(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光増感物質とキトサンのコンジュゲートを含む、下記式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
0006456284.tif 000055
［前記式中、
ｎは、３以上の整数であり、
Ｒは、前記化合物においてｎ回出現し（Ｒｎ基）、
前記総Ｒｎ基の０．５％〜９９．５％において、各Ｒは、
Ｈ,
【化２】
0006456284.tif 000056
【化３】
0006456284.tif 000057
但し、ａは１、２、３、４または５であり；ＸはＢｒ、ＣｌまたはＯＨである。；
【化４】
0006456284.tif 000058
但し、各Ｒ1は、同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ3および−（ＣＨ2）c−ＣＨ3から選択され；ｂは１、２、３、４または５であり；ｃは０、１、２、３、４または５である。;
【化５】
0006456284.tif 000059
但し、ＹはＯ；Ｓ；ＳＯ2；−ＮＣＨ3；または−Ｎ（ＣＨ2）eＣＨ3であり；ｄ＝１、２、３、４または５であり；ｅ＝１、２、３、４または５である。;
【化６】
0006456284.tif 000060
但し、Ｒ2は−（ＣＨ2）h−ＣＨ3または−ＣＯ−（ＣＨ2）h−ＣＨ3であり；ｆは１、２、３、４または５であり；ｇは１、２、３、４または５であり；ｈは０、１、２、３、４または５である。;
【化７】
0006456284.tif 000061
但し、Ｒ3は−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは１〜２００の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５であり；ｋは１、２、３、４または５である。;
【化８】
0006456284.tif 000062
但し、Ｒ3は−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは１〜２００の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５である。;
【化９】
0006456284.tif 000063
但し、Ｒ3は−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは１〜２００の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５であり；各Ｒ1は同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ3および−（ＣＨ2）c−ＣＨ3から選択され；ｃは０、１、２、３、４または５である。;
【化１０】
0006456284.tif 000064
但し、Ｒ3＝−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは１〜２００の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５である。;
【化１１】
0006456284.tif 000065
但し、Ｒ3＝−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは１〜２００の整数であり；Ｌは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；ｊは０、１、２、３、４または５である。;
【化１２】
0006456284.tif 000066
および
【化１３】
0006456284.tif 000067
但し、ｍは１、２、３、４または５である。;
から選択される基Ａであり、
前記総Ｒｎ基の０．５％〜９９．５％において、各Ｒは、
【化１４】
0006456284.tif 000068
から選択される基Ｂであり、
但し、ｐは０、１、２、３、４または５であり；ｑは１、２、３、４または５である。;
Ｒ4は、
【化１５】
0006456284.tif 000069
から選択される基である。；
Ｗは、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮ（ＣＨ3）から選択される基である。；
Ｒ7は、
【化１６】
0006456284.tif 000070
から選択される基である。；
Ｖは、ＣＯ、ＳＯ2、ＰＯ、ＰＯ2ＨまたはＣＨ2から選択される基である。；
Ｒ8は、同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）4、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2および−ＮＣＯＣＨ3から選択される基（ｏ、ｍまたはｐ位で置換）である。；
各Ｒ基は、同一であっても異なっていてもよい。］
【請求項２】
ｉは１〜１０の整数である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎは１０〜１００の整数である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ4は、
【化１７】
0006456284.tif 000071
から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ7は、
【化１８】
0006456284.tif 000072
から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ4は、ＴＰＣa1またはＴＰＣa2である、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
基Ａは、総Ｒｎ基の７０〜９５％であり、基Ｂは、総Ｒｎ基の５〜３０％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ基の各基Ａは、
【化１９】
0006456284.tif 000073
【化２０】
0006456284.tif 000074
【化２１】
0006456284.tif 000075
【化２２】
0006456284.tif 000076
【化２３】
0006456284.tif 000077
【化２４】
0006456284.tif 000078
【化２５】
0006456284.tif 000079
および
【化２６】
0006456284.tif 000080
から選択され、各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
基Ａが
【化２７】
0006456284.tif 000081
の場合、各Ｒ1はＣＨ3であり、ｂは１である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
基Ａが
【化２８】
0006456284.tif 000082
の場合、Ｙは−ＮＣＨ3であり、ｄは１である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
基Ａが
【化２９】
0006456284.tif 000083
の場合、ｊは０または１であり；ｉは３または６であり、ｋは１である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
基Ａが
【化３０】
0006456284.tif 000084
の場合、ｊは１であり、ｉは２である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
基Ａが
【化３１】
0006456284.tif 000085
の場合、ｊは０または１であり、ｉは２、４または５であり、Ｌは１である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
基Ａが
【化３２】
0006456284.tif 000086
の場合、ｍは１である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ基の各基Ｂは、
【化３３】
0006456284.tif 000087
【化３４】
0006456284.tif 000088
【化３５】
0006456284.tif 000089
【化３６】
0006456284.tif 000090
から選択され、各Ｒ基は同一であっても異なっていてもよい、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
ｐは１であり、存在する場合、ｑは１である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物は、下記に記載の化合物から選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【化３７】
0006456284.tif 000091
【化３８】
0006456284.tif 000092
【化３９】
0006456284.tif 000093
【化４０】
0006456284.tif 000094
【化４１】
0006456284.tif 000095
【化４２】
0006456284.tif 000096
【化４３】
0006456284.tif 000097
【化４４】
0006456284.tif 000098
【請求項１８】
インビトロまたは生体外で分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法、あるいは、インビボで分子をヒト以外の動物の細胞のサイトゾル内に導入する方法であって、
導入対象分子と請求項１〜１７のいずれか１項に定義された化合物とを前記細胞に接触させること、および、
前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記分子をサイトゾル内に放出することを含み、
前記導入対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、方法。
【請求項１９】
インビトロまたは生体外で細胞死を達成する方法、あるいは、インビボでヒト以外の動物の細胞死を達成する方法であって、
請求項１〜１７のいずれか１項に定義された化合物を前記細胞に接触させること、および、
前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することを含む、方法。
【請求項２０】
インビトロまたは生体外で抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法、あるいは、インビボで抗原分子またはその一部をヒト以外の動物の細胞表面上に発現させる方法であって、
前記抗原分子と請求項１〜１７のいずれか１項に定義された化合物とを前記細胞に接触させること、および、
前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含み、
前記抗原分子は前記細胞のサイトゾル内に放出され、免疫応答を刺激するのに十分な大きさの前記抗原分子またはその一部は前記細胞の表面上に提示される、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項に定義された化合物と、
１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と、
任意選択で内在化対象分子とを含み、
前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、医薬組成物。
【請求項２２】
療法、遺伝子療法または免疫応答刺激のための、請求項２１に定義された組成物。
【請求項２３】
前記療法は癌療法である、請求項２２に記載の療法のための組成物。
【請求項２４】
対象における病気、疾患または感染の治療または予防のための、請求項２２のいずれか１項に定義された組成物であって、
任意選択で内在化対象分子を含み、前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、組成物。
【請求項２５】
前記病気、疾患または感染において、異常なもしくは過剰な細胞成長が明らかである、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現が明らかである、請求項２４に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項２６】
前記病気が癌である、請求項２５に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項２７】
前記治療または予防は、内在化対象分子と前記組成物とを前記対象における細胞に接触させること、および、前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項２８】
前記内在化対象分子は、細胞毒性分子である、請求項２７に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項２９】
前記細胞毒性分子はブレオマイシンである、請求項２８に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項３０】
前記治療または予防は、前記組成物を前記対象における細胞に接触させること、および、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することを含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項３１】
免疫応答を生じさせることによって、対象における病気、疾患または感染を治療または予防する、請求項２４のいずれか１項に定義された組成物。
【請求項３２】
前記治療または予防がワクチン接種によって達成される、請求項３１に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項３３】
前記治療または予防は、前記組成物と抗原分子とを対象における細胞に接触させること、および、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含み、
前記抗原分子は前記細胞のサイトゾル内に放出され、免疫応答を刺激するのに十分な大きさの前記抗原分子またはその一部は前記細胞の表面上に提示される、請求項３１または３２に記載の治療または予防のための組成物。
【請求項３４】
請求項１８〜２０のいずれか１項に定義された方法によって得られる、細胞または細胞集団。
【請求項３５】
療法のための請求項３４に定義された細胞または細胞集団。
【請求項３６】
癌療法、遺伝子療法または免疫応答刺激のための、請求項３５に記載の療法のための細胞または細胞集団。
【請求項３７】
患者における病気、疾患または感染の治療または予防のための薬剤調製における、請求項１〜１７および２１のいずれか１項に定義された化合物または組成物および任意選択で内在化対象分子の使用であって、
前記治療または予防は、前記化合物または組成物を請求項１８に定義された方法によって、インビトロ、インビボまたは生体外（ex vivo）で１つ以上の細胞に導入すること、および、
必要に応じて、前記細胞を前記患者に投与することを含み、
前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、使用。
【請求項３８】
前記病気、疾患または感染において、異常なもしくは過剰な細胞成長が明らかである、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現が明らかである、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記病気が癌である、または前記治療または予防において免疫応答が生じる、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記治療または予防がワクチン接種である、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
請求項１〜１７および２１のいずれか１項に定義された化合物または組成物と、内在化対象分子とを含むキットであって、前記内在化対象分子は、ポリヌクレオチド、抗原分子、および細胞毒性分子から選択される、キット。
【請求項４２】
対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、同時に、別個に、または順に使用される、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
療法のための、請求項４１又は４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記療法が、癌療法、遺伝子療法または免疫応答を刺激するためのものである、請求項４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光増感剤とコンジュゲートした生体適合性のポリマーキトサン誘導体を含む新規のキトサン系コンジュゲート（例えばナノ担体）、および、光化学的内在化（ＰＣＩ）および光線力学的療法（ＰＤＴ）におけるその使用に関する。本発明はまた、病気特に癌の治療または予防およびワクチン接種目的における本発明の新規のコンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ材料は、同組成のバルク材料と比較して小サイズであり、質量比に対する表面積が大きく、高活性であるなどの生理化学的特性を有する。これらのユニークな特性は、従来の医薬品において見られたいくつかの限界を改善および克服できる。ナノ材料を適用することによって、溶解度、温度拡散率、血液循環半減期、薬物放出性、免疫原性等の特性を改良する機会が与えられる。ここ２０年、病気治療のために、ナノ粒子をベースとした多数のエージェント（剤）が治療適用および診断適用のために開発されてきた。
【０００３】
ナノ材料の使用は、より効果的でより便利な投与ルート、低毒性、副作用の最小化、生物学的利用能の向上、およびシステムにおける生成物のライフサイクルの延長を提供し得る。ナノ粒子またはナノ担体は、薬物送達システムとして、標的化送達および制御放出を提供することができる。更に、ナノ材料を診断目的で使用することもできる。ナノ材料は、例えば、確立された従来のアプローチでは検出できなかった前癌細胞、ウイルス断片、および疾患マーカの検出を可能にし得る。
【０００４】
現在、天然ポリマーおよび合成ポリマーが、リポソームと並んで文献にみられる主要なナノ粒子プラットフォームである（Peer et al., 2007, Natl., 2(12), p751-760）。他の一般的なプラットフォームとしては、デンドリマー、オイル・ナノエマルション、メソポーラスシリカナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子等が挙げられる。
【０００５】
ナノ担体であり得る本発明の新規のコンジュゲートは、キチン由来の生体適合性のポリマーキトサン誘導体を含む。キチン(ポリ(β−(1→4)−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン))は天然多糖類であり、昆虫および甲殻類のサポート材料である。キチンは、セルロースの次に地球上で２番目に豊富な天然多糖類である。キチンは、通常蟹や海老の殻などから得られる。構造的には、キチンはセルロースと類似しているが、ポリマー骨格のＣ２位にヒドロキシル基の代わりにアセトアミド基を有する。
【０００６】
キトサンは最も重要なキチンの誘導体であり、通常アルカリ法によってアセチル基を除去して作られる。天然ポリマーの大部分は本来中性または酸性であるが、キトサンは高度に塩基性の多糖類である。Ｃ２位の窒素原子は、合成戦略によってポリマーを修飾する機会を提供するものであり、分子が例えば向上した溶解度および改良された生物学的特性などの特定の望ましい特性を持つように調整する。
【０００７】
キトサンポリマーは、様々な脱アセチル化度（ＤＤ）を有するβ−（１→４）結合Ｄ−グルコサミン単位からなり、直鎖状ポリマー鎖全体に渡って残存アセチル基がブロックでまたはランダムに分布している。酸性条件下でアミノ基は陽電荷であるため、キトサンは酢酸などの希釈酸に溶解する。ＤＤは非常に可変であるが、１００％になることはほぼない。ＤＤに関するキチン対キトサンの特有の呼び方は定義されていないが、キトサンのＤＤは４０〜１００％の範囲で変化できる。分子量は最大２０００ｋＤａになり得るが、分子量が５０ｋＤａ未満の場合はオリゴキトサンであると考えられる場合もある。
【０００８】
ここ数十年間、キチンおよびキトサンは、それらの医薬品における適用潜在性について注目されてきた。溶解度を促進し且つその物理的特性、化学的特性および生物学的特性を更に改良するために、様々なキトサン誘導体が設計および合成されてきた。
【発明の概要】
【０００９】
キトサン誘導体に加え、本発明のコンジュゲートは光増感剤も含む。光増感剤は、キトサンとコンジュゲートしている。従って、該コンジュゲートは、光増感に関与する方法において特定の用途を有する。
【００１０】
光増感は、吸収された光のエネルギーを伝達するプロセスである。光の吸収後、エネルギーは（選択された）反応物に伝達される。光増感物質は、光のエネルギーをＩＩ型化学反応に転換できる化合物である。これらのプロセスの高反応性最終生成物は、細胞毒性および血管毒性をもたらす。
【００１１】
光増感物質は、様々なメカニズムによって、直接的または間接的にその効果を発揮し得る。例えば、特定の光増感物質は、光によって活性化されると直接的に毒性を持つようになり、一方で、他の光増感物質は、毒性種（例えば一重項酸素などの酸化剤または他の酸素由来フリーラジカル）を生成するよう働く。毒性種は、細胞材料、および脂質、タンパク質、核酸などの生体分子に対して極めて高い破壊力を持つ。
【００１２】
公知の光増感剤としては、ポルフィリン類、フタロシアニン類、プルプリン類、クロリン類、ベンゾポルフィリン類、リソソーム向性の弱塩基類、ナフタロシアニン類、カチオン染色およびテトラサイクリン類またはそれらの誘導体など多くのものが存在する（Berg et al., (1997), J. Photochemistry and Photobiology, 65, 403-409）。他の光増感剤としては、テキサフィリン類、フェオホルビド類、ポルフィセン類、バクテリオクロリン類、ケトクロリン類、ヘマトポルフィリン誘導体、および５-アミノレブリン酸によって誘発される内因性光増感物質が挙げられる。下記に説明するように、本発明のキトサン系分子において、ポルフィリン類およびクロリン類、特にテトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）およびテトラフェニルクロリン（ＴＰＣ）が採用されている。
【００１３】
ポルフィリン類は、最も広範囲にわたって研究されてきた光増感剤である。それらの分子構造は、メチン架橋を介して結合した４つのピロール環を含む。ポルフィリン類は、多くの場合、金属錯体を形成できる天然化合物である。例えば、酸素運搬タンパク質ヘモグロビンの場合、鉄原子がヘムＢのポルフィリンコアに導入される。
【００１４】
クロリン類は、そのコアが、４つのメチン結合で繋がった３つのピロールと１つのピロリンとからなる大きな複素環式芳香環である。従って、ポルフィリンとは異なり、クロリンは大部分が芳香族であるが、環の外周全体としては芳香族性をもたない。
【００１５】
光増感剤は、光線力学的療法（ＰＤＴ）および光化学的内在化（ＰＣＩ）方法において用いられる。ＰＤＴは、全身にまたは局所的に光増感物質を投与する工程と、それに続いて、好適な波長の光を照射する工程とに関与する２工程プロセスである。細胞毒性効果を引き起こすためには、分子酸素の存在も必須である。これらの３つの要素（すなわち、光増感物質、光および酸素）がうまく組み合わさると、光線力学的反応が発生する。光線力学的反応は、細胞死および組織損傷を引き起こす細胞毒性種を発生させる。
【００１６】
ＰＤＴは、例えば癌の治療に用いられる。光線力学的反応からのラジカル中間体は、生体組織内の酸素に捕捉されて、一重項酸素(1Ｏ2)などの活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する。1Ｏ2は高い細胞毒性潜在性を有する短命な形の酸素である。よって、全身性副作用を大幅に防止する選択性の高い細胞毒性治療を達成できる。
【００１７】
ＰＣＩは、ＰＤＴと同じ原理に基づくが、（例えば低い光照射量を用いて）より少ない数のＲＯＳを生成することによって、ＲＯＳによる著しい細胞死なしで閉じ込めた薬物および高分子をエンドソームからサイトゾル内に放出させる。ＰＣＩにおいて、光励起が、リソソーム膜および／またはエンドソーム膜のＲＯＳを媒介した損傷選択、および閉じ込めた親水性薬物および高分子の放出を引き起こす。これにより、エンドサイトーシスによって取り込まれた分子は、リソソーム内で分解される前に、アクションの標的に辿り着くように放出される。
【００１８】
ＰＣＩは、多種多様な高分子および原形質膜を容易に透過しない他の分子の生物活性を促進することが示されてきた。これらの分子としては、例えばＩ型リボソーム不活性化タンパク質、イムノトキシン類、ブレオマイシン（Blenoxane（登録商標））およびドキソルビシンなどの化学療法剤、プラスミドをコードする遺伝子、およびオリゴヌクレオチド類が挙げられる。ＰＣＩは、対応するＰＤＴと比べてより深い組織層で細胞毒性を誘発することが分かっている。固形腫瘍に選択的に蓄積される光増感物質により誘発される光活性化サイトゾル送達と標的治療とを組み合わせることによって、ＰＣＩは高い特異性を有することができ、抗腫瘍効能の促進にも寄与している。
【００１９】
臨床適用におけるＰＤＴ関連の共通する課題の一つは、皮膚光感作性および好ましくない光増感物質の生体内分布である。副作用を減少し、ＰＤＴにおける薬物動態を向上するための一つのアプローチとして、デンドリマー、リポソームおよび高分子ミセルなどのナノ担体が導入されてきた。
【００２０】
ＰＣＩおよびＰＤＴ方法で用いるナノ担体および光増感剤の改良が依然求められている。本発明は、このニーズに取り組む。本発明者は、光増感物質とキトサンのコンジュゲートをベースとした新規の化合物を開発した。下記実施例に記載の如く、インビトロおよびインビボの両方で驚くべき優れた効能を実証した新規の分子は、ＰＣＩ方法において驚くべき高い効能を有する。
【００２１】
従って、第一の態様において、本発明は、光増感物質とキトサンのコンジュゲートを含む下記式（Ｉ）で表される化合物（例えば、ナノ担体）を提供する。
【００２２】
【化１】
0006456284.tif 000002
【００２３】
［前記式中、
ｎは、３以上の整数であり、
Ｒは、前記化合物においてｎ回出現する。
【００２４】
前記総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％において、各Ｒは、
Ｈ,
【化２】
0006456284.tif 000003
【化３】
0006456284.tif 000004
但し、ａは１、２、３、４または５であり；ＸはＢｒ、ＣｌまたはＯＨである。；
【化４】
0006456284.tif 000005
但し、各Ｒ1は、同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ3および−（ＣＨ2）c−ＣＨ3から選択され；ｂは１、２、３、４または５であり；ｃは０、１、２、３、４または５である（対イオンは、例えばＣＩ-であり得る）。;
【化５】
0006456284.tif 000006
但し、ＹはＯ；Ｓ；ＳＯ2；−ＮＣＨ3；または−Ｎ（ＣＨ2）eＣＨ3であり；ｄ＝１、２、３、４または５であり；ｅ＝１、２、３、４または５である。;
【化６】
0006456284.tif 000007
但し、Ｒ2は−（ＣＨ2）h−ＣＨ3または−ＣＯ−（ＣＨ2）h−ＣＨ3であり；ｆは１、２、３、４または５であり；ｇは１、２、３、４または５であり；ｈは０、１、２、３、４または５である。;
【化７】
0006456284.tif 000008
但し、Ｒ3は−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは１〜２００の整数、好ましくは１〜５０または１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、または１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００もしくは２００以上の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５であり；ｋは１、２、３、４または５である。;
【化８】
0006456284.tif 000009
但し、Ｒ3は−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは上記定義の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５である。;
【化９】
0006456284.tif 000010
但し、Ｒ3は−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは上記定義の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５であり；各Ｒ1は同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、ＣＨ3および−（ＣＨ2）c−ＣＨ3から選択され；ｃは０、１、２、３、４または５である。;
【化１０】
0006456284.tif 000011
但し、Ｒ3＝−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは上記定義の整数であり；ｊは０、１、２、３、４または５である。;
【化１１】
0006456284.tif 000012
但し、Ｒ3＝−（ＣＨ2）j−ＣＨ3であり；ｉは上記定義の整数であり；Ｌは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり；ｊは０、１、２、３、４または５である。;
【化１２】
0006456284.tif 000013
および
【化１３】
0006456284.tif 000014
但し、ｍは１、２、３、４または５である。;
から選択される基Ａである。
【００２５】
前記総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％において、各Ｒは、
【化１４】
0006456284.tif 000015
から選択される基Ｂである。
【００２６】
ここで、ｐは０、１、２、３、４または５であり；ｑは１、２、３、４または５であり；ｒは１、２、３、４または５である。;
【００２７】
Ｒ4は、
【化１５】
0006456284.tif 000016
から選択される基である。；
【００２８】
（好ましくは、Ｒ4は、
【化１６】
0006456284.tif 000017
から選択される。）；
【００２９】
Ｗは、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＮ（ＣＨ3）から選択される基である。；
【００３０】
Ｒ5は、−（ＣＨ2）s−ＣＯ−；−（ＣＨ2）s−Ｚ−（ＣＨ2）t−ＣＯ−および−（ＣＨ2）s−Ｚ−（ＣＨ2）t−Ｚ−ＣＯ−から選択される基であり；ｓは０、１、２、３、４または５であり；ｔは０、１、２、３、４または５である。；
Ｚは、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、またはＳＯ2である。；
【００３１】
Ｒ6は、−ＣＮおよびＣＨ3から選択される基である。；
【００３２】
Ｒ7は、
【化１７】
0006456284.tif 000018
から選択される基である。；
Ｖは、ＣＯ、ＳＯ2、ＰＯ、ＰＯ2ＨまたはＣＨ2から選択される基である。；
【００３３】
（好ましくは、Ｒ7は、
【化１８】
0006456284.tif 000019
から選択される。)；
【００３４】
Ｒ8は、同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣＨ3、−ＣＨ3、−ＣＯＣＨ3、Ｃ（ＣＨ3）4、−ＮＨ2、−ＮＨＣＨ3、−Ｎ（ＣＨ3）2および−ＮＣＯＣＨ3から選択される基（ｏ、ｍまたはｐ位で置換）である（好ましくは、各Ｒ8はＨまたは少なくとも一つのＲ8はＨではない）。；
【００３５】
各Ｒ基は、同一であっても異なっていてもよい。］
【００３６】
前記キトサンポリマーは、少なくとも３単位（ｎ＝３）有する。しかしながら、好ましくは、ｎは、１０、２０、５０、１００、５００、１０００以上、例えば１０〜１００または１０〜５０である。
【００３７】
上述の通り、コンジュゲートに採用された光増感物質は、ポルフィリンおよびクロリン誘導体、特にＴＰＰa、ＴＰＣa1、ＴＰＣa2、ＴＰＰc、ＴＰＣc1およびＴＰＣc2である。前記光増感物質誘導体Ｒ4またはＲ7は、好ましくはＴＰＣa1、ＴＰＣa2、ＴＰＣc1またはＴＰＣc、特に好ましくはＴＰＣa1またはＴＰＣa2である。
【００３８】
コンジュゲートのキトサン誘導体は、上記Ｒ基の置換度（ＤＳ）を種々異ならせることができる。例えば、１つ以上の上記Ｒ基は、有する場合、１％未満、好ましくは０．１〜１．０％、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５もしくは９９．９％よりも大きいキトサン置換を有し得る。上記記載の如く、Ｒ基の基Ａおよび基Ｂは、それぞれ総Ｒｎ基の０．１％〜９９．９％（好ましくは０．５〜９９．５％）である。好ましくは、基Ａは、総Ｒｎ基の５０％以上、好ましくは６０、７０、８０、９０または９５％以上である。特に好ましくは、基Ａは、総Ｒｎ基の５０〜９５％、例えば７０〜９５％である。好ましくは、基Ｂは、総Ｒｎ基の５０％未満、例えば４０、３０、２０、１０または５％未満である。特に好ましくは、基Ｂは、総Ｒｎ基の５〜３０％、例えば１０〜２５％である。
【００３９】
Ｒ基の基Ａ（またはＲ基の基Ｂ）は、同一であっても異なっていてもよい。異なる基が存在する好適な態様において（例えば、Ｒ基の基Ａにおいて）、各基の割合は変化し得る。例として、一つのＲ基が主成分として例えば（総Ｒｎ基の）７５〜９５％の範囲で存在し得るのに対し、他のＲ基は副成分として例えば（総Ｒｎ基の）０．１〜１０％の範囲で存在し得る。しかしながら、別の場合では、主成分が低レベル（例えば５０〜９０％）で存在し、副成分が高レベル（例えば０．１〜５０％）で存在し得る。好ましくは、存在するＲ基の基Ａがキトサン分子のアセチル化を反映する場合、すなわちＲが
【化１９】
0006456284.tif 000020
である場合、それは総Ｒｎ基の１％未満で存在する。該Ｒ基は、本発明の化合物を生成するのに用いられる原料キトサン分子のアセチル化度（ＤＡ）を反映する傾向があり、そのため、その普及度（prevalence）は変化し得る。好ましくは、それは総Ｒｎ基の６０％未満であり、好ましくは３０％または２０％未満、例えば総Ｒｎ基の０．１〜３０％である。
【００４０】
Ｒ基のすべての基Ａおよび基Ｂが占める総％は１００％であり、上記の範囲内から選択が行われることが理解されるであろう。
【００４１】
使用した合成方法によっては、多少の不純物または別の生成物が低レベルで存在し得ることに気付くであろう。例えば微量の他のＲ基または残余保護基（例えばＴＢＤＭＳ）が最終生成物に残り得る。しかしながら、そのような微量の成分または化合物は、存在するにしても全体の１％未満（好ましくは０．１％未満）であり、機能性に影響を与えることはない。そのような微量の成分または化合物を含む化合物または組成物は、本発明の範囲内にある。
【００４２】
本明細書に記載する好適な態様において、選択されたＲ基の％は、総Ｒｎ基における割合を示す。そのような場合、％範囲が好ましい（例えば、製造におけるばらつきを反映するため）。好ましくはその範囲は５％である。すなわち、特定の構造を有するＲ基の基Ａ：９０％について述べる場合、これは該Ｒ基の基Ａを８５〜９５％有する化合物にまで及ぶ。
【００４３】
好ましいＲ基の基Ａは、
【化２０】
0006456284.tif 000021
【化２１】
0006456284.tif 000022
但し、好ましくは、各Ｒ1はＣＨ3、ｂは１である。;
【化２２】
0006456284.tif 000023
但し、好ましくはＹは−ＮＣＨ3であり、ｄは１である。;
【化２３】
0006456284.tif 000024
但し、好ましくはｊは０または１であり；ｉは３または６であり、ｋは１である。;
【化２４】
0006456284.tif 000025
但し、好ましくはｊは１であり、ｉは２である。; 
【化２５】
0006456284.tif 000026
但し、好ましくはｊは０または１であり、ｉは２、４または５（例えば２または４）であり、Ｌは１である。;
【化２６】
0006456284.tif 000027
【化２７】
0006456284.tif 000028
但し、好ましくはｍは１である。；
から選択される。
【００４４】
好ましくは、上記Ｒ基は、主成分（すなわち、総Ｒｎ基の７５％を超える（上述の通り））としてまたは副成分（すなわち、総Ｒｎ基の１０％未満（上述の通り））として存在する。好ましくは、基
【化２８】
0006456284.tif 000029
は、副成分としてのみ存在する。
【００４５】
好ましいＲ基の基Ｂは、
【化２９】
0006456284.tif 000030
但し、好ましくはｐは１である。;
【化３０】
0006456284.tif 000031
但し、好ましくはｐは１であり、ｑは１である。;
【化３１】
0006456284.tif 000032
但し、好ましくはｐは１である。；および
【化３２】
0006456284.tif 000033
但し、好ましくはｐは１である；
から選択される。
【００４６】
特に好ましいＲ基の基Ａは、
【化３３】
0006456284.tif 000034
【化３４】
0006456284.tif 000035
但し、好ましくは各Ｒ1はＣＨ3であり、ｂは１である。;
【化３５】
0006456284.tif 000036
但し、好ましくはＹは−ＮＣＨ3であり、ｄは１である。;
【化３６】
0006456284.tif 000037
但し、好ましくはｊは１であり、ｉは２である。；
【化３７】
0006456284.tif 000038
但し、好ましくは、ｊは０または１であり、ｉは２、４または５（例えば２または４）であり、Ｌは１である。；
から選択される。
【００４７】
特に好ましいＲ基の基Ｂは、
【化３８】
0006456284.tif 000039
但し、好ましくはｐは１である。;
【化３９】
0006456284.tif 000040
但し、好ましくはｐは１であり、ｑは１である。;
【化４０】
0006456284.tif 000041
但し、好ましくはｐは１である。；
から選択される。
【００４８】
好ましいＲ基、および総Ｒｎ基におけるそれらの相対的な普及度を下の表に示す。表において、キトサンとコンジュゲートする様々なＲ基が示されている。Ｒ基の各タイプの優位性（predominance）を括弧内に記すが、記載値の±５％の範囲で変化し得る。Ｒ基の基Ｂには、光増感物質基Ｒ4またはＲ7が結合している。
【００４９】
【化４１】
0006456284.tif 000042
【化４２】
0006456284.tif 000043
【化４３】
0006456284.tif 000044
【化４４】
0006456284.tif 000045
【化４５】
0006456284.tif 000046
【化４６】
0006456284.tif 000047
【００５０】
特に好ましい本発明の化合物もまた、図１に示されている通りである。そこにＲ基の普及度が記載されているが、普及度は記載値の最大±５％の範囲で変化し得る。いずれの場合にも、光増感物質が結合しているＲ基は、低い記載普及度を有する。
【００５１】
本発明の化合物は、本明細書の実施例に記載の如く準備され得る。その合成方法としては、当該技術において標準的な手順が用いられる。当該手順は、当業者にとって馴染み深いものであり、下記の実施例において説明されている。関連するＲ基を提供するためのＰＥＧ化（PEGylation）およびＴＥＧ化（TEGylation）は、当該技術において標準的な方法に従って実施することができる。本発明はまた、例えば本願明細書に記載の実施例およびスキームに記載の如く、本発明の化合物を準備する方法にも適用される。
【００５２】
本発明の化合物は毒性が低く、そのため様々な医療適用に適している。
【００５３】
本発明の化合物は、ＰＣＩ方法における使用に特に適している。本実施例に例示されているように、本発明の化合物は、分子の細胞内への内在化において驚くべき優れた効能を有する。実施例３において、本発明の化合物の効能は、増感物質単独（本ケースでは、ＰＣＩ用に特別に設計され且つ癌治療のために臨床開発中の光増感物質ＴＰＣＳ2aが用いられた（Berg et al. 2011, Photochem. Photobiol. Sci., 10, p1637-1651））で達成される効能と比較して非常に優れていることが分かった。ＴＰＣＳ2aと比較すると、本発明の化合物は、少なくとも１０倍活性である、すなわち該コンジュゲートは、１０分の１の濃度で使用された場合であっても、ＴＰＣＳ2aを用いた観察よりも実質的により大きなトランスフェクションの促進をもたらした（図１９および２０を参照）。
【００５４】
光化学的内在化（ＰＣＩ）の基本的な方法は、ＷＯ９６／０７４３２およびＷＯ００／５４８０２に記載されており、引用によって本明細書に援用される。要約すると、内在化対象分子および光増感剤（本ケースでは、本発明の化合物の一部としての光増感物質）を細胞に接触させる。光増感剤および内在化対象分子は、細胞内の細胞膜結合サブ区画（cellular membrane-bound subcompartment）に取り込まれる。細胞を好適な波長の光で曝露すると、光増感剤が活性化し、細胞内区画膜を破壊する反応種を直接的または間接的に生成する。これにより、内在化された分子はサイトゾル内に放出される。
【００５５】
これらの方法は、その他には、膜不透過性分子（または難透過性分子）を細胞のサイトゾル内に導入するためのメカニズムとして、その方法論（methodology）が例えば照射回数または光増感物質の量を減らすことによって過剰な毒性種の生成を回避するように適切に調整されていれば、広範囲な細胞破壊または細胞死を招かないような方法で、光化学効果を利用している。
【００５６】
このように、本発明はまた、分子を細胞のサイトゾル内に導入する方法であって、導入対象分子と本発明の化合物とを前記細胞に接触させること、および、前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することを含む方法を提供する。一旦光増感剤が活性化されると、前記化合物を含む前記細胞内の細胞内区画は、これらの区画に含まれていた分子をサイトゾル内に放出する。内在化したい分子を内在化するために本発明の化合物を用いることも、本発明の一部を形成する。
【００５７】
ＰＣＩは、多くの異なる種類の分子を細胞内にトランスフェクションすることを可能にする。分子は、例えば、ＤＮＡもしくはアンチセンスＤＮＡ；オリゴ（デオキシ）ヌクレオチド；ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡ等のＲＮＡ；ＰＮＡ、糖類；タンパク質類；ペプチド類；膜不透過性薬物；その他の膜不透過性分子、または上記分子の共有結合もしくは非共有結合の組合せから選択され得る。好ましくは、導入対象分子は、ＰＣＩの手助けなしでは顕著に内在化（すなわち、サイトゾル内に）されない。例えば、分子の内在化は、分子が適用された細胞のうち５０％未満（例えば、３０％または１０％未満）の細胞が４時間の期間内に１つ以上の分子をサイトゾル内に内在化するように制限される。
【００５８】
内在化対象分子は、様々な結果を達成するよう選択され得る、例えば、標的遺伝子の発現を変化（例えば減少もしくは増加）させるように、または細胞の特性もしくは生存能力に影響力を持つように選択され得る。遺伝子発現に影響を与えるために、移動対象分子は、センスまたはアンチセンス・オリゴまたはポリヌクレオチド、例えばプラスミドまたはアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子などにおける遺伝子配列であり得る。このような方法は、癌などの病気および疾患を治療するまたは予防するのに有効であり、遺伝子療法の適用においても有効であろう。
【００５９】
本発明の方法は、内在化対象分子のサイトゾル内への転位（translocation）を実現する。しかしながら、理解されるであろうが、細胞と接触した一つ一つの分子をサイトゾル内に取り込みむことはできない。しかしながら、ＰＣＩまたは本発明の化合物が用いられていない背景水準と比較すると、顕著かつ改良された内在化を達成することができる。
【００６０】
本発明の方法は、分子の内在化を、その効果が例えば細胞の発現生成物においてまたは細胞に対する効果によって明らかに分かるレベルで可能にすることが好ましい。細胞と接触する分子の適切な濃度は、この目的を達成するよう調整され得る。例えば、いくつかの適用では、標的遺伝子（または導入された遺伝子）の発現を上昇もしくは低減させること、または細胞毒性分子の導入後に細胞死を達成することが望まれる。発現の低減または細胞死は、それぞれ、１０％以上、例えば２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０もしくは９０％以上の発現の低減（例えば、標的遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現において）、または、例えば２４、４８、７２もしくは９６時間（例えば２４〜４８時間）細胞とインキュベーションした後の細胞死であり得る。発現の上昇は、非内因性分子が使用された場合にはゼロになり得る既存レベルに対して評価されてもよく、発現の低減に関して上述されたレベルと数値的に同等のレベルの発現の上昇が達成され得る。同様に、（本発明の）化合物のタイプおよび／または濃度および照射時間を調整することによって、上述した発現の低減を達成することができる。
【００６１】
発現生成物のレベルを、例えば当該技術において公知の標準的な手法（ウェスタンブロッテイング等）を用いて細胞内のタンパク質レベルを決定することによって、測定することができる。タンパク質の低減レベルは、タンパク質の半減期に依存する。すなわち、既存のタンパク質は、半減期に伴い取り除かれる。細胞死は、任意の適切な手段によって決定され得る。
【００６２】
導入された遺伝子材料の効果を、例えば細胞内に存在するｍＲＮＡの発現レベルの観点からも測定することができる。例としては、この方法は、例えば２４、４８、７２または９６時間、具体的には２４〜４８時間、細胞とインキュベーションした後のｍＲＮＡレベルの上昇または低減が、遺伝子材料を加えていない標的または導入配列の同じタイムポイントでのｍＲＮＡレベルに対して、１０％以上、例えば２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％以上の上昇または低減を達成するよう実施され得る。これを、ハイブリダイゼーションまたはブロッテイング手法などの当該技術において公知の標準的な手法およびＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することもできる。
【００６３】
本明細書で用いられる「細胞」という用語には、あらゆる真核細胞（昆虫細胞および真菌細胞を含む）が含まれる。従って代表的な「細胞」としては、あらゆるタイプの哺乳類および非哺乳類の動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞および原生動物が挙げられる。しかしながら、該細胞は、好ましくは哺乳類、例えば猫、犬、馬、ロバ、羊、豚、山羊、牛、マウス、ラット、ウサギ、モルモットからの細胞であり、最も好ましくはヒトからの細胞である。
【００６４】
本明細書で用いられているように、「接触（contacting）」とは、本発明の化合物を含む光増感剤および／または導入対象分子と細胞とを、細胞内への内在化に適した環境下、例えば好ましくは適切な栄養培地において３７℃にて、例えば２５〜３９℃にて、互いに物理的に接触させることを指す。
【００６５】
光増感剤を活性化するための細胞の「照射」は、下記に説明するように、直接的または間接的に光を投与することを指す。従って、細胞は、光源を用いて例えば直接的に（具体的には、インビトロ、単細胞上）または間接的に（具体的には、インビボ、細胞が皮膚表面下にある場合、または細胞が細胞層の形をとり、全ての細胞に直接的に光が照射される（すなわち他の細胞によるスクリーンがない）わけではない場合）照射される。
【００６６】
光増感剤を活性化するための光照射工程は、当該技術において周知の手法および手順に従って実施され得る。光の波長および強さは、使用された光増感剤に応じて選択される。適した人工光源は、当該技術において周知の、例えば青色（４５０〜４７５ｎｍ）または赤色（６２０〜７５０ｎｍ）の波長光である。
【００６７】
本発明の方法における細胞の光曝露時間は変化し得る。分子のサイトゾル内への内在化効率は、光への曝露を最大まで増加させるにつれて高まる。最大を超えると、細胞損傷および細胞死が増加する。
【００６８】
好適な照射工程の時間の長さは、標的、光増感物質（本発明の化合物内）、標的細胞または標的組織に蓄積された光増感物質の量、および光増感物質の吸収スペクトルと光源の発光スペクトルとの間のオーバーラップなどの要因に依存する。一般的に、照射工程の時間の長さは、数秒から数分または最大数時間のオーダーにあり、例えば好ましくは６０分間まで、具体的には０．２５もしくは１分間から３０分間、例えば０．５〜３分間または１〜５分間または１〜１０分間、具体的には３〜７分間、好ましくは約３分間、例えば２．５〜３．５分間である。短い照射時間、例えば１〜６０秒間、具体的には１０〜５０、２０〜４０または２５〜３５秒も用いられ得る。
【００６９】
適切な光照射量は、当業者によって選択され得るが、これもまた、使用した光増感物質（本発明の化合物内）および標的細胞または標的組織に蓄積された光増感物質の量に依存する。例えば、光増感物質のフォトフリン（Photofrin）およびプロトポルフィリン前駆体の５−アミノレブリン酸を使用する癌の光線力学的治療に使用される典型的な光照射量は、高熱を避けるために、２００ｍＷ／ｃｍ2未満のフルエンス範囲で５０〜１５０Ｊ／ｃｍ2の範囲にある。可視スペクトルの赤色領域においてより高い吸光係数を有する光増感物質を用いる場合、通常光照射量は低い。ＰＣＩ方法では、より低い照射量が用いられ得る。例えば、光照射量は７５〜１５０ｍＷ／ｃｍ2のフルエンス範囲で５〜２５Ｊ／ｃｍ2の範囲にある。更に、光増感物質の蓄積が少ない非癌性組織の治療では、必要となる総光量は、癌治療よりも実質的に高くなり得る。更に、細胞の生存能力を維持しなければならない場合、毒性種の過剰レベルの生成を避けなければならず、そのため関連パラメータが調整され得る。
【００７０】
本発明のＰＣＩ方法は、光化学的処理の性質上、すなわち光増感剤を活性化して毒性種を生成することを介するＰＤＴの効果上、不可避的に細胞殺傷を多少引き起こすであろう。提案された使用によっては、この細胞死は重要ではなく、実際にいくつかの適用（例えば癌治療）においては有利になり得る。
【００７１】
一実施形態において、本発明は細胞死を達成する方法を提供する。前記方法は、本発明の化合物を前記細胞に接触させること、および、前記化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を前記細胞に照射することにより、前記細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することを含む。細胞死（ＰＤＴによる）を達成させる場合、照射工程のタイミング、強さおよび波長を適切に選択して、最適に標的細胞の細胞死を達成する。
【００７２】
しかしながら、本発明のいくつかの実施形態において、例えば細胞毒性無しで遺伝子発現を抑制することが望ましい場合または細胞死が代わりに導入された分子によって達成される場合、細胞死が避けられる。例えば、いくつかの使用において、遺伝子発現の抑制、または一般的な細胞毒性が無い状態での発現、または細胞生存能力への効果を達成することは、例えばいくつかの遺伝子療法アプローチにおいて非常に有利である。本発明の方法は、光増感剤（本発明の化合物内）の濃度に応じて光照射量を選択することによって、生存細胞の比率または割合を調節するように改良され得る。このような手法もまた、当該技術において公知である。
【００７３】
生存細胞が望ましい適用において、実質上すべての細胞、あるいは大多数の細胞（具体的には、細胞の５０％以上、より好ましくは６０、７０、８０または９０％以上）が殺傷されない。ＰＣＩ治療に伴う細胞生存能力は、ＭＴＳ試験などの当該技術において公知の標準的な手法によって測定することができる。
【００７４】
いくつかの適用において、光増感物質の活性化によって引き起こされた細胞死の量に関係なく、ＰＣＩ効果が現れているいくつかの個々の細胞が、純粋な光化学的処理によっては殺傷されないように光照射量を調節することは重要である（もっとも細胞内に導入された分子に細胞毒性効果があれば、後にそれらの分子によって殺傷されるかもしれない）。
【００７５】
細胞毒性効果は、例えば細胞毒性分子（例えばゲロニン（gelonin）またはブレオマイシンなどの細胞毒性ペプチド）を導入することによって、または本発明の方法によって、例えば遺伝子アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子などのエージェントを腫瘍細胞に内在化させる遺伝子療法を用いることによって、達成され得る。
【００７６】
本発明の化合物および方法は、例えば遺伝子療法において、特定の遺伝子産物の発現を抑制または上昇させるなどの様々な目的のために、インビトロまたはインビボ、例えばその場（in situ）での処理あるいは生体外（ex vivo）での処理に使用され、その後、該処理細胞を身体に投与するものであってもよい。  
【００７７】
従って、本発明の更なる態様は、本発明の化合物またはコンジュゲートを含む組成物（例えば、医薬組成物）と、任意選択で別個に内在化対象分子とを提供する。該組成物が医薬組成物である場合、１つ以上の医薬的に許容される希釈剤または賦形剤を含む。
【００７８】
更なる態様において、本発明は、治療のための該化合物または組成物を提供する。
【００７９】
本発明は、本明細書に記載の本発明の化合物または組成物と、内在化対象分子とを含むキットを提供する。好ましくは、該キット（または製品）は、医療において、同時に、別個に、または順に使用され、好ましくは癌の治療、または以下に更に詳述されているようにワクチン接種のためのキットである。
【００８０】
従って、更なる態様は、対象における病気、疾患または感染、好ましくは異常なもしくは過剰な細胞成長が明らかである、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現が明らかである、特に好ましくは該病気が癌である場合の治療または予防に使用される、本明細書に定義された化合物または組成物と、任意選択で内在化対象分子とを提供する。対象における病気、疾患または感染を、本発明の化合物または組成物と、任意選択で内在化対象分子とを投与することによって治療するまたは予防する方法（本明細書に記載された使用に対応）も含まれる。好ましくは、該治療または予防は、本明細書に記載された方法を用いて達成される。
【００８１】
この方法はＰＣＩ方法を用いて実施され得る。または、細胞死が最終目的である場合、ＰＣＩ方法またはＰＤＴ方法が使用され得る。
【００８２】
従って、ＰＣＩ方法は上記記載の如く実施され得る、すなわち導入対象分子と該化合物または組成物とを対象における細胞に接触させ、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射することによって実施され得る。好ましくは、導入対象分子は細胞毒性分子、好ましくはブレオマイシンである。
【００８３】
ＰＤＴ方法は、該化合物または組成物を対象における細胞に接触させ、化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を細胞に照射して、細胞を死に至らしめる活性酸素種を生成することによって実施され得る。
【００８４】
或いは、本発明は、病気、疾患または感染の治療または予防のための薬剤調製における、本明細書に記載の化合物または組成物および任意選択で細胞内に内在化される分子の使用を提供する。また、該治療または予防のための薬剤調製における、該化合物または組成物の使用も提供する。該治療または予防は、本明細書に記載されている通りである。該病気、疾患または感染は、異常なもしくは過剰な細胞成長を示すもの、または異常に上昇したもしくは異常に抑制された遺伝子発現を示すもの、および／または細胞成長の減少から恩恵を受けるもの、または１つ以上の遺伝子発現の抑制もしくは上昇から恩恵を受けるものが好ましい。
【００８５】
本明細書では、異常または過剰とは、年齢および性別をマッチさせた正常な個々または同じ個体の他の正常な部分において、正常でないと考えられるものを指す。従って、異常な成長とは、癌、良性腫瘍を指し、過剰な細胞成長とは、光線性角化症、いぼ、ほくろなどの皮膚の状態を指し得る。本発明の方法が適用され得る癌としては、頭部癌、頸部癌、胆管癌、脳腫瘍、黒色腫、皮膚転移(異なる癌から)、肺癌、中皮腫、膵臓癌、胃癌、直腸癌、肛門癌、陰茎癌、外陰癌および食道癌が挙げられる。従って、薬剤は、癌の治療に使用され得る。内在化対象分子が使用される場合、それは抗癌性化学療法剤であり得る。
【００８６】
異常に上昇したまたは異常に抑制された遺伝子発現は、例えば内在化対象分子が遺伝子アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ分子である場合、該対象における１つ以上の標的遺伝子の発現を変化させることによって治療され得る。好ましくは、該薬剤は、遺伝子療法のための薬剤、すなわち異常な遺伝子発現を特徴とするまたは１つ以上の遺伝子を抑制することから恩恵を受ける病気、疾患または感染を治療するまたは予防するための薬剤である。該発現の変化は、該発現の下方制御（down regulation）も含む。
【００８７】
ＰＣＩ方法を使用すると、化合物（または本発明の組成物）および内在化対象分子を、同時にまたは順に患者（または対象）の細胞または組織に接触させることができ、該細胞は、該化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で照射される。照射は、細胞が該化合物および分子を該光増感剤を含む細胞内区画内に取り込む前、取り込む間または取り込んだ後に、好ましくは細胞が該輸送分子を細胞内区画内に取り込む前に、実施される。
【００８８】
また、細胞を治療して、それらを対象に投与する方法も意図している。従って、代替の態様において、本発明は、患者における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するための方法を提供する。該方法は、本発明の化合物（または組成物）と任意選択で内在化対象分子とを、上記記載の方法に従って、インビトロ、インビボまたは生体外で１つ以上の細胞に導入すること、および、必要に応じて（すなわち、トランスフェクションをインビトロまたは生体外で実施する場合）、該細胞を該患者に投与することを含む。従って、生成された細胞は、上記記載の治療または特定の使用で用いられ得る。
【００８９】
本明細書では、対象は動物であり、好ましくは哺乳動物、例えば牛、馬、羊、豚、山羊、ウサギ、猫、犬であり、特に好ましくはヒトである。
【００９０】
本明細書に定義される「治療（treatment）」は、治療前の症状に関して、治療される１以上の病気、疾患または感染の症状を軽減し、緩和し、または取り除くことを指す。「予防」は、病気、疾患または感染の症状の発現を遅らせる、または防ぐことを指す。
【００９１】
本発明の組成物もまた、本発明の方法によって分子がサイトゾル内に内在化されている細胞を含み得る。本発明は更に、療法用の、特に癌療法用または遺伝子療法用のこのような組成物にも適用される。
【００９２】
従って、本発明の他の更なる態様は、分子がサイトゾル内に内在化されている細胞または細胞集団を提供する。該細胞は、本発明の方法によって得ることができる。
【００９３】
本発明の他の更なる態様は、上記記載の療法、好ましくは癌療法または遺伝子療法に使用される組成物または薬剤を調製するためのそうした細胞または細胞集団の使用を提供する。
【００９４】
本発明は更に、本発明の細胞または組成物を患者に投与することを含む、患者の治療または予防の方法を提供する。すなわち、該方法は、上記記載の如く、分子を細胞内に導入する工程、および、このように調製された該細胞を該患者に投与する工程を含む。該方法は、好ましくは癌の治療または遺伝子療法（または、下記記載の如く、ワクチン接種）において使用される。
【００９５】
インビボでは、当該技術において一般的なまたは標準的な任意の投与方式、例えば、身体の内部および外部表面などに対する注射、注入、局所性投与、経皮投与が使用できる。インビボでの使用について、本発明は、光増感剤または内在化対象分子をそこに局在化させる細胞を含む任意の組織、固形組織ばかりでなく体液の存在場所を含めて、任意の組織に関して使用することができる。標的細胞により光増感物質が取り込まれ且つ光が適切に伝達される限りは、あらゆる組織を処置することができる。
【００９６】
従って、本発明の組成物は、医薬技術において公知の手法および手順に従って、例えば１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を用いて簡便に作製され得る。本明細書に記載の「医薬的に許容される」とは、組成物の他の成分と親和性があり且つ受け取り側にとって生理的に受容できる成分を指す。組成物の性質、担体または賦形剤材料、投与量等は、選択および所望の投与ルート、治療目的などに応じて通常の方法で選択することができる。投与量も同様で、通常の方法で同様に決定することができ、分子の性質、治療目的、患者の年齢、投与の方式等に依存する。光増感剤に関しては、照射による膜破壊の潜在性／能力についても考慮されるべきである。
【００９７】
本発明の化合物および組成物の更なる使用は、ワクチン接種のプロトコルにおける使用である。なぜなら、ＰＣＩ方法を使用して、抗原を細胞表面上に提示または発現させることができるからである。従って、ＰＣＩによって内在化対象分子が細胞のサイトゾル内に輸送および放出された後、分子は細胞表面に輸送され、そこで細胞の外側（すなわち細胞表面上）に提示されるであろう。この方法はワクチン接種の分野において特に有用である。この場合、ワクチン成分（すなわち抗原または免疫原）を表面提示のために細胞内に導入して、免疫応答を誘発、促進または増強してもよい。
【００９８】
従って、本発明は、抗原分子（例えば抗原）またはその一部を細胞表面上、好ましくは抗原提示細胞の表面上に発現させる方法を提供する。該方法は、本明細書に記載の化合物および方法を用いて、ＰＣＩによって分子を細胞のサイトゾル内に導入することを含む。該分子またはその一部は、後に該細胞表面上に提示される。
【００９９】
もう一つの選択肢として、本発明は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法を提供する。該方法は、該抗原分子と本明細書に定義された化合物とを該細胞に接触させること、および、該化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を該細胞に照射することを含む。該抗原分子は細胞のサイトゾル内に放出され、免疫応答を刺激するのに十分な大きさの該抗原分子またはその一部は該細胞の表面上に提示される。
【０１００】
本明細書で使用する「発現」は、該分子の少なくとも一部が、該細胞を取り巻く環境に曝されアクセスできるように、該細胞の表面に、該抗原分子またはその一部が存在することを指す。「表面」での発現は、発現対象分子が、細胞膜および／または細胞膜に存在するまたは存在させた成分と接触している状態で達成され得る。
【０１０１】
そのような抗原の提示は、有利な面として、結果的に免疫応答を刺激、好ましくは該抗原分子またはその一部を構成するまたは含む実体（entity）による次の攻撃に対する防御を与える免疫応答を刺激し得る。その結果、本発明は、ワクチン接種方法としての特別な有用性を見出した。
【０１０２】
より具体的には、本発明の本態様は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させる方法を提供する。該方法は、該抗原分子と本発明の化合物とを該細胞に接触させて、該分子および該化合物をそれぞれ該細胞の細胞内膜制限区画に取り込ませること、および、該細胞内区画の膜が破壊されるように、該化合物の光増感剤を活性化するのに有効な波長の光を該細胞に照射して、細胞を殺傷することなく該分子を細胞のサイトゾル内に放出することを含む。該放出された抗原分子またはその一部は、後に該細胞表面上に提示される。
【０１０３】
本明細書で使用する「破壊された（disrupted）」区画とは、その中に含まれる抗原分子が放出されるのに十分な程度に、永久的にまたは一時的にその区画の膜の完全性（integrity）が破壊されたことを指す。
【０１０４】
或いは、本発明の本態様は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるのに使用される化合物または組成物も提供する。該化合物または組成物は、例えば、対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、好ましくは免疫応答を引き起こすまたは刺激するために、好ましくはワクチン接種の方法で使用される。該組成物は、好ましくは抗原分子と、本発明の化合物とを含む。好ましくは、該組成物は、医薬的に許容されるものであり、上記記載の医薬的に許容される賦形剤、担体または希釈剤も含む。好ましくは、該治療または予防は、本明細書に記載の方法を用いて達成される。
【０１０５】
更なる態様において、本発明は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるのに使用される薬剤の調製における、抗原分子および／または本発明のエージェント（剤）の化合物の使用も提供する。これらは、例えば、対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、好ましくは免疫応答を引き起こすまたは刺激するために、好ましくはワクチン接種の方法で使用される。好ましくは、該治療または予防は、本明細書に記載の方法を用いて達成される。該抗原分子および本発明の化合物を投与することによる、対応の治療方法または予防方法も提供する。
【０１０６】
本発明の他の更なる態様は、抗原分子と本発明の化合物とを含む組み合わせ製剤（combined preparation）としての製品（生成物）を提供する。該製品（生成物）は、該抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるために、同時に、別個に、または順に使用され、例えば、対象における病気、疾患または感染を治療するまたは予防するために、好ましくは免疫応答を刺激するために使用される。
【０１０７】
本発明の他の更なる態様は、抗原分子またはその一部を細胞表面上に発現させるのに使用されるキットを提供する。該キットは、該抗原分子を収容する第１の容器と、本発明の化合物を収容する第２の容器とを含む。
【０１０８】
本発明において、抗原分子は適切に免疫システムに提示されているときに該分子およびその一部が免疫応答を刺激することができるなら、どのような分子であってもよい。従って、抗原分子は、ワクチン抗原またはワクチン成分、例えばポリペプチドを含む実体であることが有利である。
【０１０９】
そうした抗原または抗原ワクチン成分の多くは当該技術において公知であり、あらゆる種類の細菌性抗原もしくはウイルス性抗原、または原生動物もしくは高等生物等の任意の病原性種の抗原または抗原性成分を含む。伝統的に、ワクチンの抗原性成分は、生物全体（生きたもの、死んだもの、または弱毒化されたもの）、すなわち全細胞ワクチンを含み、更に、サブユニットワクチン、すなわち生物の特定の抗原性成分をベースとするワクチン（例えば、タンパク質、またはペプチド、または炭水化物でさえも）を含み、これらは幅広く研究され、文献に報告されてきた。このような任意の「サブユニット」ベースのワクチン成分を、本発明による抗原分子として使用してもよい。
【０１１０】
しかしながら、本発明は、ペプチドワクチンの分野において、特別な有用性を見出した。従って、本発明による好適な抗原分子は、ペプチドである（本明細書で定義するペプチドは、短いペプチドと長いペプチドの両方（すなわち、ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、およびタンパク質分子またはそのフラグメント（例えば、５〜５００アミノ酸、具体的には１０〜２５０アミノ酸、例えば１５〜７５アミノ酸、あるいは８〜２５アミノ酸のペプチド）を含む）。提示または発現される抗原分子の部分は、好ましくは抗原処理機構（antigen-processing machinery）によって細胞内に生成される部分を含む。しかしながら、それらの部分は、他の手段によっても生成され得る。例えば、適切な抗原設計（例えば、ｐＨ感受バンド）または他の細胞処理手段によって達成され得る。このような部分は、免疫応答を生じさせるのに十分な大きさ、例えばペプチドの場合、５アミノ酸を超える大きさ（具体的には１０または２０アミノ酸を超える大きさ）が好都合である。
【０１１１】
膨大な数のペプチドワクチン候補が、例えばＡＩＤＳ／ＨＩＶ感染またはインフルエンザ、犬パルボウイルス、ウシ白血病ウイルス、肝炎などのウイルス性の病気および感染の治療についての文献に提案されてきた（例えば、Phanuphak et al., Asian Pac. J. Allergy. Immunol. 1997, 15(1), 41-8; Naruse, Hokkaido Igaku Zasshi 1994, 69(4), 811-20; Casal et al., J. Virol., 1995, 69(11), 7274-7; Belyakov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(4), 1709-14; Naruse et al., Proc. Natl. Sci. USA, 1994 91 (20), 9588-92; Kabeya et al., Vaccine 1996, 14(12), 1118-22; Itoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 83(23) 9174-8を参照）。
【０１１２】
同様に、細菌性ペプチドを、実際に他の生物または種由来のペプチド抗原のように使用してもよい。
【０１１３】
病原性生物由来の抗原に加えて、ペプチドは、癌または多発性硬化症のような他の病気に対するワクチンとしての使用が提案されてきた。例えば、変異癌遺伝子ペプチドは、細胞毒性Ｔリンパ球の刺激における抗原の役割をする癌ワクチンとして、非常に期待がもてるペプチドである（Schirrmacher, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 1995, 121, 443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological Response Modifiers, 1997, 17, 316-327）。合成ペプチドワクチンもまた、転移性黒色腫の治療について評価されてきた（Rosenberg et al., Nat. Med. 1998, 4(3), 321-7）。多発性硬化症を治療するためのＴ細胞受容体ペプチドワクチンは、Wilsonら、J. Neuroimmunol. 1997, 76(1-2), 15-28に記載されている。このようなペプチドワクチン成分のいずれも、実際に文献においてペプチドワクチンとして記載または提案されている任意のペプチドのように、本発明の抗原分子として用いてもよい。従って、ペプチドは、合成されたものであっても、単離したものであっても、生物由来のものであってもよい。
【０１１４】
本発明の方法や使用などに供される細胞は、そのサイトゾル内に投与または輸送される分子をその表面上に発現または提示することができるものであれば、どのような細胞であってもよい。
【０１１５】
細胞は、免疫エフェクター細胞、すなわち免疫応答に関与する細胞であることが都合がよい。しかしながら、他の細胞もまた免疫システムに抗原を提示するかもしれず、これらも本発明の範囲内にある。従って、本発明による細胞は、有利には、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、液性免疫および細胞媒介性免疫の両方を含め、免疫応答のいかなる局面または「アーム」に関わってもよく、例えば、抗体産生の刺激、または細胞毒性細胞もしくはキラー細胞（これらは細胞表面に「外来」抗体を発現する細胞を認識し破壊する（もしくは排除する））の刺激である。従って、「免疫応答を刺激する」という用語は、あらゆる種類の免疫応答およびそれらを刺激するメカニズムを含む。
【０１１６】
細胞毒性細胞または抗体産生細胞の刺激は、抗原提示細胞による特定の様式、例えば、ＭＨＣクラスＩ提示によって刺激される細胞に対して、抗原が提示されることを要求する（具体的には、ＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞の活性化は、ＭＨＣ−１抗原提示を要求する）。
【０１１７】
抗原提示細胞は、当該技術において公知であり、文献に記載されており、これには例えばリンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞の両方）、樹状細胞、マクロファージなどが挙げられる。その他にも、例えば癌細胞（具体的にはメラノーマ細胞）が挙げられる。
【０１１８】
抗原提示細胞によって抗原を細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に提示するためには、抗原分子を抗原提示細胞のサイトゾルに入り込ませる必要がある（Germain, Cell, 1994, 76, 287-299）。本発明は、抗原分子をサイトゾル内に送達する効率的な手段を提供する。
【０１１９】
抗原分子は、一旦光化学的内在化プロセスによって細胞のサイトゾル内に放出されると、細胞の抗原処理機構によって処理され、例えばクラスＩ ＭＨＣによって適切に細胞表面上に提示され得る。この処理は、抗原の分解、例えばタンパク質またはポリペプチド抗原のペプチドへの分解を伴い、次いで該ペプチドは提示のためにＭＨＣの分子と複合化される。従って、本発明に基づき細胞表面上に発現または提示される抗原分子は、内在化（エンドサイトーシス）される抗原分子の一部またはフラグメントであり得る。
【０１２０】
抗原は、エンドサイトーシスによって抗原提示細胞に取り込まれ、エンドサイトーシス小胞においてペプチドに分解され得る。これらのペプチドは、エンドソーム中でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合して細胞表面に輸送され、そこでペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ複合体がＣＤ４+Ｔヘルパー細胞によって認識され、免疫応答を引き起こすことになる。或いは、サイトゾル内のタンパク質が例えばプロテアソームによって分解され、ＴＡＰ（抗原提示に関与するトランスポータ）によって小胞体内に輸送され得る。そこにおいて、ペプチドはＭＨＣクラスＩ分子に結合し、細胞表面に輸送され得る（Yewdell and Bennink, 1992, Adv. Immunol. 52： 1-123）。ペプチドが外来の抗原由来のものであれば、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体はＣＤ８+細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識されるであろう。ＣＴＬは、ペプチド−ＭＨＣ（ＨＬＡ）クラスＩ複合体に結合して活性化され、増殖を開始してＣＴＬのクローンを形成するであろう。標的細胞および細胞表面上に同じペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を有する他の標的細胞は、ＣＴＬクローンによって殺傷され得る。外来抗原に対する免疫は、十分な量の抗原をサイトゾル内に導入できれば、確立されることができる（Yewdell and Bennink, 1992, supra；Rock, 1996, Immunology Today 17： 131-137）。これは、特に癌ワクチンの開発の基礎となる。
【０１２１】
実用化への最大の課題の一つは、十分な量の抗原（または抗原の一部）をサイトゾル内に導入することである。これは、本発明によると解決され得る。
【０１２２】
これらの方法は、上記記載の如く、インビトロまたはインビボで使用され得る。
【０１２３】
従って、本発明の更なる態様は、抗原分子またはその一部をその表面上に発現する抗原提示細胞を提供する。当該細胞は、上記に定義された方法によって得ることができる（または得られる）細胞である。本発明の他の態様は、そうした細胞の集団または培養、特に生存能力があり機能性が損なわれていないそうした細胞の集団または培養を提供し、また、特に免疫応答を刺激するための、とりわけＣＴＬを刺激するためのそうした細胞（または、細胞の集団もしくは培養）の療法における使用も提供する。
【０１２４】
また、免疫応答を刺激するための、特にＣＴＬを刺激するための薬剤（例えばワクチン組成物）の調製におけるそうした細胞（または、細胞の集団もしくは培養）の使用を提供する。
【０１２５】
本発明を、以下の限定されない実施例において、以下の図面を参照しながら更に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１−１】図１（図１−１及び図１−２）は、特に好ましい本発明の化合物を示す（ＴＰＣ＝テトラフェニルクロリン）。
【図１−２】図１（図１−１及び図１−２）は、特に好ましい本発明の化合物を示す（ＴＰＣ＝テトラフェニルクロリン）。
【図２】図２は、スキーム１：化合物５を合成するための合成ルートを示す。試薬と条件：（ａ）プロピオン酸、還流、１時間（２０％）；（ｂ）ＮａＮＯ2（１．８ｅｑ）、ＴＦＡ、室温、３分、６７％）；（ｃ）ＳｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、濃縮ＨＣｌ、６０℃、１時間（８８％）；（ｄ）臭化ブロモアセチル、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１時間（６４％）；（ｅ）ピペラジン、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１時間（９４％）。
【図３】図３は、スキーム２：Ｎ−修飾キトサン誘導体（ＴＰＰ−ＣＳ−ＴＭＡおよびＴＰＰ−ＣＳ−ＭＰ）の合成を示す。ここで、Ａは第１バッチの化合物を示し、Ｂは第２バッチの化合物を示す。試薬と条件：（ａ）ＭｅＳＯ3Ｈ／Ｈ2Ｏ、１０℃−室温、１時間、（９０％）；（ｂ）ＴＢＤＭＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＳＯ、室温、２４時間（９６％）；（ｃ）臭化ブロモアセチル、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、−２０℃、１時間（９２％）；（ｄ）化合物５、すなわち、ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ（０．１または０．２５ｅｑ）、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨＣｌ3、室温、２時間（９２−９０％）；（ｅ）ＮＭｅ3または１−メチルピペラジン、ＣＨＣｌ3、室温、２４時間；（ｆ）ＴＢＡＦ、ＮＭＰ、５５℃、２４時間、または、濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨ、室温、２４時間。
【図４】図４は、ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１８Ａ）の合成における全ての中間体および最終化合物の代表的なＦＴ−ＩＲスペクトルのオーバーレイを示す：（Ａ）ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５；（Ｂ）ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−Ｃ ９；（Ｃ）ＴＰＰｐ0.1−ＣＨ2ＣＯ−ＤｉＴＢＤＭＳ−Ｃ １０Ａ；（Ｄ）ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9 １４Ａ；（Ｅ）ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9 １８Ａ。
【図５】図５は、ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１８Ａ）の合成における全ての中間体および最終化合物の代表的な1Ｈ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイを示す：（Ａ）ＤｉＴＢＤＭＳ−Ｃ ８；（Ｂ）ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−Ｃ ９；（Ｃ）ＴＰＰｐ0.1−ＣＨ2ＣＯ−ＤｉＴＢＤＭＳ−Ｃ １０Ａ；（Ｄ）ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9 １４Ａ；（Ｅ）ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9 １８Ａ。
【図６】図６は、水性：ＣＨＣｌ3二相系に溶解した化合物の分配（partitioning）を示す。（Ａ）ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1 ３；（Ｂ）ＴＰＰＮＨ−Ｐｉｐ ５；（Ｃ）ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75 １７Ａ；（Ｄ）ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＭＰ0.75 １９Ａ。上部が水相である。
【図７】図７は、ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１７Ｂ）およびＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＭＰ0.75（１９Ｂ）の代表的な最終化合物の固体13Ｃ ＮＭＲスペクトルを示す。
【図８】図８は、（Ｉ）溶媒中のＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75 １７Ｂの1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す：（Ａ）ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（９８：２）；（Ｂ）ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（７５：２５）；（Ｃ）ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（５０：５０）；（Ｄ）ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（２５：７５）；（Ｅ）ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（０：１００）；（ＩＩ）共溶媒中の定濃度（０．３ｍｇ／Ｌ）のＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75 １７ＢのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルのオーバーレイを示す：（Ａ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（１００：０）；（Ｂ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（７５：２５）；（Ｃ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（５０：５０）；（Ｄ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（２５：７５）；（Ｅ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（０：１００）；（ＩＩＩ）一定の吸光度（０．８５−０．９０；データ図示せず）であり、共溶媒中４１９ｎｍ（3-3 slit）にて励起された時のＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75 １７Ｂの蛍光発光スペクトルのオーバーレイを示す：（Ａ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（１００：０）；（Ｂ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（７５：２５）；（Ｃ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（５０：５０）；（Ｄ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（２５：７５）；（Ｅ）ＤＭＳＯ：Ｈ2Ｏ（０：１００）を示す。
【図９】図９は、（Ａ）ＴＰＰ−ＣＳ−ＴＭＡ独立ナノ粒子のＳＥＭ画像；（Ｂ）ＴＰＰ−ＣＳ−ＴＭＡ樹状ナノ凝集体のＳＥＭ画像；（Ｃ）ＴＰＰ−ＣＳ誘導体の接触角のグラフを示す。
【図１０】図１０は、スキーム３−化合物１、３、２０および２１の合成スキームを示す。反応および条件：（Ａ）プロピオン酸、還流、１時間、（２０％）;（ｂ）ＮａＮＯ2（１．８ｅｑ．）、ＴＦＡ、室温、３分；（Ｃ）ＳｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、濃縮ＨＣｌ、６０℃、１時間、（５４％）；（ｄ1）ｐ−トルエンスルホニルヒドラジド、Ｋ2ＣＯ3、ピリジン、還流、２４時間；（ｄ2）ｏ−クロラニル、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、（８０％）;（ｅ）塩化クロロアセチル、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、２時間、in situ；（ｆ）ピペラジン、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、１２時間、（６１％）。化合物２０および２１の全ての誘導体は、ＴＰＣａ1およびＴＰＣａ2異性体を含む。しかしながら、ＴＰＣａ1構造のみがスキームおよび構造図に示されている。
【図１１】図１１は、スキーム４−化合物２２〜２８の合成スキームを示す。反応および条件：（ａ）塩化アセチル、ＭｅＯＨ、還流、２４時間、（８７％）；（ｂ）ＢＦ3.Ｅｔ2Ｏ、ＣＨＣｌ3、室温、ｐ−クロラニル、４８時間、（１４％）；（ｃ）２Ｎ ＫＯＨ（ＭｅＯＨ中）、ＴＨＦ：ピリジン（１０：１）、還流、２４時間（７１％）；（ｄ1）ｐ−トルエンスルホニルヒドラジド、Ｋ2ＣＯ3、ピリジン、還流、２４時間；（ｄ2）ｏ−クロラニル、ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（７５：２５）、室温、（７０％）；（ｅ）ＥＤＣＩ．ＨＣｌ、ＨＯＢＴ、Ｅｔ3Ｎ、Ｎ−Ｂｏｃ−ピペラジン ５、ＤＭＦ、室温、２４時間（５４％）；（ｆ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、 室温、１時間（８９％）。化合物２６〜２８の全ての誘導体は、ＴＰＣｃ1およびＴＰＣｃ2異性体を含む。しかしながら、ＴＰＣｃ1構造のみがスキームおよび構造図に示されている。
【図１２】図１２は、スキーム５−化合物７〜９の合成を示す。試薬と条件：（ａ）ＭｅＳＯ3Ｈ／Ｈ2Ｏ、１０℃−室温、１時間、（９０％）;（ｂ）ＴＢＤＭＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＳＯ、室温、２４時間、（９６％）；（Ｃ）臭化ブロモアセチル、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、−２０℃、１時間、（９２％）。
【図１３】図１３は、スキーム６Ａおよび６Ｂを示す。 試薬と条件（６Ａ）：（ａ）化合物２１、すなわちＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ（０．１ｅｑ）、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨＣｌ3、室温、２時間（７８％）；（ｂ）ＮＭｅ3または１−メチルピペラジン、ＣＨＣｌ3、 室温、２４時間。試薬と条件（６Ｂ）：ａ）化合物２８、すなわちＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ（０．１ｅｑ）、Ｅｔ3Ｎ、ＮＭＰ、７５℃、１２時間（８９％）；（ｂ）ＮＭｅ3または１−メチルピペラジン、ＣＨＣｌ3、 室温、２４時間。
【図１４】図１４は、ＣＤＣｌ3におけるＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ（２８）の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。２つの異性体が示されている。
【図１５】図１５は、ＣＤＣｌ3における化合物２１（ＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ）の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す（２つの異性体が示されている）。
【図１６】図１６は、ＣＤＣｌ3における化合物２９の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。この化合物は、ＴＰＣａ１およびＴＰＣａ２異性体を含む。
【図１７】図１７は、ＣＤＣｌ3における化合物３４の1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。この化合物は、ＴＰＣｃ１およびＴＰＣｃ２異性体を含む。
【図１８】図１８は、ｄ6−ＤＭＳＯ／Ｄ2Ｏにおける最終担体化合物（３７、３８、３２および３３）のＮＭＲスペクトルを示す。
【図１９】図１９は、ＨＣＴ１１６／ＬＵＣ細胞におけるｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いたトランスフェクションを示す。トランスフェクションは、フローサイトメトリーによって照射４８時間後に測定された。細胞生残率はＭＴＴアッセイによって測定された。（ａ）１６Ａ、０．１μｇ／ｍｌ ＴＰＰ、（ｂ）１６Ｂ、０．１μｇ／ｍｌ ＴＰＰ、（Ｃ）１７Ａ、０．０１μｇ／ｍｌ ＴＰＰ、（ｄ）１９Ａ、０．０１μｇ／ｍｌ ＴＰＰ、（ｅ）ＴＰＣＳ2a、０．１μｇ／ｍｌ。
【図２０】図２０は、ＨＣＴ１１６／ＬＵＣ細胞におけるｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いたトランスフェクションを示す。トランスフェクションは、フローサイトメトリーによって照射４８時間後に測定された。細胞生残率はＭＴＴアッセイによって測定された。（ａ）化合物３７、０．０５μｇ／ｍｌ ＴＰＣ（ｂ）化合物３８、０．０５μｇ／ｍｌ ＴＰＣ（Ｃ）化合物３２、０．０５μｇ／ｍｌ ＴＰＣ（ｄ）化合物３３、０．０５μｇ／ｍｌ ＴＰＣ（ｅ）ＴＰＣＳ2a、０．１μｇ／ｍｌ。
【図２１】図２１は、ＨＣＴ１１６／ＬＵＣ細胞におけるｐＥＧＦＰ−Ｎ１を用いたトランスフェクションを示す。トランスフェクションは、フローサイトメトリーによって照射４８時間後に測定された。細胞生残率はＭＴＴアッセイによって測定された。化合物５４は、濃度０．１μｇ／ｍｌで用いられた。
【図２２】図２２は、担癌動物をキトサンコンジュゲートおよびブレオマイシンを用いてＰＣＩ治療を行った後の、インビボでの生物発光画像を示す。これらの動物は、実施例３の材料および方法の項に記載の如く取り扱われた。各動物の治療および画像のタイムポイント（光増感物質投入後の日数）が示されている。
【図２３】図２３は、担癌動物を化合物３７、３８または３３およびブレオマイシンを用いてＰＣＩ治療を行った後の腫瘍の成長を示す。これらの動物は、実施例３の材料および方法に記載の如く取り扱われた。ＰＳ：光増感物質
【図２４】図２４は、スキーム７−ＴＥＧ化およびＰＥＧ化のための試薬の合成を示す。反応条件：（ａ）ＫＯＨ、ｐ−ＴｓＣｌ、ＴＨＦ/Ｈ2Ｏ、室温、１２時間；（ｂ）ピペラジン、ＣＨ3ＣＮ、室温、１２時間、（４１％）；（Ｃ）スワーン酸化：（ＣＯＣｌ）2、ＣＨ2Ｃｌ2、ＤＭＳＯ、Ｅｔ3Ｎ、−７８℃。
【図２５】図２５は、スキーム８−ＤｉＴＢＤＭＳ−キトサンのＴＥＧ化を示す。試薬と条件：（ａ）ＭｅＳＯ3Ｈ／Ｈ2Ｏ、１０℃−室温、１時間、（９０％）;（ｂ）ＴＢＤＭＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＳＯ、室温、２４時間（９６％）；（ｃ）ＴＥＧ−ＯＴｓ ４２、Ｃｓ2ＣＯ3、ＮＭＰ、ＫＩ、５０℃、２４時間;（ｄ）ＨＣｌ／ＭｅＯＨ（３０％ v/v）、室温、２４時間;（ｅ）臭化ブロモアセチル、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、−２０℃、１時間（９２％）；（ｆ）ＴＥＧ−Ｐｉｐ ４６ Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、２４時間；（ｇ）ＨＣｌ/ＭｅＯＨ（３０％v/v）、室温、２４時間。
【図２６】図２６は、スキーム９−ＴＥＧ化されたキトサン−ＴＰＰコンジュゲートの合成を示す。試薬と条件：（ａ）臭化ブロモアセチル、Ｅｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、−２０℃、１時間（９２％）；（ｂ）ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５（０．１ｅｑ．）、ＣＨ2Ｃｌ2、Ｅｔ3Ｎ、室温；（ｃ）ＴＥＧ−ＰＩＰ（化合物４６）（２ｅｑ．）、ＣＨ2Ｃｌ2、Ｅｔ3Ｎ、室温、２４時間；（ｄ）ＭｅＯＨ中30％（V/V）ＨＣｌ、室温、１２時間;（ｅ）化合物４（０．２５ｅｑ）、ＮＭＰ、５０℃、Ｃｓ2ＣＯ3、２４時間；（ｆ）ＴＥＧ−モノエチルエーテル−トシラート（化合物４２）、ＮＭＰ、５０℃、ＫＩ、２４時間；（ｇ）ＭｅＯＨ中３０％（V/V）ＨＣｌ、室温、１２時間。
【図２７】図２７は、化合物５４の1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ、９６：４）を示す。
【図２８】図２８は、マウス初代マクロファージにおけるＩＬ−２産生を示す。該マウス初代マクロファージは、オバルブミン特異的（ＯＶＡ ２５７−２６４）ＣＤ８+Ｔ細胞クローンを有する抗原特異的Ｔ細胞設定（antigen-specific T cell setting）において、化合物３２（Ａ）、３８（Ｂ）およびオバルブミンＯＶＡ ２５７−２６４とインキュベートされたものである。活性化されたＣＤ８+Ｔ細胞からのＩＬ−２産生は、ＥＬＩＳＡによって分析された。
【発明を実施するための形態】
【０１２７】
実施例１−メソ−テトラフェニルポルフィリン−キトサン系ナノ担体の合成
７ステップの手順において、３，６−ｄｉ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−キトサン（ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ）および５−（ｐ−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン［ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1］を原料として、光増感物質のメソ−テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）にテザーされた（tethered）高水溶性キトサンナノ担体を合成した。ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳは、ＣＨ2Ｃｌ2への溶解性が高く、そのため高親油性の光増感物質は定量反応で導入され、０．１および０．２５の置換度を得ることができた。次に、トリメチルアンモニウミル（trimethylammoniumyl）および／または１−メチルピペラジニル基をポリマー骨格に導入して、最終脱保護担体の水溶解度を増加させた。この方法は再現性が高く、得られた材料は、固体ＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよび1Ｈ ＮＭＲによって十分に特徴づけることができることが分かった。担体は動的構造であり、水溶液においてナノ粒子状構造を形成し、そのコアは半固体のπ−スタックされた光増感物質であることがＵＶ−Ｖｉｓ、蛍光およびＮＭＲ調査で分かった。親油性環境下、これらの構造はアンフォールドできるため、光増感物質部分を細胞膜内に挿入することができると考えられる。
【０１２８】
一般的な材料および方法
Ｇｅｎｉｓ ＥＨＦ社（アイスランド）から提供されたキトサンポリマーを合成に用いた［キトサンポリマーＧＯ３０６２６−２（９５％ＤＤ、９５ｃｐ）］。溶媒および試薬はすべて市販品を購入して、更に精製することなく用いた。ＮＭＲスペクトルは、２９８ＫでＤＲＸ４００ＭＨｚ ＢＲＵＫＥＲ ＮＭＲスペクトロメーターに記録した。ケミカルシフトは、使用された重水素化ＮＭＲ溶媒［1Ｈ ＮＭＲ：ＣＤＣｌ3（７．２６ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ−ｄ6（２．５０ｐｐｍ）；13Ｃ ＮＭＲ：ＣＤＣｌ3（７７．１６ｐｐｍ）、ＤＭＳＯ−ｄ6（３９．５２ ｐｐｍ）］に対するシフトを報告した。アセトンピーク（２．２２ｐｐｍ）を、溶媒Ｄ2Ｏの内部基準として用いた。ポルフィリンのフェニル環上のプロトン（オルト、メタ、パラ）は、フェニル環上の置換基に対してではなく、ポルフィリン環系と相対的なそれらの位置に対して特定された。
【０１２９】
化合物１７Ｂおよび１９Ｂの固体13Ｃ ＮＭＲは、ダラム大学（Durham University）の化学科から入手した。これらのスペクトルは、13Ｃに１００．５６ＭＨｚで動作するＶａｒｉａｎ ＶＮＭＲＳスペクトロメーターを使って得られたスペクトルである。交差分極マジック角回転試験（Cross-polarization magic-angle spinning experiments）を、６ｍｍ（rotor o.d.）のプローブを用いて実施した。スペクトルを、回転速度６．８ｋＨｚ、接触時間１ミリ秒、リサイクル遅れ１．５秒にて、“ＴＯＳＳ”回転サイドバンド抑圧を用いて記録した。スペクトル基準は、アダマンタンからの高周波信号を３８．５ｐｐｍに設定することによって間接的に行なわれる正味の（neat）テトラメチルシランの外部サンプルに対する基準である。
【０１３０】
質量スペクトルをＢＲＵＫＥＲ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩまたはＢＲＵＫＥＲ ｍｉｃｒＯＴＯＦ−Ｑ１１に記録した。ＦＴＩＲ測定は、ＡＶＡＴＡＲ ３７０ ＦＴ−ＩＲ装置（Thermo Nicolet社, Madison, USA）を用いて実施した。サンプル（２〜３ｍｇ）は、ＫＢｒを用いて十分に混練した。そのサンプルを、Ｓｐｅｃａｃコンプレッサ（Specac社, Smyrna, USA）を用いてペレット状にプレスした。融点は、Ｂｕｃｈｉ Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｐｏｉｎｔ Ｂ−５４０に記録した。ポリマーサンプルは、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（ＭＷＣＯ：３５００）を用いて透析した。
【０１３１】
吸収スペクトルおよび定常状態の蛍光スペクトル
ＵＶ−Ｖｉｓ測定を、ペルチェ（Peltier）温度プログラマを備えたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ ２５ ＵＶ−Ｖｉｓスペクトロメーターに記録した。１７０〜２２００ｎｍのスペクトル範囲を有する細胞（Spectrocell社, Oreland, PA, USA）を使って、ＳＰＥＸ ＦｌｕｏｒｏＭａｘスペクトロメーターを用いて、蛍光発光スペクトルを得た。パス長１０ｍｍの石英キュベットを用いて、吸収スペクトルを２０℃にて、蛍光発光スペクトルを周囲温度にて記録した。全ての蛍光スペクトルは、励起１ｎｍ、発光１ｎｍの一定のスリット幅で記録した。蛍光スペクトルを、量子収量の研究のため、３回スキャンして平均化した。しかしながら、図５（ＩＩＩ）の蛍光スペクトルは、励起３ｎｍ、発光３ｎｍのスリット幅で得られたスペクトルである。
【０１３２】
定常状態比較法を用いて、無水エタノール中の標準アントラセン（ΦF = ０．２７, λex = ３６５．５ ｎｍ）の希薄溶液に対する化合物３、５、１６Ａ〜１９Ｂの蛍光量子収量（全てλex. = λmax =４１９ｎｍにて励起）を決定した。下記式を用いた：
ΦX = ΦST (GradX / GradST) (ηX2 / ηST2)
ここで、下付き文字ＳＴおよびＸは、それぞれ標準（standard）およびテスト（test）を示し、Φは蛍光量子収量であり、Ｇｒａｄは積分蛍光強度対吸光度のプロットからの勾配であり、ηは溶媒の屈折率である。
【０１３３】
安定性研究
物理的安定性を研究するために、１７ＡをＨ2Ｏ（１ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、３０分間超音波処理し、遠心分離機（ＨＥＲＭＬＥ Ｚ−３２０、４０００ｒｐｍ、１０分間）にかけ、デカンターに移してアルミホイルで包んだ。ＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を、０〜９０日間の期間に亘ってＨ2Ｏ中でλmax= ４１９ｎｍにて測定した。
【０１３４】
1Ｈ ＮＭＲによる置換度（ＤＳ）の決定
ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐの置換度を計算するために、最終化合物の１Ｈ ＮＭＲを用いた。最終化合物１６Ａ〜１９ＢからＤＳを計算するために、ＴＰＰピーク（ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ部から）の積分値およびＨ−１ピーク（キトサン部から）の積分値を用いた。ＴＰＰ（芳香族領域からの４つのピーク）の積分を考慮に入れ、またＨ−１基の積分を計算して、下記式に用いた。
【数１】
0006456284.tif 000048
この条件下、ポリマー骨格は、ＨＤＯピークによって部分的にオーバーラップされるが、ＤＳは、Ｈ−１ピークとＴＰＰピークの積分の相対比から、精度よく決定することができる。
【０１３５】
ＴＰＣ−ＮＨ−ＰｉｐおよびＴＰＣ−ＣＯ−ＰｉｐのＤＳを計算するために、中間体化合物２９＆３４およびＴＰＣピークの積分値（芳香族領域におけるＴＰＣ−ＮＨ−ＰｉｐまたはＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ並びにα-ピロールＮＨピークの積分から）、およびＴＢＤＭＳピークの積分値（キトサンから）を下記式において用いた。
【数２】
0006456284.tif 000049
様々なキトサン誘導体のＴＥＧ化のＤＳを計算するために、対応する1Ｈ ＮＭＲを用いた。キトサンのＨ−１ピークの積分値およびキトサン骨格の（ＴＥＧの末端エチルピークの）ＣＨ3の積分値を考慮に入れた。−エチルエンドトリプレットの積分値は、置換度が１００％の場合、３に等しくなるだろう。従って、式は下記の通り。
【数３】
0006456284.tif 000050
【０１３６】
ＳＥＭ及びエリプソメトリ（Ｅｌｉｐｓｏｍｅｔｒｙ）
クラス−１００のクリーンルーム環境下、溶液を、従来のスピナーを用いて未処理の（pristine）シリコン＜１００＞基板（１５ｍｍ ｘ １５ｍｍ）上に１０００ｒｐｍでスピンコートした。そのシリコンは約１５A厚の自然酸化物層を有する。更に、１０μlの同溶液を直接シリコン基板上にピペットで移して、空気中で室温にて乾燥させた。コーティングされた基板を、インレンズ検出器を用いて、加速電圧１０ｋｅＶ、作動距離２ｍｍにてＺｅｉｓｓ ＬＥＯ １５５０走査型電子顕微鏡においてイメージ化した。
【０１３７】
水接触角測定
水接触角を、ＫＳＶ ＣＡＭ ２００光学接触角メーター（KSV Instruments社）を用いて決定した。５μlの脱イオン水の水滴をシリコンウェーハ中央に滴下して、水接触角をラプラス＆ヤング方程式に基づいて決定した。室温、周囲湿度で測定を行った。
【０１３８】
合成
ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐの合成は、図２のスキーム１を参照のこと。
メソ−テトラフェニルポルフィリン（１）  文献の手順に従う（Adler、J Organic Chem 1967, 32：476）。
【０１３９】
５−（４−ニトロフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン［ＴＰＰ（ｐ−ＮＯ2）1］（２）  文献の手順に従う（Luguya R et al. Tetrahedron 2004, 60:2757）。
【０１４０】
５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン［ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1］（３）  文献の手順に従う（Luguya R et al. Tetrahedron 2004, 60:2757）。
【０１４１】
５−（４α−ブロモアセチルアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン（４）  化合物３（５００ｍｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）に溶解してＮ2雰囲気下で攪拌した。トリエチルアミン（０．２４ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を加えた後、臭化ブロモアセチル（０．０９７ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）を室温にて滴下して、１時間室温にて攪拌し続けた。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（４５ｍＬ）で希釈して、水（２ｘ２５ｍＬ）とブライン（２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。ＣＨ2Ｃｌ2とヘキサンと溶離剤として用い、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、３８５ｍｇ（６４％）の所望の生成物４を得た。TLC (Hexane/CH2Cl2 3:7): Rf =0.17; FT-IR, ν cm-1: 3313 (N-H), 3049,3019 (aryl C-H), 1687,1594 (CONH),1556, 1514, 1471, 1439,1399, 1348, 1177, 1153, 964, 798, 726, 699; 1H NMR (CDCl3): δ = 8.88-8.91 (m. 8H, β-pyrrole H), 8.41 (br s, 1H, TPPNHCO), 8.22-8.27 (m, 8H, tetraphenyl HO), 7.91 (d, J= 8Hz, 2H, CONH-phenyl-Hm  ), 7.75-7.80 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.15 (s, 2H, COCH2Br), -2.70 (br s, 2H, α-pyrrole NH) ppm; 13C NMR (CDCl3): δ = 163.78, 142.26, 139.20, 136.78, 135.25, 134.68, 131.23, 127. 87, 126.83, 120.42, 120.38, 119.24, 118.34, 29.72 ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C46H33BrN5O ([M+H]+) 750.1863 found 750.1864; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
【０１４２】
５−（４α−ピペラジンアセチルアミドフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン［ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ］（５）  化合物４（２７５ｍｇ，０．３６６ｍｍｏｌ）および過剰なピペラジン（１５８ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）中で混合し、Ｎ2雰囲気下で１時間室温にて攪拌した。反応終了後、反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（８５ｍＬ）で希釈して、水（２ｘ４０ｍＬ）とブライン（３５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。１：１２のＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2を溶離剤として用いて、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、紫色の固体としての名称化合物５（２６０ｍｇ、９４％）を得た。TLC (CH2Cl2/ MeOH, 9:1): Rf =0.15; FT-IR (KBr): ν 3442 (pip. NH), 3312 (aryl N-H), 3052,3022 (aryl C-H), 2903, 2816 (aliphatic CH2), 1691,1596 (CONH),1557, 1517, 1471,1439, 1400, 1349, 1309, 1179, 1153, 1071, 1001, 965, 799, 728, 700 cm-1; 1H NMR(CDCl3): δ = 9.51 (br s, 1H, TPP-NHCO), 8.89-8.93 (m,  8H, β-pyrrole H ), 8.23-8.26 (m, 8H, tetraphenyl HO ), 8.01 (d, J= 8.0 Hz, 2H, Pip-NH-phenyl-Hm ), 7.75-7.81 (m, 9H, triphenyl-Hm,p ), 3.31 (s, 2H, COCH2-Pip.), 3.11 (t, 4H), 2.77 (br t, 4H), 2.60 (br s, 1H, piperazine NH), -2.71 (br s, α-pyrrole 2H) ppm; 13C NMR (CDCl3): δ = 168.75, 142.30, 138.26, 137.44, 135.33, 134.68, 131.26, 127.86, 126.83, 120.32, 119.66, 117.89, 62.87, 54.53, 46.24 ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C50H42N7O ([M+H]+) 756.3445 found 756.3467; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
【０１４３】
図３のスキーム２および図１２のスキーム５を参照のこと。
キトサンメシラート（７）  弊社が以前公表した手順に従って合成した（Song et al. Carbohydrate Polymers 2010, 81:140）。
【０１４４】
３，６−Ｏ−ｄｉ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルキトサン［ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ］（８）  弊社が以前公表した手順に従って合成した（Song et al. Carbohydrate Polymers 2010, 81:140）。
【０１４５】
Ｎ−ブロモアセチル−３，６−Ｏ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ［ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ］（９）  ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ８（１ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を、Ｎ2雰囲気下で丸底フラスコ内の乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）に溶解した。次に、反応混合物を氷／塩の混合物を用いて−２０℃まで冷却した。Ｅｔ3Ｎ（１．８１ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化ブロモアセチル（０．９１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。１時間攪拌した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2で希釈して、減圧下で濃縮した。粗生成物をアセトニトリル中で攪拌し、濾過してフレッシュなアセトニトリルで洗浄した。乾燥材料をＣＨ2Ｃｌ2に溶解・抽出して、水とブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。１．２ｇ（９２％収量）の薄黄色の粉末状の生成物９を得た。FT-IR (KBr): ν 3402 (br , NH), 2957,2931, 2886,  2858 (s, C-H TBDMS), 1682 (vs, C=O amide I), 1530 (vs, C=O amide II), 1473, 1391, 1362, 1311, 1259, 1101, 1005, 837, 777 (Si-C), 669 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 4.40 (br s, H-1), 4.02-3.26 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=OCH2Br),  0.90 and 0.88 (br s, (CH3)3C), 0.13 and 0.07 (br s, (CH3)2Si) ppm.
【０１４６】
（Ｎ−ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−ブロモアセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ［ＴＰＰｐ0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ］（１０Ａ）
化合物９（７００ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）および化合物ＮＨ−ｐｉｐ−ＴＰＰ５（１０５ｍｇ、０．１３８ｍｍｏｌ）をＮ2雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。５に対して正確に等モル量のＥｔ3Ｎ（１９．３μＬ、０．１３０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。原料の総消費量をＴＬＣで確認した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、抽出し、水とブラインで洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、７３０ｍｇ（９２％）の生成物１０Ａを得た。FT-IR (KBr): ν 3324 (br , NH), 2955, 2929, 2884, 2856 (s, C-H TBDMS), 1678 (vs, C=O amide I),1600 ,1524 (vs, C=O amide II),1472, 1403, 1361, 1311, 1256, 1098,1004,966, 837,801,778, 701, 670, 550 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 9.30(s,  TPPNHCO),  8.85 (m,  β-pyrrole H ), 8.23-8.20 (m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.73(m,  triphenyl-Hm,p), 4.41(br s, H-1), 4.13-3.50 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, TPPNHCOCH2pip, CH2CONGlc and (CH2)2 of piperazine), 2.81-2.86 (m, piperazine-H), 0.92, 0.89 (br s, (CH3)3C), 0.14, 0.07(br s, (CH3)2Si), -2.77 (br s, α-pyrrole NH) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
【０１４７】
ＴＰＰｐ0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（１０Ｂ）  中間体５（１８０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）および９（１．２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を用いて、化合物１０Ｂ（１．３ｍｇ、９１％）を上記の手順通りに準備した。
【０１４８】
ＴＰＰｐ0.25−ＢｒＡ0.75−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（１１Ａ）  化合物９（５５０ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）および化合物ＮＨ−ｐｉｐ−ＴＰＰ５（２０６ｍｇ、０．２７３ｍｍｏｌ）をＮ2雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。５に対して正確に等モル量のＥｔ3Ｎ（３８μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。原料の総消費量をＴＬＣで確認した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2で希釈し、抽出し、水とブラインで洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、６７０ｍｇ（９１％）の生成物１１Ａを得た。FT-IR (KBr): ν 3317(br , NH), 2952,2926, 2883, 2855 (s, C-H TBDMS), 1680 (vs, C=O amide I), 1598, 1520,1471, 1440, 1402, 1361, 1309, 1254, 1096, 1002, 966, 837, 800, 778, 730, 701, 667, 558 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 9.30(s,  TPPNHCO),  8.85 (m,  β-pyrrole H ), 8.22-8.20 (m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.80-7.75(m,  triphenyl-Hm,p ), 4.40(br s, H-1), 4.06-3.63 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, TPPNHCOCH2pip, CH2CONGlc and (CH2)2 of piperazine), 2.81-2.86 (m, piperazine-H), 0.92, 0.89(br s, (CH3)3C), 0.14, 0.10, 0.07 and 0.02(br s, (CH3)2Si), -2.77 (br s, α-pyrrole NH) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 417, 517, 542, 597, 650 nm.
【０１４９】
ＴＰＰｐ0.25−ＢｒＡ0.75−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（１１Ｂ）  中間体５（４１５ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）および９（１．１ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を用いて、化合物１１Ｂ（１．３５ｇ、９２％）を上記の手順通りに準備した。
【０１５０】
化合物１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａおよび１３Ｂを合成するための一般的な手順Ａ
（Ｎ−ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウミル）アセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ［ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.9］（１２Ａ）  化合物１０Ａ（３５０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）をＮ2雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。過剰量のトリメチルアミン溶液を加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、紫色の固体としての粗生成物１２Ａ（４２０ｍｇ、９９％）を得た。FT-IR (KBr): ν 3426, 3021, 3011, 2962, 2855, 27.7, 2560, 2438, 1749, 1689, 1599, 1563, 1482, 1443, 1401, 1360, 1288, 1254, 1053, 1010, 966, 922, 901, 837, 797, 779, 744, 701, 671, 552 cm-1.
【０１５１】
ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.9（１２Ｂ）  一般的な手順Ａに従って、１０Ｂ（６００ｍｇ、１．０４ｍｍｏｌ）およびＮＭｅ3を用いて、粗固体としての１２Ｂ（７２０ｍｇ、９９％）を得た。
【０１５２】
ＴＰＰｐ0.25−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１３Ａ）  一般的な手順Ａに従って、１１Ａ（３００ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）およびＮＭｅ3を用いて、粗固体としての１３Ａ（３４０ｍｇ、９８％）を得た。FTIR (KBr)： ν 3415, 3021,3011,2962,2854, 1749, 1686, 1598, 1522, 1482, 1442, 1402, 1360, 1311, 1288, 1252, 1053, 1010, 966, 922, 901, 837, 798, 779, 744, 701, 671, 558 cm-1. 
【０１５３】
ＴＰＰｐ0.25−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１３Ｂ）  一般的な手順Ａに従って、１１Ｂ（６００ｍｇ、０．８９ｍｏｌ）およびＮＭｅ3を用いて、粗固体としての１３Ｂ（６８５ｍｇ、９９％）を得た。
【０１５４】
化合物１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａおよび１５Ｂのための一般的な手順Ｂ
（Ｎ−ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−（Ｎ−メチルピペラジニル）アセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ［ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9］（１４Ａ）  化合物１０Ａ（３５０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）をＮ2雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。過剰量の１−メチルピペラジンを加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。その後、粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、対応する粗生成物１４Ａ（４２５、１０５％）を得た。FT-IR (KBr)： ν 3378 , 2950, 2930, 2884, 2854, 2798, 2694, 2608, 2477, 2223, 1678, 1617, 1519, 1461,1394, 1371, 1293, 1253, 1168, 1092,1051,1003,966, 939, 920, 837, 801, 779, 701, 671, 612 cm-1.
【０１５５】
ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9（１４Ｂ）  一般的な手順Ｂに従って、１０Ｂ（６００ｍｇ、１．０４ｍｏｌ）および１−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての１４Ｂ（７１０ｍｇ、１０２％）を得た。
【０１５６】
ＴＰＰｐ0.25−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.75（１５Ａ）  一般的な手順Ｂに従って、１１Ａ（２５０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）および１−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての１５Ａ（２９０ｍｇ、１０４％）を得た。FT-IR (KBr)： ν 3380, 2950, 2930, 2884, 2854, 2800, 2480, 1677, 1598, 1519, 1461, 1400, 1394, 1371, 1284, 1252, 1168, 1089, 1050, 1003,966, 939, 920, 837, 801, 779, 732, 701, 671, 591 cm-1.
【０１５７】
ＴＰＰ0.25−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.75（１５Ｂ）  一般的な手順Ｂに従って、１１Ｂ（６５０ｍｇ、０．９６ｍｏｌ）および１−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての１５Ｂ（７３５ｍｇ、１０２％）を得た。
【０１５８】
化合物１６Ａ、１７Ａ、１８Ａ＆１９Ａ（第１バッチの化合物）のための一般的なＴＢＤＭＳ脱保護手順Ｃ
ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.9（１６Ａ）  材料１２Ａ（３５０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５〜１０ｍＬ）に溶解して、濃縮ＨＣｌ（２〜３ｍＬ）を加えた。反応混合物を１２時間室温にて攪拌した。過剰量の脱イオン水を反応混合物に加え３０分間攪拌した後、８％ＮａＣｌに対して１日間透析し、脱イオン水に対して３日間透析した。この期間、溶液の色は徐々に深緑色から赤色に変化した。赤色の溶液を冷凍乾燥して、茶色のスポンジ状の材料を得た。材料を再び脱保護し、イオン交換し、透析して冷凍乾燥した。同じ条件を用いてこの手順を繰り返して微量のＴＢＤＭＳを取り除き、茶色のスポンジ材料としての１６Ａ（２１０ｍｇ、８９％）を得た。FT-IR (KBr): ν 3419 (br, O-H), 3064 (C-H), 1683, 1558, 1506,1488, 1473, 1403, 1296, 1153, 1112, 1068, 1032, 966, 911, 800, 730, 701, 618 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.81 (br m,  β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.04 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.75-7.84(m,  triphenyl-Hm,p ),4.66 (br s, H-1), 4.21 (br s, BrCH2C=O), 3.83-3.54 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.32 (s, +N(CH3)3)) ppm.
【０１５９】
ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１７Ａ）  一般的な手順Ｃに従って、１３Ａ（２４０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）および濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、紫色の固体としての１７Ａ（１２０ｍｇ、７１％）を得た。FT-IR (KBr): ν 3392, 3061, 2950, 1683, 1559, 1506, 1489, 1473, 1402,  1350, 1296, 1154, 1112, 1068, 1032, 966, 911, 800, 730, 701, 619 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2) δ ppm: 8.81 (br m,  β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.04 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.87(m,  triphenyl-Hm,p ),4.50 (br s, H-1), 4.15 (br s, BrCH2C=O), 3.27-3.65 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.24 (s, +N(CH3)3)) ppm.
【０１６０】
ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１８Ａ）  一般的な手順Ｃに従って、１４Ａ（３５０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）および濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、紫色の固体としての１８Ａ（２００ｍｇ、８７％）を得た。FT-IR (KBr): ν 3419 (br, O-H), 3057 (C-H), 1683, 1558, 1474, 1403, 1296, 1234, 1154, 1112,1068,1032,966, 930, 911,799,730, 701cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.83 (br m,  β-pyrrole H ), 8.13-8.19 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.08 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.87(m,  triphenyl-Hm,p ),4.48 (br s, H-1), 3.24-3.78 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.30-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.48 (br s, piperazine, N-CH3) ppm.
【０１６１】
ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＭＰ0.75（１９Ａ）  一般的な手順Ｃに従って、１５Ａ（２００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）および１−メチルピペラジンを用いて、紫色の固体としての１９Ａ（８０ｍｇ、５８％）を得た。FT-IR (KBr): ν 3392, 3056, 2947, 1683, 1558, 1520, 1489, 1472, 1458, 1400, 1349, 1309, 1248, 1154, 1068, 1031, 1001, 966, 911, 800, 729, 701, 658 cm-1. 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.83 (br m,  β-pyrrole H ), 8.14-8.20 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.08 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.78-7.86(m,  triphenyl-Hm,p ),4.50 (br s, H-1), 3.24-3.78 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.28-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.48 (br s, piperazine, N-CH3) ppm.
【０１６２】
最終化合物１６Ｂ、１７Ｂ、１８Ｂおよび１９Ｂ（第２バッチの化合物）のための一般的なＴＢＤＭＳ脱保護手順Ｄ（代表例として化合物１６Ｂ）
ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.9（１６Ｂ）  材料１２Ｂ（６００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）（５〜１０ｍＬ）に溶解し、続いて過剰量のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）を加えた。反応混合物を５５℃にて２４時間攪拌し、冷却し、希釈したＨＣｌで酸性化して３０分間攪拌し、次に脱イオン水中で８％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して２日間透析し、脱イオン水に対して３日間透析した。この期間、溶液の色は徐々に灰色から赤色に変化した。赤色の溶液を冷凍乾燥して、茶色のスポンジ状の材料を得た。材料を再び脱保護し、イオン交換し、透析して冷凍乾燥した。同じ条件を用いてこの手順を繰り返して残った微量のＴＢＤＭＳを取り除き、茶色のスポンジ材料としての１６Ｂ（３５０ｍｇ、８７％）を得た。FTIR (KBr): ν 3405, 2943, 2817, 1655, 1528, 1459, 1401, 1375, 1308, 1248, 1153, 1111, 1068, 1031, 966, 832, 799, 729, 702 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.82 (br m,  β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.04 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.75-7.84(m,  triphenyl-Hm,p ),4.47 (br s, H-1), 4.04 (br s, BrCH2C=O), 3.24-3.55 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.19 (br s, +N(CH3)3)) ppm.
【０１６３】
ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１７Ｂ）  一般的な手順Ｃに従って、１３Ｂ（６５０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ／ＮＭＰを用いて、紫色の固体としての１７Ｂ（４００ｍｇ、８７％）を得た。FTIR(KBr):ν 3396, 2942, 2829, 1662, 1526, 1458, 1441, 1401, 1310, 1249,  1068, 1032, 1002, 966, 800, 730, 701 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2) δ ppm: 8.81 (br m,  β-pyrrole H ), 8.12-8.16 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.08 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.74-7.86(m,  triphenyl-Hm,p ),4.51 (br s, H-1), 4.10 (br s, BrCH2C=O), 3.26-3.55 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.22 (br s, +N(CH3)3)) ppm; Solid-state 13C NMR (100.56 MHz): δ 170.85, 164.68, 128.11, 119.45, 101.53, 75.39, 61.09, 55.47.
【０１６４】
ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１８Ｂ）  一般的な手順Ｃに従って、１４Ｂ（６００ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ／ＮＭＰを用いて、紫色の固体としての１８Ｂ（３１５ｍｇ、８０％）を得た。FTIR (KBr): ν 3396, 3315 (br, OH, NH), 2941, 1655 (vs, C=O amide I), 1534 (vs, C=O amide II), 1522, 1471, 1440, 1401, 1375, 1310, 1244, 1069, 1030, 1001, 966, 800, 729, 701cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2) δ ppm: 8.81 (br m,  β-pyrrole H ), 8.13-8.19 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.07 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.85(m,  triphenyl-Hm,p ),4.48 (br s, H-1), 3.24-3.72 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.33-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.48 (br s, piperazine, N-CH3) ppm.
【０１６５】
ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１９Ｂ）  一般的な手順Ｃに従って、１５Ｂ（７００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ／ＮＭＰを用いて、紫色の固体としての１９Ｂ（４１５ｍｇ、８５％）を得た。FTIR (KBr): ν 3396, 3315 (br, OH, NH), 2941, 1655 (vs, C=O amide I), 1534 (vs, C=O amide II), 1522, 1471, 1440, 1401, 1375, 1310, 1244, 1069, 1030, 1001, 966, 800, 729, 701cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 95:5) δ ppm: 8.82 (br m,  β-pyrrole H ), 8.13-8.19 (br m, phenyl-Ho  & Pip-NHTPP-phenyl-Hm ), 8.07 (br d, J= 8.0 Hz, RNTPP- phenyl-Ho), 7.79-7.87(m,  triphenyl-Hm,p ),4.49 (br s, H-1), 3.24-3.78 (m, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´), 3.92 (dd, J= 12Hz, Pip-CH2C=O), 2.30-2.67 (m, piperazine (CH2)4), 2.40 (br s, piperazine, N-CH3) ppm; Solid-state 13C NMR (100.56 MHz): δ 171.63, 138.74, 127.97, 119.74, 101.93, 75.54, 61.54, 55.42, 45.34 ppm.
【０１６６】
結果および議論
求核性ＴＰＰ中間体５  現在の研究において、ＴＰＰ １は大規模に合成され、原料として用いられてきた。モノ−ニトロＴＰＰ(ｐ−ＮＯ2)1 ２の機能性をＴＦＡ中で１．８当量のＮａＮＯ2を用いてレジオ選択的に導入した後、ＳｎＣｌ2・２Ｈ2Ｏで還元して、モノ−アミノポルフィリンＴＰＰ(ｐ−ＮＨ2)1 ３を得た。還元工程前の時間のかかる粗材料２の精製を省くことによって、以前報告された手順を簡略化した。その後精製を経て、全収率（５４％）を損なうことなく、アミノポルフィリン３を得た。
【０１６７】
アミノポルフィリンＴＰＰ(ｐ−ＮＨ2)1 ３は弱求核性であることが知られており、ＳＮ2攻撃によってこの化合物を求電子性ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ９にリンクすることを試みるが、厳しい条件下でも我々の初期研究において望ましい結果をもたらさなかった。従って、この光増感物質誘導体をより強力な求核剤に変換するために、先ずＴＰＰ(ｐ−ＮＨ2)1をアシル化してブロモアシル−ＴＰＰ ４を得、次に過剰量のピペラジンを用いて求核置換反応を引き起こして、求核性ポルフィリン中間体ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５を得た。ピペラジンモチーフは、生理学的条件下、正電荷を有する（水溶液ｐＨ７．４）。ピペラジン部分もまた、低毒性、および、いくつかの周知の代謝反応に関与する体内変化のため、スペーサーとして適している。ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐの合成の全合成ルートを図２のスキーム１に示す。
【０１６８】
求電子性キトサン中間体９  以前報告されたようにキトサンを修飾して、ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ８を得た。ヒドロキシル基を保護した後、バイオポリマーの溶解度は劇的に変化して、高親油性部分の修飾を促進するＣＨ2Ｃｌ2などの一般的な有機溶媒に溶けやすくなる。従って、８を２−臭化ブロモアセチルと反応させて、求電子性中間体ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ９を準備した（図３のスキーム２）。この反応では、脱保護やエステル化などの副反応を防ぐために、反応時間、温度、および異なる試薬の当量比の正確な制御が要求される。８を臭化ブロモアセチルと０℃で１．５時間反応させると、ＣＨ2Ｃｌ2に不溶な材料が得られた。ＦＴ−ＩＲ分析によると、エステルピークは１７６０ｃｍ-1、アミドピークは１６８０ｃｍ-1（データ不掲載）であった。従って、副反応を防ぎ、溶解し易い材料を得るためには、反応を正確に最適化する必要があった。この反応の最適化条件は、厳密に４当量の臭化ブロモアセチルと５当量のＥｔ3Ｎを用いること、および、反応温度を−２０℃に１時間維持することである。得られた中間体９をＣＨ2Ｃｌ2に十分に溶解して、その正確な構造を1Ｈ ＮＭＲおよびＦＴ−ＩＲ分析で確認した。その後、化合物９を、キトサン担体の合成における重要な求電子性中間体として用いた。
【０１６９】
キトサンのＴＰＰ誘導体（１６Ａ−１９Ｂ）  合計８つのキトサン化合物のＴＰＰ誘導体を、４つの異なる化合物を用いた２つの別々のバッチにおいて合成した。第１バッチ（“Ａ”と称する）を８０〜２００ｍｇの規模で合成し、第２バッチ（“Ｂ”と称する）をそれより少し大きい３００〜４５０ｍｇの規模で合成して、手順の再現性および整合性を確認した。
【０１７０】
ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ９と求核性ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５中間体とを反応させて、親油性ＰＳをポリマー骨格に共有結合させた。この反応は定量的であり、得られる材料における置換度の良好な制御を容易にする。事前の調査によって、高いポルフィリン置換度（ＤＳ）を有する担体は水溶液に不溶であり、そのため修飾は０．１および０．２５ＤＳ（グルコサミン単量体当たり）に限られることが分かった。従って、ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５を、求電子性キトサン中間体９の単量体当たり０．１または０．２５当量に制御しながら反応を行い、所望の生成物ＴＰＰｐ0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（１０Ａ／１０Ｂ）またはＴＰＰｐ0.25−ＢｒＡ0.75−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（１１Ａ／１１Ｂ）をそれぞれ得た。反応の進行をＴＬＣによってモニターし、５が無くなると反応を止めて、副反応を防いだ。これらの材料の1Ｈ ＮＭＲ分析は、ＴＰＰのキトサンへの共有結合における定量反応と一致した。
【０１７１】
次に、カチオン部分をＴＰＰ置換キトサン骨格に導入して、担体の水溶解度を促進し、エンドサイトーシス膜に対する親和性を与えた。従って、化合物１０Ａ／１０Ｂおよび１１Ａ／１１Ｂを過剰量のＭｅ3Ｎ（ＴＭＡ）と反応させて、一定のカチオン電荷を有するＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.9 （１２Ａ／１２Ｂ）およびＴＰＰｐ0.25−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１３Ａ、１３Ｂ）をそれぞれ得た。同様に、化合物１０Ａ／１０Ｂおよび１１Ａ／１１Ｂを過剰量の１−メチルピペラジン（ＭＰ）と反応させて、ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9（１４Ａ／１４Ｂ）およびＴＰＰｐ0.25−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.75（１５Ａ、１５Ｂ）をそれぞれ得た。これらの粗材料を、最終脱保護工程において直接用いた。
【０１７２】
最後に、第１バッチからの粗材料１２Ａ〜１５Ａを濃縮ＨＣｌ（ＭｅＯＨ中、室温、１２時間）で脱保護し、第２バッチからの粗材料１２Ｂ〜１５ＢをＴＢＡＦ／ＮＭＰ（６０℃、２４時間）で脱保護した。これにより、最終生成物１６Ａ〜１９Ａおよび１６Ｂ〜１９Ｂをそれぞれ得た。両方の場合において、最初の脱保護工程の後も依然存在する微量のＴＢＤＭＳ（１．５〜７％）を取り除くために、脱保護工程を繰り返した。ＭｅＯＨ中での濃縮ＨＣｌを用いた脱保護は従来から用いられてきたが、近年では、よりマイルドなＤｉＴＢＤＭＳキトサン誘導体のＴＢＡＦ／ＮＭＰ脱保護を導入して、ポリマー骨格を分解し得る強い酸性条件を回避している。しかしながら、後者の方法は、ＮＭＰ溶媒の除去に非常に長い透析工程を要するという欠点をもつ。トリメチルアンモニウム（Ｍｅ3Ｎ+）誘導体［ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.9（１６Ａ、１６Ｂ）およびＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１７Ａ、１７Ｂ）］は、１−メチルピペラジン誘導体［ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１８Ａ、１８Ｂ）、ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＭＰ0.75（１９Ａ、１９Ｂ）］よりも早く水に溶けた。これは、前者の担体化合物には、一定のイオン電荷が存在するからだと考えられる。
【０１７３】
ナノ担体のキャラクタリゼーション
ＦＴ−ＩＲ分析：図４に、代表的な最終化合物ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9（１８Ａ）の合成における様々な中間体のＦＴ−ＩＲスペクトル比較を示す。ポルフィリン中間体ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５（図４Ａ）の特徴的なピークは３３１０〜３４５０ｃｍ-1の領域にＮ−Ｈ伸縮（stretching）として示され、芳香族および脂肪族のＣ−Ｈ伸縮は３０２２および２８１６ｃｍ-1に示されている。１６９１および１５９５ｃｍ-1のピークはアミド結合と一致し、９６６、７９９、７００ｃｍ-1の３つの強いピークはＴＰＰ環系の特徴である（矢印で図示）。
【０１７４】
ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ中間体９における最も特徴的なピークは２８５８〜２９５７ｃｍ-1に観察され、Ｓｉ−ＣＨ3のＣ−Ｈ伸縮を示している。アミドピークは１６８２および１５３０cm-1である。また、８３６および７７７cm-1のピークはＳｉ−Ｃ伸縮およびＣＨ3横揺れ（rocking）を表している(これら最後の２つのピークは、図４Ｂに矢印で示されている)。
【０１７５】
中間体ＴＰＰｐ0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ １０Ａ（図４Ｃ）のスペクトルに特徴的なＴＰＰピークが現れたことから、ポルフィリン（ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５）のキトサン（９）への共有結合が確認された。１０Ａが粗ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9 １４Ａに変換されても、スペクトルに顕著な変化は観察されなかった。しかしながら、材料を最終ＴＢＤＭＳ脱保護してＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9 １８Ａが得られたことは、特徴的なＳｉ−ＣＨ3ピークが不在であること、広いＯ−Ｈピークが現れたこと、その一方で特徴的なＴＰＰピークは損なわれていないことから、明確に示された（図４Ｅ）。
【０１７６】
1Ｈおよび13Ｃ（固体）核磁気共鳴分光学（ＮＭＲ）分析：
1Ｈ ＮＭＲ分析：図５は、ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9 １８Ａの合成における全ての中間体および最終化合物の代表的な1Ｈ ＮＭＲスペクトルのオーバーレイを示す。ＴＢＤＭＳ保護後、材料（ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ８）は、ＣＤＣｌ3に見事に可溶になり、またキトサン骨格における各プロトンのよく分解された（well resolved）ピーク（図５Ａ）も示している。０．９０〜０．８９(br s)および０．１３〜０．０５(br s)のピークは、それぞれ（ＣＨ3）3Ｃ−Ｓｉおよび（ＣＨ３）2Ｓｉに割り当てることができる。
【０１７７】
Ｈ−２（ＧｌｕＮ）ピークがダウンフィールドにシフトしていることから、ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳがブロモアセチル化してＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ９が得られたことが示されている。また、ＣＯＣＨ2Ｂｒピークと共に全てのキトサン骨格ピークＨ−１〜Ｈ−６が４．４０〜３．２６ｐｐｍで一緒になっており、その一方でＴＢＤＭＳピークにはその位置に目立った変化は見られない（図５Ｂ）。
【０１７８】
ＴＰＰｐ0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ １０Ａ中間体の1Ｈ ＮＭＲスペクトル（図５Ｃ）によって、芳香族領域に見られるＴＰＰ部分の特徴的なピークが確認され、また−２．７のピーク［図５Ｃにおいて図示せず］も特定された。−２．７のピークは、通常、遊離塩基ポルフィリンのコア内の２つのピロールインナーアミンプロトン（pyrrolic inner amine protons）と関係している。更に、ピペラジン部分の環状−ＣＨ2基の半分に割り当てることができる一つの特徴的なピークが２．８１〜２．８６（ｍ）ｐｐｍにて観察された。ピペラジンの残りの環状−ＣＨ2基は、キトサン部分の広い領域（３．３〜４．５ｐｐｍ）に属している。
【０１７９】
ＴＰＰｐ0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9 １４Ａのスペクトルにおいて、１−メチルピペラジン部分のＮ−ＣＨ3に関する新たなピークが観察された（図５Ｄ）。精製はこの段階で行なわれなかったため、このスペクトルは過剰な１−メチルピペラジンを示す。
【０１８０】
最終脱保護工程後、優れた水溶解度を有する材料が得られた。最終化合物ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9 １８Ａの1Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて、１−メチルピペラジンピークと共に、キトサン骨格の全てのピークを明確に特定することができた。しかしながら、観察可能なＴＰＰ部分のＮＭＲシグナルは存在しない（図５Ｅ）。全ての脱保護された最終化合物（１７Ａ〜１９Ｂ）について、同様の結果が観察された。ｄ6−ＤＭＳＯにおいて、ＴＰＰピークを観察することができたが、この場合、キトサン骨格のピークは広くなり、はっきりと特定できなかった。この溶媒における担体の溶解度も乏しかった。最良の結果は、これらの２つの溶媒の混合物を用いて得られることを発見した（下記の議論を参照）。ＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＭＰ0.9 １８Ａは赤褐色であり、ＰＳの存在を確認した。分配実験（partitioning experiment）において、高親油性ＰＳ部分ＴＰＰ−ＮＨ2およびＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐは、二相系Ｈ2Ｏ／ＣＨＣｌ3において水相に分配されなかったが（図６）、最終（極性）ＴＰＰ−ＣＳ−ＴＭＡ担体およびＴＰＰ−ＣＳ−ＭＰ担体は高極性であることが分かった。それらは水相に十分に溶解し、有機相には分配されなかった。
【０１８１】
固体13Ｃ ＮＭＲ分析：最終担体の炭素ピークを固体ＮＭＲにおいて観察することができた（図７）。グルコサミンのＣ２〜Ｃ６炭素およびＣＯＣＨ2炭素は６０〜８０ｐｐｍの領域において観察され、Ｃ１ピークは〜１０２ｐｐｍではっきりと分解されている。１１５〜１５５ｐｐｍのピークは、ＴＰＰ部分のＣｍｅｓｏ（〜１１９）、Ｃｍ、ｐ（〜１２８）、Ｃβ（〜１３１）、Ｃｏ（〜１３８）、Ｃｉ（〜１４０）およびＣα（〜１５０）として割り当てることができる。この割り当ては、ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５の溶液13Ｃ ＮＭＲスペクトルと完全に比較することができる。カルボニル（ＣＳ−ＮＨ−Ｃ＝ＯおよびＴＰＰ−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ）は、１６０〜１６９ｐｐｍに現れている。Ｎ−（２−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウミル）アセチル）誘導体ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＴＭＡ0.75（１７Ｂ）において、第４級メチル炭素（+Ｎ（ＣＨ3）3）は、強いピークとして５５．５ｐｐｍにて観察することができる。Ｎ−メチル−ピペラジニル誘導体ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＭＰ0.75（１９Ｂ）において、メチル炭素（Ｎ−ＣＨ3）は４５ｐｐｍにて観察することができる。環状メチレン（−ＣＨ2−Ｎ）炭素は、グルコサミンシグナルと５０〜５５ｐｐｍの領域でマージする。従って、固体13Ｃ ＮＭＲは、共有結合されたＰＳを有する担体と一致している。
【０１８２】
置換度（ＤＳ）および変換効率  下の表１は、最終担体化合物のＤＳを示す。その目的は、反応工程“ｅ”（図３のスキーム２）において、ＤＳを化合物５と化合物９の当量比で制御することである。最終ＤＳは、標的値（反応における当量（０．１または０．２５）が２％のマージン内にあり、反応における１００％の効率を示す値）とマッチしている。従来から、様々な親油性部分のキトサンへの共有結合が調査されてきた。親油性部分としては、例えばドキソルビシンおよびパクリタクセルなどの薬物；５α−コラン酸、５β−コラン酸、デオキシコール酸およびコレステロールなどの内因性生体分子；並びにクロリンｅ６（Ｃｅ６）およびプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ）などの光増感物質が挙げられる。ほとんどの場合、ＤＳは、高親油性ＴＰＰについて我々が本明細書に報告しているＤＳよりも著しく低い。従来の研究者達は、コンジュゲーション効率は置換度が上がるにつれて減少するであろうとの見解も持っていた。本プロセスは、有機溶媒への溶解性が高く、そのため温穏和な条件下で親油性ＰＳ部分と効率的に結合できる保護キトサンを使用している点で有利である。２つのバッチ（ＡおよびＢ）におけるＤＳが同じ２％のマージン内でマッチしているため、優れた反応再現性も確認された。
【０１８３】
【表１】
0006456284.tif 000051
【０１８４】
担体の自己凝集によるナノ粒子の形成および担体ナノ粒子のアンフォールディングに関する分析
芳香族ポルフィリンは、Ｊ凝集（レッドシフト）またはＨ凝集(ブルーシフト)と定義されるπ−πスタッキングシステムを形成することができる。周辺置換基は、凝集機構に寄与することができる。この凝集は、ＮＭＲ、ＵＶ−Ｖｉｓおよび蛍光分光法によって観察することができる。カルボキシフェニル-ポルフィリン（ＴＣＰＰ）凝集体、ｐ−スルホナトフェニルおよびフェニルメソ置換ポルフィリン、並びに３種類のカチオンポルフィリン（ＴＯＰｙＰ、ＴＭＰｙＰおよびＡＰＰ）に関して、1Ｈ ＮＭＲにおける極端なピーク広がりおよびピーク損失が報告されてきた。同様に、親油性のｎ−ブチルメタクリレートとポリ(エチレンオキサイド)マクロモノマーとの分散共重合においても、固定化（immobilization）によるシグナル損失が観察されてきた。
【０１８５】
今回の研究において、最終化合物１６Ａ〜１９ＢのＤ2Ｏ中での1Ｈ ＮＭＲにおいて、芳香族領域におけるピークの欠如は、π−πスタッキングによるＤ2Ｏ中でのＴＰＰ部分の凝集および疎水性相互作用を示唆している。図８は、代表的なＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.9 １６Ｂ化合物のＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ混合物におけるＮＭＲ研究を示す。純粋なＤ2Ｏ中ではＴＰＰ部分のピークは無く、ＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（２５：７５）の混合物中では芳香族領域に非常に弱いピークが観察されるのみであるが、キトサン骨格ピークは観察することができる。ＤＭＳＯ−ｄ6の含有量を更にＤＭＳＯ−ｄ6：Ｄ2Ｏ（５０：５０）まで増加させると、広いピークを観察することができる（図８（Ｉ）Ｃ）。混合物中、ＤＭＳＯ−ｄ6の含有量が増加するにつれて、芳香族ピークの相対強度は高まる。ほぼ純粋なｄ6−ＤＭＳＯ（僅か２％Ｄ2Ｏ ｖ／ｖ）中では、Ｈ−１ピーク、残存キトサン骨格ピークおよび+ＮＭｅ3ピークと共に、芳香族ＴＰＰピークをはっきり見ることができる（図８（Ｉ）Ａ）。これは、これらの条件下で担体が十分にアンフォールドされたことも示唆している。この解釈は、ＵＶ−Ｖｉｓ研究および蛍光研究（図８）によって更に裏付けられた。
【０１８６】
水に溶解されたナノ担体は、π−πスタックされた光増感物質に関して、４１７ｎｍにて最大吸収度を有する広いソーレー帯を示している（図８（II））。このピークは、ＤＭＳＯ濃度が増加して構造がアンフォールドするにつれて、徐々に鋭くなり、僅かにシフトする（１００％ＤＭＳＯにおいて、４２０ｎｍにシフト）。
【０１８７】
純水中で、蛍光はほぼ完全に消光する。これも光増感物質部分の凝集と一致する。ＤＭＳＯの含有量を５０％まで増加させると、蛍光強度は劇的に増加する。更にＤＭＳＯ濃度を徐々に１００％まで増加させると、急激な蛍光強度の増加が観察される（図８（ＩＩＩ））。
【０１８８】
ナノ担体粒子を、走査電子顕微鏡法によって更に特徴付けることを試みた。ナノ担体溶液の液滴をシリコンウェーハの表面にピペットで移し、ＳＥＭで乾燥させた（図９Ａ、９Ｂ）。いくつかのサンプルにおいて、ナノ粒子懸濁液を乾燥させると通常観察されるものと同じように、サイズ（粒度）のバラツキが１０〜２００ｎｍの単離された（図９Ａ）、塊となった、またはデンドライト構造に結晶化された（図９Ｂ）ナノ粒子を観察することができた。粒子凝集を避けるために、サンプルのスピンコーティングを試みたが、この場合、特徴のないフィルムやいくつかの粒子が観察された。スピンコーティング後のフィルム厚は、分光偏光解析法によって１０ｎｍよりも大幅に小さいと評価された。しかしながら、表面の溶液を乾燥させた後に形成された層の最大厚は、約１００ｎｍであった。水接触角測定によって、フィルム表面は比較的疎水性であること、フィルムの疎水性は塗布された担体サンプルの濃度に依存することが明らかになった(図９Ｃ)。これらの結果は、コーティングされるとアンフォールドし、その親水性のポリマー骨格が極性の二酸化ケイ素の表面に付着してその粒子コアから疎水性の光増感物質部分を露出する、動的なナノ粒子と一致している。
【０１８９】
不溶性凝集体の形成を導くナノ粒子凝集および物理的不安定性は、共通して観察されることである。ＴＰＰｐ0.25−ＣＳ−ＭＰ0.75（１７Ａ）の１ｍｇ／ｍｌ水溶液の物理的安定性を３ヶ月間に渡ってモニターした。この化合物の沈殿は観察されなかった。
【０１９０】
蛍光量子収量
ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1、ＴＰＰ−ＮＨ−ＰｉｐおよびＴＰＰキトサン誘導体（１６Ａ〜１９Ｂ）の蛍光量子収量をＤＭＳＯ中で調査した（４１９ｎｍにて励起）。ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1の量子収量は、その誘導体であるＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ並びにＴＰＰ−ＣＳ−ＴＭＡ誘導体およびＴＰＰ−ＣＳ−ＭＰ誘導体の量子収量よりも少なかった。これは、励起状態が高いと、ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1は、その誘導体と比較して消光することを実証している。ΦFについては、全ての担体化合物（１６Ａ〜１９Ｂ）がほぼ同じであり、中間体ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐの値に対するばらつきは±０．００４と軽微である。
【０１９１】
しかしながら、ＴＰＰ（ｐ−ＮＨ2）1のΦF値（０．０００２）は、いくつかの文献が公開するデータと比較して低い。Ｂｈａｕｍｉｋら（J Org Chem 2009, 74：5894）は、ＤＭＦ中で４１８ｎｍにて励起した場合、ΦF値は０．０５であると報告している。Ｂｈａｕｍｉｋらは、６６４ｎｍでの最大蛍光発光を報告しているが、これは我々の現在の発見である６５０ｎｍとは異なる。ＴＰＰが標準として用いられている一方で、我々はアントラセンを標準として用いた。本研究でΦFが低いのは、光増感物質の自己会合によると考えられる。下の表２は、ＴＰＰ修飾キトサン担体１６Ａ〜１９Ｂの蛍光量子収量(ΦF)を示す。
【０１９２】
【表２】
0006456284.tif 000052
【０１９３】
結論
我々は、メソ−テトラフェニルポルフィリンにテザーされたキトサン系ナノ担体の高効率な合成に、ＤｉＴＢＤＭＳキトサンを使用できることを示してきた。これらの担体の合成は十分に再現可能であり、その方法によって高親油性光増感物質の置換度を正確に制御することができる。ＮＭＲ研究、蛍光研究、およびＵＶ−Ｖｉｓ研究は、光増感物質部分の自己会合と一致した。担体には極性があり、良好な水溶解度および物理的安定性を示す。ＤＭＳＯ中で、光増感物質は自己会合から分離（dissociates）して、蛍光を発するようになる。水溶液において、担体は、そのコアが凝集された（π−πスタックされた）親油性ＴＰＰ部分で構成され、その周りにカチオン基とポリマー骨格で外殻を形成するナノ粒子状構造に組み立てられる。カチオン基およびポリマー骨格は、水溶液において比較的自由に動くため、ＮＭＲで観察することができる。対照的に、ＴＰＰコアは半固体であり動きが非常に限られているため、固体ＮＭＲにおいてのみ検出することができる。この構造は、アンフォールドした蛍光のフォームと動的に平衡状態であり、ＤＭＳＯ中で優位（dominant)になるため、ＮＭＲによってＴＰＰを検出することができる。担体が細胞またはエンドサイトーシス膜と接触している場合、その構造はアンフォールドして親油性分子はエンドサイトーシス膜に挿入され、励起および光増感が可能となり、ＰＤＴおよびＰＣＩ効果がもたらされる。
【０１９４】
実施例２−ＴＰＣ−キトサン系ナノ担体の合成  一般的な材料および方法は、該当する場合、実施例１と同じである。
合成
ＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐの合成は、図１０のスキーム３を参照のこと。
メソ−テトラフェニルポルフィリン（１）  化合物１（ＴＰＰ）を、Journal of Organic Chemistry 1967, 32, 476に記載された手順に従って準備した。
【０１９５】
５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリン [ＴＰＰ(ｐ−ＮＨ2)1]（３）  化合物３を、Tetrahedron 2004, 60, 2757における文献の手順に従って準備した。
【０１９６】
５−（４−アミノフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルクロリン:ＴＰＣ（ｐ−ＮＨ2）1（２０）  化合物３（１．５ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でピリジンに溶解した。Ｋ2ＣＯ3（２．９６ｇ、 ２１．５ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（０．８８７ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を加え、得られた反応混合物を還流温度に加熱した。更なる量のｐ−トルエンスルホニルヒドラジド（０．８８７ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）を２、４、６および８時間後に加えた。攪拌を２４時間還流温度にて続けた。反応混合物をＥｔＯＡｃ：Ｈ2Ｏの１：１混合物に加えて（２：１、９００ｍＬ）、１時間還流させた。室温まで冷却した後、有機相を分離して２Ｎ ＨＣｌ（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、続いて水（２ｘ１００ｍＬ）とＮａＨＣＯ3飽和水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄した。次に、有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮して、１．３ｇの粗混合物を得た。粗生成物の可視スペクトルを分析したところ、それはクロリンとバクテリオクロリン（bacterochlorin）との混合物（帯域はそれぞれ６５１および７３８）であることが分かった。また、1Ｈ ＮＭＲスペクトル分析により、微量のポルフィリン原料も残っていないことが分かった。
【０１９７】
上記反応工程から得られた粗材料（１．３ｇ）（クロリン／バクテリオクロリン混合物）をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解した。次に、オルト−クロラニル（４２０ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）を攪拌した有機溶液に室温にて一度に加え、反応の進行をＵＶ−ｖｉｓによって同時にモニターした。バクテリオクロリン（７３８ｎｍ）のピークが完全に減少した直後に、反応混合物を５％重亜硫酸ナトリウム水溶液（２ｘ１２５ｍＬ）で洗浄し、続いて水（１００ｍＬ）、５％ＮａＯＨ（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、最後に水（１５０ｍＬ）で洗浄した。次に、有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、茶色の固体としての名称クロリン化合物２０（１．２ｇ、８０％）を独占的に得た。化合物３は、２つ以上の異性体において存在するようである。
TLC (Hexane/CH2Cl2 3:7): Rf =0.23, 1H NMR (CDCl3): δ = 7.86-8.66 (m, 14H, β-pyrrole-H & phenyl-Ho ),  7.63-7.73 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 7.00 (d, J=8Hz, 2H, NH2-phenyl-Hm), 4.14-4.23 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2),  3.95 (br s, 2H, NH2), -1.38 and -1.46 (br s, 2H, α-pyrrole-NH) ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C44H34N5 ([M+H]+) 632.2809, found 632.2792.; UV-vis (DMSO): λmax: 422, 524, 553, 600, 652 nm.
【０１９８】
中間体ＴＰＣ−ＮＨ−ｐｉｐ（２１）の合成  化合物２０（６００ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）に溶解してＮ2雰囲気下で攪拌した。Ｅｔ3Ｎ（０．３２ｍＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を加え、塩化クロロアセチル（０．０９２ｍＬ、１．１５ｍｍｏｌ）を室温にて滴下し、室温にて攪拌を続けた。２時間in situ後、過剰量のピペラジン（０．３２８ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を加え、一晩攪拌を続けた。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（８５ｍＬ）で希釈し、抽出し、水（３ｘ３５ｍＬ）、ブライン（３５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。次に粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。溶離剤ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（８：９２）において、所望の生成物を分離して、茶色の固体としての名称中間体２１（４４０ｍｇ、６１％）を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH, 9:1): Rf =0.15; 1H NMR (CDCl3): δ = 9.34, 9.39 (s, 1H, TPC-NH), 7.86-8.65 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m ), 7.66-7.73 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.18-4.19 (br s, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.30 (s, 2H, ArNHCOCH2-pip), 3.17 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 2.81 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), -1.37 (br s, 2H, α-pyrrole-NH); 13C NMR (CDCl3): δ = 168.37, 167.48, 152.61, 143.14, 142.22, 140.86, 139.20, 138.32, 137.19, 136.99, 135.33, 134.64, 133.98, 133.01, 132.37, 132.12, 131.96, 128.17, 127.69, 126.81, 123.56, 123.38, 122.79,  122.08, 119.22, 117.94, 112.41, 111.65, 62.63, 53.50, 45.59, 35.90 ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 521, 549, 598, 651 nm.
【０１９９】
図１１のスキーム４を参照のこと。
ｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート（２２）の合成  ピペラジン（６ｇ、６９．６ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１２０ｍＬ）に溶解した。溶液を０℃まで冷却して、ＣＨ2Ｃｌ2（８０ｍＬ）中Ｂｏｃ2Ｏ（７．６ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温に温めて、攪拌を２４時間続けた。沈殿物を濾過してＣＨ2Ｃｌ2（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、合わせた（combined）ろ過液を分離して水（３ｘ４０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、白い固体としての名称化合物２２（６．５ｇ、５０％）を得た。
Mp 44-46 o C (lit. mp 46-47 o C); 1H NMR (CDCl3): δ = 3.32 (t, J= 4Hz, 4H), 2.74 (t, J= 4Hz, 4H), 1.39 (s, 9H); 13C NMR (CDCl3): δ = 154.85, 80.00, 79.52, 45.96, 44.45, 28.45 ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C9H19N2O2  ([M+H]+) 187.1441 found 187.1412.
【０２００】
ｐ−（メトキシカルボニル）ベンズアルデヒド（２３）の合成  ４−カルボキシベンズアルデヒド（４ｇ、２６．６ｍｍｏｌ）を６０ｍＬの無水ＭｅＯＨに懸濁して、Ｎ2下で攪拌した。反応混合物を０℃まで冷却して、塩化アセチル（９．５ｍＬ、１３３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を１２時間室温にて攪拌した。ＭｅＯＨを減圧下で除去して、粗混合物をＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で希釈した。有機相を１Ｎ ＮａＯＨ水溶液（５ｘ３０ｍＬ）とブライン（２ｘ２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮した。次に、粗固体をＥｔＯＡｃと石油エーテルを用いて再結晶させて、白い固体としてのエステル２３（３．８ｇ、８７％）を得た。
TLC (Hexane: CH2Cl2, 3:7): Rf  = 0.36;  Mp: 61-63 oC (lit. mp 59-64 oC); 1H NMR (CDCl3): δ = 10.06 (s, 1H, CHO), 8.15 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.91 (d, J=8.4 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H) ppm; 13C NMR (CDCl3): δ =191.66, 166.07, 139.21, 135.13, 130.23, 129.55, 52.62 ppm.
【０２０１】
５−（４−メトキシカルボニルフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリンＴＰＰ（ｐ−ＣＯ2Ｍｅ）1（２４）の合成  文献の方法に従う（J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 4236-4237）。
【０２０２】
５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルポルフィリンＴＰＰ（ｐ−ＣＯ2Ｈ）1（２５）の合成
化合物２４（１．２ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ：ピリジン（１０：１、１００ｍＬ）の混合物に溶解した。２ＮメタノールＫＯＨ（１２０ｍＬ）を加え、反応混合物を２４時間還流させた。次に、反応混合物を室温まで冷却して、クエン酸飽和水溶液で中和した。続いて、反応混合物をＭｅＯＨとＴＨＦが完全に除去されるまで減圧下で濃縮した。次に、粗混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１５０ｍＬ）と水（１２０ｍＬ）で希釈して、水相をＣＨ2Ｃｌ2（３ｘ５０ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機相を水（２ｘ４０ｍＬ）とブライン（３５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗混合物をＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（溶離剤、１００：０〜９６：４）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、紫色の固体としての名称酸２５（０．８３ ｇ、 ７１％）を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH 95:5): Rf  = 0.54; 1H NMR (DMSO-d6): δ = 8.84 (br s, 8H, β-pyrrole-H), 8.33-8.39 (m, 4H, R-COTPP-phenyl-Ho,m), 8.21-8.23 (m, 6H, triphenyl-Ho), 7.81-7.88 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), -2.92 (s, 2H, NH) ppm; MS (ESI): m/z calcd. for C45H31N4O2 ([M+H]+) 659.2442, found 659.2420.
【０２０３】
５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルクロリン ＴＰＣ（ｐ−ＣＯ2Ｈ）1（２６）の合成  化合物２５（６００ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）および無水Ｋ2ＣＯ3（１．１３ｇ、８．２ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2雰囲気で下ピリジン（４２ｍＬ）に溶解した。次に、トルエン−４−スルホニルヒドラジド（３４０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を還流温度にて攪拌した。３ｍＬピリジンに、更なる量のトルエン−４−スルホニルヒドラジド（３４０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を反応２、４、６、８および１０時間後に加えた。攪拌を２４時間還流温度にて続けた。室温まで冷却後、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）と脱イオン水（２５０ｍＬ）とを加えて反応混合物を再び１時間還流させた。室温まで冷却後、有機相を分離して２Ｎ ＨＣｌ（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、次に水（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、５６５ｍｇの粗混合物を得た。粗生成物の可視スペクトルを分析したところ、それはクロリンとバクテリオクロリンとの混合物（帯域はそれぞれ６５１および７３８）であることが分かった。また、1Ｈ ＮＭＲスペクトル分析により、微量のポルフィリン原料も残っていないことが分かった。
【０２０４】
上記反応工程から得られた粗材料（クロリン／バクテリオクロリン混合物、５６５ｍｇ）をＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ （７５：２５）の混合物に完全に溶解した。次に、オルト−クロラニル（１８０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を攪拌された有機溶液に室温にて一度に加え、反応の進行をＵＶ−ｖｉｓによって同時にモニターした。バクテリオクロリン（７３８ｎｍ）の吸収ピークが減少した直後に、有機相を５％重亜硫酸ナトリウム水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、続いて水（１００ｍＬ）、次に５％ＮａＯＨ水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、最後に水（１２０ｍＬ）で洗浄した。エマルジョンが観察される場合には、有機相をクエン酸飽和水溶液で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、茶色の固体としての名称クロリン化合物２６（４２０ｍｇ、７０％）を独占的に得た。化合物９は、２つ以上の異性体において存在する。
TLC (CH2Cl2: MeOH, 95:5): Rf  = 0.54, 1H NMR (DMSO-d6): δ =  7.91-8.58 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m ), 7.68-7.77 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.12-4.13 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), -1.53 and -1.60 (2 brs, 2H, α-pyrrole-NH);  1H NMR (CDCl3): δ =7.87-8.60 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.64-7.74 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.16-4.18 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), -1.39 and -1.49 (2 br s, 2H, α-pyrrole-NH) ppm; MS (ESI) calcd. for C45H33N4O2 ([M+H]+) 661.2598, found 661.2566; UV-vis (DMSO): λmax: 420, 520, 547, 599, 651 nm.
【０２０５】
中間体ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌ Ｎ−［ピペラジン−１−カルボキシレート］−５−（４−カルボキシフェニル）−１０，１５，２０−トリフェニルクロリン）（２７）の合成  クロリン化合物２６（５００ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチルピペラジン−１−カルボキシレート２２（１５５ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でＤＭＦ（４ｍＬ）に溶解した。反応混合物にＥＤＣＩ−ＨＣｌ（１７４ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）およびＨＯＢＴ（１２３ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を加え、Ｅｔ3Ｎ（０．２６ｍＬ、１．８２ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。次に、反応混合物を室温にて一晩攪拌し、撹拌水（１００ｍＬ）にゆっくりと注ぎ込んだ。固体材料を濾過し、大量の水で洗浄し、十分に乾燥させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ １００：０〜９９：１）によって精製して、茶色の固体としての名称アミド化合物２７（３４０ｍｇ、５４％）を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH 99:1): Rf =0.74; 1H NMR (CDCl3): δ = 7.74-8.59 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.65-7.72 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.16-4.17 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.78-3.86 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 3.63 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 1.53 (s, 9H, boc-(CH3)3), -1.39 and -1.47 (2 brs, 2H, α-pyrrole-NH) ppm.
【０２０６】
中間体ＴＰＣ−ＣＯ−ｐｉｐ（２８）の合成  化合物２７（３２０ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でＣＨ2Ｃｌ2（８ｍＬ）に溶解した。ＣＨ2Ｃｌ2：ＴＦＡ（１：１、４ｍＬ）を加え、１時間室温にて攪拌した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）で希釈して、水（２ｘ１５ｍＬ）、ＮａＨＣＯ3飽和水溶液（２ｘ１５ｍＬ）とブライン（１５ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。次に、粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離剤、ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝１００：０〜９２：８）によって精製して、茶色の固体としての名称中間体２８（２５０ｍｇ、８９％）を得た。
TLC (CH2Cl2: MeOH, 9:1): Rf  = 0.35, 1H NMR (CDCl3): δ = 7.74-8.59 (m, 16H, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.64-7.72 (m, 9H, triphenyl-Hm,p), 4.16-4.17 (m, 4H, chlorin β-pyrrole-CH2), 3.73-3.90 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), 3.04 (br m, 4H, piperazine ring-CH2), -1.40 and -1.47 (2 brs, 2H, α-pyrrole-NH) ppm;  MS (ESI) calcd. for C49H42N6O ([M+2H]+/2) 365.1705, found 365.1707; UV-vis (DMSO): λmax: 420, 520, 546, 599, 651 nm.
【０２０７】
キトサンメシル酸塩（７）  弊社が以前公表した手順に従って合成した（Carbohydrate Polymers 2010, 81：140-144）。
【０２０８】
Ｎ−ブロモアセチル−３，６−Ｏ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＢｒＡ−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ， ９）  ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ ８（１ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を、Ｎ2雰囲気下で丸底フラスコ内の乾燥ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）に溶解した。反応混合物を氷／塩の混合物を用いて−２０℃まで冷却した。Ｅｔ3Ｎ（１．８１ｍＬ、１３ｍｍｏｌ）を加え、続いて臭化ブロモアセチル（０．９１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。攪拌を１時間続けた。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2で希釈して、減圧下で濃縮した。粗生成物をアセトニトリル中で攪拌し、濾過してフレッシュなアセトニトリルで洗浄した。乾燥材料をＣＨ2Ｃｌ2に溶解・抽出して、水とブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、薄黄色の粉末状固体としての名称ブロモ化合物２６（１．２ｇ、９２％）を得た。
FT-IR (KBr): ν 3402 (br , NH), 2957,2931, 2886,  2858 (s, C-H TBDMS), 1682 (vs, C=O amide I), 1530 (vs, C=O amide II), 1473, 1391, 1362, 1311, 1259, 1101, 1005, 837, 777 (Si-C), 669 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 4.40 (br s, H-1), 4.02-3.26 (m, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=OCH2Br),  0.90 and 0.88 (br s, (CH3)3C-Si), 0.13 and 0.07 (br s, (CH3)2Si) ppm.
【０２０９】
図１３のスキーム６Ａを参照のこと。
中間体２９の合成
（Ｎ−ＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−ブロモアセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＴＰＣNP0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ，２９）  化合物９（８００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）および化合物ＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ２１（１２０ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）に溶解した。２１に対して正確に等モル量のＥｔ3Ｎ（２２μＬ、０．１５８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。原料の総消費量をＴＬＣで確認した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（５５ｍＬ）で希釈して、水（２ｘ２５ｍＬ）とブライン（２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物２９（７００ｍｇ、７８％）を得た。
1H NMR (CDCl3): δ = 9.21, 9.25 (s, TPCNHCO), 7.86-8.60 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m), 7.65-7.73 (m, triphenyl-Hm,p), 3.35-4.50 [br m, chitosan (H-1, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc), TPCNHCOCH2-pip, piperazin ring-CH2 and chlorin β-pyrrole-CH2], 2.77-2.83 (m, piperazine ring-CH2), 0.88-0.89 [br s, (CH3)3C-Si], 0.02-0.13 [ (br m, (CH3)2Si), -1.44 (br s, 2H, α-pyrrole-NH) ppm.
【０２１０】
図１３のスキーム６Ｂを参照のこと。
中間体３４の合成
（Ｎ−ＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−ブロモアセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＴＰＣCP0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ，３４）  化合物９（８００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でＮＭＰ（２５ｍＬ）に溶解した。ＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ ２８（１２５ｍｇ、０．１７３ｍｍｏｌ）とＮａＨＣＯ3（０．２９ｇ、３．４５ｍｍｏｌ）を室温にて加えた。次に、反応混合物を７５℃にて加熱して一晩攪拌した後、冷却して撹拌水に注ぎ込んだ。固体を濾過し、大量の水で洗浄し、吸着乾燥させた。次に得られた固体をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、濾過し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去して、茶色の固体としての化合物３４（８１０ｍｇ、８９％）を得た。
1H NMR (CDCl3): δ = 7.75-8.60 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.64-7.71 (m, triphenyl-Hm,p), 3.38-4.5 [br m, chitosan (H-1, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc), piperazin ring-CH2 and chlorin β-pyrrole-CH2], 2.76-2.84 (m, piperazin ring-CH2), 0.89-0.92 [br s, (CH3)3C-Si], 0.02-0.10 [ (br m, (CH3)2Si) ],  -1.40 and -1.48 (br s, α-pyrrole-NH) ppm.
【０２１１】
化合物３０および３５のための一般的な手順Ａ
（Ｎ−ＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウミル）アセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＴＰＣNP0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.9，３０）  化合物２９（３５０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）に溶解した。過剰量のトリメチルアミン溶液を加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、茶色の固体としての粗生成物３０（３５５ｍｇ、９４％）を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
【０２１２】
(Ｎ−ＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ−アセチル)0.1−（Ｎ−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウミル）アセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＴＰＣCP0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＴＭＡ0.9, ３５）  一般的な手順Ａに従って、３４（３５０ｍｇ、０．６１ｍｏｌ）およびトリメチルアミン溶液を用いて、粗固体としての３５（３６０ｍｇ、９４％）を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
【０２１３】
化合物３１および３６のための一般的な手順Ｂ
（Ｎ−ＴＰＣ−ＮＨ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−（Ｎ−メチルピペラジニル）アセチル）0.9-ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＴＰＣNP0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9, ３１）  化合物２９（３５０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を暗所にてＮ2下でＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）に溶解した。過剰量の１−メチルピペラジンを加え、反応混合物を２４時間室温にて攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。次に、粗生成物を高真空下で完全に乾燥させて、対応する粗生成物３１（３３０、８９％）を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
【０２１４】
（Ｎ−ＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ−アセチル）0.1−（Ｎ−（Ｎ−メチルピペラジニル）アセチル）0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（ＴＰＣCP0.1−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ−ＭＰ0.9, ３６）  一般的な手順Ｂに従って、３４（２５０ｍｇ、０．３８ｍｏｌ）および１−メチルピペラジンを用いて、粗固体としての３６（２６５ｍｇ、９３％）を得た。この粗化合物を、次の工程でそのまま使用した。
【０２１５】
最終生成物（３２、３３、３７および３８）の合成
以下の一般的な手順Ｃによって最終脱保護を行った：
化合物（３０／３１／３５／３６）を暗所にてＮ2下でＭｅＯＨに溶解した。反応混合物を５分間Ｎ2でパージして脱気し、続いて０℃まで冷却後、４ｍＬの濃縮ＨＣｌを加えた。反応混合物を室温まで温めて１２時間攪拌し、減圧下で完全に濃縮した。粗残留物を再びＭｅＯＨに溶解して、暗所にてＮ2下で脱気した。反応混合物を０℃まで冷却した後、２ｍＬの濃縮ＨＣｌを加えた。反応混合物を室温まで温めて、１２時間攪拌した。次に、反応混合物を希釈し、１時間５％ＮａＣｌ水溶液を加えてイオン交換した後、８％ＮａＣｌ水溶液に対して２４時間透析し、脱イオン水に対して３日間透析した。続いて清潔な茶色の溶液を一晩凍結乾燥して、茶色のふわふわした（fluffy）材料としての最終生成物（それぞれ３２／３３／３７／３８）を得た。
【０２１６】
ＴＰＣNP0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.90（３２）  一般的な手順Ｃに従って、３０（３２５ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）および濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、茶色の固体としての３２（１７５ｍｇ、８５％）を得た。
1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.83-8.62 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m), 7.69-7.77 (m, triphenyl-Hm,p), 4.52 (br s, H-1), 4.11-4.14 (m, -CH2CONGlc and  chlorin β-pyrrole-CH2), 3.26-3.67 (br m, partially overlapped with HDO peak, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, TPCNHCOCH2-pip, piperazine ring-CH2) 3.24 (s, +N(CH3)3)) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 520, 549, 599, 651 nm.
【０２１７】
ＴＰＣNP0.1−ＣＳ−ＭＰ0.90（３３）  一般的な手順Ｃに従って、３１（３００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、茶色の固体としての３３（１６５ｍｇ、８４％）を得た。
1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.83-8.62 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-NHTPC-phenyl-Ho,m), 7.66-7.75 (m, triphenyl-Hm,p),  4.50 (br s, H-1), 4.10-4.14 (m, chlorin β-pyrrole-CH2), 2.92-3.55 (m,  partially overlapped with HDO peak , H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc, TPCNHCOCH2-pip), 2.33-2.63 (m, partially overlapped with DMSO-d6 peak, piperazine ring-CH2, piperazine- N-CH3) ppm; UV-vis (H2O): λmax: 412, 430, 531, 560, 611, 664 nm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 521, 548, 596, 651nm.
【０２１８】
ＴＰＣCP0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.90（３７）
一般的な手順Ｃに従って、３５（３００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）および濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、茶色の固体としての３７（１７０ｍｇ、８９％）を得た。
FT-IR (KBr): ν 3353, 3061, 2950, 1683, 1580, 1473, 1440,  1376, 1291, 1154, 1112, 1067, 1032, 970, 911, 794, 703 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.89-8.62 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.67-7.76 (m, triphenyl-Hm,p), 4.50 (br s, H-1), 4.06-4.16 (m, CH2CONGlc and  chlorin β-pyrrole-CH2), 3.26-3.75 (m, partially overlapped with HDO peak, H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, piperazine ring-CH2), 3.24 (s, +N(CH3)3)) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 420, 520, 547, 599, 651nm.
【０２１９】
ＴＰＣCP0.1−ＣＳ−ＭＰ0.90（３８）  一般的な手順Ｃに従って、３６（２４０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）および濃縮ＨＣｌ／ＭｅＯＨを用いて、茶色の固体としての３８（８５ｍｇ、５２％）を得た。
FT-IR (KBr): ν 3349, 2927, 1644, 1580, 1461, 1440, 1374, 1285, 1070, 1043, 985, 945, 794719, 703 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 98:2): δ = 7.86-8.63 (m, β-pyrrole-H, phenyl-Ho & R-COTPC-phenyl-Ho,m), 7.67-7.76 (m, triphenyl-Hm,p), 4.50 (br s, H-1), 4.08-4.14 (m, chlorin β-pyrrole-CH2), 2.92-3.55 (m,  partially overlapped with HDO peak , H-2 GlcNAc, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6´, 2H GluNH-C=O, CH2CONGlc) 2.27-2.63 (m, partially overlapped with DMSO-d6 peak, piperazine ring-CH2, piperazine- N-CH3) ppm; UV-vis (DMSO): λmax: 421, 520, 547, 599, 651nm.
【０２２０】
化合物３２、３３、３７および３８のＴＰＰアナログ
最終化合物３２、３３、３７および３８のための一般的なＴＢＤＭＳ脱保護手順Ｄに従って使用された場合、予想外の結果（ＴＢＡＦ／ＮＭＰによるＴＰＣ化合物のＴＰＰ化合物への再酸化（Back-oxidation））が観察された。
【０２２１】
実施例：化合物３２のＴＰＰアナログ（ＴＰＰNP0.1−ＣＳ−ＴＭＡ0.9）  材料３０（６００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）をＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）（５〜１０ｍＬ）に溶解して、過剰量のフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を加えた。反応混合物を５５℃にて２４時間攪拌し、冷却して、希釈ＨＣｌで酸性化して３０分間攪拌した後、脱イオン水中で８％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）に対して２日間透析し、脱イオン水に対して３日間透析した。この期間、溶液の色は徐々に灰色から赤色に変化した。次に、赤色の溶液を冷凍乾燥して、茶色のスポンジ状の材料を得た。材料を再び脱保護し、イオン交換し、透析して冷凍乾燥した。しかしながら、驚いたことに、再酸化のため、化合物はそれらのＴＰＰアナログに再変換（converted back）されたことがＵＶ−Ｖｉｓによって確認された(６５０の特徴的なピークはほぼ完全に減少している)(データ図示せず)。
【０２２２】
結果
下の表３は、最終担体化合物のＤＳを示す。表４は、ＴＰＣ修飾キトサン担体の蛍光量子収量（ΦF）を示す。図１４は、ＴＰＣ−ＣＯ−Ｐｉｐ（２８）の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示し、両方の異性体を図示している。図１５〜１７は、それぞれ化合物２１、２９および３４の等価スペクトル（equivalent spectra）を示す。図１８は、ｄ6−ＤＭＳＯ／Ｄ2Ｏにおける最終担体化合物３７、３８、３２および３３のＮＭＲスペクトルを示す。
【０２２３】
【表３】
0006456284.tif 000053
【０２２４】
【表４】
0006456284.tif 000054
【０２２５】
実施例３−インビトロおよびインビボ研究
材料
Ｍｏｈａｍｍｅｄ Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ博士（siRNAsense社、Oslo, Norway）から、ＨＣＴ１１６／ＬＵＣヒト結腸癌細胞株（ルシフェラーゼをコードする遺伝子を永続的にトランスフェクトしたもの）の提供を受けた。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−ｙｌ］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（MO, USA；cat. no. M2128）から入手して、ＰＢＳ中で５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、滅菌ろ過して、４℃にて保管した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１はＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（CA, USA; Cat. No. 6085-1）から購入した。これは、ＥＬＩＭ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（CA, USA）（lot# 1002）が製造し、滅菌水中、濃度２ｍｇ／ｍｌで送達されたものである。この原液（stock solution）を分取（aliquoted）して−２０℃にて保持した。ポリ−Ｌ−リジンＨＢｒ（分子量１５０００〜３００００）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（MO, USA; cat. no. P 7890）から入手した。ポリ−Ｌ−リジンＨＢｒを蒸留水に溶解・希釈して、滅菌ろ過して、−２０℃にて保管した。
【０２２６】
インビトロ研究
細胞培養法（cell cultivation）
ＨＣＴ１１６／ＬＵＣを、３７℃、５％ＣＯ2の湿潤環境において、１０％ウシ胎仔血清（PAA Laboratories社, Pasching, Austria）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Sigma-Aldrich社, MO, USA）を添加したＤＭＥＭ培地（Lonza社, Veviers, Belgium）で培養した。
【０２２７】
細胞の処理
ＨＣＴ１１６／ＬＵＣ細胞（トランスフェクション測定：１,５ ｘ １０5細胞／ウェル、ＭＴＴアッセイ：３,７５ ｘ １０5細胞／ウェル）を、６ウェルプレート（トランスフェクション）と２４ウェルプレート（ＭＴＴ）（Nunc, Roskilde, Denmark）に播種して、２４時間（５％ＣＯ2、３７℃）インキュベートした。次に、光増感物質ＴＰＣＳ2aまたはキトサンコンジュゲート（１６Ａ、１６Ｂ、１７Ａ、１９Ａ、３７、３８、３２または３３）を細胞に添加して、細胞を１８時間インキュベートした（５％ＣＯ2、３７℃）。次に、これらの細胞を細胞培養培地を用いて３回洗浄して、プラスミド複合体を含む培地で４時間（５％ＣＯ2、３７℃）インキュベートした。次に、細胞を１回洗浄した。新しい培地を添加してから、細胞を異なる光照射量で照射した。４８時間のインキュベート後、ＥＧＦＰ（増強緑色蛍光タンパク質）の発現をフローサイトメトリーによって分析した。細胞生残率は、並列実験においてＭＴＴアッセイによって測定した。
細胞をＬｕｍｉＳｏｕｒｃｅ（登録商標）（PCI Biotech社, Oslo, Norway）からの光で曝露した。ＬｕｍｉＳｏｕｒｃｅ（登録商標）は、ピーク波長領域が４２０〜４３５ｎｍの青色光を主に発する４つの照明管群(4 x 18 W Osram L 18/67, Blue)で光を送達する。
【０２２８】
プラスミド／ポリ−Ｌ−リジン複合体の準備
プラスミドＤＮＡ溶液とポリ−Ｌ−リジン溶液とを穏やかに混ぜ合わせて、チャージ比が２．２のプラスミド／ポリ−Ｌ−リジン複合体を形成した。２．５μｌのＤＮＡ（原液２μｇ／μｌ）を４７．５μｌの水で希釈し、６．９２μlのポリ−Ｌ−リジン（１μｇ／μｌ）を４３．０８μｌの水で希釈した。混合後、溶液を３０分間室温にてインキュベートし、最終体積が１ｍｌになるまで培養培地で希釈して、細胞に添加した(１ｍｌ／ウェル)。
【０２２９】
トランスフェクションの測定
細胞を１００μｌのトリプシン（Trypsin-EDTA, Sigma-Aldrich社, MO, USA）中でトリプシン処理し、５００μｌの細胞培養培地に再懸濁して、細胞ストレーナーキャップを有する５ｍｌポリスチレン丸底チューブ（BD Falcon社）（５０μｍメッシュナイロンフィルター）でろ過した後、ＢＤ ＬＳＲフローサイトメーター（Becton Dickinson社, CA, USA）による分析を行った。ＥＧＦＰは、４８８ｎｍでの励起の後、４２５〜４７５ｎｍのフィルターを通じて測定し、ヨウ化プロピダム（propidium iodide）（Calbiochem社, CA, USA）は、５６１ｎｍでの励起の後、６００〜６２０ｎｍのフィルターを通じて測定した。ヨウ化プロピダム（１μｇ／ｍｌ）を用いて生存細胞から死細胞を区別し、パルス処理を行って単一細胞から細胞二重体（cell doublets）を区別した。各サンプルで１００００事象を集めてデータをＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Becton Dickinson社, CA, USA）を用いて分析した。
【０２３０】
細胞生残率測定
生存して代謝的に活性のある細胞中に存在しているミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより、水溶性テトラゾリウム塩（ＭＴＴ）が還元されて不溶性の紫色ホルマザン生成物になることに基づく方法により、細胞生残率を測定した。０，１２５ｍｇのＭＴＴを含む培地０，５ｍｌを細胞に加え、５％ＣＯ2、３７℃にて２時間インキュベートした。得られたホルマザン結晶を、１ウェルあたり５００μｌのＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich社, MO, USA）を添加して溶解した。プレートをＰｏｗｅｒＷａｖｅ ＸＳ２マイクロプレート分光光度計（BioTek Instruments社, VT, USA）によって読み取った。細胞生残率は、コントロール（光なしのパラレル）の割合として計算した。
【０２３１】
インビボ研究
動物
Ｈｓｄ：無胸腺ヌードＦｏｘｎ１nu雌マウスは、ノルウェー・ラジウム病院（Norwegian Radium Hospital）の動物部門で繁殖された。これらのマウスは、特定の無菌状態で維持された。水と食物は自由に与えた。マウスに関与する手順はすべて、国家倫理委員会の動物保護に関するガイドラインの下で、ノルウェー・ラジウム病院の動物飼育委員会に是認されたプロトコルに従って実施された。
【０２３２】
実験開始時のマウスは２２〜２５ｇ（生後５〜８週目）であった。ＨＣＴ１１６／ＬＵＣ細胞を、移植前に３７℃、５％ＣＯ2の湿潤環境で培養した。１,５ ｘ １０6の細胞を各マウスの右臀部に皮下注射した。腫瘍の大きさを、週に２、３回、二つの直交する直径を計測することによって測定した。腫瘍体積を次の式を用いて計算した：
Ｖ＝（Ｗ2 ｘ Ｌ）／２
ここで、Ｗは測定した腫瘍の幅、Ｌは直径の長さである）。
【０２３３】
処理（treatment）
キトサンを、ＰＢＳ（化合物３７）および３％Ｔｗｅｅｎ８０（化合物３８および３３）において、濃度１．２５ｍｇ／ｍｌ ＴＰＣに希釈した。腫瘍体積が６０〜１００ｍｍ3に到達したときに８８〜１００μｌを尾静脈に静脈注射した（最終用量５ｍ／ｋｇ）。ＴＰＣＳ2aを、３％Ｔｗｅｅｎ８０において、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。腫瘍体積が６０〜１００ｍｍ3に到達したときに８８〜１００μｌを尾静脈に静脈注射した（最終用量５ｍ／ｋｇ）。光増感物質の注射から９６時間後に、６５２ｎｍのダイオードレーザー（Ceramoptec社, Bonn, Germany）を用いて、腫瘍を放射照度９０ｍＷ／ｃｍ2、光照射量１５Ｊ／ｃｍ2の光に曝した。ＰＣＩ＋ブレオマイシン処理を受ける動物には、１００μ中１５００ＩＵのブレオマイシン（欧州単位）を腹腔内注射した。ＢＬＭの注射から３０分後に、６５２ｎｍのダイオードレーザー（Ceramoptec社, Bonn, Germany）を用いて腫瘍を放射照度９０ｍＷ／ｃｍ2の光に曝した。腫瘍部分を除いて、これらの動物にアルミ箔を被せた。アルミ箔には、腫瘍部分よりも直径２ｍｍ大きい穴を開けた。
【０２３４】
インビボイメージングシステム
生物発光は、ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ １００シリーズ（Caliper Life Sciences社、MA, USA）を用いて測定した。動物に麻酔をかけ（Zoletil）、２００μｌのＤ−ルシフェリン（Caliper Life Sciences社）（ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌ）を腹腔内注射した。Ｄ−ルシフェリンの注射から１０分後にイメージを撮影した。生物発光は、ＰＳ注射後の１１日目からほぼ週に一回測定した。動物は、腫瘍体積が１０００ｍｍ3を超えた場合、或いは痛みのサインまたは異常行動を見せた場合に、殺処分された。データをリビングイメージ４．２ソフトウェア（Caliper Life Sciences社）を用いて分析した。
【０２３５】
ＴＰＰ−キトサンコンジュゲート１６Ａおよび１６Ｂの生物学的効果を、実験を通してテストした。実験では、これらのコンジュゲートを、光化学的内在化において遺伝子送達を促進する光増感剤として用いた。実験の詳細は、材料および方法に記載されている。図１９（（ａ）および（ｂ））から、コンジュゲート１６Ａおよび１６Ｂは、低い光照射量でも実質的なトランスフェクションの促進が観察できた点で、ＰＣＩ用の優れた光増感物質であることが分かる。この効果は、ＰＣＩ用に特別に設計され且つ癌治療のために臨床開発中の光増感物質ＴＰＣＳ2a（Berg et al. 2011, supra）を用いて得られた効果と比較して、促進されていた。ＴＰＣＳ2aでは、より高い光照射量を採用した場合であっても、同レベルのトランスフェクションは達成されなかった（図１９（ｅ））。
【０２３６】
ＴＰＰ−キトサン１７Ａおよび１９Ａ（図１９（ｃ）および（ｄ））を用いて、同様の実験を行った。これらのコンジュゲートは、１６Ａおよび１６Ｂよりも更に効能があることが分かる。従って、ＴＰＣＳ2aと比較すると、これらのコンジュゲートは、１／１０の濃度で使用された場合であってもＴＰＣＳ2aで観察されたそれよりも実質的に大きなトランスフェクションの促進をもたらした点で、１０倍以上活性であった。当業者は、キトサンコンジュゲートにおける増感剤分子の近接性（proximity）は光増感効果の消失を導き、そのためコンジュゲートはそのような消失効果に曝されない増感剤自由分子と比較して効果が劣ると予想していた点で、この結果は非常に驚くべきものであった。従って、光増感物質−キトサンコンジュゲートは、何らかの未知な方法でエンドサイトーシス膜と相互作用することによって、ＰＣＩおよび関連した方法での使用において、とりわけ適したものになったと考えられる。
【０２３７】
図２０から分かるように、ＴＰＣ−キトサンコンジュゲート（化合物３７、３８、３２および３３）を用いても、同様の結果が得られた。これらのＴＰＣ−キトサンコンジュゲートは、ＴＰＰ−コンジュゲートと比較すると、赤色光を用いた照射によっても活性化されるため、インビボでの使用においてより良好な組織透過が可能になるという利点がある。これは、インビボでの大きな病変（例えば大きな腫瘍）の治療において重要な特徴であるが、表層部の光化学効果のみを求める場合には、例えば所望の効果が皮膚の上層部にあるワクチン接種のアプローチにおいては、不利である。
【０２３８】
図２１から分かるように、化合物５４を用いても同様の結果が得られた。ＰＥＧを含むコンジュゲートは、ＰＣＩ効果の誘発に効果があることが示されている。
【０２３９】
また、ＴＰＣ−コンジュゲートをインビボ実験においても考察し、ＰＤＴおよびＰＣＩベースの療法的アプローチにおいて活性があるかを調査した。図２２は、コンジュゲート３８および３３のいずれかを単独で、または細胞毒性抗癌剤ブレオマイシン（詳細については、材料および方法を参照）を共に用いて処理された光照射に供された担癌マウスの写真を示す。未処理の動物、およびＴＰＣＳ2a＋ブレオマイシンを注射した動物を標準として用いた。使用された癌細胞は、ルシフェラーゼを発現するよう永続的にトランスフェクトされたものである。それにより、ルシフェリン注射後に生物発光を画像化することによって、腫瘍の程度をモニタリングすることができる。図２２に示されているように、未処理の標準動物およびＴＰＣＳ2a＋ブレオマイシン動物（それぞれ８および７）は、光増感物質注射後１１日目および１５日目（照射後７日目および１１日目）に強い蛍光を示し、腫瘍内での大量の生きた癌細胞の存在を示した。これらの動物は、腫瘍が非常に大きく成長したため、人道的な理由から１５日目に殺処分されなければならなかった。対照的に、キトサンコンジュゲートで処理した動物は、１１日目にわずか一匹の動物（動物３）が弱い蛍光を見せたのみであり、純粋な光化学的処理（ＰＣＩ単独、ＰＤＴ処理に類似）、およびＰＣＩ＋ブレオマイシンの組み合わせ処理は、共に腫瘍内の癌細胞の量を強力に減少させたことを示している。ＰＣＩ単独で処理された動物（動物３および５）において、蛍光は１５日目〜２０日目にかけて増加しているため、ＰＣＩ光化学的処理単独では全ての腫瘍細胞を殺傷するのに十分でないことが分かった。対照的に、ＰＣＩ＋ブレオマイシンで処理した動物（動物４および６）は、２０日目であっても実質的に蛍光を示さなかったことから、この組み合わせはＰＣＩ単独よりもかなり効果的であり、キトサンコンジュゲートは強い光化学的内在化効果を誘発し、そしてその効果は癌治療のために臨床開発中の光増感物質ＴＰＣＳ2aによって誘発される効果よりも遥かに強いことが分かった。
【０２４０】
図２３は、処理された動物における腫瘍成長の曲線を示す（化合物３７キトサンコンジュゲートも含む）。図２３は、図２２に示された画像結果を立証するものであり、化合物３８＋ブレオマイシンまたは化合物３３＋ブレオマイシンを用いて処理した動物において、腫瘍は完全に根絶したらしいことを示している。これらの結果からも、キトサンコンジュゲートは、（本実験においてブレオマイシンと組み合わせても腫瘍成長に何ら効果のなかった）ＴＰＣＳ2aと比較して、遥かに効果的なＰＣＩ用エージェントであることが分かる。更に、処理スケジュールにブレオマイシンを加えることによって、テストを行った３つ全てのキトサンコンジュゲートの治療効果が著しく向上することが分かる（光化学的処理単独と比較）。これは、強い光化学的内在化効果は、これらのコンジュゲートによって誘発されることを示している。光増感物質−ポリマーコンジュゲートを設計した主な理由は、いわゆるＥＰＲ効果によってさらに優れた処理選択性を得ることであったため、この促進された効能は非常に驚くべきものである。しかしながら、当業者は、大きい分子量のコンジュゲートは、小さい分子の光増感物質よりも組織を介する拡散が遥かに遅く、そのため腫瘍細胞における増感剤の濃度が低くなり、また腫瘍内全ての細胞に増感剤を送達することの難しさから、この潜在的に促進された選択性は効能を低下させるであろうと予測するはずである。本発明に記載のキトサンコンジュゲートは、明らかにこれに該当しない。
【０２４１】
実施例４
一般的な材料および方法は、該当する場合、実施例１と同じである。図２４のスキーム７を参照のこと。
トリエチレングリコールモノメチルエーテルトシラート（４０）の合成（２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）エチル ４−メチルベンゼンスルホン酸とも称される）
トリエチレングリコールモノメチルエーテル３９（４．８７ｍＬ、３０．４３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解した。水酸化カリウム（３．７ｇ、６５．９５ｍｍｏｌ）の水溶液（２５ｍＬ）を加え、得られた混合物を０℃まで冷却した。次に、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した塩化パラトルエンスルホニル（p-toluenesulfonyl chloride）（６．８６ｇ、４８．７７ｍｍｏｌ）を、３０分間かけて滴下漏斗を介して滴下した。反応混合物を０℃にて２時間以上攪拌した後、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、その後ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）で希釈して、ＥｔＯＡｃ（２ｘ７５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、灰色の濁った油状の材料としての化合物４０（７．１３ｇ）を得た。
FT- IR: 2878, 1598, 1453, 1356, 1177, 1097 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.80 (d, J=8Hz, 2H), 7.34 (d, J=8Hz, 2H), 4.16 (t, 2H, CH2OTs), 3.67-3.70 (m, 2H, -CH2-CH2OTs ), 3.58-3.62 (m, 6H, TEG OCH2´s), 3.37 (s, 3H, OCH3), 2.44 (s, 3H, Ar-CH3) ppm; 13C NMR (400MHz, CDCl3): δ = 144.91, 133.19, 129.94, 128.12, 72.05, 70.90, 70.71, 69.36, 68.83, 59.17, 21.78 ppm.
【０２４２】
（トリエチレングリコールモノエチルエーテルトシラート）（４２）の合成（２−（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）エチル ４−メチルベンゼンスルホン酸とも称される）
トリエチレングリコールモノエチルエーテル４１（４．９ｍＬ、２８．１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）に溶解した。水酸化カリウム（３．７ｇ、６５．９５ｍｍｏｌ）の水溶液（２５ｍＬ）を加えた。その後、反応混合物を０℃まで冷却した。次に、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した塩化パラトルエンスルホニル（６．８６ｇ、４８．７７ｍｍｏｌ）を、３０分間かけて滴下漏斗を介して滴下した。反応混合物を０℃にて２時間以上攪拌した後、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、その後ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）で希釈して、ＥｔＯＡｃ（２ｘ７５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過して減圧下で濃縮して、灰色の濁った油状の材料としての化合物４２（６．８３ｇ）を得た。
FT-IR: 2870, 2975, 1598, 1453, 1358, 1177, 1110 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.77 (d, J=8Hz, 2H), 7.31 (d, J=8Hz, 2H), 4.13 (t, 2H, CH2OTs), 3.64-3.67 (m, 2H, -CH2CH2OTs ), 3.52-3.59 (m, 8H, TEG OCH2´s), 3.49 (q, J=8Hz, 2H, -OCH2CH3), 2.42 (s, 3H, Ar-CH3), 1.17 (t, J=8Hz, 3H, -OCH2CH3 ) ppm.
【０２４３】
メトキシポリエチレングリコールトシラート（４４）の合成
ポリエチレングリコールモノメチルエーテル４３（５ｇ、１４．２９ｍｍｏｌ、平均分子量：３５０Ｄａ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した。水酸化カリウム（１．７６ｇ、３１．４４ｍｍｏｌ）の水溶液（２５ｍＬ）を加えた。その後、反応混合物を０℃まで冷却した。次に、ＴＨＦ（５０ｍＬ）に溶解した塩化パラトルエンスルホニル（３．２７ｇ、１７．１４ｍｍｏｌ）を、３０分間かけて滴下漏斗を介して滴下した。反応混合物を０℃にて２時間以上攪拌した後、室温にて一晩攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、その後ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）と水（３０ｍＬ）で希釈して、ＥｔＯＡｃ（２ｘ７５ｍＬ）を用いて抽出した。合わせた有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過して減圧下で濃縮して、灰色の濁った油状の材料としての化合物４４（５．９１ｇ）を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 7.74 (d, J=8Hz, 2H), 7.29 (d, J=8Hz, 2H), 4.11 (br t, 2H, CH2OTs), 3.49-3.65 (m, 28H, -CH2-CH2OTs & PEG OCH2´s), 3.32 (s, 3H, OCH3), 2.39 (s, 3H, Ar-CH3) ppm.
【０２４４】
トリエチレングリコールモノエチルエーテルピペラジン（４６）の合成（１−（２−（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）エチル）ピペラジン）（４６）とも称される）（ＴＥＧ−Ｐｉｐ）
ピペラジン（１０．４ｇ、〜１２０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下アセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解した。アセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解した化合物４２（５ｇ、１５．０４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を１２時間室温にて攪拌し、減圧下で濃縮してアセトニトリルを除去した。ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（８：９２）を溶離剤として用いて粗生成物をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、無色液体としての純粋な化合物４６（１．５２ｇ、４１％）を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3): δ= 3.54-3.64 (m, 10H, TEG OCH2´s), 3.50 (q, J=8Hz, 2H, -OCH2CH3), 3.43 (s, 1H, NH), 2.88 (t, 4H, Piperazine ring-CH2), 2.55 (t, 2H, OCH2-CH2-Piperazine), 2.46 (br m, 4H, Piperazine ring-CH2), 1.18 (t, J=8Hz, 3H, -OCH2CH3) ppm; 13C NMR: 70.76, 70.70, 70.47, 69.92, 68.86, 66.73, 58.47, 54.89, 50.55, 45.99, 15.25 ppm; MS (ESI) calcd. for C12H27N2O3 ([M+H]+) 247.2016, found 247.2014.
【０２４５】
２−（２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ）アセトアルデヒド（４５）の合成
塩化オキサリル（５ｍＬ、５８．２４ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下ＣＨ2Ｃｌ2（７５ｍＬ）に溶解した。得られた混合物をドライアイス／アセトン混合物を用いて−７８℃まで冷却した後、ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）で希釈したＤＭＳＯ（５ｍＬ）を慎重に滴下した。滴下完了後、反応混合物を１０分以上攪拌して、ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）で希釈したトリエチレングリコールモノメチルエーテル３９（５ｍＬ、３１ｍｍｏｌ）を滴下した。滴下完了後、反応混合物を１５分間攪拌した。次に、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）で希釈したＥｔ3Ｎ（２０ｍＬ、１４３ｍｍｏｌ）を２０分間かけて滴下し、３０分以上−７８℃まで攪拌した後、室温に戻した。次に、白い「乳白」色の反応混合物を水（２ｘ４５ｍＬ）とブライン（４０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、ろ過して減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（０：１００〜１０：９０）を溶離剤として用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、アルデヒド４５（２．４０ｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ分析によって、化合物４７が分離できないいくらかの不純物で汚染されたことが明らかになった。
FT-IR: 3436, 2879, 1734,1454,1353,1108, 1028 cm-1; 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ ppm: 9.73 (s, 1 H, CHO), 4.16 (s, 2H), 3.54-3.76 (m, 10H), 3.38 (s, 3H) ppm. (Product is contaminated with starting material. Product is approximately 50%.)
【０２４６】
２−（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）アセトアルデヒド（４７）の合成
原料にトリエチレングリコールモノメチルエーテル（３９）の代わりにトリエチレングリコールモノエチルエーテル（４１）を使用したこと以外は、上記化合物と同じ手順を用いた。化合物４７（収量：２．３４ｇ、〜４２％）は、分離できないいくらかの不純物で汚染された。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ ppm: 9.67 (s, 1 H, CHO), 4.10 (s, 2H), 3.52-3.69 (m, 10H), 3.45 (q, 2H), 1.15 (t, 3H) ppm. (Product is contaminated with starting material. Product is approximately 42%).
【０２４７】
３，６−ｄｉ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−キトサンの直接Ｎ修飾によるキトサンのＴＥＧ化
図２５のスキーム８を参照のこと。
Ｎ−（２−（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）エチルアミノキトサン  ＴＥＧ0.41−ＣＳ（４９ａ）の合成
ＤｉＴＢＤＭＳ−キトサン８（３００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（５ｍＬ）に溶解して、反応容器内で５０℃に加熱した。Ｃｓ2ＣＯ3（１ｇ、３，０７ｍｍｏｌ）と触媒量のヨウ化カリウムを加えた。次に、反応容器を密閉して反応混合物を２時間攪拌した後、シリンジを介して化合物４２（７６７ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４８時間攪拌した後、冷却して氷水に流し込み、得られた沈殿物を濾過して真空オーブンで乾燥させた。黄色い粉末としての粗生成物４８ａ（２７０ｍｇ）を得た。それを下述の次の脱保護工程でそのまま用いた。
ヒドロキシル基を脱保護するために（シリル基の除去）、粗化合物４８ａをＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に懸濁した。濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を１２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に再懸濁して、濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を加えて１２時間攪拌した後、希釈してＮａＣｌ水溶液（５％、３５ｍＬ）でイオン交換して、脱イオン水に対して３日間透析した。透析完了後、水溶性材料を凍結乾燥して、白く粘着性のある材料としての４９ａ（１２５ｍｇ）を得た。
FT-IR: 3418, 2874, 1712, 1631, 1536, 1378, 1077 cm-1; 1H NMR (400MHz, D2O) δ = 4.68 and 4.27 (s, 1H, chitosan H-1 & H-1´), 3.14-3.97 (br m, 10H, chitosan H-2 to H-6, TEG (〜41% DS) OCH2´s and O-CH2CH3), 2.96-3.14 (br m, 1H, H-2 & H-2´), 1.21 (t, 1.24 H (〜41% DS) TEG O-CH2CH3) ppm.
【０２４８】
Ｎ−（２−（２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ）エチルアミノキトサン ＴＥＧ0.27−ＣＳ（５１ｂ）の合成（置換度２７％）
トリエチレングリコールトシラート（４２）エージェントを３当量の代わりに１．５当量用いたこと以外は、上記と同じ手順を用いて化合物４９ｂを準備した。白く粘着性のある材料としての化合物４９ｂ（２７ｍｇ）を得た。
FT-IR: 3417, 2876, 1602, 1382, 1259, 1078, 599 cm-1; 1H NMR (400MHz, D2O: DCl, 95:5) δ = 5.13 and 4.95 (s, 1H, chitosan H-1 & H-1´), 3.24-3.99 (br m, 12H, chitosan H-2 to H-6, H-2´, TEG (27% DS) OCH2´s and O-CH2CH3), 1.21 (t, 0.89 H, TEG O-CH2CH3) ppm.
【０２４９】
Ｎ−アセチルブロモ−３，６−Ｏ−ｄｉＴＢＤＭＳ−キトサン（９）の合成
ＤｉＴＢＤＭＳ−キトサン ８（３ｇ、７．７０ｍｍｏｌ）（Ｉｎｇoｌｆｕｒ Ｍａｇｎuｓｓｏｎ氏によって前もって合成されたもの）を窒素雰囲気下ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を−２０℃まで冷却して、シリンジを用いてトリエチルアミン（５．３０ｍｌ、３８ｍｍｏｌ）を加えた。１０分間攪拌した後、ＣＨ2Ｃｌ2（２．５ｍＬ）で希釈した臭化ブロモアセチル（２．６５ｍｌ、３０．５１ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて滴下した。反応混合物を−２０℃にて１時間攪拌した後、ＣＨ2Ｃｌ2（７０ｍＬ）で希釈して、即座に減圧下で濃縮した。次に、こげ茶色の材料を粉砕してアセトニトリル（３ｘ３５ｍＬ）で洗浄して乾燥させた後、ＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）に再溶解して分液漏斗に移し、水(２ｘ２５ｍＬ)とブライン（３５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、茶色の固体材料としてのブロモアシル中間体９（２．５７ｇ）を得た。
FT-IR (KBr): ν 3404 (br , NH), 2956-2858 (s, C-H TBDMS), 1682 (vs, C=O amide I), 1530 (vs, C=O amide II), 1473, 1391, 1362, 1311, 1259, 1101, 1005, 837, 777 (Si-C), 669 cm-1; 1H NMR (CDCl3) δ ppm: 4.40 (br s, 1H, H-1), 3.26-4.02 (m, 8H, H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and  GluNH-C=OCH2Br),  0.90 and 0.88 (br s, 18H, (CH3)3C-Si), 0.13 and 0.07 (br s, 12H, CH3-Si) ppm.
【０２５０】
Ｎ−アセチルブロモ−３，６−ｄｉＴＢＤＭＳ−キトサンに対する求核置換反応によるキトサンのＰＥＧ化
Ｎ−（アセチルピペラジン−ＴＥＧ）−キトサン（５１）
（ｉ）アセチルブロモキトサン９（２００ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍＬ）に溶解した。ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍＬ）で希釈した化合物４６（２０４ｍｇ、０．８２８ｍｍｏｌ）を室温にて滴下した。得られた混合物を１０分間攪拌した後、トリエチルアミン（１１５μＬ、０．８２８ｍｍｏｌ）を加えた。攪拌を２４時間室温にて続け、原料４６の総消費量をＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（１：９）におけるＴＬＣを調べて確認した。その後、反応混合物を分液漏斗に移し、有機相を水（２ｘ３５ｍＬ）とブライン（３５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、次の脱保護工程でそのまま用いられる粗液としての化合物５０（２１４ｍｇ）を得た。
（ｉｉ）ヒドロキシル基を脱保護するために（シリル基の除去）、粗化合物５０をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に懸濁した。濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を１２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に再懸濁して、濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を加えて１２時間攪拌した後、希釈してＮａＣｌ水溶液（５％、３５ｍＬ）でイオン交換して、脱イオン水に対して３日間透析した。透析完了後、水溶性材料を減圧下で乾燥させて、黄色がかった透明な粘着性のある材料としての５１（１１２ｍｇ）を得た。
1H NMR (400MHz, D2O) δ = 4.63 (s, 1H, chitosan H-1), 2.74-3.76 (m, 30H, chitosan H-2 to H-6, GlcNHCOCH2-Pip-TEG, TEG OCH2´s & O-CH2CH3, piperazine ring-CH2´s ), 1.21 (t, 3 H, TEG O-CH2CH3) ppm; DS= 100%.
【０２５１】
Ｎ−アセチル−ピペラジン−テトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ）（５）の合成
上記実施例１およびスキーム１に記載されている通りに合成した。
【０２５２】
ＴＰＰ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＴＢＤＭＳ−キトサン（５５）の合成
図２６のスキーム９を参照のこと。
ＤｉＴＢＤＭＳ−キトサン（１００ｍｇ、ｍｍｏｌ）を５５℃にてＮＭＰ（１０ｍＬ）に溶解した。炭酸セシウム（５００ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を１５分間攪拌した後、化合物４（７２．２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）を加えた。触媒量のヨウ化カリウムを加えて２４時間攪拌を続け、触媒量のＤＭＡＰを加えて２４時間攪拌した後、冷却して水に注ぎ込んだ。沈殿物を濾過して真空オーブンで乾燥させ、粗固体としての化合物５５を得た。しかしながら、赤色の水溶液が観察されており、化合物がいくらか水に溶けて無駄になったことを示している。これは、ＮＭＰによるものと考えられる。従って、この段階での透析は有益であろう。
1H NMR (400MHz, D2O) δ ppm: 8.84-8.86 (br m,  β-pyrrole H), 8.68 (s, TPPNHCO), 8.21-8.22 (m, tetraphenyl-Ho), 7.99 (d, J= 8.0 Hz, RNHTPP-phenyl-Hm), 7.72-7.79 (m, triphenyl-Hm,p), 2.72-4.80 (m, chitosan H-2-H6, TPPNHCOCH2), 0.89-0.90 (br s, (CH3)3C-Si), 0.05-0.07 (br s, 12H, CH3-Si). -2.78 (s, α-pyrrole NH); ( (DS of TPP-NHCOCH2 = 〜 5%)
【０２５３】
ＴＰＰｐ0.1−ＢｒＡ0.9−ＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳ（５２）の合成
化合物９（８００ｍｇ、１．５８７ｍｍｏｌ）を室温にて窒素雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）に溶解した。ＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ ５（１２０ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）を加え、トリエチルアミン（３０μｌ、０．２１６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温にて２４時間攪拌した。原料５の消費の完了をＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2、１：９）で確認した。反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（７５ｍＬ）で希釈して水（２ｘ３５ｍＬ）とブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過して減圧下で濃縮して、紫色の固体としての５２（収量：７１６ｍｇ）を得た。
1H NMR (CDCl3) δ ppm: 9.31 (s, TPPNHCO),  8.84-8.86 (m,  β-pyrrole H), 8.20-8.23 (m, tetraphenyl-Ho), 7.97 (d, J= 8.0 Hz, RNHTPP-phenyl-Hm), 7.74-7.79 (m, triphenyl-Hm,p), 4.43 (br s, H-1), 3.50-4.14 (m, chitosan H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and H-2 GluNHCO, TPPNHCOCH2-Pip, -CH2CONGlc and Piperazine ring-CH2's), 2.81-2.86 (m, piperazine ring-CH2's), 0.91, 0.87 (br s, (CH3)3C-Si), 0.07, 0.14 (br s, CH3-Si), -2.77 (br s, α-pyrrole NH) ppm; (DS of TPP-NH-Pip =〜10%).
【０２５４】
ＴＰＰがコンジュゲートされたＤｉＴＢＤＭＳ−ＣＳのＴＥＧ化および脱保護
ＴＥＧ化されたＮ−（ＴＰＰ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2）−キトサン（５７）の合成
（ｉ）粗化合物５５（３５０ｍｇ、０．８３３ｍｍｏｌ）を反応容器内で５０℃にてＮＭＰ（１０ｍＬ）に溶解した。Ｃｓ2ＣＯ3（１．０９ｇ、３．３３ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を３０分間攪拌した後、化合物４２（１．１０８ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）と触媒量のヨウ化カリウムを加えた。攪拌を１２時間続けた後、反応混合物を冷却し、水（３０ｍＬ）で希釈して脱イオン水に対して３日間透析し、凍結乾燥して、次の脱保護工程でそのまま用いられる化合物５６を得た。
（ｉｉ）粗化合物５６をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に懸濁した。濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を１２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に再懸濁して、濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を加えて１２時間攪拌した後、希釈してＮａＣｌ水溶液（５％、３５ｍＬ）でイオン交換して、脱イオン水に対して３日間透析した。透析完了後、水溶性材料の一部を減圧下で乾燥させて、茶色の固体としての５７（１１５ｍｇ）を得た。
【０２５５】
ＴＥＧ化されたＴＰＰ−ＮＨ−Ｐｉｐ−キトサンＴＰＰｐ0.1−ＣＳ−ＴＥＧ0.9（５４）の合成
（ｉ）化合物５２（４００ｍｇ、０．７９９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でＣＨ2Ｃｌ2（３５ｍＬ）に溶解した。化合物４６（３９４ｍｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を加え、続いてＥｔ3Ｎ（２２２μｌ、１．５６ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を室温にて２４時間攪拌した。次に、ＴＬＣを確認して、Ｅｔ3Ｎ（２２２μｌ、１．５６ｍｍｏｌ）を加えて原料４６の消費を完了させて、攪拌を１２時間以上続けた。その後、反応混合物を減圧下で濃縮して、次の脱保護工程でそのまま用いられる粗材料としての５３（４１７ｍｇ）を得た。
（ｉｉ）粗化合物５３をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に懸濁した。濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を室温にてゆっくりと加え、得られた混合物を１２時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた粗生成物をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に再懸濁して、濃縮ＨＣｌ（２ｍＬ）を加えて１２時間攪拌した後、希釈してＮａＣｌ水溶液（５％、３５ｍＬ）でイオン交換して、脱イオン水に対して３日間透析した。透析完了後、水溶性材料を凍結乾燥して、赤紫褐色の固体としての最終化合物５４（２５２ｍｇ）を得た。
FT-IR: 3431, 2869, 1665, 1529, 1442, 1308, 1109, 1070, 1029, 800, 701, 559 cm-1; 1H NMR (DMSO-d6: D2O 96:4) δ ppm: 8.83 (br m,  β-pyrrole H), 8.15-8.22 (m, tetraphenyl-Ho), 8.11(d, J= 8.0 Hz, RNHTPP-phenyl-Hm), 7.80-7.88 (m, triphenyl-Hm,p), 4.55 (br s, H-1), 2.54-3.65 (br m, partially overlapped with HDO peak, chitosan  H-2 GlcN, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6' and H-2 GluNHCO, TPPNHCOCH2-pip, CH2CONGlc, piperazine ring-CH2's, TEG OCH2's and TEG  OCH2CH3 ), 1.09 (t, TEG OCH2CH3) ppm.; (DS of TPP-NH-Pip = ~ 10%  and DS of TEG= 〜90%)
構造データをＮＭＲ、ＦＴ−ＩＲおよび質量分析（データ図示せず）によって確認した。図２７に化合物５４の代表的なＮＭＲスペクトルを示す。
【０２５６】
実施例５
インビトロＴ細胞活性化アッセイ
キトサンコンジュゲート３２、３８のＭＨＣクラスＩ制限抗原提示およびＣＤ８+Ｔ細胞活性化に対する効果をテストするために、オバルブミン特異的（ＯＶＡ ２５７−２６４）ＣＤ８+Ｔ細胞クローンを有する抗原特異的Ｔ細胞設定（antigen-specific T cell setting）において、マウス初代マクロファージをコンジュゲート３２、３８およびオバルブミンＯＶＡ ２５７−２６４ペプチド抗原とインキュベートした。活性化ＣＤ８+Ｔ細胞からのＩＬ−２産生を、ＥＬＩＳＡで分析した。
【０２５７】
骨髄由来のマクロファージ（ＢＭＤＭ）は、オバルブミン特異的Ｔ細胞ハイブリドーマを有する抗原特異的Ｔ細胞設定において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として用いられた。ＢＭＤＭは、２０％Ｌ−２９２細胞株上清を添加した培地において、マウス骨髄細胞を少なくとも５日間培養することによって産生された。
【０２５８】
キトサンコンジュゲート３２、３８を添加して／添加せずに、１ウェルあたり３０，０００個のＡＰＣを９６ウェルプレート内で一晩インキュベートした。コンジュゲートの濃度は、ＴＰＣ濃度が０．０５μｇ／ｍｌとなるように調整された。次の日、ＡＰＣを２μｇ／ｍｌの抗原性ペプチド（ＯＶＡ ２５７−２６４、Anaspec社より入手）と４時間インキュベートした（全ての刺激を３倍にした）。
【０２５９】
細胞を洗浄し、異なる照射量の青色光（０、３０、６０、９０、１８０秒）で曝露した後、１ウェルあたり１００，０００個のオバルブミン特異的Ｔ細胞を添加してＡＰＣと一晩共培養した。ＣＤ８+Ｔ細胞クローンＲＦ３３．７０（ＯＶＡ ２５７−２６４のＭＨＣ Ｉ−制限認識）を用いた。
【０２６０】
ＣＤ８+Ｔ細胞およびＡＰＣを一晩共培養した後、細胞培養から上清を採取した。上清を標準マウスＩＬ−２ ＥＬＩＳＡを用いて分析し、活性化されたＴ細胞からのインターロイキン（ＩＬ）−２の産生を調べた（IL-2 ELISA Duoset, RnD Systems社、Ｔ細胞培養の各ウェルからの２重（duplicates）分析、２５μｌの不希釈上清を各ＥＬＩＳＡウェルにおいて分析した）。
【０２６１】
その結果（図２８）、これらのコンジュゲートを用いると、ＣＤ８+抗原特異的Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生が、照射された細胞において顕著に増加することが分かった（例えば化合物３２コンジュゲートはＩＬ−２の産生を２倍にした、図２８Ａ）。抗原を含まないコンジュゲートとインキュベートされた、照射された標準細胞には、そのような増加は見られなかった（データ図示せず）。これは、観察された効果は抗原依存であり、何らかの特定されていない光化学的処理の効果によるものではないことを実証している。ＡＰＣの表面上で抗原性ペプチドの提示が促進したのは、観察されたＩＬ−２産生の増加が原因であることを実証している。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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