(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる方法であって、
a. 前記多能性幹細胞を、０．８×１０５細胞／ｃｍ２〜３．０×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Ｙ２７６３２を追補した既知組成の培地またはＹ２７６３２を追補した調整培地中で４８時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉細胞に分化させる工程と
を含み、
前記工程ｃが、
前記多能性幹細胞をアクチビンおよび血清を追補した培地中で培養する工程、
前記多能性幹細胞を酪酸ナトリウムおよびアクチビンＡを追補した培地中で培養する工程、または
前記多能性幹細胞をＧＤＦ−８およびＭＣＸ化合物を追補した培地中で培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる方法であって、
a. 前記多能性幹細胞を、１．５×１０５細胞／ｃｍ２〜３．０×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Ｙ２７６３２を補充した既知組成の培地またはＹ２７６３２を補充した調整培地中で４８時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、ＧＤＦ８およびＭＣＸ化合物を追補した培地中で培養することによって胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含む方法。
【請求項３】
胚体内胚葉細胞を得る方法であって、
多能性幹細胞を、ＧＤＦ８および１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンを追補した培地中で培養することによって胚体内胚葉細胞に分化させる工程
を含み、
前記多能性幹細胞が、１．５×１０５細胞／ｃｍ２より高い密度で表面上に播種されており、Ｙ２７６３２を追補した既知組成の培地またはＹ２７６３２を追補した調整培地中で分化前の４８時間培養されている、方法。
【請求項４】
胚体内胚葉細胞を分化させる方法であって、
多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含む方法であり、
前記多能性幹細胞が、０．８×１０５細胞／ｃｍ２〜３．０×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で表面上に播種されて、Ｙ２７６３２を追補した既知組成の培地またはＹ２７６３２を追補した調整培地中で分化前に４８時間培養され、ならびに
前記多能性幹細胞を、
ＧＤＦ−８およびＭＣＸ化合物；
ＧＤＦ−８および１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン；
アクチビンおよび血清；または
酪酸ナトリウムおよびアクチビンＡ
を追補した培地中で培養することによって、前記多能性幹細胞が胚体内胚葉細胞へと分化される、方法。
【請求項５】
胚体内胚葉細胞を分化させる方法であって、
前記胚体内胚葉細胞を１．５×１０５細胞／ｃｍ２〜５．０×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で表面上に播種する工程と、
前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含み、
前記胚体内胚葉細胞が、
ＧＤＦ８およびＭＣＸ化合物；
ＧＤＦ−８および１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン；
アクチビンおよび血清；または
酪酸ナトリウムおよびアクチビンＡ
を追補した培地中で多能性幹細胞を培養することによって取得されたものである、方法。
【請求項６】
前記膵臓内胚葉細胞を膵臓内分泌細胞に分化させる工程をさらに含む、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
膵臓内胚葉細胞を得る方法であって、
a. 多能性幹細胞を、０．８×１０５細胞／ｃｍ２〜３．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Ｙ２７６３２を追補した既知組成の培地またはＹ２７６３２を追補した調整培地中で４８時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、ＧＤＦ８およびＭＣＸ化合物を追補した培地中で培養することによって胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
d. 前記胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦ７を追補した培地中で培養することによって原腸管細胞に分化させる工程と、
e. 前記原腸管細胞を、ＳＡＮＴ−１、アクチビン−ＡおよびＬＤＮ−１９３１８９を追補した培地中で培養することによって前腸細胞に分化させる工程と、
f. 前記前腸細胞を、ＳＡＮＴ−１、ＴＰＢ、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＤ−２０８およびＮ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１、２、４−トリアゾル−１−イル）ブチル］フェニル｝−１，３−ベンゾチアゾール−２−アミンを追補した培地中で培養することによって、膵臓前腸前駆細胞に分化させる工程と、
g. 前記膵臓前腸前駆細胞を、ＬＤＮ−１９３１８９、ＳＤ−２０８およびＮ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１、２、４−トリアゾル−１−イル）ブチル］フェニル｝−１、３−ベンゾチアゾール−２−アミンを追補した培地中で培養することによって膵臓内胚葉細胞に分化させる工程とを含む、方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞が、１．５×１０５細胞／ｃｍ２〜３．０×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で表面上に播種される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記胚体内胚葉細胞を、１．５×１０５細胞／ｃｍ２〜５．０×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で播種する工程を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記膵臓内胚葉細胞を膵臓内分泌腺細胞へと分化させる工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される、請求項１〜４および７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
胚体内胚葉細胞を分化させる方法であって、
a. 多能性幹細胞を、０．８×１０５細胞／ｃｍ２〜３．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で、第１の表面上に播種する工程と、
b. 前記多能性幹細胞を、Ｙ２７６３２を追補した既知組成の培地またはＹ２７６３２を追補した調整培地中で４８時間培養する工程と、
c. 前記多能性幹細胞を、ＧＤＦ８およびＭＣＸ化合物を追補した培地中で胚体内胚葉細胞に分化させる工程と、
d. 前記胚体内胚葉細胞を、１．５×１０５細胞／ｃｍ２〜５．０×１０５細胞／ｃｍ２の密度で第２の表面上に播種する工程と、
e. 前記胚体内胚葉細胞を、膵臓内胚葉細胞に分化させる工程と、
を含む方法。
【請求項１３】
前記ＭＣＸ化合物が、１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オンである、請求項１、２、４、５、７または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の表面がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の表面がＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１および第２の表面が同じ表面である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記胚体内胚葉細胞が、ヒトのものである、請求項１〜６および１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記膵臓内胚葉細胞が、ヒトのものである、請求項４〜６および１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記既知組成の培地がｍＴＥＳＲである、請求項１〜５、７および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記調整培地がＭＥＦ調整培地である、請求項１〜５、７および１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程が、前記胚体内胚葉細胞をＦＧＦ−１０およびレチノイン酸を用いて培養することを含む、請求項４、５または１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記胚体内胚葉細胞を膵臓内胚葉細胞に分化させる工程が、前記胚体内胚葉細胞をノギンと共にＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養することを含む、請求項４、５または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年５月７日に出願された、米国特許仮出願シリアル番号６１／６４３，６８４号の利益を主張するものであり、当該出願を参照により本明細書にその全容において、かつあらゆる目的について援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞分化の分野にある。より具体的には、本発明は、膵臓の内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞及び膵臓の内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞のその後の有効な生成に有用な、ヒト多能性細胞及び／又は胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の播種密度の範囲を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞即ちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。
【０００４】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４、及びＳＯＸ１７などの多数のマーカーを発現する。
【０００５】
原腸形成の終了までに、内胚葉は、内胚葉の前部、中間、及び後部の領域を特異的にマークする因子のパネルの発現によって認識することができる前部−後部ドメインに分割される。例えば、Ｈｈｅｘ及びＳｏｘ２は内胚葉の前領域を特定し、Ｃｄｘ１、２及び４は後半分を特定する。
【０００６】
内胚葉組織の移行は、内胚葉を腸管の領域化に役立つ異なった中胚葉組織に近接させる。これは、例えば、ＦＧＦ、Ｗｎｔ、ＴＧＦ−Ｂ、レチノイン酸（ＲＡ）、及びＢＭＰリガンド、並びにそれらのアンタゴニストのような多数の分泌された因子によって達成される。例えば、ＦＧＦ４及びＢＭＰは推定後腸内胚葉においてＣｄｘ２の発現を促進し、前方の遺伝子Ｈｈｅｘ及びＳＯＸ２の発現を阻害する（２０００  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：１５６３〜１５６７）。ＷＮＴシグナル伝達はまた、後腸の発達を促進し、前腸の運命を阻害するために、ＦＧＦシグナル伝達と平行して作用することが示されている（２００７  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３４：２２０７〜２２１７）。最後に、間葉によって分泌されるレチノイン酸は、前腸−後腸の境界を調節する（２００２  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，１２：１２１５〜１２２０）。
【０００７】
特異的転写因子の発現レベルは、組織のアイデンティティを指定するために使用できる可能性がある。原腸管への胚体内胚葉の形質転換中に、腸管は、制限された遺伝子発現パターンにより分子レベルで観察することができる広いドメインに領域化される。例えば、腸管で領域化された膵臓ドメインは、ＰＤＸ−１の非常に高い発現並びにＣＤＸ２及びＳｏｘ２の非常に低い発現を示す。同様に、Ｆｏｘｅ１の高レベルの存在は、食道組織の指標である。肺組織において高度に発現されるのはＮＫＸ２．１である。ＳＯＸ２／Ｏｄｄ１（ＯＳＲ１）は胃組織において高度に発現される。ＰＲＯＸ１／Ｈｈｅｘ／ＡＦＰの発現は肝組織において高い。ＳＯＸ１７は胆管構造の組織で高度に発現される。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１／ＰＴｆ１ａ、及びＮＫＸ２．２は膵臓組織において高度に発現される。ＣＤＸ２の発現は、腸組織において高い。上記要約は、Ｄｅｖ  Ｄｙｎ  ２００９，２３８：２９〜４２及びＡｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２００９，２５：２２１〜２５１からの引用である。
【０００８】
膵臓の形成は、膵臓内胚葉への胚体内胚葉の分化から生じる（２００９  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ，２５：２２１〜２５１；２００９  Ｄｅｖ  Ｄｙｎ，２３８：２９〜４２）。背側と腹側の膵臓ドメインは、前腸上皮から生じる。また、前腸は、食道、気管、肺、甲状腺、胃、肝臓、膵臓、胆管系を生じさせる。
【０００９】
膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程を印している。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【００１０】
Ｄ’Ａｍｏｕｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下でのヒト胚性幹（ＥＳ）細胞由来の胚体内胚葉の濃縮培地の生産を記述している（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００５，２３：１５３４〜１５４１；米国特許第７，７０４，７３８号）。マウスの腎臓被膜下でのこれらの細胞の移植は、内胚葉組織の特徴を有する、より成熟した細胞への分化をもたらした（米国特許第７，７０４，７３８号）。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許公開第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。免疫不全マウスの脂肪パッド中のこれら膵臓前駆細胞のその後の移植は、３〜４ヶ月の成熟期の後に、機能的膵臓内分泌細胞の形成をもたらした（米国特許第７，９９３，９２０号及び米国特許第７，５３４，６０８号）。
【００１１】
Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞からの膵島細胞の産生のためのシステムを報告している（米国特許第７，０３３，８３１号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。ヒト胚性幹細胞は、最初に、酪酸ナトリウムとアクチビンＡとの組み合わせを用いて内胚葉に分化された（米国特許第７，３２６，５７２号）。次に細胞をノギンなどのＢＭＰアンタゴニストと共に、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成した。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。
【００１２】
小分子阻害剤もまた、膵内分泌前駆細胞の誘導のために使用されている。例えば、ＴＧＦ−Ｂ受容体及びＢＭＰ受容体の小分子阻害剤（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０１１，１３８：８６１〜８７１；Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１１，６０：２３９〜２４７）は、有意に膵内分泌細胞の数を増すために使用されている。加えて、小分子活性化剤もまた、胚体内胚葉細胞又は膵臓前駆細胞を生成するために使用されている（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００９，２１：７２７〜７３２；Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２００９，５：２５８〜２６５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ヒト多能性幹細胞から膵臓細胞を生成するプロトコルの改善においては大きな発展がなされたが、ＥＳ細胞から膵臓細胞を生成する上でのこれらの効率においては、異なる群から報告される結果に大きなばらつきが存在する。このばらつきは、ＥＳ系における差、使用される試薬を含めるプロトコルの持続時間、及び懸濁培養に対しての接着性の選択などの因子に起因してきた。ＥＳ細胞を胚体内胚葉への分化に向かわせる上での効率は、細胞密度に対して非常に敏感ではないが、膵臓内胚葉を生成するための効率は、ＥＳ細胞の初期播種密度に大きく依存することを、我々はここで立証する。特に、０．８〜２×１０5細胞／ｃｍ2の範囲の初期細胞密度は、膵臓の内胚葉及び内分泌腺マーカーの最高の発現をもたらした。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一実施形態では、本発明は、表面上に多能性幹細胞を播種する工程を含む多能性幹細胞を培養する方法に関し、この多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で播種される。いくつかの実施形態では、培養される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、培養される多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法に関し、方法は、多能性幹細胞を、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種する工程と、多能性幹細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。いくつかの実施形態では、分化させる多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、分化させる多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、ヒトのものである。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法に関し、方法は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種された多能性幹細胞を分化させる工程を含む。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法で使用される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を得る方法で使用される胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、ヒトのものである。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法を提供し、方法は、多能性幹細胞の分化効率を最大化するのに十分な播種密度で第１の表面上に播種された多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の膵臓内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化効率を最大化するのに十分な播種密度で、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を第２の表面上に播種することによって、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。本発明のいくつかの態様では、多能性幹細胞の胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞への分化効率を最大化するのに十分な播種密度は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2である。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の膵臓内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化効率を最大化するのに十分な播種密度は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2である。いくつかの実施形態では、細胞を分化させる方法で使用される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明のいくつかの実施形態では、細胞を分化させる方法で使用される胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞が播種される第１の表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。本発明のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が播種される第２の表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。本発明のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、ヒトのものである。本発明のいくつかの実施形態では、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、ヒトのものである。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる方法に関し、方法は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種された多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程とを含む。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させるために使用される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させるために使用される胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させるために使用される多能性幹細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法に関し、方法は、多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、この多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を表面上に播種する工程と、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程とを含む。本発明のいくつかの態様では、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法で使用される多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０Ｘ１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化される胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、多能性幹細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法に関し、方法は、多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、この多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程とを含む。本発明のいくつかの態様では、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法で使用される多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×Ｘ１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化される胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、多能性幹細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む表面上に播種される。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる工程に関し、方法は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種する工程と、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する胚望に分化させる工程とを含む。本発明のいくつかの態様では、使用される細胞は、ヒトのものである。
【００２２】
本発明は、０．８×１０5多能性細胞／ｃｍ2〜３×１０5多能性細胞／ｃｍ2の段階的分化によってインビトロで得られた膵臓内胚葉系統の指標であるマーカーを発現する細胞の集団を提供する。
【００２３】
本発明の一実施形態では、膵臓内分泌腺系統の指標であるマーカーを発現する細胞は、０．８×１０5多能性細胞／ｃｍ2〜３×１０5多能性細胞／ｃｍ2の段階的分化によって、インビトロで得られる。
【００２４】
本発明の一実施形態では、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種された胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の段階的分化によって、インビトロで得られる。
【００２５】
本発明の一実施形態では、膵臓内分泌腺系統の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2で表面上に播種された胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の段階的分化によって、インビトロで得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。
【図１Ｂ】０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。
【図１Ｃ】０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。
【図１Ｄ】０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。
【図１Ｅ】０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。
【図１Ｆ】０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。
【図２Ａ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図２Ｂ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図２Ｃ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図２Ｄ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図２Ｅ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図２Ｆ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図２Ｇ】実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化させるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図３Ａ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｂ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｃ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｄ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｅ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｆ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｇ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図３Ｈ】種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｃ）、０．９×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｄ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｅ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｆ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｇ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図３Ｈ）で播種されたＤＥの誘導前の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ａ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ｂ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ｃ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ｄ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ｅ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ｆ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図４Ｇ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ａ）、０．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｂ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｄ）、１．１×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｅ）、１．２×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｆ）及び１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図４Ｇ）で初期に播種されたＤＥの４日間の培養物の位相差画像を示す。
【図５Ａ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。
【図５Ｂ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。
【図５Ｃ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。
【図５Ｄ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。
【図５Ｅ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。
【図５Ｆ】ＥＳ細胞の種々の細胞密度：５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。
【図６Ａ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｂ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｃ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｄ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｅ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｆ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｇ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｈ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｉ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【図６Ｊ】実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に分化させたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子：ＺＩＣ１（図６Ａ）、ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）、ＨＮＦ４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小項目に分割する。
【００２８】
定義
幹細胞は、単一細胞レベルでの自己再生能及び分化能の両方によって定義される未分化細胞である。幹細胞は、自己再生前駆細胞、非再生性前駆細胞、及び最終分化細胞を含む子孫細胞を生成することができる。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）から様々な細胞系統の機能性細胞へとインビトロで分化する能力を特徴とする。幹細胞は、移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞に注入後、実質的に（全てではないとしても）ほとんどの組織に寄与する。
【００２９】
幹細胞は、発生能によって、（１）全胚及び胚体外細胞型を生じる能力を意味する全能性、（２）全胚細胞型を生じる能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じるが、すべて特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じる能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む後代を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系統の小集合を生じる能力を意味する寡能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じる能力を意味する単能性に分類される。
【００３０】
分化は、専門化されていない（「中立の」）又は比較的専門化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの専門化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞又は分化誘導された細胞とは、細胞の系統内でより特化した（「拘束された」）位置にある細胞である。分化プロセスに適用された際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合への分化を続け、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化したり、又は低分化細胞型に戻ったりすることができない地点まで、分化経路において進行した細胞を指す。「脱分化」は、細胞が細胞系統内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系統は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。ある細胞の系統とは、所定の発生及び分化の遺伝体系内にその細胞を位置付けるものである。系統特異的マーカーとは、対象とする系統の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、未拘束の細胞の、対象とする系統への分化を評価するために使用することができる。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。これに関して、差異的発現とは、未分化細胞と比べて、陽性マーカーについては増大したレベルを意味し、陰性マーカーについては減少したレベルを意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。
【００３２】
本明細書で使用するとき、細胞は、特異的マーカーが細胞内で検出されたとき、特異的マーカー「について陽性」又は「陽性」である。同様に、細胞は、特異的マーカーが細胞内で検出されないとき、特異的マーカー「について陰性」又は「陰性」である。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「細胞密度」及び「播種密度」は、本明細書では互換的に使用され、平面基材又は湾曲基材の単位面積あたりに播種される細胞の数を指す。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「ステージ１」及び「Ｓ１」は、胚体内胚葉（ＤＥ）に特徴的なマーカーを発現する細胞を同定するために互換的に使用される。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を有する細胞を指す。胚体内胚葉細胞  は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する：ＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「腸管」は、以下のマーカーのうちの少なくとも一つを発現する胚体内胚葉に由来する細胞を指す：ＨＮＦ３β、ＨＮＦ１β、又はＨＮＦ４α。腸管細胞は、肺、肝臓、膵臓、胃、腸などの全ての内胚葉臓器を生じさせ得る。
【００３７】
本明細書で使用するとき、原腸管に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定する「ステージ２」及び「Ｓ２」は互換的に使用される。
【００３８】
「前腸内胚葉」とは、食道、肺、胃、肝臓、膵臓、胆嚢、十二指腸の一部を生じさせる内胚葉細胞を指す。
【００３９】
「後方前腸」は、後方胃、膵臓、肝臓、及び十二指腸の一部を生じさせることができる内胚葉細胞を指す。
【００４０】
「中腸内胚葉」は、腸、十二指腸の一部、虫垂、及び上行結腸を生じさせることができる内胚葉細胞を指す。
【００４１】
「後腸内胚葉」は、横行結腸の遠位３分の１、下行結腸、Ｓ状結腸、及び直腸を生じさせることができる内胚葉細胞を指す。
【００４２】
「ステージ３」及び「Ｓ３」の双方は、前腸内胚葉に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。「前腸系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、本明細書で使用するとき、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＦＯＸＡ２、ＣＤＸ２、ＳＯＸ２、及びＨＮＦ４  α。
【００４３】
「ステージ４」及び「Ｓ４」は、膵臓前腸前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「膵臓前腸前駆細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ６、ＦＯＸＡ２、ＰＴＦ１ａ、Ｐｒｏｘ１、及びＨＮＦ４  α。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「ステージ５」及び「Ｓ５」は、膵臓内胚葉及び膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを発現する細胞を特定するために互換的に使用される。本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４  α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＣＤＸ２又はＳＯＸ２を実質的に発現しない。
【００４５】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモンの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド。
【００４６】
「膵内分泌前駆細胞（precursor cel）」又は「膵内分泌前駆細胞（progenitor cell）」は、細胞を発現する膵臓ホルモンになり得る膵臓内胚葉細胞を指す。そのような細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現し得る：ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ−１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、又はＡＲＸ。
【００４７】
本明細書では、「ｄ１」、「ｄ  １」、及び「１日目」、「ｄ２」、「ｄ  ２」、及び「２日目」、「ｄ３」、「ｄ  ３」及び「３日目」等は互換的に使用される。これらの数字の組み合わせは、本願の段階的分化プロトコル中の異なるステージにおけるインキュベーションの日を特定する。
【００４８】
「グルコース」及び「Ｄ−グルコース」は、本明細書で互換的に使用され、天然に一般に見出される糖、デキストロースを指す。
【００４９】
膵内分泌前駆細胞において発現されるタンパク質及びそれをコードする遺伝子を特定する「ＮｅｕｒｏＤ」及び「ＮｅｕｒｏＤ１」は、本明細書で互換的に使用される。
【００５０】
「ＬＤＮ」及び「ＬＤＮ−１９３１８９」は本明細書で互換的に使用され、米国カリフォルニア州のＳｔｅｍｇｅｎｔから入手可能なＢＭＰ受容体を示す。
【００５１】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞は、段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現する（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５〜１１４７）。インビトロでの多能性細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現の消失をもたらす。未分化多能性幹細胞は、一般にアルカリホスファターゼ活性を有し、これは、製造業者（カリフォルニア州Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により説明されているように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、基質としてＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄを使用して発色させることにより検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。
【００５２】
増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉のすべて、即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化する能力である。幹細胞の多能性は、例えば、細胞をＳＣＩＤマウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して、形成された奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００５３】
増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体がすべて揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。多能性細胞は、様々なフィーダー層を用いて、又はマトリックスタンパク質被覆した容器を用いて、容易に培養で増殖させることができる。あるいは、ｍＴｅｓｒ（登録商標）１培地（カナダ、ＶａｎｃｏｕｖｅｒのＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のような既知組成の培地と組み合わせた化学的に既知組成の表面を、細胞のルーチン増殖に用いてもよい。多能性細胞は、酵素で、機械的に、又はＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）など様々なカルシウムキレート剤を用いて、培養プレートから容易に取り出すことができる。あるいは、多能性細胞は、マトリックスタンパク質又はフィーダー層の非存在下で、懸濁液中で増殖させてもよい。
【００５４】
多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば、胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣｓ）又はヒト胚生殖細胞の樹立株であり、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（米国ウィスコンシン州ＭａｄｉｓｏｎのＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などである。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。また、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、及びＺＦＰ４２など多数の多能性に関係する転写因子の強制発現を用いて、成体体細胞から誘導することができる誘導性多能性細胞（ＩＰＳ）又は再プログラム化された多能性細胞も好適である（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，２０１１，１２：１６５〜１８５）。本発明の方法で使用されるヒト胚性幹細胞もまた、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５〜１１４７；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １９９８，３８：１３３〜１６５；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２：７８４４〜７８４８）によって記載されるように調製することができる。
【００５５】
多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。多能性幹細胞のマーカーとして、例えば、以下のもの、即ち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、Ｔｒａ  １−８１の１つ以上の発現が挙げられる。
【００５６】
本発明で用いるのに好適な多能性幹細胞としては、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマーカー、即ち、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４３、ＣＯＮＮＥＸＩＮ４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、及びＴｒａ  １−８１の少なくとも１つを発現する細胞も本発明で用いるのに好適である。
【００５７】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーの少なくとも１つを発現している細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００５８】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４  α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵臓内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーの少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞であり、ＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１の発現はＣＤＸ２及びＳＯＸ２の発現より実質的に高い。
【００５９】
膵内分泌系統に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、及びＰＡＸ６からなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するに好適なものは、膵内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００６０】
本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、即ち、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３  β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、β細胞である。
【００６１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞を培養する方法を詳述し、方法は、ヒト多能性幹細胞を、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種する工程を含む。本発明の一態様では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明の一態様では、細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６２】
一態様では、本発明は、多能性幹細胞を分化させる方法に関する。この方法は、多能性幹細胞を、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で表面上に播種する工程と、次いでこの多能性細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程とを含む。本発明の一態様では、この多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明の一態様では、この胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明の一態様では、この細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６３】
本発明は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種されたヒト胚性多能性幹細胞を分化させることによって、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法に関する。本発明のいくつかの態様では、この細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６４】
一態様では、本発明は、ヒト胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法に関し、方法は、多能性細胞の分化を最大化するのに十分な播種密度で第１の表面上に播種されたヒト胚性多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、分化効率を最大化するのに十分な播種密度で第２の表面上に播種された、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で播種される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種される。いくつかの態様では、ヒト胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法における多能性細胞の使用は、胚性幹細胞を使用する工程を含む。本発明のいくつかの態様では、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６５】
本発明は、多能性幹細胞の分化によって生成された胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる方法に関する。ここでは、多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種されている。本発明のいくつかの実施形態では、使用される多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明のいくつかの実施形態では、使用される胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、この細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６６】
一態様では、本発明は、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法に関し、方法は、多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、この多能性幹細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。本発明のいくつかの態様では、この多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で播種される。本発明のいくつかの態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で播種される。本発明のいくつかの態様では、この多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、この胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、この細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６７】
一態様では、本発明は、膵臓内分泌腺系統の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法に関し、方法は、多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、この多能性幹細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。本発明の一態様では、膵臓内分泌腺系統の指標であるマーカーを発現する細胞を得るために使用される多能性幹細胞は、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で播種される。本発明の一態様では、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度で播種される。本発明のいくつかの態様では、この多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、この胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。本発明のいくつかの態様では、この細胞が播種される表面は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。
【００６８】
一態様では、本発明は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法に関し、方法は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で、表面上に播種する工程と、次に、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現するこの細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む。本発明のいくつかの態様では、本方法で使用される胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現するこの細胞は、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現するヒトの細胞である。本発明のいくつかの態様では、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現するこの細胞は、ヒトのものである。
【００６９】
一態様では、本発明は、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種された胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる工程と、次いでこの胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程とを含む方法に関する。いくつかの態様では、この胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞は、ヒトのものである。いくつかの態様では、この膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞は、ヒトのものである。
【００７０】
本発明は、膵臓の内胚葉及び内分泌腺系統に有効に分化し得るＥＳ細胞の範囲を記載する。
【００７１】
本発明の別の態様は、膵臓の内胚葉及び内分泌腺系統に有効に分化し得るＤＥ細胞の範囲を記載する。
【００７２】
本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
（実施例１）
胚性幹細胞の播種密度は、胚体内胚葉マーカーの発現に大きく影響しない
この実施例は、ＥＳ細胞の初期播種密度が胚体内胚葉系統の細胞の生成に大きく影響を与えるかどうかを理解するために行った。
【００７４】
ヒト胚性幹細胞系Ｈ１（ｈＥＳＣＨ１）の細胞を、種々の継代（４０継代〜５２継代）で採取し、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｏｃｋ阻害剤、カタログ番号Ｙ０５０３、米国ミズリー州のＳｔ．ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）を追補したｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（カナダのＶａｎｃｏｕｖｅｒのＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は１０μＭのＹ２７６３２を追補したＭＥＦ−ＣＭ（調整培地）のいずれか中に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）をコーティングした皿上で、以下の密度で単一細胞として播種した：０．３×１０5細胞／ｃｍ2、０．５×１０5細胞／ｃｍ2、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2、０．９×１０5細胞／ｃｍ2、１×１０5細胞／ｃｍ2、１．２５×１０5細胞／ｃｍ2、１．５×１０5細胞／ｃｍ2、１．８×１０5細胞／ｃｍ2、及び２×１０5細胞／ｃｍ2。播種の４８時間後に、培養物を不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で約３０秒間洗浄し、インキュベートした。培養物を、以下の通りに、胚体内胚葉（ＤＥ）系統に分化させた：
ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−４日）：ステージ１の培地（２％の無脂肪酸ＢＳＡ（カタログ番号６８７００、米国アイオワ州のＡｎｋｅｎｙのＰｒｏｌｉａｎｔ）、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム（カタログ番号Ｓ３１８７、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（カタログ番号３５０５０−０７９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２．５ｍＭのＤ−グルコース（カタログ番号Ｇ８７６９、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１：５００００ＸＩＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８（米国ミネソタ州のＭｉｎｎｅａｐｏｌｉｓのＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び２．５μＭのＭＣＸ化合物（ＧＳＫ３Ｂ阻害剤、１４−Ｐｒｏｐ−２−エン−１−イル−３，５，７，１４，１７，２３，２７−ヘプタアザテトラシクロ［１９．３．１．１〜２，６〜．１〜８，１２〜］ヘプタコサ−１（２５），２（２７），３，５，８（２６），９，１１，２１，２３−ノナエン−１６−オン、米国特許出願公開第２０１０−００１５７１１号、参照によりその全容が本明細書に援用される）を追捕したＭＣＤＢ−１３１培地（カタログ番号１０３７２−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州のＣａｒｌｓｂａｄ））において、細胞を１日培養した。次いで、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、２．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び１：５００００Ｘ  ＴＳ−Ｘを追補したＭＣＤＢ−１３１培地で細胞を更に３日培養した。
【００７５】
ＤＥのステージの終わりに、試料を収集し、リアルタイムＰＣＲ及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により解析した。ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１２６０４）内で、３７℃にて３〜５分間インキュベートすることによって、細胞ｈＥＳＣ誘導細胞を単一細胞懸濁液中に放出させ、その後、血球計算器を用いて、２回計測した。次いで、細胞を染色緩衝液（０．２％のＢＳＡを含有するＰＢＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４６５７）中で２回洗浄した。表面マーカー染色については、１×１０5〜１×１０6個の細胞を、１００μＬのブロッキング緩衝液（染色緩衝液中、１：４希釈した０．５％のヒトγ−グロブリン）に再懸濁させた。直接抱合型一次抗体ＣＤ１８４ＡＰＣ（アロフィコシアニン、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５９７６）、及びＣＤ９  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５３７２）を、１：２０の最終希釈で細胞に加え、４℃で３０分間インキュベートした。染色された細胞をＢＤ染色緩衝液中で２回洗浄し、２００μＬの染色緩衝液に再懸濁させ、続いて、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏでの解析前の生細胞／死細胞の判別のために、１５μＬの７ＡＡＤ中でインキュベートした。
【００７６】
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  カリフォルニア州、Ｖａｌｅｎｃｉａ）で抽出し、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って逆転写した。ｃＤＮＡを、特注のＴａｑｍａｎ  Ａｒｒａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に組み込み済みのＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓを使用して増幅させた。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してデータを解析し、ΔΔＣｔ法を用いて、未分化のヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞に正規化した。全てのプライマーは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【００７７】
図１Ａ〜図１Ｆは、０．３×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ａ）、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｅ）、及び２×１０5細胞／ｃｍ2（図１Ｆ）で播種されたＨ１細胞についてのＣＸＣＲ４（Ｙ軸、ＤＥのマーカー）及びＣＤ−９（Ｘ軸、未分化ＥＳ細胞のマーカー）のＦＡＣＳヒストグラム発現プロファイルを示す。ＣＸＣＲ４及びＣＤ９のパーセント発現を表１に要約する。図１及び表１に示すように、ＣＸＣＲ４のアップレギュレーション及びＣＤ９のダウンレギュレーションによって測定されたように、未分化のＥＳ細胞の初期播種密度は、胚体内胚葉への後続の分化には大きく影響を与えなかった。
【００７８】
【表１】
0006450674.tif 000002
【００７９】
図２Ａ〜図２Ｇは、実施例１に概説される、種々の密度で播種され、その後ＤＥに分化されるヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子、即ち、ＳＯＸ７（図２Ａ）、ＮＡＮＯＧ（図２Ｂ）、ＯＣＴ４（図２Ｃ）、ＡＦＰ（図２Ｄ）、ＳＯＸ１７（図２Ｅ）、ＦＯＸＡ２（図２Ｆ）、及びＣＸＣＲ４（図２Ｇ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析から得たデータを示す。ＦＡＣＳデータと一致して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングされた表面上に種々の密度で播種されたＨ１細胞については、ＤＥのステージで一般的に発現する遺伝子（ＣＸＣＲ４、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２）の間で有意差はなかった。更に、初期播種密度は、胚体外域内胚葉に関連する遺伝子（ＡＦＰ、ＳＯＸ７）及び多能性関連遺伝子（ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇ）に大きな影響を有さなかった。
【００８０】
図３及び図４は、種々の播種密度、即ち、３×１０4細胞／ｃｍ2（図３Ａ及び図４Ａ）、５×１０4細胞／ｃｍ2(図４Ａ及び４Ｂ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図４Ａ及び図４Ｃ）、１×１０5細胞／ｃｍ2、図４Ｄ、図４Ｅ、１．１×１０5細胞／ｃｍ2、図４Ｆ、１．２×１０5細胞／ｃｍ2、図４Ｇ、１．５×１０5細胞／ｃｍ2で播種されたＨ１細胞についてのＤＥの誘導前（図３Ａ〜図３Ｇ）及びＤＥへの分化の開始後４日目（図４Ａ〜図４Ｇ）の位相差画像を示す。図４は、より高い細胞密度で播種された細胞と比べて、＜１×１０５細胞／ｃｍ2で播種された培養物については、有意な形態的な差があったことを明確に示している。しかしながら、この差は、ＤＥに関連する遺伝子／タンパク質における有意差には移行しなかった。この実施例から得たデータは、初期播種密度は、ＤＥに関連するマーカーの発現に大きく影響を及ぼすことはなかったことを強調している。０．３〜２×１０5細胞／ｃｍ2の範囲の密度で播種されたＥＳ細胞の培養物は、ＤＥへの分化において同様な効率を示した。
【００８１】
（実施例２）
胚性幹細胞の播種密度は、膵臓内胚葉及び膵臓内分泌腺マーカーの発現に大きく影響を及ぼす
この実施例は、ＥＳの初期播種密度が、膵臓の内胚葉／内分泌腺培養物の生成に大きく影響を及ぼすかどうかを理解するために行った。
【００８２】
ヒト胚性幹細胞系Ｈ１（ｈＥＳＣＨ１）の細胞を、種々の継代（４０継代〜５２継代）で採取し、１０μＭのＹ２７６３２が追補されたＭＥＦ−ＣＭ（調整培地）中に、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（１：３０の希釈、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州）をコーティングした皿上で、以下の密度で単一細胞として播種した：０．５×１０5細胞／ｃｍ2、０．７５×１０5細胞／ｃｍ2、１×１０5細胞／ｃｍ2、１．５×１０5細胞／ｃｍ2、１．８×１０5細胞／ｃｍ2、及び２×１０5細胞／ｃｍ2。播種の４８時間後に、培養物を不完全なＰＢＳ（Ｍｇ又はＣａを含まないリン酸緩衝生理食塩水）中で約３０秒間洗浄し、インキュベートした。
【００８３】
以下の通りに、培養物を、膵臓の内胚葉／内分泌腺系統に分化させた。
ａ）ステージ１（胚体内胚葉（ＤＥ）−４日）：ステージ１の培地（２％の無脂肪酸ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ、カタログ番号６８７００）、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ３１８７）、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３５０５０−０７９）、２．５ｍＭのＤ−グルコース（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｇ８７６９）、１：５００００Ｘ  ＴＳ−Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び２．５μＭのＭＣＸ化合物を追捕したＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１０３７２−０１９）において、細胞を１日培養した。次いで、２％の無脂肪酸ＢＳＡ、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、２．５ｍＭのＤ−グルコース、１００ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ８、及び１：５００００ＸＩＴＳ−Ｘを追補したＭＣＤＢ−１３１倍地で細胞を更に３日培養した。
ｂ）ステージ２（原腸管−２日）：細胞を、１：５００００Ｘ  ＩＴＳ−Ｘ、０．１％ＡＬＢＵＭＡＸ  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．００１２ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、２．５ｍＭのＤ−グルコース、及び５０ｎｇ／ｍＬを追補したＭＣＤＢ−１３１培地で２日間処理し、次いで
ｃ）ステージ３（前腸−３日）：細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭのグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、０．１％のＡＬＵＢＵＭＡＸ  ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、２０ｎｇ／ｍＬのアクチビン−Ａ、２μＭのＲＡ、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、及び２００ｎＭのＬＤＮ（ＢＭＰ受容体阻害剤、カタログ番号０４−００１９、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、カリフォルニア州）を追補したＭＣＤＢ１３１培地で処理した。
ｄ）ステージ４（膵臓前腸前駆細胞−３日）：細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭのグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、０．１％のＡＬＢＵＭＡＸ  ＢＳＡ、０．２５μＭのＳＡＮＴ−１、５０ｎＭのＴＰＢ（ＰＫＣ活性化剤、カタログ番号５６５７４０、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ニュージャージー州のＧｉｂｓｔｏｗｎ）、２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、２μＭのＡＬｋ５阻害剤（ＳＤ−２０８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２００７、７２：１５２−１６１に開示されている）、及び１００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤（Ｎ−｛４−［２−エチル−１−（１Ｈ−１、２、４−トリアゾル−１−イル）ブチル］フェニル｝−１、３−ベンゾチアゾール−２−アミン、ベルギー、Ｊａｎｓｓｅｎ）を追補したＭＣＤＢ１３１培地で３日間処理した。
ｅ）ステージ５（膵臓内胚葉／内分泌腺−３日）：ステージ４の細胞を、ＩＴＳ−Ｘの１：２００希釈、２０ｍＭのグルコース、１Ｘ  ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、０．００１５ｇ／ｍＬの重炭酸ナトリウム、０．１％のＡＬＢＵＭＡＸ  ＢＳＡ、２００ｎＭのＬＤＮ−１９３１８９、１００ｎＭのＣＹＰ２６Ａ阻害剤、及び２μＭのＡＬｋ５阻害剤を追補したＭＣＤＢ１３１培地で３日間処理した。
【００８４】
ステージ５の終わりに、関連する膵臓内胚葉遺伝子のＰＣＲ分析用のｍＲＮＡに加えて、全ての試験された細胞密度について位相差画像を取得した。図５Ａ〜図５Ｆは、ＥＳ細胞の種々の細胞密度、即ち、５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ａ）、７．５×１０4細胞／ｃｍ2（図５Ｂ）、１×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｃ）、１．５×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｄ）、１．８×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｅ）及び２．０×１０5細胞／ｃｍ2（図５Ｆ）で初期に播種されたステージ５の培養物の位相差画像を示す。１×１０5細胞／ｃｍ2未満の密度で播種された培養物から分化させた培養物の劇的な異種性は、ＥＳ細胞の初期細胞密度が後のステージの培養物の形態に大きく影響を及ぼすことを示唆している。特に、１．５×１０5細胞／ｃｍ2よりも高い密度で初期播種された培養物から分化させた細胞は、培養皿の区域全体で均一の形態を示した。
【００８５】
図６Ａ〜図６Ｊは、実施例２に概説した、種々の密度で播種され、その後ステージ５に
分化されたヒト胚性幹細胞系Ｈ１の細胞中の以下の遺伝子、即ち、ＺＩＣ１（図６Ａ）、
ＣＤＸ２（図６Ｂ）、ＰＤＸ−１（図６Ｃ）、ＮＫＸ６．１（図６Ｄ）、ＮＫＸ２．２（
図６Ｅ）、ＮＧＮ３（図６Ｆ）、ＮＥＵＲＯＤ（図６Ｇ）、インスリン（図６Ｈ）ＨＮＦ
４ａ（図６Ｉ）、及びＰＴＦ１ａ（図６Ｊ）の発現のリアルタイムＰＣＲ分析からのデー
タを示す。実施例１で観察された影響とは異なり、初期播種密度は、膵臓の内胚葉／内分
泌腺マーカーの発現に劇的に影響を与えた。特に、１〜１．５×１０5細胞／ｃｍ2未満の
初期播種密度による培養物から分化させた細胞は、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３
、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、及びインスリンの発現における著しい下降を示したが、
一方内胚葉マーカーＺＩＣ１及び後方腸管マーカー、ＣＤＸ２のアップレギュレーション
を示した。実施例１からのデータに加えてこのデータは、ＣＸＣＲ４及び他のＤＥ関連遺
伝子の高い発現が、膵臓の内胚葉／内分泌腺遺伝子の生成の予測ではないことを明確に強
調する。初期播種密度は、膵臓の内胚葉／内分泌腺細胞の効率を制御する上での重要な変
数であると考えられる。
本出願は、例えば以下の発明を提供する。
[１]  多能性幹細胞を培養する方法であって、前記多能性幹細胞を、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種する工程を含む、方法。
[２]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[１]に記載の方法。
[３]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[２]に記載の方法。
[４]  前記多能性幹細胞が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む表面上に播種される、[１に記載の方法。
[５]  多能性幹細胞を分化させる方法であって、前記多能性幹細胞を、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種する工程と、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[６]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[５]に記載の方法。
[７]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[６]に記載の方法。
[８]  前記多能性幹細胞が播種される前記表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[５]に記載
の方法。
[９]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[５]に記載の方法。
[１０]  胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、多能性幹細胞を、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程を含む方法であり、前記多能性幹細胞が、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種されている、方法。
[１１]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[１０]に記載の方法。
[１２]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[１１]に記載の方法。
[１３]  前記多能性幹細胞が播種される前記表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[１０]に記載の方法。
[１４]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[１０]に記載の方法。
[１５]  胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞の分化効率を最大化するのに十分な播種密度で、第１の表面上に播種する工程と、前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞の分化効率を最大化するのに十分な密度で播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[１６]  前記多能性幹細胞が、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で前記第１の表面上に播種される、[１５]に記載の方法。
[１７]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で第２の表面上に播種される、[１５]に記載の方法。
[１８]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[１５]に記載の方法。
[１９]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[１８]に記載の方法。
[２０]  前記第１の表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[１５]に記載の方法。
[２１]  前記第２の表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[１５]に記載の方法。
[２２]  前記第１の表面と前記第２の表面が同一表面である、[１５]に記載の方法。
[２３]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[１５]に記載の方法。
[２４]  前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[１５]に記載の方法。
[２５]  胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、多能性幹細胞を胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法であり、前記多能性幹細胞が、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種されている、方法。
[２６]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[２５]に記載の方法。
[２７]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[２６]に記載の方法。
[２８]  前記表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[２５]に記載の方法。
[２９]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[２５]に記載の方法。
[３０]  前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[２５]に記載の方法。
[３１]  膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、
ａ）多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、
ｂ）前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ）前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[３２]  前記多能性幹細胞が、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種される、[３１]に記載の方法。
[３３]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で播種する工程を更に含む、[３１]に記載の方法。
[３４]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[３１]に記載の方法。
[３５]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[３４]に記載の方法。
[３６]  前記表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[３１]に記載の方法。
[３７]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[３１]に記載の方法。
[３８]  前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[３１]に記載の方法。
[３９]  膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞を得る方法であって、
ａ）多能性幹細胞を表面上に播種する工程と、
ｂ）前記多能性幹細胞を、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、
ｃ）前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[４０]  前記多能性幹細胞が、約０．８×１０5細胞／ｃｍ2〜約３．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で播種される、[３９]に記載の方法。
[４１]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で播種する工程を更に含む、[３９]に記載の方法。
[４２]  前記多能性幹細胞が胚性幹細胞である、[３９]に記載の方法。
[４３]  前記胚性幹細胞がヒト胚性幹細胞である、[４０]に記載の方法。
[４４]  前記表面が、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含む、[３９]に記載の方法。
[４５]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[３９]に記載の方法。
[４６]  前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[３９]に記載の方法。
[４７]  胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を分化させる方法であって、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[４８]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[４７]に記載の方法。
[４９]  前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[４７]に記載の方法。
[５０]  胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる方法であって、胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、約１．５×１０5細胞／ｃｍ2〜約５．０×１０5細胞／ｃｍ2の播種密度で表面上に播種する工程と、前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞を、膵臓内分泌腺の指標であるマーカーを発現する細胞に分化させる工程と、を含む方法。
[５１]  前記胚体内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[５０]に記載の方法。
[５２]  前記膵臓内胚葉の指標であるマーカーを発現する細胞が、ヒトのものである、[５０]に記載の方法。
[５３]  ヒト胚性幹細胞と比べる場合、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、及びインスリンから選択される少なくとも１つのマーカーの発現において下降を示し、並びにＺＩＣ１及びＣＤＸ２のアップレギュレーションを示す、ヒト胚性幹細胞からインビトロで分化させた細胞の集団であって、前記ヒト胚性幹細胞が、５×１０5細胞／ｃｍ2未満の播種密度で表面上に播種される、細胞の集団。

【図１Ａ】
0006450674.tif 000003
【図１Ｂ】
0006450674.tif 000004
【図１Ｃ】
0006450674.tif 000005
【図１Ｄ】
0006450674.tif 000006
【図１Ｅ】
0006450674.tif 000007
【図１Ｆ】
0006450674.tif 000008
【図２Ａ】
0006450674.tif 000009
【図２Ｂ】
0006450674.tif 000010
【図２Ｃ】
0006450674.tif 000011
【図２Ｄ】
0006450674.tif 000012
【図２Ｅ】
0006450674.tif 000013
【図２Ｆ】
0006450674.tif 000014
【図２Ｇ】
0006450674.tif 000015
【図３Ａ】
0006450674.tif 000016
【図３Ｂ】
0006450674.tif 000017
【図３Ｃ】
0006450674.tif 000018
【図３Ｄ】
0006450674.tif 000019
【図３Ｅ】
0006450674.tif 000020
【図３Ｆ】
0006450674.tif 000021
【図３Ｇ】
0006450674.tif 000022
【図３Ｈ】
0006450674.tif 000023
【図４Ａ】
0006450674.tif 000024
【図４Ｂ】
0006450674.tif 000025
【図４Ｃ】
0006450674.tif 000026
【図４Ｄ】
0006450674.tif 000027
【図４Ｅ】
0006450674.tif 000028
【図４Ｆ】
0006450674.tif 000029
【図４Ｇ】
0006450674.tif 000030
【図５Ａ】
0006450674.tif 000031
【図５Ｂ】
0006450674.tif 000032
【図５Ｃ】
0006450674.tif 000033
【図５Ｄ】
0006450674.tif 000034
【図５Ｅ】
0006450674.tif 000035
【図５Ｆ】
0006450674.tif 000036
【図６Ａ】
0006450674.tif 000037
【図６Ｂ】
0006450674.tif 000038
【図６Ｃ】
0006450674.tif 000039
【図６Ｄ】
0006450674.tif 000040
【図６Ｅ】
0006450674.tif 000041
【図６Ｆ】
0006450674.tif 000042
【図６Ｇ】
0006450674.tif 000043
【図６Ｈ】
0006450674.tif 000044
【図６Ｉ】
0006450674.tif 000045
【図６Ｊ】
0006450674.tif 000046