(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸がんの悪性度及び／又は予後を判定する方法であって、
１）判定対象の大腸がん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
【表１】
0006548184.tif 000006
【表２】
0006548184.tif 000007
２）前記ｍｉＲの発現量から前記表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）判定対象の大腸がん患者における前記表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は判定対象の大腸がん患者における前記表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、判定対象の大腸がん患者における大腸がんの悪性度が高い及び／又は予後が不良であると判定する工程
を含む、前記判定方法。
【請求項２】
相対的発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
大腸がんに対する抗がん剤治療の有効性を判定する方法であって、
１）抗がん剤治療を受けた大腸がん患者から採取された血液における、請求項１に記載の表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から前記表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）抗がん剤治療を受けた大腸がん患者における前記表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は抗がん剤治療を受けた大腸がん患者における前記表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、抗がん剤治療が有効でないと判定する工程
を含む、前記判定方法。
【請求項４】
相対的発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される、請求項３に記載の判定方法。
【請求項５】
アクセッション番号がＭＩＭＡＴ００１９８１０であるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸及びその機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、大腸がんに対する抗がん剤。
【請求項６】
請求項５に記載の抗がん剤を含有する医薬。
【請求項７】
大腸がん患者への請求項５に記載の抗がん剤の投与の適否を判定する方法であって、
１）判定対象の大腸がん患者から採取された血液における、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐの発現量を測定する工程、
２）前記発現量から相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出された相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者におけるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐの相対的発現量と比較する工程、及び
４）判定対象の大腸がん患者における相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合に、判定対象の大腸がん患者は前記抗がん剤の投与が有効であると判定する工程を含む、前記判定方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定するためのバイオマーカーであるマイクロＲＮＡ、これらバイオマーカーを用いたがんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定する方法、前記マイクロＲＮＡ又はこれに対する阻害性核酸を有効成分とする抗がん剤、並びに抗がん剤を選択するための前記マイクロＲＮＡを含むコンパニオン診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な疾患に関連して、特異的な塩基配列を有する微小なＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、以下、ｍｉＲと表す）が注目されている。ｍｉＲは、ゲノムＤＮＡから数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（プライマリｍｉＲ、ｐｒｉ−ｍｉＲ）として転写された後、Ｄｒｏｓｈａによるプロセッシングを受けて約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するプレカーサーｍｉＲ（ｐｒｅ−ｍｉＲ）となり、さらにＤｉｃｅｒによるプロセッシングを受けて２０〜２５塩基程度の二本鎖成熟ｍｉＲとなる。以下、本明細書では、単にｍｉＲと表したときはこの二本鎖成熟ｍｉＲを指す。
【０００３】
ｍｉＲは、多くの場合それぞれｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのヘアピンを挟んだ２つのステム部分に由来し、５’末端側に−５ｐ、また３’末端側に−３ｐという符号が付けられる。
【０００４】
ｍｉＲは、その一方のＲＮＡ鎖が標的遺伝子のｍＲＮＡに作用して標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現を阻害することで、遺伝子発現及び転写調節に関与すると考えられている。最近では、血液中にもｍｉＲが安定的に存在していることが明らかになり、各種がんの悪性度、患者の生命予後の判定への利用に加え、ＨＩＶ感染、ＨＣＶ感染、関節リウマチ、薬物性肝障害、心筋梗塞や脳梗塞のバイオマーカー又は診断薬としてのｍｉＲの利用に関する研究開発が試みられている（例えば非特許文献１）。
【０００５】
一方、がん患者の血液中のインターロイキン６（ＩＬ−６）の発現レベルが、がんの悪性度、がんの予後及び抗がん剤の投与による治療（以下、抗がん剤治療と表す）の有効性と相関することが、幾つかの研究により明らかにされている。具体的には、血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いがん患者については、がんの悪性度は高く、予後も不良で、抗がん剤治療の有効性も低いと報告されている（例えば非特許文献２〜５）。
【０００６】
しかし、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルに関連したｍｉＲの発現プロファイルに関する報告はなく、かかるｍｉＲのがんの悪性度、予後及び／若しくは抗がん剤治療の有効性を判定するための利用又は適切な抗がん剤を選択するためのコンパニオン診断薬としての利用、あるいはかかるｍｉＲ自身又はその阻害性核酸の抗がん剤としての利用に関する報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｏｉｙａｍａら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、２０１３年、第１０５巻、第１２号、第８４９−８５９ページ
【非特許文献２】Ｋｎｕｐｆｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ．、２０１０年、第２５巻、第１３５−１４０ページ
【非特許文献３】Ｍｉｔｓｕｎａｇａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２０１３年、第１０８巻、第２０６３−２０６９ページ
【非特許文献４】Ｇｕｐｔａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、２０１２年、第１０巻、第６３８−６４０ページ
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉら、Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｄ．、２０１２年、第３巻、第４６３−４６９ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルと共に又はこれに代わって利用可能な、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性の判定のためのバイオマーカー、前記ｍｉＲを用いたがんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定する方法、並びに前記ｍｉＲを含むコンパニオン診断薬又は抗がん剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いがん患者の血液中のｍｉＲを網羅的に解析し、幾つかのｍｉＲの発現レベルが上昇又は低下することを見いだし、下記の各発明を完成させた。
（１）表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定するためのバイオマーカー。
【表１】
0006548184.tif 000002
【表２】
0006548184.tif 000003
（２）がんが大腸がんである、（１）に記載のバイオマーカー。
（３）がん患者におけるがんの悪性度及び／又は予後を判定する方法であって、
１）判定対象のがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）判定対象のがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は判定対象のがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、判定対象のがん患者におけるがんの悪性度が高い及び／又は予後が不良であると判定する工程
を含む、前記判定方法。
（４）相対的発現量がグローバルノーマライゼーション法によって算出される、（３）に記載の判定方法。
（５）がんが大腸がんである、（３）又は（４）に記載の判定方法。
（６）がん患者における抗がん剤治療の有効性を判定する方法であって、
１）抗がん剤治療を受けたがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）抗がん剤治療を受けたがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は抗がん剤治療を受けたがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、抗がん剤治療が有効でないと判定する工程
を含む、前記判定方法。
（７）表１に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸、その機能的等価物、表２に示されるｍｉＲ及びその機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも一種以上の核酸を有効成分とする、抗がん剤。
（８）がんが大腸がんである、（７）に記載の抗がん剤。
（９）（７）又は（８）に記載の抗がん剤を含有する医薬。
（１０）表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲを含む、がん治療のためのコンパニオン診断薬。
（１１）（７）又は（８）に記載の抗がん剤の投与対象となる患者を選定するための、（１０）に記載のコンパニオン診断薬。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルと共に又はこれに代えて、血液中のＩＬ−６の発現レベルに関連したｍｉＲを測定することで、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を、がん患者の免疫体質又は免疫状態をも考慮した形で判定することができる。さらには、本発明で特定されるｍｉＲ、これに対する阻害性核酸又はそれらの機能的等価物は、がん細胞内に導入されることでがん細胞の増殖を抑制することができ、いずれも抗がん剤として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である大腸がん患者の血液における各ｍｉＲのグローバルノーマライゼーション値、及び血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い大腸がん患者の血液における各ｍｉＲのグローバルノーマライゼーション値を二次元にプロットした図である。
【図２】血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者一名及び血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者一名の各血液におけるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐの相対的発現量を示すグラフである。
【図３】血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者一名及び血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者一名の各血液におけるｈｓａ−ｍｉＲ−４３１９の相対的発現量を示すグラフである。
【図４】血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者一名及び血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者一名の各血液におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１５３８の相対的発現量を示すグラフである。
【図５】ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸をヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ−１に導入したときの、同細胞の生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を表したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜定義＞
本明細書を通じ、ｍｉＲのＩＤ及びアクセション番号は、ｍｉＲの配列情報等を集めたデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）に定められたものが使用される。各ｍｉＲの塩基配列は、前記データベースに登録されているとおりである。
【００１３】
本明細書における血液は、末梢血、末梢血から常法によって調製される血清及び血漿と交換可能に用いられる。例えば、血液中の発現レベルは、末梢血の発現レベル、血清中の発現レベル又は血漿中の発現レベルを意味する。本発明において好ましい態様は血清である。
【００１４】
血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いとは、例えばＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製のＢＤ  ＯｐｔＥＩＡＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔその他のＩＬ−６測定用試薬を用いた免疫学的測定法において陽性と判定される程度以上にＩＬ−６が発現していることを意味し、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるとは、上記の免疫学的測定法においてＩＬ−６の発現量が検出できない又は実質的に発現しているとは言えないレベル以下であることを意味する。なお、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であることを血液中のＩＬ−６の発現レベルが低いと表すこともある。
【００１５】
本明細書にいう相対的発現量とは、ｍｉＲの発現量を比較解析方法によって補正した値を意味する。かかる方法としては、グローバルノーマライゼーション法、ｑｕａｎｔｉｌｅ法、ｌｏｗｅｓｓ法、７５ｐｅｒｃｅｎｔｉｌｅ法などを挙げることができる。これらの方法は、いかなる検体であっても複数の遺伝子の発現データを一塊とし、遺伝子発現データ群としてとらえた場合には、発現量に差がないという原理を前提とするものである。
【００１６】
相対的発現量は、定量ＰＣＲで測定した結果から算出してもよい。例えば、被験者から採取した血液サンプルについて、市販の定量ＰＣＲキットを使用して本発明にかかるｍｉＲ及び各キットで標準として使用されるコントロールｓｍａｌｌＲＮＡをそれぞれ定量し、各ｍｉＲ発現量をコントロールｓｍａｌｌＲＮＡについて標準化することで、相対的発現量を算出してもよい。
【００１７】
ｍｉＲの発現量は、便宜上、本明細書においては、ＤＮＡマイクロアレイ上に搭載した全遺伝子の発現量の中央値を求め、この中央値が２５になるように補正するグローバルノーマライゼーション法（例えば特開２０１４−００７９９５号公報など）で算出された相対的発現量を採用して説明する。
【００１８】
がんの悪性度とは、がんとしての性質（たち）の悪さ、増殖・転移・再発しやすさの程度を意味する。例えば、がん細胞の増殖又は腫瘍の成長が早い、転移しやすい又は再発しやすい場合には、がんの悪性度は高いなどと表される。またがんの予後とは、がんに罹患した後の、とくに何らかの治療的処置が行われた後のがんの進行又は治療効果などの医学的な経過についての見通しを意味する。例えば、がんが進行しない、がんの進行が遅い、治療効果が期待できる又は認められる場合には予後は良好であるなどと表され、がんが進行する、がんの進行が早い、治療効果が期待できない又は認められない場合には予後は不良であるなどと表される。なお、本明細書においては、がん、腫瘍及び悪性腫瘍はいずれも交換可能に用いられる。
【００１９】
一般に、悪性度の高いがんに関する予後は不良であり、また悪性度の低いがんに関する予後は良好であるという相関が経験的に認められている。本発明においても、「悪性度が高い」は予後が不良であると、また「悪性度が低い」は予後が良好であると、それぞれ交換可能に用いられる。
【００２０】
本発明において、抗がん剤は、制がん剤、抗がん作用を示す化合物その他のがんの治療に有効な物質を含む。
【００２１】
本発明における複数のｍｉＲとは、表１又は表２に示されるｍｉＲの２種以上、好ましくは５種以上、より好ましくは１０種以上、さらに好ましくは２０種以上のｍｉＲをいう。
【００２２】
本発明の第一の態様は、表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲである、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定するためのバイオマーカーに関する。
【００２３】
また本発明の第二の態様は、上記第一の態様に関連して、被験者におけるがんの悪性度及び／又は予後を判定する方法であって、
１）判定対象のがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）判定対象のがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は判定対象のがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、判定対象のがん患者におけるがんの悪性度が高い及び／又は予後が不良であると判定する工程を含む、前記判定方法に関する。
【００２４】
さらに本発明の第三の態様は、がん患者に対する抗がん剤治療の有効性を判定する方法であって、
１）抗がん剤治療を受けたがん患者から採取された血液における、表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上のｍｉＲの発現量を測定する工程、
２）前記ｍｉＲの発現量から表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの少なくとも一種以上の相対的発現量を算出する工程、
３）２）で算出されたｍｉＲの相対的発現量を、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量と比較する工程、並びに
４）抗がん剤治療を受けたがん患者における表１に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して２倍以上である場合、及び／又は抗がん剤治療を受けたがん患者における表２に示されるｍｉＲの相対的発現量が、血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者における相対的発現量に対して１／２以下である場合に、抗がん剤治療が有効でないと判定する工程を含む、前記判定方法に関する。
【００２５】
本発明者らは、大腸がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルを測定するとともに、ＩＬ−６の発現レベルが高い患者群とＩＬ−６の発現レベルが低い患者群それぞれについてＤＮＡマイクロアレイ技術を用いて、血液中に含まれるｍｉＲの発現量を網羅的に解析した。その結果、ＩＬ−６の発現レベルの高低に相関した、特徴的なｍｉＲの発現変動パターンが確認された。
【００２６】
表１に示されるｍｉＲは、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して、血液中のＩＬ−６発現レベルが高い大腸がん患者の血液における相対的発現量が２倍以上であるｍｉＲである。また表２に示されるｍｉＲは、血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して、血液中のＩＬ−６発現レベルが高い大腸がん患者の血液における相対的発現量が１／２倍以下であるｍｉＲである。なお、１／２倍以下には、実質的に０、すなわちｍｉＲの発現が検出できない場合も含まれる。
【００２７】
先に言及したように、血液中のＩＬ−６の発現レベルの高低とがんの悪性度、予後及び抗がん剤治療の有効性との間には、例えば血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いときは、がんの悪性度は高い、予後は不良である、又は抗がん剤治療の有効性は低い等の相関が認められている。したがって、表１及び表２に示されるｍｉＲの相対的発現量はいずれも、血液中のＩＬ−６の発現レベルの確認と共に又はこれに代えて、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性の判定に利用することができる。
【００２８】
具体的には、あるがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して２倍以上であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。また、あるがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して１／２以下であるときは、その被験者にかかるがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。
【００２９】
また、あるがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表３に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６高値患者における相対的発現量）と実質的に同じかそれ以上であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。同様に、あるがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表４に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６高値患者における相対的発現量）と実質的に同じかそれ以下であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。ここで表３は、表１の各ｍｉＲについて血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者及びＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者の各混合血液における相対的発現量を表した表であり、表４は表２の各ｍｉＲについて血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者及びＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下である患者の各混合血液における相対的発現量を表した表である。
【００３０】
【表３】
0006548184.tif 000004
【００３１】
【表４】
0006548184.tif 000005
【００３２】
さらに、あるがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表３に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６低値患者における相対的発現量）の２倍以上であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。同様に、あるがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が表４に示される血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者における相対的発現量（表中のＩＬ−６低値患者における相対的発現量）の１／２以下であるときは、そのがん患者のがんの悪性度は高い又はその予後は不良である、と判定することができる。
【００３３】
同様に、抗がん剤治療を受けているがん患者の血液における表１に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６の発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して２倍以上であるときは、その被験者に対してその抗がん剤治療の有効性はない又は低い、と判定することができる。また、抗がん剤治療を受けているがん患者の血液における表２に示されるｍｉＲの少なくとも１種以上の相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して１／２以下であるときは、その被験者に対してその抗がん剤治療の有効性はない又は低い、と判定することができる。
【００３４】
また、抗がん剤治療の有効性の判定においても、がんの悪性度及び／又は予後の判定と同様に、表３及び表４における各ｍｉＲの血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者の相対的発現量又は血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者の相対的発現量に基づいても、判定することができる。
【００３５】
前記第一の態様において、表１〜表４に示されるバイオマーカーであるｍｉＲはいずれか一種を単独で利用してもよいが、複数のｍｉＲを利用することが好ましい。同様に、前記第二〜第三の態様において、表１〜表４に示されるバイオマーカーであるｍｉＲのいずれか１種の相対的発現量を単独で利用してもよいが、好ましくは複数のｍｉＲの相対的発現量を利用して判定することが好ましい。さらに好ましくは、表１又は表３に示される複数のｍｉＲ及び表２又は表４に示される複数のｍｉＲの相対的発現量を利用して判定することが好ましい。このように、複数のｍｉＲを対象とすることで、本発明の方法による判定の信頼性は向上する。ただし、複数のｍｉＲを対象とした場合、必ずしも全てのｍｉＲの相対的発現量の結果を全て反映させて判定することは必要とはされない。
【００３６】
本発明の第四の態様は、表１に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸、その機能的等価物、表２に示されるｍｉＲ及びその機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも１種以上の核酸を有効成分とする抗がん剤である。
【００３７】
先に言及したように、悪性度の高い又は予後が不良であるがんに関連して、表１に示されるｍｉＲは相対的発現量が上昇するｍｉＲであり、表２に示されるｍｉＲは相対的発現量が低下するｍｉＲである。したがって、表１に示されるｍｉＲの機能を阻害することのできる核酸、その機能的等価物、表２に示されるｍｉＲ又はこれらの機能的等価物は、がん患者に投与されることにより抗腫瘍効果が発揮させることができる、すなわち抗がん剤として利用することができると期待される。後の実施例に示すように、表１に示されるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸は、がん細胞株に導入されることでそのがん細胞株の生存率を低下させる、すなわちがん細胞を死滅させる活性を有している。
【００３８】
本発明における抗腫瘍効果とは、がん細胞を死滅させる、がん細胞の増殖を抑制する、がん細胞の薬剤感受性を高める、腫瘍を縮退させる又は腫瘍の成長を抑制する効果を意味する。がん細胞に対する効果は、本発明の抗がん剤を適当な培地中のがん細胞に適用し、好ましくはがん細胞内に導入することで、がん細胞の増殖が抑制される又はがん細胞が死滅することを、公知の細胞増殖アッセイ又は細胞生存率アッセイを用いて確認することができる。腫瘍に対する効果は、適当な担がんモデル動物の体内に好ましくは腫瘍に直接投与することで、腫瘍の成長の抑制又は縮退を公知の方法で観察することで確認することができる。
【００３９】
ｍｉＲに対する阻害性核酸を設計及び生産する手法は、当業者に広く知られている。また、このような阻害性核酸の設計から生産を受託により行う会社等も多数存在する。例えばこの様な受託生産は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ａｎｄ−ｒｎａｉ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｃｒｏｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ．ｈｔｍｌ）、ＱＩＡＧＥＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃａｔａｌｏｇ／ａｓｓａｙ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ｍｉｒｎａ／ｍｉｓｃｒｉｐｔ−ｍｉｒｎａ−ｍｉｍｉｃｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉｇａｔｅ２＆ｃａｔＩＤ＝６０２４００）などが行っている。このような受託先に本明細書に記載の各表中のＩＤ又はアクセッション番号から特定される塩基配列を提供すれば、阻害性核酸を入手することができる。なお、ｍｉＲの塩基配列に相補する塩基配列からなる核酸は、阻害性核酸の一例である。
【００４０】
本発明における機能的等価物とは、表１のｍｉＲに対する阻害性核酸及び表２に示されるｍｉＲ（以下、これらをｍｉＲｓと表す）に関連して、下記のいずれかの核酸を意味する。
ａ）ｍｉＲｓの各塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有するＲＮＡ、
ｂ）生体内においてｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる核酸、
ｃ）ｍｉＲｓ、ａ）又はｂ）のＲＮＡの塩基配列において一部の塩基がデオキシリボヌクレオチドに置き換えられたキメラ核酸であって、かつ抗腫瘍効果を有する核酸、
ｄ）ｍｉＲｓ又はａ）〜ｃ）のＲＮＡ若しくは核酸とこれに相補するＤＮＡ鎖又はＲＮＡ鎖とのハイブリッド核酸であって、かつ抗腫瘍効果を有する核酸、又は
ｅ）ｍｉＲｓ又はａ）〜ｄ）のＲＮＡ若しくは核酸の塩基配列の一部が修飾された又は非天然塩基によって置換された塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有する核酸。
【００４１】
ａ）のＲＮＡは、ｍｉＲｓのいずれかの塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失又は置換されており、あるいは１若しくは数個の塩基が挿入されており、ｍｉＲｓの塩基配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示す塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有するＲＮＡである。
【００４２】
「同一性」とは、当該技術分野において公知のアルゴリズムを用いて算出される最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方若しくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
【００４３】
同一性は例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
【００４４】
ｂ）の生体内においてｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる核酸の一つの例は、ｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡに対するｐｒｉ−ｍｉＲ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲに相当するＲＮＡである。かかるＲＮＡは細胞内においてＤｒｏｓｈａ及び／又はＤｉｃｅｒによってプロセッシングされ、最終的にｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる。なお、２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡが連結された塩基配列からなり、プロセッシングによって２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡが同時に産生されるＲＮＡも含まれる。
【００４５】
ｂ）の生体内においてｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを産生することができる核酸の他の例は、ｍｉＲｓ、ａ）のＲＮＡ又はそれらのｐｒｉ−ｍｉＲ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲに相当するＲＮＡを転写誘導することができるＤＮＡである。
【００４６】
ｂ）のＤＮＡは、制御可能な適当な発現プロモーター配列、特にがん細胞の中で高い発現誘導能を有するプロモーター配列の支配下に置かれることが好ましい。かかるＤＮＡががん細胞内に導入されることで、ｍｉＲｓ、ａ）のＲＮＡ又はそれらのｐｒｉ−ｍｉＲ若しくはｐｒｅ−ｍｉＲに相当するＲＮＡが転写発現され、さらにこれらがプロセッシングされることで、最終的にｍｉＲｓ又は上記ａ）のＲＮＡが産生される。なお２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡが連結された塩基配列からなるＲＮＡを転写誘導することができ、プロセッシングによって２以上のｍｉＲｓ又はａ）のＲＮＡを同時に産生することができるＤＮＡも含まれる。
【００４７】
ｂ）のＤＮＡは、前記プロモーター配列を含む発現ベクターの形態であることが好ましい。発現ベクターは、プロモーター配列の他に、転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばオペレーター配列、エンハンサーなどをさらに含んでいてもよい。これらの機能性塩基配列は、上記ＤＮＡと機能的に連結され得る。
【００４８】
発現ベクターの構築方法としては、当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従うことが好ましい。
【００４９】
ｃ）のキメラ核酸は、ｍｉＲｓ、ａ）又はｂ）のＲＮＡの一部の塩基が対応するデオキシリボヌクレオチドに置き換えられた核酸であって、かつ抗腫瘍効果を有する核酸である。
【００５０】
ｄ）のハイブリッド核酸は、ＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖からなる二本鎖又は三本鎖の核酸であって、少なくとも一の鎖の塩基配列がｍｉＲｓ又はａ）〜ｃ）のＲＮＡに相当する塩基配列からなる核酸をいう。
【００５１】
ｅ）のｍｉＲｓ又はａ）〜ｄ）のＲＮＡ若しくは核酸の塩基配列の一部が修飾された又は非天然塩基によって置換された塩基配列からなり、かつ抗腫瘍効果を有する核酸の例としては、ｍｉＲｓ若しくはａ〜ｄ）のＲＮＡの塩基配列の一部がヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させることのできる修飾を受けたＲＮＡ、又はｍｉＲｓ若しくはａ）〜ｄ）のＲＮＡの塩基配列の一部がヌクレアーゼによる分解に耐性を示す非天然塩基に置換されたＲＮＡを挙げることができる。
【００５２】
ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、２’Ｏ−メチル化、２’−Ｆ化、４’−チオ化などを挙げることができる。また、リン酸部分やヒドロキシル部分がビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等によって修飾されたものであってもよい。
【００５３】
ヌクレアーゼによる分解に耐性を示す非天然塩基としては、例えば５‐（２‐アミノ）プロピルウリジン又は５‐ブロモウリジンなどの５位修飾ウリジン又はシチジン、例えば８‐ブロモグアノシンなどの８位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば７−デアザ−アデノシンなどのデアザヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンなどのＯ−又はＮ−アルキル化ヌクレオチドを挙げることができるが、これらには限定されない。
【００５４】
修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、抗腫瘍効果を失わない限り、特に制限は無い。
【００５５】
本発明の抗がん剤の有効成分となるｍｉＲｓ又はそれらの機能的等価物である核酸は、その機能を妨げない限りにおいて、５’又は３’末端に付加的な塩基を有していてもよい。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
本発明の抗がん剤の有効成分となるｍｉＲｓ又はそれらの機能的等価物である核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に知られ又は周知である方法を採用することができる。またいわゆるＤＮＡシンセサイザーなどの機器を用いることで、核酸を合成してもよい。
【００５７】
本発明の抗がん剤の有効成分となるｍｉＲｓ又はそれらの機能的等価物はそのまま生体に投与されてもよいが、腫瘍に対して選択的に投与される方法、特に腫瘍中の細胞内に導入することができる方法により投与されることが好ましい。かかる目的において、本発明の抗がん剤は、核酸導入用試薬と組み合わせて使用されることが好ましい。該核酸導入用試薬の例としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リポフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質等を挙げることができる。また、適当なウイルスベクターを用いて腫瘍中の細胞内に導入してもよい。
【００５８】
本発明の抗がん剤は、薬学的に許容される賦形剤、担体その他の成分と共に医薬、特に医薬組成物を形成し又は製剤化して使用することができる。特に、核酸製剤の調製に好適な賦形剤等の利用が好ましい。かかる医薬も、本発明の一態様である。
【００５９】
薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、ＲＮＡ干渉誘導性核酸などを含む製剤で利用されている各種の成分を利用することが好ましい。治療対象となる疾患に応じて、本発明の抗がん剤とその他の医薬とを併用して使用してもよい。
【００６０】
本発明の抗がん剤を含む医薬は、通常、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった、製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。本発明の抗がん剤を含む医薬はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含んでもよい。
【００６１】
また、本発明の抗がん剤を含む医薬は、高分子ミセル、リポソーム、エマルジョン、マイクロスフェア及びナノスフェアなどの適切なＤＤＳに封入及び／又は固定することもできる。
【００６２】
本発明の抗がん剤又はこれを含む医薬の投与方法は特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内又はその近傍への局所投与などを挙げることができる。好ましい態様の一つにおいて、本発明の抗がん剤又はこれを含む医薬は、静脈内投与又は腫瘍内若しくはその近傍への局所投与により対象に投与される。
【００６３】
ウイルスベクターを利用して哺乳動物の体内で本発明の抗がん剤の発現を誘導する場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０３〜１×１０１４、好ましくは１×１０５〜１×１０１２、より好ましくは１×１０６〜１×１０１１、最も好ましくは１×１０７〜１×１０１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）であることができる。
【００６４】
本発明の第五の態様は、表１及び表２に示されるＩＤ及びアクセッション番号で特定されるｍｉＲよりなる群から選択される１種以上のｍｉＲを含む、がん治療のためのコンパニオン診断薬である。特に好ましい態様は、本発明の第四の態様である抗がん剤の投与対象となる患者を選定するためのコンパニオン診断薬である。
【００６５】
本発明の第一の態様により表１及び／又は表２に示されるｍｉＲの発現パターンを確認することで、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性を判定することができること、並びにかかるｍｉＲの発現パターン及びがんの悪性度、予後及び抗がん剤治療の有効性と血液中のＩＬ−６の発現レベル、具体的には血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いこととの間には相関があることは先に説明したとおりである。したがって、表１又は表２に示されるｍｉＲは、血液中のＩＬ−６の発現レベルが高いことを判定するために有用であり、例えば登録商標アクテラム（一般名トリシズマブ）などの抗ＩＬ−６抗体の投与の適否を判定するためのコンパニオン診断薬として利用することができる。
【００６６】
また表１又は表２に示されるｍｉＲは、本発明の抗がん剤すなわち表１に示されるｍｉＲに対する阻害性核酸又はその機能的等価物である抗がん剤又は表２に示されるｍｉＲ又はその機能的等価物である抗がん剤の投与が有効であり得るか否かを判定するためのコンパニオン診断薬としても利用することができる。
【００６７】
具体的には、がん患者の血液中の表１に示されるｍｉＲの相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して２倍以上であるときは、そのｍｉＲに対する阻害性核酸又はその機能的等価物の投与が有効であると判定することができる。同様に、がん患者の血液中の表２に示されるｍｉＲの相対的発現量を測定し、その値が血液中のＩＬ−６発現レベルが検出限界以下であるがん患者の血液における相対的発現量と比較して１／２倍以下であるときは、そのｍｉＲ又はその機能的等価物の投与が有効であると判定することができる。
【００６８】
なお、コンパニオン診断薬としての使用においても、表３及び表４における各ｍｉＲの血液中のＩＬ−６の発現レベルが高い患者の相対的発現量又は血液中のＩＬ−６の発現レベルが低い患者の相対的発現量に基づいて、判定することができる。
【００６９】
本発明はまた、本発明の抗がん剤を投与して哺乳動物の悪性腫瘍を治療する、予防する、転移を抑制する及び／又は再発を防止する方法を提供する。具体的には、哺乳動物に有効量の本発明の抗がん剤又はこれを含む医薬を投与して哺乳動物における悪性腫瘍を治療する、予防する、転移を抑制する及び／又は再発を防止する方法を提供する。
【００７０】
本明細書中で用いられる「哺乳動物」の例としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ等を挙げることができるが、本発明の方法は特にヒトを対象とする。
【００７１】
本明細書中で用いられる「有効量」とは、哺乳動物における悪性腫瘍の増殖又は症状の悪化を抑制する、悪性腫瘍を縮退させる、がんの転移を抑制する及び／又は再発を防止するのに効果的な抗がん剤の量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
【００７２】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。実施例において、市販のキットを用いた操作はキット製造者のプロトコルに従って行った。なお本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種及び属、コンストラクト並びに試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。
【実施例】
【００７３】
＜実施例１＞
１）血液の調製
６９名の大腸がん患者から採取した血液から常法に従って調製した血清について、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡＴＭ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いてＩＬ−６の発現量を測定した。この測定によってＩＬ−６の発現量が約１５ｐｇ／ｍＬ血清以上と測定された患者（ＩＬ−６高値患者）５名及びＩＬ−６の発現が上記測定では検出限界以下であった患者（ＩＬ−６低値患者）５名を選択した。各患者の血清の一部を別々に保存した残りを、ＩＬ−６高値患者、ＩＬ−６低値患者それぞれで一つに纏めて混合した。
【００７４】
２）マイクロアレイ解析
１）で調製した２種類の混合血清に対して、東レ株式会社に委託して「ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ」を用いたマイクロアレイ解析を行い、検出されたｍｉＲごとの相対的発現量をグローバルノーマライゼーション法によって算出した。
【００７５】
３）ｍｉＲの特定
混合血清についてのマイクロアレイ解析結果から、ＩＬ−６高値患者の血清における相対的発現量がＩＬ−６低値患者の血清における相対的発現量に対して２倍以上であるｍｉＲを選択し、それらのＩＤ、アクセッション番号及び測定された相対的発現量を前記表３に示した。同様に、ＩＬ−６高値患者の血清における相対的発現量がＩＬ−６低値患者の血清における相対的発現量に対して１／２倍以下であるｍｉＲを選択した。それらのＩＤ、アクセッション番号及び測定された相対的発現量を前記表４に示した。なお、表３及び表４は、表１及び表２に対して、各ｍｉＲのＩＬ−６高値患者の混合血清及びＩＬ−６低値患者の混合血清におけるそれぞれの相対的発現量を追記したものである。
【００７６】
また、ＩＬ−６高値患者及びＩＬ−６低値患者の各混合血清におけるｍｉＲの相対的発現量（グローバルノーマライゼーション値）の値の二次元プロットを図１に示す。なお、非特許文献１で大腸がんの予後判定因子の一つとなり得ると報告されているｈｓａ−ｍｉＲ−２１は、上記の選択基準では表３又は表４のいずれの群にも属さないことが確認された。
【００７７】
さらに、別に保存した患者個々の血清の一部について、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１９及びｈｓａ−ｍｉＲ−１５３８の各発現量を定量ＰＣＲによって測定した。ＩＬ−６高値患者一名及びＩＬ−６低値患者一名における前記定量ＰＣＲの結果を図２〜４に示す。各ｍｉＲの発現レベルの差異は、混合血清におけるそれと一致していた。
【００７８】
＜実施例２＞
表１に示されるｍｉＲの一つであるｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸（ＤＮＡ）を、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨに依頼して化学合成した。
【００７９】
ヒト大腸がん細胞株ＤＬＤ−１（５×１０３個／ウェル／９６穴プレート）を２４時間培養した後、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者のプロトコルに従って上記阻害性核酸及びネガティブコントロールｍｉＲ各３０ｐｍｏｌ／ウェルを別々のウェルに加えた。４８時間後における大腸がん細胞株の生存率を、ＭＴＴアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｑｕａｎｔ  ＭＴＴ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ社）を行って評価した。その結果を、ネガティブコントロールｍｉＲを導入したがん細胞株群に対する阻害性核酸が導入されたがん細胞株群のＯＤ値の比として、図５に示す。
【００８０】
図５に示されるように、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０８−３ｐに対する阻害性核酸を導入されたがん細胞株の増殖は抑制された。この結果から、かかる阻害性核酸は抗がん剤として有効であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
表１及び表２に示されるｍｉＲであるバイオマーカーは、がん患者の血液中のＩＬ−６の発現レベルと共に又はこれに代わり、がんの悪性度、予後及び／又は抗がん剤治療の有効性の判定に利用することができる。また本発明は、悪性度が高い又は予後が不良ながんに対する有効な医薬を選択するためのコンパニオン診断薬として、さらにはかかるがんに対する抗がん剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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