(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出する工程を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法であって、
前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５、Ｔｍｅｍ１７１、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、検出方法。
【請求項２】
前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子のｍＲＮＡ増幅用プライマー、
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子に対するプローブ、又は
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体若しくはアプタマー、
を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キットであって、
前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５、Ｔｍｅｍ１７１、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、キット。
【請求項５】
前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、請求項４又は５に記載のキット。
【請求項７】
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子に対するプローブを備えたＤＮＡアレイである、請求項４〜６のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜を構成するリン脂質は、２位に不飽和脂肪酸を有している。図１に示すように、鉄を介したフェントン反応により、スーパーオキシド又は過酸化水素から生成したヒドロキシラジカルが上記不飽和脂肪酸と反応すると、リン脂質ヒドロペルオキシドが生じることが知られている。
【０００３】
リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、以下「ＰＨＧＰｘ」という場合がある。）は、グルタチオンを補酵素として、生成したリン脂質ヒドロペルオキシドを直接還元し、リン脂質ヒドロキシ体に変換する酵素である。このＰＨＧＰｘ遺伝子のノックアウトマウスは、胎性致死であることが知られていた（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死のメカニズムは不明であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Imai H, et al., Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse PHGPx gene, Biochem Biophys Res Commun., 305, 278-86, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死の経路に関与する因子を明らかにし、上記細胞死（以下、「リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死」という。）の検出方法及びキット、を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
（１）細胞中の、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出する工程を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法であって、前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、ｏｏｃｙｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｌｐｈａ（Ｏｍｔ２ａ）、ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ  ｔｙｐｅ  ＸＩ  ａｌｐｈａ（Ｓｃｎ１１ａ）、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ２０５（Ｉｆｉ２０５）、ＩＱ  ｍｏｔｉｆ  ａｎｄ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（Ｉｑｕｂ）、ｈｏｍｅｏｂｏｘ  Ｄ１（Ｈｏｘｄ１）、ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ２（Ｐｅｔ２）、ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｅｉｏｓｉｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＳＰＯ１１  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｓｐｏ１１）、ＡＦ４／ＦＭＲ２  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ４（Ａｆｆ４）、ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｋｅ  ５（Ｅｍｌ５）、ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ７  （ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｙ＋  ｓｙｓｔｅｍ）  ｍｅｍｂｅｒ  ９（Ｓｌｃ７ａ９）、Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌ  （Ｎ−ａｃｅｔｙｌ）  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２，  Ｉ−ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（Ｇｃｎｔ２）、ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｔｉｆ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １Ｂ（Ａｎｋｓ１ｂ）、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  （ｌｉｇａｎｄ）  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  １０（Ｔｎｆｓｆ１０）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  Ａ８３００２８Ｅ２３  ｇｅｎｅ（ＢＢ２６７００６）、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ（Ｃｃｋ）、ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｆａｍｉｌｙ  ４  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｘ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  １（Ｃｙｐ４ｘ１）、ｍａｎｎｏｓｉｄｅ  ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ５（Ｍｇａｔ５）、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７１（Ｔｍｅｍ１７１）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  Ｄ９３００１５Ｆ０４  ｇｅｎｅ（ＢＢ５２３５５６）、ｈｏｍｅｒ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １（Ｈｏｍｅｒ１）、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  Ｃ７３００３１Ｆ２１  ｇｅｎｅ（ＢＢ６６７６６５）、ｃｌａｖｅｓｉｎ  ２（Ｃｌｖｓ２）、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、検出方法。
（２）前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、（１）に記載の検出方法。
（３）前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、（１）又は（２）に記載の検出方法。
（４）リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子のｍＲＮＡ増幅用プライマー、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子に対するプローブ、又はリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体若しくはアプタマーを備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キットであって、前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５、Ｔｍｅｍ１７１、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、キット。
（５）前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、（４）に記載のキット。
（６）前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、（４）又は（５）に記載のキット。
（７）リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子に対するプローブを備えたＤＮＡアレイである、（４）〜（６）のいずれか一項に記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】生体膜新脂質酸化反応とその代謝経路を説明する図である。
【図２】ＰＨＧＰｘタンパク質を検出するウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞内で生成されたリン脂質ヒドロペルオキシド（１８：０、２０：４ホスファチジルコリン由来のヒドロペルオキシド）の量の経時変化を示すグラフである。
【図４】タモキシフェン添加によりＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞が致死となるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）は、アポトーシス阻害剤を用いた時のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果を細胞生存率（％）で示した結果を示すグラフである。（ｂ）は、スタウロスポリン処理とタモキシフェン処理の際のアポトーシスの指標の蛍光免疫染色の結果を示す写真である。
【図６】（ａ）は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加３０分後のＨＭＧＢ１の蛍光免疫染色の結果を示す写真であり、図６（ｂ）は、タモキシフェン添加４８時間後のＨＭＧＢ１の蛍光免疫染色結果を示す写真である。
【図７】（ａ）は、オートファジー関連因子ＡＴＧ５のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ＲＴ−ＰＣＲによるＡＴＧ５の発現抑制の結果を示す写真である。
【図８】（ａ）は、ネクロトーシス関連因子Ｒｉｐ１のノックダウン細胞によるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによるＲｉｐ１の発現低下の結果を示す写真である。
【図９】発明者らの解析により明らかとなった、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図である。
【図１０】（ａ）〜（ｄ）は、ＤＮＡアレイを用いてリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子を探索した結果を示す図である。
【図１１】定量ＰＣＲによる解析の結果を示すグラフである。
【図１２】定量ＰＣＲによる解析の結果を示すグラフである。
【図１３】定量ＰＣＲによる解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法］
１実施形態において、本発明は、細胞中の、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出する工程を備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法であって、前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５、Ｔｍｅｍ１７１、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、検出方法を提供する。
【００１０】
後述するように、発明者らは、アポトーシス、ネクローシス、オートファジー性細胞死、ネクトローシスとは明確に異なる新規の経路による細胞死（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死）を見出した。更に、後述するように、ＤＮＡアレイ等を用いた解析の結果から、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５、Ｔｍｅｍ１７１、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ遺伝子が関与していることを明らかにした。
【００１１】
したがって、細胞中のこれらの遺伝子の発現上昇を検出することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。本実施形態の方法により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中であるか否かを検出することもできるし、細胞死が生じた後に当該細胞死がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路を介していたか否かを判断することもできる。
【００１２】
細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル等の細胞が挙げられる。これらの細胞において、発現上昇を検出する遺伝子としては、上述した遺伝子のそれぞれの種におけるホモログを検出すればよい。
【００１３】
本実施形態のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法において、発現上昇を検出するリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子は、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることがより好ましい。
【００１４】
これらの遺伝子は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の進行中における発現上昇がより高いため、これらの遺伝子を検出対象とすることにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出精度を更に高めることができる。
【００１５】
本実施形態のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法において、発現上昇を検出するリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子は、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることが更に好ましい。
【００１６】
これらの遺伝子は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の進行中における発現上昇が特に高いため、これらの遺伝子を検出対象とすることにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出精度を更に高めることができる。
【００１７】
［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キット］
１実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子のｍＲＮＡ増幅用プライマー、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子に対するプローブ、又はリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体若しくはアプタマーを備える、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キットであって、前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５、Ｔｍｅｍ１７１、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子である、キットを提供する。
【００１８】
本実施形態のキットを用いてリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。本実施形態のキットにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中であるか否かを検出することもできるし、細胞死が生じた後に当該細胞死がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路を介していたか否かを判断することもできる。
【００１９】
（ｍＲＮＡ増幅用プライマー）
本明細書において、ｍＲＮＡ増幅用プライマーとは、ｍＲＮＡを逆転写して得られたｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅することができるプライマーを意味する。本実施形態のキットにおけるｍＲＮＡ増幅用プライマーとしては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）等により、上記のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出することができるものであれば特に制限なく用いることができる。
【００２０】
（プローブ）
本実施形態のキットにおけるプローブとしては、上記のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子のｍＲＮＡ、又は当該ｍＲＮＡを逆転写することにより得られたｃＤＮＡにハイブリダイズし、ノーザンブロッティング、ＤＮＡアレイ解析等により、上記のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出することができるものであれば特に制限なく用いることができる。
【００２１】
プローブは、例えば基板上に固定されたＤＮＡアレイの形態であってもよい。ＤＮＡアレイは、本発明の効果が得られる限り特に制限されず、例えば、フォトリソグラフィーの技術を応用して基板上でプローブＤＮＡ断片を直接合成したものであってもよく、あらかじめ調製したプローブＤＮＡ断片を基板にスポットして固定することにより製造されたものであってもよい。
【００２２】
（抗体又はアプタマー）
本実施形態のキットにおける抗体又はアプタマーとしては、上記のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子がコードするタンパク質（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子が転写・翻訳されることにより形成されるタンパク質）に結合し、上記のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の発現上昇を検出することができるものであれば特に制限なく用いることができる。
【００２３】
抗体又はアプタマーは、例えば基板上に固定された抗体アレイ又はアプタマーアレイの形態であってもよい。
【００２４】
なお、本明細書において、「抗体」は、抗体及び抗体誘導体を含む。抗体誘導体としては、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の抗体断片、ｓｃＦｖ等の１本鎖抗体等が挙げられる。
【００２５】
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体は、定法により、当該タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として動物を免疫すること等により作製することができる。
【００２６】
また、アプタマーとしては、例えばＤＮＡアプタマーが挙げられる。リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子がコードするタンパク質に対するＤＮＡアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等の定法により、当該タンパク質に対する結合能を指標として、ランダム配列の核酸ライブラリー等から選別することができる。
【００２７】
本実施形態のキットにおいて、発現上昇を検出するリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子は、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４、Ｅｍｌ５、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることがより好ましい。
【００２８】
これらの遺伝子は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の進行中における発現上昇がより高いため、これらの遺伝子を検出対象とすることにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出精度を更に高めることができる。
【００２９】
本実施形態のキットにおいて、発現上昇を検出するリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子は、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子であることが更に好ましい。
【００３０】
これらの遺伝子は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の進行中における発現上昇が特に高いため、これらの遺伝子を検出対象とすることにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出精度を更に高めることができる。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
［実験例１］
（タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の樹立）
ＰＨＧＰｘ欠損細胞死のメカニズムを明らかにするために、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株を樹立した。この細胞は、タモキシフェンを培地に加えると２４時間以内にＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムによりＰＨＧＰｘゲノム遺伝子が欠失する。
【００３３】
具体的には、ＰＨＧＰｘ遺伝子ノックアウトマウス（ＰＨＧＰｘ−／−）に、ｌｏｘＰ配列に挟まれたＰＨＧＰｘ遺伝子（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）を遺伝子導入（Ｔｇ）した、Ｔｇ（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）：ＰＨＧＰｘ−／−マウスと、ＰＨＧＰｘ＋／−マウスを交配させた。続いて、遺伝子型がＴｇ（ｌｏｘＰ−ＰＨＧＰｘ）：ＰＨＧＰｘ−／−である１３．５日胚から、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を調製した。続いて、得られた細胞にＳＶ４０ウイルスのＴ抗原遺伝子を遺伝子導入することにより不死化した。続いて、得られた細胞にタモキシフェン誘導型ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子を導入した。これにより、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株が得られた。
【００３４】
なお、ＣｒｅＥＲＴ２とは、エストロゲン受容体と融合タンパク質にしたＣｒｅ（ＣｒｅＥＲ）を、エストロゲンに反応せず、タモキシフェンに反応するように変異させたものである。タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを添加すると、ＣｒｅＥＲ２のエストロゲン受容体部分にタモキシフェンが結合し、エストロゲン受容体の核移行シグナルが露出する。その結果、ＣｒｅＥＲ２が核内へ移行し、ｌｏｘＰで挟まれたＰＨＧＰｘゲノム遺伝子が破壊される。添加するタモキシフェンの濃度は終濃度１μＭ程度でよい。
【００３５】
［実験例２］
（タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株へのタモキシフェンの投与）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。続いて、タモキシフェン添加から０、２４及び４８時間後の細胞を回収し、抗ＰＨＧＰｘ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞サンプル中のＰＨＧＰｘタンパク質の量を測定した。
【００３６】
図２は、ＰＨＧＰｘタンパク質を検出するウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、タモキシフェン投与から２４時間以内にＰＨＧＰｘタンパク質の発現量が減少することが確認された。
【００３７】
［実験例３］
（ＰＨＧＰｘ欠損細胞におけるリン脂質ヒドロペルオキシドの検出）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、生成されるリン脂質ヒドロペルオキシドを検出した。検出には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）／質量分析（ＭＳ）を用いた。
【００３８】
液体クロマトグラフィーには、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ装置（ウォーターズ社）を用い、質量分析には、四重極リニアイオントラップ質量分析システム（商品名４０００  Ｑ−ＴＲＡＰ、エービー・サイエックス社）を用いた。液体クロマトグラフィーのカラムには、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（商標）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（０．１７μｍ、１５０ｍｍ×１．０ｍｍ）を使用した。
【００３９】
タモキシフェン添加から、０、１２、２４、３６及び４８時間後の各細胞から抽出した全リン脂質画分のサンプルをオートサンプラーに供し、移動相Ａ（アセトニトリル／メタノール／水＝２：２：１（ｖ／ｖ）、０．１％ほう酸、０．０２８％アンモニア）：移動相Ｂ（イソプロパノール、０．１％ほう酸、０．０２８％アンモニア）の１００：０（０〜５分）、５０：５０（５〜２５分）、５０：５０（２５〜４９分）、１００：０（５９〜６０分）及び１００：０（６０〜７５分）のステップグラジエント、流量７０μＬ／分、カラム温度３０℃の条件で分離した。
【００４０】
ＭＳ／ＭＳ解析は、ＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）の手法を用いてネガティブイオンモードで実施した。イオンスプレー電圧は、−４５００Ｖに設定した。窒素ガスを障壁ガス及びコリジョンガスとして使用した。酸化リン脂質の検出において、コリジョンエネルギーは２０−６５ｅＶに設定した。装置のスキャンレンジは、ｍ／ｚ  ５０〜９５０、スキャンスピード１０００Ｔｈ／秒に設定した。Ｑ０トラッピングをオンにし、リニアイオントラップフィルタイムを１０ミリ秒に設定した。デクラスタリングポテンシャルを−１０５Ｖに設定した。Ｑ１の解像度を「ユニット」に設定した。ホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（１８：０：２０：４由来）の特徴的なフラグメンテーションパターンは、ドウェル  タイム５０ミリ秒、デクラスタリングポテンシャルを−８０Ｖに設定した。Ｑ１及びＯ３の解像度はユニットに設定し、Ｑ１は８８６ｍ／ｚ、Ｏ３は２８３ｍ／ｚ（コリジョンエネルギー−６０ｅＶ）及び３３５ｍ／ｚ（コリジョンエネルギー−４５ｅＶ）に設定した。
【００４１】
図３は、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加後、０、１２、２４、３６及び４８時間後の細胞内で、１８：０（ステアリン酸）、２０：４（アラキドン酸）をもつホスファチジルコリン（ＰＣ）から酸化により生成した酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシド（ＰＣＯＯＨ）の生成量を経時的に示したグラフである。タモキシフェンの添加から２４時間後をピークに、アラキドン酸を含むリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドが生成された。ＤＨＡを含むリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドでも同様な結果が得られている（図なし）。
【００４２】
［実験例４］
（ＰＨＧＰｘ欠損細胞のＭＴＴアッセイ）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、ＭＴＴアッセイにより、細胞の生存率を測定した。また、タモキシフェンと同時に終濃度２００μＭのビタミンＥ添加群についても同様の検討を行った。
【００４３】
より具体的には、タモキシフェンの添加から２４、４８及び７２時間後の細胞の培地にＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄ）を添加し、４時間後に各細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４４】
図４は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。タモキシフェン添加から４８時間後から７２時間の間に細胞死が起こることが明らかとなった。また、ビタミンＥの添加により細胞死が完全に抑制されることが明らかとなった。
【００４５】
［実験例５］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とアポトーシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死（ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死）が、アポトーシスによる細胞死経路を介しているのか否かについて詳細に検討した。
【００４６】
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫを終濃度５０μＭ、ミトコンドリアタンパク質であるアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出阻害剤であるＤＨＩＱを終濃度３００μＭ、ビタミンＥ誘導体であるトロロックスを終濃度４００μＭ添加したもの、及び、対照として何も添加していない細胞を用意した。各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを同時に添加した。タモキシフェン、阻害剤添加３日後にＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。対物レンズにＰｌａｎ  Ｆｌｏｕｒ  ＥＬＷＤ２０ｘ０．４５（Ｎｉｃｏｎ）を用いて１０倍で観察した（一視野  ８７７．５μｍ×６６１．２μｍ）。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加せずに、３日培養した時の細胞数を１００％として表した。
【００４７】
結果を図５（ａ）に示す。カスパーゼ阻害剤、ＡＩＦ系の阻害剤では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができなかった。一方ビタミンＥ誘導体であるトロロックスは細胞死を抑制することができた。
【００４８】
次に、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にアポトーシス誘導試薬であるスタウロスポリンを終濃度０．５μＭで添加したものと、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加したものを用意した。５時間後、２４時間後、４８時間後に、各細胞を、蛍光免疫染色し、シトクロムＣ及び活性化カスパーゼ３を染色した。また、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄＵＴＰ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）法によりアポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片化を検出した。
【００４９】
結果を図５（ｂ）に示す。スタウロスポリン処理では、５時間後にシトクロムＣの放出が観察され、カスパーゼ３が活性化し、２４時間後にはＴＵＮＥＬ陽性の細胞死（アポトーシス）が観察された。一方、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死では、シトクロムＣの放出やカスパーゼ３の活性化は観察されなかった（図では４８時間後を示したが、６０時間後でも観察されなかった）。ＴＵＮＥＬ染色のみ、核内にドット状の染色が観察されたが、ＤＮＡラダーは検出されなかった。
【００５０】
以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、典型的なアポトーシスとは異なることが明らかとなった。
【００５１】
［実験例６］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とネクローシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、ネクローシスによるものか否かについて詳細に検討した。
【００５２】
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、細胞死の瞬間をタイムラプス解析で検討した。しかしながら、細胞死の瞬間にネクローシスの特徴である細胞の膨潤は観察されなかった。細胞死の直前に細胞が形を変形し、最後はシャーレよりはがれて突然致死となった（図示せず。）。
【００５３】
続いて、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、ネクローシス誘導剤であるｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドを終濃度３００ｍＭで添加したものと、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加したものを用意した。３０分後（ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加群）及び４８時間後（タモキシフェン添加群）に、各細胞を、蛍光免疫染色し、ネクローシスの特徴であるＨＭＧＢ１（Ｈｉｇｈ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｂｏｘ１）タンパク質の細胞質への放出を観察した。また、核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。
【００５４】
図６（ａ）は、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加３０分後の結果を示す写真であり、図６（ｂ）は、タモキシフェン添加４８時間後の結果を示す写真である。その結果、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド添加による細胞死では、ネクローシスの指標であるＨＭＧＢ１の核から細胞質への放出が観察されたのに対し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死では、ＨＭＧＢ１は核にとどまっており細胞質への放出が認められなかった。
【００５５】
以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、ネクローシスとは異なることが明らかとなった。
【００５６】
［実験例７］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とオートファジー性細胞死との比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、オートファジー性細胞死によるものか否かについて詳細に検討した。オートファジー性細胞死を起こすためにはＡＴＧ５遺伝子が必須であることが知られている。
【００５７】
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、ＡＴＧ５特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）を導入し、ＡＴＧ５の発現をノックダウンした細胞を用意した。ＡＴＧ５特異的ｓｈＲＮＡとしては、ＡＴＧ５  ｓｈＲＮＡ−３（配列番号１）及びＡＴＧ５  ｓｈＲＮＡ−４（配列番号２）の２種類のｓｈＲＮＡを使用した。また、対照として、ｓｈＲＮＡ発現ベクターのみを導入した細胞を用意した。これらの細胞の培地に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、２４、３６、４８、６０及び７２時間後の細胞を、Ｋｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、それぞれの時間の生細胞数の割合の変化を細胞生存率（％）として表した。
【００５８】
結果を図７（ａ）及び図７（ｂ）に示す。ＡＴＧ５の発現をノックダウンしても、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することはできなかった。また、図７（ｂ）に示すように、ＲＴ−ＰＣＲの結果から、ｓｈＲＮＡの導入により、ＡＴＧ５遺伝子の発現がノックダウンされたことが確認された。
【００５９】
以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、オートファジー性細胞死とは異なることが明らかとなった。
【００６０】
［実験例８］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とネクトローシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、ネクトローシスによるものか否かについて詳細に検討した。ネクトローシスは、プログラムされたネクローシスとして知られる細胞死の１形態である。また、ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  １（Ｒｉｐ１）のノックダウンにより、ネクトローシスが顕著に抑制されることが知られている。
【００６１】
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｒｉｐ１特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）を導入し、Ｒｉｐ１の発現をノックダウンした細胞を用意した。Ｒｉｐ１特異的ｓｈＲＮＡとしては、Ｒｉｐ１  ｓｈＲＮＡ−４（配列番号３）を使用した。また、対照として、ｓｈＲＮＡ発現ベクターのみを導入した細胞、及び培地中に終濃度４００μＭでトロロックスを添加した細胞を用意した。これらの細胞の培地に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。
【００６２】
結果を図８（ａ）及び図８（ｂ）に示す。Ｒｉｐ１の発現をノックダウンしても、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死を抑制することはできなかった。また、図８（ｂ）に示すように、ウエスタンブロッティングの結果から、ｓｈＲＮＡの導入により、Ｒｉｐ１タンパク質の発現がノックダウンされたことが確認された。
【００６３】
以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、ネクトローシスとは異なることが明らかとなった。すなわち、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、アポトーシス、ネクローシス、オートファジー性細胞死、ネクトローシスとは異なる新規の細胞死であることが明らかとなった。
【００６４】
図９に、発明者らの解析により明らかとなった、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図を示す。ＰＨＧＰｘが欠損すると、２４時間後をピークとしてリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドが上昇する。その下流でＣＤＫ４が活性化し、３６時間後以降にＭＡＰキナーゼ経路のＭＥＫ、ＥＲＫがリン酸化され、４８時間後から７２時間の間で細胞死を引き起こす。
【００６５】
発明者らは更に、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株を利用した検討の結果、ビタミンＥ、ＣＤＫ４阻害剤である３−ＡＴＡ（３−アミノ−９−チオ［１０Ｈ］−アクリドン）又はＭＥＫ阻害剤であるＵ−０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノ−フェニルチオ］ブタジエン）を培地中に添加することにより、ＰＨＧＰｘの欠損により誘導されるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できることを見出した。
【００６６】
［実験例９］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の同定）
ＤＮＡアレイを用いて、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子を同定した。具体的には、まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭ添加した群（タモキシフェン添加群）、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭ及びビタミンＥ誘導体であるトロロックスを終濃度３００μＭ添加した群（タモキシフェン／トロロックス添加群）、及び、対照として、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地に何も添加していない群（対照群）を用意した。続いて、各群の細胞を３６時間インキュベートした後、それぞれＲＮＡを抽出し、ＤＮＡアレイ（商品名「Ｇｅｎｅｃｈｉｐ」、アフィメトリクス社）を用いて遺伝子の発現の変動を網羅的に解析した。図１０（ａ）〜（ｄ）は、ＤＮＡアレイを用いてリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子を探索した結果を示す図である。
【００６７】
その結果、図１０（ａ）に示すように、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）とタモキシフェン添加群（Ｔａｍ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、ＰＨＧＰｘが欠損したことにより発現量が１．５倍以上上昇した遺伝子が３４７７個同定された。また、タモキシフェン添加群（Ｔａｍ）とタモキシフェン／トロロックス添加群（Ｔａｍ＋Ｔｒｏｌｏｘ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、脂質の過酸化に依存して発現量が１．５倍以上上昇した遺伝子が１５９０個同定された。更に、これらの遺伝子群に共通する６３５個の遺伝子が同定された。
【００６８】
また、図１０（ｂ）に示すように、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）とタモキシフェン添加群（Ｔａｍ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、ＰＨＧＰｘが欠損したことにより発現量が３倍以上上昇した遺伝子が１２９０個同定された。また、タモキシフェン添加群（Ｔａｍ）とタモキシフェン／トロロックス添加群（Ｔａｍ＋Ｔｒｏｌｏｘ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、脂質の過酸化に依存して発現量が３倍以上上昇した遺伝子が５３２個同定された。更に、これらの遺伝子群に共通する４４個の遺伝子が同定された。表１に、上記の４４個の遺伝子のリストを示す。
【００６９】
【表１】
0006555708.tif 000002
【００７０】
また、図１０（ｃ）に示すように、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）とタモキシフェン添加群（Ｔａｍ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、ＰＨＧＰｘが欠損したことにより発現量が１．５倍以上減少した遺伝子が５７６１個同定された。なお、発現量が１．５倍以上減少したとは、対照群における対象遺伝子の発現量が、タモキシフェン添加群における対象遺伝子の発現量の１．５倍以上であったことを意味する。また、タモキシフェン添加群（Ｔａｍ）とタモキシフェン／トロロックス添加群（Ｔａｍ＋Ｔｒｏｌｏｘ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、脂質の過酸化に依存して発現量が１．５倍以上減少した遺伝子が１８６７個同定された。更に、これらの遺伝子群に共通する８２６個の遺伝子が同定された。
【００７１】
また、図１０（ｄ）に示すように、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）とタモキシフェン添加群（Ｔａｍ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、ＰＨＧＰｘが欠損したことにより発現量が３倍以上減少した遺伝子が３０１２個同定された。また、タモキシフェン添加群（Ｔａｍ）とタモキシフェン／トロロックス添加群（Ｔａｍ＋Ｔｒｏｌｏｘ）との間での遺伝子の発現量の比較に基づいて、脂質の過酸化に依存して発現量が３倍以上減少した遺伝子が５９３個同定された。更に、これらの遺伝子群に共通する４９個の遺伝子が同定された。
【００７２】
［実験例１０］
（定量ＰＣＲによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子の確認）
実験例９で同定した、ＰＨＧＰｘが欠損したことにより発現量が３倍以上上昇し、かつ、脂質の過酸化に依存して発現量が３倍以上上昇した４４遺伝子について、定量ＰＣＲを行い、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死関連遺伝子であるか否かを確認した。
【００７３】
具体的には、まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭ添加した群（タモキシフェン添加群）、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭ及びビタミンＥ誘導体であるトロロックスを終濃度３００μＭ添加した群（タモキシフェン／トロロックス添加群）、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地にトロロックスを終濃度３００μＭ添加した群（トロロックス添加群）及び、対照として、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞の培地に何も添加していない群（対照群）を用意した。続いて、各群の細胞を３６時間インキュベートした後、それぞれＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成した。
【００７４】
続いて、各ｃＤＮＡを鋳型とした定量ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）を行い、上記の４４遺伝子の発現量をそれぞれ定量した。具体的には、各群の細胞における対象遺伝子の発現量を、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量を用いて基準化し、対照群における対象遺伝子の発現量を１として、各群の細胞における対象遺伝子の発現量の相対値を算出して比較した。表２に、定量ＰＣＲに用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列の配列番号を示す。
【００７５】
【表２】
0006555708.tif 000003
【００７６】
また、ＧＡＰＤＨの定量ＰＣＲに用いたセンスプライマーの塩基配列を配列番号９２に示し、アンチセンスプライマーの塩基配列を配列番号９３に示す。
【００７７】
定量ＰＣＲによる解析の結果、Ｏｍｔ２ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｉｆｉ２０５、Ｉｑｕｂ、Ｈｏｘｄ１、Ｐｅｔ２、Ｓｐｏ１１、Ａｆｆ４及びＥｍｌ５遺伝子は、タモキシフェン添加群において、対照群の約５倍以上に発現量が上昇した。図１１は、各群の細胞におけるこれらの遺伝子の発現量を示すグラフである。
【００７８】
また、Ｓｌｃ７ａ９、Ｇｃｎｔ２、Ａｎｋｓ１ｂ、Ｔｎｆｓｆ１０、ＢＢ２６７００６、ｖａｖ２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃｃｋ、Ｃｙｐ４ｘ１、Ｍｇａｔ５及びＴｍｅｍ１７１遺伝子は、タモキシフェン添加群において、対照群の約２倍〜５倍に発現量が上昇した。図１２は、各群の細胞におけるこれらの遺伝子の発現量を示すグラフである。
【００７９】
また、ＢＢ５２３５５６、Ｈｏｍｅｒ１、ＬＯＣ１０２６３２２０９、ＢＢ６６７６６５、Ｃｌｖｓ２、ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １Ｂ及びＤ−ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ遺伝子は、タモキシフェン添加群において、対照群の約２倍に発現量が上昇した。図１３は、各群の細胞におけるこれらの遺伝子の発現量を示すグラフである。
【００８０】
これらの遺伝子は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の進行中に、再現性よく発現量が上昇するため、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用マーカーとして有用である。
【００８１】
表３に、実験例９において、これらの遺伝子のｃＤＮＡにハイブリダイズした、ＤＮＡアレイ上のプローブの塩基配列の配列番号を示す。実験例９で使用したＤＮＡアレイでは、各遺伝子に付き１１種類ずつのプローブが使用されており、いずれのプローブも対象遺伝子のｃＤＮＡにハイブリダイズすることができた。
【００８２】
【表３】
0006555708.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキットを提供することができる。
【図１】
0006555708.tif 000005
【図２】
0006555708.tif 000006
【図３】
0006555708.tif 000007
【図４】
0006555708.tif 000008
【図５】
0006555708.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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