(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであって、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質分解活性を有し、
（ａ）前記ポリペプチド又はその活性フラグメントが、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸＸＸＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤが活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨが活性部位であるヒスチジンであり、Ｘは任意のアミノ酸であるか、又は、
（ｂ）前記ポリペプチド又はその活性フラグメントが、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸａＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸｂＸＸｃＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤが活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨが活性部位であるヒスチジンであり、Ｘ、Ｘａ、Ｘｂ、及びＸｃが任意のアミノ酸であり、ただし、Ｘａがアルギニンであるとき、Ｘｂ及びＸｃはグリシンではない、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメント。 
【請求項２】
配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、タンパク質分解活性を有する、請求項１に記載の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメント。
【請求項３】
（ａ）前記ポリペプチド又はその活性フラグメントが、８０〜８２番目の残基位置にあるＶＳＧ配列を含み、ここで、前記ポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置が、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされ；
（ｂ）前記ポリペプチド又はその活性フラグメントが、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を含み、ここで、前記挿入が３９〜４７番目の残基位置にあり、前記残基位置が、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされ、ここで、前記３９〜４７番目の残基位置がＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧで置換されていてもよく；
（ｃ）前記ポリペプチド又はその活性フラグメントが、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、ここで、前記欠失が５１〜６４番目の残基位置にあり、前記残基位置が、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされ、ここで、前記５１〜６４番目の残基位置が、ＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨ、ＶＧＧＳＡ／ＰＥＤＶＱＧＨ、ＶＧＧＮＰＥＤＲＱＧＨ、又はＶＧＧＴＰＡＤＶＨＧＨで置換されていてもよく；及び／又は
（ｄ）前記ポリペプチド又はその活性フラグメントが、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、ここで、前記欠失が６８〜９５番目の残基位置にあり、前記残基位置が、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされ、ここで、前記６８〜９５番目の残基位置が、ＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶで置換されていてもよい、請求項１又は２に記載の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメント。 
【請求項４】
前記ポリペプチドが、５〜１２の範囲のｐＨにおいて、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％を保持し；及び／又は前記ポリペプチドが、５５℃〜８０℃の範囲の温度において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％を保持する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメント。 
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ストレス条件下、５０℃において２０分後に少なくとも８０％の活性を保持し、ここで、前記ストレス条件が、ＬＡＳ／ＥＤＴＡアッセイ、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡアッセイ、又はＨＤＬアッセイから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメント。 
【請求項６】
前記組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントが、Ｘ００３Ｎ、Ｘ００６Ｒ、Ｘ０１０Ｅ、Ｘ０２０Ｉ、Ｘ０２６Ｎ、Ｘ０２８Ｒ、Ｘ０２９Ｉ、Ｘ０３８Ａ、Ｘ０４１Ｐ、Ｘ０４２Ｎ、Ｘ０４４Ｒ、Ｘ０４８Ｄ、Ｘ０５３Ｒ、Ｘ０５９Ｇ、Ｘ０６１Ｇ、Ｘ０８５Ｑ、Ｘ０８８Ｒ、Ｘ０９０Ｉ、Ｘ０９６Ｇ、Ｘ０９８Ｎ、Ｘ１０３Ｍ、Ｘ１０４Ｙ、Ｘ１０７Ｑ、Ｘ１１３Ａ、Ｘ１１５Ｓ、Ｘ１１７Ｎ、Ｘ１３１Ｄ、Ｘ１３２Ｓ、Ｘ１３３Ｄ、Ｘ１３６Ｎ、Ｘ１３７Ｎ、Ｘ１３８Ｉ、Ｘ１３９Ｎ、Ｘ１４３Ｓ、Ｘ１４４Ｓ、Ｘ１４６Ｔ、Ｘ１４７Ｌ、Ｘ１５７Ｒ、Ｘ１６８Ｎ、Ｘ１６９Ａ、Ｘ１７８Ｎ、Ｘ１７９Ｒ、Ｘ１８０Ｔ、Ｘ２０４Ｙ、Ｘ２０７Ｇ、Ｘ２０８Ｑ、Ｘ２０９Ｆ、Ｘ２１０Ｒ、Ｘ２１２Ｌ、Ｘ２１９Ｔ、Ｘ２２２Ｖ、Ｘ２２９Ｉ、Ｘ２３０Ｋ、Ｘ２３１Ｓ、Ｘ２３１Ａ、Ｘ２３９Ｔ、Ｘ２４０Ｑ、Ｘ２４１Ｖ、Ｘ２４３Ｎ、Ｘ２４５Ｌ、Ｘ２４６Ｒ、Ｘ２４７Ｄ、Ｘ２５５Ｌ、Ｘ２５６Ｎ、Ｘ２５７Ｑ、Ｘ２６４Ｎ、Ｘ２６６Ｙ、Ｘ２７１Ａ、及びＸ２７３Ｇから選択される少なくとも１つの置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメント。 
【請求項７】
界面活性剤と、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドと、を含む組成物であって、前記組成物が、洗濯用洗剤、布地柔軟化洗剤、自動食器洗浄洗剤、手洗い用食器洗浄洗剤、及び硬質表面クリーニング用洗剤から選択される洗剤組成物であり得る、組成物。 
【請求項８】
前記組成物が、少なくとも１種のカルシウムイオン及び／又は亜鉛イオン；少なくとも１種の安定剤；少なくとも１種の漂白剤；少なくとも１つの補助成分；及び／又は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、追加のセリンプロテアーゼ、及びこれらの組み合わせから選択される１種又は２種以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
（ａ）前記組成物が、０．００１重量％〜１．０重量％の、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチドを含み；
（ｂ）前記組成物がリン酸塩を含まなく；
（ｃ）前記組成物がリン酸塩を含み；
（ｄ）前記組成物がホウ素を含まなく；
（ｅ）前記組成物がホウ素を含み；又は
（ｆ）前記組成物がｐＨ７〜１２で処方される、請求項７又は８に記載の組成物。 
【請求項１０】
クリーニング方法であって、表面又は物品を、（ｉ）緩衝液と、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換えポリペプチド、又は、（ｉｉ）請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物、と接触させることを含む、方法。 
【請求項１１】
組み換えポリペプチドの作製方法であって、 
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより、宿主細胞を安定的に形質転換することと、 
（ｂ）前記形質転換した宿主細胞が前記ポリペプチドを産生するのに好適な条件下で、前記形質転換した宿主細胞を培養することと、 
（ｃ）前記ポリペプチドを回収することと、を含む、方法。 
【請求項１２】
配列番号３及び配列番号４から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。 
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。 
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、織物若しくは皮革加工組成物、羽毛加工用組成物、動物飼料用組成物、コンタクトレンズ洗浄用組成物、又は創傷清拭用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願特許第６１／９６８８５３号（２０１４年３月２１日出願）の利益を主張するものであり、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、バチルス（Bacillus）種からクローニングされたセリンプロテアーゼ、及びその変異体に関する。セリンプロテアーゼを含有している組成物は、布地及び硬質表面のクリーニング、並びに様々な工業用途に好適である。
【０００３】
セリンプロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合の加水分解を開始する、活性部位であるセリンを持つ酵素である（ＥＣ番号３．４．２１）。これらはその構造に基づき、キモトリプシン様（トリプシン様）又はサブチリシン様の２つに大別される。原型のサブチリシン（ＥＣ番号３．４．２１．６２）は、元々Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）から得られた。サブチリシン及びその相同体は、ＭＥＲＯＰＳ分類法のうちＳ８ペプチダーゼファミリーのメンバーである。ファミリーＳ８のメンバーは、アミノ酸配列中に、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、及びＳｅｒの順で触媒トライアドを有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
セリンプロテアーゼは産業用酵素の技術分野において古くから既知であるが、特定の条件及び用途に適した工学操作されたプロテアーゼが今なお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の組成物及び方法は、バチルス（Bacillus）種からクローニングされた組み換えセリンプロテアーゼ、及びその変異体に関する。セリンプロテアーゼを含有している組成物は、布地及び硬質表面のクリーニング、並びに様々な工業用途に好適である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸＸＸＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸＸＸＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸａＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸｂＸＸｃＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘ、Ｘａ、Ｘｂ、及びＸｃは任意のアミノ酸であり、ただしこのとき、Ｘａはアルギニンであり、Ｘｂ及びＸｃはグリシンではない。いくつかの実施形態では、モチーフのＶＸＧ配列はＶＱＧである。いくつかの実施形態では、ＶＱＧ配列は６３〜６５番目の残基位置にあり、このときポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置は、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はその活性フラグメントは、８０〜８２番目の残基位置にあるＶＳＧ配列を含み、このときポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置は、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を有する組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、このとき挿入は３９〜４７番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、３９〜４７番目の残基位置はＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧで置換されており、このとき残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を有する組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、このとき欠失は５１〜６４番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置はＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨで置換されており、このとき残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を有する組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、このとき欠失は６８〜９５番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、６８〜９５番目の残基位置はＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶで置換されており、このとき残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＷＨＹ系統群の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＷＴ７７系統群の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＷＴ２２系統群の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＷＰ０２６６７５１１４系統群の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、ＢｓｐＡＧ００２９６系統群の組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、ただし、このアミノ酸配列が、ＷＰ０１０２８３１０６、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００４、又は国際公開第２０１２１７５７０８号−０００６を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、ただし、このアミノ酸配列が、ＷＰ０１０２８３１０６、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、又は同第２０１２１７５７０８号−０００６を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２又は同第２０１２１７５７０８号−０００４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２又は同第２０１２１７５７０８号−０００４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであり、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、プロテアーゼ活性、具体的にはカゼイン加水分解活性を有する。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、８〜１２の範囲のｐＨにおいて、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％を保持する。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、５０℃〜７５℃の範囲の温度において、その最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％を保持する。いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、自動食器洗浄洗剤及び洗濯用洗剤等の洗剤組成物中でクリーニング活性を有する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、界面活性剤と、上記組み換えポリペプチドと、を含む、組成物である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双極性界面活性剤、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、洗濯用洗剤、布地柔軟化洗剤、食器用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤等の洗剤組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのカルシウムイオン及び／又は亜鉛イオン、少なくとも１種の安定剤、少なくとも１種の漂白剤、リン酸塩、又はホウ酸塩を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、リン酸塩を含まず、及び／又はホウ酸塩を含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、粒状、粉末、固形、バー状、液体、錠剤、ゲル、ペースト、又は一回用量型組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、メタロプロテアーゼ、追加のセリンプロテアーゼ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、１つ又は２つ以上の追加の酵素又は酵素誘導体を更に含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、表面又は物品を上記組成物と接触させることを含む、クリーニング方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、上記組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって、宿主細胞を安定的に形質転換することを含む、組み換えポリペプチドの産生方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＢｓｐＡＧ００２９６セリンプロテアーゼの発現用ｐＨＹＴ−ＢｓｐＡＧ００２９６のプラスミドマップを示す。
【図２】ＢｓｐＭ０４０３３セリンプロテアーゼの発現用ｐＢＮ−ＢｓｐＭ０４０３３のプラスミドマップを示す。
【図３】ＤＭＣ基質に対するＢｓｐＡＧ００２９６のプロテアーゼ活性のプロットを示す。
【図４】ＤＭＣ基質に対するＢｓｐＭ０４０３３のプロテアーゼ活性のプロットを示す。
【図５】強力液体（ＨＤＬ）洗濯用洗剤中のＢｓｐＡＧ００２９６のクリーニング効率曲線を示す。
【図６】強力乾燥（ＨＤＤ）洗濯用洗剤中のＢｓｐＡＧ００２９６のクリーニング効率曲線を示す。
【図７】自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤中のＢｓｐＡＧ００２９６のクリーニング効率曲線を示す。
【図８】強力液体（ＨＤＬ）洗濯用洗剤中のＢｓｐＭ０４０３３のクリーニング効率曲線を示す。
【図９】強力乾燥（ＨＤＤ）洗濯用洗剤中のＢｓｐＭ０４０３３のクリーニング効率曲線を示す。
【図１０】自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤中のＢｓｐＭ０４０３３のクリーニング効率曲線を示す。
【図１１】ＷＨＹ系統群、ＳＷＴ７７系統群、ＢｓｐＡＧ００２９６系統群、ＷＰ０２６６７５１１４系統群、及びＳＷＴ２２系統群のサブチリシン、並びに様々なその他細菌由来のセリンプロテアーゼの系統樹を示す。
【図１２Ａ】サブチリシンＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３のアミノ酸配列の、いくつかのその他細菌由来のセリンプロテアーゼ配列とのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアライメントを示す。１ＪＥＡ及び１ＣＳＥ構造中の残基番号は、サブチリシンＢＰＮ’に対するものであり、ＢｓｐＭ０４０３３及び示されるその他全てのプロテアーゼについての残基番号は、連続する一次配列である。
【図１２Ｂ】サブチリシンＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３のアミノ酸配列の、いくつかのその他細菌由来のセリンプロテアーゼ配列とのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアライメントを示す。１ＪＥＡ及び１ＣＳＥ構造中の残基番号は、サブチリシンＢＰＮ’に対するものであり、ＢｓｐＭ０４０３３及び示されるその他全てのプロテアーゼについての残基番号は、連続する一次配列である。
【図１２Ｃ】サブチリシンＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３のアミノ酸配列の、いくつかのその他細菌由来のセリンプロテアーゼ配列とのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアライメントを示す。１ＪＥＡ及び１ＣＳＥ構造中の残基番号は、サブチリシンＢＰＮ’に対するものであり、ＢｓｐＭ０４０３３及び示されるその他全てのプロテアーゼについての残基番号は、連続する一次配列である。
【図１２Ｄ】サブチリシンＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３のアミノ酸配列の、いくつかのその他細菌由来のセリンプロテアーゼ配列とのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアライメントを示す。１ＪＥＡ及び１ＣＳＥ構造中の残基番号は、サブチリシンＢＰＮ’に対するものであり、ＢｓｐＭ０４０３３及び示されるその他全てのプロテアーゼについての残基番号は、連続する一次配列である。
【図１２Ｅ】は、サブチリシンＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３のアミノ酸配列の、いくつかのその他細菌由来のセリンプロテアーゼ配列とのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアライメントを示す。１ＪＥＡ及び１ＣＳＥ構造中の残基番号は、サブチリシンＢＰＮ’に対するものであり、ＢｓｐＭ０４０３３及び示されるその他全てのプロテアーゼについての残基番号は、連続する一次配列である。
【図１３】触媒残基Ｄ３３及びＨ６６（ＢｓｐＭ０４０３３の一次配列による残基番号）によってカッコで囲まれるモチーフを含む、ＷＨＹ系統群アミノ酸配列の領域の構造ベースのアライメントを示す。
【図１４】ＷＨＹ系統群のサブチリシンにおいて見いだされる、配列モチーフの変化の構造画像を示す。
【図１５Ａ】ＢｓｐＡＧ００２９６及びＳＷＴ７７−ｔｒの結晶構造からモノマーを重ねて示している図を示す。
【図１５Ｂ】ＳＷＴ７７−ｔｒの構造をＢ．レンタス（B. lentus）のサブチリシンと比較した際に見いだされる、配列モチーフの変化の構造画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
いくつかのバチルス（Bacillus）種由来の組み換えセリンプロテアーゼに関する組成物及び方法が記載される。この組成物及び方法は、特に組み換えＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３が、塩基性反応条件及び高温において、界面活性剤存在下でプロテアーゼ活性を有するという観察結果に一部基づいている。これらＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３の特徴は、ＳＷＴ７７、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、及びＳＷＴ１２３で共有されていると予測され、この特徴によって、これらプロテアーゼが、布地及び硬質表面のクリーニング、並びに織物、皮革、及び羽毛の加工における使用に適するようになる。新規プロテアーゼは、洗濯用洗剤及び食器用洗剤が挙げられるが、これらに限定されない、タンパク質分解用組成物に含めるのにも適している。
【００１５】
Ｉ．定義
本組成物及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語が定義される。定義されない用語及び略語は、当該技術分野において用いられるそれらの通常の意味を有するものとする。本明細書で特に定義されない限りは、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特に指定しない限り、本開示の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えＤＮＡにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な任意の方法及び材料が本開示の実施に使用されるが、本明細書には一部の好適な方法及び材料を記載する。以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
【００１６】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、複数形も包含する。別途記載のない限り、核酸配列は５’から３’方向に左から右に記述され、アミノ酸配列はアミノ基からカルボキシ基の方向に左から右に記述される。本開示が、これとは反対の指示がない限り、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコール及び試薬に限定されるものではないことを理解されたい。
【００１７】
本明細書全体を通して与えられるあらゆる最大数値限度は、それよりも小さいあらゆる数値の限度が、あたかもこうしたより小さい数値の限度が本明細書に明確に記載されているかのように包含されることが意図される。本明細書全体を通して与えられるあらゆる最小数値限定には、それよりも大きいあらゆる数値の限度が、あたかもこうしたより大きい数値の限度が本明細書に明確に記載されているかのように包含される。本明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るより狭い全ての数値範囲を、あたかもそのような狭い数値範囲が全て本明細書に明示的に記載されているかのように包含される。
【００１８】
数値に関連して本明細書で使用するとき、用語「約」は、この用語が文脈において具体的に定義されない限り、数値の＋／−０．５の範囲を指す。例えば、「ｐＨ約６」は、ｐＨが具体的に定義されない限り、ｐＨが５．５〜６．５であることを指す。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、タンパク質及びペプチドを分解する能力を有する酵素を指す。プロテアーゼは、ペプチド又はポリペプチド鎖においてアミノ酸を共に結合してタンパク質を形成するペプチド結合を加水分解することにより「タンパク質分解」を行う能力を有する。タンパク質消化酵素としてのプロテアーゼのこの活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定には、多くの周知の手順がある。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが好適な基質を加水分解する能力を分析する、比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ  Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を用いる比色分析は当該技術分野において周知である（例えば、国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい）。ｐＮＡペプチジルアッセイ（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，９９：３１６〜３２０，１９７９を参照されたい）も、活性酵素濃度の測定における使用が見出されている。このアッセイは、酵素が、可溶性の合成基質、例えばスクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解する際に放出される、ｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応による黄色の生成速度を分光光度計で４１０ｎｍにて測定するが、この速度は活性酵素濃度に比例する。更に、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を利用して、精製したタンパク質サンプル中の全タンパク質濃度を求めることができる。「基質に対する活性」／「タンパク質濃度」により、酵素の特異的な活性が得られる。
【００２０】
プロテアーゼ等のポリペプチドに関連して本明細書で使用するとき、用語「変異体」は、親又は参照ポリペプチド（野生型ポリペプチドを非限定的に含む）のアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。この違いは、挿入、欠失、又は置換のいずれかである修飾であってよい。いくつかの実施形態では、親又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるポリペプチド変異体は、１つ又は２つ以上の、自然発生的又は人為的なアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む。別の実施形態では、親又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるポリペプチド変異体は、１つ又は２つ以上の、自然発生的アミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む。更なる実施形態では、親又は参照ポリペプチドのアミノ酸配列と異なるポリペプチド変異体は、１つ又は２つ以上の、人為的なアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を含む。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属の全ての種を包含し、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）、Ｂ．ソノレンシス（B. sonorensis）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．プミルス（B. pumilus）、Ｂ．ラウタス（B. lautus）、Ｂ．パブリ（B. pabuli）、Ｂ．セレウス（B. cereus）、Ｂ．アガラドハエレンス（B. agaradhaerens）、Ｂ．アキバイ（B akibai）、Ｂ．クラキイ（B. clarkii）、Ｂ．シュードファーマス（B. pseudofirmus）、Ｂ．レヘンシス（B. lehensis）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．シルクランス（B. circulans）、Ｂ．ギブソニイ（B. gibsonii）、及びＢ．チューリンギエンシス（B. thuringiensis）が挙げられるが、これらに限定されない。バチルス（Bacillus）属は分類学上の再構築を絶えず受けているものと認識される。したがって、Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）（現在では「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）」と命名されている）、又はＢ．ポリミクサ（B. polymyxa）（現在では「パエニバチルス・ポリミクサ（Paenibacillus polymyxa）」）等の生物が挙げられるが、これらに限定されない、これまでに再分類された種を包含するものと意図される。ストレスの多い環境条件下での耐性内生胞子の産生は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属を定義する特徴であるとみなされているものの、この特徴は、近年、アリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレビバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びビルジバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）と命名された複数の属にも該当する。
【００２２】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用され、ヌクレオチドモノマーが鎖状に共有結合している任意の長さのポリマーを指す。デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであるＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、及びリボヌクレオチドポリマーであるＲＮＡ（リボ核酸）は、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、若しくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン塩基及びピリミジン塩基、若しくは他の天然の、化学的に改変された、生化学的に改変された、非天然の、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが挙げられる。遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現配列標識（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、運搬ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定例である。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「変異」は、参照アミノ酸配列又は核酸配列に生じた変化を指す。この用語には、置換、挿入及び欠失が包含されることを意図する。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、核酸を標的細胞又は組織の中に導入する又は移入するために使用される核酸構築物を指す。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡを細胞又は組織に導入するために使用される。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクター等が挙げられる。典型的には、ベクターは複製開始点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーを備えている。ベクターを標的細胞に挿入するプロセスは、典型的に形質転換と呼ばれる。いくつかの実施形態では、本発明は、セリンプロテアーゼポリペプチド（例えば、前駆体又は成熟セリンプロテアーゼポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターを包含するものであり、当該ＤＮＡ配列は、好適な宿主内でのＤＮＡ配列の発現、並びに組み換えポリペプチド鎖のフォールディング及び転座を行うことができる好適なプロ配列（例えば、分泌性のシグナルペプチド配列等）に機能的に連結される。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」、「発現プラスミド」又は「発現ベクター」は、対象とする核酸を標的細胞で発現させるための組み換え又は合成により生成される核酸構築物又はベクターを指す。発現ベクター又は発現カセットは、典型的には外来核酸の発現を促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。また、典型的には発現ベクター又は発現カセットは、標的細胞で特定の核酸の転写を可能にする任意の他の指定された核酸エレメントを包含する。組み換え型発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。多くの原核及び真核細胞発現ベクターが、市販されている。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる染色体外ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、環状であってもよく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。
【００２７】
本明細書で、核酸配列を細胞に導入する文脈において使用するとき、用語「導入」は、核酸配列を細胞に移入するのに好適な任意の方法を指す。かかる導入法として、原形質融合、トランスフェクション、形質転換、エレクトロポレーション、接合、及び形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、任意でゲノムへの組み込み、及び発現により生じる、細胞の遺伝的変化を指す。
【００２８】
本明細書で使用するとき、核酸は、別の核酸配列と機能的に関連を持つよう配置された場合に、別の核酸配列と「機能的に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーは、ヌクレオチドコード配列に機能的に連結される。リボソーム結合部位は、コード配列の翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に機能的に連結され得る。通常、「機能的に連結された」ＤＮＡ配列は隣接している。ただし、エンハンサーが隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の実践に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーが用いられ得る。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指し、コード領域の前及び後に続く領域を包含する。場合によっては、遺伝子は、個々のコード化セグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００３０】
本明細書で使用するとき、細胞を参照して使用する場合の「組み換え」は、典型的には、その細胞が外来核酸配列の導入により改変されていること、あるいは、その細胞がそのように改変された細胞から誘導されることを指す。例えば、組み換え細胞は、未改変（非組み換え型）の細胞において同一の形で見られない遺伝子を含み得るか、又は組み換え細胞は、改変されて細胞に再導入されている未改変の遺伝子（未改変の細胞で見られる）を含み得る。組み換え細胞は、細胞から核酸を除去することなく改変されている細胞に対して内因性の核酸を含み得るが、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異、及び当業者に既知の関連技術によって生じる改変が挙げられる。組み換えＤＮＡ技術には、インビトロで組み換えＤＮＡを生産する技術、及び組み換えＤＮＡが発現され得る又は増加し得る細胞に組み換えＤＮＡを移入して、それによって組み換えポリペプチドが産生される技術が挙げられる。ポリヌクレオチド又は核酸の「組み換え」及び「組み換える」は、概して、２つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチド鎖若しくは断片をアセンブル又は結合させて新しいポリヌクレオチド又は核酸を生成することを指す。
【００３１】
核酸又はポリヌクレオチドは、未改変の状態にせよ又は当業者に既知の手法により工学操作された場合にせよ、転写及び／又は翻訳されてポリペプチド又はそれらの断片を産生できるのであれば、ポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸のアンチセンス鎖も、同様に、配列をコードすると言われる。
【００３２】
用語「宿主株」及び「宿主細胞」は、対象とするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにとって好適な宿主を指す。
【００３３】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列からなる。「タンパク質」及び「ポリペプチド」なる用語は、本明細書ではほぼ同じ意味で使用される。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を、本開示全体を通して使用する。一文字のＸは、２０種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。ポリペプチドは、遺伝子コードの縮重により１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。変異は、親アミノ酸の一文字表記、続いて位置番号、次に変異アミノ酸を表す一文字表記により記載される。例えば、８７番目のグリシン（Ｇ）のセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表される。変異は、また、アミノ酸の三文字表記に続いて、ポリペプチド鎖のＮ末端から数えた位置により記載されることがあり、例えば、１０番目のアラニンはＡｌａ１０で記載される。複数の変異は、変異間に「−」、「＋」、「／」又は「；」を挿入して示す。８７位及び９０位での変異は、「Ｇ０８７Ｓ−Ａ０９０Ｙ」若しくは「Ｇ８７Ｓ−Ａ９０Ｙ」、又は「Ｇ８７Ｓ＋Ａ９０Ｙ」若しくは「Ｇ０８７Ｓ＋Ａ０９０Ｙ」のいずれかとして表される。欠失については、一文字コード「Ｚ」を使用する。親配列に対する挿入については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の左側に記載する。欠失については、一文字コード「Ｚ」を位置番号の右側に記載する。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の位置番号にアミノ酸毎に０．０１を加えた番号である。例えば、位置８７と８８の間に三つのアミノ酸、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ）を挿入することは、「Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ」と表される。したがって、上記の全ての変異に加え第１００番目の位置に欠失が存在する場合には、「Ｇ０８７Ｓ−Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ−Ａ０９０Ｙ−Ａ１００Ｚ」となる。改変について記載するとき、位置の後に続く括弧内に記載のアミノ酸は置換一覧を意味し、すなわち、その位置において、掲載の任意のアミノ酸により置換がなされる。例えば、６（Ｌ，Ｉ）とは、６位がロイシン又はイソロイシンで置換され得ることを意味する。
【００３４】
「プロ配列」又は「プロペプチド配列」とは、適切なフォールディング及びプロテアーゼの分泌にとって必要な、シグナルペプチド配列と成熟型プロテアーゼ配列との間のアミノ酸配列を指す。これらは、分子内シャペロン分子と称されることもある。プロ配列又はプロペプチド配列の開裂により、成熟型活性プロテアーゼを生じる。細菌由来のセリンプロテアーゼは、プロ酵素と表現されることが多い。
【００３５】
用語「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」は、成熟型又は前駆体型タンパク質の分泌又は直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、典型的に、前駆体型又は成熟型タンパク質配列のＮ端末に位置する。シグナル配列は内因性又は外来性であり得る。シグナル配列は通常、成熟型タンパク質には存在しない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から開裂される。
【００３６】
用語「成熟」型タンパク質、ポリペプチド又はペプチドとは、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を持たないタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的形態を指す。
【００３７】
用語「前駆体」型タンパク質又はペプチドとは、タンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に機能的に連結されたプロ配列を有する成熟型タンパク質を指す。前駆体は、プロ配列のアミノ末端に、制御可能なように連結された「シグナル」配列を有する場合もある。前駆型タンパク質又はペプチドは、翻訳後活性に関係する追加のポリペプチド（例えば、前駆体から開裂されて、成熟型のタンパク質又はペプチドを後に残すポリペプチド）を有する場合もある。
【００３８】
アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配列が未改変又は自然発生的配列であることを示す。本明細書で使用するとき、用語「自然発生的」とは、自然界で見出される任意のもの（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）を指す。反対に、用語「非自然発生的」とは、自然界で見出されない任意のもの（例えば、研究室で作製された組み換え核酸及びタンパク質配列、又は野生型配列の改変）を指す。
【００３９】
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」とは、タンパク質若しくはペプチド中の列挙された位置にあるアミノ酸残基、又はタンパク質若しくはペプチド中の列挙された残基と類似、相同、若しくは等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、「対応する領域」とは、概して、関連するタンパク質又は参照タンパク質における類似の位置を指す。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「に由来する」及び「から得られる」とは、当該生物株により産生されるあるいは産生され得るタンパク質だけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によってコードされ、このようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるタンパク質も指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされかつ当該タンパク質の識別特徴を有するタンパク質を指す。例示すると、「バチルス（Bacillus）に由来するプロテアーゼ」は、バチルス（Bacillus）により自然に産生されるタンパク質分解活性を有する酵素、並びにバチルス（Bacillus）供給源により産生されるものと類似しているが、遺伝子工学技術を使用することにより、セリンプロテアーゼをコードする核酸によって形質転換された他の宿主細胞によって産生されるセリンプロテアーゼを指す。
【００４１】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下に記載され、当該技術分野において既知の配列比較又は解析アルゴリズムを用いて測定されるとき、最大限一致するように整列させたときに同じである２つの配列中の核酸又はアミノ酸を指す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「相同遺伝子」又は「相同タンパク質」は、互いに同一又は非常に類似しており、共通の祖先に由来すると考えられる、一対の遺伝子又はタンパク質を指す。この用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子又はタンパク質（例えば、オルソロガス遺伝子又はオルソロガスタンパク質）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子又はタンパク質（例えば、パラロガス遺伝子又はパラロガスタンパク質）を包含する。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「同一性％」又は「同一性パーセント」又は「ＰＩＤ」は、タンパク質配列の同一性を指す。同一性パーセントは、当該技術分野において既知の標準的手技を用いて決定できる。有用なアルゴリズムとして、ＢＬＡＳＴアルゴリズムが挙げられる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３〜４１０，１９９０；及びＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：５８７３〜５７８７，１９９３参照）。ＢＬＡＳＴプログラムは、そのほとんどがデフォルト値に設定される複数の検索パラメーターを使用する。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、生物学的類似性の点で最も相関する配列が特定されるものの、２０残基未満のクエリ配列には推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜３４０２，１９９７及びＳｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２９９４〜３００５，２００１）。核酸配列の検索におけるデフォルトのＢＬＡＳＴパラメーター例は次の通りである。隣接ワード閾値＝１１；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアマトリックス＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝−３）；ギャップ開始＝５；及びギャップ伸長＝２。アミノ酸配列の検索におけるデフォルトのＢＬＡＳＴパラメーター例は次の通りである。ワードサイズ＝３；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップ開始＝１１；及びギャップ伸長＝１。アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最適／最大のアラインメントが得られるようにプログラムによって作成された任意のギャップを含む「参照」配列の残基総数で、マッチする同一残基数を除することによって求められる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、「参照」配列を「クエリ」配列と呼ぶ。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「相同タンパク質」又は「相同プロテアーゼ」は、一次、二次、及び／又は三次構造に明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質を整列させるとき、一次アミノ酸配列の類似性を指す場合もある。タンパク質配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを閾値（Ｅ値カットオフ）０．００１で用いて実施できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅ  ＴＬ，Ｓｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ。Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｓｅｔ  １；２５（１７）：３３８９〜４０２）。この情報を用いて、タンパク質配列をグループ化できる。系統樹は、アミノ酸配列を用いて作ることができる。アミノ酸配列をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｓｕｉｔｅ等のプログラムに入力し、近隣結合（ＮＪ）法を用いて樹形図を作成できる（Ｓａｉｔｏｕ  ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ，４：４０６〜４２５，１９８７）。樹形構成は、配列距離について木村の相関を用い、ギャップ位置を無視して計算できる。ＡｌｉｇｎＸ等のプログラムは、系統樹上に表示された分子名に続いて、カッコ内に計算した距離値を表示できる。
【００４５】
分子間の相同性を理解すると、分子の進化の過程、並びにそれらの機能に関する情報を明らかにでき、新たに配列決定されたタンパク質が既に特徴が明らかであるタンパク質と相同である場合、新たなタンパク質の生化学的機能の強い兆候が見られる。２つの実体間の最も基本的な関連性は相同性であり、２つの分子が共通の祖先に由来している場合、相同であると言われる。相同分子、つまり相同体は、パラログ及びオルソログの２つの種類に分けられる。パラログは、１つの種内に存在する相同体である。多くの場合パラログは、詳細な生化学的機能が異なっている。オルソログは、異なる種内に存在する相同体であり、非常に類似した、又は同一の機能を有する。タンパク質スーパーファミリーは、共通の起源であると推測できる、タンパク質の最も大きいグループ（系統群）である。通常、この共通の起源は、配列アライメント及び機序的類似性に基づく。スーパーファミリーは、典型的には、ファミリー内で配列類似性を示すいくつかのタンパク質ファミリーを含む。用語「タンパク質クラン」は、ＭＥＲＯＰＳプロテアーゼ分類システムに基づくプロテアーゼスーパーファミリーにおいて一般に使用される。
【００４６】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムは、配列アライメントアルゴリズムの別の例である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２：４６７３〜４６８０，１９９４）。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターは、以下の通りである。ギャップ開始ペナルティ＝１０．０；ギャップ伸長ペナルティ＝０．０５；タンパク質重みマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭシリーズ；ＤＮＡ重みマトリックス＝ＩＵＢ；分岐配列遅延（Delay divergent sequences）％＝４０；ギャップ分離距離＝８；ＤＮＡ転位重み＝０．５０；親水性残基リスト＝ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ；ネガティブマトリックスの使用＝オフ；残基特異性ペナルティのスイッチ＝オン；親水性ペナルティのスイッチ＝オン；及び末端ギャップ分離ペナルティのスイッチ＝オフ。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、どちらか一方の末端に存在する欠失を含める。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドのどちらか一方の末端で（又はポリペプチド内に）アミノ酸５個の欠失を有する変異体は、「参照」ポリペプチドに対して９９％の配列同一性パーセントを有する（同一残基４９５個／５００個×１００）。このような変異体は、ポリペプチドに対して「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含されるであろう。
【００４７】
核酸又はポリヌクレオチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、核酸又はポリヌクレオチドは「単離され」ている。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から少なくとも部分的又は完全に分離されているとき、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは「単離され」ている。単離された分子種は、モルベースで、組成物中に他の分子種よりも豊富に含まれている。例えば、単離された種は、含まれている全ての高分子種の（モルベースで）少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％を構成し得る。好ましくは、対象とする種は、本質的に均一に精製される（すなわち、通常の検出手法により組成物中で汚染種が検出されることはない）。純度及び均一性は、当該技術分野で周知の多数の技術、例えば核酸又はタンパク質試料のそれぞれアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後の染色による可視化を用いて決定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
【００４８】
核酸又はポリペプチドに使用される場合、用語「精製された」は、概して、当業者に周知の解析技術により決定したときに、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた培養液中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルで本質的に１本のバンドのみが生じる核酸又はポリペプチドは、「精製されている」。精製されている核酸又はポリペプチドは、少なくとも純度約５０％のものであり、通常、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、又は約９９．８％以上（例えば、モル重量による純度）のものである。関連する意味で、精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に増加している場合、組成物はその分子について濃縮されている。用語「濃縮された」とは、化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、アミノ酸、又は他の特定の材料若しくは成分が開始組成物よりも高い相対濃度又は絶対濃度で組成物中に存在することを指す。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「機能アッセイ」は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、タンパク質を、通常の性能で機能し得るかに関して解析するアッセイ系を指す。例えば、プロテアーゼの場合、機能アッセイは、プロテアーゼがタンパク質基質を加水分解する実効性を評価することを包含する。
【００５０】
用語「クリーニング活性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本開示の他のプロセスの際に一般的に適用される条件下で、セリンプロテアーゼポリペプチド又は参照プロテアーゼにより得られるクリーニング性能を指す。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチド又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の１種又は２種以上の様々な酵素反応性の染み（例えば、食物、草類、血液、インク、牛乳、油及び／又は卵タンパク質による染み）をクリーニングするための様々なアッセイを用いることで決定され得る。変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の染みを標準的なクリーニング条件に晒す工程、及び染みが除去される程度を、様々なクロマトグラフィー、分光光度法、又はその他の定量法を用いて評価する工程によって決定され得る。代表的なクリーニングアッセイ及び方法は、当該技術分野において既知であり、国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，６０５，４５８号（両方が参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されるもの、並びに、以下の実施例に含まれるクリーニングアッセイ及び方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
用語、セリンプロテアーゼポリペプチド又は参照プロテアーゼ「クリーニング有効量」は、特定のクリーニング組成物中で所望のレベルの酵素活性を達成するプロテアーゼの量を指す。このような有効量は、当業者によって容易に確認され、使用される特定のプロテアーゼ、クリーニング用途、クリーニング組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥形態（例えば、粒状、錠剤、バー状）のいずれであるのか、等の多くの要因に基づくものである。
【００５２】
用語「クリーニング助剤」は、クリーニング組成物に包含される、本開示のセリンプロテアーゼポリペプチド以外の任意の液体、固体、又はガス状の材料を指す。いくつかの実施形態では、本開示のクリーニング組成物は、１種又は２種以上のクリーニング助剤を包含する。各クリーニング助剤は、典型的には、クリーニング組成物の特定のタイプ及び形態（例えば、液体、粒状、粉末、バー状、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、フォーム、又はその他の構成）に応じて選択される。好ましくは、各クリーニング助剤は、組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合性である。
【００５３】
クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の対象物、物品、及び／又は表面をクリーニング、漂白、消毒、及び／又は殺菌するのに好適な任意の組成物を含む。このような組成物及び配合物として、例えば、液体及び／又は固体組成物、例えば、クリーニング又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、バー状、粒状、及び／又は固体洗濯洗浄又は洗剤組成物、並びにおしゃれ着用洗剤組成物等）；硬質表面クリーニング組成物及び配合物（例えば、ガラス、木材、セラミック及び金属製のカウンター甲板及び窓用のもの）；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；及び織物、洗濯洗浄性能増進用クリーニング又は洗剤組成物、洗濯用添加型クリーニング組成物、及び洗濯物のシミ抜き前処理用クリーニング組成物；食器手洗い用又は食器手動洗浄用組成物（例えば、食器「手洗い」用又は食器「手動」洗浄用洗剤）及び自動食器洗浄組成物（例えば、「自動食器洗浄洗剤」）を包含する食器洗浄用組成物が挙げられるが、これらに限定されない。丸剤、錠剤、ジェルキャップ、又は予め計量された粉末、懸濁液、若しくは液体等の他の一回用量単位が挙げられるが、これらに限定されない、任意の好適な一回用量単位も本発明において有用である。
【００５４】
本明細書で使用するとき、クリーニング組成物又はクリーニング配合物としては、別途記載のない限り、粒状又は粉末状万能又は強力洗浄剤、特に、クリーニング洗剤；液体、粒状、ゲル、固形、錠剤、ペースト状、又は一回用量型万能洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力乾燥洗剤（ＨＤＤ）型；おしゃれ着用液体洗剤；高起泡型のものを含む食器手洗い又は食器手動洗浄剤；食器手洗い又は食器手動洗浄、食器自動洗浄、或いは家事用及び業務用の様々な錠剤、粉末、固形、粒状、液状、ゲル状及びすすぎ助剤型の食器類若しくは食卓用食器類洗浄剤；抗菌性手洗い用液体クリーニング及び殺菌剤、固形石鹸、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、車洗浄剤、カーペット洗浄剤、風呂場クリーナー等の液体クリーニング及び殺菌剤；人間及び他の動物の毛髪用シャンプー及び／又は毛髪用リンス；シャワージェル及びバブルバス、並びに金属製品クリーナー；加えて、漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型等のクリーニング補助剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、粒状組成物は「コンパクト」形態であり；いくつかの実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
【００５５】
本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」としては、洗濯用添加型組成物等の手洗い用及び洗濯機用洗剤組成物、並びに染みの付いた布地（例えば、衣類、リネン類、及び他の繊維材料）の浸け置き及び／又は前処理に使用するのに好適な組成物が挙げられる。
【００５６】
本明細書で使用するとき、「非布地用クリーニング組成物」として、例えば、食器手洗い用若しくは手動食器洗浄又は自動食器洗浄洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、コンタクトレンズ洗浄用組成物、創傷清拭用組成物、及びパーソナルクレンジング組成物が挙げられるが、これらに限定されない、非織物（すなわち、非布地）表面用クリーニング組成物が挙げられる。
【００５７】
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及び／又は非布地製の物体又は物品等の、汚れた又は泥のついた物体を洗浄するために洗浄媒質中で使用することが意図される組成物に関して使用される。本開示のこのような組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は配合物に限定されない。実際に、一部の実施形態では、本開示の洗剤は、少なくとも１種の本開示のセリンプロテアーゼポリペプチドと、加えて、１種又は２種以上の界面活性剤、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩）、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤、蛍光染料、凝固阻害剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化剤、及び／又は可溶化剤を含有する。場合によっては、ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。例えば、限定するものではないが、クリーニング組成物又は洗剤組成物等の、本開示のいくつかの組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）を含まない。
【００５８】
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、材料の増白（すなわち、ホワイトニング）及び／若しくはクリーニングを行うために充分な時間及び／又は適切なｐＨ及び／又は温度条件下での物質（例えば、布地、洗濯物、パルプ等）又は表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ（例えば、本開示のセリンプロテアーゼポリペプチド）の「洗浄性能」は、組成物にセリンプロテアーゼポリペプチドを加えていない洗剤と比較して、追加のクリーニング性能を洗剤に付与するセリンプロテアーゼポリペプチドの洗浄への貢献を指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。一部の試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度等の他の関連する要因を、特定のマーケットセグメントにおける家事用途に典型的な条件（例えば、食器手洗い又は食器手動洗浄、自動食器洗浄、食器クリーニング、食卓用食器類クリーニング、及び布地クリーニング等）を模倣するように調節することができる。
【００６０】
本明細書において使用される用語「関連する洗浄条件」は、食器手洗い、自動食器洗浄、又は洗濯洗剤のマーケットセグメントに含まれる家事で実際に使用される条件であって、具体的には、洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度、洗剤のタイプ及び水硬度等の条件を意味する。
【００６１】
用語「改良された洗浄性能」の使用により、関連する洗浄条件下での染み除去において、良好な最終結果が得られること、あるいは対応する野生型又は初期親プロテアーゼと比較して、同じ最終結果を得るのに必要とされる本開示のセリンプロテアーゼポリペプチドが、重量ベースで少なくなることを意味する。
【００６２】
本明細書で使用するとき、用語、「消毒」は、汚染物質を表面から除去すること、並びに、物品の表面上の微生物の阻害又は死滅を指す。本開示が、特定の表面、物品、又は除去しようとする汚染物質若しくは微生物に限定されることは意図するところではない。
【００６３】
本明細書における洗浄組成物の「圧縮」形態とは、密度に最もよく反映され、組成物の観点からは無機充填剤塩の量に反映される。無機塩充填剤は、粉末形態の洗剤組成物の通常の成分である。通常の洗剤組成物では、塩充填剤は、相当量で、典型的には組成物全体の約１７〜約３５重量％で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、塩充填剤は、組成物全体の約１５重量％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、塩充填剤は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、無機塩充填剤は、硫酸アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩、並びアルカリ塩化物及びアルカリ土類金属塩化物から選択される。いくつかの実施形態では、塩充填剤は硫酸ナトリウムである。
【００６４】
ＩＩ．セリンプロテアーゼポリペプチド
本開示は、新規セリンプロテアーゼ酵素を提供する。本開示のセリンプロテアーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチド、組み換えポリペプチド、実質的に純粋なポリペプチド、又は非自然発生的ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、このポリペプチドは、クリーニング用途で有用であり、その必要のある物品又は表面をクリーニングする方法において有用なクリーニング組成物に組み込むことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、ＷＨＹ系統群ポリペプチドであってよい。ＷＨＹ系統群は、Ｎ末端付近（ＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、及びこの系統群の他のメンバーにおいてＷの残基位置は７）の、完全に保存された残基ＷＨＹに由来する。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、ＷＨＹ系統群ポリペプチドであってよく、ただし、ポリペプチドが国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１を含まないことを条件とする。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸＸＸＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸＸＸＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸＸＸＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘは任意のアミノ酸であり、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。
【００６７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＤＴＧＩＤＸＸＨＸＸＬＸａＮＬＶＸＴＳＬＧＸＳＸＶＧＧＸｂＸＸｃＤＶＸＧＨモチーフを含み、このとき最初のＤは活性部位であるアスパラギン酸であり、最後のＨは活性部位であるヒスチジンであり、Ｘ、Ｘａ、Ｘｂ、及びＸｃは任意のアミノ酸であり、ただしこのとき、Ｘａはアルギニンであり、Ｘｂ及びＸｃはグリシンではない。いくつかの実施形態では、モチーフのＶＸＧ配列はＶＱＧである。いくつかの実施形態では、ＶＱＧ配列は６３〜６５番目の残基位置にあり、このときポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置は、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、８０〜８２番目の残基位置にあるＶＳＧ配列を含み、ポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置は、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、８０〜８２番目の残基位置にあるＶＳＧ配列を含み、ポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置は、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、８０〜８２番目の残基位置にあるＶＳＧ配列を含み、ポリペプチド又はその活性フラグメントのアミノ酸位置は、配列番号７に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を含み、この挿入は３９〜４７番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。別の実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を含み、この挿入は３９〜４７番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。更に別の実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を含み、この挿入は３９〜４７番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、３９〜４７番目の残基位置は、ＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧで置換されている。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、この欠失は５１〜６４番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされている。別の実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、この欠失は５１〜６４番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。なお更なる実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、この欠失は５１〜６４番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨ、ＶＧＧＳＡ／ＰＥＤＶＱＧＨ、ＶＧＧＮＰＥＤＲＱＧＨ、又はＶＧＧＴＰＡＤＶＨＧＨで置換されている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨで置換されている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＳＡ／ＰＥＤＶＱＧＨで置換されている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＳＡＥＤＶＱＧＨで置換されている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＳＰＥＤＶＱＧＨで置換されている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＮＰＥＤＲＱＧＨで置換されている。いくつかの実施形態では、５１〜６４番目の残基位置は、ＶＧＧＴＰＡＤＶＨＧＨで置換されている。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、この欠失は６８〜９５番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。別の実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号１８と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含み、この欠失は６８〜９５番目の残基位置にあり、残基位置は、配列番号１８に定めるアミノ酸配列に対応して番号付けされており、ただし、このポリペプチドが、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１のアミノ酸配列を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、６８〜９５番目の残基位置は、ＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶで置換されている。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＳＷＴ７７系統群にある。ＳＷＴ７７系統群は、近隣結合方法の使用等によって系統樹を作成することによる、実施例１３に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、任意のＳＷＴ７７系統群メンバーの距離値は、ＳＷＴ７７配列の直近の先祖ノード内にある。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＳＷＴ２２系統群にある。ＳＷＴ２２系統群は、近隣結合方法の使用等によって系統樹を作成することによる、実施例１３に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、任意のＳＷＴ２２系統群メンバーの距離値は、ＳＷＴ２２配列の直近の先祖ノード内にある。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＷＰ０２６６７５１１４系統群にある。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＷＰ０２６６７５１１４系統群にあり、ただしこのポリペプチドがＷＰ０２６６７５１１４でないことを条件とする。ＷＰ０２６６７５１１４系統群は、近隣結合方法の使用等によって系統樹を作成することによる、実施例１３に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、任意のＷＰ０２６６７５１１４系統群メンバーの距離値は、ＷＰ０２６６７５１１４配列の直近の先祖ノード内にある。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド、又はその活性フラグメントは、新規ポリペプチド又は本発明の上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このときポリペプチド又はその活性フラグメントは、ＢｓｐＡＧ００２９６系統群にある。ＢｓｐＡＧ００２９６系統群は、近隣結合方法の使用等によって系統樹を作成することによる、実施例１３に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、任意のＢｓｐＡＧ００２９６系統群メンバーの距離値は、ＢｓｐＡＧ００２９６配列の直近の先祖ノード内にある。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドは、例示されるポリペプチドに対して特定の程度のアミノ酸配列相同性を有する、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、ポリペプチドである。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、例示されるポリペプチドに対して特定の程度のアミノ酸配列相同性を有する、例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、ポリペプチドである。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬ等のプログラムを使用した、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、プロテアーゼ活性（例えば、ジメチルカゼイン加水分解活性）を有する、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非自然発生的酵素である。
【００７７】
アルカリプロテアーゼ活性等のプロテアーゼ活性を有する、本発明のポリペプチド酵素も提供され、かかる酵素は、上記アライメント法のいずれかを使用して整列させたとき、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列と、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基が異なる、アミノ酸配列を含む。より更に、アルカリプロテアーゼ活性等のプロテアーゼ活性を有する、本発明のポリペプチド酵素が提供され、かかる酵素は、上記アライメント法のいずれかを使用して整列させたとき、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、又は配列番号４３のアミノ酸配列と、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基が異なる、アミノ酸配列を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド又はその活性フラグメントは、本発明の新規ポリペプチド又は上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、及び配列番号４４からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、この組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、Ｘ００３Ｎ、Ｘ００６Ｒ、Ｘ０１０Ｅ、Ｘ０２０Ｉ、Ｘ０２６Ｎ、Ｘ０２８Ｒ、Ｘ０２９Ｉ、Ｘ０３８Ａ、Ｘ０４１Ｐ、Ｘ０４２Ｎ、Ｘ０４４Ｒ、Ｘ０４８Ｄ、Ｘ０５３Ｒ、Ｘ０５９Ｇ、Ｘ０６１Ｇ、Ｘ０８５Ｑ、Ｘ０８８Ｒ、Ｘ０９０Ｉ、Ｘ０９６Ｇ、Ｘ０９８Ｎ、Ｘ１０３Ｍ、Ｘ１０４Ｙ、Ｘ１０７Ｑ、Ｘ１１３Ａ、Ｘ１１５Ｓ、Ｘ１１７Ｎ、Ｘ１３１Ｄ、Ｘ１３２Ｓ、Ｘ１３３Ｄ、Ｘ１３６Ｎ、Ｘ１３７Ｎ、Ｘ１３８Ｉ、Ｘ１３９Ｎ、Ｘ１４３Ｓ、Ｘ１４４Ｓ、Ｘ１４６Ｔ、Ｘ１４７Ｌ、Ｘ１５７Ｒ、Ｘ１６８Ｎ、Ｘ１６９Ａ、Ｘ１７８Ｎ、Ｘ１７９Ｒ、Ｘ１８０Ｔ、Ｘ２０４Ｙ、Ｘ２０７Ｇ、Ｘ２０８Ｑ、Ｘ２０９Ｆ、Ｘ２１０Ｒ、Ｘ２１２Ｌ、Ｘ２１９Ｔ、Ｘ２２２Ｖ、Ｘ２２９Ｉ、Ｘ２３０Ｋ、Ｘ２３１Ｓ、Ｘ２３１Ａ、Ｘ２３９Ｔ、Ｘ２４０Ｑ、Ｘ２４１Ｖ、Ｘ２４３Ｎ、Ｘ２４５Ｌ、Ｘ２４６Ｒ、Ｘ２４７Ｄ、Ｘ２５５Ｌ、Ｘ２５６Ｎ、Ｘ２５７Ｑ、Ｘ２６４Ｎ、Ｘ２６６Ｙ、Ｘ２７１Ａ、及びＸ２７３Ｇからなる群から選択される、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチド又はその活性フラグメントは、本発明の新規ポリペプチド又は上記ポリペプチドのうち任意のものであってよく、このポリペプチド又はその活性フラグメントは、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、及び配列番号４３からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、この組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントは、Ｘ００３Ｎ、Ｘ００６Ｒ、Ｘ０１０Ｅ、Ｘ０２０Ｉ、Ｘ０２６Ｎ、Ｘ０２８Ｒ、Ｘ０２９Ｉ、Ｘ０３８Ａ、Ｘ０４１Ｐ、Ｘ０４２Ｎ、Ｘ０４４Ｒ、Ｘ０４８Ｄ、Ｘ０５３Ｒ、Ｘ０５９Ｇ、Ｘ０６１Ｇ、Ｘ０８５Ｑ、Ｘ０８８Ｒ、Ｘ０９０Ｉ、Ｘ０９６Ｇ、Ｘ０９８Ｎ、Ｘ１０３Ｍ、Ｘ１０４Ｙ、Ｘ１０７Ｑ、Ｘ１１３Ａ、Ｘ１１５Ｓ、Ｘ１１７Ｎ、Ｘ１３１Ｄ、Ｘ１３２Ｓ、Ｘ１３３Ｄ、Ｘ１３６Ｎ、Ｘ１３７Ｎ、Ｘ１３８Ｉ、Ｘ１３９Ｎ、Ｘ１４３Ｓ、Ｘ１４４Ｓ、Ｘ１４６Ｔ、Ｘ１４７Ｌ、Ｘ１５７Ｒ、Ｘ１６８Ｎ、Ｘ１６９Ａ、Ｘ１７８Ｎ、Ｘ１７９Ｒ、Ｘ１８０Ｔ、Ｘ２０４Ｙ、Ｘ２０７Ｇ、Ｘ２０８Ｑ、Ｘ２０９Ｆ、Ｘ２１０Ｒ、Ｘ２１２Ｌ、Ｘ２１９Ｔ、Ｘ２２２Ｖ、Ｘ２２９Ｉ、Ｘ２３０Ｋ、Ｘ２３１Ｓ、Ｘ２３１Ａ、Ｘ２３９Ｔ、Ｘ２４０Ｑ、Ｘ２４１Ｖ、Ｘ２４３Ｎ、Ｘ２４５Ｌ、Ｘ２４６Ｒ、Ｘ２４７Ｄ、Ｘ２５５Ｌ、Ｘ２５６Ｎ、Ｘ２５７Ｑ、Ｘ２６４Ｎ、Ｘ２６６Ｙ、Ｘ２７１Ａ、及びＸ２７３Ｇからなる群から選択される、少なくとも１つの置換を含む。いくつかの実施形態では、置換は、Ｐ００３Ｎ、Ｑ００６Ｒ、Ｎ０１０Ｅ、Ｔ０２０Ｉ、Ｓ０２６Ｎ、Ｉ０２８Ｒ、Ｑ０２９Ｉ、Ｈ０３８Ａ、Ｑ０４１Ｐ、Ｓ０４２Ｎ、Ａ０４４Ｒ、Ｎ０４８Ｄ、Ｑ０５３Ｒ、Ｓ０５９Ｇ、Ｍ０６１Ｇ、Ｈ０８５Ｑ、Ｔ０８８Ｒ、Ｖ０９０Ｉ、Ｎ０９６Ｇ、Ｓ０９８Ｎ、Ｌ１０３Ｍ、Ｆ１０４Ｙ、Ｔ１０７Ｑ、Ｓ１１３Ａ、Ｄ１１５Ｓ、Ｇ１１７Ｎ、Ｎ１３１Ｄ、Ｑ１３２Ｓ、Ｓ１３３Ｄ、Ａ１３６Ｎ、Ａ１３７Ｎ、Ａ１３８Ｉ、Ｑ１３９Ｎ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｓ、Ｓ１４６Ｔ、Ｉ１４７Ｌ、Ａ１５７Ｒ、Ｓ１６８Ｎ、Ｖ１６９Ａ、Ｔ１７８Ｎ、Ｇ１７９Ｒ、Ａ１８０Ｔ、Ｖ２０４Ｙ、Ｎ２０７Ｇ、Ｇ２０８Ｑ、Ｙ２０９Ｆ、Ａ２１０Ｒ、Ｆ２１２Ｌ、Ｓ２１９Ｔ、Ａ２２２Ｖ、Ｎ２２９Ｉ、Ｒ２３０Ｋ、Ａ２３１Ｓ、Ｖ２３１Ａ、Ｓ２３９Ｔ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４１Ｖ、Ｓ２４３Ｎ、Ｍ２４５Ｌ、Ｑ２４６Ｒ、Ｎ２４７Ｄ、Ｐ２５５Ｌ、Ｔ２５６Ｎ、Ｆ２５７Ｑ、Ｄ２６４Ｎ、Ｎ２６６Ｙ、Ｑ２７１Ａ、及びＳ２７３Ｇからなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、ＷＰ０１０２８３１０６、ＷＰ００６６７９３２１、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、又は同第２０１２１７５７０８号−０００６を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１を含まないことを条件とする。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、ＷＰ０１０２８３１０６、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、又は同第２０１２１７５７０８号−０００６を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、同第２０１２１７５７０８号−０００６、ＷＰ０２６６７５１１４、ＷＰ０２５０２５８８７、ＷＰ０１０２８３１０６、又はＷＰ００６６７９３２１を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、ＷＰ０２６６７５１１４、又はＷＰ０１０２８３１０６を含まないことを条件とする。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２又は同第２０１２１７５７０８号−０００４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、ＷＰ０２６６７５１１４、又はＷＰ０２５０２５８８７を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２を含まないことを条件とする。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２又は同第２０１２１７５７０８号−０００４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００２、同第２０１２１７５７０８号−０００４、又はＷＰ０２６６７５１１４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントであるが、ただし、このアミノ酸配列が、国際公開第２０１２１７５７０８号−０００４又はＷＰ０２６６７５１１４を含まないことを条件とする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチド又はその活性フラグメントである。
【００８５】
上記のように、本発明の変異体酵素ポリペプチドは、酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）を有し、例えば、食器類、食卓用食器類、布地、及び硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、卓上、壁、家具、床、天井等の硬質表面）をクリーニングする方法が挙げられるが、これらに限定されない、クリーニング用途に有用である。本発明の１つ又は２つ以上の変異体セリンプロテアーゼ酵素ポリペプチドを含む代表的なクリーニング組成物を以下に記載する。本発明の酵素ポリペプチドの酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性）は、当業者に周知の手順を利用して容易に求めることができる。酵素活性及びクリーニング性能を評価する方法について、以下に例を示す。本発明のポリペプチド酵素の、染み（例えば、血液／牛乳／インク又は卵黄等のタンパク質性の染み）の除去、硬質表面のクリーニング、又は衣類、食器類、若しくは食卓用食器類のクリーニングについての性能は、当業者に周知の手順を利用して、及び／又は実施例に記載の手順を利用して容易に決定することができる。
【００８６】
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、広範なｐＨ条件でプロテアーゼ活性を有し得る。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、実施例７において例示される通り、ジメチルカゼインを基質としてプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約４．０〜約１２．０でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約６．０〜約１２．０でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ約６．０〜約１２．０、又は約７．０〜約１２．０での最大プロテアーゼ活性の、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、又は１１．５超でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、ｐＨ１２．０、１１．５、１１．０、１０．５、１０．０、９．５、９．０、８．５、８．０、７．５、７．０、又は６．５未満でプロテアーゼ活性を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、約１０℃〜約９０℃、又は約３０℃〜約８０℃の温度範囲でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、約５５℃〜約７５℃の温度範囲でプロテアーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、約５５℃〜約７５℃の温度で最大プロテアーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、又は７０℃超の温度で活性を有する。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼは、７５℃、８０℃、７０℃、６５℃、６０℃、又は５５℃未満の温度で活性を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、ストレス条件下、５０℃において２０分後に少なくとも８０％の活性を有する。ストレス条件は、例えば、実施例１１に示されるものであってよい。いくつかの実施形態では、ストレス条件は、ＬＡＳ／ＥＤＴＡアッセイ、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡアッセイ、又はＯＭＯ  ＨＤＬアッセイの状態である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、クリーニング組成物中でクリーニング性能を示す。クリーニング組成物は、多くの場合、酵素の安定性及び性能に有害であり、クリーニング組成物を、酵素、例えばセリンプロテアーゼが機能を保持するには過酷な環境にする。したがって、酵素をクリーニング組成物に加えて、酵素機能（例えば、クリーニング性能により示されるもの等のセリンプロテアーゼ活性）を期待することは簡単ではない。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤組成物中でクリーニング性能を示す。いくつかの実施形態では、自動食器洗浄（ＡＤＷ）洗剤組成物におけるクリーニング性能には、卵黄の染みのクリーニングが含まれる。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、洗濯洗剤組成物中でクリーニング性能を示す。いくつかの実施形態では、洗濯洗剤組成物におけるクリーニング性能には、血液／牛乳／インク染みのクリーニングが含まれる。各クリーニング組成物において、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、漂白成分による又はよらないクリーニング性能を示す。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、及び／又は保存的若しくは非保存的のいずれかの置換等といった様々な変化を受けることができ、このような変化としては、この変化によってポリペプチドの酵素活性が実質的に変更されないものが包含される。同様にして、本発明の核酸には様々な変更を施すこともでき、例えば、同じ又は異なるアミノ酸をコードしている特定のコドン等の１つ以上のコドン中の１つ以上のヌクレオチドの１つ以上を置換することによるサイレント変異（例えば、コードされているアミノ酸はヌクレオチドの変異により変更を受けない場合）又は非サイレント変異、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の欠失、配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の付加又は挿入、及び／又は配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）の１つ以上の開裂又は切断を施すこともできる。核酸配列における多くのこのような変更は、得られるコードされているポリペプチド酵素の酵素活性を、もとの核酸配列によりコードされているポリペプチド酵素と比較して実質的に変更し得るものではない。本発明の核酸配列を改変し、１つ又は２つ以上のコドンを含有させて、発現系（例えば、細菌発現系）において最適な発現を提供させることもでき、一方、所望される場合、前述の１つ又は２つ以上のコドンには尚も同じアミノ酸をコードさせることもできる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明は、所望の酵素活性（例えば、プロテアーゼ酵素活性又はクリーニング性能活性）を有する酵素ポリペプチド類を提供し、このポリペプチドは、本明細書に記載のアミノ酸置換を有する配列を含み、かつ１つ又は２つ以上の追加のアミノ酸置換、例えば、保存的及び非保存的置換も含み、このポリペプチドは、所望の酵素活性（例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２５、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４３、又は配列番号４４のポリペプチド酵素のクリーニング活性又は性能に反映されるもの等のタンパク質分解活性）を示し、維持し、又はおよそ維持する。本発明に従うアミノ酸置換には、限定するものではないが、１つ以上の非保存的置換及び／又は１つ以上の保存的アミノ酸置換が包含され得る。保存的なアミノ酸残基置換は、典型的には、１つの機能クラスのアミノ酸残基に含まれるメンバーの、同じ機能クラスに属する残基による置き換えを包含する（保存的なアミノ酸残基は機能的相同性（％）の算出において相同又は保存的に機能するものとみなされる）。保存的アミノ酸置換は、典型的には、アミノ酸配列中のアミノ酸を機能的に類似するアミノ酸により置換することを含む。例えば、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは機能的に類似するものであり、このため互いに保存的アミノ酸置換を提供し得る。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、互いに保存的置換を提供し得る。アスパラギン及びグルタミンは、互いに保存的置換を提供し得る。アルギニン、リジン、及びヒスチジンは、互いに保存的置換を提供し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンは、互いに保存的置換を提供し得る。フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、互いに保存的置換を提供し得る。
【００９２】
他の保存的アミノ酸置換基も想定され得る。例えば、アミノ酸は、類似の機能又は化学構造又は組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、イオウ含有）により分類することができる。例えば、脂肪族のグループには、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）が含まれ得る。互いに保存的な置換であるものと考えられるその他のアミノ酸を包含するグループには、芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））、硫黄含有（メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ））、塩基性（アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ））、酸性（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））、非極性非荷電残基（システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、及びプロリン（Ｐ）、親水性非荷電残基（セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ））が挙げられる。アミノ酸のその他の分類も当業者に周知であり、様々な一般的な文献に記載されている。上記の置換基と共に、本明細書においてポリペプチド配列を列挙することで、保存的に置換された全てのポリペプチド配列の明白な一覧を提供する。
【００９３】
上記のアミノ酸残基分類には、より保存的な置換が存在し、これらも同様に又は別法として好適であり得る。より保存的である保存的置換基としては、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。
【００９４】
本発明のポリペプチド配列の保存的置換変異体（例えば、本発明のセリンプロテアーゼ変異体）は、わずかな割合の、場合によりポリペプチド配列中のアミノ酸の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、若しくは１％未満、又は１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、又は１個未満のアミノ酸と、同じ保存的置換基の保存的に選択されたアミノ酸との置換を包含する。
【００９５】
ＩＩＩ．セリンプロテアーゼをコードする核酸
本発明は、単離された、非天然起源の、又は組み換え型の核酸（本明細書では「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる）を提供し、これは集合的に本発明のポリペプチドをコードする「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と呼ばれ得る。以下に記載の全てのものを含む本発明の核酸は、典型的に、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した本発明のポリペプチドの組み換えによる産生（例えば発現）に有用である。上記の通り、ポリペプチドは、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有するセリンロプロテアーゼポリペプチドを包含し、クリーニング用途、並びにクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例示されるポリヌクレオチドに対して特定の程度の核酸相同性を有するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、配列番号８、及び配列番号１２からなる群から選択される核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、配列番号８、及び配列番号１２からなる群から選択される核酸配列に対する相補的核酸配列を有してもよい。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬ等のプログラムを使用した、アミノ酸配列アラインメントにより決定することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の表題「本発明のポリペプチド」と付けられた節及び本明細書の他の場所に記載される、任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質等が包含される）をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非自然発生的核酸を提供する。本発明は、上記及び本明細書の他の箇所に記載の、本発明の任意のポリペプチドの２つ以上の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された、組み換え型の、実質的に純粋な、又は非自然発生的の核酸も提供する。本発明は、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードする核酸を提供し、このセリンプロテアーゼポリペプチドは、タンパク質分解活性を有する成熟型である。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼ（例えば、ＢｓｐＡＧ００２９６）は、相同プロペプチド配列（例えば、ＢｓｐＡＧ００２９６プロペプチド）と共に組み換えにより発現される。別の実施形態では、セリンプロテアーゼは、異種プロペプチド配列（例えば、別のサブチリシンプロテアーゼ由来のプロペプチド配列）と共に組み換えにより発現される。
【００９８】
本発明の核酸は、任意の好適な合成技術、操作技術、及び／又は単離技術、又はこれらの組み合わせを用いて作製できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の固相合成法等の標準的な核酸合成技術を用いて製造することもできる。このような技術では、典型的には５０個まで又はそれ以上のヌクレオチド塩基の断片を合成して、次いで連結することで（例えば、酵素的若しくは化学的連結方法、又はポリメラーゼによる組み換え方法）、本質的に任意の所望の連続的な核酸配列が形成される。本発明の核酸の合成は、典型的には、自動合成法で実行されるように、古典的なホスホラミダイド法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９〜６９［１９８１］参照）、又は、Ｍａｔｔｈｅｓらによって述べられた方法（Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１〜８０５［１９８４］参照）を用いる化学合成が挙げられるが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって促進してもよい。本発明の核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を使用しても作製できる。カスタマイズされた核酸を、各種供給業者（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．及びＤＮＡ２．０）に発注することができる。核酸を合成するその他の手法及び関連する原理は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３［１９８４］；及びＩｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６［１９８４］）。
【００９９】
上記のように、核酸の改変に有用な、ＤＮＡの組み換え技術は、当該技術分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、及びｃＤＮＡの生産、並びにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）等の技法が知られており、当業者により容易に使用される。本発明のヌクレオチドは、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、又はこれをＰＣＲ増幅させることができる１つ又は２つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを利用して、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより得ることもできる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及び単離手順、並びにＰＣＲによる増幅手順は当業者に周知のものであり、当業者に既知の標準的な参考文献に記載されている。本発明の核酸のいくつかは、自然発生的ポリヌクレオチド主鎖（例えば、酵素又は親プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド主鎖）を、例えば既知の突然変異誘発法（例えば、部位特異的突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、及びインビトロ組み換え）によって変化させることによって得ることができる。本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードする本発明の改変されたポリヌクレオチドを生成するのに好適であるものとして様々な方法が当該技術分野において既知であり、例えば、部位飽和突然変異誘発、系統的突然変異誘発、挿入突然変異誘発、欠失突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、部位特異的変突然変異誘発、及び定向進化、並びにその他の各種リコンビナトリアルなアプローチが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１００】
ＩＶ．セリンプロテアーゼを産生するベクター、宿主細胞、及び方法
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む単離若しくは組み換えベクター、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離若しくは組み換え型の発現ベクター又は発現カセット、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋な、又は組み換えＤＮＡ構築物、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む単離又は組み換え型細胞、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡ構築物、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ若しくは混合物を１種以上含む組成物を提供する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む本発明のベクター（例えば、発現ベクター又はＤＮＡ構築物）を少なくとも１つ含む組み換え細胞を提供する。いくつかのこのような組み換え細胞は、このような少なくとも１つのベクターにより形質転換又は形質移入される。このような細胞は、典型的には宿主細胞と呼ばれる。このような細胞の一部のものは、例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）細胞等のバチルス（Bacillus）種の細胞が挙げられるが、これらに限定されない、細菌細胞を含む。本発明は、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む、組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）も提供する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチド配列が、効率的な遺伝子発現に必要とされる１つの又は追加の核酸セグメント（例えば、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドに操作可能に連結されているプロモーター）に操作可能に連結されている、発現ベクター又は発現カセットである。ベクターには、転写ターミネーター及び／又は選択遺伝子を含有させることができ、選択遺伝子は、例えば、抗生物質を含有させた培地で増殖させることによりプラスミド感染させた宿主細胞の持続的な培養を維持することのできる、抗生物質耐性遺伝子等である。
【０１０３】
発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導され得るか、又は代替的な実施形態では、これらの両方の要素を含有する。代表的なベクターとして、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ［１９９０］（Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）に好適な複製プラスミドとしては９２頁に記載されているものが挙げられる）参照、また、Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，［ｅｄｓ．］Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３］，ｐｐ．６１５〜６２４も参照のこと）、及びｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
細胞において、対象とするタンパク質（例えば、セリンプロテアーゼポリペプチド）を発現及び産生させるため、セリンロプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピー、及び場合によっては複数のコピーを含む、少なくとも１種の発現ベクターを、セリンプロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞に形質転換させる。本発明のいくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチド（並びにベクターに含有させるその他の配列）をコードしているポリヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノムに組み込むのに対し、別の実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を含むプラスミドベクターは、細胞内に自律性の染色体外エレメントとしてとどまる。本発明は、染色体外の核酸エレメント、並びに宿主細胞のゲノムに組み込まれる移入ヌクレオチド配列の両方を提供する。本明細書に記載のベクターは、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを産生させるのに有用である。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド構築物は、セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを宿主染色体に組み込みかつ任意選択的に増幅させることのできる、組み込みベクター上に存在する。組み込み部位の例は、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの転写は、選択された前駆体プロテアーゼのための野生型プロモーターにより実施される。他のいくつかの実施形態では、プロモーターは、前駆体プロテアーゼとは異種であるものの、宿主細胞中で機能するものである。具体的には、細菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターの例としては、例えば、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ＳＰＡＣ、ＡｐｒＥ、Ｖｅｇ、ＨｐａＩＩプロモーター、Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）のマルトース生成アミラーゼ遺伝子、Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefaciens）（ＢＡＮ）のアミラーゼ遺伝子、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）のアルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）のアルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．プミルス（B. pumilis）のキシロシダーゼ遺伝子、Ｂ．チューリンギエンシス（B. thuringiensis）のｃｒｙＩＩＩＡ、及びＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。追加のプロモーターとしては、限定するものではないが、Ａ４プロモーター、並びにファージλＰＲ又はＰＬプロモーター、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられる。
【０１０５】
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、細菌及び真菌等の任意の好適な微生物宿主細胞において産生させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、は、グラム陽性細菌において産生させることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、バチルス（Bacillus）種、ストレプトマイセス（Streptomyces）種、エシェリキア（Escherichia）種、アスペルギルス（Aspergillus）種、トリコデルマ（Trichoderma）種、シュードモナス（Pseudomonas）種、コリネバクテリウム（Corynebacterium）種、サッカロマイセス（Saccharomyces）種、又はピチア（Pichia）種である。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、バチルス（Bacillus）種の宿主細胞によって産生される。本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドの産生に有用なバチルス（Bacillus）種宿主細胞の例として、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）、Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ソノレンシス（B. sonorensis）、Ｂ．ブレビス（B. brevis）、Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．シルクランス（B. circulans）、Ｂ．プミルス（B. pumilis）、Ｂ．チューリンギエンシス（B. thuringiensis）、Ｂ．クラウジイ（B. clausii）、及びＢ．メガテリウム（B. megaterium）、並びに、バチルス（Bacillus）属内の他の微生物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドの産生には、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）宿主細胞が使用される。米国特許第５，２６４，３６６号及び同第４，７６０，０２５号（再発行３４，６０６）には、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドの産生に使用できる様々なバチルス（Bacillus）宿主株が記載されているものの、その他の好適な株を使用することもできる。
【０１０６】
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを産生するために使用できるいくつかの工業用細菌株としては、非組み換え（すなわち、野生型）バチルス（Bacillus）種株、並びに、自然発生株の変異体及び／又は組み換え株が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主株は組み換え株であり、宿主には、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている。いくつかの実施形態では、宿主株は、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）宿主株であり、特に組み換えバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）宿主株である。数多くのＢ．ズブチリス（B.subtilis）株が既知であり、限定するものではないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ  ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ  ３９，０８７）、ＡＴＣＣ  ２１３３２、ＡＴＣＣ  ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ  ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ  １１０、及びＰＥＰ  ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７３：２１５〜２２８頁［１９７３年］、また同様に、米国特許第４，４５０，２３５号及び同第４，３０２，５４４号、並びに欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい。これら各公報は参照によりその全文が組み込まれる）。発現宿主細胞としてのＢ．ズブチリス（B. subtilis）の使用は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９：８１〜８７［１９８２］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４［１９８６］及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：３９〜４７［１９８８］参照）。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）宿主細胞は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ、及びｄｅｇＱの遺伝子のうち少なくとも１つに変異又は欠失を含む、バチルス（Bacillus）種である。いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ遺伝子中のものであり、いくつかの実施形態では、変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２中のものである（例えば、Ｍｓａｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４〜８３４［１９９０］及びＯｌｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２〜５６７［１９９７］参照）。いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）宿主は、ｓｃｏＣ４（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９〜７３４０［２００１］参照）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７〜１４１５［１９９９］参照）及び／又は、ｏｐｐＡ若しくはｏｐｐオペロンの他の遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３〜１８５［１９９１］参照）に、変異又は欠失を含む。実際に、ｏｐｐＡ遺伝子の変異と同じ表現型を生じるｏｐｐオペロンにおけるいかなる変異も、本発明の変化させたバチルス（Bacillus）株に関するいくつかの実施形態において有用であろうと想到される。いくつかの実施形態では、これらの変異は単独で生じるが、他の実施形態では複数の変異が組み合わさって存在する。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドの産生に使用できる、変化させたバチルス（Bacillus）宿主細胞株は、上記遺伝子の１種又は２種以上に予め変異を含有しているバチルス（Bacillus）宿主株である。加えて、内因性のプロテアーゼ遺伝子に関する変異及び／又は欠失を含むバチルス（Bacillus）種宿主細胞が有用である。いくつかの実施形態では、バチルス（Bacillus）宿主細胞は、ａｐｒＥ及びｎｐｒＥ遺伝子の欠失を含む。別の実施形態では、バチルス（Bacillus）種宿主細胞は、５種類のプロテアーゼ遺伝子の欠失を含み、一方別の実施形態では、バチルス（Bacillus）種宿主細胞は、９種類のプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号参照）。
【０１０８】
宿主細胞は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法の利用により、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている少なくとも１種の核酸で形質転換される。プラスミドＤＮＡ構築物又はベクターを利用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス（Bacillus）細胞又は大腸菌（E. coli）細胞に導入する方法、及びこのようなプラスミドＤＮＡ構築物又はベクターをそのような細胞に形質転換する方法は既知である。いくつかの実施形態では、プラスミドは、続いて大腸菌（E. coli）細胞から単離され、バチルス（Bacillus）細胞に形質転換される。しかしながら、大腸菌（E. coli）等の介在微生物を用いることは必須ではなく、いくつかの実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは直接バチルス（Bacillus）宿主に導入される。
【０１０９】
当業者は、本発明の核酸又はポリヌクレオチド配列をバチルス（Bacillus）細胞に導入する好適な方法を十分に承知している（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．［ｅｄｓ．］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐｐ．５７〜７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８〜７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５〜１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１〜１３５［１９８６］；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１〜１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１〜２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３〜２１７［１９８１］及びＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３［１９８４］参照）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合（congression）を包含する形質転換、形質導入、及びプロトプラスト融合等の方法は周知であり、本発明でも好適に使用される。本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含むＤＮＡ構築物又はベクターを宿主細胞に導入するために、形質転換法が使用される。バチルス（Bacillus）細胞を形質転換させるのに当該技術分野において既知の方法としては、部分的に相同性の常在性プラスミドを保有しているコンピテントセルにドナープラスミドを取り込ませることを包含するプラスミドマーカーレスキュー形質転換法（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ  ２：５５５〜５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５〜１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７〜１０８７［１９８３］及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５〜１２１１［１９８７］参照）等の方法が挙げられる。この方法では、組み込まれるドナープラスミドは、染色体の形質転換を模倣するプロセスにおいて、常在性の「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組み換えられる。
【０１１０】
共通して使用される方法に加え、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＮＡ構築物、又は本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含むベクターにより、直接形質転換される（すなわち、ＤＮＡ構築物又はベクターを宿主細胞に導入する前の増幅、あるいは別のプロセスに中間体細胞は使用されない）。本発明のＤＮＡ構築物又はベクターの宿主細胞への導入法には、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を、プラスミド又はベクターに挿入することなく、宿主細胞に導入するための、当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法が包含される。このような方法として、塩化カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、ネイキッドＤＮＡ、リポソーム等が挙げられるが、これらに限定されない。更なる実施形態では、ＤＮＡ構築物又はベクターは、プラスミドに挿入されることなく、プラスミドと共に同時形質転換される。更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において既知の方法により、変更を加えたバチルス（Bacillus）株から除去される（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１〜４１８［１９８４］及びＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５〜２６４［２０００］参照）。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明の形質転換細胞は、一般的な栄養培地で培養される。温度及びｐＨ等の好適な具体的な培養条件は当業者に既知であり、科学文献に詳しく記載されている。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチド又は本発明の少なくとも１種の核酸を含む培養（例えば、細胞培養）を提供する。同様に、本発明の核酸、ベクター、又はＤＮＡ構築物を少なくとも１つ含む組成物も提供する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている少なくとも１種のポリヌクレオチド配列により形質転換させた宿主細胞を、好適な栄養培地で、本発明のプロテアーゼを発現させる条件下で培養した後、得られるプロテアーゼを培地から回収する。細胞培養に使用する培地には、宿主細胞を増殖させるのに好適な、適切な添加剤を含有している最少培地又は複合培地等といった任意の一般的な培地を含む。好適な培地は、販売元から入手することができ、又は公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログを参照されたい）。いくつかの実施形態では、細胞により産生されたプロテアーゼは、限定するものではないが、例えば、遠心沈降又は濾過による培養液からの宿主細胞の分離、塩（例えば、硫酸アンモニウム）による上清又は濾液中のタンパク質様成分の沈殿、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティー等）等の従来法により培地から回収される。プロテアーゼ変異体を回収又は精製するための任意の好適な方法が、本発明において有用である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、組み換え宿主細胞により産生されたセリンプロテアーゼポリペプチドは、培養培地に分泌される。精製促進ドメインをコードしている核酸配列を使用して、タンパク質の精製を促進することができる。セリンプロテアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター又はＤＮＡ構築物は、セリンプロテアーゼポリペプチドの精製を促進する精製促進ドメインをコードしている核酸配列を更に含む（例えば、Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜５３［１９９３］参照）。かかる精製促進ドメインとして、例えば、固定化金属での精製が可能なヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレート化ペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１［１９９２］参照）、固定化免疫グロブリンでの精製が可能なプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系で使用されるドメインが挙げられるが、これらに限定されない。精製ドメインと非相同的なタンパク質との間に、凝固因子ＸＡ又はエンテロキナーゼ等の開裂可能なリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な配列）を含めることも、精製を促進するために有用である。
【０１１４】
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチド等の酵素の酵素活性を検出及び測定するためのアッセイは周知である。プロテアーゼ（例えば、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチド）の活性を検出及び測定するための様々なアッセイも、当業者に既知である。特に、当業者に周知であるように、２８０ｎｍでの吸光度として又はフォーリン法を用いる比色法により測定した、カゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくアッセイを、プロテアーゼの活性を測定するのに利用できる。他の例示的なアッセイは、可溶性の発色性基質を包含する（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」，ｉｎ  Ｆｏｇａｒｔｙ（ｅｄ．）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］，ｐｐ．２５１〜３１７参照）。他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当業者に既知の多くの更なる文献は、好適な方法を提供している（例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９〜１２９［１９９４］及びＨｓｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１〜２２７［１９９９］参照）。
【０１１５】
様々な方法を使用して、宿主細胞における成熟型プロテアーゼ（例えば、本発明の成熟型セリンプロテアーゼポリペプチド）の産生レベルを評価することができる。このような方法としては、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを利用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定するものではないが、例えば、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらの及びその他のアッセイは、当該技術分野で既知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］参照）。
【０１１６】
いくつかのその他の実施形態では、本発明は、本発明の成熟型セリンプロテアーゼポリペプチドを作製又は産生するための方法を提供する。成熟型セリンプロテアーゼポリペプチドは、シグナルペプチド又はプロペプチド配列を含有しない。いくつかの方法は、例えば、バチルス（Bacillus）種細胞（例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）細胞）等の組み換え細菌宿主細胞において本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを作製又は産生することを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含む組み換え発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を、セリンプロテアーゼポリペプチドの産生を誘導する条件下で培養することを含む。いくつかのこのような方法は、培養物からセリンプロテアーゼポリペプチドを回収することを更に含む。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、（ａ）本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている核酸を含む組み換え発現ベクターを細胞集団（例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）細胞等の細菌細胞）に導入することと；（ｂ）この細胞を、発現ベクターによりコードされているセリンプロテアーゼポリペプチドの産生を実施する条件下で、培養培地で培養することと、を含む。いくつかのこのような方法は、（ｃ）細胞又は培養培地からセリンプロテアーゼポリペプチドを単離することを更に含む。
【０１１８】
Ｖ．セリンプロテアーゼを含む組成物
Ａ．布地ケア及びホームケア製品
特に断りのない限り、本明細書に提供される成分又は組成物のレベルは全て、成分又は組成物の活性レベルに関するものであり、市販の供給源に存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は除外される。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。百分率（％）及び比率は全て、特に断りのない限り、重量で計算している。全ての百分率（％）及び比率は、特に断りのない限り、総組成物に対し計算している。本発明の組成物は、クリーニング組成物、例えば、洗剤組成物等を包含する。例示された洗剤組成物において、酵素レベルは、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に断りのない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表記される。
【０１１９】
本発明の目的には必須でないが、以下に例示される助剤の非限定的な一覧は、本発明のクリーニング組成物での使用に好適である。いくつかの実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニング性能を補助又は強化させるために、クリーニングされる基材を処理するために、あるいは香料、着色剤、又は染料等の場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドにこのような助剤が加えられることは理解されたい。このような追加成分の正確な性質及びその添加レベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が使用されるクリーニング操作の性質によって決まる。好適な助剤として、漂白触媒、その他の酵素、酵素安定系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、染料移行剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、塩充填剤、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、縮み防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、カラースペックル、シルバーケア、黄ばみ防止及び／又は腐食防止剤、アルカリ源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調節剤、界面活性剤、ビルダー、キレート化剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、ポリマー分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は顔料が挙げられるが、これらに限定されない。以下の開示に加え、このような他の助剤の好適な例、及び使用量は、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、同第６，３２６，３４８号、同第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号（これら全ては参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。洗濯組成物中で、クリーニング助剤が本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドと適合するものでない実施形態では、これら２種の構成成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを別々に保管する（すなわち、互いに接触させない）好適な方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離等）。上述の補助成分は、本発明のクリーニング組成物の残部を構成し得る。
【０１２０】
本発明のクリーニング組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面のクリーニング用途、自動食器洗い及び食器の手洗いを含む食器洗浄用途、並びに義歯、歯、毛髪及び肌のクリーニング等の美容用途において、有利に利用される。本発明の酵素は、コンタクトレンズ洗浄用途及び創傷清拭用途での使用にも適している。加えて、低温の溶液中で有効性作用が増大するという独特の利点により、本発明の酵素は洗濯用途に理想的なものである。更に本発明の酵素は、粒状及び液体組成物において有用である。
【０１２１】
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、クリーニング添加剤製品においても有用である。いくつかの実施形態では、低温溶液を用いるクリーニング用途において有用である。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の酵素を少なくとも１種含むクリーニング添加剤を提供し、当該クリーニング添加剤は、更に漂白効果が所望される場合に、クリーニングプロセスに含めるために理想的に適している。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液を用いるクリーニング用途が挙げられる。いくつかの実施形態では、添加剤は最も単純な形態の１種以上のプロテアーゼである。いくつかの実施形態では、添加剤は、クリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、添加剤は、過酸化物供給源が用いられかつ漂白効果の増加が所望されるクリーニングプロセスに添加される剤形にパッケージングされる。限定するものではないが、例えば、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体等の他の一回用量単位が挙げられる、任意の好適な一回用量単位が、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、このような組成物を増量するために充填剤又はキャリア材料を含める。好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及びクレイ等が挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオール等の低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、組成物は、このような材料を約５％〜約９０％含有する。酸性充填剤はｐＨを低下させるために有用である。あるいは、いくつかの実施形態では、クリーニング添加剤として、以下により詳細に記載されるような補助成分が挙げられる。
【０１２２】
本発明のクリーニング組成物及びクリーニング添加剤は、単独で又はその他のプロテアーゼ及び／又は追加の酵素と組み合わせて本明細書で提供される、有効量の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを必要とする。必要とされる酵素レベルは、１種以上の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを添加することにより達成される。典型的には、本発明のクリーニング組成物は、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドのうち少なくとも１種を、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、又は約０．０１〜約０．１重量％含む。
【０１２３】
本明細書に記載のクリーニング組成物は、典型的には、水性クリーニング操作において使用している間、洗浄水が約４．０〜約１１．５、又は更には約５．０〜約１１．５、又は更には約５．０〜約８．０、又は更には約７．５〜約１０．５のｐＨを有するよう配合される。液体製品の処方は、典型的には、ｐＨが約３．０〜約９．０、又は更には約３〜約５になるよう配合される。粒状洗濯製品は、典型的にはｐＨが約９〜約１１になるよう配合される。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、ｐＨ約８．０〜約１２．０、又は約８．５〜約１１．０、又は約９．０〜約１１．０等の洗浄条件下でアルカリｐＨを有するよう処方できる。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、ｐＨ約５．０〜約８．０、又は約５．５〜約８．０、又は約６．０〜約８．０、又は約６．０〜約７．５等の洗浄条件下で、中性のｐＨを有するよう処方できる。いくつかの実施形態では、中性のｐＨ条件は、２０℃にてクリーニング組成物を脱イオン水に１：１００（重量：重量）で溶解させて、標準的なｐＨメーターを利用して測定することで測定できる。推奨される使用レベルでｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸等の使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドを粒状組成物又は液体中で使用するとき、保管中にセリンプロテアーゼポリペプチドを粒状組成物以外の成分から保護するため、セリンプロテアーゼポリペプチドがカプセル化された粒子の形態であることが望ましい。更に、カプセル化は、クリーニングプロセス中のセリンプロテアーゼポリペプチドの利用能を調節する手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル化は、セリンプロテアーゼポリペプチド及び／又は追加の酵素の性能を増強する。これに関し、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、当該技術分野において既知の任意の好適なカプセル材でカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル材は、典型的には、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドの少なくとも一部をカプセル化する。典型的には、カプセル材は、水溶性及び／又は水分散性である。一部の実施形態では、封入剤のガラス転移温度（Ｔｇ）は０℃以上である。ガラス転移温度は、ＷＯ  ９７／１１１５１号により詳細に記載されている。カプセル材は、典型的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される。カプセル材が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。一部の典型的な実施形態では、カプセル材はデンプンである（例えば、欧州特許第０  ９２２  ４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、カプセル材は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物等のプラスチックから製造されるマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとしては、限定するものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）、並びにＰＭ  ６５４５、ＰＭ  ６５５０、ＰＭ  ７２２０、ＰＭ  ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ  Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）として供給されるものが挙げられる。
【０１２５】
本明細書に記載のように、本発明のプロテアーゼ変異体は、限定するものではないが、洗濯用洗剤及び食器用洗剤等のクリーニング産業において特に有用である。これらの用途では、酵素を様々な環境ストレス下に置く。本発明のプロテアーゼ変異体は、様々な条件下で安定であることから、現在使用されている多数の酵素よりも有利である。
【０１２６】
実際に、多様な洗剤の配合、多様なクリーニング水の容量、多様なクリーニング水の温度、及び多様なクリーニング時間の長さを含む各種クリーニング条件が存在し、クリーニングに関与するプロテアーゼはこれらの条件に晒される。加えて、異なる地域で使用される洗剤配合物では、クリーニング水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分をクリーニング水中に有するが、日本の洗剤は一般的には６６７ｐｐｍの洗剤成分をクリーニング水に有する。北アメリカ、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分をクリーニング水中に有する。
【０１２７】
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分がクリーニング水に存在する洗剤が包含される。日本の洗剤は、クリーニング水中におよそ６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に低濃度洗剤系とみなされる。
【０１２８】
中間濃度の洗剤には、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分がクリーニング水中に存在する洗剤が包含される。北アメリカの洗剤は、洗浄水中におよそ９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に中間濃度の洗剤系であるとみなされる。ブラジルでは、典型的にクリーニング水中におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
【０１２９】
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在している洗剤が包含される。欧州の洗剤は、クリーニング水中におよそ４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、一般に高濃度洗剤系であるとみなされる。
【０１３０】
ラテンアメリカの洗剤は、概して高起泡性のリン酸塩ビルダー洗剤であり、クリーニング水中に１５００〜６０００ｐｐｍの範囲の洗剤成分が存在していることから、ラテンアメリカで使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に包含される。上記のように、ブラジルでは、クリーニング水中に典型的におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、例えば、他のラテンアメリカの国々に限定されないが、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、クリーニング水中に、洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
【０１３１】
前述の内容を考慮すると、世界中の典型的な洗浄液中の洗剤組成物の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「低濃度洗剤地域」）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍのものから、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「中間濃度の洗剤地域」）、例えば、米国の約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍのもの、そして約２０００ｐｐｍ超の洗剤組成物（「高濃度洗剤地域」）、例えば、欧州の約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍのもの、及び高起泡性リン酸ビルダーの地域では約６０００ｐｐｍのものまで様々であることが明白である。
【０１３２】
典型的な洗浄液の濃度は経験的に決定される。例えば、米国では、典型的な洗濯機の洗浄液容量は約６４．４Ｌである。したがって、クリーニング溶液中に約９７５ｐｐｍの洗剤濃度を得るためには、６４．４Ｌのクリーニング液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者が、洗剤に付属された計量カップを用いてクリーニング水に量り入れる典型的な量である。
【０１３３】
更なる例として、異なる地域では異なるクリーニング温度が使用される。日本で使用されているクリーニング水の温度は、一般的に、欧州で使用される温度よりも低い。例えば、北アメリカ及び日本での洗浄水の温度は、典型的には約１０℃〜約３０℃（例えば、約２０℃）の間である一方、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約３０℃〜約６０℃（例えば、約４０℃）である。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水洗浄の使用に切り替えている。加えて、いくつかの更なる地域では、典型的に洗濯だけでなく食器洗浄用途にも冷水が使用されている。いくつかの実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃の洗浄温度、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内の他の全ての組み合わせの洗浄温度、及び１０℃〜４０℃の範囲に含まれる全範囲の温度において、洗浄に好適な「冷水洗剤」を使用するものである。
【０１３４】
更なる例として、異なる地域では、典型的に、異なる硬度の水が用いられている。水の硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋合計のグレイン／ガロン単位で記述される。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬度の程度は様々である。中硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、６０〜１８１ｐｐｍ（ｐｐｍをグレイン／ＵＳガロン単位に変換する場合、ｐｐｍ数を１７．１で除したものがグレイン／ガロンに相当する）の鉱物を含有する。
【０１３５】
【表１】
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【０１３６】
欧州の水硬度は、典型的には、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を組み合わせて、約０．１８０（例えば、約０．１８０〜約０．３４２）グレイン／リットル（約１０．５（例えば、約１０．５〜約２０．０）グレイン／ガロン）を超える（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を組み合わせて約０．２６グレイン／リットル（約１５グレイン／ガロン））。北アメリカの水硬度は、一般的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度より低い。例えば、北米の水硬度は、約０．０５〜約０．１８グラム（約３〜約１０グレイン）、約０．０５〜約０．１４グラム（約３〜約８グレイン）、又は約０．１グラム（約６グレイン）であり得る。日本の水硬度は、典型的には、北米の水硬度よりも低く、通常約０．０７グラム／リットル（約４グレイン／ガロン）未満であり、例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を組み合わせて約０．０５グラム／リットル（３グレイン／ガロン）である。
【０１３７】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示すセリンプロテアーゼポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、その他のセリンプロテアーゼポリペプチドプロテアーゼに対し、洗浄性能において適合する。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書において提供するセリンプロテアーゼポリペプチドは、増強された酸化安定性、増強された熱安定性、様々な条件下で増強されたクリーニング能力、及び／又は増強されたキレート安定性を示す。更に、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、洗剤を含有しないクリーニング組成物への、単独使用、又はビルダー及び安定剤と組み合わせての使用が見いだされる。
【０１３８】
本発明のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルで本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドと、組成物の重量をもとに、クリーニング助剤を含む残部（例えば、約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）と、を含む。本発明のいくつかのその他の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％のレベルの少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドと、クリーニング助剤を含むクリーニング組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）とを含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、クリーニング性能及び／又は布地ケア及び／又は食器洗浄効果を提供する追加の洗剤用酵素を１種以上含む。
【０１４０】
好適な酵素の例として、追加のセリンプロテアーゼ、アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、クチナーゼ、エンド−β−１，４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ−マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、メタロプロテアーゼ、非セリンプロテアーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルヒドロダーゼ、フェノールオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、レダクターゼ、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチル−エステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、又は任意の組み合わせ、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／又はセルラーゼ等の一般的に適用可能な酵素をプロテアーゼと共に含む酵素混合物（すなわち、「カクテル」）が使用される。
【０１４１】
本発明の組成物には、本明細書で提供されるセリンプロテアーゼポリペプチドに加え、任意のその他の好適なプロテアーゼの使用が見いだされる。好適なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、微生物由来のプロテアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性の微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリプロテアーゼの例として、サブチリシン、バチルス（Bacillus）由来のものが挙げられる（例えば、サブチリシン、レンタス（lentus）、アミロリケファシェンス（amyloliquefaciens）、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８）。更なる例として、米国特許第ＲＥ  ３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８（これら全ては参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている変異体プロテアーゼが挙げられる。追加のプロテアーゼ例として、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及び国際公開第８９／０６２７０号に記載のフサリウム（Fusarium）プロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明において有用な市販のプロテアーゼ酵素として、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１００、Ｐ１１０、Ｐ２８０）、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００、Ｐ１０５０、Ｐ２０００）、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（商標）プロテアーゼ（例えば、Ｐ１０００）、ＵＬＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ａｕｆ  Ａｋｔｉｅｎ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、並びに、ＫＡＰ（Ｂ．アルカロフィラス（B. alkalophilus）サブチリシン；Ｋａｏ  Ｃｏｒｐ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。様々なプロテアーゼは、国際公開第９５／２３２２１号、同第９２／２１７６０号、同第０９／１４９２００号、同第０９／１４９１４４号、同第０９／１４９１４５号、同第１１／０７２０９９号、同第１０／０５６６４０号、同第１０��０５６６５３号、同第１１／１４０３６４号、同第１２／１５１５３４、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号、及び、米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、同第ＲＥ３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、同第６，４８２，６２８号、同第８，５３０，２１９号、並びに様々なその他特許に記載されている。いくつかの更なる実施形態では、国際公開第１９９９０１４３４１号、同第１９９９０３３９６０号、同第１９９９０１４３４２号、同第１９９９０３４００３号、同第２００７０４４９９３号、同第２００９０５８３０３号、同第２００９０５８６６１号、同第２０１４１９４０３２号、同第２０１４１９４０３４号、及び同第２０１４１９４０５４号に記載されているメタロプロテアーゼが挙げられるが、これらに限定されない、メタロプロテアーゼが本発明で有用である。代表的なメタロプロテアーゼとして、ｎｐｒＥ（Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）で発現する中性メタロプロテアーゼの組み換え型（例えば、国際公開第０７／０４４９９３号参照））、及びＰＭＮ（Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefacients）由来の精製中性メタロプロテアーゼ）が挙げられる。
【０１４２】
加えて、任意の好適なリパーゼが本発明において有用である。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体は本発明に包含される。有用なリパーゼの例として、フミコーラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（例えば、欧州特許第２５８  ０６８号、及び同第３０５  ２１６号参照）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（例えば、欧州特許第２３８  ０２３号参照）、カンジダ（Candida）リパーゼ、例えば、Ｃ．アンタルチカ（C. antarctica）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタルチカ（C. antarctica）リパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４  ７６１号参照）、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）リパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）リパーゼ（例えば、欧州特許第２１８  ２７２号参照）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）リパーゼ（例えば、欧州特許第３３１  ３７６号参照）、Ｐ．スタットゼリ（P. stutzeri）リパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号参照）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescens）リパーゼ、Ｂ．リパーゼ（例えば、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）リパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：２５３〜２６０［１９９３］）；Ｂ．ステロサーモフィラス（B. stearothermophilus）リパーゼ［例えば、ＪＰ６４／７４４９９２号参照］；及びＢ．プミルス（B. pumilus）リパーゼ［例えば、国際公開第９１／１６４２２号参照］）が挙げられる。
【０１４３】
更に、本発明のいくつかの実施形態には、ペニシリウム・カマンベルティ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０３：６１〜６７［１９９１］参照）、ゲオトリクム・カンジドウム（Geotricum candidum）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８［１９８９］参照）、及び様々なリゾプス（Rhizopus）リパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（R. delemar）リパーゼ（Ｈａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０９：１１７〜１１３［１９９１］参照）、Ｒ．ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９［１９９２］）、及びＲ．オリゼ（R. oryzae）リパーゼが挙げられるが、これらに限定されない、数多くのクローン化されたリパーゼの使用が見いだされる。
【０１４４】
本発明のいくつかの実施形態では、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号参照）、及びフザリウム・ソラニ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（同９０／０９４４６号参照）が挙げられるがこれらに限定されないクチナーゼ等の、他の種類のリパーゼポリペプチド酵素も使用が見いだされる。
【０１４５】
その他の好適なリパーゼとしては、Ｍ１  ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ  ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ  Ｐ（商標）「Ａｍａｎｏ」（Ａｍａｎｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（Ｊａｐａｎ））等のリパーゼが挙げられる。
【０１４６】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のリパーゼのレベルのリパーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にリパーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％リパーゼのレベルで含む。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態では、任意の好適なアミラーゼが、本発明において有用である。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液に使用するのに好適である任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、細菌由来のもの又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明において有用なアミラーゼとしては、限定するものではないが、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）から得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号参照）。追加の好適なアミラーゼとして、国際公開第９５１０６０３号、同第９５２６３９７号、同第９６２３８７４号、同第９６２３８７３号、同第９７４１２１３号、同第９９１９４６７号、同第００６００６０号、同第００２９５６０号、同第９９２３２１１号、同第９９４６３９９号、同第００６００５８号、同第００６００５９号、同第９９４２５６７号、同第０１１４５３２号、同第０２０９２７９７号、同第０１６６７１２号、同第０１８８１０７号、同第０１９６５３７号、同第０２１０３５５号、同第９４０２５９７号、同第０２３１１２４号、同第９９４３７９３号、同第９９４３７９４号、同第２００４１１３５５１号、同第２００５００１０６４号、同第２００５００３３１１号、同第０１６４８５２号、同第２００６０６３５９４号、同第２００６０６６５９４号、同第２００６０６６５９６号、同第２００６０１２８９９号、同第２００８０９２９１９号、同第２００８０００８２５号、同第２００５０１８３３６号、同第２００５０６６３３８号、同第２００９１４０５０４号、同第２００５０１９４４３号、同第２０１００９１２２１号、同第２０１００８８４４７号、同第０１３４７８４号、同第２００６０１２９０２号、同第２００６０３１５５４号、同第２００６１３６１６１号、同第２００８１０１８９４号、同第２０１００５９４１３号、同第２０１１０９８５３１号、同第２０１１０８０３５２号、同第２０１１０８０３５３号、同第２０１１０８０３５４号、同第２０１１０８２４２５号、同第２０１１０８２４２９号、同第２０１１０７６１２３号、同第２０１１０８７８３６号、同第２０１１０７６８９７号、同第９４１８３３１４号、同第９５３５３８２号、同第９９０９１８３号、同第９８２６０７８号、同第９９０２７０２号、同第９７４３４２４号、同第９９２９８７６号、同第９１００３５３号、同第９６０５２９５号、同第９６３０４８１号、同第９７１０３４２号、同第２００８０８８４９３号、同第２００９１４９４１９号、同第２００９０６１３８１号、同第２００９１００１０２号、同第２０１０１０４６７５号、同第２０１０１１７５１１号、及び同第２０１０１１５０２１号に見られるものが挙げられる。本発明において有用な市販のアミラーゼとしては、限定するものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ  ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（���標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
【０１４８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％の追加のアミラーゼのレベルのアミラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。同様に、本発明の一部の他の実施例では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にアミラーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％アミラーゼのレベルで含む。
【０１４９】
いくつかの更なる実施形態では、任意の好適なセルラーゼが、本発明のクリーニング組成物において有用である。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。好適なセルラーゼとして、フミコーラ・インコレンス（Humicola insolens）セルラーゼ（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。特に好適なセルラーゼは、色ケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許第０  ４９５  ２５７号を参照されたい）。本発明において有用である市販のセルラーゼとして、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＲＥＶＩＴＡＬＥＮＺ（商標）１００（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ）及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（Ｋａｏ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、Ｎ−末端部分が欠失している成熟野生型又は変異体セルラーゼの部分又はフラグメントとして組み込まれる（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号参照）。追加の好適なセルラーゼとして、国際公開第２００５０５４４７５号、同第２００５０５６７８７、米国特許第７，４４９，３１８号、及び同第７，８３３，７７３号に見いだされるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づき約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルの追加のセルラーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にセルラーゼを、組成物の重量に基づいて約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％のレベルで含む。
【０１５０】
洗剤組成物で使用するのに好適な任意のマンナナーゼも同様に本発明において有用である。好適なマンナナーゼとしては、限定するものではないが、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。本発明で有用な様々なマンナナーゼが既知である（これらの全てが参照することにより本明細書に組み込まれる、例えば、米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号、及び同第６，４４０，９９１号参照）。本発明において使用が見いだされる市販のマンナナーゼの例としては、ＭＡＮＮＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＰＵＲＡＢＲＩＴＥ（商標）、ＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルの追加のマンナナーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％レベルでマンナナーゼを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ペルオキシダーゼは過酸化水素又は過酸化水素供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）と組み合わせて本発明の組成物に使用される。いくつかの代替的な実施形態では、オキシダーゼは酸素と組み合わせて使用される。いずれのタイプの酵素も「溶液を漂白する」（すなわち、布地を一緒にクリーニング液でクリーニングする場合に、繊維製品の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号及び同第９５／０１４２６号を参照されたい）。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施例では、化学物質により改変された又は遺伝子改変された変異体が包含される。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の重量に基づいて約０．００００１重量％〜約１０重量％のレベルの追加のペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼと、組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤と、を更に含む。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はまた、更にペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼを、組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％ペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼのレベルで含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、有用な追加の酵素として、ペルヒドロダーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、国際公開第２００５０５６７８２号、同第２００７１０６２９３号、同第２００８０６３４００号、同第２００８１０６２１４号、及び同第２００８１０６２１５号参照）。加えて、いくつかの実施形態では、上述の酵素の混合物、特に、１種以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種のセルラーゼ等の酵素の混合物が、本明細書に包含される。実際に、これらの酵素の多様な混合物が本発明において有用であることは想到される。様々なレベルのセリンプロテアーゼポリペプチドと、１種以上の追加の酵素を、いずれも独立して、約１０％の範囲までとし、クリーニング組成物の残部をクリーニング助剤としてもよいことも想到される。具体的なクリーニング助剤の選別は、クリーニングされる表面、物品、又は布地、並びに使用時（例えば、洗剤を用いた洗浄中）のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することで容易になされる。
【０１５３】
好適なクリーニング助剤の例として、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、その他の酵素、酵素安定系、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、染料移行剤、移染防止剤、触媒材料、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、ポリマー分散剤、泥汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、塩充填剤、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、顔料、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、縮み防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、カラースペックル、シルバーケア、黄ばみ防止及び／又は腐食防止剤、アルカリ源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調節剤が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号参照）。具体的なクリーニング組成物材料の実施形態を以下に詳細に例示する。クリーニング助剤が、クリーニング組成物中で本発明のプロテアーゼ変異体と適合性でない実施形態では、２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを分離した（すなわち、互いに接触させない）ままにしておくという好ましい手段が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離等）。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される有効量の１種以上のセリンプロテアーゼポリペプチドを、タンパク質性の染みを除去する必要のある様々な表面をクリーニングするのに有用な組成物に含有させる。このようなクリーニング組成物としては、硬質表面、布地、及び皿のクリーニング等の用途向けのクリーニング組成物が挙げられる。実際に、いくつかの実施形態では、本発明は布地クリーニング組成物を提供するが、他の実施形態では、本発明は非布地用クリーニング組成物を提供する。特に、本発明は、口腔ケア組成物（歯磨剤、歯磨き粉、マウスウォッシュ等、並びに義歯クリーニング用組成物を包含する）、皮膚クリーニング組成物及び毛髪クリーニング組成物等のパーソナルケアに好適なクリーニング組成物も提供する。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、粒状、バー状、半固形、ゲル、乳濁液、錠剤、カプセル剤等）の洗剤組成物を包含することを意図する。
【０１５５】
例として、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドの使用が見いだされる複数種のクリーニング組成物を以下に詳細に記載する。本発明のクリーニング組成物が、洗濯機を用いる洗浄方法で使用するのに好適な組成物として配合されるいくつかの実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、少なくとも１種のビルダー化合物と、並びに好ましくは、有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸カス分散剤、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、及び防食剤から選択される１種以上のクリーニング助剤と、を含有する。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も含有する（すなわち、追加のクリーニング助剤として）。本発明の組成物は、固体又は液体形態の洗剤添加剤への使用も見いだされる。このような添加剤は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加できる。いくつかの実施形態では、２０℃で測定した場合、本明細書の洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／リットルの範囲であり、一方別の実施形態では約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
【０１５６】
食器手洗い方式で使用する組成物として配合される実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、好ましくは有機高分子化合物、起泡剤、第２族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び追加の酵素から選択される少なくとも１種の追加のクリーニング助剤と、を含有する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるような様々なクリーニング組成物は、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドと共に使用される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、コンパクトな粒状布地クリーニング組成物である一方、別の実施形態では、組成物は、着色された布地を洗濯するのに有用な粒状布地洗浄組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、洗浄能を通して柔軟効果を提供する粒状布地クリーニング組成物であり、追加の実施形態では、組成物は、強力液体布地クリーニング組成物である。いくつかの実施形態では、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載のもの等の布地クリーニング組成物である。加えて、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、欧州又は日本の洗浄条件（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号参照）下で特に有用である粒状洗濯洗剤組成物への使用が見いだされる。
【０１５８】
いくつかの代替的な実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む硬質表面クリーニング組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に記載されるもの等の硬質表面クリーニング組成物である。
【０１５９】
なお更なる実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む食器洗浄用組成物を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号のもの等の硬質表面クリーニング組成物である。いくつかのなお更なる実施形態では、本発明は、本明細書で提供される少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む食器洗浄用組成物を提供する。いくつかの更なる実施形態では、少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に記載のもの等の口腔ケア組成物を含む。上記米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に含まれる化合物及びクリーニング助剤の処方及び説明が、本明細書に提供されるセリンプロテアーゼポリペプチドと共に使用される。
【０１６０】
本発明のクリーニング組成物は、配合者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形態に処方され、かつ調製される（例えば、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号参照）。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される場合、かかる組成物のｐＨは、モノエタノールアミン又は酸性材料（例えば、ＨＣｌ）等の追加の材料により調整される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、本発明によるクリーニング組成物は、酸性化粒子又はアミノカルボン酸ビルダーを含む。アミノカルボン酸ビルダーの例としては、アミノカルボン酸、それらの塩及び誘導体が挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、アミノポリカルボン酸ビルダー、例えば、グリシン−Ｎ，Ｎ−二酢酸又は一般式ＭＯＯＣ−ＣＨＲ−Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＭ）２（式中、ＲはＣ１〜１２アルキルであり、Ｍはアルカリ金属である）の誘導体である。いくつかの実施形態では、アミノカルボン酸ビルダーは、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ＧＬＤＡ（グルタミン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）、イミノ二コハク酸（ＩＤＳ）、カルボキシメチルイヌリンイヌリン及びそれらの塩及び誘導体、アスパラギン酸−Ｎ−一酢酸（ＡＳＭＡ）、アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＳＤＡ）、アスパラギン酸−Ｎ−一プロピオン酸（ＡＳＭＰ）、イミノ二コハク酸（ＩＤＡ）、Ｎ−（２−スルホメチル）アスパラギン酸（ＳＭＡＳ）、Ｎ−（２−スルホエチル）アスパラギン酸（ＳＥＡＳ）、Ｎ−（２−スルホメチル）グルタミン酸（ＳＭＧＬ）、Ｎ−（２−スルホエチル）グルタミン酸（ＳＥＧＬ）、ＩＤＳ（イミノ二酢酸）及びそれらの塩及び誘導体、例えば、Ｎ−メチルイミノ二酢酸（ＭＩＤＡ）、α−アラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（α−ＡＬＤＡ）、セリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＥＤＡ）、イソセリン−Ｎ，Ｎ二酢酸（ＩＳＤＡ）、フェニルアラニン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＰＨＤＡ）、アントラニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＮＤＡ）、スルファニル酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＬＤＡ）、タウリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＴＵＤＡ）及びスルホメチル−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＳＭＤＡ）及びこれらのアルカリ金属塩及び誘導体とすることができる。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、約４００μ〜約１２００μの加重幾何平均粒径と、少なくとも５５０ｇ／Ｌのかさ密度を有する。いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、少なくとも約５％のビルダーを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、酸性化粒子は、有機酸及び鉱酸等の任意の酸を含み得る。有機酸は、１種又は２種のカルボキシル部分を有し得るものであり、いくつかの例では、最大１５個、特に最大１０個の炭素を有することができ、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、カプリン酸、シュウ酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸、セバシン酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、酒石酸、及びグリオキシル酸等である。いくつかの実施形態では、酸はクエン酸である。鉱酸としては、塩酸及び硫酸が挙げられる。いくつかの例では、本発明の酸性化粒子は、アミノカルボン酸ビルダーを高レベルで含む高活性の粒子である。硫酸は、最終的な粒子の安定性に更に貢献することも判明している。
【０１６３】
本発明の目的には必須でないが、以下に例示される助剤の非限定的な一覧は、本発明のクリーニング組成物での使用に好適である。いくつかの実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニング性能を補助又は強化させるために、クリーニングされる基材を処理するために、あるいは香料、着色剤、又は染料等の場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。これらの助剤が本発明のプロテアーゼ変異体に添加されることは理解されたい。このような追加成分の正確な性質及びその添加レベルは、組成物の物理的形態、及び組成物が使用されるクリーニング操作の性質によって決まる。好適な補助剤としては、限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着助剤、分散剤、追加の酵素、及び酵素安定化剤、触媒材料、漂白活性化剤、漂白増進剤、過酸化水素、過酸化水素供給源、予形成された過酸、高分子分散剤、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤及び／又は色素が挙げられる。以下の開示に加え、このような他の補助剤の好適な例及び使用レベルは、米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に記載されており、これら公報は参照により組み込まれる。上述の補助成分は、本発明のクリーニング組成物の残部を構成し得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明に従うクリーニング組成物は、少なくとも１種の界面活性剤及び／又は界面活性剤系を含み、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択される。いくつかの低ｐＨクリーニング組成物の実施形態（例えば、原液のｐＨが約３〜約５の組成物）では、界面活性剤がこのような組成物により加水分解される恐れがあると考えられることから、典型的には当該組成物はエトキシル化アルキル硫酸塩を含まない。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、クリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約６０重量％のレベルで存在する一方、代替的な実施形態では約１重量％〜約５０重量％のレベルで、あるいは更に他の実施形態では約５重量％〜約４０重量％のレベルで存在する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の洗剤ビルダー又はビルダー系を含む。少なくとも１種のビルダーを組み込むいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、クリーニング組成物の重量に基づいて、少なくとも約１重量％、約３重量％〜約６０重量％、又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、限定するものではないが、例えば、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、ケイ酸アルカリ金属塩、炭酸のアルカリ土類金属塩及びアルカリ金属塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボン酸塩化合物、エーテルヒドロキシポリカルボン酸塩、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、及びカルボキシメチルオキシコハク酸、ポリ酢酸の様々なアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩（例えば、エチレンジアミン四酢酸及びニトリロ三酢酸）、並びにメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、及びこれらの可溶性塩等のポリカルボン酸類が挙げられる。実際に、本発明の様々な実施形態では任意の好適なビルダーが有用であることが想到される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ビルダーは水溶性の硬度イオン錯体（例えば、金属イオン封鎖ビルダー）、例えば、クエン酸塩及びポリリン酸塩等（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、並びにトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物等）を形成する。当該技術分野において既知のものが挙げられる（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号参照）、任意の好適なビルダーが、本発明において有用であることが想到される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるビルダーは、リン酸塩ビルダー及び非リン酸塩ビルダーを包含する。いくつかの実施形態では、ビルダーはリン酸塩ビルダーである。いくつかの実施形態では、ビルダーは非リン酸塩ビルダーである。存在させる場合、ビルダーは、組成物の０．１重量％〜８０重量％、又は５〜６０重量％、又は１０〜５０重量％のレベルで使用する。いくつかの実施形態では、製品は、リン酸塩及び非リン酸塩ビルダーの混合物を含む。好適なリン酸塩ビルダーとしては、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩又はオリゴマー程度のポリリン酸塩が挙げられ、これらの化合物のアルカリ金属塩が包含され、ナトリウム塩が包含される。いくつかの実施形態では、ビルダーは、三リン酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）とすることができる。更に、組成物には、カルボン酸塩及び／又はクエン酸塩を含ませることができる。好ましくは、クエン酸は本発明のｐＨ組成物を達成するよう機能する。その他の好適な非リン酸塩ビルダーとしては、ポリカルボン酸及びそれらの部分的に又は完全に中和された塩、ポリカルボン酸及びヒドロキシカルボン酸及びそれらの塩のホモポリマー及びコポリマーが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記の化合物の塩としては、アンモニウム及び／又はアルカリ金属塩、すなわち、リチウム、ナトリウム、及びカリウム塩、ナトリウム塩が挙げられる。好適なポリカルボン酸としては、非環式、脂環式、複素環式及び芳香族カルボン酸が挙げられ、いくつかの実施形態では、それらのポリカルボン酸は、いずれの場合にも互いに別々のものであり、炭素原子２個以下の少なくとも２つのカルボキシル基を含有する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は少なくとも１種のキレート剤を含有する。好適なキレート剤としては、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤及びこれらの混合物が挙げられるがこれらに限定されない。少なくとも１種のキレート剤を使用する実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、対象とするクリーニング組成物の重量に基づいて、約０．１重量％〜約１５重量％又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
【０１６９】
いくつかの更なる実施形態では、本明細書で提供されるクリーニング組成物は、少なくとも１種の付着助剤を含有する。好適な付着助剤としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボン酸塩、ポリテレフタル酸等の汚れ剥離ポリマー、カオリナイト等のクレイ、モンモリロナイト、アタパルジャイト（atapulgite）、イライト、ベントナイト、ハロイサイト、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１７０】
本明細書に記載されるように、再付着防止剤は、本発明の一部の実施形態において有用である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は有用である。例えば、自動食器クリーニング機の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、表面改質の目的で、特にシーチングのために、フィルミングとスポッティングを防止するため、及び光沢を改善するために有用である。これらの非イオンの界面活性剤は、また、汚れの再付着の防止にも有用である。いくつかの実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野において既知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号）。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、エトキシル化非イオン性界面活性剤、エポキシ保護ポリ（オキシアルキル化）アルコール及びアミンオキシド系界面活性剤とすることができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の移染防止剤を包含する。好適なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン、及びポリビニルイミダゾール、又はこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種の移染防止剤が使用される実施形態では、本発明のクリーニング組成物において、クリーニング組成物の重量に基づき約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を構成する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ケイ酸塩が本発明の組成物に含まれる。このようないくつかの実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶質フィロケイ酸塩）は有用である。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％のレベルで存在する。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は組成物の約５重量％〜約１５重量％のレベルで存在する。
【０１７３】
いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は分散剤も含有する。好適な水溶性有機材料には、ホモポリマー型若しくはコポリマー型の酸又はそれらの塩が挙げられるが、これらに限定されず、このうち、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以内の程度で互いに離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
【０１７４】
いくつかの更なる実施形態では、クリーニング組成物に使用される酵素は任意の好適な技術により安定化されている。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性供給源を存在させて、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを酵素に供給することで安定化する。いくつかの実施形態では、酵素安定剤としては、オリゴ糖、多糖、及びアルカリ土類金属塩等の無機二価金属塩、例えば、ギ酸カルシウム等のカルシウム塩が挙げられる。酵素安定化に関する様々な技術が本発明において有用であると想到される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で使用される酵素は、最終組成物中に、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオンの水溶性供給源、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ）イオン）の水溶性供給源を存在させて当該イオンを酵素に供給することで安定化される。塩化物及び硫酸塩もまた、本発明のいくつかの実施形態において有用である。好適なオリゴ糖類及び多糖類（例えば、デキストリン）の例は、当該技術分野において既知である（例えば、国際公開第０７／１４５９６４号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、例えば、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒド等の可逆的プロテアーゼ阻害剤もまた、所望により更に安定性を改善させるために有用である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤及び／又は漂白触媒が、本発明の組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤として、ペルハイドレート塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機ペルハイドレート塩が、更なる保護はされずに結晶質の固体として含まれるが、他のいくつかの実施形態では、この塩はコーティングされる。当該技術分野において既知の任意の好適な塩が、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号参照）。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤を本発明の組成物に使用する。漂白活性化剤は、典型的に、６０℃以下の温度で洗浄中に漂白作用を増強する有機過酸前駆体である。本明細書に用いるのに好適な漂白活性化剤としては、過加水分解条件下で好ましくは約１〜約１０個の炭素原子、特に約２〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸及び／又は任意に置換された過安息香酸を生じる化合物が挙げられる。追加の漂白活性化剤が当該技術分野において既知であり、本発明において有用である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号参照）。
【０１７７】
加えて、いくつかの実施形態において及び本明細書に更に記載されるように、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも１種の漂白触媒を更に含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト錯体、銅錯体、マンガン錯体、及び鉄錯体も有用である。追加の漂白触媒も本発明において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、同第４，８１０，４１０号、国際公開第９９／０６５２１号、及び欧州特許第２  １００  ９４９号参照）。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は１種以上の触媒性金属錯体を含有する。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒は有用である。いくつかの実施形態では、金属系漂白触媒には、所定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンカチオン）、漂白触媒活性をわずかしか有さない又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムカチオン）、及び触媒型及び補助金属カチオンに関して所定の安定性定数を有する金属イオン封鎖剤、具体的には、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性塩を含む触媒系が含まれる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号参照）。いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物はマンガン化合物により触媒される。このような化合物及び使用レベルは当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号参照）。追加の実施形態では、コバルト漂白触媒は、本発明のクリーニング組成物において有用である。様々なコバルト漂白触媒が当該技術分野において既知であり（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号参照）、既知の手順により容易に調製される。
【０１７９】
いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、マクロ多環式剛性配位子（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含有する。実際問題として、制限を目的とするものではないが、いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物及びクリーニング方法は、水性クリーニング媒質中に少なくとも１ｐｐｈｍの次数で活性ＭＲＬ種を供給するように調整され、及びいくつかの実施形態では約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、及び最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬがクリーニング液中に供給される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒の遷移金属としては、限定するものではないが、例えば、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。同様に、ＭＲＬとしては、限定するものではないが、例えば、特定の架橋型超剛性配位子（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ（６．６．２）ヘキサデカン）が挙げられる。好適な遷移金属ＭＲＬは、既知の手順により容易に調製される（例えば、国際公開第２０００／３２６０１号及び米国特許第６，２２５，４６４号参照）。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、金属ケア剤を含有する。金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金（例えば、銀及び銅）を包含する金属の、変色、腐食、及び／又は酸化の予防及び／又は軽減に有用である。好適な金属ケア剤としては、欧州特許第２  １００  ９４９号、国際公開第９４２６８６０号及び同第９４／２６８５９号に記載のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、金属ケア剤は亜鉛塩である。いくつかの更なる実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上の金属ケア剤を約０．１重量％〜約５重量％含む。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、変異体セリンプロテアーゼポリペプチドプロテアーゼを有する高密度液体（ＨＤＬ）組成物である。ＴＨＤＬ液体洗濯洗剤には、アニオン性洗剤界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキル硫酸塩、スルホン酸アルキル、アルキルアルコキシル化硫酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルホスホン酸塩、アルキルカルボン酸塩、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）；及び任意選択的に非イオン界面活性剤（線状又は分岐状又はランダム鎖、置換又は非置換アルキルアルコキシル化アルコール、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシル化アルコール及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレートからなる群から選択される）を含む、洗剤界面活性剤を含ませることができ（１０％〜４０％）、任意選択的に、アニオン性洗剤界面活性剤（親水性指数（ＨＩｃ）が６．０〜９のもの）の非イオン性洗剤界面活性剤に対する重量比は１：１である。好適な洗浄界面活性剤には、カチオン性洗浄界面活性剤（アルキルピリジニウム化合物、アルキル第四級アンモニウム化合物、アルキル第四級ホスホニウム化合物、アルキル第三級スルホニウム化合物、及び／又はこれらの混合物からなる群から選択される）、双極性及び／又は両性洗浄界面活性剤（アルカノールアミンスルホベタインからなる群から選択される）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、並びにこれらの混合物も含まれる。
【０１８３】
組成物には、任意選択的に、両親媒性アルコキシル化グリースクリーニングポリマーからなる界面活性増強ポリマー（surfactancy boosting polymer）（分岐親水性及び疎水性を備える分岐部分を有するアルコキシル化ポリマーからなる群から選択され、例えば、アルコキシル化ポリアルキレンイミンを０．０５重量％〜１０重量％）、及び／又はランダムグラフトポリマー（典型的には、不飽和Ｃ１〜Ｃ６カルボン酸、エーテル、アルコール、アルデヒド、ケトン、エステル、糖単位、アルコキシ単位、無水マレイン酸、飽和ポリアルコール、例えば、グリセロール、及びこれらの混合物からなる群から選択されるモノマーを含む親水性主鎖と、Ｃ４〜Ｃ２５アルキル基、ポリプロピレン、ポリブチレン、飽和Ｃ〜Ｃ６モノカルボン酸のビニルエステル、アクリル酸又はメタクリル酸のＣ１〜Ｃ６アルキルエステル、及びこれらの混合物からなる群から選択される疎水性側鎖とを含む）を含ませることができる。
【０１８４】
組成物には、追加ポリマー、例えば汚れ剥離ポリマー（アニオン性末端保護ポリエステル、例えば、ＳＲＰ１、ランダム又はブロック構成で、単糖類、ジカルボン酸、ポリオール及びこれらの組み合わせから選択される少なくとも１種のモノマー単位を含むポリマー、ランダム又はブロック構成のエチレンテレフタレート系ポリマー及びそれらのコポリマーであって、例えば、Ｒｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ  ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６、Ｔｅｘｃａｒｅ  ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５、Ｍａｒｌｏｑｕｅｓｔ  ＳＬを含む）、再付着防止ポリマー（分子量５００〜１００，０００Ｄａの範囲の、アクリル酸、マイレン酸（若しくはマレイン酸無水物）、フマル酸、イタコン酸、アコニット酸、メサコン酸、シトラコン酸、メチレンマロン酸、及びこれらの任意の混合物から選択される少なくとも１種のモノマーを含むポリマー、ビニルピロリドンホモポリマー、並びに／又はポリエチレングリコール等のカルボキシレートポリマーを０．１重量％〜１０重量％含む）、セルロースポリマー（アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースであって、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、及びこれらの混合物等から選択されるものを含む）、並びに高分子カルボキシレート（マレイン酸／アクリル酸ランダムコポリマー又はポリアクリル酸ホモポリマー等）等を含めることもできる。
【０１８５】
組成物は、飽和又は不飽和脂肪酸、好ましくは飽和又は不飽和Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸（０重量％〜１０重量％）、及び付着補助剤を含んでもよく、付着補助剤の例としては、多糖類、好ましくはセルロース系ポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムハロゲン化物（ＤＡＤＭＡＣ）、及びＤＡＤ  ＭＡＣと、ビニルピロリドン、アクリルアミド、イミダゾール、ハロゲン化イミダゾリニウム、及びそれらの混合物との、ランダム又はブロック構成のコポリマー、カチオン性グアーガム、カチオン性セルロース（例えば、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース等）、カチオン性デンプン、カチオン性ポリアシルアミド、並びにそれらの混合物が挙げられる。
【０１８６】
組成物には、更に、移染防止剤を含ませることもでき、移染防止剤としては、例えば、マンガンフタロシアニン、ペルオキシダーゼ、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール、並びに／又はこれらの混合物、キレート剤（例えば、エチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸（ＤＴＰＭＰ）、ヒドロキシ−エタンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンＮ，Ｎ’−二コハク酸（ＥＤＤＳ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、プロピレンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド（ＨＰＮＯ）、又はメチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）が挙げられる）、グルタミン酸Ｎ，Ｎ二酢酸（Ｎ，Ｎ−ジカルボキシメチルグルタミン酸四ナトリム塩（ＧＬＤＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、４，５−ジヒドロキシ−ｍ−ベンゼンジスルホン酸、クエン酸及びその任意の塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、Ｎ−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、エチレンジアミンテトラプロピオン酸（ＥＤＴＰ）、及びこれらの誘導体が挙げられる。
【０１８７】
組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、クチナーゼ、ラッカーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、ペルヒドロダーゼ、アリールエステラーゼ、及びこれらの任意の混合物から選択される酵素（通常は、約０．０１重量％の活性酵素〜０．５重量％の活性酵素）を更に含んでよい。組成物は、酵素安定化剤（例としては、プロピレングリコール若しくはグリセロール等のポリオール類、糖若しくは糖アルコール、乳酸、可逆的プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸、若しくは芳香族ホウ酸エステル等のホウ酸誘導体、又は４−ホルミルフェニルボロン酸等のフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）を含んでもよい。
【０１８８】
組成物は、シリコーン又は脂肪酸系抑泡剤、色調染料、カルシウムカチオン及びマグネシウムカチオン、視覚的シグナル成分、消泡剤（０．００１重量％〜約４．０重量％）、及び／又は構造化剤／増粘剤（０．０１重量％〜５重量％、ジグセリド及びトリグリセリド、ジステアリン酸エチレングリコール、結晶セルロース、セルロース系材料、微小繊維状セルロース、バイオポリマー、キサンタンガム、ジェランガム、及びこれらの混合物からなる群から選択されるもの）を更に含んでよい。
【０１８９】
前記組成物は、任意の液体状（例えば、液体状若しくはゲル状、又はこれらの任意の組み合わせ等）であってよい。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、錠剤、カプセル、分包剤、パウチ、及び多区画パウチ等の一回用量形状で提供される。いくつかの実施形態では、一回用量形状は、多区画パウチ（又は他の一回用量形状）内の成分を制御放出するよう設計される。好適な一回用量型及び制御放出形式は、当該技術分野において既知である（例えば、欧州特許第２  １００  ９４９号、国際公開第０２／１０２９５５号、米国特許第４，７６５，９１６号及び同４，９７２，０１７号、並びに、一回用量型及び制御放出形式に使用するための好適な材料については国際公開第０４／１１１１７８号参照）。いくつかの実施形態では、一回用量形状は、水溶性フィルムで包装された錠剤又は水溶性パウチとして提供される。様々な一回用量形状が、欧州特許第２  １００  ９４７号及び国際公開第２０１３／１６５７２５号（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されており、当該技術分野において既知である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、変異体セリンプロテアーゼポリペプチドプロテアーゼを有する高密度粉末（ＨＤＤ）組成物である。ＨＤＤ粉末洗濯用洗剤は、アニオン性洗浄性界面活性剤（例えば、直鎖若しくは分子鎖又はランダム鎖の、置換若しくは非置換アルキルサルフェート、アルキルスルホネート、アルキルアルコキシル化サルフェート、アルキルホスフェート、アルキルホスホネート、アルキルカルボキシレート及び／又はこれらの混合物）、非イオン性洗浄性界面活性剤（例えば、直鎖若しくは分子鎖又はランダム鎖の、置換若しくは非置換Ｃ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート、及び／又はＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート）、カチオン性洗浄性界面活性剤（例えば、アルキルピリジニウム化合物、アルキル四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル三級スルホニウム化合物、及びこれらの混合物）、双極性及び／又は両性洗浄性界面活性剤（例えば、アルカノールアミンスルホ−ベタイン）、両性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物を含む、洗浄性界面活性剤；ホスフェートを含まないビルダー（例えば、ゼオライトビルダー、これらの例には、０重量％〜１０重量％未満の範囲のゼオライトＡ、ゼオライトＸ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰが含まれる）、ホスフェートビルダー（例えば、０重量％〜１０重量％未満の範囲のトリポリリン酸ナトリウム）、クエン酸、クエン酸塩、及びニトリロ三酢酸、又は１５重量％未満の範囲のこれらの塩、ケイ酸塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲のケイ酸ナトリウム若しくはカリウム、又は、メタケイ酸ナトリウム、又は、層状ケイ酸塩（ＳＫＳ−６））、カルボネート塩（０重量％〜１０重量％未満の範囲の炭酸ナトリウム及び／又は重炭酸ナトリウム）；並びに、漂白剤（光漂白剤、例えば、スルホン化フタロシアニン亜鉛、スルホン化フタロシアニンアルミニウム、キサンテン系染料、及びこれらの混合物を含む）、疎水性又は親水性漂白活性化剤（例えば、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸、又はこれらの塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン−ＴＡＥＤ、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート−ＮＯＢＳ、ニトリルクアット、及びこれらの混合物）、過酸化水素、過酸化水素源（例えば、無機ペルハイドレート塩、これらの例には、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、又は過ケイ酸塩の一又は四水和物ナトリウム塩が含まれる）、予形成された親水性及び／又は疎水性過酸（例えば、過カルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、過イミド酸及び塩、ペルオキシ一硫酸及び塩）、及びこれらの混合物、並びに／又は漂白触媒（例えば、イミン漂白促進剤、これらの例には、イミニウムカチオン及びポリイオンが含まれる）、イミニウム双性イオン、変性アミン、変性アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン、及びこれらの混合物、金属含有漂白触媒（例えば、亜鉛又はアルミニウム等の補助金属カチオン、及びエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四（メチレンホスホン酸）等の封鎖剤と併せた、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンカチオン、及びこれらの水溶性塩）を含んでよい。
【０１９２】
組成物には、香料マイクロカプセル、デンプンカプセル化香料アコード、色相剤（hueing agent）、追加のポリマー（布地保全剤（fabric integrity）及びカチオン性ポリマー）、染料固定剤、布地柔軟剤、増白剤（例えば、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤）、凝集剤、キレート剤、アルコキシル化ポリアミン、布地付着助剤、及び／又はシクロデキストリン等の追加の洗剤原料を更に含ませることができる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、本発明のセリンプロテアーゼを有する自動食器洗い（ＡＤＷ）洗剤組成物である。ＡＤＷ洗剤組成物は、０〜１０重量％の量で存在する、エトキシル化非イオン界面活性剤、アルコールアルコキシル化界面活性剤、エポキシ保護ポリ（オキシアルキル化）アルコール、又はアミンオキシド界面活性剤からなる群から選択される２種以上の非イオン界面活性剤；５〜６０％の範囲の、リン酸塩（一リン酸塩、二リン酸塩、トリポリリン酸塩又はオリゴマーポリリン酸塩（oligomeric-poylphosphates）のいずれかのビルダー、好ましくはトリポリリン酸ナトリウム−ＳＴＰＰ又はリン酸塩を含有しないビルダー［アミノ酸ベースの化合物、例えば、ＭＧＤＡ（メチル−グリシン−二酢酸等）、及びそれらの塩及び誘導体、ＧＬＤＡ（グルタミン−Ｎ，Ｎ二酢酸）及びそれらの塩及びそれらの誘導体、ＩＤＳ（イミノジコハク酸）及びそれらの塩及びそれらの誘導体、カルボキシメチルイヌリン、及びそれらの塩及び誘導体、並びにそれらの混合物、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｂ−アラニンニ酢酸（Ｂ−ＡＤＡ）及びそれらの塩］、０．５重量％〜５０重量％の範囲のポリカルボン酸及びそれらの部分的に又は完全に中和された塩のホモポリマー及びコポリマー、ポリカルボン酸単量体及びヒドロキシカルボン酸単量体及びそれらの塩；約０．１重量％〜約５０重量％の範囲のスルホン化／カルボキシル化ポリマー（製品に寸法安定性を提供する）；約０．１重量％〜約１０重量％の範囲の乾燥助剤（ポリエステルから選択され、特にアニオン性ポリエステルと、場合により、特に、酸、アルコール、又はエステル官能基の重縮合をもたらす３〜６個の官能基を有するモノマー、ポリカーボネート、ポリウレタン−、及び／又はポリウレア−ポリオルガノシロキサン化合物又はそれらの活性環状カーボネート及び尿素タイプの前駆体化合物との組み合わせ）；約１重量％〜約２０重量％の範囲のシリケート（ケイ酸ナトリウム又はケイ酸カリウム、例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロ珪酸）；無機漂白剤（例えば、過酸化水素化物塩、例えば、過ほう酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過珪酸塩）及び有機（例えば、ジアシル及びテトラアシルペルオキシド、特にジペルオキシドデカン二酸、ジペルオキシテトラデカン二酸、及びジペルオキシヘキサデカン二酸等の有機過酸）；約０．１重量％〜約１０重量％の漂白活性剤−有機過酸前駆体；漂白触媒（マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｍｎ及びＦｅビスピリジルアミン及び関連する錯体、並びにペンタミン酢酸コバルト（ＩＩＩ）及び関連する錯体から選択）；約０．１重量％〜５重量％の金属ケア剤（ベンザトリアゾール（benzatriazoles）、金属塩及び錯体、及び／又は珪酸塩から選択）；自動食器洗浄洗剤組成物１ｇ当たり約０．０１〜５．０ｍｇ活性酵素の範囲の酵素（アシルトランスフェラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アラビノシダーゼ、アリールエステラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、カラギナーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、コンドロイチナーゼ、���チナーゼ、エンド−β−１、４−グルカナーゼ、エンド−β−マンナナーゼ、エステラーゼ、エキソ型マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、ケラチナーゼ、ラッカーゼ、ラクターゼ、リグニナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、マンナナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチナーゼ、ペントサナーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノロキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、還元酵素、ラムノガラクツロナーゼ、β−グルカナーゼ、タンナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシランアセチルエステラーゼ、キシラナーゼ、キシログルカナーゼ、及びキシロシダーゼ、及びこれらの任意の混合物）；並びに酵素安定成分（オリゴ糖、多糖及び無機二価金属塩から選択）を含んでよい。
【０１９４】
上記の通り、本発明のクリーニング組成物は、配合者により選択される任意のプロセスにより、任意の好適な形態に処方され、かつ調製され、その非限定例は、米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、同第５，４８６，３０３号、同第４，５１５，７０５号、同第４，５３７，７０６号、同第４，５１５，７０７号、同第４，５５０，８６２号、同第４，５６１，９９８号、同第４，５９７，８９８号、同第４，９６８，４５１号、同第５，５６５，１４５号、同第５，９２９，０２２号、同第６，２９４，５１４号、及び同第６，３７６，４４５に記載されている。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される他のいくつかの実施形態では、このような組成物のｐＨは、ＨＣｌ等の酸性材料を添加することで調整される。
【０１９５】
本明細書で開示されるクリーニング組成物は、部位のクリーニングにおいて有用である（例えば、表面、物品、食器類又は布地）。典型的には、このような部位の少なくとも一部を、原液又は洗浄液で希釈した本発明のクリーニング組成物と接触させ、そしてその後、場合により、その部位を洗浄及び／又はすすぎ洗いする。本発明の目的に関し、「洗浄」には、擦ること及び機械的撹拌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、典型的には溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃であり、部位が布地を含む場合、水と布地との割合は、典型的には、約１：１〜約３０：１である。
【０１９６】
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを有益に含有する代表的な洗剤処方としては、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１３０６３４６０号、第７８〜１５２頁に見られるものが挙げられ、特に、第９４〜１５２頁に見られるものが挙げられる。セリンプロテアーゼは、通常、酵素タンパク質のレベルが、組成物の０．００００１重量％〜１０重量％になるように洗剤組成物に組み込まれる。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、組成物の０．０００１重量％超、０．００１重量％超、０．０１重量％超又は０．１重量％超のセリンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、組成物の１重量％未満、０．１重量％未満、０．０１重量％未満、又は０．００１重量％未満のセリンプロテアーゼを含む。
【０１９７】
本発明は、クリーニングの必要がある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄する方法を提供し、こうした方法としては、これらに限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地物品、洗濯物物品、パーソナルケア物品等のクリーニング又は洗浄方法、及び硬質若しくは軟質表面（例えば、物品の硬質表面）のクリーニング又は洗浄方法が挙げられる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明は、クリーニングする必要のある物品、対象物、又は表面をクリーニングするための方法を提供し、この方法は、物品又は表面（又はクリーニングされることが所望される物品又は表面の一部）を本発明の少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチド又は本発明の組成物と、物品、対象物若しくは表面を所望される程度まで洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに好適な及び／又は有効な条件下で接触させることを含む。このような方法のいくつかのものは、物品、物体、又は表面を水ですすぐ工程を更に含む。このような方法のいくつかのものでは、クリーニング組成物は食器洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は食器類又は食卓用食器類である。本明細書で使用するとき、「食器類」は、食品を給仕する際又は食べる際に一般的に使用される物品である。食器類は、これらに限定するものではないが、例えば深皿、平皿、カップ、椀等のようなものであり得る。本明細書で使用するとき、「食卓用食器類」はより広義の用語であり、これらに限定するものではないが、例として深皿、金属食器、ナイフ、フォーク、スプーン、箸、ガラス食器、水差し、ソース入れ、飲用容器、給仕用具等が挙げられる。「食卓用食器類」は食品を給仕する又は食べるための上記又は類似物品のいかなるものも包含することを意図する。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、自動食器クリーニング用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は、食器又は食卓用食器類である。このような方法のいくつかのものでは、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物（例えば、粉末洗濯洗剤組成物又は液体洗濯洗剤組成物）であり、クリーニングされる物品は布地物品である。その他のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は洗濯物前処理用組成物である。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、それぞれ所望によりクリーニング又はクリーニングが必要な布地物品をクリーニング又はクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、布地又は洗濯物クリーニング組成物を包含する、プロテアーゼ変異体を含む組成物、及びクリーニングが必要な布地物品又は洗濯物物品を準備する工程と、この布地物品又は洗濯物物品（又はクリーニングが望ましい物品の一部）を、組成物に、布地又は洗濯物物品を望ましい程度までクリーニング又はクリーニングするのに十分な又は有効な条件下で接触させる工程と、を含む。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明は、所望によりクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄するための方法を提供し、方法は、クリーニング又は洗浄される物品又は表面を準備する工程、並びに物品又は表面（又はクリーニング又は洗浄することが所望される物品又は表面の一部）を、本発明の少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチド又は少なくとも１種のこのようなセリンプロテアーゼポリペプチドを含む本発明の組成物に、所望される程度まで物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに十分又は有効な条件下で接触させる工程を含む。このような組成物としては、これらに限定するものではないが、例えば、本発明のクリーニング組成物又は洗剤組成物（例えば、食器手洗い用洗剤組成物、食器手洗い用クリーニング組成物、洗濯洗剤又は布地洗剤又は洗濯物若しくは布地クリーニング組成物、液体洗濯洗剤、液体洗濯物クリーニング組成物、粉末洗濯洗剤組成物、粉末洗濯物クリーニング組成物、自動食器洗浄用洗剤組成物、洗濯用補助クリーニング又は洗剤組成物、洗濯物クリーニング添加剤、及び洗濯物シミ抜き前処理用組成物（laundry pre-spotter composition）等）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本方法は、特に追加のクリーニング又はクリーニングが望ましい場合に、１回以上繰り返される。例えば、場合によっては、本方法は任意で、その物品又は表面を望ましい程度までクリーニング又はクリーニングするのに十分な又は有効な時間にわたって、物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物に接触させ続ける工程を更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、物品又は表面を水及び／又は別の液体ですすぎ洗いする工程を更に含む。いくつかの実施形態では、本方法は、物品又は表面を少なくとも１種の本発明のプロテアーゼ変異体又は本発明の組成物と再度接触させる工程と、その物品又は表面を望ましい程度までクリーニング又はクリーニングするのに十分な又は有効な時間にわたって、物品又は表面を少なくとも１種のプロテアーゼ変異体又は組成物に接触させ続ける工程と、を更に含む。いくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、食器洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は、自動食器クリーニング用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法のいくつかの実施形態では、クリーニング組成物は洗濯洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は布地物品である。
【０２０１】
本発明はまた、自動食器洗浄機で食卓用食器類又は食器類をクリーニングする方法を提供し、この方法は、自動食器洗浄機を準備する工程、食卓用食器類又は食器類をクリーニングするのに十分な量の、少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む自動食器洗浄機用組成物又は本発明の組成物を自動食器洗浄機内に（例えば、組成物を適切な又は食器洗浄機内に装備された洗剤区画若しくはディスペンサーに入れることにより）入れる工程と、自動食器洗浄機内に食器類又は食卓用食器類を入れる工程と、食卓用食器類又は食器類がクリーニングされるよう自動食器洗浄機を操作する工程（例えば、製造元による取り扱い説明書に従って）と、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載の任意の自動食器洗浄機用組成物を包含し、組成物は、限定するものではないが本明細書で提供される少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む。自動食器洗浄用組成物の使用量は、製造元による取り扱い説明書又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明のプロテアーゼ変異体を少なくとも１種含むいかなる形態の自動食器洗浄用組成物（例えば、液体、粉末、固体、ゲル、錠剤等）も使用できる。
【０２０２】
本発明は、所望によりクリーニングする必要のある表面、物品又は対象物をクリーニングするための方法も提供し、本方法は、所望される程度まで物品又は表面をクリーニング又は洗浄するのに十分な時間にわたって及び／又はそうするのに十分な若しくは有効な条件下で、物品又は表面（又はクリーニングすることが所望される物品又は表面の部分）を、原液若しくは洗浄溶液に希釈した本発明の少なくとも１種の本発明のセリンプロテアーゼポリペプチド又は本発明のクリーニング組成物と接触させる工程を含む。必要に応じて、その後、表面、物品、又は対象物を（任意に）洗浄し及び／又はすすいでもよい。
【０２０３】
本発明は、洗濯物又は布地物品を洗濯機でクリーニングする方法も提供し、方法は、洗濯機を準備する工程と、洗濯物又は布地物品をクリーニングするのに十分な量の、本発明の少なくとも１種のセリンプロテアーゼポリペプチド酵素を含む洗濯洗剤組成物を（例えば、組成物を洗濯機内の適切な又は備え付けの洗剤区画又はディスペンサーに入れることにより）洗濯機内に入れる工程と、洗濯機内に洗濯物又は布地物品を入れる工程と、及び洗濯物又は布地物品がクリーニングされるように洗濯機を（例えば、製造元の取扱説明書に従って）操作する工程と、を包含する。本発明の方法は、限定するものではないが、本明細書で提供される少なくとも１種の任意のセリンプロテアーゼポリペプチド酵素を含む、本明細書に記載の任意の洗濯物洗浄用洗剤組成物を包含する。洗濯洗剤組成物の使用量は、製造元の取扱説明書又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含むいかなる形態の洗濯洗剤組成物（例えば、固体、粉末、液体、錠剤、ゲル等）も使用できる。
【０２０４】
Ｂ．織物の加工
本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを用いて布地を処理する（例えば、布地を湯通しする）組成物及び方法も提供される。布地の処理方法は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，０７７，３１６号を参照されたい）。例えば、布地の感触及び外観は、その布地を溶液中のセリンプロテアーゼと接触させる工程を含む方法により改善することができる。布地は、圧力下で溶液により処理することができる。
【０２０５】
本発明のセリンプロテアーゼは、織物の製織の間に若しくはその後に、又は糊抜き段階、若しくは１つ以上の追加の布地加工工程の間に、適用することができる。糸は、織物の製織の間に、相当程度の機械的歪みに晒される。織機において織る前に、縦糸を糊付け用デンプン又はデンプン誘導体でコーティングし、引張り強度を増して、切断を防ぐことが多い。本発明のセリンプロテアーゼは、これらの糊付け用デンプン又はデンプン誘導体を取り除くために、製織の間又はその後に適用することができる。製織後にセリンプロテアーゼを使用して、均一かつ耐洗浄効果を確保すべく布地を更に加工する前に、糊付けコーティングを取り除くことができる。
【０２０６】
本発明のセリンプロテアーゼは、単体で使用して、又は他の糊抜き用化学試薬、及び／若しくは糊抜き用酵素と共に、（例えば、水性組成物中の）洗剤添加剤として使用して、綿含有布地等の布地の糊抜きを行ってよい。また、アミラーゼは、インディゴ染色デニム布地及び衣類のストーンウォッシュ加工したような見た目を作り出すための組成物及び方法において使用することもできる。衣服の製造に際し、布地を裁断し、衣服又は衣類に縫製し、その後仕上げることができる。特にデニムジーンズの製造に関し、異なる酵素による仕上げ方法が開発されている。デニム衣類の仕上げは、通常、酵素による湯通し工程により開始され、この間、衣類はタンパク質分解酵素による作用を受け、布地には柔軟性がもたらされ、木綿は以降の酵素による仕上げ工程による作用を受けやすくなる。セリンプロテアーゼは、デニム衣類の仕上げ方法（例えば、「バイオストーン加工」）、酵素による糊抜き方法及び、布地への柔らかさの付与方法、並びに／又は仕上げ加工にて使用することができる。
【０２０７】
Ｃ．皮革及び羽毛の加工
本明細書に記載のセリンプロテアーゼポリペプチドは、羽毛、皮膚、毛髪、皮革、及び等価物等の動物由来のタンパク質の酵素による除去及びそれらの分解又は廃棄への使用が更に見出される。いくつかの例では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを含む溶液中に動物の死骸を浸漬することで、従来の熱湯消毒水への浸漬又は抜羽プロセスと比較して皮膚を損傷から保護するよう機能させることができる。一実施形態では、羽毛には、羽毛の消化又は分解の開始に好適な条件下で、本発明の単離されたセリンプロテアーゼポリペプチドを噴霧することができる。いくつかの実施形態では、本発明のセリンプロテアーゼは、上記の通りに酸化剤と組み合わせて使用することができる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、原羽毛の油脂の除去は本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドを使用することにより補助される。いくつかの実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、羽毛のクリーニング並びに繊維の消毒及び部分的脱水のために組成物に使用される。更に別の実施形態では、本開示のセリンプロテアーゼポリペプチドは、羽毛由来のタンパク質の回収への使用が見出される。いくつかの別の実施形態では、セリンプロテアーゼポリペプチドは、約０．５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤を添加して又は添加せずに、９５％エタノール又はその他の極性有機溶媒と組み合わせて利用される。
【０２０９】
Ｄ．動物飼料
本発明の更なる態様では、本発明のセリンプロテアーゼポリペプチドは、セリンプロテアーゼ及びそれらの変異体を含む動物飼料組成物、動物飼料添加剤、及び／又はペットフードの成分として使用することができる。更に、本発明は、１種類以上の動物飼料材料、及び／又は動物飼料添加物成分、及び／又はペットフード材料に、セリンプロテアーゼポリペプチドを混合することを含む、このような動物飼料組成物、動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製方法に関する。更に、本発明は、動物飼料組成物、及び／又は動物飼料添加組成物、及び／又はペットフードの調製における、セリンプロテアーゼポリペプチドの使用に関する。
【０２１０】
用語「動物」は、全ての非反芻及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、馬及び単胃動物等の非反芻動物である。単胃動物の例としては、豚及び家畜豚（子豚、育成豚、雌豚等）、鶏（七面鳥、アヒル、鶏、ブロイラー、産卵鶏等）、魚（鮭、鱒、テラピア、ナマズ、及び鯉等）、及び甲殻類（海老及び車海老等）が挙げられるがこれらに限定されない。更なる実施形態では、動物は反芻動物であり、畜牛、幼若牛、ヤギ、羊、キリン、バイソン、ヘラジカ、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、リャマ、レイヨウ、エダツノレイヨウ、及びニルガイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１１】
この文脈において、用語「ペットフード」は、イヌ、ネコ、スナネズミ、ハムスター、チンチラ、高級ラット、モルモット、飼育用鳥類（カナリア、インコ、及びオウム等）、飼育用爬虫類（亀、とかげ、及びヘビ等）、並びに飼育用水生生物（熱帯魚、及び蛙等）であるがこれらに限定されない家庭内飼育用動物のための飼料を意味するものと理解されることが意図される。
【０２１２】
用語「動物飼料組成物」、「飼料原料」及び「飼葉」は、互換的に使用され、かつａ）シリアル類、例えば、小粒（例えば、小麦、大麦、ライ麦、オーツ麦、及びこれらの組み合わせ）及び／又はトウモロコシ若しくはソルガム等の大粒；ｂ）シリアル、例えば、トウモロコシグルテンミール、醸造乾燥粒可溶化物（ＤＤＧＳ）（特にコーンベースの醸造乾燥粒可溶化物（ｃＤＤＧＳ）、小麦ふすま、ホイートミドリングス、小麦ショート、米ふすま、もみ殻、オーツ殻、パーム核、及びシトラスパルプからの生成物；ｃ）大豆、ひまわり、落花生、ハウチワマメ、えんどう、そら豆、綿、キャノーラ、魚肉、乾燥結晶タンパク質、肉骨粉、じゃがいもタンパク質、乳清、コプラ，胡麻等の資源から得られたタンパク質；ｄ）植物及び動物資源から得られる油脂；ｅ）ミネラル及びビタミンからなる群から選択される１種以上の試料成分を含ませることができる。
【実施例】
【０２１３】
以下の実施例は、本開示の特定の好ましい実施形態及び態様を実証及び例示する目的で示されるものであって、限定と解釈されるべきものではない。
【０２１４】
以下の実験の開示において、以下の略語を適用する：ＡＤＷ（自動食器洗浄）；ＢＭＩ（血液／牛乳／インク）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＣＡＰＳ（Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸）；ＣＨＥＳ（Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸）；ＤＭＣ（ジメチルカゼイン）；ＨＤＤ（強力乾燥／粉末）；ＨＤＬ（強力液体）；ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）；ＭＴＰ（マイクロタイタープレート）；ＮＤ（未実施）；ＯＤ（吸光度）；ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）；ｐｐｍ（百万分率）；ＱＳ（十分量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ＡＡＰＦ（スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド）；ＴＮＢＳＡ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）；ｖ／ｖ（容量対容量）；ｗ／ｖ（重量対容量）。
【０２１５】
（実施例１）
タンパク質定量方法
Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎによるタンパク質定量
Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ法によってタンパク質を定量した。この方法は、各バンドの強度が対象とするタンパク質中に存在するトリプトファン残基の量に依存する、染料を含まない予成形ＰＡＧＥゲルを利用する。ＰＡＧＥ用Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）ＴＧＸ（Ｔｒｉｓ−グリシン延長型）Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（商標）予成形ゲルは、独自のトリハロ化合物を含む。これが、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＥＺ撮像システムによる、タンパク質の迅速な蛍光検出を可能にする。トリハロ化合物は、ＵＶ誘発反応においてトリプトファン残基と反応して蛍光を発し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＥＺ撮像装置によってゲル内を容易に検出できる。アッセイに使用した試薬：濃縮（１０×）Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ、カタログ＃４２５５６）；１８又は２６ウェルのＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｓｔｒａｉｎ−Ｆｒｅｅ予成形ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、それぞれカタログ＃５６７−８１２４及び５６７−８１２５）；及びタンパク質マーカー「Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ」（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ＃１６１−０３６３）。アッセイは以下のように実施した：２５μＬのタンパク質サンプル及び２５μＬの０．５Ｍ  ＨＣＬを、氷上の９６ウェルＰＣＲプレートに１０分間加え、プロテアーゼを失活させて自己加水分解を予防した。次に、５０μＬの酸タンパク質ミックスを、９６ウェルＰＣＲプレート中の、０．３８５ｍｇのＤＴＴを含むサンプルバッファー５０μＬに加えた。Ｂｉｏ−ＲａｄのＭｉｃｒｏｓｅａｌ「Ｂ」Ｆｉｌｍでプレートを封し、ＰＣＲ機に配置し、７０℃で１０分間加熱した。その後、チャンバをランニングバッファーで満たし、ゲルカセットを設置した。続いて、１０μＬの各サンプルをマーカーと共に各ポケットに加えた。その後、２００Ｖ  ３５分間の電気泳動を開始した。電気泳動後、ゲルをＩｍａｇｅｒに移した。Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを使用して、各バンドの強度を計算した。標準サンプルのタンパク質量及びトリプトファン含量を知ることによって、検量線を作成できる。バンド強度及びトリプトファン数をタンパク質濃度に外挿することによって、実験サンプルの量を測定できる。このタンパク質定量法を、実施例で定められるアッセイに使用される、サンプルＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼの調製に用いた。
【０２１６】
Ｎ及びＣ末端アミノ酸の決定
配列確認の準備において、単離されたタンパク質サンプルを、１０ｋＤａのスピンフィルター一連の化学処理にかけてよい。尿素及びＤＴＴ処理によって、サンプルを変性し、還元する。グアニジン化工程を実施してリジンをホモアルギニンに変換し、リジン側鎖のアセチル化を防いだ。続く、ヨードアセトアミドを用いるアセチル化反応は、タンパク質のＮ末端残基のみを修飾する。続いて、サンプルを、１８Ｏ水を含む緩衝液と混合し、消化のために酵素トリプシン及びキモトリプシンを加える。得られるペプチドは、１８Ｏ及び１６Ｏを混合して含むが、カルボキシル末端は、天然の１６Ｏを保持している。消化産物を、ナノＬＣシステム、続いて、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）高分解能質量分析器を用いて分離解析し、ペプチドのＭＳ／ＭＳフラグメントスペクトル、及びペプチドの同位体パターンからアミノ酸配列を推定した。
【０２１７】
場合によっては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析前に、タンパク質サンプルを、以下で説明するようなＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。Ｎ及びＣ末端の決定を含む配列確認の準備において、次に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのタンパク質バンドを、以下で説明するような一連の化学処理にかけた。各化学処理間に、蒸留水及びエタノールを用いてゲル片を洗浄した。ＤＴＴ／ヨードアセトアミド処理によって、タンパク質を還元／アルキル化した。グアニジン化工程を実施してリジンをホモアルギニンに変換し、リジン側鎖のアセチル化を防いだ。スルホ−ＮＨＳ−アセテートを用いるアセチル化反応は、Ｎ末端残基のみを修飾する。ゲル片を、１８Ｏ：１６Ｏ水、及びタンパク質消化のためのキモトリプシン又はトリプシンを含む緩衝液で膨潤させた。ゲル内処理を必要としないサンプルについて上で記載した後続工程を続けた。
【０２１８】
（実施例２）
セリンプロテアーゼＢｓｐＡＧ００２９６の発見及び同定
バチルス（Bacillus）種１Ｍ５（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｄｕｐｏｎｔ）を、産業用途で有用な酵素源候補として選択した。バチルス（Bacillus）種１Ｍ５により産生される酵素及びこれら酵素をコードする遺伝子を同定するため、合成（ＳＢＳ）法によるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定法を利用して、バチルス（Bacillus）種１Ｍ５の完全なゲノムの配列を決定した。ゲノムの配列決定及び配列データのアセンブリはＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。コンティグはＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により注釈付した。バチルス（Bacillus）種１Ｍ５株においてこの方法により同定された遺伝子のうち１つが、様々なその他の細菌のセリンプロテアーゼに対し相同性を示すタンパク質をコードする。この遺伝子配列、ＢｓｐＡＧ００２９６．ｎを配列番号１に示す。
【０２１９】
配列番号１には、ＢｓｐＡＧ００２９６．ｎ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＴＡＴＧＴＣＴＧＴＣＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＧＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＡＴＧＴＴＧＡＣＧＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＧＡＴＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＴＡＧＣＧＧＡＴＴＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧＡＴＴＣＣＧＴＣＧＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＴＴＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＧＧＡＴＴＴＧＴＴＴＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＡＴＡＴＴＣＴＡＣＡＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＡＴＣＧＡＴＧＡＴＧＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＣＧＡＡＡＡＡＣＡＧＴＴＡＡＣＧＧＡＣＡＴＣＧＧＣＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＡＧＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧＡＧＧＴＡＡＴＡＣＡＧＣＣＧＧＣＡＡＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＣＡＧＣＧＣＴＧＧＣＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＣＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧＴＴＣＧＡＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣＧＡＡＣＴＴＡＧＣＡＡＡＣＣＴＴＧＴＧＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＧＧＡＣＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣＧＴＡＴＣＡＧＧＴＧＴＴＡＴＧＣＡＡＡＡＣＧＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＴＴＣＣＧＴＡＡＡＡＧＴＡＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＴＴＴＡＴＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＴＴＣＴＧＴＡＴＧＣＣＧＣＧＡＧＣＡＴＴＡＡＣＧＣＣＧＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＡＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＡＴＧＣＧＡＴＴＣＡＧＡＣＡＧＣＣＧＴＴＡＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＧＴＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＴＣＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＴＣＧＧＴＴＣＣＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＣＡＴＡＴＣＣＡＡＡＣＡＧＣＣＧＧＴＡＴＧＣＣＡＣＧＣＴＡＴＣＣＧＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＣＧＣＴＣＧＧＴＣＡＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＴＴＣＣＧＣＧＧＣＧＣＡＡＧＴＡＡＧＡＡＣＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＣＡＡＴＡＣＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＣＡＧＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧＧＡＡＴＣＧＴＣＧＡＴＧＣＧＴＡＴＧＣＴＧＣＧＧＴＡＣＴＣＴＣＡＧＣＣＣＧＣ。
【０２２０】
ＢｓｐＡＧ００２９６．ｎ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号２に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予測される通りの長さ２３残基のアミノ酸のシグナルペプチドを有する（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２：９５３〜９７１）。配列番号２において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。この酵素は、１３５残基のアミノ酸であることが予測されるプロ配列を有する。完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＢｓｐＡＧ００２９６、２７４残基のアミノ酸）を配列番号３に示す。
【０２２１】
配列番号２には、セリンプロテアーゼ前駆体ＢｓｐＡＧ００２９６のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000003
【０２２２】
配列番号３には、成熟型プロテアーゼＢｓｐＡＧ００２９６の予測されるアミノ酸配列を示す（２７４残基のアミノ酸）。ＡＭＨＡＮＱＲＷＨＹＥＭＩＲＡＰＱＡＷＮＩＴＴＧＳＲＮＶＲＭＡＶＬＤＴＧＩＤＳＳＨＰＮＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＲＳＦＶＧＧＴＰＡＤＶＨＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＱＮＡＴＬＩＳＶＫＶＬＤＮＳＧＳＧＴＩＹＧＩＱＱＧＩＬＹＡＡＳＩＮＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＳＹＮＱＧＭＮＤＡＩＱＴＡＶＮＳＧＴＶＶＶＡＡＳＧＮＮＧＡＳＳＩＳＹＰＡＡＹＳＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＳＲＴＲＳＳＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＹＰＮＳＲＹＡＴＬＳＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＧＬＩＲＳＶＮＰＮＬＳＡＡＱＶＲＴＩＬＲＮＴＡＱＹＡＧＳＳＴＱＹＧＹＧＩＶＤＡＹＡＡＶＬＳＡＲ。
【０２２３】
（実施例３）
ＢｓｐＡＧ００２９６の異種発現
Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）において、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥプロモーター、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥシグナルペプチド配列、天然のＢｓｐＡＧ００２９６プロテアーゼプロペプチド、成熟型ＢｓｐＡＧ００２９６プロテアーゼ、及びＢＰＮ’ターミナーターからなる発現カセットを使用して、ＢｓｐＡＧ００２９６プロテアーゼを産生させた。このカセットをｐＨＹＴ複製シャトルベクターにクローニングし、好適なＢ．ズブチリス（B. subtilis）株を形質転換した。ｐＨＹＴベクターは、ＢｓｔＥＩＩ及びＥｃｏＲＩ部位を使用して、テトラサイクリン耐性遺伝子の後ろに転写終結部位を付加することによって、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）から誘導した（転写終結配列、ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＧＣＴＣＧＧＴＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＧＡＡＴＴＣ）（配列番号４５）。ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位内にクローニングしたリンカーを用いて、ｐＨＹ３００ＰＬＫ中のＨｉｎｄＩＩＩ部位も取り除いた（新たなリンカー配列、ＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴ）（配列番号４６）。
【０２２４】
ＢｓｐＡＧ００２９６遺伝子（ｐＨＹＴ−ＢｓｐＡＧ００２９６）を含有しているｐＨＹＴベクターのマップを図１に示す。
【０２２５】
ＢｓｐＡＧ００２９６を産生するため、尿素を主要な窒素源とし、グルコースを主要な炭素源とし、ロバストな細胞増殖のため１％ソイトンを添加した、ＭＯＰｓ緩衝系の富化半合成培地で、ｐＨＹＴ−ＢｓｐＡＧ００２９６を含有するＢ．ズブチリス（B. subtilis）形質転換体を培養した。培地には２５ｐｐｍテトラサイクリンを添加した。インキュベート後（３２℃で２日間）、増殖培地中にＢｓｐＡＧ００２９６プロテアーゼが検出された。遠心分離及びろ過後、ＢｓｐＡＧ００２９６プロテアーゼを含む培養上清を、アッセイ及び精製に用いた。
【０２２６】
ＢｓｐＡＧ００２９６タンパク質サンプルを実施例１に記載されるように解析した。最も主要なタンパク質（約２８ｋＤａ）の配列を決定し、配列番号４に記載の配列に対応させた。
【０２２７】
配列番号４には、主要型の成熟型プロテアーゼＢｓｐＡＧ００２９６のアミノ酸配列（２７３残基）を示す。ＭＨＡＮＱＲＷＨＹＥＭＩＲＡＰＱＡＷＮＩＴＴＧＳＲＮＶＲＭＡＶＬＤＴＧＩＤＳＳＨＰＮＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＲＳＦＶＧＧＴＰＡＤＶＨＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＱＮＡＴＬＩＳＶＫＶＬＤＮＳＧＳＧＴＩＹＧＩＱＱＧＩＬＹＡＡＳＩＮＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＳＹＮＱＧＭＮＤＡＩＱＴＡＶＮＳＧＴＶＶＶＡＡＳＧＮＮＧＡＳＳＩＳＹＰＡＡＹＳＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＳＲＴＲＳＳＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＹＰＮＳＲＹＡＴＬＳＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＧＬＩＲＳＶＮＰＮＬＳＡＡＱＶＲＴＩＬＲＮＴＡＱＹＡＧＳＳＴＱＹＧＹＧＩＶＤＡＹＡＡＶＬＳＡＲ。
【０２２８】
（実施例４）
セリンプロテアーゼＢｓｐＭ０４０３３の発見及び同定
バチルス（Bacillus）種ＷＤＧ２９０種１Ｍ５（Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｄｕｐｏｎｔ）を、産業用途で有用な酵素源候補として選択した。バチルス（Bacillus）種ＷＤＧ２９０により産生される酵素及びこれら酵素をコードする遺伝子を同定するため、合成（ＳＢＳ）法によるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定法を利用して、バチルス（Bacillus）種ＷＤＧ２９０の完全なゲノムの配列を決定した。ゲノムの配列決定及び配列データのアセンブリはＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。コンティグはＢｉｏＸｐｒ（Ｎａｍｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）により注釈付した。バチルス（Bacillus）種ＷＤＧ２９０株においてこの方法により同定された遺伝子のうち１つが、様々なその他の細菌のセリンプロテアーゼに対し相同性を示すタンパク質をコードする。この遺伝子の配列、ＢｓｐＭ０４０３３．ｎを配列番号５に示す。
【０２２９】
配列番号５には、ＢｓｐＭ０４０３３．ｎ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ＡＴＧＧＡ  ＧＧＡＧＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＧＴＧＣＡＧＴＴＴＧＧＧＴＣＣＴＴＡＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＴＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＴＡＡＣＧＧＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＴＴＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＣＧＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＣＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＡＧＴＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＣＧＧＡＡＣＧＣＡＣＧＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＴＣＴＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＣＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＧＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＧＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＡＴＴＴＣＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＧＣＧＧＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＡＣＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＴＡＣＧＧＧＡＴＣＧＴＴＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＣ���ＧＣＧＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＧＣＣＴＣＡＴＧＧＡＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＡＣ。
【０２３０】
ＢｓｐＭ０４０３３．ｎ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号６に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予測される通りの長さ３３残基のアミノ酸のシグナルペプチドを有する（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２：９５３〜９７１）。配列番号６において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。この酵素は、１３３残基のアミノ酸であることが予測されるプロ配列を有する（この予測は、パエニバチルス（Paenibacillus）サブチリシン中のプロ成熟型接合部に基づく：国際公開第２０１２１７５７０８号、配列番号６）。プロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＢｓｐＭ０４０３３、３８２残基のアミノ酸）を配列番号７に示す。
【０２３１】
配列番号６には、セリンプロテアーゼ前駆体ＢｓｐＭ０４０３３のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000004
【０２３２】
配列番号７には、予測される成熟型プロテアーゼＢｓｐＭ０４０３３（３８２残基のアミノ酸）のアミノ酸配列を示す。ＱＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＧＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＮＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＳＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＰＮＬＳＶＳＮＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳＧＧＰＳＮＩＴＥＴＳＩＳＴＤＲＦＹＶＱＲＧＱＮＶＴＳＴＡＱＶＴＮＥＮＧＱＧＬＡＮＡＴＶＴＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＳＳＧＦＡＳＷＴＶＧＴＳＧＡＴＡＴＧＴＹＳＶＥＡＳＳＳＬＱＧＹＱＧＳＳＡＳＴＳＦＦＶＹ。
【０２３３】
（実施例５）
ＢｓｐＭ０４０３３の異種発現
Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）において、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥプロモーター、Ｂ．ズブチリス（B. subtilis）ａｐｒＥシグナルペプチド配列、天然のＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼプロペプチド、成熟型ＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼ、及びＢＰＮ’ターミナーターからなる発現カセットを使用して、ＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼを産生させた。このカセットをｐＢＮ系複製シャトルベクター（Ｂａｂｅ’  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：１１７〜１２４）にクローニングし、このプラスミドを用いてＢ．ズブチリス（B. subtilis）の好適な株を形質転換した。
【０２３４】
ＢｓｐＭ０４０３３遺伝子（ｐＢＮ−ＢｓｐＭ０４０３３）を含有しているｐＢＮベクターのマップを図２に示す。
【０２３５】
プラスミドｐＢＮ−ＢｓｐＭ０４０３３中のＢｓｐＭ０４０３３遺伝子のプロ成熟ヌクレオチド配列を、配列番号８に示す。ＴＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＡＣＡＴＡＧＡＧＧＧＧＣＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＣＧＧＴＡＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＧＡＡＴＣＧＡＡＧＧＧＧＴＡＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＣＧＧＧＧＡＴＴＣＧＣＣＡＴＡＡＣＧＧＡＴＴＣＴＡＴＴＡＴＧＧＧＡＣＴＣＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＧＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＴＴＴＡＣＣＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＣＡＴＣＴＣＧＡＡＧＡＡＣＴＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＣＧＣＧＡＴＣＧＧＧＧＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡＴＧＴＣＴＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴＡＣＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＣＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＡＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＧＧＧＧＡＴＴＧＡＣＣＡＣＡＡＴＣＡＴＣＡＧＡＧＴＣＴＣＧＣＡＡＡＣＴＴＡＧＴＡＡＡＣＡＣＡＡＧＴＣＴＣＧＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＴＧＴＧＧＧＣＧＧＡＡＧＴＡＣＧＡＴＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＣＧＧＡＡＣＧＣＡＣＧＴＴＧＣＣＧＧＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＴＴＣＴＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＴＡＣＧＣＴＣＧＴＡＣＣＧＧＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＴＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＣＡＴＴＡＣＧＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＧＧＧＧＣＣＧＡＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＣＧＧＴＴＣＧＡＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＧＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＡＴＴＴＣＧＴＡＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴＧＣＧＧＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＣＴＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＣＧＴＴＣＣＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＡＣＣＴＧＧＴＴＣＡＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＡＣＧＧＣＴＡＴＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＧＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＴＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡＴＣＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＡＴＧＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＧＧＣＴＣＡＧＴＡＴＧＣＣＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＴＡＣＧＧＧＡＴＣＧＴＴＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＧＧＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡＧＴＡＴＡＴＣＣＡＣＴＧＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＣＧＴＧＡＣＧＴＣＡＡＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＴＡＣＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＴＣＣＡＡＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣＡＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＧＧＴＴＴＣＧＣＣＴＣＡＴＧＧＡＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＡＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＴＣＡＧＴＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＧＧＧＡＡＧＴＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴＧＴＴＴＡＣ。
【０２３６】
プラスミドｐＢＮ−ＢｓｐＭ０４０３３により発現されるＢｓｐＭ０４０３３前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、配列番号９に示し、予測されるプロペプチドを下線で示す。
0006585698.tif 000005
【０２３７】
ＢｓｐＭ０４０３３を産生するため、ｐＢＮ−ＢｓｐＭ０４０３３を含有するＢ．ズブチリス（B. subtilis）形質転換体を、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内の１０ｐｐｍネオマイシンを含むＴＳＢ（ブロス）中で１６時間培養し、この予備培養液３００μＬを、１０ｐｐｍネオマイシンを添加した３０ｍＬの培養培地（以下で説明）を満たした、５００ｍＬのフラスコに加えた。このフラスコを、３２℃で、１８０ｒｐｍの定速回転で混合しながら４８時間インキュベートした。コニカルチューブ内で１４５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離することによって、培養物を回収した。培養上清をアッセイに使用した。培養培地は、主要な窒素源として尿素を富化させ、主要な炭素源としてグルコースを富化させ、ロバストな細胞増殖のため１％ソイトンを添加したＭＯＰｓ緩衝剤系の半合成培地とした。
【０２３８】
ＢｓｐＭ０４０３３タンパク質サンプルを実施例１に記載されるように解析した。このサンプルは、一方は約４４ｋＤａ、もう一方は約２８ｋＤａである、２種類の主要型酵素を含んでいた。大きい方のタンパク質は、配列番号１０に示されるように、プロ配列と、後続の残基Ｑ１（Ｇｌｎ）を欠く、プロセシングされたプロテアーゼ領域の全長に相当する。配列番号１０は、この観察された全長ＢｓｐＭ０４０３３タンパク質（プラスミドｐＢＮ−ＢｓｐＭ０４０３３により発現）（３８１残基のアミノ酸）を示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＧＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＮＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＳＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＰＮＬＳＶＳＮＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳＧＧＰＳＮＩＴＥＴＳＩＳＴＤＲＦＹＶＱＲＧＱＮＶＴＳＴＡＱＶＴＮＥＮＧＱＧＬＡＮＡＴＶＴＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＳＳＧＦＡＳＷＴＶＧＴＳＧＡＴＡＴＧＴＹＳＶＥＡＳＳＳＬＱＧＹＱＧＳＳＡＳＴＳＦＦＶＹ。
【０２３９】
サンプルを保管して、最も主要なタンパク質サンプル（約２８ｋＤａ）の配列を決定し、配列番号１１に記載の配列である、Ｃ末端切断型に対応させた。このポリペプチドは、予測されるプロ領域に続くＧｌｎ１を欠き、ペプチダーゼＳ８ファミリードメインの長さと一致している。
【０２４０】
配列番号１１には、観察されたプロテアーゼＢｓｐＭ０４０３３（２７６残基のアミノ酸）の主要型のアミノ酸配列を示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＧＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＮＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＳＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＰＮＬＳＶＳＮＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳ。
【０２４１】
（実施例６）
セリンプロテアーゼＢｓｐＷ０１７６５の発見及び同定
バチルス（Bacillus）種ＳＷＴ２１１（Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、産業用途で有用な酵素源候補として選択した。バチルス（Bacillus）種ＳＷＴ２１１により産生される酵素及びこれら酵素をコードする遺伝子を同定するため、合成（ＳＢＳ）法によるＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定法を利用して、バチルス（Bacillus）種ＳＷＴ２１１の完全なゲノムの配列を決定した。ゲノムの配列決定、並びに配列データのアセンブリ及び注釈付はＢａｓｅＣｌｅａｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実施した。ＳＷＴ２１１においてこの方法により同定された遺伝子のうち１つが、様々なその他の細菌のセリンプロテアーゼに対し相同性を示すタンパク質をコードする。この遺伝子の配列、ＢｓｐＷＯ１７６５．ｎを、配列番号１２に示す。
【０２４２】
配列番号１２には、ＢｓｐＷＯ１７６５．ｎ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＣＡＣＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＴＡＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＡＡＧＴＡＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＴＴＡＡＴＣＧＴＡＴＣＧＧＴＡＧＡＡＣＣＧＧＡＴＧＣＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＴＣＡＡＴＡＧＧＡＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＣＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＣＴＣＣＴＣＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＡＧＧＧＣＴＣＧＴＴＴＡＣＣＴＣＡＴＡＧＡＡＴＡＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＴＴＴＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＧＣＣＡＴＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＧＧＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＴＡＴＴＡＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＣＡＧＴＡＡＴＧＴＡＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＴＡＴＴＧＧＡＴＡＣＴＧＧＡＡＴＡＧＡＴＴＣＴＡＧＣＣＡＴＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＴＡＧＡＴＡＣＴＡＧＴＣＴＴＧＧＡＡＧＡＡＧＣＴＡＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＴＣＡＡＧＧＴＣＡＴＧＧＡＡＣＧＣＡＣＧＴＡＧＣＡＧＧＴＡＣＧＡＴＡＧＣＡＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＧＴＡＴＣＧＧＧＴＧＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＣＡＡＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＧＴＴＴＴＡＴＡＴＧＣＴＡＣＡＡＧＴＡＴＴＧＧＴＧＣＡＧＡＣＧＴＣＡＴＴＡＡＴＡＴＧＴＣＴＴＴＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＴＡＴＡＡＴＣＡＡＧＧＴＴＴＣＡＡＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＧＡＡＴＧＧＡＴＣＡＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＧＧＴＡＡＴＧＡＴＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＡＣＴＴＣＴＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＧＣＴＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＡＡＣＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧＴＣＴＴＧＡＧＴＴＡＡＴＧＧＣＡＣＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＴＡＴＣＴＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＡＡＣＧＴＴＡＴＣＡＧＧＴＡＣＡＴＣＴＡＴＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＴＣＣＧＡＡＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＴＡＴＴＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＡＡＡＣＧＧＴＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＣＧＡＡＴＡＣＡＧＴＴＧＴＴＴＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＡＡＧＴＧＴＴＴＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＴＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＴＡＡＴＴＧＧＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＴＴＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＴＧＡＣＧＧＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＣＴＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＣＴＡＣＴＴＣＣＴＴＴＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＡＣＧＧＡＴＧＴＴＴＣＡＡＣＧＡＡＴＡＧＴＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＡＡＴＧＴＡＡＣＣＡＴＡＴＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＡＴＣＡＡＡＴＧＣＴＡＣＧＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＡＡＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＴＡＡＴＡＧＣＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＡＡＣＧＡＧＴＡＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＴＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＡＣＡＡＴＣＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴ。
【０２４３】
ＢｓｐＷＯ１７６５．ｎ遺伝子によりコードされるプレプロ酵素を配列番号１３に示す。このタンパク質は、Ｎ−末端に、ＳｉｇｎａｌＰ−ＮＮにより予測される通りの長さ２３残基のアミノ酸のシグナルペプチドを有する（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００７）２：９５３〜９７１）。配列番号１３において、このシグナルペプチド配列には下線を引き、ボールド体で示す。シグナルペプチドが存在することから、このセリンプロテアーゼは分泌酵素であることが示唆される。この酵素は、（バチルス・ボゴリエンシス（Bacillus bogoriensis）プロテアーゼ中のプロ成熟型接合部に基づいて：国際公開第２０１２１７５７０８号、配列番号４参照）、１４２残基のアミノ酸（配列番号１３中のイタリック）であることが予測されるプロ配列を有する。プロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＢｓｐＷＯ１７６５、４８８残基のアミノ酸）を配列番号１４に示す。ＢｓｐＷＯ１７６５の成熟鎖は、Ｎ末端のペプチダーゼＳ８ファミリードメインと、Ｃ末端の未知の機能を有するドメインからなる。ＢｓｐＷＯ１７６５プロテアーゼの触媒性ペプチダーゼドメインの配列は、２７０残基のアミノ酸であると予測され、配列番号１５に示される。
【０２４４】
配列番号１３には、セリンプロテアーゼ前駆体ＢｓｐＷＯ１７６５の予測されるアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000006
【０２４５】
配列番号１４には、成熟型プロテアーゼＢｓｐＷＯ１７６５の予測されるアミノ酸配列を示す（３８２残基のアミノ酸）。ＭＨＳＮＱＥＷＨＹＧＭＩＮＡＰＤＡＷＧＩＴＴＧＤＳＮＶＴＩＡＶＬＤＴＧＩＤＳＳＨＳＳＬＳＮＬＶＤＴＳＬＧＲＳＹＶＧＧＳＰＥＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＡＶＳＧＶＭＱＤＡＴＬＩＳＶＫＶＬＧＤＤＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＶＬＹＡＴＳＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＧＦＮＤＡＩＤＴＡＶＡＮＧＳＶＶＩＡＡＳＧＮＤＧＲＡＳＩＳＹＰＡＡＹＤＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＳＧＮＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＳＩＹＳＴＹＰＮＧＱＹＲＴＬＳＧＴＳＭＡＡＰＨＡＡＧＶＡＧＬＶＲＡＶＮＰＮＬＳＶＡＥＶＲＮＩＬＡＤＴＡＱＹＡＧＳＳＨＱＹＧＮＧＩＶＤＡＦＡＡＶＱＡＡＧＧＳＧＧＴＰＳＰＧＶＴＮＴＶＶＳＴＤＫＳＶＹＥＲＧＥＱＶＴＭＴＴＴＶＴＤＥＧＧＮＡＬＱＤＡＴＶＮＹＴＩＴＲＰＮＧＳＴＶＴＮＴＴＴＴＮＳＮＧＩＡＴＷＩＩＧＳＮＳＱＴＡＬＧＴＹＤＶＴＡＥＴＳＬＳＧＹＱＴＳＳＤＴＴＳＦＳＦＳＤＱＡＱＴＱＱＴＶＴＤＶＳＴＮＳＳＹＹＡＲＧＱＮＶＴＩＳＡＥＶＫＤＱＤＧＥＡＬＳＮＡＴＶＳＦＴＩＩＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＳＡＧＶＡＴＷＴＶＳＴＳＳＧＴＡＲＧＴＹＥＶＴＡＥＳＳＹＳＴＹＤＧＳＳＤＴＴＩＦＹＶＹ。
【０２４６】
配列番号１５には、ＢｓｐＷＯ１７６５プロテアーゼのペプチダーゼＳ８ファミリードメインの予測されるアミノ酸配列を示す（２７０残基のアミノ酸）。ＭＨＳＮＱＥＷＨＹＧＭＩＮＡＰＤＡＷＧＩＴＴＧＤＳＮＶＴＩＡＶＬＤＴＧＩＤＳＳＨＳＳＬＳＮＬＶＤＴＳＬＧＲＳＹＶＧＧＳＰＥＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＡＶＳＧＶＭＱＤＡＴＬＩＳＶＫＶＬＧＤＤＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＶＬＹＡＴＳＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＧＦＮＤＡＩＤＴＡＶＡＮＧＳＶＶＩＡＡＳＧＮＤＧＲＡＳＩＳＹＰＡＡＹＤＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＳＧＮＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＳＩＹＳＴＹＰＮＧＱＹＲＴＬＳＧＴＳＭＡＡＰＨＡＡＧＶＡＧＬＶＲＡＶＮＰＮＬＳＶＡＥＶＲＮＩＬＡＤＴＡＱＹＡＧＳＳＨＱＹＧＮＧＩＶＤＡＦＡＡＶＱ。
【０２４７】
（実施例７）
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３のプロテアーゼ活性
ＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼのプロテアーゼ活性を、ジメチルカゼイン（ＤＭＣ）基質の加水分解を測定することによって試験した。ＤＭＣアッセイに使用した試薬溶液は次の通りとした。１００ｍＭ炭酸ナトリウムｐＨ９．５中、２．５％ジメチルカゼイン（ＤＭＣ、Ｓｉｇｍａ）、試薬Ａ中、０．０７５％  ＴＮＢＳＡ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。試薬Ａ：１５ｍＬの４Ｎ  ＮａＯＨ中に４５．４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（Ｍｅｒｃｋ）を入れ、ＭＱ水で最終容量１０００ｍＬにしたもの、希釈液：１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−８０。プロテアーゼ上清を、アッセイに適当な濃度まで希釈液で希釈した。９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に９５μＬのＤＭＣ基質を満たし、その後、５μＬの希釈したプロテアーゼ上清を加えた。次に、１００μＬの試薬Ａ中ＴＮＢＳＡを、ゆっくり混合しながら加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを、室温にて動態解析モードで使用して、４０５ｎｍで５分間にわたって活性を測定した。プロテアーゼを含まないブランクの吸光度を値から引いた。活性は、ｍＯＤ／分で示した。ＢｓｐＡＧ００２９６のプロテアーゼ活性曲線を図３に、ＢｓｐＭ０４０３３を図４に示す。ＤＭＣアッセイを用いて、ＢｓｐＡＧ００２９６プロテアーゼの比活性が５６ｍＯＤ／分／ｐｐｍ、ＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼが７１ｍＯＤ／分／ｐｐｍであることがわかった。同じアッセイ条件下において、ＧＧ３６及びＢＰＮ’プロテアーゼの比活性は、それぞれ５４及び２３ｍＯＤ／分／ｐｐｍであることがわかった。
【０２４８】
（実施例８）
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼのｐＨ特性
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼのタンパク質分解活性についてのｐＨ依存性を、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭアセテート／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液中でアゾ−カゼインを基質として用いて試験した。４〜１２のｐＨにおいて、ｐＨを１ずつ上昇させて活性を測定した。Ｐｒｏｔａｘｙｍｅ  ＡＫ錠剤（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）１つを、適当な緩衝液１．９ｍＬと磁石と共にガラス製試験管に加え、続いて、電磁撹拌機を取り付けた温度制御した水浴中で、４０℃にて５分間穏やかに水和させた。新たに調製したプロテアーゼサンプル（アッセイに適当な濃度まで脱イオン水で希釈）１００マイクロリットルを、予水和させた基質に加え、４０℃で１０分間反応を行った。反応を止めるために１０ｍＬの２％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ１２を加え、溶液を混合し、直ちにサンプルをＷｈａｔｍａｎの１番濾紙を通して濾過した。上清を回収し、上清の５９０ｎｍにおける吸光度を測定し、反応生成物を定量した。緩衝液のみのコントロールの吸光度を引き、得られた値を、至適ｐＨにおける活性を１００％として、相対活性の割合に変換した。このアッセイ条件下において、ＢｓｐＡＧ００２９６は、６〜１２のｐＨ範囲にわたり≧５０％の活性を維持していると測定され、ＢｓｐＭ０４０３３は、７〜１２のｐＨ範囲にわたり≧５０％の活性を維持していると測定された。
【０２４９】
（実施例９）
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼの温度特性
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼのタンパク質分解活性についての温度依存性を、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭアセテート／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ／ＣＨＥＳ緩衝液、ｐＨ９中でアゾ−カゼインを基質として用いて試験した。３０℃〜８０℃の温度において、１０℃ずつ上昇させて活性を測定した。Ｐｒｏｔａｘｙｍｅ  ＡＫ錠剤（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）１つを、適当な緩衝液１．９ｍＬと磁石と共にガラス製試験管に加え、続いて、電磁撹拌機を取り付けた温度制御した水浴中で、設定した温度にて５分間穏やかに水和させた。新たに調製したプロテアーゼサンプル（アッセイに適当な濃度まで脱イオン水で希釈）１００μＬを、予水和させた基質に加え、３０℃〜８０℃の温度で１０分間反応を行った。反応を止めるために１０ｍＬの２％ｗ／ｖ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ１２を加え、溶液を混合し、直ちにＷｈａｔｍａｎの１番濾紙を通して濾過した。上清を回収し、上清の５９０ｎｍにおける吸光度を測定し、反応生成物を定量した。各サンプルの値から、緩衝液のみのコントロールの吸光度を引き、得られた値を、至適温度における活性を１００％として、相対活性の割合に変換した。このアッセイ条件下において、ＢｓｐＡＧ００２９６は、５５〜７５℃の範囲にわたり≧５０％の活性を維持していると測定され、ＢｓｐＭ０４０３３は、５５〜８０℃の範囲にわたり≧５０％の活性を維持していると測定された。
【０２５０】
（実施例１０）
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３のクリーニング性能
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３プロテアーゼのクリーニング性能を、洗濯系用途に関してはＢＭＩ（綿に血液／牛乳／インクを染みこませたもの）布見本小片（ＥＭＰＡ−１１６、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び食器系の用途に関しては卵黄（ポリアクリル布に卵黄を染みこませ、エージングし、カーボンブラック染料で染色したもの）布見本小片ＰＡＳ−３８、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）について試験した。予め打抜き（ＭＴＰに合うように）、予めリンスした布片を含むＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６４１）に、酵素添加に先立ち洗剤を満たした。市販の洗剤を熱失活させて酵素を除去し、表２に記載の通りに添加した。
【０２５１】
強力液体（ＨＤＬ）洗濯用洗剤を９５℃の水浴で４時間加熱し、失活させた。強力乾燥（ＨＤＤ）洗濯用洗剤を、１０％  ｗ／ｖ溶液を調製し、９５℃で４時間加熱することによって失活させた。ＨＤＤ及びＨＤＬ洗剤を４時間加熱後、プロテアーゼ活性は残存しなかった。失活処理後、プロテアーゼ活性を、Ｎ−ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質を用いて試験した。ＡＡＰＦ加水分解アッセイに使用した試薬溶液は次の通りとした。０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含む１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）（Ｔｒｉｓ希釈緩衝液）、１０ｍＭのＣａＣｌ２及び０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．６）（Ｔｒｉｓ／Ｃａ緩衝液）、並びに１６０ｍＭのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ保存溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）。基質の希釈溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのＴｒｉｓ／Ｃａ緩衝液に加え、ウェルをよく混合した。１ｍｇ／ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈液を入れたＭＴＰプレート（Ｃｏｓｔａｒ９０１７）に酵素サンプルを加え、室温で、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを動態モードで使用して、４０５ｎｍで３分間活性をアッセイした。プロテアーゼ活性は、ｍＯＤ／ｍｉｎ１で表した。
【０２５２】
表１に示す最終洗剤洗浄濃度（ｇ／Ｌ）を含む洗浄溶液を作製し、クリーニング性能アッセイに使用した。
【０２５３】
【表２】
0006585698.tif 000007
＊洗剤の供給元：Ｋｉｒｋｌａｎｄ  Ｕｌｔｒａ  ＨＤＤ及びＨＤＬ（Ｓｕｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）は、２０１２年に米国の地方のスーパーマーケットで購入した。ＯＭＯ  ｃｏｌｏｒ  ＨＤＤ及びＯＭＯ  Ｋｌｅｉｎ  ＆  Ｋｒａｃｈｔｉｇ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）は、２０１３年にオランダの地方のスーパーマーケットで購入した。ＧＳＭ−Ｂは、ＷＦＫ  Ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ、ｗｗｗ．ｔｅｓｔｇｅｗｅｂｅ．ｄｅ）から購入し、その組成を表２に示す。
【０２５４】
【表３】
0006585698.tif 000008
【０２５５】
クリーニングアッセイには、希釈バッファー（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−８０）で希釈した１０μＬのプロテアーゼを、洗剤を満たした布見本小片プレートに、最終酵素濃度が０．０４〜１０ｐｐｍになり、最終体積が２００μＬになるまで加えた。ＨＤＬ又はＨＤＤ処方による洗濯クリーニングアッセイを２５℃で１５分間実施し、一方、自動食器洗浄（ＡＤＷ）アッセイは４０℃で３０分間実施した。
【０２５６】
インキュベート後、１００μＬの上清を新しいＭＴＰ（Ｋｉｓｋｅｒ  Ｇ０８０−Ｆ）に移しＥＭＰＡ−１１６布片については６００ｎｍ、又はＰＡＳ−３８布片については４０５ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーを用い吸光度を読み取った。緩衝液のみのコントロールから得られた吸光度を引き、６００ｎｍ（ＨＤＬ及びＨＤＤ洗剤について）、並びに４０５ｎｍ（ＡＤＷ洗剤について）で得られたＯＤ値をプロテアーゼ濃度の関数としてプロットした。このデータをラングミュア曲線に代入した。ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３のクリーニング性能を、それぞれ図５〜７、及び図８〜１０にグラフで示す。
【０２５７】
（実施例１１）
プロテアーゼの安定性評価
ＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、Ｂ．種ＮＮ０１８１３２（国際公開第２０１２１７５７０８号−００２）全長配列（配列番号１６）及び切断型（配列番号１７）、ＧＧ３６（配列番号１８）、並びにＦＮＡ（配列番号１９）プロテアーゼの安定性を、様々な条件下で決定した。
【０２５８】
配列番号１６には、全長Ｂ．種ＮＮ０１８１３２プロテアーゼの配列を示す。ＬＭＨＮＮＱＲＷＨＹＥＭＩＮＡＰＱＡＷＧＩＴＴＧＳＳＮＶＲＩＡＶＬＤＴＧＩＤＡＮＨＰＮＬＲＮＬＶＤＴＳＬＧＲＳＦＶＧＧＧＴＧＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＱＮＡＲＬＩＰＶＫＶＬＧＤＮＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＩＬＹＡＡＳＩＮＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＤＳＧＭＮＮＡＩＮＴＡＶＳＳＧＴＬＶＩＡＡＳＧＮＤＧＲＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＮＡＩＡＶＧＳＶＴＳＮＲＴＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＹＰＮＧＱＦＲＴＬＳＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＧＬＩＫＳＡＮＰＮＬＳＶＴＱＶＲＮＩＬＲＤＴＡＱＹＡＧＳＳＮＱＹＧＹＧＩＶＮＡＹＡＡＶＱＡＡＧＧＧＡＶＳＹＥＴＮＴＳＶＳＴＮＱＳＴＹＹＲＧＮＮＶＴＭＴＡＩＶＴＤＱＮＮＳＲＬＱＧＡＴＶＮＦＴＩＴＲＰＮＧＴＴＶＴＮＡＴＴＴＮＳＳＧＶＡＴＷＴＩＧＳＮＳＳＴＡＶＧＴＹＱＶＲＡＱＴＴＹＰＮＹＱＳＳＳＡＴＴＳＦＲＬＱ。
【０２５９】
配列番号１７には、切断型Ｂ．種ＮＮ０１８１３２プロテアーゼの配列を示す。ＭＨＮＮＱＲＷＨＹＥＭＩＮＡＰＱＡＷＧＩＴＴＧＳＳＮＶＲＩＡＶＬＤＴＧＩＤＡＮＨＰＮＬＲＮＬＶＤＴＳＬＧＲＳＦＶＧＧＧＴＧＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＱＮＡＲＬＩＰＶＫＶＬＧＤＮＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＩＬＹＡＡＳＩＮＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＤＳＧＭＮＮＡＩＮＴＡＶＳＳＧＴＬＶＩＡＡＳＧＮＤＧＲＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＮＡＩＡＶＧＳＶＴＳＮＲＴＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＹＰＮＧＱＦＲＴＬＳＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＧＬＩＫＳＡＮＰＮＬＳＶＴＱＶＲＮＩＬＲＤＴＡＱＹＡＧＳＳＮＱＹＧＹＧＩＶＮＡＹＡＡＶＱＡＡＧＧ。
【０２６０】
配列番号１８には、ＧＧ３６プロテアーゼの配列を示す。ＡＱＳＶＰＷＧＩＳＲＶＱＡＰＡＡＨＮＲＧＬＴＧＳＧＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩＳＴＨＰＤＬＮＩＲＧＧＡＳＦＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶＬＧＡＳＧＳＧＳＶＳＳＩＡＱＧＬＥＷＡＧＮＮＧＭＨＶＡＮＬＳＬＧＳＰＳＰＳＡＴＬＥＱＡＶＮＳＡＴＳＲＧＶＬＶＶＡＡＳＧＮＳＧＡＧＳＩＳＹＰＡＲＹＡＮＡＭＡＶＧＡＴＤＱＮＮＮＲＡＳＦＳＱＹＧＡＧＬＤＩＶＡＰＧＶＮＶＱＳＴＹＰＧＳＴＹＡＳＬＮＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＡＡＡＬＶＫＱＫＮＰＳＷＳＮＶＱＩＲＮＨＬＫＮＴＡＴＳＬＧＳＴＮＬＹＧＳＧＬＶＮＡＥＡＡＴＲ。
【０２６１】
配列番号１９には、ＦＮＡプロテアーゼ（ＢＰＮ’Ｙ２１７Ｌ）の配列を示す。ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＨＰＤＬＫＶＡＧＧＡＳＭＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＮＮＳＨＧＴＨＶＡＧＴＶＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡＰＳＡＳＬＹＡＶＫＶＬＧＡＤＧＳＧＱＹＳＷＩＩＮＧＩＥＷＡＩＡＮＮＭＤＶＩＮＭＳＬＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰＳＶＩＡＶＧＡＶＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＤＶＭＡＰＧＶＳＩＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＬＮＧＴＳＭＡＳＰＨＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＨＰＮＷＴＮＴＱＶＲＳＳＬＥＮＴＴＴＫＬＧＤＳＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ。
【０２６２】
安定性を、設定した温度でインキュベートした後に残存するタンパク質分解活性を測定することによって、以下に示す３種類のストレス条件下で試験した。
１．ＬＡＳ／ＥＤＴＡ：０．０２％  ＬＡＳ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）中２．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０
２．Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０
３．ＯＭＯ  ＨＤＬ：１０％  ＯＭＯ  Ｋｌｅｉｎ  ＆  Ｋｒａｃｈｔｉｇ（使用前にプロテアーゼを失活）
【０２６３】
ストレス条件では、希釈した酵素サンプルを、９６ウェルＰＣＲプレート中でストレス緩衝液／洗剤に混合し、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃及び７５℃で２０分間、Ｔｅｔｒａｄ２  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを用いてインキュベートした。非ストレス条件では、酵素をストレス媒体と混合した直後にアッセイし、ベースライン（初期活性）を確立した。ストレス及び非ストレス条件下のプロテアーゼ活性を、上記の、ＡＡＰＦ−ｐＮＡ（ＯＭＯ  ＨＤＬ）又はＤＭＣ（ＬＡＳ／ＥＤＴＡ及びＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ）基質のいずれかの加水分解アッセイによって測定した。各温度における非ストレス時の活性に対するストレス時の活性の比をとり、１００を乗じて、残存活性パーセントを算出した。様々な温度で実施した各条件における各プロテアーゼの残存活性パーセントを表３〜５に示す。
【０２６４】
【表４】
0006585698.tif 000009
【０２６５】
【表５】
0006585698.tif 000010
【０２６６】
【表６】
0006585698.tif 000011
【０２６７】
（実施例１２）
更なるＢ．種セリンプロテアーゼの同定
別のＢ．種のゲノムを配列決定することによって、更なるサブチリシンを同定した。Ｂ．種ＳＷＴ８１（ＢｓｐＡＡ０２８３１）、Ｂ．種ＳＷＴ４（ＳＷＴ４＿１１１０１１２）、Ｂ．種ＳＷＴ２２（ＳＷＴ２２＿１１８１５６６）、Ｂ．種ＳＷＴ３２（ＳＷＴ３２＿１２１４６０７）、Ｂ．種ＳＷＴ４０（ＳＷＴ４０＿１２３７８４２）、Ｂ．種ＳＷＴ４１（ＳＷＴ４１＿１４３１４８１）、Ｂ．種ＳＷＴ７７（ＳＷＴ７７＿１３３９３９４）、及びＢ．種ＳＷＴ１２３（ＳＷＴ１２３＿１４１８５６１）をＤｕＰｏｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから得た。ゲノムの配列決定、アセンブリ及び注釈付は、本質的に実施例２に記載されるものとした。全てのゲノムは、ＢｓｐＡＧ００２９６及びＢｓｐＭ０４０３３に相同なタンパク質をコードしていた。
【０２６８】
ＢｓｐＡＡ０２８３１のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＢｓｐＡＡ０２８３１、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２６９】
配列番号２０には、ＢｓｐＡＡ０２８３１のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000012
【０２７０】
ＢｓｐＡＡ０２８３１のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２１に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＢｓｐＡＡ０２８３１、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２７１】
配列番号２１には、ＢｓｐＡＡ０２８３１のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000013
【０２７２】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＢｓｐＡＡ０２８３１、３８１残基のアミノ酸）を配列番号２２に示す。ＭＨＮＮＱＲＷＨＹＥＭＩＮＡＰＱＡＷＮＩＴＴＧＳＲＮＶＲＩＡＶＬＤＴＧＩＤＡＮＨＰＮＬＲＮＬＶＮＴＳＬＧＲＳＦＶＧＧＧＴＧＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＱＮＡＴＬＩＰＶＫＶＬＧＤＮＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＩＬＹＡＡＳＶＮＳＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＳＱＧＭＤＤＡＩＲＴＡＶＳＳＧＴＩＶＶＡＡＴＧＮＤＳＲＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＮＲＴＲＳＳＦＳＮＹＧＱＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＹＰＮＧＱＦＲＴＬＳＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＧＬＩＲＡＡＮＰＮＩＳＶＳＥＡＲＳＩＬＱＮＴＡＱＹＡＧＳＦＮＱＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＲＡＡＲＧＱＳＱＱＰＳＹＥＴＮＴＴＶＳＴＮＡＳＳＹＲＲＧＱＳＶＴＶＲＡＤＶＶＤＱＤＧＲＡＬＡＮＳＴＶＱＦＴＩＴＲＰＮＧＴＴＶＴＮＴＡＴＴＮＮＳＧＶＡＴＷＴＩＡＴＳＳＳＴＡＲＧＴＹＧＶＱＡＡＴＳＬＳＧＹＥＧＳＴＡＴＴＳＦＳＶＮ。
【０２７３】
ＳＷＴ４のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２３に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ４、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２７４】
配列番号２３には、ＳＷＴ４のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000014
【０２７５】
ＳＷＴ４のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２４に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ４、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２７６】
配列番号２４には、ＳＷＴ４のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000015
【０２７７】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ４、３８１残基のアミノ酸）を配列番号２５に示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＧＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＮＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＶＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＳＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＰＮＬＳＶＳＮＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳＧＤＰＳＮＩＴＥＴＳＩＳＴＤＲＦＹＶＱＲＧＱＮＶＴＳＴＡＱＶＴＮＥＮＧＱＧＬＡＮＡＴＶＴＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＳＳＧＦＡＳＷＴＶＧＴＳＧＡＴＡＴＧＴＹＳＶＥＡＳＳＳＬＱＧＹＱＧＳＳＡＳＴＳＦＦＶＹ。
【０２７８】
ＳＷＴ２２のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２６に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ２２、４８８残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２７９】
配列番号２６には、ＳＷＴ２２のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000016
【０２８０】
ＳＷＴ２２のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２７に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ２２、４８８残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２８１】
配列番号２７には、ＳＷＴ２２のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000017
【０２８２】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ２２、４８８残基のアミノ酸）を配列番号２８に示す。ＭＨＲＮＱＥＷＨＹＧＭＩＮＡＰＤＡＷＧＩＴＴＧＳＳＮＶＲＭＡＶＬＤＴＧＩＤＳＳＨＰＳＬＲＮＬＶＤＴＳＬＧＲＳＹＶＧＧＮＰＥＤＲＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＮＶＳＧＶＭＱＮＡＳＬＩＳＶＫＶＬＧＤＤＧＳＧＳＴＹＧＩＱＱＧＶＬＹＡＡＳＩＮＳＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＳＱＧＦＳＤＡＩＤＴＡＶＡＮＧＴＶＶＩＡＡＳＧＮＤＧＲＡＳＩＳＹＰＡＡＹＤＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＳＧＳＲＳＮＦＳＮＹＧＮＧＬＥＬＭＡＰＧＳＳＩＹＳＴＹＰＮＧＱＹＲＴＬＳＧＴＳＭＡＡＰＨＡＡＧＶＡＧＬＶＲＡＶＤＰＳＬＳＶＳＱＶＲＧＩＬＡＤＴＡＱＹＡＧＳＳＨＱＹＧＮＧＩＶＤＡＹＡＡＶＱＡＡＧＧＳＧＧＡＰＡＰＳＥＴＮＴＳＶＳＴＮＧＳＶＦＥＲＧＤＤＶＴＭＴＡＳＶＴＤＤＮＧＮＧＬＱＧＡＡＶＮＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＶＴＮＴＡＴＴＮＳＳＧＮＡＴＷＴＩＧＳＮＳＱＴＡＬＧＴＹＥＶＴＡＥＴＴＬＳＧＹＥＳＳＳＤＴＴＳＦＳＦＳＮＱＡＱＴＨＱＴＶＴＤＶＳＴＮＳＮＹＹＡＲＧＱＮＶＴＶＳＡＥＶＲＤＱＤＧＡＶＬＳＮＡＴＶＳＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＶＴＮＴＧＡＴＮＳＡＧＶＡＴＷＴＶＳＴＳＧＡＴＡＴＧＴＹＱＶＴＡＥＴＴＬＴＮＹＤＧＳＳＤＳＴＳＦＹＶＹ。
【０２８３】
ＳＷＴ３２のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号２９に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ３２、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２８４】
配列番号２９には、ＳＷＴ３２のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000018
【０２８５】
ＳＷＴ３２のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３０に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ３２、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２８６】
配列番号３０には、ＳＷＴ３２のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000019
【０２８７】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ３２、３８１残基のアミノ酸）を配列番号３１に示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＧＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＮＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＳＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＰＮＬＳＶＳＤＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳＧＧＰＳＮＩＴＥＴＳＩＳＴＤＲＦＹＶＱＲＧＱＮＶＴＳＴＡＱＶＴＮＥＮＧＱＧＬＡＮＡＴＶＴＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＧＳＧＦＡＳＷＴＶＧＴＳＧＡＴＡＴＧＴＹＳＶＥＡＳＳＳＬＱＧＹＱＧＳＳＡＳＴＳＦＦＶＹ。
【０２８８】
ＳＷＴ４０のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３２に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ４０、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２８９】
配列番号３２には、ＳＷＴ４０のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000020
【０２９０】
ＳＷＴ４０のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３３に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ４０、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２９１】
配列番号３３には、ＳＷＴ４０のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000021
【０２９２】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ４０、３８１残基のアミノ酸）を配列番号３４に示す。ＭＨＮＮＱＲＷＨＹＥＭＩＮＡＰＱＡＷＮＶＴＴＧＳＲＮＶＲＩＡＶＬＤＴＧＩＤＡＮＨＰＮＬＲＮＬＶＮＴＳＬＧＲＳＦＶＧＧＧＴＧＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＱＮＡＴＬＩＰＶＫＶＬＧＤＮＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＩＬＹＡＡＳＶＮＳＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＳＱＧＭＤＤＡＩＲＴＡＶＳＳＧＴＩＶＶＡＡＴＧＮＤＳＲＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＮＲＴＲＳＳＦＳＮＹＧＱＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＹＰＮＧＱＦＲＴＬＳＧＴＳＭＡＴＰＨＶＡＧＶＡＧＬＩＲＡＡＮＰＮＩＳＶＡＥＡＲＳＩＬＱＮＴＡＱＹＡＧＳＦＮＱＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＲＡＡＲＧＱＴＥＱＰＲＹＥＴＮＴＴＶＳＴＮＡＳＴＹＲＲＧＱＳＶＴＶＲＡＤＶＶＤＱＤＧＲＡＬＡＮＳＴＶＱＦＴＩＴＲＰＮＧＴＴＶＴＮＴＡＴＴＮＳＳＧＶＡＴＷＴＩＧＴＳＳＳＴＡＲＧＴＹＧＶＱＡＡＴＳＬＳＧＹＥＧＳＴＡＴＴＳＦＶＶＮ。
【０２９３】
ＳＷＴ４１のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３５に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ４１、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２９４】
配列番号３５には、ＳＷＴ４１のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000022
【０２９５】
ＳＷＴ４１のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３６に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ４１、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２９６】
配列番号３６には、ＳＷＴ４１のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000023
【０２９７】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ４１、３８１残基のアミノ酸）を配列番号３７に示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＧＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＮＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＳＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＰＮＬＳＶＳＤＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳＧＧＰＳＮＩＴＥＴＳＩＳＴＤＲＦＹＶＱＲＧＱＮＶＴＳＴＡＱＶＴＮＥＮＧＱＧＬＡＮＡＴＶＴＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＧＳＧＦＡＳＷＴＶＧＴＳＧＡＴＡＴＧＴＹＳＶＥＡＳＳＳＬＱＧＹＱＧＳＳＡＳＴＳＦＦＶＹ。
【０２９８】
ＳＷＴ７７のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３８に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ７７、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０２９９】
配列番号３８には、ＳＷＴ７７のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000024
【０３００】
ＳＷＴ７７のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号３９に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ７７、３８１残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０３０１】
配列番号３９には、ＳＷＴ７７のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000025
【０３０２】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ７７、３８１残基のアミノ酸）を配列番号４０に示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＥＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＤＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＡＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＳＮＬＳＶＳＤＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳＧＧＳＧＧＰＳＮＩＴＥＴＳＩＳＴＤＲＹＹＶＱＲＧＱＮＶＴＳＴＡＱＶＴＮＥＮＧＱＡＬＡＮＡＴＶＴＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＳＳＧＶＡＳＷＴＶＧＴＳＧＧＴＡＴＧＴＹＳＶＥＡＳＳＳＬＱＧＹＱＧＳＳＡＳＴＳＦＦＶＹ。
【０３０３】
ＳＷＴ１２３のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号４１に示す。予測されるシグナルペプチド配列は下線であり、プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ１２３、４８８残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０３０４】
配列番号４１は、ＳＷＴ１２３のプレプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000026
【０３０５】
ＳＷＴ１２３のプロ酵素型のアミノ酸配列を配列番号４２に示す。プロ配列はイタリックである。予測される、完全にプロセシングを受けた成熟鎖（ＳＷＴ１２３、４８８残基のアミノ酸）の配列は太字である。
【０３０６】
配列番号４２には、ＳＷＴ１２３のプロ酵素型のアミノ酸配列を示す。
0006585698.tif 000027
【０３０７】
完全にプロセシングを受けた成熟鎖に予測される配列（ＳＷＴ１２３、４８８残基のアミノ酸）を配列番号４３に示す。ＭＨＳＮＱＥＷＨＹＧＭＩＮＡＰＤＡＷＧＩＴＴＧＳＳＮＶＲＩＡＩＬＤＴＧＩＤＳＳＨＰＳＬＲＮＬＶＤＴＧＬＧＲＳＹＶＧＧＳＰＥＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＡＶＳＧＶＭＱＤＡＴＬＩＳＶＫＶＬＧＤＤＧＳＧＳＭＹＧＩＱＱＧＶＬＹＡＡＳＶＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＧＦＳＤＡＩＤＴＡＶＡＮＧＴＶＶＩＡＡＳＧＮＤＧＲＡＳＩＳＹＰＡＡＹＤＧＡＩＡＶＧＳＶＴＳＳＧＮＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＳＩＹＳＴＹＰＮＧＱＹＲＴＬＳＧＴＳＭＡＡＰＨＡＡＧＶＡＧＬＶＲＡＶＮＰＮＬＳＶＡＥＶＲＳＩＬＡＤＴＡＱＹＡＧＳＴＹＱＹＧＮＧＩＶＤＡＦＡＡＶＱＡＡＧＧＳＧＧＴＰＳＰＧＶＴＮＴＶＶＳＴＤＫＳＶＹＥＲＧＤＱＶＴＭＴＡＴＶＴＤＥＤＧＮＡＬＱＧＡＳＶＮＹＴＩＴＲＰＮＧＳＤＶＴＮＴＡＴＴＮＴＮＧＩＡＴＷＴＩＧＳＮＳＱＴＡＩＧＴＹＤＶＴＡＥＳＳＬＳＧＹＥＳＳＴＤＴＴＳＦＲＦＳＤＱＡＱＳＱＱＴＶＴＤＶＳＴＮＳＳＹＹＡＲＧＱＮＶＴＩＳＡＥＶＴＤＱＤＧＡＡＬＳＮＡＴＶＳＦＴＩＴＲＰＮＧＳＴＬＴＮＴＡＴＴＮＳＡＧＶＡＳＷＴＶＳＴＳＳＧＴＡＲＧＴＹＥＶＴＡＥＳＴＹＳＴＹＥＧＳＳＤＴＴＳＦＹＶＹ。
【０３０８】
（実施例１３）
相同なプロテアーゼの同定
ＢｓｐＡＧ００２９６（配列番号３、２７４残基のアミノ酸）、ＢｓｐＭ０４０３３（配列番号１１、２７６残基のアミノ酸）、及びＳＷＴ７７（配列番号４０、３８１残基のアミノ酸）の予測される成熟型のアミノ酸配列を、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質データベースに対して、ＢＬＡＳＴ検索した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９〜４０２，１９９７）。クエリ配列としてそれぞれ配列番号３、配列番号７、及び配列番号４０を用いて、検索パラメーターをデフォルト値に設定して、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｑｕｅｓｔ  Ｐａｔｅｎｔデータベースに対する類似性検索を行った。ＢｓｐＡＧ００２９６についての検索結果のサブセットを表６及び７に、ＢｓｐＭ０４０３３について表８及び９に、ＳＷＴ７７について表１０及び１１に示す。いずれの検索セットに関しても、同一性パーセント（ＰＩＤ）は、ペアワイズアラインメントにおいて、同一残基数をアラインメントした残基の数で除したものとして定義した。「配列長」と称されたカラムは、一覧の登録番号に関連するタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指し、一方「アライメント長」と称されたカラムは、ＰＩＤ計算に使用されたアライメントしたタンパク質配列の長さ（アミノ酸で）を指す。
【０３０９】
【表７】
0006585698.tif 000028
【０３１０】
【表８】
0006585698.tif 000029
【０３１１】
【表９】
0006585698.tif 000030
【０３１２】
【表１０】
0006585698.tif 000031
【０３１３】
【表１１】
0006585698.tif 000032
【０３１４】
【表１２】
0006585698.tif 000033
【０３１５】
以下のサブチリシンのアミノ酸配列についての系統樹を作製した。ＢｓｐＡＧ００２９６（配列番号４）、ＢｓｐＭ０４０３３（配列番号１１）、ＢｓｐＷＯ１７６５（配列番号１５）、ＢｓｐＡＡ０２８３１（配列番号２２）、ＳＷＴ４（配列番号２５）、ＳＷＴ２２（配列番号２８）、ＳＷＴ３２（配列番号３１）、ＳＷＴ４０（配列番号３４）、ＳＷＴ４１（配列番号３７）、ＳＷＴ７７（配列番号４０）、ＳＷＴ１２３（配列番号４３）、Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefaciens）（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＡＡ２４９９０）、Ｂ．レンタス（B. lentus）（ＮＣＢＩ登録番号：Ｐ２９５９９）、Ｂ．種ＳｐｒＣ（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＡＣ４３５８０）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＣＡＪ７０７３１）、Ｂ．種ＮＮ０１８１３２（配列番号１７）及びＢ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（国際公開第２０１２１７５７０８Ａ２号の配列番号４）、Ｂ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０２６６７５１１４．１、Ｂ．チモネンシス（B. timonensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０１０２８３１０６）、及びＰ．デンドリチフォルミス（P. dendritiformis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ００６６７９３２１）。配列をＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｓｕｉｔｅに入力し、近隣結合（ＮＪ）法を用いて樹形図を作成した（Ｓａｉｔｏｕ  ａｎｄ  Ｎｅｉ，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ，４：４０６〜４２５，１９８７）。木構成は、以下のパラメーターを用い算出した：配列距離については木村の相関を用い、ギャップ位置は無視した。ＡｌｉｇｎＸは、図１１に示される系統樹上に表示された分子名に続いて、カッコ内に計算した距離値を表示する。ＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３、Ｂ．種ＮＮ０１８１３２（配列番号１７）及びＢ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（国際公開第２０１２１７５７０８Ａ２号の配列番号４）、Ｂ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０２６６７５１１４．１、Ｂ．チモネンシス（B. Timonensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０１０２８３１０６）、及びＰ．デンドリチフォルミス（P. dendritiformis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ００６６７９３２１）サブチリシンは、全て同じ領域に密集し（図１１に示されるように）、ＷＨＹ系統群を形成する。ＢｓｐＭ０４０３３、ＳＷＴ４、ＳＷＴ３２、及びＳＷＴ７７サブチリシンは、全て同じサブ領域に密集し（図１１に示されるように）、ＳＷＴ７７系統群を形成する。ＢｓｐＡＧ００２９６サブチリシンは、サブ領域に密集し（図１１に示されるように）、ＢｓｐＡＧ００２９６系統群を形成する。ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４０、及びＷＰ０２６６７５１１４サブチリシンは、全て同じサブ領域に密集し（図１１に示されるように）、ＷＰ０２６６７５１１４系統群を形成する。ＢｓｐＷＯ１７６５、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ１２３、及びＳＷＴ２２サブチリシンは、全て同じサブ領域に密集し（図１１に示されるように）、ＳＷＴ２２系統群を形成する。
【０３１６】
（実施例１４）
ＷＨＹ系統群サブチリシンの独自の特徴
ＢｓｐＡＧ００２９６（配列番号４）、ＢｓｐＭ０４０３３（配列番号１１）、ＢｓｐＷＯ１７６５（配列番号１５）、ＢｓｐＡＡ０２８３１（配列番号２２）、ＳＷＴ４（配列番号２５）、ＳＷＴ２２（配列番号２８）、ＳＷＴ３２（配列番号３１）、ＳＷＴ４０（配列番号３４）、ＳＷＴ４１（配列番号３７）、ＳＷＴ７７（配列番号４０）、ＳＷＴ１２３（配列番号４３）、Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefaciens）のＢＰＮ’サブチリシン（ｐｄｂエントリー、２ＳＴＩ）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）のカールスバーグ（ｐｄｂエントリー、１ＣＳＥ）、Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシン（ｐｄｂエントリー、１ＪＥＡ）、Ｂ．種ＮＮ０１８１３２（配列番号１７）、Ｂ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（国際公開第２０１２１７５７０８号−００４）、Ｂ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０２６６７５１１４）、Ｂ．マンナニライティカス（B. mannanilyticus）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０２５０２５８８７）、Ｂ．チモネンシス（B. timonensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０１０２８３１０６）、及びＰ．デンドリチフォルミス（P. dendritiformis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ００６６７９３２１）のプロテアーゼの構造類似性を探索するため、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）ソフトウェア（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）の「アライン」オプションを用いて、構造ベースのアライメントを行い、図１２に示す。アライメントは、従来の配列アライメントに対する追加のガイドとして、保存された構造モチーフを適用する。ＭＯＥの２０１２．１０配布版にある標準的なデフォルトプログラムを用いて、このアライメントを行った。
【０３１７】
図１２に示されるように、サブチリシンＢｓｐＡＧ００２９６、ＢｓｐＭ０４０３３、ＢｓｐＷＯ１７６５、ＢｓｐＡＡ０２８３１、ＳＷＴ４、ＳＷＴ２２、ＳＷＴ３２、ＳＷＴ４０、ＳＷＴ４１、ＳＷＴ７７、ＳＷＴ１２３、Ｂ．種ＮＮ０１８１３２（配列番号１７）、Ｂ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（国際公開第２０１２１７５７０８号−００４）、Ｂ．ボゴリエンシス（B. bogoriensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０２６６７５１１４）、Ｂ．マンナニライティカス（B. mannanilyticus）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０２５０２５８８７）、Ｂ．チモネンシス（B. timonensis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ０１０２８３１０６）、及びＰ．デンドリチフォルミス（P. dendritiformis）（ＮＣＢＩ登録番号：ＷＰ００６６７９３２１）配列の構造アライメントは、三次元構造が存在する（ｐｄｂエントリー、それぞれ２ＳＴ１、１ＣＳＥ及び１ＪＥＡ）サブチリシン（Ｂ．アミロリケファシェンス（B. amyloliquefaciens）のＢＰＮ’、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）のカールスバーグ、及びＢ．レンタス（B. lentus）のサブチリシン）の配列に対して、１ヶ所の挿入と２ヶ所の欠失という共通パターンを示す。１ＪＥＡ及び１ＣＳＥ構造中の残基番号は、サブチリシンＢＰＮ’に対するものであり、ＢｓｐＭ０４０３３及び示されるその他全てのプロテアーゼについての残基番号は、連続する一次配列である。
【０３１８】
これらのＷＨＹ系統群のサブチリシンは、後にＷＨＹ系統群と名付けられる系統群を設定するのに十分な特徴を共有しており、この名称ＷＨＹは、Ｎ末端付近の完全に保存された残基ＷＨＹに由来する（ＢｓｐＭ０４０３３及びこの系統群の他のメンバーにおいてＷは７番目の残基位置）。加えて、ＷＨＹ系統群サブチリシンは、Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシンと共通の欠失を共有しており、そのためこの構造を参照として用いて、ＷＨＹ系統群サブチリシンの特徴の識別から予想される結果を理解する。Ｐ．デンドリチフォルミス（P. dendritiformis）、Ｂ．マンナニライティカス（B. manannilyticus）、Ｂ．チモネンシス（B. timonensis）サブチリシンを除いて、この系統群の全ての他のメンバーは、図１３に示されるモチーフ内のＢｓｐＭ０４０３３の４５〜４７番目に相当する位置に、保存されたＮＬＶ残基を有する。これらＷＨＹ系統群サブチリシンの特徴に共通である他の顕著な点は、モチーフ（図１３）内の欠失１に続く配列ＶＱＧ（ＢｓｐＭ０４０３３中の６３〜６５番目の残基）、及び、欠失２に続く配列ＶＳＧ（ＢｓｐＭ０４０３３中の８０〜８２番目の残基）である。この独特の配列領域の編集により、ＷＨＹ系統群に、その他市販のペプチダーゼＳ８サブチリシンファミリーの酵素とは異なる特徴が付与される。
【０３１９】
図１３では、ＷＨＹ系統群モチーフが、触媒残基Ｄ３３及びＨ６６（ＢｓｐＭ０４０３３の一次配列による残基番号）によってカッコで囲まれている。Ａｓｐ（Ｄ）３３、Ｈｉｓ（Ｈ）６６、及びＳｅｒ（Ｓ）２１６からなる触媒トライアドは、全てのセリンプロテアーゼに共通している。
【０３２０】
Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシン及びその他市販のサブチリシンと比較するとき、Ｄ３３−Ｈ６６モチーフは、全てのＷＨＹ系統群配列に見いだされる共通の挿入（挿入１）及び欠失（欠失１）を組み込んでいる。挿入１の結果、Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシン中の残基ＨＰＤＬＮＩＲＧＧ（３９〜４７）が、ＢｓｐＭ０４０３３中のＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧ（４０〜５２）に置き換わる。欠失１の結果、Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシン中の残基ＶＰＧＥＰＳＴＱＤＧＮＧＨ（５１〜６４）が、ＢｓｐＭ０４０３３中の残基ＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨ（５６〜６６）に置き換わる。ｐｄｂエントリー１ＪＥＡでは、番号はサブチリシンＢＰＮ’に対するものである。サブチリシンＢＰＮ’に対して、Ｂ．レンタス（B. lentus）及びカールスバーグサブチリシンのいずれも、配列中の異なる場所に生じる１残基の欠失を有する（図１３参照）。
【０３２１】
上記ＷＨＹ系統群モチーフの外側に、ＷＨＹ系統群酵素では、第２の共通する欠失（欠失２）が見つかっている。この場合、Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシンの残基ＶＡＧＴＩＡＡＬＮＮＳＩＧＶＬＧＶＡ  ＰＳＡＥＬＹＡＶＫＶ（６８〜９５）が、ＢｓｐＭ０４０３３のＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬ  ＶＰＶＫＶ（７０〜９４）に置換されている。Ｂ．レンタス（B. lentus）等のサブチリシン、並びにＢＰＮ’及びカールスバーグでは、この領域は保存されたカルシウム結合部位を形成する。ＢｓｐＭ０４０３３配列の欠失２に見いだされる残基の改変の結果、対応するカルシウム結合部位がなくなった。
【０３２２】
図１４は、Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシンの構造を用いる、ＷＨＹ系統群のメンバーの構造モデルを示す。Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシン構造を対照として用いて（明灰）、ＷＨＹ系統群モチーフセグメントを黒くハイライトしている。全てのセリンプロテイナーゼに共通する、触媒トライアドのＡｓｐ（Ｄ）３３及びＨｉｓ（Ｈ）６６残基の側鎖を棒状に示す。これらの２つの欠失及び１つの挿入が生じるとされる並んだループも矢印で示す。
【０３２３】
Ｂ．レンタス（B. lentus）サブチリシン、並びにサブチリシンＢＰＮ’及びカールスバーグでは、７０〜９４番目の残基を含むセグメントは、延長したループを形成し、これらサブチリシンのＮ末端にある残基Ａｓｐ４１及び残基Ｇｌｎ２と共に、強力なカルシウム結合部位をもたらす。このカルシウム結合部位は、これらサブチリシンの不可欠な部分である。突然変異誘発によってこのカルシウム結合がなくなると、サブチリシンＢＰＮ’の安定性が実質的に低下する（Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１  ４９３７〜４９４５）。欠失２のせいで、ＢｓｐＭ０４０３３サブチリシンの残基ＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶ（７３〜８３）からなる短縮したループ領域は、カルシウムを結合しなくなると予想される。注目されるのは、Ａｓｐ４１が挿入１の領域に現れ、ＷＨＹ系統群サブチリシンのＮ末端における配列が、成熟型タンパク質のＮ末端において、他のサブチリシンと実質的に異なることである（図１３）。本明細書では、挿入１は、ＷＨＹ系統群プロテアーゼの実質的に異なるＮ末端配列（図１３）と共に、タンパク質安定性に寄与し、上記カルシウム結合ループの欠如を補うと仮定される。サブチリシンＢＰＮ’、カールスバーグ、及びＢ．レンタス（B. lentus）は、欠失２によって失われるループ中のカルシウム結合によって、大いに安定化されることが知られている。ＷＨＹ系統群サブチリシンが、ＥＤＴＡ等のキレート剤を含有する洗剤の存在下で、これらの他のサブチリシンに対して安定化されることが見いだされているため、この非常に魅力的な特徴は、欠失２と変更されたＮ末端との組み合わせで、ＷＨＹ系統群サブチリシンにある独特の配列モチーフによって生じた結果だろう。最後に、その他の共通の欠失である欠失１は、別の隣接するループ（図１４）に生じると見られ、挿入１及び欠失２によってもたらされた改変を補完するために、タンパク質の主鎖を修飾すると仮定され得る。図１４から明らかに、挿入１は、欠失２によって短縮される別のループに隣接するループに起こる。ＷＨＹ系統群の三次元構造では、延長されるループが、欠失２によってもたらされる空洞を補うと仮定される。
【０３２４】
以下に挙げるのは、本明細書で報告したＷＨＹ系統群酵素のうち最も安定なメンバーであるＢｓｐＭ０４０３３と、別の以前に述べられたメンバーであるＢ．種ＮＮ０１８１３２との間の残基の差である。Ｐ３Ｎ、Ｑ６Ｒ、Ｎ１０Ｅ、Ｔ２０Ｉ、Ｓ２６Ｎ、Ｉ２８Ｒ、Ｑ２９Ｉ、Ｈ３８Ａ、Ｑ４１Ｐ、Ｓ４２Ｎ、Ａ４４Ｒ、Ｎ４８Ｄ、Ｑ５３Ｒ、Ｓ５９Ｇ、Ｍ６１Ｇ、Ｈ８５Ｑ、Ｔ８８Ｒ、Ｖ９０Ｉ、Ｎ９６Ｇ、Ｓ９８Ｎ、Ｌ１０３Ｍ、Ｆ１０４Ｙ、Ｔ１０７Ｑ、Ｓ１１３Ａ、Ｄ１１５Ｓ、Ｇ１１７Ｎ、Ｎ１３１Ｄ、Ｑ１３２Ｓ，Ｓ１３３Ｄ、Ａ１３６Ｎ、Ａ１３７Ｎ、Ａ１３８Ｉ、Ｑ１３９Ｎ、Ｎ１４３Ｓ、Ａ１４４Ｓ、Ｓ１４６Ｔ、Ｉ１４７Ｌ、Ａ１５７Ｒ、Ｓ１６８Ｎ、Ｖ１６９Ａ、Ｔ１７８Ｎ、Ｇ１７９Ｒ、Ａ１８０Ｔ、Ｖ２０４Ｙ、Ｎ２０７Ｇ、Ｇ２０８Ｑ、Ｙ２０９Ｆ、Ａ２１０Ｒ、Ｆ２１２Ｌ，Ｓ２１９Ｔ、Ａ２２２Ｖ、Ｎ２２９Ｉ、Ｒ２３０Ｋ、Ａ２３１Ｓ、Ｖ２３１Ａ、Ｓ２３９Ｔ、Ｎ２４０Ｑ、Ａ２４１Ｖ、Ｓ２４３Ｎ、Ｍ２４５Ｌ、Ｑ２４６Ｒ、Ｎ２４７Ｄ、Ｐ２５５Ｌ、Ｔ２５６Ｎ、Ｆ２５７Ｑ、Ｄ２６４Ｎ、Ｎ２６６Ｙ、Ｑ２７１Ａ、及びＳ２７３Ｇ。
【０３２５】
（実施例１５）
ＷＨＹ系統群サブチリシンの結晶構造
２種類の切断型ＷＨＹ系統群構造の三次元構造を、Ｘ線結晶構造解析法を用いて決定した。精製したＢｓｐＡＧ００２９６（配列番号４、２７３残基のアミノ酸）及び切断型ＳＷＴ７７−ｔｒ（配列番号４４、２７３残基のアミノ酸）タンパク質からなる精製したＳＷＴ７７の構造を解析した。２種類のタンパク質はＷＨＹ系統群モチーフを共有しているが、７４．４％が同一にすぎない一次アミノ酸配列を有する。
【０３２６】
単離され結晶化された、切断型ＳＷＴ７７プロテアーゼ（ＳＷＴ７７−ｔｒ、２７３残基のアミノ酸）の配列を配列番号４４に示す。ＭＨＰＮＱＱＷＨＹＮＭＩＮＡＰＱＡＷＥＴＴＴＧＳＳＳＶＩＱＡＶＬＤＴＧＩＤＨＮＨＱＳＬＡＮＬＶＮＴＳＬＧＱＳＦＶＧＧＳＴＭＤＶＱＧＨＧＴＨＶＡＧＴＩＡＳＹＧＳＶＳＧＶＭＨＮＡＴＬＶＰＶＫＶＬＮＤＳＧＳＧＳＬＦＧＩＴＱＧＩＬＹＳＡＤＩＧＡＤＶＩＮＭＳＬＧＧＧＧＹＮＱＳＭＡＥＡＡＱＴＡＶＤＡＧＳＩＶＩＡＡＳＧＮＤＧＡＧＳＩＳＹＰＡＡＹＳＳＶＩＡＶＧＳＶＴＳＴＧＡＲＳＮＦＳＮＹＧＳＧＬＥＬＭＡＰＧＳＮＩＹＳＴＶＰＮＮＧＹＡＴＦＳＧＴＳＭＡＡＰＨＡＡＧＶＡＧＬＭＲＡＶＮＳＮＬＳＶＳＤＡＲＳＩＭＱＮＴＡＱＹＡＧＳＰＴＦＹＧＹＧＩＶＤＡＮＡＡＶＱＱＡＳ。
【０３２７】
ＢｓｐＡＧ００２９６の構造は、分解能１．５Åまで、格子定数、ａ＝１１１．１、ｂ＝６３．３及びｃ＝７２．７Å、β＝９０．０２°の非対称単位中に２つの分子を有する空間群Ｃ２にあると判定された。結晶を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中、１％タンパク質溶液で開始する、ハンギングドロップ法によって得た。リザーバ溶液に、０．８Ｍ  ＮＨ４ＳＯ４、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．１Ｍ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン（ｐＨ６．５）を含めた。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｘ８  Ｐｒｏｔｅｕｍシステム（Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｘｉｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）にデータを収集した。開始モデルとしてのＢ．レンタス（B. lentus）サブチリシン（subtiltin）ｐｄｂエントリー１ＪＥＡの座標による分子置換法を用いて、構造を決定した。プログラムＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６  ４８６〜５０１（２０１０））を利用して、得られた電子密度にＢｓｐＡＧ００２９６の座標を当てはめた。当てはめた後、及び再当てはめして調節した後、ＣＣＰ４ソフトウェアスイートに一般的なデフォルト設定を利用し、ＲＥＦＭＡＣプログラムにより座標を精密化した。最終モデルは立体化学的に良好であり、１．５Åまでの全てのデータについて、Ｒ−ｗｏｒｋは０．１４、Ｒ−ｆｒｅｅは０．１５であった。
【０３２８】
ＳＷＴ７７−ｔｒの構造は、分解能０．１８８Åまで、格子定数、ａ＝１４９．３、ｂ＝８０．１及びｃ＝８２．４Åの非対称単位中に４つの分子を有する空間群Ｐ２１２１２にあると判定された。結晶を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び０．１０Ｍ  塩化ナトリウム、及び１ｍＭ  ＰＭＳＦ中、２０ｍｇ／ｍＬのＳＷＴ−７７−ｔｒタンパク質原液で開始する、ハンギングドロップ法によって得た。リザーバ溶液に、３．５Ｍ  ギ酸ナトリウム＋０．１０Ｍビシン（ｐＨ９．０）を含めた。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｘ８  Ｐｒｏｔｅｕｍにデータを収集した。開始モデルとしてＢｓｐＡＧ００２９６構造のモノマーを用いる分子置換法を用いて、構造を決定した。Ｃｏｏｔソフトウェアパッケージを用いてＳＷＴ７７−ｔｒの座標を当てはめ、ＣＣＰ４ソフトウェアパッケージシステム内のＲＥＦＭＡＣプログラムを用いてモデルを精密化した。最終モデルは立体化学的に良好であり、１．８８Åまでの全てのデータについて、Ｒ−ｗｏｒｋは０．１７、Ｒ−ｆｒｅｅは０．２２であった。
【０３２９】
ＢｓｐＡＧ００２９６及びＳＷＴ７７−ｔｒのモノマーの座標は、１５６７個の共通原子について、全体ＲＭＳ０．３４２Åで重なり合う。これら２つの構造は、非対称単位中に２つ又は４つの分子を含む異なる空間群にあると判定されたが、２つの構造の全体的な折り畳みは、実験誤差内で同一である。これを図１５Ａに示す。
【０３３０】
これは、ＷＨＹ系統群の改変により、他の既知の市販サブチリシンにある強力なカルシウム部位が除かれることを裏付ける。図１５Ｂに示されるように、欠失１及び２を含むセグメントの領域において、ＳＷＴ７７−ｔｒ（黒）の主鎖の折り畳みの模式をＢ．レンタス（B. lentus）サブチリシン（明灰）と比較すると、ＳＷＴ７７−ｔｒ中の７６〜８１番目の残基によって形成されるループ内にカルシウムの電子密度が見つからず、これは、挿入１及び同様にＮ末端セグメントの改変によっていくらか補償されている。
【０３３１】
図１５Ｂに示されるように構造を重ね合わせると、他のプロテアーゼで見られるカルシウム結合を排除する、欠失２及びＮ末端により生じる改変、並びに、挿入１及び欠失１により生じる改変がはっきりと見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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