(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、
前記細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、
前記細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、
前記細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、
前記細胞システムを培地で培養する段階と、
プテロスチルベンを生成する段階と、を備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法であって、
前記４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼを発現させる段階および前記スチルベンシンターゼを発現させる段階は、４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を遺伝子導入する段階を含む、
プテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項２】
前記４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（生態型  Ｃｏｌｕｍｂｉａ‐０）からクローニングされた４ＣＬ遺伝子（配列番号１４）から発現される、請求項１に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項３】
前記スチルベンシンターゼは、ぶどう（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされたＳＴＳ遺伝子（配列番号１６）から発現される、請求項１または２に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項４】
前記レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼは、ぶどう（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされた遺伝子（配列番号１２）から発現される、請求項１から３のいずれか一項に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項５】
前記レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼを発現させる段階は、ＲＯＭＴ遺伝子を遺伝子導入する段階を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項６】
前記細胞システムは、少なくともバクテリア、酵母、植物細胞、動物細胞およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項７】
前記細胞システムは酵母である、請求項１から６のいずれか一項に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項８】
前記細胞システムは、異所性生合成反応を可能にする、請求項１から７のいずれか一項に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項９】
前記細胞システムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換システムを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のプテロスチルベンを生成する生合成方法。
【請求項１０】
細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、
前記細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、
前記細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、
前記細胞システムを培地で培養する段階と、
レスベラトロルを生成する段階と、を備える、レスベラトロルを生成する生合成方法であって、
前記４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼを発現させる段階および前記スチルベンシンターゼを発現させる段階は、４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を遺伝子導入する段階を含む、
レスベラトロルを生成する生合成方法。
【請求項１１】
第１の細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、
前記第１の細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、
前記第１の細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、
前記第１の細胞システムを培地で培養する段階と、
レスベラトロルを生成する段階と、
第２の細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、
前記第２の細胞システムにレスベラトロルを供給する段階と、
前記第２の細胞システムを培地で培養する段階と、
プテロスチルベンを生成する段階と、を備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法であって、
前記４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼを発現させる段階および前記スチルベンシンターゼを発現させる段階は、４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を遺伝子導入する段階を含む、
プテロスチルベンを生成する生合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
【０００２】
本開示は、発明の名称「プテロスチルベンの生合成製造のためにＯ‐メチルトランスフェラーゼを使用する方法」のＰＣＴ特許出願である。本願は、２０１３年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９８８９９号に対する優先権を主張し、それは参照により本明細書にその全体が組み込まれる。  本開示は、食品、医療、および薬物産業における適用可能性を有する。本開示は概して、Ｏ‐メチルトランスフェラーゼを利用するプテロスチルベンの生合成製造（ＲＯＭＴ）のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術：プテロスチルベンは、レスベラトロルに化学的に関連するスチルベノイドであり、それはブルーベリーおよびブドウに存在する。プテロスチルベンは、植物により生成される感染症と戦うための化学物質であるファイトアレキシンのグループに属する。動物実験に基づき、プテロスチルベンは、抗癌、抗高コレステロール血症、抗高トリグリセリド血症特性、および認知低下を克服および改善する能力を示すと考えられている。当該化合物はまた、抗糖尿病特性も有すると考えられているが、これまでのところ、この件についての研究はほとんどされていない。
【０００４】
シュミードリンその他によると、レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）は、レスベラトロルのプテロスチルベンへの直接変換を触媒可能であることが報告されている（２００８年シュミードリンその他）。（受入番号：ＦＭＩ７８８７０）。プテロスチルベンは、４‐クマル酸‐ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）、スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）およびレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）の作用により生成される（図１）。
【０００５】
本発明において、出願人らは、ＲＯＭＴは、レスベラトロルをプテロスチルベンに変換すべく、４ＣＬおよびＳＴＳと共に細胞システムにおいて発現可能であることを示している。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、プテロスチルベンを酵母またはバクテリアのような細胞システムにおいて生成することに関する技術的課題を扱う。出願人らは、４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）、スチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）、およびレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）の遺伝子を独自に分離し、それらをプテロスチルベンの生成を促進する細胞システムにおいて発現させた。本開示は、レスベラトロルおよびプテロスチルベンの産業的製造をもたらす。
【０００７】
本開示は、細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、上記細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、上記細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、上記細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、それによりプテロスチルベンを生成する段階と、を備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法である。
【０００８】
別の実施形態は、上記細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、レスベラトロルを上記細胞システムに供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、プテロスチルベンを生成する段階とを備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法である。
【０００９】
別の実施形態は、細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、上記細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、上記細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、レスベラトロルを生成する段階と、を備える、レスベラトロルを生成する生合成方法である。
【００１０】
別の実施形態は、第１の細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、上記第１の細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、上記第１の細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、上記第１の細胞システムを培地で培養する段階と、レスベラトロルを生成する段階と、第２の細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、上記第２の細胞システムに生成された上記レスベラトロルを供給する段階と、上記第２の細胞システムを培地で培養する段階と、プテロスチルベンを生成する段階と、を備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法である。
【００１１】
本開示をより良く理解するために、以下の添付図面への参照がなされる。本開示には様々な修正形態および代替的形態を取り入れることが可能であるが、図面においては、その複数の特定の実施形態が例示として示されており、本明細書において詳細に説明されている。しかしながら、図面および本明細書において示される詳細な説明は、本開示を開示された特定の実施形態に限定する意図はなく、その逆に、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の精神および範囲に属する、すべての修正形態、均等技術、および代替形態に及ぶ意図であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プテロスチルベンの生合成経路を示す。
【図２】３つのスタンダード（ｐ‐クマル酸、レスベラトロルおよびプテロスチルベン）のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図３】４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を発現する大腸菌細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図４】ＲＯＭＴ遺伝子を発現する大腸菌細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図５】４ＣＬ：：ＳＴＳおよびＲＯＭＴ遺伝子を共発現する大腸菌細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図６】４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を発現する酵母細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図７】ＲＯＭＴ遺伝子を発現する酵母細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図８】４ＣＬ：：ＳＴＳおよびＲＯＭＴ遺伝子を共発現する酵母細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図９】リボン状で表されるＲＯＭＴのモデルを示す。基質は、濃い灰色の棒モデルで表されている。基質結合残基は、黒色の棒モデルで表されている。Ｆ１６７Ａ、Ｄ１７４Ａ、Ｗ２５８Ａ、Ｈ２６１Ａ（Ｈ２６１は重要なアミノ酸）の置換がなされた。それらはすべて、活性のための重要なアミノ酸であり、Ｈ２６１が最重要である。
【図１０】野生型ＲＯＭＴおよびＲＯＭＴ変異体を発現する大腸菌細胞からの抽出物のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［定義］
［細胞システム］
【００１４】
細胞システムとは、異所性タンパク質の発現をもたらす任意の細胞である。それには、バクテリア、酵母、植物細胞および動物細胞が含まれる。それには、原核および真核細胞の両方が含まれる。また、それにはリボソームのような細胞コンポーネントに基づくタンパク質のインビトロ発現も含まれる。
［細胞システムの培養］
【００１５】
培養には、細胞が増殖および分裂することを可能にする培地を提供することが含まれる。培養には、細胞または細胞コンポーネントが、組み換えタンパク質を翻訳および合成できるようなリソースを提供することも含まれる。
［遺伝子導入］
【００１６】
遺伝子導入とは、核酸を細胞に意図的に導入するプロセスである。当該用語は通常、真核細胞における非ウイルス性の方法に使用される。当該用語が他の方法および細胞タイプにも言及することがあるが、他の用語が好ましく、バクテリア、植物細胞を含む動物以外の真核細胞における非ウイルス性のＤＮＡ転移を記載するのに、「変換」がより一般的に使用される。動物細胞においては、遺伝子導入が好ましい用語である。というのは、「変換」は、これらの細胞における癌状態（発癌）への進行に言及する際にも使用されるからである。ウイルス仲介性のＤＮＡ転移を記載するのに、「形質導入」が通常使用される。変換、形質導入、およびウイルス感染が、本願の遺伝子導入の定義下に含まれる。
［修飾されたアミノ酸］
【００１７】
修飾されたアミノ酸とは、化学的に修飾されたアミノ酸であり、ポリペプチド配列の一部として組み込み可能である。アミノ酸は、翻訳後の方法、または翻訳中のポリペプチド配列への組み込み前に、修飾可能である。
［４ＣＬ］
【００１８】
４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（生態型  Ｃｏｌｕｍｂｉａ‐０）からクローニングされた４ＣＬ遺伝子から発現される。別の実施形態において、４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼは、シロイヌナズナ（生態型  Ｃｏｌｕｍｂｉａ‐０）からクローニングされた、４ＣＬ遺伝子との少なくとも６６％の配列同一性を有する遺伝子から発現される。さらなる実施形態において、４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼは、シロイヌナズナ（生態型  Ｃｏｌｕｍｂｉａ‐０）からクローニングされた、４ＣＬ遺伝子との少なくとも９０％の配列類似性を有する遺伝子から発現される。
［ＳＴＳ］
【００１９】
スチルベンシンターゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされたＳＴＳ遺伝子から発現される。別の実施形態において、スチルベンシンターゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされた、ＳＴＳ遺伝子との少なくとも６６％の配列同一性を有する遺伝子から発現される。さらなる実施形態において、スチルベンシンターゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされた、ＳＴＳ遺伝子との少なくとも９０％の配列類似性を有する遺伝子から発現される。
［ＲＯＭＴ］
【００２０】
レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされた遺伝子から発現される。別の実施形態において、レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされた、ＲＯＭＴ遺伝子との少なくとも６６％の配列同一性を有する遺伝子から発現される。さらなる実施形態において、レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼは、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）からクローニングされた、ＲＯＭＴ遺伝子との少なくとも９０％の配列類似性を有する遺伝子から発現される。
【００２１】
本開示の一実施形態は、細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、上記細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、上記細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、上記細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、プテロスチルベンを生成する段階と、を備える、プテロスチルベンを作成する生合成方法である。
【００２２】
一実施形態において、４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼを発現させる段階およびスチルベンシンターゼを発現させる段階は、４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を遺伝子導入する段階を含む。別の実施形態において、４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼを発現させる段階は、４ＣＬ遺伝子を遺伝子導入する段階を含み、スチルベンシンターゼを発現させる段階は、個別のＳＴＳ遺伝子を遺伝子導入する段階を含む。レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼを発現させる段階は、ＲＯＭＴ遺伝子を遺伝子導入する段階を含む。
【００２３】
上記細胞システムは、少なくとも、バクテリア、酵母、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される。別の実施形態において、上記細胞システムは、異所性生合成反応を可能にする。
【００２４】
さらなる実施形態は、上記細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、上記細胞システムにレスベラトロルを供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、プテロスチルベンを生成する段階とを備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法である。
【００２５】
さらなる実施形態は、細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、上記細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、上記細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、上記細胞システムを培地で培養する段階と、レスベラトロルを生成する段階と、を備える、レスベラトロルを生成する生合成方法である。
【００２６】
さらなる実施形態は、第１の細胞システムにおいて４‐クマル酸：コエンザイムＡリガーゼ（４ＣＬ）を発現させる段階と、上記第１の細胞システムにおいてスチルベンシンターゼ（ＳＴＳ）を発現させる段階と、上記第１の細胞システムにｐ‐クマル酸を供給する段階と、上記第１の細胞システムを培地で培養する段階と、レスベラトロルを生成する段階と、第２の細胞システムにおいてレスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ（ＲＯＭＴ）を発現させる段階と、上記第２の細胞システムにレスベラトロルを供給する段階と、上記第２の細胞システムを培地で培養する段階と、プテロスチルベンを生成する段階と、を備える、プテロスチルベンを生成する生合成方法である。
［材料および方法］
菌株、プラスミド、および培養条件
【００２７】
プラスミドクローニングに、Ｈｉ−Ｃｏｎｔｒｏｌ  １０ＧおよびＤＨ５αが使用され、大腸菌における組み換えタンパク質の発現に、ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロゲン）が使用され、酵母におけるタンパク質の発現にＷａｔ１１菌株が使用された。ｐ‐クマル酸、レスベラトロルおよびプテロスチルベンスタンダードはすべてシグマ社から購入された。ルシジェン社（ウィスコンシン州ミドルトン）からｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎベクターが購入された。プラスミドｐＥＴＤｕｅｔ‐１がノバゲンから購入され、組み換えタンパク質の発現の目的に使用された。
［ＤＮＡ操作］ 
【００２８】
すべてのＤＮＡ操作は、標準的な手順に従って実行された。制限酵素およびＴ４  ＤＮＡリガーゼがニューイングランドバイオラボから購入された。ＰＣＲ増幅およびクローニング反応はすべて、ニューイングランドバイオラボのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して実行された。
［ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成］
【００２９】
ＲＯＭＴ（レスベラトロルＯ‐メチルトランスフェラーゼ）、４ＣＬ（４‐クマル酸コエンザイムＡリガーゼ）およびＳＴＳ（スチルベンシンターゼ）が、様々な植物種からクローニングされた。ＲＯＭＴおよびＳＴＳのクローニングのためにぶどう（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）から、４ＣＬのクローニングのためにシロイヌナズナ（生態型Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）から、植物の全ＲＮＡがＴｒｉｚｏｌ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ精製キット（インビトロゲン）を用いて抽出された。ｃＤＮＡの合成は、プロメガ社のＩｍ  Ｐｒｏｍ−ＩＩ（商標）逆転写システムを用いて、当該メーカのマニュアルに従い実行された。遺伝子は、表１のプライマーを使用して、ニューイングランドバイオラボのＰｈｕｓｉｏｎ  ＰＣＲキットを用いて、合成されたｃＤＮＡから増幅された。
【実施例１】
【００３０】
［細菌発現ベクターの構造］
当該メーカのマニュアルに従って、ＲＯＭＴのＰＣＲ生成物がｐＥＴｉｔｅ  Ｎ‐Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ  Ｋａｎ  ベクター（ルシジェン）にクローニングされた。適切なインサートを持つ合成プラスミドは、シークエンシング、すなわちＳｕｍｏ−ＲＯＭＴによって確認され、すなわちＳｕｍｏ‐ＲＯＭＴは異種遺伝子の発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）に導入された。
【００３１】
４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子を構築すべく、Ａｔ４ＣＬおよびＶｖＳＴＳがＰＣＲ増幅法を使用して融合された。４ＣＬの終止コドンが除去され、３つのアミノ酸リンカー（Ｇｌｙ‐Ｓｅｒ‐Ｇｌｙ）が、４ＣＬおよびＳＴＳのオープンリーディングフレーム間に導入された。このプラスミドの構造は、４ＣＬ、トリペプチドリンカー、およびＳＴＳをコードする２．８７  ｋｂの融合遺伝子のコンストラクトをもたらした。ｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロゲン社）を使用して、Ｇａｔｅｗａｙエントリベクターにクローニングされた融合遺伝子４ＣＬ：：ＳＴＳが、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ大腸菌細胞に導入され、その後、配列が決定された。４ＣＬ：：ＳＴＳ融合遺伝子は増幅され、ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌを介して、ｐＥＴＤｕｅｔ‐１ベクターのマルチクローニング部位にクローニングされた。ｐＥＴＤｕｅｔ‐４ＣＬＳＴＳと命名する。すべてのクローニング反応のプライマーは、表１に記載されている。
【実施例２】
【００３２】
［酵母発現ベクターの構造］
４ＣＬ：：ＳＴＳ遺伝子が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアドバンストＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクターｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐ｃｃｄＢ（マサチューセッツ州ボストンのアドジーン社）に導入され、ＲＯＭＴ遺伝子が、ＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックスキット（インビトロゲン）によって、別のＧａｔｅｗａｙデスティネーションベクターｐＡＧ３０５ＧＰＤ‐ｃｃｄＢ（アドジーン社）へ置換された。得られたプラスミドは、ｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐４ＣＬＳＴＳおよびｐＡＧ３０５ＧＰＤ‐ＲＯＭＴと命名された。ベクターは、構成型プロモータ（ＧＰＤ）の制御下、組み込みの組み換え側および発現カセットを含む。これらのベクターは、発酵試験のためにＷＡＴ１１に変換された。
［酵母形質転換］
【００３３】
コントロールとしてのｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐ｃｃｄＢベクターおよびｐＡＧ３０５ＧＰＤ‐ｃｃｄＢベクターと共に、ｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐４ＣＬＳＴＳコンストラクトおよびｐＡＧ３０５ＧＰＤ‐ＲＯＭＴコンストラクトは、Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩキット（カリフォルニア州オレンジ郡のザイモリサーチ）を用いて、ＷＡＴ１１細胞に導入された。ｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐４ＣＬＳＴＳベクターおよびｐＡＧ３０４ＧＰＤ−ＲＯＭＴベクターは、酵母ＷＡＴ１１細胞に同時形質転換された。
［ＲＯＭＴの基質結合残基の推定のためのホモロジーモデリングおよびドッキング］
【００３４】
出願人らの知識によると、基質結合部位の分析に使用可能なＲＯＭＴの３次構造はない。基質結合部位を解析するために、出願人らはコンピュータプログラムＩ‐ＴＡＳＳＥＲ（２０１０年、アンブリッシュその他）で、ＲＯＭＴのモデル（図９）を構築した。出願人らは、エンハンスドＲＯＭＴの実験室での進化および発生のために、分子生物学と構造生物学との組み合わされた方法を適用する。基質結合部位は、コンピュータプログラムＳＷＩＳＤＯＣＫ（２０１１年、グロスディディエその他）を使用して、レスベラトロルをＲＯＭＴモデルとドッキングさせることにより、推定された。
［大腸菌および出芽酵母における４ＣＬ：：ＳＴＳ融合タンパク質を用いたｐ‐クマル酸からレスベラトロルへのバイオコンバージョン］
【００３５】
大腸菌菌株のシングルコロニーが、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む３ｍＬ  ＬＢ培地の中で、３７℃で一晩培養された後、種培養が、１００μｇ  ｍＬアンピシリンを含む５０ｍＬ  Ｍ９改変培地に移された。ｐＥＴＤｕｅｔ‐４ＣＬＳＴＳベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）が改変Ｍ９培地の中で、ＯＤ６００が０．６に到達するまで２００ｒｐｍ、３７℃で振とうされ続け、その後、１ｍＭのＩＰＴＧが加えられ、２時間のＩＰＴＧ誘導後、１００％エタノールに溶解されたｐ‐クマル酸が、培養液に０．５ｇ／Ｌになるまで加えられた。同一の培養条件下で、培養液が振とうされ続け、ＨＰＬＣ分析のために、途中で間隔をおいて複数の試料が採取された。
【００３６】
ｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐４ＣＬＳＴＳプラスミドを有するＷＡＴ１１細胞がＳＤドロップアウト培地の中で、ＯＤ６００が０．２に到達するまで３０℃で培養され、その後、ｐ‐クマル酸（０．５ｇ／Ｌ）が加えられた。同一の培養条件下で、培養液は４日間振とうされ続け、ＨＰＬＣ分析のために、途中で間隔をおいて複数の試料が採取された。
［大腸菌および出芽酵母におけるＲＯＭＴのタンパク質を用いるレスベラトロルからプテロスチルベンへのバイオコンバージョン］
【００３７】
ＳＵＭＯ−ＲＯＭＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）が、改変Ｍ９培地の中で、ＯＤ６００が０．６に到達するまで３７℃で培養され、その後、ＩｍＭ  ＩＰＴＧが加えられ、２時間のＩＰＴＧでの誘導後、ＤＭＳＯに溶解されたレスベラトロルが、０．２２８ｇ／Ｌになるまで培養液に加えられた。酵母抽出物（１．２５ｇ／Ｌ）およびグリセロール（０．５％ｖ／ｖ）の添加により、Ｍ９培地は標準的なＭ９培地に改変された。同一の培養条件下で、培養液は振とうされ続け、ＨＰＬＣ分析のために複数の試料が途中で間隔をおいて採取された。
【００３８】
ｐＡＧ３０５ＧＰＤ‐ＲＯＭＴプラスミドを有するＷＡＴ１１細胞が、標準的な酵母ドロップアウト培地の中で、ＯＤ６００が０．２に到達するまで３０℃で培養され、その後、レスベラトロル酸（０．２２８ｇ／Ｌ）が加えられた。同一の培養条件下で、培養液は振とうされ続け、ＨＰＬＣ分析のために複数の試料が途中で間隔をおいて採取された。
［大腸菌および出芽酵母におけるＲＯＭＴおよび４ＣＬ：：ＳＴＳ融合タンパク質のタンパク質を用いるｐ‐クマル酸のプテロスチルベンへのバイオコンバージョン］
【００３９】
ｐＥＴＤｕｅｔ‐４ＣＬＳＴＳベクターおよびＳＵＭＯ‐ＲＯＭＴベクターを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）が、改変Ｍ９培地の中で、ＯＤ６００が０．６に到達するまで３７℃で培養され、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧが加えられ、２時間のＩＰＴＧでの誘導後、１００％エタノールに溶解されたｐ‐クマル酸が、０．５ｇ／Ｌになるまで培養液に加えられた。同一の培養条件下で、培養液は振とうされ続け、ＨＰＬＣ分析のために複数の試料が途中で間隔をおいて採取された。
【００４０】
ｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐４ＣＬＳＴＳおよびｐＡＧ３０５ＧＰＤ‐ＲＯＭＴプラスミドを有するＷＡＴ１１細胞がＳＤドロップアウト培地の中で、ＯＤ６００が０．２に到達するまで３０℃で培養され、その後、ｐ‐クマル酸（０．５ｇ／Ｌ）が加えられた。同一の培養条件下で、培養液は振とうされ続け、ＨＰＬＣ分析のために複数の試料が途中で間隔をおいて採取された。
［生成物の抽出］
【００４１】
培養液（４００μｌ）のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）が８００μｌの酢酸エチルを用いて抽出された。エッペンドルフのバキュフュージ（ニューヨークのウェストベリーのエッペンドルフサイエンティフィック）を用いて、抽出物を室温にて乾燥するまで蒸発させ、２００μｌの８０％（ｖ／ｖ）メタノールに再度溶解された。
［ＨＰＬＣ分析］
【００４２】
レスベラトロルおよびプテロスチルベンのＨＰＬＣ分析が、ダイオネクスＵｌｔｉｍａｔｅ３０００システムを用いて行われた。中間物が逆相クロマトグラフィによって、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８カラム（粒子サイズ２．６μｍ；１５０×４．６μｍ）で、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸（溶液Ａ）および１００％アセトニトリル（溶液Ｂ）を用いて分離された。試料は８０％メタノールに希釈され、次のような勾配方式が使用された。すなわち、溶液Ｂの１０％が２分間、溶液Ｂの１０％から７０％の直線勾配が１８分間、溶液Ｂの７０％から３０％が１分間、溶液Ｂの３０％から１０％が２分間、溶液Ｂの１０％が５分間、流量０．８ｍｌ／分で使用された。定量化のために、すべての中間物は、外部基準によりキャリブレーションされた。複数の化合物は、それらの保持時間、および系内のダイオードアレイ検出器で識別される対応するスペクトルにより識別された。
［結果］
［４ＣＬおよびＳＴＳの融合タンパク質を用いるｐ‐クマル酸のレスベラトロルへのバイオコンバージョン］
【００４３】
３つのスタンダードがＨＰＬＣにより実行され、ＨＰＬＣは、それらが十分に分離されたことを示している（図２）。ＰＣＲ増幅法により、４ＣＬおよびＳＴＳが、４ＣＬおよびＳＴＳ間のＧｌｙ‐Ｓｅｒ‐Ｇｌｙのリンクを用いて融合された。出願人らは、ｐＥＴＤｕｅｔ‐４ＣＬＳＴＳプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を用いた、ｐ‐クマル酸からレスベラトロルへの変換をフラスコ内の改変Ｍ９培地中でテストした。図３に示される通り、ｐ‐クマル酸は、改変Ｍ９培地の中で、レスベラトロルへ変換可能であった。
【００４４】
ｉｎ  ｖｉｖｏの酵母試験のために、ｐＡＧ３０４ＧＰＤ‐４ＣＬＳＴＳを有する新たに形成されてから間もない酵母コロニーが、０．５ｇ／Ｌのｐ‐クマル酸を含む３ｍｌの酵母ドロップアウト培地の中で、３０℃で４日間培養された。抽出物は、ＨＰＬＣによって分析された。図６に示される通り、４日間でほぼすべてのｐ‐クマル酸がレスベラトロルに変換された。大腸菌と比較すると、酵母の変換効率の方がはるかに優れている。
［ＲＯＭＴのタンパク質を用いるレスベラトロルのプテロスチルベンへのバイオコンバージョン］
【００４５】
図４に示される通り、ＲＯＭＴの発現を持つ大腸菌の培養液の中へ供給されたレスベラトロルは、フラスコ内でプテロスチルベンに変換された。ＨＰＬＣ分析は、レスベラトロルは、フラスコ内でプテロスチルベンに変換可能であることを示している。しかしながら、もう一つ未知のピークがあり、それはおそらくレスベラトロルへ添加されたメチル基のものである。同様の結果が、酵母からも得られた（図７）。
［４ＣＬ：：ＳＴＳおよびＲＯＭＴの共発現を用いるｐ‐クマル酸のプテロスチルベンへのバイオコンバージョン］
【００４６】
ｐ‐クマル酸が、４ＣＬ：：ＳＴＳおよびＲＯＭＴを共発現する大腸菌および出芽酵母の培養液に供給された。図５および図８に示される通り、２４時間後の大腸菌および出芽酵母に対するＨＰＬＣによれば、ｐ‐クマル酸はフラスコ内でレスベラトロルおよびプテロスチルベンに変換されていた。当該条件下で９６時間内に、ＨＰＬＣのプロファイルが取得された。
［ＲＯＭＴの従来型の飽和突然変異誘発］
【００４７】
基質結合部位を注意深く分析した後、ＲＯＭＴの活性を向上させるべく、アミノ酸残基１６７、１７４、２５８および２６１が飽和突然変異誘発に選択された。出願人らは、ＲＯＭＴのＦ１６７Ａ、Ｄ１７４Ａ、Ｗ２５８Ａ、およびＨ２６１Ａの変異体を構築すべく、従来型の突然変異誘発を既に実行しており、それらのエンザイム活性に対する効果を認識している。Ｄ１７４Ａを除き、上記のうちいずれも活性を示さず、Ｄ１７４Ａは非常に低い活性を示した（図１０）。この結果は、部位１６７、１７４、２５８および２６１におけるアミノ酸残基が、基質結合および触媒活性において重要であることを示唆している。従って、次のステップにおいて、出願人らは、ＲＯＭＴの酵素活性を上げるべく、部位特異的飽和突然変異誘発を実行することにする。飽和突然変異誘発は、あるアミノ酸を他の代替的な１９のアミノ酸残基に置換することを可能にする。出願人らは、ＮＮＫ縮重プライマー（ＮはＧ／ＴのためのＡ、Ｇ、Ｃ、およびＫの混合物を示す）を使用する、改変されたＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異法（カリフォルニア州のストラタジーン社）に従い、ＲＯＭＴの部位１６７、１７４、２５８、および２６１における飽和突然変異誘発を実行することにする。コドンＮＮＫは、３２重の縮重を有し、希少コドンを含めずに２０種のアミノ酸すべてをコードする。ＰＣＲ混合物（２５μｌ）は、６０ｎｇのＳｕｍｏ‐ＲＯＭＴ  ＤＮＡテンプレート、２００μＭのｄＮＴＰＳ、０．５μＭのフォワードプライマー、０．５μＭのリバースプライマー、５％のＤＭＳＯおよび０．３μｌのポリメラーゼを含有するＰｈｕｓｉｏｎ  ＨＦバッファーで構成される。ＰＣＲは、９８℃で２０秒間変性させ、５８℃で３０秒間アニーリングした後、７２℃で２分３０秒間を２５回のサイクルで、伸長させることにより行われた。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動により検査され、次に、１５μｌのＰＣＲ生成物が１μｌのＤｐｎＩ（ニューイングランドバイオラボ）を用いて３７℃で４時間切断され、テンプレートプラスミドが除去された。（２μｌ）の切断消化生成物のアリコートが５０μｌのＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（カリフォルニア州のストラタジーン社）に加えられ、氷上で３０分間保持された。その後、熱ショックが４２℃で２０秒間与えられ、２分間氷上に保持され、次に５００μｌのＳＯＣ培地が加えられ、３７℃で１時間細胞が培養された。細胞は、５０００ｒｐｍで１分間遠心され、４５０μｌの上清が捨てられ、細胞はＳＯＣ培地の残りで懸濁され、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天プレートに植菌された。我々は、プラスミドおよびＤＮＡ配列を分離し、変異体を確認することにする。我々は、ライブラリの質をＤＮＡ配列によって確認することにする。
【表１】
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【００４８】
［同一性および類似性］
【００４９】
同一性とは、配列のアライメント後における一組の配列間で同一であるアミノ酸の割合をいう（これは、配列情報または構造情報または何らかの他の情報のみを使用して行うことができるが、通常は配列情報のみに基づく）。類似性とは、いくつかの類似性マトリックスを使用するアライメントに基づき、割り当てられるスコアをいう。類似性インデックスは、次のＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、若しくはＧＯＮ  ＥＴ、または当業者によってタンパク質の配列アライメントのために使用される任意のマトリックスのうちのいずれかであってよい。
【００５０】
同一性は、２つのサブ配列間の一致の度合いをいう（当該配列間にギャップがない）。２５％または２５％より高い同一性は、機能の類似性を示唆し、一方１８〜２５％の同一性は、構造または機能の類似性を示唆する。２つの全く無関係またはランダムな配列（残基数が１００より多いもの）が、２０％より高い同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較する際の２つの配列間の類似の度合いである。これは、それらの同一性に依存する。
【００５１】
前述の説明から明らかなように、本開示の特定の態様は、本明細書に示される実施例の具体的な詳細によっては限定されず、従って、複数の他の修正および応用、またはそれらの均等技術が当業者に想起されことが考えられる。従って、特許請求の範囲は、本開示の精神および範囲から逸脱しない、そのようなすべての修正および応用に及ぶことが意図されている。
【００５２】
さらに、別途規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的な用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等な任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用可能であり、好ましい方法および材料が上記されている。
【００５３】
本開示の他の態様、目的および利点が、図面、本開示および添付の特許請求を検討することで獲得可能である。
［参照文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006522640.tif 000011
【図１０】
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【配列表】
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