(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た試料中の、プロテインホスファターゼ２レギュレイトリーサブユニットＡα遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の１又は２以上の変異の存在を検出することを特徴とする、被験者における消化管間質腫瘍の予後又は化学療法抵抗性に関する遺伝子変異検出方法であって、
前記変異が、次の（１）〜（２６）の変異から選ばれる１又は２以上である遺伝子検出方法。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
【請求項２】
プロテインホスファターゼ２レギュレイトリーサブユニットＡα遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を含む請求項１記載の方法であって、
プロテインホスファターゼ２レギュレイトリーサブユニットＡα遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いる方法。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
【請求項３】
プロテインホスファターゼ２レギュレイトリーサブユニットＡα遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域にストリンジェント条件でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を含む、請求項１記載の方法。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
【請求項４】
プロテインホスファターゼ２レギュレイトリーサブユニットＡα遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域を増幅できるように設計したプライマーセット又は当該領域にストリンジェント条件でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを含有する消化管間質腫瘍の予後又は化学療法抵抗性の診断薬。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化管間質腫瘍（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｔｕｍｏｒ：ＧＩＳＴ）の予後又は化学療法抵抗性の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
消化管に発生する間葉系腫瘍の中で最も頻度の高い腫瘍であるＧＩＳＴは、その約８５％にｃ−ｋｉｔ又はＰＤＧＦＲα遺伝子変異を有し、その変異によりｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎであるＴｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＫＲ）がリガンド非依存性に恒常的に自己リン酸化され、腫瘍化することが分かっている（非特許文献１）。また、ＴＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるイマニチブの投与に伴う耐性機構に、ｃ−ｋｉｔやＰＤＧＦＲαの二次性の遺伝子変異が関わっていることが示されている（非特許文献２）。ｃ−ｋｉｔやＰＤＧＦＲα遺伝子変異はＧＩＳＴ腫瘍発生には関与しているものの、進展や転移には直接の関与が明らかではないとされているが、ＴＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒの投与による二次性の遺伝子変化が治療抵抗性に関与する（非特許文献１，２）など、その治療抵抗性への関与は明らかであり、その克服も急務となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Liegl-Atzwanger B, Fletcher JA, Fletcher CD. Gastrointestinal stromal tumors. Virchows Arch. 2010;456:111-27.
【非特許文献２】Lee JH, Kim Y, Choi JW, Kim YS. Correlation of imatinib resistance with the mutational status of KIT and PDGFRA genes in gastrointestinal stromal tumors: a meta-analysis. J Gastrointestin Liver Dis. 2013;22:413-8.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記のように、ＧＩＳＴの初期診断方法はある程度確立しているものの、その予後（進展や転移）及び治療抵抗性については何ら診断材料が示されていない。
従って、本発明の課題は、ＧＩＳＴの予後及び治療抵抗性を評価できる新たな手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者は、子宮体癌や卵巣癌などの他癌種において報告されているプロテインホスファターゼ２レギュレイトリーサブユニットＡα（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ２，ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ａ，ａｌｐｈａ：ＰＰＰ２Ｒ１Ａ）遺伝子の変異に着目して、ＧＩＳＴにおけるＰＰＰ２Ｒ１Ａ変異の有無と予後、治療抵抗性を検討した。その結果、ＰＰＰ２Ｒ１Ａのエクリン５及びエクソン６中の変異の存在が、ＧＩＳＴの予後、治療抵抗性と相関することを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔６〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕被験者におけるＧＩＳＴの予後又は化学療法抵抗性を診断する目的で、被験者から得た試料中の、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の１又は２以上の変異の存在を検出する方法。
〔２〕前記変異が、次の（１）〜（２６）の変異から選ばれる１又は２以上である〔１〕記載の方法。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
〔３〕ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を含む〔１〕記載の方法。
〔４〕次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いる〔３〕記載の方法。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
〔５〕ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域にストリンジェント条件でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を含む、〔１〕記載の方法。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
〔６〕ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域を増幅できるように設計したプライマーセット又は当該領域にストリンジェント条件でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを含有するＧＩＳＴの予後又は化学療法抵抗性の診断薬。
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＧＩＳＴの予後（進展、転移等）及び化学療法抵抗性が診断できることから、新たな治療指針の策定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】無病生存期間とＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子変異の有無との関係を示す。ｐ＝０．０２１は危険率を示す。
【図２】生存期間とＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子変異の有無との関係を示す。ｐ＝０．００２は危険率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の検出方法は、被験者におけるＧＩＳＴの予後又は化学療法抵抗性を診断する目的で、被験者から得た試料中のＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の１又は２以上の変異の有無を検出する。
【００１１】
被験者は、ＧＩＳＴ患者である。ＧＩＳＴ患者のうち、外科的治療及び／又は化学療法を受けた又は受けている患者であるのが好ましいが、診断目的で採取される生検検体のみを有する患者に対しても有効である。
【００１２】
被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、採取された細胞組織、体液（血液、口腔粘液等）、生検された試料等を用いるが、好適には生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることもできる。特に、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
【００１３】
検出対象となる変異は、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５及び／又はエクソン６中の１又は２以上の変異である。当該ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５又はエクソン６中の変異と、ＧＩＳＴの予後や治療抵抗性との関係は、従来全く知られていない。
【００１４】
当該エクソン５及び／又はエクソン６中の変異としては、次の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上が挙げられる。
【００１５】
（１）エクソン５の１７３番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（２）エクソン５の１８４番目のＡｌａがＡｓｐへの変異
（３）エクソン５の１９３番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（４）エクソン５の１９４番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
（５）エクソン５の１９５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（６）エクソン５の１９７番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（７）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＡｌａへの変異
（８）エクソン５の２０１番目のＶａｌがＩｌｅへの変異
（９）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＶａｌへの変異
（10）エクソン５の２０４番目のＧｌｕがＧｌｙへの変異
（11）エクソン５の２０６番目のＩｌｅがＴｈｒへの変異
（12）エクソン５の２０８番目のＭｅｔがＴｈｒへの変異
（13）エクソン５の２０９番目のＰｈｅがＬｅｕへの変異
（14）エクソン５の２１１番目のＡｓｎがＡｓｐへの変異
（15）エクソン５の２１４番目のＳｅｒがＰｒｏへの変異
（16）エクソン６の２２５番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（17）エクソン６の２３２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（18）エクソン６の２３３番目のＧｌｎがＨｉｓへの変異
（19）エクソン６の２３４番目のＬｅｕがＰｒｏへの変異
（20）エクソン６の２３８番目のＧｌｕがＬｙｓへの変異
（21）エクソン６の２４４番目のＶａｌがＭｅｔへの変異
（22）エクソン６の２４８番目のＬｅｕがＧｌｎへの変異
（23）エクソン６の２５２番目のＡｌａがＴｈｒへの変異
（24）エクソン６の２５７番目のＴｒｐが終止コドンへの変異
（25）エクソン６の２６１番目のＴｙｒがＨｉｓへの変異
（26）エクソン６の２６６番目のＬｙｓがＡｒｇへの変異
【００１６】
本発明においては、検出対象変異を有するタンパク質又は検出対象変異を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれを検出対象としてもよい。
【００１７】
本発明においてポリヌクレオチドの変異の存在を検出する場合、被験者から得た試料のゲノムＤＮＡ中の変異ポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、変異ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施できる。ゲノムＤＮＡの抽出、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は当該分野で公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。
【００１８】
この検出工程は、当該分野で公知の遺伝子変異解析方法を使用することができる。例えば、被験者から得た試料由来の核酸（例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡ等）に対して公知の核酸増幅方法（ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ’ｓ ＴＭＡ ｓｙｓｔｅｍ）等）を用いて、変異ポリヌクレオチド中の検出対象変異に対応する部分を含む領域を増幅させる工程を含み、増幅後、この増幅産物について配列決定を行うことによって変異の有無を確認することができる。このような配列決定法としては、ダイレクトシーケンス法等の当該分野で公知の方法を使用することができる。
【００１９】
核酸増幅方法に用いられるプライマーは、変異ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるものであれば、特には限定されず、変異ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。プライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用してできる。また、増幅産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００２０】
核酸増幅方法を用いる別の公知の遺伝子変異解析方法として、ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型解析法）、ＴａｑＭａｎ法、アレル特異的プライマーＰＣＲ（ＡＳＰ−ＰＣＲ）法、ＳＳＣＰ法等のＰＣＲに基づく方法も使用可能である。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲにより検出対象変異領域を増幅した後、変異に基づき制限酵素認識部位に変化が生じる場合に、その制限酵素処理後の核酸断片の差異を電気泳動により解析する。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端に蛍光物質（ＦＡＭ、ＶＩＣ等）、３’末端にクエンチャー（消光）物質で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に添加する方法である。本方法では、検出対象変異領域に対してＴａｑＭａｎプローブをハイブリダイズさせ、プライマーからのＰＣＲ反応を行うと、伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが分解され、それにより蛍光物質がプローブより遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光物質から蛍光が発し、これにより目的の変異が検出される。ＡＳＰ−ＰＣＲ法は、３’末端に検出対象変異部位を有するようにプライマーを設計し、ＰＣＲによる核酸増幅の有無を検出する方法である。ＳＳＣＰ法では、検出対象変異領域をＰＣＲ増幅した後、一本鎖ＤＮＡに分離し、これを非変性ゲルでの電気泳動により分離する。変異によりＤＮＡの高次構造が変化し、これがゲル上の移動度の差異を反映する。
【００２１】
また別の遺伝子変異解析方法として、プローブハイブリダイゼーションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＤＮＡチップ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、融解曲線解析法等が挙げられる。ＤＮＡチップ法では、検出対象変異領域を含むＤＮＡを基板上に配置し、被験者由来の核酸をＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無を確認する。Ｉｎｖａｄｅｒ法では、検出対象変異部位の前後にハイブリダイズする２種の核酸（Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ及びシグナルプローブ）を被験者由来の核酸に反応させた後、形成されるＤＮＡの三重鎖構造を認識するＣｌｅｖａｓｅ酵素を作用させ、シグナルプローブ中のＦｌａｐを遊離させる。次いで、Ｆｌａｐが検出用ＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅとハイブリダイズし、これに同酵素が再度作用し、ＦＲＥＴ Ｐｒｏｂｅから遊離された蛍光物質の蛍光を検出する。融解曲線解析法は、検出対象変異領域に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、温度上昇に伴う蛍光の変化を測定して融解曲線を作成する。これにより、変異の有無に伴う融解温度の変化を確認する。
【００２２】
また別の遺伝子変異解析方法として、プライマーエクステンションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、検出対象変異部位に隣接するプライマーと蛍光標識したｄｄＮＴＰを用い、プライマーから一塩基のみを伸長させて取り込まれた塩基を検出する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、プライマー伸長反応において、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、ポリメラーゼの反応によりｄＮＴＰが取り込まれるとピロリン酸が生じる。生じたピロリン酸をルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光ピークパターンから塩基配列を決定する。
【００２３】
当業者であれば、使用する遺伝子変異解析方法に基づいて、使用されるプライマー及びプローブを適宜設計することができ、特に限定されることはないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【００２４】
本発明により、前記の変異の１又は２以上が検出された場合、当該被験者の予後が悪い、及び／又は化学療法抵抗性があると診断できる。
【００２５】
本発明に用いるプライマーセットは、前記エクソン５及び／又はエクソン６の変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは、変異ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
【００２６】
好ましくは、本発明のプライマーセットは、前記の（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上の変異を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。
【００２７】
本発明に用いるプローブは、前記のエクソン５及び／又はエクソン６の変異領域にハイブリダイズすることができるように設計したプローブである。本発明のプローブは、変異ポリヌクレオチド又はその相補鎖中の検出対象変異領域にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
【００２８】
好ましくは、本発明のプローブは、前記（１）〜（２６）から選ばれる１又は２以上を含む領域にハイブリダイズするように設計される。
【００２９】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００３０】
本発明のプライマー及びプローブは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００３１】
本発明のプライマーセット及びプローブは、例えば、化学合成法によって当業者に容易に製造することができ、また、検出方法に応じて、蛍光標識等で標識化してもよい。
【００３２】
本発明の診断薬は、ＧＩＳＴの予後又は化学療法抵抗性の診断薬であり、前記のプライマーセット又はプローブの少なくとも１つを含む。
【実施例】
【００３３】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００３４】
実施例１
（１）ＧＩＳＴ患者由来のホルマリン固定パラフィン包埋検体より腫瘍部のゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子のエクソン５、エクソン６について、エクソン５は２種類、エクソン６は１種類のプライマーを用いてＰＣＲを施行し、両方向性のダイレクトシークエンス法で配列を確定し解析した。ＰＣＲは、９４℃２分後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒を４０サイクル、その後７２℃２分で行った。
【００３５】
用いたプライマーセットを以下に示す。
（１）PPP2R1A exon5 F1/R1（Product size: 219bp）
F:5’-AAAACCTGGACCCACACAAC-3’（配列番号１）
R:5’-TTGGAGAACATGGGGATGAT-3’（配列番号２）
（２）PPP2R1A exon5 F1/R1（Product size: 165bp）
F: 5’-AAAACCTGGACCCACACAAC-3’（配列番号３）
R: 5’-TTGGAGAACATGGGGATGAT-3’（配列番号４）
（３）PPP2R1A exon6 F1/R1（Product size: 219bp）
F: 5’-CTCTCCTCTCCCTAGGACTCG-3’（配列番号５）
R: 5’-GTGTCAGTGTCCCCACCAGT-3’ （配列番号６）
【００３６】
（１）のプライマーセットのＰＣＲ産物を配列番号７に、（２）のプライマーセットのＰＣＲ産物を配列番号８に、（３）のプライマーセットのＰＣＲ産物を配列番号９にそれぞれ示す。
【００３７】
（２）その結果、ＧＩＳＴ患者９６症例のうち、１７症例に表１に記載の変異が検出された。
【００３８】
【表１】
0006472075.tif 000002
【００３９】
遺伝子変異のあった１７症例のうち、１個の変異を有する症例は１０例、変異を複数有する症例が７例あり、そのうち３個変異を有する症例が３症例、２個の症例が４例であった。
【００４０】
９６症例の臨床経過より無病生存期間、生存期間との相関を統計解析したところ、変異陽性症例は、１７症例（１７．７％）であり、無病生存期間はｐ＝０．０２１＜０．０５、生存期間はｐ＝０．００２＜０．０１であった（図１、図２）。
この結果より、ＧＩＳＴ患者におけるＰＰＰ２Ｒ１Ａ遺伝子中のエクソン５及びエクソン６中のいずれか１個以上の変異がある症例は、予後が悪いことが明らかとなり、当該変異の検出はＧＩＳＴの予後の診断に有用であることが判明した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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