(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の核酸分子：
(I) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも90％の同一性を有する核酸分子、又は    (III) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群より選択される配列を有する組換え核酸分子であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子のアミノ酸グルタミンをコードするコドンが、アミノ酸ヒスチジンをコードするコドンにより、又はアミノ酸アルギニンをコードするコドンにより、又はアミノ酸チロシンをコードするコドンにより置換されているか、あるいは配列番号2の5位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸グルタミンが、アミノ酸ヒスチジンにより、又はアミノ酸アルギニンにより、又はアミノ酸チロシンにより置換されており、かつ
(I)〜(IV)に規定される核酸分子によりコードされるポリペプチドが、配列番号2を有するポリペプチドと比較して活性及び／又は発現が改変されている、
上記組換え核酸分子。
【請求項２】
以下のポリペプチド分子：
(I) 配列番号2の配列を含むポリペプチド分子、又は
(II) 配列番号2のポリペプチド分子に対して少なくとも90％の同一性を有するポリペプチド分子
の群より選択される配列を有する組換えポリペプチド分子であって、
配列番号2の5位に対応する(I)又は(II)に属するポリペプチドのアミノ酸グルタミンが、ヒスチジンにより、又はアルギニンにより、又はチロシンにより置換されており、かつ  (I)又は(II)に規定されるポリペプチド分子が、配列番号2を有するポリペプチドと比較して活性及び／又は発現が改変されている、上記組換えポリペプチド分子。
【請求項３】
請求項1に規定される核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的な少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現構築物。
【請求項４】
請求項1に規定される核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含み、該プロモーターが、以下：
(I) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも90％の同一性を有し、かつプロモーター活性を有する核酸分子
からなる群より選択される核酸分子を有する、請求項3に記載の組換え発現構築物。
【請求項５】
請求項1に規定される核酸分子又は請求項3若しくは4に規定される組換え発現構築物のうちの少なくとも1つを含む、組換えベクター。
【請求項６】
請求項1に規定される組換え核酸分子又は請求項3若しくは4に記載の組換え発現構築物又は請求項5に記載の組換えベクターのうちの少なくとも1つを含む、組換え微生物。
【請求項７】
(I) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも90％の同一性を有する核酸分子、又は
(III) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも90％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
を含む、請求項6に記載の組換え微生物であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子のアミノ酸グルタミンをコードするコドンが、アミノ酸ヒスチジンをコードするコドンにより、又はアミノ酸アルギニンをコードするコドンにより、又はアミノ酸チロシンをコードするコドンにより置換されているか、あるいは配列番号2の5位に対応する(I)〜(IV)に属する遺伝子によりコードされるポリペプチドのアミノ酸グルタミンが、アミノ酸ヒスチジンにより、又はアミノ酸アルギニンにより、又はアミノ酸チロシンにより置換されており、かつ
上記の変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変するものであり、
上記組換え微生物はさらに以下：
（a）ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、
（b）二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、
（c）NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、
（d）リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、
（e）フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
（f）アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強
からなる群より選択される特徴の少なくとも2つを有し、ここで、遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制、欠失、増大又は増強は、それぞれの参照微生物と比較して決定される、上記組換え微生物。
【請求項８】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変をさらに含む、請求項6又は7に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属からなる群の属から選択される、請求項6〜8のいずれか1項に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
請求項6〜9のいずれか1項に記載の1種以上の組換え微生物を含む組成物。
【請求項１１】
アラニン産生を可能にする条件下で、請求項6〜9のいずれか1項に記載の1種以上の組換え微生物を培養するステップを含む、アラニンの製造方法。
【請求項１２】
アラニンの発酵生産のための、請求項1に記載の組換え核酸分子、請求項2に記載の組換えポリペプチド分子、請求項3若しくは4に記載の組換え発現構築物、請求項5に記載の組換えベクター、請求項6〜9のいずれか1項に記載の組換え微生物又は請求項10に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
以下のステップ：
(I) 発酵槽中で請求項6〜9のいずれか1項に記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、アラニンを回収するステップ
を含む、アラニンの発酵生産のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、すべて2013年9月25日に出願された出願第61/881968号、第61/881969号、第61/881975号及び第61/881972号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、組換え核酸分子、組換え微生物、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシンの製造方法、並びにアラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシンの発酵生産のための該組換え核酸分子又は組換え微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アミノ酸は、カルボキシ基及びアミノ基を有する有機化合物である。最も重要なアミノ酸は、アミノ基がカルボキシ基の隣に位置しているα-アミノ酸である。タンパク質は、α-アミノ酸に基づいている。
【０００４】
アラニンは、食料、飼料及び医薬品産業において添加物として使用されているので、かなりの関心を集めてきた。さらに、アラニンは、強力なキレート剤であるアラニン、N,N-ビス(カルボキシメチル)-, 三ナトリウム塩（MGDA, 商品名Trilon M）の工業生産のための原材料であり、これは有機及び無機規模の溶解に優れた性能を示す（WO94/29421号、WO2012/150155号）。Trilon Mグレードは、標準的なOECD試験において容易に生分解性である。卓越した生態学及び毒物学プロフィールのため、Trilon Mグレードは最終消費者のための製品に使用するのに特に適しており、そのような生分解性複合材料（complex builders）の要求が常に増加している。
【０００５】
アラニンは、コリネ型細菌（Hermann, 2003: Industrial production of amino acids by Coryneform bacteria, J. of Biotechnol, 104, 155-172）又は大腸菌（E.coli.）（WO2007/120198号、WO2008/119009号）を用いる発酵によって生産することができる。
【０００６】
大腸菌について、ygaW遺伝子の過剰発現が微生物の発酵的アラニン生産性を改善することが最近記載されている（WO2012/172822号）。
【０００７】
大腸菌におけるアラニン生産はより効率的であり、化学産業のための原材料としてのアラニンの工業生産のために広く使用されている。化学産業によるアラニンの要求が高まっているため、アラニンの発酵生産の生産性の改善の要求もある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的の1つは、高収量及び高効率でのアラニンの発酵生産に使用することができる微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
それぞれの参照微生物と比較して、（i）lpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいは（ii）zipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは（iii）配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子であって、該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する、ygaW遺伝子、の少なくとも1つを有するエッシェリヒア・コリ（E.コリ、大腸菌）のファミリーの組換え微生物を提供することにより、上述の目的を達成するのに寄与する。
【００１０】
例えば酵素の発現及び／若しくは活性、又は収量若しくは生産性を参照して、「より高い」、「増大」又は「増強」という用語は、有意に高い、増大している又は増強されている発現及び／若しくは活性、又は収量若しくは生産性を意味する。
【００１１】
「酵素の発現及び／又は活性の低減、抑制又は欠失」という用語は、発現及び／又は活性の有意な低減、抑制又は欠失を意味し、またそれぞれの酵素の検出不能な発現及び／又は活性を包含する。
【００１２】
酵素の発現及び／又は活性の「改変」という用語は、野生型の非組換え微生物におけるそれぞれの酵素の発現及び／又は活性とは有意に異なる、組換え微生物における酵素の発現及び／又は活性を意味する。
【００１３】
予想外にも、（i）lpd遺伝子によりコードされるタンパク質の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいは（ii）zipA遺伝子によりコードされるタンパク質の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは（iii）配列番号1の13〜15位に又はそのホモログ若しくは機能的等価物の対応する位置に変異を含むygaW遺伝子、の少なくとも1つを有する微生物が、各lpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいは各zipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは各変異を含まないygaW遺伝子を含まない同じ微生物と比較した場合に、発酵生産における高いアラニンの収量及び／又は生産性を有することを見出した。
【００１４】
したがって、目下の本発明の一実施形態は、それぞれの参照微生物と比較して、（i）リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいは（ii）Zリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは（iii）配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）、の少なくとも1つを含み、かつそれぞれの参照微生物と比較して発酵生産におけるアラニンの高い収量及び／又は生産性を有する、組換え微生物である。
【００１５】
目下の本発明の一実施形態において、それぞれの参照微生物と比較して、（i）リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいは（ii）Zリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは（iii）配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）、の少なくとも1つを含み、それぞれの参照微生物と比較して発酵生産におけるアラニンの高い収量及び／又は生産性を有する、組換え微生物はさらに、WO2007/120198号及びWO2008/119009号（参照により組み入れられる）に記載された酵素活性の欠失及び導入を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】ackA-pta遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。A：プライマーP395-ackA-pta-check2及びP395-ackA-pta-check5を用いて、大腸菌W ΔackA-pta::FRTのゲノムDNAから得られたPCRアンプリコン（338bp）。M：DNAサイズマーカー。
【図１Ｂ】ackA-pta遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。B：P395-ackA-pta-check2及びP395-ackA-pta-check5を用いるPCRアンプリコンの配列決定により、ackA-pta遺伝子座の正確な塩基対での改変を確認した。配列決定により確認されたヌクレオチドは、斜体で示されている。残余のFRT部位は緑色で示され、隣接するプライマー結合部位は赤色で示される。大文字：コード配列。小文字：遺伝子間領域。
【図２Ａ】adhE遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。A：プライマーP395-adhE-check2及びP395-adhE-check5を用いて、大腸菌W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRTのゲノムDNAから得られたPCRアンプリコン（569bp）。M：DNAサイズマーカー。
【図２Ｂ】adhE遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。B：P395-adhE-check2及びP395-adhE-check5を用いるPCRアンプリコンの配列決定により、adhE遺伝子座の正確な塩基対での改変を確認した。配列決定により確認されたヌクレオチドは、斜体で示されている。残余のFRT部位は緑色で示され、隣接するプライマー結合部位は赤色で示される。大文字：コード配列。小文字：遺伝子間領域。
【図３Ａ】frdABCD遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。A：プライマーP395-frd-check1及びP395-frd-check4を用いて、大腸菌W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT ΔfrdABCD::FRTのゲノムDNAから得られたPCRアンプリコン（797bp）。M：DNAサイズマーカー。
【図３Ｂ】frdABCD遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。B：P395-frd-check1及びP395-frd-check4を用いるPCRアンプリコンの配列決定により、frd遺伝子座の正確な塩基対での改変を確認した。配列決定により確認されたヌクレオチドは、斜体で示されている。残余のFRT部位は緑色で示され、隣接するプライマー結合部位は赤色で示される。大文字：コード配列。小文字：遺伝子間領域。
【図４Ａ】pflB遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。A：プライマーP395-pflB-check1及びP395-pflB-check3を用いて、大腸菌W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT ΔfrdABCD::FRT ΔpflB::FRTのゲノムDNAから得られたPCRアンプリコン（511bp）。M：DNAサイズマーカー。
【図４Ｂ】pflB遺伝子の不活性化後のクローン検証を示す図である。B：P395-pflB-check1及びP395-pflB-check3を用いるPCRアンプリコンの配列決定により、pflB遺伝子座の正確な塩基対での改変を確認した。配列決定により確認されたヌクレオチドは、斜体で示されている。残余のFRT部位は緑色で示され、隣接するプライマー結合部位は赤色で示される。大文字：コード配列。小文字：遺伝子間領域。
【図５Ａ】alaD-gstear遺伝子の組み込み後のクローン検証を示す図である。A：プライマーP395-ldhA-check1及びP395-ldhA-check2を用いて、大腸菌W ΔackA-pta::FRT ΔadhE::FRT ΔfrdABCD::FRT ΔpflB::FRT ΔldhA::alaD-gstearのゲノムDNAから得られたPCRアンプリコン（1833bp）。M：DNAサイズマーカー。
【図５Ｂ】alaD-gstear遺伝子の組み込み後のクローン検証を示す図である。B：P395-ldhA-check1及びP395-ldhA-check2を用いるPCRアンプリコンの配列決定により、ldhA遺伝子座の正確な塩基対での改変及びalaD-gstearの組み込みを確認した。配列決定により確認されたヌクレオチドは、斜体で示されている。alaD-gstear ORFはシアン色で示され、残余のFRT部位は緑色で示され、隣接するプライマー結合部位は赤色で示される。大文字：コード配列。小文字：遺伝子間領域。
【図６】実施例1に記載される通りのすべての突然変異を含む、大腸菌Ex1株（互換的にQZ16株と称される）でのアラニンの生合成経路を示す図である。
【図７−１】ydbHコード領域の部分的欠失及びldhAプロモーター（ステムQZ16株にてalaD遺伝子の発現を駆動した）の欠失を含むステムEv3株（互換的にQZ20株と称される）でのalaD遺伝子の挿入部位での新規遺伝子座のゲノム構成を示す図である。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８】37℃にてLB培地中で一晩増殖させた大腸菌W株、大腸菌QZ16株、大腸菌QZ20株、及び大腸菌QZ32株の可溶性タンパク質画分のSDS-PAGE分析を示す図である。39.37kDaのアラニンデヒドロゲナーゼ（AlaD）バンドは白色で囲まれている。大腸菌培養物は、細胞を溶解する前にOD600に対して正規化した。M：マーカー。
【図９】体積測定アラニンデヒドロゲナーゼ（alaD）活性を、大腸菌粗精製細胞溶解物を用いてin vitroアッセイでモニタリングしたことを示す図である。L-アラニンからピルビン酸への変換を、340nmでのNADHの形成を介して分光光度分析によりモニタリングした。
【図１０】大腸菌QZ16株（8時間）と比較した、バッチ発酵中の8時間、11時間及び28時間での大腸菌QZ16株及びQZ20株でのalaDの相対的遺伝子発現分析を示す図である。すべてのqPCR由来データを、参照としてのrrsA遺伝子に対して正規化した。
【図１１】80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での大腸菌QZ16株、大腸菌QZ32株及び大腸菌QZ63株のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。グラフは、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニンの形成を示す。
【図１２】炭素源として80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の間に完全なグルコース消費に達するまでの、大腸菌QZ16株（50時間超）及びQZ32株（ΔydbH-lpdA）及びQZ63株（ΔlpdA）の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。
【図１３】80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での大腸菌QZ33株（ΔydbH-lpdA、ygaW Q5H）及び大腸菌QZ32株（ΔydbH-lpdA）のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。グラフは、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニンの形成を示す。
【図１４】炭素源として80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の間に完全なグルコース消費に達するまでの、大腸菌QZ32株（ΔydbH-ldhA）、QZ60株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5N）、QZ61株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5R）、QZ62株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5Y）及びQZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。
【図１５】80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での大腸菌QZ32株（ΔydbH-lpdA）及び大腸菌QZ33株（ΔydbH-lpdA、ygaW Q5H）と比較した、大腸菌QZ60株（ΔydbH-lpdA、ygaW Q5N）、大腸菌QZ61株（ΔydbH-lpdA、ygaW Q5R）及び大腸菌QZ62株（ΔydbH-lpdA、ygaW Q5Y）のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。(A)は、発酵全体を通したバイオマス形成を示す。(B)は、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニンの形成を示す。
【図１６】RT-qPCRにより測定される、大腸菌QZ16株（8時間）と比較した、バッチ発酵の8時間、11時間及び28時間での大腸菌QZ16株及びQZ20株でのygaWの相対的遺伝子発現分析を示す図である。すべてのqPCR由来データは、参照としてのrrsA遺伝子に対して正規化した。
【図１７】80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での大腸菌QZ41株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP）及び大腸菌QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。グラフは、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニンの形成を示す。
【図１８】炭素源として80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の間に完全なグルコース消費に達するまでの、大腸菌QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）及びQZ41株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP）の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。
【図１９】100g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での大腸菌QZ52株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、lpd SNP）及び大腸菌QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。(A)は、発酵全体を通した両方の菌株のバイオマス形成を示す。(B)は、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニンの形成を示す。
【図２０】炭素源として100g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の41時間後の、大腸菌QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）及びQZ52株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、lpd SNP）の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。QZ53株は41時間後にすべてのグルコースを完全に消費していたが、QZ33株は53時間までに試験条件下でグルコースを完全に消費できなかった。
【図２１】炭素源として80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の間に完全なグルコース消費に達するまでの、大腸菌QZ32株（ΔydbH-ldhA）、QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）、QZ41株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP）及びQZ53株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP、lpd SNP）の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。
【図２２】100g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での大腸菌QZ53株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP、lpd SNP）及び大腸菌QZ41株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP）のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。グラフは、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニン力価の形成を示す。
【図２３】炭素源として80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の間に完全なグルコース消費に達するまでの、大腸菌QZ53株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP、lpd SNP）及びQZ41株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H、zipA SNP）の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。
【図２４】80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中での、対照プラスミドpACYC184を有する大腸菌QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）及びlpd ORFの追加のコピーを含むプラスミドpACYC184-lpdを有する大腸菌QZ33株のバッチ発酵を示す図である。発酵は、通気なしで、5N NH4OHを用いてpH6.8にて、37℃、400rpmで制御した。グラフは、サンプルのアラニン濃度及びNH4OH消費速度から相関されるアラニン力価の形成を示す。
【図２５】炭素源として80g/Lグルコースを含む500mL NBS培地中でのバッチ発酵の間に完全なグルコース消費に達するまでの、対照プラスミドpACYC184を有する大腸菌QZ33株（ΔydbH-ldhA、ygaW Q5H）及びlpd ORFの追加のコピーを含むプラスミドpACYC184-lpdを有する大腸菌QZ33株の、反応器容量及び時間により除算した生成産物量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において使用する「参照微生物」という用語は、組換え微生物を比較する対照の微生物を意味する。この参照微生物は、分析しようとする相違点を除いて組換え微生物と実質的に同じ遺伝子型を有する。好ましくは、参照微生物は、組換え微生物が由来する菌株である。例えば、ある遺伝子が野生型微生物に導入され、組換え微生物が作出されている、この場合には、野生型がこの組換え微生物のために好適な参照微生物となるだろう。また、組換え微生物Aにさらなる変異が導入され、それにより組換え微生物Bを作出することも可能である。続いて、組換え微生物Aは、組換え微生物Bのために好適な参照微生物となりうる。結果的に、組換え微生物及びそれぞれの参照微生物の性能は、実質的に同じ条件下で増殖させた両微生物で比較しうる。
【００１８】
当業者には、アラニンの収量及び／又は生産性の増大を有する微生物はまた、アラニンに近縁の他の代謝産物、例えばアラニン経路における中間体である代謝産物、アラニン経路と共通の中間体を有する代謝産物、又はそれらの経路における中間体としてアラニンを利用する代謝産物の製造に用いることができることが自明である。本発明の微生物はまた、特定の酵素活性の増大若しくは導入により、又は特定の酵素活性のノックアウト若しくは低減により、そのような関連する代謝産物の収量及び／又は生産性の増大を有するために容易に適合させることができる。
【００１９】
かかる代謝産物は、例えば、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及びロイシンである。
【００２０】
例えば、本発明の組換え微生物を使用してコハク酸を製造するために、本発明の微生物のゲノムにおいて、遺伝子ldh、pfl、pta及びadhEをノックアウトする必要があり、かつPEPカルボキシラーゼ遺伝子及び／又はピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を導入する必要がある。それぞれの経路及び必要な変異は、例えばZhang et al. (2009), PNAS (106) pp20180-20185に記載されている。
【００２１】
したがって、目下の本発明の別の実施形態は、それぞれの参照微生物と比較して、（i）リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいは（ii）Zリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは（iii）配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）、の少なくとも1つを含み、かつそれぞれの参照微生物と比較して発酵生産におけるピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシンの高い収量及び／又は生産性を有する、組換え微生物である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、微生物は原核細胞である。好適な原核細胞には、グラム陽性菌、グラム陰性菌及びグラム不定性菌細胞、好ましくはグラム陰性菌が挙げられる。
【００２３】
したがって、本発明において使用することができる微生物には、限定されるものではないが、グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter oxydans）、グルコノバクター・アサイイ（Gluconobacter asaii）、アクロモバクター・デルマルヴァエ（Achromobacter delmarvae）、アクロモバクター・ヴィスコサス（Achromobacter viscosus）、アクロモバクター・ラクチカム（Achromobacter lacticum）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、アルスロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アルスロバクター・ツメセンス（Arthrobacter tumescens）、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アルスロバクター・オキシダンス（Arthrobacter oxydans）、アウレオバクテリウム・サペルダエ（Aureobacterium saperdae）、アゾトバクター・インディカス（Azotobacter indicus）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・グロボサム（Brevibacterium globosum）、ブレビバクテリウム・フスカム（Brevibacterium fuscum）、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム（Brevibacterium ketoglutamicum）、ブレビバクテリウム・ヘルコラム（Brevibacterium helcolum）、ブレビバクテリウム・プシラム（Brevibacterium pusillum）、ブレビバクテリウム・テスタセウム（Brevibacterium testaceum）、ブレビバクテリウム・ロセウム（Brevibacterium roseum）、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilium）、ブレビバクテリウム・リネンス（Brevibacterium linens）、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ（Brevibacterium protopharmiae）、コリネバクテリウム・アセトフィラム（Corynebacterium acetophilum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エルウィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）、エルウィニア・ヘルビコーラ（Erwinia herbicola）、エルウィニア・クリサンテミ（Erwinia chrysanthemi）、フラボバクテリウム・ペレグリナム（Flavobacterium peregrinum）、フラボバクテリウム・フカツム（Flavobacterium fucatum）、フラボバクテリウム・アウランティナム（Flavobacterium aurantinum）、フラボバクテリウム・レナナム（Flavobacterium rhenanum）、フラボバクテリウム・セワネンセ（Flavobacterium sewanense）、フラボバクテリウム・ブレーベ（Flavobacterium breve）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Flavobacterium meningosepticum）、ミクロコッカス・エスピー（Micrococcus sp.）CCM825、モルガネラ・モルガニイ（Morganella morganii）、ノカルジア・オパカ（Nocardia opaca）、ノカルジア・ルゴサ（Nocardia rugosa）、プラノコッカス・ユーシナタス（Planococcus eucinatus）、プロテウス・レッゲリ（Proteus rettgeri）、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ（Propionibacterium shermanii）、シュードモナス・シンキサンタ（Pseudomonas synxantha）、シュードモナス・アゾトフォルマンス（Pseudomonas azotoformans）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas jluorescens）、シュードモナス・オバリス（Pseudomonas ovalis）、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）、シュードモナス・アシドボランス（Pseudomonas acidovolans）、シュードモナス・ムシドレンス（Pseudomonas mucidolens）、シュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosteroni）、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）、ロドコッカス・ロドクラウス（Rhodococcus rhodochrous）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC 15592、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp.）ATCC 19070、スポロサルシナ・ウレエ（Sporosarcina ureae）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ビブリオ・メチニコフィイ（Vibrio metschnikovii）、ビブリオ・チロゲネス（Vibrio tyrogenes）、アクチノマデュラ・マデュレ（Actinomadura madurae）、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス（Actinomyces violaceochromogenes）、キタサトスポリア・パルロサ（Kitasatosporia parulosa）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・フラベラス（Streptomyces flavelus）、ストレプトマイセス・グリセオラス（Streptomyces griseolus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリバセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・バージニエ（Streptomyces virginiae）、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス（Streptomyces antibioticus）、ストレプトマイセス・カカオイ（Streptomyces cacaoi）、ストレプトマイセス・ラベンデュレ（Streptomyces lavendulae）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、アエロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・チアミノリティカス（Bacillus thiaminolyticus）、エシェリキア・フロインディイ（Escherichia freundii）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラ・ショットムレリ（Salmonella schottmulleri）、ザントモナス・シトリ（Xanthomonas citri）、シネコシスティス・エスピー（Synechocystis sp.）、シネココッカス・エロンガタス（Synechococcus elongatus）、サーモシネコッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）、ミクロシスティス・アエルギノサ（Microcystis aeruginosa）、ノストック・エスピー（Nostoc sp.）、N.コミュネ（N. commune）、N.スファエリカム（N.sphaericum）、ノストック・プンクチフォルメ（Nostoc punctiforme）、スピルリナ・プラテンシス（Spirulina platensis）、リングビヤ・マジュスキュラ（Lyngbya majuscula）、L.ラゲルヘイミイ（L. lagerheimii）、フォルミディウム・テヌエ（Phormidium tenue）、アナバエナ・エスピー（Anabaena sp.）、レプトリングビヤ・エスピー（Leptolyngbya sp）などが含まれる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、微生物は真核細胞である。好適な真核細胞としては、酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）種、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ハンセヌラ（Hansenula）種、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）種、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）種、例えばクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）及びクルイベロミセス・マルキシアナス（Kluyveromyces marxianus）、ヤロウィア（Yarrowia）種、例えばヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ピヒア（Pichia）種、例えばピヒア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピヒア・スティピテス（Pichia stipites）及びピヒア・パストリス（Pichia pastoris）、ジゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）種、例えばジゴサッカロミセス・ルキシー（Zygosaccharomyces rouxii）及びジゴサッカロミセス・バイリイ（Zygosaccharomyces bailii）、カンジダ（Candida）種、例えばカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）、カンジダ・ユティリス（Candida utilis）、カンジダ・フレイシュシイ（Candida freyschussii）、カンジダ・グラブラータ（Candida glabrata）及びカンジダ・ソノレンシス（Candida sonorensis）、シュワンニオミセス（Schwanniomyces）種、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）、アルクスラ（Arxula）種、例えばアルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、オガタエア（Ogataea）種、例えばオガタエア・ミヌータ（Ogataea minuta）、クレブシエラ（Klebsiella）種、例えばクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）が挙げられる。
【００２５】
多数の工業用細菌株が本明細書に開示される方法に使用するために特に好適である。いくつかの実施形態において、微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の種、例えばC.アセトフィラム（C. acetophilum）、C.グルタミカム（C. glutamicum）、C.カルナエ（C. callunae）、C.アセトアシドフィラム（C. acetoacidophilum）、C.アセトグルタミカム（C. acetoglutamicum）である。いくつかの実施形態において、微生物は、バチルス（Bacillus）属の種、例えばB.チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、B.アントラシス（B. anthracis）、B.メガテリウム（B. megaterium）、B.ズブチリス（B. subtilis）、B.レンティルス（B. lentils）、B.サーキュランス（B. circulans）、B.プミルス（B. pumilus）、B.ラウタス（B. lautus）、B.コアギュランス（B.coagulans）、B.ブレビス（B. brevis）、B.フィルムス（B. firmus）、B.アルカオフィウス（B. alkaophius）、B.リケニフォルミス（B. licheniformis）、B.クラウシイ（B. clausii）、B.ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、B.ハロデュランス（B. halodurans）、B.ズブチリス（B. subtilis）、B.プミルス（B. pumilus）、及びB.アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）である。いくつかの実施形態において、微生物は、エルウィニア（Erwinia）属の種、例えばE.ウレドボーラ（E. uredovora）、E.カロトボーラ（E. carotovora）、E.アナナス（E. ananas）、E.ヘルビコーラ（E. herbicola）、E.プンクタータ（E. punctata）及びE.テレウス（E. terreus）である。いくつかの実施形態において、微生物は、エシェリキア（Escherichia）属の種、例えば大腸菌（E. coli）である。他の実施形態において、微生物は、パントエア（Pantoea）属の種、例えばP.シトレア（P. citrea）又はP.アグロメランス（P. agglomerans）である。また他の実施形態において、微生物は、ストレプトミセス（Streptomyces）属の種、例えばS.アムボファシエンス（S. ambofaciens）、S.アクロモゲネス（S. achromogenes）、S.アヴェルミティリス（S. avermitilis）、S.コエリコロル（S. coelicolor）、S.アウレオファシエンス（S. aureofaciens）、S.アウレウス（S. aureus）、S.フンギシディカス（S. fungicidicus）、S.グリセウス（S. griseus）又はS.リビダンス（S. lividans）である。さらなる実施形態において、微生物は、ザイモモナス（Zymomonas）属の種、例えばZ.モビリス（Z. mobilis）又はZ.リポリティカ（Z. lipolytica）である。さらなる実施形態において、微生物は、ロドコッカス（Rhodococcus）属の種、例えばR.オパカス（R opacus）である。
【００２６】
好ましくは、微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）から選択され、好ましくはエシェリキア（Escherichia）属、例えば大腸菌（E. coli）、好ましくはDSMZ 1116に相当する大腸菌W株（ATCC9637に相当する）である。
【００２７】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）に加えて、本発明の組換え微生物は、（a）ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失（ここでpflB遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失はそれぞれの参照微生物と比較して決定される）をさらに含んでもよい。
【００２８】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）に加えて、本発明の組換え微生物は、（b）二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失（ここでadhE遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失は、それぞれの参照微生物と比較して決定される）をさらに含んでもよい。
【００２９】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）に加えて、本発明の組換え微生物は、（c）NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失（ここでldhA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失は、それぞれの参照微生物と比較して決定される）をさらに含んでもよい。
【００３０】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）に加えて、本発明の組換え微生物は、（d）リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失（ここでpta遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失は、それぞれの参照微生物と比較して決定される）をさらに含んでもよい。
【００３１】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）に加えて、本発明の組換え微生物は、（e）フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失（ここでfrdA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失は、それぞれの参照微生物と比較して決定される）をさらに含んでもよい。
【００３２】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）に加えて、本発明の組換え微生物は、（f）アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強（ここでalaD遺伝子の活性及び／又は発現の増大又は増強は、それぞれの参照微生物と比較して決定される）をさらに含んでもよい。
【００３３】
好ましくは、リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強、並びに／あるいはZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）を含む本発明の組換え微生物は、以下：
（a）ピルビン酸ギ酸リアーゼIをコードするpflB遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
（b）二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼをコードするadhE遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
（c）NAD依存性発酵性D-乳酸デヒドロゲナーゼをコードするldhA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
（d）リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするpta遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
（e）フマル酸レダクターゼをコードするfrdA遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制又は欠失、並びに
（f）アラニンデヒドロゲナーゼをコードするalaD遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大又は増強
（ここで、遺伝子の活性及び／又は発現の低減、抑制、欠失、増大又は増強は、それぞれの参照微生物と比較して決定される）
からなる群より選択される特徴の少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、よりさらに好ましくは少なくとも4つ、よりさらに好ましくは少なくとも5つ、最も好ましくは全てをさらに有する。
【００３４】
alaD遺伝子は、任意の生物に由来してもよいし、又は人為的に設計された合成遺伝子、例えば本発明の組換え微生物における発現のために最適化されたコドン用法を有する又は酵素活性が最適化された、例えばVmax若しくはKmが改善された合成遺伝子であってもよい。好ましくは、alaD遺伝子は、バチルス（Bacillus）、ゲオバチルス（Geobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）属の1つの微生物に由来する。より好ましい実施形態において、alaD遺伝子はゲオバチルス属の微生物に由来する。最も好ましい実施形態において、alaD遺伝子はゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）に由来する。
【００３５】
好ましい実施形態において、alaD遺伝子は、本発明の組換え微生物における発現のためにコドン最適化されている。
【００３６】
本発明の微生物は、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量及び／又は生産性をさらに改善する、遺伝的改変、例えば突然変異、ノックアウト又は酵素活性の増強若しくは導入をさらに含んでもよい。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明の組換え微生物において活性及び／又は発現が導入、増大又は増強されたリポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子は、以下の核酸分子：
(i) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号50を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００３８】
一例において、本発明の組換え微生物において活性及び／又は発現が導入、増大又は増強されたリポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子は、配列番号52を有するタンパク質をコードする配列番号51の配列を有する。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明の組換え微生物において活性及び／又は発現が導入、増大、増強又は改変されたZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子は、以下の核酸分子：
(i) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、(ii)、(iii)又は(v)によりコードされるポリペプチドは、配列番号46を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００４０】
一例において、本発明の組換え微生物において活性及び／又は発現が導入、増大、増強又は改変されたZリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子は、配列番号48を有するタンパク質をコードする配列番号47の配列を有する。
【００４１】
さらなる実施形態において、本発明の組換え微生物において活性及び／又は発現が改変されたアラニントランスポーターをコードするygaW遺伝子は、以下の核酸分子：
(i) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択され、、
ここで配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでなく、
(1)〜(5)において上で定義した遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して活性及び／又は発現が改変されており、
上で定義された変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵においてアラニン収量の改善を有する。
【００４２】
一例において、本発明の組換え微生物において活性及び／又は発現が改変されたアラニントランスポーターをコードするygaW遺伝子は、配列番号4、57、59又は61を有するタンパク質をコードする配列番号3、56、58又は60の配列を有する。
【００４３】
リポアミドデヒドロゲナーゼタンパク質をコードするlpd遺伝子の発現及び／又は活性の導入、増大又は増強、並びに／あるいはzipA遺伝子の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、並びに／あるいは配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）を含む本発明の組換え微生物はさらに(a)〜(f)で上で定義した特徴のいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は全てを含んでもよく、
pflB遺伝子は、以下の核酸分子：
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(C) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(B)、(C)又は(E)によりコードされるポリペプチドは、配列番号6を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
adhE遺伝子は、以下の核酸分子：
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(H) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(G)、(H)又は(J)によりコードされるポリペプチドは、配列番号8を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
ldhA遺伝子は、以下の核酸分子：
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(M) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(L)、(M)又は(O)によりコードされるポリペプチドは、配列番号10を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
pta遺伝子は、以下の核酸分子：
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(R) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(Q)、(R)又は(T)によりコードされるポリペプチドは、配列番号12を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
frdA遺伝子は、以下の核酸分子：
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(W) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(V)、(W)又は(Y)によりコードされるポリペプチドは、配列番号14を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有し、
alaD遺伝子は、以下の核酸分子：
(Z) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(AA) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(BB) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(CC) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択され、(AA)、(BB)又は(DD)によりコードされるポリペプチドは、配列番号16を有するポリペプチドの少なくとも10％、20％、好ましくは少なくとも30％又は50％、より好ましくは少なくとも60％又は70％、よりさらに好ましくは少なくとも75％、80％、85％又は90％、最も好ましくは少なくとも95％の活性を有する。
【００４４】
好ましくは、(Z)〜(DD)に定義される核酸分子は、以下：
(1) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドからなる断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドからなる断片
の配列を有する微生物中でプロモーターとして機能する配列の制御下にある。好ましくは、配列番号54若しくは55の断片は、配列番号54若しくは55の3’領域を含む断片であり、したがって配列番号54若しくは55の5’末端に欠失を含む。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態は、上で定義した1又はそれ以上の本発明の組換え微生物を含む組成物である。この組成物は、本発明の組換え微生物の増殖を可能にする培地をさらに含んでもよい。培地はさらに、炭素源、例えばヘキソース、ペントース又はポリオール、例えば、スクロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、ラフィノース、キシロース、アラビノース、キシルロース（xylulose）、グリセロール、マンニトール、アラビトール、キシリトール、デンプン、セルロース、リグノセルロース又はそれらの組み合わせを含んでもよい。好ましくは炭素源はグルコース又はスクロースであり、より好ましくは炭素源はグルコースである。
【００４６】
好ましい実施形態において、本組成物は、本発明の微生物と、NBS培地、AM1培地又はPPM01培地とを含む。より好ましくは、本組成物はさらに、炭素源、好ましくは糖を含む。これらの培地の成分は当業者に公知である。
【００４７】
好ましくは、NBS培地は、1リットル当たり、
1〜5g、好ましくは3.5gのKH2PO4、及び
1〜10g、好ましくは5.0gのK2HPO4、及び
1〜5g、好ましくは3.5gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜1g、好ましくは0.25gのMgSO4-7H2O、及び
5〜25mg、好ましくは15mgのCaCL2-2H2O、及び
0.1〜1mg、好ましくは0.5mgのチアミン、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.1M HCLの1リットル当たり、0.5〜5g、好ましくは1.6gのFeCL3-6H2O；0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのCoCl2-6H2O；0.01〜0.5g、好ましくは0.1gのCuCl2-2H2O；0.1〜0.5g、好ましくは0.2gのZnCl2；0.05〜0.5g、好ましくは0.2gのNaMoO4-2H2O；0.001〜0.1g、好ましくは0.05gのH3BO3を含む。
【００４８】
NBS培地中の好ましい炭素源はグルコース又はスクロース、好ましくは2％〜18％グルコース又は2％〜16％スクロースである。
【００４９】
好ましくは、AM 1培地は、0.1〜10mM、好ましくは1mMベタイン溶液の1リットル当たり、
1〜10g、好ましくは2.6gの(NH4)2HPO4、及び
0.1〜5g、好ましくは0.87gのNH4H2PO4、及び
0.05〜2.5 g、好ましくは0.15gのKCl、及び
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、0.01〜1M、好ましくは0.12M HCLの1リットル当たり、1〜5g、好ましくは2.4gのFeCL3-6H2O；0.1〜1g、好ましくは0.3gのCoCl2-6H2O；0.1〜1g、好ましくは0.21gのCuCl2-2H2O；0.1〜1g、好ましくは0.3gのZnCl2；0.1〜1g、好ましくは0.27gのNaMoO4-2H2O；0.01〜0.5g、好ましくは0.068gのH3BO3及び0.1〜1g、好ましくは0.5gのMnCl2-4H2Oを含み、場合により1〜30g、好ましくは15gの(NH4)2SO4を含んでもよい。
【００５０】
NBS培地中の好ましい炭素源はグルコース又はスクロース、好ましくは2％〜18％グルコース又は2％〜16％スクロースである。
【００５１】
好ましくは、PPM01培地は、1リットル当たり、
0.05〜5g、好ましくは0.37gのMgSO4-7H2O、及び
0.1〜10g、好ましくは1gの(NH4)2SO4、及び
0.05〜5 g、好ましくは0.46gのベタイン、及び
0.001〜0.5g、好ましくは0.05gのシアノコバラミン(B12)、及び
1〜10g、好ましくは3.74gのKH2PO4、及び
0.1〜5ml、好ましくは1mlの微量金属ストック
を含み、ここで微量金属ストックは、10〜100mM、好ましくは60mM硫酸の1リットル当たり、1〜10g、好ましくは3.48gの(NH4)2Fe(II)(SO4)2-7H2O；0.1〜1g、好ましくは0.35gのCoSO4-7H2O；0.1〜1g、好ましくは0.31gのCuSO4-5H2O；0.1〜5g、好ましくは0.63gのZnSO4-7H2O；0.1〜1g、好ましくは0.27gのMnSO4-H2O；0.01〜1g、好ましくは0.07gのNaMoO4-2H2O及び0.1〜5g、好ましくは0.43gのH3BO3を含む。
【００５２】
PPM01培地中の好ましい炭素源はグルコース一水和物、好ましくは培地1リットル当たり10〜500g、より好ましくは140gのグルコース一水和物である。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態は、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量又は生産性が増強された組換え微生物の作製方法であって、以下のステップ：
(I) (i) lpd遺伝子の1以上の活性及び／又は発現の少なくとも1つを導入、増大又は増強する、並びに／あるいは(ii) zipA遺伝子の1以上の活性及び／又は発現を導入、増大、増強又は改変する、並びに／あるいは(iii) 配列番号1の13〜15位のコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を含むygaW遺伝子を導入する（該変異がygaW遺伝子によりコードされるアラニントランスポーターの活性及び／又は発現を改変する）、並びに／あるいは、場合によりさらに微生物における上の(a)〜(e)で定義される改変の1つ以上を導入するステップと、
(II) 上の(I)で定義された改変を有しない対応する微生物と比較して、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量又は生産性が増強された組換え微生物を作出、同定及び単離するステップと
を含む方法である。
【００５４】
好ましい実施形態において、活性及び／又は発現が導入、増大又は増強されたlpd遺伝子は、配列番号51の配列を有する及び／又は配列番号52のポリペプチドをコードする。
【００５５】
好ましい実施形態において、活性及び／又は発現が導入、増大、増強又は改変されたzipA遺伝子は、配列番号47の配列を有する及び／又は配列番号48のポリペプチドをコードする。
【００５６】
好ましい実施形態において、活性及び／又は発現が改変されたygaW遺伝子は、配列番号3、56、58若しくは60の配列を有する及び／又は配列番号4、57、59若しくは61のポリペプチドをコードする。
【００５７】
本発明の組換え微生物の作製方法の好ましい実施形態において、該方法はさらに、pflB遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pta遺伝子又はfrdA遺伝子、例えば上の(A)〜(Y)で定義する遺伝子、の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ又は全ての活性及び／又は発現を低減、抑制又は欠失するステップ、並びに／あるいはalaD遺伝子、例えば上の(Z)〜(DD)で定義する遺伝子の活性及び／又は発現を導入、増大又は増強するステップを含む。
【００５８】
本発明の組換え微生物の作製方法のさらに好ましい実施形態において、(Z)〜(DD)に定義される核酸分子は、
(1) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドからなる断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドからなる断片
の配列を有する微生物中でプロモーターとして機能する配列の制御下にある。好ましくは、配列番号54若しくは55の断片は、配列番号54又は55の3’領域を含む断片、したがって配列番号54又は55の5’末端に欠失を含む断片である。
【００５９】
本発明の組換え微生物を作製する最も好ましい方法は、(i) pflB遺伝子、adhE遺伝子、ldhA遺伝子、pta遺伝子及びfrdA遺伝子のすべての活性及び／又は発現を低減、抑制又は欠失するステップ、並びに(ii) 好ましくは配列番号54又は55の配列を含むプロモーターの制御下で、alaD遺伝子の活性及び／又は発現を導入、増大又は増強するステップ、並びに(iii) lpd遺伝子、好ましくは配列番号51の配列を有する及び／又は配列番号52のポリペプチドをコードするlpd遺伝子の活性及び／又は発現を導入、増大又は増強するステップ、並びに(iv) zipA遺伝子、好ましくは配列番号47の配列を有する及び／又は配列番号48のポリペプチドをコードするzipA遺伝子の活性及び／又は発現を導入又は改変するステップ、並びに(v) 活性及び／又は発現が改変されたygaW遺伝子を導入する、又は配列番号3、56、58若しくは60の配列を有する及び／又は配列番号4、57、59若しくは61のポリペプチドをコードする内因性ygaW遺伝子に変異を導入するステップ、を含む。
【００６０】
本発明の組換え微生物の作製方法の一実施形態において、微生物は、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）の種、例えばC.アセトフィラム（C. acetophilum）、C.グルタミカム（C. glutamicum）、C.カルナエ（C. callunae）、C.アセトアシドフィラム（C. acetoacidophilum）、C.アセトグルタミカム（C. acetoglutamicum）、バチルス（Bacillus）属の種、例えばB.チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、B.アントラシス（B. anthracis）、B.メガテリウム（B. megaterium）、B.ズブチリス（B. subtilis）、B.レンティルス（B. lentils）、B.サーキュランス（B. circulans）、B.プミルス（B. pumilus）、B.ラウタス（B. lautus）、B.コアギュランス（B.coagulans）、B.ブレビス（B. brevis）、B.フィルムス（B. firmus）、B.アルカオフィウス（B. alkaophius）、B.リケニフォルミス（B. licheniformis）、B.クラウシイ（B. clausii）、B.ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、B.ハロデュランス（B. halodurans）、B.ズブチリス（B. subtilis）、B.プミルス（B. pumilus）、及びB.アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、エルウィニア（Erwinia）属の種、例えばE.ウレドボーラ（E. uredovora）、E.カロトボーラ（E. carotovora）、E.アナナス（E. ananas）、E.ヘルビコーラ（E. herbicola）、E.プンクタータ（E. punctate）及びE.テレウス（E. terreus）、エシェリキア（Escherichia）属の種、例えば大腸菌（E. coli）、パントエア（Pantoea）属の種、例えばP.シトレア（P. citrea）、P.アグロメランス（P. agglomerans）、ストレプトミセス（Streptomyces）属の種、例えばS.アムボファシエンス（S. ambofaciens）、S.アクロモゲネス（S. achromogenes）、S.アヴェルミティリス（S. avermitilis）、S.コエリコロル（S. coelicolor）、S.アウレオファシエンス（S. aureofaciens）、S.アウレウス（S. aureus）、S.フンギシディカス（S. fungicidicus）、S.グリセウス（S. griseus）、S.リビダンス（S. lividans）、ザイモモナス（Zymomonas）属の種、例えばZ.モビリス（Z. mobilis）又はZ.リポリティカ（Z. lipolytica）、及びロドコッカス（Rhodococcus）属の種、例えばR.オパカス（R opacus）からなる群より選択される。
【００６１】
好ましくは、微生物は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）から選択され、好ましくはエシェリキア（Escherichia）属、例えば大腸菌（E. coli）、好ましくはDSMZ 1116に相当する大腸菌W株（ATCC9637に相当する）である。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態は、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくはL-アラニンの製造方法であって、上で定義した1以上の組換え微生物を、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくはL-アラニンの製造を可能にする条件下で培養するステップを含む方法である。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本発明に包含される組換え微生物は、バッチ発酵又は連続発酵条件下で増殖させる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成を発酵の開始時に設定して、発酵中は人為的な変更を行わない。バッチ系の変法がフェドバッチ発酵である。この変法では、発酵が進行するにつれ徐々に基質を添加する。フェドバッチ系は、カタボライトリプレッションが細胞の代謝を阻害する可能性がある場合（培地に限定量の基質が含まれることが望ましい場合）に有用である。バッチ及びフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。本発明においてまた有用である連続発酵は、既定の発酵培地をバイオリアクタに連続的に添加し、等量の条件培地（例えば所望の最終産物を含む）を処理のために同時に取り出す系である。連続発酵は一般的に、一定の高密度で培養物を維持し、そこで細胞は最終産物の産生が増強される増殖期で主に存在する。連続発酵系は、一定の安定増殖条件を維持するように努める。連続発酵プロセスのための栄養素及び増殖因子を変更する方法、並びに産物形成の速度を最大化する技術は、工業的微生物学の分野で周知である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、発酵は、約10℃〜約60℃、約15℃〜約50℃、約20℃〜約45℃、約25℃〜約45℃、約30℃〜約45℃、及び約25℃〜約40℃の範囲内の温度で行われる。好ましい実施形態において、温度は約34℃、35℃又は36℃である。最も好ましい実施形態において、温度は約37℃又は38℃である。
【００６５】
他のいくつかの実施形態において、発酵は、約8時間〜240時間、約8時間〜約168時間、約10時間〜約144時間、約15時間〜約120時間、又は約20時間〜約72時間の範囲内の時間にわたり行われる。好ましくは、発酵は約20時間〜約40時間行われる。
【００６６】
他のいくつかの実施形態において、発酵は、pH約4〜約9の範囲内、約4.5〜約8.5の範囲内、約5〜約8の範囲内、又は約5.5〜約7.5の範囲内で行われる。好ましくは、発酵はpH 7で行うことができる。
【００６７】
アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの製造方法の一実施形態において、微生物は、1％〜30％(w/v)の糖、5％〜25％(w/v)の糖、10％〜20％(w/v)の糖、14％〜18％(w/v)の糖を含む培地中で培養される。好ましくは、微生物は、15％〜17％(w/v)の糖を含む培地中で培養される。
【００６８】
アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの製造方法の別の実施形態において、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシンの収量は、少なくとも80％、例えば少なくとも81％、少なくとも82％、少なくとも83％、少なくとも84％又は少なくとも85％である。好ましくは、収量は、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％又は少なくとも90％である。より好ましくは、収量は、少なくとも90.5％、少なくとも91％、少なくとも91.5％、少なくとも92％、少なくとも92.5％、少なくとも93％、少なくとも93.5％、少なくとも94％又は少なくとも94.5％である。よりさらに好ましい実施形態において、収量は少なくとも95％又は少なくとも95.5％である。最も好ましい実施形態において、収量は少なくとも96％である。収量％は、培地中1gのグルコースから製造される産物gとして計算される。したがって、培地が100gのグルコースを含有し、発酵によって98gのアラニンが生じた場合、収量は98％となる。
【００６９】
アラニンの製造方法の別の実施形態において、好ましくは、L-アラニンのキラル純度が少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％又は少なくとも94％であるL-アラニンが製造される。好ましい実施形態において、L-アラニンのキラル純度は少なくとも95％又は少なくとも95.5％である。より好ましい実施形態において、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも96％又は少なくとも96.5％又は少なくとも97％である。よりさらに好ましい実施形態において、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも97.5％、少なくとも98％又は少なくとも98.5％、例えば少なくとも99％である。よりさらに好ましくは、L-アラニンのキラル純度は、少なくとも99.5％又は少なくとも99.6％、例えば少なくとも99.7％、少なくとも99.8％、又は少なくとも99.9％である。最も好ましい実施形態において、キラル純粋なL-アラニンが製造される。
【００７０】
本発明の別の実施形態は、上で定義した遺伝的に改変された微生物のいずれかを培養する又は増殖させる方法であって、1以上の遺伝的改変微生物を培養培地に接種するステップ、及び上で定義した条件下で培養培地中で該遺伝的改変微生物を培養する又は増殖させるステップを含む方法である。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは L-アラニンの発酵生産のための、上で定義した組換え微生物又は上で定義した組成物の使用である。
【００７２】
本発明に係る組換え微生物は、それぞれの参照微生物、例えば野生型と比較して、lpd遺伝子によりコードされる酵素の発現及び／又は活性が増大され、並びに／あるいはzipA遺伝子によりコードされる酵素の発現及び／又は活性が増大又は改変され、並びに／あるいはygaW遺伝子の活性及び／又は発現が配列番号1の13〜15位におけるコドン又は配列番号1の機能的等価物の対応するコドンに変異を導入することにより改変されていることを特徴とする。
【００７３】
一実施形態において、遺伝子の発現及び／又は活性の低減は、遺伝子の不活性化、変異又はノックアウトにより達成される。これは、遺伝子のコード領域及び／又はプロモーター領域の一部又は全部の欠失により、遺伝子のコード領域にフレームシフトを生じさせる遺伝子の変異、例えばいくつかのヌクレオチド（例として1若しくは2個のヌクレオチド）の挿入又は欠失により、コード領域中の終止コドンの導入により、遺伝子のプロモーターの不活性化により、例えばプロモーターボックス（リボソーム侵入部位、TATAボックスなど）の欠失又は変異により、行うことができる。低減はまた、遺伝子の転写産物の分解により、例えばリボソーム、dsRNA、アンチセンスRNA又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入による分解により、達成することができる。遺伝子の活性の低減は、標的酵素に特異的に結合する抗体又はアプタマーを細胞中で発現させることにより達成することができる。遺伝子の発現及び／又は活性を低減するための他の方法は当業者に公知である。
【００７４】
本発明の一実施形態において、lpd遺伝子の発現及び／又は活性の増大は、この遺伝子への、変異、好ましくは配列番号50のタンパク質の70位におけるアミノ酸のアラニンからプロリンへの交換を生じる点突然変異の導入により達成される。
【００７５】
好ましくは、lpd遺伝子の発現及び／又は活性の増大は、lpd遺伝子に突然変異を導入することにより達成され、ここで変異型lpd遺伝子は、配列番号52のタンパク質をコードする配列番号51の配列を有する。
【００７６】
本発明の一実施形態において、zipA遺伝子の発現及び／又は活性の増大は、この遺伝子への、変異、好ましくは点突然変異の導入により達成される。より好ましくは、点突然変異は、配列番号45又はその機能的ホモログによりコードされるzipA遺伝子のコドン913〜915に導入され、各タンパク質の305位においてアミノ酸アルギニンのグリシン又は別の芳香族アミノ酸又は表2に示されるグリシンに関連するアミノ酸への交換を生じる。
【００７７】
好ましくは、zipA遺伝子の発現及び／又は活性の増大は、zipA遺伝子に突然変異を導入することにより達成され、ここで変異型zipA遺伝子は、配列番号48のタンパク質をコードする配列番号47の配列を有する。
【００７８】
本明細書に開示される酵素の発現及び／又は活性の低減、特に、乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）、ピルビン酸ギ酸リアーゼI (pflB)、二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼ（adhE）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（pta）、及び／又はフマル酸レダクターゼ（frdA）によりコードされる酵素の発現の低減及び／又は活性の低減は、それぞれの参照微生物、例えば野生型の微生物における前記酵素の発現及び／若しくは活性と比較して、少なくとも50％の発現及び／若しくは酵素活性の低減、又は少なくとも90％の発現及び／若しくは酵素活性の低減、又はより好ましくは少なくとも95％の発現及び／若しくは酵素活性の低減、又はより好ましくは少なくとも98％の発現及び／若しくは酵素活性の低減、又はさらにより好ましくは少なくとも99％の発現及び／若しくは酵素活性の低減、又はさらにより好ましくは少なくとも99.9％の発現及び／若しくは酵素活性の低減でもよい。最も好ましい実施形態において、これらの酵素の発現及び／又は活性は、本発明の微生物において検出されない。
【００７９】
本明細書に開示する酵素の発現及び／又は活性の増強又は増大、特にlpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子によりコードされる酵素の発現及び／又は活性の増強又は増大は、それぞれの参照微生物、例えば微生物の野生型における該酵素の発現及び／又は活性と比較して少なくとも25％の発現及び／又は酵素活性の増大、あるいは少なくとも50％の発現及び／又は酵素活性の増大、あるいはより好ましくは少なくとも100の発現及び／又は酵素活性の増大、あるいはより好ましくは少なくとも3倍、例えば少なくとも5倍の発現及び／又は酵素活性の増大、あるいはよりさらに好ましくは少なくとも10倍の発現及び／又は酵素活性の増大、あるいはよりさらに好ましくは少なくとも20倍の発現及び／又は酵素活性の増大でありうる。
【００８０】
lpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子の発現及び／又は活性の増大は、それぞれの参照微生物と比較して、本発明の組換え微生物におけるアラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量及び／又は生産性の改善をもたらす。したがって、lpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子の発現及び／又は活性の増大は、それぞれの参照微生物と比較して、本発明の組換え微生物のアラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンの収量又は生産性を測定することによって決定することができる。代謝産物、例えばアラニンの発酵生産方法は、当業者に公知であり、また本明細書に記載する。それぞれの参照微生物による発酵におけるアラニン収量と比較した本発明の微生物の発酵における例えばアラニンの収量の改善は、lpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子の発現及び／又は活性の増大の尺度である。
【００８１】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ldhA）の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Bunchら、「The ldhA gene encoding the fermentative lactate de hydrogenase of Escherichia Coli」、Microbiology (1997)、第143巻、187〜155頁;又はBergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M. (1983〜1986)、「Methods of Enzymatic Analysis」、第3版、第III巻、126〜133頁、Verlag Chemie, Weinheim;又はEnzymes in Industry: Production and Applications、第2版(2004)、Wolfgang Aehle、23頁によって開示されている。最後の方法が好ましい。
【００８２】
ピルビン酸ギ酸リアーゼI（pflB）の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Knappe J, Blaschkowski HP, Grobner P, Schmitt T (1974). "Pyruvate formate-lyase of Escherichia coli: the acetyl-enzyme intermediate." Eur J Biochem 1974;50(1);253-63. PMID: 4615902；KNAPPE, Joachim, et al. "Pyruvate Formate‐Lyase of Escherichia coli: the Acetyl‐Enzyme Intermediate." European Journal of Biochemistry 50.1 (1974): 253-263；Wong, Kenny K., et al. "Molecular properties of pyruvate formate-lyase activating enzyme." Biochemistry 32.51 (1993): 14102-14110；及びNnyepi, Mbako R., Yi Peng, and Joan B. Broderick. "Inactivation of E. coli pyruvate formate-lyase: Role of AdhE and small molecules." Archives of biochemistry and biophysics 459.1 (2007): 1-9に開示されている。
【００８３】
二官能性アセトアルデヒド-CoAデヒドロゲナーゼ／鉄依存性アルコールデヒドロゲナーゼ／ピルビン酸-ギ酸リアーゼデアクチバーゼ (adhE)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Membrillo-Hernandez, Jorge, et al. "Evolution of the adhE Gene Product of Escherichia coli from a Functional Reductase to a Dehydrogenase GENETIC AND BIOCHEMICAL STUDIES OF THE MUTANT PROTEINS." Journal of Biological Chemistry 275.43 (2000): 33869-33875；及びMbako R. Nnyepi, Yi Peng, Joan B. Broderick, Inactivation of E. coli pyruvate formate-lyase: Role of AdhE and small molecules, Archives of Biochemistry and Biophysics, Volume 459, Issue 1, 1 March 2007, P.1-9に開示されている。
【００８４】
リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Dittrich, Cheryl R., George N. Bennett, and Ka‐Yiu San. "Characterization of the Acetate‐Producing Pathways in Escherichia coli." Biotechnology progress 21.4 (2005): 1062-1067；及びBrown, T. D. K., M. C. Jones-Mortimer, and H. L. Kornberg. "The enzymic interconversion of acetate and acetyl-coenzyme A in Escherichia coli." Journal of general microbiology 102.2 (1977): 327-336に開示されている。
【００８５】
フマル酸レダクターゼ（frdA）の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Dickie, Peter, and Joel H. Weiner. "Purification and characterization of membrane-bound fumarate reductase from anaerobically grown Escherichia coli." Canadian journal of biochemistry 57.6 (1979): 813-821；Cecchini, Gary, et al. "Reconstitution of quinone reduction and characterization of Escherichia coli fumarate reductaseactivity." Journal of Biological Chemistry 261.4 (1986): 1808-1814；又はSchroder, I., et al. "Identification of active site residues of Escherichia coli fumarate reductase by site-directed mutagenesis." Journal of Biological Chemistry 266.21 (1991): 13572-13579に開示されている。
【００８６】
アラニンデヒドロゲナーゼ(alaD)の発現又は活性を測定する方法は、例えば、Sakamoto, Y., Nagata, S., Esaki, N., Tanaka, H., Soda, K. "Gene cloning, purification and characterization of thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus" J Fermen. Bioeng. 69 (1990):154-158に開示されている。
【００８７】
用語「酵素の発現の低減」としては、例えば、それぞれの参照微生物、例えば前記微生物の野生型が発現するものより低いレベルでの、前記遺伝子操作された（例えば、遺伝子組換えされた）微生物による酵素の発現が含まれる。酵素の発現を低減させるための遺伝子操作としては、酵素をコードする遺伝子若しくはその一部を欠失させること、（例えば、強力なプロモーター若しくは抑制性プロモーターを除去することによって）酵素をコードする遺伝子の発現と関係がある調節配列若しくは部位を変化させる若しくは改変すること、酵素をコードする遺伝子の転写及び／若しくは遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写活性化因子など）を改変すること、又は当技術分野で慣例的な特定の遺伝子の発現を低下させる任意の他の慣用的手段（これらに限定されないが、アンチセンス核酸分子の使用若しくは標的タンパク質の発現をノックアウト若しくはブロックする他の方法が挙げられる）を挙げることができるが、これらに限定されない。さらに、mRNAに不安定化エレメントを導入してもよいし、RNAのリボゾーム結合部位（RBS）の変質をもたらす遺伝子改変を導入してもよい。翻訳効率及び速度を低下させるように遺伝子のコドン用法を変化させることも可能である。
【００８８】
酵素の活性の低減は、酵素の活性の低減をもたらす1つ以上の有害な遺伝子変異を導入することによって得ることもできる。さらに、酵素の活性の低減は、活性を低減すべき酵素を活性化するために必要な活性化酵素の不活性化（又は発現の低減）を含むこともできる。後者の手法によって、活性を低減すべき酵素は、好ましくは、不活性化された状況で維持される。
【００８９】
本出願において有害変異は、遺伝子のコード領域によりコードされるタンパク質のタンパク質活性の低下又は除去をもたらす、プロモーター及びコード領域を含む遺伝子内の任意の変異である。そうした有害変異は、例えば、フレームシフト、コード領域中への終止コドンの導入、転写などを妨げる、TATAボックスなどのプロモーターエレメントの変異を含む。
【００９０】
lpd遺伝子、zipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子によりコードされる酵素の発現及び／又は活性が増大又は増強した微生物は、天然に、すなわち自発的な変異が原因で生じ得る。微生物は、化学処理又は放射線照射などの様々な技法によって、前記遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の活性を有意に増大するように改変することができる。この目的のために、微生物は、例えば、変異誘発性化学薬剤、X線又はUV光で処理される。次のステップで、前記遺伝子の1つ以上によりコードされる酵素の発現及び／又は活性が増大した微生物が選択される。組換え微生物は、野生型遺伝子によりコードされる酵素と比較して、発現及び／若しくは活性が増大している酵素をコードする対応の遺伝子で前記遺伝子の1つ以上を置換することを目的とする相同組換え技法によっても獲得可能である。
【００９１】
本発明に係る組換え微生物の一実施形態において、lpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子によりコードされる酵素の発現及び／又は活性の増大は、lpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子の改変により達成することができ、この（これらの）遺伝子改変は、微生物のゲノムにおけるlpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子のコピー数の増加により、微生物への自己複製発現ベクター上の該遺伝子の導入により、強力なプロモーターへのlpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子のプロモーターの交換により、あるいは該遺伝子の内因性プロモーターのより強力なプロモーターへの変換により（例えばプロモーター配列への点突然変異の導入による）行われる。
【００９２】
さらにlpd遺伝子及び／又はzipA遺伝子及び／又はygaW遺伝子の活性は、遺伝子の活性を改善するタンパク質におけるアミノ酸交換を達成するために遺伝子を変異させることにより増強することができる。そのような方法は当業者に公知である。
【００９３】
上記遺伝子への変異は、例えば、部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発、続いて、組換えによる微生物のゲノムへの改変遺伝子の導入によって、導入することができる。遺伝子の変異体は、PCRで遺伝子配列を変異させることにより作製することができる。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」（Stratagene）を、定方向変異誘発を行うのに使用することができる。コード配列全体、さもなければその一部のみにわたるランダム変異誘発を、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」（Stratagene）を用いて実施することができる。変異誘発率は、使用する鋳型DNA量を介して所望の変異量に設定される。多重変異は、標的とされる個々の変異の組み合わせ又はいくつかの変異誘発サイクルの連続的な実施によって作製される。
【００９４】
以下では、組換え、特に変異導入又は配列欠失のための好適な技術を記載する。
【００９５】
この技術はまた、本明細書で「キャンベル組換え（Campbell recombination）」と称されることもある（Leenhouts et al., Appl Env Microbiol. (1989), Vol. 55, p.394-400）。本明細書で用いる「キャンベルイン（Campbell in）」とは、環状二本鎖DNA分子（例えばプラスミド）の全体が、単一の相同組換え事象（クロスイン事象）によって染色体に組み込まれ、それにより、該環状DNA分子の線状型が、該環状DNA分子の第一DNA配列に相同な染色体の第一DNA配列に効率的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体を意味する。「キャンベルドイン（Campbelled in）」とは、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれている線状化DNA配列を意味する。「キャンベルイン」は、第一相同DNA配列の重複を含有し、その各コピーは、相同組換え交差点のコピーを含み、それを取り囲む。
【００９６】
本明細書で用いる「キャンベルアウト（Campbell out）」とは、第二相同組換え事象（クロスアウト事象）が、「キャンベルドイン」DNAの線状化挿入DNA上に含まれる第二DNA配列と、該線状化挿入体の第二DNA配列に相同な染色体由来の第二DNA配列との間で起きている、「キャンベルイン」形質転換体の子孫である細胞を意味する。第二組換え事象は、組み込まれたDNA配列の一部の欠失（放出）をもたらすが、重要なことに、組み込まれた「キャンベルドイン」DNAの一部（これはわずか単一塩基であってもよい）の染色体中への残存ももたらし、元の宿主細胞と比べて「キャンベルアウト」細胞は、染色体における1つ以上の意図的な変化を含有する（例えば、一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子若しくはDNA配列の挿入、相同遺伝子若しくは改変相同遺伝子のさらなる1つ又は複数コピーの挿入、あるいは上に挙げたこれらの例の2つ以上を含むDNA配列の挿入）。「キャンベルアウト」細胞は、好ましくは、「キャンベルドイン」DNA配列の一部（放出されることが望ましい一部）に含まれる遺伝子（例えば、約5％〜10％スクロースの存在下で増殖する細胞中で発現されると致死である、枯草菌（Bacillus subtilis）sacB遺伝子）に対する対抗選択によって得られる。対抗選択を行っても、又は行わなくても、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型、例えば以下に限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在又は不在、ポリメラーゼ連鎖反応による所定のDNA配列の存在又は不在、栄養要求性の存在又は不在、酵素の存在又は不在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニングなどを用いて、所望の細胞をスクリーニングすることによって得る又は同定することができる。「キャンベルイン」及び「キャンベルアウト」という用語はまた、上記方法又はプロセスを参照するために、様々な時制の動詞として使用することができる。
【００９７】
「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」をもたらす相同組換え事象が、相同なDNA配列内のDNA塩基の範囲にわたって起こり得ることが理解されており、相同な配列は少なくともこの範囲の部分では互いに同一であるため、交差事象が起きた正確な場所を特定することは通常可能ではない。言い換えると、どの配列が挿入されたDNAに由来するか、そしてどの配列が染色体DNAに由来するかを正確に特定することはできない。さらに、第一相同DNA配列及び第二相同DNA配列は、通常、部分的に非相同な領域によって分離され、「キャンベルアウト」細胞の染色体に残ったままであるのはこの非相同領域である。
【００９８】
好ましくは、第一及び第二相同DNA配列は、少なくとも約200塩基対長であり、最大数千塩基対長であり得る。しかし、本方法は、より短い又はより長い配列で機能するようにすることができる。例えば、第一及び第二相同配列の長さは約500〜2000塩基であることができ、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」を得ることは、第一及び第二相同配列をおよそ同じ長さにすることによって、好ましくは200塩基対未満で異なるように、最も好ましくは2つのうち短い方を塩基対が長い方の長さの少なくとも70％であるようにすることによって、促進される。
【００９９】
一実施形態において、lpdの発現及び／又は活性の導入は、リポアミドデヒドロゲナーゼをコードするlpd遺伝子の活性化により達成される。
【０１００】
一実施形態において、zipAの発現及び／又は活性の導入は、Zリングアセンブリに関与する細胞分裂タンパク質をコードするzipA遺伝子の活性化により達成される。
【０１０１】
本発明において使用する用語「アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン」は、それらの最も広い意味で理解されるべきであり、その塩、例えば、Na+及びK+塩などのアルカリ金属塩、又はMg2+及びCa2+塩などのアルカリ土類金属塩、又はアンモニウム塩；あるいはアラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシンの無水物も包含する。
【０１０２】
好ましくは、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニンを微好気的条件下で生産する。好気的条件又は嫌気的条件を使用してもよい。
【０１０３】
微好気的とは、酸素濃度が空気中の濃度未満であることを意味する。一実施形態において、微好気的とは、酸素圧5〜27mmHg、好ましくは10〜20Hgを意味する（Megan Falsetta et al. (2011), The composition and metabolic phenotype of Neisseria gonorrhoeae biofilms, Frontiers in Microbiology, Vol 2, p.1-11）。好ましくは、微好気的条件は、0.1〜1vvmの気流を用いて確立される。
【０１０４】
嫌気的条件は、慣用技術により、例えば、反応媒体の構成要素を脱気し、二酸化炭素若しくは窒素又はその混合物、必要に応じて、水素を、例えば流速0.1〜1又は0.2〜0.5vvmで導入することにより嫌気的条件を維持することにより確立することができる。好気的条件は、慣用技術により、例として、例えば流速0.1〜1又は0.2〜0.5vvmで空気又は酸素を導入することにより確立することができる。適当であれば、プロセス中に0.1〜1.5バールのわずかな過圧を印加することができる。
【０１０５】
本発明の方法の一実施形態において、同化可能な炭素源は、グルコース、グリセリン、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、スクロース、アラビノース、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組み合わせとすることができる。
【０１０６】
好ましい実施形態において、同化可能な炭素源は、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、グリセロール又はその組み合わせである。好ましい炭素源は、グルコース；スクロース；グルコース及びスクロース；グルコース及びキシロース；並びに／又はグルコース及びアラビノース及びキシロースである。本発明に係る方法の一実施形態において、同化可能な炭素源は、スクロース、グリセリン及び／又はグルコースでありうる。
【０１０７】
同化可能な炭素源の初期濃度、好ましくは初期濃度は、好ましくは、5〜250g/l、好ましくは50〜200g/l、より好ましくは125〜150g/l、最も好ましくは約140g/lの範囲の値に調整し、培養の間に該範囲に維持することができる。反応培地のpHは、例えば、気体アンモニア、NH4OH、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N、及び／又はそれらの混合物などの好適な塩基の添加により制御することができる。
【０１０８】
本発明の別の実施形態は、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは L-アラニンの発酵生産方法であって、以下のステップ：
(I) 発酵槽中で上で定義した本発明に係る微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくは L-アラニンを回収するステップ
を含む方法である。
【０１０９】
本発明における発酵ステップ(I)は、例えば、撹拌発酵槽、気泡塔及びループ反応器中で行うことができる。撹拌機の種類及び幾何学的設計を含む可能な方法の種類の包括的概観は、Chmiel:「Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik」第1巻に見出すことができる。本発明の方法において、利用できる典型的な変形は、当業者に公知の、又は例えばChmiel, Hammes and Bailey:「Biochemical Engineering」中に説明されている以下の変形、例えば、バイオマスの再循環を伴う又は伴わない、バッチ発酵、フェドバッチ（fed-batch）発酵、反復フェドバッチ発酵、又は他の連続発酵である。生産株に応じて、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素又は適切な気体混合物の注入（スパージ）を、優れた収量（YP/S）を達成するために行ってよい。
【０１１０】
方法ステップ(I)において、アラニン、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン及び／又はロイシン、好ましくはコハク酸又はアラニン、より好ましくはアラニン、最も好ましくはL-アラニンを生産するための特に好ましい条件は：
同化可能な炭素源：グルコース
温度：30〜45℃
pH：6.0〜7.0
微好気的条件
である。
【０１１１】
方法ステップ(II)では、方法ステップ(I)において得られた発酵液から産物を回収する。
【０１１２】
通常、回収方法は、いわゆる「バイオマス」としての発酵液から組換え微生物を分離するステップを含む。バイオマスを除去する方法は、当業者に公知であり、ろ過、沈降、浮選又はその組み合わせを含む。その結果、バイオマスを例えば遠心機、分離機、デキャンター、フィルターを用いて、又は浮選装置中で除去することができる。価値ある生成物を最大限回収するために、例えば透析ろ過の形式での、バイオマスの洗浄が望ましい場合が多い。方法の選択は、発酵液中のバイオマス含量、及びバイオマスの特性に依存し、そしてまたバイオマスと有機化合物（例えば価値ある生成物）との相互作用にも依存する。一実施形態において、発酵液を滅菌又は殺菌することができる。さらなる実施形態において、発酵液は濃縮される。必要に応じて、この濃縮はバッチ方式で又は連続的に行うことができる。圧力及び温度範囲は、第一に生成物の損傷が起こらないように、第二に必要な装置及びエネルギーの使用が最小限になるように、選択するべきである。多段蒸発法についての圧力及び温度レベルをうまく選択すると、特に、エネルギーの節約が可能となる。
【０１１３】
回収方法はさらに、発酵産物をさらに精製する追加の精製ステップを含んでもよい。しかしながら、発酵産物が以下に記載するように化学反応により第二の有機生成物に変換される場合には、発酵産物のさらなる精製は、反応の種類及び反応条件に応じて異なるが、必ずしも必要なわけではない。方法ステップ(II)において得られる発酵産物をさらに精製するため、当業者に公知の方法、例えば結晶化、ろ過、電気透析、及びクロマトグラフィーを用いることができる。得られる溶液を、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製して、望ましくない残留イオンを除去することができる。
【０１１４】
一実施形態において、lpd遺伝子の発現及び／又は活性の増強又は増大は、野生型遺伝子への変異の導入により達成される。好ましくは、これは配列番号1を有する野生型遺伝子又はその機能的変異体の208〜210位におけるコドンに特異的な変異を導入することにより達成される。
【０１１５】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、以下：
(1) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号49の208〜210位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の70位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１１６】
好ましくは、組換え核酸分子は、以下：
(6) 配列番号51の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号51の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号51を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号52のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号52のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号51の208〜210位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸プロリンをコードするか、又は配列番号52の70位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がプロリンであり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号52を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１１７】
別の実施形態において、zipA遺伝子の発現及び／又は活性の増強、増大又は改変は、野生型遺伝子への変異の導入により達成される。好ましくは、これは、配列番号45又はその機能的変異体を有する野生型遺伝子の913〜915位におけるコドンに特異的変異を導入することにより達成される。
【０１１８】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、以下：
(1) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号45の913〜915位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アルギニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号46の305位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアルギニンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号46を有するタンパク質と比較して増強又は増大又は改変された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１１９】
好ましくは、組換え核酸分子は、以下：
(6) 配列番号47の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号47の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号47を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号48のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号48のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号47の913〜915位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グリシン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするか、又は配列番号48の305位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグリシン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号48を有するタンパク質と比較して増強、増大又は改変された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１２０】
一実施形態において、アラニン又は関連する化合物の収量及び／又は生産性の増強又は増大は、野生型ygaW遺伝子に変異を導入することにより達成される。
【０１２１】
したがって、本発明の一実施形態は、以下：
(1) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(2) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(3) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(4) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(5) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有する組換え核酸分子であり、
ここで配列番号1の13〜15位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(1)〜(5)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでなく、
上で(1)〜(5)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して改変された発現及び／又は活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１２２】
好ましくは、組換え核酸分子は、以下：
(6) 配列番号3、56、58若しくは60の配列を含む核酸分子、又は
(7) 配列番号3、56、58若しくは60の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(8) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号3、56、58若しくは60を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(9) 配列番号4、57、59若しくは60のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(10) 配列番号4、57、59若しくは60のポリペプチドに対して少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、若しくは少なくとも99％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を有し、
ここで配列番号3の13〜15位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸ヒスチジン又は関連するアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸をコードするか、又はアミノ酸アスパラギン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするか、又はアミノ酸アルギニン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするか、又はアミノ酸チロシン又は関連するアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸をコードするか、あるいは配列番号2の5位に対応する(7)〜(10)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がヒスチジン又は関連するアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸であり、又はアスパラギン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、又はアルギニン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、又はチロシン又は関連するアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸であり、
上で(7)〜(10)に定義される遺伝子によりコードされるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して改変された活性及び／又は発現を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１２３】
用語「関連するアミノ酸」又は「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸を類似の側鎖を有するアミノ酸で置き換えることを意味する。関連するアミノ酸のリストを以下の表2に示す。保存的置換の表は当技術分野で周知である（例えば、Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds)及び以下の表2参照）。
【０１２４】
0006572206.tif 000002
【０１２５】
好ましい実施形態において、組換え核酸分子は配列番号3、56、58、60、47又51を有し、配列番号4、57、59、61、48又は52を有するタンパク質をコードする。
【０１２６】
本発明のさらなる実施形態は、以下：
(11) 配列番号52の配列を含むアミノ酸分子、又は
(12) 配列番号52のポリペプチドに対して60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号52の70位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がプロリンであり、
上で(12)に定義されるタンパク質が、配列番号50を有するタンパク質と比較して増強又は増大された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１２７】
好ましくは、本発明の組換えアミノ酸分子は配列番号52を有する。
【０１２８】
本発明のさらなる実施形態は、以下：
(11) 配列番号48の配列を含むアミノ酸分子、又は
(12) 配列番号48のポリペプチドに対して60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号48の305位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がグリシン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
上で(12)に定義されるタンパク質が、配列番号46を有するタンパク質と比較して増強、増大又は改変された活性を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１２９】
好ましくは、本発明の組換えアミノ酸分子は配列番号48を有する。
【０１３０】
本発明のさらなる実施形態は、以下：
(11) 配列番号4、57、59若しくは61の配列を含むアミノ酸分子、又は
(12) 配列番号4、57、59若しくは61のポリペプチドに対して60％、好ましくは少なくとも70％、例えば少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、例えば少なくとも85％、よりさらに好ましくは少なくとも90％、例えば少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％若しくは少なくとも99％の相同性を有するアミノ酸分子
の群から選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であり、
ここで配列番号4の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がヒスチジン又は関連するアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸であり、
配列番号57の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がアスパラギン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
配列番号59の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がアルギニン又は関連するアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸であり、
配列番号61の5位に対応する(12)に属するタンパク質のアミノ酸がチロシン又は関連するアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸であり、
上で(12)に定義されるタンパク質が、配列番号2を有するタンパク質と比較して改変された活性及び／又は発現を有し、
上で定義した変異型の遺伝子及び／又はタンパク質を含む微生物は、発酵において改善されたアラニン収量を有する。
【０１３１】
好ましくは、本発明の組換えアミノ酸分子は配列番号4、57、59若しくは61を有する。
【０１３２】
本発明のさらなる実施形態は、上で(1)〜(5)に定義された核酸と機能的に連結された、微生物中で機能的なプロモーターを含む組換え発現構築物である。
【０１３３】
本発明のさらなる実施形態は、上で(1)〜(5)に定義された核酸分子又は上で定義した組換え発現構築物を含む組換えベクターである。
【０１３４】
本発明のさらなる実施形態は、以下の核酸分子：
(I) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、例えば少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、例えば少なくとも96％、よりさらに好ましくは少なくとも97％、例えば少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％の同一性を有する核酸分子、又は
(III) 中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、最も好ましくは非常に高度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも20個のヌクレオチド、少なくとも30個のヌクレオチド若しくは少なくとも40個のヌクレオチドからなる断片、より好ましくは少なくとも50個のヌクレオチド、少なくとも75個のヌクレオチド若しくは少なくとも100個のヌクレオチド、よりさらに好ましくは少なくとも150個のヌクレオチド若しくは少なくとも200個のヌクレオチドからなる断片
の群から選択される配列を有する微生物（例えば大腸菌）中で機能的なプロモーターである。好ましくは、配列番号54若しくは55の断片は、配列番号54若しくは55の3’領域を含む断片であり、したがって配列番号54若しくは55の5’末端に欠失を含む。
【０１３５】
好ましくは、(II)〜(IV)に定義される核酸分子は、本明細書に定義される微生物においてプロモーター活性を有する。
【０１３６】
本発明のさらなる実施形態は、(I)〜(IV)に定義されたプロモーターに対して異種に発現される核酸と機能的に連結された、微生物中で機能的な上で(I)〜(IV)に定義されたプロモーターを含む組換え発現構築物である。
【０１３７】
本発明のさらなる実施形態は、上で(I)〜(IV)に定義された核酸分子又は上で定義した組換え発現構築物を含む組換えベクターである。
【０１３８】
本発明のさらなる実施形態は、上で定義した組換え発現構築物又は上で定義したベクターを含む組換え微生物である。好ましくは、微生物は、本明細書で列挙した微生物の群から選択される。
【０１３９】
本発明のさらなる実施形態は、微生物中で核酸分子を発現させる方法であって、上で定義したプロモーターを、発現対象の異種核酸分子に機能的に連結し、それにより組換え発現構築物を作製するステップ、及び該発現構築物を微生物に導入するステップを含む方法である。本発明のプロモーターは、微生物外で組換えDNA技術を使用して発現対象の核酸分子と機能的に連結することができ、続いて微生物中に導入される、又は微生物に存在する本発明のプロモーターの近傍にある微生物のゲノム中に発現対象の核酸を導入することにより機能的に連結されたものとすることができ、それにより発現対象の核酸を本発明のプロモーターと連結する。
【０１４０】
本発明のさらなる実施形態は、微生物中で核酸分子を発現させるための、上で定義したプロモーター、上で定義した組換え発現構築物又は上で定義したベクターの使用である。
【０１４１】
定義
理解すべきこととして、本発明は特別な手法又はプロトコルに限定されるものでない。理解すべきこととしてまた、本明細書で使用する用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、添付した特許請求の範囲によって限定されうる本発明の範囲を限定することを意図しない。注意しなければならないこととして、本明細書及び添付した特許請求の範囲における使用で、単数形の冠詞「a」「an」及び「the」は、文脈が明確に断らない限り、複数の言及を含むものである。従って、例えば、ベクター（a vector）は１以上のベクターへの言及であり、当業者に公知のその等価物などを含むものである。本明細書で使用する用語「約」は、およそ、大雑把に、大体、又はその範囲のを意味する。用語「約」を数字の範囲と共に用いる場合、この用語は記載した数値の上限及び下限の境界を拡げることにより範囲を改変する。一般に、本明細書では用語「約」を用いて、記載した値の上限及び下限の数値を20％、好ましくは10％上方若しくは下方（高い若しくは低い）の分散をもつ値に改変する。本明細書で使用する用語「又は（若しくは、あるいは）」は特定のリストの任意の1つのメンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含むものである。用語「含む（compriseとその変化形）」「含む（includeとその変化形）」は、本明細書及び以下の特許請求の範囲で使用する場合、1以上の記載した特徴、整数、成分、又はステップの存在を説明することを意図するが、これらの用語は他の特徴、整数、成分、又はステップ、又はその群の存在若しくは付加を排除するものではない。明確にするために述べると、本明細書に使用するある特定の用語は次の通り定義されかつ使用される。
【０１４２】
コード領域：本発明で使用する用語「コード領域」は、構造遺伝子を言及して用いる場合、mRNA分子の翻訳の結果として新生ポリペプチドに見出されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を意味する。コード領域は、真核生物においては、5'側にヌクレオチドトリプレット「ATG」（イニシエーターのメチオニンをコードする）と結合し、原核生物は、開始コドンとしてトリプレット「GTG」及び「TTG」も利用する。3'側に、終止コドンを表す3つのトリプレット（すなわち、TAA、TAG、TGA）の1つが結合されている。さらに、遺伝子はまた、RNA転写物に存在する配列の5'と3'末端の両方に位置する配列も含みうる。これらの配列は、「隣接（flanking）」配列又は領域と呼ばれる（これらの隣接する領域はmRNA転写物に存在する非翻訳配列に対して5'若しくは3'に位置する）。5'隣接領域は、調節配列、例えば、遺伝子の転写を制御又は影響するプロモーター及びエンハンサーを含有しうる。3'隣接領域は、転写の終結、転写後の切断及びポリアデニル化を指令する配列を含有しうる。
【０１４３】
相補性：「相補的」又は「相補性」は、アンチパラレルなヌクレオチド配列が相補的塩基残基間で水素結合を形成すると（塩基対合規則により）お互いに対合することができるアンチパラレルなヌクレオチド配列を含むものである、2つのヌクレオチド配列を意味する。例えば、配列 5'-AGT-3'は配列 5'-ACT-3'と相補的である。相補性は「部分的」であっても又は「全体」であってもよい。「部分的」相補性は、１以上の核酸塩基が塩基対合規則によってマッチしない場合である。「全体」又は「完全」相補性は、それぞれ及び全ての核酸塩基が他の塩基と、塩基対合規則のもとでマッチする場合である。核酸分子鎖間の相補性の程度は、核酸分子鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度に有意な影響を及ぼす。本明細書で使用する核酸配列の「相補体」は、その核酸分子が核酸配列の核酸分子に対して全体相補性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【０１４４】
内因性：「内因性」ヌクレオチド配列は、野生型微生物のゲノム中に存在するヌクレオチド配列を意味する。
【０１４５】
発現の増強：微生物中の核酸分子の発現の「増強」又は「増大」を本明細書では同じ意味で使用し、微生物における核酸分子の発現のレベルが、参照微生物、例えば野生型と比較して高いことを意味する。本明細書で使用する用語「増強」又は「増大」は、ここでは発現すべき核酸分子のより高い、好ましくは有意に高い発現を意味する。本明細書で使用する、作用物質、例えばタンパク質、mRNA又はRNAのレベルの「増強」又は「増大」は、実質的に同一条件のもとで増殖させた実質的に同一の微生物と比較して、そのレベルが増大したことを意味する。本明細書で使用する、標的遺伝子により発現された作用物質、例えばpreRNA、mRNA、rRNA、tRNA等の及び／又はそれがコードするタンパク質産物のレベルの「増強」又は「増大」は、そのレベルが好適な参照微生物と比較して、50％以上、例えば100％以上、好ましくは200％以上、より好ましくは5倍以上、さらにより好ましくは10倍以上、最も好ましくは20倍以上、例えば50倍増大することを意味する。その増強又は増大は、当業者が精通する方法により測定することができる。従って、核酸又はタンパク質の量の増強又は増大はタンパク質の免疫学的検出により測定することができる。さらに、タンパク質アッセイ、蛍光、ノーザンハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写（定量RT-PCR）、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（RIA）又は他のイムノアッセイ及び蛍光活性化細胞分析（FACS）などの技法を使って微生物中の特定のタンパク質又はRNAを測定することができる。誘導されるタンパク質産物の種類に応じて、微生物の表現型に与えるその活性又は効果を測定してもよい。タンパク質の量を測定する方法は当業者に公知である。記載しうる例には次のものがある：マイクロ-ビウレット法（Goa J (1953) Scand J Clin Lab Invest 5：218-222）、フォーリン-チオカルト法（Lowry OH ら (1951) J Biol Chem 193：265-275） 又は CBB G-250の吸収を測定する方法（Bradford MM (1976) Analyt Biochem 72：248-254）。
【０１４６】
発現：「発現」は、細胞における、遺伝子産物の生合成、好ましくは、ヌクレオチド配列、例えば、内因性遺伝子又は異種遺伝子の転写及び／又は翻訳を意味する。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は構造遺伝子のmRNAへの転写及び、場合によっては、引き続いてmRNAの１以上のポリペプチドへの翻訳に関わる。他の場合では、発現はRNA分子を保持するDNAの転写だけに関わりうる。
【０１４７】
外来：用語「外来」は、細胞中に実験操作により導入されたいずれかの核酸分子（例えば、遺伝子配列）を意味し、導入された配列がいくつかの改変（例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在など）を含有する限り、天然の配列とは異なる配列がその細胞中に見出される。
【０１４８】
機能的連結：用語「機能的連結（functional linkage）」又は「機能的に連結した（functionally linked）」は、用語「機能可能な連結（operable linkage）」又は「機能可能に連結した（operably linked）」と同等であり、調節エレメント（例えば、プロモーター）の発現対象の核酸配列との、及び、適宜、さらなる調節エレメント（例えば、ターミネーターなど）との配列の配置であって、それぞれの調節エレメントがその意図する機能を完遂して前記核酸配列の発現を可能にし、改変し、促進し又はさもなくば影響を与え得る前記配列の配置を意味すると理解される。同義語として、表現「機能可能な連結」又は「機能可能に連結した」を使用してもよい。発現は、核酸配列のセンス又はアンチセンスRNAと関係した配置に依存してもたらされうる。この目的にとって、化学的意味の直接連結は必ずしも必要でない。例えば、エンハンサー配列などの遺伝子制御配列は、さらに離れた位置から、又は他のDNA分子からでも、標的配列に対するその機能を果たしうる。好ましい配置は、発現対象の核酸配列が組換えによってプロモーターとして作用する配列の後方に位置し、2つの配列が互いに共有結合で連結される配置である。好ましい実施形態においては、転写開始が本発明のキメラRNAの所望の開始と同一であるように、転写すべき核酸配列をプロモーターの後ろに配置する。機能的連結、及び発現構築物は、記載された通例の組換え及びクローニング技法を用いて作製することができる（例えば、Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)；Silhavy et al. (1984) Expeiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY)；Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience；Gelvin et al., (Eds) (1990) Plant Molecular Biology Manual; Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands）。しかし、例えば、制限酵素に対する特異的切断部位をもつリンカーとして、又はシグナルペプチドとして作用するさらなる配列も2つの配列の間に配置することができる。配列の挿入はまた、融合タンパク質の発現をもたらしうる。好ましくは、調節領域、例えばプロモーター及び発現対象の核酸配列の連結から成る発現構築物をベクターに組込まれた形で存在させてもよく、又は例えば、形質転換によりゲノム中に挿入することができる。
【０１４９】
遺伝子：用語「遺伝子」は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド又は機能性RNA）の発現をいくつかの方式で調節することができる適当な調節配列と機能可能に連結された領域を意味する。遺伝子は、コード領域（オープンリードフレーム、ORF）に先行する（上流の）及び後続する（下流の）DNAの非翻訳調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサーなど）を含む。本明細書で使用する用語「構造遺伝子」は、mRNAに転写され、次いで特定のポリペプチドの特徴であるアミノ酸の配列に翻訳されるDNA配列を意味することを意図している。
【０１５０】
ゲノムとゲノムDNA：用語「ゲノム」又は「ゲノムDNA」は、宿主生物の遺伝性の遺伝子情報を意味する。前記ゲノムDNAは核様体のDNAを含むが、自己複製プラスミドのDNAも含む。
【０１５１】
異種：核酸分子又はDNAに関する用語「異種」は、天然では機能可能に連結されてない又は天然では異なる位置で機能可能に連結された第2の核酸分子と、機能可能に連結された、又は機能可能に連結されるように遺伝子操作された核酸分子を意味する。核酸分子及びそれと連結された1以上の調節核酸分子（プロモーター又は転写終結シグナルなど）を含む異種発現構築物は、例えば、実験遺伝子操作に由来する構築物であって、(a)前記核酸分子、又は(b)前記調節核酸分子、又は(c）両方（すなわち(a)と(b)）がその天然（生来）の遺伝環境に位置しないか、又は、実験遺伝子操作により改変されている（改変の例は１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位又は挿入である）前記構築物である。天然の遺伝環境は、起源の生物における天然のゲノム遺伝子座、又はゲノムライブラリー中の存在を意味する。ゲノムライブラリーの場合、核酸分子の配列の天然の遺伝環境は好ましくは、少なくとも部分において保持される。前記環境は核酸配列に少なくとも1つの側において隣接し、そして少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、とりわけ好ましくは少なくとも1,000bp、非常にとりわけ好ましくは少なくとも5,000bpの長さの配列を有する。天然の発現構築物（例えば、プロモーターと対応する遺伝子との天然の組み合わせ）は、非天然、合成の「人工的」方法、例えば変異誘発により改変されると、トランスジェニック発現構築物になる。かかる方法は記載されている（米国特許第5,565,350号；WO 00/15815号）。例えば、この分子の生来のプロモーターでないプロモーターと機能可能に連結されたタンパク質をコードする核酸分子は、プロモーターについて異種であるとみなされる。好ましくは、それを導入した細胞に対して内因性でないか又は天然で随伴しないが、他の細胞から得られたか又は合成された異種DNAは内因性でない。異種DNAはまた、内因性DNA配列のいくつかの改変、非天然、多コピーを含有する内因性DNA配列、又はそれに物理的に連結された他のDNA配列を天然で随伴しないDNA配列を含む。一般に、必ずではないが、異種DNAはそれが発現される細胞により通常産生されないRNA又はタンパク質をコードする。
【０１５２】
ハイブリダイゼーション：本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸分子の1つの鎖が塩基対合を介して相補鎖に参加する任意のプロセス」を含む（J. Coombs (1994） Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York）。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸分子間の会合の強度）は、核酸分子間の相補性の程度、関わる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、及び核酸分子内のG：C比などの因子の影響を受ける。本明細書で使用する用語「Tm」は「融点」の意味で使用される。融点は二本鎖の核酸分子の集団が半分に解離して一本鎖になる温度である。核酸分子のTmを計算する式は当技術分野において周知である。標準の参考文献に示されるように、核酸分子が1M NaClの水溶液中に含まれる場合、Tm値の単純な計算は式：Tm=81.5+0.41(％ G+C)により計算することができる［例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985）を参照］。他の参考文献は、構造並びに配列の特徴を考慮に入れてTmを計算するさらに複雑な計算を含む。ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。好適なハイブリダイゼーション条件は、例えば、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、よりさらに好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子に対して、50℃における7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと50℃における2X SSC、0.1％SDS中での洗浄に等しい条件下でハイブリダイズするもの（低ストリンジェンシー）である。他の好適なハイブリダイゼーション条件は、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、よりさらに好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子に対して、50℃における7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと50℃（中程度ストリンジェンシー）又は65℃（高ストリンジェンシー）における1X SSC、0.1％SDS中での洗浄である。他の好適なハイブリダイゼーション条件は、配列の相補体の少なくとも50、好ましくは少なくとも100、より好ましくは少なくとも150、よりさらに好ましくは少なくとも200、最も好ましくは少なくとも250個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子に対して、50℃における7％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTA中でのハイブリダイゼーションと65℃における0.1X SSC、0.1％SDS中での洗浄である（非常に高度なストリンジェンシー）。
【０１５３】
「同一性」：「同一性」は、2以上の核酸又はアミノ酸分子の比較について使用する場合、前記分子の配列がある特定の程度の配列類似性を共有し、配列が部分的に同一であることを意味する。2つのアミノ酸配列又は2つの核酸分子のパーセント同一性（核酸配列を参照する場合、本明細書では相同性を互換的に使用する）を決定するために、配列の1つを他の配列の下に書いて最適な比較を行う（例えば、ギャップを一方のタンパク質又は核酸の配列中に挿入し、他のタンパク質又は他の核酸と最適なアラインメントを作り出すことができる）。
【０１５４】
対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又は核酸分子を次いで比較する。もし1つの配列の1つの位置が他配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又は同じ核酸分子により占められていれば、その分子はこの位置において同一性である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の全数×100）である。用語「相同性」及び「同一性」は従って、核酸配列を参照する場合には同義語と考えるべきである。アミノ酸配列を参照する場合、「同一性」の用語は、配列中の特定の位置における同一のアミノ酸を指し、「相同性」の用語は、配列中の特定の位置における相同アミノ酸を指す。相同なアミノ酸は、類似の側鎖を有するアミノ酸である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で規定されている。
【０１５５】
本発明のタンパク質に相同なタンパク質をコードする核酸分子は、1以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失がコードされるタンパク質に導入されるように、1以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失をヌクレオチド配列に導入することにより作製することができる。突然変異は、標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発及びPCR介在変異誘発により、本発明の配列の1つに導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、1以上の予想された非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、本発明のタンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられる。
【０１５６】
あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば飽和変異誘発（saturation mutagenesis）によりコード配列の全体又は一部においてランダムに導入することができ、得られる変異体を本明細書に記載の各活性についてスクリーニングし、その活性を保持する変異体を同定することができる。本発明の配列の1つの変異誘発後、コードされるタンパク質は組換えにより発現することができ、タンパク質の活性は、例えば本明細書に記載のアッセイを用いて決定することができる。
【０１５７】
2以上のアミノ酸又は2以上のヌクレオチド配列のパーセント同一性を確認するために、いくつかのコンピューターソフトウエアプログラムが開発されている。2以上配列の同一性は、例えば、ソフトウエアfastaを用いて計算することができ、これは現在バージョンfasta 3が使用されている（W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444(1988)；W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63 (1990)；W. R. Pearson and D. J. Lipman, PNAS 85, 2444 (1988)；W. R. Pearson, Enzymology 183, 63 (1990））。異なる配列の同一性を計算する他の有用なプログラムは標準blastプログラムであって、これはBiomax pedantソフトウエアに含まれている（Biomax、Munich、Federal Republic of Germany）。このソフトウエアは残念ながら、 blastが主題及びクエリの完全な配列を常に含まないので、最適性の劣る結果をもたらすことがある。それにも関わらず、このプログラムは非常に効率的であるので、膨大な数の配列を比較するために用いることができる。以下の設定は、配列のかかる比較のための典型的に使用されるものである。
【０１５８】
-p プログラム名 [文字列]； -d データベース [文字列]； デフォルト = nr； -i クエリーファイル[File In]； デフォルト = stdin； -e 期待値 （E） [実数]； デフォルト = 10.0； -m アラインメントビューオプション： 0 = ペアワイズ； 1 = 同一性を示すクエリー-アンカー； 2 = 同一性を示さないクエリー-アンカー； 3 = フラットクエリー-アンカー、同一性を示す； 4 = フラットクエリー-アンカー、同一性を示さない； 5 = フラットクエリー-アンカー、同一性を示さない、かつ平滑末端； 6 = フラットクエリー-アンカー、同一性を示さない、かつ平滑末端； 7 = XML Blast出力； 8 = 表形式； 9 コメントラインを含む表形式[整数]； デフォルト = 0； -o BLASTリポート出力ファイル[File Out] オプション； デフォルト = stdout； -F フィルタークエリー配列（blastnを用いるDUST、他を用いるSEG） [文字列]； デフォルト = T； -G ギャップを開くためのコスト（0はデフォルト行動を引き起こす） [整数]； デフォルト = 0； -E ギャップを拡張するためのコスト（0はデフォルト行動を引き起こす） [整数]； デフォルト = 0； -X ギャップ付加されたアラインメントに関するX下落値（ビット） （0はデフォルト行動を引き起こす）； blastn 30、megablast 20、tblastx 0、他の全部15 [整数]； デフォルト = 0； -I デフラインにGIを示す[T/F]； デフォルト = F； -q ヌクレオチド不一致に関するペナルティ（blastnのみ） [整数]； デフォルト = -3； -r ヌクレオチド一致に関する報酬（blastnのみ） [整数]； デフォルト = 1； -v （V）に関する1行記述を示すデータベース配列の数 [整数]； デフォルト = 500； -b （B）に関するアラインメントを示すデータベース配列の数 [整数]； デフォルト = 250； -f 拡張ヒットに関する閾値、デフォルト 0の場合； blastp 11、blastn 0、blastx 12、tblastn 13； tblastx 13、megablast 0 [整数]； デフォルト = 0； -g ギャップ付加アラインメントを実行（tblastxでは利用不可） [T/F]； デフォルト = T； -Q 使用するクエリー遺伝子コード[整数]； デフォルト = 1； -D DB遺伝子コード（tblast[nx]についてのみ） [整数]； デフォルト = 1； -a 使用するプロセッサーの数[整数]； デフォルト = 1； -O SeqAlignファイル[File Out] オプション； -J クエリーデフラインを信じる[T/F]； デフォルト = F； -M マトリックス[文字列]； デフォルト = BLOSUM62； -W ワードサイズ、デフォルト 0の場合 （blastn 11、megablast 28、他の全部 3） [整数]； デフォルト = 0； -z データベースの有効長さ（実際のサイズについては0を使用する） [実数]； デフォルト = 0； -K 保持する領域から得られる最良のヒットの数（デフォルトにより除去、使用する場合、100の値が推奨される） [整数]； デフォルト = 0； -P 複数ヒットについては0、単一ヒットについては1[整数]； デフォルト = 0； -Y 検索スペースの有効長さ（実際のサイズについては0を使用する） [実数]； デフォルト = 0； -S データベースに対して検索するためのクエリー・ストランド（blast[nx]、及びtblastxについて）； 3は両方、1は上、2は下である[整数]； デフォルト = 3； -T HTML出力を作製 [T/F]； デフォルト = F； -l GIの一覧に対するデータベースの限定的検索 [文字列] オプション； -U FASTA配列のフィルタリングには小文字を使用する [T/F] オプション； デフォルト = F； -y ビットで示される非ギャップ付加拡張のためのX下落値（0.0はデフォルト行動を引き起こす）； blastn 20、megablast 10、他の全部 7 [実数]； デフォルト = 0.0； -Z ビットで示される最終的なギャップ付加アラインメントに関するX下落値（0.0はデフォルト行動を引き起こす）； blastn/megablast 50、tblastx 0、他の全部 25 [整数]； デフォルト = 0； -R PSI-TBLASTN チェックポイントファイル[File In] オプション； -n MegaBlast検索 [T/F]； デフォルト = F； -L クエリー配列上の位置[文字列] オプション； -A 複数ヒットウィンドウサイズ、デフォルト 0の場合（blastn/megablast 0、他の全部 40 [整数]； デフォルト = 0； -w フレームシフトペナルティ（blastxに関するOOFアルゴリズム） [整数]； デフォルト = 0； -t HSPsを連結するためにtblastnにおいて許容される最大のイントロンの長さ （0は連結不可） [整数]； デフォルト = 0。
【０１５９】
Needleman及びWunsch、又はSmith及びWatermanのアルゴリズムを用いることにより、高品質の結果が達成される。従って、前記アルゴリズムに基づくプログラムが好ましい。有利には、配列の比較を、プログラムPileUp（J. Mol. Evolution., 25, 351 (1987）、Higgins et al., CABIOS 5, 151 (1989））又は、好ましくは、プログラム「Gap」及び「BestFit」（両方とも、Needleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 48; 443-453 (1970)のアルゴリズムに基づく）並びに「BestFit」（Smith及びWaterman（Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)）のアルゴリズムに基づく）を用いて行うことができる。「Gap」及び「Needle」はGCGソフトウェアパッケージ [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711 (1991); Altschul ら(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997）]の一部であり、「Needle」はThe European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS）(Trends in Genetics 16 (6）, 276 (2000））の一部である。従って、好ましくは、配列同一性のパーセントを決定する計算を、配列の全範囲にわたりプログラム「Gap」又は「Needle」を用いて行う。核酸配列の比較のための以下の標準的な調整を「Needle」について用いた: マトリックス: EDNAFULL, ギャップ_ペナルティ: 10.0、 拡張_ペナルティ: 0.5。核酸配列の比較のための以下の標準的な調整を「Gap」について用いた：ギャップウエイト：50、長さウエイト：3、平均マッチ：10.000、平均ミスマッチ：0.000。
【０１６０】
例えば、核酸レベルで配列番号1の配列と80％同一性を有するといわれる配列は、配列番号1により表される配列と上記プログラム「Needle」により上記パラメーターセットを用いて比較すると80％同一性を有する配列を意味することがわかる。好ましくは、同一性はクエリー配列、例えば配列番号1の完全長に基づいて計算する。
【０１６１】
単離された：本明細書で使用する用語「単離された」は、材料が人手により取り出されていて、その元来の、生来の環境から離れて存在し、それ故に天然の産物でないことを意味する。単離された材料又は分子（DNA分子又は酵素など）は精製された形態で存在しうるし又は例えば、トランスジェニック宿主細胞などの非生来の環境で存在しうる。例えば、生細胞中に存在する天然の核酸分子又はポリペプチドは単離されてないが、天然の系で共存する材料のいくつかの又は全てから分離された同じ核酸分子又はポリペプチドは単離されている。かかる核酸分子はベクターの一部でありうるし及び／又はかかる核酸分子若しくはポリペプチドは組成物の一部でありうるのであって、かかるベクター若しくは組成物が元来の環境の部分でないという点では単離されているであろう。好ましくは、核酸分子に関係して、「単離された核酸配列」のように使用される場合の「単離された」は、同定され、天然源で元来随伴している少なくとも１つの夾雑核酸分子から分離された核酸配列を意味する。単離された核酸分子は、天然で見出されるのとは異なる形態又は設定で存在する核酸分子である。対照的に、単離されてない核酸分子は、それらが天然で存在する状態で見出されたDNA及びRNAなどの核酸分子である。例えば、所与のDNA配列（例えば、遺伝子）は宿主細胞染色体において、隣接する遺伝子の近位で見出され；RNA配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列は細胞において、多数のタンパク質をコードする数多くの他のmRNAとの混合物として見出される。しかし、例えば配列番号1を含む単離された核酸配列は、例として挙げれば、配列番号1を通常含有する細胞中のかかる核酸配列であって、その核酸配列が天然の細胞とは異なるゲノム若しくはプラスミドの位置にあるか、又は、さもなくば、天然に見出されるのとは異なる核酸配列が隣接する前記核酸配列を含むものである。単離された核酸配列は一本鎖又は二本鎖の形態で存在しうる。単離された核酸配列をタンパク質を発現するために利用する場合、その核酸配列は最小限、少なくともセンス又はコード鎖の部分を含有してもよい（すなわち、核酸配列は一本鎖であってもよい）。あるいは、センスとアンチセンス鎖の両方を含有してもよい（すなわち、核酸配列は二本鎖であってもよい）。
【０１６２】
非コード：用語「非コード」は、発現されるタンパク質の一部若しくは全てをコードしない核酸分子の配列を意味する。非コード配列は、限定されるものでないが、エンハンサー、プロモーター領域、3'非翻訳領域、及び5'非翻訳領域を含む。
【０１６３】
核酸及びヌクレオチド：用語「核酸」及び「ヌクレオチド」は天然又は合成又は人工の核酸又はヌクレオチドを意味する。用語「核酸」及び「ヌクレオチド」はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又は任意のヌクレオチド類似体及びポリマー又はそれらのハイブリッドを、一本鎖若しくは二本鎖のセンス又はアンチセンス型で含む。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、暗示的に保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列、並びに明確に示した配列を包含する。用語「核酸」は、「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」と本明細書では互換的に使用される。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖及び／又はリン酸塩の化学構造に改変を有するヌクレオチドを含み、前記改変には、限定されるものでないが、5-位置ピリミジン改変、8-位置プリン改変、シトシン環外アミン類における改変、5-ブロモ-ウラシルの置換など；及び限定されるものでないが、2'-位置糖改変（2'-OHがH、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2、又はCNから選択される基により置換された糖改変を含む）されたリボヌクレオチドが含まれる。ショートヘアピンRNA（shRNA）はまた、非天然エレメント、例えば、非天然塩基、例えばイオノシン及びキサンチン、非天然糖、例えば2'-メトキシリボース、又は非天然リン酸ジエステル結合、例えばメチルホスホネート、ホスホロチオアート及びペプチドを含みうる。
【０１６４】
核酸配列：表現「核酸配列」は、5'から3'末端へ読まれたデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを意味する。核酸配列は染色体のDNA、自己複製プラスミド、DNA又はRNAの感染性ポリマー及び主に構造的役割を果たすDNA又はRNAを含む。「核酸配列」はまた、ヌクレオチドを表す略語、文字、記号又は言語の継続的列挙を意味する。一実施形態において、核酸は長さが通常100ヌクレオチド未満の比較的短い核酸である「プローブ」であってもよい。核酸プローブは長さが約50ヌクレオチド〜長さが約10ヌクレオチドであることが多い。核酸の「標的領域」は目的のものであると同定された核酸の一部分である。核酸の「コード領域」は、適当な調節配列の制御下に置かれると、配列特異的な方式で転写されかつ翻訳され、特別なポリペプチド又はタンパク質を産生する核酸の部分である。コード領域はかかるポリペプチド又はタンパク質をコードすると言われる。
【０１６５】
オリゴヌクレオチド：用語「オリゴヌクレオチド」はリボ核酸（RNA）又はデオキシリボ核酸（DNA）又はそれらの擬似体のオリゴマー又はポリマー、並びに同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドを意味する。かかる改変された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば、細胞取込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強及びヌクレアーゼの存在のもとでの安定性の増強故に、しばしば、生来の形態よりも好ましい。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、結合（例えば、リン酸ジエステル）又は代わる結合により互いに共役結合された2以上のヌクレオモノマーを含む。
【０１６６】
オーバーハング：「オーバーハング」は、二本鎖のオリゴヌクレオチド分子の5'-又は3'-ヒドロキシル末端の比較的短い一本鎖ヌクレオチド配列である（「伸長」「突出末端」又は「粘着性末端」とも呼ばれる）。
【０１６７】
ポリペプチド: 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」及び「タンパク質」は本明細書では互換的に使用されていて、連続するアミノ酸残基のポリマー又はオリゴマーを意味する。
【０１６８】
プロモーター:「プロモーター」又は「プロモーター配列」は等価であり、本明細書で使用する場合、目的のヌクレオチド配列に機能可能に連結されると目的のヌクレオチド配列のRNAへの転写を制御することができるDNA配列を意味する。プロモーターは、目的のヌクレオチド配列（mRNAへのその転写を制御する）の転写開始部位の5'（すなわち、上流）の近位に位置し、そして転写開始のためのRNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。プロモーターはコード領域又は5'非翻訳領域を含まない。プロモーターはそれぞれの細胞に対して異種又は相同性であってもよい。核酸分子配列は、もし外来種に由来するか、又はもし同じ種由来であってその元来の形態から改変されていれば、生物又は第2の核酸分子配列に対して「異種」である。例えば、異種コード配列と機能可能に連結されたプロモーターという場合、そのコード配列は、そのプロモーターが由来する種と異なる種由来のコード配列、又は、もし同じ種由来であれば、そのプロモーターに天然では随伴しないコード配列（例えば、遺伝子操作で作られたコード配列又は異なるエコタイプ若しくは変種からの対立遺伝子）を意味する。好適なプロモーターは、発現が起こるべき宿主細胞の遺伝子から又は宿主に対する病原体から誘導することができる。
【０１６９】
精製された：本明細書で使用する用語「精製された」は、その天然環境から取り出され、単離されるか又は分離された分子、核酸若しくはアミノ酸配列を意味する。「実質的に精製された」分子は、それが天然で随伴する他成分の少なくとも60％を含有しない、好ましくは少なくとも75％を含有しない、そしてより好ましくは少なくとも90％を含有しない。精製された核酸配列は単離された核酸配列であってもよい。
【０１７０】
組換え体：核酸分子に関する用語「組換え体」は組換えDNA技法により産生された核酸分子を意味する。この用語はまた、天然には存在しないが、改変、変更、変異又はそうでなければ人為的に操作されている核酸分子を含む。好ましくは、「組換え核酸分子」は、天然の核酸分子とは配列において少なくとも1つの核酸が異なる非天然の核酸分子である。「組換え核酸分子」はまた、好ましくは機能可能に連結された天然ではその順で存在しない核酸分子の配列を含む「組換え構築物」を含みうる。前記組換え核酸分子を作製する好ましい方法は、クローニング技法、定方向又は非部位特異的な変異誘発、合成又は組換え技法を含みうる。
【０１７１】
有意な増大：測定技法に固有の誤差限界より大きい、例えば酵素活性、遺伝子発現、特定の産物の生産性又は収量の増大、好ましくは、対照酵素の活性、発現、生産性若しくは収量又は対照細胞における発現又は対照細胞の生産性若しくは収量の約10％又は25％、好ましくは50％又は75％、より好ましくは2倍若しくは5倍又はそれ以上の増大、より好ましくは、約10倍以上の増大を意味する。
【０１７２】
有意な低減：測定技法に固有の誤差限界より大きい、例えば酵素活性、遺伝子発現、特定の産物の生産性又は収量の低減、好ましくは、対照酵素の活性、発現、生産性若しくは収量又は対照細胞における発現又は対照細胞の生産性若しくは収量の少なくとも約5％又は10％、好ましくは少なくとも約20％又は25％、より好ましくは少なくとも約50％又は75％、よりさらに好ましくは少なくとも約80％又は85％、最も好ましくは少なくとも約90％、95％、97％、98％又は99％の低減を意味する。
【０１７３】
実質的に相補的な：その最も広い意味で、用語「実質的に相補的な」は、参照又は標的ヌクレオチド配列と比較してヌクレオチド配列について本明細書で使用する場合、前記参照又は標的ヌクレオチド配列の実質的に相補的なヌクレオチド配列と正確に相補的な配列の間のパーセント同一性は少なくとも60％、より望ましくは少なくとも70％、より望ましくは少なくとも80％又は85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも93％、さらにより好ましくは少なくとも95％又は96％、なおさらにより好ましくは少なくとも97％又は98％、またさらにより好ましくは少なくとも99％又は最も好ましくは100％（最後の場合、この文脈では用語「同一」と等しい）であるヌクレオチド配列を意味する。（以下で特に断らなければ）好ましくは、同一性を核酸配列の少なくとも19ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは全長にわたり前記参照配列に対して評価する。配列比較は、デフォールトGAP分析を用いて、GAPのSEQWEBアプリケーション（University of Wisconsin GCG）により、Needleman及びWunsch（Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453；先に定義した通り）のアルゴリズムに基づいて実施する。参照ヌクレオチド配列に「実質的に相補的な」ヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列と低度ストリンジェンシー条件、好ましくは中程度ストリンジェンシー条件、最も好ましくは高度ストリンジェンシー条件（先に定義した通り）のもとでハイブリダイズする。
【０１７４】
トランスジーン：本明細書で使用する用語「トランスジーン」は、実験遺伝子操作により細胞のゲノム中に導入される任意の核酸配列を意味する。トランスジーンは「内因性DNA配列」又は「異種DNA配列」（すなわち「外来のDNA」）であってもよい。用語「内因性DNA配列」は、天然の配列に関係して何らかの改変（例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在など）のない限り、導入される細胞において天然で見出されるヌクレオチド配列を意味する。
【０１７５】
トランスジェニック：生物に言及する場合、用語「トランスジェニック」は、形質転換された、好ましくは目的のDNA配列と機能可能に連結された好適なプロモーターを含む組換えDNA分子によって、好ましくは安定して形質転換されたことを意味する。
【０１７６】
ベクター：本明細書で使用する用語「ベクター」は、連結されている他の核酸分子を輸送することができる核酸分子を意味する。ベクターの1つのタイプはゲノム組み込み型ベクター、すなわち、宿主細胞のゲノムDNA中に組み込むことができる「組み込みベクター」である。ベクターの他のタイプはエピソームベクター、すなわち、染色体外複製の能力があるプラスミド又は核酸分子である。機能可能に連結された遺伝子の発現を指令する能力のあるベクターを本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。本明細書においては、文脈からそうでないことが明らかでない限り、「プラスミド」と「ベクター」を互換的に使用する。
【０１７７】
野生型：用語「野生型」、「天然の」又は「天然の起源」は、生物に関する場合、その生物が人為的に改変、変異又はさもなくば操作が行われていないことを意味する。ポリペプチド又は核酸配列に関する場合、そのポリペプチド又は核酸配列が天然であるか、又は人為的に改変、変異若しくはさもなくば操作が行われていない少なくとも1つの天然の生物において入手できるものを意味する。
【０１７８】
微生物の野生型とは、ある遺伝子の遺伝的改変を導入する前の場合と同様の状況でゲノムが存在する微生物を指す。遺伝的改変は、例えば、遺伝子若しくはその一部の欠失、又は点変異、又は遺伝子の導入とすることができる。
【０１７９】
「生産」又は「生産性」の用語は当技術分野で認識され、所定時間内に所定の発酵体積で形成された発酵産物（例えばアラニン）の濃度（例えば産物kg/時/L）が含まれる。「生産の効率」という用語には、特定のレベルの生産が達成されるのに必要な時間（例えば、細胞がファインケミカルの出力の特定の速度を獲得するために要する時間）が含まれる。
【０１８０】
「収量」又は「産物／炭素収量」の用語は当技術分野で認識され、産物（すなわちファインケミカル）への炭素源の変換の効率が含まれる。これは一般的に、炭素源1kg当たりの産物kgとして記載される。化合物の収量又は生産を増大させることにより、所定の時間量における所定の培養量における化合物の回収される分子又は有用な回収分子の量が増大する。
【０１８１】
「組換え微生物」という用語には、それが由来する野生型微生物と比較して改変された又は異なる遺伝子型及び／又は表現型を示すように遺伝的に改変された微生物（例えば、遺伝的改変が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす）が含まれる。組換え微生物は、少なくとも1つの組換えDNA分子を含む。
【０１８２】
DNAに関する用語「組換え体」は、組換えDNA技法を使用して人為的に作製されたDNA分子を指す。この用語は、それ自体は天然には存在しないが、人為的に改変、変化、変異又は操作されたDNA分子を含む。好ましくは、「組換えDNA分子」は、少なくとも1つの核酸によって天然に存在する核酸分子と配列が異なる、非天然の核酸分子である。「組換えDNA分子」は、好ましくは機能可能に連結させた、その順序で天然に存在しない核酸分子の配列を含む「組換え構築物」を含むこともできる。前記組換えDNA分子を作製する好ましい方法は、クローニング技法、定方向若しくは非定方向変異誘発、遺伝子合成又は組換え技法を含むことができる。
【０１８３】
用語「定方向進化」は、本明細書において用語「代謝進化」と同義に用いられ、目的の形質を有する突然変異体の増殖を選択する選択圧をかけることを含む。選択圧は、種々の培養条件、ATP及び増殖連結選択、並びに酸化還元関連選択に基づき得る。選択圧は、連続移動接種を行うバッチ発酵又は同じ圧での連続培養を用いて実施することができる。
【０１８４】
そのような組換えDNAの例は、異種DNA配列が挿入されたプラスミド、あるいはその組換えDNAが由来する遺伝子又はプロモーターと比較して変異されている遺伝子又はプロモーターである。変異は、当技術分野で公知の定方向変異誘発技法により、又はランダム変異誘発技術（例えば、化学剤、UV光若しくはx線変異誘発により）、あるいは定方向進化技法によって導入することができる。
【０１８５】
用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特定の遺伝子（複数可）又は特定の遺伝子ベクター構築物の転写を意味する。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、特に、遺伝子（複数可）又は遺伝子ベクター構築物のmRNAへの転写を意味する。このプロセスは、DNAの転写及び生じたRNA産物のプロセシングを含む。用語「発現」又は「遺伝子発現」は、mRNAの翻訳及びそれとともにコードされるタンパク質の合成、すなわちタンパク質発現を含むこともできる。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
１．以下の核酸分子：
(I) 配列番号1、45若しくは49の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1、45若しくは49の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号1、45若しくは49を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2、46若しくは50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号2、46若しくは50のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群より選択される配列を有する組換え核酸分子であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでなく、かつ終止コドンでなく、かつ
配列番号45の913〜915位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アルギニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号46の305位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアルギニンでなく、かつ終止コドンでなく、かつ
配列番号49の208〜210位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸アラニンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号50の70位に対応する(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がアラニンでなく、かつ終止コドンでない、
上記組換え核酸分子。
２．配列番号1の配列を有する実施形態1に記載の組換え核酸分子であって、13〜15位のアミノ酸グルタミンをコードするコドンが、アミノ酸ヒスチジン又はヒスチジンに類似のアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸をコードするコドンにより、あるいはアミノ酸アスパラギン又はアスパラギンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするコドンにより、あるいはアミノ酸アルギニン又はアルギニンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするコドンにより、あるいはアミノ酸チロシン又はチロシンに類似のアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸をコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
３．配列番号45の配列を有する実施形態1に記載の組換え核酸分子であって、913〜915位のアミノ酸アルギニンをコードするコドンが、アミノ酸グリシン又はグリシンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸をコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
４．配列番号49の配列を有する実施形態1に記載の組換え核酸分子であって、208〜210位のアミノ酸アラニンをコードするコドンが、アミノ酸プロリンをコードするコドンにより置換されている、上記組換え核酸分子。
５．以下のアミノ酸分子：
(VI) 配列番号2の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号2の核酸分子に対して少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号2の5位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がグルタミンでない、上記組換えアミノ酸分子。
６．以下のアミノ酸分子：
(VI) 配列番号46の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号46の核酸分子に対して少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号46の305位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がアルギニンでない、上記組換えアミノ酸分子。
７．以下のアミノ酸分子：
(VI) 配列番号50の配列を含むアミノ酸分子、又は
(VII) 配列番号50の核酸分子に対して少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸分子の群より選択される配列を有する組換えアミノ酸分子であって、
配列番号50の70位に対応する(VII)に属するタンパク質のアミノ酸がアラニンでない、上記組換えアミノ酸分子。
８．5位のアミノ酸グルタミンが、ヒスチジン又はヒスチジンに類似のアミノ酸若しくは別の塩基性アミノ酸により、あるいはアスパラギン又はアスパラギンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸により、あるいはアルギニン又はアルギニンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸により、あるいはチロシン又はチロシンに類似のアミノ酸若しくは別の芳香族アミノ酸により置換されている、実施形態2に記載の組換えアミノ酸分子。
９．305位のアミノ酸アルギニンがグリシン又はグリシンに類似のアミノ酸若しくは別の脂肪族アミノ酸により置換されている、実施形態3に記載の組換えアミノ酸分子。
１０．70位のアミノ酸アラニンがプロリンにより置換されている、実施形態4に記載の組換えアミノ酸分子。
１１．実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子のうちの少なくとも1つに機能可能に連結された、微生物中で機能的な少なくとも1つのプロモーターを含む組換え発現構築物。
１２．実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子又は実施形態11に規定される組換え発現構築物のうちの少なくとも1つを含む、組換えベクター。
１３．  (a) lpd遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、
(b) zipA遺伝子又はその相同体若しくは機能的変異体の活性及び／又は発現の導入、増大、増強又は改変、
(c)(I) 配列番号1の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号1の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号1を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号2のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号2のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
のうちの少なくとも1つを含む組換え微生物であって、
配列番号1の13〜15位に対応する(c)(I)〜(V)に属する遺伝子のコドンがアミノ酸グルタミンをコードせず、かつ終止コドンでないか、又は配列番号2の5位に対応する(c)(I)〜(V)に属する遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸がグルタミンでない、上記組換え微生物。
１４．lpd遺伝子が、以下の核酸分子：
(i) 配列番号49の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号49の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号49を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号50のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号50のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、実施形態13に記載の組換え微生物。
１５．zipA遺伝子が、以下の核酸分子：
(i) 配列番号45の配列を含む核酸分子、又は
(ii) 配列番号45の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(iii) ストリンジェントな条件下で配列番号45を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(iv) 配列番号46のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(v) 配列番号46のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される、実施形態13に記載の組換え微生物。
１６．実施形態1〜4のいずれかに規定される組換え核酸分子又は実施形態11に記載の組換え発現構築物又は実施形態12に記載の組換えベクターのうちの少なくとも1つを含む、組換え微生物。
１７．alaD遺伝子の活性及び/又は発現の導入、増大又は増強をさらに含む、実施形態16に記載の組換え微生物。
１８．pflB遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16又は17に記載の組換え微生物。
１９．adhE遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜18のいずれかに記載の組換え微生物。
２０．ldhA遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜19のいずれかに記載の組換え微生物。
２１．pta遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜20のいずれかに記載の組換え微生物。
２２．frdAの活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態16〜21のいずれかに記載の組換え微生物。
２３．alaD遺伝子が、以下の核酸分子：
(AA) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(BB) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(CC) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(DD) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(EE) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態17〜22のいずれかに記載の組換え微生物。
２４．alaD遺伝子が、配列番号54若しくは55を有するプロモーター又は以下の核酸分子：
(I) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(II) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(III) 配列番号54を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドからなる断片
に機能可能に連結されている、実施形態17〜23のいずれかに記載の組換え微生物。
２５．pflB遺伝子が、以下の核酸分子：
(A) 配列番号5の配列を含む核酸分子、又は
(B) 配列番号5の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は (C) ストリンジェントな条件下で配列番号5を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(D) 配列番号6のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(E) 配列番号6のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態18〜24のいずれかに記載の組換え微生物。
２６．adhE遺伝子が、以下の核酸分子：
(F) 配列番号7の配列を含む核酸分子、又は
(G) 配列番号7の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は (H) ストリンジェントな条件下で配列番号7を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(I) 配列番号8のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(J) 配列番号8のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態19〜25のいずれかに記載の組換え微生物。
２７．ldhA遺伝子が、以下の核酸分子：
(K) 配列番号9の配列を含む核酸分子、又は
(L) 配列番号9の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は (M) ストリンジェントな条件下で配列番号9を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(N) 配列番号10のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(O) 配列番号10のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態20〜26のいずれかに記載の組換え微生物。
２８．pta遺伝子が、以下の核酸分子：
(P) 配列番号11の配列を含む核酸分子、又は
(Q) 配列番号11の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は (R) ストリンジェントな条件下で配列番号11を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(S) 配列番号12のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(T) 配列番号12のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態21〜27のいずれかに記載の組換え微生物。
２９．frdA遺伝子が、以下の核酸分子：
(U) 配列番号13の配列を含む核酸分子、又は
(V) 配列番号13の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は (W) ストリンジェントな条件下で配列番号13を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(X) 配列番号14のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(Y) 配列番号14のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
からなる群より選択される、実施形態22〜28のいずれかに記載の組換え微生物。
３０．前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属からなる群の属から選択される、実施形態13〜29のいずれかに記載の組換え微生物。
３１．実施形態13〜30のいずれかに記載の1種以上の組換え微生物を含む組成物。
３２．培地及び炭素源をさらに含む、実施形態31に記載の組成物。
３３．以下のステップ：
(I) 実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態5〜10のいずれかに規定されるアミノ酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態11に記載の発現構築物又は実施形態12に記載のベクターを、微生物に導入するステップ；及び
(II) 実施形態1〜4のいずれかに規定される核酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態5〜10のいずれかに規定されるアミノ酸分子のうちの少なくとも1つ又は実施形態11に記載の発現構築物又は実施形態12に記載のベクターを含まない対応する微生物と比較して、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が増強された組換え微生物を生成するステップ
を含む、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が増強された組換え微生物の作製方法。
３４．前記方法で用いられる組換え微生物が、実施形態8若しくは14に規定される遺伝子の活性及び/又は発現の増大又は増強、並びに/あるいは実施形態9〜13若しくは15〜19のいずれかに規定される少なくとも1種の遺伝子の活性及び/又は発現の低減、抑制又は欠失をさらに含む、実施形態33に記載の方法。
３５．前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、エルウィニア属、エシェリキア属、パントエア属、ストレプトミセス属、ザイモモナス属及びロドコッカス属からなる群の属から選択される、実施形態33又は34に記載の方法。
３６．アラニン産生を可能にする条件下で、実施形態13〜30のいずれかに記載の1種以上の組換え微生物を培養するステップを含む、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの製造方法。
３７．前記微生物が、0.5％〜30％(w/v)の糖を含む培地中で培養される、実施形態36に記載の方法。
３８．ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの収量が少なくとも80％である、実施形態36又は37に記載の方法。
３９．L-アラニンのキラル純度が少なくとも98％である、実施形態36〜38のいずれかに記載の方法。
４０．実施形態13〜30のいずれかに記載の1種以上の遺伝的に改変された微生物を培養培地に接種するステップ及び該培養培地中で該遺伝的に改変された微生物を培養又は増殖させるステップを含む、遺伝的に改変された微生物を培養又は増殖させる方法。
４１．ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの発酵生産のための、実施形態1〜4のいずれかに記載の組換え核酸分子、実施形態5〜10のいずれかに記載の組換えアミノ酸分子、実施形態11に記載の組換え発現構築物、実施形態12に記載の組換えベクター、実施形態13〜30のいずれかに記載の組換え微生物又は実施形態31若しくは32に記載の組成物の使用。
４２．以下のステップ：
(I) 発酵槽中で実施形態13〜30のいずれかに記載の微生物を増殖させるステップ、及び
(II) (I)で得られた発酵液から、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンを回収するステップ
を含む、ピルビン酸、コハク酸、アスパラギン酸、リンゴ酸、乳酸、バリン、ロイシン及び/又はアラニンの発酵生産のための方法。
４３．以下の核酸分子：
(I) 配列番号15の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号15の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(III) ストリンジェントな条件下で配列番号15を有する核酸分子の相補体にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号16のポリペプチドをコードする核酸分子、又は
(V) 配列番号16のポリペプチドに対して少なくとも60％の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
の群から選択される配列を、
(VI) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(VII) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(VIII) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IX) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドからなる断片
の配列を有する微生物中で機能的なプロモーターと機能的に連結されて有する核酸分子を含む、組換え発現構築物。
４４．実施形態43に規定される組換え発現構築物を含む、組換えベクター。
４５．  (I) 配列番号54若しくは55の配列を含む核酸分子、又は
(II) 配列番号54若しくは55の核酸分子に対して少なくとも80％の同一性を有する核酸分子、又は
(III) 中程度にストリンジェントな条件下で配列番号54若しくは55を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子、又は
(IV) 配列番号54若しくは55を有する核酸分子の少なくとも10個のヌクレオチドからなる断片
の群から選択される配列を有する、微生物中で機能的なプロモーター。
４６．発現対象の異種核酸分子と機能的に連結された実施形態45に記載のプロモーター
を含む、組換え発現構築物。
４７．実施形態45に記載のプロモーター又は実施形態46に記載の組換え発現構築物を含む、ベクター。
４８．実施形態45に記載のプロモーター、実施形態46に記載の組換え発現構築物又は実施形態47に記載のベクターを含む、組換え微生物。
４９．実施形態45に記載のプロモーターを、発現対象の核酸分子に機能的に連結し、それにより組換え発現構築物を作製するステップ、及び該発現構築物を微生物に導入するステップを含む、微生物中で核酸分子を発現させる方法。
５０．微生物中で核酸分子を発現させるための、実施形態45に記載のプロモーター、実施形態46に記載の組換え発現構築物又は実施形態47に記載のベクターの使用。
【実施例】
【０１８６】
化学物質及び一般的方法
特に示さない限り、制限消化、アガロースゲル電気泳動、核酸の精製、核酸のライゲーション、形質転換、細菌細胞の選択及び培養をはじめとする、本発明の目的のために行なわれるクローニング手順は、記載される通りに行なわれる（Sambrook et al., 1989）。組換えDNAの配列分析は、Sangerの技術（Sanger et al., 1977）を用いて、レーザー蛍光DNAシーケンサー（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて行なわれる。特に記載しない限り、化学物質及び試薬は、Sigma Aldrich社（Sigma Aldrich, St. Louis, USA）、Promega社（Madison, WI, USA）、Duchefa社（Haarlem, The Netherlands）又はInvitrogen社（Carlsbad, CA, USA）から入手される。制限エンドヌクレアーゼは、New England Biolabs社（Ipswich, MA, USA）又はRoche Diagnostics GmbH（Penzberg, Germany）からのものである。オリゴヌクレオチドは、Eurofins MWG Operon社（Ebersberg, Germany）により合成される。
【０１８７】
実施例1：
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFの不活性化並びにalaD遺伝子のコドン最適化変異体（alaD-gstear）によるldhA ORFの置換により、L-アラニン産生に関して大腸菌W株（LU17032）を遺伝子操作した。
【０１８８】
ackA-pta、adhE、frdABCD及びpflB ORFは、FRT隣接カナマイシン耐性カセットの挿入、及びそれに続くFLP組換えによる抗生物質耐性カセットの除去により不活性化された。
【０１８９】
ldhA遺伝子は、alaD-gstear及び下流FRT隣接ゼオシン耐性カセット（最終的にはFLP組換えにより除去される）により置換された。
【０１９０】
材料及び方法
細菌培養
大腸菌W株（LU17032）は、Luria-Bertani（LB）液体培地中又はLuria-Bertani固体培地上で培養した。時折、W株の正体を確認するために、10mMスクロースを含有するM9最小寒天上にクローンを継代した。抗生物質を、15μg/mL（カナマイシン、クロラムフェニコール）、25μg/mL（ゼオシン）又は3μg/mL（テトラサイクリン）の最終濃度まで、適宜、液体培地及び固体培地に添加した。
【０１９１】
Red/ET組換え
Red/ET組換えは、Gene Bridges GmbH（www.genebridges.com）の標準的プロトコールを用いて行なった。簡潔には、Red/ET能の高い大腸菌W株を、30℃にて、OD600nmが約0.3になるまで好気的に増殖させた。red遺伝子の発現は、50μLの10％(w/v) L-アラビノースの添加及びそれに続く37℃までの温度上昇により誘導した。アラビノースは、非誘導対照培養では省略した。37℃での35分間のインキュベーション後、細胞を、氷冷10％(v/v)グリセロールを用いて2回洗浄し、1.35kV、10μF、600Ωで500ngのPCR産物を用いてエレクトロポレーションした。次に、細胞を1mL氷冷LB培地中に再懸濁し、約1.5時間、37℃にて好気的に増殖させた。次に、培養物を、15μg/mLカナマイシン（ノックアウト）又は25μg/mLゼオシン（ノックイン）を含有するLB寒天上に播種した。
【０１９２】
FLP組換え
隣接するFRT部位は、大腸菌染色体の改変に続くFLP組換えによる抗生物質耐性マーカーの除去を可能にした。FLP組換えは、1箇所のFRT部位（34bp）並びに短い隣接配列（それぞれ約20bp）を残し、これは、カセットの増幅でのプライマー結合部位として用いられる。
【０１９３】
FLP組換えを行なうために、FLPリコンビナーゼをコードするプラスミド708-FLPe（表1）を、エレクトロポレーションによりRed/ET組換え体へと導入した。KanR CmR又はZeoR CmR形質転換体を用いて、0.2mL LB培養物に接種し、これを30℃にて3時間インキュベートした。次に、37℃への温度シフト及びそれに続く37℃での3時間のインキュベーションにより、FLP活性を誘導した。これらの培養物から得られた単一コロニーを、続いて、CmS及びKanS又はZeoS表現型についてスクリーニングした。
【０１９４】
DNA調製及び分析
大腸菌ゲノムDNA（gDNA）を、Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit B（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて一晩培養物から単離した。ノックアウト又はノックインカセットを保持するPCR産物を、PRECISOR高忠実性DNAポリメラーゼ（BioCat, Heidelberg）を用いて鋳型プラスミドから増幅し、分析用PCR反応は、PCR Extender System（5PRIME GmbH, Hamburg, Germany）を用いて、製造業者の推奨に従って行なった。PCRアンプリコンを、GeneJET PCR Purification Kit又はGeneJET Gel Extraction Kit（Fermentas, St. Leon-Rot, Germany）を用いて精製し、配列決定はGATC BioTech社（Konstanz, Germany）又はBioSpring社（Frankfurt am Main, Germany）により行なわれた。
【０１９５】
0006572206.tif 000003
0006572206.tif 000004
0006572206.tif 000005
0006572206.tif 000006
【０１９６】
1.1. ackA-pta遺伝子座 - ackA-ptaの標的化
約500ngのΔackA-pta PCR構築物（1737bp）を、Red/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。3種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった（データ示さず）。
【０１９７】
クローン確認。ackA-pta遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した（図1）。
【０１９８】
1.2 adhE遺伝子座 - adhEの標的化
約500ngのΔadhE PCR構築物（1093bp）を、ΔackA-pta::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。2種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった（データ示さず）。
【０１９９】
クローン確認。adhE遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した（図2）。
【０２００】
1.3 frd遺伝子座 - frdABCDの標的化
約500ngのΔfrdABCD PCR構築物（1093bp）を、ΔackA-pta::FRT及びΔadhE::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった（データ示さず）。
【０２０１】
クローン確認。frd遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した（図3）。
【０２０２】
1.4 pflB遺伝子座 - pflBの標的化
約500ngのΔpflB PCR構築物（1093bp）を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT及びΔfrdABCD::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。8種類のKanR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。4種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった（データ示さず）。
【０２０３】
クローン確認。pflB遺伝子座の不活性化及びカナマイシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した（図4）。
【０２０４】
1.5 ldhA遺伝子座 - alaD-gstearのノックイン
約500ngのΔldhA::alaD-gstear PCR構築物（1783bp）を、ΔackA-pta::FRT、ΔadhE::FRT、ΔfrdABCD::FRT及びΔpflB::FRT改変を保持するRed/ET能の高い大腸菌W株細胞へとエレクトロポレーションした。4種類のZeoR形質転換体を、ゲノム特異的プライマーを用いるPCRにより耐性マーカーカセットの正しい組み込みに関して分析した。1種類のクローンがFLP組換えに供され、FLP組換えは材料及び方法に記載される通りに行なった（データ示さず）。
【０２０５】
クローン確認。alaD-gstearの組み込み及びゼオシン耐性カセットの除去は、FRT残痕にわたるPCRにより確認した。正しいPCRシグナルを生じた1種類のクローンは、配列決定によっても確認した（図5）。
【０２０６】
実施例2：アラニンのHPLC検出及び定量化
細胞培養培地中でのアラニン検出のために、以下のHPLC法を用いた：
カラム：Aminex HPX-87Cカラム（Bio-Rad社）、300×7.8mm, i.d.粒径9μm
移動相：0.1mol/LのCa(NO3)290％、アセトニトリル10％
流速：0.6mL/分
カラム温度：60℃
検出：屈折率検出器
【０２０７】
上記の方法では、細胞培養物サンプルマトリックス中の主要な推定上の成分を、アラニンの定量化を妨げることなく、アラニンからうまく分離させることができる。
【０２０８】
サンプル中のアラニンの量は、外部標準較正法により決定した。0.5〜10.0g/Lのアラニンを含有する標準サンプルを注入し、ピーク面積を較正のために用いた。較正曲線の線形回帰係数は、0.9995であった。
【０２０９】
サンプルは、20μLにて一度注入する。ピーク面積を用いて、Waters LC Milleniumソフトウェアにより、サンプル中に存在する量を算出する。
【０２１０】
実施例3：グルコース、コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸及びエタノールのHPLC検出及び定量化
用いたHPLC法：
カラム：Aminex HPX-87Hカラム（Bio-Rad社）、300×7.8mm、i.d.粒径9μm
移動相：H2SO44mM
流速：0.4mL/分
カラム温度：45℃
検出：屈折率検出器
【０２１１】
アナライトの量は、外部標準較正法により決定した。0.1〜38.0g/Lのグルコース、0.05〜10.0g/Lのコハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸及びエタノールを含有する標準サンプルを注入し、ピーク面積を較正のために用いた。6種類すべての較正曲線の線形回帰係数は、0.999よりも良好であった。
【０２１２】
サンプルは、20μLにて一度注入する。ピーク面積を用いて、Waters LC Milleniumソフトウェアにより、サンプル中に存在する量を算出する。
【０２１３】
実施例4：改善されたアラニン収量に関する実施例1に由来する大腸菌Wステム株の代謝的進化
大腸菌Ex1株又はQZ16株と命名された、実施例1に記載される通りのすべての突然変異を含む大腸菌ステム株を、大腸菌Ex1ステム株のアラニン収量を改善するために、代謝的進化手順のために用いた。
【０２１４】
代謝的進化は、以下の通りに行なった：第1及び第2進化ラウンドでは、NBS培地5％グルコース中で、それぞれ500時間及び750時間にわたって継続的進化を行なった。
【０２１５】
NBS培地：
3.5g KH2PO4
5.0g K2HPO4
3.5g (NH4)2HPO4
0.25g MgSO4-7H2O
15mg CaCL2-2H2O
0.5mgチアミン
1mL微量金属ストック
【０２１６】
微量金属ストックは、0.1M HCL中、1.6g FeCL3-6H2O；0.2g CoCl2-6H2O；0.1g CuCl2-2H2O；0.2g ZnCl2；0.2g NaMoO4-2H2O；0.05g H3BO3を用いて調製した。
【０２１７】
細胞をLB平板上で画線培養し、アラニン収量について試験した。最良の大腸菌ステム株（大腸菌Ev1株又はQZ17株）は、37℃にて24時間及び48時間の5％グルコースを含むNBS培地を用いる発酵にて、84％〜86％のアラニン収量を生じ、これと比較して、開始ステム株である大腸菌Ex1株は80％〜83％のアラニン収量を生じた。
【０２１８】
大腸菌Ev1株をさらなる進化ステップのために用い、このステップは、20日間のバッチ進化として行なった。細胞のうちの5％を、37℃にて、14％グルコースを含むAM1培地中に、24時間、48時間、72時間毎などに新鮮培地に再接種した。
【０２１９】
AM1培地：
19.92mm (NH4)2HPO4＝2.6g/L       MW：132.07
7.56mm NH4H2PO4＝0.87g/L         MW：115
2.0mm KCl＝0.15g/L              MW：74.55
1.5mm MgSO4-7H2O＝0.37g/L        MW：246.5
15g/L硫酸アンモニウムを、最終ステップで添加した。
1mmベタイン
1mL微量金属ストック”
【０２２０】
1Lの微量金属ストックを作製するために：
微量金属ストックは、0.12M HCL中、2.4g FeCL3-6H2O；0.3g CoCl2-6H2O；0.21g CuCl2-2H2O；0.3g ZnCl2；0.27g NaMoO4-2H2O；0.068g H3BO3；0.5g MnCl2-4H2Oを用いて調製した。
【０２２１】
この進化のために、ステム大腸菌Ev2株（QZ18株とも称される）が単離された。このステム株を、AM1培地14％グルコースを含む発酵槽中で行なわれる発酵にて試験した。ステム大腸菌Ev2株は92％〜94％のアラニン収量を有し、これと比較して、同じ条件下で大腸菌Ev1株は91％〜92％のアラニン収量を有した。
【０２２２】
12％グルコースを含むAM1培地中での300時間のさらなるバッチ進化ステップ及び12％グルコースを含むAM1中での引き続く10回のバッチ進化ステップ後に、ステム大腸菌Ev3株（QZ20株とも称される）が単離された。
【０２２３】
アラニン収量に関する試験により、ステム大腸菌Ev3株が12％グルコースを含むAM1培地中で94％〜96％のアラニン収量を有し、これと比較して、同じ条件下で大腸菌Ev2株は92％〜93％のアラニン収量を有したことが明らかになった。
【０２２４】
実施例5：大腸菌Ex1株と比較したステム大腸菌Ev3株での突然変異の決定
ステム大腸菌Ev3株の増大したアラニン収量をもたらす突然変異を決定するために、大腸菌ステム株である大腸菌Ex1株及び大腸菌Ev3株のゲノムを配列決定し、結果を比較した。
【０２２５】
lpd遺伝子中の突然変異が同定され、この突然変異は、ステム大腸菌Ex1株での配列番号50を有するタンパク質をコードする配列番号49から、ステム大腸菌Ev3株での配列番号52を有するタンパク質をコードする配列番号51へと、lpd遺伝子の配列を変化させた。
【０２２６】
zipA遺伝子中のさらなる突然変異が同定され、この突然変異は、ステム大腸菌Ex1株での配列番号46を有するタンパク質をコードする配列番号45から、ステム大腸菌Ev3株での配列番号48を有するタンパク質をコードする配列番号47へと、zipA遺伝子の配列を変化させた。
【０２２７】
ygaW遺伝子中の突然変異もまた同定され、この突然変異は、ステム大腸菌Ex1株での配列番号2を有するタンパク質をコードする配列番号1から、ステム大腸菌Ev3株での配列番号4を有するタンパク質をコードする配列番号3へと、ygaW遺伝子の配列を変化させた。
【０２２８】
さらに、ydbHコード領域の部分的欠失及びalaD遺伝子の発現を駆動するldhAプロモーターの欠失及びalaD遺伝子の前のydbH遺伝子の5’コード領域の部分的欠失が同定され、これらは、alaD遺伝子を、配列番号55を有するプロモーターの制御下に置く。新規遺伝子座のゲノム構成の詳細については、図7を参照されたい。
【０２２９】
実施例6：アラニン収量に対するalaD遺伝子の変異型プロモーターの影響の確認
大腸菌Ev3/QZ20株で検出されたalaD遺伝子の上流での欠失の、アラニン収量及び生産性に対する影響を確認するために、大腸菌Ex1（QZ16）株のゲノムに欠失を導入して、大腸菌QZ32株を作製した。
【０２３０】
大腸菌QZ32株の菌株構築
選択可能なクロラムフェニコール耐性マーカー及び対抗選択可能なsacBマーカー（スクロース感受性を付与する）を含むydbH-ldhA-cat-sacBカセット（3091bp）を、Phusionホットスタート高忠実性DNAポリメラーゼ（Thermo社）を用いて、プライマーRec1_1_F及びRec1_1_Rにより鋳型ベクターpQZ11（Genescript社）から増幅した。PCR産物を、プラスミド鋳型バックグラウンドを減少させるために37℃にて1時間、DpnI（NEB社）消化し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen社）を用いて1％アガロースゲルからゲル抽出した。ydbH-ldhA欠失カセット（116bp）を、Phusionホットスタート高忠実性DNAポリメラーゼ（Thermo社）を用いて、自己アニーリングプライマーRec1_2_F及びRec1_2_Rのセットから増幅し、QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen社）を用いて精製した。
【０２３１】
Red/ET組換えのために、Genebridges Red/ET Recombination Kitを、製造業者のプロトコールに従って用いた。約200ngのydbH-ldhA-cat-sacB PCR産物を、Red/ET能の高い大腸菌Ex1株細胞へとエレクトロポレーションした。培養物を、エレクトロポレーション後の陽性形質転換体の選択のために、10μg/mLクロラムフェニコールを含むLB寒天平板上に播種した。ゲノム特異的プライマーRec1_seq_F及びRec1_seq_Rを用いるPCRにより、マーカーカセットの組み込みに関して、数個のコロニーをスクリーニングした。PCRで確認されたクローンを、cat-sacBマーカーカセットを置き換えるためのydbH-ldhA欠失カセットを用いる第2のRed/ET組換えのために用いた。培養物を、エレクトロポレーション後の陽性形質転換体の選択のために、NaClを含まず、6％スクロースを含むLB寒天平板上に播種した。cat-sacBマーカーカセットの欠損に関して、ゲノム特異的プライマーRec1_seq_F及びRec1_seq_Rを用いて、数種類のクローンをスクリーニングした。正しいサイズのPCR産物を生じた少なくとも1種類のクローンは、配列決定（Genewiz社）によっても確認した。バイオリアクター中で菌株を試験する前に、LB平板上にて一晩、42℃で、菌株から熱感受性組換え性（recombineering）プラスミドpRedET（amp）を救済した。ydbH-ldhA欠失を、大腸菌Ex1（QZ16）株へと導入した。ydbH-ldhAプロモーター欠失を含む得られたQZ16株を、QZ32株と称した。
【０２３２】
ydbH欠失及び新規alaDプロモーターの役割の決定
529bpのydbH-ldhAプロモーター欠失によりalaDの過剰発現が達成されるメカニズムをさらに特徴付けるため、かつ部分的なydbH遺伝子の欠失がそこで役割（roll）を有するか否かを決定するために、大腸菌QZ16株に基づく2種類の菌株を構築した。大腸菌QZ63株では、50bpのldhAプロモーター配列のみが欠失され、新規プロモーター（配列番号55）を形成させるために、新規alaDプロモーター配列を補完することが予測される追加の塩基対TATTGが追加された。大腸菌QZ64株では、ydbH遺伝子全体が欠失され、一方で生来のldhAプロモーターは損傷されずに残っている。
【０２３３】
大腸菌QZ63株及び大腸菌QZ64株の菌株構築
大腸菌QZ63株及び大腸菌QZ64株の菌株構築は、上記の通りに行なった。ΔPldhA-cat-sacBカセット（3091bp）をプライマーRec1B_1_F及びRec1B_1_Rを用いて増幅し、ΔydbH-cat-sacBカセット（3091bp）をプライマーRec1C_1_F及びRec1C_1_Rを用いて増幅した。生成されたPCRアンプリコンを、大腸菌QZ16株でのRed/ET組換えの基質として用いた。PldhA欠失カセット（125bp）及びydbH欠失カセット（108bp）は、自己アニーリングプライマーRec1B_2_F及びRec1B_2_R並びにRec1C_2_F及びRec1C_2_Rをそれぞれ用いて増幅した。PCRアンプリコンを、cat-sacBマーカーカセットを置き換え、所望の遺伝子型の大腸菌QZ63株及び大腸菌QZ64株を作製するために用いた。大腸菌QZ63株のコロニーを、ゲノム特異的プライマーRec1B_seq_F及びRec1B_seq_Rを用いるPCRにより試験し、少なくとも1種類の陽性クローンを配列決定により確認した。大腸菌QZ64株のコロニーを、ゲノム特異的プライマーRec1C_seq_F及びRec1C_seq_Rを用いるPCRにより試験し、少なくとも1種類の陽性クローンを配列決定により確認した。
【０２３４】
SDS-PAGE分析
alaDの発現レベルに対するydbH-ldhAプロモーター欠失の影響を調べるために、作製された大腸菌QZ32株のSDS-PAGE分析を、大腸菌W株、大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ20株と比較して行なった。37℃、200rpmでのLB培地中の一晩培養物由来の細胞を、OD600に対して正規化し、回収して、溶解させた。可溶性タンパク質画分を、比較のためにSDS-PAGEにロードした。
【０２３５】
大腸菌QZ20株で見出される通りの529bp ydbH-ldhAプロモーター欠失を有する菌株（QZ32株）でのalaD（39.37kDa）の発現量は、QZ16株でのものよりも有意に高く、QZ20株でのAlaD発現レベルと同等であった（図8）。この結果は、alaDの上流の大腸菌QZ20株で見出される529bp欠失が、alaD遺伝子の著しい過剰発現を引き起こすことを示す。
【０２３６】
AlaD酵素的in vitroアッセイ
大腸菌QZ32株を、大腸菌W株、大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ20株細胞溶解物と比較して、in vitroにて粗精製細胞溶解物中でのAlaD活性について試験した。
【０２３７】
粗精製溶解物は、LB培地中で37℃で増殖させた一晩培養物から調製した。遠心分離により細胞をペレット化し、BugBuster（Novagen社）界面活性剤を製造業者の推奨プロトコールに従って用いて、溶解させた。粗精製溶解物の総タンパク質濃度は、Bradfrod Assay（Amresco社）及びウシ血清アルブミン（BSA）標準曲線を用いて測定した。alaDにより触媒される反応
（L-アラニン＋H2O＋NAD+→ ピルビン酸＋NH3＋NADH＋H+）
←
は可逆的であり、L-アラニンからピルビン酸への逆変換を、λ＝340nmにて分光光度計を用いて、NADHの形成を介して間接的にモニタリングした。
【０２３８】
このin vitroアッセイ反応は、125mMグリシン/KOH（pH10.2）、125mMグリシン/KOH（pH10.2）中の100mM L-アラニン、10mM Tris-HCl（pH7.0）中の1.25mM NAD+及びグリシン/KOH中のOD600に対して正規化された10μL粗精製細胞溶解物を含有した（合計アッセイ体積300μL）。アッセイ成分を氷上でまとめ、NADの添加により反応を開始させた。動的読み取り（kinetic read）（λ＝340nm）を、37℃×15分（30秒毎）で行なった。
【０２３９】
alaD遺伝子を含まない大腸菌W株の粗精製溶解物は、粗精製細胞溶解物を含まない陰性対照と同様の結果を生じた（図9）。SDS-PAGE分析（図8）から予測される通り、ldhA遺伝子がalaD遺伝子で置き換えられた大腸菌QZ16株は、大腸菌W株と比較してほとんどalaD酵素活性を示さなかった。ydbH-alaDプロモーター欠失を有するQZ20株は、観察されたAlaD発現の増大から予測される通り、大腸菌QZ16株と比較して有意に高い体積測定alaD酵素活性を示した。大腸菌QZ32株の体積測定alaD酵素活性は、大腸菌QZ20酵素活性と近かった。
【０２４０】
alaD遺伝子転写レベルのRT-qPCR分析
alaDタンパク質発現をモニタリングするためのSDS-PAGE分析の他に、定量的逆転写PCRを（RT-qPCR）によって、alaD転写レベルを測定した。iTaq Universal One-Step Kit（Biorad社）を、SYBR Greenベースのワンステップ逆転写（RT）-qPCR反応のために用いた。前述の通りに行なわれた大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ20株の並行バッチ発酵から、8、11、22、28及び48時間で培養物サンプルを採取した。サンプルを、RNAを安定化させるために直ちにRNAprotect Bacteria Reagent（Qiagen社）を用いて処理した。AurumTotal RNA Mini Kit（Biorad社）を製造業者のマニュアルに従って用いて、サンプルからRNAを抽出した。混入したゲノムDNAを除去して、qPCR中のバックグラウンドを低下させるために、DNA-free DNA Removal Kit（lifetechnologies社）を用いて単離されたRNAをさらに処理した。RNAを、λ＝260nmにて分光光度法で定量した。
【０２４１】
100ngの大腸菌QZ16株RNAの7段階10倍希釈系列を、以下のRT-qPCRプライマー（表1）を用いて試験した：alaD遺伝子に特異的であるalaD_RT_F及びalaD_RT_R、並びにqPCR試験中に参照遺伝子として機能したrrsA遺伝子をコードするリボソーム16S RNAに特異的であるrrsA_RT_F及びrrsA_RT_R。シグナル増幅効率90％＜E＜110％及び線形回帰因子R2＞0.985をもたらしたRNA希釈の好適な線形ダイナミックレンジを、それぞれのRT-qPCRプライマーセットに対して決定した。rrsAは正規化のための内部参照遺伝子としてのその好適性に関して試験され、すべての被験サンプルにわたって好適に発現されることが見出された（データ示さず）。RT-qPCR反応は、CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System（Biorad社）を製造業者のプロトコールに従って用いて行なった。遺伝子発現の相対的定量化は、ΔΔCt法に従って内部較正因子として大腸菌QZ16株8時間RNAを用いて算出した。
【０２４２】
alaDは、8時間では大腸菌QZ16株と比較して大腸菌QZ20株での11倍高い発現を示す（図10）。このことは、alaD遺伝子発現に対するydbH-ldhAプロモーター欠失の影響の別の確認である。
【０２４３】
大腸菌QZ16株と比較した大腸菌QZ32株の発酵試験
大腸菌QZ32株を、実験室規模のバイオリアクター中での発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、大腸菌QZ16株及びQZ20株と比較してモニタリングした。
【０２４４】
前培養物を、37℃かつ200rpmにて一晩、20％の充填容量のLB培地を含む振盪フラスコ中で増殖させた。発酵は、500mL NBS培地（3.50g/L KH2PO4、5.00g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4・7H2O、3.50g/L (NH4)2HPO4、0.5mg/Lチアミン、15.00mg/L CaCl2・2H2O、15.00g/L (NH4)2SO4、153.61mg/Lベタイン、1ml/L微量金属ストック溶液）中でDASGIP 1.5L並行バイオリアクターシステム（Eppendorf社）にて行なった。微量金属ストックは、1.6g/L FeCL3・6H2O；0.2g/L CoCl2・6H2O；0.1g/L CuCl2・2H2O；0.2g/L ZnCl2；0.2g/L NaMoO4・2H2O；0.05g/L H3BO3、0.1M HCLを含んだ。80g/Lグルコースを、発酵培地中の炭素源として用いた。
【０２４５】
OD600・mLが7に相当する大腸菌細胞を、遠心分離によって回収し、5mL NBS培地中に再懸濁した。#OD600・mL＝(未希釈培養物のOD600)×(培養体積(mL))。5mLの再懸濁された細胞を用いて、1.5L DASGIPバイオリアクター中の500mL培養培地に接種した。それぞれの菌株を、37℃及び400rpm撹拌速度にて2回反復で実験した。pHを6.8に制御し、かつ発酵全体を通してアラニン前駆体としてのアンモニアを培養物に提供するために、5N NH4OHを用いた。細胞による培地中の溶存酸素の初期消費後に発酵を微好気的条件下で行なうために、発酵の間は通気せず、容器を加圧しなかった。サンプルを発酵全体を通して採取し、アラニン及びグルコース濃度についてHPLCにより分析した。
【０２４６】
ydbH-ldhAプロモーター欠失及びそれにより生じるQZ32株での主要な酵素であるalaDの相対的に高い発現レベルがアラニン形成に強い影響を有することは、自明であった（図11）。2.00±0.07g/(Lh)の有意に高い最大の体積測定アラニン形成速度が大腸菌QZ32株で到達され、それと比較して、大腸菌QZ16株は約0.74±0.02g/(Lh)の最大の体積測定アラニン形成速度を示した。大腸菌QZ16株は、50時間超の延長された発酵時間の後でさえ、発酵培地中の80g/Lグルコースを完全に消費できなかった。50時間後のQZ16株の、反応器容量及び時間で除算した生成産物の量として定義される体積測定アラニン生産性（空時収量）は0.58±0.04g/(Lh)であった。大腸菌QZ32株はグルコース枯渇時で1.47±0.04g/(Lh)の合計での体積測定アラニン生産性を示した（図12）。
【０２４７】
大腸菌QZ63株及び大腸菌QZ64株の発酵試験
発酵は、上記の通りに行なった。大腸菌QZ63株、大腸菌QZ64株、大腸菌QZ16株及び大腸菌QZ32株を、2回反復で並行して実験した。
【０２４８】
QZ64株でのydbH遺伝子欠失は、QZ16株と比較してアラニン生産性の上昇をもたらさなかった（データ示さず）。しかしながら、新規alaDプロモーターを補完することが予測されるTATTG ntを用いたwt ldhAプロモーター中の50bpの置換は、QZ16株と比較してQZ63株でのアラニン形成の有意な増大をもたらした（図11）。QZ63株のアラニン形成は、延長された529bp ydbH-ldhAプロモーター欠失を担持するQZ32株と同等であった。QZ63株はまた、QZ32株（1.47±0.05g/(Lh)）と同様の1.36±0.08g/(Lh)の体積測定アラニン生産性を示した（図12）。
【０２４９】
このことは、alaDの上流の新規プロモーターのみが、alaD発現の増大、したがって、より良好なアラニン生産性の原因となることを示す。
【０２５０】
実施例7：アラニン収量に対するygaW遺伝子中のSNPの影響の確認
大腸菌QZ20株ゲノム配列では、ygaW遺伝子中のG15TがQ5Hアミノ酸交換を生じさせることが明らかにされた。YgaW（alaEとも称される）は、以前に、アラニンエクスポーターであることが決定された。プラスミドからのygaWの過剰発現が、アラニン排出を引き起こすことが示された（国際公開第2012/172822号）。アラニン収量に対するygaW遺伝子中のSNPの影響を試験するために、それぞれの突然変異を、QZ16株と比較してalaD発現が増強された大腸菌QZ32株遺伝的バックグラウンドへと導入した。他のアミノ酸交換がアラニン収量に対する有益な影響を有するか否かを試験するために、さらなる突然変異を、同じコドンに導入した。
【０２５１】
大腸菌QZ33株、QZ60株、QZ61株、QZ62株の菌株構築
菌株構築を、上記の通りに行なった。ygaW-cat-sacBカセット（3091bp）は、プライマーRec2_1_F及びRec 2_1_Rを用いて増幅した。ygaW-SNP-カセット（130bp）は、自己アニーリングプライマーRec2_2_F及びRec2_2_Rを用いて増幅した。対照PCRを、ゲノム特異的プライマーRec2_seq_F及びRec 2_seq_Rを用いて行なった。ydbH-ldhAプロモーター欠失及びYgaW Q5H SNPを有する作製された菌株を、QZ33株と命名した。
【０２５２】
同様に、代替的なアミノ酸置換を大腸菌QZ32株に導入した。対象となる突然変異を含む二本鎖DNA（gBlocks）をIDT Technologies社に発注し、Red/ET組換え中にcat-sacBマーカーカセットを置き換えるために用いた。大腸菌QZ60株はYgaW Q5N突然変異を保持し、大腸菌QZ61株はYgaW Q5R突然変異を保持し、大腸菌QZ62株はYgaW Q5Y突然変異を保持する。
【０２５３】
大腸菌QZ32株、QZ60株、QZ61株及びQZ62株、QZ33株の発酵試験
QZ33株（ygaW Q5H、ydhB-ldha欠失突然変異体）を、大腸菌QZ32株と比較して、発酵中のその性能について試験した。バッチ発酵を、上記の通りに行なった。
【０２５４】
ygaW Q5H突然変異は、大腸菌QZ32株と比較して大腸菌QZ33株のアラニン形成のさらなる増大をもたらした（図13）。大腸菌QZ32株の1.47±0.05g/(Lh)と比較して、1.82±0.03g/(Lh)のさらに増強された体積測定アラニン生産性が、大腸菌QZ33株を用いて到達された（図14）。
【０２５５】
代替的Q5突然変異を有する菌株を、バッチ発酵中に同一の条件下で試験した。3種類すべての代替的突然変異が、野生型YgaWを有する大腸菌QZ32株と比較して高い最大アラニン形成速度を示した（図15）。大腸菌QZ60株（YgaW Q5N）は1.56±0.004g/(Lh)の体積測定アラニン生産性を示し、大腸菌QZ61株（YgaW Q5R）は1.68±0.02g/(Lh)、QZ62株（YgaW Q5Y）は1.61±0.04g/(Lh)を示し、それと比較してQZ32株の体積測定アラニン生産性は1.47±0.04g/(Lh)であった（図14）。したがって、アルギニン置換が最も強い有益な影響を有し、それにチロシン置換及びアスパラギン置換が続いた。しかしながら、YgaW Q5H突然変異を有する大腸菌QZ33株が、1.82±0.03g/(Lh)の体積測定アラニン生産性を伴って、合理的に設計された突然変異体のそれぞれよりも、適応進化の間に優れていたことが見出された。
【０２５６】
ygaW遺伝子転写レベルのRT-qPCR分析
YgaWのN末端領域中の単一SNPが、増強されたアラニンエクスポーター活性を付与する正確なメカニズムは不明である。本発明者らは、遺伝子特異的プライマーygaW_RT_F及びygaW_RT_R（表1）を用いて、上述した通りのRT-qPCRによって、QZ16株及びQZ20株のRNAサンプルでのygaWの遺伝子発現レベルを試験した。遺伝子発現データは、参照遺伝子としてrrsAを用いて正規化して、較正因子としての大腸菌QZ16株8時間での遺伝子発現レベルに対して計算した。
【０２５７】
8時間及び11時間発酵からの菌株サンプルに対して、ygaW遺伝子発現の有意なアップレギュレーション又はダウンレギュレーションは観察されなかった（図16）。これらの結果は、YgaW Q5H突然変異の影響は相対的に高いygaW発現レベルには関連しないが、YgaW活性又は安定性には直接的に影響を及ぼしているはずであることを確認する。
【０２５８】
実施例8：アラニン収量に対するzipA遺伝子中のSNPの影響の確認
zipA SNPがアラニン生産性に対して果たす役割を決定するために、zipA SNPを、大腸菌QZ33株（ydbH-ldhAプロモーター欠失、YgaW Q5H）へと導入した。
【０２５９】
菌株構築
zipAは必須遺伝子であるので、zipA cat-sacB組み込みカセットを、zipAに干渉せず、しかしその下流に組み込むために設計した。カセットは、プライマーRec4B_1_F/R（表1）を用いてベクターpQZ11（Genescript社）から増幅した。zipA SNPカセット（197bp）は、プライマーRec4B_2_F/Rを用いてQZ20株のゲノムDNAから増幅した。Red/ETを上記の通りに行なった。Rec4_seq_F/R配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。zipA SNPを、ldhAプロモーター欠失及びygaW SNPを有する大腸菌QZ33株へと導入した。作製された菌株は、QZ41株と称された。
【０２６０】
QZ33株及びQZ41株の発酵試験
QZ41株（zipA SNP、ygaW Q5H、Δldha突然変異体）を、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ33株と比較してモニタリングした。
【０２６１】
zipA SNPは、前駆体菌株であるQZ33株と比較して、アラニン形成のさらなる増大をもたらした（図17）。QZ41株の体積測定アラニン生産性は、1.82±0.03g/(Lh)と比較して、2.06±0.06g/(Lh)であった（図18）。
【０２６２】
実施例9：アラニン収量に対するlpd遺伝子中のSNPの影響の確認
アラニン生産性に対するlpd SNPの影響を試験するために、大腸菌WZ33株（ydbH-ldhA del、ygaW Q5H）へとこれを導入して大腸菌QZ52株を作製し、QZ41株（ydbH-ldhA del、ygaW Q5H、zipA SNP）へと導入して大腸菌QZ53株を作製した。
【０２６３】
菌株構築
lpd cat-sacB組み込みカセット（3087bp）を、lpdに干渉せず、しかしその上流に組み込むために設計した。カセットは、プライマーRec3B_1_F/R（表1）を用いてベクターpQZ11（Genescript社）から増幅し、lpd SNPを担持するQZ20株へと組み込むために用いた。lpd_SNP-cat-sacBカセット（3527bp）は、プライマーRec3B_2_F/Rを用いて、組み込まれたcat-sacBカセットを有するQZ20株のゲノムDNAから増幅し、大腸菌QZ33株及び大腸菌QZ41株へとそれぞれ組み込むために用いた。cat-sacB置換カセットは、QZ20株のゲノムからプライマーRec3B_F/Rを用いて増幅し、QZ33株及びQZ41株中のcat-sacBマーカーカセットを除去するために用いた。Red/ETは、上記の通りに行なった。Rec3_seq_F及びRec_3B_FR配列決定プライマーを用いるコロニーPCRにより、クローンを試験した。
【０２６４】
QZ33株とQZ52株の発酵試験
QZ52株（ΔydbH-ldhaプロモーター、ygaW Q5H、lpd SNP）を、炭素源として10g/Lグルコースを用いて、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ33株と比較してモニタリングした。
【０２６５】
lpd SNPは、QZ33株と比較して、アラニン形成に対する有意な正の影響を有した（図19）。QZ33株は52時間のモニタリング時間内に発酵培地中の100g/Lグルコースを完全に消費することができなかった。QZ52株は、41時間以内に利用可能なグルコースを完全に消費し、同じ時間でのQZ33株の1.45±0.007g/(Lh)と比較して、1.79±0.160g/(Lh)の体積測定アラニン生産性に達した（図20）。
【０２６６】
QZ41株とQZ53株の発酵試験
lpd SNPが大腸菌QZ41株に導入されたQZ53株（ΔydbH-ldhaプロモーター、ygaW Q5H、zipA SNP、lpd SNP）を、上記の通りに発酵中のその性能について試験した。アラニン形成を、QZ41株と比較してモニタリングした。
【０２６７】
QZ53株中のlpd SNPもまた、QZ41株と比較してアラニン形成に対するその正の影響を示した（図22）。QZ53株の体積測定アラニン生産性は2.21±0.004g/(Lh)であり、それと比較してQZ41株は2.06±0.06g/(Lh)を有した（図23）。
【０２６８】
ydbH-ldhAプロモーター欠失、ygaW Q5H SNP、zipA SNP及びlpd SNPの結果としての体積測定アラニン生産性の全体的な改善は、図21に表わされる。
【０２６９】
lpd遺伝子の過剰発現
その生来のプロモーターの制御下にあるlpdの追加コピーを、pACYC184プラスミドへと導入した。pACYC184-Lpd（p15 ori、ChlR、1細胞当たり約15コピー）を、市販のInFusionクローニング技術（Clontech, Mountain View, CA, USA）によって構築した。最初に、ベクターpACYC184（p15 ori、chlR、tetR）をNEB社（Ipswich, MA, USA）を介して入手し、これもまたNEB社からのHindIII及びSalI制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化した。この消化は、テトラサイクリン耐性遺伝子の大部分を除去した。それとは別に、lpd ORFを、以下のプライマー（lpd-pACYC_F、配列番号114及びlpd-pACYC_R、配列番号115）と共にPhusionポリメラーゼ（Thermo Scientific, Waltham, MA）を用いて、野生型大腸菌W株DNAからPCR増幅した。
【０２７０】
プライマーは、シームレスなクローニングを容易にするために、直線化ベクターの末端に相同な追加の15bpオーバーハングを含んだ。次に、両方とも精製された直線化ベクターバックボーン及びlpdインサートを用いて、製造業者のプロトコールに従ってInFusion反応を行なった。続いて、得られたInFusion産物を、エレクトロポレーション及びLBクロラムフェニコール平板上での選択によってQZ33株（ydbH-ldhAプロモーター欠失、YgaW Q5H）を形質転換するために用いた。陽性クローンをPCRで特定し、DNA配列決定により確認し、過剰発現研究のための発酵で用いた。
【０２７１】
QZ33/pACYC184とQZ33/pACYC184-lpdとの発酵比較
lpd発現ベクターを含む菌株（QZ33/pACYC184-lpd）のアラニン生産性を、空の対照ベクターを含む菌株（QZ33/pACYC184）と比較した。前培養物を、37℃かつ200rpmにて一晩、20％の充填容量のLB培地を含む振盪フラスコ中で増殖させた。発酵は、8％グルコースのNBS培地を用いて、DASGIP 1.5L並行バイオリアクターシステムにて行なった。他の条件は上記と同様であった。
【０２７２】
33時間の時点で、QZ33/pACYC184-lpd株は58.4g/Lのアラニンを生成し、それと比較して、57.1g/LがQZ33/pACYC184株により生成された（図24）。
【０２７３】
QZ33/pACYC184株と比較して、QZ33/pACYC184-lpd株の空時収量（生産性）もまた、1.63から1.77g/h/Lに増大した（図25）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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