(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素分子を１(v/v)％以上含む気体からなる、低下した精子運動性の向上剤であって、水素ガス雰囲気下で精子含有液と接触させる場合、少なくとも３０分間接触させる、前記向上剤。
【請求項２】
水素分子を１(v/v)％以上含む気体が、水素分子を４５〜５５(v/v)％含む気体であることを特徴とする請求項１記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項３】
気体が、水素ガスと酸素ガスと炭酸ガスと窒素ガスとの混合ガスであることを特徴とする請求項１又は２記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項４】
水素分子を飽和溶解度の１％以上含む液体からなる、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項５】
水素分子をバブリングにより溶解した液体であることを特徴とする請求項４記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項６】
液体が、水素分子を含む生理食塩水、培養液又は緩衝液であることを特徴とする請求項４又は５記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項７】
容器に収納されていることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項８】
精子の前進運動性を向上することを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項９】
精子が凍結保存した精子であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の、低下した精子運動性の向上剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか記載の、低下した精子運動性の向上剤を、生体外で、運動性が低下した精子と接触させることを特徴とする精子の低下した運動性を向上する方法であって、気体からなる前記向上剤を、水素ガス雰囲気下で精子含有液と接触させる場合、少なくとも３０分間接触させる、前記方法。
【請求項１１】
低下した精子運動性の向上剤を複数回精子と接触させることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
気体状又は液体状の、低下した精子運動性の向上剤の調製における、水素分子の使用であって、前記気体状の向上剤を、水素ガス雰囲気下で精子含有液と接触させる場合、少なくとも３０分間接触させる、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水素分子を有効成分として含む、精子の運動性、特に前進運動性や前進運動する精子の移動距離を向上させ、受精率を高める精子運動性改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＷＨＯ（世界保健機関）によると、不妊原因のうち、「男性のみ」に原因がある場合が２４％であり、男女双方に原因がある場合を加えると、約５０％のケースで男性が関係している。しかしながら、日本の不妊治療は女性側に偏っており、男性側の対策はほとんどなされていないのが現状である。【０００３】
男性不妊の原因は、射精された精液量が少ない場合を精液減少症、精子の数が少ない場合を乏精子症、精液中に精子が全く存在しない場合を無精子症と分類される。また、精子の運動性が低い場合は、精子無力症と診断される。しかしながら、なぜ精子数が減少し、運動率が低下するのか、その原因が特定できるのはむしろ少数で、男性不妊の６割は原因不明とされる。【０００４】
無精子症は更に二つに区別され、閉塞性無精子症と非閉塞性無精子症に分類される。閉塞性無精子症は、精巣では精子が正常に形成されているが、精巣上体や精管などの異常で、精子が射出精液中に出てこない病態である。一方、非閉塞性無精子症は、精巣自体の造精機能に障害があるために、精子ができない病態である。この診断には、採血によるゴナドトロピン（ＦＳＨ、ＬＨなど）の血中濃度異常、精巣容量および弾力の低下、輸精管閉塞がないことの確認が重要である。血清ゴナドトロピン値はその時点での造精機能の指標となるため、無精子症でＦＳＨが正常値範囲内であれば、精子は造られているのに射出精液に出てこないことを意味し、閉塞性無精子症と診断される。ＦＳＨが非常に低い場合や非常に高い場合は、非閉塞性無精子症と診断される。【０００５】
非閉塞性無精子症で、精巣生検で精子が確認される場合は未熟な精子や奇形精子が多く、そのほとんどが不動精子である。このような不動精子を用いて顕微授精を行っても、妊娠率は非常に低くなる。そのため、精子の生存性をHOS test［hypo-osmotic swelling test］で確認してから顕微授精を行っている施設もある［Jeyendran RS, et al., J Reprod Fertil. 1984;70:219-28.］。しかしながら、低浸透圧の培養液に精子を浸漬するHOS testにより、精子の生存の有無を確認できても、その精子を顕微授精に使用することは技術的に困難である。精巣内精子に限らず、射出精液中の精子でも運動性がない場合は、顕微授精による受精・胚発生率・移植後の妊娠率が極端に低いという報告から［Vandervorst M, et al., Hum Reprod. 1997;12:2429-33.］、臨床の現場では、運動性のある正常形態精子を選択し顕微授精に用いられている。【０００６】
また、生殖治療では凍結保存された精子が日常的に用いられている。しかし、凍結処理は精子のミトコンドリアの損傷を含む精子の形態の変化を引き起こすことが報告されており、特に、精子の運動性に大きな影響を与えることが報告されている［O'Connell M, et al., Hum Reprod. 2002; 17: 704-9.］［Boitrelle F, et al. J Androl. 2012; 33: 1371-8.］。凍結処理精子の低運動性を活性化するための、臨床における有効なアプローチは報告されていない。【０００７】
精子の運動性の原動力である鞭毛運動は、モータータンパク質であるダイニン［Gibbons IR, et al., Science, 1965;149:424-426.］とレール役である細胞骨格の微小管を構成するチューブリン［Mohri H, Nature, 1968;217:1053-54.］の働きでおこる。鞭毛運動の基本がダイニンの働きによる微小管同士の滑りにあることや［Summers KE, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1971;68:3092-3096.］、微小管の滑りによって鞭毛の屈曲が生じることは［Shingyouji, et al., Nature, 1977;265:269-270.］、すでに１９７０年代に明らかにされているが、屈曲が鞭毛の根元で生じる仕組みや屈曲波が伝わる仕組みは未だ解明されていない。鞭毛運動はＡＴＰによって支えられている。主にミトコンドリアで作られたＡＴＰは拡散により鞭毛の各部分で使われていると考えられている［Steeghs, et al., Biochem. Biophys. Acta., 1995;30:130-138.］。一方、嫌気性の条件下、例えば、マウスやウシの子宮や卵管内での精子では、酸素を必要としない解糖系で造られたＡＴＰに依存しているとの報告もある［Mukai, et al., Biol. Reprod., 2004;71:540-547.］。【０００８】
ミトコンドリアでのＡＴＰ産生には酸素が必要である。酸素を必要とする細胞の一つとして、精子も過酸化水素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素種の影響を受けることが知られている［Aitken, et al., J. Reprod. Fertil., 1987;81:459-469.］。スーパーオキシドアニオンなどは、精子の超活性化や受精能獲得といった役割を担っているが、作用箇所や作用期間などによって働きが異なっている。一方、精漿には活性酸素種を取り除くカタラーゼやスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）などが含まれ、過剰な活性酸素種を除去している。この為、不妊治療に用いるため精漿を洗浄除去した精子は、活性酸素種に曝されやすくなる。【０００９】
酸化ストレスは、強い酸化力を持つ活性酸素種やフリーラジカルが過剰に生じることにより起こる。なかでも強力なヒドロキシラジカルは、生体に様々な悪い影響をもたらすことが知られており、抗酸化物を用いてヒドロキシラジカルを消去する試みや、その効果が検討されてきた。例えば、ヒドロキシラジカルなど毒性の高いラジカルを選択的に還元し失活させる水素分子の性質を利用した検討では、脳における虚血・再灌流障害の抑制や、アテローム性動脈硬化症の抑制を示した実験動物モデルのほか［非特許文献１］、脂質代謝の改善［特許文献１］、水素含有薬剤を肺の炎症治療に用い得ること［特許文献２］、健康促進効果を狙った水素ガスの体内吸入方法［特許文献３］などの報告がある。また、精子の運動性に関しては、ミオイノシトールを精子懸濁液に添加することでミトコンドリア機能の回復を促し、精子の運動性が向上したと報告されているものの［非特許文献２］、体外受精あるいは顕微授精の治療に使用可能な、採取当日に射出された運動性を有する精子の検討であるため、不動精子の臨床使用の問題に対する解決策にはなり得ない。さらに、水素分子と精子運動性の関連については何ら報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】再表２００８−０２６７８５号公報
【特許文献２】特表２０００−５１７３１１号公報
【特許文献３】特開２００５−０８７２５７号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】大澤郁朗著  「水素分子医学の現状と展望」基礎老化研究  ３５（１）；１−７，２０１１
【非特許文献２】Condorelli, et. al., Urology. 2012 Jun;79(6):1290-5.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、男性不妊治療における運動性の低下した精子を対象とした精子運動性改善剤，特に精子前進運動性改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その過程において、不妊治療用に採取された後に余剰として破棄される、射精から５日以上経過し著しく運動機能の低下した精子を被検体として、高濃度に水素分子を含む気体を精子懸濁液と接触処置したところ、精子の前進運動能回復と前進移動距離の飛躍的向上を見いだした。また、水素分子を溶解した培養液に、運動機能の低下した精子を接触させたところ、前進運動性が回復することを見いだした。さらに、水素分子を溶解した培養液で凍結保存した精子を洗浄したところ、前進運動性が回復することを見いだした。本発明はこれらの知見に基づき完成する至ったものである。【００１４】
すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
（１）水素分子を１(v/v)％以上含む気体からなる精子運動性改善剤、
（２）水素分子を１(v/v)％以上含む気体が、水素分子を４５〜５５(v/v)％含む気体であることを特徴とする上記（１）記載の精子運動性改善剤、
（３）気体が、水素ガスと酸素ガスと炭酸ガスと窒素ガスとの混合ガスであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の精子運動性改善剤、
（４）水素分子を飽和溶解度の１％以上含む液体からなる精子運動性改善剤、
（５）水素分子をバブリングにより溶解した液体であることを特徴とする上記（４）記載の精子運動性改善剤、
（６）液体が、水素分子を含む生理食塩水、培養液又は緩衝液であることを特徴とする上記（４）又は（５）記載の精子運動性改善剤、
（７）容器に収納されていることを特徴とする上記（４）〜（６）のいずれか記載の精子運動性改善剤、
（８）精子の前進運動性を改善することを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれか記載の精子運動性改善剤、
（９）精子が凍結保存した精子であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の精子運動性改善剤、
（１０）上記（１）〜（９）のいずれか記載の精子運動性改善剤を、生体外で精子と接触させることを特徴とする精子の運動性を改善する方法、
（１１）精子運動性改善剤を複数回精子と接触させることを特徴とする上記（１０）記載の方法、
（１２）気体状又は液体状の精子運動性改善剤の調製における水素分子の使用、
（１３）精子の運動性を改善するための水素分子、
（１４）水素分子を含む気体の導入口と導入気体の排出口を備えた、精子の運動性を改善するための処置容器に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、現在確たる対策のない運動性を有さない不動精子に対して、前進運動能を回復させる新たな治療法が提供される。また、凍結保存により運動性が低下した精子の前進運動能を回復させることが可能となり、精子採取による負担を軽減することが可能となる。本発明によると、前進運動性を有する精子を使用した場合に比べて、極端に妊娠率が劣ることを承知の上で、運動性のない精子を顕微授精に用いざるを得ない男性側を原因とする不妊治療の症例、とりわけ、精巣内精子など運動機能のない精子や、精子として未熟な円形精子細胞を治療に使用せざるを得ない男性不妊患者を含む治療中の患者にとって、妊娠率の向上が期待される有力な技術がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の精子運動性改善剤で処置するための容器の写真である。
【図２】本発明の精子運動性改善剤で処置するための装置の概略図である。
【図３】（ａ）採取後５日以上経過した精子のＨ２処置及びＮ２処置後の前進運動精子率を示した図である。（ｂ）採取後５日以上経過したのちＨ２処置した精子における、処置時間と前進運動精子率の関係を示した図である。
【図４】採取後５日以上経過した精子のＨ２処置及びＮ２処置前後の、前進運動精子率を検体別に示した図である。
【図５】採取後５日以上経過したのちＨ２処置及びＮ２処置した精子における、前進運動精子の１秒間あたりの移動距離を示した図である。
【図６】採取後５日以上経過した精子にＨ２処置及びＮ２処置を行うにあたり、一度目の処置から２４時間後に再処置した精子における、前進運動精子率の推移を経時的に示した図である。
【図７】（ａ）無処置、（ｂ）Ｈ２処置、及び（ｃ）Ｎ２処置をそれぞれ行った精子を、ミトコンドリアの膜電位依存色素を用いて共染色した後、レーザー走査型共焦点顕微鏡で撮影した画像である。（ｄ）ミトコンドリア膜電位依存色素で染色した精子の蛍光強度をImageJを用いて半定量化したグラフである。
【図８】凍結融解処理を行った精子を、異なるＨ２濃度で処置した際の前進運動精子率を検体別に示した図である。（ａ）は前進運動精子率５０％以上の患者より得た検体、（ｂ）は前進運動精子率５０％未満の患者より得た検体が対象である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の精子運動性改善剤としては、水素分子を１(v/v)％以上含む気体、又は水素分子を飽和溶解度の１％以上含む液体からなり、精子を水素分子に接触処置させることができるものであれば特に制限されず、本発明の精子運動性改善剤によると、男性不妊患者由来の精子における運動性、とりわけ前進運動性を回復せしめ、顕微授精による妊娠成立の可能性を高めることができる。
【００１８】
本発明において、精子運動性改善とは、日本泌尿器科学会が監修した精液検査標準化ガイドライン（金原出版、東京、２００３年）又は、ＷＨＯ精液検査ラボマニュアル第５版（世界保健機構刊行、高度生殖医療技術研究所訳、２０１０年）に準拠した精液検査・精子運動率の測定法により、１００個程度の精子を、Ａ：速度が速く、直進する精子、Ｂ：速度が遅い、あるいは直進性が良好でない精子、Ｃ：頭部あるいは尾部の動きを認めるが、前進運動していない精子、Ｄ：非運動性の不動精子の４項目に分類し、原則上述の検査を２〜３回繰り返した平均値で示される精子運動率％（Ａ＋Ｂ＋Ｃ／Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）が有意に向上することを意味する。また本発明において、前進運動精子率％とは、Ａ＋Ｂ／Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄで示される。
【００１９】
上記精子運動率の測定方法としては、液化した精液１０μｌを、望ましくは３７℃の保温性を維持しながら計算盤に載せカバーガラスで覆い、２００又は４００倍率の検鏡下にて、５カ所以上の視野中１００個程度の精子を上記４項目に分類し、これを原則２〜３回繰り返す平均値の算出方法を好ましく例示することができる。また、上記精液に代えて、生理食塩水、培養液、緩衝液等で適宜濃度に希釈した精液を用いることができる。
【００２０】
上記精子としては、上記精液検査標準化ガイドライン又は、ＷＨＯ精液検査ラボマニュアルに記載のサンプル採取法に準拠した方法で採集されることが好ましく、具体的には、最低２日間以上、最高７日間以内の禁欲期間を経た男性患者より、好ましくは専用の精液採取場所にて、マスターベーションにより、清潔なガラス又はプラスチック製広口容器中に採取された、一生産工程分からなる、射出されて４時間以内、より好ましくは３時間以内、特に好ましくは２時間以内、最も好ましくは１時間以内の精液サンプル中精子（射出精子）や、精巣内精子採取術又は顕微鏡下精巣内精子採取術によって採取された精子（精巣内精子）を好ましく例示することができる。
また、これら方法で採取後の精子を凍結処理し保存した精子が、男性患者の精子採取における負担を軽減する観点で特に好ましく、本発明の効果を享受することができる。凍結処理の条件は特に制限されることはないが、例えば、採取した精子をテストヨークバッファー［Refrigeratin Medium-TEST Yolk Buffer, Irvine Scientific、カリフォルニア、米国）］などの凍結保存用緩衝液に懸濁した後クライオチューブに分注し、液体窒素下にて凍結する方法を挙げることができる。精子を解凍する際には、例えば、精子が分注されているクライオチューブを３７℃の温水中で加熱し融解する方法を挙げることができる。凍結融解した精子は、凍結処理を行っていない精子と同様に本発明の精子の運動性を改善する方法に用いることが可能である。
【００２１】
上記精子の由来としては、ヒトを最も好適に例示することができるが、その他にも、通常、実験動物、家畜、ペットとして一般的に使用される哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、サルなどを例示することができる。ウシ、ウマ、ブタといった大型動物の場合は、人工膣法、電気刺激法、精管膨大部マッサージ法、手掌圧迫法などの方法により採取された精子を好適に挙げることができる。
【００２２】
本発明の水素分子を１(v/v)％以上含む気体からなる精子運動性改善剤としては、水素ガス濃度の下限が、好ましくは１０(v/v)％以上、より好ましくは２０(v/v)％以上、さらに好ましくは３０(v/v)％以上、中でも４０(v/v)％以上含む混合ガスを挙げることができ、他方水素ガス濃度の上限は、安全性を考慮して決定され、密閉条件下で静電気が発生しないように配慮された安全な条件下においては、１００(v/v)％であっても差し支えないが、実用面を考慮すると、水素ガス濃度８０(v/v)％以下、好ましくは６０ (v/v)％以下であり、例えば、水素ガス濃度４５〜５５(v/v)％の混合ガスを特に好適に挙げることができる。かかる混合ガス中の水素ガス以外のガス成分としては、酸素ガス、二酸化炭素ガス、不活性ガス等を挙げることができ、不活性ガスとしては、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス等を挙げることができるが、安価でかつ空気の組成物である窒素ガスが好ましい。水素ガス以外のガス成分の含有量は、当業者が任意に設定することができるが、水素ガスを５０％、窒素ガスを２５％、酸素ガスを２０％、二酸化炭素ガスを５％の混合ガスが好ましい。
【００２３】
水素分子を飽和溶解度の１％以上含む液体からなる精子運動性改善剤としては、水素ガス又は水素含有混合ガスを、バブリング等により、生理食塩水、培養液、緩衝液等に溶解した液体を挙げることができる。水素分子の溶解度は水素分圧が０．１０１ＭＰａ（１気圧）２０℃の場合、１０００ｇの水に対して０．００１６２ｇ(約１．６ｐｐｍ、０.８ｍＭ)であるが、過飽和状態まで水素ガスが溶解した水素溶解量が大きいものが好ましい。５０％の水素分子を含む水素含有混合ガスで液体をバブリングすると約０.４ｍＭとなる。上記生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９(w/v)％含有する食塩水であれば特に制限されず、上記培養液としては、体外受精用に調製された培養液が望ましく、ヒト胚専用の培養液として開発された、クリベージメディウム［SAGE（登録商標）Cleavage Medium CooperSurgical,Inc.、コネチカット、米国）］に１０％の血漿タンパク質分画（PPF: plasma protein fraction）の添加されたもの、スパームウォッシングメディウム［Irvine Scientific、カリフォルニア、米国］、ファティリゼイション（ＨＴＦ）メディウム［SAGE In-Vitro Fertilization、コネチカット、米国］、Ferticult（登録商標）Sperm Washing Flushing Medium［FertiPro N.V.、ベールネム、ベルギー］を好適に挙げることができる。また、上記緩衝液としては、ヒト卵管液組成培養液［human tubal fluid culture medium(HTF)］に２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ［4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid］を添加することで緩衝作用を持たせた改変ＨＴＦ液や、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を挙げることができる。また、上記培養液や緩衝液に１０％加熱ヒト血漿たん白［プラズマプロテインフラクション（ＰＰＦ）; バクスター株式会社、カリフォルニア、米国］を加えたものを最も好ましく挙げることができ、上記ＰＰＦは、エタノール分画、加熱処理、Ｓ／Ｄ処理などにより不活化されているものが望ましい。
【００２４】
上記本発明の液体状精子運動性改善剤は、水素分子を溶解した液体、好ましくは滅菌された液体が収容された容器（ボトル）として提供することができる。かかる容器入り液体状精子運動性改善剤の製法としては、水素非透過性の素材で形成された容器に水素ガス溶解液体を充填する方法や、液体が収容された水素透過性の素材で形成された容器を、水素ガス雰囲気下に維持する方法を挙げることができる。水素ガス雰囲気下に維持する方法として、例えば、液体が収容された水素透過性の素材で形成されたボトルを、水素非透過性の素材で形成された包装パックに収容する方法を挙げることができる。
【００２５】
上記水素非透過性の素材としては、アルミニウム（缶、箔）、アルミニウム合金（缶、箔）、エポキシ樹脂を含浸させた高強度カーボン繊維をアルミニウム製ライナーの全面に巻きつけたカーボンＦＲＰ、合成樹脂フィルムにアルミ箔をラミネート（圧着）したアルミパウチ、紙とポリエチレンの間にアルミ箔を挟んだラミネート等を挙げることができる。また、水素透過性の素材としては、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート・ポリエステル）、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、環状オレフィンコポリマー等を挙げることができる。
【００２６】
本発明の精子の運動性を改善する方法としては、上記本発明の気体状精子運動性改善剤又は液体状の精子運動性改善剤と精子とを生体外で接触させる方法であれば特に制限されず、精子と気体状精子運動性改善剤とを接触させるには、水素分子を含む気体の導入口と導入気体の排出口を備えた（精子の運動性を改善するための）処置容器内に、薄層状態の精子懸濁液を載置し、気体状精子運動性改善剤を所定時間、例えば１〜６０分間、流し続けることで容器内の空気を気体状精子運動性改善剤で置換後、精子懸濁液を容器内に所定時間、例えば１０〜１２０分間、静置してガス平衡することで、行うことができる。また、精子と液体状精子運動性改善剤とを接触させるには、液体状精子運動性改善剤を精液の洗浄液、希釈液として使用することにより行うことができる。精子運動性改善剤と精子との接触は、所定間隔、例えば１２〜４８時間間隔で複数回行うこともできる。精子運動性改善剤による再処置により、精子の運動能を再度回復することができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。以下の実施例において使用した精子は、山下湘南夢クリニックにて不妊治療中の患者の同意のもと、施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）の承認を受けた研究目的で使用された。
【実施例１】
【００２８】
１．精子採取と調整
３日以上７日以内の禁欲期間を経た男性患者から、マスターベーションにより射出精子を採取した。射出から４時間以内にクリニックに搬送された精液を、３７．５℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）、５％酸素（Ｏ２）、９０％窒素（Ｎ２）でガス平衡を２４時間行った１．５ｍｌの１０％ＰＰＦ添加のSAGE（登録商標）Cleavage Medium（CooperSurgical,Inc.、コネチカット、米国）にて希釈を行った。１５ｍｌの遠心菅に８０％Sperm Filter、続いて６０％Sperm Filterの上に希釈精液を重層し、６００ｇ×１５分の条件で遠心分離を行った。遠心後、上澄みを捨て、沈殿したペレットを６ｍｌの１０％ＰＰＦ添加のCleavage Mediumにて希釈し、４００ｇ、５分の条件で遠心分離を行った。上澄みを捨て、沈殿したペレットに１０％ＰＰＦ添加のCleavage Mediumを添加し、体外受精に使用する場合には、１×１０６個／ｍｌの濃度に希釈し、顕微授精用の場合には、最終容量が０．０５ｍｌになるように調整した。
以下実施例２〜８においての検討には、体外受精や顕微授精に使用した後の残余の精子懸濁液を、室温で５日以上保管したものを用いた。
【実施例２】
【００２９】
２．気体状精子運動性改善剤への処置
精子懸濁液を無処置群、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２、５０％水素（Ｈ２）、２５％Ｎ２からなる混合ガス処置群（以下、Ｈ２処置群）、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２、７５％Ｎ２からなる混合ガス処置群（以下、Ｎ２処置群）の３群に分け、各群における精子の運動率（前進運動率及び非前進運動率）と不動率の比較を行った。混合ガスは、MIGM Incubation Gas Mixer (株式会社トッケン、千葉、日本)と流量計により、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２のガスを調整し、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の流量が安定したことを確認した後、Ｈ２ガスのボンベを開き、密閉したフラスコ内の水にＨ２ガスを通気し、フラスコ内で、Ｈ２ガスを含む混合ガスを作製した。フラスコからつながれたルートをアクリルボックスに接着し、密閉したアクリルボックス内にＨ２ガスを含む混合ガスを通気した。アクリルボックスに通気されているかどうかの確認のため、もう一つのルートを水の入ったビーカーに挿入した。そのルートからビーカー内の水にバブリングが起こることで通気されていることを確認した。Ｎ２ガスについても同様に行い、すべて室温で行った。１００８ディッシュに１００μｌの精子懸濁液を滴下し、混合ガス通気前にアクリルボックスに入れた。Ｈ２処置群及びＮ２処置群それぞれ４０分間処置した。４０分経過後、それぞれの精子懸濁液をピペッティングによりよく混和し、数μｌをマクラーチャンバーに滴下し、精子濃度、前進運動精子数、非前進運動精子数、不動精子数を目視で測定した。精子懸濁液をそのまま使用した無処置群についても同様に精子濃度、前進運動精子数、非前進運動精子数、不動精子数を目視で測定した。以上の検討では、採取から５日以上経過し、運動性がほぼ消失している精子を被検体として用いており、無処置群での前進運動率が１５％を超える検体を除外した検体について、１検体を３つの処置群に分け、各処置群につき２回ずつ測定した。すなわち、各サンプルにつき、視野中の総精子数に対する前進運動性を有する精子数の割合を前進運動精子率とし、前進運動性を示さないものの運動性を有する（鞭毛の動いている）精子数の割合を非前進運動精子率とし、運動性を示さない精子数の割合を不動精子率とした。
【実施例３】
【００３０】
３．前進運動精子率測定結果
各処置群における前進運動精子率を図３（ａ）に示す。図３（ａ）において、無処置群における前進運動精子率は平均３．６％、及びＮ２処置群における前進運動精子率は平均７．７％であるのに対し、Ｈ２処置群における前進運動精子率は１６．８％と上昇していたことがわかる。次に、検体ごとの運動性の回復についてみると、Ｈ２処置群及びＮ２処置群において３０検体中１２検体（４０％）は、前進運動性の回復が見られなかった。Ｈ２処置群における前進運動性の回復しない１２検体のうち、Ｈ２処置により非前進運動精子（前進しないが鞭毛の動いているもの）３検体（２５％）を確認した。Ｈ２処置を行っても精子の運動性が回復しない精子は、無処理の時点で、精子の鞭毛が直線ではなく、渦巻き状の形態を示すものがほとんどであったのに対し、Ｈ２処置後に運動性が回復した前進運動精子及び非前進運動精子は鞭毛が直線であった。渦巻状の形態の精子はＰＩ（Propidium Iodide）による蛍光染色で死滅精子であると確認した。
前進運動性の回復した１８検体中１７検体（９４％）において、Ｈ２処置群はＮ２処置群より長い移動距離（高い前進性）を示した（Ｐ＜０．０１）。Ｈ２処置群がＮ２処置群より高い前進性を示した１７検体中６検体（３５％）では、無処置群とＮ２処置群において前進運動の回復が見られず、Ｈ２処置群でのみ前進運動が回復した。【００３１】
また、検体別前進運動精子率を図４に示す。前進運動精子率１５％未満の患者より得た１７検体を対象としたＨ２処置により、１６検体において前進運動精子率が上昇したことがわかる。これに対し、Ｎ２処置群では４検体において前進運動精子率が上昇したが、この４検体はいずれもＨ２処置によっても前進運動精子率が上昇した検体であった。また、Ｈ２処置群の前進運動精子率は平均１１％だったのに対し、Ｎ２処置群では平均３．６％だった。これより、Ｈ２処置により精子の運動性の改善が効果的に行われることが示された。
【実施例４】
【００３２】
４．前進運動精子率測定結果
１０人の患者の採取５日目の各条件で処置した精子における、１０秒間の前進運動における移動距離を動画撮影により測定した。その後、撮影した動画をCASAシステム（ＮＩＨ）（Computer assisted sperm analysis using ImageJ; description of necessary components and use of free software）による精子の前進運動により移動距離を測定した。結果を図５に示す。１０人の患者において、無処置群（コントロール）、Ｈ２処置群、及びＮ２処置群の平均移動距離を比較したところ、有意差はみられなかった（Ｐ＝０．２１９３）。これは、Ｈ２処置が精子の前進速度に影響を与えないことを示している。また、Ｈ２処置群の精子の１秒間あたりの移動距離が最も長いという結果が示された。
【実施例５】
【００３３】
５．各Ｈ２処置時間における前進運動精子率測定結果
患者別のＨ２処置時間と前進運動精子率とを比較した。５分、３０分、６０分のＨ２処置時間における患者別前進運動精子率の比較結果を図３（ｂ）に示す。Ｈ２処置時間５分では、コントロール（無処置群）に対する前進運動精子率はむしろ低下の傾向を示した。Ｈ２処置時間３０分又は６０分では、約７０％の検体で前進運動率がコントロールより上昇した。これより、３０分のＨ２処置により精子運動性は十分に改善されることが示された。
【実施例６】
【００３４】
６．Ｈ２処置及びＨ２再処置による運動精子数の経時的推移
１０人の患者の採取５日目の精子における、Ｈ２処置（３０分）による前進運動精子率の経時的推移（３０分後、６０分後）を図６に示す。３０分間のＨ２処置後、１０分を経過すると懸濁液１０μｌ中の水素は消失するが、３０分〜１５０分後であっても、精子の前進運動性に大きな変化はみられなかったことから、Ｈ２処置したのちに運動機能を回復した精子をそのまま顕微授精に使用することが可能であることがわかる。Ｈ２処置（３０分）から２４時間後にＨ２再処置（３０分）を行うと、Ｈ２処置した精子は２４時間後でも運動性を有していた。
【実施例７】
【００３５】
７．液体状精子運動性改善剤への処置
精子を洗浄する培養液６ｍｌに、水素を含む混合ガス（５％Ｏ２，５％ＣＯ２，４０％Ｎ２，５０％Ｈ２）を１０分間バブリングして液体状精子運動性改善剤を作製した。水素をバブリングにより培養液へ溶解させた場合、ユニセンス社の水素電極を用いて測定した結果、水素濃度はバブリングから１０分後に３００μＭで平衡に達した。その後、静置して水素濃度を測定すると緩やかに減少し、３時間後に５０μＭとなった。上記の様に作製した培養液を用いて精子を洗浄し、運動性の変化を検討したところ、洗浄前は前進運動精子率が０％であったのに対し、水素を含む混合ガスバブリング培養液による５分間の洗浄処置により前進運動精子率が４７％に増加した。また洗浄過程において、４００ｇ×５分間の遠心により、５分後の水素濃度は１５０μＭとなり、再度遠心すると１００μＭまで減少した。このことから、遠心処置は培養液から水素を分散させる要素となることがわかったが、図３（ｂ）に示すように５分間の気体状精子運動性改善剤での処置では精子の運動性が回復しなかったのに対して、液体状精子運動性改善剤による５分間の洗浄処置では精子の運動性を亢進させることが示された。
【実施例８】
【００３６】
８．Ｈ２処置によるミトコンドリア膜電位の増加
無処置群、Ｈ２処置群、及びＮ２処置群の精子懸濁液を用い、精子のミトコンドリアを２μＭ  テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ；Life Technologies、カリフォルニア、米国）及び対照として２μＭ  MitoTrackerグリーン（ＭＴＧ；Life Technologies、カリフォルニア、米国）で３０分間共染色した。ＭＴＧの蛍光は膜電位とは無関係であるが、ＴＭＲＭの蛍光はミトコンドリアの膜電位に依存することが知られている。染色した精子はレーザー走査型共焦点顕微鏡（Leica、ヴェッツラー、独国）を用いて可視化した。また、精子の生存率はＰＩによる蛍光染色にて確認した。【００３７】
共染色の結果を図７（ａ）〜（ｃ）に示す。（ａ）は無処置群、（ｂ）はＨ２処置群、及び（ｃ）はＮ２処置群である。また、微分干渉による像をＤＩＣ（Differential interference contrast）として示した。バーは１０μｍである。（ｄ）は、ＴＭＲＭ染色した精子の蛍光強度をImageJを用いて半定量化したグラフである。無処置群及びＮ２処置群と比較し、Ｈ２処置群は強いＴＭＲＭ蛍光強度を示した（Ｐ＜０．００１）。精子の運動性は、ＡＴＰ含有量に依存する。Ｈ２処置群の精子は、ミトコンドリア膜電位に依存するＴＭＲＭの蛍光強度が他群よりも増加することが示された。これより、Ｈ２処置により精子のミトコンドリアの機能が高まり、運動性が高まることが示唆された。
【実施例９】
【００３８】
９．凍結融解精子のＨ２処置による運動性の向上
３日以上７日以内の禁欲期間を経た男性患者から、マスターベーションにより射出精子を採取した。射出から４時間以内にクリニックに搬送された精液を、Cleavage MediumとTEST-yolk buffer（ＴＹＢ; Irvine Scientific、カリフォルニア、米国）とを等量混合した溶液に懸濁し、クライオチューブに分注した。得られたクライオチューブは、まず５分間窒素蒸気に暴露した後、液体窒素下にて凍結保存した。解凍時には、クライオチューブを３７℃の温水中で加熱した後、クライオチューブ内の精子懸濁液を４本のバイアルに分注した。
Ｈ２で飽和させたCleavage Mediumと、５％ＣＯ２で平衡化させたCleavage Mediumを混合し、精子洗浄培地を作製した。精子洗浄培地は、Ｈ２飽和Cleavage Mediumの混合割合が５０％、７５％、及び１００％のものを用意した。分注した精子懸濁液は精子洗浄培地で５分間洗浄した後、精子運動性を測定した。【００３９】
凍結融解精子の運動性の測定結果を図８にて示す。（ａ）は前進運動精子率５０％以上の患者より得た６検体、（ｂ）は前進運動精子率５０％未満の患者より得た１５検体を対象としている。（ａ）において、Ｈ２処理をしなかった際の前進運動精子率の平均は２７．５％だったが、Ｈ２５０％洗浄培地処理後は６１．３％、Ｈ２７５％洗浄培地処理後は７１．０％、及びＨ２１００％洗浄培地処理後は７０．０％にそれぞれ増加した。（ｂ）においては、Ｈ２処理をしなかった際の前進運動精子率の平均は６１．３％だったが、Ｈ２５０％洗浄培地処理後は４１．２％、Ｈ２７５％洗浄培地処理後は４０．８％、及びＨ２１００％洗浄培地処理後は３１．４％にそれぞれ増加した。
これより、Ｈ２処置により効果的かつ大幅に、凍結融解精子の低運動性を改善することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明は、男性不妊治療において死滅精子と判断される、不動精子に対する精子運動性改善剤を提供する。精子無力症に代表される症例において、本発明により不動精子の運動機能を回復せしめ、顕微授精−胚移植療法による妊娠率を向上させるものと期待される。
【符号の説明】
【００４１】
１    精子運動性改善剤処置容器
２    ガス混合機
３    水素ガス容器
４    水素ガス以外のガス容器
５    配管
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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