(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のmiR-21-5pの発現量を測定する工程を含み、前記生物学的試料中のmiR-21-5pの発現量が、正常組織中のmiR-21-5pの発現量と比較して高いことが、前記生物学的試料が自己免疫性肝炎由来のものであることを示すことを特徴とする、自己免疫性肝炎の診断補助方法。
【請求項２】
前記生物学的試料は、被験者から採取された血清であることを特徴とする、請求項１に記載の自己免疫性肝炎の診断補助方法。
【請求項３】
前記miR-21-5pは、リアルタイムPCR法で検出されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の自己免疫性肝炎の診断補助方法。
【請求項４】
自己免疫性肝炎を診断するためのキットであって、生物学的試料におけるmiR-21-5pを増幅するためのプライマーセットを含み、前記生物学的試料中のmiR-21-5pの発現量が、正常組織中のmiR-21-5pの発現量と比較して高いことが、前記生物学的試料が自己免疫性肝炎由来のものであることを示す、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性肝炎を診断するためのバイオマーカー、自己免疫性肝炎の診断補助方法、及び、自己免疫性肝炎を診断するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎には、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎（以下、「AIH：Autoimmune hepatitis」と略することがある。）が知られている。ウイルス性肝炎及びアルコール性肝炎については発症の原因物質が明らかとなっているが、AIHについてはまだ解明されていない。AIHは女性に多い疾患であり関節痛・全身倦怠感、食欲低下、悪心、黄疸、発熱等の症状を呈す。多くの症例では、副腎皮質ステロイド投与が極めて良く奏効し、投与によりAST、ALTは速やかに基準値内へと改善するが、治療開始が遅れた場合、有効性は低下する。
【０００３】
AIHの診断は、特異性の高い診断マーカーが存在しないため、ウイルス性肝炎の有無を確認した後、血清トランスアミナーゼ・血清γグロブリン・自己抗体（抗核抗体、抗平滑筋抗体）の検査結果を総合的に判断してなされるものである。2013年版改訂厚生労働省「難治性の肝・胆道疾患に関する調査研究」班AIH診断指針でも、(1)他の原因による肝障害が否定される、(2)抗核抗体陽性あるいは抗平滑筋抗体陽性、(3)IgG高値（＞基準上限値1.1倍）、(4)組織学的にinterface hepatitisや形質細胞浸潤がみられる、(5)副腎皮質ステロイドが著効する、のうち上記項目で１を満たし、2〜5のうち3項目以上を認める場合をAIH典型例に該当するとしている。
【０００４】
特許文献１には、血清あるいは血漿中の所定の抗サイトケラチン抗体がAIH患者で有意に高値を示し、更に抗体の量が治療に伴って減少することが記載されている。
【０００５】
近年、血液試料中の肝特異的なmiRNAは既存の診断マーカーに比べて組織特異性が高いことから、高感度なマーカーとして注目されている。非特許文献１には、AIH患者では、血清内のmiR-941とmiR-1280の発現量が低下していることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−２６４３３５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「自己免疫性肝疾患における血清内microRNAの発現を解析することで病因解明できる可能性がある」日本消化器病学会,ポスターセッション(肝臓学会)自己免疫性肝疾患４,二宮匡史,2007年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上述の技術によってはAIHの迅速且つ的確な診断は十分であるとはいえない。
【０００９】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、迅速且つ的確なAIHの診断を可能とするバイオマーカー等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかるバイオマーカーは、自己免疫性肝炎を診断するためのバイオマーカーであって、miR-21-5pであることを特徴とする。
【００１１】
本発明にかかる自己免疫性肝炎の診断補助方法は、生物学的試料中のmiR-21-5pの発現量を決定するステップを含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明にかかるキットは、自己免疫性肝炎を診断するためのキットであって、生物学的試料におけるmiR-21-5pの発現量を検出又は定量する手段を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、AIHの迅速且つ的確な診断が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】AIHに特異的なmiRNAの発現量を示す図である。
【図２】治療前及び治療後におけるmiRNAの発現量を示す図である。
【図３】健常人及び慢性C型肝炎患者と比較したAIH患者のmiRNA-21-5p発現量を示す図である。
【図４】ステロイド治療におけるmiRNA-21-5p発現量を示す図である。
【図５】(A)はASTとの相関を示す図であり、(B)はASTとの相関を示す図である。
【図６】肝硬変進展例におけるmiRNA-21-5p発現量を示す図である。
【図７】肝組織の線維化の進行とmiRNA-21-5p発現量との関係を示す図である。
【図８】肝炎の活動性とmiRNA-21-5p発現量との関係を示す図である。
【図９】PBCとAIHとにおけるmiRNA-21-5p発現量の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本実施形態にかかるバイオマーカーは、自己免疫性肝炎を診断するためのバイオマーカーであって、miR-21-5pである。
【００１７】
miRNAは、タンパク質をコードしない22塩基程度の一本鎖RNAであり、標的mRNAの主に3’非翻訳領域に部分相補的に結合し、分解又は翻訳を抑制することにより、タンパク質の発現を負に制御することが知られている。miRNAは発生、分化、増殖、免疫、細胞死、恒常性等あらゆる生命現象に関与している。現在までにヒトでは約1500種類のmiRNAが同定されている。多くのmiRNAが様々な組織に広く分布しているが、いくつかのmiRNAは組織特異性の高いものが知られている。
【００１８】
肝臓には多種類のmiRNAの発現が認められ、miR-941等のようにAIHのバイオマーカーも散見されるが、高感度なものは未だ見出されていない。本発明者はmiR-21-5pがAIHにおいて選択的に高発現することを見出し、かかる新知見に基づいて本件発明を完成させた。miR-21-5pは下記配列を有している。
【００１９】
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA・・・配列番号１
本明細書において「バイオマーカー」とは、自己免疫性肝炎の罹患の有無又は罹患の程度を診断するために、直接又は間接的に利用されるものである。
【００２０】
本実施形態においては、miR-21-5pの発現量の増加を指標として自己免疫性肝炎の診断がなされ、具体的には、(A)生物学的試料中に含まれるmiRNAを抽出する工程と、(B)生物学的試料中の本件miRNAの発現量を測定する工程と、(C)本件miRNAの発現量の増加を指標として自己免疫性肝炎を検出する工程と、を含む。
【００２１】
生物学的試料は、特に制限されることなく、被験者の血清、血液、唾液、腹水、尿、糞便、胃洗浄液、生検組織等が含まれ、例えば血清を好適に用いることができる。
【００２２】
上記(A)工程におけるmiRNAを抽出する方法としては、被験者から得られる生物学的試料からmiRNAを含むRNAを抽出することのできる方法であれば特に制限されず、例えば、RNAzol RT試薬(Molecular Research Center社)でRNAを抽出後、miRCURY column(EXIQON社)にて精製することによって、miRNAを含むトータルRNAを抽出する方法が挙げられる。
【００２３】
上記(B)工程におけるmiRNAの発現量を測定する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば定量PCR法（リアルタイムPCR法を含む）が挙げられる。この定量PCR法は、本件miRNAの配列を増幅し得るプライマーセットを用いる方法であり、本件miRNAの発現量を測定することが可能である限り特に制限されず、蛍光プローブ法（例えば、TaqMan（登録商標）プローブ法）、アガロース電気泳動法、SYBRグリーン法等の通常のPCR法を用いることができる。
【００２４】
定量PCR法におけるプライマーセットとは、本件miRNAの配列を増幅し得るプライマー（ポリヌクレオチド）の組合せを意味する。上記プライマーとしては、本件miRNAの配列を増幅し得る限り特に限定されないが、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを例示することができる。プライマーセットは、その配列情報に基づき当該技術分野において周知の方法を用いて化学合成等することにより得ることができる。
【００２５】
上記(C)工程において、上記のように測定された本件miRNAの発現量の増加は、具体的には、被験者の生物学的試料中の本件miRNAの発現量が、コントロールの生物学的試料中の本件miRNAの発現量（例えば、健常者の生物学的試料中の本件miRNAの発現量）に比して高い場合に、被験者がAIHであると診断することができる。
【００２６】
なお、自己免疫性肝炎が進行して肝組織の線維化が進むと肝硬変となるが、かかる場合にあっては本件miRNAの発現量は逆に低下する。これにより本件miRNAには、病態の経過が把握できるという利点がある。
【００２７】
また、本実施形態による自己免疫性肝炎を診断するためのキットは、生物学的試料における本件miRNAの発現量を測定する手段を含むものであり、例えば、本件miRNAの配列を増幅し得る、フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットを含む。
【実施例】
【００２８】
無治療のAIH患者(n=5)血清と健常人(n=5)をmiRNAアレイでスクリーニングし、AIHで特異的に上昇しているmiRNAを同定した（図１）。
【００２９】
さらに、無治療AIH(n=5)、治療後寛解時(n=5)の血清を、同様にmiRNAアレイで解析し、AIHで特異的に上昇し、治療後、寛解時に正常レベルまで低下するmiRNAを絞り込んだ（図２）。これにより、miRNA-21-5pがAIHの急性期に特異的に血清中で増加しているmiRNAであることが判明した。
【００３０】
次にAIH患者(n=46)、慢性C型肝炎患者(n=40)、健常人(n=13)の血清を用い、確立したmiRNA-21-5p定量PCRで測定した。血清からのmiRNAはQIAGEN社のmiRNeasySerum/plasmaキットを用いて抽出した。miRNA発現レベルの測定において、miRNA抽出に起因する試料間の格差を補正するために、内部標準でmiRNAの発現レベルを補正した。単離手順の前にあらかじめcel-miR-39を血清に添加し内部標準とした。抽出したmiRNAはマイクロキャピラリー電気泳動により評価した(2100バイオアナライザー・アジレントテクノロジー)。
【００３１】
hsa-miR-21-5p、cel-miR-39はTaqman MicroRNA Assay (applied biosystems by Life Technoligies)を用いて逆転写し、リアルタイムPCR法にて発現量を分析した。発現量解析は、cel-miR-39を内部標準として、hsa-miR-21-5pを補正し比較Ct定量法(Comparative Ct Method,ΔΔCt法)を用いて計算し相対定量を行った。
【００３２】
AIH患者においては、健常人及びCHC患者に比べ有意にmiRNA-21-5p発現量が増加していた（図３）。そしてAIH患者において、ステロイド治療（プレドニゾロン平均投与量40.3±11.6 mg/day  20-60mg/day)でmiRNA-21-5p発現量は低下することが判明した（図４）。
【００３３】
さらに、AIH患者の同一血清を用い肝炎の指標であるALT、ASTと、miRNA-21-5pとの相関を調べた所、強い相関を示すことが判明した（図５）。
【００３４】
また、肝硬変進展例では、血清miRNA-21-5pが有意に低下することが判明した（図６）。AIHの肝生検組織像との関連を検討した結果、miR-21-5pはAIH肝組織の線維化(staging)の進行と共に低下していた（図７）。なお、肝組織において門脈域より線維化が進展し小葉が改築され肝硬変へ進展する段階を線維化なし（F0）、門脈域の線維性拡大（F1）、線維性架橋形成（F2）、小葉のひずみを伴う線維性架橋形成（F3）までの４段階に区分され、さらに結節形成傾向が全体に認められる場合は肝硬変（F4）と分類される(Staging分類)。図７においてF4におけるmiRNA-21-5pの発現量は、健常者のmiRNA-21-5pの発現量とほぼ同程度であった。
【００３５】
また、miR-21-5pはAIH肝組織の肝炎の活動性(grading)の上昇と相関することが判明した（図８）。なお、肝組織において壊死・炎症所見はその程度により活動性なし（A0）、軽度活動性（A1）、中等度活動性（A2）、高度活動性（A3）の４段階に区分され、すなわち、活動性の評価はpiecemeal necrosis、小葉内の細胞浸潤と肝細胞の変性ならびに壊死（spotty necrosis、bridging necrosis等）で行われる(Grading分類)。
【００３６】
また、同じ自己免疫性肝疾患である原発性胆汁性肝硬変症(PBC)との比較では、AIHのほうが有意に血清miR-21-5pが増加していることが判明した（図９）。なお、PBC患者のmiR-21-5pの発現量は、健常者のmiRNA-21-5pの発現量よりもやや高いものであった。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
自己免疫性肝炎の診断に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００３８】
配列番号１：マイクロRNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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