(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために最適化された、海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法であって、
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し、ここで、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、サンゴから構成され；
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値を確立し、ここで、前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；そして
・少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、ここで、前記流体が、水、血液又は血漿である、海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る、方法。
【請求項２】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、骨充填材又は骨代替材として使用され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、骨充填材又は骨代替材をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、０．１〜６０分間接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を可能にする工程をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、１〜２４時間接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を可能にする工程をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを接触し、そして海洋生物骨格誘導体系の固体材料に負の圧力を適用し、前記全流体摂取値に到達するよう海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の最大摂取を促進する工程をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記特異的流体摂取容量値が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料における重量変化の関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記特異的流体摂取容量値が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に対する適用された流体の流体体積の変化の関数である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記流体が、前記固体基材が対象の細胞又は組織と接触される場合、前記対象の細胞又は組織に関して自己由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、円筒、円錐、タック、ピン、スクリュー、長方形の棒、プレート、板、角錐、顆粒、粉末、サンゴ砂、顆頭、骨、肋骨、脊椎、骨盤、軟骨組織、ボール又は立方体の形状に近い、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料のカルテシアン座標軸に沿って１つの中空又は複数の中空を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、生体適合性ポリマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体適合性ポリマーが、前記固体基材におけるボイド又は孔内に組み込まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体適合性ポリマーが、前記固体基材の外表面に結合される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体適合性ポリマーが、グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、絹、キトサン、アルギン酸塩及びそれらの任意の組み合わせを含む、天然ポリマーを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、架橋されたヒアルロン酸、又はそれらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、サイトカイン、成長因子、治療用化合物、骨誘導剤、生体活性ガラス、骨充填材、骨セメント、薬剤、又はそれらの組み合わせをさらに含み、
前記治療用化合物又は薬剤が、抗炎症化合物、抗感染化合物、血管新生促進因子又はそれらの組み合わせを含む、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記固体基材が、心臓、筋肉、肝臓、皮膚、腎臓、結合組織又は神経組織への適用のための培養中で、細胞、組織及び器官の三次元支持及び成長を提供する、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項１９】
細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために準最適な海洋生物骨格誘導体系の固体基材を、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材に転換するための方法であって、
ａ．海洋生物骨格誘導体系の固体材料グループの特異的流体摂取容量値を確立し、ここで前記特異的流体摂取容量値は、前記固体材料グループにおける各サンプルについて、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；
ｂ．流体と接触するときの特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し、ここで前記流体は、水、血液又は血漿であり、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、サンゴから構成され；
ｃ．（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と、両親媒性材料、極性溶媒、カチオン性材料、アニオン性材料、又はそれらの組み合わせとを接触し；
ｄ．（ｃ）で得られた前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料において（ａ）におけるような特異的流体摂取容量を決定し；そして
ｅ．新しく確立された、高められた特異的流体摂取容量値を有する、（ｄ）で得られた海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成り、
前記高められた特異的流体摂取容量値が、少なくとも５％高められ、
前記選択された海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、７５％〜１００％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる、
方法。
【請求項２０】
前記高められた特異的流体摂取容量値が、少なくとも１５％高められる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記両親媒性材料、極性溶媒、カチオン性材料、又はアニオン性材料が、Tween、プルロニック、エタノール、メチレンブルー、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、又はそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記両親媒性材料、極性溶媒、カチオン性材料、アニオン性材料、又はそれらの組み合わせとの接触後、（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に、二次洗浄方法を適用する工程をさらに含んで成り、
前記二次洗浄方法が、熱、音波処理、正圧、負圧、又はそれらの組み合わせの適用を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、０．１〜１５分間接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を可能にする工程をさらに含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、０．０５〜２４時間接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を可能にする工程をさらに含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを接触し、そして海洋生物骨格誘導体系の固体材料に負の圧力を適用し、前記全流体摂取値に到達するよう海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の最大摂取を提供する工程をさらに含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記特異的流体摂取容量値が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料における重量変化の関数である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記特異的流体摂取容量値が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に対する適用された流体の流体体積の変化の関数である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、円筒、円錐、タック、ピン、スクリュー、長方形の棒、プレート、板、角錐、顆粒、粉末、サンゴ砂、顆頭、骨、肋骨、脊椎、骨盤、軟骨組織、ボール又は立方体の形状に近い、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、所望の組織の増殖又は修復の部位を収容する形状に近い、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料のカルテシアン座標軸に沿って１つの中空又は複数の中空を含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に関する相互参照
本出願は、すべて２０１３年２月１３日に提出された、米国特許仮出願第６１／７６３，９８１号、米国特許仮出願第６１／７６３，９８５号、米国特許仮出願第６１／７６４，４６７号及び米国特許仮出願第６１／７６４，４９６号の利益を主張し、そして２０１３年３月６日に提出された、米国特許仮出願第６１／７７３，２１９号及び米国特許仮出願第６１／７７３，２２８号に対する利益を主張し、それらのすべての内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
組織の増殖、再生及び修復は、例えば外傷、腫瘍形成、異常組織の増殖、老化及び他のものへの暴露の結果として、機能を回復し、そして組織の形態を再構成するために、しばしば必要である。
【０００３】
合成材料はまた、エクスビボ組織アセンブリー及び修復を促進するために、及び同様に、異なった組織、例えば骨を復元し、そして再構成するために、長年にわたり、混合成功を伴って、基材として使用されて来た。別の可能性は、自家組織の供給は制限されるが、自家組織移植であり、そしてその収集は、感染症、出血、化粧障害、神経損傷及び機能喪失の危険性と共に、痛みを伴う。さらに、重要な罹患率が、自家移植片収集部位に関連づけられる。それらの問題は、幹細胞、例えば間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の付着、移動、増殖及び分化を促進する合成又は天然生体適合材料から製造される固体基材を用いて、組織を構築することにより克服され得る。
【０００４】
治療が求められている多くの疾患及び状態は、損傷又は患者部位内での新規組織の増殖及び取り込を促進する部位特異的態様で細胞及び組織の増殖を促進する能力から利益を得るであろう。
【０００５】
骨及び軟骨用途においては、即時微小環境及び三次元（３Ｄ）組織は、一般的に分化及び特に軟骨及び骨成分化において重要な要因である。
【０００６】
いくつかの骨組織工学足場は、天然ポリマー、例えばコラーゲン、アルギンサン塩、ヒアルロン酸及びキトサンから成る。天然材料は、特異的細胞相互作用、それらの親水性相互作用のために細胞の容易な接種、低毒性及び低慢性炎症応答の利点を提供する。しかしながら、それらの足場はしばしば、機械的に不安定であり、そして移植のための特定の事前定義された形状を有する組織構造の創造に容易には寄与していない。機械的強度を得るためには、毒性を導くことができる化学的修飾が必要とされる。
【０００７】
関節の関節軟骨表面の欠陥及び変性が、痛み及び剛性を引起す。関節を保護する軟骨に対する損傷は、外傷、スポーツ又は反復ストレスの結果としての物理的傷害（例えば、骨軟骨骨折、十字靱帯損傷による二次損傷）、又は疾患（例えば、変形性関節症、関節リウマチ、無菌壊死、離断性骨軟骨症）の何れかに起因する。
【０００８】
変形性関節炎（ＯＡ）は、関節、最も顕著には股関節及び膝関節の一般的な磨耗及び裂けから生じる。変形性関節炎は高齢者で一般的であるが、しかし実際、年齢４０までに、ほとんどの人は、自分の体重を支える関節のいくらかの変形性関節炎性変化を有する。変形性関節炎の罹患率を高める別の明白な傾向は、肥満の増加である。ＣＤＣは、米国成人の３０％（又は６００万人）が、肥満であると推定している。肥満成人は、通常の体重の成人よりも変形性膝関節炎を４倍発症する可能性がある。関節リウマチは、軟骨の破壊をもたらす炎症状態である。これは、少なくとも部分的には、患者に対する遺伝的素因を有する自己免疫疾患の患者であると思われる。
【０００９】
損傷関節の整形外科的予防及び修復は、患者を治療する費用及び費やした時間の点で、医療従事者に大きな負担になる。一部では、これは、軟骨が自己修復能力を有さないためである。軟骨損傷の修復のための硝子軟骨を再成長する試みは、失敗のままである。整形外科手術は、関節における深刻な退行性変化を未然に防ぐための努力により、欠陥を修復し、そして関節損傷を防止するために使用可能である。外科技術の使用はしばしば、損傷又は罹患した組織を交換するために、健康な組織の除去及び付与を要する。自家移植片、同種移植片又は異種移植片からの寄贈された組織を利用する技法は、自家移植片が対象に追加の外傷を付与するので、完全には不十分であり、そして同種移植片及び異種移植片は、宿主対象に対する免疫学的反応性及び感染剤の可能な移動により制限される。軟骨再生のためのヒト又は動物組織以外の材料を利用する外科的試みはまだ成功していない。
【００１０】
より広くは、細胞及び組織の増殖、拡大及びモデリングへの他の適用のための適切な固体基材の欠如がまた存在する。
【００１１】
組織機能を回復し、そしてそのような組織の形態の再構成を促進する理想的材料がまだ不足している。
【発明の概要】
【００１２】
発明の概要
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された固体基材を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、海洋生物骨格誘導体系の固体材料のための特異的流体摂取容量値を確立し、そして少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択することを含んで成る、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、最適化された海洋生物骨格誘導体を含み、そして全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そして一定の後−単離精製及び／又は処理手順にさらされた、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の、及び本発明の方法により得られた固体基材は、少なくとも８０％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び本発明の方法により得られた固体基材は、少なくとも８５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び本発明の方法により得られた固体基材は、少なくとも９０％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び本発明の方法により得られた固体基材は、少なくとも９５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び本発明の方法により得られた固体基材は、少なくとも９７％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。いくつかの実施形態によれば、本発明の、及び本発明の方法により得られた固体基材は、７５〜１００％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、用語「特異的流体摂取容量値」（a specific fluid uptake capacity value）とは、「ＳＦＵＣ」又は「ＳＷＣ」として、本明細書において言及され、それらのすべては、交換可能であることが理解されるべきである。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の特異的流体摂取容量値は、自動化された装置を用いて決定される。いくつかの側面によれば、及び例示され、そしてこの後、さらに記載されるように、種々のサンプルの特異的流体摂取容量値の評価は、商業的生産のために適した自動スケールアップ工程の一部として、同時に又は連続的に評価され得る。いくつかの側面によれば、そのような装置はさらに、所望の特徴を有するサンプルの個々の選択及び輸送を提供することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材、又は生物骨格誘導体を含み、そして流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる固体基材を得るための方法を提供する。
【００１８】
当業者が理解するように、接触角は、例えば角度測定を介して、標準方法及び装置を用いて、本明細書に記載され、そして例示されるようにして決定され得る。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、下記に記載されるような方法を利用することができる：P.A. Thomson, W.B. Brinckerhoff, M.O. Robbins, in: K.L. Mittal (Ed.), Contact Angle Wettability and Adhesion, VSP, Utrecht, 1993, pp. 139-158; E.L. Decker, S. Garof, Langmuir 13 (1997) 6321; and M.G. Orkoula et al. : Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 157 (1999) 333-340; Hiemenz, P. C.; Rajagopalan, R.  Principles of Colloid and Surface Chemistry, 1997 , 3rd Ed., Marcel Dekker, Inc; Applied Colloid and Surface Chemistry Chapter 2: Surface Tension and wetting, by Richard Pashley, Marilyn Karaman, 2004, John Wiley and sons（これらのすべては、全体が本明細書に組み込まれる）。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡を走査することにより測定される場合、実質的な表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられる、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材、又はそれを得るための方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、サンゴ又はサンゴ誘導体は、アラゴナイト（aragonite）、カルサイト（calcite）、それらの混合物、又はそれらの他の多形体（polymorph）である。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、サンゴ又はサンゴ油動態の構造組成は、Ｘ線回折（ＸＲＤ）又はファイグル(Feigl)溶液陽性染色により決定される。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、ポリテス（Porites）種、ゴニオポラ（Goniopora）、ミレポラ（Millepora）種 又はアクロポラ（Acropora）種から単離される。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、甲殻動物（barnacle）又は軟体動物（mollusk）から単離される。いくつかの実施形態によれば、前記固体基材は真珠層（nacre）から構成される。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載されるような１又は２以上の固体基材を含むキットを提供する。いくつかの実施形態によれば、キットは、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そして／又は本発明の方法により精製される一連の固体基材を含み、ここでキットにおける海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、７５％〜９９％の特異的流体摂取容量値を有し、そして、いくつかの実施形態によれば、キットは、８０％〜９９％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる一連の固体基材を含み、そしていくつかの実施形態によれば、キットは、８５％〜９９％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる一連の固体基材を含み、そしていくつかの実施形態によれば、キットは、９０％〜９９％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる一連の固体基材を含み、そしていくつかの実施形態によれば、キットは、９５％〜９９％又はいくつかの実施形態によれば、９５％〜１００％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる一連の固体基材を含む。
【００２５】
別の実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供し、ここで前記方法は、
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値を確立し（前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される）；そして
・少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【００２６】
いくつかの実施形態によれば、及び、本発明の側面によれば、前記方法は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、０．１〜１５分間接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を促進する工程をさらに含んで成る。
【００２７】
いくつかの実施形態によれば、及び、本発明の側面によれば、前記方法は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを接触し、そして海洋生物骨格誘導体系の固体材料に負の圧力を適用し、前記全流体摂取値に到達するよう海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の最大摂取を促進する工程をさらに含んで成る。
【００２８】
いくつかの実施形態において、本発明の側面によれば、前記特異的流体摂取容量値が、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料における重量変化の関数である。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明の側面によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料における重量の変化は、前記固体材料における隙間内の前記流体の吸収によるものであるか、又はいくつかの実施形態によれば、前記固体材料における孔内の前記流体の吸収によるものであり、又はいくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料における重量の変化は、前記固体材料における隙間内の前記流体の吸収、及び前記固体材料における孔内の前記流体の吸収によるものであり、この流体は、いくつかの実施形態によれば、個々のサンゴ結晶内に存在するか、又はいくつかの実施形態によれば、個々のサンゴ結晶間に存在する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、本発明の側面によれば、前記特異的流体摂取容量値は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に対する適用された流体の流体体積の変化の関数である。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、生物骨格誘導体を含み、そして流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供し、ここで前記方法は、
・生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・前記生物骨格誘導体系の固体材料と、流体とを接触し、そして前記生物骨格誘導体についての接触角を確立し；そして
・６０°未満の接触角により特徴づけられる生物骨格誘導体系の固体材料を選択することを含んで成る。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された生物骨格誘導体系の固体基材の選択を促進する本発明の方法は、１つの工程を包含し、この工程によれば、生物骨格誘導体系の固体材料と、流体との接触、及び前記生物骨格誘導体についての接触角の確立、又は全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される、海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値の確立が、本明細書に記載されるように、目的のサンプルのすぐ近位のサンプル、及びいくつかの実施形態によれば、近位領域の性能、および選択のための所望する基準の達成に基づかれると想定される選択を伴って、年輪におけるサンゴ成長の領域の点で匹敵する領域内からのサンプルに対して実施され得る。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、炭酸カルシウムから実質的に構成される。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、下記工程を含む：
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料上に実質的に粗い表面の存在を確立する工程、ここで、前記実質的に粗い表面は電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡を走査することにより決定される；及び
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料上での実施的に粗い表面の存在の決定により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択する工程。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供し、ここで前記方法は、下記工程を含んで成る：
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料上に実質的に粗い表面の存在を確立する工程、ここで、前記実質的に粗い表面は電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡を走査することにより決定される；及び
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料上での実施的に粗い表面の存在の決定により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択する工程。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載されるような方法について記載される工程の組み合わせを含んで成る、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法はさらに、前記固体基材と、細胞又は組織とを接触する工程を含んで成る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本発明の側面によれば、前記接触は、前記細胞、又は前記組織内の細胞の付着、増殖又は分化、又はそれらの組み合わせを促進する。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、流体は、タンパク質含有、塩含有、又は炭水化物含有溶液であるか、又はいくつかの実施形態によれば、前記流体は生物学的流体であり、そしていくつかの実施形態によれば、前記生物学的流体は、前記固体基材が対象の細胞又は組織と接触される場合、対象の細胞又は組織に対して自家由来又は異種異系である。いくつかの実施形態によれば、前記流体は水である。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、前記固体基材は、外傷又は疾患により損傷された組織における細胞又は組織の増殖を促進する。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載されるような任意の側面に従っての方法により生成される固体基材を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために準最適な海洋生物骨格誘導体基材の固体材料を、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材に転換するための方法を提供し、ここで前記方法は、
ａ)海洋生物骨格誘導体系の固体材料グループの特異的流体摂取容量値を確立し、前記特異的流体摂取容量値は、前記グループにおける各サンプルについて、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；
ｂ)特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し；
ｃ)（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と、両親媒性物質、極性溶媒、カチオン性物質、アニオン性物質、又はそれらの組み合わせとを接触し；
ｄ)（ｃ）で得られた前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料において（ａ）におけるような特異的流体摂取容量を決定し；そして
ｅ)新しく確立された、高められた特異的流体摂取容量値を有する、（ｄ）で得られた海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【００４４】
本発明はまた、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために準最適な海洋生物骨格誘導体基材の固体材料を、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材に転換するための方法を提供し、ここで前記方法は、
ａ)海洋生物骨格誘導体系の固体材料グループの特異的流体摂取容量値を確立し、ここで、前記特異的流体摂取容量値は、前記グループにおける各サンプルについて、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；
ｂ)特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し；
ｃ)（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料を、低温プラズマ処理、コロナ処理、又はそれらの組み合わせにゆだね；
ｄ)（ｃ）で得られた前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料において（ａ）におけるような特異的流体摂取容量を決定し；そして
ｅ)新しく確立された、高められた特異的流体摂取容量値を有する、（ｄ）で得られた海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、前記特異的流体摂取容量値が、少なくとも５％高められる。いくつかの実施形態によれば、前記選択された海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、７５％〜９５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。いくつかの実施形態によれば、前記特異的流体摂取容量値が、少なくとも１５％高められる。いくつかの実施形態によれば、前記選択された海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、４５％〜７０％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。いくつかの実施形態によれば、前記特異的流体摂取容量値が、少なくとも３５％高められる。いくつかの実施形態によれば、前記選択された海洋生物骨格誘導体系の固体材料が、１％〜４０％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。いくつかの実施形態によれば、前記固体基材は、サンゴ又はサンゴ系の誘導体から実質的に構成される。いくつかの実施形態によれば、前記固体基材は、アラゴナイト、カルサイト、ヒドロキシアパタイト又はその組み合わせから実質的に構成される。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、（ｄ）における前記特異的流体摂取容量値を確立する前、アラゴナイトである海洋生物骨格誘導体系の固体材料を、ヒドロキシアパタイトに完全に又は部分的に転換するか又は前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料をヒドロキシアパタイトに完全に又は部分的に被覆する工程をさらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、（ｄ）における前記特異的流体摂取容量値の確立に続いて、ほとんど炭酸カルシウムである海洋生物骨格誘導体系の固体材料を、ヒドロキシアパタイトに完全に又は部分的に転換する工程をさらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、骨充填材、又は骨代替材として使用され得る。いくつかの実施形態によれば、前記両親媒性材料、極性溶媒、カチオン性材料、又はアニオン性材料は、Tween、プルロニック、エタノール、メチレンブルー、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、又はそれらの組み合わせである。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記両親媒性材料、極性溶媒、カチオン性材料、アニオン性材料、又はそれらの組み合わせとの接触に続いて、（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に、二次洗浄方法を適用する工程をさらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記二次洗浄方法は、熱、音波処理、正圧、負圧、又はそれらの組み合わせの適用を含む。いくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料はさらに、骨充填材、骨セメント、バイオガラス又は骨代替材を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、０．１〜１５分間、又はいくつかの実施形態によれば、１〜２秒〜２０分間、又はいくつかの実施形態によれば、０．５〜４０分間、接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を可能にする工程をさらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを、０．０５〜２４時間、又はいくつかの実施形態によれば、２〜１５時間、又はいくつかの実施形態によれば、１〜２４時間、又はいくつかの実施形態によれば、６〜２４時間、又はいくつかの実施形態によれば、１８〜２４時間、接触し、前記自発的流体摂取値に到達するよう、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の自発的流体摂取を可能にする工程をさらに含んで成る。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを接触し、そして海洋生物骨格誘導体系の固体材料に負の圧力を適用し、前記全流体摂取値に到達するよう海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の最大摂取を提供する工程をさらに含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記特異的流体摂取容量値は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料における重量変化の関数である。いくつかの実施形態によれば、前記特異的流体摂取容量値は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に対する適用された流体の流体体積の変化の関数である。いくつかの実施形態によれば、前記流体は、タンパク質含有、塩含有、又は炭水化物含有溶液である。いくつかの実施形態によれば、前記生物学的流体は、前記基材が前記対象の細胞又は組織と接触される場合、対象の細胞又は組織に関して自己由来である。いくつかの実施形態によれば、前記流体は、水である。いくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、ポリテス（Porites） 種、 ゴニオポラ（Goniopora）、ミレポラ（Millepora）種 又はアクロポラ（Acropora）種から単離される。いくつかの実施形態によれば、前記固体基材は甲殻動物（barnacle）又は軟体動物（mollusk）から単離される。いくつかの実施形態によれば、前記固体基材は真珠層（nacre）から構成される。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、円筒、円錐、タック、ピン、スクリュー、長方形の棒、プレート、板、角錐、顆粒、粉末、サンゴ砂、ボール、骨、顆頭、肋骨、脊椎又は立方体の形状に近い。いくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、所望の組織の増殖又は修復の部位を収容する形状に近い。いくつかの実施形態によれば、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、前記サンゴ系の固体材料のカルテシアン座標軸(Cartesian coordinate axis)に沿って１つの中空又は複数の中空を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供し、ここで前記方法は、
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値を確立するか、又は接触角値を確立し、ここで前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；
・少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられるか、又は流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し；
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料上に実質的に粗い表面の存在を確立し、ここで、前記実質的に粗い表面は電子顕微鏡、Ｘ線回折又は原子間力顕微鏡を走査することにより決定され；そして
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料上での実質的に粗い表面の存在の決定により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供し、ここで前記方法は、
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値を確立するか又は接触角値を確立し、ここで、前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；
・少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられるか、又は流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し；そして
・Ｘ線回折又はファイグル染色陽性の使用により、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の結晶組成又は構造を確立すること
を含んで成る。
【００５２】
本明細書に言及されるすべての出版物、特許及び特許出願は、各個々の出版物又は特許が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているかのように、全体が参照により本明細書に組み込まれる。明細書と組み込まれる参照との間の抵触の場合、明細書が優先するものとする。数値範囲が本文書に記載されている場合、エンドポイントは、その範囲内に含まれる。さらに、特にことわらない限り又はさもなければ、当業者の状況及び理解から明らかなように、範囲として表される値は、記載される範囲内の任意の特定値又はザプ範囲を取ることができ、任意には、何れかの又は両エンドポイントを含むか又は除き、本発明の異なった実施形態によれば、特にことわらない限り、範囲の下限の単位の1/10まで含むことが理解されるべきである。百分率が本質的に整数である単位を有する値を基準に記載される場合、任意の得られる割合は最も近い整数に包含され得る。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ−１Ｆ】図１は、生物学的流体、この場合、ヒト全血を吸収するインプラントの能力について評価された、それらのインプラントの一連の写真を示す。図１Ａ−１Ｃは、小サンゴ固体基材サンプル内の摂取の３タイプのパターン、合理的には、表面色変化の観察により決定される場合、それぞれ、完全な摂取、中程度の摂取及び最少の摂取を示す。図１Ｄ−１Ｆは、より小さなインプラントが単離されたサンゴ固体基材の大きなブロックを示す。
【図２】図２は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の同定のための具体化されたスクリーニングプロトコルについてのフローチャートを示す。
【図３Ａ−３Ｆ】図３は、移植の前の生物学的流体摂取と、部位治癒との間の経時的相関関係を示す。有意な水及び血液摂取、又は移植の前、インプラント内のその最少摂取により特徴づけられるインプラントにより処理された移植部位が、４週間後、肉眼で評価された。軟骨概観と一致する組織は、有意な流体摂取によりサンプル中のインプラントを実質的に被覆し、ところが最少の／減じられた流体摂取により特徴づけられたサンプルは、インプラント移植上に、より繊維状のカバーを提供した（それぞれ、図３Ａ対図３Ｄ）。最少の／減じられた流体摂取により特徴づけられるそれぞれのインプラント［図３Ｂ及び３Ｃ］対、有意な流体摂取により特徴づけられるそれらのインプラント［図３Ｅ及び３Ｆ］のＸ線及びマイクロ−ＣＴ分析は、有意な流体摂取により特徴づけられたインプラントは、卓越した骨結合、骨誘導及び骨導入との有意な有害反応を伴わないで、移植部位内に適切に結合されると思われ、ところが最少の／減じられた流体摂取により特徴づけられたインプラントは、たぶん強化された破骨細胞活性のために、骨吸収、溶解及び機会的統合性の損失を誘発するように思われることを実証した。
【図４Ａ−４Ｄ】図４は、流体に暴露される場合、それらの接触角について評価された、具体化されたインプラントの写真を示す。図４Ａ及び４Ｂは、それらの接触角の特徴化について評価されたサンプルがより大きなブロックから切断された場所を示し、そして図４Ｃ及び４Ｄは、示された領域について得られた接触角を提供する。図４Ａ及び４Ｂにおいて評価されたブロックの領域の大部分が主に、６０°未満の接触角を提供した。図４Ｃ及び４Ｄにおける特定領域が、６０〜９０°（図４Ｃ）及び９０°超（図４Ｄ）の接触角を提供した。
【図５Ａ−５Ｃ】図５は、流体に暴露される場合、それらの接触角について評価された、具体化されたインプラントの写真を示す。図５Ａは、それらの接触角の特徴化について評価された、大きなブロックから切断された領域を示す。図５Ｂ及び５Ｃにおいて評価されたブロックの領域の大部分が、主に６０°未満の接触角を提供した。図５Ｂ及び５Ｃにおける特定の領域が、６０〜９０°、及び９０°超の接触角を提供した（それぞれ、青領域−対−赤領域）。
【図６Ａ−６Ｂ】図６は、同様に、流体に暴露される場合、それらの接触角について評価された、具体化されたインプラントの写真を示す。図６Ａは、それらの接触角の特徴化について評価された、大きなブロックから切断された領域を示す。図６Ｂ及び６Ｃにおいて評価されたブロックの領域の大部分が、主に６０°未満の接触角を提供した。図６Ｂ及び６Ｃにおける特定の領域が、６０〜９０°、及び９０°超の接触角を提供した（それぞれ、青領域−対−赤領域）。
【図７Ａ−７Ｅ】図７は、比較表面湿潤特性を示すＥＳＥＭ分析の結果を示す。図７において評価されるサンプルは、ゼロ降下角度値を示し、そして降下形成は存在せず、このことは、高親水性構造を示す。図７Ｂは、流体の適用に続いて、水が適用される場合、「湿潤」（ｗｅｔ）するのに失敗したサンプルを示す。図７Ｃは、再乾燥に続いて、水滴が表面上で明らかであり、このことは、不良な表面湿潤の表現型と一致することを示す。図７Ｄは、６０°未満の接触角と一致する結果を伴って、異なったサンプルについての結果を示し、そして図７Ｅは、６０°よりも高い接触角を有する、異なったサンプルについての結果を示す。
【図８Ａ−８Ｆ】図８は、種々のサンプルにおける実質的生物学的流体摂取により特徴づけられる単離された基材に対する、最少生物学的流体摂取により特徴づけられる単離された基材の、種々の倍率でのＥＳＥＭにより決定された場合の微細構造を示し、ここで最少生物学的流体摂取のサンプルは、実質的摂取のサンプルに比較して、より滑らかな外表面を示す（図８Ａ−８Ｃ対８Ｄ−８Ｆ）。
【図９Ａ−９Ｃ】図９は、種々のサンプルにおける実質的生物学的流体摂取により特徴づけられる単離された基材に対する、最少生物学的流体摂取により特徴づけられる単離された基材の、種々の倍率でのＡＦＭにより決定された場合の微細構造を示し、ここで最少生物学的流体摂取のサンプルは、実質的摂取のサンプルに比較して、より滑らかな外表面を示す（図９Ａ−９Ｃ対９Ｄ−９Ｆ）。
【図９Ｄ−９Ｆ】図９は、種々のサンプルにおける実質的生物学的流体摂取により特徴づけられる単離された基材に対する、最少生物学的流体摂取により特徴づけられる単離された基材の、種々の倍率でのＡＦＭにより決定された場合の微細構造を示し、ここで最少生物学的流体摂取のサンプルは、実質的摂取のサンプルに比較して、より滑らかな外表面を示す（図９Ａ−９Ｃ対９Ｄ−９Ｆ）。
【図１０】図１０は、サンゴサンプルへのTween80の適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１１】図１１は、サンゴサンプルへのTween80及び音波処理の適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１２】図１２は、サンゴサンプルへのTween80を伴って又は伴わないで、プルロニックの適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１３】図１３は、サンゴサンプルへの無水エタノールの適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１４】図１４は、サンゴサンプルへのメチレンブルーの適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１５】図１５は、サンゴサンプルへのヒアルロン酸の適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１６】図１６は、サンゴサンプルへのコンドロイチン硫酸の適用の前及び適用に続いて、評価されるそのようなサンゴサンプルの関数としてのＳＦＵＣ値のプロットを示す。
【図１７】図１７は、次の精製化学物質：次亜塩素酸塩及び過酸化水素、及び続く無水エタノール抽出に連続的に暴露された２種のサンプル（第１の評価サンゴ（ｎ＝１３）及び第２の評価サンゴ（ｎ＝１５））からのインプラントのＳＷＣ値のプロットを示す。*Ｐ＜０．０５; ** Ｐ＜０．０１。
【図１８】図１８は、同様に、精製工程に暴露され、そしてエタノール抽出工程に続いて、インプラントについての平均ＳＷＣ値のプロットを示す。
【図１９】図１９は、同様に、精製工程に暴露され、そしてエタノール抽出工程に続いて、インプラントについての平均ＳＷＣ値のプロットを示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａ及び２０Ｂは、本発明の具体化された自動装置の側面図及び上面図の略図を示す。
【図２１Ａ−２１Ｃ】図２１Ａ−２１Ｃは、高い特異的流体摂取容量値（図２１Ｃ）対低い特異的流体摂取容量値（図２１Ａ及び２１Ｂ）を有するサンゴ基材への細胞付着の走査型電子顕微鏡写真を示す。
【図２２Ａ−２２Ｂ】図２２Ａ−Ｂは、高い特異的流体摂取容量値対低い特異的流体摂取容量値を有するサンプルにおいて、alamarBlue（登録商標）アッセイにより決定される場合のＨＥＰＭ細胞増殖及び生存容量値をグラフで示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】図２３Ａ−Ｆは、文献に報告されるような従来のファイグル染色（図２３Ａ−２３Ｂ）、及びさらなるエタノール精製工程の前（図２３Ｃ、２３Ｄ）及び続いて（図２３Ｅ、２３Ｆ）、本発明の具体化された方法により単離され、そして処理されたサンゴサンプルにおける血液摂取対ファイグル染色を示す。
【図２３Ｃ−２３Ｆ】図２３Ａ−Ｆは、文献に報告されるような従来のファイグル染色（図２３Ａ−２３Ｂ）、及びさらなるエタノール精製工程の前（図２３Ｃ、２３Ｄ）及び続いて（図２３Ｅ、２３Ｆ）、本発明の具体化された方法により単離され、そして処理されたサンゴサンプルにおける血液摂取対ファイグル染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明の詳細な記載
本発明は、中でも、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された固体基材の選択方法及び入手方法、及びそれにより得られた材料を提供する。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材を提供し、ここで前記固体基材は、サンゴを含み、そして全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材を提供し、ここで前記固体基材は、生物骨格誘導体を含み、そして流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材を提供し、ここで前記固体基材は、海洋生物骨格誘導体を含み、そして走査型電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡により測定される場合、実質的な表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられる。
【００５８】
本発明の固体基材は、海洋生物骨格誘導体系の材料を含み得る。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、用語「海洋生物骨格誘導体系の固体材料」（marine organism skeletal derivative -based material）とは、海洋生物、及び前記生物の骨格成分、例えばヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう、さらに、処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理された前記生物の外骨格に起因する固体片又は粉砕材料を意味する。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、用語「海洋生物骨格誘導体系の材料」（marine organism skeletal derivative -based material）とは、ヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう、さらに、処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理されたサンゴ系の材料を意味する。
【００６１】
ＣａＣＯ3から主に構成されるサンゴは、早い細胞浸潤、付着及び増殖を支持する利点を有することが示されている。サンゴは、間葉系幹細胞の付着、増殖及び分化の促進、および軟骨及び／骨組織中への究極的組込みのための効果的基材であることが示されている。サンゴはまた、細胞及び組織の増殖のための卓越した基材として機能する、多くの他の細胞型の付着及び増殖を促進するための卓越した支持体として機能することも示されている。
【００６２】
用語「サンゴ」（coral）及び［炭酸カルシウム］（calcium carbonate）、及び「アラゴナイト」（aragonite）及び「カルサイト」（calcite）とは、特にことわらない限り、交換可能的に使用され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、用語「海洋生物骨格誘導体系の材料」（marine organism skeletal derivative -based material）とは、ヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう、さらに、処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理されたサンゴ又はサンゴ誘導体を意味する。いくつかの実施形態によれば、用語「海洋生物骨格誘導体系の材料」（marine organism skeletal derivative -based material）とは、ヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう、さらに、処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理されたフジツボ又は軟体動物に由来する骨格材料を意味する、そしていくつかの実施形態によれば、ヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう、さらに処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理された真珠層の包含が意図される。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、用語「海洋生物骨格誘導体系の材料」（marine organism skeletal derivative -based material）とは、天然の海洋生物から単離され、そして続いて、ヒト又は動物対象内への移植のために適切であるよう、本明細書に記載されるように処理されるサンゴ又はサンゴ誘導体を意味し、前記海洋生物骨格誘導体系の材料は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適切化された海洋生物骨格誘導体系の固体材料に、準最適な単離された海洋生物骨格誘導体系の固体材料を転換するために、時前洗浄及び精製工程を含む、本明細書に記載のような追加の処理に特に施されている。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、そのような最適化は特に、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と、両親媒性材料、極性溶媒、カチオン性材料、アニオン性材料又はそれらの組み合わせとの接触を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、生体適合性マトリックスに懸濁された、サンゴ由来の粉砕粒子を含む。いくつかの実施形態によれば、前記生体適合マトリックスは、ヒドロゲルである。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、「インプラント」（implant）又は「プラグ」（plug）又は「固体基材」（solid substrate）とは、本明細書において使用される場合、固体基材に関連して本明細書に記載されるような任意の実施形態又は組合わされた実施形態を言及し、そして本発明の記載される側面に含まれていると見なされることを意味する。例えば、「固体基材：（solid substrate）とは、本明細書において使用される場合、指示された目的のために適用されるか、又は支持される属性、等を含む、本明細書に記載されるような固体基材の任意の実施形態を言及するものとして理解されるべきである。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、「固体基材」（solid substrate）とは、細胞及び／又は組織修復及び／又は機能回復のために使用される形状化されたプラッとフォームを意味し、ここで前記形状化されたプラッとフォームは、そのような修復及び／又は機能回復のための部位を提供する。１つの実施形態によれば、固体基材は、一時的プラットフォームである。１つの実施形態によれば、「一時的プラットフォーム」（temporary platform）とは、そのような修復の間、経時的に発生する、本発明のサンゴの事前分解を意味し、ここで前記サンゴの完全な又は部分的自然分解は、経時的な固体基材形状の変化、及び／又は経時的な固体基材サイズの変化をもたらすことができる。
【００６９】
異なった種のサンゴは、それらの平均孔直径及び孔容積の点で変化し、そして本発明は、本明細書に記載されるような固体基材の調製のための出発材料として任意のそのようなサンゴの使用を意図し、ここで前記固体基材は、それが少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、ヒト又は動物対象における移植のために適切なよう、さらに処理され、そしてさらに、下記に記載のように移植のために最適化されるよう処理されることにより特徴づけられることが理解されるであろう。
【００７０】
本明細書において使用される場合、用語「孔容積」（pore volume）とは、本発明の多孔性足場内の容積又は開放空間を意味する。孔容積は、当業界において公知の任意の手段により決定される。多孔率は標準の方法により計算され、前記方法の例は、下記にさらに提供され、例えばKarageorgiou V, Kaplan D. (2005) "Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis" Biomaterials.;26(27):5474-91（その内容は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００７１】
用語「サンゴ」（coral）とは、出発材料を言及し、この材料から、アラゴナイト、炭酸カルシウム、カルサイト又はヒドロキシアパタイト、等が、単離され、そしてさらに、ヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理され得ることが理解されるであろう。
【００７２】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材、方法及び／又はキットは、ヒト又は動物対象における移植のために適切なよう、さらに処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理されたサンゴを使用する。１つの実施形態によれば、サンゴは、任意の種、例えば、中でも、ポリテス（Porites） 種、アクロポラ（Acropora）種、 ゴニオポラ（Goniopora）種、ミレポラ（Millepora）種 又は又はそれらの組み合わせを含む。別の実施形態によれば、本発明の固体基材、方法及び／又はキットは、真珠層、軟体動物の殻（molusc shell）、又は骨断片（bone morsels）を使用する。
【００７３】
１つの実施形態によれば、サンゴはポリテス（Porites）種からである。１つの実施形態によれば、サンゴはポリテス・ルテア（Porites Lutea）である。１つの実施形態によれば、サンゴはアクロポラ（Acropora）種からである。１つの実施形態によれば、サンゴはアクロポラ・グランディス（Acropora grandis）であり、１つの実施形態によれば、これは、非常に一般的であり、早く成長し、そして培養下で容易に成長する。従って、１つの実施形態によれば、アクロポラサンプルは、サンゴ礁の保護領域で容易に収集され得、そしてサンゴ礁からの収集は、培養されたサンゴ材料を用いることにより、回避され得る。
【００７４】
別の実施形態によれば、サンゴはミレポラ（Millepora）種からである。１つの実施形態によれば、サンゴはミレポラ・ジコトマ（Millepora dichotoma）である。１つの実施形態によれば、サンゴは１５０μｍの孔サイズを有し、そしてクローン化され、そして培養され得、本発明の固体基材、方法及び／又はキットにおける骨格としてミレポラを有用にすることができる。
【００７５】
１つの実施形態によれば、サンゴは、ゴニオポラ（Goniopora）種からである。いくつかの実施形態によれば、サンゴは、ゴニオポラ・アルビコナス（Goniopora albiconus）、 ゴニオポラ・ブルゴシ（Goniopora burgosi）、ゴニオポラ・セルロサ（Goniopora cellulosa）、ゴニオポラ・セイロン（Goniopora ceylon）、 ゴニオポラ・シリアタス（Goniopora ciliatus）、ゴニオポラ・コルムナ （Goniopora columna）、 ゴニオポラ・ディジボウチエンシス（Goniopora djiboutiensis）、ゴニオポラ・エクリプセンシス（ Goniopora eclipsensis）、 ゴニオポラ・フルチコサ（Goniopora fruticosa）、 ゴニオポラ・（Goniopora gracilis）、 ゴニオポラ・（Goniopora klunzingeri）、 ゴニオポラ・ロバタ（Goniopora lobata） 、ゴニオポラ・マウリチエンシス（Goniopora mauritiensis）、 ゴニオポラ・ミノル（Goniopora minor）、 ゴニオポラ・ノルフォルケンシス（Goniopora norfolkensis）、 ゴニオポラ・パルメンシス（Goniopora palmensis）、 ゴニオポラ・パンドラエンシス（Goniopora pandoraensis）、 ゴニオポラ・パルビステラ（Goniopora parvistella）、 ゴニオポラ・ペアルソニ（Goniopora pearsoni）、 ゴニオポラ・ペンヂュラス（Goniopora pendulus）、 ゴニオポラ・プラヌラタ（Goniopora planulata）、 ゴニオポラ・ポリホルミス（Goniopora polyformis）、 ゴニオポラ・レプタンス（Goniopora reptans）、 ゴニオポラ・サビジニイ（Goniopora savignyi）、 ゴニオポラ・ソマリエンシス（Goniopora somaliensis）、 ゴニオポラ・ストケス（Goniopora stokes）、 ゴニオポラ・スツチブリ（Goniopora stutchburyi）、 ゴニオポラ・スルタニ（Goniopora sultani）、 ゴニオポラ・テネラ（Goniopora tenella）、ゴニオポラ・テヌイデンス （Goniopora tenuidens）又はゴニオポラ・ビリジス（Goniopora viridis）である。
【００７６】
別の実施形態によれば、サンゴは、任意の１又は２以上の次の種：ファビテス・ハリコラ（Favites halicora）;ゴニアストレア・レチホルミス（ Goniastrea retiformis）; アカンタストレア・エチナタ（Acanthastrea echinata）; アカンタストレア・ヘムプリチ（Acanthastrea hemprichi）; アカンタストレア・イシガキエンシス（Acanthastrea ishigakiensis）; アクロポラ・アスペラ（Acropora aspera）; アクロポラ・アウステラ（Acropora austera）; アクロポラ属（Acropora sp. 「ブラウン・ディジタテ（brown digitate）」）; アクロポラ・カルダウス（Acropora carduus）; アクロポラ・セレアリス（ Acropora cerealis）; アクロポラ・ケステリフィエルデンシス（ Acropora chesterfieldensis）; アクロポラ・クラトラテ（Acropora clathrata）; アクロポラ・コフォダクチラ（Acropora cophodactyla）; アクロポラ属（Acropora sp. 「アルゴス人様（danai-like）」）; アクロポラ・ジバリカタ（ Acropora divaricata）; アクロポラ・ドネイ（ Acropora donei）; アクロポラ・エチナタ（Acropora echinata）; アクロポラ・エフロレセンス （Acropora efflorescens）; アクロポラ・ジェミフェラ（Acropora gemmifera）; アクロポラ・グロビセプス（ Acropora globiceps）; アクロポラ・グラヌロサ（Acropora granulosa）; アクロポラcf・ヘムプリチ（Acropora cf hemprichi）; アクロポラ・コスリニ（ Acropora kosurini）; アクロポラ  cf・ロイセタエ（Acropora cf loisettae）; アクロポラ・ロンジシアタス（ Acropora longicyathus）; アクロポラ・ロリペス（Acropora loripes）; アクロポラ  cf・ルツケニ（Acropora cf lutkeni）; アクロポラ・パニキュラタ（ Acropora paniculata）; アクロポラ・ウロキシマリス（Acropora proximalis）; アクロポラ・ルジス （Acropora rudis）; アクロポラ・セラゴ（Acropora selago）; アクロポラ・ソリタリエンシス（ Acropora solitaryensis）; アクロポラ  cf・スピシフェラ（Acropora cf spicifera 、Veronによる）; アクロポラ  cf・スピシフェラ（Acropora cf spicifera、 Wallaceによる）; アクロポラ・テヌイス（Acropora tenuis）; アクロポラ・バレンシエネシ（Acropora valenciennesi）; アクロポラ・バウガニ（Acropora vaughani）; アクロポラ・ベルミキュラタ（ Acropora vermiculata）; アステレオポラ・グラシリス（Astreopora gracilis）; アステレオポラ・ミリオフタルマ（Astreopora myriophthalma）; アステレオポラ・ランダリ（Astreopora randalli） ; アステレオポラ・スゲスタ（Astreopora suggesta）; アウストラロムサ・ロウレイエンシス（Australomussa rowleyensis）; コシナラエラ・コルムナ（Coscinaraea collumna）; コシナラエラ・クラサ（Coscinaraea crassa）; シナリナ・ラクリマリス（Cynarina lacrymalis）; ジスチコポラ・イオラセア（Distichopora violacea）; エチノフィリア・エチナタ（Echinophyllia echinata）; エチノフィリア cf・エチノポロイデス （Echinophyllia cf echinoporoides）; エチノポラ・ゲマセア（Echinopora gemmacea）; エチノポラ・ヒルスチシマ（Echinopora hirsutissima）; ユーフィラ・アンコラ（Euphyllia ancora）; ユーフィラ・ジビア（ Euphyllia divisa）; ユーフィラ・ヤエヤメンシス（Euphyllia yaeyamensis）; ファビア・ロツンダタ（Favia rotundata）; ファビア・ツルンカタス（Favia truncatus）; ファビテス・アクチコリス（Favites acuticollis）; ファビテス・ペンタゴナ（Favities pentagona）; フンギア・グラヌロサ（Fungia granulosa）; フンギア・クルンジンゲリ（Fungia klunzingeri）; フンギア・モルセンシス（ Fungia mollucensis）; ガラキセア・アクレキア（Galaxea acrhelia）; ゴニア��トレア・エドワルデス（Goniastrea edwardsi）; ゴニアステア・ミヌタ（Goniastea minuta）;ヒドノポラ・ピロサ（ Hydnophora pilosa）; レプトセリス・エクスプラナタ（Leptoseris explanata）; レプトセリス・インクルスタンス（Leptoseris incrustans）; レプトセリス・ミセトセロイデス（Leptoseris mycetoseroides）; レプトセリス・スカブラ（Leptoseris scabra）; レプトセリス・ヤベイ（Leptoseris yabei）; リトフィロン・ウンジュラタム（Lithophyllon undulatum）;ロボフィリア・ヘムプリチ（ Lobophyllia hemprichii）; メルリナ・スカブリキュラ（Merulina scabricula）; ミレポラ・ジコトマ（Millepora dichotoma）; ミレポラ・エグザエサ（ Millepora exaesa）; ミレポラ・イントリカタ（Millipora intricata）; ミレポラ・ムラエンシス （Millepora murrayensis）; ミレポラ・プラチフィラ（Millipora platyphylla）; モナストレア・クルタ（Monastrea curta）; モナストレア・コレマニ （Monastrea colemani）;モンチポラ・カリキュラタ（ Montipora caliculata）; モンチポラ・カピタタ（Montipora capitata）; モンチポラ・フォベオラタ（Montipora foveolata）; モンチポラ・メアンドリナ（Montipora meandrina）; モンチポラ・ツベルキュロサ（ Montipora tuberculosa）; モンチポラ cf・ビエトナメンシス（Montipora cf vietnamensis）; オウロフィリア・ラエビス（Oulophyllia laevis）; オキシポラ・クラシスピノサ（Oxypora crassispinosa）; オキシポラ・ラセラ（Oxypora lacera）; パボナ・ビパルチタ（Pavona bipartita）; パボナ・ベノサ（ Pavona venosa）; ペクチニア・アルシコルニス（Pectinia alcicornis）; ペクチニア・パエオネア（Pectinia paeonea）; プラチギラ・アキュタ（Platygyra acuta）; プラチギラ・ピニ（Platygyra pini）; プラチギラ属・（Platygyra sp 「グリーン（green）」）; プラチギラ・ベルウエイ（ Platygyra verweyi）; ポダバシア cf ラナケンシス（Podabacia cf lanakensis）; ポリテス・アンナエ（Porites annae）; ポリテス・シリンドリカ（Porites cylindrica）; ポリテス・エベルマニ（Porites evermanni）; ポリテス・モンチキュロサ（Porites monticulosa）; プサモコラ・ジギタタ（Psammocora digitata）; プサモコラ・エクスポラヌラタ （Psammocora explanulata）; プサモコラ・ハイメアナ（Psammocora haimeana）; プサモコラ・スペルフィシアリス（Psammocora superficialis）; サンダロリタ・デンタタ（Sandalolitha dentata）; セリアトポラ・カリエンドラム（Seriatopora caliendrum）; スチロコエニエラ・アルマタ（Stylocoeniella armata）; スチロコエニエラ・グエンテリア（Stylocoeniella guentheri）; スチラステル属（Stylaster sp.）; ツビポラ・ムシカ（Tubipora musica）; ツルビナリア・ステルラタ（Turbinaria stellulata）；又は当業界において知られている任意のサンゴ、又はそれらの組み合わせからである。
【００７７】
別の実施形態によれば、本発明の固体基材、方法及び／又はキットに使用され得る、海洋動物、例えばサンゴ、海綿、軟体動物の殻、及び他の関連する生物の誘導体は、マドレポラリア（Madreporaria）、コエノテカリア（Coenothecalia）目のヘリオポリダ（Helioporia）、ストロニフェラ（Stolonifera）目のツビポラ（Tubipora）、ミレポリナ（Milleporina）目のミレポラ（Millepora）、又は当業界において知られている他のものからであり得る。いくつかの実施形態によれば、本発明の基材、方法及び／又はキットへの使用のためのサンゴは、スクレラクチニアン（Scleractinian）サンゴ、例えばいくつかの実施形態によれば、ゴニオポラ（Goniopora）及び他のものを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の基材、方法及び／又はキットに使用するためのサンゴは、アルベポラ（Alveoppora）を含むことができる。いくつかの実施形態によれば。本発明の基材、方法及び／又はキットに使用するためのサンゴは、バンブーサンゴ（bamboo corals）例えば、いくつかの実施形態によれば、イシジダエ（Isididae）科、ケラトイシス（Keratoisis）属、イシデラ（Isidella）及び他のものからのサンゴを含むことができる。
【００７８】
本発明の１つの実施形態によれば、用語「サンゴ」（coral）とは、サンゴの単一片から切断され、そしてさらに、ヒト又は動物対象における移植のために適切であるよう処理され、そしてさらに、下記のように移植のために最適化されるよう処理されるサンゴを意味する。
【００７９】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、任意の所望の形状のものである。
【００８０】
本発明の１つの実施形態によれば、サンゴは、種々の形状に機械加工され得、そして非常に複雑な形状、例えば円筒状構造及びねじ構造が、適切な機械又は他の処理、例えば化学処理により形成され得る。別の実施形態によれば、サンゴは、固体ブロック、棒又は顆粒形を形成するよう形状化され得る。１つの実施形態によれば、サンゴ材料は、所望する組織構造の形状に適合するか、又は潜在的な移殖部位におけるギャップ及び輪郭欠損を満たすような手段で形状化される。１つの実施形態によれば、サンゴは、それが隣接して位置する組織構造の最大表面積との接触を可能にする方向で移植される。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、円筒、円錐、タック、ピン、スクリュー、長方形の棒、プレート、板、角錐、顆粒、粉末、サンゴ砂、ボール、骨、顆頭、肋骨、脊椎、又は立方体の形状に近い。いくつかの実施形態によれば、固体基材は所望の組織の増殖又は修復の部位を収容する形状に近い。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、前記固体基材のカルテシアン座標軸に沿って１つの中空又は複数の中空を含む。
【００８３】
１つの実施形態によれば、サンゴ固体基材のサイズは、目的に依存して、当業者に知られているように、本発明の目的のために有用である任意のサイズであり得る。例えば、及び１つの実施形態によれば、固体基材は、それが置換することを意図している構造と実質的に同じサイズであるが、ところが、別の実施形態によれば、固体基材又はその一部は、それが個別の位置で組織形態／機能を増強し／置換するためにそこに配置され得ることができるように、欠陥、亀裂又は破壊のサイズであり得る。１つの実施形態によれば、本発明の固体基材への使用のためにサンゴは、細胞播種及び／又は血管系の発育のために適切な、平均ボイド直径、平均孔サイズ又はそれらの組み合わせを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法及び材料は、使用のための海洋生物骨格誘導体系の固体材料の単離又は調製に依存する。いくつかの実施形態によれば、そのような単離及び調製は、中でも、所望するサンプルの選択、例えば大きなサンゴサンプルにおける年輪の所望する領域からの多数のサンプルの選択、及び／又はいくつかの実施形態によれば、そのようなサンプルの第１処理、及び／又はいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるような流体のそれらの摂取のためのそのようなサンプルのプレスクリーニング、及び／又はいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるような、そのようなサンプルのさらなる処理を含むことができる。この側面によれば、そのような単離及び調製は、本明細書に記載されるように、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値の記載される確立の前、及びいくつかの実施形態によれば、少なくとも７５％の記載される特異的流体摂取容量値、又は水と接触される場合、６０°未満の接触角値、又は本明細書に記載されるような表面粗さ又はファイグル染色陽性により特徴づけられるような海洋生物骨格誘導体系の固体材料の選択の前、もたらされるであろう。
【００８５】
１つの実施形態によれば、サンゴは、その使用の前、洗浄され、漂白され、凍結され、乾燥され、電気力、磁力又は超音波又はマイクロ波又は電磁放射線又は高圧又はそれらの組み合わせに暴露される。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、サンゴは、下記のように、さらなる処理に暴露される。
【００８６】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、当業者に理解され得るように、意図される目的のために適切であるサイズのものである。
【００８７】
例えば、及びいくつかの実施形態によれば、骨軟骨治療又は修復への使用のための固体基材は、円筒形又は隋円形である基材を使用し、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び／又は記載のようなキット及び方法に使用するための本発明の固体基材は、約５〜１５ｍｍの直径、及び約５〜２５ｍｍの高さを有することができる。いくつかの実施形態によれば、固体基材は、約１〜３５ｍｍの直径及び約１〜４５ｍ又は約５〜４０ｍｍの高さ、及び約５〜６０ｍｍ、又は約６〜１５ｍｍの高さ、及び約４〜４５ｍｍ、５〜３０ｍｍ、１５〜６０ｍｍ又はそれ以上の高さを有する。
【００８８】
例えば、及びいくつかの実施形態によれば、本発明の、及び／又は記載されるようなキット及び方法に使用するための固体基材は、円筒形又は隋円形である基材を使用し、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び／又は記載のようなキット及び方法に使用するための固体基材は、ナノメーター又はマイクロメーター尺度での直径を有する。いくつかの実施形態によれば、骨軟骨治療又は修復への使用のための固体基材は、円筒形は楕円形である基材を使用し、そして約１〜１００ｎｍの直径を有するか、又はいくつかの実施形態によれば、約５０〜１０００ｎｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１０〜２０００ｎｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１００〜４０００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態によれば、骨軟骨治療又は修復への使用のための固体基材は、円筒形は楕円形である基材を使用し、そして約１〜１００μｍの直径を有するか、又はいくつかの実施形態によれば、約５０〜１０００μｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１０〜２０００μｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１００〜４０００μｍの直径を有する。
【００８９】
例えば、及びいくつかの実施形態によれば、本発明の、及び／又は記載されるようなキット及び方法に使用するための固体基材は、円筒形又は隋円形である基材を使用し、そしていくつかの実施形態によれば、本発明の、及び／又は記載のようなキット及び方法に使用するための固体基材は、ミリメーター又はセンチメーター尺度での直径を有する。いくつかの実施形態によれば、骨軟骨治療又は修復への使用のための固体基材は、円筒形は楕円形である基材を使用し、そして約１〜１００ｍｍの直径を有するか、又はいくつかの実施形態によれば、約５０〜１０００ｍｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１０〜２０００ｍｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１００〜４０００ｍｍの直径を有する。いくつかの実施形態によれば、骨軟骨治療又は修復への使用のための固体基材は、円筒形は楕円形である基材を使用し、そして約１〜１００ｃｍの直径を有するか、又はいくつかの実施形態によれば、約５０〜１０００ｃｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１０〜２０００ｃｍの直径を有し、又はいくつかの実施形態によれば、約１００〜４０００ｃｍの直径を有する。
【００９０】
基材のサイズはまた、例えば骨修復のための足場材料として使用する場合、特定の適用に対して適切であるよう選択され、次にそのサイズは対象における長骨の寸法に近似することは当業者に理解され得るであろう。従って、本発明は、固体基材のサイズにより限定されるものではない。
【００９１】
本発明の固体基材の相内のボイドの平均寸法は、任意の手段、例えばデジタル画像分析により決定され得る。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、本発明に従っての使用のためのサンゴは、ＰＣＴ国際出願公開番号２００９／０６６２８３号、ＰＣＴ国際出願公開番号２０１０/０５８４００号、ＰＣＴ国際出願公開番号２０１０/１４６５７４号及び国際出願公開番号２０１０/１４６５７４号（それらの個々は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載のようにして調製され得る。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、サンゴは、既知方法により、及び本明細書に記載のようにして、天然源から単離される。いくつかの実施形態によれば、より大きなサンゴサンプル内の１又は２以上の年輪の領域からサンゴスライスを単離することに注意すべきであり（ここで前記領域は、本明細書に記載のように、適切な特異的流体摂取容量値、適切な接触角値及び／又は表面粗さを有することが示されており）、そしていくつかの実施形態によれば、次に、下記のように、さらなる処理にさらされる。
【００９４】
本発明の方法は、特定適用のために所望される場合、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる、本発明の固体基材の入手を促進し、ここで前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される。
【００９５】
本明細書に記載され、そして例示されるように、例えば実施例３及び４に記載されるように、特異的流体摂取容量値は、所定のサンプルについて全摂取容量レベルに到達することにより決定され得、それにより、前記値が７５％超である場合、そのような固体基材は細胞及び組織の増殖及び／又は機能回復を促進する用途に使用されるであろう。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、固体基材の選択方法は、サンゴ系の固体材料のサンプルを単離し、そして前記材料の特異的流体摂取容量値を確立することを包含し、ここで前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立し、そして少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられた材料を選択することにより決定される。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、生物学的流体は血液であり、そしていくつかの実施形態によれば、生物学的流体は水である。いくつかの実施形態によれば、生物学的流体は親水性である。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、生物学的流体は、前記固体基材が対象の細胞又は組織と接触される場合、前記対象の細胞又は組織に対して自系である。
【００９９】
生物学的流体は、生体適合性である任意の流体であり得、そしてその組込みは、所望する用途のための固体基材内で適切であることが理解されるであろう。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、自発的流体摂取値に到達するようサンゴ系の固体材料内の流体の自発的流体摂取を促進するために、前記材料と流体とを２〜１５分間、接触する工程を含んで成る。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、自発的流体摂取を促進するために、前記流体と前記材料とを、０．５〜１５分間、又はいくつかの実施形態によれば、０．５〜５分間、又はいくつかの実施形態によれば、１０〜６０分間、又はいくつかの実施形態によれば、６０〜９０分間、又はいくつかの実施形態によれば、他の期間、接触することができる。当業者は、流体が自発的摂取を決定するために適用される時間が、評価されるサンプル基材の寸法及び幾何学的形状に応じて延長するか又は短縮され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態によれば、より大きなサンプルが評価される場合、前記方法はさらに、自発的流体摂取値に到達するよう前記サンゴ系の固体材料内の流体の自発的流体摂取を促進するために、前記材料と流体とを、２〜２４時間、接触する工程を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを接触し、そして全流体摂取値に到達するようサンゴ系の固体材料内の流体の最大摂取を促進するために、前記サンゴ系の固体材料に、負圧、又はいくつかの実施形態によれば、機械的圧力を適用する工程を含む。いくつかの実施形態によれば、正圧の適用は、流体に含浸された基材への真空又はいくつかの実施形態によれば、機械的圧力の適用を介してであり、それにより、基材内部への流体の浸入を促進する。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、海洋生物骨格誘導体系の固体材料と流体とを接触し、そして全流体摂取値に到達するようサンゴ系の固体材料内の流体の最大摂取を促進するために、前記サンゴ系の固体材料に、正圧を適用する工程を含む。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、圧力の適用が固体基材の構造的結合性を、いずれにせよ損なわないことを確実にすることに注意すべきである。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、正圧の適用は、任意の手動的手段を介してであり、例えば当業者に理解され得るように、任意のアプリケーター、注射器、等、靜水圧、及び他の手段を介してである。いくつかの実施形態によれば、正圧の適用は、浸透圧、遠心分離又は他の手段を介してである。いくつかの実施形態によれば、記載される方法及び他の手段の組み合わせが想定される。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、プレスクリーニング工程が行われ得る。例えば、及びいくつかの実施形態によれば、例えば、サンゴサンプルの年輪に対して垂直であり得る、所望の厚さのサンゴスライスが取られる。そのスライスは、生物学的流体の急速な摂取、例えば着色されたタンパク質性流体、例えば血液の摂取について評価され得る。いくつかの実施形態によれば、何れかの源、例えば家畜又は他の源からの血液が使用され得る。
【０１０５】
記載されたプレスクリーン方法の一部として迅速な摂取を提供するサンプルがさらに、それらの特異的流体摂取容量値について評価され得る。
【０１０６】
例えば、及びいくつかの実施形態によれば、小さなサンプル又は特定の足場が、サンゴスライスがプレスクリーニングのために取られたブロックから、すなわち生物学的流体の急速な摂取を提供するためにプレスクリーンにより決定された領域から単離され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態によれば、足場及び／又はより小さなサンプルが乾燥され、そして次に、さらなる処理にゆだねられる。そのようなさらなる処理は、例えば、ヒト又は動物対象における移植のためにインプラントを不適合にする物質の除去を保証する。いくつかの実施形態によれば、そのような処理は、何れかの規則当局の指針、例えばＡＳＴＭ F １１８５−０３: 外科用インプラントのためのハイドロキシアパタイトの構成のための標準仕様、又はＡＳＴＭ Ｆ １５８１−０８：外科用インプラントのための無機骨の構成のための標準仕様に従って、移植のために適合される生成物を製造する。
【０１０８】
いくつかの実施形態によれば、そのようなさらなる処理は、足場及び／又はより小さなサンプルにおける有機残留物の酸化、及び使用される酸化剤の続く排除を含む。いくつかの側面によれば、そのような酸化剤は、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素（それらの溶液）又は両者の使用を包含し、いくつかの実施形態によれば、それに続いて、極性溶媒の適用を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態によれば、そのようなさらなる処理工程は、特異的流体摂取容量値の確立に続いて行われ得、そしていくつかの実施形態によれば、そのようなさらなる処理工程は、サンプルについての特異的流体摂取容量値を確立する前、行われ得る。
【０１１０】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、そのような足場又はより小さなサンプルは、下記実施例１に記載のようにして、十分に乾燥され、そして次に、それらの自発的流体摂取値について評価され得る。例えば、乾燥サンプルが水に含浸され、そして自発的流体摂取値が評価され、続いて、全流体摂取値が評価される。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値を生成するサンプルが、さらなる処理のために選択される。いくつかの実施形態によれば、少なくとも６０−９５％の特異的流体摂取容量値を生成するサンプルが、さらなる処理のために選択される。
【０１１１】
いくつかの側面によれば、そのようなさらなる処理は、所定の足場及び／又はサンプルの特異的流体摂取容量値を改善するか又はさらに、最適化する工程、例えば本明細書に記載のように前記摂取容量値を最適化する工程を含む。いくつかの実施形態によれば、そのようなさらなる処理は、本明細書に記載のように、足場及び／又はサンプルを極性溶媒暴露にゆだねることを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態によれば、本発明はまた、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために準最適な海洋生物骨格誘導体基材の固体材料を、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材に転換するための方法を提供し、ここで前記方法は、
ａ)海洋生物骨格誘導体系の固体材料グループの特異的流体摂取容量値を確立し（前記特異的流体摂取容量値は、前記グループにおける各サンプルについて、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される）；
ｂ)特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し；
ｃ)（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料を、低温プラズマ処理、コロナ処理、又はそれらの組み合わせにゆだね；
ｄ)（ｃ）で得られた前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料において（ａ）におけるような特異的流体摂取容量を決定し；そして
ｅ)新しく確立された、高められた特異的流体摂取容量値を有する、（ｄ）で得られた海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【０１１３】
いくつかの実施形態によれば、前記さらなる処理は特に、低温プラズマ処理、コロナ処理、又はそれらの組み合わせを意図する。いくつかの実施形態によれば、さらなる処理は、例えば既知方法により、水熱反応を介してヒドロキシアパタイトへの表面変換を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材は、流体と接触する場合、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる生物骨格誘導体を含む。
【０１１５】
実施例５は、６０°未満の接触角値により特徴づけられる固体基材は、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値を有するサンプルに匹敵し、そして従って、そのようなサンプルがまた、本発明の一部を含むと見なされるべきであることを示した。
【０１１６】
接触角を決定するための方法は、良く知られており、そして何れの適切な方法でも使用され得る。そのような方法の１つの実施形態は、実施例５に関して、及び上述のように本明細書中に提供される。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、サンゴ又はサンゴ誘導体の構造組成は、Ｘ線回折（ＸＲＤ）又はファイグル溶液陽性染色により決定される。
【０１１８】
いくつかの実施形態によれば、用語「ファイグル溶液陽性染色」（Ｆeigl solution positive staining）又は「ファイグル染色陽性」（Ｆeigl stain positivity）とは、公知のように、及び本明細書に記載のように、標準のファイグル染色パターン（黒）と一致する染色パターンを言及する。
【０１１９】
同様に、本発明のいくつかの実施形態によれば、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法が提供され、ここで前記方法は、
・生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・前記生物骨格誘導体系の固体材料と、流体とを接触し、そして前記生物骨格誘導体についての接触角を確立し；そして
・６０°未満の接触角により特徴づけられる生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【０１２０】
いくつかの実施形態によれば、本発明のサンゴ系の固体基材は、既知方法により、ヒドロキシアパタイトに部分的に又は完全に転換され得る。
【０１２１】
この側面によれば、全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる固体基材は、ヒドロキシアパタイトに転換され得、そして示される活性がその転換された基材に存在する。
【０１２２】
別の実施形態様によれば、流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる固体基材は、ヒドロキシアパタイトに転換され得、そして示される活性がその転換された基材に存在する。
【０１２３】
別の側面によれば、固体基材がヒドロキシパタイトに転換され、そして次に、同じ基材が全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立することにより決定される、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値の存在について評価され、そして言及される基準を満たすそのような基材が、本出願により特に選択され、そして包含される。
【０１２４】
別の側面によれば、固体基材はヒドロキシアパタイトに転換され、そして次に、同じ基材が、その接触角に関して、及び角度が６０°未満であるかどうかについて、評価され、そして言及される基準を満たすそのような基材が、本出願により特に選択され、そして包含される。
【０１２５】
この側面によれば、及び１つの実施形態によれば、本明細書に定義されるような固体基材、例えばサンプル又は真珠層、又は本明細書に記載される他のものが、本明細書に記載されるような方法への使用のために小乾燥サンプルを選択することにより評価され、より大きなブロックからの単離のこの領域が、追加のサンプルが単離され、そして次に、使用されるブロックにおける領域の特徴に関する情報を提供するために確認され得る。
【０１２６】
いくつかの側面によれば、サンプルは、真空下で乾燥され、そして／又は加熱されるか、又は加圧されるか、又は蒸気処理される。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、特異的流体摂取容量値に関する側面に関して、そのような値は、前記サンゴ系の固体材料における重量の変化の関数である。
【０１２８】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、各サンプルについての乾燥重量が記録され、そして本明細書に記載のような流体がアッセイ容器に添加される。
【０１２９】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、少なくとも１：１の比のｍｍでサンプルのサイズ：ｍｌで添加される流体の体積が、容器に適用される。いくつかの実施形態によれば、適用され流体の量は、サンプルサイズに比較して、過剰である。
【０１３０】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、初期流体摂取が評価されると、この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、次に固体基材サンプルが、流体と接触され、そして固体基材サンプルの重量が評価される。他の実施形態によれば、比重がアルキメデスの原理による勾配遠心分離により評価される。
【０１３１】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、サンプルの重量の変化に基づいて、自発的流体摂取が評価され、そして自発的流体摂取値が確立される。
【０１３２】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、特異的流体摂取容量値は、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に対する適用される流体の流体体積の変化の関数である。この側面によれば、自発的流体摂取が評価され、そして自発的流体摂取値が、サンプルに適用される体積の完全な摂取に基づいて、確立される。
【０１３３】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、次に、前記方法はさらに、有意に高められた量の流体とサンプルとを接触し、そしてこれに圧力を適用し、サンプルの全流体摂取容量に最大流体摂取を促進することを含む。
【０１３４】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、述べたように、そのような圧力は正又は負圧の何れでも良く、そして適用時間は、海洋生物骨格誘導体サンプルに適用される流体の最大摂取を確実にするのに十分な時間である。
【０１３５】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、そのような時間は、０．５〜６０分の間隔を包含し、又はいくつかの実施形態によれば、より大きなサンプルが評価される場合、そのような時間は、前記自発的流体摂取値に到達するために２〜２４時間の間隔を含むことができる。本明細書に記載される時間間隔は、本明細書に記載のように、それに関する任意の実施形態に適用できることが理解されるであろう。当業者は、流体が十分な流体摂取容量を決定するために適用される時間は、評価されるサンプル基材の寸法及び幾何学の関数として延長されるか、又は短縮され得ることを理解するであろう。
【０１３６】
それらの側面によれば、従って、全流体摂取容量が評価され、そして次に特異的流体摂取容量値が決定される。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、本発明は特に、細胞又は組織の増殖を促進するための固体基材として最適化される、注意すべきサンプルについて、７５％のカットオフ値を超える特異的流体摂取容量値を有する固体基材を企画する。本発明は、かなりの偽陽性、すなわち、記載される適用のために最適ではない固体基材の存在を低める適正値を促進するための記載されたカットオフを意図することが理解されるであろう。
【０１３８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は特に、細胞又は組織の増殖を促進するための固体基材として最適化される、注意すべきサンプルについて、流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる固体基材を企画する。本発明は、かなりの偽陽性、すなわち、記載される適用のために最適ではない固体基材の存在を低める適正値を促進するための記載されたカットオフを意図することが理解されるであろう。
【０１３９】
組織、例えば軟骨及び骨増強を促進するためのサンゴ基材の有用性は以前に示されていることに注目すべきである。驚くべきことには、多くの単離されたサンゴ系の基材はそのような修復のために使用され得るが、一貫して優れた機能が、基材が生物学的流体のそれらの増強された自発的摂取のために特異的に選択される場合、見出されたことが現在、見出されている。驚くべきことには、サンゴ系の材料が細胞及び組織の増殖及び／又は機能回復を促進するための効果的材料であることのみならず、また、前述のように使用するためのサンゴの選択されたサンプルの自発的流体吸収特性がこれに関して、さらに高い活性を提供することも見出された。
【０１４０】
理論に束縛するものではなく、そして本発明の基材、方法及び用途の非制限的実施形態を表すものではないが、少なくとも７５％の所望する特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択、又は流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、血管新生が増強され、又はいくつかの実施形態によれば、リンパへのアクセスが向上され、又はいくつかの実施形態によれば、吸収能力が細胞外マトリックス−関連の材料に対する親和性を伝達し、又はいくつかの実施形態によれば、吸収能力が近位血管外漏出を含む細胞誘引に対する親和性を伝達するサンプルについて選択することができる。
【０１４１】
本発明の基材、方法及び用途のほかの実施形態によれば、少なくとも７５％の所望する特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択、又は流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有するか、又は記載される表面粗さを有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、抗癌用途において特に有用であるサンプルについて選択することができる。
【０１４２】
本発明の基材、方法及び用途のほかの実施形態によれば、少なくとも７５％の所望する特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択、又は流体と接触するときに、６０°未満の接触角値を有するか、又は記載される表面粗さを有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、骨統合、骨伝導、骨伝達、軟骨形成または軟骨再生の促進において特に有用であるサンプルについて選択することができる。
【０１４３】
本発明の基材、方法及び用途のほかの実施形態によれば、少なくとも７５％の所望する特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択、又は流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有するか、又は記載される表面粗さを有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、細胞、組織又は器官増殖のためのエクスビボ三次元支持体及び構造の促進において特に有用であるサンプルについて選択することができる。いくつかの実施形態によれば、そのような細胞、組織又は器官増殖は、心臓、筋肉、肝臓、腎臓、血管及び神経増殖及び成長を含む。
【０１４４】
本発明の基材、方法及び用途のほかの実施形態によれば、少なくとも７５％の所望する特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択、又は流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有するか、又は記載される表面粗さを有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、本発明の基材の適用のためにエクスビボ又はインビトロ幹細胞成長、増殖及び／又は分化を促進することにおいて、例えば基材から生じる細胞、組織又は器官成長のために、例えば心臓、筋肉、肝臓、皮膚、腎臓、血管及び神経増殖及び成長のための三次元支持体及び構造を提供することにおいて、特に有用であるサンプルについて選択することができる。
【０１４５】
それらの機構及び他のものの何れかが、増強された細胞又は組織の増殖又は機能回復の現象を説明することでき、そして少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の適用に関連する何れかのそのような機構が本発明の一部であるものとして理解されるべきであることが、理解されるべきである。
【０１４６】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値、又は流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択により特徴づけられるよう処理され、そして見出されたサンプルが、そのようなサンプルが取られる部分の近位に位置する領域の単離のために使用され得、次に、このサンプルは確実に使用され、そして本発明の方法に従って最適化されるものとして見なされ得る。いくつかの実施形態によれば、サンゴ系のサンプルに関して、そのような領域は、サンプルが由来するサンゴ内の全体の年間成長年輪領域を含むことができる。
【０１４７】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値、又は流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択により特徴づけられるよう処理され、そして見出されたサンプルは、次に十分に乾燥され、そして対象への移植のために、又は続く移植のための細胞、組織又は器官増殖のためのエクスビボ基材としての使用のために利用され得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態によれば、及び本明細書における実施例９に例示されるように、本発明の基材、方法及び用途によれば、海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、所望する特異的流体摂取容量値、接触角値又は表面粗さにより特徴づけられ、そのような基材への改善された付着性及び生存能力を促進する。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、細胞付着性及び細胞生存性アッセイは、流体摂取のために最適化されると思われるサンプルは、経時的に、より高い十分な細胞付着性及び生存性を促進する。
【０１４９】
いくつかの実施形態によれば、サンプルが続く用途のためにインビボで使用される場合、いくつかの側面によれば、サンプルはまず、宿主への移植の前、自家生物学的流体、又は宿主からの材料と接触され、本明細書に記載のように、観察される、増強された流体摂取表現型を実証する。
【０１５０】
本発明の固体基材は、いくつかの実施形態によれば、当業者により理解されるであろうように、走査型電子顕微鏡、又は原子間力顕微鏡、陽性染色についてのＸ線回折又はファイグル溶液分析、又は他の既知手段により測定されるように、実質的な表面粗さ（Ｒａ）により、代わりに又は同時に、特徴づけられ得る。
【０１５１】
本明細書に記載され、そして例示されるように、例えば実施例６に記載されるように、単離されたサンゴの特定部分は、より大きなサンゴ片の別の領域から収穫されたサンプルに比較して、異なった表現型を提供する。そのような表現型は、サンプルの吸収能力、表面構造粗さ又は両者において反映され得、そして記載される差異は、細胞及び組織の増殖及び／又は機能回復を促進することにおいて特徴づけられるサンプルをもたらす。
【０１５２】
いくつかの実施形態によれば、固体基材の選択方法は、サンゴ系の固体材料のサンプルを単離し、そして走査型電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡、Ｘ線回折又はファイグル溶液陽性染色により決定される、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料上の実質的に粗い表面を確立し、そして海洋生物骨格誘導体系の固体材料上の実質的に粗い表面の存在の決定、ファイグル溶液染色を介して陽性染色（黒）により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択することを含んで成る。
【０１５３】
いくつかの実施形態によれば、本発明のサンゴ系の固体基材は、既知方法により、ヒドロキシアパタイトに部分的に完全に転換され得る。
【０１５４】
別の側面によれば、固体基材は、ヒドロキシアパタイトに転換され、そして次に、走査型電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡又はＸＲＤ分析により測定されるように、実質的な表意面粗さ（Ｒａ）の存在について評価され、そして記載される基準を満たすそのような基材が特に選択され、そして本出願に包含される。
【０１５５】
理論に束縛するものではなく、そして本発明の基材、方法及び用途の非制限的実施形態を表すものではないが、本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）より特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、血管新生が増強され、又はいくつかの実施形態によれば、リンパへのアクセスが向上され、又はいくつかの実施形態によれば、吸収能力が細胞外マトリックス−関連の材料に対する親和性を伝達し、又はいくつかの実施形態によれば、吸収能力が近位血管外漏出を含む細胞誘引に対する親和性を伝達するサンプルについて選択することができる。
【０１５６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられた海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、抗癌活性を促進することにおいて有用である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられた海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、骨統合、骨伝導、骨伝達、軟骨又は軟骨再生、又はそれらの組み合わせを促進することにおいて有用である。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられた海洋生物骨格誘導体系の固体基材の特定の選択は、細胞、組織又は器官増殖のためのエクスビボ三次元構造支持体を促進することにおいて有用であり、これは、いくつかの実施形態によれば、細胞、組織又は器官増殖は、心臓、筋肉、肝臓、腎臓、血管及び神経への適用のために特に、適切である。
【０１５７】
それらの機構及び他のものの何れかが、増強された細胞又は組織の増殖又は機能回復の現象を説明することでき、そして本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられる、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の適用に関連する何れかのそのような機構が本発明の一部であるものとして理解されるべきであることが、理解されるべきである。
【０１５８】
いくつかの実施形態によれば、このようにして処理され、そして本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられることが見出されたサンプルが、そのようなサンプルが採取された部分の近位に位置する領域の単離のために使用され得、次にこのサンプルは、本発明の方法に応じて、信頼を持って使用され、そして最適化されているとみなされ得る。いくつかの実施形態によれば、サンゴ系のサンプルに関して、そのような領域は、サンプルが由来するサンゴ内の全体の年間成長年輪領域を含むことができる。
【０１５９】
いくつかの実施形態によれば、このようにして処理され、そして本明細書に記載のように特徴を決定するための方法により測定されるような、所望の特異的流体摂取容量値又は所望する表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられることが見出されたサンプルは、対象への移植のために、又は続く移植のために細胞又は組織の増殖のためのエクスビボ基材としての使用のために利用され得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、骨充填材又は骨代替材を形成するために処理され／調製され得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、整形外科用ネジ、補綴、及び当業界により理解されるだろう他のものとしての使用を含む、整形外科用途において有用である。いくつかの実施形態によれば、本発明の海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、充填材料、例えばギャップ充填材を必要とする用途において有用である。
【０１６２】
いくつかの実施形態によれば、そのような充填材は、当業者に知られているように、活性ガラスを含む。他の市販の製品が、本発明の海洋生物骨格誘導体系の固体基材と組合わされ得る。いくつかの実施形態によれば、次の米国特許に記載される骨充填材料が、本発明の海洋生物骨格誘導体系の固体基材と組合わされ得る：米国特許第５，９３９，０３９号; 第６，３２５，９８７号; 第６，３８３，５１９号; 第６，５２１，２４６号; 第６，９６９，５０１号;及び第６，９９１，８０３号（それらのすべては、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、補強構造体を利用する用途において、例えば補強ネジ、移植片又は他のものとして有用である。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法及び材料は、ネジ、補綴及びそのような適用のために適切な他の構造体の固定において有用である。
【０１６４】
本発明の方法及び材料は、創傷治癒において有用である。いくつかの実施形態によれば、本発明の材料は、本明細書に記載のような任意の実施形態によれば、海洋生物骨格誘導体系の固体基材、例えば、中でも、ｍｍ又はｃｍ尺度での基材を包含し、又はいくつかの実施形態によれば、粉末化された又は粒状化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の使用が想定される。
【０１６５】
いくつかの実施形態によれば、そのような創傷治癒は、当業者により理解されるであろうように、火傷、壊死組織、糖尿病性潰傷、外科的創傷及び任意の創傷の治癒を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法及び材料は、外科的切除に続く、虚血性壊死、嚢胞又は骨腫瘍の治療への用途において有用である。
【０１６７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法及び材料は、頭蓋顔面の骨格手術及び骨格復元における用途において有用である。
【０１６８】
他の実施形態によれば、基材は、いくつかの海洋起源の材料の混合物、又は骨及びサンゴ顆粒又は軟骨及びサンゴ顆粒の混合物であり得る。いくつかの実施形態によれば、固体基材は、本明細書に記載されるような海洋生物骨格誘導体の複数サンプルから構成される複合材料であり得る。
【０１６９】
本発明の１つの実施形態によれば、固体基材は、単離された海洋生物骨格誘導体材料のみであり得るか、又はいくつかの実施形態によれば、前記基材はさらに、追加の材料を含むことができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態によれば、そのような追加の材料は、ポリマーを含むことができる。
【０１７１】
用語「ポリマー」（polymer）とは、いくつかの実施形態によれば、固体基材材料の少なくとも１部に関連してポリマー材料の層の存在を意味する。いくつかの実施形態によれば、そのようなポリマー層は、固体基材材料のためのコーティングである。
【０１７２】
いくつかの実施形態によれば、そのようなコーティングは、固体基材全体上に存在することができ、そしていくつかの実施形態によれば、そのようなコーティングは、固体基材のボイド及び／又は孔及び／又は中空内に侵入することができる。いくつかの実施形態によれば、そのようなコーティングは、固体基材の特定領域に選択的に適用され、結果的に、それは固体基材上に別々の相を創造し、そしていくつかの実施形態によれば、そのようなポリマーは、厚いポリマー層又は相が固体基材の一部と関連し、それにより、本明細書に記載のような固体基材と関連して別々のポリマー相を創造するよう適用され得る。
【０１７３】
１つの実施形態によれば、ポリマーコーティングは、本明細書に記載のような固体基材への追加機能、例えば固体基材への追加の引っ張り強度、追加の柔軟性、減じられた脆性及び他の属性を提供し、そしていくつかの実施形態によれば、ポリマーコーティングは、本明細書に記載のような固体基材への高い細胞誘引及び結合をもたらし、中でも、修復の量、質及びタイミングの観点から増強された修復をもたらす。いくつかの実施形態によれば、ポリマーコーティングは、細胞増殖及び／又は所望する成熟組織への分化を増強し、これは、中でも、修復の量、質及びタイミングの観点から増強された修復をもたらす。
【０１７４】
本発明の１つの実施形態によれば、ポリマーコーティング透過性である。１つの実施形態によれば、透過性ポリマーコーティングは、特別な多孔性膜を含む。１つの実施形態によれば、用語「透過性」（permeable）とは、孔及び開口を有することを意味する。１つの実施形態によれば、本発明の透過性ポリマーコーティングは、栄養物、治療用化合物、細胞集団、キレート剤又はそれらの組み合わせの侵入を可能にする孔及び開口を有する。１つの実施形態によれば、本発明の透過性ポリマーコーティングは、栄養物、治療用化合物、細胞集団、キレート剤又はそれらの組み合わせの排出／放出を可能にする孔及び開口を有する。
【０１７５】
１つの実施形態によれば、本発明のポリマーコーティングは不連続である。１つの実施形態によれば、本発明のサンゴの１つの領域又は複数のサブ領域は、ポリマーコーティングを含まず、サンゴと環境との間の直接的接触を可能にする。
【０１７６】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、任意の物理的又は化学的会合を介して、アラゴナイト又はカルサイト成分と会合される、生体適合性ポリマーを、その内部に組込む。いくつかの実施形態によれば、ポリマーはヒドロゲルの一部であり、これは本発明の固体基材に組み込まれる。いくつかの実施形態によれば、その後、そのようなヒドロゲル含有固体基材は、凍結乾燥されるか又は乾燥され、そしてその後、再構成され得る。
【０１７７】
本発明の固体基材のいくつかの実施形態によれば、ポリマーは、別々の相を形成するために固体基材に適用され得るか、又はいくつかの実施形態によれば、ポリマーは、固体基材上に層として適用され得、又はいくつかの実施形態によれば、固体基材は、同じか又は異なったポリマー材料を含む、それに結合される別々の相を有する、内部又は外部会合される層として両ポリマーを含むことができる。
【０１７８】
そのようなポリマー含有固体基材は、軟骨修復、再生又はその形成の強化のために、特に適切であり得る。いくつかの実施形態によれば、この側面によれば、例えば軟骨骨欠損の治療において、サンゴ系の固体基材は、影響される骨内への組込みのために適切な寸法のものであり、そしてさらに、ポリマー含有相を含み、この相は、影響される欠損部位内に挿入される場合、影響された軟骨の近位に存在する。別の側面、及び本発明の実施形態を表す場合、固体基材は、軟骨修復の部位内に挿入される固体基材のボイド及び孔内に浸透したポリマーを含み、ここで前記ポリマーは、欠損部位の軟骨成長、再生又は治療を促進する。
【０１７９】
そのようなポリマー含有固体基材は、骨修復、再生又はその形成の増強に特に適切である。いくつかの実施形態によれば、この側面によれば、例えば骨浮腫、骨の破損又は断片化、疾患又は欠損の治療において、サンゴ系の固体基材は、影響される骨内への組込みのために適切な寸法のものであり、そしてさらに、骨内に挿入される固体基材のボイド及び孔内に浸透し、そして欠損部位の骨成長、再生又は治療を促進するポリマーを含む。
【０１８０】
１つの実施形態によれば、本発明のポリマーコーティングは、コラーゲン、フィブリン、エラスチン、シルク、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、架橋されたヒアルロン酸、キトサン、架橋されたキトサン、アルギン酸塩、アルギン酸カルシウム、架橋されたアルギン酸カルシウム、又はそれらの何れかの組み合わせを含む天然のポリマーを含む。
【０１８１】
１つの実施形態によれば、ポリマーは合成的に変性された天然ポリマーを含み、そしてセルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースエーテル、セルロースエステル及びニトロセルロースを含むことができる。適切なセルロース誘導体の例は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシメチルセルロース、三酢酸セルロース及びセルロース硫酸ナトリウム塩を含む。
【０１８２】
本発明の１つの実施形態によれば、ポリマーは、合成生分解性ポリマーを含む。本発明の１つの実施形態によれば、合成生分解性ポリマーは、α−ヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、それらの鏡像異性体、それらのコポリマー、ポリオルトエステル及びそれらの組み合わせを含む。
【０１８３】
１つの実施形態によれば、本発明のポリマーは、ポリシアノアクリレート）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（ケタール）、ポリカプロラクトン）、ポリ（アセタール）、ポリ（α−ヒドロキシエステル）、ポリ（α−ヒドロキシエステル）、ポリ（ヒドロキシルアルカノエート）、ポリ（プロピレン−フマレート）、ポリ（イミノカーボネート）、ポリ（エステル）、ポリ（エーテル）、ポリ（カーボネート）、ポリ（アミド）、ポリ（シロキサン）、ポリ（シラン）、ポリ（スルフィド）、ポリ（イミド）、ポリ（尿素）、ポリ（アミド - エナミン）、ポリ（有機酸）、ポリ（電解質）、ポリ（p−ジオキサノン）、ポリ（オレフィン）、ポロキサマー、無機又は有機金属ポリマー、エラストマー、又はそれらの誘導体の何れか、又はそれらの組み合わせにより得られるコポリマーを含む。
【０１８４】
１つの実施形態によれば、本発明のポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）を含む。別の実施形態によれば、ポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡ）を含む。別の実施形態によれば、ポリマーは、ポリ（Ｄ，Ｌ−グリコリド）（ＰＧＡ）を含む。１つの実施形態によれば、ポリマーはグリコサミノグリカンを含む。
【０１８５】
１つの実施形態によれば、ポリマーは合成分解ポリマーを含み、これは次のものを含むが、但しそれらだけには限定されない：ポリヒドロキシ酸、例えばポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）及びそれらのコポリマー；ポリ（エチレンテレフタレート）；ポリ（ヒドロキシ酪酸）;ポリ（ヒドロキシ酸）;ポリ[ラクチド - コ - （ε−カプロラクトン）];ポリ[グリコリド - コ（ε−カプロラクトン）];ポリ（カーボネート）、ポリ（擬似アミノ酸）；ポリ（アミノ酸）;ポリ（ヒドロキシアルカノエート）;ポリ（無水物）；ポリ（オルトエステル）；及びそれらのブレンド及びコポリマー。
【０１８６】
本発明の１つの実施形態によれば、ポリマーは、タンパク質、例えばゼイン、変性されたゼイン、カゼイン、ゼラチン、グルテン、血清アルブミン、コラーゲン、アクチン、α−フェトプロテイン、グロブリン、マクログロブリン、コヒーシン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、オステオプロテゲリン、又は当業者により理解されるような他のものを含む。別の実施形態によれば、ポリマーは、環式糖、シクロデキストリン、シクロデキストリンの合成誘導体、糖脂質、グリコサミノグリカン、オリゴ糖、多糖類、例えばアルギン酸塩、カラギーナン(χ, λ, μ, κ)、キトサン、セルロース、コンドロイチン硫酸塩、カードラン、デキストラン、エルシナン、ファーセレラン、ガラクトマンナン、ジェラン、グリコーゲン、アラビアガム、ヘミセルロース、イヌリン、カラヤガム、レバン、ペクチン、プルラン、プルラン、ポルフィリン、スクレログルカン、デンプン、トラガカントガム、ウェラン、キサンタン、キシラン、キシログルカン、ヒアルロン酸、キチン、ポリ（３−ヒドロキシアルカノエート）、例えばポリ（β−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３−ヒドロキシ脂肪酸）、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。
【０１８７】
１つの実施形態によれば、ポリマーは、生侵食性ポリマー、例えば、また使用され得るポリマー侵食物の滑らかな表面としての外表面上に暴露されるカルボン酸基を有する、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（無水物）及びポリ（オルトエステル）を含む。１つの実施形態によれば、ポリマーは、不安定結合、例えばポリ無水物及びポリエステルを含む。
【０１８８】
１つの実施形態によれば、ポリマーは、その化学的誘導体（化学基、例えばアルキル、アルキレンの置換、付加及び除去、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者により日常的に行われる他の修飾）、タンパク質又は炭水化物単独での又は合成ポリマーと組合してのブレンドを含むことができる。
【０１８９】
本発明の１つの実施形態によれば、ポリマーは、生分解性である。１つの実施形態によれば、用語「生分解性」（biodegradable）又はその文法的な形は、それが見出される対象の生物学的環境下で分解される、本発明の材料を言及する。１つの実施形態によれば、生分解性材料が分解を受ける間、酸性生成物又は別の実施形態によれば、塩基性生成物が放出される。１つの実施形態によれば、生分解とは、例えば生化学工程による消化を介して、その成分サブユニットへの材料の分解を含む。１つの実施形態によれば、生分解は、例えば本発明のポリマー主鎖における結合（共有結合であるか、又はそれ以外の結合）の切断を含む。別の実施形態によれば、生分解は、側鎖の内部の結合（共有結合であるか、それ以外の結合）、又は例えばポリマー主鎖を連結する結合の切断を含む。
【０１９０】
１つの実施形態によれば、本発明のサンゴは、架橋剤の使用を介してポリマーコーティングに共有結合される。１つの実施形態によれば、用語「架橋剤」（cross-linking agent ）とは２原子間に共有結合の形成を促進する剤を言及する。１つの実施形態によれば、架橋剤はゼロ長架橋剤である。
【０１９１】
１つの実施形態によれば、架橋剤は、（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ−スルホヒドロキシスクシンアミド（Sulfo  NHS）、５−ヨードピリミジン、Ｎ−カルバルコキシジヒドロキノリン、ピロロキノリンキノン、ゲニピン又はそれらの組み合わせである。
【０１９２】
１つの実施形態によれば、架橋剤は、ホモニ官能性架橋剤、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えばジスクシンイミジルスベレート又はジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート））、ホモ二官能性イミドエステル（例えばジメチルアジピミデートまたはジメチルピメリミデート）、スルフヒドリル反応性架橋剤（例えば、１，４−ジ − ［３’− （２’-ピリジルジチオ）プロピオンアミド]ブタン）、ジフルオロベンゼン誘導体（例えば、１，５−ジフルオロ‐２,４−ジニトロベンゼン）、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）、ビス−エポキシド（例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）、ヒドラジド（例えば、アジピン酸ジヒドラジド）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、o−トリジン）、ビス−ハロゲン化アルキル、又はそれらの組み合わせである。
【０１９３】
１つの実施形態によれば、架橋剤は、ヘテロニ官能性架橋剤、例えばアミン−反応性及びスルフヒドリル−反応性架橋剤（例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸、カルボニル−反応性及びスルフヒドリル−反応性架橋剤（例えば、４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、又はそれらの組み合わせである。
【０１９４】
いくつかの実施形態によれば、架橋剤は、三官能性架橋剤、例えば４−アジド‐２− ニトロフェニルビオシチン−４−ニトロフェニルエステル、スルホスクシンイミジル‐２−［６−ビオチンアミド] −２−（ｐ−アイドベンズアミド）ヘキサノアミド]エチル−１,３'−ジチオ（スルホ−ＳＢＥＤ）、又はそれらの組み合わせである。
【０１９５】
別の実施形態によれば、架橋剤は酵素である。本発明の１つの実施形態によれば、架橋剤は、トランスグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ポリメラーゼ又はリガーゼ、又はそれらの組み合わせを含む。
【０１９６】
活性のための使用される架橋剤の濃度の選択は、当業者により理解されるように、所定の用途において選択される、体積、剤及びポリマーの関数として変化するであろう。
【０１９７】
１つの実施形態によれば、本発明のポリマーコーティングと、本発明のサンゴとの会合は、物理的及び／又は機会的会合を含む。例えば、１つの実施形態によれば、物理的及び／又は機械的会合は、本明細書に記載されるように、サンゴとポリマーコーティングとの間の物理的会合を促進するために、任意の手段の吸収、空気乾燥、架橋剤の使用、熱の適用、真空の適用、凍結乾燥法の適用、凍結、機械的力の適用、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるように、ポリマーの選択、又は固体基材へのポリマーの適用は、流体摂取を高める追加の能力のために選択され得る。同様に、固体基材の表面は、その内部への流体摂取を高めるために処理され得る。いくつかの実施形態によれば、そのような表面処理は、固体基材への血漿の適用を含むことできる。
【０１９９】
本発明の固体基材及びその成分へのポリマー適用の物理的及び／又は化学的性質が、軟骨及び／又は骨修復を誘発するか又は増強するために、本発明の使用方法及びそのキットに影響を及ぼすことができることは当業者に明白であろう。
【０２００】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーは、２．０μｍ〜０．１μｍの厚さを有する。１つの実施形態によれば、ポリマーコーティングは、約１．０μｍの厚さを有する。１つの実施形態によれば、本発明のポリマーコーティングは、１０μｍ〜５０μｍの厚さを有する。１つの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーコーティングは、約１０〜２５、又は約１５〜３０、又は約２５〜５０μｍの厚さを有する。１つの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーコーティングは、約０．０００１〜０．１μｍの厚さを有する。１つの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーコーティングは、約２０〜２００μｍの厚さを有する。１つの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーコーティングは、約１００〜１５００μｍの厚さを有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーは、本発明の固体基材と会合し、そして上記のような厚さを有する薄いコーティングである。
【０２０２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーは、本発明の固体基材全体に適用され、結果的に、いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材内の孔及びボンドは、本明細書に記載のようなポリマーにより満たされ、そして適用されるようなポリマー層は、役６０〜９００μｍの厚さを有する。
【０２０３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーは、本発明の固体基材上に追加のポリマー相を形成するコーティングの末端又は一部である。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、適用されるようなポリマー層は、約０．０１〜１０ｍｍの厚さを有するであろう。
【０２０４】
いくつかの実施形態によれば、ポリマー添加剤を含む複数の固体基材は、所望する移植部位中に移植され、ここで第１の固体基材に適用されるポリマーの厚さは、所望する部位に移植される第２固体基材に適用されるようなポリマーの厚さ比較して、変化することができる。そのような厚さの変動は、本明細書に記載される範囲に影響を及ぼすことができる。
【０２０５】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材に適用されるようなポリマーの厚さは、本発明の固体基材の物理的特性に影響を及ぼす。例えば、ポリマー適用の厚さは、本発明の固体基材の弾力性、付着性又は保持性、又はそれらの任意の組み合わせに影響を及ぼす。１つの実施形態によれば、ポリマー適用は、本発明の固体基材の弾力性を高める。１つの実施形態によれば、ポリマー適用は、本発明の固体基材の引張り強度を高める。１つの実施形態によれば、ポリマー適用する付着性は、間葉系幹細胞、血管、軟骨修復を含む所望する修復の部位での組織、軟骨組織、又は骨組織、又はそれらの組み合わせの付着に関する。１つの実施形態によれば、ポリマー適用は、本発明の固体基材の付着性を低める。１つの実施形態によれば、ポリマー適用は、本発明の固体基材の付着性を高める。当業者は、ポリマー手共がアイテム（ｉｔｅｍ）についての付着性を高めるが、ところが、別のアイテムについては低めることを認識するであろう。例えば、１つの実施形態によれば、ポリマー適用は、間葉系幹細胞についての付着性を高め、そして感染剤の付着性を低める。１つの実施形態によれば、ポリマー適用の保持性は、細胞集団の保持に関する。１つの実施形態によれば、ポリマーコーティング内に保持される細胞集団は、間葉系幹細胞集団、軟骨細胞集団、骨芽細胞集団、等である。１つの実施形態によれば、ポリマー適用の保持性は、エフェクター化合物の保持に関する。
【０２０６】
１つの実施形態によれば、ポリマー適用の厚さは、本発明の固体基材に適用される細胞の増殖及び／又は分化に影響を及ぼし、又は本発明の基材への細胞又は組織の増殖／機能回復に関連する細胞の活性化又は移動、又はそれらの組み合わせに影響を及ぼす。
【０２０７】
本発明の固体基材内への生体適合性ポリマー、例えばヒアルロン酸の組込みは、任意の手段、例えば、いくつかの実施形態によれば、圧力駆動型適用を介して、例えば真空、遠心力又は機械的圧力下での適用を介して達成され得る。いくつかの実施形態によれば、重力は、インプラントの所望する深さへのヒアルロン酸の適切な及び比較的均一の浸透を可能にするのに十分である。この側面によれば、１つの実施形態によれば、Fast Green／Safranin Oによる染色を用いてのインプラントの目視検査は、時間の関数及び適用の条件として所望する深まで基材を通してのヒアルロン酸の均一な分布を示す。
【０２０８】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材はさらに、いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材と直接的に会合され得るか、又はいくつかの実施形態によれば、ポリマーと会合され、そしてそれに関連して適用され得るエフェクター化合物を含むことができる。
【０２０９】
１つの実施形態によれば、そのようなエフェクター化合物は、銀イオン、銅イオン又は他の金属、又はそれらの組み合わせを含むことができる。別の実施形態によれば、この化合物の放出は、電荷の適用により促進され得る。
【０２１０】
別の実施形態によれば、第１インプラントが金属、例えば銀により被覆され、そして第２インプラントが第２金属、例えば金により被覆され得る。電場の適用又は電池による作動が移植された材料間での電荷の流れを引起し、そして銀イオン放電のためにその領域の殺菌を導く。そのような移植は、骨髄炎の治療に有用である。
【０２１１】
１つの実施形態によれば、エフェクター化合物は、本明細書に記載されるように、本発明の固体基材に組込むのに使用するための本発明のキットの成分を含む。
【０２１２】
本発明の１つの実施形態によれば、エフェクター化合物は、サイトカイン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、成長因子、キレート剤、細胞集団、治療用化合物又は抗生物質、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。
【０２１３】
本発明の１つの実施形態によれば、用語「治療用化合物」（therapeutic compound）とは、ペプチド、タンパク質又は核酸、又はそれらの組み合わせを言及する。別の実施形態によれば、治療用化合物、抗菌、抗ウィルス、抗真菌又は抗寄生虫化合物である。別の実施形態によれば、治療用化合物は、細胞毒性又は抗癌活性を有する。別の実施形態によれば、治療用化合物は、酵素、受容体、チャネルタンパク質、ホルモン、サイトカイン又は成長因子である。別の実施形態によれば、治療用化合物は、免疫刺激性である。別の実施形態によれば、治療用化合物は、炎症又は免疫応答を阻害する。１つの実施形態によれば、治療用化合物は、血管新生促進因子を含む。
【０２１４】
１つの実施形態によれば、エフェクター化合物は、抗蠕虫剤、抗ヒスタミン剤、免疫調節、抗凝固剤、界面活性剤、抗体、β-アドレナリン受容体阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、ACE阻害剤、成長因子、ホルモン、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はベクター、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む。
【０２１５】
１つの実施形態によれば、用語「エフェクター化合物」（effector compound）とは、本発明の固体基材、キット及び／又は方法に適用される場合、感染、疾患、傷害又は病状の治療、予防、阻害、抑制、遅延、又は発生率の低減において有用である、特定の目的又は用途を有する任意の剤又は化合物を意味する。１つの実施形態によれば、本発明のエフェクター化合物は、化合物をイメージングする能力を除外する所望の効果を生成するであろう。いくつかの実施形態によれば、エフェクター化合物は、その化合物が存在する部位のイメージングにおいて有用であるが、しかしながら、そのような能力は化合物の使用目的又は選択の補助的なものである。
【０２１６】
本発明の１つの実施形態によれば、用語「エフェクター化合物」（effector compound）とは、未明細書において言及される場合、用語「薬物」（drug）及び「剤」（agent）を含むことが理解されるべきであり、そして本発明の固体基材及び／又はキット内に組み込まれるか、又はその使用が所望される分子を表す。１つの実施形態によれば、剤は、本発明の固体基材及び／又はキット内に直接、組み込まれる。別の実施形態によれば、剤は、本発明のポリマーコーティング、サンゴ又はサンゴ粒子、及び／又は本発明のキットとの物理的相互作用、又はそれらとの会合の何れかにより、本発明の固体基材及び／又はキット内に組み込まれる。
【０２１７】
１つの実施形態によれば、「エフェクター化合物」（effector compound）は、治療用化合物である。
【０２１８】
１つの実施形態によれば、用語「治療用化合物」（therapeutic compound）とは、必要な対象に提供される場合、有益な効果を提供する分子を意味する。いくつかの場合、前記分子は、それが対象においてそのような分子の不在又は低減された存在を置換するよう機能することにおいて、治療的である。１つの実施形態によれば、分子はタンパク質の発現をコードする核酸であり、例えば外来性タンパク質の発現により補足される内因性ヌル変異体の場合、前記分子は存在しない。他の実施形態によれば、内因性タンパク質が変異誘発され、そして異種官能タンパク質の発現により補足される非官能タンパク質を生成する。他の実施形態によれば、異種タンパク質の発現は、低い内因性レベルへの付加性であり、所定のタンパク質の累積増強発現をもたらす。他の実施形態によれば、分子は、細胞又は宿主機能のための重要な要素の発現、又は分泌、又は他のものを提供するシグナル伝達カスケードを刺激する。
【０２１９】
別の実施形態によれば、治療用化合物は、天然または非天然のインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、カルボキシペプチダーゼ、ホルモン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ、オルニチントランス、シトクロムＰ４５０酵素、アデノシンデアミナーゼ、血清胸腺因子、胸腺液性因子、サイモポエチン、成長ホルモン、ソマトメジン、共刺激因子、抗体、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮成長因子、肝赤血球生成因子（ヘマトポエチン）、肝細胞増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、負の増殖因子、線維芽細胞成長因子、αファミリーのトランスフォーミング増殖因子、βファミリーのトランスフォーミング増殖因子、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニン、サブスタンスＰ、転写因子、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０２２０】
本明細書における何れかの実施形態によれば、本発明の方法におけるサンゴ固体基材及びそれらの使用はさらに、次の他の化合物を含むか、又はそれらにより移植され得る：抗酸化剤、成長因子、サイトカイン、抗生物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、防腐剤、鎮痛薬、他の治療薬、及び賦形剤。１つの実施形態によれば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤に加えて投与され得る成長因子の例は、次のものを含むが、但しそれらだけには限定されない：上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子-α（ＴＧＦ−α）、 形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、ヒト内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、軟骨由来の形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、又はそれらの何れかの組み合わせ。抗生物質の例は、抗微生物剤及び抗菌剤を含む。
【０２２１】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材及び／又はキット、及び／又は本発明の方法に使用するためのエフェクター化合物は、中でも、抗体又は抗体フラグメント、ペプチド、オリゴヌクレオチド、生物学的標的に対するリガンド、免疫複合体、化学模倣物官能基、糖脂質、標識剤、酵素、金属イオンキレート、酵素補助因子、細胞毒性化合物、殺菌化合物、静菌性化合物、殺真菌性化合物、静真菌化合物、化学療法剤、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、毒素、プロドラッグ、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、放射性物質、又は標的部分、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。
【０２２２】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材及び／又はキット、及び／又は本発明の方法は、オリゴヌクレオチド、核酸又はベクターを含むか、又は使用する。いくつかの実施形態によれば、用語「オリゴヌクレオチド」（oligonucleotide）は、用語「核酸」（nucleic acid）と交換可能であり、そして次のものを含む分子を言及するが、但しそれらだけには限定されない：原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列。この用語はまた、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知塩基類似物の何れかを含む配列も言及する。
【０２２３】
本発明の固体基材及び／又はキット、及び／又は本発明の方法は、１つの実施形態によれば、核酸を含み、又は別の実施形態によれば、本発明の固体基材及び／又はキット、及び／又は本発明の使用方法は、特定のベクターの一部として、その送達を含むことができる。１つの実施形態によれば、目的の配列をコードするポリヌクレオチドセグメントは、哺乳類細胞を形質導入し／形質転換するために、及び形質導入された細胞内の組換え生成物の発現を指図するために適切な市販の発現ベクターシステムに連結され得る。そのような市販のベクターシステムは、存在するプロモーター又はエンハンサー配列を置換するか、重複するか又は変異誘発するために、及び／又は追加のポリヌクレオチド配列、例えば追加の選択マーカーをコードする配列、又はレポーターヌクレオチドをコードする配列を導入するために、商業的に使用される組換え技法を介して容易に修飾され得ることが理解されるであろう。
【０２２４】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材及び／又はキット、及び／又は本発明の方法に使用するためのエフェクター化合物は、中でも、サイトカイン、骨形成タンパク質（BMP）、成長因子、キレート剤、細胞集団、治療用化合物、抗炎症化合物、血管新生促進化合物又は抗生物質、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
【０２２５】
いくつかの実施形態によれば、本発明のキット及び／又は海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、既知の骨誘導材料、骨セメント、骨ガラス又は骨充填材、又はそれらの何れかの組み合わせを含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態によれば、骨セメントは、既知の任意のセメント、例えばβ−リン酸三カルシウム、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）(Ｃａ（Ｈ2ＰＯ4）2Ｈ2Ｏ)及びそれらの混合物、例えばブルサイトセメントを含む。いくつかの実施形態によれば、セメントは、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）、リン酸二カルシウム二水和物（DCPD）、リン酸二カルシウム無水（ＤＣＰＡ）、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、リン酸二カルシウム（ＤＣＰ）、リン酸四カルシウム（ＴＴＣＰ）、リン酸一カルシウム一水和物（ＭＣＰＭ）、炭酸カルシウム（ＣＣ）、及び他のもの、及びそれらの混合物を含むことができる。
【０２２７】
いくつかの実施形態によれば、本発明のキット及び／又は海洋生物骨格誘導体系の固体基材は、既知の、及びいくつかの実施形態によれば、市販の骨誘導材料、例えば生体活性ガラス、骨セメント成分、例えばβ−ＴＣＰ、ポリ（メチルメタクリレート）を含む。
【０２２８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材は、細胞、細胞集団又は組織により播種され得る。
【０２２９】
いくつかの実施形態によれば、細胞又は組織は、幹細胞又は前駆体細胞、又はそれらの組み合わせを含む。
【０２３０】
本発明の１の実施形態によれば、本発明の基材、使用方法又はキットに従って使用されるような細胞又は組織は、所望する生成物を発現するために操作される。
【０２３１】
１つの実施形態によれば、用語「細胞集団」（a cell population）とは、トランスフェクトされた細胞集団、形質導入された細胞集団、形質転換された細部集団又は対象から単離された細胞集団、又はそれらの組み合わせを言及する。いくつかの実施形態によれば、トランスフェクトされた、形質導入された又は形質転換された細胞は、固体基材上の播種され得、又はいくつかの実施形態によれば、それへのポリマー適用に組み込まれるか、又はそれらの組み合わせを含む。
【０２３２】
１つの実施形態によれば、本発明の細胞集団は、間葉系幹細胞を含む。１つの実施形態によれば、間葉系幹細胞は形質転換される。
【０２３３】
１つの実施形態によれば、細胞集団は、本発明の固体基材の移植が所望される組織の修復において有益な細胞を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態によれば、細胞は、軟骨及び／又は骨形成及び／又は修復の促進において有益である。そのような細胞は、軟骨芽細胞及び軟骨細胞;繊維軟骨細胞;骨細胞;骨芽細胞;破骨細胞;滑膜細胞; 骨髄細胞；ストローマ細胞; 幹細胞;胚性幹細胞；脂肪組織由来前駆細胞; 末梢血前駆細胞；成人組織から単離された幹細胞; 遺伝的に形質転換された細胞；又はそれらの組み合わせを含むことができる。別の実施形態によれば、前駆体細胞は、軟骨細胞と他の細胞の組み合わせ；骨細胞と他の細胞の組み合わせ; 滑膜細胞及び他の細胞の組み合わせ；骨髄細胞と他の細胞の組み合わせ; 間葉細胞と他の細胞の組み合わせ;間質細胞と他の細胞の組み合わせ; 幹細胞及び他の細胞の組み合わせ；胚性幹細胞及び他の細胞の組み合わせ；成体組織から単離された前駆細胞及び他の細胞の組み合わせ；末梢血前駆細胞と他の細胞の組み合わせ; 成体組織から単離された幹細胞及び他の細胞の組み合わせ；及び遺伝的に形質転換された細胞と他の細胞の組み合わせを言及することができる。本発明の方法に使用するための前駆体細胞は、受容体哺乳類（自系）、又は同系哺乳類の器官組織から調製される。別の実施形態によれば、同種及び異種前駆体細胞が利用され得る。
【０２３５】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材は、幹細胞、又は前駆体細胞を組込む。そのような細胞は、哺乳類のドナー、例えば、患者自身の細胞、ドナーからの細胞の培養物、又は確立された細胞培養株から直接得られる。いくつかの実施形態によれば、哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、類人猿、又はヒトである。同じ種及び／又は同じ免疫学的プロフィールの細胞は、患者又は近親者の何れかからの生検により得られる。標準の細胞培養技法及び条件を用いて、細胞は、集密性まで、培養下で増殖され、そして必要な場合、使用される。細胞は、十分な数の細胞が特定の用途のために得られるまで、培養され得る。
【０２３６】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材は、組織修復、例えば軟骨及び／又は骨形成又は修復に関与することができる任意の細胞を組込む。いくつかの実施形態によれば、そのような細胞は、細胞が本発明の固体基材上に細胞を播種するためにエクスビボで培養され、そしてそのような播種された固体基材が対象中に移植されることにおいて、自家移植を表す。
【０２３７】
いくつかの実施形態によれば、そのような細胞は、本発明の固体基材内に組み込まれ、そして修復の部位内に移植され得る、同種移植又は異種移植を表すことができる。
【０２３８】
１つの実施形態によれば、本発明のサンゴは、サンゴにおいて細胞を播種するのに十分な時間の、サンゴのインビトロ培養からの細胞集団を含む。１つの実施形態によれば、細胞集団は、間葉系幹細胞集団；軟骨細胞。繊維軟骨細胞;骨細胞;骨芽細胞;破骨細胞;滑膜細胞; 骨髄細胞；ストローマ細胞; 幹細胞;胚性幹細胞；脂肪組織由来前駆細胞；末梢血前駆細胞；成人組織から単離された幹細胞; 遺伝的に形質転換された細胞；又はそれらの組み合わせである。１つの実施形態によれば、間葉系幹細胞；軟骨細胞;繊維軟骨細胞;骨細胞;骨芽細胞;破骨細胞;滑膜細胞;骨髄細胞；ストローマ細胞; 幹細胞;胚性幹細胞；脂肪組織由来前駆細胞; 末梢血前駆細胞；成人組織から単離された幹細胞; 遺伝的に形質転換された細胞；インビトロで播種されたそれらの組み合わせが形質転換される。１つの実施形態によれば、細胞集団は、軟骨修復のために有益な細胞集団を含む。１つの実施形態によれば、培養物はキレート剤を含む。本発明の１つの実施形態によれば、培養物におけるキレート剤は、カルシウムキレート剤を含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態によれば、固体基材はさらに、骨代替材又は骨空隙充填材として機能することができる。いくつかの実施形態によれば、固体基材はさらに、骨代替材又は骨空隙充填材を組込むことができる。いくつかの実施形態によれば、そのような骨含有材料は、自己又は同種異系骨を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、骨含有材料は、動物骨を含むことができる。
【０２４０】
本明細書に例示されるように、記載されるような血液、水及び他の親水性流体は、サンゴサンプルに適用され、そしてサンゴサンプル内への流体の吸収が評価された。
【０２４１】
図１は、評価されるサンプルに依存して、それぞれ、流体の摂取パターン、実質的摂取及び部分的、最小限摂取又は無摂取を示す、記載のようにして行われた代表的吸収研究の結果を示す。吸収パターンのこの変動は驚くべきことには、移植に続いて、細胞及び組織の増殖及び／又は機能回復において最適化された有効性を有する固体基材の選択手段を提供した。
【０２４２】
本明細書に提供されるような実施例２は、最小流体摂取を有したサンゴ固体基材に比較して、移植されたサンゴ固体基材内への生物学的流体の実質的な摂取と、驚くべき卓越した態様での移植部位での続く治癒との間の相関関係を示す。
【０２４３】
実施例３に提供される、細胞又は組織の増殖を促進するためのそのような最適化されたサンゴ系の固体基材を選択するたに確立されたスクリーニングプロトコルの開発がまた、例示される。
【０２４４】
実施例５は、上述のように、特異的流体摂取容量値により提供される選択手段と同程度の選択手段であるものとして、流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有する生物骨格誘導体系の固体基材の特性評価のためのサポートを提供する。
【０２４５】
本発明は、細胞及び組織の増殖及び／又は機能回復において有用である、最適に選択されたサンゴ系の固体基材の予想外の適用を提供し、そして軟骨及び骨修復及び形成の増強のためへの特定の適用が本明細書に例示されている。
【０２４６】
特に、本発明は、骨再生、（任意には、骨統合、骨伝導及び骨伝達を伴う）修復及び形成の増強が、固体基材が、全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立することにより決定された、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そしてそのような基材が骨修復のための部位内に挿入される場合、最適である予想外の適用を提供する。
【０２４７】
特に、本発明は、骨再生、修復及び形成の増強が、固体基材が、流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられ、そしてそのような基材が骨修復のための部位内に挿入される場合、最適である予想外の適用を提供する。
【０２４８】
他の実施形態によれば、本発明は、固体基材が、全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立することにより決定された、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられ、そしてそのような基材が軟骨欠損部位内に挿入される場合、高い軟骨形成の観点から、予想外の利点を提供する。
【０２４９】
他の実施形態によれば、本発明は、固体基材が、流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有することにより特徴づけられ、そしてそのような基材が軟骨欠損部位内に挿入される場合、高い軟骨形成の観点から、予想外の利点を提供する。
【０２５０】
本発明はまた、いくつかの実施形態によれば、細胞及び組織の増殖及び／又は機能回復において有用である、最適に選択されたサンゴ系の固体基材の予想外の適用も提供し、そして軟骨及び骨修復及び形成の増強についての特定の適用が本明細書に例示される。
【０２５１】
特に、本発明は、任意には、骨統合、骨伝導及び骨伝達を伴っての、骨再生、修復及び形成の増強が、固体基材が、走査型電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡又はＸＲＤ分析により測定される場合、実質的に表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられ、そしてそのよう基材が骨修復のための部位内に挿入される場合、最適である予想外の適用を提供する。
【０２５２】
他の実施形態によれば、本発明は、固体基材が、走査型電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡又はＸＲＤ分析により測定される場合、実質的に表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられ、そしてそのよう基材が軟骨欠損部位内に挿入される場合、高い軟骨形成の観点から、予想外の利点を提供する。
【０２５３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材は、修復の必要な骨欠損を有する対象への使用のために適用され得、ここで骨欠損へのアクセスが上層軟骨における欠損の創造をもたらし、そして本発明の固体基材が影響される骨、又は骨又は軟骨組織の治療を可能にする。
【０２５４】
他の実施形態によれば、そのような固体基材は、修復の必要な軟骨欠損を有する対象に投与され得、ここで軟骨修復の刺激のためへの固体基材の最適な挿入は、例えば固体基材の挿入のために下層の骨にボイドを創造することにより、その下層の骨に足場の固定を必要とし、そして挿入されると、固体基材は、下層の軟骨及び下層の骨の両修復を促進する。
【０２５５】
他の実施形態によれば、そのような固体基材は、骨軟骨欠損を有する対象に投与され得、ここで骨及び軟骨組織は、障害の病因の一部として修復を必要とする。この側面の固体基材は、いくつかの実施形態によれば、そのような用途のために特に適切である。
【０２５６】
特に骨治療に関連する用途は、本明細書に記載されるような任意の追加の要素、例えば骨同種移植片、骨自家移植片、骨代用物、既知の骨空隙充填材、治療用化合物、及び同様のものを組込む固体基材の使用を含むことは、当業者に理解されるであろう。
【０２５７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材は、例えば骨及び／又は軟骨修復を促進することにより、細胞及び／又は組織の増殖、及び／又は機能回復を刺激するために、他の既知の及び／又は利用できる材料と組合して使用され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材は、全体の関節修復又は靱帯修復、又は他の結合組織修復への使用のために、追加の固体基材を固定するために利用され得る。
【０２５９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の固体基材は、骨修復又は再生、等のために他の足場と組合して、ピンとして使用され得る。細胞又は組織の増殖又は機能回復の処置、修復、又は刺激のために、単独で、又は他の適切な材料と組合しての本発明の固体基材の任意の使用が、本発明の一部として見なされるべきであることは理解されるべきである。
【０２６０】
本発明の固体基材は、本発明の方法に従って、その適用に適応するよう任意の適切な形状又はサイズのものであり得ることが理解されるであろう。例えば、及びいくつかの実施形態によれば、対象の長骨内での本発明の固体基材の適用に関しては、その固体基材の寸法は、足場が移植され得る部位のその寸法に近似するよう調整され、そして必要に応じて、ミリメートル〜センチメートルの大きさの程度であり得る。同様に、本発明の固体基材の形状は、本発明の固体基材が機械加工されるか、又は処理され得る任意の形状であり得、そして細胞及び／又は組織の増殖、及び機能回復のための所望する適用を実現するために適切であるよう任意の構成を有することができる。
【０２６１】
１つの実施形態によれば、サンゴは、増殖されるべき組織の形状に成形される。例えば、サンゴは、軟骨組織の一部として、例えば膝及び肘のためのメニスカスとして；推骨、背骨適用、頭蓋骨、板、関節；骨、肋骨、腰、骨盤、耳、鼻、靭帯、気管支及び椎間板の関節面として成形され得る。
【０２６２】
本発明は、いくつかの実施形態によれば、物理的外傷に関連する軟骨及び／又は骨組織欠損、又は対象における疾患又は障害に関連する軟骨及び／又は骨組織欠損の修復への使用のためのサンゴ固体基材を提供する。
【０２６３】
１つの実施形態によれば、サンゴ固体基材は、軟骨及び／又は骨修復の方法への使用の前、形状化される。１つの実施形態によれば、サンゴ固体基材は、軟骨及び／又は骨修復の方法と同時に形状化され、例えばサンゴ基材は、修復の部位が最良に観察され得る場合、手術の間、形状化され、従って、使用されるサンゴ固体基材の形状が最適化される。
【０２６４】
いくつかの実施形態によれば、複数のサンゴ固体基材が、欠損部位を最大に占有するよう挿入され、結果的に、各サンゴ固体基材が、所望する移植部位内の所望する領域中への適切な挿入に対応するよう、異なった角度、及び／又は形状、及び／又は深さ、及び／又は多孔度で挿入され得る。角度又は位置決定への参照は、特定の移植部位に挿入される１又は２以上のサンゴ固体基材に関してであり得ることは理解されるべきである。
【０２６５】
１つの実施形態によれば、用語「軟骨修復」（cartilage repair）とは、軟骨欠損を、より健康な状態に復元することを意味する。１つの実施形態によれば、軟骨の復元は、軟骨組織の再生をもたらす。１つの実施形態によれば、軟骨の復元は、完全な又は部分的な厚さの関節軟骨欠損の再生をもたらす。１つの実施形態によれば、軟骨の復元は、軟骨修復の部位での軟骨組織の完全な又は部分的再生をもたらす。１つの実施形態によれば、軟骨修復は、欠落又は欠損骨組織の復元／修復をもたらし、ここで軟骨欠損の修復は、軟骨修復の部位での骨組織の除去を必要とする。１つの実施形態によれば、軟骨復元は、軟骨骨欠損の再生をもたらす。１つの実施形態によれば、軟骨修復は、関節（例えば、膝、肘、腰、肩関節）、耳、鼻又は喉笛の軟骨欠損の復元を含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態によれば、「軟骨修復」（cartilage repair）とは、変形性関節症の治療、予防又は改善、又は変形性関節症の症状の抑制、又は変形性関節症の病因及び軟骨における変性変化の改善又は抑制を意味する。
【０２６７】
１つの実施形態によれば、用語「骨修復」（bone repair）とは、骨欠損のより健康な状態への復元を意味する。１つの実施形態によれば、骨復元は、骨組織の再生をもたらす。１つの実施形態によれば、骨復元は、骨組織内の任意の骨折及びボイドの充填をもたらす。１つの実施形態によれば、骨復元は、骨修復の部位での骨組織の完全な又は部分的再生をもたらす。１つの実施形態によれば、骨修復は、欠落又は欠損骨組織の復元／修復をもたらすことができる。１つの実施形態によれば、骨修復は、必要な場合、任意の骨の骨欠損の復元、骨の浮腫の治療、及び他の骨障害の治療を含む。
【０２６８】
いくつかの実施形態によれば、用語「骨修復」（bone repair）とは、骨粗鬆症、パジェット病、線維性骨異形成、骨の浮腫又は骨ジストロフィーを有する対象の治療を意味する。別の実施形態によれば、対象は、骨及び／又は軟骨虚弱を有する。別の実施形態によれば、対象は、他の骨リモデリング傷害、例えば骨軟化症、くる病、関節リウマチ、軟骨形成不全症、骨軟骨炎、副甲状腺機能亢進症、骨形成不全症、先天性低ホスファターゼ血症、線維腫の病変、多発性骨髄腫、異常な骨代謝回転、溶骨性骨疾患、歯周病、又はそれらの組み合わせを有する。１つの実施形態によれば、骨リモデリング障害は、有機マトリックスの乱れ、代謝性骨疾患、骨石灰化、骨リモデリング、骨格及びミネラル恒常性を調節する内分泌、栄養及び他の因子、又はそれらの組み合わせにより特徴づけられる代謝性骨疾患を含む。そのような傷害は、遺伝性又は後天性であり得、そして１つの実施形態によれば、全身性であり、そして骨格系全体に影響を及ぼす。
【０２６９】
いくつかの実施形態によれば、用語「骨修復」（bone repair）とは、骨軟骨欠損、骨嚢胞、腫瘍、虚血壊死及び他の関連する疾患又は状態の治療、予防又は改善、又はそれらの症状の抑制、又はそれらの病因の改善又は抑制を意味する。
【０２７０】
本発明の固体基材、キット及び方法はまた、骨及び／又は軟骨欠損が骨リモデリング障害以外の要因により引起される条件下で骨及び／又は軟骨形成を増強するために使用され得る。そのような骨欠損は、骨折、骨外傷、外傷後骨の手術、後人工関節手術、後プラスチック製の骨の手術、骨の化学療法、後歯科手術及び骨放射線療法に関連する状態を含む。骨折は、微視的及び巨視的な骨折のすべてのタイプを含む。１つの実施形態によれば、骨折のいくつかの例は、裂離骨折、粉砕骨折、横骨折、斜骨折、らせん状骨折、分節骨折、変位骨折、影響を受け骨折、若木骨折、トーラス骨折、疲労骨折、関節内骨折（骨端骨折）、閉鎖骨折（単純骨折）、開放骨折（複雑骨折）及びオカルト骨折を含む。１つの実施形態によれば、本発明の方法を用いて治療されることを意図する骨折は、非癒合骨折である。
【０２７１】
１つの実施形態によれば、本発明の方法は、軟骨及び／又は骨欠損又は障害又は疾患の誘発された又は増強された修復のために使用される。１つの実施形態によれば、軟骨欠損は、外傷、断裂、スポーツ傷害、全層関節軟骨損、関節欠損又は反復ストレス障害（例えば、骨軟骨骨折、十字靱帯損傷に起因する二次的損傷）に起因する。１つの実施形態によれば、軟骨障害は、軟骨の疾患を含む。１つの実施形態によれば、本発明の方法は、変形性関節症、関節リウマチ、無菌壊死、離断性骨軟骨症、関節軟骨損傷、軟骨軟化膝蓋骨、軟骨肉腫、軟骨肉腫-頭頸部、肋軟骨炎、内軟骨腫、強直母趾、股関節唇の断裂、離断性骨軟骨症、引き裂かれた半月板、再発性多発性軟骨炎、イヌ関節炎、第四鰓弓欠陥及びカリフラワー耳における軟骨修復を誘発するか又は増強する。１つの実施形態によれば、本発明の方法は、筋肉、嚢（滑膜）、腱、靭帯、及び線維組織を含む関節又は関連する構造のみならず、また成長板、半月板システム、及び椎間板を含む、身体の結合組織の変性又は代謝異常により、少なくとも部分的に特徴づけられる傷害を含む変性軟骨障害において軟骨修復を誘発するか又は増強する。
【０２７２】
１つの実施形態によれば、本発明の固体基材、キット及び方法はまた、長骨の骨折修復を増強し；分節欠損において骨を生成し；骨折のための骨代替材を提供し；腫瘍の再構築及び脊椎融合を促進し；股関節、脊椎、又は手首の骨粗鬆症における弱いか又は骨粗鬆症の骨のために（注射による）局所治療を提供し、又はそれらの組み合わせを行うためにも使用され得る。別の実施形態によれば、本発明の固体基材、キット及び方法はまた、骨折した長骨の修復を加速させ；長骨骨折の遅延された融合又は非融合、又は脊椎融合の偽関節を治療するか、又はそれらの組み合わせを行うための方法にも使用され得る。
【０２７３】
１つの実施形態によれば、本発明の方法は、軟骨及び／又は骨組織修復の部位を試験することにより評価され、ここで評価は、組織学、組織化学、触診、生検、内視鏡検査、関節鏡検査、イメージング技法（Ｘ線写真、コンピュータ化されたX線デンシトメトリー、コンピュータ化された蛍光デンシトメトリー、ＣＴ、ＭＲＩ、又は当業界において知られている別の方法、又はそれらの任意の組み合わせを含む）によるものである。
【０２７４】
１つの実施形態によれば、本発明の方法は、軟骨及び／又は骨修復を誘発し、そして増強することを包含し、ここで軟骨及び／又は骨修復の部位内への本発明の固体基材の移植が、軟骨及び／又は骨修復に影響を及ぼし、そして改善する。
【０２７５】
１つの実施形態によれば、本発明の方法は、軟骨及び／又は骨修復を誘発し、そして増強し、ここで固体基材は、その固体基材に細胞集団を引き付け、それにより、軟骨及び／又は骨修復に影響を及ぼすか、又は改善する。
【０２７６】
当熟練した臨床医は、軟骨及び／又は骨修復の部位内へのサンゴ固体基材の移植を含む、本発明の方法が、軟骨及び／又は骨修復の部位の調製を必要とするかも知れないことを認識するであろう。それらの調製は、サンゴ固体基材の移植の前、又は移植と同時に生じることができる。例えば、軟骨及び／又は骨修復の部位に近接した、軟骨及び／又は骨組織及び／又は他の組織がまず、穿孔され、本発明の方法に使用されるサンゴ固体基材のために適切な寸法のチャネルが創造され得る。次に、サンゴ固体基材が前記部位内に移植され、結果的に、サンゴ固体基材領域が前記穿孔された軟骨及び／又は骨組織に貫通する。他方では、サンゴ固体基材が軟骨及び／又は骨、又は他の組織、又はそれらの組み合わせを通して貫通できるツールに取り付けられ得る。この場合、ツールが軟骨及び／又は骨組織を通して貫通するにつれて、取り付けられたサンゴ固体基材が同時に移植される。
【０２７７】
いくつかの実施形態によれば、修復部位内へのサンゴ固体基材、又は修復部位内へのいくつかのサンゴ固体基材の移植に続いて、産後固体基材は、組込み及び最適な軟骨及び／又は骨修復を最適化するために処理される。いくつかの実施形態によれば、そのような処理は、最適な修復のために、サンゴ固体基材又はサンゴ固体基材類の表面を切断し、研磨するか、又は他方では、平滑化することを含むことができる。
【０２７８】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に定義されるような固体基材は、全流体摂取値により割算された自発的流体摂取値を確立することにより、決定される、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられるであろう。
【０２７９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に定義されるような固体基材は、流体と接触するときに６０°未満の接触角値を有するものとして特徴づけられるであろう。
【０２８０】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に定義されるような固体基材は、走査型電子顕微鏡により評価される場合、図８Ｄ−８Ｆで明らかな構造により特徴づけられるであろう。
【０２８１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に定義されるような固体基材は、原子間力顕微鏡により評価される場合、図９Ｄ−９Ｆで明らかな構造により特徴づけられるであろう。
【０２８２】
いくつかの実施形態によれば、固体基材は、
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料を単離し；
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料の特異的流体摂取容量値を確立し、ここで、前記特異的流体摂取容量値は、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され；そして
・少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択することを含んで成る方法により調製され、又はいくつかの実施形態によれば、固体基材は、
・生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・前記生物骨格誘導体系の固体材料と、流体とを接触し、そして前記生物骨格誘導体についての接触角を確立し；そして
・６０°未満の接触角により特徴づけられる生物骨格誘導体系の固体材料を選択することを含んで成る方法により調製され；又はいくつかの実施形態によれば、そのような海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、走査型電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡により測定される場合、実質的に表面粗さ（Ｒａ）により特徴づけられるであろう。
【０２８３】
いくつかの実施形態によれば、本発明はサブ最適化され海洋生物骨格誘導体を、細胞又は組織の増殖又は機能回復を提供する海洋生物骨格誘導体に転換するための方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本発明は、増強された細胞又は組織の増殖又は機能回復を提供する海洋生物骨格誘導体を最適化するための方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、及びこの側面によれば、ヒト又は動物適用において、哺乳類組織内移植と適合できる形であるよう、そのような海洋生物骨格誘導体の初期単離及び処理は、特異的流体摂取容量値を減じることができ、そして本発明の最適化方法は、そのような値の改善を促進する。
【０２８４】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、本発明に従っての使用のための海洋生物骨格誘導体のそのような単離及び処理は、次亜塩素酢酸ナトリウム及び過酸化水素の溶液への暴露を含む。この側面によれば、それは、第１の洗浄／処理プロトコルの一部として、次亜塩素酸ナトリウムによりサンゴ／アラゴナイトサンプルを処理するための標準的な実施である［例えば、米国特許番号ＵＳ５４３３７５１号を参照のこと］。
【０２８５】
種々のグループがヒト対象における治療用途へのサンゴ系の材料の使用を提案して来たが、現在まで、所定の種のすべてのサンゴサンプルが治療効果を提供する徴候は何も示されていない。
【０２８６】
驚くべきことには、その治療用途に影響を及ぼす、サンゴの物理的特性に変動性が存在し、そしてさらに、特定の標準的処理工程がサンゴ系の材料の治療能力に負の影響を及ぼすことが現在、見出された。
【０２８７】
治療活性が、特定の処理工程の適用、例えば本発明のサンゴ系の材料の処理工程の一部としてサンプルへのエタノールの選択的適用により復元され、そして／又は改善され得る発見は、さらに驚くべきことである。
【０２８８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために準最適な海洋生物骨格誘導体基材の固体材料を、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材に転換するための方法を提供し、ここで前記方法は、
ａ)海洋生物骨格誘導体系の固体材料グループの特異的流体摂取容量値を確立し、ここで、前記特異的流体摂取容量値は、前記グループにおける各サンプルについて、全流体摂取値により割り算された自発的流体摂取値を確立することにより決定され； 
ｂ)特異的流体摂取容量値により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択し；
ｃ)（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と、両親媒性物質、極性溶媒、カチオン性物質、アニオン性物質、又はそれらの組み合わせとを接触し；
ｄ)（ｃ）で得られた前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料において（ａ）におけるような特異的流体摂取容量を決定し；そして
ｅ)新しく確立された、高められた特異的流体摂取容量値を有する、（ｄ）で得られた海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【０２８９】
いくつかの実施形態によれば、高められた特異的流体摂取容量値は、少なくとも３％高められる。いくつかの実施形態によれば、高められた特異的流体摂取容量値は、少なくとも５％高められる。いくつかの実施形態によれば、高められた特異的流体摂取容量値は、少なくとも４．５％高められる。いくつかの実施形態によれば、高められた特異的流体摂取容量値は、少なくとも３％〜１５％高められる。
【０２９０】
この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、そのような海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、７５％〜９５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。
【０２９１】
いくつかの実施形態によれば、高められた特異的流体摂取容量値は、少なくとも１０〜１５％、高められる。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、そのような海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、４５％〜７０％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。
【０２９２】
いくつかの実施形態によれば、高められた特異的流体摂取容量値は、少なくとも２０〜３５％高められる。この側面によれば、及びいくつかの実施形態によれば、そのような海洋生物骨格誘導体系の固体材料は、１％〜４０％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる。
【０２９３】
いくつかの実施形態によれば、両親媒性材料は、洗剤又は海面活性剤である。いくつかの実施形態によれば、両親媒性材料は、Tween, 又は例えばポリオキシプロピンの２つの親水性鎖を端に有するポリオキシプロピレン（ポリ（酸化プロピレン））の中心疎水性鎖から構成される非イオン性コポリマーである。
【０２９４】
いくつかの実施形態によれば、極性溶媒は、アルコール、例えばエタノール、メタノール、アセトン、イソプロパノール及び他のものである。
【０２９５】
いくつかの実施形態によれば、極性媒体は、トルエン、ヘキサン、キシレン及び他のものである。
【０２９６】
いくつかの実施形態によれば、前記方法はさらに、（ｃ）に列挙される材料と基材との接触に続いて、又は接触の前、（ｂ）の前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に二次洗浄方法を適用する工程を含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態によれば、二次洗浄方法は、圧力、熱、音波処理、エタノール、有機溶媒、塩緩衝液、例えばリン酸緩衝液、蒸気処理又はそれらの組み合わせの適用を含む。
【０２９８】
いくつかの実施形態によれば、前記二次洗浄方法は、有機溶媒による処理を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次洗浄方法は、酵素処理、例えばパパイン、トリプシン又はコンドロイチナーゼＡＢＣの使用を含むが、但しそれらだけには限定されない。いくつかの実施形態によれば、二次洗浄方法は、音波処理、加熱、凍結乾燥、高圧適用、高圧下での浸漬、及び同様の手段を含む。
【０２９９】
別の実施形態によれば、本発明は、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するために最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材の選択方法を提供し、ここで前記方法は、
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料を単離するか又は調製し；
・海洋生物骨格誘導体系の固体材料上に実質的に粗い表面の存在を確立する工程、ここで、前記実質的に粗い表面は電子顕微鏡又は原子間力顕微鏡を走査することにより決定される；及び
・前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料上での実施的に粗い表面の存在の決定により特徴づけられる海洋生物骨格誘導体系の固体材料を選択すること
を含んで成る。
【０３００】
いくつかの実施形態によれば、及びこの側面によれば、前記方法はさらに、前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料と、流体とを接触し、そして前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料に、負圧を適用し、前記全流体摂取値に到達するよう前記海洋生物骨格誘導体系の固体材料内の前記流体の最大摂取を促進せしめる工程を含む。
【０３０１】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載されるような任意の側面の方法により生成される固体基材を提供する。
【０３０２】
種々の修飾及び変形が、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、本発明の固定基材、キット、工程及び方法において行われ得ることは、当業者に明らかであろう。
【０３０３】
１つの実施形態によれば、本発明は組み合わされた調製を提供する。１つの実施形態によれば、用語「組み合わされた調製」（a combined preparation）とは、上記で定義されたような組み合わせパートナーが独立して、又は異なった組み合わせで、すなわち同時に、一斉に、別々に又は連続して、使用され得るという意味で、特に「キット−オブ−パーツ」（kit of parts）を定義する。
【実施例】
【０３０４】
実施例１：本発明のサンゴ系の固体基材における物性変動
材料及び方法
ダイヤモンドディスクソーを用いて、サンゴ外層を除き、そして所望する寸法の代表的な小さなセクションを、サンゴブロックから切断した。
【０３０５】
１００−１５０μｍの平均孔サイズを有するヒドロサンゴ  ポリテス・ルテア（Porites lutea）からのサンゴを、サンゴ内の種々の領域から収穫した。サンゴを、その外観、密度及び多孔度について可視的に評価した。次に、サンゴを任意には、外部有機組織の除去のために５％次亜塩素酸ナトリウムに浸漬した。手短には、サンゴをまず、５％次亜塩素酸ナトリウム溶液に３０分間、暴露し、ＲＴ−５０℃の温度、及び０．２〜０．００００１バールの範囲の真空圧を用いてのサブ大気圧下で３度、交換した。次に、サンゴセクションを、ＲＴ−５０℃の温度範囲、及び０．２〜０．００００１バールの範囲の真空圧を用いてのサブ大気圧下で１５分間、過酸化水素の１０％溶液に暴露した。次に、洗浄されたセクションを、蒸留水により３０分間、洗浄し、ＲＴ−５０℃の温度範囲、及び０．３−０．００００１バールの範囲の真空圧を用いてのサブ大気圧下で、３度、交換した。
【０３０６】
サンゴを任意には、少なくとも２２．５ｋＧｙの強度でガンマ放射線への暴露により殺菌し、そして次に、包装材料に無菌的に保存し、そして特に、より小さなサンプルを照射し、そして評価されたより大きなブロックは照射されなかった。
【０３０７】
次に、各セクションを、プラスチックペトリ皿に置き、そして２ｍｌの流体を各皿に適用した。流体の吸収についての観察を記録した。使用される流体は、動物血液、血漿、水、及び種々の着色された溶液を包含した。
【０３０８】
結果
種々の領域からのサンプル除去が、それらの物理的特徴において変化する材料を提供するかどうか、及びそのような変動がそのような特徴に他の性質を提供するかどうかを決定するために、血液及び他の列挙される流体を、サンゴサンプルに適用し、そしてサンゴサンプル内の流体の吸収を評価した。
【０３０９】
図１は、記載のようにして行われた代表的吸収研究の結果を示す。サンゴサンプルを、サンゴブロックの異なった領域から単離し、そしてそれに適用された血液の吸収のそれらのパターン及び強度について評価した。驚くべきことには、吸収プロフィールの点で全く均一性はないように見え、そしてその同じことは、「全が無」（all or none）現象ではない。
【０３１０】
例えば、図１Ａは、構造全体にわたって合理的に実質的な吸収性を示し、ところが図１Ｃは、全体にわたって不良吸収〜無吸収を示し、そして図１Ｂは、いくつかの領域が流体を実質的に吸収し、そしていくつかの領域が流体の最少〜無吸収を示すことにおいて、構造内に暫定的な現象を提供する。図１Ｄ−１Ｆは、サンゴプラグが切断され、そして調製されたサンゴ片の断面スライスを示し、同様に、マクロ構造内の吸収の異なったパターンを提供する。
【０３１１】
他の流体を、図１Ｃにおけるサンプルに匹敵する並列サンプル内でのそれらの吸収の観点から評価した。染色として機能するよう、塩溶液、炭水化物溶液及びイオン溶液を、調製し、そして適用し、そして結果は、不良吸収〜無吸収が図１Ｃのサンプルに生じたことにおいて、適用された血液の結果を実質的に反映した。それに適用された淡水は実質的に同じことを提供し、図１Ｃのサンゴサンプル内の不良吸収〜無吸収をもたらした。
【０３１２】
図１Ｄ−１Ｆは、図１Ａ−１のサンプルが、それぞれ採取されたサンゴの大きなブロックの画像を提供する。図１Ｄに見られ得るように、１Ａのサンプルが採取される領域は、適用される流体、この場合、血液の良好な摂取を示し、ところがサンプルが採取される図１Ｃにおける領域（すなわち、図１Ｆのブロック）は、最少の摂取を示し、そして図１Ｂのサンプルが採取される、図１Ｅに示される領域は、中位の摂取を示し、この場合、いくつかの領域は良好な摂取を示し、ところが他の領域は最少の摂取を示す。
【０３１３】
本明細書に示されるように、評価されるサンプルのサイズは制限的ではなく、そして従って、実際、種々のサイズ及び厚さのサンプルが評価され得る。さらに、表面張力の差は明らかである（図１Ａと図１Ｃとを比較すること）。
【０３１４】
実施例２：サンゴ系の固体基材についてのスクリーニングプロトコルの確立
実施例１における発見に基づいて、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための最適化されたサンゴ系の固体基材を選択するためのスクリーニングプロトコルを確立することができる。図２は、想定されるスクリーニングプロトコル工程の流れ図を提供する。サンゴサンプルを、同定し、単離し、そして所望するサイズ及び形状に機械処理するか、又はブロック下で評価する。次に、サンプルを洗浄し、そして任意には、殺菌し、次に乾燥する。評価されるサンゴサンプルを、真空化で乾燥し、そして／又はこの端部に向かって加熱することができる。
【０３１５】
次に、各サンプルについての乾燥重量を記録することができる。
【０３１６】
本明細書に記載されるような流体を、約１：１の比又はそれをわずかに上回る比で、各アッセイ容器に添加し、すなわちｍｌでの流体の体積に比較して、ｍｍでのサンプルのサイズに等しいか、又はわずかにそれを上回る量が、各容器に添加される。
【０３１７】
次に、サンプルを計量し、そして自発的流体摂取値を決定する。
【０３１８】
サンプルを任意には、サンプルのさらなる操作の前、乾燥することができる。
【０３１９】
有意に高められた量の流体を、サンプルと接触せしめ、そして真空を、サンゴサンプル中への適用される流体の最大摂取を確保する時間、適用する。
【０３２０】
全流体摂取容量を評価し、そして特異的流体摂取容量値を、前流体摂取容量により自発的流体摂取値を割算することにより決定する。
【０３２１】
前記値が７５％のカットオフ値を超える場合、サンプルは、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材としてのその適合性について注目されるであろう。サンプルが続く用途においてインビボで使用される場合、いくつかの側面によれば、サンプルは最初に、自家生物学的流体又は宿主からの材料と、宿主への移植の前、接触される。前記値が言及されるカットオフ値未満である場合、サンプルは、細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための固体基材として使用されない。
【０３２２】
実施例３：本発明のサンゴ系の固体基材における特定物性の関数としての改良された固体基材組込み
実施例１のプラグにおける血液吸収の表現型変動の結果を評価するために、サンゴプラグを、３回の次亜塩素酸洗浄、過酸化水素処理及び複数回の再蒸留水洗浄を含む標準生成方法を用いて調製した。それらの自発的流体摂取及び全流体摂取値を、実施例２に記載のようにして決定し、そして水が、この場合、評価されるサンプル流体である。７５％超の自発的流体摂取値を示すサンプルインプラントをまた、それらの自発的血液摂取容量について調べた。
【０３２３】
インプラントを、赤、白、中間として等級付けし、そして中間は、赤の領域及び白のままである領域を示す。インプラントを、各ヤギの膝に配置し、結果的に、各ヤギは、７５％以上の自発的流体摂取値により特徴付けられるインプラント及び５０％未満の自発的流体摂取値により特徴づけられたインプラントを受けた。動物を４週間、追跡し、そして次いで、屠殺した。
【０３２４】
初期軟膏形成を、肉眼的に及び組織学的に評価した。オステオインテグレーション及び初期の骨形成又は吸収を、Ｘ−線、マイクロ−ＣＴ及び組織学を用いて評価した。
【０３２５】
図３は、移植の前の生物学的流体摂取と、経時的治療の部位との間の相関関係を示す。インプラント内の有意な水及び血液摂取又は最少摂取により特徴づけられるインプラントを、欠損部位内に移植し、そして移植後４週で、肉眼的に評価した。ヒアリン軟膏外観と一致する組織が、有意な流体摂取を有するサンプルにおいて、インプラントを被覆し、ところが、最少／減じられた流体摂取により特徴づけられたサンプルは、インプラント移植上を被覆する、より線維性の被膜を示した（それぞれ、図３Ａ対３Ｄ）。最少／減じられた流体摂取により特徴づけられるそれぞれのインプラント［図３Ｂ及び３Ｃ］対、有意な流体摂取により特徴づけられるそれら［図３Ｅ及び３Ｆ］のＸ−線及びマイクロ−ＣＴ分析は、有意な流体摂取により特徴づけられたインプラントが重大な有害反応を伴わないで移植部位内に正しく総合されると思われることを示した。最少／減じられた流体摂取により特徴づけられるインプラントは、インプラントの骨吸収、溶解及び緩みを誘発するように見える。
【０３２６】
実施例４：移植のためのサンゴ系の固体基材のプレスクリーニング
細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進することへの適用のために、固体基材を、流体、例えば、水を吸収するそれらの能力について評価する。次に、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値を提供する基材を、所望する組織部位に移植する。例えば、及び１つの実施形態によれば、そのような固体基材を、骨軟骨欠損又は疾患における修復又は再生への適用のために軟骨及び隣接する骨内に移植することができる。
【０３２７】
固体基材を、当業者に理解され得るように、本明細書に記載されるような任意の実施形態に従って調製することができる。
【０３２８】
基材は、動物用途への使用のために、同様にヒト対象の治療への使用のために想定される。適切な間隔で、標準方法を用いて、基材の良好な組込み及び影響される組織の治療を評価し、例えばＸ−線、ＣＴ又はＭＲＩイメージングを行い、インプラントの位置を確認することができる。
【０３２９】
移植は、任意の適切な位置で存在することができ、例えば膝関節修復に関しては、移植は、内側大腿顆（ＭＦＣ）、横方向の大腿顆（ＬＦＣ）、膝蓋骨、滑車溝（ＴＧ）及び脛骨内であり得る。
【０３３０】
細胞又は組織の増殖又は機能回復の促進に関する用途においては、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる固体基材は、４０％未満の特異的流体摂取容量値により特徴づけられる固体基材を、部位での細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進し、移植部位での治療を促進し、戻される組織機能を促進し、又はそれらの組み合わせを行うそれらの能力の観点から、有意にしのいでいることが注目される。
【０３３１】
実施例５：本発明のサンゴ系の固体基材における物性変動性
天然の表面は、それらの可変材料組成、表面粗さ及び多孔性のために不均一であり、そして従って、可変撥水性／接着特性を示す。接触角測定は、表面のトポグラフィー及び化学構造を考慮して、粗い表面の湿潤性を特徴づけることができる。
【０３３２】
接触角の測定は、角度測定による。接触角は、固体表面上を肉眼的に測定される平均接触角である。接触角は、原子的に平滑な、化学的均質な表面上で測定されるヤング接触角とは区別されるべきである。
【０３３３】
領域は３つの種類に分類され、そしてそれらの相対的表面積は、全表面積の割合として近似する。
【０３３４】
０〜６０°の接触角により特徴づけられる領域は、提供される図中の白色領域として表示される。６０〜９０°の接触角により特徴づけられる領域は、提供される図中に青色で示され、そして９０°及びそれを超える接触角により特徴づけられる領域は、提供される図中に赤色で示される。
【０３３５】
１μｌ〜１０μｌの体積の水滴を、正確なマイクロ投与注射器を用いて、洗浄され、そして乾燥されたサンゴサンプル上に堆積した。接触角を、０．１度の精度のRame-Hartゴニメーター（Model 500）により測定した（Bormashenko, 2012）。測定値は、水滴の両側について評価され、そして平均された。使用される試験媒体は、生理食塩水であった。
【０３３６】
Ｒ４３、Ｒ３４及びＲ４４と称する３種の３×３ｍｍのサンゴサンプルを評価した。接触角の評価の前、特異的流体摂取容量値を、各ブロックからサンプルについて評価し、そして結果は、表１に示される。
【表１】
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【０３３７】
図４は、それらの接触角について評価されたサンゴサンプルＲ４３検体の写真を提供する。図４及び４Ｂは、それらの接触角の特徴化について評価された、大きなブロックから切断された領域を示す。図４Ａ及び４Ｂにおいて評価されたブロックの大部分の領域は、主に６０°未満の接触角を提供した。図４Ｃ及び４Ｄにおける特定領域は、６０〜９０°（図４Ｃ）及び９０°超（図４Ｄ）の接触角を提供した。
【０３３８】
図５は、それらの接触角について評価されたサンゴサンプルＲ３４検体の写真を提供する。図５Ａは、それらの接触角の特徴化について評価された、大きなブロックから切断された領域を示す。図５Ａ及び５Ｂにおいて評価されたブロックの大部分の領域は、主に６０°未満の接触角を提供した。図５Ｂ及び５Ｃにおける特定領域は、６０〜９０°及び９０°超（それぞれ、青対赤領域）の接触角を提供した。図６は、同様に、それらの接触角について評価されたサンゴサンプルＲ４４検体の写真を提供する。図６Ａは、それらの接触角の特徴化について評価された、大きなブロックから切断された領域を示す。図６Ｂ及び５Ｂにおいて評価されたブロックの大部分の領域は、主に６０°未満の接触角を提供した。図６Ｂにおける特定領域は、６０〜９０°及び９０°超（それぞれ、青対赤領域）の接触角を提供した。
【０３３９】
接触角測定値は、それぞれのサンゴサンプルについて得られた特異的流体接触容量値に類似する。従って、本発明の細胞又は組織の増殖又は機能回復を促進するための改善された固体基材を、接触角の決定、又は特異的流体摂取容量値の何れかにより特徴づけることができる。
【０３４０】
さらに、環境型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）研究が、本明細書に提供される接触角研究の結果を確認した。
【０３４１】
表２は、ＥＳＥＭにより評価されたサンゴサンプルについての特異的流体摂取容量値を示す。
【表２】
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【０３４２】
図７は、表２に記載されるサンプルに対して行われたＥＳＥＭ分析の結果を示す。Ｒ２７−７ブロックから評価されたサンプルは、ゼロドロップ角度値を提供し、そしてドロップ形成は見られなかった（図７Ａ）。図７Ｂ−７Ｃは、サンプルＲ３０−４０についての結果を示す。図７Ｂは、流体の適用に続いて取られ、そして水が適用される場合、サンプルが「湿潤」に失敗したことが認められた。図７Ｃは、再乾燥に続いて、水滴が表面上で明らかであり、これは、不良な表面湿潤の表現型と一致することを示す。
【０３４３】
図７Ｄ−７Ｅは、サンプルＲ４３−１についての結果、及びその結果が、サンプルＲ３０−４０について見られるそれらの結果と一致したことを示す。
【０３４４】
まとめると、それらの結果は、接触角データ、同様に、それぞれのサンゴサンプルについて得られた特異的流体摂取容量値を裏付けている。７５％超の、それぞれのサンゴサンプルについて得られた特異的流体摂取容量値を有するサンプルは、表面上でのドロップ形成を示さず、これは「良好な湿潤」表現型と一致し（図７Ａ）、ところが、より低い特異的流体摂取容量値を有するサンプルは、乾燥の間、液滴形成を示した。
【０３４５】
実施例６：本発明の改良されたサンゴ系の固体基材の物理的特性
サンゴサンプルを、上記実施例１に記載されるようにして処理した。次に、サンプルを、標準方法に従って、環境走査型電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡にかけた。
【０３４６】
図８Ａ−Ｃは、実質的な特異的流体摂取容量値を有する固体基材の表面構造に比較して、最小の特異的流体摂取容量値のその表面構造を示す（図８Ａ−Ｃ及び８Ｄ−Ｆを比較すること）。より低い特異的流体摂取容量値を有する基材は、より高い特異的流体摂取容量値を有するそれらの基材に比較して、後者のサンプルの結晶構造は容易に見られるが、滑らかな外表面構造を示した。
【０３４７】
さらに、原子間力顕微鏡は、低い特異的流体摂取容量値を有する基材がより滑らかな外表面により特徴づけられたことを示した（図９Ａ−９Ｃ）。極めて対照的に、高い特異的流体摂取容量値により特徴づけられる基材は、より粗い表面粗示した（図９Ｄ−９Ｆ）。
【０３４８】
まとめると、それらの結果は、表面構造の特徴づけがそれぞれのサンゴサンプルについて得られる特異的流体摂取容量値と相関するという事実を裏付けている。７５％超の、それぞれのサンゴサンプルについて得られた特異的流体摂取容量値を有するサンプルは、より粗い表面を示し、ところが、より低い特異的流体摂取容量値を有するサンプルは、より滑らか表面を示した。
【０３４９】
実施例７：サブ最適な海洋生物骨格誘導体系の固体基材を、最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材に転換するための方法の開発
材料及び方法
ヒドロサンゴ  ポリテス・ルテア（Porites lutea）のサンゴサンプルを、実施例１に記載のようにして単離し、そしてプラグを調製した。
【０３５０】
プラグを計量し、サンプル当たりの乾燥重量を確立した。プラグを、２ｍｌの二回蒸留水に、５分間、暴露し、次に計量し、自発的摂取値を提供した。次に、プラグを、過剰の二回蒸留水に、真空下で３０分間、暴露し、そして次に、計量し、各プラグについて全流体摂取値を決定した。次に、特異的流体摂取容量値を、得られる全流体摂取値により自発的流体摂取値を割算することにより決定した。
【０３５１】
各セクションを任意には、プラスチックペトリ皿に配置し、そして２ｍｌの流体、例えば血液を各皿に適用し、そして流体摂取のそれぞれの表現型を、特定の特異的流体摂取容量値を生成したサンプルに保存した。
【０３５２】
不良な摂取をもたらすことが示され、そして４０％未満の特異的流体摂取容量値を有するサンプル、４１％〜７４％の中間の全特異的流体摂取容量値をもたらすことが示されるサンプル、及び７５％〜９９％の特異的流体摂取容量値をもたらすことが示されるサンプルを、試験材料と接触した。いくつかの側面によれば、試験条件は、５ｍｌの０．５％Ｔｗｅｅｎ８０の適用を包含した。
【０３５３】
いくつかの側面によれば、試験条件は、１５分間の音波処理；無水エタノールの適用；前のＴｗｅｅｎ８０適用を伴って、又は伴わずに、５ｍｌのプルロニックの適用を包含した。いくつかの側面によれば、試験条件は、０．０３％の酢酸中、５ｍｌのメチレンブルー、又はＤＤＷ中、３Ｍの０．０５％ヒアルロン酸溶液の適用を包含した。
【０３５４】
そのような処理に続いて、サンプルを、上記のようにして、流体、例えば水と再び接触し、そして特異的流体摂取容量値を、各サンプルについて再び評価した。プラグ内への流体の摂取、例えば血液の摂取を同様に、肉眼で確認した。
【０３５５】
５０％超の特異的流体摂取容量値を提供するサンプルを、同様に評価し、そして５０％未満の値を有するそれらのサンプルと比較した。
【０３５６】
結果
実施例２は、少なくとも７５％の特異的流体摂取容量値により特徴付けられる固体基材が細胞又は組織の増殖又は機能回復を提供し、そして海洋生物骨格誘導体の所定の単離されたブロックにおいて、所望する特異的流体摂取容量値を示す、それらから単離され得るプラグの数に関して、変動性が存在することを示した。従って、４０％未満、又は４１％〜７４％、又は７５％〜９９％の特異的流体摂取容量値により特徴づけられるサンプルが、細胞又は組織の増殖又は機能回復を提供する各基材の能力を改善するよう、高められ得るかどうかを決定することが興味の対象であった。
【０３５７】
それぞれ、各特異的流体摂取容量値について示される範囲により特徴づけられるそのような骨格誘導体のサンプルを単離し、そしてサンプルを処理し、それにより、特異的流体摂取容量値を、前に得られたその値よりも改善することが可能であったかどうかを決定するために、サンプルの多くの操作を実施した。
【０３５８】
Ｔｗｅｅｎ  ８０は、非イオン性界面活性剤、及びポリエトキシル化されたソルビタン及びオレイン酸由来の乳化剤である。従ってＴｗｅｅｎ  ８０を、試験されるサンゴの特異的流体摂取容量値を変更するその能力について評価する。図１０は、多くの評価されたサンプルの結果を提供する。評価された実質的にすべてのサンプルにおいては、Ｔｗｅｅｎ処理は、特異的摂取容量（ＳＦＵＣ）値を高めた。低いＳＦＵＣ値を示すいくつかのサンプルが有意に増強された。サンプル３１−１０、３５−５及び他のものが、約３０％未満の初期ＳＦＵＣ値を示し、そしてＴｗｅｅｎ  ８０による処理に続いて、６０％超の、及びさらに、８０％超の高い値に、ＳＦＵＣの著しい上昇性を示した。血液がサンプルに適用される場合、急速な摂取が、前の不良な摂取に著しく対照的に、発生した（図１０）。両親媒性化合物によるプラグの処理は、評価されるすべてのサンプルにおいて、高められたＳＦＵＣを提供するので、他の操作がこの現象を改善するかどうかを決定することは興味の対象であった。
【０３５９】
この目的に向かって、Ｔｗｅｅｎ  ８０が適用されたサンプルを、音波処理した。図１１は、そのような方法の結果を示す。図に見られ得るように、ほとんどのサンプルにおいて、Ｔｗｅｅｎ  ８０処理及び音波処理により得られたＳＦＵＣは、続くＳＦＵＣ値を改善した。サンプル３７−３０、３７−１４及び他のものは、初期値の２倍超のＳＦＵＣ上昇を示した。多くのサンプルにおいては、Ｔｗｅｅｎ  ８０処理及び音波処理は、８５％超のＳＦＵＣ値をもたらした。
【０３６０】
他の両親媒性化合物が、ＳＦＵＣ値を高める点で、Ｔｗｅｅｎにより見られるのと同じ結果を提供するかどうかを決定するために、ポリオキシプロピレンの２つの親水性鎖を端に有するプルロニック（ポリオキシプロピレン（ポリ（酸化プロピレン））の中心の疎水性鎖から構成される非イオン性トリ−ブロックコポリマー）を、上記に記載の方法に従って、Ｔｗｅｅｎの代わりに、サンプルに適用した。図１２に見られ得るように、プルロニックによる処理は、試験された、実質的にすべてのサンプルにおいて、ＳＦＵＣを高めた（図１２において、濃い灰色のバーと、明灰色のバーとを比較すること）。ほとんどの場合、サンプルへのプロロニック及びＴｗｅｅｎ  ８０の両者の適用は、得られるＳＦＵＣ値を、さらに高めた。
【０３６１】
極性溶媒が、ＳＦＵＣ値を高める点で、Ｔｗｅｅｎにより見られる結果と同じ結果を提供するかどうかを決定するために、無水エタノールを、サンプルに適用した。図１３は、Ｔｗｅｅｎ及びプルロニックにより見られるように、エタノールが適用される場合、評価された多数のサンプルが、ＳＦＵＣの上昇し示し、ところがこの場合、前記上昇は、７０％超の初期ＳＦＵＣを有するサンプルが評価される場合、実質的に低かったことを実証する。
【０３６２】
カチオン性化合物が、ＳＦＵＣ値を高める点で、Ｔｗｅｅｎにより見られるのと同じ結果を提供するかどうかを決定するために、サンプルを、メチレンブルーに、同様に、上記方法をセクションにおいてＴｗｅｅｎ  ８０について記載されるそれに暴露した。図１４に見られるように、実際、サンプルへのメチレンブルーの適用は、より高い上昇性が３０％未満のＳＦＵＣ値を有するサンプルに見出された点で、幾分、エタノールにより観察される現象に匹敵した。
【０３６３】
アニオン性化合物が、ＳＦＵＣ値を高める点で、Ｔｗｅｅｎにより見られるのと同じ結果を提供するかどうかを決定するために、サンプルを、ヒアルロン酸に、同様に、上記方法をセクションにおいてＴｗｅｅｎ  ８０について記載されるそれに暴露した。図１５に見られるように、実際、サンプルへのヒアルロン酸の適用は、評価されたほとんどのサンプルにおいてＳＦＵＣ値を高めたが、しかしながら、そのような上昇は、Ｔｗｅｅｎ  ８０について評価されたそれよりも控えめであった。
【０３６４】
同様に、図１６に見られるように、硫酸コンドロイチンが使用される場合、ＳＦＵＣの上昇は、各サンプルにおいて明白であった。
【０３６５】
上記に報告される結果の他に、３種の異なったサンゴスラブ（Ｒ−７６、Ｒ−７７、Ｒ−７８）からの少なくとも７８％の特異的流体摂取容量値を示す一連のインプラント（ｎ＝４２）を、次の通りに、精製方法にゆだねた：サンプルを、少なくとも０．０３バールの適用される負圧下で、３０分、１：２０（プラグ体積：ＮａＯＣｌ）の比で５％ＮａＯＣｌ（Ｗ／Ｗ）溶液に浸漬けし、この後、液体をデカントし、そしてサンプルを、少なくとも０．０３バールの適用される負圧にさらに３０分間、暴露した。次に、サンプルを、少なくとも０．０３バールの適用される負圧下で、１５分、１：２０（プラグ体積：Ｈ2Ｏ2）の比で１０％Ｈ2Ｏ2（Ｗ／Ｗ）溶液に浸漬けし、この後、液体をデカントし、そしてサンプルを、少なくとも０．０３バールの適用される負圧にさらに３０分間、暴露した。サンプルを水により反復して洗浄し、続いて、１：２０（プラグ体積：Ｈ2Ｏ）の比で、滅菌水に浸漬けし、そして次に、少なくとも０．０３バールの適用される負圧に、さらに３０分間、暴露した。洗浄段階を、少なくとも３度、反復した。次に、サンプルを、０．０３バールの真空圧下で少なくとも４−６時間、乾燥した。次に、特異的流体摂取容量値を、代表的サンプルについて確認した。
【０３６６】
次に、サンプルを、少なくとも０．０３バールの真空条件下で３０分間、１：１０（プラグ体積：エタノール）の比で無水エタノールに浸漬けし、続いて溶液をデカントし、そして前の段落で記載したように、滅菌水により洗浄した。次に特異的流体摂取容量値（ＳＷＣ）を、代表的サンプルについて確認し、そして示されるアンプルの平均ＳＷＣ値を示す結果が、図１７に提供される。この図から明らかなように、基本的洗浄プロトコル、続く極性溶媒、この場合、エタノールによる抽出工程に従って、ＳＷＣ値は、統計学的に有意な態様で改善した。
【０３６７】
図１８−１９は、基本的単離／処理工程に続いて適用されるエタノール抽出工程の前及び後、多くのサンプルについて得られた平均ＳＷＣ値を示す。評価される無数のサンプルから明らかなように、予想外に、特異的流体摂取容量値は、抽出工程が極性溶媒、例えばエタノールを用いて実施される場合、基本的単離／処理工程に続いて、高められる。
【０３６８】
実施例８：最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材を単離し、そして調製するための自動方法及び装置
ヒドロサンゴポリテス・ルテア（Porites lutea）のサンゴサンプルを、実施例１に記載のようにして単離し、そしてインプラントを調製する。インプラント２０−１０を、保持用カセット２０−２０に配置し、そしてカバー２０−７０を装置上に配置する。インプラントが十分に乾燥し、そして次に、適用が停止されるまで、負圧を、真空２０−３０を介して、所定の時間、適用する。次に装置は、乾燥重量を確立するために、各インプラントの重量を個別に計量する。充填を促進する自動サイクルが開始され、そして所望する流体レベルが、その工程の間、維持される。自発的流体摂取を可能にするために、カセット２０−２０を、流体内のカセットマニピュレーター２０−４０を通して、個々に上昇させ、そして第１流体レベルに低下し、そしてインプラントマニピュレーター２０−６０が、自発劇流体摂取値を決定するために、重量決定のための個々のインプラントを指向し／移動し、続いて任意には、乾燥／ブロッティングステーションの先に各インプラントの通過を指向し／移動せしめる。個々のインプラントをすべて計量し、そしてカセット内のそれらの位置に戻す。次に、カセット２０−２０を、個々に上昇させ、そしてインプラントの十分な浸漬けを促進するために、過剰の流体内に、カセットマニピュレーター２０−４０を通して、第２の有意に高い流体レベルに下げ、そして負圧を、一定の時間、真空を介して再び適用し、各インプラント内に最大の流体摂取を確保する。インプラントマニピュレーター２０−６０は再び、全流体摂取を提供する、第２重量決定のために個々のインプラントを、個々に指向し／移動せしめる。装置のデータ処理ユニットは、特異的流体摂取値の出力を決定し、そして提供し、任意には、サンプルが示される基準に基づいて選択されるべきであることを特異的に同定する。
【０３６９】
カセットの寸法は、種々のサイズのインプラントを収容するよう構成されるであろうことは理解されるであろう。装置は、多数又は少数のカセットを縮尺し、同様に、収容するよう構築され、そしてその材料は、言及されるインプラント内へのそれらの摂取のために評価される種々の流体のために適切であろう。センサー及び適切なリレーは、例えば、故障した場合、警報システムを提供するために組み込まれ、そして装置はさらに、得られる、決定された自発的及び全流体摂取値から特異的流体摂取容量値を計算するために、データ処理ユニットを含むことができる。統計学的分析はまた、本発明の装置を、任意には提供するデータ処理パッケージの一部として包含され得る。
【０３７０】
実施例９：最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材による改善された細胞付着性及び生存性
材料及び方法
ヒト胚口蓋間葉（ＨＥＰＭ）細胞を、適切な増殖培地において増殖した。
【０３７１】
各サンゴの最適化された（７５％超の特異的流体摂取容量値を有する）及び非最適化された（６０％未満の特異的流体摂取容量値を有する）サンゴのインプラントを、ＨＥＰＭ細胞により、それぞれ１．６５×１０4及び０．８×１０4個の細胞／１０μｌの密度で、細胞を足場と共に３７℃で１５分間のインキュベーション、続いて、より多くの培地の添加、及び７日間までのさらなるインキュベーションにより、播種した。増殖培地は、２日ごとに交換された。
【０３７２】
足場含有細胞を、４％ホルムアルデヒドに固定し、エタノール勾配溶液及びＨＭＤＳ、勾配溶液により洗浄し、そして乾燥し、次にＳＥＭにより評価した。
【０３７３】
細胞付着及び形態を、固定化に続いて、播種後、１、３及び７日で、ＳＥＭにより観察した。
【０３７４】
細胞生存性を、alamarBlue（登録商標）代謝アッセイにより、その製造業者のプロトコルに従って評価した。サンプルは、播種後、１及び７日で採取された。蛍光を、Fluoreskanアセント、すなわちマイクロプレート蛍光リーダー（Labotal）を用いて、５４４ｎｍ及び５９０ｎｍ（それぞれ、励起及び発光）で評価した（三重データ）。
【０３７５】
新鮮な２００ＬのalamarBlue（登録商標）含有培地（それぞれ、１：１０）を、各足場に添加し、そして１８時間超（合計２４時間）、インキュベートした。
【０３７６】
結果
細胞付着が、評価されたすべてのサンプルにおいて、播種の１日後ほどで見出され、ここで最適化された（ｏｐｔ）とは、ＳＥＭ分析により評価される場合、７５％超の特異的流体摂取容量値を有し、そして非最適化された(ｎｏｎｏｐｔ)とは、６０％未満の特異的流体摂取容量値を有する。
【０３７７】
２６％の特異的流体摂取容量値を有する非最適化されたサンプルは、細胞がサンプルに付着され、そして生存細胞拡張（ｐｏｄｓ）がそのサンゴ表面に近位に位置することを示した（図２１Ａ）。細胞拡張はサンゴ基材と接触しているが、細胞体の大部分は容易には接触していないようである。図２１Ｂは、サンゴとの末端細胞拡張との接触を示すが、しかし細胞は平坦化されないか、又はその全体の細胞体上でサンゴと十分には接触していない、図２１Ａにおける「ボックス化された」領域の高倍率を表す。
【０３７８】
著しく対照的には、９５％の特異的流体摂取容量値を有する、最適化されたサンプルは、細胞がサンゴに良好に付着し、そして十分な細胞体がサンゴ上に広がったことを示した（図２１Ｃ）。
【０３７９】
非−ｏｐｔ及びｏｐｔのサンゴサンプル上に播種されたＨＥＰＭ細胞を、alamorBlue（登録商標）アッセイにより評価し、種々のヒト及び動物細胞系の増殖を定量化した。播種の１日後で、値を、ポリスチレンウェル上に播種された細胞の培養物について行われたそれらの値に対して標準化する。１００％とは、１日でポリスチレンウェル上での細胞生存率値として決定される（図２２Ａ）。図２２Ｂは、播種の７日後、種々のサンゴ上でのＨＥＰＭ細胞生存性を表す。各サンゴにおいては、７日での値が、１日の値により割算され、結果的に、細胞生存率での増加倍率が示される。容易に理解されるように、最適化されたサンプルは、非最適化されたサンプルに比較して、有意に高められた細胞生存率値を生成した。ＨＥＰＭ細胞を生存率は、１日でと比較して、７日で、４２倍、平均して上昇したが、ところが低ＳＷＣサンゴＲ２９及び対照グループでの上昇性は、それぞれ、わずか１３及び７倍であった。
【０３８０】
まとめると、細胞付着及び細胞生存性アッセイは、流体摂取のために最適化されると思われるサンプルは、経時的に、より高い十分な細胞付着及び生存性を促進することを実証する。
【０３８１】
実施例１０：最適化された海洋生物骨格誘導体系の固体基材を生成するためにインプラントの単離及び処理との結晶形の関連性
材料及び方法
サンゴサンプルを、実施例１に記載される方法に従って、単離し、そして調製した。サンプルを、［Chemical staining methods used in the identification of carbonate minerals, Tamer AYAN, Mineral Research and Exploration Institute of Turkey  http://www.mta.gov.tr/v2.0/eng/dergi_pdf/65/11.pdf］に記載のようなプロトコルに従って染色した。手短に言及すると、ファイグル溶液を、標準方法に従って調製する。次に、サンゴサンプルを、ファイグル溶液により染色し、そしてそれらの特異的流体摂取容量値について前に評価されたサンプルを、それにより染色した。この場合、実施例９において評価されたような２種のサンプル、すなわち９５％の特異的流体摂取容量値を有するサンプルＲ９１、及び４２％の特異的流体摂取容量値を有するサンプルＲ４８を評価した。
【０３８２】
結果
サンゴは主に炭酸カルシウム（約９８％）から構成される。炭酸カルシウムは、異なった結晶形、例えばアラゴナイト及びカルサイトで存在することができる。サンゴポリープは、年代的層状アーカイブを表す、複雑な外骨格を形成するそれらの基礎外胚葉の下にアラゴナイト骨格を分泌することができる。いくつかの領域においては、アラゴナイト構造は溶解し、そしてカルサイト又はミクライトが、通常、後者の段階で、続成作用（Diagenesis）として知られている方法により、形成される。
【０３８３】
より多くのカルサイト沈殿物が、近代サンゴに比較して、古代サンゴ（中新世）に見出されるが示されている。図２３−Ａは、ファイグル溶液により染色された中新世サンゴを示し、ここで黒の領域は、アラゴナイト結晶構造を表す。図２３−Ｂは、黒色が観察されないので、アラゴナイトがサンプルに存在しない場合、ファイグル染色されたサンゴを示す [両図は、化石石サンゴ（fossil scleractinian corals）における成長バンドの続成作用から取られ：同定及び保存モード、Reuter et al.  Facies (2005), 51: 146-159、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる]。
【０３８４】
ファイグル溶液はアラゴナイトを黒い染色する。サンゴサンプルが巨視的に見られる場合、所定のサンプルにアラゴナイトの不在下で、サンプルは白又は灰色に見えるであろう。
【０３８５】
従って、結晶構造が特異的流体摂取容量値と相関関係を示すかどうか、及び本明細書における最適化工程がファイグル染色プロトコルの点で影響されるかどうかを決定することが興味の対象である。この目的に向かって、サンゴサンプルＲ９１及びＲ４８を、ヤギ血液の摂取の最初の巨視的評価を含む、それらの特異的流体摂取容量値について評価し、そしてさらなる処理、例えば実施例７に記載されるようなエタノール抽出工程にゆだねた。
【０３８６】
図２３は、さらなるエタノール精製工程の前及び続いて、Ｒ９１及びＲ４８から採取された実質的に同一のサンプルの分析の結果を表す。ファイグル染色の総パターンはそれぞれ各サンプルにおける血液の取得のそのパターンに近似するが（図２３Ｃ対図２３Ｄ、及び図２３Ｅ対図２３Ｆを比較すること）、染色パターンは同一ではない。さらに、エタノール処理の前及び後、Ｒ４８のサンプルを比較する場合に容易に観察されるように、高められた血液摂取及びファイグル陽性染色が観察され、このことは、記載される、さらなる工程にゆだねられる場合、サンプルのより高い最適化を示唆する。
【０３８７】
まとめると、非アラゴナイト対アラゴナイトについて富化されたサンプルは、本明細書に記載されるように、特定のさらなる処理工程により、さらに改善され得る、より高い特異的流体摂取容量値、自発的血液吸収、及びファイグル溶液を用いての黒色染色に溶液に関連しているように思える。
【０３８８】
形態及び詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行われ得ることは、当業者により理解されるであろう。当業者は、日常的な単なる実験、すなわち本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を用いて認識するか、又は確認することができるであろう。そのような同等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０３８９】
いくつかの実施形態によれば、用語「含む」（comprise）又はその文法的な形とは、本発明の示された構成要素の包含、及び医薬産業において知られているような、他の活性剤、及び医薬的許容される担体、賦形剤、エモリエント剤、安定剤、等の包含を意味する。
【０３９０】
本発明の１つの実施形態によれば、「約」（About）とは、特定の必要を満たすための手段が満たされ、例えばサイズが、完全ではないが、大部分、指定されているサイズであるが、しかしそれは、軟骨修復の部位で軟骨修復の特定の必要性を満す、性質を意味する。１つの実施形態によれば、「約」（About）とは、正確ではないが、正確に近いか又は近似であることを意味する。小さなマージングの誤差が存在する。このマージンの誤差は、±同じ整数値を越えないであろう。例えば、約０．１μｍは、０よりも低くなく、しかも０．２よりも高くないことを意味する。いくつかの実施形態によれば、基準値に関しての用語「約」（About）とは、示される値のわずか５％、わずか１０％、又はわずか２０％超又は未満の量から偏差を含む。１つの実施形態によれば、用語「約」（About）とは、示される値からの、１〜１０％の分散、又は別の実施形態によれば、５〜１５％の分散、又は別の実施形態によれば、１０％までの分散、又は別の実施形態によれば、２５％までの分散を意味するが、但し分散が１００％を越える値をもたらすべきではないことを、前後関係が示す場合は除く。
【０３９１】
本特許請求の範囲において、冠詞、例えば不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」、及び定冠詞「ｔｈｅ」とは、反対に示されない限り、又は他方では、前後関係から明らかなように、１つ、又は１つ以上（複数）を意味する。グループのメンバー間に、「又は」（ｏｒ）又は「及び／又は」（ａｎｄ／ｏｒ）を含む請求項又は説明は、グループメンバー中の１つ、１つ以上、又はすべてが、反対に示されない限り、又は他方では、前後関係から明らかなように、所定の生成物又は方法に、存在するか、使用されるか、又は他方では、関連する場合、満たされると考えられる。本発明は、グループ中の正確に１つのメンバーが、所定の生成物又は方法に、存在するか、使用されるか、又は他方では、関連する実施形態を含む。本発明はまた、１以上又はすべてのグループメンバーが、所定の生成物又は方法に存在するか、使用されるか、又は他方では、関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、種々の実施形態によれば、１又は２以上の列挙される請求項からの１又は２以上の制限、要素、節、記述用語、等が、特に断らない限り、又は矛盾又は不一致が生じるであろう当業者に明らかでない限り、同じ基本的請求項に依存して、別の請求項に導入される、すべての変更、組み合わせ及び順列を提供することが理解されるべきである。要素が、例えばマーカッシュ群形式又は同様の形式下で、リストとして提供される場合、要素の各サブグループもまた、開示され、そして任意の要素がそのグループから除かれ得ることが理解されるべきである。一般的に、本発明、又は本発明の側面が、特定の要素、特徴、等を含むものとして言及される場合、本発明の特定の実施形態、又は本発明の側面は、そのような要素、特徴、等から構成されるか、又は実質的に成ることが理解されるべきである。簡略化のために、それらの実施形態は、あらゆる場合、本明細書において具体的に、その通りの言葉では示していません。特定の請求項は、便宜のために従属形式で提供されているが、しかし出願人は、独立請求項及びそのような請求項が従属する任意の他の請求項の要素又は制限を含むよう独立形式で任意の従属請求項を書き換える権利を保有し、そのような書き換えられた請求項は、独立形式で書き換えられる前、その形式が補正されたか、又は補正されていないか、どのような形式で存在する場合でも従属請求項にすべての点で同等と見なされるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図９Ｄ−９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ−２２Ｂ】
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【図２３Ａ−２３Ｂ】
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【図２３Ｃ−２３Ｆ】
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