(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシＤＮＡを含む試料においてＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を検出する方法であって、
前記試料を、
ａ．配列番号２９の残基１〜１８７３、配列番号２９の残基６６９０〜８５５７およびその相補鎖からなる群から選択されるフランキング配列と結合する第１プライマー、および
ｂ．配列番号２９の残基１８７４〜６６８９またはその相補鎖を含む挿入配列と結合する第２プライマー
と接触させるステップと、
前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、前記プライマー間に生じるアンプリコンについてアッセイするステップとを含み、前記アンプリコンの検出がＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９について特徴的である、方法。
【請求項２】
トウモロコシＤＮＡを含む試料においてＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を検出する方法であって、前記試料を少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるステップを含み、
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも３０ヌクレオチドを含み、配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記方法が、前記試料および前記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供するステップと、前記ＤＮＡとの前記ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについて前記試料をアッセイするステップとをさらに含み、前記ハイブリダイゼーションの検出がＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９について特徴的である、方法。
【請求項３】
配列番号５、７、１２、１４−１６、１９−２２、２４、２６及び２８からなる群から選択される第１プライマー、および配列番号１−４、６、８−１１、１３、１７、１８、２３、２５及び２７からなる群から選択される第２プライマーを含む、トウモロコシＤＮＡを含む試料においてＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９を検出するための、ＤＮＡ検出キット。
【請求項４】
請求項２に記載の方法を行うためのＤＮＡ検出キットであって、配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、キット。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群から選択される配列を含む、請求項４に記載のＤＮＡ検出キット。
【請求項６】
第１プライマーが、配列番号５、７、１２、１４−１６、１９−２２、２４、２６及び２８からなる群から選択され、および第２プライマーが、配列番号１−４、６、８−１１、１３、１７、１８、２３、２５及び２７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ａａｄ−１遺伝子（スフィンゴビウム・ハービシドボランス（Sphingobium herbicidov
orans）を起源とする）は、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−
１）タンパク質をコードする。この形質は、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびアリ
ールオキシフェノキシプロピオネート（一般的に、キザロホップ（quizalofop）のような
「ホップ（fop）」除草剤とよばれる）除草剤に対する耐性を与え、植物形質転換中およ
び育種養樹場における選択マーカーとして用いることができる。ａａｄ−１遺伝子自体は
、植物の除草剤耐性について、ＷＯ２００５／１０７４３７において最初に開示された（
ＵＳ２００９−００９３３６６も参照されたい）。
【０００２】
植物における異種または外来の遺伝子の発現は、外来遺伝子が染色体のどこに挿入され
るかにより影響される。このことは、例えば、クロマチン構造（例えばヘテロクロマチン
）または組み込み部位に近い転写調節要素（例えばエンハンサー）の近接さを原因とし得
る（Weisingら、Ann. Rev. Genet 22:421〜477、1988）。同じ型のトランスジェニック植
物（またはその他の生物）における同じ遺伝子は、異なるイベント間で広く多様な発現レ
ベルを示すことができる。発現の空間的または時間的なパターンにおける違いも存在する
ことがある。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対的発現における相違は、
導入された遺伝子構築物に存在する転写調節要素から予測されるパターンに対応しないこ
とがある。
【０００３】
よって、多数のイベントがしばしば創出され、ある目的のために満足できるレベルで対
象の導入された遺伝子を発現するイベントを同定するためにスクリーニングされる。商業
的な目的のために、数百〜数千の異なるイベントを生成して、これらのイベントを、所望
の導入遺伝子発現レベルおよびパターンを有する単一のイベントについてスクリーニング
することが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルおよび／またはパターンを有す
るイベントは、導入遺伝子を、他の遺伝子背景に、従来の育種方法を用いる有性外交雑（
sexual outcrossing）により遺伝子移入するために有用である。このような交雑の子孫は
、元の形質転換体に特徴的な導入遺伝子発現を維持する。この方策を用いて、局所的な成
長条件によく適合するいくつかの品種において確実に信頼できる遺伝子発現が得られる。
【０００４】
米国特許出願公開第２００２０１２０９６４Ａ１号および第２００４０００９５０４Ａ
１号は、ワタイベントＰＶ−ＧＨＧＴ０７（１４４５）ならびにそれを検出するための組
成物および方法に関する。ＷＯ０２／１００１６３は、ワタイベントＭＯＮＩ５９８５な
らびにそれを検出するための組成物および方法に関する。ＷＯ２００４／０１１６０１は
、トウモロコシイベントＭＯＮ８６３植物ならびにそれを検出するための組成物および方
法に関する。ＷＯ２００４／０７２２３５は、ワタイベントＭＯＮ８８９１３ならびにそ
れを検出するための組成物および方法に関する。
【０００５】
ＷＯ２００６／０９８９５２は、トウモロコシイベント３２７２に関する。ＷＯ２００
７／１４２８４０は、トウモロコシイベントＭＩＲ１６２に関する。
【０００６】
米国特許第７，１７９，９６５号は、ｃｒｙ１Ｆイベントおよびｃｒｙ１Ａｃイベント
を有するワタに関する。
【０００７】
本明細書に開示される特定のイベントを有するＡＡＤ−１トウモロコシは、以前に開示
されていなかった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−
１０２４４で寄託された種子を有する、ＤＡＳ−４０２７８−９とよばれるＡＡＤ−１ト
ウモロコシイベント、およびそれに由来する子孫に関する。本発明の他の態様は、子孫植
物、種子および穀粒または植物の再生可能な部分ならびにトウモロコシイベントＤＡＳ−
４０２７８−９の種子および子孫、ならびにこれらのいずれかから作製される食品または
飼料製品を含む。本発明は、それらに限定されないが、花粉、胚珠、花、苗条（shoot）
、根および葉ならびに栄養細胞、花粉細胞および卵細胞の核を含むトウモロコシイベント
ＤＡＳ−４０２７８−９の植物部分も含む。本発明は、フェノキシオーキシン型および／
またはアリールオキシアルカノエート除草剤に対する耐性を有するトウモロコシ植物、ト
ウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の新規な遺伝子組成およびトウモロコシイベ
ントＤＡＳ−４０２７８−９を含むトウモロコシ植物の農業経済学的（agronomic）性能
の態様にもさらに関する。
【０００９】
本発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、トウモロコ
シ細胞のゲノム内の特定の部位に挿入された、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配
列を含むトウモロコシ植物における新規なａａｄ−１形質転換イベントを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記イベント／ポリヌクレオチド配列は、例えばその他
の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫阻害タンパク質を含むその他の形質と
「掛け合わせる」ことができる。しかし、主題の発明は、本明細書に記載されるように、
単一イベントを有する植物を含む。
【００１１】
追加の形質は、植物ゲノムに、植物育種、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−
９を含有するトランスジェニック植物の再形質転換、または相同組換えによる標的組み込
みによる新しい形質の追加により掛け合わせることができる。
【００１２】
他の実施形態は、例えばｐａｔ遺伝子発現カセットを含むトウモロコシイベントＤＡＳ
−４０２７８−９を含むポリヌクレオチド配列の切り出しを含む。ポリヌクレオチド配列
の切り出しにより、改変されたイベントは、特定の染色体の部位に再び標的にされ、ここ
で、追加のポリヌクレオチド配列は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９と掛
け合わせることができる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、２００８ＤＡＳトウモロコシ連鎖地図（linakge map
）上のおよそ２０ｃＭにてＳＳＲマーカーＵＭＣ１２６５（配列番号３０および配列番号
３１を参照されたい）とＭＭＣ０１１１（配列番号３２および配列番号３３を参照された
い）との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位を包含
し、ここで、標的部位は異種核酸を含む。別の実施形態において、本発明は、配列番号２
９においてまたはそれにより規定される場所を含むトウモロコシ染色体標的部位と、当業
者により認識される、本明細書に記載されるその残基を包含する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、２００８ＤＡＳトウモロコシ連鎖地図上のおよそ２０
ｃＭにてＳＳＲマーカーＵＭＣ１２６５（配列番号３０および配列番号３１を参照された
い）とＭＭＣ０１１１（配列番号３２および配列番号３３を参照されたい）との間のおよ
そ２０ｃＭにて第２染色体上の位置に異種核酸を挿入するステップを含む、トランスジェ
ニックトウモロコシ植物を作製する方法を包含する。さらに別の実施形態において、挿入
された異種核酸は、配列番号２９を参照して本明細書で規定される５’フランキング配列
の全てまたは一部と５’にて接し、配列番号２９を参照して本明細書で規定される５’フ
ランキング配列の全てまたは一部と３’にて接する。
【００１５】
さらに、主題の発明は、（例えばトウモロコシ穀粒の）試料中の主題のイベントの存在
を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、組換え構築物の、トウモロコシゲノ
ムに挿入された、挿入部位に接するゲノム配列上のＤＮＡ配列に基づく。アッセイを実行
するために有用なキットおよび条件も提供される。
【００１６】
したがって、主題の発明は、部分的に、ＡＡＤ−１挿入断片全体のＤＮＡ配列およびそ
の境界領域（トランスジェニックトウモロコシ系統における）のクローニングおよび解析
に関する。これらの配列は、ユニークである。これらの挿入断片および境界配列に基づい
て、イベント特異的プライマーを作製した。ＰＣＲ解析は、これらのイベントが、これら
のイベント特異的プライマーセットを用いて生じるＰＣＲアンプリコンの解析により同定
できることを証明した。したがって、これらのおよびその他の関連する手順は、主題の発
明のイベントを含むトウモロコシ系統を独自に同定するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ｐＤＡＳ１７４０のプラスミド地図を示す。
【図２】ＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０）についての挿入断片の要素を示す。
【図３】ＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０）についての挿入断片の制限地図および要素を示す。
【図４】ＤＡＳ−４０２７８−９についてのＤＮＡ挿入断片および境界についてのアンプリコン、プライマーおよびクローニング方策を示す。
【図５】ＤＡＳ−４０２７８−９についての挿入断片および境界に関するプライマーの位置を示す。
【図６】ＤＡＳ−４０２７８−９についての接合部領域および挿入を示す。
【図７】実施例７で言及する育種ダイアグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関する。本発明は、トウモロコ
シ細胞のゲノム内の特定の位置に挿入された、本明細書に記載される主題のａａｄ−１ポ
リヌクレオチド配列を含むトウモロコシ植物（メイズ（maize））の新規な形質転換イベ
ントを含む。いくつかの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列は、例えばその
他の除草剤耐性遺伝子（複数可）および／または昆虫阻害タンパク質をコードする遺伝子
（複数可）のようなその他の形質と「掛け合わせる」ことができる。いくつかの実施形態
において、上記のポリヌクレオチド配列は、切り出して、その後、追加のポリヌクレオチ
ド配列を用いて再び標的にすることができる。しかし、主題の発明は、本明細書に記載さ
れるように単一イベントを有する植物を含む。
【００１９】
さらに、主題の発明は、試料中の主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提
供する。主題の発明の態様は、本明細書において例示されるかまたは示唆される任意の診
断用核酸分子、特に主題のフランキング配列に全体的または部分的に基づくものを設計お
よび／または生成する方法を含む。
【００２０】
より具体的には、主題の発明は、部分的に、トランスジェニックトウモロコシイベント
ＤＡＳ−４０２７８−９（ｐＤＡＳ１７４０−２７８としても知られる）、これらのイベ
ントを含む植物系統、ならびにこの挿入断片および／またはその境界領域のＤＮＡ配列の
クローニングおよび解析に関する。主題の発明の植物系統は、本明細書に開示され、示唆
される配列を用いて検出できる。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明は、除草剤耐性トウモロコシ系統およびその同定
に関する。主題の発明は、部分的に、有性交雑の子孫が対象のイベントを含有しているか
を決定するために、主題のイベントの存在を検出することに関する。さらに、イベントを
検出するための方法が含まれ、例えば、市場に出す前の承認および組換え作物植物に由来
する食物のラベル付けが必要とされる規制を遵守するために役に立つ。主題のイベントの
存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸プローブを用いるＤＮＡハイブリダ
イゼーションのような任意の公知の核酸検出法により検出できる。イベント特異的ＰＣＲ
は、例えば、Windelsら（Med. Fac. Landbouww、Univ. Gent 64/5b:459462、1999）で論
じられている。これは、挿入断片とフランキングＤＮＡとの間の接合部に及ぶプライマー
セットを用いるＰＣＲによる、グリホサート耐性ダイズイベント４０−３−２の同定に関
する。より具体的には、１つのプライマーは挿入断片からの配列を含み、第２プライマー
はフランキングＤＮＡからの配列を含んだ。
【００２２】
トウモロコシを、アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１）タン
パク質をコードするスフィンゴビウム・ハービシドボランス（Sphingobium herbicidovor
ans）からのａａｄ−１遺伝子の挿入により改変した。この形質は、２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（一般的に、キザロホップ
のような「ホップ」除草剤とよばれる）除草剤に対する耐性を与え、植物形質転換中およ
び育種養樹場における選択マーカーとして用いることができる。プラスミドｐＤＡＳ１７
４０からのＤＮＡ断片でのトウモロコシの形質転換を育種により行って、イベントＤＡＳ
−４０２７８−９を生成した。
【００２３】
イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの世代に由来する２０の個別のトウモロコシ植
物および世代ごとの４つの植物から抽出したゲノムＤＮＡ試料を、ＡＡＤ−１トウモロコ
シイベントＤＡＳ−４０２７８−９の分子特徴決定のために選択した。ＡＡＤ−１タンパ
ク質発現を、ＡＡＤ−１特異的迅速テストストリップキットを用いて試験した。ＡＡＤ−
１タンパク質発現について陽性と試験された植物だけを、その後の分子特徴決定のために
選択した。サザンハイブリダイゼーションにより、ａａｄ−１遺伝子が、ＡＡＤ−１タン
パク質発現について陽性と試験されたトウモロコシ植物に存在し、ａａｄ−１遺伝子が、
ａａｄ−１遺伝子プローブとハイブリダイズした場合にこれらの植物中に単一のインタク
トなコピーとして挿入されたことが確認された。
【００２４】
ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入されたＤＮＡの
分子特徴決定も、本明細書に記載される。イベントは、プラスミドｐＤＡＳ１７４０のＦ
ｓｐＩ断片を用いるウィスカー形質転換により生成した。サザンブロット解析を用いて、
挿入されたＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、イベントＤＡＳ−４０２７８−９に
おけるａａｄ−１遺伝子の挿入断片／コピーの数を決定した。データを作製して、トウモ
ロコシゲノムに挿入されたａａｄ−１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。プ
ロモーターおよびターミネーターのような非コード領域（コード領域を調節するように設
計された）、マトリクス付着領域ＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３およびＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４の組
み込みの特徴決定、ならびに世代にわたる導入遺伝子挿入断片の安定性を評価した。挿入
されたＤＮＡの安定性は、植物の５つの異なる世代にわたって証明された。さらに、アン
ピシリン抵抗性遺伝子（Ａｐｒ）領域を含む形質転換プラスミド主鎖配列が存在しないこ
とを、プラスミドｐＤＡＳ１７４０の制限部位（ＦｓｐＩ）に接する主鎖領域のほぼ全体
をカバーするプローブにより証明した。挿入の詳細な物理的な地図は、イベントＤＡＳ−
４０２７８−９のこれらのサザンブロット解析に基づいて描いた。
【００２５】
ＡＡＤ−１タンパク質のレベルを、トウモロコシ組織において決定した。さらに、トウ
モロコシのフォレージ（forage）および穀粒について組成解析を行って、同質遺伝子非形
質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコシ系統ＤＡＳ−４０２７８−９
との間の等価性を調べた（噴霧なし、２，４−Ｄを噴霧、キザロホップを噴霧および２，
４−Ｄとキザロホップとを噴霧）。同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統の農業経済学
的特徴も、ＤＡＳ−４０２７８−９トウモロコシと比較した。
【００２６】
非トランスジェニック対照とアリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１（Ａ
ＡＤ−１）を含有するハイブリッドトウモロコシ系統との野外での発現、栄養組成および
農業経済学的試行を、Ｉｏｗａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（２箇所）、Ｉｎｄｉａｎａ、Ｎｅｂ
ｒａｓｋａおよびＯｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａにある６つの現場で同じ年に行った。発
現レベルは、本明細書において、葉、花粉、根、フォレージ、植物全体および穀粒におけ
るＡＡＤ−１タンパク質、農業経済学的決定の結果、ならびに対照およびＤＡＳ−４０２
７８−９  ＡＡＤ−１トウモロコシからのフォレージおよび穀粒試料の組成解析について
まとめる。
【００２７】
可溶性の抽出可能なＡＡＤ−１タンパク質を、トウモロコシの葉、花粉、根、フォレー
ジ、植物全体および穀粒において、定量的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を
用いて測定した。良好な平均発現値が、本明細書により詳細に論じられるように、根およ
び花粉組織において観察された。発現値は、全ての噴霧処理、ならびに２，４−Ｄおよび
キザロホップ除草剤を噴霧したプロットおよび噴霧しなかったプロットについて同様であ
った。
【００２８】
近成組成（proximates）、ミネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、抗栄養素、および
２次代謝産物を含む組成解析を行って、対照に対するＤＡＳ−４０２７８−９  ＡＡＤ−
１トウモロコシ（除草剤処置ありまたはなし）の等価性を調べた。ＤＡＳ−４０２７８−
９  ＡＡＤ−１組成試料についての結果は、全て、対照系統および／または従来のトウモ
ロコシに基づいて、対照およびＤＡＳ−４０２７８−９  ＡＡＤ−１トウモロコシプロッ
トから収集された農業経済学的データの解析と同様であったか、またはそれよりも良好で
あった（生物学的および農業経済学的に）。
【００２９】
上記の背景技術の部分で言及したように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組み
込みは、いくつかのランダムなイベントを含む（よって、発現される所定の挿入について
の名称「イベント」）。つまり、アグロバクテリウム（Agrobacterium）形質転換、「遺
伝子銃」およびウィスカーのような多くの形質転換技術を用いると、ゲノム中のどこに導
入遺伝子が挿入されるかを予測できない。したがって、挿入断片の両側でのフランキング
植物ゲノムＤＮＡを同定することは、所定の挿入イベントを有する植物を同定するために
重要になり得る。例えば、挿入断片と宿主ゲノムとの接合部領域にわたるＰＣＲアンプリ
コンを生じるＰＣＲプライマーを設計できる。このＰＣＲアンプリコンを用いて、ユニー
クなまたは別個の型の挿入イベントを同定できる。
【００３０】
「イベント」は、もともとランダムなイベントであるので、この開示の一部分として、
イベントを含むトウモロコシ系統の少なくとも２５００の種子は、アメリカンタイプカル
チャーコレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａ
ｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０に寄託されており、制限なく一般に利用可能
である（但し、特許権下にある）。この寄託は、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２４４（
イエローデントメイズハイブリッド種子（ゼア・メイズ  エル．（Zea Mays L.））：Ｄ
ＡＳ−４０２７８−９；Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣのために寄託；ＡＴ
ＴＣによる種子／株（複数可）の受領日：２００９年７月１０日；生存確認日は２００９
年８月１７日）とよばれる。この寄託は、特許手続上の種子の寄託に関するブダペスト条
約に従い、この条約の下で行われ、維持される。寄託は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ
寄託機関にて、制限なく、３０年または直近の要請後５年、または特許の有効期間のいず
れかより長い期間にわたって維持され、その期間中に生存しなくなった場合は置き換えら
れる。
【００３１】
寄託された種子は、主題の発明の一部である。明らかに、トウモロコシ植物は、これら
の種子から成長でき、このような植物は、主題の発明の一部である。主題の発明は、これ
らの植物およびその子孫を検出するために有用なこれらのトウモロコシ植物に含まれるＤ
ＮＡ配列にも関する。主題の発明の検出方法およびキットは、試験の最終目的に応じてこ
れらのイベントのいずれか１つ、２つまたは３つ全てでさえも同定するようにできる。
【００３２】
本明細書において、本発明を説明することを補助し、当業者が本発明を行う手引きとな
るように定義および実施例が提供される。そうでないと記載しない限り、用語は、関連す
る技術分野の当業者による従来の慣例に従って理解される。３７ＣＦＲ§１．８２２に記
載されるＤＮＡ塩基についての命名法を用いる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、用語「子孫」は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４
０２７８−９を含む親の植物の任意の世代の子のことをいう。
【００３４】
トランスジェニック「イベント」は、植物細胞を異種ＤＮＡ、すなわち対象の導入遺伝
子を含む核酸構築物で形質転換し、導入遺伝子を植物のゲノムに挿入することにより得ら
れる植物の集団を再生し、特定のゲノムの場所への挿入を特徴とする特定の植物を選択す
ることにより生成される。用語「イベント」は、元の形質転換体および異種ＤＮＡを含む
形質転換体の子孫のことをいう。用語「イベント」は、形質転換体と、ゲノム／導入遺伝
子ＤＮＡを含む別の品種との間の有性外交雑により作出される子孫のこともいう。反復親
との繰り返しの戻し交雑の後でさえ、形質転換された親からの挿入された導入遺伝子ＤＮ
ＡおよびフランキングゲノムＤＮＡ（ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡ）は、交雑の子孫におい
て、染色体上の同じ場所に存在する。用語「イベント」は、元の形質転換体およびその子
孫からのＤＮＡのこともいい、それらは、挿入されたＤＮＡを含む１つの親の系統（例え
ば元の形質転換体および自家生殖により得られる子孫）と挿入されたＤＮＡを含まない親
の系統との有性交雑の結果としての、対象の導入遺伝子を含む挿入されたＤＮＡを受ける
子孫に伝達されると予測される挿入されたＤＮＡに直接隣接するフランキングゲノム配列
と挿入されたＤＮＡとを含む。
【００３５】
「接合部配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に接するトウモロコシの天然
のゲノムからのＤＮＡと連結される点に及び、植物の遺伝子材料における一方または他方
の接合部配列の同定または検出は、イベントに特徴的（diagnostic）であるために十分で
ある。本明細書に記載されるトウモロコシイベントにおける挿入と、類似の長さのフラン
キングＤＮＡとに及ぶＤＮＡ配列が含まれる。このような特徴的配列の具体的な例を本明
細書に示す。しかし、挿入の接合部または挿入とゲノム配列との接合部とオーバーラップ
するその他の配列も特徴的であり、主題の発明に従って用いることができる。
【００３６】
主題の発明は、このようなフランキング配列、接合部配列および挿入断片配列の同定に
関する。関連するＰＣＲプライマーおよびアンプリコンが、本発明に含まれる。主題の発
明に従って、挿入されたＤＮＡとその境界に及ぶアンプリコンを用いるＰＣＲ解析法を用
いて、市場にあるトランスジェニックトウモロコシ品種または主題の所有権のあるトラン
スジェニックトウモロコシ系統に由来する系統を検出または同定することができる。
【００３７】
これらの挿入断片のそれぞれの配列全体を、それぞれのフランキング配列の部分と一緒
に、本明細書において配列番号２９として示す。配列番号２９（全８５５７塩基対）に関
するこのイベントについての挿入断片およびフランキング配列の座標を以下に記載する。
このことは、例えば実施例３．８でより詳細に議論する。
【００３８】
0006472474.tif 000002
【００３９】
この挿入イベントおよびそのさらなる要素を、図１および２にさらに示す。これらの配
列（特にフランキング配列）は、ユニークである。これらの挿入断片配列および境界配列
に基づいて、イベント特異的プライマーを作製した。ＰＣＲ解析により、これらのトウモ
ロコシ系統が、異なるトウモロコシ遺伝子型において、これらのイベント特異的プライマ
ーセットを用いて生じるＰＣＲアンプリコンの解析により同定できることが証明された。
したがって、これらのおよびその他の関連する手順を用いて、これらのトウモロコシ系統
を独自に同定できる。本明細書において同定される配列は、ユニークである。例えば、Ｇ
ＥＮＢＡＮＫデータベースに対するＢＬＡＳＴ検索は、クローニングされた境界配列と、
データベース中の配列との間にいずれの著しい相同性も明らかにしなかった。
【００４０】
主題の発明の検出技術は、子孫において１または複数の追加の対象の形質を与えるため
の努力において対象のイベントを含む親の植物を別の植物系統と交雑させた後にどの子孫
植物が所定のイベントを含むかを決定するために、植物育種と関連して特に有用である。
これらのＰＣＲ解析法は、トウモロコシ育種プログラムならびに特に市場にあるトランス
ジェニックトウモロコシ種子についての品質管理に利益をもたらす。これらのトランスジ
ェニックトウモロコシ系統についてのＰＣＲ検出キットも、今回、作製して用いることが
できる。このことも、製品の登録および製品の管理に利益をもたらし得る。
【００４１】
さらに、フランキングトウモロコシ／ゲノム配列を用いて、各挿入断片のゲノムでの場
所を特異的に同定できる。この情報を用いて、各イベントに特異的な分子マーカーシステ
ムを作製できる。これらは、育種方策を促進し、連鎖データを創出するために用いること
ができる。
【００４２】
さらに、フランキング配列情報を用いて、導入遺伝子組み込みプロセス、ゲノム組み込
み部位の特徴、イベントの分類、導入遺伝子およびそれらのフランキング配列の安定性、
ならびに遺伝子発現（特に遺伝子サイレンシング、導入遺伝子メチル化パターン、位置効
果、およびＭＡＲＳ［マトリクス付着領域］などのような可能性のある発現関連要素に関
する）を研究して特徴決定できる。
【００４３】
全ての主題の開示に鑑みて、主題の発明が、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０２４４の下
で利用可能な種子を含むことが明確である。主題の発明は、受託番号ＰＴＡ−１０２４４
の下でＡＴＣＣに寄託された種子から成長した除草剤抵抗性トウモロコシ植物も含む。主
題の発明は、葉のような上記の植物の一部分、組織試料、上記の植物により作出される種
子、花粉などをさらに含む。
【００４４】
さらに、主題の発明は、寄託された種子から成長した植物の子孫（descendant）および
／または子孫（progeny）植物、好ましくは除草剤抵抗性トウモロコシ植物であって、上
記の植物が、本明細書に記載される検出可能な野生型ゲノムＤＮＡ／挿入断片ＤＮＡ接合
部配列を含むゲノムを有する植物を含む。本明細書で用いる場合、用語「トウモロコシ」
は、メイズ（ゼア・メイズ（Zea mays））を意味し、トウモロコシと育種できるその全て
の品種を含む。
【００４５】
本発明は、主題の発明の植物を少なくとも一方の親として用いて交雑種を作製するプロ
セスも含む。例えば、主題の発明は、本明細書に例示される植物のいずれかを一方または
両方の親として有するＦ１ハイブリッド植物を含む。主題の発明のこのようなＦ１ハイブ
リッドにより作出される種子も、主題の発明に含まれる。本発明は、例示される植物を、
異なる（例えば近交系の親）植物と交雑させ、得られるハイブリッド種子を収穫すること
によりＦ１ハイブリッド種子を作出する方法を含む。主題の発明は、雌性の親または雄性
の親のいずれかである例示される植物を含む。得られる植物の特徴は、親の植物を注意し
て考慮することにより改良できる。
【００４６】
除草剤耐性トウモロコシ植物は、本明細書で言及する系統のいずれか１つの種子から成
長したトウモロコシ植物からなる第１の親のトウモロコシ植物と、第２の親のトウモロコ
シ植物とをまず有性交雑させ、それにより複数の第１子孫植物を作出し、次いで、除草剤
に抵抗性の第１子孫植物（または主題の発明のイベントの少なくとも１つを有するもの）
を選択し、第１子孫植物を自家生殖し、それにより複数の第２子孫植物を作出し、次いで
、第２子孫植物から、除草剤に抵抗性の植物（または主題の発明のイベントの少なくとも
１つを有するもの）を選択することにより育種できる。これらのステップは、第１子孫植
物または第２子孫植物を、第２の親のトウモロコシ植物または第３の親のトウモロコシ植
物と戻し交雑することをさらに含み得る。主題の発明のトウモロコシ種子を含むトウモロ
コシ作物またはその子孫を、次いで、植えることができる。
【００４７】
また、２つの異なるトランスジェニック植物を交配させて、２つの独立して分離した付
加外因性遺伝子を含む子を作出することができることも理解されたい。適当な子孫の自家
生殖は、両方の付加外因性遺伝子についてホモ接合の植物を作出できる。親の植物との戻
し交雑および非トランスジェニック植物との外交雑も、栄養繁殖であるので、企図される
。異なる形質および作物について一般的に用いられるその他の育種方法は、当該技術にお
いて知られている。戻し交雑育種は、単純に遺伝された高度に遺伝性の形質についての遺
伝子を、反復親である所望のホモ接合の栽培変種または近交系統に伝達するために用いら
れている。伝達される形質の供給源は、ドナー親とよばれる。得られる植物は、反復親（
例えば栽培変種）の属性と、ドナー親から伝達された所望の形質とを有すると予測される
。最初の交雑の後に、ドナー親の表現型を有する個体を選択し、反復親と繰り返し交雑さ
せる（戻し交雑）。得られる親は、反復親（例えば栽培変種）の属性と、ドナー親から伝
達された所望の形質とを有すると予測される。
【００４８】
本発明のＤＮＡ分子は、マーカー支援育種（ＭＡＢ）法において分子マーカーとして用
いることができる。本発明のＤＮＡ分子は、当該技術において知られるように、遺伝子的
に連結した農業経済学的に有用な形質を同定する方法において用いることができる（例え
ばＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰおよびＳＳＲ）。除
草剤抵抗性形質は、主題の発明のトウモロコシ植物との交雑の子孫（またはその子孫およ
び任意のその他のトウモロコシ栽培変種または品種）において、ＭＡＢ法を用いて追跡で
きる。ＤＮＡ分子は、この形質についてのマーカーであり、当該技術において公知のＭＡ
Ｂ法を用いて、主題の発明の少なくとも１つのトウモロコシ系統またはその子孫は、親ま
たは祖先であったトウモロコシ植物における除草剤抵抗性形質（複数可）を追跡できる。
本発明の方法を用いて、主題のイベントを有する任意のトウモロコシ品種を同定できる。
【００４９】
主題の発明の方法は、除草剤耐性トウモロコシ植物を作出する方法であって、主題の発
明の植物を育種するステップを含む方法を含む。より具体的には、上記の方法は、主題の
発明の２つの植物、または主題の発明の１つの植物と任意のその他の植物とを交雑するス
テップを含み得る。好ましい方法は、上記の交雑種の子孫を、主題の発明に従って検出可
能なイベントについて上記の子孫を解析することにより選択するステップをさらに含む。
例えば、主題の発明は、種々の実施例において本明細書で試験されるもののような農業経
済学的形質のようなその他の所望の形質を含む植物との育種サイクル中に主題のイベント
を追跡するために用いることができる。主題のイベントおよび所望の形質を含む植物は、
例えば検出でき、同定でき、選択でき、さらなる回の育種において迅速に用いることがで
きる。主題のイベント／形質は、昆虫抵抗性形質（複数可）および／またはさらなる除草
剤耐性形質と育種により組み合わせ、主題の発明に従って追跡できる。後者のある好まし
い実施形態は、除草剤ジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせた主題の
イベントを含む植物である。
【００５０】
したがって、主題の発明は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば抵抗性植物または細
菌のＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、ＧＡＴ）、グルフォシネート抵抗性（例えばＰａｔ、ｂａｒ）
、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害除草剤抵抗性（例えばイミダゾリノン［例えばイマ
ゼタピル］、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド、ピルミジニルチ
オベンゾエート（pyrmidinylthiobenzoates）およびその他の化学物質［Ｃｓｒ１、Ｓｕ
ｒＡら］）、ブロモキシニル抵抗性（例えばＢｘｎ）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシフェニ
ル−ピルベート−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性、フィトエン不飽和化
酵素（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性、光化学系ＩＩ阻害除草剤に対する抵抗性（例え
ばｐｓｂＡ）、光化学系Ｉ阻害除草剤に対する抵抗性、プロトポルフィリノゲン酸化酵素
ＩＸ（ＰＰＯ）阻害除草剤に対する抵抗性（例えばＰＰＯ−１）、フェニル尿素除草剤に
対する抵抗性（例えばＣＹＰ７６Ｂ１）、ジカンバ分解酵素（例えばＵＳ２００３０１３
５８７９を参照されたい）をコードする形質と組み合わせることができ、その他のものを
単独または複数の組み合わせで掛け合わせて、雑草のシフトおよび／もしくは上記のクラ
スの任意の除草剤に対する抵抗性を効果的に制御または妨げる能力を提供できる。
【００５１】
さらなる除草剤に関して、いくつかの追加の好ましいＡＬＳ（ＡＨＡＳとしても知られ
る）阻害剤は、トリアゾロピリミジンスルホンアニリド（例えばクロランスラム−メチル
、ジクロスラム、フロラスラム、フルメツラム、メトスラムおよびペノキススラム）、ピ
リミジニルチオベンゾエート（例えばビスピリバックおよびピリチオバック）、およびフ
ルカルバゾンを含む。いくつかの好ましいＨＰＰＤ阻害剤は、メソトリオン、イソキサフ
ルトールおよびスルコトリオンを含む。いくつかの好ましいＰＰＯ阻害剤は、フルミクロ
ラック、フルミオキサジン、フルフェンピル、ピラフルフェン、フルチアセット、ブタフ
ェナシル、カルフェントラゾン、スルフェントラゾンおよびジフェニルエーテル（例えば
アシフルオオルフェン、フォメサフェン、ラクトフェンおよびオキシフルオルフェン）を
含む。
【００５２】
さらに、ＡＡＤ−１単独または１もしくは複数の追加のＨＴＣ形質を掛け合わせたもの
は、１または複数の追加の入力（例えば昆虫抵抗性、真菌抵抗性またはストレス耐性など
）または出力（例えば収率の増加、油プロファイルの改善、繊維の質の改善など）形質と
掛け合わせることができる。したがって、主題の発明を用いて、任意の数の農業経済学的
害虫を柔軟にかつ経済的に効率よく制御する能力を有する、作物の質が改善された完全な
農業経済学的パッケージを提供できる。
【００５３】
相同組換えにより植物細胞の特定の染色体部位内にポリヌクレオチド配列を組み込む方
法は、当該技術において記載されている。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１
１１８８Ａ１号に記載されるような部位特異的組み込みは、ドナーポリヌクレオチド配列
の染色体標的への導入を媒介するためのリコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用につ
いて記載する。さらに国際特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号は、１または複数の
ドナーポリヌクレオチド配列を、ゲノムの特定の位置に組み込むためのジンクフィンガー
媒介相同組換えについて記載している。米国特許第６７２０４７５号に記載されるＦＬＰ
／ＦＲＴまたは米国特許第５６５８７７２号に記載されるＣＲＥ／ＬＯＸのようなリコン
ビナーゼの使用は、ポリヌクレオチド配列を特定の染色体部位に組み込むために利用でき
る。最後に、ドナーポリヌクレオチドを特定の染色体の場所を標的にさせるためのメガヌ
クレアーゼの使用は、Puchtaら、PNAS USA 93(1996)pp.5055〜5060に記載された。
【００５４】
植物細胞内の部位特異的組み込みのためのその他の種々の方法は、一般的に知られ、用
いることができる（Kumarら、Trands in Plant Sci. 6(4)(2001)pp.155〜159）。さらに
、いくつかの原核および下等真核生物で同定されている部位特異的組換え系を、植物で用
いるために当てはめることができる。このような系の例は、それらに限定されないが、酵
母ザイゴサッカロミセス・ロキシイ（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミド
からのＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Arakiら(1985)J. Mol. Biol. 182:191〜203）および
ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（MaeserおよびKahlmann(1991)Mol. Gen. Genet. 230:1
70〜176）を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態において、現存するトランスジェニックイベントの近傍に
おいて新しい導入遺伝子（複数可）を組み込むかまたは掛け合わせることが望ましいこと
がある。トランスジェニックイベントは、単一挿入部位、通常のメンデルの分離および安
定な発現のような独自の特徴、ならびに除草剤耐性および複数の環境の場所における、そ
してそれらにわたる農業経済学的性能を含む優れた効力の組み合わせに基づいて選択され
た好ましいゲノム遺伝子座と考えることができる。新しく組み込まれた導入遺伝子は、現
存する形質転換体の導入遺伝子発現の特徴を維持する。さらに、新しく組み込まれたイベ
ントの検出および確認のためのアッセイの開発は、新しく組み込まれたイベントのゲノム
フランキング配列および染色体での場所が既に同定されているので、克服される。最後に
、新しい導入遺伝子を、現存する導入遺伝子と連結された特定の染色体の場所に組み込む
ことは、導入遺伝子を、その他の遺伝子背景に、従来の育種方法を用いる有性外交雑によ
り遺伝子移入することを促進する。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態において、トランスジェニックイベントからポリヌクレオ
チド配列を切り出すことが望ましいことがある。例えば、米国仮特許出願第６１／２９７
，６２８号に記載されるような導入遺伝子の切り出しは、遺伝子発現カセットからなるポ
リヌクレオチド配列を、染色体に組み込まれたトランスジェニックイベントから除去する
ためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用について記載する。除去されるポリヌクレオ
チド配列は、選択マーカーであり得る。ポリヌクレオチド配列の切り出しおよび除去の際
に、改変されたトランスジェニックイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入により再び
標的にできる。ポリヌクレオチド配列の切り出しおよび改変されたトランスジェニックイ
ベントのその後の再標的化は、選択マーカーの再使用または特定の遺伝子の発現に起因す
る植物トランスクリプトームへの意図しない変更を克服する能力のように、利点を提供す
る。
【００５７】
主題の発明は、本明細書において、異種核酸の導入のために優れたトウモロコシゲノム
中の第２染色体上の特定の部位を開示する。第２染色体上の標的化部位の場所を同定する
ために有用な５’分子マーカー、３’分子マーカー、５’フランキング配列および３’フ
ランキング配列も開示される。したがって、主題の発明は、対象の異種核酸を、この予め
確立された標的部位またはこの標的部位の付近において導入するための方法を提供する。
主題の発明は、開示される標的部位にてまたはそのような部位のほぼ付近において挿入さ
れた任意の異種ヌクレオチド配列を含むトウモロコシ種子および／またはトウモロコシ植
物も包含する。このような標的にされた組み込みを達成するためのある選択肢は、本明細
書で例示するｐａｔ発現カセットを切り出し、かつ／またはその代わりに異なる挿入断片
で置き換えることである。この一般的な点において、標的にされた相同組換えを、例えば
、そして制限することなく、主題の発明に従って用いることができる。
【００５８】
本明細書で用いる場合、遺伝子、イベントまたは形質を「掛け合わせる」ことは、所望
の形質を１つのトランスジェニック系統に組み合わせることである。植物育種家は、トラ
ンスジェニック形質を、それぞれが所望の形質を有する親同士の交雑種を作製し、次いで
これらの所望の形質の両方を有する子を同定することにより掛け合わせる。遺伝子を掛け
合わせる別の方法は、２以上の遺伝子を、植物の細胞核に、形質転換中に同時に伝達する
ことによる。遺伝子を掛け合わせる別の方法は、トランスジェニック植物を、対象の別の
遺伝子で再形質転換することによる。例えば、遺伝子掛け合わせは、例えば２以上の異な
る昆虫形質、昆虫抵抗性形質（複数可）および疾患抵抗性形質（複数可）、２以上の除草
抵抗性性形質、ならびに／または昆虫抵抗性形質（複数可）および除草剤抵抗性形質（複
数可）を含む２以上の異なる形質を組み合わせるために用いることができる。対象の遺伝
子に加えて選択マーカーを用いることは、遺伝子掛け合わせと考えることもできる。
【００５９】
「相同組換え」は、それにより２つのヌクレオチド配列が相互作用（組換え）して新し
い組換えＤＮＡ配列を形成できる類似のヌクレオチド配列を含有する対応する部位を有す
るヌクレオチド配列の任意の対同士の反応のことをいう。類似のヌクレオチド配列の部位
は、それぞれ、本明細書において、「相同配列」という。一般的に、相同組換えの頻度は
、相同配列の長さが増加するにつれて増加する。したがって、相同組換えは、同一未満で
ある２つのヌクレオチド配列間で生じ得るが、組換え頻度（または効率）は、２つの配列
間の相違が増加するにつれて減少する。組換えは、ドナー分子および標的分子のそれぞれ
にある１つの相同配列を用いて達成され、それにより、「単一交差」組換え生成物が生じ
得る。代わりに、２つの相同配列を、標的ヌクレオチド配列およびドナーヌクレオチド配
列のそれぞれに配置できる。ドナー上の２つの相同配列と、標的上の２つの相同配列との
組換えは、「二重交差」組換え生成物を生じる。ドナー分子上の相同配列が、操作される
配列（例えば対象の配列）と接する場合、標的分子との二重交差組換えは、対象の配列が
、標的分子上の相同配列の間に元々あったＤＮＡ配列を置き換える組換え生成物をもたら
す。標的とドナーとの間のＤＮＡ配列を二重交差組換えイベントにより交換することを、
「配列置き換え」とよぶ。
【００６０】
主題のＡＡＤ−１酵素は、ほぼ全ての広葉雑草および禾本雑草（grass weeds）を制御
する除草剤の組み合わせに対する耐性をもたらすトランスジェニック発現を可能にする。
ＡＡＤ−１は、例えばその他の除草剤耐性作物（ＨＴＣ）形質（例えばグリホサート抵抗
性、グルフォシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ブロモキシニル抵抗性など）およ
び昆虫抵抗性形質（Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ３４／４５など）と掛け合わせる
ための優れたＨＴＣ形質として働くことができる。さらに、ＡＡＤ−１は、第２の遺伝子
または遺伝子の群で遺伝子的に工学的に操作された植物の１次形質転換体の選択を助ける
ための選択マーカーとして働くことができる。
【００６１】
主題の発明のＨＴＣ形質は、その他のＨＴＣ形質（それに限定されないが、グリホサー
ト耐性を含む）との新規な組み合わせにおいて用いることができる。形質のこれらの組み
合わせにより、新しく獲得した抵抗性または除草剤（例えばグリホサート）に対する固有
の耐性により、雑草（など）の種を制御する新規な方法が得られる。つまり、ＨＴＣ形質
に加えて、除草剤を用いて雑草を制御するための新規な方法（除草剤耐性は、トランスジ
ェニック作物における上記の酵素により確立された）は、本発明の範囲内である。
【００６２】
さらに、グリホサート耐性作物を世界的に成長させることが普及している。その他のグ
リホサート耐性作物との輪作が多数になると、グリホサート抵抗性の自生植物（voluntee
rs）の制御は、輪作作物において困難になることがある。したがって、掛け合わされたか
または作物に個別に形質転換された主題のトランスジェニック形質の使用は、その他のＨ
ＴＣ自生作物の制御のためのツールを提供する。
【００６３】
主題の発明の好ましい植物または種子は、そのゲノムに、本明細書で同定される挿入配
列を、本明細書で同定される挿入断片の両側の少なくとも２０〜５００またはそれより長
い連続フランキングヌクレオチドとともに含む。そうでないと示さない限り、フランキン
グ配列についての言及は、配列番号２９に関して同定されるもののことをいう（上記の表
を参照されたい）。ここでもまた、配列番号２９は、元の形質転換体に挿入された異種Ｄ
ＮＡと、挿入されたＤＮＡに直接隣接する説明となるフランキングゲノム配列を含む。こ
れらのフランキング配列の全てまたは一部分は、イベントを含む親の系統の有性交雑の結
果として挿入されたＤＮＡを受ける子孫に伝達されると予測できる。
【００６４】
主題の発明は、主題の発明の植物の再生可能な細胞の組織培養物を含む。このような組
織培養から再生された植物も含まれ、特に上記の植物は、例示される品種の全ての形態学
的および生理的特性を発現できる。主題の発明の好ましい植物は、寄託された種子から成
長した植物の全ての生理的および形態学的特徴を有する。本発明は、このような種子の子
孫および対象の定性的形質を有する種子をさらに含む。
【００６５】
植物もしくは種子またはその一部分の操作（例えば変異、さらなるトランスフェクショ
ンおよびさらなる育種）は、「従属」（essentially derived）品種とよばれることがあ
るものの創出を導くことがある。植物新品種保護のための国際連合（ＵＰＯＶ）は、ある
品種が保護された品種に従属するかを決定するための以下のガイドラインを提供している
。
品種は、
（ｉ）それが、最初の品種に支配的に由来するか、またはそれ自体が最初の品種に支配的
に由来する品種に由来するが、最初の品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因
する本質的な特徴の発現を保持し、
（ｉｉ）それが、最初の品種から明確に区別でき、
（ｉｉｉ）導出の働きに起因する相違を除いて、それが、最初の品種の遺伝子型または遺
伝子型の組み合わせに起因する必須の特徴の発現における最初の品種と同様になる
場合、別の品種（「最初の品種」）に従属するとみなされる。
【００６６】
ＵＰＯＶ、国際機関との第６回会議、ジュネーブ、１９９２年１０月３０日；連合の事
務局により作製された文書。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「系統」は、少なくとも１つの形質について個体間でほとんど
または全く遺伝子的変動を示さない植物の群である。このような系統は、自家受粉および
選択のいくつかの世代、または単一の親からの組織または細胞培養技術を用いる栄養繁殖
により創出できる。
【００６８】
本明細書で用いる場合、用語「栽培変種」（cultivar）および「品種」（variety）は
、同義であり、商業的な生産のために用いられる系統のことをいう。
【００６９】
「安定性」または「安定な」は、所定の要素に関して、その要素が世代から世代に維持
され、好ましくは、少なくとも３世代にわたって実質的に同じレベル、例えば好ましくは
±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％維持されることを意味する。
安定性は、植えつけの温度、場所、ストレスおよび時期により影響されることがある。野
外条件下でのその後の世代の比較は、その要素を同様の様式で生成する。
【００７０】
「商用」（Commercial Utility）は、良好な草勢および高い受精能を有して、作物が、
従来の農業設備を用いて農業家により生産でき、記載される成分を有する油が、従来の粉
砕および抽出装置を用いて種子から抽出できることと定義される。商業的に有用になるた
めに、種子重量、油含量およびエーカー当たりに生産される全油により測定される収率は
、同じ領域で成長した高い価値の形質を有さない、他の点では比較の商業的なカノーラ品
種の平均収率の１５％以内である。
【００７１】
「農業経済学的にエリート」は、系統が、収率、成熟度、疾患抵抗性などのような所望
の農業経済学的特徴を、主題のイベント（複数可）による昆虫抵抗性に加えて有すること
を意味する。以下の実施例に示すように、主題の発明のイベントを含む植物において個別
または任意の組み合わせで考慮される農業経済学的形質は、主題の発明の範囲内である。
これらの農業経済学的特徴およびデータ点のいずれかおよび全てを用いて、このような植
物を規定するために用いる特徴の範囲における点として、または一端もしくは両端のいず
れかとしてこのような植物を同定できる。
【００７２】
当業者は、本開示に鑑みて、例えば検出キットの好ましい実施形態が、「接合部配列」
もしくは「移行部配列」（トウモロコシゲノムフランキング配列が挿入配列と出会うとこ
ろ）に指向され、かつ／またはそれを含むプローブおよび／あるいはプライマーを含み得
ることを認識する。例えば、これは、表１に示すような、一方もしくは両方の接合部配列
（挿入断片がフランキング配列と出会うところ）を同定するように設計されたポリヌクレ
オチドプローブ、プライマーおよび／またはアンプリコンを含む。ある共通の設計は、フ
ランキング領域でハイブリダイズする１つのプライマーと、挿入断片でハイブリダイズす
る１つのプライマーとを有することである。このようなプライマーは、それぞれ、しばし
ば、少なくとも約〜１５残基の長さである。この構成を用いて、プライマーは、主題の発
明のイベントの存在を示す検出可能なアンプリコンを作製／増幅するために用いることが
できる。これらのプライマーを用いて、上記のように接合部配列に及ぶ（そしてそれを含
む）アンプリコンを作製できる。
【００７３】
フランキング配列内で「つながる」（touching down）プライマー（複数可）は、約２
００塩基を超えてまたは接合部を超えてハイブリダイズするようには典型的に設計されな
い。つまり、典型的なフランキングプライマーは、挿入断片の始点からフランキング配列
内に２００塩基以内のいずれかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計される。つま
り、配列番号２９の残基約〜１６７４−１８７３および／または約〜６６９０−６８９０
における適当なサイズの配列を含むプライマーは、主題の発明の範囲内である。挿入プラ
イマーは、同様に、挿入断片上のいずれの場所でも設計できるが、例えば残基約〜１８７
４−２０７４および約〜６４８９−６６８９は、このようなプライマー設計のために排他
的でなく用いることができる。
【００７４】
当業者は、プライマーおよびプローブを、ある範囲の標準的なハイブリダイゼーション
および／またはＰＣＲ条件の下で、配列番号２９（または相補鎖）のセグメントおよびそ
の相補鎖とハイブリダイズするように設計でき、ここで、プライマーまたはプローブは、
例示される配列と完全に相補的でないことも認識している。つまり、ある程度のミスマッ
チが許容できる。およそ２０ヌクレオチドのプライマーについて、例えば、典型的に、１
または２などのヌクレオチドは、ミスマッチ塩基が内部にあるかまたはアンプリコンの反
対にあるプライマーの末端にあるならば、反対の鎖と結合する必要はない。種々の適当な
ハイブリダイゼーション条件を、以下に示す。イノシンのような合成ヌクレオチド類似体
もプローブに用いることができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブならびにＤＮＡおよ
びＲＮＡプローブも用いることができる。重要なことは、このようなプローブおよびプラ
イマーは、主題の発明のイベントの存在について特徴的（diagnostic）である（独自に同
定して区別できる）ということである。
【００７５】
例えばマイナーな配列の誤りをもたらすと考えられるＰＣＲ増幅における誤りが生じ得
ることに注意されたい。つまり、そうでないと記載しない限り、本明細書で列挙する配列
は、トウモロコシゲノムＤＮＡから長いアンプリコンを作製し、次いで、アンプリコンを
クローニングして配列決定することにより決定した。この様式で作製され決定された配列
においてわずかな相違およびマイナーな不一致が見出されることは、ゲノムＤＮＡからの
配列決定のために十分なアンプリコンを生じるために必要な多くの回の増幅に鑑みて、異
常なことではない。当業者は、これらの型の一般的な配列決定の誤りまたは不一致により
必要になるいずれの調整も、主題の発明の範囲内であることを認識し、そのように通知さ
れる。
【００７６】
例えば、配列をイベントの創出中に挿入する場合に、いくつかのゲノム配列が欠失され
ることは珍しくないことにも注意されたい。つまり、主題のフランキング配列と、例えば
ＧＥＮＢＡＮＫに列挙されたゲノム配列との間にもいくらかの相違が出現し得る。
【００７７】
いくらかのこれらの相違（複数可）を、以下の実施例部分で論じる。プローブおよびプ
ライマーへの調整は、しかるべく行うことができる。
【００７８】
「挿入断片」のそれぞれの要素を、図１および２に示し、以下の実施例においてより詳
細に論じる。これらの要素またはその断片のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、本発明の方
法においてＤＮＡプライマーまたはプローブとして用いることができる。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態において、植物および種子などにおけるトウモロコシ植物
からの導入遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供され
る。本明細書で示す主題の導入遺伝子／ゲノム挿入領域接合部配列（配列番号２９の残基
１８７３〜１８７４と６６８９〜６６９０の間）、そのセグメントならびに例示される配
列の相補鎖およびその任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域接合部
配列は、ゲノムに挿入された異種ＤＮＡと、挿入部位に接するトウモロコシ細胞からのＤ
ＮＡとの接合部に及ぶ。このような配列は、所定のイベントについて特徴的であり得る。
【００８０】
これらの挿入断片および境界配列に基づいて、イベント特異的プライマーを作製できる
。ＰＣＲ解析は、主題の発明のトウモロコシ系統が、これらのイベント特異的プライマー
セットを用いて生じるＰＣＲアンプリコンの解析により異なるトウモロコシ遺伝子型にお
いて同定できることを証明した。これらのおよびその他の関連する手順は、これらのトウ
モロコシ系統を独自に同定するために用いることができる。つまり、このようなプライマ
ー対に由来するＰＣＲアンプリコンは、ユニークであり、これらのトウモロコシ系統を同
定するために用いることができる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、新規な導入遺伝子／ゲノム挿入領域の連続する断片を含
むＤＮＡ配列は、本発明のある態様である。導入遺伝子挿入断片配列の十分な長さのポリ
ヌクレオチドと、上記の３つのトウモロコシ植物の１もしくは複数からのトウモロコシゲ
ノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドとを含むＤＮＡ配列、および／またはこれらの
トウモロコシ植物の１もしくは複数について特徴的なアンプリコン生成物の生成のための
プライマー配列として有用な配列が含まれる。
【００８２】
関連する実施形態は、本明細書で同定されるＤＮＡ配列（例えば配列番号２９およびそ
のセグメント）の導入遺伝子部分の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５またはそれより多くの連続ヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、またはその相補鎖、
およびこれらの配列からの同様の長さのフランキングトウモロコシＤＮＡ配列、またはそ
の相補鎖に関する。このような配列は、ＤＮＡ増幅法においてＤＮＡプライマーとして有
用である。これらのプライマーを用いて生成されるアンプリコンは、本明細書で言及する
任意のトウモロコシイベントについて特徴的である。よって、本発明は、このようなＤＮ
Ａプライマーおよび相同的プライマーにより生成されるアンプリコンも含む。
【００８３】
本発明は、本明細書で言及するトウモロコシイベントに対応するＤＮＡの存在を試料中
で検出する方法も含む。このような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、これらのトウモ
ロコシイベントの少なくとも１つからのＤＮＡとの核酸増幅反応で用いる場合に、上記の
イベント（複数可）について特徴的であるアンプリコンを生成するプライマーセットと接
触させるステップと、（ｂ）核酸増幅反応を行って、それによりアンプリコンを生成する
ステップと、（ｃ）アンプリコンを検出するステップとを含み得る。
【００８４】
主題の発明のさらなる検出方法は、上記のイベントの少なくとも１つに対応するＤＮＡ
の存在を試料中で検出する方法であって、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、上記のトウモロコ
シイベントの少なくとも１つからのＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下でハイブリダイズし、対照トウモロコシ植物（対象のイベントでないＤＮＡ）とス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしないプローブと接触
させるステップと、（ｂ）試料およびプローブをストリンジェントなハイブリダイゼーシ
ョン条件下に供するステップと、（ｃ）ＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションを
検出するステップとを含む方法を含む。
【００８５】
さらなる実施形態において、主題の発明は、主題の発明のａａｄ−１イベントを含むト
ウモロコシ植物を作出する方法であって、（ａ）第１の親のトウモロコシ系統（上記の系
統の植物に上記の除草剤抵抗性を与える、本発明の発現カセットを含む）と、第２の親の
トウモロコシ系統（この除草剤耐性形質を欠く）とを有性交雑させ、それにより複数の子
孫植物を作出するステップと、（ｂ）分子マーカーを用いて子孫植物を選択するステップ
とを含む方法を含む。このような方法は、子孫植物を第２の親のトウモロコシ系統と戻し
交雑して、上記の昆虫耐性形質を含む優良種（true-breeding）トウモロコシ植物を作出
するさらなるステップを所望により含み得る。
【００８６】
本発明の別の態様によると、上記の３つのイベントのいずれか１つ（または複数）との
交雑種の子孫の接合状態を決定する方法が提供される。上記の方法は、トウモロコシＤＮ
Ａを含む試料を主題の発明のプライマーセットと接触させるステップを含み得る。上記の
プライマーは、上記のトウモロコシイベントの少なくとも１つからのゲノムＤＮＡとの核
酸増幅反応において用いる場合、上記のトウモロコシイベントの少なくとも１つについて
特徴的である第１アンプリコンを生成する。このような方法は、核酸増幅反応を行って、
それにより第１アンプリコンを生成するステップと、第１アンプリコンを検出するステッ
プと、トウモロコシＤＮＡを含む試料を上記のプライマーセット（上記のプライマーセッ
トは、トウモロコシ植物からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応において用いる場合、トウ
モロコシゲノム領域に相同的な天然トウモロコシゲノムＤＮＡを含む第２アンプリコンを
生成する）と接触させるステップと、核酸増幅反応を行って、それにより第２アンプリコ
ンを生成するステップとをさらに含む。方法は、第２アンプリコンを検出するステップと
、試料中の第１アンプリコンと第２アンプリコンとを比較するステップであって、両方の
アンプリコンの存在が、試料が導入遺伝子挿入についてヘテロ接合性であることを示すス
テップとをさらに含む。
【００８７】
ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示される組成物およびＤＮＡ検出の技術分野におい
て公知の方法を用いて開発できる。キットは、試料中の主題のトウモロコシイベントＤＮ
Ａを同定するために有用であり、このＤＮＡを含有するトウモロコシ植物を育種する方法
に用いることができる。キットは、例えば、本明細書に開示されるアンプリコンまたは主
題のイベントの導入遺伝子遺伝要素に含まれるＤＮＡに相同もしくは相補的なＤＮＡ配列
に相同または相補的なＤＮＡ配列を含有する。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応に
おいて、またはＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして用いることがで
きる。キットは、検出法の実行のために必要な試薬および材料も含有してよい。
【００８８】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポーター分子（例えば放射活性同位体
、リガンド、化学発光剤または酵素）と結合した単離核酸分子である。このようなプロー
ブは、本発明の場合は標的核酸の鎖、上記のトウモロコシイベントの１つからのゲノムＤ
ＮＡの鎖（トウモロコシ植物からまたはイベントからのＤＮＡを含む試料からのいずれか
）に相補的である。本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでな
く、ポリアミドおよび標的ＤＮＡ配列と特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検
出するために用いることができるその他のプローブ材料を含む。
【００８９】
「プライマー」は、相補的標的ＤＮＡ鎖に、核酸ハイブリダイゼーションによりアニー
ルして、プライマーと標的ＤＮＡ鎖とのハイブリッドを形成し、次いで、標的ＤＮＡ鎖に
沿って、ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより伸長される単離／合成核酸であ
る。本発明のプライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはその他の従
来の核酸増幅方法による、標的核酸配列の増幅のためのそれらの使用のことをいう。
【００９０】
プローブおよびプライマーは、一般的に、  
0006472474.tif 000003
ポリヌクレオチドまたはそれより長い長さである。このようなプローブおよびプライマー
は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で標的配列と特異的にハイブリ
ダイズする。好ましくは、本発明によるプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な
配列類似性を有するが、標的配列と異なり、標的配列とハイブリダイズする能力を保持す
るプローブを、従来の方法により設計できる。
【００９１】
プローブおよびプライマーを調製して用いる方法は、例えば、Molecular Cloning: A L
aboratory Manual、第2版、1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989に記載されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば
その目的を意図するコンピュータプログラムを用いることにより既知の配列から導くこと
ができる。
【００９２】
本明細書に開示されるフランキングＤＮＡ配列および挿入断片配列に基づくプライマー
およびプローブは、開示された配列を、従来の方法、例えば再クローニングおよびそのよ
うな配列の配列決定により確認する（必要であれば修正する）ために用いることができる
。
【００９３】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、標的ＤＮＡ配列とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を用い
て、試料中のトランスジェニックイベントからのＤＮＡの存在を同定できる。核酸分子ま
たはその断片は、あるいくつかの状況の下でその他の核酸分子と特異的にハイブリダイズ
できる。本明細書で用いる場合、２つの核酸分子は、２つの分子が逆平行２本鎖核酸構造
を形成できるならば、互いに特異的にハイブリダイズできるという。核酸分子は、それら
が完全な相補性を示すならば、別の核酸分子の「相補鎖」であるという。本明細書で用い
る場合、分子は、一方の分子の全てのヌクレオチドが他方のヌクレオチドと相補的である
場合に、「完全な相補性」を示すという。２つの分子は、それらが互いに、少なくとも従
来の「低ストリンジェンシー」条件の下で互いにアニールしたままであることができるよ
うな十分な安定性で互いにハイブリダイズできるならば、「最小限に相補的」であるとい
う。同様に、分子は、それらが互いに、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いに
アニールしたままであることができるような十分な安定性で互いにハイブリダイズできる
ならば、「相補的」であるという。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら、1989
により記載されている。完全な相補性からの逸脱は、よって、そのような逸脱が、二本鎖
構造を形成する分子の能力を完全に妨げない限りは、許容される。核酸分子がプライマー
またはプローブとして働くためには、採用する特定の溶媒および塩濃度下で安定な２本鎖
構造を形成できる配列において十分に相補的であることだけが必要である。
【００９４】
本明細書で用いる場合、実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシー条件の下で比較
される核酸配列の相補鎖と特異的にハイブリダイズする核酸配列である。用語「ストリン
ジェント条件」は、Sambrookら、1989において9.52〜9.55で論じられる特定のハイブリダ
イゼーション手順による標的核酸（すなわち対象の具体的な核酸配列）との核酸プローブ
のハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。Sambrookら、1989の9.47〜9.52
および9.56〜9.58も参照されたい。よって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ断片の
相補的なひと続きとの二重分子を選択的に形成するそれらの能力について用いることがで
きる。
【００９５】
構想する用途に応じて、標的配列に対するプローブの多様な程度の選択性を達成するた
めに、多様なハイブリダイゼーション条件を用いることができる。高い選択性が要求され
る用途のために、ハイブリッドを形成するために比較的ストリンジェントな条件を典型的
に採用し、例えば、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ  ＮａＣｌで約５０℃〜約７０℃の温度
により与えられるような比較的低い塩および／または高い温度の条件を選択する。例えば
、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションフィルタを、高ストリンジェンシ
ー洗浄バッファー（０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）で少なくとも２回洗浄す
ることを含み得る。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー
条件、例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃、そ
の後に２．０×ＳＳＣで５０℃での洗浄は、当業者に知られている、６．３．１〜６．３
．６。例えば、洗浄ステップにおける塩濃度は、約２．０×ＳＳＣで５０℃の低ストリン
ジェンシーから約０．２×ＳＳＣで５０℃の高ストリンジェンシーまで選択できる。さら
に、洗浄ステップにおける温度は、室温、約２２℃の低ストリンジェンシー条件から、約
６５℃の高ストリンジェンシー条件まで増加できる。温度および塩はともに変動できるか
、または温度もしくは塩濃度のいずれかを一定に保持しながら他方の変数を変化させてよ
い。このような選択的条件は、プローブと鋳型または標的鎖との間のミスマッチがあった
とすればそれにほとんど耐えない。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の検出は当
業者に公知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および第５，１７６，９９５号の教
示は、ハイブリダイゼーション分析の方法の例である。
【００９６】
特に好ましい実施形態において、本発明の核酸は、相補鎖およびその断片を含む本明細
書で例示または示唆されるプライマー（またはアンプリコンもしくはその他の配列）の１
または複数と、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする。本発明の一
態様において、本発明のマーカー核酸分子は、配列番号３〜１４に示す核酸配列またはそ
の相補鎖および／もしくは断片を有する。
【００９７】
本発明の別の態様において、本発明のマーカー核酸分子は、このような核酸配列と、８
０％と１００％の間または９０％と１００％の間の配列同一性を有する。本発明のさらな
る態様において、本発明のマーカー核酸分子は、このような配列と、９５％と１００％の
間の配列同一性を有する。このような配列は、植物育種法においてマーカーとして用いて
、遺伝的交雑種の子孫を同定できる。標的ＤＮＡ分子とのプローブのハイブリダイゼーシ
ョンは、当業者に知られる任意の数の方法により検出でき、これらは、それらに限定され
ないが、蛍光タグ、放射活性タグ、抗体に基づくタグおよび化学発光タグを含み得る。
【００９８】
特定の増幅プライマー対を用いる標的核酸配列の増幅（例えばＰＣＲによる）に関して
、「ストリンジェントな条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（またはその相
補鎖）を有するプライマーが結合し、好ましくはユニーク増幅産物であるアンプリコンを
生成する標的核酸配列のみとハイブリダイズすることを許容する条件である。
【００９９】
用語「（標的配列）に特異的」は、プローブまたはプライマーが、標的配列を含む試料
において標的配列のみとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダ
イズすることを示す。
【０１００】
本明細書で用いる場合、「増幅されたＤＮＡ」または「アンプリコン」は、核酸鋳型の
一部分である標的核酸配列の核酸増幅の生成物のことをいう。例えば、有性交雑に起因す
るトウモロコシ植物が本発明のトウモロコシ植物からのトランスジェニックイベントゲノ
ムＤＮＡを含有するかを決定するために、トウモロコシ植物組織試料から抽出されるＤＮ
Ａを、挿入された異種ＤＮＡの挿入部位に隣接する植物のゲノムにおけるフランキング配
列に由来するプライマーと、挿入された異種ＤＮＡに由来する第２プライマーとを含むプ
ライマー対を用いて、イベントＤＮＡの存在について特徴的であるアンプリコンを生成す
る核酸増幅法に供することができる。アンプリコンは、ある長さのものであり、これもま
たイベントについて特徴的である配列を有する。アンプリコンは、プライマー対＋１ヌク
レオチド塩基対の組み合わさった長さから、および／またはプライマー対＋約
0006472474.tif 000004
もしくはそれより多くのヌクレオチド塩基対（＋または−上で列挙する任意の増分）の組
み合わさった長さの範囲であり得る。代わりに、プライマー対は、挿入ヌクレオチド配列
全体を含むアンプリコンを生成するように、挿入されたＤＮＡの両側のフランキング配列
に由来できる。植物ゲノム配列に由来するプライマー対のメンバーは、挿入されたＤＮＡ
配列からのある距離に位置し得る。この距離は、１ヌクレオチド塩基対から約２万ヌクレ
オチド塩基対までの範囲であり得る。用語「アンプリコン」の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応
において形成されることがあるプライマーダイマーを特に除く。
【０１０１】
核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む当該技術において知られる種々の
核酸増幅法のいずれによっても達成できる。種々の増幅法は当該技術において知られてお
り、なかでも、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号
に記載されている。ＰＣＲ増幅法は、２２ｋｂまでのゲノムＤＮＡを増幅するために開発
されている。これらの方法およびＤＮＡ増幅の技術分野において知られるその他の方法を
、本発明の実行において用いてよい。異種導入遺伝子ＤＮＡ挿入断片の配列または主題の
トウモロコシイベントからのフランキングゲノム配列は、このような配列を、イベントか
ら、本明細書で示される配列に由来するプライマーを用いて増幅し、その後、ＰＣＲアン
プリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定を行うことにより確
認（そして、必要であれば修正）できる。
【０１０２】
これらの方法により生成されるアンプリコンは、複数の技術により検出できる。アガロ
ースゲル電気泳動および臭化エチジウムでの染色は、ＤＮＡアンプリコンを検出するため
の一般的な公知の方法である。別のこのような方法は、隣接するフランキングゲノムＤＮ
Ａ配列と挿入されたＤＮＡ配列との両方とオーバーラップするようにＤＮＡオリゴヌクレ
オチドが設計される遺伝的ビット解析である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプ
レートのウェルに固定化される。対象の領域のＰＣＲの後に（挿入された配列内の１つの
プライマーと、隣接するフランキングゲノム配列内の１つのプライマーとを用いる）、１
本鎖ＰＣＲ生成物は、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズでき、ＤＮＡポ
リメラーゼと予測される次の塩基に特異的な標識ｄｄＮＴＰとを用いる単一塩基伸長反応
のための鋳型として働く。読出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡに基づくことができる。シグ
ナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による挿入断片／フラ
ンキング配列の存在を示す。
【０１０３】
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00:18〜24、2000）により記載されるピロ
シーケンス技術である。この方法において、オリゴヌクレオチドは、隣接するゲノムＤＮ
Ａおよび挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするように設計される。オリゴヌクレオチド
を、対象の領域からの１本鎖ＰＣＲ生成物（挿入された配列内の１つのプライマーと、フ
ランキングゲノム配列内の１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸
およびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ＤＮＴＰを個別に加え、組み込みは
、光のシグナルをもたらし、これが測定される。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼー
ションおよび単一または多重塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入断片／フランキング配
列の存在を示す。
【０１０４】
蛍光分極は、本発明のアンプリコンを検出するために用いることができる別の方法であ
る。この方法に従って、ゲノムフランキングおよび挿入されたＤＮＡ接合部とオーバーラ
ップするオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドを、対象の領域からの１本
鎖ＰＣＲ生成物（挿入されたＤＮＡ内の１つのプライマーと、フランキングゲノムＤＮＡ
配列内の１つのプライマー）とハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識
ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。単一塩基伸長は、ｄｄＮＴＰの組み込みをも
たらす。組み込みは、蛍光計を用いて分極の変化として測定できる。分極の変化は、増幅
、ハイブリダイゼーションおよび単一塩基伸長の成功による導入遺伝子挿入断片／フラン
キング配列の存在を示す。
【０１０５】
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔ
ｙ、Ｃａｌｉｆ．）は、ＤＮＡ配列の存在を検出し、定量する方法である。簡単に述べる
と、ゲノムフランキングおよび挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌ
クレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ
配列内の１つのプライマーと、フランキングゲノム配列内の１つのプライマー）を、熱安
定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環させる。特異的増幅の間に、Ｔａｑ  Ｄ
ＮＡポリメラーゼは蛍光部分をＦＲＥＴプローブの消光部分から浄化して放出させる。蛍
光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功によるフランキング／導入遺伝
子挿入配列の存在を示す。
【０１０６】
分子ビーコンは、配列検出において用いるために記載されている。簡単に述べると、フ
ランキングゲノムおよび挿入ＤＮＡ接合部とオーバーラップするＦＲＥＴオリゴヌクレオ
チドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブのユニーク構造により、これは、蛍光部分と
消光部分とが近接したまま維持される２次構造を含有するようになる。ＦＲＥＴプローブ
およびＰＣＲプライマー（挿入ＤＮＡ配列内の１つのプライマーと、フランキングゲノム
配列内の１つのプライマー）を、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下で循環さ
せる。ＰＣＲ増幅が成功した後に、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーシ
ョンは、プローブ２次構造の除去と、蛍光部分および消光部分の空間的な分離をもたらす
。蛍光シグナルが得られる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功
によるフランキングゲノム／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【０１０７】
挿入のために優れたトウモロコシゲノムの場所を開示したが、主題の発明は、少なくと
も１つの非ａａｄ１挿入断片を、おおよそこのゲノムの場所の付近に含むトウモロコシ種
子および／またはトウモロコシ植物も含む。あるオプションは、異なる挿入断片を、本明
細書で例示されるａａｄ−１挿入断片の代わりに置換することである。一般的にこれらの
点に関して、例えば標的にされた相同組換えを主題の発明に従って用いることができる。
この型の技術は、例えばＷＯ０３／０８０８０９Ａ２および対応する公開されたＵ．Ｓ．
出願（ＵＳ２００３０２３２４１０）の主題である。したがって、主題の発明は、本明細
書で同定されるフランキング配列の全てまたは認識可能部分（例えば配列番号２９の残基
１〜１８７３および６６９０〜８５５７）と接する異種挿入断片（ａａｄ−１のマルチコ
ピーの代わりまたはそれとともに）を含む植物および植物細胞を含む。
【０１０８】
本明細書で言及したかまたは引用した全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、
それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度でその全体が参照により組み込まれて
いる。
本発明は以下の態様を含み得る。［１］
配列番号２９を含むゲノムを含むトランスジェニックトウモロコシ植物。
［２］
アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ−１０２４４
の下で寄託された種子に存在するＡＡＤ−１イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含むゲノ
ムを含むトウモロコシ種子。
［３］
配列番号２９を含むゲノムを含むトウモロコシ種子。
［４］
配列番号２９を含む、請求項２に記載の種子を成長させることにより作出されるトウモ
ロコシ植物。
［５］
ＡＡＤ−１イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含む、請求項４に記載のトウモロコシ植
物の子孫植物。
［６］
配列番号２９を含む、請求項１に記載のトウモロコシ植物の除草剤耐性子孫植物。
［７］
配列番号３０および配列番号３１により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＵＭＣ１２
６５と、配列番号３２および配列番号３３により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＭＭ
Ｃ０１１１との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上にあるトウモロコシ染色体標的部位
に導入遺伝子挿入断片を含むトランスジェニックトウモロコシ植物であって、標的部位が
異種核酸を含む植物。
［８］
配列番号３０および配列番号３１により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＵＭＣ１２
６５と、配列番号３２および配列番号３３により部分的に増幅可能なＳＳＲマーカーＭＭ
Ｃ０１１１との間のおよそ２０ｃＭにて第２染色体上の位置に異種核酸を挿入するステッ
プを含む、トランスジェニックトウモロコシ植物を作製する方法。
［９］
花粉、胚珠、花、さや（boll）、長繊維（lint）、苗条、根および葉からなる群から選
択され、配列番号２９を含む、請求項４に記載の植物の一部分。
［１０］
導入遺伝子挿入断片を、配列番号２９の残基１〜１８７３および配列番号１の残基６６
９０〜８５５７からなる群から選択されるゲノム配列内に、またはそれに接して含むトラ
ンスジェニックトウモロコシ植物。
［１１］
少なくとも１５ヌクレオチドを含み、配列番号２９の残基１〜１８７３、配列番号２９
の残基６６９０〜８５５７およびその相補鎖からなる群から選択される核酸配列とのスト
リンジェントな洗浄条件下でのハイブリダイゼーションを維持する単離ポリヌクレオチド
分子。
［１２］
配列番号１〜２８および３０〜３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む
単離ポリヌクレオチド。
［１３］
配列番号２９の残基１８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およ
びその相補鎖からなる群から選択されるヌクレオチド配列とストリンジェントな洗浄条件
下でハイブリダイズする単離ポリヌクレオチド。
［１４］
ポリメラーゼ連鎖反応により生じるアンプリコンである、請求項１３に記載のポリヌク
レオチド。
［１５］
トウモロコシＤＮＡを含む試料においてトウモロコシイベントを検出する方法であって
、前記試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＰＴＡ
−１０２４４の下で寄託された種子に存在するＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−
４０２７８−９について特徴的である少なくとも１つのポリヌクレオチドと接触させるス
テップを含む方法。
［１６］
前記試料を、
ａ．配列番号２９の残基１〜１８７３、配列番号２９の残基６６９０〜８５５７およびそ
の相補鎖からなる群から選択されるフランキング配列と結合する第１プライマー、および
ｂ．配列番号１の残基１８７４〜６６８９またはその相補鎖を含む挿入配列と結合する第
２プライマー
と接触させるステップと、前記試料をポリメラーゼ連鎖反応に供するステップと、前記プ
ライマー間に生じるアンプリコンについてアッセイするステップとを含む、請求項１５に
記載の方法。
［１７］
前記プライマーが、配列番号１〜２８からなる群から選択される、請求項１６に記載の
方法。
［１８］
前記ポリヌクレオチドが、少なくとも３０ヌクレオチドを含み、配列番号２９の残基１
８６３〜１８７５、配列番号２９の残基６６７９〜６７００およびその相補鎖からなる群
から選択される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記方法が、前記
試料および前記ポリヌクレオチドをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供
するステップと、前記ＤＮＡとの前記ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションについ
て前記試料をアッセイするステップとをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
［１９］
請求項１７に記載の第１プライマーおよび第２プライマーを含むＤＮＡ検出キット。
［２０］
請求項１８に記載の方法を行うためのＤＮＡ検出キット。
［２１］
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ検出キット。
［２２］
配列番号２９を含むポリヌクレオチド。
［２３］
請求項２２に記載のポリヌクレオチドを生成する方法。
［２４］
トウモロコシゲノムのＤＮＡセグメントに導入遺伝子を挿入する方法であって、前記Ｄ
ＮＡセグメントが、配列番号２９のヌクレオチド残基１〜１８７３を含む５’末端と、配
列番号１のヌクレオチド残基６６９０〜８５５７を含む３’末端とを含む方法。
［２５］
トウモロコシ植物を育種する方法であって、配列番号２９を含む第１トウモロコシ植物
を第２トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第３トウモロコシ植物を作出するス
テップと、前記第３トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列番号２９の存在について
アッセイするステップとを含む方法。
［２６］
トウモロコシ植物に除草剤耐性形質を遺伝子移入する方法であって、配列番号２９を含
む第１トウモロコシ植物を第２トウモロコシ植物と交雑させて、ゲノムを含む第３トウモ
ロコシ植物を作出するステップと、前記第３トウモロコシ植物を前記ゲノムにおける配列
番号２９の存在についてアッセイするステップとを含む方法。
【０１０９】
以下の実施例は、本発明を実行するための手順を説明し、本発明のあるいくつかの好ま
しい実施形態を示すために含まれる。これらの実施例は、限定すると解釈されるべきでな
い。以下の実施例に開示される技術は、好ましい形態をその実行のために説明するために
用いられる具体的なアプローチを表すことが当業者により認識される。しかし、当業者は
、本開示に鑑みて、これらの具体的な実施形態において多くの変更を行いながら、本発明
の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をまだ得ることができるこ
とを認識している。そうでないと記載しない限り、全てのパーセンテージは重量により、
全ての溶媒混合比率は、そうでないと記載しない限り容量による。
【０１１０】
そうでないと示さない限り、以下の略語を用いる。
ＡＡＤ−１  アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１
ｂｐ        塩基対
℃          セ氏度
ＤＮＡ      デオキシリボ核酸
ＤＩＧ      ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ    エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ        キロベース
μｇ        マイクログラム
μＬ        マイクロリットル
ｍＬ        ミリリットル
Ｍ          モル質量
ＯＬＰ      オーバーラッププローブ
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ      植物転写単位
ＳＤＳ      ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ      標準操作手順
ＳＳＣ      塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含有するバッファー溶
液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ      Ｔｒｉｓベース、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含有するバッファー溶液
、ｐＨ８．３
Ｖ  ボルト
[実施例]
【実施例１】
【０１１１】
ＡＡＤ１イベントｐＤＡＳ１７４０−２７８の形質転換および選択
ＡＡＤ１イベントであるｐＤＡＳ１７４０−２７８を、メイズ系統Ｈｉ−ＩＩのウィス
カー（WHISKER）媒介形質転換により生成した。用いる形質転換法は、米国特許出願公開
第２００９００９３３６６号に記載されている。プラスミドｐＤＡＳ１７４０（ｐＤＡＢ
３８１２ともよばれる）のＦｓｐＩ断片（図１）を、メイズ系統に形質転換した。このプ
ラスミド構築物は、ＲＢ７  ＭＡＲｖ３：：ゼア・メイズ（Zea mays）ユビキチン１プロ
モーターｖ２／／ＡＡＤ１  ｖ３／／ゼア・メイズＰＥＲ５  ３’ＵＴＲ：：ＲＢ７  Ｍ
ＡＲｖ４植物転写ユニット（ＰＴＵ）を含有する植物発現カセットを含有する。
【０１１２】
多数のイベントを生成した。生存し、健常で、ハロキシホップ抵抗性カルス組織を生成
したイベントに、推定上の形質転換イベントを表すユニーク識別コードを割り当て、新鮮
な選択培地に継続して移した。植物は、各ユニークイベントに由来する組織から再生し、
温室に移した。
【０１１３】
葉の試料を、分子解析のために採取して、ＡＡＤ−１導入遺伝子の存在を、サザンブロ
ット、ＤＮＡ境界の確認およびゲノムマーカーにより支援される確認により検証した。陽
性のＴ０植物を、近交系統と受粉してＴ１種子を得た。イベントｐＤＡＳ１４７０−２７
８−９（ＤＡＳ−４０２７８−９）のＴ１植物を選択し、自家受粉し、５世代にわたって
特徴決定した。その間に、Ｔ１植物を戻し交雑し、エリート生殖質（ＸＨＨ１３）に、マ
ーカーにより支援される選択により数世代にわたって遺伝子移入した。このイベントは、
独立した形質転換単離体から作製した。イベントを、単一挿入部位、標準メンデル分離お
よび安定的な発現のようなそのユニークな特徴、ならびに広い遺伝子型背景におけるおよ
び複数の環境の場所にわたる除草剤耐性および農業経済学的性能を含む優れた効率の組み
合わせに基づいて選択した。以下の実施例は、イベントｐＤＡＳ−１７４０−２７８−９
を特徴づけるために用いたデータを含有する。
【実施例２】
【０１１４】
サザンブロットによるｐＤＡＳ１７４０−２７８−９イベントの特徴決定
サザンブロット解析を用いて、挿入されたＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、イ
ベントｐＤＡＳ−１７４０−２７８−９（ＤＡＳ−４０２７８−９）におけるａａｄ−１
遺伝子の挿入断片／コピーの数を決定した。データを得て、トウモロコシゲノムに挿入さ
れたａａｄ−１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を証明した。
【０１１５】
サザンブロットデータは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるｐＤ
ＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片挿入が、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのａａｄ−１  Ｐ
ＴＵの単一のインタクトなコピーの単純な組み込みとして生じたことを示唆した。詳細な
サザンブロット解析を、プラスミド領域に含有される遺伝子、プロモーター、ターミネー
ターおよびその他の調節要素に特異的なプローブと、プラスミド内にある切断部位を有し
、プラスミドの内部のハイブリダイズする断片またはトウモロコシゲノムＤＮＡとのプラ
スミドの接合部に及ぶ断片（境界断片）を生成する説明的な制限酵素とを用いて行った。
制限酵素とプローブとの組み合わせについてサザンハイブリダイゼーションから示された
分子量は、イベントについてユニークであり、その同定パターンを確立した。これらの解
析は、プラスミド断片が、ａａｄ−１  ＰＴＵの再構成なしにトウモロコシゲノムＤＮＡ
に挿入されたことも示した。同一のハイブリダイゼーション断片が、トランスジェニック
トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の異なる５つの世代において観察され、こ
のことは、世代にわたるａａｄ−１  ＰＴＵ挿入の遺伝形質の安定性を示す。プラスミド
ｐＤＡＳ１７４０上のＦｓｐＩの制限部位の外側に位置する３つの主鎖プローブの混合物
とのハイブリダイゼーションは、いずれの特定のＤＮＡ／遺伝子断片も検出せず、このこ
とは、トランスジェニックトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるアンピ
シリン抵抗性遺伝子の不在と、プラスミドｐＤＡＳ１７４０のＦｓｐＩ制限部位に直接隣
接するその他のベクター主鎖領域の不在とを示した。ａａｄ−１トウモロコシイベントＤ
ＡＳ−４０２７８−９における挿入断片の説明のための地図を、図２〜３に示す。
【０１１６】
（実施例２．１）
トウモロコシの葉の試料の回収およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離
ｇＤＮＡを、ａａｄ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の個別の植物の
葉から調製した。ｇＤＮＡを、ａａｄ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９
を有する個別の植物から収穫した葉組織から抽出した。イベントＤＡＳ−４０２７８−９
の５つの異なる世代からのトランスジェニックトウモロコシ種子を用いた。世代あたり４
つの植物に由来する、イベントＤＡＳ−４０２７８−９についての２０の個別のトウモロ
コシ植物を選択した。さらに、ｇＤＮＡを、従来のトウモロコシ植物ＸＨＨ１３から単離
したが、これは、本質の系統の代表である遺伝子背景を含有し、ａａｄ−１遺伝子は存在
しない。
【０１１７】
ｇＤＮＡを単離する前に、葉の押し抜きを各植物から採取して、ａａｄ−１タンパク質
発現を、迅速テストストリップキット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｗ
ｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ）を製造者が推奨する手順に従って用いて試験した。それぞれの
葉の押し抜き試料には、ａａｄ−１の存在または不在について、それぞれ＋または−の評
点を与えた。イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの世代からの陽性植物だけを、さら
なる特徴決定に供した。
【０１１８】
トウモロコシの葉の試料を、イベントＤＡＳ−４０２７８−９および従来の対照ＸＨＨ
１３の個別の植物から回収した。葉の試料を液体窒素中で迅速に凍結し、使用時までおよ
そ−８０℃にて貯蔵した。
【０１１９】
個別のゲノムＤＮＡを、凍結トウモロコシ葉組織から、標準的なＣＴＡＢ法に従って抽
出した。必要な場合に、いくらかのゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−Ｔ
ｉｐ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を、製造者により推奨される手順に従っ
て用いてさらに精製した。抽出の後に、ＤＮＡを、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて分光蛍光的に定量した。ＤＮＡを、次
いで、アガロースゲル上で視覚化して、Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ解析からの値を確認し、Ｄ
ＮＡの質を決定した。
【０１２０】
（実施例２．２）
ＤＮＡ消化および分離
ＤＮＡの分子特徴決定のために、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９  ＤＮ
Ａ試料および従来の対照からの９マイクログラム（９μｇ）のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ１
μｇあたりに選択された制限酵素をおよそ５〜１１単位と対応する反応バッファーとを各
ＤＮＡ試料に加えることにより消化した。各試料を、およそ３７℃にて一晩インキュベー
トした。制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＦｓｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを消
化のために用いた（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）
。陽性のハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＳ１７４０
（ｐＤＡＢ３８１２）を、従来の対照からのゲノムＤＮＡと、トウモロコシゲノムあたり
１コピーの導入遺伝子にほぼ等しい比率で組み合わせることにより調製し、試験試料と同
じ手順および制限酵素を用いて消化した。従来のトウモロコシ対照（ＸＨＨ１３）からの
ＤＮＡを、試験試料と同じ手順および制限酵素を用いて消化して、陰性対照とした。
【０１２１】
消化したＤＮＡ試料を、Ｑｕｉｃｋ−Ｐｒｅｃｉｐ（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ
、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて沈殿させ、１×Ｂｌｕｅ  Ｊｕｉｃｅ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に再懸濁して、ゲルローディングのため
の所望の容量を達成した。ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、次いで、０．８％ア
ガロースゲルに１×ＴＢＥバッファー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔ
ｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を５５〜６５ボルトでおよそ１８〜２２時間用いて電気泳動して、
断片の分離を達成した。ゲルを、臭化エチジウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ、ＣＡ）で染色し、ＤＮＡを紫外（ＵＶ）光の下で視覚化した。
【０１２２】
（実施例２．３）
サザントランスファーおよびメンブレン処理
サザンブロット解析を、Memelinkら(1994) Southern, Northern, and Western Blot An
alysis. Plant Mol. Biol. Manual F1:1〜23に記載されるようにして本質的に行った。簡
単に述べると、ＤＮＡ断片の電気泳動分離および視覚化の後に、ゲルを、０．２５Ｎ  Ｈ
Ｃｌ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）をおよそ１
５分間用いて脱プリン化し、次いで、変性溶液（ＡｃｃｕＧＥＮＥ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）におよそ３０分間、その後中和溶液（ＡｃｃｕＧＥＮＥ、Ｓｉｇｍａ
、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に少なくとも３０分間曝露した。サザントランスファーを、
ナイロンメンブレン（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ
、ＩＮ）上に、灯心（wicking）システムを１０×ＳＳＣ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ）とともに用いて一晩行った。トランスファーの後に、メンブレンを２×ＳＳＣ
溶液中で洗浄し、ＤＮＡをメンブレンにＵＶ架橋により結合させた。このプロセスにより
、ハイブリダイゼーションのための準備ができたサザンブロットメンブレンが得られた。
【０１２３】
（実施例２．４）
ＤＮＡプローブ標識およびハイブリダイゼーション
ナイロンメンブレンと結合したＤＮＡ断片を、標識プローブを用いて検出した。この研
究のために用いたプローブは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ヌクレオチドである［ＤＩ
Ｇ−１１］−ｄＵＴＰのＰＣＲに基づく組み込みにより、プラスミドｐＤＡＳ１７４０か
らの遺伝子要素とその他の領域に特異的なプライマーにより作製された断片から作製した
。ＰＣＲ合成によるＤＮＡプローブの作製は、ＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キット（Ｒｏ
ｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を、製造者が推奨
する手順に従って用いて行った。この研究に用いたプローブのリストを、表１に記載する
。
【０１２４】
【表１】
0006472474.tif 000005
【０１２５】
標識プローブを、アガロースゲル電気泳動により解析して、それらの質および量を決定
した。所望の量の標識プローブを、次いで、ＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）について記載される手順
を用いる特定の断片の検出のために、ナイロンメンブレン上で標的ＤＮＡへのハイブリダ
イゼーションのために用いた。簡単に述べると、ＤＮＡを固定したナイロンメンブレンブ
ロットを、２×ＳＳＣ中で短く洗浄し、２０〜２５ｍＬの予め温めたＤＩＧ  Ｅａｓｙ  
Ｈｙｂ溶液を用いて、ハイブリダイゼーション瓶中でおよそ５０℃にて最短で３０分間、
ハイブリダイゼーションオーブン中でプレハイブリダイゼーションした。プレハイブリダ
イゼーション溶液を、次いで、デカントし、水中で５分間煮沸することにより予め変性さ
せた所望の量の特異的プローブを含有する２０ｍＬの予め温めたＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈｙ
ｂ溶液で置き換えた。ハイブリダイゼーションステップを、次いで、およそ４０〜６０℃
にて一晩、ハイブリダイゼーションオーブン中で行った。
【０１２６】
（実施例２．５）
検出
プローブハイブリダイゼーションの最後に、プローブを含有するＤＩＧ  Ｅａｓｙ  Ｈ
ｙｂ溶液をきれいなチューブにデカントし、−２０℃にて貯蔵した。これらのプローブは
、製造者が推奨する手順に従って２〜３回再使用できた。メンブレンブロットを短くすす
ぎ、きれいなプラスチック容器中で、低ストリンジェンシー洗浄バッファー（２×ＳＳＣ
、０．１％ＳＤＳ）でおよそ５分間室温にて２回洗浄し、その後、高ストリンジェンシー
洗浄バッファー（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で１５分間、それぞれおよそ６５℃
にて２回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、別のきれいなプラスチック容器に移
し、ＤＩＧ洗浄およびブロックバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からの１×洗浄バッファーでおよそ２分間短く洗浄
し、１×ブロッキングバッファー中で最短で３０分間のブロッキングと、その後の１×ブ
ロッキングバッファー中での抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）抗体（１：５，
０００希釈、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）
との最短で３０分間のインキュベーションに進んだ。１×洗浄バッファーで２〜３回洗浄
した後に、特異的ＤＮＡプローブは、メンブレンブロットに結合したままであり、ＤＩＧ
標識ＤＮＡ標準物質を、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ化学発光核酸検出システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を製造者の推奨に従って用いて
視覚化した。ブロットを化学発光フィルム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、１または複数の時点で露光して、ハイブリダイズして
いる断片を検出して、分子サイズ標準物質を視覚化した。フィルムを、次いで、Ａｌｌ−
Ｐｒｏ  １００  Ｐｌｕｓフィルム現像器（Ｋｏｎｉｃａ  ＳＲＸ−１０１）で現像し、
画像を報告のために走査した。検出されたバンドの数およびサイズを、各プローブについ
て文書化した。記載されるようなＤＩＧ検出後に視覚化されるＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マ
ーカーＩＩ（ＭＷＭ  ＤＩＧ  ＩＩ）を用いて、サザンブロット上のハイブリダイズして
いる断片のサイズを決定した。
【０１２７】
（実施例２．６）
プローブ除去（stripping）
ＤＮＡプローブを、サザンハイブリダイゼーションデータが得られた後にメンブレンブ
ロットから除去させ、メンブレンブロットは、製造者の推奨する手順に従って（DIG Appl
ication Manual for Filter Hybridization、(2003). Roche Diagnostics）、異なるＤＮ
Ａプローブとのハイブリダイゼーションのために再使用できた。簡単に述べると、シグナ
ル検出およびフィルム曝露の後に、メンブレンブロットをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で十分にすす
ぎ、除去バッファー（０．２Ｎ  ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳ）中でおよそ１５分間、室温
または３７℃で２回洗浄した。メンブレンブロットを、次いで、２×ＳＳＣ中で短く洗浄
し、プレハイブリダイゼーションおよび別のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の準備ができた。メンブレンブロットを、新しい化学発光フィルムに露光して、全てのＤ
ＮＡプローブを、次のハイブリダイゼーションに進む前に確実に除去させた。再露光した
フィルムを、記録のための研究ファイルに以前のハイブリダイゼーションデータパッケー
ジとともに保存した。
【０１２８】
（実施例２．７）
サザンブロットの結果
ｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片の既知の制限酵素部位に基づいて、特定の消化物およ
びプローブで予測される断片サイズおよび観察された断片サイズを、表２に示す。２つの
型の断片をこれらの消化物およびハイブリダイゼーションから同定した：既知の酵素部位
がプローブ領域と接し、ｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片内に完全に含まれる内部断片と
、既知の酵素部位がプローブ領域の一端にあり、第２の部位がトウモロコシゲノム中に予
測される境界断片。境界断片のサイズはイベントにより変動した。なぜなら、ほとんどの
場合、ＤＮＡ断片組み込み部位は各イベントについてユニークであるからである。境界断
片は、組み込まれたＤＮＡに対して制限酵素部位の場所を決定し、ＤＮＡ挿入の数を評価
するための手段を提供する。この研究で完了したサザンブロット解析に基づいて、プラス
ミドｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩからのインタクトなａａｄ−１  ＰＴＵの単一コピーが
、挿入断片地図に詳細に示されるように、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコ
シゲノムに挿入されたと結論付けた（図２〜３）。
【０１２９】
【表２】
0006472474.tif 000006
0006472474.tif 000007
【０１３０】
プラスミドｐＤＡＳ１７４０中にユニーク制限部位を有する制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｎｃ
ｏＩ、ＳａｃＩ、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを選択して、イベントＤＡＳ−４０２７８−
９におけるａａｄ−１遺伝子挿入断片を特徴決定した。＞３３８２ｂｐ、＞２７６４ｂｐ
、＞４３８９ｂｐの境界断片は、それぞれＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ消化の後
にａａｄ−１遺伝子プローブとハイブリダイズすると予想された（表２）。約（〜）１２
０００ｂｐ、約４０００ｂｐおよび約１６０００ｂｐの単一のａａｄ−１ハイブリダイゼ
ーションバンドが、それぞれＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを用いた場合に観察さ
れ、このことは、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコシゲノムにおけるａａｄ
−１遺伝子挿入の単一の部位を示した。ＦｓｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いる二重消化
を選択して、ａａｄ−１植物転写単位（ＰＴＵ、プロモーター／遺伝子／ターミネーター
）を含有する３３６１ｂｐの断片を放出した（表２）。予想される３３６１ｂｐの断片が
、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後にａａｄ−１遺伝子プローブを用いて観察された。
ＤＡＳ−４０２７８−９試料の４つ全ての酵素／酵素の組み合わせでの消化とその後のａ
ａｄ−１遺伝子プローブハイブリダイゼーションで得られた結果は、プラスミドｐＤＡＳ
１７４０からのインタクトなａａｄ−１  ＰＴＵの単一コピーが、イベントＤＡＳ−４０
２７８−９のトウモロコシゲノムに挿入されたことを示した。
【０１３１】
制限酵素ＮｃｏＩ、ＳａｃＩおよびＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを選択して、イベントＤ
ＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１についてのプロモーター（ＺｍＵｂｉ１）領域
を特徴決定した。ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ消化は、ＺｍＵｂｉ１プロモーター領域に特異
的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた場合に、それぞれ＞３４７２ｂｐおよび＞４
３８９ｂｐの境界領域断片を生じると予測される（表２）。約（〜）６３００ｂｐおよび
約３６００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＮｃｏＩ消化の後にＺｍＵｂ
ｉ１プロモータープローブを用いて検出された。しかし、約３６００ｂｐのバンドは、従
来の対照を含む全ての試料のレーンにわたって存在し、このことは、この約３６００ｂｐ
のバンドが、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター（ＺｍＵｂｉ１）プローブがトウ
モロコシ内因性ｕｂｉ遺伝子と相同結合することによる非特異的シグナルバンドであるこ
とを示唆した。これとは対照的に、約６３００ｂｐのシグナルバンドは、試験されたＤＡ
Ｓ−４０２７８−９試料で検出されたが従来の対照では検出されず、このことは、この約
６３００ｂｐのバンドが、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＺｍＵｂｉ１プロモーター
プローブに特異的であり、よって、これが表２に示す予測されたＮｃｏＩ／ＺｍＵｂｉ１
バンドであることを示した。同様に、約３８００ｂｐおよび約１６０００ｂｐの２つのハ
イブリダイゼーションバンドが、ＳａｃＩ消化の後にＺｍＵｂｉ１プロモータープローブ
を用いて検出された。約３８００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料のレーン
において出現し、よって、トウモロコシ内因性ｕｂｉ遺伝子へのＺｍＵｂｉ１プロモータ
ープローブの非特異的ハイブリダイゼーションであると考えられる。ＤＡＳ−４０２７８
−９試料にのみ存在する約１６０００ｂｐのハイブリダイゼーションバンドは、予測され
たＳａｃＩ／ＺｍＵｂｉ１バンドと考えられる。ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩでの二重消化
は、ＺｍＵｂｉ１プロモータープローブとハイブリダイズする３３６１ｂｐのａａｄ−１
ＰＴＵ断片を遊離すると予測される（表２）。この３３６１ｂｐのバンドおよび約６４
００ｂｐの非特異的ハイブリダイゼーションバンドが、ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化の
後にＺｍＵｂｉ１プロモータープローブにより検出された。約６４００ｂｐバンドは、ト
ウモロコシ内因性ｕｂｉ遺伝子とのＺｍＵｂｉ１プロモータープローブの非特異的結合と
考えられる。なぜなら、このバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンに存在するか
らである。さらに、約６４００ｂｐに非常に近い別のバンドが、従来の対照、ＢＣ３Ｓ１
およびいくつかのＢＣ３Ｓ２試料で観察された。約６４００ｂｐに非常に近いこの追加の
バンドも、非特異的であるとみなされる。なぜなら、これは、従来の対照ＸＨＨ１３試料
レーンに存在し、ＸＨＨ１３の遺伝子背景と関連する可能性が高いからである。
【０１３２】
同じ制限酵素／酵素の組み合わせＮｃｏＩ、ＳａｃＩおよびＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
を選択して、イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるターミネーター（ＺｍＰｅｒ５）
領域を特徴決定した。ＮｃｏＩ消化は、ＺｍＰｅｒ５ターミネーター領域に特異的なＤＮ
Ａプローブとハイブリダイズする場合に、＞２７６４ｂｐの境界領域断片を生じると予測
される（表２）。約（〜）４０００ｂｐおよび約３９００ｂｐの２つのハイブリダイゼー
ションバンドが、ＮｃｏＩ消化の後にＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブを用いて検出
された。約３９００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料レーンにわたって存在
し、このことは、この約３９００ｂｐのバンドが、おそらく、トウモロコシ由来ペルオキ
シダーゼ遺伝子ターミネーター（ＺｍＰｅｒ５）プローブがトウモロコシ内因性ｐｅｒ遺
伝子と相同結合することによる非特異的シグナルバンドであることを示唆した。これとは
対照的に、約４０００ｂｐのシグナルバンドは、試験されたＤＡＳ−４０２７８−９試料
で検出されたが従来の対照では検出されず、このことは、この約４０００ｂｐのバンドが
、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブに特異的であ
り、よって、これが表２に示す予測されたＮｃｏＩ／ＺｍＰｅｒ５バンドであることを示
した。＞１８４７ｂｐの境界断片は、ＳａｃＩ消化の後にＺｍＰｅｒ５ターミネータープ
ローブとハイブリダイズすると予測される。約１９００ｂｐおよび約９０００ｂｐの２つ
のハイブリダイゼーションバンドが、ＳａｃＩ消化の後にＺｍＰｅｒ５ターミネータープ
ローブを用いて検出された。約９０００ｂｐのバンドは、従来の対照を含む全ての試料レ
ーンにわたって存在し、よって、トウモロコシ内因性ｐｅｒ遺伝子へのＺｍＰｅｒ５ター
ミネータープローブの非特異的ハイブリダイゼーションであると考えられた。ＤＡＳ−４
０２７８−９試料にのみ存在した約１９００ｂｐのハイブリダイゼーションバンドは、予
測されたＳａｃＩ／ＺｍＰｅｒ５バンドであると考えられる。ＦｓｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
での二重消化は、ＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブとハイブリダイズする３３６１ｂ
ｐのａａｄ−１  ＰＴＵ断片を遊離すると予測される（表２）。この３３６１ｂｐのバン
ドおよび約２１００ｂｐの追加の非特異的ハイブリダイゼーションバンドが、ＦｓｅＩ／
ＨｉｎｄＩＩＩ消化の後のＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブにより検出された。追加
の約２１００ｂｐのバンドは、トウモロコシ内因性遺伝子へのＺｍＰｅｒ５ターミネータ
ープローブの非特異的結合である。なぜなら、このバンドは、陰性対照を含む全ての試料
レーンに存在するからである。ＤＡＳ−４０２７８−９試料のこれらの消化とその後のＺ
ｍＵｂｉ１プロモーターおよびＺｍＰｅｒ５ターミネータープローブのハイブリダイゼー
ションで得られた結果により、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのインタクトなａａｄ−
１  ＰＴＵの単一コピーが、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のトウモロコシゲノムに挿
入されたことがさらに確認された。
【０１３３】
制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｃＩを選択して、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ
−４０２７８−９におけるｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片からの残りの要素について特
徴決定した（表２）。要素ＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３およびＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４のＤＮＡ配
列は、９９．７％を超える同一性を有し、よって、ＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３またはＲＢ７  
Ｍａｒ  ｖ４に特異的なＤＮＡプローブは、ＲＢ７  Ｍａｒのいずれかのバージョンを含
有するＤＮＡ断片とハイブリダイズすると予測された。＞２７６４ｂｐおよび＞３４７２
ｂｐの２つの境界断片は、ＮｃｏＩ消化の後にＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４およびＲＢ７  Ｍａ
ｒ  ｖ３プローブとハイブリダイズすると予測された（表２）。約（〜）４０００ｂｐお
よび約６３００ｂｐの２つのハイブリダイゼーションバンドが、ＤＡＳ−４０２７８−９
試料におけるＮｃｏＩ消化の後にＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４またはＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３プロ
ーブのいずれかを用いて観察された。同様に、＞１８４７ｂｐおよび＞４３８９ｂｐの２
つの境界断片が、ＳａｃＩ消化の後にＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４およびＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３
プローブを用いて予想された（表２）。約１９００ｂｐおよび約１６０００ｂｐのハイブ
リダイゼーションバンドが、ＤＡＳ−４０２７８−９試料において、ＳａｃＩ消化の後に
ＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４またはＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３プローブを用いて検出された。
【０１３４】
まとめると、これらの要素プローブを用いて得られたサザンハイブリダイゼーションの
結果は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９に挿入されたＤＮＡが、インタク
トなａａｄ−１  ＰＴＵを、挿入断片のそれぞれ５’末端および３’末端のマトリクス付
着領域ＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ３およびＲＢ７  Ｍａｒ  ｖ４とともに含有することを示した
。
【０１３５】
（実施例２．８）
主鎖配列の不在
プラスミドｐＤＡＳ１７４０のほぼ全体のＦｓｐＩ主鎖領域（プラスミドｐＤＡＳ１７
４０の４８６７〜７１４３ｂｐ）をカバーする３つのＤＮＡ断片（表１）の等モル比率の
組み合わせを主鎖プローブとして用いて、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０
２７８−９の特徴決定をした。プラスミドｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片を用いて、イ
ベントＤＡＳ−４０２７８−９を作製したので、主鎖プローブの組み合わせを用いて、い
ずれの制限酵素消化の後にも特異的ハイブリダイゼーションシグナルは予測されなかった
（表２）。全てのＤＡＳ−４０２７８−９試料において、ＮｃｏＩまたはＳａｃＩ消化の
後に主鎖プローブを用いて特異的ハイブリダイゼーションシグナルが検出されなかったこ
とが確認された。陽性対照レーンは、予測されたハイブリダイズするバンドを含有し、こ
のことは、プローブが、試料中に存在するならばいずれの相同ＤＮＡ断片ともハイブリダ
イズできたことを証明した。このデータは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−
９の挿入が、プラスミドｐＤＡＳ１７４０からのＦｓｐＩ領域の外側のいずれのベクター
主鎖配列も含まなかったことを示唆した。
【０１３６】
イベントＤＡＳ−４０２７８−９の５つの異なる世代からの葉の試料を用いて、分子特
徴決定のためのサザンブロット解析を行った。組み込みパターンを、選択された制限酵素
消化物およびプローブの組み合わせを用いて調べて、挿入された遺伝子であるａａｄ−１
、ならびに遺伝子発現のプロモーター、ターミネーターを含む非コード領域およびマトリ
クス付着領域の特徴を決定した。
【０１３７】
イベントＤＡＳ−４０２７８−９に挿入されたＤＮＡのサザンブロット特徴決定は、ａ
ａｄ−１  ＰＴＵの単一のインタクトなコピーが、イベントＤＡＳ−４０２７８−９に組
み込まれたことを示す。制限酵素の組み合わせおよびプローブについてのサザンハイブリ
ダイゼーションにより示された分子量はイベントについてユニークであり、その同定パタ
ーンを確立した。ハイブリダイゼーションパターンは、５つ全ての世代にわたって同一で
あり、このことは、挿入断片がトウモロコシゲノム中で安定であることを示す。プラスミ
ドｐＤＡＳ１７４０からのｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ形質転換断片を超える主鎖領域を
カバーするプローブとのハイブリダイゼーションにより、ベクター主鎖配列がイベントＤ
ＡＳ−４０２７８−９に組み込まれていないことが確認される。
【実施例３】
【０１３８】
トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片およびフランキング境界領域に
おけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴決定
挿入されたＤＮＡを特徴決定し、ゲノム挿入部位を示すために、イベントＤＡＳ−４０
２７８−９の挿入断片および境界領域のＤＮＡ配列を決定した。合計で、８５５７ｂｐの
イベントＤＡＳ−４０２７８−９ゲノム配列が確認され、これは、１８７３ｂｐの５’フ
ランキング境界配列、１８６８ｂｐの３’フランキング境界配列および４８１６ｂｐのＤ
ＮＡ挿入断片を含んだ。４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断片は、インタクトなａａｄ−１発現
カセット、５’末端に２５９ｂｐの部分ＭＡＲ  ｖ３および３’末端に１０９６ｂｐの部
分ＭＡＲ  ｖ４を含有する。配列解析により、５’組み込み接合部での２１ｂｐの挿入と
、トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座からの２塩基対の欠失とが明らかになった。１塩基
対の挿入が、トウモロコシゲノムとＤＡＳ−４０２７８−９挿入断片との間の３’組み込
み接合部にて見出された。また、単一塩基変化（ＴからＣ）が、挿入断片中に、３’ＵＴ
Ｒの非コード領域内の５２１２位にて見出された。これらの変化はいずれも、ａａｄ−１
発現カセットのオープンリーディングフレーム組成に影響しない。
【０１３９】
イベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入断片および境界配列に基づくＰＣＲ増幅により、
境界領域がトウモロコシ起源であり、接合部領域を、ＤＡＳ−４０２７８−９のイベント
特異的同定に用いることができたことが確認された。接合部領域にわたる配列の解析は、
新規なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ＞＝２００コドン）が、イベントＤＡＳ−
４０２７８−９におけるＤＮＡ挿入から得られず、ゲノムのオープンリーディングフレー
ムは、天然トウモロコシゲノムへのＤＡＳ−４０２７８−９の組み込みにより遮られなか
ったことを示した。全体として、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−
９の挿入断片および境界配列の特徴決定は、ａａｄ−１発現カセットの単一のインタクト
なコピーが、天然トウモロコシゲノムに組み込まれたことを示した。
【０１４０】
（実施例３．１）
ゲノムＤＮＡ抽出および定量
ゲノムＤＮＡを、凍結乾燥したかまたは新しく粉砕した葉の組織から、ＣＴＡＢ変法を
用いて抽出した。ＤＮＡ試料を、１×ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  
ＥＤＴＡ）（Ｆｌｕｋａ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に溶解し、Ｐｉｃｏ  
Ｇｒｅｅｎ法を製造者の使用説明（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、
ＯＲ）に従って用いて定量した。ＰＣＲ解析のために、ＤＮＡ試料を分子生物学グレード
の水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて希釈して、１０〜１０
０ｎｇ／μＬの濃度を得た。
【０１４１】
（実施例３．２）
ＰＣＲプライマー
表３に、イベントＤＡＳ−４０２７８−９のＤＮＡ挿入断片およびフランキング境界領
域をクローニングするために用いたプライマー配列を、図４に示す位置および記載ととも
に列挙する。表４に、挿入断片および境界配列を確認するために用いたプライマー配列を
列挙する。プライマーの位置は、図４および５にそれぞれ示す。全てのプライマーは、Ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌ
ｌｅ、ＩＡ）で合成した。プライマーを水（５ＰＲＩＭＥ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、
ＭＤ）に、貯蔵溶液のために１００μＭの濃度まで溶解し、作業溶液のために１０μＭの
濃度まで水で希釈した。
【０１４２】
【表３】
0006472474.tif 000008
0006472474.tif 000009
【０１４３】
【表４】
0006472474.tif 000010
【０１４４】
（実施例３．３）
ゲノムウォーキング
ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ユニバーサルキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて、トウモロ
コシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の５’および３’フランキング境界配列をクローニ
ングした。製造者の使用説明に従って、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２
７８−９からの約２．５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＶ、ＳｔｕＩ（ともにキットに
より提供される）またはＳｃａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗ
ｉｃｈ、ＭＡ）を用いて一晩消化した。消化したＤＮＡを、ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）−２５（ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ
）を用いて精製した後に、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）アダプタにライゲーション
して、ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーを構築した。各ＧｅｎｏｍｅＷａ
ｌｋｅｒ（商標）ライブラリーを、キットで提供されるアダプタプライマーＡＰ１と、各
構築物特異的プライマー５Ｅｎｄ３８１２＿Ａおよび３Ｅｎｄ３８１２＿Ｃとを用いる１
次ＰＣＲ増幅のためのＤＮＡ鋳型として用いた。１マイクロリットルの１：２５希釈の１
次ＰＣＲ反応物を、次いで、ネステッドアダプタプライマーＡＰ２と、各ネステッド構築
物特異的プライマー５Ｅｎｄ３８１２＿Ｂと３Ｅｎｄ３８１２＿Ｄとを用いる２次ＰＣＲ
増幅のための鋳型として用いた。ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＨＳ（Ｔａｋａｒ
ａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）をＰＣＲ増幅において用いた。５０μ
ＬのＰＣＲ反応中に、１μＬのＤＮＡ鋳型、８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、０
．２μＭの各プライマー、２．５単位のＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（商標）ＨＳ  ＤＮ
Ａポリメラーゼ、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ２＋プラス）、およ
び１．５μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いた。具体的なＰＣＲ条件を表５に列挙する。
【０１４５】
【表５】
0006472474.tif 000011
【０１４６】
（実施例３．４）
従来のＰＣＲ
標準的なＰＣＲを用いて、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるＤＮ
Ａ挿入断片および境界配列をクローニングして確認した。ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（
商標）（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）、ＨｏｔＳｔａｒ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｅｘｐａｎｄ
Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）またはＥａｓｙ−Ａ（登録商標）Ｈｉｇ
ｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲクローニング酵素＆マスターミックス（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を、製造者が推奨する手順に従う従来のＰＣＲ増幅のため
に用いた。具体的なＰＣＲ条件およびアンプリコンの説明を、表６に列挙する。
【０１４７】
【表６】
0006472474.tif 000012
【０１４８】
（実施例３．５）
ＰＣＲ生成物の検出、精製、ＰＣＲ生成物のサブクローニングおよび配列決定
ＰＣＲ生成物を、製品の使用説明に従って、１．２％または２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いる電気泳動により調査した。断片サイズを
、ＤＮＡマーカーとの比較により見積もった。必要であれば、ＰＣＲ断片を、臭化エチジ
ウムで染色した１×ＴＢＥ中の１％アガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット
（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて断片を切り出すことにより精製した
。
【０１４９】
ＰＣＲ断片を、ｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）中に、配列決定のための
ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、ＣＡ）を製品の使用説明に従って用いることによりサブクローニングした。具
体的には、２〜５マイクロリットルのＴＯＰＯ（登録商標）クローニング反応を、Ｏｎｅ
Ｓｈｏｔ化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞に、製造者の使用説明に従って形質転換し
た。クローニングされた断片は、プラスミドＤＮＡ（ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップ
キット、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の少量調製と、その後のＥｃｏＲＩで
の制限消化またはキットで提供されるＴ３およびＴ７プライマーを用いる直接のコロニー
ＰＣＲにより確認した。プラスミドＤＮＡまたは選択されたコロニーのグリセロールスト
ックを、次いで、配列決定に送った。
【０１５０】
サブクローニングの後に、推定標的ＰＣＲ生成物を、まず配列決定して、予測されるＤ
ＮＡ断片がクローニングされていることを確認した。適当なＤＮＡ配列を含有するコロニ
ーを、プライマーウォーキングのために選択して、完全なＤＮＡ配列を決定した。配列決
定は、Ｃｏｇｅｎｉｃｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）により行った。
【０１５１】
挿入断片および境界配列の最終的な組み立てを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェア（
バージョン４．８  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏ
ｒ、ＭＩ）を用いて完了した。トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片
および境界配列のアノテーションは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（バージョン１０および１１
、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて行った。
【０１５２】
相同性検索は、ＢＬＡＳＴプログラムをＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して用いて行
った。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（バージョン１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）解析を行って、完全な挿入断片およびフランキング境
界配列におけるＯＲＦ（＞＝２００コドン）を同定した。
【０１５３】
（実施例３．６）
５’末端境界配列
ＤＮＡ断片を、各トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９  ＧｅｎｏｍｅＷａｌ
ｋｅｒ（商標）ライブラリーから、導入遺伝子の５’末端についての特異的ネステッドプ
ライマーセットを用いて増幅した。およそ８００ｂｐのＰＣＲ生成物が、イベントＤＡＳ
−４０２７８−９  ＥｃｏＲＶおよびＳｔｕＩ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライ
ブラリーの両方から観察された。ＳｃａＩ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラ
リーは、約２ｋｂの生成物を生じた。断片をｐＣＲ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標
）にクローニングし、各ライブラリーからの６つのコロニーを、末端の配列決定のために
無作為に採取して、挿入断片が予測される配列を含有することを確認した。挿入断片のプ
ライマーウォーキングによる完全な配列決定により、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０
２７８−９  ＳｔｕＩ、ＥｃｏＲＶおよびＳｃａＩ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）
ライブラリーから増幅される断片が、それぞれ７９３、８２２および２１３２ｂｐであっ
たことが明らかになった。ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＶ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標
）ライブラリーから作製したＤＮＡ断片は、ＳｃａＩ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標
）ライブラリーから作製したＤＮＡ断片と１００％一致し、このことは、これらのＤＮＡ
断片が、導入遺伝子挿入断片の５’領域から増幅されたことを示唆した。得られた１８７
３ｂｐのトウモロコシゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索は、トウモロコシＢＡＣクローンの配
列と高い類似性を示した。さらに、挿入接合部の配列解析は、９１７ｂｐのＭＡＲ  ｖ３
が、その５’末端領域にて、プラスミドｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩ断片と比較して切断
され、ａａｄ−１発現カセットの５’領域にて２５９ｂｐの部分ＭＡＲ  ｖ３が残ってい
ることを示した。
【０１５４】
（実施例３．７）
３’末端境界配列
およそ３ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９
ＳｔｕＩ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ（商標）ライブラリーから、導入遺伝子の３’末
端についての特異的ネステッドプライマーセットを用いて増幅した。ＤＮＡ断片を、ｐＣ
Ｒ（登録商標）４−ＴＯＰＯ（登録商標）にクローニングし、１０のコロニーを、末端の
配列決定のために無作為に採取して、予測される配列の挿入を確認した。予測される挿入
断片を有する３つのクローンを完全に配列決定し、２９９７ｂｐのＤＮＡ断片を産出した
。このＤＮＡ断片の配列解析により、部分ＭＡＲ  ｖ４要素（その５’領域の７０ｂｐを
欠く）および１８６７ｂｐのトウモロコシゲノム配列が明らかになった。ＢＬＡＳＴ検索
は、１８６７ｂｐのゲノムＤＮＡ配列が、５’境界配列で同定されたのと同じトウモロコ
シＢＡＣクローンにおける配列と１００％一致したことを示した。
【０１５５】
（実施例３．８）
ＤＮＡ挿入断片および接合部配列
ＤＮＡ挿入断片および接合部領域を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９か
ら、以前に記載したようなＰＣＲに基づく方法を用いてクローニングした。５つのプライ
マー対を、５’および３’フランキング境界配列と予測される導入遺伝子配列とに基づい
て設計した。合計で、５つのオーバーラップＤＮＡ断片（１７６７ｂｐのアンプリコン１
、１７０３ｂｐのアンプリコン２、１７００ｂｐのアンプリコン３、１９８４ｂｐのアン
プリコン４および１４８４ｂｐのアンプリコン５）をクローニングし、配列決定した（図
４）。全体の挿入断片およびフランキング境界配列を、５つの断片のうちのオーバーラッ
プ配列に基づいて組み立てた。最終的な配列では、ｐＤＡＳ１７４０／ＦｓｐＩに由来す
る４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断片、１８７３ｂｐの５’フランキング境界配列および１８
６８ｂｐの３’フランキング境界配列の存在が確認される。４８１６ｂｐのＤＮＡ挿入断
片は、インタクトなａａｄ−１発現カセット、５’末端に２５９ｂｐの部分ＭＡＲ  ｖ３
および３’末端に１０９６ｂｐの部分ＭＡＲ  ｖ４を含有する（配列番号２９）。
【０１５６】
各プライマー対について少なくとも２つのクローンを、プライマーウォーキングのため
に用いて、ＤＮＡ挿入断片およびその境界配列についての完全な配列情報を得た。配列解
析は、５’組み込み接合部にて、トウモロコシゲノムＤＮＡとｐＤＡＳ１７４０／Ｆｓｐ
Ｉからの組み込まれた部分ＭＡＲ  ｖ３との間に２１ｂｐの挿入を示した。ＢＬＡＳＴ検
索およびＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ解析の結果は、２１ｂｐの挿入ＤＮＡが、いずれの植物種
のＤＮＡまたはｐＤＡＳ１７４０プラスミドＤＮＡとも相同性を示さなかったことを示し
た。単一塩基対挿入が、３’組み込み接合部にて、トウモロコシゲノムＤＮＡとｐＤＡＳ
１７４０／ＦｓｐＩからの部分ＭＡＲ  ｖ４との間に見出された。ＤＮＡの組み込みは、
トウモロコシゲノムの挿入遺伝子座にて２塩基対の欠失ももたらした（図６）。さらに、
５２１２ｂｐの位置にて１つのヌクレオチドの相違（ＴからＣ）が、ＤＮＡ挿入断片の非
翻訳３’ＵＴＲ領域において観察された（配列番号２９）。しかし、これらの変化のいず
れも、ａａｄ−１発現にとって重要でなく、ＤＡＳ−４０２７８−９の挿入断片において
接合部にわたっていずれの新しいＯＲＦ（＞＝２００コドン）も創出しないとみられる。
【０１５７】
（実施例３．９）
トウモロコシゲノム配列の確認
トウモロコシゲノムにおけるイベントＤＡＳ−４０２７８−９導入遺伝子の挿入部位を
確認するために、ＰＣＲ増幅を、異なるプライマー対を用いて行った（図４）。イベント
ＤＡＳ−４０２７８−９およびその他のトランスジェニックまたは非トランスジェニック
トウモロコシ系統からのゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。２つのａａｄ−１特異的プラ
イマーであるＡＩ５Ｅｎｄ０１およびＡＩ５Ｅｎｄ０２と、５’末端境界配列に基づいて
設計した２つのプライマーである１Ｆ５Ｅｎｄ０１および１Ｆ５Ｅｎｄ０２とを用いて、
ａａｄ−１遺伝子が５’末端境界領域に及ぶＤＮＡ断片を増幅した。同様に、ａａｄ−１
が３’末端境界配列に及ぶＤＮＡ断片を増幅するために、３’末端境界配列に由来する１
Ｆ３Ｅｎｄ０５プライマーと、ａａｄ−１特異的ＡＩ３Ｅｎｄ０１プライマーとを用いた
。予測されるサイズのＤＮＡ断片は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７
８−９のゲノムＤＮＡからのみ、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−
９のフランキング境界にある一方のプライマーと、一方のａａｄ−１特異的プライマーと
からなる各プライマー対を用いて増幅された。対照ＤＮＡ試料は、同じプライマー対を用
いてＰＣＲ生成物を生じず、このことは、クローニングされた５’末端および３’末端の
境界配列が、実際に、挿入されたａａｄ−１遺伝子構築物のそれぞれ上流および下流の配
列であることを示した。約８ｋｂのサイズのかすかなバンドが、ＡＡＤ−１トウモロコシ
イベントＤＡＳ−４０２７８−９、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０４７４
および非トランスジェニックトウモロコシ系統ＸＨＨ１３を含む全てのトウモロコシ試料
から、１Ｆ５Ｅｎｄ０１およびＡＩ５Ｅｎｄ０１のプライマー対をＰＣＲ増幅に用いた場
合に観察されたことに注意されたい。観察されたかすかなバンド（調製したゲル上で）は
、このプライマー対を用いてのトウモロコシゲノムにおける非特異的増幅の結果であり得
る。
【０１５８】
トウモロコシゲノムにおけるＤＮＡ挿入をさらに確認するために、５’末端境界配列に
ある２つのプライマー１Ｆ５Ｅｎｄ０３および１Ｆ５Ｅｎｄ０４と、３’末端境界配列に
ある２つのプライマー１Ｆ３Ｅｎｄ０３および１Ｆ３Ｅｎｄ０４とを用いて、挿入遺伝子
座に及ぶＤＮＡ断片を増幅した。プライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０３／１Ｆ３Ｅｎｄ０３また
はプライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０４／１Ｆ３Ｅｎｄ０４のいずれかを用いたＰＣＲ増幅によ
り、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のゲノムＤＮＡからおよそ
８ｋｂの予測されるサイズを有する断片が得られた。これとは対照的に、ＡＡＤ−１トウ
モロコシイベントＤＡＳ−４０４７４−７または非トランスジェニックトウモロコシ系統
ＸＨＨ１３のゲノムＤＮＡからは、ＰＣＲ生成物は得られなかった。ＡＡＤ−１トウモロ
コシイベントＤＡＳ−４０２７８−９およびイベントＤＡＳ−４０４７４−７がＨｉＩＩ
の形質転換と、その後の元のトランスジェニックイベントのトウモロコシ系統ＸＨＨ１３
との戻し交雑により作製されたことに鑑みて、これらの２つのイベントのそれぞれにおけ
るゲノムの大部分は、トウモロコシ系統ＸＨＨ１３に理論的に由来する。ａａｄ−１導入
遺伝子に近いフランキング境界配列だけが、元のゲノムＤＮＡから持ち越され、ＡＡＤ−
１イベント遺伝子移入プロセス中に保存されたが、ゲノム配列のその他の領域は、ＸＨＨ
１３のゲノム配列により置き換えられたと考えられる。したがって、ＡＡＤ−１トウモロ
コシイベントＤＡＳ−４０４７４−７およびＸＨＨ１３のゲノムＤＮＡから、プライマー
対１Ｆ５Ｅｎｄ０３／１Ｆ３Ｅｎｄ０３またはプライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０４／１Ｆ３Ｅ
ｎｄ０４のいずれを用いても断片が増幅されなかったことは、驚くことではない。およそ
３．１および３．３ｋｂの断片が、プライマー対１Ｆ５Ｅｎｄ０３／１Ｆ３Ｅｎｄ０３お
よび１Ｆ５Ｅｎｄ０４／１Ｆ３Ｅｎｄ０４をそれぞれ用いて、トウモロコシ系統ＨｉＩＩ
およびＢ７３のゲノムＤＮＡから増幅されたが、トウモロコシ系統Ａ１８８では増幅され
なかった。この結果は、境界配列がトウモロコシ系統Ｂ７３のゲノムを起源とすることを
示す。
【０１５９】
Ｂ７３／ＨｉＩＩからのトウモロコシゲノムＤＮＡのさらなるクローニングを行って、
フランキング境界配列の正当性を確実にした。ＰＣＲ増幅断片を配列決定して、Ｂ７３／
ＨｉＩＩゲノムＤＮＡの特定の場所に組み込まれた挿入ＤＮＡ領域を証明した。プライマ
ーは、得られた配列に基づいて設計した。プライマーセットＡｍｐ１Ｆ／Ａｍｐ５Ｒを用
いて、天然Ｂ７３／ＨｉＩＩゲノムからの５’から３’の接合部に及ぶ、挿入ＤＮＡを有
さない２２１２ｂｐの断片を増幅した。配列解析により、導入遺伝子挿入遺伝子座におい
て天然Ｂ７３ゲノムから２塩基対の欠失があったことが明らかになった。クローニングさ
れた天然Ｂ７３ゲノム断片からのＤＮＡ配列の解析は、１つのＯＲＦ（＞＝２００コドン
）が３’組み込み接合部領域の下流にあることを同定した。さらに、ＡＡＤ−１トウモロ
コシイベントＤＡＳ−４０２７８−９が組み込まれた元の遺伝子座にわたって、その他の
ＯＲＦは存在しない。ＢＬＡＳＴ検索によっても、イベントＤＡＳ４０２７８−９からの
５’末端および３’末端の両方の境界配列が、同じトウモロコシＢＡＣクローン上で隣同
士にあることが確認された。
【０１６０】
ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の５’組み込み接合部の独自
性に鑑みて、特異的ＰＣＲプライマーの２つの対である１Ｆ５ＥｎｄＴ１Ｆ／１Ｆ５Ｅｎ
ｄＴ１ＲおよびＣｏｒｎ２７８−Ｆ／Ｃｏｒｎ２７８−Ｒを設計して、この挿入断片から
植物ゲノムへの接合部を増幅した。予想されたように、所望のＤＮＡ断片は、ＡＡＤ−１
トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９のゲノムＤＮＡでのみ生じたが、いずれの
その他のトランスジェニックまたは非トランスジェニックトウモロコシ系統では生じなか
った。したがって、これらの２つのプライマー対は、ＡＡＤ−１トウモロコシイベントＤ
ＡＳ−４０２７８−９イベント特異的な識別子として用いることができる。
【実施例４】
【０１６１】
ＤＡＳ−４０２７８−９のフランキングＳＳＲマーカーによるゲノムの特徴決定
ゲノム挿入部位を特徴決定して示すために、挿入断片の近傍にあるマーカー配列を決定
した。多形ＳＳＲマーカーのパネルを用いて、導入遺伝子の場所を同定して地図にした。
イベントｐＤＡＳ１７４０−２７８は、第２染色体上で、２００８ＤＡＳトウモロコシ連
鎖地図上のおよそ２０ｃＭにてＳＳＲマーカーであるＵＭＣ１２６５とＭＭＣ０１１１と
の間のおよそ２０ｃＭにある。表６に、導入遺伝子ｐＤＡＳ１７４０−２７８の近傍にあ
ると見出されるこれらの２つのマーカーについてのプライマー情報をまとめる。
【０１６２】
0006472474.tif 000013
【０１６３】
（実施例４．１）
ｇＤＮＡ単離
ｇＤＮＡを、葉の押し抜きからＤＮＥａｓｙ  ９６植物テストキット（Ｑｉａｇｅｎ、
Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて抽出した。プロトコールを改変して
、自動化のために適応させた。単離されたｇＤＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ
ｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）からのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素を用い
て定量した。ｇＤＮＡの濃度を、全ての試料について５ｎｇ／μｌに、滅菌脱イオン水を
用いて希釈した。
【０１６４】
（実施例４．２）
マーカーを用いるｇＤＮＡのスクリーニング
希釈したｇＤＮＡの遺伝子型を、単純配列反復（ＳＳＲ）マーカーのサブセットを用い
て決定した。ＳＳＲマーカーを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ
Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ／ＶＩＣまたはＮＥＤ（そ
れぞれ青、緑および黄色）の蛍光タグで標識したフォワードプライマーを用いて合成した
。マーカーをそれらの蛍光タグおよびアンプリコンサイズに基づいて群またはパネルに分
けて、ＰＣＲ後の多重化および分析を容易にした。
【０１６５】
ＰＣＲを、３８４ウェルアッセイプレートにおいて、５ｎｇのゲノムＤＮＡ、１．２５
×ＰＣＲバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、０．
２０μＭの各フォワードおよびリバースプライマー、１．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０
１５ｍＭの各ｄＮＴＰならびに０．３単位のＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有する各反応で行
った。増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００において、３８４−二重ヘッド
モジュール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行った。増幅プログラムは、次のとおりであった：（１）９５
℃にて１２分間のＴａｑの最初の活性化、（２）９４℃にて３０秒、（３）５５℃にて３
０秒、（４）７２℃にて３０秒、（５）ステップ２〜４を４０サイクル反復、そして（６
）７２℃にて３０分間の最終伸長。各ＳＳＲマーカーパネルについてのＰＣＲ生成物を、
同じ植物からの２μｌの各ＰＣＲ生成物を合計容量６０μｌの滅菌脱イオン水に加えるこ
とにより一緒に多重化した。多重化したＰＣＲ生成物のうち、０．５μｌを、１：１００
比率のＧｅｎｅＳｃａｎ５００塩基対ＬＩＺサイズ標準物質およびＡＢＩ  ＨｉＤｉホル
ムアミド（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａ）を含む５μｌのローディングバッファーを含有する３８４ウェルローディ
ングプレートにスタンプした（stamped）。試料を、次いで、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７
３０ｘｌ  ＤＮＡアナライザ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  
Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に、製造者の推奨を用いて３６分間の全運転時間でキ
ャピラリー電気泳動のために載せた。マーカーのデータは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７３
０ｘｌ自動化シーケンサーデータ収集ソフトウェアバージョン４．０により収集し、Ｇｅ
ｎｅＭａｐｐｅｒ４．０ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により
、対立遺伝子特徴決定および断片サイズ標識について収集した。
【０１６６】
（実施例４．３）
ＳＳＲマーカーの結果
導入遺伝子の近傍で同定されたフランキングマーカーについてのプライマーデータを、
表６に列挙する。２つの緊密に関連するマーカーであるＵＭＣ１２６５およびＭＭＣ０１
１１は、第２染色体上の導入遺伝子挿入断片からおよそ２０ｃＭ離れて配置される。
【実施例５】
【０１６７】
イベントＤＡＳ−４０２７８−９におけるａａｄ−１タンパク質の特徴決定
トランスジェニックメイズイベントＤＡＳ−４０２７８−９に由来する組換えａａｄ−
１タンパク質の生化学的特性を、特徴決定した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルーで染色、および糖タンパク質検
出法）、ウェスタンブロット、免疫診断テストストリップアッセイ、マトリクス支援レー
ザ脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）およびタンデムＭＳ
によるタンパク質配列決定解析を用いて、タンパク質の生化学的特性を特徴決定した。
【０１６８】
（実施例５．１）
免疫診断ストリップアッセイ
ＤＡＳ−４０２７８−９の葉の組織におけるａａｄ−１タンパク質の存在を、Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ  Ｂｉｏｎｏｓｔｉｃａからの商業的に調製された免疫診断テストストリップを
用いて確認した。ストリップは、葉の粗抽出物を試験することにより、トランスジェニッ
ク植物と非トランスジェニック植物とを区別できた（データは示さず）。非トランスジェ
ニック抽出物（ＸＨＨ１３）は、検出可能な量の免疫反応性タンパク質を含有しなかった
。この結果は、ウェスタンブロット解析によっても確認された。
【０１６９】
ａａｄ−１タンパク質の発現を試験するために、免疫診断ストリップ解析を行った。４
つの葉の押し抜きを、ＸＨＨ１３（対照植物）およびイベントＤＡＳ−４０２７８−９の
それぞれの植物から、個別の標識された１．５ｍＬのマイクロフュージチューブのスナッ
プキャップの蓋の間に組織を挟むことにより回収した。実験室で受け取る際に、０．５ｍ
Ｌのａａｄ−１抽出バッファー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｎｏｓｔｉｃａ、Ｓｗｅｄｅ
ｓｂｏｒｏ、ＮＪ）を各チューブに加え、組織を、使い捨て乳棒を用い、その後、試料を
約１０秒間振とうすることによりホモジナイズした。ホモジナイゼーションの後に、テス
トストリップをチューブに入れ、約５分間展開させた。植物抽出物中のａａｄ−１タンパ
ク質の存在または不在は、免疫診断ストリップ上にテストラインが出現する（または出現
しない）ことに基づいて確認された。ａａｄ−１タンパク質の発現がトランスジェニック
イベントについて一旦確認されると、メイズの茎の組織を収穫し、凍結乾燥し、使用時ま
でおよそ−８０℃で貯蔵した。
【０１７０】
（実施例５．２）
トウモロコシからのａａｄ−１タンパク質の精製
免疫精製されたメイズ由来のａａｄ−１タンパク質（分子量：約３３ｋＤａ）またはト
ウモロコシ茎組織からの水性粗抽出物を調製した。全ての葉および茎の組織を収穫し、実
験室まで次のようにして輸送した。葉を、ハサミで植物から切断し、布の袋に入れ、将来
の使用のためにおよそ−２０℃で貯蔵した。別に、茎を土壌の線のすぐ上で切断し、布の
袋に入れ、およそ−８０℃にて約６時間、すぐに凍結させた。茎を、次いで、凍結乾燥器
に５日間いれて水分を除去した。組織が一旦完全に乾燥したら、これらを微細な粉末にド
ライアイスを用いて粉砕し、必要になるまでおよそ−８０℃にて貯蔵した。
【０１７１】
メイズ由来のａａｄ−１タンパク質を、凍結乾燥した茎の組織から、リン酸塩ベースの
バッファー（バッファー成分について表７を参照されたい）中で、約３０グラムの凍結乾
燥組織を、冷却した１０００ｍＬのガラスブレンダーに秤量し、５００ｍＬの抽出バッフ
ァーを加えることにより抽出した。組織を、ハイで６０秒間ブレンドし、可溶性タンパク
質を、試料を３０，０００×ｇにて２０分間遠心分離することにより採集した。ペレット
を記載されるようにして再抽出し、上清を併せ、０．４５μフィルタを通して濾過した。
濾過した上清を、およそ＋４℃にて、；ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａ
ｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にコンジュゲートされた、Ｓｔｒａｔｅ
ｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（ＭＡｂ  ４７３Ｆ１  ８５．１；精製プロ
テインＡ；ロット＃：６０９．０３Ｃ−２−４；６．５ｍｇ／ｍＬ（合計約３５．２ｍｇ
））（Ｗｉｎｄｈａｍ、ＭＥ）により調製されたモノクローナル抗体とコンジュゲートさ
れた抗ａａｄ−１免疫親和性カラムに載せた。未結合タンパク質を回収し、カラムを予め
冷却した２０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファーｐＨ８．０で十分に洗浄した。結合した
タンパク質は、３．５Ｍ  ＮａＳＣＮ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、５０ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ８．０バッファーを用いて溶
出された。７つの５ｍＬ画分を回収し、画分番号２→７を一晩、およそ＋４℃にて１０ｍ
Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０バッファーに対して透析した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび
ウェスタンブロットにより調べ、残りの試料をおよそ＋４℃にて、その後の解析に用いる
まで貯蔵した。
【０１７２】
【表７】
0006472474.tif 000014
【０１７３】
免疫親和性カラムと結合したタンパク質をＳＤＳＰＡＧＥにより調べ、結果は、溶出さ
れた画分が、ａａｄ−１タンパク質を、３３ｋＤａのおおよその分子量で含有したことを
示した。さらに、ウェスタンブロットも行って、これは、ａａｄ−１タンパク質について
陽性であった。メイズ由来ａａｄ−１タンパク質を、約３０ｇの凍結乾燥茎材料から単離
した。
【０１７４】
（実施例５．３）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
イベントＤＡＳ−４０２７８−９およびＸＨＨ１３の茎からの凍結乾燥組織（約１００
ｍｇ）を２ｍＬマイクロフュージチューブに秤量し、１０％植物プロテアーゼ阻害剤カク
テル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する約１ｍＬのＰＢＳＴ（Ｓｉｇｍ
ａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で抽出した。抽出は、４つの小さいボールベアリングを加
え、試料を１分間Ｇｅｎｏ粉砕することにより容易にした。粉砕の後に、試料を２０，０
００×ｇにて５分間遠心分離し、上清を４：１で５×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー
（２％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、０．２ｍｇ／ｍＬブロモフェノールブ
ルー、１０％の新しく加えた２−メルカプトエタノールを含有する５０％（ｗ／ｗ）グリ
セロール）と混合し、約１００℃にて５分間加熱した。短い遠心分離の後に、４５μＬの
上清を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎセルゲルモジュールに装着されたＢｉｏＲａｄ  Ｃｒｉｔｅ
ｒｉｏｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に直接載
せた。微生物由来ａａｄ−１の陽性の参照標準物質を、１ｍｇ／ｍＬにてＰＢＳＴ  ｐＨ
７．４に再懸濁し、ＰＢＳＴでさらに希釈した。試料を、次いで、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａ
ｅｍｍｌｉバッファーと５％２−メルカプトエタノールとともに混合し、前に記載するよ
うにして処理した。電気泳動は、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳバッファー（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、１５０〜２００Ｖの電圧で、前方の色素がゲル
の端に到達するまで行った。分離の後に、ゲルを半分に切断し、一方の半分を、Ｐｉｅｒ
ｃｅ  ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅタンパク質染色を用いて染色し、他方の半分を、ニトロ
セルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に、Ｍｉｎｉトラン
スブロット電気トランスファーセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を６０
分間、１００ボルトの一定電圧の下で用いてエレクトロブロットした。トランスファーバ
ッファーは、２０％メタノールおよびＢｉｏ−ＲａｄからのＴｒｉｓ／グリシンバッファ
ーを含有していた。免疫検出のために、メンブレンを、ａａｄ−１特異的ポリクローナル
ウサギ抗体（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗａｒｋ、
ＤＥ、プロテインＡ精製ウサギポリクローナル抗体ロット＃：ＤＡＳ  Ｆ１  １９７−１
５  １、１．６ｍｇ／ｍＬ）でプローブ付加した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）とアル
カリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）との
コンジュゲートを２次抗体として用いた。ＳｉｇｍａＦａｓｔ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を
、免疫反応性タンパク質バンドを現像して視覚化するために用いた。メンブレンを水で十
分に洗浄して反応を停止させ、結果の記録を、デジタルスキャナ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａ
ｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて取得した。
【０１７５】
ピー・フルオレセンス（P. fluorescens）により生成されるａａｄ−１において、クー
マシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて視覚化される主なタンパク質バンドは、
およそ３３ｋＤａであった。予測されたように、対応するメイズ由来ａａｄ−１タンパク
質（イベントＤＡＳ−４０２７８−９）は、微生物により発現されるタンパク質と同一の
サイズであった。予想されたように、植物の精製された画分は、ａａｄ−１タンパク質に
加えて、マイナーな量の非免疫反応性不純物を含有した。同時精製されたタンパク質は、
カラムマトリクスとの弱い相互作用によりカラムに保持されているか、厳しい溶出条件下
でカラムからモノクローナル抗体を浸出させると考えられた。他の研究者も、臭化シアン
活性化セファロース４Ｂ免疫吸着剤上でのペプチドおよびアミノ酸の非特異的吸着につい
て報告している（KennedyおよびBarnes、1983;Holroydeら、1976;PodlaskiおよびStern、
2008）。
【０１７６】
シュードモナス（Pseudomonas）由来ａａｄ−１タンパク質は、ポリクローナル抗体ウ
ェスタンブロット解析により、予測されるサイズの陽性シグナルを示した。これは、ＤＡ
Ｓ−４０２７８−９トランスジェニックメイズ茎抽出物においても観察された。ａａｄ−
１ウェスタンブロット解析において、免疫反応性タンパク質は、対照ＸＨＨ１３抽出物に
おいて観察されず、代替のサイズのタンパク質（凝集体または分解生成物）は、トランス
ジェニック試料において観察されなかった。
【０１７７】
（実施例５．４）
翻訳後グリコシル化の検出
免疫親和性クロマトグラフィーにより精製されたメイズ由来ａａｄ−１タンパク質（画
分＃３）を、４：１で５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合した。微生物由来ａａｄ−１
、ダイズトリプシン阻害剤、ウシ血清アルブミンおよびセイヨウワサビペルオキシダーゼ
を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で、植物由来ａａｄ−１のおおよその濃度まで希釈し、Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ  Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合した。タンパク質を、次いで、約９５℃にて５分
間加熱し、２００００×ｇにて２分間遠心分離して、清澄化された上清を得た。得られた
上清を、Ｂｉｏ−ＲａｄＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲルに直接アプライし、ＸＴ  ＭＥＳ泳動バ
ッファー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で、電気泳動を１７０Ｖにて約６
０分間運転した以外は本質的に上で記載したようにして電気泳動した。電気泳動の後に、
ゲルを半分に切断し、一方の半分を、全タンパク質について、製造者のプロトコールに従
ってＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染料で染色した。染色が完了した後に、ゲルを、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ濃度計で走査して、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。ゲ
ルの他方の半分は、ＧｅｌＣｏｄｅ糖タンパク質染色キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、製造者のプロトコールに従って用いて染色して、
糖タンパク質を視覚化した。糖タンパク質（検出限界はバンドあたり０．６２５ｎｇほど
低い）を、淡いピンクの背景の上にマゼンタのバンドとして視覚化した。糖タンパク質染
色が完了した後に、ゲルをＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄデジタルスキャナで走査して
、ゲルの永続的な視覚的記録を得た。グリコシル化染色の画像を取得した後に、ゲルをＧ
ｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅで染色して、非グリコシル化タンパク質の存在について確認した
。結果は、メイズ由来および微生物由来のａａｄ−１タンパク質がともに、検出可能な共
有結合された炭水化物を有さないことを示した。この結果は、ペプチド質量フィンガープ
リンティングによっても確認された。
【０１７８】
（実施例５．５）
メイズ由来およびシュードモナス（Pseudomonas）由来のａａｄ−１の質量分析ペプチド
質量フィンガープリンティングおよび配列決定
シュードモナス（Pseudomonas）由来およびメイズ由来のａａｄ−１の質量分析解析を
行った。トランスジェニックトウモロコシの茎に由来するａａｄ−１タンパク質（イベン
トＤＡＳ−４０２７８−９）を、トリプシンによる溶液消化に供し、その後、ＭＡＬＤＩ
−ＴＯＦ  ＭＳおよびＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳに供した。検出されたペプチドの質量を、メイ
ズ由来ａａｄ−１タンパク質の配列における可能性のあるプロテアーゼ切断部位に基づい
て推定したものと比較した。理論的切断は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで、Ｐｒｏｔｅｏｍｅｔ
ｒｉｃｓ  ＬＬＣからのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｈｅｅｔ（ＰＡ
ＷＳ）フリーウェアを用いて作製した。一旦変性させたａａｄ−１タンパク質は、プロテ
アーゼにより容易に消化され、多数のペプチドピークを生じる。
【０１７９】
トランスジェニックメイズ由来ａａｄ−１タンパク質（イベントＤＡＳ−４０２７８−
９）のトリプシン消化において、検出されたペプチド断片は、タンパク質のＣ末端にて１
つの小さいトリプシン断片であるＦ２４８〜Ｒ２５３と、１つの短い（２アミノ酸）ペプ
チド断片とだけを欠いて、ほぼ完全なタンパク質配列をカバーした。この解析により、メ
イズ由来タンパク質アミノ酸配列が、微生物由来ａａｄ−１タンパク質のものと一致した
ことが確認された。これらの解析の結果は、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質のアミノ酸
配列が、ピー・フルオレセンス（P. fluorescens）発現タンパク質と等価であったことを
示す。
【０１８０】
（実施例５．５．１）
トリプシンペプチド断片配列決定
ペプチド質量フィンガープリンティングに加えて、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質（
メイズイベントＤＡＳ−４０２７８−９から免疫親和性精製された）のＮおよびＣ末端の
アミノ酸残基を配列決定し、微生物由来タンパク質の配列と比較した。タンパク質配列を
、タンデム質量分析により、微生物由来およびメイズ由来タンパク質の最初の１１残基に
ついて得た（表８）。両方のタンパク質についてのアミノ酸配列は、Ａ’ＨＡＡＬＳＰＬ
ＳＱＲ”（配列番号３０）であり、Ｎ末端のメチオニンは、アミノペプチダーゼにより除
去されていることが示された（表８）。Ｎ末端ａａｄ−１タンパク質配列は、Ｍ’ＡＨＡ
ＡＬＳＰＬＳＱＲ’２（配列番号３１）と予測された。これらの結果は、メイズおよびピ
ー・フルオレセンス（P. fluorescens）における翻訳の間またはその後に、Ｎ末端メチオ
ニンが、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断されることを示唆する。Ｍ
ＡＰは、タンパク質の２番目の残基がＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ
およびＶａｌのように小さい場合、メチオニル残基を迅速に切断する（Walsh、2006）。
メチオニンが除去されていることに加えて、ａａｄ−１タンパク質のＮ末端ペプチドの小
さい部分が、Ｎ末端メチオニンが切断された後にアセチル化されたことが示された（表８
）。この結果は、真核生物（植物）発現タンパク質でしばしば遭遇する。なぜなら、およ
そ８０〜９０％のＮ末端残基が改変されるからである（PolevodaおよびSherman、2003）
。また、セリンおよびアラニンをＮ末端に有するタンパク質は、最も頻繁にアセチル化さ
れることが示されている（PolevodaおよびSherman、2002）。２つの同時翻訳プロセス、
Ｎ末端メチオニン残基の切断およびＮ末端アセチル化は、はるかに最も一般的な改変であ
り、大多数の真核生物タンパク質（約８５％）で生じる（PolevodaおよびSherman、2002
）。しかし、Ｎ末端アセチル化に関連する生物学的重要性を証明する例は希である（Pole
vodaおよびSherman、2000）。
【０１８１】
【表８】
0006472474.tif 000015
【０１８２】
Ｎ−アセチル化に加えて、メイズ由来ａａｄ−１タンパク質の精製中に、わずかなＮ末
端切断も出現した（表８）。これらの「不揃いの（ragged）末端」は、メイズ由来タンパ
ク質からのアミノ酸Ａ２、Ｈ３およびＡ４（多様な形態および量で）の喪失をもたらした
。この切断は、ａａｄ−１タンパク質の精製中に生じたと考えられる。なぜなら、葉の粗
抽出物のウェスタンブロットプローブは、微生物由来ａａｄ−１タンパク質と同じＭＷに
て単一のはっきりしたバンドを含有したからである。ウェスタンブロットした試料につい
ての抽出バッファーは、過剰のプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有し、これは、セリン、
システイン、アスパラギン酸およびメタロプロテアーゼならびにアミノペプチダーゼの阻
害について広い特異性を有するプロテアーゼ阻害剤の混合物を含有する。
【０１８３】
メイズ由来および微生物由来ａａｄ−１タンパク質のＣ末端配列を上記のようにして決
定し、予測されるアミノ酸配列と比較した（表９）。結果は、測定された配列が、予測さ
れた配列と同一であり、メイズ由来および微生物由来ａａｄ−１タンパク質がともに同一
でＣ末端において変更がないことを示した。
【０１８４】
【表９】
0006472474.tif 000016
【実施例６】
【０１８５】
イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドメイズ系統の野外での発現、栄
養組成解析および農業経済学的特徴
この研究の目的は、トウモロコシ組織において見出されるＡＡＤ−１タンパク質のレベ
ルを決定することであった。さらに、トウモロコシのフォレージおよび穀粒に対して組成
解析を行って、同質遺伝子非形質転換トウモロコシ系統とトランスジェニックトウモロコ
シ系統ＤＡＳ−４０２７８−９との間の等価性を調べた（噴霧なし、２，４−Ｄを噴霧、
キザロホップを噴霧および２，４−Ｄとキザロホップとを噴霧）。同質遺伝子非形質転換
トウモロコシ系統の農業経済学的特徴も、ＤＡＳ−４０２７８−９トウモロコシと比較し
た。野外発現、組成および農業経済学的試行は、米国およびカナダの主要なトウモロコシ
生産地域内にある６つの試験現場で行った。これらの現場は、多様な農業経済学的実施と
環境条件の地域を表す。試行は、Ｉｏｗａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（２箇所）、Ｉｎｄｉａｎ
ａ、ＮｅｂｒａｓｋａおよびＯｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａで行った。
【０１８６】
対照、噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ、ＡＡＤ−１＋２，４−Ｄおよ
びＡＡＤ−１＋両方の参加項目（entry）試料についての全ての現場の平均値は、トウモ
ロコシについての文献の範囲内であった。噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホッ
プ、ＡＡＤ−１＋２，４−ＤまたはＡＡＤ−１＋両方のトウモロコシと対照との間での限
定数の著しい相違が観察されたが、相違は、生物学的に意味があると考えられなかった。
なぜなら、これらは小さく、結果は、商業的なトウモロコシで見出される範囲内であった
からである。組成の結果のプロットは、噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ
、ＡＡＤ−１＋２，４−ＤまたはＡＡＤ−１＋両方のトウモロコシおよび対照トウモロコ
シ系統のうちでのいずれの生物学的に意味がある処置に関連する組成の相違も示さない。
結果として、噴霧なしＡＡＤ−１、ＡＡＤ−１＋キザロホップ、ＡＡＤ−１＋２，４−Ｄ
およびＡＡＤ−１＋両方のトウモロコシの組成の結果により、ＡＡＤ−１（イベントＤＡ
Ｓ４０２７８−９）トウモロコシが従来のトウモロコシ系統と等価であることが確認され
る。
【０１８７】
（実施例６．１）
試験したトウモロコシ系統
ＤＡＳ−４０２７８−９イベントを含有するハイブリッド種子および試験物質系統と同
じ遺伝子背景の従来のハイブリッド種子であるがＤＡＳ−４０２７８−９イベントを含有
しない対照植物を、表１０に列挙する。
【０１８８】
【表１０】
0006472474.tif 000017
【０１８９】
上記のトウモロコシ植物を、米国およびカナダの主要なトウモロコシ成長地域内の場所
で成長させた。６つの野外試験施設、Ｒｉｃｈｌａｎｄ、ＩＡ；Ｃａｒｌｙｌｅ、ＩＬ；
Ｗｙｏｍｉｎｇ、ＩＬ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＮ；Ｙｏｒｋ、ＮＥ；およびＢｒａｎｃ
ｈｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ（ＩＡ、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＮ、ＮＥおよびＯ
Ｎという）は、トウモロコシについての多様な農業経済学的実施と環境条件の地域を表す
。
【０１９０】
試験および対照のトウモロコシ種子は、１列あたりおよそ２４の種子で、各列内の種子
の間隔がおよそ１０インチ（２５ｃｍ）の播種比率で植えた。各現場において、各処置の
４つの反復プロットを確立し、各プロットは、２〜２５ｆｔの列からなった。プロットを
、完全乱塊法（ＲＣＢ）で配置し、各現場にて独自の無作為化を行った。各トウモロコシ
プロットは、同様の成熟度の非トランスジェニックメイズハイブリッドの２列を境界とし
た。試行現場全体は、同様の相対的成熟度の非トランスジェニックメイズハイブリッドの
最小限で１２列（または３０ｆｔ）で囲まれていた。
【０１９１】
適当な昆虫、雑草および疾患を管理する実施を用いて、農業経済学的に許容され得る作
物を生産した。月の最高および最低気温と、降水量および潅漑は、現場について平均的で
あった。これらの範囲は、トウモロコシ生産において典型的に遭遇するものである。
【０１９２】
（実施例６．２）
除草剤散布
除草剤処理を、エーカーあたりおよそ２０ガロン（１８７Ｌ／ｈａ）の噴霧容量で行っ
た。これらの散布は、商業的実施の最大限のラベル割合を反復するように設計した。表１
１に、用いた除草剤を列挙する。
【０１９３】
【表１１】
0006472474.tif 000018
【０１９４】
２，４−Ｄ（Ｗｅｅｄａｒ６４）を、３回のオーバーザトップ散布（broadcast over-t
he-top applications）として試験参加項目４および５に用いた（季節合計３ｌｂ  ａｅ
／Ａ）。個別の散布は出芽前であり、およそＶ４およびＶ８〜Ｖ８．５段階であった。個
別の目標散布割合は、Ｗｅｅｄａｒ６４について１．０ｌｂ  ａｅ／Ａ、または１１２０
ｇ  ａｅ／ｈａであった。実際の散布割合は、１０９６〜１２３１ｇ  ａｅ／Ａの範囲で
あった。
【０１９５】
キザロホップ（ＡｓｓｕｒｅＩＩ）は、単一のオーバーザトップ散布として試験参加項
目３および５に用いた。散布時期は、およそＶ６成長段階であった。目標散布割合は、Ａ
ｓｓｕｒｅＩＩについて０．０８２５ｌｂ  ａｉ／Ａ、または９２ｇ  ａｉ／ｈａであっ
た。実際の散布割合は、９０．８〜１０３ｇ  ａｉ／ｈａの範囲であった。
【０１９６】
（実施例６．３）
農業経済学的データ収集および結果
農業経済学的特徴を、各場所でのブロック２、３および４内の全ての試験参加項目につ
いて記録した。表１２に、測定された以下の特徴を列挙する。
【０１９７】
【表１２】
0006472474.tif 000019
【０１９８】
対照、ａａｄ−１噴霧なし、ａａｄ−１＋２，４−Ｄ、ａａｄ−１＋キザロホップおよ
びａａｄ−１＋両方の参加項目から収集した農業経済学的データの解析を行った。現場間
解析（across-site analysis）について、場所間サマリー解析（across location summar
y analysis）における早期個体群（Ｖ１およびＶ４）、活力、最終個体群、作物損傷、シ
ルキング（silking）時期、花粉落下時期、茎倒伏（lodging）、根倒伏、疾患発生、昆虫
被害、成熟日数、植物高さおよび花粉生存度（形状および色）の値についての統計学的に
有意な相違は観察されなかった（表１３）。緑度保持および雌穂（ear）高さについて、
有意な対応のあるｔ検定が、対照とａａｄ−１＋キザロホップ参加項目との間で観察され
たが、有意な全体的な処理効果または偽発見率（False Discovery Rates）（ＦＤＲ）調
整ｐ値を伴わなかった（表１３）。
【０１９９】
【表１３】
0006472474.tif 000020
0006472474.tif 000021
【０２００】
（実施例６．４）
試料回収
発現および組成解析のための試料を、表１４に列挙するようにして回収した。
【０２０１】
【表１４】
0006472474.tif 000022
【０２０２】
（実施例６．５）
トウモロコシ試料中のａａｄ−１タンパク質の決定
トウモロコシの試料を、ａａｄ−１タンパク質の量について解析した。可溶性で抽出可
能なａａｄ−１タンパク質を、Ｂｅａｃｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉ
ｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）から購入した酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）キットを用いて定量する。
【０２０３】
トウモロコシ組織の試料を、試験植物から単離し、粗粉砕、凍結乾燥およびＧｅｎｏ／
粉砕機（Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）を用いる微粉
砕（必要であれば）により発現解析のために調製した。花粉について、追加の調製は必要
でなかった。ａａｄ−１タンパク質を、トウモロコシ組織から、０．５％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含有する、洗浄剤Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水
（ＰＢＳＴ）を用いて抽出した。花粉について、１ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウ
ムおよび２％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する０．５％ＰＢＳＴ／ＢＳＡバッファ
ーを用いてタンパク質を抽出した。植物組織および花粉抽出物を遠心分離した。水性の上
清を回収し、必要であれば適当なバッファーで希釈し、サンドイッチフォーマットのａａ
ｄ−１  ＥＬＩＳＡキットを用いて解析した。キットは、以下のステップを用いた。希釈
試料の分割量と、ビオチン化抗ａａｄ−１モノクローナル抗体とを、固定化抗ａａｄ−１
モノクローナル抗体で被覆したマイクロタイタープレートのウェル中でインキュベートす
る。これらの抗体は、ウェル中のａａｄ−１タンパク質と結合して、可溶性抗体と固定化
抗体との間に結合したａａｄ−１タンパク質で「サンドイッチ」を形成する。未結合の試
料およびコンジュゲートは、次いで、ＰＢＳＴで洗浄することによりプレートから除去す
る。過剰量のストレプトアビジン−酵素（アルカリホスファターゼ）コンジュゲートを、
インキュベーションのためにウェルに加える。インキュベーション期間の最後に、未結合
の試薬を、洗浄によりプレートから除去した。酵素基質をその後加えることにより、着色
生成物が得られた。ａａｄ−１は抗体サンドイッチ中に結合しているので、発色のレベル
は、試料中のａａｄ−１の濃度と関連した（すなわち、より低い残存濃度は、より低い発
色をもたらす）。４０５ｎｍでの吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｖ−
ｍａｘまたはＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  １９０プレートリーダーを用いて測定した。検量
曲線を作製し、未知試料中のａａｄ−１濃度を、プレートリーダーと適合するＳｏｆｔ−
ＭＡＸ  Ｐｒｏ（商標）ソフトウェアを用いて多項回帰等式から算出した。試料を、報告
した二重ウェルの平均濃度を有する二重ウェル中で解析した。
【０２０４】
多様なトウモロコシマトリクスにおけるａａｄ−１タンパク質濃度のまとめ（現場間で
平均した）を、表１５に示す。ａａｄ−１平均タンパク質濃度は、Ｒ１段階の根における
２．８７ｎｇ／ｍｇ乾燥重量から、花粉中の１２７ｎｇ／ｍｇの範囲であった。噴霧なし
および噴霧ありのプロットについての発現の結果は、同様であった。ａａｄ−１タンパク
質は、Ｉｎｄｉａｎａの現場からの１つの対照の根試料を除いて、いずれの対照試料から
も検出されなかった。
【０２０５】
【表１５】
0006472474.tif 000023
【０２０６】
（実施例６．６）
組成解析
トウモロコシのフォレージおよび穀粒の試料を、種々の試験を用いて栄養素含量につい
て解析した。フォレージについて行った解析は、灰分、全脂質、水分、タンパク質、炭水
化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維、中性デタージェント繊維、カルシウムおよびリ
ンを含んだ。穀粒について行った解析は、近成組成（灰分、全脂質、水分、タンパク質、
炭水化物、粗繊維、酸性デタージェント繊維）、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、ミ
ネラル、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、２次代謝産物および抗栄養素を含んだ。トウモロ
コシのフォレージおよび穀粒についての栄養素解析の結果を、文献で報告されている値と
比較した（Watson、1982(4);Watson、1984(5);ILSI Crop Composition Database、2006(6
);OECD Consensus Document on Compositional Considerations for maize、2002(7);お
よびCodex Alimentarius Commission 2001(8)を参照されたい）。
【０２０７】
（実施例６．６．１）
フォレージの近成組成、繊維およびミネラルの解析
対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよ
びａａｄ−１＋両方の参加項目からのトウモロコシフォレージ試料中のタンパク質、脂質
、灰分、水分、炭水化物、ＡＤＦ、ＮＤＦ、カルシウムおよびリンの解析を行った。全て
の場所にわたる結果のまとめを表１６に示す。現場間および現場個別の解析について、全
ての近成組成、繊維およびミネラルの平均値は、文献の範囲内であった。対照とトランス
ジェニック参加項目との間に、現場間解析において、水分、ＡＤＦ、ＮＤＦ、カルシウム
およびリンについて統計学的な相違は観察されなかった。タンパク質および灰分について
、有意な対応のあるｔ検定が、噴霧なしＡＡＤ−１（タンパク質）、ａａｄ−１＋キザロ
ホップ（タンパク質）およびａａｄ−１＋両方（灰分）について観察されたが、有意な全
体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。脂質について、有意な対応のある
ｔ検定および調整ｐ値がともに、ａａｄ−１＋キザロホップについて対照と比較して観察
されたが、有意な全体的な処理効果は観察されなかった。炭水化物について、統計的に有
意な全体的な処理効果、対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が、ａａｄ−１＋キザロ
ホップと対照との間に観察された。炭水化物についても、有意な対応のあるｔ検定が噴霧
なしａａｄ−１参加項目について観察されたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値は観察されなかっ
た。これらの相違は、生物学的に意味がない。なぜなら、これらの分析項目についての全
ての現場間の結果は、トウモロコシについて報告された文献の範囲内であり、対照からの
差は小さかったからである（＜２３％）。
【０２０８】
【表１６】
0006472474.tif 000024
【０２０９】
（実施例６．６．２）
穀粒の近成組成（proximate）および繊維の解析
全ての場所にわたるトウモロコシ穀粒における近成組成（タンパク質、脂質、灰分、水
分、コレステロールおよび炭水化物）および繊維（ＡＤＦ、ＮＤＦおよび全食物繊維）に
関する結果のまとめを、表１７に示す。近成組成および繊維についての全ての結果は、文
献の範囲内であり、現場間解析において、対照とトランスジェニック参加項目との間に、
脂質、灰分、ＮＤＦおよび全食物繊維について有意な相違は観察されなかった。水分につ
いて、有意な全体的な処理効果が観察されたが、有意な対応のあるｔ検定またはＦＤＲ調
整ｐ値を伴わなかった。ＡＤＦについて、有意な対応のあるｔ検定がａａｄ−１＋両方に
ついて観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値はみられなかった。
タンパク質および炭水化物の両方について、有意な対応のある検定、調整ｐ値および全体
的な処理効果が、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両
方についてみられた。これらの相違は小さく（＜１２％）、全ての値は文献の範囲内であ
ったので、相違は生物学的に意味があるとは考えられない。
【０２１０】
【表１７】
0006472474.tif 000025
【０２１１】
（実施例６．６．３）
穀粒のミネラル解析
ミネラルであるカルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄分、マグネシウム、マンガン、モ
リブデン、リン、カリウム、セレン、ナトリウムおよび亜鉛についてのトウモロコシ穀粒
試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のまとめを、表１８に示す。全ての結果は
、報告される文献の範囲内であった。現場間解析について、カルシウム、銅、鉄分および
カリウムについて有意な相違は観察されなかった。クロム、ヨウ素、セレンおよびナトリ
ウムについての平均の結果は、方法の定量限界未満であった。マグネシウムおよびリンに
ついて、有意な対応のあるｔ検定が、噴霧なしａａｄ−１およびａａｄ−１＋キザロホッ
プ参加項目について観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わ
なかった。マンガンおよびモリブデンについて、有意な対応のあるｔ検定が噴霧なしａａ
ｄ−１について観察されたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値および全体的な処理効果は見られな
かった。ａａｄ−１＋両方の参加項目について、有意な対応のあるｔ検定が、亜鉛につい
て観察されたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値または全体的な処理効果は存在しなかった。さら
に、対照からのこれらの相違は小さく（＜１３％）、全ての値は、入手可能である場合は
文献の範囲内であった。
【０２１２】
【表１８】
0006472474.tif 000026
【０２１３】
（実施例６．６．４）
穀粒のアミノ酸解析
トウモロコシ試料を、アミノ酸含量について、対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１
＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方のトウモロコシについ
て解析し、全ての場所にわたるおよび個別の野外の現場による結果のまとめを、表１９に
示す。全てのアミノ酸のレベルは報告された文献の範囲内であり、現場間解析における有
意な相違は、アルギニン、リジンおよびチロシンについて観察されなかった。いくつかの
アミノ酸について、現場間解析において有意な相違が観察された。これらの場合において
、対照のアミノ酸含量は、ａａｄ−１トランスジェニック系統よりも低く、これは、ａａ
ｄ−１系統と比較して、対照穀粒における全体的により低いタンパク質含量と関連すると
考えられる。噴霧なしａａｄ−１参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有
意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が、アルギニン、グリシン、リジン、トリプ
トファンおよびチロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。ａａｄ−１＋キザロホ
ップ参加項目について、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定および
ＦＤＲ調整ｐ値が、アルギニン、システイン、グリシン、リジン、トリプトファンおよび
チロシン以外の全てのアミノ酸についてみられた。ａａｄ−１＋２，４−Ｄ参加項目につ
いて、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定（有意なＦＤＲ調整ｐ値
とともに）が、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リジン、チロシン
およびバリン以外の全てのアミノ酸についてみられた。ａａｄ−１＋両方の参加項目につ
いて、有意な全体的な処理効果とともに有意な対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値が
、アルギニン、グリシン、リジン、セリン、トリプトファンおよびチロシン以外の全ての
アミノ酸についてみられた。アミノ酸について観察された多くの相違があったが、相違は
小さく（＜１５％）、全ての現場にわたって観察されず、全ての平均値は、報告された文
献の範囲内であった。
【０２１４】
【表１９】
0006472474.tif 000027
0006472474.tif 000028
【０２１５】
（実施例６．６．５）
穀粒の脂肪酸解析
脂肪酸についてのトウモロコシ穀粒試料の解析を行った。全ての場所にわたる結果のま
とめを、表２０に示す。これらの脂肪酸について解析した対照、噴霧なしａａｄ−１、ａ
ａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−１＋両方のトウモロコ
シ穀粒試料についての全ての結果は、発表された文献の範囲内であった。カプリル酸（８
：０）、カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）
、ミリストレイン酸（１４：１）、ペンタデカン酸（１５：０）、ペンタデセン酸（１５
：１）、ヘプタデカン酸（１７：０）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ガンマリノレン酸
（１８：３）、エイコサジエン酸（２０：２）、エイコサトリエン酸（２０：３）および
アラキドン酸（２０：４）についての結果は、方法の定量限界（ＬＯＱ）未満であった。
現場間解析において、１６：０パルミチン酸、１６：１パルミトレイン酸、１８：０ステ
アリン酸、１８：２リノール酸、１８：３リノレン酸および２０：０アラキジン酸につい
て有意な相違は観察されなかった。１８：１オレイン酸および２０：１エイコセイン酸に
ついて、有意な対応のあるｔ検定が、噴霧なしａａｄ−１（１８：１）およびａａｄ−１
＋２，４−Ｄ（１８：１および２０：１）参加項目について観察されたが、有意な全体的
な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値は伴わなかった。２２：０ベヘン酸について、有意な全
体的な処理効果および有意な対応のあるｔ検定が、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ
−１＋両方についてみられたが、有意なＦＤＲ調整ｐ値は存在しなかった。
【０２１６】
【表２０】
0006472474.tif 000029
0006472474.tif 000030
【０２１７】
（実施例６．６．６）
穀粒のビタミン解析
対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよ
びａａｄ−１＋両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料におけるビタミ
ンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ナイアシンおよび葉酸のレベルを
決定した。全ての場所にわたる結果のまとめを、表２１に示す。ビタミンＢ１２、Ｄおよ
びＥは、用いた解析方法によって定量可能でなかった。ビタミンについて報告される全て
の平均の結果は、利用可能である場合は報告された文献の値と同様であった。報告された
文献の範囲がないビタミン（ビタミンＢ５およびＣ）の結果は、得られた対照の値と同様
であった（対照から＜２２％の相違）。現場間解析について、ビタミンＢ１、Ｃおよびナ
イアシンを除いて、統計学的相違は観察されなかった。ビタミンＢ１についての有意な対
応のあるｔ検定が、対照と噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ
−１＋両方との間に観察されたが、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わ
なかった。ビタミンＣについて、有意な全体的な処理効果が、有意な対応のあるｔ検定お
よびＦＤＲ調整ｐ値とともに、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋２，４−Ｄ
について観察された。ナイアシンについても同様に、有意な全体的な処理効果が、有意な
対応のあるｔ検定およびＦＤＲ調整ｐ値とともに、ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａ
ｄ−１＋両方について観察された。ａａｄ−１＋２，４−Ｄについての有意な対応のある
ｔ検定も、ａａｄ−１＋２，４−Ｄ参加項目についてナイアシンについて見出されたが、
有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わなかった。相違は現場にわたって観
察されず、値は文献の範囲内であった（入手可能である場合）ので、相違は、生物学的に
意味があるとは考えられない。
【０２１８】
【表２１】
0006472474.tif 000031
【０２１９】
（実施例６．６．７）
穀粒の抗栄養素および２次代謝産物の解析
対照、噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋キザロホップ、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよ
びａａｄ−１＋両方のトウモロコシ参加項目からのトウモロコシ穀粒試料における２次代
謝産物（クマル酸、フェルラ酸、フルフラールおよびイノシトール）および抗栄養素（フ
ィチン酸、ラフィノースおよびトリプシン阻害剤）のレベルを決定した。全ての場所にわ
たる結果のまとめを、表２２および２３に示す。現場間解析について、全ての値は、文献
の範囲内であった。ａａｄ−１参加項目と対照参加項目との間で、イノシトールおよびト
リプシン阻害剤について現場間解析において、有意な相違は観察されなかった。フルフラ
ールおよびラフィノースについての結果は、方法の定量限界未満であった。有意な対応の
あるｔ検定が、クマル酸（噴霧なしａａｄ−１、ａａｄ−１＋２，４−Ｄおよびａａｄ−
１＋両方）およびフェルラ酸（ａａｄ−１＋キザロホップおよびａａｄ−１＋両方）につ
いて観察された。これらの相違は、有意な全体的な処理効果またはＦＤＲ調整ｐ値を伴わ
ず、対照と同様であった（＜１０％の相違）。有意な全体的な処理効果、対応のあるｔ検
定およびＦＤＲ調整ｐ値は、フィチン酸（噴霧なしａａｄ−１）について見出された。全
ての結果は、文献の範囲内であり、対照と同様であったので（＜１１％の相違）、これら
の相違は、生物学的に意味があるとは考えられない。
【０２２０】
【表２２】
0006472474.tif 000032
【０２２１】
【表２３】
0006472474.tif 000033
【実施例７】
【０２２２】
追加の農業経済学的試行
近同質遺伝子系統（near-isoline）のトウモロコシ系統と比較したトウモロコシ系統４
０２７８の農業経済学的特徴を、多様な環境にわたって評価した。処理は、合計２１の場
所で試験された４つの遺伝子的に異なるハイブリッドとそれらの適当な近同質遺伝子系統
対照ハイブリッドとを含んだ。
【０２２３】
４つの試験ハイブリッドは、９９〜１１３日の相対的成熟度の範囲の中〜後期成熟度ハ
イブリッドであった。実験Ａは、遺伝子背景近交系Ｃ×ＢＣ３Ｓ１転換におけるイベント
ＤＡＳ−４０２７８−９を試験した。このハイブリッドは、１０９日の相対的成熟度を有
し、１６の場所において試験された（表２４）。実験Ｂは、１１３日の相対的成熟度のハ
イブリッドであるハイブリッド背景近交系Ｅ×ＢＣ３Ｓ１転換を試験した。このハイブリ
ッドは１４の場所で試験され、実験Ａとはわずかに異なる場所のセットを用いた（表２４
）。実験ＣおよびＤは、ハイブリッド背景ＢＣ２Ｓ１転換×近交系ＤおよびＢＣ２Ｓ１転
換×近交系Ｆをそれぞれ試験した。これらのハイブリッドはともに、９９日の相対的成熟
度を有し、同じ１０の場所で試験された。
【０２２４】
【表２４】
0006472474.tif 000034
【０２２５】
各試行について、完全乱塊法を、場所あたり２つの反復および２列プロットで用いた。
列の長さは２０フィートであり、各列は、列あたり３４の種子が播種された。標準的な地
域の農業経済学的実施を用いて、試行を管理した。
【０２２６】
８つの農業経済学的特徴についてデータを収集して、解析した；植物高さ、雌穂高さ、
茎倒伏、根倒伏、最終個体群、穀粒水分、試験重量および収率。植物高さおよび雌穂高さ
のパラメータは、ハイブリッドの外観についての情報を提供する。パーセント茎倒伏およ
び根倒伏の農業経済学的特徴は、ハイブリッドの収穫しやすさ（harvestability）を決定
する。最終個体群のカウントは、収率に影響する種子の質および季節成長条件を測定する
。収穫時のパーセント穀粒水分は、ハイブリッドの成熟度を規定し、収率（湿度について
調整したブッシェル／エーカー）および試験重量（１５．５％湿度に調整した１ブッシェ
ル（bushel）のトウモロコシのポンドでの重量）は、ハイブリッドの生殖能を表す。
【０２２７】
分散分析を、線形モデルを用いて野外現場にわたって行った。参加項目および場所を、
固定された影響としてモデルに含めた。場所および無作為な影響としての参加項目による
場所を含む混合モデルを探索したが、参加項目による場所は、分散の小さい部分だけを説
明し、その分散の要素は、しばしば、ゼロから大きくは異ならなかった。茎および根の倒
伏について、対数変換を用いて分散を安定させたが、平均および範囲は元の尺度について
報告する。有意な相違は、９５％信頼レベルにて得られた。全体的な処理効果の有意性は
、ｔ検定を用いて見積もった。
【０２２８】
これらの農業経済学的特徴決定の試行からの結果を、表２において見出すことができる
。統計的に有意な相違は、雌穂高さ、茎倒伏、根倒伏、穀粒水分、試験重量および収率の
パラメータについて、同質遺伝子系統対照と比較して４つの４０２７８ハイブリッドのい
ずれについても見られなかった（ｐ＜０．０５にて）。最終個体群カウントおよび植物高
さは、実験ＡおよびＢにおいてそれぞれ統計的に相違したが、試験したその他の４０２７
８ハイブリッドとの比較において同様の相違は見られなかった。見られたばらつきのいく
らかは、エリート近交系統へのＤＡＳ−４０２７８−９イベントの戻し交雑から残ってい
る遺伝的変異性のレベルが低いことによる可能性がある。測定されたパラメータについて
の値の全体的な範囲は、全て伝統的なトウモロコシハイブリッドについて得られた値の範
囲内であり、雑草性の増加という結論は導かれない。まとめると、農業経済学的特徴のデ
ータは、４０２７８トウモロコシが、従来のトウモロコシと生物学的に等価であることを
示す。
【０２２９】
【表２５】
0006472474.tif 000035
0006472474.tif 000036
【実施例８】
【０２３０】
標的にされた組み込みのためのトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位の
使用
野外条件下で数世代にわたってトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９の導入遺
伝子の農業経済学的性能が安定していることは、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７
８−９挿入部位の周囲のこれらの同定された領域が、対象のその他のトランスジェニック
遺伝子の標的にされた組み込みについての良好なゲノムの場所を提供することを示唆する
。このような標的にされた組み込みは、いわゆる「位置効果」および導入遺伝子を宿主に
組み込む際にゲノムに変異を創出する危険性の問題を克服する。このような標的にされた
組み込みのさらなる利点は、それらに限定されないが、宿主ゲノムの重要な遺伝子座に導
入遺伝子を偶発的に挿入することに起因する異常をも示すことなく所望のレベルの導入遺
伝子の発現を示すトランスジェニック植物を得る前にスクリーニングして試験されなけれ
ばならない多数の形質転換イベントを減らすことを含む。さらに、このような標的にされ
た組み込みは、両方の遺伝子を有するエリート植物系統の育種をより効率的にする、導入
遺伝子の掛け合わせを可能にする。
【０２３１】
開示される教示を用いて、当業者は、対象のポリ核酸を、トウモロコシイベントＤＡＳ
−４０２７８−９におけるものと同じ第２染色体上の挿入部位、またはトウモロコシイベ
ントＤＡＳ−４０２７８−９における挿入部位に近い部位に標的させることができる。あ
るこのような方法は、国際特許出願第ＷＯ２００８／０２１２０７号（本明細書に参照に
よりその全体が組み込まれている）に開示される。
【０２３２】
簡単に述べると、挿入部位の５’に接する２０Ｋｂまでのゲノム配列および挿入部位の
３’に接する２０Ｋｂまでのゲノム配列（その部分は、配列番号２９を参照して同定され
る）は、相同組換えにより第２染色体上のゲノム位置に挿入しようとする１または複数の
対象の遺伝子に接して用いられる。１または複数の対象の遺伝子は、トウモロコシイベン
トＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位におけるものと全く同じように配置できるか、または
トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位の周囲の２０Ｋｂ領域内のいずれ
かの場所に配置して、植物に有害な影響を与えることなく導入遺伝子発現の一定のレベル
を与えることができる。１または複数の対象の遺伝子およびフランキング配列を含有する
ＤＮＡベクターは、それらに限定されないが、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒
介形質転換を含む当業者に知られるいくつかの方法の１つにより植物細胞に送達できる。
ドナーＤＮＡベクターをトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９標的部位に挿入す
ることは、それらに限定されないが、組換え増進遺伝子の同時発現もしくは上方制御また
は内因性組換え抑制遺伝子の下方制御を含むいくつかの方法の１つによりさらに増進でき
る。さらに、ゲノム内の特定の配列の２本鎖切断を用いて、相同組換え頻度を増加させる
ことができ、よってトウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９挿入部位およびそのフ
ランキング領域への挿入を、これらの配列を切断するための天然もしくは設計された配列
特異的エンドヌクレアーゼの発現により増進できることが当該技術において知られている
。つまり、本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核酸を、トウモロコシ第２染
色体上に、実施例４で論じた５’分子マーカーと実施例４で論じた３’分子マーカーとの
間にある標的部位、好ましくは配列番号２９内のもの、および／または本明細書の他の所
で論じるその領域にて挿入できる。
【実施例９】
【０２３３】
トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９からのｐａｔ遺伝子発現カセットの切り出
し
選択マーカー遺伝子発現カセットの除去は、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８
−９のゲノム遺伝子座への標的にされた挿入にとって有利である。ｐａｔ選択マーカーを
トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８−９から除去することにより、ポリ核酸をトウ
モロコシのその後の世代において第４染色体を標的にして組み込むためにｐａｔ選択マー
カーを再使用することが可能になる。
【０２３４】
開示された教示を用いて、当業者は、対象のポリ核酸を、トウモロコシイベントＤＡＳ
−４０２７８−９から切り出すことができる。あるこのような方法は、米国仮特許出願第
６１／２９７，６２８号（本明細書に参照によりその全体が組み込まれている）に開示さ
れる。
【０２３５】
簡単に述べると、遺伝子発現カセットの側面に位置する特定のＤＮＡ配列を認識し、結
合して切断するジンクフィンガーヌクレアーゼのような配列特異的エンドヌクレアーゼを
設計する。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、トランスジェニックジンクフィンガーヌク
レアーゼ発現カセットを含有する親の植物を、トウモロコシイベントＤＡＳ−４０２７８
−９を含有する第２の親の植物と交雑させることにより植物細胞に送達される。得られる
子孫を成熟まで成長させ、ｐａｔ発現カセットの喪失を、グルフォシネートを含有する除
草剤を用いる葉の塗装により解析する。除草剤に抵抗性でない子孫植物を、分子的に確認
し、自家繁殖に進む。ｐａｔ発現カセットの切り出しおよび除去は、自家繁殖から得られ
る子孫において分子的に確認される。本明細書で提供される教示を用いて、任意の異種核
酸を、トウモロコシの第２染色体から、実施例４で論じた５’分子マーカーと３’分子マ
ーカーとの間にある標的部位、好ましくは配列番号２９内にあるもの、またはその示され
た領域にて切り出すことができる。
【実施例１０】
【０２３６】
ブリトルスナップ（brittlesnap）への抵抗性
ブリトルスナップとは、通常、迅速成長期中の成長調節除草剤の散布後に強風によりト
ウモロコシの茎がくずれることをいう。強風による被害をシミュレートするためにトウモ
ロコシを物理的に押す棒を用いる機械的「プッシュ」試験を、イベントＤＡＳ−４０２７
８−９を含有するハイブリッドトウモロコシおよびイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含
有しない対照植物について行った。処理は、４つの地理的に異なる場所で完了し、４回反
復した（例外として３回だけ反復した１つの試行があった）。プロットは、８列からなっ
た：２列はイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有し、２列はイベントを含有しない、２
つのハイブリッドのそれぞれの４列。各列は２０フィートの長さであった。トウモロコシ
植物は、Ｖ４発達段階まで成長させ、２，４−Ｄを含有する市販の除草剤（Ｗｅｅｄａｒ
６４、Ｎｕｆａｒｍ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｒ  Ｒｉｄｇｅ、ＩＬ）を、１１２０ｇ  ａｅ
／ｈａ、２２４０ｇ  ａｅ／ｈａおよび４４８０ｇ  ａｅ／ｈａの割合で用いた。除草剤
を用いた７日後に、機械的プッシュ試験を行った。ブリトルスナップについての機械的プ
ッシュ試験は、風被害をシミュレートするために、４フィートの棒で２列のトウモロコシ
を引き倒すことからなった。棒の高さおよび移動の速さは、未処理の植物を用いて低レベ
ルの茎の破壊（１０％以下）をもたらすように設定して、処理間で相違が証明されるのに
十分に試験が厳しいことを確実にした。ブリトルスナップ処理の指向性は、もたれかかっ
たトウモロコシに対して用いた。
【０２３７】
試行場所のうち２つは、強風および雷雨を、２，４−Ｄ除草剤を用いた２〜３日後に経
験した。２日連続で、雷雨がＨｕｘｌｅｙ  ＩＡで始まった。高速で３３ｍ  ｓ−１で２
〜１７ｍ  ｓ−１の風速が、野外プロットの現場で報告された。風の方向は、変動した。
雷雨がＬａｎｅｓｂｏｒｏ  ＭＮで１日間報告された。高速の風が、この野外プロットの
現場で報告された。さらに、両方の嵐は、雨を伴った。雨と風の組み合わせは、報告され
たブリトルスナップ被害のせいであった。
【０２３８】
機械的プッシュ試験（および悪天候）に起因するブリトルスナップ被害の評価を、損傷
のパーセンテージを視覚的に評価することにより行った。ブリトルスナップの機械的な棒
による処理の前に、植物の立木のカウントを、イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有す
るハイブリッドトウモロコシおよび対照について行った。ブリトルスナップの棒での処理
の数日後に、プロット立木カウントを再評価した。プロット内のもたれかかりのパーセン
テージおよび立木のパーセンテージの減少を決定した（表２６）。試行からのデータは、
イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシが、２，４−Ｄを
用いた後に、ヌル植物と比較してブリトルスナップの傾向がより低いことを証明した。
【０２３９】
【表２６】
0006472474.tif 000037
【実施例１１】
【０２４０】
穀粒のタンパク質解析
イベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシから、イベント
を含有しない対照植物と比較して全タンパク質含量が増加した穀粒を作出した。２つの連
続する多点野外試行を行ったが、これは、噴霧なしおよび除草剤処理を、３つの異なる除
草剤の組み合わせで含んだ。８つの統計学的比較のうち７つにおいて、ＤＡＳ−４０２７
８−９イベントは、有意により高い全タンパク質含量を有する穀粒を作出した（表２７）
。このデータは、個別のアミノ酸の解析により確証される。
【０２４１】
【表２７】
0006472474.tif 000038
【実施例１２】
【０２４２】
追加の農業経済学的形質
近同質遺伝子系統（near-isoline）トウモロコシと比較した、イベントＤＡＳ−４０２
７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシの農業経済学的特徴を、成長季節について
の多様な地理的環境にわたって複数の野外試行から回収した。データを、実施例７に記載
されるような農業経済学的特徴について収集して解析した。ヌル植物と比較した、イベン
トＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシ系統についての結果を、
表２８に列挙する。さらに、発達のＶ３段階にて除草剤キザロホップ（２８０ｇ  ａｅ／
ｈａ）および発達のＶ６段階にて噴霧された２，４−Ｄ（２，２４０ｇ  ａｅ／ｈａ）を
噴霧したイベントＤＡＳ−４０２７８−９を含有するハイブリッドトウモロコシ系統およ
びヌル植物についての農業経済学的特徴を、表２９に記載する。
【０２４３】
【表２８】
0006472474.tif 000039
【０２４４】
【表２９】
0006472474.tif 000040
【配列表フリーテキスト】
【０２４５】
配列番号１〜２８は、本明細書に記載されるプライマーである。
配列番号２９は、主題のイベントＤＡＳ−４０２７８−９についての挿入断片およびフ
ランキング配列を示す。
配列番号３０〜３３は、実施例４に記載されるフランキングマーカーについてのプライ
マーである。
【図１】
0006472474.tif 000041
【図２】
0006472474.tif 000042
【図３】
0006472474.tif 000043
【図４】
0006472474.tif 000044
【図５】
0006472474.tif 000045
【図６】
0006472474.tif 000046
【図７】
0006472474.tif 000047
【配列表】
0006472474000001.app