(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法であって、ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の存在下で１以上のＬ−ヌクレオチドを第一のＬ−核酸と反応させる段階を含み、前記ポリメラーゼ活性が前記第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、前記ポリメラーゼ活性提示部分はアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸はＤ−アミノ酸である、方法。
【請求項２】
前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも３００個のアミノ酸を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびポリメラーゼλ、並びにそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、前記変異体が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびポリメラーゼλの群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、およびＳｔｏｆｆｅｌ断片、並びにそれらの変異体の群から選択され、前記変異体が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、およびＳｔｏｆｆｅｌ断片の群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応が、第二のＬ−核酸をさらに含み、前記第一のＬ−核酸の１つの分子が、前記第二のＬ−核酸の１つの分子とハイブリッド形成する、請求項１から７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｌ−ヌクレオチドおよびポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための方法であって、前記ポリメラーゼ活性が前記標的Ｌ−核酸を増幅させることができ、前記ポリメラーゼ活性提示部分はアミノ酸配列からなり、前記アミノ酸配列のアミノ酸はＤ−アミノ酸である、方法。
【請求項１０】
前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも３００個のアミノ酸を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびポリメラーゼλ、並びにそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、前記変異体が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびポリメラーゼλの群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、およびＳｔｏｆｆｅｌ断片、並びにそれらの変異体の群から選択され、前記変異体が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、およびＳｔｏｆｆｅｌ断片の群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９から１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つのプライマーを利用し、前記少なくとも１つのプライマーが、Ｌ−ヌクレオチドからなる、請求項９から１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質であって、前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ活性が第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができる、タンパク質。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも３００個のアミノ酸を含む、請求項１７または１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびポリメラーゼλ、並びにそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、前記変異体が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびポリメラーゼλの群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、およびＳｔｏｆｆｅｌ断片、並びにそれらの変異体の群から選択され、前記変異体が、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、およびＳｔｏｆｆｅｌ断片の群から選択されるそれぞれのポリメラーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７から１９の何れか１項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、ポリメラーゼ。
【請求項２５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、ポリメラーゼ。
【請求項２６】
野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体が、ポリメラーゼ活性を有し、前記ポリメラーゼ変異体がＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であり、前記変異体が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。
【請求項２７】
前記ポリメラーゼ活性が、温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項２６に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項２８】
前記ポリメラーゼ変異体がアミノ酸配列を含み、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる、請求項２６または２７に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項２９】
野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体がポリメラーゼ活性を有し、前記ポリメラーゼ変異体がＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができ、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸であり、前記変異体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。
【請求項３０】
前記ポリメラーゼ変異体がアミノ酸配列を含み、前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列が、少なくとも１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる、請求項２９に記載のポリメラーゼ変異体。
【請求項３１】
Ｌ−核酸の３’末端に対して１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法における、ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、かつ前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、タンパク質の使用。
【請求項３２】
Ｌ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための方法における、ポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質の使用であって、前記タンパク質がアミノ酸配列からなり、かつ前記アミノ酸配列のアミノ酸がＤ−アミノ酸である、タンパク質の使用。
【請求項３３】
標的Ｌ−核酸を増幅するための方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記タンパク質が、請求項１７から３０の何れか１項に記載のタンパク質である、請求項３１から３３の何れか１項に記載の使用。
【請求項３５】
標的分子結合Ｌ−核酸分子の同定のための方法であって、次の段階：
（ａ）Ｌ−核酸分子の不均一集団を作製すること；
（ｂ）段階（ａ）の前記Ｌ−核酸分子の不均一集団を前記標的分子と接触させること；
（ｃ）前記標的分子が結合しないＬ−核酸分子を分離すること；
（ｄ）前記標的分子が結合するＬ−核酸分子を増幅させること
を含み、前記増幅段階が請求項１７から３０の何れか１項に記載のタンパク質を使用する、方法。
【請求項３６】
請求項１７から３０の何れかに記載のタンパク質を作製するための方法であって、
ａ）請求項１７から３０の何れかに記載のタンパク質の２以上の断片が化学的に合成され、それによって、前記断片が全体として前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、
ｂ）段階ａ）の断片が、セグメント縮合、ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせにより互いに対して連結され、
前記タンパク質が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項３７】
前記断片が固相ペプチド合成によって合成される、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法、標的Ｌ−核酸を増幅するための方法、酵素活性提示部分を含むタンパク質、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリメラーゼ、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体、１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法における酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用、標的Ｌ−核酸を増幅するための方法における酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用、標的分子結合Ｌ−核酸分子の同定のための方法、タンパク質およびポリメラーゼをそれぞれ作製するための方法および第一のＤ−ペプチドまたは第一のＤ−タンパク質および第二のＤ−ペプチドまたは第二のＤ−タンパク質を互いに対して連結するための方法に関する。
【０００２】
より広い意味での遺伝子技術の使用は、医学および診断の分野において、ならびに基礎研究においてこの数十年にわたりなされた進歩に大いに貢献した。遺伝子技術によりもたらされる合成能力は、１つの化学合成を上回るものである。遺伝子技術および遺伝子工学によって、特に、原核および真核細胞の酵素機構を利用する事実上無制限量のＬ−ペプチドおよびＬ−タンパク質の産生が可能である。酵素およびポリメラーゼは特に、野生型であれ、またはこのような野生型の変異体であれ、理論的収率でないにせよ、化学合成によって達成可能である長さまでこのようなＤ−核酸の基本単位、すなわちＤ−ヌクレオチドを連結する、Ｄ−核酸の合成が可能である。
【０００３】
遺伝子技術において使用される酵素は、それぞれ、キラル特異性ゆえに、そのキラリティーがそれら自身のキラリティーに適合する基本単位および基質しか利用できない。キラリティーが逆である基本単位および基質は、それぞれ、酵素の活性に対する対象になり得ない。キラル相反性の原理のため、逆キラリティーの基本単位および基質それぞれのプロセシングには、酵素が逆キラリティーを有することも必要とされる。
【０００４】
このキラル相反性の原理は、例えば、シュピーゲルマーとしても知られ、このように呼ばれる標的結合Ｌ−核酸の作製において集中的に使用される。現在のところ、シュピーゲルマーは、Ｄ−ペプチドまたはＤ−タンパク質などの標的分子または標的構造の鏡像異性型に対するインビトロ選択のために第一段階でＤ−核酸ライブラリを使用する過程によって同定される。第二段階において、標的分子または標的構造の鏡像異性型に結合する、このように同定されたＤ−核酸を、対応するＬ−核酸として調製する。キラル相反性の原理の結果として、これらのＬ−核酸、すなわちシュピーゲルマーは、Ｌ−ペプチドまたはＬ−タンパク質などの真のまたは現実の標的分子に結合でき、選択過程に対して使用されるＤ−ペプチドまたはＤ−タンパク質などのその鏡像異性型には結合できない。好ましくは、このような真のまたは現実の標的分子または標的構造は、ヒトまたは動物体などの生体系で存在するような標的分子または標的構造である。このようなシュピーゲルマーの調製のための方法は、例えば「Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（ｅｄｓ．Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，２００６）」に記載されている。
【０００５】
シュピーゲルマーを同定する過程をより容易するある方法は、真のまたは現実の標的分子または標的構造により示される鏡像異性型において標的分子または標的構造を用いてＬ−核酸ライブラリからＬ−核酸が直接選択されるように過程を再設計することであり得る。この過程の一部は、標的分子および標的構造それぞれに最初に結合するＬ−核酸の増幅なので、ポリメラーゼが、Ｌ−プライマーに少なくとも１つのヌクレオチドを付加することが必要である。現在まで、このようなことが可能なＬ−アミノ酸からなるポリメラーゼは知られていない。このため、Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼおよび同様の酵素が必要とされている。遺伝子技術は、Ｄ−アミノ酸からなるこのような機能的に活性のあるポリメラーゼを提供できないので、化学合成が必要である。しかし、Ｄ−タンパク質またはＤ−ポリペプチドの合成は、比較的低分子に限定される。今までのところ合成された最大のＤ−タンパク質は、１０２個のＤ−アミノ酸からなる血管由来タンパク質血管内皮増殖因子（略称ＶＥＧＦ−Ａ）のＤ−タンパク質型であるが（Ｍａｎｄａｌら、２０１２）、ポリメラーゼは一般に３００個を超えるアミノ酸からなる。
【０００６】
したがって、本発明の根本となる問題は、プライマーなどのＬ−核酸への少なくとも１個のヌクレオチドの付加を可能にする方法の提供である。本発明の根本となるさらなる問題は、Ｌ−ヌクレオチドを利用する標的Ｌ−核酸を増幅するための方法の提供である。本発明の根本となるまたさらなる問題は、このような方法の実施を可能にする手段の提供である。
【０００７】
本発明の根本となるこれらおよび他の問題は、添付される独立した特許請求の範囲の対象により解決される。好ましい実施形態は、添付される独立した特許請求の範囲から導かれ得る。
【０００８】
本願の根本となる問題はまた、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法であって、酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で１以上のＬ−ヌクレオチドを第一のＬ−核酸と反応させる段階を含み、その酵素活性が、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加できるという方法によって、第一の態様の第一の実施形態でもある第一の態様において解決される。
【０００９】
第一の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第二の実施形態において、酵素活性提示部分は、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる。
【００１０】
第一の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第三の実施形態において、酵素活性提示部分はポリメラーゼ活性提示部分である。
【００１１】
第一の態様の第一の、第二の、および第一の態様の第三の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第四の実施形態において、酵素活性は、ポリメラーゼ活性である。
【００１２】
第一の態様の第四の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ活性は温度安定性のポリメラーゼ活性である。
【００１３】
第一の態様の第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、少なくとも３００個のアミノ酸を含む。
【００１４】
第一の態様の第六の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個のアミノ酸を含む。
【００１５】
第一の態様の第四の、第五の、第六のおよび第七の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第八の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【００１６】
第一の態様の第八の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第九の実施形態において、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【００１７】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十の実施形態において、酵素活性提示部分は、酵素である。
【００１８】
第一の態様の第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十一の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼである。
【００１９】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十二の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である。
【００２０】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十三の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリルネラーゼ（ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ）、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００、Ｐｆｘ−５０、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である。
【００２１】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二のおよび第十三の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十四の実施形態において、反応させる段階は、第一のＬ−核酸への少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの付加を可能にする、好ましくは５から２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは１０から２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは５０から５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００個のＬ−ヌクレオチドの付加を可能にする条件下で行われる。
【００２２】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三のおよび第十四の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十五の実施形態において、少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの第一のＬ−核酸への付加は、好ましくは第一のＬ−核酸の３’ＯＨと少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの１つの５’リン酸との間で３’−５’ホスホジエステル結合を形成させることによる、第一のＬ−核酸への少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの共有結合である。
【００２３】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四のおよび第十五の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十六の実施形態において、第一のＬ−核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、修飾ＲＮＡまたはそれらの組み合わせからなるプライマーである。
【００２４】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十七の実施形態において、第一のＬ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。
【００２５】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六のおよび第十七の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十八の実施形態において、第一のＬ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなる。
【００２６】
第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六の、第十七のおよび第十八の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十九の実施形態において、反応は第二のＬ−核酸をさらに含み、第一のＬ−核酸の１個の分子が好ましくはワトソン−クリック塩基対形成を通じて第二のＬ−核酸の１個の分子とハイブリッド形成する。
【００２７】
第一の態様の第十九の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第二十の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、第二のＬ−核酸と相補的である第三のＬ−核酸を合成し、この第三のＬ−核酸は、第一のＬ−核酸を含み、第一のＬ−核酸の３’末端にＬ−ヌクレオチドが付加される。
【００２８】
本願の根本となる問題はまた、Ｌ−ヌクレオチドおよび酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための方法であって、この酵素活性が標的Ｌ−核酸を増幅することができる方法によって、第二の態様の第一の実施形態でもある第二の態様においても解決される。
【００２９】
第二の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第二の実施形態において、酵素活性提示部分は、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる。
【００３０】
第二の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第三の実施形態において、酵素活性提示部分は、ポリメラーゼ活性提示部分である。
【００３１】
第二の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第四の実施形態において、酵素活性は、ポリメラーゼ活性である。
【００３２】
第二の態様の第四の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、温度安定性のポリメラーゼ活性である。
【００３３】
第二の態様の第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、少なくとも３００個のアミノ酸を含む。
【００３４】
第二の態様の第六の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個の間のアミノ酸を含む。
【００３５】
第二の態様の第四の、第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第八の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【００３６】
第二の態様の第八の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第九の実施形態において、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【００３７】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十の実施形態において、酵素活性提示部分は、酵素である。
【００３８】
第二の態様の第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十一の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼである。
【００３９】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十二の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物オリメラーゼ（ｏｌｙｍｅｒａｓｅ）β、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である。
【００４０】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十三の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分部分は、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリルネラーゼ（ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ）、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００、Ｐｆｘ−５０、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である。
【００４１】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二のおよび第十三の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十四の実施形態において、反応させる段階は、標的Ｌ−核酸の増幅を可能にする条件下で行われる。
【００４２】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三のおよび第十四の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十五の実施形態において、本方法は、少なくとも１つのプライマー、好ましくは２つのプライマーを利用し、この少なくとも１つのプライマーは、Ｌ−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。
【００４３】
第二の態様の第十五の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十六の実施形態において、プライマーはＬ−ヌクレオチドからなる。
【００４４】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十七の実施形態において、標的Ｌ−核酸はＬ−ヌクレオチドからなる。
【００４５】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五の、第十六のおよび第十七の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十八の実施形態において、本方法はポリメラーゼ連鎖反応である。
【００４６】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五の、第十六の、第十七のおよび第十八の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十九の実施形態において、標的Ｌ−核酸はＬ−ＤＮＡからなる。
【００４７】
第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五の、第十六の、第十七の、第十八のおよび第十九の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十の実施形態において、標的Ｌ−核酸は、２０から２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは３０から２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは４０から５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００個のＬ−ヌクレオチドからなる。
【００４８】
本願の根本となる問題はまた、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなり、酵素活性が、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができる、酵素活性提示部分を含むタンパク質によって、第三の態様の第一の実施形態でもある第三の態様においても解決される。
【００４９】
第三の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第二の実施形態において、酵素活性提示部分は、ポリメラーゼ活性提示部分である。
【００５０】
第三の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第三の実施形態において、酵素活性は、ポリメラーゼ活性である。
【００５１】
第三の態様の第三の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第四の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、温度安定性のポリメラーゼ活性である。
【００５２】
第三の態様の第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、少なくとも３００個のアミノ酸を含む。
【００５３】
第三の態様の第五の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個の間のアミノ酸を含む。
【００５４】
第三の態様の第三の、第四の、第五の、および第六の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【００５５】
第三の態様の第七の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第八の実施形態において、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【００５６】
第三の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七のおよび第八の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第九の実施形態において、酵素活性提示部分は、酵素である。
【００５７】
第三の態様の第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七のおよび第八の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第十の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼである。
【００５８】
第三の態様の第一の、第二の、第三の、第七の、第八の、第九のおよび第十の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第十一の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号１に記載のアミノ酸配列、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸまたはその変異体である。
【００５９】
第三の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、および第十の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第十二の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリルネラーゼ（ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ）、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００、Ｐｆｘ−５０、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Ｄｐｏ４ポリメラーゼまたはその変異体である。
【００６０】
本願の根本となる問題はまた、アミノ酸がＤ−アミノ酸である配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼによって、第四の態様の第一の実施形態でもある第四の態様においても解決される。
【００６１】
本願の根本となる問題はまた、アミノ酸がＤ−アミノ酸である配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼによって、第五の態様の第一の実施形態でもある第五の態様においても解決される。
【００６２】
本願の根本となる問題はまた、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼの、ポリメラーゼ活性、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体によって、第六の態様の第一の実施形態でもある第六の態様においても解決される。
【００６３】
第六の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第二の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
第六の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第三の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列と１または２つのアミノ酸位置で異なる。
【００６５】
第六の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第四の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列のアミノ酸位置１５５および／または２０３で、またはそれに対応するアミノ酸位置で、野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なり、好ましくは位置１５５および／または２０３のアミノ酸がシステインにより置換されている。
【００６６】
第六の態様の第一の、第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列および配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００６７】
第六の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００６８】
第六の態様の第一の、第二の、第三の、第四の第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸である。
【００６９】
第六の態様の第一の、第二の、第三の、第四の第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第八の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。
【００７０】
本願の根本となる問題はまた、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼの、ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体によって、第七の態様の第一の実施形態でもある第七の態様においても解決される。
【００７１】
第七の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第二の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、少なくとも１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。
【００７２】
第七の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第三の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、１つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる。
【００７３】
第七の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第四の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１に記載のアミノ酸配列の、アミノ酸位置８０、アミノ酸位置８６およびアミノ酸位置１２４から選択される少なくとも１つのアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置で、野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる。
【００７４】
第七の態様の第一の、第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００７５】
第七の態様の第一の、第二の、第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸である。
【００７６】
第七の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。
【００７７】
本願の根本となる問題はまた、Ｌ−核酸の３’末端への１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法において酵素活性提示部分を含むタンパク質を使用することによって、第八の態様の第一の実施形態でもある第八の態様においても解決される。
【００７８】
本願の根本となる問題はまた、Ｌ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための方法において酵素活性提示部分を含むタンパク質を使用することによって、第九の態様の第一の実施形態でもある第九の態様においても解決される。
【００７９】
第九の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第九の態様の第二の実施形態において、標的Ｌ−核酸を増幅するための方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００８０】
第八の態様の第一の実施形態および第九の態様の第三の実施形態の実施形態でもある第八の態様の第二の実施形態において、タンパクは、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質である。
【００８１】
本願の根本となる問題はまた、次の段階：
（ａ）Ｌ−核酸分子の不均一集団を作製し；
（ｂ）段階（ａ）のＬ−核酸分子の不均一集団を標的分子と接触させ；
（ｃ）標的分子が結合しないＬ−核酸分子を分離し；
（ｄ）標的分子が結合するＬ−核酸分子を増幅させること
を含み、
増幅の段階が、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質を使用し、
このタンパク質が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、
標的分子結合Ｌ−核酸分子の同定のための方法によって、第十の態様の第一の実施形態でもある第十の態様においても解決される。
【００８２】
第十の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第二の実施形態において、本方法は、
（ｅ）標的分子が結合するＬ−核酸分子の配列決定を行い；
（ｆ）核酸分子、段階（ｅ）で配列決定したＬ−核酸分子のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を合成する、段階をさらに含む。
【００８３】
第十の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第三の実施形態において、段階（ａ）のＬ−核酸分子の不均一集団の核酸分子は、それらの５’末端およびそれらの３’末端においてプライマー結合部位および、それぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応によって段階（ｄ）で得られるＬ−核酸分子の増幅を可能とするプライマー結合部位に相補的である配列を含み、ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるポリメラーゼは、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質であり、ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるプライマーは、Ｌ−ヌクレオチドからなり、ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるヌクレオチドはＬ−ヌクレオチドである。
【００８４】
第十の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第四の実施形態において、段階（ｄ）の後、次の段階：
（ｄａ）増幅された核酸分子を標的分子と接触させる段階
が導入され、
ここで、段階（ｂ）および場合によっては段階（ｃ）および／または（ｄ）が段階（ｅ）の前に行われ、段階（ｄａ）、（ｂ）、（ｃ）および場合によっては（ｄ）は、この順序で１回または数回行われる。
【００８５】
第十の態様の第一の、第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第五の実施形態において、標的分子結合Ｌ−核酸は、ＤＮＡである。
【００８６】
第十の態様の第一の、第二の、第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第六の実施形態において、標的分子結合Ｌ−核酸分子は、Ｌ−ヌクレオチドからなる。
【００８７】
本願の根本となる問題はまた、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質を作製するための方法であって、
ａ）第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質の２以上の断片が化学的に合成され、それによって断片がそれらの全体としてタンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくはこの断片が固相ペプチド合成により合成され、
ｂ）段階ａ）の断片が、セグメント縮合、ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせによって互いに対して連結され、
このタンパク質が、アミノ酸がＤ−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、
方法によって、第十一の態様の第一の実施形態でもある第十一の態様においても解決される。
【００８８】
第十一の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第十一の態様の第二の実施形態において、酵素性ライゲーションで使用される酵素は、クロストリパインである。
【００８９】
本願の根本となる問題はまた、第一のＤ−ペプチドまたは第一のＤ−タンパク質および第二のＤ−ペプチドまたは第二のＤ−タンパク質を酵素性ライゲーションによって互いに対して連結させるための方法であって、
この第一のＤ−ペプチドまたは第一のＤ−タンパク質が、そのＮ−末端で保護基によって保護され、そのＣ−末端で４−グアニジノフェニルエステル基によって保護され、
この第二のＤ−ペプチドまたは第二のＤ−タンパク質が、自由Ｎ−末端および、そのＣ−末端でチオアルキルエステルまたはチオアリールエステル基を含む、
方法によって、第十二の態様の第一の実施形態でもある第十二の態様においても解決される。
【００９０】
第十二の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第十二の態様の第二の実施形態において、酵素性ライゲーションで使用される酵素はクロストリパインである。
【００９１】
発明者らは、驚くべきことに、機能的に活性のあるＤ−アミノ酸からなるタンパク質を化学的に合成することが可能であり、それによって、このようなタンパク質が一般的にはポリメラーゼにより示されるようなサイズを有するようになることを見出した。より具体的には、発明者らは、このようなＤ−タンパク質およびＤ−ポリメラーゼ、すなわちポリメラーゼとして活性のあるＤ−アミノ酸からなるポリメラーゼの合成を可能にする方法に気付いた。この驚くべき知見に基づき、Ｌ−核酸およびＬ−核酸分子の酵素性合成に必要とされるタンパク質および酵素活性が今や利用可能である。Ｌ−核酸およびＬ−核酸分子のこのような酵素性合成は、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法および、Ｌ−核酸としてのＬ−ヌクレオチドの存在下で標的Ｌ−核酸を増幅するための、すなわち増幅産物がＬ−核酸である方法を含むが、これらに限定されない。
【００９２】
これらの方法および酵素活性は、利用するシュピーゲルマーを同定する代替的過程の一部であるので、シュピーゲルマーを同定するこのような代替的過程が現在、実現できる。
【００９３】
発明者らは、酵素活性が、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加することができる酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で、１以上のＬ−ヌクレオチドを第一のＬ−核酸と反応させる段階を含む、第一のＬ−核酸の３’末端に対して１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法を開発した。
【００９４】
好ましい実施形態において、酵素活性は、第一のＬ−核酸の３’末端に５から２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは１０から２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは５０から５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００個のＬ−ヌクレオチドを付加することができる。
【００９５】
「付加する」という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、好ましくは第一のＬ−核酸の３’ＯＨと少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの１つの５’リン酸との間に３’−５’ホスホジエステル結合を形成させることによる、本発明による、分子間の共有結合、Ｌ−核酸の共有結合およびＬ−核酸への少なくとも１以上のＬ−ヌクレオチドの共有結合である。本発明によると、Ｌ−核酸に付加されるＬ−ヌクレオチドは、Ｌ−ヌクレオチドにより延長されるＬ−核酸の３’末端を形成する。
【００９６】
好ましい実施形態において、第一のＬ−核酸の３’末端に１以上のＬ−ヌクレオチドを付加するための方法は、第二のＬ−核酸を含み、ここで、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成を通じて、第一のＬ−核酸の１つの分子が第二のＬ−核酸の１つの分子とハイブリッド形成する。より好ましい実施形態において、本方法によって、第二のＬ−核酸と相補的である第三のＬ−核酸の合成が可能となり、この第三のＬ−核酸は、第一のＬ−核酸と、第一のＬ−核酸の３’末端、すなわち第一のＬ−核酸に付加されるＬ−ヌクレオチドと、を含み、１以上のＬ−ヌクレオチドが第一のＬ−核酸の３’末端に付加され、その結果、第三のＬ−核酸が得られる。
【００９７】
本発明による酵素活性提示部分を含むタンパク質は、酵素活性提示部分のみを有するタンパク質および酵素活性提示部分と他の残基または部分とを有するタンパク質を含み、ここでタンパク質の他の残基または部分には酵素活性がない。本発明によると、酵素活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個のアミノ酸を含む。
【００９８】
本発明による酵素活性提示部分を含むタンパク質は、好ましくはポリメラーゼ活性提示部分である。本発明によるポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質は、ポリメラーゼ活性提示部分のみを有するポリメラーゼおよびポリメラーゼ活性提示部分と他の残基または部分とを有するポリメラーゼを含み、ここでポリメラーゼの他の残基または部分にはポリメラーゼ活性がない。本発明によると、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、３００から９００個の間のアミノ酸、好ましくは３００から６００個の間のアミノ酸、より好ましくは３００から３６０個の間のアミノ酸、最も好ましくは３４０から３６０個のアミノ酸を含む。
【００９９】
本発明によるポリメラーゼ活性提示部分は、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性提示部分、より好ましくは温度安定性のＤＮＡポリメラーゼ活性提示部分および最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分である。
【０１００】
本発明によるポリメラーゼ活性提示部分は、好ましくは、ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分、より好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分または温度安定性のＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分、最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性提示部分である。
【０１０１】
酵素活性という用語は、本明細書中で使用される場合、特異的な反応の触媒であり、好ましくは１以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加すること、核酸および／またはポリメラーゼ活性のアンプリケーション（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、より好ましくは１以上のＬ−ヌクレオチドをＬ−核酸の３’末端に付加すること、Ｌ−核酸のアンプリケーション（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）である。
【０１０２】
本発明によるポリメラーゼ活性という用語は、Ｌ−ヌクレオチドの重合および／またはＬ−核酸へのＬ−ヌクレオチドの重合の、酵素の性能であり、ここで好ましくはＬ−ヌクレオチドはＬ−ヌクレオシド三リン酸である。
【０１０３】
本発明によるポリメラーゼ活性は、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性、より好ましくは温度安定性のＤＮＡポリメラーゼ活性および最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【０１０４】
本発明によるポリメラーゼ活性は、好ましくはＤＮＡ−ポリメラーゼ活性、より好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼまたは温度安定性のＤＮＡ−ポリメラーゼ活性、最も好ましくは温度安定性のＤＮＡ依存性ＤＮＡ−ポリメラーゼ活性である。
【０１０５】
既知のポリメラーゼは、天然源由来であるかまたは天然源からのポリメラーゼの最適化もしくは突然変異誘導された変異体である。ポリメラーゼは、キラルな基本単位、すなわちＬ−アミノ酸からなる。結果的に、ポリメラーゼの構造は、本質的にキラルでもあり、その結果、立体特異的な基質認識が起こる。ゆえに、これらの酵素は、適正な、すなわち対応するキラル立体配置の基質分子のみを受容する。したがって、既知のポリメラーゼは、Ｄ−ヌクレオチドまたはＤ−ヌクレオシド三リン酸を重合させ、ここで、これらは、Ｄ−ヌクレオチドからなる相補的Ｄ−核酸鎖を合成するために、鋳型鎖として、Ｄ−ヌクレオチドからなるＤ−核酸を使用する。さらに、鋳型鎖に対して、ポリメラーゼは、場合によっては、鋳型鎖とハイブリッド形成し、Ｄ−ヌクレオチドからなるプライマーを使用する。天然の核酸は、Ｄ−ヌクレオチドから構成され、特にＬ−アミノ酸からなるタンパク質および酵素によって、処理、例えば増幅され得るので、それぞれＬ−アミノ酸からなるこのようなタンパク質および酵素によってＬ−核酸は認識されない。したがって、標的分子または標的構造に結合するＬ−核酸は、シュピーゲルマーとも呼ばれ、このような標的分子または標的構造の天然型を用いてインビトロ選択過程によって直接得ることができない。
【０１０６】
発明者らは、驚くべきことに、Ｌ−核酸鋳型鎖とハイブリッド形成するＬ−ヌクレオチドからなるプライマーにＬ−核酸ヌクレオチドを付加し得るポリメラーゼを作製することができることを見出した。さらに、発明者らは、驚くべきことに、好ましくはポリメラーゼ−連鎖反応（略称ＰＣＲ）として知られる過程においてＬ−核酸の増幅のために使用され得るポリメラーゼを作製することが可能であることを見出した。
【０１０７】
ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸を重合させる酵素である。ポリメラーゼは、鋳型核酸鎖に相補的である核酸鎖鎖を合成するために、鋳型核酸鎖を使用する。鋳型核酸鎖に加えて、ポリメラーゼは、場合によっては、鋳型核酸鎖に対して塩基相補性に基づきハイブリッド形成するプライマーを使用する。鋳型核酸鎖、プライマーおよびポリメラーゼにより合成される核酸鎖は、独立にＤＮＡまたはＲＮＡの何れかであり得る。ポリメラーゼは、本明細書中で好ましく使用される場合、ＤＮＡポルメラーゼ（ｐｏｌｍｅｒａｓｅ）およびＲＮＡ−ポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば逆転写酵素など、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。より好ましくは、ポリメラーゼは温度安定性のポリメラーゼである。ポリメラーゼは、対応するネイティブまたは野生型酵素で見出されるアミノ酸の全てを含有する必要はないが、ポリメラーゼが所望の触媒活性を遂行するのを可能にするのに十分であるもののみ必要である。ある実施形態において、ポリメラーゼ活性は、例えば、５’−３’重合化、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含む触媒活性を含む群から選択される触媒活性である。
【０１０８】
本発明によるポリメラーゼは、Ｄ−アミノ酸からなり、Ｌ−ヌクレオチドまたはＬ−ヌクレオシド三リン酸を重合化し、この本発明によるポリメラーゼは、Ｌ−ヌクレオチドからなる相補的Ｌ−核酸鎖を合成するために、鋳型鎖としてＬ−ヌクレオチドからなるＬ−核酸を使用する。さらに、鋳型鎖に対して、本発明によるポリメラーゼは、場合によっては鋳型鎖とハイブリッド形成し、Ｌ−ヌクレオチドからなるプライマーを使用する。鋳型鎖、プライマーおよび合成核酸鎖は独立にＬ−ＤＮＡまたはＬ−ＲＮＡの何れかであり得る。本発明によるポリメラーゼは、Ｄ−アミノ酸からなるＤＮＡポルメラーゼ（ｐｏｌｍｅｒａｓｅ）およびＤ−アミノ酸からなるＲＮＡ−ポリメラーゼ、好ましくはＤ−アミノ酸からなるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ−アミノ酸からなる逆転写酵素などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ−アミノ酸からなるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＤ−アミノ酸からなるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む。より好ましくは、本発明によるポリメラーゼは、Ｄ−アミノ酸からなる温度安定性のポリメラーゼである。本発明によるポリメラーゼは、ネイティブ酵素で見出されるアミノ酸の全てを含有する必要はないが、本発明によるポリメラーゼが所望の触媒活性を遂行するのを可能にするのに十分であるもののみ必要である。触媒活性としては、例えば、５’−３’重合化、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。
【０１０９】
Ｌ−アミノ酸のみからなるポリメラーゼは、好ましくは本明細書中で「全Ｌ−ポリメラーゼ」と呼ばれる。
【０１１０】
Ｄ−アミノ酸のみからなるポリメラーゼは、好ましくは本明細書中で「全−Ｄポリメラーゼ」と呼ばれる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ポリメラーゼＸコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼλ、ポリメラーゼＤＰＯ４、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＤＮＡポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ（商標）ポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑ（商標）ポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄ（商標）ポリメラーゼ、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉ（商標）ポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリルネラーゼ（ｐｏｌｙｒｎｅｒａｓｅ）、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＩＩ（商標）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（商標）ポリメラーゼ、Ｐａｑ５０００（商標）、Ｐｆｘ−５０（商標）、Ｐｒｏｏｆｓｔａｒｔ（商標）、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ（商標）、エロンガーゼ（商標）およびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択される。
【０１１２】
より好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるアフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸである。別のより好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸの変異体、最も好ましくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、配列番号３に記載のアミノ酸配列および配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列のアフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼＸの変異体である。
【０１１３】
より好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリメラーゼＤｐｏ４である。別のより好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体、最も好ましくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列、配列番号１７に記載のアミノ酸配列、配列番号１８に記載のアミノ酸配列、配列番号１９に記載のアミノ酸配列、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、配列番号２１に記載のアミノ酸配列および配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体である。
【０１１４】
ポリメラーゼの変異体は、１以上のアミノ酸位置でこのポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるポリメラーゼである。アミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、好ましくはポリメラーゼのＮ−末端およびＣ−末端に対するその位置および／またはそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置により決定され、
ａ）ポリメラーゼがＮ−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、ポリメラーゼのＣ−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
ｂ）ポリメラーゼがＣ−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、ポリメラーゼのＮ−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
ｂ）ポリメラーゼがＮ−末端およびＣ−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、そのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置によって決定されるようになる。
【０１１５】
温度安定性である本発明によるポリメラーゼは、温度上昇によって比較的影響を受けにくい。ある具体的な非限定例において、温度安定性であるポリメラーゼは、少なくとも５０℃、例えば、５０℃の温度、６０℃、７５℃、８０℃、８２℃、８５℃、８８℃、９０℃、９２℃、９５℃以上の温度により影響を受けない。
【０１１６】
Ｌ−ヌクレオシド三リン酸のポリメルセーション（ｐｏｌｙｍｅｒｓａｔｉｏｎ）の過程内で、本ポリメラーゼは、１個のヌクレオシド三リン酸を別のヌクレオシド三リン酸に付加し、好ましくはその結果、核酸とも呼ばれるオリゴヌクレオチドが得られる。好ましい実施形態において、本ポリメラーゼは、１個のヌクレオシド三リン酸のみを１個のヌクレオシド三リン酸にまたは、例えばヌクレオチドが連鎖停止剤ヌクレオチド、例えばジデオキシヌクレオチドである場合、核酸の末端ヌクレオチドに付加する。このような連鎖停止剤ヌクレオチドは、核酸の配列決定を行うために使用され、当業者により知られている。
【０１１７】
Ｌ−核酸、好ましくは標的Ｌ−核酸を増幅するために、Ｌ−ヌクレオシド三リン酸のポリメルセーション（ｐｏｌｙｍｅｒｓａｔｉｏｎ）の過程が使用され得る。
【０１１８】
増幅は、核酸、好ましくは標的Ｌ−核酸のコピー数を増加させる何らかの過程である。
【０１１９】
好ましい実施形態において、標的Ｌ−核酸は、２０から２０，０００個のＬ−ヌクレオチド、好ましくは３０から２，０００個のＬ−ヌクレオチド、より好ましくは４０から５００個のＬ−ヌクレオチド、最も好ましくは５０から１００個のＬ−ヌクレオチドからなる。
【０１２０】
増幅の例は、核酸鋳型に対するプライマーのハイブリッド形成を可能にする条件下で、核酸をプライマー対と接触させるものである。適切な条件下でプライマーに１以上のヌクレオシド三リン酸を付加することによってポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、核酸鋳型から解離させ、次いで再アニーリングさせ、伸長させ、解離させて核酸分子のコピー数を増幅させる。インビトロ増幅の産物は、標準的技術を用いて、電気泳動、制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成またはライゲーションおよび／または核酸配列決定によって特徴を調べることができる。
【０１２１】
代替的なインビトロ増幅技術は当業者にとって公知であり、転写フリー等温性増幅、鎖置換増幅およびＮＡＳＢＡ（商標）ＲＮＡ転写フリー増幅を含む。
【０１２２】
増幅方法の一部は、核酸、好ましくは２本鎖核酸を融解させるための反応の加熱および冷却の反復のサイクルからなる温度サイクリングおよび核酸の酵素性複製に依存する。これらの温度サイクリング段階は、核酸融解と呼ばれる過程において高温で２本鎖核酸の２本の鎖を最初に物理的に分離させるために必要である。次に、より低い温度で、標的核酸を選択的に増幅させるためのポリメラーゼによる核酸合成において、各鎖が鋳型として使用される。ポリメラーゼとともに標的領域に相補的な配列を含有するプライマー（この後この方法を示す。）は、選択的および反復性の増幅を可能にする重要な構成要素である。温度サイクリング進行に基づく増幅方法として、作製される核酸はそれ自身、複製のための鋳型として使用され、核酸鋳型が指数関数的に増幅される連鎖反応を引き起こす。
【０１２３】
温度性の増幅による最も著名な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（略称ＰＣＲ）である。
【０１２４】
プライマーは、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらの組み合わせ、好ましくは、長さが１０ヌクレオチド以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる短い核酸分子である。より好ましくは、より長いプライマーは、長さが約１５、２０または２５ヌクレオチド以上であり得る。核酸ハイブリッド形成によって相補的標的核酸鎖とプライマーをアニーリングさせ、プライマーと標的核酸鎖との間でハイブリッドを形成させることができ、次いで、ポリメラーゼプライマー対によって標的核酸鎖に沿って伸長させたプライマーを、例えばＰＣＲまたは当技術分野で公知の他の核酸増幅方法による核酸の増幅のために使用し得る。
【０１２５】
Ｄ−アミノ酸からなる本発明のポリメラーゼの使用によって、プライマーおよび相補的標的核酸鎖がＬ−ヌクレオチドからなるようにすることが必要となる。好ましくは少なくとも１つのプライマーは、Ｌ−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。
【０１２６】
核酸プライマーおよびプローブを調製し、使用するための方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｃｋら、１９８９）に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えばプライマーなど、その目的を対象としたコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列由来となることがある。当業者にとって当然のことながら、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、その長さに伴い向上する。
【０１２７】
そのため、本発明によるポリメラーゼはＤ−アミノ酸からなる。Ｄ−アミノ酸からなる本発明によるポリメラーゼは、天然源から単離することができず、細菌、酵母、真菌、ウイルスまたは動物細胞を用いた組み換え発現により作製できず、化学的過程、好ましくはライゲーション法と組み合わせた固相ペプチド合成（略称ＳＰＰＳ）などによって作製しなければならない。
【０１２８】
固相ペプチド合成は、ペプチドまたはタンパク質断片の合成に対する最新の技術であり：不溶性であるが多孔性の小型の固形ビーズをペプチド鎖が構築され得る機能的単位（「リンカー」）で処理する。ペプチドは、無水フッ化水素またはトリフルオロ酢酸などの試薬によりビーズから切断されるまで、ビーズに共有結合したままである。したがって、ペプチドは固相上に「固定化」されており、ろ過過程中に保持され得、一方で、液相試薬および合成の副産物が除去される。ＳＰＰＳの全般的な原理は、カップリング−洗浄−脱保護−洗浄の１反復サイクルである。固相連結ペプチドの自由Ｎ末端アミンを１個のＮ−保護アミノ酸単位にカップリングさせる（下記参照）。次に、この単位を脱保護し、これにより、さらなるアミノ酸が連結され得る新しいＮ末端アミンが現れる。この技術の優位性は、一部には、関心のある伸長中のペプチドが全て不溶性樹脂に共有結合されたまま、過剰な試薬を除去する各反応後の洗浄サイクルを行うことができることにある。ＳＰＰＳの主要な使用形態は２種類、ＦｍｏｃおよびＢｏｃがある。アミノ酸単量体のＮ末端は、これらの２つの基の何れかにより保護され、脱保護されたアミノ酸鎖上に付加される。ＳＰＰＳは収率により限定され、一般的には７０個のアミノ酸の範囲のペプチドおよびタンパク質が合成の利用能の限界となっている。合成の困難性は配列にも依存する。２個のペプチドを一緒にカップリングするために、断片縮合、ネイティブ化学ライゲーションまたは酵素性ライゲーションなどのライゲーション法を用いることによって、より大きな合成オリゴペプチドおよびタンパク質が得られるようになり得る。しかし、今までに合成された最大のＤ−タンパク質は、１０２個のＤ−アミノ酸からなる血管由来タンパク質血管内皮増殖因子（略称ＶＥＧＦ−Ａ）のＤ−タンパク質型である（Ｍａｎｄａｌら、２０１２）。
断片縮合は、ペプチドのアミノ酸のその鎖が化学基で完全に保護されているペプチドを使用し、そのペプチドは溶液中でカップリングされる。
【０１２９】
ネイティブ化学ライゲーションは水溶液中で行われる。必要な非保護ペプチド−チオエステル基本単位の調製は難関である。ネイティブ化学ライゲーションにおいて、非保護ペプチド２のＮ末端システイン残基のチオレート基は、ｐＨ７．０、２０℃＜Ｔ＜３７℃の水性緩衝液中で第二の非保護ペプチド１のＣ末端チオエステルを攻撃する。この可逆的トランスチオエステル化段階は、化学選択的であり、位置選択的であり、チオエステル中間体３の形成につながる。この中間体は、分子内Ｓ，Ｎ−アシルシフトにより再編成し、その結果、ライゲーション部位でネイティブアミド（「ペプチド」）結合４が形成される。
【０１３０】
実施例で示されるように、驚くべきことに、発明者らは、ネイティブ化学ライゲーションに必要なＣ末端チオエステルが、酵素性ライゲーション条件下で安定であるので、ネイティブ化学ライゲーションおよび酵素性ライゲーションを組み合わせて使用し得ることを示すことができた。
【０１３１】
Ｄ−ペプチドの酵素性ライゲーションは、次の段階を含むプロテアーゼの使用により作用する：（ａ）独自にＤ−ペプチドであるアミノ構成要素の調製、（ｂ）脱離基を含み、独自にＤ−ペプチドであるカルボキシ構成要素の調製および（ｃ）独自にＤ−ポリペプチドを与えるための、脱離基の切断によりアミノ構成要素とカルボキシ構成要素との間でペプチド結合を形成させるためのプロテアーゼ存在下でのアミノ構成要素およびカルボキシ構成要素の反応（ＷＯ２００３０４７７４３参照）。好ましくはプロテアーゼはクロストリパインである。
【０１３２】
本発明のポリメラーゼはまた、本発明のポリメラーゼ、および特に本明細書中で開示される特定の配列と基本的に相同であるポリメラーゼも含む。実質的に相同である、という用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものなどと理解されたい。
【０１３３】
本発明のポリメラーゼ活性提示部分はまた、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示される特定の配列と基本的に相同であるポリメラーゼ活性提示部分も含む。実質的に相同である、という用語は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものなどと理解されたい。
【０１３４】
本発明のポリメラーゼまたは本発明発明のポリメラーゼ活性提示部分に存在する相同アミノ酸の実際のパーセンテージは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に存在するアミノ酸の総数に依存する。％修飾は、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に存在するアミノ酸の総数に基づき得る。
【０１３５】
２つのポリメラーゼまたは２つのポリメラーゼ活性提示部分間の相同性は、当業者にとって公知のように決定され得る。より具体的には、指定のプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列相同性を計算するために配列比較アルゴリズムを使用し得る。試験配列は、好ましくは、相同であると言われるかまたは相同であるか否か、相同である場合は、異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に対してどの程度相同であるかを試験しようとするポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分であり、そのため、このような異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分は相同性参照配列とも呼ばれる。例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似度法に対する検索（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８）によって、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または目視によって、比較のためのポリメラーゼのアミノ酸配列の最適アラインメントを行い得る。
【０１３６】
パーセント配列同一性を決定するために適切であるアルゴリズムの一例は、ベーシック・ローカル・アラインメント検索ツール（本明細書中で以後、「ＢＬＡＳＴ」）において使用されるアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）参照。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（本明細書中で以後「ＮＣＢＩ」）を通じて公開されている。ＮＣＢＩから入手可能なソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）およびＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸配列用）を用いて配列同一性を決定する際に使用される初期設定パラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら（ＭｃＧｉｎｎｉｓら、２００４）に記載されている。
【０１３７】
本発明のポリメラーゼはまた、本発明のポリメラーゼおよび特に本明細書中で開示される本発明の特定のポリメラーゼに対してある一定の同一性を有し、それらのアミノ酸配列によって定められるポリメラーゼも含む。より好ましくは、本発明はまた、本発明のポリメラーゼおよび特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列またはその一部により定められる本発明の特定のポリメラーゼ対して少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える同一性を有し、それらのアミノ酸配列またはそれらの一部により定められるポリメラーゼも含む。
【０１３８】
本発明のポリメラーゼ活性提示部分は、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列により定められる本発明の特定のポリメラーゼ活性提示部分に対してある一定の同一性を有するポリメラーゼ活性提示部分も含む。より好ましくは、本発明はまた、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列またはそれらの一部により定められる本発明の特定のポリメラーゼ活性提示部に対して、少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える同一性を有するポリメラーゼ活性提示部分も含む。
【０１３９】
本願に関連して、核酸分子および核酸という用語は、別段の断りが明確に示されない場合は交換可能に使用される。
【０１４０】
好ましく本明細書中で使用される場合、「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｉｃｄおよびｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（略称ＤＮＡ）およびリボ核酸（略称ＲＮＡ）などを指す。さらに「核酸」という用語は複数の核酸を含む。「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｉｃｄおよびｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」という用語はまた、ヌクレオチド類似体、１本鎖（センスまたはアンチセンス）および２本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドからなるＲＮＡまたはＤＮＡの何れかの同等物、変異体および類似体を含むとも理解されたい。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。リボヌクレオチドには、アデノシン、シチジン、グアノシンおよびウリジンが含まれる。「ポリヌクレオチド」としての核酸分子への言及は、１本鎖のまたは２本鎖の分子を含む、共有結合により連結される２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにその広義の意味で使用される。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、共有結合によって連結される２以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにも本明細書中で使用されるが、本明細書中で定義されるように、オリゴヌクレオチドは、１００ヌクレオチド未満を含む。
【０１４１】
核酸は、核酸を形成する連続ヌクレオチド全てが互いに１以上の共有結合により連結または結合されることを特徴とする。より具体的には、このようなヌクレオチドのそれぞれは、２個の他のヌクレオチドに、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通じて連結または結合され、一続きの連続ヌクレオチドを形成する。しかし、このような配置において、このような配置が直鎖状であり、環状配置でなく、したがって環状分子でなく直鎖状であるという前提下で、２つの末端ヌクレオチド、すなわち好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドは、それぞれ１個のヌクレオチドにのみ連結される。
【０１４２】
本願の別の実施形態において、核酸は少なくとも２つの連続ヌクレオチド群を含み、それにより連続ヌクレオチドの各群内で、各ヌクレオチドが２個の他のヌクレオチドに、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通じて連結または結合され、一続きの連続ヌクレオチドが形成される。しかし、このような配置において、２個の末端ヌクレオチド、すなわち好ましくは５’末端および３’末端のヌクレオチドは、それぞれ１個のヌクレオチドにのみ連結される。しかし、このような実施形態において、連続ヌクレオチドの２つの群は、共有結合を通じて互いに連結または結合されず、共有結合、好ましくはこの２つのヌクレオチドの一方の糖部分とこの２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの他のホスホール部分との間で形成される共有結合を通じて、一方の群の１ヌクレオチドおよび別のまたは他方の群の１ヌクレオチドを連結する。しかし、代替的な実施形態において、連続ヌクレオチドの２つの群は、共有結合、好ましくはこの２つのヌクレオチドの一方の糖部分とこの２つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの他方のホスホール部分との間で形成される共有結合を通じて１つの群の１ヌクレオチドおよび別のまたは他の群の１ヌクレオチドを連結する共有結合を通じて互いに対して連結または結合される。好ましくは、連続ヌクレオチドの少なくとも２群は共有結合を通じて連結されることはない。別の好ましい実施形態において、ホスホジエステル結合とは異なる共有結合を通じて少なくとも２群が連結される。
【０１４３】
核酸という用語は、好ましくはＤ−核酸またはＬ−核酸の何れかも包含する。好ましくは、核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の１または数個の部分がＤ−核酸として存在し、核酸の少なくとも１または数個の部分がＬ−核酸であり得る。核酸の「一部分」という用語は、１ヌクレオチドのような小さいものを意味する。このような核酸は、一般に本明細書中でそれぞれＤ−およびＬ−核酸と呼ばれる。したがって、好ましい実施形態において、本発明による核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなり、少なくとも１つのＤ−ヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなＤ−ヌクレオチドは、一続きの何れかおよび何れかの核酸の末端に連結される。
【０１４４】
Ｌ−核酸は、本明細書中で使用される場合、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１４５】
Ｄ−核酸は、本明細書中で使用される場合、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１４６】
また、別段の指示がない場合、何れのヌクレオチド配列も、本明細書中で５’→３’方向に示される。
【０１４７】
核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドまたは、例えば無作為である両者の組み合わせまたは少なくとも１つのＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１つのＤ−核酸からなる一続きの定められた配列からなるか否かに関わりなく、核酸分子は、デスオキシリボヌクレオチド（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わせからなり得る。
【０１４８】
核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、これらの混合物、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれぞれおよび何らかのそれらの組み合わせであるか否かにかかわらず、核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、１本鎖核酸および２本鎖核酸も包含し、それにより好ましくは本発明による方法に供される場合の核酸分子は１本鎖核酸である。
【０１４９】
核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、修飾核酸も包含する。修飾核酸は、ヌクレオチド−修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド−修飾ＤＮＡ分子であり得、それにより、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説についてはＵｓｍａｎ  ＆  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２参照）での修飾により安定性を促進するために、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は個々のヌクレオチドにおいて大規模に修飾される。
【０１５０】
核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、完全に閉じた核酸も包含する。核酸に対する、完全に閉じた、すなわち環状構造は、ヌクレオチド配列が本発明により決定されるべきである核酸が、好ましくは共有結合を通じて閉じている場合に認められ、それによって、より好ましくはこのような共有結合は、本明細書中で開示されるように、核酸分子配列の５’末端と３’末端との間で形成される。
【０１５１】
核酸という用語は、好ましく使用される場合、非核酸分子部分を含むあらゆる核酸分子も包含する。このような非核酸分子部分は、次でより詳細に概説するように、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、様々な基を含む群から選択され得る。したがって、核酸という用語は、少なくとも１つの核酸部分および、細胞など、生体系への核酸分子の送達を促進するために使用され得る少なくとも１つのさらなる部分を含む複合物および／または複合体も包含する。提供される複合物および複合体は、細胞膜を横切って治療化合物を移送し、薬物動態を変化させ、および／または本発明の核酸の局在性を調節することによって治療活性を付与し得る。これらの種類の複合物および複合体は、好ましくは、細胞膜を横切る、低分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負電荷ポリマーおよび他のポリマー、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコールまたはポリアミンを含むがこれらに限定されない分子の送達に適切である。一般に、記載される輸送体は、分解性リンカーありまたはなしで、個別にまたは多構成要素系の一部としての何れかで使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、異なる組織由来の多くの細胞タイプへの核酸分子の送達および／または局在を向上させると予想される（米国特許第ＵＳ５，８５４，０３８号参照）。本明細書中に記載の分子の複合物は、生体分解性核酸リンカー分子など、生体分解性であるリンカーを介して生物学的活性分子に結合させ得る。
【０１５２】
配列を決定しようとする核酸に関する次の記述で詳述されるように、非核酸部分は、ＰＥＧ部分、すなわちポリ（エチレングリコール）部分またはＨＥＳ部分、すなわちヒドロキシエチルデンプン部分であり得る。
【０１５３】
直接的にまたはリンカーを通じて、の何れかで、非核酸部分および好ましくはＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を核酸分子に結合させ得る。核酸分子が１以上の修飾、好ましくは１以上のＰＥＧおよび／またはＨＥＳ部分を含むことも本発明の範囲内である。実施形態において、個別のリンカー分子によって、複数のＰＥＧ部分またはＨＥＳ部分が核酸分子に結合される。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自身、直鎖状または分岐状の何れかであり得る。これらの種類のリンカーは、当業者にとって公知であり、特許出願ＷＯ２００５／０７４９９３およびＷＯ２００３／０３５６６５にさらに記載されている。
【０１５４】
好ましい実施形態において、リンカーは生体分解性リンカーである。生体分解性リンカーによって、とりわけ、動物の身体、核酸分子からの修飾物の放出ゆえに、好ましくはヒトの身体における、滞留時間に関して、核酸分子の特徴を改変することが可能となる。生体分解性リンカーの使用によって、核酸分子の滞留時間をより良好に制御できるようになり得る。このような生体分解性リンカーの好ましい実施形態は、国際特許出願ＷＯ２００６／０５２７９０、ＷＯ２００８／０３４１２２、ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８に記載のものなどであるがそれらに限定されない生体分解性リンカーであり、したがって、国際特許出願ＷＯ２００４／０９２１９１およびＷＯ２００５／０９９７６８において、リンカーは、本明細書中で記載のような１または２個の修飾物、核酸分子およびその間の生体分解性リンカーからなる、ポリマー性オリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。
【０１５５】
本明細書中で好ましく使用される場合、「ヌクレオチド」は、天然のＤＮＡヌクレオシド一−、二−および三リン酸：デオキシアデノシン一−、二−および三リン酸；デオキシグアノシン一−、二−および三リン酸；デオキシチミジン一−、二−および三リン酸；およびデオキシシチジン一−、二−および三リン酸を含むがこれらに限定されない。（本明細書中で、それぞれｄＡ、ｄＧ、ｄＴおよびｄＣまたはＡ、Ｇ、ＴおよびＣと呼ぶ。）。ヌクレオチドという用語はまた、天然のＲＮＡヌクレオシド一−、二−および三リン酸：アデノシン一−、二−および三リン酸；グアニン一−、二−および三リン酸；ウリジン一−、二−および三リン酸；シチジン一−、二−および三リン酸（本明細書中でそれぞれＡ、Ｇ、ＵおよびＣと呼ぶ。）も含み；核酸分子、すなわちＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の単量体の単位である塩基−糖−リン酸の組み合わせを指す。しかし、言い換えると、「ヌクレオチド」という用語は、環状フラノシド型糖（ＲＮＡ中のｐ−Ｄ／Ｌ−リボースおよびＤＮＡ中のＰ−Ｄ／Ｌ−２’−デオキシリボース）を含有する何らかの化合物を指し、これは、５’位置でリン酸化されており、−グリコシルＣ１’−Ｎ結合を介してＣ−１’糖位置に連結されるプリンまたはピリミジン型塩基の何れかを有する。ヌクレオチドは、とりわけ修飾塩基（例えば５−メチルシトシン）および修飾糖基（例えば２’−Ｏ−メチルリボシル、２’−Ｏ−メトキシエチルリボシル、２’−フルオロリボシル、２’−アミノリボシルなど）による修飾ヌクレオチドを有するヌクレオチドを含むマス修飾ヌクレオチドを含め、天然または合成であり得る。
【０１５６】
「核酸塩基」という用語は、天然の核酸塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）ならびに非天然の核酸塩基、例えばキサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５〜（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、シュードイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンなど、およびＦｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ（Ｆｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７）の刊行物における米国特許ＵＳ５，４３２，２７２号に記載の「非天然の」核酸塩基を包含する。したがって、「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。
【０１５７】
１本鎖核酸が個別および安定な三次元構造を形成し得、抗体のような標的分子に特異的に結合し得ることは本発明の範囲内である。Ｄ−ヌクレオチドから構成されるこのような核酸分子はアプタマーと呼ばれる。アプタマーは、いくつかの標的分子、例えば低分子、タンパク質、核酸に対して、および細胞、組織および生物に対しても同定され得、特異的な標的分子のインビトロおよび／またはインビボ機能を阻害し得る。アプタマーは通常、インビトロ選択と呼ばれる標的に対する選択過程または指数関数的進化によるリガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ、略称ＳＥＬＥＸ）（Ｂｏｃｋら、１９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９０；Ｔｕｅｒｋ  ＆  Ｇｏｌｄ，１９９０）によって同定される。主に、ヌクレアーゼ分解および腎臓による身体からのクリアランスゆえに、非修飾アプタマーは血量から迅速に排除され、半減期は分単位から時間単位であるが、これはアプタマーが本質的に低分子量であるからである。それゆえに、アプタマーを治療に使用するためには、糖の２’位（例えばリボース）骨格でこれらが修飾されねばならない（Ｂｕｒｍｅｓｔｅｒら、２００６）。
【０１５８】
アプタマーの不安定性の主因である偏在ヌクレアーゼは、キラル基本単位、すなわちＬ−アミノ酸からなる。結果的に、ヌクレアーゼの構造は、本質的にキラルでもあり、その結果、立体特異的な基質認識が起こる。それゆえに、これらの酵素は、適正なキラル立体配置の基質分子のみを受容する。アプタマーおよび天然の核酸分子はＤ−ヌクレオチドから構成されるので、Ｌ−オリゴヌクレオチドは、酵素的認識および続く分解から逃れるはずである。残念ながら、同じ原理ゆえに、この場合では、このような鏡像核酸を増幅するための酵素活性が自然には得られなかった。したがって、ＳＥＬＥＸ過程を使用して、Ｌ−核酸アプタマーを直接得ることができない。とはいえ、立体化学の原理から、所望の機能的Ｌ−核酸アプタマーへと最終的につながる迂回路が明らかとなる。
【０１５９】
インビトロで選択された（Ｄ−）アプタマーがその天然の標的に結合する場合、このアプタマーの構造鏡像は、天然標的の鏡像と同じ特徴により結合する。ここで、両相互作用パートナーは、同じ（非天然）キラリティーを有する。生命体および殆どの生化学的化合物のホモキラリティーゆえに、このようなエナンチオ−ＲＮＡリガンドは、当然ではあるが、実際の使用には制限がある。一方で、（非天然）鏡像標的に対してＳＥＬＥＸ過程が行われる場合、この（非天然）標的を認識するアプタマーが得られる。このアプタマー−所望のＬ−アプタマーの対応する鏡像立体配置は、同様に天然標的を認識する。生体安定性核酸分子の生成のためのこの鏡像選択過程は、最初に１９９６年（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎら、１９９６；Ｎｏｌｔｅら、１９９６）に公開され、これにより、ある標的分子に対する高い親和性および特異性だけでなく、同時に生体安定性も示す、機能性の鏡像核酸分子リガンドが生成される。１本鎖核酸分子が、「シュピーゲルマー」（ドイツ語の「Ｓｐｉｅｇｅｌ」鏡より）と呼ばれるこのようなリガンド−結合Ｌ−核酸であることは本発明の範囲内である（「Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」；ｅｄｓ．Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ，２００６参照）。
【０１６０】
とりわけ、本発明による核酸は、好ましくは本発明による核酸の検出を可能にする修飾を含み得る。このような修飾は、好ましくは放射性、酵素性および蛍光標識を含む群から選択される。このような修飾はまた、それ自身、放射性、酵素性および蛍光標識を含む群から選択される修飾により修飾され得るＤ−ヌクレオチドからも選択される。
【０１６１】
本明細書中で使用される場合の、核酸、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質の様々な配列番号、化学的性質、その実際の配列および内部参照番号を次の表でまとめる。
表１（Ａ）本願において参照される配列
【表１】
0006522496.tif 000002
0006522496.tif 000003
0006522496.tif 000004
0006522496.tif 000005
0006522496.tif 000006
0006522496.tif 000007
0006522496.tif 000008
【０１６２】
上記のものは、それらが本発明と関連して使用された場合、分子の代表であることを理解されたい。添付の配列リストは、単にアミノ酸またはそのヌクレオチド配列を反映するだけのものであり、上記の表で示されるようなその分子のさらなる特性を何ら反映するものではない。
【０１６３】
本発明は、さらなる特性、実施形態および長所が汲み取られ得る、図面、実施例および配列表によりさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｌ−ポリメラーゼＸの活性試験のための１−ギャップＤ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｌ−ポリメラーゼＸの活性試験のための６−ギャップＤ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ−Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬ−ＯＧｐ（１）の分析を示す。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ−Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＲＥＥＫＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（２）の分析を示す。
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ−Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ‐ＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（３）の分析を示す。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ−Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（４）の分析を示す。
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ−Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による、ネイティブ化学ライゲーションＤ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（５）の分析を示す。
【図７】図７は、Ｄ−ポリメラーゼＸの活性試験のための１−ギャップＬ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図８】図８は、１−ギャップ基質におけるＤ−ポリメラーゼＸのＬ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｄ−ポリメラーゼＸの活性試験のための６−ギャップＬ−ＤＮＡ鋳型の組成を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、６−ギャップ基質におけるＤ−ポリメラーゼＸのＬ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ｌ−ポリメラーゼＸの活性アッセイのためのプライマー−鋳型複合Ｄ−ＤＮＡ基質を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、一定温度で行われたＬ−ポリメラーゼＸのＤ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、温度サイクリング用いて行われたＬ−ポリメラーゼＸのＤ−ＤＮＡ伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ−Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ質量分析（Ｂ）による合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの分析を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ、Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１ＳおよびＡ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣのＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、組み換えおよび合成Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４のＤ−ＤＮＡ  ＰＣＲ活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
【図１３】図１３は、質量分析による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（１）の分析を示す。
【図１４】図１４は、質量分析による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｂｏｃ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧ−ＯＨ（２）の分析を示す。
【図１５】図１５は、質量分析による断片縮合Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（３）の分析を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｚ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（４）の分析を示す。
【図１７Ａ−Ｂ】図１７Ａ−Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ｈ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（７）の分析を示す。
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ−Ｂは、ＵＰＬＣ（Ａ）および質量分析（Ｂ）による合成Ｄ−ポリペプチド生成物Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭ−ＯＧｐ（６）の分析を示す。
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａ−Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＥＳＩ質量分析（Ｂ）によるクロストリパインが介在するＤ−ポリペプチドライゲーション生成物Ａｃ‐ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（８）の分析を示す。
【図２０Ａ−Ｂ】図２０Ａ−Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ質量分析（Ｂ）による、全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４断片１５５−３５２（Ｖ２０３Ｃ）のネイティブ化学ライゲーション生成物の分析を示す。
【０１６５】
（実施例）
実施例で使用される場合の略語
ＡＣＮ  アセトニトリル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＤＣＭ  ジクロロメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＥＤＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
Ｆｍｏｃ  ９−フルオレニル−メトキシカルボニル−
ＨＡＴＵ  （２−（７−アザ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）（ＣｒｅｏＳａｌｕｓ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，ＵＳＡ）
ＨＦＩＰ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー（高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれることもある。）
ＭｅＩｍ  メチルイミダゾール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＭｅＯＨメタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＭＳＮＴ  １−（メシチレン−２−スルホニル）−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
ＮＭＰ  Ｎ−メチル−ピロリドン（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＰｙＢＯＰ  （ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧＡＡ，ＤＡＲＭＳＴＡＤＴ，ＧＥＲＭＡＮＹ）
ＳＤＳ  ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＴＢＴＵ  Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
ｔＢｕ  （ｔｅｒｔ．−ブチル−）
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＴＦＥ  １，１，１−トリフルオロエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＴＩＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）
ＵＰＬＣ  超高速液体クロマトグラフィー
【０１６６】
（実施例１）−ポリメラーゼＸの野生型および変異体の組み換え発現および精製
アフリカブタ熱ウイルス（略称ＡＳＦＶ）からのポリメラーゼＸは、１９９７年にＯｌｉｖｅｒｏｓらにより記載され、特徴が調べられた。ポリメラーゼＸの野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む、僅か５２５塩基対のオープンリーディングフレーム（略称ＯＲＦ）を有する（Ｏｌｉｖｅｒｏｓら、１９９７）。コードされるタンパク質の長さは僅か１７４アミノ酸である。この例は、どのようにポリメラーゼＸならびにそれらの変異体がＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、Ｈｉｓ６−Ｔａｇを用いて精製されたかを説明する。
【０１６７】
１．１  発現コンストラクト
ＡＳＦＶのコドン使用はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）と異なるので、ポリメラーゼＸに対するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）−コドン最適化合成遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。本合成遺伝子配列は、ｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（元の会社：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で提供された。開始コドンおよび２つの終止コドンを含むコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列：ＡＴＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＡＧＣＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＡＴＡＴＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＧＴＧＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＣＧＴＡＴＴＡＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＧＣＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＧＴＡＡＡＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＴＴＡＴＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＴＴＴＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＣＣＧＧＴＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＴＡＴＴＣＧＴＧＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＣＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＡＣＧＣＣＴＧＴＡＡＴＡＡを有した。
【０１６８】
全−ＬポリメラーゼＸとも呼ばれるポリメラーゼＸに対する発現コンストラクトを得るために、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによってポリメラーゼＸの遺伝子をｐＣＲ４−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯから切り出し、ｐＲＳＥＴ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でサブクローニングした。付加したＨｉｓ６−ＴａｇをＮ−末端にサブクローニングし、この遺伝子をＴ７プロモーターの調節下に置いた。コンストラクトをｐＭＪ１４と名付け、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−ＬポリメラーゼＸの発現のために使用した。ｐＭＪ１４から発現されたタンパク質ポリメラーゼＸは２１０個のアミノ酸の次の配列：ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＬＹＤＤＤＤＫＤＲＷＧＳＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＶＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬを有した。
【０１６９】
最初の３６個のアミノ酸は、数個のスペーサーアミノ酸およびいくつかの他の配列タグを含むＨｉｓ６−Ｔａｇに相当した（Ｔ７遺伝子１０リーダー、抗発現エピトープ）。最後の１７４個のアミノ酸部分は、ＡＳＦＶで見られるようなポリメラーゼＸタンパク質配列と同一であった。
【０１７０】
製造者のプロトコールに従い、市販のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全−ＬポリメラーゼＸの変異体に対する発現コンストラクトを作製した。プラスミドｐＭＪ１４を鋳型とした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅに必要なオリゴヌクレオチドは、ＮＯＸＸＯＮの施設で合成したか（ＱＣ１０＿ｕｐ、ＱＣ１０＿ｌｏｗ）、またはＰｕｒｉｍｅｘ（Ｇｒｅｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入したか（ＱＣ２６＿ｕｐ、ＱＣ２６＿ｌｏｗ、ＱＣ２７＿ｕｐ、ＱＣ２７＿ｌｏｗ、ＱＣ３１＿ｕｐ、ＱＣ３１＿ｌｏｗ）の何れかであった。次の変異体発現コンストラクトを作製し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−Ｌポリメラーゼの変異体の発現のために使用した。
【表２】
0006522496.tif 000009
【０１７１】
１．２  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現
発現コンストラクトｐＭＪ１４を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で全−Ｌ−ポリメラーゼＸを発現させた。ｐＭＪ１３０、ｐＭＪ３５６、ｐＭＪ３５７またはｐＭＪ４１２から全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体を発現させた。発現のために、コンピーテントＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の「ＢＬ−２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ’」（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＶＷＲ、Ｄｒｅｓｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。６００ｎｍでの光学密度がおよそ０．６に到達するまで、２ＹＴ培地中で培養物を３７℃で増殖させた。次いで、０．４ｍＭの最終濃度まで、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（略称ＩＰＴＧ）を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。３０℃で発現を４時間行った。遠心によって細胞を回収し、−８０℃で保存するか、またはすぐに処理した。
【０１７２】
１．３  タンパク質精製
「溶解および結合（ｌｙｓｅ  ａｎｄ  ｂｉｎｄ）緩衝液」（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール）中、新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｃｈｗａｂｉｓｃｈ  Ｇｍｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞破壊装置を用いて溶解させた。「Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ」材料（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて４℃で精製を行った。溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール）を用いて、段階溶出を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて「Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ」材料（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて「ＡＫＴＡ  ｐｕｒｉｆｉｅｒ」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。ＭＡＬＤＩ質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、再緩衝化した。２５ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０％グリセロールからなる緩衝液中で精製タンパク質を−２０℃で保存した。ウシ血清アルブミン（略称ＢＳＡ）標準物質を用いてＢＣＡ−タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってタンパク質濃度を評価した。
【０１７３】
実施例２−ポリメラーゼＸおよびポリメラーゼＸの変異体の活性確認
オリゴヌクレオチドにより形成される様々なタイプの基質複合体を用いて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体（実施例１参照）に対する活性アッセイを行ったが、この基質およびオリゴヌクレオチドはＤ−ＤＮＡ−ヌクレオチドからなる。
【０１７４】
２．１  １−ヌクレオチドギャップを有する基質における活性アッセイ
１−ギャップ基質に対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表３】
0006522496.tif 000010
【０１７５】
３３個のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴヌクレオチドの鋳型鎖（下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）とも呼ばれる。）をそれぞれ１５および１７個のヌクレオチドからなる２つの異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それぞれその５’−末端および３’末端で鋳型鎖とハイブリッド形成させ、その結果、上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）において１つのヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質複合体を作製した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴの何れかを含有した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、１５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＳＰ−１をその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。
【０１７６】
活性アッセイにおいて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体をＤ−立体配置１−ギャップ基質複合体と合わせた（図１Ａ参照）。陰性対照として、各基質を全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体およびＤ−デスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）なしでも温置した。１−ギャップ複合体内の鋳型塩基によって、アッセイ中に対応するＤ−ｄＮＴＰのみを添加した。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．７ｎｇ／μＬ Ｌ−全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたはそれらの変異体、８μＭの１つのＤ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒｏｖａｌａｂ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。温置時間は、３７℃で３０分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。このゲルをＫｏｄａｋ  Ｋスクリーンに−８０℃で一晩曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０１７７】
全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび変異体Ｉ１２４Ｇ、Ｖ８０ＡおよびＶ８０Ｇは、これらの条件下で活性があり、２本の上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド間の１つのヌクレオチドギャップが充填された。
【０１７８】
２．２  ６−ヌクレオチドギャップを有する基質における活性アッセイ
６−ギャップ基質に対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表４】
0006522496.tif 000011
【０１７９】
３３個のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴヌクレオチドの鋳型鎖（下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）と呼ばれる。）をそれぞれ１５および１２個のヌクレオチドからなる２つの異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それぞれその５’−末端および３’末端で鋳型鎖とハイブリッド形成させ、その結果、上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）の６個のヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質複合体を作製した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、１５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＳＰ−１をその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。
【０１８０】
活性アッセイにおいて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体をＤ−立体配置６−ギャップ基質複合体と合わせた（図１Ｂ）。陰性対照として、基質を全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたはそれらの変異体およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸塩（D-ｄＮＴＰ’ｓ）なしでも温置した。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたはそれらの変異体、８μＭの各Ｄ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒｏｖａｌａｂ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。典型的な温置時間は、３７℃で３０分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。このゲルをＫｏｄａｋ  Ｋスクリーンに−８０℃で一晩曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０１８１】
全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび変異体（Ｃ８６Ｓを除く。）はこれらの条件下で活性があり、２本の上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチド間の６ヌクレオチドギャップが充填された。
【０１８２】
実施例３−Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼＰｏｌＸの変異体の合成
【０１８３】
本実施例内で、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａの合成を記載する。全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨであった。
【０１８４】
固相ペプチド合成Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ−ストラテジーの必須要件に従い（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８１）使用する全アミノ酸を保護する。使用される全アミノ酸がＤ−アミノ酸である（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０１８５】
３．１  ＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２の合成
Ｓｅｋｉｚａｋｉら（Ｓｅｋｉｚａｋｉら、１９９６）と同様に、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−保護４−グアニジノフェノールを合成した。これに従い、４０ｍｍｏｌｅ  Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオウレア（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）および６０ｍｍｏｌｅ  ４−アミノフェノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）を５００ｍＬ丸底フラスコ中、２５０ｍＬ  ＴＨＦ中で溶解させた。この後、溶液にアルゴンを１０分間吹き付け、ＣａＣｌ２チューブで密封しながら１２０時間撹拌し続けた。
【０１８６】
溶媒を蒸発させた後、氷冷メタノールを用いて残渣を沈殿させた。Ｐ４Ｏ１０上で沈殿物を真空下で乾燥させた。最後に、ＤＣＭとともにフラッシュクロマトグラフィーを用いて生成物を精製した。生成物含有分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させた。ＴＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、質量分析およびＮＭＲを分析のために使用した。実験により決定された質量は、３５１Ｄａの計算質量に対応する。
【０１８７】
３．２  Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の合成
１ｍｍｏｌｅ  Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、０．９ｅｑ．ＴＢＴＵおよび０．９ｅｑ．ＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＤＭＦ中で溶解させた。２ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ＤＣＭを用いて粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
【０１８８】
Ｚ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＭｅＯＨ中で溶解させ、アルゴンを吹き付けた。２時間で、Ｐｄ／Ｃ触媒およびＨ２の添加によって、Ｎ末端Ｚ−基の加水分解性切断を達成した。Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２をろ別した後、ＭｅＯＨを減圧下で蒸発させた。逆相ＨＰＬＣおよび質量分析を用いて分析を行った。生成物に対する４６５Ｄａの正確な質量が見いだされ、計算質量と対応した。
【０１８９】
３．３  全−Ｄ−ペプチドＡｃＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬ−ＯＧｐ（１）の合成
Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）により記載のように、０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌレジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）をＦｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とともに載せた。したがって、０．１０ｍｍｏｌレジンを０．６ｍｍｏｌｅ塩化チオニルとともに、３０分間、２回温置し、その後ＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬ  ＤＣＭ中で、０．６ｍｍｏｌｅ  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥとともに９０分間レジンを温置した。その後、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールとともにＡＢＩ４３３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）を用いて、自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）を用いてＦｍｏｃ−脱保護化を７分間、３回行った。
【０１９０】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０１９１】
６ｍＬ  ＮＭＰ中で、０．０１ｍｍｏｌｅ完全保護化ペプチド、４ｅｑ．ＰｙＢＯＰおよび５ｅｑ．Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を溶解させた。１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元気化（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）させ、氷冷ジエチルエーテルによって残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドエステルを乾燥させ、その後、２時間にわたり、ＴＦＡ中、２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて保護基を切り離した。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０１９２】
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ（図２Ａ）および質量分析（図２Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。４６５４，７Ｄａの生成物に対する測定質量は、４６５２，７Ｄａの理論質量と一致した。
【０１９３】
３．４  全−Ｄ−ペプチドＨ−ＲＲＥＥＫＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（２）の合成
６ｍＬ  ＮＭＰ中で４５分間にわたり、５ｅｑ．アミノ酸、ｅｑ．４．９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＮＨ２レジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）に充填した。その後に、レジンをＴＨＦで洗浄した。８０℃で２時間、ＴＨＦ中の４ｅｑ．Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬と温置することによって、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ψ［ＣＳ−ＮＨ］−Ｒ−ＴｅｎｔａＧｅｌへの変換を達成した。この後、レジンをＮＭＰで洗浄した。その後、既に記載のとおり（実施例１．３参照）、そのように調製したレジンを自動化ペプチド合成において使用した。この後、Ｓｈａｒｍａら（Ｓｈａｒｍａら、２０１１）に従い、ＤＭＦ中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステルを含有する溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて２時間にわたり、側鎖保護基の切断を行った。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でペプチドチオエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０１９４】
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ（図３Ａ）および質量分析（図３Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。生成物に対して実験により決定された質量（４６８３，８Ｄａ）は、４６８１，７Ｄａの理論値と一致する。
【０１９５】
３．５  全−Ｄ−ペプチドＨ−ＣＧＥＲＫＣＶＬＦＩＥＷＥＫＫＴＹＱＬＤＬＦＴＡＬＡＥＥＫＰＹＡＩＦＨＦＴＧＰＶＳＹＬＩＲＩＲＡＡＬＫＫＫＮＹＫＬＮＱＹＧＬＦＫＮＱＴＬＶＰＬＫＩＴＴＥＫＥＬＩＫＥＬＧＦＴＹＲＩＰＫＫＲＬ−ＯＨ（３）の合成
ＤＣＭ中６ｅｑ．アミノ酸、６ｅｑ．ＭＳＮＴおよび４．５ｅｑ  ＭｅＩｍを用いて、０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＰＨＢレジン（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ）にＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨを充填した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールとともにＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて７分間にわたりＦｍｏｃ−脱保護化を３回行った。４２アミノ酸後、二重カップリング段階を行った。ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて２時間にわたり、Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護化ペプチドの切断を達成した。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。Ｃ１８カラム上でＡＣＮ／水勾配を用いて、粗製Ｎ末端保護化ペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。その後、Ｆｍｏｃ−保護化ペプチドを溶解させ、Ｎ末端Ｆｍｏｃ−基を切り離すために、ＤＭＦ中２０％ピペリン中で撹拌した。２０分後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。その後に、ＡＣＮ／水勾配とともにＣ１８カラムにより逆相ＨＰＬＣを用いて、沈殿粗製ペプチドを精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０１９６】
ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ（図４Ａ）および質量分析（図４Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。生成物の決定質量（１１１８４，３Ｄａ）は、１１１７８，２Ｄａの理論質量と一致する。
【０１９７】
３．６  ペプチド２とのペプチド１のプロテアーゼ触媒ライゲーションによる、全−Ｄ−ペプチドＡｃ−ＭＬＴＬＩＱＧＫＫＩＶＮＨＬＲＳＲＬＡＦＥＹＮＧＱＬＩＫＩＬＳＫＮＩＶＡＶＧＳＬＲＲＥＥＫＭＬＮＤＶＤＬＬＩＩＶＰＥＫＫＬＬＫＨＶＬＰＮＩＲＩＫＧＬＳＦＳＶＫＡ−ＳＭｅ（４）の合成
２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ入り）中で、ペプチド１を０．２ｍＭに、ペプチド２を０．６ｍＭに溶解させた。２０μＭクロストリパイン（Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａｒｇ−Ｃ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）の添加後、反応混合物を３７℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、Ｈ２0／ＡＣＮ／ギ酸  ６０／４０／０．５中で溶解させ、３０分内の３０％から６０％の水中ＡＣＮの勾配でＲＰ−１８−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０１９８】
逆相ＵＰＬＣ（図５Ａ）およびＥＳＩ−質量分析（図５Ｂ）によって最終ペプチドを分析した。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝９１９９．３Ｄａ）は、実測分子量（Ｍｏｂｓ＝９１９９．４Ｄａ）と一致する。
【０１９９】
３．７  ペプチド３とのペプチド４のネイティブ化学ライゲーションによる全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａの合成
【０２００】
６ＭグアニジンＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２００ｍＭメルカプトフェニル−酢酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および５ｍｍ  Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＴＲＩＳ−緩衝液（ｐＨ８．６）中でペプチド３および４の両方を０．２Ｍ溶解させた。反応混合物を室温で７２時間振盪した。その後、３０分内で３０％から６０％の水中ＡＣＮの勾配でＲＰ−８−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、逆相ＨＰＬＣによって混合物を精製した。ライゲーション生成物を含有した分画をプールし、乾燥させた。乾燥粉末を水中で溶解させ、溶出液としてのリン酸ナトリウム緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｎｅｌｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（５０ｍＭ、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ）とともにＳＥＣ３０００−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２０１】
最終生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ａ）およびＥＳＩ−質量分析（図６Ｂ）により分析した。レーン７で１４．４ｋＤａと２１．５ｋＤａとの間で明確なバンドが見られ、このことから、純粋な全長ポリメラーゼが示唆された。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２０３４２Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示されるような実測分子量（Ｍｏｂｓ＝２０３６１Ｄａ）と一致する。
【０２０２】
実施例４−Ｄ−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼＸ変異体の活性確認
６Ｍグアニジウム塩酸塩中で実施例３による乾燥全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａを溶解させ、３，５００分子量カットオフの市販の透析装置（Ｐｉｅｒｃｅ／ＰｅｒＢｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中での段階的な透析によって４℃で再折り畳みを行った。最終緩衝液は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５であった。プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用いてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、続いてＳＹＰＲＯ−ＲＥＤ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｏＲａｄ  Ｆｘスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによってタンパク質濃度を推定した。
【０２０３】
２種類の異なる基質タイプを用いて、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａに対する活性アッセイを行った。
【０２０４】
４．１  １−ヌクレオチドギャップがある基質における活性アッセイ
３３マー下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを２本の１７マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果、上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）で１ヌクレオチドギャップを生じさせることによって、基質を作製した。Ｌ−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的キナーゼ反応によって、３２Ｐにより１７マーの上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤをその５’−末端で放射性標識した。Ｌ−オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に、２つのＤ−立体配置グアノシン塩基を５’末端に付加した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でＡ、Ｃ、ＧまたはＴの何れかを含有した。基質複合体の仕組みについては、図７参照。
【０２０５】
活性アッセイにおいて、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡをＬ−立体配置１−ギャップ基質複合体と合わせた。陰性対照として、各基質を全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡおよびＬ−デスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（ｄＮＴＰ’ｓ）なしでも温置した。１−ギャップ複合体内の鋳型塩基に依存して、アッセイ中に対応するＬ−ｄＮＴＰのみが付加された。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．７ｎｇ／μＬ全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａ、８μＭの１つのＬ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｌ−ｄＮＴＰをＲａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるカスタム合成として購入した。温置時間は３７℃で３０分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。ゲルを−８０℃で一晩Ｋｏｄａｋ  Ｋスクリーンに曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０２０６】
図８から見られ得るように、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａにより、Ｌ−ＤＮＡ１−ギャップ基質上で伸長生成物がもたらされ、したがって、合成タンパク質の活性を確認した。特筆すべきことに、Ｌ−基質およびＬ−ｄＮＴＰと組み合わせた全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａのみが何らかの伸長生成物をもたらした。また、それらの鋳型塩基に対応するＬ−ｄＮＴＰを含有する試料のみが伸長生成物をもたらした。これは、Ａ−複合体上でのｄＴＴＰヌクレオチド、Ｃ−複合体でのｄＧＴＰヌクレオチド、Ｇ−複合体でのｄＣＴＰヌクレオチドおよびＴ−複合体でのｄＡＴＰヌクレオチドが何らかの伸長生成物を与えるために存在しなければならなかったことを意味する。
【０２０７】
４．２  ６−ヌクレオチドギャップがある基質における活性アッセイ
３３マー下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドを２つの１７マーおよび１２−マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）において６ヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質を作製した。Ｌ−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、１７マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤ（Ｌ−立体配置）をその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識した。Ｌ−オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿５８＿ＭＤのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に２つのＤ−立体配置グアノシン塩基を５’末端に付加した。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中で、アニーリングを行った。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上での精製によって、組み込まれなかったｇａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去した。基質複合体の仕組みについては、図９Ａを参照。
【０２０８】
活性アッセイにおいて、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡをＬ−立体配置６−ギャップ基質複合体と合わせた。陰性対照として、基質を全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａおよびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（Ｌ−ｄＮＴＰ）なしでも温置した。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａ、８μＭの各Ｌ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるカスタム合成としてＬ−ｄＮＴＰを購入した。典型的な温置時間は３７℃で３０分間であったが、そのバッチの活性に依存して、より長時間、温置を行った。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、４時間分離した。ゲルを−８０℃で一晩、Ｋｏｄａｋ  Ｋスクリーンに曝露し、ＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０２０９】
図９Ｂから見られ得るように、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａにより、Ｌ−ＤＮＡ６−ギャップ基質上でＮ＋６伸長生成物がもたらされ、したがって、合成タンパク質の活性を確認した。しかし、Ｎ＋６伸長生成物の合成は、同じ６−ギャップ複合体上でのＮ＋１伸長生成物よりも明確ではなかった。また、６−ギャップを充填するために温置時間の延長が必要であった。特筆すべきことに、何らかの伸長生成物を与えたのは、Ｌ−基質＋Ｌ−ｄＮＴＰと合わせた全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａのみであった。
【０２１０】
実施例５−ポリメラーゼＸおよびポリメラーゼＸの変異体によるＤＮＡ合成
アフリカブタ熱ウイルス（略称ＡＳＦＶ）からのポリメラーゼＸは、ギャップ修復機能がある非常に離散性の高い酵素として文献（Ｏｌｉｖｅｒｏｓ，１９９７）に記載されている。実施例２で示されるように、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体は、ギャップのある基質上でのそれぞれの開始後、非常に僅かなヌクレオチドのみの組み込みを触媒することが示された。ここで、発明者らは、全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよび変異体を用いてより長いＤＮＡを合成することを可能にする方法を開示し、８３マー鎖の完全な重合化を示す。
【０２１１】
５．１  プライマー−鋳型基質
全−Ｌ−ポリメラーゼＸおよびそれらの変異体の活性を試験するために、プライマー−鋳型複合体を使用した。全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧおよびＶ８０Ａを試験するためにも同じ複合体を使用した。
【０２１２】
ｇａｐのないプライマー−鋳型複合体に対するＤ−オリゴヌクレオチドのリスト：
【表５】
0006522496.tif 000012
【０２１３】
１９個のヌクレオチドからなるＤＮＡオリゴヌクレオチドと８３個のヌクレオチドからなる鋳型鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＪ＿１＿１＿ＤＤ）をアニーリングさせることによって、基質を作製した。ＮＯＸＸＯＮでオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿３３＿ＤＤは、蛍光色素Ａｔｔｏ−５３２（ＡｔｔｏＴｅｃ，Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を有する。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行った。プライマー−鋳型複合体を図１０Ａで示す。
【０２１４】
５．２  一定温度での反応
活性アッセイにおいて、全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧまたはＶ８０ＡをＤ−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせた。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧもしくはＶ８０Ａ、８μＭの各Ｄ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有した。Ｒｏｖａｌａｂ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。Ｐｏｌ−Ｘ試料に対して、温置時間は３７℃で３０分間であった。陰性対照として、基質を全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは全−Ｌ−ポリメラーゼＸの変異体Ｖ８０ＧもしくはＶ８０Ａなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（Ｄ−ｄＮＴＰ）なしでも温置した。製造者により供給されたＴａｑ緩衝液中０．０８３Ｕ／μＬの最終濃度でＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて陽性対照を遂行した。Ｔａｑ試料を６０℃で３０分間温置した。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性ゲル上で分離した。ゲルをＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。
【０２１５】
全−Ｌ−ポリメラーゼＸまたは変異体Ｖ８０ＧまたはＶ８０Ａ全−Ｌ−ポリメラーゼＸは、活性があったが、全長８３マー鋳型の重合化を完遂することはできなかった。Ｔａｑポリメラーゼ陽性対照は、８３マー鋳型の完全な重合化を示し、図１０Ｂを参照のこと。
【０２１６】
５．３  温度サイクリング条件下での反応
開始後の全−Ｌ−ポリメラーゼＸが僅か１個のヌクレオチドの組み込みを触媒し、次いでＤＮＡ基質上に留まりながら停止するという仮定のもと、発明者らは、全−Ｌ−ポリメラーゼＸが鋳型から解離し、鋳型に再会合できるように、加熱パルス（５０℃、２分間）を繰り返し行った。この温度サイクリング手順を繰り返して、発明者らは、全−Ｌ−ポリメラーゼＸを用いて、８３マーの完全な重合化を行うことができた。全−Ｌ−ポリメラーゼＸ試料に対する温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上に記載のように反応および対照を設定した：
５から２５サイクルの（２０℃で３０分間／／５０℃で２分間）
次いで２０℃で３０分間の最終段階。
【０２１７】
１５サイクルを超えてから、全−Ｌ−ポリメラーゼＸは、陽性対照と同様に、全長８３マー鋳型鎖を重合化することができたことが観察されたが、図１０Ｃを参照のこと。
【０２１８】
実施例６−Ｄ−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼＸ変異体を用いたプライマー伸長
この実施例で開示される方法は、全−Ｄ立体配置ポリメラーゼを試験するためにＬ−立体配置基質を使用する。
【０２１９】
６．１  プライマー−鋳型基質
ギャップのないプライマー−鋳型複合体に対するＬ−オリゴヌクレオチドのリスト：
【表６】
0006522496.tif 000013
【０２２０】
１９マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドと８３マー下鎖（ｌｏｗｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）ＤＮＡオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって基質を作製する。Ｌ−立体配置で、社内施設のＮＯＸＸＯＮでオリゴヌクレオチドを合成する。アニーリング前に、Ｇａｍｍａ−３２Ｐ−アデノシン−三リン酸（ＡＴＰ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、２１マー上鎖（ｕｐｐｅｒ  ｓｔｒａｎｄ）オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿１０９＿ＭＤをその５’−末端で３２Ｐにより放射性標識する。Ｌ−オリゴヌクレオチドＭＪ＿１＿１０９＿ＭＤのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中、２個のＤ−立体配置グアノシン塩基を５’末端に付加する。６５℃で１０分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０中でアニーリングを行う。ＮＡＰ−カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）での精製によって、組み込まれないＧａｍｍａ−３２Ｐ−ＡＴＰを除去する。
【０２２１】
６．２  一定温度での反応
活性アッセイにおいて、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０ＡをＬ−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせる。典型的な６μＬアッセイは、５０ｎＭ基質複合体、１．３ｎｇ／μＬ以下の全−ＤポリメラーゼＸ変異体、８μＭの各Ｌ−ｄＮＴＰおよび緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）を含有する。Ｌ−ｄＮＴＰをＲａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。温置時間は３７℃で少なくとも３０分間である。陰性対照として、基質をまた、ポリメラーゼなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸（Ｌ−ｄＮＴＰ）なしでも温置する。アッセイ体積全体を試料緩衝液／色素と混合し、変性ゲル上で分離する。ゲルはＢｉｏＲａｄ  Ｆｘホスホイメージャーシステムを用いて読み取る。
【０２２２】
全−ＬポリメラーゼＸの場合と同じように、合成全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａは、この状態下で活性があるが、全８３個のヌクレオチド鋳型鎖を重合化できない。
【０２２３】
６．３  温度サイクリング条件下での反応
実施例５と同様に、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａによる８３マーＬ−基質の全長全重合化を可能にするために温度サイクリング手順を繰り返す。温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上で記載されるように反応および対照を設定する：
５から２５サイクルの（２０℃で３０分間／／５０℃で２分間）
次いで２０℃で３０分間の最終段階。
【０２２４】
温度サイクル伸長を用いる場合、全−ＬポリメラーゼＸの場合と同じように、全−ＤポリメラーゼＸ変異体Ｖ８０Ａが全８３マー鋳型鎖を重合化できることが観察される。
【０２２５】
実施例７−ポリメラーゼＤｐｏ４および全てＬ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の組み換え発現および精製
ポリメラーゼＤｐｏ４は元来、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）（略称Ｓｓｏ）（Ｂｏｕｄｓｏｃｑ，２００１）で発見された。この野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む１，０５９塩基対のオープンリーディングフレーム（略称ＯＲＦ）を有する。コードされるタンパク質の長さは、３５２アミノ酸である。この例は、ポリメラーゼＤｐｏ４およびポリメラーゼＤｐｏ４の変異体がどのようにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されて、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇを用いて精製されたかを説明する。
【０２２６】
７．１  発現コンストラクト
Ｓｓｏのコドン使用はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）とは異なるので、野生型ＳｓｏポリメラーゼＤｐｏ４に対するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）−コドン最適化合成遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。合成遺伝子配列は、ｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ１０ベクター（元の会社：ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において提供された。開始コドンを含むが終止コドンを含まないコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列を有した：ＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＴＧＡＡＴＣＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＧＴＡＡＡＣＣＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＣＧＧＴＣＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＣＧＧＴＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣＣＣＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＧＣＣＧＧＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＣＧＡＡＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＣＴＧＣＣＧＡＴＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＧＡＡＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＡＧＣＧＡＴＡＡＡＧＴＧＣＧＣＧＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＡＧＣＡＴＡＴＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＴＴＧＧＣＡＡＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＴＴＡＡＴＡＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＧＧＣＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＴＡＴＣＴＧＡＴＴＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＡＴＧＡＡＣＣＧＡＴＴＣＧＴＡＣＣＣＧＴＧＴＴＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＡＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＧＴＡＣＣＴＧＴＴＴＣＧＴＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＡＧＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＴＴＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＣＴＡＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＡＡＣＧＴＡＡＡＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＴＧＴＧＣＧＣＴＴＴＡＧＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＣＣ。
【０２２７】
全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４とも呼ばれるポリメラーゼＤｐｏ４に対する発現コンストラクトを得るために、市販のＳｔａｒＧａｔｅクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を用いて、ｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ１０からｐＡＳＧ−ＩＢＡ５ベクター（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に遺伝子をサブクローニングした。サブクローニングによって、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩがＮ−末端に付加され、終止コドンがＣ−末端に付加され、遺伝子がｔｅｔプロモーターの制御下となった。本コンストラクトをｐＭＪ３４３と名付け、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の発現のために使用した。ｐＭＪ３４３から発現された全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４は、３６８個のアミノ酸の次の配列を有した：ＭＡＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＳＧＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＡＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴＧＳ。
【０２２８】
最初の１４個のアミノ酸は、数個のスペーサーアミノ酸を含むＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ  ＩＩに相当し、最後の２個のアミノ酸はスペーサーアミノ酸に相当し、中間部の３５２個のアミノ酸部分は、Ｓｓｏで見られるポリメラーゼＤｐｏ４配列と同一であった。
【０２２９】
製造者のプロトコールにしたがって、市販のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｍｂＨ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体に対する発現コンストラクトを作製した。プラスミドｐＭＪ３４３を鋳型とした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅに必要なオリゴヌクレオチドは、ＮＯＸＸＯＮで合成したか（ＱＣ＿３８＿ｕｐ、ＱＣ＿３８＿ｌｏｗ、ＱＣ＿３９＿ｕｐ、ＱＣ＿３９＿ｌｏｗ、ＱＣ＿４０＿ｕｐ、ＱＣ＿４０＿ｌｏｗ）またはＰｕｒｉｍｅｘから購入した（Ｇｒｅｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＱＣ＿２８＿ｕｐ、ＱＣ＿２８＿ｌｏｗ、ＱＣ＿２９＿ｕｐ、ＱＣ＿２９＿ｌｏｗ、ＱＣ＿３０＿ｕｐ、ＱＣ＿３０＿ｌｏｗ）。
【０２３０】
次の変異体発現コンストラクトを作製し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の発現のために使用した。
【表７】
0006522496.tif 000014
【０２３１】
７．２  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのタンパク質発現
発現コンストラクトｐＭＪ３４３を用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を発現させた。ｐＭＪ３６１、ｐＭＪ３６２、ｐＭＪ３６３、ｐＭＪ３６５、ｐＭＪ５０２、ｐＭＪ５０３またはｐＭＪ５０４から、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の突然変異の変異体を発現させた。発現のために、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｂｉｏｚｙｍ，Ｈｅｓｓｉｓｃｈ  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株「ＮＥＢ  ｅｘｐｒｅｓｓ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、培地「ＥｎＢａｓｅ  Ｆｌｏ」または「ＥｎＰｒｅｓｓｏ」（ＢｉｏＳｉｌｔａ，Ｏｕｌｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）中で３０℃にて４８時間、発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−８０℃で保存するかまたはすぐに処理した。
【０２３２】
７．３  タンパク質精製
「緩衝液Ｗ」（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｃｈｗａｂｉｓｃｈ  Ｇｍｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞破壊装置を用いて溶解させた。５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム上で４℃で精製を行った。２．５ｍＭデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む緩衝液Ｗを用いて段階溶出を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて、「Ｑ  ＨＰ」カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた「ＡＫＴＡ精製装置」システム上で陰イオン−イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、１０，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）のＶｉｖａＳｐｉｎ  １５Ｒ濃縮装置（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて再緩衝化した。１００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０％グリセロールからなる緩衝液中で、精製タンパク質を−２０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシ血清アルブミン（略称ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、ゲル密度測定によって、タンパク質濃度を推定した。
【０２３３】
実施例８−２つの断片からなる合成ポリメラーゼＤｐｏ４の産生
全−ＬポリメラーゼＤｐｏ４の長さは３５２アミノ酸である。全−ＬポリメラーゼＤｐｏ４を化学的に作製するために、固相ペプチド合成により合成され得るより短い断片から、このような合成全−ＬポリメラーゼＤｐｏ４を組み立てなければならず、このより短い断片は、ネイティブ化学ライゲーションなどのペプチドライゲーション法によってライゲーションしなければならなかった。この例は、合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を得るためにネイティブ化学ライゲーションによって、Ｄｐｏ４のライゲーション断片１−１５４、１５５−３５２、１５５−２０２および２０３−３５２が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でどのように発現され、精製され、互いに対してライゲーションされているかを説明する。
【０２３４】
８．１  発現コンストラクト
実施例７で開示されるように、市販ソースから合成遺伝子コンストラクトとして全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４に対する遺伝子を得た（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。そのコドン最適化配列に基づいてこの実施例の全ての断片をクローニングした。全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４、１５５−３５２、１５５−２０２および２０３−３５２に対する次の発現コンストラクトを作製した：
【表８】
0006522496.tif 000015
【０２３５】
８．１．１  全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４−チオエステル−発現コンストラクトｐＭＪ３７０
このコンストラクトは、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４、続いてＭｘｅ  ＧｙｒＡインテインを含有し、チオエステルおよびキチン−結合ドメイン（ＣＢＤ）を生成させるためにこれを使用した。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３４３およびプライマーＭＪ＿１＿９０＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴ−３’）およびＭＪ＿１＿９１＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＣＡＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＴＴＴ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物１を作製した。Ｍｘｅ  Ｇｙｒ  ＡインテインおよびＣＢＤを増幅するために鋳型としてのｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびプライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴ−３’）およびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴＴ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿９０＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿９１＿ＤＤは、Ｐｕｒｉｍｅｘ（Ｇｒｅｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来であり、一方でプライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤは、ＩＢＡ  ＧｍｂＨ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来であった。フラッシュゲル系（ＬＯＮＺＡ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０において一緒にクローニングし、その結果、ｐＭＪ３６６が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡｗｔ１（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）におけるｐＭＪ３６６からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３７０が得られた。コンストラクトｐＭＪ３７０は、（インテイン切断／チオエステル産生後）１５４アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４−チオエステルをコードする：ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−チオエステル。
【０２３６】
８．１．２  全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１５５−３５２−発現コンストラクトｐＭＪ３８４
このコンストラクトは、「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグと、それに続く全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１５５−３５２を含有する。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを増幅するために鋳型としてのｐＰＡＬ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびプライマーＭＪ＿１＿９９＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡ−３’）およびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物１を作製した。Ａ１５５Ｃ突然変異を含有するｄｐｏ４断片１５５−３５２を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３６１およびプライマーＭＪ＿１＿９６＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡ−３’）およびＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧ−３’）を用いて、ＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿９６＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９９＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤは全て、Ｐｕｒｉｍｅｘ（Ｇｒｅｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来であった。フラッシュゲルシステム（ＬＯＮＺＡ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０と一緒にクローニングし、ｐＭＪ３８２が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡ５（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中のｐＭＪ３８２からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３８４が得られた。コンストラクトｐＭＪ３８４は、（タンパク質分解性切断後）１９８アミノ酸長の次のタンパク質配列とともに突然変異Ａ１５５Ｃを含有する全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の断片１５５−３５２をコードする：ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ。
【０２３７】
８．１．３  全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片２０３−３５２−発現コンストラクトｐＭＪ３８５
このコンストラクトは、「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグとそれに続く、突然変異Ｖ２０３Ｃを含有するｄｐｏ４断片２０３−３５２を含有する。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを精製およびタンパク質分解性切断のために使用した。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグを増幅するために鋳型としてのｐＰＡＬ７（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびプライマーＭＪ＿１＿９９＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧＧＧＡＡ−３’）およびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＣＴＴＧＴＣ−３’）を用いてＰＣＲ生成物１を作製した。Ｖ２０３Ｃ突然変異を含有するｄｐｏ４断片２０３−３５２を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３６２およびプライマーＭＪ＿１＿９８＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＴＧＡＡＴＴＴ−３’）およびＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧ−３’）を用いてＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿９７＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９８＿ＤＤ、ＭＪ＿１＿９９＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿１００＿ＤＤは全てＰｕｒｉｍｅｘ（Ｇｒｅｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来であった。フラッシュゲルシステム（ＬＯＮＺＡ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０中で一緒にクローニングし、その結果、ｐＭＪ３８３が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡ５（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中のｐＭＪ３８３からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３８５が得られた。コンストラクトｐＭＪ３８５は、（タンパク質分解性切断後）１５０アミノ酸長の次のタンパク質配列とともにｄｐｏ４断片２０３−３５２  Ｖ２０３Ｃをコードする：ＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ。
【０２３８】
８．１．４．全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の断片１５５−２０２−発現コンストラクトｐＭＪ３８８
このコンストラクトは、ｄｐｏ４断片１５５−２０２とそれに続く、チオエステルを生成させるために使用したＭｘｅ  ＧｙｒＡインテインおよびキチン−結合ドメイン（ＣＢＤ）を含有する。２つのＰＣＲ生成物からコンストラクトを組み立てた。ｄｐｏ４  １５５−２０２断片を増幅するために鋳型としてのｐＭＪ３４３およびプライマーＭＪ＿１＿１０１＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＡＴＧＧＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴ−３’）およびＭＪ＿１＿１０２＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＣＣＣＡＧＴＴＴ−３’）を用いてＰＣＲ生成物１を構築した。Ｍｘｅ  Ｇｙｒ  ＡインテインおよびＣＢＤを増幅させるために鋳型としてのｐＴＷＩＮ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびプライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧＡＴ−３’）およびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤ（５’−リン酸−ＡＧＣＧＧＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＧＴＴ−３’）を用いてＰＣＲ生成物２を作製した。プライマーＭＪ＿１＿１０１＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿１０２＿ＤＤは、Ｐｕｒｉｍｅｘ（Ｇｒｅｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来であり、一方、プライマーＭＪ＿１＿７２＿ＤＤおよびＭＪ＿１＿７３＿ＤＤはＩＢＡ  ＧｍｂＨ（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来であった。フラッシュゲルシステム（ＬＯＮＺＡ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）上で２つのＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ＥＮＴＲＹクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＥＮＴＲＹ−ＩＢＡ２０中で一緒にクローニングし、その結果、ｐＭＪ３８６が得られた。ＳｔａｒＧａｔｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒクローニングキット（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたｐＡＳＧ−ＩＢＡｗｔ１（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中でのｐＭＪ３８６からのサブクローニングによって、ｐＭＪ３８８が得られた。コンストラクトｐＭＪ３８８は、ｄｐｏ４断片１５５−２０２とそれに続く（最初のメチオニンのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）介在切断後およびインテイン切断／チオエステル産生後）４８アミノ酸長のタンパク質配列をコードする：ＡＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−チオエステル。
【０２３９】
８．２  Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質発現
発現のために、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ／Ｂｉｏｚｙｍ，Ｈｅｓｓｉｓｃｈ  Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株「ＮＥＢ  ＥＸＰＲＥＳＳ」（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。誘導因子として２００ｎｇ／ｍＬアンヒドロテトラサイクリン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、一晩、周囲温度で培地「ＥｎＢａｓｅ  Ｆｌｏ」または「ＥｎＰｒｅｓｓｏ」（ＢｉｏＳｉｌｔａ，Ｏｕｌｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）中で発現を行った。遠心によって細胞を回収し、−８０℃で保存するかまたはすぐに処理した。
【０２４０】
８．３  Ｍｘｅ  Ｇｙｒ  Ａインテインを用いたコンストラクトｐＭＪ３７０およびｐＭＪ３８８からのチオエステルの精製および生成
「カラム緩衝液」（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｃｈｗａｂｉｓｃｈ  Ｇｍｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞破壊装置を用いて溶解させた。キチン結合ビーズを含有するカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）」上で４℃で精製を行った。細胞溶解液を適用し、ベースラインまでカラム緩衝液で洗浄した後、インテイン介在性タンパク質切断およびチオエステル形成を誘導するために、カラム緩衝液中の５０ｍＭ  ２−メルカプトエタンスルホネート（略称ＭＥＳＮＡ）とともにカラムを４℃で２０時間温置した。チオエステルを担う切断タンパク質をカラム緩衝液でカラムから洗い流し、濃縮し、５ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる緩衝液中でＢｉｏＧｅｌ  Ｐ６０媒体材料（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲルろ過に供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によって、タンパク質の正体およびチオエステルの存在を確認した。
【０２４１】
８．４  「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグによるコンストラクトｐＭＪ３８４からの精製およびタンパク質分解性切断
次のとおり、ｐＭＪ３８４からの全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１５５−３５２の精製を行った：「緩衝液Ｗ」（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で新鮮または凍結Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を氷上で再懸濁し、「フレンチプレス」（Ｇ．Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｓｃｈｗａｂｉｓｃｈ  Ｇｍｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）細胞破壊装置を用いて溶解させた。５ｍＬ  ＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム上で４℃で精製を行った。２．５ｍＭデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む緩衝液Ｗを用いて段階溶出を行った。ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ溶出緩衝液」（０．１Ｍ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２、０．１Ｍ  ＮａＦ）中での緩衝液交換に、溶出タンパク質を供し、次いでゆっくりとＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔカラムに注入した。試料を濃縮し、１ｍＭの最終濃度になるまでＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）を供給し、５ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．５、２５０ｍＭ  ＮａＣｌからなる緩衝液で展開されるＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５調製グレードカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲルろ過に適用した。タンパク質を濃縮し、−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
【０２４２】
８．５  「Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔ」タグによるコンストラクトｐＭＪ３８５からの精製およびタンパク質分解性切断
次のとおりｐＭＪ３８５からのｄｐｏ４断片２０３−３５２  Ｖ２０３Ｃの精製を行った：封入体を調製し、「ｉ−ＦＯＬＤタンパク質再折り畳み系」マニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ／Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に記載のとおり変性させた。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５微細物質（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、可溶化タンパク質を「緩衝液Ｗ」（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）への緩衝液交換に供し、ＳｔｒｅｐＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｒｅｓｓ」システム上で４℃で精製した。２．５ｍＭデスチオビオチン（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む緩衝液Ｗで段階溶出を行った。０．１Ｍの最終濃度まで溶出タンパク質溶液にＮａＦを供給し、１ｍＭの最終濃度になるようにＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）（ＴＣＥＰ）を供給し、次いでＰｒｏｆｉｎｉｔｙ  ｅＸａｃｔカラム中にゆっくりと注入した。脱イオン化水でフロースルーを１：３希釈し、ＨＣｌを用いてｐＨを７．２に調整した。「緩衝液Ａ」（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて陽イオン交換−クロマトグラフィーによって試料をさらに精製した。１７％、２５％および１００％の「緩衝液Ｂ」（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．２、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）を用いて段階溶出を行った。分画をプールし、濃縮し、脱イオン化水中で展開させるＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５調製グレードカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲルろ過に適用した。液体窒素中でタンパク質を瞬間凍結し、凍結乾燥させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用い、ＳＹＰＲＯ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、ゲル密度測定によってタンパク質濃度を推定した。ＬＣ−ＭＳ質量分析によってタンパク質同一性を確認した。
【０２４３】
８．６  断片１−１５４−チオエステルおよび１５５−３５２のネイティブ化学ライゲーションによる合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの合成
２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％チオフェノールおよび５ｍＭ  ＴＲＩＳ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するＴＲＩＳ−緩衝液（ｐＨ８．６）中で全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃの断片１−１５４−チオエステルおよび１５５−３５２を５０μＭで溶解させた。反応混合物を室温により７２時間振盪した。その後、ライゲーションの成功をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１１Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ−質量分析（ＲＰ１８−カラム、２０分間の０．１％ＴＦＡ  ５−９５％での水中０．１％ＴＦＡによるＡＣＮ勾配、図１１Ｂ）により分析した。４１ｋＤａ前後でレーンにおいて明確なバンドが見出され、このことから、全長ポリメラーゼが示された。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝４０２２３Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示される場合の、実測分子量（Ｍｏｂｓ＝４０２６５Ｄａ）と一致する。
【０２４４】
８．７  断片１５５−２０２−チオエステルおよび２０３−３５２のネイティブ化学ライゲーションによる断片１５５−３５２の合成
２％ＳＤＳ、１％チオフェノールおよび５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するＴＲＩＳ−緩衝液（ｐＨ８．６）中で、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の断片１５５−２０２−チオエステルおよび２０３−３５２  Ｖ２０３Ｃを０．２Ｍで溶解させた。室温によって反応混合物を７２時間振盪した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２０Ａ）およびＬＣ−ＥＳＩ−質量分析（ＲＰ１８−カラム、２０分間の０．１％ＴＦＡ  ５−９５％での水中０．１％ＴＦＡによるＡＣＮ勾配、図２０Ｂ）によって、ライゲーションの成功の分析を行った。レーン７で２１．５ｋＤａ前後で明確なバンドが見出され、これによりライゲーション生成物が示された。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝２２７４９Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳによって示される場合の、実測分子量（Ｍｏｂｓ＝２２７６９Ｄａ）と一致する。
【０２４５】
実施例９−ポリメラーゼＤｐｏ４およびＬ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の活性確認
この実施例は、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４および実施例７による全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体に対する、および実施例８による合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４に対するＰＣＲ活性試験を記載する。
【０２４６】
９．１  ＰＣＲ活性アッセイのための鋳型
ＰＣＲ反応のための鋳型は、８３マー１本鎖Ｄ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＪ＿１＿１＿ＤＤ）であり、これにより第一の温度サイクルにおいて逆の鎖が生成する。その後、両鎖を指数関数的増幅のための鋳型とする。Ｄ−立体配置で、ＮＯＸＸＯＮにおいて、鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプライマーを合成する。
【０２４７】
ＰＣＲ活性アッセイに対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表９】
0006522496.tif 000016
【０２４８】
９．２  ＰＣＲ反応
１５μＬＰＣＲ反応は、各０．２ｍＭの４種類のＤ−ｄＮＴＰ、１０ｎＭ  ８３マーｓｓＤＮＡ（ＭＪ＿１＿１＿ＤＤ）鋳型、１μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｘ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．８＠２５℃）および少なくとも０．６７ｎｇ／μＬの全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４または全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体または合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を含有した。フォワードプライマーはＤＥ４．４０Ｔ７であり、リバースプライマーはＤＥ４．４０Ｒであり、１０２塩基対長のＰＣＲ生成物が得られる。Ｒｏｖａｌａｂ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からＤ−ｄＮＴＰを購入した。全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４または全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体または合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を省くことによって陰性対照を遂行した。市販の全−Ｌ−ｄｐｏ４（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて陽性対照を遂行した。
【０２４９】
温度サイクリングプログラムは、１サイクル（８５℃、３分）、次に少なくとも７サイクル（８５℃、３０秒／５６℃、１分／６０℃、４分）、次いで４℃で保持から構成された。ＰＣＲ反応物の４μＬアリコートを試料ローディング緩衝液と混合し、ＴＢＥ−ＰＡＧＥまたはアガロースゲル（ＬＯＮＺＡ、Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で分析した。とりわけ１００ｂｐバンドを含有するＤＮＡ標準物質ラダーをこのゲル上に適用した。
【０２５０】
９．３活性確認
全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ１５５Ｃ、Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１Ｓ、Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃ、Ｓ８５Ｃ、Ｓ８６Ｃ、Ｓ９６Ｃおよび合成全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４を試験した。試験したポリメラーゼは全て、ＰＣＲ反応において鋳型鎖を増幅することができた。図１２Ａは、全−Ｌ−ポリメラーゼＤｐｏ４の変異体Ａ１５５Ｃ、Ｖ２０３Ｃ、Ｃ３１Ｓ、Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを用いて行ったＰＣＲ反応の分析を示し、これら全てが、ＤＮＡ標準物質ラダーと比較した場合に約１００ｂｐの範囲となるバンドを示した。予想されたＰＣＲ生成物サイズは１０２塩基対であった。このバンドはポリメラーゼがない陰性対照では現れない。またこの１０２ｂｐバンドは、８３マー鋳型より高く移動する。図１２Ｂは、組み換え全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４を用い、断片のライゲーションにより作製された合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４を使用して行ったＰＣＲ反応の分析を示す。ゲルは、ＤＮＡ標準物質ラダーと比較した場合に約１００ｂｐの範囲となるバンドを示した。予想されたＰＣＲ生成物サイズは１０２塩基対であった。ポリメラーゼがない陰性対照においてこのバンドは非常に弱い。図１２Ｂからのレーン２および３を比較した場合に見ることができるように、組み換え全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４および合成全−Ｌ−ポリメラーゼｄｐｏ４は、同一の活性を示す。
【０２５１】
実施例１０−Ｄ−アミノ酸からなるポリメラーゼＤｐｏ４の変異体の合成
本実施例中では、全−ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成を記載する。全−ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃのアミノ酸配列は、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＯＨである。
【０２５２】
固相ペプチド合成Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ−ストラテジーの要件（Ｅｒｉｃ  Ａｔｈｅｒｔｏｎら、１９８１）に従い、使用する全アミノ酸を保護する。使用するアミノ酸は全てＤ−アミノ酸である（Ｂａｃｈｅｍ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【０２５３】
１０．１  Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の合成
１ｍｍｏｌｅ  Ｚ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＨ、０．９ｅｑ．ＴＢＴＵおよび０．９ｍｍｏｌ  ＨＯ−Ｇｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＤＭＦ中で溶解させた。２ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、溶液を２時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、ＤＣＭを用いてフラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製した。Ｚ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。
【０２５４】
Ｚ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を１０ｍＬ  ＭｅＯＨ中で溶解させ、アルゴンを吹き付けた。２時間のＰｄ／Ｃ触媒およびＨ２の添加によって、Ｎ末端Ｚ−基の加水分解性切断を達成した。ろ別後、Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２ＭｅＯＨを減圧下で蒸発させた。逆相ＨＰＬＣおよび質量分析を用いて分析を行った。４８２Ｄａの計算質量は、４８３Ｄａの決定質量と一致する。
【０２５５】
１０．２  完全保護化全−Ｄ−ペプチドＨ−ＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（１）の合成
６ｍＬ  ＮＭＰ中で４５分間、５ｅｑ．アミノ酸、ｅｑ．４．９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび１０ｅｑ  ＤＩＰＥＡを用いて、Ｆｍｏｃ−脱保護後に、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨを０．１ｍｍｏｌｅ  Ｆｍｏｃ−Ｓｉｅｂｅｒ  ｒｉｎｋ  アミドＮｏｖａＳｙｎＴＧレジンに充填した。
【０２５６】
ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによりＡＢＩ  ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中で９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡ用いて、１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いて７分間にわたりＦｍｏｃ−脱保護化を３回行った。４２アミノ酸のカップリング後、二重カップリングを行った。
【０２５７】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿させたペプチドを単離し、乾燥させた。
【０２５８】
ＨＰＬＣおよび質量分析（図１３）によって最終生成物の特徴を調べた。生成物に対する計算質量（６２４４Ｄａ）は、測定質量（６２４９Ｄａ）と一致する。
【０２５９】
１０．３  完全保護化全−Ｄ−ペプチドＢｏｃ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧ−ＯＨ（２）の合成
Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）により記載されるように、０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＴｒｉｔｙｌレジンにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｙ−ＯＨを充填した。したがって、０．６ｍｍｏｌｅの塩化チオニルとともに０．１０ｍｍｏｌレジンを３０分間、２回温置し、その後にＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬＤＣＭ中の０．６ｍｍｏｌｅ  Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡとともにレジンを９０分間温置した。その後、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによりＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いてＦｍｏｃ−脱保護化を７分間、３回行った。３９アミノ酸のカップリング後、二重カップリングを行った。
【０２６０】
ＤＣＭ中の１０ｍＬ  ３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２時間、２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿させたペプチドを単離し、乾燥させた。ＨＰＬＣおよび質量分析によって最終生成物の特徴を調べた（図１４）。実験により決定された生成物の質量（１１２８９Ｄａ）は理論値（１１２８６Ｄａ）のとおりであった。
【０２６１】
１０．４  ペプチド２とペプチド１の断片縮合による全−Ｄ−ペプチドＨ−ＶＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＮＨ２（３）の合成
【０２６２】
ＤＣＭ中２５％（ｖ／ｖ）ＴＦＥ中で５μｍｏｌｅ（２）および１ｅｑ．（１）を溶解させた。５ｅｑ．ＰｙＢＯＰおよび１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、混合物を一晩撹拌した。溶媒を蒸発させた後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させ、ろ別した。
【０２６３】
２時間にわたり、ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳによってペプチドの側鎖保護基の切断を行った。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いてＣ１８カラムにおいて、Ｎ末端Ｆｍｏｃ−保護化ペプチドの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２６４】
ＨＰＬＣおよび質量分析によって最終生成物の特徴を調べた（図１５）。実験により決定された質量（１７５３１Ｄａ）は理論分子質量（１７５１２Ｄａ）と一致する。
【０２６５】
１０．５  全−Ｄ−ペプチドＺ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬ−ベンジル−チオエステル（４）の合成
Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）に記載のように、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨを０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌレジンに充填した。したがって、０．６ｍｍｏｌｅ塩化チオニルとともに０．１０ｍｍｏｌレジンを３０分間、２回温置し、その後にＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬ  ＤＣＭ中の０．６ｍｍｏｌｅ  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｅｕ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡとともにレジンを９０分間温置した。その後、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによりＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて、１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いてＦｍｏｃ−脱保護化を７分間、３回行った。
【０２６６】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドのろ別後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０２６７】
ＤＭＦ中でＮ末端Ｚ−および完全に側鎖保護されたペプチド４を１ｍＭに溶解させた。５ｅｑ．ＰｙＢＯＰ、１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡおよび３０ｅｑ．ベンジルメルカプタンの添加後、混合物を４時間撹拌した。次に、ＤＭＦを蒸発させ、ペプチドを沈殿させ、氷冷ジエチルエーテルで洗浄した。２時間にわたるＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳでの処理により、側鎖保護基を除去した。ＴＦＡの蒸発後、ペプチドを沈殿させ、氷冷ジエチルエーテルで洗浄した。次に、逆相ＨＰＬＣによってペプチド−ベンジル−チオエステルを精製し、逆相ＨＰＬＣ（図１６Ａ）およびＥＳＩ−ＭＳ（図１６Ｂ）によって分析した。理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝５５２７Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示されるように実測分子量（Ｍｏｂｓ＝５５３３Ｄａ）と一致する。
【０２６８】
１０．６  全−Ｄ−ペプチドＨ−ＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（７）の合成
６ｍＬ  ＮＭＰ中で、４５分間、５ｅｑ．アミノ酸、ｅｑ．４．９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて、０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−ＮＨ２レジンにＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを充填した。その後に、レジンをＴＨＦで洗浄した。２時間にわたり、８０℃でＴＨＦ中４ｅｑ．Ｌａｗｅｓｓｏｎ試薬との温置によって、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ψ［ＣＳ−ＮＨ］−Ｒ−ＴｅｎｔａＧｅｌへの変換を達成した。この後、レジンをＮＭＰで洗浄した。その後に、このように調製したレジンを既に記載のように自動化ペプチド合成において使用した（ＡＢＩ４３３、ＦＡＳＴｍｏｃプロトコール、ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化し；カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンによって７分間、Ｆｍｏｃ−脱保護化を３回行った。）。４４カップリングアミノ酸の後、二重カップリング段階を行った。
【０２６９】
この後、Ｓｈａｒｍａら（Ｓｈａｒｍａら、２０１１）に従い、ＤＭＦ中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステル含有溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。２時間にわたり、ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて、側鎖保護基の切断を行った。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム上で、ペプチドチオエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２７０】
ＨＰＬＣ（図１７Ａ）および質量分析（図１７Ｂ）によって、最終生成物の特徴を調べた。質量分析によって決定された生成物の分子量（９１５５Ｄａ）は、計算質量（９１５０Ｄａ）と一致した。
【０２７１】
１０．７  Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭ−ＯＧｐ（６）の合成
０．１０ｍｍｏｌｅ  ＴｅｎｔａＧｅｌ−Ｒ−Ｔｒｉｔｙｌレジンに、Ｂａｒｌｏｓら（Ｂａｒｌｏｓら、１９８９）に記載のようにＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨを充填した。したがって、０．６ｍｍｏｌｅ塩化チオニルとともに３０分間、２回、０．１０ｍｍｏｌレジンを温置し、その後に、ＤＣＭで洗浄した。この後、６ｍＬ  ＤＣＭ中０．６ｍｍｏｌｅ  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨ、２．４ｍｍｏｌ  ＤＩＰＥＡとともに、レジンを９０分間温置した。その後、ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）、１０％ＤＩＰＥＡ（ｖ／ｖ）の溶液を用いて、レジンを１０分間、３回ブロッキング処理し、ＤＣＭで洗浄した。ＦＡＳＴｍｏｃプロトコールによってＡＢＩ４３３を用いて自動化合成を行った。ＮＭＰ中９ｅｑ．ＨＡＴＵおよび２０ｅｑ．ＤＩＰＥＡを用いて１０ｅｑ．アミノ酸を活性化した。カップリング時間は４５分間であり、ＮＭＰ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンによって、７分間、３回、Ｆｍｏｃ−脱保護化を行った。４６アミノ酸のカップリング後、二重カップリングを行った。ＤＭＦ中１０％（ｖ／ｖ）無水酢酸および１０％（ｖ／ｖ）ＤＩＰＥＡを用いてＮ−末端のアセチル化を１０分間、３回行った。
【０２７２】
２時間にわたり、１０ｍＬのＤＣＭ中３０％（ｖ／ｖ）ＨＦＩＰ中でぺプチジルレジンを２回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドのろ別後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させ。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。
【０２７３】
０．０１ｍｍｏｌｅ完全保護化ペプチド、４ｅｑ．ＰｙＢＯＰおよび５ｅｑ．Ｈ−Ｄ−Ｍｅｔ−ＯＧｐ（Ｂｏｃ）２を６ｍＬ  ＮＭＰ中で溶解させた。１０ｅｑ．ＤＩＰＥＡの添加後、混合物を４時間撹拌した。この後、溶媒を還元気化（ｒｅｄｕｃｅｄ  ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ）させ、氷冷ジエチルエーテルによって残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドエステルを乾燥させ、その後、２時間にわたり、ＴＦＡ中２．５％ＥＤＴ、２．５％水、２．５％ＴＩＳを用いて保護基を切り出した。ＴＦＡの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。ＡＣＮ／水勾配を用いて、Ｃ１８カラム上でペプチドエステルの逆相ＨＰＬＣ精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。
【０２７４】
ＨＰＬＣ（図１８Ａ）および質量分析（図１８Ｂ）によって最終生成物の特徴を調べた。実験により決定された質量（８５４７Ｄａ）は、理論分子量（８５４１Ｄａ）と一致する。
【０２７５】
１０．８  ペプチド３とペプチド４のネイティブ化学ライゲーションによる、全−Ｄ−ペプチド、Ｈ−ＣＤＭＡＫＰＮＧＩＫＶＩＤＤＥＥＶＫＲＬＩＲＥＬＤＩＡＤＶＰＧＩＧＮＩＴＡＥＫＬＫＫＬＧＩＮＫＬＣＤＴＬＳＩＥＦＤＫＬＫＧＭＩＧＥＡＫＡＫＹＬＩＳＬＡＲＤＥＹＮＥＰＩＲＴＲＶＲＫＳＩＧＲＩＶＴＭＫＲＮＳＲＮＬＥＥＩＫＰＹＬＦＲＡＩＥＥＳＹＹＫＬＤＫＲＩＰＫＡＩＨＶＶＡＶＴＥＤＬＤＩＶＳＲＧＲＴＦＰＨＧＩＳＫＥＴＡＹＳＥＳＶＫＬＬＱＫＩＬＥＥＤＥＲＫＩＲＲＩＧ  ＶＲＦＳＫＦＩＥＡＩＧＬＤＫＦＦＤＴ−ＯＨ（５）の合成
【０２７６】
２％ＳＤＳ、１％チオフェノールおよび５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するトリス−緩衝液（ｐＨ８．６）中でペプチド３および４の両方を０．２Ｍに溶解させる。反応混合物を室温により７２時間振盪する。その後、逆相ＨＰＬＣによって混合物を精製する。Ｎ末端Ｚ−保護基の除去のために、２７０ｅｑ．ＴＦＡおよび５０ｅｑ．チオアニソールでペプチドを溶解させ、室温で６時間振盪した（Ｙｏｓｈｉａｋｉ  Ｋｉｓｏら、１９８０）。ＴＦＡの蒸発後、ペプチドを沈殿させ、氷冷ジエチルエーテルにより洗浄し、逆相ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって再び精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＵＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析によって、遊離ペプチド５の分析を行う。生成物の正確な質量が分かる。
【０２７７】
１０．９  全−Ｄ−ペプチドの合成
ペプチド７とのペプチド６のプロテアーゼ−触媒ライゲーションによる、全−Ｄ−ペプチド、Ａｃ−ＭＩＶＬＦＶＤＦＤＹＦＹＡＱＶＥＥＶＬＮＰＳＬＫＧＫＰＶＶＶＣＶＦＳＧＲＦＥＤＳＧＡＶＡＴＡＮＹＥＡＲＫＦＧＶＫＡＧＩＰＩＶＥＡＫＫＩＬＰＮＡＶＹＬＰＭＲＫＥＶＹＱＱＶＳＳＲＩＭＮＬＬＲＥＹＳＥＫＩＥＩＡＳＩＤＥＡＹＬＤＩＳＤＫＶＲＤＹＲＥＡＹＮＬＧＬＥＩＫＮＫＩＬＥＫＥＫＩＴＶＴＶＧＩＳＫＮＫＶＦＡＫＩＡ−ＳＭｅ（８）の合成
４Ｍ尿素を含有するリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ入り）中で、ペプチド６を０．２ｍＭに溶解させ、ペプチド７を０．６ｍＭに溶解させた。２０μＭクロストリパイン（エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）の添加後、反応混合物を３７℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、Ｈ２0／ギ酸  ８０／２０中で溶解させ、３０分内で５％から９５％の水中ＡＣＮ勾配でＲＰ−１８−カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、逆相ＨＰＬＣによって精製する。最終ペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１９Ａ）およびＥＳＩ−質量分析（図１９Ｂ）により分析した。レーン１で１４，４ｋＤａと２１．５ｋＤａとの間でバンドが見られ、ライゲーション生成物が示された。ライゲーション生成物の理論分子量（Ｍｔｈｅｏｒ＝１７４７６Ｄａ）は、ＥＳＩ−ＭＳにより示されるように実測分子量（Ｍｏｂｓ＝１７４８６Ｄａ）と一致する。
【０２７８】
１０．１０  ペプチド５とのペプチド８のネイティブ化学ライゲーションによる全−ＤポリメラーゼＤｐｏ変異体Ａ１１５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの合成
２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、１％チオフェノールおよび５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩を含有するトリス−緩衝液（ｐＨ８．６）中で、ペプチド５および８の両方を０．２Ｍに溶解させる。反応混合物を室温により７２時間振盪する。その後、逆相ＨＰＬＣにより混合物を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相ＵＰＬＣおよびＥＳＩ−質量分析により分析する。ライゲーション生成物の正確な質量が分かる。
【０２７９】
実施例１１−Ｄ−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼｄｐｏ４の活性確認
この実施例は、実施例１０による全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃに対するＰＣＲ活性試験を記載する。
驚くべきことに、合成全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃは、余分な再折り畳みを行うことなく活性であり、したがって、さらなる再折り畳み手順なく使用される。プレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上でのドデシル硫酸ナトリウム（略称ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（略称ＰＡＧＥ）により、標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用い、その後ＳＹＰＲＯ−ＲＥＤ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＢｉｏＲａｄ  Ｆｘスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによって、タンパク質濃度を推定する。
【０２８０】
１１．１  ＰＣＲ活性アッセイに対する鋳型
ＰＣＲ反応に対する鋳型は、８３マー１本鎖Ｌ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＭＪ＿１＿１０５＿ＬＤ）であり、そこから、第一の温度サイクルにおいて逆鎖が生成される。その後、両鎖を指数関数的増幅に対する鋳型とする。ＮＯＸＸＯＮにおいてＬ−立体配置で鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプライマーを合成する。
【０２８１】
ＰＣＲ活性アッセイに対するオリゴヌクレオチドのリスト：
【表１０】
0006522496.tif 000017
【０２８２】
１１．２  ＰＣＲ反応
１５μＬＰＣＲ反応は、各０．２ｍＭの４種類のＬ−ｄＮＴＰ、１０ｎＭ  ８３マーｓｓＤＮＡ（ＭＪ＿１＿１０５＿ＬＤ）鋳型、１μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｘ  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．８＠２５℃）および少なくとも０．６７ｎｇ／μＬの全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを含有する。フォワードプライマーは、ＭＪ＿ｏｌｉｇｏ＿１８７＿ＬＤであり、１０２ｂｐのＰＣＲ生成物が得られ、これは８３マー鋳型とは区別されるものである。リバースプライマーは、ＭＪ＿ｏｌｉｇｏ＿１８９＿ＬＤである。Ｌ−ｄＮＴＰは、Ｒａｓａｙａｎ，Ｉｎｃ．（Ｅｎｃｉｎｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるカスタム合成として購入する。
【０２８３】
全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃを省くことによって陰性対照を遂行する。
【０２８４】
温度サイクリングプログラムは、１サイクル（８５℃、３分）、次いで少なくとも７サイクルの（８５℃、３０秒／５６℃、１分／６０℃、４分）、次いで４℃で保持からなる。ＰＣＲ反応物の４μＬアリコートを試料ローディング緩衝液と混合し、ＴＢＥゲル上で分析する。とりわけ１００ｂｐバンドを含有するＤＮＡ標準物質ラダーをこのゲルに適用する。
【０２８５】
１１．３  活性確認
全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣおよびＬ−ＤＮＡ基質およびＬ−ヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応によって、ＤＮＡ標準物質ラダーと比較した場合に約１００ｂｐの範囲となるバンドが得られる。このバンドは、ポリメラーゼがない陰性対照では出現しない。また、この１０２ｂｐバンドは、８３マー鋳型より高く移動する。全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３ＣはＬ−ＤＮＡ増幅の出現に依存するので、温度増幅過程での合成全−ＤポリメラーゼＤｐｏ４変異体Ａ１５５Ｃ／Ｖ２０３Ｃの活性が確認される。
【０２８６】
実施例１２−Ｄ−またはＬ−核酸の合成
標準的な環外アミン保護基とともに（ＤａｍｈａおよびＯｇｉｌｖｉｅ、１９９３）２’ＴＢＤＭＳ  ＤＮＡホスホラミダイト化学を用いて、ＡＢＩ３９４合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）による固相合成によって、Ｌ−ＤＮＡ核酸またはＤ−ＤＮＡ核酸を作製した。ＤＮＡ合成のために、Ｄ−およびＬ−立体配置のｄＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、ｄＣ（Ｎ−Ａｃ）−、ｄＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−およびｄＴを適用した。ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから全ホスホルアミダイトを購入した。合成および脱保護後、ゲル電気泳動によってＬ−ＤＮＡ核酸またはＤ−ＤＮＡ核酸を精製した。
【０２８７】
参考文献
次のような、本明細書中で引用する書類の完全な文献データは、別段の断りがない場合、それによってその参考文献の開示が参照により本明細書中に組み込まれる。
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Ｂａｒｌｏｓ，  Ｋ．，  Ｇａｔｏｓ，  Ｄ．，  Ｋａｌｌｉｔｓｉｓ，  Ｊ．，  Ｐａｐａｐｈｏｔｉｕ，  Ｇ．，  Ｓｏｔｉｒｉｕ，  Ｐ．，  Ｙａｏ，  Ｗ．Ｑ．  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ｗ．  （１９８９）  Ｄａｒｓｔｅｌｌｕｎｇ  ｇｅｓｃｈｕｔｚｔｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄ−Ｆｒａｇｍｅｎｔｅ  ｕｎｔｅｒ  Ｅｉｎｓａｔｚ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｉｅｒｔｅｒ  Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−Ｈａｒｚｅ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．  ３０（３０）：３９４３−３９４６
Ｂｏｃｋ  Ｌ．Ｃ．，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ｌ．Ｃ．，  Ｌａｔｈａｍ  Ｊ．Ａ．，  Ｖｅｒｍａａｓ  Ｅ．Ｈ．  ａｎｄ  Ｔｏｏｌｅ  Ｊ．Ｊ．  （１９９２）  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ３５５（６３６０）：５６４−６．
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Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ．  （２００６）．  Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ‐  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｓ．  Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ．  ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ，  ＩＳＢＮ  ３−５２７−３１０５９−２
Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ．，  Ｎｏｌｔｅ  Ａ．，  Ｂａｌｄ  Ｒ．，  Ｅｒｄｍａｎｎ  Ｖ．Ａ．  ａｎｄ  Ｆｕｒｓｔｅ  Ｊ．Ｐ．  （１９９６）  Ｍｉｒｒｏｒ−ｉｍａｇｅ  ＲＮＡ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  Ｄ−ａｄｅｎｏｓｉｎｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４（９）：１１１２−５．
Ｋｕｓｓｅｒ  Ｗ．  （２０００）  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｓ：  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４（１）：  ２７−３８．
Ｍａｉｒａｌ  Ｔ．，  Ｏｚａｌｐ  Ｖ．Ｃ．，  Ｌｏｚａｎｏ  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａｐｔａｍｅｒｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ３９０（４）：９８９−１００７
Ｍａｎｄａｌ  Ｋ．，  Ｕｐｐａｌａｐａｔｉ  Ｍ．，  Ａｕｌｔ−Ｒｉｃｈｅ  Ｄ．，  Ｋｅｎｎｅｙ  Ｊ．，  Ｌｏｗｉｔｚ  Ｊ．，  Ｓｉｄｈｕ  Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｅｎｔ  Ｓ．Ｂ．Ｈ．  （２０１２）  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｉｒａｌ  ｛Ｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｐｌｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ｝  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｙ  ｒａｃｅｍｉｃ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．  ＰＮＡＳ．  １０９（３７）
ＭｃＧｉｎｎｉｓ  Ｓ．，  Ｍａｄｄｅｎ  Ｔ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＢＬＡＳＴ：  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ２０−５．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８（３）：４４３−５３．
Ｎｏｌｔｅ  Ａ．，  Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ．，  Ｂａｌｄ  Ｒ．，  Ｅｒｄｍａｎｎ  Ｖ．Ａ．  ａｎｄ  Ｆｕｒｓｔｅ  Ｊ．Ｐ．  （１９９６）  Ｍｉｒｒｏｒ−ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｌ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４（９）：１１１６−９．
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Ｓｅｋｉｚａｋｉ，  Ｈ．，  Ｉｔｏｈ，  Ｋ．，  Ｔｏｙｏｔａ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｔａｎｉｚａｗａ，  Ｋ．  （１９９６）  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐ−ｇｕａｎｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  ａｃｙｌ  ｄｏｎｏｒｓ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．  ４４（８）：１５８５−７
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【０２８８】
本明細書、特許請求の範囲および／または図面中で開示される本発明の特徴は、両者とも個別に、および何らかのそれらの組み合わせで、その様々な形態で本発明を実現するための材料であり得る。
【図１Ａ】
0006522496.tif 000018
【図１Ｂ】
0006522496.tif 000019
【図２Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000020
【図３Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000021
【図４Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000022
【図５Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000023
【図６Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000024
【図７】
0006522496.tif 000025
【図８】
0006522496.tif 000026
【図９Ａ】
0006522496.tif 000027
【図９Ｂ】
0006522496.tif 000028
【図１０Ａ】
0006522496.tif 000029
【図１０Ｂ】
0006522496.tif 000030
【図１０Ｃ】
0006522496.tif 000031
【図１１Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000032
【図１２Ａ】
0006522496.tif 000033
【図１２Ｂ】
0006522496.tif 000034
【図１３】
0006522496.tif 000035
【図１４】
0006522496.tif 000036
【図１５】
0006522496.tif 000037
【図１６Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000038
【図１７Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000039
【図１８Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000040
【図１９Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000041
【図２０Ａ−Ｂ】
0006522496.tif 000042