(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの第１の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せおよび少なくとも１つの第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せを含む組成物であって、少なくとも１つの第１の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せが、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン７部分中のアミノ酸配列２５６〜４１２内に位置する配列を認識し、少なくとも１つの第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せが、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン１９部分中のアミノ酸配列２４４〜４００内に位置する配列を認識し、前記第１および第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片に特異的かつ同時に結合できることを特徴とする、前記組成物。
【請求項２】
第１または第２の抗体のうちの少なくとも１つが、一次抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
一次抗体は、モノクローナル抗体またはその組換え抗体、抗原結合性フラグメントもしくは組合せである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
第１の抗体は、抗体Ｃ−３５、Ｃ−６２、Ｃ−６８、Ｃ１８、Ｃ３５、ＫＳ７．１８、ＬＤＳ−６８、ＬＰ１ＫおよびＲＣＫ１０５またはその抗原結合性フラグメント、変異体、融合物、誘導体もしくは組合せからなる群より選択され、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン７部分に位置する少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも７個、または１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列を認識する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
第１の抗体は、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨ、ドイツから入手可能なクローンＫｓ７．１８により産生されたＫｓ７．１８モノクローナル抗体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
第１の抗体は、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｇｍｂｈ、ドイツから入手可能な
クローンＲＣＫ１０５により産生されたＲＣＫ１０５モノクローナル抗体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
第２の抗体は、抗体Ａ５３−Ｂ／Ａ２．２６ａｋａ  Ｋｓ１９．１、ＢＭ−１９．２１、ＣＣＤ００３、ＣＣＤ００４、ＣＫＳ０４、ＣＫＳ０６、Ｋｓ１９．２、ＫＭ４．６２、ＬＰ２Ｋ、ＳＡ２１、ＳＡ４５またはその抗原結合性フラグメント、変異体、融合物、誘導体もしくは組合せからなる群より選択され、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のケラチン１９部分に位置する少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも７個、または１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列を認識する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
第２の抗体は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能なクローンＢＭ−１９．２１により産生されたＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体であり、ケラチン１９のアミノ酸配列３４６〜３６７に特異的に結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
第２の抗体は、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨ、ドイツから入手可能なクローンＫｓ１９．２により産生されたＫｓ１９．２モノクローナル抗体であり、ケラチン１９のアミノ酸配列３５２〜３６８に特異的に結合する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
第２の抗体は、ケラチン１９のアミノ酸配列３１１〜３３５に結合するＫｓ１９．１モノクローナル抗体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
第１の抗体は、Ｋｓ７．１８モノクローナル抗体であり、第２の抗体は、ＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
第１の抗体は、Ｋｓ７．１８モノクローナル抗体であり、第２の抗体は、Ｋｓ１９．２モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
第１の抗体は、ＲＣＫ１０５モノクローナル抗体であり、第２の抗体は、Ｋｓ１９．１モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出するためのインビトロの方法であって、該方法は：
ａ）前記生物学的サンプルを、少なくとも１つの第１の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せおよび少なくとも１つの第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せを含む組成物と接触させる工程であって、ここで少なくとも１つの第１の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン７部分中のアミノ酸配列２５６〜４１２内に位置する配列を認識し、少なくとも１つの第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン１９部分中のアミノ酸配列２４４〜４００内に位置する配列を認識し、前記第１および第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片に特異的かつ同時に結合することができる、工程；あるいは
ｂ）前記生物学的サンプルを、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン７部分中のアミノ酸配列２５６〜４１２内に位置する配列を認識する第１の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せと接触させる工程；および
ｃ）前記生物学的サンプルを、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のケラチン１９部分中のアミノ酸配列２４４〜４００内に位置する配列を認識する第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せと接触させる工程；および
ｄ）前記ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出する工
程
を含み、
ここで、工程ｂ）と工程ｃ）は、あらゆる順番でまたは同時に実行される、前記方法。
【請求項１５】
生物学的サンプルは、血清、血漿、リンパ液、浸出液、大便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液、心膜液、腹水、胸水、膿汁、唾液、痰、滑液、涙、汗、膣分泌液、嘔吐物および尿からなる群より選択される生体液サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
生体液サンプルは、血液、血清および血漿からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１または第２の抗体のうちの少なくとも１つは、一次抗体、抗原結合性フラグメントまたはその組合せである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
一次抗体は、モノクローナル抗体またはその組換え抗体、抗原結合性フラグメントもしくは組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第１の抗体は、抗体Ｃ−３５、Ｃ−６２、Ｃ−６８、Ｃ１８、Ｃ３５、ＫＳ７．１８、ＬＤＳ−６８、ＬＰ１ＫおよびＲＣＫ１０５またはその抗原結合性フラグメント、変異体、融合物、誘導体もしくは組合せからなる群より選択され、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のケラチン７部分に位置する少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも７個、または１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列を認識する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
第１の抗体は、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨ、ドイツから入手可能なクローンＫｓ７．１８により産生されたＫｓ７．１８モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第１の抗体は、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｇｍｂｈ、ドイツから入手可能なクローンＲＣＫ１０５により産生されたＲＣＫ１０５モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
第２の抗体は、抗体Ａ５３−Ｂ／Ａ２．２６ａｋａ  Ｋｓ１９．１、ＢＭ−１９．２１、ＣＣＤ００３、ＣＣＤ００４、ＣＫＳ０４、ＣＫＳ０６、Ｋｓ１９．２、ＫＭ４．６２、ＬＰ２Ｋ、ＳＡ２１、ＳＡ４５あるいはその抗体断片、変異体、融合物、誘導体または組合せからなる群より選択され、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のケラチン１９部分に位置する少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも７個、または１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列を認識する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
第２の抗体は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能なクローンＢＭ−１９．２１により産生されたＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体であり、ケラチン１９のアミノ酸配列３４６〜３６７に特異的に結合する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
第２の抗体は、ケラチン１９のアミノ酸配列３１１〜３３５に結合するＫｓ１９．１モノクローナル抗体である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１の抗体は、Ｋｓ７．１８モノクローナル抗体であり、第２の抗体は、ＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体である、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第１の抗体は、Ｋｓ７．１８モノクローナル抗体であり、第２の抗体は、Ｋｓ１９．２モノクローナル抗体である、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
第１の抗体は、ＲＣＫ１０５モノクローナル抗体であり、第２の抗体は、Ｋｓ１９．１モノクローナル抗体である、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の発現を、陽性および／または陰性対照と比較する工程をさらに含む、請求項１４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
陽性対照は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
陽性対照は、悪性新生物性疾患を患っている対象から得られた生物学的サンプルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
陰性対照は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を含まない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
陰性対照は、悪性疾患を患っていない健康な対象から得られた生物学的サンプルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の量をスコアリングする工程をさらに含む、請求項１４〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
自動化読取装置において実行される、請求項１４〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
検出が手動で実行される、請求項１４〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定するため、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を予測するため、および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を評価するため、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の再発を評価するため
であり、ここで対象は、悪性新生物性疾患を有しているかまたは有することが疑われる哺乳動物である、請求項１４〜３５のいずれか１項に記載のインビトロの方法。
【請求項３７】
悪性新生物性疾患は：胆管癌（肝臓外）、膀胱癌、乳癌、（原発）不明癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭部頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、下咽頭癌、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫（腎臓癌）、唾液腺癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌または子宮癌（子宮内膜）からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
悪性新生物性疾患は、肺癌、膀胱癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、精巣癌および卵巣癌からなる群より選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
悪性新生物性疾患は、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌からなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ｉ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出し、および／または
ｉｉ）生物学的サンプル中の悪性新生物性疾患を検出し；および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断または予後判定し、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を予測し、および／または
ｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価し、および／または
ｖｉ）対象における悪性新生物性疾患の再発を評価するための、
請求項１４〜３９のいずれか１項に記載のインビトロの方法の使用。
【請求項４１】
悪性新生物性疾患は：胆管癌（肝臓外）、膀胱癌、乳癌、（原発）不明癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭部頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、下咽頭癌、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫（腎臓癌）、唾液腺癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌または子宮癌（子宮内膜）からなる群より選択される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
悪性新生物性疾患は、肺癌、膀胱癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、精巣癌および卵巣癌からなる群より選択される、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
悪性新生物性疾患は、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌からなる群より選択される、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
ｉ）生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出するため；または
ｉｉ）対象における悪性新生物性疾患を検出するため；または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断または予後判定するため；または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を予測するため；または
ｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価するため；または
ｖｉ）対象における新生物性疾患の再発を評価するため
のキットであって、該キットは：
ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物；または
ｂ）ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む第１の容器；および
ｃ）ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む第２の容器；および
ｄ）場合により、請求項１４〜３９のいずれか１項に記載の方法を実行するための説明書
を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍性疾患の分野に関する。具体的に、本発明は、悪性腫瘍性疾患の改善された検出のための組成物および方法、ならびにその診断および／または予後判定用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
処置決定および患者管理を助けるための、悪性疾患の診断に役立ち得る単純で、正確かつ対費用効果の高い方法に対する極めて大きな必要性がある。わずかな例外を除いて、現在利用可能な腫瘍マーカーは、感度および特異性の不足によって治療モニタリングに限定されている。本質的にすべての腫瘍マーカーは単一マーカーとしては不十分であり、確立されたマーカーに新規でより特異的なマーカーを補足する必要がある。特に、現在利用可能な腫瘍マーカーの根本的な問題は、腫瘍に対する特異性の不足であり、すなわち肝硬変、腎不全および多様な組織における一般的な炎症のような多様な良性の状態でのマーカー値の増大である。
【０００３】
血清中を循環するケラチンまたはその断片は、アポトーシス性または壊死性の腫瘍および非腫瘍細胞から放出され、数種の癌における疾患進行をモニタリングするための腫瘍マーカーとして使用されてきた。上皮細胞特異的な方法での複数のケラチンの発現および腫瘍性形質転換の間にケラチンの発現プロファイルが比較的安定なままであるという事実は、なぜケラチンが一般に使用される腫瘍マーカーであるかを説明している。
【０００４】
最も一般に使用されるケラチン腫瘍マーカーは、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ；ケラチン８（Ｋ８）、ケラチン１８（Ｋ１８）およびケラチン１９（Ｋ１９）の混合物）、組織ポリペプチド特異的抗原（ＴＰＳ；Ｋ１８に由来する）、サイトケラチンフラグメント２１−１（ＣＹＦＲＡ２１−１；Ｋ１９に由来する）である。ＴＰＡは、乳房、結腸直腸、肺および膀胱に関与するものを含む、多様な上皮細胞関連癌を有する個人を同定するための潜在的な血清マーカーとして使用されてきた。ＴＰＳは、乳房、卵巣、前立腺の癌を有する個人のケアにおいて、ＣＹＦＲＡ２１−１は、肺癌を有する個人のケアにおいて臨床で使用されてきた。ＴＰＡ、ＴＰＳおよびＣＹＦＲＡ２１−１の主な潜在的臨床用途は、処置応答および腫瘍再発をモニタリングするためおよび予後情報を提供するためである。これらのマーカーの臓器特異性の欠如および非悪性疾患における血清レベル上昇のために、腫瘍マーカーとしての日常的使用を推奨するには、それらの臨床的有用性は限られている。数種の肝臓障害および多様な炎症性疾患の状況で、高レベルのＴＰＳおよびＴＰＡが認められる。ＣＹＦＲＡ２１−１は、ケラチンマーカーの中で最も特異的であり、広範に受け入れられている。しかしながら、高いＣＹＦＲＡレベルは、間質性肺線維症および腎不全を伴う。心不全においても、ＣＹＦＲＡレベルは偽陽性結果を導く。
【０００５】
上記のとおり、現在使用される腫瘍マーカーは、ＣＹＦＲＡ２１−１だけでなく、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、癌抗原１５−３（ＣＡ１５−３）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）なども、偽陽性結果の問題をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、単純かつ信頼できる方法で悪性新生物疾患を診断し予後判定する際のより優れた診断および予後判定マーカー、手段および方法、加えて悪性新生物疾患を検出するための正確でより偏りのない方法またはアッセイを実行するための手段を見出すことが緊急に必要である。したがって、本発明は、悪性新生物疾患を診断または予後判定する際の日常的検査のための単純かつ効率的なやり方で、正確かつより偏りのない診断アッセイを実行する手段および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、少なくとも２つのターゲティング剤を含む組成物であって、少なくとも１つの第１のターゲティング剤がケラチン７（Ｋ７）ペプチドおよび／またはその断片を認識し、少なくとも１つの第２のターゲティング剤がケラチン１９（Ｋ１９）ペプチドおよび／またはその断片を認識する、上記組成物を提供することによって達成される。上記第１および第２のターゲティング剤は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的かつ同時に結合することができる。
【０００８】
第１および／または第２のターゲティング剤は、標的化ペプチドまたはその断片を認識し、結合する任意の種類の分子である。第１のターゲティング剤は、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する。ケラチン７（Ｋ７）は、ヒトにおいてＫＲＴ７遺伝子によりコードされるタンパク質である。ケラチン７は、ＩＩ型ケラチンであり、内臓の腔を裏打ちする単層上皮中ならびに腺管および血管中で特異的に発現される。Ｋ７は、５１ｋＤａのタンパク質であり、４６９アミノ酸長である。
【０００９】
第２のターゲティング剤は、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する。ケラチン１９（Ｋ１９）は、ヒトにおいてＫＲＴ１９遺伝子によりコードされるタンパク質である。Ｋ１９は、発生中の表皮を覆う一過性の表層である胞皮中に特異的に認められるＩ型ケラチンである。Ｋ１９は、４４ｋＤａのタンパク質であり、４００アミノ酸長である。
【００１０】
第１および／または第２のターゲティング剤は、リガンド、阻害剤、ペプチド模倣化合物、ペプチド、タンパク質、抗体、抗体の抗原結合性フラグメントおよび／またはその組合せからなる群より有利に選択される。第１および第２のターゲティング剤は両方とも、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に、特異的かつ同時に結合することができる。
【００１１】
本明細書中で使用される用語「ケラチン７とケラチン１９の異種複合体」は、完全長ケラチン７と完全長ケラチン１９の間の平行でずれのない（in register）ダイマーおよびその断片に由来する分子実体を意味することが意図される。該用語はさらに、ケラチン７とケラチン１９の間の逆平行テトラマーを形成する、ケラチン７とケラチン１９の間の重複するダイマーおよびその断片を含む。該用語は、さらに、これらのテトラマーおよびその任意の断片から組み立てられたオリゴマー、プロトフィラメントおよびフィラメントを含む。
【００１２】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体中には、異種複合体のケラチン７部分由来の連続した配列中の少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個、または少なくとも３０個、より好ましくは４０個超のアミノ酸がなくてはならず、異種複合体のケラチン１９部分由来の連続した配列中の少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個、または少なくとも３０個、より好ましくは４０個超のアミノ酸がなくてはならない。上記アミノ酸は、それぞれケラチン７またはケラチン９に固有でなければならない。
【００１３】
有利には、連続した配列中の上記少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個、または少なくとも３０個、より好ましくは４０個超のアミノ酸は、ケラチン７中のアミノ酸配列２５６〜４１２からのものである。より好ましくは、上記連続した配列は、ケラチン７中のアミノ酸配列３００〜３８０からのものである。有利には、連続した配列中の上記少なくとも３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個、または少なくとも３０個、より好ましくは４０個超のアミノ酸は、ケラチン１９中のアミノ酸配列２４４〜４００からのものである。より好ましくは、上記連続した配列は、ケラチン１９中のアミノ酸配列３１１〜３７５からのものである。第１および第２のターゲティング剤が、上記ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的かつ同時に結合するとき、それらは両方とも上記ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に結合し、上記第１および第２のターゲティング剤ならびにケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含む三重鎖を形成する。上記第１および第２のターゲティング剤は、上記三重鎖が本明細書に記載の任意の手段または方法あるいは当業者公知のその他の手段または方法によって検出されるのに十分に長い時間の間に、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片と上記三重鎖を形成する。
【００１４】
有利な一実施態様において、第１または第２のターゲティング剤のうちの少なくとも１つは、抗体、抗原結合性フラグメントまたはその変異体、融合物、誘導体もしくは組合せである。有利には、第１および第２のターゲティング剤の両方が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を認識し、そこへ結合し、抗原−抗体三重鎖を形成する、抗体、抗原結合性フラグメントまたはその変異体、融合物、誘導体もしくは組合せである。したがって、上記抗原−抗体三重鎖は、第１および第２の両抗体、抗原結合性フラグメントまたはその変異体、融合物、誘導体もしくは組合せがそこへ結合する、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含む。第１の抗体、抗原結合性フラグメント、その変異体、融合物、誘導体または組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン７−ペプチド部分に結合し、第２の抗体、抗原結合性フラグメントまたはその変異体、融合物、誘導体または組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン１９−ペプチド部分に結合する。
【００１５】
第１および第２のターゲティング剤が、抗体、抗原フラグメントまたはその変異体、融合物、誘導体もしくは組合せである場合、それらは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の異なる抗原部位に有利に結合する。典型的に、第１の抗体、抗原結合性フラグメント、その変異体、融合物、誘導体または組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン７部分に位置する抗原部位を認識し、そこへ特異的に結合する。第２の抗体、抗原結合性フラグメント、その変異体、融合物、誘導体または組合せは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン１９部分に位置する抗原部位を認識し、そこへ特異的に結合する。
【００１６】
上記第１および第２のターゲティング剤は、あらゆる順番でケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に結合し、三重鎖を形成する。これは、一実施態様において、最初に第１のターゲティング剤が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン７部分に結合し、二重鎖を形成することを意味する。その後、第２のターゲティング剤が上記二重鎖のケラチン１９部分に結合し、三重鎖を形成する。
【００１７】
別の実施態様において、最初に第２のターゲティング剤が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン１９部分に結合し、二重鎖を形成する。その後、第１のターゲティング剤が上記二重鎖のケラチン７部分に結合し、三重鎖を形成する。さらなる実施態様において、第１および第２のターゲティング剤の両方が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に実質的に同時に結合する。
【００１８】
有利な一実施態様において、第１および／または第２のターゲティング剤は、一次抗体、および／またはその断片であり、さらなる有利な実施態様において、上記第１および／または第２のターゲティング剤は、モノクローナル抗体またはその組換え抗体、および／もしくは断片である。
【００１９】
第１のターゲティング剤が抗体である場合、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識し、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片に特異的に結合する能力を有する、抗体Ｃ−３５、Ｃ−６２、Ｃ−６８、Ｃ１８、Ｃ３５、ＫＳ７．１８、ＬＤＳ−６８、ＬＰ１ＫおよびＲＣＫ１０５またはその抗体断片、変異体、融合物、誘導体もしくは組合せからなる群より選択されることが有利である。有利には、第１のターゲティング剤は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のケラチン７部分に位置する少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも７個、または１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列であって、ケラチン７タンパク質配列に固有の配列を認識する。有利には、上記第１のターゲティング剤は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のケラチン７部分中のアミノ酸配列２５６〜４１２内に位置する配列を認識する。より好ましくは、上記配列は、ケラチン７部分中のアミノ酸配列３００〜３８０からのものである。
【００２０】
有利には、ケラチン７ペプチドまたはその断片を認識する上記抗体は、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨ、ドイツから入手可能なクローンＫｓ７．１８により産生されたＫｓ７．１８モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体ＫＳ７．１８は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、またはその断片のＫ７部分のアミノ酸３００〜３５０に特異的に結合する。
【００２１】
あるいは、ケラチン７ペプチドまたはその断片を認識する上記抗体は、Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｇｍｂｈから入手可能なクローンＲＣＫ１０５により産生されたＲＣＫ１０５モノクローナル抗体である。
【００２２】
第２のターゲティング剤が抗体である場合、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識し、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的に結合する能力を有する、抗体Ａ５３−Ｂ／Ａ２．２６ａｋａ、Ｋｓ１９．１、ＢＭ−１９．２１、ＣＣＤ００３、ＣＣＤ００４、ＣＫＳ０４、ＣＫＳ０６、ＣＫＳ１４、Ｋ１９．２、ＫＭ４．６２、ＬＰ２Ｋ、ＳＡ２１およびＳＡ４５またはその抗原断片、変異体、融合物、誘導体もしくは組合せからなる群より選択されることが有利である。
有利には、第２のターゲティング剤は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のケラチン１９部分に位置する少なくとも３個、または少なくとも５個、または少なくとも７個、または１０個またはそれ以上のアミノ酸の配列であって、ケラチン１９タンパク質配列に固有の配列を認識する。有利には、上記配列は、ケラチン１９中のアミノ酸配列２４４〜４００内に位置する。より好ましくは、上記配列は、ケラチン１９部分中のアミノ酸配列３１１〜３７５からのものである。
【００２３】
有利には、ケラチン１９ペプチドまたはその断片を認識する上記抗体は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能なクローンＢＭ−１９．２１により産生されたＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体である。ＢＭ−１９．２１は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のＫ１９部分のアミノ酸３４６〜３６７に特異的に結合する。
【００２４】
あるいは、ケラチン１９ペプチドまたはその断片を認識する上記抗体は、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨから入手可能なＫｓ１９．２モノクローナル抗体である。Ｋｓ１９．２は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のＫ１９部分のアミノ酸３５２〜３６８に特異的に結合する。
【００２５】
あるいは、ケラチン１９ペプチドまたはその断片を認識する上記抗体は、クローンＫｓ１９．１ａｋａ  Ａ５３−Ｂ／Ａ２により産生されたＫｓ１９．１モノクローナル抗体である。Ｋｓ１９．１は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のＫ１９部分のアミノ酸３１１〜３３５に特異的に結合する。
【００２６】
有利には、第１のターゲティング剤はＫｓ７．１８モノクローナル抗体であり、第２のターゲティング剤はＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体である。
【００２７】
あるいは、第１のターゲティング剤はＫｓ７．１８モノクローナル抗体であり、第２のターゲティング剤はＫｓ１９．２モノクローナル抗体である。
【００２８】
あるいは、第１のターゲティング剤はＲＣＫ１０５モノクローナル抗体であり、第２のターゲティング剤はＫｓ１９．１モノクローナル抗体である。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出するためのインビトロの方法に関し、該方法は：
ａ）上記生物学的サンプルを本明細書に記載の組成物と接触させる工程；または
ｂ）上記生物学的サンプルを、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｃ）上記生物学的サンプルを、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｄ）上記ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出する工程
を含み、ここで、工程ｂ）と工程ｃ）は、あらゆる順番でまたは同時に実行される。
【００３０】
上記方法の有利な実施態様において、本明細書に開示された組成物が、好適な条件下で生物学的サンプルを接触させるために使用される。上記組成物および生物学的サンプルが接触させられる好適な条件の例は、本明細書において以下に記載される。その後、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片が、これも本明細書に記載の任意の好適な方法によって検出される。
【００３１】
あるいは、第１および第２のターゲティング剤は、別個に、組成物としてでなく提供される。しかしながら、生物学的サンプルは、上記第１および第２のターゲティング剤とあらゆる順番で接触させられる。したがって、一実施態様において、生物学的サンプルは、生物学的サンプル中に存在するケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン７部分と結合する、第１のターゲティング剤と最初に接触し、第１のターゲティング剤および異種複合体の間の二重鎖を形成する。その後、こうして形成された第１のターゲティング剤および異種複合体の間の上記二重鎖は、上記形成された二重鎖のケラチン１９部分と結合する第２のターゲティング剤と接触させられ、それによって、異種複合体に結合した第１および第２のターゲティング剤を含む三重鎖を形成する。
【００３２】
別の実施態様において、生物学的サンプルは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のケラチン１９部分に最初に結合する、第２のターゲティング剤と最初に接触し、第２のターゲティング剤および異種複合体の間の二重鎖を形成する。その後、こうして形成された第２のターゲティング剤および異種複合体を含む上記二重鎖は、上記形成された二重鎖のケラチン７部分に結合する第１のターゲティング剤と接触させられ、それによって、第１および第２のターゲティング剤ならびに異種複合体を含む三重鎖を形成する。
【００３３】
なおさらなる実施態様において、第１および第２のターゲティング剤の両方が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に実質的に同時に結合する。
【００３４】
その後、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片が、以下に記載の任意の好適な方法によって検出される。
【００３５】
インビトロの方法において使用される第１および第２のターゲティング剤は、本明細書においてこれまで記載されたように有利である。
【００３６】
生物学的サンプルは、例えば、バイオプシー検体、組織培養またはそれに由来する細胞およびその後代のような固形組織サンプル、臨床サンプル、培養細胞、細胞上清、細胞ライセートあるいは体液からなる群より選択される任意のサンプルである。ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片は、生物学的サンプル中で発現されるかまたは発現されない。
【００３７】
有利には、上記方法は、例えば血清、血漿、リンパ液、浸出液、大便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液、心膜液、腹水、胸水、膿汁、唾液、痰、滑液、涙、汗、膣分泌液、嘔吐物および尿のような生体液サンプルのために使用される。特別に有利な実施態様において、該方法は、血液、血漿および／または血清サンプルのために使用される。
【００３８】
有利な実施態様において、上記方法は、生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現を、陽性および／または陰性対照と比較する工程をさらに含み、陽性対照は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含み、陰性対照は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含まない。
【００３９】
有利な実施態様において、上記陽性対照は、悪性新生物性疾患を患っている対象から得られた生物学的サンプルであり、上記陰性対照は、悪性疾患を患っていない健康な対象から得られた生物学的サンプルである。
【００４０】
さらなる実施態様において、上記方法は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量をスコアリングする工程を含んでもよい。該スコアリングは、本分野で知られたまたは本明細書に記載される標準的なスコアリングシステムによって、検出されたターゲティング剤複合体を用いて行われる。
【００４１】
有利には、上記方法は、自動化読取装置において実行されるかまたは検出は手動で行われる。
【００４２】
本発明のさらなる一態様は、
ｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定するため、および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を予測するため、および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を評価するため、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の再発を評価するため
のインビトロの方法であり、ここで対象は、悪性新生物性疾患を有しているかまたは有することが疑われる哺乳動物である、上記方法である。
【００４３】
上記対象は、ヒト、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種のような非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜、イヌおよびネコのような飼育哺乳類、マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物からなる群の哺乳動物である。有利には、対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物である。最も有利な実施態様において、対象はヒトである。
【００４４】
悪性新生物性疾患は、胆管癌（肝臓外）、膀胱癌、乳癌、（原発）不明癌腫、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭部頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、下咽頭癌、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫（腎臓癌）、唾液腺癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌または子宮癌（子宮内膜）からなる群のうちの１つである。
【００４５】
有利には、悪性新生物性疾患は、肺癌、膀胱癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌からなる群より選択される、上記方法は、悪性新生物性疾患が、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌からなる群より選択される場合に特に有利である。
【００４６】
対象における悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定する場合、該方法は、
ａ）所与の対象から生物学的サンプルを得る工程
ｂ）上記生物学的サンプルを本明細書に記載の組成物と接触させる工程；または
ｃ）上記生物学的サンプルを、サイトケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｄ）上記生物学的サンプルを、サイトケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｅ）上記サイトケラチン７とサイトケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出する工程；
ここで、工程ｃ）および工程ｄ）は、あらゆる順番でまたは同時に実行され、ならびに
ｆ）検出されたサイトケラチン７とサイトケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量を、陽性および／または陰性対照と比較し、それによって、対象における悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定する工程
を含む。
【００４７】
場合により、本分野で知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出された抗原−抗体複合体のスコアリングが行われる。
【００４８】
サンプルは、悪性新生物性疾患を含む可能性のある任意のサンプルである。さらなる実施態様は、陽性対照が、悪性新生物性疾患を患っている対象からの細胞を含むものである。さらなる実施態様は、陰性対照が、悪性新生物性疾患を患っていない健康な対象からの細胞を含むものである。
【００４９】
悪性新生物性疾患を患っている対象における処置の結果を予測する場合、該方法は、
ａ）悪性新生物性疾患を患っている対象から生物学的サンプルを得る工程
ｂ）上記生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体の発現を検出する工程
ｃ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体の発現を、陽性および／または陰性対照と比較し、それによって、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の検出された発現に基づいて、上記対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を予測する工程
を含む。
【００５０】
悪性新生物性疾患の処置を受けている対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価する場合、該方法は、
ａ）悪性新生物性疾患の処置を受けている対象から生物学的サンプルを得る工程
ｂ）上記生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体の発現を検出する工程
ｃ）上記対象の悪性新生物性疾患の処置の間の１つまたはそれ以上の時点において、工程ａ）およびｂ）を反復する工程であって、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体の相対的発現における経時的変化が、処置の有効性を示す、上記工程
を含む。
【００５１】
したがって、有効な処置の指標は、上記方法を反復する工程において分析された先のサンプルに対する、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体の発現減少における相対的変化である。
【００５２】
場合により、本分野で知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体のスコアリングが行われる。
【００５３】
サンプルは、悪性新生物性疾患を含む可能性のある任意のサンプル、好ましくは、悪性新生物性疾患を有する対象からの生物学的サンプルであってよく、該対象は、処置の合間にあるかまたは現在処置を受けている。
【００５４】
悪性新生物性疾患の再発を評価する場合、該方法は、
ａ）先に悪性新生物性疾患を有していた対象からの生物学的サンプルを得る工程、
ｂ）上記生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体の発現を検出する工程、
ｃ）上記対象の悪性新生物性疾患の処置後の１つまたはそれ以上の時点において、工程ａ）およびｂ）を反復する工程であって、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体の相対的発現における経時的変化が、悪性新生物性疾患の再発を示す、上記工程
を含む。
【００５５】
したがって、再発の指標は、悪性新生物性疾患を同定するケラチン７とケラチン１９の異種複合体の量の増加における相対的変化、すなわち、該方法を反復する工程において分析された先のサンプルに対する、タンパク質マーカーケラチン７とケラチン１９の異種複合体の発現の経時的増加である。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、
ｉ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出するため、および／または
ｉｉ）悪性新生物性疾患を検出するため；および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断または予後判定するため、および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を予測するため、および／または
ｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価するため、および／または
ｖｉ）対象における悪性新生物性疾患の再発を評価するため
のインビトロの方法の使用を提供する。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、
ｉ）生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出するため；および／または
ｉｉ）対象における悪性新生物性疾患を検出するため；および／または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断または予後判定するため；および／または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を予測するため；および／または
ｖ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価するため；および／または
ｖｉ）対象における新生物性疾患の再発を評価するため
のキットであって、該キットは：
ａ）本明細書に記載の組成物；または
ｂ）ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む第１の容器；および
ｃ）ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書に記載の方法を実行するための説明書
を含む、上記キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ケラチンタンパク質の構造およびフィラメント集合体を示す
【図２】Ｋ７／１９アッセイのための典型的な較正曲線を示す。
【図３】本発明の方法によりアッセイした良性疾患に関する感度対９５％特異度を示す
【図４】卵巣癌における異なる腫瘍マーカー、ＣＡ１２５、ＨＥ４、Ｋ７／１９およびＣＹＦＲＡを比較するＲＯＣ曲線を示す。
【図５】ＣＡ１２５ＥＩＡおよびＨＥ４  ＥＩＡの組合せとＣＡ１２５ＥＩＡおよびＫ７／１９の組合せのアッセイを比較するＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明が説明される前に、本発明は方法、装置および製剤として記載される具体的な実施態様に限定されず、当然ながら変更が可能であると理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法は、具体的な実施態様のみを説明する目的のために使用されると理解されるべきであり、添付の請求項のみによって限定される本発明の範囲を限定することを意図されない。本明細書および添付の請求項において使用される単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、明らかな別段の定めのない限り、複数の指示物を含み、当業者公知の等価な工程および方法への言及を含むことに注意しなければならない。
【００６０】
本発明において使用される用語は、一般に、分子生物学の分野の当業者により一般的に受け入れられる標準的な定義に忠実であるはずである。以下に列挙されるいくつかの例外は、本発明の範囲内においてさらに定義されている。
【００６１】
本明細書中で使用される「少なくとも１つ」は、１またはそれを超える、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などを意味する。
【００６２】
本明細書中で使用される「検出」、「検出する」、「検出すること」は、対照に関連したまたは関連しない定性的および／または定量的な検出（レベルを測定すること）を含み、さらに、所与のタンパク質、特に、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在、不存在または量を同定することをさす。
【００６３】
本明細書中で使用される「診断」は、疾患の性質の同定を包含する。
【００６４】
本明細書中で使用される「予後判定」は、疾患の起こり得る転帰に関する予想、疾患の性質および症状により示される疾患からの回復に関する見通しを包含する。
【００６５】
「真陽性」は、局在性のまたは転移した悪性新生物を有する対象をさす。
【００６６】
「偽陰性」は、局在性のまたは転移した悪性新生物のいずれかを有し、診断アッセイによってそのように分類されない対象をさす。
【００６７】
「真陰性」は、局在性のまたは転移した悪性新生物を有さず、診断アッセイによってそのように分類される対象をさす。
【００６８】
「偽陽性」は、局在性のまたは転移した悪性新生物を有さないが、慣用の診断アッセイによって局在性のまたは転移した悪性新生物を有すると分類される対象をさす。
【００６９】
文脈次第で、用語「偽陽性」は、悪性新生物を有さないが、診断アッセイにより悪性新生物または非悪性疾患を有すると分類される対象をさす場合もある。
【００７０】
診断アッセイへのその適用との関連において本明細書中で使用される「感度」は、正確にそのようなものとして同定される局在性のまたは転移した悪性新生物を有するすべての対象の割合（すなわち、真陽性の数を真陽性と偽陰性の数の合計で除したもの）をさす。
【００７１】
診断アッセイとの関連において本明細書中で使用される診断アッセイの「特異度」は、正確にそのようなものとして同定される局在性のまたは転移した悪性新生物をどちらも有さないすべての対象の割合（すなわち、真陰性の数を真陰性および偽陽性の数の合計で除したもの）をさす。
【００７２】
用語「新生物」または「腫瘍」は、交換可能に使用され、組織の異常な腫瘤であって、この腫瘤の成長が正常組織の成長をしのぎ、それと協調しないものをさす。新生物または腫瘍は、以下の特徴：形態および機能を含む細胞分化の程度、成長速度、局所的な浸潤および転移、によって「良性」または「悪性」と定義される。「良性」新生物は、一般によく分化しており、特徴として悪性新生物よりも成長が遅く、発生部位に局在化されたままである。さらに、良性新生物は、遠隔部位に浸潤、侵入または転移する能力を有さない。
【００７３】
「悪性」新生物は、一般に低分化型（退形成）であり、特徴として進行性の浸潤、侵入および周囲組織の破壊を伴う、急速な成長がある。さらに、悪性新生物は、遠隔部位へ転移する能力を有する。用語「転移」は、原発（原発性）腫瘍から別の臓器または組織への癌性細胞の伝播または遊走をさし、典型的に、原発（原発性）腫瘍のものであって、二次（転移性）腫瘍が位置する臓器または組織のものではない組織タイプの「二次腫瘍」または「二次細胞塊」の存在によって同定可能である。例えば、骨に遊走した肺の癌腫は、転移性肺癌と言われ、骨組織中で増殖する肺上皮細胞に由来する癌細胞からなる。
【００７４】
「健康な」は、良好な健康状態を有する対象をさす。そのような対象は、いかなる悪性または非悪性疾患もないことを示す。本願との関連において、「健康な個体」は、彼らがいかなる悪性または非悪性疾患もないという点でのみ健康であり；「健康な個体」は、通常は「健康」とみなされない他の疾患または状態を有する場合もある。
【００７５】
本明細書中で使用される「対象」は、ヒト、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種のような非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜、イヌおよびネコのような飼育哺乳類、マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物などを含む。該用語は、特定の年齢または性別を意味しない。したがって、雄性または雌性いずれかの成体および新生仔対象ならびに胎仔にわたることを意図される。好ましい実施態様において、対象は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物である。最も好ましい実施態様において、対象はヒトである。
【００７６】
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、特定の抗原に対するものであって、Ｂ細胞の単一クローンまたはハイブリドーマにより産生される、単一のアミノ酸組成の抗体をさす。
【００７７】
本明細書中で使用される「ポリクローナル抗体」は、異なるＢ細胞株に由来する特定の抗原に対する抗体をさす。
【００７８】
本明細書中で使用される「Ｆａｂ」は、約５０，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片であって、プロテアーゼ、パパインでＩｇＧを処理することによって得られる断片のうちで、そのＨ鎖のＮ末端側の約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して一緒に結合されているものをさす。
【００７９】
本明細書中で使用される「Ｆ（ａｂ’）２」は、約１００，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片であって、プロテアーゼ、ペプシンでＩｇＧを処理することによって得られる断片のうちで、ヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたＦａｂよりもわずかに大きいものをさす。
【００８０】
本明細書中で使用される「Ｆａｂ１」は、約５０，０００Ｄａの分子量および抗原結合活性を有する抗体断片であって、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られるものをさす。本明細書中で使用されるとおり、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、通常、ペプチドをコードするリンカーにより連結された、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される、共有結合したＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーをさす。本発明のヒトｓｃＦｖ断片は、好ましくは、遺伝子組換え技術を用いて適切なコンフォメーションに保たれたＣＤＲを含む。
【００８１】
本明細書中で使用される「ハイブリドーマ」は、非ヒト哺乳動物を抗原により免疫化することによって調製したＢ細胞を、抗原特異性を有する所望のモノクローナル抗体を産生するマウス等由来の骨髄腫細胞との細胞融合に供することによって得られる細胞を意味する。
【００８２】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、その中でアミノ酸残基がペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって連結されているアミノ酸鎖をさすために、本明細書中で交換可能に使用される。アミノ酸鎖は、２アミノ酸より大きな任意の長さであることができる。別段の定めのない限り、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、多様なその修飾形態も包含する。そのような修飾形態は、天然の修飾形態または化学的に修飾された形態である。修飾形態の例としては、グリコシル化形態、リン酸化形態、ミリストイル化形態、パルミトイル化形態、リボシル化形態、アセチル化形態、ユビキチン化形態などが挙げられるが、それらに限定されない。修飾は、分子内架橋および脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコールまたはその誘導体のような多様な部分への共有結合も含む。さらに、修飾は、環化、分枝および架橋も含む。さらに、遺伝子によりコードされる慣用の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸が、ポリペプチド中に含まれる可能性もある。
【００８３】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、悪性新生物を有するかまたは有さない任意の対象から得られた様々なタイプのサンプルを包含する。典型的な対象は、ヒトであるが；癌を発症し得る悪性新生物を有する任意の哺乳動物が、開示された方法において有用な生物学的サンプルの供給源としての役割を果たすことができる。開示された方法において有用な代表的な生物学的サンプルとしては、バイオプシー検体、組織培養またはそこに由来する細胞およびその後代のような固形組織サンプル、臨床サンプル、培養細胞、細胞上清、細胞ライセート、体液が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、生物学的サンプルは、悪性新生物を有することが疑われる個人から収集された組織または体液から得られたサンプルを含む。
【００８４】
生体液サンプルとしては、血清、血漿、リンパ液、浸出液、大便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液、心膜液、腹水、胸水、膿汁、唾液、痰、滑液、涙、汗、膣分泌液、嘔吐物および尿が挙げられるが、それらに限定されない。
【００８５】
さらなる例は、バイオプシーおよび／または細針吸引液である。サンプルは新鮮なものでもよいし、または（例えば、目的を達成するために）収集後に加工されたものでもよい。いくつかの例において、加工されたサンプルは、固定（例えば、ホルマリン固定）されおよび／またはワックス（例えば、パラフィン）包埋される。
【００８６】
マウントされた細胞および組織標本のための固定液は、本分野で周知であり、９５％アルコール性ブアン固定液；９５％アルコール固定液；Ｂ５固定液、ブアン固定液、ホルマリン固定液、カルノフスキ固定液（グルタルアルデヒド）、ハートマン固定液、オランド固定液（Hollande's fixative）、オース溶液（Orth's solution）（重クロム酸固定液）およびツェンカー固定液を制限なく含む（例えば、Ｃａｒｓｏｎ、Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｓｅｌｆ−Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｘｔ、Ｃｈｉｃａｇｏ：ＡＳＣＰ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照されたい）。いくつかの例において、サンプル（またはその画分）は固相支持体上に存在する。
【００８７】
開示された方法において有用な固相支持体は、生物学的サンプルを支えることのみが必要であり、場合により、しかし有利には、サンプル中の着目のタンパク質の簡便な検出を可能とする。代表的な支持体は、顕微鏡スライド（例えば、ガラス顕微鏡スライドまたはプラスチック顕微鏡スライド）、カバースリップ（例えば、ガラスカバースリップまたはプラスチックカバースリップ）、組織培養皿、マルチウエルプレート、メンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）；チップを含む。
【００８８】
本明細書中で使用される「処置」は、内科的または外科的手段による患者の管理と定義される。処置は、医学的状態または疾患の少なくとも１つの症状を改善または緩和し、治癒させることが必要とされる。本明細書中で使用される用語「処置結果」または「処置の結果」は、処置の患者に対する身体的効果である。
【００８９】
本明細書中で使用される用語「アルゴリズム」は、２つまたはそれ以上の量の間の関係を規定する数式をさす。そのような式は、線形、または非線形であってよく、コンピュータメモリにおける多様な数的重み付け係数として存在する。
【００９０】
「肺癌」は、所与の対象内の肺の新生物、例えば、悪性新生物をさし、該新生物は、上皮起源、すなわち、肺の癌腫である。肺の癌腫は、サイズおよび悪性細胞の外観により分類され、用語「肺癌」は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を両方含む。条件をつけずに使用される場合、用語「肺癌」は、局在性のおよび転移した肺癌を両方含む。用語「肺癌」は、異なるタイプの腫瘍を鑑別するために用語「局在性」または「転移性」で修飾することができ、ここで「局在性」は、元の母腫瘍をさし、転移性は元の母腫瘍から伝播した腫瘍をさす。
【００９１】
ＴＮＭシステム（腫瘍、リンパ節、転移）は、初期評価においてＮＳＣＬＣを病期分類するために使用される。ＴＮＭ記述を用いて、不顕性癌から０、ＩＡ（１−Ａ）、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢおよびＩＶ（４）期まで、群が割り当てられる。この病期群は、処置の選択および予後の予測を支援する。
【００９２】
小細胞肺癌は、従来、（胸部の半分および単一の耐容放射線治療野内に限定された）「限局期」または「拡張期」（より広範囲の疾患）に分類されてきた。しかしながら、ＴＮＭ分類および群分けは、予後を推定することにおいて有用である。
【００９３】
ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの両方に関して、２つの一般的タイプの病期判定は、臨床的病期判定および外科的病期判定である。臨床的病期判定は、根治手術の前に行われる。これは、（ＣＴスキャンおよびＰＥＴスキャンのような）画像診断の結果およびバイオプシーの結果に基づく。外科的病期判定は、手術の間または後に評価され、胸部リンパ節の外科的サンプリングを含む、外科的および臨床的知見の結果の組合せに基づく。
【００９４】
「卵巣癌」は、所与の女性対象内の卵巣の新生物、例えば、悪性新生物をさし、該新生物は、上皮起源のものである。
【００９５】
条件をつけずに使用される場合、用語「卵巣癌」は、局在性のおよび転移した卵巣癌を両方含む。用語「卵巣癌」は、異なるタイプの腫瘍を鑑別するために用語「局在性」または「転移性」で修飾することができ、ここで「局在性」は、元の母腫瘍をさし、転移性は元の母腫瘍から伝播した腫瘍をさす。
【００９６】
卵巣癌は、ＡＪＣＣ／ＴＮＭシステムによって病期分類されることができる。これは、原発腫瘍（Ｔ）の範囲、近くのリンパ節への転移（Ｎ）の不存在または存在、および遠隔転移（Ｍ）の存在または不存在を記述する。原発腫瘍の範囲は、３つの下位カテゴリ、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３を含む。これは、ほとんどの婦人科の腫瘍学者によって実際に使用されている、ＦＩＧＯシステムと呼ばれるシステムによく似ている。どちらも実際の病期に関して手術の結果に依存する。ＦＩＧＯシステムにおいては、腫瘍病期は、どれだけ遠くまで腫瘍が伝播したかによってＩ〜ＩＶに分類される。ＩＶ期が最悪であり、腫瘍がその推定される限界まで伝播していることを意味する。Ｉ〜ＩＩＩ期は、下位カテゴリＡ、ＢおよびＣを含む。
【００９７】
「食道癌」は、所与の対象内の食道の新生物、例えば、悪性新生物をさし、該新生物は、上皮起源、すなわち、食道の癌腫である。これらの癌腫は、２つのクラス：腺癌または扁平上皮癌に属する。
【００９８】
食道癌を病期分類するために使用される最も一般的なシステムは、米国対がん合同委員会（American Joint Committee of Cancer）（ＡＪＣＣ）のＴＮＭシステムである。ＴＮＭシステムは、数種の主要な情報に基づく：Ｔは、どれだけ遠くまで原発腫瘍が食道壁中および近くの臓器まで成長しているかをさす。Ｎは、近くのリンパ節まで伝播した癌をさす。Ｍは、癌が転移したか（遠隔臓器まで伝播したか）を示す。Ｇは、癌のグレードを記述し、これは、顕微鏡下で癌細胞のパターンがどのように見えるかに基づく。病期分類は、癌の細胞タイプ（扁平上皮癌または腺癌）も考慮する。扁平上皮癌については、腫瘍の位置も病期分類における要素であることができる。
【００９９】
「膀胱癌」は、所与の対象内の膀胱の新生物、例えば、悪性新生物をさし、該新生物は、尿路上皮または移行上皮が起源である。したがって、膀胱癌は、移行細胞（尿路上皮）癌腫をさすが、膀胱の腺癌もさす。
【０１００】
膀胱癌について最もよく使用される病期分類システムは、米国対がん合同委員会（ＡＪＣＣ）もものである。これは、ＴＮＭシステムとも呼ばれる。腫瘍を記述するＴカテゴリは、下位カテゴリ：Ｔ０、Ｔａ、Ｔｉｓ、Ｔ１、Ｔ２ａ、Ｔ２ｂ、Ｔ３ａ、Ｔ３ｂ、Ｔ４を含む。
【０１０１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫細胞化学（ＩＣＣ）のようなイムノアッセイ
本明細書中で使用される「イムノアッセイ」は、物質の混合物を含むことの多いサンプル中の物質の存在または濃度を測定する生化学検査である。そのようなアッセイは、１つまたは非常に限定された群の分子または抗原に高い特異性で結合する抗体固有の能力に基づく。免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、開示された方法および使用においてケラチン７とケラチン１９の抗原性異種複合体、および／またはその断片を検出するために有用な２つの代表的なイムノアッセイ技術である。
【０１０２】
免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、特異的エピトープを介して細胞中の特定のペプチドまたはタンパク質抗原を標的とする抗体を用いる、一般的な実験技術である。次いで、これらの結合した抗体は、数種の異なる方法を用いて検出されることができる。ＩＣＣは、研究者が特定のサンプル中の細胞が問題の抗原を発現するか否かを評価することを可能とする。免疫陽性のシグナルが認められた場合、ＩＣＣは、研究者がどの細胞内コンパートメントが該抗原を発現しているかを決定することも可能とする。
【０１０３】
免疫組織化学（ＩＨＣ）において、サンプルは、生体組織の切片であり、各細胞は組織構造および無処置の組織中に通常認められる他の細胞に囲まれている。免疫細胞化学は、特定のタンパク質または抗原に結合する特異的な抗体の使用によって、細胞（培養細胞、細胞懸濁液）中の該タンパク質または抗原の存在を評価するために使用される技術であって、それによって、顕微鏡下の可視化および検査を可能とする。これは、個々の細胞からの細胞内容物の決定のための価値のあるツールである。分析可能なサンプルは、血液スメア、吸引液、スワブ、培養細胞および細胞懸濁液を含む。
【０１０４】
酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびサンドイッチＥＬＩＳＡは、本明細書に開示された方法において有利に使用されるイムノアッセイである。（直接的）ＥＬＩＳＡにおいては、未知の量の抗原が表面に固定され、次いで、抗原に結合できるように、特異的な抗体が該表面に加えられる。この抗体は、酵素に連結されており、最終工程において該酵素が何らかの検出可能なシグナル、最も一般的には化学的基質における色変化に変換できるように、物質が添加される。サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、抗原に結合することができる捕捉抗体が表面に固定される。他の工程は、ＥＬＩＳＡと等しい。
【０１０５】
サンドイッチＥＬＩＳＡに類似した酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）においては、ストレプトアビジンが表面に固定され、次いで、捕捉抗体がビオチン化され、その他の点では、他の工程がＥＬＩＳＡと同等に実行される。ＥＩＡイムノアッセイは、本明細書に開示された方法において有利に使用される。
【０１０６】
（時には、タンパク質イムノブロットと呼ばれる）ウエスタンブロットは、組織ホモジェネートまたは抽出物の所与のサンプル中の特定のタンパク質を検出するために使用される、広く使用されている分析技術である。これは、ポリペプチドの長さ（変性条件）によって、またはタンパク質の３Ｄ構造（天然／非変性条件）によって、天然のまたは変性したタンパク質を分離するために、ゲル電気泳動を使用する。次いで、タンパク質は、膜（典型的には、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に移され、ここで、標的タンパク質に特異的な抗体を用いて探索（検出）される。
【０１０７】
例えば、ケラチン７とケラチン１９および／またはその断片に特異的な抗体、抗原結合性フラグメントまたはその変異体、融合物、もしくは誘導体のようなターゲティング剤が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現を検出するために使用される。本発明のターゲティング剤は、組成物として有利に提供されるが、個別に相次いで提供される場合もある。こうして、本発明の方法は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に結合する抗体、抗原結合性フラグメントあるいは変異体、融合物または誘導体を提供する。本明細書にさらに記載されるように、抗体は、例えば、放射活性標識、蛍光標識、ビオチンのようなハプテン標識、あるいはホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素による抗体自身の直接的標識化、により検出可能である。あるいは、非標識化一次抗体が、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体などを含む標識化二次抗体とともに使用される、間接的標識化が使用される。ＩＨＣおよびＩＣＣプロトコールは、本分野で周知であり、市販されており、例えば、参照により本明細書に組み入れる、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  １９８８）ならびにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（どちらもＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。
【０１０８】
上記で明らかなとおり、本発明は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および／または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の診断および／または予後判定の感度および特異度を改善するための手段および方法を提供する。より具体的には、本発明は、ＥＬＩＳＡおよびＥＩＡならびにＩＨＣおよびＩＣＣにおける悪性新生物のタンパク質マーカーの検出を改善し、それによって例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および／または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有する患者の診断および／または予後判定を実行するときにより一貫性があり信頼できる結果を与えるように、悪性新生物性疾患の検出の感度をより良くする組成物を提供する。
【０１０９】
さらに、本発明による方法は、利用可能な方法に比べて、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および／または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の同定を改善する。
【０１１０】
したがって、本明細書中の方法において使用されるターゲティング剤は、例えば、ＣＹＦＲＡ２１−１のような他の知られた方法に比べて、多様な悪性新生物性疾患の改善された検出を示す（本明細書中に与えられる実施例を参照されたい）。
【０１１１】
実施例２〜５は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および／または卵巣癌のような悪性新生物性疾患が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の発現によって同定されることを示す。該方法は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および／または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的に結合する抗体によって検出する。
【０１１２】
タンパク質
本発明の方法は、例えば、２つの一次抗体、抗原結合性フラグメント、その変異体、融合物、誘導体または断片のような少なくとも２つのターゲティング剤の使用を包含する。少なくとも１つの第１の一次抗体が、ケラチン７またはその断片に特異的に結合し、少なくとも１つの第２の一次抗体が、ケラチン１９またはその断片に特異的に結合する。上記第１および第２の両一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片（複数可）に特異的にかつ同時に結合することができる。
【０１１３】
サイトケラチン７（ＣＫ７）またはサルコレクチン（ＳＣＬ）としても知られるケラチン７（Ｋ７）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００５５４７．３、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３８５５）は、ヒトにおいてＫＲＴ７遺伝子によりコードされるタンパク質である。ケラチン７は、ＩＩ型ケラチンであり、ＩＩ型ケラチンをコードする他の遺伝子とともに染色体１２ｑ１２−ｑ１３の領域中にクラスター化されている。Ｋ７は、４６９アミノ酸長であり、図１に見られる一般構造を有する、５１ｋＤａのタンパク質である。別のスプライシングは、数種の転写変異体を生じさせる。これは、内部臓器の腔を裏打ちする単層上皮中ならびに腺管および血管中で特異的に発現される。
【０１１４】
ケラチン１９（Ｋ１９）（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００２２６７．２、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３８８０）は、サイトケラチン（ＣＫ１９）としても知られ、発生中の表皮を覆う一過性の層である胞皮中に特異的に認められるＩ型ケラチンである。Ｋ１９は、４００アミノ酸長であり、図１に見られる一般構造を有する、４４ｋＤａのタンパク質である。Ｋ１９は、ヒトにおいてＫＲＴ１９遺伝子によりコードされ、染色体１７ｑ１２−ｑ２１遺伝子の領域に位置する。
【０１１５】
インビボで、ケラチンはヘテロポリマーとして集合する、すなわち、Ｉ型およびＩＩ型タンパク質がヘテロダイマーを形成し、次に集合してテトラマーを形成する。２つのモノマーがそれらのα−ヘリックスのロッドの、ずれがなく同じ方向を向いたコイルドコイルへの巻き付きによって平行なダイマーを形成し、次いで、２つのダイマーがねじれ型の逆平行方向に並んで一緒になって二方向性テトラマーを形成する（図１を参照されたい）。ケラチンＫ７およびＫ１９がヘテロダイマーおよびテトラマーに集合するとき、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体が形成される。
【０１１６】
本明細書中で使用される用語「ケラチン７とケラチン１９の異種複合体」は、完全長ケラチン７と完全長ケラチン１９およびその断片の間の平行でずれのないダイマーに由来する分子実体を含むと意図される。これはさらに、ケラチン７とケラチン１９の間のダイマーを重ねて、ケラチン７およびケラチン１９およびその断片の間の逆平行テトラマーとすることを含む。これはさらに、これらのテトラマーおよびその任意の断片から構築されたオリゴマー、プロトフィラメントおよびフィラメントを含む。ケラチンの異種複合体の一般構造に関しては、図１を参照されたい。
【０１１７】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体中に、有利には、異種複合体のケラチン７部分由来の、最も少なくて３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個または少なくとも３０個であるが、より好ましくは、４０個超の連続した配列のアミノ酸があり、かつ、異種複合体のケラチン１９部分由来の、最も少なくて３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個または少なくとも３０個であるが、より好ましくは、４０個超の連続した配列のアミノ酸がなければならない。上記アミノ酸は、それぞれケラチン７またはケラチン１９に固有でなければならない。
【０１１８】
有利には、上記最も少なくて３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個または少なくとも３０個であるが、より好ましくは、４０個超の連続した配列のアミノ酸は、ケラチン７タンパク質中のアミノ酸２５６〜４１２からのものである。より好ましくは、該連続した配列は、ケラチン７中のアミノ酸３００〜３８０からのものである。
【０１１９】
有利には、上記最も少なくて３個、好ましくは少なくとも５個または少なくとも１０個、または少なくとも１５個、または少なくとも２０個、または少なくとも２５個または少なくとも３０個であるが、より好ましくは、４０個超の連続した配列のアミノ酸は、ケラチン１９タンパク質中のアミノ酸２４４〜４００からのものである。より好ましくは、該連続した配列は、ケラチン１９中のアミノ酸３１１〜３７５からのものである。
【０１２０】
抗体
一態様において、本発明は、生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在を検出するための、例えば、２つの一次抗体、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体のような少なくとも２つターゲティング剤の使用を包含する方法を提供し、ここで、第１の一次抗体、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体は、異種複合体のケラチン７またはその断片に特異的に結合し、第２の一次抗体、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体は、異種複合体のケラチン１９またはその断片に特異的に結合する。有利には、該少なくとも２つの抗体、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体は、使用者によってすぐに使える形式のまたは時には、原液と呼ばれる使用直前の希釈を必要とする濃縮液のいずれかである抗体カクテル中に一緒に存在する。
【０１２１】
したがって、本発明の一態様は、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する、少なくとも１つの第１の一次抗体、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体、ならびにケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する、少なくとも１つの第２の一次抗体、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体を含む組成物を包含し、ここで、第１および第２の両一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的かつ同時に結合することができる。
【０１２２】
本明細書中で使用される「に特異的に結合する」または「と特異的に反応する」は、「選択的に結合することができる」または「に特異的に結合する」に等しいと意図される。本明細書中で使用される上記表現は、抗体由来の任意の結合部分を含む抗体または抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体を意味することを意図され、これは、分子の抗原に結合することができ、さらに別のタンパク質よりも少なくとも１０倍強力に、例えば、５０倍強力にまたは少なくとも１００倍強力に結合することができる。結合部分は、生理学的条件下、例えば、インビボで、タンパク質に選択的に結合することができる。相対的結合強度を測定するための好適な方法は、例えば、結合部分が抗体であるイムノアッセイを含む。あるいは、結合は、競合アッセイを用いてまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて評価される。
【０１２３】
本明細書中で使用される用語「に特異的かつ同時に結合する」により、第１および第２のターゲティング剤が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的かつ同時に結合し、上記第１および第２のターゲティング剤ならびにケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含む三重鎖を形成することを意味することが意図される。上記第１および第２のターゲティング剤は、該複合体が本明細書に記載の任意の手段または方法によってあるいは当業者公知の手段または方法によって検出されるのに十分に長い時間の間に、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片とともに上記三重鎖を形成する。
【０１２４】
一実施態様において、第１および第２の抗体または抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体はそれぞれ、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の別々の抗原部位に結合する。典型的に、第１の一次抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ７部分に存在する抗原部位と特異的に反応し、第２の一次抗体がケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ１９部分に存在する抗原部位と特異的に反応する。
【０１２５】
ケラチン７とケラチン１９の間の異種複合体の２つのモノマー、ケラチン７およびケラチン１９は、らせん構造と平行でずれがないように整列し、ケラチン７およびケラチン１９それぞれのヘリックス１Ａから始まってヘリックス２Ｂまでの対応する位置に結合する任意の２つの抗体は同時に結合しない（図１を参照されたい）。これは、ケラチン７がケラチン１９の周りに巻き付き、対応する露出した位置が立体的な理由によって２つの抗体の同時の結合を許容しないことを意味する。これは、例えば、コイルドコイル中でケラチン１９のアミノ酸２７１〜２９１が、ケラチン７のアミノ酸２８３〜３０３と対になる場合にさらに例示される。ケラチン７に対する抗体がケラチン７の配列２８３〜３０３内に結合すると、ケラチン１９に対する抗体は立体的障害により、異種複合体中で同時にケラチン１９のアミノ酸２７１〜２９１に結合することができない。
【０１２６】
例えば、Ｃ−３５、Ｃ−６２、Ｃ−６８、Ｃ１８、Ｃ３５、ＫＳ  ７．１８、ＬＤＳ−６８、ＬＰ１Ｋ、ＲＣＫ１０５のような、ケラチン７に特異的に結合する多くの利用可能な抗体が、本明細書に示される方法において使用される。しかしながら、本明細書に示される方法において有利に使用される１つの抗体は、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨ、ドイツから入手可能なクローンＫｓ７．１８により産生されたケラチン７モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体ＫＳ７．１８は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ７部分のアミノ酸３００〜３５０に特異的に結合する。
【０１２７】
ケラチン１９に特異的に結合する利用可能な抗体の例は、Ａ５３−Ｂ／Ａ２．２６  ａｋａ  Ｋｓ１９．１、ＢＭ−１９．２１、ＣＣＤ００３、ＣＣＤ００４、ＣＫＳ０４、ＣＫＳ０６、ＳＡ２１、ＳＡ４５、Ｋｓ１９．２、ＬＰ２Ｋである。しかしながら、本方法において有利に使用される１つの抗体は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能なクローンＢＭ−１９．２１により産生されたＢＭ−１９．２１モノクローナル抗体としても知られる、Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍＢＨから入手可能なＫｓ  １９．２モノクローナル抗体である。ＢＭ−１９．２１は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ１９部分のアミノ酸３４６〜３６７に特異的に結合する。ケラチン１９に対する数種の抗体が、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ３０  Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ：Ｔｈｅ  ＩＳＯＢＭ  ＴＤ−１  ｗｏｒｋｓｈｏｐ、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ  １９９８；１９：１３２〜１５２に記載されている。
【０１２８】
有利には、第１および第２の一次抗体の各々、または抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体が、水性形態またはフリーズドライ粉末形態の抗体カクテルとしての組成物中に提供される。後者に関しては、使用前に抗体を使用可能な液体形態とするために、再水和工程が必要とされる。
【０１２９】
あるいは、第１および第２の一次抗体が個別に提供され、すなわち、本明細書に示される方法において使用される場合、一方の一次抗体が他方の前に提供される。一実施態様において、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１の一次抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含有するサンプルに与えられる。第１の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ７部分に存在する抗原部位に結合し、抗原−Ｋ７−抗体複合体を形成する。その後、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２の一次抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体−Ｋ７−抗体を含有するサンプルに与えられる。上記第２の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のＫ１９部分に存在する抗原部位に結合し、Ｋ１９−抗体−抗原−Ｋ７−抗体複合体を形成する。
【０１３０】
代わりの実施態様において、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２の一次抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含有するサンプルに与えられる。第２の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のＫ１９部分に存在する抗原部位に結合し、抗原−Ｋ１９−抗体複合体を形成する。その後、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１の一次抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体−Ｋ１９−抗体を含有するサンプルに与えられる。上記第１の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のＫ７部分に存在する抗原部位に結合し、Ｋ７−抗体−抗原−Ｋ１９−抗体複合体を形成する。
【０１３１】
抗体は、それらがインビトロで所望のタンパク質に結合することができる限り、全抗体またはその断片、例えば、抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体であってよい。そのような結合特異性は、すべてのサブユニットまたはそのヘテロダイマーを発現するトランスフェクトされた細胞を用いる、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ、免疫組織化学、免疫沈降、ウエスタンブロット、クロマトグラフィーおよびフローサイトメトリーのような、本分野で周知の方法によって決定される（実施例を参照されたい）。
【０１３２】
用語「抗体」は、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、モルモットまたはウサギ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ブタ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ロバ、ウマまたはニワトリのような非げっ歯類のような任意の種の実質的に完全な抗体分子、ならびにキメラ抗体、ヒト化抗体、（天然のヒト抗体に対して、少なくとも１つのアミノ酸が突然変異した）ヒト抗体、単鎖抗体、二重特異性抗体、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体軽鎖のホモダイマーおよびヘテロダイマー、ならびに抗原結合性フラグメントおよびその誘導体を含む。例えば、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１３３】
すべてが１つまたはそれ以上の可変ドメインを含有する抗体断片の細菌発現を含む実験からわかるように、抗原特異性は、可変ドメインによって付与され、定常ドメインには非依存性である。これらの分子は、Ｆａｂ−様分子；Ｆｖ分子；ＶＨおよびＶＬパートナードメインがフレキシブルなオリゴペプチドを介して連結されている単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子；および単離されたＶドメインを含む、単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）を含む。その特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関与する技術の一般的総説は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、２９３〜２９９中に見出される。
【０１３４】
したがって、「抗原結合性フラグメント」は、タンパク質Ｋ７もしくはＫ１９またはその断片、およびケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のいずれかに結合することのできる抗体の機能性断片を意味する。代表的な抗原結合性フラグメントは、Ｆｖ断片（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合したＦｖ）、Ｆａｂ−様断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片およびＦ（ａｂ）２断片）、単一の抗体鎖（例えば、重鎖または軽鎖）、単一の可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）ならびにドメイン抗体（単一および二重フォーマットを含むｄＡｂ；すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂ）からなる群より選択される。
【０１３５】
したがって、一実施態様において、抗体または抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体は、完全な抗体を含むかまたはそれからなる。一実施態様において、抗体はモノクローナル抗体である。
【０１３６】
例えば、抗体または抗原結合性フラグメント、またはその変異体、融合物もしくは誘導体は、完全な抗体から本質的になる。「から本質的になる」により、発明者らは、抗体または抗原結合性フラグメント、その変異体、融合物または誘導体が、２つの異なるタンパク質Ｋ７およびＫ１９またはその断片のいずれかに対する結合特異性を保持するのに十分な、完全な抗体の一部からなることを意味する。さらなる実施態様において、２つの異なるタンパク質Ｋ７およびＫ１９は、ヒト起源のものである。
【０１３７】
用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体を含む。しかしながら、一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子のようなＩｇＧ分子である。一実施態様において、抗体は、ＩｇＧ１分子である。さらなる実施態様において、抗体は、カッパ軽鎖を含むＩｇＧ１分子である。
【０１３８】
さらなる実施態様において、抗体は、非天然の抗体である。当然ながら、抗体が天然の抗体である場合、それは単離された形態で提供される（すなわち、それが自然において見出されるものとは異なる）。
【０１３９】
例えば、ポリエチレングリコールまたは他の好適なポリマーの共有結合により修飾された、抗体の修飾された異形およびその抗原結合性フラグメント、ならびにその使用も本発明の範囲内に含まれる。
【０１４０】
抗体および抗体断片の生成方法は、本分野で周知である。例えば、抗体は、抗体分子のインビボ産生の誘導、イムノグロブリンライブラリーのスクリーニングまたは培養中の細胞株によるモノクローナル抗体分子のインビボ産生を使用する数種の方法のいずれかを介して生成される。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）−ハイブリドーマ技術を含むが、それに限定されない。
例えば、Ｋ７またはＫ１９に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成することは、全タンパク質またはその好適な断片が（マウスまたはウサギのような）非ヒト哺乳動物に注射され、続いてブースター注射されて、抗体反応を生じさせる免疫化によって行われる。免疫動物から単離される血清がその中に含有されるポリクローナル抗体のために単離されるか、または免疫動物からの脾臓がハイブリドーマおよびモノクローナル抗体の産生のために使用される。
【０１４１】
一例において、上記タンパク質のうちの１つに対するモノクローナル抗体が、古典的なＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５）またはそれから派生した方法によってマウスハイブリドーマから調製される。簡単に言えば、（Ｂａｌｂ／ｃのような）マウスが、数週間にわたって、数マイクログラムの選択されたタンパク質もしくはそのペプチド断片または好適なそのキャリアーコンジュゲートを繰り返し接種される。次いで、そのマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞が単離される。脾臓細胞は、ポリエチレングリコールによりマウス骨髄細胞と融合され、過剰の未融合細胞が、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）における系の増殖によって破壊される。うまく融合した細胞が希釈され、希釈液のアリコートがマイクロタイタープレートのウエル中に入れられ、ここで培養の増殖が継続される。元はＥｎｇｖａｌｌ（Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７０：４１９、１９８０）により記述されたＥＬＩＳＡのようなイムノアッセイ手順およびそこから派生した方法によりウエルの上清液中の抗体を検出することによって、抗体産生クローンが同定される。
選択された陽性クローンは増殖されることができ、そのモノクローナル抗体生成物が使用のために回収される。
【０１４２】
抗体の商業的供給源は、ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、Ａｂｅａｍ、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ、ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ  Ｃｏｒｐ．Ａｂｎｏｖａ、Ａｃｒｉｓ、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｂｉｏｔｅｃｈなどを含む。ポリクローナル抗体産生動物は、免疫動物を失血させることおよび好適なポリクローナル抗体力価を有する適切な動物を選択することによって同定される。
【０１４３】
いくつかの実施態様において、抗体は、使用前に精製される。抗体の精製は、本分野で利用可能であり、かつ当業者公知の技術を用いて行われる。
【０１４４】
抗体Ｋ７およびＫ１９の生成は、本分野で記載され、本明細書に記載の商業的供給源から入手可能であるか、または当業者公知の技術を用い、本明細書に含まれ、その結果、参照によって組み入れられた参考文献を用いて入手可能である。
【０１４５】
抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体は、組換え手段によっても生成される。選択された抗原およびタンパク質に対する好適なモノクローナル抗体が、当業者公知の技術によって調製される。抗体断片も、当本分野で周知の方法を用いて得られることができる。例えば、抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解によってあるいは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵母細胞培養または他のタンパク質発現系）における該断片をコードするＤＮＡの発現によって調製される。あるいは、抗体断片は、慣用方法による全抗体のペプシンまたはパパイン消化によって得られることができる。
【０１４６】
したがって、一実施態様において、本明細書に示される方法において使用される一次抗体のうちの少なくとも１つは、モノクローナル抗体である。さらなる実施態様において、本発明の方法において使用される一次抗体のうちの少なくとも１つは、組換え抗体である。
【０１４７】
あるいは、複合体生成は、デュオリンク（duolink）（Ｏ−ｌｉｎｋ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出される。慣用の免疫蛍光法は、個々のタンパク質の存在を明らかにすることができるが、異なるタンパク質の間のヘテロダイマーの生成を検出することはできない。Ｄｕｏｌｉｎｋを用いて、ヘテロ二量体化がどこで起こるかを正確に位置づけ、相互作用の相対的範囲を定量することが可能である。したがって、ケラチン７に特異的な１つの抗体およびケラチン１９に特異的な１つの抗体を用い、ここで、両抗体がケラチン７とケラチン１９の間の異種複合体に同時に結合することによって、デュオリンク技術を用いてケラチン７とケラチン１９の間の異種複合体を位置づけ、定量することが可能である。
【０１４８】
本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体、あるいは上記抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体を含む組成物は、使用前の好適な担体中での貯蔵および再構成のために凍結乾燥される。任意の好適な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）および／または再構成技術が使用可能である。凍結乾燥および再構成が、異なる程度の抗体活性喪失（例えば、慣用のイムノグロブリン、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも活性喪失が大きい傾向がある）をもたらすことができ、補填するために使用レベルが上方調整されなければならない可能性があることは、当業者に理解される。一実施態様において、凍結乾燥（フリーズドライ）された組成物は、再水和されたときに、（凍結乾燥前の）その活性の約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％以下、または約４５％以下、または約５０％以下を失う。本明細書に記載の抗体および抗原結合性フラグメント、その変異体、融合物および誘導体が、モノマー型あるいはそのホモ−またはヘテロ−多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマーなど）の形態で存在し得ることは当業者にさらに理解される。
【０１４９】
本明細書にはさらに、一次抗体またはその断片が検出可能な部分によって直接的または間接的に標識されることが提供される。直接的に標識される、によって、検出可能な部分が抗体に付着されることが意味される。間接的に標識される、によって、検出可能な部分が、例えば、二次抗体または三次抗体のようなリンカーに付着されることが意味される。検出可能な部分は、当業者公知のまたは本明細書に記載の任意の部分またはマーカーであって、それが付着される分子の直接的または間接的な定量的あるいは相対的測定を可能とするシグナルを生成することのできる部分である。
【０１５０】
多種多様な検出可能な部分または標識、およびコンジュゲーション技術が、知られ、科学文献および特許文献の両方に報告されている。好適な標識は、当業者周知の放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などを含む。検出可能な部分は、検出可能な種の生成に直接的または間接的に関与する、単一の原子または分子である。場合により、検出可能な部分は、例えば、以下にさらに記載される、蛍光部分、酵素結合部分、ビオチン化部分および放射標識部分からなる群より選択される。「標識」、「検出可能な部分」は、着目の分子に直接的（例えば、ポリペプチドに組み込まれた蛍光分子）または間接的（例えば、組み込まれた蛍光分子を含む二次、三次またはそれ以上の抗体によって一次抗体に結合することにより）に付着させることができる任意の検出可能なタグを意味する。したがって、標識、マーカーまたは検出可能な部分は、例えば画像化方法を用いて可視化することができるあらゆるタグである。
【０１５１】
「検出可能な部分」は、発明者によれば、該部分が、本発明の組成物を組織サンプルのような生物学的サンプルまたは生体液サンプルに与えた後、標的部位に位置づけた時に、インビトロで検出されるものであるという意味を有する。これは、検出可能な部分がシグナルを生成するものであって、検出可能な部分が検出され、該部分の相対的な量および／または位置（例えば、組織サンプルにおける位置）が決定される場合には、さらに便利であり、したがってさらなる実施態様に含まれることを含む。検出可能な部分は、本分野で周知である。
【０１５２】
したがって、抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体、あるいはそのような抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体を含む組成物は、生物学的サンプルの、ケラチン７とケラチン１９の間の異種複合体、および／またはその断片の検出、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌のような悪性新生物性疾患のインビトロの診断または予後判定のための方法および使用によって本明細書中でさらに例証される方法において有用である。さらなる実施態様において、使用される免疫化学的方法が本明細書中で例証される。
【０１５３】
好適な検出可能な部分は、本分野で周知であり、ポリペプチドおよびタンパク質へのこれらの部分の付着または連結は、本分野でさらに周知である。検出可能な部分のさらなる例は、酵素；酵素基質；酵素阻害剤；補酵素；酵素前駆体；アポ酵素；蛍光物質；顔料；化学発光化合物；発光物質；着色物質；磁性物質；または金コロイドのような金属粒子；１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓまたは１４Ｃのような放射活性物質；ニトロフェニルホスフェート、ルシフェリン誘導体またはジオキセタン誘導体のようなリン酸化フェノール誘導体；などである。酵素は、デヒドロゲナーゼ；レダクターゼまたはオキシダーゼのようなオキシドレダクターゼ；アミノ、カルボキシル、メチル、アシルまたはホスフェート基のような官能基の移動を触媒するトランスフェラーゼ；エステル、グリコシド、エーテルまたはペプチド結合を加水分解するヒドロラーゼ；リアーゼ；イソメラーゼ；あるいはリガーゼであり得る。酵素は、別の酵素にコンジュゲーションされてもよい。酵素は、酵素的サイクリングにより検出される。例えば、検出可能な標識がアルカリホスファターゼである場合、測定は、ウンベリフェロン誘導体のような好適な基質から生成される蛍光または発光を観察することによって行われる。ウンベリフェロン誘導体は、４−メチル−ウンベリフェリルホスフェートを含む。蛍光または化学発光標識は、フルオレッセインイソチオシアネート；ローダミンＢイソチオシアネートまたはテトラメチルローダミンイソチオシアネートのようなローダミン誘導体；ダンシルクロライド（５−（ジメチルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロライド）；ダンシルフルオライド；フルオレスカミン（４−フェニルスピロ［フラン−２（３Ｈ）；ｌｙ−（３ｙＨ）−イソベンゾフラン］−３；３ｙ−ジオン）；フィコシアニンまたはフィコエリトリンのようなフィコビリタンパク質；アクリジニウム塩；ルミフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンのようなルミノール化合物；イミダゾール；シュウ酸エステル；ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）またはサマリウム（Ｓｍ）のような希土類元素のキレート化合物；あるいは７−アミノ−４−メチルクマリンのようなクマリン誘導体である。標識は、アダマンチンのようなハプテン、フルオレッセインイソチオシアネートまたはカルバゾールでもあり得る。ハプテンは、多価抗体またはストレプトアビジン含有部分と接触させられた場合に、凝集体の形成を可能とする。検出可能な部分のさらなる例としては、以下の：放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、１８８Ｒｅ）、放射性核種（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、６４Ｃｕ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、蛍光体、カルボシアニン）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、［ベータ］−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基および二次結合実体（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープまたはタンパク質タグ、炭化水素）によって認識される所定のポリペプチドエピトープが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、標識は、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【０１５４】
間接的標識化において、追加の分子または部分が、抗体−抗原複合体、すなわち、一次抗体とそれが結合するタンパク質の間の免疫複合体と接触させられるかまたはその部位において生成される。例えば、酵素のような検出可能な部分は、本明細書に例示される検出用抗体または検出用分子に付着されるかまたはそれと会合させられることができる。次いで、シグナル生成分子が、免疫複合体の部位において検出可能なシグナルを生成することができる。例えば、好適な基質とともに供給される場合、酵素は、免疫複合体の部位において可視的なまたは検出可能な生成物を生成することができる。
【０１５５】
間接的標識化の別の例として、一次抗体に対する（結合剤と呼ばれることのできる）二次抗体のような、着目の分子または着目の抗体（一次抗体）のいずれかに結合することのできる追加の分子が、免疫複合体と接触させられることができる。追加の分子は、シグナル生成分子または検出可能な部位を有することができる。
【０１５６】
追加の分子は、抗体であることができ、したがって、これは二次、三次またはそれ以上の抗体と呼ばれることができる。一次抗体への二次抗体の結合は、最初の（または一次）抗体および着目の分子との所謂サンドイッチを形成することができる。免疫−複合体は、二次免疫複合体の形成を可能とするのに有効な条件下で十分な時間、標識された二次抗体と接触させられることができる。次いで、一般に、二次免疫複合体は、任意の非特異的に結合した標識二次抗体を除去するために洗浄され、その結果、二次免疫複合体中の残った標識が検出されることができる。追加の分子は、ビオチン／アビジン分子のようなお互いに結合することのできる一対の分子または部分の一方であるかまたはそれを含むこともでき、その場合、抗体を検出することまたは分子を検出することは、対の他方のメンバーを含むはずである。
【０１５７】
間接的標識化のさらなる例は、２工程アプローチによる一次抗体−抗原（免疫−複合体）の検出を含む。例えば、抗体のような、一次抗体−抗原複合体の間の一次免疫複合体への結合親和性を有する（第１の結合剤と呼ばれることのできる）分子が、二次複合体を形成するために使用されることができる。洗浄後、二次複合体が、第１の結合剤に対する結合親和性を有する（第２の結合剤と呼ばれることのできる）別のさらなる分子と、三次複合体の形成を可能とするのに有効な条件下で十分な時間、接触させられることができる。この例において、第２の結合剤は、検出可能な部分に連結されて、こうして形成された三次複合体の検出を可能とする。このシステムはさらに、シグナル増幅を提供するための手段を含んでよい。
【０１５８】
シグナル増幅のための手段を有する一次、二次またはそれ以上の結合剤の他の例は、（例えば、アビジン／ストレプトアビジンとコンジュゲーションされた）ビオチン化抗体のようなコンジュゲーションされた抗イムノグロブリンあるいはスタフィロコッカスプロテインＡ（ＩｇＧに結合する）、プロテインＧ、デキストラン、アプタマー、タンパク質、ペプチド、有機小分子、天然化合物（例えば、ステロイド）、非ペプチドポリマー、または検出可能な部分とコンジュゲーションされた他の分子に特異的かつ効率的に結合する任意の他の分子である。さらなる一実施態様において、二次、三次またはそれ以上の結合剤は、抗マウスコンジュゲート、例えば、ブタ抗マウス抗体のような抗体である。コンジュゲートは、上記のデキストラン、ＨＲＰ、ビオチン、アルカリホスファターゼへのコンジュゲートなどである。一実施態様において、検出可能な部分は、デキストランおよびＨＲＰとコンジュゲーションされたブタ抗マウス抗体である。
【０１５９】
さらなる実施態様において、二次、三次またはそれ以上の結合剤は、抗ウサギ抗体コンジュゲート、例えば、ヤギ抗ウサギ抗体コンジュゲートのような抗体である。該コンジュゲートは、上記のデキストラン、ＨＲＰ、ビオチンなどへのコンジュゲートである。
【０１６０】
一実施態様において、検出可能な部分は、デキストランにコンジュゲーションされたヤギ抗ウサギ抗体である。さらなる実施態様において、二次、三次またはそれ以上の結合剤は、例えば、ウサギ抗ヤギ抗体コンジュゲートのような、抗ヤギ抗体コンジュゲートのような抗体である。該コンジュゲートは、上記のデキストラン、ＨＲＰ、ビオチンなどへのコンジュゲートである。
【０１６１】
一実施態様において、検出可能な部分は、デキストランおよびアルカリホスファターゼ、ＡＰとコンジュゲーションされたウサギ抗ヤギ抗体である。
【０１６２】
なおさらなる実施態様において、本明細書に提供される組成物は、バッファーをさらに含む。バッファーの例は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのようなＴｒｉｓバッファーおよびＰＢＳバッファーである。好適なバッファーは、利用可能であり、本分野で知られている。
【０１６３】
バッファーに対するさらなる添加剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＢＳＡ、アジドナトリウム、グリセロールおよび水であり、約５．５、５．６、５．７、５．８、５．９．６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９または８．０のような約５．５から約８．０までのｐＨである。
【０１６４】
抗体組成物は、液状である場合には、「すぐに使用できる」形態であるかまたは使用に際した任意の好適なバッファー系、例えば、本明細書に提供されるバッファー系または当業者に明らかなものにより、少なくとも１×１０、１×２０、１×３０、１×４０、１×５０、１×６０、１×７０、１×８０、１×９０、１×１００、１×１０００、１×１００００およびこの間のすべての範囲および値で、使用前に希釈される濃縮された形態である。
【０１６５】
有利な一実施態様において、第１の一次抗体である、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識するモノクローナル抗体Ｋｓ７．１８が、ビオチンにコンジュゲーションされ、第２の一次抗体である、ケラチン１９および／またはその断片を認識するＢＭ１９．２１が、ペルオキシダーゼ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））にコンジュゲーションされる。ビオチンまたはＨＲＰのコンジュゲーションは、当業者に知られている。
【０１６６】
本発明による組成物は、単独で、あるいはＣＡ１２５、ＨＥ４、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１、ＳＣＣ、ＰｒｏＧＲＰ、ＣＡ２４２、ＰＳＡのような別の腫瘍マーカーを検出し、測定するための手段または超音波、ＣＴスキャン、胸部放射線のような診断手段および／またはＫ５、Ｋ２０、ＴＴＦ−１、ＣＤＸ２、ＭＵＣ２、ｐ６３、ベータ−カテニン、ｐ５３、３４−ベータ−Ｅ１２、ＥＲ、ＣＤ５６、ＮＣＡＭ、Ｋ６、Ｋ７、Ｋ１９のようなＩＨＣマーカーを含むがこれに限定されない、悪性新生物を検出するための他の手段と組み合わせて使用してもよい。
【０１６７】
方法および組成物の使用
本明細書に記載の抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体、あるいはそのような抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体を含む組成物は、免疫組織化学的（ＩＨＣ）および免疫化学的方法のような多様な免疫方法において使用される。そのような免疫的方法、特に免疫組織化学的方法の一般的なプロトコールは、本分野で知られている。さらに、本発明の方法および使用は、鑑別診断の結果を改善するために、他の診断方法と併用される。
【０１６８】
悪性新生物の存在または不存在を正確に決定することの重要性は明らかである。患者およびヘルスケアシステムの両方に対する影響もさらに明らかである。したがって、方法および使用のいくつかの実施態様は、所与の生物学的サンプル内のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出することを提供する。方法および使用は、対象から生物学的サンプルを得ること、該サンプルを本明細書に開示された、２つのタンパク質Ｋ７およびＫ１９に特異的な抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体あるいはそのような抗体または抗原結合性フラグメントまたはその誘導体を含む組成物と接触させること、上記抗体とケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の間の相互作用を検出することを含み、ここで、該相互作用の検出が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在または不存在を示し、それによって、例えば、本明細書に開示された任意の方法によるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の検出、生物学的サンプル中の悪性新生物疾患の検出、診断、予後判定などを可能とし、その結果が、対象が健康であるかまたは悪性新生物性疾患を有しているかを決定し得る。
【０１６９】
本発明の組成物および方法は、悪性新生物性疾患が胆管癌（肝臓外）、膀胱癌、乳癌、（原発）不明癌腫、子宮頸部癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭部頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、下咽頭癌、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌（原発性）、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌（表層上皮性・間質性腫瘍）、卵巣胚細胞癌、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、唾液腺癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、腎盂尿管の移行上皮癌または子宮癌（子宮内膜）である場合に使用されることができる。
【０１７０】
本発明の組成物および方法は、悪性新生物性疾患が肺癌、膀胱癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌である場合に好適である。
【０１７１】
本発明の組成物および方法は、悪性新生物性疾患が肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のうちの１つである場合に特に好適である。
【０１７２】
良性疾患は、健康な個体と比較してこれらの個人でわずかに腫瘍マーカー値を上げる傾向がある。マーカー濃度を上昇させる典型的な良性疾患は、胆管、肝臓および腎臓の疾患である。これらの上昇した値によって、ほとんどのマーカーに関してボーダーラインゾーンまたは「グレーゾーン」が頻繁に使用され、このグレーゾーンは、マーカーを診断目的に適さないものともしている。ボーダーラインゾーン内の腫瘍マーカー値は、非常に不確定であり、腫瘍または良性疾患のいずれかとして分類できない。このグレーゾーンに属する対象は、癌を有するかまたは有さないと誤って疑われる。このグレーゾーンに属する対象は、本明細書に提供される方法から利益を得る。開示された方法および使用の範囲内で、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片は、（例えば、健康であるかあるいは肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有する）特定の臨床状態にある対象から採取されたサンプル内に増加したレベルで、減少したレベルでまたは全く存在しない可能性がある。
【０１７３】
したがって、所与の生物学的サンプル中に認められるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の差次的存在は、被験対象が、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有するかあるいは健康であるかの蓋然性に関する有用な情報を提供する。被験対象が、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有するかまたは健康である蓋然性は、上記対象から採取された試験サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、健康な対象から採取されたサンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量または健康な対象中に存在することが知られている対照レベルから統計学的に有意であるかに依存する。
【０１７４】
所与の生物学的サンプル中に認められるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の相違は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有することが知られている対象が、投与されている治療的処置に反応しているかを決定するためにも使用される。治療時に採取されたサンプル中に検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、処置の投与前に採取されたサンプル中で検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量と比較される。さらに、治療時に採取されたサンプル中で検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、健康な対象の指標であるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の参照値と比較される。該比較に基づいて、上記対象が治療的処置に反応しているかおよび該反応がどの程度であるかを決定することができる。
【０１７５】
さらに、所与の生物学的サンプル中に認められるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在の相違は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有することが知られている対象が所与の治療的処置に反応するか否かを決定するためにも使用される。例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有すると診断された対象から採取されたサンプル中で検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、異なる形態の処置を受けた、同様の診断を受けた対象から得られたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の参照パネルと比較される。所与の処置に曝露された対象から採取されたサンプルから作られたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の参照パネルであって、該処置が前向きの結果を収めたものは、該所与の処置が対象に前向きの効果を有し、したがって、成功したとみなされることを示すと考えられる。所与の処置に曝露された対象から採取されたサンプルから作られたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の参照パネルであって、該処置が中立の結果をもたらしたものは、該所与の処置が対象に治療効果を有さず、したがって、不成功とみなされることを示すと考えられる。所与の処置に曝露された対象から採取されたサンプルから作られたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の参照パネルであって、該処置が悪い結果をもたらしたものは、該所与の処置が対象に治療効果を有さず、不成功とみなされることを示すと考えられる。該比較に基づいて、当業者は、上記対象にとっての最良の形態の処置を投与することができる。さらに、所与の生物学的サンプル中に認められるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の差次的存在は、対象における、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の病期を決定するためにも使用される。
【０１７６】
例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有すると診断された対象から採取されたサンプル中で検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の特定の病期または段階を有することが知られている対象から採取された参照バイオマーカーパネルと比較される。該比較に基づいて、上記対象内の例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の病期または段階を決定することができる。
【０１７７】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片は、（例えば、健康であるかまたは例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有する）特定の臨床状態にある対象から採取されたサンプル内に増加したレベルで、減少したレベルで存在するかまたは全く存在しない。
【０１７８】
したがって、所与の生物学的サンプル中に認められるケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の任意の存在は、被験対象が、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有するかあるいは健康である蓋然性に関する有用な情報を提供する。被験対象が、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有するかあるいは健康である蓋然性は、上記対象から採取された試験サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、健康な対象から採取されたサンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量または健康な対象中に存在することが知られている対照レベルから統計学的に有意であるかに依存する。
【０１７９】
例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有すると言われる対象は、彼らの組織が、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患として特徴づけられ得るような、彼らの組織の形態学的、生化学的および機能的変化を有する。例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患が進行した病期は、現在利用可能であり、本明細書に示される既知の方法を用いて決定されることができる。
【０１８０】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の存在または不存在を分析するためのデータ分析は、検出されたバイオマーカーのシグナル強度（例えば、ピークの強度）を決定する工程および「異常値」（予め定められた統計学的分布を逸脱しているデータ）を除外する工程を含む。例は、ピークの正規化、それによって、何らかの基準に対して各ピークの強度が計算されるプロセスである。例えば、基準は、機器および／または化学物質（例えば、エネルギー吸収分子）によって生成されたバックグラウンドノイズであることができ、これが、スケールにおいてゼロと設定される。次いで、各タンパク質について検出されたシグナル強度が、所望のスケール（例えば、１００）における相対強度の形で表される。ある実施態様において、所与のピークについて観察されたシグナルは、特定の質量対電荷比範囲（mass to charge ratio range）内のピークとバックグラウンドノイズの両方に関して観察された全シグナルの合計に対する、該ピークの強度の割合として表されることができる。ある実施態様において、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片に関して観察されたシグナルの相対強度を計算するための基準として標準物質からのピークが使用できるように、サンプルと共に標準物質が入れられる。
【０１８１】
得られたデータは、典型的にコンピュータアルゴリズムの使用によってディスプレイするために、多様なフォーマットに変換されることができる。上記ディスプレイフォーマットのいずれかを用いて、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片がサンプル中で検出されるかが、シグナルディスプレイから容易に決定されることができる。
【０１８２】
代表的な方法は、本明細書にさらに記載されるように、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を、例えば、診断し、予後判定し、病期分類し、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の処置結果を予測し、再発の尤度を予測するために使用される。
【０１８３】
再発は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患が、最初の（または後続の）処置の後に復帰したことを意味する。代表的な最初の処置は、放射線治療、化学療法、抗ホルモン治療および／または手術を含む。
【０１８４】
本明細書に開示されたいくつかの方法は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の予後判定のために有用である。予後は、疾患の（典型的に、処置から独立した）起こり得る転帰である。本明細書に開示された方法は、予後判定、すなわち、例えば、再発のような疾患の起こり得る転帰を、そのような再発の十分前に収集されたサンプルにおいて予測するために使用される。悪い（またはより悪い）予後は、より高悪性度の癌を有する対象に関して起こり得る。いくつかの方法の実施態様において、悪い予後は、新生物性疾患の最初の診断後、患者の（１年未満の生存または２年未満の生存のような）５年未満の生存である。いくつかの方法の実施態様において、良い予後は、新生物性疾患の最初の診断後、患者の（３年超の生存、５年超の生存または７年超の生存のような）２年超の生存である。
【０１８５】
さらに他の方法の実施態様は、患者における、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の処置の結果を予測し、癌患者のための治療法を指示する（例えば、有用な治療法を選択する）ために有用である。本明細書の他の場所で議論されるとおり、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現は、処置（例えば、免疫療法、レーザー療法、手術、温熱療法、放射線療法、化学療法）が失敗しそうである（例えば、疾患が再発する）ことを予測する。よって、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片は、処置（例えば、免疫療法、温熱療法、レーザー療法、手術、放射線療法、化学療法）の起こり得る成功について癌患者に助言するために、介護者によって使用されることができる。具体的な対象の治療歴に関連して、患者および介護者は、処置する（例えば、手術を行う）か否かおよび／または（外部照射療法、近接照射療法、化学療法または待機療法のような）代替処置を提供するか否かを、情報を十分に集めた上で決断することができる。
【０１８６】
したがって、本発明は、所与の対象の生物学的サンプル内で発現されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出することによる、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の診断および予後判定のための方法に関し、ここで、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在または不存在が、対象が健康であるかまたは例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有するかの診断または予後判定を可能とする。一実施態様において、該方法は、サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在を検出し、ここで、該マーカーは、健康な、疾患を有さない個人において発現されない。関連する実施態様において、本発明の方法は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有する個人からのサンプルにおいて、正常な健康な個体に比べて高いレベルで存在する、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の上昇したレベルと検出する。
【０１８７】
本発明の一態様は、生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出するためのインビトロの方法であって、該方法は、
ａ）上記生物学的サンプルを、少なくとも１つの第１および第２のターゲティング剤またはその断片を含む組成物と接触させる工程；または
ｂ）上記生物学的サンプルを、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｃ）上記生物学的サンプルを、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｄ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出する工程、
を含み、ここで、工程ｂ）およびｃ）があらゆる順番でまたは同時に行われる。
【０１８８】
例えば、一実施態様において、生物学的サンプルが、少なくとも２つのターゲティング剤を含む組成物と接触させられ、ここで、少なくとも１つの第１のターゲティング剤がケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識し、少なくとも１つの第２のターゲティング剤がケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する。上記第１および第２のターゲティング剤は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に、特異的かつ同時に結合することができる。その後、上記第１および第２のターゲティング剤のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片への特異的かつ同時の結合が、その後当業者周知の任意の方法によって、または本明細書に記載の有利な方法によって検出される。
【０１８９】
代わりの実施態様において、生物学的サンプルは、組成物の一部としての第１および第２のターゲティング剤と接触させられずに、第１および第２の一次抗体が、個別に提供され、すなわち、一方の一次抗体が他方の前に提供される。例えば、一実施態様において、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１の一次抗体が、生物学的サンプルと接触させられる。第１の一次抗体は、上記生物学的サンプル中に存在するケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ７部分に存在する抗原部位に結合する。ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片とケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する抗体の間の複合体が生成する。その後、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１の一次抗体に結合した、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含有する生物学的サンプルに、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２の一次抗体が提供される。上記第２の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ１９部分に存在する抗原部位に結合し、Ｋ１９−抗体−抗原−Ｋ７−抗体複合体、すなわち、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片ならびにケラチン７およびケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片をそれぞれ認識する、２つの一次抗体を含む三者複合体を形成する。
【０１９０】
代わりの実施態様において、ケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２の一次抗体が、生物学的サンプルに提供される。第２の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のＫ１９部分に存在する抗原部位に結合し、抗原−Ｋ１９−抗体複合体を形成する。その後、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１の一次抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片−Ｋ１９−抗体を含有するサンプルに提供される。上記第１の一次抗体は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のＫ７部分に存在する抗原部位に結合し、Ｋ７−抗体−抗原−Ｋ１９−抗体複合体、すなわち、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片ならびにケラチン７およびケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片をそれぞれ認識する、２つの一次抗体を含む三者複合体を形成する。
【０１９１】
さらなる工程において、検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、陽性および／または陰性対照と比較され、ここで、陽性対照はケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含有し、陰性対照は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含有しない。さらなる実施態様において、陽性対照は、悪性新生物性疾患と診断された対象から得られた組織または体液を含み、陰性対照は、悪性疾患を患っていない健康な対象から得られた生物学的サンプルである。
【０１９２】
場合により、本分野において知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出された抗原−抗体複合体のスコアリングが行われる。
【０１９３】
サンプルは、当然ながら、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を含む可能性のある任意の生物学的サンプルである。そのような生物学的サンプルの例は、ヒト、マウス、ラット、モルモットのようなげっ歯類由来、またはヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、イヌ、ネコおよびさらにウサギまたは本明細書に開示された他のもの由来の組織サンプル、体液サンプルまたは細胞サンプルである。一実施態様において、サンプルは、ヒト由来である。なおさらなる実施態様において、サンプルは、組織サンプルまたは例えば、血清、血漿、リンパ液、浸出液、大便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液、心膜液、腹水、胸水、膿汁、唾液、痰、滑液、涙、汗、膣分泌液、嘔吐物および尿のようなヒト体液サンプルである。生物学的サンプルは、機能するために調製される必要がある可能性があり、サンプルの前処理が、当業者公知の方法によって行われる。
【０１９４】
本明細書に示される、生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出するためのインビトロの方法は、
ｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定するため、または
ｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を予測するため、または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を評価するため、または
ｉｖ）対象における悪性新生物性疾患の再発を評価するため
に有利に使用され、ここで該対象は、悪性新生物性疾患を有しているかまたは有することが疑われる哺乳動物である。
【０１９５】
悪性新生物性疾患は、胆管癌（肝臓外）、膀胱癌、乳癌、（原発）不明癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、頭部頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、下咽頭癌、腎臓癌、咽頭癌、（原発性）肝臓癌、肺癌（非小細胞）、肺癌（小細胞）、中皮腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌腫（腎臓癌）、唾液腺癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌または子宮癌（子宮内膜）のいずれか１つである。
【０１９６】
しかしながら、本明細書に開示された方法は、
ｉ）対象における悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定すること、または
ｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の有効性を予測すること、または
ｉｉｉ）対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を評価すること、または
ｉｖ）対象が、肺癌、膀胱癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌を有しているかまたは有することが疑われる哺乳動物である場合、該対象における悪性新生物性疾患の再発を評価すること
のために有用である。本明細書に開示された方法は、対象が、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌を有しているかまたは有することが疑われる哺乳動物である場合に、特に有用である。
【０１９７】
例えば、本発明の一態様は、生物学的サンプルにおける悪性新生物性疾患のインビトロの検出のための方法である。該サンプルは、悪性新生物性疾患を含む可能性のある任意の生物学的サンプルであり、上記方法は、
ａ）上記生物学的サンプルを、本明細書に記載の組成物と接触させる工程；または
ｂ）上記生物学的サンプルを、サイトケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｃ）上記生物学的サンプルを、サイトケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｄ）上記サイトケラチン７とサイトケラチン１９の異種複合体を検出する工程
を含み、ここで、工程ｂ）およびｃ）はあらゆる順番でまたは同時に行われる。
【０１９８】
上記第１および第２のターゲティング剤のケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片への特異的かつ同時の結合は、当業者周知の任意の方法により、あるいは本明細書に記載の有利な方法によって検出され、それによって、生物学的サンプルにおいて悪性新生物性疾患を検出する。
【０１９９】
さらなる工程において、検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、陽性および／または陰性対照と比較され、ここで、陽性対照は悪性新生物性疾患を患っている対象からの細胞を含み、陰性対照は悪性新生物性疾患を患っていない健康な対象からの細胞を含む。
【０２００】
場合により、本分野において知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出された抗原−抗体複合体のスコアリングが行われる。
【０２０１】
さらなる態様は、生物学的サンプルにおいて、インビトロで悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定するための方法であって、該方法は、
ａ）上記生物学的サンプルを本明細書で定義された組成物と接触させる工程；または
ｂ）上記生物学的サンプルを、サイトケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｃ）上記生物学的サンプルを、サイトケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤と接触させる工程；および
ｄ）サイトケラチン７とサイトケラチン１９の異種複合体を検出する工程、ここで、工程ｂ）と工程ｃ）は、あらゆる順番でまたは同時に実行され；および
ｅ）検出されたサイトケラチン７とサイトケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量を、陽性および／または陰性対照と比較し、それによって、悪性新生物性疾患を診断および／または予後判定する工程
を含む。
【０２０２】
場合により、本分野において知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出された抗原−抗体複合体のスコアリングが行われる。サンプルは、悪性新生物性疾患を含む可能性のある任意のサンプルであってよい。さらなる実施態様は、陽性対照が悪性新生物性疾患を患っている対象からの細胞を含むものである。さらなる実施態様は、陰性対照が悪性新生物性疾患を患っていない健康な対象からの細胞を含むものである。
【０２０３】
したがって、所与の対象の生物学的サンプル内のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現の有無を検出することによる、悪性新生物性疾患の診断および予後判定のための方法は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在または不存在が、対象が健康であるかまたは悪性新生物性疾患を有しているかの診断または予後判定を可能とするものである。一実施態様において、該方法は、サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の存在を検出し、ここで、該マーカーは、健康な、疾患を有さない個人において発現されない。関連する実施態様において、本発明の方法は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌、肝細胞癌、膵臓癌、胃癌および卵巣癌のような悪性新生物性疾患を有する個人からのサンプルにおいて、正常な健康な個体に比べて高いレベルで存在する、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の上昇したレベルを検出する。これはさらに、本明細書に開示された実施例において可視化される。
【０２０４】
一実施態様において、悪性新生物性疾患の診断または予後判定の方法は：所与の対象から生物学的サンプルを得ること、特定の結合条件下で上記サンプルを本明細書に開示された組成物と接触させ、ケラチン７ペプチドおよび／またはその断片およびケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片に結合する抗体が、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に結合することを可能とすること、検出方法を用いて抗体を検出し、ここで、該検出方法が、上記サンプル内の上記ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の発現のプロファイルを作成すること、作成されたプロファイルをコンピュータ読取り可能な形態に変換すること、および上記サンプルのプロファイルを健康な対象、悪性新生物性疾患を有する対象に特異的な比較サンプルからのプロファイルを含むデータベースと比較することを含む。上記比較の結果は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の存在、不存在または相対量に基づいて、生物学的サンプルがそこから得られた対象が健康であるかまたは悪性新生物性疾患を有するかの決定を可能とする。
【０２０５】
さらなる実施態様において、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の検出は、対象が健康であるかまたは悪性新生物性疾患を有しているかを診断するための別の診断ツールとともに使用される。例えば、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の検出は、認定された臨床医によるバイオプシー評価、Ｘ線検査および症候学的評価のような、しかしそれに限定されない、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌の検出に特異的な他の診断ツールとともに使用される。
【０２０６】
内科医は、肺癌に関して患者を診断するために、胸部Ｘ線およびコンピュータ断層撮影を日常的に使用する。膀胱癌は、膀胱鏡検査を用いて診断され、およびＮＭＰ２２のような尿結合マーカーも診断を助ける。食道癌は、通常、食道胃十二指腸内視鏡検査（ＥＧＤ）またはおそらくバリウム飲み込みによって診断される。卵巣癌は、骨盤検査、超音波およびＣＡ１２５によって診断される。診断は、手術によって確認されなければならない。
【０２０７】
試験のいずれかが異常である場合、医師はその所見を確認するためにバイオプシーをオーダーする。次いで、バイオプシー組織が、病理学者によって検査される。ＣＴスキャンまたはＣＴおよびＰＥＴスキャンの組合せまたは磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）ならびに上述の癌の診療において知られた他の方法のような追加の検査も使用される。
【０２０８】
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的に結合する抗体を含む、本発明の組成物は、不明瞭な病変を検出するために有用であり、それは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に結合する抗体が、悪性新生物性疾患を有する対象のみを検出し、不明瞭なケースにおいては陰性とスコアリングするからである。
【０２０９】
サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量は、本分野で周知の方法を用いて決定される。生物学的サンプル中の上記タンパク質（または抗原）レベルをアッセイするための好適な方法は、抗体に基づく技術を含む。例えば、組織中の上記タンパク質のタンパク質発現は、古典的な免疫化学的および／または免疫組織学的方法によって調べられることができる。これらにおいて、特異的な認識が、本発明による組成物中の一次抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）によって提供される。本明細書中で議論されるとおり、二次的な検出システムは、蛍光、酵素または他にコンジュゲーションされた二次抗体を利用することができる。
【０２１０】
一実施態様において、試験される生物学的サンプルは、対応する正常で健康な細胞に比べた、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のレベルの上方または下方制御によって、悪性新生物性疾患に関連したサンプルとして同定される。「上方制御された」は、発明者らによれば、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片が、正常（健康）細胞中のタンパク質の発現に比べて少なくとも１０％増加していることを意味する。
【０２１１】
同様に、「下方制御された」は、発明者らによれば、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の量が、正常（健康）細胞中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現に比べて、少なくとも１０％減少していることを意味する。例えば、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のレベルは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはさらに１００％またはそれ以上に増加してもよい。サンプル中の抗原のレベルを測定するための手段は、本明細書に含まれ、さらに本分野で知られている。
【０２１２】
化合物または抗体を検出することは、本明細書中および本分野でさらに記載される臨床画像法および診断の分野で周知の方法を用いて達成され得る。必要とされる特定の方法は、本発明による組成物の抗体に付着された検出可能な標識のタイプに依存する。
【０２１３】
さらなる態様は、悪性新生物性疾患患者の対象における処置の結果を予測するためのインビトロの方法であって、該方法は、
ａ）対象から得られた生物学的サンプル中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現を検出する工程、
ｂ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の上記発現を、陽性および／または陰性対照と比較し、それによって、検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の発現に基づいて、上記対象における悪性新生物性疾患の処置の結果を予測する工程、
を含む。
【０２１４】
場合により、本分野において知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出されたケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片のスコアリングが行われる。
【０２１５】
生物学的サンプルは、悪性新生物性疾患を含む可能性のある任意のサンプル、好ましくは、悪性新生物性疾患を有する対象からの生物学的サンプルである。
【０２１６】
さらなる態様は、悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価するインビトロの方法であって、該方法は、
ａ）悪性新生物性疾患を有する対象からの生物学的サンプルを提供する工程、
ｂ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出する工程、
ｃ）悪性新生物性疾患に関する上記対象の処置の間に、工程ａ）およびｂ）を１回またはそれ以上反復する工程であって、ここで、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の相対的発現における経時的な変化が、有効処置を示す、工程、
を含む。
【０２１７】
したがって、有効処置の指標は、方法を反復する工程において時間内に分析された先のサンプルと比較した、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現減少における相対的変化である。
【０２１８】
場合により、本分野において知られたまたは本明細書に記載の標準的なスコアリングシステムによって、検出された抗原−抗体複合体のスコアリングが行われる。
【０２１９】
サンプルは、悪性新生物性疾患を含む可能性のある任意のサンプル、好ましくは、悪性新生物性疾患を有する対象からの生物学的サンプルであってよく、対象は、処置の合間にあるかまたは現在処置を受けている。
【０２２０】
さらなる態様は、悪性新生物性疾患の再発を評価するインビトロの方法であって、該方法は、
ａ）先に悪性新生物性疾患を有していた対象からの生物学的サンプルを提供する工程、
ｂ）ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を検出する工程、
ｃ）悪性新生物性疾患に関する上記対象の処置の間に、工程ａ）およびｂ）を１回またはそれ以上反復する工程であって、ここで、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の相対的発現における経時的な変化が、悪性新生物性疾患の再発を示す、工程を含む。
【０２２１】
したがって、再発の指標は、悪性新生物性疾患を同定する、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片の量の増加における相対的変化、すなわち、方法を反復する工程において時間内に分析された先のサンプルと比較した、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片の発現の経時的増加である。
【０２２２】
本明細書に提供される方法は、手動で、または好ましくは、自動読取装置において行われる。したがって、一実施態様において、方法は、手動で行われる。さらなる実施態様において、方法は、自動読取装置において行われる。
【０２２３】
組成物の使用
本発明のさらなる態様は、本明細書に提供される方法および組成物の使用を含む。
【０２２４】
本発明のさらなる態様は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体および／またはその断片を検出するための、本明細書に提供される方法の使用である。
【０２２５】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を検出するための、本明細書に提供される方法の使用である。
【０２２６】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患を診断または予後判定するための上記方法の使用である。
【０２２７】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の処置の結果を予測するための上記方法の使用である。
【０２２８】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価するための上記方法の使用である。
【０２２９】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の再発を評価するための上記方法の使用である。
【０２３０】
キット
本発明は、免疫組織化学のようなイムノアッセイのためのキットも提供する。したがって、本発明のさらなる態様は、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む、イムノアッセイのためのキットを提供する。
【０２３１】
さらなる実施態様は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的に結合する組成物を検出することのできる可視化試薬を含む。可視化および検出試薬の例は、本分野で知られている。
【０２３２】
キットのいくつかの実施態様において、１つまたはそれ以上の一次抗体が本明細書に記載されるように直接的に標識化されることができる。
【０２３３】
キットの他の実施態様は、本明細書に記載されるような二次抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体、ウサギ抗マウス抗体、抗ハプテン抗体）または非抗体ハプテン結合分子（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）のような二次的なまたはさらなる検出を含む。そのようなキットにおいて、二次的またはさらなる検出手段は、検出可能な部分によって直接的に標識化される。他の場合において、二次的（またはさらなる）抗体または結合剤は、（ビオチン、ＤＮＰおよび／またはＦＩＴＣのような）ハプテンにコンジュゲーションされ、これは、検出可能に標識された同族のハプテン結合分子（例えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＳＡアルカリホスファターゼ）によって検出可能である。キットのいくつかの実施態様は、比色試薬の発色のための酵素で標識化された一次または二次（あるいはより高次の）検出手段（例えば、抗体または結合実体）とともに使用される、好適な容器中のそのような比色試薬（例えば、ＤＡＢおよび／またはＡＥＣ）を含んでよい。
【０２３４】
いくつかの実施態様において、キットは、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片を発現するかまたは発現しないことが知られている細胞株、組織または体液のような、陽性または陰性対照サンプルを含む。対照サンプルの例としては、正常（例えば、非癌性）細胞または組織、処置後（例えば、処置後、少なくとも５年または少なくとも１０年）に悪性新生物性疾患の任意の再発がなかったかまたはあったことが知られている対象からの悪性新生物サンプルが挙げられるが、それに限定されない。
【０２３５】
いくつかの実施態様において、キットは、例えば、組成物の使用の手段あるいはさらなる結合実体または検出手段、例えば、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片に特異的に結合する抗体または特別な試薬の使用の手段を開示する説明材料を含む。説明材料は、電子的形態（例えば、コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク）で記されるかまたは視覚的なもの（例えば、ビデオファイル）であってもよい。キットは、キットがそのために設計される具体的な適用を容易化するために追加の構成要素を含んでもよい。したがって、例えば、キットは、バッファーおよび具体的な開示された方法の実行のために日常的に使用される他の試薬を含むことができる。そのようなキットおよび適切な内容物は、当業者に周知である。
【０２３６】
キットはさらに、別個にパッケージ化された試薬としての本発明による組成物を、少なくとも１回のアッセイに十分な量で含んでもよい。
【０２３７】
パッケージ化された試薬の使用のための説明書も典型的に含まれる。そのような説明書は、典型的に、試薬の濃度および／または混合される試薬とサンプルの相対量、試薬／サンプル混合物のための維持時間、温度、バッファー条件などのような少なくとも１つのアッセイ方法のパラメータを記述する具体的表現を含む。
【０２３８】
本発明のさらなる態様は、生物学的サンプル中の、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体、および／またはその断片のインビトロの検出のためのキットを提供し、該キットは、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む。
【０２３９】
本発明のさらなる態様は、生物学的サンプル中の、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患のインビトロの検出のためのキットを提供し、該キットは、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む。
【０２４０】
本発明のさらなる態様は、生物学的サンプル中の、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患をインビトロで診断および／または予後判定するためのキットを提供し、該キットは、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む。
【０２４１】
本発明のさらなる態様は、対象における、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の処置の結果を予測するためのキットを提供し、該キットは、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む。
【０２４２】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の処置の有効性を評価するためのキットを提供し、該キットは、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む。
【０２４３】
本発明のさらなる態様は、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌または卵巣癌のような悪性新生物性疾患の再発を評価するためのキットを提供し、該キットは、
ａ）本明細書に提供される本発明の組成物；または
ｂ）本明細書で定義されるケラチン７ペプチドおよび／またはその断片を認識する第１のターゲティング剤を含む、第１の容器；および
ｃ）本明細書で定義されるケラチン１９ペプチドおよび／またはその断片を認識する第２のターゲティング剤を含む、第２の容器；および
ｄ）場合により、本明細書で定義される方法を実行するための説明書
を含む。
【０２４４】
ある一定のキットの実施態様は、箱、袋、バッグ、（成型プラスチックまたは他の透明なパッケージのような）プラスチックカートン、（密封されたまたは密封可能なプラスチック、紙または金属製の包装紙のような）包装紙または他の容器のような運送手段を含み得る。
【０２４５】
いくつかの例において、キットの構成要素は、箱または他の容器のような単一のパッケージ単位中に包まれ、このパッケージ単位は、キットの１つまたはそれ以上の構成要素を入れることができるコンパートメントを有していてもよい。他の例において、キットは、例えば、バイアル、チューブなどの、試験される１つまたはそれ以上の生物学的サンプルを保持することのできる１つまたはそれ以上の容器を含む。
【０２４６】
キットの実施態様は、例えば、シリンジ、綿棒またはラテックスグローブを含み、これは、生物学的サンプルを取扱い、収集しおよび／または加工するために有用である。キットは、場合により、１つの場所から別の場所へ生物学的サンプルを移動するために有用な、例えば、スポイト、シリンジなどを含む器具を含む。さらに他のキットの実施態様は、（対象サンプルなどのような）使用されたまたはもう必要でない物を廃棄するための廃棄手段を含む。そのような廃棄手段は、制限されることなく、プラスチック製、金属製または他の不浸透性の袋、箱または容器のような、廃棄された材料からの漏れを収容することのできる容器を含むことができる。
【０２４７】
本発明のある一定の態様を具体化する、非限定的な例がここに記載される。
【０２４８】
〔実施例１〕
体液中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体の決定のためのアッセイ
目的は、臨床評価に好適なアッセイを作り出すことである。
【０２４９】
「Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｏｄａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｍ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｎａｋａｎｅ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、１９７８）に記載の方法によって、ケラチン７に特異的なモノクローナル抗体Ｋｓ７．１８を、ビオチンにコンジュゲーションし、ケラチン１９に特異的なモノクローナル抗体ＢＭ１９．２１をペルオキシダーゼにコンジュゲーションした。
【０２５０】
悪性新生物性疾患と診断された患者から得られた、あるいは非悪性疾患と診断された患者または健康とみなされた個人から得られた体液中の、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片の存在を決定するために、サンドイッチ酵素イムノアッセイを実施した。この手順において、上記２つのモノクローナル抗体、ビオチンにコンジュゲーションされたＫｓ７．１８（１μｇ／ｍｌ）およびペルオキシダーゼにコンジュゲーションされたＢＭ１９．２１（２μｇ／ｍｌ）を含有する、ＢＳＡ  ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．２中の抗体溶液１００μｌを、５０μｌの血清サンプルまたはキャリブレーター、すなわち、既知濃度のケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片を含むサンプルとともに、マイクロプレートのストレプトアビジン被覆ウエル中で室温で振とうしながら１時間、インキュベートした。インキュベーション後、過剰の抗体を除去するために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳでウエルを６回洗浄した。その後、室温で３０分間、酵素反応を進行させるために、１００μｌの緩衝化したＴＭＢ基質（過酸化水素および３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）をウエルに添加した。酵素反応の間、抗原、すなわち、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片が血清サンプル中に存在する場合、青色がウエル中で発色した。色の強度を、６２０ｎｍでマイクロプレートリーダーにおいて決定した。吸光度値対各キャリブレーターの濃度をプロットすることによって、各アッセイについての較正曲線を構築した。患者サンプル中に存在するケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片の濃度を、較正曲線から決定した。この実施例中に記載のアッセイを、以後、「Ｋ７／Ｋ１９アッセイ」と呼ぶ。図２は、典型的な較正曲線を示す。
【０２５１】
〔実施例２〕
異なる形態の癌についてのＫ７／Ｋ１９アッセイの感度
多様な形態の癌を患っている患者からの全部で３９８個の血清を、実施例１に記載のＫ７／１９アッセイを用いて試験した。結果を表１に要約する。
【０２５２】
結論として、Ｋ７／Ｋ１９アッセイは、試験した他の癌に比べて、膀胱癌、卵巣癌、肺癌および食道癌に関して最も高い臨床的感度を示し、特に、肺癌、膀胱癌および卵巣癌患者からのサンプルは、高濃度のケラチン７とケラチン１９の異種複合体（またはその断片）を含んだ。対照的に、Ｋ７／Ｋ１９アッセイは、子宮頸部および乳房の扁平上皮癌ならびに頭部頸部癌および胃腸管の癌に関して１０％以下の低い感度を示した。これら後者の癌患者に関するケラチン７とケラチン１９の異種複合体（またはその断片）の濃度値は、表２中で（健康および良性の）対照群のものと同じ範囲にあった。したがって、Ｋ７／Ｋ１９アッセイは、低感度により、これらのタイプの癌には一般に適さない。しかしながら、２人の乳癌患者および１人のＧＩ管癌患者は、良性疾患群のサンプルの最高値よりも高い値を有した。これらの高い値は、侵攻性の癌または悪い予後を示す場合がある。すなわち、該アッセイはいくつかの癌には一般に適さないにもかかわらず、アッセイが実際に高い値を示すわずかなケースには臨床的に役に立つ可能性がある。
【０２５３】
【表１】
0006472457.tif 000002
【０２５４】
〔実施例３〕
健康な個体に関する参照範囲の確立
悪性新生物性疾患の明らかな兆候を示さない個人に関する参照範囲を確立するために、見かけ上健康な個人からの１１２個の血清を、実施例１に記載のＫ７／Ｋ１９アッセイによって試験した。該個人の９５％は、１．０１Ｕ／ｍＬ未満のケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片濃度を有するか、あるいは９５．５％は、１．０９Ｕ／ｍＬ以下の値を有した。１１２人の健康な個体のうちの５人（すなわち、４．５％）は、１．１Ｕ／ｍＬ超の濃度を有した。試験した個人に関するケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片の平均濃度は、０．１５Ｕ／ｍＬであった（表２を参照されたい）。
【０２５５】
〔実施例４〕
良性（非癌性）新生物性疾患を有する個人に関する参照範囲の確立
一般に腫瘍マーカー値を上昇させることが知られている疾患を患っている患者からの全部で２３９個の血清を、実施例１に記載のＫ７／１９アッセイにおいて試験した。結果を以下の表２に示す。
【０２５６】
結論として、９５％パーセンタイル値は、良性疾患に関して健康な血液ドナーよりも高くなかった。１．０９Ｕ／ｍＬのカット値を用いると、すべての群で陽性サンプルは５％以下であり、良性群からのサンプルの９９％は、１．８Ｕ／ｍＬ未満の値を有した（示さない）。
【０２５７】
【表２】
0006472457.tif 000003
【０２５８】
〔実施例５Ａ〕
見込まれるケラチン８とケラチン１９の異種複合体またはケラチン１９との交差反応性の試験
ケラチン８とケラチン１９の異種複合体を含有するキャリブレーター、すなわち、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡキット（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）によって決定した５０μｇ／Ｌのケラチン１９を含む（Ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｅｒａｔｉｎ  １９  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｓｅｒｕｍ  ａｓｓａｙ  Ｅｎｚｙｍｕｎ−Ｔｅｓｔ  ＣＹＦＲＡ  ２１−１．Ｂｏｄｅｎｍｕｌｌｅｒ  Ｈ、Ｏｆｅｎｌｏｃｈ−Ｈａｈｎｌｅ  Ｂ、Ｌａｎｅ  ＥＢ、Ｄｅｓｓａｕｅｒ  Ａ、Ｂｏｔｔｇｅｒ  Ｖ、Ｄｏｎｉｅ  Ｆ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ．１９９４  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；９（２）：７５〜８１に記載の）ＣＹＦＲＡ２１−１キットキャリブレーター、を含むキャリブレーターを、血液ドナーサンプル、（ケラチン７／１９を含まないキャリブレーターマトリックスからなる）Ｋ７／Ｋ１９アッセイのキャリブレーター０および卵巣癌患者からの血清からなる陽性対照とともに、実施例１に記載のとおりにアッセイした。
【０２５９】
【表３】
0006472457.tif 000004
【０２６０】
結論：アッセイにおいては有意なシグナルは検出されず、または検出された濃度は５０μｇ／ＬのＣＹＦＲＡ２１−１キャリブレーターにとって十分に低かったため、Ｋ１９またはケラチン８とケラチン１９の異種複合体への任意の交差反応性が臨床結果に影響を与える。ＣＹＦＲＡキットの最も高いキャリブレーター（５０μｇ／Ｌ）がＫ７／１９アッセイの検出限界周辺であり、同時に、血液ドナー血清よりも低く、卵巣癌血清からなる陽性対照よりもかなり低かったことから、これは明らかである。
【０２６１】
〔実施例５Ｂ〕
Ｋｓ１９．２およびＢＭ１９．２１クローンの間の比較
アッセイを構築し、実施例１のとおりに実行したが、クローンＢＭ１９．２１の代わりにケラチン１９モノクローナル抗体クローンＫｓ１９．２を使用した。このアッセイを、ケラチン１９モノクローナル抗体クローンＢＭ１９．２１を有するアッセイと比較した。同じサンプルについてアッセイを実行した。癌（肺癌、食道癌、膀胱癌または卵巣癌）を患っている個人からの１５個の血清および（肝臓、腎臓、肺またはＣＨＦの）良性疾患を患っている患者の１３個の血清を、実施例１に記載のＫ７／Ｋ１９アッセイによって試験した。
【０２６２】
結果：
アッセイと陽性サンプルの数の間には高い相関（ｒ＝０．９７）があった。
【０２６３】
【表４】
0006472457.tif 000005
【０２６４】
結論：２つのアッセイの間に有意な差はなかった。「ＢＭ１９．２１様の」モノクローナル抗体はいずれも、本発明を実証するために使用することができる。
【０２６５】
〔実施例６〕
確立されたケラチン１９マーカーＣＹＦＲＡ２１−１との比較
実施例３および４でアッセイしたものと同じサンプルを、含まれる使用説明書にしたがってＣＹＦＲＡ２１−１酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）により試験した。ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡは、ヒト血清中の可溶性ケラチン１９断片の定量を提供し、肺癌患者において、疾患および処置の経過中の疾患の進行をモニタリングする援助としてしばしば使用される。２．４２μｇ／Ｌの上位９５パーセンタイル参照限界を、腎臓疾患を除いた良性疾患（ｎ＝１９９）に基づいて、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡについて計算した。結果を図３にグラフで示す。図３は、（腎臓疾患を除いた）良性疾患に関する感度対９５％特異度を示す。カットオフ値は、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡについて２．４２μｇ／Ｌであり、Ｋ７／１９アッセイについて１．１Ｕ／ｍＬである。
【０２６６】
結論：Ｋ７／１９アッセイは、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡに比べて優れた特異度を示す。図３から、腫瘍マーカーＣＹＦＲＡ１２−１（ケラチン１９）のレベルが、腎臓疾患を患っている患者だけでなく心不全患者においても上昇することがわかる。Ｋ７／１９アッセイは、より組織限定的でもあるが、卵巣癌、食道癌（ＳＣＣ）および膀胱癌においては同等の感度を有する。すべての組織タイプの肺癌における感度は、ＣＹＦＲＡ２１−１におけるよりも低い。
【０２６７】
〔実施例７〕
卵巣癌に関するＫ７／Ｋ１９アッセイの評価および確立されたマーカーとの比較
下腹部または骨盤部（骨盤腔内腫瘤）の異常な成長のために来院している女性からの血清サンプルに以下のアッセイ：ＣＡ１２５  ＥＩＡ、ＨＥ４  ＥＩＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡ（すべて、Ｆｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．から市販されている）および実施例１によるＫ７／１９アッセイを実行した。ＣＡ１２５  ＥＩＡは、ＣＡ１２５抗原に対して特異的であり、ＨＥ４  ＥＩＡは、ＨＥ４抗原に対して特異的である。両試験とも卵巣上皮癌のような婦人科悪性腫瘍を有する患者をモニターするためにしばしば使用される。よく特徴づけされているサンプルを、以下の表３に記載する。このサンプルの組においては、２１人の患者が卵巣癌を有し、６０人の患者が良性疾患を有することが分かった。図４に見られるように、卵巣癌において、４つのアッセイ：ＣＡ１２５  ＥＩＡ、ＨＥ４  ＥＩＡ、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡに関する感度対特異度プロファイルを比較して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作った。
【０２６８】
ＣＡ１２５  ＥＩＡおよびＫ７／１９アッセイは、９５％特異度において最高の感度、５２％および最大の曲線下面積を示し、したがって、ＨＥ４  ＥＩＡまたはＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡに比べて、卵巣癌と良性の骨盤内腫瘤を鑑別する最高の能力を実証した。
【０２６９】
【表５】
0006472457.tif 000006
【０２７０】
〔実施例８〕
実施例７のバイオマーカーの組合せ
図５は、ＣＡ１２５  ＥＩＡ＆ＨＥ４  ＥＩＡの組合せとＣＡ１２５  ＥＩＡ＆Ｋ７／１９アッセイの組合せを比較するＲＯＣ曲線を示す。ＣＡ１２５  ＥＩＡをＫ７／１９アッセイと組み合わせると、ＣＡ１２５  ＥＩＡまたはＫ７／１９アッセイを単独で用いた場合に比べて診断感度は増加する。
【０２７１】
ＣＡ１２５  ＥＩＡ＆Ｋ７／１９アッセイの組合せの感度は、９５％特異度において６２％であり、７０％特異度で１００％の感度に到達する。
【０２７２】
結論：実施例７および８は、Ｋ７／１９アッセイが卵巣癌患者の管理において臨床的に役に立つ可能性があると実証した。Ｋ７／１９アッセイの比較的高い癌特異度によって、例えば、肺癌、膀胱癌、食道癌および卵巣癌のような悪性新生物性疾患のためのマーカーとしてのケラチン７とケラチン１９の異種複合体の使用は、特異度を減少させることなく、感度を増加させることができる。
【０２７３】
〔実施例９〕
肺癌：ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣの間の差次的診断
小細胞肺癌患者からの２９個の血清を、実施例１に記載のＫ７／１９アッセイによって試験した。２８サンプルは、１．１Ｕ／ｍＬ未満のケラチン７とケラチン１９の異種複合体（またはその断片）の濃度を有し、すなわち、サンプルのうちの１つのみがＫ７／１９アッセイにおいて陽性であった。サンプルは、先にＰｒｏＧＲＰについても分析し、２９サンプルのうちの１７個が２００ｐｇ／ｍＬ超のＰｒｏＧＲＰ濃度を有し、活性なＳＣＬＣを有する個人からサンプルが採取されたことを実証した。
【０２７４】
Ｋ７／Ｋ１９アッセイは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を識別することができる。これとＫ７／１９アッセイの高い特異度の組合せは、Ｋ７／Ｋ１９アッセイを、小細胞および非小細胞肺癌の鑑別診断を援助するためのツールとして好適なものとする。Ｋ７／Ｋ１９アッセイは、小細胞肺癌に関する高い感度および特異度を有するアッセイ、ＰｒｏＧＲＰ（Ｔａｎｇ  Ｊｉａｎ−ｈｕａら、Ｍｅｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｍａｒｋｅｒ  ｐｒｏ−ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１；１２４（１０）：１５６３〜１５６８）との組合せで特に有用である。ＣＹＦＲＡ２１−１は、ＳＣＬＣも検出し、したがって、そのような適用には有用でない。
【０２７５】
ＰｒｏＧＲＰおよびＫ７／１９の併用測定が、ＳＣＬＣと混合型ＳＣＬＣ（ｃ−ＳＣＬＣ）および大細胞神経内分泌癌腫（ＬＣ−ＮＥＴ）とＳＣＬＣを識別するのに役に立つ可能性があることも期待できる。
【０２７６】
〔実施例１０〕
肺癌におけるＫ７／Ｋ１９アッセイの診断能力
良性疾患（このアッセイの信頼性を損なわないために、ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡにおいては腎臓疾患を除外した）のために使用するカットオフ値の４倍のカットオフ値を用いて、実施例３（健康な個体からの１１２個のサンプル）、実施例４（良性疾患の２３９個のサンプル）および実施例５（悪性新生物性疾患の３９８個のサンプル）からのデータを活用し、カットオフ値：Ｋ７／１９アッセイのための４．４Ｕ／ｍＬおよびＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡのための９．７μｇ／Ｌを与えた。これらの限界により、陽性の肺癌サンプル、他の陽性の癌サンプル（すなわち、肺癌サンプルでない）および良性疾患を患っている患者からの陽性サンプルの数を表５に要約する。
【０２７７】
【表６】
0006472457.tif 000007
【０２７８】
結論：陽性のサンプルのパーセンテージがかなり低いにもかかわらず、陽性のサンプルは癌の確率が高い。Ｋ７／Ｋ１９アッセイの場合、４．４Ｕ／ｍＬ超のケラチン７とケラチン１９の異種複合体（またはその断片）値を有するサンプルが肺癌である確率は５０％超である。ＣＹＦＲＡ２１−１  ＥＩＡに関しては、この確率はより低く、腎不全（陽性の良性サンプル）の可能性も無視できない。この予備データセットにおいて、肺癌の組織学的タイプは未知であった。
【０２７９】
〔実施例１１〕
胆管癌におけるＫ７／Ｋ１９アッセイの能力
胆管における確認された進行上皮癌または確認された進行胃癌を有する患者からの血清を、実施例１に記載のＫ７／１９アッセイにおいて試験した。
【０２８０】
【表７】
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【０２８１】
結論：Ｋ７／Ｋ１９アッセイは、上記上皮癌を患っている患者の管理においても臨床的に役に立つ可能性がある。
【０２８２】
〔実施例１２Ｎｙｔｔ〕
血清中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体の決定のための代替アッセイ
目的は、実施例１に記載のＫｓ７．１８／ＢＭ１９．２１アッセイに対して抗体のエピトープ位置の大きな相違を有する、臨床評価に好適なアッセイを比較することであった。
【０２８３】
ケラチン１９に特異的な抗体Ｋｓ１９．１は、ケラチン１９のアミノ酸３１１〜３３５に結合し（Ｂｏｅｔｔｇｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３１、４７５〜４８５、１９９５）、モノクローナル抗体ＲＣＫ１０５は、ケラチン７に特異的である（Ｒａｍａｅｋｅｒｓら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１７０（１）：２３５〜４９、１９８７）。
【０２８４】
モノクローナル抗体ＲＣＫ１０５をビオチンにコンジュゲーションし、モノクローナル抗体ＢＭ  Ｋｓ１９．１を、「Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｏｄａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）ｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｍ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ  Ｋ．Ｎａｋａｎｅ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、１９７８）に記載の方法によってペルオキシダーゼにコンジュゲーションした。
【０２８５】
悪性新生物性疾患と診断された患者から得た血清中のケラチン７とケラチン１９の異種複合体またはその断片の存在を決定するために、実施例１のとおりにサンドイッチ酵素イムノアッセイを実行した。２つのアッセイを同じ１９個の癌サンプルについて比較した。
【０２８６】
上記アッセイ、ｒ＝０．９８、ｎ＝１９サンプル、の間には高い相関があり、以下の表に実証されるように、大きな臨床的矛盾はなかった。
【０２８７】
結果を以下の表に要約する。
【０２８８】
【表８】
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【０２８９】
結論：ケラチン７／１９のための代替アッセイは、ケラチン１９のアミノ酸３１１〜３３１に結合するケラチン１９抗体と、抗体Ｋｓ７．１８でなくケラチン７の別の部分にそのエピトープが位置するＲＣＫ１０５とを対で使用することによって構築してもよい。
【０２９０】
〔実施例１３〕
抗体Ｋｓ７．１８のためのケラチン７上のエピトープ位置は、ケラチン７とケラチン１９の異種複合体のアッセイにおけるＫｓ１９．１ケラチン１９抗体による完全な阻害によって確立できた。
【０２９１】
実施例１のとおりにアッセイを構築したが、ＢＭ１９．２１ｍａｂの代わりにＫｓ１９．１ｍａｂをペルオキシダーゼにコンジュゲーションした。抗体Ｋｓ７．１８と組み合わせた２つの異なるケラチン１９抗体についての結果を、規定サンプルについて以下の表に示す。
【０２９２】
【表９】
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【０２９３】
結論：
ケラチン７とケラチン１９の異種複合体がらせん構造と平行にずれなく整列するため、ケラチン７およびケラチン１９それぞれのヘリックス１Ａからヘリックス２Ｂまでの対応する露出位置に結合する任意の２つの抗体は、同時に結合しない、すなわち、ケラチン７がケラチン１９の周りに巻き付く場合、これらの対応位置は、立体的理由によって同時の結合を許容しない。これはさらに、例えば、ケラチン１９のアミノ酸２７１〜２９１がケラチン７のアミノ酸２８３〜３０３とコイルドコイルで対をなすということによって例証される。
【０２９４】
ＢＭ１９．２１のためのエピトープは、ケラチン１９のアミノ酸配列３５２〜３６８に位置する。Ｋｓ１９．１抗体のためのケラチン１９上のエピトープは、アミノ酸配列３１１〜３３５に位置づけられている。ケラチン７上の対応する配列は、３２３〜３４７である。
【０２９５】
Ｋｓ７．１８のためのエピトープは、ケラチン７上のアミノ酸配列３００〜３５０に位置づけられると結論できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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