(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
窒素化合物を含有する測定対象に対して１４Ｎを核とした核磁気共鳴分光法を用いた測定を行い、前記窒素化合物を定量する定量工程と、
予め、濃度が既知の前記窒素化合物と、前記窒素化合物のスペクトルのピークとは別のピーク位置にて参照用のピークが表出する基準物質であるグリシンまたはギ酸アンモニウムと、に対して前記核磁気共鳴分光法を用いた測定を行い、濃度が既知の前記窒素化合物のスペクトルのピークの面積と、前記基準物質のピークの面積とから、前記窒素化合物のピークの面積と前記窒素化合物の濃度との関係を得る定量準備工程と、
を有し、
前記関係に基づいて前記定量工程を行う、窒素化合物の定量方法。
【請求項２】
前記測定対象は複数の前記窒素化合物を含有し、
前記定量工程においては、前記核磁気共鳴分光法により得られた一つのスペクトルから複数の前記窒素化合物を一度に定量する、請求項１に記載の窒素化合物の定量方法。
【請求項３】
前記測定対象は、イオン性が互いに異なる複数の前記窒素化合物を含有する、請求項２に記載の窒素化合物の定量方法。
【請求項４】
前記測定対象はタンパク質を含有しない、請求項１〜３のいずれかに記載の窒素化合物の定量方法。
【請求項５】
前記核磁気共鳴分光法を用いた測定においては各管が同心となる多重管を用い、当該多重管のうち一つの管には前記基準物質を配置し、別の管には濃度が既知の前記窒素化合物または前記測定対象を配置し、前記定量準備工程および前記定量工程を行う、請求項１〜４のいずれかに記載の窒素化合物の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、窒素化合物の定量方法に属する。
【背景技術】
【０００２】
従来、溶液中の窒素の形態分析方法として、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）およびイオン電極を使用した方法が行われており、特許文献１では硝酸、亜硝酸の定量をイオンクロマトグラフィーで行い、アンモニアの定量をイオン電極で行っている（特許文献１の［００３４］）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−７３９２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＩＣでは、イオン性の異なる窒素化合物を同時に測定することが原理上難しく、測定モードの異なる方法でイオン性の異なる窒素化合物を別々に分析する必要が出てくる。そうなると、少なくとも２回の測定が必要となり、効率が良くない。このようなこともあり、特許文献１では陰イオンの定量のみをイオンクロマトグラフィーで行い、陽イオンの定量はイオン電極で行っている。
【０００５】
本発明の主な目的は、窒素化合物を効率良く定量可能な技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の知見に基づいて成された本発明の態様は、以下の通りである。
本発明の第１の態様は、
窒素化合物を含有する測定対象に対してＮを核とした核磁気共鳴分光法を用いた測定を行い、前記窒素化合物を定量する定量工程を有する、窒素化合物の定量方法である。
【０００７】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の発明において、
前記定量工程においては、１４Ｎを核とした核磁気共鳴分光法を用いた測定を行う。
【０００８】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の発明において、
前記測定対象は複数の前記窒素化合物を含有し、
前記定量工程においては、前記核磁気共鳴分光法により得られた一つのスペクトルから複数の前記窒素化合物を一度に定量する。
【０００９】
本発明の第４の態様は、第３の態様に記載の発明において、
前記測定対象は、イオン性が互いに異なる複数の前記窒素化合物を含有する。
【００１０】
本発明の第５の態様は、第１〜第４の態様のいずれかに記載の発明において、
前記測定対象はタンパク質を含有しない。
【００１１】
本発明の第６の態様は、第１〜第５の態様のいずれかに記載の発明において、
予め、濃度が既知の前記窒素化合物と、窒素を含有する基準物質とに対して前記核磁気共鳴分光法を用いた測定を行い、濃度が既知の前記窒素化合物のスペクトルのピークの面積と、前記基準物質のピークの面積とから、前記窒素化合物のピークの面積と前記窒素化合物の濃度との関係を得る定量準備工程をさらに有し、
前記関係に基づいて前記定量工程を行う。
【００１２】
本発明の第７の態様は、第６の態様に記載の発明において、
前記核磁気共鳴分光法を用いた測定においては各管が同心となる多重管を用い、当該多重管のうち一つの管には前記基準物質を配置し、別の管には濃度が既知の前記窒素化合物または前記測定対象を配置し、前記定量準備工程および前記定量工程を行う。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、窒素化合物を効率良く定量可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態における試料管（二重管）の概略断面図である。
【図２】実施例１での定量準備工程の一つのスペクトルの結果を示す図である。
【図３】実施例１に係るアンモニアの検量線を示すプロットであり、アンモニアに起因するピーク面積の値を縦軸とし、横軸をアンモニアの濃度としている。
【図４】実施例２での定量準備工程の一つのスペクトルの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について、以下の順に説明する。
１．窒素化合物の定量方法
１−１．（定量）準備工程
１−２．定量工程
なお、本明細書において「〜」は所定の数値以上かつ所定の数値以下のことを指す。
また、特記の無い場合、スペクトルやピークとは、核磁気共鳴分光法を用いた測定における、縦軸を強度、横軸を化学シフト（ｐｐｍ）とした際のスペクトルやピークを指す。
【００１６】
＜１．窒素化合物の定量方法＞
本実施形態においては、窒素化合物を含有する測定対象に対して窒素Ｎ（好ましくは１４Ｎ）を核とした核磁気共鳴分光法（以降、単にＮＭＲと称する。）を用いた測定を行い、窒素化合物を定量する。以下、説明する。
【００１７】
１−１．（定量）準備工程
まず、本工程においては、窒素化合物を定量する前準備を行う。具体的には、例えば、以下の工程を行う。
（ｉ）予め、測定対象となる窒素化合物と同じ組成であって濃度が既知の窒素化合物Ａと基準物質とに対して１４Ｎを核としてＮＭＲを用いた測定を行う。その際に、窒素化合物Ａのスペクトルのピークとは別の化学シフト（以降、ピーク位置と称する。）にて参照用のピークを明瞭に表出させることができる、窒素を含有する基準物質を採用する。そして、濃度が既知の窒素化合物Ａのスペクトルのピークの面積と、当該基準物質のピークの面積の値を得る。
（ii）別の濃度に設定した以外は窒素化合物Ａと同様とした窒素化合物Ｂと、先ほどの基準物質と組成や濃度等を同様とした基準物質とに対して１４Ｎを核としてＮＭＲを用いた測定を行い、濃度が既知の窒素化合物Ｂのスペクトルのピークの面積と、基準物質のピークの面積の値を得る。
（iii）適宜（ii）を繰り返し、当該窒素化合物のピークの面積と当該窒素化合物の濃度との関係を示す検量線を作成する。
なお、後述の定量工程に係る準備のことを定量準備工程と称し、それ以外の準備のことを含めて本工程では（定量）準備工程と称する。
【００１８】
ちなみに、上記の検量線の作成には、本出願人が公開する特開２００８−２２４２８４号公報に記載の手法を採用しても構わない。また、本工程において用いるＮＭＲの試料管は、同じく当該公報の図１（本願図１にて再掲）に記載の二重管式試料管を採用しても構わない。こうすることにより、諸々のクロマトグラフィー（例えばＩＣ）のように別化合物への溶解等の処理を加えない状態で溶液中の窒素化合物を効率良く測定することが可能となる。
なお、本実施形態においては、当該公報に記載の手法を採用した場合について述べ、特記の無い内容については、当該公報に記載の内容を適宜参照しても構わない。
【００１９】
本実施形態においては、スペクトルのピークの面積は、ピークが出ていないピークの両端部分の間に基準となる直線を設定し、当該直線から上の部分すなわちピークの部分の強度の積分値として得ている。当該手法は、後述の実施例におけるＮＭＲ装置を使用すれば容易に実施可能である。
【００２０】
なお、測定対象としては窒素化合物を含有していれば特に限定は無い。また、窒素化合物についても窒素Ｎの元素を含有していれば特に限定は無い。具体例としては、アンモニア（またはそのイオン、以降列挙する化合物も同様）、硝酸、ヒドラジン、尿素、チオ尿素など、またはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。また、測定対象は液体であるのが通常であるが、液体以外であっても特に限定は無い。ただ、測定対象に含有される物質によっては本実施形態がもたらす効果をさらに増幅するが、その点については後掲の定量工程にて述べる。
また、基準物質についても、窒素化合物Ａのスペクトルのピークとは別のピーク位置にて参照用のピークを明瞭に表出させることができれば特に限定は無い。具体例としては、グリシン、アセトニトリル、ギ酸アンモニウムなどが挙げられる。
【００２１】
上記の定量準備工程の内容はあくまで一具体例であり、最終的に未知の濃度の窒素化合物を定量可能ならば、上記の手法の代わりに公知の手法を適宜採用しても構わない。
【００２２】
１−２．定量工程
本工程においては、窒素化合物を含有する測定対象に対してＮを核としたＮＭＲを用いた測定を行い、窒素化合物を定量する。本実施形態においては、ＮＭＲを用いた測定を行う際に、測定対象が窒素化合物を含有することを鑑みてＮ（好ましくは１４Ｎ）を核とすることに大きな特徴がある。以下、核種１４Ｎを例に挙げて詳述する。
【００２３】
まず、１４Ｎを核としたＮＭＲを用いた測定を行う場合、諸々のクロマトグラフィーのように、測定で使用する溶媒に溶液を混合する必要がなくなる。そのため、溶液中に溶解している窒素化合物が溶媒と相互作用して形態変化を起こさせるおそれを無くすることができるし、ＧＣやＧＣＭＳのように溶液を高温に加熱して気化する必要もなくなる。
【００２４】
また、仮に、１Ｈを核としてＮＭＲを用いてしまうと、窒素化合物が尿素、チオ尿素、ヒドラジンあるいはアンモニア等の溶液である場合、当該溶液の主成分である水がスペクトルのピークとして検出される。そうなると、尿素、チオ尿素、ヒドラジンあるいはアンモニア等に起因する１Ｈのピークなのか、溶液中の水に起因する１Ｈのピークなのか、判別が不可能となってしまう。
しかしながら、１４Ｎを核としたＮＭＲを用いる場合、上記のような水に起因するピークを表出させずに済む。そのため、窒素化合物に起因するピークを精度良く表出させることができ、ひいては上記の検量線により精度良く定量することが可能となる。
【００２５】
また、１４Ｎを核としたＮＭＲを用いることによる大きな利点がある。それは、１４Ｎの核自体の天然存在比が非常に高く、測定感度が非常に高くなることである。例えば、後述の実施例に示すＮＭＲ装置（ＦＴＮＭＲ：Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＮＭＲ、以下、特記の無い限りＮＭＲはＦＴＮＭＲを指す。）を使用すると、スペクトルの入手には数分程度で済む。なお、上記の各クロマトグラフィーでは、１回の測定に３０分程度要することを考えると、本実施形態がもたらす効果は顕著である。もちろん、本工程は、ＦＴＮＭＲ以外の方式、たとえばＣＷ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｗａｖｅ）−ＮＭＲを採用しても差し支えない。
【００２６】
ちなみに、１４Ｎを核としたＮＭＲを用いる場合、１４Ｎ核自体が四極子核であるため、ＦＴＮＭＲの測定で検出されるピークは非常にブロードなピークになってしまう。つまり、測定感度が非常に高くなってしまい、ピークがブロードになる、すなわち分解能は低くなる。そのため、１４Ｎを核とした窒素化合物の構造解析を行おうとすると、多々の困難が生じる。
ところが、本工程においては上記のような困難があっても全く支障はない。なぜなら、本工程においては窒素化合物の構造解析を主として行うのではなく、窒素化合物の定量を行うことが主だからである。具体的に言うと、各々の窒素化合物に起因するピークが得られればよく、さらに言うと、逆に各ピークがブロードであればあるほどすなわち各ピークの面積が大きければ大きいほど、検量線を作成しやすくなり、ひいては定量する際の効率を良くすることができる。つまり、本発明者は、上記のようなブロードなピークとなるという特徴を逆に活かし、窒素化合物の定量化という手法を想到したのである。
【００２７】
ところで、１５Ｎを核としたＮＭＲを用いる場合も変形例として挙げられる。確かに、窒素を核種とすることにより、上記に挙げたように水に起因するピークを表出させないことは可能となる。ただ、１５Ｎ核を観測してＦＴＮＭＲを用いて定量する場合、１５Ｎは天然存在比が著しく低い。そのため、ピークは非常にシャープとなり窒素化合物のピーク位置を容易に判別できるものの、ピークの面積が小さくなる。そのため、１４Ｎを核とした場合の方が検量線を作成しやすくなる。その結果、本実施形態のように１４Ｎを核としたＮＭＲを用いるのが非常に好ましい。
【００２８】
上記の内容以外にも、以下の効果が得られる。
例えば、クロマトグラフィーの一つであるＩＣでは、イオン性の異なる窒素化合物を同時に測定することが原理上難しく、少なくとも２回の測定が必要となる。
しかしながら、１４Ｎを核としたＮＭＲを用いる場合、イオン性が互いに異なる複数の窒素化合物のピークを各々別個に表出させることが可能となる。そうなると、１回の測定で、効率良く複数の窒素化合物を定量することが可能となる。測定対象が、イオン性が互いに異なる複数の窒素化合物を含有するならば、クロマトグラフィーの一つであるＩＣに比べ、より顕著な効果を奏する。
なお、ここで言う「イオン性が互いに異なる複数の窒素化合物」とは、窒素含有陰イオン、窒素含有陽イオン、および電気的に中性な窒素化合物の組み合わせのことを指す。
【００２９】
上記の特徴を活かすのならば、測定対象は複数の窒素化合物を含有し、かつ、本工程においては、ＮＭＲにより得られた一つのスペクトルから複数の窒素化合物を一度に定量するのが好ましい。なお、各々の窒素化合物のピークの面積と窒素化合物の濃度との関係（例えば、複数の窒素化合物の各々に応じた検量線）を得ていれば、複数の窒素化合物を一度に定量することは可能である。
【００３０】
また、測定対象はタンパク質を含有しないのが好ましい。窒素が多数含有されているタンパク質が測定対象に全く存在しないならば、窒素化合物のピークを各々別個に明確に表出させることが確実に可能となる。
【００３１】
また、ＮＭＲを用いた測定においては上記のような二重管、さらに言うと各管が同心となる多重管（もちろん三重管や四重管などであっても構わない。）を用い、当該多重管のうち一つの管には基準物質を配置し、別の管には測定対象を配置するのが好ましい。例えば、多重管が二重管の場合、中心の管には基準物質を配置し、その外側の管には測定対象を配置するのが好ましい。その際、ＦＴＮＭＲ測定で磁場を固定するために必要な重水素化溶媒を中心の管に添加する。
なお、定量準備工程において検量線を得る際は、外側の管に、濃度が既知の窒素化合物ＡやＢを配置するのが好ましい。
ただ、本実施形態においては多重管を用いず、単なる試料管を用いても構わない。その場合、定量準備工程においては窒素化合物Ａを試料管に入れてＮＭＲにて測定した後、別の試料管に基準物質を入れて別途ＮＭＲにて測定することになる。定量工程でも同様であり、窒素化合物を含有する測定対象と基準物質とを別途ＮＭＲにて測定することになる。その一方、多重管を用いると、先に述べたように各窒素化合物に対して一度に測定することが可能となる。そのため、多重管を用いた上記手法の方が、窒素化合物をより効率良く定量することが可能となる。
【００３２】
以上の結果、本実施形態によれば、窒素化合物を効率良く定量可能となる。
【００３３】
なお、上記の好ましい形態は、本工程以外にも先の定量準備工程で採用するのも好ましい。窒素化合物の種類に応じた検量線が効率良く得られるためである。そのため、上記のような一度の定量を、本工程と定量準備工程とで行うのが好ましいが、そのいずれかで行っても構わない。
【実施例】
【００３４】
以下、本実施例について説明する。なお、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
１−１．（定量）準備工程
まず、ＦＴＮＭＲの試料管として、図１に示す二重管を用意した。二重管の外管は日本精密化学製Ｎ−５Ｐとし、内管は日本精密化学製Ｎ−５０２Ａとした。
そして、二重管の外管に、既知濃度のアンモニアを含有する溶液を添加した。その一方、二重管の内管に、ＦＴＮＭＲ測定時に必要な磁場固定用重水素化溶媒である重水（関東化学製、特級）、および、定量の基準物質（すなわち基準物質）としてグリシン（関東化学製、特級）を添加した。
その後、内管を外管に挿入し、１４Ｎを核としたＦＴＮＭＲ測定（装置としてはＢｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ製ＡＶＡＮＣＥ４００型を使用）を行い、得られた既知濃度のアンモニアを含有する溶液におけるアンモニアのピーク面積を基準物質であるグリシンのピーク面積で除して規格化した。
【００３６】
本実施例での定量準備工程の一つのスペクトルの結果を示したのが図２である。なお、１６０ｐｐｍ付近に表出したピークは、今回の実施例を行う際に添加していたヒドラジンに由来するものであり、本実施例に記載の内容とは直接の関係は無い。
【００３７】
次に、濃度水準を変更した既知濃度のアンモニアを含有する溶液についても同様の測定を行った。本実施例において定量準備工程にてアンモニアの濃度に応じたアンモニアに起因するピーク面積（基準物質であるグリシンのピーク面積を１として規格化した値）を以下の表に示す。
【表１】
0006485640.tif 000002
そして、上記の表を基に、アンモニアの各濃度と、規格化したアンモニアのピーク面積とから、図３に示す検量線を作成した。図３では、上記の表におけるアンモニアに起因するピーク面積の値を縦軸とし、横軸をアンモニアの濃度としている。
【００３８】
１−２．定量工程
その後、二重管の内管の内容物をそのままにした上で、外管を、測定対象となる試料溶液を添加したものと交換したこと以外は上記の定量準備工程と同様の測定を行った。そして、本工程により得られたＮＭＲのスペクトルにおけるアンモニウムイオンのピーク面積を基準物質であるグリシンのピーク面積で規格化した値を検量線に代入し、試料溶液中のアンモニアの濃度を定量した。
本工程の結果、試料溶液中のアンモニアの濃度としては１０２１ｍｇ／ｌという値を効率良く得られた。
【００３９】
（実施例２）
本実施例においては、測定対象に、イオン性が互いに異なる複数の窒素化合物（硝酸とアンモニア）を含有させた。そして基準物質としてはアセトニトリル（関東化学製）を用いた。それ以外は、実施例１と同様とした。
【００４０】
本実施例での定量準備工程の一つのスペクトルの結果を示したのが図４である。図４が示すように、硝酸とアンモニアは、イオン性が互いに異なる複数の窒素化合物（硝酸イオン（ＮＯ３−）、アンモニウムイオン（ＮＨ４＋））となっており、硝酸とアンモニアに基準物質のアセトニトリルを含めた上で、これらは全てピークとして表出していた。
なお、図４においてＮＨ４＋のピーク位置がゼロよりも小さくなっているが、これは、測定対象に含有されるＨ＋のせいでピーク位置がシフトしているためであり、決して誤測定によるものではない。
【００４１】
その結果、試料溶液中の硝酸の濃度としては２５ｍｇ／ｌ、アンモニアの濃度としては３３ｍｇ／ｌという値を効率良く得られた。
【００４２】
（比較例）
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣＭＳ）、液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣＭＳ）、１Ｈを核にしたＦＴＮＭＲを用い、窒素化合物を含有する測定対象に対する定量を図ったが、いずれも上手くいかなかった。
例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣＭＳ、ＩＣだと、溶離液との混合による形態変化が生じてしまった。特にＩＣでは、窒素含有陰イオンか窒素含有陽イオンのどちらかが検出可能であるが、同時に検出することはできなかった。また測定対象中の塩により測定が妨げられた。
また、ＧＣ、ＧＣＭＳだと、加熱による分解が生じた。特にＧＣＭＳでは分離カラムへの吸着が生じ、測定が妨げられた。
また、１Ｈを核にしたＦＴＮＭＲだと、水のピークがスペクトルに表出してしまい、測定が妨げられた。
【図１】
0006485640.tif 000003
【図２】
0006485640.tif 000004
【図３】
0006485640.tif 000005
【図４】
0006485640.tif 000006