(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容される担体または媒体中に、癌細胞におけるネトリン-1の発現もしくは過剰発現を誘導することができる、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、またはパクリタキセルから選択される化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む、ネトリン-1受容体を有し、ネトリン-1を発現または過剰発現する癌を治療するための医薬組成物であって、前記ネトリン-1干渉薬が、癌細胞上のネトリン-1受容体に対するネトリン-1の結合を阻害し、ネトリン-1受容体誘導性アポトーシスを促進し、前記ネトリン-1干渉薬が、ネトリン-1に結合する抗体、ネトリン-1受容体に結合する抗体、前記ネトリン-1受容体の細胞外ドメインから成るネトリン-1受容体の断片を含む化合物である、組成物。
【請求項２】
前記ネトリン-1干渉薬が、ネトリン-1受容体DCC、UNC5A、UNC5B、UNC5CもしくはUNC5Dの細胞外ドメインを含む化合物である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記ネトリン-1干渉薬が、ネトリン-1受容体の細胞外ドメインおよび抗体Fc部分を含む融合タンパク質である、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記ネトリン-1干渉薬が、ネトリン-1受容体に結合することができ、この結合がネトリン-1受容体によるアポトーシス誘導をブロックするネトリン-1の能力を妨害することができるペプチド部分を含む化合物である、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記ネトリン-1の発現が前記化学療法薬に依存する癌の治療のための、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記化学療法薬が、癌細胞におけるネトリン-1受容体の上方制御を誘導することができる、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記化学療法薬が、癌細胞におけるDCCの上方制御を誘導することができる、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記化学療法薬が、癌細胞におけるUNC5AまたはUNC5Bの上方制御を誘導することができる、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記癌が、転移性乳癌、非小細胞肺癌、侵襲性神経芽細胞腫、膵臓腺癌、原発性黒色腫(n=7)、黒色腫転移(n=6)、卵巣癌、神経膠芽腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、侵襲性B細胞リンパ腫、肉腫、腎臓腺癌、頭部および頸部癌、精巣癌、腎臓癌、胃癌、子宮癌から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ネトリン-1受容体を有し、ネトリン-1を発現または過剰発現する癌を治療するために、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターと組み合わせて患者に使用する抗癌医薬品として使用するための、癌細胞においてネトリン-1の発現または過剰発現を誘導することができる、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、またはパクリタキセルから選択される化学療法薬を含む医薬組成物であって、前記ネトリン-1干渉薬が、ネトリン-1に結合する抗体、ネトリン-1受容体に結合する抗体、前記ネトリン-1受容体の細胞外ドメインから成るネトリン-1受容体の断片を含む化合物である、組成物。
【請求項１１】
ネトリン-1を発現または過剰発現する癌を治療するために、癌細胞におけるネトリン-1の発現または過剰発現を誘導することができる、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、またはパクリタキセルから選択される化学療法薬と組み合わせて、またはその後に、患者に使用する抗癌医薬品として使用するための、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む医薬組成物であって、前記ネトリン-1干渉薬が、ネトリン-1に結合する抗体、ネトリン-1受容体に結合する抗体、前記ネトリン-1受容体の細胞外ドメインから成るネトリン-1受容体の断片を含む化合物である、組成物。
【請求項１２】
患者に同時に、別々に、または順次に投与するための、化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌を治療するための新たな組合せ組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
軸索ナビゲーションの手掛かりとして当初発見された(1)可溶性タンパク質、ネトリン-1が、アポトーシスを調節することによって癌の進行に重要な役割を果たす、と最近提唱された(2、3)。実際に、ネトリン-1受容体DCCならびにUNC5H、すなわち、UNC5A、UNC5B、UNC5CまたはUNC5Dとも呼ばれるUNC5H1、UNC5H2、UNC5H3およびUNC5H4は、いわゆる依存性受容体ファミリーに属する(4)(5)(6)。これらの依存性受容体は、これらのリガンドと結合していないと細胞死を誘導する能力を備えているので、それぞれのリガンドに応じて細胞状態を作り出し(7)、その結果、リガンドを利用できない状況では、発症する腫瘍細胞を排除するので、腫瘍抑制因子として作用することができる(2、8)。このようにして、アポトーシス促進活性が活性化されていないDCC受容体を有するマウスは、自然発生的に結腸癌を発症し、腸腫瘍に進行する傾向が高かった(9)。同様に、マウスにおいて、胃腸管におけるUNC5H3/Cの不活性化が、腸腫瘍進行と関係付けられている(10)。
【０００３】
したがって、依存性受容体の概念によると、侵襲性のヒト腫瘍の進行には、この死の経路を不活性化することが必要であろう。この生存優位性を実現するためには、少なくとも3つの手段:ヒト結腸癌においてDCCまたは/およびUNC5Hについて詳しく述べられているように(10〜13)、ネトリン-1受容体発現の欠如;DCCまたはUNC5Hによって誘導される下流の死シグナル伝達の欠如;リガンドの自己分泌またはパラ分泌発現の増大がある。興味深いことに、ネトリン-1は、転移性乳癌、肺癌、卵巣癌および膵臓癌のかなりの部分、炎症関連結腸癌および神経芽細胞腫において上方制御されていることが示された(14〜19)。概念実証研究によって、インビトロおよび癌のマウスまたはニワトリモデルにおいて、ネトリン-1 siRNAによるネトリン-1のサイレンシングまたはネトリン-1受容体相互作用による干渉は、腫瘍細胞死ならびに腫瘍成長および転移の阻害に関係があることが示された(14〜18)。これらの最近の研究は、ネトリン-1がその受容体に結合するのを妨げることが、ネトリン-1が自己分泌またはパラ分泌様式で発現している癌の大部分において、効果的な抗癌戦略となり得ることを提唱した。初期の薬物開発は、ネトリン-1との受容体相互作用を模倣する生物学的薬剤-生物製剤-に焦点が当てられた(20)。
【０００４】
その他のいくつかの研究では、血管新生の調節が腫瘍の進行を阻害するのに役立つことを期待して、ネトリン-1およびその受容体の血管新生における役割に焦点が当てられた。US2006/0153840は、ネトリン-1受容体活性の変更が血管新生を活性化または阻害し得ることを開示し、血管新生を減少または増加させる戦略を提案している。この文書は、血管新生促進物質としてのネトリン-1受容体またはその断片、さらに血管新生促進ポリペプチドとしてのネトリン-1受容体およびイムノグロブリンのFc断片を含む融合タンパク質の使用を開示している。この文書は、ネトリン-1誘導性抗血管新生効果は、ネトリン-1がUNC5H2(UNC5Bとも呼ばれる)などのその受容体に利用されるのをブロックすることによって反転し、ネトリン-1受容体活性を阻害またはブロックすると、血管新生を強力に誘導することができることを教示している。WO2010/059821は、UNC5Bが静止状態の成人脈管構造では下方制御されているが、移植された腫瘍では血管新生の開始中に再発現し、UNC5Bを発現する新生血管をアゴニスト(ネトリン-1)で刺激すると、血管新生の開始が阻害され、UNC5Bの機能が遺伝的に欠如していると、ネトリン-1が媒介する血管新生阻害が低下し得ることを開示している。この文書は、UNC5B活性化は血管新生の開始を阻害し、UNC5Bは有望な抗血管新生標的であることを示唆している。次に、この文書は、UNC5Bの活性を阻害するか、またはネトリン-1がこの受容体に結合するのを阻害する抗UNC5B抗体を、抗血管新生剤および癌などの異常な血管新生を特徴とする疾患を治療する薬剤として使用することを提案している。WO2006/054000は、抗ネトリン-1抗体の抗血管新生剤としての使用および癌治療用の組成物におけるその使用について開示している。後の文書はいずれも、既存の化学療法薬に対して抗UNC5Bまたは抗ネトリン-1抗体を組み合わせることをさらに提案している。これらの矛盾した開示では一貫した実験結果は得られていないので、当業者が、抗ネトリン-1または抗UNC5H2抗体の、血管新生はもちろん、潜在的抗腫瘍活性に対する影響について何らかの明確な教示にたどり着くことは困難である。当業者が、増殖する腫瘍細胞に影響を及ぼすが、血管を形成する静止状態の上皮細胞には影響を及ぼさないことが知られている化学療法薬と、抗ネトリン-1または抗UNC5H2抗体をベースにした抗血管新生治療との間を生物学的に関係付けることも困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】US2006/0153840
【特許文献２】WO2010/059821
【特許文献３】WO2006/054000
【特許文献４】WO2007/099133
【特許文献５】WO2012025618
【特許文献６】US5,525,711
【特許文献７】US4,711,955
【特許文献８】US5,792,608
【特許文献９】EP302175
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Harlowら編、1988年「Antibodies: a laboratory manual」
【非特許文献２】Methods in Enzymology 153(1987)、385〜516
【非特許文献３】Bitter(Methods in Enzymology 153 (1987)、516〜544)
【非特許文献４】Sawers(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996))
【非特許文献５】Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7 (1996)、500〜4)
【非特許文献６】Hockney(Trends in Biotechnology 12 (1994)、456〜463)
【非特許文献７】Griffiths(Methods in Molecular Biology 75 (1997)、427〜440)
【非特許文献８】Sambrook and Russell (2001)、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、CHS Press、Cold Spring Harbor、NY USA
【非特許文献９】Methods in Yeast Genetics、A Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1990年
【非特許文献１０】Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、本発明は、ネトリン-1干渉をベースにした治療と、腫瘍細胞によるストレス応答の結果として腫瘍細胞が生存するためにますますネトリン-1に依存するようにさせる化学療法薬とを組み合わせる生物学的な基本原理を実現する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実際に、早期臨床評価においてネトリン-1干渉をベースにした治療に好適な癌患者の一部を調査するうちに、本発明者らは、従来の化学療法治療のネトリン-1およびネトリン-1受容体発現に対する影響を調べることにした。ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、パクリタキセル(タキソール)およびシスプラチンは、実際に、「古典的な」化学療法で、局在型および進行型の腫瘍の患者の両方の乳癌、肺癌、結腸直腸癌ならびにその他の種類の固形腫瘍を有する患者の管理に依然として広く使用されている。しかし、その有効性にもかかわらず、従来の薬剤の使用は、毒性および抵抗性の出現のため限定されている。本発明者らはここで、これらの化学療法治療は、様々な細胞機構で作用するが、ネトリン-1およびその受容体の顕著な増加の引き金となることを示す。本発明者らは、インビトロにおいて、この増加がネトリン-1干渉による細胞死誘導の増加と関係することを示す。結果として、本発明者らは、ドキソルビシンとネトリン-1干渉薬候補の組合せが、動物モデルにおいて腫瘍成長阻害効果を高めることを示す。
【０００９】
ここで示した前臨床データは、従来の薬物およびネトリン-1干渉の組合せが、低濃度の従来の薬物で、予期せぬ有効性の増大をもたらし得るという見解を裏付ける。一緒に考え合わせると、これらのデータは、従来の化学療法と組み合わせたネトリン-1干渉をベースにした療法は、相乗的な抗癌効果と関係するという論理的根拠を裏付ける。ネトリン-1干渉をベースにした療法は2つの正の効果を有すると考えられ、1つ目はネトリン-1/受容体結合の阻害によるアポトーシスまたは細胞死の誘導であり(いわゆるネトリン-1受容体誘導性アポトーシスの促進)、2つ目は、化学療法が誘導したネトリン-1および/または受容体の発現の増加の有害な恐れのある作用は、ネトリン-1/受容体結合およびその抗アポトーシス効果の阻害によって帳消しになることである。
【００１０】
本発明では、組成物および方法は、ネトリン-1を発現または過剰発現する癌を治療するためであり、この発現または過剰発現は、癌自体に関係があるか、または化学療法薬治療のみによって誘導されるか、またはその両方である。
【００１１】
本発明の目的は、化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを、それらを必要とする患者に投与することを含む併用抗癌治療方法である。化学療法薬およびネトリン-1干渉薬は有効量である。
【００１２】
本発明の別の目的は、患者に化学療法薬と組み合わせて使用する抗癌医薬品として使用するための、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む組成物である。本発明はまた、化学療法薬で治療する患者に抗癌医薬品として使用するための、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む組成物に関する。
【００１３】
本発明の別の目的は、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターと組み合わせて患者で使用する抗癌医薬品として使用するための化学療法薬を含む組成物である。本発明はまた、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターで治療する患者に抗癌医薬品として使用するための化学療法薬を含む組成物に関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、患者に同時に、別々に、または順次に投与するための、化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む組成物または構成要素のキットである。
【００１５】
本発明の別の目的は、抗癌医薬品または抗癌治療として使用するために、患者に同時に、別々に、または順次に投与するための、化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む組成物または構成要素のキットである。
【００１６】
本発明の別の目的は、薬学的に許容される担体または媒体中の化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む組成物である。
【００１７】
本発明の別の目的は、抗癌医薬品として使用するための、薬学的に許容される担体または媒体中の化学療法薬およびネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターを含む組成物である。
【００１８】
さらに別の目的は、患者の化学療法薬との併用治療のために企図された抗癌医薬品を調製するための、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターの使用である。
【００１９】
さらに別の目的は、患者のネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターとの併用治療のために企図された抗癌医薬品を調製するための、化学療法薬の使用である。
【００２０】
さらに別の目的は、併用抗癌医薬品を調製するための、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターおよび化学療法薬の使用である。
【００２１】
さらに別の目的は、患者に同時に、別々に、または順次に投与するための併用抗癌医薬品組成物または構成要素のキットを調製するための、ネトリン-1干渉薬またはインビボにおいてネトリン-1干渉薬を発現することができるベクターおよび化学療法薬の使用である。
【００２２】
本発明の重要な特徴によると、以下にさらに説明するように、化学療法薬は癌細胞においてネトリン-1の過剰発現を誘導する薬物であり、ネトリン-1干渉薬はネトリン-1受容体誘導性アポトーシスまたは細胞死を促進する。
【００２３】
患者は、ほ乳動物、より特定するとヒトであってもよい。
【００２４】
治療的処置には、予防および療法が包含される。
【００２５】
これらの目的のためにより詳細な実施形態をここで記載する。
【００２６】
化学療法薬は特に、癌細胞においてネトリン-1の過剰発現を誘導する薬物である。薬物がネトリン-1過剰発現を誘導することの判定は、細胞系または生検の細胞などの任意の癌性細胞で容易に実施することができる。一実施形態では、アッセイは、治療する癌、例えば、生検の細胞で実施する。別の実施形態では、アッセイは、治療する癌に典型的な、細胞系などの細胞で実施する。別の実施形態では、アッセイは、A549またはH460細胞系で行う。アッセイは、化学療法薬で処理した細胞と処理していない細胞の間のネトリン-1遺伝子発現を比較することを含んでいてもよい。発現は、PCR、特に定量的RT-PCRによって、例えば、本明細書で開示し、提供したプライマー(配列番号11および12)を使用して、測定することができる。この過剰発現を誘導する薬物ファミリーにおける薬物の分類は、以下の材料および方法で記載した方法に従って、図1を参照することによって、A549またはH460細胞系で簡単に実施することができる。
【００２７】
化学療法薬は特に、細胞傷害性薬である。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態では、薬物は、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、パクリタキセル(例えば、タキソール)、またはシスプラチンである。
【００２９】
一実施形態では、薬物は細胞傷害性抗生物質である。細胞傷害性抗生物質は、アクチノマイシン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンであってもよい。アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシンまたはエピルビシンであってもよい。
【００３０】
一実施形態では、薬物はアルキル化剤である。アルキル化剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金誘導体、またはシクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、チオテパなどのその他のアルキル化剤であってもよい。その他の種類には、エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド、トポイソメラーゼ阻害剤(カンプトテシン)、例えば、イリノテカン、トポテカン、DNAの副溝のアルキル化剤、例えば、トラベクテジン(YONDELIS)、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセドが含まれる。
【００３１】
一実施形態では、薬物はタキサンまたはその他のチューブリン標的剤である。タキサンは、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはエリブリン(最近乳癌用に承認された)であってもよい。
【００３２】
一実施形態では、薬物は、
-  乳癌ホルモン療法薬:例えば、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、ファスロデックス、
-  前立腺ホルモン療法薬:例えば、LHRHアゴニスト、ビカルタミド、アビラテロン、
-  モノクローナル抗体:例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、
-  キナーゼ阻害剤:例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アファチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、パゾパニブ、クリゾチニブ、アキシチニブ
などの抗悪性腫瘍薬である。
【００３３】
本発明は、化学療法薬の投与計画の変化を含んでいても、または含んでいなくてもよい。しかし、ネトリン-1干渉薬とによって生じる相乗効果により、患者により低量の投与計画を採用することが可能になる。当業者は、本発明が提供する併用治療の場合に、最適な投与計画を決定することができる。
【００３４】
本発明はまた、少なくとも2種類の化学療法薬が治療プロトコルに組み込まれているという意味で、化学療法が既に併用化学療法である、患者の併用治療に関する。すなわち、本発明の様々な目的による方法、組成物、構成要素のキットおよび使用は、少なくとも1種のネトリン-1干渉薬と少なくとも2種類(例えば、2、3、4または5種類)の化学療法薬とを組み合わせる。
【００３５】
ネトリン-1干渉薬は、ネトリン-1がネトリン-1受容体と相互作用する能力を干渉するか、またはネトリン-1がネトリン-1受容体の二量体化または多量体化を誘導する能力を干渉するか、またはより一般的には、ネトリン-1受容体誘導性アポトーシスを促進する薬物である。当業者は、ネトリン-1とその受容体との間の干渉、ネトリン-1と受容体の間の相互作用もしくは結合の減少または阻害、あるいは、ネトリン-1がネトリン-1受容体の二量体化もしくは多量体化を誘導する能力の減少または阻害のいずれか、それによるネトリン-1受容体誘導性アポトーシスの促進を開示しているWO2007/099133を参照してもよい。
【００３６】
一実施形態では、干渉薬は、2本鎖RNA(dsRNA)(すなわち、長さが10から50ヌクレオチドであってもよい)であり、ネトリン-1をコードする遺伝子の発現を低下させる小分子干渉RNAまたはsiRNAである。第1の鎖の一部は、標的遺伝子に相補的で、すなわち、標的遺伝子にハイブリダイズするために十分な相補性を有し、例えば、標的遺伝子またはその一部と少なくとも80%の同一性がある。AP:ヒトネトリン-1 mRNA配列受託番号:NM_004822。使用可能なsiRNA配列:配列NM_004822の94〜114位に対応する配列番号10 AAGCUGGACGCAGCAUGAUGC(センス)。
【００３７】
第2の実施形態では、干渉薬は、ネトリン-1に結合する薬物であり、干渉薬が結合することによってネトリン-1がその受容体に結合することができなくなるか、またはネトリン-1受容体、特に、DCCおよび/またはUNC5の二量体化/多量体化を誘導することができなくなる。一実施形態では、この薬物はネトリン-1に結合する抗体である。ネトリン-1に特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が好ましい。別の実施形態では、この薬物は、ネトリン-1受容体の細胞外ドメインまたは前記細胞外ドメインの断片を含む化合物である。例えば、ネトリン-1受容体の細胞外ドメインまたは前記細胞外ドメインの断片のアミノ酸配列は、UniProt配列ID[細胞外ドメインの位置範囲]にある:UNC5A:Q6ZN44[aas26〜306または断片34〜240];UNC5B:Q8IZJ1[aas27〜377または断片29〜244];UNC5C:O95185[aas41〜380または断片61〜258];UNC5D:Q6UXZ4[aas33〜379];DCC:P43146[aas26〜1097]。この薬物は、ネトリン-1に結合することができる。ネトリン-1受容体は、DCC、UNC5A、UNC5B、UNC5CまたはUNC5Dであってもよい。本発明の方法は、それぞれが、異なるネトリン-1受容体の細胞外ドメインまたはその一部を含む2種以上の化合物を使用してもよい。例えば、薬物は、DCCおよびUNC5、例えば、UNC5Aの細胞外ドメインまたはその一部を含む2種の化合物を含む。
【００３８】
第3の実施形態では、この干渉薬はネトリン-1受容体に結合する薬物である。ネトリン-1受容体は、DCC、UNC5A、UNC5B、UNC5CまたはUNC5Dであってもよい。本発明の方法は、それぞれが異なるネトリン-1受容体に結合する、2種以上の干渉薬を使用してもよい。例えば、薬物は、1つはDCCに結合し、他方はUNC5、例えば、UNC5Aに結合する、2種類の干渉薬を含む。一実施形態では、この薬物はネトリン-1受容体に結合する抗体である。ネトリン-1受容体に特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体が好ましい。別の実施形態では、この薬物は、ネトリン-1受容体に結合することができる化合物、特にペプチド部分を含む化合物または小分子であり、この結合はネトリン-1がネトリン-1受容体によるアポトーシス誘導をブロックする能力、特に受容体の二量体化または多量体化を誘導する能力を妨害することができる。
【００３９】
「抗体」は、ネトリン-1に結合することができ、この結合によってネトリン-1とネトリン-1受容体の間の結合を妨げる任意の抗体を称するために、最も広い意味で使用する。
【００４０】
「抗体」には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、1本鎖抗体、および所望する生物学的活性を示すこれらの抗体の抗原結合断片が含まれる。モノクローナル抗体は、マウス、キメラであってもよく、またはヒト化されていてもよい。「抗体」という用語は、任意の完全長抗体または少なくとも1個の抗原組合せ部位を含むか、もしくはそれから構成され、抗原化合物の少なくとも1個の抗原決定基に前記抗体を結合させる抗体の機能的断片(遺伝子操作によって得られるか否かにかかわらず)を意味する。抗体断片の例として、断片Fab、Fab'、F(ab')2および1本鎖可変断片(scFv鎖)を挙げることができる。本発明で使用した抗体は、抗原に特異的な抗体である。好ましくは、モノクローナル抗体または単一特異的ポリクローナル抗体で、すなわち、それらは唯一のエピトープを特異的に認識する。本発明の場合に有用な、モノクローナル抗体もしくは単一特異的ポリクローナル血清またはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られた抗体の生成は、従来技術である。
【００４１】
抗ネトリン1ポリクローナル抗体は、それ自体当業者にとって公知の方法に従って、特に、ウサギ、マウスなどの動物を選択したアミノ酸配列を用いて免疫し、例えば、受容体を含有する免疫吸着剤上で得られた抗血清を収集し、次に、除去することによって得ることができる。
【００４２】
ネトリン-1アミノ酸配列(シグナルペプチドを含まない)は、配列番号13に示した通りで、ネトリン-1は、抗体を設計するために全体、または一部を使用することができる。
【００４３】
一般的に、モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(1975)によって記載されたリンパ球融合およびハイブリドーマ培養の従来方法に従って得ることができる。モノクローナル抗体を調製するその他の方法も公知である(Harlowら編、1988年「Antibodies: a laboratory manual」)。モノクローナル抗体は、ほ乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギまたは人類なども)を免疫し、ハイブリドーマを作り出すリンパ球融合技術を使用して(KohlerおよびMilstein、1975)調製することができる。
【００４４】
このような通例の技術の代替技術も存在する。例えば、ハイブリドーマからクローニングされた核酸を発現することによって、モノクローナル抗体を生成することも可能である。ファージディスプレイ技術によって、典型的に、ファージの表面で遺伝子ライブラリーVを表す繊維状ファージ[例えば、大腸菌(E. coli)にはfUSE5、Scott、1990]であるベクターに抗体のcDNAを導入することによって、抗体を生成することもできる。これらの抗体ライブラリーを構築するプロトコルは、Marksら(1991)によって記載されている。シグナル配列を有する完全長ネトリン-1に対応するcDNA(配列番号14)またはその適切な断片は、これらの方法によってモノクローナル抗体を生成するために使用される。
【００４５】
好ましい実施形態では、干渉薬はネトリン-1受容体の細胞外ドメインまたは前記細胞外ドメインの断片を含む。ネトリン-1受容体は、DCC、UNC5A、UNC5B、UNC5CまたはUNC5Dであってもよい。
【００４６】
一実施形態では、細胞外ドメインまたはその一部は、抗体のFc部分に結合している。好ましい実施形態では、Fc部分はヒトIgGのFcまたはその一部である。ヒトIgGは、すなわち、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3であってもよい。好ましい実施形態では、IgGはIgG1である。
【００４７】
一実施形態では、融合タンパク質は、1本鎖であり、このことは、タンパク質が、それぞれ、DCCの4番目もしくは5番目のフィブロネクチン様ドメインを含むか、または構成するDCC断片あるいはUNC5の2個のIg様ドメインを含むか、または構成するUNC5断片、および化合物の薬剤としてのパラメーターを改善するペプチドまたはタンパク質配列からできていることを意味する。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、2本鎖であり、このことは、融合タンパク質が、それぞれがDCCの4番目または5番目のフィブロネクチン様ドメインまたはUNC5の2個のIg様ドメインを含むか、もしくは構成する2本の鎖、および両鎖を好ましくは1個または複数、例えば、2個のジスルフィド結合によって一緒に結合させる抗体Fc部分からできていることを意味する。
【００４９】
一実施形態では、薬物は、DCCの5番目のフィブロネクチンドメイン(Fn5または5Fbn)を含む。好ましくは、薬物は、抗体Fc部分に融合したこのFn5を含むDCC-融合タンパク質を含む。好ましい実施形態では、Fc部分はヒトIgGのFcまたはその一部である。ヒトIgGは、すなわち、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3であってもよい。好ましい実施形態では、IgGはIgG1である。DCC遺伝子は、例えば、NCBIからID 1630(2012年7月14日にアップデート)として入手可能で、2012年7月11日にアップデートされたUniprot P43146としてDCC受容体タンパク質をコードする。本発明において有用で、Fn5を含むDCC-融合タンパク質は、WO2012025618に記載されている。一実施形態では、融合タンパク質は、WO2012025618の配列番号2、3または4のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、融合タンパク質は、WO2012025618の配列番号1のDNA配列によってコードされる。Fn5を含む融合タンパク質のその他の例は、WO2007099133、Fitamantら(14)およびDelloye-Bourgeois(16)で記載されたグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含むDCC-5-フィブロネクチン融合タンパク質(DCC-5Fbn-GST)である。
【００５０】
一実施形態では、薬物は、UNC5の2個のIg様ドメインを含む。好ましくは、薬物は、抗体Fc部分に融合したUNC5の2個のIg様ドメインを含むUNC5融合タンパク質を含む。ヒトIgGは、すなわち、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3であってもよい。好ましい実施形態では、IgGはIgG1である。一実施形態では、UNC5はUNC5Aである。別の実施形態では、UNC5はUNC5Bである。別の実施形態では、UNC5はUNC5Cである。さらに別の実施形態では、UNC5はUNC5Dである。
【００５１】
一実施形態では、UNC5A融合物中のUNC5Aタンパク質は、配列番号1のアミノ酸20から217を含むか、または構成される。この融合タンパク質はさらに、配列番号1のアミノ酸220から446を含むか、または構成されるIgG1 Fcを含んでいてもよい。このFcは、例えば、GTなどのリンカーによってUNC5Aタンパク質に融合している。一実施形態では、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列:Kappa2シグナルペプチド配列:aas1から19;UNC5AのIg様ドメイン:aas20から217;リンカー:aas218〜219;ヒトIgG1 Fc: aas220から446を含むか、または構成されるUNC5Aタンパク質のUNC5A融合物に関する。一実施形態では、成熟した融合タンパク質は、Kappa2シグナルペプチド配列を含まない。好ましい実施形態では、融合タンパク質は2本鎖である。本発明はまた、配列番号1の20〜217アミノ酸配列またはアミノ酸20〜446の全長と90%以上、好ましくは96、95、94、93、92もしくは91%を上回るパーセント同一性を有する配列変種を包含する。アミノ酸置換は、例えば、20〜217アミノ酸配列または配列番号1の全長の9、72、74、87、144、164、170、193および/または210位の1カ所または数カ所で生じてもよい。
【００５２】
別の実施形態では、UNC5B融合物中のUNC5Bタンパク質は、配列番号2のアミノ酸20から215を含むか、または構成される。この融合タンパク質はさらに、配列番号2のアミノ酸218から444を含むか、または構成されるIgG1 Fcを含んでいてもよい。このFcは、例えば、GTなどのリンカーによってUNC5Bタンパク質に融合している。一実施形態では、本発明は、配列番号2のアミノ酸配列:Kappa2シグナルペプチド配列:aas1から19;UNC5BのIg様ドメイン:aas20から215;リンカー:aas216〜217;ヒトIgG1 Fc:aas218から444を含むか、または構成されるUNC5Bタンパク質のUNC5B融合物に関する。一実施形態では、成熟した融合タンパク質は、Kappa2シグナルペプチド配列を含まない。好ましい実施形態では、融合タンパク質は2本鎖である。本発明は、配列番号2の20〜215アミノ酸配列またはアミノ酸20〜444の全長と90%以上、好ましくは96、95、94、93、92もしくは91%を上回るパーセント同一性を有する配列変種を包含する。アミノ酸置換は、例えば、20〜215アミノ酸配列または配列番号2の全長の29、74、100、109、113、146、149、155、172、184、189、201、213および/または214位の1カ所または数カ所で生じてもよい。
【００５３】
さらに別の実施形態では、UNC5C融合物中のUNC5Cタンパク質は、配列番号3のアミノ酸20から217を含むか、または構成される。この融合タンパク質はさらに、配列番号3のアミノ酸220から446を含むか、または構成されるIgG1 Fcを含んでいてもよい。このFcは、例えば、GTなどのリンカーによってUNC5Cタンパク質に融合している。一実施形態では、本発明は、配列番号3のアミノ酸配列:Kappa2シグナルペプチド配列:aas1から19;UNC5CのIg様ドメイン:aas20から217;リンカー:aas218〜219;ヒトIgG1 Fc:aas220から446を含むか、または構成されるUNC5Cタンパク質のUNC5C融合物に関する。一実施形態では、成熟した融合タンパク質は、Kappa2シグナルペプチド配列を含まない。好ましい実施形態では、融合タンパク質は2本鎖である。本発明は、配列番号3の20〜217アミノ酸配列またはアミノ酸20〜446の全長と90%以上、好ましくは96、95、94、93、92もしくは91%を上回るパーセント同一性を有する配列変種を包含する。アミノ酸置換は、例えば、20〜217アミノ酸配列、または配列番号3の全長の33、66、109、129、136、178、189および/または211位の1カ所または数カ所で生じてもよい。
【００５４】
さらに別の実施形態では、UNC5D融合物中のUNC5Dタンパク質は、配列番号4のアミノ酸20から217を含むか、または構成される。この融合タンパク質はさらに、配列番号4のアミノ酸220から446を含むか、または構成されるIgG1 Fcを含んでいてもよい。このFcは、例えば、GTなどのリンカーによってUNC5Dタンパク質に融合している。一実施形態では、本発明は、配列番号4のアミノ酸配列:Kappa2シグナルペプチド配列:aas1から19;UNC5DのIg様ドメイン:aas20から217;リンカー:aas218〜219;ヒトIgG1 Fc:aas220から446を含むか、または構成されるUNC5Dタンパク質のUNC5D融合物に関する。一実施形態では、成熟した融合タンパク質は、Kappa2シグナルペプチド配列を含まない。好ましい実施形態では、融合タンパク質は2本鎖である。本発明は、配列番号4の20〜217アミノ酸配列またはアミノ酸20〜446の全長と90%以上、好ましくは96、95、94、93、92もしくは91%を上回るパーセント同一性を有する配列変種を包含する。アミノ酸置換は、例えば、20〜217アミノ酸配列、または配列番号4の全長の38、79、80、115、131、178、186、201および/または212位の1カ所または数カ所で生じてもよい。
【００５５】
本発明は、以下の核酸分子を提供する:
-  UNC5Aタンパク質をコードする配列番号5;nt(ヌクレオチド);nt1〜6 HindIII制限部位、nt7〜15 kozak配列、nt16〜72 Kappa2シグナル配列、nt73〜666 UNC5Aコーディング配列、nt667〜672 XpnI制限部位;
-  UNC5Bタンパク質をコードする配列番号6;nt(ヌクレオチド);nt1〜6 HindIII制限部位、nt7〜15 kozak配列、nt16〜72 Kappa2シグナル配列、nt73〜660 UNC5Bコーディング配列、nt661〜666 XpnI制限部位;
-  UNC5Cタンパク質をコードする配列番号7;nt(ヌクレオチド);nt1〜6 HindIII制限部位、nt7〜15 kozak配列、nt16〜72 Kappa2シグナル配列、nt73〜666 UNC5Cコーディング配列、nt667-672 XpnI制限部位;
-  UNC5Dタンパク質をコードする配列番号8;nt(ヌクレオチド);nt1〜6 HindIII制限部位、nt7〜15 kozak配列、nt16〜72 Kappa2シグナル配列、nt73〜666 UNC5Dコーディング配列、nt667-672 XpnI制限部位;
-  ヒトIgG1 Fc(ヒンジ+CH2+CH3 DNA配列、nt7〜693)ならびに1〜6nt位にKpnI制限部位および694〜699位にXbaI制限部位をコードする配列番号9。
【００５６】
本発明の核酸分子は、DNA分子またはRNA分子であってもよい。それらはまた、オリゴヌクレオチドチオホスフェート、置換されたリボオリゴヌクレオチド、LNA(ロックド核酸)分子、PNA(ペプチド核酸)分子、GNA(グリコール核酸)分子、TNA(トレオース核酸)分子、モルホリノポリヌクレオチド、またはアンタゴmir(コレステロール結合)核酸分子または当業界で公知のそれらの任意の改変物などの核酸類似体であってもよい(例えば、改変物の例については、US5,525,711、US4,711,955、US5,792,608またはEP302175を参照のこと)。本発明の場合、核酸分子は、天然の核酸残基または人工的に生成された核酸残基であってもよい。核酸残基の例は、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U)、キサンチン(X)およびヒポキサンチン(HX)である。本発明の場合、チミン(T)およびウラシル(U)は、それぞれの種類の核酸分子に応じて、同義に使用することができる。例えば、当業者にはよくわかるように、DNAの一部としてのチミン(T)は、対応する転写されたmRNAの一部としてのウラシル(U)に対応する。本発明の核酸分子は、1本鎖または2本鎖、直鎖状または環状、天然または合成であってもよく、特に記載しなければ、大きさの制限もない。核酸分子はまた、本明細書で以下にさらに詳述したプロモーターを含んでいてもよい。プロモーターは、同種または異種であってもよい。特定の実施形態では、本明細書で提供した核酸分子は、このプロモーターの制御下にある。
【００５７】
全般的に、本明細書で使用したように、本明細書で提供した配列の核酸配列を含むポリヌクレオチドはまた、前記核酸配列から構成されるポリヌクレオチドであってもよい。
【００５８】
本発明の核酸分子は、ベクターにクローニングすることができる。当業者であれば、ベクターおよびベクターの調製方法およびそれらの使用を記載した                                            WO2007/099133を参照して、本発明の実施で使用することができる。本明細書で使用した「ベクター」という用語は特に、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子操作で通常使用されるその他のベクターを意味する。好ましい実施形態では、これらのベクターは、細胞、真菌細胞のような真核細胞、酵母などの微生物の細胞または原核細胞の形質転換に適している。特に好ましい実施形態では、このようなベクターは、例えば、本発明の核酸分子を転写するために、細菌細胞の安定した形質転換に適している。例えば、ベクターは、pUC18であってもよい。特に、WO2007/099133は、WO2007/099133の実施例1において7800および7809として同定されたベクターなどの、DCCをベースにした融合タンパク質を発現するベクターを開示している。したがって、本発明は、DCC融合タンパク質について、WO2012025618の配列番号2、3もしくは4の融合タンパク質をコードするベクター、またはWO2012025618の配列番号1のDNA配列のベクターを提供する。
【００５９】
本発明はまた、本明細書で記載し、提供した融合タンパク質をコードする本発明の核酸分子を含有するpUC18などのベクターを提供する。したがって、UNC5に関する限り、本発明は、一緒に融合した配列番号1のアミノ酸20〜217および220〜446、または配列番号1の配列;一緒に融合した配列番号2のアミノ酸20〜215および218〜444、または配列番号2の配列;一緒に融合した配列番号3のアミノ酸20〜217および220〜446、または配列番号3の配列;あるいは、一緒に融合した配列番号4のアミノ酸20〜217および220〜446、または配列番号4の配列をコードする核酸分子を含有するpUC18などのベクターに関する。特に、本発明は、配列番号5の73〜666、または配列番号6の73〜660、または配列番号7の73〜666または配列番号8の73〜666のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するpUC18などのベクターを提供する。これらのベクターはまた、配列番号9のヌクレオチド配列、特にヌクレオチド7〜693を含む。一般的に、ベクターは、真核宿主細胞において、前記核酸分子を発現することができ得る。
【００６０】
提供したベクターは、発現ベクターである。全般的に、発現ベクターは、文献で広く記載されている。発現ベクターは、選択マーカー遺伝子および宿主において複製を確実にする複製開始点を含有していてもよい。発現ベクターは、プロモーターを含んでいてもよい。さらに、転写用の終止シグナルを含んでいてもよい。プロモーターと終止シグナルの間に、好ましくは少なくとも1個の制限部位または発現を所望する核酸配列/分子の挿入を可能にするポリリンカーがあることが好ましい。一実施形態では、ベクターは、インビボにおけるタンパク質の発現を可能にし、ベクターは、患者に投与されると、インサイチューでタンパク質を発現することができる。
【００６１】
本明細書で提供したベクターの生成において、本発明の状況、例えば、本明細書で記載したようなUNC5-融合タンパク質の発現を使用するために適したプロモーターを既に含む先行技術で公知の発現ベクターを利用する際、得られたベクターには、好ましくは本発明の状況で使用するために適したプロモーターが1つだけ含まれるように、核酸分子をベクターに挿入することは理解されよう。プロモーターは、一般的に、異種または同種であってもよい。本明細書で記載したベクターはまた、複数のプロモーターを包含していてもよく、それぞれのプロモーターは異種または同種であってもよい。当業者には、このような挿入がどのように実践できるかは公知である。例えば、プロモーターは、ライゲーション前に核酸構築物または発現ベクターから切除することができる。
【００６２】
本発明によるタンパク質は、組換え手段によって生成することが好ましい。好ましくは、タンパク質は、真核細胞において発現させ、その後ポリペプチドを単離し、通常、薬学的に許容される純度まで精製する。タンパク質発現では、それらのタンパク質をコードする核酸は、標準的方法によって発現ベクターに挿入する。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞のような適切で安定的な真核宿主細胞で実施し、タンパク質は細胞(上清または溶解後の細胞)から回収する。HEK293細胞は、この目的に非常に適していると考えられ、特定の実施形態となる。
【００６３】
一実施形態では、本発明の核酸分子および/または本明細書で記載したポリヌクレオチドがクローニングされているベクターは、宿主細胞に形質導入、形質転換または遺伝子導入されてもよく、または別の方法で導入されてもよい。例えば、宿主細胞は、真核細胞または原核細胞で、好ましくは真核細胞である。非限定的な例として、宿主細胞はほ乳動物細胞である。本明細書で記載した宿主細胞は、本発明で記載し、提供したUNC5-融合タンパク質の作出に特に有用であるものとする。
【００６４】
一般的に、前述した宿主細胞は、本発明で提供した核酸分子または本明細書で記載したベクターを含む、原核細胞または真核細胞、好ましくは真核細胞、あるいはこのような細胞から得られ、本明細書で記載した核酸分子またはベクターを含有する細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、ゲノムに組み込まれた本発明の核酸分子を含有するように、本発明の核酸分子または本明細書で記載したベクターを含み、すなわち、それらによって遺伝子的に改変されている。例えば、本明細書で記載したこのような宿主細胞は、ヒト、酵母または真菌細胞であってもよい。特定の一態様では、宿主細胞は、本発明の核酸分子を転写することができる。本明細書で記載した宿主細胞を作出するために使用する様々な対応する発現系の例の概要は、例えば、Methods in Enzymology 153(1987)、385〜516、Bitter(Methods in Enzymology 153 (1987)、516〜544)、Sawers(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996))、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7 (1996)、500〜4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12 (1994)、456〜463)およびGriffiths(Methods in Molecular Biology 75 (1997)、427〜440)に含まれる。本発明の核酸分子または本明細書で記載したベクターによる宿主細胞の形質転換または遺伝子操作は、例えば、Sambrook and Russell (2001)、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、CHS Press、Cold Spring Harbor、NY USA ; Methods in Yeast Genetics、A Laboratory Course Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1990年で記載されたように、標準的方法によって実施することができる。
【００６５】
本明細書で提供した核酸分子または本明細書で記載したベクターを含む宿主細胞は、HEK293細胞またはHEK293-Freestyle細胞(ヒト胚性腎細胞系293、Invitrogen社)であってもよい。したがって、本発明は、本明細書で提供し記載した、DCCおよびUNC5-融合タンパク質を生成する方法を提供する。この方法は、本明細書で提供し記載した核酸分子を、特に本明細書で記載したような適切な宿主細胞で発現させる工程と、前記細胞または細胞培養上清からDCCまたはUNC5-融合タンパク質を回収する工程とを含む。
【００６６】
本発明は、ネトリン-1干渉薬を含む組成物に関する。特に、本明細書で提供したDCCおよび/またはUNC5-融合タンパク質を含む組成物またはDCCおよび/またはUNC5-融合タンパク質をコードするインビボ発現ベクターに関する。特に、抗ネトリン1抗体を含む組成物にも関する。これらの組成物はさらに、薬学的に許容される担体、賦形剤および/または希釈剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、同じ患者に化学療法薬または治療と組み合わせて使用するために、薬学的な共成分または調合薬として使用してもよく、あるいは医薬組成物または医薬品を形成してもよい。
【００６７】
一実施形態では、本明細書で提供したDCCおよび/またはUNC5-融合タンパク質またはDCCおよび/またはUNC5-融合タンパク質をコードするインビボ発現ベクターおよび化学療法薬の両方は、薬学的に許容される担体、賦形剤および/または希釈剤と共に同じ組成物内にある。
【００６８】
別の実施形態では、それらは別々の薬剤形態で存在する。これは、患者に同時に、別々にまたは順次に投与するために、化学療法薬およびネトリン-1干渉薬を含む組成物または構成要素のキットを形成する。
【００６９】
治療方法、使用および使用のための組成物の一実施形態では、投与は順次である。好ましい実施形態では、化学療法薬を最初に、ネトリン-1干渉薬を後で投与する。両投与の間隔は、少なくとも5、10、15、20または24時間、好ましくは24時間から96時間の間、より好ましくは24時間から72時間の間、特に24時間から48時間の間、例えば、24時間である。一実施形態では、ネトリン-1干渉薬は簡単に、化学療法薬投与の翌日に投与する。
【００７０】
これらの様々な薬剤形態は、十分な量で、本発明の治療方法で使用することができる。
【００７１】
適切な医薬担体の例は、当業界では周知である。それらには、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。このような担体を含む医薬組成物は、周知の従来方法によって製剤化することができる。
【００７２】
これらの医薬組成物は、適切な用量で対象に投与することができ、すなわち、ネトリン-1干渉薬の場合、癌を治療する対象の少なくとも1mg/kg体重、例えば、約10mg/kg体重から約100mg/kg体重である。化学療法薬は、通常の用量か、または組合せが相乗効果を有する限り、通常の用量に比して少ない用量で投与することができる。例えば、化学療法薬の用量は、10、20、30、40、50%またはそれ以上減少される。組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、経口的に(例えば、丸剤、錠剤、バッカル剤、舌下剤、崩壊剤、カプセル、薄膜、溶液もしくは懸濁液、散剤、固形結晶または流体)、直腸内(例えば、坐剤、浣腸)、注射によって(例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、皮内)、吸入によって(例えば、気管支内)、局所、膣内、皮膚上または鼻腔内に行うか、または投与することができる。投薬計画は、主治医および臨床学的要素によって決定する。医学分野では周知のように、患者の任意の一人に対する投薬は、患者の体格、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに同時投与するその他の薬物を含む多くの要素に左右される。
【００７３】
本発明の組成物および医薬組成物は、局所または全身に投与することができる。投与は、静脈内または皮下が好ましい。組成物および医薬組成物はまた、例えば、内部もしくは外部標的部位には微粒子銃送達によって、または動脈内の部位にはカテーテルによって、直接標的部位に投与することができる。
【００７４】
非経口投与用の調製物には、滅菌された水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性/水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝化媒体が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル溶液、または不揮発性油が含まれる。静脈内用媒体には、流体および栄養補液、電解質補液(リンゲルデキストロースをベースにした補液など)などが含まれる。保存剤および、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどのその他の添加剤も存在させることができる。さらに、前述の範囲例を下回る、または上回る用量も、特に前述の要素を考慮して想定される。
【００７５】
既に記載したように、本発明は、ネトリン-1を過剰発現する癌の治療において使用するための医薬組成物に関する。
【００７６】
癌のいくつかの実施形態には、転移性乳癌、非小細胞肺癌、侵襲性神経芽細胞腫、膵臓腺癌、原発性黒色腫(n=7)、黒色腫転移(n=6)、卵巣癌、神経膠芽腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、侵襲性B細胞リンパ腫、肉腫、腎臓腺癌、頭部および頸部癌、精巣癌(例えば、胚性癌腫、奇形腫、卵黄嚢種)、腎臓癌、胃癌、子宮癌が含まれる。癌の例を以下に挙げる。
【００７７】
所与の細胞が依存性受容体DCCおよび/またはUNC5を表面上で発現し、かつ/またはネトリン-1遺伝子発現の顕著な上方制御を示すかどうかを測定する方法は当業界では周知で、限定はしないが、FACS(蛍光標示式細胞分取器)のIHC(免疫組織化学)、定量的PCR(例えば、ヘキサマープライムドcDNA)あるいは発色色素をベースにしたタンパク質検出技術(銀もしくはクーマジーブルー染色など)を組み合わせたウェスタンブロットまたは免疫染色などの溶液中およびゲル、ブロットおよびマイクロアレイでのタンパク質の蛍光およびルミネセンスをベースとした検出方法、ならびに免疫沈降法、ELISA、マイクロアレイおよび質量分析法が含まれる。本発明の場合で治療する癌の例は、本明細書で列挙するが、前述の癌のいずれかの難治性型が含まれる。
【００７８】
本発明はここで、非限定的な方法で、図面を参照することによってさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】ネトリン-1およびその依存性受容体はドキソルビシン処理によって上方制御される。肺癌細胞系A549およびH460をドキソルビシン2μMで24時間処理し、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)で正規化し、非処理細胞と比較したネトリン-1遺伝子発現を定量的PCRで評価した図である。ドキソルビシン処理は、両細胞系において、ネトリン-1遺伝子発現を強く誘導した。結果は、5回の独立した実験の平均値を表す。マンホイットニー検定を実施し、P値を示す。DoxoR、ドキソルビシン;Act.D、アクチノマイシンD;NT、処理せず。
【図２】ネトリン-1およびその依存性受容体はドキソルビシン処理によって上方制御される。A549細胞をドキソルビシン1μMおよび2μMで48時間処理し、ネトリン-1タンパク質レベルをウェスタンブロッティングによって評価した図である。βアクチンで正規化したネトリン-1タンパク質は、ドキソルビシン処理の後、強く蓄積した。  ネトリン-1上方制御を、ドキソルビシン2μMで48時間処理後、免疫蛍光染色によって確認した。核は、ヘキスト染色(青色)によって対比染色した(示さず)。
【図３】ネトリン-1およびその依存性受容体はドキソルビシン処理によって上方制御される。ネトリン-1受容体遺伝子発現を、ドキソルビシン処理後のA549細胞で測定した図である。UNC5A、UNC5BおよびDCC遺伝子発現は、ドキソルビシンによって著しく上方制御され、一方、UNC5CおよびUNC5Dは、あまり著しい変動を示さなかった。マンホイットニー検定を実施し、P値を示す。DoxoR、ドキソルビシン;Act.D、アクチノマイシンD;NT、処理せず。
【図４】ネトリン-1およびその依存性受容体はドキソルビシン処理によって上方制御される。ドキソルビシン誘導ネトリン-1上方制御は、遺伝子転写によって直接左右されることを示した図である。A549細胞をドキソルビシン2μMおよび強力なRNAポリメラーゼ阻害剤アクチノマイシンD(100μg/ml)で24時間処理した。アクチノマイシンDは、ドキソルビシン処理(Doxo.)後のネトリン-1上方制御を強力に阻害した。マンホイットニー検定を実施した。P値を示す。DoxoR、ドキソルビシン;Act.D、アクチノマイシンD;NT、処理せず。Doxo.、ドキソルビシン+アクチノマイシンD。
【図５】ネトリン-1およびその受容体発現が、細胞傷害性薬で処理したいくつかの癌細胞系および卵巣腫瘍で増加していることを示した図である。ネトリン-1(NTN1)、DCC、UNC5BおよびUNC5Dの発現レベルは、定量的RT-PCRによって測定した。乳癌(HBL100)、肺癌(A549、H322、H358)、結腸癌(HCT116、HCT8)、膵臓癌(MiaPacA-2、Panc-1)、神経芽細胞腫(SH-Sy5y、IMR32)、神経膠芽腫(SF767、U87MG)および卵巣癌(PA-1、TOV-112D、NIH-OVCAR3)細胞系を古典的な化学療法薬(ドキソルビシン、シスプラチン、5-フルオロウラシルおよびタキソール)で、各細胞系で算出されたIC50値に応じた様々な薬剤濃度で、24時間の薬物処理で処理した。ネトリン-1およびその受容体遺伝子発現を対照、未処理細胞と比較し、変動を以下のように記録した:-、変化なしまたは下方制御;+、遺伝子発現が対照の2倍から4倍の間;++、対照の4倍から100倍の間;+++、対照の100倍を上回る;n.d.、測定せず;n.e.、発現せず。対照の2倍を上回る遺伝子発現の変動について、陽性の細胞系と決定した。灰色の四角は、抵抗性(すなわち、最大薬物濃度で処理した後、50%を上回る細胞が生存している)癌細胞系を表す。
【図６】ネトリン-1およびその受容体発現が、細胞傷害性薬で処理したいくつかの癌細胞系および卵巣腫瘍で増加していることを示した図である。ネトリン-1(NTN1)、DCC、UNC5BおよびUNC5Dの発現レベルは、定量的RT-PCRによって測定した。乳癌(HBL100)、肺癌(A549、H322、H358)、結腸癌(HCT116、HCT8)、膵臓癌(MiaPacA-2、Panc-1)、神経芽細胞腫(SH-Sy5y、IMR32)、神経膠芽腫(SF767、U87MG)および卵巣癌(PA-1、TOV-112D、NIH-OVCAR3)細胞系を古典的な化学療法薬(ドキソルビシン、シスプラチン、5-フルオロウラシルおよびタキソール)で、各細胞系で算出されたIC50値に応じた様々な薬剤濃度で、24時間の薬物処理で処理した。ネトリン-1およびその受容体遺伝子発現を対照、未処理細胞と比較し、変動を以下のように記録した:-、変化なしまたは下方制御;+、遺伝子発現が対照の2倍から4倍の間;++、対照の4倍から100倍の間;+++、対照の100倍を上回る;n.d.、測定せず;n.e.、発現せず。対照の2倍を上回る遺伝子発現の変動について陽性の細胞系と決定した。灰色の四角は、抵抗性(すなわち、最大薬物濃度で処理した後、50%を上回る細胞が生存している)癌細胞系を表す。
【図７】ネトリン-1およびその受容体発現が、細胞傷害性薬で処理したいくつかの癌細胞系および卵巣腫瘍で増加していることを示した図である。ネトリン-1(NTN1)、DCC、UNC5BおよびUNC5Dの発現レベルは、定量的RT-PCRによって測定した。乳癌(HBL100)、肺癌(A549、H322、H358)、結腸癌(HCT116、HCT8)、膵臓癌(MiaPacA-2、Panc-1)、神経芽細胞腫(SH-Sy5y、IMR32)、神経膠芽腫(SF767、U87MG)および卵巣癌(PA-1、TOV-112D、NIH-OVCAR3)細胞系を古典的な化学療法薬(ドキソルビシン、シスプラチン、5-フルオロウラシルおよびタキソール)で、各細胞系で算出されたIC50値に応じた様々な薬剤濃度で、24時間の薬物処理で処理した。ネトリン-1およびその受容体遺伝子発現を対照、未処理細胞と比較し、変動を以下のように記録した:-、変化なしまたは下方制御;+、遺伝子発現が対照の2倍から4倍の間;++、対照の4倍から100倍の間;+++、対照の100倍を上回る;n.d.、測定せず;n.e.、発現せず。対照の2倍を上回る遺伝子発現の変動について陽性の細胞系と決定した。灰色の四角は、抵抗性(すなわち、最大薬物濃度で処理した後、50%を上回る細胞が生存している)癌細胞系を表す。
【図８】ネトリン-1およびその受容体発現が、細胞傷害性薬で処理したいくつかの癌細胞系および卵巣腫瘍で増加していることを示した図である。ネトリン-1(NTN1)、DCC、UNC5BおよびUNC5Dの発現レベルは、定量的RT-PCRによって測定した。乳癌(HBL100)、肺癌(A549、H322、H358)、結腸癌(HCT116、HCT8)、膵臓癌(MiaPacA-2、Panc-1)、神経芽細胞腫(SH-Sy5y、IMR32)、神経膠芽腫(SF767、U87MG)および卵巣癌(PA-1、TOV-112D、NIH-OVCAR3)細胞系を古典的な化学療法薬(ドキソルビシン、シスプラチン、5-フルオロウラシルおよびタキソール)で、各細胞系で算出されたIC50値に応じた様々な薬剤濃度で、24時間の薬物処理で処理した。ネトリン-1およびその受容体遺伝子発現を対照、未処理細胞と比較し、変動を以下のように記録した:-、変化なしまたは下方制御;+、遺伝子発現が対照の2倍から4倍の間;++、対照の4倍から100倍の間;+++、対照の100倍を上回る;n.d.、測定せず;n.e.、発現せず。対照の2倍を上回る遺伝子発現の変動について陽性の細胞系と決定した。灰色の四角は、抵抗性(すなわち、最大薬物濃度で処理した後、50%を上回る細胞が生存している)癌細胞系を表す。
【図９】ネトリン-1およびその受容体発現が、細胞傷害性薬で処理したいくつかの癌細胞系および卵巣腫瘍で増加していることを示した図である。ネトリン-1は、化学療法治療後の卵巣腫瘍患者で過剰発現する。ハウスキーピング遺伝子として使用したGAPDHで正規化したネトリン-1レベルは、カルボプラチン/タキソール治療の化学療法サイクル前後に得られた患者の腫瘍の卵巣生検から抽出したRNAで分析した。ネトリン-1の中央値レベルを各群について算出した。
【図１０】ネトリン-1サイレンシングは、A549細胞をドキソルビシンに対して感作し、UNC5B受容体によるアポトーシス細胞死を誘導することを示した図である。ネトリン-1サイレンシングは、腫瘍細胞をドキソルビシンに対して感作する。A549細胞を、スクランブルsiRNA(siCTRL、siRNA汎用陰性対照#1、Sigma-Aldrich社)またはネトリン-1を標的とする特異的siRNA(siNet、配列番号10:AAGCUGGACGCAGCAUGAUGCの配列)のいずれかで遺伝子導入した。遺伝子導入して24時間後、細胞を増加する濃度のドキソルビシンで処理した。材料および方法の項で記載したtoxilightキットによって測定した細胞死率を処理の48時間後に評価した。結果は、対照、未処理細胞に対して正規化した。スクランブルsiRNAを遺伝子導入した細胞は全般的にドキソルビシン処理に対して抵抗性を示した一方、ネトリン-1サイレンシングは細胞死を強く誘導し、ドキソルビシン存在下での細胞生存を減少させた。*、P<0.05;**、P<0.01。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１１】ネトリン-1サイレンシングは、A549細胞をドキソルビシンに対して感作し、UNC5B受容体によるアポトーシス細胞死を誘導することを示した図である。ネトリン-1サイレンシングは、腫瘍細胞をドキソルビシンに対して感作する。A549細胞を、スクランブルsiRNA(siCTRL、siRNA汎用陰性対照#1、Sigma-Aldrich社)またはネトリン-1を標的とする特異的siRNA(siNet、配列番号10:AAGCUGGACGCAGCAUGAUGCの配列)のいずれかで遺伝子導入した。遺伝子導入して24時間後、細胞を増加する濃度のドキソルビシンで処理した。材料および方法の項で記載したようなtoxilightキットによって測定した細胞生存率を処理の48時間後に評価した。結果は、対照、未処理細胞に対して正規化した。スクランブルsiRNA遺伝子導入した細胞は全般的にドキソルビシン処理に対して抵抗性を示した一方、ネトリン-1サイレンシングは細胞死を強く誘導し、ドキソルビシン存在下での細胞生存を減少させた。*、P<0.05;**、P<0.01。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１２】ネトリン-1サイレンシングは、A549細胞をドキソルビシンに対して感作し、UNC5B受容体によるアポトーシス細胞死を誘導することを示した図である。ネトリン-1サイレンシングは、腫瘍細胞をドキソルビシンに対して感作する。A549細胞を、スクランブルsiRNA(siCTRL、siRNA汎用陰性対照#1、Sigma-Aldrich社)またはネトリン-1を標的とする特異的siRNA(siNet、配列番号10:AAGCUGGACGCAGCAUGAUGCの配列)のいずれかで遺伝子導入した。遺伝子導入して24時間後、細胞を増加する濃度のドキソルビシンで処理した。材料および方法の項で記載したように、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)排除によって測定した細胞死パーセントの評価によって、ネトリン-1 siRNAがA549細胞をドキソルビシン0.5μMおよび2μM処理に対して感作することが確認された。*、P<0.05;**、P<0.01。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１３】ネトリン-1サイレンシングは、A549細胞をドキソルビシンに対して感作し、UNC5B受容体によるアポトーシス細胞死を誘導することを示した図である。ネトリン-1サイレンシングは、ドキソルビシン処理と組み合わせて、アポトーシスの引き金となる。A549細胞を(図10〜12)におけるように遺伝子導入し、指示したドキソルビシン濃度で24時間処理した。未処理細胞で正規化した活性カスパーゼ-3は、材料および方法の項で記載したように評価した。ドキソルビシンはスクランブルsiRNA(siCTRL)で遺伝子導入したA549細胞においてアポトーシスを誘導できなかったが、ネトリン-1をサイレンシングした細胞では、アポトーシス率の強い増加が示された。*、P<0.05;**、P<0.01。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１４】ネトリン-1サイレンシングは、A549細胞をドキソルビシンに対して感作し、UNC5B受容体によるアポトーシス細胞死を誘導することを示した図である。ネトリン-1サイレンシングは、ドキソルビシン処理と組み合わせて、アポトーシスの引き金となる。A549細胞を(図10〜12)におけるように遺伝子導入し、指示したドキソルビシン濃度で24時間処理した。DNA断片化は、材料および方法の項で記載したように評価した。ドキソルビシンはスクランブルsiRNA(siCTRL)で遺伝子導入したA549細胞においてアポトーシスを誘導できなかったが、ネトリン-1をサイレンシングした細胞では、アポトーシス率の強い増加が示された。*、P<0.05;**、P<0.01。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１５】ネトリン-1サイレンシングは、A549細胞をドキソルビシンに対して感作し、UNC5B受容体によるアポトーシス細胞死を誘導することを示した図である。  ネトリン-1サイレンシングおよびドキソルビシン処理の組合せは、ネトリン-1受容体UNC5Bによる細胞死を誘導する。A549細胞をスクランブルsiRNA(siCTRL)、ネトリン-1特異的siRNA(siNet)、UNC5B特異的siRNA(siUnc5B)ならびにネトリン-1およびUNC5B標的siRNAの組合せで遺伝子導入した。遺伝子導入して24時間後、細胞を指示したドキソルビシン濃度で48時間処理し、細胞死率をtoxilightによって測定し、対照、未処理細胞に対して正規化した。ネトリン-1サイレンシング(siNet)は、siCTRLで遺伝子導入した細胞と比較して、A549細胞をドキソルビシン処理に対して感作する一方、ネトリン-1およびUNC5Bの同時サイレンシング(siNet+siUnc5B)は、siNetおよびドキソルビシン処理による細胞死誘導を復帰させた。*、P<0.05;**、P<0.01。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１６】ネトリン-1およびその受容体相互作用に対する干渉は、腫瘍細胞を細胞傷害性薬に対して感作することを示した図である。A549細胞を指示したドキソルビシン濃度で、TRAP-ネトリンDCC2μg/mLの存在下または非存在下で48時間処理した。ドキソルビシンおよび2種類の組換え融合タンパク質による同時処理によって、toxilightによって測定すると、ドキソルビシンおよびPBS処理細胞と比較して、細胞死率が増加した。結果は、未処理細胞に対して正規化した。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１７】ネトリン-1およびその受容体相互作用に対する干渉は、腫瘍細胞を細胞傷害性薬に対して感作することを示した図である。A549細胞を指示したドキソルビシン濃度で、TRAP-ネトリンUnc5A2μg/mLの存在下または非存在下で48時間処理した。ドキソルビシンおよび2種類の組換え融合タンパク質による同時処理によって、toxilightによって測定すると、ドキソルビシンおよびPBS処理細胞と比較して、細胞死率が増加した。結果は、未処理細胞に対して正規化した。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１８】ネトリン-1およびその受容体相互作用に対する干渉は、腫瘍細胞を細胞傷害性薬に対して感作することを示した図である。A549細胞を、指示した濃度の5-フルオロウラシル(5-FU)の存在下で、PBSまたはTRAP-ネトリンUnc5A2μg/mLで処理した。同時処理の48時間後、細胞生存率をMTSによって測定し、未処理細胞に対して正規化した。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。DoxoR、ドキソルビシン。
【図１９】ネトリン-1およびその受容体相互作用に対する干渉は、腫瘍細胞を細胞傷害性薬に対して感作することを示した図である。A549細胞を、指示した濃度のシスプラチンの存在下で、PBSまたはTRAP-ネトリンUnc5A2μg/mLで処理した。同時処理の48時間後、細胞生存率をMTSによって測定し、未処理細胞に対して正規化した。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。DoxoR、ドキソルビシン。
【図２０】ネトリン-1およびその受容体相互作用に対する干渉は、腫瘍細胞を細胞傷害性薬に対して感作することを示した図である。MiaPacA細胞を、指示した濃度の5-FUの存在下で、PBSまたはTRAP-ネトリンUnc5A2μg/mLで処理した。同時処理の48時間後、細胞生存率をMTSによって測定し、未処理細胞に対して正規化した。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。DoxoR、ドキソルビシン。
【図２１】ネトリン-1およびその受容体相互作用に対する干渉は、腫瘍細胞を細胞傷害性薬に対して感作することを示した図である。MiaPacA細胞を、指示した濃度のドキソルビシンの存在下で、PBSまたはTRAP-ネトリンUnc5A2μg/mLで処理した。同時処理の48時間後、細胞生存率をMTSによって測定し、未処理細胞に対して正規化した。*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001。DoxoR、ドキソルビシン。
【図２２】ネトリン-1の干渉が、前臨床動物モデルにおいてドキソルビシン抗癌効果を増強することを示した図である。A549細胞を7週齢雌胸腺欠損ヌードマウスに移植した。腫瘍が一旦100mm3体積に達したら、マウスをTRAP-ネトリンUNC5A(20mg/kg)、ドキソルビシン(2mg/kg)または両薬物の組合せで、週2回、2週間腹腔内処理した。対照として、マウスにPBSを注射した。ヒストグラムは、異種移植後の日数の関数として、各群の腫瘍体積増大を表す。両薬剤とも単独では腫瘍成長を低下させることはできなかったが、TRAP-ネトリンUNC5Aおよびドキソルビシン処理の組合せは、腫瘍成長を顕著に低下させた。
【図２３】細胞傷害性薬処理後のネトリン-1受容体遺伝子発現を示した図である。癌細胞は図5で記載した通りに処理し、UNC5AおよびUNC5C遺伝子発現は、薬物処理後に評価した。評点システムは図5と同様に使用する。受容体はいずれも、未処理細胞と比較して、処理後に不十分な発現レベル変化を示した。
【図２４】細胞傷害性薬処理後のネトリン-1受容体遺伝子発現を示した図である。癌細胞は図5で記載し通りに処理し、UNC5AおよびUNC5C遺伝子発現は、薬物処理後に評価した。評点システムは図5と同様に使用する。受容体はいずれも、未処理細胞と比較して、処理後に不十分な発現レベル変化を示した。
【図２５】細胞傷害性薬処理後のネトリン-1受容体遺伝子発現を示した図である。カルボプラチン/タキソール処理前後の患者の腫瘍の卵巣生検におけるネトリン-1受容体発現レベル。中央値を各群から算出した。UNC5B遺伝子発現は、化学療法処理後に類似の上方制御を示した。遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子として使用したグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)に正規化した。
【図２６】細胞傷害性薬処理後のネトリン-1受容体遺伝子発現を示した図である。カルボプラチン/タキソール処理前後の患者の腫瘍の卵巣生検におけるネトリン-1受容体発現レベル。中央値を各群から算出した。UNC5D(C)遺伝子発現は、化学療法処理後に類似の上方制御を示した。遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子として使用したグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)に正規化した。
【図２７】細胞傷害性薬処理後のネトリン-1受容体遺伝子発現を示した図である。カルボプラチン/タキソール処理前後の患者の腫瘍の卵巣生検におけるネトリン-1受容体発現レベル。中央値を各群から算出した。DCC遺伝子発現は、化学療法処理後に類似の上方制御を示した。遺伝子発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子として使用したグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)に正規化した。
【図２８】細胞傷害性薬に対する細胞の感受性を示した図である。シスプラチン、5-フルオロウラシル(5FU)、ドキソルビシン、およびパクリタキセル(タキソール)に応答した阻害濃度(IC)IC10、IC30およびIC50を指示した細胞系についてMTSアッセイによって測定した。IC50値は、2重逆数プロットの直線回帰によって算出した。抵抗性癌細胞系(すなわち、最大薬物濃度ICMAXによる処理後の細胞生存が50%を上回る)については、灰色の四角で表し、ICMAXおよび端数を算出した。
【図２９】発現プラスミドNP-Xのマップを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
配列リスト:
【００８１】
【表１】
0006467604.tif 000002
【００８２】
I.材料および方法
1.ネトリン-1発現または過剰発現の評価を可能にする定量的RT-PCR
全RNAは、NucleoSpin(登録商標)RNA IIキット(Macherey Nagel社、Duren、Germany)を使用し、製造者の指示に従って抽出した。RT-PCR反応は、iScript(登録商標)cDNA合成キット(Biorad社)で実施した。全RNA1μgを、以下のプログラム:25℃5分間、42℃30分間および85℃5分間を使用して逆転写した。発現試験では、標的転写物をLightCycler(登録商標)2.0装置(Roche Applied Science社)で、LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green Iキット(Roche Applied Science社)を使用して増幅した。標的遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子として使用したグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)およびホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子に正規化した。ハウスキーピング遺伝子に正規化した標的転写物の量は、比較CT法を使用して算出した。標的およびハウスキーピング遺伝子の効率がほぼ同じであることを示すために、検証実験を実施した。プライマーの配列は以下の通りである。
フォワードプライマー:aaaagtactgcaagaaggactatgc  配列番号11。
リバースプライマー:ccctgcttatacacggagatg  配列番号12。
【００８３】
2.ヒト癌細胞におけるネトリン-1タンパク質の定量
イムノブロット分析では、細胞を改変RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5、NaCl 150mM、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、EDTA 1mM、プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびDTT 5mM)中で超音波処理することによって溶解し、4℃で1時間インキュベートした。細胞残渣を遠心分離(10.000g 15秒、4℃)によってペレットにし、タンパク質抽出物(1列当たり200μg)を10%SDS-ポリアクリルアミドゲルに添加し、PVDFシート(Millipore Corporation社、Billerica、MA、U.S.A.)にブロットした。フィルターをPBS/0.1%Tween20(PBS-T)に溶かした10%脱脂粉乳および5%BSAで一晩ブロックし、次いでウサギポリクローナルα-ネトリン-1(1:500希釈、クローンH104、Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA、USA)およびマウスモノクローナルβ-アクチン(Santa Cruz Biotechnologies社)抗体で2時間インキュベートした。PBS-Tで3回洗浄後、フィルターを適切なHRP結合2次抗体(1:10000、Jackson ImmunoResearch社、Suffolk、UK)で1時間インキュベートした。West Dura Chemiluminescence System(Pierce社、Rockford、IL、U.S.A.)を使用して、検出を実施した。
【００８４】
免疫蛍光法による試験では、細胞を剥離し、cytospiner(Shandon Cytospin 3、Thermo Scientific社)でカバーガラス上で遠心分離し、4%(v/v)パラホルムアルデヒドで30分間固定した。次に、細胞を0.2%トリトンX-100/PBSで30分間透過処理し、2%BSAおよび2%正常ロバ血清を含有するPBSでブロックした。内在性ネトリン-1は、ラットモノクローナルα-ネトリン-1抗体(R&D systems社)およびAlexa-488ロバ抗ラットIgG(Molecular probes社)を使用して染色した。核は、ヘキスト染色(Sigma社)を使用して対比染色した。
【００８５】
3.細胞死アッセイおよび従来の薬物処理
細胞死は、異なる方法によって評価した。全細胞死アッセイでは、96ウェルプレートでウェル当たり5*103細胞を血清の少ない培地中で成長させ、ドキソルビシンで処理した。48時間後、細胞死は生物発光細胞傷害性アッセイToxiLight(Lonza社、Basel、Switzerland)を使用して、製造者の指示に従って評価した。あるいは、細胞死パーセントは、アクリジンオレンジおよびDAPI染色によって、NucleoCounter NC-3000システム(ChemoMetec A/S社、Allerod、Denmark)を使用して測定した。簡単に説明すると、5*104細胞を12ウェルプレートに播種し、ドキソルビシンで処理した。処理して48時間後、浮遊している細胞および接着した細胞を収集し、PBS中に懸濁し、2種類の異なる色素と混合し、アクリジンオレンジで細胞の全集団を染色し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で生育不能な細胞を染色した。その後、全細胞集団中のDAPI陽性細胞として測定した細胞死率は、NucleoCounter NC-3000によって、製造者の使用注意書に従って測定した。細胞生存は、MTSアッセイ(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay、Promega社)によって96ウェルプレートで測定した。MTSアッセイは、血清が少ない培地中で16時間成長させ、その後血清を含まない培地中で指示したドキソルビシン濃度で48時間処理した3*103細胞において、製造者の手順に従って実施した。カスパーゼ-3活性アッセイは、カスパーゼ3/CPP32蛍光定量アッセイキット(Gentaur Biovision社、Brussel、Belgium)を使用して、製造者の使用説明書に従って、既に記載された通りに実施した(21)。カスパーゼ活性(活性/分/タンパク質のマイクログラム)は、分光蛍光光度計(405nm/510nm、Infinite F500、Tecan社、Mannedorf、Switzerland)で1時間の動力学的周期の読み取りから計算した。
【００８６】
4.候補薬物:
TRAP-ネトリンDCCおよびTRAP-ネトリンUNC5Aはそれぞれ、IgG1 Fc部分に融合したDCC外部ドメインの5番目のフィブロネクチンドメインおよびUNC5A外部ドメインの2個のイムノグロブリン(Ig1-Ig2)ドメインである。これらの2種類の組換えタンパク質は、それぞれ293-free-styleおよびCHO-free-styleで生成した。
【００８７】
TRAP-ネトリンDCCは、WO2012025618の実施例1〜4に従って、プラスミド7800を使用して生成した。類似の融合タンパク質は、WO2012025618のこれらの実施例でまた開示されたベクター7809を使用して生成してもよい。
【００８８】
TRAP-ネトリンUNC5Aは、5に記載した方法を使用して生成した。
【００８９】
5.TRAP-ネトリンUNC5A(UNC5A-Fc)、TRAP-ネトリンUNC5B(UNC5B-Fc)およびTRAP-ネトリンUNC5C(UNC5C-Fc)の生成
プラスミドの構築
Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York、1989に記載されたように、標準的方法を使用してDNAを操作した。分子生物学的試薬は、製造者の使用説明書に従って使用した。所望する遺伝子断片は、遺伝子合成によって調製した。合成した遺伝子断片は、特定の発現ベクターにクローニングした。サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列は、DNA配列決定によって確認した。
【００９０】
発現プラスミドは、図11に表し、PS-UNC5-Fc-NP-X(PSはペプチドシグナルであり、Xは、UNC5AではV-01、UNC5BではV-02、UNC5CではV-03であることに注意する。
【００９１】
このベクターは、例えば、ヒトUNC5A、BまたはC受容体のIg様ドメインが、アミノ酸2個の人工的なリンカー配列を導入してヒトIgG1抗体(Fc定常領域;ヒンジ-CH2-CH3)のヒンジ領域に融合している人工的なIg Fc融合タンパク質の一時的発現のための発現ブラスミドである。
【００９２】
化学的な遺伝子合成は、5'および3'末端それぞれが特有のHindIIIおよびKpnI制限エンドヌクレアーゼによって切断された672(配列番号5、7)または676bps(配列番号6)のDNA断片を調製するために使用した。同様に、5'および3'末端それぞれが特有のKpnIおよびXbal制限エンドヌクレアーゼによって切断された699bps(配列番号9)のDNA断片を調製した。N末端位にKappa2シグナルペプチドを有する所望するUNC5-融合タンパク質(UNC5-Fc融合タンパク質)(配列番号1、2、3)のオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするDNA断片は、前記で引用した2個のDNA断片の連結によって得た。遺伝子を発現ベクター(NP-V)のCMV-IEの即時プロモーターおよびエンハンサーhE1およびウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化部位に導入した。
【００９３】
UNC5-融合タンパク質(UNC5-Fc融合タンパク質)は、マウスシグナル配列(配列番号1、2もしくは3のアミノ酸1から19)、ヒトUNC5受容体の2個のイムノグロブリン様ドメイン(UNC5A:配列番号1のアミノ酸20から217;アミノ酸配列UniProt ID:Q6ZN44のUNC5Aのアミノ酸34から240に対応する;UNC5B:配列番号2のアミノ酸20から215;アミノ酸配列UniProt ID:Q8IZJ1のUNC5Bのアミノ酸49から244に対応する;UNC5C:配列番号3のアミノ酸20から217;アミノ酸配列UniProt ID:O95185のUNC5Cのアミノ酸61から258に対応する;2個のアミノ酸リンカー(クローニング部位から;配列番号3のアミノ酸199から200)およびヒトIgGI抗体Fc定常領域(配列番号1または3のアミノ酸220から446;配列番号2のアミノ酸218から444)から構成される。成熟UNC5-Fc融合タンパク質は、シグナルペプチドを欠如している。
【００９４】
一時的遺伝子導入、発現および精製
組換えタンパク質は、293 Freestyle培養培地(Invitrogen社)に懸濁して、8%CO2、37℃で成長させたFreestyle HEK 293細胞(Invitrogen社)の一時的遺伝子導入によって得た。遺伝子導入のために、製造者の使用説明書に従って、293fectin(登録商標)試薬(Invitrogen社)を使用した。遺伝子導入の3日後、上清を収集し、遠心分離(200gで10分間)によって透明にした。Fc-融合タンパク質は、プロテインGセファロース4FFを使用して、製造者の使用説明書に従って精製した。溶出は、0.1MグリシンpH2.8で実施した。溶出液は、1Mトリス-Hcl pH9.0中で中和し、PBSで一晩透析した。最終的な分析は、変性および非変性条件下で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、その後クーマシーブルー染色か、またはニトロセルロース移行後のウェスタンブロット分析(抗ヒトIgG(Fc特異的)-HRP抗体、Sigma社)を使用することによって実施した。
【００９５】
組換えUNC5A-Fcasはまた、動物成分を含まない化学的合成無血清培地に懸濁して8%CO2、31℃で成長させたFreestyle CHO-S細胞(チャイニーズハムスターの卵巣、Invitrogen社)を一時的遺伝子導入することによって得た。遺伝子導入のために、製造者の使用説明書に従って、FreeStyleTM MAX試薬(Invitrogen社)を使用した。UNC5A-Fc融合タンパク質(配列番号1)は、Freestyle CHO-S細胞において、一時的発現が少なくとも300mg/Lの高い効率で分泌することができた。上清は、遠心分離および無菌的濾過(0.2μm)によって収集した。上清中におけるUNC5A-Fcの濃度は、BioRad Experionシステムを使用して測定した。Fc融合タンパク質はその後、陽イオン交換クロマトグラフィー、続いてプロテインAアフィニティクロマトグラフィー(PALL Protein A Ceramic Hyper D)によって、0.1MグリシンHCl pH3.0で溶出すること以外は製造者の使用説明書に従って精製した。溶出液は、1Mトリス-HCl pH9で中和し、クエン酸20mM、NaCl 134mM、pH6.2で一晩透析した。最後の分析は、定量、大きさの確認および混入物の存在について、Bio-Rad Experionシステムで実施した。
【００９６】
【表２】
0006467604.tif 000003
【００９７】
以下の実験では、CHO-S細胞で生成したUNC5A-Fcを使用した。
【００９８】
6.動物モデル:
7週齢(体重20〜22g)の雌胸腺欠損nu/nuマウスは、チャールスリバー動物施設から入手した。マウスは、フィルターで覆った滅菌ケージに収容し、無菌の動物施設で維持した。A549細胞は、PBS200μLに溶かした107個をマウスの右側腹部にs.c.注射することによって移植した。一旦腫瘍が形成されたら(V=100mm3)、マウスをネトリン-1干渉薬および/または細胞障害性薬で2週間処理した。腫瘍の大きさは、ノギスで測定した。腫瘍の体積は、式v=0.5*(長さ*幅2)で算出した。処理の最後に、腫瘍を摘出し、重量を測定し、7.5%ゼラチン-スクロース0.12M中に包埋し、20μmの切片に切断した。
【００９９】
7.統計学的解析:
報告されたデータは、それぞれ3連で実施した少なくとも3回の独立した測定の平均±S.D.である。統計学的解析は、指示しない限り、ノンパラメトリックマンホイットニーのU検定によって実施した。
【０１００】
II.結果および考察
1.ネトリン-1およびその受容体は、従来の化学療法を受けた腫瘍細胞で上方制御される。
まず、定量的RT-PCRによって、2種類の肺癌細胞系A549およびH460におけるドキソルビシンに応答したネトリン-1のレベルを分析した。図1に示したように、両細胞系におけるネトリン-1 mRNAレベルは、ドキソルビシン2μMによる処理によって大幅に増加した(それぞれ、430倍および300倍)。mRNAのこの増加は、ネトリン-1タンパク質発現の活発な増加が関係した[図2および免疫蛍光法(示さず)]。
【０１０１】
次に、ドキソルビシンに応答したネトリン-1受容体DCCならびにUNC5H -UNC5A、UNC5B、UNC5CおよびUNC5D- のレベルを分析した。図3に示したように、DCC、UNC5A、UNC5BおよびUNC5Dのレベルは、ドキソルビシンで処理したA549において、ネトリン-1レベルに付随して増加する。この増加は、UNC5B受容体で44倍に達した。ネトリン-1およびその受容体のこの上方制御が遺伝子転写の増加に関連するかどうかをモニターするために、A549細胞を、RNAポリメラーゼ阻害剤アクチノマイシンDの存在下で、ドキソルビシンで処理した。図4に示したように、アクチノマイシンDはドキソルビシンが媒介するネトリン-1の上方制御を完全に妨害し、したがって、従来の治療薬は遺伝子転写を増強することによってネトリン-1およびその受容体を増加させる引き金となることを支持している。
【０１０２】
ネトリン-1およびその受容体の上方制御がドキソルビシンに限定されるのか、または化学療法剤に対する一般的な応答なのかを調べるために、15種類の癌細胞系集団において、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル(5FU)、パクリタキセル(タキソール)およびシスプラチンなどの様々な従来の化学療法薬に応答したネトリン-1レベルを定量的RT-PCRによって分析した。ネトリン-1レベルの分析は、各細胞系について、各薬物で測定したIC10、IC30またはIC50に対応する3種類の濃度での処理において実施した(図28)。特定の薬物に抵抗性であると考えられる細胞系では(図28)、最大有効濃度(ICMAX)に対応する濃度を使用してネトリン-1レベルをモニターした。図5〜8に示したように、ドキソルビシンおよび5FUはいずれも、それぞれ癌細胞系の60%および36%において、ネトリン-1の顕著な(すなわち、対照の>2倍)増加を誘発する。タキソールおよびシスプラチンによる処理は、それぞれ細胞系の20%および21%のみにおいてネトリン-1上方制御が伴った。ネトリン-1上方制御は乳癌、肺癌、膵臓癌および卵巣癌ならびに神経芽細胞腫および神経膠芽腫細胞系の少なくとも1種の細胞系で認められるので、化学療法薬処理によるネトリン-1上方制御は、腫瘍の種類に特異的ではない。ネトリン-1上方制御は抵抗性および感受性細胞系の両方で検出され、いくつかの抵抗性細胞系はネトリン-1上方制御を示さなかったので(図5〜8)、ネトリン-1上方制御と化学療法抵抗性の間にはいかなる関係も検出することはできなかった。
【０１０３】
これらの細胞傷害剤に応答したネトリン-1依存性受容体の発現も、15種類の癌細胞系において調べた(図5〜8)。ネトリン-1の応答と同様、ドキソルビシンは、それぞれスクリーニングした細胞系の87%、80%および67%においてDCC、UNC5BおよびUNC5Dの上方制御に関与するので、最大効果を有するものと思われた。DCCの発現は、シスプラチン、5FUおよびタキソールそれぞれに応答して、細胞系の36%、43%および53%において強く増加したので、スクリーニングした癌細胞系において全体的に発現が低いDCCは、最も広範な上方制御を示すネトリン-1受容体である。ネトリン-1受容体UNC5AおよびUNC5Cのレベルは、スクリーニングした細胞系のほとんどにおいて、細胞障害性薬による処理によって依然としてほとんど影響を受けなかった(図23〜24)。これらのデータを一緒にすると、ネトリン-1およびその受容体の上方制御は、従来の薬物処理に応答して生じることが多いという見解が支持される。
【０１０４】
最後に、カルボプラチン/タキソールによる治療の前後の患者の卵巣癌標本におけるネトリン-1および受容体のレベルを分析した。図9に示したように、ネトリン-1 mRNAは、化学療法後上方制御された。さらに、DCC、UNC5BおよびUNC5Dレベルはまた、カルボプラチン/タキソール治療によって影響を受けた(図25〜27)。
【０１０５】
2.ネトリン-1干渉は、細胞障害性薬が誘導する細胞死を増強する。
ネトリン-1およびその受容体の両方が従来の薬物処理によって上方制御されるという事実は、ネトリン-1に対する生存の依存性が化学療法を受けた癌細胞において増幅されることを示唆している。したがって、まず、siRNA戦略によって、ネトリン-1をサイレンシングした際にドキソルビシンが誘導する細胞死を分析した。次に、A549細胞に、ネトリン-1 siRNAを遺伝子導入して、増加する濃度のドキソルビシンで処理した。細胞透過性の欠如(図10)、細胞生存(図11)、DAPI排除(図12)、カスパーゼ活性化(図13)またはDNA断片化(図14)の測定によって示されるように、ネトリン-1をサイレンシングすると、ドキソルビシンが誘導する細胞死の著しい増強が伴った。この感受性の増加が、結合していないネトリン-1依存性受容体のアポトーシス誘発機序によるものかどうかを測定するために、A549細胞においてドキソルビシン処理によって発現する主要なネトリン-1受容体であるUNC5Bをサイレンシングした設定で同様の実験を実施した。図15に示したように、UNC5Bのサイレンシングは、ネトリン-1サイレンシングおよびドキソルビシン処理によって誘導された細胞死の増強の阻害を伴った。
【０１０６】
したがって、ネトリン-1干渉のためにより治療的に関連する方法を使用して、可能性のある類似の増強効果を検討した。2種類の薬物候補、それぞれDCCまたはUNC5AのFc安定化外部ドメインであるTRAP-ネトリンDCCおよびTRAP-ネトリンUNC5Aが、インビトロにおいてネトリン-1を発現する腫瘍細胞の死、および移植したマウスモデル(示さず)において腫瘍成長阻害の引き金となることを示した。図16〜17に示したように、これら2種類の候補薬物は、A549細胞においてドキソルビシンが誘導する細胞死を強く増強する。ネトリン-1および受容体も5FUおよびシスプラチン処理によって上方制御されるので(図5〜8)、TRAP-ネトリンUNC5Aと5FUおよびシスプラチンとの類似の組合せを実施した。5FUまたはシスプラチンとTRAP-ネトリンUNC5Aとの同時処理によって、細胞死に対する同程度の増強効果が認められた(図18〜19)。同様に、5FUおよびドキソルビシンがネトリン-1およびその受容体の上方制御を示した膵臓癌細胞系MiaPacAにおいて、5FUまたはドキソルビシンおよびTRAP-ネトリンUNC5Aの同時処理は細胞死を増強した(図20〜21)。
【０１０７】
3.ネトリン-1干渉は、癌の前臨床動物モデルにおいて細胞傷害性薬の抗癌効果を増強する。
次に、前記で見られたインビトロの効果が、治療的観点においてインビボに転換できるかどうかを評価した。A549細胞をヌードマウスに移植し、触知可能な腫瘍を有する動物を媒体またはTRAP-ネトリンUNC5A20mg/kg単独もしくはドキソルビシン2mg/kgと組み合わせて週2回i.p.注射によって治療した。これらの投与計画および投薬に際して使用した単一薬剤(TRAP-ネトリンUNC5Aまたはドキソルビシン)治療は、検出可能ではあるが弱い腫瘍増殖阻害効果しか引き起こさなかった(図22)。しかし、ドキソルビシンとTRAP-ネトリンUNC5Aで同時処理すると、腫瘍増殖の強力で長い阻害が伴った。これらのデータを一緒に考え合わせると、従来の化学療法とネトリン-1干渉をベースにした治療の組合せは、相乗的な抗癌効果を伴うという見解が支持される。
【０１０８】
4.ネトリン-1干渉と細胞障害性薬を組み合わせることは、有望な治療アプローチである。
ここで、癌細胞系は、細胞障害性薬による処理に応答して、ネトリン-1の発現を上方制御することを示す。ドキソルビシン、シスプラチン、5FUおよびパクリタキセル(タキソール)を含むここで試験した細胞障害性薬は通常、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌および卵巣癌の患者の管理において、補助療法および高度な療法の両方で使用される。さらに、今までの限られたヒト試料パネルを使用して、カルボプラチン/タキソールで治療した患者から得られた原発卵巣腫瘍は、治療前の同腫瘍と比較して、ネトリン-1レベルの増加を呈示したことを示した。細胞培養では、このネトリン-1上方制御は使用した薬物および癌細胞の種類に応じて動力学および大きさが異なるが(図1)、これらの薬物が様々な細胞機構に影響を及ぼすことが知られているという事実によって、ネトリン-1上方制御が特定の化学療法薬によって影響を受ける特定の経路の特定の変化ではなく、一般的な生存ストレス応答であるという見解が支持される。それゆえ、このネトリン-1上方制御がこれらの薬物に応答して癌細胞が使用する生存機構であり得ると推測されたことは興味深い。
【０１０９】
ネトリン-1のこの上方制御の機構は依然として解明すべきではあるが、顕著な治療結果を有する可能性がある。実際に、ネトリン-1干渉薬は現在、前臨床開発中であり、これらの化合物と従来の細胞傷害剤との組合せは、相乗的であることが明らかとなる可能性がある。ネトリン-1発現は、乳癌、卵巣癌、膵臓癌および非小細胞肺癌の患者の試料で上方制御されており、ネトリン-1自己分泌/パラ分泌ループの干渉が、いくつかのモデルにおいて癌細胞アポトーシスの引き金となることを示した。さらに、本明細書で呈示したデータは、患者の大部分が、単独または細胞傷害剤と組み合わせたネトリン-1標的化剤から恩恵を受けることができることを示唆する。腫瘍を有するマウスに対するインビボでの所見に基づいて、組み合わせることによって細胞傷害剤単独と比較して毒性が増加しているようには見えない。ここで示した前臨床データは、従来の薬物およびネトリン-1干渉の組合せが、低濃度の従来の薬物で有効性の増大を導くことができるという見解を支持する。一緒に考え合わせると、これらのデータによって、早期臨床試験において、従来の化学療法と組み合わせて、ネトリン-1干渉をベースにした療法を試験する正当性が裏付けられる。
【０１１０】
5.ネトリン-1を過剰発現し、DCCならびに/またはUNC5Aおよび/またはBおよび/またはCおよび/またはDを発現する癌の例。
ネトリン-1を過剰発現する症例のパーセントを、ネトリン-1およびその受容体の発現を定量した癌の種類それぞれについて挙げる。
-  転移性乳癌の60%(Fitamantら、PNAS 2008)、
-  非小細胞肺癌の47%(Delloye-Bourgeoisら、JNCI 2009)、
-  侵襲性神経芽細胞腫の38%(Delloye-Bourgeoisら、J. Exp. Med. 2009)、
-  膵臓腺癌の61%(Linkら、Annals of Chir. Onco. 2007;Dumartinら、Gastro 2010)、
-  原発性黒色腫(n=7)、黒色腫転移(n=6)の100%(Kaufmannら、Cellular Oncology 2009)、
-  卵巣癌の76%(Panastasiouら、Oncotarget 2011)、
-  神経膠芽腫の65%、
-  急性骨髄性白血病および慢性リンパ性白血病の>60%、
-  侵襲性B細胞リンパ腫の>50%、
-  肉腫の30%、
-  腎臓腺癌の40%、
-  頭部および頸部癌の22%、
-  精巣癌(胚性癌腫の36%、奇形腫の50%、卵黄嚢腫瘍の100%)、
-  腎臓癌の50%、
-  胃癌の26%、
-  子宮癌の19%。
【０１１１】
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図３】
0006467604.tif 000007
【図４】
0006467604.tif 000008
【図５】
0006467604.tif 000009
【図６】
0006467604.tif 000010
【図７】
0006467604.tif 000011
【図８】
0006467604.tif 000012
【図９】
0006467604.tif 000013
【図１０】
0006467604.tif 000014
【図１１】
0006467604.tif 000015
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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