(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応および該増幅反応によって得られた増幅産物を検出することを含むノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を全て含み、工程（２）〜（４）が１時間以内で完了し、かつ、工程（２）以降は反応系を開放することなく行われることを特徴とする、ノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法。
（１）ノロウイルスのＩＩ群を含む試料から、ノロウイルスＧＩＩ群のＲＮＡに対して逆転写反応を行い、ノロウイルスＧＩＩ群由来のＤＮＡを得る工程
（２）（１）によって得られたＤＮＡに対して、フォワードプライマーが配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選ばれ、かつ、リバースプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも１対の核酸プライマーセットを含む核酸プライマー群、１種類の核酸プローブ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、を含む反応系で、合計反応時間が５０分間以内となるようＰＣＲを行い、増幅産物を得る工程
（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物と、配列番号９〜１２のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ、グアニン消光プローブである核酸プローブとの複合体を形成せしめる工程
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、工程（３）において使用される１種類の核酸プローブが、少なくともいずれか一方の末端の核酸がシトシンであり、該シトシンが蛍光標識されており、該標識蛍光は当該核酸プローブが鋳型となる核酸と結合している場合は消光し、当該核酸プローブが他の核酸と結合せず遊離している場合に発光するという性質を有する、ことを特徴とする核酸プローブを用いる、ノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、工程（４）が以下の（４’）である方法。
（４’）工程（３）で得られた複合体を含む反応系の温度を段階的に上昇させて融解曲線分析を行い、複合体を形成していた核酸増幅産物と核酸プローブの解離の有無を検知する工程
【請求項４】
フォワードプライマーが配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選ばれ、かつ、リバースプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドから選ばれる核酸プライマーセットと、
配列番号９〜１２のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ、グアニン消光プローブである核酸プローブと、
３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとを含む、
ノロウイルスのＧＩＩ群を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速、確実かつ簡便なノロウイルスＧＩＩ群の検出のためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用するノロウイルスの検出方法ならびに該方法を行うための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ノロウイルスは約７５００塩基の一本鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスである。ゲノム上には三つのＯｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）が存在し、ＯＲＦ１が非構造蛋白質、ＯＲＦ２が構造蛋白質1（VP1）、ＯＲＦ３が構造蛋白質2（VP2） をコードしていることが知られている。
【０００３】
ノロウイルスのゲノム塩基配列は非常に多様性に富んでおり、その相同性に基づき現在は五つの遺伝子群（ＧＩ〜ＧＶ）に分類されている。このうち、ヒトに対する病原性を有するのはＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶの３群と言われており、そのうちの多くがＧＩまたはＧＩＩ群である。最近は特にＧＩＩ／４が多く検出されている。
【０００４】
ノロウイルスの検出には免疫学的方法やＲＴ−ＰＣＲ法が使われる（特許文献１〜４、非特許文献１）。免疫学的方法は主に医療検査で用いられることが多く、ＲＴ−ＰＣＲは医療および食品検査の両方で広く使われている。
【０００５】
イムノクロマト法は１５分間程度で検査結果が得られるため、迅速な検査が可能である。しかし、その検出感度はＲＴ−ＰＣＲと比較して劣る。このため、イムノクロマト法ではノロウイルスに感染し発症した患者の確認は可能だが、発症していないウイルス保持者の検出は難しい。
【０００６】
ＲＴ−ＰＣＲ法は検出感度に優れる方法である。ノロウイルスＲＮＡの調製、ＲＮＡの逆転写、逆転写産物のＰＣＲ、ＰＣＲ産物の検出と四つの工程がある。一般的なＲＴ−ＰＣＲ法ではこれらの工程を全て行うと２時間以上を要するという欠点がある。例えば特許文献２ではノロウイルス特異的なプライマーとタックマンプローブを用いたノロウイルス検出の実施例が記載されているが、この例では逆転写産物を増幅させるためのＰＣＲ反応のみで１６０分間以上を費やしている。
【０００７】
またＲＴ−ＰＣＲ法に限らず、核酸増幅法を用いた検査では増幅産物の検出方法が問題となることもある。特許文献４ではノロウイルス特異的なプライマーでＲＴ−ＰＣＲを行った後で、アガロースゲル電気泳動により増幅産物の検出を行っている。しかしこの方法では増幅産物のキャリーオーバーによるコンタミネーションが生じる可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許３８８７３４０号
【特許文献２】特許４４１４６４８号
【特許文献３】特許４４３７５２５号
【特許文献４】特開２０１１−７８３５８
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，４１，ｐ．１５４８−１５５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、ＲＴ−ＰＣＲ法における検査時間の短縮およびキャリーオーバーコンタミネーション防止である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定のプライマーおよびプローブを用いた閉鎖系でのノロウイルスＧＩＩタイプ検出が可能であることを見出した。さらに、該プライマーおよびプローブを用いて従来の方法よりもより短時間でＲＴ−ＰＣＲが可能であることを見出し、本発明の完成に至った。すなわち本発明は以下を提供する。
【００１２】
[項１]
核酸増幅反応および該増幅反応によって得られた増幅産物を検出することを含むノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法であって、以下の工程（１）〜（４）を全て含み、工程（２）〜（４）が１時間以内で完了し、かつ、工程（２）以降は反応系を開放することなく行われることを特徴とする、ノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法。
（１）ノロウイルスのＩＩ群を含む試料から、ノロウイルスＧＩＩ群のＲＮＡに対して逆転写反応を行い、ノロウイルスＧＩＩ群由来のＤＮＡを得る工程
（２）（１）によって得られたＤＮＡに対して、少なくとも１対の核酸プライマーセットを含む核酸プライマー群、１種類の核酸プローブ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、を含む反応系で、合計反応時間が５０分間以内となるようＰＣＲを行い、増幅産物を得る工程
（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる１種類の核酸プローブとの複合体を形成せしめる工程
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程
[項２]
項１に記載の方法であって、工程（３）において使用される１種類の核酸プローブが、少なくともいずれか一方の末端の核酸がシトシンであり、該シトシンが蛍光標識されており、該標識蛍光は当該核酸プローブが鋳型となる核酸と結合している場合は消光し、当該核酸プローブが他の核酸と結合せず遊離している場合に発光するという性質を有する、ことを特徴とする核酸プローブを用いる、ノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法。
[項３]
項１または項２に記載の方法において、工程（４）が以下の（４´）である方法。
（４´）工程（３）で得られた複合体を含む反応系の温度を段階的に上昇させて融解曲線分析を行い、複合体を形成していた核酸増幅産物と核酸プローブの解離の有無を検知する工程
[項４]
項１から項３のいずれかに記載の方法であって、さらに以下の特徴（ｉ）および／または（ｉｉ）を含む、ノロウイルスＧＩＩ群の核酸を検出する方法。
（ｉ）工程（２）における核酸プライマーセットが、以下の（Ａ）より選ばれるフォワードプライマーと、以下の（Ｂ）より選ばれるリバースプライマーとの組合せの対から選ばれる少なくとも１対である。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１１２番目を３´末端とし、該配列の８１番目〜９０番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３２１番目を３´末端とし、該配列の２９１〜３００番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プライマー
（ｉｉ）工程（３）において用いられる１種類の核酸プローブが、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかに該当する核酸プローブである。
（Ｃ）配列番号１で示される塩基配列の１５３番目または１５４番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の１３５番目〜１３９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プローブ。
（Ｄ）配列番号２で示される塩基配列の３５０番目〜３５２番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３３０番目〜３４０番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プローブ。        
[項５]
以下の（Ｃ）または（Ｄ）のいずれかの特徴を有する核酸プローブ。
（Ｃ）配列番号１で示される塩基配列の１５３番目または１５４番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の１３５番目〜１３９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プローブ。
（Ｄ）配列番号２で示される塩基配列の３５０番目〜３５２番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３３０番目〜３４０番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プローブ。
[項６]
前記核酸プローブが、配列番号９〜１６のいずれかで示される塩基配列を有する、項５に記載の核酸プローブ。
[項７]
少なくとも１対の核酸プライマーからなる核酸プライマーセットであって、以下の（Ａ）より選ばれるフォワードプライマーと、以下の（Ｂ）より選ばれるリバースプライマーとの組合せの対から選ばれる少なくとも１対である、核酸プライマーセット。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１１２番目を３´末端とし、該配列の８１番目〜９０番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３２１番目を３´末端とし、該配列の２９１〜３００番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プライマー
［項８］
フォワードプライマーが配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれ、かつ、リバースプライマーが配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選ばれる、項７に記載の核酸プライマーセット。
［項９］
項７または項８に記載の核酸プライマーセットと、項５または項６に記載の核酸プローブとを組み合わせてなる、ノロウイルスのＧＩＩ群を検出するためのプライマー・プローブのセット。
［項１０］
項７または項８に記載の核酸プライマーセット、項５または項６に記載の核酸プローブ、または、項９に記載のプライマー・プローブのセットを含む、項１〜４のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ノロウイルスのＧＩＩ群の逆転写産物を１時間以内に、かつ核酸増幅産物を開放することなく検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の結果を示す図である。
【図２】実施例１の結果を示す図である。
【図３】比較例１の結果を示す図である。
【図４】比較例１の結果を示す図である。
【図５】比較例１の結果を示す図である。
【図６】実施例２の結果を示す図である。
【図７】比較例２の結果を示す図である。
【図８】比較例２の結果を示す図である。
【図９】比較例２の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ノロウイルスＧＩＩ群のＯＲＦの部分領域を核酸増幅するための核酸プライマー（プライマー）、核酸プローブ（プローブ）、ならびにこれらを用いてノロウイルスＧＩＩ群の検出および変異判別を行うための方法、および該方法を実施するためのキット等に関する。
【００１６】
本発明におけるＯＲＦの部分領域とは、ＮＣＢＩのアクセションＮｏ．ＡＦ１４５８９６のＲｅｇｉｏｎ４９２１〜５４００に掲載された塩基配列を指す。該配列が配列番号１である。また、配列番号２は配列番号１の相補的配列である。
【００１７】
［核酸プライマーセット］
本発明のノロウイルスＧＩＩ群の検出方法において、ノロウイルスＧＩＩ群に特異的な領域を増幅する核酸プライマーセットは、少なくとも１対の核酸プライマーからなる。
本明細書における「１対の核酸プライマーセット」は、１種類（１配列）のフォワードプライマーと１種類（１配列）のリバースプライマーとで構成される。
なお、核酸プライマーセットが複数対含まれる場合、フォワードプライマーおよびリバースプライマーのうちいずれかは共通のものであってもよい。
【００１８】
上記の核酸プライマーセットは、ノロウイルスＧＩＩ群のＯＲＦの部分領域を核酸増幅するために用いられるものであれば特に限定されないが、好ましくはフォワードプライマーが以下の（Ａ）からなり、リバースプライマーが以下の（Ｂ）からなる核酸プライマーセットである。
（Ａ）配列番号１で示される塩基配列の１１２番目を３´末端とし、該配列の８１番目〜９０番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プライマー
（Ｂ）配列番号２で示される塩基配列の３２１番目を３´末端とし、該配列の２９１〜３００番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プライマー
【００１９】
前記（Ａ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号１で示される塩基配列の１１２番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号１の８１番目〜９０番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号１の８３番目〜８９番目である。
また、前記（Ｂ）の核酸プライマーの塩基配列は３´末端が配列番号２で示される塩基配列の３２１番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号２の２９１番目〜３００番目の中の任意の塩基にしてよい。好ましくは５´末端が配列番号２の２９４〜２９７番目である。
【００２０】
また、前記核酸プライマーセットを構成するフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、配列番号１または２で示される塩基配列を有する核酸と結合し核酸増幅に用いることができるならば、配列番号１または２と異なる塩基配列を有していてもよい。また、核酸プライマーを構成する塩基の中に混合塩基が含まれていてもよい。ただし、該核酸プライマーの塩基配列が配列番号１または２と大きく異なる場合は該核酸プライマーの特異性が低下し、ノロウイルスＧＩＩ群のＤＮＡ以外の核酸を誤って増幅する可能性が大きくなる。従って、該核酸プライマーは配列番号１または配列番号２の一部塩基配列と８５％以上の同一性があることが好ましい。より好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは１００％である。
【００２１】
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本明細書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．１において、プログラムにｂｌａｓｔｎを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（％）を算出する。
【００２２】
既知の方法として同様の領域を核酸増幅し検出する方法が特許文献２や非特許文献１で開示されている。前記文献に記載された方法で用いられるフォワードプライマーは、本明細書における配列番号１の１０８番目の塩基を３´末端としている。該フォワードプライマーの塩基配列は、本明細書において配列番号１７として示した。
発明者らは実験の結果、配列番号１７で示される塩基配列を有するフォワードプライマーよりも、３´末端を１１２番目にした塩基配列を有するフォワードプライマーの方が、前記文献に記載されたフォワードプライマーよりも検出感度に優れることを発見した。
【００２３】
リバースプライマーについても特許文献２や非特許文献１で開示されている。前記文献に記載された方法で用いられるフォワードプライマーは、本明細書における配列番号２の３０１番目の塩基を５´末端としている。該リバースプライマーの塩基配列は、本明細書において配列番号１８として示した。
発明者らは実験の結果、配列番号１８で示される塩基配列を有するリバースプライマーよりも、５´末端を２９４〜３００番目の塩基にした塩基配列を有するリバースプライマーの方が、前記文献に記載されたリバースプライマーよりも検出感度に優れることを発見した。
【００２４】
このような検出感度に優れる核酸プライマーセットとして、特に、フォワードプライマーとして配列番号３〜５のいずれかで示される塩基配列と、リバースプライマーとして配列番号６〜８のいずれかで示される塩基配列との組合せが例示できる。
【００２５】
［核酸プローブ］
本発明で用いられる核酸プローブは、ノロウイルスＧＩＩ群のＯＲＦ領域を検出するためのものであり、上記核酸プライマーセットによって核酸増幅された核酸増幅産物の一部または全部とハイブリダイズして複合体を形成しうるものであれば特に制限されない。より好ましくは、該核酸増幅産物のみと特異的に複合体を形成し、それ以外の塩基配列を有する核酸とは複合体を形成しない核酸プローブであり、より好ましくは該核酸増幅産物の一部または全部の塩基配列と同一または相補的な塩基配列を有する核酸プローブである。
【００２６】
そのような核酸プローブとして好ましくは（Ｃ）または（Ｄ）の特徴を備えた核酸プローブが挙げられる。
（Ｃ）配列番号１で示される塩基配列の１５３番目または１５４番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の１３５番目〜１３９番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プローブ。
（Ｄ）配列番号２で示される塩基配列の３５０番目〜３５２番目の任意の塩基を３´末端とし、該配列の３３０番目〜３４０番目の任意の塩基を５´末端とする塩基配列と８５％以上相同な塩基配列を有する核酸プローブ。
【００２７】
前記（Ｃ）の核酸プローブの塩基配列は３´末端が配列番号１で示される塩基配列の１５３番目または１５４番目の塩基であるならば、５´末端は配列番号１の１３５番目〜１３９番目の中の任意の塩基にしてよい。より好ましくは５´末端が配列番号１の１３６番目〜１３８番目である。
また、前記（Ｄ）の核酸プローブの塩基配列は３´末端が配列番号２で示される塩基配列の３５０番目〜３５２番目の中の任意の塩基であるならば、５´末端は配列番号２の３３０番目〜３４０番目の中の任意の塩基にしてよい。より好ましくは５´末端が配列番号２の３３２〜３３８番目であり、より好ましくは３３３〜３３５番目である。
【００２８】
前記（Ｃ）および（Ｄ）の核酸プローブは、該核酸増幅産物と複合体を形成するのであれば、該核酸プローブ塩基配列の一部は配列番号１または２で示される塩基配列と異なっていてもよい。ただし、該核酸プローブの塩基配列が配列番号１または２と大きく異なる場合は該核酸プローブの特異性が低下し、該核酸増幅産物以外との複合体を形成しうる可能性が大きくなる。従って、該核酸プローブは配列番号１または配列番号２の一部塩基配列と８５％以上の同一性があることが好ましい。より好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは１００％である。
【００２９】
このような核酸プローブとして、配列番号９〜１６のいずれかの塩基配列で示される核酸プローブが例示できる。
【００３０】
上記核酸プローブは核酸が標識されていてもいなくてもよい。標識されている場合は、標識される核酸の位置および数に制限はないが、好ましくは核酸プローブ末端の核酸が標識されることであり、より好ましくはいずれか片方の末端が標識されることである。さらに好ましくは、標識される末端の核酸の塩基がシトシンであることである。
【００３１】
標識物質は特に制限されないが、好ましくは蛍光物質であり、より好ましくは単独では蛍光を示し、標的核酸とハイブリッドを形成した場合には消光する性質を有する蛍光物質である。前記蛍光物質は、制限されないが、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商標、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商標、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ(モレキュラープローブ社製)、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）等が例示できる。
【００３２】
［ノロウイルスＧＩＩ群の検出方法］
本発明のノロウイルスＧＩＩ群の検出方法は、試料中に含まれるノロウイルスＧＩＩ群のＲＮＡを逆転写して得られたＤＮＡを検出することを特徴とする。
【００３３】
該方法の一つの様態として、以下の工程（１）〜（４）を全て含むことを特徴とする方法が挙げられる。
（１）ノロウイルスのＩＩ群を含む試料から、ノロウイルスＧＩＩ群のＲＮＡに対して逆転写反応を行い、ノロウイルスＧＩＩ群由来のＤＮＡを得る工程
（２）（１）によって得られたＤＮＡに対して、少なくとも１対の核酸プライマーセットを含む核酸プライマー群、１種類の核酸プローブ、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、を含む反応系で合計反応時間が５０分間以内となるようＰＣＲを行い、増幅産物を得る工程
（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部または全部と複合体を形成しうる１種類の核酸プローブ複合体を形成せしめる工程
（４）工程（３）で得られた複合体を検出する工程
該方法で用いられる核酸プライマーセットおよび核酸プローブとしては前記のものが使用できる。
【００３４】
本発明のノロウイルス検出方法は、上記工程が含まれること以外は特に制限されない。ノロウイルスＤＮＡの検出が可能ならば上記工程に新たな工程を追加してもよい。
【００３５】
工程（１）は市販の逆転写酵素を用いて行うことができる。逆転写酵素は、酵素単独で市販されているものを用いてもよいし、逆転写反応キットとして市販されているものを用いてもよい、逆転写酵素および逆転写反応キットの例としては、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（タカラバイオ製）、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ製）、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＲＮａｓｅ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  Ｒｅｖｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ  Ｒｅｖｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＲｅｖｅｒＴｒａ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡製）、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  −α−（東洋紡製）、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡製）が挙げられる。
逆転写反応は、逆転写酵素または逆転写反応キットに付属のプロトコールに記載の方法や、その他従来公知の方法で行うことができる。
【００３６】
工程（１）の逆転写反応で用いられる核酸プライマーとしては、本発明の核酸プライマーである（Ａ）または（Ｂ）に記載の核酸プライマーを用いることができ、特に（Ｂ）のリバースプライマーを用いることが好ましい。また、ＲＮＡの逆転写反応で一般的に用いられるランダムプライマーを用いることができる。ランダムプライマーの塩基長は特に制限されないが、４塩基以上１２塩基以下が好ましい。より好ましくは５塩基以上１１塩基以下であり、さらに好ましくは６塩基以上１０塩基以下である。
【００３７】
工程（２）は反応系を開放しても開放しなくても実施可能だが、開放することなく工程（２）が行われることが好ましい。「開放する」とは反応容器の蓋をあけるなどの方法で核酸増幅産物を暴露させることを言う。「開放しない」とは逆に反応容器を開封せず、核酸増幅産物を外部に暴露させないことを言う。
【００３８】
前記方法の工程（４）の一つの様態として、以下の工程（４´）が挙げられる。
（４´）工程（２）で得られた複合体を含む反応系の温度を段階的に上昇させて融解曲線分析を行い、複合体を形成していた核酸増幅産物と核酸プローブの解離の有無を検知する工程
【００３９】
前記（１）（２）（３）（４）の工程、あるいは（１）（２）（３）（４´）の工程を開始してから全て完了するまでの時間は特に制限されないが、工程（２）〜（４）または（２）〜（４´）を１時間以内に終えることが好ましい。より好ましくは５５分間以内であり、５０分間以内であり、４５分間以内である。この時間は工程（２）のＰＣＲが開始されてから工程（４）の複合体検出または（４´）の解離の有無の検知が完了するまでの時間を指し、工程（２）に用いられる反応液の調製時間は含まれない。
【００４０】
前記（１）（２）（３）（４）の工程、あるいは（１）（２）（３）（４´）の工程のうち、工程（２）を開始してから完了するまでの時間は５０分間以内であることが好ましい。さらに好ましくは４５分間であり、４０分間であり、３５分間であり、３０分間である。この時間は工程（２）のＰＣＲが開始されてから完了するまでの時間を指し、工程（２）に用いられる反応液の調製時間は含まれない。
【００４１】
前記（１）（２）（３）（４）の工程、あるいは（１）（２）（３）（４´）の工程のうち、工程（１）を開始してから完了するまでの時間は特に制限されないが、好ましくは４０分間以内であり、より好ましくは３５分間以内であり、３０分間以内である。この時間は工程（１）の逆転写反応が開始されてから完了するまでの時間を指し、工程（１）に用いられる反応液の調製時間は含まれない。
【００４２】
該方法で用いられるノロウイルスＧＩＩ群のＯＲＦを増幅し検出するための核酸プライマーセットおよび核酸プローブは、それぞれ前記したものを用いることができる。さらに、例えばノロウイルスＧＩＩ群のＤＮＡとは異なる核酸を増幅し検出する目的で、前記の核酸プライマーセットおよび核酸プローブとは異なる核酸プライマーセットや核酸プローブを追加することも特に制限されない。
【００４３】
［被検核酸の増幅］
本発明における被検核酸は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。二本鎖の場合は、例えば、被検核酸とプローブとをハイブリダイズさせてハイブリッド体を形成するために、加熱により前記二本鎖を一本鎖に解離させる工程を含むことが好ましい。
【００４４】
前記被検核酸の種類としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記被検核酸は、例えば生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。この試料はそのまま用いてもよいし、適当な溶液で希釈したものを用いてもよい。適当な溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、アルカリ性水溶液、酸性水溶液、核酸抽出試薬、界面活性剤、有機溶媒などが挙げられる
【００４５】
前記生体試料としては、特に制限されないが、例えば、糞便、吐瀉物、腸液、胃液、直腸拭い液、咽頭拭い液などが挙げられる。
試料の採取方法、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の調製方法等は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。
【００４６】
続いて、単離したゲノムＤＮＡを鋳型として、上述の核酸プライマーセットを用いて、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって、検出目的の塩基部位を含む配列を増幅させる。具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等があげられるが、ＰＣＲ法を用いることが好ましい。なお、これらの各方法において、増幅反応の条件は特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００４７】
ＰＣＲ法では通常、変性反応、アニーリング反応、伸長反応の３段階の反応が繰り返される。ただし、アニーリング反応と伸長反応の反応条件を同一とすることで、２段階の反応を繰り返す場合もある。本発明において、ＰＣＲ法の反応は２段階でもよく、３段階でもよく、４段階以上でもよいが、好ましくは３段階である。
【００４８】
前記各反応の温度および時間の条件に制限はないが、変性反応の温度は９０〜１００℃のいずれかが好ましい。変性反応の時間は０〜１０秒間のいずれかが好ましい。ここでの０秒とは一瞬だけ既定の温度にし、すぐに次の段階の反応へと進むことを意味しており、変性反応を行わないことを意味しない。また、アニーリング反応の温度は５０〜６０℃のいずれかが好ましく、アニーリング反応の時間は０〜１５秒間のいずれかが好ましい。伸長反応の温度は５８〜７２℃のいずれかが好ましく、伸長反応の時間は１〜１５秒間のいずれかが好ましい。
【００４９】
変性反応、アニーリング反応、伸長反応を各１回行うことをＰＣＲサイクルと言い、ＰＣＲ法による核酸増幅反応全体でＰＣＲサイクルを行う回数をサイクル数と言う。本発明において実施可能なサイクル数は特に制限されないが、３５〜１００回の範囲であることが好ましい。サイクル数の下限は好ましくは４０回、より好ましくは５０回である。サイクル数の上限は好ましくは８０回、より好ましくは７０回である。
【００５０】
［ＤＮＡポリメラーゼ］
核酸増幅にＰＣＲ法を用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されないが、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。その理由を以下に説明する。
【００５１】
本発明プローブが含まれる反応系でノロウイルス由来のＤＮＡを増幅する場合、核酸増幅工程中に該核酸プローブが試料のノロウイルス由来のＤＮＡまたはそれらの増幅産物と結合しうる。核酸増幅工程中にノロウイルス由来のＤＮＡと結合した該核酸プローブは、核酸プライマーとＤＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応を阻害する。
【００５２】
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅなどＰｏｌＩ型のＤＮＡポリメラーゼは５’−  ３’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。この活性のため、核酸増幅反応中に鋳型となるノロウイルス由来のＤＮＡと結合した核酸がある場合、該結合核酸はエキソヌクレアーゼ活性によって分解されてしまう。このため、反応系中の該核酸プローブが減少し核酸検出工程に問題が生じる可能性がある。従って、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼを用いて本発明を実施することは好ましくない。
【００５３】
他方、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（超好熱始原菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１由来）などα型のＤＮＡポリメラーゼは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を持たず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持つ。従って、α型ＤＮＡポリメラーゼを用いれば上記問題を解決できるのみならず、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により核酸増幅工程において高い正確性が発揮される。
【００５４】
通常、α型ＤＮＡポリメラーゼは３’→  ５’エキソヌクレアーゼ活性のため、核酸増幅速度はＰｏｌＩ型酵素と比較して低い傾向がある。しかし、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはα型ＤＮＡポリメラーゼでありながらＤＮＡ合成活性が高く１００塩基／秒以上のＤＮＡ合成速度を有し伸長効率が優れている。従って、本発明の実施にはα型ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製、商標）を用いることが好ましい。
【００５５】
さらに、α型ＤＮＡポリメラーゼを変異させて１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を達成させた変異型、あるいは、野生型および／または変異型の組み合わせにより当該性能を達成させたＤＮＡポリメラーゼ組成物も、本発明の実施に適したＤＮＡポリメラーゼとして用いることができる。
例えば、上記ＫＯＤ ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ以外に１００塩基／秒以上のデオキシリボ核酸合成速度を有するＤＮＡポリメラーゼとして、「ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡製、商標）」、「ＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡製、商標）」、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ製、商標）なども利用できる。
なかでも、高い正確性とＤＮＡ合成活性とをあわせ持つＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−が望ましい。
【００５６】
前記ポリメラーゼを用いることで、従来よりも短時間でＰＣＲを行うことが可能になる。通常のＴａｑポリメラーゼではデオキシリボ核酸合成速度は６０塩基／秒程度であると言われているが、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなどは１００塩基／秒を越えるデオキシリボ核酸合成速度を持つため、伸長時間を通常の半分に縮めることができる。
【００５７】
また、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュダイアグノスティクス社製）やＧＥＮＥＣＵＢＥ（東洋紡製）など、細いキャピラリー状の反応容器を用いて核酸増幅反応を行わせる核酸増幅装置を併用することで、さらにＰＣＲを高速化することが可能である。これらの技術を利用することで、本発明の実施例が示すように１時間以内のＰＣＲが可能となる。ただし、その場合でも酵素や装置が揃っていればあらゆるプライマー、プローブでＰＣＲや増幅核酸検出反応の高速化が可能になるのではなく、いくつものプライマー、プローブの組合せを試行し、高速化に最適な組合せを決定することが必要である。
【００５８】
［核酸増幅産物とプローブとの複合体形成］
本発明のノロウイルスＤＮＡ検出方法においては、工程（１）によって得られた核酸増幅産物と、該核酸増幅産物の一部と複合体を形成せしめるように設計された核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成せしめる。
【００５９】
核酸増幅産物を含む試料に核酸プローブを添加するタイミングは、特に制限されず、例えば、前述の核酸増幅反応前、核酸増幅反応途中および核酸増幅反応後のいずれに、増幅反応の反応系に添加してもよい。
中でも、増幅反応と、後述の検出反応とを連続的に行うことができるため、増幅反応前に添加することが好ましい。このように核酸増幅反応の前に前記プローブを添加する場合は、例えば、後述のように、その３’末端に、蛍光色素を付加したり、リン酸基を付加したりすることが好ましい。
【００６０】
前記プローブは、核酸増幅産物を含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で核酸増幅産物と混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含む溶媒、ＰＣＲ反応液等、従来公知のものがあげられる。
【００６１】
［核酸増幅産物とプローブとの複合体の検出］
前記方法の（３）で示される工程において、得られた複合体を検出する方法は特に限定されない。例えば、前記（３´）のように融解曲線分析による方法が挙げられる。
【００６２】
融解曲線分析の場合は、例えば、以下のように行う。
二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は、加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。
【００６３】
本発明において、融解曲線分析を行うための温度変化に伴うシグナル変動の測定は、前述のような原理から、２６０ｎｍの吸光度測定により行うこともできるが、本発明のプローブに付加した標識のシグナルを測定することが好ましい。このため、本発明のノロウイルスＧＩＩ群の検出方法に用いるプローブとしては、標識化プローブを使用することが好ましい。
【００６４】
標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸光度等）で検出することによって、前記２６０ｎｍの吸光度測定と同様に、融解の進行を把握することができる。
【００６５】
標識化プローブの具体例として、例えば、蛍光色素で標識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象と呼ばれる。この蛍光消光現象を利用したプローブとしては、中でも、一般的にグアニン消光プローブとよばれるものが好ましい。このようなプローブは、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。グアニン消光プローブとは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の塩基がシトシンとなるように設計し、その末端の塩基シトシンが相補的な塩基グアニンに近づくと発光が弱くなる蛍光色素で前記末端を標識化したプローブである。本発明のプローブにおいては、例えば、蛍光消光現象を示す蛍光色素を、前記オリゴヌクレオチドの３’末端のシトシンに結合させてもよいし、前記オリゴヌクレオチドの５’末端をシトシンに設計し、これに結合させてもよい。
【００６６】
本発明のノロウイルスＧＩＩ群の検出方法に用いるプローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、遺伝子の有無を検出する被検核酸（標的核酸）は、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製することができ、この際、本発明のプローブを核酸増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、プローブ自体が核酸増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００６７】
得られたＰＣＲ増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記反応液の温度変化によって行うことができる。
【００６８】
前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９８℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００６９】
また、解離した一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。温度条件としては、例えば、３５〜５０℃である。
【００７０】
ハイブリダイズ工程の反応系（反応系）における各組成の体積や濃度は、特に制限されない。具体例としては、前記反応系において、ＤＮＡの濃度は、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０μｍｏｌ／Ｌ、前記標識化プローブの濃度は、例えば、前記ＤＮＡに対する添加割合を満たす範囲が好ましく、例えば、０．０１〜１００μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌである。
【００７１】
そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記一本鎖ＤＮＡと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端のＣ塩基が標識化されたプローブ（グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズした状態では、蛍光が減少（または消光）し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７２】
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．０５〜２０℃／秒であり、好ましくは０．０８〜５℃／秒である。
【００７３】
被検核酸の有無の決定は、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動を測定することによって行いうる。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定する。
【００７４】
具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ（例えば、グアニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発しているが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、前記蛍光が減少（または消光）する。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとプローブとが解離している状態では蛍光を発していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
【００７５】
また、本発明においては、目的の塩基部位における遺伝子型の決定のために、前記シグナルの変動を解析してＴｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）値として決定してもよい。
【００７６】
［プライマー、プローブ、検出キット］
本発明はまた、上記で説明したノロウイルスのＧＩＩ群を検出するための方法において用いるプライマーセット、プローブ、または、該プライマーセットと該プローブとを組合せたセットに関する。
【００７７】
本発明はまた、ノロウイルスＧＩＩ群検出キットに関する。本発明のキットは、前記核酸プライマーセットを含み、前記ノロウイルスＧＩＩ群検出方法に用いることが出来る。該キットは、さらに前記核酸プローブを含み、そのほかに、核酸増幅反応および／または核酸増幅産物検出反応に必要な試薬を適宜含むことが好ましい。また、該キットはさらにＲＮＡの逆転写反応に必要な試薬を含むことも制限されない。逆転写反応に必要な試薬としては例えば逆転写酵素やＲＮＡ分解酵素抑制剤などが挙げられる。
【００７８】
本明細書で用いられるＤＮＡ合成酵素の活性測定方法について、以下に記す。
［ＤＮＡ合成活性］
本発明において、ＤＮＡ合成活性とは鋳型ＤＮＡにアニールされたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にデオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェートのα−ホスフェートを共有結合せしめることにより、デオキシリボ核酸にデオキシリボヌクレオシド５’−モノホスフェートを鋳型依存的に導入する反応を触媒する活性をいう。
【００７９】
その活性測定法は、酵素活性が高い場合には、保存緩衝液でサンプルを希釈して測定を行う。本発明では、下記Ａ液２５μｌ、Ｂ液およびＣ液各５μｌおよび滅菌水１０μｌをエッペンドルフチューブに加えて攪拌混合した後、上記酵素液５μｌを加えて７５℃で１０分間反応する。その後、氷冷し、Ｅ液５０μｌ、Ｄ液１００μｌを加えて、攪拌後、さらに１０分間氷冷する。この液をガラスフィルター（ワットマンＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、Ｄ液及びエタノールで充分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の１単位はこの条件下で３０分あたり１０ｎモルのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とする。
Ａ：  ４０ｍＭ          Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１６ｍＭ          塩化マグネシウム
１５ｍＭ          ジチオスレイトール
１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ
Ｂ：  ２μｇ／μｌ      活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ：  １．５ｍＭ        ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ〔３Ｈ〕ｄＴＴＰ）
Ｄ：  ２０％            トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ：  １μｇ／μｌ      キャリアーＤＮＡ
【００８０】
［３’−５’エキソヌクレアーゼ活性］
本発明において、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性とは、ＤＮＡの３’末端領域を切除し、５’−モノヌクレオチドを遊離する活性をいう。
その活性測定法は、５０μｌの反応液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８  ａｔ  ２５℃），  １０ｍＭ  ＫＣｌ，  ６ｍＭ  硫酸アンモニウム，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，  ０．００１％  ＢＳＡ，５  μｇ  トリチウムラベルされた大腸菌ＤＮＡ）を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注し、ＤＮＡポリメラーゼを加える。７５℃で１０分間反応させた後、氷冷によって反応を停止し、次にキャリアーとして、０．１％のＢＳＡを５０μｌ加え、さらに１０％のトリクロロ酢酸、２％ピロリン酸ナトリウム溶液を１００μｌ加え混合する。氷上で１５分放置した後、１２，０００回転で１０分間遠心し沈殿を分離する。上清１００μｌの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で計測し、酸可溶性画分に遊離したヌクレオチド量を測定する。
【実施例】
【００８１】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００８２】
〔実施例１：本発明核酸プライマーの有用性確認〕
（１）試料の調製
ＧＩＩ群であることが分かっているノロウイルスのＲＮＡから配列番号６の核酸プライマーと配列番号７の核酸プライマーとを各５ｐｍｏｌずつ混合した核酸プライマーセットと、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡製）の５ｘＲＴ  ＢｕｆｆｅｒおよびＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘを用い、３７℃で１５分間逆転写反応させｃＤＮＡを合成した。反応後９８℃で５分間過熱し逆転写酵素を失活させた。合成したｃＤＮＡを１０ｍＭのトリス緩衝液を用いて約１００コピー／μｌに濃度調製し、試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
上記試料にそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件により核酸増幅および融解曲線分析を行い核酸プローブと核酸増幅産物との複合体を検出した。分析には東洋紡社製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を用いた。
【００８３】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。核酸プライマーセットの組合せは表１に掲載したとおりである。（表１において、プライマー列、プローブ列の数字は、配列番号を示す。）
１００μＭフォワードプライマー（配列番号３〜５のうちいずれか一つ）０．２５μｌ
１０μＭリバースプライマー（配列番号６〜８のうちいずれか一つ）０．５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
精製水  １．９５μｌ
試料  １μｌ
【００８４】
【表１】
0006569238.tif 000002
【００８５】
［核酸増幅および融解曲線分析］
９４℃・３０秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５５℃・５秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃〜７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
【００８６】
［結果］
図１は、表１の組合せＮｏ．１および２で表される核酸プライマーセットと、配列番号１３からなる塩基配列を有する核酸プローブとを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。本実施例で用いた核酸プローブは消光プローブであり、核酸増幅産物と共に３９℃に置くことによって増幅された標的核酸と結合し消光する。その後、徐々に温度を上げることで核酸プローブは標的核酸から遊離し、蛍光を発する。従って、徐々に温度を上げる過程で蛍光変化量が正に変化すれば、それは即ち標的核酸と結合していた核酸プローブが遊離したことを示している。
図１では両方の組合せからピークが認められる。従って、Ｎｏ．１および２の組合せの核酸プライマーはノロウイルスＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを核酸増幅することが可能であり、また、配列番号１３で示される塩基配列を有する核酸プローブは、該ｃＤＮＡを検出可能であることが示された。
さらに、核酸増幅反応が開始されてから融解曲線分析が行われ標的核酸の存在が検知されるまでの所要時間は約４５分間だった。
【００８７】
図２は核酸プライマーを表１に記載の組合せＮｏ．３〜５にそれぞれ変更して核酸増幅および融解曲線分析を行った結果である。いずれも蛍光微分値のピークが確認でき、ＧＩＩ群のノロウイルス由来のｃＤＮＡが増幅され検出されていることが示された
以上から、本発明の核酸プライマーはノロウイルスＧＩＩ群のＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの一部領域を核酸増幅可能であり、本発明の核酸プローブは該核酸増幅産物を検出できることが示された。また、本発明で用いられる核酸プライマーセットは１種類に限定されず、幅広い核酸プライマーの組合せが可能であることが示された。また、本発明の検出方法のうち工程（２）〜（４）は１時間以内に完了できることが示された。
【００８８】
［比較例１：本発明の方法の迅速性検証］
ここでは本発明の方法と先行文献（特許文献２）の方法とを比較し、本発明が先行文献の方法と比較して短時間で実施できることを確認した。本発明と先行文献の方法とは、使用するＤＮＡポリメラーゼおよび核酸プローブが異なり、本発明はＫＯＤ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＱＰｒｏｂｅを、先行文献の方法はＴａｑ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ（登録商標）を用いている。そのため、本比較例では表２に示す４通りの組み合わせで実験を行った。なお、Ｔａｑ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてはｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製）を使用した。
【００８９】
【表２】
0006569238.tif 000003
【００９０】
（１）試料の調製
ＧＩＩ群であることが分かっているノロウイルスのＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡製）の５ｘＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ランダムプライマーとオリゴ（ｄＴ）プライマーの混合物）を用い、３７℃で１５分間逆転写反応させｃＤＮＡを合成した。反応後９８℃で５分間過熱し逆転写酵素を失活させた。合成されたｃＤＮＡを、１０ｍＭのトリス緩衝液を用いて約１０００コピー／μｌに濃度調製し、試料とした。
【００９１】
（２）核酸増幅
核酸増幅は以下の２通りの方法で実施した。
（２−１）通常ＰＣＲ・融解曲線分析
通常ＰＣＲおよび融解曲線分析は下記の条件で行った。分析にはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。
９５℃・３分
（以上１サイクル）
９５℃・１０秒
５５℃・３０秒（ＧｒｅｅｎおよびＹｅｌｌｏｗの蛍光を取得）
７２℃・３０秒
（以上５５サイクル）
９４℃・３０秒
４０℃に冷却
４０℃〜８０℃（１℃ずつ上昇、１℃上昇ごとに５秒保持、Ｇｒｅｅｎ蛍光を取得）
【００９２】
（２−２）高速ＰＣＲ・融解曲線分析
高速ＰＣＲおよび融解曲線分析は下記の条件で行った。分析にはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０（Ｒｏｃｈｅ社）を使用した。
９５℃・１分
（以上１サイクル）
９７℃・２秒
５５℃・５秒
６８℃・５秒
（以上６０サイクル）
９４℃・６０秒
４０℃・６０秒
４０℃〜８０℃（０．４℃／秒で連続的に温度上昇）
【００９３】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。ここで使用した核酸プライマーである配列番号１７および１８は、特許文献２および非特許文献に記載されている核酸プライマーである。また、組み合わせＮｏ．１および２で使用したＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅである配列番号１９は特許文献２に記載されている核酸プローブである。本比較例で使用したＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅは５’末端がＴＥＴで標識され、３’末端がＴＡＭＲＡで標識されたものを用いた。
各試薬はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでは下記記載の１倍量、すなわち８μｌを使用し、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑでは下記記載の２．５倍量、すなわち２０μｌを使用した。Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑではさらに精製水３μｌを追加した。そして試料であるｃＤＮＡはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑとも２μｌ、すなわち約２０００コピー相当を添加した。
【００９４】
（組み合わせＮｏ．１用試薬）
１０μＭフォワードプライマー（配列番号１７）０．５μｌ
１０μＭリバースプライマー（配列番号１８）０．５μｌ
１０μＭＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ（配列番号１９、５´末端をＴＥＴ標識、３奪取末端をＴＡＭＲＡ標識）０．５μｌ
ｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製）０．７５μｌ
抗ｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ抗体（東洋紡製）０．７５μｌ
２５ｍＭ  塩化マグネシウム  ０．６μｌ
１０×ｒＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡製）１．０μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ（東洋紡製）  １．０μｌ
精製水  ２．４μｌ
合計  ８μｌ
【００９５】
（組み合わせＮｏ．２用試薬）
１００μＭフォワードプライマー（配列番号１７）０．５μｌ
１０μＭリバースプライマー（配列番号１８）０．５μｌ
１０μＭＱＰｒｏｂｅ（配列番号１３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．２５μｌ
ｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡製）０．７５μｌ
抗ｒＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ抗体（東洋紡製）０．７５μｌ
２５ｍＭ  塩化マグネシウム  ０．６μｌ
１０×ｒＴａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡製）１．０μｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ（東洋紡製）  １．０μｌ
精製水  ２．６５μｌ
合計  ８μｌ
【００９６】
（組み合わせＮｏ．３用試薬）
１０μＭフォワードプライマー（配列番号１７）０．５μｌ
１０μＭリバースプライマー（配列番号１８）０．５μｌ
１０μＭＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅ（配列番号１９、５´末端をＴＥＴ標識、３奪取末端をＴＡＭＲＡ標識）０．５μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
２５ｍＭ  硫酸マグネシウム（東洋紡製）１．２μｌ
精製水  ２．３μｌ
合計  ８μｌ
【００９７】
（組み合わせＮｏ．４用試薬）
１００μＭフォワードプライマー（配列番号１７）０．５μｌ
１０μＭリバースプライマー（配列番号１８）０．５μｌ
１０μＭＱＰｒｏｂｅ（配列番号１３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．２５μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
２５ｍＭ  硫酸マグネシウム（東洋紡製）１．２μｌ
精製水  ２．５５μｌ
合計  ８μｌ
【００９８】
［結果］
図３はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ社）にて高速ＰＣＲ・融解曲線分析を行った結果である。図３より、酵素・プローブ組み合わせＮｏ．４、すなわち３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＫＯＤ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＱＰｒｏｂｅとの組み合わせで一番明瞭なピークが得られた。融解曲線分析におけるピークは核酸増幅反応産物と核酸プローブとの複合体が存在することを示すものであるため、本ピークは組み合わせＮｏ．４の反応系で、ノロウイルスＧＩＩタイプのｃＤＮＡを鋳型とする増幅産物が得られたことを示す。一方、組み合わせＮｏ．２は全くピークが得られず、Ｎｏ．１、３はピークはあるが弱いものであるため、これらの反応系では増幅能または検出能は組み合わせＮｏ．４よりも弱く、高速ＰＣＲには不向きであると言える。ＰＣＲ開始から解析結果を得るまでは１時間以内で完了しており、この方法に適した組み合わせＮｏ．４は、短時間でノロウイルスＧＩＩ群を測定する方法として適している。
【００９９】
図４はＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ（キアゲン社）にて通常ＰＣＲ・融解曲線分析を行った結果である。ここでは酵素・プローブ組み合わせＮｏ．３、すなわちＫＯＤ  ＤＮＡ  ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅを組み合わせた反応系では、不明瞭ながらもｃＤＮＡ増幅産物検出を示すピークが得られている。一方、Ｎｏ．１では蛍光値の変化は見られるが明確なピークは存在せず、Ｎｏ．２および４、すなわちＱＰｒｏｂｅを用いた反応系ではピークが見られなかった。図４で示される実験において組み合わせＮｏ.4がノロウイルス由来のＤＮＡをうまく検出できなかった理由としては、核酸伸長反応（７２℃・３０秒）の条件が理由として挙げられる。Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの最適伸長反応温度は７２℃であり、本実験での通常ＰＣＲ条件もこれに合わせてある。本実験でのＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ測定は特許文献２の実施例を模したものとして実施するため、ＰＣＲ条件も当該文献のものと類似とした。一方、ＫＯＤ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは最適温度が６８℃前後であるため、本実験のＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ測定では増幅効率が低下し、検出結果が不明瞭になったと考える。
図５は同じくＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑでアニーリング時の蛍光をトレースしたものである。ここではＮｏ．１とＮｏ．２、すなわちＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅを使用した反応系では蛍光が観測された。曲線の立ち上がりはＮｏ．２が圧倒的に早い段階で生じていた。しかし、精製水を試料として測定した場合もＮｏ．２は同様の傾向が見られたため、Ｎｏ．２における蛍光は増幅産物とは無関係に観測されたものと考えられる。おそらく、ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎ  Ｐｒｏｂｅが鋳型ＤＮＡとの結合とは無関係に分解され蛍光物質の発光が生じたことが原因と考えられる。組み合わせＮｏ．１はｃＤＮＡを試料とした場合のみ蛍光が観測されたが、曲線の立ち上がりは約４０サイクル以降だった。曲線立ち上がりを確認するまでに１時間以上が経過していたため、反応系組み合わせＮｏ．１で通常ＰＣＲ条件による測定を行った場合でも、１時間以内でノロウイルスＧＩＩ群の測定を行うことは不可能である。
以上から、先行文献の方法よりも本発明の方法の方が、より迅速にノロウイルスＧＩＩ群を検出できることが示された。
【０１００】
〔実施例２：本発明核酸プローブの有用性確認〕
（１）試料の調製
（２）核酸増幅および融解曲線分析
いずれも実施例１と同様に行った。
【０１０１】
［核酸増幅用試薬］
以下の試薬を含む溶液を調製した。
１００μＭフォワードプライマー（配列番号４）０．５μｌ
１００μＭリバースプライマー（配列番号６）０．１μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号９または１４、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
精製水  ２．１μｌ
試料  １μｌ
【０１０２】
［核酸増幅および融解曲線分析］
実施例１と同様に行った。
【０１０３】
［結果］
図６は、フォワードプライマーが配列番号４、リバースプライマーが配列番号６、核酸プローブが配列番号９または１４のいずれかである核酸プライマー・プローブの組合せを用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図６より明らかなように、いずれの核酸プローブを用いても実施例１と同じくノロウイルスＧＩＩ群のＲＮＡ由来のｃＤＮＡを検出することができた。以上から、本発明で使用可能な核酸プローブは１通りの塩基配列ではなく、複数の塩基配列をとりうることが示された。
【０１０４】
〔比較例２：先行文献に記載の核酸プライマーとの性能比較〕
（１）試料の調製
ＧＩＩ群であることが分かっているノロウイルスのＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｋｉｔ（東洋紡製）の５ｘＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（ランダムプライマーとオリゴ（ｄＴ）プライマーの混合物）を用い、３７℃で１５分間逆転写反応させｃＤＮＡを合成した。反応後９８℃で５分間過熱し逆転写酵素を失活させた。合成されたｃＤＮＡを、１０ｍＭのトリス緩衝液を用いて約１００コピー／μｌまたは３０コピー／μｌに濃度調製し、試料とした。
（２）核酸増幅および融解曲線分析
実施例１と同じ。
【０１０５】
［試薬］
以下の試薬を含む溶液（１）および（２）を調製した。なお、核酸プライマーおよび核酸プローブの組合せは表３に示した。（表３において、プライマー列、プローブ列の数字は、配列番号を示す。）
【０１０６】
溶液（１）
１００μＭ核酸プライマー（配列番号３または１７のいずれか一つ）０．１５μｌ
１０μＭ核酸プライマー（配列番号１８）０．２５μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ｃＤＮＡ（１００コピー／μｌ）  １μｌ
精製水  ２．３μｌ
【０１０７】
溶液（２）
１００μＭ核酸プライマー（配列番号４または５のいずれか一つ）０．５μｌ
１００μＭ核酸プライマー（配列番号６または１８のいずれか一つ）０．１μｌ
１０μＭ核酸プローブ（配列番号１３、３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識）０．３μｌ
ＫＯＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ＰＰＤ  Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μｌ
ｃＤＮＡ（３０コピー／μｌ）  １μｌ
精製水  ２．１μｌ
【０１０８】
【表３】
0006569238.tif 000004
【０１０９】
［核酸増幅および融解曲線分析］
実施例１と同様に行った。
【０１１０】
［結果］
図７は、表３の組合せＮｏ．６、７で示される核酸プライマー・プローブの組合せを溶液（１）の組成で用いて、核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。ここで用いた配列番号１７のフォワードプライマーおよび配列番号１８のリバースプライマーは、特許文献２および非特許文献に記載されている核酸プライマーである。
図７より、配列番号１７と１８の組合せからなる核酸プライマーセットでは、ノロウイルスＧＩＩ群由来のｃＤＮＡが増幅されていないことが示された。一方で、フォワードプライマーを本発明に記載の核酸プライマーである配列番号３に変更すると、ｃＤＮＡが増幅されることが示された。
また図８〜９は核酸プライマーを表３に記載の組合せＮｏ．８〜１１にそれぞれ変更して、溶液（２）の組成で核酸増幅および融解曲線分析を行った結果である。組合せＮｏ．８では検出ピークが見られず、組合せＮｏ．９でもピークが低めであることから、これらの組合せを構成する核酸プライマーセットは増幅効率で劣ることが示唆された。一方で、組合せＮｏ．１０およびＮｏ．１１は検出ピークが認められたことから、これらの組合せを構成する核酸プライマーセットは、Ｎｏ．８およびＮｏ．９の核酸プライマーセットよりも増幅効率に優れることが示唆された。Ｎｏ．８およびＮｏ．９ではリバースプライマーに配列番号１８を用いており、Ｎｏ．１０およびＮｏ．１１ではリバースプライマーに配列番号６を用いていることから、これらの結果の差はリバースプライマーによるものと考えられ、本発明のリバースプライマーはより優れた性能を有することが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明をノロウイルスＧＩＩ群の遺伝子検査に利用することで、１時間以内に、なおかつ簡便にノロウイルスＧＩＩ群を検出し、同時に変異の判別を行うことができる。
【図１】
0006569238.tif 000005
【図２】
0006569238.tif 000006
【図３】
0006569238.tif 000007
【図４】
0006569238.tif 000008
【図５】
0006569238.tif 000009
【図６】
0006569238.tif 000010
【図７】
0006569238.tif 000011
【図８】
0006569238.tif 000012
【図９】
0006569238.tif 000013
【配列表】
0006569238000001.app