(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルスロバクター・アジリス細菌のカロテノイドを含む抽出物、及び
ビタミンE又はその誘導体の一つから選択される抗酸化剤
を含む、化粧用、医薬用又は食事用組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、1wt%のトリプトン及び0.5wt%の酵母抽出物からなる培地中で前記細菌を培養することによって得られることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記抽出物が、定常期にある細胞から得られることを特徴とする、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
前記抽出物が、細菌ペレットから得られる無極性相に相当することを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌ペレットが抽出され、前記無極性相が、無極性溶媒、及び飽和塩溶液を加えることによって得られることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
前記細菌ペレットがアセトン及び/又はメタノールを使用して抽出されることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記無極性溶媒がヘキサンであることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
【請求項８】
前記飽和塩溶液がNaCl溶液であることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
【請求項９】
前記抽出物が、組成物の乾燥質量の0.0001から0.01%に相当することを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ローション、クリーム、ジェル、スプレー、溶液、カプセル又は錠剤の形態であることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載の化粧用組成物を皮膚に適用することからなる、酸化ストレスに抵抗するための、美容トリートメントの方法。
【請求項１２】
皮膚の細胞老化に抵抗するための、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
可視光からの保護剤としての、請求項1から10のいずれか一項に記載の化粧用組成物の美容的使用。
【請求項１４】
前記可視光が青紫色光であることを特徴とする、請求項13に記載の使用。
【請求項１５】
フリーラジカル捕捉剤又は抗酸化剤としての、請求項1から10のいずれか一項に記載の化粧用組成物の美容的使用。
【請求項１６】
タンパク質の保護剤としての、請求項1から10のいずれか一項に記載の化粧用組成物の美容的使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に化粧品に使用するためのアルスロバクター・アジリス(Arthrobacter agilis)の抽出物、より具体的にはカロテノイドに富んだ抽出物に関する。
【０００２】
具体的には、本発明は、外部からの攻撃によって引き起こされる、細胞の変質、特に皮膚の細胞の変質と戦うための、かかる抽出物によるフリー酸素ラジカル(ROS)及び光の照射(UV及び可視)からのタンパク質の保護の検出に依拠する。したがって、他の抗酸化剤と任意選択で組み合わせたかかる抽出物は、細胞老化を含めた酸化ストレスと戦うのに役立つ。
【背景技術】
【０００３】
ヒトを含めた好気性生物では、酸素は生存に必要であるが、その反応性代謝産物に関連する酸化的損傷の原因でもある。したがって、ROS(「活性酸素種」)又はROM(「活性酸素代謝産物」)という用語は、酸化的生物学的プロセスに関与している全てのフリーラジカル及び非ラジカル化学種を指すために通例使用され、その過剰は、変性プロセス及び疾患の増加する数の基と考えられている。より具体的には、ROSという用語は、スーパーオキシドラジカルアニオンO2-・、ヒドロキシルラジカルOH・、一重項酸素1O2及び過酸化水素H2O2、並びに酸化的プロセスにおいて有機分子から形成される、アルコキシラジカルRO・及びペルオキシラジカルROO・を含む。これらの代謝産物の外因源の生成は、紫外線照射(UV)等の物理的事象、又は生体異物等の化学的事象に本質的に依存する。また、内因的生成は、主にミトコンドリア中の呼吸鎖における電子の漏れによる。
【０００４】
形成プロセスに関わらず、これらの代謝産物は、高い反応性のために身体に危険であり、それらの作用は、多数の構造タンパク質、酵素、アミノ酸、DNA及びRNA、炭水化物、並びに脂質及びリン脂質を含む、様々な細胞成分に影響する。
【０００５】
UV照射の場合、反応種の生成以外に、細胞成分へのより直接的な物理的損傷があり得ることに留意されたい。したがって、UVは、DNAにおける変異、又は切断を引き起こし得るチミン二量体を誘発することが知られている。
【０００６】
反応性代謝産物の過剰な生成の場合、身体は、「酸化ストレス」と称されるプロセスに直面する。
【０００７】
これらの代謝産物によって引き起こされる損傷から防御するために、身体は、これらの物質の反応性を減少させる又はそれらを中和するために、酸化に対する防御系を発達させた。これらの系は、血清アルブミン(HSA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ又は小ペプチド等のタンパク質性でもよく、又はユビキノール、アントシアニン、フラボノイド、脂溶性ビタミン(例えばビタミンA及びE)及び水溶性ビタミン(例えばビタミンC)等の非タンパク質性でもよい。細胞は、修復系及び酸化された分子を分解する系も有する。
【０００８】
したがって、酸化ストレスと戦うために、天然の抗酸化物質に富んだ食事を採用し、反応種を中和できるビタミン類を含有する薬物又は栄養補助食品を摂取することは賢明である。美容の分野では、抗酸化剤は、酸化ストレスによる早老と戦うのに役立つ多くの製品に組み込まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Koch等(Int J Syst Bacteriol. 1995年、45(4):837〜9)
【非特許文献２】Fong等、2001年、Appl Microbiol Biotechnol. 56(5-6):750〜6
【非特許文献３】Ali-Cohen (1889) Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. 6:33〜36
【非特許文献４】Re等、Free Radic. Biol. Med. (1999) 26(9-10): 1231〜7
【非特許文献５】Ostling、O.及びK.J. Johanson. (Biochemical and biophysical research communications 123.1 (1984): 291〜298)
【非特許文献６】Singh、Narendra P.等(Experimental cell research 175.1 (1988): 184〜191)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そのため、栄養補助食品又は化粧用組成物中に組み込まれる、抗酸化活性を有する新しい分子又は新しい抽出物の探索が、長年の間、主要な課題となっている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、実質的な抗酸化活性を有する、好極限性細菌に由来する抽出物の同定に依拠する。フリーラジカルに及ぼす直接的な効果以外に、本出願は、UV又は可視光によって引き起こされる損傷に及ぼすかかる抽出物の特定の効果、より一般的には、タンパク質に及ぼす保護又は安定化効果並びに既知の抗酸化剤との相乗作用を示す。
【００１２】
したがって、本発明は、アルスロバクター・アジリス細菌の抽出物、より具体的にはこの細菌から得られるカロテノイドに富んだ抽出物に関する。
【００１３】
アルスロバクター・アジリス細菌は、例えば、Koch等(Int J Syst Bacteriol. 1995年、45(4):837〜9)によって報告されており、X80748の番号の下でデータベースで入手可能であり、以下の配列番号1の配列に相当する、その16S RNAの配列のおかげで、容易に同定することができる:
GATCCTGGCT CAGGATGAAC GCTGGCGGCG TGCTTAACAC ATGCAAGTCG AACGATGAAC
CTCACTTGTG GGGGGATTAG TGGCGAACGG GTGAGTAACA CGTGAGTAAC CTGCCCTTGA
CTCTGGGATA AGCCTGGGAA ACCGGGTCTA ATACTGGATA CGACCTTCTG GCGCATGCCA
TGTTGGTGGA AAGCTTTTGT GGTTTTGGAT GGACTCGCGG CCTATCAGCT TGTTGGTGGG
GTAATGGCCT ACCAAGGCGA CGACGGGTAG CCGGCCTGAG AGGGTGACCG GCCACACTGG
GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC
GCAAGCCTGA TGCAGCGACG CCGCGTGAGG GATGAAGGCC TTCGGGTTGT AAACCTCTTT
CAGTAGGGAA GAAGCCTGTC TTTTGGGTGG GTGACGGTAC CTGCAGAAGA AGCGCCGGCT
AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGGCGCAAG CGTTATCCGG AATTATTGGG
CGTAAAGAGC TCGTAGGCGG TTTGTCGCGT CTGCCGTGAA AGTCCGGGGC TTAACTCCGG
ATCTGCGGTG GGTACGGGCA GACTAGAGTG CAGTAGGGGA GACTGGAATT CCTGGTGTAG
CGGTGAAATG CGCAGATATC AGGAGGAACA CCGATGGCGA AGGCAGGTCT CTGGGCTGTA
ACTGACGCTG AGGAGCGAAA GCATGGGGAG CGAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAT
GCCGTAAACG TTGGGCACTA GGTGTGGGGG ACATTCCACG TTTTCCGCGC CGTAGCTAAC
GCATTAAGTG CCCCGCCTGG GGAGTACGGC CGCAAGGCTA AAACTCAAAG GAATTGACGG
GGGCCCGCAC AAGCGGCGGA GCATGCGGAT TAATTCGATG CAACGCGAAG AACCTTACCA
AGGCTTGACA TGAACCGGAA TGATGCAGAG ATGTGTCAGC CACTTGTGGC CGGTTTACAG
GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC
GCAACCCTCG TTCCATGTTG CCAGCGGGTT ATGCCGGGGA CTCATGGGAG ACTGCCGGGG
TCAACTCGGA GGAAGGTGGG GACGACGTCA AATCATCATG CCCCTTATGT CTTGGGCTTC
ACGCATGCTA CAATGGCCGG TACAAAGGGT TGCGATACTG TGAGGTGGAG CTAATCCCAA
AAAGCCGGTC TCAGTTCGGA TTGAGGTCTG CAACTCGACC TCATGAAGTT GGAGTCGCTA
GTAATCGCAG ATCAGCAACG CTGCGGTGAA TACGTTCCCG GGCCTTGTAC ACACCGCCCG
TCAAGTCACG AAAGTTGGTA ACACCCGAAG CCGGTGGCCT AACCCCTTGT GGGAGGGAGC
CGTCGAAGGT GGGACCGGCG ATTGGGACTA AGTCGTAACA AG
【００１４】
したがって、実施形態の特定の形によれば、使用する菌種は、例えば配列番号2の部分配列の、配列番号1の配列と90%若しくは95%若しくは99%を超える又は100%までもの同一性を有する配列によってコードされる16S RNAを有する。
【００１５】
実施形態の特定の形によれば、かかる抽出物は、カロテノイドを含有し、有利にはカロテノイドに富む。
【００１６】
本発明において、「カロテノイド」という用語は、赤から黄に及ぶ色及び吸収スペクトルによって特徴付けられる脂溶性色素を指す。それらは、多価不飽和脂肪族脂環式構造を有する、テルペノイドの化学ファミリーに属する。
【００１７】
上記のように、本発明による抽出物は、膜に基づくか又は細胞質であり得るカロテノイドを含有する。
【００１８】
有利には、例えばHPLC分析によって証明されるように、本発明の抽出物は、カロテノイドに富む。カロテノイドは、400から600nmの間、より具体的には450から550nmの間の最大吸収領域を有し、490nmに近い波長での「3本指」の吸収スペクトルによって同定可能である。更により好ましくは、カロテノイドは、抽出物の量の50%、60%、70%、80%又は更に90%を超えるまでに相当する。好ましくは、抽出物は、タンパク質及び/又はDNA及び/又は炭水化物を含まない。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、本発明による抽出物は、カロテノイドの種々の形態、好ましくは種々の異性体又はグリコシル化体を含む6つの主要な形態を含有する。
【００２０】
本発明による抽出物は、以下の条件下でアルスロバクター・アジリスを培養することによって有利に得られる:
【００２１】
使用する培地は、典型的には、塩を有さず、1wt%のトリプトン及び0.5wt%の酵母抽出物を含有するLB培地である。代わりに、R2A (Koch等、1995年、Int J Syst Bacteriol. 45(4):837〜9)及びBacto Marine 2216  培地(Fong等、2001年、Appl Microbiol Biotechnol. 56(5-6):750〜6)を考慮することもできる。
【００２２】
細胞を、20から30℃の間、例えば25℃の温度で好ましくは培養する。
【００２３】
増殖は、好気性条件では、好ましくは空気又は酸素エアレーションバブル下で起こり得る。
【００２４】
本発明による抽出物は、定常期にある細胞から、すなわち典型的に上記の条件下の増殖の3日後に好ましくは得られる。
【００２５】
抽出物を得るために、細菌の細胞に、抽出/精製プロトコールを施して、カロテノイドを単離し、精製する。カロテノイドの脂溶性のために、本発明の主題である抽出物の取得は、無極性相の単離に好ましくは依拠する。
【００２６】
第1のステップでは、好ましくは脂質、タンパク質及びDNAを除いて、膜及び細胞質の成分が抽出される。適切に、極性溶媒を使用して、膜を「壊し」、多数の親水性及びいくらかの親油性分子を可溶化する。
【００２７】
したがって、例として、細菌ペレットを、アセトン、メタノール又はアセトン及びメタノールの混合物(例えば体積で1/5)を使用して抽出することができる。
【００２８】
第2のステップでは、無極性溶媒、好ましくはヘキサン、及び飽和塩水溶液、好ましくは飽和NaCl溶液を加えることで、本発明の範囲内の抽出物に相当する、二相性の混合物、すなわち一方が水性相及び他方が無極性相の混合物を得ることができる。有利には、水性相は、必要な場合、無極性溶媒を使用して数回洗浄することができる。
【００２９】
次いで、無極性相を合せて、真空下で蒸発させる。それによって得られた抽出物を、冷所で保管することができ、凍結させることもできる。
【００３０】
これが細菌の抽出物であり、培養上清でないことはこの方法から明らかである。
【００３１】
実施形態の第1の形によれば、本発明による抽出物は、粉末として乾いた形で使用される。代わりに、ペレットには、任意の適した親油性相が含まれ得る。本発明による化粧用用途の一部として、抽出物は、油、プロパンジオール又はマイクロエマルジョン中に好ましくは取り込まれる。
【００３２】
乾燥した抽出物から再構成される組成物のカロテノイド濃度は、例えばDMSOにおける512nmでの又はプロパンジオールにおける502nmでの吸光度を測定することによって、容易に測定することができる。
【００３３】
抽出及び精製の種々の段階を、抽出物の任意の劣化を避けるために、好ましくは暗条件で又は薄明かりで光から離れて行うことに留意すべきである。
【００３４】
本出願に関して実証され、以下で議論される顕著な特性により、かかる抽出物は、特に化粧用組成物、医薬組成物又は栄養補助食品において使用することができる。
【００３５】
第1の態様によれば、本発明は、アルスロバクター・アジリス細菌の抽出物を含む化粧用組成物に関する。実施形態の好ましい形によれば、化粧用組成物は、カロテノイドに富むアルスロバクター・アジリス細菌の抽出物を含む。
【００３６】
本発明による化粧用組成物は、好ましくは局所用（外用）であり、皮膚及び場合により頭髪に適用されることが目的とされている。この組成物は、化粧品において通例使用される任意の成分又は添加剤を含有することができる。換言すれば、化粧用組成物、少なくとも1つの化粧品として許容される添加剤を含み、かかる組成物において使用される全ての添加剤は、化粧品として許容されるものでなければならない。
【００３７】
メタノールは、化粧品として許容される添加剤であると特に考えられないことに留意すべきである。したがって、実施形態の特定の形によれば、本発明による化粧用組成物は、メタノールを含有しない。
【００３８】
本発明による化粧用組成物は、ローション、クリーム、ジェル、スプレーの形態又は任意の他の形態であり得る。
【００３９】
実施形態の特定の形によれば、本発明による化粧用組成物は、ピンク色に近い色を有する。
【００４０】
別の態様によれば、本発明は、アルスロバクター・アジリス細菌の抽出物を含む医薬組成物に関する。実施形態の好ましい形によれば、医薬組成物は、カロテノイドに富んだ、アルスロバクター・アジリス細菌の抽出物を含む。
【００４１】
本発明による医薬組成物は、特に、局所的又は経口投与が目的とされ得る。それは、製薬において通例使用される任意の成分又は添加剤を含有することができる。換言すれば、医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される添加剤を含み、かかる組成物において使用される全ての添加剤は、薬学的に許容されるものでなければならない。
【００４２】
メタノールは、薬学的に許容される添加剤であると特に考えられないことに留意すべきである。したがって、実施形態の特定の形によれば、本発明による医薬組成物は、メタノールを含有しない。
【００４３】
医薬組成物は、ローション、クリーム、ジェル、スプレーの形態、又は滴剤、カプセル、錠剤等の任意の他の形態であり得る。
【００４４】
かかる医薬組成物は、例えば、特にある種の網膜症例(ARMD等)を処置するために、眼科において使用し、慢性肝疾患又は虚血再灌流後の過酸素症の処置において、使用してもよい。より一般的には、酸化ストレスが持続的にタンパク質を損傷し得る病状も示される。
【００４５】
同様に、本発明による組成物は、栄養補助食品でもよい。
【００４６】
本発明による組成物は、本発明の主題である抽出物に加えて、他の活性薬剤も含有することができる。
【００４７】
これは、分子の種々のクラス、特にカロテノイド、チオール又はフェノール類をカバーする他の抗酸化剤を含むことができる。
【００４８】
本発明による抽出物との相乗効果が実証された、かかる抗酸化剤の非網羅的なリストは、以下である:
-  ビタミンE又はトロロクス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)等のその誘導体;
-  N-アセチル-システイン(NAC);
-  ブチル-ヒドロキシ-アニソール(BHA);
-  ビタミンC;
-  グルタチオン;
-  コーヒー酸又は(E)3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパ-2-エン酸;
-  クルクミン又はジフェルロイルメタン;
-  ケルセチン又はケルセトール;
-  リコピン;
-  コエンザイムQ10(Q10);
-  尿酸。
【００４９】
緑茶抽出物、つる植物苗条抽出物、アルガンの木の葉の抽出物、グレープフルーツ抽出物、桑の葉抽出物及び/又はリンゴ抽出物等の植物抽出物も、本発明による抽出物と関連し得る。
【００５０】
抽出物及び薬剤の濃度はそれぞれ、2つの間の相乗作用が十分に表出されるように、当業者によってケースバイケースで決定される。したがって、抽出物及び補充剤の濃度は、探求される抗酸化効果に最適化されていなければならない。
【００５１】
好ましくは、乾いた抽出物は、本発明による組成物の質量の0.00001(10-5)から0.1(10-1)%、すなわち0.0001(10-4)から0.01(10-2)%に相当する。
【００５２】
本出願に関して実証された顕著な特性により、かかる組成物は、特に老化に対して(抗老化効果)又は日焼け止め(抗UV効果)のために使用することができる。
【００５３】
別の態様では、本発明は、皮膚上に本発明による化粧用組成物を適用することからなる、好ましくは酸化ストレス、特に皮膚の細胞老化に抵抗するための、美容トリートメントの方法を提供する。酸化ストレスは、放射線(UV及び/又は可視)への曝露によっても引き起こし得るが、本発明による組成物は、それに対して特に効果的である。
【００５４】
本発明による抽出物の第1の考え得る使用は、特に以下のフリーラジカルに対する、フリーラジカル捕捉剤としての使用である:スーパーオキシドラジカルO2・-;過酸化水素H2O2;次亜塩素酸イオンClO-;ヒドロキシルラジカルOH・;Rが炭素鎖である、ペルオキシド又はアルコキシ(RO・)ラジカル(ROO・);不飽和脂肪酸に由来するラジカル;ペルオキシナイトライトONOO・;一酸化窒素NO・;一重項酸素1O2。
【００５５】
本発明による抽出物は、UV-A(400〜315nm)、UV-B(315〜280nm)及び/又はUV-C(280〜153nm)に対する、特にUV-Cに対するUV安定剤としても使用することができる。注目すべきことに、本発明による抽出物がいくつかの作用機構を通して抗UV効果を及ぼしたことが示された:
-  UVによって生成された一重項酸素(1O2)を中和する効果;
-  直接的なUV吸収による「スクリーン」、「フィルター」又は「遮蔽」効果;
-  古典的な抗酸化効果、すなわち一重項酸素(1O2)によって生成されたフリーラジカルの中和。
【００５６】
すでに示したように、本発明による抽出物は、可視光、特に青紫色光(典型的には400から500nmの間の波長)からの保護にも有利である。
【００５７】
更に、本発明による抽出物は、タンパク質に及ぼす保護効果を有する。したがって、かかる抽出物は、タンパク質を安定化し、保護する能力がある。
【００５８】
本出願で実証されたように、このプロテオーム保護は、特にカルボニル化に対して働くはずである。より一般的には、本出願は、プロテオームに及ぼすカロテノイドに富んだ抽出物の保護潜在力を実証する。
【００５９】
したがって、別の態様によると、本発明は、プロテオームを保護するためのカロテノイドの使用に関する。
【００６０】
上記のように、実証された相乗作用を考慮して、本発明による抽出物を、好ましくは以下のリストから選択される、他の活性薬剤、特に抗酸化剤と組み合わせて、これらの様々な適用に使用することができる:
-  ビタミンE又はトロロクス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸)等のその誘導体;
-  N-アセチル-システイン(NAC);
-  ブチル-ヒドロキシ-アニソール(BHA);
-  ビタミンC;
-  グルタチオン;
-  コーヒー酸又は(E)3-(3,4-ジヒドロキシフェニル)プロパ-2-エン酸;
-  クルクミン又はジフェルロイルメタン;
-  ケルセチン又はケルセトール;
-  リコピン;
-  コエンザイムQ10(Q10);
-  尿酸。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】SB5株の倒立顕微鏡(inverse microscopy)の画像(拡大率×100)に相当する図である。
【図２】本発明によるSBE抽出物のHPLCスペクトル及び6つの主要なピーク(1から6に類別した)のそれぞれに関する吸光度スペクトルを示す図である。
【図３】トロロクス当量として表される、他の既知の抗酸化剤と比較した、ABTSアッセイを使用して測定された本発明による抽出物(SBE)の抗酸化力を示す図である。
【図４Ａ】トロロクス当量として表される、他の抗酸化剤と比較した、フリーラジカルに対する本発明による抽出物(SBE)のタンパク質の保護能力を示す図である。
【図４Ｂ】図4Aの保護能力をHPLCにおいて観察された6つのピークに相当する画分の保護能力と比較する図である。
【図５】トロロクス当量として表される、他の抗酸化剤と比較した、UVに対する本発明による抽出物(SBE)のタンパク質の保護能力を示す図である。
【図６】本発明による抽出物(SBE)の濃度に依存する、アルカリホスファターゼ(AP)の活性のモニタリングを示す図である。
【図７】トロロクス当量として表される、フリーラジカルに対する他の抗酸化剤と混合した本発明による抽出物(SBE)のタンパク質の保護能力を示す図である。
【図８】コメットアッセイを使用して酢酸トコフェロールと比較した、フリーラジカル及びUVに対する本発明による抽出物(SBE)のヒト細胞(ケラチノサイト)及びそれらのDNAの保護能力を示す図である。
【図９】酢酸トコフェロールと比較した、UV/可視光照射に対する本発明による抽出物(SBE)のヒト細胞(ケラチノサイト)及びそれらのタンパク質の保護能力を評価するタンパク質カルボニル化の測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明を生み出すことができる方式及びそこから生じる利点は、添付の図の助けを得て、大まかな指針及び非網羅的なリストの一部として示す以下の実施形態により、理解が深められよう。
【００６３】
1/SB5株の単離及び特徴付け:
細菌(SB5)を、落雪中で単離し、そのUVCに対する耐性及びその急速に増殖する能力に関して選択した。それは、その多くの種が好極限性細菌又は極限耐性細菌(extremotolerant)であるグラム陽性細菌である、アルスロバクターに属するとして特徴付けられている。
【００６４】
具体的には、単離された細菌は、アルスロバクター・アジリスの株である。アルスロバクター・アジリスは、1889に最初単離された(Ali-Cohen (1889) Zentralbl. Bakteriol. Parasitenkd. Infektionskr. Hyg. Abt. 1 Orig. 6:33〜36)、0から3つの鞭毛を有し得る(Koch等(1995) Int J Syst Bacteriol. 45(4):837〜9)、直径が0.8から1.2mmである、非芽胞性及び非病原性グラム陽性球菌様細菌である。
【００６５】
図1は、アルスロバクター・アジリス細菌の説明と一致した、単離された株の倒立顕微鏡画像を示す。
【００６６】
更に、SB5株がアルスロバクター・アジリス種に属するという事実が、その16S RNAの部分的な配列決定によって確認された。相当する配列(配列番号2)は、以下の通りであり、塩基Nは、ヌクレオチドが、A、C、G又はTに相当したか決定されないことを示している:
ACATGCAAGT CGAACGATGA ACCTCACTTG TGGGGGGATT AGTGGCGAAC GGGTGAGTAA
CACGTGAGTA ACCTGCCCTT GACTCTGGGA TAAGCCTGGG AAACCGGGTC TAATACTGGA
TACGACCTTC TGGCGCATGC CATGTTGGTG GAAAGCTTTT GTGGTTTTGG ATGGACTCGC
GGCCTATCAG CTTGTTGGTG GGGTAATGGC CTACCAAGGC GACGACGGGT AGCCGGCCTG
AGAGGGTGAC CGGCCACACT GGGACTGAGA CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG
TGGGGAATAT TGCACAATGG GCGCAAGCCT GATGCAGCGA CGCCGCGTGA GGGATGAAGG
CCTTCGGGTT GTAAACCTCT TTCAGTAGGG AAGAAGCCGG CCTTTTGGGT TGGTGACGGT
ACCTGCAGAA GAAGCGCCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCA
AGCGTTATCC GGAATTATTG GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGTTTGTCGC GTCTGCCGTG
AAAGTCCGGG GCTTAACTCC GGATCTGCGG NGGGTACGGG CAGACTAGAG TGCAGTAGGG
GAGACTGGAA TTCCTGGTGT AGCGGTGAAA TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGATGGC
GAAGGCAGGT NTCTGGGCTG TAACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCATGGGG AGCGAACAGG
ATTAGATACC CTGGTAGTCC ATGCCGTAAA CGTTGGGCAC TAGGTGTGGG GGACATTCCA
CGTTTTCCGC GCCGTAGCTA ACGCATTAAG TGCCCCGCCT GGGGAGTACG GCCGCAAGGC
TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGCG GAGCATGCGG ATTAATTCGA
TGCAACGCGA AGAACCTTAC CAAGGCTTGA CATGAACCGG AATGATGCAG AGATGTGTCA
GCCACTTGTG GCCGGTTTAC AGGTGGTGCA TGGTTGTCGT CAGCTCGTGT CGTGAGATGT
TGGGTTAAGT CCCGCAACGA GCGCAACCCT CGTTCCATGT TGCCAGCGGG TTATGCCGGG
GACTCATGGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG GGGACGACGT CAAATCATCA
TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT TCACGCATGC TACAATGGCC GGTACAAAGG GTTGCGATAC
TGTGAGGTGG AGCTAATCCC AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGAGGTC TGCAACTCGA
CCTCATGAAG TTGGAGTCGC TAGTAATCGC AGATCAGCAA CGCTGCGGTG AATACGTTCC
CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCAAGTCA CGAAAGTNGT AACACCCGAA GCCGGNGCCT
AACCCCTTGN GGAGGGAGCC
【００６７】
この配列は、事実上、配列番号1の参照配列との99.2%を超える同一性を示し、この株がアルスロバクター・アジリス種に属することを裏づけている。
【００６８】
2/SBE抽出物の調製:
2-1.SB5株の培養:
株を、約3日後に定常期に達するまで、好気的に、活発に撹拌しながら、25℃の温度で塩を有さないLB培地中で培養する。
【００６９】
次いで細胞を、典型的に5000rpmの速度で約15分間、遠心分離によって採取する。次いでペレットを、暗所で4℃での保管によって乾燥させる。
【００７０】
2-2.SBE抽出物の単離:
ペレットを、任意選択でメタノールの存在下（例えば、メタノール/アセトン混合物(5/1)）で、ペレットのグラム当たり6mlのアセトンで採取する。この抽出ステップは、暗所で4℃で、数時間、典型的に18時間の間行う。
【００７１】
アセトン、又はアセトン/メタノール混合物中の懸濁を、好ましくはアセトンの半分の体積でのヘキサンの追加によって、完了する。次いで、一方は水性相で他方は無極性相の二相性の混合物が分離するまで、NaCl(塩化ナトリウム)の飽和溶液を加える。好ましくは、水性相を、ヘキサンを使用して再び抽出し、ヘキサン相を合わせる。
【００７２】
無極性又はヘキサン相を、好ましくは真空下で25℃で蒸発させる。
【００７３】
SBE抽出物は、そのままで-20℃で保存することができるか、又は生細胞上で試験される、例えばDMSO(ジメチルスルホキシド)又はTHF(テトラヒドロフラン)又はプロパンジオール中の溶液として取ることができ、ジクロロメタン及びアセトンに高溶解性である。
【００７４】
カロテノイド濃度は、DMSOにおける512nmでの又はプロパンジオールにおける502nmでの吸光度を測定することによって決定される。
【００７５】
抽出物のHPLCスペクトル及び6つの主要なピークのそれぞれに関する吸光度スペクトルを図2に示す。文献データ(Fong等、Appl Microbiol Biotechnol (2001) 56: 750〜756)とのこれらのスペクトルの比較は、抽出物が、490nm付近の3本「指」の特性吸収スペクトルを有し、著しい量のカロテノイドを含有することを示した。Fong等、(Appl Microbiol Biotechnol (2001) 56: 750〜756)において報告されているように、吸収スペクトルは、これらのカロテノイドのグリコシル化体及び種々の異性体の存在も明らかにした。
【００７６】
3/SBE抽出物の活性:
3-1.ABTSアッセイ:
上記のように、このアッセイは、化粧品及び農業食品産業において従来から使用されており、純化学的に、抽出物の「総抗酸化能力」を確立するのに役立つ。このアッセイは、特定種類のラジカルを扱う場合のみ抽出物の抗酸化活性が測定されるので、不完全であるが、それは、トロロクスによる標準化を介して、このように試験された数千の他の分子と比較できる結果を生成するという利点を有する。
【００７７】
このアッセイを、Re等、Free Radic. Biol. Med. (1999) 26(9-10): 1231〜7において報告されているように行った。
【００７８】
図3は、本発明による抽出物(SBE)が、参照抗酸化剤、トロロクスの抗酸化能力の4倍を超える高さの抗酸化能力を示すことを示している。
【００７９】
本発明に関して、試験する生成物のモル数に相当するトロロクス当量は、1モルのトロロクスの効果と同等の効果を得るのに役立つ。本発明による抽出物を、抽出物のマーカーとしてのカロテノイドの使用で、定量化した。したがって、1モルのSBE抽出物は、最大吸収に相当する波長での吸光度で測定し、カロテノイドのモル吸光係数から差し引かれた1モルのカロテノイドに相当する。
【００８０】
3-2.フリーラジカルからのタンパク質の保護:
この試験は、前記化合物又は抽出物のタンパク質に対する保護能力を評価するために、フリーラジカル、特にヒドロキシル(OH・)、及び化合物又は抽出物の存在下でアルカリホスファターゼ(AP)の活性を405nmで測定することからなる。
【００８１】
材料及び方法:
試薬:
緩衝液:「トリス緩衝生理食塩水」粉末(Sigma社;製品参照番号:T6664-10PAK);
酵素:緩衝グリセロール溶液中の125U/μLでのアルカリホスファターゼ10KU(Sigma社;製品参照番号:P0114);
酸化剤:
1/30%又は9Mでの過酸化水素(Sigma社;製品参照番号:H1009-5ML):溶液B1;
2/硫酸鉄II七水和物(FeSO4,7H2O)0.1M(Fluka社;製品参照番号:44970):溶液B2;
基質:4-ニトロフェニルリン酸の溶液(「アルカリホスファターゼ黄色基質」;Sigma社;製品参照番号:P7998-100ML)。
キット:
-  96-ウェルプレート;
-  緩衝液:20mlのTBS溶液-0.05M、pH8;
-  溶液A(酵素):緩衝液に1/1000(又は1.25Uすなわち0.125U/μL)で希釈された10μlの原液;
-  100μlの溶液B1及び100μlの溶液B2又は緩衝液中での適した希釈度での溶液B1及びB2の混合物に相当する溶液B(例えば30μlの溶液B1+30μLの溶液B2、すなわち1/100希釈から得られる、90mMでの3mlの溶液B);
-  溶液C(基質):5mlの市販の溶液。
プロトコール:
-  適した希釈度で緩衝液において溶液Aを希釈する;
-  0.005から0.05Uの間の酵素量を有するように、各ウェルに10μlの希釈された溶液Aを挿入する;
-  緩衝液において任意選択で希釈された、10μlの試験される生成物又は抽出物を各ウェルに加える。個々のウェルを使用して、一連の希釈度を試験することができる;
-  30μlの溶液Bを各ウェルに加える。溶液Bの濃度を調節して、存在する酵素の量の90%の不活性化を得る。溶液Bの濃度の30%に等しい酸化剤の最終濃度;
-  撹拌せずに37℃で15分間インキュベートする;
-  50μlの溶液Cを加える。したがって、反応体積は、100μlに等しい;
-  プレートを撹拌しながら37℃で設置する;
-  吸光度を、405nmで反応の20分間(動態学的)、又は反応の5分後に(選択的)読む。
【００８２】
結果:
図4Aは、本発明による抽出物(SBE)が、トロロクスの保護能力より約100倍高く、試験した全ての抗酸化剤の6倍を超える高さの、フリーラジカルからのタンパク質の保護能力を有することを示している。この結果とABTSによって測定された抗酸化潜在力間の差は、タンパク質の保護がSBEの抗酸化潜在力のみに連結しているわけではないことを実証している。
【００８３】
更に、同じ技法を使用して、HPLC分析によって同定された6つの主要なピークに相当する6つの画分(SB1からSB6に類別した)の効果を、総抽出物SBEの効果と比較した。
【００８４】
SBE抽出物が、それが含むピークのそれぞれの保護能力よりも2から4倍高い、フリータンパク質ラジカルに対する保護能力を有し、抽出物の様々な画分間の相乗効果を実証していることが図4Bから明らかである。
【００８５】
3-3.UVからのタンパク質の保護:
この試験は、前の節で記載したものと同様である。それは、前記化合物又は抽出物のタンパク質からの保護能力を評価するために、化合物又は抽出物の存在下で、UV-C(254nm)を使用して照射されたアルカリホスファターゼ(AP)の活性を405nmで測定することからなる。
【００８６】
材料及び方法:
アルカリホスファターゼを、UV-Cに相当する254nmでのUV照射に供する。一定の撹拌下で、酵素の90%の不活性化を生じるUV線量を、上記のものと同様の条件下で反応媒体に適用した。酸化剤によって占められる体積は、緩衝液と交換されることに留意すべきである。実際に、1又は2時間の曝露時間で0.0365J/cm2/分ランプに等しい力を有するランプ。
【００８７】
結果:
図5は、本発明による抽出物(SBE)が、トロロクスの保護能力の300倍を超える高さであり、試験した全ての抗酸化剤よりもほぼ40倍大きい、UVからのタンパク質保護能力を有することを示している。
【００８８】
本発明による抽出物のこの非常に強い保護能力は、以下のものの存在下で、抽出物のいくつかの複合効果によって説明することができる:
-  UVによって生成された一重項酸素(1O2)を中和する効果;
-  直接的なUV吸収による「スクリーン」、「フィルター」又は「遮蔽」効果;
-  古典的な抗酸化効果、すなわち一重項酸素(1O2)によって生成されたフリーラジカルの中和。
【００８９】
3-4.タンパク質の保護:
アルカリホスファターゼの活性を、酸化ストレスの非存在下であるが、本発明による抽出物(SBE)の増加する濃度の存在下で測定した。
【００９０】
図6は、AP活性が、非常に低い用量での本発明による抽出物(SBE)の存在下で増加することを示している。この増加は、インキュベーション及び撹拌中の酵素の保護により得る。-20℃で保管された酵素の酸化のいくらかは、「若返り法」によってその活性を増加させるSBE抽出物によって減少されるとも考えられる。
【００９１】
図6に基づくと、本発明による抽出物(SBE)の適した濃度は、0.001から100μMの間、好ましくは0.1から1μMの間である。しかしながら、これらは、皮膚の標的細胞において達成されるべき濃度である。したがって、化粧用組成物における濃度は、皮膚浸透に関連する損失を考慮するために、はるかに高くあるべきである。
【００９２】
酵素と抽出物の間の相互作用は、この「ブースティング」作用の原因であろう。したがって、本発明による抽出物は、身体においてタンパク質、特に、酸化ストレスからの身体の保護又は酸化的損傷の修復に直接的に関与しているものを保護しそうである。
【００９３】
3-5.他の抗酸化剤との相乗作用:
本発明による抽出物(SBE)によるタンパク質保護の有効性を増加させることができる抗酸化剤を同定するために、3-2節で記載した試験を、本発明による抽出物(SBE)と1ダースの既知の抗酸化剤を個々に混合することによって行った。本発明による抽出物(SBE)が抗酸化効果を複合する分子を同定すること、又は相加効果を超える相乗作用を強調することが必要である。かかる混合物の別の利点は、本発明による抽出物(SBE)の可能な安定化である。
【００９４】
図7は、試験した全ての抗酸化剤の存在下で、特にトロロクスの存在下で、本発明による抽出物(SBE)が強い相乗作用を有し、これはフリーラジカルからのそのタンパク質保護能力を著しく増加させる(トロロクスで5倍に)ことを示している。
【００９５】
3-6.ヒト細胞の保護:
A/コメットアッセイ:
本発明による抽出物(SBE)によるヒト細胞の保護を確認するために、UV/可視光によって誘発された酸化ストレスに直面しているケラチノサイトの初代培養物及びそれらのDNAを保護する措置を、Ostling、O.及びK.J. Johanson. (Biochemical and biophysical research communications 123.1 (1984): 291〜298)並びにSingh、Narendra P.等(Experimental cell research 175.1 (1988): 184〜191)によって報告されたように、コメットアッセイを通して行った。細胞モデルにおける本発明による抽出物(SBE)の保護活性を示し、それを参照抗酸化剤、酢酸トコフェロールと比較することは必須である。
【００９６】
材料及び方法:
UVB/UVA/可視放射線(照射:290nm〜800nm)に対するSBE及び酢酸トコフェロール(Ac-Toc)の抗酸化特性を、正常なヒトケラチノサイトの初代培養物上でコメットアッセイ(アルカリ変法)によって評価した。
【００９７】
抗酸化特性を、SBEに関して500nMの濃度で、Ac-Tocに関して50μMの濃度で、評価した。両方の生成物を、1%の最終濃度でテトラヒドロフランに溶解した。抗酸化特性を、UVB/UVA/可視照射(290〜800nm)後に生じる、細胞のDNAの一本鎖切断の数を減少させる能力として定義し、これらの特性を37℃で120分間の生成物との接触後に測定した。放射線を、ソーラーシミュレーターSuntest CPS+(Atlas Material Testing Technology BV社, Moussy le Boeuf, France)によって送達した。総放射線量は、2.7分の期間で12.0J/cm2であった(ランプの定格出力-750W/m2)。陰性対照は、THF(1%)によって、並びに1%THF中のAc-Toc(50μM)及びSBE(500nM)によって処置された非照射ケラチノサイトを含んだ。
【００９８】
結果:
図8は、本発明による抽出物(SBE)が、酸化ストレスからの高い細胞保護能力を有し、100倍少なく濃縮されているのに、酢酸トコフェロールよりも細胞DNAを保護するのに役立つことを示している。したがって、そのin vitroの保護能力は、酢酸トコフェロールの保護能力の100倍を超える大きさである。
【００９９】
B/カルボニル化試験:
コメットアッセイに関して上記で使用したものと同じUV/可視照射プロトコールに従って、SBE及び酢酸トコフェロールの存在下でのケラチノサイトのカルボニル化の速度を測定した。
【０１００】
材料及び方法:
1-ケラチノサイトの培養及び照射
-  正常なヒトケラチノサイト(NHK)(T6)-106細胞/条件
-  条件:
-  1%THF溶媒対照
-  SBE 200nM
-  酢酸トコフェロール20μM
-  各条件を、三連で行う。
-  2時間の種々の実験条件におけるKHNとの接触。
-  4℃でのSuntest CPS+ソーラーシミュレーター(Atlas Material Testing Technology社)によるPBSに置かれた細胞の120kJ/m2でのUVB/UVA/可視照射。陰性対照を、照射と同じ期間、4℃で維持する。
-  照射後の細胞のトリプシン処理。氷で冷やしたPBSの水洗。PBSの除去及び-80℃での細胞ペレットの即時の凍結。
2-カルボニル化の測定
-  タンパク質を、細胞の溶解後に抽出し、それらの濃度を、Bradford試験を使用して測定する。
-  タンパク質を、カルボニル基に結合する、2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)によって引き出す。
-  次いで、カルボニル化速度を、450nmでELISAプレート上で測定する(OxyELISA(商標) Oxidized Protein Quantitation Kit, Millipore)。
【０１０１】
結果:
図9は、ケラチノサイトのタンパク質のカルボニル化の速度が、UV/可視照射後に著しく増加することを示している。この増加は、酸化からタンパク質を保護する、SBE抽出物又は酢酸トコフェロールの追加によって有意に減少する(P値<0.01)。SBE抽出物は100倍少なく濃縮されているが、この保護は、SBE及び酢酸トコフェロールに関して同様である(P値>0.01)。
【０１０２】
わずかに弱いが、SBEのプロテオーム保護能力は、コメットアッセイを通して観察されたものと同じであり、酢酸トコフェロールの保護能力の100倍であり、これはアルカリホスファターゼ(AP)の活性の測定に基づいて以下で得られた結果に一致する。
【０１０３】
コメットアッセイを使用して観察された細胞の保護は、プロテオームを保護するSBEの能力によって主に駆動されたように見える。
【０１０４】
4/SBE抽出物の化粧用組成物
化粧用組成物は、0.0001から0.01wt%の本発明による抽出物(乾いた)を典型的に含む。
【０１０５】
クリームは、以下の組成(質量%)を有することができ、薬剤は、イソノナン酸イソノニル中に好ましくは組み込まれた本発明による抽出物を含む。
【０１０６】
【表１】
0006456357.tif 000002
【０１０７】
典型的に、これらの組成物は、本発明による抽出物の色のために、薄いピンクから赤にわたる色を有し得る。
【０１０８】
これらの実施形態は、(藻類植物、ラン藻、真菌等を含めた多くの種において見出される)カロテノイド源としてのアルスロバクター・アジリス細菌の特定の選択が、本出願の枠内で予想外の利点を有することを示している:
-  細菌の比較的容易な培養及び抽出物の調製(好塩菌を含めた多くの好極限性微生物とは異なる);
-  抽出物の異なる画分間の相乗作用;
-  抽出物の全体的な活性における異なるアイソフォームの寄与(例えばディノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)のデイノキサンチンのみとは異なる);
-  既知の抗酸化剤と比較して非常に強い抗ラジカル及び抗UV活性;
-  既知の抗酸化剤との相乗作用;
-  抗酸化能力をしのぐ、プロテオームに対するこれまでにない保護効果:生化学的試験並びに細胞培養の両方に関して、SBE抽出物の抗酸化能力は、トロロクスの抗酸化能力よりも4倍高い一方、タンパク質を保護するその能力は、トロロクスの能力よりも100倍強い。
【図１】
0006456357.tif 000003
【図２】
0006456357.tif 000004
【図３】
0006456357.tif 000005
【図４Ａ】
0006456357.tif 000006
【図４Ｂ】
0006456357.tif 000007
【図５】
0006456357.tif 000008
【図６】
0006456357.tif 000009
【図７】
0006456357.tif 000010
【図８】
0006456357.tif 000011
【図９】
0006456357.tif 000012
【配列表】
0006456357000001.app