｒＭ−Ｅおよび／またはＮＳ１蛋白質自体が発現されないように欠失、短縮、または変異され得て、一方、ヌクレオチド配列は、ＹＦＶ−１７Ｄワクチンの組み換えゲノムから前記蛋白質が発現されるように特定のエピトーム／抗原を含むペプチド／蛋白質をコードする。代替的に、異種の蛋白質をコードするｃＤＮＡは、Ｅ遺伝子とＮＳ１遺伝子との間の挿入（Bonaldo et al. (2007) Virol. J. 4, 115.）、Ｃ遺伝子における挿入（Jones et al. (2005) Virology 331, 247-259; Schoggings et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 14610-14615）、またはＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡの翻訳されていない領域における挿入（Jones et al. (2005)上記）など、本発明に係る細菌人工染色体内のｃＤＮＡ ＹＦＶ−１７Ｄにおける他の位置に挿入され得る。好ましくは、前記エピトープ／抗原を含む蛋白質は、腫瘍抗原、または寄生病原体のウイルスや細菌の抗原である。キメラ型ＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡを含むこのような細菌人工染色体を哺乳動物細胞に導入することにより、ＹＦＶ−１７Ｄに属する細胞内複製に応答性を有する遺伝子および遺伝���産物と前記エピトープ／抗原を含む蛋白質の遺伝子および遺伝子産物とから構成されるキメラウイルスが産生される。中和抗体の誘発に応答性を有する抗原決定基群をウイルスエンベロープが含むことから、キメラウイルスに感染する結果として、前記エピトープ／抗原を含む蛋白質に対してこのような抗体が産生される。
【００５８】
負鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを本発明に係る細菌人工染色体が含む場合、正鎖ＲＮＡウイルスについて上で記載した構築物は、発現を駆動するシス要素に対するセンス（抗ゲノム性）方向にウイルス性ゲノムｃＤＮＡが置かれ(Radecke et al. (1995) EMBO J. 14, 5773-5784)、およびウイルスＲＮＡ複製を助けるために必要なウイルス性レプリカーゼ複合体の一部をウイルスＲＮＡとともに構成するウイルス遺伝子産物によるコードをセンス方向にさらに含むように、改変されなければならない。これらのｃＤＮＡは、プラスミドからウイルスレプリカーゼを構築するこれらのウイルス遺伝子産物を発現させるのに必要な調節シス要素に隣接する。非分節性負鎖ＲＮＡウイルスの場合（Conzelmann (1998) Annu. Rev. Genet. 32, 123-162）、これらのウイルス遺伝子産物は、Ｎ（ＮＰ）、Ｐ、およびＬ蛋白質である。負鎖ＲＮＡゲノムの抗ゲノムｃＤＮＡの発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩもしくはＩＩプロモーターによって駆動され得て（Martin et al., (2006) J Virol. 80, 5708-5715）、一方で、ウイルスレプリカーゼ複合体を構築するウイルス蛋白質のための発現カセットは、ウイルス自体が自然に遭遇する多シストロン性であり得る、または各レプリカーゼ構成部分のバランスの取れた発現のために異なるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Morita et al. (2012) Biotechniques O, 1-5）の集合を採用する単シストロン性であり得る。本発明に係る人工細菌染色体からの分節性ＲＮＡゲノムを用いた負鎖ＲＮＡウイルスの救済は、非分節性ＲＮＡゲノムを有する負鎖ＲＮＡウイルスについて記載された系に対する変異を必要とする。より特定的には、適切なＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩプロモーター（Fodor et al. (1999) J. Virol. 73, 9679-9682）によって駆動される 各ゲノムセグメント（Neumann and Kawaoka (2004) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 43-60）のための発現カセットを組み込む必要がある。従来技術においてこの目的に使用されるプラスミドベクター系の限られたベクター能力により、このようなウイルスの救済のために必要な機能は、従来技術において、いくつかのプラスミドの共トランスフェクションによって提供されなければならない。たとえば、インフルエンザウイルスの救済のために８または１２個のプラスミドを使用することがHoffmann et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11411-11416およびFodor et al. 1999（上記）においてそれぞれ以前に記載された。本発明に係る細菌人工染色体の大きな挿入断片を含む高いベクター能力は、負鎖ＲＮＡウイルスゲノムもしくはゲノムセグメントおよび追加のウイルス蛋白質コード配列を単一の細菌人工染色体から正鎖ＲＮＡウイルスゲノムと同様の方法で発現させることを可能にする。
【００５９】
好ましくは、前記ウイルス発現カセットおよびウイルス複製の救済に必要な追加の発現カセットに含まれる負鎖ＲＮＡウイルスの前記ウイルスｃＤＮＡは、インフルエンザＡ型、Ｂ型、およびＣ型ウイルスを含むオルソミクソウイルス科 、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、およびＲＳウイルスを含むパラミクソウイルスを含むウイルス科のいずれか１つに属するウイルスから取り出される。ウイルス発現カセットに含まれる前記ウイルスｃＤＮＡは、野生型ＲＮＡウイルスゲノムのものに対応し得る、または異種のＤＮＡ塩基配列が挿入された、および／または生来のウイルス配列が欠失、短縮、もしくは変異されたキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物であり得る。好ましくは、前記異種のＤＮＡ塩基配列は、哺乳動物に導入された時に組み換えウイルスによって異種で発現される、このようなキメラ型ウイルスｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む本発明に係る細菌人工染色体の１つ以上のペプチド／蛋白質をコードする。
【００６０】
二本鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを本発明に係る細菌人工染色体が含む場合、Boyce et al. (2008) J. Virol. 82, 8339-8348に記載されるようなウイルスＲＮＡ複製の救助に必要なすべてのウイルスＲＮＡゲノムセグメント、すなわちブルータングウイルスの場合における１０個のＲＮＡが、発生期の転写産物に対する主にキャッピングなどの適切なプロセシングを可能とするＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターから発現され得るように、構築物を改変しなければならない。代替的に、ＲＮＡポリメラーゼ ＩおよびＩＩＩプロモーターがこの目的のために使用され得る。好ましくは、前記ウイルス発現カセットに含まれる二本鎖ＲＮＡウイルスの前記ウイルスｃＤＮＡは、レオウイルス、ロタウイルス、およびブルータングウイルスを含むレオウイルス科のウイルス科のうちのいずれか１つに属するウイルスから取り出される。ウイルス発現カセットに含まれる前記ウイルスｃＤＮＡは、野生型ＲＮＡウイルスゲノムのものに対応し得る、または異種のＤＮＡ塩基配列が挿入された、および／または生来のウイルス配列が欠失、短縮、または変異されたキメラ型ウイルスｃＤＮＡ構築物であり得る。好ましくは、前記異種のＤＮＡ塩基配列は、哺乳動物への導入時に組み換えウイルスによって異種に発現される、このようなキメラ型ウイルスｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む本発明に係る細菌人工染色体の１つ以上のペプチド／蛋白質をコードする。
【００６１】
複製のためにアンビセンスＲＮＡ戦略を使用するウイルスのｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを本発明に係る細菌人工染色体が含む場合、記載された（Lowen et al. (2004) Virology 330, 493-500）ウイルスＲＮＡ複製の救済のために必要なすべてのウイルスＲＮＡゲノムセグメントがＲＮＡポリメラーゼＩもしくはＩＩプロモーターから発現されるように構築物を改変しなければならない。好ましくは、前記ウイルス発現カセットに含まれる、複製のためにアンビセンスＲＮＡ戦略を使用するウイルスの前記ウイルスｃＤＮＡは、リフトバレー熱ウイルス、ハンターンウイルス、およびシュマレンベルクウイルスをブニヤウイルス科、ならびにラッサ熱ウイルスを含むアレナウイルス科のウイルス科のいずれか１つに属するウイルスから取り出される。ウイルス発現カセットに含まれる前記ウイルスｃＤＮＡは、野生型ＲＮＡウイルスゲノムのものに対応し得る、または異種のＤＮＡ塩基配列が挿入された、および／または生来のウイルス配列が欠失、短縮、または変異されたキメラ型ｃＤＮＡ構築物であり得る。好ましくは、前記異種のＤＮＡ塩基配列は、哺乳動物に導入された時に組み換えウイルスによって異種に発現される、このようなキメラ型ウイルスｃＤＮＡを含むウイルス発現カセットを含む本発明に係る細菌人工染色体の１つ以上のペプチド／蛋白質をコードする。
【００６２】
上記のように、および例によって示されるように、本発明は、ＤＮＡワクチンに使用される十分に高い品質のウイルスｃＤＮＡを大量に生成することを可能にする。
【００６３】
ＤＮＡをワクチン製剤に形成することは、先行技術において知られており、たとえば、"DNA Vaccines" Methods in Molecular Medicine Vol 127, (2006) Springer Saltzman, Shen and Brandsma (Eds.) Humana Press. Totoma, NJ .の第６章から第１０章、およびAlternative vaccine delivery methods, Pages 1200-1231, of Vaccines (6thEdition) (2013) (Plotkin et al. Eds.)の第６１章に詳細に記載されている。ＤＮＡワクチンの製剤に適した許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤、および補助剤についての詳細は、以下に示されるように、ＷＯ２００５０４２０１４に見つけることができる。
【００６４】
「許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤」は、特に免疫療法に関するヒトおよび／または動物向け薬剤における使用に許容可能な追加の物質をいう。
【００６５】
例示により、許容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤は、全身投与もしくは局所投与において安全に使用され得る固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質であり得る。具体的な投与経路に応じて、当該技術において周知のさまざまなキャリアが使用され得る。これらのキャリアは、砂糖、澱粉、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、滑石粉、硫酸カルシウム、植物油、合成潤滑油、ポリオル、アルギン酸、リン酸塩緩衝液、乳化剤、塩酸塩、臭化物、および硫酸塩を含む鉱酸塩などの等張生理食塩水および塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、およびマロン酸塩などの有機酸、ならびに発熱物質のない水を含むグループから選択され得る。
【００６６】
薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤、および賦形剤を記載した有用な参考文献は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N . J. USA, 1991)であり、この文献は引用により本願明細書において援用される。
【００６７】
患者に対してＤＮＡワクチンを投与するために任意の安全な投与経路が採用され得る。たとえば、口、直腸、非経口、舌下、頬、静脈内、関節内、筋肉内、皮膚内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などが採用され得る。筋肉内および皮下注射は、たとえば、免疫療法組成物、蛋白質ワクチン、および核酸ワクチンの投与において適切であり得る。微粒子衝突もしくは電気穿孔が特に核酸ワクチンの投与について特に有用であり得る。
【００６８】
剤形は、タブレット、分散液、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ、カプセル剤、坐剤、エアゾール剤、経皮的貼付剤などを含む。これらの剤形は、この目的のために特定的に設計された制御放出装置またはこの態様で付加的に作用するように変更された植込剤の注射もしくは移植を含み得る。治療薬の制御放出は、たとえば、アクリル樹脂を含む疎水性ポリマー、ろう、高脂肪族アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの特定のセルロース誘導体を用いて達成され得る。加えて、制御放出は、他のポリマーマトリクス、リポソーム、および／またはミクロスフェアを使用して達成され得る。
【００６９】
経口もしくは非経口投与に適したＤＮＡワクチンは、所定量のプラスミドＤＮＡを粉末もしくは顆粒剤として、または水溶液、非水溶液、水中油型エマルション、もしくは油中水型エマルションにおける溶液もしくは懸濁液として各々が含むカプセル剤、小袋、またはタブレットなどの個別の単位で示され得る。このような組成物は、任意の薬学的手法で製剤され得るが、すべての方法は、１つ以上の必要な成分を構成するキャリアを上記の作用薬と組み合わせるステップを含む。概して、組成物は、液状キャリアもしくは微細に分割された固体キャリアまたは両方をＤＮＡプラスミドと一様かつ密接に混ぜ合わせ、必要であれば望ましい形態に生成物を形成することによって製剤される。
【００７０】
上記の組成物は、投与製剤に準拠した方法で、効果のある用量で投与され得る。患者に投与される用量は、適切な期間にわたって患者から良好な反応が得られるよう十分にすべきである。投与される作用薬の量は、医師の判断に応じる要因である、年齢、性別、重量、および健康状態を含む治療される対象に応じ得る。
【００７１】
典型的に、ＤＮＡワクチンは、ヒトの予防的もしくは治療的免疫のために使用されるが、特定のウイルスについては家畜および伴侶動物などの家庭動物を含む脊椎動物（典型的には哺乳類、鳥、および魚）にも適用され得る。予防接種は、猿、マウス、ラット、鳥、およびコウモリなどのウイルスの生きた貯蔵庫（動物原性感染症）である動物が想定される。特定の実施形態において、ワクチンは、補助剤、すなわち免疫原性および／またはワクチン組成物の効能を向上させる１つ以上の物質を含み得る。しかしながら、生ワクチンは、ウイルス複製とは独立した生来の免疫反応を刺激する補助剤によって最終的には害され得る。好適な補助剤の非限定的な例は、スクアランおよびスクアレン（または他の動物由来の油）、ブロック共重合体、Ｔｗｅｅｎ−８０などの界面活性剤、Ｑｕｉｌ−Ａ、ＤｒａｋｅｏｌもしくはＭａｒｃｏｌなどの鉱油、落花生油などの植物油、コリネバクテリウムパルブムなどのコリネバクテリウム由来の補助剤、プロピオンバクテリウムアクネなどのプロピオンバクテリウム由来の補助剤、ウシ結核菌（カルメット・ゲラン桿菌もしくはＢＣＧ）、インターロイキン２およびインターロイキン１２などのインターロイキン、インターロイキン１などのモノカイン、腫物壊死因子、ガンマインターフェロンなどのインターフェロン、サポニン水酸化アルミニウムまたはＱｕｉｌ−Ａ水酸化アルミニウムなどの組み合わせ、リポソーム、ＩＳＣＯＭｔおよびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｂ）補助剤、ミコバクテリウム細胞壁抽出物、ムラミルジペプチドなどの合成グリコペプチドまたは他の誘導体、アブリジン、リピドＡ誘導体、硫酸デキストラン、ＤＥＡＥデキストランまたはリン酸アルミニウムを有するもの、Ｃａｒｂｏｐｏｌ′ＥＭＡなどのカルボキシポリメチレン、Ｎｅｏｃｒｙｌ Ａ６４０などのアクリル共重合体エマルション、ワクシニアもしくは動物ポックスウイルス蛋白質、ならびにコレラ毒素などのサブウイルス粒子補助剤またはその合剤を含む。本発明は、以下の例によってさらに例示される。
【００７２】
実施例
【実施例１】
【００７３】
実施例１：実施例２および実施例３の動物において示される試験研究において使用される動物、ウイルス、細胞、バクテリア、および酵母
動物
インターフェロンタイプＩおよびＩＩレセプタ―の両方のノックアウトを伴う１２９／Ｓｖマウス（ＡＧ１２９マウス、Ｂ＆Ｋ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｔｄ／ＵＫ）がハウスにおいて育成された。
【００７４】
ウイルスおよび細胞 
Ｖｅｒｏ−Ｂ（アフリカミドリザルの腎臓；American Type Culture Colletion（ＡＴＣＣ）ＣＣＬ−８１）およびＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓細胞；ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）細胞がＡＴＣＣから取得された。すべての細胞は、本質的に記載のように培養された（De Burghgraeve et al. (2012) PLoS ONE 7, e37244）。黄熱ウイルスワクチン株１７Ｄ（スタマリル（登録商標））は、ベルギー国ブリュッセルのSanofi Pasteur MSDから購入された。
【００７５】
バクテリアおよび酵母 
ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＢＡＣ生殖のルーチンクローニングおよび生殖に使用されるバクテリア菌株は、それぞれ、大腸菌Ｔｏｐ１０（Invitrogen）およびＥｐｉ３００−Ｔ（Epicenter）であった。全長フラビウイルスｃＤＮＡプラスミドｐＡＣＮＲ−ＦＬ１７ＤＩＩ、ｐＡＣＮＲ−ＤＥＮＶ２、およびｐ４を用いて形質転換させたバクテリア（以下を参照）は、慣例的に２８℃で成長させ、プラスミドＤＮＡの収率は、クロラムフェニコール増幅によって増加させた。Ｅｐｉ−３００Ｔ細胞を含むシャトルプラスミドは、以下に記載するように３７℃で成長させて増幅された。酵母株サッカロミセスセレビシエＹＰＨ５００（遺伝子型：MATα ura3-52 lys2-801_amber ade2-101_ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 Ieu2-Δ1）は、Difco-BD BiosciencesおよびSigma-Aldrichwasからの選択培地上において成長させた。コンピテント酵母細胞の形質転換は、リチウム酢酸塩法を使用して行なわれ、酵母は２８℃で成長させた。
【００７６】
試験セクションにおいて使用される実験的プライマーは、以下に示される。
【００７７】
【表１−１】
0006501756.tif 000002
【００７８】
【表１−２】
0006501756.tif 000003
【実施例２】
【００７９】
実施例２：ＹＦＶ−１７Ｄ、デング熱タイプ２（ＤＥＮＶ２）、およびデング熱タイプ４（Ｄｅｎｖ４）のウイルスｃＤＮＡを含む本発明に係る細菌人工染色体の産生
ＹＦＶ−１７Ｄ、デング熱タイプ２（ＤＥＮＶ２）、およびデング熱タイプ４（Ｄｅｎｖ４）のウイルスｃＤＮＡを含む本発明に係る細菌人工染色体は、以下に記載するように製造された。
【００８０】
材料および方法 
プラスミド構築物（細菌人工染色体） 
すべてのプラスミド構築物は、標準的な技術によって生成され、サンガー配列決定技法によって確認された。誘導性シャトルベクターｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅは、以下のいくつかのステップにおいて生成された（図１）。まず、アラビノース誘導性ｐＢｅｌｏＢＡＣ／ｏｒｉＶ（Wild et al. (2002) Genome Res. 12, 1434-1444)の誘導体であるｐＢＡＣ／ＬａｃＺ（Addgeneプラスミド＃１３４２２）内に存在するｌａｃＺ遺伝子が、（ｉ）ヒグロマイシンＢに対する抵抗性を有するｈｐｈ遺伝子を駆動するシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター／起点（配列番号１）と、（ｉｉ）デルタ肝炎ウイルス（ＨＤｒｚ）のゲノムリボザイムの合成ｃＤＮＡ（Chadalavada et al. (2007) RNA 13, 2189-2201）（配列番号２）と、（ｉｉｉ）サッカロミセスセルビシエエピソーム２μプラスミド起点および（ｉｖ）トリプトファンを栄養原体増殖させるＴＲＰ１遺伝子とを含む合成ＤＮＡカセットによって置き換えられる。ビルディングブロック（ｉ）は、プライマー＃３３４および＃４２５を使用してｐＢＡＢＥハイグロ（Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 3587-3996；Addgeneプラスミド＃１７６５）から増幅されたＰＣＲであった。ビルディングブロック（ｉｉ−ｉｖ）は、プライマー＃４２６および＃２３１を使用してpJet(-)/Trp1_2micron-YF3'_HDrz_BstEから増幅されたＰＣＲであった。プラスミドpJet(-)/Trp1_2micron-YF3'_HDrz_BstEは、ＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡの３′末端（ウイルスｎｔ９４６６から１０８６２を含む）と（ｉｉ）ＨＤｒｚ（ＤＮＡヌクレオチド＃１０９、１１０、および１１１から組み立てられる）との融合体と、ＰＣＲプライマー＃１９４および＃１９５を使用してｐＲＥ６３７（Esteban & Fujimura, (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 2568-2573）から取り出された（ｉｉｉ+ｉｖ）２μ−ＴＲＰ１配列とを含む、pJet1.2/blunt（ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキット、Fermentas）の誘導体である。ビルディングブロック（ｉ）は、ｐＢＡＣ／ＬａｃＺのＳａｌＩサイトへクローン化される前にオーバーラップ伸展ＰＣＲによって（ｉｉ−ｉｖ）に融合され、ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／ＳＶ４０＿Ｈｙｇｒｏ＿ＨＤｒｚ中間構築物を生じさせた。続いて、ｈｐｈ遺伝子スタッファー要素が、プライマー＃４７４および＃４７５を使用した全長プラスミドにわたる逆ＰＣＲ、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼによる再円化によって、大腸菌における形質転換およびクローン化の前に、最終ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅシャトルベクター（図１Ａ）における多重クローニングサイト（ＳｆｉＩ−ＰｍｅＩ−ＢｓｔＥＩＩ）のためのｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／ＳＶ４０＿Ｈｙｇｒｏ＿ＨＤｒｚから置き換えられた。
【００８１】
ウイルス発現構築物ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＤＶ２、およびｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＤＶ４は、ＹＦＶ−１７Ｄ（配列番号３）、ＤＥＮＶ２鎖ニューギニアＣ（ＮＧＣ）およびＤＥＮＶ４鎖ドミニカのｃＤＮＡをそれぞれＳ．セルビシエにおける相同組み換え（図１Ｂ）によってｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅに貼り付けることによって生成された。そのため、ウイルスｃＤＮＡは、５′末端におけるＳＶ４０プロモーター／起点の−７６ｂｐ（Ghosh et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 100- 104）と３′末端における８６ｎｔ ＨＤｒｚ配列（Chadalavada et al., (2007) RNA 13, 2189-2201）とを含む最終伸展を導入する３ラウンドのＰＣＲによって増幅された。最初のＰＣＲ（１０サイクル）は、ウイルス特定プライマー組み合わせ＃４５４プラス＃４５７、＃４５５プラス＃４５８、および＃８５６プラス＃８５７をそれぞれ使用し、その後の１０サイクルの各々では、ＳＶ４０およびＨＤｒｚに特定的な＃４５３プラス＃４５６、および最終的に＃４５３プラス＃１１１プライマーを使用した。それぞれのウイルスｃＤＮＡ鋳型は、ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１ＤＩＩ（上記のBredenbeek et al. , (2003)）、ｐＡＣＮＲ−ＤＥＮＶ２、およびｐ４（Durbin et al. (2001) Am J Trop Med Hyg. 65, 405-413）であった。プラスミドｐＡＣＮＲ−ＤＥＮＶ２は、ＤＥＮＶ２ ＮＧＣ ｃＤＮＡ由来のｐＤＶＷＳ６０１(Gualano et al. (1998) Gen. Virol. 79, 437-446）に置き換えられながら、ウイルスゲノムのｎｔ位置７５３７および１０２３２に付加的な翻訳静的ＡｇｅｌおよびＢｓｔＥＩＩサイトを含むｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７Ｄの誘導体である。組み換えに必要な線形化ベクター部分は、プライマー＃５５２プラス＃５５３を使用してＰｍｅＩを用いて予備線形化されたｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅに対する逆ＰＣＲによって作られた。ベクターアンプリコンは、ゲル精製および酵母ＹＰＨ５００への形質転換前にＤｐｎＩを用いて処理され、切断されていないプラスミド鋳型のバックグラウンド形態キャリーオーバーを減少させた。酵母クローンは、トリプトファンの無い状態で成長し、組み換えシャトルプラスミドが選択された。酵母ミニプレップから取り出されたプラスミドＤＮＡは、大腸菌Ｅｐｉ３００−Ｔ細胞 (Epicenter）へ移され、０．１％（ｗ／ｖ）のＬアラビノースを一夜で培養された６倍希釈から新鮮なＬＢ媒体（２０ｍＭの塩化マグネシウムを補充）へ付加し、強度の振動を伴う３７℃での６時間にわたる成長によって記載のように増幅された（上記のWild et al. (2000)）。
【００８２】
ＮＳ５ ＯＲＦ（ＲｄＲｐΔＧＤＤ）に無変換致死変異を含むＹＦＶ−１７Ｄ変異体は、ｎｔ９２９４の下流に適切に変異したＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡを含む酵母エピソームプラスミド（ＹＥｐ）p404Gal1/HA-NS5ΔGDD_ura3に由来する３，６ｋｂの長さのＢｇ／ＩＩ−ＰｓｔＩ制限フラグメントを、ＣｌａＩによって線形化されたｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（ＹＦＶ−１７Ｄ ｎｔ９６５６の下流）およびＫａｓＩ（ＨＤｒｚ ｎｔ位置＋２７の上流)に同相組み換えしてｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤΔＧＤＤを得ることによって生成された。
【００８３】
結果 
一連の合成ＤＮＡ構築物（ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ）は、いくつかのＤＮＡビルディングブロックから組み立てられ、ＲＮＡウイルス発現プラスミドとして機能した（図１）。共通のベクター構築物ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅは、大腸菌における状態増幅のための第２の起点（ｏｒｉＶ）と、酵母２μ起点およびサッカロミセスセルビシエにおけるエピソーム複製のためのＴＲＰ１栄養要求性マーカーとを含む細菌人工染色体である（図１Ａ）。ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡは、ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣ／Ｐｍｅ内に存在するＳＶ４０プロモーターとＨＤＶリボザイムとの間の相同によってｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄを得るために挿入された（図１Ｂ）。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄのマップが図８に示される（配列番号４）。他のフラビウイルスのｃＤＮＡもまた挿入された。ｐＡＣＮＲ・ＦＬＹＦ１７ＤＩＩなどの先行技術のフラビウイルスｃＤＮＡクローンとは対照的に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄは、大腸菌における優位な遺伝子安定性を示し（図２）、高いプラスミドＤＮＡ収率を生成するように誘導され得る。
【実施例３】
【００８４】
実施例３：ＹＦＶ−１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含む本発明に係る細菌人工染色体のインビトロおよびインビボの特徴化 
本発明に係る細菌人工染色体から発現されるＹＦＶ−１７Ｄの特徴は原生の原生ワクチンのものと同一であることが分かった（複製の効率、ウイルス収率、およびプラーク表現型など）。また、この裸ＹＦＶ−７１ＤプラスミドＤＮＡがＡＧ１２９マウスの腹腔内に注射されると、親ウイルスと同様の病理、病的状態、および死亡率が結果として現れる。この簡便、堅牢、かつ再現可能な系は、真核細胞培養または有胚鶏卵を必要とすることなく低コストでＹＦＶのＤＮＡワクチンを提供する。これは、もはやコールドチェーンを必要とせず、針を用いずに投与することができる。
【００８５】
材料および方法 
インビトロ転写、インビトロキャッピング、および電気穿孔 
全長ＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ（Bredenbeek et al. (2003) J. Gen. Virol. 84, 1261-1268）は、ＡｆｌＩＩを用いて線形化され、プロテイナーゼＫ消化、フェノールクロロホルム抽出、およびエタノール沈澱によって精製された。代替的に、インビトロ転写（ＩＶＴ）のための全長ｃＤＮＡ鋳型がプライマー＃１７３および＃５５ならびにＫＡＰＡ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用したｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩのＰＣＲによって作られ、プラスミド収率の制限が克服された。ランオフＲＮＡ転写産物は、インビトロにおいてＳｐ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用して産生された（Ribomax体規模ＲＮＡ産生キット、Promega）。転写産物は、精製されたワクシニアウイルス７−メチルグアノシントランスフェラーゼ（Scriptcap７ｍＧキャッピング系、Epicenter）を使用してキャッピングされ、キャリアＲＮＡとしてＢＨＫ−２１細胞から抽出された過剰な全ＲＮＡを使用したＢＨＫ−２１細胞の電気穿孔のために使用された。細胞培養培地は、トランスフェクトされた細胞がほぼ完全な細胞病原性を示した時に摘出された。遠心分離によってセルデブリスから媒体が取り除かれ、続いてＢＨＫ−２１細胞上にウイルスストックを準備するために使用された。
【００８６】
プラスミドトランスフェクション
Ｖｅｒｏ−Ｂ細胞は、１０％ウシ胎仔血清を含む媒地において６ウェルプレートに７０％の培養密度まで接種され、１：３のＤＮＡ対ビヒクル比率でＴｒａｎｓｉｔ−ＬＴＩ試薬（Mirus）を使用して２．５μｇのプラスミドＤＮＡを用いて後日トランスフェクトされた。プラスミドｐｍＲＦＰ１は、１：１０の比率で合わせて共にトランスフェクトされ、等しいトランスフェクション効能を確定するための視覚制御として機能した。長期にわたるウイルスストックの維持および産生のために、媒地は、２％のみの血清を含むように一夜の培養期間で変更された。
【００８７】
ウイルスＲＮＡ末端のマッピング 
ｐＳｈｕｔｔｌｅＢＡＣベクター由来ウイルスＲＮＡからの適切なプロセシングは、ｃＤＮＡ末端の急速増殖（ＲＡＣＥ）によって分析された。新しい逆連結反応／増幅プロトコルの後の５′ＲＡＣＥは、かなり詳細に開示された（Dallmeier & Neyts (2013) Anal. Biochem. 434, 1-3）。非ポリアデニル化ＹＦＶ−１７ＤゲノムＲＮＡの３′ＲＡＣＥは、本質的に以前に記載されたように行われた。簡単に、５μＬのデオキシリボヌクレアーゼＩで処理されたｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７ＤがトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞の全ＲＮＡ（ＲＮＡのうちの約１μｇ）は、１６℃で一夜における１０μＬの全反応量における１５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−８０００がある場合におけるＴ４ ＲＮＡリガーゼ２（New England Biolabs）のＫ２２７Ｑ変異体の活動により、５′アデニル化および３′ジデオキシトシン（ｄｄＣ）変質リンカー＃３９３（ｍｉＲＮＡクローニングリンカー１，ＩＤＴ ＤＮＡ技術）に連結された。連結反応生成物は、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ（Qiagen）によってＹＦＶ−１７Ｄおよびリンカー特定プライマー＃３９１および＃３９４を使用してそれぞれ増幅された。２６５ｂｐのアンプリコンは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによって生成されてサンガー配列決定法によって分析された３′アデニンオーバーハングを精白した後に、ゲル精製され、pJet1.2/blunt（ＣｌｏｎｅＪｅｔ ＰＣＲクローニングキット、Fermentas）にクローン化された。
【００８８】
細胞内ウイルス複製ＲＮＡ形態の検出 
アガロースゲル電気泳動を変性させた後のノーザンブロット法およびウイルス複製中間体の検出は、採用されたゲル系およびプローブ設計に関して僅かに変更を加えて本質的に記載のように行われた(Dallmeier et al. (2008) PLoS Pathog. 4, e1000230)。簡単に、３μｇの全ＲＮＡは、２０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ) プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ７．０、５ｍＭの酢酸ナトリウム、ならびに１％ホルムアミドおよび０．０１μｇのエチジウムブロマイドｍＬ−１を含む２ｍＭのメチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）中の１％アガロースゲルを介して熱変性されて分離され、その後に２０×ＳＳＣ（３Ｍ塩化ナトリウム、３００ｍＭクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０）において正の電荷を有するナイロン膜（Roche Diagnostics）上に毛細転移された。ＹＦＶ−１７Ｄ（ｎｔ７６３７−８１３６）のＮＳ５領域の５′末端に対して相補的な鎖特定ＤＩＧラベル一本鎖ＤＮＡプローブが、Knuchel et al. (2000) J. Histochem. Cytochem. 48, 285- 294により、プライマー＃９４７および＃９４８を使用して生成された。ハイブリダイゼーションおよび免疫検出は、フィルターハイブリダイゼーション（Roche Diagnostics）のＤＩＧ適用マニュアルによるものである。
【００８９】
プラーク検定およびＲＴ−ｑＰＣＲによるウイルス定量化 
トランスフェクトされた細胞から放出された感染性ウイルスは、 以前に開示された方法で（Kaptein et al. (2010) Antimicrob Agents Chemother. 54, 5269-8520）０．５×保存培地に置かれる１％微結晶セルロース（Avicell）を使用してＢＨＫ−２１細胞の合流単層に対する感染７日のウイルスプラーク測定法によって定量化された。感染したマウス組織におけるウイルスＲＮＡ負荷の定量化のために、スナップフローズン検死が行なわれた。ここでは、ＲＬＴバッファーにおけるPrecellysビード粉砕機（Rneasy、Qiagen）において破砕され、その後に全ＲＮＡが製造者の説明書に従って抽出された。ＮＳ３遺伝子の約１５０ｎｔ延長を標的としたプライマーおよび基準としてプローブの使用および同じクローン化されたＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡ断片の系列希釈により、開示されたものと全く同じ方法で（Kaptein et al. (2010)上記）ＹＦＶ−１７Ｄ ＲＮＡのための定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）が行なわれた。
【００９０】
免疫蛍光測定法 
トランスフェクション７日後のｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＤＶ２トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の取り除かれた上澄みが使用され、サブコンフルエントなＶｅｒｏ−Ｂ培養を接種するために使用された。Ｖｅｒｏ−Ｂ培養は、４％パラホルムアルデヒドにおいて５日後に固定され、本質的に以前に開示された方法で（De Burghgraeve et al. (2012) PLoS ONE 7, e37244）免疫染色された。細胞内Ｅ蛋白質発現は、DENV2血清型特定単クローン抗体（ｍＡｂ）３Ｈ５．１（ミリポア）、およびＡｂ分類された二次Alexa Lour-488（ミリポア）によって検出された。ＤＡＰＩ着色の後、細胞はFLoid Cell Imaging station（Life Technologies）を使用して視覚化された。
【００９１】
マウスのインビボトランスフェクション 
１０μｇから２０μｇのプラスミドＤＮＡが３３％プロピレングリコール中においてキャリア（Fumoto et al. (2012) Mol. Pharm. 9, 1962-1970）としての２０μｇ炭酸カルシウムマイクロフラワーと混合され、成体（約２０ｇ）のＡｇ１２９マウスの腹膜中に注射された。代替的に、弱毒化ＹＦＶ−１７Ｄワクチン（スタマリル（登録商標）、Sanofi Pasteur MSD、ブリュッセル）の半分の投与量が腹膜中に注射された。重量および挙動が毎日監視された。
【００９２】
結果 
哺乳動物細胞内にトランスフェクトされた場合、適切にプロセシングされたＹＦＶ−１７Ｄ ＲＮＡの転写は、細胞内の自律ウイルス複製（図３Ａ）を開始するｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（図３Ｂ）から行なわれる。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄがトランスフェクトされた細胞は、最終的に感染性ビリオンを分泌する。感染性ビリオンは、組織培養内における細胞変性効果を誘導する能力（図４Ａから図４Ｃ）、ウイルス収率、およびプラーク表現型（図４Ｄ+図４Ｅ）に関し表現型が親ＹＦＶ−１７Ｄウイルスとは区別することができない。産生された組み換えウイルスは、このため、生物学上同一（定量的および定性的）であると考えられる。同様に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＤＶ２がトランスフェクトされた細胞は、組み換え感染性DENV2ニューギニア株Ｃ（図５）を産生する。
【００９３】
ＹＦＶ−１７Ｄ感染の確立された致死のインビボマウスモデルであるＡＧ１２９マウスにおけるｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄの腹腔内トランスフェクション（Meier et al. (2009) PLoS Pathog. 5, el000614; Thibodeaux et al. (2012) Vaccine 30, 3180-3187）は、生来のＹＦＶワクチンであるスタマリル（登録商標）と同様のウイルス誘導死亡率（図６）および病的状態（図７）を引き起こす。結論として、簡便、堅牢、および再現可能な系は、真核細胞の培養および有胚鶏卵を必要とすることなく低コストでＹＦＶに対するＤＮＡワクチンを開発することが可能となり得る。これには、もはやコールドチェーンは必要ではなく、針を用いない投与となり得る。
【実施例４】
【００９４】
実施例４：皮下経路によって、および裸プラスミドＤＮＡの針無し噴射注入によって感染したＡＧ１２９マウスにおけるｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（ＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）によって誘導される病的状態および死亡率
腹腔内経路以外のｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（ＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）の適用経路の実現可能性を評価するために、９週齢の雄ＡＧ１２９マウス（雄、重量２２ｇから２５ｇ）のグループ（ｎ＝３）に対し、１００μＬの燐酸塩緩衝食塩水 （ＰＢＳ）中の２５μｇのＤＮＡ−ＹＦＶａｘが、（ｉ）注射器およびＧ２７針を使用して皮下（ｓ．ｃ．）に、または（ｉｉ）たとえばインシュリンもしくは麻酔薬のヒトへの医療的使用のための経皮的適用が許可された針無し噴射注射器（Injex-30、Injex Pharma GmbH、ベルリン、ドイツ）によって経皮的に（ｔ．ｄ．）注射された。上記のように２００μＬの３３％プロピレングリコール中の炭酸カルシウム微細結晶を用いて作られた２５μｇのＤＮＡ−ＹＦＶａｘが腹腔内に注射されたＡＧ１２９は、対照群としての役割を果たした。病的状態および死亡率は上記のように評価され、試験は３０日後に終了した（表２を参照）。
【００９５】
【表２】
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【００９６】
皮下および経皮経路でＤＮＡ−ＹＦＶａｘが注射されたＡＧ１２９マウスの少なくとも一部は、ＹＦＶ−１７Ｄによって誘導される病気の兆候を示し（体重の減少、毛の波打ち、背中のこぶ、後ろ脚の麻痺）、安楽死させなければならなかった。最も重要な点として、針無し噴射注入によって注射されたすべてのマウスが、１７日±２日以内にＹＦＶ−１７Ｄ誘導の脳炎によって一貫して死亡し、すべての腹腔内注射対照群マウスは、試験中（３０日）生き延びたことである。検査中に対照群が死亡しなかったこと（実施例３に示される１３±２のＭＭＤと比較）は、使用された動物は重量が大きく雄であったことによって容易に説明され得る。
【００９７】
注目すべきは、ＤＮＡ−ＹＦＶａｘのためのキャリアとして炭酸カルシウムを使用することは必ずしもワクチン投与に最適ではないということである。すなわち、注入の経路および炭酸カルシウムマイクロフラワーの異なるバッチ間での変動性の両方に応じてハムスターにおいて幾分の抑止効果が観測される場合があった（実施例５を参照）。結論として、ＤＮＡ−ＹＦＶａｘは、異なる形態において、および針無し噴射注入を含む異なる注入経路において投与が成功し得る。
【実施例５】
【００９８】
実施例５：ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（ＤＮＡ−ＹＶａｘ）を用いた免疫処置後のシリアンゴールデンハムスターのセロコンバージョン
ＤＮＡ-ＹＦＶａｘによるＹＦＶに対する防護免疫の誘導を評価するために、症状発現前のシリアンゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）モデルが使用された（Tesh et al. (2001) J Infect Dis. 183, 1431-1436）。このため、雌ハムスターのグループ（８週齢から１０週齢、９０ｇから１００ｇ）は、スタマリル（登録商標）の１／５投与量（１００μＬ）、または上記のように２００μＬの３３％プロピレングリコール中の炭酸カルシウム微細結晶を用いて形成された２０μｇのｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄ（ＤＮＡ−ＹＦＶａｘ)のいずれかの腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって免疫化された。代わりに、繰り返しで１０μｇのＤＮＡ−ＹＦＶａｘが適用された。血液は、完全な外科麻酔下において心臓穿刺によって週ごとに採られ、血清は、遠心分離によって採取され、−８０℃の冷凍で保存された。２匹の未処置のハムスターが、正常血清としての役割を果たした。関連する免疫保護を評価するために、（ｉ）間接免疫蛍光法分析（ＩＩＦＡ）、および（ｉｉ）プラーク減少中和テスト（ＰＲＮＴ）によって結成が分析された。
【００９９】
間接免疫蛍光法分析（ＩＩＦＡ）。免疫化されたハムスターの血清中のＹＦＶ−１７Ｄ（スタマリル（登録商標）およびＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）特定ＩｇＧ抗体は、ヒトへの臨床使用が公認された商用のＹＦＶ ＵＦＡキット（EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG、Lubeck、ドイツ、カタログ番号ＦＩ−２６６５−１００５ＧおよびＦＩ−２６６５−１０１０Ｇ）（Niedrig et al. (2008) Clin Vaccine Immunol. 15, 177-81）を使用して、一部変更を伴って製造者の説明書に従って判定された。ハムスターの血清は、サンプルバッファーにおいて２０倍、６６倍、２００倍、６６０倍、および２０００倍に希釈化され、３０μＬの血清希釈液がＹＦＶ−ＩＩＦＡスライド上に加えられた。スライドは、室温で３０分にわたって培養され、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中で５分間にわたって洗浄された。ゴールデンハムスターにおいて誘導された抗体の検出のために、ＦＩＴＣラベルの抗ハムスターＩｇＧ二次抗体 (Jackson Immuno Research Laboratories Inc.、カタログ番号３０７−０９５−００３）が、ＰＢＳ含有２％ＢＳＡ中において１：５０に希釈化され、キットに設けられた抗ヒト二次抗体の代わりに使用された。スライドはＤＡＰＩを用いて逆染色され、終点タイターが螢光顕微鏡検査法によって判定された。
【０１００】
プラーク減少中和テスト（ＰＲＮＴ）黄熱病ワクチン接種されたハムスターの血清中における中和抗体タイターがＰＲＮＴを使用して判定された。簡単に、０．５×１０６個のＢＨＫ細胞／ウェルが１２個のウェルプレートにおいて一夜にわたって増殖培養液（１０％ＦＣＳ、１％炭酸水素ナトリウム、および１％グルタミンが補充されたＭＥＭ媒体）中で平板培養された。すべての血清は、１：２０、１：６６、１：２００、１：６６０、１：２０００、および１：６６００系列希釈液でトリプレットにおいて分析された。３０μＬ血清希釈液は、ＹＦＶ−１７Ｄウイルス（スタマリル（登録商標）、ロットＧ５４００Ｐ１、Ｖｅｒｏ−Ｂ細胞上で一度培養）の４０個のプラーク形成を含む３０μＬ評価媒体と混合された。３７℃での１時間にわたるこの事前吸着の後、４４０μＬの分析媒体が加えられ、各合剤のうちの５００μＬがＢＨＫ細胞に加えられた。室温での１時間の培養後、細胞は洗浄され、０．５％の最終濃度のＬＭＰアガロース（Invitrogen）で補充された分析媒体が加えられた。その後、細胞は３７℃で５日間にわたって培養され、２時間にわたって８％ホルムアルデヒドで固定され、Ｇｉｅｍｓａ染色液で着色された。プラークが数えられ、５０％中和タイターがReed and Munch(Reed & Muench ( 1938) Am. J. Hyg. 27, 493-497)に従って計算された。
【０１０１】
全体的に、ＩＩＦＡによる交差反応抗体の検出（表３）およびＰＲＮＴによる中和抗体の検出（表４）は一貫していた。ワクチン効能に関し、ＤＮＡ- YFVaxは、スタマリル（登録商標）に対して劣性を示さなかった。両方の試験グループにおいて、３つの個体のうちの２つ（１／５スタマリル（登録商標）対２０μｇＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）、および５つのうちの４つ対４つのうちの２つの個体（１／５スタマリル（登録商標）対１０μｇＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）は、ＹＦＶ交差反応および中和抗体の高いタイターにセロコンバートされた（表３および表４）。これらの値は、完全な防御免疫（免疫保護）を表わすものと考慮され得て、４０より大きいＰＲＮＴタイターは、致死的なＹＦＶ抗原投与ハムスターモデルにおいて保護的である（Julander et al. (2011) Vaccine 29, 6008-6016）。最も重要なことは、ＷＨＯは、既に０．７より大きいログ中和率（ＬＮＩ）は霊長類における予防接種後の免疫保護に相関すると宣言しており、これはヒトに適用される（WHO position paper (2013) Wkly. Epidemiol. Rec. 88, 269-283.）。０．７より大きいＰＲＮＴログ１０滴定濃度のベンチマークは、数倍の大きさで、１５０倍より大きくハムスターにおけるＤＮＡ−ＹＦＶａｘによって越えられている（表４を参照）。
【０１０２】
また、免疫反応は、スタマリル（登録商標）と比較した場合にＤＮＡ−ＹＦＶａｘでワクチン接種された個体においてより相同であり、高いＰＲＮＴタイターへのセロコンバージョンが一貫して４週間後のみでなく、３週間にわたって検出され、すなわち、スタマリル（登録商標）グループからの他のセロコンバーターよりも３週間遅れている。
【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
【表４】
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【実施例６】
【０１０５】
実施例６：クローン化されたＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡの遺伝的不安定性の評価
（ａ）開始材料：ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ（Bredenbeek et al. (2003)上記）およびｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄの大規模プラスミド製剤が標準的な技術を使用して行なわれた。このため、ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩは、標準的な大腸菌Ｋ１２誘導体株において形質転換され、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で平板培養され、好ましいプラスミド安定性となるように２８℃（３７℃の代わり）で一夜にわたって成長された。小さなコロニーが２日間の連続的な一夜培養において強度の振動下において２８℃で１００μｇ／ｍＬを含むＬＢにおいて拡大および成長し、最終的に１Ｌバッチ培養に到達した。このバッチは、２８℃で一夜で成長し、最終的に、クロラムフェニコールを２０μｇ／ｍＬの最終濃度となるまで添加することによってさらに２８℃で８時間にわたって増幅された。同様に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄは、大腸菌株ＥＰＩ３００−Ｔ細胞(Epicentre)において形質転換され、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上で平板培養され、さらに３７℃で一晩で成長した。後者のプラスミドは、これに伴って拡大し、さらにすべての増殖が２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールの存在下において３７℃で行なわれた。最終的な一夜のバッチ培養は、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールおよび０．０１％Ｌアラビノースを含む新鮮なＬＢ媒体に６分の１に希釈化され、６時間以下の時間にわたって成長された。プラスミドは、標準的なカラム親和性精製（Qiagen）を使用して精製され、ＴＥ（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）において１μｇ／ｍＬの最終濃度に溶解され、−２０℃において冷凍保存された。
【０１０６】
（ｂ）コロニー成長およびサイズ。両方のプラスミドは、大腸菌ＥＰＩ３００−Ｔに形質転換され、選択培地としての適切な抗生物質を含むＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地（２％ペプトン、０．５％ＮａＣｌ、１％ラクトース、０．１５％胆汁酸塩、０．００３％ニュートラルレッド、０．０００１％クリスタＩバイオレット、１．３５％寒天培地）上に筋状に接種される。無菌ジルコニアビード（直径２．５ｍｍ）が寒天培地に埋め込まれ、絶対ゼロ測定のためのキャリブレータとして機能する。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄで形質転換されたバクテリアの１つの部分標本について、寒天培地は、追加の０．０１％Ｌアラビノースを含む。３７℃での１６時間にわたる培養の後、通常のデジタルカメラ（Canon Powershot SX10IS）を使用して写真が撮影され、ＪＰＥＧファイルとして保存された（図９を参照）。画像は、Geissman (2013) PLoS One.8, e54072.のコロニーカウントおよびサイズに関する画像分析のために、OpenCFUバージョン３．８．１１に送られた。
【０１０７】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄを持つ大腸菌クローンは、クローンを含むｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ（図９Ａ）と比してより大きなサイズおよびより相同の個体群（図９Ｂ）に成長した。偶然にも、これにより、アラビノース誘導状態（図９Ｃ）においても低い毒性のｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄが残った。ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ形質転換体個体群に存在するより大きなコロニー(図９Ａ）は、有毒なウイルス蛋白質の潜在発現を除去した変異を伴うプラスミドを含む可能性が最も高い（実施例６を参照）。
【０１０８】
画像分析は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄ対ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ含有クローンにおいて非常に高い相同性を示した（表５）。実際に、ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７Ｄ形質転換体は、異なる平均サイズの少なくとも２つの下位個体群に明らかに分割され、（ｉ）平均からの大きな標準偏差（表５）、非ガウスサイズ分布（図１０Ａ）、および（ｉｉｉ）たとえば、算出された算術平均と正中コロニー サイズとの大きな差（表５）が得られた。対照的に、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄを有する形質転換体は、より同相のコロニーサイズ（表５）およびベル形状のガウスサイズ分布（図１０Ｂ）を示す。偶然にも、後者は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄのアラビノース誘導状態に完全に適用される（表５、図１０Ｃ）。
【０１０９】
【表５】
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【実施例７】
【０１１０】
実施例７  大腸菌におけるクローン化されたＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡの増殖時の変異パターンおよび頻度 
ＹＦＶ−１７Ｄ ｃＤＮＡ含有プラスミドのクローン遺伝子安定性に対処するために、実施例６に記載される両方のプラスミドは、大腸菌ＥＰＩ３００−Ｔに形質転換され、上記のように選択培地として適切な抗体を含有するＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天培地上に筋状で摂取された（実施例６ｂを参照）。ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩクローンは、２８℃で２４時間にわたって培養され、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦ１７Ｄクローンは、３７℃で１６時間にわたって培養された。
【０１１１】
各プラスミドについて、２４から４８コロニーの各々のうち２つのシリーズが、２００μＬ液体培地（２０ｍＭのＭｇＣｌ２が補充された適切な抗生物質を含むＬＢ）へのプラスミド増殖のために選ばれた。小さいコロニーから開始するために１つのｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩシリーズが選択され（ｐＡＳシリーズ）、１つが大きなコロニーから選択された。大きなサイズの差が観察されないｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｙ１７Ｄについて（実施例６ｂを参照）、妥当なサイズの差を伴うコロニーが、小さいコロニー（ｐＳＳシリーズ）および大きなコロニー（ｐＳＬシリーズ）から開始する培養の２つのシリーズとしてそれぞれ選択された。
【０１１２】
ｐＡＣＮＲプラスミドを含有するバクテリアが２８℃において２４時間にわたって培養され、ｐＳｈｕｔｔｌｅコロニーが３７℃で一夜にわたって培養され、その後にクロラムフェニコールおよび０．０１％アラビノースを含有する６００μＬのＬＢにおいて６時間にわたって培養された。これらの培養の一部［経路０（Ｐ０）のプラスミドとして考慮される］は、プライマー＃２０８および#９４（ＹＦＶ−１７Ｄ ｎｔ１−９４０に対応）ならびに＃９５３および＃９５４（ＹＦＶ−１７Ｄ ｎｔ２５００−３６００に対応）をそれぞれ使用した増幅のためのＰＣＲ（GoTaq Green Mastermix、Promega）への直接的な対象となる。
【０１１３】
アンプリコンは、親和性が浄化され（Qiagen）、プライマー＃２０８および＃９５３をそれぞれ使用して直接的に配列される（Bigdye、Applied Biosystems）。分析されたｃＤＮＡ領域は、以前より知られる毒性の決定因子、すなわちウイルス性５′非翻訳領域における大腸菌における異常な転写および翻訳（Li et al. (2011)上記; Pu et al. (2011)上記）およびウイルスＥ−ＮＳ１領域内の特に疎水性の蛋白質伸長（Yamshchikov et al. (2001) Virology 281, 272-280）のための潜在プロモーターを伴うｃＤＮＡを含むことが予期された。
【０１１４】
各培養されたクローンの各々の他の部分は、新鮮な媒地において１／１００に希釈化され、以前と同様に次なる経路（Ｐ１）を生じさせる。後者は、１０の経路（Ｐ１０）まで繰り返される。Ｐ１、Ｐ３、およびＰ３からのプラスミドは、以前のようにＰＧＲおよい配列によって分析された。Ｐ１０について、プラスミドは、媒体の５ｍＬの量まで大きく成長し、プラスミドは、標準的なアルカリプラスミドミニプレップ手順によって単離される。これらのプラスミドミニプレップは、（ｉ）アガロースゲル電気泳動検査後のＰＧＲ分析（ｎｔ１−９４０および２５００−３６００領域の両方を標的とする）、（ｉｉ）直接配列（ＰＣＲアンプリコンが検出され得る場合）、および（ｉｉｉ）ＰｓｔＩを使用した制限分析の対象となった。Ｐ０、Ｐ１、Ｐ３、およびＰ１０の配列結果は、表６および表７にまとめられている。Ｐ１０のＰＣＲおよび制限分析の結果は、表８にまとめられている。
【０１１５】
初期経路に見つかった変異 
ｐＡＳおよびｐＡＬシリーズの初期経路からのプラスミドの直接配列（低い経路番号Ｐ０からＰ３）（表６）は、元のクローンプラスミド製剤において１３％という高い変異頻度を示した（実施例６ａを参照）。見付かったほぼすべての変異は、未熟停止コードン（ＰＭＳｔ）および単一のヌクレオチド欠失／挿入の導入によるノンセンスもしくはフレームシフト変異（ＦＳ）であった。これらの変異は、全長ＹＦＶ−１７Ｄ読取枠（ＯＲＦ）の明らかに完全な切除発現であった。ｐＳＬシリーズにおいて、同様の変異はＰ１において見られたが、頻度は低かった。Ｐ０におけるｐＳＳシリーズにおいて、ウイルスＯＲＦの発現を消失させないミスセンス変異が見付かった。
【０１１６】
結論として、ＹＦＶ−１７ＤのｃＤＮＡを担持する元のクローンプラスミド（実施例６ａを参照）の大規模な製剤は、容易に検出可能な量の変異体プラスミド変種を含む。ｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩの場合において、変異の大部分は、それぞれの変異体ｃＤＮＡから生じるウイルスＲＮＡを明らかに無能化する全長ウイルスポリ蛋白質の発現を切り離す。これは、すべてのプラスミドクローンのうちの１０％以上に当てはまる。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄの場合において、変異頻度は低く（１０％未満）、最も重要なことは、変異体の小さな割合が無能化されたウイルスの先天的な複製を構成する点である。
【０１１７】
経路ｐ１０において見つかった変異 
ｐＡＬおよびｐＡＳシリーズからのプラスミドが経路Ｐ１０において分析された時、プラスミドの大部分は、大きな構造的な再配列を含み、これにより、４８のうちの１０（２１％）および４８のうちの４４（９２％）のプラスミドクローンが、ｎｔ２５００−３６００領域の増幅に完全に失敗した（表８）。数キロベースに至るＤＮＡがプラスミドから消失するという、後者の変異体プラスミドに異常な制限パターンが伴った。注目すべきは、試験されたすべての変異体クローンは、依然としてｎｔ１−９４０領域（表６）を含み、無関係の汚染物ではなく元のｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ（表８）の子孫である可能性が高かった。このような毒性のｃＤＮＡ断片の欠失は予期されており、先行技術において報告されている（Yamshchikov et al. (2001)上記）。
【０１１８】
対照的に、同様の再配置および欠失は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＹＦＶ１７Ｄシリーズには見つからなかった。ここれ、４８のうちの２つのみ（４％）が、Ｅ−ＮＳ１コード領域におけるフレームＡＴＧ開始コドン（ｎｔ２９５７−２９５９）において明らかに変化するミスセンス変異を示す。これは、ウイルスＯＲＦの発現を消失させない。
【０１１９】
結論として、元のクローンｐＡＣＮＲ−ＦＬＹＦ１７ＤＩＩ（実施例６ａを参照）を繰り返し継代することにより、ウイルスｃＤＮＡにおいて大きな欠失が起こり、それぞれの変異体ｃＤＮＡから生成されるウイルスＲＮＡを完全に無機能化させる可能性が明らかに最も高いすべてのプラスミドのうちの９０％以上に至る機能性ｃＤＮＡの損失が起こる。ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄの場合において、変異頻度はかなり低く（５％未満）、最も重要なことは、たとえば弱毒化ＤＮＡワクチンとしての使用を不可能にする先天的複製機能の損失したウイルスが観察され得ないということである。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
【表８】
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【実施例８】
【０１２３】
実施例８：キメラ型フラビウイルスワクチンのための発現ベクターとしてのｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−ＪＥ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−ＷＮ、およびｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−ＵＳＵの構造 
ＹＦＶ−１７Ｄの組み換えキメラ型誘導体が開発され、非対応抗原のためのベクター（Guy et al. (2010) Vaccine 28, 632-49; 米国特許出願公開第２０１００２７８７７３号）、たとえば日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）および西ナイルウイルス（ＷＮＶ）のｐｒＭおよびＥ蛋白質などの他の病原性フラビウイルス抗原の表面糖蛋白質のためのベクターとしてＹＦＶ−１７Ｄが機能するワクチンとして使用される。これらは、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥ（Ｉｍｏｊｅｖ（登録商標） Sanofi Pasteur-MSD)およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＷＮ２０としてそれぞれ開発された。本発明に係るｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ−１７Ｄ（ＤＮＡ−ＹＦＶａｘ）は、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡからこれらの上記のＣｈｉｍｅｒｉＶａｘワクチンウイルスを直接的に開始することができるように変更され得て、生ウイルスを含有する前記弱毒化ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥ（Ｉｍｏｊｅｖ（登録商標））およびＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＷＮ２０ワクチンと完全に置き換えることができる。
【０１２４】
ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥ（図１１ａ）を発現するＢＡＣは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ１７ＤにおけるＹＦＶ−１７Ｄのｎｔ４８２−２４５１を、神経弱毒化ＪＥＶワクチン株ＪＥ ＳＡ１４−１４−２（Chambers (1999) J. Virol. 73(4), 3095-3101; Arroyo et al. (2001) J. Virol. 75, 934-942.）のｎｔ４７７−２４７７にＹＦＶ−１７ＤバックボーンのＮＳ２ＡおよびＮＳ４Ｂ遺伝子における２つの適合性変異を加えたもの（Pugachev et al. (2004) J. Virol. 78, 1032-1038）に代替することによって産生される。これは、３つのプラスミド断片を相同再配列および結合させることによって実現される。これらは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＹＦＶ１７Ｄの２つのＰＣＲアンプリコン（ｎｔ７２２８−４８１、およびｎｔ３９６６−７３４２）、および慣習的ＤＮＡ合成によって作られたキメラ型ＹＦＶ−ＪＥＶ ｃＤＮＡ断片(IDT Integrated DNA Technologies, Haasrode, Belgium)である。後者は、ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ-JEのｎｔ３５９−４１０５を含む（図１１ａ）。最終的な構築物は、配列番号５において特定される配列を有する。
【０１２５】
ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＷＮ０２、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＷＮ０２を発現するＢＡＣ（図１１ｂ）は、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥのｐｒＭ−Ｅ遺伝子領域を、Monath et al. (2006) (Proc Natl Acad Sci USA. 103, 6694- 6699)によるＥ蛋白質における３つの神経弱毒性変異、すなわちＬ１０７Ｆ、Ａ３１６Ｖ、およびＫ４４０Ｒを含む領域ＷＮＶ（ＮＹ９９株）のそれと置き換えることによって産生される。このため、キメラ型ＹＦＶ−ＷＮＶ ｃＤＮＡ断片は、慣習的ＤＮＡ合成（IDT Integrated DNA Technologies, Haasrode, Belgium）によって作られ、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＣｈｉｍｅｒｉＶａｘ−ＪＥのＸｈｏＩ（ｎｔ４０６）およびＫａｓＩ(ｎｔ２４７７）サイトに再結合される。最終的な構築物は、配列番号６で特定される配列を有する。
【実施例９】
【０１２６】
実施例９：異なるピコルナウイルスのための発現ベクターとしてのｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅｖ７１の構造 
エンテロウイルス属は、センス方向におけるＲＮＡゲノムを有する小さい無外膜ウイルスのピコナウイルスのファミリーに属する（＋）−ＲＮＡウイルスである。典型的に、ピコナウイルスのゲノムは、キャッピングされないが、代わりに５′末端が共有結合で取り付けられたＶＰｇ蛋白質を担持する。キャップ構造の無い状態で、内部のリポソーム導入部位（ＩＲＥＳ）は、ウイルス蛋白質発現のためのウイルスＲＮＡへの細胞翻訳機構を採用する。原則的に、ピコルナウイルスにおける感染性ウイルス後代の複製および産生は、ウイルスゲノムの異種転写の後に細胞内で開始される。先行技術において、ウイルスゲノムは、 ファージプロモーターの制御下におけるｃＤＮＡから発現され、同族のファージＲＮＡポリメラーゼがプロデューサ―セル（２プラスミド系）に共トランスフェクトされ、発現した場合にのみ転写される。同様に、前記ファージポリメラーゼは、組み換えバキュロウイルス（Yap ef al. ( 1997) Virology. 231, 192-200）などのヘルパーウイルスを使用したｃＤＮＡの形質導入時に細胞内で発現され得る。
【０１２７】
先行技術の複雑な手法の代わりに、ピコルナウイルスｃＤＮＡは、ヒトエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）について以下で例示されるようなウイルス複製の直接的な開始のために、ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＢＡＣ（１プラスミド系）の誘導体から細胞内で発現され得る。このため、ＥＶ７１ゲノムは、デルタ肝炎ウイルスリボザイムが続く５′ＳＶ４０プロモーターおよび３′末端ポリＡテールを有するｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＢＡＣ内に発現カセットとしてクローン化される。これは、プライマー♯９９１および♯９９２を使用するＰＣＲによってＥＶ７１のｃＤＮＡを増幅すること、およびそれぞれの発現カセットを生成するためにプライマー＃４５３および＃９９０を用いて再増幅することによって実現される。異なる核酸源が、このＰＣＲのための鋳型として使用され得て、７．４ｋｂ長のＥＶ７１ ｃＤＮＡが適切に増幅され、それらは、（ｉ）Chua et al. (2008) J. Gen. Virol. 89, 1622-1632)およびZhang et al. (2013) Virus Genes. 47, 235-243)によって開示されるようなＥＶ７１の既にクローン化されたｃＤＮＡ、または（ｉｉ）任意の組織培養の逆転写による生成物、またはヒトもしくは動物組織由来のＥＶ７１の全長ゲノムＲＮＡである。代替的に、（ｉｉｉ）ＥＶ７１ ｃＤＮＡが慣習的な遺伝子合成によって作られ得る。ｃＤＮＡの源に関わらず、生成された発現カセットは、ＰｍｅＩを使用した制限酵素消化、好ましくは酵母における組み換えによって線形化されたｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＢＡＣ−Ｐｍｅ内に挿入される。このような構築物は、ＥＶ７１株ＢｒＣｒ−ＴＲ(Arita et al. (2005) J. Gen. Virol. 86, 1391-401）についての配列番号７において特定される配列を有する。
【０１２８】
たとえば、ヒトライノウイルス１４（ｈＲＶ１４）などの他のエンテロウイルス属のクローン化については同様の戦略が行なわれ、プライマーの第１集合のみがウイルスｃＤＮＡの初期の増幅について変更される。ｈＲＶ１４の適切なプライマーは、♯９８８および♯９８９である。
【０１２９】
感染性ＥＶ７１およびｈＲＶ１４ウイルスは、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＥＶ７１およびｐＳｈｕｔｔｌｅ／ｈＲＶ１４プラスミドの、それぞれの、培養されたヒト子宮頸癌（ＨｅＬａ）細胞のトランスフェクションによって、またはインビボトランスフェクションによって生成される。その弱毒化変種は、同様の方法で産生され得て、弱毒化ワクチンとして使用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１３−１２】
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【図１３−１３】
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【図１３−１４】
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【図１３−１５】
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【図１３−１６】
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【図１３−１７】
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【図１３−１８】
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【図１３−１９】
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【図１３−２０】
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【図１３−２１】
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【図１３−２２】
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【図１３−２３】
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【図１３−２４】
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【図１３−２５】
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【図１３−２６】
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【図１３−２７】
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【図１３−２８】
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【図１３−２９】
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【配列表】
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