(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩ：
【化１】
0006450678.tif 000017
【化２】
0006450678.tif 000018
の化合物であって、式中、Ｙがそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲノ、アミノ、Ｃ１〜４アルコキシおよびＣ２〜８アルカノキシからなる群より選択される、化合物。
【請求項２】
前記化合物が、式ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸＩまたはＸ
【化３】
0006450678.tif 000019
【化４】
0006450678.tif 000020
の化合物である、請求項１の化合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の化合物を薬学的に許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤または補形剤とともに含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載の化合物を作製する方法であって、アルキルアミノアルキルアミノアントラキノンの生成に適した条件下でアントラセン−９，１０−ジオンと重水素化アルキレンジアミンとを反応させることを含む、方法。
【請求項５】
アルキルアミノアルキルアミノアントラキノンのＮ−オキシド誘導体の生成に適した条件下でアルキルアミノアルキルアミノアントラキノンとモノペルオキシフタル酸塩とを反応させる段階をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンの生成に適した条件下で１，４−ジフルオロ−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンと重水素化−−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレン−ジアミンとを反応させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオンの生成に適した条件下で１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンとモノペルオキシフタル酸マグネシウムとを反応させる段階をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
がんの治療に使用するための、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項９】
前記がんが、膀胱癌、乳癌、骨癌（原発性および続発性、例えば骨肉腫およびユーイング肉腫など）、脳癌（多形神経膠芽腫および星状細胞腫を含む）、子宮頸癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、妊娠性腫瘍、頭頸部癌、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬおよび毛様細胞性白血病など）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫（ホドキンリンパ腫（Ｈｏｄｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）および非ホドキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）など）、黒色腫、中皮腫、口腔癌、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびに子宮癌からなる群より選択される、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記腫瘍またはその一部分が本来低酸素である固形癌の治療に使用するためのまたは転移の治療または予防に使用するための、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
抗アンドロゲン剤（ステロイド性および非ステロイド性）、血管破壊剤、抗血管新生剤、抗ＶＥＧＦＲ剤、ＩＬ８阻害剤、ＮＯ合成酵素阻害剤、血管収縮剤、血管拡張剤および放射線治療剤／療法からなる群より選択される１つまたは複数の追加の癌治療と併用するための、請求項８または９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記抗アンドロゲン剤が、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、デュタステリド、ベキストステリド、イゾンステリド、ツロステリド、エプリステリドおよびアビラテロンを含むか、これよりなる、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記抗アンドロゲン剤がビカルタミドを含むか、これよりなる、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の酸素化レベルのマーカーとしての、請求項１または２に記載の化合物の使用。
【請求項１５】
前記化合物を請求項１〜１３のいずれか１項で定義される化合物の非重水素化型と併用する、請求項１４に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の化合物を含む、細胞の酸素化レベルの検出に使用するための部分のキット。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の化合物の非重水素化型をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば癌治療における、新規なアントラキノン化合物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌薬の治療上の利点は主として、その薬剤が腫瘍細胞に対して選択的活性を示す程度および非標的組織に対して毒性が低いことによって決まる。多くの場合、成長しつつある腫瘍塊内にある血管系の質に低いと、薬物、栄養素および酸素の送達に支障を来たす。腫瘍では酸素濃度中央値（約１％の酸素；ｐＯ２７．５ｍｍＨｇ）が正常組織（約５．５％の酸素；４２ｍｍＨｇ）よりもかなり低くなり得ることが認められている（ＢｒｏｗｎおよびＷｉｌｓｏｎ，２００４によって提供されたデータをまとめた）。さらに、腫瘍血管の断続的な開口および閉鎖により、腫瘍全体にわたって酸素化レベルが変化することがあり、特に腫瘍中心部の血管化が不十分であると、酸素が０．１％（１ｍｍＨｇ）未満の酸素濃度となる場合が多い。様々な程度の低酸素を示す腫瘍細胞は、通常に灌流した組織よりも治療効果が低下し、悪性化の一因となり得る。低酸素選択的薬剤（例えば、生体内還元薬）は、低酸素化状態で選択的に活性化されて細胞毒性型になることによって、極めて低酸素の環境中にある腫瘍細胞を標的とするのに使用することができる１つのクラスの薬剤を含み、非標的組織に対する毒性、低酸素細胞の薬物耐性および癌進行の問題に対処するものである。
【０００３】
酸素化が不十分であると、酸素化に支障を来たしていない酸素正常状態に比して相対的に低酸素の状態になる。腫瘍内の酸素化が不十分であると、治療様式に対する応答が変化し、癌進行の一因となり得る。このような低酸素領域内にある細胞は特に、従来用いられてきた抗癌薬による多くの治療に対して抵抗性を示すが、これは、生存しているが休止状態にある細胞に薬物が十分に送達されないこと、および／またはこのような細胞に内因性の腫瘍細胞の感受性が欠如していることに起因する。このほか放射線療法は、酸素の存在によって電離放射線の細胞毒性が増強されるため、酸素濃度が極めて低い場合は効果が低下する（Ｒａｄｉｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｓｔ，Ｈａｌｌ  ＥＪ，Ｇｉａｃｃｉａ  ＡＪ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，（２００５））。近年得られた証拠から、腫瘍細胞が低酸素条件に適応し、活性な細胞保護機序の誘導を介して抗癌剤に対する薬力学反応を変化させ得ることが示されている（ＶａｕｐｅｌおよびＭａｙｅｒ  ２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  ２６（２）：２２５−２３９）。さらに、低酸素ストレスを生き延びる腫瘍細胞が多くの場合、より悪性の転移表現型を示すことが認められており（Ｖａｕｐｅｌ  Ｐ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｋｅｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  悪性進行，Ｅｘｐ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０；３２，１２５−１２７）、これは患者にとって重大な結果をもたらす。酸素化がより良好な細胞を主要な標的とする様式の治療の後、ストレス抵抗性の低酸素細胞が、遠隔組織に拡散する可能性が増大した細胞を有する腫瘍を再増殖させることが多い。より悪性の転移腫瘍の発現は多くの場合、患者のより重大な疾患に関連する罹病率および死亡の前兆となる。
【０００４】
魅力的な方法には、全身組織にみられる十分に酸素化された細胞に対して無毒性であるが、低酸素化条件下では活性化されるか変換されて細胞毒性になる低酸素活性化プロドラッグの使用がある。細胞毒性アルキルアミノアントラキノンのＮ−オキシド誘導体は、ほとんど細胞毒性を示さないアントラキノンプロドラッグとなる。重要なのは、このようなプロドラッグが、腫瘍性組織内にみられる無酸素または低酸素条件下においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで変換することが可能なことである。腫瘍以外の全身組織が細胞毒性薬物の生成を促進する程度に低酸素濃度になることはほとんどないため、腫瘍に対する特異性が確保される。
【０００５】
アントラキノンＮ−オキシド、ＡＱ４Ｎ（ＣＡＳ番号１３６４７０−６５−０）は、低酸素腫瘍細胞内で選択的に生体内還元されて強力なＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＡＱ４になるプロドラッグである。これまでの刊行物には、プロドラッグＡＱ４Ｎの基本的特性およびｉｎ−ｖｉｔｒｏ／ｉｎ−ｖｉｖｏでの特徴が教示されている（例えば、米国特許第５，１３２，３２７号を参照されたい）。
【０００６】
本発明は、好ましい薬理学的特性と低酸素感知特性との組合せを有する新規なアントラキノン化合物を提供することによって、改善された癌治療法の必要性に応えようとするものである。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第一の態様は、式Ｉ
【化１】
0006450678.tif 000002
の化合物を提供し、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲノ、アミノ、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ２〜８アルカノイルオキシ、−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ、−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’および−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’からなる群より選択され、Ａは少なくとも炭素原子２個の鎖長を有するアルキレン基（ＮＨとＮＨＲまたはＮ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’との間）であり、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’はそれぞれ独立して、Ｃ１〜４アルキル基ならびに窒素原子と結合している炭素原子がヒドロキシ基をもたず、いずれの炭素原子も２つのヒドロキシ基によって置換されていないＣ２〜４ヒドロキシアルキルおよびＣ２〜４ジヒドロキシアルキル基から選択されるか、ＲおよびＲ’’はともに、Ｒ’およびＲ’’が結合している窒素原子とともに、環の中に３〜７個の原子を有する複素環基を形成しているＣ２〜６アルキレン基であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの少なくとも１つは重水素化型の−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ、−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’および−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’からなる群より選択される。
【０００８】
したがって、本発明は、新規な重水素化アントラキノン化合物を提供する。
【０００９】
「重水素化」には、化合物がジュウテリウムまたは重水素（すなわち、Ｄまたは２Ｈ）の原子を少なくとも１つ含むことを包含するものとする。当業者には、化合物が部分的に（すなわち、選択的に）重水素化されていても、完全に重水素化されて（すなわち、ジュウテリウムの形態でのみ存在する水素を含んで）いてもよいことが理解されよう。
【００１０】
この文脈における「選択的に」は、通常の１Ｈ水素原子の全部ではなく一部がジュウテリウムに置き換わっていることを意味する。例えば、置換基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの１つまたは複数が重水素化されているが、中央のアントラキノン環はジュウテリウムを含まないという場合があり得る。
【００１１】
一実施形態では、本発明の化合物は、置換基−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ、−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’および／または−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’のうちの１つまたは複数がＸ１、Ｘ２、Ｘ３および／またはＸ４の位置において選択的に重水素化されている。このような各置換基では、Ａ、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’が完全に重水素化されていても（すなわち、結果として１Ｈを含まない）、部分的に重水素化されていてもよいことが理解されよう。
【００１２】
好ましい実施形態では、化合物は、末端基Ｒ，Ｒ’およびＲ’’のうちの１つまたは複数においてのみ重水素化されている。例えば、Ｒ，Ｒ’および／またはＲ’’は：
−ＣＤ３；
−ＣＨ２ＣＤ３；
−ＣＤ２ＣＤ３；
−ＣＤ２ＣＨ２ＣＤ３；および
−ＣＤ２ＣＤ２ＣＤ２ＣＤ３
を表し得る。
【００１３】
「Ｃ１〜４アルキル」という用語は、１〜４個の炭素を含む直鎖または分岐鎖アルキル基を包含するものとする。Ｒ、Ｒ’および／またはＲ’’が独立して表し得る好ましいアルキル基としては、Ｃ１およびＣ２アルキルが挙げられる。
【００１４】
「低級アルキレン」という用語は、これに従って解釈されるべきである。
【００１５】
「Ｃ２〜４ヒドロキシアルキル」および「Ｃ２〜４ジヒドロキシアルキル」という用語は、１〜４個の炭素を含み、それぞれ１つまたは２つのヒドロキシ基が結合している、直鎖または分岐鎖アルキル基を包含するものとする。例えば、Ｒ、Ｒ’および／またはＲ’’は独立して：
−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ
−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３
−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨ
を表し得る。
【００１６】
「Ｃ１〜４アルコキシ」という用語は、酸素を介して中心部のアントラキノン（アントラセン−９，１０−ジオン）環と結合している直鎖または分岐鎖Ｃ１〜４アルキル基を包含するものとする。例えば、Ｒ、Ｒ’および／またはＲ’’は独立して：
−ＯＣＨ３
−ＯＣＨ２ＣＨ３
−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
を表し得る。
【００１７】
「Ｃ２〜８アルカノイルオキシ」という用語は、酸素を介して中心部のアントラキノン（アントラセン−９，１０−ジオン）環と結合している直鎖または分岐鎖Ｃ２〜８アルカノイル基を包含するものとする。例えば、Ｒ、Ｒ’および／またはＲ’’は独立して：
−Ｏ（Ｏ）ＣＣＨ３
−Ｏ（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ３
−Ｏ（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
−Ｏ（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３
−Ｏ（Ｏ）ＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ３
を表し得る。
【００１８】
「ヒドロキシ」という用語は−ＯＨを表すものとする。
【００１９】
「ハロゲノ」という用語は−Ｂｒ、−Ｃｌおよび−Ｆなどの任意のハロゲン基を表すものとする。
【００２０】
「アミノ」という用語は、−ＮＨ２などの第一級アミン基を包含するものとする。
【００２１】
当業者には、化合物のアントラキノン環が環の１位、２位、３位、４位、５位、６位、７位または８位のいずれかにおいてＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４によって置換されていてよいことが理解されよう：
【化２】
0006450678.tif 000003
【００２２】
本発明の第一の態様一実施形態では、化合物は、式ＩＩの通りに環の１位、４位、５位および８位において置換されている：
【化３】
0006450678.tif 000004
【００２３】
一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ、−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’およびその重水素化型からなる群より選択される。
【００２４】
一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ独立して、ヒドロキシ、−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’およびその重水素化型からなる群より選択される。
【００２５】
一実施形態では、Ｘ１およびＸ２はともにヒドロキシであり、Ｘ３およびＸ４はともに−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’またはその重水素化型である。
【００２６】
一実施形態では、Ｘ１およびＸ２はともにヒドロキシであり、Ｘ３およびＸ４はともにＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’またはその重水素化型である。
【００２７】
一実施形態では、Ａは不分岐である。例えば、Ａはエチレンであり得る。
【００２８】
一実施形態では、Ｒ、Ｒ’およびＲ’’はそれぞれ独立して、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨおよびその重水素化型からなる群より選択される。
【００２９】
一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの１つまたは２つが独立して、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨ）２およびその重水素化型からなる群より選択される。
【００３０】
一実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４のうちの１つまたは２つが独立して、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＣＨ（ＣＨ３）ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨ）２およびその重水素化型からなる群より選択される。
【００３１】
一実施形態では、本発明の化合物は１つの基−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’と１つの基−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲとを含み、−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ基は、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ３、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣ２Ｈ５、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨおよびその重水素化型から選択される。
【００３２】
一実施形態では、本発明の化合物は１つの基−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’と１つの基−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲとを含み、−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ基は、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ３、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣ２Ｈ５、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨおよびその重水素化型から選択される。
【００３３】
非限定的な好ましい本発明の化合物では：
（ａ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＨかつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｂ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＯＨ、Ｘ３＝−ＯＨかつＸ４＝−Ｈ；
（Ｃ）Ｘ１−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｄ）Ｘ１＝Ｘ４＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ３＝−ＯＨ；
（ｅ）Ｘ１＝Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’かつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｆ）Ｘ１＝Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｇ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＨかつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｈ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝４位の−ＯＨ、Ｘ３＝−ＯＨかつＸ４＝−Ｈ；
（ｉ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｊ）Ｘ１＝Ｘ４＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ３＝−ＯＨ；
（ｋ）Ｘ１＝Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’かつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｌ）Ｘ１＝Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ４＝−ＯＨ；および
その重水素化型である。
【００３４】
非限定的なさらなる好ましい本発明の化合物では：
（ａ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｂ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＯＨ、Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ４＝−ＯＨ；
（ｃ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝Ｘ３＝−ＯＨかつＸ４＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ；
（ｄ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｅ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＯＨ、Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ４＝−ＯＨ；
（ｆ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝Ｘ３＝−ＯＨかつＸ４＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ；および
その重水素化型である。
【００３５】
非限定的なさらなる好ましい本発明の化合物では：
（ａ）Ｘ１＝Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’かつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｂ）Ｘ１＝Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｃ）Ｘ１＝Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’かつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；および
（ｄ）Ｘ１＝Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’かつＸ２＝Ｘ４＝−ＯＨであり、式中、
−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’はともに−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）２もしくは−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２またはその重水素化型であり、ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’はともに−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２もしくは−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２またはその重水素化型である。
【００３６】
非限定的なさらなる好ましい本発明の化合物では：
（ａ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；
（ｂ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＯＨ、Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ４＝−ＯＨ；
（ｃ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ３＝Ｘ４＝−ＯＨ；および
（ｄ）Ｘ１＝−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’、Ｘ２＝−ＯＨ、Ｘ３＝−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲかつＸ４＝−ＯＨであり、式中、
−ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ’’は−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）２もしくは−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２またはその重水素化型であり、−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲはＮＨ−（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ３もしくは−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＨまたはその重水素化型であり、ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’は−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２もしくは−ＮＨ−（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２またはその重水素化型である。
【００３７】
一実施形態では、化合物は式ＩＩＩもしくはＩＶ：
【化４】
0006450678.tif 000005
の化合物またはそのプロドラッグであり、式中、Ｙはそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲノ、アミノ、Ｃ１〜４アルコキシおよびＣ２〜８アルカノキシからなる群より選択される。
【００３８】
この文脈における「プロドラッグ」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易に式ＩＩＩまたはＩＶの化合物に変換され得る化合物を包含する。一実施形態では、変換は、プロドラッグが固形腫瘍などの低酸素環境に入ることによって引き起こされる。適切なプロドラッグの例としては、式ＩＩＩまたはＩＶの化合物のＮ−オキシド誘導体が挙げられる。
【００３９】
したがって、一実施形態では、プロドラッグは式ＶまたはＶＩ：
【化５】
0006450678.tif 000006
の化合物のプロドラッグであり、式中、Ｙはそれぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲノ、アミノ、Ｃ１〜４アルコキシおよびＣ２〜８アルカノキシからなる群より選択される。
【００４０】
好ましい一実施形態では、化合物は式ＶＩＩまたはＶＩＩＩ：
【化６】
0006450678.tif 000007
の化合物またはそのプロドラッグである。
【００４１】
さらなる好ましい実施形態では、化合物は式ＩＸまたはＸ：
【化７】
0006450678.tif 000008
のプロドラッグである。
【００４２】
式ＩＩＩ〜Ｘの化合物において、化合物が少なくとも１個のジュウテリウム原子を含む限り、末端アミノ基の窒素と結合している１つまたは複数のメチル基中の１つまたは複数のジュウテリウム原子が通常の水素（すなわち、１Ｈ）に置き換わっていてもよいことが当業者に理解されよう。例えば、１つ、２つ、３つまたは４つのメチル基が−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄまたは−ＣＨＤ２であってよい。一実施形態では、化合物中のメチル基は−ＣＨ３または−ＣＤ３である。
【００４３】
当業者にはさらに、上式Ｉ〜Ｘの特定の化合物が対陰イオンによって相殺されていてよいことが理解されよう。例示的な対陰イオンとしては、特に限定されないが、ハロゲン化物（例えば、フッ化物、塩化物および臭化物）、硫酸（例えば、デシル硫酸）、硝酸、過塩素酸、スルホン酸（例えば、メタンスルホン酸）およびトリフルオロ酢酸が挙げられる。その他の適切な対陰イオンは、当業者には周知であろう。したがって、式Ｉ〜Ｘの化合物の薬学的および／または獣医学的に許容される塩および溶媒和物などの誘導体も本発明の範囲内にある。挙げ得る塩としては、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸などの無機酸とともに形成される塩、カルボン酸とともに形成される塩または有機スルホン酸とともに形成される塩；塩基付加塩；塩基とともに形成される金属塩、例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩がある。
【００４４】
一実施形態では、化合物はハロゲン化物塩、例えば、塩化物塩の形態である。
【００４５】
当業者にはさらに、式Ｉ〜Ｘの特定の化合物が互変異性を示し得ることが理解されよう。互変異性型およびその混合物はすべて本発明の範囲内にある。
【００４６】
式Ｉ〜Ｘの化合物はこのほか、１つまたは複数の不斉炭素原子を含み、それにより光学異性および／またはジアステレオ異性を示し得る。従来の技術、例えばクロマトグラフィーまたは分別結晶を用いてジアステレオ異性体を分離し得る。従来の技術、例えば分別結晶またはＨＰＬＣ技術を用いて化合物のラセミ混合物をはじめとする混合物を分離することによって、様々な立体異性体を単離し得る。あるいは、ラセミ化もしくはエピマー化を引き起こさない条件下でしかるべき光学活性出発物質を反応させることによって、または例えばホモキラルな酸による誘導体化の後、従来の手段（例えば、ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー）によるジアステレオマーエステルの分離を実施することによって、所望の光学異性体を作製し得る。立体異性体はすべて本発明の範囲内にある。
【００４７】
本発明の化合物の合成に様々な経路を用いることができる。１位および４位に基−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’を有する化合物の調製に極めて便利な１つの方法では、しかるべきアミンＲ’’Ｒ’Ｎ−Ａ−ＮＨ２と縮合し、アミンとの反応のためのロイコ化合物中で１，４位が活性化されている、適宜置換された２，３−ジヒドロ（ロイコ）−１，４−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンを使用するものである。このような縮合は、メタノール、エタノール、水、ジメチルホルムアミド、２−メトキシエタノール、アセトニトリル、ニトロベンゼン、Ν，Ν，Ν’Ν’−テトラ−メチレンジアミンまたはその混合物などの溶媒を用いて、約２５℃または３５℃〜５０℃または６０℃の範囲の温度にて１時間またはそれ以上で上手く達成され得る。いくつかの場合には、例えば環状基ＮＲ’Ｒ’’を含む化合物では、これより高い温度、短い反応時間が適切であり得る。次いで、空気酸化または過酸化水素、クロラニル、過ホウ酸ナトリウムもしくは二酸化マンガンによる酸化を適宜用いて、ロイコ誘導体を芳香族のアントラセン−９，１０−ジオンに完全に酸化する。
【００４８】
ロイコ化合物は、主として２つの−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ’Ｒ’’基で置換された化合物の調製を目的とするものであるが、このような基を２つ以上含む化合物の調製にこれを用いることが可能である。したがって、２，３−ジヒドロ（ロイコ）−１，４，５，８−テトラヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンおよび過剰なアミン−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ’Ｒ’’を用いることによって、基−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲ’Ｒ’’を３つ、１位、４位および５位に有する８−ヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンを調製してもよい。
【００４９】
ロイコ誘導体自体は、対応する完全に芳香族の１，４−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンを窒素流中、必要に応じて亜ジチオン酸ナトリウムまたは亜鉛末などの適切な還元剤の存在下、９０℃超で１時間またはそれ以上、適宜加熱することによる熱処理によって得ることができる。様々なアントラセン−９，１０−ジオン、特にヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンが市販されており、またこのような化合物の様々な合成が文献で報告されている。その調製に適した１つの方法では、塩化アルミニウムおよび水酸化ナトリウムの存在下、適宜置換された無水フタル酸とヒドロキノンとを１８０℃で１時間またはそれ以上反応させる。１つの形態の置換基を含むアントラセン−９，１０−ジオンを修飾して他の形態の置換基をもたらすことが可能であるため、例えば、アミノ基を含むジオンを水酸化ナトリウム／亜ジチオン酸ナトリウムで処理して、対応するヒドロキシ置換化合物を得ることができる。
【００５０】
本発明のＮ−オキシド化合物に酸化するための中間体の調製に適したその他の方法としては、しかるべきクロロまたはフルオロ置換アントラセン−９，１０−ジオンとしかるべきアミンＲ’’Ｒ’Ｎ−−Ａ−−ＮＨ２とを、例えば、その還流温度で１時間またはそれ以上、過剰のアミンとともに加熱することによって、反応させることが挙げられる。これらのクロロ−およびフルオロアントラセン−９，１０−ジオンの特定のものが知られており、またこのような化合物の様々な合成が文献で報告されている。したがって、例えば、ＫＦ−ＮａＦの仲介による３，６−ジクロロフタル酸無水物から１，４−ジフルオロ−４，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン作製の前駆物質としての３，６−ジフルオロフタル酸無水物への変換（ＬｅｅおよびＤｅｎｎｙ，１９９９，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１：２７５５−２７５８を参照されたい）。さらに、例えば、化学量論量の塩化スルフリルと制御された温度とを用いる１，４，５，８−テトラヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンの選択的塩素化によって、１，５−ジクロロ−４，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンを調製し得る。次いで、この前駆物質を用いて、１位および５位に基−ＮＨ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’ならびに４位および８位にヒドロキシ基を有する中間体を調製することができ、アミンＲ’’Ｒ’Ｎ−−Ａ−−ＮＨ２との反応時にヒドロキシ基が適宜保護される。他のクロロヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン中間体の調製にも同様の方法が適している。
【００５１】
本発明の化合物が１つまたは複数の基−Ｎ−Ａ−ＮＲ’Ｒ’’のほかにも１つまたは複数の基−ＮＨ−Ａ−ＮＨＲを含む場合、上述の適切な前駆物質と、アミンＲＮ−−Ａ−−ＮＨ２とＲ’’Ｒ’Ｎ−−Ａ−−ＮＨ２の混合物とを反応させ、次いで、得られた生成物の混合物を例えばクロマトグラフィーにより分離することによって化合物を分離するのが好都合である。したがって、例えば、２，３−ジヒドロ（ロイコ）−１，４−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンが２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）エチルアミンと２−（ジエチルアミノ）エチルアミンとの混合物と反応すると、１，４−ビス｛［２−（ジエチルアミノ）−エチル］アミノ｝アントラセン−９，１０−ジオンと、１，４−ビス｛［２−（２−ヒドロキシエチル−アミノ）−エチル］アミノ｝−アントラセン−９，１０−ジオンと、１−（２−（ジエチルアミノ）エチル］アミノ）−４−｛［２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−エチル］アミノ｝アントラセン−９，１０−ジオンとの混合物が得られ、そこから例えばクロマトグラフィーにより、最後に挙げた化合物を分離し得る。酸化では、［２−（ジエチルアミノ）エチル）］アミノ基の第三級窒素原子のみがＮ−オキシド型に変換される。
【００５２】
１つまたは複数の置換基が存在する場合、合成経路に応じて、これらを最終形態まで全体を通して存在させるか、のちの合成段階で所望の基を生じさせるのが適切であり得る。既知の方法に従いヒドロキシ基を修飾することによってエーテルおよびエステル基Ｘを容易に調製し得ることは言うまでもないが、ヒドロキシ基Ｘを含む前駆物質の方が、対応エーテルまたはエステル置換基を含む前駆物質よりも文献に記載されている場合が多い。
【００５３】
しかし、化合物およびそのための中間体を調製するためのまた別の方法を用いてもよく、これは、特にこのような中間体に関する文献から明らかであることが理解されよう。本発明の化合物調製のための中間体の調製に関するさらなる詳細を米国特許第４，１９７，２４９号および英国特許第２，００４，２９３Ｂ号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）にみることができる。
【００５４】
したがって、本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様による化合物を作製する工程を提供し、この工程は、アルキルアミノアルキルアミノアントラキノンの生成に適した条件下でアントラセン−９，１０−ジオンと重水素化アルキレンジアミンとを反応させることを含む。
【００５５】
任意選択で、この工程は、アルキルアミノ−アルキルアミノアントラキノンのＮ−オキシド誘導体の生成に適した条件下でアルキルアミノ−アルキルアミノアントラキノンとモノペルオキシフタル酸塩とを反応させる段階をさらに含む。
【００５６】
一実施形態では、この工程は、１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンの生成に適した条件下で１，４−ジフルオロ−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン，２８１−００５と、重水素化−Ｎ．Ｎ−ジメチルエチレン−ジアミンとを反応させることを含む。
【００５７】
さらなる実施形態では、この工程は、１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオンの生成に適した条件下で１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンとモノペルオキシフタル酸マグネシウムとを反応させる段階を含む。
【００５８】
本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様による化合物を薬学的に許容される緩衝液、希釈剤、担体、補助剤または補形剤とともに含む、医薬組成物を提供する。
【００５９】
「薬学的に許容される」は、本発明の化合物の治療効果を低下させない毒性物質を包含するものとする。このような薬学的に許容される緩衝液、担体または補形剤は当該技術分野で周知である（その開示が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０）およびｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，第３版，Ａ．Ｋｉｂｂｅ編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００）を参照されたい）。
【００６０】
「緩衝液」という用語は、ｐＨを安定させることを目的とし酸−塩基混合物を含有する水溶液を意味するものとする。緩衝液の例にはトリズマ、ビシン、トリシン、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＢＳ、トリス、ヘペス、ＨＥＰＢＳ、ＭＥＳ、リン酸、炭酸、酢酸、クエン酸、グリコール酸、乳酸、ホウ酸、ＡＣＥＳ、ＡＤＡ、酒石酸、ＡＭＰ、ＡＭＰＤ、ＡＭＰＳＯ、ＢＥＳ、ＣＡＢＳ、カコジル酸、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、エタノールアミン、グリシン、ＨＥＰＰＳＯ、イミダゾール、イミダゾール乳酸、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＳＳＰＥ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＢＳ、ＴＡＰＳＯおよびＴＥＳがある。
【００６１】
「希釈剤」という用語は、医薬製剤中の薬剤を希釈することを目的とする水溶液または非水溶液意味するものとする。希釈剤は生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油またはゴマ油など）のうちの１つまたは複数であり得る。
【００６２】
「補助剤」という用語は、本発明の化合物の生物学的効果を増大させるために製剤に添加する任意の化合物を意味するものとする。補助剤は、様々なアシル組成の亜鉛、銅または銀と様々な陰イオンとの塩、例えば、特に限定されないがフッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、水酸化物塩、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩および酢酸塩のうちの１つまたは複数であり得る。補助剤はこのほか、カチオン性セルロースエーテル、カチオン性セルロースエステル、脱アセチル化ヒアルロン酸、キトサン、カチオン性デンドリマーなどのカチオン性ポリマー、ポリ（ビニルイミダゾール）などのカチオン性合成ポリマーならびにポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニンおよびこれらのアミノ酸を含有するペプチドなどのカチオン性ポリペプチドであり得る。
【００６３】
補形剤は炭水化物、ポリマー、脂質および鉱物のうちの１つまたは複数であり得る。炭水化物の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、マンニトールおよびシクロデキストリンが挙げられ、これらは、例えば凍結乾燥を容易にするために、組成物に添加される。ポリマーの例にはデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラゲナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解が様々な程度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルならびにポリビニルピロリドンがあり、これらはすべて分子量が異なり、粘度調節のため、生体接着性を持たせるため、または化学分解およびタンパク質分解から脂質を保護するために組成物に添加される。脂質の例には、アシル鎖長および飽和度が異なる脂肪酸、リン脂質、モノトリグリセリド、ジトリグリセリド、トリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質ならびに卵レシチン、大豆レシチン、水素化卵および大豆レシチンがあり、これらはポリマーと同様の理由で組成物に添加される。鉱物の例にはタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンがあり、これらは液体蓄積の軽減または有利な着色性などの有益性を得るために組成物に添加される。
【００６４】
本発明の化合物をその送達に適するよう、当該技術分野で公知の任意のタイプの医薬組成物に製剤化し得る。
【００６５】
好ましい一実施形態では、医薬組成物を非経口的に、例えば、静脈内に、脳室内に、関節内に、動脈内に、腹腔内に、髄腔内に、心室内に、胸骨内に、頭蓋内に、筋肉内に、または皮下に投与し、またこれを注入技術によって投与し得る。このほか、医薬組成物を腫瘍内および／または腫瘍周囲に投与し得る。
【００６６】
このような医薬組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩またはグルコースを含有し得る無菌水溶液の形態で使用すると好都合である。必要に応じて、水溶液を適切に（好ましくはｐＨ３〜９に）緩衝するべきである。無菌条件下での適切な非経口の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に遂行される。
【００６７】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を目的とする被投与者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性および非水性無菌注射液；ならびに懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は単位用量または複数回用量の容器、例えば、密閉したアンプルおよびバイアルで提供してもよく、また使用直前に無菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい凍結乾燥条件で保管してもよい。既に記載されているような無菌粉末、顆粒および錠剤から即時注射液および懸濁液を調製してもよい。
【００６８】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物はリポソームの形態であり得、この形態では、薬剤を他の薬学的に許容される担体以外にミセル、不溶性単層および液晶として凝集形態で存在する脂質などの両親媒性物質と組み合わせる。リポソーム製剤に適した脂質としては、特に限定されないが、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。適切な脂質としてはこのほか、血流中循環時間を延ばすために極性頭部基をポリ（エチレングリコール）によって修飾した脂質が挙げられる。このようなリポソーム製剤の調製は、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，２３５，８７１号にみることができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物はこのほか、生分解性マイクロスフェアの形態であり得る。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡ（ＰＬＧＡ）またはポリ（カルプロラクトン（ｃａｒｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ））（ＰＣＬ）のコポリマーおよびポリ酸無水物などの脂肪族ポリエステルが生分解性ポリマーとしてマイクロスフェアの作製に広く用いられている。このようなマイクロスフェアの調製は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８５１，４５１号および欧州特許第０２１３３０３号にみることができる。
【００７０】
さらなる実施形態では、本発明の医薬組成物をポリマーゲルの形態で提供し、この場合、薬剤を含有する溶液の粘度を高くするためにポリマー、例えばデンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラゲナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリビニルイミダゾール、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドコポリマー、加水分解の程度が様々なポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルならびにポリビニルピロリドンなどを使用する。ポリマーはこのほか、ゼラチンまたはコラーゲンを含み得る。
【００７１】
あるいは、化合物を生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（ベニバナ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油またはゴマ油など）、トラガントゴムおよび／または様々な緩衝液に溶かすだけでもよい。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、活性薬剤の作用の増強のためにイオンおよび定められたｐＨを含み得ることが理解されよう。さらに、組成物は滅菌などの従来の製薬工程を経、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤などの従来の補助剤を含有し得る。
【００７３】
本発明による医薬組成物は、当業者に公知の任意の適切な経路で投与し得る。したがって、可能な投与経路としては、非経口（静脈内、皮下および筋肉内）、局所、眼内、経鼻、経肺、頬側、経口、非経口、経膣および経直腸の経路が挙げられる。ほかにも、埋植物からの投与が可能である。
【００７４】
あるいは、医薬組成物を鼻腔内に、または吸入により投与し得る（例えば、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ３）もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ３）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素またはその他の適切なガスなどを用いて、加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で投与し得る）。加圧エアロゾルの場合、定量を送達する弁を設けることによって投与単位を決定し得る。加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えば、滑沢剤、例えばソルビタントリオレアートをさらに含有し得るエタノールと溶媒の噴射剤との混合物を用いた活性なポリペプチドの溶液または懸濁液を含み得る。吸入器または吹入器で使用するカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチン製のもの）を、本発明の化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との混合粉末を含むよう製剤化し得る。
【００７５】
医薬組成物は薬学的有効量で患者に投与する。本明細書で使用される「治療有効量」、「有効量」または「治療上有効な」は、所与の条件および投与レジメンで治療効果をもたらす量を指す。これは、必要とされる添加剤および希釈剤、すなわち担体または投与溶媒とともに所望の治療効果が得られるよう計算された活性物質の所定量のことである。さらに、これは宿主の活性、機能および応答の臨床的に重要な障害を軽減する、最も好ましくはこれを予防するのに十分な量を意味するものとする。あるいは、治療有効量は、宿主の臨床的に重要な病態の改善をもたらすのに十分なものである。当業者に理解される通り、化合物の量はその比活性に応じて異なり得る。適切な投与量は、必要とされる希釈剤とともに所望の治療効果が得られるよう計算された所定量の活性な組成物を含み得る。本発明の組成物製造のための方法および使用では、治療有効量の活性成分が提供される。当該技術分野で周知の通り、治療有効量は年齢、体重、性別、病態、合併症、その他の疾患などの患者の特徴に基づいて、通常の技術を有する医療または獣医学従事者により決定され得る。薬学的有効量の投与は、個々の投与単位または複数のこれより少ない投与単位の形態での単回投与によって実施することが可能であり、また分割した用量を特定の間隔で複数回投与することによっても実施することが可能である。あるいは、長期間にわたる持続注入として投与を実施してもよい。
【００７６】
本発明の組成物を単位投与剤形、すなわち、１つの単位用量または複数もしくは小単位の単位用量を含む別個の部分の形態に製剤化し得ることが理解されよう。
【００７７】
化合物の用量は特定の化合物の活性および治療する病態に応じて異なるが、指針として述べると、０．１〜２０ｍｇ／（ｋｇ体重・日）の範囲、具体的には０．１〜５ｍｇ／（ｋｇ体重・日）の範囲で選択される用量が適切な場合が多いが、化合物によって生じる有害な副作用のレベルが低いことを考えて、これよりも高い用量、例えば、０．１〜５０ｍｇ／（ｋｇ体重・日）の範囲（または場合によっては、米国特許第４，１９７，２４９号に記載されているものと同程度の高用量）を考慮に入れる場合もあろう。この投与レジメンは、必要に応じて１日量を複数の別々の投与に分割して、問題の患者に適する日数だけ継続することができる。したがって、例えば進行性乳癌、非ホジキンリンパ腫および肝細胞癌などの病態の場合、１日治療した後、２１日などの間隔を空けて反復投与するのが適切であり得るのに対して、急性非リンパ球性白血病の治療では、５日間連続の治療がより適切であり得る。
【００７８】
本発明の第四の態様は、医療（臨床および／または獣医学）に使用するための、本発明の第一の態様による化合物を提供する。
【００７９】
本発明の第五の態様は、細胞毒素またはその低酸素活性化プロドラッグに使用するための、本発明の第一の態様による化合物を提供する。
【００８０】
一実施形態では、化合物は、細胞毒素またはその低酸素活性化プロドラッグとしてｉｎ  ｖｉｖｏで使用するためのものである。
【００８１】
「その低酸素活性化プロドラッグ」は、化合物が低酸素条件下にあるか、低酸素条件に曝露された後、優先的に細胞毒性となる（すなわち、低酸素条件下にあるか、低酸素条件に曝露された後に優先的により高い細胞毒性を示す）ことを包含するものとする。例えば、式Ｖ、ＶＩ、ＩＸおよびＸの化合物などの本発明のＮ−オキシド化合物は、正常酸素濃度条件下では比較的無細胞毒性であるが、低酸素条件下では容易に還元されて式ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩなどの細胞毒性化合物を生じる。
【００８２】
この文脈において、「低酸素」は、電極法によって直接測定したときの酸素化レベルが４％以下（または≦２３ｍｍＨｇ）であると考えられ得る。例えば、酸素化のレベルは３．０％、２．５％、２％、１．５％、１％または０．５もしくは０．１％未満であり得る。
【００８３】
当業者には、低酸素に誘発される化合物の細胞毒性作用の活性化をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで判定し得ることが理解されよう。
【００８４】
例えば、細胞毒性を直接電極法によって測定される様々な酸素化レベルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定し得る。
【００８５】
あるいは、組織の酸素化のレベルを例えば、酵素検出アッセイ調べた組織切片を用いて、または遺伝子発現解析によって、間接的に測定し得る。
【００８６】
ｉｎ  ｖｉｖｏで低酸素に誘発された細胞毒性の確認には、システムおよびＯｘｙＬｉｔｅシステムの両方を用いて、生きている組織の酸素化レベルを判定し得る（例えば、Ｗｅｎら，２００８，Ｒａｄｉａｌ  Ｒｅｓ．１６９：６７−７５を参照されたい）。
【００８７】
ほかにも、血流分析および灌流分析の結果から所与の組織における低酸素の存在を推測し得る。血流量を変化させるまたは血管形成を阻害する薬剤を適用しても、第一原理的に罹患組織における酸素化を減少させることが予想される。
【００８８】
本発明は特に、哺乳動物（中でも注目すべきはヒト）の癌の治療に使用するための本発明の第一の態様による化合物を提供する。
【００８９】
例えば、化合物は膀胱癌、乳癌、骨癌（原発性および続発性、例えば骨肉腫およびユーイング肉腫など）、脳癌（多形神経膠芽腫および星状細胞腫を含む）、子宮頸癌、絨毛癌、結腸および直腸癌、子宮内膜癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、妊娠性腫瘍、頭頸部癌、腎臓（腎細胞）癌、喉頭癌、白血病（ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ、ＣＭＬおよび毛様細胞性白血病など）、肝臓癌、肺癌、リンパ腫（ホドキンリンパ腫（Ｈｏｄｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）および非ホドキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）など）、黒色腫、中皮腫、口腔癌、骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、食道癌、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびに子宮癌からなる群より選択される癌の治療に使用するためのものであり得る。
【００９０】
一実施形態では、化合物は、様々な形態の肉腫および癌腫などの固形腫瘍の治療に使用するためのものである。
【００９１】
本発明の化合物は、本来少なくとも部分的に低酸素である（例えば、酸素レベル中央値が３％未満、例えば２．５％、２％、１．５％、１％または０．５％未満である）腫瘍の治療に特に有用であり得る。このような腫瘍の例には膵臓癌および前立腺癌があり、ともに通常、低い酸素レベルおよび悪性進行の傾向を示す。
【００９２】
本発明のプロドラッグ化合物の細胞毒性が低酸素により活性化されることよって、細胞毒性を腫瘍細胞に標的化し、健常細胞への損傷のリスクを低減することが可能になる。
【００９３】
低酸素が特定の癌の悪性進行の促進に何らかの役割を果たしている可能性があると考えられている（例えば、ＲｕｄｏｌｆｓｓｏｎおよびＢｅｒｇｈ，２００９，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒ．１３：２１９−２２５を参照されたい）。腫瘍の低酸素の領域内で優先的に細胞毒性効果を発揮することによって、本発明の化合物は、他の方法では、例えば放射線療法または従来の化学療法剤による治療に対して耐性を示す癌細胞を標的とし得る。このような耐性細胞を根絶することによって、転移を減少させ得る。
【００９４】
したがって、一実施形態では、化合物は、転移（癌の病因から、または治療の結果として生じ得る）の治療または予防に使用するためのものである。当業者
【００９５】
当業者には、本発明の化合物を単独で、または他の癌治療（放射線療法、例えば放射性同位元素および外照射、ならびに化学療法剤など；以下を参照されたい）と組み合わせて使用し得ることが理解されよう。
【００９６】
一実施形態では、化合物は単独療法（すなわち、他の癌治療を一切実施しない）として使用するためのものである。しかし、癌患者にはほかにも、異なるタイプの有益な薬剤（例えば鎮痛剤、鎮静剤、抗うつ剤、抗生物質など）を投与し得ることが理解されよう。
【００９７】
しかし、本発明の化合物は、別法として、１つまたは複数の追加の癌治療と組み合わせて使用するためのものであり得る。例えば、化合物を１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の追加の癌治療と組み合わせて使用し得る。
【００９８】
「組み合わせて」は、同じ治療過程で１つまたは複数の追加の癌治療を受けている対象に化合物を投与することを包含するものとする。したがって、この用語には、化合物を１つまたは複数の追加の癌治療と同時に投与すること（ボーラス投与または注入として）のみならず、一時的にこれらの癌治療とは別々に投与することも含まれる。例えば、患者の腫瘍医が化合物の前、化合物と同時に、または化合物の後に実施される１つまたは複数の追加の癌治療を含むと定めた治療スケジュール／サイクル内で、例えば、１０週間、９週間、８週間、７週間、６週間、５週間、４週間、３週間、２週間、１０日、１週間、５日、４日、３日、２日、１日、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、２０分、１０分または５分以内に化合物を投与し得る。各治療サイクルを数回、通常、最大６サイクル繰り返し得るが、癌の性状および治療に対するその応答に応じて、サイクルがこの数値を上回る、または下回る場合があり得る。
【００９９】
当業者には、１つまたは複数の追加の癌治療が化学療法剤または放射線療法であり得ることが理解されよう。
【０１００】
しかし、一実施形態では、１つまたは複数の追加の癌治療は１つまたは複数の化学療法および／または放射線療法を含むか、これよりなるものである。
【０１０１】
本発明のプロドラッグ化合物の細胞毒性が低酸素により活性化されることを考慮すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の酸素化レベルを低下させる（少なくとも一時的に）ことが可能な１つまたは複数の化学療法剤および／または放射線療法との併用療法の一部としてこれを投与するのが有利である。例えば、１つまたは複数の化学療法剤および／または放射線療法は、腫瘍の酸素濃度の中央値を３％未満、例えば、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％未満に低下させることが可能なものであり得る。
【０１０２】
当業者には、多数の様々な手段によって、例えば、確立された腫瘍血管系の破壊、血管新生（新たな血管の形成）の阻止および／または血管収縮によって腫瘍の酸素化レベルの低下を達成し得ることが理解されよう。
【０１０３】
適切な癌治療法は抗アンドロゲン剤（ステロイド性および非ステロイド性）、血管破壊剤、抗血管新生剤、抗ＶＥＧＦＲ剤、ＩＬ８阻害剤、ＮＯ合成酵素阻害剤、血管収縮剤、血管拡張剤および放射線療法からなる群より選択され得る。
【０１０４】
「ステロイド性抗アンドロゲン剤」は酢酸シプロテロンを包含するものとする。
【０１０５】
「抗血管新生剤」は以下のものを包含するものとする：
（ａ）ベバシズマブ、アキシチニブ、パゾパニブおよびラニビズマブなどの抗ＶＥＧＦ抗体または抗体フラグメント、ペガプタニブナトリウム、トリプトファニル−ｔＲＮＡ合成酵素、ＡｄＰＥＤＦ、ＥＹＬＥＡ、ＡＧ−０１３９５８、ＪＳＭ６４２７、ＴＧ１００８０１、ＡＴＧ３、ラパマイシン、エンドスタチン；
（ｂ）細胞内でのシグナル伝達を遮断する薬物、例えばラパチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、パゾパニブおよびＡＺ２１７１など；
（ｃ）テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）およびカンナビジオール；
（ｄ）ロシグリタゾン、ピオグリタゾンおよびトログリタゾンなどのチアゾリジンジオン
（ｅ）エルロチニブ、イマチニブ、ゲフィチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ラパチニブ；ならびに
（ｆ）細胞間のシグナルに影響を及ぼす薬物、例えばサリドマイドおよびレナリドマイドなど。
【０１０６】
「血管破壊剤」は、小分子（タキサン、タキソール、パクリタキセルコンブレタスタチン、ＣＡ４Ｐ、Ｏｘｉ４５０３、アウロスタチン、ドロスタチン、コルチン、アザコルヒチノールａｚａｃｏｌｃｈｉｃｉｎｏｌ、ＺＤ６１２６Ｉ、ＭＭＰ活性化コルヒチン、ＩＣＴ２５８８、ＤＭＸＡＡ、ＴＺＴ１０２７およびＡＶＥ８０６２など）および生物学的製剤（ＡＤＥＰＴ、ＧＤＥＰＴおよび腫瘍血管系を標的とする抗体薬物コンジュゲート）を包含するものとする。
【０１０７】
「ＩＬ８阻害剤」はレペルタキシンを包含するものとする。
【０１０８】
「ＮＯ合成酵素阻害剤」はＮＧ−メチル−ｌ−アルギニン塩酸塩（５４６Ｃ８８；ｌ−ＮＭＭＡ）、ＮＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）、Ｌ−ニトロアルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、ＬＧ−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＯ−Ａｒｇ）および７−ニトロ−インダゾール（７−ＮＩ）を包含するものとする。
【０１０９】
「血管収縮剤」は、アルファ１アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、メトキサミン、フェニレフリン、オキシメタゾリン、テトラヒドララジン、キシロメタゾリン）、アルファ２アドレナリン受容体アゴニスト（例えば、クロニジン、グアナベンズ、グアンファシン、α−メチルドパ）およびバソプレッシン類似体（例えば、アルギニンバソプレッシンおよびトリグリシルリジンバソプレッシン）を包含するものとする。
【０１１０】
「血管拡張（血管盗血）剤」はアルファ−アドレナリン受容体アンタゴニスト（アルファ遮断剤）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシン受容体遮断剤（ＡＲＢ）、ベータ２−アドレナリン受容体アゴニスト（β２−アゴニスト）、カルシウムチャネル遮断剤（ＣＣＢ）、中枢性交感神経遮断剤、直接作用型血管拡張剤、エンドセリン受容体アンタゴニスト、神経節遮断剤、ニトロ系拡張剤（ｎｉｔｒｏｄｉｌａｔｏｒｓ）、ホスホジエステラーゼ阻害剤、カリウムチャネル開口薬およびレニン阻害剤を包含するものとする。
【０１１１】
「放射線療法」は、従来の外照射放射線療法（２ＤＸＲＴ）、定位放射線手術（ＳＲＳ）、体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）およびプロトン療法などの粒子線療法；ＳＡＶＩ（商標）、ＭａｍｍｏＳｉｔｅ（商標）、Ｃｏｎｔｕｒａ（商標）、Ｐｒｏｘｃｅｌａｎ（商標）、ＴｈｅｒａＳｅｅｄ（商標）およびＩ−Ｓｅｅｄ（商標）などの近接照射療法；メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）、ヨウ素−１３１、ホルモン結合ルテチウム−１７７およびイットリウム−９０（ペプチド受容体放射性核種療法）などの放射性同位元素療法を包含するものとする。
【０１１２】
好ましい一実施形態では、１つまたは複数の癌治療法は非ステロイド性抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、デュタステリド、ベキストステリド、イゾンステリド、ツロステリド、エプリステリドおよびアビラテロンなどである。
【０１１３】
したがって、一実施形態では、本発明の第一の態様による化合物を癌の治療、例えば、転移の予防または減少にビカルタミドと組み合わせて使用する。
【０１１４】
したがって、一実施形態では、本発明の第一の態様による化合物を癌化学療法剤および／または放射線療法および／または患者が呼吸する空気を減少または増加させる方法、例えばカルボゲン（ニコチンアミドを加えるものまたは加えないもの）と組み合わせて使用する。
【０１１５】
関連する本発明の第六の態様は、癌治療のための薬剤の調製における本発明の第一の態様の化合物の使用を提供する。
【０１１６】
本発明の第六の態様の好ましい実施形態は、本発明の第五の態様に関連して上に記載されるものである。
【０１１７】
本発明の第七の態様は、治療有効量の本発明の第一の態様の化合物を患者に投与することを含む、患者の癌を治療する方法を提供する。
【０１１８】
一実施形態では、患者は哺乳動物（例えば、ヒト）である。
【０１１９】
本発明の第七の態様の好ましい実施形態は、本発明の第五の態様に関連して上に記載されるものである。
【０１２０】
本発明の第八の態様は、細胞の酸素化レベルのマーカーとしての本発明の第一の態様の化合物の使用を提供する。具体的には、このような化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで細胞低酸素マーカーとして使用し得る。
【０１２１】
一実施形態では、細胞は哺乳動物（例えば、ヒト）のものである。
【０１２２】
Ｎ−オキシド型の本発明の化合物（式ＶおよびＶＩの化合物など）を低酸素細胞に曝露すると、この細胞が対応するアミン型（式ＩＩＩおよびＩＶのものなど）に還元され、既知の手段によってこれを容易に検出することができる。
【０１２３】
還元化合物（式ＩＩＩおよびＩＶの化合物など）の存在を用いて、低酸素細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検出することができる。還元化合物（１つまたは複数）によって本来の蛍光特性が保持され、還元化合物（１つまたは複数）が細胞内に存在し続けることは、低酸素条件に曝露されていたか、曝露され続けている細胞の識別、定量化および位置特定に有利である。
【０１２４】
例えば、低酸素の細胞マーカーとして作用する場合、特に限定されないが質量分析法、赤外線分光測定法、比色定量法、ラマン分光法、核磁気共鳴法または陽電子放射断層撮影法を含めた化学組成物または物理的特性を確認する方法（１つまたは複数）を用いて、還元化合物（式ＩＩＩおよびＩＶの化合物など）を検出し得る。アフィニティーキャプチャー法では、還元化合物のＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチド配列との高親和性結合能を利用する。
【０１２５】
還元化合物（１つまたは複数）の光学的特性を用いて生物試料中の化合物を検出してもよく、このようなものとしては、特に限定されないが、還元化合物の本来の蛍光特性を用いるフローサイトメトリーおよび顕微鏡法が挙げられる。還元化合物を検出する第二の方法としては、特に限定されないが、還元化合物がアクセプターまたはドナーのいずれかとして共鳴エネルギー転移反応に関与する、他の分子のレポーター化合物との結合が挙げられる。還元化合物を検出するその他の第二の方法としては、特に限定されないが、分子検出のための抗体ベースの方法を用いる方法が挙げられる。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の化合物を用いて低酸素腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで特定し、次いで、これをｉｎ  ｓｉｔｕで可視化するか、外科的に切除する。
【０１２７】
さらなる実施形態では、本発明の第一の態様の化合物を非重水素化型の本発明の第一の態様の化合物と組み合わせて、細胞低酸素マーカーとして使用する。
【０１２８】
この文脈における「組み合わせて」は、化合物を同時にまたは逐次的に（例えば、２４時間、１２時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分、３０分、１０分またはこれ以下以内に）細胞に適用（例えば、患者に投与）し得ることを包含する。
【０１２９】
したがって、好ましい実施形態では、式ＩＸまたはＸの化合物を米国特許第５，１３２，３２７号に開示される化合物（例えば、ＡＱ４Ｎ）と組み合わせて、細胞低酸素マーカーとして（ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで）使用する。
【０１３０】
関連する本発明の第九の態様は、本発明の第一の態様による化合物を含む、細胞の酸素化レベルの検出に使用するための部分のキットを提供する。
【０１３１】
任意選択で、キットは非重水素化型の本発明の第一の態様による化合物（米国特許第５，１３２，３２７号に開示される化合物、例えばＡＱ４Ｎなど）をさらに含む。
【０１３２】
好ましくは、化合物（１つまたは複数）を無菌、無発熱物質の形態で提供する。
【０１３３】
本発明のキットは１つまたは複数の試薬、対照試料および／または指示書をさらに含み得ることが理解されよう。
【０１３４】
これより以下の図面を参照しながら、本発明の特定の態様を具体的に示す好ましい非限定的な例を記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】代謝産物ＡＱ４およびＯＣＴ１００１は正常酸素化条件下でほぼ同じ細胞周期停止作用を有し、選択的重水素化が内因性の生物活性を変化させないことを示す図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図２】ＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２のほぼ同じ低酸素活性化細胞毒性を示す図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図３】ＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２の生物活性が低酸素の程度に依存することを例示する図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図４】ＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２による低酸素依存性の増殖阻害が細胞周期のほぼ同じ機序から生じ、低酸素の程度に依存することを示す図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図５Ａ】酸素条件下におけるＡＱ４ＮとＯＣＴ１００２に共通する機能性ｐ５３（ＤｏＨＨ２）および変異体ｐ５３（ＳＵ−ＤＨＬ−４）ヒトＢ細胞リンパ腫に対する生物活性を例示する図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図５Ｂ】酸素条件下におけるＡＱ４ＮとＯＣＴ１００２に共通する機能性ｐ５３（ＤｏＨＨ２）および変異体ｐ５３（ＳＵ−ＤＨＬ−４）ヒトＢ細胞リンパ腫に対する生物活性を例示する図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図６】低酸素下でのＯＣＴ１００１赤外蛍光発色団の細胞内蓄積がＯＣＴ１００２プロドラッグ投与量および酸素化レベルに応答性であることを示す図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図７】重水素化は代謝産物（ＡＱ４またはＯＣＴ１００１）が細胞内に蓄積する内因性の能力に影響を及ぼさないことを示す図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図８】変換されたプロドラッグＯＣＴ１００１の蓄積が増殖停止と相関することを示す図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図９Ａ】低酸素条件下でＯＣＴ１００２に曝露した後の細胞内蛍光およびプロドラッグ重水素化が細胞内蓄積を減少させるが、代謝産物の残留は増大させることを実証する図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図９Ｂ】低酸素条件下でＯＣＴ１００２に曝露した後の細胞内蛍光およびプロドラッグ重水素化が細胞内蓄積を減少させるが、代謝産物の残留は増大させることを実証する図である。実施例Ｂを参照されたい。
【図１０】異種移植片として増殖した２２Ｒｖ１前立腺腫瘍の酸素化に対するビカルタミドの効果を示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【図１１】２２Ｒｖ１腫瘍異種移植片の血管に対するビカルタミドの効果を示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【図１２】マウスの２２Ｒｖ１異種移植片に対するビカルタミド単独またはＡＱ４Ｎ単回投与またはＯＣＴ１００２単回投与の効果を示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【図１３】ビカルタミドで連日処置したマウスの２２Ｒｖ１異種移植片に対するＡＱ４Ｎ単回投与またはＯＣＴ１００２単回投与の複合効果を示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【図１４】ビカルタミド処置／未処置マウスのＬＮＣａＰ異種移植片に対するＯＣＴ１００２の効果を示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【図１５】ＯＣＴ１００２がｉｎ  ｖｉｔｒｏの低酸素ＬＮＣａＰ腫瘍細胞内で還元されることを示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【図１６】ＯＣＴ１００２がＬＮＣａＰ腫瘍の肺への転移拡散を低減することを示す図である。実施例Ｃを参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
実施例Ａ：アルキルアミノアルキルアミノアントラキノンおよびそのＮ−オキシドの合成
（ａ）１，４−ジフルオロ−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンの調製
【化８】
0006450678.tif 000009
４，７−ジフルオロイソベンゾフラン−１，３−ジオン（８．５０ｇ、４６．２ｍｍｏｌ），ヒドロキノン（５．６４ｇ、５１．３ｍｍｏｌ），三塩化アルミニウム（３６．９ｇ、２７７ｍｍｏｌ）およびスルホラン（１０ｍＬ）の化合物を１６５℃で１６時間攪拌した。約１５０℃まで混合物が粘稠性の赤色のシロップにならないため、反応物は効率的に溶解した。突然の発熱およびＨＣｌガス発生の危険性を最小限に抑えるため、反応物を一部ずつ攪拌し、氷浴中で冷却し、混合が十分になるまで再び攪拌した。そのとき初めて混合物を加熱した。
【０１３７】
混合物を氷中に注加し、２Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ）を加えた。混合物を攪拌した後、ろ過し、得られたスラリーを２Ｍ  ＨＣｌでさらに洗浄した。固体を２Ｍ  ＨＣｌでさらに３回、再スラリー化して、生成物のアルミニウム含有量を減らした。最終的なスラリーをエーテルで２回洗浄し、一定重量になるまで丸底フラスコ中、６０℃で乾燥させて、１，４−ジフルオロ−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（９．８２ｇ、３５．６ｍｍｏｌ、収率７７％）を得た。
【０１３８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）に不純物は認められず、所望の物質と一致していた。
【０１３９】
（ｂ）１．４−ビス−（｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９．１０−ジオンの調製
【化９】
0006450678.tif 000010
丸底フラスコ中の重水素化−ｄ６−ジメチルアミン塩酸塩（１８．４ｇ、２１０ｍｍｏｌ）と２−ブロモアセトニトリル（１４．６３ｍｌ、２１０ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２５０ｍＬ）懸濁液を激しく攪拌しながら−１０℃に冷却し、一部ずつ炭酸カリウム（５８．１ｇ、４２０ｍｍｏｌ）で処理した。塩基を加えた後、反応物を還流冷却器および風船型フラスコに入れ、２時間にわたって緩やかに５℃に温めた。ＴＬＣ（１：１のＥｔＯＡｃ／イソ−ヘキサン）により生成物の存在が示された。混合物を室温で週末の間攪拌した。
【０１４０】
残渣をＤＣＭ（２５０ｍＬ）で希釈してろ過し、多量のＤＣＭで洗浄した。母液をＮ２で１時間脱気した後、ロータリーエバポレーターで体積を半減させた。次いで、塩化水素の４Ｍジオキサン溶液（５２．５ｍｌ、２１０ｍｍｏｌ）を加えて白色固体を沈殿させ、混合物を１０分間静置した後、ＤＣＭで洗浄しながらろ過して、重水素化−ｄ６−ジメチルアセトニトリル（２１．７３ｇ、１７２ｍｍｏｌ、収率８２％）を得た。
【０１４１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：４．４７（２Ｈ，ｓ）は所望の物質と一致していた。
【０１４２】
（ｃ）重水素化−ｄ６−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミンの調製
【化１０】
0006450678.tif 000011
０℃で攪拌している重水素化−ｄ６−ジメチルアセトニトリル（２１．７２ｇ、１７２ｍｍｏｌ）のＥｔ２Ｏ（２００ｍＬ）懸濁液に水素化アルミニウムリチウムの１Ｍエーテル溶液（５１５ｍｌ，５１５ｍｍｏｌ）を滴下漏斗で１．５時間にわたって滴加した。滴加後、冷却浴を取り外した。さらに１．５時間経過した後、硫酸ナトリウム十水和物（ＬｉＡｌＨ４に対して０．５当量、８０ｇ）を１．５時間にわたって慎重に加え（反応を遅らせて）、１５℃（１８℃以下）で反応を停止させた。混合物を１時間、攪拌しながら放置した後、エーテルで洗浄しながらろ過した。ろ液を暗所で一晩保管した。ロータリーエバポレーターで真空をかけずに約４０℃でエーテルを除去して、重水素化−ｄ６−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１５．８９ｇ、１６０ｍｍｏｌ、収率９３％に不純物は認められず、所望の物質と一致していたが、約０．２５当量のエーテルが含まれていた）。
【０１４３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：２．７６（２Ｈ，ｔ），２．３３（２Ｈ，ｔ）。
【０１４４】
（ｄ）１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシ−アントラセン−９．１０−ジオン（「ＯＣＴ１００１」）の調製
【化１１】
0006450678.tif 000012
１，４−ジフルオロ−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（４．９ｇ、１７．７４ｍｍｏｌ）のピリジン（３５ｍＬ）溶液を一定な流れの重水素化−ｄ６−Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン，（１６．５７ｍｌ、１４２ｍｍｏｌ）で処理した。混合物を４０℃に温め、窒素流下で２４時間、攪拌した。反応物を除熱し、氷浴中で冷却した。冷却した水酸化アンモニウム（３０％、３０ｍＬ）とブライン（３０ｍＬ）の混合物を加え、得られた混合物を氷浴中、２時間攪拌した。２時間後、混合物を１０％水酸化アンモニウム溶液（１３０ｍＬ）で洗浄しながらろ過した。固体を３０分間空気乾燥させた後、風袋重量を測定したフラスコに移し、６０℃、真空下で一定重量になるまで（約２時間）乾燥させた。
【０１４５】
バルク原料をＤＣＭに負荷し（脱脂綿プラグを通す）、６％、次いで１０％のＭｅＯＨ（１％ＮＨ３を含有）／ＤＣＭで溶離するフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ、１２０ｇ）により精製して、１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（２．０１ｇ、４．７３ｍｍｏｌ、収率２６．７％）を得た。
【０１４６】
生成物をＬＣＭＳ（ｍ／ｚ４２５．３（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋）により分析した；０．９０分および１．０３分において４２３．２（Ｍ−Ｈ）−（ＥＳ）−（カラム上の生成物スメア）、１００％。
【０１４７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）に不純物は認められず、所望の物質１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１３．５１（２Ｈ，ｓ），１０．４０（２Ｈ，ｂｒ  ｔ），７．１７（２Ｈ，ｓ），７．１１（２Ｈ，ｓ），３．４７（４Ｈ，ｑ），２．６６（４Ｈ，ｔ）と一致していた．
【０１４８】
（ｅ）１．４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（「ＯＣＴ１００２」）の調製
【化１２】
0006450678.tif 000013
−１１℃に冷却した攪拌している２８１−０４１（１．９０ｇ、４．４８ｍｍｏｌ）、ＡＱ４のメタノール（８ｍＬ）／ＤＣＭ（３０ｍＬ）溶液にモノペルオキシフタル酸マグネシウム、ＭＭＰＰ（３．１０ｇ、６．２７ｍｍｏｌ）を含有するメタノール（８ｍＬ）懸濁液を滴加した。添加完了後、反応溶液を０℃に温め、暗所で一晩攪拌した（この間、室温に温めた）。予め冷却したＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（６ｍＬ）を反応混合物に０℃で加えた。この混合物を３０分間攪拌した後、塩化水素の４Ｍジオキサン溶液（４．４８ｍｌ、１７．９０ｍｍｏｌ）を約−１０〜−１５℃で滴加した。次いで、得られたスラリーを１０分間攪拌した後、ＥｔＯＨ／水（９：１、１００ｍＬ）、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１：１、１００ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（６０ｍＬ）で洗浄しながらろ過し、真空下（ロータリーエバポレーターで）、４０℃で２時間（一定重量）乾燥させて、１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］−アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（２．１５ｇ、３．９９ｍｍｏｌ、収率８９％）を濃青色の粉末として得た。
【０１４９】
生成物をＬＣＭＳ（標準的な４分の方法、ａｇｉｌｅｎｔ）、３．０７分においてｍ／ｚ４５８．２（Ｍ＋Ｈ）＋（ＥＳ＋），２５４ｎｍにおける純度９８．３％により分析した。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ  ２０）δ：６．７３（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），６．４３（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），３．７６（４Ｈ，ｂｒ  ｓ），３．５８（４Ｈ，ｂｒ  ｓ）。
【０１５０】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）は所望の物質と一致していた。
【０１５１】
実施例Ｂ：１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオンおよびその活性代謝物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性
（ａ）代謝産物ＡＱ４とＯＣＴ１００１は正常酸素化条件下でほぼ同じ細胞周期停止作用を有し、このことは、選択的重水素化が内因性の生物活性を変化させなかったことを示している。
・従来の付着細胞のための方法を用いてＡ５４９ヒト肺癌細胞を培養し、３７℃、空気中の二酸化炭素５％の標準的な細胞培養条件下、０、１、３または１０ｎＭの薬剤に４日間曝露した。回収した細胞を透過処理し、ＤＮＡ蛍光色素の臭化エチジウムで染色し、従来のフローサイトメトリーにより細胞周期分布を明らかにした。
・図１（フローサイトメトリー）は、外因性代謝産物の１，４−ビス−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＡＱ４」）および１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチルアミノ）−エチル］アミノ）−５，８−ジヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＯＣＴ１００１」）に曝露した細胞の３〜１０ｎＭにおけるＤＮＡ含有量分布のＧ２ピークの増大（細胞周期停止を示す）がほぼ同じであることを示している。
【０１５２】
（ｂ）低酸素により増大するＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２の細胞毒性はほぼ同じである
・空気中または１％酸素条件下、ヒトＴ細胞白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を様々な濃度のＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２の存在下で従来の懸濁培養の方法を用いて４日間培養した。従来のコールターカウンター粒子計数法を用いて相対細胞数を求めた。
・図２は、被験化合物が細胞増殖の阻害に低酸素条件を必要とすることを示している。したがって、１，４−ビス−｛［２−（ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（「ＡＱ４Ｎ」）および１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチル−アミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＯＣＴ１００２」）はともに、低酸素条件下（１％酸素）で顕著な細胞分裂阻害活性を示す。
・対照については、低酸素症により直接作用型ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤（ＶＰ−１６）の細胞分裂阻害活性は変化せず、ほぼ同じレベルの細胞分裂阻害活性の延長がもたらされることを示している。
【０１５３】
（ｃ）ＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２の生物活性が低酸素の程度に依存することの例示
・従来の付着細胞のための方法を用いてＡ５４９ヒト肺癌細胞を培養し、３７℃、空気中の二酸化炭素５％（酸素正常）の標準的な細胞培養条件下または低酸素（１％および３％）条件下、様々な濃度のＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２剤に４日間曝露した。
・データを曝露期間の開始時および終了時における細胞剥離および細胞密度のコールターカウンター粒子計数によって求めた相対的な細胞集団倍加数としてプロットする。
・図３は、被験化合物、すなわち１，４−ビス−｛［２−（ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＡＱ４Ｎ」）および１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチル−アミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（「ＯＣＴ１００２」）では、増殖阻害が低酸素の程度および薬物濃度に依存し、２種類の薬剤がほぼ同じ応答を示すことを示している。
【０１５４】
（ｄ）ＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２による低酸素増感
・この実験にはＡ５４９ヒト肺癌細胞を使用し、培養条件は上の（ｃ）に記載される通りのものであった。
・上の（ａ）に記載される通りに細胞周期分析を実施した。
・図４は、被験化合物、すなわち１，４−ビス−｛［２−（ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＡＱ４Ｎ」）および１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチル−アミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＯＣＴ１００２」）が生物活性薬物量の範囲内でほぼ同じ細胞周期停止（フローサイトメトリーによって求められる）をもたらすことを示している。
・後期細胞周期停止の程度は酸素化レベルが減少するにつれて増大する。
【０１５５】
（ｅ）低酸素条件下におけるＡＱ４ＮとＯＣＴ１００２に共通するｐ５３機能性および変異体ｐ５３ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系に対する生物活性の例示
・ヒトＢ細胞リンパ腫細胞を空気中、１％酸素化条件または３％酸素化条件で、従来の懸濁培養の方法を用いて、様々な濃度のＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２の存在下で４日間培養した。従来のコールターカウンター粒子計数法を用いて相対細胞数を求めた。
・図５（Ａ）は、被験化合物が２１％（丸）、３％（三角）または１％（四角）Ｏ２下で４日間、懸濁液中で培養しプロドラッグに曝露したＤｏＨＨ２ヒトＢ細胞リンパ腫細胞（ｂｃｌ２過剰発現；ｐ５３ｗｔ）に対して、低酸素条件下で同程度にかつ選択的に細胞毒性であることを示している。したがって、１，４−ビス−｛［２−（ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン（「ＡＱ４Ｎ」）および１，４−ビス−｛［２−（重水素化−ｄ６−ジメチル−アミノ−Ｎ−オキシド）エチル］アミノ）−５，８−ジ−ヒドロキシ−アントラセン−９，１０−ジオン（「ＯＣＴ１００２」）はともに、低酸素（１％酸素）条件下で顕著な細胞分裂阻害活性を示し、増殖阻害は低酸素の程度に感受性である。
・同様に、図５（Ｂ）は、プロドラッグＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２が２１％（丸）、３％（三角）または１％（四角）Ｏ２下で４日間、懸濁液中で培養しプロドラッグに曝露したＳＵ−ＤＨＬ−４ヒトＢ細胞リンパ腫細胞（ｂｃｌ２過剰発現；ｐ５３変異体）に対して、低酸素条件下で同程度に選択的に細胞毒性であることを示している。同様に、増殖阻害は低酸素の程度に感受性である。
【０１５６】
（ｆ）負荷したｐＯ２レベルと最終産物生成の程度との間の相互関係
・ＯＣＴ１００２およびＡＱ４Ｎは、生物学的に関連する範囲の低酸素において、負荷したｐＯ２レベルと最終産物生成の程度との間の相互関係を示し、酸素正常下で変換が低レベルか検出不可能なレベルである（また、ＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２が検出不可能なレベルであることは、代謝産物が主要な残留するアントラキノン形態であることを示している）。
・ＡＱ４Ｎに比べて、重水素化変異型のＯＣＴ１００２は、長時間にわたる曝露条件下で瀕死細胞内での全体的な還元／蓄積能の低下（ＨＰＬＣ分析）を示し、このことは、ヒト肺癌細胞系における「不必要な標的化」の減少を示している。この場合、プロドラッグの不必要な標的化は、細胞周期停止が起こったときでもプロドラッグの変換が継続し得るため細胞不活化に必要とされるよりも過剰に細胞毒性型を生成することを指す。過剰な生成の結果、最初の標的細胞から放出されたときに変換型の有害作用が増大する。最初に低酸素条件に曝されていない周辺組織に対するこの望ましくないバイスタンダー効果は、非標的正常細胞および腫瘍細胞を含むことになる。正常細胞に対する損傷が望ましくないのは明らかである。バイスタンダー効果により非標的腫瘍細胞が適量下で曝露されると、組み合わせて送達される他の薬剤（１つまたは複数）に対する応答が低下するか、薬物耐性の発現に選択的な条件が発生し得る。
・表１は、ヒトＡ５４９細胞を様々な程度の低酸素および濃度下でＡＱ４ＮおよびＯＣＴ１００２に曝露した後の代謝産物生成のＨＰＬＣ分析の比較（データは２つの測定から得られたもの）を示し、ここでは２１％が正常な酸素化条件下であると見なされている。
・データは、示される条件に曝露し洗浄した後にプロドラッグまたはその代謝産物の存在をアッセイした細胞において、ＯＣＴ１００１の生成がＡＱ４と比較して一貫して減少していることを示している。データはほかにも、低酸素に供した細胞中に存在する分子型が代謝産物であって、親プロドラッグではないことを示している。
【０１５７】
【表１】
0006450678.tif 000014
ａいずれの試料においてもＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２が検出されないことは、受けた代謝によってプロドラッグ形態がすべて枯渇したか、用いる方法によってこのような形態が細胞内に容易に保持されないことを示している。
【０１５８】
（ｇ）低酸素下でのＯＣＴ１００１遠赤外蛍光発色団の細胞内蓄積は、ＯＣＴ１００２プロドラッグ投与量および酸素化レベルに応答する
・付着Ａ５４９細胞を従来の方法によって培養し、空気中、１％酸素化レベルまたは３％酸素化レベルで０、３０または１００ｎＭのＯＣＴ１００２に４日間曝露した。従来のフローサイトメトリーおよび波長６３３ｎｍの励起を用いて、剥離細胞を遠赤外蛍光強度について分析した（１×１０４個の細胞を分析した）。
・図６は、平均蛍光強度がプロドラッグ投与量の一次関数として増大し、酸素化レベルに依存することを示している。これは、細胞集団において優勢なｐＯ２レベルを分析するための簡便で蛍光定量的な単一生細胞の分析方法を提供するものである。
【０１５９】
（ｈ）重水素化は活性代謝物（ＯＣＴ１００１）の内因性の蓄積能に影響を及ぼさない
・この実験には、上の（ｇ）に記載される通りにＡ５４９ヒト肺癌細胞を使用した。
・酸素正常条件下では、細胞内にＯＣＴ１００１およびＡＱ４のほぼ同じレベルの蓄積が観察された（図７を参照されたい）。したがって、酸素正常下でＡＱ４またはＯＣＴ１００１に曝露した細胞の蛍光の集団分布を重ね合わせたヒストグラムは、ほぼ同じ細胞蓄積能を示している。
【０１６０】
（ｉ）変換されたプロドラッグＯＣＴ１００１の蓄積は増殖停止（瀕死細胞の増大）と相関する
・この実験には、光側方散乱（波長４８８ｎｍ）を蛍光強度（波長６９５ｎｍ超）に対して収集したことを除いて、上の（ｇ）に記載される通りにＡ５４９ヒト肺癌細胞を使用した。
・図８は、２１％、３％および１％酸素下で０、３０および１００ｎＭのＯＣＴ１００２に４日間にわたって曝露した細胞について収集されたフローサイトメトリーデータを示している。
・全データポイントのプロットから、光側方散乱パラメータの増大（増殖停止による細胞の大きさおよび複雑性の増大を反映している）が蛍光強度の増大（ＯＣＴ１００１の共蓄積を示している）と相関することがわかる。
【０１６１】
（ｊ）低酸素条件下でＯＣＴ１００２に曝露した後の細胞内蛍光およびプロドラッグ重水素化が細胞内蓄積を減少させるが、代謝産物の残留は増大させることの実証
・従来の方法を用いてＡ５４９細胞を培養し、チャンバースライドのガラス基質に付着させ、低酸素下でＯＣＴ１００２に曝露した。生細胞の蛍光造影には、赤色線レーザー励起を用いた従来の共焦点蛍光顕微鏡を使用した。
・図９ａは、細胞に検出された遠赤外蛍光が細胞質蓄積の領域の証拠から細胞内にある（対照培養物にはバックグラウンド蛍光は検出されない）ことを示している。データは、単一細胞レベルにおいて重水素化プロドラッグが単一細胞の低酸素を感知することを裏付けるものである。
・低酸素下におけるＯＣＴ１００２からＯＣＴ１００１への変換による細胞内蛍光が確認されたことを考慮して、さらにＡ５４９ヒト肺癌細胞を使用して、上の（ｇ）に記載される通りにフローサイトメトリーを用いて代謝産物の差次的蓄積または滞留を評価した。１％酸素下でＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２に曝露した後、細胞を分析のために剥離するか、剥離およびフローサイトメトリーによる分析の前に洗浄して無薬物培地で２４時間インキュベートし正常酸素化条件下に置いた。
・図９ｂのフローサイトメトリーのデータは、低酸素下のＡ５４９では、Ａ５４９細胞をプロドラッグのＯＣＴ１００１およびＡＱ４に曝露した後に細胞内蓄積が減少したこと（４日間の曝露後）に加えて、代謝産物ＡＱ４に起因する蛍光に比べて代謝産物ＯＣＴ１００１に起因する細胞内蛍光の損失が減少したこと（曝露後２４時間の回復後）を示している。したがって、重水素化が、低酸素により変換された形態のＯＣＴ１００２のｉｎ  ｓｉｔｕ細胞内区画の負荷／滞留を変化させる。
【０１６２】
結論
以上の試験は、本発明の例示的な重水素化化合物（Ｎ−オキシドプロドラッグのＯＣＴ１００２およびその活性代謝物のＯＣＴ１００１）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性を明らかにするものである。
（ａ）様々な腫瘍細胞型に増殖停止を誘発する低酸素におけるプロドラッグ還元後の主要な生物活性の証拠；
（ｂ）還元薬物（ＯＣＴ１００１）の同程度に効果的な毒性に対して、酸素正常状態におけるＯＣＴ１００２の細胞に対する毒性は有意に低い。
（ｃ）生物学的に関連する低酸素の範囲におけるｐＯ２レベルと最終生成物生成との間の相互関係；
（ｄ）細胞内蛍光が、低酸素環境を検知および報告する代謝産物のｓｉｔｕ生成を報告する能力；
（ｅ）物理化学的方法によってプロドラッグの変換および代謝を追跡するのに使用し得る、部位特異的重水素化によって得られる明確な分子的／原子的痕跡；ならびに
（ｆ）プロドラッグの重水素化により、低酸素下で還元型の蓄積が減少するが、外部薬物を除去し再酸素化すると還元型の残留／滞留が増加する。瀕死細胞で明らかにされたこの特性は、重水素化型の不必要な標的化の低減および低酸素感知用途に便利なシグナル残留の両方を裏付けるものである。
【０１６３】
実施例Ｃ−ＯＣＴ１００２の腫瘍増殖および転移に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの効果
本発明のプロドラッグ化合物の細胞毒性が低酸素により活性化されることを考慮すると、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の酸素化レベルを低下させる（少なくとも一時的に）ことが可能な１つまたは複数の化学療法剤および／または放射線療法との併用療法の一部としてこれを投与するのが有利であり得る。ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ、Ｃｏｓｕｄｅｘ、Ｃａｌｕｔｉｄｅ、Ｋａｌｕｍｉｄとして市販されている）は、前立腺癌の初期段階の治療のための単独療法として使用される場合を含め、前立腺癌の治療に使用される経口非ステロイド性抗アンドロゲン剤である。２２Ｒｖ１はヒト前立腺癌上皮細胞系である（Ｓｒａｍｋｏｓｋｉ  ＲＭ，Ｐｒｅｔｌｏｗ  ＴＧ  ２ｎｄ，Ｇｉａｃｏｎｉａ  ＪＭ，Ｐｒｅｔｌｏｗ  ＴＰ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｓ，Ｓｙ  ＭＳ，Ｍａｒｅｎｇｏ  ＳＲ，Ｒｈｉｍ  ＪＳ，Ｚｈａｎｇ  Ｄ，Ｊａｃｏｂｂｅｒｇｅｒ  ＪＷ  Ａ  ｎｅｗ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，２２Ｒｖ１．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．１９９９  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；３５（７）：４０３−９）。この細胞系は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を発現する。ジヒドロキシテストステロンによって増殖がわずかに刺激され、可溶化液はウエスタンブロット解析によりアンドロゲン受容体抗体に免疫反応性を示す。
【０１６４】
（ｉ）異種移植片として増殖した２２Ｒｖ１前立腺腫瘍の酸素化に対するビカルタミドの効果
・１００〜１５０ｍｍ３の２２Ｒｖ１前立腺腫瘍を有する雄ＳＣＩＤマウス（８週齢超）を溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）またはビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））の強制経口投与により２８日間、連日処置した。
・治療開始前（第０日）、Ｏｘｙｌｉｔｅ酸素電極プローブを用いてｐＯ２（ｍｍＨｇ）を測定し、これを示される日に繰り返した。
【０１６５】
【表２】
0006450678.tif 000015
表３には平均ｐＯ２値±ＳＤが示されている。このほか、対照および第０日の値と比較したビカルタミド群の統計学的比較が示されている；ｎｓ＝有意性なし。
【０１６６】
・２２Ｒｖ１細胞はＳＣＩＤマウスの背部で固形腫瘍として増殖する。
・溶媒およびビカルタミド（２ｍｇ／（ｋｇ・日））処置マウスにおける腫瘍酸素化を２８日間にわたって測定した（上の表３を参照されたい）。
・ビカルタミドは約１５．３ｍｍＨｇ（２％酸素）から第７日には２．０ｍｍＨｇ（０．３％酸素）、第１４日には０．５ｍｍＨｇ（０．１％酸素）まで腫瘍酸素化の低下を引き起こした（図１０に示される通り）。この低下が約２週間持続した後、第２１日および第２８日（酸素化の開始レベルとの間に有意差が認められなくなるとき）以降のどこかの時点でほぼ正常な状態に回復する。
・より速く増殖する溶媒処置対照は、第７日まで酸素レベルの有意な低下を示さなかった。しかし、翌週（腫瘍の大きさに関連すると思われる）、酸素レベル中央値が約３ｍｍＨｇ（０．４％酸素）まで低下し、確かに回復を示している。
【０１６７】
結論
２２Ｒｖ１固形腫瘍モデルには低酸素がみられる。ビカルタミドの添加により、腫瘍によって示される酸素レベルのパターンが変化する。低酸素が２２Ｒｖ１モデルおよびこのようなモデルの単独療法（±ビカルタミド）に対する応答；ならびに併用療法におけるＯＣＴ１００２の潜在的役割に関連することは明らかである。
【０１６８】
（ｉｉ）２２Ｒｖ１腫瘍異種移植片の血管に対するビカルタミドの効果
・雄ＳＣＩＤマウス（８週齢超）の背中にウィンドウチャンバーを用いて背部の皮膚のひだを確保した。２２Ｒｖ１腫瘍断片を移植し、処置開始前の７日間、血管化させた。
・溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）またはビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／ｋｇ）の強制経口投与によりマウスを連日処置した。
・共焦点顕微鏡による撮像の直前、麻酔したマウスにＦＩＴＣ標識デキストランを静脈内注射した。
・画像はそれぞれ、処置群当たり最小５個体の代表的なものである。
・ＳＣＩＤマウス背部のウィンドウチャンバー／背部皮弁で２２Ｒｖ１腫瘍が増殖した。処置開始前に（Ａ）溶媒および（Ｅ）ビカルタミド前処置群、次いで処置後第７日、第１４日および第２１日に（Ｂ〜Ｄ）溶媒単独および（Ｆ〜Ｈ）ビカルタミドについて腫瘍断片を撮像した（倍率１０倍）（図１１を参照されたい）。
・７日以内では、腫瘍断片は実験期間の第０日として示される広範囲にわたる小血管の発達を示した（図１１を参照されたい）。
・溶媒処置した腫瘍では、第１４日までに血管密度がわずかな変化を示し、第２１日までに小血管の数が減少した。
・ビカルタミド処置した腫瘍では、第７日および第１４日に小血管の消失が見られ、第２１日までにいくぶん回復した。これは酸素電極のデータ、すなわち、酸素化の低下およびその後の回復と一致する。
【０１６９】
結論
・溶媒は少なくとも７日間は血管に何ら効果を示さない。第１４日までに血管のわずかな剪定が見られ、第２１日までにこれが明白に見られるようになる。この血管消失はビカルタミド処置した腫瘍に見られる（第７日および１４日；Ｍｉｎｇら，２００７）ものほど劇的なものではないが、この急速に増殖する溶媒処置腫瘍にこの時点でみられる血管虚脱および壊死に起因すると思われる。酸素レベルの低下はいくぶん早く、すなわち、第７日から第１４日の間のどこかの時点でみられる（図１０を参照されたい）。
・ビカルタミド処置した２２Ｒｖ１腫瘍では、早期の腫瘍血管系の顕著な消失がみられる（第７日までに）。このデータは、ビカルタミドが抗血管作用を介して腫瘍酸素化の著しい低下を引き起こす証拠をもたらすものであり、これは直接的なものであるか、あるいは腫瘍細胞による血管新生促進因子の産生が阻害されたことに起因する可能性が考えられる。
・第２１日までには小血管は回復しており、このことは、図１０にみられる酸素化レベルの増大と一致している。
【０１７０】
（ｉｉｉ）マウスの２２Ｒｖ１異種移植片に対するビカルタミド単独またはＡＱ４Ｎ単回投与またはＯＣＴ１００２単回投与の効果。
・１００〜１５０ｍｍ３の２２Ｒｖ１異種移植腫瘍を有する雄ＳＣＩＤマウス（８週齢超）を２８日間処置した。処置には溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）またはビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））を含め、ともに強制経口投与により連日投与した。あるいは、実験期間の第７日目、ＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２（無菌ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与として腹腔内投与した。
・１日置きにキャリパーを用いて腫瘍体積を測定した。
・処置（１つまたは複数）の腫瘍体積に対する時間依存的効果を判定するためのデータ解析を実施した。腫瘍体積は第６日（すなわち、プロドラッグ追加前）に対して正規化した。時系列回帰分析を実施した。
・全体的な腫瘍増殖およびパターンを図１２（ＡおよびＢ）と比較できるよう、腫瘍増殖を第６日に対して正規化する。
・２２Ｒｖ１腫瘍は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでビカルタミドに対して感受性でないにもかかわらず、わずかであるが有意な増殖速度の低下を示す。増殖遅延の古典的な横断比較は、溶媒で処置したマウスが処置開始時の体積の４倍に達するのに１４．０±０．３日必要であることを示していた。ビカルタミド処置（２ｍｇ／（ｋｇ・日））ではこれが１８．５±０．８日に増加し、したがって、これは４．５日の増殖遅延であった。
・グラフの回帰適合は、ビカルタミド単独で処置した２２ＲＶ１腫瘍が、ビカルタミドに連日曝露し続けたにもかかわらず増殖の遅延を示し（第１０日〜２０日の間）、腫瘍が第２４日まで全体的な指数関数的増殖パターン（Ｒ２＝０．９９１５）を示すことを示している。
・第７日に単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ）として投与したＡＱ４Ｎの追加では、ビカルタミド単独処置のものと比較して異なる増殖パターンが観察され、回帰適合が非線形性の多項増殖パターン（Ｒ２＝０．９９４８）を示した。
・第７日に単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ）として投与したＯＣＴ１００２の追加では、この単回投与で処置した腫瘍が多項（ｘ２）増殖速度パターンを維持することができ、これは非線形パターンでもあった（Ｒ２＝０．９９７８）。
・ＯＣＴ１００２処置腫瘍は実験の残りの期間（第２２日以降）にわたって、ビカルタミド単独およびＡＱ４Ｎ単独で処置した腫瘍に比べて全体的な増殖速度の低下を示した。全期間にわたる累積増殖（累積曲線下面積）がこの差を示している（図１２Ｂ）。
【０１７１】
（ｉｖ）ビカルタミドで連日処置したマウスの２２Ｒｖ１異種移植片に対するＡＱ４Ｎ単回投与またはＯＣＴ１００２単回投与の複合効果
・１００〜１５０ｍｍ３の２２Ｒｖ１異種移植腫瘍を有する雄ＳＣＩＤマウス（８週齢超）を２８日間処置した。溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）およびビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））処置を強制経口投与により連日実施した。
・第７日、ＡＱ４ＮまたはＯＣＴ１００２（無菌ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与として腹腔内投与した。
・１日置きにキャリパーを用いて腫瘍体積を測定した。
・腫瘍量が８００ｍｍ３に達した後にマウスを間引いた。
・全体的な腫瘍増殖およびパターンを図１３（ＡおよびＢ）と比較できるよう、腫瘍増殖を第６日に対して正規化する。
・ビカルタミド単独処置（２ｍｇ／（ｋｇ・日））は上述の通りであり、第２４日まで全体的な指数関数的増殖パターン（Ｒ２＝０．９９１５）を示す。
・ビカルタミド処置を第７日に投与するＡＱ４Ｎ単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたところ、ビカルタミド単独処置のものと比較して変化した増殖パターンが観察され、回帰適合が非線形的な多項増殖パターン（Ｒ２＝０．９９８２）を示し、第２０日以降においてビカルタミド単独との増殖の相違が明らかであった。
・ビカルタミド処置を第７日に投与するＯＣＴ１００２単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせたところ、異なる増殖パターンが観察され、回帰適合が線形性の腫瘍増殖応答（Ｒ２＝０．９９５５）を示し、第１４日以降においてビカルタミド単独との増殖の相違が明らかであった。
【０１７２】
結論
・併用療法は２つの極めて重要な特徴を示している。
（ｉ）第一の特徴は、ＯＣＴ１００２の方がＡＱ４Ｎよりも早くビカルタミド処置腫瘍に対して効果的な腫瘍増殖阻害を示すことであり；
（ｉｉ）第二の特徴は持続的な腫瘍増殖阻害（線形性の応答の維持によって示される）を示すものであり、これは持続的なＯＣＴ１００２および腫瘍増殖阻害を反映している。
・その結果、低酸素状態／低い酸素レベルに達した時点でＯＣＴ１００２を投与すると、早く持続的な効果が得られた。ＯＣＴ１００２とビカルタミドとの組合せは、ＡＱ４Ｎとビカルタミドとの組合せと比較して腫瘍増殖を阻害する効果が高かった。
【０１７３】
（ｖ）ビカルタミド処置／未処置マウスのＬＮＣａＰ異種移植片に対するＯＣＴ１００２の効果
・１００〜１５０ｍｍ３のＬＮＣａＰ異種移植腫瘍を有する雄ＳＣＩＤマウス（８週齢超）を２８日間処置した。
・溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）およびビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））処置を強制経口投与により連日実施した。第７日、ＯＣＴ１００２（無菌ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与として腹腔内投与した。
・１日置きにキャリパーを用いて腫瘍体積を測定した。
・増殖曲線は、ビカルタミド処置群および溶媒処置群の５個体以上の平均値；ビカルタミド＋ＯＣＴ１００２群（第１４日までｎ＝５；その後、ｎ＝３）およびｖｅｈｉｃｌｅ＋ＯＣＴ１００２（第１３日までｎ＝５；ｎ＝１）±ｓ．ｅ．である。
・下の表６は、処置サイズの２倍に達するまでの時間について計算した増殖遅延を示している。
・ビカルタミドは、ＬＮＣａＰ腫瘍増殖に溶媒と比較して５．１日の遅延を引き起こす。
・ＯＣＴ１００２（第７日に５０ｍｇ／ｋｇの単回投与）を溶媒（連日投与）と併用して投与したところ、腫瘍増殖に対して認識できる効果は認められなかった（下の表６）。
・ビカルタミド（２８日間連日）は最初、第１２日〜１４日まで腫瘍増殖の速度を低下させる。その後、腫瘍増殖が回復し、腫瘍は第２８日までに溶媒処置腫瘍と同じ大きさになる（下の表６）。
・ＯＣＴ１００２の単回投与で処置した腫瘍は、ビカルタミドと併用した場合に増殖速度が低下し、これには第１４日から実験終了時の第２８日まで常に、対照との間に有意差が認められた（図１５）。
【０１７４】
結論
・第７日のＯＣＴ１００２投与にはＬＮＣａＰ腫瘍増殖に対する有意な効果は認められなかった。このことは、酸素化がより良好な腫瘍（すなわち、ビカルタミド処置腫瘍と比較して）ではＯＣＴ１００２の毒性が低く、この酸素化がより良好な細胞の割合が溶媒処置対照腫瘍の増殖への寄与において優勢であることを示している。
・ＯＣＴ１００２の単回投与とビカルタミドの併用により、ビカルタミド処置群に観察される増殖速度の増大が阻止された。ＯＣＴ１００２は、ビカルタミド単独では遅延の後に回復がみられる第１２日以降において腫瘍増殖の阻止に極めて効果的である。
・ビカルタミドによる連日処置期間におけるＬＮＣａＰ腫瘍増殖速度の最初の低下および第１４日以降の回復は、腫瘍の酸素化および血管の低下およびその後の回復と一致している（Ｍｉｎｇら，２０１２，上記）。
【０１７５】
【表３】
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【０１７６】
（ｖｉ）ＯＣＴ１００２プロドラッグはｉｎ  ｖｉｖｏの低酸素ＬＮＣａＰ腫瘍細胞内で代謝産物に変換される
方法
・雄ＳＣＩＤマウスの背部に背部皮弁（ウィンドウチャンバー）を付着させ、１ｍｍ３のＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ腫瘍断片を挿入し、７日間血管化させた。
・次いで、マウスを溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）またはビカルタミド（２ｍｇ／（ｋｇ・日））のいずれかで２１日間、経口的に処置した。
・（ａ）溶媒または（ｂ）ビカルタミド導入の７日後、マウスにＯＣＴ１００２（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。
・ＯＣＴ１００２注射の２時間後、マウスにＦＩＴＣ−デキストランを静脈内注射した。
・共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて画像を取り込み、腫瘍の血管（緑）およびＯＣＴ１００１（青）のパターンを示した（倍率１０倍とデジタルズーム３倍）（ピクセル解像度）。
・このほか、第０日（すなわち、腫瘍断片移植の７日後）、１４日および２１日に画像を取得した。
・第０日、１４日および２１日にＦＩＴＣ−デキストランのみを投与した。（ｃ）第０日、７日、１４日および２１日の画像の全パネル。
・対照マウスを溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）で２１日間、経口的に処置し、全体を通して血管化を維持させた。第７日までに腫瘍断片が血管化された（実験第０日を図１５Ｃの緑で示す）。
・第７日に溶媒＋ＯＣＴ１００２で処置したマウスでは、変換化合物ＯＣＴ１００１（青）は血管化が乏しい少数の領域に見られる（図１５Ａ）。
・ビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））で処置したマウスでは、第７日に血管化の減少が見られた。第７日、ＯＣＴ１００２（５０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与の腹腔内注射の２時間後、大量の変換化合物（ＯＣＴ１００１；青）が腫瘍断片全体にわたって見られる（図１５Ｂ）。
・ビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））で処置したマウスでは、第７日および１４日に血管化の減少が見られ、これは２１日までに回復した（Ｍｉｎｇら，２０１２，上記）。
・第１４日および２１日に腫瘍を再検査した。
・第１４日ではＯＣＴ１００１（青）が依然として腫瘍に局在しているが、第２１日までには化合物の量が大幅に減少していた（図１５Ｃ）。
【０１７７】
結論
・腹腔内投与したＯＣＴ１００２は、マウス背部の皮膚のひだに局在する腫瘍断片全体に広く分布していた。
・血管系が大幅に減少したとき（すなわち、第７日および１４日のビカルタミド処置まで）でも、分布が広範囲にわたっていた。
・ＯＣＴ１００１は主として、酸素レベルが低い場所（すなわち、血管化が乏しい領域）に見られたが、対照にも小さい領域が見られた（程度は少ないにせよ、未処置腫瘍に低酸素が起こり得ることを示している）。
・ビカルタミド処置の第１４日でもＯＣＴ１００１の広範にわたる局在が依然として観察され、化合物が少なくとも７日間存在し続けることを示している。
・第２１日までに腫瘍血管がある程度回復を示し、ＯＣＴ１００１レベルが低下しているが、依然としてバックグラウンドを上回っている。
・還元産物、ＯＣＴ１００１が７日間よりも長く残留したことは、変換化合物の半減期が長いことを示している。
・しかし、ＯＣＴ１００１シグナルが第２１日までに大幅に減少していることから、その半減期はＡＱ４よりも短いと考えられる。
・これはＯＣＴ１００１の細胞結合特性がＡＱ４とは異なることに起因していると考えられ、周辺の低酸素末梢組織に少量の還元化合物が残留することによって引き起こされ得る全身毒性の累積がＡＱ４よりも少ないことの理論的根拠となる可能性がある。７日間超存在し続ける低酸素腫瘍断片全体に大量にみられることから、これが代謝の主要部位（すなわち、腫瘍内の低酸素細胞）におけるＯＣＴ１００２／ＯＣＴ１００１の主要な効果に影響を及ぼすとは考えられない。
【０１７８】
（ｖｉｉ）ＯＣＴ１００２はＬＮＣａＰ腫瘍の肺への転移拡散を低減する
・１００〜１５０ｍｍ３のＬＮＣａＰ−ｌｕｃ異種移植腫瘍を有する雄ＳＣＩＤマウス（８週齢超）を２８日間処置した（ルシフェラーゼ発現細胞は親ＬＮＣａＰ細胞とほぼ同じ特徴を有する；Ｍｉｎｇら，２０１２，上記）。
・溶媒（トウモロコシ油中０．１％のＤＭＳＯ）およびビカルタミド（溶媒中、２ｍｇ／（ｋｇ・日））処置を強制経口投与により連日実施した。
・第７日、ＯＣＴ１００２（無菌ＰＢＳ中、５０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与として腹腔内投与した。
・処置第２８日、造影１５分前にＤ−ルシフェリンの溶液（ＰＢＳ中、１５０ｍｇ／ｋｇ）をマウスにｉ．ｐ．注射した。
・次いでマウスを屠殺し、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いた生物発光の検出に様々な組織を摘出した。
・５分間撮像し、領域の周囲に目的とする範囲を描き、全光束を光子／秒（ｐｈ／秒）で測定することによって、生物発光を定量化した。
・様々な組織を摘出したが、肺および腫瘍のみ測定可能な生物発光を示した。肺における生物発光の平均±ｓ．ｅを図１６に示す；ビカルタミドおよび溶媒処置群（ｎ＝１０）；ビカルタミド＋ＯＣＴ１００２群（ｎ＝３）ならびに溶媒＋ＯＣＴ１００２（ｎ＝１）。＊ビカルタミド対ビカルタミド＋ＯＣＴ１００２（ｐ＝０．０２４）。溶媒で処置したマウスに肺への転移拡散が少しみられた。第７日に単回投与したＯＣＴ１００２は、この拡散に対して何ら効果を示さなかった。
・ビカルタミドは転移拡散の程度を増大させるように思えたが、その結果は有意性には達しなかった。
・ＯＣＴ１００２とビカルタミドの併用は、ＯＣＴ１００２がビカルタミドによって引き起こされる肺への転移拡散を有意に減少させることを示した（Ｐ＝０．０２４）。
【０１７９】
結論
・第７日に単回投与として投与したＯＣＴ１００２により、ビカルタミド処置によって引き起こされる肺への転移拡散を有意に減少させることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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