(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転移性癌の予防又は治療で使用するための、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子を含む組成物であって、
分子が、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)又はエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害又は予防する分子であり、転移性癌が、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌であり、
分子が、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、若しくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、
を含み、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0又は1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0又は1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドであり、
分子が、構造Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys又はAc-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を含み、式中Acは、アセチル基であり、
分子が、対象において生殖能力を低下もさせず、又は、妨げもせず、並びに、
処置されるべき対象が、生殖能力の維持を望む対象である、
組成物。
【請求項２】
転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子の使用であって、
分子が、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)又はエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害又は予防する分子であり、転移性癌が、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌であり、
分子が、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、若しくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、
を含み、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0又は1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0又は1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドであり、
分子が、構造Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys又はAc-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を含み、式中Acは、アセチル基であり、
分子が、対象において生殖能力を低下もさせず、又は、妨げもせず、並びに、
処置されるべき対象が、生殖能力の維持を望む対象である、
使用。
【請求項３】
分子が、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する分子である、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
Srcファミリーキナーゼが、Src、Yes、Fyn、Fgr、Lck、Hck、Blk、Lyn及びFrkのいずれかである、請求項1又は3に記載の組成物。
【請求項５】
分子が、ペプチドである、請求項1、3及び4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ペプチドが、10〜57アミノ酸の長さである、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
Bが、H、又はアセチル基、又は遊離の若しくはアセチル誘導体化されたNH2基を有するアミノ酸の1つ若しくは配列のいずれかである、請求項1及び3から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Rが、OH基、又はNH2基、又はC末端のカルボキシ-アミド基を有するアミノ酸の1つ若しくは配列のいずれかである、請求項1及び3から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
第一及び第二の化学成分B及びRが、独立して、又は両方とも、脂質、脂肪酸、ポリエチレングリコール、トリグリセリド、グリセロール、プレニル若しくはイソプレニル成分、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド若しくは核酸、又はその組合せのいずれかを含む、請求項1及び3から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物が、抗体を生成するためにワクチンとして投与されるためのものである、請求項1及び3から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
分子が、担体分子に連結されている、請求項1及び3から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
担体分子が、ウシ血清アルブミン(BSA)又はキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
分子が、脂質組成物中に含まれる、請求項1及び3から12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
脂質組成物が、脂質粒子、ナノカプセル、リポソーム又は脂質小胞である、請求項13に記載の組成物。
【請求項１５】
転移性癌が、生殖器系の転移性癌である、請求項1及び3から14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
生殖器系の転移性癌が、転移性の婦人科癌である、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
転移性癌が、転移性線維肉腫、転移性前立腺癌、転移性乳癌、転移性子宮類線維症、転移性線維性ポリープの過形成、転移性卵巣癌、転移性膀胱癌、転移性子宮頚癌、転移性子宮癌、転移性精巣癌、転移性肺癌、転移性腸癌、転移性肝癌、転移性腎癌及び転移性食道癌からなる群から選択される、請求項1及び3から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
転移性癌が、転移性線維肉腫、転移性前立腺癌、転移性乳癌、転移性子宮類線維症、転移性線維性ポリープの過形成、転移性卵巣癌、転移性膀胱癌、転移性子宮頚癌、転移性子宮癌、及び転移性精巣癌からなる群から選択される、請求項1及び3から16のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
追加の治療剤を含む、請求項1及び3から18のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
治療剤が、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤である、請求項19に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項1及び3から20のいずれか一項に記載の組成物を、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と共に含む医薬組成物。
【請求項２２】
対象において転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、請求項1及び3から20のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、請求項1及び3から20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、請求項2に記載の使用。
【請求項２５】
治療剤が、増殖抑制剤である、請求項19、20及び23のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
増殖抑制剤が、細胞増殖抑制剤、細胞破壊剤又は抗癌剤である、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
対象がヒトである、請求項1、3から21、23、25及び26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
対象が、原発腫瘍に罹っており、分子が、対象内での転移を予防又は低減する、請求項1、3から21、23、及び25から27のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子の医学的な使用、特定にはアンドロゲン受容体(AR)の活性及び/又はエストラジオール受容体(ER)が寄与因子である転移性癌等の転移性癌を治療するための分子の使用に関する。
【０００２】
本明細書における明らかに先に公開された文書の列挙又は考察は、必ずしもその文書が最先端の知見の一部であるか、又は共通の一般的な知見であるとの承認とみなされるものではない。
【背景技術】
【０００３】
転移とは、1又は複数の癌性細胞が原発部位から体内の1又は複数の他の部位へ広がることであり、通常は血管又はリンパ管を経由する。その結果生成した疾患が新たに出現することを、転移とよぶ。癌細胞は、別の部位に留まった後、管又は壁を再び貫通して、殖え続け、やがて臨床的に検出可能な別の癌を形成する。この新しい癌は、転移性の(又は二次的な)癌として知られ、その細胞は、元の原発性癌の細胞に類似している。このことは、例えば、乳癌が肺に転移した場合に、二次癌は、異常な乳房細胞から構成され、異常な肺細胞からは構成されないことを意味する。それゆえ、その肺の癌は転移性乳癌とよばれ、肺癌とはよばれない。
【０００４】
転移は、複数の工程を含む複雑な過程である。転移の過程は、癌細胞がその細胞運動性を増加させることによって、原発腫瘍塊を通り抜けて遊走する能力を獲得し、血管系内又はリンパ管系内に進入して生き延び、管系から二次組織内又は器官内に遊出して、転移性の結節を形成することを必要とする。転移の間、癌細胞は、細胞外マトリックス(ECM);それらのタンパク質、ECMに関連のある成長因子及びサイトカイン;基底膜;血液循環内の血球;及び癌細胞の成長につれて、やがて正常組織に取って代わって転移病巣を形成する、二次部位の微小環境との、数多くの相互作用に関与する。いくつかの調節経路は、変化するか又は異常に発現して、腫瘍細胞に、それぞれ又は全ての転移過程の工程を首尾よく達成する能力を付与する。一例として、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は、転移中の癌細胞の助けとなる上で重要な分子であると考えられている。
【０００５】
一般に、癌対象における転移は、対象の生存の見込みを劇的に減少させる。現在の治療としては、放射線手術、化学療法、放射線療法、生物学的療法、ホルモン療法、手術、又はこれらの介入の1種又は複数の組合せが挙げられる。治療の選択は、中でも原発癌の種類、転移のサイズ及び箇所、患者の年齢及び全身の健康状態、並びに以前使用した治療の種類を含めた、非常に多くの因子に依存する。しかし、そのように広範な利用可能な治療体制を用いてさえ、現在の選択肢が、転移性癌を治癒することができるのは稀である。ゆえに、転移性癌に立ち向かうための新規かつ効果的な療法について、差し迫った必要性が残されている。
【０００６】
驚くべきことでありまた予想外のことに、今や本発明者らは、チロシンキナーゼであるSrcのSH3ドメインを標的とすることによって、線維肉腫及び前立腺癌の細胞の転移性の表現型が損なわれることを実証している。本発明者らは、SrcのSH3ドメインに結合するペプチドが、DNA合成、運動性やMMP分泌等、一括して転移に関与することで知られるEGF媒介性の過程を阻害すること(実施例1を参照のこと)、及びリンパ節転移の発生を大幅に低減すること(実施例2を参照のこと)を見出している。細胞運動性及びMMP発現が転移に関与することが知られていることから(Jungら、2010、Cortesら、2008、Murrayら、2012)、本発明者らは、この効果が他の転移性癌でも明らかになるものと考えている。
【０００７】
SrcのSH3ドメインは、様々なタンパク質のSrcとの相互作用、例えばアンドロゲン受容体(AR)及びエストロゲン受容体(ER)との相互作用を媒介することが知られている。本発明者らによって使用され、かつ実施例に記載されたペプチドは、Src、AR及びERの複合体の形成を途絶させることが知られており、この複合体は、AR及びERに関連のあるSrcシグナリングの鍵となる構成成分である。そのため、本発明者らは、この複合体の形成を途絶させる他の分子が、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌での効果と同じ効果を有するものと考えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2008/113770
【特許文献２】US5,552,534
【特許文献３】US5,550,251
【特許文献４】US5,288,707
【特許文献５】GB 0715635.9
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)
【非特許文献２】Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)
【非特許文献３】Venterら(Science 2001、291(5507):1304〜51)
【非特許文献４】Migliaccioら(EMBO J 2000、19:5406〜5417)
【非特許文献５】Plantら(1995)Analyt Biochem、226(2)、342〜348
【非特許文献６】Sambrookら(2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual.第3版. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York
【非特許文献７】O'Sullivanら、Anal. Biochem. (1979)100、100〜108
【非特許文献８】Julianら(1983)Anal.Biochem.132、68
【非特許文献９】Sambrookら(2001)「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」、第3版、Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USA
【非特許文献１０】Janewayら(2001)Immunobiology.、第5版、Garland Publishing
【非特許文献１１】Kohler及びMilstein(1975)「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」.Nature 256:495〜497
【非特許文献１２】Winterら(1994)「Making antibodies by phage display technology」.Annu.Rev.Immunol.12:433〜455
【非特許文献１３】Schaffitzelら(1999)「Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries」.J.Immunol.Methods 231:119〜135
【非特許文献１４】Giovannoniら(2001)「Isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening」.Nucleic Acids Res.29:E27
【非特許文献１５】「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application」、Hurrell(CRC Press、1982)
【非特許文献１６】「Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques」、H.Zola、CRC Press、1987、ISBN:0-84936-476-0
【非特許文献１７】「Antibodies:A Laboratory Manual」第1版、Harlow及びLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1988.ISBN 0-87969-314-2
【非特許文献１８】「Using Antibodies:A Laboratory Manual」第2版、Harlow及びLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1999.ISBN 0-87969-543-9
【非特許文献１９】「Handbook of Therapeutic Antibodies」Stefan Dubel編、第1版、-Wiley-VCH、Weinheim、2007.ISBN:3-527-31453-9
【非特許文献２０】Meziereら(1997)J.Immunol.159 3230〜3237
【非特許文献２１】Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985
【非特許文献２２】Research Horizons、University of Cambridge、2009年版8、GB 0715635.9
【非特許文献２３】Beckerら、AM J Pathol 178(4):1782〜91
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
AR及びエストロゲン受容体(ER)はいずれもチロシンキナーゼSrcと相互作用することが知られているが、他のSrc-ファミリーキナーゼとも相互作用する可能性がある。AR受容体は、SrcのSH3ドメインに結合する(Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619))。SH3ドメインは、50〜70アミノ酸長であり、真核生物のシグナル伝達及び細胞骨格タンパク質に特徴的であることが多い。このドメインは、プロリンリッチペプチドに結合することにより、キナーゼの活性調節、加えて局在化及び基質認識において主要な役割を果たす。ER受容体は、SrcのSH2ドメインに結合する(Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93))。SH2ドメインは、一般的におよそ100アミノ酸長であり、典型的には、標的タンパク質中の比較的長いペプチドモチーフの状態でリン酸化されたチロシン残基に結合する。本発明者らは、ER/Src複合体を標的とすることは、AR/Src複合体を標的とするのと同じように機能するものと考えている。
【００１１】
いかなる理論にも縛られることは望まないが、本発明者らは、SrcファミリーキナーゼとAR又はERのいずれかとの相互作用を低減させることによって、ステロイドホルモンによる非遺伝子性のシグナル伝達調節(例えばSrcファミリーキナーゼシグナル伝達の活性化、サイクリンD1の発現、及びDNA合成)を選択的に阻害することができ、それと同時にステロイドホルモンによる遺伝子性のシグナル転写調節が保持されるとも考えている。この方法で、従来のステロイドホルモン遮断又は切除(これらは、遺伝子性及び非遺伝子性作用の両方を無効にする)に関連する多くの副作用を回避し、治療をより持続的なものにすることができる。更に本発明者らは、SrcファミリーキナーゼとAR又はERのいずれかとの相互作用を低減させることは、驚くべきことに避妊効果がないことを見出した(例えば実施例３を参照)。現状では、抗アンドロゲン剤及び/又は抗エストロゲン剤を用いた治療は、受胎が可能となるように一時的に中止しなければならず、この一時的な中止は、疾患の再発をもたらしうることから、生殖能力の維持とは、ホルモン媒介治療における大幅な進歩を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明の第1の態様は、転移性癌の予防又は治療で使用するための、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子を提供する。
【００１３】
同様に、本発明は、転移性癌の予防又は治療のための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子の使用を提供する。
【００１４】
同様に、本発明は、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子を投与する工程を含む、転移性癌を予防又は治療する方法を提供する。
【００１５】
転移性癌を「予防又は治療すること」とは、本発明を使用して、障害の症状を緩和すること(すなわち、待機的な使用)、或いは障害を治療すること(例えば原因物質の阻害又は除去によって)、或いは障害を予防すること(すなわち、予防的な使用であり、症状の悪化若しくは進行を予防すること、又は障害の進行を抑制することのいずれか)が可能であることを意味するものとする。また、癌の転移性進行を減少させるという意味も含まれる。本分子は、原発癌に罹っていることを知る対象における転移を予防するために、或いは対象における転移(例えば、対象内で発達する転移の数及び/又は対象内で転移が発達する速度)を減少させるために使用してもよい。
【００１６】
好ましくは、転移性癌(例えば、AR及び/又はERの活性が対象における寄与因子である転移性癌)は、例えばヒト等の哺乳動物の対象において予防又は治療される。或いは対象は、動物、例えば飼育動物(例えばイヌ又はネコ)、実験用動物(例えば実験用げっ歯類、マウス、ラット又はウサギ)、又は農業において重要な動物(すなわち、家畜)、例えばウシ、ヒツジ、ウマ又はヤギであってもよい。対象は、雌でもよいし、又は雄でもよい。
【００１７】
一実施形態では、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子は、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)又はエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害又は予防する分子である。この一例として、転移性癌は、好ましくは、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌である。
【００１８】
そのため、本発明は、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌の予防又は治療で使用するための、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)又はエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害又は予防する分子を提供する。同様に、本発明は、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)又はエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害又は予防する分子の使用を提供する。同様に、本発明は、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療する方法であって、Srcファミリーキナーゼとアンドロゲン受容体(AR)又はエストラジオール受容体(ER)との相互作用を阻害又は予防する有効量の分子を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１９】
Srcファミリーキナーゼには、Srcファミリーのあらゆるキナーゼが含まれる。例えば、このようなキナーゼは、Src、Yes、Fyn、及びFgr(すなわち、SrcAサブファミリーのキナーゼ)、Lck、Hck、Blk、及びLyn(すなわち、SrcBサブファミリーのキナーゼ)、並びにFrk(Amanchyら、Proteome Res 2008、7(8):3447)から選択されるチロシンキナーゼ以外のあらゆるキナーゼであってもよい。最も好ましくは、Srcファミリーキナーゼは、Srcキナーゼである。
【００２０】
Srcファミリーキナーゼとは、ヒトSrcファミリーキナーゼ、例えばヒトSrcキナーゼを意味するものとし、アンドロゲン受容体(AR)とは、ヒトARを意味するものとし、エストラジオール受容体(ER)とは、ヒトERを意味するものとし、これらの配列はいずれも、Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)、Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)、Venterら(Science 2001、291(5507):1304〜51)、及びWO2008/113770で示されている。当然のことながら、遺伝子及びmRNA配列に関して天然の変異型があるが、このような変異型も、本明細書で定義されたようなそれぞれのSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、AR及びERの意味に含まれることが理解されるであろう。
【００２１】
またヒトSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、AR及び/又はERの変異体が、親のSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、AR又はERの活性のうち1つ又は複数を共有していれば、それらも含まれる。言い換えれば、変異体は、機能性変異体である。例えば、変異体は、それに対応するヒト配列に対して、少なくとも60%の配列同一性を共有していてもよいし、例えば少なくとも65%、70%、75%、80%、及び85%の配列同一性を共有していてもよいし、より好ましくは90%、95%又は99%の配列同一性を共有していてもよい。変異は、挿入、欠失、及び置換を含み、これらは保存的又は非保存的のいずれかである。「保存的置換」は、Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;及びPhe、Tyrのような組合せを意味するものとする。
【００２２】
またそれぞれのSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、AR及びERには、ヒトSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、AR及びERのオルソログも含まれる。適切な同種のSrcファミリーキナーゼ、AR及びERの例としては、マウス由来のもの、及びラット由来のものが挙げられる。他のオルソログとしては、図11に列挙した種由来のものが挙げられる。当然のことながら、それぞれのヒトSrcファミリーキナーゼ、AR及びERのオルソログをコードする遺伝子及びmRNA配列に関して天然の変異型があるが、このような変異型も、定義されたような同種のSrcファミリーキナーゼ、AR及びERの意味に含まれることが理解されるであろう。
【００２３】
SrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を阻害又は予防する分子の実施形態では、本分子は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとアンドロゲン受容体との相互作用を阻害又は予防する分子である。この相互作用の詳細は、Migliaccioら(Oncogene 2007, 26: 6619)に提供されている。このように、本分子は、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する分子である。
【００２４】
Srcファミリーキナーゼの「SH3ドメイン」とは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のN末端Src相同性3ドメインを意味するものとする。SH3ドメインは、典型的には50〜70アミノ酸長であり、プロリンリッチペプチドと結合する。Migliaccioら(EMBO J 2000、19:5406〜5417)の研究によれば、SrcキナーゼのSH3ドメインとARとの相互作用における該SH3ドメインの重要性が示されている。
【００２５】
SrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を阻害又は予防する分子の別の実施形態では、本分子は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインとエストラジオール受容体との相互作用を阻害又は予防する分子である。この相互作用の詳細は、Migliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)に示されている。
【００２６】
Srcファミリーキナーゼの「SH2ドメイン」とは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSrc相同性2ドメインを意味するものとする。SH2ドメインは、一般的にはおよそ100アミノ酸の長さであり、典型的にはリン酸化されたチロシン残基に結合する。
【００２７】
分子がSrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を予防又は阻害するとは、最初の段階で相互作用が形成されることを防ぐという意味と、相互作用が形成された後に相互作用を低減させるという意味の両方が含まれる。好ましくは、本分子は、相互作用を防ぐか、又は検出できないレベルまで低減させる。
【００２８】
好ましくは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR又はERとの相互作用を予防又は阻害する本分子は、選択的に予防又は阻害する。例えば、本分子がSrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を予防又は阻害する程度が、本分子がSrcファミリーキナーゼと他の何らかの分子との相互作用を予防する程度よりも高い程度(例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍又は1000倍)であることが好ましい。同様に、本分子がAR又はERとSrcファミリーキナーゼとの相互作用を予防又は阻害する程度が、本分子がAR又はERと他の何らかの分子との相互作用を予防する程度よりも高い程度(例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍又は1000倍)であることが好ましい。
【００２９】
分子が、SrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を予防又は阻害するかどうかは、特定の分子の存在及び非存在下でSrcファミリーキナーゼとAR又はERのいずれかとの相互作用を評価することによってうまく決定される。上述したように、SrcキナーゼのSH3ドメインは、SrcキナーゼとARとの相互作用を仲介すると考えられているため、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとARとの相互作用は、特定の分子の存在及び非存在下で評価してもよい。同様に、SrcキナーゼのSH2ドメインは、SrcキナーゼとERとの相互作用を仲介すると考えられているため、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインとERとの相互作用は、特定の分子の存在及び非存在下で評価してもよい。2種のタンパク質間の相互作用の評価方法は当技術分野で公知であり、任意の適切な方法を使用することができる。その例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、表面プラズモン共鳴アッセイ、競合アッセイ、チップベースのアッセイ、免疫細胞蛍光法(immunocytofluorescence)、酵母2ハイブリッド技術、及びファージディスプレイが挙げられ、これらはいずれも当技術分野では慣例的な方法であり、例えば、Plantら(1995)Analyt Biochem、226(2)、342〜348、及びSambrookら(2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual.第3版. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New Yorkで説明されている。タンパク質相互作用を評価する他の方法としては、限外ろ過とイオンスプレー質量分析/HPLC法との併用、又は他の物理的及び分析的方法が挙げられる。例えば、当業者に周知の蛍光エネルギー共鳴移動(FRET)法を使用することができ、この方法では、2種の蛍光標識された実体の結合は、互いに接近した際の蛍光標識の相互作用を測定することによって測定することができる。特に好ましい実施形態において、免疫沈降アッセイ、例えばMigliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)で説明されているアッセイを使用して、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとARとの相互作用、及び/又はSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインとERとの相互作用を評価することができる。
【００３０】
別の実施形態では、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子は、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する分子である。
【００３１】
上述したように、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインは、当技術分野で周知であり、当業者に容易に同定可能である。本ドメインは、タンパク質配列のアラインメントによって、タンパク質データベース(例えばUNIPROT)に照会することによって、又は市販のコンピュータアルゴリズムを使用してその位置を予測することによって、同定されてもよい。ヒトSrcでは、SH3ドメインは、アミノ酸7位から90位に及ぶ。
【００３２】
SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインへの分子の結合を評価することは、当技術分野における標準的な実践であり、上述のタンパク質相互作用を評価することを目的とする任意の手法を使用することができる。
【００３３】
好ましくは、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する分子は、選択的にそのようにする。例えば、本分子が、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに、Srcファミリーキナーゼの他のどのドメインに結合するよりも大きな程度(例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍又は1000倍)に結合する場合に好適である。同様に、本分子が、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに、他のタンパク質のSH3ドメインに結合するよりも大きな程度(例えば少なくとも5倍、10倍、20倍、50倍、100倍又は1000倍)に結合する場合に好適である。
【００３４】
治療する哺乳類対象については、本分子は、その哺乳類種のSrcファミリーキナーゼの活性を調節する(例えば、SrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を阻害又は予防する)ことができる分子であることが認識される。例えば、哺乳類対象がヒトである場合に、本分子は、ヒトSrcファミリーキナーゼの活性を調節する[例えば、ヒトSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)と、ヒトAR又はヒトERのどちらかとの相互作用を阻害又は予防する]こと等ができる。
【００３５】
本発明の第一の態様の好ましい実施形態において、本分子は、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、若しくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、又はその誘導体若しくは断片
を含む分子か又はそれからなる分子であり、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0又は1であり、nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0又は1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチド(retro-inverso peptide)である。
【００３６】
構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、又はBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むか又はそれからなる分子は、一般的に、ペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m又は[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mを有し、任意選択で更に、一方又は両方の末端(すなわち、Bj及びRp)に化学成分を有することが理解されるであろう。言い換えれば、j=0及びp=0;又はj=1及びp=0;又はj=0及びp=1;又はj=1及びp=1である。一実施形態において、j=0及びp=0であり、その結果、本分子は、構造[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m又は[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mを有するペプチドである。
【００３７】
B及びRは、独立して、どのような化学成分であってもよく、このような成分としては、例えば脂質(例えばグリコリピド、リン脂質、スフィンゴ脂質)、脂肪酸、トリグリセリド、グリセロール、プレニル若しくはイソプレニル成分(例えばファルネシル又はゲラニルゲラニル成分)、炭水化物(例えば単糖及び多糖)、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド若しくは核酸、又はその組合せのいずれかがある。従って、上記成分は、グリコペプチド又はリポペプチドであってもよい。上記成分は、低分子量又は高分子量ポリエチレングリコールであってもよく、例えば200〜70000の範囲の分子量を有するポリエチレングリコールであってもよい。追加の適切な成分は、当業者によって決定することができる。
【００３８】
一実施形態において、Bは、H、又はアセチル基、又は遊離の若しくはアセチル誘導体化されたNH2基を有するアミノ酸の1つ若しくは配列のいずれかである。
【００３９】
さらなる実施形態において、Rは、OH基、又はNH2基、又はC末端のカルボキシ-アミド基を有するアミノ酸の1つ若しくは配列のいずれかである。
【００４０】
化学成分B及びRは、分子が対象に投与されたときに、化学成分B及びRはペプチド部分から切断されて放出され得るように、分子のペプチド部分に任意選択で付着されていてもよい。例えば、成分B及びRのいずれかに、分子が体に投与されるときに切断が可能な切断部位が含まれていてもよい。一般的に、切断部位は、対象中に存在するプロテアーゼによって切断することができるプロテアーゼ切断部位である。
【００４１】
化学成分B及び/又はRは、当技術分野で公知の任意の適切な方法でペプチド部分に結合されていてもよい。例えば、成分B及び/又はRは、従来のポリペプチド架橋方法のいずれかによりペプチド部分に結合されていてもよく、このような方法としては、例えば、O'Sullivanら、Anal. Biochem. (1979)100、100〜108で概説されている方法がある。例えば、第一の部分にチオール基を多く含ませて、第二の部分を、そのチオール基と反応することができる二官能性物質と反応させてもよく、このような二官能性物質としては、例えばヨード酢酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHIA)又はN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、コンジュゲートした化学種間にジスルフィド架橋を組み入れるヘテロ二官能性架橋剤等がある。一般的に、アミド及びチオエーテル結合、例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて達成されるような結合は、in vivoではジスルフィド結合よりも安定である。
【００４２】
さらなる有用な架橋剤としては、穏やかな条件下でスルフヒドリル基を脱保護させる第一級アミン用のチオール化試薬であるS-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SATA)(Julianら(1983)Anal.Biochem.132、68)、ジメチルスベリミデートジヒドロクロリド、及びN,N'-o-フェニレンジマレイミドが挙げられる。
【００４３】
化学成分B及び/又はRをペプチド部分に結合するさらなる方法としては、化学的ライゲーションプロトコール、クリックケミストリーを使用するカップリングプロトコール、又はシュタウディンガーライゲーションを使用するカップリングプロトコールを使用することが挙げられ、これらは当技術分野で周知である。当業者により他の適切な方法に決めてもよい。
【００４４】
化学成分B及び/又はRがペプチド又はポリペプチドである場合、分子のペプチド部分並びに化学成分B及び/又はRは、核酸分子によってコードされていてもよい融合ポリペプチドの一部であってもよいことが理解される。例えば、化学成分B及び/又はRは、当技術分野において十分に確立されている遺伝子操作技術を使用して、分子のペプチド部分が含まれるように遺伝操作されていてもよい。
【００４５】
好都合には、本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m又は[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mは、57アミノ酸残基未満の長さであり、例えば55、50、45、40、35、30、25、20又は15アミノ酸未満の長さである。従って、ペプチド部分は、8から60アミノ酸残基の長さ、又は10から15アミノ酸残基の長さ、又は15から20アミノ酸残基の長さ、又は20から25アミノ酸残基の長さ、又は25から30アミノ酸残基の長さ、又は30から35アミノ酸残基の長さ、又は35から40アミノ酸残基の長さ、又は40から45のアミノ酸残基の長さ、又は45から50アミノ酸残基の長さ、又は50から55アミノ酸残基の長さを有していてもよい。好ましくは、ペプチド部分は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25アミノ酸の長さであり、最も好ましくは10アミノ酸の長さである。
【００４６】
Srcファミリーキナーゼの活性を調節することができるのであれば、構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp若しくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含む又はそれからなる分子の断片を使用することができることが理解される。例えば、本断片は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR及び/若しくはERとの相互作用を予防又は阻害することができる場合があるか、又は本断片は、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合することができる場合がある。従って、本分子に含まれる上述のアミノ酸は8個未満であってもよい。典型的には、このような断片は、本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m又は[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mの断片であり、一般的には、少なくとも3アミノ酸の長さであり、例えば少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15アミノ酸の長さである。従って、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する(例えばSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR及び/若しくはERとの相互作用を予防又は阻害するか、或いはSrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する)ことができるのであれば、本分子は、ペプチド[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m又は[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mの断片を含むか又はそれからなっていてもよい。
【００４７】
このような断片の誘導体又は塩は、以下で更に説明されているようにして使用することができる。例えば、安定性を改善するために、このような断片の一方又は両方の末端にキャッピング成分が付加されてもよい。
【００４８】
適切な断片の例は、HPHARIK、HPHAR、PHPHAR、HPH、PHPH、PPHPH、PPPHPH、PHP、PPHP、PPPHP、PPPH、PPH、及びPPPからなる群から選択することができる。断片の特定の誘導体又は塩は、Ac-HPHARIK-NH2、Ac-HPHAR-NH2、Ac-PHPHAR-NH2、Ac-HPH-NH2、Ac-PHPH-NH2、Ac-PPHPH-NH2、Ac-PPPHPH-NH2、Ac-PHP--NH2、Ac-PPHP-NH2、Ac-PPPHP-NH2P、Ac-PPPH-NH2、Ac-PPH-NH2、及びAc-PPP-NH2からなる群から選択することができる。
【００４９】
好都合には、成分B及び/又はRがペプチドである場合、分子全体がペプチドであってもよく、このようなペプチドは、57アミノ酸を超える長さであってもよいことが理解される。しかしながら、分子全体がペプチドである場合、150アミノ酸未満の長さ、例えば140、130、120、110、100、90、80、70又は60アミノ酸未満の長さであることが好ましい。
【００５０】
一般的に、本分子は、50kDa未満の分子量を有し、例えば40、30、20、10又は5kDa未満の分子量を有する。典型的には、本分子は、1000〜5000Daの分子量を有する。従って、本分子は、約4500、4000、3500、3000又は2500Daの分子量を有していてもよく、或いは1000〜2500Daの分子量を有していてもよい。
【００５１】
一実施形態において、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のいずれかであり、最も好ましくはn=3である。別の実施形態において、mは、1、2又は3のいずれかであり、最も好ましくはm=1である。従って、特に好ましい実施形態において、nは、3であり、mは、1である。
【００５２】
Xrは、1又は2個のアミノ酸残基の伸長部を表し、これらのアミノ酸残基は、独立して、又は両方とも、任意のアミノ酸残基であってよい。従って、Xrで表されるアミノ酸残基は、DNAによってコードされる天然に存在する任意のアミノ酸残基であってよく、このようなアミノ酸残基は、アラニン(Ala、A)、アルギニン(Arg、R)、アスパラギン(Asn、N)、アスパラギン酸(Asp、D)、システイン(Cys、C)、グルタミン(Gln、Q)、グルタミン酸(Glu、E)、グリシン(Gly、G)、ヒスチジン(His、H)、イソロイシン(Ile、I)、ロイシン(Leu、L)、リシン(Lys、K)、メチオニン(Met、M)、フェニルアラニン(Phe、F)、プロリン(Pro、P)、セリン(Ser、S)、スレオニン(Thr、T)、トリプトファン(Trp、W)、チロシン(Tyr、Y)、及びバリン(Val、V)から選択される。しかしながら、ペプチド部分がポリヌクレオチドからの発現によって形成されるもの以外に、Xrで表されるアミノ酸残基は、例えば以下で説明されるもののようなDNAによってコードされない1つ又は複数のアミノ酸残基を含んでもよい。一実施形態において、rは、0であり、代替の実施形態において、rは、1であり、Xは、スレオニン残基である。
【００５３】
誤解を避けるために言えば、本分子は、ARでもERでもない。
【００５４】
いかなる理論にも縛られることは望まないが、本発明者は、ペプチドPPPHPHARIKは、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインとの相互作用を仲介するヒトARの一部であると考えている。従って、特に好ましい実施形態において、本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m又は[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mは、PPPHPHARIK又はそのレトロインベルソペプチド、kirahphpppである。
【００５５】
ペプチドPPPHPHARIKは、ヒトARのアミノ酸残基377〜386に相当し、いかなる理論にも縛られることは望まないが、本発明者は、それに相当する他の種由来のARの一部は同じ活性を共有すると考えている。「それに相当する部分」とは、例えばMacVector又はCLUSTALW等のアライメントツールを使用してヒトARと他のARとを比較する際に、ヒトARの所定のアミノ酸配列に合わせてアライメントされた別のARのアミノ酸残基配列を意味するものとする。従って、別の好ましい実施形態において、ペプチド部分は、ヒトARの377〜386位のアミノ酸配列(PPPHPHARIK)に相当するペプチドである。例えば、マウス及びラットARのそれに相当するペプチドは、PPTHPHARIKであり、従ってペプチド部分は、PPTHPHARIK又はそのレトロインベルソペプチド、kirahphtppであってもよい。図11に選択された他の種のそれに相当するペプチドを示すが、ペプチド部分は、図11に列挙したペプチドのいずれかであってもよいし、又はそのレトロインベルソペプチドであってもよい。好ましくは、ペプチドPPPHPHARIKは、ヒト対象に投与され、ペプチドPPTHPHARIKは、マウス又はラット対象に投与され、他も同様である。
【００５６】
2種のタンパク質のアライメント作製は、クラスタルWプログラム(Clustal W program)(Thompsonら、1994)を使用して行ってもよい。使用されるパラメーターは、以下に示す通りであってもよい:Fastのペアワイズアライメントパラメーター:K-tuple(ワード)サイズ;1、ウィンドウサイズ;5、ギャップペナルティー;3、トップダイアゴナルの数;5。スコア付けの方法:xパーセント。マルチプルアライメントパラメーター:ギャップオープンペナルティー;10、ギャップ伸長ペナルティー;0.05。スコア行列:BLOSUM。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、本分子は、ペプチドPPPHPHARIK又はPPTHPHARIKを含むか又はそれからなる。
【００５８】
上記で定義された本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m若しくは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m又はその断片は、典型的にはタンパク質化学的な技術を使用して作製され、例えば部分的なタンパク質分解を(エキソ型分解又はエンド型分解のいずれかで)使用して、又はデノボ合成によって作製される。或いはこのようなペプチドは、組換えDNA技術によって作製してもよい。核酸のクローニング、操作、改変、及び発現、並びに発現されたタンパク質の精製に適した技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら(2001)「Molecular Cloning, a Laboratory Manual」、第3版、Sambrookら(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、USAで説明されている。
【００５９】
上記で定義された本分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m若しくは[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m又はその断片はまた、化学的に合成することもでき、例えばMerrifieldら(1964)の固相ペプチド合成によって合成することもできる。或いは、このようなペプチド部分は、標準的な溶液法を使用して合成することもできる(例えばBodanszky、1984及びDugasら、1981を参照)。新たに合成されたペプチドは、例えば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製することもでき、更に、例えば質量分析又はアミノ酸配列解析を使用して特徴付けることもできる。
【００６０】
Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR又はERとの相互作用を予防又は阻害することができる他の適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)に対するか又はARとERのどちらかに対する、任意の抗体が挙げられうることが理解される。上述したように、本発明者は、SrcキナーゼのSH3ドメインとARのアミノ酸残基377〜386とは、SrcキナーゼとARとの相互作用を仲介すると考えている。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR又はERのいずれかとの相互作用を阻害又は予防する適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに対する抗体、又はヒトARのアミノ酸377〜386に相当する位置でARに結合する抗体(例えば構造(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lysを有するペプチド(式中nは、1〜10の整数であり、Xは、任意のアミノ酸であり、rは、0〜2の整数である)に対する抗体であって、例えばPPPHPHARIK又はPPTHPHARIKに対する抗体)が挙げられることが理解される。同様に、SrcキナーゼのSH2ドメインは、SrcキナーゼとERとの相互作用を仲介すると考えられている。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR又はERのいずれかとの相互作用を阻害又は予防する適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインに対する抗体が挙げられることが理解される。好ましくは、このような抗体は、上記で考察したように、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR又はERとの相互作用を選択的に予防又は阻害する。
【００６１】
同様に、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する他の適切な分子としては、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合する抗体が挙げられることが理解される。好ましくは、本抗体は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに、選択的に結合する。
【００６２】
用語「抗体」は、本明細書で用いられる場合、これらに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片、及びFab発現ライブラリーによって生産された断片を含む。このような断片としては、標的物質との結合活性を保持する全抗体、Fv、F(ab')、及びF(ab')2断片、加えて単鎖抗体(scFv)、融合タンパク質、並びに抗体の抗原-結合部位を含む他の合成タンパク質の断片が挙げられる。更に、ドメイン抗体(dAb)、二重特異性抗体、ラクダ抗体、及び遺伝子操作されたラクダ抗体も挙げられる。更に、ヒトに投与する場合、抗体及びその断片は、ヒト化抗体であってもよく、このような抗体は現在当技術分野で周知である(Janewayら(2001)Immunobiology.、第5版、Garland Publishing)。
【００６３】
Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)又はAR及びERの特定の領域に結合する上述された適切な抗体は、当技術分野で長年かけて確立した技術を使用して当業者により作製することができる。モノクローナル抗体及び抗体断片の調製方法は当技術分野で周知であり、このような方法としては、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein(1975)「Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity」.Nature 256:495〜497);抗体ファージディスプレイ(Winterら(1994)「Making antibodies by phage display technology」.Annu.Rev.Immunol.12:433〜455);リボソームディスプレイ(Schaffitzelら(1999)「Ribosome display:an in vitro method for selection and evolution of antibodies from libraries」.J.Immunol.Methods 231:119〜135);及び反復コロニーフィルタースクリーニング(iterative colony filter screening)(Giovannoniら(2001)「Isolation of anti-angiogenesis antibodies from a large combinatorial repertoire by colony filter screening」.Nucleic Acids Res.29:E27)が挙げられる。更に、本発明で使用するのに適した抗体及び抗体断片は、例えば以下の出版物でも説明されている:「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Application」、Hurrell(CRC Press、1982);「Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques」、H.Zola、CRC Press、1987、ISBN:0-84936-476-0;「Antibodies:A Laboratory Manual」第1版
、Harlow及びLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1988.ISBN 0-87969-314-2;「Using Antibodies:A Laboratory Manual」第2版、Harlow及びLane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1999.ISBN 0-87969-543-9;及び「Handbook of Therapeutic Antibodies」Stefan Dubel編、第1版、-Wiley-VCH、Weinheim、2007.ISBN:3-527-31453-9。
【００６４】
本発明の分子は、細胞への侵入を容易にする細胞貫通ペプチド(また、タンパク質導入ドメインとしても知られている)の配列を含んでもよいことが理解される。当技術分野でよく知られているように、細胞貫通ペプチドは、一般的には、正味の正電荷を有する最大30残基の短いペプチドであり、受容体非依存的及びエネルギー非依存的に作用する(Lindgrenら、2000;Deshayesら、2005a及び2005b;Takeuchiら、2006、これらの細胞貫通ペプチドに関する全開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。従って、上述の化学成分B及びRのいずれかが細胞貫通ペプチドであってもよい。そのような場合、細胞貫通ペプチドは、Srcファミリーキナーゼの活性の調節(例えばSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR若しくはERとの相互作用の阻害又は予防、或いはSrcのSH3ドメインへの結合)に関する本分子の一部から切断可能であることが好ましい。例えば、細胞貫通ペプチドは、細胞内で切断可能である。
【００６５】
また本分子は、より容易に検出できるように改変してもよく、例えば、本分子をビオチン化することによって、又は放射標識、蛍光標識又は酵素標識等の当技術分野で公知の任意の検出可能な標識を取り込ませることによって改変してもよい。
【００６６】
本明細書において説明される分子のアミノ酸残基は、「L」型異性体であってもよい。しかし、本分子が、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の活性を調節する[例えば、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)と、AR若しくはERとの相互作用を阻害若しくは予防するか、又はSrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する]ことがまだ可能な限りは、「D」型異性体の残基をあらゆるL型アミノ酸残基に置換することができる。この定義は、特に他の指定がない限り、化学修飾されたアミノ酸、例えば、アミノ酸類似体(例えばペニシラミン、3-メルカプト-D-バリン)、天然に存在するタンパク質を構成しないアミノ酸(例えばノルロイシン)、及び当技術分野でアミノ酸に特徴的であることが知られている特性を有する化学的に合成された化合物を含む。用語「タンパク質を構成する」とは、アミノ酸がよく知られた代謝経路により細胞内に取り込まれてタンパク質になることを示す。
【００６７】
従って、一実施形態において、上記分子のペプチド部分は、ペプチド[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mのレトロインベルソペプチド又はその断片(好ましくは上記で定義されたものが挙げられる)である。レトロインベルソペプチド(また、全D型レトロ又はレトロエナンチオペプチド(retro-enantio peptide)としても知られている)とは、全てのL型アミノ酸がD型アミノ酸で置換されており、ペプチド結合が逆になったペプチドを意味するものとする。従って、このようなペプチドは、親のL型配列の順番とは逆の順番で組み立てられたD型アミノ酸で構成される。[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mのレトロインベルソペプチドは、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mである(式中、小文字は、それに相当するD型アミノ酸を表す)。レトロインベルソペプチドは、例えばMeziereら(1997)J.Immunol.159 3230〜3237で説明されている方法等の当技術分野で公知の方法で合成することができる。このアプローチは、主鎖には変化を含むが、側鎖の配置には変化を含まず、親のペプチドとの高い類似性を保持したプソイドペプチドの作製を含む。レトロインベルソペプチドは、タンパク質分解に対してかなり高い耐性を有する。
【００６８】
誤解を避けるために言えば、上記でXrについて示した好ましい選択肢はいずれも、それに相当するD型アミノ酸xrにも適用される。
【００６９】
上述した分子のペプチド部分は、ペプチド「ミメティック」、すなわち上述のようなアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドの構造的特徴を模倣したペプチドミメティックであってもよい。
【００７０】
非ペプチドの性質を有するペプチドミメティックは、標準的な有機化学的方法により設計し合成することができる。非ペプチドの性質を有するペプチドミメティックは更に、治療用途、分解に対する耐性、透過性、及び経口投与の可能性においても有利である。
【００７１】
ペプチドミメティックは、ペプチドやタンパク質の特定の構造的態様を模倣することによりタンパク質に結合することができる小分子である。これらは、科学及び医学において、タンパク質や細胞受容体及び他の受容体のペプチドリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストとして、更に酵素の基質及び基質類似体として広範囲にわたり使用される。いくつかの例は、モルヒネアルカロイド(天然に存在するエンドルフィン類似体)、ペニシリン(半合成)、及びHIVプロテアーゼ阻害剤(合成)である。このような化合物は、ペプチド又はタンパク質を模倣する構造的特徴を有しており、そのようなものとして他のタンパク質により認識されてそれと結合する。ペプチドミメティックの結合は、結合したタンパク質に、このような結合によって引き起こされる通常の機能を実行させること(アゴニスト)か、或いはこのような機能を中断させること(アンタゴニスト、阻害剤)のいずれかを誘導する。
【００７２】
ペプチドミメティック設計における主要な目的は、ペプチダーゼによる切断及び不活性化の影響を受けやすいミメティックの特徴を低減することであった。例えばShermanら(1990)で開示されているような1つのアプローチは、1つ又は複数のアミド結合を、様々な化学的官能基で実質的に比体積が等しくなるように置き換えることである。この段階的なアプローチは、活性な類似体が得られるという点である程度の成功を収めている。いくつかの例では、これらの類似体は、その天然に存在する等価物よりも長い生物学的半減期を有することが示されている。別のアプローチでは、D型アミノ酸及びN-メチルアミノ酸等の様々な非コードアミノ酸又は改変アミノ酸を使用して、哺乳動物ペプチドを改変している。或いは、推定の生物活性コンフォメーションは、環化等の共有結合の改変によって、或いはγ-ラクタムの取り込み又は他のタイプの架橋(Veberら、1978及びThorsettら、1983)によって安定化させている。Rich(1986)によって開示された別のアプローチは、酵素阻害剤の設計に遷移状態アナログの概念を適用することによりペプチドミミックを設計することである。例えば、スタチンの第二級アルコールは、ペプシン基質の不動のアミド結合の四面体遷移状態(tetrahedral transition state)を模倣することが知られている。
【００７３】
US5,552,534では、様々なペプチドの化学及び/又は生物活性を模倣又は阻害する非ペプチド化合物が開示されている。このような化合物は、テトラヒドロピラニル環等のある種のコア種に、化合物を少なくとも部分的にペプチドと交差反応するようにする化学官能基を付加することによって生産することができる。他のペプチドミメティック調製技術は、US5,550,251及びUS5,288,707に開示されている。
【００７４】
市販のソフトウェアパッケージを使用して、低分子量のペプチド及び/又はペプチドミメティック、好ましくは非加水分解性の類似体を特異的なアンタゴニスト/阻害剤として設計することができる。低分子量のペプチド及びペプチドミメティックの結晶構造、設計、及び最適化に適した市販のソフトウェアとしては、これらに限定されないが、高分子X線結晶学利用のクアンタエンバイロメント(Macromolecular X-ray Crystallography QUANTA Environment)(Molecular Simulations,Inc.);TeXsan、BioteX、及びSQUASH(Molecular Structure Corporation);並びにCrystallographica(Oxford Cryostsystems)が挙げられる。
【００７５】
本明細書において説明される分子の塩又は誘導体が、Srcファミリーキナーゼの活性を調節する(例えばSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とAR若しくはERとの相互作用を予防又は阻害する、或いはSrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する)ことができるのであれば、その塩又は誘導体は、転移性癌(例えば、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌)を予防又は治療するのに有用である可能性があることが理解される。「誘導体」とは、官能性を有する側基の反応により化学的に誘導体化された1つ又は複数の残基を有するペプチド(例えば上述した分子のペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mは、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mである)を意味するものとする。このような誘導体化された分子としては、例えば、遊離のアミノ基を誘導体化することにより、アミン塩酸塩、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基又はホルミル基が形成された分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチル及びエチルエステル若しくは他のタイプのエステル又はヒドラジドが形成されてもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、O-アシル又はO-アルキル誘導体が形成されてもよい。また誘導体としては、20種の標準的なアミノ酸の1つ又は複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含むペプチド部分も挙げられる。例えば、プロリンが4-ヒドロキシプロリンで置換されていてもよく、リシンが5-ヒドロキシリシンで置換されていてもよく、ヒスチジンが3-メチルヒスチジンで置換されていてもよく、セリンがホモセリンで置換されていてもよく、リシンがオルニチンで置換されていてもよい。誘導体化には、あるアミノ酸を別のアミノ酸に変える官能基の変化は含まれない。
【００７６】
いくつかの有用な改変は、血液中のタンパク質分解活性をブロックすることにより、溶液中、特に血液、血漿又は血清等の生体液中での分子(例えばペプチド)の安定性を高め、結果的に半減期を高めるように設計される。従って、ペプチドは、一方又は両方の末端に安定化基を有していてもよい。典型的な安定化基としては、アミド、アセチル、ベンジル、フェニル、トシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ベンジルオキシカルボニルが挙げられ、加えて類似の末端基改変も挙げられる。追加の改変としては、エキソペプチダーゼ活性を阻害するために、末端に「L型」アミノ酸の代わりに「D型」アミノ酸を使用し、アミノ又はカルボキシ末端ではなくアミドを使用することが挙げられる。従って、ペプチド部分[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]mは、上記で定義された分子の[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]mであり、一方又は両方の末端に、キャッピング成分、好ましくは分子量が200Da未満の成分を有していてもよいことが理解される。更にキャッピング成分としては、ナフチル基又はポリエチレングリコール基が挙げられる。レトロインベルソペプチドはすでに比較的安定であるため、追加のキャッピング成分を必要としない場合もあることが理解される。
【００７７】
従って、特に好ましい実施形態において、本分子は、構造Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2又はAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を含むか又はそれからなり、式中Acは、アセチル基である。
【００７８】
好ましくは、本発明の分子は、対象における生殖能力を低減又は防止しない分子である。実施例に記載されているように、本発明者らは、マウスへのペプチドAc-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2の投与が、その生殖能力に影響を及ぼさないことを実証している。Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)と、AR又はERとの相互作用を予防又は阻害する他の分子、又はSrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する他の分子は、同じ活性を有することが期待される。そのため、対象での転移性癌(例えば、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌)の予防又は治療における、本発明の分子(例えば、SrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を阻害又は予防する分子)の使用は、生殖能力の維持を望む対象に特に適していることが理解される。このことは重要な進歩であると考えられ、その理由は、本発明者らが知る限り、AR及び/又はERの活性が寄与因子である癌の既存の治療は、生殖能力に影響を及ぼすことが知られているためである。対象における生殖能力の評価方法は当技術分野で周知であり、例えば実施例で説明されるアッセイがある。
【００７９】
一実施形態において、本分子は、抗体を生成するためにワクチンとして投与される。例えば、上記で定義された構造を有する分子は、ARに特異的に結合する抗体の調製に使用することができ、従ってワクチンとして調製されてもよい。
【００８０】
本分子を免疫促進性の分子等の担体分子に連結させることが望ましい場合もある。適切な例としては、ウシ血清アルブミン(BSA)又はキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)が挙げられる。加えて、又は代替として、本分子は、脂質組成物、例えば脂質粒子、ナノカプセル、リポソーム又は脂質小胞中に含まれていてもよい。また本分子は、以下で更に説明されているような遅延放出用のコーティングカプセルに取り込まれていてもよい。
【００８１】
「転移性癌」には、癌が転移しているという意味が含まれる。そのため、原発腫瘍は、身体の1又は複数の部位に広がり、1又は複数の二次腫瘍を確立している。転移性の癌は、当技術分野で公知の定法を使用して診断することができる。典型的には、診断は、生検を採取する工程、及び生検を採取した器官又は組織の癌性細胞に任意の癌性細胞が相似であるかどうかを評価する工程(例えば、顕微鏡によって細胞組織像を検査することによって、又は免疫組織化学的手法を使用することによって)を含む。
【００８２】
本発明による予防又は治療に適用しうる転移性癌の例としては、転移性線維肉腫、転移性前立腺癌、転移性乳癌、転移性子宮類線維症、転移性線維性ポリープの過形成、転移性卵巣癌、転移性膀胱癌、転移性子宮頚癌、転移性子宮癌、転移性精巣癌、転移性肺癌、転移性腸癌、転移性肝癌、転移性腎癌及び転移性食道癌が挙げられる。
【００８３】
AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌には、少なくとも病理の一部にAR及び/又はERの活性が介在するあらゆる生物学的又は医学的な転移性癌が含まれる。このような病理は、高い又は低いAR及び/又はERの活性に起因する可能性がある。このような転移性癌は、AR及び/又はERの活性によって引き起こされる場合もあり、或いは単にAR及び/又はERの活性を特徴とする場合もある。AR及び/又はERの活性が転移性癌に直接的に寄与する場合もあるし、或いは転移性癌に間接的に寄与する場合もある。一般的に、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌とは、病因が、AR及び/又はERを介する異常なシグナル伝達に関与する状態(例えばAR及び/又はERにより細胞増殖が調節される状態)である。例えば、転移性癌は、Srcファミリーキナーゼ経路を介する異常なシグナル伝達に関与する可能性がある。このような癌は、当技術分野で利用可能な従来の方法を使用して容易に診断することができる。
【００８４】
AR及び/又はERが寄与因子である転移性癌の例としては、転移性線維肉腫、転移性前立腺癌、転移性乳癌、転移性子宮類線維症、転移性線維性ポリープの過形成、転移性卵巣癌、転移性膀胱癌、転移性子宮頚癌、転移性子宮癌及び転移性精巣癌が挙げられる。好ましくは、転移性癌は、転移性線維肉腫である。
【００８５】
一実施形態としては、転移性癌は、転移性前立腺癌ではない。
【００８６】
一実施形態において、対象は、生殖能力の維持を望むものである。「生殖能力の維持を望む」とは、対象の生殖能力を低下させないことが望ましいということを意味するものとする。例えば、対象は、妊娠を望んでいてもよい。それゆえに、癌患者が転移性癌を有すると同時に生殖能力の維持を望むような場合、このような対象の一例は、転移性癌患者の部分集団である。典型的には、そのような対象は、16歳と50歳との間であり、一例では20〜45歳又は25〜40歳である。本発明の分子の投与に引き続いて、対象は、少なくとも1か月、例えば少なくとも2、3、4、5、若しくは6か月間、又は少なくとも1、2若しくは3年間、依然として生殖可能であると考えられる。
【００８７】
生殖能力に及ぼすそれらの利点を考慮すると、本発明の分子は、特に生殖器系の転移性癌を予防又は治療するのに適することが理解される。そのため、転移性子宮類線維症、転移性卵巣癌、転移性子宮頚癌又は転移性子宮癌からなる群から選択される1種又は複数等の転移性の婦人科癌を予防又は治療するために、本発明の分子を使用することが望ましい。
【００８８】
本明細書において説明される分子又はその誘導体若しくは断片は、薬学的に許容される賦形剤、溶媒、希釈剤又は担体(それらの組合せも含む)と共に製剤化されてもよいことが理解される。担体、希釈剤、溶媒又は賦形剤は、本分子又は誘導体と適合性がありそのレシピエントに対して有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。典型的には、担体は、滅菌済みでパイロジェンフリーの水又は塩類溶液(例えば生理食塩水)と予想される。適切な賦形剤としては、マンニトール及びデキストロースが挙げられる。治療用途に応じた許容される担体、溶媒、希釈剤、及び賦形剤は製薬分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro編、1985)で説明されている。医薬担体、溶媒、賦形剤又は希釈剤は、目的とする投与経路及び標準的な製薬上の実施を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、溶媒又は希釈剤として、又はそれらに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、又は可溶化剤を含んでもよい。保存剤、安定剤、色素、更には着香剤が医薬組成物に添加されていてもよい。
【００８９】
製剤は、単位剤形で提供されることが便利な場合があり、当技術分野で周知の任意の薬学的方法により調製することができる。このような方法は、本分子を、1つ又は複数の補助的な成分を構成する担体と混合する工程を含む。一般的に、製剤は、活性成分を、液体担体若しくは微粉化した固体担体又はその両方に均一かつ密接に混合し、次に必要に応じて生成物を成形することにより調製される。
【００９０】
本発明に係る経口投与に適した製剤は、それぞれ予め決められた量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤又は錠剤等の個別の単位として;散剤又は顆粒剤として;水性液体又は非水性液体中の液剤又は懸濁剤として;又は水中油型液体乳剤又は油中水型液体乳剤として提供されてもよい。また活性成分は、ボーラス剤、舐剤又はペースト剤として提供されてもよい。
【００９１】
錠剤は、任意選択で1つ又は複数の補助的な成分と共に、圧縮又は成型することにより作製されてもよい。圧縮錠剤は、任意選択で結合剤(例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、表面活性剤又は分散剤と混合して、粉末又は顆粒等の自由流動性の形態で活性成分を適切な装置で圧縮することにより調製してもよい。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿潤させた粉末状化合物の混合物を適切な装置で成型することにより作製してもよい。錠剤は、任意選択でコーティングしたり、又は刻み目を入れたりしてもよく、更に、例えば所望の放出プロファイルが達成されるように様々な比率でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて、内部の活性成分を持続放出又は制御放出させるように製剤化してもよい。
【００９２】
口内への局所投与に適した製剤としては、風味付された基剤中に、通常はスクロース及びアカシア又はトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ剤;不活性な基剤中に、例えばゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシア中に活性成分を含む香錠;及び適切な液体担体中に活性成分を含むうがい薬が挙げられる。
【００９３】
非経口投与に適した製剤としては、水性及び非水性の滅菌注射液剤(これは、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び製剤を対象のレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでいてもよい);及び水性及び非水性の滅菌懸濁剤(これは、懸濁化剤や増粘剤を含んでいてもよい)が挙げられる。このような製剤は、単位用量で、又はマルチドーズコンテナー、例えば密封されたアンプルやバイアル中に提供されてもよく、更に、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよいフリーズドライ(凍結乾燥)した状態で保存されてもよい。即時調製用の注射液剤及び懸濁剤は、これまでに述べられたような滅菌散剤、顆粒剤、及び錠剤からも調製することができる。
【００９４】
上記で具体的に述べられた成分に加えて、製剤は、対象の製剤のタイプを考慮して当技術分野において一般的な他の物質を含んでいてもよく、例えば経口投与に適した製剤は、着香剤を含んでいてもよい。
【００９５】
本分子又はその誘導体若しくは断片、又はその製剤は、経口、鼻腔内、及び非経口(例えば皮下又は筋肉内)注射等のあらゆる従来の方法によって投与することができる。好ましい経路としては、経口、静脈内又は皮下注射が挙げられる。治療は、単回投与、又は所定時間にわたる複数回の投与からなっていてもよい。本分子又はその誘導体は、長期間にわたり、例えば少なくとも2又は4又は6又は8週間にわたり持続放出されるように持続放出製剤に製剤化されてもよい。好ましくは、持続放出は、少なくとも4週間にわたりなされる。
【００９６】
特定の実施形態において、本分子又はその誘導体若しくは断片は、生殖系に直接投与されるように製剤化される。従って、本分子又はその誘導体若しくは断片は、膣坐剤若しくは肛門坐剤、膣内用タンポン、膣内リング、膣内ペッサリー、膣内スポンジ、又は薬剤付加子宮内避妊具(IUD)、又は持続放出製剤に製剤化されてもよい。
【００９７】
対象に投与される本分子又はその誘導体若しくは断片の量は、特定の対象の状態と闘うのに有効な量である。この量は、医師が決めることができる。
【００９８】
一実施形態において、本分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp又はBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むか又はそれからなる分子は、1〜1000ngの1日用量で、例えば1〜900ng、1〜800ng、1〜700ng、1〜600ng、1〜500ng、1〜400ng、1〜300ng、1〜200ng又は1〜100ngの1日用量で対象に投与される。従って、本分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp又はBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むか又はそれからなる分子は、少なくとも1ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、60ng、70ng、80ng、90ng又は100ngの1日用量で、或いは少なくとも150ng又は200ngの1日用量で対象に投与されてもよい。
【００９９】
別の実施形態において、本分子、例えば上記で定義された構造Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp又はBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rpを含むか又はそれからなる分子は、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55又は60日間の期間にわたり、更には少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は18か月もの期間にわたり、或いは少なくとも2、3、4又は5年の期間にわたり、間隔をおいて(例えば1日1回、1日2回又は週1回)投与される。本分子又は誘導体が間隔をおいて投与される場合、異なる間隔で異なる投与経路を使用することが望ましい場合があることが理解される。例えば、本分子又は誘導体をまず注射投与して、それに続く用量を皮下埋め込みにより投与してもよい。最適な投与間隔及び治療の持続時間は、一般的に、状態の重症度によって決まると予想される。
【０１００】
一実施形態において、対象に、本明細書において説明される本分子又は誘導体に加えて追加の治療剤が投与される。例えば、特定の転移性癌を予防又は治療するために本分子又はその誘導体を投与する場合、転移性癌を予防又は治療するのに有用であることがわかっている追加の治療剤が投与されてもよい。従って、転移性乳癌を予防又は治療する場合、追加の治療剤は、転移性乳癌を予防又は治療することがわかっている物質であってもよく、転移性子宮癌を予防又は治療する場合、追加の治療剤は、転移性子宮癌を予防又は治療することがわかっている物質であってもよく、他も同様である。
【０１０１】
典型的には、追加の治療剤は、増殖を抑制する任意の物質、例えば細胞増殖抑制剤又は細胞破壊剤又は抗癌剤のいずれかであってもよい。追加の治療剤は、転移の低減又は阻害において有効であることが公知である物質であってもよいことが理解される。
【０１０２】
追加の治療剤は、本明細書において説明される分子又はその誘導体と同時に投与されてもよいし(すなわち、同時投与であり、任意選択で共に製剤化された形態であってもよい)、或いは本明細書において説明される分子又はその誘導体とは異なる時期に投与されてもよい(すなわち、連続投与であり、この場合、追加の治療剤は、本分子又はその誘導体が投与される前又はその後に投与される)ことが理解される。追加の治療剤は、本明細書において説明される本発明の分子と同じ方法で投与されてもよいし、或いはその追加の治療剤にとって通常の投与経路を使用して投与されてもよい。
【０１０３】
本発明の第2の態様は、(i)Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子と、(ii)転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物を提供する。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む医薬組成物であってもよい。
【０１０４】
従って、本発明は、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲン又はエストラジオール受容体との相互作用を阻害又は予防する分子と、(ii)AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物を提供する。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む医薬組成物であってもよい。
【０１０５】
同様に、本発明は、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合する分子と、(ii)転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物を提供する。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む医薬組成物であってもよい。
【０１０６】
本分子、誘導体、追加の治療剤、転移性癌、及び治療される対象に関して好ましいものとしては、上記で本発明の第一の態様に関して述べたものが挙げられる。例えば、本分子は、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、若しくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、又はその誘導体若しくは断片
を含むか又はそれからなっていてもよく、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0又は1であり、nは、1〜10の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0又は1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである。最も好ましくは、本分子は、構造Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2又はAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を有し、式中Acは、アセチル基である。好ましくは、対象はヒトである。
【０１０７】
したがって、本発明は、(i)Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子と、(ii)転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む、転移性癌の予防又は治療に使用するための組成物を含む。従って、本発明は、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌の予防又は治療に使用するための、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲン又はエストラジオール受容体との相互作用を阻害又は予防する分子と、(ii)AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物を提供する。本発明はまた、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合する分子と、(ii)転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む、転移性癌の予防又は治療に使用するための組成物を提供する。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む医薬組成物であってもよい。
【０１０８】
同様に、本発明は、転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、(i)Srcファミリーキナーゼの活性を調節する分子と、(ii)転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物の使用を含む。従って、本発明は、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲン又はエストラジオール受容体との相互作用を阻害又は予防する分子と、(ii)AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物の使用を提供する。本発明はまた、転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、(i)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合する分子と、(ii)転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤とを含む組成物の使用を提供する。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む医薬組成物であってもよい。
【０１０９】
本発明は、転移性癌の予防又は治療に使用するためのSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の活性を調節する分子であって、対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するための治療剤も投与される、分子を含むことが理解される。従って、本発明は、対象におけるAR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌の予防又は治療に使用するための、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲン又はエストラジオール受容体との相互作用を阻害又は予防する分子であって、対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、分子を含むことが理解される。本発明はまた、転移性癌の予防又は治療に使用するためのSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合する分子であって、対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、分子を含む。
【０１１０】
同様に、本発明は、転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の活性を調節する分子の使用であって、対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、使用を含むことが理解される。従って、本発明は、対象におけるAR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)とアンドロゲン又はエストラジオール受容体との相互作用を阻害又は予防する分子の使用であって、対象が更に、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、使用を含む。本発明はまた、転移性癌を予防又は治療するための医薬の製造における、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合する分子の使用であって、対象が更に、前記転移性癌を予防又は治療するのに適した治療剤も投与される、使用を含む。
【０１１１】
好ましくは、本分子は、構造:
Bj-[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Rp、若しくはBj-[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]m-Rp、又はその誘導体若しくは断片
を含むか又はそれからなっていてもよく、
式中Bは、第一の化学成分であり、jは、0又は1であり、nは、1〜10の整数であり、mは、1〜3の整数であり、Rは、第二の化学成分であり、pは、0又は1であり、[lys-ile-arg-ala-his-pro-his-xr-(pro)n]は、[(Pro)n-Xr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]のレトロインベルソペプチドである。最も好ましくは、本分子は、構造Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2又はAc-Pro-Pro-Thr-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys-NH2を有し、式中Acは、アセチル基である。
【０１１２】
本発明者らは、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の活性を調節する分子を、転移性癌を予防又は治療するために使用しうること(例えば、SrcファミリーキナーゼとAR及び/又はERとの相互作用を阻害又は予防する分子を使用して、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療しうること、並びにSrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する分子を使用して、転移性癌を予防又は治療しうること)を見出した。そのため、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)に及ぼす試験物質の影響を評価することによって、転移性癌を予防又は治療するための物質を同定することができることが理解される。
【０１１３】
したがって、本発明のさらなる態様は、転移性癌を予防又は治療するための物質の選択方法であって、試験物質がSrcファミリーキナーゼの活性を調節するかどうかを決定する工程を含む、方法を提供する。
【０１１４】
従って、本発明は、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌を予防又は治療する物質の選択方法を提供し、本方法は、試験物質が、(a)AR若しくはER、又はSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)に結合することができるその部分と(b)Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)、又はAR若しくはERに結合することができるその部分との相互作用を低減させるかどうかを決定する工程を含む。
【０１１５】
本発明はまた、転移性癌を予防又は治療する物質の選択方法であって、試験物質が、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合するかどうかを決定する工程を含む、方法を提供する。
【０１１６】
AR、ER及びSrcファミリーキナーゼ、並びに転移性癌に関して好ましいものとしては、上記で本発明の第1の態様に関して定義されたものが挙げられる。
【０１１７】
AR若しくはERとSrcファミリーキナーゼとの相互作用を評価する際、スクリーニング方法の目的のために、AR若しくはER、又はSrcファミリーキナーゼの全長を用意する必要がないことが認識される。Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)に結合することができるAR又はERの部分を使用してもよいし、AR又はERに結合することができるSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の部分を使用してもよい。例えば、上述したように、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3及びSH2ドメインはそれぞれ、SrcファミリーキナーゼとAR及びERそれぞれとの相互作用を仲介すると考えられている。従って、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに相当する部分若しくはARに結合することができるその一部、又はSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH2ドメインに相当する部分若しくはERに結合することができるその一部を使用することができる。同様に、ARのアミノ酸残基377〜386に相当するARの部分は、ARとSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインとの相互作用を仲介すると考えられており、使用が可能である。他の適切な部分は当業者により決定することができ、例えば、Migliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)及びMigliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93)で説明されている。
【０１１８】
試験物質は、ポリペプチド、抗体、小分子、天然産物、ペプチドミメティック又は核酸等の任意の適切な試験物質であってもよい。当然のことながら、ハイスループットスクリーニングの一環として試験物質のライブラリーをスクリーニングしてもよい。
【０１１９】
様々な手法を使用して、AR又はERとSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)又はその部分との相互作用に及ぼす試験物質の効果と、試験物質がSrcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)のSH3ドメインに結合するかどうかとを決定することができ、このような技術は、例えば上述したようなものであり、当技術分野で周知である(例えばMigliaccioら(Oncogene 2007、26:6619)及びMigliaccioら(Cancer Research 2005、65(22):10585〜93による)。
【０１２０】
一実施形態において、本方法は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の活性を調節する試験物質を単離する工程を含む。ゆえに、本方法は、(a)AR若しくはER、又はSrcファミリーキナーゼに結合することができるその部分と、(b)Srcファミリーキナーゼ、又はAR若しくはERに結合することができるその部分との相互作用を低減させる試験物質を単離する工程を含む。同様に、本方法は、SrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する試験物質を単離する工程を含む。
【０１２１】
好ましくは、選択される試験物質は、(a)AR若しくはER、又はSrcファミリーキナーゼに結合することができるその部分と(b)Srcファミリーキナーゼ、又はAR若しくはERに結合することができるその部分との相互作用を、試験物質の非存在下における元の結合の少なくとも10%、20%、30%、40%又は50%の割合で、より好ましくは少なくとも60%、70%、80%、90%又は95%の割合で低減させる試験物質である。
【０１２２】
一実施形態において、本方法は、試験物質を、転移性癌(例えば、AR及び/又はERの活性が寄与因子である転移性癌)を予防又は治療する物質であると同定する工程を更に含む。例えば、本方法は、対象の特定の転移性癌に適したアッセイ(例えば転移性癌の動物モデル)で試験物質の有効性を評価する工程を更に含んでいてもよい。例えば、転移性乳癌モデルでその物質の効果を評価する工程を含む方法を使用して、転移性乳癌を予防又は治療する物質を選択することができる。このような状態の適切なモデルは、当技術分野で周知であり、in vitro又はin vivoでありうる。一例では、in vitroの細胞株における転移の1種又は複数のマーカーに及ぼす本物質の効果が評価されてもよく、このようなマーカーは、細胞運動性及び/又はMMP発現等であり、例えば実施例1に更に記載されたようなものである。
【０１２３】
選択された試験物質は、Srcファミリーキナーゼ(例えばSrcキナーゼ)の活性を調節する物質であり、ゆえにそのように使用されうることが認識されることになる。一例では、本物質は、本発明の第1の態様の意義の範囲内におけるSrcファミリーキナーゼとAR又はERとの相互作用を阻害又は予防する物質でありうるか、本発明の第1の態様の意義の範囲内におけるSrcファミリーキナーゼのSH3ドメインに結合する物質でありうる。
【０１２４】
本明細書において説明される方法は、薬物のスクリーニング方法(これは当業者に周知の用語である)であってもよく、このような方法において、試験物質は、薬らしい化合物又は薬らしい化合物の開発のためのリード化合物であってもよいことが理解される。
【０１２５】
用語「薬らしい化合物」は当業者に周知であり、医薬で使用するのに適したようになる、例えば医薬中の活性成分として使用するのに適したようになる可能性があるという特徴を有する化合物の意味を含んでいてもよい。従って、例えば、薬らしい化合物は、有機化学の技術によって合成することができる分子であってもよいし、あまり好ましくないが分子生物学又は生化学の技術によって合成することができる分子であってもよく、好ましくは小分子であり、5000ダルトン未満の小分子であってもよく、更に水溶性であってもよい。薬らしい化合物は、加えて特定の1種又は複数のタンパク質と選択的に相互作用する特徴を示すものでもよいし、更に生物的に利用可能であり、及び/又は標的の細胞膜又は血液脳関門を通過することができるものでもよいが、これらの特徴は必須ではないことが理解される。
【０１２６】
用語「リード化合物」も同様に当業者に周知であり、このような化合物は、それ自身は薬物として使用するのに適してないが(例えば、その目的とする標的に対して弱い効力しかない、その作用において非選択的である、不安定である、溶解性が低い、合成が難しい、或いは生物学的利用率が低いという理由で)より望ましい特徴を有する可能性がある他の化合物を設計するための開始点になり得るという意味を含んでいてもよい。
【０１２７】
一実施形態において、本方法は、in vitroで行われる。in vitroは、細胞非含有アッセイと細胞ベースのアッセイの両方を含む。例えば、本方法は、単離されたヒト細胞系で、又は実験室で容易に取り扱うことができる細胞系(例えば大腸菌(Escherichia coli)及びサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae))で行ってもよい。
【０１２８】
代替の実施形態において、本方法は、in vivoで行われ、例えば特定の転移性癌の動物モデルで行われる。
【０１２９】
本発明は、実質的に本明細書で説明された通りのあらゆる分子、使用、方法又は組成物を提供する。
【０１３０】
ここで以下の図面及び実施例を参照しながら本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】カソデックスが、ヒト線維肉腫HT1080異種移植片の成長を低減することを示す図である。HT1080異種移植片を、方法項に記載されているように、雄ヌードマウスにて確立した。腫瘍を、ビヒクルのみ(エタノール)、又は純粋なアンドロゲンアンタゴニストであるカソデックス(Cx、1μM、Sigma-Aldrich社)を用いて処理した。腫瘍量を、標示された時間に測定した。平均値及びSEMを示す。nは実験数を表す。
【図２】HT1080細胞が、転写的に不活性なARを保持することを示す図である。これらの細胞に曝露したアンドロゲンは、細胞運動性を堅固に高める一方で、ARの核移行を誘発もせず、DNA合成を亢進もしない。図2Aでは、静止期のHT1080細胞を、3416又は3424 ARE-luc構築物を用いて、ヒトAR発現プラスミドの存在下又は非存在下で、トランスフェクトした。これらの手順の詳細は、方法項に記載されている。細胞を、10nM R1881存在下で18時間、非刺激又は刺激の状態においた。ルシフェラーゼ活性をアッセイし、ベータガラクトシダーゼを内部対照として使用して標準化し、誘導倍率として表記した。平均値及びSEMを示す。nは実験数を表す。図2Aの挿入図は、抗AR抗体C-19を用いたHT1080細胞又はNIH3T3細胞の溶解物のウェスタンブロットを示す。図2Bでは、カバーガラス上の静止期のHT1080細胞を、10nM R1881存在下で60分間、非処理又は処理の状態においた。細胞を、ARに対するIF(左側の画像)又はヘキスト(右側の画像)によって分析した。画像は、3回の独立した実験の代表例である。バーは5μmである。図2C及び図2Dでは、NIH3T3細胞及びHT1080細胞を、標示した化合物(R1881及びDHTをどちらも10nMで使用し、血清を20%で使用した)を用いて非処理又は処理の状態においた。図2Cでは、カバーガラス上の細胞のBrdU取込みを分析し、図2のように表記した。図2Dでは、遊走した細胞数を計測し、相対的な増加として表記した。平均値及びSEMを示す。nは実験数を表す。
【図３】HT1080細胞においてEGFによって引き起こされる、S1ペプチドによるAR/Src複合体の阻害、Src活性化及びDNA合成を示す図である。静止期のHT1080細胞を使用した。細胞を、S1又はSsペプチドの非存在下及び存在下(どちらも1nM)で、EGF(100ng/mL、Roche社)を用いて非処理又は10分間処理の状態においた。カソデックス(10nM)を、S1ペプチドとの比較のために使用した。同じ濃度のペプチド及びカソデックスを、実験を通じて使用した。図3Aの上部に、抗EGFR抗体を用いたHT1080細胞の溶解物のウェスタンブロットを示す。チューブリン(tub)を、ロード対照(ロード)として免疫ブロットによって明示した。図3Aの下部では、抗EGFR抗体を用いて溶解物を免疫沈降し、標示されたタンパク質に対する抗体を使用して、免疫複合体内のタンパク質を検出した。図3Bでは、抗Src抗体を用いて溶解物を免疫沈降し、エノラーゼを基質として使用して、免疫複合体のSrc活性をアッセイした。図3Cでは、カバーガラス上の細胞を、標示された化合物と共に18時間非処理又は処理の状態においた。BrdU(100μM、Sigma社)を用いたin vivoパルスの後、BrdU取込みをIFによって解析し、全ての核における%として表記した。平均値及びSEMを示す。nは実験数を表す。
【図４】S1ペプチドが、HT1080細胞において、EGF刺激性遊走及びMMP-9分泌を阻害することを示す図である。静止期のHT1080細胞を使用した。図4Aでは、細胞を、標示された化合物と共に6時間非処理又は処理の状態においた。MMP-9放出を、方法に記載したようにアッセイした。図4Bでは、細胞を、標示された化合物の存在下及び非存在下で、トランスウェルフィルター中で6時間遊走させた。遊走した細胞を、方法項に報じたように染色し、計数した。図4A及び図4Bでは、データを相対的な増加として表記した。平均値及びSEMを示す。nは実験数を表す。図4Cでは、細胞を付傷させ、標示された化合物と共に6時間、非刺激又は刺激の状態においた。位相差画像は、3回の異なる実験の代表例であり、各回を2連で実施した。
【図５】試験中の処理群の体重を示した図である(平均値±SD)。図は、Table 1(表1)に示された元データから作成した。
【図６】屠殺時の体重を示した図である(平均値±SD)。群は、(a)ビヒクル、(b)VAL001 0.04mg/kg、(c)VAL001 0.4mg/kg、(d)VAL001 4mg/kg、(e)VAL001 10mg/kg及び(f)VAL001 20mg/kgである。VAL001群の結果を、一元配置ANOVAを使用して、個別にビヒクル群の結果と比較した。群間に統計的有意差は検出されなかった。図は、Table 2(表2)に示された元データから作成した。
【図７】屠殺時の腫瘍体積を示した図である(平均値±SD)。群は、(a)ビヒクル、(b)VAL001 0.04mg/kg、(c)VAL001 0.4mg/kg、(d)VAL001 4mg/kg、(e)VAL001 10mg/kg及び(f)VAL001 20mg/kgである。VAL001群の結果を、一元配置ANOVAを使用して、個別にビヒクル群の結果と比較した。群間に統計的有意差は検出されなかった。図は、Table 3(表3)に示された元データから作成した。
【図８】リンパ節転移の発生率を示す図である。群は、(a)ビヒクル、(b)VAL001 0.04mg/kg、(c)VAL001 0.4mg/kg、(d)VAL001 4mg/kg、(e)VAL001 10mg/kg及び(f)VAL001 20mg/kgである。VAL001群の結果を、フィッシャーの正確確率検定を使用して、個別にビヒクル群の結果と比較した。ビヒクル群(VAL001 0.04mg/kg p=0.01643及びVAL001 0.4mg/kg p=0.03913)に比較して、VAL001 0.04mg/kg及びVAL001 0.4mg/kgの群では統計的有意に少ない転移であった。図は、Table 4(表4)に示された元データから作成した。
【図９】投与量決定試験におけるマウスの体重(g)を示す図である。
【図１０】投与量決定試験における処置後の病変の増殖(mm2)を示す図である。
【図１１−１】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−２】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−３】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−４】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−５】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−６】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−７】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−８】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−９】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【図１１−１０】種の選択におけるPPPHPHARIKの相同体を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１３２】
アンドロゲン受容体/Src複合体を標的とすることによって、ヒト線維肉腫細胞の侵襲性の表現型は損なわれる
要約
侵襲性の高いヒト線維肉腫HT1080細胞株は、古典的なアンドロゲン受容体(AR)を保持する。純粋な抗アンドロゲン剤であるカソデックスは、免疫抑制マウスにおいてHT1080細胞の異種移植片の成長を阻害するが、このことは、線維肉腫の進行におけるアンドロゲン受容体の役割を明らかに示している。そのような役割をHT1080培養細胞にて精査した。アンドロゲンとは対照的に、EGFは、これらの細胞のDNA合成を堅固に高める。カソデックスは、EGFの分裂促進効果を消失させるが、このことは、EGF-RとARとのクロストークを示している。EGF/ARクロストークの根幹を成す機構を、AR由来の小ペプチドであるS1 (Ac-PPPHPHARIK-NH2、式中、Acはアセチル基である)を使用して解析した。本ペプチドは、ヒト前立腺癌由来のLNCaP細胞を含めた様々な細胞種において、アンドロゲンによって引き起こされるAR/Srcチロシンキナーゼの会合及びSrcの活性化を予防する。
【０１３３】
本研究では、HT1080細胞において、EGFがAR/Srcの会合を誘発し、この複合体のアセンブリ及びその結果として生じるSrcの活性化をS1ペプチドが阻害することが観察された。S1ペプチドはまた、EGFによって刺激されるDNA合成を阻害する。EGFは、HT1080細胞において、細胞遊走並びにマトリックスメタロプロテアーゼ-9(MMP9)の分泌を増加させる。ここでも、本ペプチドはこれらの過程を阻害する。
【０１３４】
本研究は、AR/Src会合に関与するARドメインを標的とすることによって、EGFシグナリングが損なわれることを、ヒト線維肉腫細胞において初めて示している。本ペプチドにより阻害される、EGFによって惹起される過程(DNA合成、運動性及びMMP9分泌)は、互いに協働してHT1080細胞の侵襲性の表現型を高める。ゆえに、AR/Src相互作用は、線維肉腫並びに他の転移性癌における新しい潜在的な治療標的となっている。
【０１３５】
序論
ARは、前立腺癌療法の主要な標的であり、アンドロゲン結合性アンタゴニストによる活性の阻害は、この癌の最もよく使用されている治療アプローチを意味する。そのような療法は、初めは有効であるが、後期のステージではしばしば破綻する。
【０１３６】
臨床研究では、ステロイド受容体(SR)は、ARを含めて、種々の組織学的起源の多数のヒト軟部肉腫において発現していることが報告されている(1)。これまでのところ、ヒト線維肉腫HT1080細胞は、アンドロゲンによって調節される転写が僅かであることから、AR陰性であると考えられている(2)。最近、本発明者らの研究室では、これらの細胞が、転写的に不全の古典的なARを低いレベルで保持し、そのARは、DNA合成の非存在下でアンドロゲンによって誘発される遊走を媒介することが観察された(3)。
【０１３７】
種々の細胞種において、アンドロゲンは、核外周縁部を活性化することによって、非転写機構を介して作用する(4-5)。そのため、シグナリングのエフェクター又はスキャフォールドは、それらに核外ARの部分母集団が直接的に係合する際に、分裂促進的なホルモン性のメッセージを核に移送するか、又は細胞骨格性アクチンを修飾することによって細胞運動性を高めるかのどちらかを行う。
【０１３８】
成長因子(GF)及び同系の受容体は、核外ARに係合して、分裂促進的なシグナリングを移送し(6)、ARによって媒介された分裂促進活性は、ARを発現している癌細胞においてEGFによって刺激されうる(7)。
【０１３９】
本発明者らは、ここに、純粋なアンドロゲンアンタゴニストであるカソデックスが、in vivoでHT1080細胞の成長を阻害することを報告する。この効果を担うと考えられる機構を解析している。今回の実験は、EGFが、HT1080細胞において、AR/Src複合体を介してシグナルを伝達することを明らかに示している。そのようなクロストークは、線維肉腫の進行に極めて重要なHT1080細胞の種々の特性を調節する。
【０１４０】
材料及び方法
細胞培養、構築物、トランスフェクション、トランス活性化アッセイ及びペプチド
HT1080、NIH3T3及びLNCaP細胞を、培養して静止期とし、記載(3)のようにトランスフェクションした。野生型ヒトARをコードするcDNAは、pSG5内にあるものとした(8)。HT1080細胞におけるトランス活性化アッセイは、pTK-TATA-Luc(9)内の3416又は3424構築物を使用して行った(3)。Src-S1ペプチド(S1)及びスクランブルペプチド(Ss)は、合成し、報告(10)のように使用した。
【０１４１】
BrdU取込み、遊走、傷害治癒及びMMP-9アッセイ
BrdU取込み、遊走及び傷害治癒の解析は、記載(3、11)のように行った。MMP-9活性は、蛍光AK411キット(BIOMOL Res. Lab.社)を使用してアッセイした(12、13)。
【０１４２】
免疫蛍光解析
BrdU及びARは、DMBLライカ蛍光顕微鏡(Leica Mi1crosystems; GmbH社、ドイツ)を使用して、IF(3、11、14)によって染色して解析した。
【０１４３】
抗体、免疫沈降、免疫ブロッティング及びSrcキナーゼアッセイ
Srcチロシンキナーゼは、免疫沈降し、検出し、エノラーゼを基質として使用してアッセイした(15)。Src、EGF-R及びチューブリンは、適切な抗体を使用して、細胞溶解物から検出した(7)。ARは、報告(3)のように免疫沈降して検出した。ECLシステム(GE Healthcare社)を使用して、免疫反応性タンパク質を明らかにした。
【０１４４】
マウス異種移植片
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH7.4)中50%(v/v)マトリゲル溶液中のHT1080細胞を、ホルモンプライミングを行わずに、背側後部領域に2.5×106個細胞/雄胸腺欠損マウス(CDマウス、Charles-River社、イタリア)で皮下注射した。動物を無作為に選択し、0.1%エタノールに溶解したカソデックス又はビヒクルのみを用いて、更に4週間処理した。HT1080細胞の異種移植片の腫瘍体積をノギスによって測定し、腫瘍量(mm3)として表記した。各動物の処理については、200μLの0.1%エタノール中1μMカソデックス又は同量のビヒクルのみをマウスに隔日で腹腔内注射した。対照マウスとカソデックス処理マウスとには、体重の差は検出されなかった。
【０１４５】
結果
HT1080細胞は、核内に転位せず(図2及び図4)、かつ合成アンドロゲンであるR1881又はDHTに曝露した時にDNA合成を媒介することもない(図2)、転写的に不全なARを保持する。このことは、NIH3T3マウス胚性線維芽細胞に観察される知見を想起させる(図2、図4及び図16)。しかし、どちらの細胞株も、運動性の増加に伴い、アンドロゲン刺激に応答する(図2及び図4)。
【０１４６】
雄免疫抑制マウスにHT1080異種移植片を確立することによって、ヒト線維肉腫の成長におけるARの役割を検証した。異種移植片の成長を、4週間追跡した(図1)。この時間枠の間に、対照マウスでは腫瘍量は大幅に増加したが、一方で、純粋なアンドロゲンアンタゴニストであるカソデックスを用いて処理したマウスでは、上記の成長が減少した。現在までに、ARを標的とすることによって、ヒト線維肉腫の成長が阻害されることが証明されたのは、これが初めてである。
【０１４７】
アンドロゲンはHT1080細胞のDNA合成を増加させず(図2)、これらの細胞は大量のEGFRを発現することから(図3A)、本発明者らは、カソデックスによる線維肉腫の成長の阻害が、EGFとARとのシグナリング間のクロストークにおける干渉によって引き起こされる可能性があることを仮定した。そのようなクロストークは、EGFに曝露したLNCaP細胞に観察されている(7)。この問題に取り組むために、本発明者らは、HT1080細胞においてEGFによって誘発される様々な生物効果に及ぼす、プロリンリッチペプチド(S1ペプチド)の効果を解析した。S1ペプチドは、377〜386アミノ酸のAR配列に由来するが、このAR配列は、Src-SH3ドメインとのARの会合を担い、かつこの会合について、アンドロゲンに曝露された前立腺癌細胞のLNCaP細胞に観察されたように(10)競合する。HT1080細胞では、EGF処理は、AR及びSrcとのEGFRの会合を誘発する(図3A)。S1ペプチドは、AR/Src会合並びにこのAR/SrcとEGF-Rとの会合を消失させるが、後者の会合は、AR/Src複合体のSrc活性に依存するものと考えられる(7)。このモデルの裏付けとして、S1ペプチドはSrc活性化に干渉する(図3B)。Src活性に対する強力なEGF刺激は、1nMのS1ペプチドによってほぼ完全に消失した。そのような阻害は、10μMのカソデックスを用いた細胞の処理によって観察された阻害に匹敵する。S1ペプチドはまた、EGFによって引き起こされるDNA合成を阻害する(図3C)。S1ペプチドと同じ組成を有するが完全に配列が異なるスクランブルペプチド(Ssペプチド)を、対照として使用した。Ssペプチドは、僅かにEGF/AR/Srcの会合に影響を及ぼし(図3A)、EGFによって刺激された細胞において、Srcの活性化(図3B)又はDNA合成(図3C)を低減しない。これらの結果は、EGFが、HT1080細胞において、EGFR/AR/Srcの会合を介したDNA合成と、Srcの活性化とを引き起こすことを示している。AR/Srcの会合について競合しているS1ペプチドは、EGFの作用を予防する。
【０１４８】
マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の発現及び活性化は、遊走及び侵襲性を付与し、それゆえ腫瘍の進行に極めて重要な役割を果たす(17)。MMP-9は、MMPファミリーのメンバーであり、その調節を研究するためのモデルとして、HT1080細胞が使用されている(18)。EGFは、HT1080細胞からのMMP-9分泌を刺激し、S1ペプチドは、カソデックスのように、この効果を阻害する(図4A)。Ssペプチドは、MMP-9分泌に対し阻害効果を示すが、この効果は、S1ペプチドによって発揮されるよりもはるかに弱い(図4A)。
【０１４９】
最後に、EGFは、HT1080細胞の運動性を高め、この効果は、カソデックス及びS1ペプチドによる程度と同等であり、Ssペプチドによる程度とは同等でなかった(図4B及び図4C)。
【０１５０】
考察
SRを発現する非生殖細胞及びヒト癌細胞の数は増加しつつある。これらの知見は、潜在的な治療上の意義から、ヒトの増殖性疾患におけるSRの役割に対する関心を惹きつける。ヒト結腸癌腫Caco-2細胞は、エストラジオール受容体(ER)アルファを発現し、Srcの活性化及び増殖を伴ってエストラジオールに応答する。抗エストロゲン剤は、これらの効果を阻害する(19)。エストロゲンは、女性が喫煙するタバコの更に有害な作用、並びにヒト非小細胞性肺癌細胞及び正常気管支上皮の初代培養物におけるER(ベータ及びアルファ)の発現によって初めて示唆されたように、肺の発癌に役割を果たす。エストロゲンは、マウスにおいて非小細胞性肺腫瘍株の異種移植片の成長を刺激し、この効果を、純粋な抗エストロゲン剤であるICI 182,780が遮断する(20)。また、ヒトの肺癌の発達におけるエストロゲンの役割の追加的な知見も報告されている(21)。
【０１５１】
本明細書に示した成果では、線維肉腫が進行する間のARの役割及び調節が精査されている。アンドロゲンに対するHT1080培養細胞の分裂促進的な応答がないにも関わらず、カソデックスは、HT1080異種移植細胞の成長を阻害した。このことは、AR依存的な増殖が、ヒト前立腺癌由来のLNCaP細胞に観察されるように(7)、HT1080細胞において、成長因子によって調節される可能性があることを示唆する。これらの細胞では、アンドロゲン又はEGFによって誘発されるSrcのARとの会合が、カソデックス又はAR由来のS1ペプチドにより阻害されることによって、培養細胞中のSrcの活性化及び有糸分裂の誘発が抑制される(7、10)。ERアルファ/Src-SH2ドメインの会合に干渉しているERアルファ由来のペプチド(22)と併せて、S1ペプチドは、SRの非転写性作用を標的とし、かつ転写性作用には影響を及ぼさない状態におく、新しいカテゴリーの受容体アンタゴニストの原型となっている。そのような選択的な阻害は、受容体の転写性作用に依存した正の効果の余地を残すはずであり、そのため患者に更によく忍容されるものであるはずである。
【０１５２】
腫瘍の進行は、MMP産生及び運動性を伴う侵襲性の表現型の獲得を必要とする。遊走及びHT1080細胞からのMMP-9の分泌はまた、EGFによって刺激され、EGFによって刺激されたHT1080細胞において複数の過程を調節する際のSrcの役割の帰結として、S1ペプチドによって阻害される。そのため、AR/Src会合を標的とすることによって、癌の進行に極めて重要な様々な特性が阻害される。ステロイド受容体を発現し、かつステロイド及び/又は成長因子に応答するヒトの癌の数が増えつつあることは、古典的なホルモン依存性癌の療法における進展からの恩恵を受けうる腫瘍の数を高めるはずである。
【実施例２】
【０１５３】
PC-3前立腺癌同所移植モデルにおいて試験ペプチドの5種の用量が腫瘍の成長及び転移に及ぼす影響
要約
本プロジェクトの目的は、試験ペプチドの5種の用量が前立腺腫瘍の成長及びリンパ節転移の発達に及ぼす影響を研究することである。
【０１５４】
6週齢の免疫不全BALB/cヌードマウスを、体重に従って6つの15頭のマウスの群に配分した。PC-3細胞を、マウスの前立腺に同所的に接種した。与薬(皮下)は、研究1日目から開始し、28日目まで毎日続けた。
【０１５５】
試験群:
1.ビヒクルを受ける対照群
2.VAL001ペプチド、0.04mg/kg
3.VAL001ペプチド、0.4mg/kg
4.VAL001ペプチド、4mg/kg
5.VAL001ペプチド、10mg/kg
6.VAL001ペプチド、20mg/kg
【０１５６】
マウスを週に2回秤量し、4週間後にマウスを屠殺した。研究終了時に、全ての動物に肉眼剖検を実施し、肉眼による全ての兆候を記録した。前立腺癌の体積を測定し、前立腺並びに前立腺所属リンパ節を組織学的解析のために採集した。リンパ節内の転移の数を、顕微鏡下で決定した。
【０１５７】
VAL001ペプチドは、より低い2種の用量である0.04mg/kg及び0.4mg/kgで、統計的有意にリンパ節の転移の発生を阻害した。処理群間に体重又は腫瘍体積の統計的有意な差はなかった。
【０１５８】
これらの結果の全体は、VAL001ペプチドが、このPC-3前立腺癌同所性モデルにおいてリンパ節転移への阻害効果を有することを示唆する。
【０１５９】
研究の実施
試験施設
本プロジェクトは、Laboratory of Pharmatest Services Ltd社、イタイネン  ピッカカツ(Itainen Ptkakatu) 4C、20520  トゥルク、フィンランドにて実施された。動物実験は、Biolaboratory of Turku Biovalley社、イタイネン  ピッカカツ  4A、20520  トゥルク、フィンランドにて、動物実験国家委員会の承認下(許諾番号STH332A)で実施した。
【０１６０】
品質保証
本研究は、品質保証システム及び標準作業手順書に従って実施した。全ての作業は、最高位の科学的精度及びノウハウを伴って実施した。初期データに影響を及ぼす可能性がある研究特異的な全ての状態は、試験を通じてモニターした。全ての作業は、各ページに連続的に付番した指定の研究ノートに記録した。研究を通じて、以下の基本的なGLPの原則に従った。
-  全てのデータ及び他の研究ファイル項目は、研究番号と、データの種類を特定するのに必要なあらゆる情報とを用いて、登録時に明確に特定される。全ての項目に署名して、当該登録を行った者が登録の日時を押印する。
-  あらゆるデータの修正、追加又は削除は、変更するための理由、当該変更を行った者の署名、及び当該変更を行った日時を添える。
-  実験の各工程を進める際に、表を準備して、各試験試料、インキュベーションするプレートにおけるその位置、及び適切な解析機器用の試料参照番号について標示する。
-  ファイルノートの包括的な運用記録を維持して、合意済みのプロトコールからのあらゆる逸脱と、データの乖離を精査するために採った工程とを文書に残すようにする(例えばランの失敗、余分の反復の追加等)。
-  元のプロトコールからの逸脱は、最終報告書に詳細に記載するものとし、当該報告書には、元のプロトコールに従ってどのように実験を実施すべきであると考えたか、実験をどのように実施したか、及び何が逸脱の理由であるかを含める。
【０１６１】
試験化合物及びビヒクル
試験ペプチド
1種のペプチド、すなわちVAL001(Ac-PPPHPHARIK-NH2、式中、Acはアセチル基である)を試験に含めた。
【０１６２】
(1)VAL001、分子量=1190g/モル
PBSに希釈することによって、試験ペプチドVAL001から、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1mg/mL、2.5mg/mL及び5mg/mLの投薬懸濁液を調製した。試験ペプチド由来の投薬懸濁液を、1日目から28日目まで1日1回、4mL/kgの容量で皮下に投与し、結果として用量を0.04mg/kg、0.4mg/kg、4mg/kg、10mg/kg及び20mg/kgとした。新しい投薬懸濁液を毎週調製した。
【０１６３】
ビヒクル
ビヒクルをPBSとした。ビヒクルを、1日目から28日目まで1日1回、4mL/kgの容量で皮下に投与した。
【０１６４】
使用した試験系の記載
前立腺癌に罹患した患者では、典型的には、局所前立腺所属リンパ節に転移が発達する。終末ステージのほぼ全ての前立腺癌患者が、転移を有する。原発腫瘍を首尾よく除去することができても、疾患は既にリンパ節に広がっており、そこから更に全身に広がる。
【０１６５】
前立腺癌の微小環境における原発巣への候補癌薬の影響を試験するために、有効に使用することのできる動物モデルを使用した。このモデルにおいて、ヒト前立腺癌細胞を、4〜5週齢の雄BALB/cヌードマウスの前立腺に接種した。このマウス系統は、免疫不全であり、ヒト癌細胞を速やかに成長させ広げることができる。接種後4週間以内に、動物では、大きな腫瘍が前立腺にまで発達し、腸骨及び仙骨の局所リンパ節に転移した。接種後4週間目に動物を屠殺し、腫瘍及び局所リンパ節を伴った前立腺を、さらなる組織形態計測的解析のために採集した。
【０１６６】
本転移モデルは、以下:1)癌細胞の成長、2)血管新生、3)破骨細胞の機能又は分化、の1つ又は複数に影響を与えることが初期研究で示されている候補薬を試験するために、好都合に使用されうる。本モデルはまた、既存薬の新しい適応を見出すために使用され、幾つかの他の適応に有効であることが既に証明されている特許薬に、製薬企業が新しい適応を見出す手段を与えうる。
【０１６７】
方法
動物の取扱い
本研究の生存フェーズは、南フィンランド地域国家行政機構の動物実験委員会、ハメーンリンナ、フィンランドによる動物実験許諾STH332の下で、Pharmatest社によって実施した。生存相には、動物の収容、取扱い、体重の決定、投薬、絶命及び組織試料の採取が含まれる。生存フェーズは、Turku Science Park Ltd社、トゥルク、フィンランドとの提携によって実施した。
【０１６８】
雄のBALB/cヌードマウス(BALB/c OlaHsd-Foxn1nu、オランダのHarlan社より入手)を本研究に使用した。本研究開始時に、動物齢は6〜7週齢であり、体重はおよそ16〜23gであった。マウスは、特定病原体未感染(SPF)のアイソレーターで隔離された動物であった。正式な週齢及び良好な臨床上の健康状態を、本研究のための適格性とした。マウスの順化期間は4日間であった。群の配分は、体重に基づく無作為な手順によって実施した。動物を、耳標を用いて標識した。同所接種のために、イソフルランの吸入を用いて、マウスを麻酔した。同所接種の前及び2日後に、0.1mg/kgのブプレノルフィンの皮下投与によって鎮痛を行った。
【０１６９】
動物のモニタリング
動物を週に2回秤量した。本研究の最後の5日には、動物を毎日観察して、疾患の進行をモニターした。あらゆる臨床上の兆候の発生を、経過観察書式に記録した。必要に応じて鎮痛剤を与えた。
【０１７０】
屠殺、剖検及び試料採集
本研究の終了時に、動物を秤量し、麻酔下で頸椎脱臼により屠殺した。剖検を全ての動物に実施した。肉眼所見を経過観察書式に記録した。腫瘍及びリンパ節のある前立腺から、組織試料を収集して、リンパ節の組織構造及び転移の数を決定した。
【０１７１】
統計解析
統計解析は、R: A Language and Environment for Statistical Computing (version 2.14.2; R Development Core Team, Vienna, Austria)を用いて実施した。屠殺時の体重及び腫瘍体積の平均値及び標準偏差を決定した。分布の正規性及び分散の均一性を、さらなる解析の前に確認した。これらの仮定に反する場合、対数変換又は他の適切な変換(例えば平方根、逆数)を適用した。仮定がそのように又は変換後に満たされる場合には、一元配置ANOVAを使用して、群間で得られた値が統計的に異なるかどうかを決定した(p<0.05)。差が見出された場合には、テューキーのHSD検定を使用して、全群間を2群1組で比較した。上述の変換後でさえ仮定が満たされなかった場合には、非パラメータ性のクラスカル-ウォリス検定と、続いてマン-ホイットニーのU検定とを使用した。
【０１７２】
リンパ節転移の発生率の統計解析は、フィッシャーの正確確率検定を片側検定として使用して行い、この検定では、帰無仮説は、上記の処理が腫瘍の成長を抑制するという仮定を反映した。
【０１７３】
結果
体重、屠殺時の腫瘍体積及びリンパ節転移に関する結果を図5〜8に示す。以下の結論を引き出すことができる。
-  処理群間で体重又は腫瘍体積の統計的有意差はなかった。
-  VAL001ペプチドは、より低い2種の用量である0.04mg/kg及び0.4mg/kgで、統計的に有意にリンパ節転移の発生を阻害する。
【０１７４】
これらの結果の全体は、VAL001ペプチドが、このPC-3前立腺癌同所性モデルにおいてリンパ節転移への阻害効果を有することを示唆する。
【０１７５】
【表１Ａ】
0006456922.tif 000002
【０１７６】
【表１Ｂ】
0006456922.tif 000003
【０１７７】
【表２】
0006456922.tif 000004
【０１７８】
【表３】
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【０１７９】
【表４Ａ】
0006456922.tif 000006
【０１８０】
【表４Ｂ】
0006456922.tif 000007
【実施例３】
【０１８１】
ペプチドAc-PPPHPHARIK-NH2は、生殖能力に影響を与えることなく子宮内膜症に対して治療効果を示す
要約
子宮内膜症の治療において、ペプチドAc-PPPHPHARIK-NH2(Table 5〜8(表5〜8)ではValiRx1とも表記される)が生殖能力を低下させることなく有効であることを実証する2つの研究が行われた。
【０１８２】
結果
第一の研究において、新規のin vivo子宮内膜症モデルにおいて、5匹の対照動物で合計4回の処置を行った(Research Horizons、University of Cambridge、2009年版8、GB 0715635.9)。K-rasV12/Ah-CreトランスジェニックマウスをRosa26Rマウスと交雑しKrasV12+/-/Ah-Cre+/-/ROSA26R-LacZ+/-トランスジェニックマウスを作製した。F1世代を同系交配して、F2のK-rasV12+/-/Ah-Cre+/+/ROSA26R-LacZ+/+トランスジェニックマウスを作製した。導入遺伝子の存在を、K-ras、Cre、及びRosa26R-LacZの遺伝子特異的なプライマーを使用したPCRによって決定した。前もってホルモン等で処置したドナー動物から組織を回収し、野生型動物に分配し、次いで薬物又はビヒクルを21日間注射した。
【０１８３】
合計4匹の処置済みの動物のうち3匹は処置後に病変が完全になくなり、1匹は応答しなかったことが示された。合計5匹の動物の対照群のうち1匹において病変が発達しなかった。
【０１８４】
健康なマウスの繁殖に対するペプチドの効果と、同じ動物に再移植された子宮から得られた自家移植病変に対する有効性とを評価するために、第二の研究を設計した(Beckerら、AM J Pathol 178(4):1782〜91)。
【０１８５】
発情周期
8〜10週齢の未経産の雌C57BL6マウスを1週間順化させた。動物10匹の群は、実験前の3日間、10ngのペプチドを皮下注射することにより処置され、対照10匹の群は、ビヒクルのみが投与された。膣塗抹標本を10日間毎日採取した。全ての場合で正常塗抹標本を得た。
【０１８６】
交配(雌の処置群)
8〜10週齢の未経産の雌C57BL6マウスを1週間順化させた。雌動物10匹の群は、実験前の3日間、10ngのペプチドを皮下注射することにより処置され、動物10匹の対照群は、ビヒクルのみで処置された。
【０１８７】
5匹の雄C57BL6動物を導入し、雌を粘液栓について毎日チェックした(午前9時前に)。粘液栓が記録されたら、雌を以下について評価した:
a)妊娠可能な期間の長さ(日)
b)子孫の数
c)子孫の奇形。
【０１８８】
全ての動物が正常な同腹子を出産した(ただし投薬を受けた群のうち1つを除く)
【０１８９】
交配(雄の処置群)
8〜10週齢の未経産のC57BL6マウスを1週間順化させた。雄動物5匹の群は、実験前の3日間、10ngのペプチドを皮下注射することにより処置され、動物5匹の対照群は、ビヒクルのみが投与された(10ngを1日1回皮下投与)。
【０１９０】
各群に10匹の未処置の雌C57BL6動物を導入し、雌を粘液栓について毎日チェックした(午前9時前に)。粘液栓が記録されたら、雌を以下について評価した:
a)妊娠可能な期間の長さ(日)
b)子孫の数
c)子孫の奇形。
【０１９１】
上述したように全ての動物が正常な同腹子を出産した。
【０１９２】
交配(処置済みの雌から2世代)
投薬を受けた雌からの子孫を交配し、生殖能力についてチェックし、遺伝する可能性のある効果を決定した。上述したように栓形成について動物を評価したところ、異常は認められなかった。
【０１９３】
投与量決定のための予防的研究
順化1週間後に、8〜10週齢の未経産の雌C57BL6マウスにそれぞれドナー動物からの子宮組織栓(6×)を移植した。動物5匹の3つの群は、ARPペプチドを1ng、10ng又は100ngのペプチド量で皮下注射することによる1日1回の投与がすぐに開始され、動物5匹の対照群は、ビヒクルのみで処置された。投薬を受けた群における処置後の病変の増殖は、対照群と比較して有意に抑制された(図10を参照)。
【０１９４】
このモデルは、優れた病変を構築した(97.67%〜100%、Table 8(表8))。病変量の減少(7.18mm2に対して、6.02mm2、5.53mm2、及び4.52mm2、Table 6(表6))、及び増殖の減少(7.18mm2に対して、6.23mm2、5.72mm2、及び4.52、Table 7(表7))。
【０１９５】
用量に関しては、外科手術前の2〜3日間エストロゲンを1回注射することにより発情周期を同調させるという選択肢もある。
【０１９６】
図9及び図10並びにTable 5〜8(表5〜8)に上述の実験から得られたデータを記載する。
【０１９７】
【表５】
0006456922.tif 000008
【０１９８】
【表６】
0006456922.tif 000009
【０１９９】
【表７】
0006456922.tif 000010
【０２００】
【表８】
0006456922.tif 000011
【実施例４】
【０２０１】
アンドロゲン受容体に関連のあるSrcシグナリングをVAL201により阻害することによって、同所性マウスモデルにおける前立腺癌転移が阻害される
VAL201(Ac-PPPHPHARIK-NH2、式中、Acはアセチル基である)は、アンドロゲン受容体(AR)及びエストロゲン受容体(ER)に関連のあるsrcシグナリングの特異的な阻害剤である。VAL201によるsrcの阻害は、アンドロゲンの結合後に起こり、所望の受容体依存的な転写活性を遮断することなく、成長を阻害することを可能とし、それによって、アンドロゲン遮断療法に付随する大多数の副作用を除外する。本発明者らは、in vitroにおけるER陽性のヒト前立腺癌細胞株PC-3の細胞増殖と、in vivoにおける同所性異種移植モデルでの成長及び転移とに及ぼす、Val201の効果を検討した。増殖効果を、100pM、1nM、10nM、100nM及び1μMの濃度のVAL201について、3、5、7及び9日目のWST-1値を測定することによって検討した。ビヒクル及び基準化合物として1μMのゲムシタビンを用いた群を本研究に含めた。異種移植試験を、6〜7週齢の免疫不全BALB/cヌードマウスを用いて実施し、このマウスは、体重に従って6つの群に配分し(n=15/群)、1群にはビヒクルを与え、他の群にはVAL201を0.04、0.4、4、10及び20mg/kgの用量で与えた。マトリゲル中のPC-3細胞を、前立腺内に同所的に接種した。皮下投与を1日目に開始し、28日間毎日続けた。週に2回、マウスを秤量した。同所的な腫瘍をノギスで測定し、屠殺時に前立腺及び局所リンパ節を採取した。リンパ節での転移を、HE染色したパラフィン切片から決定した。VAL201は、PC-3細胞の増殖について、100pMを超える全ての用量で統計的に有意な用量依存的な阻害を示した。異種移植試験では、VAL201は、体重に何ら効果がなかった。同所的な腫瘍の成長に及ぼす統計的に有意な効果は、0.4mg/kgの用量を用いた腫瘍体積に35%の低下があったことを除いて観察されなかった。しかし、0.04及び0.4mg/kgの用量のVAL201は、リンパ節転移の発達に50%の有意な阻害を示した。結論として、VAL201は、in vitroにおけるPC-3細胞の増殖と、異種移植モデルにおけるリンパ節転移の発達とを阻害し、このことは、アンドロゲン遮断に関連のある有害作用を生じることなく、前立腺癌の成長と転移とを阻害しうる潜在性を実証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【配列表】
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