(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎮痛の必要な患者のために鎮痛薬を選択するための方法であって、
少なくとも１つの遺伝的変異ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２について該患者の遺伝子型を決定又は受容し、
少なくとも１つの遺伝的変異についての患者の遺伝子型に基づいて、重篤なオピオイド誘発性有害事象の低リスク及び高リスクとして定義される２つのリスク群の１つに該患者を割り当て、そして
該患者の割り当てられたリスク群に基づいて該患者のために医薬品を選択する、
ことを含んでなり、ここで、
該医薬品は、患者が高リスク群に割り当てられる場合は、非モルヒネオピオイド又は非オピオイド鎮痛薬より選択され、患者が低リスク群に割り当てられる場合は、モルヒネ又は別のオピオイド鎮痛薬より選択され、そして
変異は以下のようなリスク群に割り当てられ、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、呼吸抑制（ＲＤ）による回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］である、前記方法：
ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ：高い、ＡＧ：高い、ＧＧ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］。
【請求項２】
重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者を同定する方法であって、
少なくとも１つの遺伝的変異ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２について該患者の遺伝子型を決定又は受容し、そして
遺伝的変異のパネルの少なくとも１つについての患者の遺伝子型に基づいて、重篤なオピオイド誘発性有害事象の低リスク及び高リスクとして定義される２つのリスク群の１つに該患者を割り当てる、
ことを含んでなり、ここで、
高リスク群に割り当てられる患者は、重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者として同定され、そして
変異は以下のようなリスク群に割り当てられ、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、ＲＤによる回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］である、前記方法：
ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ：高い、ＡＧ：高い、ＧＧ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］。
【請求項３】
少なくとも１つの遺伝的変異が、ＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１、ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３、ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０、及びＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２から成る群より選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
変異が以下のような２つのリスク群の１つに割り当てられ、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、呼吸抑制［ＲＤ］、ＲＤによる回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］、並びに術後の悪心及び嘔吐［ＰＯＮＶ］より選択される、請求項３の方法：
ＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１  ＧＧ：高い、ＡＧ：高い、ＡＡ：低い［ＲＤ］；
ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３  ＧＧ：無い、ＡＧ：低い、ＡＡ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］；
ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０  ＡＡ：高い、ＡＣ：高い、ＣＣ：低い［ＰＯＮＶ］；及び
ＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２  ＴＴ：高い、ＴＣ：高い、ＣＣ：低い［ＲＤ］。
【請求項５】
ＰＯＮＶが難治性である、請求項４の方法。
【請求項６】
割り当てが、コンピュータに実装された方法によって実施され、場合により、コンピュータに実装された方法は：
ａ）  決定則、さらに場合により、それぞれのＳＮＰが２つの共役二値変数を生じるように遺伝子型をエンコードすること；又は
ｂ）  それぞれのＳＮＰが２つの共役二値変数を生じるように遺伝子型をエンコードすること、
を含む、請求項１〜５のいずれかの方法。
【請求項７】
割り当てが、決定則を含んでなるコンピュータに実装された方法によって実施され、決定則は：
IF [(rs4148412=GG)] THEN RISK=NO (low)
ELSE RISK=YES (high)
（［（ｒｓ４１４８４１２＝ＧＧ）］であれば、リスク＝無し（低い）
さもなければ、リスク＝有り（高い））
を含む、請求項１又は２の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの追加の非遺伝的要因を利用して、２つのリスク群の１つへの患者の割り当てを精緻化するか又は医薬品の用量を選択する、請求項１〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
少なくとも１つの追加の非遺伝的要因が、ジェンダー、人種、年齢、及び診断より選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
患者が小児患者である、請求項１〜９のいずれかの方法。
【請求項１１】
患者が白人家系である、請求項１〜１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
患者が、低リスク群に割り当てられる白人家系の女児患者であって、オピオイド医薬品が、総用量が０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、又は０．２７５ｍｇ／ｋｇを超えないように投与される、請求項９の方法。
【請求項１３】
患者の遺伝子型が、患者の遺伝子型を決定するのに使用される機器より直接受容される、請求項１〜１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
患者の遺伝子型が、患者から生体試料を入手又は受容し、該試料からＤＮＡを抽出し、そして該ＤＮＡを分析してパネル中のそれぞれの遺伝的変異において患者の遺伝子型を決定する、ことを含んでなる方法によって決定され、
場合により、ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応ベースの遺伝子型決定プラットフォームを使用して分析され、
さらに場合により、遺伝子型決定プラットフォームは、特定の遺伝的変異を増幅及び検出するための５’ヌクレアーゼアッセイを利用し、
さらに場合により、生体試料は、血液試料及び口腔スワブより選択される、
請求項１〜１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
鎮痛の必要な患者のために鎮痛薬を選択するための、コンピュータに実装された方法であって、
少なくとも１つの遺伝的変異について該患者の遺伝子型を決定又は受容し、
少なくとも１つのデータプロセッサによって、少なくとも１つの遺伝的変異についての患者の遺伝子型に基づいて、重篤なオピオイド誘発性有害事象の低リスク及び高リスクとして定義される２つのリスク群の１つに該患者を割り当て、そして
少なくとも１つのデータプロセッサによって、該患者の割り当てられたリスク群に基づいて該患者のために医薬品を選択する、
ことを含んでなり、ここで、
該医薬品は、患者が高リスク群に割り当てられる場合は、非モルヒネオピオイド又は他の鎮痛薬より選択され、患者が低リスク群に割り当てられる場合は、モルヒネ又はモルヒネ系オピオイドより選択され、
少なくとも１つの遺伝的変異は、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２を含み、そして
変異は以下のような２つのリスク群の１つに割り当てられ、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、ＲＤによる回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］である：
ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ：高い、ＡＧ：高い、ＧＧ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］、
前記方法。
【請求項１６】
重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者を同定する、コンピュータに実装された方法であって：
少なくとも１つのデータプロセッサによって、少なくとも１つの遺伝的変異について該患者の遺伝子型を決定又は受容し；そして
少なくとも１つのデータプロセッサによって、遺伝的変異のパネルの少なくとも１つについての患者の遺伝子型に基づいて、重篤なオピオイド誘発性有害事象の低リスク及び高リスクとして定義される２つのリスク群の１つに該患者を割り当てる、
ことを含んでなり、ここで、
高リスク群に割り当てられる患者は、重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者として同定され、
少なくとも１つの遺伝的変異は、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２を含み、そして
変異は以下のような２つのリスク群の１つに割り当てられ、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、ＲＤによる回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］である：
ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ：高い、ＡＧ：高い、ＧＧ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］、
前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[1]  本出願は、その内容がその全体で参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第６１／９４３，９４４号（２０１４年２月２４日出願）の利益を請求する。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する陳述
[2]  本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与されたＲＲ０２６３１４及びＨＧ００６８２８の下での政府支援でなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
[3]  本明細書に開示する本発明は、疼痛管理のための方法及び組成物に概して関する。
【背景技術】
【０００４】
[4]  安全で有効な鎮痛は、重要な未充足の医療ニーズである。例えば、Sadhasivam and Chidambaran, Pharmacogenomics (2012) 13(15):1719-1740; Caldas, J. et al., Paediatr. Anaesth., 14:910-5 (2004); Duedahl, T. and Hansen, E., Paediatr. Anaesth., 17:756-74 (2007) を参照のこと。オピオイドは、術後疼痛を管理するのに通常使用される鎮痛薬である。有意な鎮痛力を有するものの、オピオイドはまた、治療指数が狭くて、例えば、呼吸抑制、縮瞳、眠気、悪心、嘔吐、及び便秘が含まれる、いくつかの関連した有害作用を有する。モルヒネは、周術期の間に最もよく使用されるオピオイドである。オピオイド応答における患者間変動が予測不能で、モルヒネの治療指数が狭いために、モルヒネ誘発性呼吸抑制の発症率は高い。オピオイド誘発性呼吸抑制は、最も重篤なオピオイドの有害作用であって、５０％近くの術後呼吸不全事象の原因である（Fecho K. et al., Therapeut. and Clin. Risk Mgmt. 5:961-8 (2009)）。双子の研究により、オピオイド由来の呼吸抑制について有意な遺伝可能性（３０％）が明らかにされた（Angst M. et al., Anesthesiology 117:22-37 (2012)）。モルヒネに対する臨床応答における個体間変動性のほぼ５０％が、疼痛機序とオピオイドの代謝、輸送、及び受容体シグナル伝達に関与する遺伝子中のＳＮＰによって説明され得る。また、女性、人種、併存疾患のような非遺伝リスク因子と、ＣＹＰ２Ｄ６変異のような他の遺伝リスク因子が寄与することについても、記載されてきた（Ramachandran S. et al., J. Clin. Anesth. 23:207-13 (2011); Niesters M. et al., British Journal of Anaesthesia 110:175-82 (2013)）。オピオイドへの患者応答を予測するための努力は、その有害作用を最小にしながら疼痛緩和を最大にするように鎮痛を個別化することを臨床医に可能にするのに、多大な影響を及ぼすことができる。
【０００５】
[5]  扁桃摘出術は、小児が体験するごく一般的で有意に有痛性の外科手技の１つである。毎年、米国だけで約５３０，０００例の扁桃摘出術が実施されている（Erickson B. et al., Otolaryngol. Head Neck Surg., 140:894-901 (2009)）。アメリカの小児のほぼ８人に１人に扁桃摘出術が施行される（Marcus, C. et al., The New EnglandJournal of Medicine, 368:2366-76 (2013); Brouillette, R. The New England Journal of Medicine, 368:2428-9 (2013)）。モルヒネは、入院状況にある小児に対して投与される上位１０種の医薬品の１つであり（Lasky, T. et al., Clin. Ther., 34:720-727 (2012)）、それは、小児における扁桃摘出術の間又は後での疼痛を管理するのに頻繁に使用されている。扁桃摘出術の適応症である閉塞性睡眠時無呼吸のために、小児は、呼吸抑制が含まれるオピオイドの中枢抑制作用に対して特に敏感になる（Brown, K. et al., Anesthesiology, 105:665-669 (2006)）。扁桃摘出術後の死亡率についての最大規模の原報に関する最新の研究により、オピオイド疼痛医薬品の使用が多数の死亡と無酸素性脳障害の原因となることが実証された（Goldman, J. et al., The Laryngoscope 123:2544-53 (2013)）。２０１３年２月、アメリカ食品医薬品局は、FDA Drug Safety Communication 2013 において、死亡と重篤な有害作用に関する多数の報告に基づいて、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型と代謝状態に拘らず、扁桃摘出術を施行中の小児におけるコデイン（モルヒネのプロドラッグ）の使用を禁ずる警告を出した（アメリカ食品医薬品局、「小児おけるコデイン使用の安全性レビュー（最新版）；扁桃摘出術及び／又はアデノイド切除術後の使用に関する新たな枠組み警告と禁忌」）。
【発明の概要】
【０００６】
[6]  本発明は、鎮痛の必要な患者のために鎮痛薬を選択するための方法と、重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者を同定するための方法を提供し、該方法は、少なくとも１つの遺伝的変異について該患者の遺伝子型を決定又は受容し、少なくとも１つの遺伝的変異についての患者の遺伝子型に少なくとも一部基づいて、重篤なオピオイド誘発性有害事象の２つのリスク群（即ち、低リスク群と高リスク群）の１つへ該患者を割り当てることを含んでなる。１つの態様において、該医薬品は、患者が高リスク群に割り当てられる場合は、非モルヒネオピオイド鎮痛薬又は非オピオイド鎮痛薬より選択されて、患者が低リスク群に割り当てられる場合は、モルヒネ又は別のオピオイド鎮痛薬より選択される。１つの態様において、非オピオイド鎮痛薬は、パラセタモール（アセトアミノフェンとも呼ばれる）と非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）から成る群より選択される。１つの態様において、モルヒネ以外のオピオイド鎮痛薬は、フェンタニル、ヒドロモルホン、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、トラマドール、オンダンセトロン、デキサメタゾン、メタドン、アルフェンタニル、及びレミフェンタニルから成る群より選択される。１つの態様において、高リスク群へ割り当てられる患者は、重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者として同定される。
【０００７】
[7]  １つの態様において、少なくとも１つの遺伝的変異は、ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２、及びＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７から成る群より選択される少なくとも１つの変異を含む。１つの態様において、変異は、以下のような２つのリスク群の１つへ割り当てられて、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、呼吸抑制［ＲＤ］、ＲＤによる回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］、及び難治性ＰＯＮＶでもあり得る、術後の悪心及び嘔吐［ＰＯＮＶ］より選択される：
[8]  ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４  ＧＧ：高い、ＡＧ：高い、ＡＡ：低い［ＲＤ］；
[9]  ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ：高い、ＡＧ：高い、ＧＧ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］；及び
[10]  ＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７  ＡＡ：高い、ＡＧ：高い、ＧＧ：低い［ＰＯＮＶ］。
【０００８】
[11]  １つの態様において、少なくとも１つの遺伝的変異は、ＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１、ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３、ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０、及びＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２から成る群より選択される少なくとも１つの変異を含むか又はさらに含む。１つの態様において、その変異は、以下のような２つのリスク群の１つへ割り当てられて、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、呼吸抑制［ＲＤ］、ＲＤによる回復期の滞在の延長［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］、及び難治性ＰＯＮＶでもあり得る、術後の悪心及び嘔吐［ＰＯＮＶ］より選択される：
[12]  ＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１  ＧＧ：高い、ＡＧ：高い、ＡＡ：低い［ＲＤ］；
[13]  ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３  ＧＧ：無い、ＡＧ：低い、ＡＡ：低い［ｐｒｏｌｏｎｇＲＤ］；
[14]  ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０  ＡＡ：高い、ＡＣ：高い、ＣＣ：低い［ＰＯＮＶ］；及び
[15]  ＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２  ＴＴ：高い、ＴＣ：高い、ＣＣ：低い［ＲＤ］。
【０００９】
[16]  １つの態様において、少なくとも１つの遺伝的変異は、ＦＡＡＨ  ｒｓ２２９５６３２、ＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２、及びＡＤＲＢ２  ｒｓ１０４２７１３から成る少なくとも３つの変異を含む。１つの態様において、変異は、以下のような２つのリスク群の１つへ割り当てられて、重篤なオピオイド誘発性有害事象は、呼吸抑制［ＲＤ］である：
[17]  ＦＡＡＨ  ｒｓ２２９５６３２  ＡＡ：高い、ＣＡ  高い、ＣＣ：低い；
[18]  ＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２  ＴＴ：高い、ＴＣ：高い、ＣＣ：低い；及び
[19]  ＡＤＲＢ２  ｒｓ１０４２７１３  ＧＧ：高い、ＧＡ  高い、ＡＡ：低い。
【００１０】
[20]  上記に記載した方法のいずれにも従えば、割り当ては、コンピュータに実装された方法によって実施し得て、好ましくは実施される。１つの態様において、コンピュータに実装された方法は、決定則を含む。１つの態様において、コンピュータに実装された方法は、それぞれのＳＮＰが２つの共役（coupled）二値変数を生じるように遺伝子型をエンコードすることを含む。１つの態様において、割り当ては、決定則を含んでなるコンピュータに実装された方法によって実施されて、決定則は、
[21]  IF [(rs9282564=AA) OR (rs4148412=GG) OR (kgp8560677=GG)] THEN RISK=NO (low)
（［（ｒｓ９２８２５６４＝ＡＡ）又は（ｒｓ４１４８４１２＝ＧＧ）又は（ｋｇｐ８５６０６７７＝ＧＧ）］であれば、リスク＝無し（低い））
[22]   ELSE RISK=YES (high)
（さもなければ、リスク＝有り（高い））を含む。
【００１１】
[23]  別の態様において、割り当ては、決定則を含んでなるコンピュータに実装された方法によって実施されて、決定則は、
[24]  IF [(rs2295632=CC) OR (rs1045642=CC) OR (rs1042713=AA)] THEN RISK=NO (low)
（［（ｒｓ２２９５６３２＝ＣＣ）又は（ｒｓ１０４５６４２＝ＣＣ）又は（ｒｓ１０４２７１３＝ＡＡ）］であれば、リスク＝無し（低い））
[25]  ELSE RISK=YES (high)
（さもなければ、リスク＝有り（高い））を含む。
【００１２】
[26]  上記に記載した方法の１つの態様では、少なくとも１つの追加の非遺伝的要因を利用して、２つのリスク群の１つへの患者の割り当てを精緻化する、及び／又は該患者と同じ年齢、体重、ジェンダー、及び民族性の被験者の標準用量とは異なる、医薬品の用量を選択する。１つの態様において、少なくとも１つの追加の非遺伝的要因は、ジェンダー、人種、年齢、及び診断より選択される。
【００１３】
[27]  上記に記載した方法のいずれにも従えば、１つの態様において、患者は、小児患者である。１つの態様において、患者は、白人家系である。
[28]  特別な態様において、患者は、低リスク群へ割り当てられる白人家系の女児患者であって、オピオイド医薬品は、総用量が０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、又は０．２７５ｍｇ／ｋｇを超えないように投与される。
【００１４】
[29]  １つの態様において、鎮痛薬を選択する方法は、低リスク群へ割り当てられる患者へのオピエート鎮痛薬の用量を調整することを含み、該方法は、オピオイド感受性に関連した少なくとも１つの追加の遺伝的変異についての患者の遺伝子型を決定又は受容することを含んでなる。１つの態様において、オピオイド感受性に関連した少なくとも１つの追加の遺伝的変異は、ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９である。この態様に従えば、オピエート鎮痛薬の用量は、ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９  ＣＣ遺伝子型を有する患者では、標準用量より上方に調整されて、ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９  ＡＡ遺伝子型を有する患者では、その用量は、下方へ調整される。１つの態様において、用量は、０．０４ｍｇ／ｋｇずつ調整される。本発明で使用される標準用量は、患者の年齢、体重、ジェンダー、民族性、及び／又は診断の項目についての、ＦＤＡ承認された製品ラベル上に示される用量を意味する。
【００１５】
[30]  上記に記載した方法のいずれにも従えば、１つの態様において、患者の遺伝子型は、患者の遺伝子型を決定するのに使用される機器より直接受容される。１つの態様において、患者の遺伝子型は、患者より生体試料を入手又は受容し、該試料よりＤＮＡを抽出し、そして該ＤＮＡを分析してパネル中のそれぞれの遺伝的変異で患者の遺伝子型を決定することを含んでなる方法によって決定される。１つの態様において、ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応ベースの遺伝子型決定プラットフォームを使用して分析される。１つの態様において、遺伝子型決定プラットフォームは、特異的な遺伝的変異を増幅して検出するために５’ヌクレアーゼアッセイを利用する。１つの態様において、生体試料は、血液試料と口腔スワブより選択される。
【００１６】
[31]  本発明はまた、診断キット又は「バイオアッセイキット」を提供する。１つの態様において、バイオアッセイキットは、以下の成分：（ｉ）以下のＳＮＰ：ＯＰＲＭＩ  ｒｓ１７９９９７１、ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４、ＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２、及びＡＤＲＢ２  ｒｓ１０４２７１３のそれぞれを増幅するのに有効な配列特異的フォワードプライマーとリバースプライマーのセット；（ｉｉ）該ＳＮＰの異なるアレルへハイブリダイズするのにそれぞれ有効な２つの標識ＤＮＡプローブ；及び（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。１つの態様において、バイオアッセイキットは、以下の成分：（ｉ）ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２、及びＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７より選択される１以上の遺伝的変異を増幅するのに有効な配列特異的フォワードプライマーとリバースプライマーのセット；（ｉｉ）該ＳＮＰの異なるアレルへハイブリダイズするのにそれぞれ有効な２つの標識ＤＮＡプローブ；及び（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。１つの態様において、本発明のバイオアッセイキットは、ＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１、ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３、ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０、及びＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２より選択される１以上の追加の遺伝的変異を増幅するのに有効な配列特異的フォワードプライマーとリバースプライマーのセットをさらに含む。１つの態様において、バイオアッセイキットは、以下の成分：（ｉ）ＦＡＡＨ  ｒｓ２２９５６３２、ＡＢＣＢ１  ｒｓ１０４５６４２、及びＡＤＲＢ２  ｒｓ１０４２７１３から成る少なくとも３つの変異を増幅するのに有効な配列特異的フォワードプライマーとリバースプライマーのセット；（ｉｉ）該ＳＮＰの異なるアレルへハイブリダイズするのにそれぞれ有効な２つの標識ＤＮＡプローブ；及び（ｉｉｉ）５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】[32]  有意に関連する領域が同定された、ＦＡＡＨの４６．８６Ｍｂ〜４６．８９Ｍｂの拡大領域。１１種のＳＮＰについて試験した。ＰＯＮＶ（上パネル）、呼吸抑制（中央パネル）、及び総モルヒネ量（ｍｇ／ｋｇ）（下パネル）と単一ＳＮＰの関連性についての−ｌｏｇ１０（ｐ値）を示す。
【図２】[33]  アデノイド口蓋扁桃摘出術群の研究において観測されたＯＣＴ１、ＡＢＣＣ３、及びＡＢＣＢ１遺伝子型でのモルヒネクリアランスとＭ３Ｇ／Ｍ−６Ｇ生成クリアランスの変動。
【図３Ａ】[34]  我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動。下パネルが脊椎手術からの結果を要約するのに対し、上パネルは、アデノイド口蓋扁桃摘出術施行の研究からの結果を要約した。ＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５遺伝子型がｘ軸で変動している。Ｎｏｎｍｅｍ解析からの個々のモルヒネＣＬ（ηＭｏｒ，ＣＬ）、Ｍ３Ｇ生成ＣＬ（ηＭ３Ｇ，ＦＣＬ）、及びＭ６Ｇ生成ＣＬ（ηＭ６Ｇ，ＦＣＬ）の経験的ベイズ推定値を左パネル、中央パネル、及び右パネルのｙ軸にそれぞれプロットする。
【図３Ｂ】[35]  我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動。下パネルが脊椎手術からの結果を要約するのに対し、上パネルは、アデノイド口蓋扁桃摘出術施行の研究からの結果を要約した。ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２遺伝子型がｘ軸で変動している。Ｎｏｎｍｅｍ解析からの個々のモルヒネＣＬ（ηＭｏｒ，ＣＬ）、Ｍ３Ｇ生成ＣＬ（ηＭ３Ｇ，ＦＣＬ）、及びＭ６Ｇ生成ＣＬ（ηＭ６Ｇ，ＦＣＬ）の経験的ベイズ推定値を左パネル、中央パネル、及び右パネルのｙ軸にそれぞれプロットする。
【図４Ａ】[36]  我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動。下パネルが脊椎手術からの結果を要約するのに対し、上パネルは、アデノイド口蓋扁桃摘出術施行の研究からの結果を要約した。ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３遺伝子型は、ｘ軸で変動している。Ｎｏｎｍｅｍ解析からの個々のモルヒネＣＬ（ηＭｏｒ，ＣＬ）、Ｍ３Ｇ生成ＣＬ（ηＭ３Ｇ，ＦＣＬ）、及びＭ６Ｇ生成ＣＬ（ηＭ６Ｇ，ＦＣＬ）の経験的ベイズ推定値を左パネル、中央パネル、及び右パネルのｙ軸にそれぞれプロットする。
【図４Ｂ】[37]  我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動。下パネルが脊椎手術からの結果を要約するのに対し、上パネルは、アデノイド口蓋扁桃摘出術施行の研究からの結果を要約した。ＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７遺伝子型がｘ軸で変動している。Ｎｏｎｍｅｍ解析からの個々のモルヒネＣＬ（ηＭｏｒ，ＣＬ）、Ｍ３Ｇ生成ＣＬ（ηＭ３Ｇ，ＦＣＬ）、及びＭ６Ｇ生成ＣＬ（ηＭ６Ｇ，ＦＣＬ）の経験的ベイズ推定値を左パネル、中央パネル、及び右パネルのｙ軸にそれぞれプロットする。
【図５】[38]  我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動。下パネルが脊椎手術からの結果を要約するのに対し、上パネルは、アデノイド口蓋扁桃摘出術施行の研究からの結果を要約した。ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２遺伝子型がｘ軸で変動している。Ｎｏｎｍｅｍ解析からの個々のモルヒネＣＬ（ηＭｏｒ，ＣＬ）、Ｍ３Ｇ生成ＣＬ（ηＭ３Ｇ，ＦＣＬ）、及びＭ６Ｇ生成ＣＬ（ηＭ６Ｇ，ＦＣＬ）の経験的ベイズ推定値を左パネル、中央パネル、及び右パネルのｙ軸にそれぞれプロットする。
【図６】[39]  脊椎後方固定術を施行中の若年者におけるＡＢＣＣ３  ｒｓ７３３３９２と呼吸抑制の間の関連性の検証。ＡＢＣＣ３  ＳＮＰ  ｒｓ７３３３９２は、脊椎手術集団における呼吸抑制に関連して、扁桃摘出術集団で見出された関連性に一致した。ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３３３９２とｒｓ７３３９２３は、連鎖不平衡状態にある。つまり、いずれも扁桃摘出術集団における呼吸抑制に関連した。
【図７】[40]  これらのグラフは、術後１日目と２日目のモルヒネ誘発性呼吸抑制（ＭＩＲＤ）と疼痛転帰に対するＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１変異の影響を図解する。異なる遺伝子型でのＭＩＲＤの発生率（Ａ）；異なる遺伝子型でＭＩＲＤのリスク（Ｂ）；異なる遺伝子型についての疼痛スコアと累積モルヒネ投与量（Ｃ）。
【図８】[41]  術後介入を必要とする患者の間で「高リスク」対「低リスク」サブタイプを同定するためのＳＮＰシグネチャーの使用。３つのＳＮＰを用いれば、このシグナルのほとんどを捉えることが可能である。各クラスターにおけるＲＤ症例のパーセント（Ａ）；患者を「低リスク層」対「高リスク層」へ分類するデシジョンツリー（決定木）。ここで「ｒｓ２２９５６３２＿Ａ＝Ｎｏ」は、Ａアレルの欠失、即ちＣＣを示して、「ｒｓ２２９５６３２＝Ｙｅｓ」は、ＣＡ遺伝子型とＡＡ遺伝子型に対応する（Ｂ）。
【図９】[42]  術後呼吸抑制と Human Illumina Omni5 GWAS チップからのＡＢＣＣ  ３ＳＮＰの間の関連性。
【図１０】[43]  人種、性別、ＯＳＡ（非ＯＳＡ：左のボックスプロット；ＯＳＡ：右のボックスプロット）、ＲＤ（非ＲＤ：左のボックスプロット；ＲＤ：右のボックスプロット）とモルヒネ用量の相関性。ＯＳＡ患者は、より低い全投与量を有して、モルヒネの用量増加につれてＲＤリスクが増加した。これらの結果には、２７４名の患者のセットが含まれる。
【図１１】[44]  このコソートダイアグラムは、試験参加者の本臨床試験での流れを図解する。有資格参加者、除外理由、及び登録患者について報告する。ＩＲＢ＝施設内審査委員会。
【図１２Ａ】[45]  麻酔後回復室（ＰＡＣＵ）でのモルヒネ関連性の術後悪心及び嘔吐（ＰＯＮＶ）における性特異的な差異。ＰＡＣＵでのモルヒネ関連性ＰＯＮＶにおける性特異的な差異。男児と女児に関して、Ｘ軸に総モルヒネ用量をプロットして、Ｙ軸にモルヒネ関連性ＰＯＮＶの確率をプロットする。ＰＡＣＵでのオピオイド関連性ＰＯＮＶの全体発生率は、総モルヒネ用量が増加するにつれて、男児と比べて女児で相対的に高かった。
【図１２Ｂ】麻酔後回復室（ＰＡＣＵ）でのモルヒネ関連性の術後悪心及び嘔吐（ＰＯＮＶ）における性特異的な差異。ＰＡＣＵでの滞在延長をもたらすモルヒネ関連性ＰＯＮＶにおける性特異的な差異。男児と女児に関して、Ｘ軸に総モルヒネ用量をプロットして、Ｙ軸にＰＯＮＶによるＰＡＣＵ滞在延長の確率をプロットする。ＰＡＣＵ滞在延長をもたらすＰＯＮＶの確率は、総モルヒネ用量が増加するにつれて、男児と比べて女児で相対的に高かった。
【図１３Ａ】[46]  ＰＡＣＵでのモルヒネ関連性の呼吸抑制（ＲＤ）における性特異的な差異。ＰＡＣＵでのモルヒネ関連性ＲＤにおける性特異的な差異。男児と女児に関して、Ｘ軸に総モルヒネ用量をプロットして、Ｙ軸にモルヒネ関連性ＲＤの確率をプロットする。ＰＡＣＵでのオピオイド関連性呼吸抑制の全体発生率は、総モルヒネ用量が増加するにつれて、男児と比べて女児で相対的に高かった。
【図１３Ｂ】ＰＡＣＵでのモルヒネ関連性の呼吸抑制（ＲＤ）における性特異的な差異。ＰＡＣＵでの滞在延長をもたらすモルヒネ関連性ＲＤにおける性特異的な差異。男児と女児に関して、Ｘ軸に総モルヒネ用量をプロットして、Ｙ軸にＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長の確率をプロットする。ＰＡＣＵ滞在延長をもたらすＲＤの確率は、総モルヒネ用量が増加するにつれて、男児と比べて女児で相対的に高かった。
【図１４】[47]  低い総モルヒネ用量（＜０．３ｍｇ／ｋｇ）と高い総モルヒネ用量（≧０．３ｍｇ／ｋｇ）の間での、ＰＡＣＵの滞在期間における性特異的な差異。０．３ｍｇ／ｋｇ以上の総モルヒネを受容した白人女児は、＜０．３ｍｇ／ｋｇ未満の総モルヒネを受容した女児（８２．２±３．３分）より長くＰＡＣＵに滞在した（１１１．１±６．６分）。０．３ｍｇ／ｋｇ未満のモルヒネを受容した男児がＰＡＣＵに８８．３±３．６分間滞在したのに対し、０．３ｍｇ／ｋｇ以上の総モルヒネを受容した男児は、ＰＡＣＵに９９．７±６．４分間滞在した。白人女児では、低い総モルヒネ用量と高い総モルヒネ用量の間で約３０分のより長い滞在があったので、ＰＡＣＵ滞在期間における差異は、臨床的に有意であるが、年齢、体重、ＯＳＡの既往歴について補正した後では、統計学的有意差に達しなかった（ｐ＝０．０９）。高用量の女児におけるＰＡＣＵ滞在の延長が、男児におけるそれと統計学的有意差をもって異ならない（ｐ＝０．０９）としても、性によって層別した解析では、高用量の女児が低用量の女児より長いＰＡＣＵ滞在を有した（ｐ＝０．０００２）。しかし男児では、この差異は、統計学的に有意でない（ｐ＝０．１１）。
【図１５】[48]  このコソートダイアグラムは、試験参加者の本臨床試験での流れを図解する。有資格参加者、除外理由、登録されて分析された患者について報告する。ＩＲＢ＝施設内審査委員会。
【図１６】[49]  ５種のＡＢＣＢ１  ＳＮＰと臨床転帰の遺伝的関連性。加法モデルにおいて検定した単一ＳＮＰ関連性の−ｌｏｇ１０（ｐ値）をプロットした。基準線は、−ｌｏｇ１０（０．０５のｐ値）レベルを示す。この検定は、白人（Ａ）、黒人（Ｂ）において、そして人種混合（Ｃ）で実施した。いずれの人種においても、ＡＢＣＢ１  ＳＮＰのｒｓ９２８２５６４は、常に、呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長と有意な関連性を有し；そしてＡＢＣＢ１  ＳＮＰのｒｓ２２２９１０９は、術後モルヒネ要求性に関連した。ＲＤ＝呼吸抑制；ＰＡＣＵ＝麻酔後回復室；ＦＬＡＣＣ＝顔・脚・活動性・泣き声・機嫌の疼痛尺度。
【図１７】[50]  ＡＢＣＢ１遺伝子型と呼吸抑制のリスク。ｒｓ９２８２５６４がＧＧ遺伝子型の小児は、ＧＡ遺伝子型の小児と比較して、ＰＡＣＵにおける滞在延長をもたらす呼吸抑制の確率が４．７倍高かった（（９５％ＣＩ：２．１〜１０．８，ｐ＝０．０００２）。ｒｓ９２８２５６４がＡＡ遺伝子型の小児は、ＧＡ遺伝子型の小児と比較して、ＰＡＣＵにおける滞在延長をもたらす呼吸抑制の確率がより低かった［０．２（０．１〜０．５）］。ＰＡＣＵ＝麻酔後回復室。
【図１８】[51]  ＡＢＣＢ１輸送体の構造と非同義多型のマッピング。配列アライメント、二次構造、及びＴＭヘリックス予測（http<colonslashslash>sable<dot>cchmc<dot>org）とマウス相同体の決定構造を使用して、３つの非同義ＳＮＰを２１位（未決定Ｎ末端断片内部の赤色部位）、４００位（第一のＡＴＰ結合部位の近傍に示した青色の側鎖モデル）、及び８９３位（ＴＭ１０の細胞質延長部分内にあるマゼンタ色の部位）へマッピングする。この構造の残りでは、黄色を使用して疎水性残基を示し、赤色、橙色、及び褐色を使用して、荷電性残基と親水性残基をそれぞれ示す。膜は、青色の矩形として象徴的に示す。Polyview-3D（http<colonslashslash>polyview<dot>cchmc<dot>org）を使用して、この図を作成した。ＡＢＣＢ１  ＳＮＰの効果についての構造ベースの分析：分析したＡＢＣＢ１  ＳＮＰの中で、ｒｓ９２８２５６４、ｒｓ２２２９１０９、及びｒｓ２０３２５８２は非同義であって、それぞれ２１位（Ｎ対Ｄ）、４００位（Ｓ対Ｎ）、及び８９３位（Ｓ対Ａ対Ｔ）でアミノ酸配列の変化を生じる。赤色、マゼンタ色、及び青色の部位によって示されるように、影響を受ける３つの残基は、いずれも輸送体の細胞質「アーム」の１つの内部に位置している。上記部位の第一部位（残基２１）は、可撓性のＮ末端細胞質セグメントの内部に位置して、膜貫通ヘリックスのＴＭ１がすぐに続く。このＮ末端ドメインは、きわめて可変性であって、多数の陽電荷残基を含有する。それは、輸送体の細胞質部分の残りと、又はＡＢＣＢ１補因子と相互作用し得るが、この部位の機能上の役割への洞察を深めるには、さらなる配列決定とともに、そのような相互作用に関する構造データが必要であろう。一方、第二の変異（青色の部位）の構造コンテクストに関する詳細な分析からは、それがＡＢＣＢ１機能の調節において直接的な役割を潜在的に担う可能性があると示唆されている。４００位は、それ自体は進化的に保存されていないが、強固に保存された２つの芳香族残基が隣接して、ＦＳＹモチーフを形成する。これら２つの残基は、残基４４２〜４４５（ＲＬＹＤ）を含む、別の保存部位と接触する。これら２つの溶媒曝露ループは、一緒になって、残基４２７〜４３４（緑色で示される）が含まれるＡＴＰ結合部位（と直に接触してはいないが）の直ぐ近傍を構成する。これらのループは、ＡＴＰ加水分解時にコンホメーション変化を受けると予測されるので、Ａｓｎ４００アレルは、これらの変化が構造全体に伝播する仕組みに影響を及ぼして、この輸送体の開閉に寄与する可能性がある。残る２つのＳＮＰ（即ち、ｒｓ１１２８５０３とｒｓ１０４５６４２）は、同義である。興味深いことに、これら２つのＳＮＰは、互いとだけでなく、非同義のｒｓ２０３２５８２とも比較的強い連鎖状態にある（但し、他の２つの非同義ＳＮＰ、ｒｓ９２８２５６４とｒｓ２２２９１０９とは連鎖しない）。1000 Genomes CEU コホートでは、ｒｓ２０３２５８２と上記２つの非同義ＳＮＰの間に０．８７と０．５１のｒ２が観測される。これらＳＮＰのいずれも、連鎖不平衡状態にある別の遺伝子多型の有効なマーカーになり得る（例えば、ＡＢＣＢ１タンパク質の発現に影響を及ぼす）。真の機能マーカーを確定するには、さらなる配列決定、構造研究、及び生化学研究が必要とされよう。
【図１９】[52]  主成分１及び２の散布図。Golden Helix Software を使用して、２１８の家系情報マーカー（ＡＩＭ）で主成分分析を実施した。研究コホートの自己申告性の人種（白人種を赤丸として示し、黒人種を青丸として示す）を HapMap プロジェクト由来の準拠集団（白三角印）とともにプロットした。準拠集団を以下の略語と異なる色の開き三角印によって以下のように示した：ΔＣＥＵ＝北欧・西欧家系のユタ州住民；ΔＡＳＷ＝米国南西部のアフリカ系；ΔＬＷＫ＝ウェブエ（ケニア）のルイヤ族；ΔＭＫＫ＝キニャワ（ケニア）のマサイ族；ΔＹＲＩ＝イバダン（ナイジェリア）のヨルバ族；ΔＣＨＤ＝コロラド州デンバー市の中国人；ΔＣＨＢ＝北京（中国）の漢民族；ΔＪＰＴ＝東京（日本）の日本人；及びΔＧＩＨ＝テキサス州ヒューストンのグジャラティーインド人。
【図２０】[53]  本明細書に記載するシステムの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
[54]  本発明は、鎮痛の必要な患者のために鎮痛薬を選択するための方法と、重篤なオピオイド誘発性有害事象のリスク状態にある患者を同定するための方法を提供し、該方法は、少なくとも１つの遺伝的変異について該患者の遺伝子型を決定又は受容し、少なくとも１つの遺伝的変異についての該患者の遺伝子型に少なくとも一部基づいて、重篤なオピオイド誘発性有害事象の２つのリスク群（即ち、低リスク群と高リスク群）の１つへ該患者を割り当てることを含んでなる。本発明はまた、鎮痛薬の必要な患者のためにその投与量を調整するための方法を提供し、該方法は、少なくとも１つの遺伝的変異について該患者の遺伝子型を決定又は受容し、本明細書に記載のように従って、医薬品の投与量を調整することを含んでなる。１つの態様において、鎮痛薬は、オピオイド鎮痛薬である。１つの態様において、オピオイド鎮痛薬は、モルヒネである。１つの側面において、本発明は、単独で、又は他の遺伝的変異又は非遺伝的要因との組合せにおいて、特別な遺伝子型を有する患者にとっての１以上のオピオイド関連の有害事象、又は不十分な疼痛制御、又はその両方のより高いリスクを示す遺伝的変異を提供する。１つの態様において、遺伝的変異は、一塩基多型（single nucleotide polymorphism）、又はＳＮＰである。
【００１９】
[55]  本発明はまた、有害事象のリスクを抑えるとともに鎮痛作用を高めるための個別化介入を提供するのに有用な臨床転帰の予測モデルを作成するために、本明細書に記載の遺伝的関連性を取り込んだデシジョンツリー及びアルゴリズムを提供する。これらのデシジョンツリー及びアルゴリズムはまた、オピオイド及び／又は鎮痛薬を投与することの効能と安全性について評価するために使用することができる。本明細書に記載のデシジョンツリー及びアルゴリズムの使用は、有害作用がほとんど無いより良好な鎮痛を提供することによって周術期臨床転帰を改善し得るだけでなく、ＰＡＣＵ滞在延長、不十分な疼痛制御のための緊急室往診、オピオイド誘発性嘔吐に続く脱水症状、及び酸素と集中的な呼吸支援手段が求められる呼吸抑制を減らすことによって、経済的成果を高めることもできる。これらの臨床決定アルゴリズムは、個別対応のオピオイド選択及び投薬を可能にして、重篤な有害事象のリスクを最小にする一方で疼痛緩和を最大にすることができる。上記の知見は、オピオイドが求められる外科的又は非外科的疼痛のある成人及び小児へ外挿することができる。他に述べなければ、種々の用語は、関連技術分野の当業者による慣用の使用法に従って理解されたい。
【００２０】
[56]  「一塩基多型」又は「ＳＮＰ」は、ゲノム中の特定位置にある単一ヌクレオチドが種の成員間で、又は個体中の対合染色体間で異なる場合に生じるＤＮＡ配列変異である。ほとんどのＳＮＰ多型は、２つのアレルを有する。各個体は、この場合、多型の１つのアレルについて同型接合である（即ち、個体の両方の染色体コピーは、そのＳＮＰ位置で同じヌクレオチドを有する）か又はその個体は、異型接合である（即ち、個体の２つの姉妹染色体は、異なるヌクレオチドを含有する）。本明細書において報告されるＳＮＰの命名法は、それぞれ独自のＳＮＰに対して国立生命工学情報センター（ＮＣＢＩ）によって割り当てられるような公式のレファレンスＳＮＰ（ｒｓ）ＩＤ識別タグを参照とするか、又は同定された遺伝子多型に関連する残基変化を明確にする。
【００２１】
[57]  本明細書に使用するように、「参照表（look-up table）」という用語は、あるデータ形式を別の形式へ関連付ける、又は１以上のデータ形式をそのデータが関連する、表現型又は形質のような予測結果へ関連付ける表である。例えば、参照表は、本明細書に記載のような遺伝的変異と、その変異を保有する個体が示す可能性があるか又はその変異を保有しない個体より示す可能性が高い特別な形質又は表現型（例、薬物に関連した有害事象のリスク、又は標準用量での不十分な薬物活性）との相関性を含み得る。参照表は、多次元的であり得る、即ち、それらは、多数の遺伝的変異（例、アレル、ＳＮＰ、遺伝子欠失又は挿入）に関する情報を含有し得るか又はそれらは、多数の変異に関する情報を含有し得る；それらはまた、診断、ジェンダー、民族性，併存疾患、等のような患者特有の臨床データが含まれる他の非遺伝的要因、並びに、例えば、治療法と医薬品が含まれる治療オプションに関する情報を含み得る。
【００２２】
[58]  本明細書に使用するように、「デシジョンツリー」という用語は、多変量データ解析及び分類化のための標準的な機械学習技術に関連する（Hastie, T., et al.「The Elements of Statistical Learning（統計学習の要素）」第2版、スプリンガー (2009)；Witten, I. and Frank, E.「Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques（データマイニング：実践的な機械学習ツール及び技術）」第2版、モーガン・カウフマン、サンフランシスコ (2005)；Hothorn, T. Journal of Computational and Graphical Statistics, 15:651-74 (2010)）。デシジョンツリーを使用して、決定支援システム用の容易に解釈可能で直観的な規則を導くことができる。
【００２３】
[59]  本発明の態様には、それぞれの遺伝的変異の診断又は予後マーカーとしての別々の使用、又は１つのパネルに組み合わせた２以上の変異の使用が含まれ、ここでそのパネルは、表現型（例、薬物誘発性又は薬物関連性の有害事象、又は薬物の標準用量での無効性）のより良好な予測因子である。
【００２４】
遺伝的変異と非遺伝的要因
[60]  本発明は、臨床決定支援のための方法、例えば、鎮痛薬の必要な患者に適したそれを選択するための方法、並びに重篤な薬物誘発性（又は薬物関連性）の有害事象のリスク状態にある患者を同定するための方法を提供する。該方法は、特別な遺伝的変異での患者の遺伝子型に関する情報を単独で、又は他の遺伝的要因又は（年齢、ジェンダー、民族性、併存疾患、診断、等のような）非遺伝的要因との組合せにおいて利用して、該患者に適した医薬品の選択を知らせて、重篤な薬物誘発性（又は薬物関連性）の有害事象のリスク状態にある患者、特に高リスク状態にある患者を同定する。
【００２５】
ＡＴＰ結合カセットＢ１（ＡＢＣＢ１）（ＭＣＲ１としても知られる）
[61]  モルヒネの脳中濃度は、血液脳関門にあるＰ−糖タンパク質輸送体、ＡＢＣＢ１によって影響されける。ＡＢＣＢ１の遺伝子多型、３４３５Ｃ＞Ｔは、成人におけるモルヒネの血液脳関門輸送活性に関連付けられていて、同型接合のＴＴ遺伝子型は、他の遺伝子型より高いモルヒネの最大ＣＳＦ濃度に関連していた（Meineke, I. et al., British Journal of Clinical Pharmacology, 54:592-603 (2002)）。以前から、同じＡＢＣＢ１遺伝子多型の３４３５Ｃ＞Ｔは、別のオピオイド、フェンタニルを受容している韓国の成人での呼吸抑制増加と関連付けられてきた（Park, H. et al., Clin.Pharmacol. Ther., 81:539-546 (2007)）が、小児におけるモルヒネ誘発性呼吸抑制にＡＢＣＢ１変異が関連しているかどうかは、実施例７において詳述される研究までは知られていなかった。その実施例において記載されるように、ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４は、白人種とアフリカ系アメリカ人の小児の両方で、呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在の延長と強く関連していた（人種特異的な影響は検出されなかった）。このように、ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４のＧＧ同型接合体は、病院滞在の延長をもたらす呼吸抑制のリスクを増加させた。本研究において観測された別の臨床的に重要な関連性は、ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９と、ＰＡＣＵでモルヒネの救助的投与を必要とした小児における術後モルヒネ用量との間にあった。ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９のマイナーアレル（Ａ）のそれぞれの追加コピーは、術後モルヒネ用量を０．０４ｍｇ／ｋｇだけ減少させた（９５％ＣＩ：０．０１〜０．０７）。従って、ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９のＣＣ同型接合体では、術後の鎮痛介入が必要とされるときにより多くのモルヒネが要求され、一方ＡＡ遺伝子型の小児は、モルヒネに対してより感受性が高くて、モルヒネをさほど必要としない。
【００２６】
ＡＢＣＣ３
[62]  胆管側多選択性有機アニオン輸送体２は、肝細胞の側基底面において主に発現されるＡＢＣＣ３遺伝子によってエンコードされて（Scheffer, G., et al., Lab Invest., 82:193-201 (2002)）、モルヒネの活性代謝産物、Ｍ３Ｇ及びＭ６Ｇが含まれるグルクロニドへの高親和性を有すると報告されたことがある（Zelcer, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 102:7274-9 (2005)）。−２１１Ｃ＞Ｔ  ＴＴ遺伝子型の被験者では、ＣＣ遺伝子型よりも、おそらくは該遺伝子のプロモーター領域への核内タンパク質の結合の低下により、肝臓組織におけるｍＲＮＡ発現が減少していると報告された（Lang, T. et al., Pharmacogenetics, 14:155-64 (2004); Gradhand, U. et al., Life Sci., 80:1490-4 (2007)）。実施例２において詳しく記述されるように、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５でＣ／Ｃ遺伝子型の小児は、モルヒネの２つの活性代謝産物の４１〜４６％高い生成を有し、この遺伝子型がモルヒネの薬物動態に対して有意な影響があることを示唆して、この遺伝子型が白人種においてより頻出するので、アフリカ系アメリカ人に比較して、白人種においてモルヒネクリアランスがより低くてモルヒネの有害作用の発生率がより高いことへの有り得る説明を提供する。実施例３において考察するように、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５の薬物動態効果を確認して、有意な薬物動態効果を有する別のＡＢＣＣ３変異を同定した。このＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ遺伝子型も、他の遺伝子型と比べて、モルヒネの活性代謝産物のより高い生成に関連していることが見出された。加えて、有害事象（例、術後の悪心及び嘔吐と、呼吸抑制による回復期の滞在の延長）が含まれる臨床転帰と総モルヒネ要求量に有意に関連しているものとして、いくつかのＡＢＣＣ３変異が同定された。これらには、例えば、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２、ｒｓ７３９９２３、及びｋｇｐ８５６０６７７が含まれる。他の変異についても実施例３に記載する。
【００２７】
脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）
[63]  脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）は、アナンダミド異化の原因となる、内在性カンナビノイド系の一部である。アナンダミドは、嘔吐の神経修飾物質である。ＦＡＡＨは、ＣＢ１受容体への内因性アゴニストとして、アナンダミドを分解する。カンニボイド（canniboid）アゴニストは、ＣＢ１受容体を介して、オピオイドに抗する有効な鎮吐薬となる。実施例１において詳述されるように、白人種患者では、ＰＯＮＶと３種のＳＮＰ（ｒｓ３２４４２０、ｒｓ２２９５６３２、及びｋｇｐ１２５１７３６９）の間に、そして総モルヒネ用量とｒｓ６４７３２５の間に有意な関連が検出された。しかしながら、アフリカ系アメリカ人の患者では、その転帰のいずれについても、名義的な関連しか検出されなかった。白人種では、ＦＡＡＨ  ｒｓ４１４１９６４、ＦＡＡＨ  ｒｓ３７６６２４６、ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０、ＦＡＡＨ  ｒｓ２２９５６３２、及びＦＡＡＨ  ｋｇｐ１２５１７３６９のマイナーアレルの１コピーが加わると、ＰＯＮＶの確率がそれぞれ２．４２、２．４２、２．７３、２．６１、及び２．６１倍増加した（Ｐ＜０．００１８）。ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０は、ＰＯＮＶと有意に関連して（Ｐ＝０．００５３）、マイナーアレル（Ａ）の１コピーが加わると、オッズ比が２．０倍高まって；それは、ＰＡＣＵ滞在延長をもたらすＰＯＮＶとも関連して（Ｐ＝０．０２０９）、マイナーアレル（Ａ）の１コピーが加わると、そのオッズ比が２．２倍高まった。実施例３において考察するように、ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０のＰＯＮＶとの強い関連性は、より大きな標本でさらに立証された。
【００２８】
オピオイド受容体μ１（ＯＰＲＭ１）
[64]  その受容体をコードするオピオイド受容体ｍｕ１（ＯＰＲＭ１）遺伝子は、疼痛知覚とオピオイドへの反応における変異の候補遺伝子であり得る（Mogil, J. Proc. Natl. Adac. Sci. U.S.A., 96:7744-51 (1999)）。ＯＰＲＭ１  ｒｓ１７９９９７１（Ａ１１８Ｇ）は、脳中でのμ受容体結合能の減少をもたらす（Ray, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 108:9268-73 (2011)）。ＧＧ同型接合遺伝子型の成人保有者は、ＡＡ変異体より２〜４倍まで高いモルヒネ用量を要求することができる。実施例４は、ＯＰＲＭ１  ＡＡ遺伝子型の保有者では、ＡＧ／ＧＧ遺伝子型の保有者に比較して、モルヒネ要求量がより少ないにもかかわらず、呼吸抑制のリスクがより高いこと、そしてさらに、Ｇアレルの存在が保護効果を有することを示す、最初の前向き臨床試験について記載する。この関連性は、呼吸抑制のより高いリスク状態にある小児を同定することと、重篤な有害事象の見込みを最小にする一方で疼痛緩和を最大にするように小児におけるモルヒネの使用を個別化することにおいて有用である。
【００２９】
ＯＣＴ１
[65]  モルヒネがＯＣＴ１の基質であることについては十分に明らかにされているが、実施例２に記載されるその活性代謝産物の取込みにおけるＯＣＴ１の役割は、これまで知られていなかった。実施例２に提示する結果は、モルヒネクリアランスに対するＯＣＴ１の影響が現在推定されている１６％よりずっと高い可能性があることを示し、同型接合の被験者は、モルヒネ投薬に反応して、より良好な鎮痛であるがより不良な有害反応を経験することを意味する。
【００３０】
閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）
[66]  閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）は、アフリカ系アメリカ人の患者の間で大きな比率を占めていて、彼らは、不十分な疼痛緩和のより高いリスク状態にある可能性がより高い。故に、ＯＳＡと人種は、重要な共変数を代表するが、それがさらに注目されるのは、ＡＤＲＢ２とＦＡＡＨの遺伝子多型を使用して、比較的正確に人種を予測することができる（約８０％の予測精度）という知見による。ＯＳＡそれ自体も、ほとんど理解されていないものの、比較的強い遺伝要素を有するようである（Larkin, E. et al. Resp. Crit. Care Med. 182:947-53 (2010)）。ＯＳＡは、扁桃摘出術の適応症でもある。
【００３１】
ジェンダー
[67]  いくつかの前臨床試験と実験研究によって、齧歯動物の雄と雌の間での疼痛調節における差異と、そして成人においても、女性での疼痛とオピオイド感受性の増加に関連した差異が示されているが、術後疼痛と性差について検討した臨床試験結果は、一致していない。さらに、成人試験に由来する、オピオイド鎮痛薬に関連した性差のデータは、小児の臨床診療を確実に導くのに十分ではない（Hurley R. and Adams M. Anesth. Analg., 107:309-17 (2008)）。実施例６において詳しく考察するように、術後の悪心及び嘔吐（ＰＯＮＶ，ｐ＝０．００１）とＰＯＮＶによるＰＡＣＵ滞在の延長（ｐ＝０．０１０）では、有意な性特異的な影響が検出された。女児では、総モルヒネ用量の増加に伴ってこれらの有害作用を有する確率が高かったのである。
【００３２】
マーカーとハプロタイプの評価
[68]  特異的な多型マーカー及び／又はハプロタイプを検出することは、当該技術分野で知られている、多型部位で配列を検出するための方法によって達成することができる。例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ネステッド（nested）ＰＣＲ、及び核酸増幅用の他の技術を利用して、蛍光ベースの技術のような、ＳＮＰ及び／又はマイクロサテライトマーカーの存在について遺伝子型決定するための標準技術を使用することができる（例えば、 Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999); Kutyavin et al., Nucleic Acid Res. 34:e128 (2006)）。ＳＮＰ遺伝子型決定のために利用可能な特定の市販の手法には、限定されないが、TaqMan 遺伝子型決定アッセイと SNPlex プラットフォーム（アプライド・バイオシステムズ）、ゲル電気泳動法（アプライド・バイオシステムズ）、質量分析法（例、Sequenom 製の MassARRAY システム）、ミニ配列決定法、リアルタイムＰＣＲ、Bio-Plex システム（BioRad）、 CEQ 及び SNPstream システム（ベックマン）、アレイハイブリダイゼーション技術（例、Affymetrix GeneChip；Perlegen）、BeadArray Technologies（例、Illumina GoldenGate 及び Infinium アッセイ）、アレイタグ技術（例、Parallele）、及びエンドヌクレアーゼベースの蛍光ハイブリダイゼーション技術（Invader；ThirdWave）が含まれる。このように、当業者に利用可能な上記又は他の方法の使用によって、多型マーカー（マイクロサテライト、ＳＮＰが含まれる）又は他の種類の多型マーカーで１以上のアレルを同定することができる。
【００３３】
[69]  ある疾患又は形質への罹患性が増加している（即ち、リスク増加）状態にある個体とは、その中で、その疾患又は形質への罹患性増加（リスク増加）を付与する１以上の多型マーカー又はハプロタイプで、少なくとも１つの特異的なアレル（即ち、リスク状態マーカーのアレル又はハプロタイプ）が同定される個体である。このリスク状態マーカー又はハプロタイプは、該疾患のリスク増加（罹患性増加）を付与するものである。いくつかの態様では、マーカー又はハプロタイプと関連する有意性が相対リスク（ＲＲ）によって測定される。いくつかの態様では、マーカー又はハプロタイプと関連する有意性がオッズ比（ＯＲ）によって測定される。さらなる態様において、その有意性は、百分率によって測定される。
【００３４】
[70]  本明細書に記載されるリスク状態の多型マーカー又はハプロタイプとは、少なくとも１つのマーカー又はハプロタイプの少なくとも１つのアレルが、ある形質についてリスク状態にある、例えば、鎮痛薬、特にオピオイドからの、特に周術期疼痛のための治療の間の不十分な疼痛緩和又は有害作用（例、難治性であり得る、術後の悪心及び嘔吐、呼吸抑制、及び呼吸抑制による回復期の滞在の延長）のリスク状態にある個体において、比較群（対照）におけるその存在の頻度に比べて、より頻繁に存在する場合のものであって、そのマーカー又はハプロタイプの存在は、その形質への罹患性の指標となる。いくつかの態様において、対照群は、集団標本、即ち、一般集団からのランダム標本であり得る。いくつかの態様において、対照群は、１以上の追加の非遺伝リスク因子、例えば、ジェンダー、年齢、及び人種の非存在を特徴とする。いくつかの態様において、リスク因子は、少なくとも１つの追加の遺伝リスク因子を含む。
【００３５】
[71]  本発明のいくつかの態様では、ある形質への罹患性が減少している（即ち、リスク減少）状態にある個体とは、その中で、罹患性減少を付与する１以上の多型マーカー又はハプロタイプで、少なくとも１つの特異的なアレルが同定される個人である。リスク減少を付与するマーカーアレル及び／又はハプロタイプは、保護的であるとも言われる。いくつかの態様において、保護的なマーカー又はハプロタイプとは、ある形質の有意なリスク（又は罹患性）減少を付与するものである。
【００３６】
[72]  当業者は、研究されている集団に２つのアレルが存在するマーカー（ＳＮＰのような）では、その集団中で１つのアレルがある形質の個体群において、対照と比較して増加した頻度で見出される場合、そのマーカーの他のアレルは、その形質の個体群において、対照と比較して減少した頻度で見出されるであろうと理解されよう。そのような場合、そのマーカーの一方のアレル（その形質のある個体において増加した頻度で見出されるもの）がリスク状態アレルとなるのに対し、他のアレルは、保護的なアレルとなろう。
【００３７】
[73]  ある形質に関連した遺伝的変異を単独で使用して、所与の遺伝子型について、その疾患のリスクを予測することができる。ＳＮＰのような二対立遺伝子マーカーでは、３つの可能な遺伝子型がある：リスク状態変異についての同型接合体、異型接合体、及びリスク状態変異の非保有者。多数の遺伝子座での変異に関連したリスクを使用して、全リスクを推定することができる。多重ＳＮＰ変異では、ｋ通りの可能な遺伝子型がある（ｋ＝３ｎ×２ｐ；ここでｎは、常染色体遺伝子座の数であって、ｐは、生殖染色体（性染色体）遺伝子座の数である。複数のリスク変異についての全リスク評価の計算は、典型的には、異なる遺伝的変異の相対リスクを掛け合わせると仮定する、即ち、特別な遺伝子型の組合せに関連した全リスク（例、ＲＲ又はＯＲ）は、各遺伝子座での遺伝子型についてのリスク値の積である。提示されるリスクがある個人又はある個人に特異的な遺伝子型についての、ジェンダーと民族性が同じである準拠集団と比較した相対リスクであれば、複合リスクとは、遺伝子座特異的なリスク値の積であって、それはまた、その集団と比較した全リスク推定値に対応する。ある個人のリスクがリスク状態アレルの非保有者との比較に基づくならば、複合リスクは、所与の遺伝子型の組合せがすべての遺伝子座にある個人を、その遺伝子座のどこでもリスク変異を保有しない個体群と比較する推定値に対応する。リスク状態変異の非保有者の群は、最低の推定リスクを有して、それ自身（即ち、非保有者）と比較して１．０の複合リスクを有するが、集団と比較すれば、１．０未満の全リスクを有する。明記すべきことは、非保有者の群が、特に多数の遺伝子座では、きわめて小さくなり得る可能性が高くて、その場合、その妥当性もそれに応じて小さくなることである。
【００３８】
[74]  この乗法モデルは、通常は、複合形質のデータを十分合理的に適合させる節減（parsimonious）モデルである。多数性からの逸脱については、通常疾患についての共通変異の状況ではほとんど記載されてこなかったし、報告されたとしても、通常は示唆的なものでしかない。これは、遺伝子座間の統計学的な相互作用を証明することを可能にするのに、きわめて大きな標本サイズが典型的には必要とされるからである。
【００３９】
[75]  例えば、前立腺癌に関連していると記載されてきた全部で８種の変異について考察しよう（Gudmundsson, et al., Nat Genet 39:631-7 (2007); Gudmundsson, et al., Nat Genet 39:977-83 (2007); Yeager, et al., Nat Genet 39:645-49 (2007); Amundadottir, et al., Nat Genet 38:652-8 (2006); Haiman, et al., Nat Genet 39:638-44 (2007)）。これら遺伝子座の７つは常染色体上にあって、残る遺伝子座は、Ｘ染色体上にある。それで、遺伝子型の組合せの理論的な総数は、３７×２１＝４３７４である。この遺伝子型群のいくつかは、ごく稀であるがそれでも可能であって、これらを全リスク評価のために考慮することができる。多重遺伝的変異の場合に適用される乗法モデルは、遺伝的変異が「環境」因子と明白には相関しないと仮定すれば、非遺伝リスク変異と組み合わせても、正当であり得る。言い換えると、遺伝リスク状態変異と非遺伝リスク状態変異については、非遺伝リスク因子と遺伝リスク因子が相互作用しないと仮定して、乗法モデルの下で評価して、複合リスクを推定することができる。
【００４０】
[76]  同じ定量的アプローチを使用して、本明細書に開示するマーカー及び／又は遺伝子多型、又はそれらと連鎖不平衡状態にあるマーカーのいずれの組合せも含まれる、有害な麻酔作用に関連した複数の変異に関連する複合又は全リスクについて評価することができる。
【００４１】
リスク計算
[77]  全遺伝リスクを計算するモデルの創出には、２つの工程が関与する：ｉ）単一遺伝的変異のオッズ比を相対リスクへ変換すること、及びｉｉ）異なる遺伝子座における多重変異由来のリスクを単一の相対リスク値へ組み合わせること。
【００４２】
オッズ比からリスクを導くこと
[78]  権威のある雑誌においてこれまで公表されてきた複雑な疾患又は形質についてのほとんどの遺伝子探索研究では、その後ろ向き設定による症例対照デザインが利用されてきた。これらの研究では、症例（特定の疾患状態を有する人々）と対照個体の選択セットを標本にして遺伝子型決定する。その関心は、症例と対照におけるその頻度が有意に異なる遺伝的変異（アレル）にある。
【００４３】
[79]  その結果は、典型的には、罹患群と対照群におけるリスク変異（保有者）対非リスク変異（非保有者）の割合（確率）の間の比について記載する、オッズ比で報告される。即ち、罹患状態に対する条件付き確率で表現される：
ＯＲ＝（Ｐｒ（ｃ｜Ａ）／Ｐｒ（ｎｃ｜Ａ））／（Ｐｒ（ｃ｜Ｃ）／Ｐｒ（ｎｃ｜Ｃ））
[80]  いくつかの態様において、特定の疾患又は形質についての絶対リスクは、決定されているもの、即ち、該疾患になるリスク変異を保有する個体の割合、又は言い換えると、該疾患になる確率である。一部は「症例」対「対照」の比が典型的には一般集団におけるそれと同じでないという理由から、この数字を症例−対照研究において直接測定することはできない。しかしながら、ある仮定の下では、オッズ比の値からリスクを計算することができる。
【００４４】
多重マーカーからリスクを組み合わせること
[81]  多くのＳＮＰ変異の遺伝子型を使用して個体のリスクについて評価する場合、他に述べなければ、リスクについての乗法モデルを仮定することができる。このことは、集団に対する複合した遺伝リスクが個別マーカーの対応推定値の積として計算されることを意味する。例えば、２つのマーカー、ｇ１とｇ２では：
ＲＲ（ｇ１，ｇ２）＝ＲＲ（ｇ１）ＲＲ（ｇ２）
[82]  その根底にある仮説は、そのリスク因子が非依存的に生じて挙動するということ、即ち、同時条件付き確率を積として表し得ることである：
Ｐｒ（Ａ｜ｇ１，ｇ２）＝Ｐｒ（Ａ｜ｇ１）Ｐｒ（Ａ｜ｇ２）／Ｐｒ（Ａ）であって、Ｐｒ（ｇ１，ｇ２）＝Ｐｒ（ｇ１）Ｐｒ（ｇ２）
[83]  マーカーがゲノム上に近接して隔てられている、即ち、２以上のリスクアレルの同時発生が相関するような連鎖不平衡状態にある態様では、相関するＳＮＰのすべてのアレルの組合せに対してオッズ比が規定されるハプロタイプモデリングを利用することができる。
【００４５】
[84]  １例として、２型糖尿病のリスクに関連した４種のマーカーでの以下の遺伝子型を、各マーカーでの集団に対するリスクともに有する個体について考慮しよう：
第３染色体（Chromo3）  ＰＰＡＲＧ  ＣＣ算出リスク：ＲＲ（ＣＣ）＝１．０３
第６染色体（Chromo6）  ＣＤＫＡＬ１  ＧＧ算出リスク：ＲＲ（ＧＧ）＝１．３０
第９染色体（Chromo9）  ＣＤＫＮ２Ａ  ＡＧ算出リスク：ＲＲ（ＡＧ）＝０．８８
第１１染色体（Chromo11）  ＴＣＦ７Ｌ２  ＴＴ算出リスク：ＲＲ（ＴＴ）＝１．５４
[85]  組み合わせると、この個体の集団に対する全リスクは、１．０３×１．３０×０．８８×１．５４＝１．８１である。
【００４６】
リスク評価
[86]  本発明の態様は、個体由来のゲノムＤＮＡを含んでなる試料について、有害な薬物反応、具体的には、特にオピオイドとモルヒネに関連していると本明細書に記載される変異の存在を評価する方法へ向けることができる。このような方法は、典型的には、当業者によく知られて本明細書にさらに記載される方法を使用して、少なくとも１つの多型マーカーの少なくとも１つのアレルの存在又は非存在を検出することを含み、そのような評価の結果に基づいて、その試料が由来する個体が有害な麻酔作用のリスクが増加又は減少している（罹患性が増加又は減少している）状態にあるかどうか判定する。いくつかの態様では、多型マーカーの特別なアレルを検出することを、少なくとも１つの多型マーカーの少なくとも１つのアレルが確認される特別なヒト個体に関する核酸配列データを入手することによって行うことができる。少なくとも１つのマーカーの異なるアレルは、ヒトにおけるそのような作用に対する異なる罹患性に関連している。核酸配列データを入手することはまた、単一のヌクレオチド位置での核酸配列を同定することを含み得て、このことはＳＮＰでのアレルを同定するのに十分である。核酸配列データはまた、特に多数のヌクレオチド位置を含む遺伝子マーカーについて、他の任意数のヌクレオチド位置での配列情報を含み得て、２個〜数十万個、可能であれば数百万個のヌクレオチド（特に、ＣＮＶの場合）のいずれの範囲でもあり得る。
【００４７】
[87]  いくつかの態様において、該方法は、ある疾患又は形質に関連する少なくとも１つの多型マーカー（又は該疾患又は形質に関連する少なくとも１つのマーカーと連鎖不平衡状態にあるマーカー）の遺伝子型状態に関する情報を含んでなるデータセットの利用を含む。言い換えると、そのような遺伝子状態に関する情報を、例えば、配列データ、特定の多型マーカー又は複数のマーカー（例えば、特定のリスク状態アレルの存在又は非存在を示すもの）での遺伝子型の数、又は１以上のマーカーについての実際の遺伝子型の形式で含有するデータセットについて、本明細書に開示するような特定の多型マーカーでの特定のリスク状態アレルの存在又は非存在を検索して、該疾患又は形質に関連付けることができる。該疾患又は形質に関連した変異（例、マーカーアレル）についての陽性結果は、そのデータセットが由来する個体が該疾患への罹患性が増加した（リスク増加）状態にあることを示唆する。
【００４８】
[88]  いくつかの態様では、遺伝子多型の少なくとも１つのアレルと疾患の間の相関性を含む参照表へ多型マーカーについての遺伝子型データを参照にすることによって、多型マーカーを該疾患又は形質へ相関させる。いくつかの態様において、該表は、１つの遺伝子多型についての相関性を含む。いくつかの態様において、該表は、複数の遺伝子多型についての相関性を含む。あるマーカーと疾患の間の相関性について示唆する参照表を参照することによって、試料が由来する個体において、該疾患又は形質へのリスク又は該疾患又は形質への罹患性を同定することができる。いくつかの態様において、その相関性は、統計的測定値として報告される。この統計的測定値は、相対リスク（ＲＲ）、絶対リスク（ＡＲ）、又はオッズ比（ＯＲ）のようなリスク尺度として報告することができる。
【００４９】
[89]  本明細書に記載するマーカーは、単独でも組み合わせても、リスク評価と診断目的のために有用であり得る。本明細書に記載のマーカーに基づいた、有害な麻酔作用を蒙るリスクの結果はまた、有害な麻酔作用についての他の遺伝子マーカー又はリスク因子のデータと組み合わせて、全リスクを確定することができる。このように、個々のマーカーによるリスクの増加が比較的小さい（例えば、１０〜３０％のオーダーにある）場合であっても、その合体は、重大な意義を持つ可能性がある。従って、比較的共通した変異でも、全リスクへ有意な貢献をする（集団起因リスクが高い）可能性があるか、又はマーカーの組合せを使用して、マーカーの複合リスクに基づいて、有害な麻酔作用による合併症を発症する有意な複合リスク状態にある個体群を明確にすることができる。
【００５０】
[90]  このように、いくつかの態様では、全リスク評価のために複数の変異（遺伝子マーカー、バイオマーカー、及び／又はハプロタイプ）を使用する。いくつかの態様では、本明細書に開示されるような変異からこれらの変異を選択することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示されるような変異の、有害な麻酔作用への罹患性を診断するのに有用であることが知られている他の変異と組み合わせた使用が使用される。そのような態様では、複数のマーカー及び／又はハプロタイプ遺伝子型状態が個体において決定されて、その個体の状態を、関連する変異の集団頻度、又は臨床的に健常な被験者（同年齢の被験者又は同性の被験者のような）における該変異の頻度と比較する。引き続き、多変量解析又はジョイントリスク分析のような、当該技術分野で知られた方法や当業者に知られた他の方法を使用して、多数の遺伝子座での遺伝子型状態に基づいて付与される全リスクを決定することができる。続いて、そのような解析に基づいたリスクの評価を、本明細書に記載のような本発明の方法、使用、及びキットにおいて使用することができる。
【００５１】
[91]  有害な麻酔作用を蒙るリスク状態変異が同型接合である個体は、そのような作用が発現される特に高いリスク状態にあり得る。これは、同型接合の保有者のリスクが各アレルのコピーについて二乗されたリスクとして概して推定されるように、リスク状態アレルの用量依存的な効果によるものである。
【００５２】
[92]  本明細書に記載のＳＮＰマーカーについて、麻酔剤及び鎮痛剤からの有害作用が観察される状況では、患者において過剰に見出されるアレル（リスク状態アレル）と反対のアレルが減少した頻度で見出される。このように、ＬＤにおける、及び／又は年齢、人種、体重（又は肥満度指数、ＢＭＩ）が含まれる他の因子とともにそのようなマーカーを含んでなるこれらのマーカー及びハプロタイプは、有害な麻酔及び鎮痛作用に対して保護的である、即ち、それらは、これらのマーカー及び／又はハプロタイプを保有する個体が疼痛及び／又は麻酔薬及び鎮痛薬からの有害作用を発現することへの減少したリスク又は罹患性を付与する。
【００５３】
[93]  いくつかの態様では、あるハプロタイプが含まれる、本明細書に開示されるような変異が様々な遺伝子マーカー（例、ＳＮＰとマイクロサテライト）の組合せを含み得る。ハプロタイプを検出することは、多型部位での配列を検出するための、当該技術分野で知られている、及び／又は本明細書に記載される方法によって達成することができる。さらに、標準技術を使用して、特定のハプロタイプ又はマーカーのセットと疾患表現型の間の相関性を証明することができる。相関性についての簡易検定の代表例は、２×２表に対するフィッシャー（Fischer）の正確検定であろう。
【００５４】
予測モデル
[94]  デシジョンツリーは、決定支援システム用の容易に解釈可能で直観的な規則を導くために使用し得る、多変量データ解析及び分類化のための標準的な機械学習技術である。デシジョンツリーは、データを簡単な論理規則によって諸層へ階層的に分ける、再帰分割アプローチとみなすことができる。デシジョンツリーの利点は、その簡明性、カテゴリー変数と数的変数だけでなく欠損値も取り扱えること、外れ値及び尺度調整（scaling）への頑健性、並びに特徴選択を層別化及び分類化と組み合わせる能力である。デシジョンツリーはまた、決定支援システム用の容易に解釈可能で直観的な規則を導くために使用し得る。
【００５５】
[95]  デシジョンツリーを使用して、最も予測能力のあるＳＮＰを人口統計学上、臨床上、及び他の入力特徴とともに選択して、これらを組み合わせて、患者を分類して有害作用を予測するために使用し得る簡単な論理則として、それによって不十分な疼痛緩和とオピオイド関連の有害作用に関する確実で正確なポイント・オブ・ケア予測が可能になる。そのような知識は、個別化された治療を可能にする。
【００５６】
[96]  これまでに観測された個別層と複雑な相互作用のパターンは、オピオイドの輸送、感知、及び代謝に関与する遺伝子のような、特異的な遺伝子多型の相互作用が小児におけるモルヒネの有害作用に有意に影響を及ぼすかどうかの体系的な判定法をもたらしてきた。現行アプローチの限界により、個別化される介入へのより確実で正確な決定則を提供することができる、個別対応の解決法と拡張法へのニーズが存在する。
【００５７】
[97]  ＣＡＲＴのような標準的な再帰分割（又はデシジョンツリーベースの）アプローチを初めて使用して、有害作用、疼痛感受性、及び他の臨床表現型の状況において、遺伝子−遺伝子相互作用の特異的なパターンに関連した個別層を同定して分析した。次いで、遺伝子型決定、人口統計、及び関連の臨床データを組み合わせて、オピオイド誘発性呼吸抑制の転帰が含まれる、有害作用のリスクが高いか又は低い患者を予測するための論理則を導いた。このようなモデルの予測能力は、固有の生物学的ノイズ、限定された標本サイズ、及び（分子レベル、ひいては臨床レベルの転帰における変動をもたらし得る多くの機序の代表となる）複雑な相互作用のパターンによって制限される。特異的な層の状況においてのみ出現し得る、より弱い関連性も同様に存在し得るが、検出することは難しい。
【００５８】
[98]  アレル（加法）、優性、及び劣性モデル、並びに三分探索木（ここでは、分離した各遺伝子型の値についても実施して、個別層の同定及び解析を容易にする）を取り込むことによって、デシジョンツリーと関連した論理則を強化した。加えて、フェーズモデルと類似の集団ベースのモデルを使用して、各遺伝子についてのハプロタイプ再構築（ここで含まれるいくつかの遺伝子では、強いＬＤのパターンが観測される）を取り込んで、決定則の簡略化とデータにおいて観測される多くの暗示的な相互作用の説明を可能にした。古典的なデシジョンツリー、支援ベクターマシン（ＳＶＭ）、及び階層型エキスパート混合（ＨＭＥ）モデルを統合した。
【００５９】
[99]  ＨＭＥアプローチは、確率論的デシジョンツリーとみなすことができる（Hasti et al., 第9章とその中の参考文献を参照のこと）。例示のＨＭＥデシジョンツリーにおいて、終端節点は、応答（例、有害作用）の個別（及び状況依存的な）予測を提供する「エキスパート」（又はエキスパートネットワーク）と呼ばれる。これらの個別予測を非終端節点のデシジョンモデル（「ゲーティングネットワーク」）によって組み合わせる。典型的には、インプットの線形結合を使用して、線形又はロジスティック回帰モデルをそれぞれの終端節点において適合させる。例えば、客観的な術後疼痛スコア（Ｐ）を遺伝子と他の予測因子の関数とする以下のモデルのように：
Ｅ（Ｐ｜Ｘ）＝β０＋β１（年齢）＋β２（性別）＋β３（人種）＋β４（ＧＣＨ１）＋β５（ＣＯＭＴ）＋β６（ＡＢＣＢ１）＋他の因子
[100]  上記の式において、Ｅ（Ｙ｜Ｘ）は、予測因子変数（特徴）ベクターがＸと仮定される場合のＹの期待値を意味する。確実な線形ＳＶＭ予測因子を使用することによるように、他の好適な分類化（又は回帰）アプローチを使用して、エキスパートモデルを一般化することができる。このアプローチでは、終端ＳＶＭモデルを状況依存的なやり方で最適化されるエキスパート分類器のアンサンブルとみなすことができる（適用可能な場合は、一分類ＳＶＭが含まれる）。
【００６０】
[101]  このことは、異なるデータのサブセットに関して最適化される分類器のアンサンブルを開発して（交差検証の文脈におけるように）、それを組み合わせてより確実な結果と関連した信頼レベル（これは、アンサンブル内の一貫性に関して定義される）を提供することと比較され得る。ここでは、標準的なデシジョンツリーを（可能であれば、リサンプリングとブースティングとともに）使用して入手される確実な個別層によってそのようなサブセットを定義した。従って、そのような拡張型ＨＭＥモデルのツリートポロジーは、元のデシジョンツリー分析において同定される安定層を代表して、ＨＭＥアプローチの限界の１つ、即ち、良好なツリートポロジーを見出すための方法の不足に対処することが期待されよう。故に、得られるツリーは、決定則の解釈の容易さを保つと同時に、正確度を改善する。
【００６１】
[102]  ニューラルネットワーク、プロトタイプ、及びカーネルベースのアプローチが含まれる、他の標準的な統計法と機械学習法も適用して、遺伝子−遺伝子相互作用のパターンをさらに詳しく吟味して、それらの予測能力について評価した（そして、この新たなアプローチの相対的な利点を評価した）。訓練コホート全体を反復的に（そして無作為的に）訓練及び検証のサブセットへ分割する交差検証を使用して、正確度を評価して、得られる決定則と観測層の安定性について評価した。全分類化正確度が含まれる正確度、精度、リコール（recall）、及びＲＯＣ曲線下面積の標準測定値を使用して、提唱される混合型再帰分割モデルに基づいて、決定則の正確度を評価した。
【００６２】
アドレス可能な集団
[103]  一般的な意味において、本発明の方法及びキットは、あらゆる供給源とあらゆる個体由来の核酸物質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含有する試料から、又はそのような試料から導かれる遺伝子型データから利用することができる。いくつかの態様において、個体は、ヒト個体である。個体は、成人、小児、又は胎児であり得る。核酸供給源は、生体試料が含まれる、核酸物質を含んでなるどの試料であっても、それに由来する核酸物質を含んでなる試料であってもよい。本発明の態様はまた、標的集団の成員である個体においてマーカー及び／又はハプロタイプについて評価することを提供する。そのような標的集団とは、１つの態様において、例えば、遺伝的要因、バイオマーカー、生物物理パラメータ、麻酔関連合併症の既往歴、麻酔に対するアレルギー反応、麻酔関連合併症の家族歴、等といった他のパラメータに基づいて、有害な麻酔作用を発現するリスク状態にある個体の集団又は群である。
【００６３】
[104]  いくつかの態様において、標的集団には、１８歳未満、１６歳未満、又は１２若しくは１０歳未満の個体のような、特定の年齢亜群からの個体が含まれる。個体は、男性又は女性のいずれの性でもよい。
【００６４】
[105]  本明細書に開示されるような有害な鎮痛及び／又はオピオイド作用に関連することが見出されたマーカーは、本研究において利用した集団以外の他のヒト集団でも類似の関連性を示し得ると考えられる。いくつかの態様において、ヒト被験者は、限定されないが、白人種集団、ヨーロッパ人集団、アメリカ人集団、ユーラシア人集団、アジア人集団、中央／南アジア人集団、東アジア人集団、中東人集団、アフリカ人集団、ヒスパニック系集団、及びオセアニア人集団が含まれる、１以上のヒト集団又はエスニック・グループに由来する。
【００６５】
[106]  個々の被験者における人種の貢献は、遺伝子解析によっても決定することができる。Smith et al．（Am J Hum Genet 74, 1001-13 (2004)）において説明されるもののような、非関連のマイクロサテライトマーカーを使用して、家系の遺伝子解析を行うことができる。
【００６６】
[107]  他に定義しなければ、本明細書において使用する技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al.「Dictionary of Microbiology and Molecular Biology（微生物学・分子生物学辞典）」第3版, J. ウィリー・アンド・サンズ（ニューヨーク州ニューヨーク、2001); March「Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure（先端有機化学反応：機序と構造）」第5版, J. ウィリー・アンド・サンズ（ニューヨーク州ニューヨーク、2001)；及び、Sambrook and Russel「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（分子クローニング：実験マニュアル）」第3版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版局（ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、2001）は、当業者に対して、本出願において使用される用語の多くへの一般的な手引きを提供する。
【００６７】
[108]  当業者は、本明細書に記載されるものに類似しているか又はそれと同等であって、本発明の実施において使用することができる、多くの方法及び材料を認められよう。実際、本発明は、本明細書に記載される方法及び材料に決して限定されない。
【００６８】
診断方法
[109]  本発明の態様では、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドから有害作用を蒙るリスク状態にある患者を評価する方法、又はその評価を支援する方法を提供し、該方法は、そのような作用に相関する遺伝子マーカーで特別なアレルを検出することを含んでなる。いくつかの態様では、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドへの有害作用を発現する罹患性を判定する方法を提供し、該方法は、少なくとも１つの多型マーカー（例、本明細書に記載のマーカー）の少なくとも１つのアレルを検出することを含んでなる。本明細書において開示するように、特別なマーカー又はハプロタイプの特別なアレルが、投与される鎮痛薬からの有害作用を蒙る罹患性の指標となる。そのような作用に対する患者のリスク又は罹患性を評価するための予後又は予測アッセイを使用して、麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドの投与に関連する手技の前と間で被験者用にカスタマイズされる麻酔プロトコールを開発することもできる。
【００６９】
[110]  いくつかの態様では、疼痛知覚、持続的な術後／慢性疼痛、及び／又は麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイド関連の有害作用に関連した少なくとも１つの遺伝子多型の存在又は非存在について、マイクロアレイ又は遺伝子チップ技術（ここでマイクロアレイ又は遺伝子チップは、少なくとも１つの遺伝子多型を含む）を使用して試料を分析することによって、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドから有害作用を蒙るリスク状態にある患者を同定する方法を行う。
【００７０】
[111]  いくつかの態様において、遺伝子チップは、低密度アレイを含む。
[112]  いくつかの態様において、該方法には、疼痛療法と麻酔を特別設計して麻酔薬及び鎮痛薬関連の有害作用を最小にするための、追加の臨床情報の評価が含まれる。いくつかの態様において、該方法には、疼痛療法とオピオイドを特別設計してオピオイド及び鎮痛薬関連の有害作用を最小にするための、追加の臨床情報の評価が含まれる。このような方法における使用のための追加の臨床情報には、限定されないが、患者の年齢、人種、体重（又はＢＭＩ）、睡眠時呼吸障害、ジェンダー、アレルギー、感受性、又は送達される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドの投与経路に影響を及ぼす医学的状態が含まれる。例えば、民族性、治療歴、薬物相互作用、精神不安、ストレスレベル、及び生活様式といった他の因子も、該方法の一部として評価され得る。
【００７１】
[113]  本発明の態様はまた、再帰分割とデシジョンツリーを使用して、遺伝子型−表現型の関連性を解析すること、そして遺伝子と他の非遺伝的変数の間に明確な相互作用パターンがある推定層を同定することへ向けられる。
【００７２】
[114]  本発明の態様において、該方法は、ゲノムＤＮＡを含有する試料を個体より分析のために入手することを含む。該試料は、例えば、口腔スワブ、唾液試料、血液試料又は、本明細書に開示されるような、ゲノムＤＮＡを含有する他の好適な試料、等であり得る。ゲノムＤＮＡは、例えば、ハイスループット技術、又は低密度アレイ技術、等のような、当業者に利用可能などの通常技術を使用しても分析し得る。引き続き、このような遺伝子型決定からの結果について、本明細書に開示される遺伝的変異のような、特別な状態への罹患性変異であることが知られている特定の変異の存在を分析することができる。その個体に特別な遺伝子型によって付与されるリスクを計算することは、その個体の遺伝子型を、例えば（投与される麻酔薬からの有害作用についての変異のような）特別な状態又は形質についてのリスク状態変異の異型接合保有者に関して、その遺伝子型についてこれまでに決定されたリスク（例えば、相対リスク（ＲＲ）又はオッズ比（ＯＲ）として表現される）に比較することに基づくことができる。その個体について算出されるリスクは、ジェンダーと民族性が同一の平均集団と比較した、ある個人について、又はある個人の特異的な遺伝子型についての相対リスクであり得る。平均集団リスクは、準拠集団からの結果を使用して、異なる遺伝子型のリスクの加重平均として表現され得て、次いで、該集団に比べたある遺伝子型群のリスクを計算するのに適した計算を実施することができる。あるいは、個体のリスクは、特別な遺伝子型の比較に基づき、例えば、あるマーカーのリスク状態アレルの異型接合保有者をそのリスク状態アレルの非保有者と比較する。いくつかの態様では、集団平均を使用することがより簡便であり得る。なぜなら、それは、ユーザーにとって解釈するのが容易である尺度、即ち、その個体のリスクを彼／彼女の遺伝子型に基づいて集団の平均と比較して与える尺度を提供するからである。
【００７３】
[115]  標準的な方法を使用して、多重リスク変異についての全リスク計算を実施することができる。例えば、乗法モデルを仮定すること、即ち、個々のリスク変異のリスクを掛け合わせることで全体効果が確定されると仮定することによって、多重マーカーの全リスクの直接計算が可能になる。
【００７４】
[116]  特別なハプロタイプを構成する特別な遺伝子マーカーアレルの、試料中の検出は、本明細書に記載される、及び／又は当該技術分野で知られている多様な方法によって実施することができる。例えば、遺伝子マーカーは、核酸レベルで（例、直接的なヌクレオチド配列決定によるか、又は当業者に知られた他の遺伝子型決定手段によって）、又はその遺伝子マーカーがタンパク質のコーディング配列に影響を及ぼす場合は、アミノ酸レベルで（例、タンパク質配列決定によるか又はそのようなタンパク質を認識する抗体を使用するイムノアッセイによって）検出することができる。本明細書に開示されるマーカーのアレル又はハプロタイプは、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドの有害作用の発現に関連するゲノムセグメント（例、遺伝子）の断片に対応する。そのような断片には、問題の多型マーカー又はハプロタイプのＤＮＡ配列が含まれるが、そのマーカー又はハプロタイプと強いＬＤ（連鎖不平衡）状態にあるＤＮＡセグメントも含まれ得る。いくつかの態様では、そのようなセグメントが、０．２より大きいｒ２、及び／又は｜Ｄ’｜＞０．８の数値によって判定されるようなマーカー又はハプロタイプとＬＤ状態にあるセグメントを含む。
【００７５】
[117]  いくつかの態様では、ハイブリダイゼーション方法を使用して、投与される麻酔薬の有害作用を発現する罹患性の判定を行うことができる（「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）」Ausubel, F. et al. 監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（すべての補遺が含まれる）を参照のこと）。特異的なマーカーアレルの存在は、その特別なアレルに特異的な核酸プローブの配列特異的ハイブリダイゼーションによって示すことができる。１より多い特異的なマーカーアレル又は１つの特異的なハプロタイプの存在は、そのそれぞれが特別なアレルに特異的である、数個の配列特異的核酸プローブを使用することによって示すことができる。配列特異的プローブをゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、又はｃＤＮＡへハイブリダイズするように指向させることができる。「核酸プローブ」は、相補配列へハイブリダイズするＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブであり得る。当業者であれば、検査試料由来のゲノム配列中に特別なアレルが存在する場合にのみ配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるように、そのようなプローブを設計する方法を知っていよう。本発明はまた、特別な多型マーカーを遺伝子型決定するための市販の技術及び方法を含めて、どの簡便な遺伝子型決定法を使用しても実施化することができる。
【００７６】
[118]  ゲノムＤＮＡ試料のような、麻酔の有害作用に関連する核酸を含有する検査試料を少なくとも１つの核酸プローブと接触させることによって、ハイブリダイゼーション試料を生成することができる。ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するためのプローブの非限定的な例は、本明細書に記載のｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列へハイブリダイズすることが可能である標識核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、全長核酸分子又は、ストリンジェントな条件の下で適正なｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡへ特異的にハイブリダイズするのに十分である、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０、又は５００個のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのような、その一部であり得る。ハイブリダイゼーションは、当業者によく知られた方法によって実施することができる（例えば、「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）」Ausubel, F. et al. 監修、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（すべての補遺が含まれる）を参照のこと）。いくつかの態様では、ハイブリダイゼーションが、特異的ハイブリダイゼーション、即ち、ミスマッチの無いハイブリダイゼーション（正確なハイブリダイゼーション）を意味する。いくつかの態様において、特異的ハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーション条件は、高ストリンジェンシーである。
【００７７】
[119]  特異的ハイブリダイゼーションは、存在するならば、標準法を使用して検出する。特異的ハイブリダイゼーションが核酸プローブと検査試料中の核酸との間で生じるならば、該試料は、核酸プローブ中に存在するヌクレオチドに相補的であるアレルを含有する。この方法は、本明細書に開示されるようなどのマーカーについても、又は本明細書に開示されるようなハプロタイプを構成するマーカーについて繰り返すことができるか、又は多重プローブを同時に使用して、１より多いマーカーアレルを同時に検出することができる。また、特別なハプロタイプの１より多いマーカーアレルを含有する単一のプローブ（例、特別なハプロタイプを構成するマーカーの２、３、４、５個、又は全部へ相補的なアレルを含有するプローブ）を設計することができる。ハプロタイプの特別なマーカーの試料中の検出は、該試料の供給源が特別なハプロタイプ（例、ハプロタイプ）を有するが故に、投与される麻酔薬からの有害作用を蒙る罹患性があるか又はそのリスク状態にあることを示唆する。
【００７８】
[120]  検出プローブは、どの好適なサイズであってもよいが、好ましくは、該プローブは、相対的に短い。いくつかの態様において、該プローブは、５〜１００ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、該プローブは、１０〜５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、該プローブは、１２〜３０ヌクレオチドの長さである。他の長さのプローブも想定されて、平均的な当業者の技量の範囲内にある。
【００７９】
[121]  いくつかの態様において、ＳＮＰ多型を含有するＤＮＡ鋳型は、検出に先立ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。そのような態様において、増幅されたＤＮＡは、検出プローブとエンハンサープローブのための鋳型として役立つ。
【００８０】
[122]  いくつかの態様において、鋳型のＰＣＲによる増幅のために使用される検出プローブ、エンハンサープローブ、及び／又はプライマーには、修飾Ａと修飾Ｇが含まれる、修飾塩基の使用が含まれる。修飾塩基の使用は、ヌクレオチド分子（プローブ及び／又はプライマー）の融点を鋳型ＤＮＡに対して調整するために、例えば、低い百分率のＧ又はＣ塩基を含有する領域中の融点を上昇させるために（ここでは、その相補的なＴに対して３つの水素結合を形成する能力がある修飾Ａを使用することができる）、又は高い百分率のＧ又はＣ塩基を含有する領域中の融点を下降させるために（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子中の相補的なＣ塩基に対して２つだけの水素結合を形成する修飾Ｇ塩基を使用することによって）有用であり得る。いくつかの態様では、検出ヌクレオチドプローブの設計において修飾塩基を使用する。上記の方法では、当業者に知られているどの修飾塩基も選択し得て、好適な塩基の選択は、本明細書での教示に基づけば、当業者の技量の範囲内に十分にあって、既知の塩基は、当業者に知られている市販供給元より入手可能である。
【００８１】
[123]  いくつかの態様では、本明細書に記載のハイブリダイゼーション方法において、核酸プローブに加えて、又はその代わりにペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを使用することができる。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位のようなペプチド様の無機骨格を有して、有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵ）がそのグリシン窒素へメチレンカルボニルリンカーを介して付いた、ＤＮＡ模倣体である（例えば、Nielsen, P., et al., Bioconjug. Chem. 5: 3-7 (1994) を参照のこと）。ＰＮＡプローブは、投与される麻酔薬の有害作用と相関している１以上のマーカーアレル又はハプロタイプを含有することが疑われる試料中の分子へ特異的にハイブリダイズするように設計することができる。このように、ＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、そのような作用への罹患性の診断となる。
【００８２】
[124]  本発明の態様はまた、遺伝子のセット内のＳＮＰを検出することへ向けられ、検出の方法には、限定されないが、例えば、ＳＮＰマイクロアレイ、遺伝子チップ、動的アレル特異的ハイブリダイゼーション、分子ビーコン、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）ベースの方法、ＰＣＲベースの方法、フラップエンドヌクレアーゼベースの方法、プライマーエクステンション法、５’−ヌクレアーゼベースの方法、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、一本鎖コンホメーション多型法、温度勾配ゲル電気泳動法、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解曲線分析、ＤＮＡミスマッチ結合法、キャピラリー電気泳動法、及び次世代配列決定法、等の使用が含まれる。
【００８３】
[125]  本発明の態様では、被験者より得られる、ゲノムＤＮＡを含有する検査試料を採取して、ＰＣＲを使用して、本発明の１以上のマーカー又はハプロタイプを含んでなる断片を増幅する。本明細書に開示されるように、多様な方法（例、配列解析、制限酵素消化による分析、特異的ハイブリダイゼーション、一本鎖コンホメーション多型アッセイ（ＳＳＣＰ）、電気泳動分析、等）を使用して、特別なマーカーアレル又はハプロタイプの同定を達成することができる。いくつかの態様では、発現分析によって、例えば、定量的ＰＣＲ（動的熱循環）を使用することによって診断を達成する。この技術は、例えば、TaqMan. RTM（アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）のような市販の技術を利用することができる。この技術は、ポリペプチドの発現又は組成における改変、又はスプライシング変異（複数）の存在について評価し得る。さらに、この変異（複数）の発現は、物理的又は機能的に異なるものとして定量することができる。
【００８４】
[126]  いくつかの態様において、ＤＮＡ鋳型は、本明細書に記載のような特異的多型マーカーの存在についての評価に先立って、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法によって増幅することができる。当業者によく知られた、ＷＧＡを実施するための標準法を利用し得て、それは本発明の範囲内にある。
【００８５】
[127]  いくつかの態様では、特別なアレルが参照配列に対する制限部位の創出又は消失をもたらすならば、制限酵素消化による分析を使用して、そのアレルを検出することができる。ＲＦＬＰ分析は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）、上記に記載のように実行することができる。関連するＤＮＡ断片の消化パターンは、特別なアレルの試料中の存在又は非存在を示す。
【００８６】
[128]  特異的なアレル又はハプロタイプを検出するには、配列分析も使用することができる。従って、いくつかの態様では、特別なマーカーアレル又はハプロタイプの存在又は非存在の決定が、被験者又は個体より得られるＤＮＡ又はＲＮＡの検査試料の配列分析を含む。ＰＣＲ又は他の適正な方法を使用して、多型マーカー又はハプロタイプを含有する核酸の一部を増幅してから、試料中のゲノムＤＮＡの多型部位（又はハプロタイプ中の多重多型部位）を配列決定することによって、特異的なアレルを直接検出することができる。
【００８７】
[129]  いくつかの態様では、被験者由来の標的核酸配列セグメントへ相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを使用して、多型部位で特別なアレルを同定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用し得る。オリゴヌクレオチドアレイは、典型的には、異なる既知の場所において基質の表面へ結合する、複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。これらのアレイは、一般に、機械合成法、又はフォトリソグラフィー法と固相オリゴヌクレオチド合成法の組合せを取り込む光指向性合成法を使用して、又は当業者に知られた他の方法によって産生することができる（例えば、Bier, et al. Adv Biochem Eng Biotechnol 109:433-53 (2008); Hoheisel, J. D., Nat Rev Genet. 7:200-10 (2006); Fan, et al. Methods Enzymol 410:57-73 (2006); Raqoussis, J. and Elvidge, G., Expert Rev Mol Diagn 6:145-52 (2006); 及び Mockler, et al. Genomics 85:1-15 (2005) を参照のこと。このそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、このそれぞれがその全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８５８，３９４号、米国特許第６，４２９，０２７号、米国特許第５，４４５，９３４号、米国特許第５，７００，６３７号、米国特許第５，７４４，３０５号、米国特許第５，９４５，３３４号、米国特許第６，０５４，２７０号、米国特許第６，３００，０６３号、米国特許第６，７３３，９７７号、米国特許第７，３６４，８５８号、ＥＰ６１９３２１、及びＥＰ３７３２０３には、遺伝子多型の検出のためのオリゴヌクレオチドアレイの製法と使用についての多くの追加の記載を見出すことができる。
【００８８】
[130]  当業者に利用可能である、核酸分析の他の方法を使用して、特別なアレルを多型部位で検出することができる。代表的な方法には、例えば、直接的なマニュアル配列決定法（Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 (1988); Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977); Beavis, et al., U.S. Pat. No. 5,288,644）；自動化蛍光配列決定法；一本鎖コンホメーション多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；クランプ付き（clamped）変性ゲル電気泳動法（ＣＤＧＥ）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）（Sheffield, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236 (1989)）、移動度シフト分析（Orita, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2766-2770 (1989)）、制限酵素分析（Flavell, et al., Cell, 15:25-41 (1978); Geever, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085 (1981)）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ切断法（ＣＭＣ）（Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401 (1985)）；ＲＮアーゼ保護アッセイ（Myers, et al., Science, 230:1242-1246 (1985)；大腸菌（E. coli）ｍｕｔＳタンパク質のような、ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；及びアレル特異的ＰＣＲ、等が含まれる。当業者には、上記目的のために使用し得る他の技術がわかるはずである。
【００８９】
[131]  本発明の態様では、本明細書に開示されるような遺伝子マーカー（複数）又はハプロタイプ（複数）が、投与される麻酔薬への有害作用に関連する核酸によってコードされるポリペプチドの組成又は発現において変化をもたらす場合には、そのポリペプチドの発現及び／又は組成を検討することによって、投与される麻酔薬、鎮痛薬及び／又はオピオイドに対して有害作用を発現する罹患性又はリスクの判定をすることができる。このように、本発明の遺伝子マーカー又はハプロタイプが、投与される麻酔薬への有害作用の発現に関連する核酸によってコードされる上記ポリペプチドの１つ又は別のポリペプチドの組成又は発現において変化をもたらす場合には、そのポリペプチドの発現及び／又は組成を検討することによって、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドへの有害作用を発現することへの罹患性の判定をすることができる。
【００９０】
[132]  タンパク質の発現レベルを検出するには多様な方法を使用し得て、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、及び免疫蛍光法、等が含まれる。被験者由来の検査試料について、特別な核酸によってコードされるポリペプチドの発現における改変、及び／又は組成における改変の存在を評価することができる。該核酸によってコードされるポリペプチドの発現における改変は、例えば、定量的なポリペプチド発現（即ち、産生されるポリペプチドの量）における改変であり得る。該核酸によってコードされるポリペプチドの組成における改変は、定性的なポリペプチド発現（例、突然変異ポリペプチド又は異なるスプライシング変異の発現）における改変であり得る。いくつかの態様では、投与される麻酔薬への有害作用を発現することへの罹患性の判定を、そのような有害作用の発現に関連した核酸によってコードされる特別なスプライシング変異、又はスプライシング変異の特別なパターンを検出することによって行う。
【００９１】
[133]  また、そのような改変（定量的と定性的）の両方が存在し得る。ポリペプチド発現又は組成における「改変」は、本明細書に使用するように、対照試料中のポリペプチドの発現又は組成に比較されるような、検査試料中の発現又は組成における改変を意味する。対照試料とは、検査試料（例えば．同一の細胞種に由来する）に対応して、投与される麻酔薬への有害作用によって影響を受けない、及び／又はその発現への罹患性を有さない被験者に由来する試料である。いくつかの態様において、対照試料は、本明細書に開示されるような、投与される麻酔薬への有害作用の発現に関連したマーカーアレル又はハプロタイプを保有しない被験者に由来する。同様に、対照試料と比較した、検査試料における１以上の異なるスプライシング変異の存在、又は検査試料中の有意に異なる量の様々なスプライシング変異の存在は、投与される麻酔薬への有害作用を発現することへの罹患性を示唆する可能性がある。対照試料と比較した、検査試料中のポリペプチドの発現又は組成における改変は、特異的なアレルが対照試料中の基準に対してスプライス部位を改変させる場合において、そのアレルを示唆する可能性がある。当業者には、分光法、比色法、電気泳動法、等電点分画法、及びイムノブロッティング法（例えば、Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新プロトコール）、特に第10章、上記を参照のこと）のようなイムノアッセイ（例えば、David et al., 米国特許第４，３７６，１１０号）を含めて、核酸によってコードされるポリペプチドの発現又は組成を検討する様々な手段が知られていて、使用することができる。
【００９２】
[134]  例えば、いくつかの態様では、投与される麻酔薬への有害作用の発現に関連した核酸によってコードされるポリペプチドへ結合することが可能である抗体（例、検出可能な標識付きの抗体）を使用し得る。抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。インタクト抗体又はその断片（例、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）を使用し得る。プローブ又は抗体に関する「標識」という用語には、プローブ又は抗体へ検出可能な物質を結合させること（即ち、物理的に連結させること）による、該プローブ又は抗体の直接的な標識、並びに直接的に標識される別の試薬との反応による、プローブ又は抗体の間接的な標識が含まれる。間接的な標識の例には、標識二次抗体（例、蛍光標識二次抗体）を使用する一次抗体の検出と、蛍光標識ストレプタビジンでそれが検出され得るような、ＤＮＡプローブのビオチンでの末端標識が含まれる。
【００９３】
[135]  いくつかの態様において、検査試料中のポリペプチドのレベル又は量は、対照試料中のポリペプチドのレベル又は量と比較される。対照試料中のポリペプチドのレベル又は量より、その差が統計学的に有意であるように高いか又は低い、検査試料中のポリペプチドのレベル又は量は、該核酸によってコードされるポリペプチドの発現における改変を示唆して、発現においてその差を引き起こす原因となる特別なアレル又はハプロタイプの診断となる。あるいは、検査試料中のポリペプチドの組成は、対照試料中のポリペプチドの組成と比較される。いくつかの態様では、ポリペプチドのレベル又は量とその組成のいずれについても、検査試料と対照試料において評価することができる。
【００９４】
[136]  いくつかの態様では、投与される麻酔薬への有害作用を発現することへの罹患性の判定が、追加のタンパク質ベース、ＲＮＡベース、又はＤＮＡベースのアッセイと組み合わせて、本明細書に開示されるような少なくとも１つのマーカー又はハプロタイプを検出することによってなされる。いくつかの態様では、不十分な疼痛緩和への罹患性又は感受性の判定が、追加のタンパク質ベース、ＲＮＡベース、又はＤＮＡベースのアッセイと組み合わせて、本明細書に開示されるような少なくとも１つのマーカー又はハプロタイプを検出することによってなされる。いくつかの態様では、ＯＳＡへの罹患性の判定が、追加のタンパク質ベース、ＲＮＡベース、又はＤＮＡベースのアッセイと組み合わせて、本明細書に開示されるような少なくとも１つのマーカー又はハプロタイプを検出することによってなされる。いくつかの態様では、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドへの有害作用を発現することへの罹患性の判定が、追加のタンパク質ベース、ＲＮＡベース、又はＤＮＡベースのアッセイと組み合わせて、本明細書に開示されるような少なくとも１つのマーカー又はハプロタイプを検出することによってなされる、ＯＳＡの発症率を決定することによってなされる。
【００９５】
[137]  いくつかの態様では、投与されるオピオイドへの有害作用を発現する罹患性の判定が、追加のタンパク質ベース、ＲＮＡベース、又はＤＮＡベースのアッセイと組み合わせて、本明細書に開示されるような少なくとも１つのマーカー又はハプロタイプを検出することによってなされる。いくつかの態様において、投与されるオピオイドは、モルヒネである。いくつかの態様において、投与されるオピオイドは、コデインである。いくつかの態様では、ＯＣＴ１遺伝子型の特性決定を使用して、投与されるオピオイドへの有害作用を発現することへの罹患性を判定する。いくつかの態様では、ＵＧＴ２Ｂ７  ｒｓ７４３８１３５アレルについて判定する。いくつかの態様では、ｒｓ６２２３４２アレルについて特性決定する。
【００９６】
キット
[138]  本発明の方法に有用なキットは、例えば、核酸増幅用のプライマー、ハイブリダイゼーションプローブ、制限酵素（例えば、ＲＦＬＰ分析用）、アレル特異的なオリゴヌクレオチド、本明細書に開示されるような核酸（例、本発明の少なくとも１つの多型マーカー及び／又はハプロタイプを含んでなるゲノムセグメント）によってコードされる改変ポリペプチドへ、又は本明細書に記載のような本発明の核酸によってコードされる非改変（ネイティブ）ポリペプチドへ結合する抗体、投与される麻酔薬への有害作用の発現に関連した核酸の増幅用の手段、投与される麻酔薬への有害作用の発現に関連した核酸の核酸配列を分析するための手段、投与される麻酔薬への有害作用の発現に関連した核酸によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列について分析するための手段、等を含めて、本明細書に開示される方法のいずれにおいても有用な諸成分を含む。該キットには、例えば、必要な緩衝液、本発明の核酸（例、本明細書に記載のような多型マーカーの１以上を含んでなる核酸セグメント）を増幅するための核酸プライマー、及びそのようなプライマーと必要な酵素（例、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して増幅される断片のアレル特異的な検出用の試薬、等を含めることができる。加えて、キットは、本明細書に開示されるような方法と組み合わせて使用し得るアッセイ用の試薬、例えば、投与される麻酔薬への有害作用の発現への罹患性を判定するための他の診断アッセイでの使用のための試薬を提供し得る。いくつかの態様では、この試薬キットに、ＷＧＡを実施するための試薬が含まれる。
【００９７】
[139]  いくつかの態様では、投与される麻酔薬、鎮痛薬、及び／又はオピオイドへの有害作用を被験者において発現することへのリスク又は罹患性を検出するために被験者由来の試料についてアッセイするためのキットを提供し、ここで該キットは、本明細書に開示されるような少なくとも１つの遺伝子多型の少なくとも１つのアレルを個体のゲノムにおいて選択的に検出するのに必要な試薬を含む。いくつかの態様において、該試薬は、本明細書に開示されるような少なくとも１つの遺伝子多型を含んでなる個体のゲノムの断片へハイブリダイズする、少なくとも１つの連続したオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、該試薬は、被験者より入手されるゲノムセグメントの反対の鎖へハイブリダイズする、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドを含み、ここでそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー対は、投与される麻酔薬への有害作用を発現することに関連した少なくとも１つの遺伝子多型が含まれる、個体のゲノムの断片を選択的に増幅するように設計される。いくつかの態様では、試薬が、被験者より入手されるゲノムセグメントの反対の鎖へハイブリダイズする、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドを含み、ここでそれぞれのオリゴヌクレオチドプライマー対は、投与されるオピオイドへの有害作用を発現することに関連した少なくとも１つの遺伝子多型が含まれる、個体のゲノムの断片を選択的に増幅するように設計される。いくつかの態様において、その断片は、少なくとも２０塩基対のサイズである。そのようなオリゴヌクレオチド又は核酸（例、オリゴヌクレオチドプライマー）は、投与される麻酔薬への有害作用を発現するリスクに関連している遺伝子多型（例、ＳＮＰ又はマイクロサテライト）の傍らにある核酸配列の諸部分を使用して設計することができる。いくつかの態様において、該キットは、１以上の特異的多型マーカー又はハプロタイプのアレル特異的な検出の可能な１以上の標識核酸、並びに、その標識の検出用試薬を含む。好適な標識には、例えば、放射性同位体、蛍光標識、酵素標識、酵素補因子標識、磁気標識、スピン標識、エピトープ標識、等が含まれる。
【００９８】
[140]  特定の態様において、該キットは、該キットを含んでなる試薬を使用するための説明書のセットをさらに含む。
鎮痛薬
[141]  鎮痛薬には、パラセタモール（アセトアミノフェンとも呼ばれる）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）（例えば、サリチル酸塩が含まれる）、及びオピオイド薬（モルヒネ、フェンタニル、ヒドロモルホン、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、トラマドール、オンダンセトロン、デキサメタゾン、メタドン、アルフェンタニル、レミフェンタニル、及びこれらの誘導体のような）、並びに、非オピオイド鎮痛薬（アセトアミノフェン、ＮＳＡＩＤが含まれる）と、これら組合せ及び派生物が含まれる。
【００９９】
[142]  本発明について詳しく記載してきたが、付帯の特許請求項において明確化される本発明の範囲より逸脱することなく、様々な修飾態様、変更態様、及び均等態様が可能であることが明らかであろう。本開示における実施例は、いすれも非限定的な実施例として提供される。
【０１００】
システム
[143]  図２０は、本明細書に記載される１以上の特徴を実施することができるシステムの例を図解する。ここで、システム（２００）には、プロセッサ（２１０）とメモリ（２２０）が含まれる。システム（２００）には、例えば、１以上の入力デバイス（２６０）と１以上のディスプレイ（２７０）を通してユーザーがこのシステムと相互作用することを可能にする、ユーザーインターフェス（２５０）も含まれる。
【０１０１】
[144]  システム（２００）には、本明細書に記載の１以上の特徴を実施する１以上のモジュール及び／又はエンジンも含めることができる。例えば、システム（２００）には、リスク群割り当てエンジン（Risk Group Assignment Engine）（２３０）が含まれ得て、これは、少なくとも１つの遺伝的変異についての患者の遺伝子型に基づいて、患者をリスク群へ割り当てることができる。システム（２００）には、医薬品選択エンジン（Medication Selection Engine）（２４０）も含めてよく、これは、患者の割り当てられたリスク群に基づいて、該患者への医薬品を選択することができる。
【０１０２】
[145]  いくつかの態様では、遺伝子型判定装置（２８０）より患者のデータを受容するようにシステム（２００）を構築することができる。いくつかの態様では、該システムへデータ連結によって連結しているデータ保存又はデータベース（２９０）に１以上の患者データを保存することができる。
【０１０３】
[146]  本明細書に記載される主題の１以上の側面又は特徴は、デジタル電子回路、集積回路、特別設定された特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、及び／又はこれらの組合せにおいて実現することができる。これらの様々な側面又は特徴には、保存システムよりデータ及び命令を受容して、データ及び命令をそれらへ伝達するように結合される（特殊用途でも一般用途でもあり得る）少なくとも１つのプログラマブルプロセッサ、少なくとも１つの入力デバイス、及び少なくとも１つの出力デバイスが含まれるプログラマブルシステムにおいて実行可能及び／又は解釈可能である１以上のコンピュータプログラムにおける実行が含まれ得る。このプログラム可能なシステム又は計算システムには、クライアントとサーバーを含めてよい。一般に、クライアントとサーバーは、互いに離れていて、典型的には、コミュニケーションネットワークを介して相互作用する。クライアントとサーバーの関係は、それぞれのコンピュータで作動して、互いへのクライアント−サーバー関係を有するコンピュータプログラムによって生じる。
【０１０４】
[147]  プログラム、モジュール、モデルジェネレータ、コンピュータ命令、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、アプリケーション、コンポーネント、又はコードとも言及され得る、これらのコンピュータプログラムには、プログラマブルプロセッサへの機械命令が含まれて、高レベル手続き型言語、オブジェクト指向プログラミング言語、関数型プログラミング言語、論理プログラミング言語、及び／又はアセンブリ／機械言語において実行することができる。本明細書に使用するように、「機械読取り可能媒体」という用語は、機械命令及び／又はデータをプログラマブルプロセッサへ提供するために使用される、例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ、及びプログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）のような、あらゆるコンピュータプログラム製品、装置、及び／又はデバイスに言及し、機械命令を機械読取り可能シグナルとして受容する機械読取り可能媒体が含まれる。「機械読取り可能シグナル」という用語は、機械命令及び／又はデータをプログラマブルプロセッサへ提供するために使用されるあらゆるシグナルを意味する。機械読取り可能媒体は、例えば、非一時的な固体状態メモリ又は磁気ハードドライブ又はあらゆる記憶媒体がそうであるように、そのような機械命令を非一時的に保存することができる。あるいは、又は追加的に、機械読取り可能媒体は、例えば、プロセッサキャッシュ、又は１以上の物理プロセッサコアに関連した他のランダムアクセスメモリがそうであるように、そのような機械命令を一時的なやり方で保存することができる。
【０１０５】
[148]  ユーザーとの相互作用をもたらすために、本明細書に記載される主題の１以上の側面又は特徴を、例えば、情報をユーザーへ表示するための陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）又は発光ダイオード（ＬＥＤ）モニターのような表示装置とキーボード、並びに、それによってユーザーがコンピュータへ入力を提供し得る、例えばマウス又はトラックボールのようなポインティングデバイスを有するコンピュータで実行することができる。ユーザーとの相互作用をもたらすには、他の種類のデバイスも同様に使用し得る。例えば、ユーザーへ提供されるフィードバックは、例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、又は触覚フィードバックのような、どんな形式の感覚フィードバックであってもよくて、ユーザーからの入力は、限定されないが、音響入力、音声入力、又は触覚入力が含まれる、どんな形式で受容されてもよい。他の可能な入力装置には、限定されないが、タッチスクリーン、又はシングル又はマルチポイント抵抗膜式又は静電容量式トラックパッドのような他のタッチセンス装置、音声認識ハードウェア及びソフトウェア、光学式スキャナー、光学式ポインター、デジタル画像キャプチャーデバイスと関連の解釈ソフトウェア、等が含まれる。
【実施例】
【０１０６】
[149]  以下の非限定的な実施例を提供して、本明細書に開示される本発明の態様をさらに例解する。当業者には、以下に続く実施例において開示される技術が本発明の実践において十分機能することが見出されたアプローチを代表するものであるので、その実践モードの例を構成するとみなし得ることが理解されよう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的態様において多くの変更をなし得て、それでもそれらが本発明の精神及び範囲より逸脱することなく、同等又は類似の結果を入手し得ることを理解されよう。
【０１０７】
実施例１：ＦＡＡＨ遺伝的変異と術後中枢オピオイド関連有害事象の間の新規な関連性
[150]  本実施例では、小児における周術期オピオイド関連有害作用に対する、ゲノムワイドアレイ由来の脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）のすべての重要な遺伝的変異の影響について評価した。本実施例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Sahasivam et al., The Pharmacogenomics Journal (2015) 1-7 として後に公表された。
【０１０８】
研究デザイン、参加者、及び手順
[151]  これは、外来アデノイド口蓋扁桃摘出術を標準的な周術期麻酔、外科及び看護ケアで施行中の小児の大規模コホートにおける、前向きの遺伝子型盲検の臨床観察研究であった。この研究は、clinicaltrials. gov, NCT01140724 で登録された、「Personalizing Perioperative Morphine Analgesia in Children（小児における周術期モルヒネ鎮痛の個別化）」と題した、より大規模な進行中の臨床研究の一環である。標準的な周術期ケアでのこの大規模な前向き臨床試験（臨床治療チームには、患者の遺伝子型を知らせない）によって、小児での周術期オピオイドに対する鎮痛及び有害作用反応における個体間変動に寄与する因子を評価した。この研究は、施設内審査委員会によって承認されて、書面によるインフォームドコンセントを両親より得て、７歳を超える小児からは、登録前に適宜同意を得た。
【０１０９】
[152]  選択外来の扁桃摘出術又はアデノイド口蓋扁桃摘出術を施行中の６〜１５歳の小児を本研究のために手術の当日に登録した。標本選択基準は、再発性扁桃炎、アデノイド口蓋扁桃肥大、又は閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）の故に扁桃摘出術又はアデノイド口蓋扁桃摘出術の予定がある、米国麻酔学会（ＡＳＡ）の身体状態１又は２を有すると指定される小児であった。いびき＋１０秒以上続く睡眠休止又は日中の眠気の既往歴がある睡眠時呼吸障害の小児は、術前外科記録に文書化するように、ＯＳＡの臨床症状として考慮し、これらの小児における扁桃摘出術の適応は、ＯＳＡの臨床診断であった。加えて、実証済みのツールである小児用睡眠問診表（ＰＳＱ）（Chervin R. et al., Sleep Med, 1:21-32 (2000); Chervin R. et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 133:216-22 (2007)）を使用して、小児の睡眠障害を評価した。ＰＳＱ中の２２の質問の内８以上に被験小児の両親が「はい」と報告すれば、その小児は、ＯＳＡを有するとみなした。
【０１１０】
[153]  小児又はその両親が英語を話せなければ、彼らを除外した。試験薬に対してアレルギーがあるか又は発達障害、肝臓又は腎臓の疾患、又は鎮痛薬を必要とする術前疼痛（例、慢性扁桃炎）を有する小児も除外した。本研究への研究コーディネーターの利用に限りがあったので、本研究では、簡便な標本抽出をもたらす有資格被験者をすべて登録し得たわけではなかった。
【０１１１】
[154]  すべての参加者が、標準化された外科技術と麻酔技術が含まれる、同質の周術期ケアを受けた。セボフルランを使用して麻酔を誘導し、プロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）ボーラスを続けて、気管内挿管を容易にした。麻酔は、神経筋肉遮断を使用せずにセボフルランで維持した。患者は、外科的切開に先立って、モルヒネを受容した。ＯＳＡ既往歴のある小児が０．１ｍｇ／ｋｇのモルヒネを受容したのに対して、ＯＳＡ診断のない小児は、０．２ｍｇ／ｋｇを受けた。外科的切開と焼灼に続く疼痛（心拍数及び血圧の臨床的に有意な増加）が示唆されるどんな徴候でもあれば、臨床麻酔チームは、術中に必要に応じて追加のモルヒネを０．０５ｍｇ／ｋｇの増分で提供した。すべての小児が予防用オンダンセトロン（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を術中に受容した。顔の表情；脚の動き；活動性；泣き声；及び機嫌（ＦＬＡＣＣ）の疼痛スコア（Merkel S. et al., Pediatr. Nurs., 23: 293-7 (1997））で測定される有意な術後疼痛が４／１０以上であれば、術後麻酔回復室（ＰＡＣＵ）においてモルヒネ（０．０５ｍｇ／ｋｇの増分）の救助的投与で管理した。
【０１１２】
臨床転帰の測定
[155]  各参加者について、鎮痛作用とオピオイド関連有害作用の測定結果（metrics）を記録した。この研究では、２つのオピオイド関連有害作用の転帰：臨床呼吸抑制（ＲＤ）と難治性ＰＯＮＶに注目した。鎮痛作用の尺度として総モルヒネ要求量（ｍｇ／体重ｋｇ）も検討した。本研究では、ＲＤを、臨床的に明白な上気道閉塞の非存在下での、１分あたり１０回未満の呼吸という持続的な（１分を超える）呼吸数、又は９２％より高いＳｐＯ２を維持するのに酸素補充を必要とする９２％未満の酸素脱飽和として定義した。ＰＯＮＶは、制吐薬の介入を必要とする、実際の嘔吐エピソード及び／又は自己申告性の持続的な悪心のエピソードとして定義した。
【０１１３】
遺伝子解析
[156]  ＦＡＡＨ  ＳＮＰの遺伝子型決定をするために、手術室において麻酔下での静脈ライン確保時に、ＤＮＡ用に血液を吸引した。同じ日にＤＮＡを単離して、−２０℃で冷凍した。これまでに研究された６種のよくあるＳＮＰを選択して、TaqMan アレル識別システムアッセイ（ライフ・テクノロジーズ、アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して、遺伝子型決定をした。これには、ｒｓ９３２８１６、ｒｓ４１４１９６４、ｒｓ３７６６２４６、ｒｓ３２４４２０、ｒｓ３２４４１９、及びｒｓ２２９５６３２が含まれた。加えて、Illumina Human Omni 5 Genome-Wide Human Array を使用して、ゲノムワイドの遺伝子型決定を実施した。全部で３０９７個のＳＮＰについて遺伝子型決定をして、これを使用して、ＰＬＩＮＫにおいてメジアンχ２統計量より遺伝的インフレ係数（λ）を推定した。３０９７個のＳＮＰの中で、ｒｓ３７６６２４６とｒｓ３２４４２０を含めて、６６個がＦＡＡＨ遺伝子中にある。このアレイでは、２４４種の家系情報マーカー（ＡＩＭ）についても遺伝子型決定して、これを使用して自己申告性の人種を検証して、遺伝的家系マーカーによる集団の層別化及び検証を是正した。
【０１１４】
[157]  自己申告性の白人種及び黒人種が遺伝的家系へ良好に適合するかどうかについて評価するために、１３９７名の HapMap 被験者を準拠集団として使用した。遺伝子型決定した２４４種のＡＩＭのうち２１８種が HapMap データに見出された。故に、SVS7. 7. 6（Golden Helix, マサチューセッツ州ボーズマン）を使用して、２１８種のＡＩＭで主成分（ＰＣ）分析を実施した。統計モデリングには１０個までのＰＣも使用して、集団層別化による潜在的交絡について検定した。
【０１１５】
統計解析
[158]  統計解析ソフトウェア（Statistical Analysis Software，ＳＡＳ）、バージョン９．３，JMP Genomics，バージョン６．０（SAS Institute 社、ノースカロライナ州ケーリー）、及びＲを使用して、統計解析を実施した。
【０１１６】
[159]  解析に先立って、データの質を確認した。アフリカ系アメリカ人の小児と白人種の小児において、患者の特徴とＳＮＰの特性についてそれぞれ検討した。ハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）（Stern C., Science, 97:137-8 (1943)）について検定した。ＲＤとＰＯＮＶの対立項目比率を解析するために、ロジスティック回帰を実施した。総モルヒネ要求量について解析するには、線形回帰を使用した。ＦＡＡＨ変異の評価に先立って、共変数の影響について検定した。総モルヒネ用量について、年齢、性別、ＢＭＩ  ｚスコア、及びＯＳＡを評価した。ＲＤとＰＯＮＶの有害作用転帰については、総モルヒネ量を追加の共変数とみなした。最良の適合モデルを選択するために、対数尤度、赤池ベイズ情報量基準（Akaike and Bayesian Information criterion）を比較して、残差を検討した。モデル適合度を有意に（ｐ＜０．０５）改善する共変数を後続の遺伝子解析用に保持した。この転帰と単一ＳＮＰの関連性について評価するために加法モデルを使用し、ここでは遺伝子型を記録して、連続変数として検定した。コホート全体のマイナーアレルの数に従って、遺伝子型を０、１、及び２へ記録した。白人患者と黒人患者をそれぞれ用いて、統計モデリングを実行した。
【０１１７】
結果
[160]  人口統計。参加者は主に白人で、男性より女性がわずかに多かった。白人小児に比べて、黒人小児はやや体重が重くて、より高いＯＳＡ頻度を有した。研究対象とした２６９名のアフリカ系アメリカ人の小児と白人種の小児において、自己申告性の人種は、出身の遺伝的家系とよく相関した。
【０１１８】
[161]  ＦＡＡＨ  ＳＮＰ特性。ＦＡＡＨ遺伝子中の全７０種のＳＮＰについて、TaqMan 又は Omni 5 技術によって、遺伝子型決定をした。ＳＮＰ  ｒｓ３７６６２４６とＳＮＰ  ｒｓ３２４４２０について両方の方法によって遺伝子型決定をしたところ、同一の遺伝子型が観測され、遺伝子型データの信頼性が示唆された。白人患者と黒人患者の両方で、７０種のＳＮＰのうち３９種が０．０５以上のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を有した。ハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）に関する検定は、これら３９種のＳＮＰがいずれもα＝０．００１水準でのＨＷＥにあることを示した（３９種の検体のボンフェローニ補正）。故に、３９種のＳＮＰを遺伝的関連解析に含めた。
【０１１９】
[162]  自己申告性の人種と遺伝的家系。自己申告された白人種と黒人種について、２１８のＡＩＭより推定される遺伝的家系と比較した。全部で２５９名の患者のうち２５０名（＞９５％）の患者において、自己申告された人種は、ＣＥＵとアフリカ系の家系によく集中した。主成分（ＰＣ）１と２によって、白人種と黒人種を成功裡に分離した。本研究では、解析結果を自己申告性の人種によって層別したが、そのほうが臨床医にとってＡＩＭと比べて容易に利用可能だからである。
【０１２０】
[163]  臨床転帰との遺伝的関連性。ＰＯＮＶ、ＲＤ、及び総モルヒネ用量と単一ＳＮＰとの関連性について、白人と黒人でそれぞれ検定した。黒人患者の方がより高い総モルヒネ用量を必要として（ｐ＜０．０５，ｔ検定）、ＰＯＮＶの発症率がより低い傾向にあった（ｐ＝０．１５９，フィッシャーの正確検定）が、ＲＤの発症率は、黒人と白人の間で同等であった（ｐ＝０．３７６，フィッシャーの正確検定）。
【０１２１】
[164]  単一ＳＮＰ関連検定の結果を表１と図１に要約する。白人患者では、ＰＯＮＶと３種のＳＮＰ（ｒｓ３２４４２０、ｒｓ２２９５６３２、及びｋｇｐ１２５１７３６９）の間に、そして総モルヒネ用量とｒｓ６４７３２５の間に有意な関連が検出された。加えて、数個の名義関連性が観測された。しかしながら、黒人患者では、上記転帰のいずれについても、名義関連性しか検出されなかった（表１）。
【０１２２】
【表１−１】
0006581117.tif 000002
【０１２３】
【表１−２】
0006581117.tif 000003
【０１２４】
[165]  単一ＳＮＰ関連検定に基づいて、４６８６５０４０ｂｐ〜４６８８２１１８ｂｐに及ぶ興味深い領域を同定した（図１）。白人では、この領域に存在する１１種のＳＮＰのうち７種がＰＯＮＶと関連して、５種がＲＤと関連していた。連鎖分析は、高いＤ’とＲ２を明らかにして、この１１種のＳＮＰが１つのハプロタイプブロックに属することを示唆した。
【０１２５】
[166]  ゲノムインフレーション。白人小児において、ＰＯＮＶとの有意な遺伝的関連性に対する混合の影響について評価するために、３０９７種のＳＮＰゲノムワイドを使用して、ゲノムインフレ係数（λ）について評価した。この分析は、λが１であることを見出して、集団層別化による強い交絡が存在しないことを示唆した。１０までのＰＣで補正するとき、白人におけるＰＯＮＶとの遺伝的関連性は、有意なままであった。
【０１２６】
[167]  ＰＯＮＶとのＦＡＡＨ遺伝的関連性の信頼性。ＦＡＡＨ  ＳＮＰ、ｒｓ３２４４２０とＰＯＮＶの間の生物学的及び統計学的に有意な関連性の故に、その関連性を検証するために、我々は、類似のプロトコールで扁桃摘出術をすでに受けたさらに６６名の白人小児との関連性を再解析した。より大きなコホート（元のコホートの２１６名の白人小児＋６６名の追加の白人小児）は、以下の常に有意な関連性を再現した。ＦＡＡＨ  ＳＮＰのｒｓ３２４４２０は、ＰＯＮＶと有意に関連して（Ｐ＝０．００５３）、１コピーのマイナーアレル（Ａ）を追加するとＯＲが２．０倍増加し；それは、ＰＡＣＵ滞在延長をもたらすＰＯＮＶとも関連して（Ｐ＝０．０２０９）、１コピーのマイナーアレル（Ａ）を追加するとＯＲが２．２倍増加した。統計学的に有意ではないが、ｒｓ３２４４２０  ＡＡ遺伝子型の小児は、ＣＣ及びＣＡ遺伝子型の小児（８３．９（７９．９〜８８．２分、Ｐ＝０．０７２））より全般的に長く（９７．９（８４．３〜１１３．６）分）ＰＡＣＵに滞在し、このことは、一般的な外来外科手術に続いて、臨床的かつ経済的に重要である。
【０１２７】
[168]  我々の研究は、ＦＡＡＨ遺伝子多型と一般的な外来外科手術の扁桃摘出術に続く難治性ＰＯＮＶの間に有意な関連性を示した。加えて、白人小児群では、オピオイド誘発性ＲＤとＰＯＮＶによる回復室滞在の延長の特異的ＦＡＡＨ  ＳＮＰとの名義関連性が同定された。具体的には、白人小児において、ｒｓ４１４１９６４、ｒｓ３７６６２４６、ｒｓ３２４４２０、ｒｓ２２９５６３２、及びｋｇｐ１２５１７３６９の１コピーのマイナーアレルを加えると、ＰＯＮＶのオッズがそれぞれ２．４２、２．４２、２．７３、２．６１、及び２．６１倍増加した（Ｐ＜０．００１８、表１）。ミスセンス遺伝子多型のｒｓ３２４４２０が含まれる、上記５種のＦＡＡＨ  ＳＮＰは、オピオイド関連のＲＤと難治性ＰＯＮＶによるＰＡＣＵでの滞在延長に名義関連性を有して、オピオイドと内在性カンナビノイド経路の間に生物学的に相乗的な相互作用があり得ることをはっきりさせた。
【０１２８】
[169]  未知の遺伝リスク因子（例、超迅速代謝者におけるコデイン）は、他の点では健常な患者でも、呼吸抑制、無酸素症、及び死亡のリスクを高める可能性がある（Kelly L. et al., Pediatrics, 129:e1343-7 (2012); Sadhasivam S. and Myer C., Pain Med., 13:982-3, author reply 4 (2012)）。事前のリスク同定、層別化、及び予防手段は、オピオイド関連の呼吸抑制とＰＯＮＶのような他の有害作用という負の影響を最小にするのに重要である。ＰＯＮＶは、予防的な制吐薬があるにもかかわらず、依然として麻酔後の重大問題であって、オピオイドに関連することが多い。
【０１２９】
[170]  要約すると、扁桃摘出術を施行中の小児において、ＦＡＡＨ遺伝子多型と術後のオピオイド関連の呼吸抑制、ＰＯＮＶ、及びＰＡＣＵでの滞在延長の間に、新たな関連性を見出した。メジャー脊椎固定術を施行中の、より高齢の若年者の異なる集団において上記の関連性を検証した。これらの結果は、ＦＡＡＨの特異的な遺伝的変異が小児における外科手術後のオピオイド誘発性呼吸抑制、ＰＯＮＶ、及びＰＡＣＵでの滞在延長と常に関連していることを実証し、このことは、類似のエスニック背景と医学的背景の成人へ外挿し得るだろう。小児の疼痛を管理する場合、臨床医は、特定のＦＡＡＨ遺伝的変異のある小児においてオピオイド誘発性の呼吸抑制とＰＯＮＶが潜在的により高い確率で発症することを予測する必要がある。
【０１３０】
実施例２：ＡＢＣＣ３とＯＣＴ１の遺伝子型は、モルヒネの薬物動態に影響を及ぼす。
[171]  我々は、主要な輸送体及び酵素をコードする遺伝子（ＯＣＴ１、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ２、及びＵＧＴ２Ｂ７が含まれる）のよくある機能欠損遺伝子多型がモルヒネとその代謝産物のＰＫを実質的に改変させる可能性があると仮定した。この前向き臨床研究の目的は、主要な輸送体及び酵素の選択した遺伝的変異が静脈内モルヒネＰＫに及ぼす潜在的な影響を、扁桃摘出術を施行中の小児の拡大された均質コホートにおいて評価することであった。本実施例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Venkatasubramanian et al., Pharmacogenomis (2014) 15(10): 1297-1309 として後に公表された。
【０１３１】
研究デザイン、参加者、及び手順
[172]  この研究は、clinicaltrials. gov,（NCT01140724）で登録された、「Personalizing Perioperative Morphine Analgesia in Children（小児における周術期モルヒネ鎮痛の個別化）」と題した、より大規模な進行中の臨床観察研究の一環である。現行の薬物動態−薬理ゲノム学研究には、既報の被験者に加えた、被験者の拡張コホートが含まれる（Fukuda, T. et al., Pharmacogenomics, 14: 1141-51 (2013）、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。本研究は、周術期オピオイドへの鎮痛及び有害作用反応における個体間変動に寄与する因子を評価するための、標準的な周術期ケアを伴う外来アデノイド口蓋扁桃摘出術を施行中の小児の大規模コホートにおける前向きの遺伝子型盲検試験として設計された。この研究は、シンシナチ小児病院医療センターでの施設内審査委員会によって承認されて、書面によるインフォームドコンセントを両親より登録前に得て、７歳を超える小児からは、適宜同意を得た。
【０１３２】
[173]  本研究には、再発性扁桃炎、アデノイド口蓋扁桃肥大、又はＯＳＡの故に扁桃摘出術又はアデノイド口蓋扁桃摘出術の予定がある、米国麻酔学会の身体状態１又は２を有する６歳〜１５歳の若年者と小児が登録された。モルヒネアレルギー、誕生後の発育遅延、肝／腎疾患、術前疼痛による慢性的な鎮痛薬要求を有する小児と、英語を話すことができない小児又は両親は、本研究から除外した（Fukuda, T. et al., Pharmacogenomics, 14:1141-51 (2013); Sadhasivam, S., et al., Pediatrics, 129:832-8 (2012); Sadhasivam, S., et al., J. Opioid Manag., 8:217-26 (2012)）。本研究に登録した小児は、０．２ｍｇ／ｋｇの術中麻酔薬モルヒネ用量（但し、ＯＳＡの小児は、０．１ｍｇ／ｋｇの用量を受容した）とともに、標準的な周術期ケアを受けた。
【０１３３】
薬物動態試験用の試料採取と分析
[174]  各小児より連続血液試料を入手して、モルヒネとその活性代謝産物、Ｍ３Ｇ及びＭ６Ｇの全身濃度を定量した。ＩＶモルヒネボーラス投薬前に静脈内ラインより投薬前試料を入手した。初回のボーラスモルヒネ静脈内投薬から０〜５分、１０〜１５分、及び３０〜４５分後に、静脈留置針を使用して、さらなる試料を入手した。倫理的な理由から、モルヒネ投薬後に入手する血液試料（番号：１〜３）は、その小児が回復室において麻酔から完全に回復する前に採取した。確立されて検証済みの半自動式液体クロマトグラフィー−質量分析法／質量分析法アッセイを使用して、ＥＤＴＡ血漿中のモルヒネ、Ｍ３Ｇ、及びＭ６Ｇを定量した。この分析法の詳細については、他所に記載されてきた（Clavijo, C. et al., Anal. Bioanal. Chem., 400:715-28 (2011)）。信頼し得る定量限界は、モルヒネに関して０．２５〜１０００ｎｇ／ｍｌ（ｒ２＞０．９９）で、Ｍ３ＧとＭ６Ｇに関しては、ともに１〜１０００ｎｇ／ｍｌ（ｒ２＞０．９９）であった。全不正確性は、１５％未満であった。日間正確度は、８５〜１１５％内であった。分析物の定量に干渉する、持越し、マトリックス干渉、又はイオン抑制／増大はなかった。
【０１３４】
遺伝子型決定と遺伝子サンプリング
[175]  関連する多型の遺伝子型決定をするために、麻酔用に確保した静脈内ラインを使用して、手術室において血液試料を採取した。同じ日にＤＮＡを単離し、−２０℃で冷凍して、機能的に重要な遺伝子（ＯＣＴ１、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＢ１、及びＵＧＴ２Ｂ７）の予選択リスト内の特異的ＳＮＰについて検査して、市販の TaqMan ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイを使用して決定した。Human Omni 5 Genome-Wide Human Array を使用して、上記選択遺伝子における追加の重要なＳＮＰを同定した。この参加者では、ＯＣＴ１遺伝子中の４つの非同義ＳＮＰについて遺伝子型決定をした。これらは、ＯＣＴ１輸送活性の低下又は喪失を引き起こし、Ａｒｇ６１Ｃｙｓ（ｒｓ１２２０８３５７）、Ｇｌｙ４０１Ｓｅｒ（ｒｓ３４１３０４９５）、Ｇｌｙ４６５Ａｒｇ（ｒｓ３４０５９５０８）とＭｅｔ４２０の欠失（ｒｓ７２５５２７６３）が含まれる。加えて、核内因子の結合に影響を及ぼすｍＲＮＡ発現を改変させることが知られている、ＡＢＣＣ３のプロモーター領域中のＳＮＰである、ｒｓ４７９３６６５（−２１１Ｃ＞Ｔ）の遺伝子型決定をした。さらに含めたのは、ＡＢＣＢ１  ３４３５Ｔアレル（癌関連疼痛におけるより高いモルヒネ鎮痛作用と慢性疼痛の混合集団におけるより低いモルヒネ用量要求量へ関連付けられてきたので）と、ＵＧＴ２Ｂ７（−１６１Ｃ＞Ｔ）（ＣＣ遺伝子型被験者がラモトリギンのクリアランス増加と関連したので）である。
【０１３５】
モルヒネＰＫモデル開発と評価
[176]  PsN-Toolkit（バージョン３．５．３）をインターフェスとするＮＯＮＭＥＭ（バージョン７．２，ICON Dev. Soln．，メリーランド州、アメリカ）を使用して、モルヒネデータ用に非線形、混合作用集団の薬物動態モデルを開発した。統計パッケージＲ（バージョン２．１５）を使用して、データの前処理、後処理、及び可視化を実施した。２−コンパートメント構造を使用して、モルヒネ濃度−時間プロフィールについて記載した。このモデルでは、モルヒネの仮説コンパートメントへの輸送における遅延の遅延コンパートメントを取り込んで、代謝産物生成がその仮説コンパートメント中のモルヒネ濃度に依存するとしてモデル化した。
【０１３６】
[177]  体重を共変数として使用することの影響について初めに検定して、アロメトリック（allometric）モデル付きの薬物動態モデルに含めた。個々のパラメータの推定は、平均の集団パラメータと、対数正規分布をとる基本的な個体間変動性に依存するようにモデル化した。詳細は、Venkatasubramanian et al., Pharmacogenomis (2014) 15(10): 1297-1309 を参照のこと。
【０１３７】
[178]  目的関数値（ＯＦＶ）、残差診断、及びブートストラップ検証技術を使用するモデル安定性考慮が含まれる様々な判定基準を使用して、モデルの質について評価した。異なるモデル間の初期比較は、ネスティド（nested）モデル間で統計学的に有意とみなされる、３．８４のＯＦＶ（ｐ＜０．０５，ＤＯＦ＝１）の棄却に基づいた。ＯＦＶ改善に加えて、診断用の適合度プロットを使用してモデルについて評価して、モデル不適切性を示唆する可能な傾向を同定するために検討し、η−分布ヒストグラムを検討して単一様態性を確認した。このモデルを１０００の無作為抽出したブートストラップデータセットへ再適合させることによって、最終のモデル安定性を評価した。
【０１３８】
薬理ゲノム学分析
[179]  選択した遺伝子型の、体重正規化（ａ）モルヒネクリアランス；及び（ｂ）Ｍ３Ｇ／（ｃ）Ｍ６Ｇ生成クリアランスの個々のアドホックベイズ推定値についてのカテゴリー型共変量としての有意性を検定するために、共変量解析も実施した。ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなす、フィッシャーの片側分散分析を使用して、予備的な薬理遺伝学−薬物動態分析を行った。次いで、モルヒネクリアランスと代謝産物生成クリアランスのカテゴリー型共変量としてその遺伝子型を取り込むことによって、有意な共変数について、ＮＯＮＭＥＭにおいて正式に検定した。モルヒネＰＫ中の共変数としての遺伝子型の有意性は、（ａ）ネスティドモデル間の３．８４（ｐ＜０．０５，自由度＝１）のＯＦＶの棄却と（ｂ）加法共変数パラメータ推定値の精度が含まれる、様々な判定基準によって判定した。
【０１３９】
結果
[180]  登録被験者の人口統計学的属性、本研究に登録された２２３名の被験者よりモルヒネ投薬後採取した、モルヒネ、Ｍ３Ｇ、及びＭ６Ｇの時間及び濃度プロフィール、並びにアロメトリックに（体重）スケール調整したモルヒネ及び代謝産物の集団ＰＫモデルのＮＯＮＭＥＭモデルパラメータ推定値の詳細については、Venkatasubramanian et al., Pharmacogenomis (2014) 15(10): 1297-1309 に記載されている。簡潔には、２２０名の登録被験者のうち、１７９名が白人種、３８名がアフリカ系アメリカ人であって、残る６名の被験者には、アジア系の小児１名、アジア系インド人の小児１名、及び４名の二人種小児（一方が白人種で他方がアフリカ系アメリカ人の両親）が含まれた。白人種とアフリカ系アメリカ人のコホート間で、年齢、体重、又は身長に有意差は観測されなかった。
【０１４０】
[181]  下記の表にＳＮＰ遺伝子型の分布を示す。被験者を、先に記載のように、ＯＣＴ１遺伝子型に基づいて、３つの群へ分けた（Fukuda, T. et al., Pharmacogenomics, 14:1141-51 (2013); Fukuda, T. et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 93:S49-S49 (2013); Tzvetkov, M. et al., Biochemical Pharmacology, 86:666-678 (2013)）。遺伝子型決定の結果に基づくと、５８％の小児がＯＣＴ１野生型であり、３６％がＯＣＴ１異型接合であり、そして５．４％がＯＣＴ１同型接合であった。同型接合の遺伝子型である１２名の小児のうち１１名が白人種で、１名がヒスパニックであって、アフリカ系アメリカ人の子孫はいなかった。ＡＢＣＢ１Ｃ  ３４３５Ｔ遺伝子型では人種の不均質性も観測されたが、ＡＢＣＣ３の−２１１Ｃ＞Ｔ位置での遺伝子多型においては、人種差を観測しなかった。
【０１４１】
【表２】
0006581117.tif 000004
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
[182]  モルヒネの薬物動態については、その全身クリアランス（ＣＬ）に個体間変動性がある２−コンパートメントモデルを使用して記載した。代謝産物プロフィールは、生成クリアランスに個体間変動性がある単一コンパートメントモデルを使用して把握した。代謝産物の分布容積とクリアランスは、以前の報告（Bouwmeester, N. et al., Br. J. Anaesth., 92:208-17 (2004)）に基づいて固定したが、これは、今回のプロフィールでは、短い試料採取時間によるその生成に関する情報しか含有しないからである。モルヒネクリアランスとＭ３Ｇ生成クリアランスに関するη−収縮は低かった（１６．５％と２０％）が、Ｍ６Ｇ生成クリアランスでは高く（３１．８％）、このデータセットではＭ６Ｇ生成に関する情報が限られていることを示した（Savic, R. and Karlsson, M., AAPS J., 11:558-69 (2009)）。代謝産物の生成は、仮説コンパートメント中のモルヒネ濃度に依存し、これは中心コンパートメントに停滞して、代謝産物生成の遅延をもたらした。遅延コンパートメントを加えると、より早期での、そしてより後期での予測下での代謝産物レベルの過剰予測の除去をもたらして、有意により優れたモデル（ｄＯＦＶ＝−３０５）をもたらした。クリアランス及び容積に対する体重の影響を説明するためにアロメトリックスケーリングを０．７５と１の指数で取り込むと、モデル適合度が有意に改善される（ｄＯＦＶ＝−１８４）ことが見出された（Anderson, B. and Holford, N., Br. J. Clin. Pharmacol., 72:518-20; author reply 521-3 (2011)）。モルヒネクリアランスに対する人種の影響を含めると、このモデルが改善されて、アフリカ系アメリカ人は白人種より８％高い平均クリアランスを有した（Sadhasivam, S. et al., J. Opioid Manag., 8: 217-26 (2012)）。同様に、ジェンダーもモルヒネの薬物動態に影響を及ぼして、女児は、男児より５％高いクリアランスを有する。
【０１４５】
[183]  体重正規化したモルヒネクリアランスと両方の代謝産物の生成クリアランスの事後（ad-hoc）ベイズ推定値に関する片側 ANOVA を使用して、予め選択した機能遺伝子型の貢献についての予備的な共変量解析を実施した。体重による貢献を正規化した後に得られるこれらの推定値は、交絡因子としてのサイズの非存在下での個別のクリアランス値を表す。モルヒネクリアランスの個別の事後ベイズ推定値（図２）を外観視察すると、我々の研究コホートでは、同型接合のＯＣＴ遺伝子型被験者が野生型と異型接合群を合わせたものより低い平均ＣＬＭを有したと示唆される。Ｍ３Ｇ生成クリアランスでも類似の傾向が観測され、ここでは、ＯＣＴ１同型接合群が他群より約５０％低い平均値を有した。同型接合群におけるより低い（約５５％）Ｍ６Ｇ生成クリアランスの証拠は、統計学的に有意ではない（ｐ＝０．０９）ものの、実質的なものであった。この予備的な ANOVA 分析に一致して、ＮＯＮＭＥＭ共変量解析は、ＯＣＴ１同型接合群がＣＬＭとＣＬＦＭ３Ｇについて有意な共変数（ｄＯＦＶ＞３．８４）であって、同型接合体が他のものより１６％と４８％低いクリアランスを有することを明らかにした。Ｍ６Ｇ濃度を定量したのは、１２名の同型接合被験者のうち２名だけであり（ＬＯＱ未満の濃度と分析上の問題による）、異なる群間でのＭ６Ｇ生成における差異に関する定量的な情報の不足をもたらした。
【０１４６】
[184]  ＡＢＣＣ３（−２１１Ｃ＞Ｔ）遺伝子型に関して、個別のクリアランスについての事後ベイズ推定値の変動（図２）を外観視察すると、被験者では、Ｃアレルの数が増加するにつれて代謝産物生成クリアランスとモルヒネクリアランスが進行的に高くなることが示される。二者択一的なグルーピング（即ち、（１）ＴＴ＋ＣＴ対ＣＣと、（２）ＴＴ対ＣＴ＋ＣＣ）を使用して行った予備的な片側 ANOVA 分析は、前者のグルーピングでの証拠の方が、すべての変数についての検定全体で後者より統計学的に有意であることを示唆した（Mizuno, T. et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 93:S63-S63 (2013)）。このＡＢＣＣ３遺伝子型を潜在的な共変数としてＮＯＮＭＥＭモデルにおいて評価すると、ＣＣ遺伝子型が有意に高いＣＬＦＭ３Ｇを有して、それを含めると、モデル適合度が有意に改善されることが明らかになった（ｄＯＦＶ＝−９）。同様に、ＡＢＣＣ３遺伝子型は、片側 ANOVA（ｐ＝０．０３）とＮＯＮＭＥＭモデルにおける共変数包含（ｄＯＦＶ＝−４．８６）に基づいて、ＣＬＦＭ６Ｇに有意な共変数であることが見出された。このＮＯＮＭＥＭモデル推定値に基づくと、ＣＣ遺伝子型は、ＴＴ遺伝子型とＣＴ遺伝子型を合わせたものより４６％（９５％ＣＩ：４．３％〜８８％）高いＣＬＦＭ３Ｇを有した。ＣＬＦＭ６Ｇの増加についての推定値はＣＬＦＭ３Ｇに類似していたが、このパラメータに関する精度は、より低かった。１０００個のブートストラップ推定値に基づくノンパラメトリック変数信頼区間推定値を使用してさらに評価すると、ＣＬＦＭ６Ｇの増加が４７％のメジアンと２％〜１００％の９５％ＣＩでかなりよく推定されることが確かめられた。同型接合のＣＣ遺伝子型がより高い代謝産物生成を有するとする証拠は強いものの、モルヒネクリアランスに対するその影響はさほど明白でなかった。ＡＢＣＣ３遺伝子型を潜在的な共変数として含めると、モデル適合度が改善された（ｄＯＦＶ＝−２）が、他より適度に高い（８．１％；９５％ＣＩ：−０．７％〜１６．８％）モルヒネクリアランスを有すると推定されるＣＣ遺伝子型では、このモデルを有意には改善しなかった。
【０１４７】
[185]  個別のクリアランス（ＣＬＭ／ＣＬＦＭ６Ｇ）についての事後推定における変動（図２）は、ＡＢＣＢ１  Ｃ３４３５Ｔ遺伝子型がＣＬＭとＣＬＦＭ６Ｇに対して識別可能な影響力の無いことを示す。しかしながら、ＣＴ遺伝子型とＴＴ遺伝子型を合わせた被験者は、ＴＴ遺伝子型の被験者より高いＣＬＦＭ３Ｇを有するように思われた（図２）。これらの傾向は、片側 ANOVA 分析に基づいて、統計学的に有意であることが確かめられが、それは、ＣＴ＋ＴＴ遺伝子型がＴＴより１８．４％高いＣＬＦＭ３Ｇを有する（ｐ＝０．０４）一方で、ＣＬＭに対するその影響はほとんど無い（１％）ことを明らかにした。上記のことは、Ｃ３４３５Ｔ遺伝子型を、ＣＬＭとＣＬＦＭ６Ｇに対してではなくて、ＣＬＦＭ３Ｇに対して有意な共変数（ｄＯＦＶ＝−４．３２）として同定したＮＯＮＭＥＭ解析からの結果と一致した。
【０１４８】
考察
[186]  最近、オピオイド処方の増加に伴って、オピオイド応答における変動性に対する様々な薬理遺伝学（ＰＧ）因子の貢献を定量することへの関心の高まりが認められている（Branford, R. et al., Clin. Genet., 82:301-10 (2012); Cohen, M. et al., Curr. Opin. Anaesthesiol., 25:419-27 (2012); Sadhasivam, S. and Myer, C., Pain Med., 13:982-3, author reply 984 (2012); Eissing, T. et al., Mol. Diagn. Ther., 16:43-53 (2012)）。本研究の現下の関心は、オピオイド応答への遺伝的変動性の貢献の一部が薬力学（ＰＤ）因子によるものであるとしても、モルヒネ薬物動態（ＰＫ）に対するＰＧの役割を把握することである。我々は、本章で、モルヒネとその代謝産物の時間プロフィールを把握するためのＮＯＮＭＥＭモデルの成功裡の開発を示す。事後の個別推定値での簡便な片側ＡＮＯＶＡベースのアプローチを使用して、予め選択したＳＮＰについて、ＣＬＭ、ＣＬＦＭ３Ｇ、及びＣＬＦＭ６Ｇに対する潜在的な影響をスクリーニングした。次いで、ＮＯＮＭＥＭベースの共変量解析を使用して、モルヒネＰＫ及び／又はその代謝産物へ有意に貢献する、３種の異なる遺伝子（ＯＣＴ１、ＡＢＣＣ３、及びＡＢＣＢ１）全体でＳＮＰを同定したが、ＵＧＴ２Ｂ７遺伝子型又はＡＢＣＣ２遺伝子型との関連性はいずれも見出せなかった。
【０１４９】
[187]  このより大規模なコホート研究の結果は、ＯＣＴ１同型接合群が野生型と異型接合を合わせたものより約１７％低いクリアランスを有することを示す我々の初期の結果（Fukuda, T. et al., Pharmacogenomics, 14: 1141-51 (2013); Fukuda, T. et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 93: S49-S49 (2013)）を追認した。我々の結果と一致して、別の臨床研究では、２以上の機能欠損アレルがある被験者が他者より有意に低いモルヒネクリアランスを有することが実証された（Tzvetkov, M. et al., Biochemical Pharmacology, 86: 666-678 (2013)）。今回提示された結果は、機能欠損ＯＣＴ１遺伝子型の肝細胞へのモルヒネの限られた取込みがモルヒネＣＬに直接影響を及ぼすというさらなる証拠を提供する。より低いＣＬの観測結果と一致して、本研究はまた、ＯＣＴ１同型接合の被験者が両方の代謝産物、Ｍ３ＧとＭ６Ｇのより低い変換を有したことを初めて実証する。これらの被験者では、肝細胞へのモルヒネ取込みが限られるために、下流のモルヒネの代謝プロセスに影響を及ぼして、より低いモルヒネグルクロニド産生をもたらした。同型接合の被験者でのより低いモルヒネＣＬ並びにＭ３Ｇ／Ｍ６Ｇ生成の相関した観測結果は、モルヒネの肝細胞へのＯＣＴ１取込みがモルヒネのＰＫにおいて重要な役割を担うことのより強固な証拠を提供する。
【０１５０】
[188]  生理学的なｐＨで、モルヒネは、アミド基が帯電したイオン化状態（ｐＫａ＝８．４）にあって、それによりＯＣＴ１の好適な基質になると予測される。これまでの試験管内（in vitro）研究では、モルヒネの輸送体非依存性の透過性が低くて、モルヒネの肝細胞への輸送体依存性の取込みが取込み全体の約６０％を占めることが示唆された。さらに、これらの研究はまた、モルヒネ取込みが野生型ＯＣＴ１を過剰発現している肝細胞において濃度依存的であるが、機能喪失の遺伝子多型が存在する場合は、取込み率が実質的に（７５〜１００％）低下することを示した。上記の結果に基づくと、欠損型アレルの存在の影響は、モルヒネクリアランス（約１６％）より代謝産物生成（約４５％）において高くて、２以上の欠損型アレルがある被験者において観測された、３７％低いＡＵＣとより一致している。ＯＣＴ１の基質であるモルヒネについては十分に特性決定されているが、グルクロニド代謝産物の取込みにおけるＯＣＴ１の役割については、これまで知られていない。上記の結果は、モルヒネクリアランスに対するＯＣＴ１の作用が現在推定されている１６％よりずっと高い可能性があることを示し、同型接合の被験者では、モルヒネ投薬へ応答して、より良好な鎮痛作用であるがより悪い有害反応を受けることを意味する。
【０１５１】
[189]  加えて、本研究は、ｒｓ４７９３６６５（ＡＢＣＣ３）でＣ／Ｃ遺伝子型の小児が４６％高いＭ６Ｇ生成と４１％高いＭ３Ｇ生成を有することを示し、Ｃ／Ｔ遺伝子型とＴ／Ｔ遺伝子型を合わせたものと比較して、Ｍ６Ｇの血漿への流出が増加していることを示唆した。初期の研究では、本研究からの被験者のサブセット中のＣ／Ｔ及びＴ／Ｔ遺伝子型の患者において、Ｍ３Ｇのモルヒネに対する比とＭ６Ｇのモルヒネに対する比が有意に低いことを報告した（Mizuno, T. et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 93:S63-S63 (2013)）。現行のＮＯＮＭＥＭベースの解析では、投薬と体重による研究全体の変動性が以前よりよく説明され（Mizuno, T. et al., Clinical Pharmacology & Therapeutics, 93:S63-S63 (2013)）、それによって本結果のより機序的な解釈が容易になる。遺伝子型によって代謝産物生成が明らかに改変されることが観測されたが、被験者間のモルヒネクリアランスの増加も観測された。モルヒネの血漿への流出は、ＡＢＣＣ３によるのではないかと思索されてきたが、モルヒネがＡＢＣＣ３の基質であるとする明らかな証拠は存在しない（Tzvetkov, M. et al., Biochemical Pharmacology, 86:666-678 (2013)。
【０１５２】
[190]  モルヒネ投薬後の有害作用の発症率は、アフリカ系アメリカ人の小児より白人種の小児において、そして非ラテン系の小児よりラテン系の小児において高いと報告されてきた（Sadhasivam S. et al., Pediatrics, 129:832-8 (2012); Sadhasivam S. et al., J. Opioid Manag., 8:217-26 (2012); Jimenez, N. et al., J. Health Care Poor Underserved, 21:229-36 (2010)）。我々は、アフリカ系アメリカ人の小児が白人種の小児に比較してより多くのモルヒネを要求するという、臨床で観察されるモルヒネ要求量の人種差について報告したことがある。我々は、白人種がアフリカ系アメリカ人より８％低いモルヒネＣＬを有して、ＯＣＴ１遺伝子型を人種とともに共変数として含めるときは、これがさらに７％へ低下することを見出した。また、我々のＰＫ／ＰＧ関連性は、多数派の人種（白人種：８０％）間で検定することによって集団層別化の影響を限定するときに、矛盾無く再現された。我々が先に報告したように、アフリカ系アメリカ人と比較して白人種の間にＯＣＴ１同型接合群の頻度（約５％）がより高いことは、白人種の小児におけるより低いモルヒネＣＬの背後にある理由の１つで有り得よう。
【０１５３】
[191]  結論として、今回の大規模な小児の薬物動態及び薬理遺伝学研究により、モルヒネとその代謝産物の薬物動態では、体重に加えて、ＯＣＴ１とＡＢＣＣ３の同型接合の遺伝子型が有意な役割を担うことが実証される。具体的には、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５同型接合Ｃ／Ｃ遺伝子型の小児は、野生型と異型接合遺伝子型を合わせたものより約４６％高いＭ６Ｇ生成速度を有して、血漿中への増加したＭ６Ｇ輸送をもたらし、同型接合のＣ／Ｃ遺伝子型では、常に４１％高いＭ３Ｇ生成も観測された。ＯＣＴ１同型接合の遺伝子型（ｎ＝１２）は、有意に低いモルヒネクリアランス（約１７％）を有することが見出された。白人種の集団では、より高い頻度のＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５  Ｃ／ＣとＯＣＴ１同型接合の遺伝子型が観察された。この知見は、アフリカ系アメリカ人より白人種においてモルヒネクリアランスがより低くて、モルヒネでの有害作用の発症率がより高いことを一部説明する。女児と男児の間でモルヒネクリアランスにわずかな差があることも観測された。
【０１５４】
実施例３：ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＢ１、及びＦＡＡＨ変異の検証
[192]  ＡＢＣＣ３についての上記結果を拡張して検証するために、さらなる研究を行った。薬物動態モデルと解析法は、上記に考察した通りであった。上記に記載の扁桃摘出術コホート（Ｔ＆Ａ研究）に加えて、今回の研究では、脊椎後方固定術を施行中の若年者の異なる外科手術集団（脊椎研究）も含めた。この脊椎研究群には、脊椎後方固定術を施行した８８名の特発性側湾症の非肥満若年者を含めた。すべての患者が術後にモルヒネの患者制御鎮痛作用を受けて、４８時間追跡された。モルヒネ消費、術後疼痛スコア、ジアゼパムの使用、及び他の鎮痛薬に関するデータを記録した。登録被験者は、１１〜１９歳で；５９％が女性で、８５％が白人種であった。
【０１５５】
[193]  アロメトリックスケーリングを伴うモルヒネと代謝産物の集団ＰＫモデルについてのモデルパラメータの推定値を下記の表に示す。
【０１５６】
【表５】
0006581117.tif 000007
【０１５７】
[194]  図３Ａは、我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ４７９３６６５遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動を示す。全般的に、ｒｓ４７９３６６５遺伝子型は、ＣＣ遺伝子型が他の型よりそれぞれ３８％と４６％高い生成を有するＮＯＮＭＥＭ共変量解析に基づいて、ＦＣＬＭ６ＧとＦＣＬＭ３Ｇ（それぞれ、ｄＯＦＶ＝−８．４１、及び−７．４４）にとって有意な共変数であることが見出された。ＣＣ遺伝子型の被験者はまた、脊椎研究において有意に高いＭ６Ｇ生成ＣＬ（３８％高い；２９％ＲＳＥ）を有することがわかった。同様の傾向は、有意ではなかったものの、アデノイド口蓋扁桃摘出術の被験者の間でも観測された。両研究を通して、ＣＣ遺伝子型は、より高いＭ３Ｇ生成ＣＬと有意に関連して、アデノイド口蓋扁桃摘出術の研究（４６％高い；４６％ＲＳＥ）と脊椎研究（５７％高い；３８％ＲＳＥ）より類似した推定値を得た。
【０１５８】
[195]  図３Ｂは、我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動を示す。ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ遺伝子型は、ＡＡ遺伝子型が３６％（９５％ＣＩ［−０．００２；０．７１］）高い生成を有するＮＯＮＭＥＭ共変量解析に基づいて、ＦＣＬＭ３Ｇ（ｄＯＦＶ＝−６．５４）にとって有意な共変数であることが見出された。ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ遺伝子型の脊椎被験者の間では一貫したＰＫ−ＰＧ関連性が見出されて、ＮＯＮＭＥＭを使用する共変量解析に基づいて、ＦＣＬＭ３Ｇ（ｄＯＦＶ＝−３．８）にとって有意な共変数の強い傾向を示した。脊椎被験者の間で、ｒｓ４１４８４１２  ＡＡ遺伝子型は、他の遺伝子型より４８％（９５％ＣＩ［０．２１；１．０６］）高い生成を有すると推定された。要約すると、ＡＡ遺伝子型の被験者は、アデノイド口蓋扁桃摘出術の研究において、有意に高いＭ３Ｇ生成ＣＬ（３６％高い；５１％ＲＳＥ）を有することが見出された。脊椎研究においても、ＡＡ遺伝子型が５２％高い（６０％ＲＳＥ）生成を有し、有意性へ傾く同様の傾向（ｐ＝０．０６）が観測された。両研究を通して、ＡＡ遺伝子型は、より高いＭ６Ｇ生成の傾向を示した。
【０１５９】
[196]  図４Ａは、我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｒｓ７３３３９２遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動を示す。ｒｓ７３３３９２遺伝子型は、ＡＡ被験者が他者より５７％低い生成を有する脊椎被験者の間では、Ｍ３Ｇ生成にとって有意な共変数であった。しかし、ｒｓ７３３３９２遺伝子型は、より大規模なＴ＆Ａ研究においては、有意な共変数ではなかった。ＡＢＣＣ３  ｒｓ７３９９２３遺伝子型とモルヒネＣＬ及び代謝産物生成ＣＬの間に有意な遺伝的関連性が見出されなかったからである。
【０１６０】
[197]  図４Ｂは、我々の研究において観測されたＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７遺伝子型でのモルヒネＣＬと代謝産物（Ｍ３Ｇ／Ｍ６Ｇ）生成クリアランス（ＦＣＬＭ３Ｇ及びＦＣＬＭ６Ｇ）における個体間変動を示す。ＡＢＣＣ３  ｋｇｐ８５６０６７７遺伝子型とモルヒネＣＬ及び代謝産物生成ＣＬの間に有意な遺伝的関連性は見出されなかった。これらの結果を下記の表に要約する。
【０１６１】
【表６】
0006581117.tif 000008
【０１６２】
[198]  上記２つの研究からのモルヒネと代謝産物の薬物動態について、モルヒネの中心及び末梢コンパートメント、各代謝産物について１つの分布コンパートメント、及び代謝産物生成の遅延を説明するためのコンパートメントが含まれる、同じ構造ＰＫモデルを使用して、十分に記載した。このモルヒネＰＫモデルパラメータは、両研究の間で類似していたが、モデルパラメータは、脊椎被験者の方がＴ＆Ａ被験者より高いことがわかった。両研究からのモルヒネモデルにおける差は、（ａ）集団（ｂ）併用医薬品、及び（ｃ）薬物動態用試料の採取法における差により生じる研究間の偏差に起因する可能性があった。Ｍ３Ｇの生成クリアランスのＭ６Ｇモルヒネクリアランス推定値に対する比は、脊椎研究において７．２であり、Ｔ＆Ａ研究において９．６であることがわかった。このことは、Ｍ３Ｇ代謝産物生成がＭ６Ｇ生成の７〜１０倍であるという他の報告に一致する。
【０１６３】
[199]  初期の研究において、我々は、ｒｓ４７９３６６５（ＡＢＣＣ３）のＣ／Ｃ遺伝子型の小児が、Ｃ／ＴとＴ／Ｔ遺伝子型を合わせたものより４６％高いＭ６Ｇ生成と４１％高いＭ３Ｇ生成を有して、代謝産物の血漿への流出増加が示唆されることを示した。今回の分析において、我々は、ＡＢＣＣ３  ｒｓ４１４８４１２ＡＡ遺伝子型がより高いＭ３Ｇ生成を有することを示した。ｒｓ４１４８４１２における遺伝的変異がＡＢＣＣ３の機能に及ぼす影響についての基本機序については十分に理解されてはいない。ＡＢＣＣ３は、主に肝細胞の側基底面において発現されることが見出されて、モルヒネグルクロニドへの高い親和性を有すると報告されてきた。その遺伝子型は、代謝産物生成を明らかに改変させることが観測されたが、モルヒネクリアランスに対する有意な影響は観測されなかった。
【０１６４】
[200]  ＡＢＣＣ３  ＳＮＰの意義をさらに決定するために、我々は、それらを臨床転帰に対して検証した。図６は、脊椎後方固定手術を施行中の若年者におけるＡＢＣＣ３  ｒｓ７３３３９２と呼吸抑制の間の関連性の検証を示す。
【０１６５】
[201]  下記の表は、ＡＢＣＣ３の指定の変異の検証を臨床転帰とともに示す。ｃｈｒ１７：４８７１０ｋｂとｃｈｒ１７：４８７７０ｋｂの間の全６５種のＳＮＰが含まれる、ＧＷＡＳ ＡＢＣＣ３データに関する Plink 分析は、品質検査を合格した。このモデルでは、他の有意な共変数と同様に、白人種とアフリカ系アメリカ人の集団を合わせて補正した。これらの解析では、オッズ比を「同型接合の突然変異体」対「ｈｅｔ（異型接合）／ｈｅｔ」対「野生型」として計算した；ＰＯＮＶ＝術後の悪心及び嘔吐；及びｐｌｏｎｇＲＤ＝ＰＡＣＵ滞在延長をもたらす呼吸抑制。
【０１６６】
【表７】
0006581117.tif 000009
【０１６７】
[202]  以下の表は、クリティカル領域中のＡＢＣＣ３  ＳＮＰについて、呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長との関連性を、オッズ比（ＯＲ）及び９５％信頼区間として表示される作用とともに示す。オッズ比は、マイナーアレル（合わせた人種）が１コピー増加した場合の比を示す。図９は、Human Illumina Omni5 GWAS チップからの術後呼吸抑制とＡＢＣＣ３  ＳＮＰの間の関連性を示す。
【０１６８】
【表８】
0006581117.tif 000010
【０１６９】
[203]  加えて、我々は、上記に考察したＡＢＣＢ１、ＦＡＡＨ、及びＯＰＲＭ１のデータをより大きな標本で解析した。下記の表に詳述されるように、ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４のＰＡＣＵ滞在延長をもたらす呼吸抑制（ｐｌｏｎｇＲＤ）との関連と、ＦＡＡＨ  ｒｓ３２４４２０の術後の悪心及び嘔吐（ＰＯＮＶ）との関連の有意性を０．０００２と０．０１４３のｐ値で検証した。この結果は、各症例においてマイナーアレルを有する患者が、そのオッズ比によって示唆されるように、これら有害事象のより高いリスクを有することを示した。
【０１７０】
【表９】
0006581117.tif 000011
【０１７１】
実施例４：若年者における脊椎固定術に続くモルヒネ誘発性呼吸抑制のリスクとＯＰＲＭＩ  Ａ１１８Ｇ変異の関連性
[204]  本研究は、ＯＰＲＭ１  Ａ１１８Ｇ変異がモルヒネ誘発性呼吸抑制（ＭＩＲＤ）への罹患性に影響を及ぼし得るかどうかを判定するために実行した。本実施例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Chidambaran et al. The Pharmacogenomic Journal (2014) 1-8 として後に公表された。
【０１７２】
[205]  ＩＲＢ承認と同意の後で、脊椎後方固定術を施行された８８名の特発性側湾症の非肥満若年者において前向きの遺伝子型盲検試験を実行した。すべての患者が術後にモルヒネ患者制御鎮痛を受けて、４８時間追跡された。ＭＩＲＤ転帰を「１分間に８回未満のＲＲが術後に出現して、３分より長い間の是正処置が必要とされること」として定義した。モルヒネ消費、術後疼痛スコア、ジアゼパムの使用、及び他の鎮痛薬に関するデータを記録した。患者について、ＯＰＲＭ１  Ａ１１８Ｇ変異の遺伝子決定をした。ＯＩＲＤに影響を及ぼす因子についての回帰分析には、人種、性別、モルヒネ要求量、及び遺伝子型が含まれた。遺伝子型サブ群における疼痛スコアと関連の変数を比較した。登録被験者は、１１〜１９歳で；５９％が女性で、８５％が白人であった。ＯＰＲＭ１遺伝的変異に基づくと、６７名が野生型の同型接合（ＡＡ）で、２１名が変異の異型接合／同型接合（ＡＧ／ＧＧ）であった。ＡＡ遺伝子型の３７％がＰＯＤ１／２にＭＩＲＤを有したのに対し、ＧＧ／ＡＧ遺伝子型でＭＩＲＤを有したのは９％にすぎなかった（図７Ａ）。ＡＡ遺伝子型の患者におけるＭＩＲＤは、変数について補正した後で、Ｇアレルを保有する患者と比較して、有意に（＞５倍）高かった（ＯＲ  ９５％ＣＩ：１．５〜４０．６，ｐ＝０．０２７）（図７Ｂ）。ＡＡ遺伝子型と比較して、ＡＧ／ＧＧ遺伝子型の小児は、ＰＯＤ１／２に有意により高い疼痛スコア（ｐ＝０．０２）とより高いモルヒネ要求量を有した（図７Ｃ）。
【０１７３】
[206]  これは、ＯＰＲＭ１  ＡＡ遺伝子型では、ＡＧ／ＧＧ遺伝子型よりもモルヒネ要求量が少ないにもかかわらず呼吸抑制のリスクがより高いことを示した最初の前向き臨床試験である。Ａ１１８Ｇ変異でのＧアレルの存在は、ＭＩＲＤに対する保護効果を有した。この遺伝子型−呼吸抑制の関連性は、より高いリスク状態にある小児を予測して重篤な有害作用の見込みを最小にする一方で、疼痛緩和を最大にするように小児におけるモルヒネの使用を個別化することの重要な一歩である。
【０１７４】
実施例５：小児の扁桃摘出術に続くオピオイド誘発性呼吸抑制の遺伝リスクシグネチャー
[207]  遺伝子研究の知見を臨床診療と遺伝リスク因子の重要な意義のより良い臨床適応性へ翻案するためには、多変量予測因子に基づいた、容易に適用可能な臨床決定則を開発しなければならない。本研究の目的は、遺伝的要因と非遺伝的要因を使用して、モルヒネ誘発性呼吸抑制への罹患性の予測のための信頼し得る安定したモデルを開発することであった。本実施例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Biesiada et al., Pharmacogenomics (2014) 15(14): 1749-1762 として後に公表された。
【０１７５】
[208]  呼吸抑制についての遺伝リスク因子を同定することは、遺伝子−遺伝子相互作用（個々の遺伝子／マーカーのＲＤとの関連性は弱い）によって、そして人種と家系、ＯＳＡのような様々な臨床病態、そしてさらに文化的背景（これは、疼痛忍容性と、疼痛を改善するために使用されるオピオイドの最終用量に影響を及ぼす可能性がある）との相互作用によって複雑化される。結果として、別個のサブタイプへ患者を層別化するための戦略は、ＳＮＰ（又は他のマーカー）とＲＤとの間の関連性のより強い（そしておそらくは各サブタイプにおいて明瞭な）パターンを同定するのに役立つ可能性がある。
【０１７６】
[209]  本研究では、上記の目標を達成するために、教師付き（supervised）アプローチと教師無し（unsupervised）アプローチの両方を使用した。デシジョンツリーを使用する再帰分割法は、データ固有の層別化を提供して、予測ＳＮＰ（とそれらの組合せ）の選択と全体の正確度を最適化する。加えて、デシジョンツリーは、臨床決定支援の基礎として使用し得る、解釈するのが容易な決定則を提供する。教師無しクラスタリングアプローチは、多数のＳＮＰでのアレルだけでなく、上記に言及した複雑な相互作用を把握することに関連し得る他の特徴を共有する患者のクラスターへのコホートの二者択一的な層別化を提供することができる。個別のクラスターを定義することに最も貢献するＳＮＰ（とＯＳＡのような臨床変数）は、例えば、癌の分子サブタイプを定義する遺伝子シグネチャーに喩えて、それらクラスター（サブタイプ）の「ＳＮＰシグネチャー」とみなすことができる。
【０１７７】
[210]  捕捉的な分類化（再帰分割）及びクラスタリング（ＳＮＰシグネチャー）の戦略を使用することで、結果の検証を容易にして、データ中に隠れた構造を解明することもできる。本研究では、この２つのアプローチの結果が概ね一致した結果を生むことを見出した。有意に異なるＲＤのリスクを特徴とする、別個のクラスターの両方へ貢献する数個のＳＮＰを見出した。特異的な層の内部で比較的高い正確度でＲＤを予測するために使用し得る決定則も確定した。これらの結果を下記に要約する。
【０１７８】
研究デザイン、参加者、及び手順
[211]  適正なＩＲＢ承認と同意の後で、扁桃摘出術を施行中で、標準的な周術期ケアの一環としてモルヒネを受容する６〜１５歳の２７３名の小児において前向きの遺伝子型盲検試験を実行した。すべての患者について、回復室において、モルヒネ要求量、疼痛転帰とＲＤの発生、研究対象とした主要転帰を観測した。臨床的に明白な上気道閉塞の非存在下での、１分あたり１０回未満の呼吸という呼吸数、又は９２％より高いＳｐＯ２を維持するのに酸素補充を必要とする９２％未満の持続的な酸素脱飽和としてＲＤを定義した。すべての患者について、TaqMan アッセイを使用して、モルヒネ薬物動態と呼吸抑制経路に関与することが知られている１５種の遺伝子中４８個の一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子型決定をした。遺伝的要因と非遺伝的要因（人種、性別、ＯＳＡ）についてＲＤのリスクとの関連性を解析して、簡単な論理則及びデシジョンツリーのアプローチを使用して、段階的なリスクベースのアルゴリズムを構築した。
【０１７９】
結果
[212]  本研究では、疼痛を改善するために追加の術後モルヒネ投薬を必要とした患者（２７３名の患者のうち１７０名、このうち４５名がＲＤを有した）において、ＲＤのリスクを考慮した。このやり方で解析を層別化することで、この解析において、より高い疼痛感受性、人種、及びＯＳＡ（より高い有害作用リスクのために、ＯＳＡの患者は、予防措置として、モルヒネをより低い用量から開始する）の間の相互作用をより良く考慮することが可能になった。高用量のモルヒネ（非ＯＳＡ患者への０．２ｍｇ／ｋｇのベースラインとＯＳＡ患者への０．１ｍｇ／ｋｇと対照的に、０．３ｍｇ／ｋｇより高いと定義される）を受けた患者のサブセットでも定性的に類似した結果が得られ、ＲＤの予測リスクがあれば、そのように確定される決定則を使用して、モルヒネの追加用量に関する臨床決定を導くことが可能であることを示唆した。
【０１８０】
[213]  教師無しクラスタリングアプローチとこの解析に含まれるすべてのＳＮＰ（互いと高いＬＤ状態にあるものは除く）を使用して、ＲＤのリスクが「低リスククラスター」の約１０％から「高リスククラスター」の約４０％へ徐々に増加する、５つのクラスターを同定した（図８Ａ）。この段階では、人種、ＯＳＡ、及び性別が含まれる、いくつかの臨床／人口統計変数を使用したことに注目すべきである。しかしながら、これらの変数は、クラスタリング結果を偏らせるものの、同定したクラスターとの明白な関連性は示さなかった。そのような定義クラスターの重心（centroids）を使用すること（癌サブタイプ分類化のための「遺伝子シグネチャー」ベースのアプローチに似ている；ここでは、ＳＮＰシグネチャーを使用して、リスクサブタイプを判定する）で、「高い」対「中間」対「低い」リスクの評価について約８２％の正確度を得た。
【０１８１】
[214]  このように入手した諸層の解析は、ほとんどの識別シグナルがほんの一握りのＳＮＰに由来することを明らかにする。このことは、３種のＳＮＰ、即ち、ｒｓ２２９５６３２（ＦＡＡＨ）、ｒｓ１０４５６４２（ＡＢＣＢ１）、及びｒｓ１０４２７１３（ＡＤＲＢ２）の組合せにより、単変量解析と比べてＲＤ症例の識別が改善されるという事実によってはっきりされる。図８Ｂに示すデシジョンツリーから導かれる簡単な決定則を使用すると、（最も識別力のあるＳＮＰ  ｒｓ２２９５６３２単独での０．０００２とは対照的に）０．０００００３のｐ値が得られ、術後介入を必要とした患者のセットに対して約７０％の平均（balanced）正確度で、「低リスク層」対「高リスク層」を同定することが可能になる：
IF [(rs2295632=CC) OR (rs1045642=CC) OR (rs1042713=AA)] THEN RD=NO (low risk of RD)
ELSE RD=YES (high risk of RD)
（［（ｒｓ２２９５６３２＝ＣＣ）又は（ｒｓ１０４５６４２＝ＣＣ）又は（ｒｓ１０４２７１３＝ＡＡ）］であれば、ＲＤ＝無し（ＲＤの低リスク）
さもなければ、ＲＤ＝有り（ＲＤの高リスク））。
【０１８２】
[215]  上記の決定則は、全３つの遺伝子座にリスクアレルを有する患者を高リスク患者として同定する（図８Ｂのツリーの右端のリーフ、ＲＤ＝有りの２６症例とＲＤ＝無しの２４症例）。ここで提示した「ＳＮＰシグネチャー」は、教師無しアプローチを使用して導いた（そしてそれ故に、モデル中のパラメータの訓練セットに対する最適化を必要としなかった）が、このことは、その一般化にとって吉兆である。このデータの階層的クラスタリングについては、本研究の公表版である、Pharmacogenomics, 15(14): 1749-1762 (2014) に示されている。
【０１８３】
[216]  ＳＮＰ選択、コーディングアレル（「アレル」対「優性−劣性」ベース）、追加の層別化判定基準（例、「高用量のモルヒネ」対「必要とされる介入」）の包含の影響について検定することによって、上記の知見を検証した。ＰＶＣＬＵＳＴも使用してブートストラップを実施して、観測されたクラスタリングパターンの安定性についてさらに評価した。主たる５つのクラスターへの支援は高いものの、それらの全体順位はずっと不安定であって低い支援を有し、さらなる改善が達成し得ることを示唆した。
【０１８４】
[217]  独立的な検証では、本プロジェクトの第一相の結論が出てからそのデータが利用可能になった、７４名の患者のセットを使用した。２７４名の患者の訓練セットと一緒にこの新しいデータ点をクラスタリングすると、２７４名の訓練セットだけで観測されるクラスタリングパターンが再現された。介入を必要とした、対照セット由来の新しい患者では、低リスククラスターへ割り当てられた患者が、高リスククラスターへ割り当てられた患者（３０％）と比較して、２倍少ないＲＤ症例（１６％）を有した。加えて、２つの極端なクラスター（ＲＤの最高リスクと最低リスク）は、実のところ、いくらか良く分離したものの、さらにより多くのデータが利用可能になるときは、さらなる改善が達成される可能性があることを示唆した（図１０）。適正で独立した検証の後には、遺伝子型ベースの決定アルゴリズムが根底にあるリスクを事前に判定して周術期の管理を特別設計するのに役立って、個別化鎮痛の臨床実施における重要な基礎ステップとなる可能性がある。
【０１８５】
実施例６：外科手術を施行中の小児におけるオピオイド関連の有害作用：女児に対する不公平な重荷
[218]  オピオイドに対する、鎮痛作用と有害作用の観点からの性特異的な応答について研究する、小児における臨床研究は無い。
【０１８６】
[219]  小児集団におけるモルヒネ作用の性差についての研究は、その根底にある機序が生理学的因子、発育因子、及びホルモン因子（これらは、思春期前の小児、若年者、及び成人の間で変動し得る）によって影響を受ける可能性があるので、特に重要である。異なる外科手術を施行中で異なる周術期医薬品を服用している、様々な合併症を抱えた成人と比べて、１種類の外科手術を標準化された周術期管理で施行中の、比較的多数の健常な小児は、オピオイドに関連した個体間変動を研究するのにより良好な集団である。本研究では、小児の性別が、オピオイドの使用に伴う術後の鎮痛転帰と有害作用転帰に影響を及ぼすと仮定した。故に、我々の研究の目的は、扁桃摘出術を施行中の小児においてモルヒネの鎮痛特性と有害作用を決定することにおける、小児の性の役割を判定することであった。多様なオピオイド応答へ貢献する因子に関する知識は、将来において、オピオイド投薬、鎮痛転帰を最適化して、有害作用の防止戦略を知らせるのに役立つであろう。
【０１８７】
研究デザイン、参加者、及び手順
[220]  これは、扁桃摘出術集団内で標準的な周術期麻酔と外科診療、及び標準的な術後看護ケアを使用する、前向き臨床観察研究であった。本研究は、シンシナチ小児病院メディカルセンター（オハイオ州シンシナチ、アメリカ）の施設内審査委員会によって承認されて、書面のインフォームドコンセントと同意をすべての両親と参加児童より適宜入手した。本プロジェクトでは、特定の人種への選択はなかったが、この病院での扁桃摘出術又はアデノイド口蓋扁桃摘出術（Ｔ／ＴＡ）の手術患者の人口統計からすると、大多数の患者は、白人であった（図１１）。多数の人種についてのデータが利用可能であったが、非白人の男児及び女児の標本サイズが小さいことから、以前の研究（Sadhasivam S. et al., Pediatrics, 129: 832-8 (2012)）では、小児におけるオピオイド関連有害事象における人種による差異（白人小児のほうが黒人小児より相対的に多くの有害作用を受ける）が示されたので、本研究は、白人小児に絞って、白人小児における性の影響について検討した。
【０１８８】
[221]  本試験に資格がある、選択外来Ｔ／ＴＡを施行中の６〜１５歳の小児に交渉して、２００８年８月と２０１２年２月の間の手術日に登録した。人種は、両親か子供のいずれかによる自己申告性であって、人種を確定するための自己報告を受け入れる（Boehmer U. et al., American Journal of Public Health, 92: 1471-2 (2002); Dahan A. et al., Anesthesiology, 88: 903-13 (1998)）。標本選択基準は、再発性扁桃炎、アデノイド口蓋扁桃肥大、又はＯＳＡの故にＴ／ＴＡの予定がある、米国麻酔学会（ＡＳＡ）の身体状態１又は２を有すると指定される小児であった。ＯＳＡ指定の臨床診断には、いびき＋１０秒以上続く睡眠休止又は日中の眠気の既往歴がある睡眠時呼吸障害が含まれた。小児又はその両親が英語を話せなければ、彼らを本研究から除外した。モルヒネに対してアレルギーがあるか又は発達障害、肝臓又は腎臓の疾患、又はオピオイド鎮痛薬を必要とする術前疼痛（例、慢性扁桃炎）を有する小児も除外した。本研究への研究コーディネーターの利用に限りがあったので、有資格被験者をすべて登録し得たわけではなかった（図１１）。
【０１８９】
[222]  本研究施設でのＴ／ＴＡ標準診療の一環として、すべての小児は、予防用のオンダンセトロン（０．１ｍｇ／ｋｇ）とデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を術中に服用する。セボフルラン吸入誘導により麻酔を誘導し、プロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）ボーラスを続けて気管内挿管を容易にする。麻酔は、神経筋肉遮断を使用せずにセボフルランで維持した。患者は、外科的切開に先立って、予防的な（pre-emptive）鎮痛のためにモルヒネを受容する。ＯＳＡ既往歴のある小児が０．１ｍｇ／ｋｇのモルヒネを受容するのに対して、ＯＳＡ診断のない小児は、０．２ｍｇ／ｋｇを受容する。外科的切開と焼灼に続く疼痛（心拍数及び血圧の臨床的に有意な増加）が示唆されるどんな徴候でもあれば、臨床麻酔チームは、術中に必要に応じて追加のモルヒネを提供する。
【０１９０】
転帰
[223]  鎮痛作用とオピオイド関連有害作用についての転帰を回収した。鎮痛作用の転帰には、術後疼痛スコア、モルヒネ用量（ｍｇ／ｋｇ）、静脈内鎮痛介入の必要（有り／無し）、疼痛によるＰＡＣＵ滞在延長（＞９０分）（有り／無し）、及び与えた全鎮痛介入の回数が含まれた。加えて、０〜１０の数値評価スケール（ＮＲＳ）（Voepel-Lewis T. et al., Anesth. Analg., 112: 415-21 (2011)）と０〜１０のＦＬＡＣＣ（顔の表情；脚の動き；活動性；泣き声；及び機嫌）スケール（Merkel S. et al., Pediatr. Nurs., 23: 293-7 (1997)）をそれぞれ使用して、主観的疼痛スコアと客観的疼痛スコアについて評価した。ＰＡＣＵでは、モルヒネ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の救助的投与で有意な術後疼痛（ＮＲＳ又はＦＬＡＣＣが４／１０以上）を管理した。最大のＮＲＳスコアとＦＬＡＣＣスコアについて検討した。
【０１９１】
[224]  １）ＲＤ、悪心／嘔吐（ＰＯＮＶ）、及び掻痒が含まれるオピオイド関連の副作用；２）呼吸抑制又は悪心／嘔吐に続発するＰＡＣＵ滞在延長という２組の二元転帰によって有害作用を測定した。我々の研究では、ＲＤを、臨床的に明白な上気道閉塞と１分以上の人為的結果の非存在下での、１分あたり１０回未満の呼吸という持続的な呼吸数、又は９２％より高いＳｐＯ２を維持するのに酸素補充を必要とする９２％未満の持続的な酸素脱飽和として定義した。
【０１９２】
[225]  ＰＡＣＵ滞在の期間（ＰＡＣＵ退院準備を達成するための時間）を、以下の退院判定基準に達する前のＰＡＣＵ中の時間として定義した。意識レベル：容易に覚醒可能であるか又は覚醒している、気道：十分な空気交換が可能、深部体温：３６．３℃以上、許容疼痛レベル（４未満の疼痛スコア）、血行力学的に安定している、ＰＯＮＶや呼吸抑制のような有意なオピオイド関連有害作用無し、及び外科手術部位に出血も合併症も無いこと。この退院準備時間は、社会的な理由（例、乗車待ち、等）による遅延を含めなかったので、実際のＰＡＣＵ退院時間とは異なるものである。
【０１９３】
統計解析
[226]  解析に先立って、データの質を検討した。アフリカ系アメリカ人が４４名で、他の人種も１０名しか含まれなかったので、白人に対して解析を実施した。性別の影響について評価するために、初めに転帰測定値をＯＳＡ層別化の有り無しで男児と女児の間で比較した。ｔ検定又はウィルコクソン（Wilcoxon）順位和検定を使用して連続変数を比較して、フィッシャーの正確検定を使用してカテゴリー変数を比較した。モルヒネ作用について解析するために、術中モルヒネ用量（ｍｇ／ｋｇ）と総モルヒネ用量（ｍｇ／ｋｇ）を低、中、及び高用量（術中モルヒネでは、０．１以下、＞０．１〜０．２、＞０．２、総モルヒネでは、０．２未満、０．２〜０．３、及び＞０．３）へ分類した。スピアマン（Spearman）相関係数を使用して、モルヒネ用量と転帰との関係を性別で評価した。
【０１９４】
[227]  次いで、多変量統計モデリングを実施して、共変数効果について考慮しながら、性別の影響と性とモルヒネ用量の相互作用について正式に検定した。鎮痛作用の転帰では、術中モルヒネ量を共変数として使用し；副作用の転帰では、総モルヒネ要求量（術中モルヒネ用量と術後モルヒネ用量の和として計算される）を共変数として使用した。年齢、体重、ＢＭＩ  ｚスコア、及びＯＳＡの影響についても、すべての転帰の共変数として検定した。有意な影響が検出された（ｐ＜０．０５）場合、共変数を最終モデルに含めた。ロジスティック回帰を使用して、二元転帰を解析した。線形回帰を使用して、最大ＮＲＳを解析した。スコア０の過剰頻度の故に、ゼロ過剰負の二項分布モデルを使用することによって、最大ＦＬＡＣＣスコアを解析した。鎮痛介入の総数は、ポアソン分布に従ったので、一般化線形モデルを使用して解析した。介入を必要とした患者において、線形回帰を使用して、術後モルヒネ用量を解析した。
【０１９５】
[228]  副作用と総モルヒネ用量の間の関係が年齢によって異なるのかどうかを検討するために、女性患者を３つの年齢群（８歳未満、８〜１３歳、及び１３歳より上の年齢）へ群分けして、正式のタナー分類（Tanner staging）の代わりに、女性を思春期前、思春期、及び思春期後として分類した。この解析では、モルヒネの潜在的な閾値効果の故に、総モルヒネ要求量を≧０．３又は＜０．３ｍｇ／ｋｇの用量範囲へ二分した。この３つの年齢群において別々に、総モルヒネ量とＰＯＮＶ、ＲＤ、ＰＯＮＶとＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長の間の線形傾向について評価した。次いで、この仮説を、多変量ロジスティックモデルを使用して正式に検定した。
【０１９６】
[229]  統計解析ソフトウェア、バージョン９．３（SAS Institute 社、ノースカロライナ州ケーリー）を使用して、統計解析を実施した。０．２６の平均スピアマン相関係数で１１種の相関転帰を検討した。相関性補正したボンフェローニ補正（http <colon slash slash> www <dot> quantitiveskills <dot> com <slash> sisa）により、０．００８の有意閾値を生じた。０．０５の閾値に近づく関連性についても報告した。このことは、将来の研究のために潜在的な関連性を同定するのに役立ち得るが、第一種過誤率の上昇による上記結果を解釈する場合には、注意を払わなければならない。
【０１９７】
結果
[230]  コソートダイアグラムでは、有資格で、交渉されて登録した研究被験者を図解する（図１１）。非白人小児の相対的により少ない標本サイズ（４４名のアフリカ系アメリカ人と１０名の他の人種、又は二人種）のために、本研究は、２１９名の白人小児（１１４名の女児と１０５名の男児）に焦点を当てた。平均年齢と平均体重は同等であったが、ＯＳＡの発症率は女児の方が高かった（５０％対３６％，ｐ＝０．０４）（表１０）。年齢とＢＭＩは、男児と女児の間で同等であった。
【０１９８】
[237]  すべての総モルヒネ用量を一緒の群にまとめると、単変量解析（表１１）又は多変量モデリング（データ示さず）において、鎮痛作用とオピオイド関連の有害転帰のいずれにおいても、有意差を検出しなかった。ＯＳＡによる層別化は、上記の結果に影響しなかった。
【０１９９】
【表１０】
0006581117.tif 000012
【０２００】
【表１１】
0006581117.tif 000013
【０２０１】
【表１２】
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【０２０２】
【表１３】
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【０２０３】
【表１４】
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【０２０４】
[231]  この単変量解析は、総モルヒネ量を連続変数として使用する、モルヒネ作用を性別によって正式に検定する多変量モデルによって支持された。ＰＯＮＶ（ｐ＝０．００１）とＰＯＮＶによるＰＡＣＵ滞在延長（ｐ＝０．０１０）において、有意な性特異的なモルヒネ作用が検出された。女児では、これらの有害作用を有する確率が総モルヒネ用量の増加とともに高まったが、一方男児では、総モルヒネ用量の増加に伴って有害作用を有する確率において、有意な変化を検出しなかった（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【０２０５】
[232]  表１２に示すデータは、女児において、総モルヒネが０．３ｍｇ／ｋｇを超えるときにほとんどの副作用が起きることを示した。この閾値モルヒネ作用について、多変量モデルを使用して検定した。副作用の確率は、２つの低モルヒネ群の間で異ならなかった。しかしながら、モルヒネが０．３ｍｇ／ｋｇを超えると、掻痒以外のすべてのオピオイド有害作用の確率が有意に（ｐ＜０．０５）増加した。
【０２０６】
[233]  女児において、呼吸抑制を有する確率は、総モルヒネ用量の増加に伴って高まった（ｐ＝０．００１）（図１３Ａ及び１３Ｂ）。男児では、総モルヒネ用量の増加に伴ってＲＤを有する確率において、有意な変化を検出しなかった（ｐ＝０．０７９，表１２）。より若年の女児（８歳未満と８〜１３歳）では、ＲＤとより高い総モルヒネ用量（０．３ｍｇ／ｋｇ以上）の間に統計学的に有意な関連性が検出された（表１３）。
【０２０７】
[234]  ０．３ｍｇ／ｋｇ以上の総モルヒネを受容した白人女児は、０．３ｍｇ／ｋｇ未満の総モルヒネを受容した女児（８２．２±３．３分）より長くＰＡＣＵに滞在した（１１１±６．６分）（図１４）。＜０．３ｍｇ／ｋｇ未満のモルヒネを受容した男児がＰＡＣＵに８８．３±３．６分間滞在したのに対し、０．３ｍｇ／ｋｇ以上の総モルヒネを受容した白人男児は、ＰＡＣＵに９９．７±６．４分間滞在した（図１３）。このＰＡＣＵ退院準備時間における差は、年齢、体重、ＯＳＡの既往歴を補正した後で、統計学的有意性に達しなかった（ｐ＝０．０９）ものの、より高い総モルヒネ用量を受容した白人女児において、より低い用量より滞在時間が約３０分長いことは、外来扁桃摘出術の後で臨床的及び経済的に重要である。性別によって層別化した解析において、高用量の女児におけるＰＡＣＵ滞在延長が男児のそれと統計学的有意性（ｐ＝０．０９）で異ならなかったものの、高用量の女児は、低用量の女児より長いＰＡＣＵ滞在を有し（ｐ＝０．０００２）、一方男児では、その差は、統計学的に有意でない（ｐ＝０．１１）（図１４）。
【０２０８】
[235]  単変量モデリングと多変量モデリングのいずれを使用しても、鎮痛転帰に対する性特異的なモルヒネ作用についての証拠は無かった（表１３）。鎮痛作用に関しては、性別による、モルヒネへの差示的な応答は無かった。
【０２０９】
[236]  要約すると、女児では、ＰＯＮＶ、ＲＤ、ＰＯＮＶとＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長について、総モルヒネ用量との有意な関連性が検出された。この関連性が年齢（即ち、思春期後の女児におけるホルモンの影響）によって影響を受けるかどうかを検定するために、８歳未満、８〜１３歳、及び１３歳より上の女児を比較した（表１３）。より若年の女児（８歳未満と８〜１３歳）は、ＲＤ、ＰＯＮＶ、及びＰＡＣＵ滞在延長との関連性を示した。しかしながら、この年齢効果だけを多変量モデルにおいて検定すると、おそらくは標本サイズが小さいために、統計学的に有意な年齢差異は検出されなかった（データ示さず）。
【０２１０】
[237]  本研究は、同様の鎮痛作用を受けるものの、白人女児は、総モルヒネ用量が増加するにつれて、男児よりもオピオイド有害作用に対して敏感であったことを実証する。白人女児は、男児に比べて、オピオイド関連有害作用のより高い発症率と外来手術後の入院延長という不公平な重荷をもたらす、より高い総モルヒネ用量への差示的な応答を有する。具体的には、女児でのモルヒネ用量の増加は、男児に比べて、ＲＤ、ＰＯＮＶの増加と、オピオイド関連の呼吸抑制とＰＯＮＶによる回復室での滞在延長に関連した。総モルヒネを低用量、中用量、及び高用量へ層別しない場合、小児における周術期モルヒネ使用での安全性と鎮痛転帰は、性別によって異ならなかった。上記の知見は、年齢、ＢＭＩ、及び外科技術に関連しなかった。女児では、男児に比べて、より高用量のオピオイドでより多くのオピオイド関連のＲＤ及びＰＯＮＶを受けて、より長期の入院につながる可能性があるので、上記の知見には、有意な臨床上及び経済上の影響がある。
【０２１１】
[238]  モルヒネ用量を高めることは、男児ではなく女児において、副作用の増加をもたらすことが見出された。具体的には、最高のモルヒネ用量カテゴリー（０．３ｍｇ／ｋｇ）を受容した女児は、高用量カテゴリーではない女児に比べて、有意により多いＲＤ、ＰＯＮＶ、ＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長、及びＰＯＮＶによるＰＡＣＵ滞在延長を有した。しかしながら、男児では、モルヒネ用量が副作用と関連しなかった。重要にも、上記作用は、このコホート中の女児においてＯＳＡの発症率が相対的に高いにもかかわらず、ＯＳＡに関連しなかった。成人集団では、男性に比べ、女性が、呼吸抑制を含めてより高率のオピオイド関連有害作用を体験すると文献が裏付けている（Fillingim R. et al., J Pain, 6:116-24 (2005); Zacny J. Drug Alcohol Depend., 63:23-8 (2001); Zun L. et al., Am. J. Emerg. Med., 20:151-4 (2002); Cepeda M. et al., Clin. Pharmacol. Ther., 74:102-12 (2003); Franconi F. et al., Pharmacol. Res., 55:81-95 (2007)）。モルヒネ誘発性呼吸抑制に伴う性差に注目した少数の成人研究（Sarton E. et al., Anesthesiology, 93:1245-54 (2000); Sarton E. et al., Anesthesiology, 90:1329-38 (1999)）は、男性に比べて、女性が呼吸抑制を発現するより高いリスク状態にあることを示した。しかしながら、オピオイド関連有害作用に対する性の影響を小児において検討したデータはほとんど存在しない。
【０２１２】
[239]  研究コホートの拡大された退院後フォローアップでは、機能的なＣＹＰ２Ｄ６表現型のある女児が、退院前のＰＡＣＵの女児に見られる、より高用量の静脈内モルヒネ投薬に関連した有害作用に類似及び一致した有害作用を、最初の術後２〜３日目に自宅での経口コデイン（モルヒネプロドラッグ）で、有意により高い頻度で発症したことが観測されている（Prows C. et al., The Laryngoscope, DOI: 10 <dot> 1002 <slash> lary <dot> 24454 (2013)）。静脈内モルヒネと経口コデインでの有害作用が病院と家庭の状況で女児の間でより高率に発症するという上記の一貫した知見は、これまでの知見を追認するだけでなく、女児に対する拡大されて不公平な臨床上及び潜在的に経済上の諸影響を示すものである。呼吸抑制における性関連の差異は、中枢媒介性の作用ではなくて、末梢の化学反射ループによって媒介される作用に続いて生じることが示されている（Sarton E. et al., Anesthesiology, 93:1245-54 (2000)）。
【０２１３】
[240]  本研究では、性別、モルヒネ用量、及び鎮痛作用の間にいかなる関連性も見出せなかった。女児の思春期年齢カテゴリーによる、疼痛の差示的な関連性も見出せなかった。これは、女性の方がオピオイドでのより良好な疼痛制御を体験することを示唆するいくつかのヒト成人研究と対照的である（Campesi I. et al., Handb. Exp. Pharmacol. 265-78 (2012)）。疼痛体験全体では、性によって異なる知覚を有する場合がある（Toomey M. AANA J., 76:355-9 (2008)）。加えて、男性と女性では、薬物動態において有意差（ほぼ４０％）が存在し、このことは、男性よりも女性において体内全水分量が少ないこと、並びに筋肉に対する脂肪百分率が高いことに起因する（Anderson G. J. Womens Health (Larchmt), 14:19-29 (2005)）。薬物代謝に必要な酵素の異なる発現も、これらの差異の原因であるかもしれない（Anderson G. J. Womens Health (Larchmt), 14:19-29 (2005); Schwartz J. Clin. Pharmacol. Ther., 82:87-96 (2007); Franconi F. et al., Curr. Pharm. Des., 17:1095-107 (2011)）。モルヒネクリアランスが含まれるモルヒネの薬物動態については以前に報告されたことがある（Sadhasivam S. et al., J. Opioid Manag., 8:217-26 (2012)）。性別は、モルヒネクリアランスの共変数として含まれたが、小児におけるモルヒネ薬物動態の変動性への主要な予測因子であるとは見出されなかった（Sadhasivam S. et al., J. Opioid Manag., 8:217-26 (2012)）。
【０２１４】
[241]  本研究では、オピオイド関連の有害作用が、高い総モルヒネ用量（＞０．３ｍｇ／ｋｇ）が投与される場合に、女児においてより頻繁に出現する傾向にあって、一方男児においては、総モルヒネ用量に伴ってオピオイド有害作用が増加するというそのような線形の傾向を観測しなかった（表１２）。男児と女児の間のホルモンの違いによって、オピオイド有害作用における性差を潜在的に説明することができるのではないかと仮定された。オピオイド有害作用における性差の背後にある機序を潜在的に説明するために、女児の一般的な思春期年齢を思春期に関連した異なるホルモンレベルの代用因子として使用して、女児の３つの年齢カテゴリー：＜８歳（思春期前）、８〜１３歳（思春期）、＞１３歳（思春期後）について解析した。女児では、ＰＯＮＶ、ＲＤ、及びＰＯＮＶとＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長と総モルヒネ用量の有意な関連性が検出された；より高用量のモルヒネで、より若年の女児が有意により多いＲＤ及びＰＯＮＶを有したのである（表１４）。興味深いことに、年齢もＯＳＡ発症率（より若年の女児及び男児においてより高い頻度）も、年齢とＯＳＡの影響を多変量モデルにおいて検定すると、モルヒネ用量への女児の感受性に関連しなかった（おそらくは、各年齢と総モルヒネ用量のカテゴリーにおいて女児の数が少ないためであろう）。高モルヒネ用量（０．３ｍｇ／ｋｇ）でのオピオイド有害作用の高い発症率は、３つの年齢カテゴリー全体で明らかである（特に、より若年の女児において）ので、上記のデータは、女児におけるホルモン媒介性の差異を支持しない。しかしながら、タナー分類を実施しなかったので、この年齢カテゴリー化が思春期の良好な測定基準で無かった可能性はある。
【０２１５】
[242]  上記の解析が自己申告性だけの白人集団に限定されたことに留意することは重要である。これまでの諸研究で、副作用のリスクに人種差があることが実証されてきた（Sadhasivam S. et al., Pediatrics, 129: 832-8 (2012)）ので、人種によって解析することが重要であった。人種そのものは本研究の主眼でなかったが、我々の研究では、自己申告性の人種と家系情報マーカーの間に９５％より高い相関性があった。人種の自己申告は、臨床医が即座に利用可能であるので、祖先の遺伝子マーカーよりも使用するのが容易である。意味のある解析のために利用可能な少数派の小児の数が相対的に少ないために、本結果は、白人小児に絞られた。上記の差異が非白人集団においてもやはり認められるかどうかは明らかでない。上記のデータに基づくと、白人女児は、白人女児のためのより積極的なＰＯＮＶ及びＲＤ予防戦略より利益を受ける可能性がある。
【０２１６】
[243]  結論として、白人小児では、用量関連性のオピオイド有害作用リスクについての性差が存在する。白人女児は、外科手術を施行中の男児より、より高用量のモルヒネでオピオイド関連性の呼吸抑制及びＰＯＮＶとオピオイド有害作用によるＰＡＣＵでの滞在延長を受けるより高いリスクを有する。この差異は、思春期年齢でもＯＳＡを示唆する病歴でも説明できなかった。小児を治療する場合、男児と類似の鎮痛を経験しながらも、白人女児は、より高用量のオピオイドに対して相対的により敏感であって、より高率にオピオイド関連有害事象を有してＰＡＣＵにより長く滞在することに留意すべきである。この知識は、小児において好ましくない臨床的及び経済的な周術期転帰を防ぐのに役立つことだろう。
【０２１７】
実施例７：オピオイド誘発性の呼吸抑制：ＡＢＣＢ１輸送体の薬理ゲノム学
[244]  モルヒネの作用は、脳幹、特に延髄（これは、鎮痛作用だけでなく高炭酸症への喚起応答性の原因となるミュー受容体を豊富に含有する）に存在するミュー（ｍｕ）オピオイド受容体によって媒介される（Zhang, Z., et al., Anesthesiology, 107:288-297 (2007); Pattinson, K. Br. J. Anaesth., 100:747-758 (2008)）。加えて、オピオイドは、呼吸を制御する皮質中枢に深い影響を及ぼして、それにより脳幹におけるそれらの作用が強化される（Pattinson, K. et al., J. Neurosci., 29: 8177-8186 (2009)）。従って、脳中へのモルヒネ輸送の変動性は、モルヒネに対する個体間応答を説明するのに役立つ可能性がある。モルヒネの脳中濃度は、血液脳関門にあるＰ−糖タンパク質輸送体、ＡＢＣＢ１によって影響を受ける。ＡＢＣＢ１の遺伝子多型、ｃ．３４３５Ｃ＞Ｔは、成人におけるモルヒネの血液脳関門輸送活性に関連付けられていて、同型接合のＴＴ遺伝子型は、他の遺伝子型より高いモルヒネの最大ＣＳＦ濃度に関連していた（Meineke, I. et al., British Journal of Clinical Pharmacology, 54:592-603 (2002)）。以前から、同じＡＢＣＢ１遺伝子多型のｃ．３４３５Ｃ＞Ｔは、別のオピオイド、フェンタニルを服用中の韓国の成人での呼吸抑制増加と関連付けられてきた（Park, H. et al., Clin.Pharmacol. Ther., 81:539-546 (2007)）。しかしながら、小児におけるモルヒネ誘発性呼吸抑制にＡＢＣＢ１変異が関連しているかどうかは、知られていない。
【０２１８】
[245]  本研究では、ＡＢＣＢ１中の遺伝的変動性が小児におけるモルヒネの安全性及び臨床効果に有意に影響を及ぼすと仮定した。本研究は、扁桃摘出術を施行中の米国小児の均質な大集団において、術後鎮痛に加えて呼吸抑制の臨床測定値を使用して、よくあるＡＢＣＢ１遺伝的変異と静脈内モルヒネ誘発性術後呼吸抑制の間の特異的な関連性を判定することを目標とした。本実施例は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Sadhasivam et al., The Pharmacogenomics Journal (2014) 1-8 として後に公表された。
【０２１９】
研究デザイン、参加者、及び手順
[246]  扁桃摘出術を施行中の２７３名の小児における前向き臨床観察研究を、標準的な周術期の麻酔及び外科診療、並びに標準的な術後看護ケアで実行した。本研究は、シンシナチ小児病院メディカルセンターの施設内審査委員会によって承認されて、書面のインフォームドコンセントと同意（１１歳を超える小児より）をすべての両親と参加児童より入手した。本研究にはすべての人種の小児を登録したが、我々の病院での扁桃摘出術患者の人口統計からすると、大多数の小児は、白人であった（図１５）。
【０２２０】
[247]  選択外来扁桃摘出術を施行中の６〜１５歳の小児が本試験に資格があって、手術日に登録した。人種は、両親か子供のいずれかによる自己申告性であって、人種を確定するための自己報告を十分に受け入れる（Boehmer, U. et al., American Journal of Public Health, 92: 1471-1472 (2002); Lalovic, B. et al., Drug Metab. Dispos., 32: 447-454 (2004)）。標本選択基準は、再発性扁桃炎、アデノイド口蓋扁桃肥大、又はＯＳＡの故に扁桃摘出術の予定がある、米国麻酔学会（ＡＳＡ）の身体状態１又は２を有すると指定される小児であった。ＯＳＡ指定の臨床診断には、いびき＋１０秒以上続く睡眠休止又は日中の眠気の既往歴がある睡眠時呼吸障害が含まれた。小児又はその両親が英語を話せなければ、彼らを除外した。モルヒネに対してアレルギーがあるか又は発育遅延、肝臓又は腎臓の疾患、又はオピオイド鎮痛薬を必要とする術前疼痛（例、慢性扁桃炎）を有する小児も除外した。
【０２２１】
[248]  すべての参加者が標準の周術期ケアを受けた。セボフルランを使用して麻酔を誘導し、プロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）ボーラスを続けて、気管内挿管を容易にした。麻酔は、神経筋肉遮断を使用せずにセボフルランで維持した。患者は、外科的切開に先立って、モルヒネを受容した。ＯＳＡ既往歴のある小児が０．１ｍｇ／ｋｇのモルヒネを受容したのに対して、ＯＳＡ診断のない小児は、０．２ｍｇ／ｋｇを受けた。外科的切開と焼灼に続く疼痛（心拍数及び血圧の臨床的に有意な増加）が示唆されるどんな徴候でもあれば、臨床麻酔チームは、術中期に必要に応じて追加のモルヒネを０．０５ｍｇ／ｋｇの増分で提供した。すべての小児が予防用オンダンセトロン（０．１ｍｇ／ｋｇ）及びデキサメタゾン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を術中期に受けた。ＦＬＡＣＣ疼痛スコア（Merkel, S. et al., Pediatr. Nurs., 23: 293-7 (1997））で測定される有意な術後疼痛が４／１０以上であれば、ＰＡＣＵにおいてモルヒネ（０．０５ｍｇ／ｋｇの増分）の救助的投与で管理した。
【０２２２】
[249]  ＰＡＣＵ滞在の期間（ＰＡＣＵ退院準備を達成するための時間）を、以下の退院判定基準に達する前のＰＡＣＵ中の時間として定義した。意識レベル：容易に覚醒可能であるか又は覚醒している、気道：十分な空気交換が可能、深部体温：３６．３℃以上、許容疼痛レベル（４未満の疼痛スコア）、血行力学的に安定している、ＰＯＮＶや呼吸抑制のような有意なオピオイド関連有害作用無し、及び外科手術部位に出血も合併症も無いこと。この退院準備時間は、社会的な理由（例、乗車待ち）による遅延を含めなかったので、実際のＰＡＣＵ退院時間とは異なるものである。
【０２２３】
[250]  登録した２７３名の小児のうち、２１９名が白人小児で、４４名が黒人小児であった。ＡＢＣＢ１  ＳＮＰの異なるアレル頻度と他の人種からの小児数が少ないことのために、本解析は、白人と黒人の小児に絞った。他の人種の小児と二人種の小児については、解析しなかった（図１５）。参加者は主に白人で、男性より女性がわずかに多かった。白人小児に比べて、黒人小児はやや体重が重くて、より高いＯＳＡ頻度を有した（表１４）。
【０２２４】
【表１５】
0006581117.tif 000017
【０２２５】
転帰
[251]  各参加者について、鎮痛作用とオピオイド関連有害作用の測定結果（metrics）を記録した。オピオイド関連有害作用の測定結果のために、本研究は、２つの臨床的及び経済的に重要な転帰：臨床ＲＤと、研究コーディネーターによって不断に評価される、呼吸抑制に続発するＰＡＣＵ滞在延長（＞９０分）に注目した。本研究では、ＲＤを、臨床的に明白な上気道閉塞の非存在下での、１分あたり１０回未満の呼吸という呼吸数と、１分間以上持続して、９２％より高いＳｐＯ２を維持するのに酸素補充を必要とする９２％未満の酸素脱飽和として定義した。
【０２２６】
[252]  鎮痛作用の測定結果には、最大術後疼痛スコア、ＰＡＣＵにおける静脈内鎮痛介入（有り／無し）、及び鎮痛介入が必要とされる患者における術後モルヒネ用量（ｍｇ／ｋｇ）が含まれた。各小児についての最大術後疼痛スコアは、０〜１０のＦＬＡＣＣ疼痛尺度（Merkel, S. et al., Pediatr. Nurs., 23: 293-297 (1997)）を使用して、ＰＡＣＵにおいて多数の時点で評価される術後疼痛スコアより作成した。
【０２２７】
遺伝子型
[253]  各参加者より手術室において麻酔下で血液を採取して同じ日にＤＮＡを単離して、−２０℃で保存した。すべての研究参加者に関する臨床データを入力した後で、バッチ式の遺伝子型決定を実施した。TaqMan アレル識別システムアッセイと Genotyper Software Version 1.0.1（ライフ・テクノロジーズ、アプライド・バイオシステムズ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用して、以下のＡＢＣＢ１遺伝子多型について分析して報告した：ｒｓ１０４５６４２、ｒｓ２０３２５８２、ｒｓ１１２８５０３、ｒｓ２２２９１０９、及びｒｓ９２８２５６４。
【０２２８】
統計解析
[254]  解析に先立って、データの質を検討した。ＡＢＣＢ１変異では、アレルと遺伝子型頻度について、白人患者と黒人患者でそれぞれ評価して、ハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）について検定した。二元転帰（ＲＤ、ＲＤに続発するＰＡＣＵ滞在延長、及び鎮痛介入の必要性）について解析するために、ロジスティック回帰を実施した。術後モルヒネ用量では、用量が正規分布しているので、線形回帰を使用した。最大ＦＬＡＣＣスコアは、２６％の患者が疼痛を経験しない、ゼロ過剰負の二項分布を明示した。このように、ゼロ過剰負の二項分布を使用して最大ＦＬＡＣＣスコアを解析して、この変数の分布を適正に把握した。ＡＢＣＢ１変異の評価に先立って、共変数（年齢、性別、ＢＭＩ  ｚスコア、ＯＳＡ、術中モルヒネ（鎮静転帰用）、及び総モルヒネ（有害作用転帰用））の影響を評価した。最良の適合モデルを選択するために、対数尤度、赤池ベイズ情報量基準を比較して、残差を検討した。この転帰と単一ＳＮＰの関連性について評価するために加法モデルを使用し、ここでは遺伝子型を記録して、連続変数として検定した。４種の二対立遺伝子ＳＮＰについて、マイナーアレルの数に従って、遺伝子型を０、１、及び２へ記録した。ｒｓ２０３２５８２では、ＧＧ遺伝子型を０と記録し；ＧＡ遺伝子型とＧＴ遺伝子型を合わせて１と記録して、ＴＴ遺伝子型とＴＡ遺伝子型を２と記録した。白人患者と黒人患者で別々に統計モデリングを実行して、組み合わせた。人種を組み合わせた場合、人種と人種＊ＳＮＰ相互作用の影響について検定した。
【０２２９】
[255]  本研究では、ＡＢＣＢ１の５種のＳＮＰの、２種の主要副作用転帰と３種の二次鎮痛転帰との関連性について検証した。この５種のＳＮＰの間の平均相関係数は、０．４０であった。主要転帰間のスピアマン相関係数と二次転帰間のスピアマン相関係数は、それぞれ０．４９と０．７４であった。多重検定用にｐ値を補正するために、この転帰とＳＮＰの相関特性を確認した。相関性補正したボンフェローニ補正（http<colon slash slash>www<dot>quantitativeskills<dot>com<slash>sisa）によって、主要副作用転帰に関する検定では０．０１３の有意閾値を得て、二次転帰に関する検定では０．０１４の閾値を得た。０．０５の閾値に近づく関連性についても名義的に関連するものとして報告する。統計解析は、統計解析ソフトウェア（ＳＡＳ）、バージョン９．３と JMP Genomics，バージョン６．０（SAS Institute 社、ノースカロライナ州ケーリー）を使用して実施した。
【０２３０】
[256]  並べ替え検定：遺伝子関連研究では、低いアレル頻度（＜０．１）が関連性を推進する少数の個別値をもたらす可能性がある。従って、０．１未満のマイナーアレル頻度と有意に関連していると同定された変異について、両方の人種を合わせて使用して、並べ替え検定を実施した。Ｒプログラミング言語を使用して、共変数と転帰の間の関連性を変えないまま遺伝子型を無作為にシャッフルすることによって、１０００の反復データを作成した。次いで、上記に記載したのと同じ共変数を補正した同じ方法を使用して、それぞれの反復データについて解析した。
【０２３１】
[257]  自己確認性の人種と遺伝的家系の間の相関性−感度分析：自己申告性の白人種と黒人種が遺伝的家系へ十分適合するかどうかを評価するために、Golden Helix ソフトウェアを使用して、２１８種の家系情報マーカー（ＡＩＭ）で主成分分析を実施した。１３９７の HapMap 被験者を分析用の準拠集団として使用した。
【０２３２】
[258]  検定力分析：本研究の解析に先立って、Quanto を使用して、遺伝子効果を検出するための統計的検出力を推定した。マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）は、我々の変異の変動性を捉えるために０．０３から０．５へ変化させて、αは、多重検定を説明するために０．０１３へ固定した。主要な有害作用転帰である、呼吸抑制をもたらす呼吸抑制（頻度１１％）については、２６３名の小児という我々の全標本を使用し、８０％検出力を使用して、２．６（ＭＡＦ≧０．３）、２．８（ＭＡＦ＝０．２）、３．６（ＭＡＦ＝０．１０）、及び７．３（ＭＡＦ＝０．０３）に等しいオッズ比を検出した。主要な鎮痛転帰である術後モルヒネ要求量については、鎮痛介入を必要とする個体だけを含めた（ｎ＝１６２）。８０％検出力を使用して、９％ほどの小さな変動（β範囲：０．３７〜１．０９の標準偏差単位）を説明する影響を検出した。
【０２３３】
結果
[259]  ＡＢＣＢ１  ＳＮＰとアレル頻度。検討した５種のＳＮＰの中で、１つ（ｒｓ２０３２５８２）は三対立遺伝子であり；１つ（ｒｓ２２２９１０９）は、白人と黒人の両方で低頻度であり；１つ（ｒｓ１０４５６４２）は、白人と黒人に入り込んだメジャー及びマイナーアレルに共通している。すべてのＳＮＰがＨＷＥ（Stern, C. Science, 97: 137-138 (1943)）状態にあって、高い連鎖不平衡を示した（表１５と表１６）。
【０２３４】
【表１６】
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【０２３５】
【表１７】
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【０２３６】
【表１８】
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【０２３７】
【表１９】
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【０２３８】
[260]  ＡＢＣＢ１と呼吸抑制。２６３名の患者のうち５１名（１９％）がＲＤを有して、３０名（１１％）がＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長を有した。ＡＢＣＢ１  ＳＮＰの遺伝子効果を評価するために、初めに、生の転帰測定値を遺伝子型によって要約した。いくつかの潜在的な関連性、特に、白人患者と黒人患者の両方における、呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長とｒｓ９２８２５６４の間の関連性（表１７と表１８）が観測された。この遺伝子効果をさらに確認するために、転帰に対して有意な影響を示す共変数を補正した、統計モデリングを実行した。白人では、呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長に対して、ｒｓ９２８２５６４の統計学的に有意な効果が検出された（ｐ＝０．００１２）（図１６Ａ）。この知見は、黒人でも再現された（ｐ＝０．０２５１）（図１６Ｂ）。人種を合わせて補正すると、ＡＢＣＢ１  ＳＮＰのｒｓ９２８２５６４は、呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長と強く関連していた（ｐ＝０．０００２）（図１６Ｃ）。ｒｓ９２８２５６４のマイナーアレル（Ｇ）の１コピーを加えると、ＰＡＣＵ滞在延長のオッズが白人と黒人でそれぞれ４．１倍（９５％ＣＩ：１．７〜９．９）と１３．９倍（９５％ＣＩ：１．１〜１７５．８）増加した。人種を合わせたとき、マイナーアレル（Ｇ）の１コピーを加えると、ＰＡＣＵ滞在延長のオッズが４．７倍（９５％ＣＩ：２．１〜１０．８）増加した（図１７）。呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長に対して、人種特異的なｒｓ９２８２５６４の効果は検出されなかった。他の変異は、人種特異的な分析においても複合解析においても、ＲＤ又はＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長との名義関連性に達しなかった。ｒｓ９２８２５６４とＲＤによるＰＡＣＵ滞在延長との間の関連性については、１０００の反復値のうち１検体だけが０．０００２の観測ｐ値未満のｐ値を示し、０．００２の経験的ｐ値を生じて、この知見の重要性を裏付けた。
【０２３９】
[261]  ＡＢＣＢ１と鎮痛転帰：最大ＦＬＡＣＣスコア、介入必要性、及び介入（複数）を必要とした患者における術後モルヒネ用量という、３種の鎮痛転帰について検討した。最大ＦＬＡＣＣスコアのメジアンは、０．６のＩＱＲで３であった。２６３名の患者のうち、１６２名（６２％）が鎮痛介入（複数）を必要とした。平均して、術後モルヒネ介入を必要とした患者は、０．１０±０．０５ｍｇ／ｋｇのモルヒネを受容した。モルヒネの救助的投与を受容した患者では、ｒｓ２２２９１０９と術後モルヒネ用量の間に関連性が検出された。その関連性は、白人において名義的であった（ｐ＝０．０５）が、黒人において、それは統計学的に有意であった（ｐ＝０．０１）。人種を組み合わせたとき、術後モルヒネとｒｓ２２２９１０９の関連性が依然として検出され（ｐ＝０．０２）；マイナーアレル（Ａ）の１コピーを加えると、術後モルヒネ用量が０．０４ｍｇ／ｋｇだけ減少した（９５％ＣＩ：０．０１〜０．０７）。人種特異的な影響は、検出されなかった。ｒｓ２２２９１０９と術後モルヒネ用量の間の関連性については、１０００の反復値のうち１３が０．０２未満のｐ値を示し、０．０１４の経験的ｐ値を生じて、それによってこの知見の重要性を裏付けた。
【０２４０】
[262]  自己申告性の人種と遺伝的家系：自己申告された白人種と黒人種を２１８のＡＩＭより推定される遺伝的家系と比較した。図１９に示されるように、２５０名（＞９５％）の小児において、自己申告された人種は、ＣＥＵ及びアフリカ系の家系によく集中した。主成分（ＰＣ）１と２によって、白人種と黒人種を成功裡に分離した（図１９）。本研究において自己申告性の人種を使用したのは、そのほうが臨床医にとってＡＩＭと比べて容易に利用可能だからである。しかしながら、自己申告性の人種と有意な臨床転帰で観測された相関性を確かめるには、遺伝的家系を使用した。ＰＣ１及び２について補正したモデルを使用して、術後モルヒネ要求量とｒｓ２２２９１０９の間の関連性（ｐ＝０．０３）に加えて、ＰＡＣＵ滞在延長をもたらす呼吸抑制とｒｓ９２８２５６４の間の関連性（ｐ＜０．０００１）をさらに確認した。
【０２４１】
[263]  本研究は、一般麻酔下で通常の外科手技を施行中の２６３名の米国小児の均質群における、ＡＢＣＢ１遺伝子多型と、（回復室での滞在延長をもたらす）臨床的に重要なオピオイド関連の呼吸抑制と術後モルヒネ要求量の間の関連性を示した。重要にも、本研究は、白人（ｐ＝０．００１２）、黒人（ｐ＝０．０２５１）及び両人種を合わせたもの（ｐ＝０．０００２）において、ＡＢＣＢ１  ＳＮＰのｒｓ９２８２５６４が呼吸抑制によるＰＡＣＵ滞在延長と関連していることを実証した。ＡＢＣＢ１  ＳＮＰ、ｒｓ９２８２５６４のマイナーアレル（Ｇ）のそれぞれの追加コピーを保有する効果は、ＰＡＣＵ滞在延長をもたらす呼吸抑制のオッズを４．７倍（９５％ＣＩ：２．１〜１０．８）増加させた。このことは、オピオイド誘発性呼吸抑制との関連性についての新しい報告であって、この効果量は、薬理遺伝学的な臨床検査に利用されてきた既知の遺伝的変異における効果量に匹敵する。
【０２４２】
[264]  本研究において観測された別の臨床的に重要な関連性は、ＡＢＣＢ１  ＳＮＰのｒｓ２２２９１０９とＰＡＣＵでモルヒネの救助的投与を必要とした小児における術後モルヒネ用量の間にあった。ＡＢＣＢ１  ＳＮＰ、ｒｓ２２２９１０９のマイナーアレル（Ａ）のそれぞれの追加コピーは、術後モルヒネ用量を０．０４ｍｇ／ｋｇ（９５％ＣＩ：０．０１〜０．０７）減少させて、ＡＡ遺伝子型の小児がモルヒネに敏感であって、さほどモルヒネを必要としないことを示唆した。ＡＢＣＢ１  ＳＮＰのｒｓ２２２９１０９は、ミスセンス遺伝子多型でもあって；核酸の１６９２位でのＧからＡへのアレル変化がＡＢＣＢ１タンパク質におけるアミノ酸残基の変化（Ｓｅｒ→Ａｓｎ）を引き起こす。最近、この変異は、本研究に含まれる他の変異と共同して、ハプロタイプの一部としてメタドンの薬物動態に影響を及ぼすことが示唆されている（Barratt, D. et al., Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 5: 53-62(2012)）。
【０２４３】
[265]  これまで、比較的大規模で均質のアメリカ人集団、特に小児において、モルヒネ関連の有害転帰に対する、ＡＢＣＢ１遺伝子の多型の影響への調査は無かった。本研究は、これまでの限界の多くを最少化する一方でこれまでの学術研究（Leschziner, G. et al., The Pharmacogenomics Journal, 7:154-179 (2007)）に立脚することを試みて、通常のＡＢＣＢ１  ＳＮＰに加えて追加の非同義ＳＮＰを含めた（図１８）。
【０２４４】
[266]  本研究に対しては、いくつかの限界がある。被験者登録の地理的位置のために、上記の知見を他の人種へ一般化するほど多くの非白人小児がいなかった。それでも、その知見は、アフリカ系アメリカ人でもやはり再現された。臨床医にとっての使用のし易さとその容易な利用可能性のために、自己申告性の人種を使用した。しかしながら、自己申告性の人種と遺伝的家系の間には、きわめて高い相関性（＞９５％）が観測された（図１９）。異なる家系由来の小児が含まれる、大規模な多施設試験であれば、異なる人種におけるＡＢＣＢ１遺伝子型の影響を研究するのに役立つであろう。本研究において臨床転帰と関連付けられたたＡＢＣＢ１  ＳＮＰは、非同義でアミノ酸変化と関連しているが、それらは、原因であり得るというよりは、呼吸抑制と術後モルヒネ用量の原因マーカーと連鎖状態にあるのかもしれない（図１８）。ＡＢＣＢ１の配列決定又は緻密なＳＮＰ分析は、「高」対「低」リスクをよりよく識別する他の変異があるかどうかを決定することに役立ち得るだろう。
【０２４５】
[267]  結論として、扁桃摘出術を施行中の小児において、ＡＢＣＢ１遺伝子多型と、術後オピオイド関連の呼吸抑制とオピオイド要求量の間に新規の関連性を見出した。ＡＢＣＢ１  ｒｓ９２８２５６４  ＧＧ同型接合体は、入院延長をもたらす呼吸抑制の増加リスクを有して、ＡＢＣＢ１  ｒｓ２２２９１０９  ＣＣ同型接合体は、術後の鎮痛介入が必要とされるときにより多くのモルヒネを必要とした。上記の知見には、小児外科患者における術後疼痛管理に重要な意義がある。オピオイド関連の呼吸抑制の負の影響を最小にするには、事前のリスク同定、層別化、及び予防手段が重要である。今回のＡＢＣＢ１遺伝子関連データを臨床診療へ適用する前には、潜在的な遺伝子−遺伝子相互作用についてのさらなる検証及び検討が必要であろう。
【０２４６】
[268]  上記に記載した様々な方法及び技術は、本出願を実行するためのいくつかの方法を提供する。記載した目標又は利点の必ずしもすべてが本明細書に記載の特別な態様に従って達成されるわけではないことを理解されたい。従って、例えば、当業者は、本方法が、本明細書において教示された１つの利点又は一群の利点を達成又は最適化するやり方で実施し得ても、本明細書において教示又は示唆された他の目的又は利点を必ずしも達成し得ないことを認められよう。本明細書では、様々な代替態様が言及されている。１つの特徴、別の特徴、又はいくつかの特徴が特に含まれる好ましい態様がある一方で、１つの特徴、別の特徴、又はいくつかの特徴が特に除外される態様もあること、一方、１つの、別の、又はいくつかの有利な特徴の包含によって特別な特徴が薄まる態様もあることを理解されたい。
【０２４７】
[269]  さらに、当業者は、異なる態様からの様々な特徴の適用可能性を認めるであろう。同様に、上記に考察した様々な要素、特徴、及び工程、並びにそのような要素、特徴、及び工程のそれぞれについての他の既知の均等物を様々な組合せにおいて利用して、当業者は、本明細書に記載の原理に従って本方法を実施することができる。様々な要素、特徴、及び工程の中には、多様な態様において特に含まれるものもあれば、特に除外されるものもあろう。
【０２４８】
[270]  本出願を特定の態様及び実施例の文脈で開示してきたが、当業者には、本出願の態様が具体的に開示した態様を超えて、他の代替態様及び／又は使用とその修飾態様及び均等物へ拡張されることが理解されよう。
【０２４９】
[271]  いくつかの態様において、本出願の特定の態様について記載して特許請求するために使用される、成分量、分子量のような特性、反応条件、等を表す数字は、いくつかの事例において、「約」という用語によって修飾されると理解されたい。従って、いくつかの態様において、明細書と付帯の特許請求項において明記される数値パラメータは、概数であって、特別な態様によって得られることが希求される所望の特性に依存して変動する可能性がある。いくつかの態様において、数値パラメータは、報告される有効数字の数に照らして、そして通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本出願のいくつかの態様の広範囲を明記する数値範囲及びパラメータが概数であっても、具体的な態様において明記される数値は、実践可能なほど正確に報告されている。
【０２５０】
[272]  いくつかの態様において、本出願の特別な態様について記載する文脈において（特に、以下の特許請求項のいくつかの文脈において）使用される、「a（１つの）」及び「an（１つの）」（不定冠詞）と「the（その）」（定冠詞）という用語と類似の参照句には、単数と複数の両方が含まれると解釈され得る。本明細書における数値の範囲の引用は、その範囲内に入るそれぞれ別の値へ個別に言及することの簡略表記法として役立つことを単に企図している。本明細書において他に断らなければ、それぞれの個別値は、それが本明細書において個別に引用されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において他に示されなければ、又は状況によって明らかに矛盾しなければ、どの好適な順序でも実施することができる。本明細書の特定の態様に関して提供される、ありとあらゆる実施例、又は例示言語（例えば、「〜のような」）の使用は、本出願をより明確化することを単に企図するのであって、他のやり方で特許請求される本出願の範囲に制限を加えるものではない。本明細書中のどの言語も、本出願の実施に必須な特許請求されない要素を示すものと解釈してはならない。
【０２５１】
[273]  本明細書では、本出願の好ましい態様が、本出願を実行するための、本発明者に知られた最良の形式を含めて記載される。当業者には、先述の記載を読めば、これら好ましい態様に対する変更態様が明らかになろう。当業者は、そのような変更態様を適正なものとして利用し得て、本出願は、本明細書に具体的に記載されるものとは別のやり方で実施することができると考慮される。従って、本出願の多くの態様には、準拠法によって許容されるような、本明細書に付帯される特許請求項において引用される本主題のすべての修飾態様と均等物が含まれる。さらに、上記に記載の要素のあらゆる組合せが、そのすべての可能なバリエーションにおいて、本明細書において他に示されなければ、又は状況によって明らかに矛盾しなければ、本出願に含まれる。
【０２５２】
[274]  本明細書において参照される、すべての特許、特許出願、特許出願の公開公報、並びに、論文、書籍、明細書、公表物、文書、事物、及び／又は同等物のような他の素材は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるが、それに関連したあらゆる審査ファイル履歴、本明細書と一致しないか又は矛盾するもの、又は本明細書と現在又は後に関連する特許請求項の最も広い範囲に対して限定的な効果を有し得るものは、いずれも除外される。例えば、その組み込まれる素材のいずれにも関連する用語の説明、定義、及び／又は使用と、本文書に関連するそれとの間に不一致又は矛盾があるとすれば、本文書における用語の説明、定義、及び／又は使用が優先されよう。
【０２５３】
[275]  最後に、本明細書に開示される本出願の態様は、本出願の態様の諸原理を例解するものであると理解されたい。利用し得る他の修飾態様も本発明の範囲内にあり得る。このように、例示であって、限定ではない、本出願の態様の代替構造も、本明細書の教示に従って利用することができる。従って、本出願の態様は、ここで示して記載したものへ正確に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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