(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＲ６又はＳｄｃ１に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤であって、前記生理活性物質が、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達に作用する抗ＤＲ６アゴニスト抗体及びその機能的断片、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達に作用する抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体及びその機能的断片、並びにＳｄｃ１及びその機能的等価物よりなる群から選択される少なくとも１の物質である、前記免疫制御剤。
【請求項２】
抗ＤＲ６アゴニスト抗体が下記ａ）〜ｅ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、請求項１に記載の免疫制御剤；
ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
ｂ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
ｃ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
ｄ）配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
ｅ）配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
【請求項３】
抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体が下記ｆ）及びｇ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、請求項１に記載の免疫制御剤；
ｆ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒからなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
ｇ）配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
【請求項４】
Ｓｄｃ１の機能的等価物が、Ｓｄｃ１変異体、可溶化Ｓｄｃ１、可溶化Ｓｄｃ１変異体及びこれらと他のタンパク質とからなる融合タンパク質よりなる群から選択される、請求項１に記載の免疫制御剤。
【請求項５】
Ｓｄｃ１及びその機能的等価物が下記ａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドから選択されるいずれか１である、請求項１又は４に記載の免疫制御剤；
ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに
ｄ）配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド。
【請求項６】
下記ａ）〜ｅ）の工程を含む、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質をスクリーニングする方法。
ａ）ＤＲ６又はその機能的等価物と、Ｓｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質とを共存させる工程、
ｂ）工程ａ）におけるＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、
ｃ）被検物質の非存在下でＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物とを共存させる工程、
ｄ）工程ｃ）におけるＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、及び
ｅ）工程ｂ）の検出結果と工程ｄ）の検出結果とを比較する工程。
【請求項７】
Ｔ細胞で発現しているＤＲ６又はその機能的等価物を使用する、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
抗原提示細胞で発現しているＳｄｃ１又はその機能的等価物を使用する、請求項６又は７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
シグナル伝達の検出が、Ｔ細胞が産生するインターロイキン２の検出により行われる、請求項６から８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７２９として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン２５−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１７７−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン８２−３０、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８６−１８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３３として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８０−１０、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３４として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン４６−１５−２３及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３５として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１００−１１よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株。
【請求項１１】
ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤であって、前記生理活性物質がＤＲ６をコードする遺伝子を標的としたｓｈＲＮＡである、前記免疫制御剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デスレセプター６（Ｄｅａｔｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＤＲ６）とそのリガンドであるシンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１、Ｓｄｃ１）との結合によるシグナル伝達を抑制又は誘導することのできる物質を有効成分とする免疫制御剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＲ６は、デスレセプターファミリーのメンバーであり、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーメンバー２１（ＴＮＦＲＳＦ２１）、又はＴＲ９とも呼ばれる。ＤＲ６は４つの細胞外システインリッチモチーフ及び１つの細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通レセプターである（非特許文献１）。【０００３】
ＤＲ６の発現は、心臓、脳、胎盤、膵臓、リンパ節、胸腺、前立腺組織、骨格筋、腎臓、及び精巣などの組織において観察されており、様々な生体制御機構において重要な役割を担っている他、様々な疾患との関係も指摘されている。【０００４】
例えば、ＤＲ６は多発性硬化症の増悪化因子である可能性が指摘されている（非特許文献２）。また、ＤＲ６は喘息の増悪化因子である可能性も指摘されている（非特許文献３）【０００５】
また、アルツハイマー病の原因とされるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と結合し、神経細胞の細胞死・軸索伸長不全を制御する機能を有することが報告されており(非特許文献４)、ＤＲ６とＡＰＰとの相互作用を阻害又は遮断するＤＲ６アンタゴニストとなるＤＲ６拮抗性抗体が特許出願されている（特許文献１）。【０００６】
一方、ＤＲ６は免疫機構の制御にも深く関与していることが知られている。例えば、前出の非特許文献１は、ＤＲ６をコードする遺伝子が形質導入された特定の細胞株におけるＤＲ６の過剰発現が、ＮＦ−ｋＢ及びＪＮＫ両方の活性化及びアポトーシスを引き起こすことが報告されている。【０００７】
また、ＤＲ６遺伝子が欠損したモデルマウスにおいて、Ｔ細胞はＪＮＫ活性化において実質的に正常に機能せず、ＤＲ６（−／−）マウスにタンパク質抗原を投与すると、それらのＴ細胞は過剰増殖し、Ｔｈ２応答への強い偏向を示すことが報告されている（非特許文献５）。【０００８】
さらに、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質によって誘発された実験的自己免疫性脳脊髄炎のモデルを使用したところ、ＤＲ６（−／−）マウスは、野生型の同腹仔と比較して、ＣＮＳ疾患の発症及び進行の両方に高い耐性を示した。つまり、ＤＲ６は、白血球の浸潤に関与し、実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発と進行に機能している可能性がある（非特許文献６）。【０００９】
このように、ＤＲ６は免疫機構、特に末梢Ｔ細胞の活性化制御に関する細胞内シグナル伝達の開始点となる重要なレセプター分子であると考えられている。したがって、ＤＲ６と特異的に結合してＤＲ６の免疫制御に関するレセプター機能を調節することのできる分子は、ＤＲ６のシグナル伝達を介した免疫機能を活性化する又は抑制するトリガー分子となり、免疫制御剤として利用することができると期待される。【００１０】
しかし、ＤＲ６はこれまでに知られているＴＮＦリガンドファミリー分子とは結合親和性を示さず、ＤＲ６と特異的に結合して免疫制御に関するシグナルを誘導することのできるＤＲ６リガンドの正体はこれまでのところ不明である。【００１１】
一方、Ｓｄｃ１はＣＤ１３８抗原とも呼ばれ、フィブログリカン（ｆｉｂｒｏｇｌｙｃａｎ）とも呼ばれるシンデカン２、Ｎ−シンデカンとも呼ばれるシンデカン３及びアムフィグリカン（ａｍｐｈｉｇｌｙｃａｎ）とも呼ばれるシンデカン４とともに、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインにホモロジーを有するシンデカンファミリーを構成する、膜貫通型ヘパラン硫酸化プロテオグリカン高分子（ＨＳＰＧ）である。【００１２】
ＨＳＰＧは細胞種に特異的な分布をしており、細胞外基質タンパク質や細胞表面分子又はサイトカインなどの可溶性タンパク質との相互作用に関与することが知られている。また、この膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインには位置が高度に保存されたチロシン残基が４個存在しており、いずれかのチロシン残基がリン酸化されることにより細胞内情報伝達に関与する可能性が指摘されている。【００１３】
ヒトのＳｄｃ１（ｈＳｄｃ１）をコードする遺伝子はすでにクローニングされている（非特許文献７）。ｈＳｄｃ１は３１０アミノ酸残基からなり、アミノ酸１〜２５１の細胞外ドメイン、それに続く２５アミノ酸残基（アミノ酸２５２〜２７６）の疎水性膜貫通領域、最後の３４アミノ酸残基（アミノ酸２７７〜３１０）の細胞質ドメインを含む。アミノ酸１〜１７は分泌シグナルであり、ｈＳｄｃ１を生合成する細胞からＳｄｃ１が分泌される際には有用であるが、ｈＳｄｃ１の生理活性には必要ではないと理解されている。【００１４】
一方、ｈＳｄｃ１の細胞外ドメインには、３７位、４５位、４７位、２０６位及び２１６位の５つのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）付着可能部位が存在する。これらのうち４５位と４７位のアミノ酸残基はこれらを他のアミノ酸残基へと置換することによってヘパラン硫酸との結合能を失い、同時にｈＳｄｃ１としての生理活性を失うことが知られている。【００１５】
しかし、Ｓｄｃ１がＤＲ６と特異的に結合することによってＴ細胞の活性化抑制に関与していること、すなわちＤＲ６による免疫応答の制御に関してＤＲ６の生理的リガンドであることは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｐａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９８年、第４３１巻、ｐｐ．３５１−３５６
【非特許文献２】Ｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１１年、第１７巻、ｐｐ．８１６−８２１
【非特許文献３】Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒ、２００６年、第１０６巻、ｐｐ．４２−４７
【非特許文献４】Ｎｉｋｏｌａｅｖら、Ｎａｔｕｒｅ、２００９年、第４５７巻、ｐｐ．９８１−９８９
【非特許文献５】Ｚｈａｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１年、第１９４巻、ｐｐ．１４４１−１４４８
【非特許文献６】Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５年、第１７５巻、ｐｐ．２２８６−２２９２
【非特許文献７】Ｍａｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０年、第２６５巻、ｐｐ．６８８４〜６８８９
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特表２０１０−５１４７００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、免疫制御剤として利用可能な、ＤＲ６の免疫制御に関するレセプター機能を調節することのできる分子並びにＤＲ６及びシンデカン１を用いた免疫制御剤のスクリーニング方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、種々研究の結果、Ｓｄｃ１がＤＲ６と特異的に結合して免疫制御に関するシグナル伝達を誘導することのできるＤＲ６リガンドであることを見出し、下記の各発明を完成させた。【００２０】
（１）ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤。
（２）生理活性物質がＳｄｃ１又はその機能的等価物である、（１）に記載の免疫制御剤。
（３）生理活性物質が下記ａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（２）に記載の免疫制御剤；
ａ）配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
ｂ）配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド、
ｃ）配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、並びに
ｄ）配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するポリペプチド。
（４）生理活性物質がＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達に作用する抗ＤＲ６アゴニスト抗体又は抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である、（１）に記載の免疫制御剤。
（５）抗ＤＲ６アゴニスト抗体が下記ａ）〜ｅ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、（４）に記載の免疫制御剤；
ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
ｂ）配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
ｃ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、
ｄ）配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
ｅ）配列番号５４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
（６）抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体が下記ｆ）及びｇ）よりなる群から選ばれる１又は複数の抗ＤＲ６抗体である、（４）に記載の免疫制御剤；
ｆ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒからなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体、並びに
ｇ）配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６抗体。
（７）下記ａ）〜ｅ）の工程を含む、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質をスクリーニングする方法。
ａ）ＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と、（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つと被検物質とを共存させる工程、
ｂ）工程ａ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、
ｃ）被検物質の非存在下でＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとを共存させる工程、
ｄ）工程ｃ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、及び
ｅ）工程ｂ）の検出結果と工程ｄ）の検出結果とを比較する工程。
（８）Ｔ細胞で発現しているＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質を使用する、（７）に記載のスクリーニング方法。
（９）シグナル伝達の検出が、Ｔ細胞が産生するインターロイキン２の検出により行われる、（７）又は（８）に記載のスクリーニング方法。
（１０）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７２９として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン２５−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１７７−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン８２−３０、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８６−１８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３３として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８０−１０、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３４として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン４６−１５−２３及び受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３５として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１００−１１よりなる群から選ばれるハイブリドーマ細胞株。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、これまでに知られていない作用機序に基づく免疫制御剤を提供することができ、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、移植病、クローン病、潰瘍性大腸炎等の自己免疫疾患、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患に対する新しい治療薬の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】野生型のＤＲ６及び可溶型組換えマウスＤＲ６（ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ）の構造の模式図である。
【図２】ｍＤＲ６−ｈＦｃｍを結合させたマウス脾臓由来のナイーブ細胞に関するＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。ＤＲ６リガンド発現細胞はリンパ細胞画分に含まれる。
【図３】各種細胞特異的マーカータンパク質に対する標識化抗体で染色したＤＲ６リガンド発現細胞に関するＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図４】ＬＰＳで刺激したＢ細胞のｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能の経時変化を示すグラフである。
【図５】ＬＰＳで刺激したＢ細胞のｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能及び活性化マーカーであるＣＤ８６の発現パターンの経時変化を示すグラフである。
【図６】抗ＣＤ３抗体で刺激したＴ細胞中のＤＲ６ｍＲＮＡの発現量の経時変化を示すグラフである。
【図７】Ａ２０細胞、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞及びＷＥＨＩ３Ｂ細胞のｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能を示す図である。
【図８】ｍＴＮＦＲ２−ｈＦｃｍ、ｍＦａｓ−ｈＦｃｍ、ｍＤＲ５−ｈＦｃｍ及びｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対するＡ２０細胞の結合能を示す図である。
【図９】ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現しているＤＯ１１．１０−Ｔ形質転換細胞のｍＤＲ６−ｈＦｃｍ及びｈＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能を示す図である。
【図１０】ｍＳｄｃ１に対する特異的ｓｈＲＮＡを導入したＡ２０細胞の抗ｍＳｄｃ１抗体、ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ及び抗Ｂ２２０抗体に対する結合能を示すグラフである。
【図１１】抗原ＯＶＡ３２３−３３９を含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地でｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現しているＡ２０細胞とＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とを共培養したときの、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞によるＩＬ２の産生量の低下を示すグラフである。
【図１２】ｍＳｄｃ１の４５位及び４７位のセリンをいずれもアラニンに置換したｍＳｄｃ１変異体を発現している形質転換細胞のｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能を示す図である。
【図１３】ｍＳｄｃ１−ＨｉｓのＤＯ１１．１０−Ｔ細胞に対するアゴニスト（Ｔ細胞のＩＬ２産生量の抑制）効果を示すグラフである。
【図１４】ｍＳｄｃ１−ＨｉｓによるＩＬ２産生抑制はｍＤＲ６に対する特異的ｓｈＲＮＡを導入したＤＯ１１．１０−Ｔ細胞において観察されないことを示すグラフである。
【図１５】抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓにより刺激されたＤＯ１１．１０−Ｔ細胞におけるＦａｓ、ＦａｓＬ、ＣＤ６９、ＰＤ−１及びＣＤ３の各タンパク質の発現変動を示す図である。
【図１６】抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓにより刺激されたＤＯ１１．１０−Ｔ細胞におけるＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ及びＩＳＲＥの各タンパク質の活性変動を表したレポータータンパク質であるルシフェラーゼ活性の変化を示すグラフである。
【図１７】ｍＤＲ６又はｈＤＲ６を発現している形質転換Ｌ９２９細胞に対するクローン２５−１、クローン２５−３、クローン１００−１１及びクローン１７７−１が産生するモノクローナル抗体の結合強度を示す図である。
【図１８】クローン２５−１、クローン２５−２、クローン２５−３、クローン１００−１１及びクローン１７７−１が産生するモノクローナル抗体の作用を、ｍＤＲ６の細胞外ドメインとｍＣＤ４０の膜貫通領域及び細胞内ドメインとからなるキメラタンパク質を用いて試験した結果を示すグラフである。
【図１９】モノクローナル抗体２５−１のＤＯ１１．１０−Ｔ細胞に対するＩＬ２産生抑制効果を示すグラフである。
【図２０】ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とＯＶＡペプチドによりパルスしたＡ２０細胞との共培養系に、抗ｍＤＲ６抗体産生ハイブリドーマの培養上清（１００μＬ）あるいは精製抗体（１００μｇ／ｍＬを添加したときのＩＬ２産生量を示すグラフである。
【図２１】全身性エリテマトーデスモデル動物の血清中のＳｄｃ１の含有量の変化を示すイムノブロッティングの写真である。
【図２２】ｍＳｄｃ１を発現している形質転換細胞に対する、正常ｍＤＲ６及びシステインリッチドメインを欠いた変異型ｍＤＲ６それぞれの結合能を示すグラフである。
【図２３】全身エリテマトーデスのモデルマウス（ＳＬＥモデルマウス）にモノクローナル抗体２５−１を投与したときの、モデルマウスの生存率を示すグラフである。
【図２４】ＳＬＥモデルマウスにモノクローナル抗体２５−１を投与したときの、ＳＬＥモデルマウスにおける蛋白尿症の発症率を示すグラフである。
【図２５】モノクローナル抗体２５−１を投与したＳＬＥモデルマウスから調製された全脾臓細胞群における、ＣＤ３、ＤＲ６、ＣＤ４及びＣＤ８それぞれの発現細胞に関するＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図２６】図２５のパネルＢ及びパネルＤで観察されたＤＲ６陽性細胞の存在率の増加（平均値）を示すグラフである。
【図２７】蛋白尿症発症期のＳＬＥモデルマウスにモノクローナル抗体２５−１を投与することで、ＤＲ６を発現しているＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）の存在率が低下することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤に関する。
【００２４】
本発明におけるＤＲ６とは、４つの細胞外システインリッチモチーフ（ＣＲＤ１〜ＣＲＤ４）及び１つの細胞質デスドメイン構造を有するＩ型膜貫通レセプターをいう。ヒトのＤＲ６（ｈＤＲ６）は、非特許文献１に報告された配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる全６５５アミノ酸残基のタンパク質で、推定シグナル配列（アミノ酸１−４１）、細胞外ドメイン（アミノ酸４２―２１１）、膜貫通ドメイン（アミノ酸３５１−３７０）及び細胞質ドメイン（アミノ酸３７１−６５５）が含まれる。マウスのＤＲ６（ｍＤＲ６）は非特許文献５に報告された配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる全６５５アミノ酸残基のタンパク質で、ｈＤＲ６とのアミノ酸配列の同一性は８８％である。
【００２５】
本明細書における用語ＤＲ６には、いわゆる遺伝子多形にコードされる配列番号２又は配列番号４とは一部異なるアミノ酸配列からなる天然に存在するＤＲ６変異体、天然に存在する切断型又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列を含む可溶化ＤＲ６）、天然に存在するスプライス変異体及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。なお、本明細書において単にＤＲ６と表したときは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するいずれかのＤＲ６を意味する。当該ＤＲ６は、自然から単離精製されうるか、又は遺伝子工学的に又は化学合成的に製造することができる。
【００２６】
本明細書における「変異体」なる用語は、例えば配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＤＲ６の場合には、これらアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは少なくとも約８５％以上、より好ましくは少なくとも約９０％以上、もっとも好ましくは少なくとも約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるＤＲ６又はその断片、又はその細胞外ドメインを包含する。また用語「変異体」は、例えば配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＤＲ６の場合には、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が欠失、置換及び／又は付加したアミノ酸配列からなるＤＲ６、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基が付加したポリペプチド、配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端から１又は複数のアミノ酸残基が欠失したＤＲ６も含む。
【００２７】
なお、アミノ酸配列の同一性（％）は、当業者によって通常用いられる適当なソフトプログラム、例えば配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２などを用い、比較されるアミノ酸配列をアラインメントしたときに得られる最大のパーセント配列同一性を意味する。
【００２８】
本明細書におけるｈＳｄｃ１は、非特許文献７に報告された配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、４５位と４７位にヘパラン硫酸が結合した全３１０アミノ酸残基の膜貫通型ヘパラン硫酸化プロテオグリカン高分子をいう。またマウスのＳｄｃ１（ｍＳｄｃ１）は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、４５位と４７位にヘパラン硫酸が結合した全３１１アミノ酸残基の膜貫通型ヘパラン硫酸化プロテオグリカン高分子をいう。
【００２９】
本明細書におけるＳｄｃ１には、いわゆる遺伝子多形にコードされる配列番号６又は配列番号８とは一部異なるアミノ酸配列からなる天然に存在するＳｄｃ１変異体、天然に存在する切断型又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列を含む可溶化Ｓｄｃ１）、天然に存在するスプライス変異体及び天然に存在する対立遺伝子変異体を含む。なお、本明細書において単にＳｄｃ１と表したときは、ヒトを含む任意の哺乳動物由来の天然に存在するいずれかのＳｄｃ１を意味する。当該Ｓｄｃ１は、自然から単離精製されうるか、又は遺伝子工学的に又は化学合成的に製造することができる。
【００３０】
本明細書における「ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達」は、前記２つの分子のリガンド−レセプター間相互作用によって開始されて免疫細胞であるＴ細胞の活性化抑制へと至る、ＤＲ６を発現している細胞内における連鎖反応の全部又は一部をいう。ＤＲ６を発現している細胞がＴ細胞である場合、当該シグナル伝達はそのＴ細胞のインターロイキン２（ＩＬ２）産生量を測定することでモニターすることができる。また当該シグナル伝達はＤＲ６の細胞内デスドメインと細胞内の他のタンパク質との相互作用によって伝達されることから、シグナル伝達に関与するＤＲ６以外の細胞内分子の機能、活性、形態、化学構造などの変化を測定することで、本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。
【００３１】
本明細書における「シグナル伝達の制御能」とは、上述のシグナル伝達を開始させる、増強させる若しくは増幅させる能力、又は当該シグナル伝達の開始を防止する、抑止する、中和する、遮断する、停止させる、中断させる若しくは減衰させる能力をいう。本発明では特に断らない限り、前記シグナル伝達を開始させる、増強させる又は増幅させる能力を誘導能と、前記シグナル伝達の開始を防止する、抑止する、遮断する、停止させる、中断させる又は減衰させる能力を抑制能と表すことにする。また、ＤＲ６への結合能及び前記誘導能を有する物質をＤＲ６アゴニストと、ＤＲ６への結合能及び前記抑制能を有する物質をＤＲ６アンタゴニストと表すことにする。
【００３２】
「ＤＲ６アンタゴニスト」又は「ＤＲ６アゴニスト」なる用語は最も広い意味に使用され、インビトロ、インサイツ、インビボ又はエクスビボの何れかで、ＤＲ６とＳｄｃ１との結合によりＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を制御する任意の分子を含む。
【００３３】
本発明として意図されるＤＲ６アンタゴニスト又はＤＲ６アゴニストは、抗ＤＲ６抗体、Ｓｄｃ１、Ｓｄｃ１変異体、可溶化Ｓｄｃ１、可溶化Ｓｄｃ１変異体又はそれらと他のタンパク質とからなる融合タンパク質、これらの多量体、又はＤＲ６と結合してＤＲ６とＳｄｃ１との結合を抑制する低分子化合物などを挙げることができる。
【００３４】
したがって、本発明における「免疫制御剤」の一態様は、ＤＲ６への結合能を有し、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって開始されるＴ細胞の活性抑制へと至るシグナル伝達に関するアゴニスト又はアンタゴニストであって、Ｔ細胞の活性化が関与する免疫応答を開始させる、増強させる、増幅させる、防止する、抑止する、遮断する、停止させる、中断させる又は減衰させるための物質を含む。
【００３５】
また本発明における「免疫制御剤」の別の態様は、Ｓｄｃ１への結合能を有し、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって開始されるＴ細胞の活性抑制へと至るシグナル伝達を防止する、抑止する、遮断する、停止させる、中断させる又は減衰させるための物質を含む。
【００３６】
以下、実施態様を例示することにより本発明をさらに説明する。
１．アゴニストである免疫制御剤
【００３７】
本発明のある実施態様では、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるＴ細胞の活性化抑制に至るシグナル伝達の誘導能を有する免疫制御剤が提供される。すなわち、本実施態様は、ＤＲ６と結合して前記シグナル伝達を誘導してＴ細胞活性化を抑制することのできる、ＤＲ６アゴニストとしての免疫制御剤に関する。
【００３８】
１−ａ）Ｓｄｃ１
本発明の免疫制御剤であるＤＲ６アゴニストの一つの実施態様は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるｈＳｄｃ１、又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるｍＳｄｃ１である。
【００３９】
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであるｍＳｄｃ１が生理的条件下でｍＤＲ６と結合することでＴ細胞の活性抑制へと至るシグナル伝達を誘導することは、以下に示す本発明者らの研究（１）〜（７）によって明らかにされた。
【００４０】
（１）ＤＲ６のリガンド分子を探索するために、ｍＤＲ６をコードする遺伝子（配列番号３）を組み換えて、可溶型組換えｍＤＲ６（ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ）を作成した。この組換タンパク質は、ｍＤＲ６の細胞外領域（アミノ酸配列の１〜３５０番目、配列番号８８）とヒトＩｇＧのＦｃ領域とからなる融合タンパク質の２分子がＦｃ領域でジスルフィド結合してなる２量体である。また、非特異的な結合を抑制する為に該ヒトＩｇＧのＦｃ領域の２３３番目のグルタミン酸がフェニルアラニンに、２３４番目のロイシンがバリンに、２３５番目のロイシンがアラニンに、それぞれ置換されている。野生型のＤＲ６及びｍＤＲ６−ｈＦｃｍの構造の模式図を図１に示す。
【００４１】
ＡＰＣ（アロフィコシアニン）で標識化したｍＤＲ６−ｈＦｃｍ（標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ）を用いてマウス脾臓由来のナイーブ細胞を染色した後、ＦＡＣＳでそれらを分離したところ、リンパ細胞群中に標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍが結合した細胞すなわちＤＲ６リガンド発現細胞が検出された（図２、パネルＤ、リンパ球の左上部）。さらにＤＲ６リガンド発現細胞を、細胞特異的マーカータンパク質であるＢ２２０、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４９ｂ及びＦ４／８０のそれぞれに特異的な標識化抗体で染色したところ、ＤＲ６リガンド発現細胞はＢ細胞特異的マーカータンパク質であるＢ２２０に対する標識化抗体より染色された（図３、Ｂ２２０細胞を示すパネルの右上部）。
【００４２】
（２）マウス脾臓から単離したＢ細胞をＬＰＳで刺激し、同細胞と標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍとの結合を経時的に測定したところ、標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍのＢ細胞への結合はＬＰＳ刺激後２日目に増加した（図４）。また、同時に測定したＢ細胞の活性化マーカーであるＣＤ８６も、ＬＰＳ刺激後２日目に増加した（図５）。これらから、ＤＲ６リガンドの発現はＢ細胞の活性化期に誘導されることが確認された。一方、ＤＲ６を細胞膜上に発現しているＴ細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激し、同細胞中のＤＲ６のｍＲＮＡの発現量を経時的に測定したところ、ＤＲ６の発現も抗ＣＤ３抗体による刺激すなわちＴ細胞の活性化刺激により誘導されることが確認された（図６）。
【００４３】
（３）免疫細胞であるＡ２０細胞、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞、ＷＥＨＩ２３１細胞及びＷＥＨＩ３Ｂ細胞の標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能を調べたところ、成熟Ｂ細胞由来のＡ２０のみが標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍとの結合能を示した（図７）。さらに、標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍのｍＤＲ６（１−３５０残基）をマウスＴＮＦレセプター（ｍＴＮＦＲ２）、マウスＦａｓタンパク質（ｍＦａｓ）、マウスデスレセプター５（ｍＤＲ５）にそれぞれ置き換えた標識化ｍＴＮＦＲ２−ｈＦｃｍ、標識化ｍＦａｓ−ｈＦｃｍ及び標識化ｍＤＲ５−ｈＦｃｍを作製し、これらに対するＡ２０細胞の結合能を調べたところ、Ａ２０細胞は標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍと特異的に結合した（図８）。すなわち、Ａ２０細胞上に存在するＤＲ６リガンドは、ＤＲ６と特異的に結合することが確認された。
【００４４】
（４）ｍＳｄｃ１をコードする遺伝子（配列番号７）を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１)、ｈＳｄｃ１をコードする遺伝子（配列番号５）を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１）及びコントロールベクター（ｐＭＸｓＩＧ）をそれぞれＤＯ１１．１０−Ｔ細胞に導入して形質転換細胞を作製した。また、標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍのｍＤＲ６（１−３５０残基）をｈＤＲ６の細胞外領域（アミノ酸配列の１〜３５０番目、配列番号８６）に置き換えて標識化ｈＤＲ６−ｈＦｃｍを作製した。
【００４５】
標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ及び標識化ｈＤＲ６−ｈＦｃｍに対する上記３種類の形質転換細胞の結合能を調べたところ、コントロールを除くいずれの形質転換細胞も、標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ及び標識化ｈＤＲ６−ｈＦｃｍいずれにも結合した（図９）。すなわち、ｍＤＲ６はｍＳｄｃ１及びｈＳｄｃ１と、またｈＤＲ６はｍＳｄｃ１及びｈＳｄｃ１と結合することが確認された。
【００４６】
（５）ｍＳｄｃ１をコードする遺伝子の異なる領域を標的とした２種類の特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍＳｄｃ１−２及びｓｈｍＳｄｃ１−５）をＡ２０細胞に導入して、ｍＳｄｃ１の発現が抑制された形質転換細胞を作製した。市販の抗ｍＳｄｃ１抗体、標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ及び抗Ｂ２２０抗体に対する前記形質転換細胞の結合能を調べたところ、標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能は抗Ｓｄｃ１抗体と同程度に減少した（図１０）。すなわち、Ａ２０細胞におけるＳｄｃ１の発現と標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する結合能には正の相関があることが確認された。
【００４７】
（６）抗原ＯＶＡ３２３−３３９に反応性を示す抗原提示細胞としてのＡ２０細胞に、マウスＳｄｃ１（ｍＳｄｃ１）をコードする遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１）、ｈＳｄｃ１をコードする遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１）及びコントロールベクター（ｐＭＸｓＩＧ）をそれぞれ導入して、３種類の形質転換細胞を作製した。抗原ＯＶＡ３２３−３３９を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で前記形質転換細胞とＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とを共培養した後、各培地中のＩＬ２産生量をＥＬＩＳＡによって測定した。コントロール形質転換細胞及び形質転換しなかったＡ２０細胞と比較して、ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現している形質転換Ａ２０細胞とＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とを共培養した培地中のＩＬ２の産生量は、１７０ｐｇ／ｍｌ以下に低下した（図１１）。すなわち、抗原提示細胞におけるｈＳｄｃ１又はｍＳｄｃ１の発現はＴ細胞の活性化を抑制することが確認された。
【００４８】
（７）ｍＳｄｃ１の４５位及び４７位のセリンをいずれもアラニンに置換したｍＳｄｃ１変異体をコードする遺伝子を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／Ｓ４５Ａ／Ｓ４７ＡｍＳｄｃ１）及び前記ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１をＡ２０細胞にそれぞれ導入して、ｍＳｄｃ１変異体を発現している形質転換細胞及びｍＳｄｃ１を発現している形質転換細胞を作製した。標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍに対する上記２種類の形質転換細胞の結合能を調べたところ、ｍＳｄｃ１を発現している形質転換細胞（コントロール）と比較して、ｍＳｄｃ１変異体を発現している細胞の結合能はほとんど検出されなかった（図１２）。
【００４９】
（１）〜（７）に示された研究結果は、Ｓｄｃ１がＢ細胞の細胞膜上に発現しており、Ｔ細胞の細胞膜上に発現しているＤＲ６と結合することでＴ細胞の活性化抑制すなわちＴ細胞によるＩＬ２産生を抑制する機能を有することを示している。このことは、Ｓｄｃ１がＤＲ６に対する特異的結合能を有し、Ｔ細胞の活性化抑制に至るシグナル伝達の誘導能を有する免疫制御剤として利用可能であることを意味する。したがって、本発明の好ましい実施態様の一つは、配列番号６又は８に示されるアミノ酸配列からなるＳｄｃ１を有効成分とする免疫制御剤又はＴ細胞活性化抑制剤に関する。
【００５０】
なお、上記の研究において行われた各種実験は、いずれも当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行われたものである。また市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従った。
【００５１】
本発明の免疫制御剤の一つであるＳｄｃ１は、配列番号５又は配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
【００５２】
本発明においては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、宿主細胞としてヒト胎児腎細胞由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。かかる哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている各種方法を挙げることができる。
【００５３】
１−ｂ）アゴニストであるＳｄｃ１変異体
本発明の別の実施態様は、配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチド（以下、Ｓｄｃ１変異体とする）である、免疫制御剤である。
【００５４】
一般に、あるアミノ酸配列からなる機能性タンパク質において、その機能を保持しながらも一定の範囲でアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加が許容されることは、当業者に広く知られている。例えば、ｈＳｄｃ１と異種生物のＳｄｃ１例えばｍＳｄｃ１とのアミノ酸配列のアライメントによって確認される互いに異なるアミノ酸残基や、シンデカンファミリー間でのアミノ酸配列のアライメントによって確認される互いに異なるアミノ酸残基について、それらを相互に置き換えても元のタンパク質の機能性が失われない場合がある。
【００５５】
また、アミノ酸配列のアライメントによって確認される対応するアミノ酸が存在しないアミノ酸ギャップについて、そのギャップに相当するアミノ酸を欠失させたりあるいは付加したりしても、元のタンパク質の機能が失われない場合がある。さらに、例えばＬｅｕ（本明細書では天然アミノ酸を３文字表記で表すこととする）とＩｌｅ、ＡｓｐとＧｌｕ、ＡｓｎとＧｌｎ、ＬｙｓとＡｇｒ、ＳｅｒとＴｈｒその他の当業者に保存的置換として知られているアミノ酸間の置換によっても、元のタンパク質の機能が失われない場合があることも広く知られている。特に現在では、機能を維持することができる置換位置とアミノ酸の選択を、タンパク質の２次構造予測及び／又は３次元構造予測、疎水性、親水性、電荷、側鎖の嵩その他のアミノ酸の物理化学的特性に基づいて、高い確度をもって予測することが可能となっている。
【００５６】
したがって、本発明の実施態様の一つであるＳｄｃ１において、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失され、置換され及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＤＲ６との結合能及びＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチドは、ＤＲ６に対するＳｄｃ１アゴニスト変異体として利用可能であり、本発明である免疫制御剤を構成する。
【００５７】
なお、配列番号６又は配列番号８の４５位と４７位のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ヘパラン硫酸による糖鎖修飾を受けることができず、その結果当該ポリペプチドはＤＲ６に対するアゴニストとしての機能を示すことができない。かかる配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において４５位と４７位のアミノ酸残基が置換された又は欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明には包含されない。
【００５８】
また、配列番号６又は配列番号８の１〜１７番目のアミノ酸配列は、Ｓｄｃ１を生合成する細胞においてＳｄｃ１が分泌又は膜に配置される際には有用な、いわゆるシグナル配列である。かかるシグナル配列はＤＲ６に対するリガンド機能にとって必要ではない。したがって、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列において１〜１７番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、ＤＲ６に対するＳｄｃ１アゴニスト変異体として利用可能であり、本発明である免疫制御剤を構成する。
【００５９】
本発明の免疫制御剤の一つであるＳｄｃ１変異体は、配列番号５又は配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
【００６０】
本発明においては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、発現宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。かかる哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現、及び所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
【００６１】
１−ｃ）アゴニストである可溶化Ｓｄｃ１
本発明のさらなる実施態様は、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、ＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチド（以下、可溶化Ｓｄｃ１とする）である、免疫制御剤である。
【００６２】
可溶化Ｓｄｃ１は、Ｓｄｃ１の細胞外ドメインの全部又は一部に相当するポリペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号６に示されるアミノ酸配列の１〜２５０番目のアミノ酸配列又は配列番号８の１〜２５１番目のアミノ酸配列に相当する。可溶化Ｓｄｃ１は膜貫通領域を持たないので膜にはアンカーリングされず、細胞質、血液その他の液体媒体中に可溶化状態で存在することができる。
【００６３】
本発明の免疫制御剤の一つである可溶化Ｓｄｃ１は、配列番号９又は配列番号１１に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。また、配列番号５又は配列番号７に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して一般的な遺伝子組み換え手法を適用して得られるＳｄｃ１をプロテアーゼ消化して、可溶化Ｓｄｃ１を製造してもよい。
【００６４】
本発明においては、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現、及び所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
【００６５】
１−ｄ）アゴニストである可溶化Ｓｄｃ１変異体
本発明のさらに異なる実施態様は、配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチド（以下、可溶化Ｓｄｃ１変異体とする）である、免疫制御剤である。
【００６６】
本実施態様には、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列において、先にＳｄｃ１変異体に関して説明した態様のようなアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列からなる可溶化Ｓｄｃ１変異体が含まれる。例えば、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列において１〜１７番目のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、ＤＲ６との結合能及びＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を誘導する活性を有するポリペプチドであり、可溶化Ｓｄｃ１変異体として本発明である免疫制御剤を構成する。
【００６７】
また、配列番号１０のＣ末端アミノ酸残基は配列番号６の２５０番目のアミノ酸残基に相当するが、配列番号６の２５１番目以降のアミノ酸配列が配列番号１０に示されるアミノ酸配列のＣ末端に数個〜十数個付加されても、逆に配列番号１０のＣ末端が数個〜十数個欠失されても、かかるアミノ酸配列からなるポリペプチドはＤＲ６との特異的結合能及びＤＲ６を介した免疫制御に関するシグナル伝達を誘導する活性を有することができる。配列番号１２についても同様である。かかる配列番号１０又は配列番号１２のＣ末端において数個〜十数個のアミノ酸が付加された又は欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドも、可溶化Ｓｄｃ１変異体として本発明である免疫制御剤を構成する。
【００６８】
本発明の免疫制御剤である可溶化ｈＳｄｃ１変異体は、配列番号９又は配列番号１１に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
【００６９】
本発明においては、配列番号１０又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５位及び４７位に適切な糖鎖を付与させるために、宿主細胞としてＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞を利用することが好ましい。かかる哺乳動物細胞における外来タンパク質の発現、所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
【００７０】
１−ｅ）抗ＤＲ６アゴニスト抗体
ＤＲ６アゴニストのまた別の実施態様の例は、ＤＲ６に特異的に結合し、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができる抗ＤＲ６アゴニスト抗体である。抗ＤＲ６アゴニスト抗体としては、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。
【００７１】
本発明の特定の実施態様では、ＤＲ６アゴニストである免疫制御剤はＤＲ６細胞外ドメイン又はその断片に結合する抗ＤＲ６アゴニスト抗体を含むことができる。
【００７２】
本発明の抗ＤＲ６抗体は、当業者に知られた一般的な抗体作成方法によって得ることができる。具体的には、ＤＲ６好ましくは遺伝子組み換え手法によって製造されたＤＲ６又はその一部、若しくはそれらと適当なキャリア物質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビタなど）とのコンジュゲートを、必要に応じて免疫賦活剤（フロインドの完全又は不完全アジュバント等）とともに、ラット、ラビット、ヒト抗体産生トランスジェニックマウスなどの非ヒト哺乳動物に免疫することにより、抗ＤＲ６抗体産生細胞群を誘導し、抗ＤＲ６抗体を調製することができる。又は、ＤＲ６をコードする遺伝子を適当な発現ベクターに導入し、非ヒト哺乳動物内でＤＲ６を発現させることによって免疫感作させ、抗ＤＲ６抗体産生細胞群を誘導し、抗ＤＲ６抗体を調製してもよい。
【００７３】
本発明の抗ＤＲ６抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、抗ＤＲ６抗体産生細胞と自己抗体産生能のない不死化株化細胞、例えば骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）とを融合することにより得られるハイブリドーマを培養し、免疫に用いた抗原に対して免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって取得することができる。かかるモノクローナル抗体の作製方法を構成する工程としては、後の実施例において説明する抗原の作製工程及びモノクローナル抗体の生理活性及びその認識特異性の検定を含む所望の抗体の選別工程を除き、当業者に周知の工程を利用することができる。
【００７４】
一般に、抗体の重鎖及び軽鎖はそれぞれＮ末端側に可変領域及びＣ末端側に定常領域（ＣＨ、ＣＬ）を有している。重鎖及び軽鎖の可変領域にはそれぞれ相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。ＣＤＲ以外の部分はＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。
【００７５】
重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域は、重鎖相補性決定領域と呼ばれる。また軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）及び第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域は、軽鎖相補性決定領域とよばれる。
【００７６】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体には、新規なアミノ酸配列を含有するＣＤＲを有する抗ＤＲ６アゴニスト抗体、好ましくはモノクローナル抗体が包含される。
【００７７】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体の好ましい実施態様としては、後述の実施例に記載されるクローン２５−１により産生される抗体（２５−１抗体）を挙げることができる。クローン２５−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７２９（識別の表示：２５−１）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７２９（識別の表示：２５−１）として国際寄託されている。
【００７８】
クローン２５−１により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【００７９】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１７７−１により産生される抗体（１７７−１抗体）を挙げることができる。クローン１７７−１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７３０（識別の表示：１７７−１）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３０（識別の表示：１７７−１）として国際寄託されている。
【００８０】
クローン１７７−１により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【００８１】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン８２−３０により産生される抗体（８２−３０抗体）を挙げることができる。クローン８２−３０は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７３１（識別の表示：８２−３０）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３１（識別の表示：８２−３０）として国際寄託されている。
【００８２】
クローン８２−３０により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号３６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号３８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号４０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号４２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【００８３】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１８６−１８により産生される抗体（１８６−１８抗体）を挙げることができる。クローン１８６−１８は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７３２（識別の表示（識別のための表示：１８６−１８）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３２（識別の表示（識別のための表示：１８６−１８）として国際寄託されている。
【００８４】
クローン１８６−１８により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号５０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号５２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【００８５】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１８０−１０により産生される抗体（１８０−１０抗体）を挙げることができる。クローン１８０−１０は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７３３（識別の表示：１８０−１０）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３３（識別の表示：１８０−１０）として国際寄託されている。
【００８６】
クローン１８０−１０により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号５４に示されるミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号６０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【００８７】
上記の各具体的な態様である抗ＤＲ６アゴニスト抗体において、各ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、必要に応じてＦＲに１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入を伴っていてもよい。また、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が本発明の抗体以外の他の抗体、特にＣＤＲ以外が異なる生物種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体も本発明の抗体に包含される。
【００８８】
ＣＤＲ移植抗体の好適な例は、ＣＤＲ配列がマウス、ラット、ウサギその他の非ヒト動物由来であり、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列がヒト由来であるヒト化抗体又はヒト抗体である。かかるヒト化抗体又はヒト抗体の製造方法は当業者に周知であり、例えばＪｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、第３２１巻、５２２−５２５ページ）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、第３３２巻、３２３−３２７ページ）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、第２３９巻、１５３４−１５３６ページ）の方法などがあり、上記の抗ＤＲ６アゴニスト抗体であるクローンそれぞれに適用することができる。
【００８９】
本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体は、その機能的断片も包含する。機能的断片とは、抗体の部分断片であって抗原への結合能、抗原への反応性又は抗原の認識能を保持したものを意味する。かかる機能性断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【００９０】
本発明に包含されるＦａｂは、抗ＤＲ６アゴニスト抗体をパパイン消化して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂをコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【００９１】
本発明に包含されるＦ（ａｂ’）２は、抗ＤＲ６アゴニスト抗体をペプシン消化して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものより大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、下記に説明するＦａｂ’の２分子をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで調製することができる。
【００９２】
本発明に包含されるＦａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合をジチオスレイトールなどの還元剤で切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂ’をコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【００９３】
本発明に包含されるｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）と１本の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｌと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ又はＶＬ−Ｌ−ＶＨと表すことができる構造を有する、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００９４】
本発明に包含されるｓｃＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして上記構造を有するｓｃＦｖをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【００９５】
本発明に包含されるダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は同一であっても、また互いに異なっていてもよい。ダイアボディについては例えば欧州特許第４０４，０９７号及び国際公報ＷＯ１９９３／１１１６１号パンフレットに詳細に記載されている。
【００９６】
本発明に包含されるダイアボディは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、アミノ酸配列の長さが８残基以下であるペプチドリンカーＬを介してＶＨ及びＶＬが連結されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【００９７】
本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したシステイン含有ＨＶとシステイン含有ＬＶとを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換されるアミノ酸残基の決定は、Ｒｅｉｔｅｒら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４，１９９４）の方法に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【００９８】
本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、上記Ｒｅｉｔｅｒらの方法によって特定されたアミノ酸残基がシステインに置換されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【００９９】
なお、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体及びその機能的断片は、ヨウ素１２５などの放射性同位元素、核酸プローブや蛍光標識物質などの低分子化合物、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー及びヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどの高分子薬剤又はタンパク質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合又はコンジュゲートさせた標識化抗体又は誘導体とすることができ、これらはいずれも本発明に含まれる。抗体又はその機能的断片に結合させることのできる化学物質やその結合は、当業者に周知の方法（例として抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４に記載された方法)を使用することができる。
【０１００】
また、本発明の抗ＤＲ６アゴニスト抗体は、公知の方法によってグリコシル化して用いてもよい。抗体をグリコシル化する方法は、例えばＪｅｆｆｅｒｉｓら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第６５巻、ｐｐ．１１１−１２８）又はＷｒｉｇｈｔら（ＴｉｂＴＥＣＨ、１９９７年、第１５巻、ｐｐ．２６−３２）などに記載されており、本発明の抗体又はその機能的断片に対してもかかる方法を適用することができる。
【０１０１】
なお、グリコシル化する方法によって、本発明のモノクローナル抗体のグリコシル化パターンが変更された抗体、具体的には元の抗体における１以上の糖鎖が除去された、１以上の糖鎖を新たに加えられた、又は糖鎖の組成が変更された抗体を作製することができる。本発明は、抗ＤＲ６アゴニスト抗体である限り、かかるグリコシル化抗体も含む。
【０１０２】
さらに本発明は、前記クローン２５−１、１７７−１、８２−３０、１８６−１８及び１８０−１０の各ＣＤＲのアミノ酸配列の１又は複数を含むポリペプチドを、抗ＤＲ６アゴニストとして含む。各ＣＤＲは直接又は適当なペプチドリンカーを介して互いに結合させてもよい。かかるポリペプチドは、各アミノ酸配列の１つ又は２以上をコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。また、本発明のＣＤＲを含むポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの当業者に周知の化学合成法によって製造することができる。
【０１０３】
２．アンタゴニストである免疫制御剤
本発明の一実施態様では、ＤＲ６に対する特異的結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の抑制能を有する免疫制御剤が提供される。すなわち、本実施態様は、ＤＲ６と結合してＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を抑制することでＴ細胞を活性化させることのできる、ＤＲ６アンタゴニストとしての免疫制御剤に関する。
【０１０４】
２−ａ）抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体
ＤＲ６アンタゴニストの実施態様の例は、ＤＲ６に特異的に結合し、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を抑制することができる抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である。抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体としては、例えばモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体が挙げられる。
【０１０５】
本発明の特定の実施態様では、ＤＲ６アンタゴニストである免疫制御剤はＤＲ６細胞外ドメイン又はその断片に結合する抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体を含むことができる。
【０１０６】
本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体の好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン４６−１５−２３により産生される抗体（４６−１５−２３抗体）を挙げることができる。クローン４６−１５−２３は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７３４（識別の表示（識別のための表示：４６−１５−２３）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３４（識別の表示（識別のための表示：４６−１５−２３）として国際寄託されている。
【０１０７】
クローン４６−１５−２３により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号６６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号６８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号７０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒからなる軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号７２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【０１０８】
本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のもう一つの好ましい実施態様は、後述の実施例に記載されるクローン１００−１１により産生される抗体（１００−１１抗体）を挙げることができる。クローン１００−１１は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに２０１３年１０月１７日付で受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７３５（識別の表示：１００−１１）として国内寄託され、２０１４年１０月２７日付で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３５（識別の表示：１００−１１）として国際寄託されている。
【０１０９】
クローン１００−１１により産生される抗ＤＲ６抗体は、配列番号７４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号７６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、配列番号８０に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、アミノ酸配列がＴｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒである軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号８２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む抗ＤＲ６モノクローナル抗体である。
【０１１０】
上記の各具体的な態様である抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体において、各ＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、必要に応じてＦＲに１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／又は挿入を伴っていてもよい。また、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が本発明の抗体以外の他の抗体、特にＣＤＲ以外が異なる生物種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体も本発明の抗体に包含される。
【０１１１】
ＣＤＲ移植抗体の好適な例は、ＣＤＲ配列がマウス、ラット、ウサギその他の非ヒト動物由来であり、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列がヒト由来であるヒト化抗体又はヒト抗体である。かかるヒト化抗体又はヒト抗体の製造方法は当業者に周知であり、例えばＪｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８６年、第３２１巻、５２２−５２５ページ）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ、１９８８年、第３３２巻、３２３−３２７ページ）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、第２３９巻、１５３４−１５３６ページ）の方法などがあり、上記の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体であるクローンそれぞれに適用することができる。
【０１１２】
本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体は、その機能的断片も包含する。機能的断片とは、抗体の部分断片であって抗原への結合能、抗原への反応性又は抗原の認識能を保持したものを意味する。かかる機能性断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
【０１１３】
本発明に包含されるＦａｂは、抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体をパパイン消化して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂをコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【０１１４】
本発明に包含されるＦ（ａｂ’）２は、抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体をペプシン消化して得られる断片のうち、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものより大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、下記に説明するＦａｂ’の２分子をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させることで調製することができる。
【０１１５】
本発明に包含されるＦａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合をジチオスレイトールなどの還元剤で切断した、分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として調製することができる。また、該抗体のＦａｂ’をコードする核酸を作成し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【０１１６】
本発明に包含されるｓｃＦｖは、１本の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）と１本の軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｌと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ又はＶＬ−Ｌ−ＶＨと表すことができる構造を有する、抗原結合活性を有する抗体断片である。
【０１１７】
本発明に包含されるｓｃＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして上記構造を有するｓｃＦｖをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【０１１８】
本発明に包含されるダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は同一であっても、また互いに異なっていてもよい。ダイアボディについては例えば欧州特許第４０４，０９７号及び国際公報ＷＯ１９９３／１１１６１号パンフレットに詳細に記載されている。
【０１１９】
本発明に包含されるダイアボディは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、アミノ酸配列の長さが８残基以下であるペプチドリンカーＬを介してＶＨ及びＶＬが連結されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【０１２０】
本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したシステイン含有ＨＶとシステイン含有ＬＶとを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換されるアミノ酸残基の決定は、Ｒｅｉｔｅｒら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７：６９７−７０４，１９９４）の方法に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
【０１２１】
本発明に包含されるｄｓＦｖは、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体のＶＨ及びＶＬをコードする核酸を基にして、上記Ｒｅｉｔｅｒらの方法によって特定されたアミノ酸残基がシステインに置換されたポリペプチドをコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。
【０１２２】
なお、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体及びその機能的断片は、ヨウ素１２５などの放射性同位元素、核酸プローブや蛍光標識物質などの低分子化合物、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー及びヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどの高分子薬剤又はタンパク質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合又はコンジュゲートさせた標識化抗体又は誘導体とすることができ、これらはいずれも本発明に含まれる。抗体又はその機能的断片に結合させることのできる化学物質やその結合は、当業者に周知の方法（例として抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４に記載された方法)を使用することができる。
【０１２３】
また、本発明の抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体は、公知の方法によってグリコシル化して用いてもよい。抗体をグリコシル化する方法は、例えばＪｅｆｆｅｒｉｓら（Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、第６５巻、ｐｐ．１１１−１２８）又はＷｒｉｇｈｔら（ＴｉｂＴＥＣＨ、１９９７年、第１５巻、ｐｐ．２６−３２）などに記載されており、本発明の抗体又はその機能的断片に対してもかかる方法を適用することができる。
【０１２４】
なお、グリコシル化する方法によって、本発明のモノクローナル抗体のグリコシル化パターンが変更された抗体、具体的には元の抗体における１以上の糖鎖が除去された、１以上の糖鎖を新たに加えられた、又は糖鎖の組成が変更された抗体を作製することができる。本発明は、抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体である限り、かかるグリコシル化抗体も含む。
【０１２５】
さらに本発明は、前記クローン４６−１５−２３及び１００−１１の各ＣＤＲのアミノ酸配列の１又は複数を含むポリペプチドを、抗ＤＲ６アンタゴニストとして含む。各ＣＤＲは直接又は適当なペプチドリンカーを介して互いに結合させてもよい。かかるポリペプチドは、各ＣＤＲのアミノ酸配列の１つ又は２以上をコードする核酸を構築し、当業者に周知の各種宿主発現系を用いて原核生物又は真核生物内で発現させ、回収することで製造することができる。また本発明のＣＤＲを含むポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの当業者に周知の化学合成法によって製造することができる。
【０１２６】
２−ｂ）アンタゴニストであるＳｄｃ１変異体
ＤＲ６アンタゴニストの実施態様の別の例は、ＤＲ６に特異的に結合するが、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができないＳｄｃ１変異体である。具体的には、配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号６若しくは配列番号８に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するがＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができないポリペプチド（以下、Ｓｄｃ１不活化変異体とする）である、免疫制御剤である。
【０１２７】
２−ｃ）アンタゴニストである可溶化Ｓｄｃ１変異体
ＤＲ６アンタゴニストの実施態様の別の例は、ＤＲ６に特異的に結合するが、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができない可溶化Ｓｄｃ１変異体である。具体的には、配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列の４５番目及び４７番目のアミノ酸を除く１若しくは複数のアミノ酸が欠失された及び／若しくは置換されたアミノ酸配列、並びに／又は配列番号１０若しくは配列番号１２に示されるアミノ酸配列に１若しくは複数のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなり、かつＤＲ６との特異的結合能を有するがＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することができないポリペプチド（以下、可溶化Ｓｄｃ１不活化変異体とする）である、免疫制御剤である。
【０１２８】
３．Ｓｄｃ１との結合能を有する免疫制御剤
本発明の一実施態様では、Ｓｄｃ１又はその細胞外ドメインからなるポリペプチドに対する結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の抑制能を有する生理活性物質を有効成分とする免疫制御剤が提供される。
【０１２９】
ＤＲ６を発現している細胞において、Ｓｄｃ１がＤＲ６に結合すると、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達が生じる。そのため、Ｓｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質は、ＤＲ６発現細胞におけるＴ細胞活性化抑制を解き、Ｔ細胞の活性化を促すことができると期待される。
【０１３０】
Ｓｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質の例は、Ｓｄｃ１、特にＳｄｃ１の細胞外ドメインに対する抗Ｓｄｃ１抗体である。抗Ｓｄｃ１抗体はすでに市販されており、これらはいずれも本発明の免疫制御剤として利用することができる。また、当業者に周知の方法に従って新たに抗Ｓｄｃ１抗体を調製し、本発明の免疫制御剤として利用してもよい。さらにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｄｓＦｖ及びＣＤＲを含むペプチドなどに相当する各種機能的断片も、抗Ｓｄｃ１抗体から調製することができ、これらも本発明の免疫制御剤として利用することができる。
【０１３１】
Ｓｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質の別の例は、ＤＲ６の可溶性細胞外ドメインからなるタンパク質及び／又はその変異体である。ＤＲ６の細胞外ドメイン配列からなる可溶化ＤＲ６が天然に存在していることはすでに知られている。この可溶化型ＤＲ６はＳｄｃ１との結合能を保持している一方、細胞質デスドメインを欠いているので、細胞に対してＴ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を開始させることはできない。かかる天然に存在する可溶化型ＤＲ６はＳｄｃ１に結合することでＳｄｃ１とＤＲ６との結合を妨げることができる物質であり、本発明の免疫制御剤として利用することができる。
【０１３２】
かかる天然に存在する可溶化ＤＲ６は、ＤＲ６をコードする核酸から遺伝子組み換え手法によって作製することができ、その際に前述のアミノ酸の「保存的置換」、アミノ酸ギャップの欠失又は付加、Ｎ末端及び／又はＣ末端側へのアミノ酸残基の付加などの変異を、Ｓｄｃ１との結合能を失わずに行うことができる。この様な可溶化ＤＲ６の変異体も、本発明の免疫制御剤として利用することができる。
【０１３３】
可溶化ＤＲ６変異体は、配列番号１又は配列番号３に示されたアミノ酸配列をコードする核酸に対して所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法を適用することで、リコンビナントタンパク質として製造することができる。外来タンパク質の発現、及び所望の変異を導入する方法を含む一般的な遺伝子組み換え手法としては、前記Ｓａｍｂｒｏｏｋら又はその他の当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用される方法論を挙げることができる。
【０１３４】
なお、後述する実施例１０において、ＤＲ６の細胞外ドメインに存在する４つのＣＲＤのうちＣＲＤ１を欠損させると、Ｓｄｃ１との結合能が増加することが明らかになった。したがって、ＣＲＤ１を欠損した可溶化ＤＲ６変異体は、本発明の免疫制御剤の好ましい一態様である。
【０１３５】
４．ハイブリドーマ
本発明は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７２９として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン２５−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１７７−１、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン８２−３０、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８６−１８、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３３として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１８０−１０、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３４として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン４６−１５−２３、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７３５として寄託されているハイブリドーマ細胞株クローン１００−１１、及びそれらハイブリドーマ細胞株が産生するモノクローナル抗体が認識し結合するエピトープと同じエピトープを認識し結合することができる抗体を提供するハイブリドーマを含む。
【０１３６】
５．核酸
本発明の別の態様は、上述のＤＲ６アンタゴニスト又はＤＲ６アゴニストであるポリペプチドをコードする単離された核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、該核酸を含む発現ベクター、該核酸又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。これら核酸は、タンパク質をコードする塩基配列がその転写発現を調節する任意の機能性塩基配列、例えばプロモータ配列、オペレータ配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどと連結し、「遺伝子」を形成していてもよい。
【０１３７】
さらに本発明は上記核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなる核酸も包含する。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェント条件は温度、イオン濃度などの条件を考慮して当業者が適宜決定することができるが、概ねハイブリダイゼーション後に５０℃の６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、２５℃ないし６８℃中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムを含む）のサザンハイブリダイゼーションでハイブリダイズする程度であればよい。
【０１３８】
６．スクリーニング方法
本発明のある実施態様では、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達の制御能を有する免疫制御剤をスクリーニングする方法が提供される。具体的には、下記ａ）〜ｅ）の工程を含む、ＤＲ６とＳｄｃ１との結合によるシグナル伝達の制御能を有する生理活性物質をスクリーニングする方法が提供される。
ａ）ＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と、（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つと被検物質とを共存させる工程、
ｂ）工程ａ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、
ｃ）被検物質の非存在下でＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとを共存させる工程、
ｄ）工程ｃ）におけるＤＲ６、ＤＲ６の機能的等価物又は少なくともＤＲ６の機能的細胞外ドメインを含むタンパク質と（３）に規定されるポリペプチドの少なくとも一つとの特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を検出する工程、及び
ｅ）工程ｂ）の検出結果と工程ｄ）の検出結果とを比較する工程。
【０１３９】
ここにいうＤＲ６の機能的等価物とは、ＤＲ６の機能を保持した変異体、Ｓｄｃ１との結合能を有するＤＲ６の細胞外ドメイン、該細胞外ドメインの機能を保持した変異体又はこれらを含むポリペプチドをいう。またＳｄｃ１の機能的等価物とは、ＤＲ６との結合能及びＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導する機能を有する物質であり、具体的にはＤＲ６に対してアゴニスト作用を有する前記Ｓｄｃ１変異体、可溶化Ｓｄｃ１及び可溶化Ｓｄｃ１変異体をいう。
【０１４０】
ＤＲ６及びその機能的等価物並びにＳｄｃ１及びその機能的等価物は、天然に存在するものを単離精製して用いてもよいが、遺伝子クローニング、遺伝子増幅、発現ベクターへの組み込み、宿主細胞への核酸又は発現ベクターへの導入、タンパク質の発現及び精製その他の作業を含むいわゆる遺伝子工学的方法によって調製した組換タンパク質の利用が好ましい。具体的には、ＤＲ６及びその機能的等価物については配列番号１又は配列番号３に示された塩基配列からなる核酸に対して、またＳｄｃ１及びその機能的等価物については配列番号５又は配列番号７に示された塩基配列からなる核酸に対して、遺伝子工学的方法を適用して調製することができる組換タンパク質である。
【０１４１】
遺伝子工学的方法としては、当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を挙げることができる。また市販のキットや試薬を使用するときは、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従うことが好ましい。
【０１４２】
ＤＲ６及びその機能的等価物並びにＳｄｃ１及びその機能的等価物の調製において、特に好ましい発現ベクター、宿主細胞、精製方法はｐｃＤＮＡ３、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ヒトＩｇＧのＦｃ領域、或はヒスチジンタグ等付加されたタグに対するアフィニティーカラム精製などである。
【０１４３】
本発明のスクリーニング方法は、天然のＴ細胞上に発現しているＤＲ６、又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物を用いて実施されることが好ましい。特に、Ｔ細胞を宿主細胞とした前記組換えＤＲ６又はその機能的等価物を用いて実施されることが好ましい。かかるＴ細胞を用いることにより、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達の誘導又は抑制を、当該Ｔ細胞のＩＬ２産生量でモニターすることができる。
【０１４４】
また、ＤＲ６を発現している天然のＴ細胞、又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物を用いて実施される本発明のスクリーニング方法において、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達に関与するＤＲ６以外の細胞内分子（膜タンパク質を含む）の機能、活性、形態、化学構造などの変化を測定することで、本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。この様な細胞内分子としては、ＮＦκＢ、ＮＦＡＴ、Ｆａｓ、ＦａｓＬを挙げることができる。これらの細胞内分子はいずれも既知分子であり、各特異抗体等を用いたイムノアッセイその他の当該細胞内分子の検出方法は当業者に知られている。
【０１４５】
さらに、Ｔ細胞活性化抑制に至るシグナル伝達を受けて適当なレポータータンパク質の発現が誘導される又は抑制されるように予め改変した宿主細胞を用い、ＩＬ２産生量に代えて当該レポータータンパク質の挙動を測定することで本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。
【０１４６】
さらには、ＤＲ６の膜貫通領域及び細胞内デスドメインを他の膜貫通タンパク質の膜貫通領域及び細胞内ドメインに置換したキメラタンパク質を使用することで、ＤＲ６とＳｄｃ１との結合で開始されるシグナル伝達を前記キメラタンパク質の細胞内ドメインの機能変化として、又は細胞内ドメインからシグナルを受けた他の細胞内分子機能、活性、形態、化学構造などの変化を測定することで、本発明にいうシグナル伝達をモニターしてもよい。この様なキメラタンパク質も本発明におけるＤＲ６変異体に包含される。
【０１４７】
本発明のスクリーニング方法の実施態様の一つは、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合により開始されるシグナル伝達を検出することができる条件下で、ＤＲ６又はその機能的等価物及びＳｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質とを共存させる工程を含む。本実施態様の好ましい例としては、天然のＴ細胞上に発現しているＤＲ６、又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物及びＳｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質とを共存させる工程、及び前記天然のＴ細胞又は宿主細胞におけるシグナル伝達を検出する工程を含むスクリーニング方法である。
【０１４８】
この実施態様のスクリーニング方法を実施することにより、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合に直接的に関与する物質だけでなく、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合には関与せずに当該結合によるシグナル伝達を制御することができる物質を選択することが可能になる。
【０１４９】
本発明のスクリーニング方法の別の実施態様は、ＤＲ６又はその機能的等価物及びＳｄｃ１又はその機能的等価物と被検物質と共存させ、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合を阻害する又は抑制することができる被検物質を選別し、しかる後に当該選別された被検物質についてさらにＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合により開始されるシグナル伝達を検出する工程を含む。
【０１５０】
本実施形態の好ましい例としては、ＤＲ６の機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物、好ましくは可溶化Ｓｄｃ１又は可溶化Ｓｄｃ１変異体と被検物質とを共存させる工程、ＤＲ６の機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合を阻害する又は抑制することができる被検物質を選別する工程、及び天然のＴ細胞上に発現しているＤＲ６又はＤＲ６若しくはその機能的等価物をコードする核酸を用いて形質転換された宿主細胞上に発現している組換えＤＲ６若しくはその機能的等価物と選別された被検物質とを共存させ、前記天然のＴ細胞又は宿主細胞におけるシグナル伝達を検出する工程を含むスクリーニング方法である。特に可溶化ＤＲ６及び可溶化Ｓｄｃ１又は可溶化Ｓｄｃ１変異体と被検物質とを共存させる工程を含む方法が好ましい。
【０１５１】
この実施態様のスクリーニング方法を実施することにより、ＤＲ６又はその機能的等価物とＳｄｃ１又はその機能的等価物との結合に直接的に関与する物質をより効率的に選択することが可能になる。
【０１５２】
なお、本発明のスクリーニング方法において、ＤＲ６若しくはその機能的等価物とＳｄｃ１若しくはその機能的等価物との結合又はこれらと被検物質との結合は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、プルダウンアッセイその他の生化学的手法により検出することができる。また、ＩＡｓｙｓ解析、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）センサーチップ解析、マイクロアレイ解析又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などを用いて前記結合を検出してもよい。この場合において、ＤＲ６若しくはその機能的等価物又はＳｄｃ１若しくはその機能的等価物は適当なマトリックス上に固定化され使用されることが好ましい。これら手法はいずれも当業者に広く知られており、当業者の通常の実施能力の範囲内で本発明に適用することができる。
【０１５３】
７．治療方法
本発明の実施態様はまた、対象における免疫疾患を予防又は治療する方法を提供し、具体的には、哺乳動物に有効量の本発明の免疫制御剤を投与することを含む。
【０１５４】
本明細書中で用いられる「対象」は哺乳動物であり、その例としてはヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコ等を挙げることができるが、本発明は特にヒトを対象とする。
【０１５５】
本明細書中で用いられる「有効量」とは、治療対象である疾患又は症状を予防、治癒又は寛解するのに効果的な免疫制御剤の量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
【０１５６】
本発明の治療方法の実施形態の一つは、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を誘導することのできる前述の免疫制御剤の有効量を投与することで、哺乳動物の過剰な又は異常な免疫応答による疾患を予防又は治療する方法に関する。
【０１５７】
本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、移植病、クローン病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群等の自己免疫疾患、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患を挙げることができる。
【０１５８】
本発明の治療方法の別の実施態様は、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を抑制することのできる前述の免疫制御剤の有効量を投与することで、哺乳動物における免疫機能の増強が望まれる疾患を予防又は治療する方法に関する。
【０１５９】
本実施形態の治療方法の対象となる疾患としては、細菌、真菌その他の外来生物による感染症、悪性新生物を挙げることができる。また、本発明の免疫制御剤をワクチンアジュバントとしても利用することも、本実施形態に含まれる。
【０１６０】
本発明の治療方法では、免疫制御剤は、薬学的に許容される賦形剤、担体その他の成分を含む医薬組成物又は製剤の形態で投与されることが好ましい。かかる医薬組成物又は製剤の形態にある免疫制御剤も、本発明の免疫制御剤の一態様である。
【０１６１】
薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、治療対象となる疾患に応じて、本発明の免疫制御剤とその他の医薬とを併用して使用してもよい。
【０１６２】
８．診断方法
本発明は、対象から採取された試料中のＤＲ６及び／又はＳｄｃ１の存在又は含有量について試料を試験する工程を含む、過剰な又は異常な免疫応答による疾患又は免疫機能の低下による疾患を有するか又はかかる疾患が疑われる対象を診断する方法を提供する。
【０１６３】
本発明の診断方法の対象となる疾患としては、リュウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の自己免疫疾患、花粉症、アトピー、重症薬疹などのアレルギー疾患を挙げることができる。
【０１６４】
本発明の診断方法の好ましい実施態様は、本明細書に開示された抗ＤＲ抗体及び／又は抗Ｓｄｃ１抗体を用いて前記ＤＲ６及び／又はＳｄｃ１の存在又は含有量について試験するイムノアッセイに関する。また本発明の診断方法の別の実施態様は、試料中のＤＲ６及び／又はＳｄｃ１の存在又は含有量を、それらをコードする核酸に基づいて試験する方法に関する。
【０１６５】
前記イムノアッセイは、試料及び細胞株の組織免疫学的解析、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析を非限定的に含む当技術分野でよく知られた多くの手段によって実施することができる。また核酸ベースの診断は、ＲＴ-ＰＣＲを含む各種のＰＣＲ解析、ノーザンブロット解析、サザンブロット解析を非限定的に含む当技術分野でよく知られた多くの手段によって実施することができる。
【実施例】
【０１６６】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。【０１６７】
また、実施例を含む本明細書中に記載又は参照の技術及び手順は、例えば前出のＳａｍｂｒｏｏｋらその他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行われたものである。また市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従った。これら当分野の教科書やハンドブック、及び本明細書で引用されたすべての文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。【０１６８】
＜実施例１＞
（１）ｍＳｄｃ１及びｈＳｄｃ１の発現ベクターの構築
Ａ２０細胞より抽出されたｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号８に示されるマウスＳｄｃ１（ｍＳｄｃ１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当するＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで開環させた発現ベクターｐＭＸｓＩＧに組み換え、ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１を構築した。【０１６９】
同様に、ヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞より抽出されたｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、配列番号６に示されるヒトＳｄｃ１（ｈＳｄｃ１）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当するＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。この増幅ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで開環させた発現ベクターｐＭＸｓＩＧに組み換え、ｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１を構築した。【０１７０】
（２）形質転換及びＩＬ２産生量の測定
ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１又はｐＭＸｓＩＧ／ｈＳｄｃ１をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いたリポフェクション法により、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞に導入し、レトロウイルスを作製した。得られたレトロウイルスと抗原ＯＶＡ３２３−３３９に反応性を示す抗原提示細胞としてのＡ２０細胞とを混合し、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で４８時間培養することで、ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を細胞上に発現している形質転換Ａ２０細胞を作製した。抗原ＯＶＡ３２３−３３９を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で前記形質転換細胞とＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とを３７℃で１６時間共培養した後、各培地中のＩＬ２産生量をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）によって測定した。【０１７１】
図１１に示されるように、コントロール及び形質転換しなかったＡ２０細胞と比較して、ｍＳｄｃ１又はｈＳｄｃ１を発現しているＡ２０細胞とＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とを共培養した培地中のＩＬ２の産生量は１７０ｐｇ／ｍｌ以下に低下した。
【０１７２】
＜実施例２＞
（１）リコンビナントＳｄｃ１の調製
配列番号７に示されるｍＳｄｃ１をコードする遺伝子がクローニングされているｃＤＮＡベクターｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１を鋳型とし、ｍＳｄｃ１の細胞外ドメイン（配列番号８の２５１番目までのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ（配列番号１１）が増幅される様に設計し合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。【０１７３】
増幅されたＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで開環させた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ｈｉｓ＿ｖｅｒ．Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、発現ベクターに予め組み込まれているＨｉｓ配列と組み込まれたｍＳｄｃ１細胞外ドメインの読み枠が合う様に組み込み、Ｃ末端にＨｉｓ配列が追加されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｍＳｄｃ１−Ｈｉｓ、配列番号８４）が増幅される様に、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍＳｄｃ１−ｈｉｓを構築した。これをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で７日間培養して、ｍＳｄｃ１−Ｈｉｓを培地中に分泌させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムを用いて精製した。【０１７４】
（２）ｍＳｄｃ１刺激のＣＤ３依存性ＩＬ２産生に対する影響
３×１０４個のＤＯ１１．１０−Ｔ細胞を（１）で調製したｍＳｄｃ１−Ｈｉｓ（最終濃度１００ｎＭ）を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で、抗ＣＤ３抗体が固定化された９６穴細胞培養用プレート上で１６時間培養した。培養上清中のＩＬ２をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定した。その結果を図１３に示す。【０１７５】
抗ＣＤ３抗体刺激のみを与えたＤＯ１１．１０−Ｔ細胞（図中の抗ＣＤ３）が産生するＩＬ２量と比較して、ｍＳｄｃ１−Ｈｉｓを加えた同ハイブリドーマのＩＬ２産生量は約５０％低下することが観察された。なお、図中のｎｏｎは、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓを含まない条件下で培養した培地を対象にＩＬ２量を調べたネガティブコントロールである。【０１７６】
（３）ＤＲ６発現抑制の影響
上記（２）の実験を、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞の代わりに、ＤＲ６をコードする遺伝子の異なる領域を標的とした２種類の特異的ｓｈＲＮＡ（ｍＤＲ６−３及びｍＤＲ６−４）を導入したＤＯ１１．１０−Ｔ細胞を用いて行った。図１４に示す結果の通り、ｓｈＲＮＡを導入したＤＯ１１．１０−Ｔ細胞において、ｍＳｄｃ１−ＨｉｓによるＩＬ２産生抑制は観察されなかった。【０１７７】
以上から、ｍＳｄｃ１はＤＲ６を発現しているＴ細胞に対し、そのＩＬ２産生をＤＲ６の発現に依存して抑制する機能を有していることが確認された。【０１７８】
＜実施例３  Ｆａｓ及びＦａｓＬの発現変化＞
実施例２における抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓにより刺激されたＤＯ１１．１０−Ｔ細胞において、刺激から６時間経過時のＦａｓ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ６９、ＰＤ−１及びＣＤ３の各タンパク質の発現変動をフローサイトメトリー法により解析した。その結果を図１５に示す。図中、無色の波形は抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓの刺激を加えていないコントロール、グレーの波形は抗ＣＤ３抗体の刺激のみを受けたＤＯ１１．１０−Ｔ細胞、黒い波形は抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓの刺激を受けたＤＯ１１．１０−Ｔ細胞を示す。【０１７９】
図１５に示されるように、抗ＣＤ３抗体による刺激に依存して誘導されるＦａｓ及びＦａｓＬの発現が、ｍＳｄｃ１の刺激によって抑制されることが観察された。このＦａｓ又はＦａｓＬの発現量の変動によって、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合により誘導されるシグナル伝達をモニターすることができることが示された。【０１８０】
＜実施例４  転写因子の挙動変化＞
５’端側にＸｈｏＩ制限酵素認識配列、３’端側にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識配列を付加する様に合成されたＮＦκＢ、ＣＲＥＢ、又はＩＳＲＥ応答配列をコードするＤＮＡ断片を、ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素処理により開環されたホタルルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたｐＧＬ４．２６（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込み、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ及びＩＳＲＥ応答レポータープラスミドを作製した。ＮＦＡＴ活性測定用には市販のＮＦＡＴ応答配列の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたレポータープラスミド（ｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた。【０１８１】
上記レポータープラスミドを導入したＤＯ１１．１０−Ｔ細胞に抗ＣＤ３抗体による刺激、又は抗ＣＤ３抗体及びｍＳｄｃ１−Ｈｉｓによる刺激をそれぞれ加え、刺激から６時間経過時のＮＦＡＴ、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ及びＩＳＲＥの各転写因子タンパク質の活性を、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの活性の変化によりモニターした。その結果を図１６に示す。【０１８２】
図１６に示されるように、ｍＳｄｃ１による刺激はＮＦＡＴ及びＮＦκＢの活性を強く抑制することが観察された。このＮＦＡＴ又はＮＦκＢの活性の変動によって、ＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合により誘導されるシグナル伝達をモニターすることができることが示された。【０１８３】
＜実施例５  モノクローナル抗体の作製＞
（１）ハイブリドーマの作製
可溶型組換えｍＤＲ６であるｍＤＲ６−ｈＦｃｍを孔径０．４５ｍｍのフィルター（ミリポア社）に通した後、常法に従ってアジュバントを注射したウィスターラットに３回腹腔内注射（０．２ｍｇ／回）することにより免疫を行った。その後、常法に従って、免疫したラットから脾臓細胞を採取し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）を用いてマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と融合させてハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、常法に従って、ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％（ｗ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＨＡＴ溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、コロニーが確認できるまで約１０日間培養した。【０１８４】
以上の操作により、抗ＤＲ６抗体を産生するハイブリドーマとしてクローン２５−１、クローン２５−２、クローン２５−３、クローン１７７−１、クローン８２−３０、クローン１８６−１８、クローン１８０−１０、クローン４６−１５−２３及びクローン１００−１１を得た。クローン２５−２及びクローン２５−３を除くこれらハイブリドーマは常法に従って凍結乾燥され、独立行政法人製品評価技術基盤機構の特許微生物寄託センターに寄託された。【０１８５】
（２）ＣＤＲ解析
ＳＭＡＲＴｃＤＮＡライブラリー作製キット（タカラバイオ株式会社製）を用いて、（１）で選択されたハイブリドーマのＣＤＲ配列を解析した。具体的には、各ハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として３’末端側ＩｇＧ１重鎖特異的プライマー、ＩｇＧ２ａ重鎖特異的プライマー又はκ軽鎖特異的プライマーを用いてｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡを鋳型とし、フォワードプライマーとしてキットに添付の５’末端側特異的プライマーを、リバースプライマーとして３’末端側ＩｇＧ１重鎖特異的プライマー、ＩｇＧ２ａ重鎖特異的プライマー又はκ軽鎖特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。増幅されたＤＮＡ断片の核酸配列をＤＮＡシーケンサーを用いて解析し、得られた配列情報をＩｇＢＬＡＳＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）上で検索した。その結果、（１）で作製されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、いずれも新規なＣＤＲ配列の組み合わせを有することが確認された。クローン２５−１、１７７−１、８２−３０、１８６−１８、１８０−１０、４６−１５−２３及び１００−１１それぞれの重鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を表１に、軽鎖ＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を表２に示す。【０１８６】
【表１】
0006555687.tif 000002
【０１８７】
【表２】
0006555687.tif 000003
【０１８８】
（３）ｈＤＲ６及びｍＤＲ６に対する結合親和性
配列番号１に示されるｈＤＲ６をコードする遺伝子を、ヒトＴリンパ腫細胞由来Ｊｕｒｋａｔ細胞より抽出したＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、その推定シグナル配列から膜貫通ドメインを含むアミノ酸１−３７１領域をコードするＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。同様に、配列番号３に示されるｍＤＲ６をコードする遺伝子を、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞より抽出したＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、その推定シグナル配列から膜貫通ドメインを含むアミノ酸１−３７１領域をコードするＤＮＡが増幅される様に設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。プライマーは増幅されたＤＮＡの一端に制限酵素サイトＢａｍＨＩが、他端に制限酵素サイトＥｃｏＲＩが導入されるように設計された。【０１８９】
２種類の増幅断片をそれぞれ制限酵素で処理し、同じ制限酵素で開環させたレトロウイルスベクターｐＭＸｓＩＧに組み換えて、ｈＤＲ６をコードする発現プラスミドｐＭＸｓＩＧ及びｍＤＲ６をコードする発現プラスミドｐＭＸｓＩＧを作製した。これらプラスミドをＰＬＡＴ−Ｅ細胞を用いてパッケージングし、ウイルス粒子を作製した。このウイルス粒子をマウスＬ９２９細胞に感染させ、ｈＤＲ６又はｍＤＲ６を発現している２種類の形質転換Ｌ９２９細胞を得た。【０１９０】
この２種類の形質転換Ｌ９２９細胞及び親株であるＬ９２９細胞を、非特異的ラットＩｇＧ（ｒａｔＩｇＧ）、クローン２５−１、クローン２５−３、クローン１００−１１及びクローン１７７−１が産生するモノクローナル抗体をそれぞれ含む培地中で４℃、１時間インキュベートした後、２回の洗浄操作を行い、標識抗ラットＩｇＧ抗体を含む培地中で４℃、１時間再度インキュベートし、２回の洗浄操作の後にフローサイトメトリーを用いて各抗体の結合強度を測定した。その結果を図１７に示す。【０１９１】
本実験で使用したモノクローナル抗体はいずれもｍＤＲ６に対して反応性を示すとともに、ｈＤＲ６に対しても交差反応を示した。【０１９２】
＜実施例６  抗ＤＲ６アゴニスト抗体のスクリーニング＞
Ｊｕｒｋａｔ細胞より抽出したＲＮＡを元に作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）の膜貫通領域及び細胞内ドメインをコードするＤＮＡが増幅されるように設計したＥｃｏＲＩ認識配列を付加したフォワードプライマー及びＮｏｔＩ認識配列を付加したリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。同様に、ｍＤＲ６の細胞外ドメインをコードするＤＮＡが増幅されるように設計したＥｃｏＲＩ認識配列を付加したフォワードプライマー及びＥｃｏＲＩ認識配列を付加したリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った。【０１９３】
２種類の増幅断片を上記２種類の制限酵素で処理し、同じ制限酵素で開環させた発現ベクターｐＴｒａｃｅｒ−ＳＶ４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組み換えて、ｍＤＲ６の細胞外ドメインとｈＣＤ４０の膜貫通領域及び細胞内ドメインとからなるキメラタンパク質をコードする発現プラスミドｐｍＤＲ６−ｈＣＤ４０を作製した。このｐｍＤＲ６−ｈＣＤ４０をＮＦκＢ活性化依存性ホタルルシフェラーゼ発現レポータープラスミドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入して、細胞表面にｍＤＲ６の細胞外ドメインが露出するようにキメラタンパク質が配置されている形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を得た。この形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＤＲ６の細胞外ドメインにリガンドであるＳｄｃ１或はアゴニスティック抗ＤＲ６抗体が結合することで開始されるシグナル伝達を、リポータータンパク質であるホタルルシフェラーゼの活性変化によってモニターすることができるように改変された細胞である。【０１９４】
上記形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、クローン２５−１、クローン２５−２、クローン２５−３、クローン１００−１１及びクローン１７７−１が産生するモノクローナル抗体を３０μｇ／ｍＬ又は０．３μｇ／ｍＬとなるように固相化した９６穴細胞培養プレートに播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後の形質転換ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のレポータータンパク質活性をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。その結果を図１８に示す。【０１９５】
その結果、クローン２５−１の産生するモノクローナル抗体がＤＲ６を介したシグナル伝達を顕著に誘導することのできる、抗ＤＲ６アゴニスト抗体であることが示された。また、ｐｍＤＲ６−ｈＣＤ４０のｍＤＲ６をｈＤＲ６に置き換えて、ｈＤＲ６の細胞外ドメインとｈＣＤ４０の膜貫通領域及び細胞内ドメインとからなるキメラタンパク質をコードする発現プラスミドｐｈＤＲ６−ｈＣＤ４０を作製し、上記と同様の実験を行ったところ、このキメラタンパク質も同様の挙動を示すことが確認された。【０１９６】
＜実施例７  モノクローナル抗体２５−１のＩＬ２産生抑制効果＞
ｍＳｄｃ１−Ｈｉｓをモノクローナル抗体２５−１に置き換えた他は条件を実施例２の（２）と同一にして、ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞／ＲＰＭＩ１６４０培地のＣＤ３依存性ＩＬ２産生に対するモノクローナル抗体２５−１の影響を測定した。ｍＳｄｃ１−Ｈｉｓを非特異的ラットＩｇＧに置き換えた実験をコントロールとした。その結果を図１９に示す。【０１９７】
図１９に示されるように、モノクローナル抗体２５−１は容量依存的にＤＯ１１．１０−Ｔ細胞のＩＬ２産生を抑制した。【０１９８】
＜実施例８  抗ＤＲ６抗体の評価＞
ＤＯ１１．１０−Ｔ細胞とＯＶＡペプチドによりパルスしたＡ２０細胞との共培養系に、抗ｍＤＲ６抗体産生ハイブリドーマの培養上清（１００μＬ）あるいは精製抗体（１００μｇ／ｍＬ）を添加した。添加後４８時間の培養上清に含まれるＩＬ２をＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図２０に示す。【０１９９】
この実験結果から、クローン２５−１、クローン１７７−１、クローン８２−３０、クローン１８６−１８及びクローン１８０−１０が抗ＤＲ６アゴニスト抗体であり、クローン４６−１５−２３及びクローン１００−１１が抗ＤＲ６アンタゴニスト抗体であることが確認された。【０２００】
＜実施例９  全身性エリテマトーデスモデル動物におけるＳｄｃ１発現＞
正常Ｂ６マウス及び、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルマウスとして知られているＮＺＢ／ＷＦ１マウス（日本ＳＬＣ社より入手）から、４月齢（ＳＬＥ発症前）、６月齢（ＳＬＥ発症前期）及び８月齢（ＳＬＥ発症後期）の各時点で血清を採取し、抗ｍＳｄｃ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）を用いて血清に含まれる可溶化ｍＳｄｃ１を免疫沈降させた。各沈降物に含まれるｍＳｄｃ１を抗ｍＳｄｃ１抗体で、ｍＳｄｃ１に結合している糖鎖を糖鎖特異的抗体である抗ヘパラン硫酸抗体１０Ｅ４（生化学工業社製）でそれぞれ検出した。その結果を図２１に示す。【０２０１】
図２１に示される様に、正常マウス又はＳＬＥ発症前のＮＺＢ／ＷＦ１マウスと比較して、ＳＬＥ発症前期及び後期において、糖鎖修飾された可溶化ｍＳｄｃ１の含有量が増加している事が示された。したがって、血清中の可溶化Ｓｄｃ１の含有量は、ＳＬＥの進行をモニターすることのできるバイオマーカーとして利用可能である。【０２０２】
＜実施例１０  可溶化ＤＲ６変異体の構築＞
（１）システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を欠失させた可溶化ｍＤＲ６の調製
配列番号８８に示されるｍＤＲ６の細胞外領域とヒトＩｇＧのＦｃ領域とからなる可溶型組換えｍＤＲ６（ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ）をコードする遺伝子がクローニングされているｐｃＤＮＡ／ｍＤＲ６−ｈＦｃｍを鋳型として、ＣＲＤ１（配列番号８８の６６番目〜１０５番目のアミノ酸）を欠いたｍＤＲ６の細胞外ドメイン改変体（そのアミノ酸配列は配列番号９０に示される）をコードするＤＮＡ（配列番号８９）が増幅される様に設計し合成したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ｐｃＤＮＡ３／ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ  ｄｅｌｔａＣＲＤ１を得た。【０２０３】
ｐｃＤＮＡ３／ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ  ｄｅｌｔａＣＲＤ１をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で７日間培養して、ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ  ｄｅｌｔａＣＲＤ１を培地中に分泌させ、ｐｒｏｔｅｉｎＧ結合アガローズカラムを用いて精製した後、標識化した。【０２０４】
ｍＳｄｃ１をコードする遺伝子（配列番号７）を発現可能に組み込んだ発現ベクター（ｐＭＸｓＩＧ／ｍＳｄｃ１)、及びコントロールベクター（ｐＭＸｓＩＧ）をＤＯ１１．１０−Ｔ細胞に導入して形質転換細胞を作製した。標識化ｍＤＲ６−ｈＦｃｍ及び標識化ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ  ｄｅｌｔａＣＲＤ１に対する上記２種類の形質転換細胞の結合能を調べたところ、ｍＤＲ６―ｈＦｃｍ  ｄｅｌｔａＣＲＤ１の結合性がｍＤＲ６−ｈＦｃｍのそれの約２．５倍に増加していることが確認された（図２２）。【０２０５】
＜実施例１１  モデル動物における抗ＤＲ６抗体の治療効果＞
（１）ＳＬＥモデルマウス８匹を通常の飼育環境に置き、１５週齢から２７週齢までモノクローナル抗体２５−１を腹腔内投与（３００μｇ／頭／回／２日）しながら４４週齢まで飼育して、生存率及び蛋白尿症の発症率を測定した。尿蛋白はウロペーパー法により測定し、３００ｍｇ／ｄｌ以上の値を示す個体を陽性とした。また、モノクローナル抗体２５−１に代えてラットＩｇＧを腹腔内投与したＳＬＥモデルマウス８匹をコントロール群とした。その結果を図２３及び図２４に示す。【０２０６】
図２３に示されるように、４４週齢の時点での生存率は、コントロール群が３７．５％であったのに対してモノクローナル抗体２５−１を投与した群は８７．５％であり、モノクローナル抗体２５−１投与によって生存率が改善することが確認された。【０２０７】
また、図２４に示されるように、コントロール群と比較してモノクローナル抗体２５−１を投与した群において蛋白尿症の発症の有意な遅延が認められた。【０２０８】
＜実施例１２  抗ＤＲ６アゴニスト抗体の投与による免疫細胞の応答＞
実施例１１と同条件で飼育した１０週齢（ＳＬＥ発症前）及び２４週齢（ＳＬＥ発症後）のＳＬＥモデルマウス及び同週齢の正常マウスからそれぞれ全脾臓細胞群を調製した。この細胞群におけるＴ細胞表面マーカー（ＣＤ３）、ＤＲ６、ヘルパーＴ細胞表面マーカー（ＣＤ４）及びキラーＴ細胞表面マーカー（ＣＤ８）の発現を、モノクローナル抗体２５−１、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ８抗体を用いたフローサイトメトリー法により解析した。その結果を図２５に示す。【０２０９】
図２５のパネルＢに示されるように、ＳＬＥモデルマウスでは、１０週齢及び２４週齢いずれにおいてもモノクローナル抗体２５−１との結合親和性を示すＣＤ４陽性細胞、すなわちＤＲ６陽性ヘルパーＴ細胞の出現が観察された。またパネルＤに示されるように、ＳＬＥモデルマウスの２４週齢において、ＣＤ８陽性細胞全体におけるＤＲ６の発現量の増加が観察された。図２５のパネルＢ及びパネルＤで観察されたＤＲ６陽性細胞の存在率の増加（平均値）をグラフ化した図を図２６に示す。【０２１０】
これらの結果は、ＳＬＥモデルマウスにおいて全身エリテマトーデスの進行につれてＤＲ６を発現している免疫細胞が増加することを示している。【０２１１】
＜実施例１３  抗ＤＲ６アゴニスト抗体の投与による免疫細胞の応答＞
実施例１１と同条件で飼育した２４週齢のＳＬＥモデルマウスを、ラットＩｇＧ又はモノクローナル抗体２５−１を腹腔内投与（３００μｇ／頭／回／２日）しながらさらに２週間飼育した。投与終了後、各群のマウスから全脾臓細胞群を調製し、この細胞群におけるＤＲ６を発現しているＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）の存在率を、試験例１と同様にフローサイトメトリー法により解析した。その結果（平均値）を図２７に示す（ｐ＜０．０５）。【０２１２】
この試験により、蛋白尿症発症期のＳＬＥモデルマウスにモノクローナル抗体２５−１を投与することで、ＤＲ６を発現しているＣＤ４陽性細胞の存在率が低下することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０２１３】
本発明の免疫制御剤は、これまでに知られていない作用機序に基づいた、すなわちＤＲ６とＳｄｃ１との特異的結合によって誘導されるシグナル伝達を制御することのできる免疫制御剤として、哺乳動物の過剰な又は異常な免疫応答による疾患又は哺乳動物における免疫機能の増強が望まれる疾患の治療又は予防に利用することができる。【０２１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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