(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号：３を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：５を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号：３を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：６を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号：３を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：７を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ．配列番号：４を含む、又はからなる重鎖可変ドメイン及び配列番号：７を含む、又はからなる軽鎖可変ドメイン、又は
を含む、ＣＸＣＲ５に結合するモノクローナル抗体又はそのＣＸＣＲ５結合フラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が重鎖定常領域を含み、前記定常領域が、タイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はそのＣＸＣＲ５結合フラグメント、の重鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのＣＸＣＲ５結合フラグメント、の軽鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はそのＣＸＣＲ５結合フラグメント、の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
a.  請求項３のポリヌクレオチド及び請求項４のポリヌクレオチド；又は
b.  請求項５のポリヌクレオチド、
を含む発現ベクター。
【請求項９】
a.  請求項６の発現ベクター及び請求項７の発現ベクター、又は、
b.  請求項８の発現ベクター、
を用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項９の宿主細胞。
【請求項１１】
a.  請求項９又は請求項１０の宿主細胞を培養する工程、及び
b.  該宿主細胞によって製造される前記抗体を単離する工程、
を含む、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、又は、請求項１１に記載の方法によって製造されるモノクローナル抗体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
薬剤として使用するための、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、又は、請求項１１に記載の方法によって製造されるモノクローナル抗体。
【請求項１４】
自己免疫若しくは炎症性疾患及びがんの治療に使用するための、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体、又は、請求項１１に記載の方法によって製造されるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＸＣＲ５に特異性を有する抗体に関する。より詳細には、本発明はモノクローナル抗体に関し、より詳細には、ヒトＣＸＣＲ５に対して高親和性にて特異的に結合し、中和する、完全ヒトモノクローナル抗体に関する。本発明は、該抗体をコードする核酸、これらの核酸を発現するためのベクター、及び該抗体を産生するための宿主細胞にも関する。さらに、本発明は、自己免疫若しくは炎症性疾患及びがんの診断並びに／又は治療における前記抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）上の抗原（Ａｇ）に結合するナイーブＢ細胞は、ＣＣＲ７をアップレギュレートし、Ｔ細胞ヘルプを誘発するために外側のＴ細胞領域へと遊走し、Ｔ細胞依存又は非依存的様式で分化を導く。Ｂ細胞の活性化に非依存的なＴ細胞は、短期生存のＩｇＭ抗体分泌プラズマ細胞を誘導する。しかし、活性化Ｔ細胞との同族相互作用は、さらに、Ｂ細胞の機能を強化し、濾胞分化を促進することができる。Ｔ細胞領域を通過するＴヘルパー細胞の集合は、樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）複合体上の同一抗原に暴露される。抗原−ＭＨＣＩＩ複合体の提示は、関連する抗原受容体を有するＴ細胞の活性化や増殖を導くことができる。活性化Ｔ細胞は、Ｂ細胞領域へと遊走し、同様の特異性を備えたＢ細胞上のＭＨＣＩＩ結合抗原に結合し、免疫シナプスの形成を導く。この様式で活性化されたＢ細胞は濾胞を播き、激しい増殖を起こし、高親和性メモリーＢ細胞又は長期生存プラズマ細胞へと分化する。ＢＣＲの体細胞超突然変異を介した高親和性抗原結合Ｂ細胞を産生するための基準は、専門の間葉系細胞及びＴ細胞集団によって制御される。濾胞樹状細胞（ＦＤＣｓ）上に提示された抗原に結合し、処理することができる高親和性抗原結合Ｂ細胞は、さらに、濾胞ＢヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞と相互作用することによって分化するために選択される。ＴＦＨ細胞との相互作用は、高親和性バインダー（ｂｉｎｄｅｒ）の選択を促進し、同様に、プラズマ細胞及び長期生存プラズマ細胞へ分化するためのシグナル伝達を促進する。Ｂ細胞及びＴＦＨ細胞上のＣＸＣＲ５の発現は、胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｒｅ）内のこれらの相互作用を最適化する鍵となる役割を果たすことが知られている。Ｔ細胞及びＢ細胞相互作用を促進する専門的な微小環境は、ＣＸＣＲ５を発現する専門的なリンパ球サブセットの局在と維持を促進する、ＣＸＣＬ１３を恒常的に発現するＦＤＣによって創られる。
【０００３】
胚中心において、ＣＸＣＲ５陽性ＴＦＨ細胞との相互作用が、高親和性抗体反応の誘導のためには必要とされる。Ｂ細胞は、ミエリン破壊の原因となる特異的な（自己）抗体の産生を介して多発性硬化症（ＭＳ）の病因における役割を果たすことが、文献に蓄積した証拠にある。加えて、Ｂ細胞は、ＭＳ疾患プロセスの、開始（抗原捕捉）から炎症及び組織損傷までの全ての段階において関与し、これらに限定されないが、抗原提示やサイトカイン産生を含む、ＭＳでのさらなる役割を果たし得る。既存のＭＳ療法において、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）リツキシマブ（抗−ＣＤ２０）を使用したパイロット研究を用いた最近まで、Ｂ細胞は標的にされていない。しかし、ＭＳに対する、多くの現在の療法（インターフェロンベータ、グリココルチコイド、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ，）、ナタリズマブ、フィンゴリモド（ｆｉｎｇｏｌｉｍｏｄ））及び次に来る療法は、Ｂ細胞の振る舞いに影響を与えるための潜在能力を有している。Ｂ細胞への効果は、それらの治療効果に寄与しうる可能性がある。
【０００４】
ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ球受容体としてしられている、すなわち、ＢＬＲ−１及びＣＤ１８５）は、Ｇタンパク結合７回膜貫通ドメイン受容体（ＧＰＣＲ  ７ＴＭ受容体）であって、Ｂ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞の亜集団上に高発現している。ＣＸＣＲ５に対する唯一知られたリガンドが、ＣＸＣケモカインＣＸＣＬ１３（ＢＬＣ又はＢＣＡ−１としても知られる）である。ＣＸＣＲ５の標的の欠損は、この受容体がリンパ節におけるＢ細胞の遊走やＢ細胞の局在に関与していることを示した。ＣＸＣＲ５の非存在下では脾臓のＴ細胞リッチ領域からＢ細胞濾胞へと遊走することに失敗し、その結果、機能的な胚中心が形成されない。ＣＸＣＬ１３及びＣＸＣＲ５ノックダウンマウスは同様の表現型を有し、しかし興味深いことに、野生型よりもはるかに低いにもかかわらず、重要な抗原特定的な反応を載せる能力を未だに有している。
【０００５】
ＣＸＣＬ１３は、炎症を有する中枢神経系（ＣＮＳ）において高発現しているが、通常のＣＮＳにおいては実質的に検出不可能である。ＣＸＣＬ１３の髄腔内の産生は、脳脊髄液（ＣＳＦ）へＣＳＣＲ５陽性Ｂ細胞及びＴ細胞を動員することに関与すると考えられており、ＭＳ患者のＣＳＦにおける大部分のＢ細胞はＣＸＣＲ５陽性である。ＣＸＣＬ１３発現もまた、二次進行型ＭＳの患者の脳髄膜中のリンパ濾胞様構造中で観察されるＦＤＣにおいて検出される。ＭＳにおいて認められる病原性Ｂ細胞反応は、Ｂ細胞機能を調整することが示されている異所性リンパ系構造におけるリンパ球の蓄積の直接的な産生物であり得る。さらに、活動的脱髄病変の近接は、持続性自己免疫反応を引き起こす自己抗原を産生することによって、慢性的な疾患を誘導する上で主要な寄与的な役割を果たし得る。ＣＸＣＬ１３及びＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ；Ｂ細胞生存の重要な調節因子）は、寛解が再発した、又は慢性的再発性の実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡ）を有するマウスのＣＮＳにおいて、両者顕著に及び持続的にアップレギュレートされており、これは、Ｂ細胞機能もまた、動物モデルにおいて慢性ＣＮＳ炎症において役割を果たしていることを示唆している。この知見は、野生型と比較して、炎症症状の迅速な解決で制御するＥＡＥの緩やかな形態を示し、病態から完全に回復を示す、ＣＸＣＬ１３ノックアウトマウスの表現型と一致する。これらの研究は、Ｂ細胞遊走、分化、及び増殖反応において、ＣＸＣＬ１３及びＣＸＣＲ５が重要な役割を果たしていることを示している。血管系において、Ｂ細胞は比較的少ない数が存在し、それゆえ、専門化されたリンパ系微小環境内に配置することは、Ｂ細胞エフェクター機能に命令する他のリンパ球亜集団と相互作用させることに重要な意味を持つ。ＣＸＣＲ５の発現は、この過程において中心的な役割を果たし、それゆえ、ＣＸＣＲ５拮抗作用は、Ｂ及びＴ細胞のＣＮＳへの動員を減少することによって、Ｂ細胞のプラズマ細胞若しくはセントロサイト（ｃｅｎｔｒｏｃｙｔｅ）への成熟を阻害することによって、及び、ＴＦＨ細胞との相互作用を阻害することによって、ＭＳ疾患を潜在的に阻害し、自己抗体産生を阻害しうる。おそらく、著しく、ＣＸＣＲ５の遮断は、これらの無菌の環境内における自己抗原提示を減衰させることによって、異所性のリンパ濾胞の発生を妨害し、炎症プロセスの解決を促進しうる。
【０００６】
ＣＸＣＲ１３の発現及びＣＸＣＲ５を有する細胞との相互作用を介した、異所性のリンパ型構造の生成は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）及びシェーングレン症候群のような他の慢性炎症疾患として同定されており、より最近、ＣＸＣＲ５の発現もまた、多くの膵がんにおいて示されている。このように、ＣＸＣＲ５に対する抗体の使用を介した、ＣＸＣＲ５の拮抗作用は、これらの疾患において、有用な治療アプローチとなり得る。上述のように、これは、ＥＡＥを有するマウスのＣＮＳにおいて、ＣＸＣＬ１３（ＣＸＣＲ５のリガンド）とＢＡＦＦの間の発現の類似性の観点から信頼性があるものであり、なぜなら、抗−ＢＡＦＦ療法は、炎症性／自己免疫疾患の治療のために十分に確立されているからである。実際には、異なる抗−ＢＡＦＦ抗体が市販されているか、又は、炎症性／自己免疫疾患の治療のために開発されている：例えば、既に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のために承認された、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）が、ＭＳ、ＲＡ及びシェーングレン症候群のような疾患に対して評価されており、また、タバルマブ（ｔａｂａｌｕｍａｂ）が現在、ＳＬＥ及びＭＳのために臨床試験中である。
【０００７】
上述のように、ＣＸＣＬ１３／ＣＸＣＲ５経路は、Ｂ細胞機能において、重要な役割を果たす。Ｂｕｒｋｌｅら（２００７）が、例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）等の、がんにおいて、この経路が関与していることも示している。ＣＬＬ患者は、健常な患者よりＣＸＣＬ１３の血清レベルが有意に高いことが特に示されている。著者らは、抗−ＣＸＣＲ５抗体がＣＸＣＬ１３に対する走化性を阻害することを示すことができており、ＣＸＣＲ５はＣＬＬを有する患者に対する新たな治療標的であることを示唆している。
【０００８】
ＷＯ２００９０３２６６１は、ヒトＣＸＣＲ５の細胞外ドメインに特異的に結合するヒト化抗体ペプチドを記述する。該患者に対して、ＣＸＣＲ５に結合するＣＸＣＲ５アンタゴニストを投与することを含む、ＣＸＣＲ５陽性細胞に関与する疾患を有する患者を治療するための方法もまた記載する。
【０００９】
公衆衛生における、炎症性及び／又は自己免疫疾患、並びにがんの主要な影響を考慮すると、ＣＸＣＲ５／ＣＸＣＬ１３経路が関与する、多発性硬化症、リウマチ性関節炎若しくはシェーングレン症候群等の炎症性及び／又は自己免疫疾患、並びに、膵がん、Ｂ−ＣＬＬ若しくはがん／リンパ腫等のがんを治療するための、とりわけ薬剤として有用であり得る新規分子に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ＣＸＣＲ５に特異的に結合する新規のモノクローナル抗体、特に、完全ヒト抗体を提供する。これらのＣＸＣＲ５抗体は、結合するだけでなく、ＣＸＣＲ５を中和することも可能である。それらは、特に、Ｂ細胞等のＣＸＣＲ５+細胞に結合することができる。
【００１１】
第一の実施形態において、本発明は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を介して、ＣＸＣＲ５に結合する、抗体又はその一部を記述する。該ＣＤＲを含む抗体は、ＣＤＲが得られた親分子のＣＸＣＲ５結合特異性を維持する。
【００１２】
さらなる実施形態において、前記抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）が記述される。該ＦＲは、本発明のＣＤＲと結合されることになる。
【００１３】
他の実施形態において、対象の抗体の可変重鎖及び軽鎖、並びに、好ましい結合することができる定常領域のアミノ酸配列も開示される。
【００１４】
また、本発明の別の実施形態は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列を含むベクター及び株化細胞を構成する。
【００１５】
また、本発明に沿った、抗体を産生するための方法を開示する。
【００１６】
本発明の他の実施形態は、一又は少なくとも一つの目的の抗体を含む、医薬組成物である。
【００１７】
最後の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、薬剤として使用するためのものである。特に、それらは、ＣＸＣＲ５又はＣＸＣＲ５経路に関連する障害の治療のために使用することができ、このような、自己免疫又は炎症性疾患の治療のために使用されることができる。特に、このような障害又は疾患は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎又はシェーングレン症候群から選択される。それらは、膵がん、Ｂ−ＣＬＬ若しくはＣＸＣＲ５／ＣＸＣＬ１３経路に関連する他のタイプのがん等のがんの治療のために使用され得る。
【００１８】
＜定義＞
用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１又は数個のポリペプチドからなるタンパク質を示す。免疫グロブリンの一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体であり、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対から構成され、それぞれの対は、一つの軽鎖及び一つの重鎖を有する。軽鎖は２つの部位：可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）、を有しており、軽鎖の文脈において、同様に定常領域と呼ぶことができる。重鎖も同様に、２つの部位：可変ドメイン（ＶＨ）及び定常領域（ＣＨ）を有する。それぞれの対において、軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ともに抗原への結合に関与しており、定常領域は、抗体エフェクター機能に関連している。全長免疫グロブリン「軽鎖」（通常、約２５ｋＤａ）は、Ｎ末端の可変ドメイン遺伝子（通常、約１１０アミノ酸）、及び、Ｃ末端のκ又はλ定常ドメイン（それぞれＣκ及びＣλ）遺伝子によってコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」（通常、約５０ｋＤａ）は、同様に、可変ドメイン遺伝子（通常、約１１６アミノ酸）、及び、本明細書中で後述する他の定常領域遺伝子の一つ（通常、約３３０アミノ酸）によってコードされている。ギリシャ文字：［アルファ］、［デルタ］、［イプシロン］、［ガンマ］、および［ミュー］で表される、哺乳動物の重鎖の５つのタイプが存在する。重鎖のタイプはそれぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭのような抗体のアイソタイプを定義する。定常領域は、同じアイソタイプのすべての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。重鎖［ガンマ］、［アルファ］及び［デルタ］は、３つのＩｇ定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる定常領域、及び柔軟性のためのヒンジ領域を有し、重鎖［ミュー］及び［イプシロン］は、４つのＩｇ定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２，ＣＨ３及びＣＨ４）及びヒンジ領域からなる定常領域を有している。
【００１９】
免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変ドメインは、３つの超可変領域が割り込まれた「フレームワーク」から構成される。このように、用語「超可変領域」は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、軽鎖可変ドメイン中の「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」、すなわち、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３由来のアミノ酸残基、と、重鎖可変ドメイン中のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ−３（Ｋａｂａｔら。１９９１）、並びに／又は、「超可変ループ」由来のこれらの残基（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、１９８７）を含む。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。異なる軽鎖（すなわち、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３及びＬ−ＦＲ４）又は重鎖（すなわち、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３及びＨ−ＦＲ４）のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。このように、「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的同一（約８５％以上、通常は９０〜９５％以上）であるフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち定常軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを位置決めし、整列させる働きをする。ＣＤＲは抗原のエピトープに結合する主要な役割を担う。
【００２０】
−本明細書中で使用される用語「抗体」及びその複数形「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、特に、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、並びに、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆａｂタンパク分解フラグメント及び一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖｓ）等の抗原結合抗体、を含む。キメラ抗体、ｓｃＦｖ及びＦａｂフラグメント等の遺伝子操作されたインタクトの抗体又はフラグメント、並びに、合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた含まれる。
【００２１】
−用語「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワークと、非ヒト（通常、マウス又はラット）免疫グロブリン由来の１又は数個のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる（ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒトＣＤＲを移植することによってヒト化すること、又は、ヒト定常領域上に全長非ヒト可変ドメインを組み込むこと（キメラ化））。定常領域は存在する必要はないが、それらがある場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。それゆえ、エフェクター機能の調整が必要とされる場合、可能性のあるＣＤＲ及び重鎖定常領域中のいくつかの残基を除いて、ヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖可変ドメイン及びヒト化重鎖可変ドメインを含む抗体である。いくつかの例において、ヒト化抗体は、適切な結合特性を増強するためにヒトフレームワーク領域内に非ヒト残基を保持してもよく、並びに／あるいは、結合親和性を向上するために、及び／又は、抗原性を減少するため、及び／又は、ヒト化の程度を増加させるため、及び／又は、抗体の生化学的／生物物理学的特性を向上させるために、いくつかのアミノ酸変異がＣＤＲ内に導入されてもよい。ヒト化抗体を通して、生物学的半減期を増加される可能性があり、ヒトへの投与の際に有害な免疫反応の可能性が減少する。
【００２２】
−用語「完全ヒト」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域とヒトＣＤＲの両方を含む、免疫グロブリンを指す。定常領域が存在することは必要ないが、もしそれらがある場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質同一、すなわち、少なくとも約８５％〜９０％、好ましくは約９５％以上同一、でなければならない。それゆえ、エフェクター機能又は薬物動態の調整が必要な場合、重鎖定常領域中の可能性のあるいくつかの残基を除いて、完全ヒト免疫グロブリンの全ての部分が、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「完全ヒト抗体」又は「完全ヒトモノクローナル抗体」は、完全ヒト軽鎖可変ドメイン及び完全ヒト重鎖可変ドメインを含む抗体である。いくつかの例において、抗体の結合親和性を向上するため、及び／又は、免疫原性を低減するため、及び／又は、生化学的／生物物理学的特性を向上するために、ＣＤＲ、フレームワーク領域、あるいは定常領域内に、アミノ酸変異が導入されても良い。
【００２３】
−用語「組換え抗体」は、アミノ酸配列が、天然抗体の配列から変化された抗体を意味する。抗体の産生における組換えＤＮＡ技術の関連性のため、天然の抗体で見出されるアミノ酸配列に限定される必要はなく、抗体は所望の性質を得るために再設計することが可能である。可能なバリエーションは多く、ちょうど１つ又は数個のアミノ酸の変化から、例えば、可変ドメイン又は定常領域の完全な再設計までの範囲である。一般的には、補体結合（例えば、補体依存性細胞傷害、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体との相互作用、及び他のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害、ＡＤＣＣ）、薬物動態学的特性（例えば、新生児Ｆｃ受容体への結合、ＦｃＲｎ）等の性質を改善、減少、変化させるために、定常領域の変化が行われる。可変ドメインの変更は、抗原結合性質を向上させるために行われる。抗体に加え、免疫グロブリンは、例えば、一本鎖若しくはＦｖ、Ｆａｂ及び（Ｆａｂ’）２、並びにダイアボディ、リニア抗体、多価若しくは多特異的ハイブリッド抗体を含む、バラエティに富む他の形態で存在しうる。
【００２４】
−本明細書で使用する用語「抗体部分」とは、インタクト（ｉｎｔａｃｔ）のフラグメント、又は、全長鎖若しくは抗体を指し、通常、結合若しくは可変領域である。該一部若しくはフラグメントは、インタクトの鎖／抗体の少なくとも一つの活性を維持しなければならない、つまり、それらは、「機能的な部分」又は「機能的なフラグメント」である。それらは、少なくとも一つの活性を維持しなければならず、それらは好ましくは、標的結合能を維持する。抗体部分（又は、抗体フラグメント）の例としては限定されないが、「一本鎖Ｆｖ」、「一本鎖抗体」、「Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」を含む。これらの用語は、全ての単一ポリペプチド鎖内における、重鎖及び軽鎖の両方由来の可変領域を含み、しかし、定常領域は欠損している抗体フラグメントを指す。一般的に、一本鎖抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインの間に、抗体結合を許容する所望の構造を形成することを可能とする、ポリペプチドリンカーをさらに含む。特定の実施形態では、一本鎖抗体は、二重特異性及び／又はヒト化することが可能である。
【００２５】
−「Ｆａｂフラグメント」は、一つの軽鎖、及び、一つの重鎖の可変ドメインとＣＨ１ドメインから構成される。Ｆａｂ分子の重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。鎖間のジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成されることができるように、一つの軽鎖と一つの重鎖を含み、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に、定常領域をより含む「Ｆａｂ’フラグメント」は、Ｆ（ａｂ′）２分子と呼ばれる。「Ｆ（ａｂ′）２」は、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖の間に形成されるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に定常領域の部分を含んだ、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含む。いくつかの重要な用語が定義されているので、本発明の特定の実施形態に注意を集中することが可能となる。
【００２６】
−本発明の文脈中における用語「治療」は、疾患の発症後、病理学的な発達の減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）、縮小（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）、及び減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）若しくは減少（ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ）を含む、疾患の進行上の任意の有益な効果を指す。
【００２７】
−用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主に対して毒性でない、任意の担体（ｃａｒｒｉｅｒ）を包含することを意味している。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質（単数又は複数）は、限定されないが、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンガー溶液等の溶媒中において、注射用の単位剤形で製剤化されてもよい。
【００２８】
−ヒトの免疫系は、無数のウイルス、微生物及びその他の脅威に対抗するために進化してきた。液性の構成要素−抗体反応−は、免疫系の武器庫の重要な構成要素である。抗体は、外来の侵入物を覆い、阻害し、処理することが可能であり、重要なことに、オフェンダーを圧迫するための一連の広範な防御をもたらす免疫エフェクター細胞を動員することができる。ヒト免疫系において、複数の抗体のクラス及びアイソタイプが存在し、おそらく侵入する病原体の性質に合わせた、エフェクター機能のパレットをそれぞれ賦与する。組換え治療用抗体は、ヒト配列から構築され、ほとんどの場合、ＩｇＧクラス由来である。現在まで、多くの治療用抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプ由来であり、２番目はＩｇＧ２及びＩｇＧ４由来である。ＩｇＧ１アイソタイプは、免疫エフェクター細胞及び補体に結合する組み込まれた能力を有するために、広い有用性を有している。抗体により仲介されるエフェクター機能及びエフェクター細胞は、主に細胞溶解（ＡＤＣＣ＝抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）、食作用（ＡＤＣＰ＝抗体依存性細胞媒介食作用）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む。これらのエフェクター機能の発明者らの理解の多くは、抗体が媒介する殺傷性のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの解析から来るものである。例えば、標的細胞（典型的には、腫瘍細胞株）と標的特異的抗体と共にヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）のインキュベーションは、何時間もの期間にわたって標的細胞の溶解をもたらす。全ての場合ではないが、ＡＤＣＣのほとんどは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって行われる。古典的なＩｇＧエフェクター機能は、適切な名称のＦｃγレセプターを通して媒介されることが決定されている（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ及びＲａｖｅｔｃｈ、２０１１）。ヒトにおいて、ＦｃγＲは、３つの活性化受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩａを含み、それらは、白血球上で変化するレベルで、独占的に発現している。ＩＴＡＭ細胞内ドメインを介した全てのシグナルは、シグナルカスケードを導き、それぞれのＦｃγＲを発現する細胞の同族のエフェクター機能を引き起こす。ＮＫ細胞は、常に排他的にＦｃγＲＩＩＩａを発現しており、この受容体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣを仲介する明確な責任がある。補体タンパク質Ｃ１ｑと共に抗体Ｆｃの関与によって引き起こされる古典的な（抗体依存）補体経路は、非細胞性及び細胞性メカニズム、並びに、補体とＦｃγＲ経路との間の相乗効果を含む。
【００２９】
＜発明の詳細な説明＞
本発明は、ＣＸＣＲ５に特異的な新規モノクローナル抗体、より具体的には、完全ヒトモノクローナル抗体の発見に基づいている。特に、それらは、ＣＸＣＲ５のヒト及びマカク（例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））形態の両方に特異的である、すなわち、それらは交差反応性である。ＣＸＣＲ５のアンタゴニストとしてのこれらの抗体は、多発性硬化症（ＭＳ）、リウマチ性関節炎（ＲＡ）又はシェーグレン症候群等の炎症性及び／又は自己免疫障害若しくは疾患を治療するために有用であり得る。それらは、膵がん、Ｂ−ＣＬＬ若しくはＣＸＣＲ５／ＣＸＣＬ１３経路に関与する他の種類のがんの治療に使用することができる。
【００３０】
本発明は、ＣＸＣＲ５、好ましくはＣＸＣＲ５のヒト及びマカク（例えば、カニクイザル）形態の両方、を認識し、結合し、調節し、及び／又は中和する、モノクローナル抗体の使用を提供する。特に、本発明は、ＣＸＣＲ５、好ましくはＣＸＣＲ５のヒト及びマカク（例えば、カニクイザル）形態の両方、に結合し、調節し、及び／又は中和する、軽鎖及び重鎖可変ドメインの使用を提供する。加えて、本発明に関するモノクローナル抗体は、ＣＸＣＲ５を介したＣＸＣＬ１３のシグナル伝達を阻害する。それらは、ＣＸＣＬ１３が誘導する細胞内カルシウム流入を阻害し、ＣＸＣＬ１３が誘導する走行性及びＣＸＣＬ１３が誘導するＥＲＫリン酸化を阻害することが可能であることが示されている（実施例の節を参照のこと）。それらはまた、初代ヒトＢ細胞に対してＡＤＣＣを仲介することが可能である。本発明による抗体は、好ましくは、除去した（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗体、すなわち、自己のＴ細胞及びＢ細胞の両方のみならず、関連する樹状細胞及びマクロファージを除去する事ができる利点を有している抗体である。それらの軽鎖及び重鎖可変ドメインは、カッパ若しくはラムダ定常ドメイン、及び、任意のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧＢ及びＩｇＭ）から選択される重鎖の定常領域へそれぞれ融合することができ、様々な宿主細胞中で発現される。好ましくは、選択される定常領域はＩｇＧであり、より好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４であり、さらに好ましくは、ＩｇＧ１である。本発明の抗体又はその一部は、グリコシル化／非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）、及び／又は、フコシル化／アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）のいずれか可能である。本発明の好ましい抗体は、低フコース含有を有する、又は、アフコシル化されており、増強されたＡＤＣＣを許容する。
【００３１】
第一の実施形態によれば、ＣＸＣＲ５に結合する本発明のモノクローナル抗体のいずれか、又はその一部は、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、並びに、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含む。好ましくは、１）重鎖可変ドメインは、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３を含み、ここで、Ｈ−ＣＤＲ１は、配列番号：８と９からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り；  Ｈ−ＣＤＲ２は、配列番号１０と１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、及び、Ｈ−ＣＤＲ３は配列番号：１２と１３からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、並びに、２）軽鎖可変ドメインは、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３を含み、ここで、Ｌ−ＣＤＲ１は、配列番号：１４と１５からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り；  Ｌ−ＣＤＲ２は、配列番号：１６と１７からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、及び、Ｌ−ＣＤＲ３は配列番号：１８と１９からなる群から選択されるアミノ酸配列から成る。さらにより好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、１）アミノ酸配列番号：８、１０及び１２、２）アミノ酸配列番号：８、１１及び１２；  又は、３）アミノ酸配列番号：９、１１及び１３、を含む、あるいは、それぞれからなる、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２及びＨ−ＣＤＲ３のセットを有する。同様に、モノクローナル抗体は、１）アミノ酸配列番号：１４、１６及び１８、２）アミノ酸配列番号：１５、１７及び１８、又は、３）アミノ酸配列番号：１５、１７及び１９、を含む、あるいは、それぞれからなる、好ましくは、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２及びＬ−ＣＤＲ３のセットを有する。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は、本明細書中で記載されるように、モノクローナル抗体又はその一部を提供し、ここで、１）モノクローナル抗体の重鎖可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３及びＨ−ＦＲ４を含み、ここで：Ｈ−ＦＲ１は、配列番号：２０のアミノ酸配列から成り、Ｈ−ＦＲ２は、配列番号：２１と２２からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、Ｈ−ＦＲ３は、配列番号２３と２４から成る群から選択されるアミノ酸配列から成り、Ｈ−ＦＲ４は、配列番号：２５のアミノ酸配列から成り；並びに、２）軽鎖可変ドメインは、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３及びＬ−ＦＲ４を含み、ここで：Ｌ−ＦＲ１は、配列番号：２６と２７と２８からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、Ｌ−ＦＲ２は、配列番号：２９と３０と３１からなる群から選択されるアミノ酸配列から成り、Ｌ−ＦＲ３は、配列番号：３２と３３から成る群から選択されるアミノ酸配列から成り、Ｌ−ＦＲ４は、配列番号３４のアミノ酸配列から成る。好ましくは、本明細書中に記載されるようなモノクローナル抗体は、１）アミノ酸配列番号：２０、２１、２３及び２５、若しくは、２）アミノ酸配列番号：２０、２２、２４及び２５、を含む、又は、からそれぞれなる、Ｈ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３及びＨ−ＦＲ４の重鎖可変ドメインセットを備え、並びに、１）アミノ酸配列番号：２６、２９、３２及び３４、若しくは、２）アミノ酸配列番号：２７、３０、３３及び３４、若しくは、３）アミノ酸配列番号：２８、３１、３３及び３４、を含む、又は、からそれぞれなる、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３及びＬ−ＦＲ４の軽鎖可変ドメインセットを備える。好ましくは、本発明のＨ−ＦＲ及びＬ−ＦＲは、上述されたＨ−ＣＤＲ及びＬ−ＣＤＲに関連する。
【００３３】
さらに他の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体又はその一部を提供するものであって、好ましくは完全ヒトモノクローナル抗体であり、ここで、重鎖可変ドメインは、配列番号：１、３、４、５１、５３、５５、５７、５９及び６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は、から成り；  軽鎖可変ドメインは、配列番号：２、５、６、７、５２、５４、５６、５８、６０、６２及び６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、又は、から成る。好ましい実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体を提供するものであって、重鎖可変ドメインは、配列番号：１、３及び４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は、から成り、軽鎖可変ドメインは、配列番号：２、５、６及び７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、又は、から成る。好ましくは、可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせは、１）配列番号：１及び２（４０Ｃ０１と呼ばれるｍＡｂ）、２）配列番号３及び７（４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３と呼ばれるｍＡｂ）、並びに、３）配列番号：４及び７（４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３と呼ばれるｍＡｂ）、からなる群から選択される。Ｆａｂの温度安定性の有意な増加は、親（ｐａｒｅｎｔａｌ）ｍＡｂ  ４０Ｃ０１（配列番号１及び２）と比較したとき、配列番号：３又は４に関するアミノ酸配列を有する可変重鎖と、配列番号：５、６又は７に関するアミノ酸配列を有する可変軽鎖とを用いることで得られる。最良の結果は、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及び４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３を用いた時に得られる。代替的な実施形態において、可変重鎖及び可変軽鎖の組み合わせもまた、配列番号：５１及び５２（最適化された４２Ｆ０３と呼ばれるｍＡｂ）、２）配列番号：５３及び５４（８０Ａ１０と呼ばれるｍＡｂ）、３）配列番号：５５及び５６（８０Ａ１１と呼ばれるｍＡｂ）、４）配列番号：５７及び５８（８０Ｂ０９と呼ばれるｍＡｂ）、５）配列番号：５９及び６０（８０Ｄ１１と呼ばれるｍＡｂ）、５）配列番号：６１及び６２（４２Ｆ０３と呼ばれるｍＡｂ）、並びに、６）配列番号：１及び６５（１２Ａ０１と呼ばれるｍＡｂ）からなる群から選択され得る。
【００３４】
本明細書において開示される重鎖可変領域配列と、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、又は、少なくとも９９％以上配列同一性を有する追加的な重鎖可変領域アミノ酸配列もまた提供される。本明細書において開示される軽鎖可変領域配列と、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、又は、少なくとも９９％以上配列同一性を有する追加的な軽鎖可変領域アミノ酸配列もまた提供される。
【００３５】
本発明の、操作されたモノクローナル抗体、好ましくは、完全ヒト抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意のクラスの抗体、並びに、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）由来の、重鎖定常領域若しくはその一部の任意のタイプを含んでもよい。抗体が細胞傷害活性を示すことが所望される場合、重鎖定常ドメインは、通常、補体固定定常ドメイン（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｆｉｘｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）であって、クラスは一般的にはＩｇＧ１クラスである。そのような細胞傷害活性が所望されない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４クラスであってもよい。操作された抗体は、複数のクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでもよい。本発明の文脈において、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４クラスが使用されうる。例えば、重鎖定常領域の以下の配列が使用されうる：１）ヒトＩｇＧの、Ｋａｂａｔらにより提唱されたＥＵインデックスで示される、ＣＨ１ドメイン中のポジション２１４におけるアルギニン、及び、ポジション３５６及び３５８のそれぞれグルタミン酸及びメチオニンを有する、アロタイプＧ１ｍ（ｆ）のＩｇＧ１（Ｐｒｅｓｓ  及びＨｏｇｇ、  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  １９７０）、２）配列番号：３９に開示されるような配列を有する、ＩｇＧ２アイソタイプ（ＷＯ２００９０１０２９０に開示される、サブタイプＨＣ２ｈ）、あるいは、３）ヒトＩｇＧ４の、Ｋａｂａｔらにより提唱されたＥＵインデックスで示される、ポジション２２８のセリン及びポジション４０９のアルギニンが、それぞれプロリンとリジンに置換されている、配列番号：４０に開示される配列を有する、Ａｎｄａｌら、１９９３に記載される、ＩｇＧ４アイソタイプ。上述の定常領域配列は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３部分等、完全若しくはその一部分のみで使用されうる。可変ドメイン及び定常ドメインの両方を含む重鎖の非限定的な例は、配列番号：７９及び８０に開示されるアミノ酸配列である。本発明の操作されたモノクローナル抗体は、任意のタイプの軽鎖免疫グロブリン定常遺伝子、すなわち、カッパ特有定常遺伝子又はラムダ定常遺伝子１、２、３、６若しくは７、を含んでも良い。例えば、軽鎖定常領域に対する以下の配列が使用され得る：配列番号：６３で記載されるもの等のラムダ定常遺伝子３、又は、配列番号：６４で記載されるもの等のカッパ定常遺伝子。可変ドメイン及び定常ドメインの両方を含む軽鎖の非限定的な例は、配列番号：８１にて開示されたアミノ酸配列である。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に記載される任意の抗体若しくはその一部をコードする単離した核酸分子、又は、ポリヌクレオチド、又は、その相補鎖若しくは縮重配列である。この点において、用語「核酸分子」、又は相互に変換可能な「ポリヌクレオチド」は、限定することなく、デオキシリボ核酸（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成ＤＮＡ等）、リボ核酸（例えば、ＲＮＡ）及び、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む、全ての異なるタイプの核酸を包含する。好ましい実施形態において、核酸分子は、二本差ＤＮＡ分子若しくはｃＤＮＡ分子等のＤＮＡ分子である。用語「単離した」とは、通常は、天然源に付随している、少なくとも一つの汚染核酸分子から同定及び分離された核酸分子を意味する。単離された核酸分子は、天然で見出される形態又は設定以外のものである。単離された核酸分子は、それゆえ、天然の細胞中に存在するような特定の核酸分子とは区別される。縮重配列は、参照ヌクレオチド配列と同様のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を指すが、遺伝的コードの縮重の結果として異なるヌクレオチド配列を含んでいる。
【００３７】
他の実施形態において、ポリヌクレオチドとも呼ばれる、核酸分子は、重鎖可変ドメイン等の、本発明のモノクローナル抗体の任意の一つの重鎖、又は、その一部をコードし、他のポリヌクレオチドは、軽鎖可変ドメイン等の、本発明の任意の一つの軽鎖、又は、その一部をコードしている。代替実施形態では、ユニークなポリヌクレオチドは、可変ドメイン若しくはＦａｂ領域等の、本発明の抗体の任意の一つの重鎖及び軽鎖の両方、又はその一部をコードしている。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４１、４３、４４、４５、４６、６６、６９、７１、７３、７５若しくは７７を含む、又は、からなる。好ましい実施形態において、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４２、４７、４８、４９、５０、６７、６８、７０、７２、７４、７６若しくは７８を含む、又は、からなる。代替実施形態においては、ユニークなポリヌクレオチドは、本発明の抗体の任意の一つの重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方をコードするものであって、ここで、該ポリヌクレオチドは、配列番号：４１、４３、４４、４５、４６、６６、６９、７１、７３、７５若しくは７７を含む、又は、からなる重鎖可変ドメインをコードし、並びに、該ポリヌクレオチドは、配列番号：４２、４７、４８、４９、５０、６７、６８、７０、７２、７４、７６若しくは７８を含む、又は、からなる軽鎖可変ドメインをコードする。配列番号：４３〜４６の５７最初のヌクレオチド、配列番号：４１〜４２、４７〜５０、６６〜７０、６９〜７５若しくは７７〜７８の６０最初のヌクレオチド、並びに、配列番号：７６の６３最初のヌクレオチド、又は、配列番号：６８の７５最初のヌクレオチドは、リーダー配列をコードする。本発明の文脈において、これらのヌクレオチドは、除去されたり、リーダー配列をコードする任意の他のヌクレオチド配列で置き換えられることができることが理解される。それゆえ、他の実施形態において、本発明の抗体の重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４１のヌクレオチド６１〜４２９、配列番号：４３のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：４４のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：４５のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：４６のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：６６のヌクレオチド６１〜３９９、配列番号：６９のヌクレオチド６１〜４３８、配列番号：７１のヌクレオチド６１〜４２０、配列番号：７３のヌクレオチド６１〜４１４、配列番号：７５のヌクレオチド６１〜４０５、若しくは、配列番号：７７のヌクレオチド６１〜３９９、を含む、又は、からなる。同様に、好ましい実施形態において、本発明の抗体の軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号：４２のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：４７のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：４８のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：４９のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：５０のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：６７のヌクレオチド６１〜３７８、配列番号：６８のヌクレオチド７６〜３９６、配列番号：７０のヌクレオチド６１〜３８４、配列番号：７２のヌクレオチド６１〜３９０、配列番号：７４のヌクレオチド６１〜３９０、配列番号：７６のヌクレオチド６４〜３８４、若しくは、配列番号：７８のヌクレオチド６１〜３８１、を含む、又は、からなる。代替実施形態においては、ユニークなポリヌクレオチドは、本発明の抗体の任意の一つの重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方をコードするものであって、該重鎖可変ドメインをコードする該ポリヌクレオチドは、配列番号：４１のヌクレオチド６１〜４２９、配列番号：４３のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：４４のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：４５のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：４６のヌクレオチド５８〜４２６、配列番号：６６のヌクレオチド６１〜３９９、配列番号：６９のヌクレオチド６１〜４３８、配列番号：７１のヌクレオチド６１〜４２０、配列番号：７３のヌクレオチド６１〜４１４、配列番号：７５のヌクレオチド６１〜４０５、若しくは、配列番号：７７のヌクレオチド６１〜３９９、を含む、又は、からなり、並びに、該軽鎖可変ドメインをコードする該ポリヌクレオチドは、配列番号：４２のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：４７のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：４８のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：４９のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：５０のヌクレオチド６１〜３８１、配列番号：６７のヌクレオチド６１〜３７８、配列番号：６８のヌクレオチド７６〜３９６、配列番号：７０のヌクレオチド６１〜３８４、配列番号：７２のヌクレオチド６１〜３９０、配列番号：７４のヌクレオチド６１〜３９０、配列番号：７６のヌクレオチド６４〜３８４、若しくは、配列番号：７８のヌクレオチド６１〜３８１、を含む、又は、からなる。
【００３９】
遺伝暗号の縮重のために、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、最適化されることができることが理解される。それゆえ、本明細書中で開示される重鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、若しくは、少なくとも９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、上で挙げられた好ましいポリヌクレオチド配列等も提供される。同様に、本明細書中で開示される軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、若しくは、少なくとも９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列、例えば、上で挙げられた好ましいポリヌクレオチド配列等も提供される。
【００４０】
本発明のさらなる実施形態は、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）又はＦａｂ領域等の、本明細書中に記載された任意の抗体、又は、その一部をコードするＤＮＡを含むベクターである。ベクターは、任意の原核細胞若しくは真核細胞において、組み込み又は自立複製する、機能的な、任意のクローニングベクター、又は、発現ベクターであってよい。とりわけ、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、エピソーム、人工染色体等であってよい。ベクターは、重鎖及び軽鎖の両方に対してコードする配列の全体若しくは一部、又は、軽鎖及び重鎖をコードする配列のいずれか、若しくは、その一部、を含んでもよい。ベクターは、重鎖及び軽鎖の両方、及びその一部に対してコードする配列を含むべきであり、これらのコードする配列は、それぞれ、プロモーターに対して実施可能なように連結されてもよい。プロモーターは、重鎖及び掲載をコードする配列、又はその一部に対して、同じ、又は異なっても良い。重鎖及び軽鎖に対するコードする配列、又はその一部が、好ましくは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されてもよい場合、重鎖及び軽鎖をコードする配列、又はその一部は、一つの単一プロモーターに実施可能なように連結されてもよい。真核生物の遺伝子発現に適したプロモーターは、例えば、当業者によく知られている、マウス若しくはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス双方向性（ｂｉ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、又は、ヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ−１α）プロモーター等の、ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。ベクターは、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、複製起点、インシュレーター等のような、調節因子を含んでも良い。一般的に、ＤＮＡは、当該技術分野で公知の技術を用いて、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数又は複数）に挿入される。これらの構成の１又は複数を含む最適なベクターの構築は、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を採用する。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態は、組換え宿主細胞であって、該細胞は、上記で定義された、１若しくは複数の核酸分子（単数又は複数）／ポリヌクレオチド（単数又は複数）、又は、１若しくは複数のベクター（単数又は複数）、を含む。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であってよい。原核細胞の例は、大腸菌等の細菌を含む。真核生物の例は、任意の初代細胞培養（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、又は、確立された細胞株（例えば、３Ｔ３、Ｖｅｒｏ、ＨＥＫ２９３、ＴＮ５、等）を含む、酵母細胞、植物細胞、哺乳類細胞、及び、昆虫細胞である。グリコシル化タンパク質の発現に最適な宿主細胞は、多細胞生物由来である。好ましい有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０及びＣＯＳ細胞を含む。本発明の抗体は、組換え技術、化学的合成、クローニング、ライゲーション、又はその組み合わせ等の、当該技術で公知の技術によって製造されてもよい。低グリコシル化レベルを有する抗体、アグリコシル化抗体、又は、アグリコシル化Ｆｃ部分等の、アグリコシル化されたその一部を得るために必要とされるべき場合、酵母発現系若しくは工学的／糖鎖工学的、ＣＨＯ細胞株が有利に使用することができる。同様に、低フコシル化レベルを有する抗体、アフコシル化抗体、又は、アフコシル化Ｆｃ部分等の、アフコシル化されたその一部、を得るために必要とされるべき場合、操作された／糖鎖操作された酵母発現系、又は、操作された／糖鎖操作されたＣＨＯ細胞株が、有利に使用されることができる。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、それゆえ、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）又は、Ｆａｂ領域等の本発明の抗体を製造する方法であって、該方法は、本明細書中に記載される任意の抗体又はその一部をコードする核酸分子（単数又は複数）の発現を許容する条件下において、本発明の組換え宿主細胞を培養し、及び、製造されたポリペプチド（単数又は複数）を回復し／単離すること、を含む。製造されるポリペプチド（単数又は複数）は、グリコシル化されている、若しくはされていなくてもよく、フコシル化されている、若しくはされていなくてもよく、又は、使用される宿主細胞に依存した他の翻訳後修飾を含んでいてもよい。本発明の抗体、若しくはその一部を製造する方法は、さらに、抗体若しくはその一部を精製する工程、及び／又は、該抗体若しくはその一部を、医薬組成物へと配合する工程、をさらに含んでも良い。
【００４３】
可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域等の、抗体の一部を含む、本明細書で記載される抗体をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）を準備するための他の方法は、当該技術分野で周知である。総ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート抽出物を使用して準備し、続いて、ＣｓＣｌ勾配中で遠心分離によって単離されることができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ＪＭ  ら１９７９）。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ（Ａｖｉｖ  Ｈら、１９７２）の方法を使用して総ＲＮＡから準備される。相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、公知の方法を使用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから準備される。あるいは、ゲノムＤＮＡが単離されることができる。ＣＸＣＲ５抗体若しくはその部分をコードするポリヌクレオチドは、その時、例えば、ハイブリダイゼーションやＰＣＲによって同定され、単離される。可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域等の、抗体の一部を含む、本明細書で記載される抗体は、組換え技術、化学的合成、クローニング、ライゲーション若しくはその組み合わせ等の、当該技術で公知の任意の技術によって製造されてもよい。多くの書籍や総説が、ベクター及び原核若しくは真核宿主細胞を用いて、組換えタンパク質をクローン化し、製造する方法の技術を提供する。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のモノクローナル抗体、又は、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域等の抗体の一部を含む医薬組成物である。好ましくは、該医薬組成物は、緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、担体、希釈剤、溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）等の、少なくとも一つの追加的な賦刑剤を、さらに含む。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、若しくはシェーングレン症候群、並びに、膵がん、Ｂ−ＣＬＬ若しくはＣＸＣＲ５／ＣＸＣＬ１３経路が関与する他の形態のがんのような、炎症性若しくは自己免疫疾患／障害の診断、予防及び／又は治療（局所又は全身的）において有用である。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体とともに投与されてもよい。
【００４６】
他の局面において、本発明は、薬剤として使用するための、本発明のモノクローナル抗体、又は、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域等の、その一部を提供する。特に、それらは、炎症性又は自己免疫疾患／障害の治療のために使用される。好ましくは、該障害／疾患は、ＭＳ、ＲＡ又はシェーングレン症候群から選択される。他の局面において、本発明は、患者における疾患を治療するための方法を提供するものであって、本発明の医薬組成物、又は、任意の一つの抗体若しくはその一部を患者に投与すること、を含んでいる。好ましくは、ＭＳ、ＲＡ又はシェーングレン症候群等の、炎症性若しくは自己免疫疾患／障害である。さらなる局面において、本発明は、がんを治療する方法に関するものであって、本発明の医薬組成物、又は、任意の一つの抗体若しくはその一部を患者に投与すること、を含んでいる。好ましくは、がんは、膵がん、Ｂ−ＣＬＬ又はＣＸＣＲ５／ＣＸＣＬ１３経路が関与する任意のタイプのがんである。
【００４７】
他の局面において、本発明は、炎症性若しくは自己免疫疾患／障害、並びに、がんの治療のための薬剤を製造するための本発明の抗体の使用を提供する。好ましくは、該炎症性又は自己免疫障害／疾患は、ＭＳ、ＲＡ又はシェーングレン症候群から選択される。好ましくは、該がんは、膵がん、Ｂ−ＣＬＬ又はＣＸＣＲ５／ＣＸＣＬ１３経路を含む任意のタイプのがんである。
【００４８】
本発明の医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等の、任意の適切な方法によって投与することができる。
【００４９】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、皮内）投与のために、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容しうる非経口溶媒（ｖｅｈｉｃｌｅ）（例えば、水、整理食塩水、デキストロース溶液）、及び、等張性を維持する添加剤（例えば、マンニトール）若しくは化学的安定性を維持する添加剤（例えば、例えば、防腐剤及び緩衝液）と関連して、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として製剤化され得る。製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。固定に投与される用量は、薬物動態特性、投与経路、患者の状態及び特徴（特に、性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、併用療法、治療の頻度、及び、所望の効果に依存して変わる。本発明の抗体、又は、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域等の、抗体の一部は、製造され、製剤化され、投与され、あるいは、使用及び／又は製造する所望の方法を実施されうる他の代替する形態で使用され得る。有用な結合又は複合体は、薬物運搬の有効性の点において薬剤を改善するために生成される。この目的のために、本明細書中に記載される抗体は、ポリエチレングリコール及び他の天然若しくは合成ポリマー等の分子との活性化結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）又は複合体の形態であり得る（Ｈａｒｒｉｓ  ＪＭら、２００３）。この点において、本発明は、抗体がポリマーと結合されている、化学的に修飾された抗体を企図する。典型的には、ポリマーは、生理的環境等の水性環境中で、結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が沈殿しないように水溶性である。さらに、ポリマーの混合物は、結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を製造するために使用されうる。治療に使用される結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓｅ）は、薬学的に許容される水溶性ポリマー部分を含み得る。適切な水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ＰＥＧ、ビス−サクシニミジルカーボネーＰＥＧ、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロール、又は、他の炭水化物ベースのポリマーである。適切なＰＥＧは、約６００〜約６０，０００の分子量、例えば、５，０００、１２，０００、２０，０００及び２５，０００を含む分子量を含んでも良い。結合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、このような水溶性ポリマーの混合物も含み得る。結合物の例としては、ここで開示される任意の抗体、及び、Ｎ末端に結合したポリアルキルオキサイド部分を含む。ＰＥＧは、一つの適切なポリアルキルオキシドである。例示として、本明細書で開示される任意の抗体は、「ＰＥＧ化（ＰＥＧｌａｔｉｏｎ）」として知られる工程、ＰＥＧを用いて修飾することができる。ＰＥＧ化は、当該技術分野で公知の任意のＰＥＧ化反応によって実施されうる（Ｆｒａｎｃｉｓ  ＧＥら、１９９８）。例えば、ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いて、アシル化反応、又はアルキル化反応によって実施される。好ましくは、これらの修飾は、ヒト又はマカク（例えば、カニクイザル等）ＣＸＣＲ５に結合する抗体の能力に重大な影響を与えない。
【００５０】
本発明もまた、上述のものと機能的に同等であるヒト及び／又はマカク（カニクイザル等）ＣＸＣＲ５に対する組換え抗体、又は、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域などの抗体の一部を含む。向上された安定性及び／又は治療効果が改善する修飾された抗体、又はその一部もまた含まれる。修飾された抗体、又はその一部の例としては、著しく有害な抗原結合特性を変化させない、保存的アミノ酸残基の置換、及び、アミノ酸の１又は数個の欠損若しくは付加するものが含まれる。置換は、治療特性が維持されている限り、領域の再設計を完了するために１又は数個のアミノ酸残基を変化する、又は修飾する範囲にありうる。本発明の抗体、又はその一部は、翻訳後修飾され得る（例えば、アセチル化、酸化、脱アミノ化、ラセミ化及びリン酸化）、又は、合成的に修飾され得る（例えば、標識基の付加）。本発明の方法によって設計された、抗体、又はその一部は、実質的に抗原結合、又は他の免疫グロブリン機能に影響がない、追加的な保存的アミノ酸置換を有してもよいことが理解される。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体、又は、可変ドメイン（重及び／又は軽可変ドメイン）若しくはＦａｂ領域のような、抗体の一部は、誘導体を含み得る。例えば、しかし限定はしないが、誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／阻害基、タンパク分解切断、細胞性リガンド又は他のタンパクへの連結等による誘導体化によって、修飾された抗体、を含む。付加的に、誘導体は、一又は数個の非古典的及び／又は非天然アミノ酸を含んでもよい。本発明のモノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体の間の相互作用に関連することが同定されるアミノ酸残基の修飾（例えば、代替、欠損、又は付加）によって増大させることができる。
【００５２】
学術論文又は要約、特許出願又は他の参考文献を含む、本明細書中で引用される全ての参考文献は、引用される参考文献中に提示される全てのデータ、表、図及びテキストを含む、本明細書中で参照として、全て援用される。追加的に、本明細書中で引用される参考文献中で引用される参考文献の全ての内容も、参照によって全て援用される。
【００５３】
特定の実施形態の前述の説明は、他の者が、当該技術分野の技術内の知識（本明細書中で引用される参考文献の文脈を含む）を適用することによって、過度の実験をすること無く、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、容易に修正及び／又は適合することができる、本発明の一般的な性質を完全に明らかにする。それゆえ、このような適用及び修正は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づき、開示された実施形態の均等の範囲内であることが意図される。本明細書の用語（ｐｈｒａｓｅｏｌｏｇｙ）又は用語法（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、説明の目的であり、限定するものではないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、可変重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示し、２つのバリアントの間のフレームワーク領域及びＣＤＲのアミノ酸配列と、ヒト生殖系列免疫グロブリン重可変３−２３（ＩＧＨＶ３−２３＊０１）及びヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖結合グループ４（ＩＧＨＪ４＊０２）との違いを示す。
【図２】図２は、可変軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示し、３つのバリアントの間のフレームワーク領域及びＣＤＲのアミノ酸配列と、ヒト生殖系列免疫グロブリン軽可変１−２７（ＩＧＫＶ１−２７＊０１）及びヒト生殖系列免疫グロブリンカッパ結合グループ５（ＩＧＫＪ５＊０１）の違いを示す。
【図３】４０Ｃ０１ｍＡｂの３形態（４０Ｃ０１ＶＨ−ＶＬ、４０Ｃ０１ＶＨ１−Ｖｋ１及び４０Ｃ０１ＶＨ１−Ｖｋ２）に対するＤＳＣ解析結果。４つの完全ヒトＩｇＧ１抗体、抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１親分子（４０Ｃ０１  ＶＨ−ＶＬ）、軽鎖変異体１（ＶＨ１−Ｖｋ１）と対になった抗ＣＸＣＲ−５  ４０Ｃ０１重鎖変異体１、軽鎖変異体２と対になった抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１重鎖変異体１、及びアイソタイプコントロールの熱アンフォールディング曲線。Ｆａｂアンフォールディング遷移が高度に可変である一方、４つのＩｇＧ１構築物の全てについてのＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアンフォールディング遷移は、同一である。
【図４】４０Ｃ０１  ＶＨ１−Ｖｋ３及び４０Ｃ０１ＶＨ２−Ｖｋ３変異体について得られたサーモプロファイル。３つの完全ヒトＩｇＧ１抗体、軽鎖変異体３（ＶＨ１−Ｖｋ３）と対をなした抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１重鎖変異体１、軽鎖変異体３（ＶＨ−Ｖｋ３）と対をなした抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１重鎖変異体２及びアイソタイプコントロールの熱アンフォールディング曲線。抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１変異体の両者に対するＦａｂアンフォールディング遷移が、アイソタイプコントロールに対するものよりも、高い（８０℃以上）一方、４つのＩｇＧ１構築物の全てについてのＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアンフォールディング遷移は、同一である。
【図５ａ−５ｄ】ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の軽視での全抗体を発現する抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及び４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体による、ヒト（パネルＡ〜Ｆ）及びカニクイザル（Ｇ〜Ｈ）ＣＸＣＲ５発現Ｌ１．２細胞のＣＸＣＬ１３が刺激する走行性の阻害。結果は、基礎活性（培地のみ）及び、１０ｎＭ  ＣＸＣＬ１３で得られる最大反応（１００％）で正規化された。表示されるデータは、３回の独立した実験の代表である。全ての点において、３連で行った（エラーバーは、＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す）。
【図５ｅ−５ｈ】ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の軽視での全抗体を発現する抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及び４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体による、ヒト（パネルＡ〜Ｆ）及びカニクイザル（Ｇ〜Ｈ）ＣＸＣＲ５発現Ｌ１．２細胞のＣＸＣＬ１３が刺激する走行性の阻害。結果は、基礎活性（培地のみ）及び、１０ｎＭ  ＣＸＣＬ１３で得られる最大反応（１００％）で正規化された。表示されるデータは、３回の独立した実験の代表である。全ての点において、３連で行った（エラーバーは、＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍを示す）。
【図６】図６は、ＩｇＧ１のような全体の抗体形式で発現された抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３（パネルＡ）及び４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３（パネルＢ）変異体により引き起こされる、ヒトＣＸＣＬ１３で刺激された初代ヒトＢ細胞の走行性の阻害の代表的な例を示す。結果は、ＩＣ50（半最大阻害濃度）として示される。値は、それぞれ、８回（４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３）及び５回（４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３）の独立した実験の平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍである。
【図７】ヒトＣＸＣＲ５を安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３Ｔに対するＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｒｏｒ６４７標識抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１変異体の結合
【図８】全血中のヒトＢ細胞に対するＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｒｏｒ６４７標識抗−ＣＸＣＲ５
【図９】全血中のカニクイザルＢ細胞に対する抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１変異体の結合
【図１０】抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂによるヒト全血中のＢ細胞のＣＸＣＬ１３が刺激するＥＲＫリン酸化の阻害
【図１１】抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂによるカニクイザル全血中のＢ細胞のＣＸＣＬ１３が刺激するＥＲＫリン酸化の阻害
【図１２】ＫｉｎＥｘＡ方法論を用いた、ＣＸＣＲ５発現細胞膜に対する、抗ＣＸＣＲ５ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３変異体のＫDの決定。ＣＸＣＲ５−ＨＥＫ−２９３細胞（５×１０6／ｍＬ）は連続的に希釈され、０．０２％ＮａＮ3の存在下において、抗ＣＸＣＲ５ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３の活性化結合サイト濃度、３０ｐＭ（黒菱形）又は３００ｐＭ（白丸）と共にインキュベートされ、平衡化させた。上清中に残存したフリーのｍＡｂを測定した。（Ａ）抗原濃度に対するフリーｍＡｂの％がプロットされている（１０-9Ｍ抗原と等しくなるように任意に各１００万細胞を採取）。未知の抗原を使用した複数の曲線分析（「ｎ−曲線解析」）が、ＫD及び抗原乗数（ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）に対する最適な値を決定するために実施された（それぞれ、Ｂ及びＣ）。９５％信頼区間は、最適な値における他のパラメータは維持する一方、ＫD又は抗原乗数（ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）に対する最適な値の反復した変化によって決定された。
【図１３】ＫｉｎＥｘＡ方法論を用いた、ＣＸＣＲ５発現細胞膜に対する、抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体のＫDの決定。ＣＸＣＲ５−ＨＥＫ−２９３細胞（５×１０6／ｍＬ）は連続して希釈され、０．０２％ＮａＮ3の存在下で、抗ＣＸＣＲ５ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３の活性化結合サイト濃度、１００ｐＭ（黒菱形）又は１ｎＭ（白丸）と共にインキュベートされ、平衡化させた。上清中に残存したフリーのｍＡｂを測定した。（Ａ）抗原濃度に対するフリーｍＡｂの％がプロットされている（１０-9Ｍ抗原と等しくなるように任意に各１００万細胞を採取）。未知の抗原を使用した複数の曲線分析（「ｎ−曲線解析」）が、ＫD及び抗原乗数（ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）に対する最適な値を決定するために実施された（それぞれ、Ｂ及びＣ）。９５％信頼区間は、最適な値における他のパラメータは維持する一方、ＫD又は抗原乗数（ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）に対する最適な値の反復した変化によって決定された。
【図１４】５１Ｃｒ標識ヒトＢ細胞を標的とする末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から精製したヒトＮＫ細胞の抗−ＣＸＣＲ５媒介抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【図１５】ヒト（パネルＡ）又はカニクイザル（パネルＢ）ＣＸＣＲ５のいずれかを発現する５１ＣＲ標識Ｌ１．２細胞を標的とするヒトＰＢＭＣの抗ＣＸＣＲ５媒介ＡＤＣＣ。同様のエフェクター／標的細胞の混合物は、同じアッセイ条件の下、標準のグリコシル化コンテント（４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１）若しくは、アフコシル化抗体（４０ＤＣ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１低フコース）のいずれかとして準備された抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂとインキュベートされた。
【図１６】抗−ＣＸＣＲ５抗体によってインキュベートされたヒトＢ細胞の除去。ヒトＰＢＭＣ（５×１０6／ｍＬ）は、示された抗体の濃度の範囲の存在にて、一晩培養された。リンパ球ゲートにおけるＣＤ１９＋の割合は、５人のドナーからフローサイトメトリーを用いて評価された。データは、アイソタイプコントロールに対するドナーごとに正規化され、５人のドナーを統合した（ＰＯＣ＝ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）。平均±ＳＥＭが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
＜配列の説明＞
配列番号：１：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１及び１２Ａ０１に対する可変重鎖（アミノ酸配列）
配列番号：２：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１に対する可変軽鎖（アミノ酸配列）
配列番号：３：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１に対する可変重鎖（アミノ酸配列）
配列番号：４：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ２に対する可変重鎖（アミノ酸配列）
配列番号：５：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−Ｖｋ１に対する可変軽鎖（アミノ酸配列）
配列番号：６：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−Ｖｋ２に対する可変軽鎖（アミノ酸配列）
配列番号：７：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−Ｖｋ３に対する可変軽鎖（アミノ酸配列）
配列番号：８〜１９：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１シリーズのＣＤＲ配列（アミノ酸配列）
配列番号：２０〜３４：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１シリーズのＦＲ配列（アミノ酸配列）
配列番号：３５：ヒトＣＸＣＲ５（アミノ酸配列）
配列番号：３６：カニクイザルＣＸＣＲ５（アミノ酸配列）
配列番号：３７：アカゲザルＣＸＣＲ５（アミノ酸配列）
配列番号：３８：重鎖定常領域−ヒトＩｇＧ１、アロタイプＧ１ｍ（ｆ）（アミノ酸配列）
配列番号：３９：重鎖定常領域−ヒトＩｇＧ２  ＤＩ−ＮＱ−ＨＣ２ｈサブタイプ（アミノ酸配列）
配列番号：４０：重鎖定常領域−ヒトＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ−Ｒ４０９Ｋサブタイプ（アミノ酸配列）
配列番号：４１：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４２：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４３：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜５７は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４４：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１に対する可変重鎖（コドン最適化核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜５７は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４５：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ２に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜５７は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４６：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ２に対する可変重鎖（コドン最適化核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜５７は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４７：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−Ｖｋ１に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４８：ｍＡｂ４０Ｃ０１−Ｖｋ２に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：４９：ｍＡｂ４０Ｃ０１−Ｖｋ３に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：５０：ｍＡｂ４０Ｃ０１−Ｖｋ３に対する可変軽鎖（コドン最適化核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：５１：ｍＡｂ最適化４２Ｆ０３に対する可変重鎖。
配列番号：５２：ｍＡｂ最適化４２Ｆ０３に対する可変軽鎖。
配列番号：５３：ｍＡｂ  ８０Ａ１０に対する可変重鎖。
配列番号：５４：ｍＡｂ  ８０Ａ１０に対する可変軽鎖。
配列番号：５５：ｍＡｂ  ８０Ａ１１に対する可変重鎖。
配列番号：５６：ｍＡｂ  ８０Ａ１１に対する可変軽鎖。
配列番号：５７：ｍＡｂ  ８０Ｂ０９に対する可変重鎖。
配列番号：５８：ｍＡｂ  ８０Ｂ０９に対する可変軽鎖。
配列番号：５９：ｍＡｂ  ８０Ｄ１１に対する可変重鎖。
配列番号：６０：ｍＡｂ  ８０Ｄ１１に対する可変軽鎖。
配列番号：６１：ｍＡｂ  ４２Ｆ０３に対する可変重鎖。
配列番号：６２：ｍＡｂ  ４２Ｆ０３に対する可変軽鎖。
配列番号：６３：軽鎖定常領域−ラムダ定常遺伝子３（アミノ酸配列）。
配列番号：６４：軽鎖定常領域−カッパユニーク定常遺伝子（アミノ酸配列）。
配列番号：６５：ｍＡｂ  １２Ａ０１に対する可変軽鎖。
配列番号：６６：ｍＡｂ最適化４２Ｆ０３に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：６７：ｍＡｂ最適化４２Ｆ０３に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：６８：ｍＡｂ  ８０Ａ１０に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜７５は、リーダー配列をコードする。
配列番号：６９：ｍＡｂ  ８０Ａ１０に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７０：ｍＡｂ  ８０Ａ１１に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７１：ｍＡｂ  ８０Ａ１１に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７２：ｍＡｂ  ８０Ｂ０９に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７３：ｍＡｂ  ８０Ｂ０９に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７４：ｍＡｂ  ８０Ｄ１１に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜７５は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７５：ｍＡｂ  ８０Ｄ１１に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７６：ｍＡｂ  ４２Ｆ０３に対する可変軽鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６３は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７７：ｍＡｂ  ４２Ｆ０３に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７８：ｍＡｂ  １２Ａ０１に対する可変重鎖（核酸配列）。この配列のヌクレオチド１〜６０は、リーダー配列をコードする。
配列番号：７９：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−ＩｇＧ１に対する可変重鎖（アミノ酸配列）
配列番号：８０：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−ＩｇＧ２＿ＤＩ−ＮＱ−ＨＣ２ｈ−サブタイプに対する重鎖（アミノ酸配列）
配列番号：８１：ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−Ｖｋ３−ｃ−カッパに対する軽鎖（アミノ酸配列）
【実施例】
【００５６】
＜実施例１−発見＞
１．１．ヒト及びマカクＣＸＣＲ５発現安定細胞株の製造
ヒトＣＸＣＲ５をコードするコドン最適化ＤＮＡ（ＮＣＢＩ参考文献  ＮＭ＿００１７１６．３、配列番号：３５のアミノ酸配列をコードする）、及び、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＸＣＲ５（配列番号：３６参照）は、Ｃ末端タグ有り又は無しで遺伝子合成によって製造された。カニクイザルＣＸＣＲ５に対する配列は、公的データベースでは入手できなかった。ｃＤＮＡ配列は、それゆえ、ヒトＣＸＣＲ５及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（ＮＣＢＩ参照  ＸＭ＿００１１０００１７．２、配列番号：３７のアミノ酸配列をコードする）を基にした縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより、カニクイザル脾臓ＤＮＡ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ社より購入した）からクローン化した。全長ＤＮＡは、哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングされた。コドン最適化ｈＣＸＣＲ５を過剰発現する安定な細胞株：チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−ｈＣＸＣＲ５；イヌ胸腺細胞株Ｃｆ２Ｔｈ−ｈＣＸＣＲ５；ハムスター線維芽細胞株Ｒ１６１０−ｈＣＸＣＲ５；ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３−ｈＣＸＣＲ５、及び、コドン最適化カニクイザルＣＸＣＲ５：チャイニーズハムスター卵巣細胞ｃＣＸＣＲ５−ＣＨＯは、ジーンポーター（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社）等の市販のトランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションすることによって得られた。トランスフェクトされたＣＸＣＲ５遺伝子が発現する細胞は、ネオマイシン（Ｇ４１８）で選択された。ネオマイシン耐性で、細胞表面上に高レベルのＣＸＣＲ５を発現する安定なクローンは、市販の抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂ（ｍＡｂ  １９０、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用したＦＡＣＳ解析によって同定された。
【００５７】
１．２．ＣＸＣＲ５を発現する常磁性プロテオリポソーム（ＰＭＰＬｓ）の調整
ヒト又はカニクイザルＣＸＣＲ５を含む常磁性プロテオリポソーム（Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、ＰＭＰＬｓ）は、Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖら（２０００）に記載された方法に基づいたＭＳＭが所有する技術を使用したＭＳＭタンパク技術によって調整された。簡潔には、ＣＸＣＲ５を過剰発現した細胞を集め、細胞の膜を界面活性剤の独自の混合物中で溶解した。非多孔性の常磁性ビーズの表面に、ストラプトアビジンとＣＸＣＲ５条のＣ末端タグを認識知る抗体とを共有結合させた。結合させたビーズは、可溶化した細胞溶解物からＣ末端にタグ化されたＣＸＣＲ５を捕捉するために使用された。汚染物質を除去するために、徹底的に洗浄した後、ビーズは、０．１〜１％のビオチン化ＤＯＰＥを含有する界面活性剤で可溶化した脂質と混合した。ビーズの周りに脂質二重膜が自己集合し、ＣＸＣＲ５が天然の環境へと戻る間に、界面活性剤は透析によって除去される。市販の抗−ＣＸＣＲ５−ＰＥ結合抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）は、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリー（ミリポア社）によって、正しい配置においてＣＸＣＲ５が含まれたビーズであるか（すなわち、ビーズの表面において露出された細胞外部分）を証明するために使用された。ｈＣＸＣＲ５−ＰＭＰＬを製造するために使用された条件は、カニクイザルＣＸＣＲ５に対するＰＭＰＬｓを製造するためにも使用された。
【００５８】
１．３．ファージディスプレイ技術を使用した抗−ＣＸＣＲ５抗体の製造
ファージディスプレイ技術は、標的とするＣＸＣＲ５を生じるＰＭＰＬを用いて、ＤＹＡＸ社のヒトＦａｂ−ファージ４１０抗体ライブラリーから、ＣＸＣＲ５に対する中和抗体を同定するために使用された。ヒト及びカニクイザルＣＸＣＲ５に対する選択の変更するラウンドを採用し、特異的にヒトＣＸＣＲ５に結合するＦａｂ（４〜５ラウンドの選択）若しくはヒト及びカニクイザルＣＸＣＲ５に結合する交差反応性Ｆａｂを選択するために、いくつかの異なる選択目的が採られた。
【００５９】
ラウンド３セレクションの結果から約９５３５クローン単離されたＦａｂが、発現ベクターｐＸＰ１ｓ−ＳａｃＢ（ＤＹＡＸ社）へ再フォーマットされ、本質的には、Ｈｏｅｔら（２００５）が以前記載したように、大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ細胞にて、９６又は２４ウェルプレートにて、ＩＰＴＧ（１００μＭ）を用いて１８時間インキュベートして、発現させた。可溶の分泌されたＦａｂを含む培養液は、ヒト又はカニクイザル過剰発現ＣＸＣＲ５細胞株と４０分間室温にてインキュベートすることによってスクリーニングされた。結合していないＦａｂは洗浄され、そして細胞は、抗−ｃ−Ｍｙｃマウスモノクローナル抗体（９Ｅ１０）を用いて室温にて２０分間インキュベートされた。非結合抗体は、洗い流され、細胞は、抗−マウスＩｇＧ−ＰＥ標識二次抗体で、２０分間室温にてインキュベートされた。細胞は２度洗浄され、固定され、Ｇｕａｖａ（登録商標）ＦＡＣＳプレートリーダーを用いて解析された。
【００６０】
ヒト−カニクイザルＣＸＣＲ５と交差反応を示す９７３クローンが同定された。シークエンス解析上、１６８のユニークな配列が同定され、４６はユニークな重鎖ＣＤＲ３配列を有していた（データは示さず）。全ての対象のクローンは、哺乳類細胞発現ベクターｐＴＴ５（カナダ国立研究評議会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ）、出願ＵＳ２０１１００３９３３９参照）に完全ヒトＩｇＧとして再フォーマットされ、ＨＥＫ２９３にて一時的に発現され、細胞ベースアッセイでテストするために精製された。
【００６１】
１．４．抗体発現及び精製
抗体重鎖及び軽鎖は、別々にｐＴＴ５ベクターへとサブクローニングされ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクション試薬を使用してトランスフェクションした後、懸濁培養に適したＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にて一時的に共発現させた。細胞は、５％ＣＯ2の加湿したインキュベータにて、37℃で振盪して3日間インキュベートされた。培養上清が回収され、細胞破片（ｄｅｒｉｓ）を除去するために遠心分離された。抗体は、通常の方法を使用して、プロテインＡアフィニティ−クロマトグラフィーによって細胞上清から精製され、セファデックスＧ２５で脱塩され、ＴＢＳ中で調整されるＦＬＩＰＲカルシウムアッセイを除き、全てのアッセイのために、抗体はＰＢＳ中で調整された。大量の抗体調整のために（＞４００ｍＬの培養物）、凝集物を除くために、追加的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）工程がＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００樹脂上で実施された。以下のＱＣ解析は、精製されたタンパク上で実施された：還元、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ：純度及び見せかけのＭＷの決定のためのＳＥＣ；濃度決定のためのＵＶ分光。エンドトキシンの混入の測定は、Ｅｎｄｏｓａｆｅ  ＰＴＳアッセイを使用して実施された。１〜５ｍｇの精製された抗体が、一般的には、５０ｍＬ培養物より得られた。
【００６２】
１．５．抗−ＣＸＣＲ５  Ｆａｂに対する細胞ベース結合アッセイ
ヒトＣＸＣＲ５又は種オーソログを発現する細胞株及び初代細胞への抗−ＣＸＣＲ５抗体の結合は、ＦＡＣＳによって評価された。簡潔には、約１×１０5ＣＸＣＲ５発現細胞は、０〜１００μｇ／ｍＬの範囲で抗−ＣＸＣＲ５抗体の増加する濃度を含むＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ及び０．０２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）にて懸濁し、４℃で２０分インキュベートした。細胞は、洗浄され、その後、ＰＥ標識したヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ社）を含むＦＡＣＳバッファー中にて２０分間４℃で再懸濁した。細胞はその後３回洗浄され、１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁され、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ装置（ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて解析された。抗体濃度に対するＭＦＩがプロットされ、ＥＣ50値を算出するためにグラフパッドプリズムソフトウエアが使用された。ｍＡｂ  ８０Ａ１１、８０Ａ１０、８０Ｂ０９は、ヒトＣＸＣＲ５に対して高い特異性があった（データ示さず）。４２Ｆ０３、１２Ａ０１、４０Ｃ０１及び８０ＤＮＡ１１は、ヒト及びカニクイザルＣＸＣＲ５の両方に結合しした（データ示さず）。実施例１．３にて同定された抗体は、ラット又はマウスＣＸＣＲ５に交差反応しなかった。
【００６３】
１．６．ＦＬＩＰＲカルシウム動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）アッセイ
ＣＸＣＲ５発現細胞におけるＣＸＣＬ１３によって誘導される細胞内カルシウムの動員（カルシウム流入）を阻害するための抗−ＣＸＣＲ５の能力は、カルシウム５アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用したＦＬＩＰＲアッセイで決定された。Ｒ１６１０−ｈＣＸＣＲ５細胞は、９６ウェル平底組織培養プレートにＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ社）を用いてウェルあたり４０，０００〜６０，０００細胞を播種し、加湿された５％ＣＯ２インキュベータ中にて細胞がウェルの底へ接着して１００％近くのコンフルエントの単層を形成するように３７℃で一晩培養した。細胞は、キット製造業者のプロトコールに従って、色素を載せ、その後、濃度増加した抗−ＣＸＣＲ５抗体（１μＭまで）と１時間３７℃でプレインキュベートし、洗浄し、その後、１３０ｎＭのＣＸＣＬ１３に暴露した。カルシウムの流入の変化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社のＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ  ＩＩＩ  装置で測定した。実施例１．５で同定された全ての抗体は、ＣＸＣＬ１３が誘導する細胞内カルシウム流入を阻害することができた（データ示さず）。
【００６４】
１．７．走行性アッセイ
ＣＸＣＲ５を過剰発現するＬ１．２細胞のＣＸＣＬ１３が誘導する遊走を阻害する抗−ＣＸＣＲ５抗体の能力は、走行性アッセイシステムにて決定した。ヒト又はカニクイザルＣＸＣＲ５を安定的にトランスフェクトしたマウス  プレＢ細胞株Ｌ１．２は、この目的のために作製された。５％の熱失活したＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、及び５０μＭメルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地中にて維持されたＬ１．２細胞は、哺乳類細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｈｙｇｒｏ  ＤＥＳＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ社）へクローン化されたヒト又はカニクイザルＣＸＣＲ５ｃＤＮＡをエレクトロポレーションによってトランスフェクトされた。ＣＸＣＲ５発現細胞は、６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを含む培地中で選択され、１２〜１４日後、９６ウェル組織培養プレート中で、０．３細胞／ウェルにて細胞を播種することでシングルセルクローニングされた。育ったクローンは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社の抗−ＣＸＣＲ５抗体（ｍＡｂ  １９０）を用いて、ＦＡＣＳでＣＸＣＲ５発現をテストした。ＣＸＣＲ５を高レベル発現する一つのクローン（Ｌ１．２／ＣＸＣＲ５  ｃｌｏｎｅ  １９）が、さらなる使用のために増幅された。
【００６５】
走行性アッセイのために、Ｌ１．２／ＣＸＣＲ５細胞は、０．７×１０6細胞／ｍＬにて懸濁され、抗−ＣＸＣＲ５抗体（０〜１．０μＭ）の増加する濃度で３７℃、３０分間インキュベートされた。細胞は、８μｍの孔径フィルターを有し、マイクロプレートチャンバーの底には１０ｎＭのＣＸＣＬ１３を含む、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ  ＣｈｅｍｏＴｘ９６ウェル ケモタキシスシステムの上部チャンバーに加えられた。アッセンブリは蓋がかぶせられ、５時間、５％ＣＯ2でパルス加湿空気インキュベータ中にて、３７℃でインキュベートされた。５時間後、フィルターを除去し、下部のチャンバー中に遊走した細胞は、製造業者インストラクションに従って９６ウェル平底黒プレートへ移した。移動後、黒プレートはシールされ、細胞を凍結するために−８０℃冷凍庫に１〜２時間、又は一晩静置した。細胞をその後、室温にて２０分間融解し、ＣｙＱｕａｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて染色した。蛍光は、ＳｙｎｅｒｇｙTM  Ｈ４  マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）にて測定した。蛍光は、遊走した細胞の数の割合である。走行性インデックスはそれぞれのサンプルで計算され（ＣＸＣＬ１３に反応した蛍光シグナル／ケモカイン非存在下の自発的な細胞遊走の蛍光シグナル）、抗ＣＸＣＲ５抗体の濃度の関数としてプロットした。ＩＣ50値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  プリズムソフトウエアを用いて決定した。
【００６６】
実施例１．３において同定されたユニークな重鎖ＣＤＲ３を有する４６のクローンのうち、４２は、正常に再フォーマットされ、ＩｇＧ１として発現した。少なくとも１２のクローンは、ＩＣ50値が１〜２２００ｎＭの範囲で、ＣＸＣＬ１３が誘導するＬ１．２／ＣＸＣＲ５細胞走行性を中和することができた（表１参照）。
【００６７】
＜実施例２−ｍＡｂ４０Ｃ０１の最適化＞
２．１．重鎖及び軽鎖変異体
４０Ｃ０１重鎖（配列番号：１；ＶＨ）及び軽鎖（配列番号：２；ＶＬ）は、重鎖及び軽鎖可変領域のフレームワーク領域及びＣＤＲ配列の両方を変えることで、別々に修飾された。これらの配列の変更の目的は、そのポジションで見出される最も相同性のあるヒト生殖系列の残基へとフレームワークアミノ酸残基を変異させるため、関連する細胞性アッセイにおける力価を高めるため、アスパラギン（Ａｓｎ）の異性化、Ａｓｎの脱アミド化及びメチオニン（Ｍｅｔ）酸化を防止することにより分子の製造を改善するため、又は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定されたヒトＴ細胞エピトープの抗体を除き、それによってヒトにおける潜在的な免疫原性を減少若しくは無効化するための、いずれかである。
【００６８】
２つの重鎖変異体（配列番号：３及び４）は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ４（ヒンジドメインを安定化するＳ２４１Ｐアミノ酸変更（Ａｎｇａｌら、１９９３）及び、ポジション４０９のＬｙｓを有するアロタイプを含む）、又は、修飾されたＩｇＧ２（ＷＯ２００９０１０２９０で記述されるサブタイプＨＣ２ｈ）重鎖アイソタイプとして構築され、ＶＨ１（配列番号：３に相当）及びＶＨ２（配列番号：４に相当）と表示される。ＶＨ１及びＶＨ２は、以下の変異を含む（カバット番号付けに従う；下線が引かれている残基はＣＤＲの一つに位置する）：
ＶＨ１：  Ｄ４６Ｅ−Ｄ６１Ａ−Ｍ８９Ｖ，
ＶＨ２：  Ｙ３２Ｓ−Ｄ４６Ｅ−Ｄ６１Ａ−Ｍ８９Ｖ−Ｍ９９Ｋ
【００６９】
３つの軽鎖変異体は、ヒト  カッパ鎖のバックグラウンドで構築され、Ｖｋ１、Ｖｋ２及びＶｋ３と表示される。Ｖｋ１、Ｖｋ２及びＶｋ３は、以下の変異を含む（上述のように、カバット番号付けに従い、下線が引かれている残基はＣＤＲの一つに位置する）：
Ｖｋ１：Ｋ６Ｑ−Ａ７Ｓ−Ｄ９Ｓ−Ｉ３１Ａ−Ｍ４８Ｉ−Ｈ４９Ｙ−Ａ５１Ｔ−Ｒ６５Ｓ−Ｎ７６Ｓ−Ａ８０Ｐ（配列番号：５も参照）、
Ｖｋ２：Ｒ６Ｑ−Ａ７Ｓ−Ｄ９Ｓ−Ｉ３１Ａ−Ａ４３Ｖ−Ｍ４８Ｉ−Ｈ４９Ｙ−Ａ５１Ｔ−Ｒ６５Ｓ−Ｎ７６Ｓ−Ａ８０Ｐ（配列番号：６も参照）、
Ｖｋ３：Ｒ６Ｑ−Ａ７Ｓ−Ｄ９Ｓ−Ｉ３１Ａ−Ａ４３Ｖ−Ｍ４８Ｉ−Ｈ４９Ｙ−Ａ５１Ｔ−Ｒ６５Ｓ−Ｎ７６Ｓ−Ａ８０Ｐ−Ｓ９３Ａ  （配列番号：７も参照）
【００７０】
オリジナルの及び変異体の重鎖及び軽鎖は、多くの機能的に完全なヒト抗−ＣＸＣＲ５抗体を製造するために全ての可能なペアワイズ組み合わせで組み合わせられた。
【００７１】
２．２．示差走査熱量測定（ＤＳＣ）測定
モノクローナル抗体のようなマルチドメインタンパク質の安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ、例を参照）を使用して一般的には調べられる。大きな利点の一つは、タンパク質の個別のドメインの間の相互作用の微調整として使用されることが可能であることである。ＤＳＣにより測定されるモノクローナル抗体の熱誘導アンフォールディングは、タンパク質構造を監視するために使用される不可欠なツールとなっている。その結果、観察される遷移の正しい解釈が不可欠である。
【００７２】
４つのＩｇＧモノクローナル抗体の熱誘導アンフォールディングは、中性のｐＨにてＤＳＣで監視された。得られたサーモグラムのプロファイルは、図３に示される。インタクトの抗体の４つ全てのサーモグラムは、２つのピークを示す。コントロ−ルＩｇＧアイソタイプ及びオリジナルの４０Ｃ０１−ＶＨ−ＶＬの両方に対し、アンフォールディングは、７１℃及び８３℃付近に融解温度（Ｔｍ）を有し、第二ピークの振幅よりも大きな第一ピークの振幅を有する２つの遷移を表す。インタクトのＩｇＧとその単離されたＦａｂ及びＦｃフラグメントのＤＳＣプロファイルを比較する研究の結果を基に（Ｉｏｎｅｓｃｕら、２００８）、第二の遷移が主にＣＨ３ドメインのアンフォールディングを表す一方、これらのインタクトの２つの抗体でのアンフォールディング事象は、ＦｃフラグメントのＣＨドメインの融解、及び、Ｆａｂフラグメントの融解と関連することが推測され得る。このアプローチは、Ｆａｂフラグメントが協調的な様式において展開（アンフォールド）する、つまり、唯一の遷移がＦａｂフラグメントのサーモグラムにて観察されるという仮定に依存している。
【００７３】
４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ１変異体の場合、サーモグラムは、第一のピークに対して７４．５℃付近により高いＴｍを有しているが、同一のプロファイルを有している。４０Ｃ０１ＶＨ−Ｖｋ２変異体の場合、ＤＳＣサーモグラムは、７２℃付近のＴｍを有する第一のピークの振幅よりも大きい、８３℃付近のＴｍを有する第二のピークの振幅を有する異なった融解プロファイルを有している。ＤＳＣサーモグラム中のピーク領域は、アンフォールディングの実験エンタルピーを表すので、本実施例において、第一ピークが主にＣＨ２ドメインの展開（アンフォールド）を表す一方、第二ピークは、Ｆａｂフラグメント及びＦｃフラグメントのＣＨ３ドメインアンフォールディングを表すことが推測され得る。
【００７４】
図３において、ＤＳＣ解析は、ＦａｂフラグメントのＴｍが、オリジナルの４０Ｃ０１抗体における７１℃付近から、ＶＨ１−Ｖｋ２変異体においては７４．５℃付近へ、ＶＨ１−Ｖｋ２においては８３℃まで上昇することが示される。Ｆａｂフラグメントの低安定性又は不均一性は、長期間保存や生産の一貫性に対する問題を提供しうる。それゆえ、８３℃付近のＴｍ値を有するＦａｂフラグメントを有することは、この治療用モノクローナル抗体の開発にとって有益であるとみなされ得る。ＦａｂフラグメントのＴｍにおけるこの変化は、その安定性が、可変重鎖及び軽鎖ドメインの配列によって有意に影響されることを証明する。それゆえ、重鎖に対して４０Ｃ０１  ＶＨとＶＨ１の間に起こり、軽鎖に対して４０Ｃ０１  ＶＨ、Ｖｋ１及びＶｋ２変異体の間におこる、重鎖及び軽鎖フレームワーク並びにＣＤＲ残基の変化は、ＶＨ及びＶＬドメインの間の相互作用の微調整による、分子の全体的な熱安定性を上昇している。
【００７５】
４０Ｃ０１  ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３変異体に対して得られたサーモグラムのプロファイルは、図４に示される。ＤＳＣサーモグラムは、第二ピークの振幅よりずっと小さい第一のピークの振幅を有する、４０Ｃ０１  ＶＨ１−Ｖｋ２変異体と同一の融解プロファイルを有する。第一のアンフォールディング事象は、ＦｃフラグメントのＣＨ２ドメインの融解と関連しており、第二のアンフォールディング事象は、ＦｃフラグメントのＦａｂ及びＣＨ３ドメインの融解と関連する。４０Ｃ０１  ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶｋ２−Ｖｋ３変異体の場合、第一及び第二ピークに相当するＴｍは、それぞれ、７２℃付近と８２℃付近、及び、７２℃付近と８１℃付近である。全長インタクトのＩｇＧ１分子を用いて得られるサーモグラムから計算されたＦａｂフラグメントに対する上記８１℃の推定された高いＴｍ値は、哺乳類細胞発現システムで製造された、相当する組換えＦａｂフラグメントに対して得られたＴｍ値によって確認された。４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及び４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３の組換えＦａｂフラグメントに対してＤＳＣによって得られたＴｍは、それぞれ８５．５℃及び８４．１℃であった（データは示さず）。
【００７６】
２．３．ＣＸＣＬ１３が刺激するＬ１．２−ＣＸＣＲ５細胞走行性の阻害
実験１．７に開示されたものと同様のプロトコールに従った。
図５は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４としての全抗体フォーマットで発現された、抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及び４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体によって、Ｌ１．２−ヒト及びカニクイザルＣＸＣＲ５のＣＸＣＬ１３が刺激する走行性の阻害を示す。算出されたＩＣ50（半最大阻害濃度）は、表２中で要約される。全てのテストを行ったｍＡｂは、１００％の効力で走行性を阻害した。ヒトＣＸＣＲ５に対する異なるＩｇＧアイソタイプ間で、効力の差異は認められなかった。ヒトＣＸＣＲ５の場合、４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体は、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３変異体（一桁のナノモル範囲）よりも、１０〜２０倍高い効力を有し（ナノモル以下の範囲のＩＣ50）、一方でカニクイザルＣＸＣＲ５の場合は、該変異体は、等しい効力である（ナノモル以下の範囲）。
【００７７】
二価ＩｇＧ抗体上の単一の結合部位に対する一価抗原の結合強度は、親和性として定義される。溶液中において、一価抗原に対するＩｇＧ抗体のそれぞれの結合部位の結合は独立している。しかしながら、細胞膜上のように抗原の動きが部分的に制限される時、ＣＸＣＲ５のような抗原上のエピトープは、ＩｇＧ結合部位の両方に対して空間的に近位になることがあり、一つの部位の結合が他の結合部位の結合強度を増強することがある。抗体と抗原との間の全ての結合部位の強さの合計は、アビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）と定義される。アビディティは、抗体の価数及び抗原の価数の両方によって影響される。アビディティは、それぞれの親和性の合計よりも大きくなり得る。
【００７８】
抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１変異体のアビディティが、走行性の阻害の強さにおいて役割を果たしたかどうか試験するために、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３変異体の組換えＦａｂフラグメントをヒトＣＸＣＲ５−Ｌ１．２細胞走行性の阻害のテストが行われた。発明者らは、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３の組換えＦａｂフラグメントが、それぞれ、２８８ｎＭ及び２０．９ｎＭのＩＣ50を有していることを見出し、一方で、それらに相当する全長ヒトＩｇＧは，それぞれ、０．３８ｎＭ及び０．０５ｎＭのＩＣ50であった。インタクトのＩｇＧとＦａｂフラグメントの間の走行性の阻害の効力におけるこれらの差異は、明らかに、ＩｇＧの二価性が重要な要素であることを示している（データは示さない）。
【００７９】
２．４．ヒト血清中のＣＸＣＬ１３によって誘導されるヒト初代Ｂ細胞走行性の阻害
ヒトリンパ球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号１７−１４４０−０３）を使用して、バフィーコートから単離された。Ｂ細胞は、ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ  ヒトＢ細胞単離キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＭＡＧＨ１０３）を使用して、ネガティブセレクションによって精製した。精製したＢ細胞は、３×１０6細胞／ｍＬにて、Ｂ細胞培地（２ｍＭ  グルタミン、１％非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、２５ｍｇ／ｍｌ  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、５０μＭβ−メルカプトエタノール及び１０％熱不活性化ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁され、可能性のあるｉｎ  ｖｉｖｏ脱感作を克服するために４℃にて一晩保存され（Ｈａｕｓｄｏｒｆｆら、１９９０；  Ｔｏｍｈａｖｅ  ＥＤ  １９９４）、従って、遊走する細胞の数が増加する。Ｂ細胞は、１００％の非熱不活性化ヒト血清（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カタログ番号Ｃ１１−０２０）中にて、１００μｇ／ｍＬにて開始し、０．３８ｎｇ／ｍＬまでの一連の４倍希釈の４０Ｃ０１変異体とともに３７℃で２０分間プレインキュベートした。３００ｎＭヒトＣＸＣＬ１３（内製）に対するヒトＢ細胞の遊走は、５μｍ孔径の９６ウェル走行性プレート（ＣｈｅｍｏＴｘ＃１０１−５、Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ社）を用いたＣｈｅｍｏＴｘ（登録商標）システムを使用して評価された。走行性は、加湿されたインキュベータ内で、５％ＣＯ２、２時間、３７℃で行われて許容された。遊走した細胞は、その後、新しい９６ウェルマイクロプレートに移され、数時間−８０℃で保存され、解凍され、ＣｙＱｕａｎｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カタログ番号Ｃ７０２６）を用いて染色され、そしてカウントされた。阻害パーセントは、以下の式を使用して算出した：阻害パーセント＝１００×（１−Ａｂ処理下の平均細胞数／処理なしの平均細胞数）
【００８０】
結果は、以下の式を用いて、コントロール（すなわち、ＣＸＣＬ１３誘導）遊走のパーセンテージとして表される：％Ｍ    ｄ＝（Ｍａｂ＋ＣＸＣＬ１３  −  Ｍｂｕｆｆｅｒ  ／  Ｍｃｘｃｌ１３  −  Ｍｂｕｆｆｅｒ）×１００；  Ｍは遊走、Ｍａｂ＋ｃｘｃｌ１３はａｎｔｉｂｏｄｙ＋ｃｘｃｌ１３による遊走、Ｍｂｕｆｆｅｒは、バッファーのみによる遊走を意味する、及び、Ｍｃｘｃｌ１３は、ｃｘｃｌ１３単独による遊走を意味する。ＣＸＣＬ１３の存在下での細胞の遊走の数が１００％である。基礎の遊走は、最小であることに注意すべきである（ＣＸＣＬ１３を用いて得られた最大反応の０．５％未満）。
【００８１】
図６は、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３変異体の場合、平均ＩＣ50は１．８９ｎＭであって、０．２９〜３．０９ｎＭの範囲であり、７１〜８８．５％の範囲の阻害パーセントを有することを示す。４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体の場合、平均ＩＣ50は０．３４ｎＭであって、０．０８２〜０．４７９ｎＭの範囲であり、８０．８〜９０．５％の範囲の阻害パーセントである。
【００８２】
２．５．ヒトＣＸＣＲ５安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞へのＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ｍＡｂの結合
抗ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３変異体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のモノクローナル抗体標識キット（カタログ番号Ａ２０１８６）を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素で標識された。ヒトＣＸＣＲ５を安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞への標識したｍＡｂの結合は、直接免疫蛍光アッセイによって調べられた。合計１×１０5のヒトＣＸＣＲ５を過剰発現する安定ＨＥＫ−２９３細胞は、ＦＡＣＳバッファー（１％ＢＳＡ及び０．１％ＮａＮ3を含むＰＢＳ）中で、６０μｇ／ｍＬから０．３３ｎｇ／ｍＬの範囲の３倍希釈系列のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ｍＡｂとともに、１時間、氷上でインキュベートされた。細胞はＦＡＣＳバッファーで２回洗浄され、ＦＡＣＳＣａｌｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて解析された。ＥＣ50（半最大細胞結合（％）に達する各Ａｂの濃度及び幾何学的平均蛍光強度（Ｇｅｏ  ｍｅａｎ））、及びＥＣ80は、抗体濃度の関数として、ＦＬ４蛍光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の発光）をプロットすることで算出された。これらのＥＣ50及びＥＣ80あたりは、ヒトＣＸＣＲ５陽性細胞に対する各変異体の相対的結合親和性の尺度として使用された。図７で示される結果から、発明者らは、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３それぞれに対し、２．２６ｎＭ及び４．６ｎＭのＥＣ50値を算出した。
【００８３】
２．６．全血中のヒトＢ細胞に対するＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ｍＡｂの結合
４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３  及びＶＨ２−Ｖｋ３変異体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のモノクローナル抗体標識キット（カタログ番号Ａ２０１８６）を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素で標識された。血液は、ナトリウム−ヘパリンチューブ中に採取され、２時間室温に置いた。アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）をその後、終濃度０．０１％になるように全血に添加された。６０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬの範囲の３倍希釈系列のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７標識ｍＡｂが全血サンプルへ添加され、室温で３０分間インキュベートされた。フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗−ＣＤ１９（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、カタログ番号５５５４１３）及び、抗−ヒトＣＸＣＲ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、カタログ番号ＦＡＢ３３１Ｐ）ｍＡｂ及びその各アイソタイプコントロールが、Ｂ細胞をゲーティングするため、及び、顆粒球上のＣＸＣＲ２発現をモニタリングするために、それぞれ使用された。標識された赤血球は、その後、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヒト赤血球溶解キット（カタログ番号ＷＬ１０００）で溶解され、血液細胞は、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3）中に再懸濁され、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にてフローサイトメトリーによって解析された。ＥＣ50及びＥＣ80あたりは、抗体濃度の関数として、ＦＬ４蛍光（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素の発光）をプロットすることによって算出された。図８に示された結果より、発明者らは、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３に対してそれぞれ、ＥＣ50値が、１．９２ｎＭ及び７．２２ｎＭと算出した。２つの４０Ｃ０１変異体の結合は、ＣＸＣＲ２を発現する顆粒球の集団（好中球）上では検出されなかった。
【００８４】
２．７．全血中のカニクイザルＢ細胞への抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１変異体の結合
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）血液は、ナトリウム−ヘパリンチューブ中で採取されて、室温で保存された。アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）は、最終濃度が０．０１％になるまで全血へ加えられた。５００μｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬの抗体の希釈５μＬが、４５μＬの血液に対し、二重（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で添加され、室温で３０分間インキュベートされた。赤血球は、その後、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヒト赤血球溶解キット（カタログ番号ＷＬ１０００）で溶解された。Ｆｃ受容体は、Ｉｎｎｏｖｅｘ社のＦｃ受容体ブロッカー（カタログ番号ＮＢ３０９）を使用してブロックされた。フィコエリトリン（ＰＥ）結合ヤギ抗−ヒトＦｃフラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９−１１６−０９８）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合マウスＩｇＧ２ｂ抗−ヒトＣＤ２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号５５９７７６）及びその各アイソタイプコントロールは、抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３及びＶＨ２−Ｖｋ３変異体ｍＡｂの結合を検出するため、Ｂ細胞をゲーティングするためにそれぞれ使用された。氷上での３０分間のインキュベート後、血液細胞は洗浄され、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3）中に再懸濁され、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にてフローサイトメトリーによって解析された。図９に示された結果は、５０μｇ／ｍＬにおいて、４０Ｃ０１変異体の両方は、Ｂ細胞上に発現したカニクイザルＣＸＣＲ５に対して強力かつ特異的な結合を示すことを表す。
【００８５】
２．８．抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂによる、ヒト及びカニクイザル全血からのＢ細胞中において、ＣＸＣＬ１３刺激によるＥＲＫのリン酸化の阻害
ケモカインレセプターＣＸＣＲ５に対するＣＸＣＬ１３の結合は、様々な細胞内シグナル伝達イベント、特に、ｐ４４／４２マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ（細胞外シグナル調節キナーゼ；  ＥＲＫ１／２）の一時的なリン酸化（活性化）の引き金となる。このアッセイは、フローサイトメトリーを使用して、抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１変異体による全血中のＢ細胞中のＣＸＣＬ１３刺激によるＥＲＫリン酸化の阻害を測定する。
【００８６】
血液は、ナトリウム−ヘパリンチューブで採取され、室温にて２時間、静置される。抗体の一連の希釈を該血液に添加され、３７℃にて３０分間インキュベートされる。全血中のＢ細胞は、その後、５００ｎＭのヒト又は３５０ｎＭのカニクイザルＣＸＣＬ１３を用いて、３７℃にて活性化される。シグナル伝達活性化は、２分後に、室温にて８分間、４％ホルムアルデヒド中の細胞の固定によって止められる。固定後、トライトンＸ−１００が、終濃度０．１％になるまで添加され、３５分間３７℃でインキュベートされた。細胞は、ＰＢＳで洗浄され、メタノールで固定され（５０％終濃度）及び、少なくとも１時間、−２０℃でインキュベートされる。細胞は、その後、室温まで温めるためにベンチ上に残され、洗浄され、ＦＡＣＳ染色バッファー（４％ＦＣＳ含有ＰＢＳ）中の抗−リン酸−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カタログ番号４３７０Ｓ）の１／５０希釈を加え、さらに１時間室温にてインキュベートする。細胞は、その後、ＦＡＣＳ染色バッファーで洗浄され、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ロバ抗−ウサギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カタログ番号Ａ３１５７３）の１／４００希釈と抗−ヒトＣＤ２０−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５６６３３）抗体の１／２．５希釈との混合物を添加し、氷上にて１時間インキュベートされた。細胞は、その後、洗浄され、ＦＡＣＳ染色バッファー中に再懸濁され、フローサイトメトリーで解析された。ＣＤ２０＋細胞でゲートされたリン酸−ＥＲＫ蛍光ヒストグラムが表示される（ＦＬ４）（データは示さない）。各サンプルに対して、パーセント陽性細胞が報告される。陽性細胞のパーセンテージは、抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂの濃度の関数及び算出されたＩＣ50として表される。図１０で表される結果より、ヒト血液に対し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２としての４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３に対する算出されるＩＣ50は、それぞれ、０．１７ｎＭ（パネルＤ）及び０．７３６ｎＭ（パネルＡ）；並びに、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２としての４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３に対しては、それぞれ０．４５ｎＭ（パネルＣ）及び０．８８ｎＭ（パネルＢ）であった。カニクイザル血液に対する図１１で得られた結果より、ＩｇＧ１としての４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３と４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３の両者に対する算出されたＩＣ50は、それぞれ、０．１９５ｎＭ及び１．５７ｎＭであった。得られた結果は、表３に要約される。
【００８７】
２．９．ＣＸＣＲ５発現細胞膜に対する抗−ＣＸＣＲ５ｍＡｂ変異体のＫdの決定
速度論除外アッセイ（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （ＫｉｎＥｘＡ））は、完全ヒトＩｇＧ（サブタイプＨＣ２ｈ、ＷＯ２００９０１０２９０に記載）抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１抗体変異体と安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞上に発現したヒトＣＸＣＲ５の間に平衡が確立された後に、溶液中に残存する遊離抗体の濃度を決定するために使用され、そこから、平衡解離定数（Ｋｄ）が決定された。この方法は、ＧＰＣＲのような、完全な膜タンパク質に対する抗体の親和性／結合性（アビディティ）の真の測定を提供する。
【００８８】
７つのトランスメンブレンドメインを有する完全膜タンパク質、ヒトＣＸＣＲ５を安定的に発現する、ＨＥＫ−２９３は、Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞剥離液を使用して回収され、２×１０6細胞／ｍＬで再懸濁され、１５個のファルコンチューブ中にＫｉｎＥｘＡバッファー（１ｍｇ／ｍL  ＢＳＡ及び０．０２％ＮａＮ3含有ＰＢＳ）を使用して２倍に段階希釈した。精製されたｍＡｂの適切な一定濃度は、ＫｉｎＥｘＡバッファー中で作成され、等量のｍＡｂは段階希釈された細胞とともに混合された。標準Ｋｄ値を得るために、２つの異なる濃度のｍＡｂ、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３変異体に対しては３０ｐＭ及び３００ｐＭ、４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３変異体に対しては１００ｐＭ及び１Ｍ、が試験された。細胞は、少なくとも２４時間室温にて、回転によってｍＡｂと混合された。細胞は、その後、遠心分離され、上清中に存在する遊離のｍＡｂは、ＫｉｎＥｘＡバッファー中にて、１μｇ／ｍＬ使用されるヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９−００５−００３）及びＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９結合抗−ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、ヤギ抗−ヒトＦｃ、カタログ番号１０９−４９５−０９８）でコートされたＰＭＭＡビーズ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、カタログ番号４４０１９８）を使用し、ＫｉｎＥｘＡｎｉｙｏｔｔｅ測定された。標準のＫｄは、ＫｉｎＥｘＡソフトウエアを使用することによって、及び、単一Ｋｄ値に対して同時に、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３に対しては３０ｐＭ及び３００ｐＭにて、４０’Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３に対しては１００ｐＭ及び１ｎＭにて得られる曲線にフィットする「ｎ−カーブ解析」によって得られた。溶液中に残った遊離ｍＡｂのパーセンテージは、ＫｉｎＥｘＡソフトウエアを使用することで、抗原の濃度に対してプロットされ（任意に１００万細胞ごとに１ｎＭ抗原として定義される）、シグモイド曲線が作成された。
【００８９】
４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３と４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３に対するｎ−曲線解析を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウエアによって算出されたＫｄの代表的な実験が、それぞれ、図１２及び図１３で示される。ヒト抗−ＣＸＣＲ５  ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３に対して算出されたＫｄは１５．３５ｐＭであって、９５％信頼区間においてＫｄ高（ｈｉｇｈ）で４１．８４ｐＭ及びＫｄ低（ｌｏｗ）で２．２９ｐＭであった。１１．３の抗原乗数は、細胞あたり１．６×１０5ＣＸＣＲ５受容体に変換するこの方法によって算出された。ヒト抗−ＣＸＣＲ５  ｍＡｂ  ４０Ｃ０１−ＶＨ２−Ｖｋ３に対する算出されたＫｄは、４７．０４ｐＭであって、９５％信頼区間においてＫｄ高（ｈｉｇｈ）は９２．４１であり、Ｋｄ低（ｌｏｗ）は２０．４４であった。２２．９４の抗原乗数は、細胞あたり２．８×１０6ＣＸＣＲ５受容体に変換するこの方法によって算出された。
【００９０】
２．１０．抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ２介在ＡＤＣＣ
クロム５１標識細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイは、標的としてヒトＢ細胞及びエフェクター細胞としてヒトＮＫ細胞を使用して実施された。Ｂ細胞とＮＫ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社からの各々のＭＡＣＳ細胞単離キットを使用して、ヒトＰＢＭＣから精製された。単離したＢ細胞は、その後、５１Ｃｒで標識された。細胞傷害性を測定するために、エフェクター（Ｅ）及び標的（Ｔ）細胞を１０／１  Ｅ／Ｔ比率で、抗−ＣＸＣＲ５−４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ２  ｍＡｂ、リツキシマブ（ポジティブコントロールＩｇＧｍＡｂ）、抗−ニワトリ−卵−リソザイムｍＡｂ（ネガティブコントロールＩｇＧｍＡｂ）又は培地のみを用いて、３７℃４時間共培養した。細胞溶解のパーセンテージは、公式を使用して算出した：特異的溶解のパーセンテージ＝  （（毎分の実験カウント（ｃ．ｐ．ｍ．）−自発性ｃ．ｐ．ｍ．）／（最大ｃ．ｐ．ｍ．−自発性ｃ．ｐ．ｍ．））×１００。図１４にて示された結果は、抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ２  ｍＡｂが、初代ヒトＢ細胞に対するＡＤＣＣを仲介する能力を有し、その効果は、よく記述されているＦＤＡで承認された抗−ＣＤ２０抗体、リツキシマブの効果と、勝るとはいわないまでも、同等であることを示す。
【００９１】
２．１１．アフコシル化抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩＧ１仲介ＡＤＣＣ
クロム５１標識標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイは、標的細胞としてヒト又はカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）いずれかのＣＸＣＲ５を安定的に発現するＬ１．２細胞（上記例１．７を参照）と、エフェクター細胞としてのヒトＰＢＭＣを使用して、実施された。細胞傷害性を測定するために、エフェクター（Ｅ）と標的（Ｔ）細胞を１００／１  Ｅ／Ｔ割合にて、抗−ＣＸＣＲ５−４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１  ｍＡｂ、抗−ＣＸＣＲ５−４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１低フコースｍＡｂ若しくは培地のみとともに４時間３７℃で共培養した。細胞溶解のパーセンテージは、式を使用して算出した：特異的な溶解のパーセンテージ＝  （（毎分の実験的カウント（ｃ．ｐ．ｍ．）−自発性ｃ．ｐ．ｍ．）／（最大ｃ．ｐ．ｍ．−自発性ｃ．ｐ．ｍ．））×１００。図１５に表された結果は、抗−ＣＸＣＲ５−４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ  ｍＡｂが、ヒト又はカニクイザルいずれかのＣＸＣＲ５を発現するＬ１．２標的細胞に対してＡＤＣＣを仲介するための能力を有していることを示す。さらに、同様のアッセイ条件下において、アフコシル化バージョンのこの抗体（抗−ＣＸＣＲ５−４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１＿低フコース）は、ヒト若しくはカニクイザルＣＸＣＲ５のいずれかを発現する標的細胞に対して増強されたＡＤＣＣ活性を示す。
【００９２】
２．１２．抗−ＣＸＣＲ５  ４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１はヒトＢ細胞の除去を誘導する
５名のドナー由来のヒトＰＢＭＣは、濃度範囲にわたって抗−ＣＸＣＲ５抗体又はＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体の存在下で培養された。一晩のインキュベーション後、リンパ球集団内のＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセンテージがフローサイトメーターで評価された。データは、アイソタイプコントロールに対して正規化され、各ドナーから統合された。図１６中に示されるように、発明者らは、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ２＿ＤＩ−ＮＱ−ＨＣ２ｈは、Ｂ細胞の除去の原因ではないことを観察した。しかしながら、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１及び４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１低フコースバージョンの両者とも、Ｂ細胞の除去を引き起こした。発明者らは、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１低フコースバージョンは、低濃度の該抗体がＢ細胞除去を誘導することに必要であり、より強力であることを見出した。このデータは、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１及び４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１低フコースは、Ｂ細胞の除去を誘導することができ、４０Ｃ０１−ＶＨ１−Ｖｋ３−ＩｇＧ１低フコースは増強された効力を有することを証明した。
【００９３】
【表１】
0006522585.tif 000002
【００９４】
【表２】
0006522585.tif 000003
【００９５】
【表３】
0006522585.tif 000004
【００９６】
＜参考文献＞
1) Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.
2) Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Bioi., 196: 901-917.
3) Chirgwin JM et al. (1979) Biochemistry, 18(24): 5294-9.
4) Aviv H et al. (1972) Proc Natl Acad Sci USA, 69(6):1408-12.
5) Harris JM et al. (2003) Nat Rev Drug Discov., 2(3): 214-221
6) Francis GE et al. (1998) lnt. J Hematol., 68(1): 1-18.
7) Mirzabekov et al., (2000) Please add the info of publication
8) Hoet et al., (2005) Please add the info of publication
9) Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108
10) Ionescu et al. (2008) J Pharm Sci, 97:1414-1426, 2008
11) Hausdorff et al. (1990) FASEB J. 4:2881-2889.
12) Tomhave et al. (1994) J Immunol. 153:3267-3275
13) Press and Hogg (1970) Biochem J. 117: 641-660
14) Burkle et al. (2007) Blood. 110:3316-33251
15) WO2009032661
16) WO2009010290
17) F. Nimmerjahn, et al (2011) Curr. Top. Microbiol. Immunol., 350:105-125
【図１】
0006522585.tif 000005
【図２】
0006522585.tif 000006
【図３】
0006522585.tif 000007
【図４】
0006522585.tif 000008
【図５ａ−５ｄ】
0006522585.tif 000009
【図５ｅ−５ｈ】
0006522585.tif 000010
【図６】
0006522585.tif 000011
【図７】
0006522585.tif 000012
【図８】
0006522585.tif 000013
【図９】
0006522585.tif 000014
【図１０】
0006522585.tif 000015
【図１１】
0006522585.tif 000016
【図１２】
0006522585.tif 000017
【図１３】
0006522585.tif 000018
【図１４】
0006522585.tif 000019
【図１５】
0006522585.tif 000020
【図１６】
0006522585.tif 000021
【配列表】
0006522585000001.app