(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の分析用の、細胞またはウイルス粒子を含有する試験試料を処理する方法であって、
ａ）前記試験試料を粘土鉱物と接触させるステップと、
ｂ）前記粘土鉱物が前記試験試料中に均一に分散されるまで、前記試験試料および前記粘土鉱物を混合するステップと、
ｃ）前記粘土鉱物を前記試験試料から実質的に除去するステップと、
ｄ）前記試験試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したｐＨでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成するステップと、
ｅ）任意選択で、前記核酸溶液を、前記核酸溶液のｐＨを中和するのに適した酸性溶液と接触させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記粘土鉱物が、カオリナイト、スメクタイトまたはイライト粘土鉱物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粘土鉱物が、タルクを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記粘土鉱物が、ハロイサイトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記粘土鉱物が、ベントナイトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記粘土鉱物が、合成粘土鉱物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記合成粘土鉱物が、ラポナイトを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリ性溶液が、ＫＯＨ、ＮａＯＨもしくはＬｉＯＨ、またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アルカリ性溶液が、ＫＯＨを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶解に適したｐＨが、約０．１Ｍ塩基のアルカリ性溶液から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
任意選択の前記酸性溶液が、ＨＣｌ、Ｃ２Ｈ４Ｏ２またはＨ２ＳＯ４を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験試料が、１つまたは複数の感染性因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の感染性因子が、ウイルス性因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験試料が、少なくとも２つのウイルス性因子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験試料が、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡウイルスが、ＨＢＶである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡウイルスが、ＨＣＶまたはＨＩＶである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験試料が、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、呼吸器洗浄液、涙および組織スワブから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験試料が、血液、血漿および血清から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
核酸増幅ステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸増幅ステップが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲから選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益についての声明
本明細書に記載された研究への部分的な資金供与は、契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−１０−２−０１５８の下、Ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．  Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙからの助成金によって提供された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は概して、分子診断適用のための試料を加工処理するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの診断、研究および開発手順は、生物学的試料中に存在する特異的な核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列の検出を必要とする。例えば、核酸検出方法を使用して、その存在が、感染性疾患の原因を示し得る細菌、ウイルスまたは他の微生物を同定する。核酸バイオマーカーは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、汎流行性インフルエンザおよびデング熱を含む世界的な健康の高い重要性のいくつかの感染性疾患に関する標的分析物である。また、ヒト組織などのより複雑な標本（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）の核酸は、がんまたは遺伝子疾患に関連付けられる突然変異の存在を確立するために、ますます一般的に試験される。事件現場から直接採取される血液などの生物学的組織の試料中の核酸の検出はまた、例えば、父系試験または法医学的分析として、試料が由来する個体の正体を決定するのに使用される。
【０００４】
核酸分子が上述の目的のいずれかに関して検出され得る前に、生物学的材料の試料から入手可能な目的の特異的な核酸を作製することが必要である。生物学的標本から核酸を放出させるプロセスは、当該技術分野において「試料調製」として一般的に公知である。多くの場合、標的核酸は、ウイルス粒子、細菌細胞、真菌細胞、またはヒト白血球などのより複雑な生物体の細胞内に含有される。
【０００５】
試料調製中、細胞またはウイルス粒子は、膜およびタンパク質性被膜を溶解または変性させるように、化学的にまたは酵素的に処理されてもよく、これは核酸の放出をもたらす。溶解のこのプロセスは、一般的に「溶解」と称され、かかる溶解材料を含有する得られた溶液は、「溶解物」または「抽出物」と称される。不運にも、かかる放出は、核酸の破壊が放出時に即座に開始するような存在量で存在し得る、試料中に存在する内因性ヌクレアーゼによる分解に、核酸を曝す。続く精製プロセス中に残存する任意のヌクレアーゼは、無傷の核酸を分解し続けることができ、試料からの標的分子の損失をもたらす。ヌクレアーゼは、ほとんどの生物学的試料中で豊富であり、他の酵素を不活性化することが公知である処理に極めて抵抗性である場合が多い。特に、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）は、全てではないがほとんどの生物学的試料、特に、診断目的で最も一般的に収集される組織である血液で活性である。ヌクレアーゼの他に、多くの他のタンパク質および混入物（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ）が、頻繁に生物学的試料中に存在し、および／または溶解物の調製中に放出される。例えば、血液試料は、ヘムおよびヘパリン（採血中に使用される抗凝固薬）を含んでもよく、これらが多くの下流の分析手順を干渉し、および／または阻害する。
【０００６】
生物学的溶解物中に存在するヌクレアーゼおよび他の望ましくない生成物の問題を克服するために、酵素を不活性化するステップ、および核酸をさらに精製するステップの両方を伴う複雑なプロトコールを考案することが必要となっている。例えば、陰イオン洗剤およびチオシアン酸グアニジンなどのカオトロピック剤は、細胞および細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）構造内部から核酸を放出すると同時に、ヌクレアーゼ活性を不活性化または阻害するのに使用されている。溶解物から核酸をさらに精製するために、低分子量アルコールを使用して、溶液から核酸を沈殿させることが当該技術分野で一般的である。他の高分子もまた、これらの条件下で沈殿して、核酸を捕捉する粘着性の扱いにくい塊を生じるため、エタノール沈殿前に、フェノールおよび／またはクロロホルムを含有する有害な有機溶媒混合物による試料の抽出を用いることが、多くの場合で必要となっている。
【０００７】
ＲＮＡ分析用の試料を調製する際のさらなる挑戦は、これらの不安定な分子の完全性を保護することである。ＤＮＡとは異なり、ＲＮＡは、加水分解に対して極めて影響を受けやすい。結果として、ＤＮＡ標的を含有する溶解物は、厳しい条件下で生物学的試料から調製され得るが、ＲＮＡ分析用の試料の調製は通常、安定化剤、ヌクレアーゼ阻害剤ならびに冷蔵および／または凍結の使用を必要としている。２つの方法の変形が、生物学的試料からＲＮＡを調製するのに歴史的に使用されている：化学抽出および多くの場合「固相抽出」と称されるガラス上での固定。上述するように、化学抽出方法は通常、ＲＮアーゼを不活性化して、他の生体分子からＲＮＡを精製するために、酸性フェノールまたはフェノール−クロロホルム溶液と併せて、高濃度のカオトロピック塩を使用する。これらの方法は、ＲＮＡの非常に純粋な調製物を提供するが、ＲＮＡは通常、アルコール沈殿ステップで、脱塩および濃縮されなくてはならない。Ｂｏｏｍらに対する米国特許第５，２３４，８０９号に記載される固相抽出方法は、カオトロピック剤チオシアン酸グアニジンの存在下での固体状態のシリカ粒子または珪藻の核酸結合特性とともに、この作用物質の溶解特性およびヌクレアーゼ不活性化特性に依存する。シリカ結合性ＲＮＡが、エタノールを含有する高塩緩衝液で洗浄された後、ＲＮＡは、低いイオン強度緩衝液中で溶出される。
【０００８】
有機溶媒による水性抽出またはカオトロピック剤を必要とする試料調製方法は、長くて、有害であり、労働集約的であり、またゆっくりとしていることが容易に理解されよう。さらに、手順を実施する際に細心の注意が払われない場合には、ヌクレアーゼによる残留混入が起こる可能性があり、試料核酸は、分解または損失される。かかる試料を用いて実施される診断試験は、かかる分解に起因して偽陰性の結果を付与し得る。偽陰性の結果はまた、例えば、試料中に残存して、標的増幅手順を阻害する残留陰イオン洗剤、カオトロピック塩またはエタノール由来の化学的干渉に起因して得られ得る。陰イオン洗剤およびプロテアーゼが使用されている場合、残留タンパク質分解活性もまた、標的増幅および／またはハイブリダイゼーション検出反応で使用される酵素を分解して、偽陰性の結果をもたらし得る。’８０９号特許に開示される「Ｂｏｏｍの溶解」プロトコールに基づく試料調製方法は、これらの問題を適正に対処すると一般的にみなされる。しかしながら、本発明者らは、予期せぬことに、固相抽出と組み合わせてカオトロピック塩を利用するかかる抽出方法が、ＨＢＶゲノムのＰＣＲベースの検出用の血液または血漿試料の調製に確実には有効でないことを見出した。したがって、上述のプロトコールはいずれも、複雑な生物学的出発材料、例えば全血および血清からのＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方の検出用の一般的な試料の調製に適していない。このことは、臨床検査室状況で、時間需要が非常に高い場合に、また対費用効果、毒性廃棄物流の低減および単純さが同様に最も重要である低資源地域で、感染性疾患の診断に関して特に当てはまる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，２３４，８０９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この分野で進歩が成されてきたが、各種試料からの核酸の抽出、および核酸含有溶液の調製方法は、当該技術分野では必要とされ続けている。本発明は、これらの必要性を満たし、さらなる関連利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、公知のプロセスの欠点を克服する試料調製方法を提供する。特に、本発明の実施形態の目的は、生物学的試料などの一般的な試料からＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方の検出を可能にする試料調製方法を提供することである。本発明は、かかる未損傷の状況で、かつかかる試料が診断分析における試薬として即座に使用することができる混入の低い危険性で、核酸を供給する、これまでになく迅速で簡素で再現可能な方法を提供する。本発明の実施形態は、試料が抽出または溶解前に粘土鉱物で処理される試料調製方法に基づく。次に、試料はアルカリ性溶液で処理されて、目的の核酸を含有する細胞またはウイルス粒子から核酸を放出させる（「アルカリ溶解」）。
【００１２】
本発明者らは驚くべきことに、粘土鉱物による試料（例えば、生物学的試料）の前処理が、核酸分子、特にＲＮＡを、アルカリ溶解中に加水分解から保護することを見出した。本発明の方法による粘土鉱物の使用はまた、ヌクレアーゼ媒介性分解から核酸を保護する。有利には、粘土鉱物およびアルカリ性溶液の使用を組み合わせる方法は、阻害および／または分解酵素、および／または他の混入物を十分に含まない核酸含有試料の調製を可能にし、試料が、いかなるさらなる精製ステップも必要とせずに、核酸増幅手順などの検出アッセイに直接使用することができることを見出した。したがって、本発明の実施形態は、目的のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方の検出用の複雑な生物学的試料を調製する、迅速で簡素で比較的有害でない方法を提供する。本発明はまた、小型化に特に適しており、自立型「ラブオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）」マイクロ流体カートリッジならびに他の診断試験キットおよびデバイスと適合性である。したがって、いくつかの実施形態は、マイクロ流体環境において、例えばマイクロ流体カード上で開示する方法を実施することを対象とする。
【００１３】
本発明者らは驚くべきことに、方法が粘土鉱物による試料の処理を含む場合に、アルカリ溶解に基づく方法を使用して、核酸分析用の複雑な生物学的試料を調製することができることを見出した。本発明の方法は有利には、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的分子の両方の検出用の一般的な試料を調製するのに使用することができる。本発明の方法は、本発明の方法のある特定の実施形態が、検出前に核酸のさらなる精製も単離も必要としない点で、公知の試料調製方法を上回る改善を提供する。理論により拘束されないが、粘土鉱物は、アルカリ性条件下での加水分解からの核酸の保護、ヌクレアーゼ媒介性分解からの核酸の保護、試料結合性阻害剤および他の混入物からのＤＮＡポリメラーゼなどの下流アッセイ試薬の保護、および一般的な緩衝特性を含むが、これらに限定されないいくつかの有益な効果を提供すると考えられる。本発明により調製される核酸試料は、ヌクレアーゼ活性を本質的に含まず、修飾酵素用の優れた基質である。本明細書中に開示する試料調製方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスの両方の検出用の血液または血清試料の調製において特に有利である。本発明の主要な実施形態の主要な特色を以下に概要する。本発明の様々な他の目的および利点は、本発明の詳細な説明および本明細書中に提供される実施例から明らかである。
【００１４】
１つの実施形態では、本発明は、核酸の分析用の核酸含有試料を処理する方法に関する。上記方法は、試料を粘土鉱物と接触させることと、粘土鉱物が試料中に均一に分散されるまで、試料および粘土鉱物を混合することと、粘土鉱物を試料から実質的に除去することと、試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したｐＨでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成することと、任意選択で、核酸溶液を、核酸溶液のｐＨを中和するのに適した酸性溶液と接触させることとを含む。上述のいくつかの実施形態では、試料は、生物学的試料、例えば生物学的試料を含有する溶液である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、アルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、ＨＢＶウイルス粒子を含有するヒト血漿を抽出することにより生成される試料中のＨＢＶ  ＤＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ分析を示す。
【図２】図２は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、ＭＳ２  ＲＮＡを含有するヒト血液を抽出することにより生成される試料中のＭＳ２  ＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ分析を示す。
【図３】図３は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、ＭＳ２粒子を含有するヒト血漿を抽出することにより生成される試料中のＭＳ２  ＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ分析を示す。
【図４】図４は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、ＨＣＶ粒子を含有するヒト血液を抽出することにより生成される試料中のＨＣＶ  ＲＮＡを検出するための定量的ＰＣＲ分析を示す。
【図５】図５は、粘土鉱物による処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールの下で、ＨＢＶおよびＨＣＶ粒子を含有するヒト血液を抽出することにより生成される試料中のＨＢＶ  ＤＮＡおよびＨＣＶ  ＲＮＡの両方を検出するための定量的ＰＣＲ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１つの態様では、本発明は、粘土鉱物およびアルカリ溶解を使用したＤＮＡおよびＲＮＡ標的分子の両方の分析用の生物学的試料などの試料を調製する方法である。本明細書中で記載する場合、「アルカリ溶解」は、生物学的試料中に存在する微生物細胞壁、ウイルス粒子、細胞膜および／または他の構造の可溶化をもたらすためのアルカリ性溶液の使用を指す。試料成分のこの可溶化は、かかる構造から核酸を放出するのに十分であり、それらを下流の実験適用に利用可能にさせる。好ましくは、粘土鉱物は、目的の核酸を、アルカリ溶解中に加水分解およびヌクレアーゼ媒介性分解から保護する本発明の方法における使用に関して選択される。
【００１７】
より広い意味では、本発明は、食品および関連製品、ワクチンおよびウイルスまたは細菌に感染した乳汁を含む任意の核酸含有出発材料に適用可能であるが、本発明の実施形態は、用いられる出発材料が、目的の核酸を含有する細菌またはウイルス粒子などの感染性因子を含有する生物学的材料（例えば、生物学的試料溶液）であるプロセスを対象とする。かかる感染した生物学的材料としては、目的の核酸を含有する全血、血漿、血清、ならびに尿、精子、唾液、痰、呼吸器洗浄液、および涙などの他の体液、ならびに／または糞便もしくは組織スワブ上に含有される任意の他のものなどの細胞材料が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的出発材料はまた、目的のバイオマーカーを含有する肺、結腸、膵臓、乳房、前立腺および細胞培養物（哺乳動物および細菌培養物など）などの正常な固形組織および癌性固形組織の両方を含み得る。
【００１８】
したがって、各種実施形態では、本発明は、核酸の分析用の核酸含有試料を処理するための方法を対象とし、上記方法は、
ａ）試料を粘土鉱物と接触させるステップと、
ｂ）粘土鉱物が試料中に均一に分散されるまで、試料および粘土鉱物を混合するステップと、
ｃ）粘土鉱物を試料から実質的に除去するステップと、
ｄ）試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したｐＨでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成するステップと、
ｅ）任意選択で、核酸溶液を、核酸溶液のｐＨを中和するのに適した酸性溶液と接触させるステップと
を含む。
【００１９】
ある特定の実施形態では、試料は、生物学的試料（例えば、血液、組織または細胞を含有する他の試料）である。試料は、各種形態で、例えば溶液、懸濁液、またはそれらの組合せとして供給され得る。各種実施形態では、試料は、生物学的試料溶液である。
【００２０】
上記方法で使用される粘土の正確な型は、特に限定されず、当業者に公知の粘土、例えば本明細書中に記載する特定の粘土鉱物のいずれかから選択され得る。いくつかの実施形態では、粘土鉱物は、カオリナイト、スメクタイトまたはイライト粘土鉱物を含む。異なる実施形態では、粘土鉱物は、タルクを含む。他の実施形態では、粘土鉱物は、ハロイサイトを含む。さらなる実施形態では、粘土鉱物は、ベントナイトを含む。さらに他の実施形態では、粘土鉱物は、合成粘土鉱物、例えばラポナイト（ｌａｐｏｎｉｔｅ）を含む。
【００２１】
アルカリ性溶液もまた、ｐＨが７よりも大きければ、特に限定されない。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液は、ＫＯＨ、ＮａＯＨもしくはＬｉＯＨ、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、アルカリ性溶液は、ＫＯＨを含む。他の実施形態では、アルカリ性溶液は、ＮａＯＨを含む。異なる実施形態では、アルカリ性溶液は、ＬｉＯＨを含む。上述の各種実施形態では、アルカリ性溶液は、上述の塩基のいずれかの水溶液である。
【００２２】
アルカリ性溶液または緩衝液は、およそ１Ｍの濃度で、水などの適切な溶媒中でアルカリ性塩基を混合することにより調製される。１つの実施形態では、アルカリ性溶液または緩衝液は、溶解に適したｐＨを得るために、およそ０．１Ｍの最終濃度で添加される。試験試料の有効な処理を達成するのに他の適切な濃度が本発明で使用され得ることは、当業者に理解されよう。
【００２３】
必要とはされないが、ある特定の実施形態は、アルカリ溶解溶液を中和するための任意選択の中和ステップを含む。中和溶液は、通常酸性（即ち、ｐＨ７未満）である。例えば、いくつかの実施形態では、任意選択の酸性溶液は、ＨＣｌ、Ｃ２Ｈ４Ｏ２またはＨ２ＳＯ４を含む。いくつかの実施形態では、任意選択の酸性溶液は、ＨＣｌを含む。他の実施形態では、任意選択の酸性溶液は、Ｃ２Ｈ４Ｏ２を含む。さらなる実施形態では、任意選択の酸性溶液は、Ｈ２ＳＯ４を含む。任意選択の酸性溶液は、任意の適した酸、例えば上述の酸のいずれかの水溶液の形態で供給され得る。
【００２４】
本発明の任意選択の中和ステップに関して、酸性溶液または緩衝液は、アルカリ溶解緩衝液を、およそｐＨ７．２などの、およそ生理学的ｐＨへと中和するのに十分な濃度で添加される。１つの実施形態では、酸性緩衝液または溶液は、およそ０．１Ｍの最終濃度で添加される。
【００２５】
目的の核酸を含有する任意の試料は、ここで開示される方法で使用され得る。ある特定の実施形態では、試料は、１つまたは複数の感染性因子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、１つまたは複数の感染性因子は、ウイルス性因子である。いくつかの実施形態では、試料は、少なくとも２つのウイルス性因子を含む。例えば、各種実施形態では、試料は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡウイルスは、ＨＢＶであり、他の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＨＣＶまたはＨＩＶである。
【００２６】
いくつかの異なる実施形態では、試料は、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、呼吸器洗浄液、涙および組織スワブから選択される。より特定の実施形態では、試料は、血液、血漿および血清から選択される。
【００２７】
様々な異なる実施形態では、上記方法は、核酸増幅ステップをさらに含み、例えば、核酸増幅ステップは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲから選択される。
【００２８】
開示される方法は、任意の一般的な研究室フォーマットでの、および様々な規模での使用に適している。ある特定の実施形態では、方法は、マイクロ流体カードにおいて実施される。
【００２９】
「核酸」という用語は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含み、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を含むが、これらに限定されない任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。核酸は、単鎖もしくは二重鎖もしくは他のコンホメーション、またはそれらの任意の組合せで存在し得る。比較的短い核酸ポリマーは多くの場合、「プライマー」または「プローブ」として使用される。定義は、メチル化され得るか、またはキャップされ得る天然供給源由来の核酸、また置換または誘導体化された核酸塩基を含有することができ、かつペプチド骨格に基づき得る合成形態を包含する。核酸は概して、アデノシン、グアニン、チミンおよびシトシンならびにそれらの「デオキシ」形態のポリマーであるが、ウラシルおよびキサンチンなどの他のピリミジン、またはスペーサーおよびデオキシイノシンなどの普遍的塩基も含有し得る。デオキシ核酸は、相補的配列の存在または非存在、ならびにｐＨ、塩濃度、温度の条件、およびホルムアミド、ｎ，ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドおよびｎ−メチルピロリジノンなどのある特定の有機溶媒の存在または非存在に応じて、単鎖または二重鎖であり得る。
【００３０】
「試料」または「試験試料」は、核酸を含有する任意の試料を包含する。各種実施形態では、試料は、臨床標本であり得る生物学的試料または「生体試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）」である。代表的な生体試料としては、例えば、試験され得る血液、血清、血漿、バフィーコート、唾液、創傷滲出液、膿、肺および他の呼吸器吸引液、鼻吸引液および洗液、副鼻腔の排液（ｓｉｎｕｓ  ｄｒａｉｎａｇｅ）、気管支洗浄液、痰、中耳および内耳吸引液、嚢胞吸引液、脳脊髄液、糞便、下痢液、尿、涙、乳腺分泌物、卵巣内容物、腹水液、粘液、胃液、胃腸内容物、尿道分泌物、滑液、腹腔液、胎便、膣液または分泌物、羊水、精液、陰茎分泌物等が挙げられる。粘膜分泌物および上皮を代表とするスワブまたは洗浄液、例えば全ての種類の組織標本のホモジネート、溶解物および消化物であるような咽頭、扁桃腺、歯肉、鼻腔、膣、尿道、直腸、下部結腸および眼の粘膜スワブからのアッセイが許容可能である。哺乳動物細胞は、許容可能な試料である。生理学的または生物学的流体の他に、水、産業廃棄物、食品、乳汁、空気濾過物等の試料もまた、試験標本である。いくつかの実施形態では、試験試料は、開示する方法に直接付され、他の実施形態では、分析前の加工処理が企図される。
【００３１】
本発明の方法に特に適している標的感染性因子は、ＤＮＡベースのゲノムまたはＲＮＡベースのゲノムのいずれかを有する微生物およびウイルスである。いくつかの実施形態では、適切なウイルスとしては、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＩおよびＩＩ、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＡおよびＢ、ヒトメタニューモウイルス（ＭＰＶ）ならびに単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＩおよびＩＩが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
他の実施形態では、本発明により検出され得るウイルス感染性因子としては、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）ＡおよびＢ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球好性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス）、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、風疹ウイルス、レオウイルス、ノロウイルス、ヒトメタニューモウイルス（ＭＰＶ）、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、狂犬病ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、マールブルグウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エボラウイルス、コロラドダニ熱ウイルス（ＣＴＦＶ）および／またはライノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
異なる実施形態では、本発明により検出され得る細菌感染性因子としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｂ−溶血連鎖菌（Ｂ−Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｓｔｒｅｐ．）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌａｄｉｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、リケッチア病原体（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｓ）、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｃｉｔｎｏｍｙｃｅｔｅｓおよび／またはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
さらに他の実施形態では、本発明により検出され得る真菌感染性因子としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅ）（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、黒色真菌症（Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｏｓｉｓ）および／またはマズラ菌症（Ｍａｄｕｒｏｍｙｃｏｓｉｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明により検出され得る寄生虫因子としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒａ、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ  ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ、吸虫（ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ、Ｔａｅｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉおよび／またはＮｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｕｓが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
概して、「粘土鉱物」という用語は、本明細書中で使用および定義される場合、層（シート状）構造および非常に小さな粒径（通例は２マイクロメートル未満）を有する含水ケイ酸アルミニウムまたはマグネシウム（フィロケイ酸塩を含む）の群のいずれかを指す。粘土鉱物は、相当量の鉄、アルカリ金属またはアルカリ土類を含有し得る。粘土鉱物は、天然に存在する粘土および粘土岩の主な鉱物ストックを形成して、かかる地質堆積物から生産される。粘土鉱物はまた、シルト岩、粘土粘板岩ならびにいくつかの砂および砂岩などの他の天然供給源に由来し得る。粘土鉱物はまた、合成的に生産されてもよい。
【００３７】
「フィロケイ酸塩」という用語は、本明細書中で使用および定義される場合、Ｓｉ２Ｏ５の組成またはケイ素対酸素の２：５の比を有するケイ酸塩４面体の平行シートを形成するシート状ケイ酸塩として記載されるより広範囲の種類の鉱物を包含する。フィロケイ酸塩は、下記群：アンチゴライトおよびクリソタイルの蛇紋石群、魚眼石群、ぶどう石群、および以下に記載する粘土鉱物群を含む。タルクとして公知である鉱物を含むこれらのフィロケイ酸塩のいずれも、本発明における使用に適している。
【００３８】
粘土鉱物は、化学組成の変動を含む各種基準に従って分類されている。本明細書中に開示する実施形態における使用に適した粘土鉱物としては、下記群：カオリナイト群（例えば、カオリナイト、ジッカイト、ナクライト、ハロイサイト、ヒシンゲライト）、モンモリロナイト／スメクタイト群（例えば、バイデライト、パイロフィライト、バーミキュライト、ソーコナイト、サポナイト、ノントロナイトおよびモンモリロナイト、タルクは多くの場合、この群に配置されるが、必ずしもそうであるとは限らない）、イライト（または粘土−雲母）群（例えば、白雲母、イライト）、および緑泥石群（例えば、アメス石、ベイリクロア、シャモス石、斜緑泥石、カメレライト、クーク石、コランドフィライト（ｃｏｒｕｎｄｏｐｈｉｌｉｔｅ）、月桂石、デレス石、ゴニエライト（ｇｏｎｙｅｒｉｔｅ）、ニマイト（ｎｉｍｉｔｅ）、オディナイト（ｏｄｉｎｉｔｅ）、オルソシャモス石、苦土緑泥石、パンナンタイト（ｐａｎｎａｎｔｉｔｅ）、リピドライト（ｒｈｉｐｉｄｏｌｉｔｅ）、プロクロア（ｐｒｏｃｈｌｏｒｅ）、須藤石、チュリンゲン石）の粘土が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に適した他の粘土鉱物としては、アルバイト、フィリップサイト、方沸石およびギブス石が挙げられる。
【００３９】
粘土鉱物はまた、それらの原子構造により当該技術分野で定義される。一連の１つの４面体と１つの８面体層で形成される粘土鉱物はそれぞれ、２層粘土鉱物、１：１鉱物、または４面体層の間隔（専門用語では、底間隔と称される）後の７Å粘土鉱物と称される。この群は、例えば、カオリナイト、ハロイサイト、ジッカイトおよびナクライトを含む。１つの８面体および２つの４面体層の形成からの粘土鉱物は、３層、１０Å鉱物、または２：１鉱物と称される。この群は、例えば、イライト、およびスメクタイト、海緑石およびバーミキュライトを含む。モンモリロナイトは、スメクタイト群の主な代表であり、ベントナイトの主な構成成分である。実際に、ベントナイト、スメクタイトおよびモンモリロナイトは、多層ケイ酸塩に対する同義語として一般的に使用される。さらなる独立した８面体層が３層形成間に組み込まれる場合、４層、または１４Å鉱物が生産される。この群の代表は、緑泥石である。特殊な粘土鉱物群は、間に挟まれた鉱物により代表とされる。層パッケージ間では、イオンおよび水分子は、例えば包埋されるようになり得る。これは、スメクタイトに一般的に観察される層間隔の拡張（膨張）を引き起こし得る。本明細書中に記載する粘土鉱物および粘土鉱物構造はいずれも、本発明の実施に適している。
【００４０】
本明細書中に記載するような粘土鉱物の各種型は、Ｔｈｉｅｌｅ  Ｋａｏｌｉｎ  Ｃｏ．（サンダーズビル、Ｇａ．）、Ｉｍｅｒｙｓ（ロズウェル、Ｇａ．）、Ｄｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｋａｏｌｉｎ  Ｃｏ．（ドライブランチ、Ｇａ．）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ボルティモア、Ｍｄ．）およびＭｉｎｅｒａｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｍｅｎｅｒａｌｓ、ベツレヘム、Ｐａ．）、ＢＹＫ−Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ（ウェーゼル、ドイツ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ（セントルイス、Ｍｏ．）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（アーリントンハイツ、Ｉｌ）などの会社から市販されている。
【００４１】
上述するように、本発明の実施形態は、核酸分析用の生物学的試料の調製における粘土鉱物の使用を対象とする。本発明の意義内での粘土鉱物は、任意の単一の粘土鉱物または種々の粘土鉱物の混合物であり得る。特定の実施形態によれば、モンモリロナイトまたはベントナイトが使用される。モンモリロナイトは、商品名ＭＫ１０で入手可能である。実際に、ベントナイト、モンモリロナイトおよびスメクタイトは、多層ケイ酸塩に関する同義語として一般的に使用される。モンモリロナイトは、純粋な粘土鉱物である。ベントナイトは、イライトおよびカオリナイトもまた含有し得る主にモンモリロナイトの純粋でない混合物である。ベントナイトの主な型は、粘土のシート間の優勢陽イオン：カリウム、アルミニウム、ナトリウムまたはカルシウムにより定義される。本発明で使用する場合、ベントナイトは、ナトリウムを含有するが、ベントナイト粘土の全ての型が、本発明の実施に適している。別の実施形態によれば、ハロイサイトが、粘土鉱物として使用される。本発明のさらに別の実施形態によれば、フラー土が、粘土鉱物として使用される。フラー土は、モンモリロナイト、カオリナイトおよびアタパルジャイト、ならびに方解石および石英のような他の鉱物を含む複雑な混合物として、当該技術分野で公知である。本発明の別の実施形態によれば、合成粘土ラポナイト（ＢＹＫ−Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ（ウェーゼル、ドイツ））が、粘土鉱物として使用される。以下で「粘土鉱物」について言及するときはいつでも、この用語はまた、上述の粘土の混合物を包含すると意図される。
【００４２】
本発明の実施形態によれば、目的の核酸を含有することが疑わしい試料を、アルカリ溶解処理前に粘土鉱物と混合させる。アルカリ性緩衝液は、核酸を放出するために試料中で細胞および／またはウイルス粒子を溶解させる目的で使用される。本発明の方法に関して、緩衝液中での変性アルカリ性塩基の存在は、細胞および／またはウイルス粒子の溶解に十分である。
【００４３】
本発明の方法では、目的の核酸を含有することが疑わしい試料、例えば、生物学的試料をまず、粘土鉱物と接触させる。いくつかの実施形態では、例えば試料が生物学的試料である場合、生物学的試料は、懸濁溶液の形態で存在する。溶液中に所与の生物学的試料を懸濁させるのに使用される方法は、その性質に依存する。いくつかの液体試料、例えば血液製剤または尿は、さらなる懸濁を必要としない。場合によっては、液体溶液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または類似の希釈剤による希釈を必要とする。動物組織の多くの形態が、凍結および微粉砕などの、またはブレンダ−もしくは他の機械的混合デバイスを用いた均質化による、懸濁前のより激しい処理を必要とする。本発明の懸濁溶液は好ましくは、水溶液であり、より好ましくは緩衝液を含む、さらに好ましくはおよそｐＨ６．０での酢酸緩衝液をさらに含む水溶液である。
【００４４】
粘土鉱物は、試料と接触させる際には乾燥していてもよい。試料が水溶液中に存在する場合には、粘土鉱物は、試料溶液中で湿潤化（ｈｙｄｒａｔｅ）および懸濁するようになる。あるいは、粘土鉱物は、試料と接触させる前に、水性緩衝液中に湿潤化および懸濁させてもよい。本発明の１つの実施形態では、水性緩衝液は、およそｐＨ６．０の酢酸緩衝液である。
【００４５】
本発明の１つの実施形態では、粘土鉱物は、２０ｍｇ／ｍＬの濃度で試料溶液に添加される。およそ１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬから最大約１６０ｍｇ／ｍＬまでなどの他の適切な濃度が企図される。試料溶液に添加される粘土鉱物の量は、標的核酸の分解を防止して、下流の分子分析を干渉するのに十分な量であることが理解されよう。
【００４６】
本発明の試料を調製する方法では、試料は、粘土鉱物とさらに混合される。混合ステップは、好ましくは、試料中の核酸を分解することが可能なタンパク質が実質的に不活性化されるまで、かかる期間、周囲温度で試料および粘土鉱物をインキュベートすることにより実施される。概して、これは、粘土鉱物が試料全体にわたって均一に分散されるようになるのに必要な時間である。本発明の１つの実施形態では、試料および粘土鉱物は、約５分〜約３０分間混合される。各種実施形態では、粘土鉱物は、生物学的試料、例えば生物学的試料溶液と混合される。
【００４７】
本発明の試料を調製する方法では、次に、湿潤化された粘土鉱物が、試料から実質的に除去される。「実質的に除去される」とは、除去後に試料中に残存する残留粘土の量が、特許請求される方法の続くステップ（複数可）を干渉も、阻害もしないことを意味する。粘土鉱物の実質的な除去は、当該技術分野で周知の方法により達成され得る。１つの実施形態では、混合された試料を、室温でおよそ２分間、微量遠心機中で回転させて、粘土鉱物をペレット状にして、実質的にきれいになった試料溶液の除去を可能にし得る。本発明の別の実施形態では、混合試料を０．４５μＭ中性フィルターに通して濾過して、実質的に粘土鉱物を含まない試料溶液を得てもよい。
【００４８】
本発明の試料を調製する方法では、粘土処理した試料のｐＨが、アルカリ溶解溶液を添加することによりアルカリ性ｐＨに調節される。アルカリ溶解溶液は、塩基、好ましくは溶液のｐＨを、細胞膜および／またはウイルス粒子の構造が崩壊（即ち、「溶解」）されて、目的の核酸が放出されるレベルに上げるのに十分強いが、単離されるべき核酸材料に損傷を与えるほど強くはない塩基を含む。１つの実施形態では、塩基は、水酸化カリウム（ＫＯＨ）である。別の実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）から選択される。アルカリ性溶液または緩衝液は、およそ１Ｍの濃度で、水中でアルカリ性塩基を混合することにより調製される。１つの実施形態では、アルカリ性溶液または緩衝液は、およそ０．１Ｍの最終濃度で添加されて、およそ５分〜最大およそ３０分間、およそ室温でインキュベートされる。
【００４９】
本発明の方法は、任意選択の中和ステップを含む。いくつかの適切な酸が、本発明の任意選択の酸性溶液または緩衝液として使用され得る。例示的な酸としては、塩酸（ＨＣｌ）および酢酸（Ｃ２Ｈ４Ｏ２）が挙げられる。酸性溶液または緩衝液は、およそ１Ｍの濃度で酸を水と混合することにより調製される。本発明の任意選択の中和ステップに関して、酸性溶液または緩衝液は、アルカリ溶解緩衝液を、およそｐＨ７．２などのおよそ生理学的ｐＨへと中和するのに十分な濃度で添加される。１つの実施形態では、酸性緩衝液または溶液は、およそ０．１Ｍの最終濃度で添加される。
【００５０】
本発明の方法により調製される核酸含有試料は、いかなるさらなる精製ステップも単離ステップもなしで、続く増幅手順（ＰＣＲベースの手順）に直接使用され得る。本発明の方法により調製される単一の核酸含有試料はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的分子の両方を検出するのに使用され得る。ＰＣＲを使用した核酸の増幅および検出に関する一般的な原理および条件はとても周知されており、それらの詳細は、米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）、米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）および米国特許第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）を含む数多くの参照文献に提供されており、それらの全てが、参照により本明細書に援用される。好ましくは、ＰＣＲは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用して実施される。いくつかの適切な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、米国特許第４，９６５，１８８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）および米国特許第４，８８９，８１８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）に詳細に言及されるものを含めて当該技術分野で報告されており、ともに、それらの全体が参照により本明細書に援用される。他の増幅プロトコールとしては、ＬＡＭＰ（ＤＮＡリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）のループ媒介性等温増幅）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）が挙げられ、「ローリングサイクル」、「ＲＡＣＥ」および「非対称的ＰＣＲ」とも称される「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」もまた使用されてもよく、検出可能なプローブに相補的な鎖が過剰に合成されるという利点を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡレベルを決定するための方法は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による増幅ベースの方法である。増幅ステップ前に、ｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）が合成されなくてはならない。これは、別個のステップとして実施され得る逆転写により、またはＲＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の改変であるホモジーニアス逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で達成される。リボ核酸のＰＣＲ増幅に適した方法は、ＲｏｍｅｒｏおよびＲｏｔｂａｒｔ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４０１〜４０６頁；Ｐｅｒｓｉｎｇら編、Ｍａｙｏ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  Ｍｉｎｎ．、１９９３年；Ｅｇｇｅｒら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３３巻：１４４２〜１４４７頁、１９９５年；および米国特許第５，０７５，２１２号により記載されており、これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【００５２】
アッセイは、エンドポイントまたは動態（「実時間」とも称される）検出を含み得る。プローブなどの指示試薬が使用される場合、それは、増幅中、または増幅後に添加され得る。当該技術分野で公知の蛍光プローブ、蛍光消光プローブおよび「アップコンバーティング（ｕｐ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ）」蛍光プローブが好ましい。
【００５３】
標的核酸レベルの定量化は、例えば製造業者の指示書に従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７６００、７７００または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア）を使用して、実時間定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により達成され得る。多くの他の適切な検出システム、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＯＴＯＲ−ＧＥＮＥ（商標）およびＢｉｏＲａｄにより提供される類似のシステムが利用可能である。これらは、蛍光検出システムであり、これにより、実時間でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物のハイスループット定量化が可能となる。ＰＣＲが完了した後に増幅生成物が定量化される標準的なＰＣＲとは対照的に、実時間定量的ＰＣＲにおける生成物は、それらが蓄積するにつれて定量化される。これは、ＰＣＲ反応において、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー間で特異的にアニーリングして、２つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含むことにより達成される。
【００５４】
１つの実施形態では、蛍光オリゴヌクレオチドプローブは、溶液中の特異的な核酸の存在を報告するように設計された単鎖ヘアピン形状のオリゴヌクレオチドプローブである「分子ビーコン」である。分子ビーコンは、４つの構成成分；基部、ヘアピンループ、末端が標識されたフルロオロフォアおよび反対の末端が標識されたクエンチャーからなる。ヘアピン様ビーコンが標的に結合されない場合、フルオロフォアおよびクエンチャーは、すぐ近くに位置し、蛍光が抑制される。相補的な標的ヌクレオチド配列の存在下では、ビーコンの基部が開放して、標的とハイブリダイズする。このことが、フルオロフォアおよびクエンチャーを分離させて、フルオロフォアが蛍光を発するのを可能にする。あるいは、分子ビーコンはまた、末端が標識されたドナーに近接して発光するフルオロフォアを含む。「波長シフト分子ビーコン」は、フルオロフォアがより強力に発光するのを可能にするさらなるハーベスターフルオロフォアを組み込む。分子ビーコンの現在の概説としては、Ｗａｎｇ  Ｋら、２００９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ＤＮＡ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ．  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ、４８巻（５号）：８５６〜８７０頁；Ｃｉｓｓｅｌｌ  Ｋ  Ａら、２００９年、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３９３巻（１号）：１２５〜３５頁およびＬｉ  Ｙら、２００８年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ：  ａｎ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ３７３巻（４号）：４５７〜６１頁が挙げられる。最近の進歩としては、Ｃａｄｙ  Ｎ  Ｃ、２００９年、Ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５５４巻：３６７〜７９頁が挙げられる。
【００５５】
蛍光シグナルを検出するための手段は、定性的または定量的であり得るアッセイのエンドポイント、即ち結果を表示するための当該技術分野で周知の装置を含んでもよく、分光光度計、蛍光光度計、ルミノメーター、光電子増倍管、光ダイオード、比濁計、光子計数器、電圧計、電流計、ｐＨ計、容量性センサー（ｃａｐａｃｉｔａｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｏｒ）、無線周波数トランスミッター、磁気抵抗計（ｍａｇｎｅｔｏｒｅｓｉｓｔｏｍｅｔｅｒ）またはホール効果デバイスを装備した機械を含んでもよい。カバープレートにおける拡大レンズ、光学フィルター、着色した流体および標識されたプローブを使用して、アッセイの結果の検出および解釈を改善させてもよい。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、「約」、「およそ」および「概して」という用語は、不正確さの表現を広くするものであり、「ほぼ」の意味での「多かれ少なかれ」、「おおよそ」または「大体」であるという状態について記載しており、ここで変動は、ほんのわずかであるか、明確であるか、または等価な有用性もしくは機能を有し、さらに標準、規則または限界に対して明確なごくわずかな例外の存在をさらに示している。例えば、各種実施形態では、上述の用語は、用語に続く値の２０％、１０％、５％、１％または０．１％内の量を指す。
【実施例】
【００５７】
下記実施例は、本発明のある特定の例示的な実施形態を提供するために提示され、本発明の範囲を限定するものとは意図されない。
【００５８】
（実施例１）
ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方の検出用の試料を調製するための簡素な方法
この実施例は、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方の検出用の生物学的試料からの核酸の調製に関する簡素で有効な方法を実証する。
【００５９】
本発明者らは、カオトロピック塩、ガラス／シリカ基板、およびプロテイナーゼＫの使用に基づく核酸抽出プロトコール（当該技術分野では「Ｂｏｏｍの溶解」として公知である）が、驚くべきことにＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）検出用の試料を調製するのに無効であることをこれまでに見出してきた。このＤＮＡウイルスを検出する代替的な試料調製方法を同定するために、アルカリ溶解に基づくプロトコールを研究した。
【００６０】
分析用の試料を生成するために、ヒト血漿を、頂部が紫の標準的なＥＤＴＡ収集チューブ中に収集した全血から得、続いて２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、血漿を赤血球と分離させた。次に、血漿を除去して、１×１０６個のコピー／μＬ（ウイルスの試料）の濃度のＨＢＶ  ５０μＬを、血漿またはＰＢＳ  ２ｍＬに添加することにより、ＨＢＶまたはＭＳ２  ＲＮＡファージのいずれかでスパイクした。スパイクした血漿試料を、最終濃度０．１Ｍで水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）と室温で６０分間混合することにより、アルカリ溶解を使用して、試料を抽出した。その後、試料は、０．１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）の添加により中和して、いかなるさらなる精製ステップなしで、融解分析を用いた標準的な定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）で直接使用して、ウイルス核酸を検出した。対照として、ＨＢＶ配列を含有するプラスミドを別個の試料に添加した。
【００６１】
図１に示されるように、アルカリ溶解は、ＨＢＶウイルス粒子でスパイクした血漿およびＰＢＳ試料から発生される強力なＰＣＲシグナルから明らかであるように、ＰＣＲ分析用のＨＢＶでスパイクした試料を有効に抽出した。対比して、ＲＮＡファージ、ＭＳ２でスパイクした試料から、シグナルは発生せず、このプロトコールが、ＲＮＡ試料の調製に適さないことを示した。ＲＮＡがアルカリ性条件下での化学的加水分解に影響されやすいため、この結果は驚くべきことではなかった。
【００６２】
アルカリ溶解プロトコールを、ＲＮＡ標的の調製にも同様に適切となるように修飾するために、アルカリ溶解溶液前に、試料をフィロケイ酸アルミニウム粘土、ベントナイトで処理することの効果を研究した。ＭＳ２  ＲＮＡファージでスパイクした血漿を、上述するように調製し、最終濃度２０ｍｇ／ｍＬでベントナイトを含有するチューブに添加した。ベントナイト粘土が血漿試料とともに完全に湿潤化されるまで、試料を混合した。試料は、最大３０分間インキュベートして、次に遠心分離して、粘土をペレット状にして、除去した。アルカリ溶解に関して、ＮａＯＨを新鮮なチューブに分取して、ベントナイトで処理した血漿５０μＬを最終濃度０．１Ｍになるように分取した。試料を１０分間インキュベートして、次に最終濃度０．１ＭになるようにＨＣｌの添加により中和した。上述するように、いかなるさらなる核酸精製ステップなしで、試料をｑＲＴ−ＰＣＲ分析に直接供して、ＭＳ２  ＲＮＡを検出した。
【００６３】
粘土の非存在下では、これまで観察されたように、ファージＲＮＡは、アルカリ溶解により調製される試料では検出されなかった。しかしながら、驚くべきことに、ベントナイトによる試料の前処理、続くアルカリ溶解は、ＲＮＡ標的に関して強力なＰＣＲシグナルを付与した（データは示していない）。これらの結果により、粘土が、強力な塩基の存在下では加水分解からＲＮＡを保護することが示される。
【００６４】
次に、ベントナイト粘土／アルカリ溶解プロトコールを、ＥＤＴＡチューブ中に収集され、ＲＮＡファージ、ＭＳ２でスパイクした全血試料に関して試験した。粒子溶解およびＰＣＲ分析手順は、１０％、２５％、５０％または７５％溶解赤血球を含有するスパイクした血漿試料に関して上述するように実施した。図２に示されるように、各試料がシグナルを発生し、抽出した材料における無傷のウイルスＲＮＡの存在を実証した。これらの結果により、全血が、粘土処理およびアルカリ溶解の組合せに基づく試料調製プロトコールに適した出発材料であることが示される。驚くべきことに、さらなる核酸抽出ステップも精製ステップも、ＲＮＡ標的の検出に必要とされない。さらに、上述する試料調製プロトコールにおいて種々の濃度の塩基および中和酸を試験したところ、本発明者らは驚くべきことに、粘土処理した試料が、アルカリ溶解後に、かつＰＣＲ分析前に酸中和ステップを必要としないことを発見した。理論により拘束されないが、粘土が、アルカリ溶解後に中和ステップを添加する必要を排除するある特定の緩衝特性を提供すると仮定される。
【００６５】
（実施例２）
各種粘土鉱物とともにアルカリ溶解を使用したＤＮＡおよびＲＮＡ標的検出用の試料調製
この実施例は、様々な粘土鉱物がＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方の検出用の試料の調製に、アルカリ溶解プロトコールを適応させるのに有効であることを実証する。
【００６６】
この実施例では、下記鉱物を評価した：フィロケイ酸塩粘土、ベントナイト、フラー土およびモンモリロナイト（ＭＫ１０）およびケイ酸マグネシウム、タルク。ヒト血漿試料を上述するように調製して、試料１つにつき１０６ｐｆｕでのＭＳ２  ＲＮＡファージ、または１，６００もしくは１６０ＩＵ／試料でのＨＢＶ  ＤＮＡウイルスのいずれかでスパイクした。各粘土を、最終濃度１、１０、２０または４０ｍｇ／ｍＬで血漿試料に添加して、粘土が完全に湿潤化されるまで（室温でおおよそ５分）振とうさせた。粘土を遠心分離により血漿試料から除去して、最終濃度０．０８Ｍになるように１Ｍ水酸化カリウム（ＫＯＨ）を室温で５〜１０分間添加することにより、試料をアルカリ溶解に供した。中和ステップは、ＰＣＲ分析前に実施しなかった。ウイルスＲＮＡの存在に関して試験するために、ウイルス特異的なプライマーを使用して、標準的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を試料に関して実施した。
【００６７】
図３に示されるように、粘土鉱物それぞれによる試料の処理により、ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ標的検出が可能となった。対比して、ウイルスＲＮＡは、粘土処理の非存在下では検出されなかった。試料をＤＮＡ標的の検出用に調製した場合に、類似した結果が得られた。ここで、ＨＢＶでスパイクした血漿試料は、ベントナイト、ハロイサイトまたは超微細粒径へとふるいにかけられたベントナイト粘土（ナノベントナイト）による前処理後にアルカリ溶解に供した。ＰＣＲ分析前にさらなる中和ステップも精製ステップも実施せずに、ウイルス標的を検出した。これらの結果により、核酸分析用の複雑な生物学的試料を調製するために、いくつかの型の粘土がアルカリ溶解と組み合わせるのに適していることが示される。
【００６８】
（実施例３）
ＲＮＡ標的を検出するための全血に由来する試料の調製
この実施例は、粘土溶解に基づく試料調製プロトコールを使用して、ＲＮＡウイルスの検出用に全血の抽出物を生成することができることを実証する。
【００６９】
全血が、ＰＣＲ分析を干渉する因子を含有することは、当該技術分野で周知である。このことは、核酸ベースの診断アッセイにおいて、試料として未分画血液を使用することにおいて課題を提起している。粘土がこれらの固有の阻害特性を克服し得るかどうかを研究するために、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者に由来する血漿でスパイクした全血を、分析用の出発材料として使用した。この実験では、ベントナイトまたは合成膨潤性粘土、ラポナイトのいずれかを、アルカリ溶解前の試料処理に使用した。粘土を水中に溶解させて、最終濃度０．６３〜１．３３％（ｗｔ／ｖｏｌ）で、ＨＣＶでスパイクした全血試料に添加した。試料を室温で５分〜１０分間混合して、遠心分離により粘土を除去した。上述するように、試料をＫＯＨによるアルカリ溶解に供した。ｑＰＣＲ分析は、いかなるさらなる抽出ステップも精製ステップもなしで、溶解させた全血試料に対して直接実施した。ＨＣＶ  ＲＮＡ標的は、ＨＣＶ特異的プライマーおよびプローブを使用した標準的なｑＲＴ−ＰＣＲにより検出した。
【００７０】
ＰＣＲデータを、各データ点に関して定量サイクル（Ｃｑ）のボックスプロットとしてグラフに描き、これらは図４に記載される（Ｃｑのより低い値は、より大量の鋳型および／またはｑＰＣＲもしくはｑＲＴ−ＰＣＲの阻害がより少ないこと）を示す）。ボックスは、データの四分位数間範囲（「ＩＱＲ」、これは、データ点の２５〜７５％である）を表す一方で、ボックスを通る線は、データの中央値を表す。ひげは、最高および最低のデータ点を表す。四分位数間範囲が重複しない場合、データは、統計学的に有意な差により異なるとみなされる。図４で見ることができるように、ラポナイトおよびベントナイト処理はともに、全血におけるＲＮＡ標的の検出において有意な改善を提供する。これらの結果により、粘土がＲＮＡ標的をアルカリ性加水分解から保護するだけでなく、標的を、全血中に存在するヌクレアーゼからも保護することが示される。さらに、粘土およびアルカリ溶解の組合せが、ＰＣＲ反応に対する血液中に存在する他の因子の阻害効果を克服し得ることが、データにより示唆される。
【００７１】
（実施例４）
粘土およびアルカリ溶解を用いた同時ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出
この実施例は、粘土処理、続くアルカリ溶解に基づくプロトコールを使用して、ＤＮＡおよびＲＮＡ標的の両方を検出するための単一試料を調製することができることを実証する。
【００７２】
この実験では、ヒト血液を、ＨＢＶに感染した患者、およびＨＣＶに感染した異なる患者の両方由来の血清でスパイクした。ウイルスでスパイクした血液試料を、ベントナイト、珪藻土もしくはラポナイト粘土、または対照として粘土なしで前処理した。これに続いて、上述するようにアルカリ溶解を行った。溶解した試料を、いかなるさらなる抽出ステップも精製ステップもなしで、ｑＲＴ−ＰＣＲ反応において直接使用し、ＨＢＶまたはＨＣＶ特異的配列を検出した。
【００７３】
Ｃｑデータを、図５においてボックスプロットとして提示し、これは、３つの粘土がそれぞれ、全血試料溶解物の同じ調製物中に存在するＲＮＡおよびＤＮＡ標的の両方の検出を有意に改善することを実証している。まとめると、これらの実施例で提示されるデータにより、粘土が、アルカリ性加水分解からのＲＮＡ標的の保護、ならびに生物学的試料抽出物中に存在する阻害剤からの核酸標的および下流アッセイ構成成分の保護を含むが、これらに限定されない核酸分析用の試料調製において数多くの有利な特性を提供することが示される。
【００７４】
上述の各種実施形態は、さらなる実施形態を提供するのに組み合わせることができる。２０１３年５月７日に出願した米国特許出願第６１／８２０，５８７号を含むが、これに限定されない、本明細書中で言及され、および／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。実施形態の態様は、さらなる実施形態を提供するために各種特許、出願および刊行物の概念を用いる必要があれば、修飾することができる。これらの変更および他の変更は、上述の詳細な説明を鑑みて、実施形態に対して行うことができる。概して、下記特許請求の範囲では、使用する用語は、明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に、特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、かかる特許請求の範囲が認められる等価体の全範囲とともに、全ての考え得る実施形態を包含すると解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されない。
例えば、本発明の実施形態において以下の項目が提供される。
（項目１）
核酸の分析用の核酸含有試料を処理する方法であって、
ａ）前記試料を粘土鉱物と接触させるステップと、
ｂ）前記粘土鉱物が前記試料中に均一に分散されるまで、前記試料および前記粘土鉱物を混合するステップと、
ｃ）前記粘土鉱物を前記試料から実質的に除去するステップと、
ｄ）前記試料を、細胞およびウイルス粒子の溶解に適したｐＨでアルカリ性溶液と接触させて、核酸溶液を形成するステップと、
ｅ）任意選択で、前記核酸溶液を、前記核酸溶液のｐＨを中和するのに適した酸性溶液と接触させるステップと
を含む方法。
（項目２）
前記粘土鉱物が、カオリナイト、スメクタイトまたはイライト粘土鉱物を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記粘土鉱物が、タルクを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記粘土鉱物が、ハロイサイトを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記粘土鉱物が、ベントナイトを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記粘土鉱物が、合成粘土鉱物を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記合成粘土鉱物が、ラポナイトを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記アルカリ性溶液が、ＫＯＨ、ＮａＯＨもしくはＬｉＯＨ、またはそれらの組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記アルカリ性溶液が、ＫＯＨを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記溶解に適したｐＨが、約０．１Ｍ塩基のアルカリ性溶液から得られる、項目１に記載の方法。
（項目１１）
任意選択の前記酸性溶液が、ＨＣｌ、Ｃ２Ｈ４Ｏ２またはＨ２ＳＯ４を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記試料が、１つまたは複数の感染性因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記１つまたは複数の感染性因子が、ウイルス性因子である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記試料が、少なくとも２つのウイルス性因子を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記試料が、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記ＤＮＡウイルスが、ＨＢＶである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＮＡウイルスが、ＨＣＶまたはＨＩＶである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記試料が、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、呼吸器洗浄液、涙および組織スワブから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記試料が、血液、血漿および血清から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
核酸増幅ステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記核酸増幅ステップが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲから選択される、項目２０に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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