(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞系の表現型安定性を予測する方法であり、
−  アッセイ期間中細胞系を培養する工程と
−  前記アッセイ期間中の複数の異なる時間点で細胞系に対する環境応答フィンガープリントを生成する工程であって、各環境応答フィンガープリントが少なくとも３種の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で、細胞の環境応答を決定することによって生成される工程と、
−  前記複数の環境応答フィンガープリントを比較して、アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化を検出する工程
を含み、
前記アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化のレベルが細胞系における予測された表現型不安定性のレベルを示す、方法。
【請求項２】
複数の環境応答フィンガープリントを比較して、アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化を検出する工程が、問題の化学的細胞ストレッサー又は各々の化学的細胞ストレッサーに特異的な環境応答の変化を決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記環境応答が生育反応、産生応答、又はグリコシル化応答である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の異なる時間点が、アッセイ期間中の１以上の継代に及ぶ、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記環境応答フィンガープリントが、アッセイ期間の間の３以上の時間点で生成される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記環境応答フィンガープリントが、アッセイ期間の間の４以上の時間点で生成される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
各環境応答フィンガープリントが、少なくとも３種類の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で細胞の環境応答を決定することによって生成される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
各環境応答フィンガープリントが、少なくとも５種類の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で細胞の環境応答を決定することによって生成される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
化学的細胞ストレッサーが、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、炭素源、浸透圧性ストレス（osmotic stress）源、酸化的ストレス源、アポトーシス誘導物質、代謝エフェクター、ｐＨ調整剤（pH modifier）、解糖の阻害剤、及び毒素から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞系は、哺乳動物産生細胞系である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化が、ユークリッド距離、マハラノビス距離、ＬＤＡ距離、ＰＣＡ距離から選択される手段によって決定される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも３種類の化学的細胞ストレッサーが、０．５〜２×ＩＣ５０の濃度で提供される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細胞を同定するためのシステムであって、
−  複数の反応チャンバーを含むデバイスと、
−  前記反応チャンバー内に、個々に配置された少なくとも３種類の化学的細胞ストレッサーと、
−  複数の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で、細胞の環境応答を決定するための決定システムと、
−  前記細胞の複数の環境応答にそれぞれ対応する、複数の環境応答フィンガープリントを記憶するための記憶システムと、
−  前記複数の環境応答フィンガープリントの少なくとも幾つかを比較し、前記環境応答フィンガープリントの変化を検出するように構成された比較システムと、
−  前記比較ステップの出力を表示するためのディスプレイシステム
を含む、システム。
【請求項１４】
前記環境応答フィンガープリントが生育反応フィンガープリント、産生応答フィンガープリント、又はグリコシル化応答フィンガープリントである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記デバイスがマイクロタイタープレートである、請求項１３又は１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記比較システムは、アッセイ期間中の複数の異なる時間点で、細胞からの環境応答フィンガープリントを入力し、生育反応フィンガープリント、産生応答フィンガープリント、又はグリコシル化応答フィンガープリントを比較してそのフィンガープリントの変化を検出し、そのフィンガープリントの変化に一部基づいた内容を出力するように構成されたコンピュータモデルを含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本発明は、細胞、典型的には、哺乳類産生細胞における表現型不安定性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
調節の観点からは、安定性の主要な側面は、生成物、即ち生成物の一貫した特徴（例えば、一貫した糖型、より一般的にはin-vivo活性）を純粋に考察する。
【０００３】
しかし、製造の観点からは、安定性の重要な側面は、当然ながら、生成物の品質であるが、産生する細胞系クローンの首尾一貫した成長及び生産性もある。例えば、Ｌｏｎｚａ（商標）ガイドラインから、４０を越える二重複製の生成物力価で３０％を越える変化（大まかに１０継代）は、不安定な細胞系とみなされる。
【０００４】
細胞系の変化は、概ね、遺伝子コピー数の変化、ｍＲＮＡコピー数の変化、及び細胞に対する基本的な変化（即ち、プロテオーム及びメタボロームに対する変化）と考えられる。細胞のゲノムに対する変化は、ある程度の表現型遺伝子の不安定性、即ち「突然変異誘発遺伝子の表現型（mutator phenotype）」を含意する（Loeb et al 1999（非特許文献１））。この表現型になる任意の細胞系クローンは、表現型の他の関連した変化を受けるであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Loeb et al 1999
【非特許文献２】Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells (2004), Wurm, Florian M, New York, NY, Nature Biotechnology 22 (2004), S.1393-1398
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上で参照した問題の少なくとも１つを解決することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の説明
本発明は、細胞系の表現型安定性を予測する方法であって、
−  アッセイ期間中細胞系を培養する工程と、
−  前記アッセイ期間中の複数の異なる時間点で細胞系に対する環境応答フィンガープリントを生成する工程であって、各環境応答フィンガープリントが、複数の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で、細胞の環境応答を決定することによって生成される工程と、
−  前記複数の環境応答フィンガープリントを比較して、アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化を検出する工程
を含み、
前記アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化のレベルが細胞系における予測された表現型不安定性のレベルを示す、方法。
【０００８】
典型的には、複数の環境応答フィンガープリントを比較して、アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化を検出する前記工程は、問題の化学的細胞ストレッサー又は各々の化学的細胞ストレッサーに特異的な環境応答の変化を検出する工程を含む。
【０００９】
適切には、環境応答は生育反応（growth response）である。
【００１０】
好ましくは、複数の異なる時間点は、アッセイ期間中の１以上の継代に及ぶ。
【００１１】
典型的には、環境応答フィンガープリントは、アッセイ期間の間の３以上の時間点で生成される。
【００１２】
適切には、環境応答フィンガープリントは、アッセイ期間の間の４以上の時間点で生成される。
【００１３】
一般には、各々の環境応答フィンガープリントは、少なくとも３種類の異なる化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で、細胞の環境応答を決定することによって生成される。
【００１４】
好ましくは、各々の環境応答フィンガープリントは、少なくとも５種類の異なる化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で、細胞の環境応答を決定することによって生成される。
【００１５】
適切には、化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、炭素源、浸透圧性ストレス（osmotic stress）源、酸化的ストレス源、アポトーシス誘導物質、代謝エフェクター、ｐＨ調整剤（pH modifier）、解糖の阻害剤、及び毒素から選択される。
【００１６】
一般に、細胞系は、哺乳類産生細胞系である。
【００１７】
典型的には、アッセイ期間中の環境応答フィンガープリントの変化は、数学的モデル、適切には、公知の表現型安定性若しくは不安定性、又は両方を持つ細胞の、１以上の環境応答フィンガープリントを用いて生成された数学的モデルの手段で決定される。典型的には、数学的モデルは、ユークリッド距離、マハラノビス距離、ＬＤＡ距離、ＰＣＡ距離から選択される手段を使用する。
【００１８】
本発明はまた、細胞を同定するためのシステムを提供する。このシステムは、
−  複数の反応チャンバーを含むデバイスと、
−  前記反応チャンバー内に、個々に配置された複数の化学的細胞ストレッサーと、
−  前記複数の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で、細胞の環境応答を決定するための決定システムと、
−  前記細胞の複数の環境応答にそれぞれ対応する、複数の環境応答フィンガープリントを記憶するための記憶システムと、
−  前記複数の環境応答フィンガープリントの少なくとも幾つかを比較し、前記環境応答フィンガープリントの変化を検出するように構成された比較システムと、
−  前記比較ステップの出力を表示するためのディスプレイシステム
を含む。
【００１９】
適切には、環境応答フィンガープリントは生育反応フィンガープリントである。
【００２０】
典型的には、デバイスは、マイクロタイタープレートである。
【００２１】
適切には、比較システムは、アッセイ期間中の複数の異なる時間点で、細胞からの環境応答フィンガープリントを入力し、生育反応フィンガープリントを比較してそのフィンガープリントの変化を検出し、そのフィンガープリントの変化に一部基づいた内容を出力するように構成されたコンピュータモデルを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】クローンからの化学的生育フィンガープリントの例である。細胞を、９６ウェルプレート中、注目の化学物質の存在下又は非存在下で７２時間成長した。細胞成長の相対的レベルを、明細書に記載した「プレスト−ブルー（Presto-Blue）」法を用いてアッセイした。
【図２】初期及び後期の継代培養物間の生育反応の有意な変化の比率である。エラーバーは比率の標準偏差を表す。
【図３】初期及び中期の継代培養物間の生育反応の有意な変化の比率である。エラーバーは比率の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、用語「細胞」は、原核生物細胞又は真核生物細胞を含む任意の細胞タイプを指す。適切には、細胞は真核生物細胞、理想的には哺乳動物細胞である。典型的には、細胞は、産生細胞、好ましくは哺乳動物産生細胞である。細胞は、クローンに由来してもよく、非クローン的であってもよい。好ましい実施形態では、細胞は、単一の親細胞集団から誘導された、又は、トランスフェクションされた異なる細胞から誘導されたクローン細胞のパネルからのクローンである。細胞はまた、明確に区別できる細胞系、例えば遺伝的に修飾された細胞（即ち「ノックアウト」又は「ノックイン」突然変異を持つ細胞）からのものであってもよい。細胞系はまた、指向進化によって、即ち目的の特別な環境に適した細胞の選択によって誘導されてもよい。用語「明確に区別できる細胞のパネル」は、互いに異なる細胞のパネルを意味すると理解されるべきである。例えば、細胞のパネルは、単一の親細胞集団から全てが誘導されるクローンのパネルを含んでいてもよい。或いは、独立したクローン起源の細胞、例えば、異なる導入遺伝子又は異なる突然変異を持つ細胞を含んでいてもよく、細胞のパネルは非クローン細胞を含んでいてもよい。細胞系はまた、指向進化によって、即ち目的の特別な環境に適した細胞の選択によって誘導されてもよい。細胞のパネルはまた、異なる細胞タイプの細胞、例えば異なる細胞系、細菌又は真菌の異なる株、同じ細胞タイプであるが、異なる発達の段階にある細胞、及び、遺伝的に異なっている同じ細胞タイプの細胞、例えば同じタイプ若しくは起源の細胞、又は異なる導入遺伝子を持つ同じ親細胞集団から誘導された細胞を含んでいてもよい。
【００２４】
本明細書において、用語「クローン細胞のパネル」は、単一細胞系由来のクローン細胞集団のパネルを意味し、２から５００以上のクローン細胞集団を含むと理解されるべきである。クローン細胞のパネルを生成するための方法は、当業者に周知であり、Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells (2004), Wurm, Florian M, New York, NY, Nature Biotechnology 22 (2004), S.1393-1398（非特許文献２）に記載されている。典型的には、クローン細胞集団のパネルは、１０〜５００、２０〜５００、３０〜５００、４０〜５００、５０〜５００、６０〜５００、７０〜５００、８０〜５００、９０〜５００、又は、１００〜５００クローン細胞集団を含む。典型的には、クローン細胞集団のパネルは、１００〜５００、１００〜４００、１５０〜４００、１５０〜３５０のクローン細胞集団を含む。
【００２５】
本発明は、細胞を複数の細胞ストレッサー分子とインキュベートすることを含む。これは、細胞が各々の細胞ストレッサー分子と個別にインキュベートされ、各細胞ストレッサー分子の存在下で細胞の生育反応を得ることを意味する。細胞と細胞ストレッサー分子とのインキュベーションは、いずれかの適切な反応容器、例えばマイクロタイタープレートのウェル中で実施することができる。典型的には、アッセイは、細胞サンプルを化学的細胞ストレッサーと混合すること、この混合物を１から４日インキュベートすること、及び細胞の成長のレベルをアッセイすることを含む。適切には、細胞サンプルは、混合物１ｍｌ当たり０．１から１．０×１０6細胞の濃度で提供される。典型的には、細胞ストレッサーは、０．５から２×ＩＣ５０の濃度、理想的には約１×ＩＣ５０の濃度で提供される。適切には、各クローンの成長は、５日未満のインキュベーションの期間後にアッセイされる。理想的には、各クローンの成長は、１〜４日の間のインキュベーション期間の後、理想的には、２及び３日後にアッセイされる。好ましくは、各クローンの成長は、同時にアッセイされる。
【００２６】
用語「細胞ストレッサー分子」又は「細胞ストレッサー」は、複数の細胞経路の１以上を介して、細胞成長の低下を引き起こす分子又は化合物を意味すると理解されるべきである。典型的には、複数の化学的細胞ストレッサーが、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、炭素源、浸透圧性ストレス源、酸化的ストレス源、アポトーシス誘導物質、代謝エフェクター、ｐＨ調整剤、解糖の阻害剤、及び毒素よりなる群から選択される。典型的には、複数の化学的細胞ストレッサーは、アミノ酸輸送阻害剤、細胞周期阻害剤、炭素源、浸透圧性ストレス源、酸化的ストレス源、アポトーシス誘導物質、代謝エフェクター、ｐＨ調整剤、解糖の阻害剤、及び毒素からなる群の少なくとも４、５、６又は７から選択されるストレッサーを含む。
【００２７】
本明細書において、細胞ストレッサー分子に適用される用語「複数」は、少なくとも３つの異なる細胞ストレッサー分子を意味すると理解されるべきである。典型的には、この用語は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の異なる細胞ストレッサー分子を指す。従って、本発明の方法は、わずか３つの明確に区別できる細胞ストレッサー分子、例えば、ＣｏＣｌ2、ＮＡＶ及びＭＳＢ；Ｃａｄｍ、ＭＳＢ及び２ＤＧ；Ｃａｄｍ、ｄｐｈｅ、ＭｅｉＡＢ；ｄｐｈｅ、ＭｅＩＡＢ、Ｃａｄｍ；Ｄｐｈｅ、Ｃａｄｍ、２ｄｇ；Ｄｐｈｅ、乳酸ナトリウム、２ｄｇ；Ｄｐｈｅ、ＮａＯｘ、クエン酸；ＭｅＩＡＢ、Ｃａｄ、２ｄｇを使用して細胞特異的生育反応フィンガープリントを生成することによって、実施することができる。
【００２８】
用語「環境応答」は、細胞ストレッサー分子に曝されたときの細胞の測定可能な応答、例えば、生育反応、産生応答（例えばモノクローナル抗体力価）、又はグリコシル化応答を言う。典型的には、環境応答は、正規化された環境応答であり、これは、細胞ストレッサー分子の存在下及び非存在下で細胞の環境応答を測定し、細胞ストレッサー分子の存在による環境応答の差を決定することによって決定される。
【００２９】
用語「生育反応（growth response）」は、細胞ストレッサー分子の存在下での細胞の成長をいう。典型的には、生育反応は、正規化された生育反応であり、これは細胞ストレッサー分子の存在下及び非存在下での成長を測定し、細胞ストレッサー分子の存在による生育反応の差を決定することによって決定される。細胞の成長は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて決定することができる。一実施形態では、色素をインキュベーション混合物に添加し、色素によって放出されるシグナルを所定時間にわたってモニタリングし、成長との相関関係を算定する。例えば、蛍光又は燐光色素を使用することができる。適切な色素の例は、プレストブルー（Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ）（登録商標）（Invitrogen, Paisley, UK）などの酸化還元色素である。
【００３０】
用語「表現型不安定性」は、細胞の１以上の表現型の特徴の不安定性、例えば、成長、生産性、及び組換えタンパク質生成物の特徴の不安定性を意味すると理解されるべきである。
【００３１】
用語「環境応答フィンガープリント」は、細胞と複数の細胞ストレッサー分子を個別に反応することによって得られる特定の細胞に対する複数の環境応答をいう。このフィンガープリントは、複数の環境応答の値として使用されるか、又は、グラフの形態で若しくはパターンのような任意の他のタイプの視覚的表現で使用されうる。所定の時間にわたるフィンガープリントの変化は、問題の化学的ミクロ環境又は各々の化学的ミクロ環境の環境変化をモニタリングすることによって決定することができる。
【００３２】
用語「生育反応フィンガープリント」は、細胞と複数の細胞ストレッサー分子を個別に反応することによって得られる特定の細胞に対する複数の生育反応をいう。このフィンガープリントは、複数の生育反応の値として使用されるか、又は、グラフの形態で若しくはパターンのような任意の他のタイプの視覚的表現で使用されうる。
【００３３】
用語「アッセイ期間」は、試験される細胞が培養される間の期間をいう。典型的には、アッセイ期間は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の細胞の継代の期間である。
【００３４】
用語「複数の異なる時間点」は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の異なる時間点をいう。一般に、各時間点は、少なくとも１、２又は３継代により分けられる。
【００３５】
本発明の一側面は、アッセイ期間の間に細胞についての環境応答フィンガープリント（即ち、生育反応フィンガープリント）を比較し、環境応答フィンガープリントの変化を検出し、続いてこれを細胞の安定性又は不安定性と関連づけることを含む。環境応答フィンガープリントに適用される用語「変化」は、アッセイ期間中に生じる環境応答フィンガープリントの少なくとも１つの違いをいう。種々の方法が、所定時間の環境応答フィンガープリントの変化を検出するのに使用でき、これには数学的モデリング、パターン認識又は視覚的検査によるものが含まれる。例えば、時間点Ａ、Ｂ及びＣにおける細胞の環境応答は、細胞ストレッサーに対してプロットすることができ、時間点Ａ、Ｂ及びＣにおける細胞の環境応答フィンガープリントを表すグラフを提供する。環境応答フィンガープリントは、視覚的に比較され、所定時間にわたってフィンガープリントの変化を同定することができる。一般に、アッセイ期間中のフィンガープリントの変化が大きくなるにつれて、細胞はより不安定になる。例えば、Ｌｏｎｚａ（商標）ガイドラインから、４０を越える二重複製の生成物力価で３０％を越える変化は（大まかに１０継代）は、不安定な細胞系とみなされる。Ｌｏｎｚａの定義に従って不安定な細胞系と相関する生育反応フィンガープリントの変化のレベルを定量的に決定するために本発明の方法を使用し、これによって不安定な細胞系を同定するために本発明の方法を使用することができる。好ましい実施形態では、比較ステップは、数学的モデリング、典型的には、表現型の安定性及び／又は不安定性が知られている細胞、例えば予め決められた安定性及び予め決められた不安定性を有する細胞系からの環境応答フィンガープリント（又は化学的な特定の環境応答）を用いて生成される数学的モデルを用いて実施されうる。モデリングのアプローチは、化学的生育反応のサブセットを使用して「線形判別分析」及び「最近傍ユークリッド距離最小化法（nearest neighbour elucidian distance minimisation）」を用いることができる。従って、一実施形態では、本方法は、試験細胞系に対する環境応答フィンガープリントをコンピュータモデルに入力するステップを含む。この場合、このコンピュータモデルは、表現型安定性が知られている細胞系の校正セットから得られる環境応答フィンガープリントから生成され、このコンピュータモデルは、細胞系に対して予想される安定性を出力するように構成されている。環境応答フィンガープリントは、環境応答の１以上の化学的特異的変化（ΔＣＥ）であってよい。
【００３６】
本発明はまた、細胞を同定するためのシステム又はキットを提供する。このシステム又はキットは、典型的には、複数の反応チャンバーを有するデバイスを含む。好ましくは、このデバイスは、マイクロタイタープレート、典型的には少なくとも１２、２４、４８又は９６ウェルを有するマイクロタイタープレートである。
【００３７】
このシステム又はキットは、典型的には、複数の細胞ストレッサー分子を含む。好ましくは、細胞ストレッサー分子は、マイクロタイタープレートのウェル内に個別に配置され、好ましくはマイクロタイタープレートのウェルに接着される。
【００３８】
このシステム又はキットは、複数の化学的細胞ストレッサーの各々の存在下で細胞の環境応答（即ち生育反応）を決定するための決定システムを含む。典型的には、この決定システムは、マイクロタイタープレートのウェル内の細胞の成長を検出するように構成されたマイクロタイタープレートリーダーを含む。適切には、マイクロタイタープレートリーダーは、商業的に利用可能であり、ＢＭＧ社によって販売されている。この決定システムは、典型的には、例えば、コンピュータで読み取り可能な形態の生育反応のデータを提供するための、コンピュータで実行可能な指令を有する。
【００３９】
このシステム又はキットはまた、記憶システム及び比較システム（細胞に対する育成反応フィンガープリントを異なる時間点で比較するためのもの）を含む。これらの機能性モジュールは、１つ又は多数のコンピュータ上で実行することができ、或いは、１つ又は多数のコンピュータネットワークを用いることによって実行することができる。決定システムは、例えばコンピュータで読み取り可能な形態の配列情報を提供するための、コンピュータで実行可能な指令を有する。
【００４０】
決定システムで決定される情報は、記憶システムによって読み取られうる。本明細書で使用される「記憶システム（storage system）」は、任意の適切な計算又は処理装置、又はデータ若しくは情報を記憶するように構成された又はそれらを記憶するのに適した他のデバイスを含むと解釈される。本発明の方法で使用するのに適した電子装置の例は、独立型計算装置、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、インターネット、イントラネット及びエクストラネットを含めたデータ遠距離通信ネットワーク、及び、ローカル及び分散型コンピュータ処理システムを含む。記憶デバイスにはまた、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、磁気テープのような磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤのような光記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等のような電子記憶媒体、一般的なハードディスクとこれらのカテゴリーの複合型、例えば磁気／光記憶媒体が含まれるが、これらに限定されない。記憶システムは、生育反応の情報及び生育反応フィンガープリントの情報を記憶システムに記憶させるのに適しているか、又はそれらの情報を記憶システムに記憶させるように構成される。このような情報は、例えばインターネットを介して、ディスケット上に、ＵＳＢ（ユニバーサルシリアルバス）を介して、又は任意の他の適切な通信モードを介して電子的に伝送され、読み取られうる。
【００４１】
記憶システムは、これに記憶された参照環境（例えば、生育）応答フィンガープリント情報を有していてもよい。本明細書で使用される「記憶された（stored）」とは、記憶デバイス上に情報をコード化するためのプロセスをいう。一実施形態では、記憶デバイスに記憶され、比較モジュールによって読み出される参照データが比較される。例えば、問い合わせの細胞特異的成長応答フィンガープリントを参照生育反応フィンガープリントの一組又はパネルと比較する。
【００４２】
「比較システム」は、比較のための多くの利用可能なソフトウェアプログラム及びフォーマットを使用することができ、これらは、環境（即ち育成）応答フィンガープリントの変化を検出するためのアッセイ期間中の異なる時間点で、細胞からの環境応答フィンガープリントを比較するのに効力がある。一実施形態では、比較モジュールは、パターン認識技術を使用するように構成され、一以上のエントリーから一以上の参照データパターンまでの情報を比較する。比較モジュールは、パターンを比較するための、存在する商業的に利用可能なソフトウェア又は自由に利用可能なソフトウェアを使用するように構成され、処理される個々のデータの比較に最適化されうる。比較モジュールは、サンプルの遺伝子型に関連した、コンピュータで読み込み可能な情報を提供する。好ましくは、比較システムは、比較の目的のための計算モデルを使用する。
【００４３】
比較モジュールは、又は他のいずれかの本発明のモジュールは、リレーショナルデータベース管理システムを実行するオペレーティングシステム（例えばＵＮＩＸ：登録商標）、ワールドワイドウェブアプリケーション、及びワールドワイドウェブサーバーを含むことができる。ワールドワイドウェブアプリケーションは、データベース言語命令文（例えば、構造化照会言語（ＳＱＬ）命令文）の生成に必要な実行可能なコードを含む。一般に、実行可能なものは、埋め込み型ＳＱＬ命令文を含む。加えて、ワールドワイドウェブアプリケーションは構成ファイルを含み、この構成ファイルは、ポインタを含有し、ユーザーの要求に応えるためにアクセルする必要のあるサーバー並びに種々の外部及び内部データベースを含む種々のソフトウェアエンティティにアドレッシングする。構成ファイルはまた、適切なハードウェアに対してサーバーリソースの要求を割り当てる−−必要に応じて、サーバーは２以上の別々のコンピュータ上に配置されるべきである。一実施形態では、ワールドワイドウェブサーバーは、ＴＣＰ／ＩＰプロトコルをサポートする。このようなローカルネットワークは、時々「イントラネット」と称される。このようなイントラネットの利点は、イントラネットがワールドワイドウェブ上に存在するパブリックドメインデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ又はＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサイト）と容易な通信が可能なことにある。従って、本発明の特に好ましい実施形態では、ユーザーは、ウェブブラウザ及びウェブサーバーによって提供されるＨＴＭＬインターフェースを用いてインターネットデータベース上に存在するデータ（例えばハイパーテキストリンク）に直接にアクセスできる。
【００４４】
比較モジュールは、典型的には、コンピュータで読み取り可能な比較結果を提供し、この比較結果は、予め定義された基準、又はユーザーによって定義された基準によってコンピュータで読み取り可能な形態に加工され、比較結果に一部基づいたコンテンツを提供し、このコンテンツはディスプレイシステムを用いたユーザーによって要求されたとおりに記憶及び出力されうる。
【００４５】
本発明の一実施形態では、比較結果に基づいた内容は、コンピュータのモニタ上に表示される。本発明の一実施形態では、比較結果に基づいた内容は、印刷可能な媒体を通して表示される。ディスプレイモジュールは、コンピュータで読み取り可能な情報をコンピュータから受信して、これをユーザーに表示するように構成された任意の適切なデバイスである。非制限的な例には、例えば、インテルペンティアム型プロセッサ、モトローラパワーＰＣ、Ｓｕｎ  ＵｌｔｒａＳＰＡＲＣ、ヒューレトパッカードＰＡ−ＲＩＳＣプロセッサ、サニーバル（Ｓｕｎｎｙｖａｌ）、カリフォルニアのアドバンスドマイクロデバイセズ（ＡＭＤ）から利用できる種々のプロセッサのいずれか、又は他のタイプの任意のプロセッサに基づいたものなどの汎用コンピュータ、フラットパネルディスプレイ、ブラウン管等のような視覚表示デバイス、並びに、種々のタイプのコンピュータプリンターが含まれる。
【００４６】
一実施形態では、ワールドワイドウェブブラウザは、比較結果に基づく内容を表示するためのユーザーインターフェイスを提供するために使用される。本発明の他のモジュールは、ウエブブラウザインターフェースを有するように適合されうることが理解されるべきである。ウェブブラウザを通して、ユーザーは、比較モジュールからデータを検索するための要求を構成することができる。従って、ユーザーは、典型的には、グラフィカルユーザーインターフェースで従来から使用されている、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバーなどのようなユーザーインターフェイス要素をポイントし、クリックする。
【００４７】
発明の詳細な説明
（実施例）
細胞成長の小スケール決定：
９６ウェルプレートでの細胞成長をアッセイする：「プレストブルー（Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ）」（インビトロゲン、ペーズリー、ＵＫ（Invitrogen, Paisley, UK））をＣＤ−ＣＨＯ培地と１：１で混合し、この２０ｕｌを各ウェルに添加した。このプレートを機械的に震盪し、続いて、静的加湿インキュベーター（static humidified incubator）中、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  ａｓｃｅｔ（サーモ−フィッシャー、ラフバラ、ＵＫ（Thermo-Fisher, Loughborough, UK））プレートリーダーを用いて、ウェルの蛍光（励起５３５ｎｍ、発光６２０ｎｍ）を測定した。これを、蛍光がウェル中の生存細胞密度で直線的に補正される前に行った。
【００４８】
化学試験プレートの調製：
方法：使用した複数の細胞ストレッサー分子は以下のとおりである。
２−アミノビシクロ−（２，２，１）ヘプタン−カルボン酸（ＢＨＣ）
Ｄ−フェニルアラニン−（Ｄ−Ｐｈｅ）
α−（メチルアミノ）イソ酪酸（ＭｅＡＩＢ）
酪酸ナトリウム（ＭａＢｕ）
シクロヘキシミド
塩化アンモニウム
酢酸カドミウム六水和物（hexhydrate）
塩化コバルト（ＣｏＣｌ2）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）
乳酸ナトリウム（ＮａＬａｃ）
アミノトリアゾール（ＡＭＴ）
メナジオン重亜硫酸ナトリウム（ＭＳＢ）
ブチオニンスルホキシイミン（ＢＳＯ）
メルカプトコハク酸（ＭＳ）
２，４−ジニトロフェノール（２４ＤＮＰ）
オキサミド酸ナトリウム
２−デオキシグルコース（２ｄｇ）
３−ブロモピルベート（３−ＢｒＰＡ）
ジクロロアセテート（ＤＣＡ）
６−ジアゾ−５−オキソ−ｌ−ノルロイシン（ｌ−ｄｏｎ）
バルプロ酸（Ｖａｌ）
オルトバナジン酸ナトリウム（Sodium Orthovandate）（ＮａＶ）
クエン酸
ＦＫ８６６
乳酸
【００４９】
「インハウス（in house）」親細胞系を用いて、上記化学物質の阻害用量（inhibitory dose）５０（Ｃ５０）濃度を、成長試験を通して同定した。ここで、ＩＣ５０は、３日間の間に５０％までの正常細胞の成長を阻害する、問題の化学物質の濃度として定義される。ＩＣ５０が確立されたら、９６ウェルプレートをセットする。これには、上記の選択した化学物質がＩＣ５０の濃度で含有され、細胞成長培地のみを含有した対照ウェルが含まれる。
【００５０】
安定性を予測する方法：
いずれの不安定も現れる前に初期継代で開始して、フィンガープリントを多数の継代にわたって取得した。取得した最初のフィンガープリントを、今後「参照フィンガープリント」と称する。ここで注目した評価基準は、ミクロ環境での生育反応がないが、参照フィンガープリントに対して生育反応が変化する。
【００５１】
従って、参照フィンガープリントの後に取得される各フィンガープリントについて、「化学的特異的生育反応の変化」（ΔＣＥ）が、各ミクロ環境に対して計算される。これは、安定性に関係する最も有益な評価基準となるであろう。各ミクロ環境に対するこれらのΔＣＥを予測モデルのパラメータとして使用して、安定又は不安定のバイナリー出力を得る。
【００５２】
安定性を予測するために使用されるこのモデルは、種々のモデルから選択される。１つの適切な例は、「線形判別式モデル」（ＬＤＡ）モデルであり、不安定な細胞系から安定な細胞系を最大限に分離するためにΔＣＥの線形的組み合わせを使用する。別法として、モデルは、ロジステック回帰モデル、又は、単純なユークリッド距離若しくは、ＰＣＡ又はＬＤＡ空間などの他の「空間」の距離に基づくものである。加えて、「サポートベクトルマシーン」などの技術を使用することができる。
【００５３】
注目の新たな細胞系の評価に対して、参照フィンガープリント及び多数の引き続きのフィンガープリントを取得して、ΔＣＥフィンガープリントを生成する。引き続きのフィンガープリントからのこれらのΔＣＥを、「安定又は不安定」を予測するためのモデルアプローチに使用するか、或いは、「不安定の程度」などの、いくつかの他の連続した安定性の評価基準に使用する。一実施形態では、安定性の状況は、「参照フィンガープリント」の後の最初の継代ですぐに予測される。
【００５４】
一実施形態では、細胞系の「校正セット」は必要とされず、安定性は、例えば参照フィンガープリントからの単純な距離によって、又は、任意のモデリング、パターン認識若しくは「目視による」方法によって、参照フィンガープリントからの経時変化を見ることで一貫して予測される。
【００５５】
例
５つの安定な、及び４つの不安定な産生ＣＨＯ細胞系を取得した。これらを、培養物の初期、中期及び末期世代で、冷凍状態で得た。ここで、不安定は、後期世代期までの、３０％を超える最大産生力価の低下（drop）として定義される。
【００５６】
各異なる時間点での各細胞に対する化学的フィンガープリントは、上記の複数の化学物質の存在下で成長及び力価を測定する前の３日間化学スクリーニングプレートで成長させることによって得た。ここで注目する、測定したパラメータは、所定期間中、即ち初期、中期及び後期の化学的応答の変化であった。
【００５７】
化学的成長応答の「有意な」変化の回数は、初期と後期の培養物間で安定なクローンに対してよりも不安定なクローンに対して有意に高かったことが観測された（図２）。従って、安定性の見込みは、適切な時間経過での化学的応答の有意な変化の回数を測定することで得ることができる。ここで、生育応答の有意な変化は、特定の化学的生育反応ついてのプレートの標準偏差に対して評価したプレートの標準偏差の変化が２を超えることとして定義される。図２は、不安定なクローンについての化学的変化の比率が０．４１であり、安定なクローンについての変化の比率が０．２６であったことを示す。
【００５８】
この結果は、初期及び中期世代の培養物の間でも観測されたが、大きさはより小さかった。更に、これは、所定期間中の化学的生育応答のどのような変化が不安定性のマーカーとして使用できるかを例示したものであり、成長試験を長期のものに進めるためにどのクローンを選別するかの助けとなる。即ちクローンには、この結果から不安定性の可能性が割り当てられうる。例えば、所望の性質を等しく持つ多くのクローンが与えられた場合、本発明は、これらのクローンのスクリーニングが、安定性試験の次のステージをどれに進めるかを決定することを可能にし、時間とリソースを節約する。
【００５９】
逆に、本発明は、力価などの標準の性質において、魅力の低い初期段階でのクローンの同定を可能にするが、低い化学的フィンガープリントの変化を観測することから、これらが高度に安定であろうと同定される。これらは、先に進められ、クローンよりも潜在的に選択され、初期段階で良好に実施されるが、長期間の試で力価の低下を経験する。
【００６０】
本発明は、先に記載した実施形態に限定されず、本発明の精神から逸脱することなく校正及び詳細を変更しうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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