(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基
（ただし、Ｒ基は、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基である）
に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法であって、
フッ素含有修飾ピリミジン塩基が、
次の式（Ｉ）：
【化１】
0006472141.tif 000012
（ただし、式（Ｉ）において、
Ｒは、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドの塩基部分であり、
光架橋が、
上記修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基との間に形成される光架橋であり、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、
次の式（ＩＩ）：
【化２】
0006472141.tif 000013
（ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分であり、
光架橋が、
上記光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸中の、上記光応答性塩基と、
被光架橋性核酸中のフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に形成される光架橋である、方法。
【請求項２】
Ｃ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基が、
−ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１−ｍは０以上の整数である）
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｃ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基が、
−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、光架橋を製造する方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって、検出する方法。
【請求項８】
光架橋が、
光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成によって、光架橋可能に配置されて形成された光架橋である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって検出することによって、
光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成を検出する方法。
【請求項１０】
次の式（Ｉ）：
【化３】
0006472141.tif 000014
（ただし、式（Ｉ）において、
Ｒは、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸からなる、光架橋形成検出剤であって、
検出される光架橋が、
上記式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基との間に形成される光架橋であり、
上記光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、次の式（ＩＩ）：
【化２】
0006472141.tif 000015
（ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分である、光架橋形成検出剤。
【請求項１１】
光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、請求項１０に記載の光架橋形成検出剤。
【請求項１２】
式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とを、
ハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズさせた被光架橋性核酸と光応答性核酸に、光照射する工程、
を含む、光架橋された核酸を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の塩基配列の検出は、生命工学のあらゆる分野で使用される基本的な技術である。核酸の相補性による塩基配列の検出に特に有用であり、生命工学のあらゆる分野で使用可能な基本的な技術に、核酸の架橋技術がある。【０００３】
核酸の光架橋技術として、本発明者の研究グループによって、光応答性塩基が開発され、特許出願が行われている（特許文献１）。この技術によれば、例えば、相補性による二重鎖の形成とそれに続く光架橋によって、所望の塩基配列の核酸を高感度に検出することができる。この検出には、例えば、蛍光標識、発色酵素標識などの手段が、適宜使用される。しかし、これらの手段は、生体内での計測には、必ずしも適したものではない。【０００４】
生体内の様々な情報を得る手段の一つとして、ＮＭＲ、ＭＲＩなど、核磁気共鳴法を用いたイメージング技術が挙げられる。核磁気共鳴法のターゲットとなる原子（分子）は主に1Ｈであり、水が生体内に多く存在し高い強度が得られることに由来する。核磁気共鳴法のターゲットとなるその他の原子としては、19Ｆ（フッ素１９）が研究されている。フッ素１９は天然存在比がほぼ１００％であること、生体内にほとんど存在しないことなどが、利点として挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００９／０６６４４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、光応答性塩基によって形成される光架橋を検出するための、生体内での計測に適した、高感度な検出手段を、提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、鋭意研究の結果、光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、19Ｆ（フッ素１９原子）含有置換基に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用して、光応答性塩基との光架橋を光照射によって光架橋を形成させると、顕著な19Ｆケミカルシフトの変化が生じることを見いだして、本発明に到達した。【０００８】
19Ｆをターゲットとした核磁気共鳴法は、従来から研究されていたが、イメージング可能なほどに十分なケミカルシフトの変化を得ることは困難であったところ、本発明者は、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用すると、これが通常のＴ又はＵと同様に光架橋可能であること、そして、光架橋の結果として、大きな19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることを見いだして、本発明に到達したものである。【０００９】
したがって、本発明は、次の（１）〜にある。
（１）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基
（ただし、Ｒ基は、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基である）
に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法。
（２）
フッ素含有修飾ピリミジン塩基が、
次の式（Ｉ）：
【化１】
0006472141.tif 000002
（ただし、式（Ｉ）において、
Ｒは、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドの塩基部分であり、
光架橋が、
上記修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基との間に形成される光架橋である、（１）に記載の方法。
（３）
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、
次の式（ＩＩ）：
【化２】
0006472141.tif 000003
（ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分であり、
光架橋が、
上記光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸中の、上記光応答性塩基と、
被光架橋性核酸中のフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に形成される光架橋である、（２）に記載の方法。
（４）
Ｃ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基が、
−ＣnＨ2n+1-mＦm 
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１−ｍは０以上の整数である）
である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
Ｃ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基が、
−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（６）
単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（７）
単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル基である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。【００１０】
さらに、本発明は、次の（１１）〜にある。
（１１）
（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、光架橋を製造する方法。
（１２）
（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、光架橋された核酸を製造する方法。
（１３）
（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって、検出する方法。
（１４）
光架橋が、
光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成によって、光架橋可能に配置されて形成された光架橋である、（３）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１５）
（１４）に記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって検出することによって、
光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成を検出する方法。【００１１】
さらに、本発明は、次の（２１）〜にある。
（２１）
次の式（Ｉ）：
【化３】
0006472141.tif 000004
（ただし、式（Ｉ）において、
Ｒは、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸からなる、光架橋形成検出剤。
（２２）
光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、（２１）に記載の光架橋形成検出剤。
（２３）
Ｃ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基が、
−ＣnＨ2n+1-mＦm 
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１−ｍは０以上の整数である）
である、（２１）〜（２２）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
（２４）
Ｃ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基が、
−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3である、（２１）〜（２３）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
（２５）
単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基である、（２１）〜（２４）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
（２６）
単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル基である、（２１）〜（２４）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。【００１２】
さらに、本発明は、次の（３１）〜にある。
（３１）
式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とを、
ハイブリダイズさせる工程、
ハイブリダイズさせた被光架橋性核酸と光応答性核酸に、光照射する工程、
を含む、光架橋された核酸を製造する方法。
（３２）
（３１）に記載の方法によって製造された、
式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とが、
光架橋されてなる、光架橋された核酸。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、光応答性塩基による光架橋の形成を、核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトによって、検出することができる。この核磁気共鳴法による検出は、生体内の三次元イメージングに特に適しており、時間的にある時点のスナップショットを撮影することにも特に適しているので、光応答性核酸を使用した所望の相補的核酸配列の検出を、生体内の三次元リアルタイムスナップショット映像によって行うという、医療的に価値の高い新しい応用を実現するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＴとTFＴの光反応性を比較した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図２】図２は、CNVＫとTFＴのクロスリンク反応のＨＰＬＣ解析（Ａ）、及びＯＤＮ２（Ｔ）とＯＤＮ３（TFＴ）の光反応性の比較（Ｂ）を示すグラフである。
【図３】図３は、光架橋に伴うケミカルシフトの変化を表す図である。
【図４】図４は、ＮＭＲのシフトしたピークの割合とＨＰＬＣでのピークの減少量から求めた光架橋率の相関を示すグラフである。
【図５】図５は、３１２ｎｍの光照射による開裂を確認した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。
【図６】図６は、光架橋反応に伴う可逆的なＦ−ＮＭＲケミカルシフトの変化の結果を示す図である。
【図７】図７は、トロンビンアプタマーによるカリウムイオンのセンシングを示す説明図である。
【図８】図８は、カリウムイオンの添加によるＮＭＲピークの変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００１６】
［光架橋形成によるケミカルシフトの変化］
本発明によれば、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒ基は、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基である）に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることができる。
【００１７】
［フッ素含有修飾ピリミジン塩基］
本発明のフッ素含有修飾ピリミジン塩基は、次の式（Ｉ）：
【化４】
0006472141.tif 000005
（ただし、式（Ｉ）において、
Ｒは、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドの塩基部分であり、次の式（ＩＩＩ）：
【化５】
0006472141.tif 000006
（ただし、式（ＩＩＩ）において、
Ｒは、フッ素原子、
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基である）
で表されるチミン誘導体である。
【００１８】
［フルオロアルキル基］
好適な実施の態様において、上記Ｒ基として、１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基を使用することができる。このフルオロアルキル基としては、例えば、次の式：
−ＣnＨ2n+1-mＦm 
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１−ｍは０以上の整数である）
で表される基である。
【００１９】
好ましいフルオロアルキル基としては、例えば、−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、−Ｃ（ＣＦ3）3を挙げることができ、特に−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3が好ましい。
【００２０】
［フルオロアリール基］
好適な実施の態様において、上記Ｒ基として、１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１〜Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基を使用することができる。このフルオロアリール基としては、例えば、１個以上の水素原子が、フッ素原子、−ＣＦ3、−ＣＨ2−ＣＦ3、又は−Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基を使用することができる。
【００２１】
好ましいフルオロアリール基としては、３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル基：
【化６】
0006472141.tif 000007
（ただし、上記構造式中の点線は、遊離基の位置を表す）
を使用することができる。
【００２２】
［光応答性塩基］
光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基としては、次の式（ＩＩ）：
【化７】
0006472141.tif 000008
（ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
Ｒ２は、水酸基を表し、
Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分を挙げることができ、このビニルカルバゾール構造を有する人工塩基は、特許文献１（国際公開第２００９／０６６４４７号）に開示されているものである。
【００２３】
好適な実施の態様において、式（ＩＩ）のＲ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２４】
好適な実施の態様において、式（ＩＩ）のＲ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２５】
［光架橋の形成］
上記の光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基との間には、光架橋を形成することができる。すなわち、上記修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、上記光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸中の、上記光応答性塩基との間には、光架橋を形成することができる。本発明によれば、この構造変化を核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトの変化として検出することができる。
【００２６】
［光架橋形成のための二重鎖形成］
光応答性塩基と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基との間の光架橋は、光照射に先立って、光応答性塩基を含む塩基配列と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む塩基配列とが、その相補性によって二重鎖を形成して、光架橋反応が進行可能に配置されて、その状態で光照射を受けることによって、光反応が好適に進行して、形成される。二重鎖形成の条件としては、核酸の二重鎖形成の条件及び手段として、当業者に公知の条件及び手段を使用することができる。そこで、好適な実施の態様において、光応答性塩基を含む光応答性核酸の塩基配列中の光応答性塩基を含む塩基配列に対して、フッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む被光架橋性核酸中の塩基配列は、相補的な塩基配列である。好適な実施の態様において、光応答性塩基配列と、相補的塩基配列とは、二重鎖の領域を形成できるよう相補性を有しており、ただし、光応答性塩基と相補的位置にある塩基については、ビニルカルバゾール構造を有する人工塩基が相補的な水素結合を形成しない構造であることから、特に制限なく、種々の塩基を選択することができる。
【００２７】
好適な実施の対応において、光応答性塩基を含む光応答性核酸と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む被光架橋性核酸とが、同じ核酸分子であってもよく、この場合には、光応答性塩基を含む塩基配列とフッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む塩基配列とによって、自己の分子中に二重鎖構造をとって、自己架橋を形成させることができ、この構造変化を核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトの変化として検出することができる。
【００２８】
［光反応の条件］
光架橋のための光反応には、上記光応答性塩基について従来から知られている光架橋形成の条件を使用することができる。例えば、光架橋のために照射される光は、一般に３５０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光である。光照射時間は、数秒間、例えば、１〜９秒間、１〜７秒間、１〜５秒間、又は１〜３秒間の時間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を形成することができる。そして、光反応であることから、溶媒等についても、水溶液、緩衝液、生理的ｐＨや塩濃度の使用を含めて、種々の条件を広く使用することができる。
【００２９】
また、上記の光架橋の形成は、可逆的なものである。すなわち、光照射によって光架橋した後に、さらに光照射によって光開裂をすることができる。光開裂のために照射される光は、例えば、３３０〜３７０ｎｍの範囲の波長を含む光を使用することができ、例えば、３６６ｎｍの単波長のレーザー光を使用することができ、あるいは、例えば、３００〜３３０ｎｍの範囲の波長を含む光を使用することができ、例えば、３１２ｎｍの波長の光を使用することができる。
【００３０】
［19Ｆケミカルシフト］
光架橋によって生じた19Ｆケミカルシフトの変化は、核磁気共鳴法によって検出することができる。このために使用可能な手段、条件、装置等としては、公知の手段、条件、装置等を使用することができる。本発明によって生じる19Ｆケミカルシフトの変化は、従来技術による各種プローブでの19Ｆケミカルシフトの変化よりも、大きなものであるために、本発明は、高感度の19Ｆケミカルシフトイメージングを可能にするものとなっている。例えば、カリウムイオンを中心としてＧｕａｎｉｎｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）として知られるＤＮＡの高次構造をとらせることによって、ＤＮＡに結合させた19Ｆのケミカルシフトの変化を研究した報告があるが、従来のプローブによれば、この場合のΔｐｐｍは、０．１５ｐｐｍとされており、本願の19Ｆケミカルシフトの変化はこの５０倍以上にあたる。本願の19Ｆケミカルシフトの変化は、例えば、２．０ｐｐｍ以上、３．０ｐｐｍ以上、４．０ｐｐｍ以上、５．０ｐｐｍ以上、６．０ｐｐｍ以上、７．０ｐｐｍ以上、８．０ｐｐｍ以上であり、例えば、５０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下である。
【００３１】
［19Ｆケミカルシフトの可逆性］
上記光架橋の形成は、可逆的なものであり、この可逆的な光架橋の形成に伴って、19Ｆケミカルシフトもまた、可逆的に変化する。したがって、19Ｆケミカルシフトの変化による光架橋の検出と、これを利用した二重鎖形成の検出は、その可逆性を利用して、同じプローブ分子（被光架橋性核酸）によって、繰り返し行うことができる。
【実施例】
【００３２】
実施例をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる実施例に限定されるものではない。【００３３】
［CNVＫ含有ＯＤＮとTFＴ含有ＯＤＮの合成］
研究室で合成した光応答性人工核酸３−ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（CNVＫ）のアミダイト体、Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（TFＴ）（5-trifluoromethyl-2’-deoxyuridine）のアミダイト体をアセトニトリルで１００ｍＭに調整し、ＡＢＩ３４００にてＯＤＮを合成した。合成したＯＤＮ配列は下記表１に示す。合成後、CNVＫ含有ＯＤＮは２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。TFＴ含有ＯＤＮは５０ｍＭ  Ｋ2ＣＯ3  メタノール溶液を用いて室温で４時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。【００３４】
【表１】
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【００３５】
【化８】
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【００３６】
【化９】
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【００３７】
［CNVＫとCNＴの光反応性の解析］
２０μＭ  ＯＤＮ１と２０μＭ  ＯＤＮ２もしくは２０μＭ  ＯＤＮ３をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム）中で９０℃で５分間加熱した後、ゆっくり４℃までアニーリングを行った。その後、ＵＶ−ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を４℃で行い、光照射による光架橋体の確認を変性ＰＡＧＥにより解析した。この結果を図１に示す。【００３８】
図１は、ＴとTFＴの光反応性を比較した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。図１において、レーンＭ：１０ＤＮＡラダーマーカー、レーン１〜５：ターゲット塩基がＴの場合、レーン６〜１０：ターゲット塩基がCNＴの場合であり、光照射時間はそれぞれ０ｓ（秒）、０．１ｓ、０．５ｓ、１ｓ、２ｓである。【００３９】
ターゲット塩基がＴの場合には、１秒の光照射で原料となる９ｍｅｒのバンドがほぼ消失している。一方、ターゲットがTFＴの場合には２秒の光照射で原料のバンドが消失していた。この結果よりTFＴはCNVＫとの光架橋反応が、ほぼＴと同様に進行することがわかった。質量分析の結果からもＯＤＮ１とＯＤＮ３の架橋体のピークが得られている。【００４０】
［TFＴとCNVＫの光架橋反応速度の解析］
次にTFＴとCNVＫの光架橋反応がどれくらいの速度で進行するのかをＨＰＬＣ解析より求めた。この結果を、図２に示す。【００４１】
図２の（Ａ）は、CNVＫとTFＴのクロスリンク反応のＨＰＬＣ解析である。横軸はリテンション時間（分）を表し、光照射時間０ｓ（秒）、０．１ｓ、０．５ｓ、１ｓ、２ｓ、５ｓのそれぞれについてのチャートを示している。図２の（Ｂ）はＯＤＮ２（Ｔ）とＯＤＮ３（TFＴ）の光反応性の比較である。横軸は光照射時間（秒）を表し、縦軸は光架橋率（％）を表す。グラフの上側の曲線がターゲット塩基がＴの場合を表し、グラフの下側の曲線がターゲット塩基がTFＴの場合を表す。【００４２】
ＨＰＬＣ解析の結果TFＴとCNVＫの光架橋反応はＴよりも遅く、約４分の１の速度で光架橋反応が進行していることが確認された。【００４３】
［19Ｆ−ＮＭＲ測定］
次に光架橋前後での１９Ｆ−ＮＭＲ測定を行い、光架橋による［２＋２］光環化反応に伴うＣＦ3基の周辺環境の変化によるケミカルシフトの変化の確認を行った。
19Ｆ−ＮＭＲ測定は２０μＭ  ＯＤＮを１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ中で測定を行った。内部標準として１０μＭ  ＴＦＡ、１０％  Ｄ2Ｏとした。光照射時間を延ばしていき、その変化をＮＭＲとＨＰＬＣにより解析した。この結果を、図３に示す。【００４４】
図３は、光架橋に伴うケミカルシフトの変化を表す図である。図３の（Ａ）は、光照射時間による19Ｆ−ＮＭＲスペクトルの変化を表す。光照射時間０ｓ（秒）、１ｓ、２ｓ、５ｓ、１０ｓ、２０ｓのそれぞれについてのチャートを示している。図３の（Ｂ）は、各ＮＭＲサンプルに対応したＨＰＬＣチャートを表す。横軸はリテンション時間（分）を表し、光照射時間０ｓ（秒）、１ｓ、２ｓ、５ｓ、１０ｓ、２０ｓのそれぞれについてのチャートを示している。【００４５】
まず、光架橋を行っていないサンプルではフッ素のピークが−６３．２ｐｐｍ付近に確認できる。その状態から光照射時間を延ばしていくに従って−７１．２ｐｐｍ付近のピークが現れる。最終的には−６３．２ｐｐｍ付近のピークが消え、−７１．２ｐｐｍのピークのみになる。この変化をＨＰＬＣで解析するとTFＴ含有のピークが減少し、クロスリンク体のピークが増加していることが確認された。ＮＭＲでのシフトしたピークの割合とＨＰＬＣでのTFＴ含有ＯＤＮの減少率から求めた光架橋率をプロットしたところ、図４の様になった。【００４６】
図４は、ＮＭＲのシフトしたピークの割合とＨＰＬＣでのピークの減少量から求めた光架橋率の相関を示すグラフである。ＮＭＲ解析、ＨＰＬＣ解析から求めた光架橋率が一致していることより、確認できているケミカルシフトの変化は光架橋によるＣＦ3周辺の環境が変化したためだと考えられる。【００４７】
［光照射による開裂（変性ＰＡＧＥ）］
次に３１２ｎｍの光照射による開裂実験を行った。３１２ｎｍの各光照射時間でサンプリングし、変性ＰＡＧＥによる解析を行った。この結果を、次の図５に示す。【００４８】
図５は、３１２ｎｍの光照射による開裂を確認した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。変性ＰＡＧＥの結果、加熱条件下での３１２ｎｍの光照射によって、TFＴとCNVＫの光架橋体の開裂が確認された。Ｔと比較すると開裂のスピードは少し遅いものの、ゲル結果から、３０分の光照射で開裂していることが確認された。【００４９】
［光照射による開裂（19Ｆ−ＮＭＲ測定）］
CNVＫとTFＴの光架橋もＴの場合と同様に３６６ｎｍで架橋、３１２ｎｍで開裂という操作が可能であるため、それを１９Ｆ−ＮＭＲのケミカルシフトにより読み取ることが可能かどうかを１９Ｆ−ＮＭＲにより確認した。この結果を、次の図６に示す。【００５０】
図６は、光架橋反応に伴う可逆的なＦ−ＮＭＲケミカルシフトの変化の結果を示す図である。
４℃で３６６ｎｍの光照射によりケミカルシフトは−７１．２ｐｐｍに変化し、６０℃で３１２ｎｍの光照射により−６３．２ｐｐｍに変化していることが確認できた。さらに４℃で３６６ｎｍの光照射によりケミカルシフトは−７１．２ｐｐｍに変化した。これらの結果より、３６６ｎｍと３１２ｎｍの光照射によりケミカルシフトの変化が可逆的に操作可能であること、これを利用してイメージングが可能であることが示された。【００５１】
［TFＴを用いたケミカルシフトによる構造のセンシング技術］
核酸には通常のＢ型の二重螺旋だけでなく、特定の配列が存在する条件下での形成する高次構造が存在する。それらは小分子のアプタマーなどとしても利用可能である。高次構造は通常の二重螺旋と比較して構造が大きく変化するために、TFＴを用いたケミカルシフトによるイメージングが可能ではないかと考え実験を行った。【００５２】
ターゲットとしたのはトロンビンアプタマーとして報告されている配列であり、ＴをTFＴに置換した配列ＯＤＮ４を用いて実験を行った。カリウムイオン存在下でＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を取るというものである。この変化を、次の図７で説明する。【００５３】
図７は、トロンビンアプタマーによるカリウムイオンのセンシングを示す説明図である。２０μＭ  ＯＤＮを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中で１９Ｆ−ＮＭＲで測定を行った。内部標準として１０μＭ  ＴＦＡ、１０％Ｄ2Ｏとした。ＮＭＲ測定結果を図８に示す。【００５４】
図８は、カリウムイオンの添加によるＮＭＲピークの変化を示す図である。１９−ＮＭＲ測定の結果、カリウムイオンを加える前では、−６３．１ｐｐｍにピークが確認できた。これが１本鎖状態のピークである。次にＫＣｌを５０ｍＭ加えた際に−６４．０ｐｐｍに新たなピークが確認できた。このピークがカリウムイオン存在下でのみとるＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ由来のピークだと考えられる。最終的にＫＣｌの濃度を十分に挙げるとすべてのＯＤＮがＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成し、−６４．０ｐｐｍのピークのみとなる。この結果から、TFＴをアプタマー配列に導入することによってカリウムイオンのセンシングがケミカルシフトの変化から読み取ることが可能である。【００５５】
TFＴを用いたケミカルシフトによる構造のセンシング技術は、カリウムイオンのセンシングを実現する技術であり、光架橋を伴うものではない。この技術は、次の（１）以下のような発明として、把握することができる。
（１）
核酸アプタマーに、式Ｉで表される修飾ピリミジンヌクレオチドを導入して使用し、核酸アプタマーとリガンドとを結合させて、結合の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトを生じさせる方法。
（２）
核酸アプタマーに、式Ｉで表される修飾ピリミジンヌクレオチドを導入して使用し、核酸アプタマーとリガンドとの結合を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトによって検出する方法。
（３）
核酸アプタマーが、カリウムイオン結合可能なアプタマー配列と、式Ｉで表される修飾ピリミジンヌクレオチドを配列中に有し、
リガンドがカリウムイオンである、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトによって、カリウムイオンを検出する方法である、（３）に記載の方法。
（５）
式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドが導入された核酸アプタマー。
（６）
式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドが核酸アプタマーに導入されてなる、アプタマーリガンド検出剤。
（７）
式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドが、カリウムイオン結合可能なアプタマー配列を有する核酸アプタマーに導入されてなる、カリウムイオン検出剤。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、光応答性塩基による光架橋の形成を、核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトによって、検出することができる。本発明は産業上有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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