(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖのヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁した状態で維持することを含む、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ由来細胞の非低温のインビトロでの保存方法であって、前記組成物が２℃から８℃の間で少なくとも２４時間維持される、保存方法。
【請求項２】
ａ）（ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、および（ｉｉ）前記ヒト血漿もしくはヒト血清または前記それらの混合物を含む組成物を提供するステップ、ならびに
ｂ）前記細胞の保存を行うために前記組成物を維持するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記提供するステップが、ａ１）前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくとも前記ヒト血漿もしくはヒト血清または前記それらの混合物で懸濁することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が、少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が少なくとも４８時間維持される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、少なくとも１２０時間維持される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヒト血漿の源が、新鮮な血漿、凍結乾燥血漿、溶媒／界面活性剤処理された血漿、新鮮な凍結血漿、解凍された血漿、またはクリオプレシピテート、寒冷上清成分、もしくは血漿濃縮物、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物であるか、あるいは前記ヒト血清が、新鮮な血清、解凍された凍結血清、または血漿から調製された血清、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記血漿濃縮物が、凍結血漿由来の濃縮物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、組成物の前記維持の間中、液体であり続け得る、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物中の前記ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物の濃度が、少なくとも５０％ｖ／ｖ、または少なくとも６０％ｖ／ｖ、または少なくとも７０％ｖ／ｖ、または少なくとも８０％ｖ／ｖ、または少なくとも９０％ｖ／ｖ、または少なくとも９９〜１００％ｖ／ｖである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物中の前記ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物の濃度が、少なくとも５０％ｖ／ｖである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物中の前記ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物の濃度が、少なくとも９９〜１００％ｖ／ｖである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物中の前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の前記濃度が、組成物１ｍＬ当たり１×１０４個から１×１０１１個、または１×１０５個から１×１０１０個、または１×１０６個から１×１０９個、または１×１０７個から１×１０８個、または２×１０７個から５×１０７個の細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物中の前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の前記濃度が、組成物１ｍＬ当たり１×１０７個から１×１０８個の細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物中の前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の前記濃度が、組成物１ｍＬ当たり２．５×１０７個の細胞である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、ｉ）前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）前記ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物から基本的になるかまたはそれからなる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、１つまたは複数の分画された血漿または血清成分をさらに補充される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＭＳＣ由来細胞が、骨前駆細胞、造骨細胞、骨細胞、造軟骨細胞、軟骨細胞、造線維細胞、線維芽細胞、線維細胞、腱芽細胞、腱細胞、または滑膜細胞を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞がヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、広くは医療分野に、より正確には、細胞療法に有用な、細胞に基づく生成物の分野にある。特に、本発明は、生存動物細胞のインビトロでの保存に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞療法のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ由来細胞などの動物細胞は、生存可能であり続け、望ましい特性を保持するために、医療のまたは医療研究の目的でそれらを使用する前に適切に保存することが必要である、細胞療法を企図する。
【０００３】
このような細胞は、大気圧での液体窒素の温度（−１９６℃）で事実上無期限に保存され得、そのため、凍結プロセスによって生じる細胞へのダメージを防ぐために、凍結保存可能な作用物質が凍結の前に細胞懸濁液に一般に添加される。しかし、非常に低い温度を連続的に維持する必要性があることから、凍結保存された細胞をその生産現場（例えば細胞療法企業）からそれらの使用現場（例えば病院）に輸送することは物流管理上（logistically）負担であり、それらの使用現場で細胞を保管し続けるためには専門的装置（例えば液体窒素タンク）が必要である。さらに、患者への投与前などの使用前に、細胞を解凍し、洗浄してあらゆる凍結保存可能な作用物質を除去し、そして適切な賦形剤組成物中に再懸濁する必要がある。このようなさらなる試料操作ステップはとりわけ、細胞の生存能力を低減させ得、細胞の汚染のリスクを増大させ得、そして試料間のばらつきを増大させ得る。
【０００４】
非低温の細胞保存方法も知られている。多くのこのような方法では、細胞は通常、典型的には約０℃から約８℃の間の範囲の温度の適切な水性液相中の細胞懸濁液として保管され得る。このような水性保管液は一般に、例えばイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、またはロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地などの、周知の組織細胞培養物成長培地に基づく。あるいは、このような水性保管液は、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ（例えば、Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡのＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、ｐＨ７．４（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｔｙｐｅ  １、ＵＳＰ））、乳酸リンゲル液（例えば、Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡのＬａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ＵＳＰ）、または、ヒト血清アルブミンを場合によって補った（例えば５％ｗ／ｖ）ハルトマン溶液などの、生理学的電解質溶液に基づき得る。
【０００５】
歴史的に、血漿または血漿含有溶液は、懸濁された状態の血球成分、特に血小板または赤血球の広範な非低温保管に使用されている。しかし、出願人の知るところでは、血清または血漿は、血球成分以外の細胞型の懸濁細胞生成物中、特にこのような細胞生成物の非低温保管のための懸濁細胞生成物中の賦形剤としては一般に用いられていない。
【０００６】
時として、１０％ｖ／ｖまたは５％ｖ／ｖ以下などの低濃度の自己血清、自己血漿、または血小板に富んだ血漿が、治療用細胞を患者に注射または注入する前に懸濁するために使用される溶液内に含まれる。他の場合では、治療用細胞を、患者に注射または注入する前に、自己血清、自己血漿、または血小板に富んだ血漿を主にまたは排他的に含有する溶液中に懸濁することができる。しかし、細胞は、患者に投与される直前に、このような血清含有または血漿含有溶液中に典型的には懸濁され、細胞懸濁液の非低温保管は検討されていない。
【０００７】
米国特許出願第２０１４／２４２１８１号明細書を含むいくつかの研究は、自己血漿または血小板に富んだ血漿で構成され包埋された治療用細胞を含有する足場の移植を伴う、骨の修復または再生のための方法を探究した。これらの研究は、懸濁細胞生成物についてもその広範な非低温保管についても考慮していない。
【０００８】
Garvican et al. (Stem Cell Res Ther, 2014, vol. 5, 94)は、４から８℃で最大７２時間培地中で懸濁保管に供されたウマＭＳＣの生存能力および増殖特性に対する様々な同種異系培地の影響を比較した。細胞の生存能力は、同種異系のウマ血漿または同種異系のウマ血清と比較して、１０％ｖ／ｖウシ胎児血清を補った等張生理食塩水またはＤＭＥＭにおいてより長い時間明らかに保存された。Ｇａｒｖｉｃａｎらによると、ウマの血漿、血清、または血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）中で７２時間保管されたウマＭＳＣの生存能力は、治療用細胞生成物について規制当局によって一般に要求される保管の際の細胞生存能力の閾値である７０％よりも著しく低かった。Ｇａｒｖｉｃａｎらは、ウマＭＳＣを生理食塩水中で最大２４時間維持することを代わりに提唱し、より長い保管期間にわたる凍結保存を提案している。
【０００９】
Ｃｏｏｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＩＮ、ＵＳＡ）製のＣｅｌｌＳｅａｌ（登録商標）系は、直接的な臨床的使用のための、凍結されていない細胞療法生成物の輸送の間の試料保護のための閉鎖系容器である（http://cellseal.cookmedical.com/wp-content/uploads/2014/04/PI-BP-SCIPOSJ-EN-201404.pdf）。自己血漿血小板溶解物中に懸濁されたウマＭＳＣをＣｅｌｌＳｅａｌ（登録商標）バイアルにパッケージし、４〜８℃で一晩輸送した。
【００１０】
国際公開第２０１４／０４９０６３号パンフレットは、対象への骨内投与用の、溶媒／界面活性剤で処理された血漿（Ｓ／Ｄ血漿）および間葉系幹細胞を含む細胞送達製剤を開示している。この製剤は、投与の際にゲルコンシステンシーを示すかまたは獲得すると想定されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、学術調査または医療の目的で有用な治療用細胞などの生存動物細胞のインビトロでの保存のためのさらなるおよび改良された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は以下を提供する。
［１］接着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖのヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁した状態で維持することを含む、細胞の非低温のインビトロでの保存方法。
［２］ａ）（ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、および（ｉｉ）上記ヒト血漿もしくはヒト血清または上記それらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）上記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）上記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくとも上記ヒト血漿もしくはヒト血清または上記それらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびに
ｂ）上記細胞の保存を行うために上記組成物を維持するステップ
を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］上記組成物が周囲温度以下で維持される、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］上記組成物が約０．１℃から周囲温度の間で維持される、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］上記組成物が約０．１℃から約２５℃の間で維持される、上記［１］または［２］に記載の方法。
［６］上記組成物が約２℃から約８℃の間で維持される、上記［１］または［２］に記載の方法。
［７］上記組成物が少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持される、上記［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］上記組成物が少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間、さらに好ましくは少なくとも９６時間、さらにより好ましくは少なくとも１２０時間、例えば少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持される、上記［７］に記載の方法。
［９］上記組成物が約２℃から約８℃の間で少なくとも４８時間、好ましくは少なくとも７２時間、さらに好ましくは少なくとも９６時間、さらにより好ましくは少なくとも１２０時間、例えば少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持される、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］ヒト血漿の源が、新鮮な血漿、凍結乾燥血漿、溶媒／界面活性剤処理された血漿、新鮮な凍結血漿、解凍された血漿、またはクリオプレシピテート、寒冷上清成分、もしくは血漿濃縮物、例えば凍結血漿の濃縮物、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物であるか、あるいは上記ヒト血清が、新鮮な血清、解凍された凍結血清、または血漿から調製された血清、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物である、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載の方法。
［１１］上記組成物が、組成物の上記維持の間中、液体であり続け得る、上記［１］から［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］上記組成物中の上記ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物の濃度が、少なくとも５０％ｖ／ｖ、好ましくは少なくとも６０％ｖ／ｖ、さらに好ましくは少なくとも７０％ｖ／ｖ、さらにより好ましくは少なくとも８０％ｖ／ｖ、さらにより好ましくは少なくとも９０％ｖ／ｖ、さらにより好ましくは少なくとも９９〜１００％ｖ／ｖである、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］上記組成物中の上記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の上記濃度が、組成物１ｍＬ当たり約１×１０４個から約１×１０１１個の細胞、または約１×１０５個から約１×１０１０個の細胞、または約１×１０６個から約１×１０９個の細胞、または約１×１０７個から約１×１０８個の細胞、または約２×１０７個から約５×１０７個の細胞、例えば約２．５×１０７個の細胞である、上記［１］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］上記組成物が、ｉ）上記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）上記ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物から基本的になるかまたはそれからなる、上記［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］上記組成物が、１つまたは複数の分画された血漿または血清成分をさらに補充される、好ましくは上記組成物がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補充される、上記［１］から［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］上記ＭＳＣ由来細胞が、骨前駆細胞、造骨細胞、骨細胞、造軟骨細胞、軟骨細胞、造線維細胞、線維芽細胞、線維細胞、腱芽細胞、腱細胞、または滑膜細胞を含む、上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載の方法。
［１７］上記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞がヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞である、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
本発明のある特定の代表的な実施形態を記載する実験の節によって確証されるように、本発明者らは、ヒト血漿またはヒト血清に基づく液体保管培地において非低温懸濁保管に供された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ由来細胞が、長期間にわたる保管の後でも、有利な細胞生成物の生存能力および安定性を示すことを明らかにした。この発見は予想外であり、とりわけ、ウマ血漿および血清が多くの他の液体培地、最も顕著には生理食塩水ほどには、２４時間にわたるウマＭＳＣの懸濁保管について満足のいくものではないと報告されているため、およびウマＭＳＣのより長い保管期間には凍結保存があらゆる事象で推奨されているためである（Ｇａｒｖｉｃａｎら）。
【００１３】
したがって、一態様において、本発明は、接着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖのヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁液した状態で維持することを含む、細胞のインビトロでの保存方法を提供する。好ましくは、本発明は、接着性ＭＳＣまたは接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖのヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁した状態で維持することを含む、細胞の非低温のインビトロでの保存方法を提供する。
【００１４】
本発明の上記のおよびさらなる態様ならびに好ましい実施形態は、以下の節および添付の特許請求の範囲に記載されている。添付の特許請求の範囲の発明の主題は、ここで本明細書に具体的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】示された保管培地中で２〜８℃で２４、４８、７２、９６、１４４、または１９２時間懸濁保存した後の、ヒトＭＳＣ由来造骨細胞（osteoblastic cell）の集団における生存細胞の割合を示す図である。ＮＡ（この図およびその後の図）：入手不可能。「標準的賦形剤」（この図およびその後の図）：５％ｗ／ｖのＨＳＡを補ったＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）、「血漿」（この図およびその後の図）：１００％Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）、「血清」（この図およびその後の図）：１００％自己血清、ＨＳＡに富んだ血清：５０％ｗ／ｖのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を補った自己血清。
【図２】示された保管培地中で２〜８℃で７２時間懸濁保存し、再播種し、そして２４時間培養した後の、ヒトＭＳＣ由来造骨細胞の光学顕微鏡画像を示す図である。
【図３】示された培地中で２〜８℃で示された時間懸濁保管した後の、ヒトＭＳＣ由来造骨細胞によるマーカー発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。結果は、それぞれのマーカーについて陽性であると考えらえる細胞の割合（％、平均±標準偏差）を示す。
【図４】細胞を有さない標準的賦形剤（上部の列）を、または標準的賦形剤（中央の列）もしくはヒト血漿（下部の列）中で２〜８℃で示された時間、懸濁液中で事前に保管されたヒトＭＳＣ由来造骨細胞を注射した１４日後の、マウス頭蓋骨内での骨形成を示す図である。蛍光色素、特に緑色のカルセインおよび黄色のテトラサイクリンの組込みに起因して、細胞注射前に石灰化した骨は比較的暗く見え、細胞注射後に石灰化した骨は比較的明るく見える。
【図５−１】（Ａ）示された培地中で２〜８℃で示された時間、懸濁された状態で事前に保管されたＭＳＣ由来造骨細胞の注射の１４日後の、マウス頭蓋骨の骨密度を示す図である。Ｙ軸は、Ｘ線画像で測定されたピクセル数を表す。
【図５−２】（Ｂ）示された培地中で２〜８℃で示された時間、懸濁された状態で事前に保管されたＭＳＣ由来造骨細胞の注射の１４日後の、マウス頭蓋骨内での骨形成を示す図である。Ｙ軸は、平均骨形成値（％で表される）を表す。○ｐ＜０．１、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において使用される場合、単数形態「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、単数形および複数形の参照の両方を含む。
【００１７】
本明細書において用いられる用語「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、および「構成される」は、「含む（including）」、「含む（includes）」、または「含有する（containing）」は、「含有する（contains）」と同義であり、かつ包括的または無制限であり、さらなる言及されていないメンバー、要素、または方法ステップを排出しない。この用語はまた、特許用語においてよく確立された意味を享有する「からなる」および「から基本的になる」も包含する。
【００１８】
エンドポイントによる数値範囲の列挙には、それぞれの範囲内に包含される全ての数値および小数部（fractions）、ならびに言及されたエンドポイントが含まれる。
【００１９】
本明細書において使用される用語「約」または「およそ」は、パラメータ、量、継続時間などの測定可能な値に言及する場合、特定された値のおよび特定された値からの変動、例えば、特定された値のおよび特定された値からの＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、さらに好ましくは＋／−１％以下、さらに好ましくは＋／−０．１％以下の変動が、このような変動が開示された発明において生じることが適切な限りにおいて包含されることを意味する。修飾語「約」が言及する値は、それ自体も具体的にかつ好ましくは開示される。
【００２０】
メンバー群の１つもしくは複数のメンバーまたは少なくとも１つのメンバーなどの、用語「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」は、さらなる例示によってそれ自体が明らかであるが、この用語は、とりわけ、前記メンバーのいずれか１つ、または前記メンバーのいずれか２つ以上、例えば、前記メンバーのいずれか≧３、≧４、≧５、≧６、または≧７など、および最大で全ての前記メンバーへの言及を包含する。別の実施例において、「１つまたは複数の」または「少なくとも１つの」は、１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上に言及し得る。
【００２１】
本明細書における本発明の背景についての議論は、本発明の内容を説明するために含まれる。これは、言及された材料のいずれかが公開された、公知である、またはいずれかの請求項の優先日の時点でいずれかの国において共通の一般知識の一部であることを承認するものではない。
【００２２】
本開示の全体を通して、様々な刊行物、特許、および公開された特許明細書が、確認的引用（identifying citation）によって参照される。本明細書において引用される全ての文献は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。特に、本明細書において具体的に言及されるこのような文献の教示または節は、参照によって組み込まれる。
【００２３】
別段の定義がない限り、技術用語および科学用語を含む、本発明の開示において使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。さらなる手引きによって、用語の定義は、本発明の教示をより良く理解するために含まれる。具体的な用語が本発明の特定の態様または本発明の特定の実施形態に関連して定義される場合、このような含意は、別段の定義がない限り、本明細書の全体を通して、すなわち本発明の他の態様または実施形態の文脈においても適用されることを意味する。
【００２４】
以下の節において、本発明の異なる態様または実施形態がより詳細に定義される。そのように定義される各態様または実施形態は、そうでないことが明らかに示されていない限り、あらゆる他の態様または実施形態と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示されるいかなる特性も、好ましいまたは有利であると示されるあらゆる他の１つまたは複数の特性と組み合わせることができる。
【００２５】
本明細書の全体を通しての「一実施形態（one embodiment）」、「一実施形態（an embodiment）」への言及は、実施形態に関連して記載されている特定の特性、構造、または特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通して様々な箇所において「一実施形態において（in one embodiment）」、「一実施形態において（in an embodiment）」という表現が存在する場合、必ずしも全てが同一の実施形態に言及している必要はないが、している可能性がある。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において、本開示から当業者に明らかであるように、あらゆる適切な様式で組み合わされ得る。さらに、本明細書において記載される一部の実施形態は他の実施形態に含まれる一部の特性を含み他の特性を含まないが、当業者には理解されるように、異なる実施形態の特性の組合せは本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成する。例えば、添付の特許請求の範囲において、請求項に記載の実施形態のいずれも、あらゆる組合せで使用することができる。
【００２６】
上記のように、本発明者らは、所与の最小量のヒト血漿またはヒト血清を含む液体保管培地において非低温懸濁保管に供された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ由来細胞が長期保管の後でも有利な細胞生成物安定性を示すことに気付いた。
【００２７】
したがって、本発明の一態様は、接着性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖ（組成物の容積に対する）のヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁した状態で維持することを含む、細胞のインビトロでの保存方法を提供する。好ましくは、本発明は、接着性ＭＳＣまたは接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖのヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁した状態で維持することを含む、細胞の非低温のインビトロでの保存方法を提供する。
【００２８】
本方法は細胞の非低温での維持を可能にし、その結果、組成物は保管の間に非凍結状態（すなわち、組成物の凍結点を上回る温度を典型的に有する液体状態）を維持する。
【００２９】
用語「組成物」、「製剤」、または「調製物」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【００３０】
本明細書において使用される用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、間葉系系統の、典型的には２つ以上の間葉系系統、例えば骨芽細胞（骨）系統、軟骨芽細胞（軟骨）系統、筋細胞（筋肉）系統、腱細胞（腱）系統、線維芽細胞（結合組織）系統、脂肪細胞（脂肪）系統、および間質生成（stromogenic）（骨髄間質）系統の細胞の生成が可能である、中胚葉由来の成体幹細胞を指す。ＭＳＣは、例えば、骨髄、骨梁、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には胎児および青年期の皮膚、骨膜、および脂肪組織から単離され得る。ヒトＭＳＣ、それらの単離、インビトロでの増殖、および分化は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号明細書、米国特許第５，８１１，０９４号明細書、米国特許第５，７３６，３９６号明細書、米国特許第５，８３７，５３９号明細書、または米国特許第５，８２７，７４０号明細書において記載されている。当技術分野において記載されているおよび当技術分野において記載されているあらゆる方法によって単離されるあらゆるＭＳＣが、本方法において適切であり得る。
【００３１】
用語ＭＳＣはまた、ＭＳＣの子孫、例えば、動物またはヒト対象の生体試料から得られたＭＳＣのインビトロまたはエクスビボでの増殖（繁殖）によって得られた子孫も包含する。
【００３２】
好ましいＭＳＣは、少なくとも骨芽細胞（骨）系統の細胞、例えば骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞など、または、少なくとも軟骨形成（軟骨）系統の細胞、例えば軟骨形成細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞、線維芽細胞（結合組織）系統の細胞、例えば線維芽細胞、線維細胞、または少なくとも滑膜細胞（滑液）もしくは腱細胞などを生成する能力を有する。
【００３３】
用語「幹細胞」は、概して、自己再生し得る、すなわち分化することなく増殖し得る、かつそれまたはその子孫が少なくとも１つの比較的さらに専門化した細胞型を生じさせ得る、専門化していないまたは比較的あまり専門化していない、かつ増殖能力のある細胞を指す。この用語は、幹細胞の子孫またはその少なくともその一部が、母幹細胞の専門化していないまたは比較的あまり専門化していない表現型、分化能力、および増殖能力を実質的に保持する、実質的に無制限の自己再生をし得る幹細胞、ならびに、制限された自己再生を示す幹細胞、すなわち、子孫またはその一部のさらに増殖および／または分化する能力が、母細胞と比較して明らかに低減している幹細胞を包含する。例として、かつ限定はしないが、幹細胞は、１つもしくは複数の系統に従って分化してますます比較的さらに専門化した細胞を生産し得る子孫（このような子孫および／またはますます比較的さらに専門化した細胞はそれ自体、本明細書において定義されるような幹細胞であり得る）を生じさせ得るか、または最終分化細胞、すなわち有糸分裂後であり得る完全に専門化した細胞さえも生じさせ得る。
【００３４】
本明細書において使用される用語「成体幹細胞」は、胎児段階、または好ましくは誕生後の（例えば、特にしかし限定はしないが、ヒト生物では、誕生後少なくとも１か月齢、例えば誕生後少なくとも２か月齢、少なくとも３か月齢、例えば少なくとも４か月齢、少なくとも５か月齢、例えば誕生後少なくとも６か月齢、例えば誕生後１年齢もしくはそれ以上、５年齢以上、少なくとも１０年齢以上、１５年齢以上、２０年齢以上、または２５年齢以上の）、例えば成人に達した後の生物内に存在するかまたはそれから得られる（例えば単離される）幹細胞を指す。例として、成体幹細胞は、さもなければ従来の用語「乳児」、「子供」、「若者」、「青年」、または「成人」で記載されるヒト対象から得ることができる。
【００３５】
本明細書において使用される用語「間葉系幹細胞由来細胞」または「ＭＳＣ由来細胞」は、ＭＳＣの分化によって得られる、特にＭＳＣのインビトロ（エクスビボを含む）での分化によって得られる間葉系系統（例えば、骨芽細胞（骨）系統、軟骨芽細胞（軟骨）系統、筋細胞（筋肉）系統、腱細胞（腱）系統、線維芽細胞（結合組織）系統、脂肪細胞（脂肪）系統、または間質生成（骨髄間質）系統）の細胞を指す。
【００３６】
ＭＳＣの分化は、所望の細胞型にＭＳＣの分化を誘発し得る条件下でＭＳＣを培養すること、より典型的には、所望の細胞型にＭＳＣの分化を誘発し得る１つまたは複数の因子（例えば成長因子）を含む培地においてＭＳＣを培養することを伴い得る。ＭＳＣの分化のプロトコールはそれ自体が公知である（とりわけ、国際公開第２００７／０９３４３１号パンフレット、さらにREGER, R.L. et al. 'Differentiation and Characterization of Human MSCs'. In: Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Edited by DJ. Prockop et al. Humana Press, 2008, Vol. 449, p. 93-107、VERMURI, M.C. et al. (Eds.). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, Vol. 698, especially pages 201 to 352を参照されたい）。
【００３７】
用語「インビトロ」は概して、動物またはヒトの身体の外側または外部を示す。用語「エクスビボで」は、典型的には、動物またはヒトの身体から除去され、身体の外側で、例えば培養管内で維持または増殖された組織または細胞を指す。本明細書において使用される用語「インビトロ」は、「エクスビボ」を含むと理解される。用語「インビボ」は概して、動物またはヒトの身体の内部、身体上、または身体内を示す。
【００３８】
ある特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨芽細胞（骨）系統、軟骨芽細胞（軟骨）系統、筋細胞（筋肉）系統、腱細胞（腱）系統、線維芽細胞（結合組織）系統、脂肪細胞（脂肪）系統、または間質生成（骨髄間質）系統の細胞を含み得る。
【００３９】
ある特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨芽細胞（骨）系統または軟骨芽細胞（軟骨）系統の細胞を含み得る。
【００４０】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨前駆細胞、造骨細胞、骨細胞、造軟骨細胞、軟骨細胞、造線維細胞、線維芽細胞、線維細胞、腱芽細胞、腱細胞、または滑膜細胞を含み得、例えば、ＭＳＣ由来細胞は、骨前駆細胞、造骨細胞、骨細胞、造軟骨細胞（chondroblastic cell）、軟骨細胞、造線維細胞（fibroblastic cell）、線維芽細胞、線維細胞、腱芽細胞（tenoblast）、腱細胞、滑膜細胞、および場合によってそれらの混合物を含むかまたはそれからなる群から選択され得る。本明細書において教示される方法のある特定の好ましい実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨前駆細胞、造骨細胞、または骨細胞を含み得、例えば、ＭＳＣ由来細胞は、骨前駆細胞、造骨細胞、骨細胞、および場合によってそれらの混合物を含むかまたはそれからなる群から選択され得る。本明細書において教示される方法のある特定のさらに好ましい実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は骨前駆細胞または造骨細胞を含み得、例えば、ＭＳＣ由来細胞は、骨前駆細胞、造骨細胞、および場合によってそれらの混合物を含むかまたはそれからなる群から選択され得る。本明細書において教示される方法のある特定のさらに好ましい実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は造骨細胞であり得る。
【００４１】
当技術分野において知られているように、骨芽細胞（骨）系統の細胞は、骨形成表現型を有する細胞型を典型的には包含し、これは、骨材料または骨基質の形成に寄与し得る細胞に寄与し得るかまたは細胞に発展し得る。本明細書において使用される場合、「骨前駆細胞」は、初期および後期骨前駆細胞を特に含み得る。「造骨細胞」は、前骨芽細胞および骨芽細胞を特に包含し得る。全てのこれらの用語はそれ自体が周知である。
【００４２】
さらなる手引きによって、限定ではないが、骨前駆細胞および造骨細胞、ならびに骨前駆細胞および／または造骨細胞を含む細胞集団は、以下の特徴を示し得る：
ａ）細胞は、骨芽細胞分化を調節する多機能転写因子であるＲｕｎｘ２の発現、および骨芽細胞分化の間の多くの細胞外基質タンパク質遺伝子の発現を含む；
ｂ）細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰの少なくとも１つの発現を含み、さらに好ましくは、オステオカルシン（ＯＣＮ）、プロコラーゲン１型アミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、オステオネクチン（ＯＮ）、オステオポンチン（ＯＰ）、および／もしくは骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）などの１つもしくは複数のさらなる骨マーカー、ならびに／またはデコリンおよび／もしくはオステオプロテグリン（ＯＰＧ）などの１つもしくは複数のさらなる骨基質タンパク質の発現も含む；
ｃ）細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、細胞の約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらに好ましくは約２％未満がＣＤ４５を発現し得る）；
ｄ）細胞は、外部環境を石灰化するか、またはカルシウム含有細胞外基質を合成する能力の証拠を示す（例えば骨形成培地に曝露される場合、Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312を参照されたい）。細胞内でのカルシウムの蓄積および基質タンパク質内への堆積は、例えば、４５Ｃａ２＋中での培養、洗浄、および再培養、次いで細胞内に存在するかもしくは細胞外基質内に堆積したあらゆる放射能の判定によって（米国特許第５，９７２，７０３号明細書）、またはアリザリンレッドに基づく石灰化アッセイを使用して（例えば、Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84を参照されたい）、従来通り測定され得る；
ｅ）細胞は、脂肪細胞系統（例えば脂肪細胞）または軟骨芽細胞系統（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）の細胞のいずれにも実質的に分化しない。このような細胞系統への分化の不存在は、当技術分野において確立された標準的な分化誘発条件（例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7を参照されたい）およびアッセイ方法（例えば、誘発されると、脂肪細胞は脂質の蓄積を示すオイルレッドＯで典型的には染色され、軟骨細胞はアルシアンブルーまたはサフラニンＯで典型的には染色される）を使用して試験することができる。脂肪生成分化および／または軟骨形成分化に対する性向を実質的に欠くことは、試験細胞の２０％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満が、それぞれの試験に適用された場合に脂肪生成分化または軟骨形成分化の兆候を示すことを典型的には意味し得る。
【００４３】
当技術分野において知られているように、軟骨芽細胞（軟骨）系統の細胞は、軟骨形成表現型を有する細胞型を典型的には包含し、これは、軟骨または軟骨性基質の形成に寄与し得る細胞に寄与し得るかまたは細胞に発展し得る。本明細書において使用される場合、「軟骨前駆細胞」は、初期および後期軟骨前駆細胞を特に含み得る。「造軟骨細胞」は、前軟骨芽細胞および軟骨芽細胞を特に包含し得る。全てのこれらの用語はそれ自体が周知である。
【００４４】
さらなる手引きによって、限定ではないが、軟骨前駆細胞および造軟骨細胞、ならびに軟骨前駆細胞および／または造軟骨細胞を含む細胞集団は、以下の特徴を示し得る：
ａ）細胞は、軟骨芽細胞分化および軟骨形成の中心的役割を有する転写因子であるＳＯＸ９の発現を含む；
ｂ）細胞は、アグリカン（ＡＧＧ）、ＩＩ型コラーゲン、またはＣＤ９０の少なくとも１つの発現を含む；
ｃ）細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、細胞の約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらに好ましくは約２％未満がＣＤ４５を発現し得る）；
ｄ）細胞は、高レベルの、ｉｎ  ｓｉｔｕでのガラス状の細胞外基質（ＥＣＭ）の主な構成要素であるＩＩ型、ＩＸ型、およびＸＩ型コラーゲン、ならびにプロテオグリカンを生産する能力の証拠を示す。軟骨形成は、例えば、グリコサミノグリカンおよび非コラーゲンタンパク質をそれぞれ染色するためのサフラニン−Ｏ／ファストグリーンアッセイを使用して従来通り測定され得る（例えば、Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98を参照されたい）；
ｅ）ヒト関節軟骨細胞は、Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-42)において概説されている細胞発現特徴を示し得、例えば、これらは、インテグリンおよび他の接着分子（ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１／６１、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、ＣＤ５８、ＣＤ４４）、テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１５１）、受容体（ＣＤ１０５、ＣＤ１１９、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０a、ＣＤ２２１、ＣＤ９５、ＣＤ１２０a、ＣＤ７１、ＣＤ１４）、細胞外酵素（ＣＤ１０、ＣＤ２６）、ならびに他の表面分子（ＣＤ９０、ＣＤ９９）を発現し得る。単層培養の間、軟骨細胞は、間葉系幹細胞に特有であると考えられている特定のマーカー（ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）を上方調節し得る。このようなマーカーは、こうして、あまり成熟していない造軟骨細胞によっても発現され得る；
ｆ）細胞は、脂肪細胞系統（例えば脂肪細胞）または骨芽細胞系統（例えば、骨芽細胞、骨細胞）の細胞のいずれにも実質的に分化しない。このような細胞系統への分化の不存在は、当技術分野において確立された標準的な分化誘発条件（例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7を参照されたい）およびアッセイ方法（例えば、誘発されると、脂肪細胞は脂質の蓄積を示すオイルレッドＯで典型的には染色され、造骨細胞はＡＬＰに典型的には染色される）を使用して試験することができる。脂肪生成分化および／または造骨分化に対する性向を実質的に欠くことは、試験細胞の２０％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満が、それぞれの試験に適用された場合に脂肪生成分化または造骨分化の兆候を示すことを典型的には意味し得る。
【００４５】
当技術分野において知られているように、線維芽細胞系統の細胞は、結合組織の形成に寄与し得る細胞に、寄与し得るかまたは細胞に発展し得る。
【００４６】
さらなる手引きによって、限定ではないが、造線維細胞は以下の特徴を示し得る：
ａ）細胞は、ＦＳＰ１（線維芽細胞特異的タンパク質１）の発現を含む；
ｂ）細胞は、コラーゲン、ビメンチン、デスミン、またはＣＤ９０の少なくとも１つの発現を含む；
ｃ）細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、細胞の約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらに好ましくは約２％未満がＣＤ４５を発現し得る）；
ｄ）細胞は、結合組織の細胞外基質を形成するためのコラーゲン、グリコサミノグリカン、細網線維および弾性線維、糖タンパク質を生産する能力の証拠を示す。線維芽細胞は、靭帯および腱の構造的完全性に寄与し、組織修復機能を有する。コラーゲンの堆積は、三重染色（Li et al. World J Gastroenterol, 2014 vol. 20(16), 4648-61）を使用して視覚化され得る。Ｉ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｓ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）およびテネイシン−Ｃ（Ｔｎ−Ｃ；ＩＢＬ−Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｉｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）は、靭帯線維芽細胞の２つのマーカーであり、ＥＬＩＳＡによってアッセイされ得る（Brissett et al. Arthritis Rheum, 2012, vol. 64(1), 272-80）。
【００４７】
当技術分野において知られているように、腱細胞系統の細胞は、腱材料または腱基質の形成に寄与し得る。腱は、コラーゲン原線維のネットワーク、ならびにコラーゲン分子において列として縦方向に横たわる滑膜細胞、内皮細胞、腱芽細胞、および腱細胞を含む異なるタイプの細胞を含む、大きな線維の束によって構成される。腱芽細胞は、代謝活性の低下を伴う加齢につれて腱細胞に分化する、未成熟形態の腱細胞である。
【００４８】
さらなる手引きによって、限定ではないが、腱細胞は以下の特徴を示し得る：
ａ）細胞は、スクレラキシス（ＳＣＸ）の発現を含み、転写因子の基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーのメンバーは、腱における細胞分化および細胞外基質の組織化に関与する；
ｂ）細胞は、テノモジュリン（ＴＮＭＤ）およびテネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）の少なくとも１つの発現を含む；
ｃ）細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５を実質的に発現するが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４６、またはｓｔｒｏ−１は発現しない；
ｄ）細胞は、腱組織の再生のためのＩ型、ＩＩＩ型、およびＶ型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ならびに弾性原線維からなる腱の細胞外成分を生産する能力の証拠を示す（Gungormus et al. Connect Tissue Res, 2008, vol. 53(6), 485-91）；
ｅ）細胞は、脂肪細胞系統（例えば脂肪細胞）、軟骨芽細胞系統（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）、または骨芽細胞系統（例えば、骨芽細胞、骨細胞）の細胞のいずれにも実質的に分化しない。
【００４９】
当技術分野において知られているように、滑膜細胞（滑液）系統の細胞は、Ａ型またはマクロファージ様滑膜細胞およびＢ型または線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＣ）を典型的には包含し、これは、滑膜および滑液の形成に寄与し得る。全てのこれらの用語はそれ自体が周知である。本明細書において使用される用語「滑膜細胞」は、このように、このような細胞型のいずれか１つを、および集合的に全てを指す。
【００５０】
さらなる手引きによって、限定ではないが、滑膜細胞は以下の特徴を示し得る：
ａ）細胞は、プロテオグリカン４（ＰＲＧ４）を分泌する能力の証拠を示し、滑液内に存在する表面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）およびヒアルロナン（ＨＡ）の主な源である（Tamer et al. Interdiscip Toxicol, 2013, vol. 6(1), 111-125）；
ｂ）Ａ型またはマクロファージ様滑膜細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＤＲ抗原、およびＦｃ受容体を含む造血由来マーカーの発現を含む。Ｂ型または線維芽細胞様滑膜細胞は、ＩＶ型およびＶ型コラーゲン、ビメンチン、およびＣＤ９０の発現を含む線維芽細胞の多くの特徴を示す間葉性の細胞である。さらに、Ｂ型細胞は、下内層の（sublining）常在性線維芽細胞を含む多くの他の線維芽細胞系統から区別するｉｎ  ｓｉｔｕでのいくつかの固有の特性を有する。例えば、カドヘリン−１１（ＦＬＳのホモタイプ凝集において鍵となる役割を有する特異的接着分子）、ＣＤ５５（崩壊促進因子）、ＶＣＡＭ−１（血管接着分子１）、およびＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）（Bartok et al. Immunol Rev, 2011, vol. 233(1), 233-255）；
ｃ）細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、細胞の約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらに好ましくは約２％未満がＣＤ４５を発現し得る）；
ｄ）細胞は、脂肪細胞系統（例えば脂肪細胞）、軟骨芽細胞系統（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）、または骨芽細胞系統（例えば、骨芽細胞、骨細胞）の細胞のいずれにも実質的に分化しない。
【００５１】
細胞が特定のマーカーについて陽性である（または特定のマーカーを発現するもしくは特定のマーカーの発現を含む）と言われる場合、これは、当業者によって、適切な測定をした場合に、適切な対照と比較して、そのマーカーについての、異なるシグナルの存在または証拠、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による抗体の検出可能性（antibody-detectable）または検出を結論付けられることを意味する。この方法によってマーカーの定量的評価が可能になる場合、陽性細胞は、概して、対照と有意に異なるシグナル、例えば、限定はしないが、対照細胞によって生成されるこのようなシグナルよりも少なくとも１．５倍高い、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、またはそれ以上高いシグナルを生成し得る。
【００５２】
上記の細胞特異的なマーカーの発現は、当技術分野において知られているあらゆる適切な免疫学的技術、例えば免疫細胞化学もしくは親和性吸着、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなどを使用して、または酵素活性（例えばＡＬＰの）のあらゆる適切な生化学的アッセイによって、またはマーカーｍＲＮＡ量のあらゆる適切な測定技術、例えば、ノーザンブロット、半定量的もしくは定量的なＲＴ−ＰＣＲなどによって、検出することができる。本開示において列挙されるマーカーの配列データは公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のデータベースから得ることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。
【００５３】
検出方法によって単一細胞レベルでマーカーの発現を評価することが可能な場合（例えばフローサイトメトリー）、および細胞がマーカーの発現を含むと言われる場合、試験細胞のサイズ判定可能な画分がマーカーについて陽性であり得、例えば、試験細胞の少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、および最大１００％が、マーカーについて陽性であり得る。
【００５４】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、動物細胞、好ましくは温血動物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞であり得る。
【００５５】
本明細書において意図されるＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は接着性であり、すなわち、成長のための表面を要し、培養培地（懸濁培養物）中の遊離浮遊細胞よりも前記表面上の接着単層（すなわち接着細胞培養物）として典型的には成長する。組織培養プラスチック容器の表面などの表面への細胞の接着は、倒立顕微鏡での目視検査によって容易に調べることができる。接着培養において成長した細胞は、細胞が表面から酵素的に（例えばトリプシンを使用して）除去され得、成長培地中に懸濁され得、新たな培養管内に再播種され得る、断続的な継代を要する。通常、そこへの細胞の接着を可能にする表面または基質は、あらゆる実質的に親水性の基質であり得る。当技術分野において知られているように、組織培養管、例えば、培養フラスコ、ウェルプレート、皿などは、親水性基質表面とするために鋳造後に適切に表面が処理または被覆された、多種多様なポリマー性材料で通常作製され得る。
【００５６】
本明細書において教示される方法は、概して、生存（生育可能）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞のインビトロでの保存に関する。好ましくは、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、機能的細胞である。
【００５７】
本明細書において使用される用語「生存細胞」または「生育可能細胞」は、それ自体が公知である試験によって生育可能であると定性され得る細胞を指し、より具体的には、分裂および増殖が可能なＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を指す。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が生存しているまたは生育可能であると言われる場合、試験細胞のサイズ判定可能な画分は生育可能であると試験判定され得、例えば、試験細胞の少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、および最大１００％が生育可能であると試験判定され得る。
【００５８】
細胞の生存能力は、当技術分野において知られている技術を使用して測定することができる。生存能力または細胞の生存を判定するための技術は、生存能力アッセイと一般に呼ばれる。例えば、細胞の生存能力は、トリパンブルー排出アッセイまたはヨウ化プロピジウム排出アッセイなどの従来の色素排出アッセイを使用して測定することができる。このようなアッセイにおいて、生育可能細胞は色素を排出し、したがって染色されないままでいるが、一方、生育不可能細胞は色素を取り込み、染色される。細胞およびその色素の取り込みは、適切な技術（例えば、従来の光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー）によって可視化され明らかにされ得、試験対象試料中の生育可能（染色されていない）細胞および生育不可能（染色された）細胞が計数され得る。細胞の生存は、生存細胞の絶対数として、または細胞の生存能力（すなわち、総（すなわち生育可能細胞および生育不可能細胞の合計）細胞に対する生育可能細胞の比率または割合（％））として都合良く表され得る。
【００５９】
本明細書において使用される用語「機能的細胞」は、その天然の細胞特性を保持し、細胞回復（例えば、表面に接着する細胞の能力）、細胞同一性（例えば、鍵となる細胞表面マーカーの発現）、および細胞の分化能（例えば骨形成特性）などのその天然の細胞機能を行い得る、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を指す。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が機能的であると言われる場合、試験細胞のサイズ判定可能な画分、例えば、試験細胞の少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、および最大１００％が、その天然の細胞特性を保持し得る。
【００６０】
細胞の機能性は、当技術分野において知られている技術を使用して測定することができる。細胞の機能性を判定するための技術には、細胞回復、細胞同一性、および分化能などの公知の細胞機能を測定するためのアッセイが含まれる。
【００６１】
例えば、細胞回復は、培養において所定の時間（例えば２４時間）後に組織培養プラスチック表面に付着するＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の数または画分（％）を判定することによって測定することができる。接着細胞は、従来の光学顕微鏡法によって可視化することができる。細胞の可視化を改良するために、適切な染色方法、例えばロマノフスキー型染色を使用することができる。
【００６２】
例えば、細胞同一性は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を特徴付ける鍵となる細胞表面マーカーの発現を検出することによって判定することができる。理想的には、本明細書において教示されるインビトロでの保存方法に供されるＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞におけるマーカーの発現は、インビトロでの保存方法に供されていないＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞（すなわち対照）におけるマーカーの発現と有意に異ならない。
【００６３】
例として、限定はしないが、ＭＳＣの細胞同一性を評価するための適切な細胞表面マーカーには、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、およびＣＤ４５が含まれ得る。これらの細胞表面マーカーは、例えば、フローサイトメトリーによる細胞検出を可能にする蛍光色素標識されたモノクローナル抗体などの市販のモノクローナル抗体によって検出することができる。特に、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、およびＣＤ７３は間葉系マーカーであり、ＭＳＣによって典型的には高度に発現され、ＣＤ４５は造血マーカーであり、ＭＳＣに典型的には実質的に存在しない。
【００６４】
例として、限定はしないが、ＭＳＣ由来の造骨細胞の細胞同一性を評価するための適切な細胞表面マーカーには、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４５、およびアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、特に骨−肝臓−腎臓型のＡＬＰが含まれ得る。これらの細胞表面マーカーは、例えば、フローサイトメトリーによる細胞検出を可能にする蛍光色素標識されたモノクローナル抗体などの市販されているモノクローナル抗体によって検出することができる。特に、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、およびＣＤ７３は間葉系マーカーであり、ＭＳＣ由来の造骨細胞によって典型的には高度に発現される。ＣＤ４５は造血マーカーであり、ＭＳＣ由来の造骨細胞に典型的には実質的に存在せず、ＡＬＰは造骨細胞のマーカーであり、ＭＳＣ由来の造骨細胞のかなりの画分によって典型的には発現される。
【００６５】
例えば、ＭＳＣ由来の造骨細胞の分化能は、このような細胞の骨形成特性の測定によって判定することができる。骨形成を誘発するＭＳＣ由来の造骨細胞の能力は、例えば頭蓋骨上への皮下注射によってマウスに細胞を投与した後の新たに石灰化された骨の厚さを評価することによって、インビボで測定することができる。
【００６６】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の（好ましくは生存しているＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の、または好ましくは生存しており機能的なＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の）濃度は、組成物１ｍＬ当たり約１×１０４から約１×１０１１の間、または約１×１０５から約１×１０１０の間、または約１×１０６から約１×１０９の間の細胞であり得る。ある特定の実施形態において、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の濃度は、組成物１ｍＬ当たり約１×１０７から約１×１０８の間の細胞であり得る。ある特定の実施形態において、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の濃度は、組成物１ｍＬ当たり約２×１０７から約５×１０７の間の細胞であり得る。ある特定の実施形態において、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の濃度は、組成物１ｍＬ当たり約２．５×１０７の細胞であり得る。
【００６７】
用語「血漿」は、従来通り定義される。ある特定の実施形態において、ヒト血漿は、またはヒト血漿の源は、新鮮な血漿、凍結乾燥血漿、溶媒／界面活性剤処理された血漿、新鮮な凍結血漿、解凍された血漿、またはクリオプレシピテート、寒冷上清成分（cryosupernatant）、もしくは血漿濃縮物、例えば凍結血漿の濃縮物、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物であり得る。血漿は通常、アフェレーシスによって得られた試料から、または抗凝固剤（例えば、ヘパリン、クエン酸塩、シュウ酸塩、またはＥＤＴＡ）と共に提供されたかもしくはそれと接触させられた全血試料から得られる。その後、血液試料の細胞成分は、適切な技術によって、典型的には遠心分離によって液体成分（血漿）から分離される。具体的な例として、限定はしないが、本発明における使用に適した血漿を得るために、血液試料を、抗凝固剤ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するバキュテナー管に内に引き込むことができる（例えば、ＢＤバキュテナープラスチックＥＤＴＡ管、１０ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ）。試料を穏やかに振とうし、次いで１０分間、室温で１，０００〜２，０００ｇで遠心分離して、赤血球から血漿を分離する。上清（血漿）を回収し、場合によってプールし（複数の血液試料が使用される場合）、そしてクライオバイアル内にアリコート化し、これを−８０℃で使用するまで保管する。用語「血漿」は、したがって、ヒトまたは動物の身体の一部を形成しない、血液試料の細胞成分を有さない組成物を指す。したがって、本明細書において意図される血漿は無細胞血漿であり、例えば血漿は、約１．０％ｗ／ｗ未満、好ましくは約０．５％ｗ／ｗ未満、もしくは０．１％ｗ／ｗ未満の全細胞材料を含むか、または全細胞材料を実質的に含まない。
【００６８】
血漿は、好ましくは未処理血漿、すなわち、全血からの分離に由来し、かつ、任意の熱不活化、保管（低温または非低温の）、滅菌、濾過、凍結乾燥、および／または溶媒／界面活性剤処理以外の、その化学的、生化学的、または細胞組成を変化させる下流の処理ステップに供されていない血漿であり得る。
【００６９】
用語「血漿」は、ある特定の実施形態において、処理された血漿、すなわち、全血からのその分離の後に、その組成を、具体的にはその化学的、生化学的、または細胞組成を変化させる１つまたは複数の処理ステップに供された血漿を具体的に排除し得る。好ましくは、本明細書において意図される用語「血漿」は、血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）、すなわち、血小板を富むようにされた血漿を具体的に排除する。典型的には、ＰＲＰは約１．０×１０６血小板／μｌを含有し得、一方、全血中の血小板濃度は約１．５×１０５から３．５×１０５／μＬであり得る。したがって、本明細書において意図される血漿は、約８．０×１０５未満、好ましくは約７．０×１０５未満、さらに好ましくは約６．０×１０５未満、さらにより好ましくは約５．０×１０５未満、例えば約４．０×１０５未満の血小板／μＬを含有し得る。
【００７０】
本明細書において意図される血漿はヒト血漿であり、すなわち、単一のヒト対象からまたは複数のヒト対象から得られる（例えば血漿混合プール）。
【００７１】
血漿は、本方法において直接使用することができる。血漿はまた、その後の使用のために適切に保管することができる（例えば、より短期間では、例えば最大約１〜２週間、血漿の凍結点を上回るが周囲温度を下回る温度で（この温度は通常約４℃から５℃である）、またはより長期間の凍結保管では、通常、約−７０℃から約−８０℃の間で）。
【００７２】
本発明の方法は、治療される対象に対して、したがって血漿を含む組成物中で保存される細胞に対して自己の血漿を用いることができる。血漿に関する用語「自己の」は、血漿が、血漿と接触させられるかまたは血漿で処理される同一の対象から得られることを示す。本発明の方法は、治療される対象に対して、したがって血漿を含む組成物中で保存される細胞に対して「相同な」または「同種異系の」、すなわち、血漿と接触させられるかまたは血漿で処理される対象以外の１つまたは複数の（プールされた）対象から得られる血漿を用いることができる。本発明の方法はまた、上記で定義した自己のおよび相同な（同種異系の）血漿の混合物も用いることができる。好ましくは、本発明の方法は、治療される対象に対して「同種異系の」血漿を用いることができる。有利には、同種異系の血漿は市販されており、したがって、血漿の未制限な源である。本明細書において特に意図されるものはヒト血漿であり、さらに好ましくは、ヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞のインビトロでの保存のための同種異系のヒト血漿である。
【００７３】
血漿は、特に補体を除去するために、当技術分野において知られているように熱不活化することができる。本方法が治療される対象に対して自己の血漿を用いる場合、血漿の熱不活化は不要であり得る。血漿が治療される対象に対して少なくとも部分的に同種異系である場合、血漿の熱不活化が有利であり得る。
【００７４】
ある特定の実施形態において、血漿は、溶媒／界面活性剤処理された血漿であり得る。用語「溶媒／界面活性剤処理された血漿」、「Ｓ／Ｄ処理された血漿」、または「Ｓ／Ｄ血漿」は、概して、（ａ）溶媒および界面活性剤で血漿を処理するステップ、ならびに（ｂ）溶媒／界面活性剤処理された血漿を濾過するステップを含む方法によって得ることができるかまたは得られる、脱細胞化された血漿（すなわち、血液の細胞成分を有さない血漿、無細胞血漿）を指す。
【００７５】
ステップ（ａ）で処理される血漿は、新鮮な血漿、再構成された凍結乾燥血漿、新鮮な凍結血漿、解凍された凍結血漿、または凍結血漿のクリオプレシピテート、寒冷上清成分、もしくは濃縮物、およびそれらの希釈生成物などの、従来通り定義されるあらゆる血漿であり得る。
【００７６】
リン酸ジアルキルまたはリン酸トリアルキルなどの溶媒および界面活性剤は、米国特許第４，７６４，３６９号明細書に記載されている。Ｓ／Ｄ血漿を調製するために使用される溶媒は、好ましくはリン酸ジアルキルまたはリン酸トリアルキルであり、その両方は１から１０の炭素原子、特に２から１０の炭素原子を含有するアルキル基を有する。溶媒の例示的な例には、リン酸トリ−（ｎ−ブチル）、リン酸トリ−（ｔ−ブチル）、リン酸トリ−（ｎーヘキシル）、リン酸トリ−（２−エチルヘキシル）、またはリン酸トリ−（ｎ−デシル）が含まれ得る。好ましい溶媒は、リン酸トリ−（ｎ−ブチル）である。異なるリン酸トリアルキルの混合物、および異なるアルキル鎖のアルキル基を有するリン酸塩、例えばリン酸エチルジ（ｎ−ブチル）もまた用いることができる。同様に、異なるアルキル基混合物を有するリン酸ジアルキルを含むそれぞれのリン酸ジアルキルを用いることができる。さらに、リン酸ジアルキルおよびリン酸トリアルキルの混合物を用いることができる。
【００７７】
処理ステップ（ａ）において使用するためのリン酸ジアルキルまたはリン酸トリアルキルなどの溶媒は、好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲の量で用いられる。換言すると、処理ステップ（ａ）において使用するためのリン酸ジアルキルまたはリン酸トリアルキルは、好ましくは、約０．００１％ｗ／ｖから約１０％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０１％ｗ／ｖから約１％ｗ／ｖの範囲の量で用いられる。
【００７８】
Ｓ／Ｄ血漿を調製するために使用される界面活性剤は、好ましくは無毒の界面活性剤である。検討される非イオン性界面活性剤には、１００ｍｌの溶液当たり１グラムの界面活性剤が溶液に導入される場合に、一般温度（prevailing temperature）で少なくとも０．１重量％の脂肪を脂肪含有水溶液内に分散させる界面活性剤が含まれる。界面活性剤の例示的な例には、脂肪酸のポリオキシエチレン誘導体、ソルビトール無水物の部分的エステル、例えば、「Ｔｗｅｅｎ  ８０」または「ポリソルベート８０」（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、「Ｔｗｅｅｎ  ２０」または「ポリソルベート２０」（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）として商業的に知られている生成物、および非イオン性の油溶性水性界面活性剤、例えば商標「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００」（オキシエチル化されたアルキルフェノール、オクチルフェノールエトキシレート）で市販されているものが含まれ得る。同様に検討されるものは、デオキシコール酸ナトリウム、および「スルホベタイン」として知られている合成両性イオン性界面活性剤である「両性洗浄剤」、例えばＮ−ドデシル−Ｎ、Ｎ−メチル−２−アンモニオ−１エタンスルホネートおよびその同類物、または非イオン性界面活性剤、例えばオクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００７９】
界面活性剤の量は、約０．００１％ｖ／ｖから約１０％ｖ／ｖ、好ましくは約０．０１％ｖ／ｖから１．５％ｖ／ｖの範囲であり得る。
【００８０】
溶媒および界面活性剤での処理は、好ましくは、−５℃から７０℃の間、好ましくは０℃から６０℃の間の温度で行われる。このような処理（接触）の時間は、少なくとも１分、好ましくは少なくとも１時間、通常４から２４時間である。処理は通常、大気圧で効果的であるが、低大気圧および過圧も用いることができる。
【００８１】
通常は、処理後、リン酸トリアルキルなどの溶媒および界面活性剤は除去される。溶媒および界面活性剤は、血漿から溶媒および界面活性剤を分離するために適切なあらゆる技術によって除去することができる。非イオン性界面活性剤がリン酸トリアルキルなどの溶媒と共に用いられる場合、これらは、（１）血漿タンパク質を保持するＴＥＦＬＯＮ(登録商標）などの微孔性膜を使用するダイアフィルトレーション、（２）クロマトグラフィー担体またはアフィニティークロマトグラフィー担体への所望の血漿成分の吸収、（３）例えば血漿タンパク質の塩析による沈殿、（４）凍結乾燥などによって除去することができる。
【００８２】
リン酸ジアルキルまたはリン酸トリアルキルなどの溶媒は、以下のように除去することができる：（ａ）抗血友病因子（ＡＨＦ）からの除去は、２．２モル濃度のグリシンおよび２．０Ｍの塩化ナトリウムでのＡＨＦの沈殿によって行うことができる、（ｂ）フィブロネクチンからの除去は、不溶化したゼラチンカラムへのフィブロネクチンの結合、および試薬を有さない結合したフィブロネクチンの洗浄によって行うことができる。
【００８３】
濾過ステップ（ｂ）は、通常、１μｍのフィルターを用いる細胞および残屑の除去、次いで０．２μｍのフィルターを使用する滅菌濾過で行われる。
【００８４】
好ましい例に基づいて、Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、１９９２（Blood, 3, 826-831）によって記載されるように、Ｓ／Ｄ血漿は以下のように調製することができる：新鮮な凍結血漿は迅速に解凍することができ、かつ、４時間、１％（ｖ／ｖ）トリ−（Ｎ−ブチル）−リン酸（ＴＮＢＰ）および１％（ｖ／ｖ）ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を３０℃で撹拌しながら処理することができる。処理後、大豆油（５％ｖ／ｖ）またはヒマシ油などの食用油を添加することができ、３０分間穏やかに混合し、１０，０００ｇで２０分間の遠心分離によって除去することができる。清澄化した血漿を、カラム容積に対する血漿の比率が６になるように、かつ接触時間が３分になり得るように、Ｗａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ  Ｃ１８樹脂のカラムに適用することができる。カラム溶出液は、０．２μｍのフィルターで濾過することができる。
【００８５】
用語「Ｓ／Ｄ血漿」は、０．６０ＩＵ／ｍｌ以下または０．５０ＩＵ／ｍｌ以下のプラスミン阻害剤レベル、例えば０．２０から０．３０ＩＵ／ｍｌの間の、より具体的には０．２２から０．２５ＩＵ／ｍｌの間のプラスミン阻害剤レベルなどの、プラスミン阻害剤の濃度または活性の低減を含む、血漿を包含する。
【００８６】
新鮮な凍結血漿と比較すると、Ｓ／Ｄ血漿は、プラスミン阻害剤、タンパク質Ｓ、因子ＸＩ、因子Ｖ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、α２抗プラスミン、抗トリプシン、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、およびジスインテグリンとしても知られているヴォン・ヴィレブランド因子切断プロテアーゼ（ＶＷＦＣＰ）、およびトロンボスポンジン１型モチーフを有するメタロプロテイナーゼ、メンバー１３（ＡＤＡＭＴＳ−１３）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インタロイキン−８（ＩＬ−８）、インタロイキン−１０（ＩＬ−１０）の１つまたは複数の低減した量および／もしくは活性を含んでいてよく（Benjamin and McLaughlin, 2012、Svae et al., 2007、Beeck and Hellstern, 1998、Doyle et al., 2003、Mast et al., 1999、Theusinger et al., 2011）、ならびに／または因子ＶＩＩの増大した量および／もしくは活性を含んでいてよい（Doyle et al., 2003）。全般的に、Ｓ／Ｄ処理は凝固促進剤因子の低減を誘発し得るが、それらのレベルは正常範囲内のままである。
【００８７】
例えば、Ｓ／Ｄ血漿は、Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）として市販されている（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＧ、Ｌａｃｈｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。
【００８８】
用語「血清」は従来通り定義され、新鮮な血清、解凍された凍結血清、もしくは血漿から調製された血清、またはそれらのいずれか２つ以上の混合物を含む。血清は通常、試料内で凝血が生じることをまず可能にし、その後、そのようにして形成された凝血塊および血液試料の細胞成分を適切な技術によって、典型的には遠心分離によって液体成分（血清）から分離することによって、全血試料から得ることができる。凝血は、不活性触媒、例えばガラスビーズまたは粉末によって容易となり得る。あるいは、血清は、抗凝固剤およびフィブリンを除去することによって血漿から得ることができる。具体的な例として、限定はしないが、本発明における使用に適した血清を得るために、血液試料を、抗凝固剤を含有しないバキュテナー管内に引き込み（例えば、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓプラスチック血清管、１０ｍｌ）、３０から４５分、室温でインキュベートして凝血させることができる。管を次いで１５分、室温で１，０００〜２，０００ｇで遠心分離して、赤血球から血清を分離する。上清（血清）を回収し、場合によってプールし（複数の血液試料が使用される場合）、クライオバイアル内にアリコート化し、これを−８０℃で使用するまで保管する。用語「血清」は、したがって、ヒトまたは動物の身体の一部を形成しない無細胞組成物を指す。
【００８９】
本明細書において意図される血清はヒト血清であり、すなわち、単一のヒト対象または複数のヒト対象（例えば血清の混合プール）から得られる。
【００９０】
血清は、好ましくは未処理血清、すなわち、全血からの分離に由来し、かつ、任意の熱不活化、保管（低温または非低温の）、滅菌、凍結乾燥、および／または濾過以外の、その化学的、生化学的、または細胞組成を変化させる下流の処理ステップに供されていない血清であり得る。
【００９１】
用語「血清」は、ある特定の実施形態において、処理された血清、すなわち、全血からのその分離の後に、その組成を、具体的にはその化学的、生化学的、または細胞組成を変化させる１つまたは複数の処理ステップに供された血清を具体的に排除し得る。
【００９２】
血清は、本明細書において教示される方法において直接使用することができる。血清はまた、その後の使用のために適切に保管することができる（例えば、より短期間では、例えば最大約１〜２週間、血清の凍結点を上回るが周囲温度を下回る温度で（この温度は通常約４℃から５℃である）、またはより長期間の凍結保管では、通常、約−１６℃から約−２４℃の間、または約−７０℃から約−８０℃の間で）。
【００９３】
場合によって、血清はまた、０．２μｍ以下の孔径を好ましくは有する従来の微生物学的フィルターを使用して、保管または使用の前に滅菌することができる。
【００９４】
ある特定の実施形態において、本方法は、治療される対象に対して、したがって血清を含む組成物中で保存される細胞に対して自己の血清を用いることができる。血清に関する用語「自己の」は、血清が、血清と接触させられる同一の対象から得られることを示す。ある特定の実施形態において、本方法は、治療される対象に対して、したがって血清を含む組成物中で保存される細胞に対して「相同な」または「同種異系の」、すなわち、血清と接触させられる対象以外の１つまたは複数の（プールされた）対象から得られる血清を用いることができる。ある特定の実施形態において、本方法は、上記で定義した自己のおよび相同な（同種異系の）血清の混合物を用いることができる。本明細書において特に意図されるものはヒト血清であり、さらに好ましくは、ヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞のインビトロでの保存のための同種異系のヒト血清である。
【００９５】
血清は、特に補体を除去するために、当技術分野において知られているように熱不活化することができる。本方法がその存在下で培養された細胞に対して自己の血清を用いる場合、血清の熱不活化は不要であり得る。血清が培養された細胞に対して少なくとも部分的に同種異系である場合、血清の熱不活化が有利であり得る。
【００９６】
ある特定の実施形態において、血清は、溶媒／界面活性剤処理された血漿から得ることができる。Ｓ／Ｄ血漿は、抗凝固剤の作用に対抗するように、例えばフィブリノーゲンのフィブリンへの変換および凝血塊の形成を可能にするように、適切に処理され得る。例えば、抗凝固剤がＥＤＴＡ、クエン酸塩、またはシュウ酸塩などのカルシウム（Ｃａ２＋）イオンを隔離する場合、十分な量の二価カルシウム（Ｃａ２＋）イオン源の添加が必要であり得る。適切な二価カルシウム（Ｃａ２＋）イオン源には、薬学的に許容されるカルシウム塩、好ましくは可溶性カルシウム塩が含まれる。このようなＣａ２＋塩は、無機酸または有機酸で形成され得る。このような塩の例には、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、グリセロリン酸カルシウム、リン酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸カルシウム、硫酸カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、およびそれらの混合物が含まれる。特に好ましいものは、有利に良好な溶解度を示し、注射可能な溶液中で忍容性が良好な、ＣａＣｌ２であり得る。
【００９７】
そのように処理されたＳ／Ｄ血漿は、凝血塊の形成を促す条件でインキュベートすることができ、例えば、限定はしないが、３７℃で約１時間、次いで−２０℃で最短１２時間インキュベートし、その後例えば３７℃で解凍する。その後、血清を凝血塊から適切に分離し、例えば、シリンジを使用して引き込む。
【００９８】
場合によって、上記に教示したように血清を得るためにＳ／Ｄ血漿を処理する前に、さらなる量（例えば、約５％ｖ／ｖから約２０％ｖ／ｖの間、好ましくは約１０％ｖ／ｖ）の血清、好ましくはヒト血清、さらに好ましくは自己のまたは同種異系の血清をＳ／Ｄ血漿と混合して、凝血を容易にすることができる。
【００９９】
本明細書において教示される方法または使用のある特定の特に好ましい実施形態において、組成物は、１つまたは複数の分画された血漿または血清成分をさらに補充され得る（富むようにされ得る）。特に、さらなる（余剰の、余分な）量の１つまたは複数の分画された血漿または血清成分を組成物に含めることができる。組成物に含めるためのこのような分画された血漿または血清成分の特に好ましい例は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。例として、限定はしないが、組成物は、少なくとも約１％ｗ／ｖ（組成物の容積に対する）のＨＳＡ（すなわち、組成物は、血漿または血清中に存在するあらゆるＨＳＡに加えて少なくとも約１％ｗ／ｖのＨＳＡを含むことになる）、例えば少なくとも約５％ｗ／ｖ、または少なくとも約１０％ｗ／ｖ、少なくとも約１５％ｗ／ｖ、少なくとも約２０％ｗ／ｖ、少なくとも約３０％ｗ／ｖ、少なくとも約４０％ｗ／ｖ、または少なくとも約５０％ｗ／ｖのＨＳＡが補充され得る（富むようにされ得る）。９５％または９９％以上もの純度を有するＨＳＡの天然型（ヒト血液から単離された）および組み換え型の両方が市販されている。
【０１００】
組成物中の血漿もしくは血清またはそれらの混合物の濃度（すなわち、組成物の容積に対する）は、少なくとも２０％ｖ／ｖ、例えば、少なくとも２５％ｖ／ｖ、少なくとも３０％ｖ／ｖ、少なくとも３５％ｖ／ｖ、少なくとも４０％ｖ／ｖ、または少なくとも４５％ｖ／ｖである。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物中の血漿もしくは血清またはそれらの混合物の濃度は、少なくとも５０％ｖ／ｖ、例えば少なくとも５５％ｖ／ｖであり得る。ある特定の実施形態において、組成物中の血漿もしくは血清またはその混合物の濃度は、少なくとも６０％ｖ／ｖ、例えば少なくとも６５％ｖ／ｖであり得る。ある特定の実施形態において、組成物中の血漿もしくは血清またはそれらの混合物の濃度は、少なくとも７０％ｖ／ｖ、例えば少なくとも７５％ｖ／ｖであり得る。ある特定の実施形態において、組成物中の血漿もしくは血清またはその混合物の濃度は、少なくとも８０％ｖ／ｖ、例えば少なくとも８５％ｖ／ｖであり得る。ある特定の実施形態において、組成物中の血漿もしくは血清またはその混合物の濃度は、少なくとも９０％ｖ／ｖであり得る。ある特定の実施形態において、組成物中の血漿もしくは血清またはその混合物の濃度は、少なくとも９９〜１００％ｖ／ｖであり得る。
【０１０１】
ある特定の実施形態において、希釈および濃縮がされていない血漿生成物（例えば、新鮮な血漿、再構成された凍結乾燥血漿、溶媒／界面活性剤処理された血漿、新鮮な凍結血漿、および／もしくは解凍された血漿、またはそれらの混合物）を、少なくとも２０％ｖ／ｖの血漿濃度で組成物中に含めることができるか、または、希釈および濃縮がされていない血清生成物（例えば、新鮮な血清、解凍された凍結血清、もしくは血漿から調製された血清、またはその混合物）を、少なくとも２０％ｖ／ｖの血清濃度で組成物中に含めることができるか、または、希釈および濃縮がされていない血漿生成物ならびに希釈および濃縮がされていない血清生成物の混合物を、少なくとも２０％ｖ／ｖの血漿および血清の混合物の濃度で組成物中に含めることができる。
【０１０２】
他の実施形態において、希釈された血漿および／または血清生成物を代わりに用いることができる。このような希釈された血漿および／または血清生成物は、希釈因子を相殺する（平衡させる、補償する）などのために、所望の血漿および／または血清濃度よりも高い濃度で組成物中に含められ、それによって、少なくとも２０％ｖ／ｖの希釈されていない血漿および／または血清生成物を含めることによって得られるものと同等の組成物が得られる。
【０１０３】
なおさらなる実施形態において、濃縮された血漿および／または血清生成物（例えば、凍結血漿の濃縮物などの血漿濃縮物）を用いることができる。このような濃縮された血漿および／または血清生成物は、濃縮因子を相殺する（平衡させる、補償する）などのために、所望の濃度の血漿および／または血清よりも低い濃度で組成物中に含めることができ、それによって、少なくとも２０％ｖ／ｖの濃縮されていない血漿および／または血清生成物を含めることによって得られるものと同等の組成物が得られる。あるいは、このような濃縮された血漿および／または血清生成物は、少なくとも２０％ｖ／ｖの濃度で組成物中に含めることができ、それによって、２０％ｖ／ｖを超える（濃縮因子に応じて）濃縮されていない血漿および／または血清生成物を含めることによって得られるものと同等の組成物が得られる。
【０１０４】
組成物が血漿および血清の混合物を含む場合、混合物中の血漿および血清の例示的な濃度（すなわち、血漿および血清は混合物の１００％ｖ／ｖを構成し、混合物は組成物の少なくとも２０％ｖ／ｖを構成する）は、例えば、１〜１０％ｖ／ｖの血漿および９０〜９９％ｖ／ｖの血清（例えば、１％ｖ／ｖの血漿および９９％ｖ／ｖの血清、または１０％ｖ／ｖの血漿および９０％ｖ／ｖの血清）、または１１〜２０％ｖ／ｖの血漿および８０〜８９％ｖ／ｖの血清（例えば、１１％ｖ／ｖの血漿および８９％ｖ／ｖの血清、または２０％ｖ／ｖの血漿および８０％ｖ／ｖの血清）、または２１〜３０％ｖ／ｖの血漿および７０〜７９％ｖ／ｖの血清（例えば、２１％ｖ／ｖの血漿および７９％ｖ／ｖの血清、または３０％ｖ／ｖの血漿および７０％ｖ／ｖの血清）、または３１〜４０％ｖ／ｖの血漿および６０〜６９％ｖ／ｖの血清（例えば、３１％ｖ／ｖの血漿および６９％ｖ／ｖの血清、または４０％ｖ／ｖの血漿および６０％ｖ／ｖの血清）、または４１〜５０％ｖ／ｖの血漿および５０〜５９％ｖ／ｖの血清（例えば、４１％ｖ／ｖの血漿および５９％ｖ／ｖの血清、または５０％ｖ／ｖの血漿および５０％ｖ／ｖの血清）、または５１〜６０％ｖ／ｖの血漿および４０〜４９％ｖ／ｖの血清（例えば、５１％ｖ／ｖの血漿および４９％ｖ／ｖの血清、または６０％ｖ／ｖの血漿および４０％ｖ／ｖの血清）、または６１〜７０％ｖ／ｖの血漿および３０〜３９％ｖ／ｖの血清（例えば、６１％ｖ／ｖの血漿および３９％ｖ／ｖの血清、または７０％ｖ／ｖの血漿および３０％ｖ／ｖの血清）、または７１〜８０％ｖ／ｖの血漿および２０〜２９％ｖ／ｖの血清（例えば、７１％ｖ／ｖの血漿および２９％ｖ／ｖの血清、または８０％ｖ／ｖの血漿および２０％ｖ／ｖの血清）、または８１〜９０％ｖ／ｖの血漿および１０〜１９％ｖ／ｖの血清（例えば、８１％ｖ／ｖの血漿および１９％ｖ／ｖの血清、または９０％ｖ／ｖの血漿および１０％ｖ／ｖの血清）、または９１〜９９％ｖ／ｖの血漿および１〜９％ｖ／ｖの血清（例えば、９１％ｖ／ｖの血漿および９％ｖ／ｖの血清、または９９％ｖ／ｖの血漿および１％ｖ／ｖの血清）であり得る。
【０１０５】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物中のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の濃度、および組成物中の血漿もしくは血清またはそれらの混合物の濃度は、表１に示すものであり得る（表１の各行は、このような実施形態の例を提供する）。
【０１０６】
【表１−１】
0006450478.tif 000002
【０１０７】
【表１−２】
0006450478.tif 000003
【０１０８】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物から本質的になり得るかまたはそれからなり得る。
【０１０９】
好ましくは、本発明は、細胞の非低温のインビトロでの保存方法を提供する。したがって、ある特定の実施形態において、組成物は、組成物の凍結点を上回って（上回る温度で）維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０℃以上で、または約０．１℃以上で（例えば約０．１０℃）、または約１℃以上で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃以上で、例えば、約３℃以上で、または約４℃以上で、または約５℃以上で、または約６℃以上で、または約７℃以上で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃以上で、例えば約９℃以上で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１０℃以上で、例えば約１１℃以上で、または約１２℃以上で、または約１３℃以上で、または約１４℃以上で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃以上で、例えば、約１６℃以上で、または約１７℃以上で、または約１８℃以上で、または約１９℃以上で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２０℃以上で維持され得る。
【０１１０】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、周囲温度以下（すなわち「室温」）で維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約２５℃以下で、例えば約２４℃以下で、または約２３℃以下で、または約２２℃以下で、または約２１℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２０℃以下で、例えば約１９℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１８℃以下で、例えば、約１７℃以下で、または約１６℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃以下で、例えば、約１４℃以下で、または約１３℃以下で、または約１２℃以下で、または約１１℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１０℃以下で、例えば約９℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃以下で、例えば、約７℃以下で、または約６℃以下で、または約５℃以下で、または約４℃以下で、または約３℃以下で、または約２℃以下で、または約１℃以下で維持され得る。
【０１１１】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０℃から周囲温度の間で維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０℃から約２５℃の間で、または約０℃から約１８℃の間で、または約０℃から約１５℃の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃から約１０℃の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃から約８℃の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１℃から約８℃の間で維持され得る。
【０１１２】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で、または約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約１８℃の間で、または約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約１５℃の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約１０℃の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約８℃の間で維持され得る。
【０１１３】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、組成物の凍結点を上回りかつ周囲温度（すなわち「室温」）以下で維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、組成物の凍結点を上回りかつ約２５℃以下で、または組成物の凍結点を上回りかつ約２０℃以下で、または組成物の凍結点を上回りかつ約１８℃以下で、または組成物の凍結点を上回りかつ約１５℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、組成物の凍結点を上回りかつ約１０℃以下で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、組成物の凍結点を上回りかつ約８℃以下で維持され得る。
【０１１４】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０℃から周囲温度の間で維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で、または約１℃から周囲温度の間で、または約２℃から周囲温度の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から周囲温度の間で維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で維持され得る。
【０１１５】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で維持され得る。
【０１１６】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で維持され得る。
【０１１７】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で維持され得る。
【０１１８】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１６時間、さらに好ましくは少なくとも２４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも３０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも３６時間維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも４２時間維持され得る。
【０１１９】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも４８時間維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２０】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも４８時間維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも４８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも１６８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも１６８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも１９２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２１】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、周囲温度以下で少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、周囲温度以下で少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２２】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０．１℃（例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２３】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも４８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも１６８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２４】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも４８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも１６８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間で少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２５】
明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも４８時間維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも４８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも７２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも９６時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも１２０時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも１４４時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも１６８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも１６８時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも１９２時間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも１９２時間維持され得る。
【０１２６】
本発明の状況において使用される温度は、摂氏（℃）で表される。しかし、温度はケルビン（Ｋ）などのあらゆる他の適切な単位でも表され得ることに留意されたい。
【０１２７】
温度は最も近い温度に四捨五入されることに留意されたい。例えば、８．１℃、８．２℃、８．３℃、および８．４℃は８℃に切り下げられ、一方、８．５℃、８．６℃、８．７℃、８．８℃、および８．９℃は９℃に切り上げられる。いかなる小数位も続いていない温度値への言及は、小数第１位に０が続く同一の値も特に含み、例えば、８℃への言及は８．０℃を特に包含する。
【０１２８】
本発明の背景において使用される時間は、時間単位または日数で表される。しかし、時間は、秒または分などの他の単位でも表され得ることに留意されたい。
【０１２９】
時間単位で表される時間は最も近い時間に四捨五入されることに留意されたい。例えば、２４．１時間（２４時間６分）、２４．２時間（２４時間１２分）、２４．３時間（２４時間１８分）、２４．４時間（２４時間２４分）は２４時間に切り下げられ、一方、２４．５時間（２４時間３０分）、２４．６時間（２４時間３６分）、２４．７時間（２４時間４２分）、２４．８時間（２４時間４８分）、および２４．９時間（２４時間５４分）は２５時間に切り上げられる。いかなる小数位も続いていない期間への言及は、小数第１位に０が続く同一の値も特に含み、例えば、２４時間への言及は２４．０時間を特に包含する。
【０１３０】
用語「時間」、「期間」、および「継続時間」は、互換的に使用することができる。
【０１３１】
用語「２４時間」および「１日」は、互換的に使用することができる。用語「４８時間」および「２日」は、互換的に使用することができる。用語「７２時間」および「３日」は、互換的に使用することができる。用語「９６時間」および「４日」は、互換的に使用することができる。用語「１２０時間」および「５日」は、互換的に使用することができる。用語「１４４時間」および「６日」は、互換的に使用することができる。用語「１６８時間」および「７日」は、互換的に使用することができる。用語「１９２時間」および「８日」は、互換的に使用することができる。
【０１３２】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、表２に記載する温度で、表２に記載する期間維持され得る。ある特定の実施形態において、組成物は、表２に記載する温度（Ｔｘ）で、表２に記載する期間（ｔｘ）維持され得る。本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、表２に記載する温度Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ８、Ｔ９、Ｔ１０、Ｔ１１、Ｔ１２、Ｔ１３、Ｔ１４、Ｔ１５、Ｔ１６、Ｔ１７、Ｔ１８、Ｔ１９、Ｔ２０、Ｔ２１、またはＴ２２のいずれか１つで、表２に記載する期間ｔ１、t２、t３、t４、t５、t６、t７、t８、t９、t１０、ｔ１１、またはt１２維持され得る。例えば、組成物は、表２に記載する温度Ｔ１で、表２に記載する期間t１維持され得る。
【０１３３】
「表２に記載する温度Ｔｘで、表２に記載する期間ｔｘ」という詳述は、表２に記載する温度および期間のいずれか１つまたは複数の組合せ、例えば全ての組合せ、特に、表２の各欄で表現「Ｔｘ＋ｔｘ」によって特定される組合せを指す。
【０１３４】
【表２−１】
0006450478.tif 000004
【０１３５】
【表２−２】
0006450478.tif 000005
【０１３６】
上記のように、本発明は、接着性ＭＳＣまたは接着性ＭＳＣ由来細胞を、少なくとも２０％ｖ／ｖのヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物中に懸濁した状態で維持することを含む、細胞のインビトロでの保存方法に関する。特に、組成物は、上述したような温度および時間で維持され得る。
【０１３７】
本明細書において使用される「所与の温度（約０℃など）から別の所与の温度（約２５℃など）の間で少なくとも所与の期間（２４時間など）組成物を維持する」という詳述は、組成物の温度が前記温度の間で少なくとも詳述された期間存続する（すなわち、維持される、保持される、または制御される）ことを確実にすることを指す。
【０１３８】
組成物の温度を制御するために、組成物は、所望の温度、例えば、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間の温度、または約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間の温度を有する環境に所望の期間都合よく曝露され得る。
【０１３９】
ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約１８℃の間、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約１５℃の間、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約１２℃の間、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約１０℃の間、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約８℃の間の温度、約１℃から約１８℃の間、約１℃から約１５℃の間、約１℃から約１２℃の間、約１℃から約１０℃の間、約１℃から約８℃の間の温度、約２℃から約１８℃の間、約２℃から約１５℃の間、約２℃から約１２℃の間、約２℃から約１０℃の間、または約２℃から約８℃の間の温度、または約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間、または約１５℃から約２５℃の間、または約８℃から約１５℃の間、または周囲温度以下、または組成物の凍結点を上回りかつ周囲温度以下、または約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間、または約１５℃から周囲温度の間の温度を有する環境に、組成物を表２に記載するＴｘで表２に記載するtｘ維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４０】
ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間の温度を有する環境に、組成物を約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４１】
ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間の温度を有する環境に、組成物を約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４２】
ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間の温度を有する環境に、組成物を約１５℃から周囲温度の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４３】
ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間の温度を有する環境に、組成物を約１５℃から約２５℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間の温度を有する環境に、組成物を約８℃から約１５℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間の温度を有する環境に、組成物を約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４６】
ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間の温度を有する環境に、組成物を約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４７】
ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間の温度を有する環境に、組成物を約１５℃から周囲温度の間で少なくとも２４時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４８】
ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間の温度を有する環境に、組成物を約１５℃から約２５℃の間で少なくとも２４時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１４９】
ある特定の実施形態において、組成物は、約８℃から約１５℃の間の温度を有する環境に、組成物を約８℃から約１５℃の間で少なくとも２４時間維持するために効果的な期間、曝露され得る。
【０１５０】
上記の温度を有する環境は、あらゆる様式によって、例えばあらゆる従来の温度制御手段によって適切に作成または生成され得る。例えば、約２０℃から約２５℃の範囲の温度は周囲温度条件（すなわち「室温」）に対応し、その結果、組成物をこのような温度に維持するために専用の温度制御手段は不要であり得る。周囲温度を下回る温度で組成物を維持するために、例えば、一般的な家庭用冷蔵庫、産業用冷蔵庫、温度制御された冷蔵庫、輸送可能な冷却システム（例えば冷却ボックス）などの、あらゆる従来の冷蔵手段を用いることができる。
【０１５１】
組成物の温度が所望の範囲内で維持される所望の期間の最中に、組成物は、前記範囲を外れた温度を有する環境に一時的に曝露され得ることを理解されたい。例えば、組成物は、その検査、操作、包装、ラベル付けなどを可能にするために、冷蔵環境から一時的に取り出され得、または、組成物は、１つの冷蔵環境から簡単に取り出され、別の冷蔵環境に置かれ得る。このような曝露の一時的性質は、しかし、組成物の温度が所望の範囲内であり続けることを意味する。
【０１５２】
したがって、ある特定の実施形態において、組成物の温度が約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間維持されるという条件で、組成物は、約０℃より低いまたは周囲温度より高い温度を有する環境に、前記少なくとも２４時間の最中の１つまたは複数の期間、曝露され得る。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、組成物の温度が約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも２４時間維持されるという条件で、組成物は、約０℃より低いまたは約２５℃より高い温度を有する環境に、前記少なくとも２４時間の最中の１つまたは複数の期間、曝露され得る。
【０１５４】
ある特定の実施形態において、組成物の温度が表２に記載する温度Ｔｘで表２に記載する期間ｔｘ維持されるという条件で、組成物は、Ｔｘよりも低いまたは高い温度（例えば室温）を有する環境に、前記期間ｔｘの最中の１つまたは複数の期間、曝露され得る。
【０１５５】
ある特定の実施形態において、組成物の温度が約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持されるという条件で、組成物は、約２℃より低いかまたは約８℃より高い温度（例えば室温）を有する環境に、前記少なくとも２４、３０、３６、４２、４８、７２、８４、９６、１２０、１４４、１６８、または１９２時間の最中の１つまたは複数の期間、曝露され得る。
【０１５６】
ある特定の実施形態において、組成物の温度が約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間維持されるという条件で、組成物は、約２℃より低いおよび／または約８℃より高い温度（例えば室温）を有する環境に、前記少なくとも２４時間の最中の１つまたは複数の期間、曝露され得る。
【０１５７】
本明細書において教示される方法は、特に、組成物の保管および／または例えば組成物の生産場所（例えば細胞療法企業）から組成物の使用場所（例えば病院）への組成物の輸送の間などの、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞のインビトロでの保存に適している。好ましくは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が本明細書において教示されるように維持される場合、２０％未満、さらに好ましくは１５％未満、さらにより好ましくは１０％未満の細胞が、本方法の着手時の組成物と比較して生存能力を喪失し得る。
【０１５８】
ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞のインビトロでの保存方法は、したがって、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の生存能力を適切に保持することを可能にする。
【０１５９】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）（ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、および（ｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を培養すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）細胞の保存を行うために組成物を維持する、例えば、組成物を約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間維持するか、または組成物を約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも２４時間維持するステップを含み得る。
【０１６０】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）（ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、および（ｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、提供するステップ、ならびにｂ）細胞の保存を行うために組成物を維持する、例えば、組成物を約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間維持する、または組成物を約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも２４時間維持するステップを含み得る。
【０１６１】
ある特定の実施形態において、本明細書において教示される方法は、それ自体が公知である細胞または組織培養培地の存在下で、例えば、液体の細胞または組織培養培地を使用して、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を培養する（例えば、維持する、繁殖させる、および／または分化させる）ことに関し得る。このような培養培地は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の持続（例えば、生存の、遺伝子型の、表現型の、および／または機能的な安定性）および増殖を望ましくは保持し得る。
【０１６２】
使用される細胞培養および培地における通常の技術は、とりわけ、Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., 1997, Curr Opin Biotechnol, 8, 148)、Serum-free Media (K. Kitano, 1991, Biotechnology, 17, 73)、またはLarge Scale Mammalian Cell Culture (Curr Opin Biotechnol, 1991, 2, 375)において概説されている。
【０１６３】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）（ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、および（ｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはその混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を表２に記載するＴｘで表２に記載するｔｘ維持するステップを含み得る。
【０１６４】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するステップを含み得る。
【０１６５】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を約１５℃から周囲温度の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するステップを含み得る。
【０１６６】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を約１５℃から約２５℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間維持するステップを含み得る。
【０１６７】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間維持するステップを含み得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を約１５℃から周囲温度の間で少なくとも２４時間維持するステップを含み得る。
【０１６９】
ある特定の実施形態において、本方法は、ａ）ｉ）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞、およびｉｉ）ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含む組成物を提供するステップであって、場合によって、ａ１）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を回収すること、およびａ２）ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を少なくともヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物で懸濁することを含む、ステップ、ならびにｂ）組成物を約１５℃から約２５℃の間で少なくとも２４時間維持するステップを含み得る。
【０１７０】
ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、組成物中に懸濁した状態である。
【０１７１】
用語「懸濁液」および「細胞懸濁液」は、概して、液相中に分散したＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を含有する異種混合物を指す。組成物は液体であるため、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、原則として、組成物が上記で論じた温度および期間で維持されていても、組成物から積もるかまたは沈殿し得る可能性があるが、必ずしもそうではない。
【０１７２】
本明細書において教示される方法のある特定の実施形態において、組成物は、好ましくは、組成物の前記維持の間中、液体（すなわち液体状態）であり続け得る。
【０１７３】
用語「液体」は、容積は確定しているが形状は一定ではない物質の状態を指すと当技術分野において良く理解されている。特に、このような実施形態において、組成物は固体、半固体、またはゲル様にならず、すなわち、ゲルを形成しない／ゲル化しない。
【０１７４】
ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち、上記のような液体状態）であり続け得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から周囲温度の間で少なくとも２４時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち液体状態）であり続け得る。
【０１７５】
ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち、上記のような液体状態）であり続け得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約０℃（例えば約０．１℃、例えば約０．１０℃）から約２５℃の間で少なくとも２４時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち液体状態）であり続け得る。
【０１７６】
ある特定の実施形態において、組成物は、表２に記載するＴｘで表２に記載するｔｘの組成物の前記維持の間中、液体（すなわち、上記のような液体状態）であり続け得る。
【０１７７】
ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち、上記のような液体状態）であり続け得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約２℃から約８℃の間で少なくとも２４時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち液体状態）であり続け得る。
【０１７８】
ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち、上記のような液体状態）であり続け得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から周囲温度の間で少なくとも２４時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち液体状態）であり続け得る。
【０１７９】
ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも２４時間、または少なくとも３０時間、または少なくとも３６時間、または少なくとも４２時間、または少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、または少なくとも８４時間、または少なくとも９６時間、または少なくとも１２０時間、または少なくとも１４４時間、または少なくとも１６８時間、または少なくとも１９２時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち、上記のような液体状態）であり続け得る。ある特定の実施形態において、組成物は、約１５℃から約２５℃の間で少なくとも２４時間の組成物の前記維持の間中、液体（すなわち液体状態）であり続け得る。
【０１８０】
実施例において説明するように、本発明者らは、ヒト血漿またはヒト血清に基づく組成物中でのＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞のインビトロでの保存が、細胞の生存能力を長期保存の後でも有利に保持することに気付いた。
【０１８１】
したがって、さらなる態様において、本発明は、ヒト血漿もしくはヒト血清またはそれらの混合物を含むか、それから基本的になるか、またはそれからなる組成物の、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の懸濁保管のための（それを可能にする）賦形剤または防腐剤としての使用を提供する。
【０１８２】
本明細書において教示される方法または使用のある特定の実施形態において、組成物は、懸濁された状態での細胞のインビトロでの保存と両立可能なまたはそれを促す、例えば水性保管液を含む、さらなる成分または構成要素をさらに含み得る。
【０１８３】
このような水性保管液は、当技術分野において周知である。適切な水性保管液の非限定的な例には、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ（登録商標）低温保存溶液（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＣＡ、ＵＳＡ）、組織細胞培養成長培地に基づく水性保管液、例えば、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、またはＲＰＭＩ培地、および生理学的電解質溶液に基づく水性保管液、例えばＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ（例えば、Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡのＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｐＨ７．４（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｔｙｐｅ  １、ＵＳＰ））、乳酸リンゲル液（例えば、Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、ＵＳＡのＬａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ＵＳＰ）、またはハルトマン溶液が含まれる。
【０１８４】
本発明をその具体的な実施形態と共に記載してきたが、多くの代替物、修正、および変型が先の記載に照らして当業者に明らかとなろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲において以下の全てのこのような代替物、修正、および変型が包含されることが意図される。
【０１８５】
本明細書において開示される本発明の態様および実施形態は、以下の非限定的な実施例によってさらにサポートされる。
［実施例］
【実施例１】
【０１８６】
ヒトＭＳＣ由来造骨細胞のインビトロでの保存
本実施例は、本発明の原理を具体化する、懸濁された状態での生存ＭＳＣ由来細胞の非低温保管、特に低温（冷却）保管のための方法を記載する。特に、ヒトＭＳＣ由来造骨細胞を、２℃から８℃の間で少なくとも２４時間、最大１９２時間（８日）、ヒト血清アルブミンを補った生理学的電解質溶液に基づく細胞療法生成物において以前から使用されている液体保存培地と比較して、本発明のある特定の実施形態に従ったヒト血漿またはヒト血清に基づく液体保管培地中で懸濁保管に供した。保管後のＭＳＣ由来造骨細胞生成物の安定性を、細胞の生存、細胞の回復（すなわち、表面に接着する細胞の能力）、細胞の同一性（すなわち、鍵となる細胞表面マーカーの発現）、および分化能（すなわち骨形成特性）を判定することによって評価した。以下に記載する結果によって、ヒト血漿に基づくおよびヒト血清に基づく液体保管培地の優位性が裏付けられた。
【０１８７】
ＭＳＣ由来造骨細胞の生成
ＭＳＣ由来造骨細胞を、基本的に国際公開第２００９／０８７２１３号パンフレットにおいて記載されているように得た。簡潔に述べると、２０から６０ｍｌのヘパリン化骨髄（ＢＭ）を８人の健康なヒトボランティアの腸骨稜から得た。同時に、健康なヒトドナーの血清を、乾いた試験管に流出させた１６０ｍｌの血液を遠心分離した後に得た。骨髄を一定の白血球密度（５０，０００細胞／ｃｍ２）で培養フラスコ内に蒔き、血清、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦｂ−１）、および増殖因子を補った従来の培養培地中で、５％ＣＯ２を含有する３７℃の加湿環境で培養した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、最初の培地交換の前に付着させた。培地を通常通り交換した。最初の培養の最後に、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を１〜５分、３７℃で使用して細胞を分離し、計数し、第２の培養のために培養フラスコ中の同一の培地に１，０００細胞／ｃｍ２で再播種した。第２の培養の最後に、ＭＳＣ由来造骨細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。
【０１８８】
細胞懸濁保管
採取後、ＭＳＣ由来造骨細胞を、一定の細胞密度（試料容積１ｍｌから４ｍｌ）で以下の液体保管培地において室温で懸濁させた：
−  ５％ｗ／ｖのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（２０％ｗ／ｖのＨＳＡ溶液から希釈した、Ｓａｎｑｕｉｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｐｐｌｙ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（本明細書の以下においておよび図面において「標準的賦形剤」とも呼ばれる）を補ったＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ、カタログ番号ＡＥ０３２３）
−  ヒト血漿（１００％Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＧ、Ｌａｃｈｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
−  ヒト血清（１００％自己血清）
−  ヒト血清アルブミンを富むようにされたヒト血清（５０％ｗ／ｖのＨＳＡ（Ｃ．Ａ．Ｆ．−Ｄ．Ｃ．Ｆ．、カタログ番号ＣＲ−ＲＫ−４５０、形態：２０％のＨＳＡを有する水溶液、純度≧９５％）を補った自己血清）
【０１８９】
試料を、２〜８℃で、モニタリングされた温度制御された冷蔵庫内で２４、４８、７２、９６、１４４、または１９２時間保管した。
【０１９０】
ヒト血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標））およびヒト血清
製造者によると、Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）は、プールされた血漿（プール内に含まれる血漿は、単一のＡＢＯ群または複数のＡＢＯ群ものものであり得る）から製造されている。凍結血漿単位を解凍し、プールする。リン酸二水素ナトリウム二水和物を、ＣＯ２の喪失に起因するｐＨの上昇に対する緩衝液として添加する。１μｍの孔径の膜を介する濾過の後、血漿プールを、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）試薬（１％ｖ／ｖのトリ（ｎ−ブチル）リン酸（ＴＮＢＰ）および１％ｖ／ｖのオクトキシノール）で１〜１．５時間、３０℃で処理する。Ｓ／Ｄ試薬を、連続的な油相および固相抽出手順によって除去する。グリシンを添加して重量モル浸透圧濃度を調整する。場合によって、グリシンを有する血漿を、プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）の選択的結合のために、親和性リガンド樹脂で満たされたカラムに適用する。最終的に、生成物を滅菌濾過し、典型的には、無菌のポリ塩化ビニル血液袋内に満たし、ラベル付けし、低温凍結し、−１８℃以下の温度で保管する。
【０１９１】
細胞の生存
２〜８℃で２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、または１９２時間の懸濁保管の後、様々な液体保管培地（５０μＬ）中のＭＳＣ由来造骨細胞の細胞懸濁液試料を、０．４％ｗ／ｖのトリパンブルー溶液（新鮮かつ濾過された）で１：１に希釈した。約５０μＬの混合物を、計数チャンバを有するスライドに滴下した。細胞（未染色生存細胞、および青く染色された非生存細胞を含む）を、顕微鏡下、手動で計数した。各試料の細胞の生存を、細胞の生存能力（すなわち、計数した全細胞のうちの生存細胞の割合）として表した（図１）。
【０１９２】
ヒト血漿またはヒト血清中のＭＳＣ由来造骨細胞の保管によって、標準的賦形剤と比較して、経時的な細胞の生存のより良好な維持が可能になった（図１）。
【０１９３】
細胞の回収
２〜８℃で７２時間の懸濁保管の後、一定数のＭＳＣ由来造骨細胞（トリパンブルー染色によって評価される、死細胞および生存細胞の両方）を、プラスチック培養プレートに５５，０００細胞／ｃｍ２の密度で再播種した。細胞を、５％ｖ／ｖの血清を補った上記のような従来の培地中で、２４時間、５％ＣＯ２を含有する３７℃の加湿環境で培養した。２４時間後、培養プレートを分析して、保管後に基質に再接着する細胞の能力を評価した。特に、細胞を、ロマノフスキー型染色（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（登録商標）染色、Ｍｅｄｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＡＧ、Ｄｕｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）使用して可視化した。簡潔に述べると、細胞をメタノール溶液中に固定し、アジ化ナトリウム／エオシンで細胞質を（ピンク）、チアジン色素で核を（青）染色した。
【０１９４】
図２に示すように、わずかな細胞のみが、標準的賦形剤中での７２時間の保管後に基質に接着した。逆に、ヒト血漿またはヒト血清の場合では，細胞は紡錘様の形状でプラスチック基質に容易に接着し、コンフルエンスに達した。
【０１９５】
基質に再付着した細胞の数は、再播種前の対応する集団における細胞生存能力のパーセンテージを定性的に反映する（図１を参照されたい）。したがって、ヒト血漿またはヒト血清中での７２時間の懸濁の後に生存している細胞は、プラスチックに再接着する能力を維持していた。標準的賦形剤の場合では、再播種前の生存細胞の数は既に非常に少なく（図１）、そのため、図２に示す結果に基づいて再付着する細胞の能力に関して結論付けることは非常に困難である。
【０１９６】
細胞の同一性
２〜８℃で０〜２、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、または１９２時間の懸濁保管の後、細胞表面マーカーをＭＳＣ由来造骨細胞におけるフローサイトメトリーによって分析した。細胞表面マーカーを検出するために、細胞を、以下のコンジュゲートしたモノクローナル抗体：抗ＣＤ４５（ＣＤ４５は造血マーカーであり、ＭＳＣ由来造骨細胞において実質的には不存在である）、抗ＣＤ７３（ＣＤ７３は間葉系マーカーであり、ＭＳＣ由来造骨細胞によって高度に発現される）、および抗ＡＬＰと、１５分、室温でインキュベートし、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、遠心分離し、０．３ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁した。結果を図３の表にまとめる。
【０１９７】
図３で示すように、細胞によるマーカーの発現は、どの培地を使用しても、保管時間にわたって維持された。したがって、標準的賦形剤に代わってヒト血漿またはヒト血清を使用することは、保管の間のＭＳＣ由来造骨細胞の細胞同一性の維持に対して有害な影響を有さなかった。
【０１９８】
分化能（インビボ）
様々な培地中で保管された後のマウスにおける骨形成を誘発するＭＳＣ由来造骨細胞の能力もまた評価した。
【０１９９】
１０８頭のメスＮＭＲＩヌードマウスを、３つの等しいサイズの群に分けた：
１）いかなる細胞も有さない標準的賦形剤（５％ｗ／ｖのＨＳＡを補ったＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標））を注射された対照群；
２）標準的賦形剤中に懸濁されたＭＳＣ由来造骨細胞を注射された群；および
３）ヒト血漿（１００％Ｏｃｔａｐｌａｓ  ＬＧ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＧ、Ｌａｃｈｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に懸濁されたＭＳＣ由来造骨細胞を注射された群。
【０２００】
各群を、ＭＳＣ由来造骨細胞の６つの異なる保管時間（０〜２、４８、７２、９６、１２０、または１４４時間）に対応する、それぞれ６頭のマウスからなる６つの亜群に分けた。
【０２０１】
０日目（Ｄ０）に、マウスに、細胞生成物を２．５×１０６／１００μＬの固有の細胞用量で、または細胞を有さない標準的賦形剤を、頭蓋骨上に皮下注射によって注射した（１００μＬ）。
【０２０２】
この実験において、アリザリンレッド（赤）を使用して基底ライン、すなわち細胞移植時の石灰化前線を染色し、カルセイン（緑）を使用して、細胞移植後の１週間以内に新たに形成された骨にほぼ対応する初期石灰化前線を染色し、テトラサイクリン（黄色）を使用して、細胞移植後の２週目の間に新たに形成された骨にほぼ対応する後期石灰化前線を染色した。石灰化した骨は顕微鏡下で青く見えた。
【０２０３】
Ｄ１４（すなわち、細胞または対照の投与の１４日後）にマウスを屠殺した。頭蓋骨を採取し、Ｘ線画像化（Ｆａｘｉｔｒｏｎ（登録商標））して、骨密度を評価した。シグナル強度（すなわち、ピクセル単位値の平均）を石灰化量（mineralised）と関連付け、Ｘ線画像から各頭蓋骨について測定し、そしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）のヒストグラムツールを使用して分析した。
【０２０４】
さらに、頭蓋骨をプラスチック内に包埋し、ミクロトームで横方向にスライスした（５μｍのスライス）。細胞注射の前後の石灰化した骨の厚さを、蛍光色素の組込みを介して測定した。説明のために、蛍光色素、特に緑色のカルセインおよび黄色のテトラサイクリンの組込みに起因して、細胞注射前に石灰化した骨は比較的暗く見え、細胞注射後に石灰化した骨は比較的明るく見える、図４を参照されたい。骨形成のパーセンテージを以下のように計算した：
【０２０５】
【数１】
0006450478.tif 000006
（この式は、各頭蓋骨について測定され、％で表されたものである）。最初および最後の厚さの値は、４つの異なる頭蓋骨区画についての測定平均値である。
【０２０６】
図５Ａおよび図５Ｂで示すように、標準的賦形剤またはヒト血漿のいずれかにおいて非常に短い時間（０〜２時間）保管された、新たに調製されたＭＳＣ由来造骨細胞は、新たな骨を形成する類似の能力を有している。
【０２０７】
対照的に、細胞を少なくとも４８時間事前に保管した場合、それらの新たな骨を形成する能力は保管培地に大きく依存する。実際、事実上全ての試験対象の保管時間で、Ｘ線画像上で測定されたピクセル数（骨密度を反映する）および骨形成のパーセンテージの両方は、ヒト血漿中で保管された細胞を注射された頭蓋骨において、標準的賦形剤と比較してより高かった。実際、標準的賦形剤中で７２時間以上保管されたＭＳＣ由来造骨細胞は、細胞を有さない対照賦形剤と類似の骨形成能力を有する。したがって、新たな骨の形成を促進する造骨細胞の能力は、それらがヒト血漿中で保管されるとはるかに長く維持され、すなわち、標準的賦形剤中では４８時間未満であるのに対し、この実験では最大少なくとも１２０時間である。
【図１】
0006450478.tif 000007
【図２】
0006450478.tif 000008
【図３】
0006450478.tif 000009
【図４】
0006450478.tif 000010
【図５−１】
0006450478.tif 000011
【図５−２】
0006450478.tif 000012