(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．α−ＧａｌＣｅｒ化合物、
ii．ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに特異的に結合する結合分子を含み、ＣＤ１ｄ分子を含まない、粒子状実体。
【請求項２】
該粒子状実体が、１０〜２０００nmの直径のサイズを有するナノ粒子である、請求項１の粒子状実体。
【請求項３】
ポリマーを含有するコアとコーティングを含むナノ粒子であり、該結合分子が、該コーティングの表面に共有結合的に連結されている、請求項２の粒子状実体。
【請求項４】
該コアが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はそれらのコポリマーを含む、請求項３の粒子状実体。
【請求項５】
α−ＧａｌＣｅｒ化合物及び該結合分子が共有結合的に連結されたコンジュゲートとして存在する、請求項１の粒子状実体。
【請求項６】
ＢＤＣＡ−３＋樹状細胞の該細胞表面マーカーが、ＸＣＲ−１及びＣＬＥＣ９Ａからなる群より選択される、請求項１の粒子状実体。
【請求項７】
該結合分子が、ヒトＢＤＣＡ−３＋樹状細胞の細胞表面マーカーの少なくとも１つに特異的に結合する抗体である、請求項１又は請求項６の粒子状実体。
【請求項８】
１つ以上の抗原決定基をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の粒子状実体。
【請求項９】
該抗原決定基が、感染剤、病原体、真菌細胞、細菌細胞、ウイルス粒子、又は腫瘍細胞に特異的である、請求項８の粒子状実体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の粒子状実体及び１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
ｉ．ワクチン組成物におけるアジュバントとして；
ii．腫瘍、癌又は感染症の処置において；
iii．自己免疫疾患及び炎症性疾患の処置において
のいずれかに使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項記載の粒子状実体又は請求項１０の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特にワクチンにおけるアジュバントとして又は免疫療法において使用するための、粒子状実体、例えばナノ粒子又はコンジュゲートに関する。より具体的には、本発明は、
ｉ．ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えば原型ｉＮＫＴ細胞リガンドα−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）、
ii．場合により、１つ以上の抗原決定基（群）、例えば腫瘍抗原（群）又は病原体由来の抗原（群）、及び
iii．インビボにおいて該ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（群）及び場合により該１つ以上の抗原決定基（群）を、樹状細胞、例えばヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体に関する。
【０００２】
発明の背景
癌に対する免疫療法は依然として、腫瘍増殖を制御する有望なアプローチであり、抗腫瘍免疫の誘導に大いに有望である。
【０００３】
インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、「自然免疫(innate)に似た」機能を有し、癌、感染、炎症、及び自己免疫疾患をはじめとする数多くの病態においてプラス及びマイナスの役割を果たす、非定型的Ｔリンパ球の集団を示す１−３。インバリアントＮＫＴ細胞は、ＮＫ系統受容体、及び、少数のＶβ鎖と対を形成するセミインバリアントＴＣＲα鎖を発現する。この細胞集団は、そのＴＣＲを通して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現されるＣＤ１ｄ分子によって提示される自己及び外来性の脂質抗原を認識する４，５。原型ｉＮＫＴ細胞アクチベーターであるα−ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）に応答して、ｉＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４をはじめとする多種多様な免疫刺激サイトカインを産生し、いくつかの共刺激分子をアップレギュレートする２。これらの事象は、ＡＰＣの相互成熟、例えば樹状細胞（ＤＣ）によるＩＬ−１２の放出、並びに、ＮＫ細胞、γδＴ細胞、並びにＢ及びＴリンパ球の下流における活性化に寄与し、免疫応答に対して重要な結果を及ぼす１〜３，６。この活性化カスケードを通して、α−ＧａｌＣｅｒ及びα−ＧａｌＣｅｒ類似体は、癌におけるワクチン又は療法のための強力なアジュバントと見なされる１，２，７。
【０００４】
通常型ＤＣ（ＤＣと呼ばれる）は、α−ＧａｌＣｅｒに応答したｉＮＫＴ細胞応答の開始、及び、バイスタンダー細胞の下流における活性化における、主な役者であると考えられている８〜１２。樹状細胞は異種性であり、その表現型、組織内分布及び機能に従って異なるサブタイプに分類され得る１３，１４。血液によって運ばれる抗原に対する免疫応答の重要な部位である脾臓における樹状細胞は、主に、ＣＤ８α−ＤＣ（ＣＤ４＋及びＣＤ４−サブセットを包含する）、並びにＣＤ１０３及びＣＤ２０７分子を発現している又は発現していないＣＤ８α＋ＤＣから構成される１６，１７。ＣＤ８α＋ＤＣ、最も特定するとＣＤ２０７＋画分は交差提示のために特殊化され、一方、ＣＤ８α−ＤＣは、ＭＨＣクラスＩＩ上で抗原を提示するのがより効率的である１３，１６，１８，１９。ｉＮＫＴ細胞応答の開始に関与するＤＣサブセットの性質は大部分が依然として知られていない。以前の研究は、α−ＧａｌＣｅｒの全身投与後、ＣＤ２０７＋ＣＤ８α＋ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞の初期活性化に不必要であるが、それらは、ＩＬ−１２ｐ７０の放出を通して、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの産生に重要な役割を果たすことを示した１８，２０。
【０００５】
マウスにおける以前の研究は、α−ＧａｌＣｅｒの単回投与が、二回目の刺激時にＩＦＮ−γを増殖及び産生することができないことによって定義される、ｉＮＫＴ細胞アネルギーを誘導することを示した１０、１１。この特性は、ヒトにおけるα−ＧａｌＣｅｒの臨床使用を強く妨げる２１，２２。いくつかの報告は、Ｂリンパ球をはじめとする不適切なＣＤ１ｄを有するＡＰＣによるα−ＧａｌＣｅｒの提示は、ｉＮＫＴ細胞アネルギーに至り得ることを示唆した１０，１１，２３。対照的に、ＤＣによるα−ＧａｌＣｅｒの提示は、ｉＮＫＴ細胞アネルギーを回避するようであるが１０，１１、これには近年疑問が投げ掛けられている２３。従って、ｉＮＫＴ細胞アネルギーにおけるＤＣの役割は依然として未解決の問題である。
【０００６】
本発明の目的は、特に癌患者における、改善された、免疫をベースとした療法及びワクチンを提供することである。より具体的には、本発明は、効率的なｉＮＫＴ活性化のための、及び後の時点における効率的なｉＮＫＴ細胞性適応免疫応答のための、場合により１つ以上の腫瘍抗原（群）と一緒に、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒの、特定のＡＰＣへの制御された送達に基づく。
【０００７】
発明の要約
本発明は、
ｉ．ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、
ii．場合により、１つ以上の抗原決定基（群）、及び
iii．インビボにおいて該ｉＮＫＴ細胞アゴニスト及び場合により該１つ以上の抗原決定基（群）を、ヒト樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体に関する。
【０００８】
１つの具体的な実施態様において、該ｉＮＫＴ細胞アゴニストはα−ＧａｌＣｅｒ分子又はその機能的誘導体である。別の具体的な実施態様において、該抗原決定基（群）は、腫瘍又は病原体に由来する抗原である。別の具体的な実施態様において、該標的化剤は、該ｉＮＫＴ細胞アゴニストをヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞にターゲティングする。より具体的な実施態様において、該粒子状実体はＣＤ１ｄ分子を含まない。
【０００９】
従って、１つの好ましい実施態様において、本発明は、
ｉ．α−ガラクトシルセラミド又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を活性化することのできるその機能的誘導体からなるα−ＧａｌＣｅｒ化合物、及び
ii．場合により、１つ以上の抗原決定基、例えば腫瘍抗原（群）又は病原体に由来する抗原（群）、
iii．インビボにおいて該α−ＧａｌＣｅｒ及び場合により該１つ以上の抗原決定基（群）を、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体に関する。
【００１０】
１つの実施態様において、該粒子状実体は、直径１０〜２０００nmのサイズを有するナノ粒子である。典型的には、該ナノ粒子は、ポリマーを含有するコア、及びコーティングを含み、該標的化剤は、該コーティングの表面に共有結合的に連結している。特に関連した実施態様において、ナノ粒子の該コアは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はそれらのコポリマーを含む。
【００１１】
別の実施態様において、該粒子状実体は、場合によりリンカーを介して、標的化剤に共有結合的に連結した、該ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物からなるコンジュゲートである。
【００１２】
α−ガラクトシルセラミドは、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール又はｉＮＫＴ細胞を活性化するその機能的誘導体からなり得る。
【００１３】
前の実施態様と合わせられ得る実施態様において、該標的化剤は、ＢＤＣＡ−３＋樹状細胞をはじめとするヒト樹状細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する結合分子を含む。ＢＤＣＡ３＋樹状細胞は、Ｌｉｎ−（ＣＤ３、Ｃ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＢＤＣＡ３＋（ＣＤ１４１としても知られる）、Ｃｌｅｃ９Ａ＋、ＸＣＲ−１＋、ＴＬＲ３＋、ＣＤ１１ｃ＋である。従って、１つの具体的な実施態様において、該標的化剤は、ＢＤＣＡ−３＋樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する分子である。例えば、ＢＤＣＡ３＋樹状細胞に特異的な該マーカーは、ＸＣＲ−１及びＣＬＥＣ９Ａ（ＤＮＧＲ−１としても知られる）からなる群より選択される。
【００１４】
前の実施態様と合わせられ得る他の実施態様において、標的化剤として使用するための結合分子は、ヒトＢＤＣＡ−３＋樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーの少なくとも１つに特異的に結合する抗体である。
【００１５】
前の実施態様と合わせられ得る具体的な実施態様において、該粒子状実体は、ＣＤ１ｄ分子を含まない。
【００１６】
別の実施態様において、粒子状実体はさらに、抗原決定基を含む。該抗原決定基は、感染剤、病原体、真菌細胞、細菌細胞、ウイルス粒子、又は腫瘍細胞に特異的であり得る。
【００１７】
本発明はまた、上記されているような粒子状実体及び１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物に関する。該組成物はさらに、ｉＮＫＴ細胞アゴニストを、抗原決定基、及び／又は他の免疫刺激剤（Ｔｏｌｌ様受容体及び／又はＮＯＤ様受容体ファミリーのアゴニストを含むがこれらに限定されない）と共に含み得る。
【００１８】
本発明による粒子状実体又は医薬組成物は、
ｉ．ワクチン組成物におけるアジュバントとして；
ii．癌若しくは感染症の予防若しくは治療において；又は
iii．自己免疫疾患及び炎症疾患、例えば喘息などの予防又は治療において
のいずれかに特に有用である。
【００１９】
より具体的には、本発明の粒子状実体又は組成物は、腫瘍発症又は感染症の予防又は治療のための方法に使用され得る。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明者らは実際に、抗体（Ａｂ）を備えたナノ粒子（ＮＰ）を用いて、能動的にインビボにおいてα−ＧａｌＣｅｒ及び抗原を樹状細胞にターゲティングすることが、ｉＮＫＴ細胞依存性免疫応答を改善し得るという可能性を調べた。その表面上にＣＤ８α＋マウスＤＣへの標的化剤を担持したＰＬＧＡをベースとしたナノ粒子を使用して、本発明者らは初めて、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒ化合物及び抗原のインビボにおける送達は、ｉＮＫＴ細胞の初期活性化を増強し、後の時点でｉＮＫＴ細胞性適応免疫応答（Ｂ及びＴ細胞応答）を増強するだけでなく、ｉＮＫＴ細胞が、さらなる再刺激に応答することを可能とし、癌療法及びワクチン接種のための新規戦略への道を開拓することを示す。
【００２１】
従って、１つの態様において、本発明は、
ｉ．インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞アゴニスト、及び
ii．場合により、１つ以上の抗原決定基、及び
iii．インビボにおいて該ｉＮＫＴ細胞アゴニスト及び場合により該１つ以上の抗原決定基（群）を樹状細胞にターゲティングする標的化剤
を含む、粒子状実体を提供する。
【００２２】
ｉＮＫＴ細胞アゴニスト
本明細書において使用される「ｉＮＫＴ細胞アゴニスト」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってＣＤ１ｄのコンテクストにおいて提示され、かつｉＮＫＴ細胞を活性化、すなわち、特異的に、ｉＮＫＴ細胞によるサイトカイン産生を促進することのできる、脂質から導かれた任意の誘導体又は類似体を指す。典型的には、ｉＮＫＴ細胞アゴニストはα−ガラクトシルセラミド化合物である。
【００２３】
本明細書において使用される「α−ガラクトシルセラミド化合物」又は「α−ＧａｌＣｅｒ化合物」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、可変長のアシル及びスフィンゴシン鎖を有するセラミド脂質にα結合によって付着したガラクトース炭水化物を含む、スフィンゴ糖脂質から導かれた任意の機能的誘導体又は類似体を指す（Van Kaer L. α-Galactosylceramide therapy for autoimmune diseases: Prospects and obstacles. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 31-42）。
【００２４】
機能的誘導体は、ｉＮＫＴ細胞を活性化する能力を保持する。
【００２５】
様々な刊行物が、α−ＧａｌＣｅｒ化合物及びその合成を記載している。例示的であって決して網羅的なものではない、このような参考文献のリストとしては、Morita, et al., J. Med. Chem., 25 38:2176 (1995); Sakai, at al., J. Me d. Chem., 38:1836 (1995); Morita, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 5:699 (1995); Takakawa, etal., Tetrahedron, 54:3150 (1998); Sakai, at al., Org. Lett., 1:359 (1998); Figueroa-Perez, et al., Carbohydr. Res., 328:95 (2000); Plettenburg, at al., J. Org. Chem., 67:4559 (2002); Yang, at al., Angew. Chem., 116:3906 (2004); Yang, at al., Angew. Chem. Int. Ed., 43:3818 (2004); and, Yu, etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(9):3383-3388 (2005)が挙げられる。
【００２６】
α−ＧａｌＣｅｒ化合物の例を記載した特許及び特許出願の例としては、米国特許５，９３６，０７６号；米国特許第６，５３１，４５３号、米国特許第５，Ｓ５３，７３７号、米国特許第８，０２２，０４３号、米国特許出願第２００３０３０６１１号、米国特許出願第２００３０１５７１３５号、米国特許出願第２００４０２４２４９９号、米国特許出願第２００４０１２７４２９号、米国特許出願第２０１００１０４５９０号、欧州特許第ＥＰ０６０９４３７号及び国際特許出願第Ｗ０２００６０２６３８９号が挙げられる。
【００２７】
典型的なα−ＧａｌＣｅｒ化合物はＫＲＮ７０００（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−０−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール））（ＫＲＮ７０００、a novel immunomodulator, and its antitumor activities. Kobayashi E, Motoki K, Uchida T, Fukushima H, Koezuka Y. Oncol Res. 1995;7(10-11):529-34）である。
【００２８】
他の例としては、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−２−ドコサノイルアミノ(docosanoylamina)−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−イコサノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オクタデカノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−２−デカノイルアミノ−１−（α−Ｄ−４０ガラクトピラノシルオキシ）−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３−テトラデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｒ，３Ｓ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｓ，３Ｓ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オクタデカノイルアミノ−４−オクタデセン−３−オール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−４−オクタデセン−３−オール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ペンタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ウンデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ペンタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ウンデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ］−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ］−３，４−ノナデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ(hydroxyhexacosanoylamina)］−３，４−イコサンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｓ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ヘキサデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｓ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−１６−メチル−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１６−メチル−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシトリコサノイルアミノ］−１６−メチル−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシペンタコサノイルアミノ］−１６−メチル−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オレオイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オクタコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｒ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−ヘキシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−ヘプチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−ヘキサデシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−トリコシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−テトラコシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−ペンタコシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−（６−フェニルヘキシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−（７−フェニルヘプチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−（８−フェニルオクチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール、
１１−アミノ−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）ウンデカンアミド、
１２−アミノ−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オキシ）オクタデカン−２−イル）ドデカンアミド、
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１１−ヒドロキシウンデカンアミド、
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１２−ヒドロキシドデカンアミド、
８−（ジヘプチルアミノ）−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）オクタンアミド、
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１１−（ジペンチルアミノ）ウンデカンアミド、
１１−（ジヘプチルアミノ）−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）ウンデカンアミド、
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１１−メルカプトウンデカンアミド、
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−ジヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１２−メルカプトドデカンアミドが挙げられる。
【００２９】
いくつかの実施態様において、α−ＧａｌＣｅｒ化合物はＰＥＧ化されている。本明細書において使用される「ＰＥＧ化」という用語は、化合物部分（すなわちα−ＧａｌＣｅｒ化合物）と、少なくとも１つのポリアルキレン単位を含有するコンジュゲート部分（群）とのコンジュゲーションを指す。特に、ＰＥＧ化という用語は、化合物部分（すなわちα−ＧａｌＣｅｒ化合物）と、少なくとも１つのポリエチレングリコール単位を有するコンジュゲート部分とのコンジュゲーションを指す。
【００３０】
α−ガラクトシルセラミドの誘導体はまた、別の分子との化学的カップリング（コンジュゲーション）のために修飾された、α−ガラクトシルセラミドの機能的誘導体を含む。
【００３１】
「ｉＮＫＴ細胞を活性化する」又は「ｉＮＫＴ免疫応答を誘導する」という語句は類似の意味を有し、例えば、α−ＧａｌＣｅｒ化合物によるｉＮＫＴ細胞におけるＩＦＮ−γなどのサイトカインの産生の観察される誘導を指す。ｉＮＫＴ細胞によるサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）産生の分析は、ＰＢＳ−５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマー及びＴＣＲβ抗体を使用した細胞内フローサイトメトリーによって実施され得る。
【００３２】
１つの具体的な実施態様において、本発明よる粒子状実体は、（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール又はその機能的誘導体を含む。
【００３３】
標的化剤
特定の樹状細胞、特にマウスＣＤ８α＋又はヒトにおいて相当するＢＤＣＡ３＋樹状細胞に、場合により１つ以上の抗原決定基（群）と共に、α−ＧａｌＣｅｒ化合物などのｉＮＫＴ細胞アゴニストを効率的に送達することは、ｉＮＫＴ細胞の早期活性化を増強することを可能とさせ、かつｉＮＫＴ細胞がさらなる再刺激に対して応答することを可能とすることは、本発明の重要な発見である。
【００３４】
従って、本発明の粒子状実体は、インビボにおいて該ｉＮＫＴ細胞アゴニストを、場合により１つ以上の抗原決定基（群）、例えば腫瘍抗原又は病原体に由来する抗原と一緒に、樹状細胞に、例えばヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞、又は類似の表現型を有する他の哺乳動物種の関連細胞、例えばマウス種のＣＤ８α＋樹状細胞にターゲティングする標的化剤を含む。
【００３５】
１つの実施態様において、該標的化剤は、ヒト樹状細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する分子である。具体的な実施態様において、該標的化剤は、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する。
【００３６】
１つの実施態様において、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞の「細胞表面マーカー」は、ＢＤＣＡ３＋細胞の外表面上に発現される、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞のタンパク質又は生体分子を指す。より具体的には、それは、ＢＤＣＡ３＋樹状細胞の表面上に発現され、抗体によって特異的に認識され得る、ＢＤＣＡ３＋細胞の抗原決定基に相当し得る。好ましくは、標的化剤は、ＢＤＣＡ３＋細胞に特異的である、すなわち、他の樹状細胞上に発現されていない（又は低いレベルで発現されている）細胞表面マーカーに結合する。１つの具体的な実施態様において、該標的化剤は、ＢＤＣＡ３＋細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合し、該細胞表面マーカーは、ＣＬＥＣ９Ａ陰性細胞には発現されていない。
【００３７】
１つの実施態様において、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞の細胞表面マーカーに特異的に結合する分子は、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞の該細胞表面マーカーの細胞外ドメインに１０００μM以下、１０μM以下、１μM以下、１００nM以下、又は１０nM以下のＫＤで結合する分子である。本明細書において使用されるＫＤという用語は、ＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表現される、解離定数を指すことが意図されている。ＫＤ値は、当技術分野において十分に確立された方法を使用して決定され得る。分子、例えばタンパク質又は抗体のＫＤを決定するための方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる、又はビアコア（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【００３８】
ＢＤＣＡ３＋樹状細胞は、Ｌｉｎ−（ＣＤ３、Ｃ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６）、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＢＤＣＡ３＋（ＣＤ１４１としても知られる）、Ｃｌｅｃ９Ａ＋、ＸＣＲ−１＋、ＴＬＲ３＋、ＣＤ１１ｃ＋である。従って、１つの具体的な実施態様において、該標的化剤は、ＣＬＥＣ９Ａ（例えば配列番号１のヒトＣＬＥＣ９Ａ）又はＸＣＲ−１（例えば配列番号２のヒトＸＣＲ−１）からなる群より選択されるＢＤＣＡ−３＋樹状細胞に特異的な細胞表面マーカーに結合する分子である。従って、１つの実施態様において、粒子状実体は、標的化剤として、ＣＬＥＣ９Ａ及び／又はＸＣＲ−１に、典型的には、ＣＬＥＣ９Ａの細胞外ドメイン又はＸＣＲ−１の細胞外ドメインに特異的に結合する分子を含む。
【００３９】
ヒト樹状細胞の細胞表面マーカーに対する、好ましくはヒトＢＤＣＡ３＋特異的細胞表面マーカーに対する結合特異性を有することが知られる任意の分子を、本発明の粒子状実体の調製に使用することができる。抗体が特に適切である。なぜなら、所望の結合特異性を有する抗体は、例えば、抗体ライブラリーを所望の標的に対してスクリーニングすることによって、ルーチン的に生成され得るからである。スクリーニング法としては、例えば、ファージディスプレイ技術又は当技術分野において公知の他の関連した技術が挙げられ得る。このような抗体はまた、ナノ粒子に容易に移植され得るか、又は、慣用的な化学的カップリング技術を使用して、α−ＧａｌＣｅｒ化合物などのｉＮＫＴ細胞アゴニストに直接コンジュゲートされ得る。
【００４０】
それ故、好ましい実施態様において、本発明の粒子状実体は、標的化剤として、ヒトＢＤＣＡ３＋樹状細胞の細胞表面タンパク質に、例えば少なくとも１００μM以下、１０μM以下、１μM以下、１００nM以下、又は１０nM以下のＫＤで、特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば抗ＸＣＲ−１抗体又は抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体を含む。
【００４１】
本明細書において使用される抗体という用語は、完全長抗体及びその任意の抗原結合フラグメント又は一本鎖を含む。「完全長」抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）及び２本の軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略称される）、並びに３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む重鎖定常領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略称される）、並びに１つのドメインを含む軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨドメイン及びＶＬドメインはさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域の介在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変性領域にさらに細分される。各ＶＨ及びＶＬは、それ故、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で並んだ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００４２】
市販されている抗体又はその誘導体を、本発明の粒子状実体に使用し得る。抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体は、例えば、Miltenyi Biotec (Germany)から入手できる。
【００４３】
ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、場合により抗原決定基（群）及び標的化剤を担持したナノ粒子
標的化剤による、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）及び場合により抗原決定基（群）の効率的なターゲティングのために、該ｉＮＫＴ細胞アゴニスト及び場合により該抗原決定基（群）を、間接的又は直接的なカップリングのいずれかによって標的化剤にカップリングさせて、粒子状実体を形成しなければならない。間接的なカップリングの一例は、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）、場合により抗原決定基（群）の、該ｉＮＫＴ細胞アゴニスト及び場合により該抗原決定基（群）を適切な樹状細胞に適切にインビボにおいて送達するための、標的化剤をさらに担持するナノ粒子への封入である。このような実施態様において、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）、場合により１つ以上の抗原決定基（群）、及び標的化剤は、同じ粒子状実体、すなわちナノ粒子に物理的に関連付けられている。
【００４４】
理想的には、ナノ粒子は、以下の特徴を有し得る：
−  それは生体適合性である、
−  それは、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、場合により抗原決定基（群）、及び標的化剤を、共有結合又は非共有結合的な連結を介して物理的にカップリングさせ得る。
【００４５】
「物理的カップリング」は、標的化剤及び／又はｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）及び場合により抗原決定基（群）のナノ粒子の構成成分への共有結合、或いは、静電気的相互作用又はイオン相互作用などの非共有結合的な相互作用のいずれかから生じ得る。
【００４６】
ヒトにおける活性成分のインビボ送達のために当技術分野において記載された任意のナノ粒子を使用し得る。このようなナノ粒子としては、例えば、リポソーム及びミセル、ナノスフィア又はナノ粒子、ナノチューブ、ナノ結晶、ヒドロゲル、カーボンベースのナノ粒子などが挙げられる（例えばPeer et al., 2007, Nature nanotechnology, vol. 2, pp751-760参照）。
【００４７】
適切なナノ粒子の例はまた、Cruz et al J Control Release 2010, 144(2):118-26にも記載されている。
【００４８】
好ましくは、本発明によるナノ粒子は、直径１〜２０００nm、例えば１０〜５００nm又は１０〜２００nmの平均直径を有する。
【００４９】
本明細書において使用される、ナノ粒子のサイズは、Cruz et al, 2011, Cruz et al.,2010３０，３１に記載のような動的光散乱測定の１０回の測定値の平均値±ＳＤに相当し得る。
【００５０】
本発明のナノ粒子は、半導体、金属（例えば金、銀、銅、チタン、ニッケル、白金、パラジウム及び合金）、金属酸化物ナノ粒子（例えばＣｒ２Ｏ３、ＣＯ３Ｏ４、ＮｉＯ、ＭｎＯ、ＣｏＦｅ２Ｏ４及びＭｎＦｅＯ４）などの、ただしこれらに限定されない、無機コアを含み得る。
【００５１】
他の実施態様において、ナノ粒子は、１つ以上のポリマー、又はそれらのコポリマー、例えば１つ以上のデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、キトサン、トリメチルキトサン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ無水物、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド(polyacylamide)、セルロース、ヒプロメロース(hydromellose)、デンプン、デンドリマー、ポリアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール−コ−プロピレングリコール、脂肪族ポリエステル、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸、及びそれらのコポリマー、例えば乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、又はポリ（ε−カプロラクトン）を有する、少なくとも１つのコアを含む。
【００５２】
一般的に、ナノ粒子の表面はまた、溶解度、生体適合性などの所望の物理的特性を生じさせるために、及び他の生体分子（例えばｉＮＫＴ細胞アゴニスト、抗原決定基（群）、又は標的化剤）との化学的連結を促進するために、官能基化又はコーティングされていてもよい。
【００５３】
例えば、ナノ粒子の表面は、カルボキシル基、アミン基、カルボキシル／アミン、ヒドロキシル基、ポリマー、例えばシラン、デキストラン、若しくはＰＥＧ、又はその誘導体などの、ただしこれらに限定されない、１つ以上の化学的リンカーを取り込むことによって官能基化されていてもよい。
【００５４】
具体的な実施態様において、ナノ粒子は、ポリ乳酸、ポリグルコール酸、又はその混合物からなる群より選択されるポリマーを含むコアを有する。別の具体的な実施態様において、ナノ粒子は乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）を含む。
【００５５】
他の適切なポリマーは、ポリ（ｇ−グルタミン酸）、ポリ（ａ−アスパラギン酸）、ポリ（ｅ−リジン）、ポリ（ａ−グルタミン酸）、ポリ（ａ−リジン）、ポリ−アスパラギン、又はその誘導体、及びその混合物からなる群より選択されるポリアミノ酸を含み得る。
【００５６】
具体的な実施態様において、本発明のナノ粒子は、ポリマーを含有するコア、及びコーティングを含み、標的化剤は、コーティングの表面への共有結合的な連結によってナノ粒子に付着している。さらなる具体的な実施態様において、ナノ粒子は、
（ｉ）その表面上にコーティングを有する、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はそれらのコポリマーから作られたコア、
（ii）有効量のｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物、
（iii）場合により、有効量の１つ以上の抗原決定基（群）、例えば腫瘍抗原又は病原体に由来する抗原、
（iv）ナノ粒子のコーティングに共有結合的に付着した抗体
を含み、該抗体は、ＢＤＣＡ３＋樹状細胞に特異的に結合する。
【００５７】
１つの具体的な実施態様において、ナノ粒子に含まれる該抗体は、ＣＬＥＣ９Ａ陰性又はＸＣＲ１陰性樹状細胞に結合しない。
【００５８】
より具体的な実施態様において、該抗体は、ＢＤＣＡ３＋樹状細胞上に発現されるＣＬＥＣ９Ａ又はＸＣＲ１細胞表面マーカーに特異的に結合する。
【００５９】
他の適切なナノ粒子は、場合により有機又は無機安定化剤、例えばシラン、デキストラン又はＰＥＧを用いてコーティングされた、酸化物及びハイブリッドナノ構造、例えば酸化鉄ナノ粒子又はポリマーベースのナノ粒子を含む（例えば、S. Chandra et al. / Advanced Drug Delivery Rev (2011), doi:10.1016/j.adr.2011.06.003参照）。
【００６０】
ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物、及び／又は場合により１つ以上の抗原決定基（群）、例えば腫瘍細胞によって又は病原体によって発現される抗原、及び／又は標的化剤を、ナノ粒子に封入又は化学的にカップリングさせるための方法は当技術分野において公知である。例えば、ナノ粒子は、α−ＧａｌＣｅｒ化合物及び場合により１つ以上の抗原決定基（群）と一緒に調製され、α−ＧａｌＣｅｒ化合物及び場合により該１つ以上の抗原決定基（群）はナノ粒子に封入される（非共有結合によって保持される）。あるいは、ナノ粒子を調製し、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物、及び場合により、該１つ以上の抗原決定基（群）を、慣用的なカップリング技術を介して、ナノ粒子の官能基化された表面に化学的に連結させる。α−ＧａｌＣｅｒの封入された、ＰＬＧＡをベースとしたナノ粒子の調製例は、Cruz et al, 2011 [Mol Pharm 2011, 8:520-531]及びCruz et al. 2010 [J Control Release 2010, 144:118-126]に記載されている。
【００６１】
１つの具体的な実施態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子１mgあたり０．０１〜１０００ngの量で封入されたα−ＧａｌＣｅｒを含む。具体的な実施態様において、ナノ粒子１mgあたり１ngから１０００ngのｉＮＫＴ細胞アゴニストが使用される。具体的な実施態様において、本発明のナノ粒子はさらに、次の節により詳細に記載されるように、抗原決定基を含む。このような抗原決定基は、標的化剤と同様に、封入又はナノ粒子の表面に付着され得る。
【００６２】
コンジュゲート
あるいは、本発明の粒子状実体は、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）の、標的化剤への、直接的か又は場合によりリンカーを介してかのいずれかでの化学的カップリングによりコンジュゲートを形成することからもたらされる。
【００６３】
それ故、このようなコンジュゲートは、ｉＮＫＴ細胞アゴニストを標的化剤と、場合によりリンカーを介して、カップリング（共有結合的又は非共有結合的なカップリングのいずれかによる）させることによって得られる。
【００６４】
ｉＮＫＴ細胞アゴニストと標的化剤との間の共有結合的な連結は、典型的には、その機能性を維持しつつ又は切断を可能としつつ、両方の分子の共有結合のためのカップリング剤又は架橋剤及び場合によりリンカーの使用を介して得られる。様々なカップリング剤又は架橋剤を、本発明のコンジュゲートの作製のために使用し得る。架橋剤の例としては、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky ef a/. , 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA ef a/., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照）。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,1 18-132; Brennan ef a/. , 1985 Science 229:81 -83、及びGlennie ef a/. , 1987 J. Immunol. 139: 2367- 2375に記載のものが挙げられる。リンカーの種類の例としては、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、及びペプチド含有リンカーが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、リソソーム区画内の低いｐＨによる切断を受けやすい又はプロテアーゼによる切断を受けやすいリンカーが選択され得る。
【００６５】
他の化合物にα−ＧａｌＣｅｒ化合物をカップリングさせる方法についての参考文献については、例えば、Bioorg Med Chem Lett. 2004 14(2):495-8及びDaoudi et al, 1999, Bioconjug Chem. 10(6):1021-31を参照されたい。
【００６６】
標的化剤へのα−ＧａｌＣｅｒ化合物の共有結合的コンジュゲーションのために、ビオチン化α−ＧａｌＣｅｒ化合物を、ストレプトアビジン−抗体又はアビジン−抗体と結合(associate)させ得る（McReynolds et al, Bioconjugate Chem., 1999, 10 (6), pp 1021-1031 DOI: 10.1021/bc990050x）。
【００６７】
１つの具体的な実施態様において、該コンジュゲートは、標的化剤として、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）と共有結合的にコンジュゲートした、少なくとも１つの抗体分子を含む。抗体分子を含むコンジュゲート（これはまた、イムノコンジュゲート又はＡＤＣ（抗体−薬物−コンジュゲート、antibody-drug-conjugates）とも称される）を調製するための方法は、当技術分野において広く記載されている。
【００６８】
治療剤をタンパク質、特に抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当技術分野において周知であり、例えばFlygare et al (Chem Biol Drug Des 2013; 81: 113-121)に記載されている。
【００６９】
１つの実施態様において、該コンジュゲートは、１分子の標的化剤（例えば抗ＣＬＥＣ９Ａ又は抗ＣＸＲ１抗体）にコンジュゲートした１分子のｉＮＫＴ細胞アゴニスト（例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物）を含む。具体的な実施態様において、該コンジュゲートは、複数の標的化剤にコンジュゲートした複数のα−ＧａｌＣｅｒ化合物を含んでいてもよい。
【００７０】
具体的な実施態様において、本発明のコンジュゲートは、１つ以上の抗ＸＣＲ−１抗体又は抗ＣＬＥＣ９Ａ抗体に共有結合的に連結した、１つ以上のｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えば１つ以上のα−ＧａｌＣｅｒ化合物を含む。
【００７１】
抗原決定基
本発明の粒子状実体は、アジュバントとして、すなわち、抗原決定基に対する免疫応答を増強させるために使用され得る。従って、本発明の粒子状実体は、抗原と共に、２つの別々の医薬組成物として、又は同組成物の一部として、又は同じ粒子状実体の一部としてのいずれかとして投与され得る。別々に投与されるならば、両方の組成物は、順次又は同時に投与され得る。具体的な実施態様において、抗原及び粒子状実体は同時に投与され、例えば、同組成物に製剤化される。他の実施態様において、該抗原は、ナノ粒子又はコンジュゲートなどの粒子状実体に含まれる。
【００７２】
抗原決定基を有する得られた粒子状実体又は組成物は免疫原性であり得、このことは、該抗原決定基に関して、体液性又は細胞性免疫応答、好ましくはその両方を誘起できることを意味する。好ましくは、抗原決定基は、単独で投与された場合には、免疫エフェクター応答を誘導できない。従って、本明細書において使用される「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、免疫系を有する宿主又は動物又はヒトに導入された場合に、免疫系の抗原認識分子、例えば免疫グロブリン（抗体）又はＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）と特異的に相互作用ことのできる任意の物質（例えば、タンパク質、ペプチド、多糖、糖タンパク質、糖脂質、核酸、又はその組合せ）を指す。抗原はそれ自体免疫原性でなくてもよく、本発明の粒子状実体、例えばナノ粒子又はコンジュゲートは、アジュバントとして使用され、すなわち共投与された場合に抗原決定基に対する宿主免疫応答を増大（増強）させることができる。
【００７３】
抗原決定基は、Ｂ細胞又はＴ細胞又はその両方によって認識される抗原の一部からなる「エピトープ」を含む。例えば、このようなエピトープと、免疫グロブリン（抗体）又はＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の抗原認識部位との相互作用により、抗原特異的免疫応答が誘導される。
【００７４】
該組成物中に使用される又は本発明による粒子状実体と共に使用される抗原決定基は、腫瘍細胞から導かれ得るか、又は腫瘍細胞に特異的であり得、すなわちそれは腫瘍抗原である。本明細書において使用される「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の両方を含む。腫瘍特異的抗原は、腫瘍細胞によってのみ発現される抗原として知られるが、一方、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞上に発現されるが、いくつかの正常な細胞上にも発現され得る。腫瘍特異的抗原及び腫瘍関連抗原は、当技術分野において記載されている。このような腫瘍抗原は、ヒト上皮細胞ムチン（Ｍｕｃ−１：乳癌細胞及び膵癌細胞上に存在する、Ｍｕｃ−１糖タンパク質についての２０アミノ酸のコアのリピート）、Ｈａ−ｒａｓ発癌遺伝子産物、ｐ５３、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ｒａｆ発癌遺伝子産物、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＴＦ、ｓＴｎ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、チロシナーゼ、ｇｐ７５、メランＡ／Ｍａｒｔ−１、ｇｐ１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１及び２、ＨＰＶ−Ｆ４、６、７、前立腺血清抗原（ＰＳＡ）、α−胎児タンパク質（ＡＦＰ）、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＡ７３３、ｇｐ７２、ｐ５３、ｒａｓ発癌遺伝子産物、プロテイナーゼ３、ウィルムス腫瘍抗原−１、テロメラーゼ、ＨＰＶ Ｅ７及びメラノーマガングリオシド、並びに現在公知の又は将来に同定される任意の他の腫瘍抗原であり得るがこれらに限定されない。
【００７５】
他の抗原決定基としては、寄生虫又は真菌（例えばカンジダ、白癬菌）、細菌細胞（例えばブドウ球菌、肺炎球菌又は連鎖球菌細胞、ボレリア、シュードモナス、リステリア）、ウイルス粒子（例えばＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＨＶＴ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、Ｃ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、フラビウイルス、ラウス関連ウイルス、又はＳＡＲＳウイルス、黄熱病ウイルス、又はデング熱ウイルス）の抗原、又は任意のその一部を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
具体的な実施態様において、該抗原決定基は、病原体に由来する抗原である。本明細書において使用される病原体に由来する抗原は、病原体によって発現されるが哺乳動物細胞上、特にヒト細胞上には発現されない抗原を指す。例えば、それはウイルス、細菌、又は哺乳動物の真菌病原体によって発現される抗原である。
【００７７】
医薬組成物
本発明は、前の節に記載のように、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、場合により抗原決定基、及び樹状細胞への標的化剤を含有する本発明の粒子状実体並びに、１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００７８】
１つの具体的な実施態様において、本発明は、粒子状実体を、前の節に記載の少なくとも以下の３つの成分
−  ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物、
−  場合により、１つ以上の抗原決定基（群）、
−  樹状細胞、好ましくは特にＢＤＣＡ３＋樹状細胞への標的化剤
と共に含む医薬組成物に関し、該組成物は、該抗原に対する免疫応答を誘導することができる。
【００７９】
本発明の組成物は、免疫刺激を必要とする（例えば、感染症、癌及び／又はアレルギー疾患を治療又は予防するために）個体への投与に特に有用であり、有効量の本発明による粒子状実体、例えば、前の節に記載されたナノ粒子又はコンジュゲートを含む。
【００８０】
本発明の組成物は、１つ以上の生理学的に許容される賦形剤を使用して製剤化され得る。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、無菌等張水性緩衝液など及びその組合せである。さらに、所望であれば、製剤はまた、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、免疫刺激剤、又は、医薬組成物若しくはワクチンの効力を増強させる他のアジュバントを含み得る。非経口及び経口薬物送達のための賦形剤並びに製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences 19th Ed. Mack Publishing (1995)に示されている。
【００８１】
例えば、本発明のワクチン及び医薬組成物は、経皮送達による、又は経粘膜送達による（経口、頬側、鼻腔内、眼内、膣内、直腸内、脳内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下経路を含むがこれらに限定されない）、吸入による、又は任意の他の標準的な免疫化経路による投与のために製剤化される。
【００８２】
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、非経口送達のために、すなわち、静脈内（i.v.）、皮下（s.c.）、腹腔内（i.p.）、筋肉内（i.m.）、皮下（s.d.）又は皮内による送達のために製剤化され得る。
【００８３】
特定の投与計画、すなわち、投与量、タイミング及び反復は、特定の個体及びその個々の病歴に依存する。
【００８４】
本発明はまた、医薬組成物又はワクチン組成物の調製のための、以下の１つ以上の成分で充填された１つ以上の容器を含むキットに関する：
−  ｉＮＫＴ細胞アゴニスト、例えばα−ＧａｌＣｅｒ化合物、
−  樹状細胞、好ましくはＢＤＣＡ３＋樹状細胞への標的化剤、
−  場合により、１つ以上の抗原決定基（群）、
−  １つ以上の生理学的に許容される担体又は賦形剤、
−  場合により、１つ以上の補助物質。
【００８５】
本発明によるキット又は組成物には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の注意書き、及び／又は、ワクチン又は医薬組成物をすぐに使用できるように調製する方法に関する説明書が添付されていてもよい。
【００８６】
ワクチン組成物において、該組成物はさらに、他の適切なアジュバント又は賦形剤を含み得る。
【００８７】
使用法
本発明の粒子状実体及び医薬組成物は、例えば、様々な感染症を防ぎ、及び／又は処置するのに、或いは、腫瘍又は癌を治療又は予防するのに有用である。
【００８８】
本明細書において使用される「処置する」という用語は、このような疾患を患う被験者における、疾患の少なくとも１つの症状を予防、低減、寛解、又は抑制することを意味する。
【００８９】
例えば、本発明の粒子状実体及び／又は医薬組成物は、ウイルス感染（例えばインフルエンザウイルス、白血病ウイルス、免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ポックスウイルス、ムンプスウイルス、サイトメガロウイルス［ＣＭＶ］、エプシュタイン・バーウイルス）、細菌感染（例えばブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、淋菌、ボレリア、シュードモナスなど）、及び真菌感染（例えばカンジダ、アスペルギルス属、白癬菌、ピチロスポルムなど）を治療又は予防するために使用され得る。
【００９０】
本発明の粒子状実体及び／又は医薬組成物は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、メラノーマ、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓（kidney）癌、腎臓（renal）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肉腫、血液系の癌（白血病）、星状細胞腫、及び頭頸部癌を含むがこれらに限定されない、腫瘍又は癌を治療又は予防するのに使用され得る。
【００９１】
例えば、本発明は、癌、感染症、並びに／又は炎症疾患（例えば喘息）及び自己免疫疾患を患う被験者を処置する方法に関し、該方法は、該被験者に、治療有効量の本発明の粒子状実体又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００９２】
より具体的には、本発明の粒子状実体及び／又は医薬組成物は、癌、感染症、炎症疾患（例えば喘息）及び自己免疫疾患を処置するのに使用され得る。
【００９３】
以下において、本発明は、以下の実施例及び図面を用いて説明されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞の初回活性化のために、及びｉＮＫＴ細胞アネルギーの防止のために重要である。（Ａ）トランスジェニックＣＤ１１ｃ．ＤＴＲマウスに、ＰＢＳ又はＤＴを注射し、２４時間後にα−ＧａｌＣｅｒを接種した（１００ng／マウス）。（Ｂ）脾臓ＤＣをＣＤ１１ｃ発現に基づいて選別し、α-ＧａｌＣｅｒ（２５ng／ml）を用いて２時間かけて感作した。その後、マウスに、α−ＧａｌＣｅｒ感作ＤＣ又は遊離α−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）を注射した。Ａ及びＢ、マウスを、α−ＧａｌＣｅｒ（Ａ及びＢ）又はＤＣ／α−ＧａｌＣｅｒ（Ｂ）の接種（初回活性化、灰色）から３時間後に安楽死させたか、又は２回目のα−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）の静脈内注射を７日後に受けた（リコール応答、黒色）。これらの後者の群においては、動物をα−ＧａｌＣｅｒによるチャレンジから３時間後に屠殺した。その後、脾臓ｉＮＫＴ細胞を細胞内ＩＦＮ−γの産生について分析した。２回の（Ａ）又は３回の（Ｂ）の中１つの実験が代表として示されている（平均値±ＳＤ）（ｎ＝４）。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図２】ＣＤ８α＋及びＣＤ８α−ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞を活性化するその能力において異なる。Ａ、Ｂ及びＣ、マウスに、α−ＧａｌＣｅｒ（２μg）を静脈内注射した。２時間後、脾臓ＣＤ８α＋及びＣＤ８α−ＤＣを、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ８の発現に基づいて選別し（Ａ）、選別されたＮＫＴ細胞（Ｂ）と共に、又は抗原提示の読み出し情報としてのα−ＧａｌＣｅｒ応答性ＩＬ−２産生ｉＮＫＴ細胞ハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３（Ｃ）と共に培養した。Ｂ及びＣ、サイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって定量した。結果は、４回の実験の平均値±ＳＤを示す。Ｄ、ＣＤ８α＋及びＣＤ８α−ＤＣ上のＣＤ１ｄ発現をフローサイトメトリーによって評価した。アイソタイプ対照を用いての染色は、両方のＤＣサブセットにおいて同一であった。３回の中１つの実験が代表として示されている。Ｅ、レシピエントマウスに、Ｃｙ５のコンジュゲートしたα−ＧａｌＣｅｒ、又は対照としてのコンジュゲートしていないα−ＧａｌＣｅｒ（２０μg）を静脈内注射し、ＣＤ８α＋ＤＣ（灰色）及びＣＤ８α−ＤＣ（黒色）によるＣｙ５の取り込みを２時間後にフローサイトメトリーによって分析した。２回の独立した実験の中の代表的なヒストグラムが示されている。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図３】ＮＰ／ＤＥＣ２０５へのα−ＧａｌＣｅｒの封入はＣＤ８α＋ＤＣをターゲティングし、インビトロにおいてｉＮＫＴ細胞を効率的に活性化する。Ａ、ＢＭ−ＤＣ（５×１０５個の細胞／ウェル）を、抗ＤＥＣ２０５抗体（ＮＰ／ＤＥＣ２０５）又はアイソタイプ対照（ＮＰ／ＩｇＧ）抗体を備えたＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＰＬＧＡ粒子の存在下又は非存在下で２時間曝露し、洗浄し、抗ＣＤ１１ｃ抗体及び抗ＤＥＣ２０５抗体を用いて標識した。その後、ＤＥＣ２０５＋及びＤＥＣ２０５−ＢＭ−ＤＣにおけるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識をフローサイトメトリーによって評価した。２回中１回の実験の代表的なヒストグラムが示されている。Ｂ、脾臓ＭＮＣ（１×１０６個の細胞／ウェル）を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識ＮＰ／ＤＥＣ２０５又はＮＰ／ＩｇＧの存在下又は非存在下で２時間インキュベートした。その後、ＣＤ８α−及びＣＤ８α＋ＤＣ集団を、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ８の発現に基づいて区別し、フローサイトメトリーによって分析した。示されているのは、２回の独立した実験（ｎ＝４）のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７陽性ＤＣの代表的なヒストグラム（左パネル）及び平均比率±ＳＤ（右パネル）である。特に、ＮＰ／ＩｇＧを脾臓細胞と共にインキュベートした場合に、２つのＤＣサブセット間に差異は観察されなかった。Ｃ、ＢＭ−ＤＣ（１×１０５個の細胞／ウェル）を、ｉＮＫＴ細胞ハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３（１×１０５個の細胞／ウェル）と共に様々な用量の遊離α−ＧａｌＣｅｒ又はＮＰ／ＤＥＣ２０５若しくはＮＰ／ＩｇＧにベクター化されたα−ＧａｌＣｅｒの存在下で２４時間共培養した。特に、ＢＭ−ＤＣのみとインキュベートした場合、α−ＧａｌＣｅｒのローディングされた又はローディングされていないＮＰ／ＤＥＣ２０５及びＮＰ／ＩｇＧは、ＤＣの成熟を誘導できなかった（示されていない）。Ｄ、ＷＴ及びＣＤ１ｄ−/−マウスからのＢＭ由来ＤＣを、ＤＮ３２．Ｄ３と共に、遊離又はベクター化α−ＧａｌＣｅｒ（２５ng/ml）の存在下で２４時間培養した。Ｃ及びＤ、ＩＬ−２の産生は、ＥＬＩＳＡによって定量された。データは、４回（Ｃ）及び３回（Ｄ）の独立した実験の平均値±ＳＤを示す。Ｂ−Ｄ、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図４】ＮＰ／ＤＥＣ２０５へのα−ＧａｌＣｅｒの封入は、インビボにおいてｉＮＫＴ細胞を効率的に活性化する。マウスに、ＰＢＳのみ、或いは、遊離可溶形又はＮＰ／ＤＥＣ２０５若しくはＮＰ／ＩｇＧに封入されたα−ＧａｌＣｅｒ（５ngのα−ＧａｌＣｅｒ／マウス）を静脈内注射した。Ａ、３時間後、マウスから採血し、脾臓ｉＮＫＴ細胞（ＴＣＲβ＋ＰＢＳ５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマー＋）を細胞内ＩＦＮ−γ産生についてスクリーニングした（左パネル）。ＩＦＮ−γについて陽性のｉＮＫＴ細胞の平均比率±ＳＤが示されている。血清中のＩＬ−４の産生を、ＥＬＩＳＡによって定量した（右パネル）（ｎ＝３〜８）。Ｂ、トランスジェニックＣＤ１１ｃ．ＤＴＲマウスに、ＰＢＳ又はＤＴを注射し、２４時間後にＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒ（５ng／マウス）を接種した。ＩＦＮ−γ＋ｉＮＫＴ細胞の出現頻度±ＳＤが示されている（ｎ＝３）。Ｃ、ＩＦＮ−γ＋ＮＫ細胞（ＣＤ３ε−ＮＫ１．１＋）及びγδＴリンパ球（ＣＤ３ε＋ＴＣＲγδ＋）の出現頻度±ＳＤが示されている（刺激から４時間後）。ＤＣ（ＤＣ１１ｃｈｉ）によるＣＤ８６の発現（平均蛍光強度として表現）が示されている。２回の中の代表的な実験（平均値±ＳＤ）が示されている（ｎ＝４）。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図５】ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのターゲティングは、インビボにおいてｉＮＫＴ細胞アネルギーを防ぐ。マウスに、ＰＢＳ、遊離α−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）、又はＮＰ／ＤＥＣ２０５若しくはＮＰ／ＩｇＧに封入されたα−ＧａｌＣｅｒ（５ng／マウス）を静脈内注射した。Ａ、３時間後、マウスから採血し、脾臓ｉＮＫＴ細胞を細胞内ＩＦＮ−γ産生についてスクリーニングした。ＩＦＮ−γについて陽性のｉＮＫＴ細胞の平均比率±ＳＤが示されている（左パネル）。血清中のＩＬ−４の産生をＥＬＩＳＡによって定量した（右パネル）。Ｂ、マウスは７日後に遊離α−ＧａｌＣｅｒ（１００ng/ml）の２回目の注射を受け、脾臓ｉＮＫＴ細胞を細胞内ＩＦＮ−γ産生について３時間後にスクリーニングした。特に、７日前にＮＰ／ＩｇＧ／α−ＧａｌＣｅｒで処置されたマウスは、α−ＧａｌＣｅｒでチャレンジされた場合にＩＦＮ−γを産生した。これは、使用された用量において、ＮＰ／ＩｇＧ／α−ＧａｌＣｅｒが初期ｉＮＫＴ細胞活性化をトリガーできなかったという事実と一致する（図４Ａ）。２回の中の代表的な実験が示されている（平均値±ＳＤ）（ｎ＝３）。Ｃ、ＰＤ−１を発現しているｉＮＫＴ細胞の比率±ＳＤが示されている（α−ＧａｌＣｅｒによる刺激から７日後）。２回の中の代表的な実験が示されている（ｎ＝４）。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図６】ＮＰ／ＤＥＣ２０５へのα−ＧａｌＣｅｒ及びＯＶＡの共封入は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び抗体応答を増強させる。Ａ、ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ細胞が以前に注射されたマウスに、遊離又はＮＰ／ＩｇＧ若しくはＮＰ／ＤＥＣ２０５に共封入されたα−ＧａｌＣｅｒ（５ng／マウス）及びＯＶＡ（２５０ng／マウス）を皮下接種した。３日後、膝窩リンパ節におけるＣＦＳＥ標識Ｖα２ＴＣＲ＋ＣＤ８α＋の増殖を、フローサイトメトリーによって決定した（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）。Ｂ、免疫化から６日後、マウスに、ＣＦＳＥ標識ＳＩＩＮＦＥＫＬで刺激された脾臓細胞（標的）及びＰＫＨ２６で標識された刺激されていない脾臓細胞（対照）を移植した。データは、比溶解率±ＳＥＭを示す（ｎ＝６〜８）。Ｃ及びＤ、マウスに、遊離又はＮＰ／ＩｇＧ若しくはＮＰ／ＤＥＣ２０５に共封入されたα−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）及びＯＶＡ（５μg／マウス）を２回（０日目及び２１日目）注射した。Ｃ、脾臓細胞を、２か月後にＳＩＩＮＦＥＫＬ（１０μg/ml）を用いて４８時間かけて再刺激し、上清中のＩＦＮ−γ産生を定量した（平均値±ＳＤ、ｎ＝５）。Ｄ、血液を２８日目に採取し、抗ＯＶＡＩｇＧ力価を決定した（平均値±ＳＤ、ｎ＝７〜９）。２回の中の１回の代表的な実験が示されている。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【図７】Ａ及びＢ、ＣＦＳＥ標識ＯＴ−Ｉ細胞（５×１０６個の細胞／マウス）が以前に注射されたマウスに、遊離又はＮＰ／ＩｇＧ若しくはＮＰ／ＤＥＣ２０５に共封入されたα−ＧａｌＣｅｒ（５ng／マウス）及びＯＶＡ（２５０ng／マウス）を皮下接種した。Ａ、３日後、膝窩リンパ節におけるＣＦＳＥ標識Ｖα２ＴＣＲ＋ＣＤ８α＋の増殖をフローサイトメトリーによって決定した。Ｂ、膝窩ＬＮ細胞を、ＭＨＣクラスＩ拘束ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを用いて再刺激し、Ｖα２ＴＣＲ＋ＣＤ８α＋によるＩＦＮ−γの発現を、細胞内ＦＡＣＳ染色によって１８時間後に評価した。２回の独立した実験の中の代表的なヒストグラム（Ａ）及びドットプロット（Ｂ）が示されている。
【図８】ＮＰ／ＤＥＣ２０５へのα−ＧａｌＣｅｒ及びＯＶＡの共封入は、強力な抗腫瘍応答をトリガーする。マウスに、ＮＰ／ＤＥＣ２０５又はＮＰ／ＩｇＧにベクター化されたα−ＧａｌＣｅｒ（２０ng）及びＯＶＡ（１μg）を注射し、７日後、動物に、ＯＶＡを発現するＢ１６Ｆ１０細胞を静脈内注射した。遊離α−ＧａｌＣｅｒ（２００ng／マウス）及びＯＶＡ（１０μg／マウス）の注射されたマウスを陽性対照として使用した。Ｂ１６Ｆ１０結節の平均数±ＳＥＭが示されている（ｎ＝５）。２回の中の１回の代表的な実験が示されている。＊Ｐ＜０．０５。
【００９５】
実施例
材料及び方法
マウス
６〜８週令の雄の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Janvier (Le Genest-St-Isle, France)から、ＲＡＧ２−/− ｘ ＯＴＩは、Jackson laboratory (St. Germain sur l'Arbresle, France)から購入した。ＣＤ１ｄ−/−及びＣＤ１１ｃ−ＤＴＲマウスの作製はすでに記載されている２７，２８。マウスを、本発明者ら自身の施設で病原体を含まない条件で飼育した。動物は、パスツール研究所の動物管理使用委員会の指針に沿って取扱い及び飼った。
【００９６】
試薬及び抗体
α−ＧａｌＣｅｒは、以前に記載のように合成された（５１）。Vybrant CFDA SE Cell Tracer KitはLife technologies（St Aubin, France）から購入した。ＰＫＨ−２６標識キット及びオボアルブミン（ＯＶＡ）はSigma-Aldrich（St Quentin-Fallavier, France）から購入した。シアニン（Ｃｙ）５にコンジュゲートしたα−ＧａｌＣｅｒは記載のように合成された２９。マウスＣＤ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６に対するＡＰＣにコンジュゲートしたモノクローナル抗体、ＰＥにコンジュゲートした抗ＮＫ１．１抗体、抗ＴＣＲγδ抗体、ＦＩＴＣにコンジュゲートした抗ＣＤ８α抗体、抗ＴＣＲβ抗体、抗ＣＤ３ε抗体、ＰｅｒＣｐＣｙ５．５にコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂ抗体、ｅＦｌｕｏｒ４５０にコンジュゲートした抗Ｖα２ ＴＣＲ抗体、ＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ８α抗体、抗ＰＤ−１抗体、ビオチンにコンジュゲートした抗ＣＤ１ｄ抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００にコンジュゲートしたストレプトアビジン、及びアイソタイプ対照は、BD Pharmingen (Le Pont de Claix, France)又はOzyme/Biolegend (Saint-Quentin-en-Yvelines, France)から購入した。ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０抗ＣＤ２０５抗体はeBioscience (Paris, France)から購入した。ＩＦＮ−γ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７のコンジュゲートした）及びアイソタイプ対照は全てOzyme/Biolegendから購入した。ＰＥにコンジュゲートしたＰＢＳ−５７糖脂質のローディングされたＣＤ１ｄテトラマーはNIAID Tetramer Facility (Emory University, Atlanta, GA)製であった。ＮＰに備えるために使用された抗ＤＥＣ２０５抗体（ＣＤ２０５）及びアイソタイプ対照（ＩｇＧ２ｂ）抗体は、BIO-X-CELL (West Lebanon, NH)製であった。
【００９７】
ＰＬＧＡをベースとした粒子の調製及びキャラクタリゼーション
脂質−ＰＥＧでコーティングされかつ抗体を担持するナノ粒子は、前記されているように乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）を使用して作製された３０、３１。簡潔に言えば、エンドトキシンを含まないＯＶＡ（５mg、Sigma-Aldrich）及び／又はα−ＧａｌＣｅｒ（５０μg）を、ＰＬＧＡ１００mgに封入した。抗ＤＥＣ２０５抗体及びそのアイソタイプ対照を、以前に記載のように脂質−ＰＥＧ層に付着させた３０。粒子表面上の抗体の存在は、クーマシー色素タンパク質アッセイによって決定された（表１）。ＰＬＧＡ ＮＰは、動的光散乱及びゼータ電位によってキャラクタライズされた（表１）。
【００９８】
【表１】
0006456306.tif 000002
【００９９】
表１：ナノ粒子は、動的光散乱及びゼータ電位の測定によってキャラクタライズされた。ナノ粒子サイズのデータは、動的光散乱の測定の１０回の測定値の平均値±ＳＤを示す３０，３１。ゼータ電位データは、５回の測定値の平均値±ＳＤを示す。ＮＰの内部に封入されたＯＶＡ抗原の量は、クーマシー色素タンパク質アッセイによって決定され、２回の実験の平均値±ＳＤとして示される。ＮＰへのＫＲＮの取り込みは、その疎水性に因り完全であった。ＮＰに導入された抗体の量は、クーマシープラスタンパク質アッセイ試薬（Pierce）によって決定された。
【０１００】
ＤＣ及びＤＣ−ｉＮＫＴ共培養液によるＮＰ取り込みの分析
ＤＣがＰＬＧＡをベースとしたＮＰに結合／取り込む能力を評価するために、骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ）（５×１０５個の細胞／ウェル）３２又は脾臓単核細胞（ＭＮＣ）（１×１０６個の細胞／ウェル）を、３７℃で２時間、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で標識された粒子（それぞれ１０μg/ml及び１００μg/ml）に曝した。十分に洗浄した後、ＢＭ−ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＤＥＣ２０５＋/−）及び脾臓ＣＤ８α＋及びＣＤ８α−ＤＣをフローサイトメトリーによって分析した。ＢＭ−ＤＣ（１×１０５個の細胞／ウェル）を、ｉＮＫＴ細胞ハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３（１×１０５個の細胞／ウェル）と共に、段階付をした用量の遊離又は封入されたα−ＧａｌＣｅｒの存在下で２４時間共培養した。ＣＤ８α＋及びＣＤ８α−ＤＣのエクスビボにおける刺激能を試験するために、マウスに、α−ＧａｌＣｅｒ ２μgを静脈内注射し、２時間後、ＤＣサブセットをＦＡＣＳＡｒｉａ（Becton Dickinson, MD, USA）を使用して選別し、選別された肝ＮＫＴ細胞（ＣＤ５＋ＮＫ１．１＋細胞、純度は９８％超）又はＤＮ３２．Ｄ３（１×１０５個の細胞／ウェル）と共にそれぞれ４８時間及び２４時間共培養した。培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−２の産生を、ＥＬＩＳＡ（R&D systems）によって測定した。
【０１０１】
ＦＡＣＳ分析
細胞を、抗体の適切な組合せ中に再懸濁することにより、ＤＣサブセット（抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ８α抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体）、ｉＮＫＴ細胞（抗ＴＣＲβ抗体、ＰＢＳ−５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマー）、ＮＫ細胞（抗ＣＤ３ε抗体、抗ＮＫ１．１抗体）、又はγδＴリンパ球（抗ＴＣＲγδ抗体、抗ＣＤ３ε抗体）の同定を可能とした。その後、抗ＰＤ−１抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ１ｄ抗体、又はアイソタイプ対照を必要である場合には加えた。細胞内ＩＦＮ−γの発現を以前に記載されているように分析した３２。脾臓ＤＣサブセットによるＣｙ５−α−ＧａｌＣｅｒ取り込みを測定するために、マウスに、Ｃｙ５にコンジュゲートしたα−ＧａｌＣｅｒ（２０μg）を静脈内注射し、２時間後、脾臓ＤＣサブセットによるＣｙ５の取り込みをフローサイトメトリーによって分析した。
【０１０２】
インビボにおけるｉＮＫＴ細胞活性化及びアネルギーにおけるＤＣの役割
マウスに、５ngの遊離（又は対照として１００ng）又は封入されたα−ＧａｌＣｅｒを含有するＰＢＳ２００μlを静脈内投与した。ＣＤ１１ｃ−ＤＴＲマウスには、記載のように２７、α−ＧａｌＣｅｒ投与の２４時間前に、ジフテリア毒素（ＤＴ）を注射した。脾臓ＤＣを選別し（ＣＤ１１ｃ＋細胞）、２５ng/mlのα-ＧａｌＣｅｒを用いて感作し、マウスに静脈内注射した。リコール応答を分析するために、マウスは１週間後に遊離α−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）の２回目の静脈内注射を受けた。動物から採血し、処置から３時間後に屠殺した。脾臓ｉＮＫＴ細胞を、細胞内ＩＦＮ−γ発現について分析し、血清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０１０３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞及び抗体応答の分析
マウスは、ＲＡＧ２−／−ｘＯＴ−Ｉマウスから精製された５×１０６個のＣＦＳＥで標識されＯＶＡ特異的であるＣＤ８＋Ｔ細胞を受けた。１日後、マウスの足蹠に、α−ＧａｌＣｅｒ（５ng／マウス）及びＯＶＡ（２５０ng／マウス）の両方を含有するＮＰを、又は、同量の遊離α−ＧａｌＣｅｒ及びＯＶＡを注射した。３日後、膝窩リンパ節（ＬＮ）におけるＣＦＳＥ標識細胞の増殖をフローサイトメトリーによって測定した。Ｖα２ ＴＣＲ＋ＣＤ８α＋細胞によるＩＦＮ−γの発現を、膝窩ＬＮ細胞をＭＨＣクラスＩ拘束ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（１０μg/ml）でインビトロで１８時間かけて再刺激した後に決定した。インビボにおけるＣＴＬアッセイのために、マウス動物に、ＮＰを用いての免疫化から６日後に、ＣＦＳＥ標識ＳＩＩＮＦＥＫＬで刺激された脾臓細胞及びＰＫＨ−２６で標識された刺激されていない脾臓細胞（２×１０７個の細胞／マウス）の混合物を静脈内注射した。脾臓を２日後に収集し、ＣＦＳＥ及びＰＫＨ−２６で標識された細胞の数を、フローサイトメトリーによって決定した。特異的溶解率を、以下のように決定した：［１−（刺激されていない割合／刺激された割合）］×１００（式中、割合は、ＰＨＫ−２６で標識された細胞／ＣＦＳＥで標識された細胞の数に等しい）。体液性応答及び記憶Ｔ細胞応答を分析するために、マウスに、遊離又はＮＰに共封入されたα−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）及びＯＶＡ（５μg／マウス）を２回（０日目及び２１日目）静脈内注射した。血液を２８日目に採取し、抗ＯＶＡ全ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡによって決定した。脾臓ＭＮＣを、２回目の免疫化から２か月後に調製し、ＳＩＩＮＦＥＫＬを用いて４８時間インビトロで再刺激した。
【０１０４】
Ｂ１６Ｆ１０肺転移モデル
マウスに、遊離又はベクター化ＯＶＡ及びα−ＧａｌＣｅｒの接種から７日後にＯＶＡを発現している２．５×１０５個のＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を注射した。マウスを１８日目に殺滅し、肺転移を顕微鏡を用いて計数した。
【０１０５】
統計
結果は、平均値±ＳＤ又はＳＥＭとして表現される。実験群間の差の統計学的有意性は、対応のないスチューデント両側ｔ検定によって計算された（GraphPad Prism 4 software, San Diego, CA）。０．０５未満のｐ値を有する結果を有意と判断した。
【０１０６】
結果
樹状細胞は、インビボにおいてアネルギーを誘導することなく、ｉＮＫＴ細胞を効率的に活性化する
本発明者らはまず、トランスジェニックＣＤ１１ｃ．ＤＴＲマウスを使用して、初回及び二次ｉＮＫＴ応答に対するＤＣ枯渇の結果を調べた。ＤＴによる処置は脾臓ＤＣを枯渇させ（データは示されていない）、ＩＦＮ−γ陽性ｉＮＫＴ細胞の出現頻度の減少によって（図１Ａ）及び血清中のサイトカインの早期放出の減少によって（示されていない）例証されるように、初回ｉＮＫＴ細胞活性化の程度を強く低下させた。ＤＣコンピテント動物においては、ｉＮＫＴ細胞は、α−ＧａｌＣｅｒによる再刺激時にＩＦＮ−γを産生する能力の低下を示したが、リコール応答は、初回ｉＮＫＴ細胞刺激時にＤＣが欠失していた場合には、完全に鈍っていた（図１Ａ）。この効果は、脾臓においてＤＣの再増殖異常に起因するものではなかった（データは示されていない）。さらに、α−ＧａｌＣｅｒを経験していない動物においては、この新規に再増殖したＤＣ集団は、α−ＧａｌＣｅｒ接種後早期にｉＮＫＴ細胞応答を促進することができた（データは示されていない）。総合すると、初期ｉＮＫＴ細胞活性化時におけるＤＣの欠失により、顕著なｉＮＫＴ細胞の無応答性がもたらされ、これによりＤＣは、α−ＧａｌＣｅｒによる反復チャレンジ時のｉＮＫＴ細胞応答の正の制御因子ということになる。この所見を確認するために、本発明者らは、ＤＣによるｉＮＫＴ細胞の初期活性化がｉＮＫＴ細胞アネルギーを防ぐことができるかどうかを調べた。本発明者らの実験条件においては、遊離α−ＧａｌＣｅｒ及びインビトロでα−ＧａｌＣｅｒのローディングされたＤＣは、同じようなｉＮＫＴ細胞の初期活性化をトリガーした（図１Ｂ）。注目すべきことに、遊離α−ＧａｌＣｅｒは、予想されたｉＮＫＴ細胞アネルギーを誘導したが、α−ＧａｌＣｅｒのローディングされたＤＣが以前に接種されたマウスからのｉＮＫＴ細胞は、再活性化する能力を維持していた。特に、遊離α−ＧａｌＣｅｒは、ｉＮＫＴ細胞アネルギーを引き起こす阻害分子である、ｉＮＫＴ細胞上のＰＤ−１の増強された発現を誘導したが３３〜３５、α−ＧａｌＣｅｒのローディングされたＤＣは誘導しなかった（データは示されていない）。従って、ＤＣによるα−ＧａｌＣｅｒの提示により、その後のチャレンジ時にアネルギーを誘導することなくｉＮＫＴ細胞活性化がもたらされる。
【０１０７】
インビボにおいてα−ＧａｌＣｅｒのローディングされた脾臓ＣＤ８α＋ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞を強力に活性化する
その後、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞の活性化におけるＣＤ８α−及びＣＤ８α＋ＤＣサブセットのそれぞれの役割を調べた。この問題に取り組むために、マウスにα−ＧａｌＣｅｒを接種し、２時間後、脾臓ＣＤ８α−及びＣＤ８α＋ＤＣを精製し（図２Ａ）、ＮＫＴ細胞と共に培養した。ＣＤ８α−ＤＣと比べて、ＣＤ８α＋ＤＣは、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のはるかにより強力な分泌を促進した（図２Ｂ）。同様に、ＣＤ８α＋ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞ハイブリドーマＤＮ３２．Ｄ３によるより高いＩＬ−２の産生をトリガーしたが、その活性化は、ＣＤ１ｄ／抗原により媒介されるＴＣＲトリガーのみに依存する（図２Ｃ）。フローサイトメトリー分析は、ＣＤ８α−ＤＣと比べて脾臓ＣＤ８α＋ＤＣ上でのより高度なＣＤ１ｄの発現を明らかにした（図２Ｄ）。この差異はα−ＧａｌＣｅｒのインビボにおける取り込みの相違にも起因し得るという可能性を調べるために、Ｃｙ５のコンジュゲートしたα−ＧａｌＣｅｒを投与した。ＣＤ８α−ＤＣと比べて、Ｃｙ５のコンジュゲートしたα−ＧａｌＣｅｒの取り込み率は、ＣＤ８α＋ＤＣにおいてより重要であった（図２Ｅ）。逆に、脾臓細胞を、Ｃｙ５のコンジュゲートしたα−ＧａｌＣｅｒにインビトロで曝すと、ＣＤ８α−及びＣＤ８α＋ＤＣの両方による同等の取り込みが行なわれた（データは示されていない）。まとめると、遊離α−ＧａｌＣｅｒの全身接種時に、ＣＤ８α＋ＤＣはｉＮＫＴ細胞の強力な活性化因子である。
【０１０８】
ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒの送達は、インビトロ及びインビボにおいてｉＮＫＴ細胞活性化を改善する
エンドサイトーシスＣ型レクチン受容体ＤＥＣ２０５は、脾臓及びＬＮのＣＤ８α＋ＤＣの細胞表面上に発現されている３６。本発明者らはこの特性を利用して、α−ＧａｌＣｅｒをＣＤ８α＋ＤＣにターゲティングした。そのために、本発明者らは、ＤＥＣ２０５を認識する抗体でコーティングされたＰＬＧＡをベースとしたＮＰ（ＮＰ／ＤＥＣ２０５）中にα−ＧａｌＣｅｒを製剤化した（ＮＰの物理的及び生化学的な特徴については、表１を参照されたい）。図３Ａが示すように、ＤＥＣ２０５＋ＢＭ−ＤＣは、ＤＥＣ２０５−ＢＭ−ＤＣとは対照的に、ここで陰性対照として使用されたＮＰ／ＩｇＧと比べて、ＮＰ／ＤＥＣ２０５を取り込んだ（図３Ａ）。より重要なことには、脾臓細胞と共にインキュベートした場合、ＣＤ８α＋ＤＣは、ＣＤ８α−ＤＣと比べてＮＰ／ＤＥＣ２０５をより効率的に取り込んだ（図３Ｂ）。その後、本発明者らは製剤の生物学的活性を比較した。段階付をした用量のＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒと共にインキュベートされたＢＭ−ＤＣは、遊離のベクター化されていないα−ＧａｌＣｅｒと比較して、特にＮＰ／ＩｇＧ／α−ＧａｌＣｅｒと比較して、より高度にｉＮＫＴ細胞活性化をトリガーした（図３Ｃ）。図３Ｄに示されているように、効果はＣＤ１ｄに依存的であった。これらのデータは、まとめると、ＮＰ／ＤＥＣ２０５へのα−ＧａｌＣｅｒの封入は、ＣＤ８α＋ＤＣを選択的にターゲティングし、インビトロにおいてｉＮＫＴ細胞を効率的に活性化することを示す。
【０１０９】
インビボにおいて、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒは、遊離Ｇａｌ−Ｃｅｒと比較して、特にＮＰ／ＩｇＧ／α−ＧａｌＣｅｒ（５ngのα−ＧａｌＣｅｒ／マウス）と比較して、より高度にｉＮＫＴ細胞活性化を促進した（図４Ａ）。特に、ＤＣ枯渇は、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒ投与後に強力にｉＮＫＴ細胞活性化を低減させた（図４Ｂ）。ｉＮＫＴ細胞の初期活性化により、ＮＫ細胞、γδＴ細胞及びＤＣをはじめとする他の細胞型のトランス活性化が起こる７，３７。図４Ｃに示されているように、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒは、遊離α−ＧａｌＣｅｒと比較して、ＮＫ細胞及びγδＴ細胞によるより高いレベルのＩＦＮ−γ産生を誘導した。より低い程度で、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒは、ＤＣによるより高いレベルのＣＤ８６発現をトリガーした。従って、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのインビボでの送達は、自然免疫細胞のｉＮＫＴ細胞をベースとしたトランス活性化をトリガーするのに特に強力である。
【０１１０】
ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのターゲティングは、インビボにおいてｉＮＫＴ細胞アネルギーを防ぐ
ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのインビボにおける送達は、ｉＮＫＴ細胞の初期活性化を増強することが確立されたので、本発明者らは次に、リコール応答時のその応答性に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。この問題に取り組むために、マウスに、ＮＰ／ＤＥＣ２０５に封入された低用量のα−ＧａｌＣｅｒ（５ng／マウス）又は高用量の遊離α−ＧａｌＣｅｒ（１００ng／マウス）のいずれかを注射し、両方共に、同等な初期ｉＮＫＴ細胞活性化をもたらした（図５Ａ）。注目すべきことに、遊離α−ＧａｌＣｅｒはｉＮＫＴ細胞アネルギーを誘導したが、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒは誘導しなかった（図５Ｂ）。この条件において、ＩＦＮ−γ陽性ｉＮＫＴ細胞の出現頻度は、高用量のα−ＧａｌＣｅｒを１回注射された動物と同等であったことが注目に値する。最後に、遊離α−ＧａｌＣｅｒはｉＮＫＴ細胞上でＰＤ−１の発現を誘導したが、これは、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒ投与後には当てはまらなかった（図５Ｃ）。まとめると、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのインビボにおける送達はｉＮＫＴ細胞アネルギーを防ぐ。
【０１１１】
ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒ及びＯＶＡの共送達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び抗体応答を最適化する
マウスにおける数多くの研究が、ＤＥＣ２０５を介して抗原をＣＤ８α＋ＤＣにターゲティングする利点、特に、抗原交差提示を促進し、ＣＤ８Ｔ細胞を刺激する利点を示した３８，３９。α−ＧａｌＣｅｒと抗原とを互いに近接させた状態でＣＤ８α＋ＤＣにターゲティングする効果は、依然として調査されていない。それをするために、ＣＦＳＥで標識されたＯＴ−Ｉ細胞で再構成されたマウスに、α−ＧａｌＣｅｒ及びモデル抗原オボアルブミン（ＯＶＡ）の両方を含有するＮＰ／ＤＥＣ２０５を接種した。ＮＰ／ＤＥＣ２０５／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒは、ＮＰ／ＩｇＧ／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒを用いて又は可溶性α−ＧａｌＣｅｒとＯＶＡ、又はＯＶＡ単独を用いて接種されたマウスと比較して、ＯＶＡ特異的ＯＴ−Ｉ細胞のより高度な増殖を誘導した（図６Ａ及び図７）。さらに、インビトロにおけるペプチドによる再刺激時に、ＩＦＮ−γを発現しているＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の出現頻度は、他の動物群と比較して、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒを受けたマウスにおいてより高かった（図Ｓ１Ｂ）。ＮＰ／ＤＥＣ２０５／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒはまた、標的細胞溶解の測定によって評価したところ、より高い細胞障害性Ｔ細胞活性を惹起した（図６Ｂ）。最後に、最後の免疫化から２か月後のリコール応答は他の群においてはほぼ検出不可能であったが、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒを投与されたマウスは、長期間持続するＣＤ８＋Ｔ細胞記憶応答を示した（図６Ｃ）。ＤＥＣ２０５のターゲティングはまた、体液性応答も促進し得る４０，４１。
【０１１２】
実際に、ＯＶＡプラスα−ＧａｌＣｅｒと比較して、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒは、ＯＶＡ特異的ＩｇＧのより高い力価を促進した（図６Ｄ）。従って、ＯＶＡ及びα−ＧａｌＣｅｒを同じ粒子中で合わせて、ＤＥＣ２０５を介してＣＤ８α＋ＤＣをターゲティングすることは、細胞性及び体液性免疫応答を増強するのに明らかに利点がある。
【０１１３】
α−ＧａｌＣｅｒ及び抗原を取り込んだＮＰは、腫瘍の発症を防御する
腫瘍発症の制御に対するα−ＧａｌＣｅｒ及び抗原のベクター化の結果を調べるために、マウスにＮＰ／ＤＥＣ２０５／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒを用いてワクチン接種し、その後、ＯＶＡを発現しているＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞を接種した。陽性対照として、マウスは、高用量の遊離α−ＧａｌＣｅｒとＯＶＡ（１０倍以上）を受けた。図８が示しているように、ＮＰ／ＩｇＧ／ＯＶＡ／α−ＧａｌＣｅｒを受けているマウスと比較して、ワクチン接種を受けたマウスは、肺転移の発症から完全に防御された。
【０１１４】
考察
α−ＧａｌＣｅｒは、治療目的及びワクチン開発に対して非常に有望である強力な免疫刺激分子である１，２，７，４２。しかしながら、いくつかの懸念がその臨床使用を制限する。その中で、α−ＧａｌＣｅｒがターゲティングする細胞の性質が依然として不明であること、及び従ってそれが促進する制御不能の応答は、依然として大きな問題である。最も重要なことは、α−ＧａｌＣｅｒが誘導する顕著かつ長期なｉＮＫＴ細胞の不応答性であり、効果的な（例えば抗腫瘍）応答を発達させるため複数回の免疫学的な刺激を必要とする患者にとっては大きなハードルである２２，２４，２６，４３。ｉＮＫＴ細胞機能をよりうまく制御する可能性は、適切なＡＰＣ、例えばＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒの受動的又は能動的な送達に見出し得る。この戦略はまた、ｉＮＫＴ細胞性免疫応答の強度及び品質を増強させ得る。本発明者ら及び他の者は、ＰＬＧＡをベースとしたＮＰ３２若しくはリポソーム（データは示されていない）中にベクター化された又はウイルス様粒子４４に含まれたα−ＧａｌＣｅｒは、ｉＮＫＴ細胞を活性化したが、再刺激時にそのアネルギーを防ぐことができなかったことを示した。それ故、α−ＧａｌＣｅｒの制御された送達は、ｉＮＫＴ細胞応答を最適化するための必要条件である。本発明において、本発明者らは初めて、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒの特異的送達が、ｉＮＫＴ細胞の初期活性化を増強し、ｉＮＫＴ細胞アネルギーを回避するために役立つことを実証する。平行して、ＣＤ８α＋ＤＣ（同じＤＣであるようである）へのα−ＧａｌＣｅｒ及び抗原の共送達は、細胞性及び体液性免疫応答を非常に増幅(exacerbate)させる。
【０１１５】
データは、他の報告と一致して８〜１２、ＤＣは、ベクター化されていないα−ＧａｌＣｅｒの全身投与後のｉＮＫＴ細胞活性化の主要な(primary)開始因子であることを示した。脾臓からの樹状細胞は異種であり、近年の研究により、ＤＣサブセットは、ｉＮＫＴ細胞を刺激するその能力において異なり得ることが示唆された１８，２０，２９。例えば、ＣＤ８α−ＤＣサブセットの中で、ＣＤ４−ＤＣは、ＣＤ４＋ＤＣと比較して、ｉＮＫＴ細胞の活性化においてより効率的であったことが以前に報告されていた２９。インビボにおけるより高いα−ＧａｌＣｅｒ取り込み率及び増強したレベルの細胞表面ＣＤ１ｄと一致して、結果は、ＣＤ８α−ＤＣと比較して、ＣＤ８α＋ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞活性化の強力なトリガーであることを示す。大量のＣＤ８α＋ＤＣ及びｉＮＫＴ細胞が、脾臓の辺縁帯に共局在するという事実は１２，３６，４５，４６、このような観察と一致する。その後、免疫応答に対するＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒの送達の影響を調べた。ＮＰ／ＤＥＣ２０５は脾臓ＣＤ８α＋（ＤＥＣ２０５＋）ＤＣを特異的にターゲティングし、ＮＰ／ＤＥＣ２０５にベクター化されたα−ＧａｌＣｅｒは、ＣＤ１ｄ上にローディングされ得、かつ、ｉＮＫＴ細胞に提示され得、そしてｉＮＫＴ細胞を活性化し得る。重要なことには、ＮＰ／ＤＥＣ２０５／α−ＧａｌＣｅｒは、遊離α−ＧａｌＣｅｒ及びＮＰ／ＩｇＧ／α−ＧａｌＣｅｒと比較して、インビトロ及びインビボにおいてｉＮＫＴ細胞を活性化するのにはるかにより効率的であり、このプロセスはＤＣに依存していた（図４Ｂ）。増強されたｉＮＫＴ細胞応答は、おそらく、ＣＤ８α＋ＤＣによる、ＮＰの、従ってα−ＧａｌＣｅｒの、急速な取り込みに起因する。また、ＤＥＣ２０５により媒介されるＮＰの取り込みは、ＤＣのエンドソーム／リソソーム中で、ＣＤ１ｄ分子にα−ＧａｌＣｅｒが近づくことを促進するようである。興味深いことには、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒの送達はまた、ＮＫ、γδＴリンパ球及びＤＣのトランス活性化を増加させた。従って、ＤＥＣ２０５を通してのＣＤ８α＋ＤＣへのターゲティングは、ｉＮＫＴ細胞により媒介される自然免疫応答を最適化する。
【０１１６】
初期活性化後、ｉＮＫＴ細胞は、長期間持続する低応答性を発達させ、これによりα−ＧａｌＣｅｒへの反復曝露時の活性化を妨げる１１。ｉＮＫＴ細胞アネルギーにおけるＤＣによって果たされる可能性ある役割は依然として議論されている１０，１１，２３。２つの相補的な戦略を使用したところ（ＣＤ１１ｃ−ＤＴＲマウス及びＤＣ導入）、結果は、ＤＣによるα−ＧａｌＣｅｒの提示は（初期ｉＮＫＴ細胞活性化）、２回目の刺激後のｉＮＫＴ細胞アネルギーをもたらさないことを明瞭に示しているが、これは他の研究と一致する１０，１１。これと並行して、ＮＰ／ＤＥＣ２０５を用いてＣＤ８α＋ＤＣへとα−ＧａｌＣｅｒをターゲティングすることは、ｉＮＫＴ細胞非応答性を促進せず、このことは、二回目のｉＮＫＴ細胞活性化の維持にＤＣによって果たされる重要な役割を確認する。従って、α−ＧａｌＣｅｒのローディングされたＣＤ８α＋ＤＣは、ｉＮＫＴ細胞におけるＴＣＲシグナリングを効率的にトリガーするだけでなく（初回刺激）、チャレンジ後の二次活性化も維持する。初期ｉＮＫＴ細胞活性化の最中に、表面に結合した可溶性の共刺激及び／又は阻害性分子からの複数のシグナルが協奏して機能して、ｉＮＫＴ細胞応答を刺激及び微調整する。従って、ＣＤ１ｄに加えて、ＣＤ８α＋ＤＣは、ＣＤ１１ｃを発現していない細胞（例えばＢリンパ球）に存在しない追加のシグナルを与えることにより、二次ｉＮＫＴ細胞活性化を維持するようである。
【０１１７】
抗原及びアジュバントをＤＣ（ＣＤ８α＋ＤＣを含む）へと共送達することは、最適なＴ及びＢ細胞性免疫応答を誘導することが示された４７〜４９。ＤＣの特定のサブセットへのα−ＧａｌＣｅｒ及び抗原の共送達が免疫応答に影響を及ぼすかどうかは、依然として研究されていない。ＴＬＲアゴニストは、直接的なＤＣ成熟を誘導することによってアジュバント効果を発揮し、このプロセスは、抗原の取り込みを低下させるが、ナイーブＴ細胞を効率的に刺激するのに重要である。α−ＧａｌＣｅｒの場合、ＤＣ成熟は間接的であり、初回活性化後に産生されたｉＮＫＴ細胞因子に依拠する。ＴＬＲアゴニストと比較して、α−ＧａｌＣｅｒに応答したＤＣの遅延成熟は、ＤＣの抗原取り込み能を延長させ得、従って、増幅された免疫応答がもたらされ得る。本発明者らは、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒ及びＯＶＡの共送達は、非標的化形で与えられた同量のα−ＧａｌＣｅｒ及びＯＶＡと比較して、初期及び後期ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増幅させたことを示した。ＣＤ８α＋ＤＣはＭＨＣクラスＩ交差提示に優れており、ｉＮＫＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の非存在下でさえ、交差提示(cross priming)のためにＣＤ８α＋ＤＣを直接ライセンスすることが示された５０。本発明者らの知識の限りでは、本報告は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強するために、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒ及び抗原の共送達の利点を実験的に証明した最初のものである。同様に、ＯＶＡ特異的抗体応答は、同粒子に挿入されかつＣＤ８α＋ＤＣにターゲティングされたα−ＧａｌＣｅｒ及び抗原に応答して大いに増大された。従って、ＴＬＲアゴニストについて示されているように４９、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのターゲティングは、α−ＧａｌＣｅｒのアジュバント活性を向上させる。これはいまだ完全に実証されていないが、本発明者らは、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒ／抗原の共送達は、ＴＬＲアゴニスト／抗原の共送達と比較して優れた効果を有し得るという仮説を立てている。実際に、ＴＬＲアゴニストは、直接的なＤＣの成熟を誘導することによってアジュバント効果を発揮するが、このプロセスは抗原の取り込みを低下させるが、ナイーブＴ細胞を効率的に刺激するのに重要である。α−ＧａｌＣｅｒの場合、ＤＣ成熟は間接的であり、初回活性化後に産生されたｉＮＫＴ細胞因子に依拠する。ＴＬＲアゴニストと比較してα−ＧａｌＣｅｒに応答したＤＣの遅延した成熟は、ＤＣの抗原取り込み能を延長させ得、従って、増幅された免疫応答がもたらされ得る。ｉＮＫＴ細胞がＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の代用になり、Ｔ細胞及びＢ細胞応答を誘導するという事実は、多くの状況におけるｉＮＫＴ細胞をベースとしたアジュバント特性の結果を調べるための新たな手段をもたらす。本発明者らのデータはさらに、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒ／抗原の共送達は、強力な抗腫瘍応答をトリガーすることを明らかとする。
【０１１８】
結論すると、本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞が効率的な適応免疫応答及び抗腫瘍免疫応答を促進する能力を最大化しつつ、制御不能のｉＮＫＴ細胞活性化という望ましくない作用を最小化するために、その表面上にＤＣ特異的抗体を担持したＰＬＧＡをベースとしたＮＰの使用に基づいた能動的ターゲティング戦略の設計及び着手を行った。本発明者らは初めて、ＣＤ８α＋ＤＣへのα−ＧａｌＣｅｒのインビボにおける送達が、ｉＮＫＴ細胞の初期活性化を増強させるが、またこれらの細胞がさらなる再刺激に応答することを可能とすることを示す。重要なことには、ＣＤ８α＋ＤＣへの、ＮＰにより媒介されるα−ＧａｌＣｅｒ及びタンパク質抗原の両方の同時の共送達は、マウス系において、最適なＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び抗腫瘍応答を誘導する。
【０１１９】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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