(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細分化された哺乳動物の臍帯組織、胎盤組織または卵膜からの水性媒体抽出物を有効成分として含有する、異常な間葉系幹細胞の賦活化剤であって、前記異常な間葉系幹細胞は、正常な間葉系幹細胞により治療することができる疾患に対する治療効果を失った、または該疾患に対する治療効果が正常な間葉系幹細胞と比べて低減している間葉系幹細胞である、前記賦活化剤。
【請求項２】
前記抽出物が、前記哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まない、請求項１に記載の賦活化剤。
【請求項３】
前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の賦活化剤。
【請求項４】
前記異常な間葉系幹細胞が、疾患を有する対象から分離されたものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の賦活化剤。
【請求項５】
前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、請求項４に記載の賦活化剤。
【請求項６】
前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、請求項４に記載の賦活化剤。
【請求項７】
対象から分離された異常な間葉系幹細胞を、細分化された哺乳動物の臍帯組織、胎盤組織または卵膜からの水性媒体抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で処理する工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法であって、前記異常な間葉系幹細胞は、正常な間葉系幹細胞により治療することができる疾患に対する治療効果を失った、または該疾患に対する治療効果が正常な間葉系幹細胞と比べて低減している間葉系幹細胞である、前記製造方法。
【請求項８】
前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項７に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項９】
前記対象が疾患を有する対象である、請求項７または８に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項１０】
前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、請求項９に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、請求項９に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞の賦活化剤、該賦活化剤により賦活化された間葉系幹細胞およびその製造方法、ならびに賦活化された間葉系幹細胞を含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の患者数は世界的に増加の一途を辿っており、糖尿病がもたらす慢性的な高血糖により引き起こされる様々な合併症は、患者のＱＯＬや生命をおびやかす、重大な問題となっている。【０００３】
糖尿病の三大合併症と呼ばれる糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害はいずれも、毛細血管を中心とした細い血管に起こる病的変化である細小血管障害により臓器が障害されて発症する。これらの合併症は、食事療法や薬物療法などで適切に血糖をコントロールすることによって、ある程度防ぐことが可能であるが、一方で合併症が重症化した場合は、根本的な治療法は存在しない。【０００４】
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、以下ＭＳＣともいう）は、間葉系細胞のみならず、胚葉を超えた多様な細胞への分化が可能な細胞であり、組織発生や修復・再生を制御する能力を持つことが知られている。【０００５】
間葉系幹細胞は、単離培養が容易かつ増殖力が旺盛で、短期間で移植可能な細胞数を確保できること、免疫拒絶のない自家移植が可能で、倫理的問題も少ないこと、低免疫原性により前処置を要せず同種移植が現実的であることから、理想的な細胞移植療法の材料として、多様な疾患に対する治療応用の検討が進められている。【０００６】
例えば、上述の糖尿病およびその合併症（非特許文献１および２）のほか、脳・心血管疾患（特許文献１）、自己免疫疾患（非特許文献３）、多発性硬化症の実験的自己免疫脳脊髄炎モデル（非特許文献４）、炎症性疾患（肺線維症モデルについて非特許文献５、炎症性腸疾患について非特許文献６）などの疾患において、間葉系幹細胞の治療効果が確認されている。【０００７】
疾患の治療に用いる場合、一定の品質を保持した間葉系幹細胞を、迅速かつ大量に用意する必要がある。ドナーから採取した間葉系幹細胞を生体外で増殖させるため、増殖促進物質や培養基材などの様々な検討が行われており、例えば特許文献２においては、臍帯抽出物が無血清培地での幹細胞培養の際に血清代替材として使用可能であることが開示されている。また、細胞の品質に関しては、例えば特許文献３において、継代培養時の間葉系幹細胞の老化を抑制するための細胞増殖培地が開示されている。【０００８】
しかしながら、特許文献２に開示された臍帯抽出物は血清代替材に過ぎず、また特許文献３は生体外増殖において間葉系幹細胞の品質を維持または劣化の度合を抑えることを目的としたものであって、採取時点で治療用途に適さない、いわば低品質な間葉系幹細胞の品質を向上または改変するものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／００７１７６号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１３／００９１００号パンフレット
【特許文献３】特開２００６−３２５４４４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｅｚｑｕｅｒ，Ｆ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００８；１４（６）：６３１−４０
【非特許文献２】Ｌｅｅ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００６；１０３（４６）：１７４３８−４３
【非特許文献３】Ｄｊｏｕａｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，２００５；５２（５）：１５９５−１６０３
【非特許文献４】Ｚａｐｐｉａ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０６：１７５５−１７６１
【非特許文献５】Ｏｒｔｉｚ，Ａ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００３；１００（１４）：８４０７−８４１１
【非特許文献６】Ｔａｎａｋａ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１１；４６：１４３−１５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、糖尿病や関節リウマチを発症した対象から採取した間葉系幹細胞は、健常対象由来の間葉系幹細胞と比べて、糖尿病およびその合併症や関節リウマチに対する治療効果が劣っており、むしろそれら疾患を増悪する効果をも有することを見出した。【００１２】
このことは、糖尿病や関節リウマチを発症し、特に重症化した後に、その対象から間葉系幹細胞を採取して自家細胞移植療法を行っても、その効果は期待できないことを意味する。したがって、有効な自家細胞移植療法を行うには、発症前または間葉系幹細胞が異常化して治療効果を失う前に、自己の間葉系幹細胞を予め採取しておく必要があることになる。しかしながら、間葉系幹細胞の採取は侵襲的であり、健常人にとって身体的にも経済的にも大きな負担となる。また、糖尿病のように初期の自覚症状がほとんどなく進行する疾患の場合、診断時には既に間葉系幹細胞が異常化しているため、前述の理由から、自家細胞移植療法が適用できないおそれがある。【００１３】
したがって本発明は、このように治療効果が喪失もしくは低減した、またはむしろ疾患増悪効果を持つ異常な間葉系幹細胞を、細胞移植療法に適した状態へと賦活化させることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物が、異常な間葉系幹細胞を賦活化させることを見出し、下記の各発明を完成させた。
（１）哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する、異常な間葉系幹細胞の賦活化剤。
（２）胎児付属物が臍帯組織、胎盤組織または卵膜である、（１）に記載の賦活化剤。
（３）前記抽出物が、前記哺乳動物由来の増殖能を有する細胞を含まない、（１）または（２）に記載の賦活化剤。
（４）前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の賦活化剤。
（５）前記異常な間葉系幹細胞が、疾患を有する対象から分離されたものである、（１）から（４）のいずれか一項に記載の賦活化剤。
（６）前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、（５）に記載の賦活化剤。
（７）前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、（５）に記載の賦活化剤。
（８）対象から分離された異常な間葉系幹細胞を、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で処理する工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法。
（９）前記異常な間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、（８）に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
（１０）前記対象が疾患を有する対象である、（８）または（９）に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
（１１）前記疾患が、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、（１０）に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
（１２）前記疾患が糖尿病または関節リウマチである、（１０）に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
（１３）（８）から（１２）のいずれか一項に記載の方法により製造された、疾患治療および／または予防用の間葉系幹細胞。
（１４）前記疾患が糖尿病もしくはその合併症、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症である、（１３）に記載の間葉系幹細胞。
（１５）前記疾患が糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害または関節リウマチである、（１３）に記載の間葉系幹細胞。
（１６）（１３）から（１５）のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞および／またはその培養物を含む、疾患治療および／または予防用の医薬。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、対象から採取された異常な間葉系幹細胞を、細胞移植療法に適した状態へと賦活化させることができる。これにより、自己の間葉系幹細胞が異常化したために自家細胞移植療法が不適であった患者に対し、自家細胞移植療法を適用することが可能になる。また、本発明の賦活化剤は、胎児付属物ドナーである哺乳動物に由来する、増殖能を有する細胞を含まない。したがって、賦活化処理後のドナー由来細胞の除去は不要であり、余分な細胞加工工程を伴わないという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】胎児付属物からの抽出物の一例である臍帯組織抽出物（ＷＪ）の位相差顕微鏡観察像（Ａ）および電子顕微鏡観察像（Ｂ）である。
【図２】臍帯組織抽出物中の増殖因子含有量（Ａ）、ヒアルロン酸含有量（Ｂ）およびＬ−グルタミン酸含有量（Ｃ）を示すグラフである。
【図３】臍帯組織抽出物の粘度を示すグラフである。
【図４】臍帯組織抽出物中のエクソソームの電子顕微鏡像（Ａ）、抗ＣＤ９抗体および抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタンブロット（Ｂ）、および抗ＣＤ９抗体を用いて測定したエクソソーム含有量を示すグラフ（Ｃ）である。図４Ｂの＃１〜＃６は、それぞれロットの異なる６つの臍帯組織抽出物由来のエクソソーム分画に相当する。
【図５】ロットの異なる臍帯組織抽出物の培養像を示す図である。
【図６】臍帯組織抽出物で賦活化処理を行ったストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導Ｉ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞（ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋））、および賦活化処理を行っていないＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞（ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−））のＭＴＴアッセイ結果を示すグラフである。
【図７】正常ラットの間葉系幹細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ）、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の位相差顕微鏡観察像である。
【図８】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の電子顕微鏡観察像（弱拡大）である。
【図９】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の電子顕微鏡観察像（強拡大）である。
【図１０】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）のＫｉ６７染色結果を示す。上段は蛍光顕微鏡観察像であり、下段はＤＡＰＩ陽性細胞およびＫｉ６７陽性細胞の数から算出される一視野あたりの全細胞数およびＫｉ６７陽性細胞の割合を示すグラフである。
【図１１】ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）におけるＥＲＫ１／２の活性化を示すウエスタンブロットである。レーン１はＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）、レーン２〜８はロットの異なる７つの臍帯組織抽出物により賦活化処理を行ったＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）に相当する。
【図１２】ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）における小胞体ストレス関連タンパク質の発現を示すウエスタンブロットである。レーン１はＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）、レーン２〜６はロットの異なる５つの臍帯組織抽出物により賦活化処理を行ったＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）に相当する。
【図１３】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）における増殖因子、分化関連因子およびサイトカイン・ケモカインの遺伝子発現量の比を示すグラフである。斜線の棒グラフはＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）における遺伝子発現量／Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣにおける遺伝子発現量を、黒色の棒グラフはＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）における遺伝子発現量／ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）における遺伝子発現量を表す。
【図１４】ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の脂肪細胞への分化を示す明視野顕微鏡観察像である。
【図１５】ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の表面抗原の発現を解析したフローサイトメトリー結果を示す図である。破線はアイソタイプコントロール、実線は標的抗体に相当する。
【図１６】臍帯組織抽出物で賦活化処理を行ったＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）および位相差顕微鏡観察像（Ｂ）である。Ｂの各写真の上の文字は、賦活化処理における臍帯組織抽出物の添加濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図１７】臍帯組織抽出物で賦活化処理を行ったＯＬＥＴＦ  ＩＩ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）および位相差顕微鏡観察像（Ｂ）である。Ｂの各写真の上の文字は、賦活化処理における臍帯組織抽出物の添加濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図１８】ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加の有無および臍帯組織抽出物の添加濃度を変えて賦活化処理を行ったＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）ならびにＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質の発現を解析したウエスタンブロット（Ｃ）である。Ｂの各写真の上の文字は、賦活化処理における臍帯組織抽出物の添加濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図１９】ＦＢＳ添加の有無および臍帯組織抽出物の添加濃度を変えて賦活化処理を行ったＯＬＥＴＦ  ＩＩ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）ならびにＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質の発現を解析したウエスタンブロット（Ｃ）である。Ｂの各写真の上の文字は、賦活化処理における臍帯組織抽出物の添加濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図２０】ＦＢＳ添加の有無および臍帯組織抽出物の添加濃度を変えて賦活化処理を行ったＩＩ型糖尿病患者由来間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）および位相差顕微鏡観察像（Ｂ）である。Ｂの各写真の上の文字は、賦活化処理における臍帯組織抽出物の添加濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表す。
【図２１】ＦＢＳ存在下、臍帯組織抽出物の添加濃度１．０ｍｇ／ｍＬでのＩＩ型糖尿病患者骨髄液の培養により得られた各継代における総細胞数を表すグラフである。
【図２２】臍帯組織抽出物で賦活化処理を行ったＩ型糖尿病患者由来間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）および位相差顕微鏡観察像（Ｂ）である。Ｂの各写真の上の文字は、賦活化処理における臍帯組織抽出物添加の有無を表す。また、下列の写真は、健常人由来の間葉系幹細胞である。
【図２３】胎児付属物からの抽出物の別の一例である胎盤組織抽出物（Ｐ）および卵膜抽出物（ＰＭ）から調製したエクソソーム分画の、抗ＨＳＰ７０抗体を用いたウエスタンブロットである。
【図２４】胎盤組織抽出物および卵膜抽出物の培養像を示す図である。
【図２５】胎盤組織抽出物または卵膜抽出物で賦活化処理を行ったＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）ならびにＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質の発現を解析したウエスタンブロット（Ｃ）である。
【図２６】Ｌ−グルタミン酸を添加した、または添加しない培地で培養したＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）および電子顕微鏡観察像（Ｃ）である。
【図２７】ヒアルロン酸を添加した、もしくは添加しない培地で培養した、またはヒアルロン酸を消化した臍帯組織抽出物もしくはヒアルロン酸未消化の臍帯組織抽出物を添加した培地で培養したＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）および電子顕微鏡観察像（Ｃ）である。
【図２８】臍帯組織抽出物またはそのエクソソーム分画を添加した培地で培養したＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）、電子顕微鏡観察像（Ｃ）ならびにＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質の発現を解析したウエスタンブロット（Ｄ）である。
【図２９】胎盤組織抽出物またはそのエクソソーム分画を添加した培地で培養したＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）、位相差顕微鏡観察像（Ｂ）ならびにＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質の発現を解析したウエスタンブロット（Ｃ）である。
【図３０】ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病性腎症モデルマウス（ＳＴＺマウス）に対する治療効果の評価（実施例９の９−１．）に用いるＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の賦活化プロトコールを表す図（Ａ）、および治療試験計画を表す図（Ｂ）である。
【図３１】ＳＴＺマウスの治療試験（実施例９の９−１．）における体重変化率のグラフである。
【図３２】ＳＴＺマウスの治療試験（実施例９の９−１．）における血糖値のグラフである。
【図３３】ＳＴＺマウスの治療試験（実施例９の９−１．）における尿中アルブミン／クレアチニン比のグラフである。
【図３４】ＳＴＺマウスに対する治療効果の評価（実施例９の９−２．）に用いるＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の賦活化プロトコールを表す図（Ａ）、および治療試験計画を表す図（Ｂ）である。
【図３５】ＳＴＺマウスの治療試験（実施例９の９−２．）における体重変化率のグラフである。
【図３６】ＳＴＺマウスの治療試験（実施例９の９−２．）における血糖値のグラフである。
【図３７】ＳＴＺマウスの治療試験（実施例９の９−２．）における尿中アルブミン／クレアチニン比のグラフである。
【図３８】ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病性腎症モデルラット（ＳＴＺラット）に対する治療効果の評価（実施例１０の１０−１．）に用いるＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の賦活化プロトコールを表す図（Ａ）、および治療試験計画を表す図（Ｂ）である。
【図３９】ＳＴＺラットの治療試験（実施例１０の１０−１．）における尿中アルブミン／クレアチニン比のグラフである。
【図４０】ＯＬＥＴＦ  ＩＩ型糖尿病性腎症モデルラット（ＯＬＥＴＦラット）に対する治療効果の評価（実施例１０の１０−２．）に用いるＯＬＥＴＦ  ＩＩ型糖尿病モデルラット間葉系幹細胞（ＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋））の賦活化プロトコールを表す図（Ａ）、および治療試験計画を表す図（Ｂ）である。
【図４１】ＯＬＥＴＦラットの治療試験（実施例１０の１０−２．）における尿中アルブミン／クレアチニン比のグラフである。
【図４２】臍帯組織抽出物で賦活化処理を行った関節リウマチモデルラット（ＲＡラット）間葉系幹細胞（ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ）、および賦活化処理を行っていないＲＡラット間葉系幹細胞（ＲＡ−ＭＳＣ）のＭＴＴアッセイ結果（Ａ）および位相差顕微鏡観察像（Ｂ）である。
【図４３】ＲＡラットに対する治療効果の評価（実施例１１の１１−３．）に用いるＲＡラット間葉系幹細胞の賦活化プロトコールを表す図（Ａ）、および治療試験計画を表す図（Ｂ）である。
【図４４】ＲＡラットの治療試験における足部体積のグラフである。
【図４５】ＲＡラットの治療試験における関節炎スコアのグラフである。
【図４６】ＲＡラットの治療試験における血清ＣＲＰ値のグラフである。
【図４７】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ（Ａ）およびこのＭＳＣの培養上清（ＭＳＣ−ＣＭ）（Ｂ）のＳＴＺマウスに対する治療試験計画を表す図である（参考例１の１−１．）。
【図４８】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ（Ａ）およびＭＳＣ−ＣＭ（Ｂ）のＳＴＺマウスに対する治療試験における尿中アルブミン／クレアチニン比のグラフである（参考例１の１−１．）。
【図４９】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＣＭのＳＴＺマウスに対する治療試験における腎臓組織切片のＰＡＳ染色像およびＡｚａｎ染色像である（参考例１の１−１．）。
【図５０】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ（Ａ）およびＭＳＣ−ＣＭ（Ｂ）の高脂肪食誘導ＩＩ型糖尿病性腎症モデルマウス（ＨＦＤマウス）に対する治療試験計画を表す図である（参考例１の１−２．）。
【図５１】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ（Ａ）およびＭＳＣ−ＣＭ（Ｂ）のＨＦＤマウスに対する治療試験における尿中アルブミン／クレアチニン比のグラフである（参考例１の１−２．）。
【図５２】Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣおよびＭＳＣ−ＣＭのＨＦＤマウスに対する治療試験における腎臓組織切片のＰＡＳ染色像およびＡｚａｎ染色像である（参考例１の１−２．）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第一の態様は、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する、異常な間葉系幹細胞の賦活化剤に関する。また、本発明の第二の態様は、対象から分離された異常な間葉系幹細胞を、前記第一の態様の賦活化剤で処理する工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法に関する。
【００１８】
＜抽出物＞
胎児付属物は、妊娠時に子宮内で形成される胎児の発育を支える役割を担う器官であり、胎盤、臍帯、卵膜（羊膜、絨毛膜、脱落膜の３層からなる）および羊水から構成される。胎盤は、胎児と母体との間の物質交換を行う場として機能する絨毛組織であって、様々な増殖因子やサイトカインを含み、ホルモン産生も行っている。臍帯は、胎児と胎盤をつなぐ器官であり、２本の臍帯動脈と１本の臍帯静脈、ワルトン膠質、臍帯間質と呼ばれる結合組織、およびその周囲を覆う羊膜鞘から構成される。
【００１９】
ワルトン膠質は、少量の細胞と、コラーゲン、グルコサミノグリカン、ムチンなどの細胞外マトリクスとを包含する。ワルトン膠質中のグルコサミノグリカンは、その大半をヒアルロン酸が占め、その他にケラタン硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ヘパラン硫酸などの硫酸化グルコサミノグリカンが含まれる。
【００２０】
またワルトン膠質には、ＩＧＦ−１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−１）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）などの増殖因子が含まれることも知られている（Ｋ．Ｓｏｂｏｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ（２００５），２６，７４７−７５２）。
【００２１】
本発明において使用する胎児付属物は、胎児娩出後に後産として母体から娩出されるか、または帝王切開により母体から摘出されたものである。本発明の抽出物は、母体から得た胎児付属物の全体から調製することができる。あるいは、胎児付属物の一部、すなわち胎児付属物を構成する器官または組織のうちの一または複数を抽出材料として用いてもよい。この場合、賦活化活性および抽出効率の観点から、抽出材料には、臍帯組織、胎盤組織または卵膜が含まれることが好ましい。胎児付属物は、採取後直ちに抽出物の調製に使用してもよく、または汚染物質の混入を避けるために滅菌容器内に入れ、冷蔵または冷凍で保存した後に、使用することもできる。
【００２２】
胎児付属物は、哺乳動物から採取することができる。本発明の好ましい実施形態の一つにおいて、胎児付属物はヒトから採取されたものであるが、ヒト以外の動物（例えば、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなど）から採取された胎児付属物を用いることも可能である。
【００２３】
なお、胎児付属物は、その後の細胞移植療法の際の安全性を考慮した場合、間葉系幹細胞を投与する個体と同種または近縁種の個体から採取するのが好ましい。
【００２４】
本発明において使用する抽出物は、前述のように採取された胎児付属物から、抽出媒体で抽出することにより、調製することができる。胎児付属物は、付着している余分な成分を生理食塩水等で洗い流した後に抽出に用いるのが好ましい。
【００２５】
洗浄後の胎児付属物は、そのままの形状で抽出に用いてもよいが、抽出効率を上げるために切断または破砕して用いることが好ましい。例えば、凍結させた胎児付属物をミキサーで破砕することにより、より簡便な操作での抽出が可能となる。また、臍帯組織を用いる場合の本発明の好ましい実施形態の一つにおいては、後述するように、臍帯組織を適宜切断して得られる、３次元構造が実質的に維持された臍帯組織を抽出に用いる。
【００２６】
本明細書における「３次元構造が実質的に維持された臍帯組織」とは、ホモジェナイズ等の組織を破砕または均一化する処理を伴わずに、メス、ハサミ、ピンセットその他の切断手段で、あるいは用手的に、臍帯組織を抽出に適した形状または大きさに切断して得られる臍帯組織をいう。
【００２７】
ホモジェナイズ等により臍帯組織の３次元構造を破壊して抽出を行った場合、抽出物が泡立ち、その結果、器具や容器等への粘性成分の付着が増して、抽出効率が下がるおそれがある。臍帯組織を３次元構造が実質的に維持されるように切断することにより、有効成分の効率的な抽出と望ましくない発泡の回避とを同時に実現することができる。
【００２８】
なお、臍帯組織の３次元構造が維持されるかぎり、切断の方向は限定されないが、臍帯組織の構造上、臍帯の長軸方向に沿って切断するのが好ましい。
【００２９】
本発明において使用する抽出媒体は、胎児付属物中に含まれる有効成分の活性に負の影響を与えないかぎり、生化学の分野で一般に用いられる媒体であることができ、水性媒体が好適である。細胞の培養や調製に通常用いられる水性媒体がより好ましく、例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水や、細胞培養において通常用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などが挙げられる。
【００３０】
抽出媒体は、その後の細胞移植療法の際の安全性を考慮した場合、レシピエントである個体に不都合な影響を与える可能性のある成分を含まないことが好ましい。
【００３１】
また、本発明の好ましい実施形態の一つにおいて、間葉系幹細胞の賦活化は、抽出物それ自体を培地として用いて間葉系幹細胞を培養することにより行われる。この場合、当業者は、抽出媒体として、胎児付属物中の有効成分を十分に抽出することができ、かつ間葉系幹細胞の培養にも適した細胞培養用培地を適宜選択することができる。
【００３２】
抽出は、胎児付属物を抽出媒体に浸漬し、２４時間〜１４４時間、好ましくは４８時間〜９６時間、より好ましくは７２時間の間、温度２℃〜２５℃、好ましくは２℃〜８℃、より好ましくは４℃で、静置または振とうすることにより行われる。振とう速度は、抽出中の液体を過度に発泡させない程度に設定される。使用する抽出媒体の量は、胎児付属物の湿重量１gあたり０．２ｍＬ〜１００ｍＬ、好ましくは０．５ｍＬ〜２０ｍＬ、より好ましくは１ｍＬ〜１０ｍＬであり、この量は、胎児付属物の切断の程度や抽出温度、振とう速度等に応じて適宜調節される。
【００３３】
抽出後の胎児付属物を含む抽出液は、静置または遠心分離した後に得られる上清分画を回収することによって、またはろ過後のろ液を回収することによって、胎児付属物由来の不要な固形分を除去して用いることができる。
【００３４】
抽出後の胎児付属物は、有効成分が抽出される限りにおいて再利用することができる。すなわち、有効成分を抽出した後の胎児付属物に再度抽出媒体を加えて、上述の抽出処理を行って、さらなる抽出物を得ることも可能である。このように複数回の抽出を行うことにより、有効成分の収率を高めることができる。
【００３５】
このようにして得られた抽出物は、そのままの液体の状態で用いることができる。あるいは、抽出物は、その中に含まれる有効成分の活性を損なわないように濃縮または乾燥させ、濃縮液または乾燥物にした後、使用時に希釈または適当な液体に溶解させて用いることもできる。また、抽出物は、調製後すぐに使用してもよく、または冷蔵もしくは冷凍で保存した後に使用してもよい。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態の一つにおいて、抽出物は、胎児付属物のドナーである哺乳動物由来の、増殖能を有する細胞を含まない。ドナー由来の増殖能を有する細胞が混入していると、賦活化処理の間に目的の間葉系幹細胞と共にドナー由来細胞も増殖する可能性があり、これを細胞移植療法に用いると、レシピエントである個体に対して、拒絶反応や移植片対宿主病などの望ましくない作用をもたらし得るためである。
【００３７】
かかる増殖能を有する細胞を含まない抽出物は、例えば、胎児付属物に対して放射線照射などの細胞死滅処理を行うことによって得ることができる。また、かかる抽出物は、３次元構造が実質的に維持された臍帯組織を用いた前述のような抽出方法によって、細胞除去処理を必要とせずに得ることもできる。
【００３８】
抽出物中の増殖能を有する細胞の有無は、細胞増殖能・生存率を評価する公知の方法、例えば適切な増殖培地を用いた細胞培養試験や、ＭＴＴアッセイのような生化学的試験などにより、確認することができる。
【００３９】
＜間葉系幹細胞＞
間葉系幹細胞は、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋細胞といった間葉系に属する細胞に分化するだけでなく、神経細胞や肝細胞などにも胚葉を超えて分化することができる。また、間葉系幹細胞はさらに、自身が産生する液性因子によるパラクライン効果および細胞接着相互作用も有することが知られている。
【００４０】
間葉系幹細胞は、これらの作用に基づいて、標的組織や細胞の修復・再生能、および抗炎症などの免疫制御能を発揮し、その結果、様々な疾患への治療がもたらされるものと考えられている。
【００４１】
本発明における「異常な間葉系幹細胞」とは、上記のような多様な能力を失った、またはこれらの能力が正常な間葉系幹細胞と比べて低減した結果として、疾患治療効果を失った、または治療効果が正常な間葉系幹細胞と比べて低減している間葉系幹細胞をいう。本発明者らはさらに、異常な間葉系幹細胞は、治療効果を持たないだけでなく、むしろ疾患を増悪する効果すら有することを確認している。このような疾患増悪効果を有する間葉系幹細胞も、本発明にいう「異常な間葉系幹細胞」に含まれる。
【００４２】
本発明者らは、糖尿病または関節リウマチを有する個体から採取した間葉系幹細胞が異常化していることを明らかにした。同様の異常化は、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患などの疾患を有する個体や、老化した個体においても生じているものと推察される。さらに、間葉系幹細胞の異常化は、健常な個体であっても生じ得ると考えられるが、これら健常個体由来の異常細胞も本発明による賦活化が可能である。
【００４３】
間葉系幹細胞が異常化する疾患としては、具体的には、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、自己免疫性副腎機能障害、真正赤血球性貧血、多発性硬化症および自己免疫性肝炎などの自己免疫疾患；慢性肝炎、肝硬変、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病などの慢性炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、気管支ぜんそくなどのアレルギー性疾患；骨粗鬆症を挙げることができる。
【００４４】
本発明において使用される異常な間葉系幹細胞は、対象から採取される。本明細書における「対象」とは、間葉系幹細胞を有する任意の動物を意味し、好ましくは哺乳動物の個体、例えば、ヒト、チンパンジーなどの霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの齧歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどの偶蹄目、ウマなどの奇蹄目、ウサギ、イヌ、ネコなどの個体であり、さらに好ましくはヒトの個体である。
【００４５】
本発明の実施形態の一つにおいて、対象は、上記の間葉系幹細胞が異常化する疾患を有する個体または老化した個体である。別の実施形態において、疾患は、糖尿病、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症であるのが好ましく、より好ましくは糖尿病または関節リウマチである。
【００４６】
間葉系幹細胞は、その後の細胞移植療法における安全性を考慮した場合、細胞を投与する個体と同種または近縁種の個体から採取するのが好ましい。例えば、ヒトの個体に細胞移植を行う場合、好ましくは同種であるヒトから採取された細胞が、より好ましくは投与を受ける同一のヒト個体から採取された細胞、すなわち自己間葉系幹細胞が用いられる。
【００４７】
間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄液、脂肪組織、胎児付属組織、歯髄などの試料から、一般的な方法で採取することができ、例えば、試料として骨髄液を用いる場合、密度勾配遠心法、骨髄播種法などの公知の手法により、間葉系幹細胞を分離することが可能である。
【００４８】
異常な間葉系幹細胞は、生体から採取された後に、インビトロで継代培養されたものであってもよい。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態の一つにおいて、異常な間葉系幹細胞として、骨髄由来の細胞が用いられる。
【００５０】
採取した間葉系幹細胞が正常であるか異常であるかの判定は、疾患を反映した評価系、例えば疾患モデル動物や疾患モデル動物由来細胞などを用いて、細胞の疾患治療効果を評価することにより行うことができる。
【００５１】
異常性判定のための評価系として用いる疾患は、正常な間葉系幹細胞により治療することができる疾患であればよいが、採取した間葉系幹細胞を賦活化後に治療用途で用いることを予定している場合、治療予定の疾患と同じまたは関連のある疾患についての評価系を用いるのが好ましい。例えば、間葉系幹細胞を糖尿病性腎症の治療に用いることを予定しているのであれば、採取した間葉系幹細胞の異常性評価は、糖尿病性腎症を反映した評価系で行うのが好ましい。
【００５２】
採取した間葉系幹細胞が、治療効果を持たない、もしくは正常な間葉系幹細胞のそれと比べて低い治療効果を持つ場合、または疾患増悪効果を持つ場合、その間葉系幹細胞は異常であると判定することができる。
【００５３】
また間葉系幹細胞の異常性判定は、後述の試験例のように、細胞および細胞内小器官の形態、細胞増殖能、分化能、ならびに増殖因子、分化関連因子およびサイトカイン・ケモカインといった各種因子のタンパク質発現量、遺伝子発現量、細胞外分泌量などの評価指標を用いることによっても行うことができる。
【００５４】
異常な間葉系幹細胞は、一例として、正常な間葉系幹細胞と異なる以下のような性質を持つ。
【表１】
0006555691.tif 000002
【００５５】
これらの評価は、細胞生物学および分子生物学の分野で通常用いられる方法によって行うことができる。具体的には、細胞および細胞内小器官の形態は顕微鏡観察により、細胞増殖能は適切な増殖培地を用いた細胞培養試験やＭＴＴアッセイのような生化学的試験により、分化能は適切な分化誘導培地を用いた分化誘導試験により、タンパク質発現はＥＬＩＳＡやウエスタンブロット法などのタンパク質定量法により、遺伝子発現は定量的ＰＣＲやノーザンブロット法などの遺伝子定量法により、評価することができる。
【００５６】
採取した間葉系幹細胞が、上述のような評価指標のうちの一または複数について、正常な間葉系幹細胞と異なる挙動を示す場合、その間葉系幹細胞は異常であると判定することができる。
【００５７】
＜本発明の賦活化剤および賦活化された間葉系幹細胞の製造方法＞
本発明の賦活化剤は、異常な間葉系幹細胞を賦活化させることができる。
【００５８】
本明細書における「賦活化」とは、異常な間葉系幹細胞に多様な能力の少なくとも一部を回復させ、疾患治療効果を発揮できる状態にすることをいう。異常な間葉系幹細胞は、賦活化により、正常な間葉系幹細胞のそれと同程度に、あるいはそれを上回る治療効果を発揮するようになる。また、正常な間葉系幹細胞と同程度までには達しないものの、賦活化前よりも治療効果が向上した状態にすることも、本発明の「賦活化」に含まれる。
【００５９】
本発明の賦活化剤は、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する。賦活化剤は、前述の方法で得られた抽出物をそのまま、または細胞の培養や調製に通常用いられる水性媒体で希釈して、用いることができる。希釈に用いる水性媒体としては、例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水や、細胞培養において通常用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などが挙げられる。
【００６０】
さらに、本発明は、対象から分離された異常な間葉系幹細胞を、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で処理する工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法に関する。
【００６１】
間葉系幹細胞を賦活化剤で処理する工程、すなわち賦活化工程は、異常な間葉系幹細胞の培地に本発明の賦活化剤を添加し、２４時間〜１４４時間、好ましくは２４時間〜７２時間、より好ましくは４８時間の間、培養することにより行われる。賦活化処理の温度およびガス濃度は、間葉系幹細胞の培養に通常用いる温度およびガス濃度の範囲内であればよく、温度は例えば２５℃〜３７℃、好ましくは３０℃〜３７℃、より好ましくは３７℃であり、酸素濃度は例えば２％〜３０％、好ましくは２％〜２０％である。賦活化処理は、十分な賦活化が達成されるまで、複数回行うことができる。
【００６２】
賦活化処理における賦活化剤の濃度は、賦活化が達成されるかぎりにおいて、適宜設定することができる。例えば、本発明の賦活化剤は、胎児付属物からの抽出物０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬを含む。また、本発明の賦活化剤は、間葉系幹細胞の増殖に必要な成分、例えば血清成分や間葉系幹細胞用の培地などとの共存下で、間葉系幹細胞をより効率的に賦活化させる。したがって、本発明の賦活化剤は、これらの成分と共に用いることが好ましい。
【００６３】
当業者は細胞の賦活化状況を見ながら、賦活化剤の濃度、賦活化処理の温度、時間、回数を適宜調節することができる。
【００６４】
また、賦活化処理は、生体試料から分離された状態の異常な間葉系幹細胞のみならず、生体試料由来の細胞集団に含まれる状態の異常な間葉系幹細胞に対しても、行うことができる。例えば、骨髄由来間葉系幹細胞の場合、採取した骨髄液をそのまま賦活化処理に供することで、骨髄液に含まれる細胞集団中の異常な間葉系幹細胞を賦活化させることが可能である。
【００６５】
異常な間葉系幹細胞が賦活化されたか否かの判定は、前述のように疾患を反映した評価系を用いて、賦活化処理後の細胞が持つ治療効果を評価することにより、行うことができる。賦活化処理後の間葉系幹細胞が、賦活化処理前と比較して、疾患増悪効果を喪失した場合および／または治療効果が増大している場合、その間葉系幹細胞は賦活化されていると判定される。
【００６６】
なお賦活化された間葉系幹細胞は、治療効果が正常な間葉系幹細胞のそれと同程度にまで回復しないこともある。しかしながら、賦活化処理により治療効果が増大するかぎり、かかる間葉系幹細胞は、本発明において使用することが可能である。
【００６７】
さらに、賦活化の判定は、前出の異常性判定と同様の細胞生物学的評価指標、すなわち、細胞または細胞内小器官の形態、細胞増殖能、分化能、各種因子のタンパク質や遺伝子の発現量、細胞外分泌量などの指標を用いることによっても行うことができる。賦活化処理後の間葉系幹細胞が、これらの評価指標のうちの一または複数について、正常な間葉系幹細胞と同じ、またはこれに近い性質を示した場合、その間葉系幹細胞は賦活化されたと判定することができる。
【００６８】
間葉系幹細胞は、賦活化と同時に、または賦活化後にインビトロでの継代培養により増殖させてもよい。
【００６９】
また、賦活化された間葉系幹細胞は、未分化な状態で維持してもよく、あるいは所望の細胞に分化させてもよい。賦活化後の細胞をどのような分化状態にするかは、治療対象疾患や治療方法などの細胞の用途に応じて、当業者により適宜選択される。
【００７０】
間葉系幹細胞の未分化状態での維持は、未分化状態の維持に好適な培地、例えばＨｙＣｌｏｎｅ  ＡｄｖａｎｃｅＳＴＥＭ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）  ＭＳＣ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｃｅｌｌｕｔｉｏｎｓ（商標）Ｍｅｄｉａ（ＤＶ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、間葉系幹細胞専用培地キット（ＭＳＣＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、Ｌｏｎｚａ）などを用いて、間葉系幹細胞を培養することにより行うことができる。
【００７１】
間葉系幹細胞の分化は、所望の細胞への分化誘導作用を持つ因子を加えた分化誘導培地中での培養などの一般に知られる方法で行うことができる。例えば、骨芽細胞への分化においてはＢｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＢＭＰ）４、ＢＭＰ２などが、脂肪細胞への分化においてはデキサメタゾン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、インスリンなどが分化誘導因子として用いられる。
【００７２】
間葉系幹細胞の分化を確認する方法は、分化させた細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、骨芽細胞への分化の確認には、細胞のアルカリフォスファターゼを検出する方法、例としてアルカリフォスファターゼ染色などが用いられ、脂肪細胞への分化の確認には、細胞のトリグリセリドを検出する方法、例えばＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ染色などが用いられる。
【００７３】
賦活化処理が生体試料由来の細胞集団に含まれる状態の異常な間葉系幹細胞に対して行われた場合、必要に応じて、賦活化後の細胞集団から目的の間葉系幹細胞を分離または濃縮してもよい。
【００７４】
間葉系幹細胞の分離または濃縮は、間葉系幹細胞が選択的に増幅される培地中での培養や、間葉系幹細胞に特異的な１または複数の細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６など）に基づくフローサイトメトリーおよびセルソーティングにより、行うことができる。
【００７５】
間葉系幹細胞は、賦活化、増殖培養、分化誘導培養などの処理の前後において、凍結保存などの一般的な手法により保存することができる。例えば、賦活化された間葉系幹細胞を培養により増殖させた後に、一定の細胞数となるように分けて保存しておき、投与の度に必要量を解凍して用いることが可能である。
【００７６】
＜本発明の間葉系幹細胞の用途＞
本発明の第三の態様は、前記第二の態様の製造方法により製造された、疾患治療および／または予防用の間葉系幹細胞、ならびに該間葉系幹細胞および／またはその培養物を含む、疾患治療および／または予防用の医薬に関する。
【００７７】
本発明の製造方法により得られる賦活化された間葉系幹細胞は、疾患の治療および／または予防のために用いることができる。さらに本発明は、賦活化された間葉系幹細胞および／またはその培養物を含む、疾患治療および／または予防用の医薬に関する。また、本発明は、賦活化された間葉系幹細胞を用いた、もしくはこれらを含む医薬を用いた疾患の治療方法および／または予防方法も提供する。
【００７８】
治療および／または予防される疾患は、間葉系幹細胞による治療および／または予防が知られている任意の疾患であることができる。
【００７９】
本発明の実施形態の一つにおいて、賦活化された間葉系幹細胞は、糖尿病もしくはその合併症、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患または骨粗鬆症の治療および／または予防のために用いることができる。これらの疾患としては、具体的に、Ｉ型糖尿病およびＩＩ型糖尿病ならびにこれらの合併症、例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害、脳梗塞、脳卒中、心筋梗塞、狭心症、閉塞性動脈硬化症など；関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、自己免疫性副腎機能障害、真正赤血球性貧血、多発性硬化症および自己免疫性肝炎などの自己免疫疾患；慢性肝炎、肝硬変、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病などの慢性炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、気管支ぜんそくなどのアレルギー性疾患；骨粗鬆症を挙げることができる。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態において、治療および／または予防される疾患は、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症または糖尿病性神経障害である。賦活化された間葉系幹細胞は、細小血管障害を改善することにより、これら糖尿病合併症を治療および／または予防することができると考えられる。さらに、後述の実施例に記載されるように、関節リウマチもまた、賦活化された間葉系幹細胞により、好ましく治療および／または予防される疾患である。
【００８１】
本発明の医薬は、有効量の賦活化された間葉系幹細胞を含む。
【００８２】
本明細書中で用いられる「有効量」とは、疾患を治療および／または予防するのに効果的な量を意味する。かかる有効量は疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。
【００８３】
本発明の医薬の好ましい実施形態において、間葉系幹細胞の有効量は、投与される個体の体重１ｋｇあたり１０６個〜１０９個、好ましくは１０７個〜１０９個である。
【００８４】
本発明の医薬はまた、有効量の賦活化された間葉系幹細胞の培養物を含むこともできる。培養物は、好適には、間葉系幹細胞の培養上清である。間葉系幹細胞の培養上清には、間葉系幹細胞が産生する様々な液性因子が含まれており、間葉系幹細胞と同様に疾患治療効果を有することが知られている（特開２０１３−０１８７５６号公報およびＷａｔａｎａｂｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１３；Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ，ＰＭＩＤ：２４２１７９６４）。さらに後述の参考例においても間葉系幹細胞培養上清の治療効果が明らかになっている。
【００８５】
培養物は、間葉系幹細胞の培養に通常用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地などの中で、賦活化された間葉系幹細胞を培養することにより、得ることができる。
【００８６】
本発明の医薬の好ましい態様において、間葉系幹細胞培養物の有効量は、投与される個体の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、好ましくは０．２ｍｇ〜５０ｍｇ、より好ましくは０．５ｍｇ〜２０ｍｇであり、これを１回または複数回に分けて投与することができる。
【００８７】
本発明の医薬は、通常、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【００８８】
本発明の医薬はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の成分を含む組成物であってもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第１６版日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００８９】
本発明の医薬の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の医薬は、静脈内投与により生体に投与される。また、本発明の医薬は、治療および／または予防される疾患に応じて、その他の医薬と併用して使用してもよい。
【００９０】
本発明の第四の態様は、前記第三の態様の間葉系幹細胞および／またはその培養物の有効量を含む医薬を対象に投与することを含む、疾患を治療および／または予防する方法に関する。かかる第四の態様における各用語の意味は、前記第三の態様において説明したとおりである。
【００９１】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の技術的範囲はこれらにより限定されるものではない。
【実施例】
【００９２】
＜実施例１  臍帯組織抽出物の調製＞
臍帯組織は、母体に合併症のない帝王切開手術施行ヒト症例（ｎ＝２０）の胎盤娩出直後に、臍帯根部から切断することにより採取した。採取した臍帯組織を滅菌容器に回収し、氷上で保持した。【００９３】
臍帯組織からの抽出物の調製は、以下のように行った。全ての操作はクリーンベンチ内で実施した。
１）  生理食塩水で臍帯組織に付着した血液および血管内の血液を可能な限り洗い流した。
２）  ガラス製の培養皿に、無血清および抗生剤非添加のα−ＭＥＭ細胞培養用培地を１０〜３０ｍＬ分取した。
３）  洗浄した臍帯組織を湿重量で約５ｇ毎に分割し、培養皿１枚あたり約５ｇの臍帯組織を入れた。
４）  培養皿の培地の中で、ピンセットおよび先鋭のハサミを用いて羊膜鞘を長軸方向に切開した。
５）  さらに長軸方向に走行する臍帯動脈、臍帯静脈をピンセットでワルトン膠質から剥離した。
６）  さらにワルトン膠質および羊膜鞘を、ピンセットを用いて５ｍｍ程の幅で長軸方向に細切した。
７）  ５）および６）で得られた臍帯血管、ワルトン膠質および羊膜鞘のすべてを含む培地を、５０ｍＬのサンプル管に回収した。
８）  ７）を４℃の冷蔵庫内で振とう機の上に水平に置き、７０〜１００ｒｐｍの強度で７２時間、往復振とうさせた。
９）  ７２時間後にサンプル管を４℃、２０００ｒｐｍ（３００×ｇ）で５分間遠心分離した。
１０）  ９）の上清を回収して、臍帯組織抽出物（以下、「ＷＪ」ともいう）を得た。抽出物は、滅菌容器内で４℃または−８０℃で保存し、以降の実施例および参考例において用いた。なお、特に記載がないかぎり、上記２）で使用したα−ＭＥＭ培地の量は２０ｍＬであり、抽出物は４℃で保存した。【００９４】
＜実施例２  臍帯組織抽出物の分析＞
実施例１において調製された臍帯組織抽出物について、以下の分析を行った。【００９５】
２−１．形態観察
抽出物について、蛍光顕微鏡（位相差観察付）ＢＺ９０００（キーエンス）またはＴＥ２００（ニコン）を用いた位相差顕微鏡観察を行った。網目状の細胞外マトリクス成分のほか、臍帯血に由来すると考えられる赤血球が見出されたが、その他の増殖能を有する細胞の存在は認められなかった（図１Ａ）。【００９６】
また、以下のように電子顕微鏡観察用試料を作製して、抽出物の電子顕微鏡観察を行った。抽出物を２．５％グルタルアルデヒドで２４時間固定した。その後、試料を０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、１％四酸化オスミウム酸水溶液で固定した後、エタノールで脱水した。試料をプロピレンオキサイドに浸漬後、エポキシ樹脂を用いて包埋し、加熱重合した。試料の超薄切片をウルトラミクロトームＭＴ−Ｘ（ＲＭＣ）を用いて作製し、電子染色後、透過型電子顕微鏡Ｈ−７６５０（日立ハイテクノロジーズ）で観察した。細胞外マトリクスと考えられる線維状の物質の存在が認められた（図１Ｂ）。【００９７】
２−２．増殖因子、ヒアルロン酸およびグルタミン酸の含有量
抽出物に含まれる増殖因子（ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ）（１６ロットの抽出物を使用）、ヒアルロン酸（８ロットの抽出物を使用）、Ｌ−グルタミン酸（１９ロットの抽出物を使用）の量をＥＬＩＳＡで測定した。測定の際、ＩＧＦ−１はＨｕｍａｎ  ＩＧＦ−Ｉ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＥＧＦはＨｕｍａｎ  ＥＧＦ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＤＧＦ−ＡＢはＨｕｍａｎ  ＰＤＧＦ−ＡＢ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＦＧＦｂはＨｕｍａｎ  ＦＧＦ  ｂａｓｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒアルロン酸はＨｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｌ−グルタミン酸はＦ−キット  Ｌ−グルタミン酸測定キット（Ｊ．Ｋ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いた。なお、ヒアルロン酸およびＬ−グルタミン酸については、４℃のほか−８０℃で保存した抽出物についても測定を行った。Ｌ−グルタミン酸については、１０ｍＬ、２０ｍＬまたは３０ｍＬの抽出媒体（α−ＭＥＭ培地）を使用して調製した抽出物について測定を行った。
結果を図２に示す。抽出媒体の量を増やすと抽出物中のＬ−グルタミン酸濃度は若干減少した（図２Ｃ）。また、抽出物の保存温度は、測定した成分の含有量に大きな影響を与えなかった（図２Ｂ、Ｃ）。【００９８】
２−３．粘度
１０ｍＬ、２０ｍＬまたは３０ｍＬの抽出媒体（α−ＭＥＭ培地）を使用して調製し、４℃および−８０℃で保存した抽出物（それぞれ１５ロット）の粘度を音叉型振動式粘度計ＳＶ−１Ａ（Ａ＆Ｄ）で測定した。結果を図３に示す。Ｌ−グルタミン酸含有量の結果と同様に、使用した抽出媒体の量に依存して粘度は低下し、また保存温度は粘度に影響しなかった。【００９９】
２−４．エクソソーム含有量
臍帯組織抽出物から、Ｔｏｔａｌ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてエクソソーム分画を抽出した。エクソソーム分画をペレットとして回収後、電子顕微鏡観察を行った。【０１００】
また、回収されたペレットを緩衝液で抽出し、抗ヒトＣＤ９抗体（システムバイオサイエンス）および抗ヒトＨＳＰ７０抗体（システムバイオサイエンス）を用いたウエスタンブロット法にて、ＣＤ９およびＨＳＰ７０の発現を標識にエクソソームの存在を確認した。さらに、抗ヒトＣＤ９抗体を用いたＥＬＩＳＡ（ＣＤ９，Ｅｘｏｓｏｍｅ，ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ，ＥｘｏＥＬＩＳＡ、システムバイオサイエンス）により、エクソソームの含有量を定量した。【０１０１】
電子顕微鏡観察像を図４Ａに、６ロットの臍帯組織抽出物についてのウエスタンブロット結果を図４Ｂに、１５ロットの臍帯組織抽出物についてのＥＬＩＳＡ定量結果を図４Ｃに示す。臍帯組織抽出物は、平均で約１７×１０８個／ｍＬのエクソソームを含んでいた。【０１０２】
２−５．培養試験
臍帯組織抽出物（６ロット、４℃で１４〜９０日間保存したもの）にＦＢＳを最終濃度１０％になるように添加した後、培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で９６時間の培養を行った。培養後の位相差顕微鏡観察像を図５に示す。抽出物中に含まれるコラーゲン線維や赤血球等は観察されたものの、培養皿に接着して増殖してくる細胞は認められなかった。このことから、抽出物には臍帯組織由来の増殖能を有する細胞が含まれないことが示された。【０１０３】
＜実施例３  臍帯組織抽出物による糖尿病動物由来間葉系幹細胞の賦活化＞
３−１．間葉系幹細胞の採取
８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（日本ＳＬＣ）に、４０ｍｇ／ｋｇ体重に相当する量のＳＴＺを含有するＳＴＺクエン酸緩衝液溶液５００μＬを、尾静脈内投与した。ラットの血糖値は、ＳＴＺを投与した１週間後から６００ｍｇ／ｄＬ以上となり、高血糖状態となった。ＳＴＺ投与８週間後にラットを屠殺し、長管骨を採取した。長管骨から全骨髄細胞を回収し、１５０ｃｍ２の培養皿に播種し、培養を行った。培養は、１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシン、１００ｍｇ／ｄＬグルコースを含有するα−ＭＥＭ培地を用いて、２０％Ｏ２下、３７℃で行った。７２時間後に培地を交換し、非接着細胞を除去することにより、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＤＭ−ＭＳＣ、Ｐａｓｓａｇｅ０（Ｐ０））を接着細胞として得た。なお以降、数字を伴って用いられる「Ｐａｓｓａｇｅ」または「Ｐ」は細胞の継代回数を意味する。例えばＰ０の細胞とは継代回数がゼロ回である、すなわち継代を行っていない初代培養細胞を表し、Ｐ１の細胞とは継代回数が１回の細胞を表す。【０１０４】
対照である正常ラット由来の間葉系幹細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、Ｐ０）は、ＳＴＺ溶液の代わりにクエン酸緩衝液を投与したこと以外はＤＭ−ＭＳＣと同じ方法で採取した。【０１０５】
３−２．賦活化処理
実施例１の抽出物を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加したα−ＭＥＭ培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを含有）中で、Ｐ１のＤＭ−ＭＳＣを、２０％Ｏ２下、３７℃で４８時間〜９６時間培養することにより、賦活化処理を行った。培養皿に接着した細胞が８５％〜９０％コンフルエントになった時点で継代し、抽出物添加培地を用いて同様に培養した。このように継代培養したＰ３の細胞をＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）とした。【０１０６】
また賦活化処理を行わない対照のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）は、Ｐ１のＤＭ−ＭＳＣを、実施例１の抽出物を含まないα−ＭＥＭ培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを含有）を用いて、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）と同様に調製した。【０１０７】
さらに、対照である正常ラット由来のＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣは、３−１．で採取したＰ１のＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣを、上述のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）と同様に抽出物を含まない培地で継代培養することにより、調製した。【０１０８】
３−３．賦活化処理された間葉系幹細胞の評価
上述の３−１．および３−２．で得られた間葉系幹細胞について、以下の評価を行った。
（１）ＭＴＴアッセイ
各々の間葉系幹細胞を９６ウエル  マルチウエル培養皿に播種し、２４時間後に実施例１の抽出物（１５ロット）を０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加した、あるいは非添加のα−ＭＥＭ培地を用いて４８時間培養した。添加開始時を０時として、２４時間後または４８時間後にＷＳＴ８（Ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔｓ、ＤＯＪＩＮＤＯ）を各々のウエルに添加した。ホルマザン色素へ還元する酵素活性を測定し、細胞の増殖率を解析した（図６）。賦活化処理後のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）は、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）と比べて高い増殖能を示した。【０１０９】
（２）細胞形態
実施例２と同様に位相差顕微鏡観察を行った。ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）は、突起の少ない平坦な線維芽細胞様の細胞であった。一方、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）は、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ以上に突起数が多く、また細胞の厚みが増していることがわかった（図７）。【０１１０】
（３）細胞内小器官の形態
実施例２と同様に電子顕微鏡観察を行った。ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）は、ミトコンドリアの数がＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣと比べて減少していた（図８）。また、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）では、ミトコンドリア内のクリステの膨化のほか、小胞体ストレス状態を示す小胞体の顕著な拡張が認められた（図９）。これらの形態異常はＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）において、改善が認められた。【０１１１】
（４）増殖能
細胞の増殖能を、Ｋｉ６７染色および細胞増殖、分化、生存促進作用などを媒介するリン酸化酵素であるシグナル伝達因子ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ）１／２の活性化によりさらに評価した。【０１１２】
１）  Ｋｉ６７染色
各々の間葉系幹細胞をチャンバースライドに播種したのち、実施例１の抽出物（１ロット）を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加した、あるいは非添加のα−ＭＥＭ培地を用いて４８時間培養した。培養後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｃｙ３で標識した抗Ｋｉ６７抗体（ａｂｃａｍ）を用いたＫｉ６７染色を行った。細胞核はＤＡＰＩ（ＤＯＪＩＮＤＯ）で染色した。共焦点レーザースキャン顕微鏡システムＬＳＭ  ５１０  ＭＥＴＡ（ＺＥＩＳＳ）を用いて観察し、ＤＡＰＩ陽性細胞およびＫｉ６７陽性細胞の数をカウントした。結果を図１０に示す。一定期間において増殖した全細胞数においては、賦活化処理後のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）はＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）に比較して有意に増加した。一方、増殖活性を呈するＫｉ６７陽性細胞の割合は、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）はＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣと比べて有意に低く、賦活化処理後のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）ではＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣと同程度に回復した。すなわち、実施例１の抽出物により細胞が賦活化されたことが示された。【０１１３】
２）  ＥＲＫ１／２の活性化
各々の間葉系幹細胞を播種したのち、実施例１の抽出物（７ロット）を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加した、あるいは非添加のα−ＭＥＭ培地を用いて４８時間培養した。細胞を回収し、常法に従ってタンパク質を抽出してウエスタンブロット法にて解析した。ＥＲＫ１／２は抗ＥＲＫ１／２抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、リン酸化ＥＲＫ１／２は抗ｐ−ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、β−アクチンは抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。結果を図１１に示す。賦活化処理後のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）では、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）と比べて、リン酸化されたＥＲＫ１／２の発現が上昇していたことから、賦活化処理によりＥＲＫ１／２が活性化されたことが示された。【０１１４】
（５）小胞体ストレス
各々の間葉系幹細胞を播種したのち、実施例１の抽出物（５ロット）を１．０ｍｇ／ｍＬになるように添加した、あるいは非添加のα−ＭＥＭ培地を用いて４８時間培養した。細胞を回収し、常法に従ってタンパク質を抽出し、小胞体ストレス関連タンパク質の発現をウエスタンブロット法にて解析した。ＢｉＰ（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は抗ＢｉＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は抗ＣＨＯＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｅｒｏ１−Ｌ（Ｅｒｏ１−Ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）αは抗Ｅｒｏ１−Ｌα抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｋｉｎａｓｅ）１／３は抗ＪＮＫ１／３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いて検出した。結果を図１２に示す。賦活化処理後のＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）では、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）と比べて、ＢｉＰ、ＣＨＯＰおよびＪＮＫ１／３の発現が減少し、Ｅｒｏ１−Ｌαの発現が増加した。この結果は、細胞の電子顕微鏡観察において認められた結果と同様、賦活化処理により小胞体ストレスが抑制されることを示している。【０１１５】
（６）増殖因子、分化関連因子およびサイトカイン・ケモカインの遺伝子発現
各々の間葉系幹細胞からｍＲＮＡを抽出した（試薬；ＴＲＩ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）。表２に示す因子の発現をリアルタイムＰＣＲ法（試薬；Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、機器；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲシステム）で解析した。なお、各因子の発現量を正規化するための対照としてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を用いた。
【表２】
0006555691.tif 000003
【０１１６】
結果を図１３に示す。α−ＳＭＡ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＦＮγ、ＩＬ−２およびＲＡＮＴＥＳの発現量は、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）ではＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣと比べて増加し、一方、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）ではＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）と比べて減少した。ＩＧＦ−１は逆の傾向を示した。【０１１７】
（７）脂肪細胞への分化能
各々の間葉系幹細胞を脂肪分化誘導培地（試薬；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で培養し、１４日間分化誘導を行った。その後、細胞をＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ（ＳＩＧＭＡ）で染色した。明視野顕微鏡観察像を図１４に示す。ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）ではＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）と比べて細胞数が増加しているものの、全細胞に占めるＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ陽性細胞の割合は同程度であった。したがって、賦活化処理は、間葉系幹細胞が本来保持する脂肪分化能に影響を与えないことが示された。【０１１８】
（８）細胞表面抗原
ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）の表面抗原の発現を、抗ＣＤ９０抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ）、抗ＣＤ４４抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ）、抗ＣＤ４５抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ）、抗ＣＤ４３抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ）、抗ＣＤ３１抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ａｂｃａｍ）を用いてフローサイトメトリーで解析した（機器；ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）。図１５に示すように、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）は、間葉系幹細胞のマーカーであるＣＤ９０を発現し、ネガティブマーカーであるＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４３、ＣＤ３１、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ−ＤＲを発現していなかった。このことから、賦活化処理は間葉系幹細胞の細胞表面抗原に影響を与えないことが示唆された。【０１１９】
＜実施例４  臍帯組織抽出物の濃度検討、および血清成分非存在下での賦活化能の評価＞
Ｉ型糖尿病のモデルであるＳＴＺ投与ラット、およびＩＩ型糖尿病のモデルであるＯＬＥＴＦラットを用いて、賦活化に必要な臍帯組織抽出物の濃度を検討し、合わせて血清成分の存在が臍帯組織抽出物の賦活化能に与える影響を評価した。【０１２０】
４−１．抽出物添加濃度の検討
ＳＴＺ投与ラットおよびＯＬＥＴＦラット（６月齢）から実施例３の３−１．と同様に調製した間葉系幹細胞に対し、抽出物添加濃度を０．１ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲に設定して、３−２．と同様に賦活化処理を行った。ＭＴＴアッセイおよび細胞形態観察の結果から、いずれの糖尿病ラットの間葉系幹細胞においても０．５ｍｇ／ｍＬ以上の抽出物添加濃度で十分な賦活化を確認した（図１６および図１７）。【０１２１】
４−２．血清成分非存在下での抽出物の賦活化能
ＦＢＳを除いたα−ＭＥＭ培地を使用して４−１．と同様にＳＴＺ投与ラットおよびＯＬＥＴＦラットの間葉系幹細胞を培養し、ＭＴＴアッセイおよび細胞形態観察を行った。結果を図１８および図１９に示す。ＦＢＳ非添加かつ抽出物添加下で培養した細胞は、ＦＢＳ添加かつ抽出物添加下で培養した細胞と比べて極度に増殖能が低下しており、細胞形態にもほとんど変化は認められなかった。【０１２２】
また、賦活化の指標の一つとして、ＪＮＫ１／３、α−ＳＭＡのタンパク質発現の変化を評価した。実施例３の３−３．と同様にウエスタンブロット法による解析を行い、ＪＮＫ１／３は抗ＪＮＫ１／３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を、α−ＳＭＡは抗α−ＳＭＡ抗体（ａｂｃａｍ）を用いて検出した。図１８Ｃおよび図１９Ｃに示すように、糖尿病ラット間葉系幹細胞内で発現が亢進していたＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡは、ＦＢＳ添加かつ抽出物添加下でタンパク質量の減少が認められた。しかしながらＦＢＳ非添加下では、タンパク質量の変化は認められないか、認められたとしても弱いものであった。【０１２３】
以上の結果から、臍帯組織抽出物は、ＦＢＳの存在下で、異常化した間葉系幹細胞を効率的に賦活化させることが示された。【０１２４】
＜実施例５  糖尿病患者から分離した間葉系幹細胞の賦活化＞
ＩＩ型糖尿病患者（６９歳女性、ＨｂＡ１ｃ値６．８％）より採取した骨髄液から実施例３と同様の手法で間葉系幹細胞を調製し、これを用いて臍帯組織抽出物の添加濃度検討、および血清成分非存在下での賦活化能の評価を実施例４と同様に行った。【０１２５】
結果を図２０に示す。ＦＢＳを添加した場合、ヒト糖尿病患者の間葉系幹細胞においても糖尿病ラットの間葉系幹細胞と同様に、抽出物添加濃度０．５ｍｇ／ｍＬ以上で細胞増殖能亢進および細胞形態の変化が観察されたが、ＦＢＳ非添加の場合は大きな変化は認められなかった。また、ＦＢＳ存在下、抽出物添加濃度０．５ｍｇ／ｍＬでの賦活化処理における総細胞数の推移を図２１に示す。抽出物を添加した場合、２回目の継代培養時に細胞数が顕著に増加した。【０１２６】
ＤＶバイオロジクスから購入したＩ型糖尿病患者由来の間葉系幹細胞に対し、ＦＢＳ存在下、抽出物添加濃度１．０ｍｇ／ｍＬでの賦活化処理を行ったところ、細胞増殖能亢進および細胞形態はＩＩ型糖尿病患者由来の間葉系幹細胞と同様に変化した（図２２）。【０１２７】
＜実施例６  胎盤組織および卵膜からの抽出物の調製ならびに抽出物による間葉系幹細胞の賦活化＞
胎盤は、帝王切開手術施行ヒト症例（ｎ＝２）より摘出後、滅菌バックに入れ、４℃で搬送および保存を行った。搬送後２４時間以内に組織を凍結保存（−８０℃）した後、あるいは、凍結させずにそのまま、以下のように各組織を切り離し、抽出物を調製した。
１）  胎盤を滅菌バックから取り出し、生理食塩水で余分な成分を可及的に洗浄した。
２）  胎盤を平トレイにうつし、卵膜と、膜を剥離した母体側胎盤組織とに分離した。
３）  卵膜および母体側胎盤組織それぞれの湿重量を測定し、湿重量５０ｇに対して１００ｍＬの割合で無血清培地（α−ＭＥＭ）をコニカルチューブ（２２５ｍＬ）に入れ、重量に応じて必要な本数を準備した。
４）  卵膜および母体側胎盤組織それぞれを、ハサミを用いてすべて５ｍｍ角に細切し、３）で準備したコニカルチューブに入れた。
５）  ４）のコニカルチューブを密栓して口部をパラフィルムで被覆した後、横に寝かせて振とう器に固定し、４℃で８の字振とう、８０ｒｐｍで７２時間振とうした。
６）  ７２時間後、５）のコニカルチューブを４℃で１０００ｘｇ、５分間遠心し、上清を新しいコニカルチューブに回収した。
７）  ６）で回収した上清を再度、４℃で１０００ｘｇ、５分間遠心して上清を回収することで、赤血球成分、胎盤組織等の夾雑物を除去した。
８）  ７）で回収した上清を適宜分注後、使用時まで−８０℃で凍結保存した。【０１２８】
得られた胎盤組織抽出物（Ｐ）および卵膜抽出物（ＰＭ）の平均タンパク質濃度はそれぞれ９．４０５ｍｇ／ｍＬ、１０．５１１ｍｇ／ｍＬであった。なお、同一ドナーから得た臍帯組織抽出物の平均タンパク質濃度は３．０７４ｍｇ／ｍＬであった（いずれもｎ＝２）。【０１２９】
胎盤組織抽出物（Ｐ）および卵膜抽出物（ＰＭ）、さらに上記２）の分離操作前の一体とした胎盤組織から同様に調製した抽出物（Ｐ＋ＰＭ）を用いて、実施例２の２−４．と同様にエクソソーム分画を調製し、ウエスタンブロット法にてＨＳＰ７０の発現を解析し、いずれの抽出物においてもエクソソームが存在することを確認した（図２３）。【０１３０】
また、これらの抽出物について、実施例２の２−５．と同様の方法で培養試験を行った。培養後に位相差顕微鏡観察を行い、培養皿に接着して増殖してくる細胞がないこと、すなわち抽出物に胎盤組織および卵膜由来の増殖能を有する細胞が含まれないことを確認した（図２４）。【０１３１】
上記の胎盤組織および卵膜の抽出物について、ＳＴＺラットの間葉系幹細胞に対する賦活化能を評価した。評価は、臍帯組織抽出物の代わりに胎盤組織抽出物または卵膜抽出物を終濃度０．５ｍｇ／ｍＬまたは１．０ｍｇ／ｍＬで用いた点以外、実施例３に記載された手法を用いて行った。【０１３２】
ＭＴＴアッセイの結果を図２５Ａに示す。胎盤組織抽出物および卵膜抽出物は、臍帯組織抽出物と同等以上にＳＴＺラット間葉系幹細胞を増殖させた。また位相差顕微鏡像を図２５Ｂに示す。抽出物を加えずに培養した間葉系幹細胞は、突起の少ない平坦な多角形の線維芽細胞様の細胞であって、その内部にはストレスファイバーが観察された。胎盤組織抽出物または卵膜抽出物を加えて培養した場合、間葉系幹細胞の形状は紡錘形となり、ラメリポディア（仮足）の発達が認められた。また、ストレスファイバーは著明に減少した。【０１３３】
賦活化の指標の一つであるＪＮＫ１／３、α−ＳＭＡのタンパク質発現の変化を評価した結果を図２５Ｃに示す。臍帯組織抽出物（レーン２、３）、胎盤組織抽出物（レーン４、５）、卵膜抽出物（レーン６〜８）のいずれを用いた場合も、ＳＴＺラット間葉系幹細胞内で発現が亢進していたＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質量の減少が認められた。また、抽出時の形状を短冊状にした卵膜抽出物（レーン７）は、細切して得た卵膜抽出物（レーン８）と同等の活性を示した。【０１３４】
＜実施例７  臍帯組織抽出物構成成分による賦活化の検討＞
臍帯組織抽出物に含まれる構成成分であるＬ−グルタミン酸、ヒアルロン酸、エクソソームについて、間葉系幹細胞の賦活化能を評価した。【０１３５】
実施例３の３−２．で得たＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）を、表３の成分を添加した、または非添加のα−ＭＥＭ培地（１５％ＦＢＳ、１％ペニシリン、１％ストレプトマイシンを含有）中、２０％Ｏ２下、３７℃で４８時間培養した後、位相差顕微鏡および電子顕微鏡で観察した。
【表３】
0006555691.tif 000004
【０１３６】
結果を図２６〜図２８に示す。Ｌ−グルタミン酸またはヒアルロン酸を添加した培地で培養した場合、これらを添加しない培地で培養した場合と比較して、間葉系幹細胞の増殖能および細胞形態に大きな変化は認められなかった（図２６および図２７）。また、ヒアルロン酸を消化した実施例１の抽出物を添加した培地で培養した場合、ヒアルロン酸未消化の実施例１の抽出物を添加した培地で培養した場合と同様に、間葉系幹細胞は、高い増殖能および賦活化された細胞形態を示した（図２７）。したがって、Ｌ−グルタミン酸あるいはヒアルロン酸単独では、実施例１の抽出物と同等の間葉系幹細胞の賦活化効果を示さないこと、および実施例１の抽出物からヒアルロン酸を消化しても間葉系幹細胞の賦活化効果に影響しないことが明らかとなった。【０１３７】
一方、エクソソーム分画を添加した培地で培養したＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）では増殖能の亢進が認められ（図２８Ａ）、また細胞の突起数および厚みが増加して、実施例１の抽出物を添加した場合と同様の細胞形態を示した（図２８Ｂ）。さらに、エクソソーム分画の添加は、小胞体の拡張を抑制した（図２８Ｃ）。ＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡタンパク質については、実施例１の抽出物を添加した場合よりは弱いものの、発現量の減少が観察された（図２８Ｄ）。【０１３８】
＜実施例８  胎盤組織抽出物および卵膜抽出物のエクソソーム分画による賦活化＞
胎盤組織抽出物および卵膜抽出物のエクソソーム分画による間葉系幹細胞の賦活化について、実施例７と同様に評価した。結果を図２９に示す。胎盤組織抽出物または卵膜抽出物のエクソソーム分画で賦活化された間葉系幹細胞は、増殖能、細胞形態、ＪＮＫ１／３およびα−ＳＭＡ発現量のいずれも臍帯組織抽出物のエクソソーム分画の場合と同様の傾向を示した。実施例７および実施例８の結果から、胎児付属物からの抽出物中のエクソソーム分画は、間葉系幹細胞の賦活化に寄与する成分の少なくとも一つであることが示された。【０１３９】
＜実施例９  賦活化された間葉系幹細胞の糖尿病性腎症に対する治療効果（マウスモデル）＞
実施例１の抽出物によって賦活化された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）について、糖尿病性腎症モデルマウスを用いて治療効果を評価した。【０１４０】
９−１．Ｐ１の細胞にのみ賦活化処理を行ったＭＳＣの治療効果
使用したＭＳＣを、以下に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣおよびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）：実施例３の３−２．で得たＰ３の細胞を用いた。
ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）：Ｐ１のＤＭ−ＭＳＣのみを抽出物添加培地で培養し、その後は抽出物を含まない培地を用いたこと以外は、実施例３の３−２．と同様に継代培養したＰ３の細胞を用いた（図３０Ａ）。【０１４１】
試験は、図３０Ｂに示す試験計画にしたがって行った。８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇ体重に相当する量のＳＴＺを含有するＳＴＺクエン酸緩衝液溶液２００μＬを腹腔内投与し、ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルマウス（ＳＴＺマウス）を作製した。正常群のマウスには、ＳＴＺ溶液の代わりにクエン酸緩衝液を投与した。投与４週間後にＳＴＺマウスを４群に分け、ＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群にはＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣを１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むリン酸緩衝液を２５０μＬ、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群にはＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）を１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むリン酸緩衝液を２５０μＬ、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群にはＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）を１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むリン酸緩衝液を２５０μＬ、ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはビークルとしてリン酸緩衝液を２５０μＬ、尾静脈から単回投与した。ＭＳＣまたはビークルの投与後４週おきに体重測定、採血、採尿を行った。８週間目にマウスを解剖し、腎臓を採取した。血糖値は血糖測定機器アントセンスＩＩＩ（ＨＯＲＩＢＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、腎機能の指標である尿中のアルブミンおよびクレアチニンをそれぞれ免疫比濁法、酵素法により測定した。採取した腎臓は、細小血管障害などの臓器障害の評価に用いた。【０１４２】
ＭＳＣまたはビークル投与開始時の体重を１とした場合の体重変化率を図３１に示す。ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群では、正常群と比べて若干の体重減少が認められた。一方、糖尿病マウスにＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣを投与したＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群では、体重変化は正常群と同程度にまで回復した。また、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群では、ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群と比べて体重が減少した一方、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群では、正常群やＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群と同程度まで体重減少が抑制された。【０１４３】
血糖値の結果を図３２に示す。ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群は正常群と比べて血糖値が上昇したが、ＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群では血糖値上昇が抑制された。また、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群はＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群よりも血糖値が高くなったが、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群はＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群よりも血糖値の上昇がゆるやかであった。【０１４４】
尿中アルブミン／クレアチニン比（図３３）はＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群で最も高く、ＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群では経時的な減少が認められた。また、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群ではＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群よりも値が減少した。【０１４５】
９−２．Ｐ１〜Ｐ３の細胞に賦活化処理を行ったＭＳＣの治療効果
実施例３の３−２．で得たＰ３のＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）（賦活化プロトコールを図３４Ａに示す）を用いて、上記９−１．と同様に治療効果の評価を行った（図３４Ｂ）。結果を図３５〜図３７に示す。【０１４６】
体重変化、血糖値、尿中アルブミン／クレアチニン比とも、９−１．と同様の、またはより明確な傾向を示した。なお、ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群およびＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群において、投与後８週時に尿中アルブミン／クレアチニン比の大幅な減少が観察されたが、これは、両群のマウスが悪液質の結果として低蛋白血症を発症し、その結果尿中にタンパク質が排泄されなくなったためと考えられる。【０１４７】
＜実施例１０  賦活化された間葉系幹細胞の糖尿病性腎症に対する治療効果（ラットモデル）＞
実施例１の抽出物によって賦活化されたＭＳＣについて、糖尿病性腎症モデルラットを用いて治療効果を評価した。以下に特に記述がないかぎり、実施例３の３−１．および３−２．、ならびに実施例９に記載された手法を用いた。【０１４８】
１０−１．Ｉ型糖尿病による糖尿病性腎症に対する治療効果
雄性ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病ラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で２回、抽出物を含まない培地または抽出物０．５ｍｇ／ｍＬ添加培地で１回継代培養し、得られたＰ３のＭＳＣ（それぞれＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋））を以下の試験に用いた（図３８Ａ）。【０１４９】
試験は、図３８Ｂに示す試験計画にしたがって行った。８週齢の雄性ＳＤラットに、５５ｍｇ／ｋｇ体重に相当する量のＳＴＺを含有するＳＴＺクエン酸緩衝液溶液５００μＬを尾静脈から静脈内投与し、ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病性腎症モデルラットを作製した。投与４週間後にラットを３群に分け、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群にはＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）を１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むα−ＭＥＭ培地（血清成分、抗生剤を含まない）を１０００μＬ、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群にはＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）を１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むα−ＭＥＭ培地を１０００μＬ、ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはビークルとしてα−ＭＥＭ培地を１０００μＬ、尾静脈から単回投与した。ＭＳＣまたはビークルの投与後０、１、４、７週目に採尿を行い、尿中アルブミンおよびクレアチニンを測定した。【０１５０】
尿中アルブミン／クレアチニン比の変化を図３９に示す。尿中アルブミン／クレアチニン比は、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ群ではＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群と同様に推移したが、ＳＴＺ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群では低下が認められ、腎機能の改善が示唆された。【０１５１】
１０−２．ＩＩ型糖尿病による糖尿病性腎症に対する治療効果
６月齢の雄性ＯＬＥＴＦ  ＩＩ型糖尿病モデルラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で２回、抽出物を含まない培地または抽出物０．５ｍｇ／ｍＬ添加培地で１回継代培養し、Ｐ３のＭＳＣ（それぞれＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）およびＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋））を得た。また、コントロールとして正常野生株ラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で３回継代培養して、Ｐ３のＭＳＣ（Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ）を得た（図４０Ａ）。これらのＭＳＣを以下の試験に用いた。【０１５２】
試験は、図４０Ｂに示す試験計画にしたがって行った。６．５月齢の雄性ＯＬＥＴＦラットを４群に分け、ＯＬＥＴＦ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群にはＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣを１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むα−ＭＥＭ培地を１０００μＬ、ＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ群にはＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（−）を１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むα−ＭＥＭ培地を１０００μＬ、ＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群にはＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ（＋）を１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むα−ＭＥＭ培地を１０００μＬ、ＯＬＥＴＦ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはビークルとしてα−ＭＥＭ培地を１０００μＬ、尾静脈から単回投与した。ＭＳＣまたはビークルの投与後１、３、６週目に体重測定、採血、採尿を行い、血糖値ならびに尿中アルブミンおよびクレアチニンを測定した。【０１５３】
尿中アルブミン／クレアチニン比の変化を図４１に示す。上記の試験と同じく、ＯＬＥＴＦ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群およびＯＬＥＴＦ−ＤＭ−ＭＳＣ−ＷＪ群において、尿中アルブミン／クレアチニン比の低下、すなわち腎機能の改善が認められた。【０１５４】
実施例９および１０の結果から、正常動物由来のＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣには糖尿病および糖尿病性腎症の治療効果がある一方、糖尿病動物由来のＤＭ−ＭＳＣは治療効果が弱いか、むしろこれら疾患を増悪する効果を持つこと、ＤＭ−ＭＳＣは臍帯組織抽出物を用いた賦活化処理により治療効果を回復することが示された。【０１５５】
＜実施例１１  臍帯組織抽出物による関節リウマチモデル動物由来間葉系幹細胞の賦活化、および賦活化された間葉系幹細胞の関節リウマチに対する治療効果＞
１１−１．間葉系幹細胞の採取および賦活化処理
７〜９週齢の雌性Ｌｅｗｉｓラット（日本ＳＬＣ）を用いて関節リウマチ（ＲＡ）ラットを作製した。関節炎の感作には、完全フロイントアジュバント（結核死菌２０ｍｇ／ｍＬ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）およびウシＩＩ型コラーゲン溶液（ＩＩ型コラーゲン２ｍｇ／ｍＬ、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）をそれぞれ等量混合してエマルジョンを作製し、１匹あたり結核死菌２ｍｇおよびＩＩ型コラーゲン０．２ｍｇを含むエマルジョンを尾根部に投与した。さらに、同濃度のエマルジョンを７〜１０日おきに４〜５回継続投与し、関節炎を発症させた。【０１５６】
関節炎の発症は、左右足部の腫脹、すなわち足部容積の変化により判定した。精密電子ばかり（精度０．０１ｇ、Ａ＆Ｄ）に水を入れた透明なプラスチック容器を設置し、ラットの足関節上部に引いたマーカーの位置まで後肢足部を水に挿入し静止させ、重さｍｇ（質量ｍ、重力加速度ｇ）（Ｎ）を計測した。重さｍｇと足部にかかる浮力Ｆ（Ｎ）は等しいことから、Ｆ＝ｍｇ＝ρＶｇであるため水の密度ρ＝０．９９９９（ｇ／ｃｍ３）として足部体積（ｃｍ３）を算出した。左右足部体積の合計４．５ｃｍ３以上を関節炎発症とした。【０１５７】
実施例３の３−１．および３−２．に記載された手法を用いて、エマルジョン初回投与から６週〜９週後の関節炎発症ＲＡラットまたは正常ラットから骨髄細胞を調製し、抽出物を含まない培地で２回、その後に抽出物を含まない培地または実施例１の抽出物１．０ｍｇ／ｍＬを含む培地で１回、継代培養を行った（図４３Ａ）。得られたＰ３のＭＳＣ（ＲＡ−ＭＳＣおよびＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ）を以下の試験に用いた。また、７週齢の正常野生株ラットの骨髄細胞を、抽出物を含まない培地で３回継代培養して得られたＰ３のＭＳＣ（Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ）も合わせて用いた。【０１５８】
１１−２．間葉系幹細胞の評価
ＲＡラット間葉系幹細胞の異常化を確認するため、１１−１．でＲＡラットまたは正常ラットから採取した骨髄細胞を別途、１０ｃｍ２培養皿に１ｘ１０６個播種し、Ｐ０として培養した。１０日後にそれぞれの培養皿をメタノール固定してＷｒｉｇｈｔ−Ｇｉｅｍｓａ染色を行い、直径２ｍｍ以上のコロニー数を計測した。コロニー形成数はＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ（７週齢）が２６個、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ（１２週齢）が２０個、ＲＡ−ＭＳＣ（１４週齢）が３個であり、ＲＡ−ＭＳＣでコロニー形成能の低下を認めた。【０１５９】
次に、本発明の抽出物による間葉系幹細胞の賦活化を確認するため、播種後４８時間および７２時間（抽出物添加後２４時間および４８時間）のＰ３のＲＡ−ＭＳＣ、ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪの増殖能を、実施例３の３−３．に記載された手法を用いて、ＭＴＴアッセイにより評価した。抽出物添加後２４時間および４８時間のいずれにおいても、ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪはＲＡ−ＭＳＣよりも増殖能が高かった（図４２Ａ）。【０１６０】
また、同様に調製したＰ３のＭＳＣについて、抽出物添加後４８時間で位相差顕微鏡による形態観察を行った。ＲＡ−ＭＳＣはＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣよりも胞体が広く平坦で、細胞数が少なかった。ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪでは、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ様に胞体が狭く紡錘形のＭＳＣを多く認めた（図４２Ｂ）。【０１６１】
さらにＰ２の細胞を１５０ｃｍ２培養皿に２．７〜３ｘ１０６個で播種した点以外は同様に調製したＰ３のＭＳＣについて、抽出物添加後４８時間でトリプシン処理を行って細胞を剥離し、それぞれの総細胞数を計測した。総細胞数は、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣが４．１×１０６個、ＲＡ−ＭＳＣが２．６×１０６個、ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪが６．４×１０６個であり、ＲＡ−ＭＳＣはＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣよりも少なく、ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪはＲＡ−ＭＳＣよりも多かった。【０１６２】
１１−３．関節リウマチに対する治療効果
１１−１．と同様に作製したエマルジョン初回投与から３０日後の関節炎発症ＲＡラット１２匹を４群（ｎ＝３）に分け、ＲＡ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群、ＲＡ−ＭＳＣ群、ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ群として処置した（図４３Ｂ）。Ｐ３として培養したＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ、ＲＡ−ＭＳＣ、ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪは１ｘ１０４個／ｇ（体重）を１ｍＬのα−ＭＥＭ培地で懸濁し尾静脈から投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群には、α−ＭＥＭ培地のみ１ｍＬ尾静脈投与した。処置後６日にはエマルジョンを初回感作の半量投与した。処置後０日をベースラインとし、処置後３日、５日、１１日の足部腫脹を計測した。さらに、足関節部（上部、後部、足根部）、中足部、足趾部（Ｍｅｔａｔａｒｓｏｐｈａｌａｎｇｅａｌ：ＭＴＰ関節、Ｐｒｏｘｉｍａｌ  Ｉｎｔｅｒ−ｐｈａｌａｎｇｅａｌ；ＰＩＰ関節）の目視観察を行い、腫脹および変形が認められた場合にそれぞれ０．１を加算することで、その合計点として関節スコアを算出した。さらに、Ｒａｔ  Ｃ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により血清ＣＲＰ値を測定した。【０１６３】
図４４に足部体積の変化を示す。足部腫脹は、処置後３日においてＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群およびＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ群で減少し、処置後５日、１１日においても低値を維持した。一方、ＲＡ−ＭＳＣ群およびＲＡ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群では足部腫脹は変化を認めなかった。ＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ群においては、処置後０日と比較して３日、５日、１１日で有意に腫脹が減少した。関節炎スコアにおいても、処置後１１日でＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群およびＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ群でＲＡ−ＭＳＣ群と比較して有意に関節炎は軽減した（図４５）。ＣＲＰ値は処置後１１日において、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群およびＲＡ−ＭＳＣ−ＷＪ群で減少していた（図４６）。【０１６４】
以上の結果から、正常動物由来のＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣには関節リウマチの治療効果がある一方、関節リウマチ動物由来のＲＡ−ＭＳＣは治療効果がないこと、ＲＡ−ＭＳＣは臍帯組織抽出物を用いた賦活化処理により治療効果を回復することが示された。【０１６５】
＜参考例１  間葉系幹細胞培養上清の糖尿病性腎症に対する治療効果＞
実施例３の３−２．で得たＰ３のＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣおよびこのＭＳＣの培養上清（ＭＳＣ−ＣＭ）について、糖尿病性腎症に対する治療効果を評価した。ＭＳＣ−ＣＭは、Ｐ３の培養液を遠心分離して得た上清を用いた。【０１６６】
参考例１−１．ＳＴＺ誘導Ｉ型糖尿病モデルマウスにおける評価
試験は、図４７に示す試験計画にしたがって行った。実施例９の９−１．と同様に作製したＳＴＺ投与マウスを３群に分け、ＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群にはＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣを１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むリン酸緩衝液２５０μＬを４週おきに２回投与し、ＳＴＺ−ＭＳＣ−ＣＭ群には２ｍｇ／ｋｇ（体重）のＭＳＣ−ＣＭを１日１回、週５日間投与した。また、ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはビークルとしてリン酸緩衝液２５０μＬを４週おきに２回、または１日１回、週５日間、投与した。実施例９の９−１．と同様に８週間の治療試験を行い、各種測定を行った。さらに、採取した腎臓の組織切片を作製し、ＰＡＳ染色およびＡｚａｎ染色を行った。【０１６７】
尿中アルブミン／クレアチニン比の結果を図４８に示す。ＳＴＺ−ＭＳＣ−ＣＭ群では正常群と同レベルにまで、尿中アルブミン／クレアチニン比が減少した。また、腎臓組織切片染色の顕微鏡観察像を図４９に示す。ＳＴＺ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群は正常群と比べて糸球体メサンギウム領域の拡大、細胞浸潤および尿細管間質の炎症細胞浸潤と尿細管のＰＡＳ染色陽性の変性した尿細管を認めた。また、糸球体周囲および尿細管間質にＡｚａｎ染色陽性となる線維化を認めた。これらの変化は、ＳＴＺ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群およびＳＴＺ−ＭＳＣ―ＣＭ群で抑制された。【０１６８】
参考例１−２．高脂肪食誘導ＩＩ型糖尿病モデルマウスにおける評価
試験は、図５０に示す試験計画にしたがって行った。８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに６０％ラードを含有する高脂肪食（Ｈｉｇｈ−Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２、日本クレア）を給餌し、糖尿病を誘導した。給餌開始から２８週間後、作製した高脂肪食誘導ＩＩ型糖尿病モデルマウスを３群に分け、ＨＦＤ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群にはＣｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣを１ｘ１０４個／ｇ（体重）含むリン酸緩衝液２５０μＬを２週おきに４回投与し、ＨＦＤ−ＭＳＣ−ＣＭ群には２ｍｇ／ｋｇ（体重）のＭＳＣ−ＣＭを１日１回、週５日間投与した。また、ＨＦＤ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群にはビークルとしてリン酸緩衝液２５０μＬを２週おきに４回、または１日１回、週５日間、投与した。８週間の治療試験を行い、実施例９の９−１．と同様に各種測定を行った。【０１６９】
尿中アルブミン／クレアチニン比の結果を図５１に示す。ＭＳＣ−ＣＭは、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣと同様に、尿中アルブミン／クレアチニン比を減少させた。また、腎臓組織切片染色の顕微鏡観察像を図５２に示す。ＨＦＤ−Ｖｅｈｉｃｌｅ群は正常群と比べて糸球体メサンギウム基質の増生とＰＡＳ染色陽性びまん性物質の沈着、糸球体毛細血管壁と基底膜の肥厚、輸出入動脈や細動脈壁の硝子様変化を認めた。さらに、近位尿細管上皮の冊子縁の変性（不均一化）を認めた。これらの変化は、ＨＦＤ−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣ群およびＨＦＤ−ＭＳＣ―ＣＭ群で抑制された。【０１７０】
上述の参考例１−１．および１−２．から、ＭＳＣ−ＣＭは、Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＭＳＣと同様の糖尿病性腎症治療効果を有することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明によれば、疾患治療効果が喪失もしくは低減した、またはむしろ疾患増悪効果を持つ異常な間葉系幹細胞を賦活化させることができる。賦活化された間葉系幹細胞は、様々な疾患の治療および／または予防に用いることができる。
【図１】
0006555691.tif 000005
【図２】
0006555691.tif 000006
【図３】
0006555691.tif 000007
【図４】
0006555691.tif 000008
【図５】
0006555691.tif 000009
【図６】
0006555691.tif 000010
【図７】
0006555691.tif 000011
【図８】
0006555691.tif 000012
【図９】
0006555691.tif 000013
【図１０】
0006555691.tif 000014
【図１１】
0006555691.tif 000015
【図１２】
0006555691.tif 000016
【図１３】
0006555691.tif 000017
【図１４】
0006555691.tif 000018
【図１５】
0006555691.tif 000019
【図１６】
0006555691.tif 000020
【図１７】
0006555691.tif 000021
【図１８】
0006555691.tif 000022
【図１９】
0006555691.tif 000023
【図２０】
0006555691.tif 000024
【図２１】
0006555691.tif 000025
【図２２】
0006555691.tif 000026
【図２３】
0006555691.tif 000027
【図２４】
0006555691.tif 000028
【図２５】
0006555691.tif 000029
【図２６】
0006555691.tif 000030
【図２７】
0006555691.tif 000031
【図２８】
0006555691.tif 000032
【図２９】
0006555691.tif 000033
【図３０】
0006555691.tif 000034
【図３１】
0006555691.tif 000035
【図３２】
0006555691.tif 000036
【図３３】
0006555691.tif 000037
【図３４】
0006555691.tif 000038
【図３５】
0006555691.tif 000039
【図３６】
0006555691.tif 000040
【図３７】
0006555691.tif 000041
【図３８】
0006555691.tif 000042
【図３９】
0006555691.tif 000043
【図４０】
0006555691.tif 000044
【図４１】
0006555691.tif 000045
【図４２】
0006555691.tif 000046
【図４３】
0006555691.tif 000047
【図４４】
0006555691.tif 000048
【図４５】
0006555691.tif 000049
【図４６】
0006555691.tif 000050
【図４７】
0006555691.tif 000051
【図４８】
0006555691.tif 000052
【図４９】
0006555691.tif 000053
【図５０】
0006555691.tif 000054
【図５１】
0006555691.tif 000055
【図５２】
0006555691.tif 000056
【配列表】
0006555691000001.app