(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造
【化１】
0006456816.tif 000089
を有する化合物であって、前記タグが、ナノ細孔を用いて検出することができるものであって、天然の塩基を有するヌクレオチド、および（ｉ）少なくとも１つの脱塩基部位、または（ｉｉ）修飾塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、Ｘがリンカーであって、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2を含んでよく、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、前記塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４である化合物。
【請求項２】
前記タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を更に含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記タグは、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、前記タグの電荷の大きさが、前記化合物の残りの電荷の大きさと同じである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記タグが正電荷を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記タグが、適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保つ、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記タグが、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
前記タグの除去により、化合物の電荷が変化する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
前記リンカーが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、異なる長さおよび分子量のＰＥＧ、有機または無機染料、蛍光および蛍光性染料、薬物、オリゴヌクレオチド、マスタグ、化学発光化合物を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の異なる４種類の化合物を含む組成物であって、第１の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが他の３種類の化合物の各々にある前記タグと異なる、組成物。
【請求項１０】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＤＮＡを、
少なくとも第１の電解質溶液を含む第１の区画と、少なくとも第２の電解質溶液を含む第２の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも１つの電極を含み、
前記少なくとも１つの細孔が、前記印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも１つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ  を有する、
伝導性測定システム；および
構造
【化２】
0006456816.tif 000090
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物と接触させ、
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および（ｉ）少なくとも１つの脱塩基部位、または（ｉｉ）修飾塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、Ｘがリンカーであって、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2を含んでよく、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、第１の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体であり；
前記一本鎖ＤＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＤＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することと；
を含み、それによって、前記一本鎖ＤＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
【請求項１１】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＤＮＡを、
少なくとも第１の電解質溶液を含む第１の区画と、少なくとも第２の電解質溶液を含む第２の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも１つの電極を含み、
前記少なくとも１つの細孔が、前記印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも１つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ
を有する、
伝導性測定システム；および
構造
【化３】
0006456816.tif 000091
を有する化合物と接触させ、
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および（ｉ）少なくとも１つの脱塩基部位、または（ｉｉ）修飾塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、Ｘがリンカーであって、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2を含んでよく、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり；
前記一本鎖ＤＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし（１）前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり；
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＤＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することと；
を含み、それによって、前記一本鎖ＤＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
【請求項１２】
一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＲＮＡを、
少なくとも第１の電解質溶液を含む第１の区画と、少なくとも第２の電解質溶液を含む第２の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも１つの電極を含み、
前記少なくとも１つの細孔が、前記印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも１つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ
を有する、
伝導性測定システム；および
構造
【化４】
0006456816.tif 000092
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物と接触させ、
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および（ｉ）少なくとも１つの脱塩基部位、または（ｉｉ）修飾塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、Ｘがリンカーであって、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2を含んでよく、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、第１の種類の化合物の前記塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の前記塩基が、グアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の前記塩基が、シトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の前記塩基が、ウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが、他の３種類の化合物の各々にある前記タグと異なり；
前記一本鎖ＲＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の前記一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＲＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することと；
を含み、それによって、前記一本鎖ＲＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
【請求項１３】
一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＲＮＡを、
少なくとも第１の電解質溶液を含む第１の区画と、少なくとも第２の電解質溶液を含む第２の区画とを分離し、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含む、電気的抵抗がある障壁、および
前記電気的抵抗がある障壁を越えて印加電位を生じるように構成された少なくとも１つの電極を含み、
前記少なくとも１つの細孔が、前記印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており、且つ
前記少なくとも１つの細孔は、該細孔の入口に隣接して該細孔に結合するポリメラーゼ  を有する、
伝導性測定システム；および
構造
【化５】
0006456816.tif 000093
を有する化合物と接触させ：
前記タグが、天然の塩基を有するヌクレオチド、および（ｉ）少なくとも１つの脱塩基部位、または（ｉｉ）修飾塩基を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含み、前記タグは発蛍光団ではなく、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、Ｘがリンカーであって、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2を含んでよく、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり；
前記一本鎖ＲＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある前記一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし（１）前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＲＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することと；
を含み、それによって、前記一本鎖ＲＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
【請求項１４】
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を更に含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカーは、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、異なる長さおよび分子量のＰＥＧ、有機または無機染料、蛍光および蛍光性染料、薬物、オリゴヌクレオチド、マスタグ、または化学発光化合物を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国仮出願第６１／７８１，３５３号；２０１２年６月２０日出願の米国仮出願第６１／６６２，３３０号；２０１２年６月２０日出願の米国仮出願第６１／６６２，３２９号；２０１２年６月２０日出願の米国仮出願第６１／６６２，３３４号；および２０１２年４月９日出願の米国仮出願第６１／６２１，９８１号の利益を主張し、その出願を、その全体において参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
この発明は、米国国立衛生研究所により授与された補助金番号ＨＧ００５１０９の下で政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景】
【０００３】
核酸配列決定は、核酸の核酸主成分を決定するための方法である。そのような配列情報は、対象を診断するおよび／または治療する際に役立つ場合がある。例えば、対象の核酸配列は、遺伝的疾患の治療の同定、診断および潜在的には開発に使用できる。別の一例として、病原体の研究が、伝染性疾患の治療につながる場合もある。
【０００４】
核酸を配列決定するために使用してもよい利用可能な方法がある。しかし、そのような方法は、高価であり、対象を診断および／または治療するのに必要になり得る時間内におよび精度で配列情報を提供できない。
【概要】
【０００５】
ナノ細孔を通過する一本鎖核酸分子を伴う核酸配列決定の方法は、感度が十分でない場合がある。核酸分子（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）および／またはウラシル（Ｕ））を含む核酸塩基は、互いに十分に区別できる信号を生成しない場合がある。特に、プリン（すなわち、ＡおよびＧ）は、互いに類似のサイズ、形状および電荷のものであり、いくつかの実例において十分に区別できる信号を生成しない。また、ピリミジン（すなわち、Ｃ、ＴおよびＵ）は、互いに類似のサイズ、形状および電荷のものであり、いくつかの実例において十分に区別できる信号を生成しない。核酸分子の同定および核酸配列決定の方法を改善する必要性については、本明細書において認識されている。
【０００６】
本開示の側面は、核酸分子を配列決定する方法であって、（ａ）別々にアドレス可能な複数のナノ細孔を含むチップを用意し、別々にアドレス可能な前記複数のナノ細孔の別々にアドレス可能なナノ細孔が、電極に隣接して配置されている膜中にナノ細孔を含み、前記ナノ細孔が、核酸ポリメラーゼに連結されており、各別々にアドレス可能なナノ細孔が、タグ付けされたヌクレオチドが重合すると前記タグ付けされたヌクレオチドから遊離するタグを検出するように適合されていることと；（ｂ）前記ナノ細孔に隣接してまたは近接して前記核酸分子を導くことと；（ｃ）前記ポリメラーゼを用いて、前記核酸分子に沿ってヌクレオチドを重合させて、前記核酸分子の少なくとも一部に相補的な鎖を生成し、重合の間に、前記ヌクレオチドの個々のヌクレオチドからタグが遊離し、前記遊離したタグが、前記ナノ細孔を通り抜けてまたはその近接に流れることと；（ｄ）前記電極を用いてタグを検出することとを含み、タグが、前記個々のヌクレオチドから遊離した後に検出される、方法を提供する。いくつかの態様において、（ｄ）の前記検出は、前記タグを同定することをさらに含む。場合によっては、本方法は、前記同定したタグを前記個々のヌクレオチドの種類と相関させることをさらに含む。場合によっては、本方法は、重合の間に検出されるタグの評価に基づいて、コンピュータプロセッサを用いて核酸分子の核酸配列を生成することをさらに含む。
【０００７】
本開示の別の一側面は、核酸配列を決定する方法であって、（ａ）二本鎖核酸分子の末端に核酸ヘアピンをライゲーションすることと；（ｂ）二本鎖核酸分子およびヘアピンを解離させて、一本鎖核酸鋳型を形成することと；（ｃ）タグ付けされたヌクレオチドを使用して、一本鎖核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが、伸長すると遊離することと；（ｄ）ナノ細孔を用いて遊離したタグを検出することとを含み、それによって、二本鎖核酸分子の核酸配列を決定する、方法を提供する。場合によっては、本方法は、個々のヌクレオチドから遊離したタグを、ナノ細孔を通して導くことをさらに含む。場合によっては、本方法は、ナノ細孔に隣接する位置に個々のヌクレオチドから遊離したタグを導くことをさらに含む。
【０００８】
本開示の別の一側面は、核酸配列を決定する方法であって、（ａ）第１の速度で、タグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが重合すると遊離することと；（ｂ）第２の速度で、タグをナノ細孔に通すことによって遊離したタグを検出し、第２の速度が第１の速度を超えるか、それと同じであることとを含む方法を提供する。
【０００９】
本開示の別の一側面は、核酸配列を決定する方法であって、（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが重合すると遊離することと；（ｂ）ナノ細孔を用いて、遊離したタグを検出することとを含む方法を提供する。場合によっては、本方法は、個々のヌクレオチドから遊離したタグをナノ細孔を通して導くことをさらに含む。場合によっては、本方法は、ナノ細孔に隣接する位置に個々のヌクレオチドから遊離したタグを導くことをさらに含む。
【００１０】
本開示の別の一側面は、核酸配列を決定する方法であって、ナノ細孔を用いて核酸分子へのヌクレオチドの組み込みを検出することを含み、核酸分子がナノ細孔を通り抜けない、方法を提供する。
【００１１】
本開示の別の一側面は、核酸配列を決定する方法であって、ナノ細孔を用いて個々のヌクレオチド組み込み事象の副産物を検出することを含む方法を提供する。
【００１２】
核酸分子を配列決定する方法であって、４σを超える精度で個々のヌクレオチド組み込み事象を区別することを含む方法。
【００１３】
本開示の別の一側面は、核酸配列を決定する方法であって、（ａ）ナノ細孔のアレイを形成し、前記アレイ中の個々のナノ細孔が、核酸ポリメラーゼと結合していることと；（ｂ）タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、個々のタグ付けされたヌクレオチドがタグを含み、タグが遊離し、ナノ細孔を用いて検出される、方法を提供する。
【００１４】
本開示の別の一側面は、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔のアレイを含むチップ中のナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本開示の別の一側面は、核酸分子を配列決定するシステムであって、（ａ）別々にアドレス可能な複数のナノ細孔を含むチップであって、別々にアドレス可能な前記複数のナノ細孔の別々にアドレス可能なナノ細孔が、電極に隣接して配置されている膜中に少なくとも１つのナノ細孔を含み、別々にアドレス可能な各ナノ細孔が、前記核酸分子に相補的な核酸鎖にタグ付けされたヌクレオチドが組み込まれると前記タグ付けされたヌクレオチドから遊離したタグの検出に役立つように適合されている、チップと；（ｂ）前記別々にアドレス可能なナノ細孔と結合されているコンピュータプロセッサであって、前記コンピュータプロセッサが、別々にアドレス可能な前記複数のナノ細孔から受け取った電気信号に基づいて前記核酸分子の核酸配列の特徴づけに役立つようにプログラムされており、個々の電気信号が、前記核酸分子に相補的な核酸鎖におけるタグ付けされたヌクレオチドの組み込み後に前記タグ付けされたヌクレオチドから遊離するタグと関連付けられている、コンピュータプロセッサとを含むシステムを提供する。
【００１６】
本開示の別の一側面は、核酸分子を配列決定する方法であって、１ｍｍ2当たり少なくとも約５００個の部位の密度で、各部位が、核酸ポリメラーゼに付着しているナノ細孔を有する、アドレス可能な部位のアレイを用意することと、アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合することとを含み、重合すると、タグが遊離し、所与の部位でナノ細孔によって検出される、方法を提供する。場合によっては、本方法は、プロセッサを用いて、検出されたタグに基づいて核酸分子の核酸配列を生成することを導くことをさらに含む。
【００１７】
本開示の別の一側面は、（ａ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｂ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｃ）電界の変化を測定するための手段と；（ｄ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｅ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システムを提供する。
【００１８】
本開示の別の一側面は、構造
【化１】
0006456816.tif 000002
【００１９】
を有する化合物であって、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する化合物を提供する。
【００２０】
本開示の別の一側面は、構造
【化２】
0006456816.tif 000003
【００２１】
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物であって、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の３種類の化合物の各々にあるタグと異なる、組成物を提供する。
【００２２】
場合によっては、組成物は、塩基およびタグ中に４種類の化合物の各々と異なる第５の種類の化合物をさらに含み、第４の種類の化合物の塩基がチミンまたはその誘導体である場合に、第５の種類の化合物の塩基はウラシルまたはその誘導体であり、または第４の種類の化合物の塩基がウラシルまたはその誘導体である場合に、第５の種類の化合物の塩基はチミンまたはその誘導体である。
【００２３】
本開示の別の一側面は、化合物のアイデンティティを決定する方法であって、（ａ）化合物を（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと；（ｂ）化合物が細孔を通り抜けて移行するときに、電界の変化を記録し、電界の変化が、化合物と電解質と細孔との相互作用の結果であり、化合物のサイズ、電荷および組成を示すこととを含み、それによって、変化と所定の値との相関から化合物のアイデンティティを決定することが可能になる、方法を提供する。場合によっては、本方法は、工程（ａ）の前にホスファターゼ酵素で化合物を処理する工程をさらに含む。
【００２４】
本開示の別の一側面は、化合物が、タグであるかまたはタグの前駆体であるかどうかを決定する方法であって、（ａ）化合物を（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと；（ｂ）化合物が細孔を通り抜けて移行するときに、電界の変化を記録することと；（ｃ）電界の変化を、タグおよびタグの前駆体に対応する所定の値と比較することとを含み、それによって、化合物が、タグであるかまたはその前駆体であるかどうかを決定する、方法を提供する。場合によっては、本方法は、工程（ａ）において電界の電流バイアスを調節する工程をさらに含む。
【００２５】
本開示の別の一側面は、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）一本鎖ＤＮＡを（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化３】
0006456816.tif 000004
【００２６】
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物と接触させ、タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の塩基がチミンまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の３種類の化合物の各々にあるタグと異なり、一本鎖ＤＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；（ｃ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することとを含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
【００２７】
本開示の別の一側面は、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）一本鎖ＤＮＡを（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化４】
0006456816.tif 000005
【００２８】
を有する化合物と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうち１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、一本鎖ＤＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし（１）化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；（ｃ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することとを含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
【００２９】
本開示の別の一側面は、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）一本鎖ＲＮＡを（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化５】
0006456816.tif 000006
【００３０】
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の塩基がウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の３種類の化合物の各々にあるタグと異なり、一本鎖ＲＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；（ｃ）配列決定される一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することとを含み、それによって、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
【００３１】
本開示の別の一側面は、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、（ａ）一本鎖ＲＮＡを（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化６】
0006456816.tif 000007
【００３２】
を有する化合物と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうち１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、一本鎖ＲＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし（１）化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；（ｃ）配列決定される一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することとを含み、それによって、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法を提供する。
【００３３】
本開示の別の一側面は、（ａ）少なくとも第１および第２の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と；（ｂ）前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含み；（ｃ）前記第１および第２の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも１つの化合物と；（ｄ）前記少なくとも１つの細孔は、印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており；（ｅ）前記少なくとも１つの細孔は、化合物からタグを切断してタグを遊離するように構成された特徴部を含み；（ｆ）イオン電流を測定する手段、ならびに少なくとも１つの細孔がタグによって遮られていない時間およびタグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、時系列としてその時間経過を記録する手段とを含む伝導性測定システムを提供する。場合によっては、このタグは、細孔においてイオン電流帯域幅の制限より長い滞留時間およびイオン電流を測定する前記手段の電流ショットノイズ（current shot noise）を有する。
【００３４】
本開示の別の一側面は、遮られていない細孔の伝導性レベルと統計的に一致する領域、および伝導性の低下したパルス、また伝導性の低下した個々のパルス内の統計的に定常なセグメントに伝導性時系列のセグメントを正確に記述する方法であって、前記伝導性時系列が、少なくとも第１および第２の電解溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と；前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含み；前記第１および第２の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも１つの化合物と；前記少なくとも１つの細孔は、印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており；前記少なくとも１つの細孔は、化合物からタグを切断してタグを遊離するよう構成された特徴部を含み；イオン電流を測定する手段、ならびに少なくとも１つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、前記伝導性時系列を記録する手段とを含む伝導性測定システムで生成され；伝導性時系列のセグメントを正確に記述するための前記方法が、（ａ）未加工伝導性時系列から推定した、ヒドンマルコフモデルの連続密度の最尤状態配列のビタビ復号と；（ｂ）開孔伝導性レベルからの逸脱に対する閾値との比較による伝導性の低下したパルスの領域の正確な記述と；（ｃ）各セグメントに対するイオン電流レベルの中心傾向を推定することによって、または中心傾向とセグメント継続時間を一緒に測定することによって、伝導性の低下したパルスを特徴づける手段、とからなる群から選択され、セグメント中心傾向の測定が、（ｉ）連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として伝導性時系列から推定した第１のＧＭＭのガウス成分の平均パラメータと；（ｉｉ）算術平均と；（ｉｉｉ）トリム平均と；（ｉｖ）中央値と；（ｖ）サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量とからなる群から選択される方法を提供する。
【００３５】
場合によっては、本方法は、（ａ）伝導性セグメントの中心傾向の測定に基づく第２の混合ガウスモデルの最尤推定値と；（ｂ）伝導性時系列のセグメントの中心傾向の推定の経験的確率密度の補間および平滑化、ならびに補間する関数の導関数の平方根によるピーク検出と；（ｃ）多モード分布推定量のモードを位置指定する別の手段との少なくとも１つをさらに含む。
【００３６】
本開示の別の一側面は、溶液中の化合物の少なくとも１つのパラメータを決定する方法であって、第１の貯蔵部に第１の流体を入れることと；第２の貯蔵部に第２の流体を入れることと；前記第１および前記第２の流体の少なくとも一方は、少なくとも１つの化合物を含み、化合物は、タグ付けされたヌクレオチドまたはタグ付けされたヌクレオチドから切断されたタグであり；前記第１の貯蔵部内の前記第１の流体は、電気的抵抗がある障壁で前記第２の貯蔵部内の前記第２の流体と分離されており；前記電気的抵抗がある障壁は、少なくとも１つの細孔を含み；前記第１と前記第２の流体の間の電位により、前記第１の流体、前記少なくとも１つの細孔、および前記第２の流体にイオン電流を流すことと；前記少なくとも１つの細孔を通って流れるイオン電流およびイオン電流の変化の継続時間を測定することと；イオン電流の測定は、前記少なくとも１つの細孔と相互作用している化合物によって引き起こされるイオン電流の減少を測定するのに十分な一定の時間実行され；イオン電流の変化および一定の時間を通じてのイオン電流の変化の継続時間を数理的に解析することによって、化合物の少なくとも１つのパラメータを決定することとを含み、前記数理解析が、（ａ）連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として伝導性時系列から推定した第１のＧＭＭのガウス成分の平均パラメータと；（ｂ）事象平均抽出（Event-Mean Extraction）と；（ｃ）最尤事象状態割り当てと；（ｄ）閾値検出および平均化と；（ｅ）スライディングウインドウ分析（sliding window analysis）と；（ｆ）算術平均と；（ｇ）トリム平均と；（ｈ）中央値と；（ｉ）サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量とからなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、方法を提供する。
【００３７】
本開示の別の一側面は、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することが可能なタグを含む、タグ付けされたヌクレオチドを提供する。
【００３８】
本開示のさらなる一側面は、核酸配列を決定する方法であって、各部位が、核酸ポリメラーゼに付着しているナノ細孔を有する、別々にアドレス可能な部位のアレイを用意することと、前記アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、タグが遊離し、前記所与の部位でナノ細孔によって検出される、方法を提供する。
【００３９】
本開示のさらなる側面および利点は、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかとなり、本開示の例示の態様だけを、図示および記載する。認識されるように、本開示は、他の異なる態様も可能であり、そのいくつかの詳細は、本開示を逸脱しない範囲で全て、様々な明白な点で修正が可能である。したがって、その図面および説明は、本質的に例示とみなされ、限定とみなされるべきではない。
【００４０】
参照による組み込み
参照により組み込まれるべき各個々の出版物または特許出願が具体的および別々に示されるように、この明細書に記載の全ての出版物および特許出願を参照によりここに組み込む。
【００４１】
本発明の新規特徴は、特に、添付の特許請求の範囲と共に説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的態様を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本発明の方法の工程を図示する。
【図２Ａ】図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ナノ細孔検出器の例を示し、図２Ａは電極上に配置されたナノ細孔を有する。
【図２Ｂ】図２Ｂはウェル上の膜中に挿入されたナノ細孔を有する。
【図２Ｃ】図２Ｃは突出電極上にナノ細孔を有する。
【図３】図３は、核酸配列決定のための方法を例示する。
【図４】図４は、タグのナノ細孔通過により生成される信号の例を示す。
【図５】図５は、ナノ細孔検出器のアレイを示す。
【図６】図６は、ヌクレオチドのリン酸に結合したタグ分子の例を示す。
【図７】図７は、代替的なタグ位置の例を示す。
【図８】図８は、タグ付ヌクレオチドの例を示す。
【図９】図９は、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸および検出可能なＴＡＧを示す。
【図１０】図１０は、鋳型鎖を調製するための方法を示す。
【図１１】図１１は、ナノ細孔を含む例示的チップ設定を示す。
【図１２】図１２は、例示的な試験チップセルアレイ構成を示す。
【図１３】図１３は、例示的なセルアナログ回路を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび１４Ｂは、超小型回路の例を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび１４Ｂは、超小型回路の例を示す。
【図１５】図１５は、クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチド類似体の合成の例を示す。
【図１６】図１６は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる遊離したタグの特徴づけの例を示す；クマリン−ＰＥＧ１６−ＮＨ2（青色）をもたらすクマリン−ＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、クマリン−ＰＥＧ２０−ＮＨ2（緑色）をもたらすクマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、クマリン−ＰＥＧ２４−ＮＨ2（橙色）をもたらすクマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐの酸加水分解およびクマリン−ＰＥＧ３６−ＮＨ2（赤色）をもたらすクマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解により生成されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により示されるように、アルカリホスファターゼによる処理後のポリメラーゼ伸長反応において生成された対応する遊離したタグと同一である；４つの別々に得られたＭＳスペクトルの複合画像が示される；クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグの構造が示される。
【図１７】図１７は、単一分子検出レベルでのタンパク質ナノ細孔における遊離したタグの識別の例を示す；酸加水分解により４つの同等のヌクレオチドから誘導された４つのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2化合物（ｎ＝１６、２０、２４および３６）をプールし、ナノ細孔測定のために４Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２中に希釈した；（左）時系列データは、これらのＰＥＧタグが単一のα−溶血素イオンチャンネルに進入する時、それらがそのサイズに特徴的な電流遮断を引き起こすことを示している；右  個々の分子により引き起こされる平均電流遮断のヒストグラムは、１０ｋＨｚの測定バンド幅での基準分解能を示す；上部の色付きバーは、データの６σ分布を表し（４つのＤＮＡヌクレオチドのそれぞれを表すことができる４つのＰＥＧタグのそれぞれに関するガウス分布と見なす）、これは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ指定を用いることによりこの図面で表された、単一の塩基を、４つの異なる長さのＰＥＧと共に４つの異なるヌクレオチドをＤＮＡ配列決定に用いる場合に生じてもよい１／３００，０００の事象より良好な精度で識別することができることを示唆する。
【図１８】図１８は、配列決定装置を制御するために構成されたコンピュータシステムを示す。
【図１９】図１９は、セル電流読取り値のヒストグラムを示す。
【図２０】図２０は、４つの異なるタグに関する、ピコアンペアで測定された電流対秒で測定された時間のプロットを示す。
【図２１】図２１は、イオンチャンネルを形成する脂質二重層におけるα−溶血素タンパク質自己集合を示し、生成された対応する電気的特徴（下）と共に、核酸ストレッチはそれを通過する（上）（Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅら、２００１およびＤｅａｍｅｒら、２００２）。
【図２２】図２２は、ヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドアデノシン三リン酸、デオキシリボヌクレオチドグアノシン三リン酸、デオキシリボヌクレオチドシトシン三リン酸、およびデオキシリボヌクレオチドチミジン三リン酸の構造を示す。
【図２３】図２３は、４つのリン酸タグ付ヌクレオシド−５’−ポリリン酸の構造を示す。
【図２４】図２４は、リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸の合成を示す。
【図２５】図２５は、リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−四リン酸の合成を示す。
【図２６】図２６は、末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−五リン酸の合成を示す。
【図２７】図２７は、ａ）オリゴ−３’−５’−リン酸結合、ｂ）オリゴ−５’−５’−リン酸結合、ｃ）ポリメラーゼ反応後の検出可能部分を示す。
【図２８Ａ】図２８（Ａ）は、塩基改変ヌクレオシド−５’−三リン酸の合成を示す。
【図２８Ｂ】図２８（Ｂ）は、ＴＣＥＰを用いる塩基改変ヌクレオシド−５’−三リン酸の切断を示す。
【図２９】図２９は、３’−Ｏ−改変ヌクレオシド−５’−三リン酸の合成；（Ａ）３’−Ｏ−２−ニトロベンジル結合ｄＮＴＰ；（Ｂ）３’−Ｏ−アジドメチル結合ｄＮＴＰ；（Ｃ）ポリメラーゼ伸長およびＴＣＥＰ切断後の検出可能部分；ならびに（Ｄ）ポリメラーゼ伸長およびＵＶ切断後の検出可能部分を示す。
【図３０】図３０は、リン酸改変ヌクレオチド類似体を用いるＤＮＡ伸長反応を示す。
【図３１】図３１は、塩基タグ付ヌクレオチド類似体を用いるＤＮＡ伸長反応を示す。
【図３２】図３２は、２’−または３’−ＯＨ標識ヌクレオチド類似体を用いるＤＮＡ伸長反応を示す。
【図３３】図３３は、特に、単一の鋳型分子を接触させるために同時に４つ全部のヌクレオチドおよびポリメラーゼの付加を含む単一分子リアルタイム配列決定に適用可能な改変ヌクレオチドを含むナノ細孔によるＤＮＡ配列決定の図を示す。
【図３４】図３４は、可能なリンカーおよびタグを有するリン酸、塩基、２’−および３’−改変ヌクレオシドリン酸を示す；塩基＝アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルＣ、７−デアザ−Ａ、７−デアザ−Ｇまたはその誘導体；Ｒ1およびＲ2＝Ｈ、ＯＨ、Ｆ、ＮＨ2、Ｎ3、またはＯＲ’；ｎ＝１〜５；Ａ＝Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦ、ＣＦＦ、ＮＨ；Ｚ＝Ｏ、Ｓ、ＢＨ3；Ｘ＝リン酸または２’−Ｏもしくは３’−Ｏまたは塩基を、検出可能部分に連結し、Ｏ、ＮまたはＳ、Ｐ原子を含有してもよいリンカー（このリンカーは、直接的または間接的に検出可能な部分、例えば、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、異なる長さおよび分子量のＰＥＧ、有機または無機染料、蛍光および蛍光性染料、薬物、オリゴヌクレオチド、マスタグ、化学発光タグであってもよく、正または負の電荷を含有してもよい）；Ｙ＝タグまたは検出可能部分、例えば、脂肪族または１個以上の環を含む有機芳香族化合物、染料、タンパク質、炭水化物、異なる長さおよび分子量のＰＥＧ、薬物、オリゴヌクレオチド、マスタグ、蛍光染料、化学発光タグであり、正または負の電荷を含んでもよい。
【図３５】図３５は、ＰＥＧ−リン酸−標識ヌクレオチドの構造および官能基と反応する異なる反応基を有する可能なＰＥＧの例を示す。
【図３６】図３６は、ヌクレオシド塩基部分に適切な変化で結合させることもできる末端リン酸上の反応基、および反応してタグを形成することができる基の非限定的な特定例を示す。
【図３７】図３７は、合成による大規模平行ＤＮＡ配列決定のためのナノ細孔のアレイの図を示す。
【図３８】図３８は、ＰＥＧ−リン酸標識ヌクレオチドの合成を示す。
【図３９】図３９は、ＰＥＧ−リン酸標識ヌクレオチド類似体（ｄＧ４Ｐ−ＰＥＧ）の組込みにより生成されたＤＮＡ伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す；スペクトル中に示された単一の産物は、ｄＧ４Ｐ−ＰＥＧ２４およびｄＧ４Ｐ−ＰＥＧ３７がほぼ１００％の効率で組込まれることを示す。
【図４０】図４０は、＋４０ｍＶの適用された電位で４９、３７、２４、または１６個のエチレンオキシドモノマーを含有するＰＥＧの存在下でのα−溶血素ナノ細孔に関する相対遮断深度分布を示す；４つの種が容易に同定される。
【図４１】図４１は、（Ａ）単一ナノ細孔を通過する混合ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）単位の分離および質量分布；ならびに（Ｂ）４つの塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴに関するタグとしてベースライン分離した４つの異なるＰＥＧ単位の選択を示す；直鎖状および分枝状ＰＥＧの構造も示される。
【図４２】図４２は、帯電したＰＥＧ−三リン酸の合成を示す（要件に基づいて電荷を調整することができる）。
【図４３】図４３は、リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸の合成を示す。
【図４４】図４４は、リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−四リン酸の合成を示す。
【図４５】図４５は、末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−五リン酸の合成を示す。
【図４６】図４６は、ＣＭＯＳ一体化ナノ細孔測定プラットフォームを示す；（Ａ）一体型ｃｉｓ側電極を有する１つの増幅チャンネルの画像を含む８チャンネルのＣＭＯＳプリアンプチップのマイクログラフ；（Ｂ）固体状態のナノ細孔との２チップ一体化を示すダイアグラム；（Ｃ）チップの断面図および１チップ実装中のチップにナノ細孔を直接エッチングする方法を示すダイアグラム；パッケージングはｃｉｓ側の独立したウェルで行う；３．５ｎｍ直径のナノ細孔のＴＥＭ画像。
【図４７】図４７は、ＣＭＯＳ一体化ナノ細孔電子機器の電気性能を示す；（Ａ）入力−ＣF＝０．１５ｐＦ、１ＭＨｚ  ４極Ｂｅｓｓｅｌフィルター、ｆs＝４ＭＳ／ｓのベースライン電流ノイズスペクトルを表す。また、β＝１、１００ｋＨｚ  ４極Ｂｅｓｓｅｌフィルター、ｆｓ＝２５０ｋＳ／ｓでの全セルモードにおけるＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂの測定されたオープンヘッドステージ（ｏｐｅｎ−ｈｅａｄｓｔａｇｅ）も示される。（Ｂ）Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂにより測定された同じナノ細孔と比較した、結合したナノ細孔に関する新しい増幅器のノイズフロア。
【図４８】図４８は、ナノ細孔の近くでのポリメラーゼの係留を示す；ウェルは拡散を制限するのに役立つ；Ｌは、拡散に起因する分子移動度と電気泳動度とが等しい細孔開口部からの決定的な距離を示す。
【図４９】図４９は、タグ標識ヌクレオシド−５’−ポリリン酸の合成を示す。
【図５０】図５０は、３’−Ｏ−遮断−ＰＥＧ−ヌクレオチドの合成を示す。
【図５１】図５１は、ＰＥＧ−ヌクレオチドを用いる合成およびナノ細孔検出による配列決定を示す（ビーズ上に固定された多コピーの同じＤＮＡ分子および１個のＰＥＧ−ヌクレオチドの同時的付加）；４つ全部のヌクレオチドに結合した同じＰＥＧを用いる；１個のＰＥＧ−ヌクレオチドを同時に付加し、正確なヌクレオチドが組込まれた場合、サイクルあたり少なくとも１個の塩基を読み取る。
【図５２】図５２は、３’−Ｏ−遮断−ＰＥＧ−ヌクレオチドを用いる合成およびナノ細孔検出による配列決定を示す（ビーズ上に固定された多コピーの同じＤＮＡ分子および４つ全部の３’−Ｏ−遮断−ＰＥＧ−ヌクレオチドの同時的付加）；４つ全部の３’−遮断された、異なるサイズのＰＥＧに結合したヌクレオチド（３’−遮断ｄＮＴＰ−ＰＥＧ）を一緒に付加する；遊離したＰＥＧの遮断信号に基づく組込まれたヌクレオチドの検出；３’−遮断基をＴＥＣＰ処理により除去し、ホモポリマー領域を含む鋳型を正確に決定するためにサイクルを継続する。
【図５３】図５３は、配列決定プロセスを実施するためのマイクロウェルの大規模平行高密度アレイの図を示す。各ウェルは異なるＤＮＡ鋳型およびナノ細孔デバイスを保持することができる。
【図５４】図５４は、４つのクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐ分子の構造を示す。
【図５５−１】図５５は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる４つのクマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐヌクレオチド（ｎ＝１６、２０、２４、３６）の特徴づけを示す；完全長産物ピークおよび関連する塩のピークに加えて、それぞれのスペクトルの左側に第２の主要ピーク（クマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2）が存在し、これはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に用いられたマトリックスの酸性性質に起因する、ポリリン酸と、アミノヘプタンリンカーとのＮ−Ｐ結合の切断を表す。
【図５５−２】（図５５−１の続き）
【図５５−３】（図５５−２の続き）
【図５５−４】（図５５−３の続き）
【図５６】図５６は、ＳＢＳ反応に用いられる鋳型−ループ−プライマーの構造を示す；「鋳型鎖」中のＣは、「プライマー鎖」へのｄＧＭＰのポリメラーゼによる付加およびクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチドからのクマリン−ＰＥＧ−三リン酸タグの遊離を可能にする。
【図５７】図５７は、クマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2タグを生成するための２つの方法を示す；１０％酢酸を用いるヌクレオチド類似体（クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐ、ｎ＝１６、２０、２４、３６）（上）の直接処理は、アルカリホスファターゼによる処理後のポリメラーゼ遊離タグ（右下）と同一であるクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグをもたらす；次いで、クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグ（左下）はナノ細孔電流遮断特徴により単一分子レベルで特徴づけられる。
【図５８】図５８は、４つのクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチドを用いて得られた伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定を示す；鋳型が次の位置にＣを含有する鋳型−ループプライマーを、ポリメラーゼ反応のために４つのＰＥＧ−タグ改変ヌクレオチドの１つと共に用いた；それぞれの場合、２’−ｄＧＭＰはＤＮＡ中に組込まれ、単一塩基プライマー伸長産物を誘導する。
【詳細な説明】
【００４３】
本発明の様々な態様をここに図示および記載したが、そのような態様が、例の目的のためだけに提供されていることは、当業者にとって明らかであろう。当業者なら、本発明を逸脱しない範囲で、多数の変形、変更および置き換えを思いつくであろう。ここに記載される本発明の態様に対する様々な変形例が利用されてもよいことは理解されよう。
【００４４】
用語「ナノ細孔」とは、ここでは、膜中に形成されるさもなければ備えられる細孔、チャネルまたは通路のことを一般に指す。ナノ細孔は、膜中にある分子（例えば、タンパク質）によって定義することができる。膜は、有機膜、例えば脂質二重層、または合成膜、例えばポリマー材料の形状をなす膜であることができる。ナノ細孔は、検知回路、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路に隣接してまたは近接して配置されてもよい。ナノ細孔は、およそ０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの特徴的な幅または直径を有してもよい。いくつかのナノ細孔は、タンパク質である。α溶血素は、タンパク質ナノ細孔の一例である。
【００４５】
用語「核酸」とは、ここでは、１個以上の核酸サブユニットを含む分子のことを一般に指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）から選択される１個以上のサブユニットを含むことができる。いくつかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはその誘導体である。核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【００４６】
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、非限定的である。例えば、「本方法」は、語句の意味で最も幅広い定義を含み、２つ以上の方法であることができる。
【００４７】
アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルの「誘導体」は、７−デアザ−プリンおよび５−メチルピリミジンを含む。他の例には、７−デアザアデニン、７−デアザ−グアニンおよび５−メチルシトシンがある。
【００４８】
ここでは、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する分枝状と直鎖の両方の飽和脂肪族炭化水素基を含み、無置換でも置換されていてもよい。したがって、「Ｃ１〜Ｃｎアルキル」のようなＣ１〜Ｃｎは、直鎖状または分枝状配置で１、２・・・ｎ−１またはｎ個の炭素を有する基を含むものと定義される。例えば、「Ｃ１〜Ｃ５アルキル」は、直鎖状または分枝状配置で１、２、３、４または５個の炭素を有する基を含むものと定義され、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチルおよびペンチルがある。
【００４９】
ここでは、「アルケニル」とは、直鎖または分枝状の非芳香族炭化水素基のことを指し、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有し、非芳香族炭素−炭素二重結合の最大可能数まで存在してもよく、無置換でも置換されていてもよい。例えば、「Ｃ２〜Ｃ５アルケニル」とは、２、３、４または５個の炭素原子および、それぞれ１、２、３、または４個までの炭素−炭素二重結合を有するアルケニル基を意味する。アルケニル基には、エテニル、プロペニルおよびブテニルがある。
【００５０】
用語「アルキニル」とは、直鎖または分枝状の炭化水素基のことを指し、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有し、非芳香族炭素−炭素三重結合の最大可能数まで存在してもよく、無置換でも置換されていてもよい。したがって、「Ｃ２〜Ｃ５アルキニル」とは、２個もしくは３個の炭素原子と１個の炭素−炭素三重結合を有する、または４個もしくは５個の炭素原子と最大で２個の炭素−炭素三重結合を有するアルキニル基を意味する。アルキニル基には、エチニル、プロピニルおよびブチニルがある。
【００５１】
用語「置換されている」とは、上記の官能基、例えばアルキルまたはヒドロカルビルのことを指し、それに含有される水素原子との少なくとも１つの結合が、非水素または非炭素原子との結合に置きかえられている、ただし通常の原子価は維持されており、その（１つまたは複数の）置換により安定な化合物が得られる。置換されている基には、（１つまたは複数の）炭素または（１つまたは複数の）水素原子との１つ以上の結合が、ヘテロ原子との二重または三重結合を含めた１つ以上の結合に置きかえられる基も含まれる。置換基の非限定的な例には上述の官能基があり、例えば−ＣＮを形成するような、例えば、Ｎがある。
【００５２】
本発明の化合物における置換基および置換パターンが、当業者によって選択されて、化学的に安定であり、例えば以下に規定される方法を用いて容易に利用可能な出発材料から容易に合成できる化合物を提供できることを理解されたい。置換基がそれ自体２個以上の基で置換されている場合、安定な構造が得られる限り、これら複数の基は同じ炭素上にあっても異なる炭素上にあってもよいことを理解されたい。
【００５３】
本発明の化合物を選ぶ際には、様々な置換基、すなわちＲ1、Ｒ2などが、化学構造接続性の原理に則って選ばれるべきであることを当業者なら認識しよう。
【００５４】
ここに示される化合物構造において、リボースおよびデオキシリボース糖上のものを除いて、水素原子は一般に図示されない。しかし、表示した炭素原子上には、オクテット則を満たすのに十分な水素原子が存在していることを理解されたい。
【００５５】
ここでは、特に明記しない限り、以下の各用語は、規定する定義を有するべきである：Ａ−アデニン；Ｃ−シトシン；ＤＮＡ−デオキシリボ核酸；Ｇ−グアニン；ＲＮＡ−リボ核酸；Ｔ−チミン；Ｕ−ウラシル；ｄＮＰＰ−デオキシリボヌクレオチドポリリン酸；ｒＮＰＰ−リボヌクレオチドポリリン酸。
【００５６】
核酸は、任意の核酸分子を含むことができ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその混成物またはバリアントを含むが、これに限定されない。核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。一態様において、核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵならびにその誘導体であることができる。これら塩基の誘導体は、ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｕｍａｂｌｅｓ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  １９９６〜１９９７、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）に例示されており、参照によりその全体をここに組み込む。
【００５７】
ヌクレオチドポリリン酸、例えば、デオキシリボヌクレオチドポリリン酸（「ｄＮＰＰ」）またはリボヌクレオチドポリリン酸（「ｒＮＰＰ」）は、その５’糖炭素原子に結合している複数の、すなわち３、４、５、６個以上のリン酸を直鎖状に含むヌクレオチドである。ヌクレオチドポリリン酸類似体とは、ここで定義されるように、そのようなデオキシリボヌクレオチドポリリン酸またはそのようなリボヌクレオチドポリリン酸の類似体であり、特定の位置にタグが付着していることによってそれらと異なる。そのような類似体は、適切な核酸重合条件下で適切な核酸ポリメラーゼと接触させることによって、プライマーまたは核酸伸長鎖、例えばＤＮＡ伸長鎖に組み込み可能である。
【００５８】
一態様において、ｄＮＰＰは、デオキシヌクレオチド三リン酸である。
【００５９】
ここでは、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチドまたはヘキサヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合によって連結されたそれぞれ４、５または６個の核酸モノマー残基を包含し、遊離末端残基は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドであることができる。一態様において、遊離末端残基はヌクレオシドであり、他の残基はヌクレオチドである。
【００６０】
「固形基質」とは、核酸が固定されてもよい固相に存在する任意の適当な媒体を意味するべきである。非限定的な例としては、チップ、ウェル、ビーズ、ナノ細孔構造およびカラムがある。非限定的な態様において、固形基質は、水性電解質溶液を含めた溶液中に存在することができる。
【００６１】
「ハイブリダイズする」とは、配列相補性の周知の原理に基づいて、１つの一本鎖核酸が別の核酸（例えばプライマー）にアニーリングすることを意味するべきである。一態様において、他の核酸は、一本鎖核酸である。核酸間のハイブリダイゼーションの性向は、その環境の温度およびイオン強度、核酸の長さならびに相補性の程度によって決まる。ハイブリダイゼーションに対するこれらパラメータの効果は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）に記載されている。ここでは、プライマー配列またはＤＮＡ伸長産物の別の核酸へのハイブリダイゼーションとは、利用可能なヌクレオチドもしくはリン酸ジエステル結合を形成可能なヌクレオチド類似体を用いてリン酸ジエステル結合を生成することによって、プライマーまたはＤＮＡ伸長産物それぞれが伸長可能であるような十分なアニーリングを意味するべきである。
【００６２】
ここでは、特に明記しない限り、別の塩基または列挙された塩基の一覧と「異なる」塩基とは、他の塩基（単数）または塩基（複数）と異なる構造を有する塩基のことを意味するべきである。例えば、アデニン、チミンおよびシトシンと「異なる」塩基は、グアニンである塩基またはウラシルである塩基を含むことができる。
【００６３】
ここでの「プライマー」（プライマー配列）は、適当な条件下で標的ＤＮＡ（例えば一本鎖ＤＮＡ）にハイブリダイズし、そのプライマーにヌクレオチド残基を付加するまたはそのプライマーからのオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの合成を可能にするのに十分な適当な長さ、例えば約１８〜２４塩基、の短い通常は化学合成されたオリゴヌクレオチドである。一態様において、プライマーは、ＤＮＡプライマーであり、すなわち、デオキシリボヌクレオチド残基で構成されているまたは大部分が構成されているプライマーである。プライマーは、プライマーがハイブリダイズする鋳型／標的ＤＮＡの領域に逆相補になる配列を有するよう設計されている。リン酸ジエステル結合の形成によるプライマーの３’末端へのヌクレオチド残基の付加により、ＤＮＡ伸長産物が得られる。リン酸ジエステル結合の形成によるＤＮＡ伸長産物の３’末端へのヌクレオチド残基の付加により、さらなるＤＮＡ伸長産物が得られる。
【００６４】
核酸の同定および配列決定の方法およびシステム
ナノ細孔を使用して核酸を配列決定する方法、デバイスおよびシステムについて、ここで記載する。本方法は、個々のヌクレオチド組み込み事象、例えば、鋳型に相補的な成長鎖へのヌクレオチドの組み込みによる、を正確に検出することができる。酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、成長ポリヌクレオチド鎖にヌクレオチドを組み込むことができ、付加されたヌクレオチドは、対応する鋳型核酸鎖に相補的であり、鋳型核酸鎖は、成長鎖にハイブリダイズされている（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。これらのヌクレオチド組み込み事象は、ヌクレオチドからタグを遊離し、そのタグがナノ細孔を通り抜け、検出される。各種類のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）から固有のタグが遊離するので、このようにして、組み込まれた塩基（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を同定することができる。
【００６５】
ヌクレオチド組み込み事象は、リアルタイムに（すなわち、それが起こると同時に）ナノ細孔を用いて検出されてもよい。ある場合には、ナノ細孔に付着しているまたは近接している酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノ細孔を通り抜けるまたはその隣接を通過する核酸分子の流れを促進してもよい。ヌクレオチド組み込み事象または複数のヌクレオチドの組み込みは、１つ以上のタグ分子（ここでは「タグ」とも言う）を遊離してもよく、そのタグは、タグがナノ細孔を通り抜けてまたはその隣接を通過して流れるときにナノ細孔により検出されてもよい。場合によっては、ナノ細孔に付着しているまたは近接している酵素は、１つ以上のヌクレオチドが組み込まれると遊離するタグまたは他の副産物を検出するのに役立つ可能性がある。
【００６６】
ここに記載される方法は、単一分子法でもよい。すなわち、検出される信号は、単一分子（すなわち、単一のヌクレオチド組み込み）によって生成され、複数のクローン分子から生成されるのではない。本方法は、ＤＮＡ増幅を必要としなくてもよい。
【００６７】
ヌクレオチド組み込み事象は、複数のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）である））を含む混合物から起こってもよい。ヌクレオチド組み込み事象は、１種類のヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ）を含む溶液から起こるとは限らない。ヌクレオチド組み込み事象は、複数のヌクレオチドの溶液を交互に換えることにより起こる（例えば、ｄＡＴＰ、続いてｄＣＴＰ、続いてｄＧＴＰ、続いてｄＴＴＰ、続いてｄＡＴＰ）とは限らない。
【００６８】
ＤＮＡ配列決定は、生物学にとって基本的な技術である。単分子レベルでＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために、化学的または物理的な顕微鏡技術を使用するいくつかの分析法が開発された（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｒｉｅｆ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、およびＶｅｒｃｏｕｔｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【００６９】
この何年間かで、個々のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を検出するために、イオン検知技術、例えば、ポリメラーゼによってＤＮＡの鎖にヌクレオチドが組み込まれるときに遊離する水素イオン（Ｈ+）の検出を利用するイオンチャネル（Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）が、探究された（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ２００３および２００４、Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｄｅａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｂｅｒｚｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．２００１、ならびにＨｅｎｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００７０】
場合によっては、α溶血素チャネル、細菌によって分泌される外毒素、を使用して、単分子レベルで核酸を検出することができる（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）。α溶血素タンパク質は、脂質二重層膜の中で自己組織化して、前庭（ve        stibule）直径２．６ｎｍおよび制限開口（細孔で最も狭い点）直径１．５ｎｍを持つ七量体の細孔を形成する単量体ポリペプチドである（Ｍｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ａｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９およびＤｅａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ナノ細孔の制限開口は、直鎖状一本鎖核酸分子は通り抜けることができるが二本鎖核酸分子（直径約２．０ｎｍ）はできない。水性イオン食塩水、例えばＫＣｌ、において膜を越えて適切な電圧を印加する場合、α溶血素チャネルによって形成された細孔は、十分に強力で安定したイオン電流を導通する。印加された電界によって、ポリ陰イオン性核酸は細孔を通り抜け、したがって、別の方法では妨げることができないイオン電流を遮断または低下させる。この移動の方法は、電子シグニチャーを生成する（図２１）（Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１およびＤｅａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。特定の核酸分子は、ナノ細孔に入り、通り抜けるときに、それと他の核酸分子とを区別する特徴的なシグニチャーを生成する。遮断の継続時間は核酸の長さに比例し、信号強度はヌクレオチドの立体構造および電子特性、すなわち４つの塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）のアイデンティティと関係する。このように、遮断電流に対する移行時間のプロットである特定の事象線図が得られ、特徴的なパラメータ、例えば、移行電流、移行継続時間ならびに線図におけるそれらの対応するばらつきに基づく単一チャンネル記録技術によって、ポリヌクレオチドの長さおよび組成を区別するために使用される（Ｍｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。
【００７１】
共有結合で付着したアダプタを持つタンパク質ナノ細孔が、高精度で無標識のヌクレオシド５’モノリン酸（ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰおよびｄＴＭＰ）を正確に同定できることも示された（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。例えば、α溶血素細孔内に、アミノシクロデキストリンアダプタを共有結合で成功裏に付着させた。ｄＮＭＰが、脂質二重層膜中の細孔に捕捉され、通り抜けるときに、細孔を通り抜けるイオン電流は、４つあるレベルのうちの１つに低下し、各々が４つのｄＮＭＰ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）のうちの１つを表す。さらに、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子が、単一のα溶血素細孔に入るときに、特徴的な平均滞留時間を持つ固有の質量依存的伝導性状態が生じることを最近実証した。伝導性型質量スペクトルは、エチレングリコールの繰り返し単位を明確に解明し、滞留時間は、ＰＥＧの質量と共に増加する。
【００７２】
電流ナノ細孔手法は、ＤＮＡ検出法としての将来性があるが、塩基毎の正確な配列決定というさらに厳しい目的は、まだ達成されていない。
【００７３】
核酸の配列決定方法は、配列決定しようとする核酸を有する生体サンプルを回収することと、生体サンプルから核酸サンプルを抽出するまたは別の方法で単離することと、場合によっては、配列決定用の核酸サンプルを調製することとを含んでもよい。
【００７４】
図１は、核酸サンプルを配列決定する方法について略図で例示している。本方法は、生体サンプル（例えば、組織サンプル、流体サンプル）から核酸分子を単離することと、配列決定用の核酸サンプルを調製することとを含む。ある場合には、核酸サンプルは、細胞から抽出される。核酸を抽出するいくつかの例示的な技術は、リゾチーム、超音波処理、抽出、高圧またはその任意の組合せを使用する。場合によっては、核酸は無細胞核酸であり、細胞から抽出する必要がない。
【００７５】
場合によっては、核酸サンプルは、核酸サンプルからタンパク質、細胞壁破片および他の成分を除去することを含む方法によって、配列決定用に調製されてもよい。これを達成するには多くの商品、例えば、スピンカラムが利用可能である。エタノール沈殿および遠心分離が使用されてもよい。
【００７６】
核酸サンプルは、複数の断片に分割（または、破断）されてもよく、これにより、例えばアレイ中に複数のナノ細孔を含むデバイスを用いる核酸配列決定が容易になる場合がある。しかし、配列決定しようとする核酸分子（１つまたは複数）を破断する必要がない場合がある。
【００７７】
ある場合には、長い配列が決定される（すなわち、「ショットガン配列決定」法が、必要とされない場合もある）。任意の適当な長さの核酸配列が決定されてもよい。実例として、少なくとも約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、約３０００、約３５００、約４０００、約４５００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００または約１０００００塩基などが、配列決定されてもよい。ある場合には、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００塩基などが、配列決定される。ある場合には、配列決定される塩基は連続している。場合によっては、核酸サンプルは配列決定の前に分割されていてもよい。
【００７８】
ナノ細孔配列決定および分子検出
ナノ細孔を用いて核酸分子を配列決定するシステムおよび方法を、ここで提供する。ナノ細孔は、検知回路、例えば集積回路、の検知電極に隣接して配置された膜の中に形成されてもまたはそうでない場合、埋め込まれてもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であってもよい。いくつかの例において、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検知回路は、ナノ細孔を有するチップもしくは他のデバイス内に位置していても、またはチップもしくはデバイスと離れている、例えばオフチップ構成でもよい。半導体は任意の半導体であることができ、第ＩＶ族（例えば、シリコン）および第ＩＩＩ〜Ｖ族半導体（例えば、ヒ化ガリウム）を含むが、これに制限されない。
【００７９】
場合によっては、核酸またはタグがナノ細孔の中を通り抜けるときに、検知回路は核酸またはタグと関連した電気信号を検出する。核酸は、より大きな鎖のサブユニットであってもよい。タグは、ヌクレオチド組み込み事象の副産物であってもよい。検出した信号を、収集し、記憶場所に保存し、後で核酸配列を構築するために使用してもよい。収集した信号は、検出した信号中の任意の異常、例えば誤差を明らかにするために処理されてもよい。
【００８０】
図２は、参照によりその全体をここに組み込む米国特許出願第２０１１／０１９３５７０号に記載される方法にしたがって調製され得る，電流温度制御を有するナノ細孔検出器（または、センサ）の例を示す。図２Ａを参照すると、ナノ細孔検出器は、伝導性溶液（例えば、食塩水）２０７と接する上部電極２０１を含む。底部伝導性電極２０２は、ナノ細孔２０６の近くに、それに隣接して、またはその近接にあり、その細孔は膜２０５に挿入されている。ある場合には、底部伝導性電極２０２は、半導体基板２０４中に電気回路が埋め込まれている半導体２０３に埋め込まれている。半導体２０３の表面は、疎水性になるように処理されていてもよい。検出されるサンプルは、ナノ細孔２０６中の細孔を通って行く。半導体チップセンサは、本体２０８中に置かれ、これは、温度制御素子２０９の近くにある。温度制御素子２０９は、熱電加熱および／または冷却デバイス（例えば、ペルティエ素子）でもよい。複数のナノ細孔の検出器は、ナノ細孔アレイを形成してもよい。
【００８１】
図２Ｂを参照すると、同じ数字は同じ要素を表し、膜２０５は、ウェル２１０を覆って配置することができ、センサ２０２は、ウェルの表面部分を形成する。図２Ｃは、電極２０２が、処理した半導体表面２０３から隆起している例を示す。
【００８２】
いくつかの例において、膜２０５は、半導体２０３上ではなく底部伝導性電極２０２上に形成される。そのような場合、膜２０５は、底部伝導性電極２０２と接続相互作用を形成してもよい。しかし、場合によっては、膜２０５は、底部伝導性電極２０２と半導体２０３上に形成される。変形例として、膜２０５は、底部伝導性電極２０２上ではなく半導体２０３上に形成することができるが、底部伝導性電極２０２に広がっていてもよい。
【００８３】
ナノ細孔による間接的配列決定
ナノ細孔を使用して、任意に電気的検出を用いて、核酸分子を間接的に配列決定してもよい。間接的配列決定は、重合した核酸分子、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡがナノ細孔を通り抜けない任意の方法であってもよい。核酸分子は、少なくとも部分的にはナノ細孔の前庭に位置してもよいが、ナノ細孔の細孔（すなわち、最も狭い部分）には位置しない。核酸分子は、ナノ細孔から任意の適当な距離および／またはそれに近接する範囲内、任意でヌクレオチド組み込み事象から遊離したタグがナノ細孔において検出されるような距離の範囲内、を通過してもよい。
【００８４】
ヌクレオチド組み込み事象の副産物が、ナノ細孔によって検出されてもよい。「ヌクレオチド組み込み事象」とは、成長ポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組み込みのことである。副産物は、所与の種類のヌクレオチドの組み込みと相関していてもよい。ヌクレオチド組み込み事象は、酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって一般に触媒され、鋳型分子との塩基対相互作用を使用して、各位置での組み込みに利用できるヌクレオチドの中から選ぶ。
【００８５】
場合によっては、副産物は、ナノ細孔を通り抜けるおよび／またはナノ細孔において検出可能な信号を生成する。遊離するタグ分子は、副産物の例である。場合によっては、副産物は、プロトン（すなわち、ｐＨ変化）である。他の場合において、副産物は、リン酸（例えば、ヌクレオチド組み込み事象の間に遊離したリン酸）である。例えば、異なる種類のヌクレオチドの各々は、異なる数のリン酸を含んでもよく、遊離したリン酸を検出することにより、組み込まれたヌクレオチドのアイデンティティを決定することができる。
【００８６】
本方法の一例を図３に記載する。ここで、核酸鎖３００は、ナノ細孔３０２を超えてまたはその近接を通過する（しかし、矢印３０１で表示するように通り抜けることはない）。酵素３０３（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、鋳型３００として第１の核酸分子を使用してヌクレオチドを１個ずつ組み込むことにより、成長核酸鎖３０４を伸長させる（すなわち、酵素は、ヌクレオチド組み込み事象を触媒する）。
【００８７】
酵素３０３は、ナノ細孔３０２に付着していてもよい。ナノ細孔に酵素を付着させるのに適した方法には、架橋、例えば分子内ジスルフィド結合の形成がある。ナノ細孔および酵素はまた、単一のポリペプチド鎖にコードされる融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質を作製する方法は、酵素のコード配列とナノ細孔のコード配列とを読み枠を合わせて隣接させて（間に終止コドン無く）融合することと、この融合配列を単一のプロモータから発現させることとを含むことができる。場合によっては、ホスファターゼ酵素もナノ細孔に付着している。
【００８８】
場合によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼまたはそのバリアント、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（ｅｘｏ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【００８９】
タグ分子のナノ細孔配列決定
核酸サンプルは、タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用して配列決定されてもよい。いくつかの例において、核酸分子を配列決定する方法は、（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが、重合すると遊離することと、（ｂ）ナノ細孔を用いて、遊離したタグを検出することとを含む。
【００９０】
ある場合には、本方法は、個々のヌクレオチドから遊離したタグを、ナノ細孔を通して導くことをさらに含む。遊離したタグは、任意の適当な技術によって、場合によっては酵素（または、分子モーター）を用いて導かれてもよい。変形として、遊離したタグは、酵素を用いずにナノ細孔を通り抜けて導かれてもよい。例えば、ここで記載の通り、タグはナノ細孔を超える電圧差によって導かれてもよい。
【００９１】
図３を続けて参照すると、酵素は、タグ分子（表示３０５の白丸）に付着したヌクレオチドのプール（表示３０５の黒丸）から取り出す。各種類のヌクレオチドは、異なるタグ分子に付着しており、その結果タグが遊離し、ナノ細孔３０６を通り抜けるときに、ナノ細孔において生成する信号に基づいて互いに識別できる。
【００９２】
図４は、ナノ細孔によって検出される際の、異なるタグによって生成される異なる信号の例を示す。４つの異なる信号強度（４０１、４０２、４０３および４０４）が、検出される。これらは、４つの異なるタグに対応していてもよい。例えば、アデノシン（Ａ）の組み込みによってナノ細孔に提示および／または遊離されるタグは、振幅４０１を持つ信号を生成してもよい。シトシン（Ｃ）の組み込みによってナノ細孔に提示および／または遊離されるタグは、より高い振幅４０３を持つ信号を生成してもよく；グアニン（Ｇ）の組み込みによってナノ細孔に提示および／または遊離されるタグは、さらに高い振幅４０４を持つ信号を生成してもよく；チミン（Ｔ）の組み込みによってナノ細孔に提示および／または遊離されるタグは、さらにより高い振幅４０２を持つ信号を生成してもよい。場合によっては、信号は、検出間にベースラインレベル４０５に戻ってもよい。
【００９３】
ヌクレオチド組み込み事象の速度は、ヌクレオチド組み込み事象の間に遊離したタグ分子がナノ細孔を通り抜けおよび／またはそれによって検出される速度より一般に遅い（または同じである）。一般に、ヌクレオチド組み込み事象の速度は、ヌクレオチド組み込み事象の間に遊離したタグ分子がナノ細孔を通り抜けおよび／またはそれによって検出される速度を超えない（すなわち、そうでない場合、ヌクレオチド組み込み事象は、正確におよび／または正しい配列で検出されない）。
【００９４】
配列決定用ナノ細孔アレイ
図５は、複数の核酸分子が、ナノ細孔検出器のアレイ上で配列決定されてもよいことを示している。ここで、各ナノ細孔位置（例えば、５０１）はナノ細孔を含み、任意でポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素に付着している。ここでの他の場所に記載される通り、各アレイ位置にセンサも一般にある。
【００９５】
いくつかの例において、核酸ポリメラーゼに付着しているナノ細孔アレイが用意され、タグ付けされたヌクレオチドがポリメラーゼで重合される。重合の間にタグは遊離し、ナノ細孔によって検出される。ナノ細孔アレイは、任意の適当な数のナノ細孔を有してもよい。ある場合には、アレイは、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、約２０００００、約４０００００、約６０００００、約８０００００、約１００００００個などのナノ細孔を含む。ある場合には、アレイは、少なくとも２００、少なくとも４００、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、少なくとも１５０００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、少なくとも２０００００、少なくとも４０００００、少なくとも６０００００、少なくとも８０００００、少なくとも１００００００個などのナノ細孔を含む。ナノ細孔は、別々にアドレス可能であり得る。場合によっては、アレイは、ｍｍ2当たり少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００個の別々にアドレス可能なナノ細孔の密度で、別々にアドレス可能なナノ細孔を含むことができる。
【００９６】
場合によっては、単一のタグが、単一のヌクレオチドが組み込まれると遊離し、ナノ細孔により検出される。他の場合では、複数のタグが、複数のヌクレオチドが組み込まれると遊離する。ナノ細孔に隣接したナノ細孔センサが、個々の遊離したタグ、または複数の遊離したタグを検出してもよい。複数の遊離したタグと関連付けられた１つ以上の信号を検出し、処理して、平均信号を得てもよい。
【００９７】
タグは、時間の関数としてセンサによって検出されてもよい。経時的に検出されるタグを使用して、核酸サンプルの核酸配列を、例えば、センサデータを記録しそのデータから配列情報を生成するようにプログラムされているコンピュータシステム（例えば、図１８を参照のこと）を用いて、決定してもよい。
【００９８】
配列決定精度
ここで提供される方法は、個々のヌクレオチド組み込み事象（例えば、単一分子事象）を正確に区別することができる。本方法は、単一パスで、−すなわち、所与の核酸分子を再配列決定する必要無しに、個々のヌクレオチド組み込み事象を正確に区別できる。
【００９９】
核酸配列を決定する方法は、約４σを超える精度で個々のヌクレオチド組み込み事象を区別することを含む。場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象は、ナノ細孔を用いて検出される。ヌクレオチドと関連付けられたタグは、組み込まれると遊離してもよく、タグはナノ細孔を通り抜ける。異なるタグは、各種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）と関連付けられていてもおよび／またはそれから遊離してもよく、ナノ細孔を通り抜けるときに検出される。誤差には、それだけには限らないが、（ａ）タグの検出に失敗する、（ｂ）タグを誤認する、（ｃ）タグが無い場所でタグを検出する、（ｄ）誤った順番でタグを検出する（例えば、第１の順で２つのタグが遊離するが、入れ違いになって、第２の順で検出される）、（ｅ）ヌクレオチドから遊離しなかったタグが、遊離したとして検出される、またはそれらの任意の組合せがある。いくつかの態様において、個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、１００％から誤差が起こる割合（すなわち、誤差率）を差し引いたものである。
【０１００】
個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、任意の適当なパーセンテージである。個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％などでもよい。場合によっては、個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、少なくとも９９．９９９９％などである。ある場合には、個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、シグマ（σ）単位で報告される。シグマは、誤差率、例えば、欠陥のない製品のパーセンテージを報告するために経営管理および製造戦略においてときどき使用される統計的変数である。ここで、シグマ値は、以下の関係にしたがって精度と互換的に使用されてもよい：４σは９９．３８％の精度であり、５σは９９．９７７％の精度であり、６σは９９．９９９６６％の精度である。
【０１０１】
ここで記載される方法により個々のヌクレオチド組み込み事象を区別することを使用して、核酸配列を正確に決定してもよい。ある場合には、核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）の核酸配列の決定には誤差がある。例示的な誤差には、欠失（核酸の検出に失敗する）、挿入（本当は存在しない場所に核酸を検出する）および置換（誤った核酸を検出する）があるが、これに限定されない。核酸配列決定の精度は、測定した核酸配列を真の核酸配列と整列させ（例えば、バイオインフォマティクス技術による）、欠失、挿入および／または置換がある核酸位置のパーセンテージを決定することによって決定されてもよい。誤差は、欠失、挿入および置換の任意の組合せである。精度は０％〜１００％の範囲であり、１００％は核酸配列の完全に正しい決定である。同様に、誤差率は１００％−精度であり、０％〜１００％の範囲であり、０％の誤差率は核酸配列の完全に正しい決定である。
【０１０２】
本方法にしたがっておよび／またはここで記載されるデバイスを使用して実行される核酸配列決定の精度は、高い。精度は、任意の適当な高い値である。ある場合には、精度は、約９５％、約９５．５％、約９６％、約９６．５％、約９７％、約９７．５％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、約９９．９％、約９９．９９％、約９９．９９９％、約９９．９９９９％などである。ある場合には、精度は、少なくとも９５％、少なくとも９５．５％、少なくとも９６％、少なくとも９６．５％、少なくとも９７％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％、少なくとも９９．９９９％、少なくとも９９．９９９９％などである。ある場合には、精度は、約９５％〜９９．９９９９％、約９７％〜９９．９９９９％、約９９％〜９９．９９９９％、約９９．５％〜９９．９９９９％、約９９．９％〜９９．９９９９％などである。
【０１０３】
高い精度は、複数のパスを実施することによって達成してもよい（すなわち、例えば、核酸をナノ細孔に通すまたは近接を通過させ、核酸分子の核酸塩基を配列決定することによって核酸分子を複数回配列決定する）。複数のパスからのデータを組み合わせてもよい（例えば、第１のパスにおける欠失、挿入および／または置換が、他の反復したパスからのデータを使用して修正される）。本方法は、少ないパス（リードとも呼ばれる、配列決定範囲の多様性）で高い精度を提供する。パスの数は、任意の適当な数であり、整数である必要はない。いくつかの態様において、核酸分子は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１２回、１４回、１６回、１８回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回、４５回、５０回、など配列決定される。いくつかの態様において、核酸分子は、１回以下、２回以下、３回以下、４回以下、５回以下、６回以下、７回以下、８回以下、９回以下、１０回以下、１２回以下、１４回以下、１６回以下、１８回以下、２０回以下、２５回以下、３０回以下、３５回以下、４０回以下、４５回以下、５０回以下、など配列決定される。いくつかの態様において、核酸分子は、約１回〜１０回、約１回〜５回、約１回〜３回など配列決定される。精度のレベルは、２０回以下の通過から収集されるデータを組み合わせることによって達成されてもよい。いくつかの態様において、精度のレベルは、１０回以下の通過から収集されるデータを組み合わせることによって達成される。いくつかの態様において、精度のレベルは、５回以下の通過から収集されるデータを組み合わせることによって達成される。場合によっては、精度のレベルは単一パスで達成される。
【０１０４】
誤差率は、任意の適切に低い率である。ある場合には、誤差率は、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、約０．１％、約０．０１％、約０．００１％、約０．０００１％、などである。ある場合には、誤差率は、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．１％以下、０．０１％以下、０．００１％以下、０．０００１％以下、などである。ある場合には、誤差率は、１０％〜０．０００１％、３％〜０．０００１％、１％〜０．０００１％、０．０１％〜０．０００１％、などである。
【０１０５】
鋳型調製
本方法は、鋳型鎖に相補的な鎖にタグ付けされたヌクレオチドを付加することによって鋳型核酸鎖を配列決定することと、ナノ細孔において、遊離したタグ分子を検出することとを含んでもよい。
【０１０６】
図１０は、核酸鋳型を調製する方法を示す。この場合、配列決定しようとする核酸分子は二本鎖であり、センス鎖１００１およびアンチセンス鎖１００２を含む。核酸ヘアピン１００３は、センス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端にライゲーションされてもよい。
【０１０７】
核酸分子の鎖を解離させて、センス鎖１００４、ヘアピン１００５およびアンチセンス鎖１００６を含む一本鎖鋳型分子を形成してもよい。この一本鎖の核酸は、ここで記載の通り配列決定されてもよい。
【０１０８】
場合によっては、核酸鋳型を調製する本方法により、一回の配列決定の行程でセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を配列決定することが可能になる。これにより、２つの重複するデータセットを作製する（すなわち、各核酸塩基対の位置を、２回配列決定する）ことができ、元の二本鎖核酸分子の一方の鎖だけを配列決定するよりも配列の正確な決定を得ることができる。
【０１０９】
デバイス設定
図１１は、ここで記載の通り、核酸を配列決定するおよび／またはタグ分子を検出するために使用できるナノ細孔デバイス１００（または、センサ）の概念図である。脂質二重層を含有するナノ細孔は、抵抗および静電容量によって特徴づけられてもよい。ナノ細孔デバイス１００は、伝導性固形基板１０６の脂質二重層適合性表面１０４上に形成される脂質二重層１０２を含み、脂質二重層適合性表面１０４は、脂質二重層不適合性表面１０５によって絶縁されていてもよく、伝導性固形基板１０６は、絶縁材料１０７によって電気的に絶縁されていてもよく、脂質二重層１０２は、脂質二重層不適合性表面１０５上に形成される不定形脂質１０３に囲まれていてもよい。脂質二重層１０２に、特徴づけられるタグ分子および／または小さいイオン（例えば、Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、Ｃｌ-）が脂質二重層１０２の両側の間を通過するのに十分大きなナノ細孔１１０を有する単一のナノ細孔構造１０８が埋め込まれていてもよい。水分子の層１１４は、脂質二重層適合性表面１０４に吸着していても、脂質二重層１０２と脂質二重層適合性表面１０４の間にはさまれていてもよい。親水性脂質二重層適合性表面１０４に吸着している水性膜１１４は、脂質二重層適合性表面１０４上で脂質分子の秩序化を促しても、脂質二重層の形成を促進してもよい。核酸分子１１２およびタグ付けされたヌクレオチドの溶液を含有するサンプルチャンバ１１６は、脂質二重層１０２を覆って設置されてもよい。ナノ細孔１１０を開孔したままにするために、溶液は、電解質を含有し、最適イオン濃度に緩衝され、最適ｐＨに維持されている水溶液でもよい。デバイスは、脂質二重層を超えて電気的刺激（例えば、電圧バイアス）を与え、脂質二重層の電気的特性（例えば、抵抗、静電容量およびイオン電流の流れ）を検知するために、可変電源１２０に接続されている一対の電極１１８（陰極ノード１１８ａおよび陽極ノード１１８ｂを含む）を含む。陽極電極１１８ｂの表面は、脂質二重層適合性表面１０４である、またはその一部を形成する。伝導性固形基板１０６は、電極１１８のうちの一方と接続していてもその一部を形成していてもよい。デバイス１００は、電気的刺激を制御するおよび検出した信号を処理するための電気回路１２２を含んでいてもよい。いくつかの態様において、可変電源１２０は、電気回路１２２の一部として含まれている。電気回路１２２は、増幅器、積分器、ノイズフィルタ、フィードバック制御論理および／または他の様々な構成要素を含んでいてもよい。電気回路１２２は、シリコン基板１２８に一体化された集積電気回路でもよく、メモリ１２６に接続しているコンピュータプロセッサ１２４にさらに接続されてもよい。
【０１１０】
脂質二重層の形成を促進するために、脂質二重層適合性表面１０４は、イオン導入およびガス形成に適した様々な材料から形成されてもよい。いくつかの態様において、伝導性または半伝導性親水性材料により、脂質二重層電気的特性の変化をよりよく検出できる場合があるので、それらを使用してもよい。材料の例には、Ａｇ−ＡｇＣｌ、Ａｕ、Ｐｔもしくはドープシリコンまたは他の半導体材料がある。場合によっては、電極は、犠牲電極ではない。
【０１１１】
脂質二重層不適合性表面１０５は、脂質二重層の形成に適さない様々な材料から形成されてもよく、その材料は通常は疎水性である。いくつかの態様において、非伝導性疎水性材料は、脂質二重層領域を互いに分離することに加えて脂質二重層領域を電気的に絶縁するので、好ましい。脂質二重層不適合性材料の例には、例えば、窒化ケイ素（例えば、Ｓｉ3Ｎ4）およびテフロン（登録商標）がある。
【０１１２】
一例において、図１１のナノ細孔デバイス１００は、アルミニウム材料１０６上にコーティングされた脂質二重層適合性Ｐｔ表面１０４を覆って形成されたジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質二重層１０２に埋め込まれている、単一のα溶血素（ａＨＬ）タンパク質１０８を有するα溶血素（ａＨＬ）ナノ細孔デバイスである。脂質二重層適合性Ｐｔ表面１０４は、脂質二重層不適合性窒化ケイ素表面１０５によって絶縁されており、アルミニウム材料１０６は、窒化ケイ素材料１０７によって電気的に絶縁されている。アルミニウム１０６は、シリコン基板１２８に一体化された電気回路１２２に接続されている。オンチップに置かれたまたはカバープレート１２８から下方に伸びる銀−塩化銀電極は、核酸分子を含有する水溶液と接触している。
【０１１３】
ａＨＬナノ細孔は、７個の個々のペプチドの組立体である。ａＨＬナノ細孔の入口または前庭は、直径およそ２６オングストロームであり、ｄｓＤＮＡ分子の一部を収容するのに十分広い。ａＨＬナノ細孔は、前庭から、最初に広がり、次いで直径およそ１５オングストロームを有するバレルへと狭くなり、この直径は、単一のｓｓＤＮＡ分子（または、遊離したタグ分子）が通り抜けるには十分広いが、ｄｓＤＮＡ分子が通り抜けられるほど広くない。
【０１１４】
ＤＰｈＰＣに加えて、ナノ細孔デバイスの脂質二重層は、様々な要件、例えば、使用するナノ細孔の種類、特徴づける分子の種類、ならびに形成される脂質二重層の様々な物理的、化学的および／または電気的特性、例えば、形成される脂質二重層の安定性および透過性、抵抗、ならびに静電容量、に基づいて選択される他の様々な適切な両親媒性材料から組み立てられてもよい。両親媒性材料の例には、様々なリン脂質、例えば、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）およびジオレオイルホスファチジルメチルエステル（ＤＯＰＭＥ）、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、およびスフィンゴミエリンがある。
【０１１５】
上記のａＨＬナノ細孔に加えて、ナノ細孔は、他の様々な種類のナノ細孔でもよい。例としては、γ溶血素、ロイコシジン、メリチンならびに他の様々な天然に存在する、修飾された天然の、および合成のナノ細孔がある。適切なナノ細孔は、分析物分子の様々な特性、例えばナノ細孔の孔径に対する分析物分子のサイズ、に基づいて選択されてもよい。例えば、およそ１５オングストロームの制限的な孔径を有するａＨＬナノ細孔である。
【０１１６】
高アレイ密度
ナノ細孔検出器のアレイは、別々の部位を高密度で有してもよい。例えば、単位領域当たりの部位（すなわち、密度）が多いことにより、より小さなデバイスの構築が可能になり、そのデバイスは移動可能で、廉価で、または他の有利な特徴を有する。ナノ細孔と検知回路を含む多数の部位により、多数の核酸分子を一度に配列決定可能にすることができる。そのようなシステムにより、核酸サンプルを配列決定するためのスループットを高めおよび／または経費を低減することができる。
【０１１７】
核酸サンプルは、別々の部位を含む表面を備えた基板を有するセンサ（または、検出器）を使用して配列決定されてもよく、各個々の部位は、ナノ細孔、ナノ細孔に付着しているポリメラーゼ、および任意で、少なくとも１つのホスファターゼ酵素、ならびにナノ細孔に隣接する検知回路を有する。本システムは、基板と共に流体連通中にフローセルをさらに含んでもよく、フローセルは、前記基板に１つ以上の試薬を送達するように適合されている。
【０１１８】
表面は、任意の適当な密度（例えば、所定の時間または所定の経費で核酸サンプルを配列決定するのに適当な密度）の別々の部位を含む。表面は、１ｍｍ2当たり約５００部位を超えるか、それと同じ密度の別々の部位を有してもよい。いくつかの態様において、表面は、１ｍｍ2当たり約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００部位の密度の別々の部位を有する。場合によっては、表面は、１ｍｍ2当たり少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、または少なくとも５０００００部位の密度の別々の部位を有する。
【０１１９】
電流測定
ナノ細孔を基礎にした配列決定チップは、アレイとして構成された多数の、独立して動作するまたは別々にアドレス可能なセルを組み込んでもよい。ナノ細孔デバイスは、別々にアドレス可能なナノ細孔のアレイを含むことができる。各別々にアドレス可能なナノ細孔は、別々にアドレス可能な電極を含むことができる。例えば、１，０００，０００セルのアレイは、１０００行のセルｘ１０００列のセルから構築され得る。例えば、ヌクレオチド組み込み事象により遊離したタグがナノ細孔を通過するときに伝導性の差異を測定することによって、このアレイは核酸分子の並列配列決定を可能にすることができる。さらに、この回路の実行により細孔−分子複合体の伝導性特性を決定することが可能になり、特定のタグを区別する際に極めて有益になり得る。
【０１２０】
場合によっては、電流は印加電圧で測定されてもよい。これを達成するために、望ましい電位が電極に印加されてもよく、印加電位はその後、測定の間維持されてもよい。実行において、ここで記載の通り、演算増幅積分器の位相をこの目的に使用してもよい。積分器は、容量帰還を用いて、電位を電極で維持する。積分回路は、顕著な直線性、セル−セル整合性、およびオフセット特性を備えていてもよい。必要とされる性能を達成するためには、演算増幅積分器は、大きなサイズを通常必要とする。より小型の積分器の位相について、ここで記載する。
【０１２１】
場合によっては、チップ上の全てのセルに共通の電位（例えば、３５０ｍＶ）を与えるチャンバに、電位「Ｖ液体」が印加されてもよい。積分回路は、電極（電気的に積分コンデンサの上部プレートである）を共通の液体電位を超える電位に初期化してもよい。例えば、４５０ｍＶでバイアスをかけることにより、電極と液体の間に陽の１００ｍＶの電位が得られてもよい。この陽電圧は、電極から液体チャンバ接点に流れる電流を引き起こしてもよい。この実例において、担体は：（ａ）二重層の電極側（トランス）から二重層の液体貯蔵部側（シス）へと細孔を通り抜けるＫ＋イオンおよび（ｂ）電気化学反応：Ａｇ＋Ｃｌ−→ＡｇＣｌ＋ｅ−、により銀電極と反応するトランス側にある塩素（Ｃｌ−）イオンである。
【０１２２】
場合によっては、Ｋ＋は、封入されたセルから流出し（二重層のトランスからシス側に）、一方でＣｌ−は塩化銀に変換される。二重層の電極側は、電流の流れの結果、脱塩されてもよい。場合によっては、銀／塩化銀液体スポンジ状の材料またはマトリクスが貯蔵部としての機能を果たして、電気チャンバ接点で起こる逆反応においてＣｌ−イオンを供給し、それによって回路を完了してもよい。
【０１２３】
場合によっては、電子は、測定される電流を生じさせる積分コンデンサの上側に最終的に流れる。電気化学反応は銀を塩化銀に変換し、変換される利用可能な銀がある限り、電流は流れ続けることになる。場合によっては、銀の供給が限られるため、電流依存的電極寿命が起こる。いくつかの態様において、消耗しない電極材料（例えば、白金）が、使用される。
【０１２４】
セル回路
セル回路の一例が、図１４Ｂに示される。印加電圧Ｖａは、ＭＯＳＦＥＴ電流コンベアゲート１４０１の前にある演算増幅器１４００に印加される。電極１４０２ならびにデバイスによって検出される核酸および／またはタグの抵抗１４０３も、ここで示される。
【０１２５】
印加電圧Ｖａは、電流コンベアゲート１４０１を駆動することができる。次いで、電極上で得られる電圧はＶａ−Ｖｔであり、ただし、ＶｔはＭＯＳＦＥＴの閾値電圧である。ある場合には、方法の全体を通じて、ＭＯＳＦＥＴ閾値電圧は、電圧、温度、およびチップ中のデバイス相互間でも大きく変化し得るので、Ｖａ−Ｖｔは、電極に印加される実際の電圧を制限付きで制御している。閾値下漏えい効果が作用し始まり得る場合、このＶｔ変動は、低い電流レベルでより大きくなり得る。したがって、印加電圧をよりよく制御するために、フォロワフィードバック設定（follower feedback configuration）において演算増幅器を電流コンベアデバイスと共に使用することができる。これにより、電極に印加される電圧が、ＭＯＳＦＥＴ閾値電圧の変動から独立しているＶａ、であることが確保される。
【０１２６】
セル回路の別の例が、図１３に示され、積分器、比較器、および制御ビットをシフトインし同時に比較器出力の状態をシフトアウトするデジタル論理を含む。セル回路は、ここで提供されるシステムおよび方法で使用するように適合されてもよい。Ｂ０からＢ１までの線は、シフトレジスタから出ていてもよい。アナログ信号は、バンク内の全てのセルで共有され、一方でデジタル線は、セルからセルへとデイジーチェーン接続されてもよい。
【０１２７】
セルデジタル論理は、５ビットデータシフトレジスタ（ＤＳＲ）、５ビット並列ロードレジスタ（ＰＬＲ）、制御論理、およびアナログ積分回路を含む。ＬＩＮ信号を使用して、ＤＳＲにシフトインされる制御データが、ＰＬＲに並列に読み込まれる。これらの５ビットは、セルにおいてスイッチを制御するデジタル「ブレークビフォアメーク」タイミング論理を制御する。加えて、デジタル論理は、比較器出力のスイッチングを記録するためにセットリセット（ＳＲ）ラッチを有する。
【０１２８】
アーキテクチャは、個々のセル電流に比例する可変サンプルレートを送達する。より高い電流は、低い電流より多くのサンプルを秒当たりに生ずることができる。電流測定の解像度は、測定される電流と関係する。小さい電流は、大きな電流より鋭敏な解像度で測定することができ、これは固定解像度測定システムに勝る利点となり得る。利用者が積分器の電圧振幅を変えることによってサンプルレートを調節できるアナログ入力がある。生物学的に速い過程を分析するためにサンプルレートを上げるまたは生物学的に遅い過程を分析するためにサンプルレートを落とす（それによって、正確さが増す）ことが可能になり得る。
【０１２９】
積分器の出力は、電圧ＬＶＢ（低電圧バイアス）へと初期化され、電圧ＣＭＰまで積分される。サンプルは、積分器出力がこれらの２つのレベル間で振動する度に生成される。したがって、電流が大きいほど、積分器出力は速く振動し、したがって、サンプルレートは速くなる。同様に、ＣＭＰ電圧が低下する場合、新たなサンプルを生成するのに必要な積分器の出力振動は低下し、したがって、サンプルレートは高まる。したがって、単純に、ＬＶＢとＣＭＰとの電圧差を低下させることにより、サンプルレートを高めるための機序が得られる。
【０１３０】
ナノ細孔を基礎にした配列決定チップは、アレイとして構成された多数の、独立して動作するまたは別々にアドレス可能なセルを組み込んでもよい。例えば、１，０００，０００セルのアレイは、１０００行のセルｘ１０００列のセルから構築され得る。例えば、ヌクレオチド組み込み事象により遊離したタグがナノ細孔によって検出されるときに伝導性の差異を測定することによって、このアレイは核酸分子の並列配列決定を可能にする。さらに、この回路の実行により細孔−分子複合体の伝導性特性を決定することが可能になり、タグ同志を区別する際に有益になり得る。
【０１３１】
一体化したナノ細孔／二重層電子回路セル構造に適切な電圧を印加して、電流測定を実施してもよい。例えば、正確に実施するためには、（ａ）電極電位を制御することと（ｂ）電極電流をモニタリングすることとの両方が同時に必要になり得る。
【０１３２】
さらに、セルを互いにそれぞれ独立に制御する必要もあり得る。物理的に異なる状態になり得る多数のセルを管理するために、セルの独立制御が必要とされる場合もある。電極に印加される区分的線形電圧波形刺激の精密な制御が、セルの物理的状態間の遷移に使用されてもよい。
【０１３３】
回路サイズおよび複雑さを低下させるには、２つの独立した電圧を印加する論理を用意すれば、十分になり得る。これにより、セルを２つの独立したグループに分け、対応する状態遷移刺激を印加することが可能になる。状態遷移は、相対的に低い発生確率で事実上確率的である。したがって、適切な制御電圧をアサートし、続いて測定を実施して、望ましい状態遷移が起こったかどうかを決定できることが、非常に有用になり得る。例えば、適切な電圧をセルに印加し、次いで、電流を測定して、二重層が形成されたかどうかを決定してもよい。セルは、２つのグループに分けられ：（ａ）二重層形態を有しておりもはや電圧を印加する必要性がないグループ。これらのセルは、ヌル操作（ＮＯＰ）を遂行するために印加される０Ｖバイアス−すなわち同じ状態を保つ、および（ｂ）形成された二重層を持たないグループを有してもよい。これらのセルには、二重層形成電圧が再び印加されることになる。
【０１３４】
実質的な簡素化および回路サイズの減少は、物理的状態間をバッチで２回および反復して遷移しているセルに対する許容可能な印加電圧を抑制することによって達成されてもよい。例えば、許容可能な印加電圧を抑制することによって、少なくとも１．１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、または１００分の一までの減少が達成されてもよい。
【０１３５】
小型測定回路を使用する本発明のさらに別の実行が、図１４Ａに示される。ある場合には、小型測定回路を使用して、ここで記載される高いアレイ密度を達成してもよい。この回路は、電極に電圧を印加し、一方で同時に低レベルの電流を測定するようにも設計されている。
【０１３６】
セルは、超小型積分器（ＵＣＩ）として動作し、その基本動作について、ここで記載される。セルは、電極検知（Electrod-Sense）（ＥＬＳＮＳ）接続を介して、電気化学的に活性な電極（例えば、ＡｇＣｌ）に電気的に接続される。ＮＭＯＳトランジスタＭ１１は、２つの独立した機能を実行する：（１）（Ｖｇ１−Ｖｔ１）によって得られるＥＬＳＮＳノードに電圧を印加するためのソースフォロアとして動作し、（２）コンデンサＣ１からＥＬＳＮＳノードに電子を移動させる電流コンベアとして動作する（逆もまた同じ）。
【０１３７】
ある場合には、制御された電位が、ＥＬＳＮＳ電極に印加されてもよく、これは、電極ソースフォロアＭ１１のゲート電圧を変化させることにより、簡単に変更されてもよい。さらに、それがコンデンサＣ０に蓄積し得る場合、Ｍ１１ソースピンからの任意の電流は、Ｍ１１ドレインピンに直接および正確に伝播される。したがって、Ｍ１１およびＣ０は、超小型積分器として一緒に作用する。この積分器を使用して：Ｉ*ｔ＝Ｃ*Ｖ、ただしＩは電流であり、ｔは時間であり、Ｃは静電容量であり、Ｖは電圧変化である、にしたがってコンデンサに積分される電圧の変化を測定することにより、電極の入出力を行う発信／受信電流を決定してもよい。
【０１３８】
場合によっては、電圧変化は、固定間隔ｔ（例えば、１ｍｓ毎）に測定される。
【０１３９】
コンデンサ電圧を緩衝し、統合電圧の低インピーダンス表現を出力するために、トランジスタＭ２を、ソースフォロアとして構成してもよい。これは、電荷共有がコンデンサ上の電圧を変化させることを防ぐ。
【０１４０】
トランジスタＭ３は、他の多くのセルと共有される列として接続されているアナログ電圧出力ＡＯＵＴと共に、行アクセスデバイスとして使用されてもよい。列に接続しているＡＯＵＴ信号のうち単一の行だけが有効であり、その結果単一セルの電圧が測定される。
【０１４１】
交互実行においては、トランジスタＭ２のドレインを行選択可能な「スイッチドレール（switched rail）」に接続することによって、トランジスタＭ３を省略してもよい。
【０１４２】
トランジスタＭ４を使用して、積分された電圧から既定の始動電圧にセルを初期化してもよい。例えば、ＲＳＴとＲＶの両方に高電圧（例えば：ＶＤＤ＝１．８Ｖに）を印加することにより、プリチャージ値の（ＶＤＤ−Ｖｔ５）までコンデンサを近づけることになる。正確な初期値は、セル対セル（Ｍ４とＭ２のＶｔ変動による）とリセットスイッチ熱雑音による測定対測定（ｓｑｒｔ（ＫＴＣ）雑音）の両方で変化してもよい。その結果、相関２重サンプリング（ＣＤＳ）技術を使用して積分器始動電圧および終了電圧を測定し、それによって積分時間の間の実電圧変化を決定する。
【０１４３】
また、トランジスタＭ４のドレインが、制御された電圧ＲＶ（初期化電圧）に接続されてもよい点に留意すべきである。正常な動作において、これはＶＤＤに向かってもよいが、また、低電圧に向かってもよい。Ｍ４の「ドレイン」が、実際には、アースに向かう場合、電流フローは逆転してもよい（すなわち、電流は、Ｍ１およびＭ４を通って電極から回路に流れてもよく、ソースおよびドレインの概念は交換されてもよい）。場合によっては、この様式で回路を動作させるとき、電極に印加される（液体参照に対しての）陰電圧は、このＲＶ電圧によって制御される（Ｖｇ１およびＶｇ５が、少なくともＲＶより大きい閾値であると仮定する）。したがって、ＲＶのアース電圧を使用して、電極に陰電圧を印加してもよい（例えば、エレクトロポレーションまたは二重層形成を達成する）。
【０１４４】
アナログデジタル変換器（ＡＤＣ、図示しない）は、初期化直後および積分時間の後に再びＡＯＵＴ電圧を測定して（ＣＤＳ測定を実行する）、一定時間の間に積分した電流を決定する。そして、アナログマルチプレクサとして、列または各列に使用される別々のトランジスタ毎にＡＤＣを実行して、複数の列間で単一のＡＤＣを共有してもよい。この列マルチプレクサ要素は、雑音、精度およびスループットの要件に応じて変化してもよい。
【０１４５】
その時々で、各セルは、４つの異なる物理的状態：（１）液体に短絡している（２）形成された二重層（３）二重層＋細孔（４）二重層＋細孔＋核酸および／またはタグ分子、のうちの１つであってもよい。
【０１４６】
ある場合には、電圧を印加して、状態間でセルを移行させる。ＮＯＰ操作を使用して、特定の望ましい状態にセルを残し、一方、印加電位を用いて他のセルを刺激して、ある状態から別へと移行させる。
【０１４７】
液体電位に対して電極に印加される電圧を制御するために間接的に使用されるＭ１ソースフォロアのゲート電圧に印加されてもよい２つ（またはそれ以上）の異なる電圧が有ることによって、これは達成されてもよい。したがって、トランジスタＭ５を使用して電圧Ａを印加し、一方でトランジスタＭ６を使用して電圧Ｂを印加する。したがって、アナログマルチプレクサとしてＭ５とＭ６が同時に動作し、高められたＳＥＬＡまたはＳＥＬＢのいずれかにより電圧を選択する。
【０１４８】
すべてのセルは、起こり得る異なる状態であることができるので、またＳＥＬＡとＳＥＬＢが相補的なので、各セルにおいて電圧ＡとＢの間で選択するためにメモリ素子を使用することができる。このメモリ素子は、サイクル毎に充電される動的素子（コンデンサ）または単純なチーターラッチメモリ素子（クロスカップルインバータ）であることができる。
【０１４９】
演算増幅器テストチップ構造
いくつかの例において、テストチップは、各６６個のセンサセルからなる４つの別々のグループ（別名バンク）を並べた２６４個のセンサのアレイを含む。各グループは、各列に２２個のセンサ「セル」を持つ３つの「列」に分けられている。「セル」の名は、理想的には二重脂質層から構成されている仮想セルに適切に付与され、挿入されたナノ細孔は、アレイ内の２６４個のセンサ各々の上に形成される（ただし、デバイスは、そのように設置されたセンサセルの一部しか正常に動作しなくてもよい）。
【０１５０】
ダイの表面に取り付けられた伝導性円筒に含有される液体に電位を印加する、単一のアナログ入出力パッドがある。この「液体」電位は、細孔の上側に印加され、検出器アレイ内の全てのセルに共通である。細孔の底側には露出した電極があり、各センサセルはその電極に固有の底側電位を印加することができる。次いで、電流は、上部液体接続と細孔の底側にある各セルの電極接続との間で測定される。センサセルは、細孔の内側を通るタグ分子によって変調されたときに、細孔を通り抜けて進む電流を測定する。
【０１５１】
場合によっては、５ビットが各センサセルの様式を制御する。図１２を続けて参照すると、アレイ中の２６４個のセルの各々は、別々に制御されてもよい。値は、６６個セルのグループに別々に印加される。グループ内の６６個のセルの各々の様式は、３３０（６６*５ビット／セル）デジタル値をデータシフトレジスタ（ＤＳＲ）に連続的にシフトインすることによって制御される。これらの値は、６６個のセルの各グループに対して別々の対のピンを有するＫＩＮ（クロック）およびＤＩＮ（ｄａｔ  ｉｎ）ピンを使用して、アレイにシフトインされる。
【０１５２】
したがって、３３０クロックを使用して、ＤＳＲシフトレジスタに３３０ビットをシフトインする。対応するＬＩＮ＜ｉ＞（ロード入力）が高くアサートされるとき、第２の３３０ビット並列ロードレジスタ（ＰＬＲ）が、このシフトレジスタから並列にロードされる。ＰＬＲが並列にロードされると同時に、セルの状態値がＤＳＲにロードされる。完全な動作は、ＤＳＲに３３０データビットをシフトインするための３３０クロック、高くアサートされたＬＩＮ信号を含む単一のクロックサイクル、それに続いて、ＤＳＲからシフトアウトされた捕捉した状態データを読み込むための３３０クロックサイクル、から構成されてもよい。
【０１５３】
３３０ビットがアレイから出力されると同時に新たな３３０ビットがＤＳＲにシフトインされてもよいように、動作をパイプラインで転送する。したがって、５０ＭＨｚのクロック周波数では、読み出しのサイクル時間は３３１／５０ＭＨｚ＝６．６２ｕｓである。
【０１５４】
タグ付けされたヌクレオチド
場合によっては、タグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む。タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に付着していてもよい。ある場合には、タグは、発蛍光団ではない。タグは、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能でもよい。例示的なタグには、様々なポリマーがある。各種類のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）は、一般に固有のタグを含む。
【０１５５】
タグは、ヌクレオチド上の任意の適切な位置に位置してもよい。図６に、タグ付けされたヌクレオチドの例を提示する。ここで、Ｒ1は一般にＯＨであり、Ｒ2はＨ（すなわち、ＤＮＡの場合）またはＯＨ（すなわち、ＲＮＡの場合）である。ただし、他の修正も許容できる。図６において、Ｘは任意の適切なリンカーである。場合によっては、リンカーは切断可能である。リンカーの例には、それだけには制限されないが、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2がある。位置Ｚに関して適切な化学基の例には、Ｏ、ＳまたはＢＨ3がある。塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはその誘導体を含めた核酸への組み込みに適切な任意の塩基である。ユニバーサル塩基も、場合によっては許容できる。
【０１５６】
リン酸の数（ｎ）は、任意の適切な整数値（例えば、ヌクレオチドを核酸分子に組み込むことができるようなリン酸の数）である。ある場合には、タグ付けされたヌクレオチドの全ての種類が、同じ数のリン酸を有するが、これが必要とは限らない。いくつかの適用において、各種類のヌクレオチドに対して異なるタグがあり、リン酸の数を使用して様々なタグを区別するとは限らない。しかし、場合によっては、２種類以上のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）が同じタグ分子を有し、あるヌクレオチドと別のそれとを区別するする能力は、少なくとも一部分にはリン酸の数（異なるｎの値を有する様々な種類のヌクレオチド）によって決まる。様々な態様において、ｎの値は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である。
【０１５７】
適切なタグについて以下に説明する。ある場合には、タグは、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する。タグが付着しているとき、化合物全体の電荷は中性でもよい。タグの遊離により、２つの分子、帯電しているタグと帯電しているヌクレオチドが得られてもよい。帯電しているタグは、ナノ細孔を通り抜け、場合によっては検出される。
【０１５８】
適切なタグ付けされたヌクレオチドのさらなる例を図７に示す。タグは、糖分子、塩基分子またはその任意の組合せに付着してもよい。図７を参照すると、Ｙはタグであり、Ｘは切断可能なリンカーである。さらに、存在する場合、Ｒ1は一般にＯＨ、−ＯＣＨ2Ｎ3または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、存在する場合、Ｒ2は一般にＨである。また、Ｚは一般にＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎは１、２、３、または４を含めた任意の整数である。場合によっては、ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦ、ＣＦＦまたはＮＨである。
【０１５９】
図７を続けて参照すると、各ｄＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と一般に異なり、各ｄＮＰＰ類似体にあるタグの種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と一般に異なる。適切な塩基には、それだけには限らないが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミンまたはその各々の誘導体がある。場合によっては、塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニンまたは５−メチルシトシンのうちの１つである。
【０１６０】
Ｒ1が−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3である場合、本方法は、組み込まれたｄＮＰＰ類似体を処理して−ＣＨ2Ｎ3を除去し、３’位に付着しているＯＨ基を得ることを任意でさらに含み、それによって、さらなるｄＮＰＰ類似体の組み込みが可能になる。
【０１６１】
Ｒ1が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合、本方法は、組み込まれたヌクレオチド類似体を処理して−２−ニトロベンジルを除去し、３’位に付着しているＯＨ基を得ることを任意でさらに含み、それによって、さらなるｄＮＰＰ類似体の組み込みが可能になる。
【０１６２】
例示的なタグ
タグは、ナノ細孔において検出可能な任意の化学基または分子であってもよい。場合によっては、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含む。
【０１６３】
タグが、化合物中に適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保つことも考えられる。
【０１６４】
場合によっては、タグは、ポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリマーの例であり、構造：
【化７】
0006456816.tif 000008
【０１６５】
を有する。
【０１６６】
任意の数のエチレングリコール単位（Ｗ）が使用されてもよい。ある場合には、Ｗは０〜１００の整数である。場合によっては、エチレングリコール単位の数は、各種類のヌクレオチドで異なる。一態様において、４種類のヌクレオチドは、１６、２０、２４または３６個のエチレングリコール単位を有するタグを含む。場合によっては、タグは、追加の識別可能な部分、例えばクマリン性色素をさらに含む。
【０１６７】
場合によっては、タグは、複数のＰＥＧ鎖を含む。例として、タグは構造：
【化８】
0006456816.tif 000009
【０１６８】
を有し、Ｒは、ＮＨ2、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＳＨまたはＮ3であり、Ｗは０〜１００の整数である。
【０１６９】
ある場合には、タグは、分子（ｄＣｐ）ｍ、（ｄＧｐ）ｍ、（ｄＡｐ）ｍおよび（ｄＴｐ）ｍから選ばれる。図８は、ヌクレオチドに付着しているこれらの分子を示す。ここで、「ｍ」はそれぞれ独立に、０〜１００の整数であり、ｍが０であるとき、ｄＮＰＰの末端リン酸は、構造の左側に示されるヌクレオシドの３’Ｏ原子に直接結合されている。場合によっては、ｎの値は、各種類の塩基で異なっている。
【０１７０】
ある場合には、タグは、ヒドロカルビル、置換されているまたは無置換の、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルであり、３０００ダルトンまたはそれより小さい質量を有する。
【０１７１】
ここでの「アルキル」という用語は、特定の数の炭素原子を有する分枝状と直鎖状両方の飽和脂肪族炭化水素基を含み、無置換でも置換されていてもよい。ここでの「アルケニル」とは、直鎖または分枝状の非芳香族炭化水素ラジカルのことを指し、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有し、非芳香族炭素−炭素二重結合の最大可能数まで存在してもよく、無置換でも置換されていてもよい。用語「アルキニル」とは、直鎖または分枝状の炭化水素ラジカルのことを指し、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有し、非芳香族炭素−炭素三重結合の最大可能数まで存在してもよく、無置換でも置換されていてもよい。用語「置換される」とは、水素原子との結合を少なくとも１つ含有する上記の官能基、例えば、アルキルまたはヒドロカルビルが、非水素または非炭素原子との結合に置きかえられ、ただし通常の原子価は維持されており、その（１つまたは複数の）置換により安定な化合物が得られることを指す。置換される基には、（１つまたは複数の）炭素または（１つまたは複数の）水素原子との１つ以上の結合が、ヘテロ原子との二重または三重結合を含めた１つ以上の結合に置きかえられる基もある。
【０１７２】
タグ付けされたヌクレオチドの非限定的な例には、構造：
【化９】
0006456816.tif 000010
【０１７３】
を有する化合物があり、「Ｒ」は置換されているまたは無置換のヒドロカルビルであり、３０００ダルトンまでであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０１７４】
タグ付けされたヌクレオチドのさらなる非限定的な例には、構造：
【化１０】
0006456816.tif 000011
【０１７５】
を有する化合物があり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０１７６】
タグ付けされたヌクレオチドのさらなる非限定的な例には、構造：
【化１１】
0006456816.tif 000012
【０１７７】
を有する化合物がある。
【０１７８】
タグ付けされたヌクレオチドのさらなる非限定的な例には、構造：
【化１２】
0006456816.tif 000013
【０１７９】
を有する化合物があり、ｍは１〜５０の整数であり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０１８０】
タグを付着させる方法
タグを付着させるのに適した任意の方法を使用してもよい。一例として、（ａ）環状トリメタリン酸を産生できる条件下でヌクレオチド三リン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルホルムアミドと接触させることと；（ｂ）工程ａ）から得られた産物を求核原子と接触させて−ＯＨまたは−ＮＨ2官能化化合物を形成することと；（ｃ）タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させることとによってタグを末端リン酸に付着させ、それによって、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成してもよい。
【０１８１】
場合によっては、求核原子は、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＮＨ2、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ2、または
【化１３】
0006456816.tif 000014
【０１８２】
である。
【０１８３】
ある場合には、本方法は、工程ｂ）において、工程ａ）から得られた産物を構造：
【化１４】
0006456816.tif 000015
【０１８４】
を有する化合物と接触させることと、続いてまたは同時に、その産物をＮＨ4ＯＨと接触させて、構造：
【化１５】
0006456816.tif 000016
【０１８５】
を有する化合物を形成することとを含む。次いで、タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させ、それにより、構造：
【化１６】
0006456816.tif 000017
【０１８６】
を有するヌクレオチド三リン酸類似体を形成してもよく、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＨまたはＯＨであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０１８７】
タグの遊離
タグは、任意の様式で遊離してもよい。場合によっては、タグは、ポリリン酸に付着しており（例えば、図６）、核酸分子へのヌクレオチドの組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離する。組み込みは、任意でナノ細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼによって触媒されてもよい。ある場合には、少なくとも１つのホスファターゼ酵素も、細孔に付着している。ホスファターゼ酵素は、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離してもよい。場合によっては、ホスファターゼ酵素は、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼによって生じたピロリン酸が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように位置している。
【０１８８】
場合によっては、タグは、ポリリン酸に付着していない（例えば、図７を参照のこと）。これらの場合、タグは、切断可能なリンカー（Ｘ）によって付着する。切断可能にキャップされたおよび／または切断可能に連結されたヌクレオチド類似体の産生方法については、米国特許第６，６６４，０７９号に開示されており、参照によりその全体をここに組み込む。
【０１８９】
リンカーは、任意の適切なリンカーであり、任意の適切な様式で切断されてもよい。リンカーは、光切断可能であってもよい。一態様において、紫外線を使用して、光化学的に切断可能なリンカーおよび部分を光化学的に切断する。一態様において、光切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分である。
【０１９０】
−ＣＨ2Ｎ3基をＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理して、ｄＮＰＰ類似体またはｒＮＰＰ類似体の３’Ｏ原子からそれを除去し、それによって、３’ＯＨ基を生じてもよい。
【０１９１】
タグの検出
タグは、ヌクレオチドから遊離した後、ナノ細孔を通り抜けて流れてもよい。ある場合には、電圧を印加して、ナノ細孔を通り抜けてタグを引き寄せる。遊離したタグの少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９または少なくとも９９．９９％は、ナノ細孔を通り抜け移行してもよい。
【０１９２】
本方法のある場合において、ポリメラーゼは、複数の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔおよび／またはＵ）を含むタグ付けされたヌクレオチドのプールから集める。ポリメラーゼを、様々な種類のタグ付けされた塩基と反復して接触させることも可能である。この場合、各種類のヌクレオチドが固有の塩基を有する必要はなくてもよいが、異なる種類の塩基間の循環により、場合によっては本方法に経費および複雑さが追加される、それでもなお、この態様を本発明に包含する。
【０１９３】
図９は、核酸分子へのタグ付けされたヌクレオチドの組み込み（例えば、ポリメラーゼを使用して、鋳型と対になったプライマー塩基を伸長する）が、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸を遊離することを示している。場合によっては、ＴＡＧ−ポリリン酸は、ナノ細孔を通り抜けるときに検出される。ポリリン酸を含むリン酸の数に基づいて（例えば、ＴＡＧが同一の場合でも）ヌクレオチドを区別することさえも可能になる。それでもなお、各種類のヌクレオチドは、一般に固有のタグを有する。
【０１９４】
図９を参照すると、タグをナノ細孔に通し、イオン電流を測定する前に、ＴＡＧ−ポリリン酸化合物をホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）で処理してもよい。
【０１９５】
タグは、その電荷により、ナノ細孔において（少なくとも一部は）検出されてもよい。ある場合には、タグ化合物は、第１の正味電荷、および化学的、物理的または生物学的反応の後に異なる第２の正味電荷を有する、選択的に帯電している化合物である。いくつかの実例において、タグの電荷の大きさは、化合物の残りの電荷の大きさと同じである。一態様において、タグは正電荷を有し、タグの除去により、化合物の電荷は変化する。
【０１９６】
場合によっては、タグがナノ細孔を通り抜ける際に、電子的変化が生成することがある。場合によっては、電子的変化は、電流振幅の変化、ナノ細孔の伝導性の変化、またはその任意の組合せである。
【０１９７】
ナノ細孔は、生物学的なものまたは合成によるものであってもよい。細孔はタンパク質性であり、例えば、細孔がα溶血素タンパク質であるとも考えられる。合成ナノ細孔の一例は、固体細孔またはグラフェンである。
【０１９８】
場合によっては、ポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素は、ナノ細孔に付着している。融合タンパク質またはジスルフィド架橋は、タンパク質性ナノ細孔に付着させる方法の例である。固形状態ナノ細孔の場合、ナノ細孔近くの表面への付着は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介していてもよい。一例において、ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ基で官能化されているアルカンチオール自己組織化単分子層で修飾された金表面を介して固体表面に付着され、アミノ基は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ基への付着のために、ＮＨＳエステルに修飾されている。
【０１９９】
本開示の側面は、核酸分子を配列決定する方法を提供する。いくつかの態様において、前記コンピュータプロセッサは、前記チップに近接するワークステーション中にある。場合によっては、タグは、ナノ細孔を通り抜ける。いくつかの態様において、タグは、ナノ細孔に隣接して通過する。いくつかの態様において、重合の速度は、ナノ細孔を通り抜けるまたはその隣接を通過するタグの速度より小さい。場合によっては、前記電極は、前記膜を越えて電気的刺激を供給するよう適合されている。チップは、例えば、米国特許第８，３２４，９１４号に開示されている特徴および特性を有することができ、参照によりその全体をここに組み込む。
【０２００】
いくつかの態様において、前記膜は、前記膜を越えて測定されるように、約５ｆＦ／μｍ2より大きい静電容量を有する。場合によっては、前記膜は、前記膜を越えて測定されるように、約５００ＭΩを超えるか、それと同じ抵抗を有する。いくつかの態様において、前記膜は、前記膜を越えて１ＧΩより少ないか、それと同じ抵抗を有する。場合によっては、前記抵抗は、前記膜に隣接して配置された向かい合った電極を用いて測定される。いくつかの態様において、前記抵抗は、前記膜に隣接して配置された向かい合った電極を用いて測定される。
【０２０１】
場合によっては、各別々にアドレス可能なナノ細孔は、分子流を調節するように適合されている。場合によっては、前記別々にアドレス可能なナノ細孔は、前記ナノ細孔を通り抜けるまたはその隣接を通過する前記タグの分子流に応じて前記タグを検出するように適合されている。場合によっては、前記電極は、別々にアドレス可能である。場合によっては、前記電極は、前記電極を用いて検出される信号を処理する集積回路に接続される。
【０２０２】
場合によっては、前記集積回路は、論理コントローラを含む。場合によっては、前記電極は、前記電極を用いて検出される信号を処理する集積回路の一部である。
【０２０３】
場合によっては、前記膜は、脂質二重層である。場合によっては、膜は、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質二重層である。場合によっては、ナノ細孔は、α溶血素ナノ細孔である。場合によっては、前記膜は、（ｉ）前記膜を超える約５ｆＦ／μｍ2より大きい静電容量もしくは約１ＧΩより少ないか、それと同じ抵抗、または（ｉｉ）前記膜を超える約５ｆＦ／μｍ2より大きい静電容量および約１ＧΩより少ないか、それと同じ抵抗を呈する。場合によっては、前記膜は、膜適合性表面に隣接して配置される。場合によっては、前記複数の別々にアドレス可能なナノ細孔は、ｍｍ2当たり少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１０，０００、１００，０００または１，０００，０００個の別々にアドレス可能なナノ細孔の密度である。
【０２０４】
場合によっては、各種類のヌクレオチドは、固有のタグを含む。場合によっては、タグは、個々のヌクレオチドの５’−リン酸に最初は付着している。場合によっては、プライマーは、一本鎖の核酸鋳型の特定の位置にアニールする。
【０２０５】
本開示の別の側面は、核酸配列を決定する方法であって、ナノ細孔を用いて核酸分子へのヌクレオチドの組み込みを検出し、核酸分子が、ナノ細孔を通り抜けないことを含む方法を提供する。場合によっては、ヌクレオチドと関連付けられたタグは組み込まれると遊離し、遊離した後に、タグはナノ細孔を通り抜ける。
【０２０６】
場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象は、少なくとも４σの精度で検出される。場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象は、少なくとも５σの精度で検出される。場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象は、少なくとも６σの精度で検出される。
【０２０７】
本開示の別の側面は、核酸配列を決定する方法であって、ナノ細孔を用いて個々のヌクレオチド組み込み事象の副産物を検出することを含む方法を提供する。場合によっては、ヌクレオチドは、前記ナノ細孔によって直接検出されない。場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象の副産物は、前記個々のヌクレオチド組み込み事象により遊離するタグ分子である。場合によっては、タグ分子は、ナノ細孔を通り抜ける。核酸分子を配列決定する方法であって、４σを超える精度で個々のヌクレオチド組み込み事象を区別することを含む方法。場合によっては、精度は、５σを超える。場合によっては、精度は、６σを超える。場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象は、ナノ細孔を用いて検出される。場合によっては、前記ナノ細孔は、別々にアドレス可能なナノ細孔である。場合によっては、前記ナノ細孔は、電極に隣接して配置される膜中にある。場合によっては、前記電極は、ｍｍ2当たり少なくとも約５００個の電極の密度で、電極のアレイ中にある。場合によっては、前記個々のヌクレオチド組み込み事象は、前記核酸分子に相補的な核酸鎖におけるヌクレオチドの組み込みを含み、前記ヌクレオチドは、前記核酸鎖において前記ヌクレオチドが組み込まれると遊離するタグを含み、前記タグは、前記ヌクレオチドから遊離した後に、前記ナノ細孔を通り抜けるまたはその隣接を通過する。場合によっては、前記タグは、前記ヌクレオチドから遊離した後に、前記電極を用いて検出される。
【０２０８】
本開示の別の側面は、核酸の配列決定方法であって：（ａ）ナノ細孔のアレイを用意し、前記アレイ中の個々のナノ細孔が、核酸ポリメラーゼとカップリングしていることと；（ｂ）ポリメラーゼを用いてタグ付けされたヌクレオチドを重合させることとを含み、個々のタグ付けされたヌクレオチドがタグを含み、タグが遊離し、ナノ細孔を用いて検出される方法を提供する。場合によっては、タグは、遊離した後にナノ細孔に隣接して通過する。場合によっては、タグは、遊離した後にナノ細孔を通り抜ける。場合によっては、重合の速度は、ナノ細孔を通り抜けるタグの速度より小さい。場合によっては、ナノ細孔は、別々にアドレス可能である。
【０２０９】
本開示の別の側面は、タグ付けされたヌクレオチドを提供し、そのヌクレオチドは、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔のアレイを含むチップ中のナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む。場合によっては、タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に付着している。場合によっては、タグは発蛍光団ではない。場合によっては、タグは、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である。
【０２１０】
本開示の別の側面は、核酸分子を配列決定するシステムを提供する。場合によっては、前記電極は、前記膜を越えて電気的刺激を供給するよう適合されている。場合によっては、前記膜は、前記膜を越えて測定されるように、約５ｆＦ／μｍ2より大きい静電容量を有する。場合によっては、前記膜は、前記膜を越えて測定されるように、約５００ＭΩを超えるか、それと同じ抵抗を有する。場合によっては、前記膜は、前記膜を越えて約１ＧΩより少ないか、それと同じ抵抗を有する。場合によっては、前記抵抗は、前記膜に隣接して配置された向かい合った電極によって測定される。場合によっては、各別々にアドレス可能なナノ細孔は、分子流を調節するように適合されている。場合によっては、各別々にアドレス可能なナノ細孔は、前記ナノ細孔に印加される電気的刺激を用いて分子流を調節するように適合されている。場合によっては、前記コンピュータプロセッサは、前記チップに近接するワークステーション中にある。場合によっては、前記コンピュータプロセッサは、前記チップに含まれる。場合によっては、前記別々にアドレス可能なナノ細孔は、前記ナノ細孔を通り抜けるまたはその隣接を通過する前記タグの分子流に応じて前記タグを検出するように適合されている。場合によっては、前記電極は、別々にアドレス可能である。場合によっては、前記電極は、前記電極を用いて検出される信号を処理する集積回路に接続される。場合によっては、前記集積回路は、論理コントローラを含む。場合によっては、前記電極は、前記電極を用いて検出される信号を処理する集積回路の一部である。
【０２１１】
場合によっては、前記膜は、脂質二重層である。場合によっては、ナノ細孔は、α溶血素ナノ細孔である。場合によっては、膜は、ジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈＰＣ）脂質二重層である。場合によっては、前記膜は、膜適合性表面に隣接して配置される。場合によっては、前記複数の別々にアドレス可能なナノ細孔は、ｍｍ2当たり少なくとも約５００個の別々にアドレス可能なナノ細孔の密度である。場合によっては、前記密度は、ｍｍ2当たり少なくとも約１０００個の別々にアドレス可能なナノ細孔である。
【０２１２】
本開示の別の側面は、核酸分子を配列決定する方法であって、ｍｍ2当たり少なくとも約５００部位の密度で、別々にアドレス可能な部位のアレイを用意することと、各部位が、核酸ポリメラーゼに付着しているナノ細孔を有することと、アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、重合するとタグが遊離し、所与の部位でナノ細孔により検出される方法を提供する。場合によっては、本方法は、プロセッサを用いて、検出されたタグに基づいて核酸分子の核酸配列を生成することを導くことをさらに含む。いくつかの場合において、タグは、ナノ細孔を通り抜ける。いくつかの場合において、タグは、ナノ細孔に隣接して通過する。場合によっては、重合の速度は、ナノ細孔を通り抜けるまたはその隣接を通過するタグの速度より小さい。
【０２１３】
タグ配列決定方法およびシステム
本開示の別の側面は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画とを含む伝導性測定システムを提供する。本システムは、障壁を越えて電界を印加するための手段と、電界の変化を測定するための手段と、細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと、細孔に付着している１つ以上のホスファターゼ酵素とをさらに含むことができる。
【０２１４】
システムの一態様において、細孔は約１〜１０ｎｍの直径を有する。別の一態様において、ポリメラーゼおよびホスファターゼ酵素が細孔に共有結合している。さらなる態様において、ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が細孔に付着している。
【０２１５】
システムの一態様において、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼによって生じたポリリン酸が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するようにホスファターゼ酵素は位置している。
【０２１６】
別の態様において、ホスファターゼ酵素とポリリン酸の間の相互作用の速度は、ポリリン酸を生じるポリメラーゼの速度より速いか、または同じである。
【０２１７】
別の態様において、第１および第２の区画の各々は、電荷を有する。細孔の内部は、負の電荷を有することも考えられる。
【０２１８】
システムのさらに別の態様において、細孔は、生物学的なものまたは合成によるものである。細孔はタンパク質性であり、例えば、細孔はα溶血素タンパク質であるとも考えられる。
【０２１９】
システムのさらなる態様において、細孔は固体細孔またはグラフェンである。
【０２２０】
各々実質的に同一の特徴を有する細孔のアレイ、または異なる直径の細孔のアレイ、または障壁を越えて異なる電界を印加する細孔のアレイを含むシステムも考えられる。
【０２２１】
図４６に示す通り、伝導性測定システムは、ＣＭＯＳ電子回路と一体化している、または細孔または細孔のアレイは、ＣＭＯＳダイに直接一体化していることがさらに考えられる。
【０２２２】
構造
【化１７】
0006456816.tif 000018
【０２２３】
を有する化合物であって、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する化合物。
【０２２４】
本化合物の一態様において、タグの電荷の大きさは、化合物の残りの電荷の大きさと同じである。
【０２２５】
本化合物の別の態様において、タグは、複数のエチレングリコール単位、好ましくは、１６、２０、２４または３６エチレングリコール単位を含む。
【０２２６】
化合物のさらなる態様において、タグは、追加の識別可能な部分、例えばクマリン性色素をさらに含む。
【０２２７】
一態様において、タグは正電荷を有する。別の態様において、タグの除去により、化合物の電荷は変化する。
【０２２８】
タグは、化合物中に適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保つことも考えられる。
【０２２９】
構造
【化１８】
0006456816.tif 000019
【０２３０】
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物であって、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の３種類の化合物の各々にあるタグと異なる、組成物。
【０２３１】
本発明の様々な態様がここで示され記載されたが、そのような態様が、例の目的のためだけに提供されることは、当業者にとって明らかであろう。本発明を逸脱しない範囲で、多数の変形、変更および置き換えを当業者なら思いつくであろう。ここで記載される本発明の態様に対する様々な変形例が利用されてもよいことは理解されよう。
【０２３２】
核酸配列を決定する方法であって、別々にアドレス可能な部位のアレイを用意し、各部位が、核酸ポリメラーゼが付着しているナノ細孔を有することと、前記アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、タグが遊離し、前記所与の部位でナノ細孔によって検出される、方法。
【０２３３】
一態様において、タグは、ナノ細孔を通り抜ける。別の態様において、重合の速度は、ナノ細孔を通り抜けるタグの速度より遅い。
【０２３４】
核酸の配列決定方法であって：（ａ）第１の速度でタグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが重合すると遊離することと；（ｂ）第２の速度でナノ細孔に通すことによって遊離したタグを検出し、第２の速度が第１の速度を超えるか、それと同じであることとを含む方法。
【０２３５】
一態様において、各種類のヌクレオチドは、固有のタグを含む。別の態様において、タグは、個々のヌクレオチドの５’−リン酸に最初は付着している。
【０２３６】
核酸の配列決定方法であって：（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが、重合すると遊離することと；（ｂ）ナノ細孔を用いて、遊離したタグを検出することとを含む方法。
【０２３７】
一態様において、本方法は、個々のヌクレオチドから遊離したタグを、ナノ細孔を通して導くことをさらに含む。別の態様において、各種類のヌクレオチドは、固有のタグを含む。さらなる態様において、タグは、個々のヌクレオチドの５’−リン酸に最初は付着している。
【０２３８】
核酸配列を決定する方法であって、ナノ細孔を用いて核酸分子へのヌクレオチドの組み込みを検出し、前記核酸分子が、ナノ細孔を通り抜けないことを含む方法。
【０２３９】
一態様において、ヌクレオチドと関連付けられたタグは組み込まれると遊離し、タグはナノ細孔を通り抜ける。別の態様において、ヌクレオチド組み込み事象は、少なくとも４σの精度で検出される。
【０２４０】
核酸配列を決定する方法であって、ナノ細孔を用いて個々のヌクレオチド組み込み事象の副産物を検出することを含む方法。
【０２４１】
一態様において、ヌクレオチドは、直接検出されない。別の態様において、ヌクレオチド組み込み事象の副産物は、遊離するタグ分子である。さらなる態様において、タグ分子は、ナノ細孔を通り抜ける。
【０２４２】
核酸配列を決定する方法であって、４σ、５σまたは６σを超える精度で個々のヌクレオチド組み込み事象を区別することを含む方法。
【０２４３】
一態様において、ヌクレオチド組み込み事象は、ナノ細孔を用いて検出される。別の態様において、ヌクレオチドと関連付けられたタグは組み込まれると遊離し、タグはナノ細孔を通り抜ける。
【０２４４】
核酸を配列決定する方法であって、核酸ポリメラーゼに付着しているナノ細孔のアレイを用意することと、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、タグが遊離し、ナノ細孔によって検出される方法。
【０２４５】
一態様において、タグは、ナノ細孔を通り抜ける。別の態様において、重合の速度は、ナノ細孔を通り抜けるタグの速度より遅い。
【０２４６】
タグ付けされたヌクレオチドであって、ヌクレオチドは、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む。
【０２４７】
一態様において、タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に付着している。別の態様において、タグは発蛍光団ではない。さらなる態様において、タグは、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である。
【０２４８】
化合物のアイデンティティを決定する方法であって、
（ａ）化合物を、（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと；
（ｂ）化合物が細孔を通り抜けて移行するときに、電界の変化を記録し、電界の変化が、化合物と電解質と細孔との相互作用の結果であり、化合物のサイズ、電荷および組成を示すことと
を含み、それによって、変化と所定の値との相関から化合物のアイデンティティを決定することが可能になる、方法。
【０２４９】
一態様において、方法は、工程（ａ）の前にホスファターゼ酵素で化合物を処理する工程をさらに含む。
【０２５０】
化合物がタグであるかまたはタグの前駆体であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）化合物を（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと；
化合物が細孔を通り抜けて移行するときに、電界の変化を記録することと；
電界の変化を、タグおよびタグの前駆体に対応する所定の値と比較することと
を含み、それによって、化合物が、タグであるかまたはその前駆体であるかどうかを決定する、方法。
【０２５１】
一態様において、方法は、工程（ａ）において電界の電流バイアスを調節する工程をさらに含む。
【０２５２】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）一本鎖ＤＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化１９】
0006456816.tif 000020
【０２５３】
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の塩基がチミンまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが他の３種類の化合物の各々にあるタグと異なり、
一本鎖ＤＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；
（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２５４】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）一本鎖ＤＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化２０】
0006456816.tif 000021
【０２５５】
を有する化合物
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうち１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
一本鎖ＤＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし（１）化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；
（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２５６】
一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）一本鎖ＲＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化２１】
0006456816.tif 000022
【０２５７】
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の塩基が、グアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の塩基が、シトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の塩基が、ウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にあるタグが、他の３種類の化合物の各々にあるタグと異なり、
一本鎖ＲＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；
（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２５８】
一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）一本鎖ＲＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化２２】
0006456816.tif 000023
【０２５９】
を有する化合物
と接触させ、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、タグが、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
一本鎖ＲＮＡが、細孔に付着しているポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して化合物が相補的である場合に、ポリメラーゼがプライマーへの化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズしたプライマーを有し、
化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との接触を反復して繰り返し、ただし（１）化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
化合物の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離し、
細孔に付着しているホスファターゼ酵素が、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離することと；
（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成したタグが細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物がプライマーに組み込まれてＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれた化合物に相補的な一本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することと
を含み、それによって、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２６０】
本方法の一態様において、ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が、細孔に付着している。ある態様において、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、どちらを適用するにしても、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを変性させることによって得られる。別の態様において、同じ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの複数のコピーが、ビーズに固定化されている。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列が、同じ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの複数のコピーを使用して決定されることも考えられる。
【０２６１】
別の態様において、工程（ｂ）の各反復後に、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとの接触によって組み込まれていない化合物を除去する洗浄工程が実施される。さらなる態様において、工程（ｂ）の各反復後に、タグに付着している追加の識別可能な部分のアイデンティティを決定する工程が考えられる。
【０２６２】
方法の一態様において、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％の遊離したタグは、ナノ細孔を通り抜けて移行する。
【０２６３】
一態様において、化合物は、可逆性ターミネーターをさらに含み、任意で、本方法は、工程（ｂ）の各反復後に、可逆性ターミネーターを除去する工程をさらに含み、可逆性ターミネーターは、生物学的手段、化学的手段、物理的な手段によって、または光照射によって除去される。
【０２６４】
別の態様において、細孔の内部は、タグまたはタグが付着しているポリリン酸の電荷に対して反対の符号の電荷を有する。
【０２６５】
さらに別の態様において、伝導性測定システムの第１および第２の区画の各々は電荷を有し、任意で第１および第２の区画の電荷の極性は反対である。第１および第２の区画の電荷が調節可能であることも考えられる。
【０２６６】
さらなる態様において、工程（ｂ）において細孔を通り抜けて移行するタグの速度は、タグの電荷と第１および第２の区画の電荷とに基づいて決定される。
【０２６７】
さらに別の態様において、第１および第２の区画の各々は、工程（ａ）においてタグまたはタグが付着しているポリリン酸が遊離する速度を超えるか、または同じ速度で、工程（ｂ）においてタグが細孔を通り抜けて移行するような電荷を有する。
【０２６８】
少なくとも第１および第２の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と；
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含み；
前記第１および第２の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも１つの化合物と；
前記少なくとも１つの細孔は、印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており；
前記少なくとも１つの細孔は、化合物からタグを切断してタグを遊離するように構成された特徴部を含み；
イオン電流を測定する手段、ならびに少なくとも１つの細孔がタグによって遮られていない時間およびタグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、時系列としてその時間経過を記録する手段と
を含む伝導性測定システム。
【０２６９】
本システムの一態様において、タグは、細孔におけるイオン電流帯域幅の制限より長い滞留時間、およびイオン電流を測定する前記手段の電流ショットノイズを有する。
【０２７０】
遮られていない細孔の伝導性レベルと統計的に一致する領域、および伝導性の低下したパルス、また伝導性の低下した個々のパルス内の統計的に定常なセグメントに伝導性時系列のセグメントを正確に記述する方法であって、前記伝導性時系列が、
少なくとも第１および第２の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と；
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含み；
前記第１および第２の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも１つの化合物と；
前記少なくとも１つの細孔は、印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており；
前記少なくとも１つの細孔は、化合物からタグを切断してタグを遊離するように構成された特徴部を含み；
イオン電流を測定する手段、ならびに少なくとも１つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、前記伝導性時系列を記録する手段と
を含む伝導性測定システムで生成され；
伝導性時系列のセグメントを正確に記述するための前記方法が、
（ａ）未加工伝導性時系列から推定した、ヒドンマルコフモデルの連続密度の最尤状態配列のビタビ復号と；
（ｂ）開孔伝導性レベルからの逸脱に対する閾値との比較による伝導性の低下したパルスの領域の正確な記述と；
（ｃ）各セグメントに対するイオン電流レベルの中心傾向を推定することによって、または中心傾向とセグメント継続時間を一緒に測定することによって、伝導性の低下したパルスを特徴づける手段とからなる群から選択され、セグメント中心傾向の測定が、
（ｉ）連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として伝導性時系列から推定した第１のＧＭＭのガウス成分の平均パラメータと；
（ｉｉ）算術平均と；
（ｉｉｉ）トリム平均と；
（ｉｖ）中央値と；
（ｖ）サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される方法。
【０２７１】
別の態様において、本方法は、（ａ）伝導性セグメントの中心傾向の測定に基づく第２の混合ガウスモデルの最尤法推定と；
（ｂ）伝導性時系列のセグメントの中心傾向の推定の経験的確率密度の補間および平滑化、ならびに補間する関数の導関数の平方根によるピーク検出と；
（ｃ）多モード分布推定量のモードを位置指定する別の手段と
の少なくとも１つをさらに含む。
【０２７２】
溶液中の化合物の少なくとも１つのパラメータを決定する方法であって、
第１の貯蔵部に第１の流体を入れることと；
第２の貯蔵部に第２の流体を入れることと；
前記第１および前記第２の流体の少なくとも一方は、少なくとも１つの化合物を含み、化合物は、タグ付けされたヌクレオチドまたはタグ付けされたヌクレオチドから切断されたタグであり；
前記第１の貯蔵部内の前記第１の流体は、電気的抵抗がある障壁で前記第２の貯蔵部内の前記第２の流体と分離されており；
前記電気的抵抗がある障壁は、少なくとも１つの細孔を含み；
前記第１と前記第２の流体の間の電位により、前記第１の流体、前記少なくとも１つの細孔、および前記第２の流体にイオン電流を流すことと；
前記少なくとも１つの細孔を通って流れるイオン電流およびイオン電流の変化の継続時間を測定することと；
イオン電流の測定は、前記少なくとも１つの細孔と相互作用している化合物によって引き起こされるイオン電流の減少を測定するのに十分な一定の時間実行され；
イオン電流の変化および一定の時間を通じてのイオン電流の変化の継続時間を数理的に解析することによって、化合物の少なくとも１つのパラメータを決定することと
を含み、前記数理解析が、
（ａ）連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として伝導性時系列から推定した第１のＧＭＭのガウス成分の平均パラメータと；
（ｂ）事象平均抽出と；
（ｃ）最尤事象状態割り当てと；
（ｄ）閾値検出および平均化と；
（ｅ）スライディングウインドウ分析と；
（ｆ）算術平均と；
（ｇ）トリム平均と；
（ｈ）中央値と；
（ｉ）サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、方法。
【０２７３】
本方法の一態様において、化合物は、イオン電流の減少を測定する前に、ホスファターゼで処理される。別の態様において、化合物は、第１の正味電荷、および化学的、物理的または生物学的反応の後に、異なる第２の正味電荷を有する選択的に帯電した化合物である。
【０２７４】
別の態様において、数理解析は、ＧＭＭ、閾値検出および平均化、ならびにスライディングウインドウ分析からなる群から選択される。
【０２７５】
さらなる態様において、少なくとも１つのパラメータは、化合物の濃度、サイズ、電荷および組成からなる群から選択される。
【０２７６】
本方法の態様は、伝導性測定システムを較正する工程を含むことが考えられる。
【０２７７】
一態様において、本方法の精度は、４σ、５σまたは６σを超える。
【０２７８】
ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
【０２７９】
一態様において、タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に付着している。別の態様において、タグは発蛍光団ではない。さらなる態様において、タグは、その電荷、形状、サイズまたはそれらの任意の組合せによって検出可能である。
【０２８０】
本伝導性測定システムの一態様において、第１および第２の電解質溶液は同じである。
【０２８１】
本方法の一態様において、第１および第２の電解質溶液は同じである。
【０２８２】
ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
【０２８３】
一態様において、タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に付着している。別の態様において、タグは発蛍光団ではない。さらなる態様において、タグは、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である。
【０２８４】
核酸配列を決定する方法であって、別々にアドレス可能な部位のアレイを用意し、各部位が、核酸ポリメラーゼが付着しているナノ細孔を有することと、前記アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、タグが遊離し、前記所与の部位でナノ細孔によって検出される、方法。
【０２８５】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対してｄＮＰＰ類似体が相補的である場合に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーへのｄＮＰＰ類似体のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドの各々とそのうちの少なくとも１つがハイブリダイズできる４つのデオキシリボヌクレオチドポリリン酸（ｄＮＰＰ）類似体と接触させ、４つのｄＮＰＰ類似体の各々は構造：
【化２３】
0006456816.tif 000024
【０２８６】
を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンもしくはウラシル、またはこれら塩基のうちの１つ以上の誘導体であり、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＨであり、ＸはＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ｎは１、２、３または４であり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、
ただし、（ｉ）各ｄＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各ｄＮＰＰ類似体のｎの値が他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々のｎの値と異なるか、または４つのｄＮＰＰ類似体の各々のｎの値が同じであり、各ｄＮＰＰ類似体にあるタグの種類が他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、ｄＮＰＰ類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）膜を越えて電圧を印加し、工程（ａ）において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどのｄＮＰＰ類似体がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、ｎの各値に対して、またはタグの各異なる種類に対して異なり、それによって、組み込まれたｄＮＰＰ類似体に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定できることと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施し、工程（ｂ）の各反復において、工程（ａ）においてどのｄＮＰＰ類似体がＤＮＡ伸長産物に組み込まれたかを同定し、ｄＮＰＰ類似体が、ＤＮＡ伸長産物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側に位置することと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２８７】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対してＮＰＰ類似体が相補的である場合に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーへのｄＮＰＰ類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドとハイブリダイズできるデオキシリボヌクレオチドポリリン酸（ｄＮＰＰ）類似体と接触させ、ｄＮＰＰ類似体は構造：
【化２４】
0006456816.tif 000025
【０２８８】
を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン、またはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、Ｒ1は−ＯＨ、−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、Ｒ2はＨであり、ＸはＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ｎは１、２、３または４であり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、
ｄＮＰＰ類似体が組み込まれない場合は、ｄＮＰＰ類似体が組み込まれるまで、異なるｄＮＰＰ類似体との接触を反復して繰り返し、ただし（ｉ）各ｄＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他のｄＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各ｄＮＰＰ類似体のｎの値が他のｄＮＰＰ類似体の各々のｎの値と異なるか、またはｄＮＰＰ類似体の各々のｎの値が同じであり、各ｄＮＰＰ類似体にあるタグの種類が他のｄＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、ｄＮＰＰ類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）膜を越えて電圧を印加し、工程（ａ）において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどのｄＮＰＰ類似体がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、ｎの各値に対して、またはタグの各異なる種類に対して異なり、それによって、組み込まれたｄＮＰＰ類似体に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定できることと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し実施し、ＤＮＡ伸長産物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して、そのｄＮＰＰ類似体が相補的である場合に、工程（ａ）の各反復において、ｄＮＰＰ類似体がＤＮＡ伸長産物に組み込まれることと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２８９】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対してｄＮＰＰ類似体が相補的である場合に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーへのｄＮＰＰ類似体のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドの各々とそのうちの少なくとも１つがハイブリダイズできる４つのデオキシリボヌクレオチドポリリン酸（ｄＮＰＰ）類似体と接触させ、４つのｄＮＰＰ類似体の各々は、
【化２５】
0006456816.tif 000026
【０２９０】
から選ばれる構造を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン、またはこれら塩基のうちの１つ以上の誘導体であり、Ｙはタグであり、存在する場合、Ｒ1はＯＨであり、存在する場合、Ｒ2はＨであり、Ｘは切断可能なリンカーであり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎは１、２、３または４であり、ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦ、ＣＦＦまたはＮＨであり、
ただし（ｉ）各ｄＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各ｄＮＰＰ類似体にあるタグの種類が、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と異なることと；
（ｂ）工程（ａ）において組み込まれたｄＮＰＰ類似体からタグを切断することと；
（ｃ）膜を越えて電圧を印加し、工程（ｂ）において切り離されたタグがナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどのｄＮＰＰ類似体がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、タグの各異なる種類について異なり、それによって、組み込まれたｄＮＰＰ類似体に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定できることと；
（ｄ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返し実施し、工程（ｃ）の各反復において、工程（ａ）においてＤＮＡ伸長産物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にどのｄＮＰＰ類似体がＤＮＡ伸長産物に組み込まれたかを同定することと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２９１】
一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対してｄＮＰＰ類似体が相補的である場合に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーへのｄＮＰＰ類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドとハイブリダイズできるデオキシリボヌクレオチドポリリン酸（ｄＮＰＰ）類似体と接触させ、ｄＮＰＰ類似体は構造：
【化２６】
0006456816.tif 000027
【０２９２】
を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミン、またはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、Ｙはタグであり、存在する場合、Ｒ1はＯＨ、−ＯＣＨ2Ｎ3または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、存在する場合、Ｒ2はＨであり、Ｘは切断可能なリンカーであり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎは１、２、３または４であり、Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦ、ＣＦＦまたはＮＨであり、
ｄＮＰＰ類似体が組み込まれない場合は、ｄＮＰＰ類似体が組み込まれるまで、異なるｄＮＰＰ類似体との接触を反復して繰り返し、
ただし（ｉ）各ｄＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他のｄＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各ｄＮＰＰ類似体にあるタグの種類が、他のｄＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と異なることと；
（ｂ）工程（ａ）において組み込まれたｄＮＰＰ類似体からタグを切断することと；
（ｃ）膜を越えて電圧を印加し、工程（ｂ）において切り離されたタグがナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどのｄＮＰＰ類似体がプライマーに組み込まれてＤＮＡ伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、組み込まれたｄＮＰＰ類似体に相補的な一本鎖ＤＮＡ中のヌクレオチド残基を同定できることと；
（ｄ）配列決定される一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）から（ｃ）を繰り返し実施し、ＤＮＡ伸長産物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して、そのｄＮＰＰ類似体が相補的である場合に、工程（ａ）の各反復において、ｄＮＰＰ類似体がＤＮＡ伸長産物に組み込まれることと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０２９３】
場合によっては、タグ付けされたヌクレオチドは、ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む。タグは、ヌクレオチドの５’−リン酸に付着していてもよい。ある場合には、タグは発蛍光団ではない。タグは、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能でもよい。例示的なタグには、様々なポリマーがある。各種類のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）は、固有のタグを一般に含む。
【０２９４】
タグは、ヌクレオチド上の任意の適切な位置に位置してもよい。図３４に、タグ付けされたヌクレオチドのいくつかの非限定的な例を提示する。第１の図において、Ｒ1は一般にＯＨであり、Ｒ2はＨ（すなわち、ＤＮＡの場合）またはＯＨ（すなわち、ＲＮＡの場合）である。ただし、他の修正も許容できる。図３４において、Ｘは任意の適切なリンカーである。場合によっては、リンカーは切断可能である。リンカーの例には、それだけには制限されないが、Ｏ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2がある。位置Ｚに関して適切な化学基の例には、Ｏ、ＳまたはＢＨ3がある。塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはその誘導体を含めた核酸への組み込みに適切な任意の塩基である。ユニバーサル塩基も、場合によっては許容できる。
【０２９５】
リン酸の数（ｎ）は、任意の適切な整数値（例えば、ヌクレオチドを核酸分子に組み込むことができるようなリン酸の数）である。ある場合には、タグ付けされたヌクレオチドの全ての種類が、同じ数のリン酸を有するが、これが必要とは限らない。いくつかの適用において、各種類のヌクレオチドに対して異なるタグがあり、リン酸の数を使用して様々なタグを区別するとは限らない。しかし、場合によっては、２種類以上のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵ）が同じタグ分子を有し、あるヌクレオチドと別のそれとを区別するする能力は、少なくとも一部分にはリン酸の数（異なるｎの値を有する様々な種類のヌクレオチド）によって決まる。様々な態様において、ｎの値は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上である。
【０２９６】
適切なタグについて以下に説明する。ある場合には、タグは、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する。タグが付着しているとき、化合物全体の電荷は中性でもよい。タグの遊離により、２つの分子、帯電しているタグと帯電しているヌクレオチドが得られてもよい。帯電しているタグは、ナノ細孔を通り抜け、場合によっては検出される。
【０２９７】
適切なタグ付けされたヌクレオチドの追加の例も、図３４に示される。第２〜第４の図に示すように、タグは、糖分子、塩基分子またはその任意の組合せに付着してもよい。図３４を参照すると、Ｙはタグであり、Ｘは切断可能なリンカーである。さらに、存在する場合、Ｒ1は一般にＯＨ、−ＯＣＨ2Ｎ3または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、存在する場合、Ｒ2は一般にＨである。また、Ｚは一般にＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎは１、２、３、または４を含めた任意の整数である。場合によっては、ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2、ＣＨＦ、ＣＦＦまたはＮＨである。
【０２９８】
図３４を続けて参照すると、各ｄＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と一般に異なり、各ｄＮＰＰ類似体にあるタグの種類は、他の３つのｄＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と一般に異なる。適切な塩基には、それだけには限らないが、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミンまたはその各々の誘導体がある。場合によっては、塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザアデニンまたは５−メチルシトシンのうちの１つである。
【０２９９】
Ｒ1が−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3である場合、本方法は、組み込まれたｄＮＰＰ類似体を処理して−ＣＨ2Ｎ3を除去し、３’位に付着しているＯＨ基を得ることを任意でさらに含み、それによって、さらなるｄＮＰＰ類似体の組み込みが可能になる。
【０３００】
Ｒ1が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合、本方法は、組み込まれたヌクレオチド類似体を処理して−２−ニトロベンジルを除去し、３’位に付着しているＯＨ基を得ることを任意でさらに含み、それによって、さらなるｄＮＰＰ類似体の組み込みが可能になる。
【０３０１】
タグは、ナノ細孔において検出可能な任意の化学基または分子であってもよい。本方法の一態様において、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、色素、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、蛍光色素、化学発光化合物、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド一リン酸、ヌクレオチド二リン酸、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、無置換もしくは１個以上のハロゲン、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基で置換されているチオール、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含む。
【０３０２】
本方法の一態様において、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニンまたは５−メチルシトシンからなる群から選択される。
【０３０３】
一態様において、本方法は、工程（ｂ）の各反復後に、一本鎖ＤＮＡとの接触から組み込まれていないｄＮＰＰ類似体を除去する洗浄工程をさらに含む。
【０３０４】
一態様において、本方法は、工程（ｃ）の各反復後に、一本鎖ＤＮＡとの接触から組み込まれていないｄＮＰＰ類似体を除去する洗浄工程をさらに含む。
【０３０５】
本方法の一態様において、一本鎖ＤＮＡ、電解質溶液、および膜中のナノ細孔は、単一の容器内に位置する。
【０３０６】
本方法の一態様において、Ｒ1が−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3である場合、本方法は、組み込まれたｄＮＰＰ類似体を処理して−ＣＨ2Ｎ3を除去し、３’位に付着している−ＯＨ基を得ることを任意でさらに含み、それによって、さらなるｄＮＰＰ類似体の組み込みが可能になる。
【０３０７】
本方法の一態様において、Ｒ1が−Ｏ−２−ニトロベンジルである場合、本方法は、組み込まれたヌクレオチド類似体を処理して−２−ニトロベンジルを除去し、３’位に付着している−ＯＨ基を得ることを任意でさらに含み、それによって、さらなるｄＮＰＰ類似体の組み込みが可能になる。
【０３０８】
本方法の一態様において、ｄＮＰＰ類似体は、以下の構造：
【化２７】
0006456816.tif 000028
【０３０９】
を有し、
Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＨまたはＯＨであり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０３１０】
本方法の一態様において、タグは、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、またはヘキサヌクレオチドであり、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチドまたはヘキサヌクレオチドの塩基は、ｄＮＰＰ類似体の塩基と同じ種類の塩基である。
【０３１１】
本方法の一態様において、タグは：
【化２８−１】
0006456816.tif 000029
【化２８−２】
0006456816.tif 000030
【０３１２】
から選ばれ、
各構造においてｎはそれぞれ独立に、１、２、３、または４であり、ｍはそれぞれ独立に、０〜１００の整数であり、ｍが０であるとき、ｄＮＰＰの末端リン酸は、構造の左側に示されるヌクレオシドの３’Ｏ原子に直接結合されており、ｎの値は、各種類の塩基で異なる。
【０３１３】
本方法の一態様において、ｍは０〜５０の整数である。本方法の一態様において、ｍは０〜１０の整数である。
【０３１４】
タグ付けされたヌクレオチドの様々な非限定的な例が提供される。本方法の一態様において、ｄＮＰＰ類似体は構造：
【化２９】
0006456816.tif 000031
【０３１５】
を有し、
Ｒは置換されているまたは無置換のヒドロカルビルであり、３０００ダルトンまでであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０３１６】
本方法の一態様において、ｄＮＰＰ類似体は構造：
【化３０】
0006456816.tif 000032
【０３１７】
を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０３１８】
本方法の一態様において、ｄＮＰＰ類似体は構造：
【化３１】
0006456816.tif 000033
【０３１９】
を有する。
【０３２０】
本方法の一態様において、ｄＮＰＰ類似体は構造：
【化３２】
0006456816.tif 000034
【０３２１】
を有し、
ただし、ｍは１〜５０の整数であり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０３２２】
本方法の一態様において、電子的変化は、電流振幅の変化である。
【０３２３】
本方法の一態様において、電子的変化は、ナノ細孔の伝導性の変化である。
【０３２４】
本方法の一態様において、ナノ細孔は生物学的なものである。本方法の一態様において、ナノ細孔はタンパク質性である。本方法の一態様において、ナノ細孔はα溶血素を含む。本方法の一態様において、ナノ細孔はグラフェンである。本方法の一態様において、ナノ細孔は固体ナノ細孔である。本方法の一態様において、ナノ細孔は固体膜中にある。
【０３２５】
本方法の一態様において、一本鎖ＤＮＡ、プライマー、またはＤＮＡポリメラーゼは、固形表面に付着している。
【０３２６】
本方法の別の態様において、ナノ細孔は、ナノ細孔のアレイの一部である。
【０３２７】
タグを付着させるのに適した任意の方法を使用してもよい。一例として、（ａ）環状トリメタリン酸を産生できる条件下でヌクレオチド三リン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルホルムアミドと接触させることと；（ｂ）工程ａ）から得られた産物を求核原子と接触させて−ＯＨまたは−ＮＨ2官能化化合物を形成することと；（ｃ）タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させることによってタグを末端リン酸に付着させ、それによって、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成してもよい。
【０３２８】
場合によっては、求核原子は、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＮＨ2、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ2、または
【化３３】
0006456816.tif 000035
【０３２９】
である。
【０３３０】
ある場合には、本方法は、工程ｂ）において、工程ａ）から得られた産物を構造：
【化３４】
0006456816.tif 000036
【０３３１】
を有する化合物と接触させることと、続いてまたは同時に、その産物をＮＨ4ＯＨと接触させて、構造：
【化３５】
0006456816.tif 000037
【０３３２】
を有する化合物を形成することとを含む。
【０３３３】
次いで、タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させ、それにより、構造：
【化３６】
0006456816.tif 000038
【０３３４】
を有するヌクレオチド三リン酸類似体を形成してもよく、
Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＨまたはＯＨであり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０３３５】
特に、ヌクレオチド三リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド三リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド三リン酸と異なり：（ａ）環状トリメタリン酸を産生できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルホルムアミドと接触させることと；（ｂ）環状トリメタリン酸を求核開裂できる条件下で、工程ａ）から得られた産物をヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、末端リン酸にタグを結合することとを含み、それにより、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成する、方法。
【０３３６】
ヌクレオチド三リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド三リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド三リン酸と異なり：（ａ）環状トリメタリン酸を産生できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド／ジメチルホルムアミドと接触させることと；（ｂ）工程ａ）から得られた産物を求核原子と接触させて−ＯＨまたは−ＮＨ2官能化化合物を形成することと；（ｃ）タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させることとを含み、それにより、ヌクレオチド三リン酸類似体を形成する、方法。
【０３３７】
本方法の一態様において、求核原子は、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＮＨ2、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ2、または
【化３７】
0006456816.tif 000039
【０３３８】
である。
【０３３９】
一態様において、本方法は、工程ｂ）において、工程ａ）から得られた産物を構造：
【化３８】
0006456816.tif 000040
【０３４０】
を有する化合物と、次いでＮＨ4ＯＨと接触させて、構造：
【化３９】
0006456816.tif 000041
【０３４１】
を有する化合物を形成することと、
タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと反応させることとを含み、それにより、構造：
【化４０】
0006456816.tif 000042
【０３４２】
を有するヌクレオチド三リン酸類似体を形成し、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである方法。
【０３４３】
ヌクレオチド四リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド四リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド四リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化４１】
0006456816.tif 000043
【０３４４】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させ、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることと；
（ｂ）ヌクレオチド四リン酸類似体を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物をモノリン酸基が付着しているタグと接触させることとを含む方法。
【０３４５】
ヌクレオチド四リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド四リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド四リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化４２】
0006456816.tif 000044
【０３４６】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させ、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることと；
（ｂ）ヌクレオチド四リン酸を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物をリン酸と接触させることと；
（ｃ）ヌクレオチド四リン酸を１）カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミド；２）求核原子、次いで３）ＮＨ4ＯＨと接触させて、−ＯＨまたは−ＮＨ2官能化化合物を形成することと；
（ｄ）タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｃ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと接触させることとを含み、それによって、ヌクレオチド四リン酸類似体を形成する、方法。
【０３４７】
本方法の一態様において、求核原子は、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＯＨ、Ｈ2Ｎ−Ｒ−ＮＨ2、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＯＨ、Ｒ’Ｓ−Ｒ−ＮＨ2、または
【化４３】
0006456816.tif 000045
【０３４８】
である。
【０３４９】
一態様において、本方法は、工程ｂ）において、ヌクレオチド四リン酸を１）カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと；
２）構造：
【化４４】
0006456816.tif 000046
【０３５０】
を有する化合物と、次いで３）ＮＨ4ＯＨと接触させて、構造：
【化４５】
0006456816.tif 000047
【０３５１】
を有する化合物を形成することと、
タグが末端リン酸に間接的に結合できる条件下で、工程ｂ）の産物を−ＣＯＲ基が付着しているタグと接触させることとを含み、それにより、構造：
【化４６】
0006456816.tif 000048
【０３５２】
を有するヌクレオチド三リン酸類似体を形成し、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることとを含む。
【０３５３】
ヌクレオチド四リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド四リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド四リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化４７】
0006456816.tif 000049
【０３５４】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させることと；
（ｂ）ヌクレオチド四リン酸を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物をリン酸と接触させることと；
（ｃ）ヌクレオチド四リン酸をカルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドおよびヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、構造：
【化４８】
0006456816.tif 000050
【０３５５】
を有する化合物を形成することとを含み、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである方法。
【０３５６】
ヌクレオチド五リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド五リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド五リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化４９】
0006456816.tif 000051
【０３５７】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させ、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることと；
（ｂ）ヌクレオチド五リン酸類似体を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物をピロリン酸基が付着しているタグと接触させることとを含む方法。
【０３５８】
ヌクレオチド五リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド五リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド五リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化５０】
0006456816.tif 000052
【０３５９】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させ、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることと；
（ｂ）ヌクレオチド五リン酸を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物をピロリン酸基と接触させることと；
（ｃ）ヌクレオチド五リン酸をカルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドおよびヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、ヌクレオチド五リン酸類似体を形成することとを含む方法。
【０３６０】
ヌクレオチド六リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド六リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド六リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化５１】
0006456816.tif 000053
【０３６１】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させ、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることと；
（ｂ）ヌクレオチド六リン酸類似体を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物を三リン酸基が付着しているタグと接触させることとを含む方法。
【０３６２】
ヌクレオチド六リン酸類似体を産生する方法であって、ヌクレオチド六リン酸類似体は、その末端リン酸に付着しているタグを有することによりヌクレオチド六リン酸と異なり：
（ａ）構造：
【化５２】
0006456816.tif 000054
【０３６３】
を形成できる条件下で、ヌクレオチド三リン酸を１，１’−カルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドと接触させ、
Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであることと；
（ｂ）ヌクレオチド六リン酸を形成できる条件下で、工程ａ）から得られた産物を三リン酸基と接触させることと；
（ｃ）ヌクレオチド六リン酸をカルボニルジイミダゾール／ジメチルホルムアミドおよびヒドロキシルまたはアミノ基が付着しているタグと接触させて、ヌクレオチド六リン酸類似体を形成することとを含む方法。
【０３６４】
構造：
【化５３】
0006456816.tif 000055
【０３６５】
を有する化合物であって、
タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、色素、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチドまたはヘキサヌクレオチドであり、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであり、ｎが１、２、３または４である化合物。
【０３６６】
一態様において、Ｒ2はＨである。一態様において、Ｒ2はＯＨである。
【０３６７】
ある場合には、タグは、分子（ｄＣｐ）ｍ、（ｄＧｐ）ｍ、（ｄＡｐ）ｍおよび（ｄＴｐ）ｍから選ばれる。図２７（ａ）は、ヌクレオチドに付着しているこれら分子のいくつかの例を示す。例えば、構造：
【化５４−１】
0006456816.tif 000056
【化５４−２】
0006456816.tif 000057
【０３６８】
を有する化合物であって、
各構造においてｎはそれぞれ独立に、１、２、３、または４であり、ｍはそれぞれ独立に、０〜１００の整数であり、ｍが０であるとき、ｄＮＴＰの末端リン酸は、構造の左側に示されるヌクレオシドの３’Ｏ原子に直接結合されており、Ｒ1は−ＯＨまたは−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3であり、Ｒ2はＨまたはＯＨである化合物。場合によっては、ｎの値は、各種類の塩基で異なる。
【０３６９】
一態様において、ｍは０〜５０である。一態様において、ｍは０〜１０である。一態様において、Ｒ1は−ＯＨである。一態様において、Ｒ2は−Ｈである。一態様において、Ｒ2は−ＯＨである。
【０３７０】
構造：
【化５５】
0006456816.tif 000058
【０３７１】
を有する化合物であって、
ｍが０〜１００の整数であり、化合物が１種類の塩基を含み、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルもしくはチミンまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体である化合物。
【０３７２】
一態様において、ｍは０〜５０である。一態様において、ｍは０〜１０である。
【０３７３】
一態様において、化合物は、構造：
【化５６】
0006456816.tif 000059
【０３７４】
を有し、
ただし、ｍは０〜１００の整数である。
【０３７５】
構造：
【化５７】
0006456816.tif 000060
【０３７６】
を有する化合物であって、
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである化合物。
【０３７７】
構造：
【化５８】
0006456816.tif 000061
【０３７８】
を有する化合物であって、
塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであり、Ｒが置換されているまたは無置換のヒドロカルビルであり、３０００ダルトンまでである化合物。
【０３７９】
構造：
【化５９】
0006456816.tif 000062
【０３８０】
を有する化合物。
【０３８１】
構造：
【化６０】
0006456816.tif 000063
【０３８２】
を有する化合物であって、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンであり、ｍが１〜５０の整数である化合物。
【０３８３】
構造：
【化６１】
0006456816.tif 000064
【０３８４】
を有する化合物であって、
ｎが１または２であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである化合物。
【０３８５】
構造：
【化６２】
0006456816.tif 000065
【０３８６】
を有する化合物であって、
Ｒ1が−ＯＨまたは−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3であり、Ｒ2がＨまたはＯＨである化合物。
【０３８７】
一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
（ａ）ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対してｒＮＰＰ類似体が相補的である場合に、ＲＮＡポリメラーゼがプライマーへのｒＮＰＰ類似体のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＲＮＡ中のＡ、Ｕ、ＧまたはＣヌクレオチドの各々とそのうちの少なくとも１つがハイブリダイズできる４つのリボヌクレオチドポリリン酸（ｒＮＰＰ）類似体と接触させ、４つのｒＮＰＰ類似体の各々は構造：
【化６３】
0006456816.tif 000066
【０３８８】
を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンもしくはウラシル、またはこれら塩基のうちの１つ以上の誘導体であり、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＯＨであり、ＸはＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ｎは１、２、３または４であり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ただし、（ｉ）各ｒＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他の３つのｒＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各ｒＮＰＰ類似体のｎの値が他の３つのｒＮＰＰ類似体の各々のｎの値と異なるか、または４つのｒＮＰＰ類似体の各々のｎの値が同じであり、各ｒＮＰＰ類似体にあるタグの種類が他の３つのｒＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、ｒＮＰＰ類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）膜を越えて電圧を印加し、工程（ａ）において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどのｒＮＰＰ類似体がプライマーに組み込まれてＲＮＡ伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、ｎの各値に対して、またはタグの各異なる種類に対して異なり、それによって、組み込まれたｒＮＰＰ類似体に相補的な一本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド残基を同定できることと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施し、工程（ｂ）の各反復において、工程（ａ）においてどのｒＮＰＰ類似体がＲＮＡ伸長産物に組み込まれたかを同定し、ｒＮＰＰ類似体が、ＲＮＡ伸長産物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側に位置することと
を含み、それによって、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０３８９】
一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって：
（ａ）ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対してｒＮＰＰ類似体が相補的である場合に、ＲＮＡポリメラーゼがプライマーへのｒＮＰＰ類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＲＮＡ中のＡ、Ｕ、ＧまたはＣヌクレオチドとハイブリダイズできるリボヌクレオチドポリリン酸（ｒＮＰＰ）類似体と接触させ、ｒＮＰＰ類似体は構造：
【化６４】
0006456816.tif 000067
【０３９０】
を有し、
塩基はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、またはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、Ｒ1は−ＯＨ、−Ｏ−ＣＨ2Ｎ3または−Ｏ−２−ニトロベンジルであり、Ｒ2は−ＯＨであり、ＸはＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ｎは１、２、３または４であり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｒＮＰＰ類似体が組み込まれない場合は、ｒＮＰＰ類似体が組み込まれるまで、異なるｒＮＰＰ類似体との接触を反復して繰り返し、ただし（ｉ）各ｒＮＰＰ類似体にある塩基の種類は、他のｒＮＰＰ類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各ｒＮＰＰ類似体のｎの値が他のｒＮＰＰ類似体の各々のｎの値と異なるか、またはｒＮＰＰ類似体の各々のｎの値が同じであり、各ｒＮＰＰ類似体にあるタグの種類が３つのｒＮＰＰ類似体の各々にあるタグの種類と異なるかのいずれかであり、ｒＮＰＰ類似体の組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離することと；
（ｂ）膜を越えて電圧を印加し、工程（ａ）において生成したタグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を通り抜けて移行することによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどのｒＮＰＰ類似体がプライマーに組み込まれてＲＮＡ伸長産物を形成したかを同定し、電子的変化が、適用可能であるものはどれでも、ｎの各値に対して異なる、またはタグの各種類に対して異なり、それによって、組み込まれたｒＮＰＰ類似体に相補的な一本鎖ＲＮＡ中のヌクレオチド残基を同定できることと；
（ｃ）配列決定される一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し実施し、ＲＮＡ伸長産物の３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して、そのｒＮＰＰ類似体が相補的である場合に、工程（ａ）の各反復において、ｒＮＰＰ類似体がＲＮＡ伸長産物に組み込まれることと
を含み、それによって、一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する、方法。
【０３９１】
一態様において、ｄＮＰＰ類似体は、構造：
【化６５】
0006456816.tif 000068
【０３９２】
を有し、
ｎが１または２であり、塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、７−デアザプリンまたは５−メチルピリミジンである。
【０３９３】
一態様において、生物学的ナノ細孔は、ＣＭＯＳ電子回路と一体化している。別の態様において、固体ナノ細孔は、ＣＭＯＳ電子回路と一体化している。
【０３９４】
一態様において、固形表面への付着は、ビオチン−ストレプトアビジン結合による。別の態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ基で官能化されているアルカンチオール自己組織化単分子層で修飾された金表面を介して固形表面に付着され、アミノ基は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ基への付着のために、ＮＨＳエステルに修飾されている。
【０３９５】
一態様において、ｄＮＰＰ類似体は、末端がリン酸のタグ付けされたヌクレオシドポリリン酸である。さらなる態様において、各種類のｄＮＰＰ類似体は、ポリエチレングリコールタグを有し、そのタグは、他の３種類のｄＮＰＰ類似体各々のポリエチレングリコールタグとサイズが異なる。
【０３９６】
場合によっては、タグはポリマーである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ポリマーの例である。一態様において、タグは、構造：
【化６６】
0006456816.tif 000069
【０３９７】
を有し、
ただし、Ｗは０〜１００の整数である。任意の数のエチレングリコール単位（Ｗ）が使用されてもよい。ある場合には、Ｗは０〜１００の整数である。場合によっては、エチレングリコール単位の数は、各種類のヌクレオチドで異なる。一態様において、４種類のヌクレオチドは、１６、２０、２４、または３６個のエチレングリコール単位を有するタグを含む。場合によっては、タグは、追加の識別可能な部分、例えばクマリン性色素をさらに含む。
【０３９８】
場合によっては、タグは、複数のＰＥＧ鎖を含む。そのようなタグの例は、構造：
【化６７】
0006456816.tif 000070
【０３９９】
を有し、ＲはＮＨ2、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＣＨＯ、ＳＨまたはＮ3であり、Ｗは０〜１００の整数である。
【０４００】
少なくとも４つのデオキシヌクレオチドポリリン酸（ｄＮＰＰ）類似体を含む組成物であって、各々が請求項７４および７５に規定される構造から選択される構造を有し、４つのｄＮＰＰ類似体の各々が、他の３つのｄＮＰＰ類似体の塩基の種類と異なる塩基の種類を含む組成物。
【０４０１】
一態様において、４つのｄＮＰＰ類似体の各々は、ポリエチレングリコールタグを有し、そのタグは、他の３つのｄＮＰＰ類似体各々のポリエチレングリコールタグとサイズが異なる。
【０４０２】
一態様において、タグ付けされたヌクレオシドポリリン酸の正味電荷は、中性である。別の態様において、遊離したタグは正電荷を有する。
【０４０３】
一態様において、工程ｂ）の後にアルカリホスファターゼで処理する工程をさらに含む方法であって、アルカリホスファターゼが、遊離したタグ−ピロリン酸の遊離リン酸基を加水分解する方法。
【０４０４】
一態様において、一本鎖ＤＮＡの複数のコピーは、ビーズに固定化されている。
【０４０５】
同じ一本鎖ＤＮＡ分子の複数のコピーのヌクレオチド配列を決定するための図５１に示す方法であって：
（ａ）プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした配列決定される一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の配列決定されるＤＮＡのヌクレオチド残基に対してデオキシリボヌクレオチド類似体が相補的である場合に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの伸長産物の末端に類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼと、続けて配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドとハイブリダイズできる４つのタグ付けされたデオキシリボヌクレオチド類似体の各々で処理し、類似体が組み込まれない場合は、類似体が組み込まれるまで、異なる類似体との接触を反復して繰り返し、ただし（ｉ）各類似体にある塩基の種類は、他の類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各類似体にあるタグの種類は、他の類似体の各々にあるタグの種類と異なり、類似体の組み込みによりタグが遊離することと；
（ｂ）膜を越えて電圧を印加し、類似体に付着しているタグによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）において伸長産物に組み込まれた類似体を同定することと；
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を得る、方法。
【０４０６】
同じ一本鎖ＤＮＡ分子の複数のコピーのヌクレオチド配列を決定するための図５２に示す方法であって：
（ａ）プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした配列決定される一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の配列決定されるＤＮＡのヌクレオチド残基に対してデオキシリボヌクレオチド類似体が相補的である場合に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの伸長産物の末端に類似体の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、膜中のナノ細孔と接触して電解質溶液中にあり、その部分にハイブリダイズしたプライマーを有する一本鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼおよび配列決定されるＤＮＡ中のＡ、Ｔ、ＧまたはＣヌクレオチドの各々とそのうち少なくとも１つがハイブリダイズできる４つの３’遮断デオキシリボヌクレオチド類似体で処理し、各類似体が、可逆性ターミネーターを含み、ただし、（ｉ）各類似体にある塩基の種類は、他の３つの類似体の各々にある塩基の種類と異なり、（ｉｉ）各類似体にあるタグが、他の３つの類似体の各々にあるタグと異なり、類似体の組み込みによりタグが遊離することと；
（ｂ）膜を越えて電圧を印加し、類似体に付着しているタグによりもたらされるナノ細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）において伸長産物に組み込まれた類似体を同定することと；
（ｃ）工程（ａ）において伸長産物に組み込まれた類似体から可逆性ターミネーターを除去することと；
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返し実施することと
を含み、それによって、一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を得る、方法。
【０４０７】
一態様において、図４６に示すように、ナノ細孔は、ＣＭＯＳダイに直接一体化している。
【０４０８】
ナノ細孔は、負電荷を有する、またはそれとは別にタグもしくはタグが付着しているポリリン酸の電荷に対して反対の符号の電荷を有することが考えられる。
【０４０９】
一態様において、ポリメラーゼによるヌクレオチド類似体の組み込み速度は、ナノ細孔を通り抜けるタグまたはタグが付着しているポリリン酸の移行速度より小さいか、あるいは同じである。
【０４１０】
本発明は、ステップ（ａ）の前に、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡから、配列決定すべき一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを得ることをさらに含む。
【０４１１】
一態様において、ポリメラーゼは、ナノ細孔に付着している。
【０４１２】
タグは、サイズ、長さ、形状、質量、電荷、またはその任意の組合せに基づいて検出可能とすることが考えられる。
【０４１３】
伝導性測定システムの様々な態様も、ヌクレオチド配列を決定する方法に適用可能であり、逆の場合も同様に考えられる。
【０４１４】
本発明は、本出願の図および／または略図に規定されている化合物のいずれかの構造を有する化合物も提供する。
【０４１５】
本発明は、本出願の図および／または略図に規定されているタグのいずれかの構造を有するタグを含むｄＮＰＰ類似体も提供する。
【０４１６】
一態様において、タグは、ヒドロカルビル、置換されているまたは無置換の、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニルであり、３０００ダルトン以下の質量を有する。
【０４１７】
一態様において、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、１，３−両性アジド−アルキン付加環化化学反応により固形基板に結合される。一態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、ポリエチレングリコール分子を介して固形基板に結合される。一態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、アルキン標識される。一態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、ポリエチレングリコール分子を介して固形基板に結合され、固形基板は、アジド官能化される。一態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、アジド結合、アルキニル結合、またはビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固形基板に固定化される。核酸の固定化については、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｎ  Ｃｈｉｐｓ  ＩＩ、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｗｉｔｔｍａｎｎ（２００５）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎに記載されており、参照によりここに組み込む。一態様において、ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡである。一態様において、ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡである。
【０４１８】
一態様において、固形基板は、チップ、ビーズ、ウェル、毛細管、スライド、ウェーハ、フィルタ、繊維、多孔質媒体、多孔性ナノチューブまたはカラムの形態である。この発明は、固形基板が、金属、金、銀、石英、シリカ、プラスチック、ポリプロピレン、ガラスまたはダイヤモンドである本方法も提供する。この発明は、固形基板が、金属もしくは金属の組合せが付着したまたは含浸した多孔性非金属物質である本方法も提供する。固形表面は、チップ、ビーズ、チューブ、マトリックス、ナノチューブの非限定的な例を含めた異なる形態であってもよい。固形表面は、ガラスまたはナイロンの非限定的な例を含めたＤＮＡマイクロアレイ用の一般的な材料から作られてもよい。固形表面、例えばビーズ／マイクロビーズは別の固形表面、例えばチップに固定化されてもよい。
【０４１９】
一態様において、核酸サンプル、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、別々の区画、ウェルまたは表面上もしくは容器中の凹部に分離されている。
【０４２０】
この発明は、約１０００またはそれより少ないコピーの核酸サンプル、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブが、固形表面に結合している本方法も提供する。この発明は、２ｘ１０7、１ｘ１０7、１ｘ１０6または１ｘ１０4またはそれより少ないコピーの核酸サンプル、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブが固形表面に結合している本発明も提供する。
【０４２１】
一態様において、固定化されている核酸サンプル、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブは、高密度で固定化されている。この発明は、１ｘ１０7、１ｘ１０8、１ｘ１０9コピーを超えるまたはそれまでの核酸サンプル、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プライマーまたはプローブが、固形基板に結合している本発明も提供する。
【０４２２】
一態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼまたはそのバリアント、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたは９°Ｎポリメラーゼ（ｅｘｏ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９Ｖである。
【０４２３】
本方法またはここで記載される組成物の一態様において、ＤＮＡは、一本鎖である。本方法またはここで記載される組成物の一態様において、ＲＮＡは、一本鎖、Ｐｈｉ２９またはそのバリアントである。
【０４２４】
ＲＮＡ配列決定について記載される本方法の一態様において、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素またはＲＮＡ重合に適したポリメラーゼである。
【０４２５】
リンカーは、光切断可能であってもよい。一態様において、紫外線を使用して、光化学的に切断可能なリンカーおよび部分を光化学的に切断する。一態様において、光切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分である。
【０４２６】
−ＣＨ2Ｎ3基をＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理して、ｄＮＰＰ類似体またはｒＮＰＰ類似体の３’Ｏ原子からそれを除去し、それによって、３’ＯＨ基を生じることができる。
【０４２７】
タグは、任意の様式で遊離してもよい。場合によっては、タグは、ポリリン酸に付着しており（例えば、図３４）、核酸分子へのヌクレオチドの組み込みによりタグが付着しているポリリン酸が遊離する。組み込みは、任意でナノ細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼによって触媒されてもよい。ある場合には、少なくとも１つのホスファターゼ酵素も、細孔に付着している。ホスファターゼ酵素は、ポリリン酸からタグを切断してタグを遊離してもよい。場合によっては、ホスファターゼ酵素は、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼによって生じたピロリン酸が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するように位置している。
【０４２８】
場合によっては、タグは、ポリリン酸に付着していない（例えば、図３４を参照のこと）。これらの場合、タグは、切断可能なリンカー（Ｘ）によって付着する。切断可能にキャップされたおよび／または切断可能に連結されたヌクレオチド類似体の産生方法については、米国特許第６，６６４，０７９号に開示されており、参照によりここに組み込む。
【０４２９】
リンカーは、任意の適切なリンカーであり、任意の適切な様式で切断されてもよい。例えば、リンカーは、光切断可能であってもよい。一態様において、ＤＮＡに損傷を与えない光を使用して、光化学的に切断可能なリンカーおよび部分を光化学的に切断する。一態様において、光切断可能なリンカーは、２−ニトロベンジル部分である。別の態様において、−ＣＨ2Ｎ3基をＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で処理して、ｄＮＰＰ類似体またはｒＮＰＰ類似体の３’Ｏ原子からそれを除去し、それによって、３’ＯＨ基を生じてもよい。
【０４３０】
「ヌクレオチド残基」は、ポリヌクレオチドに組み込まれ、それによってそのモノマーになった後に存在する状態の単一のヌクレオチドである。したがって、ヌクレオチド残基は、ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡのヌクレオチドモノマーであり、そのモノマーは、その糖の３’位におけるリン酸ジエステル結合によってポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドモノマーと結合し、そのリン酸基を介して第２の隣接するヌクレオチドモノマーに結合するが、例外として、（ｉ）３’末端ヌクレオチド残基は、そのリン酸基由来のリン酸ジエステル結合によってポリヌクレオチドの隣接する１つのヌクレオチドモノマーとだけ結合し、（ｉｉ）５’末端ヌクレオチド残基は、その糖の３’位由来のリン酸ジエステル結合によってポリヌクレオチドの隣接する１つのヌクレオチドモノマーとだけ結合する。
【０４３１】
よく理解されている塩基対合則に則り、ナノ細孔を通り抜けて移行するタグの固有の電気信号を測定することによって、プライマーまたはＤＮＡ伸長産物（またはＲＮＡ伸長産物）に組み込まれるｄＮＰＰ類似体（またはｒＮＰＰ類似体）の（塩基の）アイデンティティを決定し、それによって、組み込まれたｄＮＰＰ類似体（またはｒＮＰＰ類似体）のアイデンティティから、プライマーまたはＤＮＡ伸長産物（またはＲＮＡ伸長産物）がハイブリダイズする一本鎖ポリヌクレオチド中の相補的ヌクレオチド残基を同定できる。したがって、組み込まれたｄＮＰＰ類似体が、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンを含む場合、そのとき、一本鎖ＤＮＡ中の相補的ヌクレオチド残基は、チミン、アデニン、グアニンまたはシトシンとしてそれぞれ同定される。プリンアデニン（Ａ）は、ピリミジンチミン（Ｔ）と対になる。ピリミジンシトシン（Ｃ）は、プリングアニン（Ｇ）と対になる。同様に、ＲＮＡに関連しては、組み込まれたｒＮＰＰ類似体が、アデニン、ウラシル、シトシンまたはグアニンを含む場合、そのとき、一本鎖ＲＮＡ中の相補的ヌクレオチド残基は、ウラシル、アデニン、グアニンまたはシトシンとしてそれぞれ同定される。
【０４３２】
ｄＮＰＰもしくはｒＮＰＰ類似体のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えばプライマーまたはＤＮＡ伸長鎖）への組み込みはそれぞれ、ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド残基の３’炭素原子とｄＮＰＰ類似体もしくはｒＮＰＰ類似体の５’炭素原子との間のリン酸ジエステル結合の形成を意味する。
【０４３３】
ここでは、特に明記しない限り、参照した分子、例えば別のヌクレオチドポリリン酸類似体の塩基の種類と異なる塩基（例えば、ヌクレオチドポリリン酸類似体）とは、その塩基が他の／参照の塩基（単数）または塩基（複数）と異なる化学構造を有することを意味している。例えば、アデニンと異なる塩基は、グアニンである塩基、ウラシルである塩基、シトシンである塩基およびチミンである塩基を含むことができる。例えば、アデニン、チミンおよびシトシンと異なる塩基は、グアニンである塩基およびウラシルである塩基を含むことができる。
【０４３４】
ここでは、特に明記しない限り、参照した分子、例えば、別のヌクレオチドポリリン酸類似体のタグの種類と異なるタグ（例えば、ヌクレオチドポリリン酸類似体）とは、そのタグが他の／参照のタグ（単数）またはタグ（複数）の化学構造と異なる化学構造を有することを意味している。
【０４３５】
タグは、ヌクレオチドから遊離した後、ナノ細孔を通り抜けて流れてもよい。ある場合には、電圧を印加して、ナノ細孔を通り抜けてタグを引き寄せる。遊離したタグの少なくとも約８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９または少なくとも９９．９９％は、ナノ細孔を通って移行してもよい。
【０４３６】
本方法のある場合において、ポリメラーゼは、複数の異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔおよび／またはＵ）を含むタグ付けされたヌクレオチドのプールから集める。ポリメラーゼを、様々な種類のタグ付けされた塩基と反復して接触させることも可能である。この場合、各種類のヌクレオチドが固有の塩基を有する必要はなくてもよいが、異なる種類の塩基間の循環により、場合によっては本方法に経費および複雑さが追加される、それでもなお、この態様を本発明に包含する。
【０４３７】
図９は、核酸分子へのタグ付けされたヌクレオチドの組み込み（例えば、ポリメラーゼを使用して、鋳型と対になったプライマー塩基を伸長する）が、検出可能なＴＡＧ−ポリリン酸を遊離することを示している。場合によっては、ＴＡＧ−ポリリン酸は、ナノ細孔を通り抜けるときに検出される。ポリリン酸を含むリン酸の数に基づいて（例えば、ＴＡＧが同一の場合でも）ヌクレオチドを区別することさえも可能になる。それでもなお、各種類のヌクレオチドは、一般に固有のタグを有する。
【０４３８】
図２８を参照すると、タグをナノ細孔に通し、イオン電流を測定する前に、ＴＡＧ−ポリリン酸化合物をホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）で処理してもよい。
【０４３９】
タグは、その電荷により、ナノ細孔において（少なくとも一部は）検出されてもよい。ある場合には、タグ化合物は、第１の正味電荷、および化学的、物理的または生物学的反応の後に異なる第２の正味電荷を有する、選択的に帯電している化合物である。いくつかの実例において、タグの電荷の大きさは、化合物の残りの電荷の大きさと同じである。一態様において、タグは正電荷を有し、タグの除去により、化合物の電荷は変化する。
【０４４０】
場合によっては、タグがナノ細孔を通り抜ける際に、電子的変化が生成することがある。場合によっては、電子的変化は、電流振幅の変化、ナノ細孔の伝導性の変化、またはその任意の組合せである。
【０４４１】
「ナノ細孔」とは、ここでは、障壁／膜に形成されるさもなければ備えられる細孔、チャネルまたは通路のことを一般に指す。「ナノ細孔」は、例えば、（ａ）例えば約１〜１０ｎｍの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の区画と、（ｂ）障壁を越えて電界を印加し、それにより、帯電分子、例えば、ＤＮＡ、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体またはタグが、第１の区画から第２の区画へと細孔を通り抜けることができる手段とを含む構造を含む。ナノ細孔は、障壁を通り抜ける分子の電子シグニチャーを測定する手段を理想的にはさらに含む。ナノ細孔障壁は、合成によるものでも一部天然に存在するものでもよい。障壁／膜は、有機膜、例えば、脂質二重層、または合成膜、例えばポリマー材料の形状をなす膜でもよい。障壁は、α溶血素、オリゴマータンパク質チャネル、例えばポーリン、および合成ペプチドなどをその中に有する、例えば脂質二重層を含むことができる。障壁は、適切なサイズの穴を１つ以上有する無機の板を含むこともできる。ナノ細孔は、検知回路、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路に隣接してまたは近接して配置されてもよい。ナノ細孔は、およそ０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍの特徴的な幅または直径を有してもよい。ナノ細孔は、生物学的なものまたは合成によるものであってもよい。細孔はタンパク質性であり、α溶血素はタンパク質ナノ細孔の一例であるとも考えられる。合成ナノ細孔の一例は、固体細孔またはグラフェンである。ここで、ナノ細孔障壁における「ナノ細孔」、「ナノ細孔障壁」および「細孔」は、時に同等に使用される。
【０４４２】
場合によっては、ポリメラーゼ酵素および／またはホスファターゼ酵素は、ナノ細孔に付着している。融合タンパク質またはジスルフィド架橋は、タンパク質性ナノ細孔に付着させる方法の例である。固形ナノ細孔の場合、ナノ細孔近くの表面への付着は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介していてもよい。一例において、ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ基で官能化されているアルカンチオール自己組織化単分子層で修飾された金表面を介して固形表面に付着され、アミノ基は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ基への付着のために、ＮＨＳエステルに修飾されている。
【０４４３】
ナノ細孔を使用して核酸を配列決定する方法、デバイスおよびシステムについて、ここで記載する。本方法は、個々のヌクレオチド組み込み事象、例えば、鋳型に相補的な成長鎖へのヌクレオチドの組み込みによる、を正確に検出することができる。酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、成長ポリヌクレオチド鎖にヌクレオチドを組み込むことができ、付加されたヌクレオチドは、対応する鋳型核酸鎖に相補的であり、鋳型核酸鎖は、成長鎖にハイブリダイズされている（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））。これらのヌクレオチド組み込み事象は、ヌクレオチドからタグを遊離し、そのタグがナノ細孔を通り抜け、検出される。各種類のヌクレオチド（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）から固有のタグが遊離するので、このようにして、組み込まれた塩基を同定することができる（すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）。
【０４４４】
ヌクレオチド組み込み事象は、リアルタイムに（すなわち、それが起こると同時に）ナノ細孔を用いて検出されてもよい。ある場合には、ナノ細孔に付着しているまたは近接している酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、ナノ細孔を通り抜ける核酸分子の流れを促進してもよい。ヌクレオチド組み込み事象または複数のヌクレオチドの組み込みは、１つ以上のタグ分子（ここでは「タグ」とも言う）を遊離してもよく、そのタグは、タグがナノ細孔を通り抜けるときにナノ細孔により検出されてもよい。場合によっては、ナノ細孔に付着しているまたは近接している酵素は、１つ以上のヌクレオチドが組み込まれると遊離するタグまたは他の副産物を検出するのに役立つ可能性がある。
【０４４５】
ここに記載される方法は、単一分子法でもよい。すなわち、検出される信号は、単一分子（すなわち、単一のヌクレオチド組み込み）によって生成され、複数のクローン分子から生成されるのではない。本方法は、ＤＮＡ増幅を必要としなくてもよい。
【０４４６】
ヌクレオチド組み込み事象は、複数のヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ、Ｎは、アデノシン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアノシン（Ｇ）またはウリジン（Ｕ）である）を含む混合物から起こってもよい。ヌクレオチド組み込み事象は、１種類のヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ）を含む溶液から起こるとは限らない。ヌクレオチド組み込み事象は、複数のヌクレオチドの溶液を交互に換えることにより起こる（例えば、ｄＡＴＰ、続いてｄＣＴＰ、続いてｄＧＴＰ、続いてｄＴＴＰ、続いてｄＡＴＰ）とは限らない。
【０４４７】
本開示のナノ細孔デバイスおよびシステムは、他のナノ細孔デバイス、例えば、その各々を参照により全体的にここに組み込む、米国特許第７，００５，２６４号Ｂ２；第７，８４６，７３８号；第６，６１７，１１３号；第６，７４６，５９４号；第６，６７３，６１５号；第６，６２７，０６７号；第６，４６４，８４２号；第６，３６２，００２号；第６，２６７，８７２号；第６，０１５，７１４号；第５，７９５，７８２号；ならびに米国特許出願第２００４／０１２１５２５号、第２００３／０１０４４２８号および第２００３／０１０４４２８号に記載されているものと組み合わせてもそれにより修飾されてもよい。
【０４４８】
ここで開示される分子および方法の一態様において、タグは、切断可能な化学的リンカーによって分子の残りに付着している。
【０４４９】
一態様において、ナノ細孔は固体膜中にある。一態様において、膜は窒化ケイ素膜である。一態様において、ナノ細孔は生体細孔である。一態様において、細孔はタンパク質性である。一態様において、細孔はα溶血素細孔である。一態様において、細孔はグラフェン細孔である。
【０４５０】
一態様において、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは一本鎖の核酸は、ナノ細孔が位置する膜の片側に位置し、膜は、導通している電解質溶液中に位置する。
【０４５１】
値の範囲が規定される場合、文脈に別段の明確な指図がない限り、各整数値の間、および各整数値の間の各１０分の１、文脈に別段の明確な指図がない限り、その範囲の上限と下限の間、ならびに他の任意の明記されたまたは明記された範囲の間の値が、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、より小さい範囲にそれぞれ独立に含まれてもよく、また、本発明に包含され、明記した範囲内にある具体的に除外された任意の制限に従う。明記した範囲が、制限の一方または両側を含む場合、それらの含まれる制限のうち（ｉ）いずれかまたは（ｉｉ）両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【０４５２】
ここで記載される様々な要素の全ての組合せは、本発明の範囲内である。ここで記載される様々な要素の全ての小結合も、本発明の範囲内である。
【０４５３】
核酸の配列決定方法は、配列決定しようとする核酸を有する生体サンプルを回収することと、生体サンプルから核酸サンプルを抽出するまたは別の方法で単離することと、場合によっては、配列決定用の核酸サンプルを調製することとを含んでもよい。
【０４５４】
ナノ細孔を用いて核酸分子を配列決定するシステムおよび方法を、ここで提供する。ナノ細孔は、検知回路、例えば、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）に隣接して配置された膜の中に形成されてもまたはそうでない場合、埋め込まれていてもよい。場合によっては、核酸またはタグがナノ細孔の中を通り抜けるときに、検知回路は核酸またはタグと関連した電気信号を検出する。核酸は、より大きな鎖のサブユニットであってもよい。タグは、ヌクレオチド組み込み事象またはタグ付けされた核酸とナノ細孔もしくはナノ細孔に隣接した種、例えば核酸からタグを切断する酵素、との間の他の相互作用の副産物であってもよい。
【０４５５】
ヌクレオチド組み込み事象の副産物は、ナノ細孔によって検出されてもよい。「ヌクレオチド組み込み事象」とは、成長ポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの組み込みのことである。副産物は、所与の種類のヌクレオチドの組み込みと相関していてもよい。ヌクレオチド組み込み事象は、酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼによって一般に触媒され、鋳型分子との塩基対相互作用を使用して、各位置での組み込みに利用可能なヌクレオチドの中から選ぶ。
【０４５６】
場合によっては、ＤＮＡポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼまたはそのバリアント、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、シーケナーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎポリメラーゼ（ｅｘｏ−）Ａ４８５Ｌ／Ｙ４０９ＶまたはＰｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（φ２９ＤＮＡポリメラーゼ）である。
【０４５７】
核酸サンプルは、タグ付けされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を使用して配列決定されてもよい。いくつかの例において、核酸分子を配列決定する方法は、（ａ）タグ付けされたヌクレオチドを重合させ、個々のヌクレオチドと関連付けられたタグが、重合すると遊離することと、（ｂ）ナノ細孔を用いて、遊離したタグを検出することとを含む。
【０４５８】
ヌクレオチド組み込み事象の速度は、ヌクレオチド組み込み事象の間に遊離したタグ分子がナノ細孔を通り抜けおよび／またはそれによって検出される速度より一般に遅い（または同じである）。一般に、ヌクレオチド組み込み事象の速度は、ヌクレオチド組み込み事象の間に遊離したタグ分子がナノ細孔を通り抜けおよび／またはそれによって検出される速度を超えない（すなわち、そうでない場合、ヌクレオチド組み込み事象は、正確におよび／または正しい配列で検出されない）。
【０４５９】
場合によっては、単一のタグが、単一のヌクレオチドが組み込まれると遊離し、ナノ細孔により検出される。他の場合では、複数のタグが、複数のヌクレオチドが組み込まれると遊離する。ナノ細孔に隣接したナノ細孔センサが、個々の遊離したタグ、または複数の遊離したタグを検出してもよい。複数の遊離したタグと関連付けられた１つ以上の信号を検出し、処理して、平均信号を得てもよい。
【０４６０】
ここで提供される方法は、個々のヌクレオチド組み込み事象（例えば、単一分子事象）同士を正確に区別できる。本方法は、単一パスで、−すなわち、所与の核酸分子を再配列決定する必要無しに、個々のヌクレオチド組み込み事象を正確に区別できる。
【０４６１】
核酸配列を決定する方法は、約４σを超える精度で個々のヌクレオチド組み込み事象を区別することを含む。場合によっては、ヌクレオチド組み込み事象は、ナノ細孔を用いて検出される。ヌクレオチドと関連付けられたタグは、組み込まれると遊離してもよく、タグはナノ細孔を通り抜ける。異なるタグは、各種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）と関連付けられていてもおよび／またはそれから遊離してもよく、ナノ細孔を通り抜けるときに検出される。誤差には、それだけには限らないが、（ａ）タグの検出に失敗する、（ｂ）タグを誤認する、（ｃ）タグが無い場所でタグを検出する、（ｄ）誤った順番でタグを検出する（例えば、第１の順で２つのタグが遊離するが、入れ違いになって、第２の順で検出される）、（ｅ）ヌクレオチドから遊離しなかったタグが、遊離したとして検出される、またはそれらの任意の組合せがある。いくつかの態様において、個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、１００％から誤差が起こる割合（すなわち、誤差率）を差し引いたものである。
【０４６２】
個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、任意の適当なパーセンテージである。ある場合には、個々のヌクレオチド組み込み事象を区別する精度は、シグマ（σ）単位で報告される。シグマは、誤差率、例えば、欠陥のない製品のパーセンテージを報告するために経営管理および製造戦略においてときどき使用される統計的変数である。ここで、シグマ値は、以下の関係にしたがって精度と互換的に使用されてもよい：４σは９９．３８％の精度であり、５σは９９．９７７％の精度であり、６σは９９．９９９６６％の精度である。
【０４６３】
本方法は、鋳型鎖に相補的な鎖にタグ付けされたヌクレオチドを付加することによって鋳型核酸鎖を配列決定することと、ナノ細孔において、遊離したタグ分子を検出することとを含んでもよい。ここで開示される本方法は、他の配列決定方法、例えば、参照によりその全体をここに組み込む、米国特許第５，４７０，７２４号に記載されているそれらと組み合わせてもよい。
【０４６４】
この発明は、以下の実験の詳細を参照することによってよりよく理解されることになるが、この後の特許請求の範囲においてさらに十分に記載されるように、詳述した特定の実験は本発明の単なる例示であるということを当業者なら容易に認識することになる。
【０４６５】
本開示の別の側面は、（ａ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｂ）障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｃ）電界の変化を測定するための手段と；（ｄ）細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｅ）細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システムを提供する。
【０４６６】
場合によっては、細孔は約１〜１０ｎｍの直径を有する。場合によっては、ポリメラーゼおよびホスファターゼ酵素が細孔に共有結合している。場合によっては、ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が細孔に付着している。場合によっては、ポリメラーゼ反応においてポリメラーゼによって生じたポリリン酸が、細孔に入る前にホスファターゼ酵素と相互作用するようにホスファターゼ酵素は位置している。場合によっては、ホスファターゼ酵素とポリリン酸の間の相互作用の速度は、ポリリン酸を生じるポリメラーゼの速度より速いか、または同じである。
【０４６７】
場合によっては、第１および第２の区画の各々は、電荷を有する。場合によっては、細孔の内部は、負電荷を有する。場合によっては、細孔は、生物学的なものまたは合成によるものである。場合によっては、細孔はタンパク質性である。場合によっては、細孔はα溶血素タンパク質である。場合によっては、細孔は固体細孔である。場合によっては、細孔はグラフェンからなる。
【０４６８】
場合によっては、伝導性測定システムは、各々実質的に同一の特徴を有する細孔のアレイをさらに含む。場合によっては、伝導性測定システムは、異なる直径の細孔のアレイをさらに含む。場合によっては、伝導性測定システムは、細孔のアレイをさらに含み、細孔は、障壁を越えて異なる電界を印加するように構成されている。
【０４６９】
場合によっては、伝導性測定システムは、ＣＭＯＳ電子回路と一体化している。場合によっては、図４６に示すように、細孔または細孔のアレイは、ＣＭＯＳダイに直接一体化している。
【０４７０】
本開示の別の側面は、構造：
【化６８】
0006456816.tif 000071
【０４７１】
を有する化合物を提供し、タグは、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1はＯＨであり、Ｒ2はＨまたはＯＨであり、ＸはＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺはＯ、ＳまたはＢＨ3であり、塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎは１、２、３または４であり、タグは、化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する。
【０４７２】
場合によっては、タグの電荷の大きさは、化合物の残りの電荷の大きさと同じである。場合によっては、タグは、複数のエチレングリコール単位を含む。場合によっては、タグは、１６、２０、２４、または３６個のエチレングリコール単位を含む。場合によっては、タグは、追加の識別可能な部分を含む。場合によっては、追加の識別可能な部分は、クマリン性色素である。場合によっては、タグは正電荷を有する。場合によっては、タグの除去により、化合物の電荷は変化する。場合によっては、タグは、適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保っている。
【０４７３】
本開示の別の側面は、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。場合によっては、ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が細孔に付着している。場合によっては、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、どちらを適用するにしても、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを変性させることによって得られる。場合によっては、同じ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの複数のコピーが、ビーズに固定化されている。場合によっては、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列は、同じ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの複数のコピーを使用して決定される。場合によっては、本方法は、工程（ｂ）の各反復後に、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとの接触によって組み込まれていない化合物を除去する洗浄工程をさらに含む。場合によっては、本方法は、工程（ｂ）の各反復後に、タグに付着している追加の識別可能な部分のアイデンティティを決定する工程をさらに含む。場合によっては、少なくとも８５〜９９％の遊離したタグは、細孔を通り抜けて移行する。場合によっては、化合物は、可逆性ターミネーターをさらに含む。場合によっては、本方法は、工程（ｂ）の各反復後に、可逆性ターミネーターを除去する工程をさらに含む。場合によっては、可逆性ターミネーターは、生物学的手段、化学的手段、物理的な手段によって、または光照射によって除去される。場合によっては、細孔の内部は、タグまたはタグが付着しているポリリン酸の電荷に対して反対の符号の電荷を有する。場合によっては、伝導性測定システムの第１および第２の区画の各々は電荷を有する。場合によっては、第１および第２の区画の電荷の極性は反対である。場合によっては、第１および第２の区画の電荷は調節可能である。場合によっては、工程（ｂ）において細孔を通り抜けて移行するタグの速度は、タグの電荷と第１および第２の区画の電荷とに基づいて決定される。場合によっては、第１および第２の区画の各々は、工程（ａ）においてタグまたはタグが付着しているポリリン酸が遊離する速度より速いか、または同じ速度で、工程（ｂ）においてタグが細孔を通り抜けて移行するような電荷を有する。
【０４７４】
本開示の別の側面は、溶液中の化合物の少なくとも１つのパラメータを決定する方法を提供する。場合によっては、化合物は、イオン電流の減少を測定する前に、ホスファターゼで処理される。場合によっては、化合物は、第１の正味電荷、および化学的、物理的または生物学的反応の後に、異なる第２の正味電荷を有する選択的に帯電している化合物である。場合によっては、数理解析は、ＧＭＭ、閾値検出および平均化、ならびにスライディングウインドウ分析からなる群から選択される。場合によっては、少なくとも１つのパラメータは、化合物の濃度、サイズ、電荷および組成からなる群から選択される。
【０４７５】
場合によっては、本方法は、伝導性測定システムを較正する工程をさらに含む。場合によっては、精度は、４σを超える。場合によっては、精度は、５σを超える。場合によっては、精度は、６σを超える。
【０４７６】
側面は、第１および第２の電解質溶液ならびに／または第１および第２の流体を含む、方法および伝導性測定システムについて記載する。場合によっては、第１および第２の電解質溶液は同じである。場合によっては、第１の流体および第２の流体は同じである。
【０４７７】
ナノ細孔検出およびタグ
ここで開示される本発明は、ナノ細孔を使用するＤＮＡ（またはＲＮＡ、必要な変更を加える）の単一分子分析のための修飾ヌクレオチドに関する。ヌクレオチドの様々な位置、すなわち末端リン酸、塩基、および／または２’もしくは３’−ＯＨに修正を作って、ヌクレオチド類似体を形成することができる。鋳型−プライマー複合体におけるポリメラーゼ伸長反応の後に、遊離した、タグが付着しているピロリン酸はナノ細孔を通り抜け、得られた電流遮断をモニタリングして付加されたヌクレオチド塩基を決定する。修正もしくはタグが、ヌクレオチドの塩基部分、または糖部分の２’／３’−ＯＨにある場合、そのときＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼによる組み込みの後に、リンカー−タグは化学的または光化学的手段により塩基／糖から切断され、遊離したリンカー−タグがナノ細孔を通り抜けて、付加されたヌクレオチドが同定される。
【０４７８】
リンカーとして異なる数のリン酸基を持ち、ヌクレオチドの末端リン酸に付着しているタグで修飾されているヌクレオシド−５’−ポリリン酸が設計され、合成される。鋳型−プライマー伸長反応におけるＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼによる組み込みの後に、遊離した、タグが付着しているポリリン酸（二−、三−、四−、五など）を、ナノ細孔を使用して検出して、配列データを作製することができる。任意で、遊離した、タグ−ポリリン酸をアルカリホスファターゼで処理して、遊離タグを得ることもできる。各ヌクレオチド塩基に対して固有であり特異的である４つの異なるタグを使用して、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を決定することができる。
【０４７９】
修飾ヌクレオチドを合成するために異なる数のリン酸基またはタグを持つヌクレオチドが用意され、それらはポリメラーゼ反応において効率的な基質になる。遊離した、タグが付着しているポリリン酸がナノ細孔を使用して検出されて、ヌクレオチドの設計および修飾条件が決定され、それによって固有の遮断信号がもたらされる。
【０４８０】
リンカー−タグ標識された単一塩基ＤＮＡ伸長産物を生成するＤＮＡポリメラーゼ反応のために、ヌクレオチド塩基部分、および／または糖部分の２’／３’−ＯＨに付着しているリンカー−タグを持つヌクレオチドも提供される。これらのヌクレオチドは、一般的に使用されるＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼにとってよい基質である。伸長されたＤＮＡ産物に付着しているリンカー−タグは、化学的または光化学的手段で切断されて、修飾ヌクレオチドを使用するさらなる伸長の用意ができたプライマーを生成する。遊離したリンカー−タグはナノ細孔を通り抜け、タグのサイズ、形状および電荷の差異に基づいて同定されて、配列データが作製される。
【０４８１】
ここで開示するように、これらの分子ツールは、単一塩基の解像度で、ナノ細孔を使用する単一分子配列決定を促進する。
【０４８２】
ここでは、ナノ細孔手法に対するいくつかの改良：１）核酸分子を構成する４つの塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）の正確かつ明らかな識別を実現すること；２）検出信号の強度を向上させ、区別すること；３）生成した電子遮断信号を判別し処理する効率的な方法を開発すること；４）細孔を通り抜ける核酸の移行速度を制御する、例えばタグの移動を減速させて、塩基対塩基の識別能力を改善すること；５）ＤＮＡ中にある４つの異なるヌクレオチドを区別するために、新しい、より効率的な合成ナノ細孔を設計し、作ることについて開示する。
【０４８３】
４つのヌクレオチドの構造は、図２２に示される。ＡおよびＧはプリンであり、一方でＣおよびＴはピリミジンである。ＡとＧの全体としての分子サイズは極めて類似しており、一方でＣとＴのサイズは類似している。ナノ細孔は、プリンとピリミジンとを区別できる（Ａｋｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９およびＭｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）が、個々のプリン間、ＡとＧ、または個々のピリミジン間、ＣとＴを区別できないことが示された。
【０４８４】
過去の研究は、さらにリン酸基を導入して四、五、もしくは六リン酸を産生することと、末端リン酸に色素を直接導入することと、または末端リン酸と色素の間にリンカーを付着させることとを含めた、ヌクレオシド−５’−三リン酸の修飾について示した（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６および２００８）。四および五リン酸はより優れたＤＮＡポリメラーゼ基質であり、色素標識した六リン酸ヌクレオチドが開発された（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｓｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００５；Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。
【０４８５】
末端リン酸部分でのヌクレオチドの修飾により各ヌクレオチドの識別を増強するように設計されているヌクレオチド類似体について、ここで開示する。ヌクレオシド−５’−ポリリン酸は、合成のものであり、異なるタグ（例えば、異なる長さ／質量のポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、アミノ酸、炭水化物、オリゴヌクレオチド、色素または有機／無機分子）が、末端リン酸基に付着している。ポリメラーゼ伸長反応の後に、タグが付着しているポリリン酸部分が生成し（図９）、タグが付着しているポリリン酸部分がナノ細孔を通り抜けるときに、各塩基に特異的な異なる信号が生じる。これらの修飾は、遊離した、タグ付けされたポリリン酸単位のサイズ、質量または電荷の差異の増加のため、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴ）相互間のナノ細孔による塩基の識別を増大させる。
【０４８６】
タグを区別できる限りナノ細孔を通り抜けるタグの移行速度を低下させる必要はないが、ナノ細孔を通り抜けるＤＮＡ移行速度は、遊離したタグが付着しているポリリン酸の嵩のせいで低下する。したがって、塩基対塩基配列決定に必要とされる精度および信頼性が、達成可能になる。ナノ細孔配列決定における他の分析パラメータ、例えば、ポリヌクレオチドの濃度、印加電圧の大きさ、溶液の温度およびｐＨ値を最適化して、ＤＮＡ鎖の検出および分析にとって最も正確で信頼性が高い結果が得られる。
【０４８７】
配列決定の単一分子手法は、遺伝学研究用にハプロタイプを得るおよびｍＲＮＡを直接配列決定できる可能性を考慮している。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の配列を解読するための潜在的な単一分子手法の１つは、個々のＤＮＡ塩基の検出器としての生物学的なもしくは合成によるナノ細孔の使用である。
【０４８８】
既存の合成時配列決定（sequencing-by-synthesis）（ＳＢＳ）手法は、切断可能蛍光ヌクレオチド可逆的ターミネータ（ＣＦ−ＮＲＴ）を使用する（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ＳＢＳ法は、ポリメラーゼ反応において各ヌクレオチドの付加後に一時中断する能力および４つの塩基を識別するための特定の発蛍光団の使用に基づいている。しかし、単一分子配列決定に対するＳＢＳの主要な制約は、高価な蛍光検出器および高速撮像ソフトウェアが必要なことである。ここで開示する方法およびプロセスは、ＳＢＳの利点、特にその高い精度を、イオン電流インピーダンス検出器であるナノ細孔の速度および感度と共に利用する。
【０４８９】
各塩基が通り抜けるときのイオン電流に対する可変効果によってそれを識別する目的で、ＤＮＡをナノ細孔に通す多くの研究が行われたが、これは、伝送速度と、細孔を通り抜けるイオンおよび対イオンに対する塩基自身の効果に寄与し得る周囲の塩基の効果との両方により、達成することが極めて困難である（Ｔｉｍｐ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。タンパク質細孔の内腔におけるシクロデキストリンまたは他の環状構造の使用は、ラチェット機構を形成して移動時間を減速するのに役立つ（Ａｓｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００６）が、各塩基が通過する際に配列決定のためにそれを完全に認識する能力は、課題のままである。１度に１個のヌクレオチドが細孔を横断できるようになるエキソヌクレアーゼを使用する別の戦略は、単一塩基識別の糸口となった（Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。しかし、異なる長さのＤＮＡおよびヌクレオチドに対するエキソヌクレアーゼの反応時間ならびにこの手法で遊離したイオンが細孔に到達する速度を制御することは今もなお困難である。
【０４９０】
ポリメラーゼ反応自体は、塩基組み込みの高い処理能力および安定な速度を示す。実際に、ポリメラーゼ反応を使用して、ナノ細孔を通り抜けるＤＮＡ鎖の移動を制御し、それによって塩基を直接識別した（Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｃｏｃｋｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｈｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。ポリメラーゼ反応の間、ピロリン酸（ＰＰｉ）部分の遊離がある。したがって、４つのヌクレオチドの各々の三リン酸に異なるタグを付着させた場合、それらが遊離し、ＤＮＡ配列決定に適したナノ細孔を通り抜けるときに、これらを識別することができる。これらの比較的小さいピロリン酸類似体、または追加の正に帯電している基を持つ同等の分子は、極めて速やかに細孔に達することができる。ポリメラーゼによるヌクレオチド組み込みの速度は、１秒につきおよそ１０００ヌクレオチド、すなわち１塩基付加当たりミリ秒であり、一方でナノ細孔を通り抜ける輸送速度は１マイクロ秒につき１分子である。したがって、適当な流体工学および工学により、本手法を用いるＤＮＡ配列決定に対してディフェージング（de-phasing）問題は無く、ホモポリマーストレッチの解読に伴う困難も無い。ポリエチレングリコールがナノ細孔における電流の遮断に対して有する効果により、広範なサイズ範囲のうちわずか１または２炭素単位だけ異なるそれらを識別することができ（Ｒｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７）、解像度は、質量分析計で得られるそれと基本的に同等であることが示された。したがって、下記の通り、異なる長さのＰＥＧ鎖が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの末端リン酸に付着している。各ヌクレオチドはポリメラーゼ反応の間に組み込まれるので、特異的にタグ付けされたリン酸基がナノ細孔へと遊離し、固有の電流遮断信号を生じて、どのヌクレオチドが組み込まれたかを示す。配列決定の速度は極めて速く、ポリメラーゼ反応の速度によってのみ制限される。ヌクレオチドにタグを付ける代わり手法として、異なるリン酸鎖長（例えば三、四および五リン酸）も利用する。
【０４９１】
加えて、製造でのより優れた制御および融通性の面で利点が有る固体ナノ細孔も使用し、したがって、タグ付けされたポリリン酸の速やかな方向輸送が確実になるが、ナノ細孔もしくはナノチャネルに向かうおよびそれを通り抜けるヌクレオチド前駆体またはＤＮＡは輸送されない。これを達成するには、２つの重要な設計上の特徴が組み込まれる。第１に、前駆体（タグ付けされたヌクレオチドポリリン酸）を、全体として中性電荷で合成し、一方で切断されるタグ付けされたリン酸は、全体として正電荷を有する。陽イオンを引き寄せる電流を利用することにより、ナノ細孔は、選ぶべき４つの遊離したタグ付けされた分子を識別するだけでよい。前駆体および産物における差異的な電荷は、リン酸（負に帯電している）の数の均衡を厳密に保つ数のリシンまたはアルギニン（正に帯電している）をタグに組み込むことによって達成される。成長プライマーへのαリン酸の組み込み後に、リン酸より１つ多いリシンが、遊離した産物中にある。任意で、アルカリホスファターゼを使用して、全てのリン酸を切り離し、それによりさらに強力な正電荷を持つＰＥＧタグを作製することができる。第２に、遊離したリン酸が最も近い細孔を通り抜けて直ちに運動することを保証するために、ＤＮＡポリメラーゼを、例えばビオチン−ストレプトアビジン結合によって、細孔の入口に固定化する。ＤＮＡ鎖がポリメラーゼを通るとき、遊離したタグ付けされた産物は、同じ短い距離を拡散して、ナノ細孔に到達しさえすればよい。
【０４９２】
光学的手法に勝る生体電子工学変換機序の利点を認識することも重要である。単一分子の光学的変換技術の場合、単一の発蛍光団由来信号は、高く短い雑音レベルで通常２５００光子／秒（およそ５０ｆＡで検出される電流レベルに相当する）であり、放射された光子を全て収集しようとすると複雑な光学システムが必要になり、プラットフォームをより高密度に縮小することが困難なる。これらの弱く雑音が多い光信号に対して十分な積分時間を得るためには、合成反応を１Ｈｚまで遅くしなければならない。光学技術に対する難題は、生体電子工学検出手法の可能性を切り開き、その手法は著しく高い信号レベル（通常は３桁以上高い）を有し、変換器と検出器と増幅器との適切な協調設計を用いる広帯域の検出の可能性が考慮される。ナノ細孔に対する信号レベルは、α溶血素の１００ｐＡと同程度の高さ（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）、ＭｓｐＡについての３００ｐＡ（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）、および固体ナノ細孔の４ｎＡより高く（Ｗａｎｕｎｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）なり得る。
【０４９３】
生体電子工学変換機序としてナノ細孔技術を開発するために多大な労力が払われてきた（Ｂｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｄｅａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９６、Ｂｒａｎｔｏｎ  ２００８、Ｂｒａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｃｈｅｎ  ２００４、Ｇｅｒｓｈｏｗ  ｅｔ  ａｌ．２００７、Ｎｅａｌｙ  ２００７、Ｍａｔｙｓｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。この電子回路センサの２つの重要な特質により、単一分子感度が得られる。第１は、細孔自体にある電荷感度の極めて限局化（ナノスケール）した配置である。細孔の直径は２〜３ｎｍでよく、電解質電荷遮蔽があるため、測定される電流は、細孔から数ナノメートルを超える電荷供給源に対して全く感度が無い。第２に、ナノ細孔センサは、生物ポリマー高分子が可動性の高い塩イオンに近い濃度を有する比較的流れの遅い電荷の効果により利得を得る。しかし、ナノ細孔は、生体分子が細孔の電荷に影響されやすい領域で費やす時間が比較的短いことにより極めて制限されている。これはタグを使用することによって直ぐに解決され、高い信号レベルおよび長い移行事象を生じるようにそのタグを最適化することができる。同時に、これら細孔のＣＭＯＳの共一体化を利用して、ナノ細孔デバイスにおける検出のために雑音制限された帯域幅を劇的に改善する。固体と生物学的な細孔の両方が、このプラットフォームに支持される。この固体組込み、ならびに関連するマイクロ流体工学により、この設計を一体化された検出用電子回路を持つ大きなアレイに拡大することも独自に可能になる。
【０４９４】
コンピュータシステム
核酸配列決定システムおよび開示の方法は、コンピュータシステムを用いて管理されてもよい。図１８は、核酸配列決定システム１８０２に接続されたコンピュータシステム１８０１を含むシステム１８００を示す。コンピュータシステム１８０１は、１つのサーバまたは複数のサーバであってもよい。コンピュータシステム１８０１は、サンプル調製および処理ならびに配列決定システム１８０２による核酸配列決定を調節するようにプログラムされてもよい。ここでの他の場所に記載されるように、配列決定システム１８０２は、ナノ細孔型シーケンサ（または、検出器）でもよい。
【０４９５】
コンピュータシステムは、本発明の方法を実行するようにプログラムされてもよい。コンピュータシステム１８０１は、中央演算処理装置（ＣＰＵ、ここでは「プロセッサ」とも言う）１８０５を含み、そのＣＰＵは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理用の複数のプロセッサであることができる。コンピュータシステム１８０１は、メモリ１８１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１８１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信用インターフェース１８２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびに周辺デバイス１８２５、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子表示アダプタ、も含む。メモリ１８１０、記憶装置１８１５、インターフェース１８２０および周辺デバイス１８２５は、通信バス（実線）、例えばマザーボード、によってＣＰＵ１８０５と通信している。記憶装置１８１５は、データを保存するためのデータ記憶装置（または、データリポジトリ）であることができる。コンピュータシステム１８０１は、通信用インターフェース１８２０を用いて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク）に作動的に接続されてもよい。ネットワークは、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであることができる。ネットワークは１つ以上のコンピュータサーバを含むことができ、そのサーバは、分散コンピューティングを可能にすることができる。
【０４９６】
本発明の方法は、コンピュータシステム１８０１の電子格納場所、例えば、メモリ１８１０または電子記憶装置１８１５に保存されているマシン（または、コンピュータプロセッサ）実行可能なコード（または、ソフトウェア）によって実行することができる。使用中に、コードは、プロセッサ１８０５によって実行され得る。場合によっては、コードは、記憶装置１８１５から読み出され、プロセッサ１８０５によって直ぐにアクセスされるようにメモリ１８１０に保存することができる。時として、電子記憶装置１８１５を除くことができ、マシン実行可能命令が、メモリ１８１０に保存される。
【０４９７】
コードを実行するように適合されているプロセッサを有するマシンで使用するために、コードをプレコンパイルおよび構成することができ、または実行中にコンパイルすることができる。コードは、プレコンパイルドまたはアズコンパイルド（as-compiled）様式でコードを実行できるように選択できるプログラミング言語で出力することができる。
【０４９８】
コンピュータシステム１８０１は、利用者プロファイル情報、例えば、名前、実住所、電子メールアドレス、電話番号、インスタントメッセージング（ＩＭ）ハンドル、教育情報、就労情報、社会的嗜好および／または嫌悪、ならびに利用者または他の利用者に対する潜在的関連性の他の情報を保存するように適合することができる。そのようなプロファイル情報は、コンピュータシステム１８０１の記憶装置１８１５に保存することができる。
【０４９９】
ここで提供されるシステムおよび方法、例えばコンピュータシステム１８０１の側面は、プログラミングに包含され得る。技術の様々な側面は、通常は、マシン（またはプロセッサ）実行可能なコード形態の「製品」もしくは「製造品」および／またはマシン可読媒体の種類に保持または包含される関連データであると考えられてもよい。マシン実行可能なコードは、電子記憶装置、そのようなメモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ）またはハードディスクに保存することができる。「記憶」型媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形のメモリ、またはその関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの一部もしくは全部を含むことができ、その媒体は、ソフトウェアプログラミングのために非一時的記憶をいつでも生成してよい。ソフトウェアの全てまたは部分は、インターネットまたは様々な他のデータ通信ネットワークを経由して時には伝達されてもよい。そのような通信は、例えば、１台のコンピュータもしくはプロセッサからもう一方へ、例えば、管理サーバもしくはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへ、のソフトウェアのロードを可能にしてもよい。したがって、ソフトウェアエレメントを運ぶことができる別の種類の媒体には、光波、電波および電磁波があり、例えば、有線および光学陸上通信ネットワークによってならびに様々な電波リンクを介してローカルデバイス間の物理的インターフェースを越えて使用される。また、そのような波、例えば、有線または無線リンク、光リンクなど、を持つ物理的要素は、ソフトウェアを運ぶ媒体と考えられてもよい。非一時的の有形の「記憶」媒体に限定しない限り、用語例えば、コンピュータまたはマシン「可読媒体」とは、実行用のプロセッサに命令を与えることに関与する任意の媒体のことを指す。
【０５００】
したがって、マシン可読媒体、例えばコンピュータ実行可能なコードは、有形の記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むがこれに限定されない多くの形態をとってもよい。不揮発性記憶媒体、例えば、光学的または磁気ディスクには、例えば、任意のコンピュータ（１つまたは複数）などにある任意の記憶デバイスがあり、例えば図面に示すように、データベースなどを実行するために使用してもよい。揮発性の記憶媒体には、ダイナミックメモリ、例えばそのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリがある。有形の伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム中のバスを含むワイヤを含めた銅ワイヤおよび光ファイバーがある。搬送波伝送媒体は、電気もしくは電磁気信号、または音波もしくは光波の形態、例えば、無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信の間に生成されるものをとってもよい。コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、したがって、例えば：フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンがある他の任意の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリチップもしくはカートリッジ、データもしくは命令を運搬する搬送波、そのような搬送波を運搬するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラムコードおよび／もしくはデータを読み込むことができる他の任意の媒体がある。コンピュータ可読媒体のこれら形態の多くは、実行用プロセッサに対する１つ以上の命令の１つ以上のシークエンスの伝達に関係してもよい。
【０５０１】
ここで提供されるシステムおよび方法は、他のシステムおよび方法、例えば、参照により全体をここに組み込むＰＣＴ特許公開番号ＷＯ／２０１２／０８３２４９に記載されるシステムおよび方法と組み合わせても、またはそれによって修飾されてもよい。
【０５０２】
［実施例］
例１
Ｉ．改変ヌクレオチドの設計および合成
ナノ細孔により生成された電気的遮断信号に対するタグ付ポリリン酸のかさ高さの効果を、ヌクレオチドの末端リン酸に結合した異なるサイズのタグまたは基を有する様々なリン酸結合ヌクレオチドを用いて決定する。４つのリン酸タグ付ヌクレオシド−５’−ポリリン酸の構造を図２３に示す。最初に、一連のヌクレオシド−５’−三、四、五および六リン酸を合成する。これらのヌクレオチドにおいて、末端リン酸は、異なるタグ、例えば、異なる長さおよびマスエチレングリコールまたは遊離したポリリン酸のかさ高さもしくは電荷を増加させる他の分子が結合されたリンカーと結合される。これらのヌクレオチドを、ナノ細孔を用いて試験して、末端リン酸に結合したどのタグまたはかさ高い基が異なる塩基間の電気的遮断信号におけるより劇的な差異と相関するのかを決定する。
【０５０３】
１）末端リン酸改変ヌクレオシド−ポリリン酸
ａ．末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸
図２４に示されるように、末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸を、対応するｄＮＴＰをＤＣＣ／ＤＭＦと反応させて、環状トリメタリン酸を得ることにより合成し、これを適切な求核試薬で開環して、タグまたはリンカーに結合したヌクレオシド−５’−三リン酸を得ることができる。これを、鋳型−プライマー伸長反応において使用し、遊離したタグ結合ピロリン酸をナノ細孔を用いて読み取ることができる。あるいは、リン酸に結合したリンカーを、タグ−ＮＨＳエステルと反応させて、代替的なタグ結合ヌクレオシド−５’−三リン酸を提供することができる。
【０５０４】
ｂ．末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−四リン酸
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−四リン酸の合成のために、対応する三リン酸を最初にＤＭＦ中のＣＤＩと反応させて、末端リン酸基を活性化した後、リン酸またはタグ−モノリン酸と反応させて、四リン酸を得る（図２５）。四リン酸上の末端リン酸をＣＤＩでさらに活性化した後、好適な求核試薬と反応させて、リンカー結合四リン酸を提供し、これをさらに用いて、異なる質量、長さまたはかさ高さのタグ、例えば、図２５にも示される、ｍ−ｄＰＥＧ−ＮＨＳエステルに結合させることができる。
【０５０５】
ｃ．末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−五および六リン酸
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−五および六リン酸の合成は、図２６に示されるものと同じ原理に従う。それらを、リン酸、ピロリン酸またはタグ結合リン酸と反応させることにより活性化された三リン酸または四リン酸から調製することができる。あるいは、リンカーを、五または六リン酸に結合させた後、活性化されたＮＨＳエステルと反応させることができる。
【０５０６】
ｄ．オリゴタグ付ヌクレオシド−ポリリン酸
ナノ細孔配列決定に対する現在の手法に関しては、例えば、ナノ細孔を通過し、核酸塩基の認識を可能にする輸送の速度または比率が登録される時の塩基の認識などのいくつかの問題が存在する。ＤＮＡは１〜５μｓの速度でα−溶血素のナノ細孔を通過し、これは単一分子配列決定実験を記録するには速すぎる。分子ブレーキの使用を含む様々なタンパク質工学戦略によりこれらの問題を克服するいくらかの進歩が為された（短い共有結合したオリゴヌクレオチド）（Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．２００６）。
【０５０７】
ここで開示されるように、短いオリゴヌクレオチドを、活性化された末端リン酸と、オリゴヌクレオチドの３’−ＯＨまたは５’−ＯＨとの反応によりヌクレオシドポリリン酸の末端リン酸に結合させることができる。あるいは、オリゴヌクレオチドの３’−または５’−リン酸を、ＣＤＩまたはイミダゾール／ＤＣＣを用いて活性化し、ヌクレオシド−５’−ポリリン酸と反応させることができる。オリゴ結合ヌクレオシドリン酸（オリゴ−３’−５’−リン酸；オリゴ−５’−５’−リン酸）の構造を、それぞれ、図２７（ａ）および図２７（ｂ）に示す。ナノ細孔を通過させることによりモニタリングされるポリメラーゼ反応副産物を、図２７（ｃ）に示す。
【０５０８】
ポリメラーゼ反応副産物がナノ細孔を通過する移動速度を、異なる長さのオリゴヌクレオチドを異なるヌクレオシド−５’−ポリリン酸に結合させることによって制御することができる。例えば、ヌクレオシドｄＡが結合した１または２個のオリゴ−ｄＡ単位を有する場合、ｄＴは３個のオリゴ−ｄＴ単位を有してもよく、ｄＣは４個のオリゴ−ｄＣ単位を有してもよく、ｄＧは５個のオリゴ−ｄＧ単位を有してもよい。各ヌクレオチドに関するオリゴの数の異なる組合せを用いて、ナノ細孔中での輸送および保持時間を制御することができる。
【０５０９】
ナノ細孔中での輸送および保持時間を、異なる数のリン酸基をヌクレオチドに付加することによって制御することもできる。かくして、電荷および質量は、それぞれのヌクレオチドポリリン酸について変化してもよい。
【０５１０】
リンカータグ構造の例
末端リン酸またはヌクレオシド塩基部分および反応することができる基上の反応基の特定例を、表１に提供する。それらが反応することができる反応基は、リンカー上またはタグ上のいずれかに存在してもよい。
【表１】
0006456816.tif 000072
【０５１１】
ナノ細孔によって検出することができるタグがここに含まれるが、それらは決してこれらの化合物群に限定されない。当業者であれば、官能基を変化させて好適なタグを想到することができる。
【０５１２】
タグは、１個以上の４〜８員環を有する脂肪族、芳香族、アリール、ヘテロアリール化合物を含み、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、ニトロ、アルコキシ、シアノ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、酸、アルデヒド、アジド、アルケニル、アルキニル、または他の基で任意に置換されていてもよい。これらのものは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、蛍光、蛍光性（非蛍光であるが、保護基の除去後に蛍光になる）、発色性（無色であるが、保護基の除去後に発色するようになる）染料、化学発光化合物、ヌクレオシド、ヌクレオシド−モノ、ジまたはポリリン酸、オリゴヌクレオチド、アリール、ヘテロアリールまたは脂肪族化合物を含む。いくつかの例を、図３５に示す。
【０５１３】
ＰＥＧ−リン酸−標識ヌクレオチドの構造および官能基と反応する異なる反応基を有する可能なＰＥＧのいくつかの例を、図３６に例示する。
【０５１４】
末端リン酸またはヌクレオチドの塩基部分に結合させるのに用いることができる染料または化合物のいくつかの他の例を、ここで提供する。これらのものは、用いることができる唯一の化合物では決してない。これらのものは例としてここに列挙されるものであり、当業者であれば、ヌクレオチドに結合させ、ナノ細孔により検出することができる好適なリンカー−タグを容易に想到することができる。
【０５１５】
好適なタグの他の例は以下の通りである。
【０５１６】
蛍光染料：キサンチン染料、ボディピー（Ｂｏｄｉｐｙ）染料、シアニン染料化学発光化合物：１，２−ジオキセタン化合物（Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）。アミノ酸およびペプチド：天然または改変アミノ酸およびそのポリマー。炭水化物：グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノースなど。ＮＭＰおよびＮＤＰ：ヌクレオシド−モノリン酸、ヌクレオシド−ジリン酸。ハロゲン、シアノ、ニトロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アジドまたは他のそのような基で置換された、脂肪族または芳香族酸、アルコール、チオール。
【０５１７】
２）塩基改変ヌクレオシド−５’−三リン酸
合成によるＤＮＡ配列決定（ＳＢＳ）のための様々なヌクレオチド可逆性ターミネーター（ＮＲＴ）を合成し、蛍光染料をヌクレオチド塩基およびヌクレオチドの３’−ＯＨに結合させる切断性リンカーを、小さい可逆性ターミネーター基で遮断する（Ｊｕら、２００６、Ｇｕｏら、２００８および２０１０）。これらのＮＲＴを用いて、ＤＮＡ合成をそれぞれの位置で可逆的に停止させる。組込まれた塩基からの蛍光信号を記録した後、組込まれたヌクレオチドの切断可能部分を除去し、サイクルを反復する。
【０５１８】
同じ型のヌクレオチドを、ナノ細孔ＤＮＡ配列決定のために用いることもできる。図２８（Ａ）に示されるように、３’−ＯＨの小さい遮断基および切断可能リンカーを介して連結された塩基で結合したタグを合成することができる。ポリメラーゼ伸長反応の後、３’−Ｏ−遮断基と塩基に由来するタグの両方を切断し、遊離したタグを用いてナノ細孔を通過させ、遮断信号をモニタリングすることができる。１つが４つの塩基のそれぞれのためのものである４つの異なるタグ（例えば、図２８（Ａ）に示されるような、異なる長さおよび分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を用いて、かくして、遮断信号を区別することができる。
【０５１９】
あるいは、かさ高い基またはヌクレオチド塩基はＤＮＡポリメラーゼが２個以上のヌクレオチドを同時に付加することを防ぐことができることが示されているため（Ｈａｒｒｉｓら、２００８）、３’−Ｏ−遮断基を用いない。図２８（Ｂ）に示されるように、かさ高いｄＮＭＰは、切断性リンカーを介して導入される。かくして、異なるｄＮＭＰが、元のｄＮＴＰに従うリンカーを介して導入される。例えば、ｄＴＴＰヌクレオチドの場合、ｄＴＭＰが導入される（ｄＡＴＰについてはｄＡＭＰ；ｄＧＴＰについてはｄＧＭＰ、およびｄＣＴＰについてはｄＣＭＰが導入される）。ポリメラーゼ組込みおよびＴＣＥＰによる切断の後、改変されたｄＮＭＰが生成され、これをナノ細孔チャンネルに通過させ、適切な方法によって検出する。
【０５２０】
３）２’−または３’−ＯＨ改変ヌクレオシド−５’−三リン酸
４つ全部の３’改変ヌクレオシド−５’−三リン酸の合成を実行することができる（Ｇｕｏら、２００８、Ｌｉら、２００３、Ｓｅｏら、２００４）。３’−Ｏ−２−ニトロベンジルおよび３’−Ｏ−アジドメチル結合ｄＮＴＰ（それぞれ、図２９Ａおよび２９Ｂ）は、ＤＮＡポリメラーゼのための良好な基質である。配列決定反応におけるＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼによる組込み後、これらの３’−Ｏ−タグ付ヌクレオチドは、３’−ＯＨでの遮断基のため、単一塩基伸長後に合成を終結する。さらなる伸長は、３’−Ｏ位置からの遮断基の切断後にのみ可能である。３’−Ｏ−２−ニトロベンジル基をＵＶ光によって、２’−Ｏ−アジドメチルをＴＣＥＰを用いる処理によって効率的に切断して、さらなる伸長のための遊離ＯＨ基を生成することができる。反応に由来する切断産物（図２９Ｃまたは２９Ｄ）を、ナノ細孔を通過させ、信号を記録することにより電気的遮断についてモニタリングする。１つがＤＮＡの４つの塩基のそれぞれのためのものである、４つの異なる置換ニトロベンジル保護ｄＮＴＰおよび４つの異なるアジドメチル置換ｄＮＴＰを合成する。
【０５２１】
ＩＩ．改変ヌクレオチドを用いるＤＮＡ伸長
１）リン酸タグ付ヌクレオチド
上記の末端リン酸タグ付ヌクレオシドポリリン酸をポリメラーゼ反応において用いて、伸長産物を生成する。図３０に示されるように、ポリメラーゼ反応後、リン酸タグ付ヌクレオチドの遊離した副産物、タグ−ポリリン酸が得られ、伸長したＤＮＡはいかなる改変物も含まない。次いで、遊離したタグ−ポリリン酸を、配列決定分析のためのシングルチャンネル記録技術により操作されたナノ細孔において用いる。遊離したタグ−ポリリン酸をアルカリホスファターゼで処理して、検出することもできる遊離タグを提供することもできる。質量、電荷またはかさが異なる４つの異なるタグ付ポリリン酸を生成するために４つのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）のための４つの異なるタグを用いて、ＤＮＡの配列を決定することができる。
【０５２２】
２）切断可能リンカーを有する塩基タグ付ヌクレオチド
合成（ＳＢＳ）によるＤＮＡ配列決定および単一分子配列決定のための塩基タグ付ヌクレオチド三リン酸を合成する（Ｇｕｏら、２００８および２０１０）。ピリミジン（ＣおよびＴ）の５位ならびに７−デアザプリン（ＧおよびＡ）の７位での大きいかさ高い基の付加は、ＤＮＡポリメラーゼ反応における２個以上のヌクレオチドの付加を遮断することができる。ヌクレオチド塩基に結合した切断可能リンカー、かさ高い基、および異なる電荷を有する改変ヌクレオチドを合成する。改変ヌクレオチドはまた、ヌクレオチドの３’−ＯＨに小さい遮断基を有してもよい。これらの改変ヌクレオチドを、ポリメラーゼ伸長反応において用いる。図３１に示されるように、適切なヌクレオチドを用いる伸長後に、ヌクレオチド塩基および糖の３’−Ｏに由来するリンカーおよびタグを、遮断される場合、化学的または光化学的手段によって切断し、遊離したリンカー−タグを、配列決定分析のためのシングルチャンネル記録技術によって操作されたナノ細孔中で用いる。
【０５２３】
３）切断可能リンカーを有する２’−または３’−タグ付ヌクレオチド
リンカーおよびタグを、ヌクレオチドの２’−または３’−ＯＨに結合させることもできる。ポリメラーゼ伸長反応の後、リンカー−タグを、化学的、光化学的または酵素的反応によって伸長産物から切断し、さらなる伸長のために遊離３’−ＯＨを遊離する。図３２に示されるように、次いで、遊離したリンカー−タグを、配列決定分析のためのシングルチャンネル記録技術によって操作されたナノ細孔中で用いる。
【０５２４】
ＩＩＩ．ナノ細孔を用いるＤＮＡ配列決定試験
ナノ細孔を用いるＤＮＡ配列決定における異なるヌクレオチドの識別は、図３０〜３２に示される戦略に従って評価される。ＤＮＡ中の４つの異なるリンカー−タグを区別するナノ細孔の能力を検証するために、図３３に示される一連の実験を実施する。ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼをナノ細孔に結合させることができ、配列決定しようとする鋳型をプライマーに沿って付加する。ＤＮＡ鋳型またはプライマーのいずれかを、ナノ細孔の頂部に固定することもでき、次いで、ＤＮＡポリメラーゼの付加の際に鋳型−プライマー複合体を形成する。この鋳型−プライマー複合体に、４つの異なるようにタグ付けられたヌクレオチドを一緒に、または連続的に付加する。正確なヌクレオチドのポリメラーゼにより触媒された組込みの後、付加されたヌクレオチドはタグに結合したポリリン酸（末端リン酸標識ヌクレオチドの場合）を遊離し、次いで、ナノ細孔を通過して、付加された塩基を同定するために記録および使用される電気信号を生成する。任意に、遊離したタグ−ポリリン酸をアルカリホスファターゼで処理して、遊離タグを提供し、これをナノ細孔を通過させることによって検出することもできる。それぞれのタグは、サイズ、質量または電荷の差異のため、異なる電気的遮断特徴を生成する。塩基改変または２’／３’−改変ヌクレオチドの場合、ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ伸長の後、伸長したプライマーに由来するタグを化学的、光化学的または酵素的手段によって切断し、遊離したタグの電気的特徴をモニタリングする。タグの形状、サイズ、質量、電荷または他の特性を、要件に従って調整することができる。
【０５２５】
ここに開示されるように、それぞれのヌクレオチドに由来する信号（図３４）および異なる同一性のヌクレオチド間の遷移を区別し、特徴づける。事象ダイアグラム上での遮断特徴の規模および持続期間を分析し、既知のダイアグラムと比較する。かくして、これらの合理的な化学的設計およびＤＮＡの構成要素の改変に関して、ナノ細孔の使用を最適化して、単一塩基分解能で単一分子レベルでのＤＮＡ配列を解読する。
【０５２６】
ＤＮＡ配列決定のためのこの新規戦略を実装するために、ナノ細孔のアレイを平面上で構築して、図３７に示されるような大規模平行ＤＮＡ配列決定を行うことができる。ナノ細孔のアレイを、シリコンチップまたは他のそのような表面上で構築することもできる。ナノ細孔を、脂質二重層もしくは他のそのような層（α−溶血素細孔、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｎａｔｉｓのポリンＡ、ＭｓｐＡ）（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０１０）を有するタンパク質から構築するか、またはそれらは窒化ケイ素、酸化ケイ素もしくは金属酸化物中で組立てられた合成固体状態のナノ細孔（Ｓｔｏｒｍら、２００５；Ｗａｎｕｎｕら、２００８）または固体状態の細孔とα−溶血素とのハイブリッドであってもよい（Ｈａｌｌら、２０１０）。
【０５２７】
図３７は、合成による大規模平行ＤＮＡ配列決定のためのナノ細孔のアレイの図を示す。ナノ細孔は、それぞれのＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ触媒ヌクレオチド付加副産物（リン酸または糖部分の塩基および／もしくは２’、３’−ＯＨに結合したタグ）を識別することができるが、それはそれがナノ細孔を通過するからである。異なるタグの電気的特性は、ナノ細孔中でのその遮断特性に基づいて塩基を区別する。図３７に示されるナノ細孔のアレイは、同じ配列または異なる配列をそれぞれ読み取ることができる。それぞれの配列が読み取られる回数が増加するほど、得られる配列データの品質がよくなる。
【０５２８】
例２
Ｉ．ＰＥＧ標識デオキシグアノシン−５’−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＰＥＧ）の合成：
ＰＥＧ標識デオキシグアノシン−５’−四リン酸（ｄＧ４Ｐ−ＰＥＧ）を、図３８に従って合成する。最初に、２’−デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）は、ＤＭＦ中のＣＤＩと反応して、末端リン酸基を活性化した後、ジブチルアンモニウムリン酸と反応して四リン酸を与える。この四リン酸上の末端リン酸を、０．１Ｍイミダゾールバッファー中のＥＤＡＣでさらに活性化した後、ジアミノヘプタンと反応させて、アミノ結合四リン酸を提供し、これをｍＰＥＧ−ＮＨＳエステルとさらに反応させて、必要な４つのＰＥＧ−ｄＧ４Ｐを提供する。ポリメラーゼ組込みの後、遊離したＰＥＧ上の正味の電荷は、−３である（ＰＥＧ−ＮＨ−三リン酸）。
【０５２９】
ＩＩ．単一塩基伸長反応における改変ヌクレオチドの試験
ｄＧ４Ｐ−ＰＥＧを、表ＩＩに示されるようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法により特徴づける。
【表２】
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【０５３０】
ｄＧ４Ｐ−ＰＥＧは、プライマー伸長におけるＤＮＡポリメラーゼのための優れた基質である。ＤＮＡ伸長産物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、図３９に示す。
【０５３１】
例３
ヌクレオチドを標識するために用いられるＰＥＧのナノ細孔による単一分子検出
ポリ（エチレングリコール）は、カチオンに弱く結合する非電解質ポリマーである（例えば、それは約２ＭのＫdでＫ+イオンに結合する）。かくして、ポリマー上の正味の電荷は、移動性カチオン濃度およびそれに化学的に連結される他の部分の存在に依存する。単一α−溶血素ナノ細孔は、モノマー分解よりも良好に、すなわち、４４ｇ／ｍｏｌより良好に異なるサイズのＰＥＧポリマー間を容易に区別することができることが示されている（Ｒｅｉｎｅｒら、２０１０；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２００７）。ポリマーが体積排除に起因して、およびさもなければ細孔を自由に流動することができる移動性カチオンに結合することにより、細孔の伝導性を減少させる（細孔の伝導性はポリマーサイズの増加と共に減少する）ため、その識別レベルが可能となる（Ｒｅｉｎｅｒら、２０１０）。さらに、細孔中でのポリマーの滞留時間は、ポリマーの電荷に対して高感度であり、ＰＥＧについては、ポリマーの長さに比例して拡大する。ナノ細孔は、他の部分に化学的に連結されたサイズが異なるＰＥＧ間を区別することができるべきである。ヌクレオチドを標識するためのＰＥＧ（ＰＥＧ１６、２４、３７および４９）は、ナノ細孔上で試験され、図４０に示されるように単一分子レベルで異なる電気的遮断特徴を生成する。
【０５３２】
ナノ細孔中で生成された電気的遮断信号に対する様々にタグ付けられたポリリン酸のかさ高さの効果を調査するために、様々なリン酸結合ヌクレオチドを、ヌクレオチドの末端リン酸に結合した異なるサイズのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タグを用いて合成する。最初に、図２３に示されるように、本発明者らは、分子サイズを増加させるか、または遊離したポリリン酸の電荷を改変するための異なるタグ、例えば、異なる長さおよび質量のＰＥＧまたは他の分子を結合させることができるリンカーを介して結合された末端リン酸を用いて一連のヌクレオシド−５’−三−、四−、および五リン酸を合成する。次いで、本発明者らは、ナノ細孔による検出と共にポリメラーゼ反応においてこれらのヌクレオチドを試験して、末端リン酸に結合したどのタグまたはかさ高い基が異なる塩基間で電気的遮断信号のより劇的な差異をもたらすかを見る。
【０５３３】
Ｉ．異なるナノ細孔遮断信号を用いる４つのＰＥＧタグのスクリーニングおよび選択
最近、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が単一α−溶血素細孔に進入する時、それが特徴的な平均滞留時間で異なる質量依存的伝導状態を惹起することが示された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２００７）。図４１Ａは、伝導性に基づく質量スペクトルがエチレングリコールの反復単位を明確に分解し、滞留時間がＰＥＧの質量と共に増大することを示す。
【０５３４】
Ｉ．ａ  ナノ細孔遮断特徴に関するＰＥＧの試験
異なる長さおよび分子量のＰＥＧ（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄまたは他の供給業者から市販されている）を選択し、例２に記載のようにナノ細孔遮断特徴をモニタリングする。図４１Ａに示されるように、２８〜４８個のエチレングリコール単位のＰＥＧが、ナノ細孔によって明確に区別される。従って、非常に異なるナノ細孔遮断信号を示す広範囲のエチレングリコール単位を有するＰＥＧをタグとして選択して、ヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧおよびＴを標識する。例を図４１Ｂに示す。タグとしての分枝状ＰＥＧはより直接的な様式で正の電荷を用いて改変することができるため、それらも評価する。いくつかの直鎖状および分枝状ＰＥＧの構造を、図４１の下部に示す。
【０５３５】
Ｉ．ｂ  Ｉ．ａで選択されたリン酸標識ＰＥＧの設計および合成
ナノ細孔配列決定において、ナノ細孔中での電流遮断信号は、ポリメラーゼ反応中に遊離したＰＥＧ−リン酸により生成される。かくして、本発明者らは、正に帯電したリンカーを有するリン酸標識ＰＥＧを設計および合成し、有機（例えば、α−溶血素）および合成（固相）ナノ細孔を用いてこれらの分子を試験して、その電流遮断信号を評価する。選択されたＰＥＧを、図４２に示されるようにその三リン酸に変換する。例えば、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ−ブタノールを、最初にオキシ塩化リンと反応させた後、１ポット反応においてトリブチルアンモニウムピロリン酸と反応させることにより、対応する三リン酸に変換することができる。精製後の三リン酸を、ＤＣＣ／ＤＭＦまたはＣＤＩ／ＤＭＦで活性化して、活性化三リン酸を提供し、これをＰＥＧのＯＨ基と反応させて、ＰＥＧ−三リン酸を生成する。同じスキームは、直鎖状ならびに分枝状ＰＥＧの両方に適用可能である。これらのＰＥＧリン酸をナノ細孔中で試験して、異なる電流遮断信号を生成するための条件を最適化する。
【０５３６】
ポリアミノ酸（ポリリシン、ポリアルギニン、中断ポリリシン）リンカーを、標準的なペプチド合成戦略により合成する；ポリリン酸鎖へのエステル結合が組込まれる場合、それを切断するためにアルカリホスファターゼを使用することができるべきであり、ナノ細孔精査のためのより強力に正のタグが得られる。正の電荷を、ＰＥＧ鎖中に組込んでもよい。
【０５３７】
Ｉ．ｃ  末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸のライブラリーの設計および合成
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三−、四−、および五リン酸を設計および合成する。これらの分子を、ポリメラーゼ反応において試験し、最適なものをナノ細孔検出のために選択する。小さいか、または大きいポリリシン、アミノ酸、様々な負または正に帯電した染料、例えば、エネルギー移動染料、およびエチレングリコール単位などの様々なタグを含む末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三−、四−、および五リン酸は、プライマー伸長のための優れた基質としてＤＮＡポリメラーゼにより許容されることが示された（Ｋｕｍａｒら、２００６および２００８；Ｓｏｏｄら、２００５；およびＥｉｄら、２００９）。
【０５３８】
Ｉ．ｃ．１  末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸の設計および合成
図４３に示されるように、末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸を、対応するｄＮＴＰをＤＣＣ／ＤＭＦと反応させて、環状トリメタリン酸を得て、これを求核試薬で開環して、タグまたはリンカーに結合したヌクレオシド−５’−三リン酸を生成することにより合成する。さらに、リン酸に結合したリンカーを、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルと反応させて、代替的なＰＥＧ結合ヌクレオシド−５’−三リン酸を提供することができる。得られる末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−三リン酸を、鋳型−プライマー伸長反応において使用し、遊離したタグに結合したピロリン酸を検出し、その特異的ナノ細孔電流遮断パラメータにより区別する。
【０５３９】
Ｉ．ｃ．２  末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−四リン酸の設計および合成
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−四リン酸の合成のために、対応する三リン酸を最初にＤＭＦ中のＣＤＩと反応させて、末端リン酸基を活性化した後、リン酸またはタグ−モノリン酸と反応させて、図４４に示されるように四リン酸を得る。四リン酸上の末端リン酸を、０．１Ｍイミダゾールバッファー中のＥＤＡＣでさらに活性化した後、好適な求核試薬と反応させて、リンカーに結合した四リン酸を提供し、これを用いて異なる質量、長さまたは電荷のタグ、例えば、ｍ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルに結合させることができる。この場合、４つのトリメチルリシンを用いて、４つのリン酸の電荷を中和する。ポリメラーゼ組込みの後、遊離したＰＥＧ上の正味の電荷は＋１であるか、またはアルカリホスファターゼで処理した場合、＋４であり、これをナノ細孔により検出することができる。
【０５４０】
Ｉ．ｃ．３  末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−五リン酸の設計および合成
末端リン酸タグ付ヌクレオシド−５’−五リン酸の合成は、図４５に示されるものと同じ原理に従う。それらを、リン酸、ピロリン酸またはタグ結合リン酸と反応させることにより、活性化三リン酸または四リン酸のいずれかから調製することができる。あるいは、リンカーを五リン酸に結合させた後、活性化ＮＨＳエステルと反応させることができる。
【０５４１】
上記の末端リン酸タグ付ヌクレオシドポリリン酸を、ポリメラーゼ反応において用いて、伸長産物を生成する。図３０に示されるスキームに従って、ポリメラーゼ伸長における末端リン酸タグ付ヌクレオシドポリリン酸の性能を評価する。本発明者らは最初に、単一塩基伸長反応を実施し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法によりＤＮＡ伸長産物を特徴づけて、組込み効率を評価する。最適化された反応条件を確立した後、本発明者らは、磁気ビーズ上に鋳型を固定し、単一塩基伸長反応を反復した後、遊離したポリリン酸タグを、単一ナノ細孔を用いる検出のために溶液から単離する。この反応を継続的に実施して、４つ全部のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）を評価し、その対応する遊離したタグをナノ細孔により検出する。ポリリン酸タグヌクレオチドを用いる連続的ポリメラーゼ反応およびナノ細孔による遊離したポリリン酸タグの明確な区別は、手法の実現可能性を確立する。
【０５４２】
図３０に示されるように、ポリメラーゼ反応後、リン酸タグ付ヌクレオチド（タグ−ポリリン酸）の遊離した副産物が得られ、伸長したＤＮＡ鎖はいかなる改変も含まない。増殖中のＤＮＡ鎖上に残存する傷はヌクレオチド付加の増加と共にポリメラーゼにより認識されるその能力に影響し、最終的にさらなるＤＮＡ合成を終結させ得るため、これは有利である。遊離したタグ結合ポリリン酸をナノ細孔中でアッセイして、配列決定の感度および精度を評価する。初期実験において、本発明者らは、ＳＢＳ反応を実行する前にその遮断信号についてタグを試験する。４つのヌクレオチドのための異なるタグを用いて、質量、電荷またはかさ高さが異なり、４つの異なる遮断信号をもたらす４つの異なるタグ付ポリリン酸を生成する場合、ＤＮＡ配列を決定することができる。
【０５４３】
ＩＩ．タンパク質ナノ細孔による遊離したタグ付リン酸の検出
本発明者らは、単一のα−溶血素ナノ細孔を用いて、多リン酸リンカーを介して結合したヌクレオチドに連結されたＰＥＧを検出し、ヌクレオチド／リボース部分の後の同じポリマーをＤＮＡポリメラーゼ反応によって切断した。４つの異なるＤＮＡ塩基のそれぞれを、ユニークな長さのＰＥＧポリマーに連結する。かくして、ポリメラーゼによりＰＥＧから除去されたそれぞれの塩基が同定される。未反応のヌクレオチドは、特にリアルタイムの状況では遊離したタグ付ポリリン酸から分離することができないため、本発明者らは、遊離した反応産物と出発材料とを識別する分子電荷に対する本発明の方法の極端な感度を利用する。本発明者らは、１００ｋＨＺおよび約４ｐＡのＲＭＳノイズでのデータ収集を可能にする円錐ガラス支持体（Ｗｈｉｔｅら、２００６および２００７）を用いて単一α−溶血素伝導性を測定する。本発明者らは、ヌクレオチド識別のための最適条件を決定し、固定された電荷での分子とのＰＥＧ−ナノ細孔相互作用（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２００７）の本発明者らの現在の理論的理解を拡張するために、様々な膜貫通能力にわたってタグ付ヌクレオチドとタグ付産物の両方の遮断深度および滞留時間分布を測定する。特徴づけおよび理論的理解は、ポリメラーゼによりポリヌクレオチド中に組込まれたヌクレオチドの明白な同定を可能にする。かくして、ＤＮＡの構成要素のこれらの合理的な化学的設計および改変について、本発明者らは、ナノ細孔の使用を最適化して、タンパク質または合成ナノ細孔において単一塩基分解能で単一分子レベルでＤＮＡを解読する。
【０５４４】
例４
単一分子配列決定のための単一固体状態ナノ細孔の製造
タンパク質ナノ細孔から固体状態ナノ細孔への遷移は、高密度ナノ細孔アレイの製造を可能にし、これは高効率単一分子電気ＤＮＡ配列決定装置を得るための重要な工程である。ここで、一体型単一固体状態ナノ細孔プラットフォームを開発して、タンパク質ナノ細孔から獲得された知識に基づいてポリメラーゼ反応におけるタグ付ヌクレオチドを特徴づける。
【０５４５】
一体型ナノ細孔プラットフォーム
本発明者らは、固体状態ナノ細孔と一体化した場合、外部電気物理的増幅器、例えば、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂを用いる「標準的な」測定技術と比較して有意な性能の利点を送達する特殊化された一体型低ノイズＣＭＯＳ電子機器を開発した。これらの利点は、慣用的な一体化増幅器設計における容量性（抵抗性よりもむしろ）フィードバックの活用に由来する。この、およびその他のバイオエレクトロニクスインタフェースに特徴的であるＤＣ電流を、ＤＣサーボループ中で運転する低ノイズ電流源を用いて除去する。同時一体化と関連する増幅器入力容量の低下および寄生容量の低下は高周波数でのノイズ特性を改善し、固体状態の細孔に関する１ＭＨｚに達するバンド幅を可能にする。そのような高い一時的分解能は、開発されたタグと組合わせた場合、高感度およびリアルタイム性能のためにこのプラットフォームを調整するための高い可撓性を提供する。
【０５４６】
このＣＭＯＳ一体型ナノ細孔（ＣＮＰ）の使用は、図４６に示されるような２チップまたは１チップ構成のいずれかに回路を一体化した。前者の場合、細孔を、図４６Ｂに示されるようにＣＮＰと一緒にパッケージングする。後者の場合、細孔を、チップのいずれかの側での流体工学を用いて図４６Ｃに示されるようにＣＮＰ中で直接製造する。両方の場合、増幅器の入力に接続するｃｉｓ電極を、ＣＮＰの表面上に直接一体化する。１チップ構成は、追加の製造複雑性の費用で多重化プラットフォームに容易に拡大可能であるという利点を有する。製造されたＣＭＯＳダイス（ある側で５ｍｍ以下である）を後処理する能力は、ここ５年にわたって確立されたユニークな能力である（Ｈｕａｎｇら、２０１１、Ｌｅｉら、２００８、およびＬｅｖｉｎｅら、２００９）。この手法は、新しい方法の開発を必要とするよりもむしろ、存在する半導体製造（foundry）工程を完全に活用するものである。
【０５４７】
１チップ製造手法は、標準的な固体状態ナノ細孔製造技術（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら、２０１１）を適合させることにより進行する。センサのために保存されたダイスの領域において、全ての金属は遮断されており、分厚いスタックの交互のガラス充填層および窒化ケイ素キャッピング層にしている。誘電体スタックの大部分を、誘導的にカップリングされたＣＨＦ3プラズマを用いてエッチングする。ダイスの背面上にＰＥＣＶＤ  Ｓｉ3Ｎ4エッチマスクを置き、パターン形成させた後、シリコン基質中の局在化された開口部を、異方性水酸化カリウムエッチを用いて作製する。次いで、緩衝化フッ化水素酸中への短時間の含浸を用いて、懸濁膜としての元の誘電体スタックから窒化ケイ素の単一の５０ｎｍ層を単離する。最後に、ナノ細孔を、高分解能透過型電子顕微鏡を用いてこれらの窒化物膜を通してドリルで穿孔する。
【０５４８】
このシステムの測定されたノイズを、同等の構成のＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂに関するベースラインノイズの測定値と共に図４７Ａに示す。Ａｘｏｐａｔｃｈ（Ｂ＝１００ｋＨｚ）により支持される最も高いバンド幅について、一体型増幅器は、Ａｘｏｐａｔｃｈの９ｐＡRMSと比較して、３．２ｐＡRMSのノイズフロアを有する。一体型増幅器（Ｂ＝１ＭＨｚ）について特徴づけられた最も高いバンド幅で、ノイズレベルは、その支持範囲を超えてＡｘｏｐａｔｃｈ応答を外挿することによりモデル化された２４７ｐＡRMSと対照的に、２７ｐＡRMSである（約１０の因数より低いノイズ）。比較の点として、１ｎＡの信号について、約６２５０個のイオンのみが１ｕｓ中で細孔を通って輸送される。一体型増幅器の２７ｐＡＶRMSの入力換算ノイズレベルは、この間隔でわずか１５０個のイオンの分解を可能にする。
【０５４９】
また、この優れた電気的性能がラックに搭載されたＡｘｏｐａｔｃｈ増幅器と比較してＣＭＯＳチップ上のわずか０．２ｍｍ2の領域を消費する一体型増幅器を用いて得られ、革新的電子機器の有意性を証明することに留意することも重要である。ナノ細孔を増幅器入力部に接続した場合、１／ｆノイズの誘導および膜容量はオープンヘッドステージベースラインより上にノイズスペクトルを上昇させる。図４７ｂは、この場合の典型的なノイズスペクトルを示し、１００ｋＨｚおよび１ＭＨｚのバンド幅について、それぞれわずか１０ｐＡRMSおよび１６３ｐＡRMSのノイズフロアを示している。測定された比較を、同じナノ細孔に関して１００ｋＨｚまでＡｘｏｐａｔｃｈを用いて示す。１００ｋＨｚで、ＣＮＰに関する入力換算ノイズ電力の２を超える因数の低下が存在する。Ａｘｏｐａｔｃｈをより高いバンド幅で測定することができる場合、１ＭＨｚで６の因数のノイズ電力差があってもよい。
【０５５０】
このプラットフォームはまた、生物学的ナノ細孔の一体化を可能にし、さらにより高い柔軟性を提供する。生物学的ナノ細孔は、２つの流体セル間でテフロン（登録商標）膜中の穴にわたって形成される脂質膜（典型的には、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ））中で作出される。その表面は、膜が単層ベシクルから形成されるのに十分に親水性でなければならない。膜タンパク質を１つのセルに添加し、一度組込みが検出されたらすぐに洗い流しながら、セルの２つのチャンバ間の伝導性をモニタリングする。ナノ細孔を製造するために用いられる膜を、脂質二重層が形成される膜中により大きい穴をドリルで穿孔しながら脂質二重層のための固相支持体として用いることもできる（Ｃｌａｒｋｅら、２００９；Ｂｅｎｎｅｒら、２００７；Ｈｏｕら、２００９；およびＷａｎｇら、２０１１）。平面二重層脂質膜（ＢＬＭ）を、ナノパターン化された穴（直径約１００ｎｍ）を有するパターン化された固相支持体上に異なるタンパク質チャンネルを用いて操作し、ならびに自己集合単層アセンブリにより金上にそれらを直接係留させた（Ａｘｅｌｒｏｄら、１９７６、Ｂｕｌｔｍａｎｎら、１９９１、Ｄｕｔｔａら、２０１０、Ｊｅｎｋｉｎｓら、２００１、Ｎａｍら、２００６、Ｐａｌｅｇｒｏｓｄｅｍａｎｇｅら、１９９１、Ｓｈｅｎら、２００９、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、２００１、Ｙａｎｇら、２００３、Ｙｉｎら、２００５）。さらに、ナノパターン化された基質上での４μｍ2／ｓの拡散係数での連続的ＢＬＭの形成；ＳＡＭ−金アセンブリ上で形成されたＢＬＭが０．８μｍ2／ｓの係数をもたらすことが示された。両方とも良好に形成されたＢＬＭを表す０．１〜１０μｍ2／ｓの理想的な拡散範囲内にある（Ａｘｅｌｒｏｄら、１９７６、Ｂｕｌｔｍａｎｎら、１９９１）。これらのＢＬＭの電気的特徴づけは、１．４ＧＷ−ｍｍ2抵抗の高インピーダンス膜を示し、膜中で形成される生物学的ナノ細孔のさらなる電気的分析に従いやすくする（Ｏｌｉｖｅｒら、１９９４、Ｓｈｉら、２０００、Ｗｉｅｈｅｌｍａｎ、１９８８）。
【０５５１】
ナノ細孔担持表面へのポリメラーゼの固定
ポリメラーゼのサイズは、約５ｎｍ  ｘ  ５ｎｍである。１個のポリメラーゼは、各ナノ細孔の入口の近くに配置される。固体状態ナノ細孔についてこれを達成するために、（１）表面上のユニークな位置を、ポリメラーゼに結合するようにＣＭＯＳ製造中に官能基で改変する；（２）部位がただ１個のポリメラーゼ分子が結合することができる程度に十分小さい；（３）遊離したタグ付ポリリン酸の近隣のチャンネルへの拡散の可能性がほとんどないようにそれらが十分に離れている；および（４）架橋剤が、酵素が機能的に無傷であるように十分に可撓性であることが必要である。ポリメラーゼ係留は、多くても１個の酵素分子が結合されるように、インキュベーション中にパターン化された結合点を、適切な濃度のポリメラーゼ溶液の使用と組合わせることによって達成される。
【０５５２】
ポリメラーゼの適切な係留点の確立は、固体状態ナノ細孔のための存在する製造手法を活用することにより達成される。典型的には、伝達信号を最大化するために、ｅ−ビームリソグラフィーを用いて支持されたＳｉ3Ｎ4膜を薄くしてウィンドウを規定した後、プラズマエッチ（例えば、ＳＦ6）を用いて薄くすることにより、これらの細孔を作出する。次いで、ナノ細孔を、ｅ−ビームアブレーションを用いて薄くなった領域中でドリルで穿孔する。このウィンドウにより作出されたウェル（図４８）は、ポリメラーゼを係留するための自然の位置を作出し、ナノ細孔入口の近くを保証する。薄くなったウィンドウをエッチングする前に、元の膜を、結合材料の埋まったエピタキシャル層を用いて増加させることができる。一度、ウィンドウがエッチングされたら、これはポリメラーゼ結合のための選択的側壁領域になることができる。結合材料は、二酸化ケイ素または金を含む。しかしながら、酸化物は適切な条件下では窒化ケイ素表面上でも形成し得るため、二酸化ケイ素については選択性が限られている。
【０５５３】
原理的には、二酸化ケイ素表面を用いる場合、ビオチン−ストレプトアビジン結合を用いることができ（Ｋｏｒｌａｃｈら、２００８および２０１０）、シリカパッチ上のビオチン化ＰＥＧ分子を使用し、ストレプトアビジンの存在下でビオチン末端標識ポリメラーゼをインキュベートする。残りの表面を、ポリビニルホスホン酸を用いて不動態化する。上記で生じた関心のため、その代わりに金表面を、アミノ基で官能化されたアルカンチオール自己集合単層（ＳＡＭ）で改変するのが好ましい（Ｌｏｖｅら、２００５）。これらのものを、ポリメラーゼ上のアミノ基への結合のためにＮＨＳエステルに容易に改変することができる。層の厚さおよび均一性を、偏光解析法または原子力顕微鏡により決定する。
【０５５４】
正に帯電したリンカーを含む５’−改変ヌクレオチドの開発
前駆体ヌクレオチドおよびＤＮＡを細孔により寄せ付けないようにしながら細孔に対する遊離したタグの迅速な拡散のためのシステムを生成する。ＤＮＡ中への組込み後に、ヌクレオシドから遊離したタグが累積正電荷を有するが、無傷のタグ−ヌクレオチドが中性のままであるようにタグ付ヌクレオチドを操作する。これにより、チャンネルが方法に従って負に帯電する場合、検出チャンネルを通して特異的に遊離したタグを活発にゲート化することができる（Ｗａｎｕｎｕら、２００７）。タグ以外の、反応混合物（プライマー、未反応のヌクレオチド、鋳型）中に存在する他の全ての遊離分子は負に帯電しているため、正電荷を担持する遊離したタグのみがチャンネル中に誘引され、検出の特異性を増加させ、ノイズを減少させる。異なる数の帯電基を、特異的ヌクレオチド塩基に応じて、異なるタグ上で用いることができる。かくして、タグの累積電荷は、そのサイズと共に、塩基識別のために用いることができる。タグの組込みおよび遊離の後、ポリリン酸が正電荷を隠すと考えられる場合、第２の反応（例えば、細孔中の第２の下流部位に固定されたアルカリホスファターゼ）を用いてそれを除去することができる。正帯電タグを、検出および認識のために負帯電チャンネル中にゲート化することができる。
【０５５５】
拡散およびドリフト
この配列決定システムの重要な側面は、隣接したナノ細孔による各ヌクレオチドの遊離したタグの信頼性が高く、時宜を得た捕捉である。タグが正確な順序で迅速に捕捉されるように、条件を操作しなければならない。さらに、組込まれなかったタグの捕捉率を最小化し、隣接するチャンネルからの干渉を無視できるほどのものにするべきである。細孔の入口でのウェルの作出（図４８に示される）はこのプロセスを補助し、これはナノ細孔開口部へのポリメラーゼの近接性にも依存する。ナノ細孔捕捉プロセスの分析は、細孔の周囲での放射対称性のプロセスを一般に考慮する。幾何学は、電界の非存在下では、静電気引力とは反対に、分子は細孔から遠くに拡散する傾向があると決定付ける。電圧勾配を用いた場合、拡散および電気泳動に起因する分子運動が等しい臨界距離Ｌが存在する（Ｇｅｒｓｈｏｗら、２００７）。この臨界距離は、イオン電流（Ｉ）および電解質伝導性（σ）、ならびに分析物分子の拡散定数（Ｄ）および移動度（μ）の関数、
【数１】
0006456816.tif 000074
【０５５６】
である。捕捉は統計プロセスであるが、距離Ｌで約５０％の分子が捕捉される。この可能性は、より短い距離について増大し、ｄ＜Ｌ／３について９０％を超える。このプロセスの間に、分子は典型的には、
【数２】
0006456816.tif 000075
【０５５７】
の次数の時間スケールで捕捉される。ポリメラーゼをナノ細孔のＬ／３以内に置くことにより、ほぼ全ての分子が捕捉される。それはまた、ｔ捕捉が、正確な順序で塩基を捕捉するために、ポリメラーゼ組込み速度よりも有意に速いことを確保する。
【０５５８】
水中への２５単位のＰＥＧ分子の拡散係数の近似値は、Ｄ＝３ｅ−１０ｍ2／ｓ（Ｓｈｉｍａｄａら、２００５）であり、これは類似する長さのｓｓＤＮＡ断片と同じ規模にある（Ｎｋｏｄｏら、２００１）。Ｎｅｒｎｓｔ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ関係の妥当性を仮定すれば（これはポリマーについて常に正しいとは限らないが）、移動度を、拡散定数および正味電荷（Ｑ）の関数、
【数３】
0006456816.tif 000076
【０５５９】
として見積もることができる。次いで、これらの見積もりについて、１Ｍ  ＫＣｌ中でＩ＝５ｎＡであり、以下の表を参照されたい。
【表３】
0006456816.tif 000077
【０５６０】
例５
固体状態ナノ細孔のアレイの製造
改善された性能に加えて、一体型電子機器を用いた場合にのみ、大規模平行ナノ細孔アレイを製造することができる。これは、ナノ細孔がチップのいずれかの側で流動するＣＭＯＳダイス中に直接一体化された図４６Ｃに示される１チップトポロジーを含む。複数の細孔を一体化するための手法も、図４６Ｃに示されている。この場合、ＳＵ−８光耐性のウェルを用いて、互いに個々のナノ細孔を単離する。これは、Ｒｏｔｈｂｅｒｇら、２０１１のものと同様の手法である。しかしながら、Ｒｏｔｈｂｅｒｇらにおいては、ウェルはチップ上の溶液リザーバによって依然として「接続」されたままであり得る。本発明の場合、ｃｉｓリザーバ間での電気的単離が必要であるため、図４６Ｃに示されるようにＰＤＭＳキャップを用いて試薬の導入後に測定のためにウェルを密封する。６４個の固体状態ナノ細孔を、同じ５ｍｍｘ５ｍｍのダイス上に一体化する。それぞれの細孔部位で複製される必要があり得る現在の一体型増幅器設計は、２５０μｍｘ１５０μｍのみであるが、細孔自体の製造のために追加の空間を残す必要がある。チップ面積を減少させるための製造技術がさらに開発されるので、これを１６ｘ１６の電極のアレイに容易に拡大することができる。
【０５６１】
例６
リン酸タグ付ヌクレオチドおよびナノ細孔検出を用いるパイロシーケンシング
パイロシーケンシングは、ポリメラーゼ反応においてヌクレオチドが増殖中のＤＮＡ鎖中に組込まれた場合に遊離されるピロリン酸の検出に依拠する合成法による配列決定（ＳＢＳ）である（Ｒｏｎａｇｈｉら、１９９８）。この手法においては、４つのｄＮＴＰのそれぞれを、酵素、基質、および通常のポリメラーゼ反応成分のカクテルと共に連続的に添加する。添加されたヌクレオチドが鋳型上の第１の利用可能な塩基と相補的である場合、そのヌクレオチドは組込まれ、ピロリン酸が遊離される。酵素カスケードを通して、遊離したピロリン酸はＡＴＰに変換された後、蛍ルシフェラーゼにより可視光信号になる。他方、添加されたヌクレオチドが組込まれなかった場合、光は生成されず、ヌクレオチドは酵素アピラーゼによって単純に分解される。パイロシーケンシングは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）検出およびＤＮＡ配列決定に上手く適用されてきた。市販の配列決定プラットフォームは、高効率ＤＮＡ配列決定のために個々のマイクロビーズ上でパイロシーケンシングとＤＮＡ鋳型増幅とを組合わせて開発されたものである（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら、２００５）。しかしながら、鋳型のホモポリマー領域（例えば、行中の一続きのいくつかのＴ）中の組込まれたヌクレオチドの数を決定するためのパイロシーケンシングにおける固有の難しさがある。この他、依然として改善を要するパイロシーケンシングの他の側面もある。例えば、４つのヌクレオチドのそれぞれを別々に添加、検出しなければならない。未分解ヌクレオチドおよび他の成分の蓄積もまた、長いＤＮＡ鋳型を配列決定する場合に本発明の方法の精度を低下させ得る。
【０５６２】
これは、ポリメラーゼ反応中の遊離したタグ−またはタグ−リン酸の検出に依拠する改変パイロシーケンシング手法である。この手法においては、リン酸タグ付ヌクレオチドを、鋳型−プライマー複合体上でのポリメラーゼ触媒反応において用いる。タグ付ヌクレオチドの組込みの際に、リン酸−タグ部分が遊離され、これをナノ細孔を通過させることによって検出することができる。同じタグをそれぞれのヌクレオチド上で用いるか、または異なる分子量および長さのタグ（例えば、ＰＥＧ）を用いることができる。異なる長さおよび質量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、溶血素ナノ細孔を通過させた場合、単一分子感度で分解することができることが示された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２００９）。
【０５６３】
α−溶血素チャンネルを用いて、単一分子レベルで核酸を検出することができる（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６）。モノマーポリペプチドは、脂質二重層中で自己集合して、１．５ｎｍ直径の限界開口部を有するヘプタマー細孔を形成する。水性イオン塩溶液中では、α−溶血素チャンネルにより形成された細孔は、適切な電圧が膜にわたって印加された場合、強力で安定的なイオン電流を伝導する。ナノ細孔の限界開口部は、直鎖状一本鎖を通過させるが、二本鎖核酸分子（直径約２．０ｎｍ）を通過させない。ポリアニオン核酸は、イオン電流を遮断するか、または減少させる、印加された電界によって細孔を通って誘導される。この通過は、ユニークな電気的特徴を生成する。かくして、転位時間対遮断電流のプロットである特異的事象ダイアグラムが得られ、特徴的なパラメータ、例えば、ダイアグラム中での転位電流、転位持続期間、およびその対応する分散に基づいてシングルチャンネル記録技術によりポリヌクレオチドの長さおよび組成を区別するために用いられる。ナノ細孔中で異なる電流遮断信号をもたらすと示された４つのＰＥＧタグを選択して、末端リン酸での４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）と結びつける。これらの新しいヌクレオチド類似体は、ポリメラーゼ反応において用いられ、図３３に示されるように組込まれた塩基を解読するための遊離したタグを検出するためにナノ細孔を用いる。
【０５６４】
この手法に対するいくつかの利点が存在する：
１）多くの異なる酵素の使用を回避する（費用および複雑性を節減する）。
【０５６５】
２）単一のタグ結合ヌクレオチドポリリン酸の連続的付加または各ヌクレオチドに結合した異なるタグを有する４つ全部のヌクレオチドの付加。
【０５６６】
３）単一単位分解能でナノ細孔により検出することができるタグとしてのＰＥＧの使用。
【０５６７】
４）タグがナノ細孔を通過する時のリアルタイム単一分子検出配列決定。
【０５６８】
５）低コストおよび高効率の大規模平行配列決定。
【０５６９】
図３３に示されるように、ＤＮＡポリメラーゼをナノ細孔に固定し、ＰＥＧタグ付ヌクレオチドと共に鋳型−プライマーを添加する。正確なＰＥＧタグ付ヌクレオチドの組込み時に、遊離したＰＥＧ−リン酸はナノ細孔を通過し、電気的遮断信号を測定する。異なる長さのＰＥＧは、異なる遮断信号を有し、かくして、４つの異なるＰＥＧを４つの異なるヌクレオチドのために用いることができる。
【０５７０】
正確なヌクレオチドが付加される場合、ヌクレオチドを一時に付加することができ、それは異なる遮断信号を与える。しかしながら、ヌクレオチドが鋳型核酸塩基と相補的ではない場合、それは組込まれず、かくして、信号は検出されない。大規模平行方法において、生化学的プロセスを実施するためのマイクロ／ナノウェルの高密度アレイを構築することができる。それぞれのマイクロ／ナノ−ウェルは、異なるＤＮＡ鋳型およびナノ細孔デバイスを保持する。遊離したＰＥＧを、単一分子感度で検出する。
【０５７１】
ＴＡＧ標識ヌクレオシド−５’−ポリリン酸の合成のための一般的方法を、図４９に示す。末端リン酸標識ヌクレオシド−５’−三、四、五または六リン酸を、対応するヌクレオシド−５’−三リン酸（ＮＴＰ）から出発して合成することができる。かくして、三リン酸を最初にＤＣＣ／ＤＭＦで活性化し、これをＴＡＧ−求核試薬と直接反応させて、ＴＡＧ結合ＮＴＰを得るか、またはそれを、ＴＡＧ−ＮＨＳまたは適切に活性化されたＴＡＧを反応させてＴＡＧ−リンカー結合ＮＴＰを提供することができるリンカー求核試薬と反応させることができる。ＴＡＧ結合ヌクレオシド四リン酸（Ｎ４Ｐ）または五リン酸（Ｎ５Ｐ）の合成のために、活性化三リン酸を最初にリン酸またはピロリン酸と反応させて、それぞれ、四−および五リン酸を得て、これをリンカー求核試薬と反応させた後、適切な活性化ＴＡＧと反応させることができる。
【０５７２】
ＰＥＧ標識ヌクレオチドの合成は、上記の例２および３で考察されている。ＰＥＧ標識ヌクレオチドは、三−、四−、五−、または六−リン酸の使用に基づいて−３、−４、−５、または−６の電荷を有する。ポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応の後、遊離したＰＥＧ−タグ上の正味の電荷は、出発ＰＥＧ−ヌクレオチドよりも小さいものであり（−１）、これはナノ細孔イオン遮断信号によって区別するのに十分なものである（未反応のＰＥＧ−ヌクレオチドも、遊離したＰＥＧ−リン酸よりもかさ高く、かくして、異なるイオン遮断信号である）。あるいは、アルカリホスファターゼが反応混合物中に存在する場合、遊離したＰＥＧは中性である（遊離リン酸基はアルカリホスファターゼにより加水分解される）。遊離したＰＥＧ−タグはまた、それらをナノ細孔により容易に検出することができるように、以下に示されるように正に帯電させることができる。同様に、それらを高度に負に帯電させることもできる。
【０５７３】
正に帯電したＴＡＧ結合ヌクレオシド−ポリリン酸の合成：
正に帯電したＴＡＧ結合ヌクレオシド−ポリリン酸を、図４４に示されるように合成する。最初に、正に帯電したトリメチル−（リシン）n−グリシンアミノ酸（Ｋ（（Ｍｅ）3）n−Ｇｌｙ）を、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルと反応させた後、活性化して、ＰＥＧ−Ｋ（（Ｍｅ）3）n−Ｇｌｙ−ＮＨＳエステルを形成させる。この活性化エステルを、図３８および４４に示されるようにアミノ末端ヌクレオシド−ポリリン酸と反応させる。ヌクレオシド−四リン酸上の正味の電荷は中性であるが、ポリメラーゼ組込み後、遊離したＰＥＧは＋１の正電荷を有し、アルカリホスファターゼを反応カクテルに添加した場合、遊離したＰＥＧ上の正味の電荷は＋４である。かくして、遊離したＴＡＧを容易に分離し、ナノ細孔を通過させることにより同定することができる。
【０５７４】
ナノ細孔検出を用いる合成による配列決定のための３’−遮断−ＰＥＧ結合ヌクレオシド−ポリリン酸の合成
３’−遮断ヌクレオシド−ポリリン酸の合成は、出発ヌクレオシド−５’−三リン酸が３’−Ｏ−遮断−ｄＮＴＰであることを除いて、ＴＡＧ結合ヌクレオシド−ポリリン酸について示されたものと同じ経路に本質的に従う。図５０に示されるように、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰ（６）を最初にＣＤＩまたはＤＣＣ／ＤＭＦと反応させた後、リン酸（四リン酸）またはピロリン酸（五リン酸）と反応させる。これを、精製後に適切な求核試薬と反応させて、アミノ末端リン酸を提供した後、適切なＰＥＧ−ＮＨＳエステル（中性、正帯電または負帯電）と反応させて、必要な３’−Ｏ−遮断−ＰＥＧ結合ヌクレオシド−ポリリン酸を提供する。
【０５７５】
ＰＥＧ−ヌクレオチドおよびナノ細孔検出を用いる配列決定スキーム（ＤＮＡ分子の多くのコピーをビーズ上に固定し、ＰＥＧ−ヌクレオチドを１個ずつ連続的に付加する）。
【０５７６】
図５１に示されるように、ＤＮＡ分子をビーズ上に固定する。かくして、それぞれのビーズは、同じＤＮＡ分子の多くのコピーを有する。ビーズをマイクロ／ナノ−ウェルに添加し、これをナノ細孔に結合させる。ＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼと複合体を形成し、ナノ細孔に結合されるか、またはＰＥＧ結合ヌクレオチドと共にマイクロ／ナノ−ウェルに添加される。ヌクレオチドを１つずつ添加することができ、正確なヌクレオチドを添加する場合、それは組込まれ、ナノ細孔を通過した場合に異なる遮断信号を与えるＰＥＧ−タグを遊離する。しかしながら、ヌクレオチドが鋳型核酸塩基と相補的でない場合、それは組込まれず、かくして、信号は検出されない。この場合、同じ長さおよび分子量のＰＥＧを４つ全部のヌクレオチド上で用いるか、または必要に応じて、４つの異なるＰＥＧを用いることもできる。かくして、核酸塩基の付加を、単一分子感度でナノ細孔遮断信号によって容易に検出することができる。
【０５７７】
３’−Ｏ−遮断ＰＥＧ−ヌクレオチドおよびナノ細孔検出を用いる合成による配列決定（ＤＮＡ分子の多くのコピーをビーズ上に固定し、４つ全部の３’−Ｏ−遮断ＰＥＧ−ヌクレオチドを同時に付加する）。
【０５７８】
ＤＮＡのホモポリマー領域を、この手法を用いて正確に配列決定することができる。かくして、ヌクレオチドの３’−ＯＨ基が可逆性部分によって遮断された場合、ＤＮＡ合成はたった１個のヌクレオチドの付加後に停止する。遮断基の除去後に合成を継続して、遊離３’−ＯＨ基を生成することができる。図５２に示されるように、４つ全部の異なるサイズのＰＥＧ結合３’−Ｏ−アジドメチル−ヌクレオチドを反応マイクロ／ナノ−ウェルに添加することができ、正確なヌクレオチドが組込まれた時にいつでも、ナノ細孔を通過させることによって遊離したＰＥＧ−タグを読み取り、イオン信号を検出する。３’−ＯＨ基が遮断されるため、ただ１個のヌクレオチドが一時に付加される。この３’−Ｏ−遮断基を、ＴＥＣＰ処理により切断することができ、かくして、遊離ＯＨ基はさらなるヌクレオチド組込みにとって準備できている。反復的ヌクレオチド付加および切断により、ホモポリマー領域を正確に、および容易に配列決定することができる。
【０５７９】
ナノ細孔を用いる大規模平行パイロシーケンシング：
図５３に示されるように、大規模平行方法において、生化学的プロセスを実施するためのマイクロウェルの高密度アレイを構築することができる。それぞれのマイクロ／ナノ−ウェルは、異なるＤＮＡ鋳型およびナノ細孔デバイスを保持する。遊離したＰＥＧは単一分子感度で検出される。
【０５８０】
実験の概要：
１）異なるサイズ、長さ、分子量、電荷の任意のＴＡＧをヌクレオチドの末端リン酸に結合させ、これをポリメラーゼ組込み後にナノ細孔によって検出することができる。
【０５８１】
２）ＴＡＧの三−、四−、五−、六−リン酸への結合。
【０５８２】
３）電気的検出。
【０５８３】
４）ビーズまたは固相表面に結合したＤＮＡ分子群および単一分子検出感度（高密度および高感度）。
【０５８４】
５）ＴＡＧ結合−３’−Ｏ−遮断ヌクレオチドを用いることによる容易に配列決定されるホモポリマー領域。
【０５８５】
６）サイクルあたり１個のＴＡＧ−ヌクレオチドを付加する。
【０５８６】
７）ホモポリマー領域を配列決定するために４つ全部の可逆的にタグ付けられたヌクレオチドを一緒に付加する。
【０５８７】
８）高い感度、精度および速度。
【０５８８】
９）大規模平行配列決定。
【０５８９】
例７
ナノ細孔を用いる溶液中での単一分子質量／サイズ分光分析
方法
溶媒を含まない平面脂質二重膜を、２つの同一のテフロン（登録商標）チャンバを分離する２５μｍの厚さのテフロン（登録商標）パーティション中、約７０μｍ直径の穴上で、ペンタン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）中のジフィタノイルホスファチジルコリン（１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａ．）から形成させた。穴を、ペンタン中の１：４００ｖｏｌ／ｖｏｌのヘキサデカン（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）の溶液で予備処理した。両チャンバは、濃クエン酸（Ｆｌｕｋａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でｐＨ７．５に調整された、４Ｍ  ＫＣｌ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｋｙ．）、５ｍＭ  ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（Ｔｒｉｓ；Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍａｎｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）を含有していた。
【０５９０】
シングルチャンネルを、約０．２５μｇのα−溶血素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｃａｌｉｆ．）をパーティションの一方の側の溶液に添加することにより形成させた。シングルチャンネルを形成させた後、第１のチャンバを新鮮なバッファーで迅速に洗い流して、さらなるチャンネル組込みを防止した。別途記述しない限り、データは、Ｖｙｃｏｒ塩架橋（３Ｍ  ＫＣｌ）によりバルク電解質から分離された２つのＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いて−４０ｍＶの印加電位を用いて得られたものである。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂパッチ−クランプ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）を用いて電流を測定し、５０ｋＨｚでデジタル処理する前に４極Ｂｅｓｓｅｌフィルターを用いて１０ｋＨｚでフィルタリングした。
【０５９１】
α−溶血素毒素は、異なる伝導性レベルおよびゲート化特性を有する少なくとも２つの配座異性体を形成してもよい。より高い伝導性の配座異性体のみがここで用いられ、これは±５０ｍＶの間で３．７５ｎＳの近似オーム伝導性を有していた（データは示さない）。ＰＥＧ（多分散性ＰＥＧ１５００；Ｆｌｕｋａ；または単分散性ＰＥＧ１２９４；Ｐｏｌｙｐｕｒｅ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を、０．０４５ｍｇ／ｍｌの最終濃度で電解質中の１２ｍｇ／ｍｌの保存溶液から第２のチャンバに添加した。
【０５９２】
ＰＥＧ試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを、リフレクトロンモードを用いることにより、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、Ｍａｓｓ．）を用いて得た。脱離／イオン化を、窒素レーザーからのパルスＵＶ光（３３７ｎｍ）を用いる照射によりもたらした。この機器を、６００ｎｓに設定した抽出遅延時間を用いることにより陽イオンモードで２５ｋＶで運転した。各スペクトルの出現に関する閾値よりもわずかに高く設定されたレーザー出力でレーザーを試料の表面上で動かしながら、１００回のショットから最終的なスペクトルを平均した。試料を、蒸留水中の１％ｗｔ／ｗｔ  ＰＥＧ溶液から調製した。マトリックス溶液は、０．１％フルオロ酢酸（Ｍａｔｈｅｓｏｎ、Ｊｏｌｉｅｔ、Ｉｌｌ．）を添加したａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）で飽和した１：１のアセトニトリル：水であった。試料およびマトリックスを１：１で混合して、乾燥前に全量２μｌにした。
【０５９３】
考察
分析物の非存在下では、ＤＣ電位により引き起こされるイオン電流は明確に定義される。イオン電流中の固有ノイズは、ナノ細孔および抵抗障壁容量におけるイオンのブラウン運動により一部引き起こされ得る。分析物（例えば、ポリ（エチレングリコール））の添加は、伝導性の明確に定義された一過的低下を引き起こす。それぞれのパルスは、ナノ細孔中の単一のＰＥＧ分子の存在に対応してもよい。電流の減少は、多分散性ＰＥＧ−１５００試料（平均分子質量〜１５００ｇ／ｍｏｌ）についてはわずかに〜５０ピコアンペアの範囲を包含する。
【０５９４】
非電解質ポリマーは、それらが脂質二重膜中の単独ナノ細孔中に分配されるため、イオン電流の明確に定義された減少を引き起こす。イオン電流は、ポリマーを含まない溶液に浸けられたα−溶血素チャンネルを通して、休止する。多分散性ＰＥＧ（Ｍr＝１，５００ｇ／ｍｏｌ）の添加は、永続的な電流減少伝導パルスを引き起こす。
【０５９５】
単一ナノ細孔は、異なる分子質量を有するポリマー間を識別する。多分散性（Ｍr＝１，５００）および単分散性（Ｍ＝１，２９４ｇ／ｍｏｌ、ｎ＝２９）のＰＥＧにより引き起こされる伝導状態間の差異は、容易に見分けられる。時系列データは、多分散性および単分散性ＰＥＧ試料について、それぞれ約５００および約７００の事象を含んでいた。イオン電流の全点ヒストグラムは、２つのポリマー試料の異なる性質を反映する。各試料に関するイオン電流ヒストグラムを、１０5を超える減少伝導パルス事象から算出した。単分散性ＰＥＧ時系列においてゼロ近くの長寿命の小さいイオン電流減少伝導パルスは、ＰＥＧ試料中の不純物により引き起こされる可能性が最も高い。これらの事象は長寿命であるが、数は少ない。
【０５９６】
質量またはサイズスペクトルの較正を、いくつかの技術により達成してもよい。例えば、標準サイズの分析物を用いる伝導性に基づく実験の反復により、多分散性試料データとして示される多分散性試料中のＰＥＧ１２９４ｇ／ｍｏｌのピークの割り当てが可能になる。伝導性に基づくヒストグラムにおける近隣のピークは、単一のエチレングリコール単位（すなわち、ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）が異なるＰＥＧ分子により引き起こされる。伝導性に基づくサイズ分布と同じ多分散性ＰＥＧ試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルとの比較は、この方法の精度を証明している。
【０５９７】
例８
タグ付ポリリン酸ヌクレオチドおよびナノ細孔を用いる単一分子配列決定
個別化医療のために単一のＤＮＡおよびＲＮＡ分子を正確に配列決定する有意な必要性が存在する。単一分子レベルで、初めは各ヌクレオチドの５’−リン酸に結合していた４つの異なるサイズのタグを正確に区別する、新規ナノ細孔に基づく合成による配列決定（ＳＢＳ）戦略がここに記載される。各ヌクレオチドはポリメラーゼ反応中に増殖中のＤＮＡ鎖に組込まれるため、そのタグはタグ付ヌクレオチドのα−リン酸と、前のヌクレオチドの３’−ＯＨ基とのホスホジエステル結合形成により遊離される。遊離したタグは、それらが遊離した順序でナノ細孔に進入し、そのサイズ、形状および電荷のためユニークなイオン電流遮断特徴に影響し、それによって、単一塩基分解能で単一分子レベルで電気的にＤＮＡ配列を決定する。非限定例として、４つの異なる長さのＰＥＧ−クマリンタグを、２’−デオキシグアノシン−５’−四リン酸の末端リン酸に結合させる。ポリメラーゼ反応中にこれらの改変ヌクレオチドの効率的な組込みが観察され、これは異なるタグがナノ細孔イオン電流を減少させる程度に基づく４つのタグ間での６σより良好なタグ識別である。アレイ形式でナノ細孔に共有結合したポリメラーゼと共にここで記載される分子手法は、単一分子ナノ細孔に基づくＳＢＳプラットフォームをもたらす。
【０５９８】
方法
クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチド類似体の合成
全てのヌクレオチドを、１５０ｘ４．６ｍｍのカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、移動相：Ａ、８．６ｍＭ  Ｅｔ3Ｎ／１００ｍＭ  １，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／水（ｐＨ８．１）；Ｂ、メタノール上での逆相ＨＰＬＣにより精製する。溶出を、１０ｍｉｎかけて１００％のＡアイソクラチック、次いで、２０ｍｉｎの０〜５０％のＢの線形勾配、および次いでさらに３０ｍｉｎかけて５０％のＢアイソクラチックから実施する。
【０５９９】
Ａ．クマリン−ＰＥＧｎ−ｄＧ４Ｐの合成
クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐの合成は、図１５のスキームに示されるような３つの工程を含む。
【０６００】
Ａ．１  ２’−デオキシグアノシン−５’−四リン酸（ｄＧ４Ｐ）の合成：
最初に、２’−ｄＧ４Ｐの合成を、２’−ｄＧＴＰから出発して実行する。３００μモルの２’−ｄＧＴＰ（トリエチルアンモニウム塩）を、無水ピリジン（５ｍｌ）中の１．５ｍｍｏｌ（５当量）のトリブチルアミンを用いることによりトルブチルアンモニウム塩に変換する。得られる溶液を濃縮乾固し、５ｍｌの無水ＤＭＦ（ｘ２）で共蒸発させる。ｄＧＴＰ（トリブチルアンモニウム塩）を５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、１．５ｍｍｏｌの１，１−カルボニルジイミダゾールを添加する。反応物を６ｈ撹拌した後、１２μｌのメタノールを添加し、撹拌を３０ｍｉｎ続ける。この溶液に、１．５ｍｍｏｌのリン酸（トリブチルアンモニウム塩、ＤＭＦ中）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌する。
【０６０１】
反応混合物を水で希釈し、０．１Ｍ〜１ＭのＴＥＡＢ勾配（ｐＨ７．５）を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ−Ａ２５カラム上で精製する。ｄＧ４Ｐは勾配の終わりに溶出する。適切な画分を合わせ、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製して、１７５μｍｏｌの純粋な四リン酸（ｄＧ４Ｐ）を提供する。31Ｐ−ＮＭＲ：δ、−１０．７（ｄ、１Ｐ、α−Ｐ）、−１１．３２（ｄ、１Ｐ、δ−Ｐ）、−２３．２３（ｄｄ、２Ｐ、β、γ−Ｐ）；ＥＳＩ−ＭＳ（−ｖｅモード）：計算値５８７．２；実測値５８５．９（Ｍ−２）。
【０６０２】
Ａ．２  ｄＧ４Ｐ−ヘプチル−ＮＨ2の合成：
２ｍｌの水および３．５ｍｌの０．２Ｍ  １−メチルイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６）中の８０μｍｏｌのｄＧ４Ｐに、１５４ｍｇのＥＤＡＣおよび２６０ｍｇのジアミノヘプタンを添加する。得られる溶液のｐＨを濃ＨＣｌで６に調整し、室温で一晩撹拌する。この溶液を水で希釈し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ａ２５イオン交換クロマトグラフィー、次いで、逆相ＨＰＬＣにより精製して、約２０μｍｏｌのｄＧ４Ｐ−ＮＨ2を得る。これをＥＳＩ−ＭＳデータ（−ｖｅモード）により確認する：計算値６９９．１；実測値（６９８．１、Ｍ−１）。
【０６０３】
Ｂ．クマリン−ＰＥＧ−酸およびＮＨＳエステルの合成：
市販のアミノ−ｄＰＥＧ−酸（アミノ−ｄ（ＰＥＧ）１６、２０、２４、３６−酸；Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を、６−メトキシクマリン−ＮＨＳエステルと反応させて、対応するクマリン−（ＰＥＧ）n−酸を提供する。アミノ−ＰＥＧ−酸（１当量）を炭酸−重炭酸バッファー（ｐＨ８．６）に溶解した後、ＤＭＦ中のクマリン−ＮＨＳ（１当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌する。クマリン−ＰＥＧ−酸を、ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ（５〜１５％）混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、適切な画分を合わせる。これらの化合物を、1Ｈ  ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により分析する。
【表４】
0006456816.tif 000078
【０６０４】
クマリン−ＰＥＧ−酸を、無水ＤＭＦ中の１．５当量のジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）および２当量のトリエチルアミンと２ｈ反応させることにより、対応するＮＨＳエステルに変換する。得られるＮＨＳエステルは、シリカゲルプレート上で酸よりもわずかに高く移動し、これをＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ（５〜１５％）混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、次の工程で用いる。
【０６０５】
Ｃ．クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐ：
上記の工程ＡからのｄＧ４Ｐ−ヘプチル−ＮＨ２を、０．１Ｍ炭酸−重炭酸バッファー（ｐＨ８．６）中に取り、この撹拌溶液に、クマリン−ＰＥＧ−ＮＨＳ化合物（ＤＭＦ中）の１つを添加する。得られる混合物を室温で一晩撹拌した後、シリカゲルカートリッジ（未反応のクマリン−酸または−ＮＨＳを除去するためのＣＨ2Ｃｌ2中の１５〜２５％ＭｅＯＨ、次いで、６：４：１のイソプロパノール／ＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ）上で精製する。これを、逆相ＨＰＬＣによりさらに２回精製して、純粋なクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐを提供する。この構造をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ上での分析により確認する。クマリン−ＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３１．７ｍｉｎ；クマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３２．２ｍｉｎ；クマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３３．０ｍｉｎ；クマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３４．３ｍｉｎ。
【表５】
0006456816.tif 000079
【０６０６】
クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐを用いるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応：
伸長反応を、ループした鋳型−プライマー（５’−ＧＡＴＣＧＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＣ−３’、Ｍ．Ｗ．７９６６）を用いて実施し、ここで鋳型上の次の相補的塩基はＣであり、単一のＧによる伸長を可能にする（図５６）。それぞれの伸長反応を、３μＭのループした鋳型−プライマー、１Ｘ  Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒγバッファー（５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．０２％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（ｐＨ９．２＠２５℃））、２ユニットのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒγＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１５μＭのクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチドの１つからなる２０μｌの反応液中、６５℃で２５分間、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーマルサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で実行する。ＤＮＡ伸長産物をエタノールと共に沈降させ、Ｃ１８  ＺｉｐＴｉｐカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して精製し、ＡＢＩ  Ｖｏｙａｇｅｒ装置を用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより特徴づける。図５８に示されるように、４つの同一の産物（予想分子量８，２９５）が得られる。
【０６０７】
それぞれのクマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐのためのポリメラーゼ伸長反応を繰り返し、産物（クマリン−ＰＥＧn−三リン酸、図５７）をアルカリホスファターゼ（３７℃で１５ｍｉｎ、１Ｕ）で処理して、クマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2タグを得る。これらのものをジクロロメタン中に抽出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により特徴づける。
【０６０８】
クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐの酸加水分解（図５７）：
酢酸をクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチドに添加して、１０％の最終濃度にし、溶液を一晩激しく振とうして、δリン酸とヘプチルアミンとのＮ−Ｐ結合の加水分解を確実にする。ＣｅｎｔｒｉＶａｐを用いて溶液を乾燥し、適切な容量の水に再懸濁する。１μｌのアリコートをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析特徴づけのために収集し、第２のアリコートを、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光計を用いて２６０ｎｍおよび３５０ｎｍで測定する。
【０６０９】
得られるクマリン−ＰＥＧ−アミン化合物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより測定された場合、予想されるサイズである（図１６および以下の表を参照されたい）。
【表６】
0006456816.tif 000080
【０６１０】
ナノ細孔測定：
膜およびチャンネル形成
単一のα−溶血素チャンネルを、以前に記載のように（Ｒｅｉｎｅｒら、２０１０）、２つの電解質溶液ウェルを分離する２５μｍの厚さのＴｅｆｌｏｎパーティション中、約８０μｍ直径の穴にわたって製造された無溶媒平面脂質二重膜（ＢＬＭ）（Ｍｏｎｔａｌら、１９７２）中に挿入する。クエン酸でｐＨ７．２に滴定した４Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを、実験を通して用いる。最初にパーティションを１％ｖ／ｖのヘキサデカン／ペンタンで湿潤させることにより、膜を形成させる。ペンタン中の１０ｍｇ／ｍＬのジフィタノイルホスファチジルコリン（ＤＰｈｙＰＣ）を、Ｔｅｆｌｏｎパーティション中の穴の下の溶液レベルウェルとの両方の空気−電解質溶液境界面に拡散させる。１０ｍｉｎ後、溶液レベルを自発的に穴の上まで上昇させて、膜を形成させる。約０．５μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ  α−溶血素を、膜にすぐ隣接する溶液中に注入し、シングルチャンネルが膜中に挿入されるまでイオン電流を観察する。次いで、ｃｉｓチャンバの含量をタンパク質を含有しない電解質溶液と交換して、シングルチャンネルを維持する。
【０６１１】
クマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2分子（ｎ＝１６、２０、２４および３６）を細孔のｔｒａｎｓ側（チャンネルのβ−バレル側と定義される）に添加して、それぞれの成分を０．４μｍｏｌ／Ｌ〜１μｍｏｌ／Ｌの最終濃度にする。イオン電流を約１５ｍｉｎ、固定電位（−４０ｍＶ）で２つの一致したＡｇ／ＡｇＣｌ（３Ｍ  ＫＣｌ）間で記録して、十分な計測統計値を達成する。データを、１０ｋＨｚで４極Ｂｅｓｓｅｌフィルターを用いて記録し、５０ｋＨｚで過剰サンプリングした。
【０６１２】
データ分析
データを、以前に記載されたように（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら、２００８）、ＬａｂＶＩＥＷ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で書かれた社内プログラムを用いてオフラインで分析する。簡単に述べると、オープン状態で５σの電流ノイズに設定された単純閾値アルゴリズムに基づいて事象検出器を用いて遮断を検索する。事象が検出された場合、上昇時間および崩壊時間における点を廃棄する（それぞれ、〜６０μｓおよび２０μｓ）。平均遮断深度を、残りの点から算出し、オープンチャンネル電流を閾値から０．２ｍｓ離れた平均０．８ｍｓのオープンチャンネルデータから算出する。データを平均の比（＜ｉ＞／＜ｉopen＞）として報告し、ナノ細孔スペクトルをこれらの値のヒストグラムとして算出する。
【０６１３】
考察
１９９６年に、Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６）が、α−溶血素（αＨＬ）チャンネルを用いて単一分子レベルで核酸を検出することができることを初めて示した。αＨＬチャンネルは、１．５ｎｍ直径の限界開口部を有し（Ｓｏｎｇら、１９９６；Ｂｅｚｒｕｋｏｖら、１９９６；Ｋｒａｓｉｌｎｉｋｏｖ  ２００２；Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  １９９５）、細孔が無期限に開いたままになるようにその電圧依存的ゲーティングを制御することができ（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  １９９５）、それをナノ細孔に基づく検出および識別のための理想的な候補にする。個々の一本鎖ポリアニオン核酸を、印加された電界によって細孔を通して誘導し、ポリヌクレオチドは細孔伝導性の明確に定義された、一過的減少を引き起こす（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６；Ｖｅｒｃｏｕｔｅｒｅら、２００１；Ｄｅａｍｅｒら、２００２；Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  ２００４）。細孔中でのポリヌクレオチドの滞留時間はＲＮＡまたはＤＮＡの輪郭の長さに比例するため、４つの塩基を互いに識別することができる場合、ナノ細孔はティッカーテープ様式でＤＮＡを配列決定することができることが示唆される（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９６）。その目標に向かって（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ  １９９６；Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、２００８；Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、２００２）、細孔中で共有結合したアダプタを含むαＨＬチャンネルが、未標識のヌクレオシド−５’−モノリン酸を同定するために用いられている（Ｃｌａｒｋｅら、２００９）。しかしながら、ＤＮＡを配列決定するためのこの概念に基づく完全なエキソヌクレアーゼ−ナノ細孔システムは、文書化されていない。
【０６１４】
単一分子レベルでのＤＮＡのいくつかの物理的特性を検出および特徴づけるナノ細孔の能力にも拘らず、一本鎖ＤＮＡをナノ細孔に通過させることによる正確な塩基間配列決定というより求められる目標は未だ実現されていない。Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは最近、４％のエラー率で３塩基の分解能でナノ細孔中で鎖配列決定を達成する能力を公表した（ＡＧＢＴ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、２０１２）。別のグループは、ナノ細孔を用いる単一塩基分解鎖配列決定を報告したが、ホモポリマー配列を正確に決定することは難しかった（Ｍａｎｒａｏら、２０１２）。
【０６１５】
天然αＨＬチャンネルは、高い分解能の分子識別の固有能力を有する。例えば、それは、水性Ｈ+とＤ+イオンとを識別することができ（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚら、１９９５）、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら（２００７）は最近、チャンネルがモノマーレベルでポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）分子を容易に分離することができることを示した。後者の研究において、個々のＰＥＧ分子により引き起こされる平均電流から見積もられる分子質量またはサイズスペクトルは、エチレングリコール反復単位を容易に分析する。さらに、細孔中でのポリマーの平均滞留時間は、ＰＥＧ質量と共に増加する（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、２００７；Ｒｅｉｎｅｒら、２０１０）。これらの観察およびＤＮＡポリメラーゼが効率的な基質として５’−末端リン酸基に広範囲の改変を含むヌクレオチド類似体を認識することができるという事実に基づいて（Ｋｕｍａｒ  ２００５、２００６、２００８；Ｓｏｏｄら、２００５；Ｅｉｄら、２００９）、ヌクレオチド自体の代わりに遊離した副産物（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ反応に由来する異なる長さのＰＥＧタグ、図９）の検出および区別により個々の塩基を同定することができる新しい単一分子ＤＮＡ配列決定手法が開発される。
【０６１６】
この手法において、ポリメラーゼ反応におけるホスホジエステル結合形成の間に、組込まれたヌクレオチド中のα−βリン酸結合の切断はタグを遊離する。それぞれの塩基について異なるタグを用いる４塩基反応配列の例を、図３０に示す。そのようなナノ細孔のアレイは、その１つを図３３に図示するが、それぞれ細孔の入口の１つに隣接する共有結合したポリメラーゼを有し、合成（ＳＢＳ）による単一分子配列決定を可能にする。それぞれのヌクレオチドの付加を、ナノ細孔伝導性に対する遊離したタグの効果により決定する。
【０６１７】
５’−リン酸タグに基づくＳＢＳシステムは、ポリメラーゼ伸長および遊離速度が細孔を通過するタグ通過時間よりも遅いため、細孔を通過する速度は最早問題ではないという点で、ナノ細孔を通過させる鎖配列決定と比較して利点を提供する。これはまた、鎖配列決定法に固有の位相化問題を排除することができる。４つの異なる長さのＰＥＧおよびクマリン部分を有する５’−リン酸結合タグを用いるヌクレオチドの合成および効率的な組込みが記載される。単一分子レベルでのα−溶血素細孔における遊離したタグの４つの異なる電流遮断パターンが示され、単一分子電気的ＳＢＳ手法の実現可能性を確立する。
【０６１８】
ＰＥＧ標識ヌクレオチドの設計、合成および特徴づけ
４つの５’−リン酸タグ付２’−デオキシグアノシン−５’−四リン酸（図５４）を、図１５に示される一般化された合成スキームに従って合成する（詳細については上記の方法を参照されたい）。最初に、２’−デオキシグアノシン−５’−三リン酸（ｄＧＴＰ）を、２’−デオキシグアノシン−５’−四リン酸（ｄＧ４Ｐ）に変換した後、ジアミノヘプタンリンカーを四リン酸の末端リン酸に付加して、異なる長さのＰＥＧタグを結合させる。別のセットの反応において、６−メトキシ−クマリンＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを、１６、２０、２４または３６のエチレングリコール単位を有する４つのアミノ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨ分子の１つと反応させて、クマリン−ＰＥＧn−ＣＯＯＨ分子を作製した後、対応するＮＨＳ−エステルに変換する。これらのものをｄＧ４Ｐ−ヘプチルアミン（ｄＧ４Ｐ−ＮＨ2）と反応させて、クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐと省略される４つの最終ヌクレオチド類似体を生成させる（図５４）。クマリン部分を用いて、中間体および最終ヌクレオチド類似体の精製を追跡する。予想される分子の合成を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法により確認する（図５５）。
【０６１９】
クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼのＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒγバリアントを用いるポリメラーゼ伸長反応において用いる。次の相補塩基がＣであり、ｄＧＭＰをＤＮＡプライマーに付加することができるプライマー−ループ−鋳型を設計する（図５６）。クマリン−ＰＥＧ−三リン酸は、反応中に遊離される（図５７）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより、４つのｄＧ４Ｐ類似体のそれぞれが実際に、８，２９０ダルトンのピークの出現により示されるように、１００％の組込み効率で正確な伸長産物を与えることが確認される（図５８）。７，９６６ダルトンでのプライマーピークの非存在は、反応が本質的に完了するまで進行したことを示唆している。
【０６２０】
分子は、２つの化合物間で１０ｍｉｎを超える保持時間差でこれらの分子を効率的に分離するＨＰＬＣシステムで２回精製されるため、全ての組込みはクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐ類似体であり、潜在的な残留ｄＧＴＰまたはｄＧ４Ｐではなかった。この可能性をさらに排除するために、精製されたクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐ類似体を、任意の夾雑する三−または四リン酸を遊離ヌクレオチドに分解することができるアルカリホスファターゼで処理し、伸長反応において得られるＨＰＬＣにより再精製されたクマリン−ＰＥＧ−ヌクレオチドを用いた。重要なことに、伸長した鎖はいかなる改変も含まない天然のヌクレオチドを含有し、ＳＢＳを広範囲の長さにわたって継続することができる。
【０６２１】
ポリメラーゼ反応に由来する遊離したタグは、クマリン−ＰＥＧ−三リン酸（クマリン−ＰＥＧ−Ｐ3、図５７）である。タグ上の電荷の複雑性を減少させるために、遊離したタグをアルカリホスファターゼで処理し、クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグを得て、そのナノ細孔電流遮断効果について分析する。ナノ細孔に基づくＳＢＳシステムのさらなる開発において、遊離したクマリン−ＰＥＧ−Ｐ3を、ポリメラーゼと同様、ナノ細孔の１つの入口に結合させることができるアルカリホスファターゼで処理して、クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグを生成するか、または遊離した帯電タグを直接検出するためにナノ細孔を用いるための条件を最適化する。対象試験において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳおよびタンパク質ナノ細孔による試験のための大量の材料を得るために、合成型の予想される遊離したタグ（クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2）を、４つのクマリン−ＰＥＧ−ヌクレオチド類似体の酸加水分解により作製して、ポリリン酸とヘプチルアミン部分とのＰ−Ｎ結合を切断する（図５７）。
【０６２２】
例９
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる遊離したタグの特徴づけ
予想されるクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2分子を、ＨＰＬＣ精製の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により確認する（図１６）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、酸加水分解により生成されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグがアルカリホスファターゼ処理後のポリメラーゼ反応中に生成された遊離したタグと同一であることを示している。
【０６２３】
図１６を参照すれば、クマリン−ＰＥＧ１６−ＮＨ2を得るＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、クマリン−ＰＥＧ２０−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、クマリン−ＰＥＧ２４−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐの酸加水分解およびクマリン−ＰＥＧ３６−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解により生成されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により示されるように、アルカリホスファターゼによる処理後のポリメラーゼ伸長反応において生成された対応する遊離したタグと同一である。４つの別々に得られたＭＳスペクトルの合成画像を示す。クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグの構造を以下に示す。
【０６２４】
例１０
単一分子でのタンパク質ナノ細孔における遊離したタグの識別
図１７を参照すれば、酸加水分解により４つの同等のヌクレオチドから誘導される４つのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2化合物（ｎ＝１６、２０、２４および３６）をプールし、ナノ細孔測定のために４Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２中に希釈した。左側の時系列データは、これらのＰＥＧタグが単一のα−溶血素イオンチャンネルに進入する時、それらがそのサイズに特徴的な電流遮断を引き起こすことを示す。右側のヒストグラムは、個々の分子により引き起こされる平均電流遮断が１０ｋＨｚの測定バンド幅で基準分解能を示すことを示す。上側の色付きのバーは、データの６σ分布を表し（４つのＤＮＡヌクレオチドのそれぞれを表すことができる４つのＰＥＧタグのそれぞれに関するガウス分布と見なす）、これは、４つの異なる長さのＰＥＧを含む４つの異なるヌクレオチドをＤＮＡ配列決定のために用いる場合に生じてもよいＡ、Ｃ、ＧおよびＴ指定を用いることによりこの図面中で表される、単一の塩基を１／３００，０００の事象より良好な精度で識別することができることを示唆する。
【０６２５】
電気的単一分子ＳＢＳ手法を証明するために、４つの遊離したクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2タグを、αＨＬナノ細孔に対するその電流遮断効果について試験する（図１７）。遮断事象のヒストグラムの相対周波数分布（＜ｉ＞／＜ｉopen＞）は、４つのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2タグ（図１７、右下においてそれぞれ左から右に向かってｎ＝３６、２４、２０および１６）に関する４つの良好に分離した、異なるピークを示す。
【０６２６】
ピークの広い分離を強調し、特定のヌクレオチドの検出をその遊離したＰＥＧにより得られるユニークな遮断信号により達成することができることの明確な証拠を提供するために、ピークを単一のガウス関数に適合させ、対応する６σエラー分布を示す（図１７、右下における上部の色付きの長方形）。別々に適用されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2分子を、細孔を用いて特徴づけ（データは示さない）、この図面に示されたＰＥＧ関連ピークの同一性を確認する。
【０６２７】
ここに記載されるように、単一のαＨＬイオンチャンネルは、そのサイズに基づいて単一の分子を分離してもよく、単一モノマー単位のサイズより良好にＰＥＧの混合物を容易に分析する（すなわち、＜４４ｇ／ｍｏｌ）。この高い分解能は、ＰＥＧポリマー、電解質（移動性カチオン）およびαＨＬチャンネルの内腔に並ぶアミノ酸側鎖の間の相互作用から生じる。これらの相互作用により、分析物のサイズ、電荷および化学的特性に特異的であるナノメートル規模のセンサとして細孔を用いることができる。
【０６２８】
ここで、そのような分析は、いずれかの末端上に異なる化学基を有するＰＥＧに拡張される。図１７、上および左下に記録しているシングルチャンネルイオン電流は、４つの異なるサイズのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2分子により引き起こされる遮断を１つずつ説明するものである。非改変ＰＥＧに関して、それぞれの電流遮断は単一モードである（すなわち、ガウス分布および明確に定義された平均値を用いてよく説明される）。
【０６２９】
ナノ細孔配列決定のために４つの塩基（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）間を正確に識別するために、以下の戦略の１つ以上を採用する必要がある：１）検出信号の強度を増強および区別する；２）生成された電気的遮断信号を識別し、処理するための有効な方法を開発する；３）例えば、鎖配列決定のためにＤＮＡ移動を遅らせることにより、細孔を通過する核酸の転位速度を制御する；ならびに４）新しく、より効率的な合成ナノ細孔を設計および作製する。ここで証明されるように、個々の塩基を分解する問題を、４つのユニークなタグ間を識別する問題に転換することは、最初の３つの問題を本質的に解決する。
【０６３０】
ここで、４つのヌクレオチドを末端リン酸部分で改変することによりそれらの識別を増強するための新規手法を示す。Ｋｕｍａｒらは、四−および五リン酸を生成するためにより多くのリン酸基を導入し、末端リン酸に直接染料を導入するか、または末端リン酸と染料との間にリンカーを結合させることによる、ヌクレオシド−５’−三リン酸の改変を初めて報告した（Ｋｕｍａｒら、２００６、２００８）。四−および五リン酸は、より良好なＤＮＡポリメラーゼ基質であることが示され、フルオロフォア標識リン酸ヌクレオチドはＤＮＡ配列決定のために広く用いられてきた（Ｋｕｍａｒら、２００５；Ｓｏｏｄら、２００５；Ｅｉｄら、２００９；Ｓｉｍｓら、２０１１）。
【０６３１】
図３３に図示される単一分子ナノ細孔ＳＢＳシステムは、ナノ細孔入口の近くに結合したＤＮＡポリメラーゼを記載し、配列決定しようとする鋳型はプライマーに沿って付加される。この鋳型−プライマー複合体に、４つの異なるタグ付ヌクレオチドを一緒に付加する。ポリメラーゼが正確なヌクレオチドの組込みを触媒した後、タグに結合したポリリン酸は遊離され、ナノ細孔を通過して、電流遮断信号を生成し、それによって付加された塩基を同定する。それぞれのタグは、異なるサイズ、質量または電荷のため異なる電気的遮断特徴を生成する。
【０６３２】
タグの物理的および化学的特性をさらに調整して、捕捉効率および測定精度を最適化することができる。例えば、ポリリン酸とＰＥＧとの間への４つのリシンまたはアルギニンからなる正に帯電したリンカーの挿入は、中性電荷を有する前駆体および正味の正電荷を有する遊離したタグをもたらす。適切な規模および符号の電位を用いて、ヌクレオチド基質ではなく、遊離したタグを、細孔を通して輸送する。
【０６３３】
基質および産物のさらなる識別を、それぞれのナノ細孔の縁部にあるポリメラーゼの近くにいくつかの共有結合したアルカリホスファターゼ分子を含有させることにより達成し、タグ上でさらにより高い正電荷を確保することができる。ポリメラーゼ反応において遊離される全てのタグが適切な順序で維持されることが重要である。従って、２つの酵素の類似する代謝率のため、それぞれのポリメラーゼ分子にとっていくつかのホスファターゼ酵素が必要である。
【０６３４】
これら全ての予防策にも拘らず、いくらかの未反応のヌクレオチドが細孔に進入し得る。かくして、切断されたタグと未反応のヌクレオチドとを識別する能力が重要である；それらは、その有意なサイズおよび電荷の差異、ナノ細孔システムの固有の能力により容易に区別されるべきである。
【０６３５】
ここに記載の方法は、タンパク質ナノ細孔（例えば、αＨＬ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのポリンＡ、ＭｓｐＡ）（Ｄｅｒｒｉｎｇｔｏｎら、２０１０）または固体状態ナノ細孔（Ｇａｒａｊら、２０１０；Ｈａｌｌら、２０１０；Ｍｅｒｃｈａｎｔら、２０１０；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２０１０；Ｓｔｏｒｍら、２００５；Ｗａｎｕｎｕら、２００８）のいずれかに適用することができる。これらの戦略は、タグのライブラリーを検出するのに適している異なる特性を有するナノ細孔を提供する。ＤＮＡ配列決定のためのこの新規戦略を実装するために、ナノ細孔37のアレイを平面上で構築して、大規模平行ＤＮＡ配列決定を容易にすることができる。
【０６３６】
結論として、ポリメラーゼ反応のためのヌクレオチド基質上の新規遊離可能タグを利用するＳＢＳおよびナノ細孔に基づく単一分子ＤＮＡ配列決定プラットフォームが示される。そのようなプラットフォームは、長い、正確な読み、および非常な高効率の電気的単一分子ＤＮＡ配列決定を可能にする。
【０６３７】
例１１
クマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐヌクレオチド類似体の合成
全てのヌクレオチドを、１５０ｘ４．６ｍｍのカラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）、移動相：Ａ、８．６ｍＭ  Ｅｔ3Ｎ／１００ｍＭの１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール／水（ｐＨ８．１）；Ｂ、メタノール上での逆相ＨＰＬＣにより精製する。溶出を、１０ｍｉｎにわたる１００％のＡアイソクラチック、次いで、２０ｍｉｎにわたる０〜５０％のＢの線形勾配、次いで、さらに３０ｍｉｎにわたる５０％のＢアイソクラチックから実施する。
【０６３８】
クマリン−ＰＥＧｎ−ｄＧ４Ｐの合成：
クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐの合成は、図１５のスキームに示されるような３つの工程を含む。
【０６３９】
Ａ．１  ２’−デオキシグアノシン−５’−四リン酸（ｄＧ４Ｐ）の合成：
最初に、２’−ｄＧ４Ｐの合成を、２’−ｄＧＴＰから出発して実行する。３００μモルの２’−ｄＧＴＰ（トリエチルアンモニウム塩）を、無水ピリジン（５ｍｌ）中の１．５ｍｍｏｌ（５当量）のトリブチルアミンを用いることにより、トリブチルアンモニウム塩に変換する。得られる溶液を濃縮乾固し、５ｍｌの無水ＤＭＦ（ｘ２）と共蒸発させる。ｄＧＴＰ（トリブチルアンモニウム塩）を５ｍｌの無水ＤＭＦに溶解し、１．５ｍｍｏｌの１，１−カルボニルジイミダゾールを添加する。反応物を６ｈ撹拌した後、１２μｌのメタノールを添加し、撹拌を３０ｍｉｎ継続する。この溶液に、１．５ｍｍｏｌのリン酸（トリブチルアンモニウム塩、ＤＭＦ中）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌する。
【０６４０】
反応混合物を水で希釈し、０．１Ｍ〜１ＭのＴＥＡＢ勾配（ｐＨ７．５）を用いてＳｅｐｈａｄｅｘ−Ａ２５カラム上で精製する。ｄＧ４Ｐは勾配の終わりに溶出する。適切な画分を合わせ、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製して、１７５μｍｏｌの純粋な四リン酸（ｄＧ４Ｐ）を提供する。31Ｐ−ＮＭＲ：δ、−１０．７（ｄ、１Ｐ、α−Ｐ）、−１１．３２（ｄ、１Ｐ、δ−Ｐ）、−２３．２３（ｄｄ、２Ｐ、β、γ−Ｐ）；ＥＳＩ−ＭＳ（−ｖｅモード）：計算値５８７．２；実測値５８５．９（Ｍ−２）。
【０６４１】
Ａ．２  ｄＧ４Ｐ−ヘプチル−ＮＨ2の合成
２ｍｌの水および３．５ｍｌの０．２Ｍ  １−メチルイミダゾール−ＨＣｌ（ｐＨ６）中の８０μｍｏｌのｄＧ４Ｐに、１５４ｍｇのＥＤＡＣおよび２６０ｍｇのジアミノヘプタンを添加する。得られる溶液のｐＨを、濃ＨＣｌで６に調整し、室温で一晩撹拌する。この溶液を水で希釈し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−Ａ２５イオン交換クロマトグラフィー、次いで、逆相ＨＰＬＣにより精製して、約２０μｍｏｌのｄＧ４Ｐ−ＮＨ2を得る。これを、ＥＳＩ−ＭＳデータ（−ｖｅモード）により確認する：計算値６９９．１；実測値（６９８．１、Ｍ−１）。
【０６４２】
Ｂ）クマリン−ＰＥＧ−酸およびＮＨＳエステルの合成：
市販のアミノ−ｄＰＥＧ−酸（アミノ−ｄ（ＰＥＧ）１６、２０、２４、３６−酸；Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を、６−メトキシクマリン−ＮＨＳエステルと反応させて、対応するクマリン−（ＰＥＧ）n−酸を提供する。アミノ−ＰＥＧ−酸（１当量）を炭酸−重炭酸バッファー（ｐＨ８．６）中に溶解した後、ＤＭＦ中のクマリン−ＮＨＳ（１当量）を添加し、反応混合物を一晩撹拌する。クマリン−ＰＥＧ−酸を、ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ（５〜１５％）混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、適切な画分を合わせる。これらの化合物を、1Ｈ  ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析により分析する。
【表７】
0006456816.tif 000081
【０６４３】
クマリン−ＰＥＧ−酸を、無水ＤＭＦ中の１．５当量のジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）および２当量のトリエチルアミンと２ｈ反応させることにより対応するＮＨＳエステルに変換する。得られるＮＨＳエステルは、シリカゲルプレート上で酸よりもわずかに高く移動し、ＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ（５〜１５％）混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーによりこれを精製し、次の工程において用いる。
【０６４４】
Ｃ）クマリン−ＰＥＧn−ｄＧ４Ｐ：
上記の工程Ａ）に由来するｄＧ４Ｐ−ヘプチル−ＮＨ２を、０．１Ｍ炭酸−重炭酸バッファー（ｐＨ８．６）中に取り、この撹拌溶液に、クマリン−ＰＥＧ−ＮＨＳ化合物（ＤＭＦ中）の１つを添加する。得られる混合物を室温で一晩撹拌した後、シリカゲルカートリッジ上で精製する（未反応のクマリン−酸または−ＮＨＳを除去するためのＣＨ2Ｃｌ2中の１５〜２５％のＭｅＯＨ、次いで、６：４：１のイソプロパノール／ＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ）。これを逆相ＨＰＬＣによりさらに２回精製して、純粋なクマリン−ＰＥＧ−ｄＧ４Ｐを提供する。この構造を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ上での分析により確認する。クマリン−ＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３１．７ｍｉｎ；クマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３２．２ｍｉｎ；クマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３３．０ｍｉｎ；クマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐ：保持時間、３４．３ｍｉｎ。
【表８】
0006456816.tif 000082
【０６４５】
例１２
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる遊離したタグの特徴づけ
予想されるクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2分子を、ＨＰＬＣ精製後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により確認する（図１６）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳの結果は、酸加水分解により生成されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグが、アルカリホスファターゼ処理後にポリメラーゼ反応中に生成された遊離したタグと同一であることを示している。
【０６４６】
図１６を参照すれば、クマリン−ＰＥＧ１６−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ１６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、クマリン−ＰＥＧ２０−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ２０−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、クマリン−ＰＥＧ２４−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ２４−ｄＧ４Ｐの酸加水分解、およびクマリン−ＰＥＧ３６−ＮＨ2を得るクマリン−ＰＥＧ３６−ｄＧ４Ｐの酸加水分解により生成されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により示されるように、アルカリホスファターゼを用いる処理後にポリメラーゼ伸長反応において生成された対応する遊離したタグと同一である。４つの別々に得られたＭＳスペクトルの合成画像を示す。クマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2タグの構造を、右側に示す。
【０６４７】
例１３
単一分子でのタンパク質ナノ細孔における遊離したタグの識別
図１７を参照して、酸加水分解により４つの同等のヌクレオチドから誘導される、４つのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2化合物（ｎ＝１６、２０、２４、および３６）をプールし、ナノ細孔測定のために４Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２中に希釈した。左側の時系列データは、これらのＰＥＧが単一のα−溶血素イオンチャンネルに進入する時、それらがそのサイズに特徴的な電流遮断を引き起こすことを示す。右側のヒストグラムは、個々の分子により引き起こされる平均電流遮断が、１０ｋＨｚの測定バンド幅で基準分解能を示すことを示す。上側の色付きのバーは、データの６σ分布を表し（４つのＤＮＡヌクレオチドのそれぞれを表すことができる４つのＰＥＧタグのそれぞれに関するガウス分布と見なす）、これは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ指定を用いることによりこの図面で表された、単一の塩基を、４つの異なる長さのＰＥＧと共に４つの異なるヌクレオチドをＤＮＡ配列決定に用いる場合に生じてもよい１／３００，０００の事象より良好な精度で識別することができることを示唆する。
【０６４８】
電気的単一分子ＳＢＳ手法を証明するために、４つの遊離クマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2タグを、αＨＬナノ細孔に対するその電流遮断効果について試験する（図１７）。遮断事象のヒストグラムの相対周波数分布（＜ｉ＞／＜ｉopen＞）は、４つのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2タグ（図１７、右下においてそれぞれ左から右に向かってｎ＝３６、２４、２０および１６）に関する４つの良好に分離した、異なるピークを示す。
【０６４９】
ピークの広い分離を強調し、特定のヌクレオチドの検出をその遊離したＰＥＧにより得られるユニークな遮断信号により達成することができることの明確な証拠を提供するために、ピークを単一のガウス関数に適合させ、対応する６σエラー分布を示す（図１７、右下における上部の色付きの長方形）。別々に適用されたクマリン−ＰＥＧ−ＮＨ2分子を、細孔を用いて特徴づけ（データは示さない）、この図面に示されたＰＥＧ関連ピークの同一性を確認する。
【０６５０】
ここに記載されるように、単一のαＨＬイオンチャンネルは、そのサイズに基づいて単一の分子を分離してもよく、単一モノマー単位のサイズより良好にＰＥＧの混合物を容易に分解する（すなわち、＜４４ｇ／ｍｏｌ）。この高い分解能は、ＰＥＧポリマー、電解質（移動性カチオン）およびαＨＬチャンネルの内腔に並ぶアミノ酸側鎖の間の相互作用から生じる。これらの相互作用により、分析物のサイズ、電荷および化学的特性に特異的であるナノメートル規模のセンサとして細孔を用いることができる。
【０６５１】
ここで、そのような分析は、いずれかの末端上に異なる化学基を有するＰＥＧに拡張される。図１７、上および左下に記録しているシングルチャンネルイオン電流は、４つの異なるサイズのクマリン−ＰＥＧn−ＮＨ2分子により引き起こされる遮断を１つずつ説明するものである。非改変ＰＥＧに関して、それぞれの電流遮断は単一モードである（すなわち、ガウス分布および明確に定義された平均値を用いてよく説明される）。
【０６５２】
例１４
タグの検出
デバイスを用いて、４つの異なるタグ分子に関する４つの異なる電流レベルを検出する。図１９に見られるように、それぞれのタグを、他の３つのいずれかから区別することができる（すなわち、ヒストグラムは対応するタグと共にグラフ中で標識される４つの異なるピークを示す）。
【０６５３】
それぞれのタグ分子は、潜在的に改変された鎖中に２つの領域を有する３’末端上でビオチン化された、約３０塩基長のホモポリマー「Ｔ」である。それぞれの３０塩基長の分子において、改変された領域は、３’末端から、塩基位置１１、１２、および１３ならびに位置１７、１８および１９である。ここで用いられる場合、「ｘ」は、脱塩基部位（塩基なし）であり、「Ｔ」はチミンである。４つのタグは、
（ａ）配列；ストレプトアビジン−ビオチン−１０Ｔ−ｘｘｘ−３Ｔ−ｘｘｘ−１１Ｔを有するフェイクタグＸＸＸ−ＸＸＸ
（ｂ）配列；ストレプトアビジン−ビオチン−１０Ｔ−ＴＴＴ−３Ｔ−ｘｘｘ−１１Ｔを有するフェイクタグＴＴＴ−ＸＸＸ
（ｃ）配列；ストレプトアビジン−ビオチン−３０Ｔを有する３０Ｔタグ
（ｄ）配列；ストレプトアビジン−ビオチン−１０Ｔ−ＴＴＴ−３Ｔ−Ｔ−ＩｆｌｕｏｒＴ−Ｔ−１１Ｔ（ここで、位置１８のＴは蛍光で標識される）を有するフェイクタグｉＦｌｕｏｒＴ
である。
【０６５４】
結果は、経時的に溶液から複数の分子を捕捉するアレイ中の１つの細孔に関するものである。検出条件は、室温で２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝化された１Ｍ  ＫＣｌである。電圧を印加しながら、それぞれの分子を細孔中に捕捉および保持する。印加される電圧を＋１６０ｍＶに増大させ、新しい分子を捕捉し、電圧を０Ｖ以下に低下させ、タグ付分子は細孔の外に落ちる。次いで、サイクルを反復する。４つの異なるタグ分子が、同時に試料混合物中に存在する。
【０６５５】
図２０に示されるように、プロットの水平軸は時間（秒で測定）であるのに対して、垂直軸上は電流（ピコアンペア（ｐＡ）で測定）である。印加される電圧の波形は示さない。印加される電圧波形は０Ｖ未満から始まり、＋１６０ｍＶまで急速に増加し、約２．３秒間そこで保持する。次いで、電圧を０Ｖ未満まで低下させる。電流読み取りは印加される電圧に従い、捕捉された分子の電流は、印加される電圧が＋１６０ｍＶである間は平坦であり、次いで、電圧が低下するにつれて低下する。
【０６５６】
図１９に示されるように、低下中の電流もプロットされるため、１６０ｍＶの適用中に見られる明確なバンドはヒストグラム中で接続されたままになるか、またはわずかに不鮮明になる。これにも拘らず、異なる、反復可能な捕捉バンドをそれぞれのタグ分子について見ることができる。
【０６５７】
特定の実装を説明および記載してきたが、様々な改変をそれに対して行い、ここで想定することができることが、前述のことから理解されるべきである。また、本発明が、明細書内に提供される特定例により限定されることも意図されない。本発明を上記の明細書を参照して記載してきたが、ここで好ましい態様の記載および説明は限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。さらに、本発明の全ての側面は、様々な条件および変数に依存するここに記載される特定の描写、構成または相対的割合に限定されないことが理解されるべきである。本発明の態様の形態および詳細における様々な改変は、当業者には明らかである。従って、本発明は任意のそのような改変、変更および等価物も包含することが想定される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内にある方法および構造ならびにその等価物がそれによって包含されることが意図される。
また、以下に本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  （ａ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；
（ｃ）前記電界の変化を測定するための手段と；
（ｄ）前記細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；
（ｅ）前記細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素と
を含む伝導性測定システム。
［２］  前記細孔が、約１〜１０ｎｍの直径を有する、［１］に記載の伝導性測定システム。
［３］  前記ポリメラーゼと前記ホスファターゼ酵素が、前記細孔に共有結合している、［１］に記載の伝導性測定システム。
［４］  ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が、前記細孔に付着している、［１］に記載の伝導性測定システム。
［５］  ポリメラーゼ反応において前記ポリメラーゼによって生じたポリリン酸が、前記細孔に入る前に前記ホスファターゼ酵素と相互作用するように前記ホスファターゼ酵素が位置する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［６］  前記ホスファターゼ酵素と前記ポリリン酸との相互作用の速度が、前記ポリメラーゼが前記ポリリン酸を生じる速度と同じか、それを超える、［５］に記載の伝導性測定システム。
［７］  前記第１および前記第２の区画の各々が、電荷を有する、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［８］  前記細孔の内部が負電荷を有する、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［９］  前記細孔が、生物学的なものまたは合成によるものである、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１０］  前記細孔が、タンパク質性のものである、［９］に記載の伝導性測定システム。
［１１］  前記細孔が、α溶血素タンパク質である、［１０］に記載の伝導性測定システム。
［１２］  前記細孔が、固体細孔である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１３］  前記細孔が、グラフェンからなる、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１４］  各々が実質的に同一の特徴を有する細孔のアレイをさらに含む、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１５］  異なる直径の細孔のアレイをさらに含む、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１６］  細孔のアレイをさらに含み、前記細孔が、前記障壁を越えて異なる電界を印加するように構成されている、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１７］  前記伝導性測定システムが、ＣＭＯＳ電子回路と一体化している、［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の伝導性測定システム。
［１８］  図４６に示すように、前記細孔または細孔のアレイが、ＣＭＯＳダイに直接一体化している、［１７］に記載の伝導性測定システム。
［１９］  構造
【化６９】
0006456816.tif 000083
を有する化合物であって、前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、前記塩基がアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有する化合物。
［２０］  前記タグの前記電荷の大きさが、前記化合物の残りの前記電荷の大きさと同じである、［１９］に記載の化合物。
［２１］  前記タグが、複数のエチレングリコール単位を含む、［１９］または［２０］に記載の化合物。
［２２］  前記タグが、１６、２０、２４、または３６個のエチレングリコール単位を含む、［１９］〜［２１］のいずれか一項に記載の化合物。
［２３］  前記タグが、追加の識別可能な部分を含む、［１９］〜［２２］のいずれか一項に記載の化合物。
［２４］  前記追加の識別可能な部分が、クマリン性色素である、［２３］に記載の化合物。
［２５］  前記タグが、正電荷を有する、［１９］〜［２４］のいずれか一項に記載の化合物。
［２６］  前記タグの除去により、前記化合物の前記電荷が変化する、［１９］〜［２５］のいずれか一項に記載の化合物。
［２７］  前記タグが、適切な数のリシンまたはアルギニンをさらに含み、リン酸の数の均衡を保っている、［１９］〜［２６］のいずれか一項に記載の化合物。
［２８］  構造
【化７０】
0006456816.tif 000084
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物であって、前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、前記タグが、前記化合物の残りの前記電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体またはウラシルもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが他の３種類の化合物の各々にある前記タグと異なる、組成物。
［２９］  前記塩基および前記タグにおいて前記４種類の化合物の各々と異なる第５の種類の化合物をさらに含み、前記第４の種類の化合物の前記塩基がチミンまたはその誘導体である場合に、前記第５の種類の化合物の前記塩基がウラシルまたはその誘導体であり、または前記第４の種類の化合物の前記塩基がウラシルまたはその誘導体である場合に、前記第５の種類の化合物の前記塩基がチミンまたはその誘導体である、［２８］に記載の組成物。
［３０］  化合物のアイデンティティを決定する方法であって、
（ａ）前記化合物を、（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）前記電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと；
（ｂ）前記化合物が前記細孔を通り抜けて移行するときに、前記電界の前記変化を記録し、前記電界の前記変化が、前記化合物と前記電解質と前記細孔との相互作用の結果であり、前記化合物のサイズ、電荷および組成を示すことと
を含み、それによって、前記変化と所定の値との相関から前記化合物の前記アイデンティティを決定することが可能になる、方法。
［３１］  工程（ａ）の前にホスファターゼ酵素で前記化合物を処理する工程をさらに含む、［３０］に記載の方法。
［３２］  化合物がタグであるかまたは前記タグの前駆体であるかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記化合物を（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）前記電界の変化を測定するための手段とを含む伝導性測定システムと接触させることと；
（ｂ）前記化合物が前記細孔を通り抜けて移行するときに、前記電界の前記変化を記録することと；
（ｃ）前記電界の前記変化を、前記タグおよび前記タグの前記前駆体に対応する所定の値と比較することと
を含み、それによって、前記化合物が、前記タグであるかまたは前記その前駆体であるかどうかを決定する、方法。
［３３］  工程（ａ）において前記電界の電流バイアスを調節する工程をさらに含む、［３０］〜［３２］のいずれか一項に記載の方法。
［３４］  一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＤＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）前記電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）前記細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）前記細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化７１】
0006456816.tif 000085
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物と接触させ、
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の前記塩基がアデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の前記塩基がグアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の前記塩基がシトシンまたはその誘導体であり、第４の種類の化合物の前記塩基がチミンもしくはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが他の３種類の化合物の各々にある前記タグと異なり、
前記一本鎖ＤＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＤＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖ＤＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
［３５］  一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＤＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）前記電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）前記細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）前記細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化７２】
0006456816.tif 000086
を有する化合物と接触させ、
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはこれらの塩基のうち１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
前記一本鎖ＤＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＤＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＤＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし（１）前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＤＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＤＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＤＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖ＤＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
［３６］  一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＲＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）前記電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）前記細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）前記細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化７３】
0006456816.tif 000087
を有する異なる４種類の化合物を含む組成物と接触させ、
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、ｎが１、２、３または４であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、第１の種類の化合物の前記塩基が、アデニンまたはその誘導体であり、第２の種類の化合物の前記塩基が、グアニンまたはその誘導体であり、第３の種類の化合物の前記塩基が、シトシンまたはその誘導体であり、前記第４の種類の化合物の前記塩基が、ウラシルまたはその誘導体であり、各種類の化合物にある前記タグが、他の３種類の化合物の各々にある前記タグと異なり、
前記一本鎖ＲＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側の前記一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物のうちの１つの組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＲＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ｂ）を繰り返し実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖ＲＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
［３７］  一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
（ａ）前記一本鎖ＲＮＡを
（ｉ）ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を有する物理的障壁によって分離されている第１および第２の電解質溶液が入った第１および第２の区画と；（ｉｉ）前記障壁を越えて電界を印加するための手段と；（ｉｉｉ）前記電界の変化を測定するための手段と；（ｉｖ）前記細孔に付着している少なくとも１つのポリメラーゼと；（ｖ）前記細孔に付着している２つ以上のホスファターゼ酵素とを含む伝導性測定システム、および
構造
【化７４】
0006456816.tif 000088
を有する化合物と接触させ、
前記タグが、エチレングリコール、アミノ酸、炭水化物、ペプチド、色素、化学発光化合物、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド、脂肪酸、芳香族酸、アルコール、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アジド基、またはそれらの組合せのうちの１つ以上を含み、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＨまたはＯＨであり、ＸがＯ、ＮＨ、ＳまたはＣＨ2であり、ＺがＯ、ＳまたはＢＨ3であり、前記塩基が、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはこれら塩基のうちの１つの誘導体であり、ｎが１、２、３または４であり、前記タグが、前記化合物の残りの電荷に対して反対の符号の電荷を有し、
前記一本鎖ＲＮＡが、前記細孔に付着している前記ポリメラーゼと接触して電解質溶液中にあり、ＲＮＡ伸長産物を形成するように、プライマーの３’末端ヌクレオチド残基にハイブリダイズした前記一本鎖ＤＮＡのヌクレオチド残基の直ぐ５’側にある前記一本鎖ＲＮＡのヌクレオチド残基に対して前記化合物が相補的である場合に、前記ポリメラーゼが前記プライマーへの前記化合物の組み込みを触媒するのを可能にする条件下で、前記一本鎖ＲＮＡがその部分にハイブリダイズした前記プライマーを有し、
前記化合物が組み込まれない場合は、化合物が組み込まれるまで、異なる化合物との前記接触を反復して繰り返し、ただし（１）前記化合物にある塩基の種類が、前の化合物の各々にある塩基の種類と異なり、（２）前記化合物にあるタグの種類が、前の化合物の各々にあるタグの種類と異なり、
前記化合物の組み込みにより前記タグが付着しているポリリン酸が遊離し、
前記細孔に付着している前記ホスファターゼ酵素が、前記ポリリン酸から前記タグを切断して前記タグを遊離することと；
（ｂ）前記障壁を越えて電界を印加し、工程（ａ）において生成した前記タグが前記細孔を通り抜けて移行することによりもたらされる前記細孔を跨ぐ電子的変化を測定することにより、工程（ａ）においてどの化合物が前記プライマーに組み込まれて前記ＲＮＡ伸長産物を形成したかを決定し、前記電子的変化が、タグの各種類について異なり、それによって、前記組み込まれた化合物に相補的な前記一本鎖ＲＮＡ中の前記ヌクレオチド残基を同定することと；
（ｃ）配列決定される前記一本鎖ＲＮＡの各ヌクレオチド残基に対して工程（ａ）および（ｂ）を反復して実施することと
を含み、それによって、前記一本鎖ＲＮＡの前記ヌクレオチド配列を決定する、方法。
［３８］  ポリメラーゼより多くのホスファターゼ酵素が、前記細孔に付着している、［３４］〜［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［３９］  前記一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡが、どちらを適用するにしても、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを変性させることによって得られる、［３４］〜［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［４０］  同じ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの複数のコピーが、ビーズに固定化されている、［３４］〜［３７］のいずれか一項に記載の方法。
［４１］  前記一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの前記ヌクレオチド配列が、同じ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの複数のコピーを使用して決定される、［４０］に記載の方法。
［４２］  工程（ｂ）の各反復後に、前記一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡとの接触によって組み込まれていない化合物を除去する洗浄工程をさらに含む、［３４］〜［４１］のいずれか一項に記載の方法。
［４３］  工程（ｂ）の各反復後に、前記タグに付着している追加の識別可能な部分のアイデンティティを決定する工程をさらに含む  、［３４］〜［４２］のいずれか一項に記載の方法。
［４４］  前記遊離したタグの少なくとも８５〜９９％が、前記細孔を通り抜けて移行する、［３４］〜［４３］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］  前記化合物が、可逆性ターミネーターをさらに含む、［３４］〜［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］  工程（ｂ）の各反復後に、前記可逆性ターミネーターを除去する工程をさらに含む、［４５］に記載の方法。
［４７］  前記可逆性ターミネーターが、生物学的手段、化学的手段、物理的手段によって、または光照射によって除去される、［４６］に記載の方法。
［４８］  前記細孔の内部が、前記タグのまたは前記タグが付着している前記ポリリン酸の電荷に対して反対の符号の電荷を有する、［３４］〜［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［４９］  前記伝導性測定システムの前記第１および前記第２の区画の各々が、電荷を有する、［３４］〜［４８］のいずれか一項に記載の方法。
［５０］  前記第１および前記第２の区画の前記電荷の極性が、反対である、［４９］に記載の方法。
［５１］  前記第１および前記第２の区画の前記電荷が、調節可能である、［４９］に記載の方法。
［５２］  工程（ｂ）において前記細孔を通り抜けて移行する前記タグの速度が、タグの前記電荷と前記第１および前記第２の区画の前記電荷とに基づいて決定される、［３４］〜［５１］のいずれか一項に記載の方法。
［５３］  前記第１および前記第２の区画の各々が、工程（ａ）において前記タグまたは前記タグが付着している前記ポリリン酸が遊離する速度を超えるか、または同じ速度で、工程（ｂ）において前記タグが前記細孔を通り抜けて移行するような電荷を有する、［３４］〜［５２］のいずれか一項に記載の方法。
［５４］  少なくとも第１および第２の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と；
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含み；
前記第１および第２の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも１つの化合物と；
前記少なくとも１つの細孔は、印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており；
前記少なくとも１つの細孔は、前記化合物から前記タグを切断して前記タグを遊離するように構成された特徴部を含み；
前記イオン電流を測定する手段、ならびに前記少なくとも１つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、時系列としてその時間経過を記録する手段と
を含む伝導性測定システム。
［５５］  前記タグが、前記細孔においてイオン電流帯域幅の制限より長い滞留時間および前記イオン電流を測定する前記手段の電流ショットノイズを有する、［５４］に記載の伝導性測定システム。
［５６］  遮られていない細孔の伝導性レベルと統計的に一致する領域、および伝導性の低下したパルス、また伝導性の低下した個々のパルス内の統計的に定常なセグメントに伝導性時系列のセグメントを記述する方法であって、前記伝導性時系列が、
少なくとも第１および第２の電解質溶液を分離している電気的抵抗がある障壁と；
前記電気的抵抗がある障壁は、ナノメートルスケールの直径を持つ少なくとも１つの細孔を含み；
前記第１および第２の電解質溶液の少なくとも一方にある、タグを持つ少なくとも１つの化合物と；
前記少なくとも１つの細孔は、印加電位によって前記第１および第２の電解質溶液を跨いでイオン電流を起こすことができるように構成されており；
前記少なくとも１つの細孔は、前記化合物から前記タグを切断して前記タグを遊離するように構成された特徴部を含み；
前記イオン電流を測定する手段、ならびに前記少なくとも１つの細孔が前記タグによって遮られていない時間および前記タグが伝導性の低下したパルスを引き起こす時間も含めて、前記伝導性時系列を記録する手段と
を含む伝導性測定システムで生成され；
伝導性時系列のセグメントを記述するための前記方法が、
（ａ）前記未加工伝導性時系列から推定した、ヒドンマルコフモデルの連続密度の最尤状態配列のビタビ復号と；
（ｂ）開孔伝導性レベルからの逸脱に対する閾値との比較による伝導性の低下したパルスの領域の記述と；
（ｃ）各セグメントに対する前記イオン電流レベルの前記中心傾向を推定することによって、または中心傾向とセグメント継続時間を一緒に測定することによって、伝導性の低下したパルスを特徴づける手段とからなる群から選択され、セグメント中心傾向の前記測定が、
（ｉ）連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として前記伝導性時系列から推定した第１のＧＭＭのガウス成分の平均パラメータと；
（ｉｉ）算術平均と；
（ｉｉｉ）トリム平均と；
（ｉｖ）中央値と；
（ｖ）サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される方法。
［５７］  （ａ）伝導性セグメントの中心傾向の前記測定に基づく第２の混合ガウスモデルの最尤法推定と；
（ｂ）前記伝導性時系列のセグメントの中心傾向の前記推定の経験的確率密度の補間および平滑化、ならびに前記補間する関数の導関数の平方根によるピーク検出と；
（ｃ）多モード分布推定量のモードを位置指定する別の手段との少なくとも１つをさらに含む、［５６］に記載の方法。
［５８］  溶液中の化合物の少なくとも１つのパラメータを決定する方法であって、
第１の貯蔵部に第１の流体を入れることと；
第２の貯蔵部に第２の流体を入れることと；
前記第１および前記第２の流体の少なくとも一方は、少なくとも１つの化合物を含み、前記化合物は、タグ付けされたヌクレオチドまたはタグ付けされたヌクレオチドから切断されたタグであり；
前記第１の貯蔵部内の前記第１の流体は、電気的抵抗がある障壁で前記第２の貯蔵部内の前記第２の流体と分離されており；
前記電気的抵抗がある障壁は、少なくとも１つの細孔を含み；
前記第１と前記第２の流体の間の電位により、前記第１の流体、前記少なくとも１つの細孔、および前記第２の流体にイオン電流を流すことと；
前記少なくとも１つの細孔を通って流れる前記イオン電流および前記イオン電流の変化の継続時間を測定することと；
前記イオン電流の前記測定は、前記少なくとも１つの細孔と相互作用している前記化合物によって引き起こされる前記イオン電流の減少を測定するのに十分な一定の時間実行され；
前記イオン電流の前記変化および前記一定の時間を通じての前記イオン電流の前記変化の前記継続時間を数理的に解析することによって、前記化合物の少なくとも１つのパラメータを決定することと
を含み、前記数理解析が、
ｉ）連続密度ヒドンマルコフモデルの一部として前記伝導性時系列から推定した第１のＧＭＭのガウス成分の平均パラメータと；
ｉｉ）事象平均抽出と；
ｉｉｉ）最尤事象状態割り当てと；
ｉｖ）閾値検出および平均化と；
ｖ）スライディングウインドウ分析と；
ｖｉ）算術平均と；
ｖｉｉ）トリム平均と；
ｖｉｉｉ）中央値と；
ｉｘ）サンプル位置の最大事後推定量、またはサンプル位置の最尤推定量と
からなる群から選択される少なくとも１つの工程を含む、方法。
［５９］  前記化合物が、前記イオン電流の前記減少を測定する前に、ホスファターゼで処理される、［５６］〜［５８］のいずれか一項に記載の方法。
［６０］  前記化合物が、第１の正味電荷、および化学的、物理的または生物学的反応の後に、異なる第２の正味電荷を有する選択的に帯電した化合物である、［５６］〜［５９］のいずれか一項に記載の方法。
［６１］  前記数理解析が、ＧＭＭ、閾値検出および平均化、ならびにスライディングウインドウ分析からなる群から選択される、［５６］〜［６０］のいずれか一項に記載の方法。
［６２］  前記少なくとも１つのパラメータが、前記化合物の濃度、サイズ、電荷および組成からなる群から選択される、［５６］〜［６１］のいずれか一項に記載の方法。
［６３］  前記伝導性測定システムを較正する工程をさらに含む、［３０］〜［５３］および［５６］〜［６２］のいずれか一項に記載の方法。
［６４］  精度が、４σより大きい、［３０］〜［５３］および［５６］〜［６３］のいずれか一項に記載の方法。
［６５］  精度が、５σより大きい、［３０］〜［５３］および［５６］〜［６３］のいずれか一項に記載の方法。
［６６］  精度が、６σより大きい、［３０］〜［５３］および［５６］〜［６３］のいずれか一項に記載の方法。
［６７］  ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
［６８］  前記タグが、前記ヌクレオチドの５’−リン酸に付着している、［６７］に記載のヌクレオチド。
［６９］  前記タグが発蛍光団ではない、［６７］に記載のヌクレオチド。
［７０］  前記タグが、その電荷、形状、サイズまたはそれらの任意の組合せによって検出可能である、［６７］に記載のヌクレオチド。
［７１］  前記第１および第２の電解質溶液が同じである、［１］に記載の伝導性測定システム。
［７２］  前記第１および前記第２の電解質溶液が同じである、［５４］に記載の伝導性測定システム。
［７３］  前記第１および前記第２の電解質溶液が同じである、［５６］に記載の方法。
［７４］  前記第１の流体および前記第２の流体が同じである、［５８］に記載の方法。
［７５］  ヌクレオチド重合事象において切断され、ナノ細孔を用いて検出することができるタグを含む、タグ付けされたヌクレオチド。
［７６］  前記タグが、前記ヌクレオチドの５’−リン酸に付着している、［７５］に記載のヌクレオチド。
［７７］  前記タグが発蛍光団ではない、［７５］に記載のヌクレオチド。
［７８］  前記タグが、その電荷、形状、サイズまたはその任意の組合せによって検出可能である、［７５］に記載のヌクレオチド。
［７９］  核酸配列を決定する方法であって、別々にアドレス可能な部位のアレイを用意し、各部位が、核酸ポリメラーゼが付着しているナノ細孔を有することと、前記アレイの所与の部位で、タグ付けされたヌクレオチドをポリメラーゼで重合させることとを含み、タグが遊離し、前記所与の部位でナノ細孔によって検出される、方法。
【０６５８】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５５−３】
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【図５５−４】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【配列表】
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