(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸鎖の通過経路を有する核酸搬送制御デバイスであって、
前記核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有し、
前記ナノチャネルが、ポリアルキルメタクリレートからなる主鎖に、液晶性を発現するメソゲン基を含む液晶性側鎖を有する疎水性高分子鎖と、ポリエチレンオキシドである親水性高分子鎖とからなるブロック共重合体のミクロ相分離構造を有し、
前記ナノチャネルが、前記ブロック共重合体の親水性高分子鎖を主成分として含有し、且つ
前記疎水性高分子鎖の主鎖を構成するポリアルキルメタクリレートが、ポリメチルメタクリレート（PMMA）であることを特徴とする、前記デバイス。
【請求項２】
前記ブロック共重合体が、以下の式：
【化１】
0006472208.tif 000003
［式中、m及びnは、ポリエチレンオキシド（PEO）及びアゾベンゼンに基づくメソゲン基を有する液晶性側鎖を有するポリメタクリレート誘導体（PMA(Az)）の重合度を示し、m=114、及びn=34である。］
で表される、請求項1に記載の核酸搬送制御デバイス。
【請求項３】
前記ナノポア及び前記ナノチャネルが互いに接触又は離間するように配置される、請求項1又は2に記載の核酸搬送制御デバイス。
【請求項４】
絶縁性下地材と、該絶縁性下地材の上方に直接又は間接的に配置された、前記ブロック共重合体を含有する薄膜とをさらに有し、
前記絶縁性下地材が、前記ナノポアを有し、前記薄膜が、前記ナノチャネルとその周囲に配置されたマトリックスとを有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸搬送制御デバイス。
【請求項５】
前記ナノチャネルが分岐構造を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸搬送制御デバイス。
【請求項６】
前記ナノチャネル及び前記マトリックスが共連続構造を有する、請求項4に記載の核酸搬送制御デバイス。
【請求項７】
前記ナノポア及び前記ナノチャネルが互いに離間するように配置され、且つ前記ナノチャネルがシリンダ状構造を有する、請求項3又は4に記載の核酸搬送制御デバイス。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか1項に記載の核酸鎖の通過経路を有する核酸搬送制御デバイスの製造方法であって、
前記核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有することを特徴とし、
該方法が、以下の工程：
絶縁性下地材に前記ナノポアを形成する工程、
前記絶縁性下地材の上方に、ポリアルキルメタクリレートからなる主鎖に、液晶性を発現するメソゲン基を含む液晶性側鎖を有する疎水性高分子鎖と、ポリエチレンオキシドである親水性高分子鎖とからなるブロック共重合体の薄膜を製膜する工程、
前記ブロック共重合体を自己組織化させて、ブロック共重合体のミクロ相分離構造を有し、且つ前記親水性高分子鎖を主成分として含有する前記ナノチャネルを形成する工程、を含む、前記方法。
【請求項９】
前記ナノチャネルを形成する工程の後に、前記ナノポアを形成する工程を実施する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1〜7のいずれか１項に記載の核酸搬送制御デバイスと、前記核酸搬送制御デバイスの核酸鎖の通過経路を介して連通する二つの溶液セルと、該二つの溶液セルのそれぞれに設けられた、該二つの溶液セルの間に電圧を印加するための電極とを有する、核酸シーケンシング装置。
【請求項１１】
複数の前記核酸鎖の通過経路が並列に配置された前記核酸搬送制御デバイスを有する、請求項10に記載の核酸シーケンシング装置。
【請求項１２】
前記電極間に流れる電流量の時間変化を計測する装置をさらに有する、請求項10又は11に記載の核酸シーケンシング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸鎖の搬送を制御するためのデバイス及びその製造方法に関する。また、本発明は、核酸鎖の塩基配列を読み取る核酸シーケンシング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
数Å〜数十nm程度の厚さの薄膜に埋め込まれた直径サブnm〜数nm程度の細孔（以下、「ナノポア」と記載する）を1分子の生体ポリマが通過すると、生体ポリマのモノマ配列パターンに応じて、ナノポア周辺部の電気的及び／又は光学的等の物理特性がパターン状に変化する。生体ポリマがデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid：DNA）又はリボ核酸（ribonucleic acid：RNA）のような核酸の場合、核酸の塩基配列に応じてパターンが変化する。
【０００３】
この現象を利用して、生体ポリマのモノマ配列解析を行う方法、特に生体ポリマがDNAの場合、DNAの塩基配列の配列解析、すなわちDNAシーケンシングを行う方法が近年盛んに研究されている。このような方法において、ナノポアは、電解質を含有する溶液を薄膜両側に配置した形態でしばしば用いられる。この薄膜の両端間に電圧を印加して、電位差を発生させることによって、ナノポアに、電解質を含有する溶液を通過させることができる。
【０００４】
電気的特性としてこの時発生するイオン電流に着目し、DNA鎖がナノポア通過した時に観測されるイオン電流の変化量がモノマ種によって異なることを原理として、DNA鎖の配列を決定する方式が最も有望視されている。イオン電流の他には、ナノポア部に１対の電極を形成しその電極間を流れるトンネル電流を利用して生体ポリマがナノポアを通過する際に観測されるトンネル電流量がモノマ種によって異なることを原理とした方式が広く知られている。
【０００５】
いずれの方式も、従来のように生体ポリマの断片化を伴う化学操作を必要とせずに、生体ポリマを直接読取することができる。生体ポリマがDNAの場合は、次世代DNA塩基配列解析システムであり、生体ポリマがタンパク質の場合は、アミノ酸配列解析システムである。いずれの場合も、従来よりも遥かに長い配列長を解読可能なシステムとして期待されている。以後、生体ポリマとしてDNAを対象として説明する。
【０００６】
ナノポアデバイスとしては、脂質二重膜に埋め込まれた中心に細孔を有するタンパク質を用いたバイオポアと半導体加工プロセスにて形成した絶縁薄膜に細孔を加工したソリッドポアの２種類が存在する。
【０００７】
バイオポアでは、脂質二重膜に埋め込まれた改変タンパク質（例えば、Mycobacterium smegmatis porin A (MspA)等）が有する細孔（直径1.2 nm，厚さ0.6 nm）を、DNA配列の検出部としてイオン電流の変化量を計測する。しかしながら、この細孔厚みが一塩基単位（DNAのモノマであるヌクレオチドの隣接距離は0.34 nm）よりも大きい場合、イオン電流変化量には複数の塩基の情報が混在してしまう。この空間分解能不足に加えて、タンパク質を利用するため溶液条件や環境条件によりタンパク質の細孔部が変性してデバイスが劣化してしまう。安定性や寿命の観点からデバイスのロバスト性が低いという課題が存在する。
【０００８】
一方、ソリッドポアでは、グラフェン又は二硫化モリブデンのような単分子層からなる薄膜を開孔して、ナノポアを形成できる。これらの厚みであれば、一塩基単位を読取るのに十分な空間分解能を確保することができる。また、タンパク質と異なり、様々な溶液条件及び環境条件において材料が安定であり、デバイスのロバスト性が高いという利点がある。加えて、半導体加工プロセスを用いてナノポア部を並列化することが可能である。前記のような利点から、ソリッドポアは、バイオポアよりも優れたデバイスとして着目されている。
【０００９】
DNA鎖をナノポア近傍まで搬送し、ナノポア内を通過させる手段として、イオン電流を発生させる電位差をそのまま駆動力として、DNA鎖を電気泳動させる方法が最も広く用いられている。しかしながら、電気泳動によるDNA鎖のナノポア通過速度は非常に速いために、隣接する複数の塩基からの信号が混在した信号値しか得られない。それ故、配列解析を実現するためには、通過速度を遅くする技術が必要であった。具体的には、100 μs／塩基以上の通過速度まで遅延できることが好ましいが、現状では0.01〜1 μs／塩基の通過速度である。このため、少なくとも100倍から10000倍程度の速度遅延を実現する必要がある。このように、通過速度を遅くすることができれば、一塩基のみの信号を取得することが可能となる。
【００１０】
この課題を解決すべく、様々な手法が考案されている。溶液の物性を調整する方法が多種検討されており、例えば、高濃度グリセロールを添加することにより、溶液粘度を上昇させて電気泳動時におけるDNA鎖の引張力と反対方向の摩擦力を増やすことで、ナノポア通過速度を遅くする方法が試みられている（非特許文献１）。また、溶液中にリチウムイオンを添加することにより、DNA鎖の見かけ上の負電荷を低減することで、電気泳動時の引張力を小さくしてナノポア通過速度の遅延させる方法が検証されている（非特許文献２）。
【００１１】
溶液の物性を調整する以外の方法としては、デバイス側に工夫をもたらす方法が検討されている。例えば、ナノポア自体を工夫する方法が検証されている。単純な方法として、ナノポアの直径を小さくすることでDNA鎖がナノポアを通過する際の摩擦力を増大させ、ナノポア通過速度を遅くする方法が知られている（非特許文献３）。
【００１２】
また、デバイスに新たな構造体を設ける方法が検討されている。特許文献１には、二次元状流路で構成されるナノポアデバイスにおいて、二次元形状の障害物を設置する方法が開示されている。前記特許文献では、ナノポアが加工された薄膜の両側に、規則的に距離を離して配置されたナノサイズの障害物群（円柱等）を設ける構造が開示されている。
【００１３】
他の障害物の例としては、ポリマ、樹脂、無機系多孔体又はビーズから構成されるゲル材料が明示されている。電気泳動時に生体ポリマが障害物に衝突することで、泳動を妨げる向きの摩擦力が発生するため、ナノポア通過速度が低減することが言及されている。
【００１４】
非特許文献４では、障害物の他の実現手段として、ナノポア上流側にランダムに多層積層させた樹脂材質のナノワイヤ群を設ける構造が開示されている。電気泳動時に生体ポリマがナノワイヤに衝突することによる摩擦力を利用して、ナノポア通過速度を低減することが言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開2014-074599号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】D.Fologea, et al. Nano Lett., 2005年, 第5(9)巻, p. 1734.
【非特許文献２】S.W.Kowalczyk, et al. Nano Lett., 2012年, 第12(2)巻, p. 1038.
【非特許文献３】R.Akahori, et al. Nanotechnology, 2014年, 第25巻, p. 275501.
【非特許文献４】A.H.Squires, et al. J. Am. Chem. Soc., 2013年, 第135(44)巻, p. 16304.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従来の方法では、遅延効果が不十分であるという課題が存在した。例えば、生体ポリマとして二本鎖DNAを対象とし、グリセロール等を添加して粘度に代表される溶液物性を調整する前記方法では、グリセロール添加前後で通過時間は5倍に遅延する程度の効果にとどまる。加えて、DNA鎖通過時に添加物も同時に通過するため、一塩基単位の塩基種別信号値差が小さくなり、塩基種の検出が困難になるという課題も存在した。一本鎖DNAを対象とし、リチウムイオンを添加する方法では、添加前後での遅延効果は10倍程度である。例えば、生体ポリマとして二本鎖DNAを対象とし、従来の障害物を利用した生体ポリマのナノポア通過速度の遅延方法では、遅延効果が15倍程度にとどまる。
【００１８】
したがって、いずれの公知の方法においても、DNA鎖のような核酸鎖のナノポア通過速度を、塩基配列が解析可能になる速度以下まで十分には遅延できておらず、別の手段の開発が望まれていた。
【００１９】
本発明は、前記課題に鑑みて為された。本発明は、新たな遅延原理を導入することにより、核酸鎖のナノポア通過速度を大幅に遅延化し、結果として塩基配列解析を安定に行うことが可能となる核酸搬送制御デバイス及びその製造方法、並びに核酸シーケンシング装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、疎水性高分子鎖と親水性高分子鎖とからなるブロック共重合体を自己組織化させることで、親水性高分子鎖が密に充填されたナノチャネルを形成し得ることを見出した。本発明者らはまた、得られたナノチャネル内部を核酸鎖が通過することで、核酸鎖の搬送速度を大幅に遅延化できることを新たに見出し、該ナノチャネルを、ナノポアを有する核酸搬送制御デバイスに適用することに想到した。
【００２１】
一態様において、本発明の核酸搬送制御デバイスは、核酸鎖の通過経路を有し、前記核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個以上のナノチャネルを有し、前記ナノチャネルが、疎水性高分子鎖と親水性高分子鎖とからなるブロック共重合体のミクロ相分離構造を有し、且つ前記ナノチャネルが、前記ブロック共重合体の親水性高分子鎖を主成分として含有する。別の態様において、本発明の核酸搬送制御デバイスは、核酸鎖の通過経路を有し、前記核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個以上のナノチャネルを有し、1個以上の前記ナノポアを有する絶縁性下地材と、該絶縁性下地材の上方に直接又は間接的に配置された薄膜とを有し、前記薄膜は、1個以上のナノチャネルとその周囲に配置されたマトリックスとを有し、且つ前記ナノチャネルには、前記ナノチャネルと前記マトリックスとの界面に固定されている親水性高分子鎖が充填されている。
【発明の効果】
【００２２】
本発明による核酸搬送制御デバイスは、塩基配列の読み取りが可能となる速度まで核酸鎖の搬送速度を遅延化させることができる。また、本発明による核酸搬送制御デバイスは、簡便な方法によって製造することができる。それ故、本発明は、高精度で且つ信頼性の高い核酸シーケンシング装置の製造に、非常に有用である。
【００２３】
前記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の核酸搬送制御デバイス１０を用いた核酸シーケンシング装置の断面構造を示す模式図である。
【図２】ブロック共重合体薄膜２０の構造を、ランダムチャネル構造及び直立シリンダ状構造を例として示す概略図である。
【図３】ブロック共重合体薄膜２０の構成単位を、直立シリンダ状構造を例に模式的に拡大して示した図である。
【図４】ナノチャネルの構造を、ランダムチャネル構造及び直立シリンダ状構造を例として示す模式図である。
【図５】ランダムチャネル構造及び直立シリンダ状構造を有するPEO-b-PMA(Az)薄膜の走査型透過電子顕微鏡観察像である。
【図６】種々の構成を有する実施例及び比較例の核酸搬送制御デバイスの断面構造を示す模式図である。
【図７】ランダムチャネル構造及び直立シリンダ状構造を有するPEO-b-PMA(Az)薄膜の、核酸搬送制御デバイス開孔部近傍における走査型透過電子顕微鏡観察像である。
【図８】第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスにおいて、ssPolyA鎖を含むバッファー溶液を試料として用いた場合に観察されたイオン電流量の時間変化を高分解能で計測した結果をプロットした図である。
【図９】第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスにおいて、ssPolyA鎖が核酸搬送制御デバイスを通過するのに要した時間の分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。以下では、適宜、図面等を用いて、本発明の実施形態について説明する。以下の説明は、本発明の内容の具体例を示すものである。本発明は、以下の説明に限定されるものではなく、本明細書に開示される技術的思想の範囲内において、当業者による様々な変更及び修正が可能である。また、本発明を説明するための全図において、同一の機能を有するものは、同一の符号を付け、その繰り返しの説明は省略する場合がある。
【００２６】
（核酸シーケンシング装置）
図１は、本発明の核酸搬送制御デバイスを用いた核酸シーケンシング装置の断面構造の一例を示す模式図である。本発明の核酸シーケンシング装置は、核酸搬送制御デバイス１０と、核酸搬送制御デバイス１０の核酸鎖の通過経路１４を介して連通する二つの溶液セル３０と、二つの溶液セル３０のそれぞれに設けられた、二つの溶液セル３０の間に電圧を印加するための電極３２とを有する。電解質水溶液３３を含有する2個の溶液セル３０が、核酸搬送制御デバイス１０の通過経路１４を介して連通している。ここで、片方の溶液セル３０には、配列を読み取るべき試料である核酸鎖３１が含まれている。核酸搬送制御デバイス１０の核酸鎖の通過経路１４は、ナノポア１３とナノチャネル２２とを有する。また、各溶液セル３０には電極３２が設置されており、両極に電圧を印加することにより、核酸搬送制御デバイス１０中の通過経路１４を、核酸鎖３１が通過する。図１においては、1個の核酸鎖の通過経路１４が配置された核酸搬送制御デバイス１０を有する実施形態を示している。しかしながら、本発明の核酸シーケンシング装置において、核酸搬送制御デバイスに含まれる核酸鎖の通過経路の数は特に制限されるものではない。例えば、複数の核酸鎖の通過経路１４が並列に配置された核酸搬送制御デバイス１０を有する実施形態であってもよい。なお、図１において、点線で示した通過経路１４の領域は、その機能を説明するために例示的に示したものである。核酸鎖が通過するナノチャネル２２の範囲は、図示された当該領域に制限されるものではない。
【００２７】
本発明において、「核酸」は、デオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）を意味する。前記核酸は、一本鎖の核酸鎖であることが好ましく、一本鎖のDNA鎖であることがより好ましい。前記核酸に本発明を適用することにより、該核酸鎖の塩基配列を高精度で読取ることができる。
【００２８】
通過経路１４を核酸鎖３１が通過する際に、通過経路を通過するイオン電流値を計測することで、核酸鎖の塩基配列を計測する実施形態の場合、電極３２間を流れる電流量の時間変化を電流計３５で測定すればよい。それ故、この実施形態においては、特にセンサを必要としない。電流計３５は、微弱電流を、高時間分解能及び低ノイズレベルで計測できる装置であることが望ましい。
【００２９】
核酸鎖の種別を計測するセンサを用いて、核酸鎖３１が核酸搬送制御デバイス１０の通過経路１４を通過する際に塩基配列を読み取る実施形態の場合、センサは、核酸搬送制御デバイス１０の前後、又はその内部に設置される。図１では、簡略化のため、センサは省略している。核酸鎖の塩基配列を読み取る手段、及びその手段に使用されるセンサの構成に関しては、特に制限はない。核酸鎖を横切るトンネル電流の変化又は核酸鎖の電荷量等の物理量を計測する種々の手段が従来から報告されている。それ故、本発明の前記実施形態においては、これらの公知の手段を利用することができる。或いは、通過経路１４を通過する核酸鎖の化学的組成を、ラマン散乱分光法又は赤外吸収分光法等の分光的手段で計測してもよい。分光的手段を用いる場合、塩基サイズに相当する空間分解能を得るために、プラズモン等の局所光増強場による励起法を適用することが好ましい。
【００３０】
（核酸搬送制御デバイス）
本発明の核酸搬送制御デバイス１０は、核酸鎖の通過経路１４を有し、核酸鎖の通過経路１４は、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポア１３に対して、複数の経路を有する1個以上のナノチャネル２２を有する。核酸鎖の通過経路１４は、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポア１３に対して、複数の経路を有する1個又は2個、特に1個のナノチャネル２２を有することが好ましい。ナノポア１３及びナノチャネル２２は、互いに接触又は離間するように配置されることが好ましい。ナノポア１３及びナノチャネル２２が互いに離間するように配置される実施形態の場合、ナノポア１３及びナノチャネル２２の間には、ナノポア１３のナノチャネル側開孔を包囲するように配置された核酸鎖整列部が配置されていてもよい。核酸鎖整列部は、空間又は任意の材料からなる層である。核酸鎖整列部が配置される場合、以下において説明するように、ナノチャネル２２の複数の経路を複数の核酸鎖が通過した場合であっても、該複数の核酸鎖を整列させて、一分子の核酸鎖のみを1個のナノポア１３に導くことができる。
【００３１】
本発明の一態様において、ナノチャネル２２は、疎水性高分子鎖と親水性高分子鎖とからなるブロック共重合体のミクロ相分離構造を有する。この場合、ナノチャネル２２は、前記ブロック共重合体の親水性高分子鎖を主成分として含有する。本発明の別の態様において、ナノチャネル２２には、ナノチャネル２２とマトリックス２１との界面に固定されている親水性高分子鎖が充填されている。
【００３２】
ナノチャネル２２は、チャネル構造を有する1個のドメインで構成されていてもよく、複数のドメインの集合体として構成されていてもよい。本明細書において、ナノチャネルが複数のドメインの集合体として構成される実施形態における、チャネル構造を有する1個のドメインを、「ナノチャネル単位」と記載する場合がある。
【００３３】
本発明の核酸鎖の通過経路において、1個のナノポアに対応する1個以上のナノチャネルは、それぞれが核酸鎖及び電解質イオンが通過し得る複数の経路を有することを特徴とする。前記の特徴を有する本発明の核酸鎖の通過経路は、封鎖電流方式を用いて核酸鎖の塩基配列の読取りを精緻に実施することが可能な点で有利である。図１に示すように、本発明の核酸搬送制御デバイス１０を塩化カリウムに代表される電解質の水溶液に浸漬した状態で、該核酸搬送制御デバイス１０に電圧を印加すると、電解質がナノポアを通過することに起因して、イオン電流が流れる。ここで、電解質の水溶液が核酸鎖３１を含有する場合、核酸鎖３１がナノポア１３を通過するイベントが発生する。この際のイオン電流値は、ナノポア１３を通過している核酸鎖３１を形成する塩基の種類に対応して、連続的に変化する。このイオン電流の変化量に基づき、核酸鎖の塩基配列を読み取る手段が、封鎖電流方式である。封鎖電流方式は、核酸鎖の塩基配列を読み取るためのセンサを別途準備する必要がない点で、優れた方法である。
【００３４】
封鎖電流方式を用いて核酸鎖の塩基配列を読み取るためには、核酸鎖が通過するナノポアに、十分な量のイオン電流を安定的且つ定常的に流す必要がある。本発明の核酸搬送制御デバイスは、1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個以上のナノチャネルを有する。このような特徴により、核酸鎖の塩基配列を読み取るために必要なイオン電流量及びその安定性を確保することができる。例えば、一分子の核酸鎖が核酸鎖の通過経路のナノチャネルを通過する場合、核酸鎖は、ナノチャネルが有する複数の経路の1個を通過する。これに対し、電解質イオンは、ナノチャネルが有する複数の経路のうち核酸鎖が通過中の経路とは異なる1個以上の経路を通過することができる。これにより、一分子の核酸鎖が核酸鎖の通過経路を通過する際に、イオン電流が安定に流れる状態を実現できる。それ故、本発明における核酸鎖の通過経路は、電解質イオンの透過挙動、例えば電解質イオンに対する抵抗に影響を与えず、核酸鎖搬送速度の遅延化効果のみを発現することができる。
【００３５】
本発明の一態様において、本発明の核酸搬送制御デバイス１０は、1個以上のナノポア１３を有する下地材１１と、下地材１１の上方に直接又は間接的に配置された薄膜２０とを有してもよい。この場合、薄膜２０は、1個以上のナノチャネル２２とその周囲に配置されたマトリックス２１とを有する。本明細書において、「下地材１１の上方に薄膜２０が配置される」とは、使用時の配置において、下地材１１の上面に薄膜２０が配置される場合のみならず、下地材１１の下面又は両面に薄膜２０が配置される場合をも意味する。下地材１１の両面に薄膜２０が配置される場合、それぞれの薄膜２０が、1個以上のナノチャネル２２とその周囲に配置されたマトリックス２１とを有することが好ましい。このような実施形態の場合、核酸鎖の通過経路１４は、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポア１３に対して、複数の経路を有する2個のナノチャネルを有することができる。また、本明細書において、「下地材１１の上方に薄膜２０が直接的に配置される」とは、下地材１１と薄膜２０とが互いに接触するように配置される場合を意味し、「下地材１１の上方に薄膜２０が間接的に配置される」とは、下地材１１と薄膜２０とが、その全体又は一部において互いに離間するように配置される場合を意味する。下地材１１の上方に薄膜２０が間接的に配置される実施形態の場合、すなわち、下地材１１と薄膜２０とが互いに離間するように配置される実施形態の場合、下地材１１と薄膜２０との間には、ナノポア１３の薄膜側開孔を包囲するように配置された核酸鎖整列部が配置されていてもよい。
【００３６】
ナノチャネル２２の形状は、図１に示すようにランダムに分岐し連結した構造に制限されるものではない。ナノチャネル２２は、例えば、薄膜２０を貫通するよう配置されたシリンダ状若しくはラメラ状の1個以上のナノチャネル単位２３が配列した集合体からなる構造を有してもよく、分岐構造を有してもよい。ナノチャネル２２が分岐構造を有する場合、ナノチャネル２２と周囲のマトリックス２１とは、通常は、一緒になって共連続且つ規則的な構造を有する。ナノチャネルの構造については、別項で詳述する。
【００３７】
ナノポア１３は、直径Dを有する。直径Dは、ナノポアを通過させる分子に応じて適宜選択すればよい。例えば、ナノポアを通過させる分子が一本鎖核酸の場合、直径Dは、0.7 nm以上であることが好ましく、0.9 nm以上であることがより好ましい。直径Dは、5 nm以下であることが好ましく、1.5 nm以下であることがより好ましい。また、直径Dは、0.7〜5 nmの範囲であることが好ましく、0.9〜1.5 nmの範囲であることがより好ましい。直径Dが前記下限値以上の場合、一本鎖核酸分子にナノポアを通過させることができる。直径Dが前記上限値以下の場合、ナノポアを通過させる分子を一本鎖核酸の一分子のみに制限することができる。
【００３８】
ナノポア１３の形状は、円形（例えば真円形若しくは楕円形）、多角形又はそれらが歪んだ形状のような任意の形状であってよく、円形であることが好ましい。ナノポア１３の形状が真円状ではない場合、ナノポア１３の直径Dは、下地材１１の表面におけるナノポア１３の断面図形に内接する真円の直径を意味する。
【００３９】
下地材１１は、図１に示すように、1個の膜層からなる単層構造を有してもよく、図６に示すように、複数の膜層からなる多層構造を有してもよい。下地材１１が多層構造を有する実施形態は、ナノポアを有し、且つ一塩基の大きさに相当する膜厚を有する膜層と、その他の機能を有する膜層（例えば、核酸鎖整列部を有する膜層）とからなる下地材を簡単に作製できることから、特に有利である。
【００４０】
下地材１１は、通常は絶縁性である。下地材１１の材質は、ナノポア１３を開孔できるものであれば特に限定されない。下地材１１の材料は、窒化シリコン（SiN、例えば、Si3N4）、酸化シリコン（SiO2）、酸化ハフニウム（HfO2）又はグラフェン等であることが好ましい。これらの材料を用いて作製される下地材１１は、電解質溶液３３に対して腐食耐性を有し、且つナノポア１３の開孔を容易に行うことができる。封鎖電流値により核酸鎖の塩基配列を読取る場合、下地材１１の材料は、SiN又はグラフェン等の1原子の厚さを有するシート形態の2次元材料であることが好ましい。下地材１１が2次元材料を用いて作製されることにより、一塩基の大きさに相当する膜厚を有する下地材を作製することができる。例えば、下地材１１が単層構造を有する場合、下地材１１は、前記2次元材料を用いて作製されることが好ましい。下地材１１が多層構造を有する場合、複数の膜層は、いずれも前記材料から選択される同一の材料を用いて作製されてもよく、前記材料から選択される互いに異なる材料を用いて作製されてもよい。この場合、ナノポア１３を有する膜層が、前記2次元材料を用いて作製されることが好ましい。ナノポア１３を有する膜層が2次元材料を用いて作製されることにより、ナノポア１３の周辺領域において一塩基の大きさに相当する膜厚を有する下地材を作製することができる。このような構成により、核酸鎖の塩基配列を高精度で読取ることができる。
【００４１】
下地材１１は、所望の直径Dを有する微細なナノポア１３を形成することができるよう、100 nm以下、特に50 nm以下の膜厚であることが好ましい。また、下地材１１は、十分な強度を有することができるよう、10 nm以上の膜厚であることが好ましい。封鎖電流値により核酸鎖の塩基配列を読取る場合、下地材１１は、0.3 nm以上の膜厚であることが好ましい。前記膜厚は、一塩基の大きさに相当する。それ故、前記下限値以上の膜厚の場合、核酸鎖の塩基配列を高精度で読取ることができる。
【００４２】
下地材１１は、その全体に亘って前記膜厚を有してもよい。しかしながら、下地材１１は、ナノポア１３の周辺領域及びそれ以外の領域において、互いに異なる膜厚を有してもよい。この場合、下地材１１は、多層構造を有することが好ましい。例えば、封鎖電流値により核酸鎖の塩基配列を読取る場合、下地材１１を構成するナノポアを有する膜層は、0.3〜2.0 nmの範囲の膜厚であり、且つ多層構造を有する下地材１１の全体が10〜100 nmの範囲の膜厚であることが好ましい。このような構成により、下地材１１は、複数の膜厚の領域を有することができる。
【００４３】
下地材１１は、下地孔１５を有してもよい。下地孔１５は、その一端の開孔部全体又はその一部分の孔径が極小化されて、ナノポア１３と接続されている。すなわち、下地孔１５は、一端にナノポア１３と接続された直径Dの開孔部を有し、他端に直径D’の開孔部を有する。多層構造を有する下地材１１に、下地孔１５が配置されることが好ましい。例えば、図６（a）、（d）及び（e）に示すように、下地材１１が多層構造を有する実施形態において、ナノポアを有する膜層６１の上方又は下方に配置される膜層６２及び６３に、下地孔が配置されることが好ましい。このような構成により、ナノポア及び下地孔を別々の膜層に形成することができる。下地孔１５において、直径D’は、0.7 nm以上であることが好ましく、0.9 nm以上であることがより好ましい。直径D’は、100 nm以下であることが好ましく、50 nm以下であることがより好ましい。また、直径D’は、0.7〜100 nmの範囲であることが好ましく、0.9〜50 nmの範囲であることがより好ましい。下地孔１５の直径D’が前記下限値以上の場合、その一端においてナノポア１３と接続することができる。下地孔１５の直径D’が前記上限値以下の場合、ナノポア１３の周辺領域において以下で説明する所望の範囲の膜厚を有し、且つそれ以外の領域において前記範囲を上回る膜厚を有する下地材を適用することができる。
【００４４】
下地孔は、使用時の配置において下地材の上面に配置されることが好ましい。下地孔がこのような配置の場合、下地孔は、下地材に形成されたナノポアとナノチャネルとの間に挟持されるように配置されて、核酸鎖整列部として機能する。この場合、核酸鎖整列部として機能する下地孔は、ナノチャネルを構成する複数のナノチャネル単位と連通することにより、該複数のナノチャネル単位の経路をナノポアに接続することができる。
【００４５】
下地材１１は、それ単独で用いてもよい。しかしながら、図１に示したように、下地材１１の硬度又は取り扱い性を向上させるために、下地材１１の下方にサポート基板１２が配置されることが好ましく、使用時の配置において、下地材１１の下面にサポート基板１２が配置されることがより好ましい。この場合、サポート基板１２は、下地材１１の下面の一部分と接触するように配置されることが好ましく、下地材１１の表面において、ナノポア１３及び／又は下地孔１５の開孔部を包囲するように配置されることがより好ましい。前記の如くサポート基板１２を配置することにより、下地材１１の硬度又は取り扱い性を向上し、且つ核酸鎖の通過経路を確保することができる。
【００４６】
下地材１１表面と薄膜２０との親和性を向上させるために、下地材１１の表面を、化学的に改質してもよい。この場合、下地材１１の表面に高分子鎖をグラフト化する方法、又は下地材１１の表面にカップリング剤を反応させる方法等を適用することができる。或いは、プラズマ処理又はUV処理等の表面改質技術を下地材１１の表面に適用してもよい。
【００４７】
下地材１１は、例えば特開平8-248198号公報に開示されるような公知の方法に従って製造することができる。例えば、サポート基板１２（例えばシリコンウエハ）の表面に、下地材１１（例えば窒化シリコン又は酸化シリコン膜）を製膜し、次いでサポート基板１２の一部分を、例えば水酸化テトラメチルアンモニウム（TMAH）溶液又は水酸化カリウム（KOH）水溶液等を用いる異方エッチング技術により除去することにより、製造することができる。下地材１１が多層構造を有する場合、フォトリソグラフィとエッチングとを組み合わせる方法のような半導体製造等の技術分野で広く適用される公知の方法により、所望の断面形状を作製すればよい。
【００４８】
ナノポア１３の形成には、公知の様々な半導体加工方法を適用することができる。ナノポア１３を形成する工程に適用される方法は、ナノポア１３のサイズ（直径D）及び／又は加工時間を考慮して、適宜選択することができる。例えば、ガリウムイオン若しくはヘリウムイオン等の粒子ビームによる集束イオンビーム（FIB）加工、集束した電子線による電子ビーム（EB）加工、又はフォトリソグラフィによる加工等を採用することができる。単一のナノポア１３を形成する場合、FIB加工又はEB加工等の直接加工技術が好ましい。ナノポア１３をアレイ化することで並列読取りが可能なデバイスを製造する場合、加工に要する時間を短縮できることから、フォトリソグラフィによる加工技術が好ましい。
【００４９】
或いは、ナノポア１３は、ナノポア１３が形成されていない核酸搬送制御デバイス１０を溶液セル３０に設置し、電解質に浸漬した状態で、電極３２の両端にパルス電圧を引加することで生じる誘電破壊現象により、形成することもできる（例えば、H. Kwok et al. PLoS ONE 9 (3), 2014）。本実施形態は、ナノポア１３のサイズ（直径D）を、電極間に流れる電流量を計測しながら調整できる点で優れた方法である。
【００５０】
（ブロック共重合体薄膜）
本発明の一態様において、薄膜は、ブロック共重合体を含有する。本明細書において、ブロック共重合体を含有する薄膜を、「ブロック共重合体の薄膜」又は「ブロック共重合体薄膜」と記載する場合がある。ブロック共重合体薄膜２０は、1個以上のナノチャネル２２とその周囲に配置されたマトリックス２１（連続相）とを有する。ナノチャネル２２は、疎水性高分子鎖と親水性高分子鎖とからなるブロック共重合体のミクロ相分離構造を有する。図２は、ブロック共重合体薄膜２０のミクロ相分離構造の例として、ナノチャネルが（ａ）ランダムな分岐構造（以下、「ランダムチャネル構造」とも記載する）、及び（ｂ）薄膜の上下を貫通するように配列した直立シリンダ状構造（以下、単に「シリンダ状構造」とも記載する）を有する実施形態を示す概略図である。
【００５１】
ナノチャネル２２がランダムチャネル構造を有する実施形態の場合、ブロック共重合体薄膜２０内において、ナノチャネル２２は、相互に結合した状態で連続的な構造を有している。マトリックス２１も同様に、相互に結合した状態で連続的な構造を有している。この場合、ナノチャネル２２とマトリックス２１とは、相補的な連続的構造を有している。本明細書において、ナノチャネル及びマトリックスの相補的な連続的構造を、「共連続構造」と記載する場合がある。ナノチャネル及びマトリックスが共連続構造を有する実施形態としては、例えば、図２（ａ）に示したランダムチャネル構造の他、規則的な分岐構造からなるギロイド構造等も包含される。本発明において、ナノチャネル及びマトリックスが共連続構造を有する実施形態の場合、前記いずれの構造も適用することができる。
【００５２】
ナノチャネル２２がシリンダ状構造を有する実施形態の場合、シリンダ状構造を有する複数のナノチャネル単位２３がマトリックス２１中に配列するとともに、ブロック共重合体薄膜２０を貫通する方向に配向する。そして、シリンダ状構造を有するナノチャネル２２は、使用時の配置におけるブロック共重合体薄膜２０の水平面（すなわち上面又は下面）において、シリンダ状構造を有する複数のナノチャネル単位２３が六方最密構造となるように規則的に配列したパターンを形成する。ナノチャネルが、独立して配列するナノチャネル単位の集合体からなる構造を有する実施形態としては、例えば、図２（ｂ）に示したシリンダ状構造の他、ラメラ状の複数のナノチャネル単位がブロック共重合体薄膜２０を貫通するように配向し配列する構造も包含される。本発明において、ナノチャネルがシリンダ状構造を有する実施形態の場合、前記いずれの構造も適用することができる。
【００５３】
次に、図３を参照して、ブロック共重合体のミクロ相分離構造について説明する。図３は、シリンダ状構造を有するナノチャネルを構成するナノチャネル単位２３を例に、ブロック共重合体薄膜２０の構成単位を模式的に拡大した図である。ブロック共重合体薄膜２０は、ブロック共重合体４０のみからなるか、又はそれを主成分として含有する。ブロック共重合体４０が、疎水性高分子鎖４１と親水性高分子鎖４２とからなる両親媒性のジブロック共重合体である場合、図３（ｂ）に示されるように、ブロック共重合体４０の分子は、疎水性高分子鎖４１と親水性高分子鎖４２とがそれぞれの末端で結合した化学構造を有する。ブロック共重合体４０は、疎水性高分子鎖４１と親水性高分子鎖４２とが互いの末端で結合したAB型のジブロック共重合体であってもよく、又はABA型のトリブロック共重合体であってもよい。ブロック共重合体４０はまた、第３の高分子鎖を有し、三種以上の高分子鎖からなるABC型ブロック共重合体であってもよい。或いは、ブロック共重合体４０は、前記のような高分子鎖が直列に結合した直列型のブロック共重合体の他、各高分子鎖が１点で結合したスター型のブロック共重合体であってもよい。いずれの場合も、本発明におけるブロック共重合体の実施形態に包含される。
【００５４】
ブロック共重合体は、適切な方法で合成すればよい。ミクロ相分離構造の規則性を向上させるために、ブロック共重合体は、可能な限り分子量分布が小さくなるような合成方法、例えばリビング重合法又は原子移動ラジカル重合（ATRP）法を用いて製造することが好ましい。
【００５５】
ブロック共重合体４０の構成単位である親水性高分子鎖４２としては、ポリエチレンオキシド（PEO）、ポリ乳酸（PLA）、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート（例えばポリヒドロキシエチルメタクリレート（PHEMA）等）、ポリアクリルアミド（例えばN,N-ジメチルアクリルアミド）、又はイオン性高分子（例えばポリアクリル酸若しくはポリアクリルメタクリル酸等の不飽和カルボン酸の重合体、ポリアミノ酸、若しくは核酸、又はそれらの塩）を含む高分子鎖を挙げることができる。親水性高分子鎖４２は、ポリエチレンオキシド、ポリ乳酸又はポリヒドロキシエチルメタクリレートであることが好ましく、ポリエチレンオキシドであることがより好ましい。
【００５６】
ブロック共重合体４０の構成単位である疎水性高分子鎖４１としては、ポリスチレン（PS）、ポリアルキルメタクリレート（例えばポリメチルメタクリレート（PMMA））、ポリビニルピリジン、ポリアルキルシロキサン（例えばポリジメチルシロキサン）、ポリアルキルジエン（例えばポリブタジエン）等を含む高分子鎖を挙げることができる。疎水性高分子鎖４１は、前記高分子鎖からなる主鎖に、液晶性を発現するメソゲン基を含む液晶性側鎖を有することが好ましい。メソゲン基としては、アゾベンゼン、スチルベン、ベンジリデンアニリン、ビフェニル、ナフタレン又はシクロヘキサンに基づく骨格を有する基を挙げることができる。前記メソゲン基を含む液晶性側鎖は、場合によりスペーサー基を介して主鎖と結合していてもよい。この場合、メソゲン基に結合するスペーサー基としては、アルキル基、アルコキシ基又はアルコキシアルキル基等を挙げることができる。スペーサー基は、直鎖状であることが好ましい。スペーサー基の炭素数は、4個以上であることが好ましく、5個以上であることがより好ましく、8個以上であることがさらに好ましく、10個以上であることがとりわけ好ましい。前記側鎖を有する疎水性高分子鎖４１としては、ポリアルキルメタクリレートにおけるアルキル部分が、部分的に又は完全に前記のような液晶性高分子鎖に置換された構造を有するものを挙げることができる。ブロック共重合体において、前記液晶性側鎖を有する疎水性高分子鎖４１と組み合わせる親水性高分子鎖４２としては、ポリエチレンオキシドが特に好ましい。ブロック共重合体の疎水性高分子鎖に液晶性側鎖を導入することにより、ブロック共重合体は、容易に自己組織化してミクロ相分離構造を形成し、ナノチャネルを形成することができる。本発明の核酸搬送制御デバイスが、ブロック共重合体薄膜２０を有する実施形態の場合、ブロック共重合体の疎水性高分子鎖に液晶性側鎖を導入することにより、ブロック共重合体は、容易に自己組織化してミクロ相分離構造を形成し、使用時の配置におけるブロック共重合体薄膜２０の上面及び下面に対して貫通した構造を有するナノチャネル２２を形成することができる。
【００５７】
液晶性側鎖を有する疎水性高分子鎖４１を含む液晶性ブロック共重合体では、液晶性側鎖を有する疎水性高分子鎖４１を主成分として含有するマトリックス２１が、液晶相を発現する。本発明の核酸搬送制御デバイスが、ブロック共重合体薄膜２０を有する実施形態の場合、使用時の配置においてマトリックス２１が液晶相を発現すると、液晶性側鎖は、ブロック共重合体薄膜２０の上部表面（すなわち自由表面）に対してホメオトロピックに配向する。この配向性効果により、ナノチャネル２２は、使用時の配置におけるブロック共重合体薄膜２０の上面及び下面に対して直立し、且つ薄膜を貫通する方向に配向しやすくなる。この場合、ナノチャネル２２の配向性は、ブロック共重合体薄膜２０の膜厚、自己組織化の際のプロセス温度、及び／又は下地材の表面状態等によっても変化することが多い。このため、ナノチャネル２２の配向性の制御は、困難を伴う場合がある。本発明において、液晶性ブロック共重合体を用いることにより、ナノチャネルを、ブロック共重合体薄膜を貫通する方向に配向させることができる。
【００５８】
ブロック共重合体の自己組織化によって形成される該ブロック共重合体のミクロ相分離構造は、構成単位である各ブロックの組成比、例えばブロック共重合体の構成単位である各高分子鎖が占有する体積の比に基づき、規定することができる。ブロック共重合体の各ブロックの組成比が0.5〜1.0の範囲で大きくなるに従い、ブロック共重合体のミクロ相分離構造、すなわちナノチャネルの構造は、ラメラ状（板状）構造から、共連続構造であるジャイロイド構造、シリンダ状構造、さらに球状構造へと変化する。それ故、疎水性高分子鎖と親水性高分子鎖との組成比を適宜決定することにより、所望の構造を有するナノチャネルを得ることができる。
【００５９】
（核酸鎖の搬送速度遅延化）
図３に示すように、本発明の一態様において、ナノチャネル２２は、親水性高分子鎖を主成分として含有する。本発明の別の態様において、ナノチャネル２２には、その内部に親水性高分子鎖が充填されている。本発明者らは鋭意検討を行い、水溶液に浸漬した状態のナノチャネル２２中を核酸鎖が通過すること、また、その際の核酸鎖の通過速度が、親水性高分子鎖が充填されていない微細孔内、又はバルク状態の水溶性高分子ゲル中の核酸鎖の通過速度と比較して、極めて遅いことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００６０】
図４を参照し、本発明における核酸鎖の搬送遅延化効果について説明する。図４（ａ）に、ランダムチャネル構造を有するナノチャネルの一部を、図４（ｂ）に、直立したシリンダ状構造を有するナノチャネルを構成するナノチャネル単位２３の一部を、それぞれ拡大して模式的に図示する。本発明の一態様において、ナノチャネル２２は、親水性高分子鎖４２を主成分として含有する。本発明の別の態様において、ナノチャネル２２には、その内部に親水性高分子鎖４２が充填されている。ナノチャネル２２の周囲には、疎水性高分子鎖４１を主成分として含有するマトリックス（以下、「疎水性マトリックス」とも記載する）２１が配置されていることが好ましい。この場合、親水性高分子鎖４２と疎水性高分子鎖４１との結合点４３は、ナノチャネル２２と疎水性マトリックス２１との界面（例えばナノチャネル２２の側面）に固定されている構造を有する。
【００６１】
ここで、ナノチャネル２２の内部における親水性高分子鎖４２の密度は、乾燥状態では固体状態と略同等であると考えられる。このような構造を有するナノチャネル２２を水溶液中に浸漬すると、親水性であるナノチャネル２２の内部に、水溶液に含まれる水及び電解質等の低分子が拡散する。しかしながら、親水性高分子鎖４２は、結合点４３の位置でナノチャネル２２の側面に固定されているため、大幅に膨潤しない。このため、ナノチャネル２２の内部における親水性高分子鎖４２の密度は、ナノチャネル２２を水溶液中に浸漬した後であっても大きく低下することはない。それ故、ナノチャネル２２の内部は、超高密度のゲルで充填された微細空間となると予測される。
【００６２】
このような微細空間中に高分子量の核酸鎖が侵入した場合、通過することが可能かどうかは全く未知であった。本発明者らは種々検討を行い、ナノチャネル２２の両端の開孔部に電位差を設けることにより、核酸鎖３１がナノチャネル２２の内部を通過することを見出した。
【００６３】
核酸鎖３１の搬送速度は、ランダムチャネル構造を有するナノチャネルの場合にはナノチャネル２２の直径、シリンダ状構造を有するナノチャネルの場合にはナノチャネル単位２３の直径、核酸鎖３１が通過するナノチャネル２２の経路長、及び／又はナノチャネル２２の主成分である親水性高分子鎖４２の密度等を適宜調整することにより、制御することができる。本発明の核酸搬送制御デバイスが、ブロック共重合体薄膜２０を有する実施形態の場合、ナノチャネル２２の経路長は、ブロック共重合体薄膜２０の膜厚と相関がある。核酸鎖３１を安定して通過させ、且つ十分な遅延効果を得るために、ブロック共重合体薄膜２０は、10 nm以上、特に20 nm以上、及び500 nm以下、特に100 nm以下の範囲の膜厚を有することが好ましい。
【００６４】
（ブロック共重合体薄膜の製造方法）
本発明の核酸搬送制御デバイスが、ブロック共重合体薄膜２０を有する実施形態の場合、ナノチャネル２２を有するブロック共重合体薄膜２０は、以下の工程を含む方法により製造することができる。
【００６５】
まず、下地材１１にナノポア１３を形成する。本工程は、前記で説明した方法により実施することができる。ナノポア形成工程は、以下において説明する各工程の前に実施してもよく、後に実施してもよい。以下において説明するナノチャネルを形成する工程の後に、ナノポアを形成する工程を実施することが好ましい。前記順序で各工程を実施することにより、ナノチャネルの末端開孔の位置とナノポアの位置との位置合わせのための処理をすることなく、簡便に本発明の核酸搬送制御デバイスを製造することができる。
【００６６】
重合反応により、所定の化学構造及び組成を有するブロック共重合体４０を合成する。重合反応には、前記のように、リビング重合法又は原子移動ラジカル重合（ATRP）法を適用することが、ブロック共重合体４０の分子量、組成及び／又は分子量分布を制御できる点で好適である。ブロック共重合体４０の分子量、及びブロック共重合体の構成単位である疎水性高分子鎖４１と親水性高分子鎖４２との分子量比に応じて、得られるナノチャネル２２の形状、サイズ、及び／又はドメイン間の距離等が変化する。それ故、重合反応の反応条件を適宜調整することにより、所望の構造を有するナノチャネルを得ることができる。
【００６７】
次に、得られたブロック共重合体４０を溶媒に溶解し、得られたブロック共重合体溶液を用いて、下地材１１の上方、好ましくは使用時の配置における下地材１１の上面に、ブロック共重合体薄膜２０を製膜する。前記溶媒としては、ブロック共重合体を均一に溶解させることができれば特に制限はない。当該技術分野で通常用いられる各種の有機溶媒、例えばトルエン又はクロロホルムを用いることができる。ブロック共重合体４０は、通常は両親媒性であるため、組み合わせる高分子鎖の化学組成によっては均一に溶解させうる溶媒が存在しない可能性がある。そのような場合、ブロック共重合体４０を溶解させるための溶媒として、複数の溶媒を混合した混合溶媒を適用すればよい。
【００６８】
ブロック共重合体薄膜２０の製膜工程には、スピンコート又はディップコート等の公知の手段を適宜適用すればよい。ブロック共重合体薄膜２０が所定の膜厚を有するように、ブロック共重合体溶液の濃度、溶媒の種類、スピンコートの場合は回転数、及び／又はディップコートの場合は引き上げ速度等の製膜条件を適宜調整することにより、所望の膜厚を有するブロック共重合体薄膜２０を得ることができる。
【００６９】
前記工程で製膜されたブロック共重合体薄膜２０の内部におけるブロック共重合体分子４０は、溶媒の蒸発に伴い、自己組織化によるミクロ相分離過程が途中で停止した状態で存在する。本発明に適用される両親媒性ブロック共重合体のように、ブロック共重合体の構成単位である異種高分子鎖間の斥力が大きい場合（強偏斥の場合）、通常は、相分離が急速に進行する。このようなブロック共重合体では、溶媒を蒸発させた状態においてもミクロ相分離がある程度進行する。この場合、ブロック共重合体の内部で、ランダムな分岐構造であるランダムチャネル構造が形成される場合が多い。それ故、ナノチャネル２２がランダムチャネル構造を有する実施形態の場合、前記原理を用いてナノチャネル２２を形成させることができる。
【００７０】
ナノチャネル２２が、ブロック共重合体の安定平衡状態への遷移によって形成されるより規則的な構造、例えば、ラメラ構造、ジャイロイド構造又はシリンダ状構造を有する実施形態の場合、下地材１１に製膜された状態のブロック共重合体薄膜２０をアニール処理することにより、ブロック共重合体を自己組織化させてミクロ相分離過程を進行させることができる。本発明において、「アニール処理」は、ブロック共重合体薄膜２０の内部においてブロック共重合体４０が運動できる状態に保持することで、薄膜の自由エネルギーが最小となるような構造を形成するようにする処理を意味する。アニール処理は、例えば、ブロック共重合体４０の構成単位である高分子鎖のガラス転移温度以上に加熱する処理（熱アニール処理）、又はブロック共重合体薄膜２０を溶媒蒸気に暴露することで膜を膨潤させる処理（溶媒アニール処理）等の公知の方法によって、実施することができる。
【００７１】
液晶性ブロック共重合体を用いて熱アニール処理する実施形態の場合、液晶の転移温度についても十分に考慮する必要がある。液晶性ブロック共重合体において、液晶性側鎖は、液晶転移温度以上ではランダムに分散したアイソトロピック相を、液晶転移温度未満では一定方向に配向することで液晶性を発現する。このため、液晶性ブロック共重合体を用いる場合、まず液晶転移温度以上に加熱した後に液晶転移温度未満に冷却することで、均一なミクロ相分離構造を得ることができる。例えば、アゾベンゼン骨格をメソゲン基として有する液晶性側鎖を有する疎水性高分子鎖４１と、ポリエチレンオキシド（PEO）からなる親水性高分子鎖４２とを有するブロック共重合体４０を用いる場合、液晶転移温度である100℃以上に一旦加熱した後に、液晶転移温度未満であり、且つガラス転移温度以上である90℃に冷却してアニール処理を行うことが好ましい。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７３】
［製造例１：直立シリンダ状構造を有するナノチャネルを有する核酸搬送制御デバイスの製造］
本製造例においては、図５〜図９を適宜参照しながら、直立シリンダ状構造を有するナノチャネルを適用した本発明の核酸搬送制御デバイスの実施例について、対応する比較例とともに詳述する。
【００７４】
（１）液晶性ブロック共重合体の合成及びその物理化学的性質の評価
ブロック共重合体には、親水性高分子鎖としてポリエチレンオキシド（PEO）を、疎水性高分子鎖としてアゾベンゼンに基づくメソゲン基を有する液晶性側鎖を有するポリメタクリレート誘導体（PMA(Az)）からなるPEO-b-PMA(Az)を、それぞれ用いた。前記ブロック共重合体の化学式を、以下に示す。
【化１】
0006472208.tif 000002
式中、m及びnは、PEO及びPMA(Az)の重合度を示す自然数である。
【００７５】
本製造例においては、m=114、及びn=34である前記ブロック共重合体を使用した。
【００７６】
PEO-b-PMA(Az)は、Y. Tian et al., Macromolecules 2002, 35, 3739-3747に記載されている方法に従い、原子移動ラジカル重合法により重合した。得られたブロック共重合体の重合度は、1H NMR及びGPCにより決定した。
【００７７】
得られたブロック共重合体（PEO114-b-PMA(Az)34）の自己組織化構造を評価した。まず、PEO114-b-PMA(Az)34を、1.5重量％の濃度になるようにトルエンに溶解させた。次に、得られた溶液を、SiN薄膜の表面に約50 nmの膜厚となるようにスピンコートして、アズスパン（スピンコートにより製膜した状態）サンプルを2個製作した。膜厚の調整は、スピンコート時の回転数を変化させることにより行った。約3000 rpmの回転数でスピンコート処理することにより、目的の膜厚が得られた。
【００７８】
次に、アズスパンサンプルのうち1個を真空オーブンに導入して、以下の方法で熱アニール処理した。この熱アニール処理により、PEO114-b-PMA(Az)34薄膜を自己組織化させて、ブロック共重合体のミクロ相分離構造を形成させた。まず、アズスパンサンプルを、真空中において140℃に加熱した状態で1時間放置した。この温度では、PMA(Az)34が等方相を形成していることを、別途行った偏光顕微鏡観察で確認した。次に、加熱後のサンプルを90℃まで冷却し、PMA(Az)34を、等方相からスメクチック液相へ転移させた。冷却後のサンプルを、この状態で3時間放置した後に、さらに自然冷却した。前記熱アニール処理により、ブロック共重合体の自己組織化を完了した。
【００７９】
アズスパン状態のサンプル及び熱アニール処理を実施後のサンプルの構造を、走査型透過電子顕微鏡（STEM、日立ハイテクノロジーズ社製HD-2700）で観察した。STEM観察は、サンプルをルテニウム（Ru）蒸気に暴露することで、PEO相を染色した後に実施した。得られたSTEMによる顕微鏡像の例を図５に示す。
【００８０】
図５（ａ）は、アズスパン状態のPEO114-b-PMA(Az)34薄膜のSTEMによる暗視野像を、図５（ｂ）は、熱アニール処理後のPEO114-b-PMA(Az)34薄膜のSTEMによる暗視野像を、それぞれ示す。Ru染色はPEOを選択的に染色する。そのため、STEMによる暗視野観察においては、PEO相が白く、PMA(Az)相が黒く、それぞれ観察される。
【００８１】
図５（ａ）より、PEO114-b-PMA(Az)34薄膜は、アズスパンの状態ではPEOからなるナノチャネルが分岐した状態でランダムに結合したランダムチャネル構造を有していることが確認された。ナノチャネルの径は、約10 nmであった。また、図５（ｂ）より、アニール後のPEO114-b-PMA(Az)34薄膜は、PEOからなるシリンダ状の独立したナノチャネル単位（以下、「PEOシリンダ」とも記載する）が、膜に対して直立した状態でヘキサゴナルに配列している直立シリンダ状構造であることが判明した。PEOシリンダの直径は、9 nmであり、各シリンダの中心間隔は、23 nmであった。
【００８２】
（２）核酸搬送制御デバイスの作製
本製造例では、図６（ａ）〜（ｃ）に断面構造を模式的に示した3種類の構成を有する核酸搬送制御デバイスを製作した。図６（ａ）に示す第一の構成は、本発明の核酸搬送制御デバイスの実施例である。図６（ｂ）に示す第二の構成、及び図６（ｃ）に示す第三の構成は、第一の構成の実施例に対応する比較例である。
【００８３】
まず、サポート基板１２であるSiウエハの上面に、下地材１１を製膜してデバイス基板を準備した。下地材１１は、フォトリソグラフィ及びエッチングプロセスを組み合わせることで形状の異なる開孔部を製作するために、SiO2層６２の上面及び下面にSiN層６１及び６３を配置したサンドイッチ構造を有する多層膜を用いた。
【００８４】
実施例である図６（ａ）に示す第一の構成においては、下地材１１の上面に作製した下地孔の上部開孔６５の直径は、50 nmとし、上部開孔６５に連通した下地材１１の下部開孔６４の直径は、2.5 nmとした。本構成において、下部開孔６４は、ナノポアの開孔部として機能する。上部開孔６５は、下地孔の開孔部として機能する。上部開孔６５を有する下地孔は、ナノポアに接続されるナノチャネル２２を構成するナノチャネル単位２３（すなわち、本実施例においては独立したPEOシリンダ）の数を、所定の範囲に制限する核酸鎖整列部として機能する。
【００８５】
比較例である図６（ｂ）に示す第二の構成においては、下地材１１の上面に作製した上部開孔６５の直径は、2.5 nmとし、上部開孔６５に連通した下地材１１の下部開孔６４の直径は、50 nmとした。本構成において、上部開孔６５は、ナノポアの開孔部として機能する。上部開孔６５は、ナノポアに接続されるナノチャネル２２を構成するナノチャネル単位２３（すなわち、本実施例においては独立したナノポアに接続されるナノチャネルを構成するナノチャネル単位）の数を、1個に制限する機能を有する。
【００８６】
比較例である図６（ｃ）に示す第三の構成においては、下地材１１に、上面及び下面の開孔部が50 nmの下地孔６６を作製した。本構成において、核酸鎖の通過経路を通過する核酸鎖を一分子のみに制限する機能を有するナノポアは存在しない。
【００８７】
下地材１１に2.5 nmの直径を有するナノポアを形成する工程は、加速電圧200 kVの走査型透過電子顕微鏡（STEM、日立ハイテクノロジーズ社製HD2700）を用いて実施した。例えば、第一の構成を有するデバイスの場合には、まず、下地材１１の上部SiN層に上部開孔６５を形成し、それをマスクとしてSiO2層６２をエッチングした後に、下部SiN層にフォーカスした電子線を照射することにより、ナノポア（下部開孔６４）を形成した。開孔径の調整は、電子線の照射時間を変化させることにより調整した。開孔の形成状況は、前記形成処理に用いたSTEMを用いて、明視野像を観察することにより確認した。
【００８８】
前記手順で開孔を形成したデバイス基板の下地材１１の表面に、PEO114-b-PMA(Az)34を製膜した。まず、PEO114-b-PMA(Az)34を、1.5重量％の濃度になるようにトルエンに溶解させた。次に、得られた溶液を、デバイス基板の表面に約50 nmの膜厚となるようにスピンコートした。膜厚の調整は、スピンコート時の回転数を変化させることにより行った。約3000 rpmの回転数でスピンコート処理することにより、目的の膜厚が得られた。
【００８９】
得られたサンプルを、真空オーブンを用いて熱アニール処理することにより、PEO114-b-PMA(Az)34薄膜を自己組織化させて、ブロック共重合体のミクロ相分離構造を形成させた。まず、サンプルを、140℃に加熱した状態で1時間放置した。次に、加熱後のサンプルを90℃まで冷却し、PMA(Az)34を、等方相からスメクチック液相へ転移させた。冷却後のサンプルを、この状態で3時間放置した後に、さらに自然冷却した。前記熱アニール処理により、ブロック共重合体の自己組織化を完了した。
【００９０】
得られた核酸搬送制御デバイスの構造を、STEMにより観察して、下地孔及び個々の直立シリンダの配置状態を確認した。図６（ａ）に示す第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスについて得られたSTEM像の例を、図７（ｂ）に示す。得られたSTEM像により、直径50 nmの上部開孔６５の上方を含め、デバイス表面全体に、PEOからなるシリンダ状構造を有するナノチャネル単位２３がヘキサゴナルに配列している様子が確認された。また、上部開孔６５の上方には、3個のPEOシリンダが、上部開孔６５の周辺領域には、4〜5個のPEOシリンダが、それぞれ配置されている様子が確認された。図７（ｂ）に示すSTEM像を得るのに用いた観察倍率及びコントラストでは、ナノポアの開孔部として機能する下部開孔６４は観察できなかった。しかしながら、STEM観察の条件を変更することで、その存在を確認した。
【００９１】
比較例である第二及び第三の構成を有する核酸搬送制御デバイスについても、同様の手順でSTEM観察を実施した。
【００９２】
図６（ｂ）に示す第二の構成に関しては、1個のPEOシリンダとナノポアの開孔部として機能する1個の上部開孔６５とが、1：1の関係で配置されている様子が確認された。
【００９３】
図６（ｃ）に示す第三の構成に関しては、直径50 nmの開孔部を有する下地孔６６の上方に3個のPEOシリンダが、下地孔６６の開孔部の周囲領域に4〜6個のPEOシリンダが、それぞれ配置されている様子が確認された。
【００９４】
（３）核酸搬送制御デバイスによる核酸鎖搬送評価
前記方法で作製した実施例（第一の構成）並びに比較例（第二及び第三の構成）の核酸搬送制御デバイスを通過するイオン電流の挙動及び核酸搬送特性を評価した。
【００９５】
まず、実施例である第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスを評価した結果について説明する。前述したように、第一の構成においては、ナノチャネル２２が、複数の独立したナノチャネル単位２３であるPEOシリンダ（上部開孔６５の中心部の上方に配置された3個のPEOシリンダと、上部開孔６５の周辺領域に配置された4〜5個のPEOシリンダ）が並列に配置された構造を有している。そして個々のPEOシリンダとナノポアとの間は、下地孔の上部開孔６５によって形成される空間からなる核酸鎖整列部を介して接続された構造を有している。
【００９６】
第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスを、アクリル樹脂で作製したフローセル内に設置した。フローセルは、核酸搬送制御デバイスの両側に溶液セル（容量90 μl）を有し、溶液セル内には、内部に液体を導入するための流路を設けた。また、各溶液セルには、Ag/AgCl電極を設置した。
【００９７】
次に、両側の溶液セルに、バッファー溶液を導入した。バッファーとしては、1 M KCl、10 mM Tris-HCl及び1 mM EDTA混合溶液を、pH7.5に調整して用いた。
【００９８】
電極間に、パッチクランプアンプ（Axopatch 200B、Axon Instruments社製）により電圧を引加し、電極間に流れるイオン電流の時間変化を測定した。信号は、ローパスフィルタにより高周波成分を除去（カットオフ周波数5 kHz)した後に、ADコンバータ（NI USB-6281、National Instruments社製）を用いてサンプリング周波数50 kHzでデジタル化し記録した。電極間に印加する電圧Vを、-100 mVから+100 mVの間で変化させてイオン電流量Iを計測したところ、リニアなV-I特性が得られた。
【００９９】
次に、溶液セルの一方に、流路を通して、前記バッファー溶液に溶解した1 nMの濃度の核酸試料を導入した。もう一方には前記バッファー溶液を導入した。核酸試料としては、一本鎖DNA（ssPolyA、塩基長1.2 kb、ポリデオキシアデニル酸）を用いた。電極間に100 mVの電位を引加したところ、両方のセルに、バッファー溶液のみを導入した際と同様に、安定で定常的なイオン電流が観察された。さらに、定常なイオン電流に、スパイク状に電流が低下するイベントが、1回/秒程度の頻度で観察された。このイベントは、ssPolyA鎖が、核酸搬送制御デバイスの通過経路に存在するナノポアを通過した際に、イオン電流が封鎖されたことに由来する。
【０１００】
時間分解能を上げて、イオン電流のスパイクを計測した結果を図８に示す。スパイク状の電流変化は、一定の封鎖電流が継続した矩形の波形を有することが判明した。同様の測定結果から、個々のスパイクの持続時間を評価して、ssPolyA鎖が通過経路を通過するのに要した時間を計測した。多数のスパイクを対象に持続時間を計測することによって作成した分布図を図９に示す。図９より、スパイクの持続時間は、正規分布することが明らかとなった。頻度が最大となる持続時間を算出したところ、その値は19 msecとなった。前記結果から、核酸搬送制御デバイスの通過経路を一分子のssPolyA鎖が通過するのに要する時間は、平均19 msecであることが明らかとなった。用いたssPolyA鎖の塩基長は1200であったので、一塩基あたりの通過時間は、平均16 μsec/塩基であることが明らかとなった。
【０１０１】
対照として、SiNからなる薄膜に、STEMにより2.5 nmの直径を有する微細孔を1個形成することにより、下地孔（ソリッドステートポア）のみからなり、且つブロック共重合体薄膜層を有しない核酸搬送制御デバイスを用意した。前記対照の核酸搬送制御デバイスを用いて、前記と同様の方法により核酸鎖搬送評価を行った。その結果、対照の核酸搬送制御デバイスにおけるssPolyA鎖の通過時間は、平均0.01μsec/塩基であった。
【０１０２】
以上の結果から、第一の構成、すなわち核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有する、実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合、十分な量のイオン電流を安定的・定常的に流せることから、封鎖挙動を高精度に計測できることが明らかとなった。さらに、実施例の核酸搬送制御デバイスは、ソリッドステートポアのみからなる対照の核酸搬送制御デバイスと比較して、一本鎖核酸の搬送速度を大幅に遅延できることが明らかとなった。
【０１０３】
前記と同様の手順により、比較例である第二の構成を有する核酸搬送制御デバイスの核酸鎖搬送評価を実施した。本構成においては、1個のPEOシリンダと1個のナノポアとが、1：1の関係で配置されている構造を有する。すなわち、核酸鎖の通過経路を構成するナノチャネルの経路は、単一である。
【０１０４】
本比較例の核酸搬送制御デバイスをフローセル内に設置し、双方の溶液セルにバッファー溶液を導入した。電極間に電位を印加してイオン電流を測定したところ、観察された電流量は、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスと比較して、約1/10となった。また、電圧Vを変化させた際のイオン電流Iの変化を観察したところ、V-I特性は、直線とはならず、S字形状を有する結果となった。また、電圧Vを掃引して電流値Iを計測したところ、ヒステリシスが観察された。
【０１０５】
次に、一方の溶液セルにssPolyA鎖を導入した状態で、イオン電流の時間変化挙動を計測した。その結果、ssPolyA鎖がナノポアを通過したことに起因すると考えられるスパイクが観察された。しかしながら、その際の電流変化量は、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合と比較して非常に小さく、且つベースとなる定常的なイオン電流のノイズに対するS/N比も、十分な値ではなかった。一方、スパイクの持続時間に基づき算出されたssPolyA鎖の通過時間は、18 μsec/塩基であった。この値は、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合と略同等であった。
【０１０６】
以上の結果から、第二の構成を有する比較例の核酸搬送制御デバイス、すなわち、1個のナノポアに対して単一の経路のみを有する1個のナノチャネルを有する核酸鎖の通過経路を有する比較例の核酸搬送制御デバイスでは、一本鎖核酸の搬送を遅延させる十分な効果を得ることは可能であることが明らかとなった。しかしながら、比較例の核酸搬送制御デバイスでは、封鎖電流方式により核酸鎖の塩基配列を決定するのに必要なイオン電流量とシグナルとのS/N比を得ることが困難であることも明らかとなった。
【０１０７】
前記と同様の手順により、さらなる比較例である第三の構成を有する核酸搬送制御デバイスの核酸鎖搬送評価を実施した。本構成においては、下地孔の上方に3個のPEOシリンダが、下地孔の開孔部の周囲領域に4〜6個のPEOシリンダが、それぞれ配置されている構造を有する。すなわち、核酸鎖の通過経路を通過する核酸鎖を一分子に制限し得るナノポアは存在しない。
【０１０８】
本比較例の核酸搬送制御デバイスをフローセル内に設置し、双方の溶液セルにバッファー溶液を導入した。電極間に電位を印加して、電圧Vを変化させた際のイオン電流Iの変化を観察したところ、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスと同様の、リニアなV-I特性が得られた。イオン電流Iの絶対値は、実施例の核酸搬送制御デバイスと比較して、約10倍程度の値となった。
【０１０９】
次に、一方の溶液セルにssPolyA鎖を導入した状態で、イオン電流の時間変化挙動を計測した。その結果、本比較例の核酸搬送制御デバイスでは、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイス及び第二の構成を有する比較例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合に観察された明瞭なスパイク状のイベントを観察することができなかった。前記結果は、本比較例の核酸搬送制御デバイスでは、ssPolyA鎖が核酸鎖の通過経路を通過する過程において、ssPolyA鎖の通過に伴いイオン電流を制限するナノポアが存在しないことに起因すると考えられる。以上の結果から、第三の構成、すなわちナノポアを有さず、複数のナノチャネル単位からなるナノチャネルを有する核酸鎖の通過経路を有する比較例の核酸搬送制御デバイスでは、一分子の一本鎖核酸の通過イベントを評価することはできないことが明らかとなった。
【０１１０】
以上の結果より、直立シリンダ状構造を有するナノチャネルを有する核酸搬送制御デバイスの場合、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合のみ、封鎖電流方式による塩基配列読取りが可能となるイオン電流特性を確保した上、核酸鎖の搬送速度を大幅に遅延できることが明らかとなった。
【０１１１】
［製造例２：ランダムチャネル構造を有するナノチャネルを有する核酸搬送制御デバイスの製造］
本製造例においては、図５〜図７を適宜参照しながら、ランダムチャネル構造を有するナノチャネルを適用した本発明の核酸搬送制御デバイスの実施例について、対応する比較例とともに詳述する。
【０１１２】
（１）核酸搬送制御デバイスの作製
本製造例では、図６（ｄ）及び（ｆ）に断面構造を模式的に示した2種類の構成を有する核酸搬送制御デバイスを製作した。図６（ｄ）に示す第四の構成は、本発明の核酸搬送制御デバイスの実施例である。図６（ｆ）に示す第六の構成は、第四の構成の実施例に対応する比較例である。第四の構成を有する核酸搬送制御デバイスに使用されたデバイス基板は、第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスに使用されたデバイス基板と同一であり、第六の構成を有する核酸搬送制御デバイスに使用されたデバイス基板は、第三の構成を有する核酸搬送制御デバイスに使用されたデバイス基板と同一である。
【０１１３】
実施例である図６（ｄ）に示す第四の構成においては、下地材１１の上面に作製した下地孔の上部開孔６５の直径は、50 nmとし、上部開孔６５に連通した下地材１１の下部開孔６４の直径は、2.5 nmとした。本構成において、下部開孔６４は、ナノポアの開孔部として機能する。上部開孔６５は、下地孔の開孔部として機能する。上部開孔６５を有する下地孔は、ナノポアに接続されるナノチャネル２２の末端開孔部の数を、所定の範囲に制限する核酸鎖整列部として機能する。
【０１１４】
比較例である図６（ｆ）に示す第六の構成においては、下地材１１に、上面及び下面の開孔部が50 nmの下地孔６６を作製した。本構成において、核酸鎖の通過経路を通過する核酸鎖を一分子のみに制限する機能を有するナノポアは存在しない。
【０１１５】
製造例1と同様のSTEM処理により、第四の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスのナノポア、及び第六の構成を有する比較例の核酸搬送制御デバイスの下地孔を形成した。次いで、開孔を形成したデバイス基板の下地材１１の表面に、製造例1と同様のスピンコート処理により、約50 nmの膜厚を有するPEO114-b-PMA(Az)34を製膜した。得られたアズスパン状態のサンプルを、熱アニール処理することなく、そのままの状態で以下の評価に供した。
【０１１６】
得られた核酸搬送制御デバイスの構造を、STEMにより観察して、下地孔及びランダムチャネルの配置状態を確認した。図６（ｄ）に示す第四の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスについて得られたSTEM像の例を、図７（ａ）に示す。得られたSTEM像により、直径50 nmの上部開孔６５の上方を含め、デバイス表面全体に、PEOからなるランダムチャネル構造を有するナノチャネル２２を有する薄膜が製膜されている様子が確認された。また、上部開孔６５の上方には、ランダムチャネル２２の開孔が約4個配置されている様子が確認された。図７（ａ）に示すSTEM像を得るのに用いた観察倍率及びコントラストでは、ナノポアの開孔部として機能する下部開孔６４は観察できなかった。しかしながら、STEM観察の条件を変更することで、その存在を確認した。
【０１１７】
比較例である図６（ｆ）に示す第六の構成を有する核酸搬送制御デバイスについても、同様の手順でSTEM観察を実施した。その結果、直径50 nmの下地孔６６の上方に、ランダムチャネルの開孔が約4個配置されている様子が確認された。
【０１１８】
（２）核酸搬送制御デバイスによる核酸鎖搬送評価
前記方法で作製した実施例（第四の構成）及び比較例（第六の構成）の核酸搬送制御デバイスを通過するイオン電流の挙動及び核酸搬送特性を評価した。
【０１１９】
まず、実施例である第四の構成を有する核酸搬送制御デバイスを評価した結果について説明する。前述したように、第四の構成においては、ナノチャネル２２が、ランダムチャネル構造を有している。ランダムチャネル構造を有するナノチャネル２２は、親水性PEOからなる複数の経路が互いに連続した共連続構造を有する。そしてランダムチャネル２２の末端開孔とナノポアとの間は、下地孔の上部開孔６５によって形成される空間からなる核酸鎖整列部を介して接続された構造を有している。これにより、本実施例の核酸鎖の通過経路は、1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有する。
【０１２０】
製造例１と同様に、実施例である第四の構成を有する核酸搬送制御デバイスをフローセル内に設置し、双方の溶液セルにバッファー溶液を導入した。製造例１と同様の手順により、電極間に電位を印加して、電圧Vを変化させた際のイオン電流Iの変化を観察したところ、リニアなV-I特性が得られた。
【０１２１】
次に、製造例１と同様の手順により、一方の溶液セルにssPolyA鎖を導入した状態で、イオン電流の時間変化挙動を計測した。その結果、両方の溶液セルにバッファー溶液のみを導入した際と同様に、安定なイオン電流が定常的に流れた。さらに、定常なイオン電流に、スパイク状に電流が低下するイベントが観察された。時間分解能を上げて、イオン電流のスパイクを計測した結果、実施例である第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスにおける結果と同様に、スパイク状の電流変化は、一定の封鎖電流が継続した矩形の波形を有することが判明した。
【０１２２】
さらに、製造例１と同様の手順により、個々のスパイクの持続時間を評価して、ssPolyA鎖が通過経路を通過するのに要した時間を計測した。その結果、スパイクの持続時間は、正規分布することが明らかとなった。頻度が最大となる持続時間を算出したところ、その値は22 msecとなった。前記結果から、核酸搬送制御デバイスの通過経路を一分子のssPolyA鎖が通過するのに要する時間は、平均22 msecであることが明らかとなった。用いたssPolyA鎖の塩基長は1200であったので、一塩基あたりの通過時間は、平均18 μsec/塩基であることが明らかとなった。
【０１２３】
以上の結果から、第四の構成、すなわち核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有する、実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合、安定的且つ十分な量のイオン電流を維持した上で、一本鎖核酸の搬送速度を大幅に遅延できることが明らかとなった。
【０１２４】
前記と同様の手順により、比較例である第六の構成を有する核酸搬送制御デバイスの核酸鎖搬送評価を実施した。本構成においては、下地孔６６の上方に複数の末端開孔を有するランダムチャネル構造を有するナノチャネル２２が配置されている構造を有する。すなわち、核酸鎖の通過経路を通過する核酸鎖を一分子に制限し得るナノポアは存在しない。
【０１２５】
製造例１と同様に、比較例である第六の構成を有する核酸搬送制御デバイスをフローセル内に設置し、双方の溶液セルにバッファー溶液を導入した。製造例１と同様の手順により、電極間に電位を印加して、電圧Vを変化させた際のイオン電流Iの変化を観察したところ、実施例である第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスと同様のリニアなV-I特性が得られた。電流の絶対値は、第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスの場合と比較して、約10倍の値となった。
【０１２６】
次に、製造例１と同様の手順により、一方の溶液セルにssPolyA鎖を導入した状態で、イオン電流の時間変化挙動を計測した。その結果、本比較例の核酸搬送制御デバイスでは、第一の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイス、第二の構成を有する比較例の核酸搬送制御デバイス、及び第四の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合に観察された明瞭なスパイク状のイベントを観察することができなかった。前記結果は、本比較例の核酸搬送制御デバイスでは、ssPolyA鎖が核酸鎖の通過経路を通過する過程において、ssPolyA鎖の通過に伴いイオン電流を制限するナノポアが存在しないことに起因すると考えられる。以上の結果から、第六の構成、すなわちナノポアを有さず、ランダムチャネル構造を有するナノチャネルを有する核酸鎖の通過経路を有する比較例の核酸搬送制御デバイスでは、一分子の一本鎖核酸の通過イベントを評価することはできないことが明らかとなった。
【０１２７】
以上の結果より、ランダムチャネル構造を有するナノチャネルを有する核酸搬送制御デバイスの場合、第四の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合のみ、封鎖電流方式による塩基配列読取りが可能となるイオン電流特性を確保した上、核酸鎖の搬送速度を大幅に遅延できることが明らかとなった。
【０１２８】
［製造例３：別工程によるランダムチャネル構造を有するナノチャネルを有する核酸搬送制御デバイスの製造］
本製造例においては、図６を適宜参照しながら、ランダムチャネル構造を有するナノチャネルを適用した本発明の核酸搬送制御デバイスの別の実施例について詳述する。
【０１２９】
（１）核酸搬送制御デバイスの作製
本製造例では、図６（ｅ）に断面構造を模式的に示した1種類の構成を有する核酸搬送制御デバイスを製作した。図６（ｅ）に示す第五の構成は、本発明の核酸搬送制御デバイスの実施例である。本製造例で適用された方法は、未開孔の下地材１１の上面にブロック共重合体薄膜２０を製膜する工程を実施し、必要に応じて熱アニール処理等の処理によりブロック共重合体薄膜中にナノチャネル２２を形成する工程を実施し、その後に、ナノポア１３を形成する工程を実施することを特徴とする。
【０１３０】
本製造例では、図６（ｅ）に断面構造を模式的に示した構成を有する核酸搬送制御デバイスを製作した。まず、サポート基板１２であるSiウエハの上面に、下地材１１を製膜した。KOHによるSiウエハの異方エッチング処理により、サポート基板１２に窓を設け、その後、フォトリソグラフィプロセスにより、下部SiN膜６３及びSiO2層６２に下部開孔６４を形成した。この時点で、ナノポアとなる上部開孔６５を形成していないことに留意されたい。
【０１３１】
次いで、開孔を形成したデバイス基板の下地材１１の表面に、製造例1と同様のスピンコート処理により、約50 nmの膜厚を有するPEO114-b-PMA(Az)34を製膜した。得られたアズスパン状態のサンプルを、熱アニール処理することなく、そのままの状態で以下の工程に使用した。
【０１３２】
前記工程で得られたアズスパン状態のサンプルを、製造例１で使用したフローセル内に設置した。双方の溶液セルに、pH 10.0に調整した1M KCl水溶液を導入した。次いで、電極間にパルス状の電圧を連続的に印加することにより、上部SiN膜６１にナノポアの開孔部として機能する上部開口６５を形成した。前記工程において、電圧印加に伴い電極間を流れる電流量を計測することで、所望の直径（本実施例では直径1.5 nm）を有するナノポアを形成することができた。
【０１３３】
図６（ｅ）に示すように、第五の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスにおいては、ランダムチャネル構造を有するPEOランダムチャネルの末端開孔の1個が1個のナノポアと1：1の関係で配置されている必要がある。そのため、製造例１及び２で適用した製造方法、すなわち、デバイス基板にナノポアを形成する工程を実施した後に、ブロック共重合体薄膜を製膜する工程及びブロック共重合体を自己組織化させてナノチャネルを形成させる工程を実施する方法では、ナノチャネルの1個の末端開孔の位置と、すでに形成された1個のナノポアの位置とを正確に一致させる必要がある。これに対し、本製造例で適用した製造方法においては、ナノポアは、パルス電圧印加により電流が流れるPEOランダムチャネルの経路の末端に形成される。このため、ナノチャネルの1個の末端開孔の位置と、すでに形成された1個のナノポアの位置とは、自己整合的に1：1の関係で配置される。それ故、本製造例で適用した製造方法においては、ナノチャネルの末端開孔の位置とナノポアの位置との位置合わせが不要であり、簡便に本発明の核酸搬送制御デバイスを得ることができる。
【０１３４】
（２）核酸搬送制御デバイスによる核酸鎖搬送評価
前記方法で作製した実施例である第五の構成の核酸搬送制御デバイスを通過するイオン電流の挙動及び核酸搬送特性を評価した。
【０１３５】
前述したように、第五の構成においては、ナノチャネル２２が、ランダムチャネル構造を有している。ランダムチャネル構造を有するナノチャネル２２は、親水性PEOからなる複数の経路が互いに連続した共連続構造を有する。そしてランダムチャネル構造を有するナノチャネル２２の末端開孔の1個が1個のナノポアと直接接続された構造を有している。これにより、本実施例の核酸鎖の通過経路は、1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有する。
【０１３６】
製造例１と同様に、実施例である第五の構成を有する核酸搬送制御デバイスをフローセル内に設置し、双方の溶液セルにバッファー溶液を導入した。製造例１と同様の手順により、電極間に電位を印加して、電圧Vを変化させた際のイオン電流Iの変化を観察したところ、リニアなV-I特性が得られた。
【０１３７】
次に、製造例１と同様の手順により、一方の溶液セルにssPolyA鎖を導入した状態で、イオン電流の時間変化挙動を計測した。その結果、両方の溶液セルにバッファー溶液のみを導入した際と同様に、安定なイオン電流が定常的に流れた。さらに、定常なイオン電流に、スパイク状に電流が低下するイベントが観察された。時間分解能を上げて、イオン電流のスパイクを計測した結果、実施例である第一の構成を有する核酸搬送制御デバイスにおける結果と同様に、スパイク状の電流変化は、一定の封鎖電流が継続した矩形の波形を有することが判明した。
【０１３８】
さらに、製造例１と同様の手順により、個々のスパイクの持続時間を評価して、ssPolyA鎖が通過経路を通過するのに要した時間を計測した。その結果、スパイクの持続時間は、正規分布することが明らかとなった。頻度が最大となる持続時間を算出したところ、その値は22 msecとなった。前記結果から、核酸搬送制御デバイスの通過経路を一分子のssPolyA鎖が通過するのに要する時間は、平均22 msecであることが明らかとなった。用いたssPolyA鎖の塩基長は1200であったので、一塩基あたりの通過時間は、平均18 μsec/塩基であることが明らかとなった。
【０１３９】
製造例１の手順において、塩基長1.2 kbのssPolyA鎖に代えて、より鎖長の短い一本鎖DNA（ssPolyA(60)、塩基長60 b、ポリデオキシアデニル酸）を用いて同様の実験を行い、ssPolyA(60)鎖の搬送挙動を評価した。その結果、塩基長1.2 kbのssPolyA鎖を用いた場合と同様に、安定なイオン電流が定常的に流れた。また、定常なイオン電流に、スパイク状に電流が低下するイベントが観察された。ssPolyA(60)鎖を用いて実験を行った場合のイベントの頻度は、塩基長1.2 kbのssPolyA鎖を用いて同様の実験を行った場合と比較して、多くなった。
【０１４０】
時間分解能を上げて、イオン電流のスパイクを計測した結果、スパイク状の電流変化は、一定の封鎖電流が継続した矩形の波形を有することが判明した。同様の測定結果から、個々のスパイクの持続時間を評価して、ssPolyA(60)鎖が通過経路を通過するのに要した時間を計測した結果、スパイクの持続時間は、正規分布することが明らかとなった。頻度が最大となる持続時間を算出したところ、その値は0.8 msecとなった。前記結果から、核酸搬送制御デバイスの通過経路を一分子のssPolyA(60)鎖が通過するのに要する時間は、平均0.85 msecであることが明らかとなった。用いたssPolyA(60)鎖の塩基長は60であったので、一塩基あたりの通過時間は、平均14 μsec/塩基であることが明らかとなった。
【０１４１】
以上の結果から、第五の構成、すなわち核酸鎖の通過経路が、一分子の核酸鎖のみが通過可能な1個のナノポアに対して、複数の経路を有する1個のナノチャネルを有する、実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合、定常的なイオン電流を維持した上で、一本鎖核酸の搬送速度を大幅に遅延できることが明らかとなった。また、第五の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスを用いた場合、鎖長の短い一本鎖核酸の搬送も制御できることが明らかとなった。この結果は、第五の構成を有する実施例の核酸搬送制御デバイスの場合、搬送遅延機能を有するPEO鎖からなるランダムチャネル構造を有するナノチャネルとナノポアとが、直接的に接続されている構造を有するためであると推測される。
【０１４２】
なお、本発明は、前記した実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、前記した実施例は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除及び／又は置換をすることが可能である。
【０１４３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【符号の説明】
【０１４４】
１０…核酸搬送制御デバイス
１１…下地材
１２…サポート基板
１３…ナノポア
１４…通過経路
１５…下地孔
２０…ブロック共重合体薄膜
２１…疎水性マトリックス
２２…親水性ナノチャネル
２３…親水性ナノチャネル単位
３０…溶液セル
３１…核酸鎖
３２…電極
３３…電解質溶液
３４…電源
３５…電流計
４０…ブロック共重合体
４１…疎水性高分子鎖
４２…親水性高分子鎖
４３…結合点
６１…SiN薄膜
６２…SiO2薄膜
６３…SiN薄膜
６４…下部開孔
６５…上部開孔
６６…下地孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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