(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（１）〜（３）を含む糖液製造プロセスを繰り返して糖液を製造する方法において、以下の工程（４）で得られる洗浄液を次回以降の糖液製造プロセスの工程（１）に使用することを特徴とする、糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスの前処理物のスラリーを調製する工程、
工程（２）：工程（１）のセルロース含有バイオマス前処理物スラリーを糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する工程、
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を精密濾過膜に通じて濾過して得られる透過液を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程
工程（４）：工程（１）〜（３）を１回または複数回繰り返した後に、精密濾過膜および／または限外濾過膜を洗浄し、精密濾過膜および／または限外濾過膜を通過しない高分子成分を含む洗浄液を回収する工程
【請求項２】
工程（４）がアルカリ性物質を含む洗浄水による洗浄であることを特徴とする、請求項１に記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ属微生物由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
工程（１）のセルロース含有バイオマスの前処理物が希硫酸処理物である、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エネルギー使用量および環境負荷が少ない、セルラーゼを使用したセルロース含有バイオマスの加水分解による糖液の製造方法が広く検討されている。しかしながら、セルラーゼを使用する糖液の製造方法の最大の欠点は、セルラーゼの価格が高いため糖液製造コストが増大するという点である。こうした技術課題を解決するために加水分解に使用したセルラーゼを回収再利用する方法が提案されているが、セルロース含有バイオマスを加水分解する際に生じる加水分解残渣にセルラーゼが強く吸着するため、再利用性が低いということが課題となっている。【０００３】
セルラーゼの加水分解残渣への吸着を低減する方法としては、セルロース含有バイオマスの加水分解時、水溶性塩類を添加して反応液の電気伝導度を５〜２５ｍＳ／ｃｍに調整する方法（特許文献１）、セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して１〜１０重量％の炭酸カルシウム粒子を添加する方法（特許文献２）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４９４７２２３号公報
【特許文献２】特開２０１２−１００６１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、セルロース含有バイオマスの加水分解に用いたセルラーゼを回収し、再利用することによりセルラーゼの使用量を削減する試みが種々なされているが、セルラーゼが加水分解残渣に強く吸着するためその回収率は低く、問題の解決には至っていない。そこで本発明は、従来よりも高い効率でセルラーゼを回収できる糖液の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らが上記課題の解決のため鋭意検討した結果、限外濾過膜および／または精密濾過膜を使用した糖液製造プロセスを繰り返して糖液を製造する方法において、前記分離膜の洗浄工程で得られる洗浄液を次回以降の糖液製造プロセスにおいてセルロース含有バイオマスの前処理物のスラリーの調製に使用することにより、糸状菌由来セルラーゼの酵素成分を高い効率で回収することができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［６］の構成を有する。
［１］以下の工程（１）〜（３）を含む糖液製造プロセスを繰り返して糖液を製造する方法において、工程（３）後の分離膜洗浄の工程（４）で得られる洗浄液を次回以降の糖液製造プロセスの工程（１）に使用することを特徴とする、糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスの前処理物のスラリーを調製する工程、
工程（２）：工程（１）のセルロース含有バイオマス前処理物スラリーを糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する工程、
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程
［２］工程（３）において、溶液成分を精密濾過膜に通じて濾過して得られる透過液を限外濾過膜に通じて濾過することを特徴とする、［１］に記載の糖液の製造方法。
［３］工程（４）で限外濾過膜および／または精密濾過膜を洗浄し、得られた洗浄液を次回以降の糖液製造プロセスの工程（１）に使用することを特徴とする、［２］に記載の糖液の製造方法。
［４］工程（４）がアルカリ性物質を含む洗浄水による洗浄であることを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［５］糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ属微生物由来であることを特徴とする、［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］工程（１）のセルロース含有バイオマスの前処理が希硫酸処理である、［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、セルロース含有バイオマスの加水分解残渣への糸状菌由来セルラーゼの吸着を抑制することができ、特に加水分解反応において重要な役割を果たすβ−グルコシダーゼを高い効率で回収および／または再利用することができる。その結果、糖液製造コストを低く抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の糖液の製造方法の実施の形態を示した略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について工程ごとに説明する。本発明の糖液の製造方法では、以下に説明する工程（１）〜（３）および、任意で工程（４）を繰り返し実施する。
【００１１】
工程（１）：セルロース含有バイオマスの前処理物のスラリーを調製する工程
セルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを挙げることができる。セルロース含有バイオマスは糖から構成されるセルロースおよびヘミセルロースの他に、芳香族高分子であるリグニンなどを含有しているため、前処理を施すことによりセルラーゼによる加水分解効率を向上させることができる。セルロース含有バイオマスの前処理方法としては、希酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理などが挙げられるが、本発明の糖液の製造方法において最も酵素の再利用性が高いのは希硫酸処理物を用いた場合であるため、希硫酸処理物が好ましく適用される。
【００１２】
前処理物のスラリーの固形物濃度は特に限定されないが、１〜３０重量％の範囲が好ましい。固形物濃度が低いと加水分解により生成する糖濃度が低く、発酵原料として利用しにくい場合がある。一方、濃度が高すぎるとハンドリングが困難になることがある。
【００１３】
スラリーのｐＨは特に限定されないが、糸状菌由来セルラーゼが作用する３．０〜７．０が好ましい。より少量の糸状菌由来セルラーゼで効率よく加水分解反応を行うためには、糸状菌由来セルラーゼの至適ｐＨに近いｐＨ３．５〜６．５の範囲がより好ましく、ｐＨ４．０〜６．０の範囲がさらに好ましい。加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
【００１４】
工程（２）：工程（１）のセルロース含有バイオマス前処理物スラリーを糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する工程
セルラーゼの起源となる糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。また、これら微生物に変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ生産性が向上した変異株由来のセルラーゼであってもよい。
【００１５】
糸状菌の中でもトリコデルマ属は、セルロースの加水分解において比活性の高い酵素成分を培養液中に大量に生産するため本発明において好ましく使用することができる。トリコデルマ属由来セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＱＭ９１２３）由来のセルラーゼが挙げられるが、中でもトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼがより好ましい。
【００１６】
糸状菌由来セルラーゼは、セルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解してグルコースやキシロースなどの単糖を生成する活性を有する酵素組成物であり、酵素成分としてセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼからなる群から選択される１種以上を含むことが好ましい。例えばトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼの酵素成分としては、セロビオハイドラーゼＩ、セロビオハイドラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、などが例示され、こうした複数の酵素成分の協奏効果あるいは補完効果により効率的なセルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解を実施することができるため、本発明において好ましく使用される。
【００１７】
セロビオハイドラーゼは、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを放出する酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。セロビオハイドラーゼＩはセルロース鎖の還元末端側から、セロビオハイドラーゼＩＩは非還元末端側から加水分解反応を開始する。
【００１８】
エンドグルカナーゼは、セルロース鎖の中央部分から加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。エンドグルカナーゼＩはトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼの生産するエンドグルカナーゼの中で最も多く発現しており、かつ広い基質特異性を有している。エンドグルカナーゼＩＩＩはセルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を持たず分子量が小さいという特徴を有する。
【００１９】
β−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することをと特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβ−グルコシダーゼに帰属する酵素群が記載されている。
【００２０】
キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２１】
β−キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてβ−キシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２２】
こうしたセルラーゼ成分は、ゲル濾過、イオン交換、二次元電気泳動などの公知手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列をデータベースと比較することにより同定することができる。なお、アミノ酸配列の分析にはＮ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析など公知の分析手法を用いればよい。
【００２３】
また、糸状菌由来セルラーゼの酵素活性は、アビセル分解活性、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性、セロビオース分解活性、キシラン分解活性、マンナン分解活性などといった多糖の加水分解活性によって評価することができる。アビセル分解活性を示す主たる酵素は、セルロース末端部分から加水分解する特徴を有するセロビオハイドラーゼである。セロビオース分解活性を示す主たる酵素は、β−グルコシダーゼである。ＣＭＣ分解活性に関与する主たる酵素は、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼである。キシラン分解活性を示す主たる酵素はキシラナーゼ、β−キシロシダーゼである。ここで“主たる”という意味は、最も分解に関与することが知られていることからの表現であり、これ以外の酵素成分もその分解に関与していることを意味している。
【００２４】
糸状菌は、培養液中にセルラーゼを産生するため、その培養液を粗酵素剤としてそのまま使用してもよいし、公知の方法で酵素群を精製し、製剤化したものを糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。糸状菌由来セルラーゼを精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを使用してもよい。なお、本発明ではこれらの中でも粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、糸状菌がセルラーゼを産生するよう調製した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するためにセルロースを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいはトリコデルマ菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。
【００２５】
粗酵素物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、５０〜９５重量％のセロビオハイドラーゼが含まれており、残りの成分にエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどが含まれている。また、トリコデルマ属の微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、β−グルコシダーゼに関しては、その多くを細胞内あるいは細胞表層に保持しているため培養液中のβ−グルコシダーゼ活性は低い。そこで、粗酵素物に、さらに異種または同種のβ−グルコシダーゼを添加してもよい。異種のβ−グルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されているＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８などを例示することができる。また、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、β−グルコシダーゼ活性の向上した培養液を用いてもよい。
【００２６】
加水分解反応の温度は、４０〜６０℃の範囲であることが好ましく、特にトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、４５〜５５℃の範囲であることがより好ましい。
【００２７】
加水分解反応の時間は、２時間〜２００時間の範囲であることが好ましい。２時間未満であると、十分な糖生成量が得られないことがある。一方で、２００時間を超えると酵素の失活が進み、回収セルラーゼの再利用性に悪影響を及ぼすことがある。
【００２８】
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、任意で精密濾過膜に通じて濾過する工程
工程（２）によって得られた加水分解物は、固液分離することで糖液および加水分解残渣に分離することができる。固液分離の方法としては、遠心分離、プレス濾過が挙げられるが、本発明においてはプレス濾過が好ましい。
【００２９】
固液分離としてのプレス濾過が好ましい理由のひとつとして、澄明な濾液を得られる点が挙げられる。固液分離により回収した溶液成分は後述の工程（３）において溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過するため、固形分あるいは微粒子成分の少ないことが膜ファウリングの観点で好ましい。プレス濾過の場合、固形分あるいは微粒子成分が少ないため、本発明で好ましく使用することができる。
【００３０】
さらに、溶液成分の澄明度が低い場合、前記溶液成分を精密濾過膜に通じて濾過することにより完全に微粒子成分を除去することが好ましい。なお、精密濾過膜については、ＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載のものを使用することができる。
【００３１】
回収した溶液成分に含まれる糸状菌由来セルラーゼ成分と糖成分は、限外濾過膜を用いた濾過によって分離する。限外濾過膜とは、分画分子量が５００〜２００，０００となる膜のことであり、ウルトラフィルトレーション膜、ＵＦ膜などとも呼ばれるものである。また、限外濾過膜は、孔径が小さすぎて膜表面の細孔径を電子顕微鏡等で計測することが困難であり、平均細孔径の代わりに分画分子量という値を孔径の大きさの指標とすることになっている。分画分子量とは、日本膜学会編  膜学実験シリーズ  第ＩＩＩ巻  人工膜編  編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤（１９９３年、共立出版）  Ｐ９２に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。
【００３２】
限外濾過膜を用いた糸状菌由来セルラーゼ成分と糖成分の分離においては、その分画分子量は糖液の主成分の単糖であるグルコース（分子量１８０）やキシロース（分子量１５０）を透過でき、糸状菌由来セルラーゼを阻止できるものであれば特に限定されないが、分画分子量５００〜５０，０００の範囲が好ましく、酵素反応に阻害的作用を示す夾雑物質を酵素と分離するという観点から、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。
【００３３】
限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルはセルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。
【００３４】
限外濾過膜の濾過方式として、デッドエンド濾過、クロスフロー濾過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフロー濾過であることが好ましい。また使用する限外濾過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０，ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。
【００３５】
セルロース含有バイオマスの加水分解物には、糖のほか、リグニン、シリカ、カルシウム塩、凝集タンパク質および未分解のセルロースなど水不溶性の微粒子、あるいはオリゴ糖、多糖、タンニンおよびタンパク質などの水溶性高分子、ならびに低分子の発酵阻害物質、無機塩および有機酸などが不純物として含まれている。本発明で使用する限外濾過膜および／または精密濾過膜は長期運転に伴ってこれらの不純物、特に水溶性高分子の付着による目詰まりが生じる。そこで、以下の工程（４）により、分離膜に付着した目詰まり成分を除去し、濾過の効率を維持することができる。本発明では、分離膜の目詰まり成分を含む洗浄液を回収して次回以降の糖液製造プロセスに使用する。
【００３６】
工程（４）:工程（３）において糖液を回収した後の分離膜を洗浄する工程
工程（４）は本発明の糖液製造プロセスにおいて毎回実施してもよいし、何回か工程（１）〜（３）を繰り返し、濾過性能が低下してから都度実施してもよい。洗浄の頻度が高いほど洗浄効果が高く分離膜は長持ちするが、洗浄コストの面で不利になる。分離膜やセルロース含有バイオマスの種類によって目詰まりを引き起こす不純物の分離膜への付着の仕方は異なるため、それぞれのプロセスにおいて最適な頻度で洗浄を行うのが好ましい。
【００３７】
本発明の分離膜の洗浄は、当業者にとって周知の方法で行うことができる。洗浄に用いる溶液（以下、洗浄水という。）に分離膜を浸漬する方法、洗浄水を分離膜で全量濾過する方法、洗浄水を分離膜でクロスフロー濾過する方法などがあり、いずれの方法を用いてもよい。
【００３８】
また、洗浄水は水以外に、塩酸、硫酸、シュウ酸、クエン酸などの酸性物質を含む洗浄水（以下、酸性洗浄水という。）や、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミンなどのアルカリ性物質を含む洗浄水（以下、アルカリ洗浄水という。）、あるいは次亜塩素酸ナトリウム、界面活性剤など公知の洗浄剤を含む薬液を使用してもよく、これらの洗浄剤の使用により洗浄効果を高めることができる。これらの洗浄剤を組み合わせ、１種または２種以上の洗浄水を用いて複数回洗浄を行ってもよい。本発明では分離膜の洗浄液を次回以降の糖液製造プロセスで使用するため、糸状菌由来セルラーゼによるセルロースの加水分解反応を阻害しにくいという点で洗浄剤は使用しない、あるいは酸性洗浄水またはアルカリ洗浄水を使用するのが好ましい。分離膜に付着する不純物の多くは有機物と考えられるため、有機物の洗浄に優れるという点でさらに好ましいのはアルカリ洗浄水である。
【００３９】
洗浄水の温度は特に限定されないが、０〜９０℃の範囲が好ましい。洗浄温度が低すぎると洗浄効果が不十分な場合がある。一方、温度が高いほど洗浄効果は優れるが、９０℃を超えると熱により分離膜そのものが損傷し、逆に濾過性能が低下してしまうことがある。そのため、より好ましい洗浄水の温度は２０〜９０℃、さらに好ましくは４０〜９０℃である。
【００４０】
工程（４）で得られる洗浄液には、上述のとおりリグニン、シリカ、カルシウム塩、凝集タンパク質および未分解のセルロースなど水不溶性の微粒子、あるいはオリゴ糖、多糖、タンニンおよびタンパク質などの水溶性高分子、ならびに低分子の発酵阻害物質、無機塩および有機酸などが含まれており、中でも、精密濾過膜および／または限外濾過膜を通過しない高分子成分がセルロース含有バイオマスの加水分解残渣への糸状菌由来セルラーゼの吸着を抑制し、本発明において高い効果を発揮する。
【００４１】
洗浄液を次回以降の糖液製造プロセスの工程（１）に使用する際、その使用量は特に限定されないが、使用量が少なすぎると本発明の効果が十分に得られない場合がある。また、使用量が多すぎると加水分解物中の不純物が増え、分離膜への負荷が高まる場合がある。そのため、工程（１）での分離膜の洗浄液の使用量は、１〜２０回の糖液製造プロセスの繰り返しにより得られる量が好ましい。さらに好ましいのは、５〜１０回の繰り返しにより得られる量である。
【００４２】
本発明により得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を生育させることで、各種化学品を製造することができる。ここでいう発酵原料として微生物を生育させるとは、糖液に含まれる糖成分あるいはアミノ源を微生物の栄養素として利用し、微生物の増殖、生育維持を行うことを意味している。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。こうした化学品は、糖液中の糖成分を炭素源として、その代謝の過程において生体内外に化学品として蓄積生産する。微生物によって生産可能な化学品の具体例として、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、本発明の糖液は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。こうした化学品の製造に使用する微生物に関しては、目的の化学品を効率的に生産可能な微生物であればよく、大腸菌、酵母、糸状菌、担子菌などの微生物を使用することができる。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４４】
（参考例１）セルロース含有バイオマスの前処理
セルロース含有バイオマス（コーンコブ）１．８ｋｇを４．２ｋｇの硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ（日東高圧製）にて処理したものを以下の実施例に使用した。希硫酸処理物の含水率は７０％であった。【００４５】
（参考例２）β−グルコシダーゼ活性の測定
糸状菌由来セルラーゼの回収効率は、β−グルコシダーゼ活性を指標とした。その活性は以下に示す方法で測定評価した。【００４６】
１．１ｍＭ  ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む５５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．９ｍＬに酵素液を０．１ｍＬ加え、３０℃で反応を行った（基質の終濃度１ｍＭ、緩衝液の終濃度５０ｍＭ）。１０分間正確に反応させた後、０．１ｍＬの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｔｅｓｔ）。ブランクとして、基質溶液に２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液、酵素液の順に添加したものについても同様に４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｂｌａｎｋ）。上記反応系で１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。なお、上記反応系における４−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数は１７．２Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍである。
β−グルコシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×１０（分間）×０．１（ｍＬ）｝。【００４７】
（参考例３）限外濾過膜および精密濾過膜を使用した糖液の製造
（工程１：セルロース含有バイオマス前処理物のスラリーの調製）
参考例１のセルロース含有バイオマス（コーンコブ）の希硫酸処理物４ｋｇを水に懸濁してスラリーを調製し、１０％アンモニア水溶液を添加してｐＨ５．０に調整した後に総重量が８ｋｇとなるよう水を添加してスラリーの固形物濃度を１５％に調整した。【００４８】
（工程２：セルロース含有バイオマス前処理物スラリーの加水分解）
工程１で調製したスラリーに市販のセルラーゼ酵素液２４０ｍＬ（“アクセルレース（登録商標）  デュエット”、ジェネンコア製）を添加し、５０℃で２４時間反応させた。【００４９】
（工程３：セルロース含有バイオマス加水分解物からのセルラーゼと糖液の回収）
工程２の加水分解物をフィルタプレス装置（藪田産業製、ＭＯ−４）により濾過し、溶液成分を、平均細孔径０．０４μｍの精密濾過膜（ＤＥＳＡＬ製  Ｅシリーズ、材質：ポリサルホン）に供することにより、ミクロンオーダーの不溶性微粒子を除去した。膜分離装置はスパイラル膜モジュールの濾過小型試験として使用できる小型の平膜ユニット“ＳＥＰＡ（登録商標）  ＣＦ−ＩＩ”（ＧＥ製、有効膜面積１４０ｃｍ２）を使用した。操作温度は２５℃、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、５Ｌの濾液を得、これを限外濾過膜による濾過に供した。【００５０】
限外濾過膜は、耐熱性限外濾過膜（ＤＥＳＡＬ製  “ＨＷＳＵＦ”シリーズ）を使用した。膜分離装置は“ＳＥＰＡ（登録商標）  ＣＦ−ＩＩ”（ＧＥ製、有効膜面積１４０ｃｍ２）を使用し、操作温度は２５℃で、膜面線速度は２０ｃｍ／ｓｅｃとし、膜フラックスが０．１ｍ／Ｄで一定になるように操作圧力を制御しながら５Ｌのうち４Ｌを濾過した。濾液を糖液、非透過液を回収セルラーゼ液としてそれぞれ回収した。【００５１】
（工程４：分離膜の洗浄）
工程３で使用した精密濾過膜および限外濾過膜について、洗浄水として０．０１２５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を用いて洗浄を行った。はじめに２Ｌの洗浄水を用い、洗浄水温度２５℃、操作圧力０．１ＭＰａ、膜面線速度３０ｃｍ／ｓｅｃでクロスフロー濾過を行い、濾液を分離膜の洗浄液１として回収した。次に、さらに２Ｌの洗浄水を用い、同様の操作条件にて２０分間クロスフロー流を循環させて膜洗浄を行った。２０分後、循環液を回収して分離膜の洗浄液２とした。膜分離装置は工程３と同じものを使用した。【００５２】
（比較例１）未利用洗浄水の使用
洗浄水として未利用の０．０１２５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２Ｌを工程１で使用し、前処理物のスラリーを調製した。水酸化ナトリウム水溶液２Ｌのみではスラリーの固形分濃度を１５％に調整することができなかったため、不足分は水を添加した。その他は参考例３に記載の方法で回収セルラーゼ液を得、参考例２に従って活性測定を行った。【００５３】
（実施例１）分離膜の洗浄液の使用
参考例３の糖液製造プロセスの工程１〜３を５回繰り返した後に分離膜を工程４と同様の方法で洗浄し、分離膜の洗浄液１と分離膜の洗浄液２を合一して分離膜の洗浄液１＋２として回収した。再度、工程１〜３を５回繰り返した後に分離膜の洗浄を行い、分離膜の洗浄液１と分離膜の洗浄液２を別々に回収した。回収したそれぞれの分離膜の洗浄液の全量を工程１で使用し、前処理物のスラリーを調製した。分離膜の洗浄液のみではスラリーの固形分濃度を１５％に調整することができなかったため、不足分は水を添加した。その他は参考例３に記載の方法で回収セルラーゼ液を得、参考例２に従って活性測定を行った。結果を相対活性として表１に示した。精密濾過膜および限外濾過膜の分離膜の洗浄液１、２および１＋２を使用した場合にも、回収セルラーゼ液の活性が大幅に増大し、特に、精密濾過膜および限外濾過膜の分離膜の洗浄液２を含む場合に顕著な効果が得られた。【００５４】
【表１】
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【００５５】
（実施例２）分離膜の洗浄の頻度とセルラーゼ回収効果
参考例３の糖液製造プロセスの工程１〜３を１、２、３、５、または１０回繰り返し実施した後に分離膜を工程４と同様の方法で洗浄した。なお本実施例においては全て、分離膜の洗浄液１と分離膜の洗浄液２を合一し、分離膜の洗浄液１＋２としてそれぞれ回収した。回収した分離膜の洗浄液１＋２を実施例１と同様に工程１で使用し、回収セルラーゼ液を得た。回収セルラーゼ液は参考例２に従って活性測定を行い、その結果を相対活性として表２に示した。分離膜の洗浄を行うまでの工程１〜３の繰り返し数が多いほど回収セルラーゼ液の活性が高まる傾向を示した。【００５６】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明で得られる糖液は、種々の発酵産物の糖原料として使用することができる。
【図１】
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