(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン配列、又は、
配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン配列、並びに、
ｂ．配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン配列
を含み、
野生型ヒトＣＣＲ７に結合するが、野生型マウスＣＣＲ７には結合しない、単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項２】
ＣＣＲ７抗原結合タンパク質は、抗ＣＣＲ７抗体であって、前記抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１に記載の単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項３】
ヒトＣＣＲ７への結合に関して、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体と競合する、請求項１に記載の単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ａ．ヒト抗体、
ｂ．ヒト化抗体、
ｃ．キメラ抗体、
ｄ．モノクローナル抗体、
ｅ．ポリクローナル抗体、
ｆ．組換え抗体、
ｇ．抗原結合性抗体フラグメント、
ｈ．一本鎖抗体、
ｉ．ダイアボディ、
ｊ．トリアボディ、
ｋ．テトラボディ、
ｌ．Ｆａｂフラグメント、
ｍ．Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、
ｎ．ドメイン抗体、
ｏ．ＩｇＤ抗体、
ｐ．ＩｇＥ抗体、
ｑ．ＩｇＭ抗体、
ｒ．ＩｇＧ１抗体、
ｓ．ＩｇＧ２抗体、
ｔ．ＩｇＧ３抗体、
ｕ．ＩｇＧ４抗体、又は
ｖ．Ｈ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を緩和する変異をヒンジ領域内に少なくとも１つは有するＩｇＧ４抗体
を含む、請求項１に記載の単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ＣＣＲ７へのＣＣＬ１９又はＣＣＬ２１の結合を阻害する、請求項１に記載の単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項６】
変異Ｆ４４Ｙでのみ野生型ヒトＣＣＲ７と相違する変異型ヒトＣＣＲ７ポリペプチドにも結合する、請求項１に記載の単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体と少なくとも同程度に該変異型ヒトＣＣＲ７ポリペプチドに結合する、請求項６に記載の単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項８】
変異Ｙ４４Ｆ及びＶ４７Ｌでのみ野生型マウスＣＣＲ７と相違する変異型マウスＣＣＲ７に結合しない、請求項１に記載の単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項９】
変異Ｋ２０１Ｒ、Ｎ２０２Ｓ、Ｇ２０４Ｓ、Ｔ２０７Ａ、及びＬ２０８Ｍでのみ野生型マウスＣＣＲ７と相違する変異型マウスＣＣＲ７に、抗体ｍＡｂ１９７よりよく結合する、請求項１に記載の単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質の軽鎖、重鎖、又はその両方をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号３、５及び７、又は、配列番号１１、１３及び１５の核酸配列を含む軽鎖可変ドメイン核酸配列、並びに、配列番号４３、４５及び４７の核酸配列を含む重鎖可変ドメイン核酸配列を含む、請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の該単離されたポリヌクレオチドを含むプラスミド。
【請求項１３】
発現ベクターである、請求項１２に記載のプラスミド。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の該単離されたポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
【請求項１５】
前記細胞の染色体が該ポリヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項１６】
ハイブリドーマである、請求項１４又は１５に記載の単離された細胞。
【請求項１７】
発現ベクターが前記ポリヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項１８】
ＣＨＯ細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項１９】
細菌細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項２０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項２１】
酵母細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項２２】
動物細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項２３】
ヒト細胞である、請求項１４に記載の単離された細胞。
【請求項２４】
ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を作製する方法であって、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の単離された細胞を、前記細胞が前記抗原結合タンパク質を発現することを可能にする条件下でインキュベートすることを含む、方法。
【請求項２５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＣＣＲ７抗原結合タンパク質を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９６２，２９６号の利益を主張する。上記の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（配列表の参照）
本願はＥＦＳ−Ｗｅｂにより電子形式の配列表を添付して出願されている。配列表はＡ−１８１４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のテキストファイルとして提供され、作成日は２０１４年３月１１日、サイズは２４２，８４８バイトである。配列表の電子形式での情報は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ＣＣＲ７と、そのリガンドＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１は、二次および三次（疾患関連）リンパ構造における樹状細胞、ならびにナイーブＴ細胞およびナイーブＢ細胞の遊走、組織化、および活性化に、他では補うことができない役割を果たしている。
【０００４】
ＣＣＲ７活性は、慢性炎症状態（Ｍｏｓｃｈｏｖａｋｉｓら，２０１２，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１９４９−５５）、アテローム性動脈硬化（Ｌｕｃｈｔｅｆｅｌｄら，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：１６２１−２８）、ＨＩＶ感染（Ｅｖａｎｓら，２０１２，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２３：１５１−５７）、およびがん（Ｂｅｎ−Ｂａｒｕｃｈ，２００９，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ３：３２８−３３）を含む多種多様な病状に関係づけられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｓｃｈｏｖａｋｉｓら，２０１２，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１９４９−５５
【非特許文献２】Ｌｕｃｈｔｅｆｅｌｄら，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：１６２１−２８
【非特許文献３】Ｅｖａｎｓら，２０１２，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２３：１５１−５７
【非特許文献４】Ｂｅｎ−Ｂａｒｕｃｈ，２００９，Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ３：３２８−３３
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本発明は、以下の配列のいずれかを含む単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を提供する：抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、もしくはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖可変ドメイン配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０ＹもしくはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖可変ドメイン配列；または抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメイン；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、もしくは６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑの軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な軽鎖可変ドメイン配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２の重鎖可変ドメイン配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な重鎖可変ドメイン配列；または抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２のそれぞれ軽鎖可変ドメイン配列および重鎖可変ドメイン配列とそれぞれ少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な軽鎖可変ドメイン配列および重鎖可変ドメイン配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、もしくは６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑの軽鎖可変ドメイン配列と１５、１２、１０、８、５、または３箇所以下のアミノ酸位置において相違する軽鎖可変ドメイン配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２の重鎖可変ドメイン配列と１５、１２、１０、８、５、または３箇所以下のアミノ酸位置において相違する重鎖可変ドメイン配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２のそれぞれ軽鎖可変ドメイン配列および重鎖可変ドメイン配列とそれぞれ１５、１２、１０、８、５、または３箇所以下のアミノ酸位置において相違する軽鎖可変ドメイン配列および重鎖可変ドメイン配列；または図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、もしくはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメイン配列；または図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０ＹもしくはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメイン配列；または図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、もしくはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメイン配列、および図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０ＹまたはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、または９９％同一な核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメイン配列；または図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、もしくはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列に、中等度にストリンジェントな条件下、ストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメイン配列；または図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０ＹもしくはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列に、中等度にストリンジェントな条件下、ストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメイン配列；または図１に記載する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、もしくはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列に、中等度にストリンジェントな条件下、ストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる軽鎖可変ドメイン配列、および同じ抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０ＹまたはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列に、中等度にストリンジェントな条件下、ストリンジェントな条件下、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされる重鎖可変ドメイン配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑの軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；または６Ｂ４．１、６Ｂ５���１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、もしくは６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０Ｙの重鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２の、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびに重鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑの軽鎖可変ドメイン配列のそれぞれ軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とそれぞれ３、２、または１箇所以下のアミノ酸位置において相違する軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；または６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、もしくは６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０Ｙの重鎖可変ドメイン配列のそれぞれ重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とそれぞれ３、２、または１箇所以下のアミノ酸位置において相違する重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列；または抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、もしくは６Ｅ１．２の軽鎖可変ドメイン配列のそれぞれ軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とそれぞれ３、２、または１箇所以下のアミノ酸位置において相違する軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびに同じ抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２の重鎖可変ドメイン配列のそれぞれ重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とそれぞれ３、２、または１箇所以下のアミノ酸位置において相違する重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列。
【０００７】
一実施形態において、前記抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質は、以下の配列を含む：図１に示す６Ｂ４．１  ＬＣの軽鎖配列または６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳの軽鎖配列および６Ｂ４．１  ＨＣの重鎖配列；または図１に示す６Ｂ５．１  ＬＣの軽鎖配列および６Ｂ５．１  ＨＣの重鎖配列；または図１に示す６Ｅ１．２  ＬＣの軽鎖配列もしくは６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑの軽鎖配列および６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、もしくは６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０Ｙの重鎖配列；またはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、もしくはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖配列およびＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖配列。
【０００８】
もう一つの実施形態において、前記単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質は、ヒトＣＣＲ７への結合に関して抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２と競合する。
【０００９】
もう一つの実施形態において、前記抗原結合タンパク質は、以下のドメインのいずれかを含む：１つ以上の非生殖細胞系アミノ酸残基が対応する生殖細胞系残基で置き換えられている点だけが抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２の軽鎖可変ドメインと相違する軽鎖可変ドメイン；１つ以上の非生殖細胞系アミノ酸残基が対応する生殖細胞系残基で置き換えられている点だけが抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２の重鎖可変ドメインと相違する重鎖可変ドメイン；または１つ以上の非生殖細胞系アミノ酸残基が対応する生殖細胞系残基で置き換えられている点だけが抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２の軽鎖可変ドメインと相違する軽鎖可変ドメイン、および１つ以上の非生殖細胞系アミノ酸残基が対応する生殖細胞系残基で置き換えられている点だけが同じ抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２の重鎖可変ドメインと相違する重鎖可変ドメイン。
【００１０】
もう一つの実施形態において、前記単離されたＣＣＲ７抗原結合タンパク質は、ヒト抗体；ヒト化抗体；キメラ抗体；モノクローナル抗体；ポリクローナル抗体；組換え抗体；抗原結合性抗体フラグメント；一本鎖抗体；ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；ドメイン抗体；ＩｇＤ抗体；ＩｇＥ抗体；ＩｇＭ抗体；ＩｇＧ１抗体；ＩｇＧ２抗体；ＩｇＧ３抗体；ＩｇＧ４抗体；またはＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を緩和する変異をヒンジ領域内に少なくとも１つは有するＩｇＧ４抗体を含む。
【００１１】
もう一つの実施形態において、前記単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質は、ＣＣＲ７へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合を阻害する。
【００１２】
もう一つの態様において、本発明は、単離された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質の軽鎖、重鎖、またはその両方をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
一実施形態において、前記単離されたポリヌクレオチドは、図１の軽鎖可変ドメイン核酸配列および／または重鎖可変ドメイン核酸配列を含む。
【００１４】
もう一つの態様において、本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドを含むプラスミドを提供する。
【００１５】
一実施形態において、前記プラスミドは発現ベクターである。
【００１６】
もう一つの態様において、本発明は、前記単離されたポリヌクレオチドを含む単離された細胞を提供する。
【００１７】
もう一つの実施形態では、前記細胞の染色体が前記ポリヌクレオチドを含む。
【００１８】
もう一つの実施形態では、前記細胞がハイブリドーマである。
【００１９】
もう一つの実施形態では、発現ベクターが該ポリヌクレオチドを含む。
【００２０】
もう一つの実施形態では、前記細胞がＣＨＯ細胞である。
【００２１】
もう一つの実施形態では、前記細胞が細菌細胞である。
【００２２】
もう一つの実施形態では、前記細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
【００２３】
もう一つの実施形態では、前記細胞が酵母細胞である。
【００２４】
もう一つの実施形態では、前記細胞が動物細胞である。
【００２５】
もう一つの実施形態では、前記細胞がヒト細胞である。
【００２６】
もう一つの態様において、本発明は、抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を作製する方法であって、前記単離された細胞が前記抗原結合タンパク質を発現することを可能にする条件下で、前記単離された細胞をインキュベートすることを含む前記方法を提供する。
【００２７】
もう一つの態様において、本発明は、前記抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｂ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｃ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｄ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｅ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｆ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｇ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｈ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｉ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｊ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｋ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｌ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｍ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｎ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｏ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｐ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｑ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｒ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｓ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｔ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｕ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｖ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｗ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｘ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｙ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１Ｚ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＡ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＢ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＣ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＤ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＥ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＦ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＧ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＨ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＩ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＪ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＫ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＬ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＭ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＮ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＯ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＰ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＱ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図１ＡＲ】本明細書に開示する抗体および他のポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列を記載する。軽鎖および重鎖抗体配列の可変ドメイン配列に下線を付す。
【図２】ハイブリドーマ上清スクリーンの結果を記載する。
【図３】ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１によって誘導されるＣＣＲ７活性の阻害に関する抗体ｍＡｂ１９７、６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、および６Ｅ１．２のＩＣ５０を決定するためのグラフを記載する。
【図４】抗体ｍＡＢ１９７、６Ｂ５．１、６Ｂ４．１、６Ｅ１．２、６Ｅ１．２  Ｇ２Ｖ、および６Ｅ１．２  Ｆ９０Ｙに関するＩＣ５０決定を記載する。
【図５】抗体ｍＡｂ１９７、６Ｂ４．１、および６Ｂ５．１に関するエピトープマッピングデータを記載する。
【図６】抗体ｍＡｂ１９７、６Ｂ４．１、および６Ｂ５．１に関するエピトープマッピングデータを記載する。
【図７】抗体ｍＡｂ１９７、６Ｂ４．１、および６Ｂ５．１に関するエピトープマッピングデータを記載する。
【図８】抗体ｍＡｂ１９７、６Ｂ４．１、および６Ｂ５．１に関するエピトープマッピングデータを記載する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書において使用する見出しは整理を目的とするものにすぎず、記載されている内容を限定するものと解釈してはならない。
【００３０】
本明細書に別段の定義がある場合を除き、本願との関連で使用される科学用語および技術用語は、当技術分野における通常の知識を有する者が一般に理解している意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がある場合を除き、単数形の用語は複数を包含するものとし、複数形の用語は単数を包含するものとする。
【００３１】
一般に、本明細書に記載する細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質化学および核酸化学、製造、製剤、薬理学、ならびに医学の術語および技法は、当技術分野において周知でありよく使用されているものである。本発明の方法および技法は、別段の表示がある場合を除き、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って、本明細書の全体にわたって引用し論述するさまざまな一般文献およびより専門的な文献に記載されているように行われる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋら著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌら著「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ著「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９９０）を参照されたい。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様書に従って、当技術分野で一般に遂行されているように、または本明細書に記載するように行われる。本明細書に記載する分析化学、有機合成化学、医化学および薬化学との関連で使用される術語ならびにその実験手法および技法は、当技術分野において周知でありよく使用されているものである。化学合成、化学分析、医薬調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置には、標準的な技法を使用することができる。
【００３２】
本発明は、本明細書に記載する特定の方法論、プロトコール、試薬などに限定されない。本明細書において使用する術語には、特定の実施形態を説明するという目的しかなく、特許請求の範囲によって画定される本発明の範囲を限定する意図はない。
【００３３】
実施例または別段の表示がある場合は別として、本明細書において使用する成分の量または反応条件を表現する数字は全て、いずれの場合も「約」という用語で修飾されていると理解すべきであり、この用語は関連技術分野の当業者によって解釈されるであろう。
【００３４】
定義
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドポリマーを包含する。それらは、例えば一本鎖、二本鎖、または三本鎖であるか、一本鎖および／または二本鎖および／または三本鎖の組み合わせであることができる。ヌクレオチドポリマーが２本以上の鎖を含む場合、各鎖はそれ自体がポリヌクレオチドまたは核酸であると理解される。ヌクレオチドポリマーが二本鎖である場合、その鎖のそれぞれは、典型的には、互いに相補的であるが、その相補性は完全である必要はなく、場合によっては、あるハイブリダイゼーション条件下でのみそれら２本の鎖の安定な会合またはハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相補性である。ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然ヌクレオチドまたは人工ヌクレオチド類似体、例えばリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはどちらかのタイプのヌクレオチドの修飾型、または異なるタイプのヌクレオチドおよび／もしくはヌクレオチド類似体の組み合わせなどであることができる。該修飾としては、例えば、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’，３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）およびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、１つ以上の非ポリヌクレオチド化学物質、例えばラベル（例えば放射性ラベル）、蛍光ラベル、ハプテンまたは抗原性ラベルなどの付加によって、共有結合的に、または非共有結合的に修飾されたヌクレオチドポリマー、ならびにハイブリダイゼーションメンブレン（例えばニトロセルロースハイブリダイゼーションメンブレン）、ビーズ、容器の壁面などの固形物または表面に、共有結合的に、または非共有結合的に結合されたヌクレオチドポリマーを包含する。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、一般に、短いポリヌクレオチドまたは核酸配列を指す。特定オリゴヌクレオチドの長さは、その作製方法および／または意図したその用途に依存するであろう。この用語は、典型的には、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが１０〜６０塩基長である。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば一本鎖でも、二本鎖でも、三本鎖でもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドはセンスオリゴヌクレオチドでもアンチセンスオリゴヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、２つ以上のポリヌクレオチドを接合するためのアダプター、およびハイブリダイゼーションプローブなどといった、多くの用途を有しうる。
【００３６】
「単離された核酸分子」は、ゲノム由来、ｍＲＮＡ由来、ｃＤＮＡ由来、もしくは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそれらの何らかの組み合わせであって、その自然の環境から少なくとも部分的に取り出されているものを意味する。単離された核酸分子の例として、自然界に見いだされる配列を有するが合成的に生産された核酸、天然の核酸であって、自然界において当該単離されたポリヌクレオチド中に見いだされるポリヌクレオチドの全部または一部分を伴わないもの、天然の核酸であって、自然界では当該核酸が連結されていないポリヌクレオチドに連結されているもの、および天然の核酸であって、それぞれにとって自然の細胞環境から少なくとも部分的に取り出されたものが挙げられる。本開示に関して、特定ヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、インタクトな天然染色体を包含しないと理解すべきである。指定した核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、例えば１つ以上の他のコード配列、言及した核酸配列のコード領域の発現を制御し、またはその発現に影響を及ぼす作動的に連結された調節配列、ベクターまたはプラスミド配列、核酸の複製を制御し、またはその複製に影響を及ぼす配列、制限部位、プライマー結合部位などといった、他の配列も含みうる。
【００３７】
別段の指定がある場合を除き、本明細書に記載するどの一本鎖ポリヌクレオチド配列もその左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向という。新生ＲＮＡ転写産物の５’→３’付加の方向を転写方向といい、ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上でＲＮＡ転写物の５’端に対して５’側にある配列領域を「上流配列」といい、ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上でＲＮＡ転写産物の３’端に対して３’側にある配列領域を「下流配列」という。
【００３８】
「制御配列」という用語は、それがライゲーションされているコード配列の発現および／またはプロセシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存しうる。特定の実施形態において、原核生物用の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含みうる。真核生物用の制御配列の例には、１つまたは複数の転写因子認識部位、転写エンハンサー配列、および転写終結配列が含まれる。「制御配列」という用語がリーダー配列および／または融合パートナー配列を指す場合もある。
【００３９】
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞中に移行させるために使用される任意の分子または実体（例えば核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００４０】
「発現ベクター」、「発現プラスミド」、および「発現コンストラクト」という用語は、それぞれ、宿主細胞の形質転換に適し、それに作動的に連結された１つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と協力して）可能にする核酸を含有するベクターを指す。限定するわけではないが、発現コンストラクトは、転写、翻訳に影響を及ぼし、または転写、翻訳を制御し、イントロンが存在する場合には、それに作動的に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を含みうる。
【００４１】
本明細書にいう「作動的に連結された」とは、この用語を適用される構成要素が、適切な条件下で、それらがそれぞれの固有のまたは所望の機能を果たすことを可能にする関係にあることを意味する。ベクター内でタンパク質コード配列に「作動的に連結された」制御配列の一例は、タンパク質コード配列の発現が当該エンハンサー領域の転写活性に適合する条件下で達成されるような形でタンパク質コード配列に（直接または中間配列を介して）ライゲーションされているエンハンサー領域である。
【００４２】
「宿主細胞」という用語は、目的のコード配列を正しい条件下で発現する能力を有する細胞を意味する。この用語は、目的のコード配列が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態または遺伝子構成が同一であるかどうかに関わりなく、親細胞の子孫を包含する。「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換された結果、目的のコード配列を発現する細胞、または核酸配列で形質転換されることで目的のコード配列を発現する能力を有する細胞であることができる。
【００４３】
「形質導入」という用語は、ある細菌から別の細菌への遺伝子の移行を意味し、通常はバクテリオファージによって起こる。「形質導入」は、複製欠損レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移行も指す。
【００４４】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞中に導入された時に、細胞は「トランスフェクトされた」という。いくつかのトランスフェクション技法が当技術分野ではよく知られており、本明細書でも開示する。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら著（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（前掲）；Ｄａｖｉｓら著（１９８６）「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。そのような技法は、適切な宿主細胞中に１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入するために使用することができる。トランスフェクト細胞を作製するために使用する技法と所望するトランスフェクト細胞の用途とに応じて、細胞を安定にトランスフェクトするか、一過性にトランスフェクトすることができる。
【００４５】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように細胞が修飾された時に、細胞は形質転換されたという。例えば、細胞が形質転換されると、新しい遺伝物質が、例えばトランスフェクションもしくは形質導入によって、または化学的技法、バリスティック技法、もしくはエレクトロポレーション技法などといった他の技法によって導入されることで、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変される。形質転換に続いて、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体中に物理的に組み込まれることによって細胞のＤＮＡとの組換えを起こすか、複製されかつ／または細胞分裂時に安定に増殖されることなく、エピソーム要素として一過性に維持されるか、プラスミドとして独立して複製しうる。形質転換ＤＮＡが宿主細胞の細胞分裂周期の一部として複製される場合、その細胞は「安定に形質転換された」と見なされる。
【００４６】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために可換的に使用される。この用語は、天然のアミノ酸ポリマーだけでなく、１つ以上のアミノ酸残基が天然アミノ酸の類似体、誘導体、またはミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。この用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような修飾には、ポリペプチドの天然の修飾または人工的な修飾がいずれも含まれる。そのような修飾にはポリペプチドの配列を変えるものも変えないものもある。そのような修飾の例として、糖質残基の付加およびリン酸化が挙げられる。ポリペプチドおよびタンパク質は、天然の非組換え細胞によって生産しかつ／または修飾するか、遺伝子操作された細胞または組換え細胞によって生産することができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列から１つ以上のアミノ酸が欠失し、ネイティブ配列に１つ以上のアミノ酸が付加され、かつ／もしくはネイティブ配列の１つ以上のアミノ酸が置換されている分子を含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、ＣＣＲ７抗原結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質配列から１つ以上のアミノ酸が欠失し、抗原結合タンパク質配列に１つ以上のアミノ酸が付加され、かつ／もしくは抗原結合タンパク質配列の１つ以上のアミノ酸が置換されている配列を包含する。「ポリペプチドフラグメント」という用語は、完全長タンパク質と比較してアミノ末端欠失、カルボキシ末端欠失、および／または内部欠失を有するポリペプチドを指す。そのようなフラグメントは、完全長タンパク質と比較して、修飾アミノ酸も含有しうる。ある実施形態では、フラグメントが約５〜５００アミノ酸長である。例えば、フラグメントは、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることができる。有用なポリペプチドフラグメントとして、結合ドメインなどといった、抗体の免疫機能性フラグメントが挙げられる。ＣＣＲ７結合抗体の場合、有用なフラグメントとして、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分、または２つのＣＤＲを含むその可変領域のみなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
「単離されたタンパク質」は、（１）通常は当該タンパク質と一緒に見いだされる他のタンパク質または細胞構成要素を少なくともいくつかは含まないか、（２）同じ供給源からの、例えば同じ種からの、他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、（４）当該タンパク質に本来付随しているポリヌクレオチド、脂質、糖質、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されているか、（５）当該タンパク質に本来付随していないポリペプチドが（共有結合または非共有結合によって）作動的に付随しているか、または（６）自然には存在しない。「単離されたタンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成することができる。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡもしくは合成由来の他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せは、そのような単離されたタンパク質をコードしうる。いくつかの実施形態において、単離されたタンパク質は、その自然環境において見いだされるタンパク質もしくはポリペプチドまたは他の夾雑物であって、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、研究的使用または他の使用を妨害するであろうものを、実質的に含まない。
【００４８】
ポリペプチド（例えば抗原結合タンパク質または抗体）の「変異体」は、もう一つのポリペプチド配列との比較で、１つ以上のアミノ酸残基が挿入され、欠失し、かつ／または置換されているアミノ酸配列を含む。あるポリペプチドの全部または一部を含む融合タンパク質は、そのポリペプチドの変異体の一例である。
【００４９】
ポリペプチドの「誘導体」は、アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換とは異なる何らかの方法で、例えばもう一つの化学部分へのコンジュゲーションなどによって、化学的に修飾されたポリペプチド（例えば抗原結合タンパク質、または抗体）である。抗体の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインのいずれかの全部または大半を含有するが、抗体の他方の可変ドメインの大半または全部を欠く抗原結合タンパク質は、抗体の誘導体の一例である。
【００５０】
例えばポリペプチド、核酸、宿主細胞などといった生物学的材料との関連で本明細書の全体を通して使用する「天然の」という用語は、自然界に見いだされる材料を指す。
【００５１】
本明細書にいう「抗原結合タンパク質」は、指定したターゲット抗原、例えばＣＣＲ７またはヒトＣＣＲ７に特異的に結合するタンパク質を意味する。
【００５２】
抗体または抗体フラグメント、変異体、もしくは誘導体などの抗原結合タンパク質は、それがそのターゲット抗原に免疫特異的に結合する場合に、そのターゲット抗原に「特異的に結合する」という。いくつかの実施形態において、特異的に結合する抗原結合タンパク質は、１〜１０×１０−８Ｍの解離定数（ＫＤ）を有する。ＫＤが１〜１０×１０−９Ｍである場合、抗体は抗原に「高いアフィニティ」で特異的に結合し、ＫＤが１〜１０×１０−１０Ｍである場合は「非常に高いアフィニティ」で特異的に結合する。一実施形態では、抗体が１〜１０×１０−９ＭのＫＤおよび約１×１０−４／秒のオフ速度を有する。一実施形態では、オフ速度が約１×１０−５／秒である。別の実施形態では、抗体が、ＣＣＲ７またはヒトＣＣＲ７に、約１０−８Ｍ〜１０−１０ＭのＫＤで結合し、またもう一つの実施形態では、１〜２×１０−１０のＫＤで結合するであろう。
【００５３】
「抗原結合領域」とは、抗体または他の抗原結合タンパク質、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体のうち、指定した抗原に特異的に結合する部分を意味する。抗原結合領域は、１つ以上の「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）を含むことができる。ある抗原結合領域は、１つ以上の「フレームワーク」領域も含む。いくつかの抗体および他の抗原結合タンパク質のフレームワーク領域内の残基は、その抗原への抗体または抗原結合タンパク質の特異的結合に直接寄与することができるが、典型的には、フレームワーク領域は、抗原結合領域と抗原の間の結合を可能にするＣＤＲのコンフォメーションを維持するのを助ける。
【００５４】
ある態様では、ＣＣＲ７またはヒトＣＣＲ７に結合する組換え抗原結合タンパク質が提供される。この文脈において「組換えタンパク質」とは、組換え技法を使って、例えば組換え核酸の発現によって作製されたタンパク質である。組換えタンパク質を生産するための方法および技法は当技術分野ではよく知られている。
【００５５】
「抗体」という用語は、任意の種類のインタクトな抗原結合免疫グロブリン、またはそのフラグメントであってそれ自体が抗体のターゲット抗原に特異的に結合するものを指し、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二特異性抗体などを包含する。「抗体」は抗原結合タンパク質の一タイプである。いくつかの実施形態において、インタクトな抗体は、２本の完全長重鎖と２本の完全長軽鎖を含む。別の実施形態では、ラクダ科動物において天然に見られる抗体のように、インタクトな抗体が含む鎖の数が少なく、重鎖だけを含んでもよい。別の実施形態では、抗体の軽鎖または軽鎖可変領域の一部または全部を欠く抗体のフラグメントまたは誘導体が作製される。別の実施形態では、抗体の重鎖の一部または全部を欠く抗体のフラグメントまたは誘導体が作製される。そのような誘導体またはフラグメントは、典型的には、軽鎖または軽鎖フラグメントを接合し、かつ／またはそれらが、その抗原への当該フラグメントまたは誘導体の結合を可能にするコンフォメーションをとることを可能にするために、１つ以上のリンカーまたは他のアミノ酸配列を含むであろう。
【００５６】
抗体のアミノ酸配列はもっぱら単一の供給源に由来してもよいし、「キメラ」であってもよい（すなわち、後段でさらに説明するとおり、抗体の異なる部分が２つの異なる抗体に由来してもよい）。抗原結合タンパク質、抗体、または結合フラグメントは、ハイブリドーマで生産するか、組換えＤＮＡ技法によって生産するか、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生産することができる。別段の表示がある場合を除き、「抗体」という用語は、２本の完全長重鎖および２本の完全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、フラグメント、および変異種を包含する。
【００５７】
「軽鎖」という用語は、完全長軽鎖を包含すると共に、必要に応じて適切な重鎖または重鎖フラグメント、誘導体、もしくは変異体との組合せで、抗原への特異的結合を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメント、誘導体、および変異体も包含する。完全長軽鎖は可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬとを含む。軽鎖の例として、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖が挙げられる。
【００５８】
「重鎖」という用語は、完全長重鎖を包含すると共に、必要に応じて適切な軽鎖または軽鎖フラグメント、誘導体、もしくは変異体との組合せで、抗原への特異的結合を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメント、誘導体、および変異体も包含する。完全長重鎖は、可変領域ドメインＶＨと３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３とを含む。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥ、ならびにその誘導体および変異体を含めて、どのアイソタイプであってもよい。
【００５９】
本明細書にいう抗体または免疫グロブリン鎖（重鎖または軽鎖）の「免疫機能性フラグメント」は、完全長鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、抗原に特異的に結合する能力は有している、抗体の一部分（その部分が取得または合成された方法を問わない）を含む抗原結合タンパク質である。そのようなフラグメントは、ターゲット抗原に特異的に結合するという点で、生物学的に活性である。いくつかの実施形態では、そのようなフラグメントが、完全長軽鎖または完全長重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保ち、またいくつかの実施形態では、単一の重鎖および／もしくは軽鎖またはその一部分を含むであろう。これらの生物活性フラグメントは、例えば組換えＤＮＡ技法によって、または抗原結合タンパク質の、例えばインタクトな抗体の、酵素的もしくは化学的切断によって、生産することができる。免疫機能性免疫グロブリンフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および一本鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、任意の哺乳動物供給源、例えば限定するわけではないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科動物またはウサギなどに由来しうる。さらに、本明細書に開示する抗原結合タンパク質の機能性部分、例えば１つ以上のＣＤＲを、第２のタンパク質または小分子に共有結合することで、二機能性の治療特性を有する、または血清中半減期が延長されている、体内の特定ターゲットを指向する治療剤を創製することも考えられる。
【００６０】
「一本鎖抗体」は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とがフレキシブルなリンカーで接続されることで、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成している、Ｆｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開ＷＯ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳述されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域だけを含有する免疫機能性免疫グロブリンフラグメントである。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域をペプチドリンカーで共有結合的に接合することで、二価ドメイン抗体が創製される。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域のターゲットは同じ抗原であっても異なる抗原であってもよい。
【００６２】
「二価抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの実施形態では、それら２つの結合部位が同じ抗原特異性を有する。別の実施形態では、二価抗原結合タンパク質および二価抗体が二特異性である。
【００６３】
「多重特異性抗原結合タンパク質」または「多重特異性抗体」は、２つ以上の抗原またはエピトープに特異的に結合するものである。
【００６４】
「二特異性」、「二重特異性」または「二機能性」の抗原結合タンパク質または抗体は、それぞれが異なるエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する、それぞれハイブリッド抗原結合タンパク質またはハイブリッド抗体である。前記２つのエピトープは同じ分子上（例えばＣＣＲ７タンパク質上）に存在することも、異なる分子上（例えばＣＣＲ７タンパク質上とＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１上）に存在することもできる。二特異性の抗原結合タンパク質および抗体は、多重特異性抗原結合タンパク質または多重特異性抗体の一種であり、限定するわけではないがハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結などといった、さまざまな方法によって生産することができる。例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。
【００６５】
「阻害抗原結合タンパク質」、「阻害抗体」、「アンタゴニスト抗原結合タンパク質」、「アンタゴニスト抗体」、「中和抗原結合タンパク質」および「中和抗体」という用語は、それぞれ、そのターゲットに特異的に結合し、その結果、ターゲットの生物学的活性、例えばリガンド、受容体、結合パートナー、調節分子、もしくは基質と結合し、または反応を触媒し、シグナルを送り、もしくは増幅し、またはそれ自体もしくは別のタンパク質をリン酸化もしくは脱リン酸化する能力などを、低減または防止する抗原結合タンパク質または抗体を指す。
【００６６】
同じターゲットに結合する抗原結合タンパク質（例えば中和抗原結合タンパク質または中和抗体）に関連して使用する場合、「競合する」という用語は、試験対象の抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその免疫機能性フラグメント）が、共通する抗原（例えばＣＣＲ７またはそのフラグメント）へのリファレンス抗原結合タンパク質（例えばリガンドまたはリファレンス抗体）の特異的結合を防止し、低減し、または阻害するアッセイによって、抗原結合タンパク質間の競合が決定されることを意味する。例えば次に挙げるような数多くのタイプの競合結合アッセイを使用することができる：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えばＳｔａｈｌｉら，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばＫｉｒｋｌａｎｄら，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）；Ｉ−１２５ラベルを用いる固相直接ラベルＲＩＡ（例えばＭｏｒｅｌら，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばＣｈｅｕｎｇら，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２参照）；および直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）。典型的には、そのようなアッセイでは、固体表面に結合された精製抗原が使用されるか、または未標識試験抗原結合タンパク質および標識リファレンス抗原結合タンパク質のいずれかを保持する細胞が使用される。競合阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞に結合したラベルの量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）には、リファレンス抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質、リファレンス抗原結合タンパク質のエピトープとオーバーラップするエピトープ、およびオーバーラップはしないが試験抗原結合タンパク質とリファレンス抗原結合タンパク質との間で立体障害を起こしうるエピトープが含まれる。競合結合を決定するための具体的方法は、本明細書の実施例に記載する。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合は、それが、共通する抗原へのリファレンス抗原結合タンパク質の特異的結合を、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％、阻害するであろう。場合によっては、結合が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９７％またはそれ以上、阻害される。
【００６７】
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む）などの選択的結合剤によって結合されうると共に、その抗原に結合する能力を有する抗体を生産するために動物において使用することができる分子または分子の一部分を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば抗体）と相互作用することができる１つ以上のエピトープを有しうる。
【００６８】
用語「エピトープ」は、ある分子のうち、抗原結合タンパク質（例えば抗体）によって結合される部分である。この用語は、抗体などの抗原結合タンパク質に、またはＴ細胞受容体に、特異的に結合する能力を有する任意の決定基を包含する。エピトープは連続的である場合も、非連続的（例えばポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列では互いに隣接していないが、その分子内にあっては、抗原結合タンパク質によって結合される、複数のアミノ酸残基）である場合もある。ある実施形態において、エピトープは、抗原結合タンパク質を生成させるために使用したエピトープと類似する三次元構造を含むが、抗原結合タンパク質を生成させるために使用したエピトープ中に見いだされるアミノ酸残基を含まないか、一部しか含まないという点で、ミメティックでありうる。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、場合によっては、核酸など、他の種類の分子上にも存在しうる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などといった、分子の化学的に活性な表面基群を含み、特異的な三次元構造特徴および／または特異的な電荷特徴を有しうる。一般に、特定のターゲット抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物において、当該ターゲット抗原上のエピトープを優先的に認識する。
【００６９】
「同一性」という用語は、配列を整列して比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子間または２つ以上の核酸分子間の関係を指す。「パーセント同一性」とは、比較される分子中のアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較される分子のうち最も小さい分子のサイズに基づいて計算される。これらの計算のためには、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって、アラインメント中のギャップ（もしあれば）に対処しなければならない。整列された核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法として、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編），１９８８，ニューヨーク州：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編），１９９３，ニューヨーク州：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編），１９９４、ニュージャージー州：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．（１９８７）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ニューヨーク州：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編），１９９１，ニューヨーク州：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＣａｒｉｌｌｏら，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されているものが挙げられる。
【００７０】
パーセント同一性の計算では、比較する配列を、配列間の一致が最大になるように整列する。パーセント同一性を決定するために使用されるコンピュータプログラムは、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ウィスコンシン州マディソン）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、パーセント配列同一性を決定しようとする２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを整列するために使用される。配列は、各々のアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致が得られるように整列される（アルゴリズムによって決定される「一致区間（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）。ギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、３×平均対角（ａｖｅｒａｇｅ  ｄｉａｇｏｎａｌ）として計算される；ここで「平均対角」とは使用されている比較行列の対角（ｄｉａｇｏｎａｌ）の平均であり、「対角」とは、その特定比較行列によって各完全アミノ酸一致に割り当てられるスコアまたは数字である）およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０やＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列が、前記アルゴリズムと一緒に使用される。ある実施形態では、標準的比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆら，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２を、またＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）も、前記アルゴリズムによって使用される。
【００７１】
ＧＡＰプログラムを使ってポリペプチド配列またはヌクレオチド配列に関するパーセント同一性を決定するためのパラメータは、次のとおりである：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，１９９２（前掲）のＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２（ただしエンドギャップについてはペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）：４
類似性の閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０。
【００７２】
２つのアミノ酸配列を整列するための整列スキームには、２つの配列の短い領域だけの一致を与えるものもあり、この整列された小さな領域は、たとえそれら２つの完全長配列間に有意な関係がなくても、極めて高い配列同一性を有しうる。したがって、所望であれば、ターゲットポリペプチドのうち、少なくとも５０個の連続するアミノ酸にまたがるアラインメントが得られるように、選択した整列方法（ＧＡＰプログラム）を調節することができる。
【００７３】
本明細書にいう「実質的に純粋」とは、記載した分子種が、存在する最も優勢な種であること、すなわちモルベースで、同じ混合物中の他のどの個別種よりも、豊富に存在することを意味する。ある実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象の種が、存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モルベース）を占める組成物である。別の実施形態では、実質的に純粋な組成物が、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を占めるであろう。別の実施形態では、対象の種が本質的に均一に精製され、この場合、夾雑種は、従来の検出方法では組成物中に検出することができず、したがって組成物は単一の検出可能な高分子種からなる。
【００７４】
「処置する」という用語は、緩解、寛解、症状の減弱、または傷害、病態または状態を患者にとって許容しやすいものにすること、変性または衰弱の速度を遅くすること、変性の最終点の消耗度を低下させること、患者の肉体的または精神的幸福を増進することなどといった、任意の客観的または主観的パラメータを含む、傷害、病態、疾患または状態の防止、予防、処置または改善の成功を示す任意の徴候を指す。症状の処置または改善は、理学的検査、神経精神医学的検査、および／または精神医学的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づくことができる。例えば、本明細書に提示するある方法は、炎症の発生を減少させ、炎症の寛解を引き起こし、かつ／または炎症に関連する症状を改善することにより、炎症状態の処置に成功する。
【００７５】
治療的処置の「有効量」は、一般に、症状の重症度および／または頻度を低減し、症状および／または基礎にある原因を排除し、症状および／またはそれらの基礎にある原因の発生を防止し、かつ／または症状もしくはそれらの基礎にある原因に起因するまたはそれらに関連する損傷を好転させまたは治療するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量が、治療有効量または予防有効量である。「治療有効量」とは、病状（例えば炎症）または症状、特に病状に関連する状態または症状を治療するか、さもなければ、病状の進行または疾患に関連する他の任意の望ましくない症状を何にせよ多少なりとも防止し、妨げ、遅延させ、または反転させるのに十分な量である。「予防有効量」とは、対象に投与された時に、例えば炎症の発症（または再発）を防止しもしくは遅延させること、または炎症もしくは炎症症状の発症（または再発）の可能性を低減することなどといった、意図する予防効果を有するであろう医薬組成物の量である。完全な治療効果または予防効果は、１回の投薬では必ずしも生じず、一連の投薬後に初めて生じることもありうる。したがって治療有効量または予防有効量は、１回以上の投与で投与することができる。
【００７６】
「アミノ酸」は、当技術分野におけるその通常の意味を包含する。２０種類の天然アミノ酸とそれらの略号は従来の用法に従う。あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ--Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第２版（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ編），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：マサチューセッツ州サンダーランド（１９９１）を参照されたい。２０種類の通常アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の異常アミノ酸も、ポリペプチドの適切な構成要素になることができ、それらも「アミノ酸」という表現に包含される。異常アミノ酸の例としては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニンなどのアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において使用するポリペプチドの表記では、標準的な用法と慣例に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル末端方向である。
【００７７】
「ＣＣＲ７媒介疾患」という用語は、炎症性疾患、感染性疾患、および自己免疫疾患を包含するが、これらに限定されるわけではない。本明細書にいう「自己免疫疾患」は、患者の免疫応答が患者自身の構成成分に向けられる病状および状態を指す。例えば、ＣＣＲ７媒介疾患として、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、若年性関節リウマチを含む関節リウマチ、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、心臓疾患、冠動脈疾患、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化、エリスロポエチン抵抗性、移植片対宿主病、移植片拒絶、自己免疫性肝炎誘発性肝障害、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変を含むアルコール誘発性肝障害、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊柱炎を含む脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、および心臓疾患が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。「ＣＣＲ７媒介疾患」という用語は、ＣＣＬ１９もしくはＣＣＬ２１またはＣＣＲ７のレベルの増加、あるいはＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１に対する感受性の増加に関連する任意の医学的状態も包含する。
【００７８】
抗原結合タンパク質
一態様において、本発明は、ＣＣＲ７（例えばヒトＣＣＲ７）に結合する抗原結合タンパク質（例えば抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体ムテイン、および抗体変異体）を提供する。
【００７９】
本発明の抗原結合タンパク質には、ＣＣＲ７の生物学的活性を阻害する抗原結合タンパク質が含まれる。そのような生物学的活性の例として、シグナリング分子（例えばＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１）に結合すること、およびシグナリング分子の結合に応答してシグナルを伝達することが挙げられる。
【００８０】
異なる抗原結合タンパク質はＣＣＲ７の異なるドメインまたはエピトープに結合するか、異なる作用機序によって作用しうる。例として、ＣＣＲ７へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合を妨害する抗原結合タンパク質、またはシグナル伝達を阻害する抗原結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。作用の部位は、例えば細胞内（例えば細胞内シグナリングカスケードを妨害することによる）であっても、細胞外であってもよい。抗原結合タンパク質は、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が誘導する活性を完全に阻害しなくても本発明には役立ち、むしろ、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の特定の活性を低減する抗原結合タンパク質を使用することも考えられる。（特定の疾患の処置におけるＣＣＲ７結合性抗原結合タンパク質の特定作用機序に関する本明細書における論述は例示に過ぎず、本明細書に提示する方法がそれらに束縛されることはない）。
【００８１】
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に記載する配列から選択される軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含むＣＣＲ７抗原結合タンパク質、または本明細書に記載する配列から選択される１つ以上のＣＤＲ配列を含むＣＣＲ７抗原結合タンパク質を提供する。本発明の抗原結合タンパク質の例として、本明細書に開示する６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８、および／またはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の配列の全部または一部を含む抗原結合タンパク質、抗体、ならびに抗体誘導体および抗体フラグメントが挙げられる。そのような抗原結合タンパク質の具体例として、抗体６Ｂ４．１［配列番号２および４２］、抗体６Ｂ５．１［配列番号１８および５０］、抗体６Ｅ１．２［配列番号２６および５８］、および抗体ｍＡｂ２２［配列番号９２および１０８］が挙げられる。本発明のさまざまな実施形態に見いだされるこれらの抗体の具体的フラグメントは、それぞれのシグナル配列、可変ドメイン、ＣＤＲ、フレームワーク領域、および定常領域を含む。そのような実施形態の一つでは、抗原結合タンパク質が、６Ｂ４．１  ＨＣ、６Ｂ５．１  ＨＣ、６Ｅ１．２  ＨＣ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０ＹまたはＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の重鎖可変ドメインを含む。もう一つのそのような実施形態では、抗原結合タンパク質が、６Ｂ４．１  ＬＣ、６Ｂ５．１  ＬＣ、６Ｅ１．２  ＬＣ、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、またはＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８の軽鎖可変ドメインを含む。もう一つのそのような実施形態では、抗原結合タンパク質が、抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２の軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとを含むか、６Ｂ４．１の重鎖可変ドメインと６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳの軽鎖可変ドメインとを含むか、６Ｅ１．２  ＬＣの軽鎖可変ドメインと６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、または６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０Ｙの重鎖可変ドメインとを含むか、６Ｅ１．２  ＨＣの重鎖可変ドメインと６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑの軽鎖可変ドメインとを含む。もう一つのそのような実施形態では、抗原結合タンパク質が、抗体６Ｂ４．１  ＨＣ、６Ｂ５．１  ＨＣ、または６Ｅ１．２  ＨＣの重鎖ＣＤＲ配列を含む。もう一つのそのような実施形態では、抗原結合タンパク質が、抗体６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２の軽鎖ＣＤＲ配列を含む。もう一つのそのような実施形態では、抗原結合タンパク質が、重鎖ＣＤＲ配列と、抗体６Ｂ４．１  ＬＣ、６Ｂ５．１  ＬＣ、または６Ｅ１．２  ��Ｃの軽鎖ＣＤＲ配列とを含む。そのような実施形態のいくつかでは、抗原結合タンパク質が、抗体または抗体の抗原結合フラグメントである。
【００８２】
もう一つの実施形態において、本発明は、本明細書に開示する軽鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１残基しか相違せず、それら配列相違のそれぞれは、独立して、１アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかであるアミノ酸の配列を含む、軽鎖可変ドメインを含むＣＣＲ７抗原結合タンパク質を提供する。もう一つの実施形態では、軽鎖可変ドメインが、本明細書に開示する軽鎖可変ドメイン配列から選択される軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、軽鎖可変ドメインが、本明細書に開示するヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、軽鎖可変ドメインが、本明細書に開示するポリヌクレオチドの相補鎖に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、軽鎖可変ドメインが、本明細書に開示するポリヌクレオチドの相補鎖に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、軽鎖可変ドメインが、本明細書に開示する軽鎖ポリヌクレオチドの相補鎖に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
【００８３】
もう一つの実施形態において、本発明は、本明細書に開示する重鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１残基しか相違せず、それら配列相違のそれぞれは、独立して、１アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換のいずれかであるアミノ酸の配列を含む、重鎖可変ドメインを含むＣＣＲ７抗原結合タンパク質を提供する。もう一つの実施形態では、重鎖可変ドメインが、本明細書に開示する重鎖可変ドメイン配列の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、重鎖可変ドメインが、本明細書に開示するヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、重鎖可変ドメインが、本明細書に開示するポリヌクレオチドの相補鎖に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、重鎖可変ドメインが、本明細書に開示するポリヌクレオチドの相補鎖に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。もう一つの実施形態では、重鎖可変ドメインが、本明細書に開示する重鎖ポリヌクレオチドの相補鎖に中等度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の配列を含む。
【００８４】
本発明の抗原結合タンパク質の特定実施形態は、本明細書に開示するＣＤＲおよび／またはＦＲのうちの１つ以上のアミノ酸配列と同一な１つ以上のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に記載する軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＣＤＲ１配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＣＤＲ２配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＣＤＲ３配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する軽鎖ＦＲ１配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する軽鎖ＦＲ２配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する軽鎖ＦＲ３配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する軽鎖ＦＲ４配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＦＲ１配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＦＲ２配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＦＲ３配列を含む。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する重鎖ＦＲ４配列を含む。
【００８５】
一実施形態において、本発明は、それぞれが本明細書に開示するＣＤＲ配列とは５、４、３、２、または１個以下のアミノ酸残基で相違する１つ以上のＣＤＲ配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。
【００８６】
もう一つの実施形態において、本発明は、ヒトＣＣＲ７の細胞外ドメインへの結合に関して本明細書に記載する抗体の１つ以上と交差競合する抗体を提供する。ここで、２つの抗体に関して、各抗体が他方の抗体の結合を少なくとも８０％低減する場合、それら２つの抗体は「交差競合する」という。
【００８７】
本明細書に開示するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を、例えばランダム変異導入法または部位指定変異導入法（例えばオリゴヌクレオチド指定部位特異的変異導入法）で改変することで、非変異型ポリヌクレオチドと比較して１つ以上の特定ヌクレオチドの置換、欠失、または挿入を含む改変オリゴヌクレオチドを創製することができる。そのような改変を行うための技法の例は、Ｗａｌｄｅｒら，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４２：１３３；Ｂａｕｅｒら，１９８５，Ｇｅｎｅ  ３７：７３；Ｃｒａｉｋ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９；Ｓｍｉｔｈら著（１９８１）「Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；および米国特許第４，５１８，５８４号および同第４，７３７，４６２号に記載されている。これらの方法および他の方法を使って、例えば、望ましい性質（例えば、誘導体化されていない抗体との比較で、ＣＣＲ７に対する増加したアフィニティ、アビディティ、もしくは特異性、インビボもしくはインビトロでの増加した活性もしくは安定性、または低減したインビボ副作用）を有する抗ＣＣＲ７抗体の誘導体を作製することができる。
【００８８】
本発明の範囲内にある抗ＣＣＲ７抗体の他の誘導体として、抗ＣＣＲ７抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合された異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、抗ＣＣＲ７抗体またはそのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合コンジュゲートまたは集合コンジュゲートが挙げられる。例えば、コンジュゲートされるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであることができる。抗原結合タンパク質含有融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製または同定を容易にするために付加されたペプチド（例えばポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。抗原結合タンパク質は、Ｈｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているように、ＦＬＡＧペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に連結することもできる。ＦＬＡＧペプチドは抗原性が高く、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって可逆的に結合されるエピトープとなり、発現した組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合されている融合タンパク質を調製するのに役立つ試薬は市販されている（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）。
【００８９】
１つ以上の抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーを、ＣＣＲ７アンタゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合で連結された、または非共有結合で連結された、二量体、三量体、またはさらに高次のオリゴマーの形態をとりうる。２つ以上の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーの使用が考えられ、その一例はホモ二量体である。他のオリゴマーとして、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体などが挙げられる。
【００９０】
一実施形態は、抗原結合タンパク質に融合されたペプチド部分間の共有結合的または非共有結合的相互作用によって接合された複数の抗原結合タンパク質を含むオリゴマーに向けられる。そのようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であるか、オリゴマー化を促進する性質を有するペプチドであることができる。ロイシンジッパーおよび抗体由来のあるポリペプチドは、後段で詳述するように、それらに取り付けられた抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促進することができるペプチドの例である。
【００９１】
特定の実施形態では、オリゴマーが２〜４つの抗原結合タンパク質を含む。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、上述した形態のいずれか、例えば変異体またはフラグメントなど、任意の形態をとりうる。好ましくは、オリゴマーはＣＣＲ７結合活性を有する抗原結合タンパク質を含む。
【００９２】
一実施形態では、免疫グロブリン由来のポリペプチドを使ってオリゴマーが調製される。抗体由来ポリペプチドのさまざまな部分（Ｆｃドメインを含む）に融合されたある異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えばＡｓｈｋｅｎａｚｉら，１９９１，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５；Ｂｙｒｎら，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６７７、および「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｓｕｐｐｌ．ｐ.４，１０．１９．１−１０．１９．１１のＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら著（１９９２）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」によって記載されている。
【００９３】
本発明の一実施形態は、抗ＣＣＲ７抗体のＣＣＲ７結合フラグメントを抗体のＦｃ領域に融合することによって創製される２つの融合タンパク質を含む二量体に向けられる。この二量体は、例えば融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を適当な発現ベクター中に挿入し、その組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞中で遺伝子融合物を発現させ、発現した融合タンパク質を抗体そっくりの分子に集合させることによって作製することができ、その結果、鎖間ジスルフィド結合がＦｃ部分間に形成されて二量体を与える。
【００９４】
本明細書において使用する「Ｆｃポリペプチド」という用語は、抗体のＦｃ領域に由来するネイティブ型およびムテイン型のポリペプチドを包含する。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切頭型も含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそこから形成されるオリゴマー）には、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムでのアフィニティクロマトグラフィーによる容易な精製という利点がある。
【００９５】
ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている適切なＦｃポリペプチドの一つは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ領域からネイティブＣ末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。もう一つの有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：３９９２−４００１に記載されているＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変えられ、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変えられ、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変えられている点を除けば、ＷＯ９３／１０１５１に提示されているネイティブＦｃ配列のアミノ酸配列と同一である。このムテインはＦｃ受容体に対して低減したアフィニティを呈する。
【００９６】
別の実施形態では、ある抗体重鎖および／または抗体軽鎖の可変部分を、抗ＣＣＲ７抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分で置換することができる。
【００９７】
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を伴うまたは伴わない、複数の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載されているものなどがある。
【００９８】
オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するためのもう一つの方法では、ロイシンジッパーが使用される。ロイシンジッパードメインは、それが見いだされるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、最初は、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質に同定されたが（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、それ以来、多種多様なタンパク質に見いだされている。既知のロイシンジッパーには、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を生産するのに適したロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８に記載されており、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｐｐｅら，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載されている。そこに融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。あるアプローチでは、ロイシンジッパーペプチドに融合された抗ＣＣＲ７抗体フラグメントまたは誘導体を含む組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞中で発現させ、形成される可溶性オリゴマー抗ＣＣＲ７抗体フラグメントまたは誘導体を、培養上清から回収する。
【００９９】
もう一つの態様において、本発明は、ヒトＣＣＲ７のリガンド結合ドメインに結合する抗原結合タンパク質を提供する。リガンド結合ドメインに結合する抗原結合タンパク質は、当技術分野において知られている任意の技法を使って作製することができる。例えば、そのような抗原結合タンパク質は、完全長ＣＣＲ７ポリペプチドを使って（例えば膜結合型調製物において）、またはＣＣＲ７の可溶性細胞外ドメインフラグメントを使って、またはリガンド結合ドメインを含むもしくはリガンド結合ドメインからなるＣＣＲ７細胞外ドメインのさらに小さいフラグメントを使って、単離することができる。そうして単離された抗原結合タンパク質は、当技術分野において知られている任意の方法を使って、それらの結合特異性を決定するためにスクリーニングすることができる。適切なアッセイの例は、ＣＣＲ７を発現する細胞へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合を阻害する能力に関して抗原結合タンパク質を試験するアッセイ、または細胞表面ＣＣＲ７受容体へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合に起因する生物学的応答または細胞応答を低減する能力に関して抗原結合タンパク質を試験するアッセイである。
【０１００】
もう一つの態様において、本発明は、本明細書に開示するリファレンス抗体、例えば６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、または６Ｅ１．２と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合タンパク質が、ヒトＣＣＲ７への結合に関してリファレンス抗体と競合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質とリファレンス抗体とが、ヒトＣＣＲ７への結合に関して交差競合する。もう一つの実施形態では、リファレンス抗体のエピトープおよび抗原結合タンパク質のエピトープが、ヒトＣＣＲ７（例えばヒトＣＣＲ７の可溶性フラグメント）に結合した抗体または抗原結合タンパク質のＸ線結晶構造を解析することによって決定される。そのような一実施形態において、エピトープは、ヒトＣＣＲ７の表面上の残基であって、リファレンス抗体または抗原結合タンパク質がヒトＣＣＲ７に結合した時に、ヒトＣＣＲ７がどちらにも結合していない時と比較して、溶媒露出度に少なくとも１０％の低減を示す残基と定義される。一実施形態では、エピトープが、ヒトＣＣＲ７のＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１結合ドメインと実質的にオーバーラップする。
【０１０１】
もう一つの態様において、本発明は、種選択性を示す抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、１つ以上の哺乳動物ＣＣＲ７に、例えばヒトＣＣＲ７とマウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＣＣＲ７のうちの１つ以上とに結合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、１つ以上の霊長類ＣＣＲ７に、例えばヒトＣＣＲ７とカニクイザル、マーモセット、アカゲザル、およびチンパンジーＣＣＲ７のうちの１つ以上とに結合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ヒト、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、またはチンパンジーＣＣＲ７に特異的に結合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類ＣＣＲ７のうちの１つ以上に結合しない。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、マーモセットなどの新世界ザル種に結合しない。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ＣＣＲ７以外のどの天然タンパク質にも特異的結合を呈さない。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、哺乳動物ＣＣＲ７以外のどの天然タンパク質にも特異的結合を呈さない。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、霊長類ＣＣＲ７以外のどの天然タンパク質にも特異的結合を呈さない。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ヒトＣＣＲ７以外のどの天然タンパク質にも特異的結合を呈さない。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＣＣＲ７に特異的に結合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、マウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＣＣＲ７に、類似する結合アフィニティで、特異的に結合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ヒトＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１とマウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＣＣＲ７との結合をブロックする。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、ヒトＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１とマウス、ラット、カニクイザル、およびヒトＣＣＲ７との結合を、類似するＫｉでブロックする。
【０１０２】
ＣＣＲ７に対する抗原結合タンパク質の選択性は、当技術分野において周知の方法を使用し、本明細書の教示に従って、決定することができる。例えば、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡを使って、選択性を決定することができる。
【０１０３】
本発明の抗原結合タンパク質の抗原結合フラグメントは、従来の技法で生産することができる。そのようなフラグメントの例として、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。遺伝子工学的技法によって生産される抗体フラグメントおよび抗体誘導体も考えられる。
【０１０４】
さらなる実施形態として、キメラ抗体、例えばヒト化型の非ヒト（例えばマウス）モノクローナル抗体が挙げられる。そのようなヒト化抗体は、既知の技法を使って調製することができ、抗体をヒトに投与する場合に免疫原性が低減しているという利点がある。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体が、マウス抗体の可変ドメイン（またはその抗原結合部位の全部もしくは一部）およびヒト抗体由来の定常ドメインを含む。あるいは、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位と、ヒト抗体由来の可変ドメインフラグメント（抗原結合部位を欠くもの）とを含みうる。キメラモノクローナル抗体およびさらに工学的に操作されたモノクローナル抗体を生産するための手法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３、Ｌｉｕら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９、Ｌａｒｒｉｃｋら，１９８９，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４、およびＷｉｎｔｅｒら，１９９３，ＴＩＰＳ  １４：１３９に記載されているものなどがある。一実施形態では、キメラ抗体がＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化するための技法は、例えば米国特許出願第１０／１９４，９７５号（２００３年２月２７日公開）、米国特許第５，８６９，６１９号、同第５，２２５，５３９号、同第５，８２１，３３７号、同第５，８５９，２０５号、Ｐａｄｌａｎら，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３−３９、およびＴａｍｕｒａら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１４３２−４１において論述されている。
【０１０５】
非ヒト動物においてヒト抗体または部分的ヒト抗体を生成させるための手法が開発されている。例えば、１つ以上の内在性免疫グロブリン遺伝子がさまざまな手段で不活化されたマウスが、調製されている。不活化されたマウス遺伝子を置き換えるために、ヒト免疫グロブリン遺伝子がマウスに導入されている。この動物で生産される抗体には、その動物に導入されたヒト遺伝物質によってコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖が組み込まれる。一実施形態では、トランスジェニックマウスなどの非ヒト動物を、ＣＣＲ７ポリペプチドに対する抗体がその動物内で生成するように、ＣＣＲ７ポリペプチドで免疫する。適切な免疫原の一例は可溶性ヒトＣＣＲ７、例えばその細胞外ドメインまたは他の免疫原性フラグメントを含むポリペプチドである。ヒト抗体または部分ヒト抗体を生産するためのトランスジェニック動物を作出し使用するための技法の例は、米国特許第５，８１４，３１８号、同第５，５６９，８２５号、および同第５，５４５，８０６号、Ｌｏ編「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州：１９１−２００のＤａｖｉｓら著（２００３）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎら，２００２，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−９７、Ｒｕｓｓｅｌら，２０００，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６８：１８２０−２６、Ｇａｌｌｏら，２０００，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎ．３０：５３４−４０、Ｄａｖｉｓら，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１８：４２１−２５、Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１：１１−２３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９８，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３１：３３−４２、Ｇｒｅｅｎら，１９９８，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８８：４８３−９５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ．７：６０７−１４、Ｔｓｕｄａら，１９９７，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４２：４１３−２１、Ｍｅｎｄｅｚら，１９９７，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６−５６、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，１９９４，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．４：７６１−６３、Ａｒｂｏｎｅｓら，１９９４，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１：２４７−６０、Ｇｒｅｅｎら，１９９４，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ．３６２：２５５−５８、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：２５５１−５５、Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｍ．Ｔｒｏｕｎｓｔｉｎｅ，Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，Ｆ．Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｋｕｒａｈａｒａ，Ｊ．Ｌｏｒｉｎｇ，Ｄ．Ｈｕｓｚａｒ「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＪＨ  ｌｏｃｕｓ」Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（１９９３）：６４７−６５６、��ｈｏｉら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−２３、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１、Ｈａｒｄｉｎｇら，１９９５，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−５９、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１  １１３：４９−１０１に記載の「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｌｏｎｂｅｒｇら，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：６５−９３、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６、Ｔａｙｌｏｒら，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−９５、Ｔａｙｌｏｒら，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−９１、Ｔｏｍｉｚｕｋａら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：１３３−４３、Ｔｏｍｉｚｕｋａら，２０００，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９７：７２２−２７、Ｔｕａｉｌｌｏｎら，１９９３，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９０：３７２０−２４、およびＴｕａｉｌｌｏｎら，１９９４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５２：２９１２−２０に記載されている。
【０１０６】
もう一つの態様において、本発明は、ＣＣＲ７に結合するモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、当技術分野において知られている任意の技法を使って、例えば免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から収穫した脾臓細胞を不死化することなどによって、生産することができる。脾臓細胞は当技術分野において知られている任意の技法を使って、例えば脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを作出することなどによって、不死化することができる。ハイブリドーマを作出する融合手法において使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは非抗体生産性であり、高い融合効率を有し、かつ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの成長を支持するある選択培地における骨髄腫細胞の成長を不可能にする酵素欠損を有する。マウス融合用の適切な細胞株の例にはＳｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ，ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌがあり、ラット融合に使用される細胞株の例にはＲ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０がある。細胞融合に役立つ他の細胞株はＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
【０１０７】
一実施形態では、動物（例えばヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＣＣＲ７免疫原で免疫し、免疫された動物から脾臓細胞を収穫し、収穫した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合することによってハイブリドーマ細胞を生成させ、ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を樹立し、ＣＣＲ７ポリペプチドに結合する抗体を生産するハイブリドーマ細胞株を同定することによって、ハイブリドーマ細胞株が作出される。そのようなハイブリドーマ細胞株、およびそれらが生産する抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体は、本発明に包含される。
【０１０８】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、当技術分野において知られている任意の技法を使って精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂをさらにスクリーニングして、特定の性質、例えばＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が誘導する活性をブロックする能力などを有するｍＡｂを同定してもよい。そのようなスクリーンの例を下記実施例に記載する。
【０１０９】
Ｓｃｈｉｅｒら，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１に記載されているように、抗体結合部位の中心にある相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化を使って、増加したアフィニティを有する抗体、例えばｃ−ｅｒｂＢ−２に対して増加したアフィニティを有する抗体が、単離されている。したがって、そのような技法はＣＣＲ７に対する抗体を調製する際に有用である。
【０１１０】
ＣＣＲ７に対する抗原結合タンパク質は、例えばＣＣＲ７ポリペプチドの存在を検出するためのアッセイにおいて、インビトロで、またはインビボで、使用することができる。本抗原結合タンパク質は、イムノアフィニティクロマトグラフィーによるＣＣＲ７タンパク質の精製にも使用しうる。ＣＣＲ７へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合をブロックすることもできる抗原結合タンパク質は、そのような結合に起因する生物学的活性を阻害するために使用することができる。ブロッキング抗原結合タンパク質は本発明の方法において使用することができる。ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１アンタゴニストとして機能するそのような抗原結合タンパク質は、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が誘発する任意の状態、例えば限定するわけではないが狼瘡、ＳＬＥ、および関節炎などの処置に使用することができる。一実施形態では、トランスジェニックマウスの免疫化を伴う手法によって生成させたヒト抗ＣＣＲ７モノクローナル抗体が、そのような状態の処置に使用される。
【０１１１】
抗原結合タンパク質は、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が誘導する生物学的活性を阻害するために、インビトロ法で使用するか、インビボ投与することができる。こうして、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１と細胞表面ＣＣＲ７との相互作用によって（直接的または間接的に）引き起こされるまたは悪化する障害（その例は本明細書に記載する）を処置することができる。一実施形態において、本発明は、治療を必要とする哺乳動物に、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１ブロッキング抗原結合タンパク質を、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が誘導する生物学的活性を低減するのに有効な量で、インビボ投与することを含む治療法を提供する。
【０１１２】
本発明の抗原結合タンパク質には、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の生物学的活性を阻害する部分ヒトモノクローナル抗体および完全ヒトモノクローナル抗体が含まれる。一実施形態は、ヒトＣＣＲ７を発現する細胞へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合を少なくとも部分的にブロックするヒトモノクローナル抗体に向けられる。一実施形態では、トランスジェニックマウスをＣＣＲ７免疫原で免疫することによって、抗体を生成させる。もう一つの実施形態では、免疫原がヒトＣＣＲ７ポリペプチド（例えばＣＣＲ７細胞外ドメインの全部または一部を含む可溶性フラグメント）である。そのような免疫マウスに由来するハイブリドーマ細胞株であって、ＣＣＲ７に結合するモノクローナル抗体を分泌するものも、ここに提供される。
【０１１３】
ヒト抗体、部分ヒト抗体、またはヒト化抗体は、多くの応用に、とりわけヒト対象への抗体の投与を伴う応用に、好適であるだろうが、ある応用には他のタイプの抗原結合タンパク質が好適であるだろう。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（例えばサル（例えばカニクイザルまたはアカゲザル）または類人猿（例えばチンパンジー））などといった任意の抗体産生動物に由来しうる。本発明の非ヒト抗体は、例えばインビトロで細胞培養ベースの応用や、本発明の抗体に対する免疫応答が起こらないか、わずかであるか、防止することができるか、問題にならないか、または望まれる他の任意の応用に使用することができる。一実施形態では、本発明の非ヒト抗体が、非ヒト対象に投与される。もう一つの実施形態では、非ヒト抗体が、非ヒト対象において免疫応答を引き出さない。もう一つの実施形態では、非ヒト抗体が非ヒト対象と同じ種から得られ、例えば本発明のマウス抗体がマウスに投与される。特定種からの抗体は、その種の動物を所望の免疫原（例えば可溶性ＣＣＲ７ポリペプチド）で免疫することによって、またはその種の抗体を生成させるための人工的な系（例えば特定種の抗体を生成させるための細菌に基づく系またはファージディスプレイに基づく系）を使って、または例えば抗体の定常領域を別の種からの定常領域で置き換えたり、抗体の１つ以上のアミノ酸残基を別の種からの抗体の配列により近くなるように置き換えたりすることで、ある種からの抗体を別の種からの抗体に転化することによって、作製することができる。一実施形態では、抗体が、２つ以上の異なる種からの抗体に由来するアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。
【０１１４】
抗原結合タンパク質は、いくつかある従来技法のどの技法でも調製することができる。例えば、抗原結合タンパク質は、当技術分野において知られている任意の技法を使って、それを天然に発現する細胞から精製するか（例えば抗体を生産するハイブリドーマからその抗体を精製することができる）、または組換え発現系で生産することができる。例えば「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ」Ｋｅｎｎｅｔら編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９８０）、および「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）を参照されたい。
【０１１５】
本発明の組換えポリペプチドの作製には、当技術分野において知られている任意の発現系を使用することができる。一般的には、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換する。使用しうる宿主細胞には、原核生物、酵母または高等真核細胞などがある。原核生物にはグラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌または桿菌などがある。高等真核細胞には、昆虫細胞や、哺乳動物由来の樹立細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例として、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，１９８１，Ｃｅｌｌ  ２３：１７５）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、およびＭｃＭａｈａｎら，１９９１，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩから派生したＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）が挙げられる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓらによって記載されている（「Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ニューヨーク，１９８５）。
【０１１６】
ポリペプチドの発現を促進する条件化で形質転換細胞を培養し、ポリペプチドを従来のタンパク質精製手法で回収することができる。そのような精製手法の一つとして、例えばＣＣＲ７の全部または一部分（例えば細胞外ドメイン）が結合されているマトリックスなどでの、アフィニティクロマトグラフィーの使用が挙げられる。ここでの使用が考えられるポリペプチドとして、夾雑内在性物質を実質的に含まない実質的に均一な組換え哺乳類抗ＣＣＲ７抗体ポリペプチドが挙げられる。
【０１１７】
抗原結合タンパク質は、いくつかある既知の技法のうちの任意の技法によって、調製し、所望の性質についてスクリーニングすることができる。それらの技法のうち、あるものは、目的の抗原結合タンパク質（例えば抗ＣＣＲ７抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部分）をコードする核酸を単離すること、その核酸を組換えＤＮＡ技術によって操作することを伴う。核酸は、もう一つの目的の核酸に融合するか、例えば１つ以上のアミノ酸残基を付加、欠失、または置換するために（例えば変異導入法または他の従来技法によって）改変することができる。
【０１１８】
一態様において、本発明は、本発明の抗ＣＣＲ７抗体の抗原結合フラグメントを提供する。そのようなフラグメントは、もっぱら抗体由来配列だけからなることも、追加の配列を含むこともできる。抗原結合フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびドメイン抗体が挙げられる。他の例が、Ｌｕｎｄｅら，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０：５００−０６に挙げられている。
【０１１９】
一本鎖抗体は、重鎖および軽鎖可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントをアミノ酸橋（短いペプチドリンカー）を介して連結して、単一のポリペプチド鎖とすることによって形成させることができる。そのような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が、前記２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することによって調製されている。その結果生じるポリペプチドは、２つの可変ドメイン間のフレキシブルリンカーの長さに依存して、折れ曲がって抗原結合性モノマーを形成するか、多量体（例えば二量体、三量体または四量体）を形成することができる（Ｋｏｒｔｔら，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３；Ｋｏｒｔｔら，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８）。異なるＶＬおよびＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることで、異なるエピトープに結合する多量体型ｓｃＦｖを形成させることができる（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら，２００１，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０）。一本鎖抗体を生産するために開発された技法には、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３；Ｈｕｓｔｏｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９；Ｗａｒｄら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４、ｄｅ  Ｇｒａａｆら，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７に記載されているものがある。本明細書に記載する抗体に由来する一本鎖抗体として、本明細書に開示する１つ以上の可変ドメイン配列を含むｓｃＦｖ、または１つ以上の可変ドメイン配列からのＣＤＲ配列を１つ以上含むｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質（例えば抗体、抗体フラグメント、および抗体誘導体）が、軽鎖および／または重鎖抗体定常領域を含む。当技術分野において知られている任意の抗体定常領域を使用することができる。軽鎖定常領域は、例えばカッパ型またはラムダ型の軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ型またはヒトラムダ型の軽鎖定常領域であることができる。重鎖定常領域は、例えばアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型の重鎖定常領域、例えばヒトアルファ型、ヒトデルタ型、ヒトイプシロン型、ヒトガンマ型、またはヒトミュー型の重鎖定常領域であることができる。一実施形態では、軽鎖または重鎖定常領域が、天然定常領域のフラグメント、誘導体、変異体、またはムテインである。
【０１２１】
目的の抗体から異なるサブクラスまたはアイソタイプの抗体を誘導するための技法、すなわちサブクラススイッチングの技法は、知られている。したがって、例えばＩｇＧ抗体をＩｇＭ抗体から誘導することができ、その逆も可能である。そのような技法によって、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、親抗体とは異なる抗体アイソタイプまたはサブクラスに関連する生物学的性質も呈する、新しい抗体の調製が可能になる。組換えＤＮＡ技法を使用することができる。そのような手法では、特定抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡなどを使用することができる。Ｌａｎｔｔｏら，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６も参照されたい。
【０１２２】
したがって、本発明の抗原結合タンパク質には、例えば、本明細書に開示する可変ドメイン配列のうちの１つ以上を含み、かつ所望のアイソタイプ（例えばＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）を有するもの、ならびにそれらのＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。さらにまた、ＩｇＧ４を所望する場合は、ＩｇＧ４抗体に不均一性をもたらしうるＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を緩和するために、参照により本明細書に組み込まれるＢｌｏｏｍら，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：４０７に記載されているように、ヒンジ領域に点変異（ＣＰＳＣＰ→ＣＰＰＣＰ）を導入することも望ましいかもしれない。
【０１２３】
異なる性質を有する抗原結合タンパク質（すなわちそれらが結合する抗原に対してさまざまなアフィニティを有する抗原結合タンパク質）を誘導するための技法も知られている。鎖シャッフリングと呼ばれるそのような技法の一つでは、免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーが線維状バクテリオファージの表面にディスプレイされ、ファージディスプレイと呼ばれることが多い。Ｍａｒｋｓら，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９に記載されているように、鎖シャッフリングは、ハプテンである２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高アフィニティ抗体を調製するために使用されている。
【０１２４】
もう一つの実施形態において、本発明は、ＣＣＲ７からの解離速度が低い抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合タンパク質が１×１０−４ｓ−１以下のＫｏｆｆを有する。もう一つの実施形態では、Ｋｏｆｆが５×１０−５ｓ−１以下である。もう一つの実施形態では、Ｋｏｆｆが本明細書に開示する抗体と実質的に同じである。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する抗体と実質的に同じＫｏｆｆで、ＣＣＲ７に結合する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、本明細書に開示する抗体からのＣＤＲを１つ以上含む抗体と実質的に同じＫｏｆｆで、ＣＣＲ７に結合する。
【０１２５】
もう一つの態様において、本発明は、インビトロまたはインビボで（例えばヒト対象に投与した場合に）、少なくとも１日の半減期を有する抗原結合タンパク質を提供する。一実施形態では、抗原結合タンパク質が、少なくとも３日の半減期を有する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が４日以上の半減期を有する。もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、８日以上の半減期を有する。もう一つの実施形態では、非誘導体化または非修飾抗原結合タンパク質と比較して、より長い半減期を有するように、抗原結合タンパク質が誘導体化、または修飾される。もう一つの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ００／０９５６０（２０００年２月２４日公開）に記述されているように、抗原結合タンパク質が、血清中半減期を増加させるために、１つ以上の点変異を含有する。
【０１２６】
本発明はさらに、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば二特異性抗原結合タンパク質、例えば、２つの異なる抗原結合部位または領域を介して、ＣＣＲ７の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合タンパク質、またはＣＣＲ７のエピトープと別の分子のエピトープとに結合する抗原結合タンパク質も提供する。さらにまた、本明細書に開示する二特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する抗体のうちの一つからのＣＣＲ７結合部位と、本明細書に記載する抗体（他の刊行物の参照によって本明細書に記載するものを含む）のうちのもう一つからの第２のＣＣＲ７結合領域とを含むことができる。あるいは、二特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載する抗体のうちの一つからの抗原結合部位と、当技術分野において知られているもう一つのＣＣＲ７抗体からの第２の抗原結合部位、または既知の方法もしくは本明細書に記載する方法によって調製される抗体からの第２の抗原結合部位とを含みうる。
【０１２７】
二特異性抗体を調製する方法は、当技術分野では数多く知られており、２００１年４月２０日に出願された米国特許出願第０９／８３９，６３２号（参照により本明細書に組み込まれる）において論述されている。そのような方法には、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７および他の研究者ら（米国特許第４，４７４，８９３号、米国特許第６，１０６，８３３号）に記載のハイブリッドハイブリドーマの使用や、抗体フラグメントの化学的カップリング（Ｂｒｅｎｎａｎら，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１；Ｇｌｅｎｎｉｅら，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７；米国特許第６，０１０，９０２号）などがある。さらにまた、組換え手段により、例えばロイシンジッパー部分（すなわち、優先的にヘテロ二量体を形成するＦｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質からのもの；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１４８：１５４７）を使って、または米国特許第５，５８２，９９６号に記載の他の鍵と鍵穴相互作用ドメイン構造を使って、二特異性抗体を生産することもできる。他の有用な技法には、Ｋｏｒｔｔら，１９９７（前掲）；米国特許第５，９５９，０８３号；および米国特許第５，８０７，７０６号に記載されているものがある。
【０１２８】
もう一つの態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、抗体の誘導体を含む。誘導体化された抗体は、例えば特定の用途における増加した半減期などといった所望の性質を抗体に付与する任意の分子または物質を含むことができる。誘導体化された抗体は、例えば検出可能な（または標識）部分（例えば放射性分子、比色分子、抗原分子または酵素分子、検出可能なビーズ（例えば磁気ビーズまたは高電子密度（例えば金）ビーズ）、または別の分子に結合する分子（例えばビオチンまたはストレプトアビジン））、治療用もしくは診断用部分（例えば放射性部分、細胞毒性部分、または医薬活性部分）、または特定の用途（例えばヒト対象などの対象への投与、または他のインビボもしくはインビトロ使用）のために抗体の安定性を増加させる分子を含むことができる。抗体を誘導体化するために使用することができる分子の例として、アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗体のアルブミン連結誘導体およびＰＥＧ化誘導体は、当技術分野において周知の技法を使って調製することができる。一実施形態では、抗体が、トランスサイレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体にコンジュゲートされるか、他の形で連結される。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）（ｐｏｌｙ（ｎ−ｖｉｎｙｌ  ｐｙｕｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群より選択される化学物質などで、化学的に修飾することができる。米国特許出願公開第２００３０１９５１５４号。
【０１２９】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の抗原結合タンパク質を使用する、ＣＣＲ７に結合する分子に関するスクリーニングの方法を提供する。任意の適切なスクリーニング技法を使用することができる。一実施形態では、ＣＣＲ７分子、または本発明の抗原結合タンパク質が結合するそのフラグメントを、本発明の抗原結合タンパク質およびもう一つの分子と接触させる。ここで、もし前記もう一つの分子がＣＣＲ７への前記抗原結合タンパク質の結合を低減するのであれば、前記もう一つの分子はＣＣＲ７に結合する。抗原結合タンパク質の結合は、任意の適切な方法、例えばＥＬＩＳＡなどを使って、検出することができる。ＣＣＲ７への抗原結合タンパク質の結合の検出は、上で論じたように、抗原結合タンパク質を検出可能なように標識することによって簡単にすることができる。もう一つの実施形態では、ＣＣＲ７結合分子をさらに解析して、それがＣＣＲ７媒介シグナリングを阻害するかどうかを決定する。
【０１３０】
核酸
一態様において、本発明は、単離された核酸分子を提供する。本核酸は、例えば抗原結合タンパク質の全部または一部、例えば本発明の抗体の一方の鎖もしくは両方の鎖、またはそのフラグメント、誘導体、ムテイン、もしくは変異体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、解析し、変異させまたは増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンスプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンス核酸、および前記の相補配列を含む。本核酸は任意の長さであることができる。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１，０００、１，５００、３，０００、５，０００ヌクレオチド長またはそれ以上であることができ、かつ／または１つ以上の追加配列、例えば調節配列を含むことができ、かつ／またはより大きい核酸、例えばベクターの一部であることができる。本核酸は一本鎖または二本鎖であることができ、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工的変異体（例えばペプチド核酸）を含むことができる。
【０１３１】
抗体ポリペプチド（例えば重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードする核酸は、ＣＣＲ７で免疫されたマウスのＢ細胞から単離することができる。本核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの従来手法によって単離することができる。
【０１３２】
本発明の抗体のいくつかをコードする代表的な核酸配列を本明細書に開示する。６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、６Ｅ１．２、６Ｂ４．１  ＬＣ  ｄｅｓＳ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＨＣ  Ｇ２Ｖ  Ｆ８０Ｙ、６Ｅ１．２  ＬＣ  Ｈ３６Ｑ、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ−Ｖ１、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、ＭＡＢ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８、およびＭＡＢ２２＿ＨＣ＿Ｖ１の可変ドメインをコードする特定核酸配列を、本明細書に開示する。遺伝コードの縮重ゆえに、本明細書に開示するポリペプチド配列のそれぞれが、多数の核酸配列によってコードされることは、当業者には理解されるであろう。本発明は、本発明の各抗原結合タンパク質または他のポリペプチドをコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【０１３３】
本発明はさらに、他の核酸（例えば本明細書に開示するヌクレオチド配列を含む核酸）に特定のハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。核酸をハイブリダイズさせるための方法は当技術分野ではよく知られている。例えば「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９８９），６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書における定義では、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および５５℃のハイブリダイゼーション温度（または他の類似するハイブリダイゼーション溶液、例えば約５０％ホルムアミドを含有するものと、４２℃のハイブリダイゼーション温度）、ならびに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件を使用する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件では、６×ＳＳＣ中、４５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、６８℃で１回以上の洗浄を行う。さらに当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件を操作してハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させることで、互いに少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には、互いにハイブリダイズした状態を保つようにすることもできる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的パラメータと、適切な条件を工夫するための指針は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓらが記載しており（１９８９「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，チャプター９および１１；ならびに「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，セクション２．１０および６．３〜６．４）、当技術分野における通常の知識を有する者であれば、例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成などに基づいて、容易に決定することができる。
【０１３４】
変異によって核酸に変化を導入し、よって、その核酸がコードするポリペプチド（例えば抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列を変化させることができる。変異は、当技術分野において知られている任意の技法を使って導入することができる。一実施形態では、１つ以上の特定アミノ酸残基を、例えば部位指定変異導入プロトコールを使って変化させる。もう一つの実施形態では、１つ以上のランダムに選択された残基を、例えばランダム変異導入プロトコールを使って変化させる。どんな作製方法でも、ミュータントポリペプチドを発現させ、所望の性質（例えばＣＣＲ７への結合またはＣＣＲ７へのＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１の結合のブロッキング）についてスクリーニングすることができる。
【０１３５】
変異は、当該核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を著しく変化させずに、核酸に導入することができる。例えば、非必須アミノ酸残基におけるアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を行うことができる。一実施形態では、本明細書に記載するヌクレオチド配列、またはその所望のフラグメント、変異体、もしくは誘導体を、それが、アミノ酸残基の欠失、置換、または付加を１つ以上含むアミノ酸配列をコードするように変異させる。もう一つの実施形態では、当該核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性（例えばＣＣＲ７の結合、ＣＣＬ１９結合またはＣＣＬ２１結合の阻害など）を選択的に変化させる１つ以上の変異が核酸に導入される。例えば変異は生物学的活性を定量的または定性的に変化させることができる。定量的変化の例として、活性の増加、低減または排除が挙げられる。定性的変化の例として、抗原結合タンパク質の抗原特異性を変化させることが挙げられる。
【０１３６】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに適した核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、例えばプローブもしくはプライマーとして使用することができるフラグメント、または本発明のポリペプチドの活性部分（例えばＣＣＲ７結合部分）をコードするフラグメントなど、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部だけを含むことができる。
【０１３７】
本発明の核酸の配列に基づくプローブは、核酸または類似する核酸、例えば本発明のポリペプチドをコードする転写産物を検出するために使用することができる。プローブは、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子などといったラベル基を含むことができる。そのようなプローブは、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用することができる。
【０１３８】
もう一つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例として、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物細胞用ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３９】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における当該核酸の発現に適した形態で含むことができる。組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列であって、発現させようとする核酸配列に作動的に連結されているものを含む。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの（例えばＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、ある宿主細胞だけでヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば組織特異的調節配列、Ｖｏｓｓら，１９８６，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７、Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７参照、これらは参照によりそのまま本明細書に組み込まれる）、および特定の処理または条件に応答してヌクレオチド配列の誘導性発現を指示するもの（例えば哺乳動物細胞におけるメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎ）プロモーター、ならびに原核系と真核系の両方におけるｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター（同上書参照））などがある。発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどといった因子に依存しうることは、当業者には理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって本明細書に記載する核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）を生産することができる。
【０１４０】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば酵母、昆虫、または哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞））であることができる。ベクターＤＮＡは原核細胞または真核細胞に従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法によって導入することができる。哺乳動物細胞の安定トランスフェクションの場合、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法に依存して、ごく一部の細胞しか、そのゲノムに外来ＤＮＡを組み込みえないことが知られている。これらの組込み体を同定し選択するために、一般的には、選択可能マーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものがある。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択（例えば選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残り、他の細胞は死ぬだろう）、その他の方法によって同定することができる。
【０１４１】
抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を作製する方法  本発明の抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質をコードする配列を含む宿主細胞は、前記抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を作製するために使用することができる。典型的には、宿主細胞において使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列と、外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列とを含有するであろう。ある実施形態において「フランキング配列」と総称されるそのような配列は、典型的には、次に挙げるヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むであろう：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位とアクセプタースプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させようとするポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択可能マーカー要素。これらの配列のそれぞれを以下に論述する。
【０１４２】
場合により、ベクターは「タグ」コード配列、すなわち抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質コード配列の５’端または３’端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく、このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）、または対応する市販の抗体が存在する他の「タグ」、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニン）、もしくはｍｙｃをコードする。このタグは、典型的には、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質のアフィニティ精製手段または検出手段として役立ちうる。アフィニティ精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティマトリックスとして使用することにより、カラムクロマトグラフィーによって達成することができる。場合によっては、次いでタグを、精製された抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質ポリペプチドから、さまざまな手段によって、例えばあるペプチダーゼを切断に使用することなどにより、除去することができる。
【０１４３】
フランキング配列は、相同（すなわち宿主細胞と同じ種および／または同じ株に由来するもの）、異種（宿主細胞の種または株以外の種に由来するもの）、ハイブリッド（すなわち２つ以上の供給源に由来するフランキング配列の組み合わせ）、合成またはネイティブであることができる。したがって、フランキング配列の供給源は、そのフランキング配列が宿主細胞の機構において機能的であり、宿主細胞の機構によって活性化されうる限り、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物もしくは無脊椎生物、または任意の植物であることができる。
【０１４４】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当技術分野においてよく知られているいくつかの方法のうち、どの方法によっても得ることができる。典型的には、ここで有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されたものであるだろうから、適正な組織供給源から適当な制限エンドヌクレアーゼを使って単離することができる。いくつかの例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であるだろう。その場合は、核酸合成または核酸クローニングについて本明細書に記載する方法を使って、フランキング配列を合成することができる。
【０１４５】
フランキング配列の全部がわかっているか、一部しかわかっていないかに関わらず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、かつ／または適切なプローブ、例えばオリゴヌクレオチドおよび／または同じ種または別の種からのフランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、フランキング配列を得ることができる。フランキング配列が未知の場合は、例えばコード配列や、さらには別の１つまたは複数の遺伝子を含有しうる、より大きなＤＮＡの一片から、フランキング配列を含有するＤＮＡのフラグメントを単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化で適正なＤＮＡフラグメントを生産した後、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（カリフォルニア州チャッツワース）、または当業者に知られている他の方法を使った単離を行うことにより、達成することができる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当技術分野における通常の知識を有する者には明白であるだろう。
【０１４６】
複製起点は、典型的には、商業的に購入された原核発現ベクターの一部であり、この起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を助長する。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合は、既知の配列に基づいて複製起点を化学的に合成し、ベクター中にライゲーションすることができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州ベバリー）由来の複製起点は大半のグラム陰性細菌に適し、さまざまなウイルス起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｕｓ）ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点構成要素は哺乳類発現ベクターには必要ない（例えばＳＶ４０起点は、それがウイルス初期プロモーターを含有するので、しばしば使用されるに過ぎない）。
【０１４７】
転写終結配列は典型的には、ポリペプチドコード領域の末端に対して３’側に位置し、転写を終結するのに役立つ。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ-Ｃリッチフラグメントとそれに続くポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローニングされ、ベクターの一部として商業的に購入されることさえあるが、本明細書に記載するような核酸合成の方法を使って、容易に合成することもできる。
【０１４８】
選択可能マーカー遺伝子は、選択培養培地中で生育する宿主細胞の生存と成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞用の、抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）天然培地もしくは合成培地からは利用できない決定的栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択可能マーカーはカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。また、有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子は、原核宿主細胞でも真核宿主細胞でも選択のために使用することができる。
【０１４９】
他の選択可能遺伝子を使って、発現される遺伝子を増幅することもできる。増幅とは、成長または細胞の生存にとって不可欠なタンパク質の生産に必要な遺伝子が、累代の組換え細胞の染色体内でタンデムに何度も反復されるプロセスである。哺乳動物細胞用の適切な選択可能マーカーの例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、ベクター中に存在する選択可能遺伝子のおかげで形質転換体だけがユニークに適応して生き残る選択圧の下に置かれる。選択圧は、培地中の選択剤の濃度を次々と増加させ、それによって選択可能遺伝子ともう一つの遺伝子（例えばＣＣＲ７ポリペプチドに結合する抗体）をコードするＤＮＡとの両方の増幅につながる条件下で形質転換細胞を培養することによってかけられる。結果として、増幅されたＤＮＡから増加した量のポリペプチド（例えば抗ＣＣＲ７抗体）が合成される。
【０１５０】
リボソーム結合部位は通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｍｏ配列（原核生物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴づけられる。この要素は、典型的には、プロモーターの３’側かつ発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
【０１５１】
真核宿主細胞発現系におけるグリコシル化が望まれる場合など、いくつかの例では、グリコシル化または収量を改良するために、さまざまなプレ配列またはプロ配列を操作することができる。例えば特定シグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変すること、またはグリコシル化にも影響を及ぼしうるプロ配列を付加することができる。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の第１アミノ酸に対する位置）に、完全には除去されていない、発現に付随する１つ以上の追加アミノ酸を有しうる。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に取り付けられた、ペプチダーゼ切断部位中に見いだされる１つまたは２つのアミノ酸残基を有しうる。あるいは、いくつかの酵素切断部位が使用されることにより、酵素が成熟ポリペプチド内の当該区域で切断を行う場合には、わずかに切り詰められた形態の所望のポリペプチドがもたらされることもありうる。
【０１５２】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、典型的には、宿主生物によって認識され、かつ抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質をコードする分子に作動的に連結された、プロモーターを含有するであろう。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち５’側）（一般的には約１００〜１０００ｂｐ以内）に位置して構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは、従来から、２つのクラス、すなわち誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの一方に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の何らかの変化、例えば栄養素の有無または温度の変化などに応答して、その制御下にあるＤＮＡから、増加したレベルの転写を開始する。これに反して、構成的プロモーターは、それが作動的に連結している遺伝子を一様に転写する。すなわち遺伝子発現に対する制御はほとんどまたは全くない。さまざまな潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。適切なプロモーターは、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、本発明の抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を構成する重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動的に連結される。
【０１５３】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーターも、当技術分野ではよく知られている。酵母エンハンサーを酵母プロモーターと共に使用すると有利である。哺乳動物宿主細胞と共に使用するための適切なプロモーターはよく知られており、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものがあるが、これらに限定されるわけではない。他の適切な哺乳類プロモーターとして、異種哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
【０１５４】
興味の対象となりうる他のプロモーターとして、ＳＶ４０初期プロモーター（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ  ８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４４５）；メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子からのプロモーターおよび調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；および原核プロモーター、例えばベータ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。組織特異性を呈し、トランジェニック動物で利用されている、次に挙げる動物転写制御領域も興味深い：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵ベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞中で活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓中で活性なアルファフェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓中で活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅs  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞中で活性なベータ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋中で活性なミオシン軽鎖２遺伝子��御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；および視床下部中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１５５】
本発明の抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を構成する軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの、高等真核細胞による転写を増加させるために、エンハンサー配列をベクターに挿入することができる。エンハンサーは、通常は約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性要素であり、プロモーターに作用して転写を増加させる。エンハンサーは、配向および位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’側の位置にも３’側の位置にも見いだされている。哺乳動物遺伝子から入手することができるエンハンサーはいくつか知られている（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトタンパク質およびインスリン）。しかし典型的には、ウイルスからのエンハンサーが使用される。当技術分野で知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマ（ｐｏｌｙｏｒｎａ）エンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核プロモーターを活性化するための例示的増強要素である。エンハンサーはベクター中でコード配列の５’側にも３’側にも位置しうるが、典型的にはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１５６】
抗体の細胞外分泌を促進するために、適当なネイティブシグナル配列または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体を生産させようとする宿主細胞のタイプに依存し、異種シグナル配列でネイティブシグナル配列を置き換えることができる。哺乳類宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例には、次に挙げるものがある：米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら（１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８）に記載のインターロイキン−２受容体のシグナル配列；ＥＰ特許第０３６７５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；ＥＰ特許第０４６０８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；ヒトＩｇＫのシグナル配列；およびヒト成長ホルモンのシグナル配列。
【０１５７】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築することができる。そのようなベクターは、所望するフランキング配列の全部を含有しても含有しなくてもよい。本明細書に記載するフランキング配列の１つ以上がベクター中に既に存在しない場合は、それらを個別に入手して、ベクター中にライゲーションすることができる。フランキング配列のそれぞれを入手するために使用される方法は当業者にはよく知られている。
【０１５８】
ベクターを構築し、抗ＣＣＲ７抗体を構成する軽鎖、重鎖、または軽鎖と重鎖をコードする核酸分子を、そのベクターの適正な部位に挿入した後、増幅および／またはポリペプチド発現のために、完成したベクターを適切な宿主細胞中に挿入することができる。選択した宿主細胞への抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質用の発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、または他の既知の技法を含む周知の方法によって達成することができる。選択される方法は、一つには、使用しようとする宿主細胞のタイプに依存するであろう。
【０１５９】
宿主細胞は、適当な条件下で培養すると、抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を合成し、それは次に、培養培地（宿主細胞が抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を培地中に分泌する場合）から、または抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を生産する宿主細胞から直接的に（分泌されない場合）、収集することができる。適当な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、または活性にとって望ましいもしくは必要なポリペプチド修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどといったさまざまな因子に依存するであろう。
【０１６０】
発現用の宿主として利用することができる哺乳動物細胞株は、当技術分野ではよく知られており、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手することができる不死化細胞株、例えば限定するわけではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ある実施形態では、どの細胞株が高い発現レベルを有し、ＣＣＲ７結合特性を有する抗体を構成的に発現させるかを決定することによって、細胞株を選択することができる。もう一つの実施形態では、自分自身の抗体は作製しないが、異種抗体を作製し分泌させる能力を有するＢ細胞系譜からの細胞株を選択することができる。
【０１６１】
製剤
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量の１つまたは複数の本発明の抗体を、医薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントと共に含む医薬組成物を提供する。好ましくは、許容される製剤物質は、使用される投薬量および濃度において、受容者にとって無毒性である。好ましい実施形態では、治療有効量の抗ＣＣＲ７抗体を含む医薬組成物が提供される。
【０１６２】
ある実施形態では、許容される製剤材料が、好ましくは、使用される投薬量および濃度において受容者にとって無毒性である。
【０１６３】
ある実施形態において、医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、容量オスモル濃度、粘度、清澄性、色、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸着または浸透などを修飾し、維持し、または保存するための製剤材料を含有しうる。そのような実施形態では、適切な製剤材料として、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗微生物剤；酸化防止剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；および他の糖質（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶剤（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサオポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性強化剤（スクロースまたはソルビトールなど）；張性強化剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達媒体；希釈剤；賦形剤および／または医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」第１８版（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【０１６４】
ある実施形態において、最適な医薬組成物は、例えば意図する投与経路、送達様式および所望の投薬量などに依存して、当業者によって決定されるであろう。例えば「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（前掲）を参照されたい。ある実施形態では、そのような組成物が、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼしうる。
【０１６５】
ある実施形態では、医薬組成物の主要媒体または主要担体が、水性または非水性でありうる。例えば適切な媒体または担体は注射用水、生理食塩溶液または人工脳脊髄液であって、場合により、非経口投与用の組成物では一般的な他の材料が補足されている。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例示的媒体である。好ましい実施形態では、医薬組成物が、ｐＨが約７．０〜８．５のトリス緩衝液、またはｐＨが約４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、さらにソルビトールまたはその適切な代用物を含みうる。本発明のある実施形態では、所望の純度を有する選択された組成物を最適な調合剤（「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ」（前掲））と混合することにより、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質組成物を貯蔵用に調製することができる。さらに、ある実施形態では、スクロースなどの適当な賦形剤を使って、抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質産物を凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、非経口送達用に選択することができる。あるいは、吸入用に、または消化管を介した送達用に、例えば経口送達用に、組成物を選択してもよい。そのような医薬上許容される組成物の調製は当技術分野の技能の範囲内である。
【０１６７】
製剤の構成要素は、好ましくは、投与部位にとって許容できる濃度で存在する。ある実施形態では、組成物を生理的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために、緩衝液が使用される。
【０１６８】
非経口投与が考えられる場合、本発明において使用するための治療用組成物は、医薬上許容される媒体中に所望の抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を含むパイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供することができる。非経口注射にとりわけ好適な媒体は滅菌蒸留水であり、そこに抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質が適正に保存処理された滅菌等張液として製剤化される。ある実施形態において、調製は、デポー注射によって送達することができる製品の制御放出または持続放出をもたらしうる薬剤、例えば注射可能なマイクロスフェア、生分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームによる所望の分子の製剤化を伴いうる。ある実施形態では、循環系における存続時間の持続を促進する効果を有するヒアルロン酸も使用することができる。ある実施形態では、埋め込み可能な薬物送達デバイスを使って、所望の抗体分子を導入することができる。
【０１６９】
本発明の医薬組成物は、吸入用に製剤化することができる。これらの実施形態では、抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を、乾燥した吸入可能な粉末として製剤化することが有利である。好ましい実施形態では、エアロゾル送達用の噴射剤を使って抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質吸入溶液も製剤化することができる。ある実施形態では、溶液を噴霧することができる。経肺投与と製剤化の方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに詳しく記載されており、参照により本明細書に組み込まれるこの出願には、化学修飾されたタンパク質の肺送達が記載されている。
【０１７０】
製剤を経口投与することも考えられる。この方法で投与される抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質は、錠剤やカプセル剤などの固形剤形の配合に通例使用される担体を使って、またはそのような担体を使わずに、製剤化することができる。ある実施形態では、バイオアベイラビリティが最大になり、体循環前分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小限に抑えられるような消化管中のポイントで製剤の活性部分が放出されるように、カプセル剤を設計することができる。抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質の吸収が容易になるように追加の薬剤を含めることができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用することができる。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、錠剤の製造に適した非毒性賦形剤と混合された１つまたは複数の抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質の有効量が含まれるように提供される。錠剤を滅菌水または他の適当な媒体に溶解することにより、単位用量型の溶液を調製することができる。適切な賦形剤として、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴムなどの結合剤、またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルクなどの潤滑剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１７２】
さらなる医薬組成物は、持続送達製剤または制御送達製剤中の抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質を伴う製剤を含めて、当業者には明白であるだろう。他のさまざまな持続送達手段または制御送達手段を製剤化するための技法、例えばリポソーム担体、生分解性の微粒子または多孔性ビーズ、およびデポー注射剤なども、当業者には知られている。例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照されたい（この出願は参照により本明細書に組み込まれ、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微粒子の制御放出について記載している）。持続放出調製物として、フィルムまたはマイクロカプセルなどといった造形品の形態にある半透過性ポリマーマトリックスを挙げることができる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（これは米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開ＥＰ０５８４８１に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒら，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら，前掲）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開ＥＰ１３３，９８８）を含みうる。持続放出組成物として、当技術分野において知られているいくつかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも挙げることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開ＥＰ０３６，６７６、ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９を参照されたい。
【０１７３】
インビボ投与に使用される医薬組成物は典型的には滅菌調製物として提供される。滅菌は滅菌濾過膜による濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使った滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のどちらにでも行うことができる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥された形態で、または溶解した状態で、貯蔵することができる。非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針で突き刺すことができる栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１７４】
医薬組成物を製剤化し終えたら、それを溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固形物、結晶、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに貯蔵することができる。そのような製剤は、すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態で、または投与前に再構成される（例えば凍結乾燥された）形態で、貯蔵することができる。
【０１７５】
本発明は、単一用量投与単位（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｕｎｉｔ）を作るためのキットも提供する。本発明のキットはそれぞれ、乾燥タンパク質が入っている第１容器と、水性製剤が入っている第２容器とを、どちらも含有する。本発明のある実施形態では、単室式および多室式充填済みシリンジ（例えば液体シリンジおよびライオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含んでいるキットも提供される。
【０１７６】
適応
本発明の方法および組成物（例えば抗ＣＣＲ７抗原結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、および本発明の他の分子など）は、広範囲にわたる疾患、状態および適応を処置するために使用することができる。処置することができる疾患のタイプの例として、炎症状態、がん性状態、ならびに組織移植または臓器移植から生じる状態および合併症が挙げられる。
【０１７７】
ＣＣＲ７活性は、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と関係づけられている。クローン病は、腸の細菌叢に対するＴＨ１性免疫応答の過剰活性を反映していると考えられる慢性で消耗性の炎症性腸疾患である。クローン病の病変は腸内のどこにでも現れ、時には消化管の他の場所にも現れうる。これに対し、潰瘍性大腸炎の病変は、通常は結腸に現れる。病変の性質も異なるが、これらの疾患は非常によく似ているので、それらを臨床的に鑑別することが困難な場合もある。例えば米国特許第６，５５８，６６１号を参照されたい。本明細書に記載する組成物および方法は、ＩＢＤ患者を処置し、かつ／またはＩＢＤの１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１７８】
ＣＣＲ７活性の阻害は組織移植拒絶または臓器移植拒絶に関係づけられている（Ｌｏら，２０１１，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９１：７０−７７；Ｌｉｕら，２０１１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：６１１−２３；Ｙｕｌｉｎｇら，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ８：１４０１−１２）。本明細書に記載する組成物および方法は、組織移植または臓器移植レシピエント、例えば腎臓、心臓、皮膚、または肺移植レシピエントを処置し、かつ／または移植手術の１つ以上の合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１７９】
ＣＣＲ７活性は、喘息、アレルギー性気道炎症、気道平滑筋過形成、および線維性肺疾患に関係づけられている（Ｇｏｍｐｅｒｔｓら，２００７，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．８２：４４９−５６；Ｋａｗａｋａｍｉら，２０１２，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５７５：２４−３２；Ｓａｕｎｄｅｒｓら，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ３９：１６８４−９２）。本明細書に記載する組成物および方法は、喘息、アレルギー性気道炎症、気道平滑筋過形成、または線維性肺疾患を有する患者を処置し、かつ／またはこれらの疾患の１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１８０】
ＣＣＲ７活性は、関節リウマチに関連付けられている（Ｍｏｓｃｈｏｖａｋｉｓら，２０１２，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：１９４９−５５）。本明細書に記載する組成物および方法は、関節リウマチを有する患者を処置し、かつ／または関節リウマチの１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１８１】
ＣＣＲ７活性は、多発性硬化症に関連付けられている（Ａｕｎｇら，２０１０，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２２６：１５８−６４）。本明細書に記載する組成物および方法は、多発性硬化症を有する患者を処置し、かつ／または多発性硬化症の１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１８２】
ＣＣＲ７活性は、アテローム性動脈硬化に関連付けられている（Ｌｕｃｈｔｅｆｅｌｄら，２０１０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １２２：１６２１−２８）。本明細書に記載する組成物および方法は、アテローム性動脈硬化を有する患者を処置し、かつ／またはアテローム性動脈硬化の１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１８３】
ＣＣＲ７活性は、ＨＩＶ感染に関連付けられている（Ｅｖａｎｓら，２０１２，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２３：１５１−５７）。本明細書に記載する組成物および方法は、ＨＩＶに感染した患者（ＡＩＤＳを有する患者を含む）またはＨＩＶと接触するリスクがある患者もしくはＡＩＤＳを発症するリスクがある患者を処置し、かつ／またはＨＩＶもしくはＡＩＤＳの１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。
【０１８４】
ＣＣＲ７活性は、がんの発生および伝播のある態様に関連付けられている（Ｂｅｎ−Ｂａｒｕｃｈ，２００９，３：３２８−３３）。本明細書に記載する組成物および方法は、がんを有する患者を処置し、かつ／またはがんの１つ以上の症状もしくは合併症を低減し、防止し、もしくは排除するために使用することができる。特定の一実施形態では、本発明の組成物および／または方法が、患者におけるがんの転移拡散を防止し、低減し、遅くし、または反転させるために使用される。
【０１８５】
治療方法および抗原結合タンパク質の投与
一態様において、本発明は、対象を処置する方法を提供する。本方法は、例えば、対象に対して概して有益な効果を有することができる。例えば、本方法は、対象の予想余命を増加させる。あるいは、本方法は、例えば、疾患、障害、状態、または不健康（「状態」）を処置、防止、治療、軽減、または改善（「処置」）することができる。本発明に従って処置される状態には、ＣＣＲ７および／またはＣＣＬ１９および／またはＣＣＬ２１の不適当な発現または活性を特徴とする状態が含まれる。前述の状態の一部では、発現レベルまたは活性レベルが高すぎ、処置は、本明細書に記載するＣＣＲ７アンタゴニストを投与することを含む。前述の状態の他の例では、発現レベルまたは活性レベルが低すぎ、処置は、本明細書に記載するＣＣＲ７アゴニストを投与することを含む。前述の状態の他の例では、ＣＣＲ７活性および／またはＣＣＬ１９活性および／またはＣＣＬ２１活性のレベルが必ずしも上昇していないが、それらに対する対象の感受性が増している。
【０１８６】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の組成物および／または処置の方法を使った処置の恩恵を受ける可能性が高い対象を同定する方法を提供する。そのような方法により、介護者は、治療レジメンを特定対象のニーズに合わせて調整することおよび処置の経過が無効または逆効果になる可能性を低減することが可能になりうる。一実施形態において、本発明は、対象が本明細書に記載する組成物または方法を使った処置の候補であるかどうかを決定する方法であって、対象におけるターゲット細胞タイプがＣＣＲ７を発現するかどうかを決定することを含み、ターゲット細胞タイプがＣＣＲ７を発現する場合は、その対象が処置の候補である方法を提供する。もう一つの実施形態において、本方法は、１ターゲット細胞あたりのＣＣＲ７分子のおよその平均数を決定することを含み、１細胞あたり１０２、１０３、１０４、１０５、または１０６個のＣＣＲ７は、その対象が処置の候補であることを示す。１ターゲット細胞あたりのＣＣＲ７分子のおよその平均数は、当技術分野において知られている任意の技法を使って、例えばターゲット細胞タイプの細胞を含む試料をＣＣＲ７結合分子で染色し、試料に結合したＣＣＲ７結合分子の量を検出することなどによって決定することができ、この場合、検出されるＣＣＲ７結合分子の量は、試料中のＣＣＲ７分子の平均数に比例する。もう一つの実施形態において、本発明は、１ターゲット細胞あたりのＣＣＲ７分子のおよその平均数を、標準試料と比較することを含み、１ターゲット細胞あたりのＣＣＲ７分子のおよその平均数が標準試料より多ければ、その対象は本発明の組成物および／または処置の方法を使った処置の恩恵を受ける可能性が高い。もう一つの態様において、本方法は、関心対象の組織において、例えばＣＣＲ７を発現する免疫細胞の近傍において、ＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が上昇したレベルで存在するかどうかを決定することを含む。もう一つの態様において、本方法は、ＣＣＲ７の下流にある分子がＣＣＲ７依存的に改変または活性化されているかどうかを決定することを含む。
【０１８７】
本明細書に記載するある方法は、ＣＣＲ７結合性抗原結合タンパク質を対象に投与し、それによって、特定の状態に関与するＣＣＬ１９またはＣＣＬ２１が誘導する生物学的応答を低減することを含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、対象への投与によって、またはエクスビボ手法で、内在性ＣＣＲ７をＣＣＲ７結合性抗原結合タンパク質と接触させることを伴う。
【０１８８】
「処置」という用語は、障害の少なくとも１つの症状もしくは他の態様の緩和もしくは防止、または疾患重症度の低減などを包含する。抗原結合タンパク質が、実用的な治療剤となるために、完全な治癒を達成する必要はなく、疾患の全ての症状または所見を根絶する必要もない。関連分野では知られているように、治療剤として使用される薬物は、所与の病状の重症度を低減しうるが、有用な治療剤と見なされるために、その疾患の全ての所見を消失させる必要はない。同様に、予防的に施行される処置も、実用的な予防剤となるために、状態の発症を防止するのに完全に有効である必要はない。疾患の悪影響を（例えばその症状の数または重症度を低減すること、または別の処置の有効性を増加させること、または別の有益な効果をもたらすことなどによって）低減するだけで、または対象において疾患が発生するまたは悪化する可能性を低減するだけで、十分である。本発明の一実施形態は、患者にＣＣＲ７アンタゴニストを、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを上回る持続的改善を誘導するのに十分な量で、かつ十分な時間にわたって、投与することを含む方法に向けられる。
【０１８９】
関連分野では理解されるとおり、本発明の分子を含む医薬組成物は、適応に適した方法で、対象に投与される。医薬組成物は、任意の適切な技法で、例えば限定するわけではないが、非経口的に、外用で、または吸入によって、投与することができる。注射する場合、医薬組成物は、例えば関節内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路で、ボーラス注射または持続注入によって投与することができる。例えば疾患または傷害の部位などへの局所的投与や、経皮送達およびインプラントからの持続放出が考えられる。吸入による投与には、例えば経鼻吸入または経口吸入、ネブライザーの使用、エアロゾル形態のアンタゴニストの吸入などが含まれる。他の選択肢として、点眼液；丸剤、シロップ剤、口中錠またはチューインガムを含む経口調製物；ならびにローション、ゲル、スプレー、および軟膏などの外用調製物が挙げられる。
【０１９０】
エクスビボ法における抗原結合タンパク質の使用も考えられる。例えば患者の血液または他の体液を、エクスビボで、ＣＣＲ７に結合する抗原結合タンパク質と接触させることができる。抗原結合タンパク質は、適切な不溶性マトリックスまたは固形支持材料に結合していてもよい。
【０１９１】
抗原結合タンパク質は、生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤などといった１つ以上の追加構成要素を含む組成物の形態で投与することが有利である。場合により、組成物はさらに、１つ以上の生理学的に活性な薬剤、例えば第２のＣＣＲ７阻害物質、抗炎症物質、抗血管新生物質、化学療法物質、または鎮痛物質を含む。さまざまな特定実施形態において、組成物は、ＣＣＲ７結合性抗原結合タンパク質に加えて、１、２、３、４、５または６種類の生理活性剤を含む。
【０１９２】
一実施形態において、医薬組成物は、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量ポリペプチド（例えばアミノ酸数が１０個未満のもの）、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンなどの糖質、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、安定剤、および賦形剤からなる群より選択される１つ以上の物質と一緒に、本発明の抗原結合タンパク質を含む。中性緩衝食塩水または同種血清アルブミンと混合された食塩水は、適当な希釈剤の例である。適当な業界標準に従って、ベンジルアルコールなどの保存剤も加えることができる。適当な賦形剤溶液（例えばスクロース）を希釈剤として使用して、組成物を凍結乾燥物として製剤化してもよい。適切な構成要素は、使用する投薬量および濃度において、受容者にとって無毒性である。医薬製剤中に使用しうる構成要素のさらなる例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１６版（１９８０）および第２０版（２０００），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルバニア州イーストンに記載されている。
【０１９３】
医師が使用するためのキットは、本発明のＣＣＲ７阻害物質、およびラベル、または本明細書で論述する状態のいずれかの処置における使用に関する他の説明書を含む。一実施形態において、キットは、１つ以上のＣＣＲ７結合性抗原結合タンパク質の滅菌調製物を含み、これは、上に開示した組成物の形態にあってもよく、１つ以上のバイアルに入っていてもよい。
【０１９４】
投薬量および投与頻度は、投与経路、使用するその特定抗原結合タンパク質、処置される疾患の性質および重症度、状態が急性であるか慢性であるか、ならびに対象のサイズおよび全身の状態などといった因子に応じて変動しうる。適当な投薬量は、関連技術分野において知られている手法によって、例えば用量漸増試験を伴いうる臨床治験で、決定することができる。
【０１９５】
本発明のＣＣＲ７阻害物質は、例えば１回投与するか、２回以上、例えばある期間にわたって定期的に投与することができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質が、少なくとも１ヶ月またはそれ以上、例えば１ヶ月、２ヶ月もしくは３ヶ月の期間にわたって、または無期限に投与される。慢性状態の処置には、一般に、長期間処置が最も有効である。しかし急性状態の処置の場合、短期間の投与、例えば１〜６週間の投与で十分であるかもしれない。一般に、抗原結合タンパク質は、患者が、選択した１つまたは複数の指標について、医学的に妥当な程度のベースラインからの改善を明示するまで、投与される。
【０１９６】
本発明の特定の実施形態では、抗原結合タンパク質が、対象に、対象の体重１ｋｇあたり１日あたり約１ｎｇ（「１ｎｇ／ｋｇ／日」）の抗原結合タンパク質〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約５００ｎｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、約５μｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、および約５ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量で投与される。さらなる実施形態では、ＣＣＲ７媒介疾患、状態または障害、例えば本明細書に開示する医学的障害を処置するために、抗原結合タンパク質が、成人に、週に１回、週に２回、週に３回、週に４回、週に５回、週に６回、もしくは週に７回またはそれ以上、投与される。注射する場合、成人１回あたりの抗原結合タンパク質の有効量は、例えば１〜２０ｍｇ／ｍ２、または約５〜１２ｍｇ／ｍ２の範囲に及びうる。あるいは、一律の用量（ｆｌａｔ  ｄｏｓｅ）を投与することができ、その用量は、１〜３００ｍｇ／回の範囲に及びうる。一律の用量に関する一範囲は１回あたり約２０〜３０ｍｇである。本発明の一実施形態では、２５ｍｇ／回の一律用量を注射によって反復投与する。注射以外の投与経路を使用する場合、用量は標準的な医薬実務に従って適当に調節される。治療レジメンの一例では、用量約２０〜３０ｍｇの抗原結合タンパク質が、少なくとも３週間の期間にわたって、週に１〜３回注射される。ただし、所望の改善度を誘導するには、より長い期間にわたる処置が必要になるかもしれない。小児対象（４〜１７歳）の場合、適切なレジメンの一例では、０．４ｍｇ／ｋｇ（最大容量２５ｍｇまで）の抗原結合タンパク質が、週に２回または３回の投与で皮下注射される。
【０１９７】
本明細書に記載する方法の特定実施形態では、週に１回または２回、０．５ｍｇ〜１０ｍｇ、好ましくは３〜５ｍｇの抗原結合タンパク質の皮下注射が行われる。もう一つの実施形態は、週に１回、３ｍｇ以上の抗原結合タンパク質の（例えばネブライザーによる）経肺投与に向けられる。
【０１９８】
本明細書に記載する治療レジメンの例は、ＣＣＲ７シグナリングが関与する状態を処置するために、週に１回、１．５〜３ｍｇの用量での抗原結合タンパク質の皮下注射を含む。そのような状態の例は、本明細書に記載すると共に、当技術分野では知られている。抗原結合タンパク質の投与は、所望の結果が達成されるまで、例えば対象の症状が静まるまで、継続することができる。処置は、必要に応じて再開するか、あるいは維持料を投与することができる。
【０１９９】
本明細書に記載する治療レジメンの他の例は、対象の体重１キログラムあたり１、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、または２０ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の用量での本発明のＣＣＲ７阻害剤の皮下または静脈内投与を含む。この用量は、対象に１回投与するか、２回以上、ある間隔で、例えば１日１回、週に３回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に３回、１ヶ月に２回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、または１年に１回、投与することができる。処置の継続期間、ならびに用量および／または処置頻度の変更は、その対象の特定ニーズに合致するように、処置の経過中に改変または変動させることができる。
【０２００】
もう一つの実施形態では、抗原結合タンパク質が、抗原結合タンパク質の濃度を所望のレベル以上に維持し、バイオマーカーの量、濃度、または他の状態を所望のレベルに維持し、または処置している障害の重症度を反映する少なくとも１つの症状または他の指標の改善（好ましくは持続的改善）を誘導するのに十分な量で、十分な時間にわたって、対象に投与される。処置の量および時間が十分であるかどうかを決定するために、対象の不健康、疾患または状態の程度を反映するさまざまな指標を評価することができる。そのような指標として、例えば疾患重症度、症状または問題の障害の所見の臨床上認識されている指標が挙げられる。一実施形態では、対象が２〜４週間隔たった少なくとも２つの機会に改善を呈するのであれば、その改善は持続的であると見なされる。改善の程度は、一般に、医師によって決定され、医師は、徴候、症状、生検、または他の試験結果に基づいてこの決定を行うことができ、また医師は、対象に与えられる質問票、例えば所与の疾患のために開発された生活の質に関する質問票を使用することもできる。
【０２０１】
併用療法
大半のＣＣＲ７媒介疾患には処置方法が存在する。ただし、これらの処置の多くは有効性に限界があるか、患者の一部にしか有効でないか、かつ／またはかなりの毒性があって、それが処置の患者認容性を制限している。本明細書に記載するＣＣＲ７阻害剤は、ＣＣＲ７媒介疾患に関する他の既存の治療法と併用することができる。
【０２０２】
一実施形態では、クローン病または潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を患っている患者を、ＩＢＤの治療法と本明細書に記載する抗ＣＣＲ７抗体とで並行して処置することができる。ＩＢＤの既存の治療法として、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸およびその誘導体（オルサラジン、バルサラジド、およびメサラミンなど）、抗ＩＦＮ−γ抗体、抗ＴＮＦ抗体（インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、およびセルトリズマブペゴールを含む）、経口投与用または非経口投与用のコルチコステロイド（プレドニゾン、メチルプレドニゾン、ブデソニド、またはヒドロコルチゾンを含む）、副腎皮質刺激ホルモン、抗生物質（メトロニダゾール、シプロフロキサシン、またはリファキシミンを含む）、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、タクロリムス、およびサリドマイドが挙げられる。
【０２０３】
別の実施形態では、関節リウマチを患っている患者を、ＲＡ治療に使用される薬物と本明細書に記載する抗ＣＣＲ７抗体とで並行して処置することができる。関節リウマチ（ＲＡ）の治療法としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（アスピリンおよびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤など）、疾患修飾性抗炎症薬（ＤＭＡＲＤ）（メトトレキサート、レフルノミド、およびスルファサラジンなど）、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキンなど）、シクロホスファミド、Ｄ−ペニシラミン、アザチオプリン、金塩、腫瘍壊死因子阻害剤（エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、およびセルトリズマブペゴールなど）、リツキシマブなどのＣＤ２０阻害剤、アナキンラなどのＩＬ−１アンタゴニスト、トシリズマブなどのＩＬ−６阻害剤、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の阻害剤（トファシチニブ）、アバタセプト、およびグルココルチコイドなどが挙げられる。
【実施例】
【０２０４】
実施例１：ヒトモノクローナル抗体の調製
次に挙げるものを含む１つ以上の適切な形態のＣＣＲ７抗原を使って免疫化を行った：（１）ｈｕＣＣＲ７を安定に発現するように工学的に操作したＣＨＯ／ＡＭ１Ｄ細胞、（２）完全長ヒトＣＣＲ７を安定に発現するように工学的に操作したマウスＬ１．２細胞、および（３）ヒトＣＣＲ７を一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞。
【０２０５】
１９９６年１２月３日出願の米国特許出願第０８／７５９，６２０号ならびに国際特許出願ＷＯ９８／２４８９３およびＷＯ００／７６３１０（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている方法に従って、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）（Ａｍｇｅｎ，カリフォルニア州サウザンドオークス）の初回免疫化には、適切な量の免疫原（すなわち、３〜４×１０６細胞／マウスの上記安定トランスフェクトＣＨＯ細胞、一過性トランスフェクト２９３Ｔ細胞、または他のＣＣＲ７発現細胞タイプ）を使用した。初回免疫化後は、引き続いて免疫原（２．０×１０６個のＣＣＲ７トランスフェクト細胞／マウス）による追加免疫を、マウスにおける適切な抗ＣＣＲ７価を誘導するのに必要なスケジュールで、必要な期間にわたって施行した。力価は適切な方法、例えば蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）によって決定した。
【０２０６】
適切な力価を呈する動物を同定し、流入領域リンパ節からリンパ球を取得し、必要であればコホートごとにプールした。適切な培地（例えばダルベッコ変法イーグル培地；ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド）から入手））中で摩砕して組織から細胞を遊離させることによってリンパ組織からリンパ球を分離し、ＤＭＥＭに懸濁した。標準的方法を使ってＢ細胞を選択し、かつ／または増殖し、適切な融合パートナー、例えば非分泌型骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＣＲＬ  １５８０；Ｋｅａｒｎｅｙら（１９７９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５０）などと、当技術分野において知られている技法を使って融合した。
【０２０７】
適切な融合方法の一つでは、リンパ球を融合パートナー細胞と１：４の比で混合した。その細胞混合物を４００×ｇで４分間の遠心分離によって穏やかにペレット化し、上清をデカントし、細胞混合物を穏やかに混合した。ＰＥＧ／ＤＭＳＯ（ポリエチレングリコール／ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）から入手；リンパ球１００万個につき１ｍｌ）で融合を誘発した。穏やかに撹拌しながらＰＥＧ／ＤＭＳＯを１分かけてゆっくり加えた後、１分間混合した。次に、穏やかに撹拌しながらＩＤＭＥＭ（グルタミンを含まないＤＭＥＭ；Ｂ細胞１００万個につき２ｍｌ）を２分かけて加えてから、ＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個につき８ｍｌ）を３分かけて加えた。
【０２０８】
融合した細胞をペレット化し（４００×ｇ、６分）、Ｂ細胞１００万個につき２０ｍｌの選択培地（例えばアザセリンおよびヒポキサンチン［ＨＡ］ならびに必要に応じて他の添加物を含有するＤＭＥＭ）に再懸濁した。細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートした後、２００ｍｌの選択培地に再懸濁し、Ｔ１７５フラスコで３〜４日間培養してから、９６ウェルプレートに移した。
【０２０９】
結果として生じるコロニーのクローン性が最大になるように、標準的技法を使って、細胞を９６ウェルプレートに分配した。最初からモノクローン性を保証するために、代替的方法も使用し、融合された細胞を３８４ウェルプレートに直接、クローン的にプレーティングした。数日間の培養後に上清を集め、ヒトＣＣＲ７受容体への結合の確認を含めて、下記の実施例で詳述するスクリーニングアッセイに付した。陽性細胞をさらに選択し、標準的クローニングおよびサブクローニング技法に付した。クローン株をインビトロで増殖し、分泌されたヒト抗体を解析のために得た。
【０２１０】
このようにして、およそ１ヶ月〜２ヶ月半の期間にわたる１１〜１７回の範囲の免疫処置により、完全長ＣＣＲ７を発現する細胞で、マウスを免疫した。ＣＣＲ７特異的抗体を分泌する数個のハイブリドーマ株を得て、それらの抗体をさらに特徴づけた。
【０２１１】
こうして生成させた抗体には、６Ｂ４．１、６Ｂ５．１、および６Ｅ１．２が含まれていた。
【０２１２】
実施例２：ＦＭＡＴによる結合抗体の選択
１４日間の培養後に、ＦＭＡＴ（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で、ヒトＣＣＲ７がトランスフェクトされているＣＨＯ  ＡＭ１／Ｄ／ｈｕＣＣＲ７細胞株または組換えＨＥＫ２９３Ｔ細胞のいずれかに対するスクリーニングと、親ＣＨＯ／ＡＭ１Ｄ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する対比スクリーニングとによって、ハイブリドーマ上清をＣＣＲ７特異的モノクローナル抗体についてスクリーニングした。簡単に述べると、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州カールズバッド）中の細胞を、３８４ウェルＦＭＡＴプレートに、体積を５０μＬ／ウェルにして、安定トランスフェクタントについては３５００細胞／ウェルの密度で、また親細胞については８５００細胞／ウェルの密度で播種し、細胞を３７℃で終夜インキュベートした。次に２０μＬ／ウェルの上清を加え、プレートを４℃で約１時間インキュベートした後、１０μＬ／ウェルの抗ヒトＩｇＧ−Ｃｙ５二次抗体を、２．８μｇ／ｍｌの濃度（最終濃度４００ｎｇ／ｍｌ）で加えた。次にプレートを４℃で１時間インキュベートし、ＦＭＡＴ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ニューヨーク州グランドアイランド）を使って蛍光を読み取った。
【０２１３】
ＦＭＡＴ法により、全部で８１のハイブリドーマ上清が、ＣＣＲ７受容体発現細胞には結合するが、親細胞には結合しないと同定された。次に、これらの上清を後述するＣＣＲ７機能アッセイで試験した。
【０２１４】
実施例３：ヒト化抗体の調製
正常マウス（すなわちマウス免疫系を持つマウス）をヒトＣＣＲ７発現細胞で免疫した。これらのマウスから、ブロッキング抗体ＭＡｂ２２を含むマウス抗ヒトＣＣＲ７抗体を単離した。重鎖定常領域残基をそれぞれのヒト対応物で置き換えることによってＭＡｂ２２をキメラ化し、ＭＡｂ２２＿ＨＣ＿Ｖ１およびＭＡｂ２２＿ＬＣ＿Ｖ１を生成させた。この抗体は、ヒトＣＣＲ７に結合するというその能力を保っていた。フレームワーク領域１、２、３、および４を改変することによってこの抗体の軽鎖をさらに改変して、一連のヒト化ＭＡｂ２２変異体を生成させた。これにより、配列ＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ２、ＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ３、ＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ４、ＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ５、ＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ６、ＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ７、およびＭＡｂ２２＿ＫＬＣ＿Ｖ８が作出された。
【０２１５】
実施例４：抗体アンタゴニストを同定するための機能スクリーニング  ハイブリドーマ上清を、ＣＣＬ１９依存的またはＣＣＬ２１依存的ＣＣＲ７シグナリングをブロックする能力についてスクリーニングした。使用した機能アッセイは、工学的に操作されたＣＨＯ細胞株を使用するヒトＣＣＲ７またはカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＣＲ７依存的エクオリン系リポーターシステムである。このアッセイは、９６ウェルプレートに６０，０００細胞／ウェルを播種し、それらを３７℃で終夜成長させることによって行った。２日目に、成長培地を取り除き、３０μＭセレンテラジンを含有するアッセイ緩衝液を細胞に加えた。次に細胞を３４℃で３時間インキュベートした。次に、ハイブリドーマ上清または対照試料を各ウェルにスパイクし、３４℃でさらに３０分間インキュベートした。次にＣＣＬ１９リガンドをＥＣ８０濃度（約１１３．６ｎＭ）で加えた。あるいは、ＣＣＬ２１リガンドをＥＣ８０濃度（約１６６．７ｎＭ）で使用した。次に、４６９ｎｍの波長で放射される青色光をミニＦＬＡＳＨマシン（ｍｉｎｉ  ＦＬＡＳＨ  ｍａｃｈｉｎｅ）で検出することによって、エクオリン活性をアッセイする。ＣＣＬ１９依存的またはＣＣＬ２１依存的ＣＣＲ７シグナリングをブロックする抗体を、活性化エクオリンのレベルを低減してシグナル強度の低減をもたらした試料として同定した。ハイブリドーマ上清について生成したデータを図２に示す。陰性対照と比較して５０％以上のシグナルの低減を引き起こす試料として、アンタゴニストを同定した。同様のアプローチで、同じアッセイを使って、精製抗体試料のＩＣ５０活性を決定した。データを図３および図４に示す。
【０２１６】
実施例５：エピトープマッピング
ヒトＣＣＲ７の一連の変異型変異体を作製した。各変異体は、その細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、細胞外ループ（ＥＣＬ）１、ＥＣＬ２、またはＥＣＬ３に、ｈＣＣＲ７アミノ酸残基をそれぞれの対応するマウスＣＣＲ７残基に転化する変化を含有した。ＥＣＤでは、位置Ｄ３５Ｅ、Ｆ４４Ｙ、Ｌ４７ＶおよびＳ４９Ｆに変異を導入した。ＥＣＬ１では、Ａ１１８Ｅ、Ｖ１２３Ｉ、Ｈ１２７ＹおよびＦ１２８Ｌ位に変異導入を行った。ＥＣＬ２では、Ｄ１９８Ｇ、Ｒ２０１Ｋ、Ｓ２０２Ｎ、Ｓ２０４Ｇ、Ｑ２０６Ｄ、Ａ２０７Ｔ、Ｍ２０８Ｌ、Ｉ２１３Ｖ、Ｔ２１４Ｓ、Ｅ２１５ＡおよびＨ２１６Ｑ位に変異導入を行った。ＥＣＬ３については、位置Ｓ２９５Ｎ、Ｔ２９７ＳおよびＬ３００Ｔに変異導入を行った。
【０２１７】
変異導入は次のオリゴを使って行った：
【化１】
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【０２１８】
前記オリゴを５０ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。次に示すテンプレートＤＮＡ  ｐｃＤＮＡ３．１  Ｎｅｏ−ｈＣＣＲ７（２０１００１２１３５７）１００ｎｇを使って、ＰＣＲ反応をセットアップした。
【０２１９】
【化２】
0006469644.tif 000004
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【０２２０】
【化３】
0006469644.tif 000006
【０２２１】
各々の変異について、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号２００５３１）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）を使用し、製造者の説明書に従って、ＰＣＲ産物を生成させた。その結果生じたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ消化してから、Ｔｏｐ１０化学コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ニューヨーク州グランドアイランド）に形質転換した。各コンストラクトについて個々のコロニーを拾い、配列決定した。正しい配列を持つクローンをスケールアップし、再び配列決定した。最終的なクローンＤＮＡ配列と翻訳されたタンパク質配列は次のとおりである。
【０２２２】
【化４】
0006469644.tif 000007
0006469644.tif 000008
【０２２３】
【化５】
0006469644.tif 000009
【０２２４】
【化６】
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【０２２５】
【化７】
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【０２２６】
【化８】
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【０２２７】
【化９】
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【０２２８】
【化１０】
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【０２２９】
【化１１】
0006469644.tif 000017
【０２３０】
【化１２】
0006469644.tif 000018
【０２３１】
【化１３】
0006469644.tif 000019
【０２３２】
【化１４】
0006469644.tif 000020
0006469644.tif 000021
【０２３３】
【化１５】
0006469644.tif 000022
【０２３４】
【化１６】
0006469644.tif 000023
0006469644.tif 000024
【０２３５】
【化１７】
0006469644.tif 000025
【０２３６】
【化１８】
0006469644.tif 000026
【０２３７】
【化１９】
0006469644.tif 000027
【０２３８】
【化２０】
0006469644.tif 000028
【０２３９】
【化２１】
0006469644.tif 000029
【０２４０】
【化２２】
0006469644.tif 000030
【０２４１】
【化２３】
0006469644.tif 000031
【０２４２】
【化２４】
0006469644.tif 000032
0006469644.tif 000033
【０２４３】
【化２５】
0006469644.tif 000034
【０２４４】
【化２６】
0006469644.tif 000035
0006469644.tif 000036
【０２４５】
【化２７】
0006469644.tif 000037
【０２４６】
【化２８】
0006469644.tif 000038
【０２４７】
【化２９】
0006469644.tif 000039
【０２４８】
【化３０】
0006469644.tif 000040
【０２４９】
【化３１】
0006469644.tif 000041
【０２５０】
【化３２】
0006469644.tif 000042
【０２５１】
【化３３】
0006469644.tif 000043
【０２５２】
【化３４】
0006469644.tif 000044
0006469644.tif 000045
【０２５３】
【化３５】
0006469644.tif 000046
【０２５４】
【化３６】
0006469644.tif 000047
0006469644.tif 000048
【０２５５】
【化３７】
0006469644.tif 000049
【０２５６】
【化３８】
0006469644.tif 000050
0006469644.tif 000051
【０２５７】
【化３９】
0006469644.tif 000052
【０２５８】
【化４０】
0006469644.tif 000053
【０２５９】
【化４１】
0006469644.tif 000054
0006469644.tif 000055
【０２６０】
【化４２】
0006469644.tif 000056
【０２６１】
【化４３】
0006469644.tif 000057
【０２６２】
【化４４】
0006469644.tif 000058
0006469644.tif 000059
【０２６３】
【化４５】
0006469644.tif 000060
【０２６４】
【化４６】
0006469644.tif 000061
0006469644.tif 000062
【０２６５】
【化４７】
0006469644.tif 000063
【０２６６】
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号０４７０９７０５００１）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，インディアナ州インディアナポリス）を使用し、製造者のプロトコールに従って、２２個のコンストラクトのそれぞれを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。使用したＤＮＡ対Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤの比は１：３であった。トランスフェクションに関する対照は、上に挙げたｐｃＤＮＡ３．１  Ｎｅｏ−ｈＣＣＲ７（２０１００１２１３５７）および次に示すｐｃＤＮＡ３．１  Ｎｅｏ−ｍｏｕｓｅＣＣＲ７（２００６０２９８６２８）とした。
【０２６７】
【化４８】
0006469644.tif 000064
【０２６８】
【化４９】
0006469644.tif 000065
【０２６９】
４８時間後に、トランスフェクト細胞を収穫し、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳで２回洗浄した。Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，マサチューセッツ州ローレンス）を使って細胞をカウントし、９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり２５０，０００個の細胞をプレーティングした。各コンストラクトをトランスフェクトした細胞を二つ一組にして次のように染色した：無染色対照、６Ｂ４．１一次Ａｂに続いてヤギ抗ヒト−ＰＥ二次Ａｂ、６Ｂ５．１一次Ａｂに続いてヤギ抗ヒト−ＰＥ二次Ａｂ、ｍＡｂ１９７一次Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）に続いてヤギ抗マウス−ＰＥ二次Ａｂ、ならびに二次Ａｂヤギ抗マウス−ＰＥだけおよびヤギ抗ヒト−ＰＥだけの対照。細胞をフローサイトメトリーによって視覚化し、幾何平均を生成して、解析した。
【０２７０】
図５は、ｍＡｂ１９７が、６Ｂ４．１および６Ｂ５．１と比較して、Ｆ４４Ｙ変異を有するＣＤＲコンストラクトに対して低い結合を示したことを示しており、抗体６Ｂ４．１および６Ｂ５．１が、それぞれｍＡｂ１９７とは異なるエピトープに結合することを実証している。３つの抗体はいずれも、野生型ヒトＣＣＲ７と比べて、Ｄ３５変異体にはそれぞれほぼ同じ程度に、またＬ４７Ｖ変異体には低く、またＳ４９Ｆ変異体にはより良く結合した。これらの抗体のうち、ｍＡｂ１９７だけは野生型マウスＣＣＲ７に結合した。
【０２７１】
図６は、ＥＣＬ１内の変異体への結合に明白な相違がないことを示している。３つの抗体はそれぞれ各ミュータントに、野生型ヒトＣＣＲ７へのそれらの結合とほぼ同程度に結合した。
【０２７２】
図７は、ｍＡｂ１９７が示すＥＣＬ２のＳ２０２Ｎ、Ｓ２０４Ｇ、およびＡ２０７Ｔ変異体への（野生型ヒトＣＣＲ７へのその結合と比較した）結合の減少が、６Ｂ．４または６Ｂ．５のどちらが示す減少よりも小さかったことを示している。ただし、３つの抗体はいずれも、これらの変異体にも、Ｒ２０１Ｋ変異体およびＭ２０８Ｌ変異体にも、野生型ヒトＣＣＲ７へのそれらの結合よりは弱く結合した。
【０２７３】
図８は、３つの抗体がいずれも、試験したＥＣＬ３変異体のそれぞれに、野生型ＣＣＲ７へのそれらの結合とほぼ同じ程度に結合したことを示している。ここでもｍＡｂ１９７だけが野生型マウスＣＣＲ７受容体に結合した。
【０２７４】
野生型マウスＣＣＲ７配列を、そのアミノ酸残基のいくつかが野生型ヒトＣＣＲ７中の相同位置に見いだされる残基で置き換えられるように変異させた、相互コンストラクト（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を作製した。
【０２７５】
次に挙げる変異導入を行った：Ｙ４４Ｆ、Ｖ４７Ｌ、Ｋ２０１Ｒ、Ｎ２０２Ｓ、Ｇ２０４Ｓ、Ｔ２０７Ａ、Ｌ２０８Ｍ。これらのアミノ酸変化を次に挙げる組合せで個々のコンストラクトとして使用した。
１）Ｙ４４Ｆ変異およびＶ４７Ｌ変異
２）Ｋ２０１Ｒ／Ｎ２０２Ｓ／Ｇ２０４Ｓ／Ｔ２０７Ａ／Ｌ２０８Ｍ
３）上記の全て：Ｙ４４Ｆ／Ｖ４７Ｌ／Ｋ２０１Ｒ／Ｎ２０２Ｓ／Ｇ２０４Ｓ／Ｔ２０７Ａ／Ｌ２０８Ｍ。
【０２７６】
次に挙げるオリゴを作製した：
Ｙ４４Ｆ＿Ｖ４７Ｌセンス：ＡＣＧＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡ
Ｙ４４Ｆ＿Ｖ４７Ｌ＿アンチセンス：ＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＴＣＣＡＣＣＧＴ
Ｋ２０１Ｒ＿Ｎ２０２Ｓ＿Ｇ２０４Ｓ＿Ｔ２０７Ａ＿Ｌ２０８Ｍセンス：
ＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＣＧＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＣ
Ｋ２０１Ｒ＿Ｎ２０２Ｓ＿Ｇ２０４Ｓ＿  Ｔ２０７Ａ＿Ｌ２０８Ｍ  アンチセンス：
ＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＴＣＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＧ
【０２７７】
オリゴを５０ｎｇ／  ｌの濃度に希釈した。１００ｎｇのテンプレートＤＮＡ  ｐｃＤＮＡ３．１  Ｎｅｏ−ｍＣＣＲ７（２００６０２９８６２８）を使って、ＰＣＲ反応をセットアップした。各々の変異について、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号２００５３１）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州ラホーヤ）を使用し、製造者の説明書に従って、ＰＣＲ産物を生成させた。その結果生じたＰＣＲ産物をＤｐｎＩ消化してから、Ｔｏｐ１０化学コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ニューヨーク州グランドアイランド）に形質転換した。各コンストラクトについて個々のコロニーを拾い、配列決定した。正しい配列を持つクローンをスケールアップし、再び配列決定した。最終的なクローンＤＮＡ配列と翻訳されたタンパク質配列は次のとおりである。
【０２７８】
Ｙ４４ＦおよびＶ４７Ｌコンストラクト  ２０１１００９４６７５（「ＹＶ」）：
【化５０】
0006469644.tif 000066
【０２７９】
【化５１】
0006469644.tif 000067
【０２８０】
Ｋ２０１Ｒ／Ｎ２０２Ｓ／Ｇ２０４Ｓ／Ｔ２０７Ａ／Ｌ２０８Ｍコンストラクト  ２０１１００９４６７３（「ＫＮＧＴＬ」）：
【化５２】
0006469644.tif 000068
【０２８１】
【化５３】
0006469644.tif 000069
【０２８２】
１つのコンストラクト中に７つの変異の全てを入れるために、コンストラクト２０１１００９４６７３を使用し、次に挙げるオリゴを使って、さらに１ラウンドのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指定突然変異導入を行った。
Ｙ４４Ｆ＿Ｖ４７Ｌセンス：ＡＣＧＧＴＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＡＡ
Ｙ４４Ｆ＿Ｖ４７Ｌ＿アンチセンス：ＴＴＧＡＡＧＣＡＣＡＡＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＴＣＣＡＣＣＧＴ
【０２８３】
Ｙ４４Ｆ／Ｖ４７Ｌ／Ｋ２０１Ｒ／Ｎ２０２Ｓ／Ｇ２０４Ｓ／Ｔ２０７Ａ／Ｌ２０８Ｍコンストラクト  ２０１１０１０５４２３（「ＹＶＫＮＧＴＬ」）：
【化５４】
0006469644.tif 000070
【０２８４】
【化５５】
0006469644.tif 000071
【０２８５】
Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号０４７０９７０５００１）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，インディアナ州インディアナポリス）を使用し、製造者のプロトコールに従って、２２個のコンストラクトのそれぞれを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。使用したＤＮＡ対Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤの比は１：３であった。トランスフェクションに関する対照は、上に挙げた野生型ｐｃＤＮＡ３．１  Ｎｅｏ−ｈＣＣＲ７（２０１００１２１３５７）および野生型ｐｃＤＮＡ３．１  Ｎｅｏ−ｍｏｕｓｅＣＣＲ７（２００６０２９８６２８）とした。４８時間後に、トランスフェクト細胞を収穫し、ＰＢＳ＋５％ＦＢＳで２回洗浄した。Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，マサチューセッツ州ローレンス）を使って細胞をカウントし、９６ウェル丸底プレートに１ウェルあたり２５０，０００個の細胞をプレーティングした。各コンストラクトをトランスフェクトした細胞を二つ一組にして次のように染色した：無染色対照、６Ｂ４．１一次Ａｂに続いてヤギ抗ヒト−ＰＥ二次Ａｂ、６Ｂ５．１一次Ａｂに続いてヤギ抗ヒト−ＰＥ二次Ａｂ、ｍＡｂ１９７一次Ａｂに続いてヤギ抗マウス−ＰＥ二次Ａｂ、ならびに二次Ａｂヤギ抗マウス−ＰＥだけおよびヤギ抗ヒト−ＰＥだけの対照。細胞をフローサイトメトリーによって視覚化し、幾何平均を生成して、解析した。
【０２８６】
先に決定されたとおり、試験した３つの抗体のうち、ｍＡｂ１９７だけが野生型マウスＣＣＲ７に結合し、一方、野生型ヒトＣＣＲ７には３つ全てが結合した。ｍＡｂ１９７は試験した抗体の中で唯一ＹＶコンストラクトに結合した。６Ｂ．４および６Ｂ．５はＫＮＧＴＬコンストラクトに結合し、実際、ｍＡｂ１９７より良く結合した。３つ全ての抗体がコンストラクトＹＶＫＮＧＴＬにも結合したが、ｍＡｂ１９７は６Ｂ．４または６Ｂ．５のどちらよりもよく結合した。
【図１Ａ】
0006469644.tif 000072
【図１ＡＡ】
0006469644.tif 000073
【図１ＡＢ】
0006469644.tif 000074
【図１ＡＣ】
0006469644.tif 000075
【図１ＡＤ】
0006469644.tif 000076
【図１ＡＥ】
0006469644.tif 000077
【図１ＡＦ】
0006469644.tif 000078
【図１ＡＧ】
0006469644.tif 000079
【図１ＡＨ】
0006469644.tif 000080
【図１ＡＩ】
0006469644.tif 000081
【図１ＡＪ】
0006469644.tif 000082
【図１ＡＫ】
0006469644.tif 000083
【図１ＡＬ】
0006469644.tif 000084
【図１ＡＭ】
0006469644.tif 000085
【図１ＡＮ】
0006469644.tif 000086
【図１ＡＯ】
0006469644.tif 000087
【図１ＡＰ】
0006469644.tif 000088
【図１ＡＱ】
0006469644.tif 000089
【図１ＡＲ】
0006469644.tif 000090
【図１Ｂ】
0006469644.tif 000091
【図１Ｃ】
0006469644.tif 000092
【図１Ｄ】
0006469644.tif 000093
【図１Ｅ】
0006469644.tif 000094
【図１Ｆ】
0006469644.tif 000095
【図１Ｇ】
0006469644.tif 000096
【図１Ｈ】
0006469644.tif 000097
【図１Ｉ】
0006469644.tif 000098
【図１Ｊ】
0006469644.tif 000099
【図１Ｋ】
0006469644.tif 000100
【図１Ｌ】
0006469644.tif 000101
【図１Ｍ】
0006469644.tif 000102
【図１Ｎ】
0006469644.tif 000103
【図１Ｏ】
0006469644.tif 000104
【図１Ｐ】
0006469644.tif 000105
【図１Ｑ】
0006469644.tif 000106
【図１Ｒ】
0006469644.tif 000107
【図１Ｓ】
0006469644.tif 000108
【図１Ｔ】
0006469644.tif 000109
【図１Ｕ】
0006469644.tif 000110
【図１Ｖ】
0006469644.tif 000111
【図１Ｗ】
0006469644.tif 000112
【図１Ｘ】
0006469644.tif 000113
【図１Ｙ】
0006469644.tif 000114
【図１Ｚ】
0006469644.tif 000115
【図２】
0006469644.tif 000116
【図３】
0006469644.tif 000117
【図４】
0006469644.tif 000118
【図５】
0006469644.tif 000119
【図６】
0006469644.tif 000120
【図７】
0006469644.tif 000121
【図８】
0006469644.tif 000122
【配列表】
0006469644000001.app