(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼを含む組成物であって、前記組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、前記組換えヒトβ−グルクロニダーゼに対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有する、前記組成物。
【請求項２】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、少なくとも１ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有し、かつ前記組換えヒトβ−グルクロニダーゼの全グリカンの少なくとも１０ｍｏｌ％の高レベルのＭ６Ｐ部分を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、０．８ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１．３ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、１．０ｍｏｌ／ｍｏｌ〜１．２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
それを必要とする対象におけるリソソーム蓄積症の治療に使用するための、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
対象がヒトである、請求項６に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
リソソーム蓄積症が、ムコ多糖症７型である、請求項６又は７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、又は４ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６〜８のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、週に１回投与される、請求項６〜１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、１週おきに投与される、請求項６〜１０のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、静脈内に投与される、請求項６〜１２のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、継続的な注入によって投与される、請求項６〜１３のいずれかに記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
組換えヒトβ−グルクロニダーゼが、抗ヒスタミン療法と同時に、またはそれに続いて投与される、請求項６〜１４のいずれかに記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年３月５日に出願された米国特許仮出願第６１／９４８，４２１号及び２０１５年２月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／１１４，３１３号の優先権を主張するものであり、これらのそれぞれを、あらゆる目的のためにその全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、シアル化糖タンパク質組成物ならびにさまざまな状態及び障害を処置する際にそれらを使用する方法に関する。
【０００３】
電子的に提出するテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出するテキストファイルの内容は、その全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする：配列表のコンピュータ読み取り可能な形式の複製（ファイル名：ＵＬＰＩ＿０２０＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データ記録日：２０１５年３月２日、ファイルサイズ：９キロバイト）。
【背景技術】
【０００４】
近年、市販の治療効果のあるタンパク質の数が劇的に増加してきており、こうしたタンパク質の大半は糖タンパク質である。糖タンパク質にシアル酸があると、吸収、血清半減期及び血清クリアランスならびにそれぞれの糖タンパク質の物理的、化学的及び免疫特性にプラスの影響を与える場合がある。したがって、特定の状況において、薬理学的用途に使用されることが意図される糖タンパク質のシアル酸含有量が増加することが望ましい場合もある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、無血清／無タンパク質培地を使用することによって哺乳動物細胞から産生される組換え糖タンパク質が、例えば、組換え糖タンパク質のＭ６Ｐ含有量を低減することなく組換え糖タンパク質のシアル化を向上させるという発見に部分的に基づくものである。
【０００６】
本発明の一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して０．０５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して０．１ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して０．５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して０．７ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して１ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して１．５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して２ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して１０ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質に対して２０ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む。
【０００７】
一部の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質のガラクトース残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がシアル化されている組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【０００８】
一部の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質がヒトβ−グルクロニダーゼであり、組換え糖タンパク質に対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【０００９】
一部の他の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質がヒトβ−グルクロニダーゼであり、組換え糖タンパク質に対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及び高レベルのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）部分を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質がヒトβ−グルクロニダーゼであり、組換え糖タンパク質に対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及び組換え糖タンパク質の全グリカンの少なくとも１０ｍｏｌ％の高レベルのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）部分を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質がヒトβ−グルクロニダーゼであり、組換え糖タンパク質に対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及び例えば、ヒト線維芽細胞（ＭＰＳ７）において試験される場合、Ｋ取り込みが、約１ｎＭから約３ｎＭなどにおいてその６０％、７０％、８０％、９０％または最大である高レベルのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）部分を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質がヒトβ−グルクロニダーゼであり、組換え糖タンパク質に対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及び例えば、糖タンパク質（例えば、ヒトβ−グルクロニダーゼ）が最大取り込みの５０％に達する濃度などの、ヒト線維芽細胞における半最大取り込みが、約１ｎＭ以下、２ｎＭ以下、３ｎＭ以下、４ｎＭ以下または５ｎＭ以下の高レベルのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）部分を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【００１３】
一部の実施形態において、本発明は、集団の少なくとも５０パーセントがシアル化されている組換え糖タンパク質の集団の調製物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、集団の少なくとも６０パーセントがシアル化されている組換え糖タンパク質の集団の調製物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、集団の少なくとも７０パーセントがシアル化されている組換え糖タンパク質の集団の調製物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、集団の少なくとも８０パーセントがシアル化されている組換え糖タンパク質の集団の調製物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、集団の少なくとも９０パーセントがシアル化されている組換え糖タンパク質の集団の調製物を提供する。
【００１４】
本発明による組成物／調製物を作製する方法も提供される。一部の実施形態において、本方法は、無血清または無タンパク質培地を用いた細胞培養物中に組換え糖タンパク質を発現させることを含む。一部の実施形態において、細胞を増殖させるために無タンパク質既知組成培地が使用されてもよい。一部の実施形態において、培地は、ガラクトース、フルクトース、ｎ−アセチル−マンノサミン、マンノース及びそれらの組み合わせから選択される有効量の糖を含まない。例えば、糖の有効量は、０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭまたは０．１ｍＭを超える。
【００１５】
一部の実施形態において、細胞培養物は、哺乳動物細胞を含む。例となる哺乳動物細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ、ＮＳＩ）またはＷＩ３８細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００１６】
一部の他の実施形態において、細胞培養物は、植物細胞を含む。例となる植物細胞としては、ニンジン細胞または、例えば、組換えタンパク質産生用に開発された細胞培養に基づくその他の任意の植物細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
さらに、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置する方法であって、そのような処置を必要とする個体に治療有効量の本明細書に記載される組成物／調製物を投与することを含む、方法が提供される。例となる実施形態において、本組成物／調製物は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼを含む。さらなる例となる実施形態において、ＬＳＤは、ムコ多糖症７型（すなわち、ＭＰＳ７、ＭＰＳ  ＶＩＩまたはスライ症候群）である。一部の実施形態において、本明細書中で提供されるヒト組換えβ−グルクロニダーゼは、シアル酸含有量が高く、ＬＳＤ、例えば、ＭＰＳ７を処置する際に特に有用である。
【００１８】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物／調製物の治療計画を施すことを含む、対象におけるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置するための方法を提供し、この施すことは、ＬＳＤの処置に統計学的に有意な治療効果をもたらす。例となる実施形態において、本組成物／調製物は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼを含む。さらなる例となる実施形態において、ＬＳＤはＭＰＳ７である。
【００１９】
定義
本明細書中で使用される場合、「ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ」（例えば、「ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ」）という用語は、所望の、予測した、または意図した結果を達成するのに十分であることを意味する。有効量は、治療有効量であってもよい。「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ」とは、対象に投与されたときに、特定の疾患または状態のそのような処置を達成するのに十分な活性成分の量を指す。「ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ」」は、例えば、疾患または状態、疾患または状態の重症度及び処置される対象の年齢、体重などに応じて変化することになる。
【００２０】
一般に、あらゆる状態、疾患または障害を「ｔｒｅａｔｉｎｇ」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」とは、一部の実施形態において、状態、疾患または障害を緩和すること（すなわち、疾患の進行またはその臨床症状のうちの少なくとも１つを阻止または低減すること）を指す。一部の実施形態において、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」とは、対象が認識できない少なくとも１つの物理的パラメーターを改善することを指す。一部の実施形態において、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」とは、物理的（例えば、識別できる症状の安定化）若しくは生理学的（例えば、物理的パラメーターの安定化）のいずれか、またはその両方で状態、疾患または障害を抑制することを指す。一部の実施形態において、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」または「ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」とは、状態、疾患または障害の発症を遅らせることを指す。
【００２１】
長きにわたる特許法規則に従い、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語は、請求項を含む本出願で使用される場合、「一つ以上」を指す。明確に別の選択肢のみを指すことが示されているか、または選択肢が互いに排他的である場合を除いて、請求項における「ｏｒ」という用語の使用は、「ａｎｄ／ｏｒ」を意味して使用される。「ｏｒ」という用語を使用した項目のいかなる列挙も、列挙された任意のそうした項目が関連する実施形態から特に除外されてもよいことを意味することが特に意図される。
【００２２】
本出願全体をとおして、「ａｂｏｕｔ」という用語は、値を測定するために利用された装置または方法に対する誤差の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。
【００２３】
糖タンパク質とは、本明細書中で使用される場合、とりわけ、１つ以上の糖残基の付加を含む１つ以上の炭水化物の付加によって修飾されたタンパク質である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、「ＧＵＳ」とは、本発明による典型的な糖タンパク質であるβ−グルクロニダーゼを指す。
【００２５】
シアル化は、本明細書中で使用される場合、糖タンパク質であってもよいタンパク質へのシアル酸残基の付加である。シアル酸という用語は、本明細書中で使用される場合、カルボキシル基を含む９個以上の炭素原子を含む糖のファミリーを包含する。シアル酸の既知のすべての天然の形態を包含する一般構造を下に示す。
0006581590.tif 000002
【００２６】
単一の分子のさまざまな位置にあるＲ１基は、互いに同じであっても、または異なっていてもよい。Ｒ１は、水素またはアセチル、ラクチル、メチル、硫酸、リン酸、無水、シアル酸、フコース、グルコース若しくはガラクトース基であってもよい。Ｒ２は、Ｎ−アセチル、Ｎ−グリコリル、アミノ、ヒドロキシル、Ｎ−グリコリル−Ｏ−アセチルまたはＮ−グリコリル−Ｏ−メチル基であってもよい。Ｒ３は、糖タンパク質の状況においてシアル酸が結合するオリゴ糖にある上記の糖残基を表わす。Ｒ３は、ガラクトース（その３、４または５位に結合）、Ｎ−アセチル−ガラクトース（その６位に結合）、Ｎ−アセチル−グルコース（その４または６位に結合）、シアル酸（その８または９位に結合）または５−Ｎ−グリコリル−ノイラミン酸であってもよい。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．１５、Ｖａｒｋｉら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９９年）。４０を超える形態のシアル酸が自然界で発見された。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．１５、Ｖａｒｋｉら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９９９年）。シアル酸の一般形態は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）であり、その中のすべての位置のＲ１は水素であり、Ｒ２はＮ−アセチル基である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】２段階注入によるラットにおけるヒト組換えβ−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ  ＣＲ０１対ＧＵＳロット４３／４４の薬物動態を比較するグラフである。このデータは、高度にシアル化されたＣＲ０１の注入は、さほど急速でないクリアランス及び注入時により高い平均濃度をもたらし、これが、酵素への全曝露を増加させ、処置するのがより難しい組織の浸透を潜在的に高めることを示している。
【図２】ＧＵＳ  ＣＲ０１対ＧＵＳロット４３／４４のクリアランス段階の注入後のみを示すグラフであり、これをｔ１／２値を算出するために使用した。クリアランスの速度のこうした差は、図１に示されるとおりのより高い酵素の血清レベルをもたらすのに十分である。
【図３】ＧＵＳ  ＣＲ０１対ＧＵＳロット４３／４４の薬物動態試験に関する組織中ＧＵＳレベルを示す一連のグラフである。シアル化されたヒトβ−グルクロニダーゼ（ＣＲ０１）の全取り込みがすべての組織においてシアル化の程度が低い酵素（４３−４４）よりも高いため、ヒトβ−グルクロニダーゼの組織送達及び取り込みが向上したことが示されている。内在性グルクロニダーゼ活性が差し引かれると、治療効果のあるヒトβ−グルクロニダーゼの効果的な送達が２倍からほぼ１０倍に増加しており、例外的で驚くべき発見である。
【図４】ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）を用いて処置した３名の対象の３６週間にわたる尿中グリコサミノグリカン（ｕＧＡＧ）レベルの測定値を示すグラフである。急速で持続した用量依存的なｕＧＡＧレベルの低下がｒｈＧＵＳを用いて処置した対象で観察された。
【図５】ｒｈＧＵＳを用いて処置した３名の対象の３６週間の評価の間の各投与間隔の終わりにおける尿中グリコサミノグリカン（ｕＧＡＧ）レベルの平均低下を示す。４ｍｇ／ｋｇ  ＱＯＷの投薬のｕＧＡＧレベルの低下が最も大きかった。
【図６】ｒｈＧＵＳを用いて処置した３名の対象の３６週間にわたる血清グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルの測定値を示すグラフである。各対象は、３６週間の処置スケジュールの終わりに血清ＧＡＧレベルが少なくとも２５％低下した。
【図７】ｒｈＧＵＳを用いて処置した対象の肝臓の大きさの測定値を示すグラフである。３６週間の処置プロトコールの結果、肝腫大の著しい減少が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、無血清／無タンパク質培地を使用することによって哺乳動物細胞から産生される組換え糖タンパク質が、組換え糖タンパク質のシアル化及び加えて、組換え糖タンパク質のマンノース−６−リン酸部分のレベルを向上させるというという発見に部分的に基づくものである。
【００２９】
シアル化糖タンパク質組成物
本明細書に記載される組成物は、高レベルまたは増加したシアル酸含有量を有する１つ以上の糖タンパク質を含む。
【００３０】
シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸由来の５０を超えるメンバーを含む９個の炭素を有するアミノ糖のファミリーを表わす。シアル酸は、糖タンパク質のグリカンを構築するいくつかの単糖のうちの１つの構成要素にすぎないが、以下のいくつかの理由のために治療効果のある任意の糖タンパク質の品質及び安定性に著しい影響を与える：（Ｉ）末端ガラクトース残基は、糖タンパク質の血清半減期を決定する主な要因の１つである。血清半減期は、肝臓のアシアロ糖タンパク質レセプターの発現によって調節される。このレセプターは非シアル化糖タンパク質と結合し、結合したアシアロ糖タンパク質はエンドサイトーシスによって血清から除去される。結果として、ガラクトース残基の末端シアル酸の発現が血清糖タンパク質の分解を妨げる；（ＩＩ）シアル酸は、抗原決定基またはエピトープのマスキングに重要である。免疫系のレセプター（Ｔ及びＢ細胞レセプター）は非シアル化構造の方を選ぶ場合が多いことがわかっている。したがって、治療効果のある糖タンパク質に対して抗体が生じる可能性は、そのシアル化の程度と相関する；（ＩＩＩ）マイナスに帯電したシアル酸は、熱安定性、タンパク質分解に対する抵抗性またはその溶解度などのタンパク質に固有のパラメーターに影響を与える（Ｂｏｒｋら、Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐａｔｈｗａｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．  ９８、Ｎｏ．１０、２００９年１０月）。
【００３１】
一態様において、本発明は、組換え糖タンパク質に対して０．０５ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．１ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．７ｍｏｌ／ｍｏｌ、１ｍｏｌ／ｍｏｌ、１．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、２ｍｏｌ／ｍｏｌ、５ｍｏｌ／ｍｏｌ、１０ｍｏｌ／ｍｏｌまたは２０ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質に対して０．５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質に対して０．７ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。特定のさらなる実施形態において、本発明は、組換え糖タンパク質に対して１ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。
【００３２】
特定の実施形態において、本組換え糖タンパク質は、ムコ多糖の非還元末端からのβ−Ｄ−グルクロン酸残基の加水分解の触媒をつかさどる酵素であるヒトβ−グルクロニダーゼの組換え型である。一部の実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して０．１ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．７ｍｏｌ／ｍｏｌ、１ｍｏｌ／ｍｏｌ、１．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、２ｍｏｌ／ｍｏｌまたは５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する。例となる一実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して０．７ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する。例となる別の実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して１．０ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する。さらに別の例となる実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して約１．２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。
【００３３】
一部の実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して約０．５ｍｏｌ／ｍｏｌから約２．０ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。一実施形態では、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して約０．６ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。別の実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して約０．７ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．４ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。例となる実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して約０．８ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．３ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。例となる別の実施形態において、本ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、ｒｈＧＵＳに対して約１．０ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。
【００３４】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のシアル化されているシアル酸結合に適した部位を有する組換え糖タンパク質を含む。一般に、ガラクトースは、シアル酸結合またはシアル化に適した部位である。特定の実施形態において、組成物は、組換え糖タンパク質のガラクトース残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がシアル化されている組換え糖タンパク質を含む。一部の実施形態において、本組成物は、組換え糖タンパク質のガラクトース残基の少なくとも５０％がシアル化されている組換え糖タンパク質を含む。さらなる実施形態において、本組成物は、組換え糖タンパク質のガラクトース残基の少なくとも６０％がシアル化されている組換え糖タンパク質を含む。特定のさらなる実施形態において、本組成物は、組換え糖タンパク質のガラクトース残基の少なくとも７０％がシアル化されている組換え糖タンパク質を含む。
【００３５】
特定の実施形態において、本組換え糖タンパク質は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）である。一部の実施形態において、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）のガラクトース残基の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％または８０％はシアル化されている。例となる一実施形態において、ｒｈＧＵＳのガラクトース残基の少なくとも５０％はシアル化されている。例となる別の実施形態において、ｒｈＧＵＳのガラクトース残基の少なくとも６０％はシアル化されている。さらに別の例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳのガラクトース残基の少なくとも７０％はシアル化されている。さらに別の例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳのガラクトース残基の約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％または約７５％はシアル化されている。
【００３６】
一部の実施形態において、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）のガラクトース残基の少なくとも約４０％から少なくとも約９０％はシアル化されている。一実施形態において、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）のガラクトース残基の少なくとも約５０％から少なくとも約８０％はシアル化されている。別の実施形態において、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）のガラクトース残基の少なくとも約６０％から少なくとも約８０％はシアル化されている。例となる実施形態において、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）のガラクトース残基の少なくとも約６５％から少なくとも約７５％はシアル化されている。
【００３７】
別の態様において、本発明は、高レベルのシアル酸含有量ならびに高レベルのマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）部分を有する組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、Ｍ６Ｐ部分は、いかなる制限もなく、一リン酸化及び二リン酸化マンノース−６−リン酸を含む、Ｍ６Ｐレセプターと結合することができるか、またはそれによって認識され得るあらゆるマンノース−６−リン酸を含む。一実施形態において、Ｍ６Ｐ部分は、カチオン非依存性Ｍ６Ｐレセプター（ＣＩ−ＭＰＲ）と結合するあらゆるＭ６Ｐを含む。別の実施形態において、Ｍ６Ｐ部分は、カチオン依存性Ｍ６Ｐレセプター（ＣＤ−ＭＲＰ）と結合するあらゆるＭ６Ｐを含む。さらに別の実施形態において、Ｍ６Ｐ部分は、あらゆる二リン酸化Ｍ６Ｐを含む。
【００３８】
本発明によると、高レベルのマンノース−６−リン酸部分としては、例えば、当業者に既知のまたは後に開発される任意の適切な手段を使用して測定され、当業者が高いと考えるあらゆるレベルのＭ６Ｐ部分を挙げることができる。一実施形態において、組換え糖タンパク質のＭ６Ｐ部分の高レベルとしては、組換え糖タンパク質の全グリカンの少なくとも１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％または１５ｍｏｌ％のＭ６Ｐ部分レベルが挙げられる。例えば、本組換え糖タンパク質は、Ｍ６Ｐピーク面積を全グリカンピーク面積で割った割合によって求められる、例えば、少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％または１５％の高レベルのＭ６Ｐを有してもよい。一部の実施形態において、本組換え糖タンパク質は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）であり、ｒｈＧＵＳの全グリカンの少なくとも１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％または１５ｍｏｌ％のＭ６Ｐ部分レベルを含む。例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１３％から約１５％のＭ６Ｐ部分レベルを含む。
【００３９】
別の実施形態において、組換え糖タンパク質の高レベルのＭ６Ｐ部分としては、高レベルのヒト細胞による組換え糖タンパク質の取り込み、例えば、ヒト線維芽細胞による高い親和性の取り込み量が挙げられる。例えば、本組換え糖タンパク質は、１ｎＭ以下、１．１ｎＭ以下、１．２ｎＭ以下、１．３ｎＭ以下、１．４ｎＭ以下、１．５ｎＭ以下、１．６ｎＭ以下、１．７ｎＭ以下、１．８ｎＭ以下、１．９ｎＭ以下、２ｎＭ以下、２．１ｎＭ以下、２．２ｎＭ以下、２．３ｎＭ以下、２．４ｎＭ以下、２．５ｎＭ以下、２．６ｎＭ以下、２．７ｎＭ以下、２．８ｎＭ以下、２．９ｎＭ以下、３ｎＭ以下、４ｎＭ以下または５ｎＭ以下の任意の適したヒト細胞、例えば、ヒト線維芽細胞によるＭ６Ｐ依存性Ｋ取り込みを有してもよい。一部の実施形態において、本組換え糖タンパク質は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）であり、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満または２ｎＭ未満のＭ６Ｐ依存性Ｋ取り込みを有する。例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１．２ｎＭから約１．８ｎＭのＭ６Ｐ依存性Ｋ取り込みを有する。
【００４０】
さらに別の実施形態において、組換え糖タンパク質中の高レベルのＭ６Ｐ部分としては、ヒト細胞による組換え糖タンパク質の最大取り込みを達成するのに必要とされるより低い濃度、例えば、より低い最大半量濃度が挙げられる。例えば、本組換え糖タンパク質は、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭまたは１ｎＭ未満の濃度で、ヒト細胞、例えば、線維芽細胞による最大取り込みを達成することができる。一部の実施形態において、本組換え糖タンパク質は、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満または２ｎＭ未満の濃度でヒト細胞、例えば、線維芽細胞による最大取り込みを達成することができるヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）である。例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１．２ｎＭから約１．８ｎＭの濃度で、ヒト細胞、例えば、線維芽細胞による最大取り込みを達成することができる。
【００４１】
さらに別の実施形態では、組換え糖タンパク質中の高レベルのＭ６Ｐ部分は、組換え糖タンパク質そのままのシアル化含有量に関連するＭ６Ｐ部分のレベルに対応する１つ以上のレベルのＭ６Ｐ部分を含む。そのままのシアル化含有量とは、例えば、本出願において開示される方法を使用するなどといったシアル化を促進させるための手段を行う前の組換え糖タンパク質のシアル化含有量のことである。
【００４２】
本発明によると、一部の実施形態において、本組換え糖タンパク質、例えば、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼまたはその他の任意のリソソーム酵素は、少なくとも１ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及び組換え糖タンパク質の全グリカンの少なくとも１０ｍｏｌ％、１１ｍｏｌ％、１２ｍｏｌ％、１３ｍｏｌ％、１４ｍｏｌ％または１５ｍｏｌ％の高レベルのＭ６Ｐ部分を有する。一実施形態において、本組換え糖タンパク質、例えば、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼまたはその他の任意のリソソーム酵素は、少なくとも１ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及びヒト細胞、例えば、ヒト線維芽細胞による少なくとも１ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｎＭ、１．５ｎＭ、１．６ｎＭ、１．７ｎＭ、１．８ｎＭ、１．９ｎＭまたは２ｎＭの取り込みによる高レベルのＭ６Ｐ部分を有する。別の実施形態において、本組換え糖タンパク質、例えば、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼまたはその他の任意のリソソーム酵素は、少なくとも１ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量及び本組換え糖タンパク質の１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭまたは１ｎＭ未満におけるヒト細胞、例えば、ヒト線維芽細胞による最大取り込みによる高レベルのＭ６Ｐ部分を有する。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％がシアル化されている組換え糖タンパク質の集団を含む組成物を提供する。一実施形態において、集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、例えば、シアル化含有量及びＭ６Ｐレベルに関して本発明による組換え糖タンパク質である。
【００４４】
本発明により提供される組換え糖タンパク質は、任意の糖タンパク質であってもよい。例となる組換え糖タンパク質は、以下のタンパク質の１つの全体または一部と同一か、または実質的に類似のアミノ酸配列を含む糖タンパク質が挙げられる：Ｆｌｔ３リガンド（ＷＯ９４／２８３９１に記載されている）、ＣＤ４０リガンド（米国特許第６，０８７，３２９号に記載されている）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、カルシトニン、レプチン、ＩＬ−２、アンジオポエチン−２（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２２）：５５〜６０に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｆａｓリガンド、ＮＦ−カッパＢ活性化受容体リガンド（ＲＡＮＫＬ、ＷＯ０１／３６６３７に記載されている）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、ＷＯ９７／０１６３３に記載されている）、胸腺間質性リンパ球新生因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、オーストラリア特許第５８８８１９号に記載されている）、マスト細胞増殖因子、幹細胞増殖因子（例えば、米国特許第６，２０４，３６３号に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる）、上皮増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、巨核球増殖分化因子、ＲＡＮＴＥＳ、成長ホルモン、インスリン、インスリノトロピン、インスリン様増殖因子、副甲状腺ホルモン、αインターフェロン、γインターフェロン及びコンセンサスインターフェロンを含むインターフェロン（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，６９５，６２３号及び同第４，８９７，４７１号に記載されているものなど）、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、シナプトタグミン様タンパク質（ＳＬＰ１〜５）、ニューロトロフィン−３、グルカゴン、インターロイキン１から１８、コロニー刺激因子、リンホトキシン−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、白血病抑制因子、オンコスタチン−Ｍ、及び細胞表面分子ＥＬＫ及びＨｅｋに対する各種リガンド（ｅｐｈ関連キナーゼリガンドすなわちＬＥＲＫなど）。本発明の方法に従って産生され得るタンパク質の説明は、例えば、Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．ＩＩ（Ａｇｇａｒｗａｌ及びＧｕｔｔｅｒｍａｎ編．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、１９９８年）；Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＫａｙ及びＬｅｉｇｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９９３年）；及びＴｈｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａ．  Ｗ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９１年）に見出すことができ、そのすべてを参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【００４５】
本発明の組換え糖タンパク質としては、あらゆるリソソーム酵素、とりわけ酵素補充療法（ＥＲＴ）に有用なあらゆる酵素を挙げることができる。そのような酵素の例としては、いかなる制限もなく、酸性アルファグルコシダーゼ、酸性ベータグルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、酸性ベータガラクトシダーゼ、ベータヘキソサミニダーゼＡ、ベータヘキソサミニダーゼＢ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、酸性セラミダーゼ、アリルスルファターゼ、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート−２−スルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチル−ＣｏＡ、アルファ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファートスルファターゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファートスルファターゼ、酸性ベータガラクトシダーゼ、アリルスルファターゼＢ、酸性アルファマンノシダーゼ、酸性ベータマンノシダーゼ、酸性アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、シアリダーゼ及びアルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼが挙げられる。
【００４６】
特定の例となる実施形態において、本発明の組換え糖タンパク質は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）である。ヒトβ−グルクロニダーゼは、高マンノース型、複合型及び混成型のさまざまな鎖を含む１分子あたり最大１６個のオリゴ糖を含む糖タンパク質である。
【００４７】
単離または精製された糖タンパク質ポリペプチドも本明細書に記載される。例えば、単離または精製されたｒｈＧＵＳポリペプチドが本明細書中で開示される。本開示の単離または精製されたｒｈＧＵＳポリペプチドは、本明細書中で開示される１つ以上の組成物または方法において使用されてもよい。
【００４８】
ｒｈＧＵＳポリペプチドとしては、ｒｈＧＵＳペプチド配列ならびにそのフラグメント、その天然の変異体及びその非天然の変異体を挙げることができる。ｒｈＧＵＳ配列は、配列番号：１として提供される。配列番号：１から構成される単離または精製されたポリペプチドが本明細書中で開示される。配列番号：１ならびにそのフラグメントを含む単離または精製されたポリペプチドも本明細書中で開示される。フラグメントは、少なくとも約１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００または５００以上の連続的なアミノ酸であってもよい。配列番号：１のアミノ酸配列をコードすることができるポリヌクレオチド配列から構成されるか、またはそれを含む単離または精製されたポリヌクレオチドも本明細書中で開示される。
【００４９】
一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳポリペプチドは、ｒｈＧＵＳポリペプチドに対して０．１ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、０．７ｍｏｌ／ｍｏｌ、１ｍｏｌ／ｍｏｌ、１．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、２ｍｏｌ／ｍｏｌまたは５ｍｏｌ／ｍｏｌを超えるシアル酸含有量を有する。一部の実施形態において、本ｒｈＧＵＳポリペプチドは、ｒｈＧＵＳポリペプチドに対して約０．５ｍｏｌ／ｍｏｌから約２．０ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。一実施形態において、本ｒｈＧＵＳポリペプチドは、ｒｈＧＵＳポリペプチドに対して約０．６ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。別の実施形態において、本ｒｈＧＵＳポリペプチドは、ｒｈＧＵＳポリペプチドに対して約０．７ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．４ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。例となる実施形態において、本ｒｈＧＵＳポリペプチドは、ｒｈＧＵＳポリペプチドに対して約０．８ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．３ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。例となる別の実施形態において、本ｒｈＧＵＳは、ｒｈＧＵＳポリペプチドに対して約１．０ｍｏｌ／ｍｏｌから約１．２ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を有する。
【００５０】
さらなる実施形態において、ｒｈＧＵＳポリペプチドのガラクトース残基の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％または８０％はシアル化されている。例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳポリペプチドのガラクトース残基の少なくとも約６５％から少なくとも約７５％はシアル化されている。
【００５１】
本明細書に記載されるとおり、本発明の糖タンパク質は、組換えで産生されてもよい。本発明の組換え糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組換え発現ベクターに導入されてもよい。例となる実施形態において、本組換え糖タンパク質は、ｒｈＧＵＳである。したがって、本出願はまた、ｒｈＧＵＳをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターに関する。一実施形態において、本組換え発現ベクターによって産生されるｒｈＧＵＳタンパク質は、配列番号：１から構成されるか、またはそれを含む。
【００５２】
当該技術分野において理解されるとおり、組換えベクターは、当該技術分野において周知の技術を使用して適切な宿主細胞系で発現させられてもよい。したがって、本出願はまた、ｒｈＧＵＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。一実施形態において、本宿主細胞によって産生されるｒｈＧＵＳタンパク質は、配列番号：１から構成されるか、またはそれを含む。本発明のｒｈＧＵＳタンパク質を発現させるために適した宿主細胞としては、タンパク質をグリコシル化することができるあらゆる細胞株、好ましくは、タンパク質を発現するよう遺伝子操作された哺乳動物細胞株を挙げることができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ、ＮＳＩ）またはＷＩ３８細胞が使用されてもよい。例となる実施形態において、本組換え糖タンパク質を産生するために使用される細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００５３】
さらに別の態様において、本発明は、高レベルまたは増加したシアル酸含有量を有する１つ以上の糖タンパク質を含む製剤を提供する。製剤としては、一般に液体形態（溶液）、例えば、以下に限定されるものではないが、再構成される凍結乾燥物ならびに固体形態、例えば、以下に限定されるものではないが、凍結乾燥された形態、ゲル、マイクロカプセル化粒子及びペーストが挙げられる。本発明の一部の実施形態による製剤は、ゲル、粒子またはペーストと組み合わせて使用される液体製剤、凍結乾燥物及び再構成した凍結乾燥物から調製される液体溶液の組み合わせであってもよい。
【００５４】
一部の実施形態において、本製剤は、水性バッファー及び本組換え糖タンパク質を含む溶液である。バッファーとしては、リン酸ナトリウム（Ｎａ−Ｐｉ）、ヒスチジン、アルギニン、グリシルグリシン、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、アスパラギン酸、コハク酸またはそれらの任意の組み合わせを挙げることができる。例となる実施形態において、バッファーとしては、Ｎａ−Ｐｉ及びヒスチジンが挙げられる。別の実施形態において、バッファーとしては、ｎａ−Ｐｉ、ヒスチジン及びアルギニンが挙げられる。
【００５５】
一部の実施形態において、バッファーは、以下に限定されるものではないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）ポリオキシエチレン（Ｔｗｅｅｎ−２０）、塩化カリウム及びソルビトール（例えば、Ｄ−ソルビトール）などの１つ以上の他の成分をさらに含む。例となる実施形態において、バッファーとしては、Ｎａ−Ｐｉ、ヒスチジン、ＮａＣｌ及びＴｗｅｅｎ２０が挙げられる。
【００５６】
当該技術分野において十分に認識されているとおり、タンパク質の安定性は、製剤のｐＨ及び／またはイオン強度に左右される場合もある。本発明の一部の実施形態によると、製剤のｐＨは、約９．０から約５．０、例えば、約７．５から約６．０である。一部の実施形態において、ｐＨは、約９．０、約８．０、約７．５、約７．０、約６．５、約６．０、約５．５または約５．０である。本発明は、製剤のｐＨが低いと、組換え糖タンパク質の安定性が向上するということを最初に認識した。例えば、実施例２の表６は、ｐＨを７．５から６．０に変えた場合、四量体の割合によって測定すると安定性が向上したことを示している。
【００５７】
産生の方法
さらに別の態様において、本発明は、無血清または無タンパク質培地を用いた細胞培養物によって産生される糖タンパク質のシアル化及び加えて糖タンパク質のＭ６Ｐレベルを高めるための方法を提供する。
【００５８】
一般に、培養培地は、合成培地のレベルに基づいていくつかの部分集合に分けることができる。例えば、培養培地は以下のものであってもよい：１）血清含有培地（一般的に１０〜２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））；２）血清低減培地（一般的に１〜５％ＦＢＳ）；３）無血清培地（合成培地と同義）；４）無タンパク質培地（タンパク質を含まないが植物加水分解産物由来の不確定なペプチドを含む）；５）既知組成培地（組換えタンパク質及び／またはホルモンのみを含む）；６）無タンパク質既知組成培地（低分子量の構成成分のみを含むが、合成ペプチド／ホルモンを含んでもよい）；及び７）無ペプチド、無タンパク質既知組成培地（低分子量の構成成分のみを含む）。
【００５９】
本発明の一部の実施形態において、糖タンパク質の発現のために、血清低減培地を使用して細胞を増殖させてもよい。本発明の一部の実施形態において、糖タンパク質の発現のために、無血清培地を使用して細胞を増殖させてもよい。一部の実施形態において、糖タンパク質の発現のために、無タンパク質培地を使用して細胞を増殖させてもよい。一部の実施形態において、糖タンパク質の発現のために、既知組成培地を使用して細胞を増殖させてもよい。一部の実施形態において、実施例１で証明されるとおり、無タンパク質既知組成培地を使用して、細胞を増殖させてもよい。さらに一部の他の実施形態において、糖タンパク質の発現のために、無ペプチド、無タンパク質既知組成培地を使用して細胞を増殖させる。
【００６０】
当該技術分野において十分に理解されるとおり、無血清培地は、（血液から精製された）血清アルブミン、加水分解産物、増殖因子、ホルモン、担体タンパク質及び接着因子などの不確定な動物由来産物を含む場合もある。これらの不確定な動物由来産物は、アルブミンの脂質分などの複雑な混入物を含むことになる。対照的に、既知組成培地は、構成成分のすべてが特定され、既知の正確な濃度を有すると定義される。一部の実施形態において、既知組成培地は、動物由来の構成成分を完全に含まない。一部の実施形態において、既知組成培地は、ＦＢＳ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）またはそれらの組み合わせを含まない。これを達成するために、既知組成培地は、一般的に通常、コメ若しくはＥ．ｃｏｌｉ由来の組換え型のアルブミン及び増殖因子またはＢＳＡ／ＨＳＡの機能の一部を再現することができるポリマーポリビニルアルコールなどの合成化学物質が補われる。
【００６１】
一部の実施形態において、本明細書に記載の無タンパク質培地は、生物学的起源のタンパク質または構成成分をまったく含まない。培地にタンパク質がないことは、血液由来若しくはその他の病原体または非ヒトタンパク質による汚染のリスクを解消する。さらに、そのような無タンパク質培地は、通常その成分のすべての同一性及び量に関して完全に規定されており、これは、タンパク質含有培地よりも無比の産生物の一貫性、優れた産生物品質管理特性及びさらに良好な産生物安定性を提供することができる。
【００６２】
一部の実施形態において、本明細書中で使用される培地は、ガラクトース、フルクトース、ｎ−アセチル−マンノサミン、マンノース及びそれらの組み合わせから選択される有効量の糖を含まない。例えば、糖の有効量は、０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭまたは０．１ｍＭを超える。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞を培養するための方法を提供し、本方法は、培養で無血清または無タンパク質培地においてタンパク質、例えば、糖タンパク質を産生する哺乳動物細胞を増殖させること含む。本発明の実施に適した細胞としては、タンパク質をグリコシル化することができるあらゆる細胞株、好ましくは、タンパク質を発現するよう遺伝子操作された哺乳動物細胞株が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は同種の細胞株である。数々の適した細胞株が当該技術分野において知られている。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、骨髄腫（例えば、ＮＳＯ、ＮＳＩ）またはＷＩ３８細胞が使用されてもよい。例となる実施形態において、本組換え糖タンパク質を産生するために使用される細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００６４】
本発明の一部の実施形態によると、特に有用な細胞は、ＣＨＯ細胞であり、これは、組換えタンパク質、例えば、サイトカイン、凝固因子及び抗体の産生に広く使用されている（Ｂｒａｓｅｌら、（１９９６年）、Ｂｌｏｏｄ  ８８：  ２００４〜２０１２；Ｋａｕｆｍａｎら、（１９８８年）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：６３５２〜６３６２；ＭｃＫｉｎｎｏｎら、（１９９１年）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：  ２３１〜２３９；Ｗｏｏｄら、（１９９０年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４５：  ３０１１〜３０１６）。ＤＸＢ１１またはＤＧ−４４などのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損変異細胞株（Ｕｒｌａｕｂら（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：４２１６〜４２２０）が有用である。それは、効率的にＤＨＦＲを選択することができ、増幅することができる遺伝子発現系は、これらの細胞中で高いレベルの組換えタンパク質発現を可能にするためである（Ｋａｕｆｍａｎ（１９９０年）、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８５：  ５２７〜５６６）。さらに、これらの細胞は、接着培養または浮遊培養として操作するのが容易であり、比較的に良好な遺伝学的安定性を呈する。ＣＨＯ細胞及びその中で発現する組換えタンパク質は、広範囲にわたって特徴づけられており、規制当局によって臨床的な商業的製造への使用が認可されている。
【００６５】
一部の実施形態において、細胞は、流加培養様式で増殖させられる。流加培養プロセスは、バイオリアクター中の増殖を高め、高い細胞密度を達成するために培養培地に１つ以上の栄養素（基質）が添加される操作技術と定義される。一般に、制御された様式で栄養素を添加することにより、培養の増殖率及び産生にプラスの効果を与える。一部の実施形態において、バイオリアクターにおいて１０６細胞／ｍＬ、１０７細胞／ｍＬ、２×１０７細胞／ｍＬ、５×１０７細胞／ｍＬまたは１０８細胞／ｍＬを超える細胞濃度を達成することができる。一部の実施形態において、流加培養様式に使用されるバイオリアクターは、少なくとも１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、８０Ｌ、１００Ｌ、２５０Ｌ、５００Ｌまたは１０００Ｌの容積を有する。細胞は、浮遊培養または接着培養のいずれかで増殖させることができる。例となる実施形態において、懸濁液中で細胞を増殖させる。哺乳動物細胞が好ましく、特定の例となる実施形態において、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００６６】
治療的処置
さらに別の態様において、本発明は、状態または障害の処置方法であって、そのような処置を必要とする個体に治療有効量の本明細書に記載される組成物／調製物を投与することを含む、方法を提供する。
【００６７】
本明細書に記載される組成物／調製物は、単独で、または本明細書に記載の処置方法においてなど、さまざまな目的のための任意の治療用薬剤／組成物とともに使用されてもよい。この点において、この組成物／調製物は、薬学的に許容することができる。
【００６８】
一部の実施形態において、処置を必要とする状態または障害は、酵素欠損に関連する。ゴルジ、小胞体及びリソソームなどの細胞内区画における酵素欠損は、多種多様なヒト疾患を引き起こす。例えば、通常、小胞体の内腔にある酵素であるリジルヒドロキシラーゼはコラーゲンの適切なプロセシングに必要とされ、この酵素がないと、重篤な結合組織障害であるエーラース・ダンロス症候群ＶＩ型を引き起こす。通常ゴルジに見られるＧｎＴ  ＩＩはタンパク質の正常なグリコシル化に必要とされ、ＧｎＴ  ＩＩがないと脳発達の欠陥につながる。
【００６９】
例となる実施形態において、酵素欠損に関連する状態または障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。リソソームに１つ以上のタンパク質がないことによって、４０を超えるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が直接的または間接的に引き起こされる。ＬＳＤは、スフィンゴ糖脂質、グリコーゲン、ムコ多糖及び糖タンパク質を含むさまざまな基質の異常な代謝から生じる。基質の代謝は、通常リソソーム中で起こり、このプロセスはさまざまな分解酵素によって段階的なプロセスにおいて調整される。したがって、いずれか１つの酵素活性の欠損が、全プロセスを乱し、特定の基質の蓄積をもたらす可能性がある。いくつかのリソソーム蓄積症及び該当する欠損酵素を以下に列挙する：
ポンペ病：酸性アルファ−グルコシダーゼ
ゴーシェ病：酸性ベータ−グルコシダーゼまたはグルコセレブロシダーゼ
ファブリー病：アルファ−ガラクトシダーゼＡ
ＧＭＩ−ガングリオシドーシス：酸性ベータ−ガラクトシダーゼ
テイ・サックス病：ベータ−ヘキソサミニダーゼＡ
サンドホフ病：ベータ−ヘキソサミニダーゼＢ
ニーマン・ピック病：酸性スフィンゴミエリナーゼ
クラッベ病：ガラクトセレブロシダーゼ
ファーバー病：酸性セラミダーゼ
異染性白質ジストロフィー：アリルスルファターゼＡ
ハーラー・シャイエ病：アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ
ハンター病：イズロネート−２−スルファターゼ
サンフィリポ病Ａ：ヘパランＮ−スルファターゼ
サンフィリポ病Ｂ：アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
サンフィリポ病Ｃ：アセチル−ＣｏＡ：アルファ−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ
サンフィリポ病Ｄ：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファートスルファターゼ
モルキオ病Ａ：Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファートスルファターゼ
モルキオ病Ｂ：酸性ベータ−ガラクトシダーゼ
マロトー・ラミー病：アリルスルファターゼＢ
スライ病：ベータ−グルクロニダーゼ
アルファマンノース症：酸性アルファ−マンノシダーゼ
ベータマンノース症：酸性ベータ−マンノシダーゼ
フコシドーシス：酸性アルファ−Ｌ−フコシダーゼ
シアリドーシス：シアリダーゼ
シルダー・カンザキ病：アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
【００７０】
特定の例となる実施形態において、本発明は、ＬＳＤの処置方法であって、そのような処置を必要とする個体に治療有効量の本明細書に記載される組成物／調製物を投与することを含む、方法を提供する。例となる一実施形態において、本組成物／調製物は、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼを含む。例となる別の実施形態において、ＬＳＤは、β−グルクロニダーゼの欠損の結果として生じる障害であるムコ多糖症７型（すなわち、ＭＰＳ７、ＭＰＳ  ＶＩＩまたはスライ症候群）である。一部の実施形態において、ヒト組換えβ−グルクロニダーゼは、増加したシアル酸含有量をもち、ＬＳＤ、例えば、ＭＰＳ７を処置する際に特に有用である。
【００７１】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の組成物／調製物の治療計画を施すことを含む、対象の状態または障害を処置するための方法を提供し、この施すことは、状態または障害の処置に統計学的に有意な治療効果をもたらす。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、本組成物／調製物は、増加したシアル酸含有量をもつ組換え糖タンパク質を含む。例となる実施形態において、本組換え糖タンパク質は、組換え糖タンパク質に対して少なくとも０．７ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有する。例となる別の実施形態において、本組換え糖タンパク質は、組換え糖タンパク質に対して少なくとも１ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル化含有量を有する。一部の実施形態において、状態または障害は、酵素欠損に関連する。例となる実施形態において、酵素欠損に関連する状態または障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である。
【００７２】
したがって、本発明は、本明細書に記載の組成物／調製物の治療計画を施すことを含む、対象におけるリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を処置するための方法を提供し、この施すことは、ＬＳＤの処置に統計学的に有意な治療効果をもたらす。例となる実施形態において、本組成物／調製物は、増加したシアル酸含有量をもつヒト組換えβ−グルクロニダーゼを含む。さらなる例となる実施形態において、ＬＳＤは、ムコ多糖症７型（すなわち、ＭＰＳ７、ＭＰＳ  ＶＩＩまたはスライ症候群）である。
【００７３】
本発明によると、ＬＳＤの処置は、あらゆる形態のＬＳＤの処置、例えば、ＬＳＤの任意の症状を低減すること、ＬＳＤの任意の症状の重症度を低減すること、ＬＳＤの１つ以上の症状の期間を短縮すること、ＬＳＤと関連する任意の原因若しくは状態を処置若しくは阻害すること、またはＬＳＤの程度若しくは状態の任意の臨床基準若しくは測定値を低減することを含む。
【００７４】
本発明によると、本発明のヒト組換えβ−グルクロニダーゼは、ＬＳＤの処置のための治療計画において投与される。一実施形態において、ＬＳＤはＭＰＳ７である。そのような治療計画には、１回の投与あたり、１日あたり、２週間あたりの投与量、ならびに処置サイクルあたりの用量の数またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００７５】
一般に、本発明のヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）は、１ｋｇあたり約０．１ｍｇから２０ｍｇ、０．２ｍｇから１５ｍｇ、０．５から１２ｍｇ、１ｍｇから１０ｍｇ、１．５ｍｇから８ｍｇ、２ｍｇから６ｍｇの用量で投与されてもよい。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、１ｋｇあたり約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇまたは約１２ｍｇの用量で投与される。例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳは、１ｋｇあたり約４ｍｇの用量で投与される。投与量は、それぞれの患者ならびに患者が飲んでいるその他の薬物の条件に対して調節されてもよい。
【００７６】
一部の実施形態において、そのような投与量は、１時間ごと、毎日、週に１回（すなわち、ＱＷ）、２週間ごと（すなわち、ＱＯＷ）または月に１回投与される。
【００７７】
一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、時間単位で、約１から２４時間、１から２０時間、１から１６時間、１から１２時間、１から８時間、１から６時間、１から４時間、１から２時間ごとまたは毎時間投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約２、３、４、５または６時間ごとに投与されるか、または約１０分、１５分、３０分、４５分若しくは６０分ごとに投与される。
【００７８】
一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、継続的な注入によって投与されてもよい。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、少なくとも約２、４、６、１０、１２時間以上の処置期間、患者に投与されてもよく、一部の実施形態において、これにより有効性が向上することもある。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、１から２４時間、１から２０時間、１から１６時間、１から１２時間、１から１０時間、１から８時間、１から６時間、１から４時間から１から２時間、継続的な注入によって投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１０分間、１５分間、３０分間、４５分間または６０分間、継続的な注入によって投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１０時間、１２時間、２４時間以上、継続的な注入によって投与される。例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約４時間、継続的な注入によって投与される。一部の実施形態において、継続的な注入期間は、非注入期間（すなわち、ｒｈＧＵＳが投与されてない期間）によって切り離される。注入は、任意の適切な手段、例えば、ミニポンプによって行われてもよい。
【００７９】
一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１から３０日ごと、１から２５日ごと、１から２０日ごと、１から１４日ごと、１から１０日ごと、１から５日ごとまたは毎日、投与される。
【００８０】
一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１から１２週間、約１から２４週間、約１から３６週間、約１から４８週間、約１から６０週間または約１から７２週間、投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１ヶ月、４ヶ月、８ヶ月、１２ヶ月、１６ヶ月、２０ヶ月以上投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、約１年間、２年間、５年間、１０年間以上投与される。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳは、永続的に投与される（すなわち、長期使用）。
【００８１】
ｒｈＧＵＳは、凍結乾燥された形態として提供され、投与に先立って滅菌した（例えば、水性の）希釈液によって再構成されてもよい。ｒｈＧＵＳは、皮下注射、筋肉内注射、静脈注射または注入によって及び経口的になど任意の効果的な経路によって投与されてもよい。特定の例となる実施形態において、ｒｈＧＵＳは、静脈内注入によって投与される。一般に、ｒｈＧＵＳの定期的投薬は、単回用量（例えば、注射）として投与されてもよく、あるいは例えば、継続的な注入若しくは分割用量の繰り返しの注射などによって、または本明細書中で広範囲にわたって記載されるとおり２４時間以下のクールで間隔をあけてもよい。一実施形態において、ｒｈＧＵＳの定期的投薬は、１回の注射として、または複数回の注射として投与されてもよい。
【００８２】
一実施形態において、患者は、ＬＳＤの重症度を緩和するために１ｋｇあたり約０．５から１２ｍｇ（例えば、約１、２、４、８または１２ｍｇ）の間の用量でおよそ１週おきに（すなわち、ＱＯＷ）ｒｈＧＵＳの投与を受ける。例となる実施形態において、患者は、１ｋｇあたり約４ｍｇの用量でおよそ１週おきにｒｈＧＵＳの投与を受ける。本治療計画は、一部の実施形態において、１２、２４、３６、４８または６０週間または永続的に継続されてもよい（すなわち、長期使用）。
【００８３】
本発明によると、本発明の方法に使用されるｒｈＧＵＳは、単独で若しくはＬＳＤに対する標準治療と組み合わせてのいずれかで、またはＬＳＤに対する標準治療を含む処置計画の一環として投与されてもよい。一部の実施形態において、患者は、ｒｈＧＵＳのそれぞれの注入に先立って予防的な抗ヒスタミン剤が投与されてもよい。別の実施形態において、患者は、ｒｈＧＵＳのそれぞれの注入に先立って解熱薬（例えば、イブプロフェンまたはアセトアミノフェン）が投与されてもよい。
【００８４】
本発明の一部の実施形態によると、ｒｈＧＵＳの投与は、統計学的に有意な治療効果をもたらす。一実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、米国若しくはその他の国の１つ以上の規制当局、例えば、ＦＤＡが提供する１つ以上の標準または基準に基づいて判定される。別の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、規制当局が認めた臨床試験の計画及び／または手順から得られた結果に基づいて判定される。
【００８５】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、無作為化、プラセボ対照、盲検開始単一交差臨床試験計画に基づいて判定される。一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、それぞれが盲検様式で予め定めた異なる時点における異なる処置順序に対応する４群のうちの１つに対象が無作為に選ばれる臨床試験設計からのデータに基づいて判定される。一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、少なくとも４、６、８、１０または１２名の対象の患者集団のデータに基づいて判定される。例となる実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、１２名の対象の患者集団のデータに基づいて判定される。
【００８６】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、１週おき（すなわち、ＱＯＷ）の４ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＵＳによる開始処置またはプラセボによる開始処置及び予め定めた異なる時点におけるＱＯＷの４ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＵＳへの切り換えのいずれかの４つの処置順序群のうちの１つに１：１：１：１で無作為に選ばれた１２名の対象を含む試験に基づいて判定される。一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、４ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＵＳまたはプラセボにいずれかをＱＯＷで４８週間投与された対象における試験に基づいて判定される。
【００８７】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、ｒｈＧＵＳがＱＯＷでおよそ４時間の時間にわたるゆっくりとしたＩＶ注入によって投与される試験に基づいて判定される。一部の実施形態において、患者は、ｒｈＧＵＳのそれぞれの注入に先立って予防的な抗ヒスタミン剤（例えば、セチリジンまたはロラタジン）を予め投薬される。
【００８８】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、プライマリーエンドポイントとして尿中グリコサミノグリカン（ｕＧＡＧ）レベルを測定することによって判定される。過去２０年にわたってＭＰＳ症に対して行われた広範囲な調査により、適度に臨床的な利益を予測する見込みのあるバイオマーカーとしてｕＧＡＧレベルの適正を認める重要な関連科学データが提供されている。ＭＰＳ７の疾患過程及びｒｈＧＵＳの作用のメカニズムは十分に理解されており、類似の酵素補充療法（ＥＲＴ）を用いた他の同様のＭＰＳ症のデータから、ｕＧＡＧはＭＰＳ症の過程の直接的で病態生理学的に容易に測定されるマーカーであり、ｕＧＡＧは、ＭＰＳ症における処置の効果及び臨床的な利益の妥当な予測因子であることが確認されている。例となる実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、４ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＵＳまたはプラセボによりＱＯＷで４８週間の期間にわたって処置された１２名の対象が関与する臨床試験におけるｕＧＡＧレベルの測定に基づいて判定される。
【００８９】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、多領域の反応指標及び個体の臨床反応の評価などの副次的な有効性基準（すなわち、セカンダリーエンドポイント）を使用して判定される。
【００９０】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、多領域の反応指標を使用して判定される。これは、独立した多領域分析同士を組み合わせて、確実に有効性に関する広範な基準を評価することができ、適格な複合エンドポイントを構築しようとする複雑さがない。一部の実施形態において、多領域の反応指標から、ＭＰＳ７患者において一般に観察される広範囲の臨床的特徴にわたるｒｈＧＵＳの有効性の評価を得る。
【００９１】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、個体の臨床反応（ＩＣＲ）を評価することによって判定される。これは、処置に対する各被験者の反応の基準であり、これは、対象／親／世話をする人が報告した事柄、臨床転帰評価を確実に完了する対象の能力及びその個体の機能障害の程度に対する評価基準の関連性に基づいて選択される。ＩＣＲの使用は、各対象に対して最も関連性のあると考えられる、前もって指定した個別の臨床転帰の変化を評価し、その後、試験対象母集団に対する全体的な奏効率を判定することによってｒｈＧＵＳの臨床的な利益の評価を可能にする。一部の実施形態において、副次的な有効性基準（すなわち、セカンダリーエンドポイント）としては、ＭＰＳ７の徴候及び対象の日々の生活を最も妨げる症状（すなわち、臨床的な問題評価）に関する処置対象の評価が挙げられる。一部の実施形態において、この評価には、肺の機能の検査、歩行距離の検査、肩屈曲可動域の検査及び微細運動機能の検査が含まれる場合もある。
【００９２】
一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、アルファ値が約０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１以下のデータに基づいて判定される。一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、信頼区間が９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のデータに基づいて判定される。一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、ｐ値が約０．０５、０．０４、０．０３、０．０２または０．０１以下のデータに基づいて判定される。一部の実施形態において、統計学的に有意な治療効果は、本発明によって提供される組成物及び方法の第ＩＩＩ相臨床試験の例えば、米国のＦＤＡによる認可により判定される。
【００９３】
一般に、統計分析には、米国若しくは中国またはその他の国の規制当局、例えば、ＦＤＡが認めた任意の適した方法が含まれてもよい。一部の実施形態において、統計分析には、非層別分析、ログランク分析、例えば、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ、Ｊａｃｏｂｓｏｎ−Ｔｒｕａｘ、Ｇｕｌｌｉｋｅｎ−Ｌｏｒｄ−Ｎｏｖｉｃｋ、Ｅｄｗａｒｄｓ−Ｎｕｎｎａｌｌｙ、Ｈａｇｅｍａｎ−Ａｒｒｉｎｄｅｌ及び階層線形モデル（ＨＬＭ）ならびにＣｏｘ回帰分析が含まれる。
【００９４】
一部の実施形態において、リソソーム蓄積バイオマーカーは、処置の反応を予測する及び／または処置の有効性を判定するために使用することができる。一部の実施形態において、尿中グリコサミノグリカン（ｕＧＡＧ）レベルが測定されてもよく、ｕＧＡＧレベルの低下は処置のプラスの反応の指標として利用することができる。一部の実施形態において、ｒｈＧＵＳを投与した後に低下する上昇したレベルのｕＧＡＧバイオマーカーは、処置の反応を予測するものである。一部の実施形態において、この情報は、ｒｈＧＵＳを使用したリソソーム蓄積症（例えば、ＭＰＳ７）の処置のための（本明細書に記載の）処置計画を決定する際に利用することができる。したがって、本発明は、処置計画を決定するための方法を提供し、この方法は、ｒｈＧＵＳを用いて処置された対象の生物学的サンプル中のＬＳＤバイオマーカーのレベルの低下を検出すること及び生物学的サンプル中の１つ以上の１つ以上のＬＳＤバイオマーカーのレベルの低下に基づいてｒｈＧＵＳの処置計画を決定することを含む。一部の実施形態において、ＬＳＤバイオマーカーはｕＧＡＧである。一部の実施形態において、低下した、または低減されたレベルのｕＧＡＧは、ｒｈＧＵＳによる処置の、処置の反応及び／または処置の有効性を示す。一部の実施形態において、所定の標準レベルに対するｕＧＡＧレベルの低下は、ｒｈＧＵＳを用いた処置の予後がより良好なことを示す。
【実施例】
【００９５】
実施例１：全シアル酸の産生及び定量化
本発明に従って産生したヒト組換えβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）をＧＵＳ  ＣＲ０１とした。この組換えタンパク質は、バイオリアクター培養系を使用して培養培地に酵素を発現及び分泌するよう操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から産生したものである。
【００９６】
β−グルクロニダーゼの以前のバッチ（ＧＵＳロット４３／４４とした）は、同じ細胞株を使用してマイクロキャリアに接着した細胞を連続灌流系において増殖させるプロセスによって産生したものである。一般にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む増殖培地で細胞を増やす。その後、ＦＢＳを洗浄し、加水分解産物を含む培地に交換し、上清を灌流様式で回収した。
【００９７】
以前に報告された方法とは対照的に、ＧＵＳ  ＣＲ０１を、流加培養様式で懸濁液中において細胞を増殖させる培養系で産生した。別の違いは、以前より使用されている血清含有培地とは対照的に、化学的合成無タンパク質培地でＧＵＳ  ＣＲ０１を培養したことだけである。
【００９８】
Ｒｅｎｔｃｈｌｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＲＢ）の品質管理部門でＧＵＳ原薬のリリース試験のために、ＧＵＳ中の全シアル酸の定量化のための方法が開発された。この方法では、酸加水分解によりｒｈＧＵＳグリカン構造からシアル酸残基が遊離する。遊離したシアル酸を、その後、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）で標識し、逆相ＨＰＬＣ分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分析した。今まで、ｒｈＧＵＳのロット４３／４４及び６つのＲＢ産生ロットが全シアル酸に関してＲＢにおいて分析された。これらの結果（表１）は、ＧｌｙｃｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓで見られた結果と一致している。
【００９９】
【表１】
0006581590.tif 000003
【０１００】
実施例２：雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおける薬物動態
この実施例では、本発明に従って産生したヒト組換えβ−グルクロニダーゼを、当該技術分野において以前に報告されたとおりに産生されたものと比較した。この試験の目的は、１回の２時間の注入として雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットの静脈内に投与したヒト組換えβ−グルクロニダーゼの薬物動態及び組織分布を評価することであった。注入の速度は、第１の時間に全体積の１／３、続いて第２の時間に全体積の２／３とした。患者に使用される投与計画をまねるためにこの投与計画を設計した。
【０１０１】
材料及び方法
試験物及び注入
この試験には３つの試験物を使用した：非酵素対照として０．９％塩化ナトリウム、ＧＵＳ  ＣＲ０１及びＧＵＳロット４３／４４。試験物に関する完全な仕様は表２で確認することができる。
【０１０２】
【表２】
0006581590.tif 000004
【０１０３】
これらの試験物を、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに２つの１時間の段階からなる１回の注入の間に約２ｍｇ／Ｋｇ体重の用量で注入した。用量の３分の１を第１の時間にわたって注入し、用量の３分の２を第２の時間の間に注入した（表３）。
【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
処置前ならびにその後、表４で概要を示すスケジュールによるゆっくりとした注入、急速な注入及び注入後の段階の過程の各期間に各ラットから血液サンプルを採取した。血液を凝固させた、血清を分離し、−８０℃で凍結保存し、分析のための出荷待ちにドライアイスで冷した。
【０１０６】
【表４】
0006581590.tif 000006
【０１０７】
血清中のＧＵＳ活性
β−グルクロニダーゼ活性を以下のとおりに測定した：０．１Ｍの酢酸ナトリウム中で１：４から１：３００に希釈した２５μＬの血清、ｐＨ４．８及び１ｍｇ／ｍＬの結晶ＢＳＡを、０．１Ｍの酢酸ナトリウム中の５０μＬの１０ｍＭの４−ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニド基質、ｐＨ４．８、１ｍｇ／ｍＬの結晶ＢＳＡと混合した。すべての溶液を、予め３７℃に温め、混合し、その後、３７℃で３０分間インキュベートした。アッセイを２００μＬのグリシンカーボネート、ｐＨ１０．５を添加することによって停止させ、３６６／４４６ｎｍの励起／蛍光波長でＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍ２ｅプレートリーダーにより読み取った。活性は、３７℃における１ユニット＝１ｎｍｏｌｅ  遊離４ＭＵ／ｍＬ／ｈｒとして表わした。
【０１０８】
組織中のＧＵＳ活性
組織を剖検で採取し、クライオバイアルに入れ、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保管し、分析のための出荷待ちにドライアイスで冷した。組織中のＧＵＳ活性の分布を以下のとおりに評価した。全部または一部の組織試料を解凍し、１０から２０倍容量の２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル、ｐＨ７．２と混合した。Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを３０秒間、氷上で使用して組織ホモジネートを調製し、得られたホモジネートを、一旦、凍結／解凍して（−８０℃）、その後、氷で冷却しながら２０秒間、超音波処理した。各ホモジネートの２５μＬの全量を、前に記載したとおり４ＭＵ−β−グルクロニドを使用してβ−グルクロニダーゼに関してアッセイした。ホモジネートのタンパク質濃度を、ビシンコニン酸法によって測定した。組織中β−グルクロニダーゼレベルを、加水分解された４ＭＵ／ｈｒ／ｍｇタンパク質のｎｍｏｌｅとして表わした。
【０１０９】
結果及び考察
血漿中におけるＧＵＳ  ＣＲ０１対ＧＵＳロット４３／４４の薬物動態
図１は、ゆっくりとした注入段階、急速な注入段階及び注入後段階の間の各注入群のラットの血清中のβ−グルクロニダーゼ活性を示している。生理的食塩水のみを注入した群１に関する曲線は、これらのラットの血清中に存在している低い内在性レベルのラットβ−グルクロニダーゼ示している。酵素を注入したラットの他の２つのプロットの値から内在性レベルを差し引いた。
【０１１０】
ＧＵＳ  ＣＲ０１及びＧＵＳロット４３／４４の両方のプロットは、酵素活性レベルの経時的な増加を示しており、これは、ゆっくりとした注入期間の終了により定常状態レベルに達し、その後、急速な注入期間の開始に伴って再び増加する。しかしながら、対照的に、ＧＵＳ  ＣＲ０１は、ＧＵＳロット４３／４４と比較してゆっくりとした注入の終わりに２倍高く、急速な注入期間の終わりに３倍高い血清中レベルに達している。一般にリソソーム酵素の特徴である注入後の両酵素の血清からの急速なクリアランスが止まることも図１からわかる。
【０１１１】
図２では、両酵素に関する注入後のクリアランス段階を示し、それからｔ１／２値を算出した。ＧＵＳロット４３／４４は、４．５０分の第１の段階のｔ１／２で血液循環から除去される。対照的に、ＧＵＳ  ＣＲ０１は、わずかにゆっくりと５．３０分のｔ１／２で除去される。ｔ１／２値を再び算出するために未処理クリアランスデータを異なる方法によって分析した（図４Ａ及びＢ）。Ｃｍａｘ（ＧＵＳ  ＣＲ０１の１４８００対ＧＵＳロット４３／４４の４３００）及びＡＵＣ−ｔ（１８７００対５５８０）も、ＧＵＳが３倍高いことを示している（表５）。第２の段階のみを考慮するよう非常に異なる仕方でｔ１／２を算出した。ＧＵＳ  ＣＲ０１に関する第２の段階のｔ１／２は１．１時間であり、ＧＵＳロット４３／４４に関しては０．９６７時間である（表５）。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
ＧＵＳ  ＣＲ０１対ＧＵＳロット４３／４４の組織分布
２つの酵素のクリアランスに加えて、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、脳及び肺におけるＧＵＳロット４３／４４と比較したＧＵＳ  ＣＲ０１の組織分布を評価した。これらの組織のそれぞれから調製した組織抽出物を、β−グルクロニダーゼ及びタンパク質に関して方法に記載されているとおりアッセイした。このアッセイの結果を、β−グルクロニダーゼ活性のユニット／ｍｇ組織タンパク質として表した。これらのアッセイの概要は、図４からわかる。この図のそれぞれのグラフでは、内在性ラットβ−グルクロニダーゼを含む全酵素レベルが左側に示されている。それぞれのグラフの右側では、全酵素レベルから平均内在性酵素レベルを差し引いてある。各組織の平均内在性β−グルクロニダーゼレベルは、生理的食塩水を注入した群１の５匹すべてのラットからの値を使用して算出した。
【０１１４】
ＧＵＳ  ＣＲ０１またはＧＵＳロット４３／４４のいずれかを注入したラットの各組織におけるＧＵＳのレベルは、生理的食塩水を注入したラットよりも高い。内在性ＧＵＳレベルを差し引くと、ＧＵＳ  ＣＲ０１を注入したラットは、ＧＵＳロット４３／４４を注入したラットよりも少なくとも２倍を超えて高いＧＵＳレベルを含むことが明白になる。
【０１１５】
この試験は、ＧＵＳ  ＣＲ０１及びＧＵＳロット４３／４４のβ−グルクロニダーゼの薬物動態及び組織分布特性を評価するために設計した。本研究は、ＧＵＳロット４３／４４に関する４．５０分のより速いｔ１／２と比較して、ＧＵＳ  ＣＲ０１が血液循環から５．３０分の第１の段階のｔ１／２で除去されることを確認した。第２の段階のｔ１／２もＧＵＳ  ＣＲ０１に関してやや大きい。
【０１１６】
Ｃｍａｘ、ＡＵＣ−ｔ及び組織分布に関して、２つの酵素間におけるさらに顕著な差が証明された。ＧＵＳ  ＣＲ０１に関する２時間の注入期間の終わりの血清中のβ−グルクロニダーゼ活性の最高濃度（Ｃｍａｘ）は１４，８２９ユニット／ｍｌであり、ＧＵＳロット４３／４４によって達成された３５３７ユニット／ｍｌの濃度の４．２倍であった。Ｃｍａｘのこの増加は、注入期間の間、ゆっくりとなくなる酵素が血液中で高い濃度にまで蓄積されることによって説明することができた。図１に示されるとおり、ＧＵＳロット４３／４４に対してＧＵＳ  ＣＲ０１のＡＵＣ−ｔも極めて増加した（３倍超）。
【０１１７】
最後になるが重要でないということではなく、試験したすべての組織において、ＧＵＳ  ＣＲ０１は、ＧＵＳロット４３／４４のレベルよりも最大２倍以上のレベルで組織に送達されたことが観察された。リソソーム酵素の血液循環からのクリアランス特性の変化が組織分布に影響を与えることはわかっている。血液循環中のＧＵＳ  ＣＲ０１のｔ１／２を遅くすると、選択した組織へのさらに効率的な酵素の分布を可能にするであろうことが予想される。さらに重要なことに、組織分布の変化は、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ−ｔの変化と非常によく相関するようである。図３からわかるように、エラーバーは非常に大きい。これは、各研究群の個々のラットで得られる値の幅が大きいことを反映している。選択した組織に対する３回の繰り返しのβ−グルクロニダーゼアッセイにより、これらのラットに見られる値の幅が広いのは本当であると考えるに至った元の値が確認された。
【０１１８】
以前に、ＧＵＳ  ＣＲ０１の分析は、マンノース６リン酸のレベル及び大半の他の特性は２つの酵素間で非常に似ているが、ＧＵＳ  ＣＲ０１のシアル酸含有量はＧＵＳロット４３／４４のシアル酸含有量の２８倍であることを示していた（１．１ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＧＵＳ単量体対０．０４ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＧＵＳ単量体）。表６参照。
【０１１９】
【表６】
0006581590.tif 000008
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【０１２０】
こうしたデータを合わせると、血管の内壁にある内皮細胞に位置するマンノースレセプターによる血液循環からの糖タンパク質のクリアランスをシアル酸が遅くすることは周知であるため、ここで示されたＧＵＳ  ＣＲ０１のより良好な組織分布がそのシアル酸含有量の増加によるものであることが非常に明白になる。高いシアル酸レベルと高い親和性のマンノース−６−リン酸部分の組み合わせは、高いシアル酸含有量のために他の炭水化物レセプターを介した組織取り込みを低減し、確実に血液循環中の濃度を高くし、その結果、高い親和性のマンノース−６−リン酸レベルによる標的とする組織における非常に良好な組織取り込みを達成するための最適な組み合わせを提供する。
【０１２１】
実施例３：酵素補充療法を使用したＭＰＳ  ＶＩＩの処置
この実施例の目的は、３６週間の臨床試験において、組換えで産生したヒトβ−グルクロニダーゼ（ｒｈＧＵＳ）を使用したムコ多糖症ＶＩＩ型（すなわち、ＭＰＳ  ＶＩＩ；スライ症候群）に対する酵素補充療法がリソソーム蓄積を低減することを実証することである。
【０１２２】
この実施例では、ＭＰＳ  ＶＩＩと診断された３名の対象にシアル酸含有量が高いｒｈＧＵＳを投与した。投薬は、以下の３６週間のスケジュールに従って実施した：
週１〜１２：２ｍｇ／ｋｇ  １週間おき；
週１３〜２０：１ｍｇ／ｋｇ  １週間おき；
週２１〜２８：４ｍｇ／ｋｇ  １週間おき；及び
週２９〜３６：２ｍｇ／ｋｇ  １週間おき。
【０１２３】
ｒｈＧＵＳの安全性及び有効性を、３６週間の処置スケジュールの間評価した。ｒｈＧＵＳ化合物は、安全で、十分に許容されるようであった。重要なことに、３６週まで重篤な有害事象は観察されず、３名の対象にいずれにも薬物関連反応または注入に伴う過敏性反応はなかった。
【０１２４】
有効性を評価するために、ＧＡＧのリソソーム蓄積がＧＵＳ欠損の特徴であるため、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の尿中及び血清レベルをまず評価した。急速で持続した用量依存的な尿中グリコサミノグリカン（ｕＧＡＧ）の低下がｒｈＧＵＳを用いて処置した対象で観察された。図４参照。各投薬期間の終わりのｕＧＡＧの平均低下を図５に示す。これは、４ｍｇ／ｋｇ用量のｕＧＡＧレベルの低下が最も大きかったことを示している。
【０１２５】
ｒｈＧＵＳを用いて処置した３名すべての対象において血清グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の累進的な低下も見られた。特に、各対象は、３６週間の処置スケジュールの終わりに血清ＧＡＧレベルが少なくとも２５％低下した。図６参照。
【０１２６】
最後に、ＭＰＳ  ＶＩＩに苦しむ患者には肝臓の大きさの増大が頻繁に観察されるため、ｒｈＧＵＳを用いて処置した対象の肝臓の大きさを評価した。３６週間の処置プロトコールの結果として肝腫大が著しく低減された。図７参照。
【０１２７】
別に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術及び科学用語は、本出願が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で示されるものと同様若しくは同等のあらゆる方法及び材料を、本出願の実務または試験に使用することができるが、代表的な方法及び材料を本明細書に記載している。
【０１２８】
本発明をその特定の実施形態に関連して記載してきたが、当然のことながら、それはさらに改変することができ、本出願は、全般的に本発明の原理に従い、本発明が属する分野の既知または従来の実務内にあり、本明細書の前に記載された必須の特徴に適用されてもよく、添付の特許請求の範囲に従う本開示からのそのような発展を含む本発明のあらゆる変形、使用または適応を範囲に含むことが意図される。
【０１２９】
本明細書中で引用したそれぞれ及びすべての特許、特許出願及び刊行物の請求項、図面及び／または図を含む開示は、これらの内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする。引用文献と本明細書との間に何らかの矛盾がある場合は、本明細書が統制するものとする。本出願の実施形態を記載する際、明確にするために特定の術語を利用している。ただし、本発明は、そのように選択された特定の術語に限定されることを意図しない。本明細書中の何も本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。示したすべての例は、代表的なものであり、限定されるものではない。上記の教示を考慮して当業者が理解するとおり、上記の実施形態は、本発明から逸脱することなく改変または変更することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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