(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の治療用タンパク質を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の能力をインビトロで増強する方法であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤と、該ＤＮＭＴ阻害剤と接触させなかった該細胞と比較して、前記治療用タンパク質の発現を増大させるために十分な時間、接触させる工程を含み、
該ＤＮＭＴ阻害剤が、５−アザシチジン、デシタビン、ゼブラリン、ＳＧＩ−１１０、ＳＧＩ−１０３６、ＲＧ１０８、コーヒー酸プラム（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｕｍ）、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、塩酸プロカインアミド、ＭＧ９８、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
少なくとも１種の治療用タンパク質を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の能力をインビトロで増強する方法であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤と、該ＤＮＭＴ阻害剤と接触させなかった該細胞と比較して、前記治療用タンパク質の発現を増大させるために十分な時間、接触させる工程を含み、
該ＤＮＭＴ阻害剤が、リボヌクレオシドアナログまたはデオキシリボヌクレオシドアナログである、方法。
【請求項３】
前記リボヌクレオシドアナログまたはデオキシリボヌクレオチドアナログがデシタビンまたはゼブラリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＭＴ阻害剤が５−アザシチジンである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記接触が細胞培養物中で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触が、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞と前記ＤＮＭＴ阻害剤を含有している薬学的組成物中で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞が少なくとも１種のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤及び
少なくとも１種のＤＮＭＴ阻害剤と接触させられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞中での前記治療用タンパク質の発現が、その配列の少なくとも一部がメチル化されているプロモーターにより制御され、ここでは、前記メチル化により、前記治療用タンパク質の発現の部分的または完全なサイレンシングが生じる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞中での前記治療用タンパク質の発現が、その配列の少なくとも一部がメチル化されているプロモーター抑制領域により制御され、ここでは、前記メチル化により、前記治療用タンパク質の発現の増強が生じる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療用タンパク質がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＡＲが少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインと少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記治療用タンパク質がサイトカイン、サイトカイン受容体、またはリガンドトラップである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療用タンパク質が単量体抗体または多量体抗体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療用タンパク質がαβＴ細胞受容体または抗原特異的受容体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞が２種以上の異なる治療用タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
２種の異なる治療用タンパク質がいずれも受容体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
２種の異なる治療用タンパク質がいずれもＣＡＲである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
２種の異なる治療用タンパク質がいずれも受容体ではない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
２種の異なる治療用タンパク質の一方がＣＡＲであり、２種の異なる治療用タンパク質の一方が抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
２種の異なる治療用タンパク質の一方がＣＡＲであり、２種の異なる治療用タンパク質の一方がαβ  Ｔ細胞受容体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
２種の異なる治療用タンパク質の一方がＣＡＲであり、２種の異なる治療用タンパク質の一方が抗原特異的受容体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞が２種以上のＤＮＭＴ阻害剤と接触させられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＤＡＣ阻害剤及びＤＮＭＴ阻害剤と接触させられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２４】
治療用タンパク質がトランスジェニックタンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１種の治療用タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を接触によって増強する為の薬剤であって、有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤を含み、
該ＤＮＭＴ阻害剤が、５−アザシチジン、デシタビン、ゼブラリン、ＳＧＩ−１１０、ＳＧＩ−１０３６、ＲＧ１０８、コーヒー酸プラム（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｕｍ）、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、塩酸プロカインアミド、ＭＧ９８、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、薬剤。
【請求項２６】
少なくとも１種の治療用タンパク質であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を接触によって増強する為の薬剤であって、有効量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤を含み、
該ＤＮＭＴ阻害剤が、リボヌクレオシドアナログまたはデオキシリボヌクレオシドアナログである、薬剤。
【請求項２７】
前記リボヌクレオシドアナログまたはデオキシリボヌクレオチドアナログがデシタビンまたはゼブラリンである、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記ＤＮＭＴ阻害剤が５−アザシチジンである、請求項２５又は２６に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記接触がインビトロで行われる、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記接触が細胞培養物中で行われる、請求項２９に記載の薬剤。
【請求項３１】
前記接触が、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞と前記ＤＮＭＴ阻害剤を含有している薬学的組成物中で行われる、請求項２９に記載の薬剤。
【請求項３２】
前記接触がインビボで行われ、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞が個体の中の細胞である、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項３３】
前記ＣＡＲが少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインと少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年７月１８日に提出された米国仮特許出願第６１／８４７，９５７号の優先権を主張する。この出願はその全体が引用により本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、米国国防総省前立腺癌研究プログラム（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ）により承認されたＷ８１ＸＷＨ−１１−１−０６２５、ならびに、ＮＩＨにより承認されたＣＡ０９４２３７およびＰ５０  ＣＡ０５８１８３の下での政府の支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の分野には、少なくとも、細胞生物学、分子生物学、免疫学、および／または医学（癌医学を含む）の分野が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されたＴ細胞は、血液系悪性腫瘍および固形腫瘍のいずれの処置においても臨床的有効性を示した。しかしおそらく、ＣＡＲで修飾されたＴ細胞の最も有効な使用法には、それらが腫瘍の免疫逃避機構を克服できるようにするためのさらなる操作が必要であろう。これらの逃避ストラテジーのうちの１つは、選択圧下での標的抗原の調節である。この現象は、不均質な腫瘍を処置するための単一抗原特異性を持つ適合移植された（ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）Ｔ細胞を使用した前臨床研究および臨床研究のいずれにおいても失敗の原因と報告されている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書中で提供される方法および組成物は、標的抗原の調節を巧みに回避するために有効な方法および組成物を提供することにより、標的抗原の調節についての可能性のある問題、例えば、（例えば、化学療法の間の）選択圧下での標的癌抗原の発現の低下に取り組む。本明細書中の方法および組成物は、表的抗原の発現が選択圧により標的抗原の発現が低下している場合にもなお、免疫細胞が治療薬としての効力を維持するように、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球）中での治療用タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））の発現をアップレギュレートする１種以上の物質を利用する。特定の実施形態では、治療用タンパク質の発現は、免疫細胞が治療上有効であるか、またはなおも治療上有効であり続けることを可能にするための十分な量の物質によりアップレギュレートされる。特異的な実施形態では、発現は上記物質により、上記物質に暴露されていない細胞中でのレベルよりも高いレベルに、細胞中でアップレギュレートされる。
【０００６】
１つの態様では、免疫細胞中での上記少なくとも１種の治療用タンパク質の発現が、上記１種以上の物質に暴露されていないそのような免疫細胞と比較してアップレギュレートされるまたは増大するように、そのような免疫細胞に対して１種以上の物質を暴露することにより少なくとも１種の治療用タンパク質を発現する免疫細胞の能力（例えば、癌細胞を死滅させる活性）を増強する方法が本明細書中で提供される。特定の実施形態では、免疫細胞を、治療用タンパク質の発現を増大させるために十分な時間の間、および十分な量の１種以上の物質と接触させる工程を含む、治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の集団の癌細胞を死滅させる活性を増大させる方法が本明細書中で提供される。特定の実施形態では、免疫細胞を、治療用タンパク質の発現を増大させ、それにより免疫細胞の集団の癌細胞を死滅させる活性を増大させるために十分な時間の間、および十分な量の１種以上の物質と接触させる工程を含む、治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）を発現する免疫細胞の集団の癌細胞を死滅させる活性を増大させる方法が本明細書中で提供される。特異的な実施形態では、発現のアップレギュレーションまたは増大は、例えば、ウェスタンブロッティングまたはノーザンブロッティングのような標準的な手段により検出することができる。
【０００７】
特定の実施形態では、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏにある場合に治療用タンパク質の発現をアップレギュレートさせるために、免疫細胞の集団が１種以上の物質と接触させられる。１つの実施形態では、免疫細胞の集団が、１種以上の物質、免疫細胞が投与されているまたは免疫細胞を投与しようとする個体と接触させられる。特異的な実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の個体への投与の前に１種以上の物質と接触させられるか、または免疫細胞は、免疫細胞の個体への投与後に１種以上の物質と接触させられる。特異的な実施形態では、上記方法は、個体から治療用タンパク質が欠失している免疫細胞を単離する工程；免疫細胞を、治療用タンパク質を発現するように操作する工程；操作した免疫細胞を同じ個体に投与する工程；および続いて、免疫細胞中での治療用タンパク質の発現の増大を生じるために十分な量の物質を上記個体に投与する工程を含む。免疫細胞は治療時に、または治療に近いタイミングで個体から得ることができ、また、治療まで適切に保管される場合もある。
【０００８】
特定の実施形態では、個体に送達しようとする治療用タンパク質を発現する免疫細胞が、１以上の他の個体から得られる。そのような細胞は、細胞が別の個体に安全に送達され、例えば、レシピエント個体の自身の免疫系により拒絶される可能性がほとんどないように、アッセイされ得るおよび／または操作され得る。細胞は、例えば、貯蔵庫内で保管され得る。
【０００９】
本明細書中の任意の実施形態の特異的な実施形態では、上記物質には、エピジェネティック修飾因子（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）および／または有糸分裂促進因子の１種以上が含まれる。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾因子は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤、またはこれらの組み合わせである。発現をアップレギュレートするために２種以上の物質が利用される場合は、任意の組み合わせが利用され得る。組み合わせには、２種以上の同じタイプの物質が含まれる場合があり、また、２種以上の異なるタイプの物質が含まれる場合もある。例えば、細胞は、２つのタイプのエピジェネティック修飾因子に暴露される場合があり、また、１つのタイプのエピジェネティック修飾因子と有糸分裂促進因子とに暴露される場合もある。２種以上のエピジェネティック修飾因子が利用される場合は、例えば、組み合わせに、２種のＨＤＡＣ阻害剤、または１種のＨＤＡＣと１種のＤＮＭＴ阻害剤が含まれ得る。
【００１０】
１つの実施形態では、少なくとも１種の治療用タンパク質を発現する免疫細胞の能力を増強する方法が本明細書中で提供される。この方法は、免疫細胞を、有効量の有糸分裂促進因子、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、および／またはデオキシリボ核酸メチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤と、上記有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤および／または上記ＤＮＭＴ阻害剤（特異的な実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤、短鎖脂肪酸、ヒドロキサム酸（ｈｙｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、環状ペプチド、ベンズアミドまたはこれらの組み合わせ）と接触させなかった上記免疫細胞と比較して、上記治療用タンパク質の発現を増大させるために十分な時間の間、接触させる工程を含む。特定の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸ナトリウム、ブフェニール（Ｂｕｐｈｅｎｙｌ）、アンモナプス（Ａｍｍｏｎａｐｓ）、デパコート（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）、バルプロ酸、ロミデプシン（ＩＳＴＯＤＡＸ（登録商標））、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、ベリノスタット（ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、エンチノスタット（ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）、ＪＮＪ−２６４８１５８５、ＭＧＣＤ−０１０のうちの１種以上、および／またはこれらの組み合わせである。他の特異的な実施形態では、ＤＮＭＴ阻害剤は、ヌクレオシドアナログ、キノロン、活性部位阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせである。特異的なＤＮＭＴ阻害剤は、５−アザシチジン、デシタビン、ゼブラリン、ＳＧＩ−１１０、ＳＧＩ−１０３６、ＲＧ１０８、コーヒー酸プラム（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｕｒｕｍ）、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、塩酸プロカインアミド、ＭＧ９８、およびこれらの組み合わせからなる群より選択することができる。特異的な場合は、ＤＮＭＴ阻害剤はリボヌクレオシドアナログまたはデオキシリボヌクレオシドアナログである。ＤＮＭＴ阻害剤はデシタビンまたはゼブラリンであり得る。ＤＮＭＴ阻害剤は、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）のような５−アザシチジンであり得る。
【００１１】
複数の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、またはＴｒｅｇ細胞を含む）、ＮＫ細胞、樹状細胞、またはこれらの任意の混合物である。
【００１２】
いくつかの場合には、免疫細胞と、有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤、および／またはＤＮＭＴ阻害剤との接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われ、接触は細胞培養物中で起こり得る。いくつかの実施形態では、接触は、免疫細胞とＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤とを含有している薬学的組成物中で行われる。特定の態様では、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで行われ、免疫細胞は個体の中のＴ細胞である。
【００１３】
特定の態様では、免疫細胞と、有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤またはＤＮＭＴ阻害剤が、例えば、別の薬学的処方物中のように、別々に個体に投与される。特定の場合は、有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤と免疫細胞が同じ薬学的処方物中で個体に投与される。有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤と免疫細胞が、実質的に同時に、または異なるタイミングで個体に投与され得る。
【００１４】
有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤と免疫細胞は、同じ投与スケジュールにしたがって、または異なる投与スケジュールにしたがって個体に投与され得る。特定の態様では、有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤、および／またはＤＮＭＴ阻害剤は、個体が免疫細胞を受け取る前に個体に提供される。いくつかの態様では、免疫細胞は個体に送達される前に、有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤、および／またはＤＮＭＴ阻害剤と接触させられる。免疫細胞は、個体に送達される前に有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤、および／またはＤＮＭＴ阻害剤と接触させてはいけない場合がある。
【００１５】
いくつかの場合には、免疫細胞は、少なくとも１種のＨＤＡＣ阻害剤および少なくとも１種のＤＮＭＴ阻害剤と接触させられる。特定の実施形態では、免疫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで上記ＨＤＡＣ阻害剤と接触させられ、続いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで上記ＤＮＭＴ阻害剤と接触させられる。免疫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＭＴ阻害剤と接触させられ得、続いてｉｎ  ｖｉｖｏで上記ＨＤＡＣ阻害剤と接触させられ得る。免疫細胞中での治療用タンパク質の発現は、その配列の少なくとも一部がメチル化されているプロモーターにより制御され得、この場合、メチル化により上記治療用タンパク質の発現の部分的または完全なサイレンシングが生じる。免疫細胞中での治療用タンパク質の発現は、その配列の少なくとも一部がメチル化されているプロモーター抑制領域により制御され得、この場合、メチル化により上記治療用タンパク質の発現の増強が生じる。
【００１６】
免疫細胞は、２種以上のＨＤＡＣ阻害剤と、２種以上のＤＮＭＴ阻害剤と、または２種以上の有糸分裂促進因子と接触させられ得る。いくつかの場合には、免疫細胞は、ＨＤＡＣ阻害剤およびＤＮＭＴ阻害剤と、またはＨＤＡＣ阻害剤および有糸分裂促進因子と、またはＤＮＭＴ阻害剤および有糸分裂促進因子と接触させられる。
【００１７】
特定の実施形態では、接触工程は個体の中でｉｎ  ｖｉｖｏで複数回起こる。特定の態様では、２回目またはそれ以降の接触工程において、免疫細胞が１回目の接触工程の免疫細胞とは異なる治療用タンパク質を発現する。特定の場合は、２回目またはそれ以降の接触工程において、有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤が個体に投与される。２回目またはそれ以降の接触工程の有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤、および／またはＤＮＭＴ阻害剤は、１回目の接触工程の有糸分裂促進因子、ＨＤＡＣ阻害剤、および／またはＤＮＭＴ阻害剤と異なる場合があり、また同じである場合もある。
【００１８】
２種以上のエピジェネティック修飾因子および／または有糸分裂促進因子が、１種以上の治療用タンパク質を発現する免疫細胞に対して暴露される実施形態では、複数種の物質が任意の適切な時系列、投与スケジュール、および／または処方物（単数または複数）で細胞に対して暴露され得る。特異的な実施形態では、２種以上の物質が、免疫細胞の送達の前、その間、および／またはその後に個体に提供され、そして同時に提供されるが、いくつかの場合には、これらは異なるタイミングで提供される。複数種の物質が個体に送達される場合は、これらは同じ処方物中に含まれる場合も、異なる処方物中に含まれる場合もあり、これらが同じ処方物中に存在しない場合は、これらは、個体に対して同じ経路で送達される場合も、また異なる経路で送達される場合もある。複数種の物質が免疫細胞および／または個体に提供される場合は、これらの物質は同じあるいは異なる投与スケジュールおよび／または投与量を有し得る。
【００１９】
特異的な実施形態では、免疫細胞により発現される治療用タンパク質は受容体である。特異的な場合は、この受容体は癌細胞上の抗原を標的とする。治療用タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、サイトカイン、サイトカイン受容体、リガンドトラップ（ｌｉｇａｎｄ  ｔｒａｐ）、抗体（単量体抗体または多量体抗体を含む）、操作されたαβＴ細胞受容体、または抗原特異的受容体のような任意の種のタンパク質であり得る。免疫細胞が２種以上の治療用タンパク質を発現する場合は、治療用タンパク質は同じタイプのタンパク質である場合も（例えば、いずれもＣＡＲ）、異なるタイプのタンパク質である場合もある（ＣＡＲと操作されたαβＴ細胞受容体）。免疫細胞が２種以上の治療用タンパク質を発現する場合は、これらはいずれも、１種以上の物質に対して暴露されると発現がアップレギュレートされ得る。
【００２０】
治療用タンパク質は任意の種のタンパク質であり得るが、特異的な実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外抗原結合ドメインと、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。特定の態様では、治療用タンパク質は、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはリガンドトラップである。治療用タンパク質は、単量体抗体または多量体抗体であり得る。治療用タンパク質は、αβＴ細胞受容体または抗原特異的受容体であり得る。特異的な実施形態では、免疫細胞は、特定の個体に対して自己由来または同種異系である。治療用タンパク質はトランスジェニックタンパク質であり得る。
【００２１】
免疫細胞は２種以上の異なる治療用タンパク質を含有し得る。いくつかの場合には、２種の異なる治療用タンパク質はいずれも受容体である。特定の実施形態では、２種の異なる治療用タンパク質はいずれもＣＡＲである。いくつかの場合には、２種の異なる治療用タンパク質の一方がＣＡＲであり、そして２種の異なる治療用タンパク質の一方が抗体であるか、あるいは、２種の異なる治療用タンパク質の一方がＣＡＲであり、そして２種の異なる治療用タンパク質の一方がαβＴ細胞受容体であるか、あるいは、２種の異なる治療用タンパク質の一方がＣＡＲであり、そして２種の異なる治療用タンパク質の一方が抗原特異的受容体である。
【００２２】
特異的な実施形態では、２種以上のＣＡＲを含む、および／または少なくとも２種の抗原を標的とする１種以上のＣＡＲを含む免疫細胞が存在する。標的抗原は任意の種の癌抗原であり得る。一例として、特異的な実施形態では、ＣＡＲはＭＵＣ１とＰＳＣＡを標的とし、ＭＵＣ１とＰＳＣＡはいずれも、ヒトの初代膵臓癌細胞のおよそ６０％で発現される。本明細書中で記載されるように、膵臓腫瘍モデルの例示的な実施形態においては、免疫逃避を、腫瘍細胞上に存在する２種類の抗原を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞を同時投与することにより防ぐことができるかどうかの特性決定が存在する。予想されるとおり、個別に試験される場合は、選択圧により、標的抗原が欠失しているかまたは標的抗原がダウンレギュレートされている腫瘍の部分集団の出現が生じ、これにより腫瘍は、その後のＴ細胞での再処置に対して非感受性になる。しかし意外なことに、両方のＴＡＡを同時に標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞の同時投与が、優れた抗腫瘍作用と関係しているにもかかわらず、腫瘍の排除を生じるには不十分であることが決定された。
【００２３】
免疫細胞が２種以上の治療用タンパク質を発現するように修飾または操作される場合は、治療用タンパク質が、治療用タンパク質を発現できる核酸の形態で免疫細胞に送達され得る。そのような核酸は、治療用タンパク質（単数または複数）の発現を制御する調節配列を含有している発現構築物であり得る。２種以上の治療用タンパク質が免疫細胞により発現されるように発現構築物（単数または複数）が免疫細胞に送達される場合は、治療用タンパク質は同じ発現構築物によってコードされる場合があり、また、同じ発現構築物によってはコードされない場合もある。発現構築物の特異的な実施形態では、治療用タンパク質の発現を調節する２つ以上の調節配列が存在する場合がある。特異的な実施形態では、調節配列はプロモーターであり得る。特定の実施形態では、プロモーターの少なくとも一部はメチル化が可能である。特異的な実施形態では、プロモーターの少なくとも一部がメチル化されている。特定の実施形態では、プロモーターのメチル化により、治療用タンパク質の発現の部分的または完全なサイレンシングが生じる。特異的な実施形態では、プロモーターは１つ以上のＣｐＧアイランドを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、特定の個体が、少なくとも１種の治療用タンパク質を含有している免疫細胞に対する２回以上の暴露により処置される。すなわち、個体に、１回分の投与量の免疫細胞が治療過程の間に２回以上投与される。治療用タンパク質を含有している免疫細胞に対する２回目またはそれ以降の暴露においては、個体に、同じ治療用タンパク質（単数または複数）を発現する免疫細胞が提供され得る。しかし特定の場合は、個体に、異なる治療用タンパク質を発現する免疫細胞が提供され得る。個体に２回以上の細胞への暴露が提供される場合は、個体および／または細胞は、ここでもまた、治療用タンパク質の発現をアップレギュレートする１種以上の物質と接触させられる。２回目またはそれ以降の回が、１回目の免疫細胞と比較して異なる治療用タンパク質を含む免疫細胞を有する場合は、異なる治療用タンパク質が同じ抗原を標的とする場合があり、また、同じ抗原を標的としない場合もある。２回目またはそれ以降の回の免疫細胞が異なる抗原を標的とする治療用タンパク質を含む場合は、２回目またはそれ以降の回の抗原は、１回目に標的化された抗原もまた発現する癌細胞上に存在し得る。例えば、膵臓癌細胞は多くの場合、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ムチン１（ｍｕｃｉｎ１）（ＭＵＣ１）と前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）を含み、第１のセットの免疫細胞はＭＵＣ１を標的化することができ、一方、第２またはそれ以降の免疫細胞のセットはＰＳＣＡを標的化することができる（あるいはその逆）。
【００２５】
特定の実施形態では、特定の標的（例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原）について、腫瘍逃避が起こり、治療用タンパク質を発現する免疫細胞での２回目の処置に、レシピエントの、（例えば、治療用タンパク質の発現の増大を生じる量の）エピジェネティック修飾因子物質または有糸分裂促進因子物質との接触が組み入れられることが推測される。他の実施形態では、治療用タンパク質を発現する免疫細胞での２回目の処置の際に、細胞のレシピエントが、腫瘍逃避の証拠について（例えば、レシピエントから組織をサンプリングし、１つ以上の腫瘍マーカー（例えば、ＴＡＡまたはＴＳＡ）について分析し、そして腫瘍逃避（例えば、再発）が証明されればエピジェネティック修飾因子物質および／または有糸分裂促進因子物質を投与することにより）モニターされ得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、誘導性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−９）のような誘導性の自殺遺伝子、例えば、ｉＣａｓｐａｓｅ９、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ジフテリア毒素、およびニトロレダクターゼを含む。
【００２７】
特定の実施形態では、個体に、本開示の免疫細胞／物質に加えて、さらなる治療が提供される。例えば、癌を有している個体は本明細書中に含まれる免疫細胞／物質による治療を受け、加えてさらなる治療、例えば、１つ以上の化学療法（ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）（例えば、有糸分裂促進因子物質でも、またエピジェネティック修飾因子物質でもない物質での化学療法）、放射線治療、ホルモン療法、免疫療法、および外科手術を受ける場合がある。個体には、免疫細胞および物質による治療の投与の前、その間、またはその後に、あるいはその組み合わせで、さらなる治療が投与される場合がある。
【００２８】
いくつかの実施形態では、上記方法には、例えば、生検、癌マーカーの分析、組織診などを含む当該分野での標準的な手段を使用して行われるような、個体が癌について診断される診断工程が含まれる。いくつかの実施形態では、個体は、癌であることが疑われるか、または癌が再発しており、本明細書中に記載される治療が提供される。特定の実施形態では、個体には癌のリスクがあるか、または癌の再発のリスクがあり、本明細書中に記載される治療が提供される。
【００２９】
１つの実施形態は、個体において癌を処置および／または予防する方法を提供する。この方法は、個体に対して、その個体において癌を処置および／または予防するために有効な量の治療用タンパク質の発現をアップレギュレートする免疫細胞および物質を投与する工程を含む。用語「処置する」および「予防する」ならびにこれらから派生する用語は、本明細書中で使用される場合は、必ずしも１００％すなわち完全な処置または予防を暗に意味するわけではない。むしろ、当業者が潜在的有効性または治療効果があると認識する処置または予防の程度は様々である。この態様では、本発明の方法は、哺乳動物において任意の量の任意のレベルの癌の処置または予防を提供することができる。さらに、本発明の方法により提供される処置または予防には、処置または予防する疾患（例えば、癌）の１つ以上の症状または症候の処置あるいは予防が含まれ得る。さらに、本明細書中での目的については、「予防」には、疾患あるいはその症候または症状の発症を遅らせることが含まれ得る。
【００３０】
本明細書中で言う個体は任意の個体であり得る。個体は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなどを含む哺乳動物であり得る。
【００３１】
本明細書中の任意の実施形態では、癌は、原発癌または転移癌である。癌は、例えば、固形腫瘍または血液癌であり得る。本発明の方法に関して、癌は、急性リンパ性癌（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、膀胱癌、骨肉腫、脳腫瘍、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、白血病、液性腫瘍、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、肥満細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽腔癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、網、および腸管膜の癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、固形腫瘍、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、および膀胱癌のうちの任意のものを含む任意の癌であり得る。
【００３２】
本発明の実施形態をより完全に理解するために、添付の図面と併せて以下の説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＰＳＣＡを発現する膵臓癌細胞を認識し、死滅させるようにＴ細胞を操作できることを示している。（ａ）第１世代の、ヒト化された、コドン最適化された、ＰＳＣＡに特異的なＣＡＲのレトロウイルスベクターのマップ。（ｂ）左のパネル、対照（ＮＴ）およびＣＡＲ−ＰＳＣＡトランスジェニック（ＣＨ２ＣＨ３陽性）細胞を示している、それぞれのドナーに由来するドットプロット；右のパネル、平均±標準偏差（ＳＤ）として表した１０のドナーについての形質導入効率データのまとめを示す。（ｃ）ＮＴ  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞の表現型（ｎ＝１０）。（ｄ）標的としてＰＳＣＡ＋（ＣＡＰＡＮ１）およびＰＳＣＡ−（２９３Ｔ細胞）を使用した、ＣＡＲ−ＰＳＣＡおよびＮＴ  Ｔ細胞の６時間のクロム放出アッセイ。データは、１０：１のＥ：Ｔでの平均±ＳＤ標的特異的溶解を表す（ｎ＝５）。
【００３４】
【図２】図２は、単一特異性ＣＡＲ−Ｔ細胞での不均質な腫瘍の標的化が腫瘍の免疫逃避につながることを示している。ＣＡＲ−ＰＳＣＡがｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＰＡＮ１腫瘍の増殖を制御できるかどうかを評価するために、ＳＣＩＤマウスに腫瘍細胞を移植した。（ａ、左のパネル）は、処置前、または処置後２８日、４２日、もしくは５６日の代表的な未処置のマウス（上）またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞で処置した動物の生物発光画像を示す。一方、右のパネルは、４匹のマウスについてのデータのまとめを示す。データを、０日と比較した発光強度の倍加としてプロットする（平均±ＳＤ）。ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞がＣＡＰＡＮ１（ＧＦＰ＋）細胞を排除できるかどうかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価するために、７２時間の同時培養実験を、ＮＴ  Ｔ細胞を対照として用いて、５：１のＥ：Ｔ比で行った。ｂは、フローサイトメトリーとＧＦＰ＋細胞上でのゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）とを使用して定量化した残存腫瘍細胞の百分率を示し、結果を平均±ＳＤとして報告する（ｎ＝４）。（ｃ）最初のＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置に対して耐性があったＣＡＰＡＮ１細胞をその後の再処置により死滅させることができたかどうかを評価するために、その後の同時培養を、ＮＴ  Ｔ細胞で最初に処置したＣＡＰＡＮ１細胞（左のパネル）または標的（５：１のＥ：Ｔ）としてのＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞で処置したＣＡＰＡＮ１細胞（右のパネル）のいずれかを使用して行った。７２時間後、残存腫瘍細胞を再びフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ）により定量化した。データを平均±ＳＤとして報告する（ｎ＝４）。（ｄ）Ｔ細胞での処置に対する腫瘍の耐性の機構を決定するために、ＣＡＰＡＮ１細胞のＩＨＣ分析だけを行ったか、あるいはＣＡＰＡＮ１細胞のＩＨＣ分析を単独で、あるいは、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置の後に行った。対照ＮＴ  Ｔ細胞への暴露後に、腫瘍細胞はＭＵＣ１およびＰＳＣＡの両方を発現するが、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞で処置した腫瘍細胞の大部分は、ＭＵＣ１の発現は保ったまま、ＰＳＣＡ抗原の発現を失っていたか、またはごくわずかなレベルでしかＰＳＣＡ抗原を発現していなかった。
【００３５】
【図３】図３は、ＭＵＣ１を認識するように修飾されたＣＡＲ−Ｔ細胞がＭＵＣ１＋腫瘍細胞を死滅させることを示している。（ａ）は、ＣＤ１９の短縮型（ΔＣＤ１９）を同時発現する第１世代のＭＵＣ１特異的ＣＡＲのレトロウイルスベクターのマップを示す。ｂ（左のパネル）は、それぞれのドナーにおけるトランスジェニック（ＣＨ２ＣＨ３およびΔＣＤ１９二重陽性細胞）の百分率を示しているドットプロットを示す。一方、右のパネルは、７のドナーについてのデータのまとめを示す（平均±ＳＤ）。ｃは、ＮＴ  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞のＴ細胞表現型を示す（ｎ＝７）。ｄは、６時間の細胞毒性試験において、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞がＭＵＣ１＋標的（ＣＡＰＡＮ１）を特異的に死滅させることができ、対照（２９３Ｔ）標的は認識しないことを示している。ＮＴ  Ｔ細胞をさらなる対照として使用し、示したデータは、５のドナーについての１０：１のＥ：Ｔでの％特異的溶解（平均±ＳＤ）を示している。
【００３６】
【図４】図４は、ＭＵＣ１特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞での不均質な腫瘍の標的化もまた腫瘍の免疫逃避につながることを提供する。（ａ、左のパネル）は、ＣＡＰＡＮ−ｅＧＦＰ−ＦＦｌｕｃを腹腔内に移植し、ＮＴ−Ｔ細胞（上）またはＣＡＲ−Ｔ細胞（下）のいずれかを投与した代表的なマウスの生物発光画像を示す。画像撮影は、Ｔ細胞の注入の前、および処置前、または処置後２８日、４２日、もしくは５６日で行った。（Ａ、右のパネル）は４匹のマウスについてのデータのまとめを示しており、０日と比較した発光強度の倍加をプロットした（平均±ＳＤ）。ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの７２時間の同時培養試験においては、必ずしも全てのＣＡＰＡＮ１／ＧＦＰを発現する細胞が死滅するわけではないことをしている（ｎ＝３）。残存腫瘍細胞をフローサイトメトリーおよびＧＦＰについてのゲーティングにより定量化し、結果を平均残存腫瘍細胞±ＳＤとして報告する；（ｃ）は、ＮＴ  Ｔ細胞で最初に処置した腫瘍細胞はＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞での再処置に対して感受性があるが、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞に対してもともと耐性であった腫瘍細胞は、再処置の際にもこの耐性を保持していたことを示している。結果は、５：１のＥ：Ｔ比を使用した１つのドナーによるデータを示す。（ｄ）ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞で処置したＣＡＰＡＮ１細胞のＩＨＣは、弱い／不連続なＭＵＣ１染色を、ＰＳＣＡ陽性集団に対しては影響がないこととともに示している。
【００３７】
【図５】図５は、二重のＣＡＲアプローチを使用した腫瘍の標的化が優れた抗腫瘍活性を生じることを示している。ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での併用療法が優れた抗腫瘍効果を生じるかどうかを決定するために、（ａ）ＮＴ、ＣＡＲ−ＭＵＣ１、ＣＡＲ−ＰＳＣＡの、または標的としてのＣＡＰＡＮ１細胞との組み合わせの６時間の細胞毒性試験を行った。結果を１０：１のＥ：Ｔでの％特異的溶解±ＳＤとして表す（ｎ＝５）。ここでは、＊は、Ｐ値がスチューデントｔ検定を使用して０．０５未満であったことを示す。（ｂ）もまた、エフェクターおよび標的の同じパネルを用いて７２時間の同時培養の研究を行った（５：１のＥ：Ｔ、ｎ＝５）。残存腫瘍細胞をＧＦＰ＋細胞についてのゲーティングにより定量化し、結果を％残存腫瘍細胞±ＳＤとして表す。次に、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞とＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞の組み合わせがＳＣＩＤマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＰＡＮ１腫瘍の増殖を制御できるかどうかを評価した。（ｃ）は、ＣＡＰＡＮ−ｅＧＦＰ−ＦＦｌｕｃを移植し、ＮＴ、ＣＡＲ−ＭＵＣ１、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ、または組み合わせで処置した代表的なマウスの生物発光画像を示し、一方、（ｄ）は、処置前、または処置後２８日、４２日、５６日、もしくは６３日でのＮＴおよび二重標的化グループ（ｎ＝４）についての結果のまとめを示す。データを０日と比較した発光強度の倍加としてプロットする（平均±ＳＤ）。
【００３８】
【図６】図６は、人工の腫瘍モデルを使用した腫瘍の免疫逃避の表現型の特性決定を明らかにしている。ａは、２つのレトロウイルスベクターのマップを示しており、第１のものは、タンデムに繰り返す可変数のプロリンリッチセグメント（可変数のタンデムリピート；ＶＮＴＲ）３７を有するＴＡＡ  ＭＵＣ１をコードしており、ｍＯｒａｎｇｅを同時発現する。第２のものは、６個の膜貫通部分を含むＴＡＡ  ＰＳＣＡをコードし、ＧＦＰを同時発現する。ｂは、形質導入された２９３Ｔ細胞中でのＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅおよびＰＳＣＡ／ＧＦＰについての免疫蛍光染色を示している。ｃは、７２時間の同時培養実験を示しており、ここでは、ＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅを発現する２９３ＴとＰＳＡＣＡ／ＧＦＰを発現する２９３Ｔの混合物（１：１の比）を、１０：１のＥ：ＴでＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞のいずれかとともにインキュベートした（ｎ＝６）。残存腫瘍細胞をＧＦＰ＋集団およびｍＯｒａｎｇｅ＋についてのゲーティングにより定量化し、結果を％残存腫瘍細胞±ＳＤとして表す。（ｄ）検出可能な腫瘍細胞の頻度を、同時培養の開始時（０）、次に、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置後１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および６０時間で定量化し（ｎ＝６）、ＧＦＰまたはｍＯｒａｎｇｅのいずれかの発現に基づいて区別した。結果を％残存腫瘍細胞として表す。（ｅ）抗原の発現の強度が処置したＴ細胞に対する感受性と相関関係があるかどうかを決定するために、ＧＦＰの蛍光強度を、同時培養の開始時（０）、次に、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置後１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および６０時間で測定した（ｎ＝６）。結果を最大蛍光強度±ＳＤとして表す。ｆは、ＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅを発現する２９３ＴとＰＳＡＣＡ／ＧＦＰを発現する２９３Ｔの混合物（１：１の比）を、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞のいずれかとともに、１０：１のＥ：Ｔでインキュベートした７２時間の同時培養実験を示す（ｎ＝５）。残存腫瘍細胞をＧＦＰ＋集団およびｍＯｒａｎｇｅ＋集団についてのゲーティングにより定量化し、結果を％残存腫瘍細胞±ＳＤとして表す。（ｇ）腫瘍細胞をＧＦＰまたはｍＯｒａｎｇｅのいずれかの発現に基づいて経時的に定量化する（ｎ＝５）。結果を％残存腫瘍細胞として表す。（ｈ）抗原の発現の強度が処置したＴ細胞に対する感受性と相関関係があるかどうかを決定するために、ｍＯｒａｎｇｅの蛍光強度を、同時培養の開始時（０）、次に、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞での処置後１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および６０時間で測定した（ｎ＝５）。結果を最大蛍光強度±ＳＤとして表す。（ｉ）は、ＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅを発現する２９３Ｔ細胞およびＰＳＡＣＡ／ＧＦＰを発現する２９３Ｔの混合物（１：１の比）を、ＮＴ  Ｔ細胞、またはＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞とＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞の組み合わせのいずれかとともに１０：１のＥ：Ｔでインキュベートした７２時間の同時培養実験を示す（ｎ＝５）。残存腫瘍細胞をＧＦＰ＋集団およびｍＯｒａｎｇｅ＋集団についてのゲーティングにより定量化し、結果を％残存腫瘍細胞±ＳＤとして表す。（ｊ）腫瘍細胞の二重ＣＡ��治療に対する感受性を、開始時（０）、次に、処置後１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および６０時間で評価する。結果を％残存腫瘍細胞として表す（ｎ＝５）。（ｋ）抗原の発現の強度が処置したＴ細胞に対する感受性と相関関係があるかどうかを決定するために、ｍＯｒａｎｇｅの蛍光強度を、開始時（０）、次に、処置後１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および６０時間で、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞とＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞の組み合わせを用いて測定した（ｎ＝５）。結果を最大蛍光強度±ＳＤとして表す。
【００３９】
【図７】図７は、腫瘍の免疫逃避が、Ｔ細胞が第１、第２、または第３世代のＣＡＲ構築物で修飾されているかどうかとは無関係に起こることを示している。（ａ）第１、第２、および第３世代のＣＡＲ−ＰＳＣＡ構築物のレトロウイルスベクターのマップ、および（ｂ）フローサイトメトリーにより測定した、ＣＡＲの３世代が全てＴ細胞上で発現され得ることを裏付けている代表的なデータ、（ｃ）ＰＳＣＡを発現するＫ５６２細胞との２：１のＴ細胞：Ｋ５６２細胞比での同時培養後の、代表的なドナーの中での第１、第２、および第３世代のＣＡＲ−ＰＳＣＡで修飾したＴ細胞の倍加、（ｄ）第１、第２、および第３世代のＣＡＲで修飾したＴ細胞は、２９３Ｔ細胞およびＣＡＰＡＮ１細胞を標的として使用した６時間の細胞毒性試験により評価した場合は、同等のＰＳＣＡ＋標的の認識を示す（データは、１つの代表的なドナーについて、および５：１のＥ：Ｔで行った７２時間の同時培養実験についての１０：１のＥ：Ｔでの％特異的溶解として表す（ｎ＝１））、（ｅ）ここでは、残存腫瘍細胞を、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ）、ＧＦＰ＋細胞についてのゲーティングにより、定量化した。
【００４０】
【図８】図８は、ｍＯｒａｎｇｅの蛍光強度が、ＭＵＣ１−ｍＯｒａｎｇｅを発現する操作した２９３Ｔ細胞上でのＭＵＣ１抗原の発現と相関関係にあることを明らかにしている。ａは、対照２９３Ｔ細胞のドットプロット、ならびにＭＵＣ１抗原とｍＯｒａｎｇｅを同時発現する操作した２９３Ｔ−ＭＵＣ１−ｍＯｒａｎｇｅ細胞（ＭＵＣ１  ＡｇおよびｍＯｒａｎｇｅ二重陽性細胞）のドットプロットを示す。
【００４１】
【図９】図９は、デシタビンでの処置がＣＡＲ耐性Ｔ細胞のＭＵＣ１の発現をアップレギュレートさせ、ＣＡＲ耐性Ｔ細胞をＴ細胞での処置に対して再度感作させることを示している。最初のＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞での処置に耐性があったＣＡＰＡＮ１細胞をその後の再処置の際に死滅させることができるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＮＴ  Ｔ細胞を対照として用いて、５：１のＥ：Ｔ比で７２時間の同時培養実験を行った。ａ（右のパネル）は、フローサイトメトリーおよびＧＦＰ＋細胞についてのゲーティングを使用して定量化した、残存腫瘍細胞の百分率を示し、結果を平均±ＳＤとして報告する（ｎ＝４）。次に、標的としてのｎＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞で最初に処置したＣＡＰＡＮ１細胞（５：１のＥ：Ｔ）を使用してその後の同時培養（左のパネル）を行い、７２時間後、残存腫瘍細胞を再びフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ）により定量化した。データを平均±ＳＤとして報告する（ｎ＝４）。（ｂ）デシタビンへの暴露によりこの耐性集団中でのＭＵＣ１の発現がアップレギュレートされるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＣＡＲ耐性細胞（灰色の柱状図）およびデシタビン中で培養したＣＡＲ耐性細胞（黒色の柱状図）についてフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ）により抗原の発現を評価した。次に、デシタビンでの処置がＣＡＰＡＮ１細胞をＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞に対して再度感作させるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞で最初に処置したＣＡＰＡＮ１細胞を使用して７２時間の同時培養実験を行った。（ｃ）次に、未処置のままとしたか、または標的としてのデシタビンとともに培養した（５：１のＥ：Ｔ）かのいずれかとした。７２時間後にＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞で再処置し、再び、残存腫瘍細胞をフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ）により定量化した。データを平均±ＳＤとして報告する（ｎ＝２）。
【００４２】
【図１０】図１０は、Ｔ細胞上でのＣＡＲ−ＭＵＣ１の例示的な発現を示す。
【００４３】
【図１１】図１１は、修飾したＴ細胞上でのＣＡＲの発現が高ければ高いほど、死滅速度論が速いことを示している（２９３Ｔ−ＭＵＣ１−ｍＯｒ  ｄｉｍ（低いＭＵＣ１の発現））。
【００４４】
【図１２】図１２は、修飾したＴ細胞上でのＣＡＲの発現が高ければ高いほど、死滅速度論が速いことを示している（２９３Ｔ−ＭＵＣ１−ｍＯｒ  ｂｒｉｇｈｔ（高いＭＵＣ１の発現））。
【００４５】
【図１３】図１３は、デシタビンが修飾したＴ細胞上でのＣＡＲ発現を増強することを示している。
【００４６】
【図１４】図１４は、デシタビンがＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の抗腫瘍作用を増強することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
上記は、以下の本明細書中で提供される方法の詳細な記載がさらに理解され得るように、本発明の主題の特徴および技術的利点をかなり広くまとめている。本明細書中で提供される方法のさらなる特徴および利点は、特許請求の範囲の主題を構成する本明細書中以後に記載される。開示される概念および特異的な実施形態を、同じ目的を実行するための他の構成へと改良または他の構成を設計するための基準として容易に利用できることは当業者に容易に理解されるものとする。そのような等価な構成が、添付の特許請求の範囲に示されるような主題の精神および範囲から逸脱しないこともまた、当業者に理解されるものとする。本明細書中で提供される方法に特徴的であると考えられる新規の特徴（その構成として、および操作方法としてのいずれも）は、さらなる目的および利点とともに、添付の図面と併せて検討されると、以下の記載から良好に理解されるであろう。しかし、各図面が例示および説明の目的のためだけに提供され、本明細書中で提供される方法の限定の定義としては意図されないことがはっきりと理解される。
【００４８】
本明細書中で使用される場合は、「ａ」または「ａｎ」は１つ以上を意味する場合がある。請求項（単数または複数）において本明細書中で使用される場合は、語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と組み合わせて使用される場合は、語句「ａ」または「ａｎ」は１を意味する場合も、また２以上を意味する場合もある。本明細書中で使用される場合は、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第２のもの、またはそれ以上のものを意味し得る。特異的な実施形態では、主題の複数の態様は、例えば、主題の１つ以上の要素または工程「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」場合があり、また主題の１つ以上の要素または工程「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」場合もある。主題のいくつかの実施形態は、主題の１つ以上の要素、方法の工程、および／または複数の方法からなる場合も、また本質的にそれからなる場合もある。本明細書中で記載される任意の方法または組成物が、本明細書中で記載される任意の他の方法または組成に関して実行され得ることが意図される。
【００４９】
本明細書中で使用される場合は、用語「免疫細胞の能力の増強」は、所定の細胞の生物学的特性（天然起源または組換え起源）の増大または改善と定義される。これらの生物学的特性としては、（ｉ）抗原特異性、（ｉｉ）増殖、（ｉｉｉ）移動、（ｉｖ）持続性、および／または（ｖ）死滅させる能力を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。さらに、免疫細胞は、（ｉ）免疫抑制性の腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｉ）薬剤に対する耐性、および／または（ｉｉｉ）自殺遺伝子のような組換えによる修飾を用いて増強することができる。
【００５０】
Ｉ．抗腫瘍活性のための免疫療法の方法
様々な実施形態において、抗腫瘍活性のために免疫細胞を利用する免疫療法の方法が提供される。少なくとも１種の治療用タンパク質を発現する免疫細胞を利用して腫瘍細胞を死滅させる方法が本明細書中で意図される。複数の方法に、免疫細胞中で治療用タンパク質の発現をアップレギュレートする物質とｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触させられた１種以上の免疫細胞を個体に投与する工程が含まれる。特定の実施形態では、上記物質は、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、有糸分裂促進因子、またはこれらの組み合わせである。特異的な実施形態では、腫瘍細胞上の１種以上の標的タンパク質もまた、治療用タンパク質（単数または複数）の発現がアップレギュレートしている免疫細胞に対して腫瘍細胞を暴露すると、発現が増大する。
【００５１】
特定の実施形態では、癌の処置が必要な個体に対して本発明の組成物を提供するための特定の投与レジメンが提供される。そのようなレジメンには、細胞自体に加えて、免疫細胞中の治療用タンパク質の発現のアップレギュレーションのための組成物が含まれる。例えば、免疫細胞中の治療用タンパク質の発現のアップレギュレーションを促す物質が、個体への細胞の送達前に免疫細胞に対して提供され得る、および／または免疫細胞中の治療用タンパク質の発現のアップレギュレーションを促す物質が、個体への細胞の送達に続いて細胞に対して提供され得る。免疫細胞（単数または複数）と物質は、個体に対して別々に提供される場合も、また、一緒に提供される場合もあり、そしてこれらは同じ処方物中に存在する場合も、また同じ処方物中には存在しない場合もあり、そしてこれらは個体に対して同時に提供される場合も、また同時に提供されない場合もある。特定の実施形態では、２種以上のＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、および／または有糸分裂促進因子が、免疫細胞に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで暴露され、そしてこれらが免疫細胞に対して暴露される順序は、細胞により発現される少なくとも１種の治療用タンパク質の発現が増大する限りは、任意の適切な種であり得る。
【００５２】
特定の実施形態では、個体は、１種以上の治療用タンパク質を発現する免疫細胞と１種以上のエピジェネティック調節因子および／または有糸分裂促進因子物質の組み合わせの有効量を個体に提供することにより、癌について処置される。処置には、免疫細胞が治療用タンパク質を発現し、続いて細胞が１種以上のエピジェネティック修飾因子および／または有糸分裂促進因子物質に対して、個体への送達の前および／または個体への送達に続いて暴露されるように、個体由来の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の調節、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの調節が利用され得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書中で記載される免疫細胞は、一旦個体に導入されると、ｉ）プロ炎症性サイトカインを生産すること、ｉｉ）ＮＫ細胞およびＡＰＣのようなさらなる免疫細胞を腫瘍部位に動員すること、ならびにｉｉｉ）エピトープ拡大を誘導することにより、内因性の免疫系に対してポジティブなバイスタンダー効果を有する。したがって、特異的な実施形態では、免疫細胞の養子移入が、抗腫瘍活性を増幅するｉｎ  ｖｉｖｏの事象のカスケードを誘発するために有用である。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾因子（単数または複数）および／または有糸分裂促進因子物質を使用しない場合もなお、免疫細胞（例えば、二重標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞）が、腫瘍の排除を生じるであろう強力な内因性の腫瘍標的化免疫応答を再活性化するために十分である。
【００５４】
ＩＩ．免疫細胞
免疫細胞が、治療が必要な個体の所望される位置に治療用タンパク質を送達する手段として、本明細書中で利用される。免疫細胞は、それらが少なくとも１種の治療用タンパク質を発現し、そして特異的な実施形態では、治療用タンパク質が治療用タンパク質を認識する標的に対して免疫細胞を標的化できるように、修飾される。特異的な実施形態では、治療用タンパク質は免疫細胞上の受容体または抗体であり、標的は抗原である。特異的な実施形態では、抗原は癌抗原であり、固形腫瘍細胞上にある場合は、抗原は腫瘍抗原と呼ばれる場合がある。
【００５５】
特定の実施形態では、免疫療法が修飾された免疫細胞を含む免疫療法のための方法および組成物が提供される。免疫細胞は１種以上の治療用タンパク質を発現するように修飾され、１種以上の治療用タンパク質の発現は、細胞を免疫療法に有効であるようにするために十分なレベルで維持される必要がある。免疫細胞は任意の種の細胞であり得るが、特異的な実施形態では、これらはＴ細胞である。免疫細胞は、治療用タンパク質（単数または複数）の発現をアップレギュレートする物質に、例えば直接、暴露される。免疫細胞は、免疫細胞が必要な個体への送達の前に物質と接触させられる場合がある、および／または免疫細胞は、免疫細胞が必要な個体への送達に続いて物質と接触させられる場合もある。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで物質（単数または複数）と直接接触させられる場合がある、および／または細胞は、個体への細胞の送達の前、その間、および／またはその後の個体への物質の全身的送達および／または局所送達の際に物質とｉｎ  ｖｉｖｏで接触させられる場合がある。
【００５６】
特異的な実施形態では、免疫細胞はＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞、および／またはＴｒｅｇ細胞）であるか、あるいは、ＮＫ細胞または樹状細胞である。本明細書中で使用される場合は、用語「免疫細胞」には、初代の対象細胞とその子孫が含まれる。子孫が同質であること、しかし、子孫は意図的なまたは故意ではない突然変異が原因で必ずしも全てが同一ではない場合があることが理解される。異種核酸配列を発現する状況では、免疫細胞は、ベクターを複製すること、およびベクターによりコードされる異種遺伝子を発現することができる細胞である。特定の実施形態では、免疫細胞は、外因性の核酸を含有しているウイルスベクターを細胞に形質導入することにより、治療用タンパク質をコードする外因性核酸を発現するように操作される。特定の実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクター（ｒｒｅｔｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）である。１つの実施形態では、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。免疫細胞は、外因性の核酸、例えば、ベクター（例えば、発現ベクター）中に含まれる核酸を発現するように操作され得る。本明細書中で使用される場合は、「操作された」細胞または「組換え」細胞は、例えば、ベクターのような外因性の核酸配列がその中に導入されている細胞をいう。したがって、組換え細胞は、組み換えによって導入された核酸を含まない自然界に存在している細胞と区別することができる。
【００５７】
いくつかのベクターは、それが原核生物細胞および真核生物細胞の両方で複製および／または発現されることを可能にする制御配列を利用し得る。当業者は、その下で上記宿主細胞が少なくとも１つのベクターを維持し、少なくとも１つのベクターを複製することができる条件をさらに理解するであろう。ベクターの大規模な生産、ならびにベクターによりコードされる核酸およびそれらに関連するポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生産を可能にするであろう技術ならびに条件もまた理解され、これらは公知である。
【００５８】
免疫細胞は、自己由来の細胞、同系細胞、同種異系細胞であり得、そしてなおさらに、いくつかの場合には、異種細胞であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、細胞は、２種以上の治療用タンパク質を保有し、少なくとも特定の態様では、細胞のエピジェネティック修飾因子または有糸分裂促進因子物質への暴露（あるいは細胞を受容する個体への暴露）により、２種以上の治療用タンパク質の発現のアップレギュレーションが生じる。
【００６０】
特定の実施形態では、免疫細胞が、治療用タンパク質（例えば、ＣＡＲ）、操作されたαβ  ＴＣＲ、および／または抗原特異的受容体を発現するように遺伝子操作される。
【００６１】
ＩＩＩ．ＣＡＲ（単数または複数）を含有している免疫細胞
特定の態様では、免疫細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞である。血液悪性腫瘍および固形腫瘍の両方についての治療としてのＣＡＲで修飾されたＴ細胞の使用がさらに広がりつつある。しかし、単一の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異性抗原（ＴＡＡ）を標的化するＴ細胞産物の注入により、この選択圧下で標的抗原の調節がもたらされ得るか、あるいは、ＴＡＡまたはＴＳＡを低いレベルで発現しており、これに続いて腫瘍の免疫逃避が起こる腫瘍細胞を選択することができる。同じ機構による腫瘍逃避は、２種のＴＡＡまたはＴＳＡが標的化される場合にもなお起こり得る。驚くべきことに、腫瘍の崩壊の大きさが標的抗原の存在だけではなく、発現強度にもまた依存することが明らかにされている。特定の実施形態では、そのようなＴＡＡまたはＴＳＡの発現を、標的の発現をアップレギュレートし、ＣＡＲ−Ｔ細胞の能力を増強するエピジェネティック調節因子を投与することにより増大させることができる。
【００６２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含有している人工的に構築されたハイブリッドタンパク質またはポリペプチドである。ＣＡＲの特徴としては、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用する、Ｔ細胞特異性および選択された標的に対する反応性の向きを、ＭＨＣによっては限定されない様式で変えるそれらの能力が挙げられる。ＭＨＣによっては限定されない抗原認識により、抗原のプロセシングとは無関係に抗原を認識し、これにより腫瘍逃避の主要な機構をバイパスする能力が、ＣＡＲを発現するＴ細胞にもたらされる。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合は、ＣＡＲは、内因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよびβ鎖とは二量体を形成しないことが有利である。
【００６３】
表現「抗原特異性を有する」および「抗原特異的応答を誘発する」は、本明細書中で使用される場合は、ＣＡＲが抗原に特異的に結合し、抗原を免疫学的に認識することができ、その結果、抗原に対するＣＡＲの結合が免疫応答を誘発することを意味する。
【００６４】
細胞外抗原結合ドメインは、標的タンパク質に結合する任意のタンパク質またはその一部（例えば、その受容体またはリガンド結合部分）；受容体のリガンド（例えば、サイトカイン）；あるいは抗体または抗体の抗原結合部分（例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）のＦｃドメイン）であり得る。
【００６５】
特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、およびＣＤ２８膜貫通ドメインからなる群より選択される膜貫通ドメインを含む。
【００６６】
細胞内シグナル伝達ドメインは、特定の実施形態では、第１のシグナル伝達ドメイン、例えば、Ｔ細胞受容体ζ鎖またはそれに由来する第１のシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、１つ以上の共刺激ドメインを含む。本明細書中で意図されるＣＡＲ中での使用に適している共刺激ドメインの説明のための例としては、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＯＸ−４０、または上記の２つ、３つ、もしくは全ての組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００６７】
特異的な実施形態では、ＣＡＲは、腫瘍抗原に対する抗体、細胞質シグナル伝達ドメインの一部もしくは全体、および／または１種以上の共刺激分子の一部もしくは全体（例えば、共刺激分子のエンドドメイン（ｅｎｄｏｄｏｍａｉｎ）を含む。特異的な実施形態では、抗体は単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、特定の態様では、抗体は癌細胞の細胞表面上の標的抗原に向けられている。特定の実施形態では、Ｔ細胞受容体ζ鎖由来の細胞質シグナル伝達ドメインのような細胞質シグナル伝達ドメインが、標的抗原とのキメラ受容体の会合後のＴリンパ球の増殖およびエフェクター機能のための刺激シグナルを生じさせるために、キメラ受容体の少なくとも一部として利用される。説明のための例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）およびＯＸ４０のような共刺激分子に由来するエンドドメイン、または上記の２つ、３つ、４つ、もしくは全ての組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特定の実施形態では、共刺激分子は、抗原の会合後にＣＡＲにより生産されるＴ細胞の活性化、増殖、および細胞傷害性を増強するために利用される。特異的な実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および４−１ＢＢである。
【００６８】
１つの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および随意に、ＣＤ８配列を含有している細胞内ヒンジドメインと、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζを含有している細胞内Ｔ細胞受容体シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の共刺激において重要なＴ細胞マーカーである。ＣＤ８もまたＴ細胞マーカーである。４−１ＢＢは強力な共刺激シグナルをＴ細胞に伝達し、Ｔリンパ球の分化を促進し、長期にわたるＴリンパ球の生存を促す。ＣＤ３ζはＴＣＲと会合してシグナルを生じ、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。１つの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および随意に細胞内ヒンジドメインを含む。
【００６９】
ＣＡＲは、第１世代、第２世代、または第３世代（シグナル伝達が、例えば、ＣＤ２８および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦｒ）（例えば、４−１ＢＢまたはＯＸ４０）により提供される共刺激とともにＣＤ３ζにより提供されるＣＡＲ）であり得る。ＣＡＲは、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ鎖または軽鎖、λ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＣＥ７、ＣＥＡ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、Ｆｅｔａｌ  ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ｓｐｌ７、腫瘍により発現されるウイルス関連抗原、あるいは遺伝的分析および／または腫瘍のディファレンシャルな発現の研究により同定された他の腫瘍関連抗原に特異的であり得る。
【００７０】
特定の実施形態では、ＣＡＲは発現ベクターによりコードされる。特定の実施形態では、ベクターは２シストロン性であり得る。いくつかの実施形態では、２種以上のＣＡＲが免疫細胞により発現される。２種以上のＣＡＲを免疫細胞により発現させようとする特定の実施形態では、２種以上のＣＡＲ発現構築物を同じベクター上に存在させることができ、また、同じベクター上に存在させなくてもよい。同じベクター上に存在する場合は、第１のＣＡＲコード配列は、第２のＣＡＲコード配列に対して５’または３’に配置され得る。第１のＣＡＲおよび第２またはそれ以上のＣＡＲ受容体の発現は、同じまたは異なる調節配列の指示下に存在し得る。
【００７１】
特定の場合は、免疫細胞は、治療用タンパク質を膜結合タンパク質として含有する。特定の実施形態では、上記タンパク質は免疫細胞から分泌可能である。特定の実施形態では、治療用タンパク質は癌抗原の受容体であり、癌抗原（固形腫瘍上に存在しても、またそうでなくてもよい）は、癌細胞の表面上に存在し得る。特異的な実施形態では、受容体はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。特定の場合は、免疫細胞は、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＡＲを含有しているＴ細胞である。
【００７２】
免疫細胞が少なくとも１つのＣＡＲを含有しているいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、任意のタイプの癌抗原に向けられ得る。特定の実施形態では、免疫細胞は、１つの癌抗原に向けられた１つのＣＡＲと、別の癌抗原に向けられた別のＣＡＲを同じ細胞中に含有する。
【００７３】
特定の実施形態では、個体に、１種以上の治療用タンパク質を発現する治療有効量の複数の免疫細胞が提供される。いくつかの実施形態では、個体には続いて、個体に最初に提供された免疫細胞（単数または複数）とは異なる、１種以上の他の治療用タンパク質を発現する治療有効量の複数の免疫細胞が提供される。
【００７４】
例えば、いくつかの状況では、修飾された免疫細胞を死滅させることができることが望まれる場合がある。特定の実施形態では、制御された条件（例えば、誘導性の自殺遺伝子）下での特定の遺伝子産物の発現により、免疫細胞を死滅させる。誘導性の自殺遺伝子の説明のための例としては、カスパーゼ−９、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、およびニトロレダクターゼが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００７５】
ＩＶ．治療用タンパク質の発現をアップレギュレートする物質
様々な実施形態において、免疫細胞中での治療用タンパク質の発現をアップレギュレートする物質が提供される。特定の実施形態では、アップレギュレーションは検出可能であり、その物質に暴露されない場合の細胞中でのその発現より大きい。特異的な実施形態では、物質（単数または複数）は、治療用タンパク質の発現を少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上にアップレギュレートする。
【００７６】
１つの実施形態では、発現をアップレギュレートする物質は任意の種の物質であり得る。特異的な実施形態では、物質は、ＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤を含むがこれらに限定されないエピジェネティック修飾因子、ならびに有糸分裂促進因子の一方あるいは両方である。
【００７７】
Ａ．エピジェネティック修飾因子
いくつかの実施形態では、１種以上のエピジェネティック修飾因子が、免疫細胞中での１種以上の治療用タンパク質の発現をアップレギュレートするための方法および組成物において利用される。エピジェネティック修飾因子は、それらが免疫細胞中の少なくとも１種の治療用タンパク質の発現をアップレギュレートできる限りは、任意の種であり得る。１以上のタイプのエピジェネティック修飾因子が同じ方法または組成物中で使用される場合がある。２種以上のエピジェネティック修飾因子が利用される場合は、これらは、細胞に対して、あるいは個体に対して、同時に、異なるタイミングで、同じ処方物中で、または異なる処方物中で送達され得る。いくつかの場合には、エピジェネティック修飾因子はヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤である。いくつかの場合には、エピジェネティック修飾因子はＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤である。特定の場合は、ＨＤＡＣ阻害剤とＤＮＭＴ阻害剤の組み合わせが利用される。エピジェネティック修飾因子は、例えば、ＤＺｎｅｐまたは３−デアザンプラノシンＡのようなＥＺＨ２アンタゴニストであり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾因子（単数または複数）は、１種以上のヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。ＨＤＡＣ阻害剤としては、短鎖脂肪酸、ヒドロキサム酸（ｈｙｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、環状ペプチド、またはベンズアミドが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＨＤＡＣ阻害剤のさらなる説明のための例として、トリコスタチンＡ、フェニル酪酸ナトリウム、ブフェニール（Ｂｕｐｈｅｎｙｌ）、アンモナプス（Ａｍｍｏｎａｐｓ）、バルプロ酸、デパコート（Ｄｅｐａｋｏｔｅ）、ロミデプシン（ＩＳＴＯＤＡＸ（登録商標））、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、ゾリンザ（Ｚｏｌｉｎｚａ）、パノビノスタット（ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、ベリノスタット（ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、エンチノスタット（ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）、ＪＮＪ−２６４８１５８５（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ社；ペンシルベニア州、ラングホーン所在）、および／またはＭＧＣＤ−０１０３（ＭｅｔｈｙｌＧｅｎｅ社；カナダ、モントリオール所在）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾因子（単数または複数）は１種以上のＤＮＭＴ阻害剤を含む。ＤＮＭＴ阻害剤としては、ヌクレオシドアナログ、キノロン、または活性部位阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＤＮＭＴ阻害剤のさらなる説明のための例としては、５−アザシチジン（例えば、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、デシタビン（例えば、ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、ゼブラリン、ＳＧＩ−１１０またはＳＧＩ−１０３６（ＳｕｐｅｒＧｅｎ社；カリフォルニア州、ダブリン所在）、ＲＧ１０８、コーヒー酸プラム、クロロゲン酸、没食子酸エピガロカテキン、塩酸プロカインアミド、プロカインアミド誘導体、５−アザデオキシシチジン、５’−アザ−２’−デオキシシチジン、あるいはＭＧ９８が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００８０】
Ｂ．有糸分裂促進因子
いくつかの実施形態では、１種以上の有糸分裂促進因子が方法または組成物中で使用される。有糸分裂促進因子（単数または複数）を、それが必要な個体に提供することができ、また、有糸分裂促進因子（単数または複数）を、それが必要な個体に送達される免疫細胞に提供することもできる。有糸分裂促進因子は、物質の唯一のタイプとして使用される場合があり、また、有糸分裂促進因子が、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤および／またはＤＮＭＴ阻害剤を含む別の物質と組み合わせて使用される場合もある。有糸分裂促進因子の説明のための例としては、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニン、リポ多糖、およびヤマゴボウ有糸分裂促進因子が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００８１】
Ｖ．細胞および／または個体への物質（単数または複数）の送達
特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの方法が提供され、いくつかの実施形態では、例えば、上記方法の一部がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であり得、これに続いてｉｎ  ｖｉｖｏでの工程が行われ得る。
【００８２】
特定のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実施形態においては、複数の免疫細胞を得ることができる。細胞は個体から得られ、操作され、最終的に同じ個体に送達して戻され得る。細胞が個体から得られ、操作され、最終的に、別の個体に送達される場合もある。いくつかの場合には、免疫細胞は例えば、貯蔵庫から得られるか、または市販により得られる。
【００８３】
細胞の物質への暴露の前に、免疫細胞が１つ以上の様々な方法で操作され得る。特異的な実施形態では、核酸が、例えば、標準的な手段により細胞に導入される。核酸は、例えば、少なくとも１つの治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの発現構築物を持つ少なくとも１つのベクターであり得る。特定の実施形態では、治療用タンパク質は、受容体、サイトカイン、リガンドトラップ、または抗体（単量体抗体または多量体抗体を含む）である。特異的な実施形態では、治療用タンパク質はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはサイトカイン受容体である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、細胞は、それらが２種以上の治療用タンパク質を含み、細胞（単数または複数）内での２種以上の治療用タンパク質の保持を監視するための機構（例えば、標識および／または選択マーカー）が存在し得るように操作される。
【００８５】
特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの方法の細胞は、例えば、当該分野で日常的に行われている方法によって増殖させられる。
【００８６】
細胞のエピジェネティック修飾因子物質または有糸分裂促進因子物質への暴露は、細胞が、治療用タンパク質の発現をアップレギュレートさせるために十分な量の物質を十分な時間にわたって受容する限りは、任意の適切なレジュメにより行われ得る。いくつかの実施形態では、物質は、個体への細胞の送達の前に２回以上、免疫細胞に対して送達される。特定の実施形態では、２種以上の物質が免疫細胞に対して、個体への細胞の送達の前に同時にまたは異なるタイミングで提供され、そしてこれらの物質は同じタイプの物質であっても、また、例えば１種のＨＤＡＣ阻害剤と１種のＤＮＭＴ阻害剤のような、異なるタイプの物質であってもよい。個体への細胞の送達の前に、個体がエピジェネティック修飾因子物質または有糸分裂促進因子物質で前処置される場合は、その物質またはそれらの複数の物質は、個体への送達の前に細胞に提供されたものと同じ物質または同じ複数の物質であってよく、またそうでなくてもよい。いくつかの場合には、細胞は、個体への細胞の送達の前にはエピジェネティック修飾因子物質または有糸分裂促進因子物質に暴露されない。
【００８７】
特定の実施形態では、免疫細胞／物質での処置が必要な個体が、細胞の受領の前に物質に暴露されるが、特異的な実施形態では、個体が、細胞の受領の前の物質への暴露に加えて、または物質への暴露の代わりとして物質に暴露され得、その後、細胞を受領し得る。特定の実施形態では、個体に、複数回の投与での物質の前処置が提供される。物質は任意の適切な手段により個体に送達され得るが、特異的な実施形態では、送達は、経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、舌下などである。２種以上の物質が個体に送達される場合は、複数種の物質が別々の送達手段により送達される場合があるが、特定の実施形態では、複数種の物質が同じ経路により送達され、そして同じ処方物中に存在する場合も、また同じ処方物中には存在しない場合もある。
【００８８】
いくつかの実施形態では、個体は免疫細胞を複数回受領し、別々の送達は、数分、数日、数週間、数か月、または数年の間隔で隔てられ得る。これらの場合は、細胞の送達の別々の経過に、同じまたは異なる治療用タンパク質を有している免疫細胞が含まれ得る。個体は、次の回で、最初の回で個体が処置された物質と同じ物質での処置に暴露される場合があり、また、異なる物質での処置に暴露される場合もある。個体への細胞の任意の回の暴露に、物質での前処置および／または後処置が含まれ得る。
【００８９】
ＶＩ．薬学的組成物
物質および／または細胞を含有している薬学的組成物に関して、薬学的に許容され得る担体は、任意の慣習的に使用されるものであってよく、溶解度および活性物質（単数または複数）との反応性がないことのような化学的−物理的検討によって、ならびに投与経路によってのみ限定される。本明細書中に記載される薬学的に許容され得る担体（例えば、媒体、アジュバント、賦形剤、および希釈剤）は当業者に周知であり、一般に容易に入手できる。薬学的に許容され得る担体は、活性物質（単数または複数）に対して化学的に不活性な担体、および使用条件下で有害な副作用も毒性もない担体であることが好ましい。
【００９０】
担体の選択は、特定の材料により、ならびに本発明の材料を投与するために使用される特定の方法により、一部決定されるであろう。したがって、本発明の薬学的組成物の様々な適切な処方物が存在する。防腐剤が使用され得る。適切な防腐剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。２種以上の防腐剤の混合物が随意に使用され得る。防腐剤またはそれらの混合物は、典型的には、組成物全体の約０．０００１重量％〜約２重量％の量で存在する。
【００９１】
適切な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩を挙げることができる。２種以上の緩衝剤の混合物が、随意に使用され得る。緩衝剤またはそれらの混合物は、典型的には、組成物全体の約０．００１重量％〜約４重量％の量で存在する。
【００９２】
投与可能な（例えば、非経口投与可能な）組成物を調製するための方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，第６２版、Ｏｒａｄｅｌｌ，ＮＪ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．，２００８年；Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１１版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００５年；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５年；およびＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，第１４版、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ：Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，２００６年（これらのそれぞれが関連する部分の参照により本明細書中に組み入れられる）の中でさらに詳細に記載されている。
【００９３】
経口、エアロゾル、非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および髄腔内）投与、ならびに局所投与のための以下の処方物は単なる例示であり、決して限定ではない。本発明のＣＡＲ材料を投与するために２以上の経路を使用することができ、特定の場合には、特定の経路が、別の経路よりもさらに迅速かつさらに有効な応答を提供することができる。
【００９４】
経口投与に適している処方物としては以下が挙げられる：希釈剤（例えば、水、生理食塩水、またはオレンジジュース）を随意に含む液体溶液；（ｂ）カプセル剤、サシェ剤（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、ロゼンジ、およびトローチ（それぞれが、固体または顆粒として所定量の有効成分を含む）；（ｃ）粉末；（ｄ）適切な液体中の懸濁剤；ならびに（ｅ）適切な乳剤。液体処方物は、薬学的に許容され得る表面活性物質が添加されているか、または添加されていない、水およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、およびポリエチレンアルコール）のような希釈剤を含み得る。カプセル形態は、例えば、表面活性物質、滑沢剤および不活性充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、およびコーンスターチ）を含有している通常のハードシェルまたはソフトシェルゼラチン型のカプセルであり得る。錠剤形態は以下の１種以上を含有し得る：ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤および他の薬理学的に適合性の賦形剤。ロゼンジ形態は、当該分野で公知であるようなそのような賦形剤を含有していることに加えて、不活性基剤（例えば、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア）、乳剤、ゲルなどの中に、香味剤化合物（通常、スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント）ならびにトローチ錠を含有し得る。
【００９５】
非経口投与に適している処方物としては、水性および非水性の等張性の滅菌された注射溶液（抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る）、ならびに水性および非水性の滅菌された懸濁剤（懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含有し得る）が挙げられる。本発明のＣＡＲ材料は、薬学的に許容され得る表面活性物質（例えば、石鹸または界面活性剤）、懸濁化剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース）、または乳化剤および他の薬学的アジュバントが添加されているか、あるいは添加されていない、薬学的担体（例えば、滅菌された液体または液体の混合物（例えば、薬学的に許容され得る細胞培養培地、水、生理食塩水、水性デキストロース、および関連する糖溶液、アルコール（例えば、エタノールまたはヘキサデシルアルコール）、グリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール（例えば、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノール）、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル、またはグリセリド、あるいはアセチル化脂肪酸グリセリドを含有している））中の生理学的に許容され得る希釈剤中で投与され得る。
【００９６】
非経口処方物中で使用され得る油としては、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。油の具体的な例としては、落花生油、大豆油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ワセリン、および鉱油が挙げられる。非経口処方物中での使用に適している脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルが、適している脂肪酸エステルの例である。
【００９７】
非経口処方物中での使用に適している石鹸としては、脂肪酸のアルカリ金属、アンモニウム、およびトリエタノールアミン塩が挙げられ、適している界面活性剤としては以下が挙げられる：（ａ）カチオン性界面活性剤（例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライドおよびアルキルピリジニウムハライド）、（ｂ）アニオン性界面活性剤（例えば、アルキル、アリール、およびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、およびモノグリセリド硫酸塩、およびスルホコハク酸塩）、（ｃ）非イオン性界面活性剤（例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、およびポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー）、（ｄ）両性界面活性剤（例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸塩および２−アルキル−イミダゾリン第４級アンモニウム塩）、ならびに（ｅ）それらの混合物。
【００９８】
非経口処方物には典型的には、例えば、溶液中に約０．５重量％〜約２５重量％の活性物質または細胞が含まれるであろう。防腐剤および緩衝液が使用され得る。注射部位での刺激を最小にするまたは排除するために、そのような組成物には、例えば、約１２〜約１７の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有している１種以上の非イオン性表面活性物質が含まれ得る。そのような処方物中の表面活性物質の量は、典型的には、例えば、約５重量％〜約１５重量％の範囲であろう。適している表面活性物質としては、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、およびプロピレンオキシドのプロピレングリコールとの縮合によって形成される、エチレンオキサイドの疎水性塩基との高分子量付加物が挙げられる。非経口処方物は、単一用量または複数用量の密封された容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中に提示され得、使用の直前の滅菌された液体賦形剤（例えば、注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時注射溶液および懸濁剤は、上記種類の滅菌された粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【００９９】
注射可能な処方物は、本発明の１つの実施形態に従う。注射可能な組成物のための有効な薬学的担体についての必要条件は、当業者に周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＢａｎｋｅｒおよびＣｈａｌｍｅｒｓ編，２３８−２５０頁（１９８２）、およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，第４版，６２２−６３０頁（１９８６）を参照のこと）。
【０１００】
局所用処方物（経皮薬物放出に有用なものを含む）は当業者に周知であり、皮膚への塗布のための本発明の実施形態の状況に適している。本明細書中で意図される組成物は、吸入により投与されるエアロゾル処方物にされ得る。これらのエアロゾル処方物は、加圧された許容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に入れられ得る。これらはまた、ネブライザーまたはアトマイザーのような非加圧型調製物用の医薬として処方される場合もある。このようなスプレー処方物は、粘膜にスプレーするためにも使用され得る。
【０１０１】
「有効量」または「処置に有効な量」は、個体において癌を予防または治療するために適切な用量をいう。治療的使用または予防的使用に有効な量は、例えば、処置される疾患または障害の病期および重篤度、患者の年齢、体重および全般的健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存するであろう。用量のサイズはまた、選択される活性物質、投与方法、投与のタイミングおよび頻度、特定の活性物質の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質および程度、ならびに所望される生理学的効果によっても決定されるであろう。様々な疾患または障害に、複数回の投与を含む長期にわたる処置が必要であり得、おそらく、各投与回または様々な投与回において本明細書中で意図される物質および／または細胞が使用されることが、当業者に理解されるであろう。本発明の限定を意図しない例として、組成物の用量は、約０．００１〜約１０００ｍｇ／治療される被験体のｋｇ体重／日、約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１ｍｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。
【０１０２】
本明細書中に記載されるＴ細胞を含有している薬学的組成物が、１０２〜１０１０細胞／ｋｇ体重、好ましくは、１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投与量で投与され得ることが一般的に記載され得る。細胞数は、組成物について意図される最終的な用途、ならびにその中に含まれる細胞のタイプに依存するであろう。本明細書中で提供される用途については、細胞は一般的には、１Ｌ以下の容積中に存在し、５００ｍＬ以下、なおさらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であり得る。よって、所望される細胞密度は、典型的には１０６細胞／ｍｌより大きく、一般的には１０７細胞／ｍｌより大きく、一般的には１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する数の免疫細胞を、複数回の注入に分配することができ、これは累積すると１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞に等しいか、あるいはこれらを上回る。本発明のいくつかの態様では、特に、注入された細胞の全てが特定の標的抗原に対して再度向けられるであろうとの理由から、１０６／ｋｇ（患者あたり１０６〜１０１１）の範囲のより少数の細胞が投与され得る。ＣＡＲを発現する細胞組成物は、これらの範囲の投与量で複数回投与され得る。
【０１０３】
本発明の目的のためには、投与される本明細書中で意図される組成物の量または用量は、合理的な時間枠の間を通じて被験体または動物において治療的応答または予防的応答をもたらすために十分でなければならない。例えば、組成物の用量は、投与時点から約２時間以上の期間（例えば、約１２時間〜約２４時間またはそれ以上）において、抗原に結合するため、または疾患を検出、処置、もしくは予防するために、十分でなければならない。特定の実施形態では、この期間はさらに長くてもよい。用量は、特定の組成物の効力および動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに処置しようとする動物（例えば、ヒト）の体重によって決定されるであろう。
【０１０４】
本明細書中で意図される実施形態の状況において有用な送達系としては、本発明の組成物の送達が、処置しようとする部位の感作の前に、および感作を生じるために十分な時間で起こるような、時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）、遅延放出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）および徐放（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）送達系を挙げることができる。本発明の組成物は、他の治療薬または治療法と組み合わせて使用され得る。そのような系は、組成物の反復投与を回避し、それにより、被験体および医師の利便性を向上させることができ、本発明の特定の組成物の実施形態に特に適したものであり得る。
【０１０５】
多くのタイプの放出送達系を利用することができ、当業者に公知である。これらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート（ｃｏｐｏｌｙｏｘａｌａｔｅ）、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物のようなポリマーをベースとする系が含まれる。薬物を含有している上記ポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系としてはまた、ステロール（例えば、コレステロール、コレステロールエステル）および脂肪酸または中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド）を含む脂質；ヒドロゲル放出系；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）系；ペプチドをベースとする系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合させられた移植物（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）などである非ポリマー系も挙げられる。具体的な例としては以下が挙げられるがこれらに限定されるわけではない：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、同第４，６６７，０１４号、同第４，７４８，０３４号および同第５，２３９，６６０号に記載されているような、活性組成物がマトリックス内にある形態で含まれる、侵食性の系、および（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号および同第３，８５４，４８０号に記載されているような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散性の系。加えて、ポンプによるハードウェア送達系も使用され得、そのうちいくつかは、移植に適合している。
【０１０６】
ＶＩＩ．併用療法
特定の実施形態では、それ自体が治療用物質を含有している免疫細胞および／またはエピジェネティック修飾因子物質あるいは有糸分裂促進因子物質に加えて、１種以上の医療が個体に提供され得る。１種以上の他の医療は、任意の種の医学的症状に適している医療であり得るが、特定の実施形態では医学的症状は癌である。
【０１０７】
特異的な実施形態では、併用療法は１種以上の抗癌剤を含む。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を死滅させる、癌細胞中でアポトーシスを誘導する、癌細胞の増殖速度を低下させる、転移の発生もしくは数を減少させる、腫瘍のサイズを小さくする、腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍もしくは癌細胞への血液の供給を減少させる、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促す、癌の進行を妨げるもしくは阻害する、または癌の被験体の寿命を延ばすことにより、被験体において癌にネガティブな影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるかまたは細胞の増殖を阻害するために有効な合計量（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｍｏｕｎｔ）で提供されるであろう。このプロセスには、細胞をナノ粒子および物質（単数または複数）と、または複数種の因子（単数または複数）と同時に接触させる工程が含まれ得る。これは、細胞を両方の物質を含有している単一の組成物もしくは薬学的処方物と接触させることにより、または細胞を２種類の異なる組成物もしくは処方物と同時に接触させることにより（この場合、１つの組成物にはナノ粒子が含まれ、他方の組成物には第２の物質（単数または複数）が含まれる）達成され得る。
【０１０８】
本発明の状況では、本発明の治療法を、例えば、化学療法、放射線治療、または免疫療法による介入と組み合わせて同様に使用することができることが意図される。代わりに、本発明の治療法は、数分から数週間までの範囲の間隔で他の処置に先行して、または他の処置に続いて行われ得る。他の治療法と本発明の治療法が細胞または個体に対して別々に行われるいくつかの実施形態では、一般的には、物質および本発明の治療法が、なおも細胞に対して有利な併用効果を発揮できるであろうように、各送達の時間の間が途切れない有意な期間が確保されるであろう。そのような場合は、互いに約１２〜２４時間以内、およびより好ましくは互いに約６〜１２時間以内に、細胞が両方の治療法と接触させられ得ると考えられる。しかし、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８週）の期間があるいくつかの状況では、処置期間を有意に伸ばすことが望まれる場合がある。
【０１０９】
様々な組み合わせが利用され得、ここでは例えば、ナノ粒子による治療が「Ａ」であり、第２の物質（例えば、放射線治療または化学療法）が「Ｂ」である：
【０１１０】
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
【０１１１】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
【０１１２】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１１３】
本発明の治療用ナノ粒子の患者への投与には、いくつかの場合は、化学療法の投与のための一般的なプロトコールが続いて行われるであろう。処置のサイクルが必要に応じて繰り返し行われるであろうと予想される。様々な標準的な治療法、ならびに外科手術による介入が本発明の過剰増殖による治療（ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）と組み合わせて行われ得ることもまた意図される。
【０１１４】
Ａ．化学療法
癌治療には、化学的処置と放射線による処置の両方を用いる様々な併用療法もまた含まれる。併用される化学療法剤としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合薬、タキソール、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または上記の任意のアナログもしくは誘導変異体が挙げられる。
【０１１５】
Ｂ．放射線治療
ＤＮＡ損傷を引き起こす、幅広く使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の方向性を持った送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波およびＵＶ照射のような、他の形態のＤＮＡを損傷する因子も意図される。これらの因子が全て、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製および修復に対して、ならびに染色体の組み立ておよび維持に対して、広範囲の損傷を引き起こす可能性が最も高い。Ｘ線についての線量域は、長期間（３〜４週間）についての５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体についての線量域は非常に幅広く、同位体の半減期、放射される放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１１６】
用語「接触させられる」および「曝露される」は、細胞に対して適用される場合は、治療用構築物（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、および化学療法剤もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞に直接近接して配置されるというプロセスを記載するために本明細書で使用される。細胞の死滅または静止を達成するためには、両方の物質が細胞を死滅させるため、またはその分裂を防ぐために有効な合計量で細胞に送達される。
【０１１７】
Ｃ．免疫療法
特定の実施形態では、加えて、本開示の免疫療法以外の免疫療法が利用され得る。免疫治療薬は一般に、癌細胞を標的とし、破壊するための、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存しており、本発明の実施形態に加えて、本発明以外の免疫治療薬が利用され得る。代わりの治療薬が本明細書中で意図される免疫細胞上に含まれる場合があり、また含まれない場合もある。
【０１１８】
免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で、治療薬のエフェクターとしての役割を果たす場合があり、または抗体が、実際に細胞死滅を生じるように他の細胞を誘導する場合もある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合して、単に標的化剤としての役割を果たす場合もある。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を持つリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０１１９】
従って、免疫療法は、併用療法の２方向からのアプローチとして使用することができる。併用療法についての一般的なアプローチが以下で議論される。一般的には、腫瘍細胞は、標的化しやすい、すなわち、大部分の他の細胞上には存在しないいくつかのマーカーを持っていなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのうちの任意のものが本発明の状況での標的化に適し得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原（Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５が挙げられる。
【０１２０】
Ｄ．遺伝子治療
さらに別の実施形態では、二次的な処置は、治療用ポリヌクレオチドが本発明の治療剤の前、後、またはそれと同時に投与される遺伝子治療であり得る。治療用ポリヌクレオチドが治療用ポリペプチド全体もしくはその一部をコードする場合があり、またはポリヌクレオチド自体が治療剤（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）である場合もある。本開示の治療剤と組み合わせた、全長もしくは短縮型の治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドのいずれかをコードするベクターの送達は、標的組織に対して組み合わせによる過剰増殖を抑える効果（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を有するであろう。
【０１２１】
Ｅ．外科手術
癌を有している人のおよそ６０％は、予防的、診断的、または病期診断的、治癒的および症状緩和的な外科手術を含む、いくつかのタイプの外科手術を受けるであろう。治癒的外科手術は、本発明の処置、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替治療のような他の治療法と組み合わせて使用され得る癌の処置である。
【０１２２】
治癒的外科手術としては、癌性組織全体または一部を物理的に切除、摘出および／または破壊する切除術が挙げられる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的切除をいう。腫瘍切除術に加えて、外科手術による処置としては、レーザー手術、冷凍外科手術、電気外科手術、および顕微鏡下手術（モース顕微鏡手術（Ｍｏｈｓ’  ｓｕｒｇｅｒｙ））が挙げられる。本発明が表在性の癌、前癌状態、または偶発的量の正常組織の切除と組み合わせて使用され得ることがさらに意図される。
【０１２３】
癌様細胞、組織、または腫瘍の一部または全てを切除すると、体内に腔が形成される可能性がある。処置は、さらなる癌に対する治療によるその領域の潅流、直接注入または局所塗布によって行われる場合がある。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎に繰り返し行われる場合があり、または１、２、３、４、および５週間毎に繰り返し行われる場合もあり、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月毎に繰り返し行われる場合もある。これらの処置は、さらに、様々な用量での処置であり得る。
【０１２４】
Ｆ．他の物質
処置の治療的有効性を改善するために、本発明と組み合わせて他の物質を使用することができることが意図される。これらのさらなる物質としては、免疫調節剤、細胞表面受容体のアップレギュレーションおよびＧＡＰ接合部に影響を及ぼす物質、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着阻害剤、またはアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を高める物質が挙げられる。免疫調節剤としては、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカインアナログ；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインが挙げられる。Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬのような細胞表面受容体またはそれらのリガンドのアップレギュレーションが、過剰増殖細胞に対する自己分泌作用またはパラクリン作用の確立により本発明のアポトーシス誘導能力を増強するであろうことがさらに意図される。ＧＡＰ接合部の数を増加させることによる細胞内シグナル伝達の増大は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する過剰増殖を抑える効果を高めるであろう。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤を、処置の過剰増殖を抑える有効性を改善するために本発明と組み合わせて使用することができる。細胞接着阻害剤は、本発明の有効性を改善すると考えられる。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５のようなアポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を高める他の物質を、処置の有効性を改善するために本発明と組み合わせて使用できることがさらに意図される。
【０１２５】
ホルモン療法もまた、本発明と組み合わせて、または上記の任意の他の癌治療と組み合わせて使用され得る。ホルモンの使用は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、または子宮頚癌のような特定の癌の処置において、またはテストステロンもしくはエストロゲンのような特定のホルモンのレベルを下げる、もしくは特定のホルモンの作用を遮断するために利用され得る。この処置はしばしば、処置の選択肢として、または転移のリスクを下げるために、少なくとも１つの他の癌治療と組み合わせて使用される。
【０１２６】
ＶＩＩＩ．キット
本明細書中に記載する任意の組成物をキットに含めることができる。非限定的な例では、エピジェネティック修飾因子および／または有糸分裂促進因子物質および／または免疫細胞および／または個体と比較して自己由来もしくは同種異系である免疫系の細胞（ｉｍｍｕｎｅ’ｓ  ｃｅｌｌ）を抽出するための装置が存在し得る。薬物（単数または複数）（例えば、抗癌剤）を含む別のタイプの治療剤のような１種以上の治療剤または他の物質が、１つのキットに含まれる場合がある。いくつかの実施形態では、免疫細胞の増殖のための試薬が含まれ得る。他の組成物として、標準的な緩衝液、塩などを挙げることができる。キットはその成分を適切な容器手段の中に含むであろう。そのような成分は適切に等分され得る。キットの成分は、水性媒体中に、または凍結乾燥した形態のいずれかでパッケージされ得る。キットの容器手段は、一般的には、その中に成分を入れる、好ましくは、成分を適切に等分することができる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器、または他の容器手段を含む。２以上の成分がキットの中に存在する場合は、キットはまた、一般的に、その中にさらに別の成分が別々に入れられ得る第２、第３、または他のさらなる容器も含む。しかし、成分の様々な組み合わせがバイアルの中に含まれ得る。また、本発明のキットは、典型的には、販売のための厳重な密封の中に成分の容器を含めるための手段も含む。そのような容器として、その中に所望されるバイアルが保持される、射出成形されたまたは吹き込み成形されたプラスチック製の容器を挙げることができる。
【０１２７】
キットの成分が、１種および／またはそれ以上の液体溶液中で提供される場合には、この液体溶液は水性溶液であり得、滅菌された水性溶液が特に好ましい。組成物はまた、注射可能な組成物に処方される場合もある。その場合は、容器手段自体が、注射器、ピペット、および／または他のそのような同様の装置であり得、そこから処方物を身体の感染部位に塗布する、動物に注射する、および／または、さらにはキットの他の成分に加えるおよび／または他の成分と混合することができる。
【０１２８】
しかし、キットの成分は乾燥した粉末（単数または複数）として提供される場合がある。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合は、適切な溶媒の添加により粉末を再構成することができる。溶媒もまた別の容器手段の中で提供され得ることが想定される。
【０１２９】
容器の数および／またはタイプとは無関係に、本発明のキットはまた、最終的な組成物の動物の体内への注射／投与、および／または配置を補助するための器具を含む場合がある、および／またはそのような器具とともに同梱される場合もある。そのような器具は、注射器、ピペット、鉗子、および／または任意のそのような医学的に承認されている送達媒体であり得る。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために含まれる。当業者は、以下の実施例で開示される技術が、本発明者によって、本発明を実施する際に十分に機能することが発見され、それゆえ、その実施に好ましい態様を構成すると考えることができる技術を代表するものであることを理解するものとする。しかし、当業者は、本開示を踏まえて、開示される具体的な実施形態に多くの変更を加えることができ、なおも、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似する結果を得ることができることを理解するものとする。
【０１３１】
実施例１
方法および材料
例示的な材料および方法を本明細書中に提供する。
【０１３２】
ドナーおよび細胞株
【０１３３】
膵臓癌細胞株ＣＡＰＡＮ１（これは自然界においてＰＳＣＡおよびＭＵＣ１を発現している）およびヒト胚腎臓細胞株２９３Ｔをアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。細胞を、完全ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニューヨーク州、グランド・アイランド所在）、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ユタ州、ローガン所在）および２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニューヨーク州、グランド・アイランド所在）中、ならびに５％の二酸化炭素（ＣＯ２）を含有している３７℃の加湿空気中で維持した。健常者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ベイラー医科大学（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の機関内評価委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）により承認されたプロトコールについてインフォームドコンセントを行って入手した。
【０１３４】
ＯＫＴ３／ＣＤ２８芽細胞の作製
【０１３５】
健常ドナーから得たＰＢＭＣを、ＯＫＴ３（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．社、ニュージャージー州、ブリッジウォーター所在）およびＣＤ２８抗体（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  Ｃｏ．社、カリフォルニア州、マウンテンビュー所在）で活性化させ、４５％のＣｌｉｃｋｓ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州、サンタアナ所在）、１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ユタ州、ローガン所在）および２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニューヨーク州、グランド・アイランド所在）を含有している完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０；Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ユタ州、ローガン所在）中の非組織培養処理した２４ウェルプレート中に１×１０６ＰＢＭＣ／２ｍｌでプレートし、続いて分割し、新鮮な培地＋ＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）を加えた。
【０１３６】
レトロウイルス構築物の作製およびレトロウイルス形質導入
【０１３７】
ＭＵＣ１のコドン最適化単鎖可変断片（ｓｃＦＶ）およびＰＳＣＡのヒト化コドン最適化ｓｃＦＶを、公開されている配列に基づいて合成した（ＤＮＡ  ２．０、カリフォルニア州、メロンパーク所在）。ｓｃＦＶ断片を、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ２ＣＨ３ドメインと、およびＳＦＧレトロウイルス骨格中のＴＣＲ／ＣＤ３複合体上のζ鎖とインフレームでクローニングして、第１世代のＣＡＲ−ＰＳＣＡおよびＣＡＲ−ＭＵＣ１レトロウイルス構築物を作製した。ＣＡＲで修飾したＴ細胞を区別するために、ΔＣＤ１９（同定を容易にするために、β細胞マーカーを発現するように修飾したＴ細胞）を、ＩＲＥＳエレメントを使用してＣＡＲ−ＭＵＣ１レトロウイルスベクター中に取り込ませた。第２および第３世代のＣＡＲ−ＰＳＣＡ構築物を作製するために、ＣＤ２８エンドドメインまたはＣＤ２８および４１ＢＢ共刺激エンドドメインを、第１世代のＣＡＲに対して、ＩｇＧｌ−ＣＨ２ＣＨ３ドメインとＴＣＲ／ＣＤ３ζエンドドメインとの間に加えた。公開されている配列に基づいて、ＴＡＡｓ  ＭＵＣ１およびＰＳＣＡもまた合成した（ＤＮＡ  ２．０、カリフォルニア州、メロンパーク所在）。蛍光マーカーであるｍＯｒａｎｇｅおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、再びＩＲＥＳエレメントを使用して、ＭＵＣ１抗原およびＰＳＣＡ抗原ベクターにそれぞれ組み込んだ。レトロウイルス上清を上記に記載したように生成し、濾過し（０．４５ｍｍのフィルターを使用して）、そして−８０℃で保管した。
【０１３８】
Ｔ細胞の形質導入
【０１３９】
Ｔ細胞の形質導入のために、ＣＡＲ−ＭＵＣ１またはＣＡＲ−ＰＳＣＡのレトロウイルス上清を、組換えフィブロネクチン断片（ＦＮ  ＣＨ−２９６；レトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）；宝酒造株式会社、日本、大津市所在）を予めコーティングした非組織培養処理した２４ウェルプレート（１ｍｌ／ウェル）中にプレートした。ＯＫＴ３／ＣＤ２８で活性化したＴ細胞（ＩＬ２  １００Ｕ／ｍｌを含む完全培地中に０．２×１０６／ｍｌ）をプレートに添加し（１ｍｌ／ウェル）、その後、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターに移した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を、ＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）を補充した１Ｌの完全培地を含むＧ−Ｒｅｘ  １００Ｍ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社；ミネソタ州、ニューブライトン所在）中で行った。
【０１４０】
２９３Ｔの形質導入
【０１４１】
形質導入のために、ＭＵＣ１−ｍＯｒａｎｇｅまたはＰＳＣＡ−ＧＦＰのウイルス上清を、レトロネクチンを予めコーティングした２４ウェルプレートにプレートした（１ｍｌ／ウェル）。０．２×１０５／ｍｌの２９３Ｔ細胞をこれらの上清に添加し（１ｍｌ／ウェル）、その後、細胞を１０００ｇで３０分間、室温（ＲＴ）で回転させ、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターに移した。ＭＵＣ１−ｍＯｒａｎｇｅまたはＰＳＣＡ−ＧＦＰの発現を、フローサイトメトリーにより、蛍光顕微鏡を使用して形質導入後に７２時間測定して、蛍光マーカーであるｍＯｒａｎｇｅおよびＧＦＰを検出した。細胞を３〜４日毎に完全ＩＭＤＭ培地中で維持または増殖させた。
【０１４２】
細胞の選別
【０１４３】
２９３Ｔ細胞を、ＭｏＦｌｏフローサイトメーター（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、コロラド州、フォート・コリンズ所在）を使用して、ｍＯｒａｎｇｅおよびＧＦＰの発現に基づいて選別した。選別した細胞を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびゲンタマイシンン（２５μｇ／ｍｌ）を補充した完全ＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ニューヨーク州、グランド・アイランド所在）中で、６ウェルプレート中で１週間培養し、その後、３〜４日毎に継ぎ足した完全ＩＭＤＭ培地を使用してＴ１７５フラスコ中でさらに増殖させた。
【０１４４】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
【０１４５】
ＣＡＰＡＮ１細胞を、上記に記載したように、それぞれ、ＰＢＳ／１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中に１：２００および１：８０に希釈したマウス抗ヒトＭＵＣ１抗体またはウサギ抗ヒトＰＳＣＡ抗体（ＡｂＣａｍ  Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ所在）のいずれかで、室温で１時間染色し、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または抗ウサギＨＲＰ（ＡｂＣａｍ  Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ所在）で同時染色した。
【０１４６】
細胞傷害性
【０１４７】
クロム放出アッセイ
【０１４８】
エフェクターＴ細胞集団の細胞傷害性の特異性を、標準的な６時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、４０：１〜５：１までの範囲のＥ：Ｔ比を使用し、標的としてＣＡＰＡＮ１および２９３Ｔ細胞を使用して測定した。
【０１４９】
同時培養実験
【０１５０】
ＣＡＰＡＮ１、２９３Ｔ、２９３Ｔ−ＭＵＣ１−ｍＯｒａｎｇｅまたは２９３Ｔ−ＰＳＣＡ−ＧＦＰを標的として使用した。簡単に説明すると、ＧＦＰ／ＣＡＰＡＮ１細胞を、ＯＫＴ３／ＣＤ２８芽細胞またはＣＡＲで修飾したＴ細胞のいずれかと、完全培地中のＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下で１：５の比で混合した。本発明者らが操作した腫瘍モデルについては、２９３Ｔ−ＭＵＣ１−ｍＯｒａｎｇｅおよび２９３Ｔ−ＰＳＣＡ−ＧＦＰ（または対照２９３Ｔ細胞のみ）を１：１の比で混合し、その後、ＯＫＴ３／ＣＤ２８芽細胞またはＣＡＲで修飾したＴ細胞をこの混合物に対して、完全培地中のＩＬ２（５０Ｕ／ｍｌ）の存在下で１０：１（Ｔ細胞：腫瘍細胞）で添加した。７２時間後、残存細胞を全て回収し、計数し、染色し、その後、フローサイトメトリー（Ｇａｌｌｉｏｓ；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州、ブレア所在）により分析した。
【０１５１】
フローサイトメトリー
【０１５２】
免疫表現型検査
【０１５３】
Ｔ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ６２Ｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＢＤ社、ニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在）に対するモノクローナル抗体での表面染色による培養物の作製後３〜４週間で分析した。細胞を２％のＦＢＳを補充したＰＢＳで１回洗浄し、ペレット化し、抗体を飽和量（１０μｌ）で添加した。ＣＡＲが形質導入された細胞を検出するために、Ｔ細胞を、モノクローナル抗体であるＦｃ特異的シアニン−Ｃｙ５結合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ペンシルベニア州、ウェスト・グローブ所在）（これは、受容体のＩｇＧ１−ＣＨ２ＣＨ３成分を認識する）で染色した。細胞を、Ｇａｌｌｉｏｓフローサイトメーターを使用して分析し、データをＫａｌｕｚａソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州、ブレア所在）を使用して分析した。
【０１５４】
ＭＵＣ１抗原の染色
【０１５５】
１００万個のＣＡＰＡＮ１細胞を８０％のメタノールで固定し、０．１％のｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した。１μｇの抗ＭＵＣ１抗体（Ａｂｃａｍ  Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州、ケンブリッジ所在）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。次に、培養物を洗浄し、０．４μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ  ＡＰＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カリフォルニア州、サンノゼ所在）とともに、４℃で２０分間、暗所でインキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、分析した。
【０１５６】
Ｉｎ  ｖｉｖｏでの研究
【０１５７】
ｅＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ）を発現するように操作した１００万個のＣＡＰＡＮ１細胞をＳＣＩＤマウスに腹腔内（ＩＰ）に接種した。生物発光画像をＬｕｍｉｎａ  ＩＶＩＳ画像撮影システム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．社、マサチューセッツ州、ホプキントン所在）を使用して１週間に１回記録し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアにより分析した。生着（少なくとも２回の連続する生物発光の測定における腫瘍シグナルの増大と定義した）後、マウスをＣＡＲで修飾したＴ細胞（３０×１０６細胞／動物）でＩＰ処置した。全ての処置群にＩＬ−２（４０００Ｕ／動物）をＩＰで、１週間に３回投与し、生物発光画像撮影を１週間に１回行った。
【０１５８】
デシタビンでの処置
【０１５９】
ＣＡＰＡＮ１細胞は、１μΜの５−アザ−２’−デオキシシチジン−デシタビン−（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．社、ミズーリ州、セントルイス所在）を含む完全ＩＭＤＭ培地を使用して、新鮮な培地＋デシタビンを毎日継ぎ足しながら、４日間、Ｔ１７５フラスコ中で培養した。続いて、デシタビンで処置したＣＡＰＡＮ１細胞を完全ＩＭＤＭ中で２日間休眠させ、その後、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞とともに同時培養した。
【０１６０】
実施例２
ＰＳＣＡを標的化するＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞は抗原を発現する標的を死滅させることができる
ＴＡＡ  ＰＳＣＡを発現している腫瘍を標的化するために、ＰＳＣＡに対して向けられたヒト化されたコドン最適化されたＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを作製した。図１ａはレトロウイルスベクターのマップを示しており、図１ｂ（左のパネル）は、代表的なドナー由来のＴ細胞上でのＣＡＲの発現を、研究した１０のドナーの全てについてまとめて示している（図１ｂ、右のパネル）。平均して８９．９％（±９％のＳＤ）のＴ細胞がＣＡＲ−ＰＳＣＡを発現しており、表現型はＣＡＲの形質導入によっては影響を受けなかった（図１ｃ）。つまり、形質導入されていない（ＮＴ）Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＰＳＣＡトランスジェニックＴ細胞のいずれもが、大部分がＣＤ３＋（９５．２±５．７％および９５．２±３．５％）であり、ＣＤ４＋（１９．２±１２．０％および１２．８±６．３％）集団とＣＤ８＋（７６．１±１５．５％および８２．２±１０．５％）集団の混合物を含んでいた。ＣＤ５６＋ＣＤ３−  ＮＫ細胞は、１．７±３．０％および２．７±２．２％のＮＴ集団と、ＣＡＲ−ＰＳＣＡが形質導入された集団を含んでいた。ＮＴ集団および形質導入された集団のいずれにおいても同じ割合のＣＤ３＋  Ｔ細胞がセントラルメモリー（ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ）マーカーであるＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、およびＣＤ４５ＲＯを発現していた。図１ｄは、ＣＡＲで修飾したＴ細胞はＰＳＣＡ＋膵臓癌細胞ＣＡＰＡＮ１を死滅させることができた（１０：１のＥ：Ｔ比で４８±６％の特異的溶解）が、ＰＳＣＡ陰性２９３Ｔ標的を死滅させることはできず、ＮＴ  Ｔ細胞はバックグラウンドレベルの溶解を生じたに過ぎなかったことを示している（ＣＡＰＡＮ１および２９３Ｔ細胞について、それぞれ、７±４％および４±１％の特異的溶解）。
【０１６１】
実施例３
単一特異性ＣＡＲ−Ｔ細胞産物を使用する不均質な腫瘍の標的化により免疫逃避変異体を選択する
ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置によりｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の排除を生じることができるかどうかを決定するために、ＳＣＩＤマウスに、自然界においてＰＳＣＡを発現し、そしてｅＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼをコードするγ−レトロウイルスベクター（ＣＡＰＡＮ１−ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ）で修飾してｉｎ  ｖｉｖｏで生物発光を検出できるようにした１×１０６のＣＡＰＡＮ１細胞（ヒト膵臓癌細胞株）を移植した。２回の連続する時の生物発光シグナルの増大により確認するとした腫瘍が確立されていれば、マウスに、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞（３０×１０６細胞）のいずれかの１回の注入を投与した。図２ａに示すように、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置により最初の抗腫瘍応答が生じ（処置後２８日）、この後に迅速な腫瘍の進行が続き、腫瘍の進行は、処置の４２日後および５６日後には、２つのグループの間で同様であった（図２ａ、右のパネル）。
【０１６２】
この免疫逃避の理由をさらに調べるために、この表現型を、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞をＣＡＰＡＮ１−ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ細胞とともに５：１の比で同時培養することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでモデル化した。７２時間後、生存している残存腫瘍細胞をフローサイトメトリー、ＧＦＰ＋細胞上についてのゲーティングにより定量化し、一方、Ｔ細胞は、ＣＤ３特異的抗体での同時染色により排除した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの所見と同様に、ＮＴ  Ｔ細胞のＣＡＰＡＮ１細胞との同時培養は腫瘍細胞の増殖に影響はなかったが、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置により、最初の抗腫瘍応答が生じ、これは腫瘍細胞数の８２±９％の減少により反映された（図２ｂ）。しかし、図２ｃに示すように、最初のＣＡＲ−Ｔ細胞への暴露を生き抜いた腫瘍集団は、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞での処置に対するそれらの感受性を保っていたＮＴ  Ｔ細胞で最初に処置した腫瘍細胞とは異なり、再度の処置に対して耐性があった。
【０１６３】
耐性の機構を決定するために、ＩＨＣ分析を、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞のいずれかで１回処置した腫瘍細胞について行った。図２ｄに示すように、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞はＰＳＣＡ抗原を高レベルで発現しているＣＡＰＡＮ１細胞を排除したが、残りのＰＳＣＡ低発現／陰性部分集団は残り、これらは引き続き増殖した。しかし、これらの残存腫瘍細胞は、第２の標的化されていないＴＡＡ、ＭＵＣ１を発現し続けた（図２ｄ）。
【０１６４】
実施例４
第２または第３世代のＣＡＲを発現するように修飾したＴ細胞を使用してもなお腫瘍の免疫逃避が起こる。
最近の報告では、共刺激性エンドドメインを含有しているＣＡＲ（第２および第３世代のＣＡＲ）を発現するように修飾したＴ細胞が、増殖の増大、サイトカイン生産の増加、および延長されたｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を有していることが示されている。低レベルで標的抗原を発現している細胞のより迅速なまたは完全な死滅により腫瘍逃避型の変異体の出現を防ぐことができるという仮説を試験するため、および、腫瘍の免疫逃避もまた後期世代のＣＡＲ構築物を使用して防ぐことができるかどうかを見出すために、ＣＤ２８共刺激性エンドドメインを組み込んだ、ＰＳＣＡを標的化するＣＡＲ（第２世代）またはＣＤ２８＋４１ＢＢ共刺激性エンドドメインを組み込んだ、ＰＳＣＡを標的化するＣＡＲ（第３世代）を作製した。図７ａは、第１、第２、および第３世代のＣＡＲ−ＰＳＣＡレトロウイルスベクターのマップを示しており、図７ｂは、形質導入した初代Ｔ細胞中でのそれぞれの発現を示している。第２および第３世代のＣＡＲ構築物の両方を発現するＴ細胞は、ＰＳＣＡ抗原を発現するように修飾したＫ５６２細胞とともに培養した場合は、第１世代の構築物よりも増殖した（図７ｃ）が、短時間（６時間）の５１Ｃｒ放出アッセイ（図７ｄ）および長時間（７２時間）の同時培養試験（図７ｅ）のいずれにおいても、ＣＡＰＡＮ１細胞に対して全て同等の細胞溶解活性を有しており、耐性がある同じ残存腫瘍の部分集団が残った。
【０１６５】
実施例５
ＭＵＣ１を標的化するＣＡＲで修飾したＴ細胞は抗原を発現している標的を特異的に死滅させるが、腫瘍の不均一性が腫瘍の免疫逃避につながる
標的抗原の発現の不均一性が腫瘍の免疫耐性および免疫逃避の明らかな原因であるので、次に、付随して起こる第２のＴＡＡであるＭＵＣ１の標的化によりこの問題が克服されるかどうかを決定した。マーカーとして短縮型ＣＤ１９分子（ΔＣＤ１９）を持つ、ＭＵＣ１に特異的なＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターを作製した１７。図３ａは、レトロウイルスベクターのマップを示している。ＭＵＣ１−ＣＡＲの活性を試験するために、７のドナー由来のＴ細胞を形質導入した。図３ｂ（左のパネル）は、１の代表的なドナーによる詳細な結果、および７のドナー全てについてまとめたデータを示している。ＣＡＲ−ＭＵＣ１発現の平均は８３．１％（±１１．５％）であり（図３ｂ、右のパネル）、Ｔ細胞の表現型はＣＡＲの形質導入によっては影響を受けなかった（図３ｃ）。ここでもまた、培養物は主にＣＤ３＋（９５．２±５．７％および９７．２±２．０％）Ｔ細胞から構成されており、ＣＤ４＋（１９．２±１２．０％および１２．３±８．１％）部分集団とＣＤ８＋（７６．１±１５．５％および８５．１±８．３％）部分集団（それぞれ、ＮＴ  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞（これらはセントラルメモリーマーカーであるＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、およびＣＤ４５ＲＯを同様のレベルで発現していた））を含んでいた。ＣＤ５６＋ＣＤ３−  ＮＫ細胞は、平均で１．７％（±３．０％）がＮＴであり、２．２％（±２．３％）がＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞であった。トランスジェニックＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞は、自然界においてＭＵＣ１抗原を発現しているＣＡＰＡＮ１細胞を特異的に死滅させることができ（１０：１のＥ：Ｔ比で３５±５％の特異的溶解）、ＭＵＣ１陰性標的である２９３Ｔ細胞に対する活性は有していなかった（図３ｄ）。
【０１６６】
ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞による単剤療法もまた腫瘍の免疫逃避につながるかどうかを決定するために、ＳＣＩＤマウスに再び、膵臓癌細胞株ＣＡＰＡＮ１−ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ細胞を移植し、腫瘍が確立されればＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞のいずれかで処置した。ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置により、処置後２８日で腫瘍シグナルの低下により測定することができる最初の抗腫瘍応答が生じたにもかかわらず、この後に、迅速な腫瘍の退行が続いた（図４ａ）。この逃避の原因が腫瘍抗原の調節であることを確認するために、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞を、ＣＡＰＡＮ１−ｅＧＦＰ−ＦＦＬｕｃ細胞とともに７２時間同時培養し、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞での処置により腫瘍細胞の最初の減少が生じたにもかかわらず（６６±２１％）（図４ｂ）、再処置に対する非感受性が証明されたものが残存し（図４ｃ）、この原因はおそらく、ＩＨＣにより確認されたような抗原発現の低下であった（図４ｄ）。しかし、これらの残存腫瘍細胞はＴＡＡ  ＰＳＣＡを発現し続けた。
【０１６７】
実施例６
２種のＴＡＡを標的化するＣＡＲ  Ｔ細胞の組み合わせが優れた抗腫瘍活性を生じる
二重標的化ＣＡＲ療法により優れた抗腫瘍効果が生じるかどうかを決定するために、自然界においてＰＳＣＡおよびＭＵＣ１の両方を発現する膵臓癌細胞株ＣＡＰＡＮ１をＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の両方と同時に培養した。短時間（６時間）の細胞毒性試験では、併用療法により、単一抗原特異的Ｔ細胞（ＣＡＲ−ＭＵＣ１およびＣＡＲ−ＰＳＣＡについて、それぞれ、１０：１のＥ：Ｔで３５±５％および４８±６％の特異的溶解）と比較して、優れた腫瘍細胞の死滅が生じた（１０：１のＥ：Ｔで７５±８％の特異的溶解）（図５ａ）。同様の結果が、３日の同時培養後に得られた。ここでは、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞単独での処置により腫瘍細胞が６５±１３％減少し、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞単独での処置により８２．１±９％の腫瘍細胞が排除され、一方、二重標的化療法は優れており、９６．６±１％の減少が生じた（図５ｂ）。
【０１６８】
二重ＣＡＲ標的化療法により腫瘍の排除を生じることができるかどうかに取り組むために、ＳＣＩＤマウスにＣＡＰＡＮ１−ｅＧＦＰ−ＦＦｌｕｃ細胞を移植した。図５ｃおよび５ｄに示すように、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞の組み合わせでの処置により、個別に試験したいずれと比較しても、優れた抗腫瘍効果が生じた。しかし、この効果は持続せず、６３日までに全ての動物において腫瘍が再発した。したがって、二重標的化療法もまた、全ての癌細胞を排除するには不十分であった。
【０１６９】
実施例７
腫瘍の免疫逃避をモデル化するための人工的なシステムの作製
この治療法の失敗の根底にある機構をさらに理解するために、操作した腫瘍モデルを、ＭＵＣ１またはＰＳＣＡのいずれかのＴＡＡを２９３Ｔ細胞中でトランスジェニックで発現させることにより開発した。したがって、２種類のレトロウイルスベクターを作製した。第１のレトロウイルスベクターはＭＵＣ１抗原をコードしており、蛍光タグであるｍＯｒａｎｇｅを同時発現する。第２のレトロウイルスベクターはＰＳＣＡ抗原をコードしており、ＧＦＰを同時発現する。ＭＵＣ１について図８に示すように、蛍光タグの強度は抗原の発現の強度と相関関係にあり、これにより、本発明者らが、本発明者らのＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性をリアルタイムでモニターすることが可能となる。図６ａはレトロウイルスベクターのマップを示しており、図６ｂは、２９３Ｔ細胞中でのＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅおよびＰＳＣＡ／ＧＦＰの発現を示している。各腫瘍細胞が標的抗原を確実に発現するように、続いて、これらの細胞を、１００％がＭＵＣ１を発現している（ｍＯｒａｎｇｅ＋）か、またはＰＳＣＡを発現している（ＧＦＰ＋）かのいずれかである純粋な集団が得られるように選別した。
【０１７０】
不均質な腫瘍の集団を模倣するために、選別した細胞を１：１の比で混合し、ＮＴ  Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞のいずれかで７２時間、最初に処置した。ＮＴ  Ｔ細胞での処置は残存腫瘍細胞の数には影響を及ぼさなかったが、ＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞単独での処置によっては操作した腫瘍細胞の数は５０．９±１％減少し（図６ｃ）、これは、ＧＦＰ＋（ＰＳＣＡを発現している）集団の選択的な減少（９８．１±１％）を反映している。ＣＡＲ−Ｔ細胞の死滅の反応速度論を試験するために、腫瘍細胞数をフローサイトメトリーにより経時的に（０、１２、２４、３６、４８、および６０時間）定量化した。図６ｄに示すように、ＧＦＰ＋腫瘍細胞数は徐々に減少し、これは処置後の最初の２４時間以内に最も顕著であり（０〜１２時間の間に４５．４±１１％の減少、および１２〜２４時間の間に２９．７±４％の減少）、その後はそれほど顕著ではなかった（２４〜３６時間までに１０．７±４％、３６〜４８時間までに１０．２±１％、および４８〜６０時間までに１±０．９％）。それにもかかわらず、残存しているＰＳＣＡを発現する部分集団（１．９％）が残った。次に、ＣＡＲに媒介される死滅に対する感度が腫瘍細胞上での標的抗原の発現強度と連関しているかどうかを調べるために、ＧＦＰの蛍光強度もまた同じ時点で測定した。図６ｅに示されるように、最も高いレベルで抗原を発現している腫瘍細胞が最初に死滅させられ、一方、最も低い発現を有している腫瘍細胞は生存した。
【０１７１】
これらの研究を、エフェクター集団としてＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞を用いて代用して、繰り返した。ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞での処置の７２時間後、腫瘍細胞の総数は４９．９％（±５％）減少し（図６ｆ）、これは、ＭＵＣ１を「低く発現している（ｌｏｗ）」腫瘍細胞だけが残るまで（図６ｈ）の、経時的なＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅ＋腫瘍細胞の選択的かつ段階的な減少を示しており（図６ｇ）、一方、ＰＳＣＡ＋集団は影響を受けなかった。
【０１７２】
次に、二重標的化ＣＡＲ療法により優れた抗腫瘍効果が生じるかどうかを決定するために、不均質な腫瘍細胞の集団（ＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅ＋およびＰＳＣＡ／ＧＦＰ＋２９３Ｔ細胞の１：１混合物）を、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞およびＣＡＲ−ＰＳＣＡ  Ｔ細胞の両方とともに同時培養した。しかし、このストラテジーもなお、全ての腫瘍細胞を排除することはできず、７２時間後、６．０±３％の細胞が残った（３．９±２％の残存ＭＵＣ１／ｍＯｒａｎｇｅ＋細胞および１．９±１％の残存ＰＳＣＡ／ＧＦＰ＋細胞（図６ｉ））。ここでもまた、これらの残存部分集団は、ｍＯｒａｎｇｅおよびＧＦＰの蛍光により判断した標的抗原の最も低い発現強度を有している細胞を反映していた（図６ｊおよび６ｋ）。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞での処置に対する感受性は、標的化された抗原を発現している細胞の集団、ならびに抗原が発現される強度の両方と関係がある。
【０１７３】
最後に、ＣＡＲ−Ｔ細胞の能力を、従来のエピジェネティック調節因子（ＤＮＡを脱メチル化することによりＴＡＡの発現を増大させることができる）との組み合わせにより改善できるかどうかを決定するために、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞で予め処置し、結果として標的抗原を低いレベルでしか発現しないＣＡＰＡＮ１細胞を、１μＭの低メチル化剤（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）であるデシタビンとともに培養した。デシタビンへの暴露により、処置の４日後に、３．５〜２６．０までのＭＵＣ１の発現強度の増大（相対平均蛍光強度）が生じ（図９ａおよび９ｂ）、これまでは耐性であった腫瘍細胞がＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の死滅に対して再感作された（図９ｃ）。
【０１７４】
実施例８
ＣＡＲ  Ｔ細胞のエピジェネティック修飾因子との併用
図１０は、高い発現を有している細胞または低い発現を有している細胞を選択した、細胞上でのＣＡＲ−ＭＵＣ１の発現を示している。
【０１７５】
図１１および１２は、ＣＡＲを標的化させる抗原を高いレベルまたは低いレベルで発現する腫瘍細胞と比較した、高いＣＡＲ発現または低いＣＡＲ発現を有しているエフェクター細胞の有効性の比較を提供する。
【０１７６】
図１１では、低いＣＡＲ−ＭＵＣ１発現または高いＣＡＲ−ＭＵＣ１発現のいずれかを有している細胞を、標的抗原を低いレベルで発現する残存腫瘍細胞の百分率をアッセイすることにより抗腫瘍特性について試験する。腫瘍細胞に対するＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の暴露の２４時間後、高いＣＡＲ発現を有しているそのようなＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞は、低いＭＵＣ１抗原発現を有している腫瘍細胞を排除することにおいて、低いＣＡＲ発現を有しているそれらのＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞よりも有効である。
【０１７７】
図１２では、低いＣＡＲ−ＭＵＣ１発現または高いＣＡＲ−ＭＵＣ１発現のいずれかを有している細胞を、標的抗原を高いレベルで発現する腫瘍細胞について残存腫瘍細胞の百分率をアッセイすることにより抗腫瘍特性について試験する同様のアッセイが存在する。腫瘍細胞に対するＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の暴露の２４時間後、高いＣＡＲ発現を有しているそのようなＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞は、高いＭＵＣ１抗原の発現を有している腫瘍細胞を排除することにおいて、低いＣＡＲの発現を有しているそのようなＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞よりも有効である。
【０１７８】
しかし、図１１を図１２と比較すると、標的抗原の高い発現を有している標的細胞中での低発現ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞と高発現ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の効率の間にそれほど有意な差異は存在しない。これは、エフェクター細胞上でのＣＡＲの発現の増大が、特に標的抗原の低い発現を有している腫瘍細胞に対して効果を有することを示している。
【０１７９】
図１３は、デシタビンが、修飾したＴ細胞上でのＣＡＲの発現を増強することを示している。エフェクター細胞をデシタビンとともに培養すると、エフェクター細胞上でのＣＡＲ−ＭＵＣ１の発現強度を調節できることが本明細書中で説明される。１日後、および数日後には確実に、細胞上でのＣＡＲ−ＭＵＣ１の発現が増大する。
【０１８０】
図１４は、デシタビンがＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の抗腫瘍効果を増強することを示している。説明したように、対照と比較して、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞単独と比較した場合は抗腫瘍効果が存在し、これは約８０％腫瘍の崩壊を生じる。しかし、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞をデシタビンと組み合わせる場合は、ＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞を単独で用いた場合に見られる能力よりも１／２をさらに上回る能力の増大が存在する。したがって、デシタビンとＣＡＲ−ＭＵＣ１  Ｔ細胞の組み合わせにより抗腫瘍効果が増大した。
【０１８１】
本発明およびその利点が詳細に記載されてきたが、様々な変更、置き換え、および代用を、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく本明細書中で行うことができることが理解されるものとする。さらに、本出願の範囲は、本明細書中に記載されるプロセス、機械、製品、物質の組成、手段、方法、および工程の特定の実施形態に限定されるようには意図されない。本発明の開示から当業者に容易に明らかであるように、本明細書中に記載される対応する実施形態と同じ機能を実質的に果たすか、または実質的に同じ結果を達成する、既存のまたはこれから開発されるプロセス、機械、製品、物質の組成、手段、方法、または工程が、本発明にしたがって利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製品、物質の組成、手段、方法、または工程をその範囲に含むように意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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