(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）ヒトnSR100 mRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、又は
（b）ヒトnSR100 mRNAの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つヒトnSR100 mRNAの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列と95％以上の同一性を有する、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド、
のいずれかを含有し、
前記ポリヌクレオチドがプライマーである場合の前記ポリヌクレオチドの塩基長が15〜50である、
小細胞肺がんの悪性度の診断薬。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがプローブ又はプライマーである、請求項１に記載の小細胞肺がんの悪性度の診断薬。
【請求項３】
（a’）miR-4279、miR-4419b、miR-4516、又はmiR-4635の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、又は
（b’）miR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635の塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635の塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列と95％以上の同一性を有する、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド、
のいずれかを含有し、
前記ポリヌクレオチドがプライマーである場合の前記ポリヌクレオチドの塩基長が15〜21である、
小細胞肺がんの診断薬。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがプローブ又はプライマーである、請求項３に記載の小細胞肺がんの診断薬。
【請求項５】
ヒトnSR100タンパク質を認識する抗体を含有する、小細胞肺がんの悪性度の診断薬。
【請求項６】
（1）被験者から採取された小細胞肺がん由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはヒトnSR100 cDNAの量を、請求項1又は2に記載の診断薬を用いて測定する工程、及び
（2）上記工程（1）で測定されたヒトnSR100 mRNA若しくはヒトnSR100 cDNAの量（被検mRNA発現量）を、他の小細胞肺がん由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはヒトnSR100 cDNAの量（対照mRNA発現量）と対比する工程を有し、
（3）対照mRNA発現量に比べて被検mRNA発現量が高いことを、被験者の小細胞肺がんの悪性度がより高いとの判断指標とする、小細胞肺がんの悪性度の評価方法。
【請求項７】
（1”）被験者から採取された血液試料におけるmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量を、請求項3又は4に記載の診断薬を用いて測定する工程、及び
（2”）上記工程（1”）で測定されたmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量（被検miRNA量）を、小細胞肺がん患者ではない被験者（例えば健常者）から採取された血液試料におけるmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量（対照miRNA量）と対比する工程、を有し、
（3”）対照miRNA量に比べて被検miRNA量が高いことを、被験者が小細胞肺がんであるとの判断指標とする、小細胞肺がんの検出方法。
【請求項８】
（1’）被験者から採取された小細胞肺がん由来の試料におけるヒトnSR100タンパク質の発現量を請求項3に記載の診断薬を用いて測定する工程、及び
（2’）上記工程（1’）で測定されたヒトnSR100タンパク質の発現量（被検タンパク質発現量）を、他の小細胞肺がん由来の試料におけるヒトnSR100タンパク質の発現量（対照タンパク質発現量）と対比する工程、を有し、
（3’）対照タンパク質発現量に比べて被検タンパク質発現量が高いことを、被験者の小細胞肺がんの悪性度がより高いとの判断指標とする、小細胞肺がんの悪性度の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、nSR100遺伝子の発現量を指標とした小細胞肺がんの検出方法、該方法に使用する診断薬、及びnSR100遺伝子を標的とした小細胞肺がん治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺がんは世界中のがん関連死の主要原因であり、大きく分けて小細胞肺がん（SCLC）と非小細胞肺がん（NSCLC）の2種類に分類される。小細胞肺がんは喫煙との関連性が大きいことが知られており、例えばタバコの煙に含まれる成分であるニコチンが、腫瘍の成長や血管新生を促進したり、がん細胞のアポトーシスを阻害するということが報告されている。また、小細胞肺がんは悪性度が高く、急速に成長・転移が起こるため、早期に検出することが非常に重要である。さらに、小細胞肺がんは化学療法に対する抵抗性が高いため有効な治療が難しいというのが現状である。したがって、より有効な治療方法の開発が求められている。【０００３】
小細胞肺がんの検出マーカー遺伝子として、REST（RE1-silencing transcription factor）遺伝子が知られている（非特許文献1）。REST遺伝子からは、通常は9つのジンクフィンガードメインを有するタンパク質が発現するが、小細胞肺がんにおいては5つのジンクフィンガードメインしか有さないスプライシングバリアントタンパク質（sRESTタンパク質）が特異的に発現する。したがって、このsRESTタンパク質又はsREST mRNAの発現量を指標とすることにより、小細胞肺がんを検出できる。【０００４】
一方、nSR100（neural-specific SR-related protein of 100 kDa）遺伝子から発現されるタンパク質はスプライシングを制御する機能を有することが知られているものの、その発現は脳、嗅球、及び目等の神経組織に限られているので、神経組織特異的なスプライシングに関与すると考えられている（非特許文献2）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】CANCER RESEARCH 60, 1840-1844, April 1, 2000
【非特許文献２】Cell 138, 898−910, September 4, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新たな小細胞肺がんマーカー遺伝子を見出し、小細胞肺がんの検出方法、及び該方法に使用する診断薬を提供することを目的とする。更には、小細胞肺がんの治療薬を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、鋭意研究を進めた結果、発現が神経組織に限られていることが報告されているnSR100遺伝子が、驚くべきことに小細胞肺がん細胞において特異的に発現していることを見出した。また、これに関連して、nSR100遺伝子抑制miRNA量が、SCLC患者の血中で亢進していることも見出した。さらに、nSR100遺伝子の発現と、小細胞肺がんの悪性度との関連性も見出した。これらの知見に基づいて更に研究を進めた結果、本発明が完成した。【０００８】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。【０００９】
項１．
（a）ヒトnSR100 mRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、又は
（b）ヒトnSR100 mRNAの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド、
のいずれかを含有する、小細胞肺がんの診断薬。【００１０】
項２．
前記ポリヌクレオチドがプローブ又はプライマーである、項１に記載の小細胞肺がんの診断薬。【００１１】
項３．
（a’）miR-4279、miR-4419b、miR-4516、又はmiR-4635の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、又は
（b’）miR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635の塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド、
のいずれかを含有する、小細胞肺がんの診断薬。【００１２】
項４．
前記ポリヌクレオチドがプローブ又はプライマーである、項３に記載の小細胞肺がんの診断薬。【００１３】
項５．
ヒトnSR100タンパク質を認識する抗体を含有する、小細胞肺がんの診断薬。【００１４】
項６．
（1）被験者から採取された肺組織由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量を、項1又は2に記載の診断薬を用いて測定する工程、及び
（2）上記工程（1）で測定されたヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量（被検mRNA発現量）を、小細胞肺がん組織及び神経組織を含まない組織由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量（対照mRNA発現量）と対比する工程、
を有し、
（3）対照mRNA発現量に比べて被検mRNA発現量が高いことを、被験者が小細胞肺がんであるとの判断指標とする、小細胞肺がんの検出方法。【００１５】
項７．
（1”）被験者から採取された血液試料におけるmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量を、項3又は4に記載の診断薬を用いて測定する工程、及び
（2”）上記工程（1”）で測定されたmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量（被検miRNA量）を、小細胞肺がん患者ではない被験者（例えば健常者）から採取された血液試料におけるmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量（対照miRNA量）と対比する工程、
を有し、
（3”）対照miRNA量に比べて被検miRNA量が高いことを、被験者が小細胞肺がんであるとの判断指標とする、小細胞肺がんの検出方法。【００１６】
項８．
（1’）被験者から採取された肺組織由来の試料におけるヒトnSR100タンパク質の発現量を項3に記載の診断薬を用いて測定する工程、及び
（2’）上記工程（1’）で測定されたヒトnSR100タンパク質の発現量（被検タンパク質発現量）を、小細胞肺がん組織及び神経組織を含まない組織由来の試料におけるヒトnSR100タンパク質の発現量（対照タンパク質発現量）と対比する工程、
を有し、
（3’）対照タンパク質発現量に比べて被検タンパク質発現量が高いことを、被験者が小細胞肺がんであるとの判断指標とする、小細胞肺がんの検出方法。【００１７】
項９．
ヒトnSR100 mRNAの発現、ヒトnSR100タンパク質の発現、又はヒトnSR100タンパク質の機能を抑制する核酸を含有する、小細胞肺がん治療薬。【００１８】
項１０．
前記核酸がヒトnSR100 mRNAの発現を特異的に抑制するsiRNAである、項９に記載の小細胞肺がん治療薬。【００１９】
項１１．
前記核酸がmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種である、項９に記載の小細胞肺がん治療薬。【００２０】
項１２．
ヒトnSR100タンパク質を認識する抗体を含有する、小細胞肺がん治療薬。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、新たな小細胞肺がんマーカー遺伝子（nSR100遺伝子）の発見に基づいた、小細胞肺がんの検出方法、及び該方法に使用する診断薬を提供することができる。更には、小細胞肺がんの治療薬も提供することができる。本発明の検出方法によれば、nSR100遺伝子の発現産物量、又はnSR100遺伝子抑制miRNA量を指標とすることにより、小細胞肺がんを簡便かつ効率的に検出することができる。また、nSR100タンパク質は、既知の小細胞肺がんマーカーであるsREST mRNA（又はタンパク質）の生成を制御していることから、小細胞肺がん細胞におけるnSR100 mRNA（又はタンパク質）の発現量増加、及びnSR100遺伝子抑制miRNAの血中量増加は、sREST mRNA（又はタンパク質）の発現量増加に先立って起こることが予想される。したがって、nSR100遺伝子発現量又はnSR100遺伝子抑制miRNA量を指標とすることにより、より早期に小細胞肺がんを検出できる。さらに、本発明によれば、小細胞肺がんの悪性度（肺以外の組織における腫瘍形成能等）をも評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】REST遺伝子の構造（I〜VI）、及びその発現産物（RESTタンパク質及びsRESTタンパク質）の構造を示す。I〜VIの各ボックスはREST遺伝子を構成するエキソンを示す。白いバーはRESTタンパク質又はsRESTタンパク質の構造を示し、該バー中のグレーのボックスはジンクフィンガードメインを示す。図の上部に示されるように、sRESTタンパク質は、フレームシフトによりエキソンVとエキソンVIの間にストップコドンが現れることにより生成される、N末端側の5つのジンクフィンガードメインを有するタンパク質である。
【図２】Aは、SCLC細胞におけるnSR100タンパク質の発現解析の結果を示し、Bは、SCLC細胞におけるnSR100タンパク質、RESTタンパク質、及びsRESTタンパク質の発現解析の結果を示す。A及びBの写真像の上部に示されるのは、発現解析に用いた細胞名の略称を示す。Bの右側に示されるのは、検出したタンパク質名を示す。
【図３】Aは、浮遊培養又は細胞外マトリックス上で接着培養されたSCLC細胞（N417）における、nSR100タンパク質の発現解析結果を示し、Bは、浮遊培養又は細胞外マトリックス上で接着培養されたSCLC細胞における、sREST mRNA（上段）、REST mRNA（下段左）、及びnSR100 mRNA（下段右）の発現解析結果を示す。A中、左側2レーンは1次抗体（抗nSR100抗体）を反応させなかった場合の結果を示し、右側2レーンは1次抗体（抗nSR100抗体）を反応させた場合の結果を示し、w/oは浮遊培養したSCLC細胞における発現解析結果を示し、wは細胞外マトリックス上で接着培養されたSCLC細胞における発現解析結果を示す。B中、各グラフの下部に示されるのは、発現解析に用いた細胞の種類を示す。＋ECLは細胞外マトリックス上で培養された細胞を用いたことを示し、(plate)は培養皿に接着していた細胞を用いたことを示し、(medium)は培養皿に接着せずに培地中に浮遊していた細胞を用いたことを示す。Bの各グラフの縦軸は、GAPDH mRNAの発現量を1とした場合の相対発現量を示す。
【図４】Aは、nSR100遺伝子が抑制されたNCI-N417細胞における、REST mRNA（上段）、sREST mRNA（中段）、及びnSR100 mRNA（下段）の発現解析結果を示し、Bは、これらのタンパク質の発現解析結果を示す。Aの各グラフの下部及びBの上部に示されるのは、発現解析に用いた細胞の種類を示す。siRNA(−)は非特異的siRNAを用いてRNAi処理を行ったNCI-N417細胞を用いたことを示し、siRNA（＋）はnSR100遺伝子に対するsiRNAを用いてRNAi処理を行ったNCI-N417細胞を用いたことを示す。Bの右側に示されるのは、検出したタンパク質名を示す。Aの各グラフの縦軸は、GAPDH mRNAの発現量を1とした場合の相対発現量を示す。
【図５】Aは、腫瘍形成実験後のマウスの写真を示し、Bは、形成された腫瘍におけるnSR100 mRNA、sREST mRNA及びRESTの発現解析結果を示す。A中、I〜IIIは注射から60日後のマウスの写真であり、IVは注射から46日後のマウスの写真である。B中、各グラフの下部に示されるのは注射したサンプルの種類を示す。N417は浮遊培養NCI-N417細胞サンプル（パターンI）、N417＋ECLは接着培養NCI-N417細胞サンプル（パターンIII）、N417＋Matrigel浮遊培養NCI-N417細胞とマトリゲルとの混合サンプル（パターンIV）を示す。Bの各グラフの縦軸は、GAPDH mRNAの発現量を1とした場合の相対発現量を示す。
【図６】Aは、NCI-N417細胞を用いた場合の結果を示し、Bは、NCI-H82細胞を用いた場合の結果を示し、Cは、NCI-H1650細胞を用いた場合の結果を示す。A〜C中、siRNA-Aは標的配列1（配列番号10）を標的としたsiRNAを示し、siRNA-Bは標的配列2（配列番号11）を標的としたsiRNAを示し、siRNA-Cは標的配列3（配列番号12）を標的としたsiRNAを示し、siRNA-Dは標的配列4（配列番号13）を標的としたsiRNAを示し、siRNA mixはsiRNA-A〜siRNA-Dの等モル混合物を示す。
【図７】各図中、縦軸は、各miRNAの血中濃度を示す。横軸の「control」は健常者のデータを示し、「SCLC」はSCLC患者のデータを示し、「NSCLC」はNSCLC患者のデータを示し、「gastric cancer」は胃癌患者のデータを示す。
【図８】各図中、縦軸は、miR-4516の血中濃度を示す。横軸の「normal」は健常者のデータを示し、「SCLC」はSCLC患者のデータを示し、「NSCLC」はNSCLC患者のデータを示し、「gastric」は胃癌患者のデータを示し、「bladder」は膀胱癌患者のデータを示し、「prostate」は前立腺癌患者のデータを示し、「kidney」は腎臓癌患者のデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
１．用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、IUPAC-IUBの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００２４】
また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００２５】
本発明において「DNA」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムDNAを含む２本鎖DNA、及びcDNAや合成DNAを含む１本鎖DNA（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖DNA（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる。本明細書中において「RNA」とは、特に言及しない限り、１本鎖RNAのみならず、それに相補的な配列を有する１本鎖RNA、さらにはそれらから構成される２本鎖RNAを包含する趣旨で用いられる。当該RNAには、total RNA、mRNA、rRNA、siRNAなどの合成RNAが含まれる。
【００２６】
また、本発明において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、DNAおよびRNAの両方を含むものとする。また、これらは2本鎖であっても1本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がRNAである場合、配列表に示される塩基記号「T」は「U」と読み替えられるものとする。
【００２７】
本発明において「ヒトnSR100 mRNA」とは、ヒトの体を構成する細胞内で発現しているnSR100 mRNAである限り特に限定されない。ヒトnSR100 mRNAとして、例えば配列番号1に示される塩基配列からなるmRNAが挙げられるが、上記の限りにおいて配列番号1に示される塩基配列に対して90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、より好ましくは98％以上の同一性、よりさらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるmRNAであってもよい。
【００２８】
本発明において「miR-4279」、「miR-4419b」、「miR-4516」、及び「miR-4635」とは、ヒトの体を構成する細胞内で発現している上記miRNAである限り特に限定されない。これらのmiRNAは、前駆体miRNA及び／又は成熟miRNAを意味するが、好ましくは成熟miRNAを意味する。miR-4279として、例えば配列番号14に示される塩基配列からなるmRNAが挙げられ、miR-4419bとして、例えば配列番号15に示される塩基配列からなるmRNAが挙げられ、miR-4516として、例えば配列番号16に示される塩基配列からなるmRNAが挙げられ、miR-4635として、例えば配列番号17に示される塩基配列からなるmRNAが挙げられるが、上記の限りにおいてこれらの配列番号に示される塩基配列に対して90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、より好ましくは98％以上の同一性、よりさらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなるmRNAであってもよい。
【００２９】
本発明において「ヒトnSR100タンパク質」とは、ヒトの体を構成する細胞内で発現しているnSR100タンパク質である限り特に限定されない。ヒトnSRタンパク質として、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられるが、上記の限りにおいて配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して90％以上の同一性、好ましくは95％以上の同一性、より好ましくは98％以上の同一性、よりさらに好ましくは99％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００３０】
本発明でいう「ヒトnSR100 mRNAの発現を抑制する核酸」及び「ヒトnSR100タンパク質の発現を抑制する核酸」には、ヒトnSR100 mRNAに対するsiRNAのみならず、miRNA、アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチド、リボザイムおよびデコイなどが包含される。
【００３１】
また本発明でいう「ヒトnSR100タンパク質の機能を抑制する核酸」とは、ヒトnSR100タンパク質の機能を抑制する作用を有する核酸のことを意味し、ヒトnSR100タンパク質に対するアプタマーなどが含まれる。
【００３２】
本発明でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
【００３３】
さらに本発明において「診断薬」とは、小細胞肺がんの有無、またはその程度を診断するために、直接または間接的に利用されるものをいう。これには、小細胞肺がんに関連して肺組織において発現が上昇するヒトnSR100 mRNA（又はタンパク質）を特異的に認識し、また結合することのできる（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドまたは抗体が包含される。これらの（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドおよび抗体は、上記性質に基づいて、肺組織内で発現した上記nSR100 mRNA（又はタンパク質）を、生体内外で検出するためのプローブとして、また（ポリ）（オリゴ）ヌクレオチドは生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することができる。
【００３４】
２．ポリヌクレオチドを含有する小細胞肺がんの診断薬
2-1．nSR100 mRNA発現量を指標とする診断薬
本発明は、（a）ヒトnSR100 mRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、又は（b）ヒトnSR100 mRNAの塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド、
のいずれかを含有する、小細胞肺がんの診断薬に関する。
【００３５】
本発明において小細胞肺がんの検出（診断）は、被験者の肺組織におけるヒトnSR100 mRNAの発現上昇の有無または発現レベル（発現量）を評価することによって行われる。この場合、本発明の診断薬は、ヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）を特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、又はヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）を特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００３６】
本発明の診断薬は、ヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）を選択的に（特異的に）認識するものであれば、ヒトnSR100 mRNAの塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００３７】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、ヒトnSR100 mRNAが特異的に検出できること、またRT-PCR法においてはヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）が特異的に増幅されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または増幅物がヒトnSR100 mRNAに由来するものであると判断できるものであればよい。
【００３８】
すなわち、本発明の診断薬は、ヒトnSR100 mRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、ヒトnSR100 mRNAの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００３９】
本発明の診断薬は、例えば配列番号1に示されるヒトnSR100 mRNAの塩基配列をもとに、例えばベクターNTI（Infomax社製）を利用して設計することができる。具体的には前記ヒトnSR100 mRNAの塩基配列をベクターNTIのソフトウエアにかけて得られる、プライマーまたはプローブの候補配列、若しくは少なくとも該配列を一部に含む配列を、プライマーまたはプローブとして使用することができる。
【００４０】
本発明の診断薬は、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的には診断薬の用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００４１】
本発明の診断薬は、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によって被験者の肺組織中におけるヒトnSR100 mRNAの発現上昇の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
【００４２】
測定対象の試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の肺組織及びその周辺組織や、肺組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAに由来する核酸（cDNA等）を用いてもよい。
【００４３】
本発明の診断薬を、小細胞肺がんの検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、ヒトnSR100 mRNAの塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドとして、通常15塩基〜100塩基、好ましくは15塩基〜50塩基、より好ましくは15塩基〜35塩基の塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15塩基〜全配列の塩基数、好ましくは15塩基〜1000塩基、より好ましくは100塩基〜1000塩基の塩基長を有するものが例示できる。
【００４４】
本発明の診断薬（プローブまたはプライマー）には、ヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）の検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００４５】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。
【００４６】
またプローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の診断薬は、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化したDNAチップ、cDNAマイクロアレイ、オリゴDNAアレイ、メンブレンフィルター等。以下「DNAチップ等」と総称する。）の形態として提供することができる。
【００４７】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばDNAマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００４８】
本発明の診断薬（プローブ）を固定化したDNAチップ等によれば、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNAとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識DNAまたはRNAとの複合体を、該標識DNAまたはRNAの標識を指標として検出することにより、肺組織中でのヒトnSR100 mRNAの発現の有無または発現レベル（発現量）を評価することができる。
【００４９】
上記DNAチップ等は、ヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）と結合し得る1種または2種以上の本発明の診断薬（プローブ）を含んでいれば良い。複数の診断薬（プローブ）を含むDNAチップ等の利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
【００５０】
本発明の診断薬は、被験者について小細胞肺がんの検出に有用である。具体的には、該診断薬を利用した小細胞肺がんの診断は、被験者の肺組織由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量（被検mRNA発現量）と、小細胞肺がん組織及び神経組織を含まない組織由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量（対照mRNA発現量）の違いを判定することによって行うことができる。この場合、具体的には、被検mRNA発現量が対照mRNA発現量と比べて50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していれば、被験者が小細胞肺がんである可能性が高くなる。
【００５１】
2-2．nSR100遺伝子抑制miRNA量を指標とする診断薬
本発明は、（a’）miR-4279、miR-4419b、miR-4516、又はmiR-4635（nSR100遺伝子抑制miRNA）の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／若しくは当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、又は（b’）miR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635の塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド、
のいずれかを含有する、小細胞肺がんの診断薬に関する。
【００５２】
本発明において小細胞肺がんの検出（診断）は、被験者の血液試料におけるnSR100遺伝子抑制miRNA量を評価することによって行われる。この場合、本発明の診断薬は、nSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）を特異的に認識し増幅するためのプライマーとして、又はnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）を特異的に検出するためのプローブとして利用することができる。
【００５３】
本発明の診断薬は、nSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）を選択的に（特異的に）認識するものであれば、nSR100遺伝子抑制miRNAの塩基配列（全長配列）からなるポリヌクレオチドであってもよいし、その相補配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。また、上記全長配列またはその相補配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列としては、上記全長配列またはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも15個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００５４】
なお、ここで「選択的に（特異的に）認識する」とは、例えばノーザンブロット法においては、nSR100遺伝子抑制miRNAが特異的に検出できること、またRT-PCR法においてはnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）が特異的に増幅されることを意味するが、それに限定されることなく、当業者が上記検出物または増幅物がnSR100遺伝子抑制miRNAに由来するものであると判断できるものであればよい。
【００５５】
すなわち、本発明の診断薬は、nSR100遺伝子抑制miRNAの塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／または当該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。ここで相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）とは、nSR100遺伝子抑制miRNAの塩基配列からなるポリヌクレオチドの全長配列、または該塩基配列において少なくとも連続した15塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」ともいう）に対して、A:TおよびG:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「１×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少なくとも90％、好ましくは95％、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上の同一性を有する塩基配列からなる鎖を例示することができる。
【００５６】
本発明の診断薬は、例えば配列番号14、15、16、又は17に示されるnSR100遺伝子抑制miRNAの塩基配列をもとに、公知のプログラムソフトを利用して設計することができる。
【００５７】
本発明の診断薬は、上述するように連続する少なくとも15塩基の長さを有するものであればよいが、具体的には診断薬の用途に応じて、長さを適宜選択し設定することができる。
【００５８】
本発明の診断薬は、ノーザンブロット法、RT-PCR法、in situハイブリダーゼーション法などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法において、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によって被験者の血液試料におけるnSR100遺伝子抑制miRNA量を評価することができる。
【００５９】
測定対象の試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、被験者の血液試料を採血等で採取し、そこから常法に従って調製したtotal RNAを用いてもよいし、さらに該RNAに由来する核酸（cDNA等）を用いてもよい。
【００６０】
本発明の診断薬を、小細胞肺がんの検出（遺伝子診断）においてプライマーとして用いる場合には、nSR100遺伝子抑制miRNAの塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドとして、通常15塩基〜21塩基、好ましくは16塩基〜21塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、nSR100遺伝子抑制miRNAの塩基配列において、連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／またはそれに相補的なポリヌクレオチドとして、通常15塩基〜21塩基、好ましくは16塩基〜21塩基を有するものが例示できる。
【００６１】
本発明の診断薬（プローブまたはプライマー）には、nSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）の検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【００６２】
本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、HEX（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、NED（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、6-FAM（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドECL 3’-オリゴラベリングシステム等）。
【００６３】
またプローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明の診断薬は、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化したDNAチップ、cDNAマイクロアレイ、オリゴDNAアレイ、メンブレンフィルター等。以下「DNAチップ等」と総称する。）の形態として提供することができる。
【００６４】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばDNAマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００６５】
本発明の診断薬（プローブ）を固定化したDNAチップ等によれば、生体組織から採取したRNAをもとに調製される標識DNAまたはRNAとハイブリダイズさせ、該ハイブリダイズによって形成された上記プローブと標識DNAまたはRNAとの複合体を、該標識DNAまたはRNAの標識を指標として検出することにより、血液中でのnSR100遺伝子抑制miRNA量を評価することができる。
【００６６】
上記DNAチップ等は、nSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸（cDNA等）と結合し得る1種または2種以上の本発明の診断薬（プローブ）を含んでいれば良い。複数の診断薬（プローブ）を含むDNAチップ等の利用によれば、ひとつの生体試料について、同時に複数の遺伝子の発現の有無または発現レベルの評価が可能である。
【００６７】
本発明の診断薬は、被験者について小細胞肺がんの検出に有用である。具体的には、該診断薬を利用した小細胞肺がんの診断は、被験者の血液試料におけるnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸の量（被検miRNA量）と、小細胞肺がん患者ではない被験者（例えば健常者）から採取された血液試料におけるnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸の量（対照miRNA量）の違いを判定することによって行うことができる。この場合、具体的には、被検miRNA量が対照miRNA量と比べて50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していれば、被験者が小細胞肺がんである可能性が高くなる。
【００６８】
３．抗体を含有する小細胞肺がんの診断薬
本発明は、診断薬として、ヒトnSR100タンパク質を特異的に認識することのできる抗体を提供する。当該抗体として、具体的には、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を特異的に認識することのできる抗体を挙げることができる。
【００６９】
本発明は、小細胞肺がん患者の肺組織においてヒトnSR100タンパク質の発現が特異的に上昇しているという知見をもとに、被験者についてヒトnSR100タンパク質の発現増加の有無やその程度を検出することによって、当該被験者が小細胞肺がんであるか否か、またその程度を特異的に検出することができるという発想に基づくものである。
【００７０】
従って、上記抗体は、被験者における上記ヒトnSR100タンパク質の発現増加の有無またはその程度を検出することによって、該被験者が小細胞肺がんであるか否かまたはその程度を診断することのできるツール(診断薬)として使用される。
【００７１】
本発明の抗体は、その形態に特に制限はなく、ヒトnSR100タンパク質を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに当該ヒトnSR100タンパク質のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体も、本発明の抗体に含まれる。
【００７２】
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology , Chapter 11.12〜11.13(2000)）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したヒトnSR100タンパク質を用いて、あるいは常法に従って当該ヒトnSR100タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したヒトnSR100タンパク質、あるいはタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。
【００７３】
抗体の作製に免疫抗原として使用されるヒトnSR100タンパク質は、本発明により提供される遺伝子の配列情報（例えば配列番号1）に基づいて、DNAクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。
【００７４】
具体的には、ヒトnSR100タンパク質をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって、本発明抗体の製造のための免疫抗原としてのタンパク質を得ることができる。またヒトnSR100タンパク質の部分ペプチドは、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号2）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。
【００７５】
また本発明の抗体は、ヒトnSR100タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のために用いられるオリゴ（ポリ）ペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、ヒトnSR100タンパク質と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性を有し、且つヒトnSR100タンパク質のアミノ酸配列において少なくとも連続する8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸、より好ましくは20アミノ酸からなるオリゴ（ポリ）ペプチドを例示することができる。
【００７６】
かかるオリゴ（ポリ）ペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、並びにリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのような表面活性物質、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含まれる。
【００７７】
本発明の抗体はヒトnSR100タンパク質に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利用することによって、被験者の肺組織内に発現したヒトnSR100タンパク質を特異的に検出することができる。即ち、当該抗体は被験者の肺組織由来の試料中のヒトnSR100タンパク質の有無およびその程度を検出するためのプローブとして有用である。
【００７８】
具体的には、被験者の肺組織及びその周辺組織や、肺組織の一部をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製した組織抽出物やタンパク質を用いて、例えばイムノブロット法、ELISA法など公知の検出方法において、本発明抗体を常法に従ってプローブとして使用することによって、ヒトnSR100タンパク質を検出することができる。
【００７９】
小細胞肺がんの検出に際しては、被験者の肺組織由来の試料におけるヒトnSR100タンパク質量（被検タンパク質発現量）と、小細胞肺がん組織及び神経組織を含まない組織由来の試料におけるヒトnSR100タンパク質量（対照タンパク質発現量）の違いを判定することによって行うことができる。この場合、具体的には、被検タンパク質発現量が対照タンパク質発現量と比べて50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していれば、被験者が小細胞肺がんである可能性が高くなる。
【００８０】
４．診断薬キット
本発明は、上記診断薬を含む、小細胞肺がんの検出や診断に使用する診断薬キットを提供するものでもある。当該キットは、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）または上記抗体を少なくとも１つ含むものである。当該キットには上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【００８１】
５．小細胞肺がんの検出方法（診断方法）
本発明の検出方法の一態様は次の（I）〜（III）の工程を含む：
（I）被験者から採取された肺組織由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量、又はヒトnSR100タンパク質の量を測定する工程、
（II）上記工程（I）で測定されたヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量、又はヒトnSR100タンパク質の量（被検mRNA／タンパク質発現量）を、小細胞肺がん組織及び神経組織を含まない組織由来の試料におけるヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量、又はヒトnSR100タンパク質の量（対照mRNA／タンパク質発現量）と対比する工程、及び
（III）対照mRNA／タンパク質発現量に比べて被検mRNA／タンパク質発現量が高いことを、被験者が小細胞肺がんであるとの判断指標とする工程。
【００８２】
かかる方法において得られた対照mRNA／タンパク質発現量に比して被験mRNA／タンパク質発現量が高い場合には、被験者は小細胞肺がんであると判断することができる。
【００８３】
ここで用いられる試料としては、被験者から採取された肺組織から調製される試料を挙げることができる。具体的には、該組織から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製される核酸（cDNA等）を含む試料、または上記組織から調製されるタンパク質を含む試料を挙げることができる。かかるRNA、核酸またはタンパク質を含む試料は、被験者の肺組織をバイオプシ等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００８４】
被験者が小細胞肺がんであるかどうかの判断は、対照mRNA／タンパク質発現量に比べて被検mRNA／タンパク質発現量が高いことを基準として判断される。具体的には、例えば対照mRNA／タンパク質発現量に比べて被検mRNA／タンパク質発現量が50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していることを指標として行うことができる。
【００８５】
また、本発明の検出方法の一態様は次の（I’）〜（III’）の工程を含む：
（I’）被験者から採取された血液試料におけるmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635（nSR100遺伝子抑制miRNA）からなる群より選択される少なくとも１種の量を、請求項3又は4に記載の診断薬を用いて測定する工程、
（II’）上記工程（1”）で測定されたmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量（被検miRNA量）を、小細胞肺がん患者ではない被験者（例えば健常者）から採取された血液試料におけるmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635からなる群より選択される少なくとも１種の量（対照miRNA量）と対比する工程、及び
（III’）対照miRNA量に比べて被検miRNA量が高いことを、被験者が小細胞肺がんであるとの判断指標とする工程。
【００８６】
かかる方法において得られた対照miRNA量に比して被検miRNA量が高い場合には、被験者は小細胞肺がんであると判断することができる。
【００８７】
ここで用いられる試料としては、被験者から採取された血液から調製される試料を挙げることができる。具体的には、血液から調製されるRNA含有試料、若しくはそれからさらに調製される核酸（cDNA等）を含む試料を挙げることができる。かかるRNA又は核酸を含む試料は、被験者の血液を採血等で採取し、そこから常法に従って調製することができる。
【００８８】
被験者が小細胞肺がんであるかどうかの判断は、対照miRNA量に比べて被検miRNA量が高いことを基準として判断される。具体的には、例えば対照miRNA量に比べて被検miRNA量が50％以上上昇、好ましくは100％以上上昇、より好ましくは200％以上上昇していることを指標として行うことができる。
【００８９】
本発明の検出方法は、測定対象の種類に応じて、具体的には下記のようにして実施される。
【００９０】
5-1．測定対象がヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸である場合
当該検出方法（診断方法）は、試料中のヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の量を測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドを含有する本発明の診断薬（ポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００９１】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記診断薬をプローブとして用いることによって、試料中のヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の有無やその量を測定することができる。具体的には、本発明の診断薬（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の試料由来のmRNAとハイブリダイズさせた後、形成された診断薬と被験者の試料由来のmRNAとの二重鎖を、診断薬の標識物（RI若しくは蛍光物質などの標識物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器などで検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って診断薬を標識し、被験者の試料由来のmRNAとハイブリダイズさせ後、診断薬の標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００９２】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記診断薬をプライマーとして用いることによって、試料中のヒトnSR100 mRNA若しくはそれに由来する核酸の有無やその量を測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的領域が増幅できるように、本発明の診断薬から調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した診断薬をプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００９３】
DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記診断薬をDNAプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の診断薬から調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。
【００９４】
5-2．測定対象がヒトnSR100タンパク質である場合
当該検出方法（診断方法）は、試料中のヒトnSR100タンパク質の量を測定することによって実施される。具体的には、前述の抗体を含有する本発明の診断薬（抗体）を用いて、イムノブロット法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００９５】
イムノブロット法は、一次抗体として本発明の診断薬を用いた後、二次抗体として125Ｉなどの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルオキシターゼ（HRP）などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に結合する抗体）を用い、得られる標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などの標識物質に由来するシグナルを放射線測定器（BAS-1800II：富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによって実施できる。また、一次抗体として本発明の診断薬を用いた後、ECL Plus Western Blotting Detection System (アマシャム ファルマシアバイオテク社製)を用いて、該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージャーSTORM860(アマシャム ファルマシアバイオテク社製)で測定することもできる。
【００９６】
5-3．測定対象がnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸である場合
当該検出方法（診断方法）は、試料中のnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸の量を測定することによって実施される。具体的には、前述のポリヌクレオチドを含有する本発明の診断薬（ポリヌクレオチド）をプライマーまたはプローブとして用いて、ノーザンブロット法、RT-PCR法、DNAチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
【００９７】
ノーザンブロット法を利用する場合は、本発明の上記診断薬をプローブとして用いることによって、試料中のnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸の有無やその量を測定することができる。具体的には、本発明の診断薬（相補鎖）を放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の試料由来のmiRNAとハイブリダイズさせた後、形成された診断薬と被験者の試料由来のmiRNAとの二重鎖を、診断薬の標識物（RI若しくは蛍光物質などの標識物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器などで検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコールに従って診断薬を標識し、被験者の試料由来のmRNAとハイブリダイズさせ後、診断薬の標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。
【００９８】
RT-PCR法を利用する場合は、本発明の上記診断薬をプライマーとして用いることによって、試料中のnSR100遺伝子抑制miRNA若しくはそれに由来する核酸の有無やその量を測定することができる。具体的には、被験者の生体組織由来のRNAから常法に従ってcDNAを調製して、これを鋳型として標的領域が増幅できるように、本発明の診断薬から調製した一対のプライマー（上記cDNA（−鎖）に結合する正鎖、＋鎖に結合する逆鎖）をこれとハイブリダイズさせて、常法に従ってPCR法を行い、得られた増幅二本鎖DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖DNAの検出は、上記PCRを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖DNAを検出する方法、産生された二本鎖DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した診断薬をプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖DNA産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。
【００９９】
DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記診断薬をDNAプローブ（１本鎖または２本鎖）として貼り付けたDNAチップを用意し、これに被験者の生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の診断薬から調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。
【０１００】
６．小細胞肺がん治療薬または予防薬
本発明は、ヒトnSR100 mRNAの発現、ヒトnSR100タンパク質の発現、若しくはヒトnSR100タンパク質の機能を抑制する核酸、又はヒトnSR100タンパク質を認識する抗体を含有する、小細胞肺がん治療薬または予防薬に関する。
【０１０１】
本発明が対象とするsiRNA は、二本鎖であり、ヒトnSR100 mRNAの標的配列に相補的な配列であるセンス鎖と該センス鎖に相補的な配列であるアンチセンス鎖がハイブリダイズしてなっている。上記二本鎖は、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA（shRNA）であってもよい。かかるsiRNAは、ヒトnSR100 mRNA（又はタンパク質）の発現を抑制するものであれば特に制限されない。このようなsiRNAとしては、公知のsiRNAデザインプログラムを用いて設計したものを用いてもよいし、抑制機能が保証されている市販のsiRNAを用いてもよい。siRNAの好ましい標的配列としては、配列番号10、11、12、13等が挙げられ、これらの中でも好ましくは配列番号11、12、13等が挙げられ、より好ましくは配列番号12、13等が挙げられる。
【０１０２】
またヒトnSR100 mRNA（又はタンパク質）の発現を抑制するsiRNAに限らず、ヒトnSR100遺伝子を抑制する核酸も本発明の治療薬の有効成分として使用することができる。かかる核酸として、ヒトnSR100遺伝子に対するmiRNA（好ましくはmiR-4279、miR-4419b、miR-4516、又はmiR-4635）、アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチド、リボザイム、アプタマーおよびデコイなどを挙げることができる。ここでアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドは、ヒトnSR100 mRNAの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するものであり、ヒトnSR100 mRNAとハイブリダイズすることによって、該RNAの合成または機能を阻害するか、あるいは該RNAとの相互作用を介してヒトnSR100 mRNAの発現を調節・制御する作用を有するものである。アンチセンスポリヌクレオチドには、上記作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドであってもよく、アンチセンスRNA、アンチセンスDNAなどが含まれる。
【０１０３】
アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドは通常、10〜1000個程度、好ましくは15〜500個程度、更に好ましくは16〜30個程度の塩基から構成される。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチドは、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。
【０１０４】
さらに、ヒトnSR100タンパク質の機能を抑制する作用を有するものも本発明の小細胞肺がん治療薬の有効成分として使用することができる。かかる作用を有するものとして、ヒトnSR100タンパク質に対する抗体、特に中和抗体を挙げることができる。
【０１０５】
ここで中和抗体とは、抗原に結合することによりその抗原が本来有していた機能又は活性を阻害する性質を有する抗体を意味する。ヒトnSR100タンパク質に対する中和抗体とは、ヒトnSR100タンパク質に結合することによりヒトnSR100タンパク質が有する機能又は活性を阻害する性質を有する抗体を言う。
【０１０６】
本発明の小細胞肺がん治療薬又は予防薬は、上記のヒトnSR100 mRNA（又はタンパク質）の発現を抑制したり、またヒトnSR100タンパク質の機能を抑制する有効成分（siRNA、アンチセンスポリ（オリゴ）ヌクレオチド、抗体など）に加え、任意の担体や添加剤、例えば医薬上許容される担体および添加剤を含むことができる。
【０１０７】
医薬上許容される担体および添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤；クエン酸、メントール等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水等の希釈剤；ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１０８】
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、非経口的な投与製剤としては、他に水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
【０１０９】
本発明の予防または治療薬の投与量は、投与対象となる被験者の体重や年齢、並びに病気の重篤度等によって異なり、一概に設定することはできないが、例えば、成人１日あたり有効成分量として数mg〜数十mg／kg体重を挙げることができ、これを１日１回〜数回に分けて投与することができる。
【０１１０】
上記の有効成分がDNAによりコードされるものである場合は、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。更に、上記有効成分がアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、そのままもしくは遺伝子治療用ベクターにこれを組込むことにより、遺伝子治療を行うこともできる。これらの場合も、遺伝子治療用組成物の投与量、投与方法は患者の体重、年齢、症状などにより変動し、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【実施例】
【０１１１】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０１１２】
実施例1．SCLC細胞におけるnSR100遺伝子の発現解析
小細胞肺がん（SCLC）細胞におけるnSR100タンパク質の発現をイムノブロット法で調べた。同時に、RESTタンパク質（図１の下段）、及び既知のSCLCマーカーであるsRESTタンパク質（RESTタンパク質のスプライシングバリアント：図１の上段）の発現も調べた。具体的には次のように行った。【０１１３】
＜1.1．イムノブロット用試料の調製＞
ヒトSCLC細胞として、NCI-N417細胞（American Type Culture Collection：ATCC）及びNCI-H82細胞（ATCC）を準備した。一方、コントロール細胞として、ヒト非小細胞肺がん（NSCLC）細胞であるNCI-H1650細胞（ATCC）を準備した。これらの細胞を、培地としてRPMI1640培地（10％FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、及び100μg/ml ストレプトマイシンを含む）を用いて、湿潤環境下、5％CO2存在下、37℃で浮遊培養した。培養後の細胞を回収し、定法に従ってタンパク質を抽出した。得られたタンパク質抽出液を試料とした。【０１１４】
＜1.2．イムノブロット＞
100μgのタンパク質を含む試料を、定法に従って10％ SDSゲルを用いた電気泳動によって展開し、泳動後のゲル中のタンパク質をPVDF膜に転写した。転写後のPVDF膜を、1％スキムミルクを含むTBS-T溶液（20 mM TBS、pH 7.2、0.1％ Tween20（登録商標））中で室温下1時間ブロッキングした。ブロッキング後のPVDF膜を、1％スキムミルクを含むTBS-T溶液で1/500に希釈した抗nSR100抗体（Santa Cruz, sc-139291）、1％スキムミルクを含むTBS-T溶液で1/1000に希釈した抗sREST抗体（Santa Cruz, H-290）、又は1％スキムミルクを含むTBS-T溶液で1/5000に希釈した抗REST抗体（Millipore, 07-579）中で室温下1時間反応させた。その後、PVDF膜をTBS-T溶液で洗浄し、1％スキムミルクを含むTBS-T溶液で1/15000又は1/20000に希釈した2次抗体（IRDye700又はIRDye800標識抗体（Li-COR社））中で室温下1時間反応させた。検出はOdyssey fluorescence detection system（LI-COR）を用いて行った。【０１１５】
＜1.3．結果＞
nSR100タンパク質の発現のみを調べた結果を図2Aに示し、nSR100タンパク質に加えてREST及びsRESTの発現も調べた結果を図2のBに示す。図2Aより、SCLC細胞であるNCI-N417細胞及びNCI-H82細胞において特異的にnSR100タンパク質の発現を示すバンド（75 kDa付近）が観察された。図2Bより、nSR100タンパク質及び既知のSCLCマーカーであるsRESTのタンパク質がSCLC細胞特異的に発現していることが示された。nSR100遺伝子の発現は神経組織以外の組織では観察されないという知見（非特許文献2）に鑑みると、図2より、nSR100遺伝子がSCLCマーカーとして有用であることが示唆された。【０１１６】
実施例2．細胞外マトリックス成分がnSR100遺伝子及びREST遺伝子の発現に与える影響の解析
SCLC細胞を細胞外マトリックス上で培養すると、SCLC細胞の腫瘍形成能が亢進することが知られている（参考文献1：PNAS USA 87, 6698-6702, 1990）。そこで、この腫瘍形成能の亢進によって、nSR100遺伝子及びREST遺伝子の発現がどのような影響を受けるかを調べた。具体的には次のように行った。【０１１７】
＜2.1．細胞培養＞
NCI-N417細胞（ヒトSCLC細胞）、NCI-H1650細胞（ヒトNSCLC細胞）、又はHela細胞を上記＜1.1．イムノブロット用試料の調製＞と同様の条件下で、48時間、浮遊培養した。これとは別に、NCI-N417細胞又はNCI-H1650細胞を、細胞外マトリックス成分（Millipore, ECL cell attachment matrix）でコーティングされた培養皿上で、上記浮遊培養と同様の条件下で、48時間、接着培養した。なお、コーティングは、ECL cell attachment matrixをPBSで20μg/mlになるように希釈した希釈液を培養皿上に広げて、37℃で1時間インキュベートした後、余分な水分を除くことによって行った。【０１１８】
＜2.2．イムノブロット＞
浮遊培養した細胞、及び細胞外マトリックス上で接着培養した細胞から、実施例1と同様に試料を調製し、該試料を用いてイムノブロットを行った。【０１１９】
＜2.3．定量的リアルタイムPCR＞
浮遊培養した細胞、及び細胞外マトリックス上で接着培養した細胞から、RNA抽出キット（Qiagen, Total RNeasy mini Kit）を用いて、Total RNAを抽出した。該Total RNAを鋳型として、逆転写反応キット（Qiagen, Quantitect reverse transcriptase又はTakara, 
Primescript RT）を用いて逆転写反応を行った。さらに、該逆転写反応後の試料を鋳型として、リアルタイムPCR反応キット（Qiagen, SYBR Green PCR kit又はTakara, SYBR Premix EX TaqII）を用いて、PCR装置（Rotor-Gene Q, Qiagen）中で核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は、95℃ 5分→［（95℃ 5秒→60℃ 5秒）×40サイクル］の温度サイクルで行った。用いたプライマーセットを、検出対象mRNA別に表1に示す。【０１２０】
【表１】
0006467580.tif 000002
【０１２１】
＜2.4．結果＞
nSR100タンパク質の発現解析結果を図3Aに示し、nSR100 mRNA、REST mRNA、及びsREST mRNAの発現解析結果を図3Bに示す。図3Aより、SCLC細胞を細胞外マトリックス上で培養することにより、nSR100タンパク質の発現量が亢進することが観察された。図3Bの下段右より、図3Aに示される傾向は、mRNAレベルでも観察されることが示された。また、図3Bの上段より、sREST mRNAについても同様の傾向が観察された。これらの結果より、SCLC細胞における発現挙動は、nSR100と既知のSCLCマーカーであるsREST共に、同様であることが示された。すなわち、nSR100遺伝子がSCLCマーカーとして有用であることがより強く示唆された。【０１２２】
実施例3．nSR100遺伝子の抑制がREST遺伝子の発現に与える影響の解析
nSR100は神経組織の細胞特異的に、オルタナティブスプライシングの制御因子として働くことが明らかとなっている（非特許文献2）。そこで、nSR100遺伝子の抑制が、REST遺伝子のスプライシングバリアント（sREST及びREST）の発現に与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【０１２３】
＜3.1．細胞培養＞
NCI-N417細胞（ヒトSCLC細胞）又はNCI-H1650細胞（ヒトNSCLC細胞）を、実施例2と同様に、細胞外マトリックス上で接着培養した。【０１２４】
＜3.2．RNAi＞
対数増殖期のNCI-N417細胞を、6ウェルプレートに1×10^5 cells/wellになるように播種し、24時間培養した。その後、nSR100遺伝子に対するsiRNA（Dharmacon, SMART-pool siRNAs）又は非特異的siRNA（Dharmacon, SMART-pool siRNAs）を、市販のトランスフェクション試薬（DharmaFECT siRNA Transfection Reagents（Thermo Scientific））を用いてトランスフェクションした。さらに培養を続け、トランスフェクションから48時間後に細胞を回収した。なお、nSR100遺伝子に対するsiRNA（Dharmacon, SMART-pool siRNAs）は表2に示す、nSR100 mRNA上の4つの配列それぞれを標的としたsiRNAの混合物である。【０１２５】
【表２】
0006467580.tif 000003
【０１２６】
＜3.3．定量的リアルタイムPCR＞
RNAi処理を行っていない細胞、及びRNAi処理を行った細胞から、実施例2と同様に定量的リアルタイムPCRを行った。【０１２７】
＜3.4．イムノブロット＞
RNAi処理を行っていない細胞、及びRNAi処理を行った細胞から、実施例1と同様に試料を調製し、該試料を用いてイムノブロットを行った。【０１２８】
＜3.5．結果＞
REST mRNA、sREST mRNA、及びnSR100 mRNAの発現解析結果を図4Aに示し、RESTタンパク質、sRESTタンパク質、及びnSR100タンパク質の発現解析結果を図4Bに示す。図4A及びBより、nSR100遺伝子の抑制により、sREST mRNA及びタンパク質の発現が低下すること、及びREST mRNA及びタンパク質の発現が亢進することが示された。このことから、SCLC細胞においては、nSR100タンパク質の亢進がREST遺伝子のスプライシングを制御し、その結果としてスプライシングバリアントであるsREST mRNA及びタンパク質の発現が高まることが示唆された。このように、SCLC細胞内における既知のSCLCマーカー（sREST）の亢進が、nSR100タンパク質によって制御されていることは、nSR100遺伝子がSCLCマーカーとして有用であることを強く示唆する。また、nSR100遺伝子の抑制によりREST mRNA及びタンパク質の発現が亢進するという図4の結果と、RESTタンパク質を強制発現させることによりSCLC細胞のアポトーシスを誘発できるという知見（参考文献2：Oncogene 22, 5636-5645, 2003）より、nSR100遺伝子の抑制によりSCLC細胞のアポトーシスを誘発できること、すなわちnSR100遺伝子の抑制がSCLCの治療に有効であることが示唆された。【０１２９】
実施例4．SCLC細胞の腫瘍形成能と、nSR100遺伝子及びREST遺伝子の発現との関係
SCLC細胞の腫瘍形成能と、nSR100遺伝子及びREST遺伝子の発現との関係を調べた。具体的には次のように行った。【０１３０】
＜4.1．移植用細胞の調製＞
NCI-N417細胞（ヒトSCLC細胞）を実施例2と同様に、細胞外マトリックス上で接着培養した。一方で、実施例2と同様に、浮遊培養したNCI-N417細胞も用意した。なお、培養は7日間行った。【０１３１】
＜4.2．腫瘍形成実験＞
下記4パターンのサンプルを、6週齢のBALB/c Slc-nu/nu胸腺欠損ヌードマウス（雌）に皮下注射した。
（I）0.1 mlの浮遊培養NCI-N417細胞溶液（5×10^5 cells/無血清RPMI培地）
（II）0.1 ml無血清RPMI培地
（III）0.1 mlの接着培養NCI-N417細胞溶液（5×10^5 cells/無血清RPMI培地）
（IV）0.05 mlの浮遊培養NCI-N417細胞溶液（5×10^5 cells/ 無血清RPMI培地）と0.05 mlのマトリゲル（BD biosciences, Lot No.38073）溶液（0.45 mg/Dulbecco’s PBS）との混合溶液
（I）〜（III）を注射したマウスについては注射から60日後に、（IV）を注射したマウスについては注射から46日後に、腫瘍形成の程度を目視で観察した。【０１３２】
＜4.3．定量的リアルタイムPCR＞
上記＜4.2．腫瘍形成実験＞で腫瘍形成を観察した後、腫瘍部分を採取した。採取されたサンプルから、実施例2と同様に定量的リアルタイムPCRを行った。【０１３３】
＜4.4．結果＞
腫瘍形成実験後のマウスの写真を図5Aに示し、形成された腫瘍におけるnSR100 mRNA及びsREST mRNAの発現解析結果を図5Bに示す。図5Aより、浮遊培養したSCLC細胞を注射してもそれ程大きな腫瘍形成は見られなかったが（Iのマウスの左側の中央部）、細胞外マトリックス上で接着培養したSCLC細胞、又は浮遊培養したSCLC細胞とマトリゲルとの混合物を注射すると、Iのマウスによりも大きな腫瘍の形成が見られた（IIIのマウスの左側下部、及びIVのマウスの右側下部）。図5Bより、図5Aで見られた腫瘍形成の程度が小さい場合（N417、AのIに相当）に比べて、腫瘍形成の程度がより大きい場合（N417＋ECL及びN417＋Matrigel、AのIII及びIVに相当）の方が、nSR100 mRNA及びsREST mRNAの発現がより高いことが示された。これらの結果から、SCLCの腫瘍形成能と、nSR100遺伝子の発現及びREST遺伝子のsRESTスプライシングバリアントの発現とが、相関していることが示された。このことより、nSR100遺伝子を抑制することにより、SCLCの腫瘍形成能を抑制できることが示唆された。【０１３４】
実施例5．nSR100遺伝子の抑制によるSCLC細胞特異的アポトーシス誘導
LDH活性を指標として、nSR100遺伝子の抑制によるアポトーシスの有無及びその程度を評価した。具体的には次のように行った。【０１３５】
＜5.1．細胞培養＞
NCI-N417細胞（ヒトSCLC細胞）、又はNCI-H82細胞（ヒトSCLC細胞）を、実施例2と同様に、細胞外マトリックス上で接着培養した。また、NCI-H1650細胞（ヒトNSCLC細胞）を、培養ディッシュ上で接着培養した。【０１３６】
＜5.2．RNAi＞
対数増殖期のNCI-N417細胞、NCI-H82細胞、又はNCI-H1650細胞を、96ウェルプレートに1×10^4 cells/wellになるように播種し、24時間培養した。その後、nSR100遺伝子に対するsiRNA（Dharmacon, SMART-pool siRNAs）を、市販のトランスフェクション試薬（DharmaFECT siRNA Transfection Reagents（Thermo Scientific））を用いて、1ウェルあたり2.5 pmolになるようにトランスフェクションし、72時間培養を続けた。なお、siRNAとしては、siRNA-A（標的配列1（配列番号10）を標的としたsiRNA）、siRNA-B（標的配列2（配列番号11）を標的としたsiRNA）、siRNA-C（標的配列3（配列番号12）を標的としたsiRNA）、siRNA-D（標的配列4（配列番号13）を標的としたsiRNA）、siRNA mix（siRNA-A〜siRNA-Dの等モル混合物）の計5種類を用いた。一方で、siRNAに変えて、抗がん剤であるカンプトテシンを、培地中の濃度が0.63、1.25、2.5、又は3μg/mlになるように添加し、72時間培養を続けた。【０１３７】
＜5.3．LDH活性測定＞
LDH活性測定キット（Takara LDH Cytotoxicity Detection kit、MK401）を用いて、キットの添付文書に記載の方法に従って行った。【０１３８】
＜5.4．結果＞
NCI-N417細胞を用いた場合の結果を図6Aに示し、NCI-H82細胞を用いた場合の結果を図6Bに示し、NCI-H1650細胞を用いた場合の結果を図6Cに示す。図6A及びBより、SCLC細胞においてnSR100遺伝子をsiRNAにより抑制した場合には、抗がん剤として知られるカンプトテシンと同程度、或いはそれ以上のLDH活性が検出された。中でも、siRNAとして、siRNA-mix、siRNA-C、又はsiRNA-Dを用いた場合には、より顕著なLDH活性が検出された。一方、図6Cより、NSCLC細胞においてnSR100遺伝子をsiRNAにより抑制しても、カンプトテシンよりも低いLDH活性しか検出されなかった。以上の結果より、nSR100遺伝子の抑制により、SCLC細胞特異的にアポトーシスを誘導できること、すなわちnSR100遺伝子の抑制がSCLCの治療に有用であることが示唆された。【０１３９】
実施例6．SCLC患者の血液におけるnSR100遺伝子抑制miRNA量の解析
SCLC細胞における各種miRNAの発現を解析した結果、nSR100遺伝子の発現を抑制すると予想されるmiRNA（hsa-miR-4279（配列番号14）、hsa-miR-4419b（配列番号15）、hsa-miR-4516（配列番号16）、及びhsa-miR-4635（配列番号17））の発現量が、正常細胞に比べて、SCLC細胞において減少していることが見出された。このことから、SCLC患者においては、nSR100遺伝子の発現を抑制するmiRNAがSCLC細胞外に排出され、その結果としてSCLC細胞内のnSR100遺伝子の発現量が亢進しているという可能性が考えられた。この仮説が正しければ、SCLC細胞外に排出された上記miRNA量を測定することにより、SCLC診断が可能となる。そこで、この仮説を確かめるために、SCLC患者の血液中の上記miRNA量を解析した。具体的には次のように行った。【０１４０】
＜6.1．血清の調製＞
健常者、SCLC患者、NCLC患者、及び胃癌患者より、血液を採取し、定法に従って血清を調製した。【０１４１】
＜6.2．定量的リアルタイムPCR＞
血清200μlから、RNA抽出キット（Qiagen, miRNeasy Serum/Plasma Kit）を用いて、total RNAを抽出した。各サンプルのRNA抽出時の誤差を抑えるために、miR-39をスパイクインして、標準コントロールとした。total RNA抽出液（14μl）中の2μlを用いて、逆転写反応キット（Qiagen, miScript II RT Kit）により、cDNAを作製した。さらに、該逆転写反応後の試料を鋳型として、リアルタイムPCR反応キット（Qiagen miRNA SYBR Green PCR kit）を用いて、PCR装置（Rotor-Gene Q, Qiagen）中で核酸増幅反応を行った。核酸増幅反応は、95℃ 15分→［（94℃ 15秒→55℃ 30秒→70℃ 30秒）×40サイクル］の温度サイクルで行った。なお、プライマーとしては、各miRNA（hsa-miR-4279（配列番号14）、hsa-miR-4419b（配列番号15）、hsa-miR-4516（配列番号16）、及びhsa-miR-4635（配列番号17））の検出用プライマーとしてQiagen社より市販されているプライマーを用いた。【０１４２】
＜6.3．結果＞
結果を図7に示す。図7の各グラフ中、各黒丸の一つ一つが、それぞれの被験者のデータを示す。図7より、SCLC患者の血中では、nSR100遺伝子の発現を抑制するmiRNA（miR-4279、miR-4419b、miR-4516、及びmiR-4635）量が亢進していた。このことから、SCLC患者においては、nSR100遺伝子の発現を抑制するmiRNAがSCLC細胞外に排出され、その結果としてSCLC細胞内のnSR100遺伝子の発現量が亢進しているという仮説が支持された。また、血中の上記miRNA量を測定することによって、SCLC診断が可能であることも示された。【０１４３】
実施例7．各種がん患者の血液におけるnSR100遺伝子制御因子の発現解析
実施例6の結果（図7）から血中量が最も多かったmiR-4516について、各種がん患者（SCLC、NSCLC、胃癌、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌、健常者）の血液中の量を、実施例６と同様に測定した。【０１４４】
結果を図8に示す。図8中、各バーが、それぞれの被験者のデータを示す。図8より、血液中のmiR-4516量は、各種癌患者の中でも、SCLC患者において亢進する傾向が示された。このことから、血中のmiR-4516量を測定することによって、高い精度でSCLC診断が可能であることが示された。
【図１】
0006467580.tif 000004
【図２】
0006467580.tif 000005
【図３】
0006467580.tif 000006
【図４】
0006467580.tif 000007
【図５】
0006467580.tif 000008
【図６】
0006467580.tif 000009
【図７】
0006467580.tif 000010
【図８】
0006467580.tif 000011
【配列表】
0006467580000001.app