(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、７、８、９、および１０から選択される一つの天然型霊長類ＣＧＬアミノ酸配列と比較して、(i)５９位にＩｌｅまたはＡｓｎを、(ii)１１９位にＡｌａまたはＬｅｕを、および(iii)３３９位にＶａｌを有し、かつ
３１１位のＧｌｙ、６３位のＬｅｕ、９１位のＭｅｔ、２６８位のＡｒｇ、および／または３５３位のＳｅｒから選択される少なくとも１つの置換を有する、
単離された、修飾された霊長類シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）酵素。
【請求項２】
（ｉ）５９位のＩｌｅ、６３位のＬｅｕ、９１位のＭｅｔ、１１９位のＡｌａ、２６８位のＡｒｇ、３１１位のＧｌｙ、および３５３位のＳｅｒを含む；
（ｉｉ）５９位のＩｌｅ、６３位のＬｅｕ、９１位のＭｅｔ、１１９位のＬｅｕ、２６８位のＡｒｇ、３１１位のＧｌｙ、および３５３位のＳｅｒを含む；
（ｉｉｉ）５９位のＡｓｎ、６３位のＬｅｕ、９１位のＭｅｔ、１１９位のＡｌａ、２６８位のＡｒｇ、３１１位のＧｌｙ、および３５３位のＳｅｒを含む；または
（ｉｖ）５９位のＡｓｎ、６３位のＬｅｕ、９１位のＭｅｔ、１１９位のＬｅｕ、２６８位のＡｒｇ、３１１位のＧｌｙ、および３５３位のＳｅｒを含む、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
異種ペプチドセグメントをさらに含む、請求項１または２に記載の酵素。
【請求項４】
前記異種ペプチドセグメントが、ＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、請求項３に記載の酵素。
【請求項５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている、請求項１または２に記載の酵素。
【請求項６】
１以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧに連結されている、請求項５に記載の酵素。
【請求項７】
請求項１または２に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項８】
細菌、真菌、昆虫、または哺乳類での発現にコドン最適化されている、請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１１】
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記細菌細胞が、ｉｌｖＡ及びｍｅｔＡ遺伝子の欠失を有する大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）株である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１もしくは２に記載の酵素または請求項７に記載の核酸を薬学的に許容される担体中に含む、医薬製剤。
【請求項１４】
腫瘍細胞または腫瘍細胞を有する対象を治療するための医薬の製造における、請求項１もしくは２に記載の酵素または請求項７に記載の核酸の使用。
【請求項１５】
前記対象が、メチオニン制限食で維持されている、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記対象が、通常食で維持されている、請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記対象が、ヒト患者である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１８】
前記医薬が、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼球内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、経粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口で、吸入によって、注射によって、点滴によって、持続点滴によって、標的細胞を直接浸す局所かん流によって、カテーテルを介して、または洗浄液を介して投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記医薬が、前記腫瘍細胞の栄養培地に投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２０】
前記栄養培地が、血液、リンパ液、または髄液である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬が、少なくとも第二の抗癌治療と組み合わせて前記対象に投与される、請求項１４に記載の使用。
【請求項２２】
前記第二の抗癌治療が、外科治療、化学療法、放射線治療、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
対象における腫瘍細胞の治療における使用のための、請求項１もしくは２に記載の酵素または請求項７に記載の核酸を含む組成物。
【請求項２４】
前記酵素が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸が、細菌、真菌、昆虫、または哺乳類での発現にコドン最適化されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、腫瘍内、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、眼内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内、経粘膜、心膜内、臍帯内、経口投与用に処方されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞の栄養培地への投与用に処方されている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記栄養培地が、血液、リンパ液、または髄液である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
少なくとも第二の抗癌治療をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第二の抗癌治療が、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６１／８７１，７６８号（２０１３年８月２９日出願。その全内容は、参照により本明細書に援用される）の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所から与えられた助成金番号Ｒ０１  ＣＡ１５４７５４の下、政府の支持でなされた。政府は、本発明にある権利を有している。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、医学及び生物学分野に関するものである。より具体的には、癌治療における使用のための、改善されたヒトメチオニン−γ−リアーゼ（ｈＭＧＬ）に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連分野の説明
癌性組織において、必須アミノ酸のＬ−メチオニンに対する要求性は異常に高い。メチオニンの枯渇は、様々な腫瘍型に効果的であり、非癌性組織に有害な影響を与えないことが示されている。アミノ酸を加水分解する酵素の作用を介して、メチオニン枯渇は生じることができる。ヒトメチオニン枯渇酵素は以前には存在していなかったが、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の細菌酵素である、メチオニン−γ−リアーゼが、臨床での治療に有効であることが示され、臨床試験で評価されていた。しかしながら、細菌性タンパク質であるメチオニン−γ−リアーゼは、高い免疫原性があり、特異抗体の形成を惹起し、それにより、有害反応が生じ、また、活性が低下してしまう。メチオニン−γ−リアーゼはまた、非常に半減期が短く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで約２時間しかなく、全身的に枯渇させるためには、非常に高頻度及び非現実的な高用量が必要となる。
【０００５】
全身的なメチオニンの枯渇は、多くの研究対象であり、たとえば、特に転移性乳癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、及び膵臓癌等の癌の治療に対する可能性を秘めている。この治療法には多くの期待が寄せられているが、細菌由来のメチオニン−γ−リアーゼは、化学療法剤としての使用を非常にためらわせるような、重篤な欠点（免疫原性、及び、上述の、血清中での急速な不活化）を有している。
【０００６】
以前、ヒト酵素のシスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）中の３つの重要なアミノ酸の置換（Ｅ５９Ｎ、Ｒ１１９Ｌ、Ｅ３３９Ｖ）を導入することにより、改変ヒトメチオニン−γ−リアーゼ（ｈＭＧＬ−ＮＬＶ）が作製された。米国特許第８，７０９，４０７号（特許文献1）を参照のこと（参照により、本明細書に援用される）。Ｌ−メチオニンに対し、本質的に何も触媒活性を示さない天然型ＣＧＬとは異なり、Ｅ５９Ｎ、Ｒ１１９Ｌ、Ｅ３３９Ｖの変異型酵素（ｈＭＧＬ−ＮＬＶ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、安定したＬ−メチオニン分解活性を示す。しかしながら、低用量及び／または低頻度の酵素投与で治療効果を得るためには、触媒活性がより高いヒトＬ−メチオニン分解酵素を開発する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８，７０９，４０７号
【発明の概要】
【０００８】
本明細書において、ｈＭＧＬ−ＮＬＶよりも高い触媒活性を有する、ヒトメチオニン−γ−リアーゼ（ｈＭＧＬ）変異体が開示される。好ましい改善ｈＭＧＬタンパク質は、６〜１０倍高い活性を示す。その高い触媒活性によって、開示されるｈＭＧＬタンパク質は、メチオニン枯渇に対する高い治療有効性を示すことができ、それにより、患者への投与に必要とされる治療剤の濃度を低くすることができる。この酵素は、Ｅ５９、Ｒ１１９またはＥ３３９残基を含む位置で、ヒト酵素のシスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）にアミノ酸置換を導入することにより改変された。１つの特定の実施形態において、ｈＣＧＬにおけるＥ５９、Ｒ１１９及びＥ３３９の好ましい置換としては、それぞれ、Ｌ−アスパラギン（５９位）、Ｌ−ロイシン（１１９位）、及び、Ｌ−バリン（３３９位）が挙げられる。本発明は、ｈＭＧＬ−ＮＬＶ変異体と比較し、高い触媒活性を示す物質の組成物を開示するものである。これらは、ｈＭＧＬ−ＮＬＶ変異体と比較し、Ｌ−メチオニン−γ−リアーゼ活性の寄与に重要であることが特定されている、Ｅ５９、Ｒ１１９またはＥ３３９位のうちの少なくとも２か所で、置換を含有する。低濃度の治療剤が患者への投与に必要とされうるため、これら変異体の高い触媒活性は重要である。
【０００９】
追加のアミノ酸置換を有する変異体としては、
0006572212.tif 000002
が挙げられる。
【００１０】
本発明のある態様により、癌治療に適し、免疫原性が低く、血清安定性が改善され、及び、触媒活性が改善されている、メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）活性を有するヒトポリペプチド配列を含有する、改善酵素を供給することによって、当分野の大きな課題が打開される。従って、第一の実施形態において、修飾ポリペプチド（すなわち、酵素）、特に、ＭＧＬに関連した霊長類酵素由来のメチオニン分解活性を有する酵素変異体が開示される。たとえば、当該新規の酵素変異体は、配列何号３〜６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有していても良い。特に、当該変異体は、ヒト酵素（たとえば、ヒトシスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）等）由来であっても良い。ある態様においては、メチオニンを分解することができる修飾ヒトＣＧＬを含有するポリペプチドであっても良い。一部の実施形態において、当該ポリペプチドは、生理学的な条件下で、メチオニンを分解することが出来ても良い。たとえば、当該ポリペプチドは、少なくとも、または、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０４、１０５、１０６Ｍ−１ｓ−１または、その中から導き出せる任意の範囲の、メチオニンに対する触媒効率（ｋｃａｔ／ＫＭ）を有していても良い。さらなる態様において、当該ポリペプチドは、１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１Ｍ−１ｓ−１または、その中から導き出せる任意の範囲のｋｃａｔ／ＫＭまでの、Ｌ−ホモシスチンに対する触媒活性を示しても良い。
【００１１】
上述の修飾ポリペプチドは、非修飾ポリペプチド（たとえば、天然型ポリペプチド）または本明細書に開示されている任意のポリペプチドと比較し、ある割合の同一性を有することで特徴付けられても良い。たとえば、非修飾ポリペプチドは、天然型霊長類シスタチオナーゼ（すなわち、シスタチオニン−γ−リアーゼ）の、少なくとも、または、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００残基（または、その中から導き出せる任意の範囲）まで含有しても良い。同一性の割合は、修飾ポリペプチドの非修飾部分（すなわち、５９、６３、９１、１１９、２６８、３１１、３３９及び／または３５３位のアミノ酸でのいずれの置換以外の修飾ポリペプチドの配列）と天然型ポリペプチドの間で、およそ、最大で、または少なくとも、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（あるいはそれらから導き出される任意の範囲）であっても良い。また、上述の同一性の割合は、ポリペプチドの非修飾領域と比較し、ポリペプチドの特定の修飾領域に関連したものでありうることも企図される。たとえば、ポリペプチドは、同一種由来、もしくは、複数種由来の非修飾または変異シスタチオナーゼに対する、シスタチオナーゼの修飾または変異基質認識部位のアミノ酸配列の同一性に基づき、特徴付けられうる、シスタチオナーゼの修飾または変異基質認識部位を含有しても良い。たとえば、非修飾シスタチオナーゼに対し、少なくとも９０％の同一性を有すると特徴付けられる修飾または変異ヒトポリペプチドとは、当該修飾または変異ヒトポリペプチド中のアミノ酸の少なくとも９０％が、当該非修飾ポリペプチドのアミノ酸と同一であることを意味する。
【００１２】
そのような非修飾ポリペプチドは、天然型シスタチオナーゼ、特に、ヒトアイソフォームまたは他の霊長類アイソフォームであっても良い。たとえば、天然型ヒトシスタチオナーゼは、配列番号１の配列を有していても良い。他の天然型霊長類シスタチオナーゼの非限定的な例としては、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉシスタチオナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＮＰ＿００１１２４６３５．１；  配列番号７）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓシスタチオナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＷ７１９９３．１；  配列番号８）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓシスタチオナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：  ＸＰ＿５１３４８６．２；配列番号９）、及び、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓシスタチオナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＸＰ＿００３８３０６５２．１；配列番号１０）が挙げられる。例示的な天然型ポリペプチドとしては、配列番号１または７〜１０またはそれらの断片の約、最大で、もしくは少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性（または、それらから導き出せる任意の範囲）を有する配列が挙げられる。たとえば、天然型ポリペプチドは、配列番号１または７〜１０の配列の少なくとも、または約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４１５残基（または、それらから導き出せる任意の範囲）まで含有しても良い。
【００１３】
一部の実施形態において、天然型ＣＧＬは、１以上の他の修飾（たとえば、化学修飾、置換、挿入、欠失、及び／または、切断）により修飾されていても良い。たとえば、当該修飾は、天然型酵素の基質認識部位であっても良い。特定の実施形態において、天然型ＣＧＬは、置換により修飾されていても良い。たとえば、当該置換の数は、４、５、６、７またはそれ以上であっても良い。さらなる実施形態において、天然型ＣＧＬは、基質特異性に影響を与えうる基質認識部位または任意の位置で、修飾されていても良い。たとえば、当該修飾ポリペプチドは、配列番号１のＥ５９、Ｓ６３、Ｌ９１、Ｒ１１９、Ｋ２６８、Ｔ３１１、Ｅ３３９、及び／または、Ｉ３５３に相当するアミノ酸の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を有していても良く、または、霊長類ＣＧＬの５９、６３、９１、１１９、２６８、３１１、３３９、及び／または、３５３のアミノ酸の位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を有していても良い。たとえば、当該霊長類は、ヒト、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅ、または、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓであっても良い。
【００１４】
ある実施形態において、５９、６３、９１、１１９、２６８、３１１、３３９、及び／または、３５３のアミノ酸の位置での置換は、アスパラギン酸（Ｎ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、またはセリン（Ｓ）である。特定の実施形態において、当該修飾は、Ｅ５９Ｎ、Ｅ５９Ｉ、Ｓ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｒ１１９Ｌ、Ｒ１１９Ａ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、Ｅ３３９Ｖ、及び、Ｉ３５３Ｓからなる群から選択される１以上の置換である。さらなる実施形態において、当該置換は、Ｓ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、Ｅ３３９Ｖ、及び、Ｉ３５３Ｓの置換を含有しても良い。さらなる実施形態において、当該置換は、Ｅ５９ＮまたはＥ５９Ｉのいずれか、及び、Ｒ１１９ＬまたはＲ１１９Ａのいずれかの追加の置換を含有しても良い。
【００１５】
一部の実施形態において、天然型ＣＧＬは、ヒトＣＧＬであっても良い。特定の実施形態において、当該置換は、ヒトＣＧＬ（たとえば、配列番号３のアミノ酸配列、その断片またはホモログを有する修飾ポリペプチド）のＥ５９Ｎ、Ｓ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｒ１１９Ｌ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、Ｉ３５３Ｓ、及び、Ｅ３３９Ｖの組み合わせ、ヒトＣＧＬ（たとえば、配列番号４のアミノ酸配列、その断片またはホモログを有する修飾ポリペプチド）のＥ５９Ｉ、Ｓ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｒ１１９Ｌ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、Ｉ３５３Ｓ、Ｅ３３９Ｖの組み合わせ、ヒトＣＧＬ（たとえば、配列番号５のアミノ酸配列、その断片またはホモログを有する修飾ポリペプチド）のＥ５９Ｎ、Ｓ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｒ１１９Ａ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、Ｉ３５３Ｓ、及びＥ３３９Ｖの組み合わせ、または、ヒトＣＧＬ（たとえば、配列番号６のアミノ酸配列、その断片またはホモログを有する修飾ポリペプチド）のＥ５９Ｉ、Ｓ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｒ１１９Ａ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、Ｉ３５３Ｓ、及びＥ３３９Ｖの組み合わせ、である。さらなる実施形態において、当該修飾ポリペプチドは、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ  ＣＧＬ−ＮＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号１１）、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ  ＣＧＬ−ＩＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号１２）、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ  ＣＧＬ−ＮＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号１３）、Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ  ＣＧＬ−ＩＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号１４）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＧＬ−ＮＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号１５）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＧＬ−ＩＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号１６）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＧＬ−ＮＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号１７）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＧＬ−ＩＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号１８）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ＣＧＬ−ＮＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号１９）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ＣＧＬ−ＩＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号２０）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ＣＧＬ−ＮＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号２１）、Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ  ＣＧＬ−ＩＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号２２）、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ  ＣＧＬ−ＮＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号２３）、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ  ＣＧＬ−ＩＬＭＬＲＧＳＶ変異体（配列番号２４）、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ  ＣＧＬ−ＮＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号２５）、または、Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ  ＣＧＬ−ＩＬＭＡＲＧＳＶ変異体（配列番号２６）であっても良い。
【００１６】
一部の態様において、本発明では、異種アミノ酸配列に連結された修飾ＣＧＬを含有するポリペプチドもまた企図される。たとえば、当該修飾ＣＧＬは、融合タンパク質として異種アミノ酸配列に連結されていても良い。特定の実施形態において、当該修飾ＣＧＬは、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、またはＸＴＥＮポリペプチド等のアミノ酸配列に連結されていても良い。
【００１７】
血清安定性を増加させるために、当該修飾ＣＧＬは、１以上のポリエーテル分子に連結されていても良い。特定の実施形態において、当該ポリエーテルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってもよい。当該修飾ポリペプチドは、特定のアミノ酸残基（たとえば、リシンまたはシステイン）を介して、ＰＥＧに連結されていても良い。治療用投与に関しては、当該修飾ＣＧＬを含有するポリペプチドは、薬学的に許容される担体中に分散されていても良い。
【００１８】
一部の態様においては、そのような修飾ＣＧＬをコードする核酸が企図される。一部の実施形態において、当該核酸は、細菌での発現にコドン最適化されている。特定の実施形態において、当該細菌は、大腸菌である。他の態様において、当該核酸は、真菌（たとえば、酵母）、昆虫、または哺乳類での発現にコドン最適化されている。本発明ではさらに、そのような核酸を含有する、たとえば発現ベクター等のベクターが企図される。特定の実施形態において、当該修飾ＣＧＬをコードする核酸は、プロモーター（限定されないが、異種プロモーターが挙げられる）に操作可能に連結されている。１つの実施形態において、修飾ＣＧＬは、ベクター（たとえば、遺伝子治療用ベクター）により、標的細胞へと送達されても良い。そのようなウイルスは、標的細胞中での当該修飾ＣＧＬコード核酸の発現が可能となるよう、組換えＤＮＡ技術により修飾されていても良い。これらベクターは、非ウイルス性（たとえば、プラスミド）またはウイルス性（たとえば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、または、ワクシニアウイルス等）起源のベクター由来であっても良い。非ウイルス性ベクターは、好ましくは、細胞膜を超えたＤＮＡの侵入が促進されるよう、剤と複合体化される。そのような非ウイルス性ベクター複合体の例としては、ポリカチオン性剤との製剤が挙げられ、それにより、ＤＮＡ凝縮及び脂質ベースの送達系が促進される。脂質ベースの送達系の例としては、リポソームベースの核酸の送達が挙げられる。
【００１９】
さらなる態様において、本発明では、そのようなベクターを含有する宿主細胞もまた企図される。当該宿主細胞は、細菌（たとえば、大腸菌）、真菌細胞（たとえば、酵母）、昆虫細胞、または哺乳類細胞であっても良い。メチオニン分解活性を有する所望のＣＧＬ変異体と、天然型ＣＧＬをさらに区別するために、ｉｌｖＡ欠損及びｍｅｔＡ欠損を有する宿主細胞（たとえば、大腸菌ｉｌｖＡ−ｍｅｔＡ−）を作製し、所望の変異体の特定に用いても良い。
【００２０】
一部の実施形態において、当該ベクターは、修飾ＣＧＬを発現するための宿主細胞へと導入される。当該タンパク質は、任意の適切な方法で発現されても良い。１つの実施形態において、当該タンパク質は、当該タンパク質がグリコシル化されるような宿主細胞において発現される。別の実施形態において、当該タンパク質は、当該タンパク質が非グリコシル化されるような宿主細胞において発現される。
【００２１】
本発明のある態様においてはまた、修飾ＣＧＬペプチド、遺伝子治療ベクター中に当該修飾ＣＧＬをコードしている核酸、または、本発明の製剤の投与による治療法が企図され、及び、特に、腫瘍細胞、または癌を有する対象の治療方法が企図される。当該対象は、たとえばマウス等の任意の動物であっても良い。たとえば、当該対象は、哺乳類、特に霊長類、より具体的にはヒト患者であっても良い。一部の実施形態において、当該方法には、癌を有する患者を選択することが含まれても良い。ある態様において、当該対象または患者は、メチオニン制限食または通常食で維持されていてもよい。
【００２２】
一部の実施形態において、当該癌は、メチオニン枯渇に感受性のある任意の癌である。１つの実施形態において、本発明から、当該ポリペプチドを含有する製剤を投与する段階を含む、腫瘍細胞、または癌患者を治療する方法が企図される。一部の実施形態において、当該投与は、少なくとも癌の細胞の一部が殺傷されるような条件下で行われる。別の実施形態において、当該製剤は、生理学的条件下で、メチオニン分解活性を有し、及び、付着ポリエチレングリコール鎖をさらに含有する、修飾ＣＧＬを含有する。一部の実施形態において、当該製剤は、上述のＣＧＬ変異体のうちのいずれか、及び、薬学的に受容可能な賦形剤を含有する医薬である。当該薬学的に受容可能な賦形剤は、当分野の当業者に公知である。上述のＣＧＬ変異体のすべてが、ヒト治療に対し有用であると企図されうる。
【００２３】
さらなる実施形態において、非細菌性（たとえば、霊長類またはマウス等の哺乳類）の、メチオニン分解活性を有する修飾ＣＧＬまたはそれをコードする核酸を含有する製剤を投与する段階を含む、腫瘍細胞を治療する方法もまた提供される。
【００２４】
腫瘍細胞は、それらの栄養培地にメチオニンを依存しているため、治療または投与は、当該細胞に対する栄養源を対象としてもよく、当該細胞それ自身を対象とする必要はない。それゆえ、ｉｎ  ｖｉｖｏ応用においては、腫瘍細胞の治療は、改変メチオニナーゼと、腫瘍細胞群のための栄養培地を接触させることが含まれる。この実施形態において、当該培地は、血液、リンパ液、髄液、及び、メチオニン枯渇が望ましい類似の体液であっても良い。
【００２５】
本発明のある態様によると、改変メチオニナーゼを含有する当該製剤は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、滑膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内、経粘膜、心膜内、臍帯内、眼球内、経口、局所、吸入により、点滴、持続点滴、局所かん流、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物中で（たとえば、リポソーム等）、または、当分野の当業者に公知の他の方法により、または前述の任意の組み合わせにより、投与されても良い。
【００２６】
さらなる実施形態において、当該方法はまた、対象に、少なくとも第二の抗癌治療を施す段階を含んでも良い。当該第二の抗癌治療は、外科的治療、化学療法、放射線治療、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法であっても良い。
【００２７】
１つの実施形態において、改変メチオニナーゼ、または改変メチオニナーゼをコードする核酸を含有する組成物は、対象中の腫瘍の治療における使用のために提供される。別の実施形態において、腫瘍の治療のための医薬の製造における、改変メチオニナーゼまたは改変メチオニナーゼをコードする核酸の使用が開示される。前記改変メチオニナーゼは、本実施形態のうちの任意の改変メチオニナーゼであっても良い。
【００２８】
本発明の方法及び／または組成物に関して検討される実施形態は、本明細書に記述される任意の他の方法または組成物に対して用いられても良い。ゆえに、１つの方法または組成物に付随する実施形態は、本発明の他の方法及び組成物に、同様に適用されても良い。
【００２９】
本明細書において使用されるとき、核酸に関連する、「コードする」または「コードしている」という用語は、当業者が容易に本発明を理解できるよう用いられている；しかしながら、これら用語は、それぞれ、「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含有する、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と相互交換可能に用いられても良い。
【００３０】
本明細書において使用されるとき、「１つの（ａまたはａｎ）」は、１以上を意味しうる。本請求項において使用されるとき、「含有する、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という文言と併せて用いられた場合には、当該「１つの（ａまたはａｎ）」という文言は、１または２以上を意味しうる。
【００３１】
本請求項において、「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことを明確に指示していない限り、または、当該代替物が相互排他的でない限り、「及び／または」を意味するために用いられているが、本開示は、代替物のみ、及び、「及び／または」を指す定義も支持している。本明細書において使用されるとき、「別の」とは、少なくとも第二のまたはそれ以上を意味しうる。
【００３２】
本明細書を通じて、「約」という用語は、値が、当該値を測定するために用いられた装置、方法に固有の誤差変動、または、実験対象間で存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００３３】
[本発明1001]
天然型霊長類ＣＧＬアミノ酸配列（配列番号1及び7〜10を参照のこと）と比較して少なくとも1つの置換を有する、単離された修飾された霊長類シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）酵素であって、前記少なくとも1つの置換が、前記天然型霊長類ＣＧＬ配列の59位、63位、91位、119位、268位、331位、339位、及び／または353位に置換を含み、前記少なくとも1つの置換が、59位のＶａｌ、59位のＡｓｎ、119位のＬｅｕ、及び／または339位のＶａｌのみであってはならない、前記酵素。
[本発明1002]
前記少なくとも1つの置換が、（ｉ）59位のＡｓｎもしくはＩｌｅ、（ｉｉ）63位のＬｅｕ、（ｉｉｉ）91位のＭｅｔ、（ｉｖ）119位のＬｅｕもしくはＡｌａ、（ｖ）268位のＡｒｇ、（ｖｉ）311位のＧｌｙ、（ｖｉｉ）339位のＶａｌ、及び／または（ｖｉｉｉ）353位のＳｅｒを含む、本発明1001の酵素。
[本発明1003]
前記少なくとも1つの置換が、63位のＬｅｕ、91位のＭｅｔ、268位のＡｒｇ、311位のＧｌｙ、339位のＶａｌ、及び353位のＳｅｒを含む、本発明1001の酵素。
[本発明1004]
59位のＡｓｎまたはＩｌｅ、及び119位のＬｅｕまたはＡｌａをさらに含む、本発明1003の酵素。
[本発明1005]
前記少なくとも1つの置換が、59位のＡｓｎ、63位のＬｅｕ、91位のＭｅｔ、119位のＬｅｕ、268位のＡｒｇ、311位のＧｌｙ、339位のＶａｌ、及び353位のＳｅｒを含む、本発明1004の酵素。
[本発明1006]
前記少なくとも1つの置換が、59位のＩｌｅ、63位のＬｅｕ、91位のＭｅｔ、119位のＬｅｕ、268位のＡｒｇ、311位のＧｌｙ、339位のＶａｌ、及び353位のＳｅｒを含む、本発明1004の酵素。
[本発明1007]
前記少なくとも1つの置換が、59位のＡｓｎ、63位のＬｅｕ、91位のＭｅｔ、119位のＡｌａ、268位のＡｒｇ、311位のＧｌｙ、339位のＶａｌ、及び353位のＳｅｒを含む、本発明1004の酵素。
[本発明1008]
前記少なくとも1つの置換が、59位のＩｌｅ、63位のＬｅｕ、91位のＭｅｔ、119位のＡｌａ、268位のＡｒｇ、311位のＧｌｙ、339位のＶａｌ、及び353位のＳｅｒを含む、本発明1004の酵素。
[本発明1009]
異種ペプチドセグメントをさらに含む、本発明1001の酵素。
[本発明1010]
前記異種ペプチドセグメントが、ＸＴＥＮペプチド、ＩｇＧ  Ｆｃ、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチドである、本発明1009の酵素。
[本発明1011]
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている、本発明1001の酵素。
[本発明1012]
1以上のＬｙｓまたはＣｙｓ残基を介してＰＥＧに連結されている、本発明1011の酵素。
[本発明1013]
本発明1001の酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
[本発明1014]
細菌、真菌、昆虫、または哺乳類での発現にコドン最適化されている、本発明1013の核酸。
[本発明1015]
本発明1014の核酸を含む発現ベクター。
[本発明1016]
本発明1014の核酸を含む宿主細胞。
[本発明1017]
細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞である、本発明1016の宿主細胞。
[本発明1018]
前記細菌細胞が、ｉｌｖＡ及びｍｅｔＡ遺伝子の欠失を有する大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）株である、本発明1017の宿主細胞。
[本発明1019]
本発明1001の酵素または本発明1013の核酸を薬学的に許容される担体中に含む、医薬製剤。
[本発明1020]
腫瘍細胞または腫瘍細胞を有する対象を治療する方法であって、本発明1019の製剤を前記腫瘍細胞または前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1021]
前記対象が、メチオニン制限食で維持されている、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記対象が、通常食で維持されている、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記対象が、ヒト患者である、本発明1020の方法。
[本発明1024]
前記製剤が、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、眼球内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、筋肉内に、皮下に、結膜下に、膀胱内に、経粘膜に、心膜内に、臍帯内に、経口で、吸入によって、注射によって、点滴によって、持続点滴によって、標的細胞を直接浸す局所かん流によって、カテーテルを介して、または洗浄液を介して投与される、本発明1020の方法。
[本発明1025]
前記製剤が、前記腫瘍細胞の栄養培地に投与される、本発明1020の方法。
[本発明1026]
前記栄養培地が、血液、リンパ液、または髄液である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記対象に少なくとも第二の抗癌治療を施す段階をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1028]
前記第二の抗癌治療が、外科治療、化学療法、放射線治療、寒冷療法、ホルモン療法、免疫療法またはサイトカイン療法である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
対象における腫瘍細胞の治療における使用のための、本発明1001の酵素または本発明1013の核酸を含む組成物。
[本発明1030]
前記酵素が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に連結されている、本発明1029の組成物。
[本発明1031]
前記酵素酸が、細菌、真菌、昆虫、または哺乳類での発現にコドン最適化されている、本発明1029の組成物。
[本発明1032]
前記組成物が、腫瘍内、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、眼内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内、経粘膜、心膜内、臍帯内、経口投与用に処方されている、本発明1029の組成物。
[本発明1033]
前記腫瘍細胞の栄養培地への投与用に処方されている、本発明1029の組成物。
[本発明1034]
前記栄養培地が、血液、リンパ液、または髄液である、本発明1033の組成物。
[本発明1035]
少なくとも第二の抗癌治療をさらに含む、本発明1029の組成物。
[本発明1036]
前記第二の抗癌治療が、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、またはサイトカイン療法である、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
腫瘍細胞の治療のための医薬の製造における、本発明1001の酵素または本発明1013の核酸の使用。
本発明の他の目的、特性、及び、利点は、以下の詳細な記述から明白となるであろう。しかしながら、本発明の主旨及び範囲内の、様々な変化及び変更が、本明細書から当業者には明らかであるため、詳細な記述及び具体的な実施例が、本発明の好ましい実施形態を示している一方で、解説の目的でのみ、提示されているものであることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある態様をさらに示すために含まれているものである。本発明は、本明細書に提示されている具体的な実施形態の詳細な記述と、これら図面のうちの１以上を組み合わせて参照することにより、さらに理解されうる。
【図１】ｈＣＧＬと、ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１〜４の配列アライメント。強調された残基は、変異残基と、その位置を示す。ｈＣＧＬ＝配列番号１；ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１＝配列番号３；ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−２＝配列番号４；ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−３＝配列番号５；及び、ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−４＝配列番号６。
【図２】ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１のタイトレーションで処置された、前立腺腫瘍細胞株ＰＣ３（白丸）及びＤＵ１４５（黒四角）に対する効果。それぞれ、０．２５μＭ及び０．２１μＭの見かけ上のＩＣ５０値が得られた。
【図３】プールされたヒト血清中、３７℃でインキュベートされた、ＰＥＧ化ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の、時間関数としての活性：見かけ上のＴ０．５＝１００±４時間。
【図４】マウスモデルにおいて、ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の単回投与により、食事療法介入を行うことなく、１５時間以上にわたり血清Ｌ−メチオニンが治療関連レベルにまで低下される。
【図５】通常食のマウスにおける、血清Ｌ−メチオニン低下に対する、２００ｍｇ／ｋｇ  ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−ＮＬＶ（白四角）と５０ｍｇ／ｋｇ  ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１（白丸）の単回投与の比較。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
例示的態様の説明
本発明は、ｈＭＧＬ−ＮＬＶ変異体（Ｅ５９Ｎ、Ｒ１１９Ｌ、Ｅ３３９Ｖ）に関し、改善されたヒトメチオニン−γ−リアーゼ（ｈＭＧＬ）に関する主題の組成物を開示するものである。これら変異体は、高い触媒活性を示し、それにより、患者への投与に必要とされる治療剤濃度が低下しうる。これら改変ヒト酵素は、アミノ酸Ｌ−メチオニンを分解する。
【００３６】
これら組成物は、癌特異的な代謝異常を通じて、特異的な腫瘍細胞標的化の方法を提供する。細菌性の酵素もまた、当該化学的性質を有し得るが、それらの使用は非常に不安定であり、及び、免疫原性が高いことが証明されている。
【００３７】
Ｉ．定義
本明細書において使用されるとき、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸を含有する化合物を指し、相互交換可能に用いられる。
【００３８】
本明細書において使用されるとき、「融合タンパク質」という用語は、人工的に操作可能に連結されたタンパク質またはタンパク質断片を含有するキメラタンパク質を指す。
【００３９】
本明細書において使用されるとき、「半減期」（１／２期）という用語は、そのポリペプチドの濃度が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて（たとえば、哺乳類への注入後）、半分にまで下がるために必要とされる時間を指す。
【００４０】
「操作可能な組み合わせで」、「操作可能な順序で」、及び、「操作可能に連結された」という用語は、そのように記述された構成要素が、意図された様式でそれらが機能できる関係性にある連結を指し、たとえば、核酸分子が、所与の遺伝子の転写及び／または所望のタンパク質分子の合成を指示することができるような様式にある核酸配列の連結、または、融合タンパク質が産生されるような様式にあるアミノ酸配列の連結等がある。
【００４１】
「リンカー」という用語は、２つの異なる分子を操作可能に連結するための分子の橋として機能する化合物または部分を指すことが意図され、ここで、当該リンカーの１つの部分は、第一の分子に操作可能に連結されており、及び、当該リンカーのもう一つの部分は、第二の分子に操作可能に連結されている。
【００４２】
「ＰＥＧ化」という用語は、生体適合性度が高く、修飾が容易である、薬剤の担体として広く用いられているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合を指す。ＰＥＧは、化学的方法を介し、当該ＰＥＧ鎖の末端で、水酸基を介して活性剤と連結（たとえば共有結合）することができる。しかしながら、ＰＥＧ自身は、１分子あたり、最大で２つの活性剤に限定される。他の方法では、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーが、ＰＥＧの生体適合性を保持しつつ、分子当たりの付加点は多く有し（それにより、より多くの薬剤が担持できる）、及び、様々な用途に適合するよう合成的に設計することができるという利点が加わった、新規バイオマテリアルとして研究されている。
【００４３】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたはその前駆体の産生に必要な制御配列及びコード配列を含有するＤＮＡ配列を指す。ポリペプチドは、全長コード配列によりコードされていても良く、または、所望の酵素活性が保持されている限りコード配列の任意の部分によりコードされていても良い。
【００４４】
「天然型」という用語は、遺伝子、遺伝子産物、または、天然型で存在する源から単離された際の当該遺伝子もしくは遺伝子産物の特徴の通常の形態を指す。天然型形態は、天然群でもっとも頻繁に存在するものであり、それゆえに、任意に通常形態または野生型の形態に指定される。対照的に、「修飾された」、「変異型」または「変種」とは、天然型遺伝子または遺伝子産物と比較した際に、配列及び機能特性において変化（すなわち、改変された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。
【００４５】
「ベクター」という用語は、核酸配列が、複製することができる細胞へと導入されるために挿入されうる、担体核酸分子を指すように使用される。核酸配列は、ベクターが導入される細胞に対して異種であること、または、当該配列が、細胞中の配列に対して同種であるが、当該配列が通常は存在しない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する、「外来性」であっても良い。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（たとえば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者であれば、標準的な組換え技術を介して、ベクターを構築することができるであろう（たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４を参照のこと（両方とも、参照により本明細書に援用される））。
【００４６】
「発現ベクター」という用語は、転写されることができるＲＮＡをコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝的構築物を指す。一部の例において、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドへと翻訳される。他の例において、これら配列は、たとえば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生により翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」（特定の宿主細胞中において、操作可能に連結されたコード配列の転写及び、場合によって翻訳に必要とされる核酸配列を指す）を含有しても良い。転写及び翻訳を統制する制御配列に加え、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を果たし、以下に記述される核酸配列を含有しても良い。
【００４７】
本明細書を通じて用いられている「治療的利益」または「治療に有効な」という用語は、当該状態の医学的処置に関し、当該対象の健康を促進または向上させる任意のものを指す。これには、限定されないが、疾患の兆候もしくは症状の頻度または重篤度の減少が挙げられる。たとえば、癌の治療には、たとえば、腫瘍サイズの減少、腫瘍浸潤度の低下、癌の増殖率の低下、または、転移の防止が含まれても良い。癌の治療はまた、癌を有する対象の生存期間の延長を指しても良い。
【００４８】
本明細書において使用されるとき、「ＫＭ」という用語は、酵素のミカエリス−メンテン定数を指し、所与の酵素が、酵素触媒反応において、その最大速度の半分を生み出す特定の基質濃度として定義される。本明細書において使用される、「ｋｃａｔ」という用語は、各酵素部位が産物へと転換する、単位時間当たりの基質分子の数または代謝回転数を指し、当該酵素は最大効率で作用する。本明細書において使用される、「ｋｃａｔ／ＫＭ」という用語は、特異性定数であり、酵素が基質を産物へと転換する効率の程度である。
【００４９】
「シスタチオニン−γ−リアーゼ」（ＣＧＬまたはシスタチオナーゼ）という用語は、システインへのシスタチオニンの加水分解を触媒する任意の酵素を指す。たとえば、シスタチオニン−γ−リアーゼの霊長類型、または特に、シスタチオニン−γ−リアーゼのヒト型が含まれる。
【００５０】
「治療」または「治療する」とは、対象に治療剤を投与もしくは適用すること、または、疾患または健康に関連した状態の治療的利益を得る目的で対象にモダリティもしくは治療を施すことを指す。たとえば、治療には、薬学的に有効な量のメチオニナーゼを投与する段階を含んでも良い。
【００５１】
「対象」及び「患者」とは、たとえば、霊長類、哺乳類、及び脊椎動物等のヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。
【００５２】
ＩＩ．メチオニン−γ−リアーゼ及びシスタチオニン−γ−リアーゼ
リアーゼは、様々な化学結合の分断を触媒する酵素であり、多くの場合、新たな二重結合または新たな環構造を形成する。たとえば、この反応を触媒する酵素は、リアーゼである：ＡＴＰ→ｃＡＭＰ＋ＰＰｉ。リアーゼは、１方向の反応に対しては１つの基質のみを必要とするが、逆反応に対しては２つの酵素を必要とする点で、他の酵素とは異なる。
【００５３】
多くのピリオキサル−５´−リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素が、システイン、ホモシステイン、及びメチオニンの代謝に関与しており、これら酵素は、進化的に関連したファミリーを形成し、Ｃｙｓ／Ｍｅｔ代謝ＰＬＰ依存性酵素と指定されている。これら酵素は、約４００アミノ酸のタンパク質であり、ＰＬＰ基は、ポリペプチドの中心に位置するリシン残基に付着している。このファミリーのメンバーとしては、シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）、シスタチオニン−γ−シンターゼ（ＣＧＳ）、シスタチオニン−β−リアーゼ（ＣＢＬ）、メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）、及び、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨ）／Ｏ−アセチル−セリン（ＯＡＳ）スルフヒドリラーゼ（ＯＳＨＳ）が挙げられる。それらすべての共通しているのは、ミカエリス複合体の形成であり、それにより、外部基質アルジミンが生じる。さらなる反応経路は、特定の酵素の基質特異性により決定される。
【００５４】
たとえば、本発明者らは、ＰＬＰ依存性リアーゼファミリーのメンバー（たとえば、ヒトシスタチオニン−γ−リアーゼ等）に特異的変異を導入し、その基質特異性を変化させた。この方法で、本発明者らは、新規変異体に、ｈＭＧＬ−ＮＬＶよりもかなり高い触媒活性で、基質としてＬ−Ｍｅｔを分解する新規の能力をもたらした。他の実施形態において、新規メチオニン分解活性をもたらすための、他のＰＬＰ依存性酵素の修飾もまた、企図されうる。
【００５５】
ＰＬＰ依存性酵素として、メチオニン−γ−リアーゼ（ＥＣ４．４．１．１１）は化学反応を触媒する酵素である：Ｌ−メチオニン＋Ｈ２Ｏ→メタンチオール＋ＮＨ３＋２−オキソブタン酸。ゆえに、この酵素の２つの基質は、Ｌ−メチオニンとＨ２Ｏであり、一方で、その３つの産物は、メタンチオール、ＮＨ３、及び２−オキソブタン酸である。この酵素はリアーゼファミリー、具体的には炭素−硫黄リアーゼ類に属している。この酵素類の系統名は、Ｌ−メチオニン  メタンチオール−リアーゼ（２−オキソブタン酸形成を脱アミノ化する）である。普遍的に用いられている他の名称としては、Ｌ−メチオニナーゼ、メチオニンリアーゼ、メチオニナーゼ、メチオニンデチオメチラーゼ、Ｌ−メチオニン−ガンマ−リアーゼ、及び、Ｌ−メチオニンメタンチオール−リアーゼ（脱アミノ化）が挙げられる。この酵素は、セレノアミノ酸代謝に関与する。補酵素を１つ（ピリドキサル−５´−リン酸）、利用する。
【００５６】
メチオニナーゼは通常、３８９〜４４１のアミノ酸からなり、ホモ四量体を形成する。メチオニナーゼ酵素は、多くの場合、同じ分子量（約４５ｋＤａ）のサブユニット４つから構成される（Ｓｒｉｄｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；  Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）。酵素の構造は、結晶化により解明された（Ｋｕｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）。四量体の各セグメントは、３つの領域から構成される：２つのヘリックスと３つのβストランドを含む、伸長Ｎ末端ドメイン（１〜６３残基）、ほとんど平行な７つのストランド型βシート（８つのαヘリックスの間に挟まれている）で構成されている大ＰＬＰ結合ドメイン（６４〜２６２残基）、及び、Ｃ末端ドメイン（２６３〜３９８残基）。補酵素ＰＬＰは、触媒機能に必要である。触媒に重要なアミノ酸は、構造を基にして特定されている。近傍サブユニットのＴｙｒ５９及びＡｒｇ６１（それらはまた、他のｃ−ファミリー酵素でとてもよく保存されている）は、ＰＬＰのリン酸基と接触する。これら残基は、活性部位内の主要アンカーとして重要である。１つの単量体のＬｙｓ２４０、Ａｓｐ２４１及びＡｒｇ６１、ならびに、隣接単量体のＴｙｒ１１４及びＣｙｓ１１６は、酵素に特異性を寄与するメチオニナーゼ活性部位において、水素結合ネットワークを形成する。
【００５７】
シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬまたはシスタチオナーゼ）は、シスタチオニンをシステインとα−ケト酪酸に分解する酵素である。リン酸ピリドキサルは、この酵素の補欠分子族である。哺乳類はメチオニナーゼ（ＭＧＬ）を有していないが、細菌性ＭＧＬ酵素に配列的、構造的、及び化学的に相同なシスタチオナーゼは有している。実施例に示されているように、タンパク質改変を用いて、Ｌ−メチオニン分解活性は有していないシスタチオナーゼを、高率で当該アミノ酸を分解することができる酵素へと転換した。
【００５８】
ＩＩＩ．メチオニナーゼ改変
ヒトはメチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬまたはメチオニナーゼ）を産生しないため、ヒト治療のために、生理学的条件下でのメチオニン分解に対し、高い活性及び特異性を有し、ならびに、生理学的液体（たとえば、血清）中で高い安定性を有し、及び、非免疫原性（それらは通常、免疫寛容を惹起する天然型タンパク質であるため）のメチオニナーゼを改変する必要がある。
【００５９】
ｐＭＧＬ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ由来のＭＧＬ）を用いた動物実験において、望ましくない免疫原性効果が認められたため、ヒト酵素において、Ｌ−メチオニン分解活性を改変することが望ましい。ヒトタンパク質に対する免疫寛容により、当該酵素が非免疫原性または最小限の免疫原性となり、それにより、免疫寛容となることが可能になる。
【００６０】
改変メチオニナーゼとしてＭＧＬ活性を有する新規酵素のある態様は、これらの必要性に対応するものである。哺乳類はＭＧＬを有していないが、細菌性ＭＧＬ酵素に配列的、構造的、及び科学的に相同なシスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬ）を有している。ＣＧＬは、哺乳類の含硫基移動経路の最終工程を触媒する四量体である（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。ＣＧＬは、Ｌ−システイン、α−ケト酪酸及びアンモニアへのＬ−シスタチオニンの転換を触媒する。ヒトＣＧＬ（ｈＣＧＬ）ｃＤＮＡは、従前にクローニング及び発現されているが、比較的低い収率（約５ｍｇ／Ｌ培養液）（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｓｔｅｅｇｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）であった。
【００６１】
たとえば、当該シスタチオニン−γ−リアーゼは、その天然型ではメチオニナーゼ活性を示していないが、高効率でメチオニンを加水分解するために、突然変異生成を介して改変された霊長類（特にヒト）シスタチオニン−γ−リアーゼ（ＣＧＬまたはシスタチオナーゼ）に関連した方法及び組成物が開示されている。
【００６２】
一部の実施形態は、修飾タンパク質及びポリペプチドに関連するものである。特定の実施形態は、非修飾型と比較し、少なくとも１つの機能的活性、好ましくは、メチオニナーゼ酵素活性を示す修飾タンパク質またはポリペプチドに関するものである。さらなる態様において、当該タンパク質またはポリペプチドは、血清安定性を高めるためにさらに修飾されていても良い。ゆえに、本出願が、「修飾タンパク質」もしくは「修飾ポリペプチド」の機能または活性を指す場合、当業者であれば、これに、たとえば、非修飾タンパク質またはポリペプチドを超える追加の利点（たとえば、メチオニナーゼ酵素活性）を有するタンパク質またはポリペプチドが含まれることを理解するであろう。ある実施形態において、非修飾タンパク質またはポリペプチドは、天然型シスタチオニン−γ−リアーゼ、具体的には、ヒトシスタチオニン−γ−リアーゼである。「修飾タンパク質」に関連する実施形態は、「修飾ポリペプチド」に対して実行されうること、及び、その逆もまた然りであることが、具体的に企図される。
【００６３】
活性の測定は、当業者に良く知られた分析法、特に、タンパク質活性に関する分析法を用いて行われても良く、比較目的に関しては、たとえば、修飾もしくは非修飾タンパク質またはポリペプチドのいずれかの天然型及び／または組換え型の使用が含まれても良い。たとえば、メチオニナーゼ活性は、メチオニンの転換から生じる任意の基質（たとえば、α−ケト酪酸、メタンチオール、及び／または、アンモニア）の産生を検出するための任意の分析法により測定されても良い。
【００６４】
ある実施形態において、修飾ポリペプチド（たとえば、修飾シスタチオニン−γ−リアーゼ）は、メチオニン分解活性における増加に基づき、特定されても良い。たとえば、非修飾ポリペプチドの基質認識部位が特定されても良い。この特定は、構造解析または相同性解析に基づいても良い。そのような基質認識部位の修飾を含む変異体群が作製されても良い。さらなる実施形態において、当該変異体群からメチオニン分解活性が増加した変異体が選択されても良い。所望の変異体の選択に、たとえば、メチオニン分解からの副産物または産物の検出等の方法が含まれてもよい。
【００６５】
修飾タンパク質は、アミノ酸の欠失及び／または置換を含んでも良く、ゆえに、欠失を含むタンパク質、置換を含むタンパク質、ならびに、欠失及び置換を含むタンパク質は、修飾タンパク質である。一部の実施形態において、これら修飾タンパク質はさらに、たとえば、融合タンパク質またはリンカーを有するタンパク質の場合のように、挿入または追加アミノ酸を含有しても良い。「修飾欠失タンパク質」は、天然型タンパク質のうちの１以上の残基を欠落しているが、当該天然型タンパク質の特異性及び／または活性は保有している。「修飾欠失タンパク質」はまた、免疫原性または抗原性が低下していても良い。修飾欠失タンパク質の例は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち、特定の生物体（たとえば当該修飾タンパク質が投与されうる生物型）において抗原性があると決定されたタンパク質の領域からのアミノ酸残基欠失を有しているものである。
【００６６】
置換または交換変異体は通常、タンパク質内の１以上の部位で、１つのアミノ酸と別のアミノ酸の交換を含有しており、及び、当該ポリペプチドの１以上の特性、特に、そのエフェクター機能及び／または生体利用効率が調節されるよう設計されていても良い。置換は、保存的（すなわち、１つのアミノ酸が、類似の形態及び電荷を有するものと置換される）であっても無くても良い。保存的置換は、当分野に公知であり、たとえば、アラニンからセリン、アルギニンからリシン、アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グルタミンからアスパラギン、グルタミン酸からアスパラギン酸、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン、イソロイシンからロイシンまたはバリン、ロイシンからバリンまたはイソロイシン、リシンからアルギニン、メチオニンからロイシンまたはイソロイシン、フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン、及び、バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更が挙げられる。
【００６７】
欠失または置換に加え、修飾タンパク質は、残基の挿入を有していても良く、通常、それは、ポリペプチド内に少なくとも１つの残基の付加を含んでいる。これは標的ペプチドまたはポリペプチドまたはシンプルに１つの残基の挿入を含んでいても良い。融合タンパク質と言われる末端付加は、以下に記述する。
【００６８】
「生物学的に機能性が等しい」という用語は、当分野において良く理解されており、本明細書にさらに詳述される。従って、当該タンパク質の生物学的機能が維持されている限り、対照ポリペプチドのアミノ酸と同一である、または機能的に等しい、約７０％〜約８０％、または、約８１％〜約９０％、または、さらには約９１％〜約９９％のアミノ酸を有する配列が含まれる。修飾タンパク質は、ある態様において、その天然型のカウンターパートと生物学的に機能性が等しくてもよい。
【００６９】
また、アミノ酸及び核酸配列は、追加の残基（たとえば、Ｎ末端アミノ酸もしくはＣ末端アミノ酸、または、５´もしくは３´配列の追加）を含んでも良く、及び、さらに、当該配列が、上述の基準（タンパク質発現が関係している場合、生物学的タンパク質活性の維持が挙げられる）を満たす限り、本質的に、本明細書に開示される配列のうちの１つに記載のものであることを理解されたい。末端配列の付加は特に、たとえば、コード領域の５´または３´位のいずれかに隣接する様々な非コード配列、または、様々な内部配列（すなわち、遺伝子内に存在することが知られているイントロン）を含み得る、核酸配列に適用される。
【００７０】
ＩＶ．治療のための酵素的Ｌ−メチオニン枯渇
ある態様において、ポリペプチドは、Ｌ−メチオニンを枯渇させる新規酵素を用いた、メチオニン枯渇に感受性のある癌（たとえば、肝細胞癌、メラノーマ、及び腎細胞癌）を含む疾患の治療に用いられても良い。本発明は、メチオニン分解活性を有する修飾シスタチオニン−γ−リアーゼを用いた治療方法を具体的に開示する。以下に記述されるように、現在利用可能なメチオニン−γ−リアーゼは、通常、細菌由来のタンパク質であり、ヒト治療への使用にはいくつかの課題が残る。本発明のある実施形態により、治療効果の増加のためのメチオニン−γ−リアーゼ活性を有する新規酵素が提示される。
【００７１】
メチオニン（Ｌ−Ｍｅｔ）の枯渇は、有望な癌治療法として長く研究されている。Ｌ−Ｍｅｔは必須アミノ酸である一方、多くの悪性腫瘍ヒト細胞株及び腫瘍は、メチオニン要求性が比較的高いことが示されている（Ｈａｌｐｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４；  Ｋｒｅｉｓ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｅｎｏｗ，  １９７８；  Ｂｒｅｉｌｌｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；  Ｋｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０；  Ｋｒｅｉｓ，  １９７９）。メチオニン依存性腫瘍細胞株は、メチオニンシンターゼを提示せず、または低レベルで提示している（当該酵素は、通常、ホモシステインをＬ−Ｍｅｔへと戻してリサイクルする）（Ｈａｌｐｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４；  Ａｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７４）。ほとんどの正常細胞は、たとえば、ホモシステイン及びホモシスチン等の前駆体で増殖することができる一方で、多くの悪性腫瘍細胞は、その細胞外環境から直接、Ｌ−Ｍｅｔを取得しなければならない。また、急速に増殖する新生物はいずれも、増殖に必要な必須の構成成分の欠乏に悪影響を受け得る。メチオニンは特に重要であり、これは、その欠乏によりタンパク質合成が低下するだけではなく、遺伝子制御にとりわけ重要なＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性メチル化経路の脱制御が発生するからである。
【００７２】
正常細胞とがん細胞の間のメチオニン要求性の違いにより、治療機会が提供される。酵素的なメチオニン枯渇は、多くの動物モデル実験ならびに第Ｉ相臨床試験において調査されている（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７  ａ；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ；  Ｌｉｓｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６ｂ；  Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４ａ；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４ｂ；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７ｂ）。
【００７３】
ヒトはメチオニン加水分解酵素を欠いているため、様々な源由来の細菌性Ｌ−メチオニン−γ−リアーゼ（ＭＧＬ）が、癌治療に関して評価されている。メチオニン−γ−リアーゼは、メチオニンのメタンチオール、α−ケト酪酸及びアンモニアへの転換を触媒する。様々な源由来の細菌性酵素が精製され、癌細胞株に対するメチオニン枯渇剤として検証されている。Ｐ．ｐｕｔｉｄａ（ｐＭＧＬ）源は、他の源と比較し、その高い触媒活性、低いＫＭ値、及び比較的高いｋｃａｔ値により治療応用に選択された（Ｅｓａｋｉ  ａｎｄ  Ｓｏｄａ，  １９８７；  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６）。さらに、ｐＭＧＬの遺伝子が大腸菌にクローニングされ、タンパク質が高いタンパク質産生率で発現された（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７ａ；  Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）。
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験が動物モデルならびにヒトで行われている。Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７ａ）は、ヌードマウスへのヒト腫瘍異種移植片を用いて実験を行い、肺、大腸、腎臓、脳、前立腺、及びメラノーマの癌がすべて、ｐＭＧＬに対して感受性であることが判明した。加えて、有効量では毒性は検出されなかった（動物に体重減少が無かったことにより測定された）。これら実験の半減期は、２時間のみであると測定された（採取された血液サンプルから測定）。さらに、ＭＧＬ活性を維持するためにはＰＬＰの点滴が必要とされる。非常に短い半減期であるにもかかわらず、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７ａ）では、生理食塩水対照と比較し、腫瘍増殖の阻害が報告された。
【００７５】
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４ｂ）は、霊長類モデルにおいて、ＭＧＬのメチオニン枯渇、抗原性、及び毒性の点から薬物動態的、薬力学的実験を行った。投与量範囲実験は、１０００〜４０００単位／ｋｇで、静脈内投与で行われた。最も高い投与量で、注射後３０分までに検出不可能レベル（０．５μＭ未満）にまで血漿メチオニンを低下させることができ、当該メチオニンレベルは、８時間、検出不可能状態が維持された。薬物動態解析から、ｐＭＧＬは２．５時間の半減期で排出されたことが示された。２週間、８時間／日毎に当該用量を投与することにより、２μＭ未満までの血漿メチオニンの枯渇が定常状態となった。軽度の毒性が、食物摂取の低下と、若干の体重低下により観察された。不運なことに、２８日目の再チャレンジで、アナフィラキシーショックが発生し、１匹の動物が死亡したことから、ｐＭＧＬは高い免疫原性があることが示唆され、それはヒト治療にとっては非常に大きなデメリットである。その後のヒドロコルチゾンを用いた前処置により、アナフィラキシー反応が予防されたが、嘔吐が頻繁に観察された。さらなる再チャレンジは、６６、８６、及び１１６日目に行われた。最初のチャレンジの後に抗ｒＭＧＬ抗体が検出され、治療期間の間、濃度が増加した。
【００７６】
ＭＧＬ治療の実現に対する、これらの観察された障害に対し、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４ｂ）は、酵素のＰＥＧ化、ならびに、半減期及び免疫原性に対するその効果について実験した。酵素は、メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルグルタル酸（ＭＥＧＣ−ＰＥＧ−５０００）に連結された。投与範囲実験が再度行われ、血漿メチオニンを１２時間、５μｍｏｌ／Ｌ未満にまで低下させるためには、４０００単位／ｋｇ（９０ｍｇ／ｋｇ）で十分であった。薬物動態解析から、非ＰＥＧ化酵素と比較し、ＰＥＧ化酵素の血漿クリアランス半減期は、３６倍に改善されたことが示された。また、ＰＥＧ化により、いくらか免疫原性が減弱した（食物摂取の低下と深刻ではない程度の体重減少の、わずかな毒性が観察された）。しかしながら、活性半減期は改善されず、Ｌ−Ｍｅｔレベルは、１２時間のみ、検出レベル以下であった（非ＰＥＧ化酵素は８時間）。抗新生物剤としてのＬ−Ｍｅｔ枯渇酵素の使用に対する期待はあるが、これらの結果から、免疫原性及び薬物動態に関する重大な欠点を抱えている。
【００７７】
本発明のある態様は、たとえば腫瘍等の疾患を治療するための、メチオニン分解活性を有する修飾シスタチオニン−γ−リアーゼを提供する。特に、当該修飾ポリペプチドはヒトポリペプチド配列を有していてもよく、それにより、ヒト患者のアレルギー反応を防止し、反復投与を可能とし、及び、治療効果を増加させ得る。
【００７８】
本治療方法が有用な腫瘍としては、任意の悪性腫瘍細胞型が挙げられ、たとえば、固形腫瘍または血液腫瘍に見出されるものが挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、限定されないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺、及び、乳からなる群から選択される器官の腫瘍が挙げられる。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、ＴまたはＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、ミエローマ等が挙げられる。本明細書に提示される方法を用いて治療されうる癌のさらなる例としては、限定されないが、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮細胞癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞の癌、胃または胃部の癌（消化管癌及び消化管間質腫瘍を含む）、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎癌または腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺がん、様々なタイプの頭頸部癌、メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、悪性黒子型メラノーマ、末端性黒子性メラノーマ、結節型メラノーマ、ならびに、Ｂ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び、慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。
【００７９】
癌は、具体的に、これらに限定はされないが、以下の組織学的型のものであっても良い：新生物、悪性；上皮性悪性腫瘍；上皮性悪性腫瘍、非分化型；巨大及び紡錘形細胞癌；小細胞癌；乳頭がん；扁平上皮細胞癌；リンパ上皮性癌：基底細胞癌；石灰化上皮癌；移行上皮細胞癌；乳頭移行上皮細胞癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；混合肝細胞癌及び胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープの腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性細胞癌；好酸性細胞癌；好酸性腺腫；好塩基性細胞癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺腫；乳頭及び濾胞性腺腫；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺癌；ムチン性腺腫；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒層細胞腫瘍、悪性；男性胚細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；乳房外パラガングリオーマ、悪性；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑の悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；繊維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミューラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑液肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛上皮腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯の腫瘍、悪性；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル芽細胞線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；原線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；グリア芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅覚神経性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン症；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ細胞性；悪性リンパ腫、巨細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸性白血病；単球性白血病；マスト細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；及び、有毛細胞性白血病。
【００８０】
本明細書において、シスタチオナーゼ由来の改変ヒトメチオニナーゼは、腫瘍細胞、腫瘍組織、または癌を有する哺乳類の循環系からメチオニンを枯渇させるための様々なモダリティにおける抗腫瘍剤として用いられても良く、または、メチオニンの枯渇が望ましいと考えられている場合のメチオニン枯渇のための様々なモダリティにおける抗腫瘍剤として用いられても良い。
【００８１】
枯渇は、哺乳類の循環系においてｉｎ  ｖｉｖｏで、組織培養または他の生物学的培地でメチオニン枯渇が望ましい場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、及び、生物学的液体、細胞、または組織が身体の外側で操作され、次いで、当該患者哺乳類の身体に戻される場合にｅｘ  ｖｉｖｏ法で、行われても良い。循環系、培養培地、生物学的液体、または細胞からのメチオニンの枯渇は、処置される物質にアクセス可能なメチオニンの量を低下させるために行われ、及び、それゆえ、枯渇される物質と、メチオニンを枯渇させる量の改変ヒトメチオニナーゼとを、メチオニン枯渇条件下で接触させ、接触された物質中の環境メチオニン量を低下させることを含む。
【００８２】
腫瘍細胞は、その栄養培地にメチオニンを依存しており、枯渇は、細胞に対する栄養源を対象としており、細胞それ自身を対象とする必要はない。それゆえ、ｉｎ  ｖｉｖｏ応用において、腫瘍細胞の治療には、当該腫瘍細胞群の栄養培地と、改変メチオニナーゼを接触させることが含まれる。この実施形態において、当該培地は、血液、リンパ液、髄液、及び類似のメチオニン枯渇が望ましい体液であっても良い。
【００８３】
メチオニン枯渇の効率は、応用によって様々に変化し、通常、当該物質中に存在するメチオニンの量、枯渇の望ましい速度、及び、メチオニナーゼ露出に対する当該物質の寛容性に依存する。物質中のメチオニンレベル、及び、当該物質からメチオニンが枯渇する速度は、当分野公知の様々な化学的及び生物学的方法により、容易にモニターされうる。例示的なメチオニン枯渇量は、本明細書にさらに記述されており、処置される物質ミリリットル（ｍＬ）あたり、０．００１〜１００単位（Ｕ）の改変メチオニナーゼ、好ましくは、約０．０１〜１０Ｕ、及び、より好ましくは約０．1〜５Ｕの改変メチオニナーゼの範囲であっても良い。
【００８４】
メチオニン枯渇条件は、メチオニナーゼ酵素の生物学的活性と適合性のある緩衝液及び温度の条件であり、当該酵素に適合性のある適度な温度、塩、ｐＨ条件が含まれる（たとえば、生理学的条件）。例示的な条件としては、約４〜４０℃、約０．０５〜０．２Ｍ  ＮａＣｌと等しいイオン強度、約５〜９のｐＨが含まれ、生理学的条件も含まれる。
【００８５】
特定の実施形態において、本発明から、抗腫瘍剤として改変メチオニナーゼを用いる方法が企図され、及び、ゆえに、腫瘍細胞群と、改変メチオニナーゼの治療に有効な量を、腫瘍細胞の増殖を阻害するために十分な期間、接触させることが含まれる。
【００８６】
１つの実施形態において、ｉｎ  ｖｉｖｏ接触は、本発明の改変メチオニナーゼを含有する、生理学的に耐容できる組成物の治療に有効な量を患者に静脈内注射または腹腔内注射により投与すること、それにより、患者中に存在する腫瘍細胞の循環メチオニン源を枯渇させることにより、遂行される。改変メチオニナーゼの接触はまた、腫瘍細胞を含有する組織内に、改変メチオニナーゼを投与することによっても遂行されうる。
【００８７】
改変メチオニナーゼの治療に有効な量は、所望の効果（すなわち、腫瘍組織または患者循環系中のメチオニンを枯渇させ、それにより、腫瘍細胞の分裂を停止させること）を得るために算出された、既定量である。ゆえに、本発明の改変メチオニナーゼ投与のための用量範囲は、腫瘍細胞分裂の兆候及び細胞サイクルを低下させる所望の効果を得るために十分な大きさである。用量は、たとえば、過粘調度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等の副作用が発生しない大きさでなければならない。通常、用量は、患者の年齢、状態、性別、疾患の程度で変化し、当業者により決定されうる。用量は、任意の合併症が発生した際に、個々の医師により調節されうる。
【００８８】
たとえば、改変メチオニナーゼの治療に有効な量は、生理学的に耐容可能な組成物で投与された際に、約０．００１〜約１００単位（Ｕ）／ｍＬ、好ましくは、約０．１Ｕ超、及びより好ましくは１Ｕ／ｍＬ超の改変メチオニナーゼの血管内（血漿）濃度または局所濃度を得るために十分な量であっても良い。典型的な投与量は、体重に基づいて投与されても良く、及び、典型的な投与量は、約５〜１０００Ｕ／キログラム（ｋｇ）／日、好ましくは、約５〜１００Ｕ／ｋｇ／日、より好ましくは約１０〜５０Ｕ／ｋｇ／日、及び、より好ましくは約２０〜４０Ｕ／ｋｇ／日である。
【００８９】
改変メチオニナーゼは、注射により、または、経時的に、徐々に点滴を行うことにより、非経口的に投与されても良い。改変メチオニナーゼは、静脈内、腹腔内、経口、筋肉内、皮下、腔内、経皮、皮膚に投与されても良く、ぜん動的手段により送達されても良く、腫瘍細胞を含有する組織内に直接注入されても良く、または、電位バイオセンサーもしくはメチオニンを含有しうるカテーテルに連結されたポンプにより投与されても良い。
【００９０】
改変メチオニナーゼを含有する治療用組成物は、通常、たとえば、単位用量の注射による等、静脈内に投与される。治療用組成物に関連して用いられる場合、「単位用量」という用語は、対象に対する統一された用量として適した、物質的な個々の単位を指し、各単位は、必要とされる希釈物質（すなわち、担体またはビヒクル）との関連で所望される治療効果が生じるよう算出された活性物質の規定量を含有する。
【００９１】
当該組成物は、投薬用製剤に適合性のある様式で、及び、治療に有効な量で、投与される。投与される量は、治療される対象、活性成分を利用するための対象のシステムのキャパシティ、及び、所望される治療効果の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、医師の裁量に依存し、各個人に特有のものである。しかしながら、全身適用の適切な投薬範囲が本明細書に開示され、投与経路に依存している。最初の投与、及び、追加投与のための適切なレジメンもまた企図され、及び、最初の投与の後、次の注射または他の適用により、１時間以上の間隔で反復投与が為されるという特徴がある。例示的な反復投与が本明細書に開示され、及び、改変メチオニナーゼの血清レベル及び組織レベルが継続的に高く維持され、逆に、メチオニンの血清レベル及び組織レベルは低く維持されるために特に好ましい。あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療に特定の範囲の血中濃度に維持するために十分な、継続的な静脈内への点滴が企図される。
【００９２】
Ｖ．結合物
本発明の組成物及び方法には、たとえば、異種ペプチドセグメントまたはポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール等）との結合物の形成による、改善のために改変されたメチオニナーゼのさらなる修飾が含まれる。さらなる態様において、改変メチオニナーゼは、酵素の流体力学的半径を増加させ、それにより血清持続性を増加させるために、ＰＥＧに連結されていても良い。ある態様において、開示されるポリペプチドは、任意の標的剤（たとえば、腫瘍細胞上の外部受容体または結合部位に特異的に、及び安定的に結合する能力を有するリガンド等）に結合されていても良い（米国特許出願公開第２００９／０３０４６６６号）。
【００９３】
Ａ．融合タンパク質
本発明のある実施形態は、融合タンパク質に関する。これら分子は、異種ドメインに、Ｎ末端またはＣ末端で連結された改変ヒトメチオニナーゼを有していても良い。たとえば、融合物はまた、異種宿主中での組換えタンパク質の発現が行えるよう、他の種由来のリーダー配列を用いても良い。別の有用な融合物としては、好ましくは、当該融合タンパク質の精製を容易に行えるように開裂可能な、タンパク質アフィニティタグ（たとえば、血清アルブミンアフィニティタグまたは６ヒスチジン残基）、または、免疫学的に活性なドメイン（たとえば、抗体エピトープ）の付加が挙げられる。非限定的なアフィニティタグの例としては、ポリヒスチジン、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及び、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が挙げられる。
【００９４】
特定の実施形態において、改変ヒトメチオニナーゼは、たとえばＸＴＥＮポリペプチド（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、ＩｇＧ  Ｆｃドメイン、アルブミン、またはアルブミン結合ペプチド等の、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を延長させるペプチドに連結されていても良い。
【００９５】
融合タンパク質を作製する方法は当分野の当業者に公知である。そのようなタンパク質は、たとえば、完全融合タンパク質のｄｅ  ｎｏｖｏ合成により作製されても良く、または、異種ドメインをコードするＤＮＡ配列の付加後に、そのままの融合タンパク質を発現することにより作製されても良い。
【００９６】
元のタンパク質の機能的活性を正常な状態に戻す融合タンパク質の作製は、遺伝子と、タンデムに連結されたポリペプチド間でスプライシングされるペプチドリンカーをコードする架橋ＤＮＡセグメントとを繋げることにより、容易になりうる。当該リンカーは、得られる融合タンパク質の適正なフォールディングが可能となるような十分な長さである。
【００９７】
Ｂ．リンカー
ある実施形態において、改変メチオニナーゼは、二官能性架橋試薬を用いて化学的に結合されても良く、または、タンパク質レベルでペプチドリンカーと融合されていても良い。
【００９８】
二官能性架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の修飾及び安定化、リガンド及び受容体結合部位の特定、及び、構造研究を含む、様々な目的に対して広く用いられている。また、たとえば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー等の適切なペプチドリンカーを用いて、改変メチオニナーゼを連結しても良い。
【００９９】
２つの同一の官能基を担持するホモ二官能性試薬は、同一及び異なる高分子、または高分子のサブユニット間の架橋を高い効率で誘導すること、及び、ポリぺプチドリガンドをその特定の結合部位に高い効率で連結することが証明されている。ヘテロ二官能性試薬は、２つの異なる官能基を含有している。２つの異なる官能基の異なる反応性を利用して、選択的、及び、連続的の両方で架橋が制御されうる。二官能性架橋試薬は、その官能基の特異性により、分けられる（たとえば、アミノ−、スルフヒドリル−、グアニジン−、インドール−、カルボキシ−特異的基）。これらの内、遊離アミノ基を指向する試薬は、市販されていること、合成が容易であること、適用されうる穏やかな反応条件が理由で、特に良く好まれている。
【０１００】
主要なヘテロ二官能性架橋試薬は、１級アミン反応基及びチオール反応基を含有している。別の例においては、ヘテロ二官能性架橋試薬及び当該架橋試薬を用いる方法が開示されている（米国特許第５，８８９，１５５号。その全体が、参照により本明細書に具体的に援用される）。当該架橋試薬は、求核性ヒドラジド残基と求電子性マレイミド残基とを結合させ、１つの例では、アルデヒドの遊離チオールへのカップリングを可能にする。当該架橋試薬を修飾し、様々な官能基を架橋することができる。
【０１０１】
さらに、当分野の当業者に公知の任意の他の連結／カップリング剤、及び／または、メカニズムを用いて、ヒト改変メチオニナーゼを結合させても良い（たとえば、抗体−抗原相互作用、アビジンビオチン結合、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホエステル結合、ホスホラミド結合、無水結合、ジスルフィド結合、イオン性及び疎水性相互作用、二特異性抗体及び抗体断片、またはそれらの組み合わせ）。
【０１０２】
血液中で合理的な安定性を有する架橋剤を用いることが望ましい。リンカーを含有する多くのタイプのジスルフィド結合が、標的剤及び治療／予防剤をうまく結合できることが知られている。立体的に障害されているジスルフィド結合を含有するリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでより高い安定性をもたらすことが判明しうる。これらリンカーは、ゆえに、連結剤の１つの群である。
【０１０３】
立体障害のある架橋剤に加え、立体障害のないリンカーもまた本明細書に従い用いることができる。保護されたジスルフィドを含有する、または生成するとみなされていない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、及び２−イミノチオランが挙げられる（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，  １９８７）。そのような架橋剤の使用は、当分野に公知である。別の実施形態は、柔軟なリンカーの使用を含む。
【０１０４】
化学的に結合された時点で、通常、当該ペプチドが精製され、非結合剤及び他の混入物から、当該結合物が分離される。臨床的に有用となる十分な程度の純度の結合物の提供における使用のための、多くの精製技法が利用可能である。
【０１０５】
通常、サイズによる分離（たとえば、ゲルろ過、ゲル透過または高速液体クロマトグラフィー等）に基づいた精製法が、最も多く用いられている。他のクロマトグラフィー法（たとえば、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ分離）を用いても良い。封入体から融合タンパク質を精製するための従来法（たとえば、ナトリウムＮ−ラウロイル−サルコシン（ＳＬＳ）等の弱洗剤の使用等）が有用でありうる。
【０１０６】
Ｃ．ＰＥＧ化
本発明のある態様において、改変メチオニナーゼのＰＥＧに関連した方法及び組成物が開示される。たとえば、改変メチオニナーゼは、本明細書に開示される方法に従いＰＥＧ化されても良い。
【０１０７】
ＰＥＧ化は、ポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖の、別の分子（通常、薬剤または治療用タンパク質）への共有結合的付加の方法である。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体と、標的高分子のインキュベーションにより、ごく普通に行われる。薬剤または治療用タンパク質へのＰＥＧの共有結合的付加は、当該剤を、宿主の免疫系から「隠す」ことができ（免疫原性及び抗原性を低下させる）、または、当該剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させる（腎クリアランスを低下させることにより、循環時間を延長させることができる）ことができる。ＰＥＧ化はまた、疎水性の薬剤及びタンパク質に、水溶性をもたらすこともできる。
【０１０８】
ＰＥＧ化の最初の工程は、１つの末端または両末端での、ＰＥＧポリマーの適切な官能基化である。同じ反応性部分を伴い各末端で活性化されたＰＥＧは、「ホモ二官能性」として知られ、一方、もし存在する官能基が異なっている場合には、当該ＰＥＧ誘導体は、「ヘテロ二官能性」または「ヘテロ官能性」と呼称される。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な誘導体、または活性化された誘導体を調製し、所望の分子にＰＥＧを付加させる。
【０１０９】
ＰＥＧ誘導体に対する適切な官能基の選択は、ＰＥＧに連結される分子上の利用可能な反応基のタイプに基づいている。タンパク質に関しては、典型的な反応性アミノ酸として、リシン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン及びチロシンが挙げられる。Ｎ末端アミノ基及びＣ末端カルボキシル基もまた用いることができる。
【０１１０】
最初のＰＥＧ誘導体の生成に用いられる方法は、通常、ヒドロキシル基と反応性の基（典型的には無水物基、酸塩化物、クロロギ酸エステル、及び炭酸塩）と、ＰＥＧポリマーを反応させることである。２回目の生成では、たとえばアルデヒド、エステル、アミド等の、より効率的な官能基のＰＥＧ化構造が結合に利用可能となる。
【０１１１】
ＰＥＧ化応用はさらに進歩し、洗練されているため、結合のためのヘテロ二官能性ＰＥＧに対する必要性が増加している。これらヘテロ二官能性ＰＥＧは、親水性で、柔軟性があり、生体適合性のあるスペーサーが必要とされる２つの部分の連結に非常に有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧの好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸、及びＮＨＳエステルである。
【０１１２】
最も普遍的な修飾剤、またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づいている。それらの活性は、タンパク質修飾基のアルコール末端への付加に依存している。一部の例において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）が、前駆体分子として用いられている。当該ジオールは、その後、ヘテロ−またはホモ−二量体ＰＥＧ連結分子を作製するために両末端で修飾される。
【０１１３】
タンパク質は、通常、たとえば、非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基等の求核性の部位でＰＥＧ化される。例示的なシステイニル特異的修飾試薬としては、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨード酢酸、ＰＥＧチオール、及びＰＥＧビニルスルホンが挙げられる。４つすべてが、穏やかな条件下、及び中性からややアルカリ性のｐＨで、高度にシステイニル特異的であるが、それらはいくつか、欠点を有している。マレイミドで形成されたチオエーテルは、アルカリ条件下でやや不安定であり、このリンカーを用いた剤型選択に若干の制限が伴う。ヨードＰＥＧで形成されたカルバモチオエート結合はより安定であるが、遊離ヨウ素が、ある条件下でチロシン残基を修飾しうる。ＰＥＧチオールはタンパク質のチオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合はまた、アルカリ条件下で不安定でありうる。ＰＥＧ−ビニルスルホンの反応性は、マレイミド及びヨードＰＥＧと比較し、ややゆっくりであるが、当該形成されたチオエーテル結合は非常に安定である。また、そのゆっくりした反応速度により、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応が、より制御しやすくなる。
【０１１４】
天然型システイニル残基での部位特異的ＰＥＧ化は、これら残基が通常ジスルフィド結合の形態にあるため、または、生物学的活性に必要であるため、めったに行われない。他方で、部位特異的突然変異誘導を用いて、チオール特異的リンカーのためのシステイニルＰＥＧ化部位を組み込むことができる。システイン変異は、ＰＥＧ化試薬がアクセス可能であるように、及び、ＰＥＧ化後も生物学的に活性であるように設計されなければならない。
【０１１５】
アミン特異的修飾剤としては、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート（ＰＥＧ  ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアン酸、及びその他いくつかが挙げられる。すべて、穏やかな条件下で反応し、アミノ基に高度に特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルは、おそらく、より反応性のある剤のうちの１つであるが、その高い反応性により、ラージスケールでのＰＥＧ化反応の制御が困難となりうる。ＰＥＧアルデヒドは、アミノ基とイミンを形成し、次いで、シアノヒドリドホウ酸ナトリウムと２級アミンに還元される。ヒドリドホウ酸ナトリウムとは異なり、シアノヒドリドホウ酸ナトリウムは、ジスルフィド結合を還元しない。しかし、この化学物質は高度に毒性があり、特に揮発性となる低ｐＨでは注意深く扱わなければならない。
【０１１６】
ほとんどのタンパク質上に複数のリシン残基があるため、部位特異的ＰＥＧ化は難しいものとなり得る。幸運なことに、これら試薬は非プロトン化アミノ基と反応するため、低ｐＨで反応を行うことにより、低ｐＫアミノ基へとＰＥＧ化を指向させることが可能である。通常、アルファ−アミノ基のｐＫは、リシン残基のイプシロン−アミノ基よりも１〜２ｐＨ単位低い。ｐＨ７以下で分子をＰＥＧ化することにより、Ｎ末端に対する高い選択性を高い頻度で得ることができる。しかしながら、これは、タンパク質のＮ末端部分が生物学的活性に必要ではない場合にのみ行うことができる。それでもなお、ＰＥＧ化による薬物動態的利益は、しばしば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の著しい喪失を上回るため、ＰＥＧ化構造に関わらず、より高いｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性を有する産物が生じることとなる。
【０１１７】
ＰＥＧ化方法を開発する際に検討するべきいくつかのパラメーターが存在する。幸運なことに、通常、４または５を超えない重要なパラメーターが存在する。ＰＥＧ化条件の最適化に対する「実験デザイン」法が非常に有用である。チオール特異的ＰＥＧ化反応に対し、検討すべきパラメーターとしては以下が挙げられる：タンパク質濃度、ＰＥＧとタンパク質の比率（モルベース）、温度、ｐＨ、反応時間、及び一部の例においては酸素の除外（酸素は、タンパク質による分子間ジスルフィド形成に寄与し得、それにより、ＰＥＧ化産物の収率が低下する）。特にＮ末端アミノ基を標的とする場合には、ｐＨがさらに重要であることを除き、アミン特異的修飾に対しても、同じ因子（酸素は除外）を検討しなければならない。
【０１１８】
アミン特異的修飾及びチオール特異的修飾の両方に対して、反応条件はタンパク質の安定性に影響を与えうる。これにより、温度、タンパク質濃度、及びｐＨが限定されうる。さらに、ＰＥＧ化反応を開始する前に、ＰＥＧリンカーの反応性を知らなければならない。たとえば、ＰＥＧ化剤が７０％のみ活性である場合、タンパク質とＰＥＧ反応の化学量論性において、用いられるＰＥＧの量は、確実に活性ＰＥＧ分子のみを計数しなければならない。
【０１１９】
ＶＩ．タンパク質及びペプチド
ある実施形態において、本発明は、たとえば改変メチオニナーゼ等の少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを含有する新規組成物に関する。これらペプチドは、上述の融合タンパク質で含有されていてもよく、または剤に結合されていても良い。
【０１２０】
本明細書において使用されるとき、タンパク質またはペプチドは通常、限定されないが、約２００アミノ酸より大きく遺伝子から翻訳される全長配列までのタンパク質；約１００アミノ酸超のポリペプチド；及び／または、約３〜約１００アミノ酸のペプチドを指す。簡便には、「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書において、相互交換可能に用いられる。
【０１２１】
本明細書において使用されるとき、「アミノ酸残基」とは、任意の天然型アミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または、当分野に公知の任意のアミノ酸模倣体を指す。ある実施形態において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、いずれの非アミノ酸も、当該アミノ酸残基配列を中断しない。他の実施形態において、配列は、１以上の非アミノ酸部分を含有しても良い。特定の実施形態において、当該タンパク質またはペプチド残基の配列は、１以上の非アミノ酸部分により中断されても良い。
【０１２２】
従って、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然型タンパク質に存在する２０の普遍的なアミノ酸のうちの少なくとも１つを含有するアミノ酸配列、または、修飾アミノ酸または異常アミノ酸を少なくとも１つ含有するアミノ酸配列を包含する。
【０１２３】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を介したタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現、天然源からのタンパク質もしくはペプチドの単離、または、タンパク質もしくはペプチドの化学的合成を含む、当分野の当業者に公知の任意の技術により作製されても良い。ヌクレオチド及びタンパク質、ポリペプチド、及び様々な遺伝子に対応するペプチド配列は従前に開示されており、及び、当分野の当業者に公知のコンピューターデータベースに見出され得る。そのようなデータベースの１つは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ'ｓ  Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｎｄ  ＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で、ワールドワイドウェブ上で利用可能である）。既知の遺伝子に対するコード領域は、本明細書に開示される技術を用いてまたは、当分野の当業者に公知である技術を用いて増幅及び／または発現されても良い。従って、様々な市販のタンパク質調製物、ポリペプチド調製物、及びペプチド調製物が当分野の当業者に公知である。
【０１２４】
ＶＩＩ．核酸及びベクター
本発明のある態様において、改変メチオニナーゼまたは改変ヒトメチオニナーゼを含有する融合タンパク質をコードする核酸配列が開示されうる。どの発現系が用いられているかにより、核酸配列は、標準的な方法に基づき選択されても良い。たとえば、もし改変メチオニナーゼがヒトシスタチオナーゼ由来であり、及び、大腸菌ではまれにしか用いられない多重コドンを含有する場合、それらは発現に干渉する可能性がある。それゆえ、各遺伝子またはそれらの変異体は、大腸菌発現のためにコドン最適化されていても良い。また様々なベクターを用いて対象のタンパク質（たとえば改変メチオニナーゼ）を発現させても良い。例示的なベクターとしては、限定されないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾン、またはリポソームベースのベクターが挙げられる。
【０１２５】
ＶＩＩＩ．宿主細胞
宿主細胞は、改変メチオニナーゼ及びそれらの結合物の発現及び分泌が可能となるよう形質転換されたものであっても良い。宿主細胞は、細菌、哺乳類細胞、酵母、または糸状菌であっても良い。様々な細菌としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ及びＢａｃｉｌｌｕｓが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｉｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ属に属する酵母は、適切な宿主細胞としての用途が見出されている。様々な種類の糸状菌が発現宿主として用いられても良く、以下の属が挙げられる：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ａｃｈｌｙａ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｅｎｄｏｔｈｉａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、及びＰｙｒｉｃｕｌａｒｉａ。
【０１２６】
使用可能な宿主生物の例としては、細菌（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＢＲＢ１の誘導体（Ｓｉｂａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＳＡＩ１２３（Ｌｏｒｄａｎｅｓｃｕ，  １９７５）またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５））；酵母（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＡＨ  ２２（Ｍｅｌｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；及び糸状菌（たとえば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ（Ｗａｒｄ，  １９８９）、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９））が挙げられる。
【０１２７】
哺乳類宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０−形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、及びマウス胚性細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。上述の細胞は解説を意図しており、当分野公知の多くの可能性のある宿主生物体を限定する意図はない。原核細胞または真核細胞かどうかにかかわらず、原則として、分泌することが出来る全ての宿主を用いることができる。
【０１２８】
改変メチオニナーゼ及び／またはそれらの融合タンパク質を発現する哺乳類細胞は、元の細胞株を培養するために通常用いられる条件下で培養される。概して、細胞は、生理食塩及び栄養素を含有する標準的な培地（たとえば、標準的なＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭ、またはＤＭＥＭ。通常、５％〜１０％の血清（たとえばウシ胎児血清）が補充されている）中で培養される。また、培養条件も標準的である（たとえば、培養物は、所望されるレベルのタンパク質が得られるまで、固定培養中、または回転培養中で、３７℃でインキュベートされる）。
【０１２９】
ＩＸ．タンパク質精製
タンパク質精製技術は、当分野の当業者に公知である。これら技術は、あるレベルで、細胞、組織または器官の、ポリペプチド及び非ポリペプチド分画へのホモジナイゼーション及び粗分画化を含む。他で特定されない限り、部分精製または完全精製（または均質になるまでの精製）を得るために、対象のタンパク質またはポリペプチドはクロマトグラフィー法及び電気泳動法を用いてさらに精製されてもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した解析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、及び等電点電気泳動である。ペプチド精製の特に効率的な方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、または、さらに高速の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。
【０１３０】
精製されたタンパク質またはペプチドは、他の成分から単離可能な組成物を指すことが意図され、ここで、当該タンパク質またはペプチドは、天然で得られる状態と比較し、任意の程度まで精製されている。単離された、もしくは精製されたタンパク質またはペプチドは、それゆえ、天然で存在しうる環境から離れたタンパク質またはペプチドとも呼称される。一般的に「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化に供されたタンパク質またはペプチドの組成物を指し、及び、その組成物は、実質的にその発現された生物学的活性を保持している。「実質的に精製された」という用語が用いられた場合、この意味は、当該タンパク質またはペプチドが、たとえば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成する等の、組成物中の主要な成分を形成する組成物を指す。
【０１３１】
タンパク質精製における使用に適した様々な技術が当分野の当業者に公知である。たとえば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等を用いた沈殿、または、熱変性後の遠心による沈殿；クロマトグラフィー工程（たとえば、イオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシアパタイト、及びアフィニティクロマトグラフィー）；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびに、これら及び他の技術の組み合わせ、が挙げられる。当分野において一般的に公知であるように、様々な精製工程の実施の順番は変更しても良く、または、ある工程を省いても良く、それでも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法となると考えられている。
【０１３２】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示の点から、当業者に明らかである。これらには、たとえば、活性分画の特異的活性を測定する、または、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析による分画内のポリペプチドの量を評価する等が挙げられる。好ましい分画の純度の評価方法は、当該分画の特異的活性を算出すること、最初の抽出物の特異的活性とそれを比較すること、及び、それにより、「精製倍数」により評価された、その純度の程度を算出すること、である。活性量を表すために用いられた実際の単位はもちろん、精製後に選択された特定の評価法、及び、発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示しているかどうかに基づいている。
【０１３３】
タンパク質またはペプチドが常にその最大の精製状態で提供されることが、すべてに求められるわけではない。実際のところ、ある実施形態においては、実質的にあまり精製されていない生成物でも有用性がありうることが企図される。部分精製は、より少ない精製工程を組み合わせて用いることにより、または、同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することにより行われても良い。たとえば、通常、ＨＰＬＣ装置を利用して行われたカチオン交換カラムクロマトグラフィーにより、低圧クロマトグラフィーシステムを利用した同じ方法よりも高い「倍数」精製が得られることが認識されている。低度の相対精製を示す方法は、タンパク質生成物の総合的な回収、または、発現されたタンパク質の活性の維持では利点を有し得る。
【０１３４】
ある実施形態において、タンパク質またはペプチド（たとえば、改変メチオニナーゼ、改変メチオニナーゼを含有する融合タンパク質、またはＰＥＧ化後の改変メチオニナーゼ）は単離または精製されていても良い。たとえば、精製を容易にするために、そのような改変メチオニナーゼ中にＨｉｓタグまたはアフィニティエピトープが含有されていても良い。アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合することが出来る分子との間の特異的アフィニティに依るクロマトグラフィー法である。これは受容体−リガンド型の相互作用である。カラム物質は、結合パートナーのうちの１つを、不溶性マトリクスへ共有結合させることにより合成される。次いで、カラム物質は溶液からの物質を特異的に吸着できるようになる。溶出は、結合が発生しない条件に変更することにより生じる（たとえば、ｐＨ、イオン強度、温度等を変える）。マトリクスはいかなる有意な程度にも分子を吸着せず、広範囲の化学的、物理的、及び温度的安定性を有している物質でなければならない。リガンドは、結合特性に影響を与えないように連結されなければならない。リガンドはまた、比較的強い結合をもたらさなければならない。試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出できなければならない。
【０１３５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子がそのサイズに基づいて分離される、またはより専門的に言えば、その流体力学的体積に基づいて分離されるクロマトグラフィー法である。通常、たとえばタンパク質及び工業用ポリマー等の大きな分子または高分子複合体に適用される。典型的には、水性溶液を用いて、カラムを通じ試料を移動させる場合、当該技術は、ゲルろ過クロマトグラフィーとして知られており、対して、有機溶媒を移動相として用いた場合には、ゲル浸透クロマトグラフィーという名称が用いられる。
【０１３６】
ＳＥＣの基本原理は、異なるサイズの粒子を、異なる速度で、固定相を通して溶出（ろ過）することである。これにより、サイズに基づいた粒子の溶液分離が得られる。全ての粒子が同時、またはほぼ同時にロードされたとすると、同じサイズの粒子は一緒に溶出されるはずである。各サイズ排除カラムには、分離することができる分子量の範囲がある。排除限界は、この範囲の上端の分子量と規定され、そこでは固定相に捕捉されるには分子が大きすぎる。浸透限界は、分離範囲の下端の分子量と定義され、そこでは十分に小さなサイズの分子は固定相の孔に完全に浸透し、この分子量以下の全ての分子はとても小さいため、１つのバンドとして溶出される。
【０１３７】
高速液体クロマトグラフィー（または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、化合物を分離、特定及び定量するために生化学及び解析化学において頻繁に用いられるカラムクロマトグラフィーの１つの形態である。ＨＰＬＣはクロマトグラフの充填材料を保持するカラム（固定相）、当該カラムを通じて移動相を移動させるポンプ、及び、分子の保持時間を示す検出器を利用する。保持時間は、固定相、解析される分子、及び用いた溶媒の間の相互作用に基づき変化する。
【０１３８】
Ｘ．医薬組成物
腫瘍細胞の増殖を阻害するために、最も好ましくは、局所進行性または転移性の癌を有する癌患者中の癌細胞を殺傷するために、新規メチオニナーゼが全身または局所に投与されうることが企図される。それらは、静脈内、髄腔内、及び／または腹腔内に投与されても良い。それらは単独で、または、抗増殖剤と組み合わせて投与されても良い。１つの実施形態において、それらは外科手術または他の治療の前に、患者の癌の量を減らすために投与される。あるいは、それらは、いずれの残留癌（たとえば、外科手術で排除しそこねた癌）も生き延びないことを確実にするために、外科手術後に投与されても良い。
【０１３９】
本発明は、治療用調製物の特定の状態に限定されることを意図されない。たとえば、そのような組成物は、生理学的に耐容性のある液体、ゲル、または固形の担体、希釈物質及び賦形剤と共に処方されて提供されても良い。これら治療用調製物は、たとえば家畜動物等の獣医学的用途のために哺乳類に投与されても良く、及び、他の治療剤と類似した様式でヒトにおける臨床使用のために投与されても良い。概して、治療効果に対し必要とされる投与量は、用途のタイプ、投与の様式、ならびに、個々の対象に特殊化された要求に従い変化する。
【０１４０】
そのような組成物は通常、注射物質としての用途に対し、液体溶液または懸濁液として調製される。適切な希釈物質及び賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等、及びそれらの組み合わせである。さらに、もし所望であれば、当該組成物は少量の補助物質（たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、安定剤、またはｐＨ緩衝剤等）を含有しても良い。
【０１４１】
臨床応用が企図される場合、タンパク質、抗体及び薬剤を含有する医薬組成物は、意図される応用法に適した形態で調製される必要がありうる。一般的に、医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散した、１以上の改変メチオニナーゼまたは追加の剤の有効量を含有しうる。「薬学的にまたは薬理学的に受容可能な」という表現は、必要に応じて、たとえばヒト等の動物に投与される際に、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。本明細書に開示される方法により単離された改変メチオニナーゼまたは追加の活性成分を少なくとも１つ含有する医薬組成物の調製は、本開示から当業者には公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０に例示されている（参照により本明細書に援用される）。さらに、動物（たとえばヒト）への投与に関しては、当該調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される滅菌、発熱性、一般的安全性及び純度標準に合致していなければならないことが理解されるであろう。
【０１４２】
本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容される担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒、塗膜物質、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（たとえば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬剤、薬剤安定剤、ゲル、結合物質、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素等の物質及びそれらの組み合わせが挙げられ、当分野の当業者に公知である（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。任意の標準的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、医薬組成物におけるその使用が企図される。
【０１４３】
本発明のある実施形態は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び、たとえば注射等の投与経路のために滅菌されている必要があるかどうかに依存し、異なるタイプの担体を含有しても良い。当該組成物は、静脈内、皮内、経皮、髄腔内、動脈内、腹腔内、鼻内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、経粘膜、経口、局所、吸入（たとえば、エアロゾル吸入）、注射、点滴、持続点滴、標的細胞を直接浸す局所かん流、カテーテル、洗浄液、脂質組成物（たとえばリポソーム）、または当業者に公知の他の方法もしくは前述の内の任意の組み合わせで投与されてもよい（たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．，  １９９０（参照により本明細書に援用される）、を参照のこと）。
【０１４４】
修飾ポリペプチドは、遊離塩基、中性、または塩の形態で組成物へと処方されても良い。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（たとえば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、または、たとえば塩酸塩もしくはリン酸塩等の無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸等の有機酸と形成されるもの）が挙げられる。また遊離カルボキシル基と形成される塩は、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄等の無機塩基から誘導することができ；または、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカイン等の有機塩基から誘導することができる。製剤化された時点で、溶液は、当該投与形態に適した様式、及び、治療に有効である量で投与される。当該製剤は、様々な投与形態で容易に投与される（たとえば、注射用溶液等の非経口投与、または肺への送達のためのエアロゾル、または薬剤放出カプセル等の食物投与用に処方される）。
【０１４５】
さらに本発明のある態様に従い、投与に適した組成物は、不活性な希釈剤の有無にかかわらず、薬学的に許容される担体において提供されても良い。当該担体は吸収可能でなければならず、及び、液体、半固形（すなわち、ペースト）、または固形担体を含む。任意の標準的な培地、剤、希釈物質または担体がレシピエントに対し有害である場合、または、その中に含有される組成物の治療有効性に対して有害である場合を除き、本発明の実施における使用のための投与可能な組成物におけるその使用は、適切である。担体または希釈物質の例としては、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合物質、充填物質等、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当該組成物はまた、１以上の成分の酸化を妨害するために、様々な抗酸化物質を含有しても良い。さらに、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤（非限定的に、パラベン（たとえば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせを含む）等の保存剤により微生物の作用を妨害しても良い。
【０１４６】
本発明のある態様に従い、当該組成物は、任意の簡便及び現実的な様式で（すなわち、溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル化、吸収等により）担体と組み合わされる。そのような手順は、当業者にとって日常的なものである。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態において、当該組成物は、半固形または固形の担体と完全に組み合わされ、または混合される。当該混合は、任意の簡便な様式（たとえば、すりつぶす等）で行うことができる。また安定化剤を当該混合プロセスに加え、治療活性の喪失（すなわち、胃での変性）から当該組成物を保護することができる。組成物中での使用のための安定化剤の例としては、緩衝剤、アミノ酸（たとえばグリシン及びリシン等）、炭水化物（たとえばデキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトール等）が挙げられる。
【０１４８】
さらなる実施形態において、本発明は、改変メチオニナーゼ、１以上の脂質、及び水性溶媒を含有する医薬用脂質ビヒクル組成物の使用に関するものでありうる。本明細書において使用されるとき、「脂質」という用語は、水中で特徴的な不溶性であり、有機溶媒中で抽出可能な広範な物質のいずれかを含むと定義される。この広範な種類の化合物は当業者に公知であり、本明細書において「脂質」という用語が用いられる場合、任意の特定の構造に限定されない。例としては、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然型または合成（すなわち、ヒトにより設計または製造された）であっても良い。しかしながら、脂質は通常、生物学的な物質である。生物学的脂質は、当分野に公知であり、たとえば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル−及びエステル結合脂肪酸を伴う脂質、重合性脂質、及びそれらの組み合わせが挙げられる。もちろん、当業者に脂質として理解されており、本明細書に具体的に開示されたもの以外の化合物もまた、本組成物及び本方法に包含される。
【０１４９】
当業者であれば、脂質ビヒクル中に組成物を分散させるために用いられうる技術の範囲に精通しているであろう。たとえば、改変メチオニナーゼまたはその融合タンパク質は、脂質を含有する溶液中に分散されても良く、脂質と共に溶解されても良く、脂質と共に乳化されても良く、脂質と混合されても良く、脂質と組み合わされても良く、脂質と共有結合されても良く、脂質中に懸濁液として含有されても良く、ミセルもしくはリポソームと共に含有され、または複合体化され、またはさもなければ、当業者公知の任意の手段により脂質もしくは脂質構造と関連付けられていても良い。分散は、リポソームの形成を生じさせても、生じさせなくても良い。
【０１５０】
動物患者に投与される組成物の実際の投与量は、身体的因子及び生理学的因子（たとえば体重、状態の重大度、治療される疾患のタイプ、前もって行われた治療介入または同時に行われる治療介入、患者の特発性疾患、ならびに、投与経路）により決定されても良い。投与の量及び経路に基づき、好ましい投与量及び／または有効量の投与の回数は、対象の反応により変化しうる。投与に対し責を負う医師は、任意の事象において、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象に対する適切な投与量を決定する。
【０１５１】
ある実施形態において、医薬組成物は、たとえば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含有してもよい。他の実施形態において、活性化合物は、単位重量の約２％〜約７５％、または、約２５％〜約６０％、たとえば、その中から導き出される任意の範囲を構成しても良い。当然ながら、各治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が、化合物の任意の所与の単位用量で得られるような方法で、調製されてもよい。たとえば溶解度、生体利用効率、生物学的半減期、投与経路、製品の保管寿命、ならびに他の薬理学的検討事項等の因子が、そのような医薬製剤の調製にかかる分野の当業者により企図され、したがって、様々な投薬量及び治療レジメンが望ましいであろう。
【０１５２】
他の非限定的な例において、１回投与量にはまた、投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重〜約１０００ミリグラム／ｋｇ体重以上、及び、それらから導き出される任意の範囲を含有しても良い。本明細書に列記される数値から導き出される範囲の非限定的な例において、上述の数値に基づき、約５ミリグラム／ｋｇ体重〜約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ体重等の範囲が投与されても良い。
【０１５３】
ＸＩ．併用療法
ある実施形態において、本発明の組成物及び方法は、第二の、または追加の療法と組み合わせた改変メチオニナーゼの投与を含む。そのような療法は、メチオニン依存と関連した任意の疾患の治療に適用することができる。たとえば、当該疾患は、癌であっても良い。
【０１５４】
併用療法を含む、方法及び組成物により、治療効果または予防効果が増強され、ならびに／または、別の抗癌治療もしくは抗過増殖性治療の治療効果が増大される。治療方法及び予防方法並びに組成物は、所望される効果（たとえば、癌細胞の殺傷及び／または細胞性過剰増殖の阻害等）を得るために有効な、総計の量で提供されても良い。この方法には、改変メチオニナーゼ及び第二の治療の療法を、細胞と接触させることが含まれても良い。組織、腫瘍または細胞を、剤（すなわち、改変メチオニナーゼまたは抗癌剤）を１以上含有する、１以上の組成物または医薬製剤と接触させても良く、または、組織、腫瘍及び／または細胞を、２以上の異なる組成物または製剤と接触させることにより、１つの組成物は、１）改変メチオニナーゼ、２）抗癌剤、または３）改変メチオニナーゼと抗癌剤の両方が提供する。または、そのような併用治療を、化学療法、放射線療法、外科的治療または免疫治療と併せて用いうることが企図される。
【０１５５】
「接触された」及び「露出された」という用語は、細胞に適用された場合、本明細書において、治療用構築物及び化学療法剤または放射線療法剤が、標的細胞に送達されるプロセス、または、標的細胞と直接並置されるプロセスを記述するために用いられる。細胞を殺傷するために、たとえば、当該細胞を殺傷する、または分裂を阻害するために有効な総量と組み合わせて、細胞に両剤が送達される。
【０１５６】
改変メチオニナーゼは、抗癌治療に対し、前、その間、その後、または、様々な組み合わせで投与されても良い。投与は、同時から、数分、数日、数週の範囲の間隔であっても良い。改変メチオニナーゼが、抗癌剤とは別に患者に投与される場合の実施形態において、通常、当該２つの化合物が、当該患者に有益な複合効果をまだもたらすことができるように、確実に、各送達の時間の間に多大な時間が経過しないようにする。そのような例において、改変メチオニナーゼと抗癌治療は、互いに、約１２〜２４または７２時間以内、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、患者に投与され得ることが企図される。一部の状況においては、治療に対する期間を著しく延長させることが望ましく、その場合、各投与の間、数日（２、３、４、５、６または７）から数週（１、２、３、４、５、６、７または８）が経過する。
【０１５７】
ある実施形態において、一連の治療は、１〜９０日以上（この範囲には、その間の日時が含まれる）継続する。１つの剤が、１日目から９０日目（この範囲には、その間の日時が含まれる）のうちの任意の日、またはそれらの任意の組み合わせで投与され、及び別の剤は、１日目から９０日目（この範囲には、その間の日時が含まれる）のうちの任意の日、またはそれらの任意の組み合わせで投与されることが企図される。１日以内（２４時間の期間）に、当該患者が、当該剤の１回投与または複数回投与を受けても良い。さらに、一連の治療の後、抗がん剤治療が投与されない期間があることが企図される。この期間は、患者の状態（たとえば、予後、体力、健康状態等）により、１〜７日、及び／または１〜５週、及び／または１〜１２か月以上（この範囲には、その間の日時が含まれる）継続しても良い。当該治療サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予測される。
【０１５８】
様々な組み合わせを用いても良い。以下の例では、改変メチオニナーゼは「Ａ」であり、抗癌治療は「Ｂ」である：
0006572212.tif 000003
【０１５９】
本実施形態の任意の化合物または療法の患者への投与は、もしあれば当該剤の毒性を考慮しながら、そのような化合物の投与に対する一般的なプロトコールに従う。それゆえ、一部の実施形態において、併用療法に起因する毒性をモニターする工程が存在する。
【０１６０】
Ａ．化学療法
広範な化学療法剤を、本実施形態に従い用いても良い。「化学療法」という用語は、癌を治療するための薬剤の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を示すために用いられる。これらの剤または薬物は、細胞内でのその作用様式によりカテゴライズされ、たとえば、細胞サイクルに影響を与えるかどうか、及び、どのステージで細胞サイクルに影響を与えるか、などがある。あるいは、剤は、直接ＤＮＡに架橋する能力、ＤＮＡ内に挿入される能力、または、核酸合成に影響を与えることにより染色体異常及び有糸分裂異常を引き起こす能力に基づき特徴付けられても良い。
【０１６１】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤（たとえばチオテパ及びシクロホスファミド）；スルホン酸アルキル（たとえばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン）；アジリジン（たとえばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパ）；エチレンイミン及びメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログのトポテカンを含む）；ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）；ＣＣ−１０６５（アドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ズオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ  ｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、及びウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａs）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン）；抗生物質（たとえば、エンジイン抗生物質（たとえば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１Ｉ及びカリケアマイシンオメガＩ１））；ダイネマイシン（ダイネマイシンＡを含む；ビスホスホン酸（たとえばクロドロネート））；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォア及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（たとえば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマ��シン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、及びゾルビシン；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、及びチオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、及びフロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール（ｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｏｌ）、メピチオスタン（ｍｅｐｉｔｉｏｓｔａｎｅ）、及びテストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ））；抗副腎ホルモン類（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌｓ）（例えば、ミトタン及びトリロスタン）；葉酸補充剤（ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸（ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジコン；エルホルミシン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド（たとえばマイタンシン及びアンサミトシン）；ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸;トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２'，２"−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ Ａ）、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド（たとえば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン）；６−���オグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体（たとえばシスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イバンドロネート；イリノテカン（たとえばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（たとえばレチノイン酸）；カペシタビン；カルボプラスチン；プロカルバジン；プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）；ゲムシタビン；ナベルビン；ファルネシル−タンパク質タンスフェラーゼ阻害剤；トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、上述のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０１６２】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられている他の因子としては、ガンマ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への直接的な放射性同位体の送達として普遍的に知られているものが挙げられる。他の形態のＤＮＡ損傷因子もまた企図され、たとえば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射がある。おそらく、これらすべての因子が、ＤＮＡ、ＤＮＡ前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに、染色体のアセンブリ及び維持に対し、広範な損傷を与える。Ｘ線量の範囲は、長期間（３〜４週）に対しては５０〜２００レントゲンの１日量、単回投与は２０００〜６０００レントゲンの範囲である。放射性同位体量の範囲は、当該同位体の半減期、放出される放射線の強さ及びタイプ、ならびに、新生細胞による取り込みに依存し、広く変化する。
【０１６３】
Ｃ．免疫療法
当業者であれば、本実施形態方法と組み合わせて、または併せて、免疫療法を用い得ることを理解するであろう。癌治療に関連し、免疫療法とは通常、癌細胞を標的とし、破壊するために、免疫エフェクター細胞及び分子を用いることに依るものである。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））はそのような例である。免疫エフェクターは、たとえば、腫瘍細胞の表面上のなんらかのマーカーに特異的な抗体であっても良い。抗体単独で治療のエフェクターとして供されても良く、または、実際に細胞殺傷作用を及ぼす他の細胞を動員しても良い。また抗体は、薬剤または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素等）に結合され、単なる標的化剤として供されても良い。あるいは、当該エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接または間接のいずれかで相互作用する表面分子を担持するリンパ球であっても良い。様々なエフェクター細胞として、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
【０１６４】
免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化に適した何らかのマーカー（すなわち、他の細胞の大部分には存在していない）を担持していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらの内のいずれかが、本実施形態に関連した標的化に適し得る。普遍的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、及びｐ１５５が挙げられる。免疫療法の他の態様は、免疫刺激効果と抗癌作用を組み合わせることである。以下を含む免疫刺激分子もまた存在している；サイトカイン（たとえばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン（たとえばＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１）、ＩＬ−８）及び増殖因子（たとえばＦＬＴ３リガンド）。
【０１６５】
現在研究中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント（たとえば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物）（米国特許第５，８０１，００５号及び第５，７３９，１６９号；Ｈｕｉ  ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，  １９９８；  Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）；サイトカイン療法（たとえば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；  Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；  Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８））；遺伝子療法（たとえば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びｐ５３（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；  Ａｕｓｔｉｎ−Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号及び第５，８４６，９４５号））；及び、モノクローナル抗体（たとえば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；  Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号））である。１以上の抗癌治療が、本明細書に開示される抗体療法と共に用いられうることが企図される。
【０１６６】
Ｄ．外科手術
およそ６０％の癌患者が何らかのタイプの外科手術（予防手術、診断手術または病期診断手術、治療的手術及び緩和手術が挙げられる）を受けている。治療的手術には、癌性組織のすべてまたは一部を物理的に除去、摘出及び／または破壊する切除術が含まれ、及び、他の療法（たとえば、本実施形態の治療、化学療法、放射線治療、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法及び／または代替療法等）と併せて用いられても良い。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。腫瘍の切除に加え、外科手術による治療には、レーザー外科手術、寒冷外科手術、電気外科手術、及び顕微鏡下手術（モース外科手術）が含まれる。
【０１６７】
癌性細胞、組織または腫瘍の一部またはすべての摘出で、身体内に腔が形成されても良い。治療は、追加の抗癌治療を用いた当該領域のかん流、直接注入または局所塗布により成し遂げられても良い。そのような治療は、たとえば、１、２、３、４、５、６もしくは７日毎、または１、２、３、４、及び５週毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２か月毎に繰り返されても良い。これら治療もまた、投与量を変化させるものであっても良い。
【０１６８】
Ｅ．他の剤
処置の治療効果を改善するために本実施形態のある態様と組み合わせて他の剤を用い得ることが企図される。これら追加の剤としては、細胞表面受容体及びＧＡＰジャンクションの上方制御に影響を与える剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞付着阻害剤、アポトーシス誘導物質への過増殖性細胞の感受性を増加させる剤、または、他の生物学的剤が挙げられる。ＧＡＰジャンクションの数を上昇させることによる細胞内シグナル伝達の増加は、近傍の過増殖性細胞群に対する抗過増殖効果を増加させる。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤または分化剤は、処置の抗過増殖性を改善するために本実施形態のある態様と組み合わせて用いられても良い。細胞付着阻害剤は、本実施形態の有効性の改善が企図される。細胞付着阻害剤の例としては、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びＬｏｖａｓｔａｔｉｎである。アポトーシスに対する過増殖性細胞の感受性を増加させる他の剤（たとえば、抗体ｃ２２５）を、治療有効性を改善するために本実施形態のある態様と組み合わせて用いられうることが企図される。
【０１６９】
ＸＩＩ．キット
本発明のある態様において、たとえば治療用キット等のキットが開示されうる。たとえば、キットは、本明細書に開示される１以上の医薬組成物及び任意選択的にそれらの使用のための説明書を含有しても良い。また、キットは、そのような組成物の投与を成し得るためのデバイスを１以上含有しても良い。たとえば、主題のキットは、医薬組成物及び当該組成物の癌性腫瘍への直接的な静脈内注入を行うためのカテーテルを含有しても良い。他の実施形態において、主題のキットは、改変メチオニナーゼを前もって充填されたアンプル（任意選択的に、医薬用として処方され、または、送達用デバイスを用いた使用のために、凍結乾燥される）を含有しても良い。
【０１７０】
キットは、ラベルを貼った容器を含有しても良い。適切な容器としては、たとえば、瓶、バイアル、及び試験管が挙げられる。容器は、様々な物質（たとえばガラスまたはプラスチック）から形成されていても良い。容器は、たとえば上述の治療応用または非治療応用に有効な改変メチオニナーゼを含有する組成物を保持していても良い。容器の上のラベルは、当該組成物が、特定の治療応用または非治療応用に使用されることを示していても良く、及び、たとえば上述のような、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途のいずれかに対する指示を示していても良い。本発明のキットは通常、上述の容器及び、販売及びユーザーの立場から望ましい物質（緩衝液、希釈物質、フィルター、針、シリンジ及び使用に対する説明を伴う添付文書）を含有する他の容器を１以上含有する。
【実施例】
【０１７１】
ＸＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれるものである。当業者であれば、以下の実施例に開示されている技術は、本発明の実施が上手く機能するよう本発明者らにより開発された技術を提示していることを認識し、ゆえに、その実施に対する好ましい様式を構成するとみなされうる。しかしながら、当業者は、本開示の観点から、開示される具体的な実施形態において、多くの変更が可能であること、及び、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、良く似た、または類似の結果が得られることを認識するであろう。
【０１７２】
実施例１  メチオニン−γ−リアーゼ活性に対し改変されたシスタチオニン−γ−リアーゼ
ＣＧＬは、哺乳類の含硫基移動経路において最後の工程を触媒する四量体である（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。ＣＧＬは、Ｌ−シスタチオニンのＬシステイン、アルファ−ケト酪酸及びアンモニアへの転換を触媒する。ヒトＣＧＬ（ｈＣＧＬ）ｃＤＮＡは従前にクローニング及び発現されているが、比較的低い収率であった（約５ｍｇ／Ｌ培養液）（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｓｔｅｅｇｂｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＣＧＬ、及びガイドとしてＭＧＬ酵素の配列及び構造アライメントを用いて、ｈＣＧＬを、メチオニンを効率的に分解する酵素へと転換した。
【０１７３】
実施例２  改善された修飾ヒトシスタチオニン−γ−リアーゼの遺伝子合成及び発現
ヒトシスタチオニン−γ−リアーゼ遺伝子は、滅多に大腸菌では用いられず、発現に干渉しうる多重コドンを含有している。ゆえに、大腸菌におけるタンパク質発現を最適化するために、各遺伝子を、ＤＮＡ−Ｗｏｒｋｓソフトウェアを用いて設計されたコドン最適化されたオリゴヌクレオチドを用いてアセンブリした（Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。各構築物は、クローニングを単純化するための、Ｎ末端ＮｃｏＩ制限酵素部位、インフレームＮ末端Ｈｉｓ６タグ、及びＣ末端ＥｃｏＲＩ部位を含有している。ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのクローニングの後、適切なシスタチオナーゼ発現ベクターを含有する大腸菌（ＢＬ２１）を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を用いて、３７℃で、振とうフラスコ、２５０ｒｐｍにて、約０．５〜０．６のＯＤ６００に達するまで増殖させた。この時点で、培養を２５℃での振とうに切り替え、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導させ、さらに１２時間、タンパク質を発現させた。次いで、細胞沈殿物を遠心により回収し、ＩＭＡＣ緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＰＯ４／１０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）に再懸濁した。Ｆｒｅｎｃｈ圧力セルにより溶解させた後、溶解物を、４℃で２０分間、２０，０００ｇで遠心し、得られた上清を、ニッケルＩＭＡＣカラムへと入れ、１０〜２０カラム体積のＩＭＡＣ緩衝液で洗浄し、次いで、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２５０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で溶出させた。次いで、酵素を含有する分画を、２５℃で１時間、１０ｍＭ  ピリドキサル−５´−リン酸（ＰＬＰ）でインキュベートした。１０，０００ＭＷＣＯ遠心フィルターデバイス（ＡＭＩＣＯＮ（登録商標））を用いて、次いで、タンパク質を、１００ｍＭ  ＰＢＳ、１０％グリセロール、ｐＨ７．３溶液へと数回、緩衝液交換を行った。酵素の分注物を、次いで、液体窒素中で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。この方法で精製したＣＧＬ及びＣＧＬ変異体は、９５％超の均一性であった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシン染色により評価）。収率は、６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５の最終緩衝液濃度中、算出された吸光係数（λ２８０＝２９，８７０  Ｍ−１ｃｍ−１）に基づき、約４００ｍｇ／Ｌ培養液であると算出された（Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ，  １９８９）。
【０１７４】
実施例３  メチオニン−γ−リアーゼ活性に対する９６ウェルプレートスクリーニング及びクローンの順位付け
ＭＧＬ及びＣＧＬの両方とも、それらの各基質から２−ケト酪酸を産生する。小ライブラリーをスクリーニングし、最も高いＭＥＴａｓｅ（メチオニン−γ−リアーゼ）活性を有するクローンを順位付けするために、３−メチルベンゾチアゾリン−２−オン  ヒドラゾン（ＭＢＴＨ）を用いた、α−ケト酸の検出に対する比色分析（Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）を９６ウェルプレート形式に大きさを合わせた。このプレートスクリーニングにより、突然変異ライブラリーから最も活性のあるクローンを選択するための簡易な方法が提供される。元の対照よりも高い活性を示しているクローンをさらなる特徴解析に選択し、動的解析のために多くの変異体を精製する手間を省いた。
【０１７５】
突然変異ｈＣＧＬ、ｈＣＧＬまたはｐＭＧＬを含有するシングルコロニーを選択し、７５μＬのＴＢ培地／ウェル（５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有）を含有する９６ウェル培養プレートへと移した。これら培養物を、次いで、プレート振とう器上、約０．８〜１のＯＤ６００に達するまで３７℃で増殖させた。２５℃まで冷却した後、さらに７５μＬの培地／ウェル（５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含有）を加えた。２時間、振とうさせながら２５℃で発現が行われ、続いて１００μＬの培養液／ウェルを９６ウェルアッセイプレートへと移した。次いで、アッセイプレートを遠心し、細胞を沈殿させ、培地を除去し、５０μＬ／ウェルのＢ−ＰＥＲ（登録商標）タンパク質抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えることにより細胞を溶解させた。遠心による除去の後、溶解物を５ｍＭ  Ｌ−Ｍｅｔと共に、３７℃で１０〜１２時間、インキュベートした。次いで、１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中で、３部の０．０３％  ＭＢＴＨ溶液を加えることにより反応物を誘導体化した。プレートを４０分間、５０℃で加熱し、冷却した後、マイクロタイタープレートリーダーで、３２０ｎｍで読み取った。
【０１７６】
実施例４  ｈＣＧＬ−Ｅ５９Ｎ−Ｒ１１９Ｌ−Ｅ３３９Ｖ由来の改善メチオニン分解変異体を作製するためのライブラリー設計
ｈＣＧＬ−Ｅ５９Ｎ−Ｒ１１９Ｌ−Ｅ３３９Ｖ（ｈＣＧＬ−ＮＬＶ）メチオニン分解酵素に対する遺伝子を、活性が改善されたさらなる変異体を作製するための開始物質として用いた。アミノ酸配列アライメントを、様々な生物体由来のＭＧＬ及びＣＧＬの配列を用いて作製した。突然変異誘導に選択された領域は、すべてのＭＧＬ酵素が１つの保存残基を有しており、及び、すべてのＣＧＬ酵素が異なる保存残基を有していた、固有のアライメント部位で特定された。ＭＧＬ及びＣＧＬは高度に相同性のある構造を有しているが、互いの各基質を分解せず、ゆえに、ＭＧＬとＣＧＬの間で系統発生学的に保存されたアミノ酸配列の差異は、各基質の分解に重要な残基を示唆している可能性がある。ライブラリーは、保存残基をコードする元のｈＣＧＬ−ＮＬＶ鋳型のコドン、または対応するＭＧＬ保存残基に対するコドンのいずれかを含有するオリゴヌクレオチドを用いた重複伸長ＰＣＲにより作製された。最終アセンブリＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩを用いて消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを有するｐＥＴ２８ａベクターへとライゲーションされた。得られたライゲーション物を、直接大腸菌（ＢＬ２１）へと形質転換し、実施例３に記述される次のスクリーニングのためにＬＢ−カナマイシンプレートに播種した。ライブラリーの理論上の多様性（すなわち、当該ライブラリーによりコードされる、すべての可能性のある遺伝子配列）の２倍以上のコロニーをスクリーニングした。元のｈＣＧＬ−ＮＬＶ変異体よりも高い活性を示すクローンを単離し、活性改善に寄与した変異を特定するために配列解析を行った。上述の変異誘導の反復ラウンドにおいて、Ｌ−メチオニン分解活性が改善されていたクローンを鋳型として用いた。
【０１７７】
実施例５  改善ヒトメチオニン分解変異体の特徴解析
実施例３及び４に記述される突然変異誘導とスクリーニングを数ラウンド行った後、元の３つの変異部位（すなわち、Ｅ５９Ｎ−Ｒ１１９Ｌ−Ｅ３３９Ｖ）に加え、５つのアミノ酸の位置が、ｈＣＧＬ−ＮＬＶと比較した、メチオニン分解活性の改善に寄与していることが判明した。これらの追加の位置は、ｈＣＧＬ（配列番号１）の６３、９１、２６８、３１１、及び３５３残基の位置である（図１を参照）。５９、１１９、及び３３９位の残基の変異と組み合わせて、これらの位置のうちの１以上のＳ６３Ｌ、Ｌ９１Ｍ、Ｋ２６８Ｒ、Ｔ３１１Ｇ、及びＩ３５３Ｓへの変異により、ｈＣＧＬ−ＮＬＶと比較し、Ｌ−メチオニン分解のｋｃａｔ／ＫＭ値の改善がもたらされた。特に、
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に相当するアミノ酸置換を含有する変異体は、最も高いＬ−メチオニン分解のｋｃａｔ／ＫＭ値を示していた。これら変異体（ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−（１−４））は、９５％を超える均一性にまで精製され（実施例２に記述されるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価）、及び、実施例３に記述されるものと類似の１ｍＬスケールのＭＢＴＨアッセイを用いて、１００ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．３）、３７℃でのＬ−Ｍｅｔ分解の能力に対し、動力学的に特徴解析がなされた。
【０１７８】
（表１）ｈＣＧＬ、ｈＣＧＬ−ＮＬＶ及び、改善変異体ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ（１〜４）を用いた、ｐＨ７．３及び３７℃でのＬ−メチオニン分解のミカエリス−メンテン反応速度の比較
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ＮＤ＝測定せず
【０１７９】
実施例６  腫瘍細胞株に対する、ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の細胞毒性
メラノーマ細胞株Ａ３７５ならびに前立腺癌細胞株ＤＵ１４５及びＰＣ３に対するｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性を評価した。Ａ３７５細胞に対しては、約３０００細胞／ウェルで、９６ウェル培養プレートのＤＭＥＭ培地中に細胞を播種し、前立腺腫瘍細胞株に対してはＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞を播種し、様々な濃度の酵素で処理を行う前に、２４時間、増殖させた。処置の５日後、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）アッセイを用いて、増殖を測定した。Ａ３７５に対して得られたデータの解析から、０．０８μＭの見かけ上のＩＣ５０値が、ＤＵ１４５に対しては０．２１μＭの見かけ上のＩＣ５０値が、及び、ＰＣ３前立腺腫瘍細胞に対しては０．２５μＭの見かけ上のＩＣ５０値が得られた（図２）。
【０１８０】
実施例７  ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の薬理学的調製
ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１酵素は、１つの例外（ＩＭＡＣカラムへの結合の後、タンパク質は、０．１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）１１４を含有するＩＭＡＣ緩衝液（９０〜１００カラム体積）を用いてしっかりと洗浄した）を除き、実施例２に記述されるように精製した。次いで、カラムを、１０〜２０カラム体積のＩＭＡＣ緩衝液を用いて洗浄し、ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４／２５０ｍＭイミダゾール／３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ８）を用いて溶出した。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）１１４を用いた洗浄は、エンドトキシン除去のために行われた。精製されたタンパク質は、１０，０００ＭＷＣＯのろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、１００ｍＭ  ＮａＰＯ４緩衝液（ｐＨ８．３）への緩衝液交換に供された。続いて、ＰＬＰを、１０ｍＭの濃度で添加し、タンパク質を、１時間、２５℃でインキュベートした。次いで、メトキシＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル５０００ＭＷ（ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、８０：１のモル比率でｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１に加え、一定して攪拌しながら、１時間、２５℃で反応させた。得られた混合物は、１００，０００ＭＷＣＯのろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて、しっかりと緩衝液交換（１０％グリセロールを伴うＰＢＳ）され、０．２ミクロンのシリンジフィルター（ＶＷＲ）を用いて滅菌された。すべてのＰＥＧ化酵素は、Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  （ＬＡＬ）キット（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて、リポ多糖（ＬＰＳ）含量を解析された。
【０１８１】
実施例８  ＰＥＧ化ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の血清安定性
ＰＥＧ化ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の血清安定性は、最終濃度１０μＭで、プールされたヒト血清中に当該酵素を３７℃でインキュベートすることにより検証された。異なる時点で分注物を採取し、ＤＴＮＢアッセイ（米国特許出願公開第２０１１／０２００５７６号（参照によりその全体が本明細書に援用される）に記述されている）を用いて活性を検証した。データをプロットした後、ＰＥＧ化ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１は、１０１±４時間の半減期（Ｔ０．５）を有していると算出された（図３）。
【０１８２】
実施例９  マウスにおける、ＰＥＧ化ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１の薬力学的解析
マウスモデルにおける、上述の実施例４〜７で開示された改変ヒトメチオニン分解酵素のＬ−メチオニン除去における有効性を評価するために、３群（各３匹）を、通常食で飼育しながら、尾静脈注射により、５０ｍｇ／ｋｇのＰＥＧ−ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１を投与した。血清採取のために、心静脈穿刺により８、２４、４８時間の時点で群を殺処分した。次いで、ｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）を用いた誘導体化により、血清サンプルをＬ−メチオニン含量に対して解析し、次いで、原則的に、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ワールドワイドウェブ、ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／Ｌｉｂｒａｒｙ／ｄａｔａｓｈｅｅｔｓ／Ｐｕｂｌｉｃ／５９８０−３０８８．ＰＤＦ）に記述されているように高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。ＰＥＧ−ｈＣＧＬ−８ｍｕｔ−１を用いたこの投与スキームにより、１５時間にわたり、５μＭ未満のレベルにまでＬ−メチオニンが枯渇された（図４）。対照的に、通常食のマウスにＰＥＧ化ｈＣＧＬ−ＮＬＶ  ２００ｍｇ／ｋｇ投与しても、血清Ｌ−メチオニンは、４時間の間、約１０μＭ程度までしか低下しなかった（図５）。
【０１８３】
本明細書に開示され、請求される方法のすべては、本開示を鑑み、過度の実験を行うことなく、作製され、実行することができる。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されているが、当業者であれば、本発明の主旨、目的、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される方法、及び、当該方法の工程または一連の工程に変更が適用され得ることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的の両方に関連したある剤が、本明細書に開示される剤と置換され得、それにより同じ結果または類似の結果が得られることが明らかであろう。当業者に明らかな、そのような類似の置換及び修飾のすべてが、添付の請求項により規定される本発明の主旨、目的及び範囲内にあるとみなされる。
【０１８４】
参照文献
以下の参照文献は、本明細書に解説されるものに対する例示的な手順の補足、または、他の詳細な補足を提示する範囲において、参照により本明細書に具体的に援用される。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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