(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体の液体溶液を調製する方法であって、以下の工程からなる方法。
（ｉ）  前記受容体、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸およびその塩ならびにクエン酸およびその塩から選択されるキレート剤ならびにＣ２−Ｃ６ポリオールを液体媒体中で混合する工程であって、前記キレート剤および前記Ｃ２−Ｃ６ポリオールの量が、前記液体溶液中で安定かつ活性化された受容体を実現するために十分である工程、および
（ｉｉ）  前記液体溶液を２℃から４０℃の温度で維持する工程。
【請求項２】
前記受容体がチロイド刺激ホルモン受容体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記受容体が部分に結合される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｃ２−Ｃ６ポリオールが、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、エリスリトール、キシリトール、リビトールおよびソルビトールから成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液体溶液中のキレート剤の前記量が０．１ｍＭから２０ｍＭである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ２−Ｃ６ポリオールの前記量が５重量％から５０重量％である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
チロイド刺激ホルモン受容体の液体溶液を安定化させる方法であって、
チロイド刺激ホルモン受容体を含む液体溶液を、（ｉ）Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸およびその塩ならびにクエン酸およびその塩から選択されるキレート剤と（ｉｉ）Ｃ３−Ｃ５ポリオールの双方の安定化量に混合することを含む方法。
【請求項８】
前記チロイド刺激ホルモン受容体キメラが、担体または標識に結合される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記液体溶液中のキレート剤の前記量が０．１ｍＭから２０ｍＭである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
Ｃ３−Ｃ５ポリオールの前記量が５重量％から５０重量％である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
水性媒体と、
受容体と、
０．１ｍＭから２０ｍＭの量のＮ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸およびその塩ならびにクエン酸およびその塩から選択されるキレート剤と、
５重量％から５０重量％の量のＣ２−Ｃ６ポリオールと、を含む組成物。
【請求項１２】
前記受容体がチロイド刺激ホルモン受容体キメラである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記受容体が部分に結合される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｃ２−Ｃ６ポリオールが、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、エリスリトール、キシリトール、リビトールおよびソルビトールから成る群から選択される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
サンプル中のチロイド刺激ホルモン受容体抗体を検出する方法であって、以下の工程からなる方法。
（ｉ）  チロイド刺激ホルモン受容体抗体を含む可能性のあるサンプルと、請求項１２による組成物であって前記チロイド刺激ホルモン受容体が担体に結合されている組成物と、標識に結合された第二のチロイド刺激ホルモン受容体と、をアッセイ媒体中で混合して提供する工程、
（ｉｉ）  前記混合物について、前記チロイド刺激ホルモン受容体抗体と、請求項１２による前記組成物であって前記チロイド刺激ホルモン受容体が担体に結合されている組成物と、標識に結合されている前記第二のチロイド刺激ホルモン受容体とを含む錯体の形成を検査する工程、および
（ｉｉｉ）  前記錯体の存在を、サンプル中の前記チロイド刺激ホルモン受容体抗体の存在および量のうちの一方またはその双方に関連づける工程。
【請求項１６】
サンプル中のチロイド刺激ホルモン受容体抗体を検出する方法であって、以下の工程からなる方法。
（ｉ）  チロイド刺激ホルモン受容体抗体を含む可能性のあるサンプルと、請求項１２による組成物であって前記チロイド刺激ホルモン受容体が標識に結合されている組成物と、担体に結合された第二のチロイド刺激ホルモン受容体、とをアッセイ媒体中で混合して提供する工程、
（ｉｉ）  前記混合物について、前記チロイド刺激ホルモン受容体抗体と、請求項１２による前記組成物であって前記チロイド刺激ホルモン受容体が標識に結合されている組成物と、担体に結合されている前記第二のチロイド刺激ホルモン受容体を含む錯体の形成を検査する工程、および
（ｉｉｉ）  前記錯体の存在を、前記サンプル中の前記チロイド刺激ホルモン受容体抗体の存在および量のうちの一方またはその双方に関連づける工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願に対する相互参照］
本出願は、２０１３年５月１４日に出願された米国仮特許出願整理番号６１／８２３，１１６に対する優先権を享受する権利を主張し、米国仮特許出願整理番号６１／８２３，１１６は、その全体において参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、分析対象物（ａｎａｌｙｔｅ）のうちの一つ以上を含有することが既知であるか、または含有すると疑われる、患者サンプルなどのサンプル中の、例えば、抗体などの分析対象物の判定用の組成物、方法およびキットに関する。幾つかの例においては、本発明は、より詳細には、氷点を超える温度での液剤として保管中の受容体試薬の安定性を保持することに関する。幾つかの例においては、本発明は、より詳細には、分析対象物用のアッセイにおいて使用するための受容体試薬の感受性の向上に関する。
【０００３】
容易かつ正確に判定されうる興味ある種々の物質と、判定用の方法の双方に関して、臨床診断分野は、過去３５年以上にわたって拡大している。液体内の低濃度の物質の存在を検出するための簡便で、信頼性が高く有害ではない手段が望まれる。臨床化学においては、これらの物質は、１０−１２Ｍ（molar）未満の濃度で体液内に存在することがある。使用できるサンプルサイズが比較的小さいために、これらの低濃度の物質の検出の困難性は、さらに高まる。
【０００４】
血液および他の生物学的流体内の多くの分析対象物を判定することは、医学の多くの部門においてますます求められてきている。内分泌学においては、多数の異なるホルモンの血漿中濃度を知ることは、その比率が疾病の進行の判定に役立ちうる場合の診断問題または特定の診断に対する一段のマーカを決定するためにしばしば必要とされ、ホルモン受容体などの受容体は、多数の生体外での（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）用途において通常使用される。診断的アッセイにおいては、例えば、ホルモン受容体などの受容体は、一つ以上の疾病状態を示す患者の抗体の検出用に使用される。具体的な一例においては、チロトロピン（チロイド刺激ホルモンまたはＴＳＨとしても知られる）受容体は、グラーベ病の鑑別診断における補助として、ＴＳＨ受容体抗体を検出するための診断アッセイで使用される。
【０００５】
液体形状において不安定であるため、多くの受容体は、表面上で乾燥されるか、または凍結乾燥されるかのいずれかである。製造コストをさらに付加し、試薬を利用するユーザに対して不便であるため、これらのアプローチは望ましくない。さらに、使用するために復元するために、多くの受容体は、非常に短い半減期を有する。
【０００６】
したがって、液体形態において良好な安定性を示し、かつ、患者において抗体レベルおよび他の分析対象物を測定するために受容体を使用するアッセイにおいて良好な感受性を示す受容体を含む組成物を開発する、継続的なニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書で記述される原理に従う幾つかの例は、受容体の液体溶液を調製する方法に関連する。この方法は、受容体、キレート剤およびＣ２−Ｃ６ポリオールを液体培地（ｍｅｄｉｕｍ）内で混合することを含む。キレート剤およびＣ２−Ｃ６ポリオールの量は、液体溶液内で安定かつ感受性の高い受容体を実現するために十分な量であって、保管中は約２℃から約４０℃の温度で保持される。
【０００８】
本明細書で記述される原理に従う幾つかの例は、チロイド刺激ホルモン受容体の液体溶液を安定化する方法に関連する。この方法は、チロイド刺激ホルモン受容体を含む液体溶液を（ｉ）三酢酸系のキレート剤、四酢酸系のキレート剤から成る群から選択されたキレート剤と、（ｉｉ）Ｃ３−Ｃ５ポリオールの双方の安定量で、混合することを含む。
【０００９】
本明細書で記述される原理に従う幾つかの例は、受容体キメラと、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの量のキレート剤と、約５重量％から約５０重量％の量のＣ２−Ｃ６ポリオールと、を水性培地内で含む組成物に関連する。
【００１０】
本明細書で記述される原理に従う幾つかの例は、サンプル中のチロイド刺激ホルモン受容体抗体を検出する方法に関連する。混合物がアッセイ培地中に提供され、この混合物は、チロイド刺激ホルモン受容体抗体と、支持するために結合された第一のチロイド刺激ホルモン受容体と、標識するために結合された第二のチロイド刺激ホルモン受容体と、を含有する可能性のあるサンプルを含む。第一および第二のチロイド刺激ホルモン受容体のうちのいずれか、またはその双方は、本明細書で記述される原理に従って保管された組成物に由来する。混合物は、チロイド刺激ホルモン受容体抗体を含む錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）形成用に検査される。錯体の存在は、サンプル中のチロイド刺激ホルモン受容体抗体の存在および量のうちの一つまたはその双方に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本明細書で提供される図面は、本明細書で記述される原理に従う実例の理解を容易にする目的で提供され、例示として提供されるものであり、添付の請求項の範囲に対する限定として提供されるものではない。
【図１】本明細書で記述される原理に従う方法の一例において、クエン酸バッファ中に溶解したアルカリホスファターゼ（“複合体”）に複合体形成された受容体キメラのｐＨ対信号のプロットを示すグラフであり、ＭＥＳおよびＰＩＰＥＳバッファ中に複合体を溶解したときのプロットも其々、比較目的で示される。
【図２】一日中３７℃で保管した後の図１の複合体溶液のｐＨに対して保持された信号百分率のプロットを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜一般的議論＞
本明細書で記述される原理に従う開示は、受容体の安定性を保持しながら長期間保管することができる受容体の液剤を調製する方法を提供する。さらに、本発明者は、本明細書で記述される原理に従って調製された受容体の感受性が、乾燥または凍結乾燥とその後の復元に晒された受容体の感受性よりも高まることを発見した。上述されたように、本明細書で記述される原理に従う幾つかの例は、受容体の液体溶液を調製し、この液体溶液を保管し、興味ある分析対象物の検出用アッセイにおいてこの液体溶液を利用する方法に関連する。
【００１３】
＜詳細な議論＞
本明細書で用いられる“受容体”という語は、構造的に特異的である物質（時にはリガンドと称される）に結合する化合物のことを称する。受容体は、リガンドと時には称される別の分子の特定の空間的極性組織と特異的に結合し、それによって相補的であると定義されるような、表面上または空洞内の領域を有する。リガンドは、薬剤、小ペプチドまたはステロイドを含む小分子か、または例えば大ペプチド、抗体、ホルモン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物を含むたんぱく質などの大分子か、その一部またはその領域を含むがそのいずれにも限定はされない。限定ではなく例示として、受容体は、例えば、ホルモン受容体、薬剤受容体および抗原受容体を含む。受容体は、未変化もしくは完全受容体またはそのフラグメントもしくはセグメントであってもよい。フラグメントまたはセグメントは、未変化受容体に断片化技術を適用することによって調製されてもよい。一方、未変化または完全受容体と同様に、受容体のフラグメントまたはセグメントは、合成で調製されてもよい。このように、受容体は、自然発生でも、源から分離されてもよく、または、受容体は、例えば、遺伝子組み換え技術およびキメラ技術を含むがそのいずれにも限定はされない合成技術によって合成されて調製されてもよい。
【００１４】
幾つかの例においては、受容体は、例えば、ある疾患状態に関連する自己抗体などの抗体に対して特異的なものであって、その疾患状態は、例えば、皮膚筋炎、糖尿病、てんかん、川崎病、糸球体腎炎、グレーブ病、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、炎症性腸疾患、ループス腎炎、多発性硬化症、重傷筋無力症、心筋炎、パーキンソン病、天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性筋炎、原発性胆管性肝硬変、乾癬、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、ウェゲナー肉芽腫症およびウィルソン病を含むがそのいずれにも限定はされない。
【００１５】
本明細書で記述される原理に従う一例においては、限定ではなく例示として、受容体は、ＴＳＨ受容体であって、自己抗体は、ＴＳＨ自己抗体である。本明細書で記述される原理に従う別の例においては、限定ではなく例示として、受容体はＴＳＨ受容体キメラであって、自己抗体はＴＳＨ自己抗体である。本明細書で記述される原理に従う別の例においては、限定ではなく例示として、受容体はＴＳＨ受容体キメラであり、その例は、２００９年１２月３１日に公開された米国特許公報２００９／０３２５３１０  Ａ１（Ｌｏｏｓ）に開示され、自己抗体はＴＳＨ自己抗体である。
【００１６】
“受容体”という語は、複合体部分（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ  ｍｏｉｅｔｙ）に結合するか、接合するための受容体も含む。受容体複合体は、受容体と、単一構造を形成するために、任意で結合基を介して結合される複合体部分と、を含む。この結合は、共有結合または非共有結合のいずれかの結果である可能性がある。共有結合は、例えば、受容体および複合体部分の間の化学結合、または結合基の介在による受容体および複合体部分の間の化学結合などの、直接結合を含む。非共有結合は、受容体と複合体の複合体部分とに接合された相補的特異的結合対（ｓｂｐ）要素間の特異的な結合を含む。
【００１７】
複合体部分は、受容体の検出用アッセイで使用される試薬を形成するために受容体に複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）されうるあらゆる実在物であるか、または受容体が結合する実在物（受容体結合分析対象物）である。複合体部分は、限定ではなく例示として、担体、信号生成形の要素（ｍｅｍｂｅｒ）、例えば、リガンドおよび受容体などの結合対の要素（例えば、ビオチンストレプトアビジンまたはフルオレセイン抗フルオレセイン抗体）、薬剤類似体にアンカーを提供する高分子を含む。
【００１８】
担体は、有機または無機、固体または流体の水不溶性物質で構成され、透明であってもよいし、部分的に透明であってもよい。担体は、合成または天然で生じたものであってもよい。担体は、ビーズを含む粒子、フィルム、膜、チューブ、ウェル、ストリップ、ロッド、プレートや紙などの平面表面、繊維などの多くの形状のうちの如何なる形状も有することができる。アッセイの種類に応じて、担体は、使用される培地中に懸濁可能であってもよいし、そうでなくてもよい。懸濁可能な担体の例は、例えば、ラテックス、脂質二重膜またはリポソーム、油滴、細胞およびハイドロゲル、金属粒子、磁気粒子などのポリマー材料である。他の担体組成物は、アガロースおよびデキストランを含む架橋された多糖類、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニルアルコール、ポリ（ビニルクロライド）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタラート）、ナイロン、およびポリ（ビニルブチレート）を含み、これらは、それ自体によって、または他の材料と共に使用される。
【００１９】
担体は粒子であってもよい。粒子は、少なくとも約０．０２ミクロンで、約１００ミクロンに満たない平均直径を有してもよい。幾つかの実施形態においては、粒子は、約０．０５ミクロンから約２０ミクロン、または約０．３ミクロンから約１０ミクロンの平均直径を有する。粒子は、有機または無機、膨潤性または非膨潤性、多孔性または非多孔性、望ましくは水に近い密度、つまり、約０．７ｇ／ｍＬから約１．５ｇ／ｍＬで、透明、部分的に透明または不透明の物質で構成されることがある。粒子は、細胞および微生物などの生物学的物質、例えば、赤血球、白血球、リンパ球、ハイブリドーマ、連鎖状球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌およびウイルスなどである可能性がある。粒子は、例えば、有機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス粒子、金属粒子、磁気または非磁気粒子、リン脂質ベシクル、カイロミクロン、リポたんぱく質で構成される可能性もある。幾つかの例においては、粒子は、ラテックス粒子または二酸化クロム（クロム合金）粒子である。幾つかの例においては、粒子は、水性培地中で容易に分散可能であり、直接的または結合基を介して間接的のいずれかでの受容体への複合を可能とするために吸収性または官能化可能である可能性がある。
【００２０】
特定の信号生成系および標識は、本明細書で記述される原理に従う例が適用されうる様々なアッセイ系の議論で以下により詳細に記述される。簡潔に言うと、信号生成系（ｓｐｓ）は、一つ以上の成分または要素、少なくとも一つの標識成分または要素を有し、この標識は、直接検出することができるか、または検出可能な信号を生成する特異的結合反応を介して検出可能である。信号生成系は、サンプル中の受容体または受容体結合分析対象物の存在に関連する信号を生成する。信号生成系は、測定可能な信号を生成するために必要な全ての試薬を含む。信号生成系の他の成分は、展開剤溶液中に含まれてもよく、例えば、基質、増強剤、活性剤、化学発光化合物、補酵素、反応抑制剤、スカベンジャー、金属イオン、信号生成物質の結合に必要な特異的結合物質を含む可能性がある。信号生成系の他の成分は、例えば、補酵素、酵素生成物と反応する物質、他の酵素および触媒であってもよい。信号生成系は、外部手段、電磁放射の利用、望ましくは目視検査によって検出可能な信号を提供する。例示的な信号生成系は、米国特許番号５，５０８，１７８（Ｒｏｓｅら）およびＵｌｍａｎらによる米国特許番号５，１８５，２４３、カラム１１−１３に記述され、関連する開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【００２１】
受容体および複合体部分である複合体成分の共有結合のために、一つ以上の成分は、一つ以上の他の成分との接合に適した官能基を含む。成分の接合に適した官能基は、カルボニル官能基、例えば、アルデヒドなどのオキソカルボニルでも良く、カルボキシ、アミジン、アミダート、チオカルボキシ、チオノカルボキシなどの非オキソカルボニル（窒素および硫黄同族体を含む）であってもよい。オキソの別の官能性は、アクティブハロゲン、ジアゾ、メルカプト、オレフィン、特に活性化オレフィン、アミノ、ホスホロなどを含む。特に興味深いものは、活性化エステルまたはアルキル化剤である。分子を互いに接合するための技術の詳細は、例えば、ＭａｔｔｈｅｗｓらによるＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）１５１：２０１−２０９；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔらによる欧州特許出願整理番号０３０２１７５および米国特許番号３，８１７，８３７に記述され、関連する開示は、その全体において参照によって本明細書に組み入れられる。
【００２２】
上述されたように、共有結合は、結合基を中間に介して達成されてもよい。結合基は、１から約５０以上の原子、１から約３０以上の原子、１から約２０の原子、１から約１０の原子の鎖であり、各々は、炭素、酸素、硫黄、窒素およびリンから成る群から通常、独立して選択されるが、通常は炭素および酸素からなる群から選択される。結合基中のヘテロ原子の数は、０から約１０以上、０から約８、１から約６、または２から約４の範囲であってもよい。鎖中の原子数は、部分構造が接続される間の最短経路に沿って、水素または他の一価原子以外の原子数をカウントすることによって決定される。結合基の原子は、例えば、アルキル、アリル、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アリルオキシ、アラルコキシ形式での炭素、酸素など、水素以外の原子で置換されてもよい。通則として、結合する成分の機能を有する結合基によって引き起こされる最小限の干渉が存在する条件で、特定の結合基の長さは、簡便な合成を提供するために任意で選択することができる。結合基は、脂肪族または芳香族であってもよい。結合基内に存在する官能性は、エステル、チオエステル、アミド、チオアミド、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ基、チオエーテル、カルボキシレートなどを含んでもよい。
【００２３】
上述されたように、受容体−部分複合体の成分、即ち受容体および複合体部分は、非共有結合されてもよい。例えば、ビスビオチンを含むビオチン、フルオロセインなどを含むがそれに限定はされない有機小分子が、成分のうちの一つに組み込まれ、他の成分が有機小分子に対する結合パートナー、例えば、其々アビジン（ストレプトアビジン）または抗フルオレセインに結合されてもよい。結合パートナーとの結合の結果、互いの成分に対して非共有結合を生じる。
【００２４】
本明細書に記述される原理に従う方法は、受容体と、有効な量のキレート剤とＣ２−Ｃ６ポリオールとを液体培地中で混合することを含む。本明細書で記述される原理に従う幾つかの例においては、キレート剤は、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−トリ酢酸（ＨＥＤＴＡ）、エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、トランス−１，２−ジアミノ−シクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミン−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）、ニトリロ−２，２’，２’’−トリ酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ酢酸、トリエチレンテトラアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ヘキサ酢酸（ＴＴＨＡ）、メチルアミン、ヒスチジン、リンゴ酸およびフィトケラチン、ヘモグロビン、クロロフィル、シデロフォア、ピオシアニン、ピオベルジン、エンテロバクチン、ペプチドおよび糖、フミン酸、クエン酸、硬水軟化剤、ホスホネート、テトラサイクリン、ガドリニウム、有機リン化合物２，２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１，１’−ビナフチル、ペンテト酸、Ｎ，Ｎ−（２−（ビス−（カルボキシメチル）アミノ）エチル）−グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）グリシン、トリグリコールアミド酸；［（カルボキシメチル）イミノ］ビス−（エチレンニトリロ）］−四酢酸）、トリロンＡ，α，α’，α’’−トリメチルアミントリカルボキシル酸、トリ（カルボキシメチル）アミン、アミノトリ酢酸、Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘｉ，ＨａｍｐｓｈｉｒｅＮＴＡ酸および上記のうちの任意の物質の適切な塩を含むがそのいずれにも限定されることはない。
【００２５】
本明細書に記述される原理に従う幾つかの例においては、キレート剤は、三酢酸部分またはその塩、四酢酸部分またはその塩、五酢酸またはその塩、六酢酸またはその塩を含む。幾つかの例においては、キレート剤は、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸およびその塩、エチレンジアミン四酢酸およびその塩、エチレングリコール四酢酸およびその塩から成る群から選択される。幾つかの例においては、キレート剤は、クエン酸およびその塩である。
【００２６】
本明細書に記述される原理に従う幾つかの例においては、ポリオール中の炭素原子数は、例えば、２から８、２から７、２から６、２から５、２から４、２から３、３から８、３から７、３から６、３から５、３から４、４から８、４から７、４から６、または４から５であり、ヒドロキシル基の数は、例えば、炭素原子あたり約１、２炭素原子あたり１、３炭素原子あたり１、２炭素原子あたり２、３炭素原子あたり２であり、ポリオール中のヒドロキシル基の総数は、約２、約３、約４、約５、約６、約７または約８である。幾つかの例においては、ポリオールは、限定ではなくて例示として、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、リビトールおよびソルビトールなどの２ヒドロキシル基、３ヒドロキシル基、４ヒドロキシル基、５ヒドロキシル基、または６ヒドロキシル基を含む、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５またはＣ６ポリオールである。ポリオールは、前述した特性を有する単一の化合物または二つ以上のポリオールの組み合わせであってもよい。本明細書に記述される原理に従う幾つかの例においては、ポリオールはグリセロールである。
【００２７】
キレート剤およびポリオールは、受容体を安定化させるおよび／または受容体の感受性を高めるために有効な量で混合物中に存在する。キレート剤の量およびポリオールの量は、例えば、受容体の特性および量、キレート剤の特性、ポリオールの特性、液剤の特性のうちの一つ以上に依存する。本明細書で記述される原理に従う幾つかの例においては、混合物中のキレート剤の有効量は、例えば、約０．１ｍＭから約２０ｍＭ、約１ｍＭから約２０ｍＭ、約５ｍＭから約２０ｍＭ、約１０ｍＭから約２０ｍＭ、約１０ｍＭから約１５ｍＭ、約１５ｍＭから約２０ｍＭまたは約１から約５ｍＭであってもよい。
【００２８】
本明細書で記述される原理に従う幾つかの例においては、混合物中のポリオールの有効な量は、例えば、約５％から約５０％、約５％から約４０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、約５％から約１０％、約１０％から約５０％、約１０％から約４０％、約１０％から約３０％、または約１０％から約２０％であってもよい。上記の割合は、液体培地中のポリオールの重量によるものである。
【００２９】
本明細書で記述される原理に従う幾つかの例は、水性培地、受容体、約０．１ｍＭから約２０ｍＭの量のキレート剤、約５重量％から約５０重量％の量のＣ２−Ｃ６ポリオールを含む組成物に関する。
【００３０】
幾つかの例においては、液体培地または液体溶液は水性培地であって、単なる水であってもよいし、または約０．１％から約８０％、０．１％から約６０％、約０．１から約４０％、約０．１％から約３０％、約０．１％から約２０％、約０．１％から約１０％、約０．１％から約５％、約１％から約８０％、１％から約６０％、約１％から約４０％、約１％から約３０％、約１％から約２０％、約１％から約１０％、約１％から約５％、約５％から約８０％、約５％から約６０％、約５％から約４０％、約５％から約３０％、約５％から約２０％、または約５％から約１０％の溶剤を含んでもよい。上記の割合は、培地の重量によるものである。例えば、溶剤は、アルコール、エステル、エーテル、アミドまたはアミンなどの有機溶媒であってもよいが、そのいずれにも限定はされない。
【００３１】
培地に対するｐＨは、通常、例えば、約４から約１１の範囲内、約５から約１０の範囲内、約６．５から約９．５の範囲内、約６．５から約７．５の範囲内、または約７である。所望のｐＨを達成し、培地のｐＨを維持するために、様々なバッファが使用されてもよい。例示的なバッファは、例えば、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリスおよびバルビタールを含む。使用される特定のバッファは決定的なものではないが、個々の組成物において何らかのバッファが望ましいことがある。培地中に様々な補助的物質も含まれてもよい。例えば、バッファに加えて、培地は、例えば、防腐剤、非特異的結合ブロッカー、誤った結果を防ぐためのヘテロ親和性干渉ブロッカーおよび界面活性剤を含んでもよい。
【００３２】
受容体、キレート剤およびＣ２−Ｃ６ポリオールの液体溶液は、例えば、約２℃から約４０℃、約２℃から約３０℃、約２℃から約２０℃、約５℃から約４０℃、約５℃から約３０℃、約５℃から約２０℃、約５℃から約１０℃、約１０℃から約４０℃、約１０℃から約３０℃、約１０℃から約２０℃、約１５℃から約４０℃、約１５℃から約３０℃、約１５℃から約２０℃、約２０℃から約２５℃、またはほぼ室温の温度で維持されてもよい。受容体の液体溶液は、例えば、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月、少なくとも約６カ月、少なくとも約１年、少なくとも約１．５年、または少なくとも約２年、良好な安定性を維持する。本明細書で用いられる“良好な安定性”という語句は、受容体が約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％を超えては、１２か月にわたってその活性を失わない、または、受容体が、約２℃から約１０℃の温度で保管中に、少なくとも約１２カ月、少なくとも約１５カ月、または少なくとも約２０カ月の半減期を有することを意味する。
【００３３】
本明細書で記述される原理に従う組成物は、受容体結合分析対象物をサンプル中で検出する方法で使用され、受容体に結合する分子のことを称する。分析されるサンプルは、一つ以上の受容体結合分析対象物を含むと疑われるサンプルである。サンプルは、望ましくはヒトまたは動物由来であり、例えば、全血、血清、血漿、痰、リンパ液、精液、膣粘液、糞便、尿、脊髄液、唾液、大便、脳脊髄液、涙、粘液などの生物学的流体、および毛髪、皮膚、臓器由来の断片または切除された組織、他の身体部分などの生物学的組織を含むがそのいずれにも限定はされない。多くの例においては、サンプルは全血、血漿または血清であり、特定の例においては、サンプルは血清である。サンプルは、受容体結合分析対象物に結合する内因性結合部分を除去するため、または内因性結合物質から受容体結合分析対象物を遊離するために、予め処理されてもよいし、されなくてもよい。
【００３４】
サンプルは、アッセイと干渉しないあらゆる簡便な培地中で調製することができ、一般的には水性培地が使用される。培地の特性は、以下により詳細に記述される。サンプルの特性に依存して、サンプルに対して一つ以上の前処理が実行されてもよく、前処理は、限定ではなく例示として、例えば、溶血剤での前処理、遊離剤での前処理、たんぱく質などの内因性結合パートナーから結合した受容体結合分析対象物を置換する置換剤での前処理、血液細胞から受容体結合分析対象物を遊離するために血液細胞の溶解を支援する（複数の）溶血界面活性剤などである。例えば、溶血、または内因性結合物質からの受容体結合分析対象物の遊離などの所望の効果または機能を達成するために、上記のあらゆる薬剤が十分な濃度または量で存在する。
【００３５】
上記の前処理に続いて、サンプル中の受容体結合分析対象物の存在および量のうちの一方またはその双方を決定するための試薬が、もしあれば、培地に添加される。試薬の特性は、実施されるアッセイの具体的な種類に依存する。一般的には、アッセイは、受容体結合分析対象物の存在および量のうちの一方またはその双方の決定または測定のための方法である。様々なアッセイ法が限定ではなく例示として以下に記述される。
【００３６】
本明細書に記述される原理に従う幾つかの例においては、アッセイ試薬は、受容体結合分析対象物に対する少なくとも一つの受容体を含む。受容体は、本明細書で記述される原理に従う液体組成物または液体溶液中に存在し、液体組成物の一部は、アッセイ培地中で混合される。上述されたように、本明細書で記述される原理に従うポリオールおよびキレート剤の混合物で処理された受容体も、この方法で処理されなかった受容体よりも高い感受性を示す。“高い感受性”という語句は、本明細書で記述される原理に従って処理された受容体を使用する受容体結合分析対象物に対するアッセイで達成される感受性が、本明細書で記述される原理に従って処理されていない受容体を使用するアッセイの感受性の少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％を超えることを意味する。
【００３７】
一つ以上の受容体に加えて、アッセイ試薬は、例えば、受容体、受容体結合分析対象物、別の抗体または小分子に対して特異的な一つ以上の抗体を含んでもよい。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルである可能性がある。このような抗体は、ホストの免疫化および血清の収集など本技術分野で既知の技術によって（ポリクローナル）、連続的ハイブリッド細胞株を調製して分泌たんぱく質を収集することによって（モノクローナル）、天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコード化するヌクレオチドシーケンスまたはその突然変異型をクローン化および発現させることによって調製することができる。抗体は、完全な免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含み、免疫グロブリンは、様々なクラスおよびアイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭなどを含む。そのフラグメントは、例えば、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ’を含んでもよい。さらに、特定の分子に対する結合親和性が維持される限りは、免疫グロブリンまたはそのフラグメントの凝集、ポリマー、複合体を、適切な場合に使用することができる。
【００３８】
他の試薬は、実施されるアッセイの特性に依存して、アッセイ培地中に含まれる。このようなアッセイは、受容体および受容体結合分析対象物などの結合パートナー間の反応を通常含み、選択された特定のアッセイフォーマットによっては、例えば、抗体と受容体などの対応する結合パートナーとの間の結合も含んでもよい。
【００３９】
上述されたように、特異的結合は、他の分子に対しての識別が実質的にしにくいことと比較すると、異なる二分子のうちの他方に対する一方の特異的な識別を含む。一方、非特異的結合は、特定の表面構造に比較的関係なく分子間の非共有結合を含む。非特異的結合は、分子間の疎水的相互作用を含む幾つかの要因の結果として生じることがある。幾つかの例においては、結合パートナーは抗体である。
【００４０】
＜アッセイの一般的議論＞
本開示は、例えば、受容体結合分析対象物を含む一つ以上の分析対象物の存在および量のうちの一方またはその双方を、当該分析対象物を含む可能性のあるサンプル中で判定するために使用されうる多くの種類のアッセイに対する適用を有する。本明細書で記述される原理に従う受容体試薬は、抗体試薬用に設計された多くのアッセイフォーマットで使用されてもよい。アッセイは、標識された、または標識されていない試薬を含んでもよい。標識されていない試薬を含むアッセイは、通常、一つ以上の受容体を含む比較的大きい錯体の形成を含む。このようなアッセイは、例えば、受容体錯体の検出用に、免疫沈降および凝集法を含み、例えば、比濁分析法および混濁分析法などの対応する光散乱技術を含む。標識されていないアッセイに対して、組成物が受容体結合分析対象物と例えば粒子などの担体との複合体を含む場合に、本明細書で記述される原理に従う組成物が使用されてもよい。一例においては、サンプル中の受容体結合分析対象物は、受容体結合分析対象物−担体複合体と競合し、サンプル中の受容体結合分析対象物の量が多くなると、凝集によって形成される沈殿物の量が少なくなる。幾つかの例においては、受容体結合分析対象物は、サンプル中に存在しうる自己抗体などの抗体であり、特定の担体に結合された受容体結合分析対象物を有する本明細書で記述される原理に従う複合体が使用される。サンプル中の抗体の存在によって、複合体試薬の凝集が生じる。
【００４１】
標識された免疫アッセイは、例えば、酵素免疫アッセイ、蛍光分極免疫アッセイ、放射免疫アッセイ、阻害アッセイ、励起発光、蛍光酸素チャネリングアッセイを含む。標識されたアッセイアプローチの一例においては、例えば酵素などの標識に結合された受容体結合分析対象物を有する複合体は、サンプル中の受容体結合分析対象物と競合する可能性があり、サンプル中の受容体結合分析対象物の量が多くなるほど、標識からの信号量が少なくなる。標識されたアッセイアプローチの他の例においては、例えば、酵素などの標識に結合された受容体を有する複合体は、サンプル中の受容体結合分析対象物に結合するために使用することができ、受容体結合分析対象物に対する第二の受容体が、サンドイッチ錯体を形成するために使用される。標識からの信号量が検出され、サンプル中の受容体結合分析対象物の量が多くなるほど、標識からの信号量は大きくなるように、サンプル中の受容体結合分析対象物の量と関連付けられる。
【００４２】
上述されたように、本明細書に記述された多くのアッセイにおいては、標識が使用され、多くの例において、標識は受容体結合分析対象物複合体の一部である。一方、標識は、受容体結合分析対象物複合体に関係なく、試薬の一部であってもよい。標識は、通常、信号生成系（“ｓｐｓ”）の一部である。標識の特性は、特定のアッセイフォーマットに依存する。上述されたように、信号生成系は、通常一つ以上の構成要素を含み、少なくとも一つの構成要素は検出可能な標識であり、結合されたおよび／または結合されていない標識の量、即ち、検出される受容体結合分析対象物に対して、または検出される受容体結合分析対象物の量を反映する薬剤に対して結合された、または結合されていない標識の量に関連する検出可能な信号を生成する。
【００４３】
標識は、信号を生成する、または信号の生成を誘発することができる、あらゆる分子である。標識は、ポリ（アミノ酸）、またはたんぱく質、または非ポリ（アミノ酸）、等方性もしくは異方性（通常異方性）であり、酵素などの触媒、触媒をコード化するためのポリヌクレオチド、プロモータ、色素、蛍光分子、化学発光分子、補酵素、酵素基質、放射性基、有機小分子、増幅可能なポリヌクレオチドシーケンス、ラテックスまたは炭素粒子などの粒子、金属ゾル、結晶子、リポソーム、細胞などであり、例えば、色素、触媒、または他の検出可能な基でさらに標識されてもよいし、されなくてもよい。幾つかの例においては、標識は、放射性同位族元素、発光、微粒子または酵素的であり、例えば、蛍光体、放射能標識、酵素、化学発光物質、または光増感剤であってもよい。このように、例えば、上記の標識に対して、信号は、場合によって、酵素活性、発光、光吸収または放射能を検出することによって検出および／または測定される。
【００４４】
“非ポリ（アミノ酸）標識”という語は、タンパク質ではない標識のことを称する。非ポリ（アミノ酸）標識は、信号生成系の要素であってもよい。非ポリ（アミノ酸）標識は、直接検出可能であるか、または、検出可能な信号を生成する特異的な結合反応を介して検出可能である。非ポリ（アミノ酸）標識は、一般的には、放射性同位族元素、発光（例えば、アクリジニウムエステルなど）、微粒子（例えば、結合していないものから結合したものを分離することができる磁気粒子、混濁および比濁分析によって測定できるラテックス粒子および化学発光ビーズ（例えば、ＬＯＣＩケミビーズ）である。標識は、等方性もしくは異方性（通常異方性）であり、触媒をコード化するためのポリヌクレオチド、プロモータ、色素、蛍光分子、化学発光分子、補酵素、酵素基質、放射性基、有機小分子、増幅可能なポリヌクレオチドシーケンス、ラテックスまたは炭素粒子などの粒子、金属ゾル、結晶子、リポソーム、細胞などであり、例えば、色素、触媒、または他の検出可能な基でさらに標識されてもよいし、されなくてもよい。ポリ（アミノ酸）標識は、限定ではなく例示として、例えば酵素などのペプチドおよびたん白質を含む。
【００４５】
標識の例は、限定ではなく例示として、アルカリホスファターゼ（“ＡＰ”）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（“Ｇ６ＰＤＨ”）およびホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素；リボザイム；ＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼに対する基質；プロモータ；色素；フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン化合物、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンなどの蛍光体；量子ドットとして知られる半導体ナノ結晶に存在するＣｄＳｅおよびＺｎＳから調製されるような錯体；イソルミノールなどの化学発光物質；増感剤；補酵素；酵素基質；１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、５７Ｃｏおよび７５Ｓｅなどの放射性標識；ラテックス粒子、炭素粒子、例えば、二酸化クロム（ＣｒＯ２）粒子などの磁気粒子を含む金属粒子などの粒子；金属ゾル；結晶子；リポソーム；細胞などを含み、色素、触媒または他の検出可能なグループでさらに標識されてもよい。好適な酵素および補酵素は、Ｌｉｔｍａｎらによる米国特許番号４，２７５，１４９のカラム１９−２８、Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉらによる米国特許番号４，３１８，９８０のカラム１０−１４に開示され、好適な蛍光体および化学発光物質は、Ｌｉｔｍａｎらによる米国特許番号４，２７５，１４９のカラム３０および３１に開示され、これらは、参照によって本明細書に組み入れられる。
【００４６】
標識は、直接信号を生成することができる。したがって、信号を生成するために追加構成要素は必要とされない。多数の有機分子、例えば、蛍光体は、紫外および可視光を吸収することができ、光吸収はこれらの分子にエネルギーを伝え、励起されたエネルギー状態へと引き上げる。この吸収されたエネルギーは、その後、第二波長の光の放射によって消失される。信号を直接生成する他の標識は、放射性アイソトープおよび色素を含む。
【００４７】
或いは、標識は、信号を生成するための他の構成要素を必要とし、信号生成系は、それによって、測定可能な信号を生成するために必要な全ての構成要素を含む。このような他の構成要素は、基質、補酵素、増強剤、追加酵素、酵素生成物と反応する物質、触媒、活性剤、補因子、反応抑制剤、スカベンジャー、金属イオン、および信号生成物質の結合に必要な特異的な結合物質を含むことがある。
【００４８】
幾つかの例においては、標識たん白として興味ある酵素は、酸化還元酵素、特に、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼなどのデヒドロゲナーゼ、過酸化水素の生成および色素前駆体を色素に酸化するための過酸化水素の使用を含む酵素である。特定の混合物は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼである色素前駆体を酸化するために、過酸化水素を使用する酵素に結合された、グルコースおよびガラクトースオキシダーゼなどの糖オキシダーゼ、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどのヘテロサイクリックオキシダーゼを含む。さらなる酵素混合物が本技術分野で既知である。単一の酵素が標識として利用されるとき、他の酵素は、ヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ、望ましくはアルカリホスファターゼおよびベータガラクトシダーゼなどのヒドラーゼなどの利用を見出すことがある。或いは、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼが使用されることがある。使用を見出す例示的な補酵素は、ＮＡＤ［Ｈ］、ＮＡＤＰ［Ｈ］、ピリドキサルホスフェイト、ＦＡＤ［Ｈ］、ＦＭＮ［Ｈ］など、通常は、サイクリング反応を含む補酵素を含む。例えば、米国特許番号４，３１８，９８０を参照されたい。その開示は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【００４９】
使用されうるアッセイのある一般的グループは、限定された受容体濃度を利用するアッセイを含む。別のグループのアッセイは、例えば、受容体結合分析対象物に対する受容体過多など、一つ以上の主な試薬の過多を利用することを含む。別のグループのアッセイは、分離のないホモジニアスアッセイであり、標識された試薬は、受容体結合分析対象物の受容体との結合反応における標識信号を調節する。別のグループのアッセイは、受容体結合分析対象物のために標識された受容体試薬によって限定される競合性アッセイを含む。この種類のアッセイにおいては、本明細書で記述される原理に従う受容体担体複合体が、一定で、限定量で存在する。固定された受容体結合分析対象物と自由な受容体結合分析対象物との間の標識の区分は、サンプル中の受容体結合分析対象物の濃度に依存する。
【００５０】
アッセイは、アッセイ構成要素または生成物のうちのいずれかの分離なし（ホモジニアス）で、または分離あり（ヘテロジニアス）で実施することができる。本明細書に記述される原理に従う受容体は、多数の免疫アッセイフォーマットで使用することができる。ホモジニアスアッセイにおいては、全ての試薬を混合した後、信号が判定され、これは、サンプル中の受容体結合分析対象物の量に関連する。ホモジニアス免疫アッセイは、Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎらによる米国特許番号３，８１７，８３７、カラム３の６行からカラム６の６４行に開示されたＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ（Ｓｙｖａ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；Ｕｌｌｍａｎらによる米国特許番号３，９９６，３４５、カラム１７の５９行からカラム２３の２５行に開示された免疫蛍光法；Ｍａｇｇｉｏらによる米国特許番号４，２３３，４０２、カラム６の２５行からカラム９の６３行までに開示された酵素チャネリング免疫アッセイ（“ＥＣＩＡ”）；例えば、とりわけ米国特許番号５，３５４，６９３に開示された蛍光分極免疫アッセイ（“ＦＰＩＡ”）などによって例示される。
【００５１】
他の酵素免疫アッセイは、ＮｇｏおよびＬｅｎｈｏｆｆによる、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９８０）１１６：２８５−２８８によって記述された酵素調節媒介免疫アッセイ（“ＥＭＭＩＡ”）；ＯｅｌｌｅｒｉｃｈによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）２２：８９５−９０４によって開示された基質標識蛍光免疫アッセイ（“ＳＬＦＩＡ”）；ＫｈａｎｎａらによるＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ（１９８９）１８５：２３１−２４０によって開示された混合酵素ドナー免疫アッセイ（“ＣＥＤＩＡ”）；粒子増強免疫比濁抑制免疫アッセイ（“ＰＥＴＩＮＩＡ”）、粒子増強免疫比濁免疫アッセイ（“ＰＥＴＩＡ”）などのホモジニアス粒子標識免疫アッセイなどである。
【００５２】
他のアッセイは、ゾル粒子免疫アッセイ（“ＳＰＩＡ”）、分散色素免疫アッセイ（“ＤＩＡ”）、メタロ免疫アッセイ（“ＭＩＡ”）、酵素膜免疫アッセイ（“ＥＭＩＡ”）、ルミノ免疫アッセイ（“ＬＩＡ”）などを含む。他の種類のアッセイは、受容体結合分析対象物の結合による抗体固定表面の光学的、音響的および電気的特性変化のモニタリングを含む免疫センサアッセイを含む。これらは、例えば、光学免疫センサアッセイ、音響免疫センサアッセイ、半導体免疫センサアッセイ、電気化学変換器免疫センサアッセイ、電位差測定免疫センサアッセイ、電流測定電極アッセイを含む。
【００５３】
受容体結合分析対象物に対する酵素アッセイの一例においては、受容体結合分析対象物を含有する可能性のあるサンプルが、受容体結合分析対象物を識別することができる受容体と、受容体結合分析対象物および酵素の複合体を含む試薬と、同時にまたは連続的のいずれかで、水性培地中で混合される。受容体は、本明細書で記述される原理に従って安定化された受容体の液体溶液から添加される。酵素に対する基質が添加され、その結果、酵素触媒反応によって、色素生成物または蛍光生成物を形成する。酵素の例は、限定ではなく例示として、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼおよびアルカリホスファターゼであるが、他の酵素が使用されてもよい。受容体結合分析対象物および酵素複合体の受容体結合分析対象物部分は、受容体に対する結合部位に対して競合する。その後、通常分光光度法による手段によって、培地中の酵素活性が決定され、較正物質または参照サンプルが試験される（受容体結合分析対象物の既知の量が存在する）とき決定された酵素活性と比較される。典型的には、受容体結合分析対象物を含有すると疑われるサンプルの試験に類似する方法で較正物質が試験される。較正物質は、異なってはいるが既知の、決定される受容体分析対象物の濃度を含む。ほとんどの例においては、較正物質中に存在する濃度範囲は、未知のサンプルにおいて疑われる受容体結合分析対象物濃度の範囲に及ぶ。
【００５４】
ヘテロジニアスアッセイは、一つ以上の分離ステップを通常含み、競合的または非競合的である可能性がある。様々な競合的および非競合的アッセイフォーマットは、Ｄａｖａｌｉａｎらによる米国特許番号５，０８９，３９０、１４のカラム２５行からカラム１５の９行までに開示され、その開示は参照によって本明細書に組み入れられる。或る種の競合的アッセイにおいては、本明細書で記述されるように、そこに結合された受容体結合分析対象物用の受容体を有する担体は、受容体結合分析対象物および受容体結合分析対象物を含むと疑われるサンプルと、受容体結合分析物および酵素の複合体である試薬とを含む培地と接触する。接合した受容体を有する担体試薬は、本明細書で記述される原理に従う液体溶液中にある。担体および培地を分離した後、担体または培地の酵素活性が、従来技術によって決定され、これは、サンプル中の受容体結合分析対象物の存在および量のうちの一方またはその双方に関連する。ある例においては、第二の酵素が酵素複合体の酵素に加えて使用されてもよい。酵素の対のうちの酵素は、第一の酵素の生成物が第二の酵素に対する基質として役立つという点で関連する。
【００５５】
別の例示的アッセイフォーマットは捕捉アッセイである。このアッセイフォーマットにおいて、受容体結合分析対象物に対する受容体は、例えば、磁気粒子など粒子に対して共有結合される。或いは、受容体は、抗体が粒子に共有結合的に接合する場合、例えば、受容体に対する抗体などによって、粒子に対して非共有結合的に結合されてもよい。この受容体−粒子試薬は、アッセイで使用する前に、本明細書で記述される原理に従って液体溶液に保管される。サンプルは、受容体結合分析対象物に対する受容体に、サンプル中の受容体結合分析対象物が結合することを可能にするために、受容体−粒子試薬とインキュベートされる。任意で、粒子は、アッセイ培地から分離され、洗浄される。受容体結合分析対象物用の第二の受容体の複合体を含む試薬は、受容体が酵素に結合されるが、粒子とインキュベートされる。この第二の受容体−粒子試薬は、アッセイでの使用前に、本明細書に記述される原理に従って液体溶液中で保管される。洗浄後に、分離された粒子に結合された酵素量が測定され、これは、サンプル中の受容体結合分析対象物の存在および量のうちの一方またはその双方に直接関連する。
【００５６】
幾つかの実施形態においては、受容体結合分析物が例えば、他の受容体結合分析対象物のなどの一つ以上の他の分析対象物と共に検出対象でありうる場合に、複数分析物アッセイが使用されてもよい。このような複数分析物系は、例えば、ＬｏｏｒらによるＪ．Ａｎａｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２：２９９（１９８８）に記述されている。
【００５７】
上述されたアッセイは、適度なｐＨにおいて水性緩衝液培地で通常実行され、一般的には、最適のアッセイ感受性を提供する。アッセイ培地に対するｐＨは、例えば、約４から約１１の範囲、約５から約１０の範囲、または約６．５から約９．５の範囲内にあってもよい。ｐＨは、通常、あらゆる特異的な結合対のうちの結合要素の最適の結合間で妥協し、例えば、信号生成系の要素などアッセイの他の試薬に対して最適なｐＨとなる。
【００５８】
判定中に所望のｐＨを達成して、そのｐＨを維持するために様々なバッファが使用されてもよい。例示的バッファは、ホウ酸、リン酸、炭酸、トリス、バルビタールなどを含む。使用される特定のバッファは決定的なものではないが、個々のアッセイにおいていずれかのバッファが望ましいことがある。上述された方法において様々な補助的物質が使用されることがある。例えば、バッファに加えて、培地は、使用される培地および試薬に対する安定剤を含んでもよい。頻繁にこれらの添加剤に加えて、例えば、アルブミン、４基アンモニウム塩、硫酸デキストランなどのポリアニオン、結合増強剤などのたんぱく質が含まれることがある。
【００５９】
一つ以上のインキュベーション期間は、上述された様々な試薬の添加間のあらゆる間隔を含む一つ以上の間隔で、アッセイ培地に適用されてもよい。試薬の様々な成分の結合が生じるのに十分な温度および期間で、培地は通常インキュベートされる。測定期間中に方法を実行するために、適温、通常は一定温度、望ましくは室温が通常使用される。インキュベーション温度は、通常、例えば、約５℃から約９９℃、約１５℃から約７０℃、または約２０℃から約４５℃の範囲にある。インキュベーション期間は、約０．２秒から約２４時間、約１秒から約６時間、約２秒から約１時間、または約１分から約１５分である。期間は、培地の温度および様々な試薬の結合速度に依存し、会合速度定数、濃度、結合定数および分解速度定数によって決定される。測定中の温度は、通常、例えば、約１０℃から約５０℃または約１５℃から約４０℃の範囲にある。
【００６０】
測定されうる受容体結合分析対象物の濃度は、一般的には、１０−５から約１０−１７Ｍで変化し、より一般的には約１０−６から１０−１４Ｍで変化する。アッセイが（サンプル中の受容体結合分析対象物の量に関連して）定量的、半定量的または定性的であるか否かなどの考慮、特定の検出技術、分析対象物の濃度が、通常、様々な試薬の濃度を決定する。
【００６１】
アッセイ培地中の様々な試薬の濃度は、一般的には、例えば、興味ある受容体結合分析対象物の濃度範囲およびアッセイの特性によって決定される。しかしながら、各試薬の最終濃度は、この範囲にわたってアッセイの感受性を最適化するために、通常、経験的に決定される。即ち、重要な受容体結合分析対象物の濃度における変化は、正確に測定可能な信号差を提供する。信号生成系の特性および受容体結合分析対象物の特性などの考慮によって、通常様々な試薬の濃度を決定する。
【００６２】
添加の順序は広く変化することがあるが、アッセイの特性に依存する或る志向が存在する。最も単純な添加順序は、全ての物質を同時に添加することであり、アッセイ培地がホモジニアスアッセイにおける信号を有する影響を決定することである。或いは、試薬は、順次、混合することができる。幾つかの例においては、インキュベーションステップは、上述されたように各添加の後に含まれてもよい。
【００６３】
＜検査ステップ＞
アッセイ方の次のステップにおいて、培地は、受容体結合分析対象物および受容体結合分析対象物に対する受容体を含む錯体の存在を検査される。錯体の存在および／または量は、サンプル中の受容体結合分析対象物の存在および／または量を示す。
【００６４】
“受容体結合分析対象物の量の測定”という語句は、受容体結合分析対象物の定量的、半定量的および定性的決定のことを称する。受容体結合分析対象物を決定するための他の全ての方法と同様に、定量的、半定量的および定性的である方法は、受容体結合分析対象物の量を測定する方法であると考えられる。例えば、受容体結合分析対象物を含有すると疑われるサンプル中の受容体結合分析対象物の存在または不在を単に検出する方法は、本発明の範囲内に含まれると考えられる。“検出”および“決定”という語は、測定に対する他の共通の同義語と同様に、本発明の範囲内であることを意図される。
【００６５】
多くの実施形態においては、培地の検査は、培地からの信号の検出を含む。信号の存在および量のうちの一方またはその双方は、サンプル中の受容体結合分析対象物の存在および／または量に関連する。検出の特定のモードは、信号生成系の特性に依存する。上述されたように、信号生成系の標識は、外部手段によって、望ましくは目視検査により検出可能である信号を生成することができ、例えば、電磁放射、電気化学、熱、放射能検出および化学試薬を含む多数の方法が存在する。
【００６６】
信号生成系の活性化は、信号生成系の要素の特性に依存する。光によって活性化される信号生成系の要素に対して、この要素は、光を照射される。他の活性化法は、本明細書の開示に照らして、当業者に対して示唆される。幾つかの信号生成系に対して、例えば、放射性標識または酵素である標識を含むこのような系などでは、活性化用の薬剤は必要ではない。酵素系に対して、基質および／または補因子の添加が必要なことがある。
【００６７】
信号の存在および／または量に対する検査は、信号の検出も含み、検出は、一般的には、単に信号が読み出されるステップに過ぎない。信号は、通常、装置を利用して読み出され、装置の特性は、信号の特性に依存する。装置は、例えば、分光光度計、蛍光光度計、吸収分光高度計、ルミノメータ、ケミルミノメータ、光量計または写真撮影装置であってもよい。検出された信号の存在と量は、サンプル中の受容体結合分析対象物の存在と量に関係する。測定中の温度は、一般的には、例えば、約１０℃から約７０℃、約２０℃から約４５℃、または約２０℃から約２５℃の範囲である。あるアプローチにおいて、標準曲線は、スクリーニングされる受容体結合分析対象物の既知の濃度を利用して形成される。上述されたように、較正物質および他の対照もまた使用される。
【００６８】
＜アッセイの具体的実施形態＞
以下の例は、限定ではなく例示として、本明細書で記述される原理に従う具体例を記述し、本開示および添付の請求項の範囲を限定することなく単に説明することを意図される。受容体結合分析対象物としてのＴＳＨ自己抗体および第一、第二のＴＳＨ受容体キメラの選択もまた、限定ではなく例示的なものである。なぜなら、本明細書に記述される原理に従う例は、一般的に受容体結合分析対象物の検出と、上述されたような全ての異なる種類の受容体の使用に対する一般的用途を有するからである。
【００６９】
本明細書で記述される原理に従う一例においては、使用されるアッセイは、励起発光アッセイであり、米国特許番号５，３４０，７１６（Ｕｌｌｍａｎら）に記述され、その開示は参照によって本明細書に組み入れられる。試薬は、二つのラテックスビーズ試薬およびＴＳＨ自己抗体に対する第二のビオチン化ＴＳＨ受容体キメラを含む。第一のビーズ試薬は、複合体であり、化学発光色素を含む一方のラテックスビーズは、ＴＳＨ自己抗体に対する第一のＴＳＨ受容体キメラに対して共有結合か、非共有結合のいずれかで結合される。幾つかの例においては、第一のＴＳＨ受容体キメラ試薬および第二のＴＳＨ受容体キメラ試薬の双方は、本明細書で記述される原理に従って、液体溶液中で別々に保管される。第二のビーズ試薬は、ストレプトアビジンでコーティングされ、光増感剤色素を含有する。第一ステップにおいて、ＴＳＨ自己抗体を含むと疑われるサンプルは、ＴＳＨ自己抗体に対する第二のビオチン化ＴＳＨ受容体キメラとインキュベートされ、それによって、第二のビオチン化ＴＳＨ受容体キメラの分画をサンプル由来のＴＳＨ自己抗体が飽和することを可能とし、この分画は、アッセイ培地中のＴＳＨ自己抗体濃度に直接関係する。第二ステップにおいて、上述されたようにＴＳＨ自己抗体に対する第一のＴＳＨ受容体キメラに接合された第一のビーズ試薬が添加され、第二のビオチン化ＴＳＨ受容体キメラの非飽和分画と第二のビーズビオチン化ＴＳＨ受容体キメラ錯体の形成につながる。その後、第二のビーズ試薬が添加され、ビーズ対錯体を形成するためにビオチンに結合する。６８０ｎｍの光で照射されると、第二のビーズ試薬は、反応溶液中に溶解した酸素をより高エネルギーの一重項酸素形態に変換する。ビーズ対においては、一重項酸素は、第一のビーズ試薬に拡散し、それによって、化学発光反応を誘発する。結果として生じる化学発光信号は、６１２ｎｍで測定され、サンプル中のＴＳＨ自己抗体の濃度の関数である。この信号の量は、サンプル中のＴＳＨ自己抗体の存在または量に関連する。
【００７０】
本開示に従う別の例においては、ＴＳＨ自己抗体を含有すると疑われる試験サンプルは、試薬（試薬Ａ）と混合され、ビーズに接合されたＴＳＨ受容体キメラに対する抗体およびビーズの抗体に結合された第一のＴＳＨ受容体キメラを有するドライビーズと混合される。サンプル、ビーズおよび試薬Ａは、サンプル中のＴＳＨ自己抗体のうちの幾らかがＴＳＨ受容体キメラに結合するために十分な期間および条件下でインキュベートされる。液体試薬は、遠心分離によってビーズから分離され、その後洗浄される。洗浄されたビーズは、ビーズの第一のＴＳＨ受容体キメラに結合されたＴＳＨ自己抗体に結合された受容体を検出するのに十分な期間および条件下で、アルカリホスファターゼ（検出受容体）に結合された第二のＴＳＨ受容体キメラを含有する試薬Ｂとインキュベートされる。ビーズは、アッセイ培地から分離されて洗浄される。その後、ビーズは、アルカリホスファターゼに対する基質を含む基質溶液でインキュベートされ、その後、培地は、信号の存在および量のうちの一方またはその双方に対して検査され、それは、時間の経過と共にルミノメータで測定される。信号の存在および／または量は、元のサンプル中のＴＳＨ自己抗体の存在および／または量に関連する。
【００７１】
＜キット＞
特定のアッセイを実施するための試薬は、受容体結合分析対象物を判定するためのアッセイを簡便に実施するために有用なキットで存在してもよい。本明細書で記述される原理に従う一例においては、キットは、受容体結合分析対象物に対する受容体と受容体結合分析対象物の検出用アッセイを実施するための他の試薬との包装された組み合わせを含み、この試薬の特性は、特定のアッセイフォーマットに依存する。受容体試薬は、本明細書で記述される原理に従うキレート剤およびポリオールを含む液体溶液において存在する。キットは、標識を含む検出受容体薬剤をも含むことができる。検出受容体薬剤は、本明細書で記述される原理に従うキレート剤およびポリオールを含む液体溶液で存在する。試薬は、別々の容器に各々存在してもよいし、または試薬の交差反応性および安定性によって、一つ以上の容器内で混合することができる。キットは、例えば、酵素基質試薬などのさらなる結合試薬および補助的試薬など、アッセイを実施するための他の別々に包装された試薬をさらに含むことができる。
【００７２】
キット内の様々試薬の相対的な量は、アッセイ方法中に生じる必要がある反応を実質的に最適化する試薬の濃度を提供するため、さらにアッセイの感受性を実質的に最適化するために広く変化させることができる。本明細書で記述される原理に従う受容体を含有する試薬以外の試薬は、乾燥粉末、通常は凍結乾燥された粉末として好適な条件下で提供することができる。乾燥粉末は、本発明に従う方法またはアッセイを実施するのに好適な濃度を有する試薬溶液を提供する溶解状態で、添加剤を含む。キットは、上述された本発明に従う方法の記載をさらに含むことができる。
【００７３】
＜定義＞
本明細書で用いられるように“少なくとも”という語句は、或る項目の数が言及される数以上でありうることを意味する。
【００７４】
本明細書で用いられるように“約”という語句は、言及される数が＋１０％または−１０％異なることを意味し、例えば、“約５”とは、４．５から５．５の範囲を意味する。
【００７５】
“第一の”および“第二の”という指定は、単に二つの項目間で区別する目的のためだけに使用され、例えば、“第一の受容体”および“第二の受容体”とは、如何なる順番または順序も意味するわけではなく、また他方に対して一項目に対する重要性を意味するものでもない。  
【００７６】
＜例＞
以下の例は、例示であって、本開示および添付の請求項の範囲における限定ではない。本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、多数の改変および代替的組成物、方法およびシステムが考案されてもよい。特に断らない限り、以下の実験での材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから購入される。割合および百分率は、特に断らない限りは重量によるものである。
【００７７】
以下の例は、アッセイを記述し、チロイド刺激免疫グロブリン（ＴＳＩ）の定量的検出用キットを利用し、ここで、ＴＳＩとはＴＳＨ受容体に対する自己抗体である。血清サンプル中のＴＳＩの測定は、グレーブ病を疑われる患者の評価の支援として利用される。キットは、ドライビーズ、サンプルインキュベーションバッファ（試薬Ａ）、（２００９年１２月３１日に発行された米国特許出願公報２００９／０３２５３１０Ａ１で開示されたような）ＡＰに複合されたＴＳＨ受容体キメラを含有する検出バッファ（試薬Ｂ）で構成される。
【００７８】
＜略語＞
Ｌ＝（複数）リットル
ＩＵ＝国際単位
ＫＣＰＳ＝（複数の）毎秒キロカウント
クエン酸バッファ＝１００ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ塩化亜鉛、０．５％ＢＳＡ、０．１％マウスＩｇＧ、０．２％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、１０％グリセロール、ｐＨ６．０−６．８
ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン
ＩｇＧ＝免疫グロブリン
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＥＳバッファ＝１００ｍＭＭＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ塩化亜鉛、０．５％ＢＳＡ、０．１％マウスＩｇＧ、０．２％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、１０％グリセロール、ｐＨ６．０−６．８
ＰＩＰＥＳバッファ＝１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ塩化亜鉛、０．５％ＢＳＡ、０．１％マウスＩｇＧ、０．２％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、１０％グリセロール、ｐＨ６．０−６．８
【００７９】
＜例１  ビーズ上のＴＳＨ受容体のコーティング＞
ポリスチレンビーズは、ＴＳＨ受容体に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）のバッファ溶液（１００ｍＭ炭酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％窒化ナトリウム、ｐＨ９）で一晩インキュベートされた。過剰なＭａｂを除去するために同一のバッファで洗浄した後、ビーズは、ＴＳＨ受容体キメラのバッファ溶液（１００ｍＭＰＩＰＥＳ、２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、ｐＨ６．８）で二時間インキュベートされた。過度のＴＳＨ受容体を除去するために、同一のバッファで洗浄した後、ビーズは、一時間、１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、５％スクロース、ｐＨ６．８でインキュベートされ、その後、真空オーブンで乾燥された。
【００８０】
＜例２  ＴＳＨ受容体バッファ中のＨＥＤＴＡの影響＞
様々な量の天然ＴＳＩを有する血清サンプルが、例１に記述されたように固定されたヒトＴＳＨ受容体キメラを有するポリスチレンビーズと３０分間インキュベートされた。ビーズの遠心洗浄に続いて、ＨＥＤＴＡを含有しない（対照）または１ｍＭ  ＨＥＤＴＡを含有する検出バッファ（１００ｍＭＰＩＰＥＳ、１００ｍＭＫＣｌ、１ｍｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、５ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、２０％グリセロール、ｐＨ６．８）中でアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に複合された第二のＴＳＨ受容体キメラが、ビーズに添加された。３０分のインキュベーション後、ビーズは再度洗浄され、ＡＰ用の基質溶液が添加され、信号はルミノメータで検出された。信号は、検出バッファが最初に調製されて２日間３７℃で保管した後に測定された。表１は、０日から２日での様々なサンプルに対する信号の百分率（％）を示す。
【表１】
0006472789.tif 000002
【００８１】
１ｍＭＨＥＤＴＡを有する試薬は、ほぼ非特異的結合（ゼロＴＳＩサンプルに対する信号）より低い大きさのオーダを示し、最も高いＴＳＩ濃度のサンプルに対して、０日で、対照試薬の２倍を超える信号を示した。ＨＥＤＴＡを含有する試薬は、対照試薬に対するわずか１６％と比較して、その活性の６６％を維持した。ＡＰ酵素活性は、二つの試薬に対して、９１％から１０４％の間でわずかに変化し、これは、本明細書で記述された原理に従ってＨＥＤＴＡの存在下で、活性保持率の向上はＴＳＨ受容体の安定性改善によるものであって、ＡＰの安定性の改善によるものではないことを示している。
【００８２】
＜例３  ＴＳＨ受容体バッファ中のグリセロールの影響＞
ＡＰに複合された（上述されたように調製された）ＴＳＨ受容体キメラは、様々な濃度のグリセロールを含有する検出バッファ（０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ塩化亜鉛、１ｍＭＨＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬカゼイン、２．５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ、０．２ｍｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシン）に溶解された。検出バッファは、最初に調製されて、７日間、３７℃で保管した後評価された。表２は、様々な試薬に対して７日後に保持された最初の信号の百分率（％）を示す。
【表２】
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【００８３】
保持された信号によって示されるように、試薬のグリセロール含有量が２０％から５０％になると、検出受容体の安定性は、６６％から１００％近くまで改善した。
【００８４】
＜例４  ＴＳＨ受容体バッファ中のＨＥＤＴＡ濃度の影響＞
ＡＰに複合された（上述されたように調製された）ＴＳＨ受容体キメラは、様々な濃度のＨＥＤＴＡを含有するバッファ（０．１Ｍ  ＰＩＰＥＳ、５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ塩化亜鉛、５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬカゼイン、３０％グリセロール、２．５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ、０．２ｍｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシン）中に溶解された。表３は、様々なＨＥＤＴＡ濃度での様々なサンプルに対して得られた信号（ＫＣＰＳ）を示す。
【表３】
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【００８５】
最も高いＴＳＩサンプルに対する信号は、ＨＥＤＴＡ濃度が増加するにつれて劇的に増加した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性は、ＨＥＤＴＡ濃度が高くなるとわずかに減少し、より高濃度のＨＥＤＴＡにおける信号増加が受容体の維持された活性が高くなることによるものであって、ＡＰ活性によるものではないことを示している。
【００８６】
＜例５  キレートバッファ内のＴＳＨ受容体の影響＞
（上述されたように調製された）アルカリホスファターゼに複合されたＴＳＨ受容体キメラは、様々なｐＨレベルで様々なバッファ（ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、クエン酸）中に溶解された。バッファ剤のうちの全てが、上述されたように１０％グリセロールを含有した。図１は、３３ＩＵ／ＬのＴＳＩを有するサンプルに対する信号を示す。この信号は、様々なｐＨレベルで様々なバッファに対して、２０００ＫＣＰＳから４０００ＫＣＰＳで変化した。
【００８７】
図２は、一日中３７℃で受容体を検出バッファで保管した後に保持された信号の百分率を示す。ＭＥＳおよびＰＩＰＥＳバッファは、本明細書に記述された原理に従わないが、ｐＨに関係なく、最初の信号の２５％以下を保持した。本明細書で記述された原理に従うクエン酸バッファは、最初の信号の６５％から８０％の間で保持した。
【００８８】
前述の本発明は、明瞭に理解する目的で、例示として、幾つかの詳細事項において記述されてきたが、添付の請求項の趣旨または範囲から逸脱することなく、或る変更および改変が行われてもよいことを、本明細書で記述された原理に従う教示に照らして、当業者に対して容易に明らかであろう。さらに、前述の記載は、説明用に、実施例の十分な理解を提供するために特定の学名命名法を利用した。この特定の詳細事項は、本明細書に記述された例を実現するために必ずしも必要ではないことが当業者には明らかであろう。このように、本明細書に記述された原理に従う特定の例の前述の記載は、例示および説明のために提示され、開示されたまさにその形態に対して網羅的であるか、例を限定することを意図するものではない。上述の教示に照らして、多くの改変および変更が可能である。例は、本明細書で記述された原理およびその実践的用途を説明するために選択され、それによって、教示を当業者が利用することを可能にする。
【図１】
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【図２】
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