(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
外傷性ニューロパチー又は機械的な神経侵襲を罹患する被験体において神経再生を促進又は改善するための、バクロフェン又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体と、ソルビトール又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体と、ナルトレキソン又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体とを含む組成物。
【請求項２】
バクロフェン又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体と、Ｄ−ソルビトール又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体と、ナルトレキソン又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体とを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
医薬的に許容可能な賦形剤又は担体を更に含む、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
前記化合物が、薬剤溶出ポリマー、生体分子、ミセル又はリポソーム形成の脂質又は水中油型エマルジョン、或いは、経口若しくは非経口又は髄腔内投与のためのペグ化された又は固体のナノ粒子又はマイクロ粒子を用いて製剤化された、請求項１〜３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
バクロフェン又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体と、ソルビトール又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体と、ナルトレキソン又はその塩、鏡像異性体若しくはラセミ体とが、一緒に又は別々に、同時に又は連続的に投与されるように製剤化された、請求項１〜４のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
神経再生を改善することが、前記機械的な神経侵襲又は外傷性ニューロパチーからの回復を改善又は加速することを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
神経再生を改善することが、神経ミエリン形成を改善すること、又は、少なくとも部分的に、軸索形態、軸索成長若しくは電気生理学的機能を回復することを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
前記機械的な神経侵襲が、神経遮断、軸索断裂又は神経断裂である、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
前記機械的な神経侵襲が、外傷性脳損傷、脊髄損傷、又は末梢神経の機械的損傷からなる、請求項１〜７のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シャルコ−マリートゥース病及び関連障害、特に機械的な神経侵襲の処置のための組成物及び方法に関する。
【０００２】
シャルコ−マリートゥース病（「ＣＭＴ」）は、希少な遺伝性末梢性の多発性ニューロパチーである。約２，５００人中１人に罹患し、この疾患は、末梢神経系の最も一般的な遺伝性障害である。その発症は、典型的には、一生のうち１０歳まで又は２０歳までに起こるが、それは乳児期に検出されうる。疾患の経過は慢性的であり、段階的な神経筋変性を伴う。疾患は身体障害を起こし、神経疼痛及び極度の筋肉障害を随伴する症例がある。ＣＭＴは、最も良く研究された遺伝的病理の１つであり、フランスにおいて約３０，０００症例がある。ＣＭＴ患者の大半が、ミエリン遺伝子ＰＭＰ２２（ＣＭＴ１Ａから）を含む１７番染色体断片の重複を持ち、二十数個の遺伝子が、異なる形態のＣＭＴに関与している。したがって、元来は単一遺伝子性であるが、この病理は、モジュレーター遺伝子に起因する臨床的な不均一性が生じている可能性がある。ＣＭＴ患者において変異している遺伝子は、堅固に関連した分子経路の周辺に密集しており、シュワン細胞又はニューロンの分化に影響を及ぼす、或いは、末梢神経においてこれらの細胞の相互作用を変化させる。
【０００３】
（ＣＭＴ１Ａ疾患の分子機構及び病理学的所見を記載する）公的に入手可能なデータの検索によって、本発明者らは、少数の機能的細胞モジュール（ＰＭＰ２２遺伝子の転写調節、ＰＭＰ２２タンパク質のフォールディング／分解、シュワン細胞の増殖及びアポトーシス、ニューロンの死、細胞外マトリクス沈着及びリモデリング、免疫応答）を、ＣＭＴ関連治療介入のための潜在的で正当な標的として優先順位をつけることができた。シャルコ−マリートゥースの病理学的所見の発症及び進行に対するこれらの無秩序な機能的モジュールの複合的影響によって、ＣＭＴ併用処置の潜在的な薬効が正当化される。
【０００４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６４５７には、病理の動的モデルを構築し、ＣＭＴ病の調節において関連する機能的な細胞経路を標的化することにより、シャルコ−マリートゥース病の処置のための薬物候補を同定する方法が記載される。
【０００５】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６４５７にはシャルコ−マリートゥース病の処置のための組成物が記載され、複数の薬物候補の群より選択される少なくとも２つの化合物を含む。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、特定の薬物の組み合わせを使用した、ＣＭＴ及び関連障害、特に外傷性ニューロパチーを処置するための新たな併用療法を提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、より具体的には、哺乳動物の被験体に対する同時、別々、又は連続投与のための、バクロフェン、ソルビトール、ならびに、ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、ラパマイシン、フルルビプロフェン、及びケトプロフェン、それらの塩又はプロドラッグより選択される化合物を含む組成物に関する。
【０００８】
本発明の特定の目的は、哺乳動物の被験体に対する同時、別々、又は連続投与のための、バクロフェン、ソルビトール、及びナルトレキソンを含む組成物に関する。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、１つ又はいくつかの医薬的に許容可能な賦形剤又は担体をさらに含む、上に開示する組成物（即ち、医薬的組成物）である。
【００１０】
本発明の別の目的は、機械的な神経侵襲又は外傷性ニューロパチーを処置するための、上に開示する組成物に関する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、機械的な神経侵襲又は外傷性ニューロパチーの処置用の医薬の製造のための、上に開示する化合物の併用に関する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、外傷性ニューロパチー又は機械的な神経侵襲を処置するための方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に定義する組成物の効果的な量を投与することを含む。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、医薬的組成物を調製する方法であって、方法が、上の化合物を、適切な賦形剤又は担体中で混合することを含む。
【００１４】
本発明のより具体的な目的は、外傷性ニューロパチー又は機械的な神経侵襲を罹患する被験体において神経再生を促進又は改善する方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００１５】
本発明のさらなる具体的な目的は、外傷性ニューロパチーを有する被験体において神経再生を促進する方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００１６】
本発明の別の目的は、外傷性ニューロパチーを処置する際での使用のための、上に開示する組成物に関する。
【００１７】
本発明のさらなる特定の目的は、それを必要とする被験体において神経再生を促進又は改善する方法であって、方法が、前記被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００１８】
本発明のさらなる特定の目的は、それを必要とする被験体において神経ミエリン形成を促進又は改善する方法であって、方法が、前記被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００１９】
本発明のさらなる特定の目的は、それを必要とする被験体において軸索の形態、成長、又は電気生理学的機能を回復する方法であって、方法が、前記被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００２０】
本発明は、神経遮断、軸索断裂（ａｘｏｎｏｍｅｔｓｉｓ）、又は神経断裂を有する被験体、ならびに外傷性脳損傷、脊髄損傷、又は末梢神経の機械的損傷を有する被験体を処置するために特に適する。
【００２１】
本明細書中に開示する処置の種々の使用又は方法のいずれかは、また、機械的侵襲を有するとして患者を診断する任意の工程を含むことができる。
【００２２】
この点において、本発明のさらなる目的は、機械的な神経損傷を処置する方法であって、方法は、（１）被験体が機械的な損傷を有するか否かを評価すること、及び（２）機械的な傷害を有する被験体を、上に記載する化合物の組み合わせの効果的な量を用いて処置することを含む。被験体が機械的な神経損傷を有するか否かを決定することは、当技術分野においてそれ自体が公知の種々のテストにより行うことができる。
【００２３】
本発明は、任意の哺乳動物の被験体、特にヒト被験体において使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】薬物の組み合わせの相乗効果、用量１：ＭＢＰ発現に対するＡ）Ｍｉｘ７（用量１、１０日目）、Ｂ）Ｄソルビトール（ＳＲＢ、５００μM、１０日目）、Ｃ）（Ｒ／Ｓ）バクロフェン（ＢＣＬ、５μM、１０日目）、及びＤ）ナルトレキソン（ＮＴＸ、５μM、１０日目）の効果。＊：ｐ＜０．０５：コントロール（＝アスコルビン酸）と有意差あり（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定）；ｎｓ：統計的差なし。
【図２】薬物の組み合わせの相乗効果、用量６：ＭＢＰ発現に対するＡ）Ｍｉｘ７（用量６、１０日目）、Ｂ）ＳＲＢ（１６０nM、１０日目）、Ｃ）ＢＣＬ（１．６nM、１０日目）、及びＤ）ＮＴＸ（１．６nM、１０日目）の効果。＊：ｐ＜０．０５：コントロール（＝アスコルビン酸）と有意差あり（一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定）；ｎｓ：統計的差なし。
【図３】ＰＭＰ２２  ＴＧ同時培養中のアスコルビン酸との同時インキュベーションにおけるＭＢＰ発現に対するＭｉｘ７（７用量）Ａ）（１０日目）及びＢ）（１１日目）のポジティブ効果（コントロール（＝アスコルビン酸）のパーセンテージ）。一元配置ＡＮＯＶＡ、それに続くフィッシャーのｐｏｓｔ−ｈｏｃ検定。
【図４】雄ラットに対するＭｉｘ１を用いた３及び６週間の処理のポジティブ効果（バーテストを使用して測定）。潜時を、テストの２つの最初のアッセイの平均値として測定した（白色バーは、プラセボを用いて処置されたコントロールラットを示す；黒色バーは、プラセボを用いて処置されたトランスジェニックラットを示す；灰色バーは、Ｍｉｘ１を用いて処置されたトランスジェニックラットを示す（＊＊ｐ＜０．０１）。統計は、スチューデントの両側検定を用いて実現する）。
【図５】雄ラットの歩行に対するＭｉｘ１組成物を用いた３及び６週間（それぞれ左及び右のグラフ）処理のポジティブ効果（白色バーは、円滑歩行を示す；灰色バーは、非円滑歩行を示す；黒色バーは、重度の歩行不能を伴うラット示す。統計は、スチューデントの両側検定を用いて実現する）。
【図６】雄ラットに対する、傾斜板テスト（２５°）を使用した、ラットにおけるＭｉｘ１組成物のポジティブ効果。ラットを、３、６、９、及び１２週間の処置後に調べた（白色バーは、プラセボを用いて処置されたコントロールラットを示す；黒色バーは、プラセボを用いて処置されたトランスジェニックラットを示す；灰色バーは、Ｍｉｘ１を用いて処置されたトランスジェニックラットを示す（＊＊ｐ＜０．０５）。統計は、スチューデントの両側検定を用いて実現する）。
【図７】雌ラットに対する、傾斜板テストを使用した、ラットにおけるＭｉｘ２組成物を用いた３週間の処置のポジティブ効果（白色バーは、プラセボを用いて処置されたコントロールラットを示す；黒色バーは、プラセボを用いて処置されたトランスジェニックラットを示す；灰色バーは、Ｍｉｘ２を用いて処置されたトランスジェニックラットを示す（＊＊ｐ＜０．０１）。統計は、スチューデントの両側検定を用いて実現する）。
【図８】雄ラットに対する、オキサリプラチン誘発性ニューロパチーに対するＭｉｘ１の保護効果（白色バーは、プラセボを用いて処置された野生型ラットを示す；黒色バーは、参照産物ガバペンチンを用いて処置された野生型ラットを示す；灰色バーは、Ｍｉｘ１を用いて処置された野生型ラットを示す（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。統計は、スチューデントの両側検定を用いて実現する）。
【図９】ＰＭＰ２２トランスジェニックラットと比較した、処置されたトランスジェニック動物におけるｐｍｐ２２  ＲＮＡ発現の有意な減少（Ｍｉｘ７用量３を用いた９週間の処置後に観察された）（参照遺伝子としてＭＰＺ、Sereda et al, 1996）（ｐ＝０．００１５）。トランスジーン組込み及びｐｍｐ２２遺伝子の過剰発現も確認されている；トランスジェニックＰＭＰ２２ラットにおけるｐｍｐ２２  ＲＮＡは、それらの野生型同腹仔コントロールと比較して、１．８倍過剰発現していた（ｐ＜１．１０−４）。ｐｍｐ２２  ＲＮＡの抽出は、１６週齢の雄ラット（野生型についてｎ＝１８、トランスジェニックラットについてｎ＝２０、及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧについてｎ＝１８）の坐骨神経で実施した。統計分析を、Ｗｅｌｃｈのｔ検定を使用することにより実施した。
【図１０】クラスタリング分析を、３５°での傾斜板テストスコアで実施し、不良な、中程度の、及び良好な成績クラスにおいて全ての評価時点（３、６、及び９週間の処置（一緒に分析された））で分布させた。有意差をＷＴとＴＧプラセボの間で観察した：ＷＴの６８％が良好な成績群に属し、ＴＧプラセボのわずか５％がこの群に属した（ｐ＝０．０００３）。Ｍｉｘ７用量２及び用量３によってＴＧラットの成績が改善された。統計分析を、５％有意水準で傾向検定を適用することにより実施した（ＷＴプラセボラットについてｎ＝１８、ＴＧプラセボラットについてｎ＝２０、Ｍｉｘ７用量２を用いて処置されたＴＧについてｎ＝１７、及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧについてｎ＝１８）。
【図１１】Ｍｉｘ７用量３を用いた９週間の処置後でのバーテストにおけるＴＧラットの落下潜時を、サンドイッチ分散推定量を伴うＣｏｘモデルを使用して分析し、５％有意水準でログランク検定を適用することにより参照ＴＧプラセボと比較した。Ｍｉｘ７用量３は、９週間の処置後に、ＴＧラットの落下潜時を有意に増加させた。
【図１２】Ｍｉｘ７用量３を用いて９週間にわたり毎日処置された野生型、トランスジェニックプラセボ、及びトランスジェニック動物の群の握力を、処置後の全ての時間（３、６、及び９週間）にわたりサンドイッチ分散推定量を伴うＣｏｘモデルを使用してモデル化し、５％有意水準でログランク検定を適用することにより参照ＴＧプラセボと比較した。トランスジェニックプラセボラット（黒色の平坦線、ｎ＝２１）の前肢の握力での有意な減少が、ＷＴラット（灰色の平坦線、ｐ＝１．４５．１０−５、ｎ＝１９）と比較して観察された。Ｍｉｘ７用量３を用いた処置によって、前肢の力が有意に増加した（黒色の破線；ｐ＝０．０３、ｎ＝１８）。
【図１３】ピアソン相関検定によって、バーテストにおける落下潜時（９週間の処置後）とｐｍｐ２２  ＲＮＡ発現レベルの間に有意な相関が示された：ｐ＝１，６．１０−４（ＷＴ、ＴＧプラセボ、及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧ（一緒に分析された））；ｐ＝０，０７（ＴＧプラセボ及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧ（一緒に分析された））。ｐｍｐ２２  ＲＮＡ発現が低いほど、バーテスト成績は良好であった。雄ラットは１６週齢であった（ＷＴラットについてｎ＝１８、白色丸；ＴＧプラセボについてｎ＝２０、黒色丸、及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧについてｎ＝１８、白色三角）。
【図１４】ピアソン相関検定によって、バーテストにおける落下潜時（９週間の処置後）と感受性神経の伝導速度（ＮＣＶ）の間に有意な相関が示された：ｐ＝１，３４．１０−６（ＷＴ、ＴＧプラセボ、及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧ（一緒に分析された））及びｐ＝０，０４（ＴＧプラセボ及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧ（一緒に分析された））。伝導速度が高いほど、バーテストでの成績は良好であった。雄ラットは１６週齢であった（ＷＴラットについてｎ＝１８、白色丸；ＴＧプラセボについてｎ＝２０、黒色丸、及びＭｉｘ７用量３を用いて処置されたＴＧについてｎ＝１８、白色三角）。
【図１５】神経挫滅マウスのＭｉｘ７（用量３）処置によって、神経生理学が回復し、軸索及びミエリンの完全性が改善される。Ａ）Ｍｉｘ７を用いた３週間の経口処置によって、坐骨神経挫滅雄マウス（各々の偽、挫滅／溶媒、及び挫滅／Ｍｉｘ７群についてｎ＝１０）のＣＭＡＰ（坐骨神経／腓腹筋）の振幅が増加した。Ｂ）Ｍｉｘ７を用いた６週間の経口処置によって、軸索内径サイズが有意に改善した。Ｃ）挫滅マウスにおける軸索直径に従ったＧ比率の分布（内側軸索直径と全外側−軸索及びミエリン−直径の比率）は、より小さな軸索のミエリン過形成及びより大きな軸索のミエリン形成不全を示した。Ｍｉｘ７を用いた６週間の経口処置によって、挫滅マウスのＧ比の分布は有意に改善された（Ｂ）およびＣ）、各々の群ｎ＝６）（ｔ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊  ＊＊ｐ＜０．００１）。全てのデータを平均値＋ＳＥＭとして示す。
【図１６】Ｍｉｘ７は、１２ヶ月間の治験において、ＣＭＴ１Ａ患者における神経障害を有意に改善させた（Ｐ＜０．０５）（平均値±ｓ．ｅ．ｍ）。Ｍｉｘ７処置群（実線）において、ＯＮＬＳは、ベースラインスコアと比較した場合、１０％以上改善されたのに対し、プラセボ群（点線）において、ＯＮＬＳは、ベースラインスコアと比較した場合、約５％減少した。
【図１７】神経挫滅マウスのＭｉｘ７処置によって、機能的挙動が回復される。Ａ）手術されたマウスは、罹患した足を適切に下に置き、正常な動作を実行することができず、表面負荷比の減少を招く。Ｂ）Ｍｉｘ７（バクロフェン（ＢＣＬ）６００μg/kg、ナルトレキソン（ＮＴＸ）７０μg/kg、Ｄソルビトール（ＳＲＢ）２１mg/kg）によって、１３日間の処置後、この機能的欠陥を完全に正常化することができるのに対し、単一薬物は、表面負荷比に対する効果を有さない（Ｃ）、Ｄ）、Ｅ））。各々の群ｎ＝１０。（データは、平均値＋ｓ．ｅ．ｍとして示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対挫滅溶剤（ｔ検定）；ｎｓ：有意ではない）。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＣＭＴ又はＣＭＴ関連障害を処置するための新たな治療的アプローチを提供する。本発明は、そのような疾患の効果的な補正を許し、任意の哺乳動物の被験体において使用してもよい新規の薬物の組み合わせを開示する。
【００２６】
本発明の文脈内で、ＣＭＴは、ＣＭＴ１Ａ、ＣＭＴ１Ｂ、ＣＭＴ１Ｃ、ＣＭＴ１Ｄ、ＣＭＴ１Ｘ、ＣＭＴ２Ａ、ＣＭＴ２Ｂ、ＣＭＴ２Ｄ、ＣＭＴ２Ｅ、ＣＭＴ２−Ｐ０、ＣＭＴ４Ａ、ＣＭＴ４Ｂ１、ＣＭＴ４Ｂ２、ＣＭＴ４Ｄ、ＣＭＴ４Ｆ、ＣＭＴ４、又はＡＲ−ＣＭＴ２Ａ、より好ましくはＣＭＴ１ａを含む。
【００２７】
本発明の文脈内で、用語「ＣＭＴ関連障害」は、異常なミエリン形成及びニューロンの喪失に導く、ＰＭＰ２２の異常発現に関連付けられる他の疾患を指定する。用語「ＣＭＴ関連障害」は、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＡＤ型の老人性痴呆症（ＳＤＡＴ）、パーキンソン病、  Ｌｅｗｉｓ体痴呆症、血管性痴呆症、自閉症、軽度認知障害（ＭＣＩ）、加齢関連の記憶障害（ＡＡＭＩ）及び加齢に関連付けられる問題、脳炎後パーキンソニスム、統合失調症、欝病、双極性疾患及び他の気分障害、ハンチントン病、運動ニューロン疾患（筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む）、多発性硬化症、緑内障、ギラン・バレー症候群、薄束軸索ジストロフィー、ニューロパチー（特発性ニューロパチーを含む）、糖尿病性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー（薬物処置により誘発されたニューロパチーを含む）、ＨＩＶ  、放射線、重金属、及びビタミン欠乏状態により引き起こされるニューロパチー及び痴呆症、又は外傷性ニューロパチー（例、機械的な神経侵襲に起因する）、プリオンベースの神経変性（クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）を含む）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）、ＧＳＳ、ＦＦＩ、クールー、及びアルパース症候群を含む。
【００２８】
好ましい実施形態において、「ＣＭＴ関連障害」は、中毒性又は外傷性ニューロパチー、特に薬物誘発性ニューロパチー、ＡＬＳ又は機械的ニューロン侵襲に起因するニューロパチーを指定する。
【００２９】
本発明の文脈内において、「機械的な神経侵襲」は、中枢神経系（ＣＮＳ）又は末梢神経系（ＰＮＳ）のいずれかにおける、神経への直接的な物理的傷害に指す。ＰＮＳへの傷害は、神経侵襲の段階に従ってランク付けすることができる。本発明は、神経遮断（神経のシグナリング能力だけが損なわれている状態）、軸索断裂（神経の周囲結合組織を損なうことのない、軸索への傷害を意味する損傷）、及び、また、神経断裂（軸索及び周囲組織の両方を傷害する損傷）からランク付けする、神経損傷を処置するために適している。機械的な神経侵襲は、偶発的な由来を有しうる、又は手術から、若しくは他の状態、例えば、出産に関連付けられる尿失禁に起因しうる。
【００３０】
ＣＮＳへの傷害は、脊髄損傷、ならびに外傷性脳損傷を包含する。外傷性脳損傷は、一次（即ち、外傷から直接的に起因する）又は二次（即ち、外傷の結果である）のいずれかの損傷でありうる。脊髄損傷は、International Standards for Neurological Classification of Spinal Cord Injury(Kirshblum et al., 2011）において設定される通り、感覚及び運動障害の程度に従ってランク付けすることができる。
【００３１】
本明細書において使用する通り、障害の「処置」は、障害により引き起こされる疼痛の治療、防止、予防、遅延、又は低下を含む。用語「処置」は、特に、疾患進行及び関連症状の制御を含む。特に、本発明に従ったＣＭＴ又は関連する神経障害の処置は、そのような疾患により起こされる運動障害、自律神経障害、及び／又は感覚障害における防止又は遅延又は減少又は改善を含む。運動症状は、制御不能な収縮、束形成の脆弱性、又は損傷した神経による神経支配筋の完全な不応答性を含む。自律神経症状は、心血管系、発汗促進、体温調節、尿、胃腸、及び／又は生殖器系に影響しうる。感覚症状は、疼痛、しびれ、又は損傷した神経による神経支配領域における感覚の喪失を含む。
【００３２】
「神経再生」は、ミエリン形成、軸索成長の促進及び／又は神経の形態学的若しくは機能的特性のいずれかの回復を包含する。
【００３３】
また、用語「化合物」は、本願において具体的に命名される化学的化合物、ならびに許容可能なその塩、水和物、エステル、エーテル、異性体、ラセミ体、抱合体、プロドラッグを伴う任意の医薬的組成物を指定する。本願において列挙する化合物は、また、その対応するＣＡＳナンバーを用いて同定されうる。
【００３４】
このように、本発明において使用する好ましい化合物は、バクロフェン（ＣＡＳ  １１３４−４７−０）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体である；ソルビトール（ＣＡＳ  ５０−７０−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体；ナルトレキソン（ＣＡＳ  １６５９０−４１−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体；ミフェプリストン（ＣＡＳ  ８４３７１−６５−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体；ピロカルピン（ＣＡＳ  ５４−７１−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体；メチマゾール（ＣＡＳ  ６０−５６−０）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体；ケトプロフェン（ＣＡＳ  ２２０７１−１５−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体；フルルビプロフェン（５１０４−４９−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体ならびにラパマイシン（ＣＡＳ  ５３１２３−８８−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、ラセミ体、プロドラッグ、及び誘導体である。
【００３５】
本発明において使用するさらなる化合物は、アセタゾラミド（ＣＡＳ  ５９−６６−５）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体である；アルブテロール（ＣＡＳ  １８５５９−９４−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；アミロライド（ＣＡＳ  ２０１６−８８−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；アミノグルテチミド（ＣＡＳ  １２５−８４−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；アミオダロン（ＣＡＳ  １９５１−２５−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；アズトレオナム（ＣＡＳ  ７８１１０−３８−０）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；バクロフェン（ＣＡＳ  １１３４−４７−０）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；バルサラジド（ＣＡＳ  ８０５７３−０４−２）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ベタイン（ＣＡＳ  １０７−４３−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ベタネコール（ＣＡＳ  ６７４−３８−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ビカルタミド（ＣＡＳ  ９０３５７−０６−５）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ブロモクリプチン（ＣＡＳ  ２５６１４−０３−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ブメタニド（ＣＡＳ  ２８３９５−０３−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ブスピロン（ＣＡＳ  ３６５０５−８４−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；カルバコール（ＣＡＳ  ５１−８３−２）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；カルバマゼピン（ＣＡＳ  ２９８−４６−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；カルビマゾール（ＣＡＳ  ２２２３２−５４−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；セビメリン（ＣＡＳ  １０７２３３−０８−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；シプロフロキサシン（ＣＡＳ  ８５７２１−３３−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；クロニジン（ＣＡＳ  ４２０５−９０−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；クルクミン（ＣＡＳ  ４５８−３７−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；シクロスポリンＡ（ＣＡＳ  ５９８６５−１３−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ジアゼパム（ＣＡＳ  ４３９−１４−５）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ジクロフェナク（ＣＡＳ  １５３０７−８６−５）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ジノプロストン（ＣＡＳ  ３６３−２４−６）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ジスルフィラム（ＣＡＳ  ９７��７７−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；Ｄソルビトール（ＣＡＳ  ５０−７０−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；デュタステリド（ＣＡＳ  １６４６５６−２３−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；エストラジオール（ＣＡＳ  ５０−２８−２）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；エキセメスタン（ＣＡＳ  １０７８６８−３０−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フェルバメート（ＣＡＳ  ２５４５１−１５−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フェノフィブレート（ＣＡＳ  ４９５６２−２８−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フィナステリド（ＣＡＳ  ９８３１９−２６−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フルマゼニル（ＣＡＳ  ７８７５５−８１−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フルニトラゼパム（ＣＡＳ  １６２２−６２−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フルルビプロフェン（ＣＡＳ  ５１０４−４９−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フロセミド（ＣＡＳ  ５４−３１−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ガバペンチン（ＣＡＳ  ６０１４２−９６−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ガランタミン（ＣＡＳ  ３５７−７０−０）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ハロペリドール（ＣＡＳ  ５２−８６−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；イブプロフェン（ＣＡＳ  １５６８７−２７−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；イソプロテレノール（ＣＡＳ  ７６８３−５９−２）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ケトコナゾール（ＣＡＳ  ６５２７７−４２−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ケトプロフェン（ＣＡＳ  ２２０７１−１５−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；Ｌカルニチン（ＣＡＳ  ５４１−１５−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；リオサイロニン（Ｔ３）（ＣＡＳ  ６８９３−０２−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；リチウム（ＣＡＳ  ７４３９−９３−２）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ロサルタン（ＣＡＳ  １１４７９８−２６−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ロキサピン（ＣＡＳ  １９７７−１０−２）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メロキシカム（ＣＡＳ  ７１１２５−３８−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メタプロテレノール（ＣＡＳ  ５８６−０６−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メタラミノール（ＣＡＳ  ５４−４９−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メトホルミン（ＣＡＳ  ６５７−２４−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メタコリン（ＣＡＳ  ５５−９２−５）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メチマゾール（ＣＡＳ  ６０−５６−０）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メチルエルゴノビン（ＣＡＳ  １１３−４２−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メトプロロール（ＣＡＳ  ３７３５０−５８−６）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；メチラポン（ＣＡＳ  ５４−３６−４）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ミコナゾール（ＣＡＳ  ２２９１６−４７−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ミフェプリストン（ＣＡＳ  ８４３７１−６５−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ナドロール（ＣＡＳ  ４２２００−３３−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ナロキソン（ＣＡＳ  ４６５−６５−６）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ナルトレキソン（ＣＡＳ  １６５９０−４１−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ノルフロキサシン（ＣＡＳ  ７０４５８−９６−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ペンタゾシン（ＣＡＳ  ３５９−８３−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フェノキシベンザミン（ＣＡＳ  ５９−９６−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；フェニルブチレート（ＣＡＳ  １８２１−１２−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ピロカルピン（ＣＡＳ  ５４−７１−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ピオグリタゾン（ＣＡＳ  １１１０２５−４６−８）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；プラゾシン（ＣＡＳ  １９２１６−５６−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；プロピルチオウラシル（ＣＡＳ  ５１−５２−５）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；ラロキシフェン（ＣＡＳ  ８４４４９−９０−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；  ラパマイシン（ＣＡＳ  ５３１２３−８８−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；リファンピン（ＣＡＳ  １３２９２−４６−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；シンバスタチン（ＣＡＳ  ７９９０２−６３−９）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；スピロノラクトン（ＣＡＳ  ５２−０１−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；タクロリムス（ＣＡＳ  １０４９８７−１１−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；タモキシフェン（ＣＡＳ  １０５４０−２９−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；トレハロース（ＣＡＳ  ９９−２０−７）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；トリロスタン（ＣＡＳ  １３６４７−３５−３）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体；バルプロ酸（ＣＡＳ  ９９−６６−１）ならびにその可能な塩、エナンチオマー、プロドラッグ、及び誘導体である。
【００３６】
用語「組み合わせ」は、いくつかの薬物を被験体に同時投与し、生物学的効果を起こす処置を指定する。組み合わせ治療において、薬物を、一緒に又は別々に、同時に又は連続的に投与してもよい。また、薬物を、異なる経路又はプロトコールを通じて投与してもよい。
【００３７】
本発明は、本明細書で、外傷性ニューロパシー及び機械的な神経侵襲のための効率的な処置を提供する特定の薬物の組み合わせの同定及び活性を開示する。より具体的には、本発明は、インビトロ及びインビボで神経再生に対する有意な効果を提供する新規の三つ組みの組み合わせを開示する。
【００３８】
この点において、本発明は、バクロフェン、ソルビトール、ならびに、ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、ラパマイシン、フルルビプロフェン、及びケトプロフェン、その塩、エナンチオマー、ラセミ体、又はプロドラッグより選択される化合物を含む組成物に関する。
【００３９】
より好ましくは、本発明は、バクロフェン、ソルビトール、ならびに、ピロカルピン、メチマゾール、ミフェプリストン、ナルトレキソン、及びケトプロフェンより選択される化合物を含む組成物に関する。
【００４０】
最も好ましい実施形態において、本発明は、哺乳動物の被験体に対する同時、別々、又は連続投与のための、ナルトレキソン、バクロフェン、及びソルビトールを含む組成物に関する。
【００４１】
好ましくは、上の組成物において、ソルビトールはＤソルビトールであり、バクロフェンはＲＳバクロフェン又はＳバクロフェン、より好ましくはＲＳバクロフェンである。
【００４２】
本発明の別の好ましい目的は、哺乳動物の被験体に対する同時、別々、又は連続投与のための（ａ）ラパマイシン、（ｂ）ミフェプリストン又はナルトレキソン、及び（ｃ）ＰＭＰ２２モジュレーターを含む組成物に関する。
【００４３】
本発明の別の好ましい目的は、：哺乳動物の被験体に対する同時、別々、又は連続投与のための（ａ）ラパマイシン、（ｂ）ミフェプリストン、及び  （ｃ）ＰＭＰ２２モジュレーターを含む組成物である。
【００４４】
ＰＭＰ２２モジュレーターは、細胞中のＰＭＰ２２経路を調節し、ミエリン組織化の正常化及び／又はニューロン喪失の阻害を本質的に起こす又はそれに寄与する任意の化合物でありうる。ＰＭＰ２２モジュレーターは、アセタゾラミド、アルブテロール、アミロライド、アミノグルテチミド、アミオダロン、アズトレオナム、バクロフェン、バルサラジド、ベタイン、ベタネコール、ビカルタミド、ブロモクリプチン、ブメタニド、ブスピロン、カルバコール、カルバマゼピン、カルビマゾール、セビメリン、シプロフロキサシン、クロニジン、クルクミン、  シクロスポリンＡ、ジアゼパム、ジクロフェナク、ジノプロストン、ジスルフィラム、  Ｄソルビトール、デュタステリド、エストラジオール、エキセメスタン、フェルバメート、フェノフィブレート、フィナステリド、フルマゼニル、フルニトラゼパム、フルルビプロフェン、フロセミド、ガバペンチン、ガランタミン、ハロペリドール、イブプロフェン、イソプロテレノール、ケトコナゾール、ケトプロフェン、Ｌカルニチン、リオサイロニン（Ｔ３）、リチウム、ロサルタン、ロキサピン、メロキシカム、メタプロテレノール、メタラミノール、メトホルミン、メタコリン、メチマゾール、メチルエルゴノビン、メトプロロール、メチラポン、ミコナゾール、ミフェプリストン、ナドロール、ナロキソン、  ナルトレキソン；ノルフロキサシン、ペンタゾシン、フェノキシベンザミン、フェニルブチレート、ピロカルピン、ピオグリタゾン、プラゾシン、プロピルチオウラシル、ラロキシフェン、ラパマイシン、リファンピン、シンバスタチン、スピロノラクトン、タクロリムス、タモキシフェン、トレハロース、トリロスタン、バルプロ酸、その塩又はプロドラッグより選択される。
【００４５】
好ましい実施形態において、化合物（ｃ）は、ピロカルピン、メチマゾール、及びバクロフェンより選択される。この点において、本発明の最も好ましい組成物は、哺乳動物の被験体に対する同時、別々、又は連続投与のための（ａ）ラパマイシン、  （ｂ）ミフェプリストン、及び（ｃ）ピロカルピン、メチマゾール、及びバクロフェンより選択される化合物を含む。
【００４６】
そのような組成物の特定の例は、以下を含む組成物を含む：
−  ラパマイシン、ミフェプリストン、及びピロカルピン、
−  ラパマイシン、ミフェプリストン、及びバクロフェン、
−  ラパマイシン、ミフェプリストン、及びメチマゾール、又は
−  ラパマイシン、ナルトレキソン、及びメチマゾール。
【００４７】
実験のセクションは、これらの特定の薬物の組み合わせが、インビトロでＰＭＰ２２発現を効率的に補正し、正常なミエリン形成及びニューロン完全性を回復させ、動物においてインビボでＣＭＴを寛解させることができることを示す。結果は、また、これらの組み合わせが、動物を、化学療法誘発性ニューロパチーから保護することができることを示す。結果として、これらの組成物を使用し、化学療法誘発性ニューロパチーを防止又は低下させ、それにより、患者が化学療法をより長期間にわたり受けることを許す。また、実験のセクションにおいて例示するのは、本発明の組成物の神経再生促進特性である。実際に、本発明者らは、軸索成長及びミエリン形成の促進により特徴付けられる本発明の組合せの神経栄養活性を実証しており、それは、筋肉への神経インパルスの伝達の有意な回復をもたらす。結果的に、本発明の組成物は、遺伝的、化学的、又は機械的な由来（例、外傷性）のいずれかの、任意の神経侵襲からの回復を改善及び／又は促進するために使用されうる。
【００４８】
本発明の別の目的は、ナルトレキソン、バクロフェン、及びさらに異なるＰＭＰ２２阻害剤（上に定義する）を含む組成物である。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、１つ又はいくつかの医薬的に許容可能な賦形剤又は担体をさらに含む、上に開示する組成物（即ち、医薬的組成物）である。
【００５０】
本発明のさらなる特定の目的は、それを必要とする被験体において神経再生を促進させる方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００５１】
本発明の別の目的は、ＣＭＴ又はＣＭＴ関連障害を処置するための、上に開示する組成物に関する。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、ＣＭＴ又はＣＭＴ関連障害の処置用の医薬の製造のための、上に開示する化合物の併用に関する。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、ＣＭＴ又はＣＭＴ関連障害を処置するための方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に定義する組成物の効果的な量を投与することを含む。
【００５４】
本発明のさらなる目的は、医薬的組成物を調製する方法であって、方法が、上の化合物を、適切な賦形剤又は担体中で混合することを含む。
【００５５】
本発明のより特定の目的は、被験体においてＣＭＴ１Ａを処置する方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００５６】
本発明のさらなる特定の目的は、被験体において中毒性ニューロパチーを処置する方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００５７】
本発明のさらなる特定の目的は、被験体においてＡＬＳを処置する方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００５８】
本発明のさらなる特定の目的は、被験体において外傷性ニューロパチーを処置する方法であって、方法が、それを必要とする被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００５９】
特定の実施形態において、神経再生の促進を必要とする被験体は、機械的な神経侵襲、例えば、外傷性脳損傷、脊髄損傷、又は末梢神経の損傷に苦しんでいる、又は苦しんできた。
【００６０】
本発明の別の目的は、それを必要とする被験体において神経侵襲からの回復を改善及び／又は加速させる方法であって、方法が、被験体に、上に開示する化合物又は化合物の組み合わせの効果的な量を投与することを含む。
【００６１】
特定の実施形態において、機械的な神経侵襲からの回復を改善及び／又は加速する必要のある被験体は、外傷性脳損傷、脊髄損傷、又は末梢神経の損傷に苦しんでいる、又は苦しんできた。
【００６２】
本発明に従った治療は、薬物の組み合わせとして及び／又は任意の他の治療と併せて実施してもよい。それは、家庭、医院、診療所、病院の外来部門、又は病院で提供してもよく、医師が、治療の効果を綿密に観察し、必要とされる任意の調整を行うことができるようになる。
【００６３】
治療の持続期間は、処置されている疾患の段階、患者の年齢及び状態、ならびに患者が処置に対してどのように応答するかに依存する。
【００６４】
加えて、追加のニューロパチー障害を発生するより大きなリスクを有する人（例、例えば、糖尿病に遺伝的に罹りやすい又はそれを有する、或いは、腫瘍学的な状態などのために処置下にある人）は、最終的なニューロパチー応答を緩和又は遅延させるための予防的処置を受けてもよい。
【００６５】
組み合わせの各成分の投与量、頻度、及び投与様式を、独立的に制御することができる。例えば、１つの薬物を経口投与してもよく、第２の薬物を筋肉内投与してもよい。組み合わせ治療を、休息期間を含むオン・オフサイクルで与えてもよく、患者の体が、任意のまだ予期せぬ副作用から回復する機会を有するようにする。薬物を一緒に製剤化してもよく、１回の投与で両方の薬物を送達するようにする。
【００６６】
医薬的組成物の製剤化
組み合わせの各薬物の投与は，他の成分と組み合わせて、患者の状態を寛解させることができる薬物の濃度をもたらす任意の適した手段によってもよい（それは、例えば、インビトロで、末梢神経への到達時のＰＭＰ２２の上昇発現に対する効果により決定してもよい）。
【００６７】
組み合わせの活性成分を純粋な化学薬品として投与することが可能であり、それらを医薬的組成物（本関連において、医薬的製剤とも呼ばれる）として提示することが好ましい。可能な組成物は、経口、直腸、局所（経皮、バッカル錠、及び舌下を含む）、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）投与のために適したものを含む。
【００６８】
より一般的には、これらの医薬的製剤は、単一パッケージ、通常はブリスター・パック中での、異なる処置期間中での使用のための定量単位用量の投与のための多数の投薬単位又は他の手段を含む「患者パック」中で患者に処方する。患者パックは、従来の処方を上回る利点を有し、そこでは、薬剤師が、バルク供給からの医薬品の患者の供給を分割し、それにおいて、患者は、常に、患者パックに含まれる添付文書（通常、従来の処方において失われる）に対するアクセスを有する。添付文書の包含によって、医師の指示への患者コンプライアンスが改善することが示されている。このように、本発明は、前記製剤のために適した包装材料と組み合わせた医薬的製剤（本明細書において以前に記載した）をさらに含む。そのような患者パックにおいて、組み合わせ処置用の製剤の意図される使用は、指示、施設、供給、適応、及び／又は処置のために最も適した製剤化を使用して助けるための他の手段により推論することができる。そのような対策によって、本発明の組み合わせを用いた処置のための使用に特に適した、及び適応された患者パックが作製される。
【００６９】
薬物は、任意の適切な量で、任意の適した担体物質中に含まれてもよく、組成物の全重量の１〜９９重量％の量で存在しうる。組成物は、経口、非経口（例、静脈内、筋肉内）、直腸、皮膚、経鼻、膣内、吸入、皮膚（パッチ）、又は眼内投与経路のために適した投与形態で提供してもよい。このように、組成物は、例えば、錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、懸濁剤、エマルジョン、溶液、ゲル（ヒドロゲルを含む）、ペースト、軟膏、クリーム、硬膏、水薬、浸透圧送達デバイス、坐剤、浣腸、注射剤、インプラント、スプレー、又はエアロゾルの形態でよい。
【００７０】
医薬的組成物は、従来の医薬的習慣に従って製剤化してもよい（例、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）。
【００７１】
本発明に従った医薬的組成物を、投与時に実質的に直ぐに又は投与後の任意の事前に決められた時間又は期間に活性薬物を放出するように製剤化してもよい。
【００７２】
制御放出製剤は以下を含む：（ｉ）薬物の実質的に一定な濃度を、体内で延長期間にわたり作る製剤；（ｉｉ）所定の遅延時間後に、薬物の実質的に一定な濃度を、体内で延長期間にわたり作る製剤；（ｉｉｉ）活性薬物物質の血漿レベルにおける変動に関連付けられる望ましくない副作用の同時最小化を伴い、比較的、一定な効果的な薬物レベルを体内で維持することにより、薬物作用を所定の期間の間に持続させる製剤；（ｉｖ）薬物作用を、例えば、罹患した組織又は器官に隣接して又はその中での制御放出組成物の空間配置により局在化させる製剤；及び（ｖ）薬物を特定の標的細胞型に送達するための担体又は化学的誘導体を使用することにより薬物作用を標的化する製剤。
【００７３】
制御放出製剤の形態での薬物の投与は、組み合わせの薬物が以下を有する場合において特に好ましい：（ｉ）狭い治療指数（即ち、有害な副作用又は毒性反応に導く血漿濃度と治療的効果に導く血漿濃度の間の差が小さい；一般的に、治療指数（ＴＩ）は、半致死量（ＬＤ５０）と半効果的な量（ＥＤ５０）の比率として定義される）；（ｉｉ）胃腸管における狭い吸収ウィンドウ；又は（ｉｉｉ）非常に短い生物学的半減期（血漿レベルを治療レベルに保持するために、１日の間での頻繁な投与が要求されることになる）。
【００７４】
多くの戦略のいずれかを、制御放出（放出速度が、問題になっている薬物の代謝速度を上回る）を得るために追求することができる。制御放出は、種々の製剤パラメーター及び成分（例、種々の型の制御放出組成物及びコーティングを含む）の適切な選択により得られうる。このように、薬物を、適切な賦形剤を用いて、医薬的組成物中に製剤化し、それは、投与時に、薬物を制御様式（単一若しくは複数の単位錠剤又はカプセル組成物、油剤、懸濁剤、エマルジョン、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ、及びリポソーム）で放出する。
【００７５】
経口使用のための固形投与形態
経口使用のための製剤は、非毒性の医薬的に許容可能な賦形剤を伴う混合物中に活性成分を含む錠剤を含む。これらの賦形剤は、例えば、以下でありうる：不活性な希釈剤又は充填剤（例、スクロース、微結晶性セルロース、デンプン（ジャガイモデンプンを含む）、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、又はリン酸ナトリウム）；造粒剤及び崩壊剤（例、セルロース誘導体（微結晶性セルロースを含む）、デンプン（ジャガイモデンプンを含む）、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、又はアルギン酸）；結合剤（例、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化でんぷん、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、又はポリエチレングリコール）；ならびに潤滑剤、流動促進剤、及び抗接着剤（例、ステアリン酸、シリカ、又はタルク）。他の医薬的に許容可能な賦形剤は、着色剤、香味剤、可塑剤、保湿剤、緩衝剤などでありうる。
【００７６】
錠剤は非コーティングでもよく、又は、それらを公知の技術によりコーティングしてもよく、場合により、胃腸管での崩壊及び吸収を遅延させ、それにより、持続作用をより長期間にわたり提供する。コーティングを適応させ、活性薬物物質を所定のパターンで放出させてもよく（例、制御放出製剤を達成するために）、又は、それを、胃の通過後まで活性薬物物質を放出しないように適応させてもよい（腸溶コーティング）。コーティングは、糖コーティング、フィルムコーティング（例、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコール、及び／又はポリビニルピロリドンに基づく）、又は腸溶コーティング（例、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ酢酸ビニルフタル酸塩、セラック、及び／又はエチルセルロースに基づく）でありうる。時間遅延材料（例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリル）を用いてもよい。
【００７７】
固形錠剤組成物は、不要な化学的変化（例、活性薬物物質の放出前の化学的分解）から組成物を保護するために適応されるコーティングを含みうる。コーティングを、Encyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載されるものと同様の様式で、固形投与形態で適用してもよい。
【００７８】
薬物を錠剤中で一緒に混合してもよく、又は、分割してもよい。例えば、第１の薬物は、錠剤の内部に含まれ、第２の薬物は、外側にあり、第２の薬物の実質的な部分が、第１の薬物の放出の前に放出されるようにする。
【００７９】
経口使用のための製剤は、また、チュアブル錠として、又は硬ゼラチンカプセルとして（それにおいて、活性成分を、不活性な固形希釈剤（例、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、又はカオリン）と混合する）、或いは、硬ゼラチンカプセル（それにおいて、活性成分を、水又は油媒質（例えば、液体パラフィン、又はオリーブオイル）と混合する）として提示してもよい。粉末及び顆粒を、上に言及する成分を使用し、錠剤及びカプセルの下に、従来の様式で調製してもよい。
【００８０】
経口使用のための制御放出組成物は、例えば、活性薬物物質の溶解及び／又は拡散を制御することにより、活性薬物を放出するように構築してもよい。
【００８１】
溶解又は拡散制御放出は、薬物の錠剤、カプセル、ペレット、又は顆粒製剤の適切なコーティングにより、又は、適切なマトリクス中への薬物の取り込みにより達成することができる。制御放出コーティングは、上に言及するコーティング物質の１つ又は複数、及び／又は、例えば、セラック、蜜蝋、グリコワックス、キャスターワックス、カルナウバワックス、ステアリルアルコール、グリセリルモノステアレート、グリセリルジステアリン酸、グリセロールパルミトステアリン酸、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌポリ乳酸、セルロースアセテートブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレート、及び／又はポリエチレングリコールを含みうる。制御放出マトリクス製剤において、マトリクス材料は、また、例えば、水和メチルセルロース、カルナウバワックス及びステアリルエチルアルコール、カーボポール９３４、シリコーン、ステアリン酸グリセリル、アクリル酸メチル−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、及び／又はハロゲン化フルオロカーボンを含んでもよい。
【００８２】
請求する組み合わせの薬物の１つ又は複数を含む制御放出組成物は、また、浮遊性錠剤又はカプセル（即ち、経口投与時に、胃腸内容物の上部に、特定の期間にわたり浮遊する錠剤又はカプセル）の形態でありうる。薬物の浮遊性錠剤製剤を、薬物の混合物を、賦形剤及び２０〜７５％  ｗ／ｗ親水コロイド（例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）と顆粒化することにより調製することができる。得られた顆粒は、次に、錠剤に圧縮することができる。胃液との接触時、錠剤は、実質的に水に不透過性のゲルバリアを、その表面の周囲に形成する。このゲルバリアは、１未満の密度を維持する際に加わり、それにより、錠剤が、胃液中で浮遊性のままであることを許す。
【００８３】
経口投与用の液体
水の添加による水性懸濁剤の調製のために適した粉末、分散粉末、又は顆粒は、経口投与のための便利な投与形態である。懸濁液としての製剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、及び１つ又は複数の保存剤との混合物中に活性成分を提供する。適した懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなどである。
【００８４】
非経口組成物
医薬的組成物は、また、投与形態、製剤中で、又は、従来の非毒性の医薬的に許容可能な担体及びアジュバントを含む、適した送達デバイス若しくはインプラントを介して、注射、注入、又は移植（静脈内、筋肉内、皮下など）により非経口的に投与してもよい。そのような組成物の製剤化及び調製は、医薬的製剤の技術分野の当業者に周知である。
【００８５】
非経口使用のための組成物は、単位投与形態中で（例、単一用量アンプル中で）、又はいくつかの用量を含むバイアル（その中に適した保存剤を加えてもよい）中で提供してもよい（以下を参照のこと）。組成物は、溶液、懸濁剤、エマルジョン、注入デバイス、移植用の送達デバイスの形態でよく、又は、それは、水若しくは別の適した溶剤を用いて、使用前に戻される乾燥粉末として提示してもよい。活性薬物は別として、組成物は、適した非経口的に許容可能な担体及び／又は賦形剤を含んでもよい。活性薬物を、制御放出用のマイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどの中に取り込ませてもよい。組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、及び／又は分散剤を含んでもよい。
【００８６】
本発明に従った医薬的組成物は、無菌注射のために適した形態でありうる。そのような組成物を調製するために、適した活性薬物を、非経口的に許容可能な液体溶剤中に溶解又は懸濁させる。用いてもよい許容可能な賦形剤及び溶媒は、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム、又は適した緩衝液の添加により適したｐＨに調整された水、１，３ブタンジオール、リンゲル溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液である。水性製剤は、また、１つ又は複数の保存剤（例、メチル、エチル、又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾアート）を含んでもよい。薬物の１つが水にやや溶けにくい又はわずかしか溶けない場合において、溶解増強剤又は可溶化剤を加えることができ、又は、溶媒は１０〜６０％  ｗ／ｗのプロピレングリコールなどを含んでもよい。
【００８７】
制御放出の非経口組成物は、水性懸濁剤、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁気マイクロスフェア、油剤、油懸濁剤、又はエマルジョンの形態でありうる。或いは、活性薬物を、生体適合性の担体、リポソーム、ナノ粒子、インプラント、又は注入デバイス中に取り込ませてもよい。マイクロスフェア及び／又はマイクロカプセルの調製における使用のための材料は、例えば、生分解性／生侵食性ポリマー、例えばポリガラクチン、ポリ（イソブチルシアノアクリラート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）などである。制御放出製剤を製剤化する際に使用してもよい生体適合性の担体は、炭水化物（例、デキストラン）、タンパク質（例、アルブミン）、リポタンパク質、又は抗体である。インプラント中での使用のための材料は、非生物分解性（例、ポリジメチルシロキサン）又は生物分解性（例、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（グリコール酸）、又はポリ（オルトエステル））でありうる。
【００８８】
直腸組成物
直腸組成物について、組成物のための適した投与形態は、坐剤（エマルジョン又は懸濁型）、及び直腸ゼラチンカプセル（溶液又は懸濁剤）を含む。典型的な座剤製剤において、活性薬物を、適切な医薬的に許容可能な座剤の基剤（例えばココアバター、エステル型脂肪酸、グリセリンゼラチン、及び種々の水溶性基剤又は分散基剤（ポリエチレングリコールなど）と組み合わせる。種々の添加剤、賦活剤、又は界面活性剤を取り込ませてもよい。
【００８９】
経皮又は局所組成物
医薬的組成物は、また、マイクロスフェア及びリポソームを含む従来の非毒性の医薬的に許容可能な担体及び賦形剤を含む投与形態又は製剤での経皮吸収のために皮膚に局所的に投与してもよい。製剤は、クリーム、軟膏、ローション、リニメント、ゲル、ヒドロゲル、溶液、懸濁剤、スティック、スプレー、ペースト、硬膏、及び他の種類の経皮薬物送達系を含む。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、乳化剤、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、保湿剤、浸透賦活剤、キレート剤、ゲル形成剤、軟膏基剤、芳香剤、及び皮膚保護剤を含みうる。
【００９０】
乳化剤は、自然発生ゴム（例、アカシアゴム又はトラガカントゴム）でありうる。
【００９１】
保存剤、保湿剤、浸透賦活剤は、パラベン（例えばメチル又はプロピルｐ−ヒドロキシベンゾアートなど）、及び塩化ベンザルコニウム、グリセリン、プロピレングリコール、尿素などでありうる。
【００９２】
皮膚への局所投与のための上に記載する医薬的組成物は、また、処置される身体の部分上への又はその近くへの局所投与に関連して使用してもよい。組成物は、直接適用のために、或いは、特別な薬物送達デバイス（例えば包帯材など）、又は、代わりに、硬膏、パッド、スポンジ、ストリップ、若しくは適した柔軟材料の他の形態を用いた適用のために適応してもよい。
【００９３】
投与量及び処置の持続期間
組み合わせの薬物を、同時に、同じ若しくは異なる医薬的製剤中で、又は、連続的に投与してもよいことが認められるであろう。連続投与がある場合、活性成分の１つを投与する際の遅延は、活性成分の組み合わせの有効な効果の利益を失うようになるべきではない。この記載に従った組み合わせについての最小限の要件は、組み合わせが、活性成分の組み合わせの有効な効果の利益を伴う組み合わせ使用のために意図されるべきであることである。組み合わせの意図される使用は、施設、供給、適応、及び／又は本発明に従った組み合わせを使用して助けるための他の手段により推論することができる。
【００９４】
本発明の対象である治療的に効果的な量の薬物を、ＰＭＰ２２遺伝子の増加発現の効果を低下させる；正常なミエリン形成及び神経完全性を回復させる、ＣＭＴ病を発症するリスクを防止する又は低下させる、ＣＭＴ病の進行を停止させる又は緩徐にする（一旦、それが、臨床的に顕在化した場合）、及びニューロパチー事象の最初の又は続く発生のリスクを防止する又は低下させるために有用な医薬の調製のために一緒に使用することができる。
【００９５】
本発明の活性薬物を分割用量で、例えば、１日に２又は３回投与してもよいが、組み合わせでの各々の薬物の単一の１日用量が好ましく、単一の医薬的組成物中での全ての薬物の単一の１日用量（単位投与形態）が最も好ましい。
【００９６】
投与は、数日から数年にわたり１日１回から数回でありうるが、さらには患者の生涯にわたってもよい。慢性的な又は少なくとも定期的に反復された長期投与が、大半の症例において指示されうる。
【００９７】
用語「単位投与形態」は、ヒト被験体用の単位投与量として適した物理的に別々の単位（例えばカプセル、錠剤、又は充填したシリンジシリンダーなど）を指し、各々の単位が、要求される医薬的担体との関連で、所望の治療効果を産生すると算出された所定量の活性材料又は材料を含む。
【００９８】
単位投与量のために好ましい組み合わせにおける各々の薬物の量は、いくつかの因子（投与経路、患者の体重及び年齢、ＣＭＴ病により起こされるニューロパチー傷害の重症度、又は処置される人の全身の健康状態を考慮した潜在的な副作用のリスクを含む）に依存しうる。
【００９９】
加えて、特定の患者に関する薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態、薬力学、又は効力プロファイルに対する遺伝子型の効果）情報が、使用される投与量に影響を及ぼしうる。
【０１００】
特に障害性のＣＭＴ病症例に応答する場合、より高い投与量が要求されうる場合、又は、小児を処置する場合、より低い投与量を選ぶべきである場合を除き、組み合わせにおける各々の薬物の好ましい投与量は、長期間の維持処置のために通常処方される、又は、大規模の第３相臨床試験において安全であることが証明されている用量を超えない範囲内にありうる。
【０１０１】
例えば、
・ラパマイシンについて、約１〜約１００μg/kg/日、典型的には１〜５０μg/kg、例えば５〜３０μg/kg/日
・ミフェプリストンについて、約１〜約３００μg/kg/日、典型的には１０〜２００μg/kg、例えば１０〜８０μg/kg/日
・ナルトレキソンについて、約１〜約１００μg/kg/日、典型的には１〜５０μg/kg、例えば１〜２０μg/kg/日
・ピロカルピンについて、約１〜約１００μg/kg/日、典型的には１〜５０μg/kg、例えば１〜２０μg/kg/日
・バクロフェンについて、約１〜約３００μg/kg/日、典型的には１０〜２００μg/kg、例えば２０〜１００μg/kg/日
・メチマゾールについて、約１〜約１００μg/kg/日、典型的には１〜５０μg/kg、例えば１〜２０μg/kg/日
・ソルビトールについて、約１７μg/kg〜約１７mg/kg/日、典型的には１６７μg/kg〜約７mg/kg/日、例えば３３３μg/kg〜約３．５mg/kg/日。
【０１０２】
典型的には、投与される量は、６０kgのヒトについて適用される量に相当する。
【０１０３】
最も好ましい投与量は、長期間の維持処置のために通常処方されるものの１％〜１０％までの量に相当しうる。
【０１０４】
実際に投与される薬物の量は、医師により、関連する状況（処置される状態、投与される正確な組成物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重症度、並びに、選ばれた投与経路を含む）に照らして決定されうることが理解されるであろう。従って、上の投与量の範囲は、一般的な指導を提供し、本明細書における教示を支持することを意図するが、しかし、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０５】
以下の実施例を、例示の目的のために、限定の方法によらず与える。
【０１０６】
実施例
Ａ．薬物の組み合わせの調製。
【０１０７】
以下の薬物の組み合わせを調製した：
【表１】
0006522641.tif 000002
0006522641.tif 000003
【０１０８】
Ｂ．インビトロ実験
１．Ｍｉｘ１−６を用いて処理されたシュワン細胞でのＰＭＰ２２発現アッセイ
１．１細胞培養
１．１．１：商業的に入手可能なラット初代シュワン細胞
【０１０９】
ラットシュワン細胞（ＳＣ）初代培養（Sciencell  ＃  Ｒ１７００）のバイアルを解凍し、密度１００００個細胞／cm2で、ポリ−Ｌ−リジンプレコーティング７５cm2フラスコ中の「Sciencellシュワン細胞培地」（Sciencellからの基礎培地＃  Ｒ１７０１）中に播種する。培養液は、基礎培地、５％ウシ胎仔血清（3H-Biomedical AB  ＃１７０１−００２５）、１％シュワン細胞成長添加物（3H-Biomedical AB  ＃１７０１−１７５２）、１％ゲンタマイシン（Sigma  ＃Ｇ１３９７）、及び１０μMフォルスコリン（Sigma  ＃  Ｆ６８８６）で構成され、それらの増殖を促進する。
【０１１０】
コンフルエントに達した後（細胞バッチに依存して４〜１０日）、シュワン細胞を、穏やかな撹拌により、又は、ｔｈｙ１．１イムノパニング（付着性繊維芽細胞からのＳＣ単離を許す）により精製し、少なくとも９５％純粋である培養物を産生する。ＳＣを次にカウントし（トリパンブルー方法）、ポリ−Ｌ−リジンプレコーティング７５cm2フラスコにおいて、同じＳＣ培地中に播種する。コンフルエントで、細胞をリンスし、トリプシン処理し（Invitrogenからの１×希釈したトリプシン−ＥＤＴＡ＃１５４００５４）、ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを伴わない）中で希釈し、カウントし、１２ウェルディッシュにおいて、Sciencellシュワン細胞培地（５％ＦＢＳ、１％細胞成長添加物（ＣＧＳ）、４０μg/mlゲンタマイシン、及び４μMフォルスコリンを伴う）中に蒔く（１４０  ０００個細胞／ウェル）。
【０１１１】
１．１．２オーダーメイドのラット初代シュワン細胞
初代シュワン細胞培養（ＳＣ）を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ新生仔ラット（Ｐ０〜Ｐ２）坐骨神経から樹立する。全ての新生仔ラットを屠殺し、ペトリディッシュ中で単離する。解剖を無菌条件下で実施する。
【０１１２】
背面皮膚を、後肢及び胴体下部から除去する。坐骨神経を単離し、氷冷Leibovitz（Ｌ１５、Invitrogen  ＃１１４１５）（１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（それぞれ５０UI/ml及び５０μg/ml；Invitrogen  ＃１５０７０）及び１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma  Ａ６００３）を添加）を含む培養ディッシュに移す。ラットごとに両方の神経を、氷冷Ｌ１５を含む１５mlチューブ中に移す。Ｌ１５培地を次に除去し、２．４mlのＤＭＥＭ（Invitrogen  ＃２１９６９０３５）（１０mg/mlのコラゲナーゼ（Sigma  ＃Ａ６００３）を伴う）により交換する。神経を、この培地中で３０分間にわたり３７℃でインキュベートする。培地を次に除去し、両方の神経をトリプシン（１０％トリプシンＥＤＴＡ  １０×、Invitrogen  ＃１５４０００５４）（ＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを伴わない）（Invitrogen  ＃  ２００７−０３）中で希釈する）により２０分間にわたり３７℃で解離する。反応を、ＤＮａｓｅ  ＩグレードＩＩ（０．１mg/ml  Roche diagnostic  ＃１０４１５９）及びウシ胎仔血清（ＦＣＳ  １０％、Invitrogen  ＃１０２７０）を含むＤＭＥＭの添加により停止する。細胞懸濁液を、１０mlピペットを用いて粉砕し、５０mlチューブ中のフィルターを通過させた（Swinnex  １３mmフィルターユニット、Millipore、２０μMナイロンメッシュフィルターを伴う、Fisher）。細胞懸濁液を、３５０ｇで１０分間にわたり室温（ＲＴ）で遠心し、ペレットをＤＭＥＭ（１０％  ＦＣＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを伴う）中に懸濁する。細胞をカウントし（トリパンブルー方法）、Falcon  １００mm  Primaria組織培養プレート中に密度５．１０５〜１０６個細胞／ディッシュで播種する。
【０１１３】
１日の培養後、培地を、ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０μMのシトシンｂ−Ｄ−アラビノフラノシド（Sigma  ＃Ｃ１７６８）に変える。４８時間後、培地を除き、細胞を、３回、ＤＭＥＭを用いて洗浄する。ＳＣ成長培地を次に加える（ＤＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２μMのフォルスコリン（Sigma  ＃Ｆ６８８６）、１０μg/mlのウシ下垂体抽出物（ＰＥＸ、Invitrogen  ＃１３０２８）で構成される）。培地を２〜３日毎に交換する。
【０１１４】
８日の培養後（細胞バッチに依存して４〜１０日）、シュワン細胞がコンフルエントに達し、培養物（多量の混入する繊維芽細胞を含む）を、ｔｈｙ１．１イムノパニング方法により精製する。この精製後、細胞を、成長培地中に、１０  ０００個細胞／cm2でポリ−Ｌ−リジンプレコーティング７５cm2フラスコ中で懸濁する。一旦、それらがコンフルエントに達した場合、細胞をリンスし、トリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ）、カウントし、１２ウェルディッシュ中に蒔く（１００  ０００個細胞／ウェル）。
【０１１５】
１．１．３薬物インキュベーション
細胞を１２ウェルディッシュ中に蒔いた後、培地を、１％のＮ２添加物（Invitrogen  ＃  １７５０２）、１％  Ｌグルタミン（Invitrogen  ＃２５０３００２４）、２．５％  ＦＢＳ（Sciencell  ＃００２５）、０．０２μg/mlのコルチコステロン（Sigma  ＃  Ｃ２５０５）、４μMフォルスコリン、及び５０μg/mlのゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２（Invitrogen  ＃  ２１３３１０２０）の混合液からなる定義された培地と交換する。ＳＣ分化を促進させるために、成長因子をこの培地に加えない。
【０１１６】
２４時間後、培地を、１％インシュリン−トランスフェリン−セレニウム−Ｘ（ＩＴＳ、Invitrogen  ＃  ５１３００）、１６μg/mlのプトレシン（Sigma  ＃  Ｐ５７８０）、０．０２μg/mlのコルチコステロン、及び５０μg/mlのゲンタマイシンを添加した定義された培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）と交換する。この段階で、プロゲステロン又はフォルスコリンのいずれも培地中に存在しない。
【０１１７】
１日後、シュワン細胞を、薬物の組み合わせにより、２４時間の間刺激する（３ウェル／条件）。各々の化合物の調製を、細胞培養培地へのその添加の直前に実施する。
【０１１８】
薬物を、１％インシュリン−トランスフェリン−セレニウム−Ｘ（ＩＴＳ、Invitrogen  ＃  ５１３００）、１６μg/mlのプトレシン、０．０２μg/mlのコルチコステロン、１０nMプロゲステロン、及び５０μg/mlのゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２で構成される定義された培地に加える。薬物刺激の間でのフォルスコリンの非存在によって、アデニル酸シクラーゼ飽和が回避される。
【０１１９】
１．２．Ｔｈｙ１．１イムノパニングによるシュワン細胞精製
繊維芽細胞培養での混入を防止するために、シュワン細胞を、クローンＴｈｙ１．１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１０３ＴＭ）イムノパニングプロトコールを使用して精製する。
【０１２０】
抗体をプレコーティングした１００mm細菌ペトリディッシュを以下の通りに調製する：これらのディッシュを、ＰＢＳを用いて３回洗浄し、２０mlのＴｒｉｓ  ＨＣｌ溶液５０mM、ｐＨ  ９．５（１０μg/mlのヤギ抗マウスＩｇＭ  ＭＵ抗体（Jackson ImmunoResearch  ＃１１５−００５−０２０）を伴う）により一晩４℃で処理する；次に、ＰＢＳを用いて３回リンスし、ＰＢＳの溶液（０．０２％のＢＳＡ及びＴ１１Ｄ７ｅ２ハイブリドーマ培養（ＡＴＣＣ  ＃ＴＩＢ−１０３）から得られた上清（Ｔｈｙ１．１  ＩｇＭ抗体を含む）を伴う）により２時間にわたり室温で処理する。最後に、プレートを、細胞懸濁液を加える前に、ＰＢＳを用いて３回洗浄する。
【０１２１】
ＳＣを、トリプシンＥＤＴＡを用いて剥離する。細胞の大半が懸濁されるとすぐに、トリプシンを、ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳを用いて中和し、細胞を遠心する。解離した細胞のペレットを、１５mlの培地（０．０２％  ＢＳＡを伴う）中に、密度０．６６×１０６個細胞/ml（最高）で再懸濁し、ペトリディッシュに移す（約６６０万個の細胞／１０ml／１００mmディッシュ）。
【０１２２】
細胞懸濁液を、Ｔｈｙ  １．１コーティングしたペトリディッシュ中で、４５分間の間、３７℃で、１５分毎に穏やかに撹拌しながらインキュベートし、非特異的結合を防止する。Ｔｈｙ１．１を発現する繊維芽細胞の大半が、ディッシュ上に付着する。インキュベーションの終わりに、細胞懸濁液を回収し、遠心する。この細胞懸濁液は、理論上は、シュワン細胞だけを含む。細胞を遠心し、細胞ペレットを、成長培地（１０μMのフォルスコリンを伴う）中に、１６  ０００個細胞／cm2で、ポリ−Ｌ−リジン処理したＴ７５cm2フラスコにおいて懸濁する。
【０１２３】
１．３定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）
定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ラットシュワン細胞初代培養におけるハウスキーピングリボソームＬ１３Ａ  ｍＲＮＡに対して薬物刺激後のＰＭＰ２２  ｍＲＮＡのレベルを比較する（）。
【０１２４】
冷滅菌済みＰＢＳを用いてリンスした後、各々の細胞サンプルからの全ＲＮＡを抽出し、Qiagen RNeasyマイクロキット（Qiagen  ＃７４００４）を使用してＳＣから精製する。核酸を、Nanodrop分光光度計により、１μlのＲＮＡサンプルを使用して定量化する。ＲＮＡの完全性を、BioAnalyzer（Agilent）装置を通じて決定する。
【０１２５】
ＲＮＡを、標準的プロトコールに従って、ｃＤＮＡに逆転写する。ＰＣＲ増幅用のｃＤＮＡ鋳型を、２００ngの全ＲＮＡから、SuperScript II逆転写酵素（Invitrogen  ＃  １８０６４−０１４）を６０分間にわたり４２℃で、オリゴ（ｄＴ）の存在において、最終容積２０μl中で使用して合成する。
【０１２６】
ｃＤＮＡを、≪LightCycler（登録商標）４８０≫システム（Roche Molecular Systems Inc.）を使用したＰＣＲ増幅に供する。各々のｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のために使用する前に、５倍希釈する。このｃＤＮＡの２．５μlを、ＰＣＲ反応溶液（最終容積１０μl）に入れる。予備実験によって、定量化を両方の配列についての増幅プロセスの対数期において行うこと、及び、参照遺伝子の発現は異なる培養条件において均一であることが確かめられた。
【０１２７】
ＰＣＲ反応を、５００ｎＭのラットＰＭＰ２２（ＮＭ＿０１７０３７）のフォワードプライマー５−ＧＧＡＡＡＣＧＣＧＡＡＴＧＡＧＧＣ−３（配列番号１）、及び５００nMのリバースプライマー５−ＧＴＴＣＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＣＴＴ−３（配列番号２）の増幅により実施する（１４８ｂｐの増幅）。ＲＰＬ１３Ａリボソーム（ＮＭ＿１７３３４０）ＲＮＡの１５２ｂｐフラグメントを、並行して別々の反応において、結果の標準化のために、５００nMのフォワードプライマー５−ＣＴＧＣＣＣＴＣＡＡＧＧＴＴＧＴＧ−３（配列番号３）、及び５００nMのリバースプライマー５−ＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＴＡＡＴＧＧＡＴ−３（配列番号４）を使用することにより増幅する。
【０１２８】
本発明者らはＦＲＥＴ化学を使用し、ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ解析を実施した。ＦＲＥＴプローブは、０．３μMのＰｍｐ２２−ＦＬ−５−ＧＣＴＣＴＧＡＧＣＧＴＧＣＡＴＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号５）又はＲｐｌ１３Ａ−ＦＬ−  ５−ＴＣＧＧＧＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＣＣ（配列番号６）で構成され、それらの３’末端は、ドナーフルオロフォア色素（フルオレセイン）を用いて標識される。０．１５μM  Ｒｅｄ６４０プローブを以下の通りに定義する：Ｐｍｐ２２−ｒｅｄ−５’−ＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡ（配列番号７）又はＲｐｌ１３Ａ−ｒｅｄ−５’−ＴＧＡＣＡＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣＧＧＡＡ（配列番号８）、それらの５’末端は、アクセプターフルオロフォア色素（ローダミンレッド６４０）を用いて標識される。
【０１２９】
各々のＰＣＲ反応には、２．５μlのｃＤＮＡ鋳型が、最終容積１０μlのマスターミックスキット（Roche  ＃０４−８８７３０１００１）中に含まれた。
【０１３０】
以下のＰＣＲ条件を使用する：９５℃で１０秒、６３℃で１０秒及び７２℃で１２秒及び４０℃で３０秒（４０回の増幅サイクル）。ＰＭＰ２２遺伝子発現の相対レベルを、標的遺伝子ＰＭＰ２２から生成される産物と内因性の内部標準ＲＰＬ１３Ａの間の比率を決定することにより測定する。
【０１３１】
１．４フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によるＰＭＰ２２タンパク質発現解析
薬物インキュベーション後の８時間、２４時間、及び４８時間目に、上清を回収し、遠心し、凍結する。ＳＣを、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥離する。細胞の大半が懸濁されるとすぐに、トリプシンを、ＤＭＥＭ（１０％  ＦＣＳを伴う）を使用して中和させる。
【０１３２】
細胞を伴う上清を回収し、遠心する。細胞のペレットをマイクロチューブ中に移し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、特定の溶液（AbCys  ＃Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ  ＢＵＦ０９Ｂ）を用いて固定する。１０分後、細胞を、１回ＰＢＳを用いてリンスし、４℃に保つ。
【０１３３】
細胞固定後５日目、異なるインキュベーション時間を伴う全ての細胞調製物を、以下のプロトコールを使用して標識する。
【０１３４】
細胞を７０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心し、ペレットを透過処理の溶液（AbCys  ＃Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ  ＢＵＦ０９Ｂ）中に懸濁し、一次ＰＭＰ２２抗体（Abcam  ＃ａｂ６１２２０、１／５０）を用いて１時間にわたり室温で標識する。細胞を次に７０００rpmで５分間にわたり遠心し、細胞ペレットを１回ＰＢＳ中でリンスする。ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Molecular Probes  ＃Ａ１１００８、１／１００）に共役している二次抗体（Alexa Fluor 488を、１時間にわたり室温で加える。細胞を次に７０００rpmで５分間にわたり遠心し、細胞ペレットを１回ＰＢＳ中でリンスする。標識化は、Alexa Fluor 488に共役している三次抗体（鶏抗ヤギＩｇＧ、Molecular Probes  ＃Ａ２１４６７、１／１００）を室温で１時間のインキュベーションのために加えることにより増加する。細胞を次に１回ＰＢＳ中でリンスする。任意の抗体を伴わないコントロール（非標識細胞）を実施して、自己蛍光レベルを決定し、光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｏｒ）の感度を適応させる。二次抗体及び三次抗体の両方を伴うが、しかし、一次抗体を伴わないコントロールを実施して、抗体の非特異的結合を評価する。
【０１３５】
データ取得及び分析は、５０００個の細胞でのFACS Arrayサイトメーター及びFACS Arrayソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて実施される。細胞容積（サイズ）に相関する前方散乱（ＦＳＣ）と、細胞の内部の複雑さ（顆粒度）に依存する側方散乱（ＳＳＣ）（とを分析する。ＰＭＰ２２の発現について、分析を全細胞内で実施し、陽性細胞のパーセントを算出する。陽性細胞は、二次抗体を伴うコントロールよりも高い蛍光強度を伴う細胞である。
【０１３６】
ＳＣの数を定量化するために、コントロール培地中の細胞を、抗Ｓ１００タンパク質抗体を使用して分析する。
【０１３７】
細胞を以下のプロトコールに従って調製する：シュワン細胞を、抗Ｓ１００タンパク質抗体（Dako  ＃Ｓ０３１１、１／１００）を用いて、１時間にわたり室温で染色する。この抗体を、ＰＭＰ２２免疫染色について上に記載するプロトコールに従って（しかし、三次抗体を用いたインキュベーションを伴わず）標識する。
【０１３８】
１．５．薬物インキュベーション及び活性
薬物を、２４時間又は４８時間にわたり、上に記載するものと同じ定義された培地中で（３ウェル／条件）、フォルスコリンの非存在下で（しかし、１０nMのプロゲステロンの存在において）インキュベートして、アデニル酸シクラーゼ刺激飽和を回避する。薬物インキュベーション後、上清を回収し、シュワン細胞をＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ解析のために凍結する。
【０１３９】
これらの実験を表１にまとめる。
【表２】
0006522641.tif 000004
【０１４０】
２．ＣＭＴについての同時培養モデルにおけるＭｉｘ７中の化合物の相乗効果の評価
同時培養のモデルを、ＣＭＴ１Ａのインビトロモデルとして使用した。ミエリン形成のこのモデルは、雄ＰＭＰ２２トランスジェニック（ＴＧ）の解離された後根神経節（ＤＲＧ）からの感覚ニューロン及びシュワン細胞を同時培養することにある。
本試験の目的は、ミエリン形成プロセスに対する３つのテスト化合物（＋／−バクロフェン、ナルトレキソン、及びソルビトール）及びＭｉｘ７（これら３つの薬物の混合物）の効果を評価することである。ミエリン形成に対する３つのテスト化合物、及びそれらの混合物の効果を、アスコルビン酸の存在において、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）発現を評価することにより評価する。
【０１４１】
２．１材料及び方法
妊娠１５日目の妊娠雌ラットを頚椎脱臼により殺す。胎仔を子宮から除去し、発生の同じ胎仔期である。
【０１４２】
２．１．１遺伝子型決定
各々の胎仔頭部の組織片（３mm3）を、２mlチューブ（ＤＮａｓｅフリー）中に置く。ＤＮＡを、ＳYBR Green Extract-N-Amp組織ＰＣＲキット（Sigma、ｒｅｆ  ＸＮＡＴＧ−１ＫＴ）を用いて抽出する。１２０μlの抽出溶液（Kit Sigma、ｒｅｆ  ＸＮＡＴＧ−１ＫＴ）を、胎仔頭部の各々の組織片上に置いた。頭部を、１０分間にわたり室温でインキュベートする。このインキュベーションの終わりに、頭部を、５分間にわたり９５℃で、抽出溶液中でインキュベートする。この最後のインキュベーションの直後に、１００μlの中和溶液を加えて、各々のＤＮＡ抽出物を、無菌超純水（Biosolve、ｒｅｆ：９１５８９）を用いて１／４０希釈し、使用まで＋４℃で保存する。雌（Ｆ）及び雄（Ｍ）胎仔の遺伝子型決定を、ＤＲＧの解剖の間に、キットFast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystem、４３８５６１２）を用いて実施する。各々の胎仔の性別を、雄のＳＲＹ遺伝子を使用して決定する。ＳＲＹプライマーは、Pharnextにより供給される（ＳＲＹ−Ｆ（配列番号９）：５’−ＧＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣ−３’；ＳＲＹ−Ｒ（配列番号１０）：５’−ＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＣ−３’）。ＳＲＹプライマーを、無菌超純水（Biosolve、ｒｅｆ：９１５８９）中で３μMに希釈する。ＰＣＲ用のミックスを、超純水（４μl/サンプル）、プライマー３μM（２μl/サンプル）、及びMaster Mix（１０μl/サンプル）を用いて調製する。ＰＣＲ９６ウェルプレートにおいて、１６μlのＰＣＲミックスを各々のウェル中に適用する。各々の希釈ＤＮＡの４μlを、予定された適用場所に従って加える。ＰＣＲを、7500 fast RT-PCRシステム（Applied Biosystem）を使用して、以下のプログラムを用いて実行する：
開始：９５℃−２０秒４５サイクル：９５℃−１０秒、６５℃−１０秒、７２℃−３０秒（データ取得）。
融解曲線：９５℃−１５秒、６４℃−１分、９０℃−３０秒（連続データ取得）、６０℃１５秒。増幅プロット及び融解曲線を、７５００ソフトウェア（Applied Biosystems）を用いて分析する。
【０１４３】
各々のサンプルについての結果を、ネガティブコントロール（超純水）及びポジティブコントロール（ＴＧ／雄及びＷＴ／雌）と比較し、各々の胎仔の遺伝子型について結論を出す。
【０１４４】
２．１．２感覚ニューロン及びシュワン細胞の同時培養
ラット後根神経節を、Cosgaya et al., 2002及びRangaraju et al., 2008により以前に記載された通りに培養する。
【０１４５】
各々の胎仔を、番号の付いたペトリディッシュ（直径３５mm）上に送る。胎仔の頭部を切断し、１．５mlチューブ（ＤＮＡａｓｅフリー）上に置く；ＤＮＡを、Extract-N-Amp Tissue Kit（Sigma Aldrich）を用いて抽出する。遺伝子型決定（雄（Ｍ）及び雌（Ｆ）、野生型及びＰＭＰ２２トランスジェニック）を、キットFast SYBR Green Master Mix（Applied Biosystem）を用いて実施する。この遺伝子型決定を、後根神経節（ＤＲＧ）の解剖と並行して実施し、解剖の終わりに、１つのタイプの培養（トランスジェニック雄からのＤＲＧ）だけが行われるようにする。各々の胎仔のＤＲＧを収集し、Leibovitz（Ｌ１５、Invitrogen）の氷冷培地中に置く。解剖の終わりに、ＴＧＭのＤＲＧをプールし、トリプシン処理（トリプシンＥＤＴＡ、０．０５％；Invitrogen）により、２０分間にわたり３７℃で解離する。反応を、ＤＭＥＭ（１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む）の添加により、ＤＮＡａｓｅ  Ｉ（Roche）の存在において停止させる。懸濁液を、１０mlピペットを用いて粉砕する。細胞を次に３５０ｘｇで１０分間にわたり室温で遠心する。解離した細胞のペレットを、２％のＢ２７（Invitrogen）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Invitrogen）、１％Ｌグルタミン、及び５０ng/ml  ＮＧＦ（Sigma）を含むneurobasal培地（Invitrogen）中に再懸濁する。この培地がニューロンの培地である。生細胞を、Neubauer血球計算器において、トリパンブルー排除テスト（Sigma）を使用してカウントし、ポリ−Ｌ−リジンを用いて処理した９６ウェルプレート（Greiner）中で、１００００個細胞／ウェルに基づいて播種する。プレートを、３７℃で、加湿インキュベーターにおいて、空気（９５％）−ＣＯ２（５％）の雰囲気中で維持する。標準的なニューロン培養液の半分を、１日おきに変える。培養物を、標準的なneurobasal培地中に７日間にわたり維持し、シュワン細胞が感覚ニューロン神経突起を集合できるようにする。７日目に、培養物に、基底膜形成及びミエリン形成を開始させるために、５０μg/mlアスコルビン酸を添加した又は添加していない標準的なニューロン培地を供給する。
【０１４６】
２．１．３．薬物インキュベーション
７日目に、以下のテスト化合物を（単独又は組み合わせで）培地（５０μg/mlアスコルビン酸を伴う）中に加える：
・（ＲＳ）バクロフェン
・  ナルトレキソン
・Ｄソルビトール
・Ｍｉｘ７＝３つの個々の化合物の組み合わせ
【０１４７】
これらの化合物又は化合物の組み合わせを、以下の濃度でテストする（表２）：
【表３】
0006522641.tif 000005
【０１４８】
テスト化合物を、５つの異なる時間にわたりインキュベートする：５、９、１０、１１、及び１３日間。
３つの別々で独立のＤＲＧ（ＴＧ胎仔雄ラット由来）の培養を行う。これらの条件を、アスコルビン酸の存在において評価する（６ウェル／条件）。全てのテスト化合物の使用準備済み溶液を、ストック溶液から用事調製し、−２０℃で保存する。この溶液を週１回調製する。標準的なニューロン培地（テスト化合物及びアスコルビン酸（各々、濃度１×）を添加している）の半分を１日おきに変える。
【０１４９】
２．１．４染色プロトコール
５、９、１０、１１、及び１３日間のインキュベーション後、細胞を、エタノール（９５％）及び酢酸（５％）の冷溶液により１０分間にわたり固定する。細胞を透過処理し、ＰＢＳ（０．１％サポニン及び１０％ヤギ血清を含む）を用いて１５分間にわたりブロックする。次に、細胞を、ミエリンの特異的マーカーを用いてインキュベートする：ポリクローナル抗体抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体（Sigma  １１８Ｋ０４３１）。
この抗体は、Alexa Fluor 568ヤギ抗ウサギＩｇＧ及びAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular probe ６８７６２１、６２３９６２)を用いて明らかにされる。ニューロンの核を、蛍光マーカー（ヘキスト溶液、Sigma  ｒｅｆ  Ｂ１１５５）により標識する。
【０１５０】
２．１．５．データプロセシング
１ウェル当たり、２０枚の写真を、InCell Analyzer（商標）1000（GE Healthcare）を使用して撮影する（２０×拡大を伴う）。全ての画像を、同じ条件において撮影する。有髄軸索の全長の分析を、Developerソフトウェア（GE Healthcare）を使用して自動的に行った（軸索周囲の長さ及び面積）。全ての値を、平均値±標準誤差の平均値（mean +/- s.e.mean）として表現する。統計分析を異なる条件で行う（ANOVA、それに続くフィッシャーのＰＬＳＤ検定（許される場合））。
【０１５１】
２．２．結果
Ｍｉｘ７の薬効における薬物の相乗効果
Ｍｉｘ７の組み合わせを構成する薬物の重要な相乗効果が、ＭＢＰ発現で観察された。実際に、１０日目（＝１７日間の培養）、（ＲＳ）バクロフェン、ナルトレキソン、及びＤソルビトールの組み合わせによって、用量１及び６でのＭＢＰ発現が有意に増加する（図１Ａ及び２Ａに示す通り）。対照的に、個々に使用される上の薬物は、コントロールと比較して実質的な効果を有さない（図１Ｂ−Ｄ及び２Ｂ−Ｄ）。
ＭＢＰ発現に対する有意な効果が、また、１０日間のインキュベーション後、Ｍｉｘ７の用量２、３、４、５、及び７で記録される（図３Ａ）。
【０１５２】
この効果は、依然として、１１日目に、用量２〜７（図３Ｂ）を用いて、明らかなベルシェープ型曲線の形態で観察される。
【０１５３】
Ｃ．  ＣＭＴ動物モデルにおけるインビボでの実験
本発明者らは、ラットモデルにおける治療効果について化合物をテストした。実験群は、両方の性別の若いラットを用いて別々に形成される。ラットは、体重に基づく無作為化スケジュールに従って群に割り当てる。一部の実験において、無作為化は、バーテストでのラットの成績に基づく。両方の性別は、処置群と数字的に等しい、又は、より大きな別々のコントロール群により示される。
【０１５４】
ラットを、３又は６週間の間に各々の薬物バイオアベイラビリティーに依存して、薬物を用いて継続的に処置する（強制的に与える、又は、Alzet浸透圧皮下ポンプ（DURECT Corporation Cupertino、ＣＡ）により注入する）。実施した全てのインビボ実験において、Ｍｉｘ７を経管栄養により投与する。
【０１５５】
動物を１週間に２回体重測定する（成長する体重に対して用量を調整するために）。浸透圧ポンプが処置投与のために選ばれた場合、薬物の用量は、ポンプ持続期間の期間（６週間）にわたりそれらの年齢について予測される動物の推定平均体重に基づいて算出される。ポンプは、必要な場合、適切な麻酔プロトコールを用いて再移植する。
【０１５６】
行動テスト
３又は４週間毎に、動物を行動テストに供する。各々のテストは、同じ研究者により、同じ部屋で、１日の同じ時刻に行なわれる；この均一性は全実験を通して維持される。全ての処置及び遺伝子型決定は、研究者に盲検化されている。「バーテスト」及び「握力」は、主に、試験を通した成績を評価するために使用されてきた。バーテストのスケジュールは、動物の成長とともに変えてもよい（例えば、学習に起因するバイアスを避けるために）。
【０１５７】
握力のアッセイは、筋力、感受性状態（例えば、痛みの触覚は、力の測定値を変えうる）、行動成分（「動機づけ」）で構成されると思われる握り成績における微妙な差の検出を許す。値は、前肢と後肢の間で異なり、動物の年齢に大きく依存する。
【０１５８】
握力テストでは、動物が、グリップをその前肢又はその後肢で握る力を別々に測定する。筋力計がグリップを伴い置かれ、力を測定する（Force Gauge FG-500A）。ラットは、実験者により、グリップをその前肢又はその後肢のいずれかで握る方法で保持され、ラットがグリップを放すまでラットをゆっくりと後ろに引く。動物がグリップを放した時に測定される力を記録する。
【０１５９】
１匹の動物当たり前肢を測定する２回の連続試行及び後肢の力を測定する２回の連続試行が処理される；最大スコア（前肢について１つ、後肢について１つ）だけを（Ｎで）通知する。
【０１６０】
バーテスト
バーテストでは、固定ロッドを握るラットの能力を評価する。筋肉の脱力を呈するＰｍｐ２２ラットは、このテストにおいて成績欠陥を示す（Sereda et al, 1996）。ラットのその４本の肢をロッドの中央に置く（直径：２．５cm；長さ：５０cm；机の上３０cm）。試行は連続的に実施する；本発明者らの実験における試行の回数及び持続時間は、動物のバッチに依存してきた。テストにおけるこのような変動を導入し、実験の経過におけるＣＭＴラットの運動欠損の最善な検出に適したスケジュールを決定する。
【０１６１】
成績指数を各々のセッションで記録する：
−  ロッドに６０秒間（又はバッチ１、セッション１及び２については３０秒間）つかまるために必要とされる試行の数。
−  各々の試行においてバー上で過ごす時間（即ち、落下潜時）及びセッションでの平均。ラットがカットオフ時間、すなわち３０又は６０秒間にわたり、バー上に留まっていた後にセッションが終了する実験手順において、カットオフ時間（３０又は６０秒間）での成績は、完了していない試行に割り当てられる（例、バッチ８について、バー上に試行１、２及び３では１０秒未満、次に試行４及び５では６０秒間にわたり留まっていた動物では、６０秒間が試行６〜１０に割り当てられる）。
−  落下数。
【０１６２】
全身健康評価
動物の体重、明白な徴候（毛の外観、体の姿勢、歩行、振戦など）を、実験を通してモニターする。評価尺度を記録のために使用する：０＝正常、１＝異常。
【０１６３】
歩行
各々のラットを、新たなラットケージ（寸法５５×３３×１８cm）（わらくずを伴わない）中で５分間にわたり観察する。ラットの歩行を、４つのパラメーターを用いて評価する：
−  スコア０：正常歩行（円滑性）
−  スコア１：異常歩行（円滑ではない、又は、ラットは、わずかな引きずり足歩行を有する）
−  スコア２：中程度の歩行障害（ラットはその足を引きずり、それを正しく置き、歩くことができる）
−  スコア３：重篤な歩行障害（ラットは、その片方又は両方の後肢を引きずるが、それ／それらを正しく置くことができない）。
【０１６４】
傾斜板テスト
滑り装置は、角度０°（水平）〜６０°に傾斜させることができる３０×５０cmプレキシグラス板を有した。各々のラットを、最初に、２５°の角度で傾斜させた板上に、頭を起こした位置（頭を起こした方向）で置いた；１分間の間隔をあけて２回の試行を実施する。３０分後、同じ実験を、３５°の角度に傾斜させた板上で、次に４０°の角度に傾斜させた板上で実行する。この時間の間は、ラットをそのケージに戻した。板を、各々の試行後に掃除する。
ラットの成績を、４つの異なるスコアにより評価する：
−  スコア０：滑りなし
−  スコア１：小さな滑り（１又は２足）
−  スコア２：中程度の滑り（４足）（しかし、平面の最後までではない）
−  スコア３：ラットは、平面の一番下まで滑っている。
【０１６５】
更なるテスト
適切である場合、ラットを電気生理学的評価、組織学的測定に供し、坐骨神経におけるｐｍｐ２２  ＲＮＡ発現レベルを定量化する。
【０１６６】
定量的ＲＴ−ＰＣＲによる坐骨神経におけるｐｍｐ２２  ＲＮＡの定量化
全ＲＮＡを、Qiazol（ｒｅｆ  Ｎ°７９３０６、Qiagen Gmbh、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して左坐骨神経から単離し、RNeasy Mini Kit（ｒｅｆ  Ｎ°  ７４１０６、Qiagen Gmbh、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた１工程精製方法（製造者のプロトコール（Qiagen-RNeasy Fibrous tissue Handbook）により記載される）が続いた。ＤＮＡ混入を、DNA-freeキット（Qiagen-Rnase-free dnase set 1500 Kunits、ｒｅｆ  Ｎ°  １０２３４６０）の使用によるＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｉを用いた消化により除去した。
ＲＮＡ濃度をNanoDrop ND-1000により推定する。品質管理のテストを、Agilent 2100 Bioanalyzerで、Agilent RNA 6000ナノチップにより行った。
逆転写及びリアルタイムＰＣＲ：定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ）を以下の通りに実施した：８０ngの全ＲＮＡを、SuperScript（商標）II Reverse Transcriptase（Invitrogen、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、オリゴ（ｄＴ）１２−１８（Invitrogen、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、２０μl反応容積中で逆転写した。
リアルタイムＰＣＲを、迅速サーマルサイクラーシステム（LightCycler（登録商標）４８０  ＩＩ、３８４−Ｗｅｌｌ、Roche、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実施した。増幅を、１０μlの全容積中で、１３０nM〜１μMの間で最適化されたプライマー濃度を用いて実施する。プライマー及び鋳型は、LightCycler（登録商標）480 SYBR Green I Master（２×濃度、Roche、Ｃａｔ．Ｒｅｆ  Ｎ°  ０４  ８８７  ３５２  ００１）に添付されている。ヌクレオチド、ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び緩衝液が、このミックス中に含まれる。増幅プロトコールには以下が組み入れられた：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの活性化のための９５℃で１０分間にわたる最初のインキュベーション、４５サイクル（１０秒間にわたる９５℃変性、４０秒間にわたる６０℃アニーリング、及び１０秒間にわたる７２℃伸長）が続き（蛍光産物の検出は、単一の取得モードによる７２℃伸長期間の終わりに実施した）、融解曲線のサイクル（５秒間にわたる９５℃変性、６０秒間にわたる６３℃アニーリング、及び９５℃）により終わる（６３℃〜９５℃まで、ランプ速度は０．１１℃／秒である。蛍光産物の検出は連続的であった）。増幅の特異性を確認するために、各々のプライマー対からのＰＣＲ産物を、融解曲線分析に供した。相対的な定量化を、ＰＣＲサンプルの各々についての交差ポイント（Ｃｐ値）に基づいて実施した。サンプルの蛍光がバックグラウンド蛍光を上回り上昇するポイントを、サンプルの「交差ポイント（Ｃｐ）」と呼ぶ。Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓミエリンタンパク質ゼロ（ＭＰＺ）遺伝子を標準化のために使用した（Sereda et al, 2006）。ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ分析のために使用するプライマー（Eurofins MWG Operon、Germanyにより合成)の配列は以下である:
ＰＭＰ２２−フォワード：５’−ＴＧＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＧＣＣＴＴＧＧ−３’（配列番号１１）及び
ＰＭＰ２２−リバース：５’−ＧＡＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣ−３’  （配列番号１２）。
ＭＰＺ−フォワード：５’−ＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１３）及び
ＭＰＺ−リバース：５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣ−３’（配列番号１４）．
結果
【０１６７】
Ｍｉｘ１組成物は、処置手順を通してバーテスト成績を改善する（図４）。
【０１６８】
Ｍｉｘ１は、３及び６週間の処置後にトランスジェニックラットの歩行スコアを改善する（図５に示す）。
【０１６９】
Ｍｉｘ１は、３、６、９、及び１２週間の処置後に傾斜板テスト（２５°）においてトランスジェニックラットの成績を増加させる（図６に記載）。
【０１７０】
図７は、傾斜板テストにおける２５、３５、及び４０°でのトランスジェニックラットの歩行スコアに対するＭｉｘ２のポジティブ効果を例示する。
【０１７１】
Ｍｉｘ７（用量３）は、ｐｍｐ２２トランスジェニックラットの坐骨神経においてｐｍｐ２２  ＲＮＡ遺伝子発現を有意に減少させる（図９）。
【０１７２】
Ｍｉｘ７（用量２及び用量３）を用いて処置されたｐｍｐ２２ラットでの成績が、傾斜板テスト（３５°）において改善される（図１０）。より具体的には、ラットの２９％及び３３％が良好な成績群に属する（ＴＧプラセボ群での５％と比較して）。ラットの２９及び１１％が不良な成績群に属する（ＴＧプラセボ群での６０％と比較して）。ｐ値（対ＴＧプラセボ）は、Ｍｉｘ７−用量２を用いて処置されたＴＧラットでの０．０１５２と等しい。ｐ値は、Ｍｉｘ７−用量３を用いて処置されたＴＧラットでの０．００２と等しい（対ＴＧプラセボ）。
【０１７３】
Ｍｉｘ７−用量３は、バーテストにおけるｐｍｐ２２ラットの落下潜時を、９週間の処置後に有意に増加させる（図１１）：黒色の破線、ｐ＝４，５６．１０−２、ｎ＝１８。ＴＧプラセボラット（黒色の平坦線、ｎ＝２０）とＷＴプラセボラット（灰色の平坦線、ｐ＝３，８２．１０−７、ｎ＝１８）の間での有意差も観察される。
【０１７４】
図１２は、Ｍｉｘ７−用量３を用いて処置されたｐｍｐ２２ラットの握力の改善を例示する。
【０１７５】
図１３は、バーテストでの潜時（Ｍｉｘ７−用量３を用いた９週間の処置後）とｐｍｐ２２  ＲＮＡの発現レベルの間での有意な相関を示す。
【０１７６】
図１４は、バーテストでの潜時（Ｍｉｘ７−用量３を用いた９週間の処置後）と感受性神経（尾）の伝導速度の間での有意な相関を表す。
【０１７７】
同様の結果が、他の組み合わせについて得られる（表３を参照のこと）。
【表４】
0006522641.tif 000006
【０１７８】
これらのデータは、インビボで、本発明の組み合わせ及び計画がＣＭＴの効果的な処置を許すことを示す。
【０１７９】
Ｄ．中毒性ニューロパチーのモデルにおけるインビボ効果
薬物処置又は計画を、オキサリプラチン（３mg/kg）の最初の腹腔内注射の前日（Ｄ−１）から、最後のテスト日の前日（Ｄ１６）まで経口で投与する。オキサリプラチン処置群に属する動物に蒸留水を毎日投与する（１０ml/kg）。動物に、テストされた処理水及び蒸留水を用いて、毎日、午前中に投与するのに対し、オキサリプラチンは午後に投与する。
【０１８０】
テスト日（即ち、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ１０）の間に、処理水及び蒸留水をテスト後に投与する。テスト日（Ｄ４）に関して（化合物及び溶剤の投与ならびにオキサリプラチン注射を含む）、処理水及び蒸留水を、テスト後のオキサリプラチンの注射前に投与する。参照処置群からの動物に、テスト日（即ち、Ｄ１、Ｄ４、Ｄ１０、及びＤ１７）の間だけ投与する。
【０１８１】
冷アロディニアを、熱非侵害刺激（アセトンテスト）に対する応答を、Ｄ１（オキサリプラチン（３mg/kg）の最初の注射後約２４時間）（オキサリプラチンの急性効果）に、Ｄ４、Ｄ１０（オキサリプラチンの慢性効果）に、及びＤ１７（処置の完了後１週間目でのオキサリプラチンの残存効果）に測定することにより評価する。
【０１８２】
テストを、アセトンテストを使用して、参照の投与後２時間目に行う。参照物質はガバペンチン（１００mg/kg、経口）である（１日１回×４テスト日）。
【０１８３】
アセトンテスト
冷アロディニアを、アセトンテストを使用して評価する。このテストにおいて、後肢引っ込めの潜時を、両方の後肢の足底面へのアセトン液滴の適用後に測定し（反応時間）、応答の強度をスコア化する（冷スコア）。
【０１８４】
アセトンの冷却効果に対する反応時間を、アセトン適用後２０秒（カットオフ）以内に測定する。アセトンに対する応答を、また、以下の４ポイントスケールでグレード化する：０（応答なし）；１（肢の迅速な引っ込め、ひっかき）；２（肢の長期引っ込め又は顕著なひっかき）；３（肢の反復ひっかき、舐め又はかみつきを伴う）。
【０１８５】
ラットによる６回の試行を実施する。各々の実験群について、結果を、累積冷スコア（各々のラットで一緒についての６スコアの合計±ＳＥＭとして定義される）として表す。最低スコアは０（６回の試行のいずれに対しても応答なし）及び最高可能スコアは１８（６回の試行の各々での肢の反復ひっかき及び舐め又はかみつき）である。
【０１８６】
ガバペンチン供給元：Zhejiang Chiral Medicine Chemicals, China
オキサリプラチン供給元：Sigma, France
【０１８７】
結果を図８に描写する。それらは、オキサリプラチン誘導性ニューロパチーに対する本発明の組成物の保護効果を明らかに示す。
【０１８８】
Ｅ．ＡＬＳのモデルにおけるインビボ効果
動物モデル
本発明者らは、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットモデル（Howland et al.により生成）を選び、筋萎縮性側索硬化症の病理を模倣している。このモデルは、脊髄、多くの脳領域、並びに末梢組織において変異ＳＯＤ１遺伝子を過剰発現する。このモデルの運動ニューロン疾患の発症は約１１５日目である；それは、後肢の異常歩行として現れる。数日内に、後肢の麻痺が生じる。
【０１８９】
実験手順
本発明者らは、繁殖用ＳＯＤ１Ｇ９３ＡラットとＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ雌ラットを交雑することによりコロニーを得た。ヘテロ接合性ＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットを、ｈＳＯＤ１に特異的なプライマーを用いた、尾ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて同定する［１］。動物を室内（制御された照明（０５００−１９００ｈでの光）及び温度（２３±１℃））で維持し、食物及び水への自由な接近を与えた。本試験における全ての動物手順を、動物愛護のガイドライン基準に従って行う。
体重測定を毎週実施し、行動テストを６０日齢に開始し、終点まで継続した。処置は、毎日、経口又は皮下方法を通じて５週齢から投与する。
【０１９０】
１．観察テスト：一般的側面の特徴付け。
各々のラットを、新たなラットケージ（寸法５５×３３×１８cm）（わらくずを伴わない）中で５分間にわたり観察する。５つの異なるパラメーターを記録する：
歩行
−  スコア０：正常歩行（円滑性）
−  スコア１：異常歩行（円滑ではない、又は、ラットは、わずかな引きずり足歩行を有する）
−  スコア２：中程度の歩行障害（ラットはその足を引きずり、それを正しく置き、歩くことができる）
−  スコア３：重篤な歩行障害（ラットは、その片方又は両方の後肢を引きずるが、それ／それらを正しく置くことができない）。
毛並み
−  スコア０：きれいな絹のような毛並み
−  スコア１：立毛又は汚れた毛並み
振戦
−  スコア０：振戦なし
−  スコア１：振戦あり
姿勢
−  スコア０：正常
−  スコア１：異常（背中を平ら又は弓状にする）
後肢位置
−  スコア０：正常
−  スコア１：後肢を広げる。
【０１９１】
２．運動スコアテスト：運動障害の特徴付け。
このテストでは、いずれかの側にひっくり返されたラットがそれら自身を３０秒以内に立直す能力（立直り反射）を評価する（Gale et al）。
ノンパラメトリックスコア化システムを、これらの判断基準に従って使用した（Matsumoto et al, Thonhoff et al）：
−  スコア０：ラットは、３０秒以内にいずれかの側から体勢を立て直すことはできない。
−  スコア１：ラットは、３０秒以内に片側だけから体勢を立て直すことはできない。
−  スコア２：ラットは、３０秒以内に両側から体勢を立て直すことはできるが、ケージ中で立つことはできない；それは、常に、身体の一部を引きずっている。
−  スコア３：ラットは、３０秒以内に両側から体勢を立て直すことはできるが、ケージ中で立つことはできず、しかし、身体の一部を引きずっていない。
−  スコア４：ラットは、３０秒以内に両側から体勢を立て直すことはでき、ケージ中に立つことができるが、しかし、目に見える機能的欠陥を有する。
−  スコア５：ラットは、３０秒以内に両側から体勢を立て直すことはでき、ケージ中に立つことができ、目に見える機能的欠陥はない。
【０１９２】
疾患のエンドポイントをスコア０に固定している；ラットを、次に、安楽死させる。
【０１９３】
３．傾斜板テスト：運動障害の特徴付け
滑り装置は、角度０°（水平）〜６０°に傾斜させることができる３０×５０cmプレキシグラス板を有した。各々のラットを、最初に、２５°の角度で傾斜させた板上に、頭を起こした位置（頭を起こした方向）で置いた；１分間により隔てられた２回の試行を実施する。３０分後、同じ実験を、３５°の角度に傾斜させた板上で、次に４０°の角度に傾斜させた板上で実行する。この時間の間に、ラットをそのケージに戻した。板を、各々の試行後に掃除する。
ラットの成績を、４つの異なるスコアにより評価する：
−  スコア０：滑りなし
−  スコア１：小さな滑り（１又は２足）
−  スコア２：中程度の滑り（４足）（しかし、平面の最後までではない）
−  スコア３：ラットは、平面の一番下まで滑っている。
【０１９４】
４．ワイヤメッシュ：困難な状況における運動能力の特徴付け。
ワイヤメッシュを、ボックスと最上部で（角度７０°）及びテーブルの端と底部で接触させた。各々のラットを、ワイヤメッシュの底部に置き、それらの同腹仔をボックス中に最上部で置くことにより登る動機づけをした。各々のラットを週１回訓練した（３回試行）。
記録されたパラメーターは、ワイヤメッシュの最上部に達するまでの潜時であった。
【０１９５】
５．オープンフィールドテスト：歩行運動活動の特徴付け。
自発運動活動を、プレキシグラスボックス（４５×４５×３０cm、Acti-Track、BIOSEB、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）（床の１及び５cm上に、２本の軸に続いて１６のフォトセルビームを伴う）中で測定した。
各々のラットでの自発活動及び探索活動を３時間の間に評価した。４つのパラメーターを記録する（全移動距離、飼育の数、移動距離及びオープンフィールドの中心で費やした時間のパーセンテージ）。
【０１９６】
Ｆ．機械的な神経侵襲−坐骨神経挫滅のモデルにおけるインビボでの効果
坐骨神経挫滅が、神経再生の評価のための有効なモデルとして広く受け入れられている。このモデルにおいて、神経傷害は、損傷した坐骨神経の刺激を通じて生成される誘発筋活動電位（ＣＭＡＰ）の測定により証明される通り、神経機能の急速な破壊を招く。
神経損傷は、ＣＭＡＰの生成において増加潜時、ならびに、振幅及び持続時間の減少をもたらす活動電位の強度障害を招くシグナルのより低い神経伝導により特徴付けられる。これは、著しい歩行機能不全を招く。
【０１９７】
１．神経挫滅
ＣＤ−１マウス（Charles River、非罹患動物）を、イソフルラン（空気中に２．５〜３％）を使用して麻酔した。右大腿部を剃毛し、坐骨神経を大腿中央レベル（坐骨神経の分岐部に対して５mmの近位）で露出させ、各々の挫滅の間に９０°回転させながら、マイクロピンセット（Holtex、Ｐ３５３１１）を用いて１０秒間にわたり２回挫滅した。偽手術動物については、坐骨神経を露出させたが、挫滅しなかった。最後に、皮膚切開を、創傷クリップを用いて固定した。ＭＩＸ７用量３の最初の投与を、挫滅３０分後に実施した。１日目から４２日目まで、投与を１日１回実施した。テスト日に、マウスを、ＣＭＡＰ記録の１．５時間前に処置した（１０ml/kg）。重量負荷実験のために、動物に、ｍｉｘ７、バクロフェン（６００μg/kg）、ナルトレキソン（７０μg/kg）、Ｄ−ソルビトール（２１mg/kg）を投与し、テストを１３日目に実施した。
【０１９８】
２．電気生理学的測定
電気生理学的記録は、キーポイント筋電計（ＥＭＧ）（Medtronic、フランス）を使用し、挫滅の３０日後に実施した。マウスを２．５〜３％イソフルランにより麻酔し、皮下単極針電極を刺激及び記録の両方のために使用した。０．２ミリ秒の超最大（１２．８mA）方形波パルスを送達し、坐骨神経（挫滅の近位側）を刺激した。右坐骨神経（同側）を、坐骨ノッチで適用される単一パルスで刺激した。ＣＭＡＰを、腓腹筋に配置された針電極により記録した。筋肉の除神経及び神経再生（ｒｅｉｎｅｒｖａｔｉｏｎ）のレベルを反映する、活動電位の振幅（μV）を決定した（図１５、パネルＡ）。
【０１９９】
３．形態計測分析
挫滅の４２日後、脛骨神経を１群当たり６匹のマウスから採取し（上に記載する通り）、以下の通りに形態計測分析を実施した：各々のサンプルの神経節全体の合成画像を、デジタルカメラ（Nikon DS-Fi1）を備えた光学顕微鏡（Nikon optiphot-2）を用いて得た。形態計測分析は、Image-Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics Inc.、USA）を使用し、デジタル画像を用いて実施し、それによって、トルイジンブルー染色ミエリン鞘のグレーレベルを介した各々の有髄繊維の個別化後、軸索及びミエリンのピクセルサイズを計算する。これによって、軸索口径（図１５、パネルＢ）、及び、内側軸索直径と神経繊維の外径（即ち、軸索＋ミエリンの厚さ）の比であるＧ比の決定が可能になった。Ｇ比と軸索直径の間のバランスは、ニューロンのミエリン形成を示している（図１５、パネルＣ）。
【０２００】
４．後肢重量負荷
四肢上の動物（ＣＤ１マウス）体重分布を、動的重量負荷テスト（BioSeb、フランス）を使用して１３日目に評価した。この障害テストは、自由に動く動物により適用された全ての圧力点の連続測定から成り、神経損傷により起こる体重の不均衡の定量的評価を可能にする。各々のマウスは、床上の４４×４４センサセルグリッドを伴う１１×１１×２２cmケージに入れた。動物の足によりセンサセル上に適用される圧力を、５分間の期間にわたり１０Hzの周波数で記録した。圧力及び表面検出閾値を、動的重量負荷１．３．２  ｈソフトウェア（Bioseb、フランス）により、各々の動物について自動的に決定した。対応する足の各々の圧力点の手動帰属後、各々の足に適用された平均重量を、表面比について算出した。片側歩行機能障害を、最終的に、ｉｐｓｉ／対側後肢重量及び表面比を通じて評価した（図１７、パネルＡ）。
【０２０１】
５．結果
ＣＭＡＰ振幅の有意な改善が、挫滅非処置動物及びと比較して注目され、これは、３週間の処置という早期であり、それにより、神経の加速された機能的回復が示される（約８４％、図１５、パネルＡ）。形態学的分析は、また、軸索内径の有意な増加（６週間の処置後、約３０％、図１５、パネルＢ）を示し、それは、神経成長促進の徴候である。神経の形態学的及び電気生理学的機能におけるそのような改善は、ｍｉｘ７により誘発される神経再生を特徴付ける。
【０２０２】
軸索ミエリン形成の正常化が、本発明の組成物を用いた処置時に観察される。正常なミエリン形成状態は、軸索のほぼ均一なミエリン形成により特徴付けられ、それは、軸索の直径にかかわらず、一定のＧ比により特徴付けられる（図１５、パネルＣ、黒色水平線）。上記の挫滅による神経損傷は、軸索のミエリン形成の有意な乱れを招く。挫滅から４２日後、大きな軸索のミエリン形成不全と一緒に、小さな軸索（低直径）のミエリン過形成が、偽動物と比較した場合に注目され、これは、Ｇ−比と軸索直径の間での正相関によりもたらされる（図１５、パネルＣ、正の傾きを伴う黒色点線）。
【０２０３】
Ｍｉｘ７を用いた処置時、軸索ミエリン形成（ｍｙｅｌｉｎｉｓａｔｉｏｎ）の正常化が、挫滅から４２日目に観察され（図１５、パネルＣ、灰色線）、それは、偽動物（黒色線）及び非処置挫滅動物（黒色点線）と比較した場合、中間の傾きを示す軸索直径に従ったＧ比の分布により例示される。
【０２０４】
これらの結果は、ミエリン鞘（有髄ニューロンの場合）或いは電気生理学的機能及び／又は軸索の完全性に作用することにより、神経侵襲からの回復を改善及び／又は促進する本発明の組成物の高い可能性を強調する。
【０２０５】
図１７（パネルＢ）に示す通り、Ｍｉｘ７が、また、挫滅マウスの機能的挙動を回復するのに効率的であるのに対し、薬剤単独は、神経挫滅により誘導される運動障害に対する任意の効果を示さず（パネルＣ、Ｄ、Ｅ）、それにより、バクロフェン−ソルビトール−ナルトレキソンの組み合わせ治療の特定の効率が強調される。
【０２０６】
故に、本発明の組成物は、神経再生の促進を通じて神経損傷を補正する際に特に効率的である。
【０２０７】
Ｇ．臨床治験において評価された本発明の組成物のインビボでの効果。
ＣＭＴ疾患に対する本発明の組成物の正の効果が、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖデータベース内のＥＵＤＲＡＣＴ２０１０−０２３０９７−４０として、また、ＮＣＴ１０４０１２５７として登録された臨床治験において確認された。この治験は、１年間の二重盲検、無作為化、プラセボ対照第２相試験であった。
【０２０８】
試験の主目的は、ＣＭＴ疾患の患者におけるＭｉｘ７の安全性及び忍容性を評価することであった。第二の目的は、患者でのさらなる試験の組織化のために使用される、Ｍｉｘ７の有効性の探索的分析を目指す。
【０２０９】
１．方法
患者、無作為化、及び盲検化
潜在的に適格な被験体を、とりわけ、ＣＭＴ１Ａ遺伝子型決定の確認、シャルコー・マリー・トゥースニューロパチースコア（ＣＭＴＮＳ、Shy et al., 2005）の記録、ＣＭＴ１Ａ診断を確定するための総合的ニューロパチー限定スケール（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  Ｓｃａｌｅ）（ＯＮＬＳ、Graham et al., 2006）を含むスクリーニング来診で評価した。
臨床検査に従ってＣＭＴ１Ａと診断され、遺伝子型決定、少なくとも足の背屈における脱力、及びシャルコー・マリー・トゥースニューロパチースコア（ＣＭＴＮＳ）≦２０により確認された、男女の患者（年齢１８〜６５歳）が、１：１：１：１に無作為に割り当てられ、１年間にわたり毎日、プラセボ又はＭｉｘ７（（ＲＳ）バクロフェン：６mg/日、ナルトレキソン：０．７mg/日、Ｄ−ソルビトール：２１０mg/日）を受けた。無作為化ブロックスキームが使用され、試験センターにより層別化された。全ての治験責任医師及び患者が、処置の割り付けを知らなかった。
【０２１０】
安全性、忍容性、コンプライアンス
Ｍｉｘ７投与の最終日後の１ヶ月間の追跡調査来診を含む試験の間での混合物の安全性を、患者及び臨床検査からの有害事象報告に基づいてモニターした。コンプライアンスを、返却された空ボトルの数及び体積測定により、各々の来診時（１、３、９、及び１２ヶ月）にモニターした。全曝露の平均（ＳＤ）持続時間は、１１．６９（１．５３）月であり、群間で類似していた。治験薬の平均（ＳＤ）コンプライアンスは９７．３（９．４１）％であった。
【０２１１】
電気生理学的アッセイ
神経伝導試験を、３２℃の皮膚温度で、標準的な技術を使用して実施した。感覚機能及び運動機能の両方を、非支配的な上肢の正中神経及び尺骨神経でアッセイした。
運動パラメーター（複合筋活動電位の振幅（ＣＭＡＰ、ミリボルト）及び遠位運動潜時（ＤＭＬ、ミリ秒））について、正中神経を手首（肘前窩）で刺激し、応答を、短母指外転筋にわたり記録した。尺骨神経を、手首で、及び肘の下で刺激し、応答を小指外転筋にわたり記録した。
感覚パラメーター（感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ、ミリボルト）の振幅）及び感覚伝導速度（ＳＣＶ、毎秒メートル）について、逆行法を使用し、神経を、手首に配置したリング状電極により刺激した。正中神経については、活性電極を、２桁目の基礎に、及び、参照電極を２桁目の第四と第五中手骨の間に配置した。尺骨神経については、活性電極を５桁目の基礎に、及び、参照電極を５桁目の第四と第五中手骨の間に配置した。
【０２１２】
シャルコー・マリー・トゥースニューロパチースコア（ＣＭＴＮＳ）
ＣＭＴＮＳがShy et al.(2005)により提案、検証され、ＣＭＴの重症度の単一の信頼できる測定値を提供した２２。それは、現在、唯一のＣＭＴ特異的な転帰の測定値である（ＣＭＴ１Ａに特異的ではないが）。ＣＭＴＮＳは、損傷の５（感覚症状、ピン感性、振動、腕及び脚の強度）、活動限定の２（腕及び脚の運動症状）、及び電気生理学の２（尺骨ＣＭＡＰ及びＳＮＡＰの振幅）を含む９項目に基づく３６ポイントスケールである。より高いスコアは、機能の悪化を示しており、スコアによって、障害は、軽度（０−１０）、中程度（１１−２０）、及び重度（２１−３６）として分類される。
【０２１３】
全体的なニューロパチー限定スケール（ＯＮＬＳ）
ＯＮＬＳは、２３得られ、上肢（５点で評価）及び下肢（７点で評価）の日常活動における限定を測定するためにGraham and Hughes(2006)により、ＯＤＳＳから由来及び改善させた２３。合計スコアは０（＝無障害）から１２（＝最大の障害）まで行く。末梢ニューロパチーを伴う患者の機能は、彼らの身体能力に加えて、他の因子により影響を受けうるが、ＯＮＬＳによって、普通の生活に移り、それを満たす、患者の認知される能力が測定され、このように、生活の質に関連付けられると予測される。
【０２１４】
統計分析
統計分析を、Ｒバージョン３．０．１又はそれ以降（ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を用いて実施した。データ分布及び群内変動を、方法論の選択を導くために、予備的に評価した（Markowski et al., 1990；Sawilowski & Blair；Vickers, 2005）。データをＭｉｓｓｉｎｇ  Ａｔ  Ｒａｎｄｏｍ（ＭＡＲ、Little & Rubin, 2002）として仮定すると、欠落データの補完を、治療企図縦断的試験（Chakraborty & Gu, 2009）のための最も適当な技術を考慮した混合モデルアプローチにより実施した。欠落データの補完を伴わない結果を、感度目的のために比較した。統計的検定を５％有意水準で行った。
集団分析
全ての分析を、Ｍｉｘ７の少なくとも１用量を摂取し、１つのベースライン後の有効性の測定値を提供したことが公知である全ての無作為化された患者を含むことにより、治療企図に基づく完全分析セットで行った。
ベースライン分析
ベースラインでの患者の特徴を、記述的に群間で比較し、フィッシャーの正確確率検定又は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によりテストした。
【０２１５】
安全性及び忍容性分析
安全性及び忍容性分析は、報告された処置中に出現した有害事象及びその他の安全性情報（臨床検査、バイタルサイン、及びＥＣＧ）に基づいた。処置中に出現した有害事象（ＴＥＡＥ）の発生率を、記述的に群間で比較し、フィッシャーの正確確率検定によりテストした。
【０２１６】
有効性分析
群間の差は、ベースライン値について調整することにより、対数変換値での共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）により評価した。推定値を、ベースラインからの平均変化率として提供した。この分析は、異なる有効性転帰に独立的に実施した。転帰の多重性のため、２つの主要な転帰（ＣＭＴＮＳ及びＯＮＬＳ）に対する処置効果の重要性を、オブライエンのＯＬＳ検定（O’Brien, 1984; Logan & Tamhane, 2006）によりテストした。この分析は、他の有効性転帰（ＤＭＬ、ＳＣＶ）について反復した。治療応答者は、１２ヶ月間の処置の間に悪化していなかった患者として定義した。悪化は、ＣＭＴＮＳ及びＯＮＬＳにわたり平均化された、ベースラインからの変化率により評価した。各々の群の応答者の割合を、ロジスティック回帰モデルを使用して比較した。相対リスクをオッズ比の推定値から推定した３６。有効性解析のための統計的検定は片側であった。片側アプローチは、臨床的根拠（ずっと高い投与量で商業的に使用される化合物の極度に低い投与量による、有効性又は安全性の両方に関する可能性の低い有害仮説）及び統計的効率に基づいて正当化された（Lewis et al., 2013；Parikh et al., 2011；  De Jager et al., 2010）。
【０２１７】
２．結果
安全性及び忍容性
Ｍｉｘ７の安全性及び忍容性の結果は、良好であった。なぜなら、処置の摂取は、バイタルサイン（血圧、心拍数、及び重量）、心電図測定、及び検査値異常（生化学及び血液学）の結果に対する影響を示さなかったからである。プラセボとＭＩＸ７群間での処置中に出現した有害事象の発生率において有意差はなかった（それぞれ４７％及び３１％）。さらに、処置中に出現した有害事象の大半が、軽度及び良性であった。
【０２１８】
有効性
Ｍｉｘ７を用いた処置は、プラセボ群と比較し、ＣＭＴＮＳの改善に導く（表４、傾向、Ｐ＜０．２０）。ＯＮＬＳスコアも、プラセボと比較し、ＭＩＸ７群で改善した（表４、１４．４％改善、Ｐ＜０．０５）。実際に、ＯＮＬＳスコアが１年後にプラセボにおいて減少したのに対し（図１６、点線）、それは、Ｍｉｘ７処置群において有意に増加した（図１６、実線）。患者の包括的な状態スコアの改善が、オブライエンのＯＬＳの有意性（Ｐ＜０．０５）を通じて、プラセボと比較した、Ｍｉｘ７群におけるＣＭＴＮＳ及びＯＮＬＳの改善を考慮した場合に確認される。
【０２１９】
興味深いことに、ミエリン機能も、感覚伝導速度及び運動遠位潜時により評価される通り、プラセボと比較した場合、Ｍｉｘ７群において改善を示した。遠位運動潜時（ＤＭＬ）は、プラセボと比較した場合、Ｍｉｘ７群において有意に減少し（表４、８％、Ｐ＜０．０５）、感覚伝導速度（ＳＣＶ）は、プラセボと比較した場合、Ｍｉｘ７群において有意に増加した（表４、２６．６％、Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、シュワン細胞機能に対するＭｉｘ７の影響と一致しており、上のインビトロ及びインビボの前臨床試験において観察された通り、神経線維の再生における本発明の組成物の効率が持続される。
【表５】
0006522641.tif 000007
【０２２０】
最後に、１２ヶ月間の処置の間に悪化した患者として定義される、治療応答者の割合は、Ｍｉｘ７群において有意に高かった（７９％、相対リスク１．６６、Ｐ＝０．０１）。
【表６】
0006522641.tif 000008
【０２２１】
応答者と非応答者の間での（試験の開始時に記録された）ベースライン特性を考慮することにより、応答者が、包括的に疾患にあまり重度に罹患していないように見えた。疾患の進行した段階で、患者における疾患の進行を減速する際に有用であるだけでなく、本発明の組成物は、病状の軽い、又は疾患の初期段階である患者（例えば小児など）において、疾患を遅らせるために、特に利益を有すると予測することができるであろう。
【０２２２】
参考文献
【表７】
0006522641.tif 000009
0006522641.tif 000010
0006522641.tif 000011
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0006522641.tif 000017
【図１】
0006522641.tif 000018
【図２】
0006522641.tif 000019
【図３】
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【図４】
0006522641.tif 000021
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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