(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１６の残基１０２〜１１５からなる組換えポリペプチド。
【請求項２】
異種配列をさらに含み、Ｇａｌ１に特異的に結合する中和抗Ｇａｌ１抗体を誘導する活性を有する、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
単離されている、請求項１または２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
検出可能な標識に共有結合により連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
担体分子に共有結合されているか、または物体に固定化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
物体が、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、黒鉛粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイおよびキャピラリーチューブからなる群から選択される、請求項５に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする組換え核酸分子。
【請求項８】
前記核酸分子が作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターであってもよい、請求項７に記載の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現するか、請求項７に記載の核酸分子を含むか、または請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクターまたは請求項９に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物。
【請求項１１】
少なくとも１種の追加的な免疫刺激剤をさらに含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
免疫刺激剤が、アジュバントおよび／または免疫チェックポイント阻害剤である、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ａＲおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
哺乳類における中和抗Ｇａｌ１抗体を誘発することができる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
中和抗Ｇａｌ１抗体を同定するための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物からなる群から選択される有効量の薬剤を含む組成物。
【請求項１６】
中和抗Ｇａｌ１抗体を同定する方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物からなる群から選択される有効量の薬剤を、インビトロ細胞培養系におけるＢ細胞に投与して、Ｇａｌ１を中和する抗体を生成することと、
（ｂ）投与された薬剤に特異的な抗Ｇａｌ１抗体を単離することと
を含む方法。
【請求項１７】
Ｇａｌ１に特異的に結合する中和抗Ｇａｌ１抗体を産生する単離されたハイブリドーマを作製する方法であって、
ａ）有効量の薬剤で免疫化された哺乳類から得られた脾細胞または有効量の薬剤と接触させることによって得られたＢ細胞を不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマを形成することと、ここで、前記薬剤は、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物からなる群から選択される、
ｂ）薬剤と特異的に結合する抗Ｇａｌ１抗体の産生に関して個々のハイブリドーマをスクリーニングすることと
を含む方法。
【請求項１８】
対象における抗Ｇａｌ１免疫応答を誘発するための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物からなる群から選択される予防的または治療的有効量の薬剤を含む組成物。
【請求項１９】
薬剤が、単一用量で投与できるか、複数用量で投与できるか、または異種プライム−ブーストレジメンの一部として投与できる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
対象におけるＧａｌ１活性を阻害するための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物からなる群から選択される予防的または治療的有効量の薬剤を含む組成物。
【請求項２１】
Ｇａｌ１活性によって媒介される対象における疾患の発病を予防もしくは遅延させるためまたはその進行速度を遅らせるための組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞および請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物からなる群から選択される予防的または治療的有効量の薬剤を含む組成物。
【請求項２２】
免疫応答を上方調節する少なくとも１種の追加的な薬剤と組み合わせられる、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも１種の追加的な薬剤が、免疫チェックポイントの阻害剤を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ａＲおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
Ｇａｌ１媒介性疾患が、Ｇａｌ１陽性がん、Ｇａｌ１媒介性血管新生障害、ＡＰ１依存性リンパ系悪性腫瘍、ＭＬＬ再編成ＡＬＬ、ＥＢＶ＋移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＤＬ）、上咽頭癌、カポジ肉腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌またはメラノーマである、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
対象が哺乳類である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
哺乳類がヒトである、請求項２６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
糖結合タンパク質の高度に保存されたファミリーのメンバーであるガレクチン−１（Ｇａｌ１）は、ＮまたはＯ結合型グリカンの分枝におけるＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌ−β１−４−ＮＡｃＧｌｃ）残基の特異的な認識により、免疫応答をモジュレートし、腫瘍免疫回避を促す［Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Rabinovich and Croci (2012) Immunity 36:322-335；Rabinovich and Toscano (2009) Nat. Rev Immunol. 9:338-352；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］。
【背景技術】
【０００２】
Ｇａｌ１は、ＣＤ４５、ＣＤ４３およびＣＤ７等、特異的にシアル酸付加（sialated）された細胞表面糖タンパク質と相互作用することにより、細胞傷害性Ｔ細胞ならびにＴヘルパー（Ｔｈ）１およびＴｈ１７細胞のアポトーシスを選択的に誘導する［Toscano et al. (2007) Nat. Immunol. 8:825-834］。Ｔｈ２細胞および調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞は、Ｇａｌ１結合糖タンパク質モチーフを欠くため、Ｇａｌ１は、これらの細胞を温存し、免疫抑制性Ｔｈ２／Ｔｒｅｇが濃縮された腫瘍微小環境を促す［Toscano et al. (2007) Nat. Immunol. 8:825-834］。Ｇａｌ１は、調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の増大化も促進し［Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Toscano et al. (2007) Nat. Immunol. 8:825-834］、Ｇａｌ１−グリカン相互作用は、低酸素に駆動される腫瘍血管新生を増す［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］。
【０００３】
これらの分子機序が、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の促進におけるＧａｌ１の効果の根底にある。ｃＨＬは、北米および欧州で毎年およそ２０，０００名の新たな患者において診断されるＢ細胞悪性腫瘍である；これらの患者のうち＞９０％が若年成人である。ｃＨＬは、広範なＴｈ２／Ｔｒｅｇの歪んだ炎症性浸潤物内に少数の悪性ホジキンリード−シュテルンベルク（ＨＲＳ）細胞を含む［Kueppers et al. (2002) Ann. Oncol. 13:11-18；Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Kueppers (2009) Nat. Rev. Cancer 9:15-27］。ＨＲＳ細胞は、Ｇａｌ１を過剰発現し、Ｇａｌ１は、Ｔｈ１および細胞傷害性Ｔ細胞を選択的に殺傷し、免疫抑制性Ｔｈ２／Ｔｒｅｇ優勢ＨＬ微小環境を促進する［Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139］。ＨＲＳ細胞は、Ｂ細胞受容体媒介性シグナルを欠き、ＮＦ−κＢおよびアクチベータータンパク質１（ＡＰ１）等、転写因子によって活性化される代替的な生存および増殖経路を利用する［Kueppers et al. (2002) Ann. Oncol. 13:11-18；Mathas et al. (2002) EMBO J. 21:4104-4113；Schwering et al. (2003) Mol. Med. 9:85-95］。ｃＨＬにおいて、腫瘍細胞は、構成的ＡＰ１活性化を示し、高レベルのＡＰ１構成成分、ｃＪｕｎおよびＪｕｎ  Ｂを発現し、ＡＰ１媒介性増殖シグナルに依存する［Mathas et al. (2002) EMBO J. 21:4104-4113；Juszczynski et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A. 104:13134-13139；Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3338-3344］。原発性ｃＨＬは、活発な炎症性浸潤を有するが、有効な宿主抗腫瘍免疫応答の証拠は殆どない。反応性Ｔ細胞集団は、免疫応答を直接的に抑制し、免疫攻撃からＨＲＳ細胞を保護する、Ｔｈ２型およびＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞を優勢に含んだ［Re et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:6379-6386；Marshall et al. (2004) Blood 103:1755-1762；Gandhi et al. (2006) Blood 108:2280-2289］。Ｔｈ１ならびにナチュラルキラーおよび細胞傷害性Ｔ細胞は、著しく提示不足である。
【０００４】
原発性ｃＨＬの免疫組織化学的解析におけるＧａｌ１発現の増加は、より不十分な無再発生存期間に関連する［Kamper et al. (2011) Blood 117:6638-6649］。特に、血清Ｇａｌ１レベルの上昇は、ｃＨＬと新たに診断された患者における腫瘍負荷および有害臨床特色に有意に関連する［Ouyang et al. (2013) Blood 121:3431-3433］。さらに、Ｇａｌ１発現は、ＥＢＶ関連の移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）［Gottschalk et al. (2005) Annu. Rev. Med. 56:29-44；Ouyang et al. (2011) Blood 117:4165-4166 and 4315-4322］、ＭＬＬ再編成ＡＬＬ［Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130］およびカポジ肉腫［Tang et al. (2010) Oncol. Rep. 24:495-500］にも関連する。これらの選択された（select）リンパ系悪性腫瘍およびウイルスにより誘導されるがんに加えて、Ｇａｌ１は、乳がん［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、前立腺がん［Dalotto-Moreno et al. (2013) Cancer Res. 73:1107-1117］、肺がん［Laderach et al. (2013) Cancer Res. 73:86-96］、膵がん［Chung et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:4037-4047］、頭頸部扁平上皮癌［Chung et al. (2008) ANZ J. Surg. 78:245-251；Alves et al. (2011) Pathol. Res. Pract. 207:236-40］、肝細胞癌［Le et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:8932-41］、上咽頭癌［Wu et al. (2012) J. Gastroenterol. Hepatol. 27:1312-1319］およびメラノーマ［Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251；Mathieu et al. (2012) J. Invest. Dermatol. 132:2245-2254］を含む多くの固形腫瘍によっても発現される。Ｇａｌ１発現は、上述の固形腫瘍における有害予後マーカーとして同定された。さらに、Ｇａｌ１サイレンシングは、乳がん［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、前立腺がん［Dalotto-Moreno et al. (2013) Cancer Res. 73:1107-1117］、肺がん［Laderach et al. (2013) Cancer Res. 73:86-96］およびメラノーマ［Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］における抗腫瘍効果に関連する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｇａｌ１の広範な免疫抑制活性を考慮すると、これらの結果は、Ｇａｌ１が、Ｇａｌ１によって媒介される多くのがんおよび他の障害における治療法の非常に強力な標的であることを示唆する。上述を踏まえると、依然として本技術分野において、望まれないＧａｌ１活性を有効に中和するための組成物および方法の必要があることが明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、全般的には、中和ガレクチン−１（Ｇａｌ１）剤の生成において予想外に有効な特異的抗Ｇａｌ１エピトープの同定に基づく、Ｇａｌ１機能を中和する抗Ｇａｌ１剤に関する。
【０００７】
一態様において、配列番号１〜１６の残基１０２〜１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、約６０アミノ酸以下の長さの組換えポリペプチドが提供される。一実施形態において、前記ポリペプチドは、１４アミノ酸の長さに等しい。別の実施形態において、前記アミノ酸配列は、配列番号１〜１６のうちいずれか１種の残基１０２〜１１５のアミノ酸配列と同一である。別の実施形態において、前記ポリペプチドは、異種配列をさらに含む。さらに別の実施形態において、ポリペプチドは、単離されている。また別の実施形態において、前記ポリペプチドは、検出可能な標識に共有結合により連結されている。別の実施形態において、前記ポリペプチドは、担体分子に共有結合されているか、または物体（object）（例えば、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、黒鉛粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイおよびキャピラリーチューブからなる群から選択される物体）に固定化されている。
【０００８】
別の態様において、ストリンジェントな条件下で、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドをコードする核酸の相補体とハイブリダイズする配列を有する、または本明細書に記載されている本発明のポリペプチドをコードする核酸と少なくとも約９５％の相同性を有する配列を有する組換え核酸分子であって、ポリペプチドをコードすることのみが必要とされる組換え核酸分子が提供される。
【０００９】
さらに別の態様において、本明細書に記載されている本発明の組換え核酸を含むベクターであって、核酸が作動可能に連結されるプロモーターを含む発現ベクターであってもよいベクターが提供される。
【００１０】
また別の態様において、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドを発現するか、本明細書に記載されている本発明の核酸を含むか、または本明細書に記載されている本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１１】
別の態様において、本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクターまたは本明細書に記載されている本発明の宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む免疫原性組成物が提供される。一実施形態において、本免疫原性組成物は、少なくとも１種の追加的な免疫刺激剤（例えば、アジュバントおよび／または免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含む。さらに別の実施形態において、免疫チェックポイントは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ａＲおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。また別の実施形態において、本免疫原性組成物は、哺乳類において中和抗Ｇａｌ１抗体を誘発することができる。
【００１２】
さらに別の態様において、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドに特異的に結合する、単離された中和抗Ｇａｌ１抗体またはその抗原結合部分が提供される。一実施形態において、本抗体またはその抗原結合部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、抗体断片、複合、マウス、ヒトであるか、または検出可能に標識されている。別の実施形態において、本抗体またはその抗原結合断片は、検出可能に標識され、エフェクタードメインを含み、Ｆｃドメインを含み、かつ／またはＦｖ、Ｆａｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディ断片からなる群から選択される。
【００１３】
また別の態様において、中和抗Ｇａｌ１抗体を同定する方法であって、（ａ）本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクター、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞または本明細書に記載されている本発明の免疫原性組成物からなる群から選択される有効量の薬剤を対象に投与して、Ｇａｌ１を中和する抗体を生成することと、（ｂ）投与された薬剤に特異的な抗Ｇａｌ１抗体を単離することとを含む方法が提供される。
【００１４】
別の態様において、中和抗Ｇａｌ１抗体を同定する方法であって、（ａ）本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクター、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞または本明細書に記載されている本発明の免疫原性組成物からなる群から選択される有効量の薬剤を、インビトロ（in vitro）細胞培養系におけるＢ細胞に投与して、Ｇａｌ１を中和する抗体を生成することと、（ｂ）投与された薬剤に特異的な抗Ｇａｌ１抗体を単離することとを含む方法が提供される。
【００１５】
さらに別の態様において、Ｇａｌ１に特異的に結合する中和抗Ｇａｌ１抗体を産生する単離されたハイブリドーマを作製する方法であって、ａ）本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクター、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞または本明細書に記載されている本発明の免疫原性組成物からなる群から選択される有効量の薬剤で哺乳類を免疫化すること、またはそれとＢ細胞とを接触させることと、ｂ）免疫化された哺乳類から脾細胞を単離してもよいことと、ｃ）免疫化された哺乳類から得た脾細胞またはＢ細胞を不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマを形成することと、ｄ）薬剤に特異的に結合する抗Ｇａｌ１抗体の産生に関して個々のハイブリドーマをスクリーニングすることとを含む方法が提供される。
【００１６】
また別の態様において、本明細書に記載されている本発明の方法によって産生された抗体が提供される。
【００１７】
別の態様において、対象における抗Ｇａｌ１免疫応答を誘発する方法であって、本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクター、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞、本明細書に記載されている本発明の免疫原性組成物または本明細書に記載されている本発明の抗体からなる群から選択される予防的または治療的有効量の薬剤を対象に投与して、これにより免疫応答を誘発することを含む方法が提供される。一実施形態において、薬剤は、単一用量で投与されるか、複数用量で投与されるか、または異種プライム−ブーストレジメンの一部として投与される。
【００１８】
さらに別の態様において、対象におけるＧａｌ１活性を阻害する方法であって、本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクター、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞、本明細書に記載されている本発明の免疫原性組成物または本明細書に記載されている本発明の抗体からなる群から選択される予防的または治療的有効量の薬剤を対象に投与して、これにより対象におけるＧａｌ１活性を阻害することを含む方法が提供される。
【００１９】
また別の態様において、Ｇａｌ１活性によって媒介される対象における疾患の発病を予防もしくは遅延させるためまたはその進行速度を遅らせるための方法であって、本明細書に記載されている本発明のポリペプチド、本明細書に記載されている本発明の核酸、本明細書に記載されている本発明のベクター、本明細書に記載されている本発明の宿主細胞、本明細書に記載されている本発明の免疫原性組成物または本明細書に記載されている本発明の抗体からなる群から選択される予防的または治療的有効量の薬剤を対象に投与して、これにより対象におけるＧａｌ１媒介性疾患の発病を予防もしくは遅延させるかまたはその進行速度を遅らせることを含む方法が提供される。
【００２０】
ある特定の実施形態は、本明細書に記載されている本発明のいかなる方法に適用することもできる。例えば、方法は、免疫応答を上方調節する少なくとも１種の追加的な薬剤を投与することをさらに含むことができる。別の実施形態において、少なくとも１種の追加的な薬剤は、免疫チェックポイントの阻害剤を含む。さらに別の実施形態において、免疫チェックポイントは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ａＲおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される。また別の実施形態において、Ｇａｌ１媒介性疾患は、Ｇａｌ１陽性がん、Ｇａｌ１媒介性血管新生障害、ＡＰ１依存性リンパ系悪性腫瘍、ＭＬＬ再編成ＡＬＬ、ＥＢＶ＋移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＤＬ）、上咽頭癌、カポジ肉腫、乳がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、頭頸部扁平上皮癌、肝細胞癌およびメラノーマである。別の実施形態において、対象は、哺乳類である。さらに別の実施形態において、哺乳類は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ウエスタンブロット（ＷＢ）により、内在性ヒトおよびマウスＧａｌ１における抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体、８Ａ１２の交差反応性を示す。ヒトホジキンリンパ腫系統、Ｌ４２８およびマウスメラノーマ系統、Ｂ１６−Ｆ１０に由来する細胞ライセートのＷＢ解析。異なるタイトレーションの８Ａ１２によりライセートを探索したところ、Ｇａｌ１の特異的なバンド（ほぼ１４ｋＤａ）を示した。８Ａ１２は、同様の範囲の力価で内在性ヒトおよびマウスＧａｌ１を認識する。
【図２】図２は、組換えＧＳＴタグ付きまたはＨＩＳタグ付きのヒトＧａｌ１（ｈＧａｌ１）および断片の概略図を示す。
【図３】図３は、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴにより調製された、２個のラクトース分子とホモ二量体ｈＧａｌ１のリボン図を示す。５ストランド（Ｆ１〜Ｆ５）および６ストランド（Ｓ１〜Ｓ６ａ／Ｓ６ｂ）のβシートにおけるβストランドを文字−数字コードで示す。本図は、Lopez-Lucendo et al. (2004) J. Mol. Biol. 343:957-970から適応させた。
【図４】図４は、８Ｆ４  ｍＡｂの微細エピトープマッピングの結果を示す。
【図５】図５は、８Ｆ４  ｍＡｂの微細エピトープマッピング結果を要約する概略図を示す。
【図６】図６は、８Ｆ４  ｍＡｂのＢＩＡｃｏｒｅ解析の結果を示す。
【図７】図７は、８Ｆ４  ｍＡｂが結合するエピトープの周囲およびこれを含む領域における、マウスＧａｌ１（ｍＧａｌ１）およびｈＧａｌ１の間の配列比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、一部には、それに対する抗ガレクチン１（Ｇａｌ１）剤がＧａｌ１機能を中和することができるＧａｌ１エピトープ、ならびにＧａｌ１機能の中和に有用な抗Ｇａｌ１剤および方法の発見に基づく。
【００２３】
Ｉ．定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において用いられる場合、この冠詞の文法上の目的語の１個または２個以上（即ち、少なくとも１個）を指すように用いられる。例として、「要素（an element）」は、１個の要素または２個以上の要素を意味する。
【００２４】
用語「アジュバント」は、タンパク質および核酸等、抗原の免疫原性の増強に適したいずれかの薬剤を指す。タンパク質に基づく免疫原による使用に適したアジュバントは、本技術分野において周知であり、その例として、ミョウバン、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ２１、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）およびＬ−１２１等の非イオン性ブロックコポリマー［プルロニック（Pluronic）；Ｓｙｎｔｅｘ  ＳＡＦ］が挙げられるがこれらに限定されない。アジュバントを抗原と組み合わせる方法は、当業者に周知である。アジュバントは、粒子状形態とすることもできる。抗原は、ポリ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ）または同様のポリマー材料で構成された生分解性粒子に取り込むことができる。かかる生分解性粒子は、免疫原の徐放をもたらし、これにより該免疫原に対する長続きする免疫応答を刺激することが公知である。他の粒子状アジュバントとして、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭ）として公知のＱｕｉｌ  Ａおよびコレステロールのミセル状混合物ならびに酸化アルミニウムまたは鉄ビーズが挙げられるがこれらに限定されない。タンパク質に基づく免疫原が、ＩＳＣＯＭおよびミクロンサイズのポリマーまたは金属酸化物粒子等、適切なアジュバントと共に製剤化および投与されると、細胞傷害性Ｔリンパ球および他の細胞性免疫応答が誘発されることも当業者に公知である。核酸に基づくワクチンに適したアジュバントとして、Ｑｕｉｌ  Ａ、精製タンパク質または核酸形態でデリバリーされるインターロイキン−１２、ＣｐＧ含有モチーフ等の短い細菌免疫刺激性ヌクレオチド配列、精製タンパク質または核酸形態でデリバリーされるインターロイキン−２／Ｉｇ融合タンパク質、ＭＦ５９等の水中油型マイクロエマルション、ポリマー微粒子、カチオン性リポソーム、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ウベニメクス等の免疫調節物質、ならびにＥ．コリ（E. coli）熱不安定性毒素およびビブリオ属（Vibrio）由来のコレラ毒素等の遺伝学的に解毒された毒素が挙げられるがこれらに限定されない。かかるアジュバントおよびアジュバントを抗原と組み合わせる方法は、当業者に周知である。加えて、抗原および粒子状アジュバントを組み合わせるための方法は、当業者に周知である。
【００２５】
用語「Ｇａｌ１媒介性障害」は、異常さもなければ望まれないＧａｌ１発現によって特徴付けられるいずれかの状態を指す。例示的なＧａｌ１媒介性障害は、がん、血管新生、低酸素関連の血管新生および移植後リンパ増殖性障害を限定することなく含む。ガレクチン−１（Ｇａｌ１）タンパク質発現および転写物存在量は、高度に相関する［Juszczynski et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:13134-13139；Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322およびBlood (2011) 4317:4165-4166における付随論説］。Ｇａｌ１は、選択されるリンパ系悪性腫瘍、ウイルスにより誘導されるがんおよび多くの固形腫瘍を含む複数の腫瘍型によって発現される。
【００２６】
例えば、リンパ系悪性腫瘍として、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）および未分化大細胞リンパ腫等、ＡＰ１依存性リンパ系悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない［Juszczynski et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104:13134-13139；Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res. 14:3338-3344］。Ｇａｌ１は、ｃＨＬにおける予後マーカーである［Kamper et al. (2011) Blood 117:6638-6649］。Ｇａｌ１は、ＭＬＬ再編成ＡＬＬも媒介する。網羅的研究において、全３２例の原発性ＭＬＬ再編成ＡＬＬが、転位置パートナーに関係なくＧａｌ１＋であった一方、２／８１例の生殖系列ＭＬＬ  ＡＬＬのみが、Ｇａｌ１を発現した［Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130］。ＭＬＬ再編成ＡＬＬは、異なる治療を必要とする予後不良疾患である［Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130］。
【００２７】
Ｇａｌ１媒介性のウイルスにより誘導される悪性腫瘍として、ＥＢＶ＋移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322およびBlood (2011) 4317:4165-4166における付随論説］、上咽頭癌［Tang et al. (2010) Oncol. Rep. 24:495-500］およびカポジ肉腫［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
Ｇａｌ１媒介性固形腫瘍（turmos）として、乳がん［Dalotto-Moreno et al. (2013) Cancer Res. 73:1107-1117］、前立腺がん［Laderach et al. (2013) Cancer Res. 73:86-96］、肺がん［Chung et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:4037-4047］、膵がん［Chung et al. (2008) ANZ J. Surg. 78:245-251］、頭頸部扁平上皮癌［Alves et al. (2011) Pathol. Res. Pract. 207:236-240；Le et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:8932-8941］、肝細胞癌［Wu et al. (2012) J. Gastroenterol. Hepatol. 27:1312-1319］およびメラノーマ［Mathieu et al. (2012) J. Invest. Dermatol. 132:2245-2254；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］が挙げられるがこれらに限定されない。Ｇａｌ１発現は、上述の固形腫瘍の全てにおける有害予後マーカーでもあり、Ｇａｌ１サイレンシングは、乳［Dalotto-Moreno et al. (2013) Cancer Res. 73:1107-1117］、前立腺［Laderach et al. (2013) Cancer Res. 73:86-96］および肺［Chung et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:4037-4047］がんならびにメラノーマ［Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］における抗腫瘍効果に関連する。さらに、Ｇａｌ１転写物は、複数種類のがんにおいて増加する。
【００２９】
用語「血管新生」または「新血管新生」は、先在する血管から新たな血管が発生するプロセスを指す［Varner et al. (1999) Angiogen. 3:53-60；Mousa et al. (2000) Angiogen. Stim. Inhib. 35:42-44；Kim et al. (2000) Amer. J. Path. 156:1345-1362；Kim et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:33920-33928；Kumar et al. (2000) Angiogenesis: From Molecular to Integrative Pharm. 169-180］。先在する血管または循環する内皮幹細胞［Takahashi et al. (1995) Nat. Med. 5:434-438；Isner et al. (1999) J. Clin. Invest. 103:1231-1236］由来の内皮細胞は、成長因子もしくはホルモンによる合図または低酸素もしくは虚血状態に応答して、遊走、増殖および管腔を有する構造へと分化するよう活性化され、新たな血管を形成するようになる。がんにおいて生じるような、虚血の際に、酸素負荷および栄養素のデリバリーを増加させる必要は、罹患組織による血管新生因子の分泌を明らかに誘導する；これらの因子は、新たな血管形成を刺激する。いくつかの追加的な用語が、血管新生に関係する。
【００３０】
例えば、用語「血管新生を示す組織」は、先在する血管から新たな血管が発生している組織を指す。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、用語「血管新生の阻害」、「血管新生の縮小」、「血管新生の低下」およびこれらの文法上の均等物は、対応する対照組織における含量の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以下の含量となるような、組織における血管新生のレベルの低下を指し、最も好ましくは、対照組織において観察されるものと同じレベルである。血管新生のレベル低下は、血管新生の絶対的非存在を意味する必要はないが、そうであってもよい。本発明は、血管新生を全面的に排除する方法を必要とせず、これに限定されない。血管新生のレベルは、本技術分野において周知の方法を用いて決定することができ、方法は、本明細書および実施例に記述されている通り、血管の数および／または血管枝分かれ部位の数の計数を限定することなく含む。企図される代替的インビトロアッセイは、細胞レベルでの新たな血管の成長を示す管状コード形成アッセイを含む［D. S. Grant et al., Cell, 58: 933-943 (1989)］。本技術分野に許容される（Art-accepted）インビボ（in vivo）アッセイも公知であり、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギその他等、様々な試験動物の使用に関与する。これらのインビボアッセイは、正常および新生物組織の両方における抗血管新生活性の提示に適したニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイを含む［Ausprunk (1975) Amer. J. Path. 79:597-610およびOssonowski and Reich (1980) Cancer Res. 30:2300-2309］。他のインビボアッセイは、ある特定のマウスにおける移植された腫瘍の成長速度を低下させる、またはがんの素因があるもしくは化学的に誘導されたがんを発現するマウスにおける腫瘍もしくは新生物発生前細胞の形成を阻害する化合物の能力を示す、マウス転移アッセイを含む［Humphries et al. (1986) Science 233:467-470およびHumphries et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:782-790］。さらに、一部の実施形態において、血管新生は、本明細書にさらに記載されている通り、周皮細胞成熟化および血管リモデリング等の性状に従って測定することができる。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、用語「低酸素関連の血管新生」または「低酸素誘導性血管新生」は、非新生物疾患状態における病理学的血管新生のプロセスを一般に指し、典型的には、新生物状態への移行を伴うが、必ずしもそうである必要はない。低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ）は、ＨＩＦ−１ｚｌｐｈａ、ＶＥＧＦ、一酸化窒素シンターゼ、ＰＤＦＧ、Ａｎｇ２その他を含む血管新生因子の発現を誘導する。結果として、低酸素関連の血管新生は、かかるプロセスによって特徴付けられる病理学的状態の周知セットを包含する［Pugh et al. (2003) Nat Med 9, 677-684；Fraisl et al. (2009) Dev Cell 16, 167-179；Ferrara et al. (2005) Nature 438, 967-974；Ferrara (2010) Cytokine Growth Factor Rev 21, 21-26］。一部の実施形態において、低酸素関連血管新生病理のセットとして、新生物およびがん、加齢黄斑変性、糖尿病、網膜症、粥状動脈硬化、慢性閉塞性肺疾患ならびに乾癬が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
本明細書に他に特記されていなければ、用語「抗体（単数）」および「抗体（複数）」は、天然起源型の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）ならびに単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体および多特異性抗体等の組換え抗体と共に、前述全ての断片および誘導体であって、少なくとも抗原結合部位を有する断片および誘導体を広範に包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質または化学的部分を含むことができる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖またはそれらの抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨと省略）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬと省略）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１個のドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名されるより保存された領域が散りばめられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名される超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。「不活性化抗体」は、補体系を誘導しない抗体を指す。
【００３４】
用語「抗体」は、本明細書において用いられる場合、抗体の「抗原結合部分」（または単純に「抗体部分」）も含む。用語「抗原結合部分」は、本明細書において用いられる場合、抗原（例えば、Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１種または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能が、全長抗体の断片によって実行され得ることが示された。抗体の用語「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体単腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片［Ward et al., (1989) Nature 341:544-546］；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらのドメインを、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価ポリペプチドを形成した単一のタンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結することができる［単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；およびOsbourn et al. 1998, Nature Biotechnology 16: 778を参照］。かかる単鎖抗体も、抗体の用語「抗原結合部分」内に包含されることを目的とする。完全ＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的ｓｃＦｖのいかなるＶＨおよびＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結することもできる。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖまたは他の断片の生成において用いることもできる。ダイアボディ等、他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、二価、二重特異性抗体であり、この抗体においては、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖において発現されるが、同じ鎖における該２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を形成する［例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照］。
【００３５】
さらにまた、抗体またはその抗原結合部分は、１種または複数の他のタンパク質またはペプチドと抗体または抗体部分との共有結合または非共有結合による会合によって形成された、より大型の免疫接着ポリペプチドの一部となり得る。かかる免疫接着ポリペプチドの例として、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用［Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101］と、二価およびビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用［Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058］が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片等、抗体部分は、抗体全体のそれぞれパパインまたはペプシン消化等、従来技法を用いて抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着ポリペプチドは、本明細書に記載されている通り、標準組換えＤＮＡ技法を用いて得ることができる。
【００３６】
抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル；異種間、同種異系間もしくは同系間；またはこれらの修飾型（例えば、ヒト化、キメラ等）であり得る。抗体は、完全にヒトとすることもできる。一実施形態において、本発明の抗体は、Ｇａｌ１ポリペプチドまたはその断片に特異的にまたは実質的に特異的に結合する。用語「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において用いられる場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のうち１種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指す一方、用語「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位のうち複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を表示する。
【００３７】
用語「体液」は、身体から排泄または分泌される流体と共に、正常には排泄または分泌されない流体を指す［例えば、羊水、眼房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳あか、カウパー腺液または尿道球腺液、乳糜、粥状液、糞便、膣液、間質液、細胞内液、リンパ液、月経、母乳、粘液、胸水、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙液、尿、膣潤滑、硝子体液、嘔吐物］。
【００３８】
用語「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖障害」は、制御不能な増殖、不死性、転移能、急速成長および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態学的特色等、がん原因細胞に典型的な特徴を保持する細胞の存在を指す。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、かかる細胞は、動物内に単独で存在することができる、あるいは白血病細胞等、非腫瘍原性がん細胞となることができる。がんとして、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病およびミュー鎖病等の重鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、および免疫細胞アミロイドーシス、メラノーマ、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんその他が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３９】
用語「ＣＤＲ」およびその複数形「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）を指し、そのうち３個が軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）、３個が重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体分子の機能活性に寄与し、足場またはフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によってそれぞれ離間される。正確な定義的ＣＤＲ境界および長さは、異なる分類およびナンバリング方式に付される。ＣＤＲは、したがって、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触または他のいずれかの境界定義によって参照することができる。異なる境界にもかかわらず、これらの方式はそれぞれ、可変配列内のいわゆる「高頻度可変領域」を構成する部分にある程度の重複を有する。これらの方式に従ったＣＤＲ定義は、したがって、長さおよび隣接フレームワーク領域に関する境界区域が異なる場合がある。例えば、Kabat、Chothiaおよび／またはMacCallum et al.［それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kabat et al., in “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, 1992；Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196, 901；およびMacCallum et al., J. Mol. Biol. (1996) 262, 732］を参照されたい。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、用語「コード領域」は、アミノ酸残基へと翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す一方、用語「非コード領域」は、アミノ酸へと翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す（例えば、５’および３’非翻訳領域）。
【００４１】
「相補的」は、２本の核酸ストランドの領域の間のまたは同じ核酸ストランドの２領域の間の配列相補性の広い概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と、この残基がチミンまたはウラシルである場合、特異的水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることが公知である。同様に、第１の核酸ストランドのシトシン残基は、第１のストランドと逆平行である第２の核酸ストランドの残基と、この残基がグアニンである場合、塩基対形成することができることが公知である。第１の領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基が、第２の領域の残基と塩基対形成することができるのであれば、該２領域が逆平行様式で配置されている場合、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。一実施形態において、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１および第２の部分が逆平行様式で配置される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。別の実施形態において、第１の部分の全ヌクレオチド残基は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。
【００４２】
本明細書において用いられる場合、用語「複合抗体」は、２種以上の無関係の可変領域由来の生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列を含む可変領域を有する抗体を指す。その上、用語「複合ヒト抗体」は、ヒト生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域および２種以上の無関係のヒト可変領域由来のヒト生殖系列または非生殖系列配列を含む可変領域を有する抗体を指す。複合ヒト抗体は、人体における複合ヒト抗体の抗原性が低下されるため、本発明に係る治療剤における有効構成成分として有用である。
【００４３】
用語「有効量」は、所望の結果の達成に十分な量を指す。例えば、「予防的有効量」は、障害が発生する見込みの低下に十分な量を指す。加えて、「治療的有効量」は、障害の進行を遅らせる、停止または反転するのに有効な量を指す。
【００４４】
本明細書において用いられる場合、用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように用いられる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０におけるアミノ酸残基からそのカルボキシル末端へと伸びるものと定義される。本発明の抗体における使用のための適したネイティブ配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について記載する。好まれるＦｃＲは、ネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好まれるＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲであり（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する［M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照。ＦｃＲはRavetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)に概説がある］。将来的に同定されるＦｃＲを含む他のＦｃＲは、本明細書において用語「ＦｃＲ」に包含される。
【００４６】
分子の実質的な画分が基質から解離することなく、流体（例えば、標準生理食塩水クエン酸塩、ｐＨ７．４）で基質をリンスできるように、分子が基質に共有結合または非共有結合により会合される場合、分子は、基質に「固定」または「添加」される。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４８】
「機能保存的変異体」は、ポリペプチドの全体的な立体構造および機能を変更することなく、タンパク質または酵素における所定のアミノ酸残基が変化された変異体であり、その例として、同様の性質（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族その他等）を有するアミノ酸によるアミノ酸の置き換え等が挙げられるがこれに限定されない。保存されたと示されるアミノ酸以外のアミノ酸は、同様の機能のいずれか２種のタンパク質間のパーセントタンパク質またはアミノ酸配列類似性が変動し得るように、タンパク質において異なることができ、例えば、類似性がＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくＣｌｕｓｔｅｒ方法による等、アライメントスキームに従って決定される７０％〜９９％となり得る。「機能保存的変異体」は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定される少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％アミノ酸同一性を有し、これが比較されるネイティブまたは親タンパク質と同じまたは実質的に同様の性質または機能を有するポリペプチドも含む。
【００４９】
本明細書において用いられる場合、用語「異種抗体」は、かかる抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関して定義される。この用語は、該トランスジェニック非ヒト動物からなるものではない生物において見出される配列に対応するアミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を指し、一般に、該トランスジェニック非ヒト動物の種以外の種に由来する。
【００５０】
「相同」は、本明細書において用いられる場合、同じ核酸ストランドの２領域の間のまたは２種の異なる核酸ストランドの領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域におけるヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基によって占有される場合、該領域同士は該位置において相同である。各領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基の位置が、同じ残基によって占有される場合、第１の領域は、第２の領域と相同である。２領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有される該２領域のヌクレオチド残基の位置の比率の観点から表現される。例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域と、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、該部分のそれぞれのヌクレオチド残基の位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基によって占有される。より好ましくは、該部分のそれぞれの全ヌクレオチド残基の位置は、同じヌクレオチド残基によって占有される。
【００５１】
本明細書において用いられる場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクター等、本発明の核酸が導入された細胞を指すことを目的とする。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において互換的に用いられる。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の後代または潜在的な後代も指すことを理解されたい。ある特定の修飾が、続く世代において突然変異または環境的影響のいずれかにより生じ得るため、かかる後代は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、依然として、本明細書におけるこの用語の範囲内に含まれる。
【００５２】
用語「ヒト化抗体」は、本明細書において用いられる場合、ヒト細胞によって作製されるより密接に似ている抗体に変更された、可変および定常領域を有する非ヒト細胞によって作製された抗体を含むことを目的とする。例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列において見出されるアミノ酸を取り込むように非ヒト抗体アミノ酸配列を変更することによる。本発明のヒト化抗体は、例えばＣＤＲにおいて、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異）。用語「ヒト化抗体」は、本明細書において用いられる場合、マウス等、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体も含む。
【００５３】
本明細書において用いられる場合、用語「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、配列が高頻度可変であるおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６種のＨＶＲを含む；ＶＨにおける３種（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬにおける３種（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ネイティブ抗体において、Ｈ３およびＬ３は、６種のＨＶＲのうち最大の多様性を表示し、Ｈ３は、特に、抗体に対する細密な特異性の付与において特有の役割を果たすと考えられる。例えば、Xu et al. (2000) Immunity 13, 37-45；Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248, 1-25［Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2003)］を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然起源のラクダ科動物抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定的である［例えば、Hamers-Casterman et al. (1993) Nature 363:446-448 (1993)およびSheriff et al. (1996) Nature Struct. Biol. 3, 733-736を参照］。
【００５４】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫細胞」は、免疫応答における役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血性起源のものであり、Ｂ細胞およびＴ細胞等、リンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球等、骨髄系細胞を含む。
【００５５】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫チェックポイント」は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞表面における分子の群を意味する。これらの分子は、抗腫瘍免疫応答を下方にモジュレートするまたは阻害することにより免疫応答を微調整する。免疫チェックポイントタンパク質は、本技術分野において周知であり、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡおよびＡ２ａＲ（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照）を限定することなく含む。本発明の方法において有用な免疫チェックポイント阻害剤として作用し得る免疫療法剤として、いずれか１種または複数の免疫チェックポイントのための遮断抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫障害」は、免疫疾患、状態およびその素因を含み、ホジキンリンパ腫（例えば、リンパ球リッチ古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型古典的ホジキンリンパ腫、リンパ球枯渇古典的ホジキンリンパ腫、結節硬化型古典的ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫またはＭＬＬ＋プレＢ細胞ＡＬＬを含む）、がん、慢性炎症性疾患および障害（例えば、クローン病、炎症性腸疾患、反応性関節炎およびライム病を含む）、インスリン依存性糖尿病、臓器特異的自己免疫（例えば、多発性硬化症、橋本病甲状腺炎、自己免疫性ぶどう膜炎およびグレーブス病を含む）、接触皮膚炎、乾癬、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、サルコイドーシス、アトピー性状態（例えば、喘息およびアレルギーを含み、アレルギー性鼻炎および食物アレルギー等の胃腸管アレルギー等が挙げられるがこれらに限定されない）、好酸球増加症、結膜炎、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、寄生虫（例えば、リーシュマニア症を含む）等のある特定の病原体感受性、ならびにある特定のウイルス感染症（例えば、ＨＩＶならびに結核およびらい腫性ハンセン病等の細菌感染症を含む）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５７】
本明細書において用いられる場合、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞傷害性活性を含む。加えて、用語、免疫応答は、Ｔ細胞活性化によって間接的にもたらされる免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。
【００５８】
用語「免疫化」は、対象において抗原に対する免疫応答を生じることを指す。これは、例えば、対象において免疫原に対する免疫応答を生じることができるように、対象に免疫原の一次用量を投与し、続いて適した期間の後に、免疫原の１回または複数のその後の投与を行うことにより達成することができる。免疫原の投与の間の適した期間は、当業者によって容易に決定することができ、通常、数週間から数ヶ月間のオーダーである。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、用語「阻害」または「中和」は、例えば、特定の作用、機能または相互作用の減少、限定または遮断を含む。例えば、免疫機能等、疾患の少なくとも１種の症状が、望ましい様式でモジュレートされる場合、Ｇａｌ１媒介性感染または疾患は、「阻害」される。本明細書において用いられる場合、疾患症状の再発が、低下される、遅らされる、遅延されるまたは予防される場合、Ｇａｌ１媒介性感染または疾患は、同様に「阻害」される。例えば、Ｇａｌ１媒介性活性は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上減少され得る。用語「促進」は、一部の実施形態において、「阻害」とは正確に反対の様式で用いることができる。
【００６０】
本明細書において用いられる場合、用語「相互作用」は、２分子間の相互作用を指す場合、分子同士の物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、かかる相互作用は、前記分子の一方または両方の活性をもたらす（生物学的効果を産生する）。活性は、分子の一方または両方の直接的な活性となり得る（例えば、シグナル伝達）。あるいは、相互作用において一方または両方の分子は、そのリガンドとの結合を防ぐことができ、これにより、リガンド結合活性に関して不活性に保持することができる（例えば、そのリガンドに結合して、免疫応答を誘発または阻害）。かかる相互作用を阻害することは、該相互作用に関与する１種または複数の分子の活性の破壊をもたらす。かかる相互作用を増強することは、前記物理的接触の見込みを延長または増加させることであり、前記活性の見込みを延長または増加させることである。
【００６１】
本明細書において用いられる場合、用語「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ヒトＧａｌ１に特異的に結合する、Ｇａｌ１に結合しない抗体を実質的に含まない単離された抗体）を指すことを目的とする。しかし、ヒトＧａｌ１のエピトープに特異的に結合する単離された抗体は、それぞれ異なる種に由来する他のＧａｌ１タンパク質に対し交差反応性を有することができる。しかし、一部の実施形態において、抗体は、ヒトＧａｌ１に対しより高い親和性および選択性を維持する。加えて、単離された抗体は、典型的には、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。本発明の一実施形態において、ヒトＧａｌ１に対し異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは、十分に定義された組成物において組み合わされる。
【００６２】
本明細書において用いられる場合、「単離されたタンパク質」は、細胞から単離されるまたは組換えＤＮＡ技法によって産生される場合は、他のタンパク質、細胞材料、分離培地および培養培地、または化学的に合成される場合は、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的活性部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質が由来する細胞または組織供給源由来の細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まない、あるいは化学的に合成される場合は化学的前駆物質または他の化学物質が実質的にない。言語「細胞材料を実質的に含まない」は、これが単離されたまたは組換えにより産生された細胞の細胞構成成分からタンパク質が分離された、標的ポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）またはその断片の調製物を含む。一実施形態において、言語「細胞材料を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量で）の非標的タンパク質（本明細書において、「混入タンパク質」とも称される）、より好ましくは、約２０％未満の非標的タンパク質、さらにより好ましくは、約１０％未満の非標的タンパク質、最も好ましくは、約５％未満の非標的タンパク質を有する標的タンパク質またはその断片の調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質またはこれらの断片、例えば、これらの生物学的活性断片が、組換えにより産生される場合、これはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まない、即ち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、最も好ましくは、約５％未満を表す。
【００６３】
本明細書において用いられる場合、用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【００６４】
本明細書において用いられる場合、用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことを目的とする。本開示発明の抗体の結合親和性は、標準抗体−抗原アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡ等、競合的アッセイ、飽和アッセイまたは標準イムノアッセイによって測定または決定することができる。
【００６５】
本明細書において用いられる場合、「キット」は、少なくとも１種の試薬、例えば、本発明のマーカーの発現を特異的に検出またはモジュレートするためのプローブを含むいずれかの製造物（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を実施するための単位として宣伝、流通または販売することができる。
【００６６】
用語「標識」または「標識された」は、ポリペプチド等、分子への検出可能マーカーの、共有結合によるものであっても非共有結合によるものであってもよい取り込みまたは取り付けを指す。ポリペプチドを標識する様々な方法は、本技術分野において公知のものであり、用いることができる。ポリペプチドの標識の例として、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位元素、蛍光標識、重原子、酵素標識またはレポーター遺伝子、化学発光基、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。かかる標識の例および使用については、より詳細に後述する。一部の実施形態において、標識は、立体障害の可能性を低下させるために、様々な長さのスペーサー腕によって取り付けられる。
【００６７】
本明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープに対し単一の結合特異性および親和性を表示する抗体を指す。したがって、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を表示し、ヒト生殖系列または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００６８】
用語「実質的に変更されない」、「実質的にモジュレートされない」その他は、他に規定がなければ、参照対照と比較した、測定された性状の最小の逸脱を指す。逸脱は、定量的または定性的手段に従って測定することができる。一実施形態において、性状の変更は、対照と比べて３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、１％以下未満異なる（例えば、残基間の差、進入角、抗体結合の親和性等）。
【００６９】
「移植後リンパ増殖性障害」、「ＰＴＬＤ」および／または「ウイルス関連ＰＴＬＤ」はそれぞれ、リンパ組織（例えば、リンパ節、脾臓および／または胸腺）において産生される白血球細胞であるリンパ球が、過剰産生されるまたは異常に作用する障害を指し、ウイルスに起因するまたはそれと相関する。リンパ系細胞は、例えば、胸腺由来リンパ球（Ｔ細胞）；骨髄由来リンパ球（Ｂ細胞）およびナチュラルキラー（ＮＫ細胞）を含む。リンパ球は、増殖、活性化および成熟化を含む、多数の異なるステージを進行し、リンパ腫または異常増殖は、各ステージにおいて発生し得る。障害は、ＩＦＮ−．ガンマに関連する悪性新生物を含む、悪性新生物となり得る（高悪性度もしくは低悪性度として、または低、中等度もしくは高グレードとして分類され得る）、あるいはこの障害は、リンパ系細胞の非悪性異常増大化に関与し得る。ＬＰＤは、治療なしでは解決しない、および／または拡張、モノクローナル、ポリクローナルもしくはオリゴクローナル、リンパ系新生物等、過剰な細胞増殖に関与するいずれかのモノクローナルまたはポリクローナルＬＰＤを含む。細胞増殖は、正常よりも急速なものとなることができ、新たな成長終止を惹起した刺激後に続けることができる。新生物は、正常組織との構造的組織化および機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、良性（良性腫瘍）または悪性（がん）のいずれかとなり得る別個の組織塊を形成することができる。
【００７０】
かかるウイルス関連ＰＴＬＤは、例えば、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヘルペスウイルス、ＨＨＶ−８、サイトメガロウイルス、Ｃ型レトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス１型（Ｃ型レトロウイルス）および／またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）に起因または関連し得る。ＨＩＶおよび／またはＡＩＤＳ関連がんは、カポジ（Karposi）肉腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＨＴＬＶ−１＋）およびＡＩＤＳ関連リンパ腫等、ＨＩＶ関連ＬＰＤを含む。ＡＩＤＳ患者、臓器移植レシピエントおよび遺伝的免疫障害における等、免疫欠損は、例えば、潜在性ＥＢＶを反応性にし、異常リンパ球の増殖を引き起こし、ＥＢＶ関連ＬＰＤを発症する潜在力をもたらし得る。ＰＴＬＤに関与する細胞等、異常細胞におけるウイルスまたはウイルス感染の存在を検出する方法は、本技術分野において公知である。ウイルス核酸またはポリペプチドは、例えば、異常細胞等、細胞、組織または生物において検出することができる。また、ウイルスに特異的な免疫応答を検出する方法が公知である。トランスビボ（trans vivo）遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイ等、ＤＴＨアッセイを用いて、例えば、調節性Ｔ細胞を検出することができる。かかるアッセイにおいて、ヒトまたは他の哺乳類末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、例えば、ウイルス抗原ありおよびなしの担体対照と混合し、ナイーブマウスの耳介または足蹠等、異種ナイーブレシピエントに注射することができる。ＰＢＭＣのドナーが、負荷抗原に以前に感作された場合、ＤＴＨ様膨張応答が観察される。
【００７１】
本明細書において用いられる場合、用語「モジュレートする」は、上方調節および下方調節、例えば、応答の増強または阻害を含む。
【００７２】
マーカーの発現の「正常」レベルは、ウイルス関連ＰＴＬＤを患っていない対象、例えば、ヒト患者の細胞におけるマーカーの発現のレベルである。マーカーの「過剰発現」または「有意により高いレベルの発現」は、発現の評価に用いられているアッセイの標準誤差よりも大きい、被験試料における発現レベルを指し、好ましくは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルの少なくとも２倍、より好ましくは、３、４、５または１０倍である。マーカーの「有意により低いレベルの発現」は、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは、３、４、５または１０倍低い、被験試料における発現レベルを指す。
【００７３】
本明細書において用いられる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを目的とする。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本明細書において用いられる場合、Ｇａｌ１に結合する抗体または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関連した用語「単離された核酸分子」は、該抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ヒトゲノムＤＮＡにおける核酸に天然に隣接し得る、Ｇａｌ１以外の抗原に結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を指すことを目的とする。
【００７４】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性に配置される場合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合、当該配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関して、作動可能に連結とは、連結されているＤＮＡ配列が、連続しており、２種のタンパク質コード領域を連結することが必要とされる場合、読み枠において連続することを意味する。スイッチ配列に関して、作動可能に連結とは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。
【００７５】
マーカーの「過剰発現」または「有意により高いレベルの発現」は、発現の評価に用いられるアッセイの標準誤差よりも大きい、被験試料における発現レベルを指し、好ましくは、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍以上高い。マーカーの「有意により低いレベルの発現」は、対照試料（例えば、マーカー関連疾患ではない健康な対象由来の試料）におけるマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料におけるマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも２倍、より好ましくは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍以上低い、被験試料における発現レベルを指す。
【００７６】
用語「ポリペプチド断片」または「断片」は、参照ポリペプチドに関連して用いられる場合、参照ポリペプチドそれ自体と比較してアミノ酸残基が欠失されているが、残るアミノ酸配列が通常、参照ポリペプチドにおける対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。かかる欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端、内部またはカルボキシ末端、あるいはその両方で生じ得る。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０、３０、４０または５０アミノ酸長、少なくとも７５アミノ酸長または少なくとも１００、１５０、２００、３００、５００以上のアミノ酸長である。これは、例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２０、４４０、４６０、４８０、５００、５２０、５４０、５６０、５８０、６００、６２０、６４０、６６０、６８０、７００、７２０、７４０、７６０、７８０、８００、８２０、８４０、８６０、８８０、９００、９２０、９４０、９６０、９８０、１０００、１０２０、１０４０、１０６０、１０８０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２２０、１２４０、１２６０、１２８０、１３００、１３２０、１３４０以上の長さであるおよび／またはこれを含む、またはかかるアミノ酸の長さ未満、あるいはその間のいずれかの範囲となり、全長ポリペプチドの長さに満たない限り、包括的となることができる。あるいは、これは、全長ポリペプチドの長さに満たない限り、かかる範囲以下および／またはこれを除外することができる。範囲は、本技術分野において周知であり、５５〜５９の間のアミノ酸の長さであるＧａｌ１のＦ５ベータストランドドメイン等、目的とするポリペプチドドメインを含むこともできる。
【００７７】
本明細書において用いられる場合、用語「再編成された」は、それぞれ本質的に完全ＶＨおよびＶＬドメインをコードする立体構造において、Ｖセグメントが、Ｄ−ＪまたはＪセグメントに直接隣接して配置された、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン遺伝子の遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較により同定することができる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１個の組換えされた七量体／九量体相同性エレメントを有するであろう。
【００７８】
本明細書において用いられる場合、用語「組換え」は、非天然起源の状態となるよう、人の手により操作または遺伝子操作された、核酸、タンパク質、抗体、細胞その他等の生物学的材料を指す。例えば、「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを目的とする。かかる用語が、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の後代も指すことを目的とすることを理解されたい。ある特定の修飾が、続く世代において突然変異または環境的影響のいずれかにより生じ得るため、かかる後代は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、依然として、本明細書における用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【００７９】
本明細書において用いられる場合、用語「組換えヒト抗体」は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子がトランスジェニックもしくは染色体導入された動物（例えば、マウス）、またはそれから調製されたハイブリドーマ（さらに後述する）から単離される抗体、（ｂ）抗体を発現するよう形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、および（ｄ）他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する他のいずれかの手段によって調製、発現、創製または単離される抗体等、組換え手段によって調製、発現、創製または単離されるあらゆるヒト抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列および／または非生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態において、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（あるいは、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックの動物が用いられる場合は、インビボ体細胞突然変異誘発）に付すことができ、これにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関係しながら、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しなくてよい配列となる。
【００８０】
本発明において、「応答」は一般に、例えば、臨床介入の進行、有効性または成績における効果の決定に関係する。一部の実施形態において、応答は、臨床介入（例えば、抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体の投与）開始後の腫瘍量および／または容量の変化に直接的に関係する。例えば、過剰増殖障害応答は、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診によって測定された初期サイズおよび寸法と比較した、全身性介入後の腫瘍のサイズに従って評価することができる。応答は、生検または外科的切除後に、腫瘍のノギス測定または病理学的試験によって評価することもできる。応答は、腫瘍容量のパーセンテージ変化等の定量的様式で、または「病理学的完全応答」（ｐＣＲ）、「臨床完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床安定的疾患」（ｃＳＤ）、「臨床進行性疾患」（ｃＰＤ）もしくは他の定性的判断基準等の定性的様式で記録することができる。評価は、臨床介入開始後早期に、例えば、数時間後、数日間後、数週間後、または好ましくは数ヶ月間後に行うことができる。応答評価のための典型的エンドポイントは、臨床介入の終結、または残渣腫瘍細胞および／または腫瘍床の外科的除去である。
【００８１】
本明細書において用いられる場合、用語「特異的結合」は、所定の抗原への抗体結合を指す。典型的には、抗体は、分析物としてヒトＧａｌ１およびリガンドとして抗体を用いたＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ機器における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満またはさらにより低い等、およそ１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合し、所定の抗原または密接に関係した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０．０倍以上の親和性で所定の抗原に結合する。語句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と本明細書において互換的に用いられる。
【００８２】
本明細書において用いられる場合、「対象」は、いずれかの健康な動物、哺乳類もしくはヒト、またはＧａｌ１媒介性障害を患ういずれかの動物、哺乳類もしくはヒトを指す。用語「対象」は、「患者」と互換的である。用語「非ヒト動物」は、あらゆる脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等、哺乳類および非哺乳類を含む。
【００８３】
言語「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質から分離されている、抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を含む。一実施形態において、言語「化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない」は、約３０％（乾燥重量で）未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、より好ましくは、約２０％未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、さらにより好ましくは、約１０％未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、最も好ましくは、約５％未満の化学的前駆物質または非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物を含む。
【００８４】
本明細書において用いられる場合、用語「生存」は、次の全てを含む：全生存としても公知の死亡までの生存（前記死亡は、関係する原因または腫瘍に無関係となり得る）；「無再発生存」（用語、再発は、局在化および遠隔再発の両方を含むであろう）；無転移生存；無疾患生存（用語、疾患は、がんおよびこれに関連する疾患を含むであろう）。前記生存の長さは、定義された出発点（例えば、診断時または治療開始時）およびエンドポイント（例えば、死亡、再発または転移）を参照することにより計算することができる。加えて、治療有効性の判断基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所定の期間内における転移の確率および腫瘍再発の確率を含むように拡張することができる。
【００８５】
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」は、本発明のマーカーの転写およびあるとすればＲＮＡ転写物の正常転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製される成熟ｍＲＮＡの全体または部分と相補的または相同なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはかかるＲＮＡもしくはｃＤＮＡのアナログ）である。
【００８６】
本明細書において用いられる場合、用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。用語、Ｔ細胞は、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。用語「抗原提示細胞」は、専門の抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）と共に他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト）を含む。
【００８７】
本明細書において用いられる場合、Ｖセグメントに関連する用語「非再編成」または「生殖系列立体配置」は、Ｖセグメントが組換えられず、ＤまたはＪセグメントに直接隣接する立体配置を指す。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、用語「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸を指す。ベクターの１種類は、その中に追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、ウイルスゲノム中に追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができるウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的に複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、これに作動的に連結された遺伝子の発現を方向づけることができる。かかるベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」または単純に「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドは、通常用いられる形態のベクターであるため、「プラスミド」および「ベクター」は、互換的に用いることができる。しかし、本発明は、均等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）等、かかる他の形態の発現ベクターを含むことを目的とする。
【００８９】
核酸に関して、用語「実質的相同性」は、２種の核酸またはその指定の配列が、最適に整列および比較された場合、適切なヌクレオチド挿入または欠失により、ヌクレオチドの少なくとも約８０％において、通常、ヌクレオチドの少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％以上、より好ましくは、ヌクレオチドの少なくとも約９７％、９８％、９９％以上において、同一であることを示す。あるいは、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下でストランドの相補体にハイブリダイズする場合、実質的相同性が存在する。
【００９０】
２配列間のパーセント同一性は、該２配列の最適アライメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、該配列によって共有される同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）。２配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、後述する非限定的な例に記載されている通り、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【００９１】
２種のヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウエイトを用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブにて利用できる）におけるＧＡＰプログラムを用いて決定することができる。２種のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基テーブル、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれている、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ［CABIOS, 4:11 17 (1989)］のアルゴリズムを用いて決定することもできる。加えて、２種のアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウエイトを用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ＧＣＧ社ウェブサイトのワールドワイドウェブにて利用できる）におけるＧＡＰプログラムに取り込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ［J. Mol. Biol. (48):444 453 (1970)］アルゴリズムを用いて決定することができる。
【００９２】
本発明の核酸およびタンパク質配列は、例えば、関係する配列を同定するための公共データベースに対する検索を実行するための、「問い合わせ配列」としてさらに用いることができる。かかる検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス＝１２により実行して、本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３により実行して、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ入りアライメントを得るために、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389 3402に記載されている通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる（ＮＣＢＩウェブサイトのワールドワイドウェブにて利用できる）。
【００９３】
核酸は、細胞全体、細胞ライセートまたは部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態において存在し得る。アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および本技術分野において周知の他の技法［F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照］を含む標準技法によって、他の細胞構成成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製される場合、核酸は、「単離される」かまたは「実質的に純粋にされる」。
【００９４】
本発明についてさらに記載する前に、説明目的のために、本明細書を通じて特異的配列識別子（配列番号）が参照されており、したがって、これを限定的に解釈するべきではないことが認められよう。本明細書に記載されているマーカーおよびここに記載されているマーカー等が挙げられるがこれらに限定されない、本発明のいずれかのマーカーは、本技術分野において周知であり、本発明の実施形態において用いることができる。
【００９５】
本発明が、記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら変動し得ることをさらに理解されたい。本明細書に用いられている用語法が、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、限定を目的としないことも理解されたい。
【００９６】
値の範囲が提示されている場合、文脈がそれ以外のことを明らかに指示しない限り下限の単位の１０分の１まで、介在する値のそれぞれと、該範囲の上限および下限の間と、該記述されている範囲における他のいずれかの記述されているまたは介在する値が、本発明の内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲に独立的に含まれることができ、同様に本発明の内に包含され、記述されている範囲におけるいずれかの特に除外される限界に付される。記述されている範囲が、限界の一方または両方を含む場合、この含まれている限界のいずれか一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００９７】
他に規定がなければ、本明細書に用いられているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様のまたは均等ないずれかの方法および材料を用いることもできるが、好まれる方法および材料をここに記載する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物を、参照により本目最初に組み込んで、刊行物が引用されるものに関連して方法および／または材料を開示および記載する。
【００９８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ（and）」および「ｔｈｅ」が、文脈がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「単数のポリペプチド（a polypeptide）」の言及は、複数のポリペプチドを含み、「単数の活性薬剤（the active agent）」の言及は、１または複数の活性薬剤および当業者に公知のその均等物の言及を含む等である。いずれかの必要に応じた要素を除外するよう特許請求の範囲を立案することができることがさらに留意される。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して、「もっぱら」、「のみ」その他としてのかかる排他的用語法の使用または「否定的」限定の使用のための先行詞として役立つことを目的とする。
【００９９】
本明細書に記載されている刊行物は、もっぱら、本願の出願日に先立つその開示のために提示されている。本明細書におけるいかなる記載も、本発明が、先行発明に基づいて先行するかかる刊行物に対する権利を与えられないことの承認として解釈するべきではない。さらに、提示されている刊行物の日付は、独立的に確認される必要がある実際の刊行日とは異なる場合がある。
【０１００】
ＩＩ．ポリペプチド、抗体および免疫原性組成物
本発明は、一部には、Ｇａｌ１活性を中和するための標的として有用なＧａｌ１エピトープに関する。かかるエピトープを用いて、Ｇａｌ１に対して作られた抗体またはその断片等、薬剤を単離し、Ｇａｌ１活性を中和することができる。かかる分子は、実施例でさらに後述する構造−機能関係性に基づきＧａｌ１タンパク質機能を中和する予想外の能力を示すことを特徴とする。
【０１０１】
Ｇａｌ１遺伝子および遺伝子産物の配列、構造、ドメイン、生物物理学的特徴および機能は、本技術分野において記載されてきた。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Rabinovich et al. (2002) Trends Immunol. 23:313-320；Liu and Rabinovich (2005) Nat. Rev. Cancer 5:29-41；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251；Le et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23:8932-8941；Vasta et al. (2004) Curr Opin Struct Biol 14:617-630；Toscano et al. (2007) Cyt. Growth Fact. Rev. 18:57-71；Camby et al. (2006) Glycobiol. 16:137R-157R；米国特許出願公開第２００３−０００４１３２号、同第２００３−０１０９４６４号、同第２００６−０１８９５１４号、同第２００９−０１７６２２３号、同第２００９−０１９１１８２号、同第２０１２−００２８８２５号および同第２０１３−００１１４０９号を参照されたい。代表的ヒトＧａｌ１バイオマーカーの核酸およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＮＭ＿００２３０５．３およびＮＰ＿００２２９６．１において公共に利用できる。ヒト以外の生物におけるＧａｌ１オルソログの核酸およびポリペプチド配列は、周知であり、例えば、サルＧａｌ１（ＮＭ＿００１１６８６２７．１およびＮＰ＿００１１６２０９８．１）、チンパンジーＧａｌ１（ＸＭ＿００３９５３８８２．１およびＸＰ＿００３９５３９３１．１；ＸＭ＿００３９５３８８３．１およびＸＰ＿００３９５３９３２．１；ＸＭ＿００１１６２１０４．３およびＸＰ＿００１１６２１０４．１）、マウスＧａｌ１（ＮＭ＿００８４９５．１およびＮＰ＿０３２５２１．１）、ラットＧａｌ１（ＮＭ＿０１９９０４．１およびＮＰ＿０６３９６９．１）、イヌＧａｌ１（ＮＭ＿００１２０１４８８．１およびＮＰ＿００１１８８４１７．１）、ニワトリＧａｌ１（ＮＭ＿２０６９０５．１およびＮＰ＿９９６７８８．１）およびウシＧａｌ１（ＮＭ＿１７５７８２．１およびＮＰ＿７８６９７６．１）を含む。例えば、検出に有用な関連するＧａｌ１配列は、下表３に示す配列を含む。
【０１０２】
【表１−１】
0006581982.tif 000002
【表１−２】
0006581982.tif 000003
【表１−３】
0006581982.tif 000004
【０１０３】
しかし、Ｇａｌ１エピトープの中和に関連するＧａｌ１エピトープは、これまでに開示されていない。よって、本発明は、抗Ｇａｌ１剤が結合しＧａｌ１活性を中和することができるＧａｌ１エピトープを包含する、組換えおよび／または単離されたＧａｌ１ペプチドまたはその断片を提供する。一態様において、かかるＧａｌ１ポリペプチドは、全体的Ｆ５  β−シート配列またはその部分を包含する全長Ｇａｌ１の断片を含むか、から本質的になるかまたはからなることができる。別の態様において、Ｇａｌ１ポリペプチドは、配列番号１〜１６またはこれらのオルソログのうちいずれか１種の残基１０２〜１１５を含む、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４以下またはその間のいずれかの範囲の配列を含むか、から本質的になるかまたはからなることができる。本発明のＧａｌ１ポリペプチドの一実施形態において、本ポリペプチドは、配列番号１〜１６またはこれらのオルソログのうちいずれか１種の残基１０２〜１１５と少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５または１００％同一である配列を含むことができる。本発明のＧａｌ１ポリペプチドの別の実施形態において、本ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個以上の保存的アミノ酸置換を有することができる。さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている組換えポリペプチドと、約２５％、あるいは１５％、あるいは５％未満の混入する生物学的高分子またはポリペプチドを含む組成物を提供する。
【０１０４】
ある特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、異種配列をさらに含むことができる。例えば、ポリペプチド溶解性およびバイオアベイラビリティを増加させる、および／またはその精製、同定、検出および／または構造的特徴付けを容易にするドメインを含有する融合タンパク質が提供される。かかる実施形態において、異種部分は、Ｇａｌ１中和エピトープの免疫原性活性および／または立体構造を実質的に変更するべきではない。例示的なドメインは、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、プロテインＧ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリＨｉｓ、ポリＨｉｓ−ＡｓｐまたはＦＬＡＧ融合タンパク質およびタグを含む。追加的な例示的なドメインは、シグナルペプチド、ＩＩＩ型分泌系標的化ペプチド、トランスサイトーシスドメイン、核局在化シグナル等、インビボにおけるタンパク質局在化を変更するドメインを含む。様々な実施形態において、本発明のポリペプチドは、１種または複数の異種融合体を含むことができる。ポリペプチドは、同じ融合ドメインの複数のコピーを含有することができる、あるいは２種以上の異なるドメインとの融合体を含有することができる。インフレーム挿入としてポリペプチド内に、ポリペプチドのＮ末端に、ポリペプチドのＣ末端に、またはポリペプチドのＮおよびＣ末端の両方に、融合が起こり得る。融合タンパク質の構築を容易にするために、または融合タンパク質のタンパク質発現もしくは構造的制約を最適化するために、本発明のポリペプチドおよび融合ドメインの間にリンカー配列を含むことも、本発明の範囲内である。別の実施形態において、本ポリペプチドは、タンパク質発現後またはその後にタグを除去するために、融合ポリペプチドおよび本発明のポリペプチドの間にプロテアーゼ切断部位を含有するように構築することができる。適したエンドプロテアーゼの例として、例えば、第Ｘａ因子およびＴＥＶプロテアーゼが挙げられる。
【０１０５】
一部の実施形態において、目的とするポリペプチドまたはその断片は、抗体断片（例えば、Ｆｃポリペプチド）に融合される。これらの融合タンパク質を調製するための技法は、公知であり、例えば、ＷＯ９９／３１２４１およびCosman et.al., 2001 Immunity 14:123 133に記載されている。Ｆｃポリペプチドへの融合は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムにおけるアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするという追加的な利点をもたらす。
【０１０６】
さらに別の実施形態において、目的とするポリペプチドまたはその断片は、検出可能な物質にカップリングすることができる。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料が挙げられる。適した酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適した蛍光材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光材料の例として、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；適した放射性材料の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。本発明のポリペプチドの検出のためのインビボ技法は、当該タンパク質に対して作られた標識抗体を対象へと導入することを含む。例えば、抗体は、対象におけるその存在および場所を標準イメージング技法により検出することができる放射性マーカーで標識することができる。
【０１０７】
特定の実施形態において、目的とするポリペプチドまたはその断片は、蛍光標識で標識して、その検出、精製または構造的特徴付けを容易にすることができる。例示的な実施形態において、目的とするポリペプチドまたはその断片は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、レニラ・レニフォルミス（Renilla Reniformis）緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、高感度シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シトリン（citrine）およびディスコソーマ（discosoma）由来の赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）を含む、検出可能蛍光シグナルを産生する異種ポリペプチド配列に融合することができる。
【０１０８】
本明細書に記載されているＧａｌ１中和エピトープ含有ポリペプチドの断片も提供される。例えば、Ｇａｌ１中和エピトープの免疫原性活性および／または立体構造に実質的に影響を与えない、ある特定の配列（例えば、タンパク質切断部位、シグナル配列その他）の欠失または置き換えが企図される。
【０１０９】
本明細書に記載されている目的とするポリペプチドまたはその断片は、組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。例えば、本タンパク質をコードする核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ（後述の通り）、この発現ベクターは、宿主細胞に導入され（後述の通り）、本タンパク質は、宿主細胞において発現される。次に、標準タンパク質精製技法を用いた適切な精製スキームによって、この細胞から目的とするタンパク質を単離することができる。組換え発現の代替として、標準ペプチド合成技法を用いて、目的とするタンパク質またはその断片を化学的に合成することができる。さらに、例えば、抗体を用いて、細胞（例えば、リンパ腫細胞）からネイティブタンパク質を単離することができる（後述の通り）。
【０１１０】
別の態様において、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技法を用いて、本発明のポリペプチドを免疫原として用いて、Ｇａｌ１中和エピトープに結合する中和薬剤（例えば、抗体、アプタマーその他）を生成することができる。ポリペプチドまたはポリペプチドをコードもしくは産生する薬剤（例えば、核酸、ベクター、宿主細胞その他）を用いて、本明細書にさらに記載されている通り、免疫原により適した対象（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）を免疫化することにより、抗体を調製することができる。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えにより発現されたタンパク質または化学的に合成されたタンパク質を含有することができる。調製物は、フロイント完全もしくは不完全アジュバント等のアジュバントまたは同様の免疫刺激剤をさらに含むことができる。
【０１１１】
本明細書に記載されている免疫原性薬剤による対象の免疫化は、ポリクローナル抗Ｇａｌ１中和抗体応答を誘導する。免疫化された対象におけるポリクローナル抗体力価は、固定化された標的タンパク質を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等、標準技法により経時的にモニターすることができる。必要に応じて、Ｇａｌ１中和エピトープに対して作られた抗体分子は、哺乳類（例えば、血液から）から単離し、プロテインＡクロマトグラフィー等、周知技法によりさらに精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化後の適切な時点で、即ち、目的とする抗体力価が最高になったときに、対象から抗体産生細胞を得て、モノクローナル抗体の調製に用いることができる。
【０１１２】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において用いられる場合、Ｇａｌ１の特定の中和エピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のうち１種のみを含有する抗体分子の集団を指す。よって、モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定のタンパク質に対する単一の結合親和性を表示する。これは、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497によって本来記載されたハイブリドーマ技法［Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46；Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83；Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31；およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照］、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法［Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72］、ＥＢＶハイブリドーマ技法［Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96］またはトリオーマ（trioma）技法等、標準技法を用いて作製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生するための技術は周知である［全般的には、R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)；E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402；M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36を参照］。簡潔に説明すると、不死細胞株（典型的には、骨髄腫）が、上述の免疫原性薬剤で免疫化された哺乳類由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）に融合され、その結果得られたハイブリドーマ細胞の培養上清がスクリーニングされて、Ｇａｌ１の中和エピトープに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０１１３】
抗Ｇａｌ１中和モノクローナル抗体を生成する目的で、リンパ球および不死化細胞株の融合に用いられる多くの周知プロトコールのいずれを適用してもよい［即ち、G. Galfre et al. (1977) Nature 266:550-52；Gefter et al. Somatic Cell Genet.、上に引用；Lerner, Yale J. Biol. Med.、上に引用；Kenneth, Monoclonal Antibodies、上に引用を参照］。さらに、当業者であれば、同様に有用なかかる方法の多くのバリエーションが存在することを認められよう。典型的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物を免疫化したマウス由来のリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合することにより作製することができる。好まれる不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に対し感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。多数の骨髄腫細胞株のいずれを、標準技法に従った融合パートナーとして用いてもよい、即ち、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系統。これらの骨髄腫系統は、ＡＴＣＣから入手することができる。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾細胞に融合される。次に、非融合および非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺傷する（非融合脾細胞は、形質転換されていないために数日後に死亡する）ＨＡＴ培地を用いて、融合から得られるハイブリドーマ細胞が選択される。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、Ｇａｌ１の中和エピトープに結合する抗体に関してハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより、即ち、標準ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出される。
【０１１４】
ＩＩＩ．核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明のさらに別の目的は、本発明の中和Ｇａｌ１活性、抗体（例えば、モノクローナル抗体）およびその断片、免疫グロブリンならびにポリペプチドに関連するＧａｌ１エピトープをコードする核酸配列に関する。
【０１１５】
一実施形態において、本発明は、本発明のペプチドまたは抗体をコードする配列を有する核酸分子を提供する。本明細書において用いられる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（即ち、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（即ち、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを目的とする。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子は、該核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸は、該核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて該核酸に天然に隣接する配列（即ち、該核酸の５’および３’端にある配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、組換えおよび／または単離された核酸分子は、ウイルスＤＮＡにおいて該核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子等、「単離された」核酸分子は、他の細胞材料、または組換え技法によって産生される場合は培養培地、または化学的に合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてよい。
【０１１６】
本発明の核酸分子（例えば、表３に開示されている核酸分子またはこれらのオルソログまたは本明細書に記載されているポリペプチドをコードする核酸分子）は、かかるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、またより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるヌクレオチド配列となることもでき、本明細書に提示されている標準分子生物学技法および配列情報を用いて、遺伝子操作および単離することができる（即ち、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載されている通りに）。さらに、かかる核酸は、本明細書に記載されている配列またはそのオルソログに基づき設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる。例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡは、核酸鋳型を含有する関連する供給源から単離することができ［即ち、Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299のグアニジウム−チオシアネート抽出手順により］、ｃＤＮＡは、逆転写酵素（即ち、モロニーＭＬＶ逆転写酵素、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手できる；またはＡＭＶ逆転写酵素、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬから入手できる）を用いて調製することができる。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。本発明の核酸は、鋳型としてのｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準ＰＣＲ増幅技法に従って増幅することができる。このようにして増幅された核酸を適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析により特徴付けることができる。さらに、本発明の核酸配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準合成技法により、即ち、自動ＤＮＡ合成機を用いて調製することができる。
【０１１７】
別の実施形態において、核酸は、本明細書に記載されているＧａｌ１エピトープ配列またはその断片と、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるタンパク質をコードする。
【０１１８】
当業者であれば、ポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、哺乳類および／またはヒト集団）内に存在し得ることが認められよう。遺伝子におけるかかる遺伝子多型は、天然アレルのバリエーションにより、集団内の個体間に存在し得る。本明細書において用いられる場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、本発明のポリペプチド、好ましくは、哺乳類ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。かかる天然アレルのバリエーションは、典型的には、遺伝子のヌクレオチド配列における１〜５％分散をもたらし得る。天然アレルのバリエーションの結果であり、ポリペプチドの機能活性を変更しない、ありとあらゆるかかるヌクレオチドのバリエーションおよびポリペプチドにおけるその結果得られるアミノ酸多型は、本発明の範囲内に収まることを目的とする。目的とする天然アレル変異体およびホモログに対応する核酸分子を単離することができる。
【０１１９】
集団において存在し得る配列の天然起源のアレル変異体に加えて、当業者は、表３に示す関連するＧａｌ１エピトープ核酸配列のヌクレオチド配列またはこれらのオルソログへの突然変異によって変化を導入して、これにより、タンパク質の機能的能力（例えば、中和エピトープ）を変更することなく、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることをさらに認めるであろう。例えば、「非必須な」アミノ酸残基にアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を配列において行うことができる。「非必須な」アミノ酸残基が、免疫原性性質または立体構造を実質的に変更することなく、野生型配列から変更され得る残基である一方、「必須な」アミノ酸残基は、免疫原性性質または立体構造に影響を与える残基である。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、マウスおよびヒトの間で保存されていないまたは半保存でしかない残基）は、活性に必須でない可能性があり、よって、ポリペプチド活性を変更することなく、その変更を受け入れる可能性がある。
【０１２０】
用語「配列同一性または相同性」は、２種のポリペプチド分子の間または２種の核酸分子の間の配列類似性を指す。２種の比較されている配列の両方における位置が、同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットによって占有される場合、例えば、２種のＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置が、アデニンによって占有される場合、この分子同士は、該位置が相同または同一の配列である。２配列の間の相同性または配列同一性のパーセントは、比較される位置の数で割った、該２配列によって共有されるマッチングまたは相同同一位置の数×１００の関数である。例えば、２配列における位置１０個のうち６個が同じである場合、該２配列は、６０％相同であるまたは６０％配列同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列、ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性または配列同一性を共有する。一般に、２配列が整列されると、比較が行われて、最大相同性を得る。他に断りがなければ、「ループアウト領域」、例えば、配列のうち一方における欠失または挿入から生じる領域は、ミスマッチとして計数される。
【０１２１】
２配列間の配列の比較およびパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。好ましくは、アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ方法を用いて実行することができる。複数のアライメントパラメータは、ギャップペナルティ＝１０、ギャップレングスペナルティ＝１０を含む。ＤＮＡアライメントに関して、ペアワイズアライメントパラメータは、Ｈｔｕｐｌｅ＝２、ギャップペナルティ＝５、ウィンドウ＝４および対角保存＝４となり得る。タンパク質アライメントに関して、ペアワイズアライメントパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５および対角保存＝５となり得る。
【０１２２】
好まれる実施形態において、２種のアミノ酸配列の間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウエイトを用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンライン利用可）におけるＧＡＰプログラムに取り込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ［J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)］アルゴリズムを用いて決定される。さらに別の好まれる実施形態において、２種のヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、ならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６のレングスウエイトを用いた、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンライン利用可）におけるＧＡＰプログラムを用いて決定される。別の実施形態において、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列の間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０ウエイト残基テーブル、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを用いた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（オンライン利用可）に取り込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ［CABIOS, 4:11-17 (1989)］のアルゴリズムを用いて決定される。
【０１２３】
Ｇａｌ１中和エピトープをコードする単離された核酸分子またはそのオルソログもしくは断片は、鋳型のヌクレオチド配列に、１個または複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより創製することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発等、標準技法によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１個または複数の予測される非必須なアミノ酸残基において行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられた置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。よって、予測される非必須なアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基に置き換えられる。あるいは、別の実施形態において、突然変異は、飽和突然変異誘発による等、標的コード配列の全体または一部にわたりランダムに導入することができ、結果として得られる突然変異体を、本明細書に記載されている標的ポリペプチド活性に関してスクリーニングして、ポリペプチド活性を保持する突然変異体を同定することができる。突然変異誘発後に、コードされるタンパク質を組換えにより発現させることができ（本明細書に記載されている通り）、例えば、本明細書に記載されているアッセイを用いて該タンパク質の活性を決定することができる。
【０１２４】
目的とするタンパク質（例えば、Ｇａｌ１中和エピトープ含有ペプチドまたは標的Ｇａｌ１ポリペプチド）のレベルは、転写された分子またはタンパク質の発現を検出するための多種多様な周知方法のいずれかにより評価することができる。かかる方法の非限定的な例は、タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製方法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション方法、核酸逆転写方法および核酸増幅方法を含む。
【０１２５】
一部の実施形態において、かかるタンパク質発現レベルは、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を測定することにより、翻訳されたタンパク質の含量の測定によりまたは遺伝子産物活性の測定により確認される。発現レベルは、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質活性の検出を含む種々の仕方でモニターすることができ、そのいずれも、標準技法を用いて測定することができる。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または酵素活性）のレベルの定量化に関与し得る、あるいは、特に対照レベルと比較した、遺伝子発現のレベルの定性的評価となり得る。検出されているレベルの種類は、文脈から明らかとなるであろう。
【０１２６】
他の実施形態において、ｍＲＮＡ発現レベルは、本技術分野において公知の方法を用いて、生物学的試料におけるインサイチュ（in situ）およびインビトロフォーマットの両方によって決定することができる。用語「生物学的試料」は、対象から単離された組織、細胞、生物学的流体およびそれらの単離物と共に、対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことを目的とする。多くの発現検出方法は、単離されたＲＮＡを用いる。インビトロ方法に関して、細胞からのＲＮＡの精製のために、ｍＲＮＡの単離に対して選択しないいずれかのＲＮＡ単離技法を利用することができる（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999を参照）。その上、多数の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９年、米国特許第４，８４３，１５５号）の単一工程ＲＮＡ単離プロセス等、当業者に周知の技法を用いて容易に処理することができる。
【０１２７】
単離されたｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応解析およびプローブアレイが挙げられるがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて用いることができる。
【０１２８】
絶対的発現レベルに基づく決定の代替として、決定は、正規化された発現レベルに基づくことができる。発現レベルは、その発現を非標的遺伝子、例えば、ハウスキーピングまたは構成的に発現される他の参照遺伝子の発現と比較することにより、絶対的発現レベルを補正することにより正規化される。正規化に適した遺伝子は、アクチン遺伝子または上皮細胞特異的遺伝子等、ハウスキーピング遺伝子を含む。この正規化は、ある試料、例えば対象試料における発現レベルの、別の試料、例えば正常試料に対する比較、または異なる供給源由来の試料の間の比較を可能にする。
【０１２９】
ポリペプチドのレベルまたは活性は、発現されたポリペプチドを検出または定量化することにより、検出および／または定量化することもできる。当業者に周知の多数の手段のいずれかにより、所望のポリペプチドを検出および定量化することができる。これらには、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速拡散（hyperdiffusion）クロマトグラフィーその他等、分析的生化学的方法、または流体もしくはゲル沈降素反応、免疫拡散法（一元または二元、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティングその他等、様々な免疫学的方法を挙げることができる。当業者は、細胞が目的とするポリペプチドを発現するかに関する決定における使用のために、公知タンパク質／抗体検出方法を容易に適応させることができる。
【０１３０】
典型的には、前記核酸は、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクター等、いずれか適したベクターに含まれ得るＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。
【０１３１】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるように、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。よって、本発明のさらに別の目的は、本発明の核酸を含むベクターに関する。
【０１３２】
かかるベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターその他等、調節エレメントを含んで、対象への投与後に前記ポリペプチドの発現をもたらすまたは方向づけることができる。動物細胞のための発現ベクターにおいて用いられるプロモーターおよびエンハンサーの例として、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Mason J O et al. 1985）およびエンハンサー（Gillies S D et al. 1983）その他が挙げられる。
【０１３３】
動物細胞のためのいずれかの発現ベクターを用いることができる。適したベクターの例として、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O'Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）その他が挙げられる。プラスミドの他の代表例として、複製起点を含む複製プラスミド、または例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲその他等の組込みプラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの代表例として、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶベクターが挙げられる。かかる組換えウイルスは、パッケージング細胞の遺伝子導入またはヘルパープラスミドもしくはウイルスによる一過性遺伝子導入等、本技術分野において公知の技法により産生することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ陽性細胞、２９３細胞等が挙げられる。かかる複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号およびＷＯ９４／１９４７８に見出すことができる。
【０１３４】
本発明のさらに別の目的は、本発明に係る核酸および／またはベクターによって遺伝子導入、感染または形質転換された細胞に関する。用語「形質転換」は、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列にコードされるタンパク質または酵素を産生することができるような、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の導入を意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け取り発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
【０１３５】
本発明の核酸を用いて、適した発現系において本発明の組換えポリペプチドを産生することができる。用語「発現系」は、適した条件下における、例えば、ベクターによって運ばれ宿主細胞へと導入される外来ＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現のための、宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
【０１３６】
一般的な発現系は、Ｅ．コリ宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞およびベクターを含む。宿主細胞の他の例として、原核細胞（細菌等）および真核細胞（酵母細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞等）を限定することなく挙げられる。具体例として、Ｅ．コリ、クリベロマイセス属（Kluyveromyces）またはサッカロマイセス属（Saccharomyces）酵母、哺乳類細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等）と共に、初代または樹立された哺乳類細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞等から産生される）が挙げられる。例として、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、「ＤＨＦＲ遺伝子」と称される）が欠損したＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２、以下、「ＹＢ２／０細胞」と称される）その他も挙げられる。この細胞において発現されると、キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が増強されるため、ＹＢ２／０細胞が好まれる。
【０１３７】
本発明は、また、本発明に従って本発明の抗体またはポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を産生する方法であって、（ｉ）インビトロまたはエクスビボ（ex vivo）で、上述の組換え核酸またはベクターをコンピテント宿主細胞に導入することと、（ｉｉ）インビトロまたはエクスビボで、得られた組換え宿主細胞を培養することと、（ｉｉｉ）前記抗体またはポリペプチドを発現および／または分泌する細胞を選択してもよいこととからなる工程を含む方法に関する。かかる組換え宿主細胞は、本発明の抗体およびポリペプチドの産生のために用いることができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、本技術分野において周知である。目的とするポリペプチドまたはその断片は、該ポリペプチドを含有する細胞および培地の混合物から分泌および単離することができる。あるいは、ポリペプチドまたはその断片は、細胞質に保持される場合があり、この細胞を収集し、溶解し、タンパク質またはタンパク質複合体を単離することができる。目的とするポリペプチドまたはその断片は、目的とするポリペプチドまたはその断片の特定のエピトープに特異的な抗体により、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動および免疫親和性（inmmunoaffinity）精製を含むタンパク質を精製するための本技術分野において公知の技法を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。他の実施形態において、本技術分野において公知の標準方法に従って、精製目的の異種タグを用いることができる（例えば、エピトープタグおよびＦＣ融合タグ）。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示されているポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸を提供する。よって、本実施形態のポリヌクレオチドは、かかるポリヌクレオチドを含む核酸を単離、検出および／または定量化するために用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、寄託されたライブラリーにおける部分的または全長クローンの同定、単離または増幅に用いることができる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、単離された、あるいはヒトまたは哺乳類核酸ライブラリー由来のｃＤＮＡと相補的なゲノムまたはｃＤＮＡ配列である。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、少なくとも８０％全長配列、好ましくは、少なくとも８５％または９０％全長配列、より好ましくは、少なくとも９５％全長配列を含む。ｃＤＮＡライブラリーは、稀な配列の表示を増加させるよう正規化することができる。低または中等度ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、典型的には、但し排他的にではなく、相補的配列と比べて低下した配列同一性を有する配列と共に用いられる。中等度および高ストリンジェンシー条件は、より高い同一性の配列に用いられてもよい。低ストリンジェンシー条件は、約７０％配列同一性を有する配列の選択的ハイブリダイゼーションを可能にし、オルソロガスまたはパラロガス配列の同定に用いることができる。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドにコードされる抗体の少なくとも部分をコードしてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドへの選択的ハイブリダイゼーションに用いることができる核酸配列を包含する。例えば、それぞれ全体的に参照により本明細書に組み込まれる、Ausubel、上記参照；Colligan、上記参照を参照されたい。
【０１３９】
ＩＶ．ポリペプチドおよび抗体を産生する方法
本発明のポリペプチドおよび抗体およびその断片、免疫グロブリンおよびポリペプチドは、単独または組み合わせたいずれかの化学的、生物学的、遺伝的または酵素的技法等が限定することなく挙げられる、本技術分野において公知のまたは本明細書に記載されているいずれかの技法によって産生することができる。
【０１４０】
例えば、宿主細胞を培養して、目的とするポリペプチドまたは抗体を発現させることができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、本技術分野において周知である。目的とするポリペプチドまたはその断片は、該ポリペプチドを含有する細胞および培地の混合物から分泌および単離することができる。あるいは、目的とするポリペプチドまたはその断片は、細胞質に保持される場合があり、細胞を収集し、溶解し、タンパク質またはタンパク質複合体を単離することができる。目的とするポリペプチドまたはその断片は、目的とするポリペプチドまたはその断片の特定のエピトープに特異的な抗体による、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動および免疫親和性精製を含む、タンパク質を精製するための本技術分野において公知の技法を用いて、細胞培養培地、宿主細胞またはその両方から単離することができる。他の実施形態において、本技術分野において公知の標準方法に従って、精製目的の異種タグを用いることができる（例えば、エピトープタグおよびＦＣ融合タグ）。
【０１４１】
よって、目的とするポリペプチドの全体または選択された部分をコードするヌクレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞によるプロセスを経て、組換え型のタンパク質を産生することができる。発現ベクター等、ポリヌクレオチドコンストラクトへの配列のライゲーションと、真核生物（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核生物（細菌細胞）のいずれかである宿主への形質転換または遺伝子導入は、標準手順である。同様の手順またはその修飾を用いて、本発明に従って、微生物による手段または組織培養技術により、目的とする組換えポリペプチドまたはその断片を調製することができる。
【０１４２】
別のバリエーションにおいて、タンパク質産生は、インビトロ翻訳系を用いて達成することができる。インビトロ翻訳系は、一般に、ＲＮＡ分子をタンパク質へと翻訳するのに必要な少なくとも最低限の要素を含有する無細胞抽出物である翻訳系である。インビトロ翻訳系は、典型的には、少なくともリボソーム、ｔＲＮＡ、イニシエーターメチオニル−ｔＲＮＡＭｅｔ、翻訳に関与するタンパク質または複合体、例えば、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３、キャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）および真核生物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）を含むキャップ結合（ＣＢ）複合体を含む。種々のインビトロ翻訳系は、本技術分野において周知であり、市販のキットを含む。インビトロ翻訳系の例として、ウサギ網状赤血球ライセート、ウサギ卵母細胞ライセート、ヒト細胞ライセート、昆虫細胞ライセートおよびコムギ胚芽抽出物等、真核生物ライセートが挙げられる。ライセートは、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、Ｉｌｌ．；およびＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ等、製造業者から市販されている。インビトロ翻訳系は、典型的には、酵素、翻訳開始および伸長因子、化学的試薬ならびにリボソーム等、高分子を含む。加えて、インビトロ転写系を用いることができる。かかる系は、典型的には、少なくともＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、リボヌクレオチド、ならびにいずれか必要な転写開始、伸長および終結因子を含む。インビトロ転写および翻訳は、ワンポット反応においてカップリングして、１種または複数の単離されたＤＮＡからタンパク質を産生することができる。
【０１４３】
ある特定の実施形態において、目的とするポリペプチドまたはその断片は、化学的に、無細胞系においてリボソームにより、または細胞内でリボソームにより合成することができる。化学的合成は、段階的固相合成、ペプチド断片の立体構造により支援される再ライゲーションによる半合成、クローニングまたは合成されたペプチドセグメントの酵素によるライゲーション、および化学的ライゲーションを含む、種々の本技術分野に認識される方法を用いて行うことができる。ネイティブ化学的ライゲーションは、２種の非保護ペプチドセグメントの官能基選択的反応を用いて、一過性チオエステル連結された中間体を産生する。次に、一過性チオエステル連結された中間体は、再編成を自発的に行って、ライゲーション部位にネイティブペプチド結合を有する全長ライゲーション産物をもたらす。全長ライゲーション産物は、無細胞合成によって産生されるタンパク質と化学的に同一である。全長ライゲーション産物は、為される通りにリフォールディングおよび／または酸化されて、ネイティブジスルフィド含有タンパク質分子を形成することができる［例えば、米国特許第６，１８４，３４４号および同第６，１７４，５３０号；ならびにT. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p 420；M. Miller, et al., Science (1989): vol. 246, p 1149；A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, p 616；L. H. Huang, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 7402；M. Sclmolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, p 180-193；K. Rajarathnam, et al., Science (1994): vol. 264, p 90；R. E. Offord, “Chemical Approaches to Protein Engineering”, in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccins, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) pp. 253-282；C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852；L. Abrahmsen, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151；T. K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12544-12548；M. Schnlzer, et al., Science (1992): vol., 3256, p 221；およびK. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184を参照］。
【０１４４】
特に、本発明は、本発明の抗体またはポリペプチドを産生する方法であって、（ｉ）前記抗体またはポリペプチドを発現させるのに適した条件下で、本発明に係る形質転換された宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収することとからなる工程を含む方法にさらに関する。
【０１４５】
本発明の抗体および他のポリペプチドは、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィー等、従来の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離される。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために用いることもできる。例えば、それぞれ全体的に参照により本明細書に組み込まれる、Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)、例えば、第１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。
【０１４６】
本発明のキメラ抗体（例えば、マウス−ヒトキメラ）は、以前に記載されたＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸（nucleic）配列を得て、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにこれを挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞に導入することにより該コード配列を発現させることにより産生することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインは、ＩｇＧクラスまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４等のそのサブクラス等、ヒト免疫グロブリンに属するいずれかの領域となり得る。同様に、ヒトキメラ抗体のＣＬは、カッパークラスまたはラムダクラス等、Ｉｇに属するいずれかの領域となり得る。標準組換えＤＮＡ技法を用いて産生することができる、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内である。かかるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法によって産生することができ、例えば、Robinson et al.、国際出願（International Patent Publication）ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira et al.、欧州特許出願第１８４，１８７号；Taniguchi, M.、欧州特許出願第１７１，４９６号；Morrison et al.、欧州特許出願第１７３，４９４号；Neuberger et al.、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly et al.、米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly et al.、欧州特許出願第１２５，０２３号；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043；Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526；Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218；Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005；Wood et al. (1985) Nature 314:446-449；Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)；Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207；Oi et al. (1986) Biotechniques 4:214；Winter、米国特許第５，２２５，５３９号；Jones et al. (1986) Nature 321:552-525；Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534；およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載されている方法を用いる。
【０１４７】
加えて、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示されているプロトコール等、標準プロトコールに従って作製することができる。別の実施形態において、抗体鎖または特異的結合対メンバーは、例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，８７１，９０７号または同第５，７３３，７４３号に記載されている本技術分野において公知の技法を用いて、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖および複製可能なジェネリックディスプレイパッケージの構成成分の融合体をコードする核酸分子を含むベクターと、単一の結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含有するベクターと間の組換えにより産生することができる。本発明のヒト化抗体は、以前に記載された通りにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得て、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターにこれを挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へと該発現ベクターを導入することによりこの遺伝子を発現させることにより産生することができる。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクターに存在する型か、両方の遺伝子が同じベクターに存在する型（タンデム型）のいずれかとなり得る。
【０１４８】
従来の組換えＤＮＡおよび遺伝子導入技法に基づきヒト化抗体を産生するための方法は、本技術分野において周知である（例えば、Riechmann L. et al. 1988；Neuberger M S. et al. 1985を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）［ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan EA (1991)；Studnicka G M et al. (1994)；Roguska M A. et al. (1994)］および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、本技術分野において公知の種々の技法を用いてヒト化することができる。かかる抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３および国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照）。
【０１４９】
同様に、本明細書に記載されている二重特異性または多特異性抗体は、標準手順に従って作製することができる。例えば、トリオーマおよびハイブリッド型ハイブリドーマは、二重特異性または多特異性抗体を分泌することができる細胞株の２例である。ハイブリッド型ハイブリドーマまたはトリオーマによって産生される二重特異性および多特異性抗体の例は、米国特許第４，４７４，８９３号に開示されている。かかる抗体は、化学的手段［Staerz et al. (1985) Nature 314:628、およびPerez et al. (1985) Nature 316:354］およびハイブリドーマ技術［Staerz and Bevan (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453、およびStaerz and Bevan (1986) Immunol. Today 7:241］によって構築することもできる。あるいは、かかる抗体は、ハイブリドーマまたは異なる抗体を作製する他の細胞を融合し、続いて所望の抗体を産生および共集合するクローンを同定することによりヘテロハイブリドーマを作製することにより生成することもできる。これは、完全免疫グロブリン鎖またはＦａｂおよびＦｖ配列等のその部分の化学的または遺伝的コンジュゲートにより生成することもできる。抗体構成成分は、本明細書に記載されている１種または複数の免疫阻害バイオマーカーを含む、本発明の１種または複数のバイオマーカーのポリペプチドまたはその断片に結合することができる。
【０１５０】
加えて、抗体断片を産生するための方法が周知である。例えば、本発明のＦａｂ断片は、ヒトＧＡＬ１と特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、パパインで処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系または真核生物発現系のためのベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入して、Ｆａｂを発現させることにより産生することができる。
【０１５１】
同様に、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、ＧＡＬ１と特異的に反応する抗体をプロテアーゼ、ペプシンで処理することにより得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２断片は、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して後述するＦａｂ’を結合させることにより産生することができる。
【０１５２】
本発明のＦａｂ’断片は、ｈＧＡＬ１と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤、ジチオスレイトールで処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂ’断片は、原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物（必要に応じて）に導入して、その発現を行うことにより産生することができる。
【０１５３】
加えて、本発明のｓｃＦｖは、以前に記載された通りにＶＨおよびＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに該ＤＮＡを挿入し、続いて原核生物または真核生物（必要に応じて）に該発現ベクターを導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖ断片を生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知技術を用いることができ、この技術は、ドナーｓｃＦｖ断片から相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択することと、それを公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖ断片フレームワークに移植することに関与する（例えば、ＷＯ９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第４，８１６，５６７号；ＥＰ０１７３４９４を参照）。
【０１５４】
Ｖ．ポリペプチドおよび抗体の修飾
本明細書に記載されているポリペプチドおよび抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的性質を改善することが望ましくなり得る。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲにおいて非ヒト動物に由来する抗体のＶＨおよびＶＬにおけるＣＤＲのみを単純に移植することにより、ヒト化抗体が産生される場合、非ヒト動物に由来する本来の抗体と比較して抗原結合活性が低下することが公知である。ＣＤＲのみならず、同様にＦＲにおける非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの数個のアミノ酸残基が、抗原結合活性と直接的にまたは間接的に関連することが考慮される。したがって、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来する異なるアミノ酸残基によるこれらのアミノ酸残基の置換は、結合活性を低下させ、アミノ酸を非ヒト動物に由来する本来の抗体のアミノ酸残基に置き換えることにより補正され得る。
【０１５５】
本発明のポリペプチドまたは抗体の構造およびこれをコードするＤＮＡ配列に修飾および変化を為すことができ、依然として、望ましい特徴を有する抗体およびポリペプチドをコードする機能的分子を得ることができる。例えば、活性の認識できる損失を伴うことなく、タンパク質構造におけるある特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することができる。タンパク質の相互作用能力および性質は、該タンパク質の生物学的機能活性を定義するため、同様の性質を有するタンパク質を得ながら、タンパク質配列において、また、当然ながら、配列をコードするそのＤＮＡにおいて、ある特定のアミノ酸置換を為すことができる。よって、その生物学的活性の認識できる損失を伴うことなく、本発明の抗体配列または前記ポリペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に様々な変化を為すことができることが企図される。
【０１５６】
一実施形態において、アミノ酸変化は、遺伝暗号の保存に基づき保存的置換をコードするように、ＤＮＡ配列におけるコドンを変化させることにより達成することができる。特に、遺伝暗号（下に示す）によって定義される通り、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、該タンパク質をコードし得るヌクレオチド配列との間には、公知かつ確定的な一致がある。同様に、遺伝暗号によって定義される通り、特定の核酸のヌクレオチド配列と、該核酸にコードされるアミノ酸配列との間には、公知かつ確定的な一致がある。
【０１５７】
遺伝暗号
アラニン（Ａｌａ、Ａ）  ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）  ＡＧＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ
アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）  ＡＡＣ、ＡＡＴ
アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）  ＧＡＣ、ＧＡＴ
システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）  ＴＧＣ、ＴＧＴ
グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）  ＧＡＡ、ＧＡＧ
グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）  ＣＡＡ、ＣＡＧ
グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）  ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ
ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）  ＣＡＣ、ＣＡＴ
イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）  ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＴ
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）  ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ
リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）  ＡＡＡ、ＡＡＧ
メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）  ＡＴＧ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）  ＴＴＣ、ＴＴＴ
プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）  ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ
セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）  ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ
スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）  ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ
トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）  ＴＧＧ
チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）  ＴＡＣ、ＴＡＴ
バリン（Ｖａｌ、Ｖ）  ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ
終結シグナル（終わり）  ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ
【０１５８】
遺伝暗号の重要な周知の特色は、その重複性であり、それによって、タンパク質の作製に用いられる大部分のアミノ酸に対し、２種以上のコードヌクレオチドトリプレットが用いられ得る（上に説明）。したがって、多数の異なるヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列をコードすることができる。かかるヌクレオチド配列は、あらゆる生物において同じアミノ酸配列の産生をもたらすため（ただし、ある特定の生物は、ある配列を他の配列よりも効率的に翻訳することができる）、機能的均等であると考慮される。さらに、時には、所定のヌクレオチド配列においてプリンまたはピリミジンのメチル化変異体を見出すことができる。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンおよび対応するアミノ酸の間のコード関係性に影響を与えない。
【０１５９】
前述を踏まえて、遺伝暗号を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳させることにより、本発明の融合タンパク質またはポリペプチド（またはそのいずれかの部分）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を用いて、融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列を派生させることができる。同様に、融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列に対して、該融合タンパク質またはポリペプチドをコードし得る対応するヌクレオチド配列は、遺伝暗号（これはその重複性によって、いずれか所定のアミノ酸配列のために複数の核酸配列を産生するであろう）から推定され得る。よって、融合タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書における記載および／または開示は、該ヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示も含むものと考慮するべきである。同様に、本明細書における融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列の記載および／または開示は、該アミノ酸配列をコードし得るあらゆる可能なヌクレオチド配列の記載および／または開示も含むものと考慮するべきである。
【０１６０】
ポリペプチドのアミノ酸（amino）配列に変化を生じさせる際に、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質への相互作用的生物学的機能の付与における疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、本技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対的疎水性親水性指標特性が、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いでこれが、他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原その他と該タンパク質との相互作用を規定することが許容される。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいて疎水性親水性指標に割り当てられ、これを次に示す：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（＜ＲＴＩ  ３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１６１】
ある特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換し、依然として、同様の生物学的活性を有するタンパク質をもたらす、即ち、依然として、生物学的機能的に均等なタンパク質を得ることができることが本技術分野において公知である。
【０１６２】
上に概要を述べる通り、したがってアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズその他に基づく。様々な前述の特徴を考慮に入れる例示的な置換は、当業者に周知であり、次のもの含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【０１６３】
本発明のポリペプチドまたは抗体のアミノ酸修飾の別の種類は、例えば、安定性を増加させるような、抗体の本来のグリコシル化パターンの変更に有用となり得る。「変更」とは、抗体に見出される１個または複数の糖鎖の欠失および／または抗体に存在しない１個または複数のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合型である。「Ｎ結合型」は、アスパラギン残基の側鎖への糖鎖の取り付けを指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素による取り付けのための認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうち１種または複数を含有するように（Ｎ結合型グリコシル化部位のため）、アミノ酸配列を変更することにより簡便に達成される。共有結合修飾の別の種類は、抗体へのグリコシドの化学的または酵素によるカップリングに関与する。これらの手順は、ＮまたはＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点において有利である。用いられているカップリング機序に応じて、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システイン等の遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリン等の遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファン等の芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に糖（複数可）を取り付けることができる。例えば、かかる方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
【０１６４】
同様に、抗体に存在するいずれかの糖鎖の除去は、化学的にまたは酵素により達成することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物、トリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物への抗体の曝露を必要とする。この処理は、抗体をインタクトにしたまま、連結する糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分または全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Sojahr H. et al. (1987)およびEdge, A S. et al. (1981)によって記載されている。抗体における糖鎖の酵素による切断は、Thotakura, N R. et al. (1987)によって記載されている種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成することができる。
【０１６５】
他の修飾は、イムノコンジュゲートの形成に関与し得る。例えば、共有結合修飾の１種類において、抗体またはタンパク質は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に表記されている様式で、種々の非タンパク質性ポリマーの１種、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに共有結合により連結される。
【０１６６】
異種薬剤と本発明の抗体または他のタンパク質とのコンジュゲートは、Ｎ−サクシニミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）、サクシニミジル（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル（アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ等）、活性エステル（スベリン酸ジサクシニミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物［ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等］、ビス−ジアゾニウム誘導体［ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等］、ジイソシアネート［トルエン（tolyene）２，６ジイソシアネート等］およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）の二官能性誘導体等が挙げられるがこれらに限定されない、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて行うことができる。例えば、炭素標識された１−イソチオシアネートベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジオヌクレオチドのコンジュゲートのための例示的なキレート化剤である（ＷＯ９４／１１０２６）。
【０１６７】
別の態様において、本発明は、細胞毒、薬物および／または放射性同位元素等、治療用部分にコンジュゲートされた抗Ｇａｌ１抗体を特色とする。細胞毒にコンジュゲートされる場合、これらの抗体コンジュゲートは、「免疫毒素」と称される。細胞毒または細胞傷害剤は、細胞に有害な（例えば、殺傷する）いずれかの薬剤を含む。例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤として、代謝拮抗薬［例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（decarbazine）］、アルキル化剤［例えば、メクロレタミン、チオテパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン］、アントラサイクリン［例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン］、抗生物質［例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ）］および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、放射性同位元素、例えば、放射性ヨウ素にコンジュゲートして、がん等、関連する障害を治療するための細胞傷害性放射性医薬品を生成することができる。
【０１６８】
コンジュゲートされた抗Ｇａｌ１抗体は、治療レジメンの一部として組織において治療用に用いることができる。一部の実施形態において、検出が有用であり、検出可能な物質へと抗体をカップリング（即ち、物理的に連結）することにより検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例として、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料および放射性材料が挙げられる。適した酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適した補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適した蛍光材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリン（ＰＥ）が挙げられ；発光材料の例として、ルミノールが挙げられ；生物発光材料の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；適した放射性材料の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。［０１３４］本明細書において用いられる場合、抗体に関する用語「標識された」は、放射性薬剤またはフルオロフォア［例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５）］等、検出可能な物質を抗体にカップリング（即ち、物理的に連結）することによる抗体の直接標識と共に、検出可能な物質との反応性による抗体の間接標識を包含することを目的とする。
【０１６９】
本発明の抗体コンジュゲートを用いて、所定の生物学的応答を修飾することができる。治療用部分は、古典的化学的治療剤に限定されるものとして解釈するべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保持するタンパク質またはポリペプチドとなり得る。かかるタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素もしくはジフテリア毒素等、酵素的な活性毒素またはその活性断片；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−．ガンマ等、タンパク質；または例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）もしくは他のサイトカインまたは成長因子等、生物学的応答修飾因子を含むことができる。
【０１７０】
抗体へとかかる治療用部分をコンジュゲートするための技法は、周知であり、例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303 16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62:119 58 (1982)を参照されたい。
【０１７１】
一部の実施形態において、コンジュゲートは、細胞における細胞傷害剤または成長阻害剤の放出を容易にする「切断可能リンカー」を用いて行うことができる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ−感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（例えば、米国特許第５，２０８，０２０号を参照）を用いることができる。あるいは、抗体および細胞傷害剤または成長阻害剤を含む融合タンパク質を組換え技法またはペプチド合成により作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接した、またはコンジュゲートの所望の性質を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって離間した、コンジュゲートの該２部分をコードするそれぞれの領域を含むことができる。
【０１７２】
ＶＩ．本発明の使用および方法
本明細書に記載されている抗Ｇａｌ１中和エピトープ薬剤（例えば、核酸、ポリペプチド、ベクター、宿主細胞その他）を用いて、抗Ｇａｌ１中和薬剤を設計することができる。特に、例えば、本発明のポリペプチドに関するタンパク質ドメイン、構造情報その他を含む、抗Ｇａｌ１治療剤の設計に有用な情報が、本明細書に記載されている。
【０１７３】
ａ．スクリーニングアッセイ
ある特異的な例示的な実施形態において、Ｇａｌ１活性に阻害効果を有するモジュレーター、即ち、候補または被験化合物または薬剤（例えば、抗体、ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣物、小分子、有機小分子または他の薬物）を同定するためのスクリーニングアッセイが提供される。
【０１７４】
当業者に公知の技法および方法を用いて、本明細書に記載されている通りに、かかるモジュレーターを同定および開発することができる。本発明のモジュレーターを用いて、Ｇａｌ１活性を阻害および／またはＧａｌ１媒介性障害を予防もしくは治療することができる。かかるモジュレーターを同定するための多数の方法は、本技術分野において公知である。例えば、かかる方法の１種において、Ｇａｌ１核酸またはポリペプチドが、被験薬剤と接触され、Ｇａｌ１媒介性グリカン結合活性が、該被験化合物の存在下で決定され、該化合物の非存在下（または対照化合物の存在下）における活性と比較した、該化合物の存在下における活性の減少が、該被験薬剤がＧａｌ１の活性をモジュレート（例えば、阻害または中和）することを示す。
【０１７５】
Ｇａｌ１活性のモジュレーターとして作用（例えば、阻害または中和）するその能力に関して検査するべき薬剤は、例えば、細菌、酵母もしくは他の生物によって産生（例えば、天然産物）、化学的に産生（例えば、ペプチド模倣物を含む小分子）または組換えにより産生することができる。上述の方法による使用のための化合物は、脂質、炭水化物、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、小分子、天然産物、アプタマーおよびポリヌクレオチドからなる化合物の群から選択することができる。ある特定の実施形態において、化合物は、ポリヌクレオチドである。
【０１７６】
種々のアッセイフォーマットが十分であり、本開示を踏まえ、明確に本明細書に記載されていないフォーマットであっても、当業者であれば、本明細書における教示に基づき把握することができる。アッセイフォーマットは、多くの異なる形態で作成することができ、無細胞系、例えば、精製されたタンパク質または細胞ライセートに基づくアッセイや、インタクトな細胞を利用する細胞に基づくアッセイを含む。単純な結合アッセイを用いて、例えば、Ｇａｌ１−グリカン複合体または相互作用の形成を阻害することにより、Ｇａｌ１活性をモジュレートする薬剤を検出することができる。Ｇａｌ１活性の阻害剤の同定に有用なアッセイの別の例は、競合的阻害アッセイに適切な条件下で、例えば、ポリペプチド、核酸、天然基質またはリガンド、抗体、または基質もしくはリガンド模倣物等、潜在的モジュレーターと１種または複数のＧａｌ１ポリペプチドとを組み合わせる競合的アッセイである。アッセイは、マイクロカロリメトリー、円二色性、キャピラリーゾーン電気泳動、核磁気共鳴分光法、蛍光分光法およびこれらの組み合わせ等が挙げられるがこれらに限定されない、多種多様な技法を用いた動態学的または熱力学的方法論を用いることができる。
【０１７７】
Ｇａｌ１と、ラクトサミン（lactoasamine）配列（複合体Ｎ−グリカンまたはコア２  Ｏ−グリカン等、Ｎ−グリカンおよび／またはＯ−グリカンにおけるＧａｌβ１，４  ＧｌｃＮＡｃまたはポリ−ＬａｃＮＡｃ残基）等の基質との間の相互作用は、種々の方法によって検出することができる。複合体形成のモジュレートは、例えば、放射標識された、蛍光標識されたまたは酵素により標識されたポリペプチドまたは結合パートナー等、検出可能に標識されたタンパク質を用いて、イムノアッセイまたはクロマトグラフィー検出によって定量化することができる。
【０１７８】
ある特定の実施形態において、被験試薬を固定化して、所望の反応物または産物の分離を容易にすることや、アッセイの自動化を適応させることが望ましくなり得る。例えば、本発明のポリペプチドは、担体分子に結合または物体に固定化することができる。一実施形態において、物体は、細胞、金属、樹脂、ポリマー、セラミック、ガラス、微小電極、黒鉛粒子、ビーズ、ゲル、プレート、アレイおよびキャピラリーチューブからなる群から選択される。アッセイは、反応物の含有に適したいずれかの容器内で達成することができる。例として、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管が挙げられる。一実施形態において、タンパク質をマトリクスに結合させることができるドメインを付加する、融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ポリペプチド（ＧＳＴ／ポリペプチド）融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着させて、続いてこれを結合パートナー、例えば、３５Ｓ標識結合パートナーおよび被験化合物と組み合わせ、僅かによりストリンジェントな条件が望まれる場合があるが、複合体形成に貢献する条件下、例えば、塩およびｐＨの生理的条件下で、この混合物をインキュベートすることができる。インキュベーション後に、ビーズを洗浄して、いかなる非結合標識も除去し、マトリクスを固定化し、放射標識を直接的に（例えば、ビーズをシンチラントに置く）、あるいは複合体がその後に解離された後の上清において決定する。あるいは、複合体は、マトリクスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ビーズ画分に見出される標的ポリペプチドのレベルを、添付の実施例に記載されている技法等、標準電気泳動的技法を用いてゲルから定量化することができる。
【０１７９】
マトリクスにタンパク質を固定化するための他の技法も、対象アッセイにおける使用に利用することができる。例えば、タンパク質は、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲートを利用して固定化することができる。例えば、ビオチン化ポリペプチド分子は、本技術分野において周知の技法（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミド）から調製し、ストレプトアビジンコーティングされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル内に固定化することができる。あるいは、本明細書に記載されているポリペプチドと反応性の抗Ｇａｌ１中和抗体をプレートのウェルへと誘導体化し、ポリペプチドを抗体コンジュゲートによりウェル内に捕捉することができる。上述の通り、結合パートナーおよび被験化合物の調製物は、プレートのポリペプチド提示ウェル内でインキュベートされ、ウェル内に捕捉された複合体の量を定量化することができる。かかる複合体を検出するための例示的な方法は、ＧＳＴ固定化された複合体に関する上述の方法に加えて、結合パートナーと反応性の、またはポリペプチドと反応性で結合パートナーと競合する抗体を用いた複合体の免疫検出；と共に、内因性または外因性活性のいずれかの、結合パートナーに関連する酵素活性の検出を利用する酵素結合アッセイを含む。後者の事例において、酵素は、化学的にコンジュゲートされ得る、あるいは結合パートナーとの融合タンパク質として提供され得る。
【０１８０】
本アッセイのある特定のインビトロ実施形態において、タンパク質−タンパク質、タンパク質−基質またはタンパク質−核酸相互作用に関与するタンパク質またはタンパク質のセットは、少なくとも半精製されたタンパク質の再構成されたタンパク質混合物を含む。半精製とは、再構成された混合物において利用されるタンパク質が、他の細胞またはウイルスタンパク質から以前に分離されたことを意味する。例えば、細胞ライセートとは対照的に、タンパク質−基質、タンパク質−タンパク質または核酸−タンパク質相互作用に関与するタンパク質は、混合物において、混合物中の他のあらゆるタンパク質と比べて少なくとも５０％純度となるよう存在し、より好ましくは、９０〜９５％純度で存在する。対象方法のある特定の実施形態において、再構成されたタンパク質混合物は、再構成された混合物が、所定のタンパク質−基質、タンパク質−タンパク質相互作用または核酸−タンパク質相互作用に起因する活性を測定する能力に干渉、さもなければ変更し得る他のタンパク質（細胞またはウイルス起源のタンパク質等）を実質的に欠くような、高度に精製されたタンパク質を混合することにより得られる。
【０１８１】
一実施形態において、再構成されたタンパク質混合物の使用は、タンパク質−基質、タンパク質−タンパク質または核酸−タンパク質相互作用条件のより慎重な制御を可能にする。さらに、この系は、タンパク質−タンパク質相互作用の特定の中間体状態のモジュレーターの発見を好むように派生させることができる。例えば、再構成されたタンパク質のアッセイは、候補薬剤の存在および非存在下の両方で行うことができ、これにより、所定のタンパク質−基質、タンパク質−タンパク質または核酸−タンパク質相互作用のモジュレーターの検出を可能にする。
【０１８２】
またさらなる実施形態において、中和Ｇａｌ１エピトープを発現するＧａｌ１剤は、対象アッセイを支持するための細胞培養技法を活用して、細胞全体において生成することができる。例えば、薬剤は、原核または真核細胞培養系において構成することができる。これは、細胞への侵入または接触を得る薬剤の能力を含む、モジュレーターの治療用途が必要とする環境により密接に近似する環境を可能にする。さらに、アッセイのある特定のインビボ実施形態は、候補薬剤のハイスループット解析を受け入れる。
【０１８３】
構成成分の一部または全ては、外来性供給源に由来し得る。例えば、融合タンパク質は、組換え技法（発現ベクターの使用による等）や、融合タンパク質それ自体または該融合タンパク質をコードするｍＲＮＡのマイクロインジェクションによって細胞に導入することができる。さらに、対象アッセイの細胞全体の実施形態において、レポーター遺伝子コンストラクトは、発現により、選択可能マーカーをもたらすことができる。
【０１８４】
レポーター遺伝子からの転写の量は、適した当業者に公知のいずれかの方法を用いて測定することができる。例えば、特異的ｍＲＮＡ発現は、ノーザンブロットを用いて検出することができる、あるいは特異的タンパク質産物は、特徴的な染色、ウエスタンブロットまたは固有の活性によって同定することができる。ある特定の実施形態において、レポーター遺伝子の産物は、該産物に関連する固有の活性によって検出される。例えば、レポーター遺伝子は、酵素活性により、色、蛍光または発光に基づく検出シグナルを生じる遺伝子産物をコードすることができる。
【０１８５】
化合物のライブラリー（例えば、ファージディスプレイ）および天然抽出物を検査する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいて、所定の期間において調査される化合物の数を最大化するために、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製タンパク質またはライセートによるアッセイ等、無細胞系で行われる本発明のアッセイは、多くの場合、被験化合物によって媒介される分子標的の変更の迅速な開発および相対的に容易な検出を可能にするように生成できるという点において、「一次」スクリーニングとして好まれる。さらに、被験化合物の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの効果は、一般に、インビトロ系において無視することができ、アッセイは代わりに、他のタンパク質との結合親和性の変更または分子標的の酵素的性質の変化において現れ得るような、分子標的における薬物の効果が主に着目される。
【０１８６】
Ｇａｌ１活性は、上述の通り当業者に周知の種々の方法を用いて同定および／またはアッセイすることができる。例えば、Ｎ−グリカン分枝のＧａｌ１遮断または防止によるＧａｌ１−グリカン相互作用の標的化された破壊をアッセイすることができる。かかるアッセイは、本技術分野において周知である（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１１４０９号およびＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１１／０６０２７２を参照）。
【０１８７】
ｂ．免疫原を用いる方法
上述の通り、本発明は、免疫原として有用な組成物（例えば、本明細書に記載されているポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、免疫原性組成物その他）を提供する。かかる免疫原は、本技術分野において公知の多数の経路のいずれか（例えば、強い抗体応答の誘発と適合性になるような）で投与することができる。投与は、注射、注入、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜内、くも膜下腔内または他の適した経路によるものとなり得る。好ましくは、本組成物は、静脈内、皮下、皮内もしくは筋肉内経路またはこれらのいずれかの組み合わせにより投与される。免疫化プロトコールは、少なくとも１回のプライミング用量と、続く経時的に投与される１回または複数のブースティング用量を含むことができる。本免疫原性ポリペプチドの免疫原的有効量の例示的な範囲は、約５〜約５００μｇ／ｋｇ体重である。好まれる範囲は、約１０〜１００μｇ／ｋｇである。
【０１８８】
一実施形態において、免疫原の１または複数の単位用量が、１、２または３時点で与えられる。ブーストの最適な数およびタイミングは、ルーチン実験法を用いて容易に決定することができる。例示的な「プライム−ブースト」レジメンは、米国特許第６，２１０，６６３号およびＷＯ００／４４４１０に記載されている。本発明に係る一方法は、プライミング組成物の投与による哺乳類対象の「プライミング」に関与する。「プライミング」は、本明細書において用いられる場合、抗原を用いた第１の免疫化が、同じ抗原による第２の免疫化後に抗原に対する免疫応答の生成を可能にするいずれかの方法を意味し、第２の免疫応答は、第１の免疫化が与えられない場合に達成されるものよりも大きくなる。
【０１８９】
好ましくは、ブースティング組成物は、哺乳類対象へのプライミング組成物の投与後の約２〜２７週間後に投与される。ブースティング組成物の投与は、プライミング組成物によって投与されるものと同じ抗原を含有するまたはそのデリバリーを可能にする有効量のブースティング組成物を用いて達成される。本明細書において用いられる場合、用語「ブースティング組成物」は、一実施形態として、プライミング組成物またはその前駆体におけるものと同じ抗原を含有するが、異なる形態の組成物を含み、ブースティング組成物は、宿主における免疫応答を誘導する。特定の一実施形態において、ブースティング組成物は、組換え可溶性タンパク質を含む。
【０１９０】
一実施形態において、ブースティング組成物は、タンパク質抗原をコードするＤＮＡ配列を含有する複製コンピテントまたは複製欠損組換えウイルスである。ブースティング組成物の例は、哺乳類の組織における抗原の発現を方向づける調節配列との作動可能な関連において、抗原をコードするＤＮＡ配列を含有する細菌組換えベクターである。一例は、組換えＢＣＧベクターである。他の例として、とりわけサルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）およびリステリア属（Listeria）に基づく組換え細菌ベクターが挙げられる。ブースティング組成物のさらに別の例は、哺乳類の組織における抗原の発現を方向づける調節配列との作動可能な関連における抗原をコードするが、追加的なベクター配列を含有しないネイキッドＤＮＡ配列である。これらのワクチンは、薬学的に適したまたは生理的に許容される担体をさらに含有することができる。さらに追加的な実施形態において、ブースティング組成物は、全てアジュバント、ケモカインおよび／またはサイトカインありまたはなしの、タンパク質またはペプチド（インタクトおよび変性された）、加熱殺菌組換えワクチン、不活性化微生物全体、本タンパク質をパルスしたまたはこれをコードする核酸分子を感染／遺伝子導入した抗原提示細胞その他を含むことができる。
【０１９１】
抗原性免疫原の代表的形態は、「ネイキッド」ＤＮＡプラスミド、「ネイキッド」ＲＮＡ分子、複製もしくは非複製ウイルスベクターにパッケージされたＤＮＡ分子、複製もしくは非複製ウイルスベクターにパッケージされたＲＮＡ分子、細菌ベクターにパッケージされたＤＮＡ分子または単独のもしくはウイルス様粒子に存在する抗原のタンパク質性形態あるいはこれらの組み合わせを含む。
【０１９２】
一実施形態において、目的とする免疫原性薬剤は、対象に投与することができる。一部の実施形態において、生物学的性質が増強された融合タンパク質を構築し、投与することができる。加えて、ポリペプチドは、免疫原性、バイオアベイラビリティの増加および／またはタンパク質分解の減少等、望ましい生物学的活性をさらに増強するために、本技術分野において周知の薬理学的方法に従って修飾することができる（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化等）。
【０１９３】
一実施形態において、いずれかの宿主における非感染性粒子であり、生きたウイルス粒子のタンパク質構成成分の全てを含有しない、「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」を用いることができる。一実施形態において、ＶＬＰは、本明細書に記載されているポリペプチドを含有し、膜に包まれたウイルス様粒子を形成する。ＶＬＰを用いる利点は、（１）免疫刺激性であるその粒子状および多価性質と、（２）ネイティブに近い、膜関連型におけるジスルフィド安定化されたエンベロープ糖タンパク質を提示する能力とを含む。ＶＬＰは、同じ細胞においてウイルスタンパク質（例えば、本明細書に記載されているポリペプチド）を同時発現させることにより産生される。これは、ウイルスタンパク質をコードする適切な発現ベクター（複数可）の遺伝子導入、ＶＬＰタンパク質をコードする１種または複数の組換えウイルス（例えば、ワクシニア）による細胞の感染、または細胞のレトロウイルス形質導入等、当業者に周知の異種遺伝子発現のいくつかの手段のいずれかにより達成することができる。かかるアプローチの組み合わせを用いることもできる。ＶＬＰは、インビトロまたはインビボのいずれかで産生することができる。ＶＬＰは、ショ糖または他の層形成物質における遠心分離およびクロマトグラフィーを含む当業者に周知の方法により、精製型で産生することができる。
【０１９４】
即時核酸デリバリーを用いる実施形態に関して、ヒトもしくは非ヒト哺乳類またはその細胞等、対象へのポリヌクレオチドの導入のためのいずれかの手段は、企図されるレシピエントへの本発明の様々なコンストラクトのデリバリーのための本発明の実施に適応させることができる。本発明の一実施形態において、ＤＮＡコンストラクトは、遺伝子導入により、即ち、「ネイキッド」ＤＮＡのまたはとコロイド分散系の複合体におけるデリバリーにより細胞にデリバリーされる。コロイド系は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質に基づく系を含む。本発明の好まれるコロイド系は、脂質複合体形成されたまたはリポソーム製剤化されたＤＮＡである。前者のアプローチにおいて、例えば脂質によるＤＮＡの製剤化に先立ち、所望のＤＮＡコンストラクトを有する導入遺伝子を含有するプラスミドを先ず実験により発現のために最適化することができる［例えば、５’非翻訳領域におけるイントロンの包接および不必要な配列の排除（Felgner, et al., Ann NY Acad Sci 126-139, 1995）］。例えば、次に、様々な脂質またはリポソーム材料によるＤＮＡの製剤化を公知の方法および材料を用いて行い、レシピエント哺乳類にデリバリーすることができる。例えば、Canonico et al., Am J Respir Cell Mol Biol 10:24-29, 1994；Tsan et al., Am J Physiol 268；Alton et al., Nat Genet. 5:135-142, 1993；およびCarson et al.による米国特許第５，６７９，６４７号を参照されたい。
【０１９５】
リポソームの標的化は、解剖学的および機構的因子に基づき分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的およびオルガネラ特異的に基づく。機構的標的化は、受動的であるか能動的であるかに基づき区別することができる。受動的標的化は、類洞毛細管を含有する臓器における網内系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの天然の傾向を利用する。能動的標的化は、他方では、天然起源の局在化部位以外の臓器および細胞型への標的化を達成するために、モノクローナル抗体、糖、糖脂質もしくはタンパク質等、特異的リガンドへのリポソームのカップリングによる、またはリポソームの組成物もしくはサイズの変化によるリポソームの変更に関与する。
【０１９６】
標的化デリバリーシステムの表面は、種々の仕方で修飾することができる。リポソーム標的化デリバリーシステムの場合、リポソーム二重層との安定的な会合において標的化リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層に脂質基を取り込むことができる。標的化リガンドに脂質鎖を連結するために、様々な連結基を用いることができる。ネイキッドＤＮＡまたはデリバリー媒体、例えば、リポソームに会合するＤＮＡを対象におけるいくつかの部位に投与することができる（後述を参照）。
【０１９７】
核酸は、任意の所望のベクターにおいてデリバリーすることができる。これらは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびプラスミドベクターを含む、ウイルスまたは非ウイルスベクターを含む。例示的な種類のウイルスは、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）を含む。核酸は、ウイルス粒子中、リポソーム中、ナノ粒子中およびポリマーへの複合体形成を含む、十分に効率的なデリバリーレベルをもたらす任意の所望のフォーマットで投与することができる。
【０１９８】
目的とするタンパク質または核酸をコードする核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクターまたは本技術分野において公知の他のベクター中に存在し得る。かかるベクターは周知であり、特定の適用のためにいずれを選択してもよい。本発明の一実施形態において、遺伝子デリバリー媒体は、プロモーターおよびデメチラーゼコード配列を含む。好まれるプロモーターは、組織特異的プロモーター、ならびにチミジンキナーゼおよびチミジル酸シンターゼプロモーター等、細胞増殖によって活性化されるプロモーターである。他の好まれるプロモーターは、α−およびβ−インターフェロンプロモーター等、ウイルスによる感染によって活性化できるプロモーター、ならびにエストロゲン等、ホルモンによって活性化できるプロモーターを含む。用いることのできる他のプロモーターは、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーターおよびマウスアルブミンプロモーターを含む。プロモーターは、構成的または誘導性となり得る。
【０１９９】
別の実施形態において、ネイキッドポリヌクレオチド分子は、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている通り、遺伝子デリバリー媒体として用いることができる。かかる遺伝子デリバリー媒体は、成長因子ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとなることができ、ある特定の実施形態において、殺傷されたアデノウイルスに連結される。Curiel et al., Hum. Gene. Ther. 3:147-154, 1992。用いてもよい他の媒体は、ＤＮＡ−リガンド（Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989）、脂質−ＤＮＡ組み合わせ（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413 7417, 1989）、リポソーム（Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7851-7855, 1987）および微粒子銃（Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2726-2730, 1991）を含む。
【０２００】
遺伝子デリバリー媒体は、ウイルス複製起点またはパッケージングシグナル等、ウイルス配列を含んでもよい。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルス等、ウイルスから選択することができる。好まれる実施形態において、成長因子遺伝子デリバリー媒体は、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびその様々な使用は、例えば、Mann et al., Cell 33:153, 1983, Cane and Mulligan, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6349, 1984、Miller et al., Human Gene Therapy 1:5-14, 1990、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号および同第４，９８０，２８９ならびにＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／０２，４６８、ＷＯ８９／０５，３４９およびＷＯ９０／０２，８０６を含む、多数の参考文献に記載されている。例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864, 1993；Vile and Hart, Cancer Res. 53:962-967, 1993；Ram et al., Cancer Res. 53:83-88, 1993；Takamiya et al., J. Neurosci. Res. 33:493-503, 1992；Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735, 1993（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１／０２８０５）に記載されている媒体を含む、多数のレトロウイルス遺伝子デリバリー媒体を本発明において利用することができる。
【０２０１】
本発明のポリヌクレオチドのデリバリーに用いることができる他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（Woo et al., issued Can 20, 1997による米国特許第５，６３１，２３６号およびNeurovexによるＷＯ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス［Ridgeway (1988) Ridgeway, “Mammalian expression vectors,” In: Rodriguez R L, Denhardt D T, ed. Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth,；Baichwal and Sugden (1986) “Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes,” In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press；Coupar et al. (1988) Gene, 68:1-10］および数種類のＲＮＡウイルスに由来した。好まれるウイルスは、アルファウイルス、ポックスウイルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスその他を含む。これらは、様々な哺乳類細胞に対しいくつかの魅力的な特色を提供する［Friedmann (1989) Science, 244:1275-1281；Ridgeway, 1988、上記参照；Baichwal and Sugden, 1986、上記参照；Coupar et al., 1988；Horwich et al.(1990) J.Virol., 64:642-650］。
【０２０２】
免疫原は、アジュバントまたは他の免疫刺激薬と共に投与することができる。よって、免疫原は、好ましくは、免疫応答のブースティングに用いられる融合タンパク質免疫原に加えられる、１種または複数のアジュバントまたは免疫刺激剤をさらに含むことができる。アジュバントは、免疫原またはワクチン製剤に加えて、タンパク質またはポリペプチド等、免疫原性部分の免疫刺激性質を増強することができるいずれかの物質である。リポソームもアジュバントであると考えられる。例えば、Gregoriades, G. et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, New York, 1989；Michalek, S. M. et al., Liposomes as Oral Adjuvants, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 146:51-58 (1989)を参照されたい。免疫原の有効性のために加えることができるアジュバントまたは薬剤の例として、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）、硫酸ベリリウム、シリカ、カオリン、炭素、油中水型エマルションおよび水中油型エマルションが挙げられる。他のアジュバントは、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ならびに様々なＭＤＰ誘導体および製剤、例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニル−（β，１−４）−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＧＭＤＰ）（Hornung, R L et al., Ther Immunol 1995 2:7-14）またはＩＳＡＦ−１［０．４ｍｇのスレオニル−ムラミルジペプチドを含有するリン酸緩衝溶液における、５％スクアレン、２．５％プルロニックＬ１２１、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０；Kwak, L W et al., (1992) N. Engl. J. Med., 327: 1209-1238を参照］および０．０２％トリエタノールアミンに可溶化されたモノホスホリルリピドＡアジュバントである。他の有用なアジュバントは、細菌内毒素、脂質Ｘ、細菌プロピオニバクテリウム・アクネス（Propionobacterium acnes）もしくはボルデテラ・パータシス（Bordetella pertussis）の生物全体もしくは細胞下画分、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニンおよびＱＳ２１等のサポニン誘導体［White, A. C. et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol., 303:207-210］、これは現在、診療所で用いられている［Helling, F et al. (1995) Cancer Res., 55:2783-2788；Davis, T A et al. (1997) Blood, 90: 509A (abstr.)］、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキストラン、ブロックコポリマーまたは他の合成アジュバントであるまたはこれらに基づく。市販のアジュバントの例として、（ａ）油に溶解した脱油レシチンでできた水中油型アジュバントであるＡｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）［例えば、米国特許第５，０８４，２６９号および米国特許出願公開第２００５００５８６６７（Ａ１）号を参照］および（ｂ）水酸化アルミニウムゲルであるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）が挙げられる。アルミニウムは、ヒト用途に承認されている。アジュバントは、様々な供給源から市販されている、例えば、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）。免疫原性材料は、ラテックスまたは金ビーズ、ＩＳＣＯＭその他等、ビーズに吸着またはコンジュゲートさせることができる。フロイントアジュバント（完全および不完全の両方）およびミョウバンゲル等、伝統的な製剤が、抗原を少なくとも部分的に変性し、立体構造エピトープの破���または提示不足をもたらすことの証拠がある。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）含有アジュバントに属するＲｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）を用いて、この問題を克服することができる。いくつかの試験の結果は、ＭＰＬ含有アジュバントを用いて製剤化された抗原が、変性抗原ではなくネイティブ抗原に優先的に結合する抗体を誘発したことを示す［Earl, P. L., et al., J. Virol 68:3015-3026 (1994)；VanCott T. C., et al., J. Virol 71:4319-4330 (1997)］。
【０２０３】
免疫原は、免疫刺激性サイトカイン、リンホカインまたはケモカインを補充することもできる。例示的なサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、インターロイキン１、インターロイキン２、インターロイキン１２、インターロイキン１８またはインターフェロン−ガンマを限定することなく含む。
【０２０４】
免疫原性医薬組成物およびワクチンを調製する一般的方法は、本技術分野において周知である（例えば、Remington's Pharmaceutical Science；Mack Publishing Company Easton, Pa.を参照）。
【０２０５】
一態様において、本発明は、当業者に公知の方法によって抗Ｇａｌ１中和薬剤（例えば、抗体およびアプタマー）の産生に用いることができる免疫原を提供する。次に、産生された抗体をＧａｌ１媒介性障害である対象に投与することができる、あるいはＧａｌ１媒介性障害を予防することができる。ハイブリドーマ産生に関与する一実施形態において、試料を多数の技法によってスクリーニングして、本明細書に記載されている免疫原への結合を特徴付けることができる。あるアプローチは、本発明に関する免疫原に結合するＥＬＩＳＡに関与する。１種または複数の免疫原への結合に対し検査が陽性の血清試料を有する動物は、ＭＡｂ産生における使用のための候補である。ＭＡｂ産生において用いるべき動物の選択のための判断基準は、動物の血清における中和抗体、または中和の非存在下における所望の免疫原に対する適切な結合パターンの証拠に基づく。
【０２０６】
ＭＡｂ産生に由来するハイブリドーマ上清は、所望の免疫原への結合に関するＥＬＩＳＡ、ライセートおよび表面免疫沈降アッセイに関してスクリーニングすることができる。結合アッセイのいずれかにおいて陽性の試料をスクリーニングして、上述の通りＧａｌ１活性を中和するその能力を確認することができる。本明細書に記載されているいずれかのアッセイに関して、被験薬剤の結果は、正規化目的のため、タイトレーションまたは陽性対照（例えば、公知の広範な中和抗体）に対し比較することができる。
【０２０７】
ｃ．治療方法
一態様において、本発明は、対象がＧａｌ１媒介性障害を患うようになるのを予防する方法であって、本明細書に記載されている予防的有効量のＧａｌ１中和薬剤を対象に投与して、これにより、前記対象が前記Ｇａｌ１媒介性障害を患うようになるのを予防することを含む方法を提供する。
【０２０８】
別の態様において、本発明は、対象がＧａｌ１媒介性障害に感染するようになる見込みを低下するための方法であって、本明細書に記載されている予防的有効量のＧａｌ１中和薬剤を対象に投与して、これにより、前記対象が前記Ｇａｌ１媒介性障害を患うようになる見込みを低下することを含む方法を提供する。
【０２０９】
さらに別の態様において、本発明は、対象におけるＧａｌ１媒介性障害の発病を予防もしくは遅延させるためまたはその進行速度を遅らせるための方法であって、本明細書に記載されている治療的有効量のＧａｌ１中和薬剤を対象に投与して、これにより、前記対象における前記Ｇａｌ１媒介性障害発病を予防もしくは遅延またはその進行速度を遅らせることを含む方法を提供する。
【０２１０】
よって、一部の実施形態において、対象における望まれないＧａｌ１活性が低下するように、本明細書に記載されている免疫原を用いて、対象を免疫化することができる。他の実施形態において、本明細書に記載されている免疫原を用いて、Ｇａｌ１媒介性障害を患っていない対象を免疫化することができる。
【０２１１】
個々の投薬量が、担当臨床医の判断、治療されている状態の重症度および用いられている特定の化合物における対象の要件に応じて変動され得ることが認められよう。治療的有効量または用量の決定において、特定の薬剤の薬力学的特徴ならびにその投与機序および経路；治療の所望の時間経過；哺乳類の種；そのサイズ、年齢および総体的な健康；関与する特異的疾患；関与の程度または疾患の重症度；個々の対象の応答；投与される特定の化合物；投与の機序；投与される調製物のバイオアベイラビリティ特徴；選択される用量レジメン；併用治療の種類；ならびに他の関連する環境等が挙げられるがこれらに限定されない、多数の追加的な因子が担当臨床医によって考慮され得る。
【０２１２】
治療的用量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重および約１００μｇ／ｋｇ体重以下となり得る。当業者であれば、かかるガイドラインが、例えば、抗体断片の使用におけるまたは抗体コンジュゲートの使用における、活性薬剤の分子量に対して調整されることが理解されよう。投薬量は、局在化投与、例えば、鼻腔内、吸入等、または全身性投与、例えば、ｉ．ｍ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．その他に対しても変動され得る。治療は、化合物の有効用量未満の、より少ない投薬量から開始され得る。その後、一実施形態において、投薬量は、環境下における最適な効果に達するまで、小さい増分で増加されるべきである。便宜上、１日の総投薬量は、必要に応じてその日の間に部分に分割し投与することができる。
【０２１３】
抗ウイルス療法による治療の持続時間および／または用量は、特定の薬剤またはその組み合わせに応じて変動し得る。特定の抗ウイルス治療剤に適切な治療時間は、当業者によって認められるであろう。本発明は、抗ウイルス治療剤毎の最適な治療スケジュールの継続した評価を企図し、本発明の方法によって決定される対象のＧａｌ１媒介性障害の表現型は、最適な治療用量およびスケジュールの決定における因子である。
【０２１４】
本明細書に記載されている組成物は、非経口的、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内を含む、いずれか適した手段によって投与することができる。非経口的注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与を含む。加えて、組成物は、特に、減衰用量の抗体によるパルス注入により適切に投与することができる。
【０２１５】
一般に、治療法の開始に先立ち対象から第１の試料を得て、治療の際に１種または複数の試料を得ることが好ましい。かかる使用において、治療法に先立ちＧａｌ１媒介性障害の対象から得た細胞の発現のベースラインが決定され、続いて治療法の経過において、Ｇａｌ１媒介性障害の対象から得た細胞の発現のベースライン状態の変化をモニターする。あるいは、治療の際に得られる２種以上の連続的試料は、治療前ベースライン試料の必要なく用いることができる。かかる使用において、対象から得られる第１の試料は、Ｇａｌ１媒介性障害の対象から得た細胞の発現が、増加しているか減少しているか決定するためのベースラインとして用いられる。
【０２１６】
タンパク質、ペプチド、抗体および他の抗Ｇａｌ１剤等、他の薬剤と共に本明細書に開示されている免疫原性組成物を投与することがさらに有利となり得る。例えば、Ｇａｌ１ならびにＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ａＲおよびこれらの組み合わせ等の別の免疫阻害分子を発現する細胞を治療すると、治療相乗作用が現れるようになると考えられる。ある特定の実施形態において、免疫原性（immunonogenic）組成物は、他の薬剤の前または後等、他の治療剤と逐次に投与される。当業者であれば、逐次投与が、数時間、数日間、数週間、数ヶ月間またはさらには数年後等、適切な期間に続いて即時またはその直後を意味し得ることが分かるであろう。
【０２１７】
ある特定の実施形態において、治療は、ヒト等、哺乳類のものである。
【０２１８】
別の態様において、本発明は、１種または複数の薬学的に許容される担体（添加物）および／または希釈液と共に製剤化された、追加的な抗ウイルス剤および／または免疫原ありまたはなしの、本明細書に記載されている治療的有効量の組成物を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。詳細に後述する通り、本発明の医薬組成物は、次のものに適応された形態を含む、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化することができる：（１）経口投与、例えば、水薬（水性もしくは非水性溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト；（２）非経口的投与、例えば、無菌溶液もしくは懸濁液としての、例えば、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射による；（３）局所的適用、例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏もしくはスプレーとして；（４）腟内または直腸内に、例えば、ペッサリー、クリームもしくは泡として；または（５）エアロゾル、例えば、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物もしくは固体粒子として。
【０２１９】
語句「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触した使用に適した、過剰な毒性、過敏、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症がない、合理的なベネフィット／リスク比に釣り合った薬剤、材料、組成物および／または剤形を指すように本明細書において用いられる。
【０２２０】
語句「薬学的に許容される担体」は、本明細書において用いられる場合、ある臓器または身体の部分から別の臓器または身体の部分への対象化学物質の運搬または輸送に関与する、液体もしくは固体フィラー、希釈液、賦形剤、溶媒または被包材料等、薬学的に許容される材料、組成物または媒体を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、対象に対し傷害性ではないという意味において「許容される」必要がある。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の数例として、次のものが挙げられる：（１）ラクトース、グルコースおよびショ糖等、糖；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン等、デンプン；（３）ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等、セルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバターおよび坐剤ワックス等、賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油等、油；（１０）プロピレングリコール等、グリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等、ポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等、エステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等、緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；ならびに（２１）医薬品製剤において用いられる他の無毒性適合性物質。
【０２２１】
用語「薬学的に許容される塩」は、Ｇａｌ１発現および／または活性、または本発明に包含される複合体の発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤の相対的に無毒性の、無機および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、薬剤の最終単離および精製の際にインサイチュで、あるいはその遊離塩基形態の精製薬剤を適した有機または無機酸と別々に反応させ、このように生成された塩を単離することにより調製することができる。代表的な塩は、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩（laurylsulphonate）その他を含む［例えば、Berge et al. (1977) “Pharmaceutical Salts”, J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照］。
【０２２２】
他の事例において、本発明の方法において有用な薬剤は、１個または複数の酸性官能基を含有することができ、これにより、薬学的に許容される塩基により薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの事例における用語「薬学的に許容される塩」は、Ｇａｌ１発現および／または活性、または複合体の発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤の相対的に無毒性の、無機および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、同様に、薬剤の最終単離および精製の際にインサイチュで、あるいはその遊離酸形態の精製薬剤を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩もしくは炭酸水素塩等、適した塩基と、アンモニアとまたは薬学的に許容される有機一級、二級もしくは三級アミンと別々に反応させることにより調製することができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩は、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩その他を含む。塩基付加塩の生成に有用な代表的な有機アミンは、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンその他を含む（例えば、Berge et al.、上記参照）。
【０２２３】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等、湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、調味料および芳香剤、保存料および抗酸化剤が、組成物中に存在することもできる。
【０２２４】
薬学的に許容される抗酸化剤の例として、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムその他等、水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールその他等、油可溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸その他等、金属キレート化剤が挙げられる。
【０２２５】
本発明の方法において有用な製剤は、経口、経鼻、局所的（頬側および舌下を含む）、直腸、腟、エアロゾルおよび／または非経口的投与に適した製剤を含む。製剤は、単位剤形で簡便に提示することができ、薬学の技術分野において周知のいずれかの方法によって調製することができる。担体材料と組み合わせて単一剤形を産生することができる活性成分の量は、治療されている宿主、特定の投与機序に応じて変動するであろう。担体材料と組み合わせて単一剤形を産生することができる活性成分の量は、一般に、治療効果を産生する化合物の量となるであろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは、約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約１０パーセント〜約３０パーセントに及ぶであろう。
【０２２６】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、Ｇａｌ１発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤を、担体および存在してもよい１種または複数のアクセサリー成分と関連させる工程を含む。一般に、製剤は、薬剤を液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と均一かつ密接に関連させ、続いて必要であれば、産物を成形することにより調製される。
【０２２７】
経口投与に適した製剤は、それぞれ活性成分として所定の量の薬剤を含有する、カプセル、カシェー、丸剤、錠剤、薬用キャンディー［風味付けした基剤、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカントを用いる］、粉末、顆粒または、水性もしくは非水性液体における溶液もしくは懸濁液として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルションとして、またはエリキシル剤もしくはシロップとして、またはトローチ（pastille）（ゼラチンおよびグリセリン、またはショ糖およびアカシア等、不活性基剤を用いる）として、および／または口腔洗浄薬としてその他の形態となり得る。化合物は、ボーラス舐剤またはペーストとして投与することもできる。
【０２２８】
経口投与のための固体剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒その他）において、活性成分は、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムおよび／または次のうちいずれか等、１種または複数の薬学的に許容される担体と混合される：（１）デンプン、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸等、フィラーまたは増量剤（extender）；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖および／またはアカシア等、結合剤；（３）グリセロール等、保水剤；（４）寒天−寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム等、崩壊剤；（５）パラフィン等、溶解遅延剤；（６）四級アンモニウム化合物等、吸収促進剤；（７）例えば、アセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート等、湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土等、吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物等、潤滑剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は、緩衝剤を含むこともできる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖等、賦形剤や、高分子量ポリエチレングリコールその他を用いた軟および硬ゼラチンカプセルにおけるフィラーとして用いることもできる。
【０２２９】
錠剤は、圧縮または成形により作製することができ、１種または複数のアクセサリー成分を共に含有してもよい。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈液、保存料、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース）、表面活性または分散剤を用いて調製することができる。成形錠剤は、適した機械において、不活性液体希釈液で湿らせた粉末ペプチドまたはペプチド模倣物の混合物を成形することにより作製することができる。
【０２３０】
錠剤、ならびに糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒等の他の固体剤形は、腸溶コーティングおよび医薬品製剤化技術分野において周知の他のコーティング等、コーティングおよび殻を用いて得るかまたは調製してもよい。これは、例えば、所望の放出プロファイルをもたらすような変動比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを用いて、その中に存在する活性成分のゆっくりしたまたは制御された放出をもたらすように製剤化することもできる。これは、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過、または使用直前に無菌水もしくは他のいずれかの無菌注射用培地に溶解することができる無菌固体組成物の形態の滅菌薬剤の取り込みによって滅菌することができる。これらの組成物は、乳白剤を含有してもよく、必要に応じて遅延様式で、胃腸管のある特定の部分において活性成分（複数可）のみまたはこれを優先的に放出する組成物のものとなり得る。用いることのできる包埋組成物の例として、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。活性成分は、適切であれば、上述の賦形剤の１種または複数と共に、マイクロカプセル化形態となることもできる。
【０２３１】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油［特に、綿実、ラッカセイ（groundnut）、トウモロコシ、胚芽（germ）、オリーブ、ヒマシおよびゴマ油］、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルならびにこれらの混合物等、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤等、本技術分野において一般的に用いられる不活性希釈液を含有することができる。
【０２３２】
不活性希釈液に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁剤、甘味料、調味料、着色、芳香および保存料等、アジュバントを含むこともできる。
【０２３３】
懸濁液は、活性薬剤に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天−寒天およびトラガカントならびにこれらの混合物等、懸濁剤を含有することができる。
【０２３４】
直腸または腟投与のための製剤は、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックスまたはサリチル酸塩を含む、１種または複数の適した非刺激性賦形剤または担体と１種または複数の薬剤とを混合することによって調製することができ、室温では固体であるが体温で液体となり、したがって、直腸または腟腔内で融解し、活性薬剤を放出する坐剤として提示することができる。
【０２３５】
腟投与に適した製剤は、適切であることが本技術分野において公知の担体等の担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡またはスプレー製剤も含む。
【０２３６】
Ｇａｌ１発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤の局所的または経皮投与のための剤形は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入薬を含む。活性構成成分は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、また、必要とされ得るいずれかの保存料、バッファーまたは噴霧剤と混合することができる。
【０２３７】
軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、薬剤に加えて、動物および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛またはこれらの混合物等の賦形剤を含有することができる。
【０２３８】
粉末およびスプレーは、Ｇａｌ１発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末またはこれらの物質の混合物等の賦形剤を含有することができる。スプレーは、ブタンおよびプロパン等、クロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素等、通常の噴霧剤をその上含有することができる。
【０２３９】
Ｇａｌ１発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤は、あるいは、エアロゾルによって投与することができる。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物または固体粒子を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液を用いることができる。化合物の分解をもたらし得る剪断への薬剤の曝露を最小化するため、音波ネブライザーが好まれる。
【０２４０】
通常、水性エアロゾルは、従来の薬学的に許容される担体および安定剤と共に薬剤の水性溶液または懸濁液を製剤化することにより作製される。担体および安定剤は、特定の化合物の要件と共に変動するが、典型的には、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎｓ、プルロニックまたはポリエチレングリコール）、血清アルブミン等の無害タンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシン等のアミノ酸、バッファー、塩、糖または糖アルコールを含む。エアロゾルは、一般に、等張性溶液から調製される。
【０２４１】
経皮パッチは、身体への薬剤の制御されたデリバリーを提供する追加された利点を有する。かかる剤形は、適切な培地に薬剤を溶解または分散させることにより作製することができる。吸収エンハンサーを用いて、皮膚にわたるペプチド模倣物のフラックスを増加させることができる。かかるフラックスの速度は、速度制御膜の提供またはポリマーマトリクスもしくはゲルにおけるペプチド模倣物の分散のいずれかにより制御することができる。
【０２４２】
点眼用製剤、眼用軟膏、粉末、溶液その他も、本発明の範囲内であると企図される。
【０２４３】
非経口的投与に適した本発明の医薬組成物は、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、製剤を企図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質または懸濁もしくは増粘剤を含有し得る、１種または複数の薬学的に許容される無菌等張性水性もしくは非水性溶液、分散物、懸濁液もしくはエマルション、または使用直前に無菌注射用溶液もしくは分散物に再構成することができる無菌粉末と組み合わせた、１種または複数の薬剤を含む。
【０２４４】
本発明の医薬組成物において用いることができる適した水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールその他等）およびこれらの適した混合物、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング材料の使用により、分散物の場合は必要とされる粒子サイズの維持により、また、界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。
【０２４５】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤および分散剤等、アジュバントを含有することもできる。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸その他の包接によって保証することができる。糖、塩化ナトリウムその他等、等張剤を組成物に含むことも望ましくなり得る。加えて、注射用医薬品形態の延長された吸収は、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン等、吸収を遅延させる薬剤の包接によってもたらすことができる。
【０２４６】
一部の事例において、薬物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、不十分な水溶性を有する結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁液の使用により達成することができる。薬物の吸収の速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の遅延された吸収は、薬物を油媒体に溶解または懸濁することにより達成される。
【０２４７】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリド等、生分解性ポリマーにおいて、Ｇａｌ１発現および／または活性をモジュレート（例えば、中和）する薬剤のマイクロカプセル化マトリクスを形成することにより作製することができる。薬物のポリマーに対する比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルションに薬物を捕捉することによっても調製される。
【０２４８】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投薬量レベルは、対象に対し毒性となることなく、特定の対象、組成物および投与機序に所望の治療応答の達成に有効な活性成分の量を得ることができるように、本発明の方法によって決定することができる。
【０２４９】
本明細書に記載されている核酸分子は、ベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして用いることができる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位的注射［例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054 3057を参照］によって対象へとデリバリーすることができる。遺伝子療法ベクターの医薬品調製物は、許容される希釈液に遺伝子療法ベクターを含むことができる、あるいは遺伝子デリバリー媒体が包埋された遅延放出マトリクスを含むことができる。あるいは、完全遺伝子デリバリーベクターを、組換え細胞からインタクトで産生することができる場合、例えば、レトロウイルスベクターの場合、医薬品調製物は、遺伝子デリバリーシステムを産生する１個または複数の細胞を含むことができる。
【０２５０】
ＶＩＩ．キット
加えて、本発明は、本明細書に記載されている抗Ｇａｌ１剤を含むキットも包含する。例えば、本キットは、免疫チェックポイント阻害剤等、追加的な治療剤ありまたはなしの中和抗Ｇａｌ１抗体を含むことができる。薬剤は、適した容器内にパッケージすることができる。例えば、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも１種の免疫原性ペプチドおよび／または１種の抗体を含むキットを提供する。本発明のキットは、固体支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされた免疫原性ペプチドおよび／または抗体を含有することができる。
【０２５１】
キットは、キットに設計された特定の適用を容易にするための追加的な構成成分を含むことができる。キットが含有し得る例示的な薬剤は、対照に必要な試薬（例えば、対照生物学的試料またはＧａｌ１タンパク質標準）を含む。キットは、本開示発明の方法における使用のために認識されるバッファーおよび他の試薬をその上含むことができる。非限定的な例として、担体タンパク質または洗剤等、非特異的結合を低下させるための薬剤が挙げられる。本発明のキットは、本明細書に提供されている本開示発明の方法における本開示発明のキットまたは抗体の使用を開示または記載する説明用材料を含むこともできる。
【０２５２】
本発明は、限定するものと解釈するべきではない次の実施例によってさらに説明される。本明細書と共に図面を通して引用されているあらゆる参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０２５３】
治療適用に有用な中和抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体
中和抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体を生成し、生化学的アッセイおよび原発性腫瘍の免疫組織化学的解析においてヒト組換えＧａｌ１および内在性Ｇａｌ１と反応させた。加えて、Ｇａｌ１モノクローナル抗体のいくつかは、カニクイザル（cynomologous monkey）およびマウス由来の内在性Ｇａｌ１とも十分に交差反応した（図１）。エピトープマッピングは、８Ｂ５、８Ｆ４および８Ｇ３  Ｇａｌ１モノクローナル抗体が全て、以前に記載された糖結合ドメインに対し遠位のドメインを認識したことを示した（図２および表１）。
【０２５４】
これらの抗体（即ち、８Ｂ５、８Ｆ４および８Ｇ３）をその後に配列決定し、それぞれ同じ配列を有し、軽鎖がラムダであることを決定した。簡潔に説明すると、各ハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出し、定常領域特異的３’プライマーおよび縮重シグナル配列特異的５’プライマープールを用いてＲＴ−ＰＣＲに付した。増幅された産物をクローニングし、配列決定した。重鎖に関して、合計３６クローンを配列決定し；軽鎖に関して、合計１９クローンを配列決定した。配列アライメントは、全３種の抗体にわたり全クローンに対し同じ重鎖および軽鎖配列を生じた。これらの配列を下表１に示し、ハイブリドーマから得られる配列の解析を下表２に要約する。加えて、ハイブリドーマ細胞株８Ｆ４．Ｆ８．Ｇ７をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）に寄託し、寄託番号ＰＴＡ−１０５３５において、特許手続きのための微生物寄託の国際認識に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure）の規定に従って２００９年１２月１７日に受理された。米国特許出願公開第２０１３／００１１４０９号およびＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１１／０６０２７２は、８Ｆ４抗体を開示し、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５５】
【表２−１】
0006581982.tif 000005
【表２−２】
0006581982.tif 000006
【表２−３】
0006581982.tif 000007
*Kabatに従ったCDR定義およびタンパク質配列ナンバリング。それぞれCDR1、CDR2およびCDR3の順序で、CDRヌクレオチドおよびタンパク質配列を赤色または下線で強調。
【０２５６】
【表３】
0006581982.tif 000008
【実施例２】
【０２５７】
治療適用に有用な中和抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体の微細エピトープマッピング
８Ｆ４  ｍＡｂは、図１においてヒトＧａｌ１およびマウスＧａｌ１の両方と十分に交差反応し、表２においてＧａｌ１のポストＣＢＤドメインを認識することが決定され、微細エピトープマッピング解析にさらに付された。図２に示す、Ｅ．コリにおいて産生される７種のＧＳＴタグ付きのヒトＧａｌ１コンストラクトに加えて、ヒトＧａｌ１ポリペプチドの様々な部分に及ぶ５種の追加的な６×ＨＩＳタグ付きのヒトＧａｌ１コンストラクトを、エピトープマッピング解析における使用のためにＥ．コリにおいて生成した（図２）。図２は、アミノ酸が、フォールドされたヒトＧａｌ−１ポリペプチド（図３）の５−ストランドβ−シート（Ｆ１−Ｆ５）および６−ストランドβ−シート（Ｓ１−Ｓ６ａ／Ｓ６ｂ）におけるβ−ストランドに関して、各ＧＳＴタグ付きおよびＨＩＳタグ付きのコンストラクトマップに包含される仕方をさらに実証する。Ｇａｌ１中和８Ｆ４  ｍＡｂは、ウエスタンブロット解析によって組換えＨＩＳ−Ｆ７、ＨＩＳ−Ｆ５およびＨＩＳ−Ｆ９を認識することが決定された一方、抗Ｇａｌ１、非中和８Ａ１２  ｍＡｂは、ウエスタンブロット解析によって組換えＨＩＳ−Ｆ７およびＨＩＳ−Ｆ５を認識することが決定された（図３）。これらの結果は、８Ｆ４  ｍＡｂが、アミノ酸残基１０２〜１１５内でＧａｌ１に結合する一方、８Ａ１２  ｍＡｂは、アミノ酸残基１１６〜１３５内でＧａｌ１に結合することを示す（図５）。加えて、ヒトＧａｌ１中和８Ｆ４  ｍＡｂは、β−シートＦ５を認識し、これにより、グリカンへのヒトＧａｌ１の結合に立体的に干渉しこれを妨害するため、かかる微細エピトープマッピングデータは、Ｇａｌ１中和のための構造的基盤を定義する（図３）。対照的に、非中和８Ａ１２  ｍＡｂは、糖結合ドメインから空間的に遠く隔たるβ−シートＳ２／Ｆ１に結合する。
【実施例３】
【０２５８】
治療適用に有用な中和抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体の生物物理学的性質
８Ｆ４  ｍＡｂとＧａｌ１との相互作用の生物物理学的性質［例えば、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（ＫＤ）］をさらに定義するために、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）（ＳＰＲ）解析［生体分子相互作用解析（Biomolecular Interaction Analysis）ＢＩＡｃｏｒｅとも呼ばれる］も行った。２５℃で標準ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰにおいて、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ）にてＳＰＲ実験を行った。簡潔には、抗マウス抗体を先ず、ＣＭ−５センサーチップ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ）に捕捉した。後に、およそ２５０応答単位（ＲＵ）の８Ｆ４  抗Ｇａｌ１  ｍＡｂを固定化し（ｒｍＧａｌ１アッセイのほぼ３５０ＲＵを除いて）、続いて組換えガレクチン［ヒトガレクチン（galetin）−１、２、３、４、７、８、９またはマウスガレクチン−１（ｍＧａｌ１）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製］の様々な希釈を行って、８Ｆ４へのガレクチンの結合を評価した。バッファー単独を充填したチャネルの減算後に、全データを示す。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いて、単純な１：１（ラングミュア）結合モデルにデータを網羅的に適合させることにより、示されている結合曲線および平衡解離定数（ＫＤ）を得るためのデータ解析を行った。８Ｆ４  ｍＡｂは、組換えｈＧａｌ１および組換えｍＧａｌ１の両方により、ナノモル濃度（ｎＭ）レベルの親和性を示したが、ｒｍＧａｌ１に対する３８．５ｎＭと比較してｒｈＧａｌ１（ｒｈＧａｌ１に対し１３ｎＭのＫＤ）に対しより高い親和性を示した（図６）。加えて、８Ｆ４  ｍＡｂは、Ｇａｌ２、Ｇａｌ３、Ｇａｌ４、Ｇａｌ７、Ｇａｌ８およびＧａｌ９を含むより高い濃度の他の組換えガレクチンへの結合を示さなかったまたは非特異的結合を示した。
【実施例４】
【０２５９】
治療適用に有用な中和抗Ｇａｌ１モノクローナル抗体の選択性
ｒｍＧａｌ１の結合を上回る８Ｆ４  ｍＡｂによるｒｈＧａｌ１の結合に対する有意な優先性は、８Ｆ４  ｍＡｂが、インビボマウス腫瘍モデルにおけるｍＧａｌ１の遮断において相対的に有効性が低いという観察に関する追加的な説明を提供する。加えて、８Ｆ４  ｍＡｂが結合するエピトープに隣接するＣＢＤの領域Ｃ６１−Ｆ８０における２０個のアミノ酸のうち６個（３５％）は、ｍＧａｌ１およびｈＧａｌ１の間で異なる。これらのアミノ酸差は、ＣＢＤの立体構造を変更し、ｍＧａｌ１の８Ｆ４媒介性遮断の効率を限定すると考えられる。この効果は、８Ｆ４  ｍＡｂが結合するマウスおよびヒトエピトープに２個のアミノ酸差が存在するという事実によって複雑になるとさらに考えられる。よって、ヒトにおける臨床開発に対する８Ｆ４  ｍＡｂの適合性を評価するための前臨床マウス腫瘍モデルの使用は、８Ｆ４  ｍＡｂが、ｍＧａｌ１よりもｈＧａｌ１に対し高い親和性を有するという事実によって平衡を保つべきである。
【０２６０】
かかる使用は、免疫チェックポイント（checkpoing）阻害剤の阻害剤等、追加的な薬剤との組み合わせありまたはなしで企図される。例えば、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１／ＣＤ２７４としても公知）は、抗原提示細胞によって主に発現される同時刺激分子のＢ７ファミリーに属する細胞表面糖タンパク質であり、細胞性免疫応答を調節するように機能する［Zou et al. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8:467-477；Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704］。その同族受容体ＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、末梢組織における活性化Ｔ細胞の増殖を阻害し、ＰＤ−１遮断によって反転され得る機能的表現型である「Ｔ細胞消耗」をもたらす［Barber et al. (2006) Nature 439:682-687；Freeman et al. (2000) J Exp Med. 192:1027-1034；Dong et al. (1999) Nat. Med. 5:1365-1369］。肺、卵巣および結腸の癌腫；メラノーマ；未分化大細胞リンパ腫；成人Ｔ細胞リンパ腫；ならびに皮膚Ｔ細胞リンパ腫を含む多くのヒト悪性腫瘍は、ＰＤ−Ｌ１を発現するが、単球、マクロファージおよび胎盤合胞体栄養細胞（synctiotrophoblast）を除く正常ヒト組織は、免疫組織化学的検査によって検出可能レベルのＰＤ−Ｌ１を発現しない［Keir et al. (2008) Annu. Rev. Immunol. 26:677-704；Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:793-800；Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-5100；Kozako et al. (2009) Leukemia 23:375-382；Andorsky et al. (2011) Clin. Cancer Res. 17:4232-4244；Kantekure et al. (2012) Am. J. Dermatopathol. 34:126-128；Wilcox et al. (2009) Blood 114:2149-2158；Wilcox et al. (2012) Eur. J. Haematol. 88:465-475］。インビトロおよび前臨床試験は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の破壊が、免疫応答を強め、抗腫瘍活性を促進することを示した［Iwai et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99:12293-12297］。ヒト化抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体による近年の第Ｉ相臨床治験は、固体臓器悪性腫瘍、最も著しくは、メラノーマ、非小細胞肺癌および腎細胞癌の患者のサブセットにおいて耐久性のある臨床応答を産生し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の標的化に基づく治療法の有望な方針を示唆する［Brahmer et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28:3167-3175；Brahmer et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2455-2465；Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。
【０２６１】
本明細書に記載されている通り、Ｇａｌ１は、別の免疫調節分子である。Ｇａｌ１が、胃腸管悪性腫瘍、甲状腺乳頭癌、喉頭扁平上皮癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ＭＬＬ再編成Ｂリンパ芽球リンパ腫および古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）のリード−シュテルンベルク細胞を含む、種々の固形腫瘍およびリンパ増殖性障害によって発現されることが示された［Cedeno-Laurent et al. (2012) Blood 119:3534-3538；Juszczynski et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16:2122-2130；Saussez et al. (2007) International Journal of Oncology. 30:1109；Danguy et al. (2002) Biochim. Biophys. Acta. 1572:28528-28529；Yamamoto et al. (2008) Blood 111:3220-3224；Gandhi et al. (2007) Blood 110:1326-1329；Juszczynski et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104:13134-13139；Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277；Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618；Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322；Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res.14:3338-3344］。機能的アンタゴニスト抗体によるＧａｌ１ノックダウンまたは遮断は、メラノーマおよびカポジ肉腫（ＫＳ）の前臨床モデルにおいてＴ細胞依存性様式での腫瘍拒絶反応をもたらし［Rabinovich (2005) Br. J. Cancer. 92:1188-1192；Rubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251；Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］、ＰＴＬＤのモデルにおいてＥＢＶ感染ヒトＢ細胞を標的とするＣＤ８＋  Ｔ細胞のＧａｌ１媒介性アポトーシスを予防する［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］。
【０２６２】
がん療法に対するマルチモーダルおよびコンビナトリアルアプローチは、腫瘍病態形成に関与する複数の機序をますます標的化する。免疫回避は、ＣＴＬＡ４およびＰＤ−１等、免疫チェックポイント分子に対して作られたヒト化抗体による臨床治験を含む、いくつかの近年の進歩による魅力的な標的を提示するがんの新たに出現した特質である［Hanahan et al. (2011) Cell 144:646-674およびPardoll (2012) Nat. Rev. Cancer 12:252-264］。固形腫瘍の患者における抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１抗体による近年の第Ｉ相臨床治験は、治療有効性を改善するために、高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍を同定する信頼できる方法の必要を実証する［Brahmer et al. (2010) J. Clin. Oncol. 28:3167-3175；Brahmer et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2455-2465；およびTopalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。抗ＰＤ−１による治験において、免疫組織化学的検査によっていずれか検出可能な腫瘍関連ＰＤ−Ｌ１を発現した２５症例のうち９症例は、耐久性のある臨床応答を示したが、検出可能なＰＤ−Ｌ１を欠く腫瘍を有する患者における臨床効果は観察されなかった［Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366:2443-2454］。本明細書に記載されているデータは、高齢者および免疫無防備状態のＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、ＮＰＣならびにＥＮＫＴＣＬ症例の大部分における頑強な膜性ＰＤ−Ｌ１染色を実証する。ＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ、ＥＢＶ陰性ＤＬＢＣＬ、ＰＢＬおよびＰＥＬ症例の少数は、ＰＤ−Ｌ１が陽性であった。
【０２６３】
Ｇａｌ１は、Ｔ細胞のアポトーシスをもたらす新たに出現した免疫調節分子でもあり、Ｇａｌ１遺伝子発現の遮断は、マウスモデルにおける腫瘍拒絶反応を促進する［Liu et al. (2005) Nat. Rev. Cancer 5:29-41およびRubinstein et al. (2004) Cancer Cell 5:241-251］。Ｇａｌ１染色は、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、ＥＮＫＴＣＬおよびＰＢＬ、ならびにＨＨＶ８関連腫瘍ＫＳおよびＰＥＬの大部分において見出されると決定された。これらのデータは、ウイルスに駆動される悪性腫瘍のクラスは、ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１に対する標的化治療法の恩恵を被ることができ、かかる治療に特異的に応答し得る症例を同定するための信頼できる方法を提供することを示す。
【０２６４】
ＥＢＶ陽性ＰＴＬＤおよびｃＨＬにおけるＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１のＡＰ−１およびＥＢＶ依存性発現を試験する以前の試験と一致して［Juszczynski et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104:13134-13139、Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618、Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322、Rodig et al. (2008) Clin. Cancer Res.14:3338-3344］、Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１発現は、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬおよびＥＮＫＴＣＬにおけるｐ−ｃＪｕｎおよびＪｕｎＢの発現と相関した。大部分のＥＢＶ陰性ＰＴＬＤ症例は、以前のＥＢＥＲ解析によってＥＢＶが陰性であるにもかかわらず、ＪｕｎＢおよびｐ−ｃＪｕｎの発現を示し、これらの症例のサブセットは、膜性ＰＤ−Ｌ１染色を示した。これらの症例の一部は、細胞質ＰＤ−Ｌ１染色も示し、ＰＤ−Ｌ１の膜発現のみが、腫瘍免疫回避に寄与する可能性があるため、これは不確かな意義のものである。これらの腫瘍は、ＥＢＶ陽性ＰＴＬＤとは対照的に、Ｇａｌ１が均一に陰性でもあった［Ouyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］。同様に、ＮＰＣ症例の大部分は、活性化されたＡＰ−１シグナル伝達および強いＰＤ−Ｌ１染色を有したが、Ｇａｌ１が陰性であった。ＰＢＬおよびＰＥＬに関して、ＡＰ−１構成成分の発現は、Ｇａｌ１発現と十分に相関したが、数例の症例は、ＰＤ−Ｌ１が陰性であった。まとめると、これらのデータは、ＰＤ−Ｌ１およびＧａｌ１の上方調節の代替的機序を示し、ＡＰ−１活性化またはＥＢＶ陽性は、Ｇａｌ１の発現の駆動に十分ではないことを示す。
【０２６５】
９ｐ２４遺伝子座の増幅は、ｃＨＬに関して示される通り［Green et al. (2010) Blood 116:3268-3277］、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するが、ＥＢＶまたは活性化ＡＰ−１構成成分が陰性である腫瘍における一般的な知見となり得る。逆に、ＰＤ−Ｌ１発現に対する、グレーゾーンリンパ腫および乳癌［Eberle et al. (2011) Modern Pathology 24:1586-1597およびWu et al. (2012) Oncogene 31:333-341］等、９ｐ２４増幅を持つ腫瘍の照合は、抗ＰＤ−Ｌ１免疫療法の候補をさらに同定するであろう。あるいは、ＮＰＭ／ＡＬＫ融合タンパク質の結果としてＡＬＫ陽性Ｔ細胞リンパ腫において最初に実証された［Marzec et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105:20852-20857］、ＳＴＡＴ３経路を介した異常シグナル伝達は、ＰＤ−Ｌ１発現の別の機序を提供することができる。
【０２６６】
他のＥＢＶ陽性悪性腫瘍の興味深い例外は、実質的にあらゆるＥＢＶ陽性ＢＬ症例におけるＧａｌ１、ＰＤ−Ｌ１およびＪｕｎＢ／ｃＪｕｎ染色の非存在である。ＢＬにおけるＥＢＶ潜伏期プログラムが、ＤＬＢＣＬとは異なることが公知である［Vereide et al. (2011) Blood 117:1977-1985およびBornkamm (2009) Semin. Cancer Biol. 19:351-365］。特に、より小さいセットのウイルスタンパク質がＢＬにおいて発現され、ＬＭＰ１は発現されない。ＰＴＬＤおよびｃＨＬにおけるＧａｌ１およびＰＤ−Ｌ１のＥＢＶ依存性発現の試験において、Ｇａｌ１およびＰＤ−Ｌ１発現が、ＬＭＰ１に特に依存性であったことが示された［Green et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18:1611-1618およびOuyang et al. (2011) Blood 117:4315-4322］。よって、ＢＬ腫瘍細胞におけるＬＭＰ１の欠如は、ＡＰ−１シグナル伝達の活性化不全と、結果的に、検出可能なＧａｌ１およびＰＤ−Ｌ１発現の非存在をもたらし得る。さらに、Ｍｙｃタンパク質が、ＰＤ−Ｌ１の発現を相殺することが示された［Durand-Panteix et al. (2012) J. Immunol. 189:181-190］。よって、ＢＬ腫瘍細胞が、ｍｙｃ転位置／増幅および変更されたＥＢＶ潜伏期プログラムのために、Ｇａｌ１またはＰＤ−Ｌ１に対する標的化治療法の恩恵を被らないことが考えられる。この知見は、いわゆる二重適合ＤＬＢＣＬ等、Ｍｙｃを過剰発現する他の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の下方調節の可能性も生じる［Aukema et al. (2011) Blood 117:2319-2331］。
【０２６７】
ＨＨＶ８陽性（postive）悪性腫瘍ＫＳおよびＰＥＬに関して、症例の大部分は、Ｇａｌ１およびＡＰ−１構成成分が陽性であったが、ＰＥＬの１症例のみは、膜性ＰＤ−Ｌ１染色を示し、ＫＳの１症例のみは、細胞質ＰＤ−Ｌ１染色を示した。内皮細胞もＧａｌ１を染色し、ＫＳの慎重な解釈を要し、これは、内皮由来腫瘍細胞の増殖を表す。ＫＳにおけるＧａｌ１発現の近年の解析は、良性血管増殖の解析を含み、Ｇａｌ１は、ＫＳ試料において上方調節のみが為された［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］。さらに、以前の試験において用いられた同じ中和抗Ｇａｌ１抗体は、ＫＳのマウスモデルにおいて異常血管新生を減弱し、腫瘍退縮を促進することを示した［Croci et al. (2012) J. Exp. Med. 209:1985-2000］。
【０２６８】
参照による組み込み
本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許または特許出願のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれることが特にかつ個々に示されるように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、本明細書のいずれかの定義を含む本願に従う。
【０２６９】
ゲノム研究所（Institute for Genomic Research）（ＴＩＧＲ）のワールドワイドウェブ、tigr.orgおよび／または国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）のワールドワイドウェブ、ncbi.nlm.nih.govによって維持される公共データベース等、公共データベースにおけるエントリーに相関する受託番号を参照するいずれかのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列もまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２７０】
均等物
当業者であれば、単なるルーチン実験法を用いて、本明細書に記載されている本発明の特異的な実施形態の多くの均等物を認識または確認することができるであろう。かかる均等物は、次の特許請求の範囲によって包含されることを目的とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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