(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含み、細胞の付着抑制能を有する（メタ）アクリルポリマー：
【化１】
0006485349.tif 000020
式中、
Ｕａ１、Ｕａ２は、水素原子を表し、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてＡｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す
が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞の容器表面への付着が抑制された細胞培養容器。
【請求項２】
上記式（ａ）及び（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式（Ａ）及び（Ｂ）：
【化２】
0006485349.tif 000021
式中、
Ｕａ１、Ｕａ２は、水素原子を表し、Ｔａ、Ｔｂ、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてｍは、０乃至６の整数を表す
で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
ｍが１であり、Ｒａ及びＲｂが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
上記（メタ）アクリルポリマーが、さらに下記式（Ｃ）又は（Ｄ）：
【化３】
0006485349.tif 000022
式中、
Ｔｃ、Ｔｄ及びＵｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表す
で表されるモノマーから誘導される架橋構造を含む、請求項１乃至３何れかに記載の細胞培養容器。
【請求項５】
Ｔｃ及びＴｄが、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Ｕｄが、水素原子を表し、Ｒｃ及びＲｄが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、請求項４に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含み、細胞の付着抑制能を有する（メタ）アクリルポリマー：
【化４】
0006485349.tif 000023
式中、Ｕａ１、Ｕａ２は、水素原子を表し、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてＡｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す
を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程；及び
コーティングされた細胞培養容器を−２００℃乃至２００℃にて乾燥させる工程
を含む、細胞の容器表面への付着が抑制された細胞培養容器の製造方法。
【請求項７】
上記式（ａ）及び（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式（Ａ）及び（Ｂ）：
【化５】
0006485349.tif 000024
式中、
Ｕａ１、Ｕａ２は、水素原子を表し、Ｔａ、Ｔｂ、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてｍは、０乃至６の整数を表す
で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
コーティング工程が、上記（メタ）アクリルポリマーを含むワニスを用いて実施される、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
上記（メタ）アクリルポリマーを含むワニスが、予めｐＨ調整されている、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥工程前及び／又は後に、洗浄する工程を含む、請求項６乃至９何れか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
乾燥工程後の洗浄が、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒を用いて実施される、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１乃至５何れか１項に記載の細胞培養容器又は請求項６乃至１１何れか１項に記載の製造方法により製造された細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法。
【請求項１３】
細胞培養容器中の培地が、細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類を含むことを特徴とする、請求項１２に記載の細胞凝集塊の製造方法。
【請求項１４】
多糖類が脱アシル化ジェランガムであることを特徴とする、請求項１３に記載の細胞凝集塊の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養器、その製造方法及びそれを用いた細胞凝集塊（スフェアともいう）の製造方法に関する。特に本発明は、生体物質、特に細胞の付着抑制能を有する共重合体が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。【０００３】
動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく２分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及び細胞凝集塊（スフェア）培養等が知られている。【０００４】
特に近年では、再生医療分野の発展に伴い、より生体内に近い環境での培養方法としてスフェア培養が注目され、その培養に適した培地組成物や、培地添加剤が種々報告されている（例えば、特許文献１及び２参照）。またスフェア培養では、培養容器（基材）からの刺激が、培養の結果を左右する重要な要因であると考えられており、細胞（特に、細胞凝集塊）を培養容器からの刺激のない、三次元環境又は完全な浮遊状態にて培養することが求められている（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０１７５１３号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／１４４３７２号公報
【特許文献３】特開２００８−６１６０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞培養器、その製造方法及びそれを用いた細胞凝集塊の製造方法を提供することを目的とする。特に本発明は、生体物質、特に細胞の付着抑制能を有する共重合体が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器、その製造方法及びそれを用いた細胞凝集塊の製造方法を提供することを目的とする。【０００７】
従来、細胞（特に、細胞凝集塊）を三次元環境又は完全な浮遊状態にて培養するために、細胞の容器表面（壁面）への付着、及び細胞培養容器に付されたコーティングの培養液への溶出という問題があった。親水性化合物によるコーティングが付された細胞培養容器は、容器表面（壁面）への細胞付着を改善しうるが、細胞培養容器に付されたコーティングの培養液への溶出等の問題が依然としてあった。また親水性化合物によるコーティングは、放射線に対する耐性が充分ではなく、コーティング後に放射線で滅菌できないものが多く、無菌的な生産が必要となるとの問題もあった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、様々な生体物質の付着抑制能を有するコーティング材料として期待されているリン酸エステル基を有するポリマーに注目し、鋭意検討した。その結果、特定の有機基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされた細胞培養容器が、細胞の容器表面（壁面）への付着を抑制すると共に、コーティングが容器表面に強固に固着しうることから、コーティングの培養液への溶出や放射線耐性が改善された細胞培養容器として有用であることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである：
１．下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：【００１０】
【化１】
0006485349.tif 000002
【００１１】
（式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてＡｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す）が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器；
２．上記式（ａ）及び（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式（Ａ）及び（Ｂ）：【００１２】
【化２】
0006485349.tif 000003
【００１３】
（式中、Ｔａ、Ｔｂ、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてｍは、０乃至６の整数を表す）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、上記１に記載の細胞培養容器；
３．ｍが１であり、Ｒａ及びＲｂが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、上記２に記載の細胞培養容器；
４．上記共重合体が、さらに下記式（Ｃ）又は（Ｄ）：【００１４】
【化３】
0006485349.tif 000004
【００１５】
（式中、Ｔｃ、Ｔｄ及びＵｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表す）で表されるモノマーから誘導される架橋構造を含む、上記１乃至３何れかに記載の細胞培養容器；
５．Ｔｃ及びＴｄが、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、Ｕｄが、水素原子を表し、Ｒｃ及びＲｄが、それぞれ独立して、エチレン基又はプロピレン基を表す、上記４に記載の細胞培養容器；
６．下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：【００１６】
【化４】
0006485349.tif 000005
【００１７】
（式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてＡｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す）を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程；及び
コーティングされた容器を−２００℃乃至２００℃にて乾燥させる工程
を含む、細胞培養容器の製造方法；
８．上記式（ａ）及び（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位が、それぞれ、下記式（Ａ）及び（Ｂ）：【００１８】
【化５】
0006485349.tif 000006
【００１９】
（式中、Ｔａ、Ｔｂ、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてｍは、０乃至６の整数を表す）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位である、上記６に記載の製造方法；
８．コーティング工程が、共重合体を含むワニスを用いて実施される、上記６又は７に記載の製造方法；
９．共重合体を含むワニスが、予めｐＨ調整されている、上記８に記載の製造方法；
１０．さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥工程前及び／又は後に、洗浄する工程を含む、上記６乃至９何れかに記載の製造方法；
１１．乾燥工程後の洗浄が、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒を用いて実施される、上記１０に記載の製造方法；
１２．さらに、コーティングされた細胞培養容器を、乾燥後に、放射線処理にて滅菌する工程を含む、上記６乃至１１何れかに記載の製造方法；
１３．上記１乃至５何れかに記載の細胞培養容器又は上記６乃至１２何れかに記載の製造方法により製造された細胞培養容器を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法；
１４．細胞培養容器中の培地が、ナノファイバー形成し細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類を含むことを特徴とする、上記１３に記載の細胞凝集塊の製造方法；
１５．多糖類が脱アシル化ジェランガムであることを特徴とする、上記１４に記載の細胞凝集塊の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の細胞培養容器は、特定の有機基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされた容器を用いることによって、容器表面（壁面）への細胞の付着を抑制することができる。本発明の細胞培養容器は、容器表面の少なくとも一部が式（ａ）で表されるアニオン、式（ｂ）で表されるカチオンを含む共重合体でコーティングされていることから、該カチオン及びアニオンの静電気的バランスにより、容器素子の表面が電気的に中性に保たれ、細胞の付着を防ぐことができると考えられる。一方、コーティング中の該カチオン及びアニオンがイオン結合（イオンコンプレックス）を形成することで、ガラス、繊維、無機粒子又は樹脂（合成樹脂及び天然樹脂）等、容器の基材の種類を選ばず固着することができ、さらに固着後は水系溶媒（水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、アルコール等）への耐久性に優れたコーティングとなる。またかかるコーティングは、放射線耐性にも優れており、放射線による滅菌が可能となる。すなわち、本発明により、細胞の付着抑制に加え、溶媒や放射線への耐久性にも優れた細胞培養容器を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】試験例１で得られた、表面処理剤Ｌ１でコーティングした平底プレートにて培養したＨｅｐＧ２細胞の凝集塊の顕微鏡写真（倍率：４０倍）を示す。
【図２】（ａ）は、試験例３で得られた、表面処理剤Ｌ１でコーティングした平底プレートにて、脱アシル化ジェランガムを添加しない培地を用いて培養したＨｅｐＧ２細胞の凝集塊の顕微鏡写真（倍率：４０倍）を示す。（ｂ）は、試験例３で得られた、表面処理剤Ｌ１でコーティングした平底プレートにて、脱アシル化ジェランガムを添加した培地を用いて培養したＨｅｐＧ２細胞の凝集塊の顕微鏡写真（倍率：４０倍）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
≪細胞培養容器≫
本発明の第一の態様は、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
【化６】
0006485349.tif 000007
【００２３】
（式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてＡｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す）が表面にコーティングされていることを特徴とする、細胞培養容器である。
【００２４】
＜細胞＞
本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、精子や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞（多能性幹細胞等）、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞又は骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞（例えば、臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞）、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳又は神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。
がん細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳がん細胞株としてＨＢＣ−４、ＢＳＹ−１、ＢＳＹ−２、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−７／ＡＤＲ  ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸がん細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺がん細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ−６２、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸がん細胞株としてＣａｃｏ−２、ＣＯＬＯ−２０５、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１５、ＨＣＴ−１１６、ＨＴ−２９、ＫＭ−１２、ＳＷ−６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺がん細胞株としてＤＵ−１４５、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系がん細胞株としてＵ２５１、ＳＦ−２９５、ＳＦ−５３９、ＳＦ−２６８、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、ＳＮＢ−１９、ヒト卵巣がん細胞株としてＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＳＫ−ＯＶ−３、ＩＧＲＯＶ−１、ヒト腎がん細胞株としてＲＸＦ−６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ−３１、ＳＮ−１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ−１、ＲＸＦ−３９３Ｌ、７８６−０、ＴＫ−１０、ヒト胃がん細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ−４、ＭＫＮ−１、ＭＫＮ−７、ＭＫＮ−７４、皮膚がん細胞株としてＬＯＸ−ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ−ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。肝細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐａＲＧ（登録商標）、ＪＨＨ７、ＨＬＦ、ＨＬＥ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＷＲＬ６８、ＨＢ６１１、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＨｕＨ−４、ＨｕＨ−７等が挙げられる。
【００２５】
本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。
【００２６】
＜容器＞
本発明の細胞培養容器を構成する、共重合体がコーティングされる容器は、当技術分野で使用され得る任意の形態の容器類であればよく、例えば、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。好ましくは、６〜１５３６穴のマルチウェルプレート及びシャーレが挙げられる。
【００２７】
容器の素材としては、典型的には、ガラス又は樹脂を用いることができる。加工容易性や経済性等の点から、樹脂を用いるのが好ましい。樹脂は、天然樹脂又は合成樹脂いずれでもよく、天然樹脂としては、例えば、セルロース、三酢酸セルロース（ＣＴＡ）、デキストラン硫酸を固定化したセルロース等を挙げることができ、合成樹脂としては、例えば、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン（ＰＵ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＡＬ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエステル（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、各種イオン交換樹脂又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）等を挙げることができる。本発明の細胞培養容器の製造では、共重合体を、該容器の表面の少なくとも一部に存在するようにコーティングする際に、高温での処理を要しないため、耐熱性が低い樹脂等も適用可能である。
【００２８】
＜共重合体＞
本発明の細胞培養容器は、容器の表面の少なくとも一部が、特定の共重合体でコーティングされていることを特徴とする。本発明に係る共重合体は、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
【００２９】
【化７】
0006485349.tif 000008
【００３０】
（式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、そしてＡｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表す）である。
【００３１】
本発明に係る共重合体は、上記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、上記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体であれば、特に制限は無い。該共重合体は、上記式（ａ）で表される有機基を含むモノマーと、上記式（ｂ）で表される有機基を含むモノマーとをラジカル重合して得られたものが望ましいが、重縮合、重付加反応させたものも使用できる。共重合体の例としては、オレフィンが反応したビニル重合ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレタン等が挙げられるが、これらの中でも特にオレフィンが反応したビニル重合ポリマー又は（メタ）アクリレート化合物を重合させた（メタ）アクリルポリマーが望ましい。なお、本発明において、（メタ）アクリレート化合物とは、アクリレート化合物とメタクリレート化合物の両方を意味する。例えば（メタ）アクリル酸は、アクリル酸及びメタクリル酸を意味する。
【００３２】
好ましくは、上記式（ａ）及び（ｂ）で表される有機基を含むモノマーは、それぞれ、下記式（Ａ）及び（Ｂ）：
【００３３】
【化８】
0006485349.tif 000009
【００３４】
（式中、Ｔａ、Ｔｂ、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｑａ及びＱｂは、それぞれ独立して、単結合、エステル結合又はアミド結合を表し、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表し、Ａｎ−は、ハロゲン化物イオン、無機酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンからなる群から選ばれる陰イオンを表し、そしてｍは０乃至６の整数を表す）で表されるモノマーである。したがって、式（Ａ）及び（Ｂ）で表されるモノマーから誘導される繰り返し単位は、それぞれ、下記式（ａ１）及び（ｂ１）：
【００３５】
【化９】
0006485349.tif 000010
【００３６】
（式中、Ｔａ、Ｔｂ、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３、Ｑａ及びＱｂ、Ｒａ及びＲｂ、Ａｎ−並びにｍは、上記と同義である）で表される。
【００３７】
本発明において、「炭素原子数１乃至５の直鎖又は分岐アルキル基」としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、t−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基又は１−エチルプロピル基が挙げられる。
【００３８】
本発明において、「エステル結合」は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−を意味し、「アミド結合」は、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−を意味する。
【００３９】
本発明において、「ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基」は、炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基、あるいは１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を意味する。ここで、「炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基」は、上記アルキル基からさらに水素原子が１個とれた２価の有機基であり、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、ジメチルエチレン基、エチルエチレン基、ペンタメチレン基、１−メチル−テトラメチレン基、２−メチル−テトラメチレン基、１，１−ジメチル−トリメチレン基、１，２−ジメチル−トリメチレン基、２，２−ジメチル−トリメチレン基、１−エチル−トリメチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン基及びデカメチレン基等が挙げられる。これらの中で、エチレン基、プロピレン基、オクタメチレン基及びデカメチレン基が好ましく、炭素原子数１乃至５の直鎖又は分岐アルキレン基、例えば、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基がより好ましく、特にエチレン基又はプロピレン基が好ましい。「１以上のハロゲン原子で置換された炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基」は、そのようなアルキレン基の１以上の任意の水素原子が、ハロゲン原子で置き換えられているものを意味し、特に、エチレン基又はプロピレン基の水素原子の一部又は全部がハロゲン原子で置き換えられているものが好ましい。
【００４０】
本発明において、「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。
本発明において、「ハロゲン化物イオン」は、ハロゲン原子のアニオンを意味し、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンが挙げられ、好ましくは、塩化物イオンである。
本発明において、「無機酸イオン」とは、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、リン酸水素イオン、リン酸二水素イオン、硝酸イオン、過塩素酸イオン又はホウ酸イオンを意味する。
上記Ａｎ−として好ましいのは、ハロゲン化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、水酸化物イオン及びイソチオシアネートイオンであり、特に好ましいのはハロゲン化物イオンである。
【００４１】
式（Ａ）及び（Ｂ）において、Ｔａ及びＴｂは、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基である。
【００４２】
式（ａ）、式（ｂ）、式（Ａ）及び（Ｂ）において、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３は、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基又はエチル基である。式（ａ）及び式（Ａ）において、Ｕａ１及びＵａ２は、より好ましくは、水素原子である。式（ｂ）及び（Ｂ）において、Ｕｂ１、Ｕｂ２（及びＵｂ３）は、より好ましくは、メチル基又はエチル基であり、特に好ましくはメチル基である。
【００４３】
式（Ａ）及び（Ｂ）において、Ｑａ及びＱｂは、好ましくは、それぞれ独立して、エステル結合（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−若しくは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−）又はアミド結合（−ＮＨＣ（＝Ｏ）−若しくは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−）であり、より好ましくは、それぞれ独立して、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−であり、特に好ましくは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−である。
【００４４】
式（Ａ）及び（Ｂ）において、Ｒａ及びＲｂは、好ましくは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖又は分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。
【００４５】
式（Ａ）及び（Ｂ）において、ｍは、好ましくは０乃至３の整数を表し、より好ましくは１又は２の整数を表し、特に好ましくは１である。
【００４６】
上記式（Ａ）の具体例としては、ビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチル（メタ）アクリレート、３−クロロ−２−アシッドホスホオキシプロピル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシプロピル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシメチル（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキポリオキシエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、アシッドホスホオキシポリオキシプロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられるが、この中でもビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ)エチル）が好ましく用いられる。
【００４７】
ビニルホスホン酸、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（＝リン酸２−（メタクリロイルオキシ)エチル）及びアシッドホスホオキシポリオキシエチレングリコールモノメタクリレートの構造式は、それぞれ下記式（Ａ−１）〜式（Ａ−３）で表される。
【００４８】
【化１０】
0006485349.tif 000011
【００４９】
これらの化合物は、合成時において、後述する一般式（Ｃ）又は（Ｄ）で表されるような、２つの官能基を有する（メタ）アクリレート化合物を含む場合がある。
【００５０】
上記式（Ｂ）の具体例としては、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレート、メタクロイルコリンクロリド等が挙げられるが、この中でもジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、メタクロイルコリンクロリド又は２−（ｔ−ブチルアミノ）エチル（メタ）アクリレートが好ましく用いられる。
【００５１】
ジメチルアミノエチルアクリレート（＝アクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）、ジメチルアミノエチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル）、メタクロイルコリンクロリド及び２−（ｔ−ブチルアミノ）エチルメタクリレート（＝メタクリル酸２−（ｔ−ブチルアミノ）エチルの構造式は、それぞれ下記式（Ｂ−１）〜式（Ｂ−４）で表される。
【００５２】
【化１１】
0006485349.tif 000012
【００５３】
上記共重合体中における式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位（又は式（ａ１）で表される繰り返し単位）の割合は、２０モル％乃至８０モル％であり、好ましくは３０モル％乃至７０モル％であり、さらに好ましくは４０モル％乃至６０モル％である。なお、本発明に係る共重合体は、２種以上の式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位（又は式（ａ１）で表される繰り返し単位）を含んでいてもよい。
【００５４】
上記共重合体中における式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位（又は式（ｂ１）で表される繰り返し単位）の割合は、全共重合体に対して上記式（ａ）（又は式（ａ１））の割合を差し引いた残部全てでもよいし、上記式（ａ）（又は式（ａ１））と下記に記述する第３成分との合計割合を差し引いた残部であってもよい。なお、本発明に係る共重合体は、２種以上の式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位（又は式（ｂ１）で表される繰り返し単位）を含んでいてもよい。
【００５５】
さらに本発明に係る共重合体は、任意の第３成分が共重合していてもよい。例えば、第３成分として２以上の官能基を有する（メタ）アクリレート化合物が共重合しており、ポリマーの一部が部分的に３次元架橋していてもよい。そのような第３成分として、例えば、下記式（Ｃ）又は（Ｄ）：
【００５６】
【化１２】
0006485349.tif 000013
【００５７】
（式中、Ｔｃ、Ｔｄ及びＵｄは、それぞれ独立して、水素原子又は炭素原子数１乃至５の直鎖若しくは分岐アルキル基を表し、Ｒｃ及びＲｄは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至１０の直鎖又は分岐アルキレン基を表す）で表される２官能性モノマーが挙げられる。すなわち本発明に係る共重合体は、好ましくは、このような２官能性モノマーから誘導される架橋構造を含むものである。
【００５８】
式（Ｃ）及び（Ｄ）において、Ｔｃ及びＴｄは、好ましくは、それぞれ独立して、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基である。
【００５９】
式（Ｃ）及び（Ｄ）において、Ｕｄは、好ましくは、水素原子、メチル基又はエチル基であり、より好ましくは、水素原子である。
【００６０】
式（Ｃ）及び（Ｄ）において、Ｒｃ及びＲｄは、好ましくは、それぞれ独立して、ハロゲン原子で置換されていてもよい炭素原子数１乃至３の直鎖又は分岐アルキレン基であり、より好ましくは、それぞれ独立して、エチレン基若しくはプロピレン基であるか、あるいは１つの塩素原子で置換されたエチレン基若しくはプロピレン基であり、特に好ましくは、エチレン基若しくはプロピレン基である。
【００６１】
式（Ｃ）で表される２官能性モノマーは、好ましくは、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。式（Ｄ）で表される２官能性モノマーは、好ましくは、リン酸ビス（メタクリロイルオキシメチル）、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）プロピル］等が挙げられる。
【００６２】
任意の第３成分は、３官能性モノマーであってもよい。そのような第３成分としての３官能性モノマーとしては、例えば、トリアクリル酸ホスフィニリジントリス（オキシ−２，１−エタンジイル）が挙げられる。
【００６３】
これらの中でも、特に、下記式（Ｃ−１）で表されるエチレングリコールジ（メタ）アクリレート及び下記式（Ｄ−１）で表されるリン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］が好ましい。
【００６４】
【化１３】
0006485349.tif 000014
【００６５】
共重合体には、これらの第三成分の１種又は２種以上が含まれていてもよい。上記の中でも、式（Ｄ）で表される２官能性モノマーが好ましく、特に、式（Ｄ−１）で表される２官能性モノマーが好ましい。
上記共重合体中における第三成分、例えば、上記式（Ｃ）又は（Ｄ）で表される２官能性モノマーから誘導される架橋構造の割合は、０モル％乃至５０モル％である。
【００６６】
＜共重合体の製造方法＞
本発明に係る共重合体の合成方法としては、一般的なアクリルポリマー又はメタクリルポリマー等の合成方法であるラジカル重合、アニオン重合、カチオン重合などの方法により合成することができる。その形態は溶液重合、懸濁重合、乳化重合、塊状重合など種々の方法が可能である。
【００６７】
反応用溶媒としては、水、リン酸緩衝液又はエタノール等のアルコール又はこれらを組み合わせた混合溶媒でもよいが、水又はエタノールを含むことが望ましい。さらには水又はエタノールを１０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを５０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを８０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。さらには水又はエタノールを９０質量％以上１００質量％以下含むことが好ましい。好ましくは水とエタノールの合計が１００質量％である。
【００６８】
反応濃度としては、例えば、上記式（ａ）で表される有機基を含むモノマーと、上記式（ｂ）で表される有機基を含むモノマーの反応溶媒中の濃度を、０．０１質量％乃至４質量％とすることが好ましい。濃度が４質量％以上であると、例えば式（ａ）で表されるリン酸基の有する強い会合性により共重合体が反応溶媒中でゲル化してしまう場合がある。濃度０．０１質量％以下では、得られたワニスの濃度が低すぎるため、十分な膜厚のコーティング膜を得るためのコーティング膜形成用組成物の作成が困難である。濃度が、０．０１質量％乃至３質量％、例えば３質量％又は２質量％であることがより好ましい。
【００６９】
本発明に係る共重合体の合成においては、例えば式（１）に記載の酸性リン酸エステル単量体（ハーフ塩）を作成後、重合して共重合体を作製してもよい。
【００７０】
【化１４】
0006485349.tif 000015
【００７１】
リン酸基含有モノマーは会合し易いモノマーのため、反応系中に滴下されたとき、速やかに分散できるように反応溶媒中に少量ずつ滴下してもよい。さらに、反応溶媒はモノマー及びポリマーの溶解性を上げるために加温（例えば４０℃乃至１００℃）してもよい。
【００７２】
重合反応を効率的に進めるためには、重合開始剤を使用することが望ましい。重合開始剤の例としては、２，２′−アゾビス（イソブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、４，４′−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、２，２′−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、１，１′−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、１−［（１−シアノ−１−メチルエチル）アゾ］ホルムアミド、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２′−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］（和光純薬(株)製：ＶＡ−０８６、１０時間半減期温度；８６℃）、過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ−水和物（和光純薬(株)製：ＶＡ−０５７、１０時間半減期温度；５７℃）、４，４′−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（和光純薬(株)製：Ｖ−５０１）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリジン−２−イル）プロパン］二塩酸塩（和光純薬(株)製：ＶＡ−０４４、１０時間半減期温度；４４℃）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリジン−２−イル）プロパン］二硫酸塩二水和物（和光純薬(株)製：ＶＡ−０４６Ｂ、１０時間半減期温度；４６℃）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリジン−２−イル）プロパン］（和光純薬(株)製：ＶＡ−０６１、１０時間半減期温度；６１℃）、２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（和光純薬(株)製：Ｖ−５０、１０時間半減期温度；５６℃）、ペルオキソ二硫酸又はｔ−ブチルヒドロペルオキシド等が用いられるが、この中でもイオンバランス、水への溶解性を考慮して２，２′−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド］、２，２′−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］ｎ−水和物、４，４′−アゾビス（４−シアノペンタン酸）、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリジン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリジン−２−イル）プロパン］二硫酸塩二水和物、２，２′−アゾビス［２−（２−イミダゾリジン−２−イル）プロパン］、２，２′−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩又はペルオキソ二硫酸の何れかを用いることが望ましい。
【００７３】
重合開始剤の添加量としては、重合に用いられるモノマーの合計重量に対し、０．０５質量％〜１０質量％である。
【００７４】
反応条件は反応容器をオイルバス等で５０℃乃至２００℃に加熱し、1時間乃至４８時間、より好ましくは８０℃乃至１５０℃、５時間乃至３０時間攪拌を行うことで、重合反応が進み本発明に係る共重合体が得られる。反応雰囲気は窒素雰囲気が好ましい。反応手順としては、全反応物質を室温の反応溶媒に全て入れてから、上記温度に加熱して重合させてもよいし、あらかじめ加温した溶媒中に、反応物質の混合物の全部又は一部を少々ずつ滴下してもよい。
【００７５】
例えば、後者の反応手順としては、上記式（Ａ）及び（Ｂ）で表される化合物、溶媒及び重合開始剤を含む混合物を、該重合開始剤の１０時間半減期温度より高い温度に保持した溶媒中に滴下し、反応（重合）させる。かかる反応手順と温度条件を採用することにより、上記式（Ａ）又は式（Ｂ）で表される化合物の反応溶媒中の濃度を、例えば、０．０１質量％乃至１０質量％とすることができる。この場合、濃度が４質量％を超えても、反応前に滴下相及び反応相が透明均一な溶液となり、反応後の共重合体の反応溶媒中でのゲル化を抑制することができる。
【００７６】
本発明に係る共重合体の分子量は、数千から数百万程度であれば良く、好ましくは５，０００乃至５，０００，０００である。さらに好ましくは、１０，０００乃至２，０００，０００である。また、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体のいずれでも良く、該共重合体を製造するための共重合反応それ自体には特別の制限はなく、ラジカル重合やイオン重合や光重合、マクロマー、乳化重合を利用した重合等の公知の溶液中で合成される方法を使用できる。これらは目的の用途によって、本発明の共重合体のうちいずれかを単独使用することもできるし、複数の共重合体を混合し、且つその比率は変えて使用することもできる。
【００７７】
このようにして製造される種々の共重合体は、２次元ポリマーでも３次元ポリマーであってもよく、水を含有する溶液に分散した状態である。つまり、これらのポリマーを含むワニスでは、不均一なゲル化や白濁沈殿が出来ることは好ましくはなく、透明なワニス、分散コロイド状のワニス、又はゾルであるのが好ましい。
【００７８】
≪細胞培養容器の製造方法≫
本発明の第二の態様は、下記式（ａ）で表される有機基を含む繰り返し単位と、下記式（ｂ）で表される有機基を含む繰り返し単位とを含む共重合体：
【００７９】
【化１５】
0006485349.tif 000016
【００８０】
（式中、Ｕａ１、Ｕａ２、Ｕｂ１、Ｕｂ２及びＵｂ３、並びにＡｎ−は、上記と同義である）を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする工程；及び
コーティングされた容器を−２００℃乃至２００℃にて乾燥させる工程
を含む、細胞培養容器の製造方法である。
【００８１】
＜コーティング工程＞
本発明の細胞培養容器の製造方法のコーティング工程では、共重合体を、容器の表面の少なくとも一部にコーティングする。例えば、容器が丸底のマルチウェルプレートである場合、ウェルのくぼみの部分のみをコーティングしてもよいが、プレート全体をコーティングしてもよい。ここで、容器及び共重合体は、それぞれ前述の項目＜容器＞及び＜共重合体＞で述べた通りである。
【００８２】
コーティング工程は、特に限定はなく、容器と共重合体を接触させることができる、当業者に公知の何れかのコーティング手段（例えば、塗布、浸漬等）により実施すればよい。例えば、共重合体を含むワニスを容器に塗布することにより、あるいは共重合体を含むワニスに容器を浸漬することにより実施することができる。好ましくは、共重合体を含むワニスに容器を浸漬することにより実施する。
【００８３】
共重合体を含むワニスは、前述の項目＜共重合体の製造方法＞で得られた共重合体を、適切な溶媒に所望の濃度で溶解することにより調製してもよく、あるいはかかる製造方法で得られた共重合体を含む反応溶液を、そのまま又は所望の固形分濃度に希釈した後、ワニスとして使用してもよい。ワニスに含まれる溶媒としては、水、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、アルコールが挙げられる。アルコールとしては、炭素数２乃至６のアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール（＝ネオペンチルアルコール）、２−メチル−１−プロパノール、２−メチル−１−ブタノール、２−メチル−２−ブタノール（＝ｔ−アミルアルコール）、３−メチル−１−ブタノール、３−メチル−３−ペンタノール、シクロペンタノール、１−ヘキサノール、２−ヘキサノール、３−ヘキサノール、２，３−ジメチル−２−ブタノール、３，３−ジメチル−１−ブタノール、３，３−ジメチル−２−ブタノール、２−エチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ペンタノール、２−メチル−２−ペンタノール、２−メチル−３−ペンタノール、３−メチル−１−ペンタノール、３−メチル−２−ペンタノール、３−メチル−３−ペンタノール、４−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、４−メチル−３−ペンタノール及びシクロヘキサノールが挙げられ、単独又はそれらの組み合わせの混合溶媒を用いてもよいが、水、ＰＢＳ及びエタノールから選ばれるのが好ましい。共重合体の溶解のため、水を必ず含む。
【００８４】
ワニス中の共重合体の濃度としては、０．０１乃至４質量％、さらに望ましくは０．０１乃至３質量％、さらに望ましくは０．０１乃至２質量％、さらに望ましくは０．０１乃至１質量％である。共重合体の濃度が０．０１質量％以下であると、十分な膜厚のコーティングが形成できず、４質量％以上であると、ワニスの保存安定性が悪くなり、溶解物の析出やゲル化が起こる可能性がある。
【００８５】
なおワニスには、上記共重合体と溶媒の他に、必要に応じて得られるコーティングの性能を損ねない範囲で他の物質を添加することもできる。他の物質としては、防腐剤、界面活性剤、基材（容器）との密着性を高めるプライマー、防かび剤及び糖類等が挙げられる。
【００８６】
ワニス中の共重合体のイオンバランスを調節するために、共重合体を含むワニスは、予めｐＨ調整されていてもよい。ｐＨ調整は、例えば、共重合体を含むワニスにｐＨ調整剤を添加し、ワニスのｐＨを３．５〜８．５、好ましくは４．０〜８．０とすることにより実施してもよい。使用しうるｐＨ調整剤の種類及びその量は、ワニス中の共重合体の濃度や、共重合体のアニオンとカチオンの存在比等に応じて適宜選択される。ｐＨ調整剤の例としては、アンモニア、ジエタノールアミン、ピリジン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の有機アミン；水酸化カリウム、水酸化ナトリウム等のアルカリ金属水酸化物；塩化カリウム、塩化ナトリウム等のアルカリ金属ハロゲン化物；硫酸、リン酸、塩酸、炭酸等の無機酸又はそのアルカリ金属塩；コリン等の４級アンモニウムカチオン；あるいはこれらの混合物（例えば、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液）を挙げることができる。これらの中でも、アンモニア、ジエタノールアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、水酸化ナトリウム及びコリンが好ましく、特にアンモニア、ジエタノールアミン、水酸化ナトリウム及びコリンが好ましい。
【００８７】
そのような共重合体を含むワニスを、容器に接触させて、その表面の少なくとも一部にコーティングを形成する。コーティングは、容器の表面全体にわたって形成されるのが望ましい。
【００８８】
なお、コーティング工程の前に、容器の表面を、公知のＵＶ／オゾン処理に付して洗浄してもよい。かかる洗浄工程は、市販のＵＶ／オゾンクリーナー等を用いて実施することができる。
【００８９】
＜乾燥・洗浄・滅菌工程＞
コーティング工程後、コーティングされた容器を−２００℃乃至２００℃の温度にて乾燥させる。乾燥により、上記コーティング膜形成用組成物中の溶媒を取り除くと共に、本発明に係る共重合体の式（ａ）及び式（ｂ）同士がイオン結合を形成して基体へ完全に固着する。本発明の血液フィルターのコーティングの膜厚は、好ましくは１０〜１０００Åであり、さらに好ましくは１０〜５００Åである。本発明者らは、本発明の細胞培養容器の製造方法では、高温での処理を要さず、低温での処理により、所望の特性を有するコーティングが容器の表面に形成され、しかも数十乃至数百Å程度の薄い膜厚にも係らず、耐久性に優れることを見出した。
【００９０】
乾燥は、例えば、室温（１０℃乃至３５℃、例えば２５℃）で実施することができるが、より迅速にコーティング膜を形成させるために、例えば４０℃乃至５０℃にて実施してもよい。またフリーズドライ法による極低温〜低温（−２００℃乃至−３０℃前後）で実施してもよい。フリーズドライは真空凍結乾燥と呼ばれ、通常乾燥させたいものを冷媒で冷却し、真空状態にて溶媒を昇華により除く方法である。フリーズドライで用いられる一般的な冷媒は、ドライアイスとメタノールを混合媒体（−７８℃）、液体窒素（−１９６℃）等が挙げられる。より好ましい乾燥温度は１０℃乃至１８０℃、より好ましい乾燥温度は２５℃乃至１５０℃である。
【００９１】
なお、乾燥工程の前及び／又は後に、コーティングされた容器の表面を、エタノール等の炭素原子数１乃至５のアルコール及び／又は水で洗浄してもよい。かかる洗浄工程は、０℃乃至６０℃、好ましくは２５℃（室温）乃至４０℃の温度で、３０分乃至４８時間、好ましくは１乃至２４時間実施することができる。
【００９２】
さらに乾燥工程後、該コーティングに残存する不純物、未反応モノマー等を除去するため、さらには膜中の共重合体のイオンバランスを調節するために、水及び電解質を含む水溶液からなる群より選ばれる少なくとも１種の溶媒を用い、流水洗浄又は超音波洗浄等で洗浄してもよい。ここで水又は電解質を含む水溶液は例えば４０℃乃至９５℃の範囲で加温されたものでもよい。電解質を含む水溶液は、ＰＢＳ及び生理食塩水（塩化ナトリウムのみ含むもの）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水及びベロナール緩衝生理食塩水が好ましく、ＰＢＳが特に好ましい。
【００９３】
アルコール、水、及びＰＢＳ等で洗浄しても、容器の表面に形成されたコーティングは、溶出せずに基材（すなわち、容器）に強固に固着したままである。形成されたコーティングは、細胞を含む様々な生体物質の付着抑制能を有する。したがって、本発明の細胞培養容器は、細胞の付着抑制に加え、溶媒や放射線への耐久性にも優れたものである。
【００９４】
必要に応じて、コーティングされた容器を滅菌するために、放射線、電子線、エチレンオキサイド、オートクレーブ等の公知の滅菌処理を施してもよい。
【００９５】
≪細胞凝集塊の製造方法≫
本発明の第三の態様は、本発明の細胞培養容器及び本発明の製造方法により得られた細胞培養容器（以下、両者を合わせて「本発明の細胞培養容器」という）を用いることを特徴とする、細胞凝集塊の製造方法である。本発明の細胞培養容器を用いると、細胞凝集塊の容器の表面（壁面）への付着が抑制され、かつコーティングの培養液への溶出が抑制されることから、容器からの刺激のない状態で細胞凝集塊を培養することができる。細胞凝集塊は、好ましくは、本発明の細胞培養容器中で細胞又は組織を浮遊させる効果を有する多糖類（特に、脱アシル化ジェランガム）を含むことを特徴とする培地を用いて培養される。そのような培地の具体的な組成や、培養方法は、例えば、国際公開第２０１４／０１７５１３号公報に開示されている。
【実施例】
【００９６】
以下に、本発明の培養容器及びその製造方法に関する合成例、実施例及び試験例を示すが、これらは本発明をさらに詳細に説明するために示されるものであって、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９７】
＜原料組成の測定方法＞
リン含有化合物を含む原料の、各リン含有化合物の濃度（質量％）測定は、３１Ｐ−ＮＭＲにより行った。下記標準物質を用いて原料中に含まれる各リン含有化合物の絶対濃度（絶対質量％）を算出した。【００９８】
(測定条件)
・モード：逆ゲートデカップリングモード（定量モード）
・装置：varian 400 MHz
・溶媒：CD3OD（重メタノール）（30重量％）
・回転数：0 Hz
・データポイント：64000
・フリップ角：90°
・待ち時間：70 s
・積算回数：16回，n=4，
・標準物質：トリメチルリン酸+D2O  （75％TMP溶液を調製）【００９９】
＜合成例１＞表面処理剤Ｌ１の調製：
アシッドホスホオキシエチルメタアクリレート（製品名；ホスマーＭ、ユニケミカル社製、乾固法１００℃・１時間における不揮発分：９１．８％、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（４４．２質量％）、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（２８．６質量％）、その他の物質（２７．２質量％）の混合物）６．００ｇに純水１２．４０ｇを加え十分に溶解し、エタノール１２．４０ｇ、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル４．１２ｇ（東京化成工業（株）社製）、２、２’−アゾ（２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド）(製品名；ＶＡ−０８６、和光純薬社製)０．１０ｇを２０℃以下に保ちながら順に加え滴下ロートに導入した。一方で、純水４７１．１３ｇ、エタノール３７．２０ｇを冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、混合液を導入した滴下ロートをセットし、０．５時間で混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、２４時間環境を維持した状態で加熱撹拌することで固形分約２質量％の透明重合液５０６．０５ｇを得た。得られた透明液体のＧＦＣにおける重量平均分子量は約８１０，０００であった。その後、共重合体含有ワニス１．００ｇに、純水０．９ｇ、エタノール０．１ｇを加えて十分に攪拌し、表面処理剤Ｌ１（固形分１質量％）を調製した。【０１００】
＜合成例２＞表面処理剤Ｌ２の調製：
アシッドホスホオキシエチルメタアクリレート（製品名；ホスマーＭ、ユニケミカル（株）社製、乾固法１００℃・１時間における不揮発分：９１．８％、アシッドホスホオキシエチルメタクリレート（４４．２質量％）、リン酸ビス［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（２８．６質量％）、その他の物質（２７．２質量％）の混合物）１０．００ｇに純水６８．８８ｇを加え十分に溶解し、エタノール２９．５２ｇ、メタクリル酸２−（ジメチルアミノ）エチル７．６３ｇ（東京化成工業（株）社製）、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２―カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］（製品名；ＶＡ−０５７、和光純薬工業（株）社製）０．０９ｇを２０℃以下に保ちながら順に加え滴下ロートに導入した。一方で、純水３７３．８９ｇ、エタノール２９．５２ｇを冷却管付きの３つ口フラスコに加えて窒素フローし、撹拌しながらリフラックス温度まで昇温した。この状態を維持しつつ、混合液を導入した滴下ロートをセットし、０．５時間で混合液を純水とエタノールの沸騰液内に滴下した。滴下後、２４時間環境を維持した状態で加熱撹拌することで固形分約３．５質量％の透明重合液５０９．６０ｇを得た。得られた透明液体のＧＦＣにおける重量平均分子量は約２８０，０００であった。その後、共重合体含有ワニス１．００ｇに、純水１．５６ｇ、エタノール０．９４ｇを加えて十分に攪拌し、表面処理剤Ｌ２（固形分１質量％）を調製した。【０１０１】
＜実施例１＞
以下の各処理工程を順番に実施し、本発明における細胞培養容器を調製した。
処理１：合成例１或いは２で作成した表面処理剤（Ｌ１又はＬ２）を、メッシュサイズが０．２２μｍのフィルターを用いてろ過した後、９６穴細胞培養プレート（下記試験例参照）のウェルに２００μＬ（固形分１質量％）／ウェルとなるよう添加し、室温にて１時間静置後、余剰の表面処理剤を除去した。【０１０２】
処理２：オーブン（アドバンテック東洋株式会社製、乾燥機ＦＣ−６１２）を用いて５０度で１晩乾燥させた。【０１０３】
処理３：γ線滅菌
＜方法−１＞：通常条件
コーティング済みの９６穴タイタープレートを遮光・防湿・酸素バリヤー性を持つアルミ/ＰＥＴラミネートフィルムからなるチャック付ガス不透過性包装容器（製品名；ラミジップＡＬ−２２、生産日本社製）に入れ、大気雰囲気下で密封し、約２４時間以上放置してからガンマ線を１５ｋＧｙ照射し滅菌を行った。
＜方法−２＞：真空条件
コーティング済みの９６穴タイタープレートを遮光・防湿・酸素バリヤー性を持つアルミ/ＰＥＴラミネートフィルムからなるチャック付ガス不透過性包装容器（製品名；ラミジップＡＬ−２２、生産日本社製）に入れ、バキュームシーラーを用いて真空下で加熱密封し、約２４時間以上放置してからガンマ線を１５ｋＧｙ照射し滅菌を行った。
＜方法−３＞：酸化防止剤・乾燥剤同梱・真空条件
コーティング済みの９６穴タイタープレートと、乾燥剤（製品名；シリカゲルＭｉｘ、豊田化工社製）と、脱酸素剤（製品名；セキュールＡＰ−５００、ニッソーファイン社製）を遮光・防湿・酸素バリヤー性を持つアルミ/ＰＥＴラミネートフィルムからなるチャック付ガス不透過性包装容器（製品名；ラミジップＡＬ−２２、生産日本社製）に入れ、バキュームシーラーを用いて真空下で加熱密封し、約２４時間以上放置してからガンマ線を１５ｋＧｙ照射し滅菌を行った。；【０１０４】
処理４：メッシュサイズが０．２２μｍのフィルターを透過させた超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）２００μＬを各ウェルに添加した後、全量を除去。本処理を３回実施した。【０１０５】
＜試験例１：表面処理剤をコーティングした細胞培養プレートの細胞接着抑制効果１＞
（コーティングプレートの調製）
実施例１に示したコーティング法により平底９６穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５１１７２）のウェルを、表面処理剤Ｌ１又はＬ２にてコーティングした。この際、γ線滅菌方法は＜方法−１＞を用いた。陰性対象としては、コーティング処理をしていないプレートを用いた。陽性対照のサンプルとしては、市販の細胞低接着プレート（コーニング社製、＃３４７４）を用いた。【０１０６】
（細胞の調製）
細胞は、ヒト胎児腎細胞株Ｈｅｋ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。
それら細胞の培養に用いた培地は、Ｈｅｋ２９３：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むEＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）、ＨｅｐＧ２：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）、ＲＡＷ２６４．７：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（シグマ社製）を用いた。細胞は、３７℃ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍｌで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液(インビトロジェン社製)１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離（久保田商事株式会社製、型番５９００、１５００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。【０１０７】
（細胞付着実験）
上記にて調製したプレートに対して、それぞれの細胞懸濁液を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各１００μＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で４日間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。【０１０８】
（細胞付着の観察）
培養４日間後、表面処理剤Ｌ１又はＬ２にてコーティングした平底９６穴タイタープレート、陰性対照、陽性対照に対する細胞の付着を倒立型顕微鏡（オリンパス社製、ＣＫＸ３１）による観察に基づき比較した。その結果を下記表１に示す。また、細胞観察の代表例として表面処理剤Ｌ１でコーティングしたプレートにて培養したＨｅｐＧ２細胞の顕微鏡写真（倍率：４０倍）を図１に示す。【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
表１及び図１の通り、Ｌ１及びＬ２処理を施したプレートは、陽性対照と同様にどの細胞の場合も細胞が付着しないことが示された。この際、図１の通り、付着しなかった細胞は細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していた。【０１１１】
＜試験例２：表面処理剤をコーティングした細胞培養プレートの細胞接着抑制効果２＞
（コーティングプレートの調製）
実施例１に示したコーティング法により平底９６穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５１１７２）のウェルを、表面処理剤Ｌ１にてコーティングした。この際、γ線滅菌方法は＜方法−１＞＜方法−２＞＜方法−３＞を用いた。陰性対象としては、コーティング処理をしていないプレートを用いた。【０１１２】
（細胞の調製）
細胞は、ヒト胎児腎細胞株Ｈｅｋ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。本細胞の培養には、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むEＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）を用いた。細胞は、３７℃ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍｌで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液(インビトロジェン社製)１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離（久保田商事株式会社製、型番５９００、１５００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地を添加して細胞懸濁液を調製した。【０１１３】
（細胞付着実験）
上記にて調製したプレートに対して、Ｈｅｋ２９３細胞懸濁液を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各１００μＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で４日間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。【０１１４】
（細胞付着の観察）
培養４日間後、表面処理剤Ｌ１にてコーティングした平底９６穴タイタープレート及び陰性対照に対する細胞の付着を倒立型顕微鏡（オリンパス社製、ＣＫＸ３１）による観察に基づき比較した。その結果を下記表２に示す。【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
表２の通り、Ｌ１処理を施した後にγ線滅菌処理を行ったプレートは、Ｈｅｋ２９３細胞が付着しないことが示された。この際、付着しなかった細胞はウェル内で細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していた。【０１１７】
＜試験例３：表面処理剤をコーティングした細胞培養プレートの細胞接着抑制効果３＞
（コーティングプレートの調製）
実施例１に示したコーティング法によりＵ字底９６穴細胞培養プレート（ＢＤバイオサイエンス社製、＃３５３２２７）のウェルを、表面処理剤Ｌ１又はＬ２にてコーティングした。この際、γ線滅菌は実施しなかった。陰性対象としては、コーティング処理をしていないプレートを用いた。陽性対照のサンプルとしては、市販の細胞低接着プレート（住友ベークライト社製、＃ＭＳ−９０９６Ｕ）を用いた。【０１１８】
（細胞の調製）
細胞は、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いた。本細胞の培養には、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）を用いた。細胞は、３７℃ＣＯ２インキュベーター内にて５％二酸化炭素濃度を保った状態で、直径１０ｃｍのシャーレ（培地１０ｍＬ）を用いて２日間以上静置培養した。引き続き、本細胞をＰＢＳ５ｍｌで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液(インビトロジェン社製)１ｍＬを添加して細胞を剥がし、上記の培地１０ｍＬにてそれぞれ懸濁した。本懸濁液を遠心分離（久保田商事株式会社製、型番５９００、１５００ｒｐｍ／３分、室温）後、上清を除き、上記の培地或いは終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地を用いて細胞懸濁液をそれぞれ調製した。ここで、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシルジェランガムを添加した培地は以下の様に調製した。すなわち、脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムとなるようによく撹拌しながら添加した。【０１１９】
（細胞付着実験）
上記にて調製したプレートに対して、それぞれの細胞懸濁液を２×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように各１００μＬ加えた。その後、５％二酸化炭素濃度を保った状態で、３７℃で５日間ＣＯ２インキュベーター内にて静置した。【０１２０】
（細胞付着の観察）
培養５日間後、表面処理剤Ｌ１又はＬ２にてコーティングしたＵ字底９６穴タイタープレート、陰性対照、陽性対照に対する細胞の付着を倒立型顕微鏡（オリンパス社製、ＣＫＸ３１）による観察に基づき比較した。その結果を下記表３に示す。また、細胞観察の代表例として表面処理剤Ｌ１にてコーティングしたプレートにて培養したＨｅｐＧ２細胞の顕微鏡写真（倍率：４０倍）を図２に示す。【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
表３及び図２の通り、Ｌ１及びＬ２処理を施したプレートは、陽性対照と同様にどの細胞の場合も細胞が付着しないことが示された。この際、図２の通り、付着しなかった細胞はウェル底の中央付近に細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していた。なお、脱アシル化ジェランガムを添加した培地を用いると無添加に比べて細胞凝集塊の大きさが小さくなり、尚且つ分散されることも示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明の細胞培養容器は、特定の有機基を含む共重合体で表面の少なくとも一部がコーティングされている。かかるコーティングは、細胞の容器表面（壁面）への付着を抑制すると共に、コーティングが容器表面に強固に固着しうることから、コーティングの培養液への溶出の抑制や放射線耐性が改善されている。したがって、本発明の細胞培養容器は、容器からの刺激のない状態で細胞凝集塊を培養することができる点で有利である。
【図１】
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【図２】
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