(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、
kfiAC遺伝子またはpmHS1遺伝子を有し、且つ
下記遺伝子（１）〜（３３）より選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が非改変株と比較して増大するように改変されていることを特徴とする、細菌：
（１）rpoE遺伝子；
（２）rfaH遺伝子；
（３）nusG遺伝子；
（４）rbsBKR-hsrA遺伝子；
（５）glgBX遺伝子；
（６）ybiXIJCB遺伝子；
（７）rcsBD-micF遺伝子；
（８）pcoESR遺伝子；
（９）yhcNO-aaeBAX遺伝子；
（１０）g1455-alpA-g1453遺伝子；
（１１）yrbA-mlaBCDEF-yrbG遺伝子；
（１２）norW遺伝子；
（１３）ybjIJK-rybB遺伝子；
（１４）thrBAL-yjtD-yjjY遺伝子；
（１５）fruA-psuK遺伝子；
（１６）ytfT-yjfF-fbp遺伝子；
（１７）yagU-paoAB遺伝子；
（１８）gsiCD-yliE遺伝子；
（１９）irp2-irp1遺伝子；
（２０）bhsA-ycfS遺伝子；
（２１）lepB-rnc-era遺伝子；
（２２）dapA-gcvR-bcp-hyfA遺伝子；
（２３）rpoE-nadB-yfiC-srmB遺伝子；
（２４）g1414-g1413遺伝子；
（２５）nuoEFG遺伝子；
（２６）glmZ-hemYXD遺伝子；
（２７）rlmL遺伝子；
（２８）artQMJ-rlmC-ybjO遺伝子；
（２９）yejOML遺伝子；
（３０）rpoS-ygbNML遺伝子；
（３１）g3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792遺伝子；
（３２）ryjA-soxRS-yjcCB遺伝子；
（３３）efeUO遺伝子。
【請求項２】
少なくともrpoE遺伝子の発現が増大するように改変されている、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
少なくともrfaH遺伝子の発現が増大するように改変されている、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
さらに、rbsR、rbsK、rbsB、hsrA、glgB、glgX、micF、rcsD、rcsB、ybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、ybiB、nusG、pcoR、pcoS、pcoE、yhcN、yhcO、aaeB、aaeA、aaeX、g1455、alpA
、g1453、yrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、yrbG、norW、ybjI、ybjJ、ybjK、rybB
、yjjY、yjtD、thrL、thrA、thrB、fruA、psuK、ytfT、yjfF、fbp、yagU、paoA、paoB、gsiC、gsiD、yliE、irp2、irp1、bhsA、およびycfS遺伝子からなる群より選択される１ま
たはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されている、請求項３に記載の細菌。
【請求項５】
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項６】
エシェリヒア・コリである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項７】
前記rbsB遺伝子が、配列番号２９の800〜1690位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号２９の800〜1690位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rbsK遺伝子が、配列番号２９の1816〜2745位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の1816〜2745位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rbsR遺伝子が、配列番号２９の2749〜3741位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の2749〜3741位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hsrA遺伝子が、配列番号２９の3707〜5134位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の3707〜5134位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記glgB遺伝子が、配列番号３４の989〜3175位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号３４の989〜3175位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記glgX遺伝子が、配列番号３４の3172〜5145位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３４の3172〜5145位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた
際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rcsB遺伝子が、配列番号４３の3312〜3962位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４３の3312〜3962位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rcsD遺伝子が、配列番号４３の623〜3295位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号４３の623〜3295位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記micF遺伝子が、配列番号４３の219〜311位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４３の219〜311位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiX遺伝子が、配列番号３７の718〜1395位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号３７の718〜1395位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiI遺伝子が、配列番号３７の1469〜1735位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の1469〜1735位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiJ遺伝子が、配列番号３７の2000〜2260位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の2000〜2260位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiC遺伝子が、配列番号３７の2488〜3574位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の2488〜3574位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiB遺伝子が、配列番号３７の3715〜4677位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の3715〜4677位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rfaH遺伝子が、配列番号４６に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４６に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nusG遺伝子が、配列番号４８に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４８に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記pcoR遺伝子が、配列番号５０の128〜808位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５０の128〜808位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記pcoS遺伝子が、配列番号５０の805〜2205位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号５０の805〜2205位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた
際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記pcoE遺伝子が、配列番号５０の2423〜2857位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５０の2423〜2857位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yhcN遺伝子が、配列番号５４の63〜326位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、
配列番号５４の63〜326位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み
、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yhcO遺伝子が、配列番号５４の382〜654位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の382〜654位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記aaeB遺伝子が、配列番号５４の746〜2713位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮ
Ａ、または、配列番号５４の746〜2713位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一
性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記aaeA遺伝子が、配列番号５４の2719〜3651位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の2719〜3651位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記aaeX遺伝子が、配列番号５４の3659〜3931位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の3659〜3931位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1455遺伝子が、配列番号６０の568〜1140位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６０の568〜1140位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一
性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記alpA遺伝子が、配列番号６０の1226〜1486位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６０の1226〜1486位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1453遺伝子が、配列番号６０の2389〜2529位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号６０の2389〜2529位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yrbA遺伝子が、配列番号６４の977〜1246位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮ
Ａ、または、配列番号６４の977〜1246位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一
性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaB遺伝子が、配列番号６４の1391〜1780位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の1391〜1780位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一
性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaC遺伝子が、配列番号６４の1684〜2319位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の1684〜2319位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaD遺伝子が、配列番号６４の2338〜2889位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の2338〜2889位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaE遺伝子が、配列番号６４の2894〜3676位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の2894〜3676位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaF遺伝子が、配列番号６４の3684〜4493位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の3684〜4493位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yrbG遺伝子が、配列番号６４の4703〜5680位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の4703〜5680位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記norW遺伝子が、配列番号７２の1201〜2334位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７２の1201〜2334位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjI遺伝子が、配列番号７４の117〜932位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の117〜932位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjJ遺伝子が、配列番号７４の932〜2140位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮ
Ａ、または、配列番号７４の932〜2140位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一
性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjK遺伝子が、配列番号７４の2224〜2760位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の2224〜2760位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rybB遺伝子が、配列番号７４の2777〜2855位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の2777〜2855位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjjY遺伝子が、配列番号７８の124〜264位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の124〜264位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjtD遺伝子が、配列番号７８の664〜1350位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号７８の664〜1350位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記thrL遺伝子が、配列番号７８の1564〜1629位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の1564〜1629位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記thrA遺伝子が、配列番号７８の1711〜4173位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の1711〜4173位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記thrB遺伝子が、配列番号７８の4175〜5107位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の4175〜5107位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記fruA遺伝子が、配列番号８４の897〜2588位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号８４の897〜2588位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記psuK遺伝子が、配列番号８４の3165〜3953位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８４の3165〜3953位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ytfT遺伝子が、配列番号８７の252〜1277位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号８７の252〜1277位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjfF遺伝子が、配列番号８７の1264〜2259位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８７の1264〜2259位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記fbp遺伝子が、配列番号８７の2292〜3290位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮ
Ａ、または、配列番号８７の2292〜3290位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yagU遺伝子が、配列番号９１の117〜731位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９１の117〜731位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記paoA遺伝子が、配列番号９１の1149〜1838位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９１の1149〜1838位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記paoB遺伝子が、配列番号９１の1835〜2791位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９１の1835〜2791位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記gsiC遺伝子が、配列番号９５の264〜1184位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または
、配列番号９５の264〜1184位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記gsiD遺伝子が、配列番号９５の1187〜2098位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９５の1187〜2098位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yliE遺伝子が、配列番号９５の2276〜4624位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９５の2276〜4624位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記irp2遺伝子が、配列番号１００に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１００に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記irp1遺伝子が、配列番号１０２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０２に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記bhsA遺伝子が、配列番号１０４の440〜697位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０４の440〜697位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ycfS遺伝子が、配列番号１０４の779〜1741位に示す塩基配列の相補配列を含むＤ
ＮＡ、または、配列番号１０４の779〜1741位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の
同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記lepB遺伝子が、配列番号１０７の1344〜2318位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０７の1344〜2318位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rnc遺伝子が、配列番号１０７の2590〜3270位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１０７の2590〜3270位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記era遺伝子が、配列番号１０７の3267〜4172位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１０７の3267〜4172位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記dapA遺伝子が、配列番号１１１の858〜1736位に示す塩基配列の相補配列を含むＤ
ＮＡ、または、配列番号１１１の858〜1736位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の
同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記gcvR遺伝子が、配列番号１１１の1882〜2454位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１１の1882〜2454位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記bcp遺伝子が、配列番号１１１の2454〜2924位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１１１の2454〜2924位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hyfA遺伝子が、配列番号１１１の3177〜3794位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１１の3177〜3794位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rpoE遺伝子が、配列番号１１６の355〜930位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の355〜930位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nadB遺伝子が、配列番号１１６の1338〜2960位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の1338〜2960位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yfiC遺伝子が、配列番号１１６の2945〜3682位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の2945〜3682位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記srmB遺伝子が、配列番号１１６の3814〜5148位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の3814〜5148位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1414遺伝子が、配列番号１２１の28〜699位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２１の28〜699位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を
含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1413遺伝子が、配列番号１２１の831〜1157位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２１の831〜1157位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nuoE遺伝子が、配列番号１２４の796〜1296位に示す塩基配列の相補配列を含むＤ
ＮＡ、または、配列番号１２４の796〜1296位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の
同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nuoF遺伝子が、配列番号１２４の1293〜2630位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２４の1293〜2630位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nuoG遺伝子が、配列番号１２４の2683〜5409位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２４の2683〜5409位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の
同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記glmZ遺伝子が、配列番号１２８の357〜563位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の357〜563位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hemY遺伝子が、配列番号１２８の611〜1807位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１２８の611〜1807位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hemX遺伝子が、配列番号１２８の1810〜2991位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の1810〜2991位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hemD遺伝子が、配列番号１２８の3013〜3753位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の3013〜3753位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rlmL遺伝子が、配列番号１３２の571〜2679位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１３２の571〜2679位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記artQ遺伝子が、配列番号１３４の386〜1102位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１３４の386〜1102位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記artM遺伝子が、配列番号１３４の1102〜1770位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の1102〜1770位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記artJ遺伝子が、配列番号１３４の2061〜2792位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の2061〜2792位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rlmC遺伝子が、配列番号１３４の2991〜4118位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の2991〜4118位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjO遺伝子が、配列番号１３４の4159〜4647位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の4159〜4647位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yejO遺伝子が、配列番号１４０の216〜2807位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１４０の216〜2807位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yejM遺伝子が、配列番号１４０の3061〜4821位に示す塩基配列の相補配列を含むＤ
ＮＡ、または、配列番号１４０の3061〜4821位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yejL遺伝子が、配列番号１４０の4841〜5068位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４０の4841〜5068位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rpoS遺伝子が、配列番号１４４の318〜1310位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１４４の318〜1310位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ygbN遺伝子が、配列番号１４４の1404〜2768位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の1404〜2768位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ygbM遺伝子が、配列番号１４４の2857〜3633位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の2857〜3633位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ygbL遺伝子が、配列番号１４４の3638〜4276位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の3638〜4276位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3798遺伝子が、配列番号１４９の615〜1268位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の615〜1268位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3797遺伝子が、配列番号１４９の1368〜2219位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、ま
たは、配列番号１４９の1368〜2219位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3796遺伝子が、配列番号１４９の2257〜2748位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、ま
たは、配列番号１４９の2257〜2748位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3795遺伝子が、配列番号１４９の3021〜3203位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、ま
たは、配列番号１４９の3021〜3203位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3794遺伝子が、配列番号１４９の3470〜4051位に示す塩基配列の相補配列を含む
ＤＮＡ、または、配列番号１４９の3470〜4051位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3793遺伝子が、配列番号１４９の4280〜4480位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、ま
たは、配列番号１４９の4280〜4480位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3792遺伝子が、配列番号１４９の4520〜4717位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、ま
たは、配列番号１４９の4520〜4717位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ryjA遺伝子が、配列番号１５７の657〜796位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の657〜796位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記soxR遺伝子が、配列番号１５７の790〜1254位に示す塩基配列の相補配列を含むＤ
ＮＡ、または、配列番号１５７の790〜1254位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の
同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記soxS遺伝子が、配列番号１５７の1340〜1663位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の1340〜1663位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjcC遺伝子が、配列番号１５７の1666〜3252位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の1666〜3252位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjcB遺伝子が、配列番号１５７の3682〜3963位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の3682〜3963位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記efeU遺伝子が、配列番号１６２の753〜1583位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、また
は、配列番号１６２の753〜1583位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配
列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記efeO遺伝子が、配列番号１６２の1641〜2768位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１６２の1641〜2768位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し、ヘパロサンを該培地中に生成蓄積すること、および該培地よりヘパロサンを採取すること、を含むヘパロサンの製造法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し、ヘパロサンを該培地中に生成蓄積すること、該ヘパロサンを化学的および／または酵素的に処理してヘパリンを生産すること、および該ヘパリンを回収すること、を含むヘパリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパロサン生産細菌及びヘパロサンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパロサン（Ｎ−アセチルヘパロサンともいう）は、グルクロン酸（GlcUA）残基とN-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）残基からなる二糖の繰り返し構造[→4)-β-GlcUA-(1→4)-α-GlcNAc-(1→]より構成される多糖である。【０００３】
自然界において、ヘパロサンは、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K5株およびパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）タイプD株により莢膜多糖として産生される（非特許文献１）。これらのヘパロサン生産細菌は、哺乳動物に対して尿路感染症や萎縮性鼻炎等の病原性を示す。【０００４】
エシェリヒア・コリK5株において、ヘパロサンの生合成には、ヘパロサン合成酵素であるグルコシルトランスフェラーゼ2種、およびヘパロサン排出担体6種が必要である。すなわち、まず、グルコシルトランスフェラーゼ（KfiAおよびKfiC）によってGlcNAcおよびGlcUAが糖鎖非還元末端へ交互に付加され、ヘパロサン鎖が伸長される（非特許文献２）。その後、ヘパロサン鎖は、ヘパロサン排出担体（KpsC、KpsD、KpsE、KpsM、KpsS、およびKpsT）を介して細胞表面上に輸送される（非特許文献３）。ヘパロサン鎖は、その還元末端での脂質置換を介して、細胞表面上でエシェリヒア・コリの外膜中のホスファチジン酸分子に固定されると考えられる（非特許文献４）。【０００５】
エシェリヒア・コリK5株では、ヘパロサン合成酵素遺伝子およびヘパロサン排出担体遺伝子は染色体上でクラスターを形成している。クラスターは、Region1〜3に区分され、クラスターの中央に位置するRegion2が、ヘパロサン合成酵素を含む４つのタンパク質（KfiA、KfiB、KfiC、KfiD）をコードする。【０００６】
また、パスツレラ・ムルトシダ タイプD株は、ヘパロサン合成酵素（グルコシルトランスフェラーゼ）としてPmHS1を有する（非特許文献５）。PmHS1はエシェリヒア・コリK5株由来のKfiAおよびKfiCの両方と相同性のある活性ドメインを有しており、UDP-グルクロン酸およびUDP-N-アセチルグルコサミンの両方を基質として重合反応を触媒する。パスツレラ・ムルトシダ タイプD株のヘパロサン排出担体は未だ明らかにされていない。【０００７】
ヘパリン（heparin）は抗凝固薬の一つであり、血栓塞栓症（thromboembolism）や播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation；DIC）の治療、人工透析や体外循環での血液凝固防止などに用いられる。ヘパロサンはヘパリンの糖鎖骨格であり、脱アセチル化、異性化、硫酸化、分子量調整等の工程を経ることによってヘパリン類似多糖類へと変換できる（非特許文献６、７）。【０００８】
ヘパリンは、抗凝固因子であるアンチトロンビンIIIの活性化を通じて、抗凝固作用を示す。アンチトロンビンIIIは、トロンビン、第Xa因子（第X因子の活性型）、およびその他のセリンプロテアーゼを、その活性セリン部位と結合することで阻害する。なお、トロンビンは血液凝固因子であり、第Xa因子はトロンビンの成熟に関与する因子である。ヘパリンは、このアンチトロンビンIIIと結合し、その構造を変化させて阻害作用を活性化する。トロンビンは、ヘパリン-アンチトロンビンIII複合体に対して、第Xa因子よりも高い親和性を有する。【０００９】
また、ヘパリンを酵素／化学処理および分画して得られる平均分子量4000-6000Daの低分子ヘパリンは、出血の副作用が少なく、近年使用頻度が増えてきている。低分子ヘパリンは、糖鎖が短いため、アンチトロンビンIIIとは結合できるが、トロンビンとはほとんど結合できない。ここで、ヘパリン-アンチトロンビンIII複合体によるトロンビンの阻害では、トロンビンがヘパリンに結合する必要があるのに対し、ヘパリン-アンチトロンビンIII複合体による第Xa因子の阻害では、第Xa因子がヘパリンに結合する必要はない。そのため、低分子ヘパリンは、トロンビンの作用をほとんど阻害しないのに対し、第Xa因子の作用は阻害できる。【００１０】
現在、大部分のヘパリン製剤は、豚腸粘膜からの抽出品である。しかしながら、２００８年に不純物混入を原因とする死亡事故が発生したことから、品質管理された非動物由来ヘパリンの製造開発が検討されてきた。【００１１】
近年、実験室規模の研究により、エシェリヒア・コリK5株から得られるヘパロサンを、ヘパリンに類似する抗凝固多糖類に酵素的に変換することができることが示された（非特許文献６、７）。また、ヘパロサンは、ヘパリンの製造以外にも、様々な用途において用いることができる（特許文献１）。【００１２】
ヘパロサンの大規模生産検討はエシェリヒア・コリK5株を用いて行われており、7 L発酵槽にて15 g/Lのヘパロサンが生成されたとの報告がある（非特許文献８、特許文献２）。ヘパリン製造の原料としてヘパロサンを工業化規模で供給するためには、100,000 L 規模へのスケールアップが必要であるが、基質消費速度向上や発酵槽の酸素供給増加などの課題が挙げられている。【００１３】
さらに、ごく最近、非病原性エシェリヒア・コリBL21(DE3)株を宿主としたヘパロサン生産細菌が報告された（非特許文献９）。すなわち、エシェリヒア・コリK5株由来Region2を構成する4つのヘパロサン生合成遺伝子kfiA, kfiB, kfiC, kfiDを発現ベクターpETDuet-1に搭載しBL21株へ導入することにより、フラスコ培養にて334 mg/Lのヘパロサン生成が確認されている。【００１４】
ヘパロサン生産に必要な因子は明らかとなっているが、ヘパロサン生産細菌においてヘパロサン生産能を向上させる因子は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO 2009/014559
【特許文献２】特表2013-503606
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Lindahl U. et al. (1998) J Biol Chem 273(39): 24979-24982
【非特許文献２】Hodson N. et al. (2000) J Biol Chem 275(35): 27311-27315
【非特許文献３】McNulty C. et al. (2006) Mol Microbiol 59(3): 907-22
【非特許文献４】Jann B, Jann K. (1990) Curr Top Microbiol Immunol 150: 19-42
【非特許文献５】Kane T.A. et al. (2006) J Biol Chem Nov 3; 281(44): 33192-33197
【非特許文献６】Lindahl U. et al. (2005) J Med Chem 48(2): 349-352
【非特許文献７】Zhang Z. et al. (2008) Journal of the American Chemical Society 130(39): 12998-13007
【非特許文献８】Wang Z. et al. (2010) Biotechnol Bioeng. 107(6): 964？973
【非特許文献９】Zang C. et al. (2012) Metabolic Engineering 14(5): 521？527
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、細菌のヘパロサン生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なヘパロサンの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本願発明者らは、鋭意検討の結果、ヘパロサン生産能を有する細菌において、表１〜３に記載の遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現を増大させることによって、ヘパロサン生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。【００１９】
【表１】
0006569530.tif 000002
【００２０】
【表２】
0006569530.tif 000003
【００２１】
【表３】
0006569530.tif 000004
【００２２】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、
rpoE、rbsR、rbsK、rbsB、hsrA、glgB、glgX、micF、rcsD、rcsB、ybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、ybiB、rfaH、nusG、pcoR、pcoS、pcoE、yhcN、yhcO、aaeB、aaeA、aaeX、g1455、alpA、g1453、yrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、yrbG、norW、ybjI、ybjJ、ybjK、rybB、yjjY、yjtD、thrL、thrA、thrB、fruA、psuK、ytfT、yjfF、fbp、yagU、paoA、paoB、gsiC、gsiD、yliE、irp2、irp1、bhsA、ycfS、lepB、rnc、era、dapA、gcvR、bcp、hyfA、nadB、yfiC、srmB、g1414、g1413、nuoE、nuoF、nuoG、glmZ、hemY、hemX、hemD、rlmL、artQ、artM、artJ、rlmC、ybjO、yejO、yejM、yejL、rpoS、ygbN、ygbM、ygbL、g3798、g3797、g3796、g3795、g3794、g3793、g3792、ryjA、soxR、soxS、yjcC、yjcB、efeU、およびefeO遺伝子からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されていることを特徴とする、細菌。
［２］
少なくともrpoE遺伝子の発現が増大するように改変されている、前記細菌。
［３］
少なくともrfaH遺伝子の発現が増大するように改変されている、前記細菌。
［４］
さらに、rbsR、rbsK、rbsB、hsrA、glgB、glgX、micF、rcsD、rcsB、ybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、ybiB、nusG、pcoR、pcoS、pcoE、yhcN、yhcO、aaeB、aaeA、aaeX、g1455、alpA、g1453、yrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、yrbG、norW、ybjI、ybjJ、ybjK、rybB、yjjY、yjtD、thrL、thrA、thrB、fruA、psuK、ytfT、yjfF、fbp、yagU、paoA、paoB、gsiC、gsiD、yliE、irp2、irp1、bhsA、およびycfS遺伝子からなる群より選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されている、前記細菌。
［５］
前記遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を高めること、及び／又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、前記細菌。
［６］
エシェリヒア・コリである、前記細菌。
［７］
前記rbsB遺伝子が、配列番号２９の800〜1690位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の800〜1690位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rbsK遺伝子が、配列番号２９の1816〜2745位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の1816〜2745位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rbsR遺伝子が、配列番号２９の2749〜3741位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の2749〜3741位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hsrA遺伝子が、配列番号２９の3707〜5134位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号２９の3707〜5134位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記glgB遺伝子が、配列番号３４の989〜3175位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３４の989〜3175位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記glgX遺伝子が、配列番号３４の3172〜5145位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３４の3172〜5145位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rcsB遺伝子が、配列番号４３の3312〜3962位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４３の3312〜3962位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rcsD遺伝子が、配列番号４３の623〜3295位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４３の623〜3295位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記micF遺伝子が、配列番号４３の219〜311位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４３の219〜311位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiX遺伝子が、配列番号３７の718〜1395位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の718〜1395位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiI遺伝子が、配列番号３７の1469〜1735位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の1469〜1735位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiJ遺伝子が、配列番号３７の2000〜2260位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の2000〜2260位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiC遺伝子が、配列番号３７の2488〜3574位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の2488〜3574位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybiB遺伝子が、配列番号３７の3715〜4677位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号３７の3715〜4677位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rfaH遺伝子が、配列番号４６に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４６に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nusG遺伝子が、配列番号４８に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号４８に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記pcoR遺伝子が、配列番号５０の128〜808位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５０の128〜808位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記pcoS遺伝子が、配列番号５０の805〜2205位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５０の805〜2205位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記pcoE遺伝子が、配列番号５０の2423〜2857位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５０の2423〜2857位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yhcN遺伝子が、配列番号５４の63〜326位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の63〜326位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yhcO遺伝子が、配列番号５４の382〜654位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の382〜654位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記aaeB遺伝子が、配列番号５４の746〜2713位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の746〜2713位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記aaeA遺伝子が、配列番号５４の2719〜3651位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の2719〜3651位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記aaeX遺伝子が、配列番号５４の3659〜3931位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号５４の3659〜3931位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1455遺伝子が、配列番号６０の568〜1140位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６０の568〜1140位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記alpA遺伝子が、配列番号６０の1226〜1486位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６０の1226〜1486位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1453遺伝子が、配列番号６０の2389〜2529位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６０の2389〜2529位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yrbA遺伝子が、配列番号６４の977〜1246位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の977〜1246位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaB遺伝子が、配列番号６４の1391〜1780位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の1391〜1780位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaC遺伝子が、配列番号６４の1684〜2319位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の1684〜2319位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaD遺伝子が、配列番号６４の2338〜2889位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の2338〜2889位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaE遺伝子が、配列番号６４の2894〜3676位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の2894〜3676位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記mlaF遺伝子が、配列番号６４の3684〜4493位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の3684〜4493位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yrbG遺伝子が、配列番号６４の4703〜5680位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号６４の4703〜5680位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記norW遺伝子が、配列番号７２の1201〜2334位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７２の1201〜2334位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjI遺伝子が、配列番号７４の117〜932位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の117〜932位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjJ遺伝子が、配列番号７４の932〜2140位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の932〜2140位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjK遺伝子が、配列番号７４の2224〜2760位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の2224〜2760位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rybB遺伝子が、配列番号７４の2777〜2855位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７４の2777〜2855位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjjY遺伝子が、配列番号７８の124〜264位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の124〜264位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjtD遺伝子が、配列番号７８の664〜1350位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の664〜1350位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記thrL遺伝子が、配列番号７８の1564〜1629位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の1564〜1629位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記thrA遺伝子が、配列番号７８の1711〜4173位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の1711〜4173位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記thrB遺伝子が、配列番号７８の4175〜5107位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号７８の4175〜5107位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記fruA遺伝子が、配列番号８４の897〜2588位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８４の897〜2588位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記psuK遺伝子が、配列番号８４の3165〜3953位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８４の3165〜3953位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ytfT遺伝子が、配列番号８７の252〜1277位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８７の252〜1277位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjfF遺伝子が、配列番号８７の1264〜2259位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８７の1264〜2259位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記fbp遺伝子が、配列番号８７の2292〜3290位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号８７の2292〜3290位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yagU遺伝子が、配列番号９１の117〜731位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９１の117〜731位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記paoA遺伝子が、配列番号９１の1149〜1838位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９１の1149〜1838位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記paoB遺伝子が、配列番号９１の1835〜2791位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９１の1835〜2791位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記gsiC遺伝子が、配列番号９５の264〜1184位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９５の264〜1184位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記gsiD遺伝子が、配列番号９５の1187〜2098位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９５の1187〜2098位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yliE遺伝子が、配列番号９５の2276〜4624位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号９５の2276〜4624位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記irp2遺伝子が、配列番号１００に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１００に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記irp1遺伝子が、配列番号１０２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０２に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記bhsA遺伝子が、配列番号１０４の440〜697位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０４の440〜697位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ycfS遺伝子が、配列番号１０４の779〜1741位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０４の779〜1741位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記lepB遺伝子が、配列番号１０７の1344〜2318位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０７の1344〜2318位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rnc遺伝子が、配列番号１０７の2590〜3270位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０７の2590〜3270位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記era遺伝子が、配列番号１０７の3267〜4172位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１０７の3267〜4172位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記dapA遺伝子が、配列番号１１１の858〜1736位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１１の858〜1736位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記gcvR遺伝子が、配列番号１１１の1882〜2454位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１１の1882〜2454位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記bcp遺伝子が、配列番号１１１の2454〜2924位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１１の2454〜2924位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hyfA遺伝子が、配列番号１１１の3177〜3794位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１１の3177〜3794位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rpoE遺伝子が、配列番号１１６の355〜930位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の355〜930位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nadB遺伝子が、配列番号１１６の1338〜2960位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の1338〜2960位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yfiC遺伝子が、配列番号１１６の2945〜3682位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の2945〜3682位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記srmB遺伝子が、配列番号１１６の3814〜5148位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１１６の3814〜5148位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1414遺伝子が、配列番号１２１の28〜699位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２１の28〜699位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g1413遺伝子が、配列番号１２１の831〜1157位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２１の831〜1157位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nuoE遺伝子が、配列番号１２４の796〜1296位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２４の796〜1296位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nuoF遺伝子が、配列番号１２４の1293〜2630位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２４の1293〜2630位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記nuoG遺伝子が、配列番号１２４の2683〜5409位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２４の2683〜5409位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記glmZ遺伝子が、配列番号１２８の357〜563位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の357〜563位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hemY遺伝子が、配列番号１２８の611〜1807位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の611〜1807位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hemX遺伝子が、配列番号１２８の1810〜2991位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の1810〜2991位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記hemD遺伝子が、配列番号１２８の3013〜3753位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１２８の3013〜3753位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rlmL遺伝子が、配列番号１３２の571〜2679位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３２の571〜2679位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記artQ遺伝子が、配列番号１３４の386〜1102位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の386〜1102位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記artM遺伝子が、配列番号１３４の1102〜1770位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の1102〜1770位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記artJ遺伝子が、配列番号１３４の2061〜2792位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の2061〜2792位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rlmC遺伝子が、配列番号１３４の2991〜4118位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の2991〜4118位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ybjO遺伝子が、配列番号１３４の4159〜4647位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１３４の4159〜4647位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yejO遺伝子が、配列番号１４０の216〜2807位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４０の216〜2807位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yejM遺伝子が、配列番号１４０の3061〜4821位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４０の3061〜4821位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yejL遺伝子が、配列番号１４０の4841〜5068位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４０の4841〜5068位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記rpoS遺伝子が、配列番号１４４の318〜1310位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の318〜1310位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ygbN遺伝子が、配列番号１４４の1404〜2768位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の1404〜2768位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ygbM遺伝子が、配列番号１４４の2857〜3633位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の2857〜3633位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ygbL遺伝子が、配列番号１４４の3638〜4276位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４４の3638〜4276位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3798遺伝子が、配列番号１４９の615〜1268位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の615〜1268位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3797遺伝子が、配列番号１４９の1368〜2219位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の1368〜2219位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3796遺伝子が、配列番号１４９の2257〜2748位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の2257〜2748位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3795遺伝子が、配列番号１４９の3021〜3203位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の3021〜3203位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3794遺伝子が、配列番号１４９の3470〜4051位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の3470〜4051位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3793遺伝子が、配列番号１４９の4280〜4480位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の4280〜4480位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記g3792遺伝子が、配列番号１４９の4520〜4717位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１４９の4520〜4717位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記ryjA遺伝子が、配列番号１５７の657〜796位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の657〜796位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記soxR遺伝子が、配列番号１５７の790〜1254位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の790〜1254位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記soxS遺伝子が、配列番号１５７の1340〜1663位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の1340〜1663位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjcC遺伝子が、配列番号１５７の1666〜3252位に示す塩基配列の相補配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の1666〜3252位に示す塩基配列の相補配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記yjcB遺伝子が、配列番号１５７の3682〜3963位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１５７の3682〜3963位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記efeU遺伝子が、配列番号１６２の753〜1583位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１６２の753〜1583位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり；
前記efeO遺伝子が、配列番号１６２の1641〜2768位に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、配列番号１６２の1641〜2768位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、且つ、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、前記細菌。
［８］
前記細菌を培地で培養し、ヘパロサンを該培地中に生成蓄積すること、および該培地よりヘパロサンを採取すること、を含むヘパロサンの製造法。
［９］
前記細菌を培地で培養し、ヘパロサンを該培地中に生成蓄積すること、該ヘパロサンを化学的および／または酵素的に処理してヘパリンを生産すること、および該ヘパリンを回収すること、を含むヘパリンの製造法。【００２３】
表１〜３に記載した各遺伝子の遺伝子産物の機能およびヘパロサン生産との関連について以下に述べる。【００２４】
RbsR、RbsK、およびRbsBは、D-リボースの取り込みと利用に関与する因子である。RbsRは、リボース代謝のリプレッサーであり、リボースの異化反応に関与するタンパク質をコードするrbsオペロンの転写を負に制御する (Laikova ON et al. (2001) "Computational analysis of the transcriptional regulation of pentose utilization systems in the gamma subdivision of Proteobacteria." FEMS Microbiol Lett. 205(2):315-22)。RbsKは、リボキナーゼであり、D-リボースのリン酸化を触媒する (Bork P et al. (1993) "Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: the hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases."Protein Sci. 2(1):31-40)。RbsBは、リボースABCトランスポーターを構成するサブユニットの１つであり、リボースABCトランスポーターはD-リボースの取り込みを行う (Iida A. et al. (1984) "Molecular cloning and characterization of genes required for ribose transport and utilization in Escherichia coli K-12." J Bacteriol. 158(2):674-82)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００２５】
HsrAは、メジャー・ファシリテーター・スーパーファミリー（MFS）の１種と推定される内膜タンパク質である (Pao SS et al. (1998) "Major facilitator superfamily." Microbiol Mol Biol Rev. 62(1):1-34)。HsrAは、配列相同性よりプロトン駆動性の薬剤排出システムの機能を有すると推定されるが、その実際の機能は同定されていない。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００２６】
GlgBおよびGlgXは、それぞれ、グリコーゲンの生合成および分解に関与する酵素である。GlgBは、グリコーゲン分枝酵素（1,4-α-グルカン分枝酵素）であり、グリコーゲン生合成過程において、α-1,6-グリコシド結合の形成によりポリグルコース鎖に分岐を導入する (Boyer C and Preiss (1977) "Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase." J Biochemistry. 16(16):3693-9)。GlgXは、グリコーゲン脱分枝酵素であり、3または4個のグルコース残基単位でα-1,6-グリコシド結合を加水分解し、グリコーゲンの分岐を解消する (Dauvillee D et al. (2005) "Role of the Escherichia coli glgX gene in glycogen metabolism." J Bacteriol. 187(4):1465-73)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００２７】
micFは、OmpFの発現抑制に関与するアンチセンスRNAであり、特に浸透圧条件下で機能することが知られている (Ramani Nら(1994)"micF antisense RNA has a major role in osmoregulation of OmpF in Escherichia coli." J. Bacteriol 176:5005-5010)。このヌクレオチド鎖とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００２８】
RcsBは、エシェリヒア（Escherichia）属、サルモネラ（Salmonella）属、クレブシエラ（Klebsiella）属等に属する細菌に見られる転写制御因子であり、主に莢膜構成成分であるコラン酸（Colanic acid）の生合成を制御していると考えられている (Majdalani Nら(2005)"The Rcs phosphorelay: a complex signal transduction system." Anuu. Rev. Microbiol. 59:379-405)。また、RcsBは、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter freundii）のVi多糖発現 (Houng HSら (1992) "Expression of Vi antigen in Escherichia coli K-12: characterization of ViaB from Citrobacter freundii and identity of ViaA with RcsB" J. Bacteriol 174:5910-5915) やクレブシエラ属細菌のK2莢膜の発現 (Rochaporn Wら (1992) "Involvement of rcsB in Klebsiella K2 Capsule Synthesis in Escherichia coli K-12" J. Bacteriol 174:1063-1067) に関与するとの報告がある。また、RcsBの過剰発現はK30莢膜多糖の生産を増大させることが知られているが、RcsBは、K30莢膜多糖の重合化酵素をコードするcspクラスターの転写には関与せず、前駆体であるUDP-グルコースの生合成酵素をコードするgalF遺伝子の発現を正に制御するとの報告がある (Andrea Rahnら (2003) "Transcriptional organization and regulation of The Escherichia coli" Mol. Microbiol. 47:1045-1060)。一方、RcsBの過剰発現は、K5莢膜多糖（ヘパロサン）やK1莢膜多糖の生産を増大させないと報告されている (Wendy J. Keenleysideら (1993) "Coexpression of Colanic Acid and Serotype-Specific Capsular Polysaccharides in Escherichia coli Strains with Group II K Antigens" J. Bacteriol 175:6725-6730)。RcsDは、ヒスチジンキナーセを有するセンサー蛋白質であり、外部からの刺激に応答してリン酸基をRcsBに伝達することが知られている。【００２９】
YbiX、YbiI、YbiJ、YbiC、およびYbiBは機能未知の因子である。従って、これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３０】
RfaHは、エシェリヒア・コリおよびサルモネラ・ティフィムリウムにおいてリポ多糖の生合成、α−ヘモリシンの分泌、およびＦ因子の産生に必要な転写因子である (Leeds JA and Welch RA (1996) "RfaH enhances elongation of Escherichia coli hlyCABD mRNA." J Bacteriol. 178(7):1850-7.)。また、エシェリヒア・コリK5株においては、K5莢膜形成にRfaHが必要であること (Stevens MP et al. (1994) "Regulation of Escherichia coli K5 capsular polysaccharide expression: evidence for involvement of RfaH in the expression of group II capsules" FEMS Microbiol Lett. 124(1):93-98.)、および、RfaHは、Region3（kpsM, kpsT）のプロモーター領域に結合し、Region3だけでなく下流のRegion2（kfiA, kfiB, kfiC, kfiD）の転写を正に制御することが知られている (Xue P. et al.(2009) "Regulation of expression of the region 3 promoter of the Escherichia coli K5 capsule gene cluster involves H-NS, SlyA, and a large 5' untranslated region." J Bacteriol. 191(6):1838-1846.)。しかしながら、エシェリヒア・コリK5株や他のヘパロサン生産細菌において、rfaH遺伝子の発現増強によるヘパロサン生産量への影響は調べられていなかった。【００３１】
NusGは転写因子であり、RNAポリメラーゼと相互作用することで転写を制御していると考えられている（Li J. et al. (1992) J Biol Chem 267(9): 6012-6019）。また、NusGは、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）の莢膜生合成に関与しているとの報告がある（Livanis M. et al. (2009） J Bacteriol 191(23): 7288-7295）。しかし、いずれもこれまでにヘパロサン生合成との関与については報告がない。なお、NusGはRfaHのホモログであり、NusGはRfaHと共通のドメインを持つとされる（Bailey M. et al. （1996） Mol Microbiol 22(4): 7729-737）。しかしながら、エシェリヒア・コリK-12株、K5株、B株のいずれにおいても、NusGとRfaH間でのアミノ酸配列の相同性は20%程度であり、両者が高い相同性を有するとは言えない。【００３２】
PcoR、PcoS、およびPcoEは、銅耐性に関与する因子である。PcoRおよびPcoSは、それぞれ、pcoオペロンのアクチベーターおよび環境刺激に応答する二成分制御系のセンサータンパク質に相同性が高い (Cooksey D.A. (2006) "Copper uptake and resistance in bacteria." Mol Microbiol. 7(1):1-5)。PcoEは、銅結合タンパク質である。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３３】
YhcNは、過酸化水素ストレスに対する菌体応答に関与する因子である。yhcN遺伝子の欠損株においては、過酸化水素への感受性が向上し、バイオフィルム形成量が増加する (Lee J. et al. (2010) "Identification of stress-related proteins in Escherichia coli using the pollutant cis-dichloroethylene." J Appl Microbiol. Jun;108(6):2088-102.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３４】
YhcOは、Bacillus amyloliquefaciens由来の有毒なRNaseであるバルナーゼの阻害因子と相同性がある。しかしながら、エシェリヒア（Escherichia）属細菌はバルナーゼファミリーのRNaseを有しておらず、YhcOの機能は明らかではない。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３５】
AaeBおよびAaeAは、４−ヒドロキシ安息香酸の排出担体のサブユニットである。AaeXも排出担体と推定されるが、実際の機能は未知である (Van Dyk T.K. et al. (2004) "Characterization of the Escherichia coli AaeAB efflux pump: a metabolic relief valve?" J. Bacteriol. 186:7196-7204)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３６】
g1455およびg1453遺伝子は、Esherichia coli K5株のみに見出された遺伝子であり、これらの遺伝子にコードされるタンパク質の機能は未知である。従って、これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３７】
AlpAは、プロファージインテグラーゼをコードするintA遺伝子の発現調節因子であり、intAの発現増加を介してLonプロテーゼの欠損を相補する働きを有する (Trempy J.E. et al. (1994) "Alp suppression of Lon: dependence on the slpA gene." J Bacteriol. 176(7):2061-7)。AlpAは、バイオフィルム形成や莢膜生成と関連がある可能性はあるものの (Herzberg M. et al. (2006) "YdgG (TqsA) controls biofilm formation in Escherichia coli K-12 through autoinducer 2 transport." J Bacteriol. 188(2):587-98)、AlpAとヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３８】
YrbA（別名IbaG）は、DNA結合型転写因子と推定される因子であり、酸性ストレス条件下で発現量が増加する (Guinote I.B. et al. (2012) "Characterization of the BolA homolog IbaG: a new gene involved in acid resistance." J Microbiol Biotechnol. 22(4):484-93.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００３９】
MlaB、MlaC、MlaD、MlaE、およびMlaFは、リン脂質ABCトランスポーターの構成因子であり、リン脂質の輸送および脂質非対称性の維持に関与する (Malinverni J.C. and Silhavy T.J. (2009) "An ABC transport system that maintains lipid asymmetry in the gram-negative outer membrane." Proc Natl Acad Sci U S A. 106(19):8009-14.)。これらのタンパク質のヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００４０】
YrbGは、５回膜貫通型の内膜タンパク質であり、配列相同性からNa+/Ca2+交換輸送体と推定されている。しかしながら、YrbGの菌体内Ca2+レベル調節能は確認されておらず、実際の機能は未知である (Naseem R. et al. (2008) "pH and monovalent cations regulate cytosolic free Ca(2+) in E. coli." Biochim Biophys Acta. 1778(6):1415-22)。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見も全く存在しない。【００４１】
NorWは、一酸化窒素（NO）ストレスに応答して発現するNO還元酵素である (Gardner A.M. et al. (2003) "Role of NorR and sigma54 in the nitric oxide stress response." J Biol Chem. 278(12):10081-6.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００４２】
YbjIは、ハロ酸脱ハロゲン化酵素様の加水分解酵素ファミリーに属するフラビンモノヌクレオチド（FMN）リン酸化酵素である (Kuznetsova E. et al. (2006) "Genome-wide analysis of substrate specificities of the Escherichia coli haloacid dehalogenase-like phosphatase family." J Biol Chem. 281(47):36149-61)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００４３】
YbjJおよびYbjKは、機能未知のタンパク質である。従って、これらのタンパク質とヘパロサン生成との関連性を示す知見も全く存在しない。【００４４】
RybBは、細胞表層ストレスに応答して活性化されるシグマ因子σEに依存して発現する低分子RNAであり、シグマ因子σEの合成を抑制する (Thompson K.M. et al. (2007) "SigmaE regulates and is regulated by a small RNA in Escherichia coli."J Bacteriol. 189(11):4243-56)。また、RybBは、OmpCおよびOmpWの発現抑制にも関与する (Johansen J. et al. (2006) "Conserved small non-coding RNAs that belong to the sigmaE regulon: role in down-regulation of outer membrane proteins." J Mol Biol. 364(1):1-8)。RybBとヘパロサン生成との関連性を示す知見は全く存在しない。【００４５】
YjjYは、機能未知のタンパク質である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見も全く存在しない。【００４６】
YjtDは、RNAメチルトランスフェラーゼの一種と推定されるが、実際の機能は未知である (Anantharaman V. et al. (2002) "SPOUT: a class of methyltransferases that includes spoU and trmD RNA methylase superfamilies, and novel superfamilies of predicted prokaryotic RNA methylases. J Mol Microbiol Biotechnol. 4(1):71-5)。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見も全く存在しない。【００４７】
ThrB、ThrA、およびThrLは、スレオニン生合成経路の酵素である。ThrBは、ホモセリンからO‐ホスホ‐L‐ホモセリンへの変換反応を触媒するホモセリンキナーゼであり、スレオニンの生合成に関与する (Burr B. et al. (1976) "Homoserine kinase from Escherichia coli K12." Eur J Biochem.62(3):519-26.)。ThrAは、アスパラギン酸キナーゼＩおよびホモセリン脱水素酵素Ｉの二つの機能を有する酵素であり、スレオニンに加えて、リジンおよびメチオニンの生合成に関与する (Clark RB, Ogilvie J.W. et al. (1972) "Aspartokinase I-homoserine dehydrogenase I of Escherichia coli K12 . Subunit molecular weight and nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate binding." Biochemistry. 11(7):1278-82.)。また、ThrLは、thrLABCオペロンのリーダーペプチドであり、スレオニンおよびイソロイシンの濃度に応じてthrLABCオペロンの発現を弱化する (Lynn S.P. et al. (1982) "Attenuation regulation in the thr operon of Escherichia coli K-12: molecular cloning and transcription of the controlling region."J Bacteriol. 152(1):363-71.)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００４８】
FruAは、フルクトースPTS透過酵素であり、IIBドメインおよびIICドメインを有する (Prior T.I. and Kornberg H.L. (1988) "Nucleotide sequence of fruA, the gene specifying enzyme IIfru of the phosphoenolpyruvate-dependent sugar phosphotransferase system in Escherichia coli K12." J Gen Microbiol. 134(10): 2757-68.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００４９】
PsuKは、シュードウリジンキナーゼであり、tRNAのTΨCループによく見られる修飾RNAであるシュードウリジンの異化に関与する (Solomon L.R. and Breitman T.R. (1971) "Pseudouridine kinase of escherichia coli: a new enzyme." Biochem Biophys Res Commun.44(2):299-304.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５０】
YtfTおよびYjfFは、ガラクトースABC輸送担体の膜構成成分であると推測されるが、実際の機能は未知である。従って、これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見も全く存在しない。【００５１】
Fbpは、糖新生経路においてフルクトース−１,６−二リン酸からフルクトース−６−リン酸への反応を触媒するフルクトース−１,６−二リン酸脱リン酸化酵素（fructose-1,6-bisphosphatase）である (Fraenkel D.G. and Horecker B.L. (1965) "Fructose-1, 6-diphosphatase and acid hexose phosphatase of Escherichia coli."J Bacteriol. 90(4):837-42.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５２】
YagUは、内膜タンパク質と推定されるが、その機能は未知である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見も全く存在しない。【００５３】
PaoA（別名YagT）およびPaoB（別名YagS）は、アルデヒド酸化還元酵素YagTSRの構成因子である。PaoAは鉄結合サブユニット、PaoBはフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）結合サブユニットである (Neumann M. et al. (2009) "A periplasmic aldehyde oxidoreductase represents the first molybdopterin cytosine dinucleotide cofactor containing molybdo-flavoenzyme from Escherichia coli." FEBS J. 276(10):2762-74)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５４】
GsiCおよびGsiDは、グルタチオンABC輸送担体の構成因子である。GsiCおよびGsiDは内膜に局在する (Moussatova A. et al. (2008) "ATP-binding cassette transporters in Escherichia coli." Biochim Biophys Acta.1778(9):1757-71.)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５５】
YliEは、c-di-GMP-特異的ホスホジエステラーゼと推定され、過剰発現によりバイオフィルム形成を促進する (Boehm A. et al. (2009) "Second messenger signalling governs Escherichia coli biofilm induction upon ribosomal stress." Mol Microbiol. 72(6):1500-16.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５６】
Irp2およびIrp1は、ノンリボソーマルペプチド合成酵素であり、鉄取込みに関与する (Pelludat C. et. al. (1998) "The yersiniabactin biosynthetic gene cluster of Yersinia enterocolitica: organization and siderophore-dependent regulation." J Bacteriol. 180(3):538-46.)。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５７】
BhsA（別名YcfR）は、外膜タンパク質と推定され、バイオフィルム形成およびストレス応答に関与する (Zhang X.S. et al. (2007) "YcfR (BhsA) influences Escherichia coli biofilm formation through stress response and surface hydrophobicity." J Bacteriol. 189(8):3051-62.)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５８】
YcfSは、L,D-トランスペプチダーゼの一種である。YcfSは、ペプチドグリカンのmeso-ジアミノピメリン酸（DAP）残基からD-アラニン残基を除去し、当該meso-DAP残基にブラウンリポタンパク質のＣ末端のリジン残基を結合する反応を触媒する。この反応によって、ペプチドグリカンはブラウンリポタンパク質を介して外膜へ共有結合的に結合する (Magnet S. et al. (2007) "Identification of the L,D-transpeptidases responsible for attachment of the Braun lipoprotein to Escherichia coli peptidoglycan." J Bacteriol.189(10):3927-31)。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００５９】
LepBは、分泌タンパク質からＮ末端リーダーペプチドを除去するシグナルペプチダーゼである（Dalbey R.E. (1991) "Leader peptidase." Mol Microbiol. 5(12):2855-60.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６０】
Rncは、二本鎖RNAを切断して5'リン酸基およびヒドロキシル基を生じるRNaseIIIであり、rRNAやファージmRNAのプロセシングに必要である。Rncの主な役割は、遺伝子発現の調節とアンチセンスRNAの機能化である（Robertson H.D. and Dunn J.J. (1975) "Ribonucleic acid processing activity of Escherichia coli ribonuclease III." J Biol Chem. 25;250(8):3050-6）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６１】
Eraは、生存に必須な因子である（Takiff HE et al. (1992) "Locating essential Escherichia coli genes by using mini-Tn10 transposons: the pdxJ operon." J Bacteriol. 174(5):1544-53）。Eraは、Yeast two-hybrid 法によりMazGと相互作用することが分かっている（Zhang J. and Inouye M. (2002) "MazG, a nucleoside triphosphate pyrophosphohydrolase, interacts with Era, an essential GTPase in Escherichia coli." J Bacteriol. 184(19):5323-9）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６２】
DapAは、4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthaseである。4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthaseは、リジン生合成酵素の１つであり、ピルビン酸とＬ-アスパラギン酸β-セミアルデヒドから(2S,4S)-4-Hydroxy-2,3,4,5-tetrahydrodipicolinateへの反応を触媒する。同反応は、アスパラギン酸キナーゼIIIの後のリジン生合成において律速段階であると考えられている（Laber B. et al. (1992) "Escherichia coli dihydrodipicolinate synthase. Identification of the active site and crystallization." Biochem J. 288 (Pt 2):691-5）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６３】
GcvRは、転写調節因子と推定されるタンパク質であり、グリシンの生合成遺伝子の発現に関与する。GcvRは、グリシン不在下では、直接GcvAと結合してGlvR/GlvA複合体を形成し、グリシン分解遺伝子群の発現を阻害する。グリシン存在下では、グリシンがGcvRに結合し、GlvR/GlvA複合体の形成を阻害する（Ghrist A.C. et al. (2001)"GcvR interacts with GcvA to inhibit activation of the Escherichia coli glycine cleavage operon." Microbiology 147(Pt 8):2215-21.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６４】
Bcpは、チオレドキシン-1依存性のチオールペルオキシダーゼである（Clarke D.J. et al. (2009) “Interrogating the molecular details of the peroxiredoxin activity of the Escherichia coli bacterioferritin comigratory protein using high-resolution mass spectrometry.” Biochemistry. 48(18):3904-14）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６５】
HyfAは、4つの4Fe-4Sクラスターを有しており、電子輸送に関与すると推定されるタンパク質である（Andrews S.C. et al. (1997) "A 12-cistron Escherichia coli operon (hyf) encoding a putative proton-translocating formate hydrogenlyase system." Microbiology. 143 (Pt 11):3633-47.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６６】
RpoEは、RNAポリメラーゼのサブユニットとして機能するシグマ因子の一種、シグマＥ（σE）である。RpoEは、熱ショックやストレスに応答して膜および膜間部のタンパク質でのプロテアーゼの発現を調節する（Ades S.E. et al. (2003) "Regulation of the alternative sigma factor sigma(E) during initiation, adaptation, and shutoff of the extracytoplasmic heat shock response in Escherichia coli." J Bacteriol. 185(8):2512-9.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６７】
NadBは、L-アスパラギン酸オキシダーゼである。L-アスパラギン酸オキシダーゼは、de novo NAD生合成経路における初発酵素であり、FAD依存的にL-アスパラギン酸からイミノアスパラギン酸への反応を触媒する（Mortarino M. et al. (1996) “L-aspartate oxidase from Escherichia coli. I. Characterization of coenzyme binding and product inhibition.” Eur J Biochem. 239(2):418-26.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６８】
YfiCは、バリンtRNAのA37（37位のアデニン）の6位のNをメチル化するメチルトランスフェラーゼである（Golovina A.Y. et al. (2009）RNA. "The yfiC gene of E. coli encodes an adenine-N6 methyltransferase that specifically modifies A37 of tRNA1Val(cmo5UAC)." 15(6):1134-41.）。tRNAの37位の塩基はアンチコドン・トリプレットに隣接しており、しばしば修飾される。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００６９】
SrmBは、リボソームの50Sサブユニット集合において初期段階の反応を促進するDEAD-box型RNAヘリカーゼである（Charollais J. et al. (2003) "The DEAD-box RNA helicase SrmB is involved in the assembly of 50S ribosomal subunits in Escherichia coli." Mol Microbiol. 48(5):1253-65.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７０】
G1414およびG1413は、機能未知のタンパク質である。従って、これらのタンパク質とヘパロサン生成との関連性を示す知見も全く存在しない。【００７１】
NuoE、NuoF、およびNuoGは、NADHデヒドロゲナーゼIの可溶性フラグメントであり、電子伝達系への電子の入り口として機能する（Braun M. et al. (1998) "Characterization of the overproduced NADH dehydrogenase fragment of the NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Escherichia coli." Biochemistry. 37(7):1861-7.）。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７２】
GlmZは、菌体内グルコサミン-6-リン酸の濃度に反応してglmS mRNAの発現および翻訳を転写後修飾によって調節する低分子RNAである（Kalamorz F. et al. (2007) “Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli.” Mol Microbiol. 65(6):1518-33.）。GlmZは、glmS mRNAの5'-UTRに直接結合し、ループ構造をとっていたglmS mRNAのSD領域を自由にすることにより、glmS mRNAの翻訳を活性化する（Urban J.H. and Vogel J.et al. (2008) "Two seemingly homologous noncoding RNAs act hierarchically to activate glmS mRNA translation." PLoS Biol. 6(3):e64）。GlmSは、L-グルタミン：D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼである。L-グルタミン：D-フルクトース-6-リン酸アミノトランスフェラーゼは、ヘパロサンの前駆体であるUDP-N-アセチルグルコサミン供給経路の第一酵素であり、フルクトース-6-リン酸からグルコサミン-6-リン酸への反応を触媒する。しかしながら、GlmSの活性強化とヘパロサン生成能の関連性を示す知見は存在せず、GlmZとヘパロサン生産との関連性を示す知見も全く存在しない。【００７３】
HemY、HemX、およびHemDは、ヘムとコリンの生合成経路の酵素である。HemYは、ヘム生合成経路でプロトポルフィリノゲンIXを酸化してプロトポルフィリンIXを生成するプロトポルフィリノゲンオキシダーゼである（Dailey T.A. et al. (1994) "Expression of a cloned protoporphyrinogen oxidase." The Journal of Biological Chemistry, 269:813-815.）。HemXは、コリン生合成経路でウロポルフィリノゲンIIIをメチル化しプレコリンIIを生成するウロポルフィリノゲンIIIメチラーゼと推定されているが、実際の機能は未知である（Sasarman A. et al. (1988) "Nucleotide sequence of the hemX gene, the third member of the Uro operon of Escherichia coli K12." Nucleic Acids Res. 16(24):11835）。HemDは、ヘムとコリンの生合成経路における共通の最終代謝中間体であるウロポルフィリノゲンIIIを生成するウロポルフィリノゲンIIIシンターゼである（Jordan P.M. and Woodcock S.C. (1991) "Mutagenesis of arginine residues in the catalytic cleft of Escherichia coli porphobilinogen deaminase that affects dipyrromethane cofactor assembly and tetrapyrrole chain initiation and elongation." Biochem J. 280 (Pt 2):445-9.）。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７４】
RlmL（別名RlmKL）は、23S rRNAのG2445およびG2069をメチル化するメチルトランスフェラーゼである（Kimura S. et al. (2012) "Base methylations in the double-stranded RNA by a fused methyltransferase bearing unwinding activity." Nucleic Acids Res. 40(9):4071-85.）。RlmLは、融合タンパク質であり、特に、Ｎ末側のドメインをRlmL、Ｃ末側のドメインをRlmKと呼ぶ場合がある。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７５】
ArtQ、ArtM、およびArtJは、アルギニンABCトランスポーターのサブユニットである（Linton K.J. and Higgins C.F. (1998) "The Escherichia coli ATP-binding cassette (ABC) proteins." Mol Microbiol. 28(1):5-13.）。ArtJはペリプラズムに局在すると推測されている。ArtMおよびArtは、疎水性タンパク質であることから、内膜に局在し、ATPaseであるArtPと協同してアルギニンの内膜透過装置として機能すると推測されている。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７６】
RlmC（別名RumB）は、23S rRNAのU747をメチル化するメチルトランスフェラーゼである（Madsen C.T. et al. (2003) “Identifying the methyltransferases for m(5)U747 and m(5)U1939 in 23S rRNA using MALDI mass spectrometry." Nucleic Acids Res. 31(16):4738-46.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７７】
YbjOは、内膜タンパク質であると推定されているが、その機能は未知である（Rapp M. et al. (2004) “Experimentally based topology models for E. coli inner membrane proteins.” Protein Sci. 13(4):937-45.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７８】
YejOは、外膜タンパク質であり、フェーズ可変的なタンパク質排出の機能を持つ（Henderson I.R. and Owen P. (1999) "The major phase-variable outer membrane protein of Escherichia coli structurally resembles the immunoglobulin A1 protease class of exported protein and is regulated by a novel mechanism involving Dam and oxyR." J Bacteriol. 181(7):2132-41.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００７９】
YejMは、ハイドロラーゼの１種と推定されているが、実際の機能は未知である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８０】
YejLは、機能未知のタンパク質である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８１】
RpoSは、RNAポリメラーゼのサブユニットとして機能するシグマ因子の一種、シグマＳ（σS）である。RpoSは、ストレスに応答してグローバルに遺伝子の発現調節を行なう（Maciag A. et al. (2011) “In vitro transcription profiling of the σS subunit of bacterial RNA polymerase: re-definition of the σS regulon and identification of σS-specific promoter sequence elements.” Nucleic Acids Res. 39(13):5338-55.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８２】
YgbNは、グルコン酸輸送に関与するGntファミリーに属するトランスポーターと推定されるタンパク質であり、プロトン駆動型代謝物質取込み担体である可能性が示唆されている（Peekhaus N. et al. (1997) "Characterization of a novel transporter family that includes multiple Escherichia coli gluconate transporters and their homologues." FEMS Microbiol Lett. 147(2):233-8.）。このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８３】
YgbMは、機能未知のタンパク質である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８４】
YbgLは、アルドラーゼの１種と推定されているが、実際の機能は未知である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８５】
G3798は、SOS-response transcriptional repressor (RecA-mediated autopeptidase)と推定されるタンパク質である。G3794は、Superinfection exclusion protein Bと推定されるタンパク質である。G3793は、restriction inhibitor protein ral (Antirestriction protein)と推定されるタンパク質である。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８６】
G3797、G3796、G3795、およびG3792は、機能未知のタンパク質である。従って、これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８７】
RyjAは、約140ntの低分子RNAである（Wassarman K.M. et al. (2001) "Identification of novel small RNAs using comparative genomics and microarrays." Genes Dev. 15(13): 1637-51.）。このRNAとヘパロサンとの関連性を示す知見は全く存在しない。【００８８】
SoxRSは、酸化ストレス応答に関与する転写制御因子である。SoxRは酸化ストレスにより活性化されてSoxSの発現を誘導し、SoxRSはSoxRSレギュロン遺伝子の発現を誘導する（Gu M. and Imlay J.A. (2011) "The SoxRS response of Escherichia coli is directly activated by redox-cycling drugs rather than by superoxide." Mol Microbiol. 79(5):1136-50.; Touati D. (2000) "Sensing and protecting against superoxide stress in Escherichia coli--how many ways are there to trigger soxRS response?" Redox Rep. 5(5):287-93.）。SoxRSは、リポポリサッカライドの生成に関与することが知られている（Lee J.H. et al. (2009) "SoxRS-mediated lipopolysaccharide modification enhances resistance against multiple drugs in Escherichia coli." J Bacteriol. 191(13):4441-50.）が、これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００８９】
YjcCは、c-di-GMP特異的なホスホジエステラーゼである（Boehm A. et al. (2009) "Second messenger signalling governs Escherichia coli biofilm induction upon ribosomal stress." Mol Microbiol. 72(6):1500-16.）。YjcCの過剰発現によりバイオフィルム形成を減少することが知られているが、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００９０】
YjcBは、機能未知タンパク質である。従って、このタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。【００９１】
EfeUおよびEfeOは、二価鉄イオン輸送担体EfeUOBのコンポーネントである。EfeUは透過酵素として、EfeOはペリプラズムに局在するタンパク質として、それぞれ機能する（Cao J. et al. (2007) “EfeUOB (YcdNOB) is a tripartite, acid-inducedand CpxAR-regulated, low-pH Fe2+ transporter that iscryptic in Escherichia coli K-12 but functional in E. coli O157:H7." Mol Microbiol 65:857？875）。これらのタンパク質とヘパロサン生産との関連性を示す知見は全く存在しない。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の構造を示す図。図中の塩基配列を配列番号１６５に示す。
【図２】変異型nlpDプロモーター（Pnlp8）の構造を示す図。図中の塩基配列を配列番号１６８に示す。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
以下、本発明を詳説する。
【００９４】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、表１〜３に記載の遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変された細菌である。
【００９５】
＜１−１＞ヘパロサン生産能を有する細菌
本発明において、「ヘパロサン生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、ヘパロサンを生成し、回収できる程度に培地中に蓄積する能力を有する細菌をいう。ヘパロサン生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするヘパロサンを培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、５０ｍｇ／Ｌ以上、１００ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上、または３００ｍｇ／Ｌ以上の量のヘパロサンを培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００９６】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００９７】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、BL21(DE3)株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号 C6000-03）。
【００９８】
本発明の細菌は、本来的にヘパロサン生産能を有するものであってもよく、ヘパロサン生産能を有するように改変されたものであってもよい。ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にヘパロサン生産能を付与することにより取得できる。
【００９９】
ヘパロサン生産能は、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、付与できる。ヘパロサン生産に関与するタンパク質としては、グリコシルトランスフェラーゼやヘパロサン排出担体タンパク質が挙げられる。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。遺伝子の導入は、後述する遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。
【０１００】
ここでいう「グリコシルトランスフェラーゼ」とは、N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）および／またはグルクロン酸（GlcUA）を糖鎖非還元末端に付加し、ヘパロサン鎖を伸長する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「グリコシルトランスフェラーゼ活性」ともいう。グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子としては、kfiA遺伝子、kfiC遺伝子、pmHS1遺伝子が挙げられる。
【０１０１】
kfiA遺伝子およびkfiC遺伝子としては、エシェリヒア・コリK5株のkfiA遺伝子およびkfiC遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリK5株のkfiA遺伝子がコードするKfiAタンパク質は、UDP-GlcNAcを基質として、GlcNAcを糖鎖非還元末端に付加する。エシェリヒア・コリK5株のkfiC遺伝子がコードするKfiCタンパク質は、UDP-GlcUAを基質として、GlcUAを糖鎖非還元末端に付加する。エシェリヒア・コリK5株のkfiAおよびkfiC遺伝子は、kfiBおよびkfiD遺伝子とともに、kfiABCDオペロン（Region2ともいう）を構成する。エシェリヒア・コリK5株のkfiABCDオペロンを含む領域の塩基配列を配列番号２４に示す。配列番号２４に示す塩基配列中、kfiA、kfiB、kfiC、kfiD遺伝子は、それぞれ、445〜1164位の配列、1593〜3284位の配列、4576〜6138位の配列、6180〜7358位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のKfiA、KfiB、KfiC、KfiDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２５〜２８に示す。
【０１０２】
pmHS1遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ タイプD株のpmHS1遺伝子が挙げられる。パスツレラ・ムルトシダ タイプD株のpmHS1遺伝子がコードするPmHS1タンパク質は、UDP-GlcNAcおよびUDP-GlcUAの両方を基質として、GlcNAcおよびGlcUAを交互に糖鎖非還元末端に付加する。パスツレラ・ムルトシダ タイプD株のpmHS1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。
【０１０３】
ここでいう「ヘパロサン排出担体タンパク質」とは、細胞膜を通してヘパロサン鎖を細胞外へ排出する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「ヘパロサン排出活性」ともいう。ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子としては、kpsC、kpsD、kpsE、kpsM、kpsS、およびkpsT遺伝子が挙げられる。kpsC、kpsD、kpsE、kpsM、kpsS、およびkpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリK5株やエシェリヒア・コリB株のkpsC、kpsD、kpsE、kpsM、kpsS、およびkpsT遺伝子が挙げられる。これらの株のkpsC、kpsD、kpsE、およびkpsS遺伝子は、kpsFおよびkpsU遺伝子とともに、kpsFEDUCSオペロン（Region1ともいう）を構成する。また、これらの株のkpsMおよびkpsT遺伝子は、kpsMTオペロン（Region3ともいう）を構成する。これらの株のkpsC、kpsD、kpsE、kpsM、kpsS、およびkpsT遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。
【０１０４】
導入する遺伝子は、用いる細菌の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、エシェリヒア・コリB株は、ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子を有するが、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有さない。よって、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリB株にヘパロサン生産能を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリK-12株は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を有さない。よって、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の両方を導入することにより、エシェリヒア・コリK-12株にヘパロサン生産能を付与することができる。
【０１０５】
すなわち、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリK5株；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株にエシェリヒア・コリK5株由来のkfiA遺伝子およびkfiC遺伝子を導入した株；W3110株やMG1655株等のエシェリヒア・コリK-12株にエシェリヒア・コリK5株由来のkfiA遺伝子およびkfiC遺伝子、ならびにエシェリヒア・コリK5株またはエシェリヒア・コリB株由来のkpsC、kpsD、kpsE、kpsM、kpsS、およびkpsT遺伝子を導入した株；ならびにそれらの派生株が挙げられる。エシェリヒア・コリB株にエシェリヒア・コリK5株由来のkfiA遺伝子およびkfiC遺伝子を導入した株として、具体的には、例えば、実施例に記載のエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-region2が挙げられる。
【０１０６】
また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、同細菌がもともと有する遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリK5株を、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリB株を、ヘパロサン排出担体タンパク質をコードする１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変してもよい。
【０１０７】
また、ヘパロサン生産能を有する細菌は、ヘパロサン生産能を損なわない限り、その他の改変がなされていてもよい。例えば、ヘパロサン生産能を有する細菌は、kfiB、kfiD、kpsF、およびkpsU遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。すなわち、例えば、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入の際には、Region2をまとめて導入してもよく、グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子とヘパロサン排出担体タンパク質をコードする遺伝子の導入の際には、Region1〜3をまとめて導入してもよい。
【０１０８】
なお、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。「元の機能が維持された」とは、例えば、グリコシルトランスフェラーゼにあっては、タンパク質のバリアントがグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することをいい、ヘパロサン排出担体タンパク質にあっては、タンパク質のバリアントがヘパロサン排出活性を有することをいう。例えば、ヘパロサン生産能の付与等の細菌の改変に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、表１〜３に記載の遺伝子およびそれらがコードするタンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【０１０９】
＜１−２＞表１〜３に記載の遺伝子の発現の増大
本発明の細菌は、表１〜３に記載の遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されている。本発明の細菌は、ヘパロサン生産能を有する細菌を、表１〜３に記載の遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、表１〜３に記載の遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように細菌を改変した後に、ヘパロサン生産能を付与することによっても得ることができる。なお、本発明の細菌は、表１〜３に記載の遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するように改変されたことにより、ヘパロサン生産能を獲得したものであってもよい。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【０１１０】
「表１〜３に記載の遺伝子」とは、具体的には、rbsR、rbsK、rbsB、hsrA、glgB、glgX、micF、rcsD、rcsB、ybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、ybiB、rfaH、nusG、pcoR、pcoS、pcoE、yhcN、yhcO、aaeB、aaeA、aaeX、g1455、alpA、g1453、yrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、yrbG、norW、ybjI、ybjJ、ybjK、rybB、yjjY、yjtD、thrL、thrA、thrB、fruA、psuK、ytfT、yjfF、fbp、yagU、paoA、paoB、gsiC、gsiD、yliE、irp2、irp1、bhsA、ycfS、lepB、rnc、era、dapA、gcvR、bcp、hyfA、rpoE、nadB、yfiC、srmB、g1414、g1413、nuoE、nuoF、nuoG、glmZ、hemY、hemX、hemD、rlmL、artQ、artM、artJ、rlmC、ybjO、yejO、yejM、yejL、rpoS、ygbN、ygbM、ygbL、g3798、g3797、g3796、g3795、g3794、g3793、g3792、ryjA、soxR、soxS、yjcC、yjcB、efeU、およびefeO遺伝子をいう。なお、表１〜３に記載の遺伝子を「表１〜３の遺伝子」ともいう。
【０１１１】
rbsR、rbsK、およびrbsB遺伝子は、D-リボースの取り込みに関与する因子をコードする遺伝子である。rbsR遺伝子は、rbsオペロンのリプレッサーをコードする。rbsK遺伝子は、リボキナーゼをコードする。rbsB遺伝子は、リボースABCトランスポーターを構成するサブユニットの１つをコードする。Escherichia coli K-12 MG1655株のrbsR、rbsK、およびrbsB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、3,936,250〜3,937,242位の配列、3,935,317〜3,936,246位の配列、および3,934,301〜3,935,191位の配列に相当する。また、MG1655株のRbsR、RbsK、およびRbsBタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418209 (version NP_418209.1 GI:16131621)、GenBank accession NP_418208 (version NP_418208.1 GI:16131620)、およびGenBank accession NP_418207 (version NP_418207.1 GI:16131619)として登録されている。
【０１１２】
hsrA遺伝子は、メジャー・ファシリテーター・スーパーファミリー（MFS）の１種と推定される内膜タンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のhsrA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3,937,208〜3,938,635位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のHsrAタンパク質は、GenBank accession NP_418210 (version NP_418210.1 GI:16131622)として登録されている。
【０１１３】
エシェリヒア・コリK5株のrbsB、rbsK、rbsR、hsrA遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号２９に示す。配列番号２９に示す塩基配列中、rbsB、rbsK、rbsR遺伝子は、それぞれ、800〜1690位の配列、1816〜2745位の配列、2749〜3741位の配列に相当する。また、配列番号２９に示す塩基配列中、hsrA遺伝子は、3707〜5134位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のRbsR、RbsK、RbsB、HsrAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３０〜３３に示す。
【０１１４】
glgB遺伝子は、グリコーゲン分枝酵素（1,4-α-グルカン分枝酵素）をコードする遺伝子である。glgX遺伝子は、グリコーゲン脱分枝酵素をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のglgBおよびglgX遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、3,569,339〜3,571,525位の配列の相補配列および3,567,369〜3,569,342位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のGlgBおよびGlgXタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_417890 (version NP_417890.1 GI:16131306)およびGenBank accession NP_417889 (version NP_417889.1 GI:16131305)として登録されている。
【０１１５】
エシェリヒア・コリK5株のglgBおよびglgX遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号３４に示す。配列番号３４に示す塩基配列中、glgBおよびglgX遺伝子は、それぞれ、989〜3175位の配列および3172〜5145位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のGlgBおよびGlgXタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３５および３６に示す。
【０１１６】
micF遺伝子は、OmpFの発現抑制に関与するアンチセンスRNAをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のmicF遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,311,106〜2,311,198位の配列に相当する。
【０１１７】
rcsDおよびrcsB遺伝子は、転写因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrcsDおよびrcsB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、2,311,510〜2,314,182位および2,314,199〜2,314,849位の配列に相当する。また、MG1655株のRcsDおよびRcsBタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_416720 (version NP_416720.1 GI:16130153)およびGenBank accession NP_416721 (version NP_416721.1 GI:16130154)として登録されている。
【０１１８】
エシェリヒア・コリK5株のrcsB、rcsD、およびmicF遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号４３に示す。配列番号４３に示す塩基配列中、rcsB、rcsD、およびmicF遺伝子は、それぞれ、3312〜3962位の配列、623〜3295位の配列、219〜311位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のRcsBおよびRcsDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号４４および４５に示す。
【０１１９】
ybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、およびybiB遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、およびybiB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、837,753〜838,430位の配列の相補配列、837,413〜837,679位の配列の相補配列、836,888〜837,148位の配列の相補配列、835,574〜836,659位の配列、および834,471〜835,433位の配列に相当する。また、MG1655株のYbiX、YbiI、YbiJ、YbiC、およびYbiBタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_415325 (version NP_415325.4 GI:90111170)、GenBank accession NP_415324 (version NP_415324.1 GI:16128771)、GenBank accession NP_415323 (version NP_415323.1 GI:16128770)、GenBank accession NP_415322 (version NP_415322.1 GI:16128769)、およびGenBank accession NP_415321 (version NP_415321.1 GI:16128768)として登録されている。
【０１２０】
エシェリヒア・コリK5株のybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、ybiB遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号３７に示す。配列番号３７に示す塩基配列中、ybiX、ybiI、ybiJ遺伝子は、それぞれ、718〜1395位の配列、1469〜1735位の配列、2000〜2260位の配列に相当する。また、配列番号３７に示す塩基配列中、ybiCおよびybiB遺伝子は、2488〜3574位の配列の相補配列および3715〜4677位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYbiX、YbiI、YbiJ、YbiC、YbiBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３８〜４２に示す。
【０１２１】
rfaHおよびnusG遺伝子は、転写因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrfaHおよびnusG遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、4,022,356〜4,022,844位の配列の相補配列および4,175,766〜4,176,311位の配列に相当する。また、MG1655株のRfaHおよびNusGタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418284 (version NP_418284.1 GI:16131688)およびGenBank accession NP_418409 (version NP_418409.1 GI:16131812)として登録されている。
【０１２２】
エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のrfaH遺伝子の塩基配列を配列番号４６に、同遺伝子がコードするRfaHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４７に、それぞれ示す。エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のnusG遺伝子の塩基配列を配列番号４８に、同遺伝子がコードするNusGタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４９に、それぞれ示す。
【０１２３】
pcoR、pcoS、およびpcoE遺伝子は、銅耐性に関与する因子をコードする遺伝子である。pcoR遺伝子は、pcoオペロンのアクチベーターに相同なタンパク質をコードする。pcoS遺伝子は、二成分制御系のセンサータンパク質に相同なタンパク質をコードする。pcoE遺伝子は、銅結合タンパク質をコードする。Escherichia coli K-12 MG1655株のゲノムにおいて、これらの遺伝子はアノテートされていない。
【０１２４】
エシェリヒア・コリK5株のpcoR、pcoS、およびpcoE遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号５０に示す。配列番号５０に示す塩基配列中、pcoR、pcoS、およびpcoE遺伝子は、それぞれ、128〜808位の配列、805〜2205位の配列、2423〜2857位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のPcoR、PcoS、およびPcoEタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５１〜５３に示す。
【０１２５】
yhcN遺伝子は、ストレス応答に関与する因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyhcN遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3,383,560〜3,383,823位の配列に相当する。また、MG1655株のYhcNタンパク質は、GenBank accession NP_417705 (version NP_417705.2 GI:90111561)として登録されている。
【０１２６】
yhcO遺伝子は、RNaseの阻害因子に相同なタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyhcO遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3,383,879〜3,384,151位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYhcOタンパク質は、GenBank accession NP_417706 (version NP_417706.1 GI:16131129)として登録されている。
【０１２７】
aaeBおよびaaeA遺伝子は、４−ヒドロキシ安息香酸の排出担体のサブユニットをコードする遺伝子である。aaeX遺伝子は、排出担体と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のaaeB、aaeA、およびaaeX遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、3,384,243〜3,386,210位の配列の相補配列、3,386,216〜3,387,148位の配列の相補配列、および3,387,156〜3,387,359位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のAaeB、AaeA、およびAaeXタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_417707 (version NP_417707.1 GI:16131130)、GenBank accession NP_417708 (version NP_417708.1 GI:16131131)、およびGenBank accession NP_417709 (version NP_417709.2 GI:90111562)として登録されている。
【０１２８】
エシェリヒア・コリK5株のyhcN、yhcO、aaeB、aaeA、およびaaeX遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号５４に示す。配列番号５４に示す塩基配列中、yhcN、yhcO、aaeB、aaeA、およびaaeX遺伝子は、それぞれ、63〜326位の配列、382〜654位の配列の相補配列、746〜2713位の配列の相補配列、2719〜3651位の配列の相補配列、3659〜3931位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYhcN、YhcO、AaeB、AaeA、およびAaeXタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５５〜５９に示す。
【０１２９】
g1455およびg1453遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のゲノムにおいて、これらの遺伝子はアノテートされていない。
【０１３０】
alpA遺伝子は、intA遺伝子の発現調節因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のalpA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,756,666〜2,756,878位の配列に相当する。また、MG1655株のAlpAタンパク質は、GenBank accession NP_417113 (version NP_417113.1 GI:16130542)として登録されている。
【０１３１】
エシェリヒア・コリK5株のg1455、alpA、およびg1453遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号６０に示す。配列番号６０に示す塩基配列中、g1455、alpA、およびg1453遺伝子は、それぞれ、568〜1140位の配列の相補配列、1226〜1486位の配列の相補配列、2389〜2529位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のG1455、AlpA、およびG1453タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６１〜６３に示す。
【０１３２】
yrbA遺伝子（別名ibaG）は、DNA結合型転写因子と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyrbA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3,334,571〜3,334,825位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYrbAタンパク質は、GenBank accession NP_417657 (version NP_417657.2 GI:90111555)として登録されている。
【０１３３】
mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、およびmlaF遺伝子は、リン脂質ABCトランスポーターの構成因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のmlaB、mlaC、mlaD、mlaE、およびmlaF遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、3,334,985〜3,335,278位の配列の相補配列、3,335,278〜3,335,913位の配列の相補配列、3,335,932〜3,336,483位の配列の相補配列、3,336,488〜3,337,270位の配列の相補配列、および3,337,278〜3,338,087位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のMlaB、MlaC、MlaD、MlaE、およびMlaFタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_417658 (version NP_417658.4 GI:90111556)、GenBank accession NP_417659 (version NP_417659.1 GI:16131082)、GenBank accession NP_417660 (version NP_417660.1 GI:16131083)、GenBank accession NP_417661 (version NP_417661.1 GI:16131084)、およびGenBank accession NP_417662 (version NP_417662.1 GI:16131085)として登録されている。
【０１３４】
yrbG遺伝子は、Na+/Ca2+交換輸送体と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyrbG遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3,338,297〜3,339,274位の配列に相当する。また、MG1655株のYrbGタンパク質は、GenBank accession NP_417663 (version NP_417663.1 GI:16131086)として登録されている。
【０１３５】
エシェリヒア・コリK5株のyrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、およびyrbG遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号６４に示す。配列番号６４に示す塩基配列中、yrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、およびyrbG遺伝子は、それぞれ、977〜1246位の配列の相補配列、1391〜1780位の配列の相補配列、1684〜2319位の配列の相補配列、2338〜2889位の配列の相補配列、2894〜3676位の配列の相補配列、3684〜4493位の配列の相補配列、4703〜5680位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYrbA、MlaB、MlaC、MlaD、MlaE、MlaF、およびYrbGタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６５〜７１に示す。
【０１３６】
norW遺伝子は、NO還元酵素をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のnorW遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,831,934〜2,833,067位の配列に相当する。また、MG1655株のNorWタンパク質は、GenBank accession NP_417191 (version NP_417191.1 GI:16130618)として登録されている。
【０１３７】
エシェリヒア・コリK5株のnorW遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号７２に示す。配列番号７２に示す塩基配列中、norW遺伝子は、1201〜2334位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のNorWタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号７３に示す。
【０１３８】
ybjI遺伝子は、フラビンモノヌクレオチド（FMN）リン酸化酵素をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のybjI遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、884,539〜885,354位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYbjIタンパク質は、GenBank accession NP_415365 (version NP_415365.4 GI:90111176)として登録されている。
【０１３９】
ybjJおよびybjK遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のybjJおよびybjK遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、885,354〜886,562位の配列の相補配列および886,646〜887,182位の配列に相当する。また、MG1655株のYbjJおよびYbjKタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_415366 (version NP_415366.1 GI:16128813)およびGenBank accession NP_415367 (version NP_415367.1 GI:16128814)として登録されている。
【０１４０】
rybB遺伝子は、OmpCおよびOmpWの発現抑制に関与する低分子RNAをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrybB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、887,199〜887,277位の配列の相補配列に相当する。
【０１４１】
エシェリヒア・コリK5株のybjI、ybjJ、ybjK、およびrybB遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号７４に示す。配列番号７４に示す塩基配列中、ybjI、ybjJ、ybjK、およびrybB遺伝子は、それぞれ、117〜932位の配列の相補配列、932〜2140位の配列の相補配列、2224〜2760位の配列、2777〜2855位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYbjI、YbjJ、およびYbjKタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号７５〜７７に示す。
【０１４２】
yjjY遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyjjY遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4,638,425〜4,638,565位の配列に相当する。また、MG1655株のYjjYタンパク質は、GenBank accession NP_418819 (version NP_418819.1 GI:16132219)として登録されている。
【０１４３】
yjtD遺伝子は、RNAメチルトランスフェラーゼの一種と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyjtD遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4,638,965〜4,639,651位の配列に相当する。また、MG1655株のYjtDタンパク質は、GenBank accession NP_418820 (version NP_418820.1 GI:16132220)として登録されている。
【０１４４】
thrL、thrA、およびthrB遺伝子は、スレオニン生合成経路の酵素をコードする遺伝子である。thrB遺伝子は、ホモセリンキナーゼをコードする。thrA遺伝子は、アスパラギン酸キナーゼＩおよびホモセリン脱水素酵素Ｉの二つの機能を有する酵素をコードする。thrL遺伝子は、thrLABCオペロンのリーダーペプチドをコードする。Escherichia coli K-12 MG1655株のthrL、thrA、およびthrB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、190〜255位の配列、337〜2,799位の配列、および2,801〜3,733位の配列に相当する。また、MG1655株のThrL、ThrA、およびThrBタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_414542 (version NP_414542.1 GI:16127995)、GenBank accession NP_414543 (version NP_414543.1 GI:16127996)、およびGenBank accession NP_414544 (version NP_414544.1 GI:16127997)として登録されている。
【０１４５】
エシェリヒア・コリK5株のyjjY、yjtD、thrL、thrA、およびthrB遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号７８に示す。配列番号７８に示す塩基配列中、yjjY、yjtD、thrL、thrA、およびthrB遺伝子は、それぞれ、124〜264位の配列、664〜1350位の配列、1564〜1629位の配列、1711〜4173位の配列、4175〜5107位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYjjY、YjtD、ThrL、ThrA、およびThrBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号７９〜８３に示す。
【０１４６】
fruA遺伝子は、フルクトースPTS透過酵素をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のfruA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,257,741〜2,259,432位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のFruAタンパク質は、GenBank accession NP_416672 (version NP_416672.1 GI:16130105)として登録されている。
【０１４７】
psuK遺伝子は、シュードウリジンキナーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のpsuK遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,256,377〜2,257,318位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のPsuKタンパク質は、GenBank accession NP_416671 (version NP_416671.1 GI:16130104)として登録されている。
【０１４８】
エシェリヒア・コリK5株のfruAおよびpsuK遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号８４に示す。配列番号８４に示す塩基配列中、fruAおよびpsuK遺伝子は、それぞれ、897〜2588位の配列および3165〜3953位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のFruAおよびPsuKタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８５および８６に示す。
【０１４９】
ytfTおよびyjfF遺伝子は、ガラクトースABC輸送担体の膜構成成分と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のytfTおよびyjfF遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、4,450,594〜4,451,619位の配列および4,451,606〜4,452,601位の配列に相当する。また、MG1655株のYtfTおよびYjfFタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418651 (version NP_418651.3 GI:145698343)およびGenBank accession NP_418652 (version NP_418652.2 GI:90111710)として登録されている。
【０１５０】
fbp遺伝子は、フルクトース−１,６−二リン酸脱リン酸化酵素（fructose-1,6-bisphosphatase）をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のfbp遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4,452,634〜4,453,632位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のFbpタンパク質は、GenBank accession NP_418653 (version NP_418653.1 GI:16132054)として登録されている。
【０１５１】
エシェリヒア・コリK5株のytfT、yjfF、およびfbp遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号８７に示す。配列番号８７に示す塩基配列中、ytfT、yjfF、およびfbp遺伝子は、それぞれ、252〜1277位の配列、1264〜2259位の配列、2292〜3290位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYtfT、YjfF、およびFbpタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号８８〜９０に示す。
【０１５２】
yagU遺伝子は、内膜タンパク質と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyagU遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、302,215〜302,829位の配列に相当する。また、MG1655株のYagUタンパク質は、GenBank accession NP_414821 (version NP_414821.1 GI:16128272)として登録されている。
【０１５３】
paoA遺伝子（別名yagT）およびpaoB遺伝子（別名yagS）は、アルデヒド酸化還元酵素の構成因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のpaoAおよびpaoB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、301,108〜301,797位の配列の相補配列および300,155〜301,111位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のPaoAおよびPaoBタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_414820 (version NP_414820.1 GI:16128271)およびGenBank accession NP_414819 (version NP_414819.1 GI:16128270)として登録されている。
【０１５４】
エシェリヒア・コリK5株のyagU、paoA、およびpaoB遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号９１に示す。配列番号９１に示す塩基配列中、yagU、paoA、およびpaoB遺伝子は、それぞれ、117〜731位の配列の相補配列、1149〜1838位の配列、1835〜2791位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYagU、PaoA、およびPaoBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９２〜９４に示す。
【０１５５】
gsiCおよびgsiD遺伝子は、グルタチオンABC輸送担体の構成因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のgsiCおよびgsiD遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、870,190〜871,110位の配列および871,113〜872,024位の配列に相当する。また、MG1655株のGsiCおよびGsiDタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_415352 (version NP_415352.1 GI:16128799)およびGenBank accession NP_415353 (version NP_415353.1 GI:16128800)として登録されている。
【０１５６】
yliE遺伝子は、c-di-GMP-特異的ホスホジエステラーゼと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyliE遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、872,202〜874,550位の配列に相当する。また、MG1655株のYliEタンパク質は、GenBank accession NP_415354 (version NP_415354.1 GI:16128801)として登録されている。
【０１５７】
エシェリヒア・コリK5株のgsiC、gsiD、およびyliE遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号９５に示す。配列番号９５に示す塩基配列中、gsiC、gsiD、およびyliE遺伝子は、それぞれ、264〜1184位の配列、1187〜2098位の配列、2276〜4624位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のGsiC、GsiD、およびYliEタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９６〜９８に示す。
【０１５８】
irp2およびirp1遺伝子は、ノンリボソーマルペプチド合成酵素をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のゲノムにおいて、irp2およびirp1遺伝子はアノテートされていない。本発明においては、irp2およびirp1遺伝子を総称して「irp遺伝子」という場合がある。
【０１５９】
エシェリヒア・コリK5株のirp遺伝子の一部を含む領域の塩基配列を配列番号９９に示す。同領域は、irp2遺伝子の後半部分（全長6108bpの内、2781〜6108位の部分；全長の約54%に相当）とirp1遺伝子の前半部分（全長9492bpの内、1〜2530位の部分；全長の約27%に相当）を含む。また、エシェリヒア・コリK5株のirp2遺伝子の塩基配列を配列番号１００に、同遺伝子がコードするIrp2タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０１に、それぞれ示す。また、エシェリヒア・コリK5株のirp1遺伝子の塩基配列を配列番号１０２に、同遺伝子がコードするIrp1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０３に、それぞれ示す。
【０１６０】
bhsA遺伝子（別名ycfR）は、外膜タンパク質と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のbhsA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1,168,296〜1,168,553位の配列に相当する。また、MG1655株のBhsAタンパク質は、GenBank accession NP_415630 (version NP_415630.1 GI:16129075)として登録されている。
【０１６１】
ycfS遺伝子は、L,D-トランスペプチダーゼの一種をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のycfS遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1,168,635〜1,169,597位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYcfSタンパク質は、GenBank accession NP_415631 (version NP_415631.1 GI:16129076)として登録されている。
【０１６２】
エシェリヒア・コリK5株のbhsAおよびycfS遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１０４に示す。配列番号１０４に示す塩基配列中、bhsAおよびycfS遺伝子は、それぞれ、440〜697位の配列および779〜1741位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のBhsAおよびYcfSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１０５および１０６に示す。
【０１６３】
lepB遺伝子は、シグナルペプチダーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のlepB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,702,357〜2,703,331位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のLepBタンパク質は、GenBank accession NP_417063 (version =NP_417063.1 GI:16130493)として登録されている。
【０１６４】
rnc遺伝子は、RNaseIIIをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrnc遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,701,405〜2,702,085位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のRncタンパク質は、GenBank accession NP_417062 (version NP_417062.1 GI:16130492)として登録されている。
【０１６５】
era遺伝子は、生存に必須な因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のera遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,700,503〜2,701,408位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のEraタンパク質は、GenBank accession NP_417061 (version NP_417061.1 GI:16130491)として登録されている。
【０１６６】
エシェリヒア・コリK5株のlepB、rnc、およびera遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１０７に示す。配列番号１０７に示す塩基配列中、lepB、rnc、およびera遺伝子は、それぞれ、1344〜2318位の配列、2590〜3270位の配列、および3267〜4172位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のLepB、Rnc、およびEraタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１０８〜１１０に示す。
【０１６７】
dapA遺伝子は、4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthaseをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のdapA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,596,904〜2,597,782位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のDapAタンパク質は、GenBank accession NP_416973 (version NP_416973.1 GI:16130403)として登録されている。
【０１６８】
gcvR遺伝子は、転写調節因子と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のgcvR遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,597,928〜2,598,500位の配列に相当する。また、MG1655株のGcvRタンパク質は、GenBank accession NP_416974 (version NP_416974.4 GI:90111443)として登録されている。
【０１６９】
bcp遺伝子は、チオールペルオキシダーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のbcp遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,598,500〜2,598,970位の配列に相当する。また、MG1655株のBcpタンパク質は、GenBank accession NP_416975 (version NP_416975.1 GI:16130405)として登録されている。
【０１７０】
hyfA遺伝子は、電子輸送に関与すると推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のhyfA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,599,223〜2,599,840位の配列に相当する。また、MG1655株のhyfAタンパク質は、GenBank accession NP_416976 (version NP_416976.4 GI:90111444)として登録されている。
【０１７１】
エシェリヒア・コリK5株のdapA、gcvR、bcp、およびhyfA遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１１１に示す。配列番号１１１に示す塩基配列中、dapA、gcvR、bcp、およびhyfA遺伝子は、それぞれ、858〜1736位の配列の相補配列、1882〜2454位の配列、2454〜2924位の配列、および3177〜3794位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のDapA、GcvR、Bcp、およびHyfAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１２〜１１５に示す。
【０１７２】
rpoE遺伝子は、シグマＥ（σE）をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrpoE遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,707,459〜2,708,034位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のRpoEタンパク質は、GenBank accession NP_417068 (version NP_417068.1 GI:16130498)として登録されている。
【０１７３】
nadB遺伝子は、L-アスパラギン酸オキシダーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のnadB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,708,442〜2,710,064位の配列に相当する。また、MG1655株のNadBタンパク質は、GenBank accession NP_417069 (version NP_417069.1 GI:16130499)として登録されている。
【０１７４】
yfiC遺伝子は、バリンtRNAのA37（37位のアデニン）の6位のNをメチル化するメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyfiC遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,710,049〜2,710,786位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYfiCタンパク質は、GenBank accession NP_417070 (version NP_417070.2 GI:90111461)として登録されている。
【０１７５】
srmB遺伝子は、DEAD-box型RNAヘリカーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のsrmB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,710,918〜2,712,252位の配列に相当する。また、MG1655株のSrmBタンパク質は、GenBank accession NP_417071 (version NP_417071.1 GI:16130501)として登録されている。
【０１７６】
エシェリヒア・コリK5株のrpoE、nadB、yfiC、およびsrmB遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１１６に示す。配列番号１１６に示す塩基配列中、rpoE、nadB、yfiC、およびsrmB遺伝子は、それぞれ、355〜930位の配列の相補配列、1338〜2960位の配列、2945〜3682位の配列の相補配列、および3814〜5148位の配列に相当する。特に、エシェリヒア・コリK5株のrpoE遺伝子の塩基配列を配列番号１７４に示す。エシェリヒア・コリK5株のRpoE、NadB、YfiC、およびSrmBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１１７〜１２０に示す。
【０１７７】
g1414およびg1413遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のゲノムにおいて、これらの遺伝子はアノテートされていない。
【０１７８】
エシェリヒア・コリK5株のg1414およびg1413遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１２１に示す。配列番号１２１に示す塩基配列中、g1414およびg1413遺伝子は、それぞれ、28〜699位の配列および831〜1157位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のG1414およびG1413タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２２および１２３に示す。
【０１７９】
nuoE、nuoF、およびnuoG遺伝子は、NADHデヒドロゲナーゼIの可溶性フラグメントをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のnuoE、nuoF、およびnuoG遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、2,399,574〜2,400,074位の配列の相補配列、2,398,240〜2,399,577位の配列の相補配列、および2,395,461〜2,398,187位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のNuoE、NuoF、およびNuoGタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_416788 (version NP_416788.1 GI:16130220)、GenBank accession NP_416787 (version NP_416787.1 GI:16130219)、およびGenBank accession NP_416786 (version NP_416786.4 GI:145698290)として登録されている。
【０１８０】
エシェリヒア・コリK5株のnuoE、nuoF、およびnuoG遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１２４に示す。配列番号１２４に示す塩基配列中、nuoE、nuoF、およびnuoG遺伝子は、それぞれ、796〜1296位の配列の相補配列、1293〜2630位の配列の相補配列、および2683〜5409位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のNuoE、NuoF、およびNuoGタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２５〜１２７に示す。
【０１８１】
glmZ遺伝子は、低分子RNAをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のglmZ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、3,984,455〜3,984,626位の配列に相当する。
【０１８２】
hemY、hemX、およびhemD遺伝子は、ヘムとコリンの生合成経路の酵素をコードする遺伝子である。hemY遺伝子は、プロトポルフィリノゲンオキシダーゼをコードする。hemX遺伝子は、ウロポルフィリノゲンIIIメチラーゼと推定されるタンパク質をコードする。hemD遺伝子は、ウロポルフィリノゲンIIIシンターゼをコードする。K-12 MG1655株のhemY、hemX、およびhemD遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、3,984,709〜3,985,905位の配列の相補配列、3,985,908〜3,987,089位の配列の相補配列、および3,987,111〜3,987,851位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のHemY、HemX、およびHemDタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418246 (version NP_418246.1 GI:16131654)、GenBank accession NP_418247 (version NP_418247.1 GI:16131655)、GenBank accession NP_418248 (version NP_418248.1 GI:16131656)として登録されている。
【０１８３】
エシェリヒア・コリK5株のglmZ、hemY、hemX、およびhemD遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１２８に示す。配列番号１２８に示す塩基配列中、glmZ、hemY、hemX、およびhemD遺伝子は、それぞれ、357〜563位の配列、611〜1807位の配列、1810〜2991位の配列、および3013〜3753位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のHemY、HemX、およびHemDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２９〜１３１に示す。
【０１８４】
rlmL遺伝子（別名rlmKL）は、23S rRNAのG2445およびG2069をメチル化するメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrlmL遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1,007,067〜1,009,175位の配列に相当する。また、MG1655株のRlmLタンパク質は、GenBank accession NP_415468 (version NP_415468.1 GI:16128915)として登録されている。
【０１８５】
エシェリヒア・コリK5株のrlmL遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１３２に示す。配列番号１３２に示す塩基配列中、rlmL遺伝子は、571〜2679位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のRlmLタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号１３３に示す。
【０１８６】
artQ、artM、およびartJ遺伝子は、アルギニンABCトランスポーターのサブユニットをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のartQ、artM、およびartJ遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、900,757〜901,473位の配列の相補配列、900,089〜900,757位の配列の相補配列、および899,067〜899,798位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のArtQ、ArtM、およびArtJタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_415383 (version NP_415383.1 GI:16128830)、GenBank accession NP_415382 (version NP_415382.1 GI:16128829)、およびGenBank accession NP_415381 (version NP_415381.1 GI:16128828)として登録されている。
【０１８７】
rlmC遺伝子（別名rumB）は、23S rRNAのU747をメチル化するメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrlmC遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、897,741〜898,868に相当する。また、MG1655株のRlmCタンパク質は、GenBank accession NP_415380 (version NP_415380.1 GI:16128827)として登録されている。
【０１８８】
ybjO遺伝子は、内膜タンパク質と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のybjO遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、897,212〜897,700位の配列に相当する。また、MG1655株のYbjOタンパク質は、GenBank accession NP_415379 (version NP_415379.1 GI:16128826)として登録されている。
【０１８９】
エシェリヒア・コリK5株のartQ、artM、artJ、rlmC、およびybjO遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１３４に示す。配列番号１３４に示す塩基配列中、artQ、artM、artJ、rlmC、およびybjO遺伝子は、それぞれ、386〜1102位の配列、1102〜1770位の配列、2061〜2792位の配列、2991〜4118位の配列の相補配列、および4159〜4647位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のArtQ、ArtM、ArtJ、RlmC、およびYbjOタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１３５〜１３９に示す。
【０１９０】
yejO遺伝子は、外膜タンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyejO遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,284,412〜2,286,936位の配列と2,288,136〜2,288,202位の配列を結合した配列の相補配列に相当する。MG1655株のyejO遺伝子は、偽遺伝子（pseudogene）であると考えられる。
【０１９１】
yejM遺伝子は、ハイドロラーゼの１種と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyejM遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,282,398〜2,284,158位の配列に相当する。また、MG1655株のYejMタンパク質は、GenBank accession NP_416693 (version NP_416693.1 GI:16130126)として登録されている。
【０１９２】
yejL遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyejL遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,282,151〜2,282,378位の配列に相当する。また、MG1655株のYejLタンパク質は、GenBank accession NP_416692 (version NP_416692.1 GI:16130125)として登録されている。
【０１９３】
エシェリヒア・コリK5株のyejO、yejM、およびyejL遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１４０に示す。配列番号１４０に示す塩基配列中、yejO、yejM、およびyejL遺伝子は、それぞれ、216〜2807位の配列、3061〜4821位の配列の相補配列、および4841〜5068位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のYejO、YejM、およびYejLタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１４１〜１４３に示す。
【０１９４】
rpoS遺伝子は、シグマＳ（σS）をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のrpoS遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,864,581〜2,865,573位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のRpoSタンパク質は、GenBank accession NP_417221 (version NP_417221.1 GI:16130648)として登録されている。
【０１９５】
ygbN遺伝子は、Gntファミリーに属するトランスポーターと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のygbN遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,863,123〜2,864,487位の配列に相当する。また、MG1655株のYgbNタンパク質は、GenBank accession NP_417220 (version NP_417220.1 GI:16130647)として登録されている。
【０１９６】
ygbM遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のygbM遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,862,258〜2,863,034位の配列に相当する。また、MG1655株のYgbMタンパク質は、GenBank accession NP_417219 (version NP_417219.1 GI:16130646)として登録されている。
【０１９７】
ygbL遺伝子は、アルドラーゼの１種と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のygbL遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2,861,615〜2,862,253位の配列に相当する。また、MG1655株のYgbLタンパク質は、GenBank accession NP_417218 (version NP_417218.1 GI:16130645)として登録されている。
【０１９８】
エシェリヒア・コリK5株のrpoS、ygbN、ygbM、およびygbL遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１４４に示す。配列番号１４４に示す塩基配列中、rpoS、ygbN、ygbM、およびygbL遺伝子は、それぞれ、318〜1310位の配列、1404〜2768位の配列の相補配列、2857〜3633位の配列の相補配列、および3638〜4276位の配列の相補配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のRpoS、YgbN、YgbM、およびYgbLタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１４５〜１４８に示す。
【０１９９】
g3798遺伝子は、SOS-response transcriptional repressor (RecA-mediated autopeptidase)と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。g3794遺伝子は、Superinfection exclusion protein Bと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。g3793遺伝子は、restriction inhibitor protein ral (Antirestriction protein)と推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。g3797、g3796、g3795、およびg3792遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のゲノムにおいて、これらの遺伝子はアノテートされていない。
【０２００】
エシェリヒア・コリK5株のg3798、g3797、g3796、g3795、g3794、g3793、およびg3792遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１４９に示す。配列番号１４９に示す塩基配列中、g3798、g3797、g3796、g3795、g3794、g3793、およびg3792遺伝子は、それぞれ、615〜1268位の配列、1368〜2219位の配列、2257〜2748位の配列、3021〜3203位の配列、3470〜4051位の配列の相補配列、4280〜4480位の配列、および4520〜4717位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のG3798、G3797、G3796、G3795、G3794、G3793、およびG3792タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１５０〜１５６に示す。
【０２０１】
ryjA遺伝子は、低分子RNAをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のryjA遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4,275,950〜4,276,089位の配列の相補配列に相当する。
【０２０２】
soxRおよびsoxS遺伝子は、転写制御因子をコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のsoxRおよびsoxS遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、4,275,492〜4,275,956位の配列および4,275,083〜4,275,406位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のSoxRおよびSoxSタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418487 (version NP_418487.1 GI:16131889)およびGenBank accession NP_418486 (version NP_418486.1 GI:16131888)として登録されている。
【０２０３】
yjcC遺伝子は、c-di-GMP特異的なホスホジエステラーゼをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyjcC遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4,273,494〜4,275,080位の配列に相当する。また、MG1655株のYjcCタンパク質は、GenBank accession NP_418485 (version NP_418485.1 GI:16131887)として登録されている。
【０２０４】
yjcB遺伝子は、機能未知の遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のyjcB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4,272,783〜4,273,064位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYjcBタンパク質は、GenBank accession NP_418484 (version NP_418484.4 GI:90111681)として登録されている。
【０２０５】
エシェリヒア・コリK5株のryjA、soxR、soxS、yjcC、およびyjcB遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１５７に示す。配列番号１５７に示す塩基配列中、ryjA、soxR、soxS、yjcC、およびyjcB遺伝子は、それぞれ、657〜796位の配列、790〜1254位の配列の相補配列、1340〜1663位の配列、1666〜3252位の配列の相補配列、および3682〜3963位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のSoxR、SoxS、YjcC、およびYjcBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１５８〜１６１に示す。
【０２０６】
efeUおよびefeO遺伝子は、二価鉄イオン輸送担体のコンポーネントをコードする遺伝子である。Escherichia coli K-12 MG1655株のefeUおよびefeO遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、それぞれ、1,080,579〜1,081,408位の配列および1,081,466〜1,082,593位の配列に相当する。MG1655株のefeU遺伝子は、偽遺伝子（pseudogene）であると考えられる。また、MG1655株のEfeOタンパク質は、GenBank accession NP_415537 (version NP_415537.1 GI:16128982)として登録されている。
【０２０７】
エシェリヒア・コリK5株のefeUおよびefeO遺伝子を含む領域の塩基配列を配列番号１６２に示す。配列番号１６２に示す塩基配列中、efeUおよびefeO遺伝子は、それぞれ、753〜1583位の配列および1641〜2768位の配列に相当する。エシェリヒア・コリK5株のEfeUおよびEfeOタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１６３および１６４に示す。
【０２０８】
本発明の細菌は、例えば、表１〜３の遺伝子の内、少なくともrfaH遺伝子の発現が増大するよう改変されていてもよく、少なくともrfaH遺伝子以外の１またはそれ以上の遺伝子の発現が増大するよう改変されていてもよい。また、本発明の細菌は、例えば、表１〜３の遺伝子の内、rfaH遺伝子の発現とrfaH遺伝子以外の１またはそれ以上の遺伝子の発現とが増大するよう改変されていてもよい。本発明の細菌は、具体的には、例えば、表１〜３の遺伝子の内、rfaH遺伝子の発現と、rbsR、rbsK、rbsB、hsrA、glgB、glgX、micF、rcsD、rcsB、ybiX、ybiI、ybiJ、ybiC、ybiB、nusG、pcoR、pcoS、pcoE、yhcN、yhcO、aaeB、aaeA、aaeX、g1455、alpA、g1453、yrbA、mlaB、mlaC、mlaD、mlaE、mlaF、yrbG、norW、ybjI、ybjJ、ybjK、rybB、yjjY、yjtD、thrL、thrA、thrB、fruA、psuK、ytfT、yjfF、fbp、yagU、paoA、paoB、gsiC、gsiD、yliE、irp2、irp1、bhsA、およびycfS遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現とが増大するよう改変されていてもよい。また、本発明の細菌は、例えば、表１〜３の遺伝子の内、少なくともrpoE遺伝子の発現が増大するよう改変されていてもよい。発現が増大する表１〜３の遺伝子の組み合わせは特に制限されない。組み合わせとしては、例えば、後述する実施例に記載の組み合わせが挙げられる。
【０２０９】
遺伝子の発現を増大させる手法については後述する。例えば、表１〜３の遺伝子の発現は、配列番号２９、３４、３７、４３、５０、５４、６０、６４、７２、７４、７８、８４、８７、９１、９５、９９、１０４、１０７、１１１、１１６、１２１、１２４、１２８、１３２、１３４、１４０、１４４、１４９、１５７、または１６２に示す塩基配列を有するＤＮＡ等の、表１〜３の遺伝子を含むＤＮＡのコピー数を増加させることにより、増大させてよい。また、irp遺伝子にあっては、配列番号９９に示す塩基配列を有するＤＮＡ等の、irp遺伝子の一部を含むＤＮＡのコピー数を増加させてもよい。上記のようなコピー数を増加させるＤＮＡは、配列番号２９、３４、３７、４３、５０、５４、６０、６４、７２、７４、７８、８４、８７、９１、９５、９９、１０４、１０７、１１１、１１６、１２１、１２４、１２８、１３２、１３４、１４０、１４４、１４９、１５７、または１６２に示す塩基配列を有するＤＮＡのバリアントであってもよい。ＤＮＡのバリアントについては、表１〜３に記載の遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。すなわち、例えば、配列番号２９、３４、３７、４３、５０、５４、６０、６４、７２、７４、７８、８４、８７、９１、９５、９９、１０４、１０７、１１１、１１６、１２１、１２４、１２８、１３２、１３４、１４０、１４４、１４９、１５７、または１６２に示す塩基配列に対して９０％以上の相同性を有するＤＮＡのコピー数を増加させてもよい。
【０２１０】
これらの遺伝子は、これらの遺伝子を保持する株の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【０２１１】
表１〜３の遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、表１〜３の遺伝子にコードされるタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したタンパク質のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、上記遺伝子名で特定される遺伝子およびそれに対応する名称で特定されるタンパク質には、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質に加えて、その保存的バリアントが含まれるものとする。すなわち、例えば、「rpoE遺伝子」という用語は、上記例示したrpoE遺伝子（Escherichia coli K-12 MG1655株やEscherichia coli K5株のrpoE遺伝子）に加えて、その保存的バリアントを包含するものとする。同様に、例えば、「RpoEタンパク質」という用語は、上記例示したRpoEタンパク質（Escherichia coli K-12 MG1655株やEscherichia coli K5株のRpoEタンパク質）に加えて、その保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【０２１２】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。
【０２１３】
すなわち、「元の機能が維持されている」とは、表１〜３の遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有することをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、表１〜３の遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることであってもよい。すなわち、表１〜３の遺伝子は、上記例示したタンパク質の保存的バリアントをコードするものであってもよい。
【０２１４】
同様に、「元の機能が維持されている」とは、表１〜３の遺伝子にコードされるタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有することをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、表１〜３の遺伝子にコードされるタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、上記タンパク質の機能、例えばRpoEタンパク質であればシグマＥ（σE）としての機能、を有することであってもよい。
【０２１５】
遺伝子またはタンパク質のバリアントが、ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するか否かは、同遺伝子または同タンパク質をコードする遺伝子をヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌に導入し、ヘパロサンの生産能が向上するか否かを確認することにより、確認できる。
【０２１６】
表１〜３の遺伝子のホモログは、例えば、上記例示した遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、表１〜３の遺伝子のホモログは、例えば、細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【０２１７】
表１〜３の遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【０２１８】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【０２１９】
また、表１〜３の遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０２２０】
また、表１〜３の遺伝子は、元の機能が維持されている限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【０２２１】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、表１〜３の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０２２２】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、表１〜３の遺伝子は、元の機能が維持されている限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、表１〜３の遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【０２２３】
表１〜３の遺伝子のバリアントは、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することによって取得することができる。また、表１〜３の遺伝子のバリアントは、例えば、変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、表１〜３の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ分子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、表１〜３の遺伝子を保持する微生物、例えば腸内細菌科に属する微生物を、Ｘ線、紫外線、またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルフォネート（EMS）、メチルメタンスルフォネート（MMS）等の変異剤によって処理する方法、エラ−プローンPCR (Cadwell,R.C. PCR Meth. Appl. 2, 28(1992))、DNA shuffling(Stemmer,W.P. Nature 370, 389(1994))、StEP-PCR (Zhao,H. Nature Biotechnol. 16, 258(1998)) などの方法が挙げられる。
【０２２４】
＜１−３＞遺伝子の発現を増大させる手法
以下に、遺伝子の発現を増大（上昇）させる手法について説明する。
【０２２５】
遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。
【０２２６】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【０２２７】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたtransduction法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【０２２８】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【０２２９】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。
【０２３０】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【０２３１】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【０２３２】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【０２３３】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２３４】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
【０２３５】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０２３６】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０２３７】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０２３８】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【０２３９】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じうる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０２４０】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０２４１】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０２４２】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。
【０２４３】
遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。また、遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子から発現するタンパク質の活性が増大したことを確認することにより確認できる。
【０２４４】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２４５】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２４６】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２４７】
上記した遺伝子の発現を増大させる手法は、任意の遺伝子、例えば表１〜３の遺伝子やヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０２４８】
＜２＞ヘパロサンの製造法
本発明のヘパロサンの製造法は、本発明の細菌を培地で培養してヘパロサンを該培地中に生成蓄積すること、および該培地よりヘパロサンを採取することを含む、ヘパロサンの製造法である。
【０２４９】
使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、ヘパロサンが生成蓄積される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地として、具体的には、例えば、LB培地（Luria-Bertani培地；1リットルあたりBacto-tryptone 10.0 g、Bacto-yeast extract 5.0 g、及びNaCl 5.0 gを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。
【０２５０】
炭素源は、本発明の細菌が資化してヘパロサンを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０２５１】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０２５２】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０２５３】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０２５４】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０２５５】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、抗生物質耐性遺伝子を搭載するベクターを用いて遺伝子を導入した際は、培地に対応する抗生物質を添加するのが好ましい。
【０２５６】
培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、ヘパロサンが生成蓄積される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、当業者が適宜設定してよい。
【０２５７】
培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に行うことができる。培養温度は、例えば、３０〜３７℃であってよい。培養期間は、例えば、１６〜７２時間であってよい。培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。また、培養は、前培養と本培養とに分けて行われてもよい。前培養は、例えば、平板培地や液体培地を用いて行ってよい。
【０２５８】
上記のようにして本発明の細菌を培養することにより、培地中にヘパロサンが蓄積する。
【０２５９】
培養液からヘパロサンを回収する方法は、ヘパロサンが回収されうる限り、特に制限されない。培養液からヘパロサンを回収する方法としては、例えば、実施例に記載する方法が挙げられる。具体的には、例えば、培養液から培養上清を分離し、次いで、エタノール沈殿によって上清中のヘパロサンを沈降させることができる。添加するエタノールの量は、例えば、上清液量の２．５〜３．５倍量であってよい。ヘパロサンの沈降には、エタノールに限られず、水と任意に混和する有機溶媒を使用することができる。そのような有機溶媒としては、エタノールに加えて、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、プロピレングリコール、アセトニトリル、アセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン、ＴＨＦが挙げられる。沈殿したヘパロサンは、例えば、元の上清液量の２倍量の水で溶解させることができる。回収されるヘパロサンは、ヘパロサン以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。ヘパロサンは、所望の程度に精製されていてよい。ヘパロサンの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【０２６０】
ヘパロサンの検出および定量は、公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、ヘパロサンは、カルバゾール法にて検出および定量することができる。カルバゾール法は、ウロン酸の定量方法として広く用いられる手法であり、ヘパロサンを硫酸の存在下でカルバゾールと熱反応させ、生成した呈色物質による530 nmの吸収を測定することにより、ヘパロサンを検出及び定量することができる (Bitter T. and Muir H.M., (1962) "A modified uronic acid carbazole reaction."Analytical Biochemistry, 4(4): 330？334)。また、例えば、ヘパロサンをヘパロサン分解酵素であるヘパリナーゼIIIで処理し、二糖組成分析を行うことによって、ヘパロサンを検出及び定量することができる。
【０２６１】
＜３＞ヘパリンの製造法
本発明の細菌により生産されるヘパロサンを利用して、ヘパリンを製造することができる。すなわち、本発明のヘパリンの製造法は、本発明の細菌を培地で培養してヘパロサンを該培地中に生成蓄積すること、該ヘパロサンを化学的および／または酵素的に処理してヘパリンを生産すること、および該ヘパリンを回収することを含む、ヘパリンの製造法である。ヘパリンは抗凝固活性を有し、医薬品の成分として利用できる。
【０２６２】
ヘパロサンからのヘパリンの製造法は既に報告されている。具体的には、例えば、ヘパロサンを出発物質として、（１）N-脱アセチル化、（２）N-硫酸化、（３）C5エピマー化、（４）2-O-硫酸化、（５）6-O-硫酸化、および（６）3-O-硫酸化の工程を経ることにより、抗凝固活性を有するヘパリンを生成できる (Zhang Z. et al., (2008) "Solution Structures of Chemoenzymatically Synthesized Heparin and Its Precursors." J Am Chem Soc., 130(39): 12998？13007.)。ヘパリンの製造法は、さらに、低分子化の工程を含んでいてもよい。このようなヘパロサンからヘパリンを製造する工程を総称して「ヘパリン生成処理」ともいう。ヘパリン生成処理における各工程の実施順序は、所望の性質を有するヘパリンが得られる限り、特に制限されない。
【０２６３】
ヘパロサンは、培地に含まれたままヘパリン生成処理に供してもよく、培地から回収してからヘパリン生成処理に供してもよい。また、ヘパロサンは、適宜前処理を行ってからヘパリン生成処理に供してもよい。前処理としては、例えば、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等が挙げられる。これらの前処理は、適宜組み合わせて行ってもよい。例えば、ヘパロサンを含有する培養液をそのまま、あるいは所望の程度に精製して、ヘパリン生成処理に供してよい。
【０２６４】
N-脱アセチル化は、例えば、水酸化ナトリウムを利用して化学的に行うことができる。反応条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、既報（Kuberan B. et al., (2003) "Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Non-classical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides." J Biol Chem., 278(52): 52613-52621.）の条件を参照することができる。
【０２６５】
N-硫酸化は、例えば、三酸化硫黄・トリメチルアミン錯体を利用して化学的に行うことができる。反応条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、既報（Kuberan B. et al., (2003) "Chemoenzymatic Synthesis of Classical and Non-classical Anticoagulant Heparan Sulfate Polysaccharides." J Biol Chem., 278(52): 52613-52621.）の条件を参照することができる。
【０２６６】
C5エピマー化は、例えば、Ｃ５−エピメラーゼを利用して酵素的に行うことができる。Ｃ５−エピメラーゼは、グルクロン酸（GlcUA）残基のイズロン酸（IdoA）残基への異性化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、C5エピマー化と、N-脱アセチル化および／またはO-硫酸化の順序によっては、適切な基質特異性を有するＣ５−エピメラーゼを選択して用いてもよい。Ｃ５−エピメラーゼは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。Ｃ５−エピメラーゼとしては、例えば、ヒトのＣ５−エピメラーゼを利用することができる。反応条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、既報（Chen J, et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate." J Biol Chem. 2005 Dec 30;280(52):42817-25.）の条件を参照することができる。
【０２６７】
2-O-硫酸化は、例えば、2-O-硫酸化酵素（2-OST）を利用して酵素的に行うことができる。2-OSTは、IdoA残基のO-2位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、2-O-硫酸化と、N-脱アセチル化、C5エピマー化、6-O-硫酸化、および／または3-O-硫酸化の順序によっては、適切な基質特異性を有する2-OSTを選択して用いてもよい。2-OSTは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。2-OSTとしては、例えば、ハムスターの2-OSTを利用することができる。反応条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、既報（Chen J, et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate." J Biol Chem. 2005 Dec 30;280(52):42817-25.）の条件を参照することができる。
【０２６８】
6-O-硫酸化は、例えば、6-O-硫酸化酵素（6-OST）を利用して酵素的に行うことができる。6-OSTは、N-硫酸化グルコサミン（GlcNS）残基のO-6位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、6-O-硫酸化と、N-脱アセチル化、C5エピマー化、2-O-硫酸化、および／または3-O-硫酸化の順序によっては、適切な基質特異性を有する6-OSTを選択して用いてもよい。6-OSTは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。6-OSTとしては、例えば、ハムスターの6-OST-1やマウスの6-OST-3を利用することができる。反応条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、既報（Chen J, et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate." J Biol Chem. 2005 Dec 30;280(52):42817-25.）の条件を参照することができる。
【０２６９】
3-O-硫酸化は、例えば、3-O-硫酸化酵素（3-OST）を利用して酵素的に行うことができる。3-OSTは、N-硫酸化・6-O-硫酸化グルコサミン残基のO-3位の硫酸化を触媒できるものであれば特に制限されない。また、3-O-硫酸化と、N-脱アセチル化、C5エピマー化、2-O-硫酸化、および／または6-O-硫酸化の順序によっては、適切な基質特異性を有する3-OSTを選択して用いてもよい。3-OSTは、動物、植物、微生物等、いずれの由来であってもよい。3-OSTとしては、例えば、マウスの3-OST-1を利用することができる。反応条件は、当業者が適宜設定することができる。例えば、既報（Chen J, et al., "Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate." J Biol Chem. 2005 Dec 30;280(52):42817-25.）の条件を参照することができる。
【０２７０】
低分子化は、例えば、亜硫酸を用いて、または光分解法により、行うことができる。低分子化の程度は特に制限されない。低分子化は、例えば、分子量1000〜35000 Daのヘパリンが製造されるように実施されてもよい。
【０２７１】
生成したヘパリンの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。回収されるヘパリンは、ヘパリン以外に、ヘパリン生成処理に用いられた成分や水分等の成分を含んでいてもよい。ヘパリンは、所望の程度に精製されていてよい。ヘパリンの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【０２７２】
得られたヘパリンは、さらに分画して、低分子ヘパリンを取得することもできる。低分子ヘパリンとは、例えば、分子量1000〜10000 Da（平均分子量4000-6000 Da）の画分をいう。低分子ヘパリンは、未分画ヘパリンと比較して、出血の副作用が少ないという利点を有する。
【実施例】
【０２７３】
以下、実施例をもとに、本発明をより具体的に説明する。【０２７４】
実施例１：エシェリヒア・コリBL21(DE3)株からのヘパロサン生産株構築
（１−１）エシェリヒア・コリ K5株のkfiABCD遺伝子の発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリ K5（ATCC 23506）よりkfiABCD遺伝子（kfiABCDオペロン）をpVK9ベクター（配列番号1、米国特許出願公開20050196846号）にクローニングし、kfiABCD遺伝子の発現プラスミドpVK9-kfiABCDを構築した。【０２７５】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリK5の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーKfiABCD-kpnF（配列番号2）及びプライマーKfiABCD-xbaR（配列番号3）を用いたPCRによって、kfiABCD遺伝子及びその上流約450 bpを含むDNA断片を取得した。PCRにはPrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 8分を30サイクル、最後に4℃保温。また、pVK9をテンプレートDNAとし、配列番号4及び配列番号5のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRによって、pVK9のDNA断片を得た。PCRにはPrimeStarポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 6分を30サイクル、最後に4℃保温。得られた両DNA断片をIn-Fusion（登録商標）HDクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、kfiABCD遺伝子の発現プラスミドpVK9-kfiABCDを構築した。クローニングされたkfiABCD遺伝子及びその上流約450 bpを含む塩基配列を配列番号24に示す。【０２７６】
（１−２）エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のkfiABCD遺伝子発現株の構築
kfiABCD遺伝子の発現プラスミドpVK9-kfiABCDをエシェリヒア・コリBL21(DE3)株（ライフテクノロジーズ社）へエレクトロポレーション（Cell; 80μL, 200Ω, 25μF, 1.8 kV、キュベット；0.1 mL）により導入し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株を得た。この株を25μg/mL カナマイシン添加LB寒天培地に塗り広げ、37℃で一晩前培養を行った。その後、プレート上の菌体を掻き取り、試験管に2 mL張りこんだ生産培地中に植菌した。37℃にて40時間振とう培養を行い、培地中のグリセロールが完全に消費された時点で培養を終了した。【０２７７】
生産培地の組成を以下に示す。
〔生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
グリセロール                                          10 g/L
成分２：
MOPS（3-N-morpholino-propanesulphonic acid）          41.9 g/L
成分３：
トリプトン                                             8.8 g/L
イーストエクストラクト                                 4.4 g/L
塩化ナトリウム                                         8.8 g/L
成分1および成分３は、それぞれ120℃、20分のオートクレーブ滅菌し、成分２はフィルター滅菌した。室温に冷却後、３者を混合した。【０２７８】
（１−３）カルバゾール法による多糖の定量
カルバゾール法（Bitter, T. and Murir H. M., Anal. Biochem. 1962;4:330-334）により、生成した多糖の定量を行った。手順を以下に示す。【０２７９】
培養液（発酵ブロス）から遠心分離により培養上清を回収した。150μLの培養上清に500μLの100% エタノールを加え、遠心分離によって多糖成分を沈降させた。得られた沈殿を風乾させ、300μLの0.2 N 水酸化ナトリウム水溶液で沈殿を溶解した。得られたサンプル（溶解物）30μLを、冷却した0.025 M 四ホウ素酸・硫酸水溶液150μLに静かに加え、100℃で10分加熱した。室温に冷却後、0.025% カルバゾール溶液（カルバゾール 0.125 gを100% エタノール 100 mLで溶解したもの）30μLを添加した。100℃で15分加熱した後、室温まで冷却し、吸光度530 nmを測定した。D-グルクロン酸を標準曲線として定量した結果、サンプル（溶解物）に含まれる多糖濃度はグルクロン酸濃度に換算して140.5 mg/Lと算出された。【０２８０】
実施例２：生成多糖の構造解析
（２−１）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル解析
実施例１で得られた発酵ブロスを遠心除菌し、上清を0.45μmのMF膜でろ過した。得られたろ過液31 gを100 KDaのUF膜（Amicon-15K  5000 rpm）を用いて1.1 gまで濃縮した。濃縮液を更に40 mLの水で2回洗浄した。洗浄済み濃縮液をエバポレーターで減圧濃縮し、その残渣液に重水600μLを添加して溶解液を調製後、1H-NMR測定を行った。【０２８１】
分析条件を以下に示す。
（Ａ）装置名  Bruker製  AVANCE400  1H; 400 MHz
（Ｂ）溶媒  重水
（Ｃ）温度  室温
（Ｄ）測定回数  16回【０２８２】
結果、1H-NMR（D2O）σ：1.9（N-アセチル基のメチルプロトン）、3.3-4.5（C2からC6のメチレン及びメチンプロトン）、5.3（C1のメチンプロトン）のスペクトルが観察された。これらのスペクトルは、Iduron製ヘパロサン（ロット番号：B.N.4）の1H-NMRスペクトルと同一であった。【０２８３】
（２−２）液体クロマトグラフ質量分析（LC-MS）による二糖組成分析
実施例1で得られた発酵ブロスを遠心除菌し、上清を0.45μmのMF膜でろ過した。得られたろ過液40 mLを100 KDaのUF膜（Amicon-15K  5000 rpm）を用いて4 mLまで濃縮した。濃縮液を更に40 mLの水で2回洗浄した。洗浄済み濃縮液50μLに、Tri-buffer（200 mM Tri-HCl、1 M NaCl、15 mM CaCl2；35％塩酸でpH7（25℃）に調整）10μL、ヘパリナーゼIII 10μL（0.005 unit/mL、Iduron製）、および水30μLを添加し、37℃で16時間酵素処理を行った。得られた酵素処理液に900μLの水を添加し、LC-MS分析を行った。【０２８４】
分析条件を以下に示す。
（Ａ）装置名  島津製作所製  LC-MS  2010
（Ｂ）カラム  UG80（SCX  資生堂）  2.0 mm * 250 mm  粒子径：5μm
（Ｃ）移動相  CH3CN/10 mM ギ酸＝8/2
（Ｄ）流速  0.2 mL/min
（Ｅ）カラム温度  40℃
（Ｆ）注入量  10μL
（Ｇ）UV（PDA）    200-600 nm
（Ｈ）MS（ESI）    100-2000（ポジ、ネガ）【０２８５】
結果、リテンションタイム：6 minに、[m/z]＝362(M+H-H2O), 380（M＋H）, 418（M+K）のフラグメントイオンを検出した。酵素処理液のリテンションタイム及びフラグメントパターンは、ヘパリンおよびヘパラン硫酸のヘパリナーゼ消化産物であるΔGlcUA-GlcNAc標品（Heparin disaccharide IV-A sodium salt, Sigma-Aldrich社）のリテンションタイム及びフラグメントパターンと一致した。ΔGlcUA-GlcNAc標品の構造式を下記式（Ｉ）に示した。【０２８６】
【化１】
0006569530.tif 000005
【０２８７】
上記のNMR及びLC-MSの結果から、BL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株の培養ブロスより得られた高分子成分は目的とするヘパロサンであると同定した。従って、カルバゾール法にて定量されるヘパロサン濃度として、グルクロン酸濃度に係数2.067を乗算した値を用いることとした。【０２８８】
（２−３）ゲルろ過クロマトグラフィー（GPC）分析
実施例１で得られた発酵ブロスを遠心除菌し、上清を0.45μmのMF膜でろ過した。得られたろ過液31 gを100 KDaのUF膜（Amicon-15K  5000 rpm）を用いて1.1 gまで濃縮した。濃縮液を更に40 mLの水で2回洗浄した。洗浄済み濃縮液のGPC測定を行った。【０２８９】
分析条件を以下に示す。
（Ａ）装置名  島津製HPLC
（Ｂ）カラム  Asahipak  GS520HQ  7.5 mm * 300 mm
（Ｃ）移動相  100 mM KH2PO4
（Ｄ）流速  0.6 mL/min
（Ｅ）カラム温度  40℃
（Ｆ）注入量  20μL
（Ｇ）UV    200 nm
（Ｈ）分子量標準試料  プルラン（昭和電工製  P-82）【０２９０】
結果、リテンションタイム（ピークトップ）：8.3 min、数平均分子量（Mn）：240,000、重量平均分子量（Mw）：320,000、Mw/Mn＝1.3であることが確認された。【０２９１】
実施例３：ヘパロサン生産能を向上させる因子のスクリーニング
本実施例では、ヘパロサン生産株にエシェリヒア・コリK5株のゲノムライブラリーを導入し、ヘパロサン生産能を向上させる因子のスクリーニングを行った。【０２９２】
（３−１）エシェリヒア・コリBL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株の構築
ゲノムライブラリーを導入するためのヘパロサン生産株として、kfiABCD遺伝子が導入され、且つ、rfaH遺伝子の発現が増強されたエシェリヒア・コリBL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株を、以下の手順で構築した。【０２９３】
rfaH遺伝子の発現増強株は、染色体上のrfaH遺伝子の天然のプロモーター領域を強力なtacプロモーター（Amann E. et al.,(1983) “Vectors bearing a hybrid trp-lac promoter useful for regulated expression of cloned genes in Escherichia coli.” Gene., 25(2-3):167-78.）へ置換することによって取得した。tacプロモーターによるrfaHプロモーターの置換は、「Red駆動型組込み(Red-driven integration)」と呼ばれるDatsenko及びWannerによって初めて開発された方法 (“One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645) を用いて行った。この手法に従い、PCRによって増幅されたDNA断片がゲノムDNAへ挿入された菌株を取得できる。【０２９４】
まず、Pantoea ananatis NA1Δc1129株（WO2010/027022A1）のゲノムDNAをテンプレートとし、プライマーrfaH-attL Fw（配列番号6）およびプライマーrfaH-Ptac Rv（配列番号7）を用いたPCRにより、プロモーター置換用DNA断片を増幅した。PCRにはPrimeStarポリメラーゼを用い、PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 3分を30サイクル、最後に4℃保温。プライマーrfaH-attL Fw（配列番号6）は、rfaH遺伝子の上流に位置する領域及びNA1Δc1129株のゲノムDNAに存在するカナマイシン(Km)耐性を付与する遺伝子に隣接する領域の両者と相同性を有する。NA1Δc1129株のゲノムDNAに存在するKm耐性遺伝子kanは、λファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子の間に挿入されており、さらにその下流にはtacプロモーター（Ptac；配列番号8）がattL-kan-attR-Ptacの順で挿入されている。プライマーrfaH-Ptac Rv（配列番号7）は、rfaH領域及びNA1Δc1129株のゲノムDNA のtacプロモーターの下流に位置する領域の両者と相同性を有する。【０２９５】
次いで、エシェリヒア・コリBL21(DE3)株（ライフテクノロジーズ社, C6000-03）に温度感受性の複製起点を有するプラスミドpKD46（Datsenko and Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45）を導入したBL21(DE3)/pKD46株に、上記で得られたPCR産物をエレクトロポレーションにより導入し、プロモーター領域の置換を行った。プラスミドpKD46は、アラビノース誘導性のParaBプロモーター制御下にあるλ-Red相同組換え系の遺伝子（γ、β、エキソ遺伝子）を含み、ファージλ（GenBankアクセッション番号J02459）の2154塩基（31088-33241）のDNAフラグメントを含む。プラスミドpKD46は、PCR産物をBL21(DE3)株の染色体に組込むのに必要である。エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pKD46株をアンピシリン（100 mg/L）含有ＬＢ培地において30℃で一晩生育させた。この培養物を、アンピシリン及びＬ−アラビノース（1 mM）を含有するLB培地100 mLで100倍に希釈した。菌体を30℃で通気しながらOD 600が約0.3になるまで生育させ、それから100倍に濃縮し、氷冷したグリセロール水溶液(10%)で３回洗浄することによりエレクトロコンピテント化した。菌体70μL及びPCR産物約100 ngを使用して、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後に、菌体をSOC培地（Sambrook et al.著「モレキュラークローニング実験室マニュアル、第２版」(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）1 mLで37℃ 2.5時間インキュベートし、LB寒天培地上にプレーティングし、37℃で生育させ、Km耐性株を選抜した。【０２９６】
rfaHプロモーターがtacプロモーターに置換されたことは、プロモーター置換後の塩基配列に特異的なプライマーrfaH CF（配列番号9）及びプライマーrfaH CR（配列番号10）によるPCRによって確認した。PCRには、PrimeStarポリメラーゼを用いた。PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温。1.6 kbpのDNA断片の増幅が確認できた株をBL21(DE3)-Ptac-rfaH(KmR)株とした。【０２９７】
BL21(DE3)-Ptac-rfaH(KmR)株からKm耐性マーカーを除去するために、プラスミドpMW118-int-xis（アンピシリン耐性（AmpR））を導入した（WO2005/010175）。AmpRクローンを、30℃で150 mg/Lのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で生育させた。数十個のAmpRクローンを拾い、Km感受性株を選抜した。得られたKm感受性株をＬＢ寒天プレート上で、42℃でインキュベートすることにより、プラスミドpMW118-int-xisをKm感受性株から除去した。得られたAmp感受性株をBL21(DE3)-Ptac-rfaH株とした。BL21(DE3)-Ptac-rfaH株に実施例1で作製したプラスミドpVK9-kfiABCDをエレクトロポレーション法によって導入し、BL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株を取得した。実施例１に示すのと同じ培地および培養方法で試験管培養を行ない、カルバゾール法によってヘパロサン生産量を定量した。rfaH遺伝子の発現を増強していないBL21(DE3)/pVK9- kfiABCD株およびrfaH遺伝子の発現を増強したBL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株のヘパロサン生産量を表４に示す。【０２９８】
【表４】
0006569530.tif 000006
【０２９９】
（３−２）エシェリヒア・コリK5株のゲノムライブラリーの構築
エシェリヒア・コリK5株のゲノムDNAの断片をpSTV28ベクター（配列番号11、TaKaRa社）にクローニングし、ゲノムライブラリーを構築した。【０３００】
ゲノムライブラリーの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリK5株のゲノムDNA 3μgをDNA断片化装置（ハイドロシェアー、Gene machine社）を用いてランダムに断片化し、アガロース電気泳動によって分画した。アガロースゲルから約3-5 kbのDNAを含む断片を切り出して、DNAを抽出、精製した後、平滑末端処理を行った。次に、HincIIで消化し、Alkaline Phosphatase（E. coli C75）（TaKaRa社）により脱リン酸化した50 ngのプラスミドベクターpSTV28（TaKaRa社）と上記のゲノムDNA断片とをライゲーションした。エレクトロポレーション法により、ライゲーション産物で大腸菌HST08株（TaKaRa社）を形質転換した。得られた形質転換体の70％以上が約3-5 kbのインサートを含んでいた。形質転換体を培養して、プラスミドを抽出し、ゲノムライブラリーとした。【０３０１】
（３−３）ゲノムライブラリー導入によるヘパロサン生産能向上株の選別
BL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株にゲノムライブラリーまたはコントロールとしてpSTV28をエレクトロポレーション法により導入した。得られたゲノムライブラリートランスフォーマントより1クローンずつ選び、発酵生産培養に供した。培養には下記組成の培地を用いた。
〔シード培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
トリプトン                                            10 g/L
イーストエクストラクト                                 5 g/L
塩化ナトリウム                                        10 g/L
シード培地は、120℃、20分のオートクレーブ滅菌した。
〔生産培地〕（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
グリセロール                                          10 g/L
成分２：
MOPS（3-N-morpholino-propanesulphonic acid）          41.9 g/L
成分３：
トリプトン                                             8.8 g/L
イーストエクストラクト                                 4.4 g/L
塩化ナトリウム                                         8.8 g/L
成分1および成分３は、それぞれ120℃、20分のオートクレーブ滅菌し、成分２はフィルター滅菌した。室温に冷却後、３者を混合した。【０３０２】
ヘパロサン生産培養は以下の手順で行った。まずは750μlのシード培地を張りこんだ96穴プレート（MEDISCAN社）にトランスフォーマントを1コロニーずつ植菌し、振とう装置（タイテック社）にて37℃で一晩振とう培養を行った。続いて、シード培養液を、試験管に2 mL張りこんだ生産培地中に20μl植菌し、37℃にて30時間振とう培養を行い、培地中のグリセロールが完全に消費された時点で培養を終了した。プラスミドを保持させるため、全培養行程でカナマイシン（25 mg/L）及びクロラムフェニコール（25 mg/L）を添加した。培地中に生産されたヘパロサンの定量は、カルバゾール法（Bitter, T. and Murir H. M., Anal. Biochem. 1962;4:330-334）により行った。同時に培養を行ったコントロールベクター（pSTV28）導入株と比較し、ヘパロサン蓄積量が上昇したクローンを単離した。単離されたクローンが保持するプラスミドに挿入された遺伝子を同定するため、プライマーpSTV Fw（配列番号12）及びプライマーpSTV Rv（配列番号13）を用い挿入されたDNA断片の塩基配列を決定した。その結果、プラスミドは、各々、rbsBKR-hsrA、glgBX、ybiXIJCB、rcsBD-micF、pcoESR、yhcNO-aaeBAX、g1455-alpA-g1453、yrbA-mlaBCDEF-yrbG、norW、ybjIJK-rybB、thrBAL-yjtD-yjjY、fruA-psuK、ytfT-yjfF-fbp、yagU-paoAB、gsiCD-yliE、irp（一部）、bhsA-ycfS、lepB-rnc-era、dapA-gcvR-bcp-hyfA、rpoE-nadB-yfiC-srmB、g1414-g1413、nuoEFG、glmZ-hemYXD、rlmL、artQMJ-rlmC-ybjO、yejOML、rpoS-ygbNML、g3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792、ryjA-soxRS-yjcCB、efeUOを含むことが明らかになった。なお、irp（一部）とは、irp2遺伝子の一部およびirp1遺伝子の一部である。rbsBKR-hsrA、glgBX、ybiXIJCB、rcsBD-micF、pcoESR、yhcNO-aaeBAX、g1455-alpA-g1453、yrbA-mlaBCDEF-yrbG、norW、ybjIJK-rybB、thrBAL-yjtD-yjjY、fruA-psuK、ytfT-yjfF-fbp、yagU-paoAB、gsiCD-yliE、irp（一部）、bhsA-ycfS、lepB-rnc-era、dapA-gcvR-bcp-hyfA、rpoE-nadB-yfiC-srmB、g1414-g1413、nuoEFG、glmZ-hemYXD、rlmL、artQMJ-rlmC-ybjO、yejOML、rpoS-ygbNML、g3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792、ryjA-soxRS-yjcCB、efeUOを含む挿入断片の塩基配列を、それぞれ、配列番号29、34、37、43、50、54、60、64、72、74、78、84、87、91、95、99、104、107、111、116、121、124、128、132、134、140、144、149、157、162に示す。単離されたクローンよりプラスミドpSTV28-rbsBKR-hsrA、pSTV28-glgBX、pSTV28-ybiXIJCB、pSTV28-rcsBD-micF、pSTV28-pcoESR、pSTV28-yhcNO-aaeBAX、pSTV28-g1455-alpA-g1453、pSTV28-yrbA-mlaBCDEF-yrbG、pSTV28-norW、pSTV28-ybjIJK-rybB、pSTV28-thrBAL-yjtD-yjjY、pSTV28-fruA-psuK、pSTV28-ytfT-yjfF-fbp、pSTV28-yagU-paoAB、pSTV28-gsiCD-yliE、pSTV28-irp、pSTV28-bhsA-ycfS、pSTV28-lepB-rnc-era、pSTV28-dapA-gcvR-bcp-hyfA、pSTV28-rpoE-nadB-yfiC-srmB、pSTV28-g1414-g1413、pSTV28-nuoEFG、pSTV28-glmZ-hemYXD、pSTV28-rlmL、pSTV28-artQMJ-rlmC-ybjO、pSTV28-yejOML、pSTV28-rpoS-ygbNML、pSTV28-g3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792、pSTV28-ryjA-soxRS-yjcCB、pSTV28-efeUOを抽出した。【０３０３】
実施例４： rbsBKR-hsrA、glgBX、ybiXIJCB、rcsBD-micF遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産（１）
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株に、実施例３にて単離したpSTV28-rbsBKR-hsrA、pSTV28-glgBX、pSTV28-ybiXIJCB、pSTV28-rcsBD-micF、及びコントロールとしてpSTV28をそれぞれ導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。実施例１に示すのと同じ培地および培養方法で各株とも4連で試験管培養を行ない、カルバゾール法によってヘパロサンを定量した。定量したヘパロサン濃度について各平均値と標準偏差を表５に示した。【０３０４】
【表５】
0006569530.tif 000007
【０３０５】
実施例５：rbsBKR-hsrA、glgBX、ybiXIJCB、rcsBD-micF遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産（２）
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株に、実施例３にて単離したpSTV28-rbsBKR-hsrA、pSTV28-glgBX、pSTV28-ybiXIJCB、pSTV28-rcsBD-micF、及びコントロールとしてpSTV28をそれぞれ導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。実施例１に示すのと同じ培地および培養方法で各株とも4連で試験管培養を行ない、カルバゾール法によってヘパロサンを定量した。定量したヘパロサン濃度について各平均値と標準偏差を表６に示した。【０３０６】
【表６】
0006569530.tif 000008
【０３０７】
実施例６：rfaH遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
（６−１）エシェリヒア・コリB株のrfaH遺伝子の発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリBL21(DE3)株よりrfaH遺伝子をpMIV-Pnlp0-terにクローニングし、rfaH遺伝子の発現プラスミドpMIV-Pnlp0-rfaHを構築した。pMIV-Pnlp0-terには強力なnlp0プロモーター（Pnlp0）とrrnBターミネーターが組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Pnlp0」はエシェリヒア・コリ K-12株由来の野生型nlpD遺伝子のプロモーターを示す。【０３０８】
発現プラスミドの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリMG1655の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP1（配列番号14）及びプライマーP2（配列番号15）を用いたPCRによって、nlpD遺伝子のプロモーター領域（以下、野生型nlpD遺伝子プロモーターを「Pnlp0」と記載する。）約300 bpを含むDNA断片を取得した。これらプライマーの5’末端には制限酵素SalI及びPaeIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をSalI及びPaeIで処理し、pMIV-5JS（特開2008-99668）のSalI−PaeIサイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pnlp0を取得した。このpMIV-Pnlp0プラスミドに挿入されたPnlp0プロモーターのPaeI-SalI断片の塩基配列は配列番号16に示したとおりである。【０３０９】
次に、MG1655の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP3（配列番号17）及びプライマーP4（配列番号18）を用いたPCRによってrrnB遺伝子のターミネーター領域約300 bpを含むDNA断片（配列番号19）を取得した。これらプライマーの5’末端には制限酵素XbaI及びBamHIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。得られた断片をXbaI及びBamHIで処理し、pMIV-Pnlp0のXbaI−BamHIサイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pnlp0-terを取得した。【０３１０】
続いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)株の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーrfaH Fw（配列番号20）およびプライマーrfaH Rv（配列番号21）を用いたPCRによって、rfaH遺伝子断片を取得した。これらプライマーの5’末端には制限酵素SalI及びXbaIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRにはPrimeStarポリメラーゼを用い、PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 4分を30サイクル、最後に4℃保温。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、pMIV-Pnlp0-terのSalI−XbaIサイトに挿入しプラスミドpMIV-Pnlp0-rfaHを取得した。こうして、pMIV-5JSベクター上に、nlpDプロモーター、rfaH遺伝子、及びrrnBターミネーターが、この順に繋がったrfaHの発現ユニットが構築された。今回クローニングされたエシェリヒア・コリBL21(DE3)株のrfaH遺伝子の塩基配列を配列番号46に示す。【０３１１】
（６−２）rfaH遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株に、pMIV-Pnlp0-rfaH及びコントロールとしてpMIV-5JSをそれぞれ導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。培地、培養方法、及びヘパロサンの定量方法は前述の手法に準じた。定量したヘパロサン濃度について各平均値と標準偏差を表７に示した。【０３１２】
【表７】
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【０３１３】
実施例７：nusG遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
（７−１）エシェリヒア・コリB株のnusG遺伝子の発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリBL21(DE3)株の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーnusG Fw（配列番号22）およびプライマーnusG Rv（配列番号23）を用いたPCRによって、nusG遺伝子断片を取得した。これらプライマーの5’末端には制限酵素SalI及びXbaIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRにはPrimeStarポリメラーゼを用い、PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 4分を30サイクル、最後に4℃保温。得られた断片をSalI及びXbaIで処理し、同制限酵素で処理したpMIV-Pnlp0-terのSalI-XbaIサイトに挿入し、nusG遺伝子がクローニングされたプラスミドpMIV-Pnlp0-nusGを取得した。今回クローニングされたエシェリヒア・コリBL21(DE3)株のnusG遺伝子の塩基配列を配列番号48に示す。【０３１４】
（７−２）nusG遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株に、pMIV-Pnlp0-nusG及びコントロールとしてpMIV-5JSをそれぞれ導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。培地、培養方法、及びヘパロサンの定量方法は前述の手法に準じた。定量したヘパロサンについて各平均値と標準偏差を表８に示した。【０３１５】
【表８】
0006569530.tif 000010
【０３１６】
実施例８：pcoESR、yhcNO-aaeBAX、g1455-alpA-g1453、yrbA-mlaBCDEF-yrbG、norW、ybjIJK-rybB、thrBAL-yjtD-yjjY、fruA-psuK、ytfT-yjfF-fbp、yagU-paoAB、gsiCD-yliE、irp（一部）、bhsA-ycfS遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産（１）
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)-Ptac-rfaH/pVK9-kfiABCD株に、実施例３にて単離したpSTV28-pcoESR、pSTV28-yhcNO-aaeBAX、pSTV28-g1455-alpA-g1453、pSTV28-yrbA-mlaBCDEF-yrbG、pSTV28-norW、pSTV28-ybjIJK-rybB、pSTV28-thrBAL-yjtD-yjjY、pSTV28-fruA-psuK、pSTV28-ytfT-yjfF-fbp、pSTV28-yagU-paoAB、pSTV28-gsiCD-yliE、pSTV28-irp、pSTV28-bhsA-ycfS、及びコントロールとしてpSTV28をそれぞれ導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。実施例１に示すのと同じ培地および培養方法で各株とも4連で試験管培養を行ない、カルバゾール法によってヘパロサンを定量した。定量したヘパロサン濃度について各平均値と標準偏差を表９に示した。【０３１７】
【表９】
0006569530.tif 000011
【０３１８】
実施例９：pcoESR、yhcNO-aaeBAX、g1455-alpA-g1453、yrbA-mlaBCDEF-yrbG、norW、ybjIJK-rybB、thrBAL-yjtD-yjjY、fruA-psuK、ytfT-yjfF-fbp、yagU-paoAB、gsiCD-yliE、irp（一部）、bhsA-ycfS遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産（２）
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株に、実施例３にて単離したpSTV28-pcoESR、pSTV28-yhcNO-aaeBAX、pSTV28-g1455-alpA-g1453、pSTV28-yrbA-mlaBCDEF-yrbG、pSTV28-norW、pSTV28-ybjIJK-rybB、pSTV28-thrBAL-yjtD-yjjY、pSTV28-fruA-psuK、pSTV28-ytfT-yjfF-fbp、pSTV28-yagU-paoAB、pSTV28-gsiCD-yliE、pSTV28-irp、pSTV28-bhsA-ycfS、及びコントロールとしてpSTV28を導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。実施例１に示すのと同じ培地および培養方法で各株とも4連で試験管培養を行ない、カルバゾール法によってヘパロサンを定量した。定量したヘパロサン濃度について各平均値と標準偏差を表１０に示した。【０３１９】
【表１０】
0006569530.tif 000012
【０３２０】
実施例１０：lepB-rnc-era、dapA-gcvR-bcp-hyfA、rpoE-nadB-yfiC-srmB、g1414-g1413、nuoEFG、glmZ-hemYXD、rlmL、artQMJ-rlmC-ybjO、yejOML、rpoS-ygbNML、g3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792、ryjA-soxRS-yjcCB、efeUO遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株に、実施例３にて単離したpSTV28-lepB-rnc-era、pSTV28-dapA-gcvR-bcp-hyfA、pSTV28-rpoE-nadB-yfiC-srmB、pSTV28-g1414-g1413、pSTV28-nuoEFG、pSTV28-glmZ-hemYXD、pSTV28-rlmL、pSTV28-artQMJ-rlmC-ybjO、pSTV28-yejOML、pSTV28-rpoS-ygbNML、pSTV28-g3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792、pSTV28-ryjA-soxRS-yjcCB、pSTV28-efeUO、及びコントロールとしてpSTV28を導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。実施例１に示すのと同じ培地および培養方法で各株とも4連で試験管培養を行ない、カルバゾール法によってヘパロサンを定量した。定量したヘパロサン濃度について各平均値と標準偏差を表１１および表１２に示した。【０３２１】
【表１１】
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【０３２２】
【表１２】
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【０３２３】
実施例１１：rpoE遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
（１１−１）エシェリヒア・コリK5株のrpoE遺伝子の発現プラスミドの構築
エシェリヒア・コリK5株よりrpoE遺伝子をpMIV-Pnlp8-terにクローニングし、rpoE遺伝子の発現プラスミドpMIV-Pnlp8-rpoEを構築した。pMIV-Pnlp8-terには強力なnlp8プロモーター（Pnlp8）が組み込まれており、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Pnlp8」はエシェリヒア・コリ K-12株由来の変異型nlpD遺伝子のプロモーターを示す。【０３２４】
発現ベクターpMIV-Pnlp8-terの構築の詳細を以下に示す。野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の-10領域を改変することでより強力なプロモーターとするため、以下の手法で-10領域のランダム化を行った。野生型nlpDプロモーター領域（図１；配列番号165）には、プロモーターとして機能すると推定される２箇所の領域が存在し、それぞれ図中ではPnlp1およびPnlp2と示してある。実施例６で構築したプラスミドpMIV-Pnlp0-terをテンプレートとして、プライマーP1（配列番号14）及びプライマーP7（配列番号166）を用いたPCRによって、野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の３'末端側に含まれる-10領域(-10(Pnlp1))をランダム化したDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。【０３２５】
同様に、プラスミドpMIV-Pnlp0-terをテンプレートとして、プライマーP2（配列番号15）及びプライマーP8（配列番号167）を用いたPCRによって、野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の５'末端側に含まれる-10領域（-10(Pnlp2)）をランダム化したDNA断片を取得した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。【０３２６】
得られた３'末端側と５'末端側の断片を、プライマーP7とP8にデザインされたBglIIサイトによってつなぎ合わせ、2箇所の-10領域がランダム化された変異型nlpDプロモーター全長を含むDNA断片を構築した。このDNA断片をテンプレートとして、プライマーP1及びプライマーP2を用いたPCRによって、変異型nlpDプロモーター全長を含むDNA断片を増幅した。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を12サイクル、最後に72℃ 5分。【０３２７】
増幅した変異型nlpDプロモーター全長を含むDNA断片を、プライマーの5'末端にデザインされている制限酵素SalI及びPaeIで処理し、同じくSalI及びPaeIで処理したプラスミドpMIV-Pnlp0-terに挿入することで、プラスミド上の野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）を変異型nlpDプロモーターと置き換えた。こうして得られたプラスミドの内、図２に示すプロモーター配列（Pnlp8；配列番号168）を有するものを選び、pMIV-Pnlp8-terとした。このプラスミドに挿入されたPnlp8プロモーターのPaeI−SalI断片の塩基配列は配列番号169に示したとおりである。【０３２８】
rpoE遺伝子の発現プラスミドpMIV-Pnlp8-rpoEの構築の詳細を以下に示す。エシェリヒア・コリK5の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーrpoE-SalI Fw（配列番号170）及びプライマーrpoE-xba Rv（配列番号171）を用いたPCRによって、rpoE遺伝子のDNA断片を取得した。PCRにはPrimeStarポリメラーゼ（TaKaRa社）を用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温。また、pMIV-Pnlp8-terをテンプレートDNAとし、配列番号172及び配列番号173のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRによって、pMIV-Pnlp8-terのDNA断片を得た。PCRにはPrimeStarポリメラーゼを用い、プロトコールに記載の反応組成で行った。PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 6分を30サイクル、最後に4℃保温。得られた両DNA断片をIn-FusionRHDクローニングキット（クロンテック社製）を用いて連結し、rpoE遺伝子の発現プラスミドpMIV-Pnlp8-rpoEを構築した。クローニングされたrpoE遺伝子の塩基配列を配列番号174に示す。【０３２９】
（１１−２）rpoE遺伝子の発現増強株によるヘパロサン生産
実施例１にて構築したエシェリヒア・コリBL21(DE3)/pVK9-kfiABCD株に、pMIV-Pnlp8-rpoE及びコントロールとしてpMIV-5JSをそれぞれ導入した菌株を構築した。これらの菌株の発酵生産培養を行い、ヘパロサンの生産量を比較した。培地、培養方法、及びヘパロサンの定量方法は前述の手法に準じた。定量したヘパロサンについて各平均値と標準偏差を表１３に示した。【０３３０】
【表１３】
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【産業上の利用可能性】
【０３３１】
本発明によれば、細菌のヘパロサン生産能を向上させることができ、ヘパロサンを効率よく製造することができる。【０３３２】
＜配列表の説明＞
配列番号１：pVK9の塩基配列
配列番号２〜７：プライマー
配列番号８：tacプロモーターの塩基配列
配列番号９、１０：プライマー
配列番号１１：pSTV28の塩基配列
配列番号１２〜１５：プライマー
配列番号１６：野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）を含むPaeI-SalI断片の塩基配列
配列番号１７、１８：プライマー
配列番号１９：rrnBターミネーターの塩基配列
配列番号２０〜２３：プライマー
配列番号２４：エシェリヒア・コリK5株のkfiABCDオペロンの塩基配列
配列番号２５：エシェリヒア・コリK5株のKfiAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６：エシェリヒア・コリK5株のKfiBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：エシェリヒア・コリK5株のKfiCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２８：エシェリヒア・コリK5株のKfiDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：エシェリヒア・コリK5株のrbsBKR-hsrA遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号３０：エシェリヒア・コリK5株のRbsBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：エシェリヒア・コリK5株のRbsKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３２：エシェリヒア・コリK5株のRbsRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３：エシェリヒア・コリK5株のHsrAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３４：エシェリヒア・コリK5株のglgBX遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号３５：エシェリヒア・コリK5株のGlgBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３６：エシェリヒア・コリK5株のGlgXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３７：エシェリヒア・コリK5株のybiXIJCB遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号３８：エシェリヒア・コリK5株のYbiXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３９：エシェリヒア・コリK5株のYbiIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４０：エシェリヒア・コリK5株のYbiJタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１：エシェリヒア・コリK5株のYbiCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４２：エシェリヒア・コリK5株のYbiBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：エシェリヒア・コリK5株のrcsBD-micF遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号４４：エシェリヒア・コリK5株のRcsBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：エシェリヒア・コリK5株のRcsDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４６：エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のrfaH遺伝子の塩基配列
配列番号４７：エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のRfaHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４８：エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のnusG遺伝子の塩基配列
配列番号４９：エシェリヒア・コリBL21(DE3)株のNusGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５０：エシェリヒア・コリK5株のpcoRSE遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号５１：エシェリヒア・コリK5株のPcoRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５２：エシェリヒア・コリK5株のPcoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５３：エシェリヒア・コリK5株のPcoEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５４：エシェリヒア・コリK5株のyhcNO-aaeBAX遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号５５：エシェリヒア・コリK5株のYchNタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５６：エシェリヒア・コリK5株のYchOタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５７：エシェリヒア・コリK5株のAaeBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５８：エシェリヒア・コリK5株のAaeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５９：エシェリヒア・コリK5株のAaeXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６０：エシェリヒア・コリK5株のg1455-alpA-g1453遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号６１：エシェリヒア・コリK5株のG1455タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６２：エシェリヒア・コリK5株のAlpAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６３：エシェリヒア・コリK5株のG1453タンパク質のアミノ酸配列
配列番号６４：エシェリヒア・コリK5株のyrbA-mlaBCDEF-yrbG遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号６５：エシェリヒア・コリK5株のYrbAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６６：エシェリヒア・コリK5株のMlaBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６７：エシェリヒア・コリK5株のMlaCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６８：エシェリヒア・コリK5株のMlaDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６９：エシェリヒア・コリK5株のMlaEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７０：エシェリヒア・コリK5株のMlaFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７１：エシェリヒア・コリK5株のYrbGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７２：エシェリヒア・コリK5株のnorW遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号７３：エシェリヒア・コリK5株のNorWタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７４：エシェリヒア・コリK5株のybjIJK-rybB遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号７５：エシェリヒア・コリK5株のYbjIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７６：エシェリヒア・コリK5株のYbjJタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７７：エシェリヒア・コリK5株のYbjKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７８：エシェリヒア・コリK5株のyjjY-yjtD-thrLAB遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号７９：エシェリヒア・コリK5株のYjjYタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８０：エシェリヒア・コリK5株のYjtDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８１：エシェリヒア・コリK5株のThrLタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８２：エシェリヒア・コリK5株のThrAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８３：エシェリヒア・コリK5株のThrBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８４：エシェリヒア・コリK5株のfruA-psuK遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号８５：エシェリヒア・コリK5株のFruAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８６：エシェリヒア・コリK5株のPsuKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８７：エシェリヒア・コリK5株のytfT-yjfF-fbp遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号８８：エシェリヒア・コリK5株のYtfTタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８９：エシェリヒア・コリK5株のYjfFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９０：エシェリヒア・コリK5株のFbpタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９１：エシェリヒア・コリK5株のyagU-paoAB遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号９２：エシェリヒア・コリK5株のYagUタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９３：エシェリヒア・コリK5株のPaoAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９４：エシェリヒア・コリK5株のPaoBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９５：エシェリヒア・コリK5株のgsiCD-yliE遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号９６：エシェリヒア・コリK5株のGsiCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９７：エシェリヒア・コリK5株のGsiDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９８：エシェリヒア・コリK5株のYliEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９９：エシェリヒア・コリK5株のirp遺伝子の一部を含む領域の塩基配列
配列番号１００：エシェリヒア・コリK5株のirp2遺伝子の塩基配列
配列番号１０１：エシェリヒア・コリK5株のIrp2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０２：エシェリヒア・コリK5株のirp1遺伝子の塩基配列
配列番号１０３：エシェリヒア・コリK5株のIrp1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０４：エシェリヒア・コリK5株のbhsA-ycfS遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１０５：エシェリヒア・コリK5株のBhsAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０６：エシェリヒア・コリK5株のYcfSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０７：エシェリヒア・コリK5株のlepB-rnc-era遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１０８：エシェリヒア・コリK5株のLepBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０９：エシェリヒア・コリK5株のRncタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１０：エシェリヒア・コリK5株のEraタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１１：エシェリヒア・コリK5株のdapA-gcvR-bcp-hyfA遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１１２：エシェリヒア・コリK5株のDapAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１３：エシェリヒア・コリK5株のGcvRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１４：エシェリヒア・コリK5株のBcpタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１５：エシェリヒア・コリK5株のHyfAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１６：エシェリヒア・コリK5株のrpoE-nadB-yfiC-srmB遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１１７：エシェリヒア・コリK5株のRpoEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１８：エシェリヒア・コリK5株のNadBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１９：エシェリヒア・コリK5株のYfiCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２０：エシェリヒア・コリK5株のSrmBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２１：エシェリヒア・コリK5株のg1414-g1413遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１２２：エシェリヒア・コリK5株のG1414タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２３：エシェリヒア・コリK5株のG1413タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２４：エシェリヒア・コリK5株のnuoEFG遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１２５：エシェリヒア・コリK5株のNuoEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２６：エシェリヒア・コリK5株のNuoFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２７：エシェリヒア・コリK5株のNuoGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２８：エシェリヒア・コリK5株のglmZ-hemYXD遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１２９：エシェリヒア・コリK5株のHemYタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３０：エシェリヒア・コリK5株のHemXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３１：エシェリヒア・コリK5株のHemDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３２：エシェリヒア・コリK5株のrlmL遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１３３：エシェリヒア・コリK5株のRlmLタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３４：エシェリヒア・コリK5株のartQMJ-rlmC-ybjO遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１３５：エシェリヒア・コリK5株のArtQタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３６：エシェリヒア・コリK5株のArtMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３７：エシェリヒア・コリK5株のArtJタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３８：エシェリヒア・コリK5株のRlmCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３９：エシェリヒア・コリK5株のYbjOタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４０：エシェリヒア・コリK5株のyejOML遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１４１：エシェリヒア・コリK5株のYejOタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４２：エシェリヒア・コリK5株のYejMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４３：エシェリヒア・コリK5株のYejLタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４４：エシェリヒア・コリK5株のrpoS-ygbNML遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１４５：エシェリヒア・コリK5株のRpoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４６：エシェリヒア・コリK5株のYgbNタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４７：エシェリヒア・コリK5株のYgbMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４８：エシェリヒア・コリK5株のYgbLタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４９：エシェリヒア・コリK5株のg3798-g3797-g3796-g3795-g3794-g3793-g3792遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１５０：エシェリヒア・コリK5株のG3798タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５１：エシェリヒア・コリK5株のG3797タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５２：エシェリヒア・コリK5株のG3796タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５３：エシェリヒア・コリK5株のG3795タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５４：エシェリヒア・コリK5株のG3794タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５５：エシェリヒア・コリK5株のG3793タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５６：エシェリヒア・コリK5株のG3792タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５７：エシェリヒア・コリK5株のryjA-soxRS-yjcCB遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１５８：エシェリヒア・コリK5株のSoxRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５９：エシェリヒア・コリK5株のSoxSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６０：エシェリヒア・コリK5株のYjcCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６１：エシェリヒア・コリK5株のYjcBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６２：エシェリヒア・コリK5株のefeUO遺伝子を含む領域の塩基配列
配列番号１６３：エシェリヒア・コリK5株のEfeUタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６４：エシェリヒア・コリK5株のEfeOタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６５：野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の塩基配列
配列番号１６６、１６７：プライマー
配列番号１６８：変異型nlpDプロモーター（Pnlp8）の塩基配列
配列番号１６９：変異型nlpDプロモーター（Pnlp8）を含むPaeI-SalI断片の塩基配列
配列番号１７０〜１７３：プライマー
配列番号１７４：エシェリヒア・コリK5株のrpoE遺伝子の塩基配列
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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