(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程と、前記比率（ＯＣ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、疲労を評価する方法。
【請求項２】
前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程とを行って疲労の状態の評価がなされた被験者に対して、前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する前記工程を行う、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
オルニチン濃度を測定するための試薬とシトルリン濃度を測定するための試薬とを備えている、疲労を評価するためのキット。
【請求項７】
オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を示す第一呈示部を備えている、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
ピルビン酸濃度を測定するための試薬とイソクエン酸濃度を測定するための試薬とをさらに備えている、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
ピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を示す第二呈示部を備えている、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
疲労を評価するための基準値と、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）とを受け取って、疲労を評価するための評価情報を生成する演算部、および
前記評価情報を受け取って、疲労を評価する評価部
を備えた疲労評価システム。
【請求項１１】
１）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）の入力を受付ける入力受付部を備えるか、
２）オルニチン濃度およびシトルリン濃度の測定値の入力を受付ける入力受付部を備え、前記演算部が、入力が受付けられた測定値からオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を算出する、
請求項１０に記載の疲労評価システム。
【請求項１２】
オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）に代えて、前記生体サンプル中のオルニチン濃度と、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineから選択される何れかの濃度との比率を用いる、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
疲労を評価する方法であって、
被験者から得た生体サンプル中のバイオマーカーの値を得る工程と、前記バイオマーカーの値に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含し、
前記バイオマーカーの値が、１）2-アミノ酪酸（2AB）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３−ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４−メチル−２−オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）前記群にイソクエン酸（Isocitrate）を加えた群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、
疲労を評価する方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の、疲労を評価する方法であって、
前記バイオマーカーの値が、１）シトルリン（Citrulline）、ピルビン酸（Pyruvate）、及び、オルニチン（Ornithine）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）シトルリン、イソクエン酸、ピルビン酸、及び、オルニチンからなる群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、
疲労を評価する方法。
【請求項１５】
上記生体サンプルは、アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼの活性及び／または一酸化窒素合成酵素の活性を抑制する処理を受けている、請求項１〜５、１２〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼまたは一酸化窒素合成酵素の阻害剤を含んでいる、請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疲労を評価するバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた疲労の評価および診断に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本国における疫学調査によれば、一般大衆の約６０％が疲労を自覚しており、その半数以上が６ヶ月以上続く疲労に悩まされている。このような慢性的な疲労を感じている人の約半数が、仕事または学業の能率低下を訴えており、かかる疲労による経済的損失は１兆円以上と予測されている。【０００３】
慢性的な疲労を感じている人の中には、たとえ疲れていなくても極度の疲労を感じてしまう、未だ原因が十分解明されていない慢性疲労症候群（Chronic Fatigue Syndrome）の患者が含まれている。慢性疲労症候群患者は、身体及び思考力両方の激しい疲労を主訴とすることが多く、それに伴い、日常生活の質（QOL）も著しく阻害される。臨床上、慢性疲労症候群は、疲労の蓄積による慢性疲労と区別して扱われるが、その診断ができる医師は少なく、また、効果的な治療法も見出されていない。【０００４】
これまでの疲労診断の多くは、患者の主観と医師の診断に基づくものであるため、疲労を客観的に診断するための指標の確立が望まれている。特許文献１には、免疫力低下の原因の１つとして挙げられているウイルス感染に着目し、ウイルスの挙動を疲労度の指標として評価する技術が開示されている。非特許文献１には、疲労を加速度脈波によって客観的に測定／評価する試みが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公開特許公報：特開２００７−３３０２６３号公報（公開日：２００７年１２月２７日）
【特許文献２】日本国公開特許公報：特開平９−７７６８８号公報（公開日：１９９７年３月２５日）
【特許文献３】日本国公開特許公報：特開平９−５９１６１号公報（公開日：１９９７年３月４日）
【特許文献４】日本国公開特許公報：特開２０１１−１７７１９４号公報（公開日：２０１１年９月１５日）
【特許文献５】日本国公開特許公報：特開２０１３−１１９００１号公報（公開日：２０１３年６月１７日）
【特許文献６】日本国公開特許公報：特開２０１１−１８２６６１号公報（公開日：２０１１年９月２２日）
【特許文献７】日本国公開特許公報：特開２０１１−１６１１３７号公報（公開日：２０１１年８月２５日）
【特許文献８】日本国公開特許公報：特開２０１０−２６６２３８号公報（公開日：２０１０年１１月２５日）
【特許文献９】日本国公開特許公報：特開２０１０−８５３６９号公報（公開日：２０１０年４月１５日）
【特許文献１０】日本国公開特許公報：特開２００７−２２８８７８号公報（公開日：２００７年９月１３日）
【特許文献１１】日本国公表特許公報：特表２０００−５１６８１８号公報（公表日：２０００年１２月１９日）
【特許文献１２】国際公開ＷＯ２００６／１２３６１１（国際公開日：２００６年１１月２３日）
【特許文献１３】国際公開ＷＯ２００５／０１２９０３号公報（国際公開日：２００５年２月１０日）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「疲労の生理学的計測：加速度脈波」  山口浩二ら、医学のあゆみ  特集「最新・疲労の科学−日本発：抗疲労・抗過労への提言」 Vol.228, No.6, 646-653 (2009)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
疲労の原因や疲労のメカニズムは複雑であり、その全貌は解明されていない。しかしながら、例えば疲労の治療等の応用を考慮した場合は特に、生体が本来有しているメカニズムや疲労の原因に則して、疲労を客観的に評価する技術の開発が望まれている。【０００８】
特許文献１に記載の技術は、被験者の体液を採取し、体液中のヒトヘルペスウイルスの量を測定し、疲労度との関係を評価している。しかし、この技術は、ヒト（宿主）に感染したウイルスの挙動を観察するものであり、ヒトにおける疲労の原因やメカニズムを反映したバイオマーカーを測定するものではない。そのため、特許文献１記載の技術では、個々の被験者の疲労状態を評価したり、治療法または予防法を提供したりすることができない。また、非特許文献１記載の技術は、非侵襲的に実施され得るという利点があるが、特殊な機器による指尖容積脈波の測定、および特殊な原理に基づくデータ処理が必要であり、汎用性に乏しい。【０００９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、疲労を客観的かつ簡便に評価および診断することを可能にする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上述の課題を解決するために、慢性疲労症候群患者、慢性疲労患者及び健常者からの血漿サンプルを用いて包括的且つ網羅的なメタボローム解析研究を行い、複雑な生体内の代謝に関わる各血漿サンプルに存在する多種の代謝物質の濃度を調べた。そして、統計解析を加えたところ、特定の代謝物質の増減パターンが疲労状態を反映していることを見出し、この増減パターンに基づいて生体代謝情報を数値化または定量化することにより、客観的かつ簡便な疲労診断を行うことが可能になることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程と、前記比率（ＯＣ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、疲労を評価する方法。
（２）オルニチン濃度を測定するための試薬とシトルリン濃度を測定するための試薬とを備えている、疲労を評価するためのキット。
（３）疲労を評価するための基準値と、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）とを受け取って、疲労を評価するための評価情報を生成する演算部、および、前記評価情報を受け取って、疲労を評価する評価部、を備えた疲労評価システム。
（４）疲労を評価する方法であって、被験者から得た生体サンプル中のバイオマーカーの値を得る工程と、前記バイオマーカーの値に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含し、前記バイオマーカーの値が、１）2-アミノ酪酸（2AB）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３−ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４−メチル−２−オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）前記群にシス−アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及びコハク酸（Succinate）を加えた群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、疲労を評価する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、疲労の評価および診断を客観的かつ簡便に行うことを可能にする。本発明はさらに、疲労の治療に有用な技術を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿中に含まれている種々の代謝物の濃度を比較した結果を示す図である。
【図２】試験１および試験２を加えた集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。
【図３】試験２の集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレストプログラムを実行した結果を示す図である。
【図４】健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の間で、血漿中に含まれている濃度に有意差が見られる代謝物の一例を示す図である。
【図５】健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の血漿中に含まれている種々の代謝物の濃度を示す図である。
【図６】健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の間で、血漿中に含まれている濃度に有意差が見られる代謝物の一例を示す図である。
【図７】健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果の一例を示す図である。
【図８】健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果の他の例を示す図である。
【図９】健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値の比を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果のさらに他の例を示す図である。
【図１０】健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値の比を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果のさらに他の例を示す図である。
【図１１】慢性疲労（ＣＦ）の患者および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿中に含まれている種々の代謝物の濃度を比較した結果を示す図である。
【図１２】疲労モデル動物（ラット）の疲労負荷実験を通じて、当該モデル動物の血液や肝臓を対象とした網羅的代謝解析から確認された、尿素回路およびＴＣＡ回路における代謝異常と、尿素回路からＴＣＡ回路への疲労病態特有の代謝の流れ込みとを示す図である（グラフデータは肝臓検体のものを示す）。
【図１３】図および本明細書中で用いたアミノ酸の略語とフルネームとの対応を示す図である。
【図１４】採取したヒトの全血において、オルニチンの濃度、及びアルギニンの濃度が時間の経過とともに変化する様子を示すグラフである。
【図１５】ラットの全血を用いた実験において、各種酵素の阻害剤を添加することでアルギニンおよびオルニチンの時間経過による濃度変化が抑えられることを示すグラフである。
【図１６】試験２の集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。
【図１７】試験２の集団に対して、慢性疲労（ＣＦ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。
【図１８】ＰＬＳ−ＤＡ法を用いて、ＨＣ群、ＣＦＳ群の２群比較を行った結果を示す図である。
【図１９】ＰＬＳ−ＤＡ法を用いて、ＨＣ群、ＣＦ群の２群比較を行った結果を示す図である。
【図２０】ＰＬＳ−ＤＡ法を用いて、ＣＦ群、ＣＦＳ群の２群比較を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔Ａ〕生体サンプル
本明細書中にて使用される場合、用語「生体サンプル」は、被験体から採取された任意の組織（血液等の体液を含む。）または細胞が意図され、これらから調製された組織切片または細胞溶解物もまた生体サンプルに包含され得る。本発明に用いるに好ましい生体サンプルとしては、血液、唾液、尿、間質液、汗、およびこれらからの調製物（例えば、血清、血漿など）などが挙げられるがこれらに限定されない。生体サンプルは好ましくは血液または血液調製物（血清、血漿など）である。
【００１４】
〔１〕疲労
現在、疲労・倦怠感を主症状として医療機関へ訪れる患者(急性疲労・慢性疲労・慢性疲労症候群を含む)の数は、痛みを主症状とする患者の数に次いで２番目に多い。しかしながら、疲労を客観的に評価する方法は、これまでに開発されていない。疲労感および倦怠感は、ヒトが日常的に経験する感覚であり、生体のホメオスタシスの乱れを知らせる重要な生体シグナルである。しかし、疲労感はあくまでも主観的なものであり、疲労度を客観的に示すものではない。乳酸が疲労の原因物質であると考えられた時期もあるが、乳酸レベルの変動は、運動の指標になり得るが、疲労状態の指標にはならないということもわかってきている。さらに、疲労に効果的な治療法も見出されていない。
【００１５】
アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）が、「慢性疲労症候群」という、原因不明の強い疲労を呈する疾患を１９８８年に報告してから、そのメカニズムの解明、バイオマーカーの探索、および治療予防法の開発を中心とした、種々の研究がなされてきた。しかし、慢性疲労症候群の発症メカニズムは未だ解明されておらず、客観的バイオマーカーについても開発されていない。現在においても、ＣＤＣが１９９４年に発表した、症状および身体所見の基準を用いて慢性疲労症候群の診断がなされている。
【００１６】
一方、これまでに、慢性疲労症候群において、ウイルス活性化または自律神経異常を指標とした疲労バイオマーカーが提案されている。しかし、これらはヒトの疲労の原因やそのメカニズムに則したものではないため、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含むが、特に慢性疲労、慢性疲労症候群）に特異的なバイオマーカーとはいいがたい。さらに、これらは、ホメオスタシスの維持／回復のメカニズムの間接的な指標であっても直接的な指標ではないため、具体的な治療法の提供にまで発展させることは試行錯誤が必要である。
【００１７】
本願発明者らは、すでに、解糖系およびＴＣＡ回路を形成する代謝物の中に、健常者と比較して、慢性疲労症候群の患者群において低下しているものがあることを見出している（参考文献：国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４  Ａ２（米国特許シリアル番号１３／８０５，４４９））。今回、より大きな、異なる集団から得られたデータを加えることで、新たに尿素回路に関係する代謝物において、疲労患者群と健常者との間で特徴的な変化を見出した。より具体的な一例では、疲労患者群において、尿素回路からＴＣＡ回路へ流入する代謝経路が促進し、その結果、アンモニアを代謝する反応系が抑制されるといった特徴的な代謝病態が同定された。こうした疲労病態を表す代謝異常は、ラットに疲労負荷したモデル実験系でも裏付けられた。
【００１８】
なお、本明細書において、特に断りのない限り、慢性疲労患者とは、慢性疲労症候群の患者を包含しないものである。なお、慢性疲労とは、６カ月以上断続的に疲労あるいは疲労感を主訴に持つものの、医師の診断によって慢性疲労症候群とは診断されなかったケースを指す。慢性疲労症候群とは、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって作成された慢性疲労症候群診断基準（Ann Intern Med. 1994;121:953-959）を日本国内用に改定したもの（医学のあゆみ 特集「最新・疲労の科学 −日本発：抗疲労・抗過労への提言」６７１−６７７）に記されているように（１）生活が著しく損なわれるような強い疲労を主症状とし、少なくとも６ヵ月以上の期間持続または再発を繰り返す（５０％以上の期間認められること）。かつ、病歴、身体所見、検査所見で疾患を除外する。さらに、（２）症状基準８項目以上か、症状基準６項目・身体基準２項目以上を満たすケースを指す。
【００１９】
〔２〕本発明のバイオマーカー
本発明の一形態にかかる、疲労のバイオマーカーは、以下の通りである。
【００２０】
１）  図２、図３、図４、図６、図７、図８、図１１、図１６、及び図１７の何れかにおいて具体的に記載されているバイオマーカー。より具体的に列挙すれば、例えば、2-アミノ酪酸（2AB）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３−ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４−メチル−２−オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シス−アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、リンゴ酸（Malate）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、コハク酸（Succinate）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）である。これらの中で、特に、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、４-ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４−メチル−２−オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、コリン（Choline）、シス−アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソクエン酸（Isocitrate）、リジン（Lys）、オルニチン（Ornithine）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、コハク酸（Succinate）、タウリン（Taurine）、トリプトファン（Trp）、及び、尿酸（Urate）は、実施例にも示す通り、異なる疲労状態の間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオマーカーである。
これらの中でも、尿素回路に関連する代謝物や尿素回路からＴＣＡ回路への代謝の流れ込みに関わる代謝物がバイオマーカーとしてより好ましい。尿素回路に関連する代謝物や尿素回路からＴＣＡ回路への代謝の流れ込みに関わる代謝物のバイオマーカーとしては、図１又は図４に示される代謝物、オルニチン（Ornithine）、シトルリン（Citrulline）、尿素（Urea）、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、およびGamma-butyrobetaineなどが挙げられる。中でも、上記バイオマーカーとしては、疲労状態によって異なる挙動を示すことから、オルニチン（Ornithine）、シトルリン（Citrulline）、尿素（Urea）等がさらに好ましく、オルニチン（Ornithine）、シトルリン（Citrulline）が特に好ましい。上記バイオマーカーは任意の複数個を同時に解析に用いてもよい。
なお、１）で上述したバイオマーカーのうち、シス−アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及び、コハク酸（Succinate）は、単独で用いるのではなく、これら以外の１）で上述したバイオマーカーと組み合わせて用いる場合がある。
【００２１】
これらバイオマーカーは、例えば、生体サンプル中の濃度として取得され、所定の閾値（基準値）と比較されて疲労の評価に用いられる。所定の閾値は、分析の手法等に応じて、バイオマーカー毎に適宜設定される。
【００２２】
上記分析の手法としては、通常生体中の代謝物の濃度測定に用いられるものであればよく、特に限定されない。例えば、ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ(キャピラリー電気泳動質量分析法)やＬＣ−ＭＳ／ＭＳ(液体クロマトグラフィー質量分析法)等が広く用いられている。
【００２３】
所定の閾値の一例は、複数の健常者における生体サンプル中のバイオマーカーの濃度の平均値や、二項分布等から得られる最頻値である。また、例えば、図２、図３、図４、図６、図７、図８、及び図１１、並びに実施例に示す通り、バイオマーカーの量が、閾値を基準としてどのような状態（例えば、閾値以上か、閾値未満か）にあれば、疲労であるか否か（或いは、例えば、慢性疲労であるか否か、慢性疲労症候群であるか否か、等）の評価が可能である。
【００２４】
特に限定されないが、図２、図３、図４、図７、及び、図８に記載のバイオマーカーは、被験者が健常者であるか慢性疲労症候群の患者であるかを評価するマーカーとして特に有用である。より具体的には、例えば、Ornithine、Citrulline、Urea、Hydroxyproline、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Isocitrate、Citrate、Pyruvate、Cis-aconitate、Gamma-Butyrobetaine、4-methyl-2-oxopentanoate、及び、2-oxoglutarateは、健常者と慢性疲労症候群の患者との間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオマーカーである。また、これら以外としては、Succinate、Pro、Leu、3-Methylhistidine、Creatinine、His、Ala、N,N-Dimethylglycine、Ser、Lys、Betaine、Glu、Taurine、2AB、Arg、3-Hydroxybutyrate、Creatine、Trp、Mucate、Cystine、Asp、Sarcosine、Thr、及びValが、ランダムフォレスト解析の結果として、被験者が健常者であるか慢性疲労症候群の患者であるかを評価するマーカーとなり得るものである。なお、SuccinateからValまでのマーカーは、ランダムフォレスト解析の結果として上位（すなわちマーカーとして有望）に来るものから順に列挙をしている。
また、特に限定されないが、図６、及び、図１６に記載のバイオマーカーは、被験者が健常者であるか慢性疲労の患者（特に慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者）であるかを評価するマーカーとして特に有用である。より具体的には、例えば、Choline、Gly、Taurine、Asn、Gamma-Butyrobetaine、Gln、Lys、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、及び、Succinateは、健常者と慢性疲労の患者（特に慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者）との間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオカーカーである。また、これら以外としては、Cis-Aconitate、Lactate、Arg、Mucate、His、Azelate、N,N-Dimethylglycine、Creatinine、beta-Ala、Tyr、Ornithine、2AB、Leu、Isocitrate、Hydroxyproline、Phe、Met、3-Methylhistidine、Sarcosine、Ile、Betaine、Pyruvate、Urate,4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Ser、Asp、Carnitine、Urea、5-oxoproline及び、Citrateが、ランダムフォレスト解析の結果として、被験者が健常者であるか慢性疲労の患者（特に慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者）であるかを評価するマーカーとなり得るものである。なお、Cis-AconitateからCitrateまでのマーカーは、ランダムフォレスト解析の結果として上位（すなわちマーカーとして有望）に来るものから順に列挙をしている。
また、特に限定されないが、図１１、及び、図１７に記載のバイオマーカーは、被験者が、慢性疲労症候群の患者であるか、慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者であるかを評価するマーカーとして特に有用である。より具体的には、例えば、Choline、Succinate、Gln、Taurine、Asn、Lys、Arg、His、Urate、及び、4-Hydroxy-3-methoxybenzoateは、慢性疲労症候群の患者と、慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者との間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオマーカーである。また、これら以外としては、N,N-Dimethylglycine、3-Methylhistidine、Azelate、Ile、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、Ser、Cis-Aconitate、Met、Phe、Gly、Lactate、Ala、Leu、Citrulline、Malate、gamma-Butyrobetaine、Sarcosine、beta-Ala、Glu、2-Oxoglutarate、Pyruvate、Asp、Urea、Creatinine、Carnitine、2AB、Betaine、Citrate、及びTyrが、ランダムフォレスト解析の結果として、被験者が慢性疲労症候群の患者であるか慢性疲労の患者（慢性疲労症候群ではない）であるかを評価するマーカーとなり得るものである。なお、N,N-DimethylglycineからTyrまでのマーカーは、ランダムフォレスト解析の結果として上位（すなわちマーカーとして有望）に来るものから順に列挙をしている。
【００２５】
２）  上記１）の複数個のバイオマーカーの相関関係として構成されるバイオマーカー。例えば、上記１）の複数のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率、および、当該生体サンプル中の濃度の差分、等が該当する。一例としては、図９、および図１０に具体的に示されたバイオマーカーである、生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率、例えば、Ｏ／ＣまたはＣ／Ｏ）；生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）；生体サンプル中のアラニン濃度とヒドロキシプロリン濃度との比率（ＡＰ比率）；等が該当する。バイオマーカーは任意の複数個を同時に解析に用いてもよい。なお、ランダムフォレスト解析で上位に位置する代謝物（図３参照：例えば、Ornithine、Citrulline、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaine等）からなる群より選択される２つの代謝物の濃度比率を、上記ＯＣ比率と代替的にかＯＣ比率と組み合わせて、バイオマーカーとして用いることもでき、上記ＯＣ比率と代替的にかＯＣ比率と組み合わせて用いるバイオマーカーとして好ましくは、生体サンプル中のオルニチン濃度と、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineから選択される何れかの濃度との比率を挙げることが出来る。
【００２６】
これらバイオマーカーは、例えば、所定の閾値（基準値）と比較されて疲労の評価に用いられる。所定の閾値は、分析の手法等に応じて、バイオマーカー毎に適宜設定される。
【００２７】
所定の閾値の一例は、複数の健常者におけるバイオマーカーの値の平均値や、二項分布等から得られる最頻値である。また、例えば、図９、及び図１０、並びに実施例の記載に示す通り、バイオマーカーの値が、閾値を基準としてどのような状態（例えば、閾値以上か、閾値未満か）にあれば、疲労であるか否か（或いは、例えば、慢性疲労であるか否か、慢性疲労症候群であるか否か、等）の評価が可能である。
【００２８】
特に限定されないが、図９、及び図１０に記載のバイオマーカーは、被験者が健常者であるか慢性疲労症候群の患者であるかを評価するマーカーとして特に有用である。
【００２９】
実施例も参照される通り、本発明のバイオマーカーの一側面は、慢性疲労症候群の患者および慢性疲労の患者の血漿と健常者の血漿とにおける代謝物質の変動を網羅的に解析することにより見出された、疲労疾患のメカニズムに基づく客観的な疲労バイオマーカーである。従って、本発明のバイオマーカーの一側面として、客観的かつ簡便な、疲労の評価および診断を可能にする。さらに、本発明のバイオマーカーを用いれば、慢性疲労や慢性疲労症候群の診断法および治療法を開発し得る。
【００３０】
また、本発明の他の側面として、本発明のバイオマーカーを用いれば、安価で簡単な疲労診断システムを作成することが可能になり、さらに、診断結果を受けて、効果的な治療法が見出せる可能性もある。例えば、強い疲労感や長期に続く疲労感を訴える患者に対し、血液を採取し、本発明のバイオマーカーを調べることで、慢性疲労か否かや慢性疲労症候群か否かの判別や、疲労度の客観的評価ができる。この評価は、疲労に関する高度な知識がなくとも、一般の医療施設で検査可能である。
【００３１】
また、本発明の一側面として、被験者の血液成分を測定することで被験者が慢性疲労症候群に属するか否かを判断できる。従来の診断基準では、（１）生活が著しく損なわれるような強い疲労を主症状とし、少なくとも６ヵ月以上の期間持続または再発を繰り返す（５０％以上の期間認められること）。かつ、病歴、身体所見、検査所見で疾患を除外する。さらに、（２）症状基準８項目以上か、症状基準６項目・身体基準２項目以上を満たすことが必要であり（医学のあゆみ 特集「最新・疲労の科学 −日本発：抗疲労・抗過労への提言」６７１−６７７）、診断されるまでの測定項目の多さ・長期間にわたる観察（測定）時間・経済的な負担・医者の判断基準の個人差などが問題として挙げられる。本発明の一側面として、限られた血液中の代謝物を測定することで、客観的な診断が下せるだけでなく、診断結果が病態そのものを表すため、治療方針を立てることにも役立つ。また、本発明で明らかになった代謝物の多くは肝臓において猛毒であるアンモニアを尿素へ代謝する尿素代謝系（尿素回路）に深く関係しており、慢性疲労症候群のみでなく、慢性疲労の診断にも利用できる。特に、実際の医療現場で使用できる測定キットを生産することにより、慢性疲労症候群・慢性疲労をより速く、安く、客観的に診断できるものと考えられる。
【００３２】
本発明のバイオマーカーは、疲労に関する既知のバイオマーカーと組み合わせて用いることもできる。既知のバイオマーカーは特に限定されないが、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４ Ａ２（米国特許シリアル番号１３／８０５，４４９）で報告されたエネルギー（ＡＴＰ）産生系代謝物に基づくものが挙げられる。国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４ Ａ２に記載のバイオマーカーと組み合わせて解析することで、生体内のどの部分に異常があるかがより正確に推測でき、慢性疲労症候群の患者および慢性疲労の患者の生活指導に活かせるたけでなく、原因と考えられる代謝系を是正する食薬の提供も可能となる。また、本発明の一側面として、解糖系やＴＣＡ回路といったエネルギー産生系代謝物のみで疲労患者群を判定する方法と組み合わせて、尿素回路およびその周辺の代謝の変化を指標とする本発明のバイオマーカーを用いれば、個人個人の代謝のばらつきに対して疲労の評価能力を特段に改善し、さらにより適した治療方針を提供することが可能となる。
【００３３】
〔３〕本発明のバイオマーカーの利用
本発明は、上述したバイオマーカーに基づいた、疲労を評価するための方法、キットおよびシステムを提供する。
【００３４】
〔３−１〕疲労評価方法
本発明に係る疲労を評価する方法は、被験者から得た生体サンプル中の上記した本発明のバイオマーカーの値を得る工程（バイオマーカー値取得工程）と、当該バイオマーカーの値を用いて評価を行う工程（評価工程）とを含んでいる。
【００３５】
バイオマーカー値取得工程は、バイオマーカーの種類に応じて適宜実施することができる。バイオマーカー値取得工程を実行するに際し、生体サンプル中の代謝物質の濃度を測定する必要がある。生体サンプル中の代謝物質の濃度の測定は、実施例の方法によらずとも、代謝物質の種類に応じた適切な方法で行うことができる。一例として、代謝物質を基質とする酵素反応がよく知られている場合は、酵素反応を利用して基質濃度を測定する市販のキットを用いてもよい。すなわち、当業者は、このような種々の技術を任意に利用して、生体サンプル中の代謝物質の濃度測定を首尾よく行い得る。なお、代謝物質の濃度の測定対象となる生体サンプルは、当該生体サンプルに含まれている、アルギニンの分解反応に関わる酵素の活性を抑制する処理を受けていることが好ましい場合があり、特に、アルギニン、オルニチンまたはシトルリン等が関連するバイオマーカーを使う場合は、測定の精度をより向上させる目的で好ましい場合がある。なお、ここで、処理によってアルギニンの分解反応に関わる酵素の活性を抑制するとは、処理後の生体サンプルの方が処理前の生体サンプルよりも当該酵素の活性が抑制されていることを意図する。係る処理の一例としては、生体サンプル（例えば、血液または血液調製物）に対して、アルギニンの分解反応に関わる酵素であるアルギナーゼ及び／または一酸化窒素合成酵素の阻害剤を添加することが挙げられる。なお、阻害剤の種類は特に限定されず、具体的な例示は、疲労評価キットに関する〔３−２〕欄で説明する。
【００３６】
評価工程は、評価を行う手法に応じて適宜実施することができ、例えば、バイオマーカーの値を所定の閾値（基準値）と比較して評価をするか、バイオマーカーの値を閾値（基準値）と比較せずに評価をすることもできる。例えば、判別分析、Partial Least Square、またはSupport Vector Machine等の分析を行うことによって、バイオマーカーの種類によっては、閾値（基準値）を用いることなく、疲労の評価（診断または判定）をすることができる。なお、閾値を用いる場合において、当該閾値は予め規定された値であっても、被験者からのサンプリングと同時に健常者のサンプリングを行い、健常者において得られた生体サンプル中の各代謝物質の濃度に基づいて算出された値であってもよい。所定の閾値の一例は、複数の健常者におけるバイオマーカーの値の平均値や、二項分布等から得られる最頻値である。
【００３７】
なお、評価工程においては、特に限定されないが、例えば、１）被験者が疲労であるか否かの評価、２）被験者が慢性疲労症候群ではない慢性疲労であるか否かの評価、３）被験者が慢性疲労症候群であるか否かの評価、４）これら１）〜３）より選択される少なくとも２つの評価の組み合わせ（例えば、被験者が慢性疲労症候群ではない慢性疲労であるか慢性疲労症候群であるかの評価、等）、５）疲労の程度の評価、等の評価が行われる。
【００３８】
本発明に係る疲労を評価する方法の具体的な一例では、被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程（１）、が包含される。さらに、必要に応じて、上記工程（１）の後に、上記ＯＣ比率に対応する閾値と当該ＯＣ比率とを比較する工程（２）が包含される。さらに、必要に応じて、上記工程（１）または工程（２）が行われることを前提として、同じ被験者から得た上記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程（３）が包含される。さらに、必要に応じて、上記工程（３）の後に、上記ＰＩ比率に対応する閾値と当該ＰＩ比率とを比較する工程（４）が包含される。なお、上記被験者から得た上記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程（３）と、当該比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と当該比率（ＰＩ比率）とを比較する工程（４）とを行って疲労の評価がなされた被験者に対して、上記ＯＣ比率に対応する閾値と当該ＯＣ比率とを比較する工程（２）を行うことが、高い正判別率と低い誤判別率とを得る上で好ましい場合がある。例えば、図９および図１０に示す決定木による評価も参照される。図９および図１０では、ＰＩ比率としてピルビン酸濃度／イソクエン酸濃度を用いて決定木分析を行って２群に分けた被験者に対して、さらに、ＯＣ比率としてオルニチン濃度／シトルリン濃度を用いて決定木分析を行うことが示されている。また、同様の効果を得る観点から、上記ＯＣ比率を得る工程（１）と、当該ＯＣ比率に対応する閾値と当該ＯＣ比率とを比較する工程（２）とを行って疲労の評価がなされた被験者に対して、上記ＰＩ比率に対応する閾値と当該ＰＩ比率とを比較する工程（４）を行うことが好ましい場合がある。
【００３９】
なお、バイオマーカー値取得工程に先立って、サンプル取得の第一段階として組織または細胞をヒト被験体から直接取り出す工程は、医師によって行われる。また、上記評価工程によって得られた結果を用いて、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）であるか否かの診断を医師が下す工程も必要に応じて行われる。これらの工程は、上記バイオマーカー値取得工程と上記評価工程とには含まれない別の工程として区別される。
【００４０】
〔３−２〕疲労評価キット
上述したような疲労評価方法を実施するために用いられる試薬を併せ持つキットもまた、本発明の範囲内である。すなわち、本発明にかかるキットは、疲労を評価するために、本発明のバイオマーカーの値を取得する上で必要な、生体サンプル中の代謝物質の濃度を測定するための試薬を備えている。一例として、オルニチンをバイオマーカーとする場合は、本発明にかかるキットは、生体サンプル中のオルニチン濃度を測定するための試薬を備えている。他の例として、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率をバイオマーカーとする場合は、本発明にかかるキットは、生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度とを測定するための試薬を備えている。オルニチン濃度を測定するための試薬としては例えばオルニチンと反応してアンモニアを発生するornithine cyclaseが挙げられ、シトルリン濃度を測定するための試薬としては例えばシトルリンと反応してATPを消費するargininosuccinate synthaseが挙げられる。キットはまた、生体サンプルに含まれている、アルギニンの分解反応に関わる酵素の活性の阻害剤を含んでいることが好ましい場合があり、特に、アルギニン、オルニチンまたはシトルリン等の濃度を測定する場合は、測定の精度をより向上させる目的で好ましい場合がある。なお、ここで、アルギニンの分解反応に関わる酵素とは、アルギナーゼ、及び、アルギニンから一酸化窒素とシトルリンとを生成する反応に関わる一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）が挙げられ、これらはとりわけ血液または血液調製物等の生体サンプルに含まれる。なお、アルギナーゼの阻害剤としては、例えば、Ｎω-Hydroxy-nor-L-arginine（ｎｏｒ−ＮＯＨＡ）又はその塩（例えば、二酢酸塩等）が挙げられ、一酸化窒素合成酵素の阻害剤としては、例えば、NG-Nitro-L-Arginine(Ｌ−ＮＮＡ)又はその塩が挙げられる。なお、これらの阻害剤は、キットの他の構成とは別体として備えられていてもよいが、例えば、生体サンプルを保存する容器内に必要量が予め仕込まれていてもよい。
【００４１】
また、本発明のバイオマーカーを、目視にて検出する構成を有するキットもまた、本発明の範囲内である。すなわち、本発明にかかる第２のキットは、疲労を評価するために、本発明のバイオマーカーの値を示す呈示部を備えている。呈示部として例えば、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を示す第一呈示部、および、ピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を示す第二呈示部の少なくとも一方を備えているキットも、本発明にかかるキットの範疇である。
【００４２】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、用語「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。指示書にはさらに必要に応じて、バイオマーカーの値と比較して評価するための、所定の閾値（基準値）が表示されていてもよい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、その複数の構成要素を同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、生体サンプルを採取するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。また、本発明に係るキットは、生体サンプルから目的の調製物を調製するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。
【００４３】
上記構成を有することによって、本発明にかかるキットは、実際の医療現場にて簡便に使用することができるので、疲労をより速く、安く、客観的な診断を提供し得る。
【００４４】
なお、本発明にかかるキットを用いれば、疲労を評価し、治療法を提案し得るだけでなく、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の判断基準を提供することができるので、疲労の状態であるか否かの診断が容易になる。すなわち、本発明にかかるキットは、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の診断基準または判定基準を提供するためのキット（例えば、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）を診断または判定するためのデータを取得するためのキット）でもあり得る。
【００４５】
〔３−３〕疲労評価システム
上述したような疲労評価方法を実行するために用いられるシステムもまた、本発明の範囲内である。下記実施形態では、本発明に係る疲労評価システムを構成する各部材が、「ＣＰＵなどの演算手段がＲＯＭやＲＡＭなどの記録媒体に格納されたプログラムコードを実行することによって実現される機能ブロックである」場合を例にして説明するが、同様の処理を行うハードウェアによって実現してもよい。また、処理の一部を行うハードウェアと、当該ハードウェアの制御や残余の処理を行うプログラムコードを実行する上記演算手段とを組み合わせて実現することもできる。さらに、上記各部材のうち、ハードウェアとして説明した部材であっても、処理の一部を行うハードウェアと、当該ハードウェアの制御や残余の処理を行うプログラムコードを実行する上記演算手段とを組み合わせて実現することもできる。なお、上記演算手段は、単体であってもよいし、装置内部のバスや種々の通信路を介して接続された複数の演算手段が共同してプログラムコードを実行してもよい。
【００４６】
本発明にかかる疲労評価システムは、その機能ブロックとして、入力受付部１１Ａ、格納部１２、ＣＰＵ１３、および表示部１４を少なくとも備えている。入力受付部１１Ａは、測定部１１での測定結果の入力を受付けるインターフェースであり、測定部１１と疲労評価システムとを接続するインターフェースとして構成されるか、場合によってはキーボードやマウスなどの入力装置として構成される。測定部１１は、本発明のバイオマーカーに関連した代謝物質（例えば、オルニチンやシトルリン）の濃度を測定する測定装置の機能を有している。格納部１２は、当該代謝物質の濃度の測定値を受容する測定値受容部１２ａ、および疲労を評価するための基準値（閾値）を格納した基準値格納部１２ｂとしての機能を有している（例えば、メモリーとして構成される）。ＣＰＵ１３は、疲労を評価するための情報を生成する演算部１３ａ、および演算部１３ａからの評価情報を受け取って疲労を評価する評価部１３ｂとしての機能を有している。表示部１４は、評価部１３ｂによる評価結果を表示する評価結果表示部１４としての機能を有している（例えば、液晶表示装置として構成される）。なお、この機能ブロックは、ＣＰＵ１３が格納部１２に格納されたプログラムを実行し、入出力回路などの周辺回路を制御することによって実現される。
【００４７】
以下、疲労評価システムの一態様として、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）をバイオマーカーの一つとして疲労を評価するシステムにつき具体的に説明する。このシステムでは、ステップ１として、測定部１１において、生体サンプルにおけるオルニチン濃度とシトルリン濃度とを測定する。次いで、ステップ２として、ステップ１で測定したオルニチン濃度とシトルリン濃度とを、入力受付部１１Ａを介して、測定値受容部１２ａが受容する（格納する）。次いで、ステップ３として、演算部１３ａが、測定値受容部１２ａに格納されたオルニチン濃度とシトルリン濃度とを読みだして、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を算出する。必要に応じてＯＣ比率は格納部１２に格納される。次いで、ステップ４として、演算部１３ａが、前記算出したＯＣ比率と、基準値格納部１２ｂに格納された基準値とから、疲労を評価するための評価情報を生成する。次いで、ステップ５として、ステップ４で生成した評価情報に基づいて、評価部１３ｂが疲労を評価する。次いで、ステップ６として、評価部１３ｂが生成した疲労の評価結果が、表示部１４に表示される。なお、ステップ２として、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を、入力受付部１１Ａを介して、測定値受容部１２ａが受容してもよい。この場合は、上記ステップ３〜４に代えて、演算部１３ａが、測定値受容部１２ａに格納されたＯＣ比率を読み出して、当該ＯＣ比率と、基準値格納部１２ｂに格納された基準値とから、疲労を評価するための評価情報を生成する。ステップ５は上述の通りである。なお、評価情報の生成から疲労の評価までのステップは、例えば、格納部１２内に格納されている評価用のプログラム（例えば、決定木解析プログラム等）を動作させることにより実行可能である。例えば、図９や図１０に示す結果を得る場合には、ＯＣ比率と同様にして、被験者の生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）、および、被験者の生体サンプル中のアラニン濃度とヒドロキシプロリン濃度との比率を、疲労評価システム内（例えば、格納部１２）に格納した上で、評価用のプログラムを動作させればよい。
【００４８】
なお、本発明にかかるシステムを用いれば、疲労を評価し、治療法を提案し得るだけでなく、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の判断基準を提供することができるので、疲労の状態であるか否かの診断が容易になる。すなわち、本発明にかかるシステムは、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の診断基準または判定基準を提供するためのシステム（例えば、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）を診断または判定するためのデータを取得するためのシステム）でもあり得る。
【００４９】
〔４〕本発明の一態様
本発明の一態様には、例えば、以下のような発明も含まれる。
（１）被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程と、前記比率（ＯＣ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、疲労を評価する方法。
（２）前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する工程を包含する、（１）に記載の方法。
（３）さらに、前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程を包含する、（３）に記載の方法。
（５）前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程とを行って疲労の状態の評価がなされた被験者に対して、前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する前記工程を行う、（２）に記載の方法。
（６）オルニチン濃度を測定するための試薬とシトルリン濃度を測定するための試薬とを備えている、疲労を評価するためのキット。
（７）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を示す第一呈示部を備えている、（６）に記載のキット。
（８）ピルビン酸濃度を測定するための試薬とイソクエン酸濃度を測定するための試薬とをさらに備えている、（６）又は（７）に記載のキット。
（９）ピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を示す第二呈示部を備えている、（８）に記載のキット。
（１０）疲労を評価するための基準値と、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）とを受け取って、疲労を評価するための評価情報を生成する演算部、および、前記評価情報を受け取って、疲労を評価する評価部を備えた疲労評価システム。
（１１）１）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）の入力を受付ける入力受付部を備えるか、２）オルニチン濃度およびシトルリン濃度の測定値の入力を受付ける入力受付部を備え、前記演算部が、入力が受付けられた測定値からオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を算出する、（１０）に記載の疲労評価システム。
（１２）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）に代えて、前記生体サンプル中のオルニチン濃度と、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineから選択される何れかの濃度との比率を用いる、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
（１３）疲労を評価する方法であって、被験者から得た生体サンプル中のバイオマーカーの値を得る工程と、前記バイオマーカーの値に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含し、前記バイオマーカーの値が、１）2-アミノ酪酸（2AB）、２−オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３−ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３−メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ−３−メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４−メチル−２−オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）前記群にシス−アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及びコハク酸（Succinate）を加えた群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、疲労を評価する方法。
（１４）（１３）に記載の、疲労を評価する方法であって、さらに、シス−アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及び、コハク酸（Succinate）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度を、前記バイオマーカーの値として用いる、疲労を評価する方法。
（１５）（１３）又は（１４）に記載の、疲労を評価する方法であって、前記バイオマーカーの値が、１）シトルリン（Citrulline）、イソクエン酸（Isocitrate）、ピルビン酸（Pyruvate）、及び、オルニチン（Ornithine）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）シトルリン、イソクエン酸、ピルビン酸、及び、オルニチンからなる群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、疲労を評価する方法。
（１６）上記生体サンプルは、アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼの活性及び／または一酸化窒素合成酵素の活性を抑制する処理を受けている、（１）〜（５）、（１２）〜（１５）の何れかに記載の方法。
（１７）アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼまたは一酸化窒素合成酵素の阻害剤を含んでいる、（６）に記載のキット。
【００５０】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００５１】
〔１．ヒトでの評価〕
試験１では、健常者２０名（男性１０名、女性１０名；平均年齢＝３６．１０歳；大阪市立大学附属病院から提供）、慢性疲労症候群２０名（男性１０名、女性１０名；平均年齢＝３６．１５歳；大阪市立大学附属病院から提供）を対象とした。また、試験２では健常者４６名（男性５名、女性４１名；平均年齢＝３８．７８歳；大阪市立大学附属病院から提供）、慢性疲労症候群４７名（男性６名、女性４１名；平均年齢＝３７．９６歳；大阪市立大学附属病院から提供）、慢性疲労１３名（男性５名、女性８名；平均年齢＝３３．６２歳；大阪市立大学附属病院から提供）を対象とした。【００５２】
試験１・２における慢性疲労症候群とは、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって作成された慢性疲労症候群診断基準（Ann Intern Med. 1994;121:953-959）を日本国内用に改定したもの（医学のあゆみ 特集「最新・疲労の科学 −日本発：抗疲労・抗過労への提言」６７１−６７７）に記されているように「（１）生活が著しく損なわれるような強い疲労を主症状とし、少なくとも６ヵ月以上の期間持続または再発を繰り返す（５０％以上の期間認められること）。かつ、病歴、身体所見、検査所見で疾患を除外する。さらに、（２）症状基準８項目以上か、症状基準６項目・身体基準２項目以上を満たす。」といった診断基準に従って病気と診断された者である。試験２における慢性疲労とは、医師による上記の慢性疲労症候群の診断は満たさないが、６カ月以上断続的に疲労あるいは疲労感が見られ、来院した者である。また、試験１・２における健常者とは、年代、疲労度、精神疾患の有無、睡眠障害の有無、精神疾患や睡眠障害の治療薬の服用の有無等を考慮して募集をした（健常者リクルート）者である。【００５３】
試験１，２ともに、健常者（ＨＣ）、そして慢性疲労症候群（ＣＦＳ: Chronic Fatigue Syndrome）および慢性疲労（ＣF: Chronic Fatigue）の患者から採取した血液から血漿サンプルを調製した。前処理した血漿サンプル中の代謝物質の測定を、慶応義塾大学先端生命科学研究所に依頼した。血漿中の代謝物の測定には、キャピラリー電気泳動−質量分析器が用いられた。一方、血糖値の測定には、Glucose analysis kit II（Biovision）を用いた。統計解析には、SPSS 17.0およびAmos 18.0を用いた有意差検定、相関解析、およびパス解析を採用した。【００５４】
試験１および試験２を加えた集団で評価した結果、本願発明者らが国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４ Ａ２（米国特許シリアル番号１３／８０５，４４９）で報告の通り、健常者と慢性疲労症候群患者との間でのエネルギー産生系代謝物の変化の再現性が確認された。さらに、他の代謝経路を含めた解析を詳細に行ったところ、尿素回路関連代謝物を中心に試験１・試験２を通してきわめて再現よく変化している代謝系から、新たなバイオマーカーを見出し、既に見出したバイオマーカーとの組合せによる、より高精度の疲労診断の可能性を見出した。【００５５】
すなわち、慢性疲労症候群患者群において、オルニチン（Ornithine）の血中レベルが上昇する一方、シトルリン（Citrulline）や尿素（Urea）のレベルが低下していた(図１)。【００５６】
試験１および試験２を加えた集団に対して、血漿サンプル中の代謝物質の測定値を解析ソフトＲ（フリーソフト、バージョン3.0.1）を用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した。また、同じランダムフォレストプログラムの実行を、試験２の集団に対して行った。Random Forestは識別、回帰、クラスタリングに用いられるアルゴリズムである。【００５７】
図２に示すように、健常者と慢性疲労症候群患者とを分類する際に、複数の測定項目の中で、Isocitrate、SuccinateおよびCis-Aconitate等のＴＣＡ回路関連代謝物に交じってこれらの尿素回路関連代謝物が上位に出現した。試験２のみを対象にした同解析においても尿素回路関連代謝物が上位に出現した（図３）。Ornithine、Citrulline、Urea以外にもUrateあるいは4-hydroxy-3-methoxybenzoateやHydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineも上位に出現した。また、こうした代謝物は健常者群と慢性疲労症候群の二群比較において有意に増加あるいは減少していた(図４)。【００５８】
この結果から、被験者の個人のばらつきに対して比較的安定している尿素回路関連代謝物を単独で用いるか、或いは、エネルギー代謝系（解糖系からＴＣＡ回路）のバイオマーカーと組み合わせることにより、慢性疲労患者群や健常者の個人差による判別の安定性が向上することが予想された。【００５９】
一方、慢性疲労の患者群でも尿素回路関連代謝物に同様の変化が見られたが(図５)、これらの比であるCitrulline/Ornithine、あるいはUrea/Ornithineの値を用いて評価したところ、慢性疲労症候群患者に比べて慢性疲労患者ではその低下の程度が小さかった。なお、ureaとAspartateに関しては試験２のみで検出できた。さらに、慢性疲労症候群患者群では見出されなかったいくつかの代謝物に関して、健常者群と比較して有意に減少あるいは増加しているものが見出された(図６)。なお、図１６は、試験２の集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。図１７は、試験２の集団に対して、慢性疲労（ＣＦ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。【００６０】
次いで、試験１と試験２のすべてのデータを対象に、疲労の有無に対応して血漿中の量が有意に変動した代謝物質と、パフォーマンス・ステイタス（ＰＳ）との相関を調べた。ＰＳは、疲労の主観的重症度の尺度であり、数値が高いほど重症であることを示す。その結果、代謝物質のうちのいくつかが、ＰＳと有意な相関を示すことがわかった（Proline; R=0.323, P=0.027: Urateあるいは4-hydroxy-3-methoxybenzoate; R=-0.334, P=0.022）。【００６１】
また、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値を対象に解析ソフトＲを用いて決定木モデルによる解析を実行した。このプログラムは、決定理論の分野において、計画を立案して目標に到達するために用いられる。例えば図７のように４ツリーへ分類した場合、Isocitrateが８．１５μＭ以上か未満か、さらにOrnithineが６２μＭ 以上か未満か、Hydroxyprolineが９．３μＭ以上か未満かで分類することで、慢性疲労症候群の患者群と健常者群の集団から、慢性疲労症候群の患者を７９．０％の正判別率（ＣＦＳ６２名中４９名）で判別できることになる。この場合、誤判別率は１８．５％（ＨＣ６５名中１２名）であった。さらに分類ツリーの数を増やして９ツリーに分類した場合、図８にあるようにSuccinateが１２．５μＭ以上か未満か、Glutamine（Ｇｌｎ）が１０６９μＭ以上か未満か、Glutamate（Ｇｌｕ）が５０μＭ以上か未満か、Leucine（Ｌｅｕ）が９５μＭ以上か未満か、Lysine（Ｌｙｓ）が１８１．５μＭ以上か未満かで分類することで慢性疲労症候群の患者群と健常者群の集団から、慢性疲労症候群の患者を９０．３％の正判別率（ＣＦＳ６２名中５６名）で判別可能である。この場合、誤判別率は７．７％（ＨＣ６５名中５名）であった。さらに、代謝物の比を用いることで、より少ないツリー数でも正判別率を上昇させ、かつ誤判別率を低下させることができる。例えば、図９のように、Pyruvate/Isocitrate（ＰＩ比率）が２０．６１以上か未満か、Ornithine/Citrulline（ＯＣ比率）が３．２１５以上か未満かの３ツリーへの分類だけで８０．６％の正判別率（ＣＦＳ６２名中５０名）、２０．０％の誤判別率（ＨＣ６５名中１３名）で慢性疲労症候群の患者を判別することが可能となる。さらに、Ornithine/Citrullineが１．３２１以上か未満か、Alanine/Hydroxyprolineが３７．７１以上か未満かを加えることで、８０．６％の正判別率は維持されつつ、誤判別率が１０．７％（（ＨＣ６５名中７名）まで低下する(図１０)。ただし、上記の決定木上の分岐を決める数値は、測定条件や目的によって変わるものであり、固定された数値ではない。こうした決定木分析は診断アルゴリズムとして用いることも可能である。【００６２】
一方、慢性疲労症候群と慢性疲労との間で、代謝における差があるかを直接比較して検討した。その結果、図１１に示すように、尿素回路関連代謝物、および尿素回路からＴＣＡ回路への代謝の流れに関わる代謝物、例えばArginineやSuccinate、Glutamine等で有意な差を示した。こうした代謝物は上記のような診断のための決定木分析を行う上で有用である。【００６３】
〔２．ヒトでの評価を受けたラットでの評価〕
本発明の一形態を用いれば、簡便なキットでの疲労診断が可能になる。さらに、本発明の一形態を用いた診断結果に基づいて、効果的な治療法を見出す可能性がある。例えば、強い疲労感や長期にわたる疲労感を訴える患者に対して、本発明の一形態を適用することによって、疲労度の客観的評価ができ、さらには慢性疲労症候群か否かの判別ができるだけでなく、代謝病態を把握することで、個人個人の疲労病態に合わせた治療・予防を実現する食薬成分の選択も可能となる。本発明による疲労度の評価は、疲労に関する高度な知識を必要としないので、一般の医療施設においても実施可能である。また、本発明の一形態を用いれば、生体内のエネルギー（ＡＴＰ）産生代謝系および尿素回路系のどの部分に異常があるかを推測することができるので、患者の生活指導に活かせるだけでなく、原因と考えられる代謝系を促進または抑制することで代謝病態を是正する食薬を提供することが可能となる。特に、上記ヒトの血液成分の解析結果のみならず、疲労モデル動物の血液や肝臓を対象とした網羅的代謝解析（図１２：グラフデータは肝臓検体の測定値を示す）から、尿素回路およびＴＣＡ回路の異常と、尿素回路からＴＣＡ回路への疲労病態特有の代謝の流れ込みを確認できている。すなわち、疲労病態においては、ＴＣＡ回路内のCitrate、cis-Aconitate、Isocitrateが有意に減少する一方、Succinate、Malateが有意に増加する。加えて、疲労病態では尿素回路におけるオルニチンが、Putrescine、ＧＡＢＡ、Succinateと順に代謝される系が優位となってＴＣＡ回路へ流れ込む。同時に、この代謝経路の促進には、尿素回路におけるオルニチンからシトルリンへの代謝が低下すること、および同回路のアルギニンからオルニチンへの代謝が増強されていることが関係している。【００６４】
疲労モデル動物の実験では、オス７週齢SD系ラット（日本SLC）を使用し、各動物は明暗周期12時間、室温23℃、湿度50%の条件にて飼育した。購入したラットは、無作為に無処理群（対照群）、食事制限群、および疲労群に群分けを行った。無処理群のラットは、エサおよび水分が十分に摂取できる環境にて５日間飼育した。疲労群のラットは、水深2.2 cmの水を張ったケージにて5日間飼育した。食事制限群のラットは、１日あたり10gのエサを与え、5日間飼育した。その後にラットを屠殺し、リン酸緩衝液を用いて血液灌流を行い、ラット肝臓を取得した。取得した肝臓試料の各代謝物は、キャピラリー電気泳動−質量分析計のカチオンモード、およびアニオンモードの両メソッドで測定を行い、約８５種類の代謝物を検出した。【００６５】
〔３．ＰＬＳ−ＤＡ法による解析〕
ＰＬＳ−ＤＡ法（Partial least squares discriminant analysis;部分最少二乗法判別分析）は、回帰分析を用いた予測モデル構築に使用される手法である。本手法を用いて、ＨＣ（健常者）とＣＦＳ(慢性疲労症候群)、ＨＣとＣＦ（慢性疲労）、ＣＦとＣＦＳの判別を行った。ＰＬＳ−ＤＡ法による解析を行うためのソフトウェアとしては、R（フリーソフト、バージョン3.0.1）を用いた。【００６６】
＝ＨＣとＣＦＳの判別結果＝
生体情報として、上述の試験２で、ＨＣ群、ＣＦＳ群の２群比較で統計的な有意差が認められたOrnithine、Citrulline、Urea、Hydroxyproline、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Isocitrate、Citrate、Pyruvate、Cis-aconitate、Gamma-Butyrobetaine、4-methyl-2-oxopentanoate、2-oxoglutarateそれぞれの濃度、および、ランダムフォレスト解析の結果からマーカーとして有望なSuccinate、Pro、Leu、3-Methylhistidine、Creatinine、His、Ala、N,N-Dimethylglycine、Ser、Lys、Betaine、Glu、Taurine、2AB、Arg、3-Hydroxybutyrate、Creatine、Trp、Mucate、Cystine、Asp、Sarcosine、Thr、Valそれぞれの濃度を全て用いてＰＬＳ−ＤＡ解析を行った。その結果、図１８に示すように、ＰＬＳ−ＤＡスコアプロットにおいて、ＨＣとＣＦＳでは異なった分布を示した。また、統計的有意差が認められた代謝物質が、２群の判別に対する高い負荷量を示した。なお、図１８中のプロット一つはヒト一人に対応し、ＨＣは健常者、ＣＦＳは慢性疲労症候群の患者を指す。【００６７】
＝ＨＣとＣＦの判別結果＝
生体情報として、上述の試験２で、ＨＣ群、ＣＦ群の２群比較で統計的な有意差が認められた、Choline、Gly、Taurine、Asn、Gamma-Butyrobetaine、Gln、Lys、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、Succinateそれぞれの濃度、および、ランダムフォレスト結果からマーカーとして有望なCis-Aconitate、Lactate、Arg、Mucate、His、Azelate、N,N-Dimethylglycine、Creatinine、beta-Ala、Tyr、Ornithine、2AB、Leu、Isocitrate、Hydroxyproline、Phe、Met、3-Methylhistidine、Sarcosine、Ile、Betaine、Pyruvate、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Ser、Asp、Carnitine、Urea、5-oxoproline、Citrateそれぞれの濃度を全て用いてＰＬＳ−ＤＡ解析を行った。その結果、図１９に示すように、ＰＬＳ−ＤＡスコアプロットにおいて、ＨＣとＣＦでは異なった分布を示した。また、統計的有意差が認められた代謝物質が、２群の判別に高い負荷量を示した。なお、図１９中のプロット一つはヒト一人に対応し、ＨＣは健常者、ＣＦは慢性疲労の患者を指す。【００６８】
＝ＣＦとＣＦＳの判別結果＝
生体情報として、上述の試験２で、ＣＦ群、ＣＦＳ群の２群比較で統計的な有意差が認められた、Choline、Succinate、Gln、Taurine、Asn、Lys、Arg、His、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoateそれぞれの濃度、および、ランダムフォレスト結果からマーカーとして有望なN,N-Dimethylglycine、3-Methylhistidine、Azelate、Ile、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、Ser、Cis-Aconitate、Met、Phe、Gly、Lactate、Ala、Leu、Citrulline、Malate、gamma-Butyrobetaine、Sarcosine、beta-Ala、Glu、2-Oxoglutarate、Pyruvate、Asp、Urea、Creatinine、Carnitine、2AB、Betaine、Citrate、Tyrそれぞれの濃度を全て用いてＰＬＳ−ＤＡ解析を行った。その結果、図２０に示すように、ＰＬＳ−ＤＡスコアプロットにおいて、ＣＦとＣＦＳでは異なった分布を示した。また、統計的有意差が認められた代謝物質が、２群の判別に高い負荷量を示した。なお、図２０中のプロット一つはヒト一人に対応し、ＣＦは慢性疲労の患者、ＣＦＳは慢性疲労症候群の患者を指す。【００６９】
図１８〜図２０の結果より、検出される生体情報を用いてＨＣ、ＣＦ、ＣＦＳの生理・病態を定性的に捉えることが可能であり、疲労を評価・診断する上で有用であることが示された。【００７０】
〔４．アルギニンの分解が与える影響の評価〕
採血後全血のまま、どのくらいの時間、室温で放置すると、バイオマーカーの値に変化が現れるかを１０名の健常者の血液（全血）を利用して検討した。その結果、採血後の血液の放置時間が長くなると、オルニチン値が上昇し、かつアルギニン値が低下することが判明した（図１４）。一方、クエン酸のように、放置をしても濃度変化を示さない代謝物もあった（図示せず）。血液中には、アルギニンからオルニチンへの反応を進めるアルギナーゼという酵素、及び、アルギニンから一酸化窒素とシトルリンとを生成する反応に関わる一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）が含まれており、採血後も試験管の中で酵素反応が進行していることが示唆された。【００７１】
そこで、ラットの血液（全血）を使用して、採血した血液を入れる試験管の中にアルギナーゼ又は一酸化窒素合成酵素の阻害剤を入れることで、オルニチンやアルギニンの濃度変化が抑えられるかを検討した。アルギナーゼ阻害剤であるＮω-Hydroxy-nor-L-arginine（nor-NOHA）と一酸化窒素合成酵素阻害剤であるNG-Nitro-L-Arginine（L-NNA）とを用いて阻害実験を試み、LC-MSシステムを用いてアルギニン及びオルニチンの定量解析を行った。なお、nor-NOHAは一酸化窒素合成酵素の活性は実質的に阻害せず、L-NNAはアルギナーゼの活性は実質的に阻害しない。【００７２】
その結果、図１５に示すように、採血後にラットの血液を室温放置すると、アルギニン値、及びオルニチン値がともに高くなることが判明した。次に、nor-NOHA、あるいはnor-NOHA、L-NNA両方を採血後すぐに添加することにより、アルギニン値やオルニチン値の上昇を抑えられることが分かった。なお、図１５において、左側はアルギニン濃度の測定結果を示し、右側はオルニチン濃度の測定結果を示す。図１５において、左側から順に、０ｈは採血直後の状態を、２ｈは採血後、阻害剤を添加せずに室温で２時間放置した状態を、５ｈは採血後、阻害剤を添加せずに室温で５時間放置した状態を示し、１００μＭ  nor-NOHA（５ｈ）は、終濃度で１００μＭ  nor-NOHAを添加し、室温で５時間放置した状態を、１００μＭ  nor-NOHA＋１００μＭ  L-NNA（５ｈ）は、終濃度で１００μＭのnor-NOHAとL-NNAとを添加し、室温で５時間放置した状態を、３００μＭ  nor-NOHA（５ｈ）は、終濃度で３００μＭ  nor-NOHAを添加し、室温で５時間放置した状態を、３００μＭ  nor-NOHA＋１００μＭ  L-NNA（５ｈ）は、終濃度で３００μＭのnor-NOHAと１００μＭのL-NNAとを添加し、室温で５時間放置した状態を、それぞれ示す。【００７３】
採血後に直ちに血液試料を冷却処理することが不可能なケースを想定して、疲労診断のための血液採取用試験管に、こうした阻害剤を前もって添加しておくことで、バイオマーカー値の変化を防ぎ、検査の精度をより一層向上させうる。【００７４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【００７５】
また、本明細書中で言及した全ての文献は、本明細書の一部を構成するものとして参照によって本明細書中に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明を用いれば、疲労の評価および診断を客観的かつ簡便に行うことが可能となる。本発明はさらに、疲労の治療に有用な技術を提供し得る。疲労は、非常に重大な健康問題であるので、疲労の評価、診断および治療が実現することは、あらゆる産業にわたって大いに貢献する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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