(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能なヒドロキシアルキルキトサン感熱応答性高分子と細胞を、ヒドロキシアルキルキトサン感熱応答性高分子濃度が最大で１０ｗｔ％の濃度となるように、細胞濃度が１ｘ１０７個／ｍＬ〜１０８個／ｍＬとなるように混合し、４〜３７℃の温度範囲の低温側で感熱応答性高分子が溶解した細胞含有高分子ゾル溶液を調製する工程、
該細胞含有高分子ゾル溶液を使用し、４〜３７℃の温度範囲の高温側温度で、所望の立体構造を有する細胞含有高分子溶液のゲルを形成する工程、
細胞を該ゲル中で培養することにより細胞の立体構造体を形成する工程、および
該細胞含有高分子溶液のゲルを４〜３７℃の温度範囲の低温側温度でゾル化し感熱応答性高分子溶液と形成された細胞の立体構造体を分離する工程、
を含むことを特徴とする、所望の立体構造を有する、生きた細胞の立体構造体の製造方法。
【請求項２】
所望の立体構造を有する細胞含有高分子溶液のゲルを、インクジェットプリンタまたは３Dプリンタを使用して形成する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
アルキルが、炭素数Ｃ１〜Ｃ５である請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
感熱応答性高分子が、ヒドロキシブチルキトサンである、請求項１〜３いずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の立体構造を有する、生きた細胞の立体構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を含んだまま、マトリックスを三次元（3D）造形する手法としては、例えば、富山大の中村らが細胞を含むアルギン酸−カルシウムイオンゲルの積層造形について報告している（例えば、非特許文献１）。【０００３】
アルギン酸−カルシウムイオンゲルは、細胞を内包可能なハイドロゲルとして知られており、生体適合性を有し、ゲル化速度も速い。しかし、アルギン酸カルシウムイオンゲルの細胞接着性は低く、また生分解性も低いため、作製した組織・臓器の機能は非常に低い。【０００４】
細胞を含んだままマトリックスを3D造形する従来の手法は、(i)造形物から足場材料が除去できない、(ii)作製した細胞・組織が機能しない、といった問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】[K. Arai et al., Biofabrication 2011, 3, 034113.]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、足場材料を容易に除去可能であり、製造した立体組織が機能を発現でき、所望の立体構造を有する、生きた細胞の立体構造体の製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能な感熱応答性高分子と細胞を混合し、感熱応答性高分子が溶解した細胞含有高分子溶液を調製する工程、
該細胞含有高分子溶液を使用し、所望の立体構造を有する細胞含有高分子溶液のゲルを形成する工程、
細胞を該ゲル中で培養することにより細胞の立体構造体を形成する工程、および
該細胞含有高分子溶液のゲルをゾル化し感熱応答性高分子溶液と形成された細胞の立体構造体を分離する工程、
を含むことを特徴とする、所望の立体構造を有する、細胞の立体構造体の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞の立体構造体の製造方法に従うと、不要になった足場材料（高分子溶液）を細胞を傷めず溶解除去するので、安全にしかも生きた細胞組織の立体構造体を、所望の立体構造に構築が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】HBC水溶液のゾル化・ゲル化の可逆性を説明するための図。
【図２】細胞を含む状態でのHBCの感熱応答ゾル-ゲル転移の様子を説明するための図。
【図３−１】実施例で得られたゲル−細胞複合体のハート形立体構造体の上方からの写真。
【図３−２】実施例で得られた細胞のハート形立体構造体の上方からの写真。
【図３−３】実施例で得られた細胞のハート形立体構造体の側面からの写真。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の製造方法に於いては、まず、４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能な感熱応答性高分子と細胞を混合し、感熱応答性高分子が溶解した細胞含有高分子溶液を調製する。
感熱応答性高分子は種々の高分子、例えば、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）等の合成高分子、キトサン・セルロース等の水溶性生体高分子を疎水化した両親媒性高分子等が知られているが、本発明においては、それらの中でも、生体適合性、生分解性、細胞接着性、細胞増殖性およびそれらの特性の２つ以上に優れた感熱応答性高分子を使用するようにする。
【００１１】
本発明においては、種々知られている感熱応答性高分子の中でも、４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能な溶液を調製できる高分子を使用する。
【００１２】
本発明において、「ゾル」とは、溶液、液状物、高分子が溶解・分散した水溶液、液体、液体状という意味で使用している。また、本発明において、「ゲル」とは、流動性を失い、立体的構造を維持できる程度にゼリー状に固化したもの、固体という意味で使用している。
【００１３】
感熱応答性高分子の分子量、溶液濃度、溶液種類等を調整することにより、４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能な溶液（細胞へ使うため基本的には水溶液・水分散液）を調製できるのであれば、その高分子は、本発明における感熱応答性高分子として使用できる。
【００１４】
本発明於いて、「４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能」とは、４〜３７℃の温度範囲の低温側でゾルを形成し、高温側でゲルを形成する、または４〜３７℃の温度範囲の低温側でゲルを形成し、高温側でゾルを形成することを意味しているが、細胞培養環境が37℃であることを考慮すれば、４〜３７℃の温度範囲の低温側、好ましくは生体温度より低い温度でゾルを形成し、高温側、好ましくは生体温度でゲルを形成することのできる感熱高分子が望ましい。
【００１５】
上記観点から、本発明において好ましく使用できる「４〜３７℃でゾル―ゲル転移が可能な感熱応答性高分子」として、生体由来のキトサンを化学的に修飾した誘導体、中でもヒドロキシアルキルキトサン、特にアルキル基が炭素数Ｃ１〜Ｃ５，好ましくはＣ２〜Ｃ４、より好ましくはヒドロキシブチルキトサンが例示できる。
【００１６】
上記例示の感熱性高分子は、すでによく知られた物質であり、当業者であれば、技術常識的に、製造、入手可能な物質である。例えば、ヒドロキシアルキルキトサンの合成方法は、例えば、US特許第4931271号、特開平6-65305号公報等を参照することができる。
【００１７】
本発明で使用できる細胞は、特に限定されず、例えば、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、心筋細胞等が使用可能である。
【００１８】
細胞は、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン等、すでに知られているコーティング剤、コーティング方法でコーティングされていてもよい。
【００１９】
本発明においては、上記感熱応答性高分子と細胞とを混合し、細胞含有高分子溶液を調製する。混合は、細胞含有高分子溶液がゾル（液体もしくは液体状）の相中で行う。ヒドロキシアルキルキトサン感熱応答性高分子は、４〜３７℃の低温側において溶液中に溶解した状態で存在する。感熱応答性高分子を溶解させる溶液は、通常の細胞培養溶液、例えば、(1x107個/mLの濃度で細胞を懸濁させた、10%血清を含むダルベッコ改変イーグル培地）等が使用される。
【００２０】
細胞含有高分子溶液における感熱応答性高分子の濃度は、最大１０ｗｔ％までの範囲で調整可能であるが、より低濃度（１〜３ｗｔ％）で用いるのが適当である。この高分子濃度が高すぎると、ゲル化に要する時間が短くなるが、ゲル内の含水率が低くなり、細胞へのダメージが危惧されるだけでなく、ゾル化に要する時間が長くなる。一方で、この高分子濃度が低すぎると、ゲル化に要する時間が長くなるだけでなく、ゲルの強度が低下する。
【００２１】
細胞含有高分子溶液における細胞の濃度は、最大2x107個/m〜108個/mLくらいまでの、より高濃度で用いるようにすればよい。この細胞濃度が低すぎると、細胞間の接着が起こり難く、組織化に長い時間を要してしまう。また、細胞間の接着により、3D組織のより長い安定性も期待できる。
【００２２】
細胞含有高分子溶液には、内包した細胞が安定して接着・増殖できる環境を与えるために、フィブロネクチン、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、エラスチン、マトリゲル等の細胞外マトリックス成分、線維芽細胞増殖因子や血小板由来成長因子等の細胞増殖因子、その他、血管内皮細胞やリンパ管内皮細胞、各種幹細胞等の添加剤を含ませてもよい。
【００２３】
次に、本発明においては、上記で調製した細胞含有高分子溶液を使用し、所望の立体構造を有する細胞含有高分子溶液のゲルを形成する。
【００２４】
所望の立体構造を有する細胞含有高分子溶液のゲルを形成する方法は、特に限定されない。例えば、所望の立体構造を有する空間に、細胞含有高分子溶液をゾル（液体もしくは液体状）の状態で流し込み、該細胞含有高分子溶液がゲルを形成する温度に調整することにより行うことができる。
【００２５】
インクジェットプリンタ、３Dプリンタを使用して、所望の立体構造を有する細胞含有高分子溶液のゲルを形成することも可能である。
【００２６】
インクジェットプリンタの場合、低温で冷却した細胞含有高分子溶液をインクジェット技術等のノズルから室温〜細胞培養温度（37度）の環境に吐出する。吐出の過程で、高分子溶液が温度に応答してゲル化する。これを連続的に積層造形することにより、望みの立体構造を有する三次元造形物(ゲル）が構築できる。本発明においては、高分子溶液に細胞を分散させているので、細胞を含んだ三次元造形物（三次元組織・臓器）が構築可能であり、望みの位置に望みの細胞密度で造形することが可能である。
【００２７】
３Dプリンタを使用して、インクジェットプリンタと同様にして細胞の立体構造体を作製することができる。３Dプリンタは、インクジェットプリンタよりもさらに、所望の立体構造を有する、立体的なゲル、細胞の立体構造体を作製するのに適している。
【００２８】
2009年の米3D Systems社の光造形特許の権利期間満了に伴い、低価格の3Dプリンタが研究者のみならず一般家庭でも利用可能になりつつある。
【００２９】
3Dプリンタの技術そのものはUVや熱により硬化する樹脂を連続的に積層させるものであるが、その単純さ故に幅広い分野への波及が期待されている。
【００３０】
米国では、3Dプリンティング技術を用いた研究プロジェクトのために10億ドルの拠出を計画しており、今後数年の間に各分野における開発競争が激化することが容易に想像される。
【００３１】
このような背景の下、再生医療分野において3Dプリンティング技術による三次元組織・臓器の印刷技術の開発が注目を集めている。上述のように、3Dプリンティング技術は熱やUVで急速に硬化する樹脂を連続的に積層造形する技術であり、それらの樹脂はバイオ用途で開発されたものではない（完全な毒である）。
【００３２】
そこで、従来技術でも述べたが、富山大の中村らを始めとした多くの研究者が、細胞を内包可能なハイドロゲルとしても有名な、生体適合性を有し、急速に硬化するアルギン酸-カルシウムイオンゲルを用いた研究を進めているが（例えば、非特許文献１）、アルギン酸ゲルの細胞接着性は低く、また生分解性も低いため、作製した組織・臓器の機能は非常に低くなってしまう。
しかしながら、使いやすさ故に、3Dバイオプリンティングに関する研究の大半はこのゲルを用いているのが現状である。
【００３３】
一方で、サイヒューズの3Dニードル技術、米Organovoの3Dバイオプリンティング技術等の細胞のみを用いた3Dプリンティング技術の開発も進められているが、細胞のみでは臓器のような3D構造を造形することは極めて困難であり、また組織作製に多大な時間がかかってしまう。
【００３４】
また、生体材料分野においても、多様な3Dプリンティング技術（三次元光造形技術, Rapid Prototyping, Rapid Manufacturing, Direct Writingとも呼ばれる）を用い、構造が精密に制御された足場材料の構築が検討されてきたが、細胞接着性の無いポリエチレングリコール（PEG）を架橋させたハイドロゲルや室温で成型できないポリ乳酸等の利用に限られる。
【００３５】
本発明は、全く新規な細胞の立体構造体の製造方法であり、該方法には、３Dプリンタ、インクジェットプリンタを適用可能であり、上記のような問題を有することなく、細胞の立体構造体を作製することができる。
【００３６】
次に、細胞を得られた細胞含有高分子溶液のゲル中で培養する。本工程においては、立体構造のゲルの中に分散した細胞の培養を行う。そうすることにより、細胞がゲル中で接着・伸展および/または増殖して、ゲル中で細胞の立体構造体が形成される。「細胞の立体構造体」とは、単に細胞膜（層）をラミネートして層を積み重ねたものではなく、３次元空間に任意の、すなわち所望の形状を持たせた細胞の凝集体あるいは塊である細胞の三次元組織を意味している。
【００３７】
培養の条件、例えば、感熱応答性高分子の濃度、細胞濃度、作製するゲルの形状や厚み等により、培養時間が異なってくるが、それらの条件は、所望する細胞の立体構造体により適宜設定変更するようにすればよい。
【００３８】
次に、該細胞含有高分子溶液のゲルをゾル化し、感熱応答性高分子溶液と形成された細胞の立体構造体を分離する。分離は、感熱応答性高分子溶液のゾルを溶解等して細胞から洗い流せて、細胞を死滅させない溶液、例えば、細胞含有高分子溶液の調製の際に使用した感熱応答性高分子を溶解させる溶液、例えば細胞培養培液等を使用して行うようにすればよい。
【００３９】
分離された細胞の立体構造体は、さらに冷却した培地等を用いて繰り返し洗浄してもよい。
【００４０】
感熱性高分子としてヒドロキシブチルキトサンを使用している場合、形成したゲルは、4〜10℃に冷却することにより、ゾル化し、流動性の高い溶液に戻るため、細胞を傷つけることなく、所望した細胞の立体構造体を得ることができる。
このように、本発明の製造方法は、足場材料を容易に除去可能である。
【００４１】
培養後、細胞含有高分子溶液のゲルを、冷却操作により細胞と高分子溶液とを分離して得られる細胞の立体構造体は、生きた細胞の立体構造体である。
【００４２】
本発明に従えば、細胞のバイアビリティ(細胞をゲルから分離する前とゲルから分離した後の生きている細胞の割合）が、７５％以上、より高くは８５％以上で生きた細胞の立体構造体を得ることができる。さらに、細胞のバイアビリティが、９０％以上、より高くは９５％以上で、細胞の所望の立体構造体を得ることが技術的に可能であることは当業者であれば容易に理解できるであろう。
【００４３】
本発明により得られる細胞の立体構造体は、各臓器・組織に適した細胞・タンパク質等を利用することで、薬剤評価試験や再生医療分野への応用が期待される。
【００４４】
[実施例]
ヒドロキシブチルキトサン（HBC）の合成
反応容器にキトサン5.0 gを50 wt%水酸化カリウム水溶液中で6時間撹拌し、上澄み液をデカンテーションにより除去した。超純水200 mLと1,2-ブチレンオキシド30 mLを加え、80℃で6時間撹拌した。この時点で、部分的にヒドロキシブチル基で修飾されたキトサンが溶液中に分散した白濁溶液が得られる。濃塩酸を用いて固体を溶解させ、1,2-ブチレンオキシド30 mLを加えて80度で6時間撹拌した。反応後、反応溶液を80度の熱水に滴下することで、ヒドロキシブチルキトサン（HBC）を精製・回収した。キトサンへのヒドロキシブチル基の導入率は、グルコサミン1ユニット当たり2.5分子であった。
【００４５】
HBCの感熱応答ゾル-ゲル転移
2.0 wt% HBC水溶液のゾル化−ゲル化の可逆性を説明するための図を図１に示した。
2.0 wt% HBC水溶液を、4℃から37℃の水浴へ、また37℃から4℃の水浴へ加熱・冷却を繰り返し行うことにより、可逆的転移（ゾル-ゲル転移）を確認した。この加熱・冷却サイクルを50回行ったが、その可逆性は変わらなかった。
濃度を変えて、上記のサイクルを行いゾル-ゲル転移を確認したところ、濃度1.5〜5.0 wt%のHBC溶液で同様にゾル・ゲル転移が可逆的に起こることが確かめられた。
【００４６】
細胞を含む状態でのHBCの感熱応答ゾル-ゲル転移
細胞を含む状態でのHBCの感熱応答ゾル-ゲル転移の様子を説明するための図を図２に示した。
ヒト線維芽細胞を用いて、予めセルトラッカーグリーンで染色した細胞を内包したゲルの作製を行った。HBCを3.0 wt%で細胞培養液(ウシ胎児血清10%含むダルベッコ改変イーグル培地）に分散させ、冷蔵庫(4℃）で一晩放置することでHBCを溶解させた。
該HBC水溶液に、ヒト線維芽細胞を1x107個/ｍｌの濃度で分散させた。
HBCのゲル化は非常に速いため、ガラス基板を予め37℃に温めておくことで、容易に望みの形状のゲル（図２左上、「ＡＫＡＳＨＩ」のゲル文字）を描くことができた。作製したゲルの一部を蛍光観察したところ、細胞が安定かつ極めて高密度でゲル内に保持されていることが確認できた（図２左下）。
ゲルを作製して3時間後に、そのゲルを4℃で冷やした細胞培養液に移すと、ゲルは瞬時に溶解した(図２右上）。
回収した細胞を培養したところ、殆ど全ての細胞が安定に接着・伸展したことから、HBCの細胞毒性が低いことが確かめられた。
【００４７】
ゲルの溶解に伴う三次元組織の回収
上記で作製した４℃に冷やした細胞含有ＨＢＣ溶液(0.1 ｍｌ）を、３７℃の上記と同じ細胞培養液へ射出してゲルを形成させた。該ゲルを細胞培養液中で３日間培養後、ゲルを4℃の細胞培養液が入った培養皿に移したところ、即座にゲルが溶解する様子が見られ、細胞塊を回収することができた。
回収した細胞の塊は、組織の色合いから、細胞層の積層数に換算して、少なくとも５−１０層程度の厚さに相当した細胞の塊であり、すなわち細胞の立体構造体であると認められた。
また、組織の一部を切り取って、新しい培養皿で培養したところ、24時間後には大量の細胞が組織から遊走する様子が観察され、組織中の細胞の生存が確かめられた。
【００４８】
さらに、組織をトリプシン処理により細胞懸濁液にした後、トリパンブルー染色することで、組織中の８５%の細胞が生存していることを確認した。
以上の結果から、本発明に従えば、生きた細胞の立体構造体が得られることが分かる。
【００４９】
細胞の立体構造体の調製
HBCを3.0 wt%で細胞培養液(ウシ胎児血清10%含むダルベッコ改変イーグル培地）に分散させ、冷蔵庫(4℃）で一晩放置することでHBCを溶解させた。
該HBC水溶液に、ヒト線維芽細胞を1x107個/ｍｌの濃度で分散させた。
上記分散液を、立体形状のハート型容器（幅約２．５ｃｍ、深さ約２ｃｍ、体積約８ｃｍ３、ステンレス製）に流し込んだ。
上記ハート型容器を、５％ＣＯ２雰囲気、温度３７℃の環境下で、１０分間放置することで、ゲルを形成させた。
形成したゲルを上記ハート型容器から取出し、培養皿（容器）に写し、３７℃の培養液5mLを加えた後、５％ＣＯ２雰囲気、温度３７℃の環境下で、３日間細胞培養を行った。
培養後、培養液を４℃の培地に交換することで、ハート形ゲルを溶解させた。溶解は、速やかに（３０秒程）で完了した。
【００５０】
ゲルを溶解させる前のゲル−細胞複合体の立体構造帯の写真を図３−１、ゲルを溶解させた後の細胞の立体構造体の写真を図３−２および図３−３に示す。図３−１および３−２は、該立体構造体の上方からの写真であり、図３−３は、該立体構造体の側面からの写真である。図３-１および３−２から判るように構造体はハートの形をしており、また図３−３から、その細胞構造体は厚みが約１ｍｍ以上あった。
【００５１】
得られた構造体は、立体形状のハート型容器内の立体ハート型形状が反映された厚みのあるハート型形状を有していることが分かる。
【００５２】
また、上記で得られた細胞培養液中の細胞の立体構造体を、トリプシン処理により細胞懸濁液にした後、トリパンブルー染色することで、組織中の７５%の細胞が生存していることが分かった。
【００５３】
以上から、本発明の方法に従うと、所望の立体構造を有する、生きた細胞の立体構造体を製造できることが理解できる。
【００５４】
上記においては、細胞の立体構造体の製造方法を提供したが、細胞に代え、無機微粒子を使用すると、下記製造方法により、無機微粒子の立体構造体を製造することができる。
【００５５】
感熱応答性高分子と無機微粒子を混合し、感熱応答性高分子が溶解した無機微粒子含有高分子溶液を調製する工程、
該無機微粒子含有高分子溶液を使用し、所望の立体構造を有する無機微粒子含有高分子溶液のゲルを形成する工程、
熱および/または光を照射し無機微粒子にコーティングした熱重合性物質および/または光重合性物質を重合し無機微粒子同士を結合させる無機微粒子の立体構造体を形成する工程、および
該無機微粒子含有高分子溶液のゲルをゾル化し感熱応答性高分子溶液と形成された無機微粒子の立体構造体を分離する工程、
を含むことを特徴とする、所望の立体構造を有する、無機微粒子の立体構造体の製造方法。
【００５６】
上記製造方法においては、無機微粒子を使用するので、ゾル・ゲル可能な温度領域は本発明の規定する温度領域に限定されず、また、使用できる感熱応答性高分子は生体適合性、生分解性、細胞接着性、細胞増殖性に優れた感熱応答性高分子に限定されることもない。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明により、所望の立体構造を有する、生きた細胞の立体構造体が製造可能となり、従来法では不可能であった三次元組織・臓器の構築が可能となり、再生医療のみならず生体材料分野において大きな進歩が期待される。
また、本発明は3Dバイオプリンティング技術の分野に利用可能な素材、製造方法を提供する点で、技術的にも経済的にも大きな波及効果を持つと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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