(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
1）当帰（Angelica Radix）、川キュウ（Cnidium Rhizoma）および芍薬（Paeonia Radix）を1：0.5〜1.5：0.5〜1.5の重量比で混合した混合生薬材からエタノール抽出物を製造する工程と、
2）前記の工程1）の当帰、川キュウ、および芍薬の混合生薬材から熱水抽出物を製造する工程と、
3）前記の工程1）のエタノール抽出物の一定分液及び前記工程2）の熱水抽出物を混合した後、66〜83％エタノールで浸漬して多糖体を収得する工程、および
4）前記の工程1）のエタノール抽出物の一定分液および、前記の工程3）の多糖体を混合する工程を含む、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法。
【請求項２】
前記工程1）のエタノール抽出物が、10〜50％のエタノールで抽出したことを特徴とする請求項１に記載の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法。
【請求項３】
前記の工程4）の混合が、多糖体成分が10〜50重量％で含まれることを特徴とする請求項１に記載の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法。
【請求項４】
前記脂溶性ポリフェノール成分が、ノダケニン（nodakenin）、デカシン（decursin）およびその他の成分からなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物。
【請求項６】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する癌の予防または治療のための薬学的組成物。
【請求項７】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する癌の予防または改善のための健康機能食品。
【請求項８】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌補助剤。
【請求項９】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌治療の副作用防止薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌治療の副作用防止用健康機能食品。
【請求項１１】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する免疫機能増強のための薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する免疫機能増強のための健康機能食品。
【請求項１３】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する酸化的損傷に対する生体防護用薬学的
組成物。
【請求項１４】
請求項５の生薬組成物を有効成分として含有する酸化的損傷に対する生体防護用健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法、前記方法で製造された生薬組成物、及び前記生薬組成物の用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌の治療は、手術、抗癌剤投与、放射線照射などの癌細胞を直接殺害する方法と免疫療法のような癌細胞を除去する生体内の免疫機能を活性化して治療する方法に分けることができる。従来は、主に前者の直接殺害する方法が用いられたが、最近では免疫療法を併用して癌の治療に用いられている。
【０００３】
最近、免疫反応の作用機序が知られるにつれて、免疫調節物質を利用して癌を治療しようとする方法が多く試みられている。免疫調節物質は、非特異的に生体内の免疫細胞を刺激して、生体の免疫機能を増進させることによって、病気の要因に対する生体の防御力を増強させる。このような非特異的免疫調節物質として、死滅させた細菌体、化学合成物質（合成された核酸誘導体またはグリコシド）、生物製剤（サイトカイン（cytokine）またはホルモン）などが知られており、前記物質を投与して、生体の免疫機能を促進させることによって抗癌効果を得ようとする研究が行われている。しかし、これらの非特異的免疫調節物質の大部分が、毒性または副作用のために、実際の臨床応用には、多くの限界を示している。特に、免疫反応に関連するさまざまなサイトカインが知られ、前記サイトカインを遺伝工学的に大量生産して癌治療に利用しようとする研究が活発に進められているが、重度の毒性により制限的な研究のみ行われているのが実情である。
【０００４】
また、癌の治療のための抗癌剤療法または放射線療法を行う場合、造血系障害および再生組織の損傷のような副作用が伴う。前記の副作用は、抗癌剤または放射線による生体組織の酸化的損傷に起因する。
【０００５】
放射線から生体を防護することができる物質に対する研究は、1949年チオール（thiol）基を含有したシステイン（cystein）が放射線防護効果を示すと報告された後、アミノチオール（aminothiol）誘導体（特に、WRシリーズ）が集中的に研究されたが、アミノチオール誘導体の毒性のために、実際の応用には限界を示した。その後、ジピリダモール（dipyridamole）、アデノシン一リン酸（adenosine monophosphate）、デオキシスペルグアリン（deoxyspergualin）などの化学合成剤を中心に、その防護効果が研究されたが、これらも毒性に起因する問題によって、実際の適用には限界を示した。また、抗癌免疫活性調節物質として研究されてきたグルカン（glucan）などの多糖体とOK-432などの無毒化された細菌体などで免疫造血系を刺激して防護効果を得ようとする研究が試みられたが、やはり副作用により実用化が難しかった。近年では免疫反応と造血機能に関連するサイトカインであるインターロイキン-1（interleukin-1）をはじめとする免疫刺激剤、腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor、TNF）、顆粒球コロニー形成刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor、GM-CSF）のような造血細胞増殖の誘導サイトカイン、ホルモン等により、放射線防護効果を得ようとしたが、やはり毒性のために制限的に試みられている。
【０００６】
前記のように、免疫機能の活性化を通じて抗癌効果、免疫機能の強化および造血機能増進効果とともに放射線照射などの副作用から生体を防護することができる物質として、その安全性が確認された物質の確保が切実である。そこで、最近では、天然物から副作用が
ない天然の生理活性物質の研究が多数行われていて、特に、放射線または化学物質だけでなく、有害な活性酸素やフリーラジカル等による酸化的生体損傷が老化、癌など様々な病気の原因として明らかになるにつれ、抗酸化物質を利用した疾病の予防および治療の研究が行われている。そして、これらの天然物から生体調節及び生体防御に効果がある生理活性物質の探索が活発に行われて、健康補助食品や治療剤として産業化に至っている。
【０００７】
特許文献１は、抗癌、免疫、および造血機能増進効果と酸化的生体損傷の抑制効果を有する生薬組成物とその製造方法に関するもので、当帰（Angelica Radix）、川キュウ（Cnidium Rhizoma ）および白芍薬（Paeonia Radix）で構成された混合生薬材から製造された生薬組成物が抗癌効果、免疫機能増進効果、造血機能増進効果および放射線防護効果があることを開示している。しかし、前記生薬組成物は、熱水抽出の方法でのみ製造された組成物であり、その構成成分に脂溶性ポリフェノールの含有量が少なく、癌細胞成長抑制、抗癌剤治療の副作用の防止、放射線癌治療の副作用を防ぐなどの医薬用途として十分有意な効果を表していると見るのは難しい。
【０００８】
そこで、本発明者らは、脂溶性ポリフェノール含有量を増加させることによって比較例の生薬組成物（特許文献１）よりも有意な効果を示すことができる生薬組成物を開発するために努力中、熱水抽出物に基づいて発明した比較例の生薬組成物とは異なり、適正な濃度のエタノール水溶液で抽出した抽出物をベースにすると、水溶性ポリフェノール成分をそのまま含有し、脂溶性ポリフェノール成分の含有量を大幅に増加させることができるという考えに基づいて、いくつかの活性を一緒に表すことができる最も有意な生薬組成物を製造し、その活性の優秀さを証明することにより、本発明を完成した。簡単に記述すると、当帰、川キュウおよび芍薬の混合生薬材のエタノール抽出物一定分液を分取しておき、残りのエタノール抽出物一定分液および熱水抽出物を混合した後、多糖体を得た。分取しておいたエタノール抽出物一定分液と前記多糖体を混合した生薬組成物（実施例では詳細に記述する）は、デカシン（decursin）を含む脂溶性ポリフェノールの含有量が著しく増加し、より有意な抗酸化活性、免疫細胞活性化の効果および癌細胞成長抑制効果を示し、抗癌剤であるシスプラチン（cisplatin）によって誘発される腎毒性及び肝毒性を通常のレベルに顕著に軽減させ、放射線照射による腸陰窩（intestinal crypt）消失に対しても、より有意な抑制効果を示すことを確認することにより、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】韓国登録特許第10-0506384号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法、前記方法で製造された生薬組成物、及びその用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は下記の工程を含む、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法を提供する：
1）当帰(トウキ)（Angelica Radix）、川キュウ (センキュウ)（Cnidium Rhizoma）および芍薬 (シャクヤク)（Paeonia Radix）の混合生薬材からエタノール抽出物を製造する工程;
2）前記工程1）の当帰、川キュウ、および芍薬の混合生薬材から熱水抽出物を製造する工程;
3）前記工程1）のエタノール抽出物の一定分液を工程4）の混合物の製造に使用するために分取して保管しておき、残りのエタノール抽出物一定分液及び前記工程2）の熱水抽
出物を混合した後、浸漬して多糖体を収得する工程;と
4）前記分取保管しておいた工程1）のエタノール抽出物の一定分液と前記工程3）の多糖体を混合する工程。
【００１２】
また、本発明は、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を提供する。
【００１３】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する癌の予防および治療のための薬学的組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する癌の予防及び改善のための健康機能食品を提供する。
【００１５】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌補助剤を提供する。
【００１６】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌治療の副作用防止用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌治療の副作用防止用健康機能食品を提供する。
【００１８】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する免疫機能増強用薬学的組成物を提供する。
【００１９】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する免疫機能増強用健康機能食品を提供する。
【００２０】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する酸化的損傷に対する生体防護用薬学的組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する酸化的損傷に対する生体防護用健康機能食品を提供する。
【００２２】
また、本発明は、前記生薬組成物を個体に投与する工程を含む癌の予防または治療方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、前記生薬組成物を投与する工程を含む抗癌治療による副作用の抑制方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、前記生薬組成物を投与する工程を含む癌の治療効果を促進する方法を提供する。
【００２５】
また、本発明は、癌の予防または治療用組成物として使用するための前記生薬組成物の用途を提供する。
【００２６】
また、本発明は、癌の予防または改善のための健康機能食品として使用するための、前記生薬組成物の用途を提供する。
【００２７】
また、本発明は、抗癌補助剤として使用するための、前記生薬組成物の用途を提供する
。
【００２８】
また、本発明は、抗癌治療の副作用防止薬学的組成物として使用するための、前記生薬組成物の用途を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、抗癌治療の副作用防止用健康機能食品として使用するための、前記生薬組成物の用途を提供する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の脂溶性ポリフェノールの含有量が増加した生薬組成物は、比較例の生薬組成物と比較してデカシン（decursin）を含む脂溶性ポリフェノールの含有量が著しく増加し、より有意な抗酸化活性、免疫細胞の活性化効果および癌細胞成長抑制効果を示し、抗癌剤であるシスプラチンによって誘発される腎毒性及び肝毒性を著しく軽減させ、放射線照射による腸陰窩（intestinal crypt）消失に対してもより有意な抑制効果を示すので、前記脂溶性ポリフェノールの含有量が増加した生薬組成物は、癌治療のための組成物、抗癌補助剤、抗癌治療の副作用防止用組成物、免疫機能増強用組成物および生体防護用組成物として有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造工程を示した図である。
【図２】比較例の生薬組成物の製造工程を示した図である。
【図３】脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の構成成分の違いを確認した結果を示した図である。  比較例1：比較例生薬組成物  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物
【図４】脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物および各組成物のポリフェノール画分の抗酸化活性を確認した結果を示した図である。  比較例1：比較例生薬組成物処理群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物処理群
【図５】脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の免疫細胞の活性化の効果を確認した結果を示した図である。  比較例1：比較例生薬組成物処理群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物処理群
【図６】試験管内で脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物のマウス癌細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図である。  比較例1：比較例生薬組成物処理群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物処理群
【図７】試験管内で脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物および各組成物のポリフェノール画分のヒト癌細胞成長抑制効果を確認した結果を示した図である。  比較例1：比較例生薬組成物処理群とそのポリフェノール画分の処理群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物処理群と彼のポリフェノール画分の処理群
【図８】試験管内で脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物および各組成物のポリフェノール画分のヒト正常細胞の成長に及ぼす影響を確認した結果を示した図である。  比較例1：比較例生薬組成物処理群とそのポリフェノール画分の処理群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物処理群とそのポリフェノール画分の処理群
【図９】マウス（mouse）動物モデルで、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の癌細胞の成長抑制効果を確認した結果を示した図である。  対照群：無処理群  水：水投与群  比較例1：比較例生薬組成物投与群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物投与群
【図１０】脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の腎毒性軽減効果を確認した結果を示した図である。  対照群：水投与群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物投与群  BUN：尿素窒素（blood urea nitrogen）  CRE：クレアチニン（creatinine）
【図１１】脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の肝毒性軽減効果を確認した結果を示した図である。  対照群：水投与群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物投与群  AST：アスパラギン酸アミノ転移酵素（aspartate aminotransferase）  ALT：アラニンアミノ転移酵素（alanine aminotransferase）
【図１２】脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物のマウス動物モデルでの放射線に対する再生組織（腸陰窩）の防護効果を確認した結果を示した図である。  対照群：無処理群  放射線照射群：放射線のみ照射した群  IR +比較例1：放射線照射と並行して比較例の生薬組成物を投与した群  IR +実施例1：放射線照射と並行して、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を投与した群  水：水投与群  比較例1：比較例生薬組成物投与群  実施例1：脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物投与群
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３３】
本発明は、下記の工程を含む脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造方法を提供する：
1）当帰(トウキ)（Angelica Radix）、川キュウ (センキュウ)（Cnidium Rhizoma）および芍薬 (シャクヤク)（Paeonia Radix）の混合生薬材からエタノール抽出物を製造する工程、
2）前記工程1）の当帰、川キュウ、および芍薬の混合生薬材から熱水抽出物を製造する工程、
3）前記工程1）のエタノール抽出物の一定分液を工程4）の混合物の製造に使用するために分取して保管しておき、残りのエタノール抽出物一定分液及び前記工程2）の熱水抽出物を混合した後、浸漬して多糖体を収得する工程、および
4）前記の工程3）で分取保管しておいた工程1）のエタノール抽出物の一定分液と前記の工程3）の多糖体を混合する工程。
【００３４】
また、本発明は、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を提供する。
【００３５】
前記の工程1）および2）の当帰、川キュウ、および芍薬は栽培したもの、または市販されているものなど制限なく使用でき、当帰（Angelica gigas Radix）、川キュウ（Cnidium officinale Rhizoma）および芍薬（Paeonia lactiflora Radix ）であることが好ましいが、これに限定されず、前記当帰、川キュウ、および芍薬は葉、茎、根、または花をすべて利用することができる。
【００３６】
前記の工程1）および2）の混合生薬材は、当帰、川キュウ、および芍薬を混合したことを特徴とし、混合比率は、1：0.5〜1.5：0.5〜1.5であり、1：0.8〜1.2：0.8〜1.2であることが好ましく、1：1：1であることがより好ましい。
【００３７】
また、前記工程1）のエタノール抽出物は、10〜50％のエタノールを使用することが好ましく、20〜35％のエタノールを使用することがより好ましい。エタノールは、好ましくは、当帰、川キュウ、および芍薬の混合生薬材重量の5〜20倍、好ましくは10〜15倍、より好ましくは10倍加えて抽出したものであり、前記抽出において抽出時間は1〜5時間であることが好ましく、1〜3時間であることがより好ましく、2時間であることが最も好ましい。抽出時間が1時間未満の場合は抽出物が十分に抽出されず、5時間以上の場合は抽出物が十分に抽出されたにもかかわらず、継続的な加熱により抽出物の変性を引き起こし得る。前記エタノール抽出物は、20〜35％のエタノール水溶液を溶媒として抽出を行うことにより、水溶性ポリフェノールだけでなく、多量の脂溶性ポリフェノールおよび若干の多糖体を含んでいる特徴がある。
【００３８】
また、前記工程2）の熱水抽出物は、水を当帰、川キュウ、および芍薬の混合生薬材重量の2〜20倍、好ましくは5〜15倍、より好ましくは5〜10倍加えて抽出したもので、前記抽出において抽出時間は1〜7時間であることが好ましく、1〜5時間であることがさらに好ましく、本発明の詳細な説明によれば、2〜4時間であることが最も好ましい。抽出時間が1時間未満の場合は抽出物が十分に抽出されず、7時間以上の場合は抽出物が十分に抽出されたにもかかわらず、継続的な加熱により抽出物の変性を引き起こし得る。前記熱水抽出物は、水溶性ポリフェノールおよび多量の多糖体を含んでいる特徴がある。
【００３９】
また、前記工程3）の多糖体は、エタノール抽出物の一定分液および熱水抽出物を混合した後、100％エタノールを添加して、最終的にエタノール80％水溶液の条件で浸漬させて得ることができる。前記浸漬は、エタノール抽出物および熱水抽出物の混合物の量の1〜7倍のエタノールを添加することが好ましく、2〜5倍のエタノールを添加することがより好ましく、本発明の詳細な説明によれば、4倍のエタノールを添加することが最も好ましい。エタノールが混合物の1倍以下で添加する場合は、多糖体を浸漬させるために十分ではなく、7倍以上添加する場合は、必要な量よりも多くの量を使用して経済的な損失が発生することになる。また、前記浸漬は、室温で18〜48時間実行することが好ましく、24時間〜36時間行うことがより好ましく、24時間行うことが最も好ましい。
【００４０】
また、前記工程4）の混合は、多糖体が10〜50重量％で含まれるように混合することが好ましく、20〜40重量％で含まれるように混合することがさらに好ましく、本発明の実施例によれば、30〜35重量％で含まれるように混合することが最も好ましい。最終的に製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物で多糖体成分が10重量％以下である場合は、多糖体成分によって誘導される活性が十分ではなく、50重量％以上である場合は、生薬組成物の様々な活性を示す脂溶性または水溶性ポリフェノールの重量％が低くなり、これによって誘導される活性が十分でないという問題がある。したがって、多糖体成分が30〜35重量％となるように混合した本発明の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物は、脂溶性ポリフェノールだけでなく、水溶性ポリフェノールおよび多糖体によって誘導される活性をすべて有意に示す。
【００４１】
また、前記脂溶性ポリフェノール成分は、ノダケニン（nodakenin）、デカシン（decursin）などからなる群から選択されることが好ましいが、これに限定されない。
【００４２】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは当帰、川キュウ、および芍薬を1：1：1で混合した混合生薬材に30％エタノール水溶液を加えて加熱してエタノール抽出物を製造し、前記抽出物を回収した次に残渣に水を加えて沸騰させて熱水抽出物を製造した。その後、前記エタノール抽出物の一定分液を、最終混合物の製造に使用するために分取して保管しておき、残りのエタノール抽出物一定分液と熱水抽出物を混合/濃縮して、100％エタノールを添加して、最終エタノール80％水溶液の条件で浸漬させて沈殿した多糖体を得た。その後、前記分取保管しておいたエタノール抽出物一定分液と多糖体を混合することにより、本発明の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を製造した。また、前記組成物の成分を分析した結果、ノダケニン、デカシンなど脂溶性ポリフェノール成分が比較例の組成物と比較して大幅に増加したことを確認した（図3及び表1を参照）。
【００４３】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する癌の予防および治療用薬学的組成物を提供する。
【００４４】
また、本発明は、前記生薬組成物を個体に投与する工程を含む癌の予防または治療方法を提供する。
【００４５】
また、本発明は、癌の予防または治療用組成物として使用するための前記生薬組成物の用途を提供する。
【００４６】
前記生薬組成物は、当帰、川キュウ、および芍薬を1：1：1で混合した混合生薬材から抽出したものが好ましく、脂溶性ポリフェノール成分が増加したことを特徴とし、脂溶性ポリフェノールの成分を増加させるために30％エタノール抽出物の一定分液と、残りの30％エタノール抽出物の一定分液および熱水抽出物からエタノール浸漬で収得した多糖体を混合して製造されたもので、ここで最終生薬組成物において多糖体成分が30〜35重量％となるように混合したものが好ましい。
【００４７】
その結果、本発明の生薬組成物は、水溶性および脂溶性ポリフェノールをすべて多量に含有しているエタノール抽出物と多糖体を混合して製造することにより、水溶性ポリフェノール、脂溶性ポリフェノールおよび多糖体を適正な比率ですべて含むようにしたものである。その結果、これらの成分から誘導される、いくつかの有意な活性が一緒に表われることを特徴とする。一方、比較例の組成物は、熱水抽出物を基に製造することで、主に水溶性ポリフェノールおよび多糖体を含むものであって、本発明の組成物と差異がある。
【００４８】
前記癌は、大腸癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、および膵臓癌からなる群から選ばれるいずれか一つであり得るが、これに限定しない。
【００４９】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物をB16マウス黒色腫瘍細胞（melanoma cell）、A549ヒト肺癌細胞およびMDA-MB-231ヒト乳癌細胞に処理したとき、比較例の生薬組成物と比較して、より有意な癌細胞成長抑制効果が表われることを確認することにより（図6及び図7を参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が癌の治療用組成物として使用し得ることを確認した。
【００５０】
本発明の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物は、前記成分に加えて、同じまたは類似の機能を示す有効成分を1種以上添加して使用することができる。
【００５１】
本発明の組成物は、薬剤学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、ここで、薬剤学的に許容可能な添加剤としては、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイダル二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアガム、アルファ化澱粉、トウモロコシ澱粉、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、でん粉グリコール酸ナトリウム、カルナウバ蝋、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール、およびタルクなどを用いることができる。本発明に係る薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物の0.1〜90重量部含むことが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００５２】
すなわち、本発明の組成物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与され得るが、製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、これらの固形製剤は、本発明の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウム炭酸（Calciumcarbonate）、スクロース（Sucrose）、ラクトース（Lactose）またはゼラチンなどを混ぜて調剤することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤およびシロップ剤などが該当するがよく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤を含むことができる。非水性溶剤、懸濁溶剤は、プロピレングリコール（Propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを用いることができる。坐剤の基剤としては、ハードファット（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを用いることができる。
【００５３】
本発明の組成物は、所望の方法に応じて、経口投与するか、非経口投与することができ、非経口投与時の皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式を選択することが好ましい。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
【００５４】
本発明に係る組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵/危険比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、および排出比率、治療期間、同時に用いられる薬物を含む要素およびその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明の組成物は、個別の治療薬として投与するか、他の治療薬と併用して投与することができ、従来の治療剤とは、順次にまたは同時に投与することができ、単一または複数投与することができる。前記した要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定することができる。
【００５５】
具体的には、本発明に係る組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって異なり得、一般的には体重1 kg当たり1ｍｇ〜200ｍｇ、好ましくは10ｍｇ〜200ｍｇを毎日または隔日投与、または1日に1〜3回に分けて投与することができる。しかし投与経路、疾患の重症度、性別、体重、年齢などによって増減し得るので、前記投与量がどのような方法
であっても、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５６】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する癌の予防及び改善用健康機能食品を提供する。
【００５７】
また、本発明は、癌の予防または改善用健康機能食品として使用するための、前記生薬組成物の用途を提供する。
【００５８】
前記生薬組成物は、当帰、川キュウ、および芍薬を1：1：1で混合した混合生薬材から抽出したものが好ましく、脂溶性ポリフェノール成分が増加したことを特徴とし、脂溶性ポリフェノールの成分を増加させるために30％エタノール抽出物の一定分液と、残りの30％エタノール抽出物の一定分液および熱水抽出物からエタノール浸漬で収得した多糖体を混合して製造したもので、ここで最終生薬組成物において多糖体成分が30〜35重量％となるように混合したものが好ましい。
【００５９】
本発明の生薬組成物は、水溶性および脂溶性ポリフェノールをともに多量に含有しているエタノール抽出物と多糖体を混合して製造したもので、特に水溶性ポリフェノール、脂溶性ポリフェノールおよび多糖体を適正な割合で含まれるようにすることで、これらの成分から誘導される、いくつかの有意な活性が一緒に表われることを特徴とする。
【００６０】
前記癌は、大腸癌、胃癌、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、肺癌、子宮癌、結腸癌、膀胱癌、および膵臓癌からなる群から選ばれるいずれか一つであり得るが、これに限定しない。
【００６１】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、本発明の方法で製造した脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物をB16マウス黒色腫瘍細胞（melanoma cell）、A549ヒト肺癌細胞およびMDA-MB-231ヒト乳癌細胞に処理したとき、比較例の生薬組成物と比較して、より有意な癌細胞成長抑制効果が表われることを確認することにより（図6及び図7を参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が癌の予防および改善用健康機能食品として使用できることを確認した。
【００６２】
本発明の健康機能食品は、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物をそのまま使用したり、他の食品や食品成分と一緒に使用することができ、通常の方法によって使用することができる。
【００６３】
前記の健康機能食品の種類に特別な制限はない。前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、通常の意味での健康食品をすべて含む。
【００６４】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖などの単糖類、マルトース、スクロースのような二糖類、およびデキストリン、シクロデキストリンのような多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としてはタウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物100g当たり、一般的に約0.01〜0.04g、好ましくは約0.02〜0.03gである。
【００６５】
前記の他、本発明の健康食品は、色々な栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。その他の天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料、野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は、独立して、または混合して使用することができる。これらの添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の組成物100重量部あたり0.01〜0.1重量部の範囲で選択するのが一般的である。
【００６６】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌補助剤を提供する。
【００６７】
また、本発明は、前記生薬組成物を投与する工程を含む癌の治療効果を促進する方法を提供する。
【００６８】
また、本発明は、抗癌補助剤として使用するための前記生薬組成物の用途を提供する。
【００６９】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を抗癌剤であるシスプラチン（cisplatin）と併用して黒色腫瘍細胞を移植したマウスの動物モデルに処理したとき、比較例の生薬組成物を処理した場合と比較して癌組織の成長がより効果的に抑制されることを確認し（図9参照）、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を抗癌剤投与マウス動物モデルに投与したとき、抗癌剤投与による腎毒性及び肝毒性が軽減されることを確認することで（図10および図11を参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が抗癌補助剤として使用することができることを確認した。
【００７０】
前記本発明の生薬組成物は、抗癌剤の投与前、または投与後に単独で投与することができ、抗癌剤と同時に、癌治療のための補助剤として一緒に投与することができる。本発明の生薬組成物を抗癌補助剤として、抗癌剤と一緒に投与する場合には、患者の状態、白金系抗癌剤の投与量、抗癌剤の投与期間等によって、抗癌剤と適切な割合で一緒に投与することができ、具体的に抗癌剤の総重量に比べて0.01〜10倍で投与することができる。
【００７１】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌治療の副作用防止用薬学的組成物を提供する。
【００７２】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する抗癌治療の副作用防止用健康機能食品を提供する。
【００７３】
また、本発明は、前記生薬組成物を投与する工程を含む抗癌治療による副作用の抑制方法を提供する。
【００７４】
また、本発明は、抗癌治療の副作用防止用薬学的組成物として使用するための前記生薬組成物の用途を提供する。
【００７５】
さらに、本発明は、抗癌治療の副作用防止用健康機能食品として使用するための前記生薬組成物の用途を提供する。
【００７６】
前記抗癌治療の副作用には、抗癌剤の副作用および放射線治療の副作用などが含まれ得る。抗癌剤の副作用とは、抗癌剤によって誘発される毒性をいい、前記抗癌剤は、腎毒性および肝毒性を誘発すると知られているすべての抗癌剤を含む。毒性を誘発する抗癌剤は、白金系抗癌剤であることが好ましく、前記白金系抗癌剤は、シスプラチン（cisplatin
）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）は、ネダプラチン（nedaplatin）及びこれらの混合物からなる群から選ばれたいずれかであり得る。また、前記の副作用は、抗癌剤投与のために、細胞または組織に毒性が発生して誘発されるすべての疾患を含み、本発明の好ましい実施例によれば、前記の毒性は腎毒性または肝毒性であり得る。放射線治療の副作用には、放射線治療に伴う細胞または組織の損傷などが含まれ得、前記の副作用は、本発明の好ましい実施例によれば、再生組織の腸陰窩（intestinal crypt）の消失であり得る。
【００７７】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を抗癌剤投与マウス動物モデルに投与したとき、抗癌剤投与による腎毒性及び肝毒性が軽減されることを確認することで（図10および図11を参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が抗癌治療の副作用防止組成物として使用することができることを確認した。
【００７８】
また、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して、放射線による腸陰窩（intestinal crypt）消失をさらに有意に減少させることを確認することにより（図12及び表2を参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が抗癌放射線治療の副作用防止組成物として使用することができることを確認した。
【００７９】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する免疫機能増強用薬学的組成物を提供する。
【００８０】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する免疫機能増強用健康機能食品を提供する。
【００８１】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して免疫細胞であるリンパ球をさらに有意に活性化させることを確認することで（図5参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が免疫機能増強用組成物として使用することができることを確認した。
【００８２】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する酸化的損傷に対する生体防護用薬学的組成物を提供する。
【００８３】
また、本発明は、本発明の生薬組成物を有効成分として含有する酸化的損傷に対する生体防護用健康機能食品を提供する。
【００８４】
本発明の具体的な実施例では、本発明者らは、本発明の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して、生体高分子に直接酸化的損傷を誘発するヒドロキシラジカル（hydroxyl radical）およびスーパーオキシドアニオン（superoxide anion）消去活性において、より有意な効果を示すことを確認することにより（図4参照）、前記脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が酸化的損傷に対する生体防護用組成物として使用することができることを確認した。
【００８５】
以下、本発明を実施例及び実験例により詳細に説明する。
【００８６】
但し、下記の実施例及び実験例は本発明を例示するものであり、本発明は下記の実施例及び実験例により限定されるものではない。
【００８７】
<実施例1>30％エタノール抽出を通じた脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造
【００８８】
食品原料として食品公典に登載されている生薬材3種、すなわち、当帰（Angelica gigas Nakai）、川キュウ（Cnidium officinale Makino）および芍薬（Paeonia lactiflora Pallas）を陰干して細切にし、同じ重量比で混合した後、前記混合生薬材重量の10倍量の30％エタノールを加え、70℃で2時間沸騰させ、エタノール抽出物を回収した。次に、残りの残渣に前記混合生薬材重量の10倍量の蒸留水を加えて2〜6時間煮沸抽出して熱水抽出物を回収した。前記エタノール抽出物の一定分液を分取して保管し、残りのエタノール抽出物の分液および熱水抽出物を混合して濃縮した後、4倍量の100％エタノールを添加して、最終的に80％エタノール水溶液の条件で24時間室温で静置した後、沈殿物を回収して多糖体分画物を準備した。そして、前記保管した30％エタノール抽出物の一定分液と多糖体分画物を混合して、最終的な混合物で多糖体成分が30〜35重量％となるようにした脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物（以下、「脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物」と表記する）を製造した。本組成物の製造において、最終的な混合物中の多糖体成分が30〜35重量％になるように、前記エタノール抽出物の一定分液の量を決定することが好ましい。
【００８９】
脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の製造工程を図1に示した（図1）。
【００９０】
<比較例>熱水抽出による生薬組成物の製造
【００９１】
食品原料として食品公典に登載されている生薬材3種、すなわち、当帰（Angelica gigas Nakai）、川キュウ（Cnidium officinale Makino）および芍薬（Paeonia lactiflora Pallas）を陰干して細切にし、同じ重量比で混合した後、前記混合生薬材重量の10倍量の蒸留水を加えて8〜10時間煮沸抽出して熱水抽出物を準備した。前記熱水抽出物の1/4〜2/3は保管し、残りの1/3〜3/4にエタノールを添加して、80％エタノール水溶液の条件で一晩中、室温（5〜15℃）に静置した後、沈殿物を回収して多糖体分画物を準備した。そして、前記保管した熱水抽出物に多糖体分画物を混合して多糖体成分が30〜40重量％となるようにした組成物、すなわち、熱水抽出による生薬組成物（以下、「比較例生薬組成物」と表記する）を製造した。
【００９２】
比較例生薬組成物の製造工程を図2に示した（図2）。
【００９３】
<実施例2>脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の構成成分比較
【００９４】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造した生薬組成物の抽出及び製造方法の違いによる成分を比較するためにHPLCフィンガープリント分析（HPLC fingerprinting analysis）を行なった。
【００９５】
詳細には、各試料の水溶液に4倍量の100％エタノールを加えて12時間4℃で静置した後、4000×gで10分間遠心分離して上澄み液であるポリフェノール層画分を得た。その後、各試料のポリフェノール層画分を減圧濃縮して、50ｍｇ/ｍｌ濃度の試料を得てHPLCフィンガープリント分析を行った。まず、濃縮された試料を濾過（0.45μｍ、PTFEフィルター）した後、HPLCに10μｌ投入した。分析には、LC-20A HPLC（Shimadzu、日本）を使用し、C18-PAQ（Cosmosil社、日本）カラムを用いて、移動相（0.1％formic acid水溶液および100％MeCN（Acetonitrile; CH3CN）の濃度勾配（gradient）に基づいて成分を分離し、230nm波長の検出器（detector）で各成分のピークを検出し、フィンガープリンティンググラフ（fingerprinting graph）を得た。次に、各指標成分を定量するために、没食子酸
（gallic acid）、クロロゲン酸（chlorogenic acid）、アルビフロリン（albiflorin）、ペオニフロリン（paeoniflorin）、安息香酸（benzoic acid）、ノダケニン（nodakenin）、デカシン（decursin）それぞれを4.5〜900ｍｇ/ｍｌ範囲の濃度で50％メタノール水溶液に溶解させた溶液を使用して 標準検量線を作成した後、フィンガープリンティンググラフ上の各成分のピーク面積を計算し、その含有量を算定した。
【００９６】
その結果、図3および表1に示すように、比較例の生薬組成物と比較して脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物で脂溶性ポリフェノール成分が著しく増加し、特にデカシン（decursin）の量が著しくに増加することにより、当帰、川キュウ、および芍薬の混合生薬材から製造された生薬組成物が抽出溶媒と抽出方法に応じて、その成分の含有量の差が著しいことを確認した。具体的には、デカシンが約9倍に増加し、ノダケニンが1.2倍に増加しており、そのほかにも、図3に矢印で表示した、少なくとも7種類以上の様々な成分が顕著に増加したことを確認した（表1および図3）。
【００９７】
すなわち<実施例1>の生薬組成物は、エタノール抽出物を使用することで<比較例1>の熱水抽出物を使用したものと比較して、脂溶性ポリフェノール成分を著しく多く含ようになった。
【００９８】
【表１】
0006581721.tif 000002
【００９９】
<実験例1>脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の抗酸化活性確認
【０１００】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の抗酸化活性を比較分析するために、DNA、タンパク質、脂質など生体高分子に直接損傷を誘発するヒドロキシラジカル（hydroxyl radical）、およびスーパーオキシドアニオン（superoxide anion）消去活性を確認するために、次のような実験を行った。
【０１０１】
詳細には、ヒドロキシラジカル消去活性測定のために、試験管で0.2mM FeCl3 0.1ｍｌ、0.1mM EDTA、0.1ｍｌ、10mM 2-デオキシリボース（2-deoxyribose）0.1ｍｌおよび0.1mMアスコルビン酸（ascorbic acid）0.1ｍｌを混合し、試料として、各濃度の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物または各生薬組成物のポリフェノール分画物0.05ｍｌと、0.1 Mリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）（pH7.4）0.45ｍｌを加え、10mM H2O2 0.2ｍｌを加えて反応を開始させた。37℃の恒温水槽で1時間反応させた後、5％TCA（trichloroacetic acid）溶液0.5ｍｌを加えて反応を停止させて、1％TBA（2-thiobarbituric acid）溶液0.5ｍｌを加えて、100℃で10分間重蕩した後、冷却させた。その後、UV-分光光度計（Shimadzu UV-1201、Japan）を用いて、532nmで吸光度を測定した。ヒドロキシラジカル消去活性は、試料添加群と無添加群の吸光度の差を、以下の[数1]に基づいて計算してパーセントで示した。
【０１０２】
【数１】
0006581721.tif 000003
【０１０３】
ＡＯ：試料とH2O2を添加していない陰性対照群の吸光度
ＡＣ：試料を添加していないH2O2処理対照群の吸光度
ＡＳ：試料を添加した H2O2処理群の吸光度
【０１０４】
その結果、図4Aに示すように、ヒドロキシラジカル消去活性の測定結果、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して、約1.4〜1.9倍高いヒドロキシラジカル消去活性を示すことを確認した（図4A）。一方、各生薬組成物のポリフェノール分画物の活性を測定した結果、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成
物のポリフェノール分画物が比較例の生薬組成物のポリフェノール分画物に比べて約2.5倍以上の著しく高いヒドロキシラジカル消去活性を示すことを確認することにより、脂溶性ポリフェノール成分の増加が、ラジカル消去活性を高めることに主要であることを立証した。ヒドロキシラジカルは、放射線によって水の分子が分割しながら多量に発生するもので、前記の実験結果を通じて、本発明の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、前記ヒドロキシラジカルを著しく消去することにより、放射線損傷防護に有意な活性を示し得ることを知ることができる。
【０１０５】
また、スーパーオキシドアニオン（superoxide anion）消去活性を測定するために、試験管で10mU/ｍｌのキサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase）を含む100mMリン酸ナトリウム（sodium phosphate）（pH 7.4）、50μｌに、試料として、各濃度の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物または各生薬組成物のポリフェノール分画物5μｌと、CCK-8（Dojindo Molecular Technologies、Rockville、ML、米国）5μｌを添加混合して1分間室温で安定化させ、ここに2.5mMキサンチン（xanthine）溶液40μｌを添加し混合して反応を開始させた。反応開始直後と反応開始20分後にそれぞれ450nmで吸光度を測定して吸光度の変化量を計算した。スーパーオキシドアニオン消去活性は、試料添加群と無添加群の吸光度変化量の差を、以下の[数2]に基づいて計算してパーセントで示した。
【０１０６】
【数２】
0006581721.tif 000004
【０１０７】
ＡＯ：試料およびキサンチンを添加していない陰性対照群の吸光度変化量
ＡＣ：試料を添加していないキサンチン処理対照群の吸光度変化量
ＡＳ：試料を添加したキサンチン処理群の吸光度変化量
【０１０８】
その結果、図4Bに示すように、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物がスーパーオキシドアニオン消去活性においても、比較例の生薬組成物と比較して類似またはそれ以上の活性を示すこと（図4B）、本発明の脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、十分な抗酸化活性を示すことを確認した。一方、各生薬組成物のポリフェノール分画物の活性を測定した結果、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物のポリフェノール分画物が比較例の生薬組成物のポリフェノール分画物に比べて約1.6倍以上の著しく高いスーパーオキシドアニオン消去活性を示すことを確認することにより、脂溶性ポリフェノール成分の増加がスーパーオキシドアニオン消去活性を高めることにおいて主要であることを立証した。
【０１０９】
<実験例2>脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の免疫細胞活性化効果確認
【０１１０】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の免疫細胞の活性化効果を確認するために脾臓から分離した免疫細胞（リンパ球）に試料を処理した後、免疫細胞の活性化を測定した。免疫細胞が活性化されると、細胞の代謝が増幅されて細胞が増殖することになるが、免疫細胞の増殖をCCK-8試薬（Dojindo Molecular Technologies、Rockville、ML、米国）を用いた吸光度分析法で測定した。
【０１１１】
詳細には、マウスから脾臓を無菌的に摘出して脾臓細胞を分離した後、Tris-NH4Cl溶液を用いて赤血球を除去し、HBSSで2回洗浄して細胞数を測定した後、脾臓リンパ球を準備した。脾臓リンパ球を、96-well培養皿に各ウェル（well）当たり2×105細胞/0.2ｍｌずつ分注して、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物または比較例の生薬組成物の試料を濃度別に添加した後、3日間培養した。培養後、CCK-8試薬を各ウェル当り10μｌずつ処理し、4時間さらに培養した後、450nm（ref.650nm）で吸光度を測定して、各試料
による脾臓リンパ球の増殖能を評価した。
【０１１２】
その結果、図5に示すように、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して有意に高い免疫細胞活性化効果を示すことを直接的に確認した（図5）。
【０１１３】
<実験例3>試験管で脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の癌細胞成長抑制効果を確認
【０１１４】
<3-1>細胞培養モデルで、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の癌細胞成長抑制効果を確認
【０１１５】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造した脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の多様な癌細胞成長抑制効果を確認するためにB16黒色腫瘍細胞（melanoma cell）、A549ヒト肺癌細胞、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞の成長抑制効果を次のように確認した。
【０１１６】
詳細には、B16マウス黒色腫瘍細胞を96ウェルプレート（96-well plate）にウェル当り5×104個の細胞になるように分注して、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物または比較例の生薬組成物を、それぞれ50、100、200、および500μｇ/ｍｌになるように処理して、合計の培養液体積が200μｌになるようにした後、細胞培養器で培養した。培養48時間後、各ウェルにCCK-8溶液10μｌを添加した後、4時間さらに培養して、450nmで吸光度を測定して、細胞の生存度を確認した。
【０１１７】
また、A549ヒト肺癌細胞およびMDA-MB-231ヒト乳癌細胞の場合には、96ウェルプレート（96-well plate）に細胞を分注し、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物、または各組成物のポリフェノール画分をそれぞれ125、250、および500μｇ/ｍｌになるように処理して、合計の培養液体積が200μｌになるようにした後、細胞培養器で培養した。各細胞の異なる増殖速度を考慮して、試料処理後、細胞が2回ほど分裂後の細胞の生存を測定するため、A549細胞は、培養48時間後に、MDA-MB-231細胞は、培養72時間後に、各ウェルにMTT（Sigma-Aldrich Co.,St. Louis,MO,米国）溶液（5mg/ml）20μlを添加した後、2時間培養した。培養液を除去した後、各ウェルにジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide; DMSO）200μlを添加して攪拌した後565nmで吸光度を測定して、細胞の生存度を確認した。
【０１１８】
その結果、図6に示すようにB16マウス黒色腫瘍細胞で脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、比較例の生薬組成物と比較して高い癌細胞成長抑制活性を示した。特に、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、比較例の生薬組成物と比較して200μｇ/ｍｌ濃度で1.5倍、500μｇ/ｍｌ濃度では約1.7倍高い癌細胞成長抑制活性を示した（図6）。 
【０１１９】
また、図7に示すように、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して、ヒトの癌細胞であるA549肺癌細胞とMDA-MB-231乳癌細胞に対して、より高い成長阻害活性を示した。特に、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、比較例の生薬組成物と比較してA549肺癌細胞では、125μg/ｍl濃度で1.7倍、250μg/ｍl濃度で1.5倍より高い癌細胞成長抑制活性を示し、MDA-MB-231乳癌細胞では125μg/ｍl濃度で3.0倍、250μg/ｍl濃度で1.4倍より高い癌細胞成長抑制活性を示した（図7）。一方、各生薬組成物のポリフェノール分画物の活性を測定した結果、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物のポリフェノール分画物が、比較例の生薬組成物のポリフェノール分画物と比較してA549肺癌細胞では、250μｇ/ｍｌ濃度で3.5倍、MDA-MB-231乳癌
細胞では250μｇ/ｍｌ濃度で1.7倍と、著しく高い癌細胞成長抑制活性を示すことを確認することにより（図7）、脂溶性ポリフェノール成分の増加が、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の癌細胞成長抑制活性を高めるにおいて主要であることを立証した。
【０１２０】
前記から、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の組成物と比較してマウスおよびヒト癌細胞に対してより高い成長抑制効果を示すことを確認した。
【０１２１】
<3-2>細胞培養モデルで、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の正常細胞成長に及ぼす影響を確認
【０１２２】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物が、正常細胞の成長に及ぼす影響を確認するためにIMR-90ヒト肺繊維芽細胞成長に及ぼす影響を、次のような方法で確認した。
【０１２３】
詳細には、IMR-90ヒト肺線維芽細胞を96ウェルプレート（96-well plate）に分注し、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物、比較例の生薬組成物および各組成物のポリフェノール画分をそれぞれ125、250、および500μｇ/ｍｌになるように処理して、合計の培養液体積が200μｌになるようにした後、細胞培養器で培養した。細胞が2回ほど分裂後の細胞の生存を測定するため、培養48時間後に、各ウェルにMTT（Sigma-Aldrich Co.,St. Louis,MO,米国）溶液（5mg/ｍｌ）20μｌを添加した後、2時間培養した。培養液を除去した後、各ウェルにジメチルスルホキシド（dimethylsulfoxide; DMSO）200μｌを添加して攪拌した後565nmで吸光度を測定して、細胞の生存度を確認した。
【０１２４】
その結果、図8に示すように、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物は、各組成物のポリフェノール画分が、正常細胞であるIMR-90ヒト肺線維芽細胞の成長に大きな影響を示しておらず、組成物間の、または組成物のポリフェノール分画物間の有意な差異は観察されなかった。
【０１２５】
前記したように、正常細胞の成長に及ぼす影響（図8）と癌細胞成長抑制効果（図6および7）を観察した結果から、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物は、正常細胞に比べて癌細胞に選択的より高い成長抑制効果を示すことを確認した。
【０１２６】
<実験例4>動物モデルで、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の癌組織の成長抑制効果を確認
【０１２７】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造した脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物の生体内癌細胞の成長抑制効果を確認するために、マウスの癌細胞あるB16F10黒色腫瘍細胞を移植した後、移植した癌組織の成長抑制効果を、以下のような方法で確認した。
【０１２８】
詳細には、7週齢のC57BL/6マウスに5×105個のB16F10黒色腫瘍細胞を左大腿部皮下に移植し、移植後2日目から最後に犠牲にさせる前日まで脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物または比較例の生薬組成物を毎日100ｍｇ/ｋｇの容量で強制経口投与した。また、黒色腫瘍細胞移植後3、10、および17日目に広く用いられている抗癌剤であるシスプラチン（cisplatin）を4ｍｇ/ｋｇの容量で腹腔注射し、生薬組成物と併用処理した後、黒色腫瘍細胞移植後20日目にマウスを犠牲にして、腫瘍を摘出して重量を測定した。
【０１２９】
その結果、図9に示すようにシスプラチンと併用して脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を処理したとき、シスプラチンのみを処理した群と比較して腫瘍の成長が
35.2％抑制され、比較例の生薬組成物を併用処理したときには腫瘍の成長抑制率が25.3％であった。この結果は、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、比較例の生薬組成物と比較して約1.39倍増加した有意な癌組織の成長抑制効果があることを示したものである（図9）。
【０１３０】
<実験例5>抗癌剤投与マウスモデルで脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の腎臓および肝毒性軽減効果を確認
【０１３１】
前記<実施例1>の方法で製造された脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、抗癌剤を投与したマウスモデルで腎毒性および肝毒性に対して軽減効果を示すことを確認するために、次のように組織学的分析と血清生化学的分析を行った。
【０１３２】
詳細には、7週齢のICRマウスに、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物を20日間毎日100ｍｇ/ｋｇの容量で強制経口投与した。生薬組成物の投与を開始した後3、4、9、10、15、および16日目に抗癌剤であるシスプラチンを3ｍｇ/ｋｇ容量で腹腔注射した。生薬組成物の投与終了後24時間後にマウスを犠牲にして、組織学的分析と血清生化学的分析を行った。組織学的評価のためにマウスから腎臓および肝臓を摘出し、10％中性ホルマリン液に固定し、固定した組織は、通常の方法によってパラフィンに包埋し、切片を作製し、ヘマトトキシリン・エオシン（hematoxylin＆eosin ）染色を実施して、顕微鏡検査を実施した。血清学的評価のためにマウスの眼窩静脈から血液を採取し、採取した血液から血清を分離して測定するまで-70℃で保管した後、AU400自動分析装置（Olympus、日本）を用いた血清生化学的分析を実施した。分析指標としては、腎毒性指標であるBUN（blood urea nitrogen）およびクレアチニン（creatinine,CRE）、肝毒性指標であるAST（aspartate aminotransferase）とALT（alanine aminotransferase）を選定して分析した。
【０１３３】
その結果、図10に示すようにシスプラチンの投与による腎組織（糸球体など）の損傷、および腎毒性血清生化学指標であるBUN（blood urea nitrogen）およびクレアチニン（creatinine,CRE）の増加が、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の投与によって通常のレベルに著しく減少したことを確認した（図10）。
【０１３４】
また、図11に示すようにシスプラチンの投与による肝毒性血清生化学指標であるAST（aspartate aminotransferase）およびALT（alanine aminotransferase）の増加が、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の投与によって通常のレベルに減少したことを確認した（図11）。
【０１３５】
前記から、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が、シスプラチンによって発生する可能性のある腎毒性および肝毒性を軽減させることから、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が抗癌剤治療の副作用防止組成物として有用に使用することができることを確認した。
【０１３６】
<実験例6>マウス動物モデルで、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物の放射線防護効果を確認
【０１３７】
前記<実施例1>または<比較例1>のそれぞれの方法で製造した脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物が、マウスの動物モデルで放射線防護効果を示すかどうかを確認するために中間高容量の放射線が照射されたマウスの腸陰窩（intestinal crypt）消失を下記のような方法で確認した。
【０１３８】
詳細には、ICRマウスに、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物および比較例の生薬組成物を100ｍｇ/ｋｇ容量で放射線照射の3日前から照射の3日後まで、強制的に
経口投与し、放射線はガンマ線を12Gy容量で全身照射した。放射線照射後3.5日にマウスを犠牲にして小腸部位を摘出し、各マウス当たり8〜10個の小腸片を切り取って、通常の方法によってパラフィン包埋し、切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色を実施した。各マウスごとに8つの縦切りされた小腸標本の端に位置する腸陰窩の数を光学顕微鏡で測定し、実験群別の平均と偏差を算定した。
【０１３９】
その結果、表2及び図12に示すように、放射線を照射したマウスの動物モデルで生存した腸陰窩の数は、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物投与群で比較例の生薬組成物投与群と比較して約1.3倍（有意性p <0.001）高かった。この結果は、脂溶性ポリフェノール成分が増加した生薬組成物が比較例の生薬組成物と比較して、より有意な放射線防護効果があることを直接的に確認したものである（表2及び図12）。
【０１４０】
【表２】
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【０１４１】
1）各実験群当りICRマウス数は8匹（n=8）。
**比較例生薬組成物投与群と比較して有意な増加が見られた、p <0.001。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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