(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質と他の関連タンパク質を含む混合物から組換えタンパク質を精製する方法であって、順に、
第１平衡化緩衝液を用いて組換えタンパク質をイオン交換媒体に結合させ、該第１平衡化緩衝液は、第１電気伝導率及び第１ｐＨを有する工程Ａ、
第２平衡化緩衝液を用いてタンパク質が結合されているイオン交換媒体を引続き平衡化し、該第２平衡化緩衝液は、第２電気伝導率及び第２ｐＨを有し、且つ該第２平衡化緩衝液は、第１平衡化緩衝液に比べて電気伝導率が低く、両者のｐＨが同じである工程Ｂ、
ｐＨが異なる洗浄液を用いてイオン交換媒体を洗浄し、イオン交換媒体から第１関連タンパク質を溶離させ、該洗浄液は、第３電気伝導率を有すると共にｐＨが漸次上昇し、且つ該洗浄液は、第１平衡化緩衝液に比べて電気伝導率が低く、ｐＨが第１及び／又は第２平衡化緩衝液より高い工程Ｃ、
第１溶出液を用いてイオン交換媒体を洗い流し、イオン交換媒体から標的組換えタンパク質を溶離させ、該第１溶出液は、第４電気伝導率及び第４ｐＨを有し、且つ該第１溶出液は、洗浄液に比べてｐＨが高く、電気伝導率が同じである工程Ｄ、及び
第２溶出液を用いてイオン交換媒体を引続き洗い流し、イオン交換媒体から第２の関連タンパク質を溶離させ、該第２溶出液は、第５電気伝導率及び第５ｐＨ有し、且つ該第２溶出液は、第１溶出液に比べてｐＨ及び／又は電気伝導率が高い工程Ｅ
を含んでなり、
前記工程Ｃ〜Ｅにおいて、前記洗浄と前記溶出は工程ごとに同じ勾配で行われることを特徴とする、組換えタンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記イオン交換媒体が陽イオン交換媒体である、請求項１に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項３】
前記陽イオン交換媒体は、異なる基質に結合している官能基がＳＯ３−である担体である、請求項２に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項４】
前記第１関連タンパク質と標的組換えタンパク質は、洗浄液と第１溶出液のｐＨを変えることで溶出される、請求項１に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項５】
前記洗浄液と第１溶出液は、ｐＨが異なる２種類の緩衝液を異なる割合で混ぜ合わせることでｐＨを変える、請求項４に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項６】
前記洗浄液と第１溶出液は、２５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）＋７５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．３〜９．４）を、１５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）＋８５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．３〜９．４）に変えることでｐＨを変える、請求項５に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項７】
工程Ａから工程Ｄにかけて、ｐＨが漸次上昇する、請求項１に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項８】
前記組換えタンパク質と他の関連タンパク質は、等電点が異なり、前記第１関連タンパク質は、前記組換えタンパク質に比べて等電点が低く、前記組換えタンパク質は、前記第２関連タンパク質に比べて等電点が低い、請求項１に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項９】
前記第１関連タンパク質は、組換えタンパク質の酸性変異体であり、且つ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおいて標的タンパク質より保持時間が短く、
前記第２関連タンパク質は、組換えタンパク質の塩基性変異体であり、且つ、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおいて標的タンパク質より保持時間が長い、請求項１に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項１０】
前記組換えタンパク質が抗体である、請求項１〜９の何れか１項に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項１１】
前記抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ、及び他のＨＥＲ２抗原を認識しうる組換え抗体からなる群より選ばれる、請求項１０に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項１２】
前記組換えタンパク質と他の関連タンパク質を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィーにかける以前、最中又は以降の段階において、１回又は数回に渡り更に精製することにより、該組換えタンパク質の均一な調製物を得る工程を更に含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の組換えタンパク質の精製方法。
【請求項１３】
組換え抗ＨＥＲ２抗体と他の関連タンパク質を含む混合物から組換え抗ＨＥＲ２抗体を精製する方法であって、順に、
第１平衡化緩衝液を用いて組換えタンパク質をイオン交換媒体に結合させ、該第１平衡化緩衝液は、第１電気伝導率及び第１ｐＨを有する工程ａ、
第２平衡化緩衝液を用いてタンパク質が結合されているイオン交換媒体を引続き平衡化し、該第２平衡化緩衝液は、第２電気伝導率及び第２ｐＨを有する工程ｂ、
ｐＨが異なる洗浄液を用いてイオン交換媒体を洗浄し、イオン交換媒体から第１関連タンパク質を溶離させ、該洗浄液は、第３電気伝導率を有すると共にｐＨが漸次上昇する工程ｃ、
第１溶出液を用いてイオン交換媒体を洗い流し、イオン交換媒体から標的組換えタンパク質を溶離させ、該第１溶出液は、第４電気伝導率及び第４ｐＨを有する工程ｄ、及び
第２溶出液を用いてイオン交換媒体を引続き洗い流し、イオン交換媒体から第２の関連タンパク質を溶離させ、該第２溶出液は、第５電気伝導率及び第５ｐＨ有する工程ｅ
を含んでなり、
前記第２平衡化緩衝液は、第１平衡化緩衝液に比べて電気伝導率が低く、両者のｐＨが同じであり、前記洗浄液は、前記第１平衡化緩衝液に比べて電気伝導率が低く、ｐＨが前記第１及び／又は第２平衡化緩衝液より高く、前記第１溶出液は、前記洗浄液に比べてｐＨが高く、電気伝導率が同じであり、前記第２溶出液は、前記第１溶出液に比べてｐＨ及び／又は電気伝導率が高く、
前記工程ｃ〜ｅにおいて、前記洗浄と前記溶出は工程ごとに同じ勾配で行われることを特徴とする、組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【請求項１４】
陽イオン交換媒体は、異なる基質に結合している官能基がＳＯ３−である担体である、請求項１３に記載の組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【請求項１５】
前記陽イオン交換媒体は、カルボキシメチルセルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸＴＭ、アガロースに固定したスルホプロピル基、ポリスチレンジビニルベンゼンに固定したスルホプロピル基、アガロースに固定したスルホニル基、及び親水性ポリアクリルアミドに固定したスルホプロピル基からなる群より選ばれる少なくと１種である、請求項１４に記載の組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【請求項１６】
前記第１平衡化緩衝液は、４０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム又は硫酸アンモニウを含んでなる１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液であり、且つ、ｐＨが４〜６、電気伝導度が８〜１３ｍｓ／ｃｍの範囲であり、
前記第２平衡化緩衝液は、塩を含まない１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液であり、ｐＨが第１平衡化緩衝液と同じく、電気伝導度が１〜２ｍｓ／ｃｍの範囲である、請求項１３〜１５の何れか１項に記載の組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【請求項１７】
前記洗浄液と第１溶出液は、２５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）＋７５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．３〜９．４）を、１５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）＋８５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．３〜９．４）に変えることにより、ｐＨが異なる２種類の緩衝液を異なる割合で混ぜ合わせてｐＨを変える、請求項１３〜１５の何れか１項に記載の組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【請求項１８】
前記組換え抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ、ペルツズマブ及び他のＨＥＲ２抗原を認識しうる組換え抗体からなる群より選ばれる、請求項１３に記載の組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【請求項１９】
前記組換え抗ＨＥＲ２抗体と他の関連タンパク質を含む混合物をイオン交換クロマトグラフィーにかける以前、最中又は以降の段階において、１回又は数回に渡り更に精製することにより、該組換え抗ＨＥＲ２抗体の均一な調製物を得る工程を更に含む、請求項１３〜１８の何れか１項に記載の組換え抗ＨＥＲ２抗体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の技術分野に属し、具体的には、組換えタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質の精製によく使われるクロマトグラフ技術である。イオン交換クロマトグラフィーにおいて、溶質の周囲を取り囲む緩衝液のイオン強度が十分低いと、溶質表面の帯電物がクロマトグラフ基質に結合している反対の電荷に吸着される。通常、緩衝液のイオン強度（電気伝導度の値、以下、「電気伝導度」とも称する）を高め、溶質とイオン交換媒体の帯電サイトを競り合うことで溶出することができる。別の手法として、ｐＨ変化によって溶質の帯電量を変えて溶質を溶出することもできる。電気伝導率やｐＨは、漸次的に（勾配溶出）変化させてもよく、数段階に分けて（段階溶出）変化させることも可能である。従来より、これらの変化は漸次的に行われ、ｐＨや電気伝導率を一方的に増大又は低下させるのが普通であった。
【０００３】
現在、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてタンパク質を精製する方法が数多く報告され、例えば、中国特許出願第２００４１００６８７９０．３号に、陽イオン交換クロマトグラフィーを使って酸性汚染物を除去することが開示され、具体的には、比較的高い電気伝導値を利用して酸性汚染物を除去し、後に電気伝導の均衡を下げてから再び電気伝導を引き上げて溶出を行うことが開示されている。精製時にはｐＨを変えることなく、その結果、酸性変異体が約５０％に低下し、塩基性変異体については言及されなかった。また、中国特許出願第２００８８０１１９３３１．Ｘ号に、陽イオン交換クロマトグラフィーでｐＨを高くして洗浄を行い、そして、ｐＨを下げることで電気伝導度を高め、抗体サンプルに含まれるＣＨＯＰ（中国ハムスター卵巣細胞に由来のタンパク質）、脱着したプロテインＡ、ＤＮＡ、凝集物等を除去することが開示され、その際、抗体サンプルに含まれる酸性、塩基性タンパク質は除去対象から外された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述の方法は、タンパク質精製の目的を一部達成できるが、酸性と塩基性タンパク質の除去が不十分であり、標的タンパク質の損失が大きいといった問題がある。
そこで、本発明は、酸性と塩基性タンパク質の除去率を向上させ、標的タンパク質の損失を減らした組換えタンパク質の精製方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上述の目的を達成するため、本発明は、以下の技術案を提供する。
【０００６】
具体的に言うと、本発明は、組換えタンパク質と他の関連のタンパク質を含む混合物から該組換えタンパク質を精製する方法を提供し、該方法は、順に以下の工程を含んでなる。
【０００７】
工程Ａ：第１平衡化緩衝液を用いて組換えタンパク質をイオン交換媒体に結合させ、該第１平衡化緩衝液は、第１電気伝導率及び第１ｐＨを有する。
【０００８】
工程Ｂ：第２平衡化緩衝液を用いてタンパク質が結合されているイオン交換媒体を引続き平衡化し、該第２平衡化緩衝液は、第２電気伝導率及び第２ｐＨを有する。
【０００９】
工程Ｃ：ｐＨが異なる洗浄液を用いてイオン交換媒体を洗浄し、イオン交換媒体から第１関連タンパク質を溶離させ、該洗浄液は、第３電気伝導率を有すると共に、ｐＨが漸次上昇する。
【００１０】
工程Ｄ：第１溶出液を用いてイオン交換媒体を洗い流し、イオン交換媒体から標的組換えタンパク質を溶離させ、該第１溶出液は、第４電気伝導率及び第４ｐＨを有する。
【００１１】
工程Ｅ：第２溶出液を用いて引続きイオン交換媒体を洗い流し、イオン交換媒体から第２関連タンパク質を溶離させ、該第２溶出液は、第５電気伝導率及び第５ｐＨ有する。
【００１２】
そのうち、上記イオン交換媒体とは、陽イオン交換媒体であり、異なる基質に結合している官能基がＳＯ３−である担体を指すものである。例えば、カルボキシメチルセルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸＴＭ、アガロースに固定したスルホプロピル基（例えば、ＧＥ社製のＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ又はＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＨＩＧＨ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥＴＭ等）、ポリスチレンジビニルベンゼンに固定したＳＯＵＲＣＥ−３０Ｓ、ＳＯＵＲＣＥ−１５Ｓ、ＡＢ社製のＰｏｒｏｓ  ＨＳ及びＰｏｒｏｓ  ＸＳ、アガロースに固定したスルホニル基（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ等）、及びＢｉｏ−ｒａｄ社製の親水性ポリアクリルアミドに固定したＮＵＶＩＡ−Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ−Ｓ等が挙げられ、これらに制限されない。
【００１３】
第１関連タンパク質の等電点（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｐｏｉｎｔ、以下、「ＰＩ」とも称する）は、組換えタンパク質のＰＩより低く、組換えタンパク質のＰＩは、第２関連タンパク質のＰＩより低い。具体的に言うと、第１関連タンパク質とは、組換えタンパク質の酸性変異体であり、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける保持時間が標的タンパク質より短い一連の物質を指し、第２関連タンパク質とは、組換えタンパク質の塩基性変異体であり、ＣＥＸ−ＨＰＬＣにおける保持時間が標的タンパク質より長い一連の物質を指す。
【００１４】
上述の第２平衡化緩衝液は、第１平衡化緩衝液に比べて電気伝導率が低いが、両者のｐＨが同じである。具体的には、第１平衡化緩衝液は、塩を含む緩衝液であり、一般に使われる緩衝液としてＰＢ、ＭＥＳ、酢酸が挙げられ、酢酸緩衝液が好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌである。ｐＨは４．０〜６．０の範囲であり、ｐＨ４．９〜５．１が好ましく、ｐＨ５．０が特に好ましい。塩の種類として、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸カリウム等の塩を使用することができ、硫酸アンモニウムが特に好ましい。塩濃度は１０〜７０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、４０〜６０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましく、電気伝導度は８〜１３ｍｓ／ｃｍの範囲である。そのうち、６０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムを用いた場合、酸性タンパク質の溶出に特に有利である。第２平衡化緩衝液は、塩を含まない緩衝液であり、一般に使われる緩衝液としてＰＢ、ＭＥＳ、酢酸が挙げられ、酢酸緩衝液が好ましく、緩衝液の濃度は１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌである。ｐＨは４．０〜６．０の範囲であり、ｐＨ４．９〜５．１が好ましく、ｐＨ５．０が特に好ましい。電気伝導度は１〜２ｍｓ／ｃｍの範囲であり、１．１ｍｓ／ｃｍが特に好ましい。
【００１５】
洗浄液は、第１平衡化緩衝液に比べて電気伝導率が低く、ｐＨが第１及び／又は第２平衡化緩衝液より高い。
【００１６】
第１溶出液は、洗浄液に比べてｐＨが高く、電気伝導率がほぼ同じである。第２溶出液のｐＨ及び／又は電気伝導率は、第１溶出液より高い。
【００１７】
洗浄液と第１溶出液は、ｐＨが異なるが、両者とも塩を含む２種類の緩衝液を異なる割合で混合することにより調製される。緩衝液として、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＢＩＣＩＮＥ等を適宜選択することができ、リン酸塩が特に好ましい。緩衝液の濃度は１０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、電気伝導度の範囲は１〜２ｍｓ／ｃｍであり、特に制限がない。そのうち、緩衝液ＡのｐＨが７．０〜７．８の範囲であり、７．５が好ましく、緩衝液ＢのｐＨが９．３〜９．４の範囲である。塩の種類として、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸カリウム等が挙げられる。より具体的には、洗浄液と第１溶出液は、２５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）＋７５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．３〜９．４）を１５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）＋８５％のＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ９．３〜９．４）に変えることでｐＨを変える。
【００１８】
第２溶出液は、高塩濃度の水溶液であり、塩の種類として、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、硫酸カリウム等が挙げられ、好ましくは塩化ナトリウムである。
【００１９】
各緩衝液は、通常、４〜３０℃で保存することができ、４〜８℃で保存するのが特に好ましい。
【００２０】
組換えタンパク質として、組換え抗体（例えば、組換え抗ＨＥＲ２抗体）をＣＨＯ細胞で発現した後、ディスク遠心と深層濾過を経て上澄液を回収し、そして、プロテインＡを用いたアフィニティクロマトグラフィーにかけてｐＨが酸性のクエン酸を用いて溶出させ、標的タンパク質、酸性及び塩基性タンパク質を含む均一な混合液の形態で取得するのが好ましい。この混合液は、つまり、陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｎｕｖｉａ−Ｓ）の注入液となる。
【００２１】
注入液は、トリス塩基、水酸化ナトリウム等のアルカリ性物質を用いてｐＨ４．０〜６．０に、好ましくはｐＨ４．９〜５．１に、より好ましくはｐＨ５．０に調整した後、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム等の塩析塩を加えて電気伝導度を調整する。電気伝導度の調整には、例えば、メトラー社のｓｅｖｅｎ−ｅａｓｙ伝導率測定器等、温度補償機能を備えた伝導率測定器を用い、参照温度を２０℃にし、電気伝導度を６．０〜１８．０ｍｓ／ｃｍの範囲、好ましくは８．０〜１２．５ｍｓ／ｃｍの範囲に調整する。
【００２２】
本発明において、８．４ｍｓ／ｃｍ、１２．０ｍｓ／ｃｍの２つの異なる電気伝導度で試料を注入する。ｐＨを変えることなく、電気伝導度を高くしてで試料を注入する場合、酸性タンパク質の流出に有利であり、通常、１０〜２０％の割合で酸性ピークを排出することができ、標的タンパク質の損失は無視できるほどである。注入試料は、ｐＨと電気伝導度を調整した後、標的タンパク質の加水分解を防止する観点から４℃で保存するのが好ましい。
【００２３】
カラムの充填は、使用需要に対応できる程度で、通常、カラム効率が２０００段／ｍ以上となるように充填することが好ましい。精製は、通常、流速５ｃｍ／分間で行う。カラム負荷量は、１０〜２０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、１５ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。タンパク質の定量に２８０ｎｍの紫外分光光度計を用いることができ、組換え抗体の吸光係数、例えば、ＨＥＲ２抗原を認識しうるヒト化モノクローナル抗体の吸光係数が１．５０である。
【００２４】
カラム精製は、まず、第１平衡化緩衝液を用いてカラムを平衡化し、通常、３カラム容量であれば完全に平衡化することができ、試料注入に支障が出ない程度となる。試料注入後に、第１平衡化緩衝液を少なくとも１カラム容量用いて更に平衡化し、そして、平衡化緩衝液中の塩による洗浄工程への影響を防ぐため、第２平衡化緩衝液を少なくとも１カラム容量用いて平衡化し続ける。そして、１００％の溶液Ａを２カラム容量用いて洗浄することでｐＨを高め、更に６０％〜７５％の溶液Ｂを用いてカラムを洗浄することで酸性タンパク質を除去する。１回又は数回分けて洗浄することができ、７５％の溶液Ｂを用いて少なくとも１回洗浄するのが一般的であり、数回分けて洗浄する場合、酸性タンパク質の除去に特に有利である。洗浄時のｐＨは、通常、７．６〜７．９の範囲である。洗浄は、通常、２０〜３０カラム容量で行う。洗浄ピークが約５０ｍＡｕに達すると、十分洗浄できたと判断できる。第１溶出液として８５％の溶液Ｂを用いて溶出を行い、溶出液のｐＨは、通常、８．０５〜８．１５の範囲である。溶出は、通常、８〜１５カラム容量で行う。溶出ピークが約５０ｍＡｕに達すると、十分溶出できたと判断できる。最後に、第２溶出液を用いて塩基性タンパク質を溶出する。
【００２５】
注入液における酸性タンパク質の割合を５０％以下にすることが好ましく、低いほど精製に有利である。塩基性ピークの割合は、２０％以下にすることが好ましく、低いほど精製に有利である。カラム精製により、メインピークの標的タンパク質のＣＥＸ−ＨＰＬＣ純度を３７％から７０％以上に高めることができ、数回分けて洗浄若しくは数回分けて試料を注入、流出させた場合、純度を更に７５％ひいては７７％以上に引き上げることができる。標的タンパク質の収率は、通常、７４％以上である。
【００２６】
本発明において、組換えタンパク質は、宿主細胞で生成したタンパク質であり、該宿主細胞は、該タンパク質を編集する核酸が導入され、若しくは相同組換えによってタンパク質を生成する能力を備えるものである。ここで、核酸の細胞への導入は、トランスフェクション法、トランスフォーメーショん法の何れかを利用することができる。細胞へ導入された核酸は、宿主細胞のゲノムに取り込んでもよく、染色体外因子として存在してもよい。宿主細胞としては、インビトロで培養した細胞株や、宿主動物の細胞を利用することができ、例えば、米国特許５，５３４，６１５に遺伝子組換えによりポリペプチドを製造する方法が開示され、その開示内容がすべて参照により本明細書に援用される。
【００２７】
本発明において、組換えタンパク質とは、主に抗体であり、特にＨＥＲ２抗原を認識しうる組換え抗体を指すものであり、例えば、トラスツズマブ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５〜４２８９，１９９２）、ペルツズマブ（ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ、商品名：ＯＭＮＩＴＡＲＧＴＭ、ＷＯ０１／００２４５）、及び米国特許ＵＳ６４０７２１３５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６６３９０５５、ＵＳ６７１９９７１、ＵＳ６８００７３８、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ５６７７１７１、ＵＳ５７７０１９５、ＵＳ５７２０９５４、ＵＳ５７７２９９７、ＵＳ６１６５４６４、ＵＳ６３８７３７１、ＵＳ６３９９０６３、ＵＳ５７２０９３７、ＵＳ  ５７２５８５６及び中国発明特許公開公報第０１１３２２２５．Ｘ号に記載の全ての抗体タンパク質が挙げられ、これらに制限されない。本明細書でいう「ＨＥＲ２抗原」とは、ヒトＨＥＲ２タンパク質を指し、例えば、ＳｅｍｂａらのＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７〜６５０１（１９８５）及びＹａｍａｍｏｔｏらのＮａｔｕｒｅ  ３１９：２３０〜２３４（１９８６）（ＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号：Ｘ０３３６３）に記載のヒトＨＥＲ２タンパク質が挙げられる。
【００２８】
酸性タンパク質：標的組換えタンパク質に比べて強い酸性（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて測定することができる）を示す標的組換えタンパク質の変異体である。酸性タンパク質の例として、脱アミド体が挙げられる。
【００２９】
塩基性タンパク質：標的組換えタンパク質に比べて強いアルカリ性（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて測定することができる）を示す標的組換えタンパク質の変異体である。塩基性タンパク質の例として、Ｃ末端のリジン残基の部分的除去、Ｎ末端のグルタミン残基（ＧＬＮ）の部分的環化が挙げられる。
【００３０】
混合液：抗体、好ましくは抗ＨＥＲ２抗体を含む組成物を意味する用語として「混合液」とは、必要とされる抗体及びその１種又は数種の酸性変異体と塩基性変異体を含むものを指す。酸性変異体は、優位を占める脱アミド化抗ＨＥＲ２抗体と少量の他の酸性変異体を含んでもよく、例えば、遺伝子組換えにより得られる抗ＨＥＲ２抗体の調製物において、約５０％の抗ＨＥＲ２抗体が脱アミド化され、約１５％の抗体が塩基性タンパク質であることが既に知られている。
【００３１】
陽イオン交換媒体：負電荷を持つ固定相を指し、遊離カチオンを持つため、固定相又は固定相の間を通過する水溶液中のカチオンと交換することができる。固定相に付着して陽イオン交換樹脂を形成する負電荷性のリガンドとして、例えば、カルボン酸塩やスルホン酸塩が挙げられる。市販ルートで入手可能な陽イオン交換樹脂は、異なる基質に結合している官能基がＳＯ３−である担体であり、例えば、カルボキシメチルセルロース、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ  ＡＢＸＴＭ、アガロースに固定したスルホプロピル基（例えば、ＧＥ社製のＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ又はＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＨＩＧＨ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥＴＭ）、ポリスチレンジビニルベンゼン基に固定したＳＯＵＲＣＥ−３０Ｓ、ＳＯＵＲＣＥ−１５Ｓ、ＡＢ社製のＰｏｒｏｓ  ＨＳ  Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ、アガロースに固定したスルホニル基（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製のＳ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷＴＭ）、Ｂｉｏ−ｒａｄ社製の親水性ポリアクリルアミドに固定したＮＵＶＩＡ−Ｓ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ−Ｓ等が挙げられ、これらに制限されない。
【００３２】
緩衝液：「緩衝液」とは、その酸・塩基共役成分の作用によってｐＨの変化を緩める溶液を指すものである。「緩衝液、生物系における緩衝液の調製と使用指南、Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．編集、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）」に、各ｐＨ範囲に対応可能な緩衝液が記載されている。本発明の一実施形態において、緩衝液としては、ｐＨ範囲が約５〜約７である（例えば、以下の実施例１）。該ｐＨ範囲を示す緩衝液として、例えば、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、アンモニウム塩緩衝液及びこれら緩衝液の混合液が挙げられる。
【００３３】
注入液：「注入液」とは、標的タンパク質分子及び１種又は数種の関連タンパク質を含む混合物をイオン交換カラムに注入する緩衝液を指すものである。注入緩衝液は、標的タンパク質分子（通常、１種又は数種の汚染物を含む）をイオン交換樹脂に結合させうる電気伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００３４】
洗浄緩衝液：「洗浄緩衝液」は、標的タンパク質に先立って、イオン交換樹脂から１種又は数種の関連タンパク質を溶出するために用いられる。洗浄緩衝液は、標的タンパク質の溶出を極限に抑え、同時にイオン交換樹脂から関連タンパク質を溶出することのできる電気伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００３５】
溶出緩衝液：固定相から標的タンパク質を溶出するために用いられる。溶出緩衝液は、標的タンパク質をイオン交換樹脂から溶出することのできる電気伝導率及び／又はｐＨを有する。
【００３６】
電気伝導率とは、水溶液が２つの電極間において電流を伝導する能力を意味するものである。溶液において、電流はイオンを媒介として流される。したがって、水溶液におけるイオン量が増加すると、溶液はより高い電気伝導率を有することとなる。電気伝導率の計量単位はｍｍｈｏｓ／ｃｍ（ｍｓ／ｃｍ）であり、導電率計（例えば、Ｏｒｉｏｎ社製の導電率計等）で測定可能である。溶液の電気伝導率は、そのイオン濃度を変えることで変化させることができる。例えば、溶液における緩衝剤の濃度及び／又は塩（例えば、ＮａＣｌやＫＣ１）の濃度を変えて必要とされる電気伝導率を得ることができる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明は、低ｐＨの酸性範囲及び比較的高い塩濃度の溶液条件において試料注入を行い、高ｐＨのアルカリ性範囲及び比較的低い塩濃度の溶液条件において洗浄、溶出する等、緩衝液のｐＨや塩濃度を変えることで酸性、塩基性タンパク質及び標的タンパク質を効率よく分離することに成功した。本発明によれば、酸性タンパク質の除去率が８５％を超え、場合によっては９３％に達し、塩基性タンパク質の除去率が５９％を超え、同時に標的タンパク質の損失率を２６％未満にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】実施例１で得られる最終産物のクロマトグラムである。
【図２】実施例１に係る各画分のＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】実施例２で得られる最終産物のクロマトグラムである。
【図４】実施例２に係る各画分のＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】実施例３で得られる最終産物のクロマトグラムである。
【図６】実施例３に係る各画分のＣＥＸ−ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、図面を参酌しつつ本発明を詳述する。以下の実施例は、本発明の一例を例示したに過ぎず、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
実施例１において、以下のクロマトグラフ条件を用い、注入液を完全に通過させることなく、１段階の７５％溶液Ｂで洗浄し、１段階の８５％溶液Ｂで溶出を行った。
【００４１】
カラム：ＸＫ１６／４０  ＮｕｖｉａＳ、１カラム容量＝５０ｍｌ、カラム高さ＝２５ｃｍ、流速＝１０ｍＬ／分間
クロマトグラフシステム：ＡＫＴＡ−ＰＵＲＩＦＩＥＲ
使用ソフト：ｕｎｉｃｏｒｎシステム
【００４２】
試料として、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２抗体と関連タンパク質の混合物を、ｒ−プロテインＡを用いるクロマトグラフィーによりクエン酸系に置換し、更にトリス塩基でｐＨ５．０に調整した後、塩化ナトリウムを加えて電気伝導度を８．５ｍｓ／ｃｍに調整した。注入液の濃度が１５ｍｇ／ｍＬであり、総注入量が７５０ｍｇであった。
【００４３】
使用溶液として、平衡化緩衝液１は、２０ｍｍ  ＨＡｃ−ＮａＯＨ＋４０ｍｍ  硫酸アンモニウムで構成され、ｐＨが５．０であり、電気伝導度が８．４ｍｓ／ｃｍであった。
【００４４】
平衡化緩衝液２は、２０ｍｍ  ＨＡｃ−ＮａＯＨで構成され、ｐＨが５．０であり、電気伝導度が１．１ｍｓ／ｃｍであった。
【００４５】
溶液Ａは、１０ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋リン酸で構成され、ｐＨが７．５２であり、電気伝導度が１．５ｍｓ／ｃｍであった。
【００４６】
溶液Ｂは、１０ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋リン酸で構成され、ｐＨが９．３６であり、電気伝導度が１．５ｍｓ／ｃｍであった。
【００４７】
１００％の溶液Ａを洗浄液１とし、２５％溶液Ａ＋７５％溶液Ｂを洗浄液２とし、１５％溶液Ａ＋８５％溶液Ｂを溶出液１とし、且つ、電気伝導度が２６ｍｓ／ｃｍの３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを溶出液２とした。
【００４８】
精製は、平衡化緩衝液１（３カラム容量）→試料注入→平衡化緩衝液１（１カラム容量）→平衡化緩衝液２（２カラム容量）→洗浄液１（２カラム容量）→洗浄液２（２０カラム容量）→溶出液１（１２カラム容量）→溶出液２（２カラム容量）→２Ｎ  塩化ナトリウム（２カラム容量）→純水（１カラム容量）→０．１Ｎ  水酸化ナトリウム（３カラム容量）の順で行い、回収画分は、以下の通りであった。
【００４９】
タンパク質の定量として、回収ピークごとに分光光度計を用いて測定することにより各画分（注入試料、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４）のタンパク質濃度を確定し、測定結果に基づいて産物の収率を算出した。
【００５０】
ピーク１（洗浄ピーク）：０．８５５Ｌ×０．３７ｍｇ／ｍＬ＝３１６．３５ｍｇ
【００５１】
ピーク２（主ピークの前）：２７ｍＬ×０．３１ｍｇ／ｍＬ＝８．３７ｍｇ
【００５２】
ピーク３（主ピーク）：５２０ｍＬ×０．６ｍｇ／ｍＬ＝３１２ｍｇ
【００５３】
ピーク４（３００ｍｍ  塩化ナトリウムで溶出）：５０ｍＬ×１．９６ｍｇ／ｍＬ＝９８ｍｇ
【００５４】
総収率：７３４．７２／７５２×１００％＝９７．７％
【００５５】
主ピークの収率：４１．４８％
【００５６】
目的ピークの収率について、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析結果を図２に示し、関連データを表１に示す。
【００５７】
【表１】
0006456376.tif 000002
【００５８】
表１にクロマトグラムを示す。注入液を完全に通過させることなく、１段階の７５％溶液Ｂで洗浄を行い、１段階の８５％溶液Ｂで溶出を行うことにより、目的ピークの純度を３７．５１％から６９．９９％に引き上げた。このとき、酸性ピークの除去率が（１−５３．１５／３５９．２５）×１００％＝８５．２２％、塩基性ピークの除去率が（１−４０．１２／１０９．４３）×１００％＝６３．４％、目的ピークの損失率が（１−２１８．３７／２８１．３３）×１００％＝２２．３８％であった。
【実施例２】
【００５９】
実施例２において、以下のクロマトグラフ条件を用い、注入液を完全に通過させることなく、多段階の６０％溶液Ｂ→７０％溶液Ｂ→７５％溶液Ｂで洗浄し、１段階の８５％溶液Ｂで溶出を行った。
【００６０】
カラム：ＸＫ１６／４０  ＮｕｖｉａＳ、１カラム容量＝５０ｍＬ、カラム高さ＝２５ｃｍ、流速＝１０ｍＬ／分間
クロマトグラフシステム：ＡＫＴＡ−ＰＵＲＩＦＩＥＲ
使用ソフト：ｕｎｉｃｏｒｎシステム
【００６１】
試料として、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２抗体及び関連タンパク質の混合物を、ｒ−プロテインＡを用いるクロマトグラフィーによりクエン酸系に置換し、更にトリス塩基でｐＨ５．０に調整した後、塩化ナトリウムを加えて電気伝導度を８ｍｓ／ｃｍに調整した。注入液の濃度が１５ｍｇ／ｍＬであり、総注入量が７４５ｍｇであった。
【００６２】
使用溶液として、平衡化緩衝液１は、２０ｍｍ  ＨＡｃ−ＮａＯＨ＋４０ｍｍ  硫酸アンモニウムで構成され、ｐＨが５．０であり、電気伝導度が８．４ｍｓ／ｃｍであった。
【００６３】
平衡化緩衝液２は、２０ｍｍ  ＨＡｃ−ＮａＯＨで構成され、ｐＨが５．０３であり、電気伝導度が１．１ｍｓ／ｃｍであった。
【００６４】
溶液Ａは、１０ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋リン酸で構成され、ｐＨが７．５２であり、電気伝導度が１．５ｍｓ／ｃｍであった。
【００６５】
溶液Ｂは、１０ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋リン酸で構成され、ｐＨが９．３６であり、電気伝導度が１．５ｍｓ／ｃｍであった。、
【００６６】
１００％の溶液Ａを洗浄液１とし、４０％溶液Ａ＋６０％溶液Ｂを洗浄液２とし、３０％溶液Ａ＋７０％溶液Ｂを洗浄液３とし、２５％溶液Ａ＋７５％溶液Ｂを洗浄液４とした。また、溶出液１は、１５％溶液Ａ＋８５％溶液Ｂで調製され、溶出液２は、電気伝導度が２６ｍｓ／ｃｍの３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌであった。
【００６７】
精製は、平衡化緩衝液１（３カラム容量）→試料注入→平衡化緩衝液１（１カラム容量）→平衡化緩衝液２（２カラム容量）→洗浄液１（２カラム容量）→洗浄液２→４段階の勾配［６０％溶液Ｂ（５カラム容量）→７０％溶液Ｂ（７カラム容量）→７５％溶液Ｂ（１２カラム容量）→溶出液１（９カラム容量）］→溶出液２（２カラム容量）→２Ｎ  塩化ナトリウム（２カラム容量）−純水（１カラム容量）→０．１Ｎ  水酸化ナトリウム（３カラム容量）の順で行い、回収画分は、以下の通りであった。
【００６８】
ピーク１（洗浄ピーク、７５％溶液Ｂで洗浄する前の全部ピークを含む）：１．１Ｌ×０．３１ｍｇ／ｍＬ＝３４１ｍｇ
【００６９】
ピーク２（主ピークの前、８５％溶液Ｂで１５０ｍａｕまで溶出）：２８ｍＬ×０．３ｍｇ／ｍＬ＝８．４ｍｇ
【００７０】
ピーク３（主ピーク、８５％溶液Ｂで１５０ｍａｕから５０ｍａｕまで溶出）：３６７ｍＬ×０．７７ｍｇ／ｍＬ＝２８２．５９ｍｇ
【００７１】
ピーク４（３００ｍｍ  塩化ナトリウムで溶出）：５３ｍＬ×１．４８ｍｇ／ｍＬ＝７８．４４ｍｇ
【００７２】
総収率：７１０．４３／７４５８×１００％＝９５．３５％
【００７３】
主ピークの収率：３７．９５％
【００７４】
目的ピークの収率について、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析結果を図４に示し、関連データを表２に示す。
【００７５】
【表２】
0006456376.tif 000003
【００７６】
図３にクロマトグラムを示す。注入液を完全に通過させることなく、多段階の６０％溶液Ｂ→７０％溶液Ｂ→７５％溶液Ｂで洗浄し、１段階の８５％溶液Ｂで溶出することにより、目的ピークの純度を３７．５３％から７５．１５％に引き上げた。このとき、酸性ピークの除去率が（１−２６．７６／３５８．１３）×１００％＝９２．５３％、塩基性ピークの除去率が（１−４３．４６／１０７．７７）×１００％＝５９．６７％、目的ピークの損失率が（１−２１２．３７／２７９．９０）×１００％＝２４．１３％であった。
【実施例３】
【００７７】
実施例３において、以下のクロマトグラフ条件を用い、注入液を全部通過させ、１段階の７５％溶液Ｂで洗浄し、１段階の８５％溶液Ｂで溶出を行った。
【００７８】
カラム：ＸＫ１６／４０  ＮｕｖｉａＳ、１カラム容量＝５０ｍＬ、カラム高さ＝２５ｃｍ、流速＝１０ｍＬ／分間
クロマトグラフシステム：ＡＫＴＡ−ＰＵＲＩＦＩＥＲ
使用ソフト：ｕｎｉｃｏｒｎシステム
【００７９】
試料として、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２抗体と関連タンパク質の混合物を、ｒ−プロテインＡを用いるクロマトグラフィーによりクエン酸系に置換し、更にトリス塩基でｐＨ５．０に調整した後、塩化ナトリウムを加えて電気伝導度を１２ｍｓ／ｃｍに調整した。注入液の濃度が１５ｍｇ／ｍＬであり、総注入量が７５３．２８ｍｇであった。
【００８０】
使用溶液として、平衡化緩衝液１は、２０ｍｍ  ＨＡｃ−ＮａＯＨ＋６０ｍｍ  硫酸アンモニウムで構成され、ｐＨが５．０であり、電気伝導度が１２ｍｓ／ｃｍであった。
【００８１】
平衡化緩衝液２は、２０ｍｍ  ＨＡｃ−ＮａＯＨで構成され、ｐＨが５．０であり、電気伝導度が０．９ｍｓ／ｃｍであった。
【００８２】
溶液Ａは、１０ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋リン酸で構成され、ｐＨが７．５０であり、電気伝導度が１．５ｍｓ／ｃｍであった。
【００８３】
溶液Ｂは、１０ｍｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４＋リン酸で構成され、ｐＨが９．３６であり、電気伝導度が１．５ｍｓ／ｃｍであった。
【００８４】
そして、それぞれ洗浄液１として１００％の溶液Ａ、洗浄液２として２５％溶液Ａ＋７５％溶液Ｂ、溶出液１として１５％溶液Ａ＋８５％溶液Ｂを用いた。溶出液２は、電気伝導度が２６ｍｓ／ｃｍの３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを用いた。
【００８５】
精製は、平衡化緩衝液１（３カラム容量）→試料注入→平衡化緩衝液１（１カラム容量）→平衡化緩衝液２（２カラム容量）→洗浄液１（２カラム容量）→洗浄液２（３０カラム容量）→溶出液１（１１カラム容量）→溶出液２（２カラム容量）→２Ｎ  塩化ナトリウム（２カラム容量）→純水（１カラム容量）→０．１Ｎ  水酸化ナトリウム（３カラム容量）の順に行い、回収画分は、以下の通りであった。
【００８６】
タンパク質の定量において、回収ピークごとに分光光度計を用いて測定することにより各画分（注入試料、ピーク１、ピーク２、ピーク３、ピーク４、ピーク５）のタンパク質濃度を確定し、測定結果に基づいて産物の収率を算出した。
【００８７】
ピーク１（通過ピーク）：１５０ｍＬ×０．１００４ｍｇ／ｍＬ＝１５．０６ｍｇ
【００８８】
ピーク２（洗浄ピーク）：８０７ｍＬ×０．４３８８ｍｇ／ｍＬ＝３５４．１９ｍｇ
【００８９】
ピーク３（主ピークの前）：６０ｍＬ×０．１３ｍｇ／ｍＬ＝８ｍｇ
【００９０】
ピーク４（主ピーク）：４１８ｍＬ×０．６５０７ｍｇ／ｍＬ＝２７２ｍｇ
【００９１】
ピーク５（３００ｍｍ  塩化ナトリウムで溶出）：５１ｍＬ×１．９６ｍｇ／ｍＬ＝１００ｍｇ
【００９２】
総収率：７４９．２５／７５３．２８×１００％＝９９．４６％
【００９３】
主ピークの収率：３６．１１％
【００９４】
目的ピークの収率について、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析結果を図６に示し、関連データを表３に示す。
【００９５】
【表３】
0006456376.tif 000004
【００９６】
図５にクロマトグラムを示す。注入液を全部通過させ、１段階の７５％溶液Ｂで洗浄し、１段階の８５％溶液Ｂで溶出することにより、目的ピークの純度を３７．５９％から７７．３４％に引き上げた。このとき、酸性ピークの除去率が（１−２２．２８／３５８．５６）×１００％＝９３．７８％、塩基性ピークの除去率が（１−３９．３３／１１１．５６）×１００％＝６４．７５％、目的ピークの収率が（１−２１０．３６／２８１．３６）×１００％＝２５．２３％であった。
【００９７】
実施例１と２に比較して、実施例３のほうがより効果的に酸性ピークと塩基性ピークを除去することができるが、標的タンパク質の収率が若干低下する傾向が見られた。実施例１〜３の結果から、比較的低いｐＨと高塩濃度で試料を注入し、比較的高いｐＨと低塩濃度で洗浄、溶出することにより、組換えタンパク質と他の関連タンパク質をより効果的に分離することのできることが実証された。
【００９８】
実施例１〜３において、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２抗体と関連タンパク質の混合物は、ＣＨＯ細胞において中国特許出願第２００４１００６８７９０．３号に記載のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で表される軽鎖アミノ酸配列、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される重鎖アミノ酸配列を含む全長ヒトＩｇＧ  ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２[Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５〜４２８９（１９９２）]を発現することにより得られたものであり、ＣＨＯ細胞で組換え抗体を発現した後、ディスク遠心と深層濾過を経て上澄液を収集し、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２抗体と関連タンパク質の混合物を取得した。
【００９９】
本発明者は、更に、米国特許ＵＳ６４０７２１３５号、ＵＳ５８２１３３７号、及び中国発明特許公開公報第０１１３２２２５．Ｘ号に記載のｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２抗体配列についても上記方法を用いて調製し、そして、実施例１〜３と同様に測定、検証を行ったところ、ほぼ一致する結果が得られることを確認した。
【０１００】
実施例１〜３におけるＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析方法は、具体的には、以下の通りであった。
【０１０１】
１）試薬と測定装置
化学試薬の純度は、少なくとも分析用のレベルであった。カルボキシペプチダーゼＢは、濃度が５ｍｇ／ｍＬのものを使い、１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ溶液は、ｐＨ７．４〜７．６の範囲であり、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸塩緩衝液は、ｐＨ６．４〜６．６の範囲であり、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸塩緩衝液＋２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌは、ｐＨ６．４〜６６の範囲であった。
【０１０２】
また、高速液体クロマトグラフとしてＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ社の２９９８＋２６９５．Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００Ｂシリーズ、若しくは他社の同類の液体クロマトグラフを用い、カラムとしてＤｉｏｎｅｘＰｒｏｐａｃ  ＷＣＸ−１０（４×２５０ｍｍ）を用いた。
【０１０３】
２）試料の調製と精製
試料調製は、以下の順に従って行った。すなわち、カルボキシペプチダーゼＢを用いて測定用試料を消化し、反応系の体積が１００〜５００ｕＬであり、溶液中にＨＥＲ２を認識しうるｒｈＭＡｂ試料５ｍｇ／ｍＬを含み、また、体積比で１０％の１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）及び体積比で２％のカルボキシペプチダーゼＢ（５ｍｇ／ｍＬ）を含み、３７℃、水浴の条件下において３時間反応させた。
【０１０４】
そして、カラムへ注入する前に、上記処理で得られた反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．４〜６．６）を用いて１．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、１２０００ｒ／分間の速度で１０分間遠心した後、上澄液を回収し、該上澄液を注入試料とした。
【０１０５】
クロマトグラフ条件は、以下の通りであった。
【０１０６】
カラム温度：４０±２．０℃
試料温度：５±３．０℃
検出波長：２１４ｎｍ
注入量：１０ｕＬ
流速：１．０ｍＬ／分間
【０１０７】
移動相は、溶液Ａ及び溶液Ｂを用い、溶液Ａは、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．４〜６．６）であり、溶液Ｂは、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．４〜６６）＋２００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌであり、それぞれ０．２２ｕｍのフィルターで減圧濾過した後、超音波処理によりガス抜きを行い、後段階の使用に備えて２〜８℃の温度で保存した。
【０１０８】
移動相は、下記表４に示される勾配を有するものであった。
【０１０９】
【表４】
0006456376.tif 000005
【０１１０】
３）結果分析
クロマトグラムごとに積分ソフトを用いて処理し、各ピークごとに相対面積比較法により純度を算出した。
【図１】
0006456376.tif 000006
【図２】
0006456376.tif 000007
【図３】
0006456376.tif 000008
【図４】
0006456376.tif 000009
【図５】
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【図６】
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