(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインターロイキン６（IL6）に結合する単離された抗体であって、
（ａ）配列番号２の重鎖相補性決定領域１（HC CDR1）、配列番号４の重鎖相補性決定領域２（HC CDR2）、および配列番号６の重鎖相補性決定領域３（HC CDR3）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、配列番号９の軽鎖相補性決定領域１（LC CDR1）、配列番号１１の軽鎖相補性決定領域２（LC CDR2）、および配列番号１３の軽鎖相補性決定領域３（LC CDR3）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｂ）配列番号２の重鎖相補性決定領域１（HC CDR1）、配列番号４の重鎖相補性決定領域２（HC CDR2）、および配列番号６の重鎖相補性決定領域３（HC CDR3）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、配列番号９の軽鎖相補性決定領域１（LC CDR1）、配列番号１１の軽鎖相補性決定領域２（LC CDR2）、および配列番号１５の軽鎖相補性決定領域３（LC CDR3）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）；または
（ｃ）配列番号２の重鎖相補性決定領域１（HC CDR1）、配列番号４の重鎖相補性決定領域２（HC CDR2）、および配列番号１６の重鎖相補性決定領域３（HC CDR3）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに、配列番号９の軽鎖相補性決定領域１（LC CDR1）、配列番号１１の軽鎖相補性決定領域２（LC CDR2）、および配列番号１５の軽鎖相補性決定領域３（LC CDR3）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記抗体。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬ；または
（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬ；
を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
抗体が、全長抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１または請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
抗原結合フラグメントが、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２である、請求項３に記載の単離された抗体。
【請求項５】
抗体が一本鎖抗体である、請求項１または請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項６】
抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１または請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体およびキャリアを含む、組成物。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、および別の抗癌剤または疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）を含む、組成物。
【請求項１０】
抗癌剤が、ドセタキセル、オキサリプラチンおよびゲムシタビンからなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
DMARDが、メトトレキサート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリンＡおよびスルファサラジンからなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
抗体が請求項１〜６のいずれか一項に記載のものである、医薬における使用のための抗体。
【請求項１３】
IL6に関連する疾患を処置することにおける使用のための医薬組成物であって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、前記医薬組成物。
【請求項１４】
IL6に関連する疾患が、炎症性障害、自己免疫性疾患（これは任意に、関節リウマチ、クローン病、キャッスルマン病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および乾癬からなる群より選択される）、血管新生、癌（これは任意に、多発性骨髄腫、白血病、乳癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、口腔癌および前立腺癌、腫瘍転移、癌関連悪液質からなる群より選択される）からなる群より選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
IL6に関連する疾患が癌である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
別の抗癌剤と共に使用される、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
別の抗癌剤が、オキサリプラチン、ゲムシタビンおよびドセタキセルからなる群より選択される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
IL6に関連する疾患が自己免疫性疾患である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
自己免疫性疾患が関節リウマチ（RA）である、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
１または２以上の疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）と共に使用される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
DMARDが、メトトレキサート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリンＡおよびスルファサラジンからなる群より選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）または両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ＶＨおよびＶＬは、請求項１または請求項２に記載されるものである、前記核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２４】
発現ベクターである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載の核酸または請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２６】
ヒトIL6に結合する抗体を生成するための方法であって、
請求項２５に記載の宿主細胞を、抗体の発現を可能にする条件下において培養すること；および
抗体を収集すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2012年10月22日に出願された米国仮出願第61/716,802号の、35 U.S.C.§119に基づく利益を主張し、当該仮出願の全内容は、本明細書において参照として組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトインターロイキン−６（IL6）は、１８４個のアミノ酸（２１ｋＤａ）を有する分泌型糖タンパク質であり、４ヘリックスバンドル構造を有する。IL6は、多機能性サイトカインであり、多様な型の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、肝細胞、破骨細胞、神経細胞、メサンギウム細胞、表皮角化細胞および造血前駆細胞に対して、２つの区別し得る受容体タンパク質、IL6受容体（IL6R）および糖タンパク質130（gp130）への結合を介して作用する。IL6／IL6R／gp130複合体の形成は、細胞内シグナル伝達経路を伝達し、これは、（１）ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ（PI3K）、（２）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAK）、および（３）ヤヌスチロシンキナーゼ（JAK）−シグナル伝達兼転写活性化因子（signal transducer and activator of transcription）１および３（STAT1およびSTAT3）により媒介されるものを含む。
【０００３】
IL6は、免疫制御因子、細胞増殖因子、骨代謝制御因子、細胞分化因子、およびいくつかのエフェクター細胞に対する急性相タンパク質誘導因子として機能する。肝臓においては、IL6は、血清アミロイドＡ（SAA）、Ｃ反応性タンパク質（CRP）、ヘプシジン、フィブリノーゲン、およびハプトグロビン、アンチキモトリプシンなどの多様な急性相タンパク質を誘導する。多様な疾患についてのIL6の病理学的重要性は、慢性炎症性疾患、自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ、クローン病、キャッスルマン病および乾癬）、癌（例えば、多発性骨髄腫、白血病、乳癌、膵臓癌、前立腺癌および多様な癌）、ならびに悪液質および冠動脈心疾患を含む、多くの研究において示されている。
したがって、IL6シグナル伝達に関連する疾患を処置することにおける使用のための新たなIL6アンタゴニストを開発することは、多大な重要性を有する。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要旨
本開示は、ヒトIL6に対する予想外に高い結合アフィニティーおよび特異性、ならびに、IL6により誘導される細胞増殖（例えば癌細胞の増殖）およびサイトカイン産生（例えば炎症性サイトカイン産生）、血管新生、癌により誘導される悪液質、および癌の転移を阻害することにおいて優れた活性を示した、多数の例示的な抗IL6抗体、例えば、1-4-62、Ag1-4-6（別名FB704）、またはHAg1T-3-10の同定に基づく。かかる抗体はまた、オキサリプラチン、ゲムシタビンおよびドセタキセルなどの他の化学療法剤の抗癌効果を、著しく増強した。
【０００５】
したがって、本開示の一側面は、ヒトインターロイキン６（IL6）に結合する単離された抗体に関し、該抗体は、
（ａ）配列番号２の重鎖相補性決定領域１（HC CDR1）、配列番号４の重鎖相補性決定領域２（HC CDR2）、および配列番号６もしくは配列番号１６の重鎖相補性決定領域３（HC CDR3）を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；または
（ｂ）配列番号９の軽鎖相補性決定領域１（LC CDR1）、配列番号１１の軽鎖相補性決定領域２（LC CDR2）、および配列番号１３もしくは配列番号１５の軽鎖相補性決定領域３（LC CDR3）を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
【０００６】
いくつかの態様において、単離された抗IL6抗体は、（ｉ）配列番号２のHC CDR1、配列番号４のHC CDR2、および配列番号６のHC CDR3を含むＶＨ；または（ｉｉ）配列番号２のHC CDR1、配列番号４のHC CDR2、および配列番号１６のHC CDR3を含むＶＨを含む。一例において、抗体は、配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。
【０００７】
他の態様において、単離された抗IL6抗体はさらに、（ｉ）配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、および配列番号１３のLC CDR3を含むＶＬ；または（ｉｉ）配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、および配列番号１５のLC CDR3を含むＶＬを含む。一例において、抗体はさらに、配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０００８】
ここに記載される抗IL6抗体の例として、限定されないが、以下が挙げられる：
（ｉ）配列番号２のHC CDR1、配列番号４のHC CDR2、および配列番号６のHC CDR3を含むＶＨ；ならびに、配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、および配列番号１３のCDR3を含むＶＬを含む抗体；
（ｉｉ）配列番号２のHC CDR1、配列番号４のHC CDR2、および配列番号１６のHC CDR3を含むＶＨ、ならびに、配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、および配列番号１３のCDR3を含むＶＬを含む抗体；
（ｉｉｉ）配列番号２のHC CDR1、配列番号４のHC CDR2、および配列番号６のHC CDR3を含むＶＨ、ならびに、配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、および配列番号１５のCDR3を含むＶＬを含む抗体；
（ｉｖ）配列番号２のHC CDR1、配列番号４のHC CDR2、および配列番号１６のHC CDR3を含むＶＨ、ならびに、配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、および配列番号１５のCDR3を含むＶＬを含む抗体；
【０００９】
（ｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体；
（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体；ならびに
（ｖｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体；ならびに
（ｖｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
【００１０】
本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれかは、全長抗体またはその抗原結合フラグメントであってもよく、これは、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２であってもよい。あるいは、抗IL6抗体は、一本鎖抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってよい。
【００１１】
別の側面において、本開示は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）または両方をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、ここで、ＶＨおよびＶＬは、本明細書において記載されるとおりである。
【００１２】
別の側面において、本開示は、本明細書において記載される核酸のいずれかを含むベクター（例えば発現ベクター）、およびかかるベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の側面において、本開示は、ヒトIL6に結合する抗体を製造するための方法を提供し、該方法は、（ｉ）請求項４０に記載の宿主細胞を、抗体の発現を可能にする条件下において培養すること、および任意に、（ｉｉ）抗体を収集することを含む。
【００１３】
本開示の別の側面は、（ａ）本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれか、本明細書において記載される核酸のいずれか、または本明細書において記載されるベクターのいずれか；および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアなどのキャリアを含む組成物（例えば医薬組成物）に関する。
【００１４】
いくつかの態様において、本明細書において記載される組成物のいずれかは、さらに、別の抗癌剤または疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）を含む。抗癌剤の例として、限定されないが、ドセタキセル、オキサリプラチン、およびゲムシタビンが挙げられる。DMARDの例として、限定されないが、メトトレキサート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリンＡおよびスルファサラジンが挙げられる。
【００１５】
さらに別の側面において、本開示は、IL6に関連する疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれか、またはかかる抗IL6抗体をコードする核酸のいずれかの治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。IL6に関連する疾患の例として、限定されないが、炎症性障害、自己免疫性疾患、血管新生および癌が挙げられる。
【００１６】
いくつかの態様において、IL6に関連する疾患は癌であり、これは、多発性骨髄腫、白血病、乳癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、口腔癌および前立腺癌であってもよい。いくつかの例において、抗体またはコードする核酸の量は、腫瘍転移または癌関連悪液質を軽減することにおいて有効である。他の例において、方法はさらに、別の抗癌剤、例えば、オキサリプラチン、ゲムシタビンまたはドセタキセルを対象に投与することを含む。
【００１７】
他の態様において、IL6に関連する疾患は、自己免疫性疾患、例えば、関節リウマチ（RA）、クローン病、キャッスルマン病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、または乾癬である。いくつかの例において、本明細書において記載される方法は、さらに、対象に、１または２以上の疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）、例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリンＡ、スルファサラジンを投与することを含む。
【００１８】
また本開示の範囲内であるのは、IL6に関連する疾患を処置することにおける使用のための、医薬組成物であり、ここで、該医薬組成物は、（ａ）本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれか、または核酸／ベクターのいずれか；（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア；および任意に（ｃ）本明細書において記載されるもののような抗癌剤またはDMARDを含む。例示的なIL6に関連する疾患として、限定されないが、炎症性障害、自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ（RA）、クローン病、キャッスルマン病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および乾癬）、血管新生、癌（例えば、多発性骨髄腫、白血病、乳癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、口腔癌および前立腺癌）、腫瘍転移、癌関連悪液質が挙げられる。
【００１９】
さらに、本開示は、抗IL6抗体のいずれか、またはコードする核酸のいずれかの、医薬における使用、あるいは、本明細書において記載されるもののようなIL6に関連する疾患または状態を処置するための医薬の製造のための使用を提供する。
【００２０】
本発明の１または２以上の態様の詳細を、以下に記載する。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な説明から、ならびに添付される請求の範囲からもまた、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、細胞のシグナル伝達経路および増殖に対する高アフィニティー抗IL6抗体の効力を示す図である。（Ａ）リン酸化STAT3シグナル伝達は、抗IL6抗体Ag1-4-6およびHAgT1-3-10により、用量依存的な様式において減少した。（Ｂ）抗IL6抗体Ag1-4-6およびHAgT1-3-10は、対照の抗体アクテムラ(Actemra)と比較して、はるかに高いレベルにおいて、STAT3シグナル伝達を抑制した。（Ｃ）抗IL6抗体1-4-62、Ag1-4-6およびHAgT1-3-10は、B9細胞の増殖を、用量依存的な様式において阻害し、ＩＣ５０は、それぞれ、０．６１８、０．０４６８および０．００４５６μｇ／ｍｌであった。
【００２２】
【図２】図２は、抗IL6抗体がHUVEC細胞におけるケモカイン産生を抑制したことを示す図である。HUVECを、示されるように、IL6、sIL6R、IL6およびsIL6R、またはIL6、sIL6Rおよび抗IL6抗体の組み合わせと共に、２４時間培養した。培養上清中のMCP-1およびsICAM-1をELISAにより測定した。（Ａ）IL6＋sIL6Rは、MCP-1の分泌を誘導し、抗IL6抗体Ag1-4-6およびHag1T-3-10により阻害された。（Ｂ）抗体Ag1-4-6およびHag1T-3-10は、sICAM-1の産生を、アクテムラより高いレベルにおいて阻害した。
【００２３】
【図３】図３は、本明細書において記載される例示的な抗IL6抗体の結合特異性を示す図である。
【００２４】
【図４】図４は、抗体Ag1-4-6（FB704）が血管新生をin vivoで阻害することを示す図である。hIL6組換えタンパク質を、マトリゲル中に添加し、マウスの背側の２か所において注射した。マウスを、i.v.注射またはプレミックスを通して、抗体で処置した。（Ａ）FB704がIL6により誘導される血管新生を阻害したことが、処置の６日後に観察された。（Ｂ）抗体FB704による処置は、ヘモグロビン濃度を著しく変化させた。
【００２５】
【図５】図５は、抗体FB704がヒト前立腺癌細胞PC-3により誘導される悪液質および転移を阻害したことを示す図である。腫瘍注射の後で、第３１日においてマウスの体重を測定した。（Ａ）PBS処置マウスの体重は、約１９％減少した。対照的に、高用量のFB704およびアクテムラ処置群は、安定なままであり、有意差を示した（Ｐ＜０．０１）。（Ｂ）FB704（ｎ＝１５；Ｐ＝０．００００１）およびアクテムラ（ｎ＝１２；Ｐ＝０．０２４）は、PC3腫瘍を有するマウスの無症状生存を有意に延長した。FB704は、アクテムラよりも有意に優れた効力を示した（Ｐ＝０．０３）。（Ｃ）PBS処置群の肉眼的剖検は、肝臓における重篤な拡大および腫瘍細胞浸潤を示した。しかし、FB704処置群は、肝臓の左葉および中葉において中程度の腫瘍細胞浸潤および５０％近くの正常な肝細胞を示した。（Ｄ）免疫組織化学は、腫瘍切片において、FB704で処置した後に血管密度が減少したことを示した。（Ｅ）CD31染色の半定量的分析は、FB704で処置した後に、有意に減少したことを示した（Ｐ＜０．０５）。（Ｆ）FB704と化学薬であるドセタキセルとの組み合わせ処置は、より良好な総生存率を提供した。
【００２６】
【図６】図６は、抗体FB704が、膵臓癌異種移植のオキサリプラチンまたはゲムシタビンの抗腫瘍活性を増強したことを示す図である。（Ａ）BxPC-3担癌マウスの、週２回の２０ｍｇ／ｋｇのFB704および週１回のオキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ）による処置は、統計学的に有意な４９％の腫瘍増殖の阻害（Ｐ＜０．０１）をもたらした。（Ｂ）マウスの体重は、処置の間、正常に増加した（ＣおよびＤ）。実験の後で個々の腫瘍の質量を測定し、腫瘍の重量は、処置の後で有意に減少した。（Ｅ）腫瘍切片の様々な処置についての、腫瘍細胞増殖マーカーKi-67を示した。（Ｆ）PBS、オキサリプラチン、FB704、ならびにFB704およびオキサリプラチン処置群のKi-67陽性細胞の割合は、それぞれ、２６％、１４％、１６％および７．５％であると示された。（Ｇ）BxPC-3担癌マウスの、週２回の２０ｍｇ／ｋｇのFB704およびゲムシタビン（８０ｍｇ／ｋｇ）による処置は、統計学的に有意な６０％の腫瘍増殖阻害をもたらした（Ｐ＜０．０１）。
【００２７】
【図７】図７は、本明細書において記載される例示的な抗IL6抗体が、U937およびヒトPBMC細胞におけるMCP-1産生を抑制したことを示す図である。（Ａ）U937細胞を、２４時間にわたり、IL6と共に培養し、抗体により処置した。ELISAキットによりMCP-1を測定した。本発明者らの抗体は、用量依存的に、MCP-1産生の抑制を示す（ｎ＝３）。（Ｂ）PBMC細胞を、２４時間にわたり、IL6と共に培養し、抗体により処置した。ELISAキットによりMCP-1を測定した。本発明者らの抗体は、用量依存的に、MCP-1産生の抑制を示した（ｎ＝５）。
【００２８】
【図８】図８は、本明細書において記載される例示的な抗IL6抗体による、RA-FLSにおけるMCP-1産生の阻害を示す図である。（Ａ）市販のRA-FLS細胞および（Ｂ）RA患者のFLS細胞を、IL6およびsIL6Rと共に、抗体の存在下または不在下において、２４時間にわたり培養した。本発明者らの抗体は、用量依存的にMCP-1産生の抑制を示す（ｎ＝６）。
【００２９】
【図９】図９は、本明細書において記載される例示的な抗IL6抗体による、RA-FLSにおけるVEGF産生の阻害を示す図である。（Ａ）市販のRA-FLS細胞および（Ｂ）RA患者のFLS細胞を、２４時間にわたり、IL6、sIL6RおよびIL1βと共に培養し、抗体で処置した。本発明者らの抗体は、用量依存的にVEGF産生の抑制を示す（ｎ＝６）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本開示は、IL6の活性を中和し得る、ヒトインターロイキン−６（IL6）に結合する抗体、IL6により媒介されるシグナル伝達経路を制御することにおけるそれらの使用に関する。本明細書において記載される抗IL6抗体は、炎症性障害、自己免疫性疾患、血管新生、癌、腫瘍転移および癌関連悪液質などの、IL6に関連する疾患または障害の処置において有用である。
【００３１】
以下の記載は、単に、本発明の多様な態様を説明することを意図するものである。したがって、本明細書において議論される特定の態様は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。当業者には、本発明の範囲から解離することなく多様な変更または等価物が作られ得ることは明らかであろう。
【００３２】
一般的技術
本発明の実施は、他に記されない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用し、これらは、当業者の技術の範囲内である。かかる技術は、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版（Sambrookら、1989）Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait編、1984）；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook（J. E. Cellis編、1998）Academic Press；Animal Cell Culture（R. I. Freshney編、1987）；Introduction to Cell and Tissue Culture（J. P. MatherおよびP. E. Roberts、1998）Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures（A. Doyle, J. B. GriffithsおよびD. G. Newell編、1993-8）J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology（Academic Press, Inc.）；Handbook of Experimental Immunology（D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J. M. MillerおよびM. P. Calos編、1987）；Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubelら編、1987）；PCR：The Polymerase Chain Reaction（Mullisら編、1994）；Current Protocols in Immunology（J. E. Coliganら編、1991）；Short Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons、1999）；Immunobiology（C. A. JanewayおよびP. Travers、1997）；Antibodies（P. Finch, 1997）；Antibodies：a practical approach（D. Catty.編、IRL Press, 1988-1989）；Monoclonal antibodies：a practical approach（P. ShepherdおよびC. Dean編、Oxford University Press、2000）；Using antibodies：a laboratory manual（E. HarlowおよびD. Lane（Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999）；The Antibodies（M. ZanettiおよびJ. D. Capra編、Harwood Academic Publishers、1995）などの文献において完全に説明される。
【００３３】
定義
本開示の明確かつ容易な理解を提供するために、特定の用語を初めに定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、関連する分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、冠詞「a」および「an」は、１つ、または１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）の文法的な目的の物品を指す。例として、「an element」は、１つの要素、または１つより多くの要素を意味する。
本明細書において用いられる場合、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基からなるポリマーを指す。用語「タンパク質」は、典型的には、相対的に大きなポリペプチドを指す。用語「ペプチド」は、典型的には、相対的に短いポリペプチド（例えば、１００、８０、６０、５０、３０または２０個までのアミノ酸残基を含む）を指す。
【００３５】
抗体（複数形体において交換可能に用いられる）とは、免疫グロブリン分子であって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に対して、当該免疫グロブリン分子の可変領域中に配置された少なくとも１つの抗原認識部位を通して、特異的に結合することができるものである。本明細書において用いられる場合、用語「抗体」は、完全な（すなわち全長の）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のみならず、また、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）など）、その変異体、抗体の部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体（diabody）、直鎖状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例えば、二特異性（bispecific）抗体）、および任意の他の修飾された立体配置の免疫グロブリン分子であって、必要とされる特異性の抗原認識部位を含むもの（抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合により修飾された抗体を含む）をも包含する。
【００３６】
完全な、または全長の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各々の重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに、第１、第２および第３の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を含む。全長抗体は、IgD、IgE、IgG、IgAまたはIgM（またはそれらのサブクラス）などの、任意のクラスの抗体であってよく、抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2へと分割することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元立体配置は、周知である。
【００３７】
用語「抗原結合ドメイン」または「抗原結合フラグメント」は、完全な抗体分子の部分または領域であって、抗原結合の原因であるものを指す。抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、または両方を含み得る。ＶＨおよびＶＬの各々は、典型的には、３つの相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3を含む。ＶＨまたはＶＬにおける３つのCDRは、フレームワーク領域（FR1、FR2、FR3およびFR4）により挟まれている。
【００３８】
抗原結合フラグメントの例として、限定されないが、以下が挙げられる：（１）Ｆａｂフラグメント、これは、ＶＬ−ＣＬ鎖およびＶＨ−ＣＨ１鎖を有する一価のフラグメントであってよい；（２）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、これは、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメント、すなわちＦａｂの二量体であってよい；（３）抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨドメインを有するＦｖフラグメント；（４）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、これは、ペプチドリンカーを通してＶＨドメインおよびＶＬドメインからなる単一のポリペプチド鎖であってよい；ならびに（５）（ｓｃＦｖ）２、これはペプチドリンカーにより連結された２つのＶＨドメイン、およびジスルフィド架橋を介して２つのＶＨドメインと結合した２つのＶＬドメインを含んでもよい。
【００３９】
用語「ヒト抗体」は、ヒト対象に実質的に対応するかまたはヒト対象から誘導される、例えば、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列またはそのバリアントによりコードされる、可変領域および定常領域を有する抗体を指す。本明細書において記載されるヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされない１または２以上のアミノ酸残基（例えば、in vitroでの無作為もしくは部位特異的な変異誘発により、またはin vivoでの体細胞変異により誘導される変異）を含んでもよい。かかる変異は、CDRのうちの１もしくは２以上において、またはFRのうちの１もしくは２以上において存在することができる。いくつかの例において、ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基により置き換えられた、少なくとも１、２、３、４、５、６または７以上の部位を有していてもよい。
【００４０】
「単離された」物質とは、それが、人の手によって、天然の状態から改変されていることを意味する。「単離された」物質は、天然において存在するか、その元の環境から変更もしくは除去されたか、またはその両方である。例えば、生きている対象において天然に存在するポリペプチドは、「単離され」ていないが、ポリペプチドは、それがその天然の状態の共存する材料から実質的に分離されて実質的に純粋な状態において存在する場合、単離されている。
【００４１】
用語「特異的結合」または「特異的に結合すること」とは、抗原のエピトープへの抗体の結合などの、２つの分子間の非無作為的な結合反応を指す。標的またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該分野においてよく理解される用語であり、かかる特異的結合を決定するための方法もまた、当該分野において周知である。分子は、それが、特定の標的抗原またはエピトープと、それが代替的な標的／エピトープに対して行うよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い持続期間により、および／またはより高いアフィニティーにより、反応または会合する場合に、「特異的結合」を示すと言われる。抗体は、それが、それが他の物質に結合するよりも、より高いアフィニティー、アビディティーにより、より容易に、および／またはより長い持続期間により、結合する場合に、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、IgEエピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体とは、それが他のIgEエピトープまたは非IgEエピトープに結合するよりも、より高いアフィニティー、アビディティーにより、より容易に、および／またはより長い持続期間により、このIgEエピトープに結合する抗体である。また、この定義を読むことにより、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的にまたは優先的に結合しても、結合しなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、必ずしも排他的結合を必要としない（が、それを含んでもよい）。一般に、必ずしもではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。
【００４２】
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において交換可能に用いられ、処置について評価されているおよび／または処置されている哺乳動物を指す。対象は、ヒトであってもよいが、また他の哺乳動物、特にヒト疾患のための研究室モデルとして有用な哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌなどを含む。
【００４３】
用語「処置」または「処置すること」とは、行為、適用または治療を指し、ここで、ヒトを含む対象は、当該対象の状態を直接的または間接的に改善することを目的として、医学的支援に供される。特に、用語は、発生率を減少させること、症状を軽減すること、再発を除去すること、再発を予防すること、発生を予防すること、症状を改善すること、予後を改善すること、またはいくつかの態様においてはそれらの組み合わせを指す。当業者は、処置が必ずしも症状の完全な不在または除去をもたらさないことを理解するであろう。例えば、癌に関して、「処置」または「処置すること」は、腫瘍性もしくは悪性の細胞の生育、増殖または転移を緩徐化させること、腫瘍性もしくは悪性の細胞の生育、増殖または転移の発症を予防または遅延させること、またはそれらのいずれかの組み合わせを指す場合がある。
【００４４】
薬理学的剤の投与に関する「有効量」または「有効用量」または「治療有効量」とは、本明細書において用いられる場合、薬物または医薬剤の量であって、かかる量を投与されていない対応する対象と比較して、意図される薬理学的結果、あるいは、疾患、障害または副作用の処置、治癒、予防もしくは寛解、または疾患もしくは障害の進行の速度の低下をもたらすものを指す。薬理学的剤の有効量または用量は、使用される特定の活性成分、投与の様式、ならびに処置されるべき対象の年齢、サイズおよび状態に依存して変化し得る。投与されることが必要とされる薬理学的剤の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に特有である。
【００４５】
「IL6に関連する疾患または状態」とは、その疾患または状態をもたらすシグナル伝達経路においてIL6が制御的役割を果たす、任意の疾患または状態を指す。IL6は、シグナル伝達性糖タンパク質gp130の少なくとも１つのサブユニットおよびIL6受容体からなる受容体複合体を通して細胞応答を惹起するサイトカインのファミリーのメンバーである。IL6はIL6Rに結合し、これが次いでgp130を二量体化し、これが、gp130のチロシン残基のリン酸化の引き金を引く。少なくとも３つの主要なシグナル伝達経路が、IL6／IL6R／gp130複合体の形成に関与している：（１）ホスファチジルイノシトール−３’−キナーゼ（PI3K）、（２）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAK）、および（３）ヤヌスチロシンキナーゼ（JAK）−シグナル伝達兼転写活性化因子１および３（STAT1およびSTAT3）経路。IL6は、広範な疾患または障害の発症において役割を果たすと考えられ、これらは、限定されないが、炎症、自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ（RA）、クローン病、キャッスルマン病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および乾癬）、血管新生、癌（例えば、多発性骨髄腫、白血病、乳癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、口腔癌および前立腺癌）、腫瘍転移、癌関連悪液質を含む。
【００４６】
本明細書において用いられる場合、「関節リウマチ」とは、ある型の自己免疫性疾患を指し、これは、全身にわたる滑膜性の関節の炎症により特徴づけられる。疾患の初期の症状は、関節の疼痛であり、これは、関節の変形、または血管、心臓、肺、皮膚および筋肉などの身体器官における損傷へと進行する。
【００４７】
本明細書において用いられる場合、「血管新生」とは、一般に、それにより新たな血管が形成される基本的なプロセスを指す。血管新生は、筋肉の増加、創傷の修復および妊娠などの組織の成長の間の正常な生理学的プロセスとして起こるが、また、癌および糖尿病性網膜症などの、血管の成長が患者の健康に対して有益でない疾患状態にも関連する。
【００４８】
用語「癌」とは、本明細書において用いられる場合、固形癌および非固形癌を含む、腫瘍性または悪性の細胞群、増殖、または転移により媒介される医学的状態を指す。癌の例として、限定されないが、肺癌、腎臓癌、胃癌、乳癌、脳癌、前立腺癌、肝細胞癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、黒色腫、頭頚部癌、結腸癌、白血病、リンパ腫および骨髄腫が挙げられる。
【００４９】
用語「悪液質」とは、一般的な体調不良および栄養不良の状態を指す。それは、通常、悪性の癌に関連し、およびこれにより誘導され、重篤な食欲の喪失、劇的な体重の減少、特に除脂肪体重、および筋消耗により特徴づけられる。
【００５０】
高アフィニティー抗IL6抗体
本開示は、1-4-62、Ag1-4-6（別名FB704）、およびHAg1T-3-10を含む多数の高アフィニティー抗IL6抗体の同定に基づく。これらの抗IL6抗体が、ヒトIL-6に対して、高い結合アフィニティー（例えば、10-8Mより低い、好ましくは10-9Mより低いＫＤ値を有する）および高い特異性により結合すること、例えば、ヒトIL6と比較して、図３において示すものなどの他のIL6ファミリーのサイトカインに対して、はるかに低い結合アフィニティーにより結合することを見出した。さらに、これらの抗体が、IL-6により誘導される細胞増殖およびSTAT3のリン酸化、血管新生およびヘモグロビン産生を著しく減少させることを見出した。さらに、これらの抗IL6抗体は、癌により誘導される（例えば、前立腺癌により誘導される）悪液質、膵臓癌の増殖、および前立腺癌の転移などの癌の転移を首尾よく抑制し、オキサリプラチン、ゲムシタビンおよびドセタキセルなどの他の化学療法剤の抗癌効果を著しく増強し、ならびに、HUVECおよびPBMC細胞、および／または滑膜線維芽細胞（例えばRA患者から得られるものなど）による炎症性サイトカイン（例えば、MCP-1およびsICAM）および／またはVEGFの産生を減少させた。
【００５１】
したがって、本明細書において記載されるのは、1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10を含む、ヒトIL6に結合すること（例えば特異的に結合すること）ができる、高アフィニティー抗体およびそれらの機能的バリアントである。1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10の各々の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を、以下の表１において示す。これら３つの抗体の機能的バリアントは、1-4-62、Ag1-4-6またはHAg1T-3-10のＶＨのアミノ酸配列（配列番号１７または配列番号１８）と少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一のアミノ酸配列を含むＶＨ鎖、1-4-62、Ag1-4-6またはHAg1T-3-10のＶＬのアミノ酸配列（配列番号１９または配列番号２０）と少なくとも８５％（例えば、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）同一のアミノ酸配列を有するＶＬ鎖、または両方を含んでもよい。これらのバリアントは、ヒトIL6に結合することができる。いくつかの例において、バリアントは、上記の参照抗体と比較して類似の抗原結合アフィニティーを有する。（例えば、１×１０−８より低い、好ましくは１×１０−９または１×１０−１０Ｍより低いＫｄを有する）。
【００５２】
結合のアフィニティーは、用語ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、またはＫＤ（平衡解離）により定義される。典型的には、特異的に結合するとは、抗体に関して用いられる場合、１０−８Ｍより低い、例えば１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍより低いアフィニティー（ＫＤ）値でその標的に特異的に結合する（「認識する」）抗体を指す。より低いＫＤ値は、より高い結合アフィニティー（すなわち、より強力な結合)を表わし、すなわち、１０−９のＫＤ値は、１０−８のＫＤ値より高い結合アフィニティーを示す。
【００５３】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズム（KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993において改変された）を用いて決定される。かかるアルゴリズムは、Altschulら（J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990）のNBLASTおよびXBLASTプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれる。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムを用いて、目的のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、score＝５０、wordlength＝３で行うことができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Altschulら、Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997において記載されるようなGapped BLASTを利用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）の初期設定のパラメーターを用いることができる。
【００５４】
1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10のように同じエピトープに結合する抗体もまた、本開示の範囲内である。
【００５５】
いくつかの態様において、抗IL6抗体は、ＭＨＩＤＤＳＮＧＹＸＳＤＡＦ（配列番号２１）のHC CDR3を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここでＸは、Ｆ、Ｙ、ＨまたはＷなどの芳香族アミノ酸残基である。いくつかの例において、HC CDR3は、配列番号６または配列番号１６である。かかる抗体のＶＨ鎖は、さらに、配列番号２のHC CDR1、配列番号２のHC CDR2、または両方を含んでもよい。
【００５６】
あるいは、またはさらに、抗IL6抗体は、配列番号１３または配列番号１５のLC CDR3を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。かかる抗体のＶＬ鎖は、さらに、配列番号９のLC CDR1、配列番号１１のLC CDR2、または両方を含んでもよい。
【００５７】
いくつかの態様において、本明細書において記載される抗IL6抗体は、以下の表１において示すように、抗体1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10のように、同じ重鎖および軽鎖CDRを含む。いくつかの例において、３つの抗体は、1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10として、同じＶＨおよびＶＬ鎖を含む。ＶＨおよびＶＬ鎖は、それぞれ重鎖ＣＨ１およびＣＬと融合して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成する。あるいは、ＶＨおよびＶＬ鎖を、重鎖定常領域（例えば、ヒトIgG定常鎖）および軽鎖定常領域（カッパ鎖）と融合させて、全長抗体を形成させてもよい。他の例において、ＶＨおよびＶＬ鎖を、直接的に、またはリンカーを介して融合させて、一本鎖抗体を形成させてもよい。
【００５８】
他の態様において、本明細書において記載される機能的バリアントは、ＶＨ、ＶＬ、または両方のＦＲにおいて、抗体1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10と比較して、１または２以上の変異（例えば、保存的置換）を含んでもよい。好ましくは、かかる変異は、CDRの１または２以上と相互作用することが予測される残基においては起こらない。当該分野において公知であるように、ＦＲ領域内での変異は、抗体の抗原結合活性に影響を及ぼす可能性が低い。いくつかの例において、抗体1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10のCDR領域の１または２以上における変化は、非実質的である、すなわち、参照配列に対して実質的に同一である。
【００５９】
用語「非実質的」または「実質的に同一」とは、バリアントの関連するアミノ酸配列（例えば、ＦＲ、ＣＤＲ、ＶＨ，またはＶＬドメインにおけるもの）は、当該バリアントが参照抗体と比較して実質的に類似する結合活性（例えば、アフィニティー、特異性、または両方）および生物活性を有するように、参照抗体と比較して非実質的に異なる（例えば、保存的アミノ酸置換を含む）ことを意味する。かかるバリアントは、マイナーなアミノ酸の変化、例えば、特定される領域の５アミノ酸の配列において１または２の置換を含んでもよい。一般に、ＦＲ領域においては、ＣＤＲ領域とは対照的に、それらが抗体の結合機能に有害な影響（元の抗体と比較して結合アフィニティーを５０％より多く低下させるなど）を及ぼさない限りにおいて、より多くの置換を行うことができる。いくつかの態様において、配列同一性は、元の抗体と改変された抗体との間で、約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高くともよい。いくつかの態様において、改変された抗体は、元の抗体と同じ結合特異性を有し、元の抗体のアフィニティーの少なくとも５０％を有する。いくつかの例において、バリアントは、
抗体1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10のＶＨ、ＶＬまたは両方の１または２以上のＣＤＲ領域において、５個までの保存的置換などのアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４または５）を含む。
【００６０】
保存的置換は、かかる改変が行われる元の分子と類似する機能的および化学的特徴を有する分子を生成する。例えば、「保存的アミノ酸置換」は、ネイティブのアミノ酸残基の、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対して殆どまたは全く影響が存在しないような、別の残基による置換を含んでもよい。所望されるアミノ酸置換（保存的であるか非保存的であるかにかかわらず）は、当業者により決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、分子配列の重要な残基を同定するために、または、本明細書において記載される分子のアフィニティーを増大または低下させるために、用いることができる。１または２以上の保存的アミノ酸置換を含むバリアントは、ポリペプチド配列を改変するための当業者に公知の方法、例えばかかる方法を収集する参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrookら編、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989年、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら編、 John Wiley & Sons, Inc., New Yorkにおいて見出される方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換は、以下の群中のアミノ酸の間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００６１】
本開示はまた、抗体の生物学的特性が改善された、例えばより高い結合アフィニティーを有する、抗体バリアントを提供する。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体の核酸中に適切なヌクレオチドの変更を導入することにより、またはペプチド合成を介して、調製することができる。かかる改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列中の残基からの欠失、および／またはそれらへの挿入、および／またはそれらの置換を含む。最終的なコンストラクトが所望される特徴を有することを前提として、最終的なコンストラクトを達成するために、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行う。抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、当該分野において公知の多様な方法により調製することができる。これらの方法として、限定されないが、より初期に調製された抗体のバリアントまたは非バリアント（天然の）バージョンの、オリゴヌクレオチド指定（または部位特異的）変異誘発、PCR変異誘発、およびカセット変異誘発が挙げられる。一態様において、本発明の抗IL6抗体の平衡解離定数（ＫＤ）値は、１０−８Ｍより低く、特に１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍより低い。結合アフィニティーは、ELISAまたは生体分子特異的相互作用分析、または当該分野において公知の他の技術などの、当該分野において公知の技術を用いて決定することができる。
【００６２】
本明細書において記載されるような例示的な抗IL6抗体として、限定されないが、以下が挙げられる：
（ｉ）（ａ）配列番号２において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR1、配列番号４において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR2、および配列番号６もしくは配列番号１６において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR3を含むＶＨ；または（ｂ）配列番号９において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR1、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR2、および配列番号１３もしくは配列番号１５において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR3を含むＶＬ
を含む抗体；
（ｉｉ）配列番号２において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR1、配列番号４において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR2、および配列番号６において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR3を含むＶＨ
を含む抗体；
【００６３】
（ｉｉｉ）配列番号９において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR1、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR2、および配列番号１３において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR3を含むＶＬ
を含む抗体；
（ｉｖ）（ａ）配列番号２を含むHC CDR1、配列番号４において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR2、および配列番号６において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR3を含むＶＨ、ならびに（ｂ）配列番号９において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR1、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR2、および配列番号１３において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR3を含むＶＬ
を含む抗体；
【００６４】
（ｖ）配列番号９において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR1、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR2、および配列番号１５において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR3を含むＶＬ
を含む抗体；
（ｖｉ）（ａ）配列番号２において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR1、配列番号４において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR2、および配列番号６において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR3を含むＶＨ、ならびに（ｂ）配列番号９において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR1、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR2、および配列番号１５において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR3を含むＶＬ
を含む抗体；
【００６５】
（ｖｉｉ）配列番号２において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR1、配列番号４において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR2、および配列番号１６において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR3を含むＶＨ
を含む抗体；
（ｖｉｉｉ）（ａ）配列番号２において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR1、配列番号４において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR2、および配列番号１６において記載されるアミノ酸配列を含むHC CDR3を含むＶＨ、ならびに（ｂ）配列番号９において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR1、配列番号１１において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR2、および配列番号１５において記載されるアミノ酸配列を含むLC CDR3を含むＶＬ
を含む抗体。
【００６６】
本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれかを、抗原結合活性、抗原結合特異性および生物学的機能などのそれらの特性を決定するために、慣用的な方法（例えば以下の例において記載されるもの）に従って、試験することができる。
【００６７】
本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれかを、当該分野において公知であり容易に利用可能なさらなる非タンパク質性部分を含ませるように、修飾することができる（例えばPEG化、高グリコシル化（hyperglycosylation）など）。血清半減期を延長することができる修飾は、重要である。
【００６８】
また本明細書において開示されるのは、本明細書において記載される抗IL6抗体のいずれかをコードする核酸、これらの核酸を含む発現ベクターなどのベクター、および該ベクターを含む宿主細胞である。一例において、重鎖および軽鎖の両方のコード配列（例えば、ＶＨおよびＶＬ、ＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬ、または全長重鎖および全長軽鎖をコードする配列）を、１つの発現ベクター中に含める。別の例において、抗体の重鎖および軽鎖の各々を、個別のベクター中にクローニングする。後者の場合において、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、両方の鎖の発現のために１つの宿主細胞中に共トランスフェクトすることができ、in vivoまたはin vitroにおいてこれらを集合させて、完全な抗体を形成させることができる。あるいは、重鎖をコードする発現ベクターと軽鎖をコードするものとを、重鎖および軽鎖の各々の発現のために、異なる宿主細胞中に導入してもよく、これらを次いで精製し、in vitroにおいて集合させて、完全な抗体を形成させてもよい。
【００６９】
当業者に公知の多数の方法が、抗体またはその抗原結合フラグメントを得るために利用可能である。例えば、抗体は、組換えDNA方法を用いて産生させてもよい。モノクローナル抗体もまた、ハイブリドーマの作製により産生させることができる。この様式において形成されたハイブリドーマを、次いで、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１または２以上のハイブリドーマを同定するために、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）などの標準的な方法を用いてスクリーニングする。さらに、一本鎖抗体についてスクリーニングするために、ファージディスプレイ系を用いてもよい。
【００７０】
あるいは、抗IL6抗体のいずれかを、従来の方法論、例えば組換え技術を介して調製することができる。例えば、本明細書において記載される例示的な抗体のための、本明細書において提供されるポリペプチド配列（例えば表１を参照）を用いて、それらをコードする好適な核酸配列を得ることができ、核酸配列を、従来の組換え技術を介して好適な発現ベクター中にクローニングして、好適な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、またはCHO細胞などの哺乳動物細胞）において、慣用的な方法において抗体を産生させることができる。このようにして調製された抗体は、細胞または培養上清から単離することができ、それらの結合特性および生理活性もまた、慣用的な技術により試験することができる。
【００７１】
一例において、IL6一本鎖抗体を選択するために、ファージディスプレイ系を用いる。単離された後で、特定のIL6 scFvsをコードするポリヌクレオチドを、全長免疫グロブリンおよび所望の特異性を有するそのフラグメントを発現するように設計された発現ベクター中にクローニングすることができる。簡単に述べると、一本鎖抗体のＶＨおよびＶＬポリヌクレオチドを、免疫グロブリン足場（すなわちIgG）ベクター中にクローニングし、発現させ、一本鎖を完全な抗体に「変換」するために、二量体化する。免疫グロブリン足場は、必要に応じて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス（IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM）のうちのいずれかから選択することができる。scFvsの完全な免疫グロブリン分子への変換のための方法は、例えばWO 94/11523、WO 97/9351またはEP 0481790において記載されるように、周知である。
【００７２】
本明細書において記載される抗体の発現のための組換えベクターは、典型的には、構成的または誘導性のいずれかのプロモーターと作動的に連結した、抗体アミノ酸配列をコードする核酸を含む。ベクターは、原核生物、真核生物、または両方における複製および組み込みのために好適なものであってよい。典型的なベクターは、転写および翻訳のターミネーター、および抗体をコードする核酸の発現の制御のために有用なプロモーターを含む。ベクターは、任意に、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、原核生物および真核生物の両方においてカセットの複製を可能にする配列（すなわちシャトルベクター）、ならびに原核生物および真核生物の両方の系のための選択マーカーを含む、遺伝子発現カセットを含む。
【００７３】
本明細書において記載されるような組換え抗IL6抗体は、原核生物および真核生物の発現系（細菌、酵母、糸状菌、昆虫および哺乳動物細胞など）において産生させることができる。本発明の組換え抗体はグリコシル化される必要はなく、真核細胞中で発現させる必要もない；しかし、哺乳動物細胞における発現が、一般に好ましい。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ヒト胎性腎臓細胞株（293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−または＋DHFR（CHO、CHO-S、CHO-DG44、Flp-in CHO細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO細胞）、およびヒト肝細胞（Hep G2細胞）である。宿主細胞は、ベクターにより形質転換またはトランスフェクトされ（例えば、化学的トランスフェクションまたはエレクトロポレーション法により）、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するために、従来の栄養培地（または適切に改変されたもの）中で培養される。産生された抗体タンパク質は、さらなるアッセイおよび適用のための実質的に均一である調製物を得るために、さらに単離または精製することができる。当該分野において公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。例えば、好適な精製手順として、免疫アフィニティーまたはイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈澱、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）、硫酸アンモニウム沈澱、およびゲル濾過を挙げることができる。
【００７４】
全長抗体が所望される場合、本明細書において記載される抗IL6のＶＨおよびＶＬ鎖のいずれかのコード配列を、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域のコード配列に連結して、生じた全長抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、好適な宿主細胞（例えば植物細胞、哺乳動物細胞、酵母作用または昆虫細胞）中で発現させてアセンブルすることができる。
【００７５】
抗原結合フラグメントは、慣用的な方法を介して調製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、全長抗体分子のペプシン消化により生成することができ、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることにより生成することができる。あるいは、かかるフラグメントは、組換え技術を介して、重鎖および軽鎖フラグメントを好適な宿主細胞（例えば、E. coli、酵母、哺乳動物、植物または昆虫の細胞）中で発現させて、それらを、in vivoまたはin vitroのいずれかにおいてアセンブルして、所望される抗原結合フラグメントを形成することにより調製することができる。
【００７６】
一本鎖抗体は、組換え技術を介して、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列とを連結することにより、調製することができる。好ましくは、可橈性のリンカーを、２つの可変領域の間に組み込む。
【００７７】
抗IL6抗体の使用
本明細書において記載されるような抗IL6抗体が、IL6に結合し、IL6に対するアンタゴニストとして作用し、IL6依存的なシグナル伝達経路を制御することを見出した。特に、これらの抗体が、IL6依存的な細胞増殖（例えば、膵臓癌細胞の増殖）およびリン酸化STATシグナル伝達を著しく阻害し、IL6により誘導される血管新生形成をin vivoで減少させ、ヒト腫瘍転移（例えば、前立腺癌の転移）を抑制することを見出した。さらに、これらの抗体は、ヒト膵臓腫瘍の動物モデルにおいて、オキサリプラチン、ゲムシタビンおよびドセタキセルなどの化学療法剤と共に使用された場合に、相乗的効力を示した。
【００７８】
したがって、本明細書において記載される抗IL6抗体は、限定されないが、以下：炎症性障害、自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ（RA）、クローン病、キャッスルマン病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎および乾癬）、血管新生、癌、例えば固形腫瘍（例えば、多発性骨髄腫、白血病、乳癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、口腔癌および前立腺癌）、腫瘍転移、および癌関連悪液質を含むIL6に関連する疾患または状態を処置することにおいて用いることができる。
【００７９】
本明細書において記載される処置方法を実施するために、抗IL6抗体（例えば、抗体1-4-62、Ag1-4-6もしくはHAg1T-3-10と同じＣＤＲもしくは同じＶＨおよびＶＬ鎖を有する抗体）、またはかかる抗体をコードする核酸（例えば発現ベクター）のいずれかを、１または２以上の薬学的に受容可能なキャリアと共に、医薬組成物に処方することができる。「薬学的に受容可能な」とは、本明細書において用いられる場合、当該キャリアが、組成物中に含有される活性成分と適合性であり、好ましくは当該活性成分を安定化することができ、および処置されるべき対象にとって有害ではないことを意味する。キャリアは、活性成分のための希釈剤、ビヒクル、賦形剤または媒質として役立ち得る。好適なキャリアのいくつかの例として、ハンクス溶液、リンガー溶液、生理食塩水バッファー、乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギナート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、無菌水、シロップ、およびメチルセルロースなどの生理学的に適合可能なバッファーが挙げられる。医薬組成物は、さらに、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油などの潤滑剤；湿潤化剤；乳化剤および懸濁剤；メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾアートなどの保存剤；甘味剤；ならびに香味剤を含んでもよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Mack Publishing Co., Easton, Pa（1980年）；ならびにGoodmanおよびGilman著「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第10版、Gilman, J. HardmanおよびL. Limbird編、McGraw-Hill Press、155-173（2001年）を参照。
【００８０】
本発明による医薬組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、小包（sachet）、カシェー（cachet）、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、軟質および硬質ゼラチンカプセル、坐剤、無菌注射溶液および包装された粉末の形態におけるものであってよい。本発明の医薬組成物は、任意の生理学的に受容可能な経路を通して送達することができる。これらの経路として、決して限定されないが、非経口投与、全身投与、経口投与、鼻投与、直腸投与、腹腔内注射、血管内注射、皮下注射、経皮投与、吸入投与、および筋肉内注射が挙げられる。用語「非経口」とは、本明細書において用いられる場合、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技術を含む。
【００８１】
治療的用途のために処方される医薬組成物は、所望される程度の純度を有する剤を任意の薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A.編（1980年））と混合することにより、凍結乾燥処方物または水性溶液の形態において、貯蔵のために調製することができる。受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度において、レシピエントにとって非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／あるいは、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００８２】
いくつかの態様において、本明細書において記載される方法は、前立腺癌などの癌を処置することを目的とする。この処置を必要とするヒト対象は、癌を罹患する患者、または癌を有することを疑われる患者であってよい。いくつかの例において、本明細書において記載される抗IL6抗体の量は、IL6により誘導される細胞増殖を、ブランクの対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、５０％、８０％、１００％、２００％、４００％または５００％、阻害することにおいて有効である。他の態様において、本明細書において記載される抗IL6抗体の量は、STAT3のリン酸化を、少なくとも２０％、３０％、５０％、８０％、１００％、２００％、４００％または５００％、阻害することにおいて有効である。いくつかの例において、本明細書において記載される抗IL6抗体の量は、IL6により誘導される血管新生、癌により誘導される悪液質（例えば、前立腺癌により誘導される悪液質）、癌の転移（前立腺癌の転移）、またはこれらの組み合わせを阻害することにおいて有効である。
【００８３】
他の態様において、本明細書において記載される方法は、関節リウマチなどの自己免疫性疾患を処置するためのものである。別の例において、対象は、ヒトの関節リウマチ患者であって、当該疾患を罹患するか、または当該疾患を有することが疑われる者である。いくつかの例において、本明細書において記載される抗IL6抗体の量は、例えばMCP-1および／またはsICAMなどの炎症性サイトカインの産生を、少なくとも２０％、３０％、５０％、８０％、１００％、２００％、４００％または５００％、減少させることにおいて有効である。
【００８４】
癌または関節リウマチなどの標的疾患を処置するために、上記の医薬組成物の有効量を、処置を必要とする対象（例えばヒト）に、好適な経路を介して投与することができる。処置を必要とするヒト対象は、IL6に関連する障害を有するか、その危険性があるか、またはそれを有することが疑われるヒト患者であってよい。かかる患者は、慣用的な医学的検査により同定することができる。
【００８５】
本明細書において記載されるような抗IL6抗体のいずれかは、別の治療剤との組み合わせにおいて用いてもよい。この文脈における用語「組み合わせにおいて」とは、抗体組成物および治療剤が、同時にまたは連続的に投与されることを意味する。例えば、組み合わせ治療は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共処方される、および／またはこれと共投与される、少なくとも１つの抗IL6抗体を含んでもよい。一態様において、さらなる剤は、癌の化学療法剤、例えば、オキサリプラチン、ゲムシタビン、ドセタキセルである。別の態様において、さらなる剤は、RAの処置のための、疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）、例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリンＡ、スルファサラジンであってもよい。かかる組み合わせ治療は、投与される治療剤のより低い投与量を有利に利用し、したがって、起こり得る多様な単剤治療に関連する毒性または合併症を予防する。さらに、本明細書において開示されるさらなる治療剤は、IL6／I6R／gp130経路に加える経路、またはこれとは区別し得る経路に対して作用し得、したがって、抗IL6抗体の効果を増強する、および／またはこれと相乗作用する（synergize）ことが期待される。
【００８６】
ここで記載される抗体組成物が第２の治療剤と共に使用される場合、当該組成物の治療量以下の投与量、または第２の剤の治療量以下の投与量、または両方の治療量以下の投与量を、IL6により媒介されるシグナル伝達に関連する疾患または障害を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象の処置において用いることができる。「治療量以下の用量」とは、本明細書において用いられる場合、他の剤の不在下において投与される場合に対象において治療的結果をもたらす投与量よりも低い投与量を指す。したがって、ある剤の治療量以下の用量は、本明細書において記載される抗IL6抗体の投与の不在下においては、対象において所望される治療的結果をもたらさないであろうものである。臨床的に使用されている多くの剤の治療的用量は、医学の分野において周知であり、さらなる治療的用量は、当業者により、過度の実験なしに決定することができる。治療的投与量は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版（1990年）などの参考文献；ならびに、医学の専門家により疾患および障害の処置のためのガイダンスとして信頼される多くの他の医学参考文献において、広範に記載されている。
【００８７】
医学の当業者に公知の従来の方法を、処置されるべき疾患の型または疾患の部位に依存して、対象に医薬組成物を投与するために用いることができる。
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの多様なキャリアを含むことができる。静脈内注射のために、水溶性抗体は、点滴法により投与することができ、これにより、抗体および生理学的に受容可能な賦形剤を含む医薬処方物が注入される。生理学的に受容可能な賦形剤は、例えば、５％デキストロース、０．９％食塩水、リンガー溶液または他の好適な賦形剤を含んでもよい。筋肉内用の調製物、例えば、抗体の好適な可溶性の塩形態の無菌処方物は、注射用水、０．９％食塩水または５％ブドウ糖溶液などの医薬用賦形剤中で溶解して投与することができる。
【００８８】
本明細書において記載されるような抗IL6抗体をコードする核酸が、治療剤として用いられる場合、抗体を発現する核酸またはベクターは、Akhtarら、1992年、Trends Cell Bio. 2, 139において記載されるものなどの方法により対象に送達することができる。例えば、それを、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、または生体接着性マイクロスフェアを用いて、細胞中に導入することができる。あるいは、核酸またはベクターは、直接的な注射により、または注入ポンプの使用により、局所的に送達してもよい。他のアプローチとして、例えばコンジュゲートおよび生分解性ポリマーの使用を通して、多様な輸送系およびキャリア系を用いることが挙げられる。
【００８９】
送達を促進するために、抗IL6抗体またはそのコード核酸のいずれかを、シャペロン剤と抱合させてもよい。本明細書において用いられる場合、「抱合した」とは、２つの実体が、好ましくは２つの実体の間の会合の治療的利益を実現する十分なアフィニティーにより、会合していることを意味する。抱合したとは、共有結合または非共有結合、ならびに他の形態の会合、例えば、１つの実体の、他方の上もしくは中での封入、または一方もしくは両方の実体の、第３の実体の上もしくは中での封入（例えばミセル）を含む。
【００９０】
シャペロン剤は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質もしくはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンもしくはヒアルロン酸）、または脂質などの、天然に存在する物質であってよい。それはまた、合成のポリマー、例えば合成のポリアミノ酸などの組換えまたは合成の分子であってもよい。ポリアミノ酸の例として、ポリリジン（PLL）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー（HMPA）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、およびポリホスファジンが挙げられる。
【００９１】
一例において、シャペロン剤は、その中にオリゴヌクレオチド／干渉RNAが封入されるミセル、リポソーム、ナノ粒子またはマイクロスフェアである。かかるミセル、リポソーム、ナノ粒子またはマイクロスフェアを調製するための方法は、当該分野において周知である。例えば、米国特許第5,108,921号；同第5,354,844号；同第5,416,016号；および同第5,527,5285号を参照。
【００９２】
別の例において、シャペロン剤は、膜融合剤または縮合剤の１または２以上の結合のための基質として役立つ。
【００９３】
膜融合剤は、局所ｐＨに対して応答性である。例えば、エンドソーム内でｐＨに相対した場合、それは、その即時の環境の物理的変化、例えば、浸透圧特性の変化を引き起こし得、これは、エンドソーム膜の透過性を妨害または増大し、それにより宿主細胞の細胞質中へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの放出を促進する。好ましい膜融合剤は、電荷を変化させ、例えば、生理学的範囲よりも低いｐＨにおいて（例えば、ｐＨ４．５〜６．５において）プロトン化される。膜融合剤は、特定のｐＨ範囲に暴露された場合に電荷の変化（例えばプロトン化）を経験することができるアミノ基を含有する分子であってよい。かかる膜融合剤として、ポリアミノ鎖（例えば、ポリエチレンイミン）を有するポリマーおよび膜破壊剤（例えばメリチン）が挙げられる。他の例として、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、およびポリアセタール物質（例えばカチオン性ポリアセタール）が挙げられる。
【００９４】
縮合剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相互作用し、それに縮合を引き起こし（例えば、オリゴヌクレオチドのサイズを減少させ）、それにより、それを分解から保護する。好ましくは、縮合剤は、オリゴヌクレオチドと例えばイオン性相互作用を介して相互作用する部分（例えば、荷電部分）を含む。縮合剤の例として、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、ポリアミンまたはその四級塩、シュードペプチド(pseudopeptide)−ポリアミン、ペプチド模倣性(peptidomimetic)ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリンおよびアルファヘリカルペプチドが挙げられる。
【００９５】
本明細書において記載される抗IL6抗体はまた、生物学的試料中のIL6の存在を検出するために用いることができる。抗体に基づく検出方法は、当該分野において周知であり、例えば、ELISA、イムノブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光法、免疫沈降、および他の関連技術を含む。抗体は、タンパク質の検出のために少なくとも１つの他の構成要素を組み込む、診断キットにおいて提供してもよい。キットはまた、包装材、説明書またはタンパク質の検出およびキットの使用のために役立つ他の材料を含んでもよい。
【００９６】
抗体は、リガンド基（例えばビオチン）、放射性同位体、フルオロフォアまたは酵素を含む、検出可能なマーカーにより修飾されていてもよい。酵素は、それらの活性により検出される。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、それが基質であるテトラメチルベンジジン（TMB）を分光光度計により定量可能な青色の色素に変換する能力により検出される。抗体はまた、（例えば、遺伝子融合、化学的カップリング、非共有結合的会合その他により）、別の抗体（例えば二重特異性または多重特異性抗体）、細胞傷害剤または細胞分裂停止剤、トキシン、放射性同位元素などの少なくとも１つの他の分子に、機能的に連結していてもよい。
【００９７】
キット
本開示はまた、IL6に関連する疾患を処置することにおける使用のためのキットを提供する。かかるキットは、抗IL6抗体（例えば、1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10）またはそのコード核酸を含有する１または２以上の容器を含んでもよい。
いくつかの態様において、キットは、本明細書において記載される方法のいずれかに従う使用のための説明書を含んでもよい。含まれる説明書は、癌（例えば、前立腺癌）または自己免疫性疾患（例えばRA）などのIL6に関連する疾患を、本明細書において記載される方法のいずれかに従って、処置するか、その発症を遅延させるか、またはそれを緩和するための、抗IL6抗体の投与の説明を含んでもよい。キットは、さらに、処置のために好適な個体を、その個体が疾患を有するか否かを同定することに基づいて選択することの説明を含んでもよい。なお他の態様において、説明書は、疾患の危険性を有する個体に抗IL6抗体を投与することの説明を含む。
【００９８】
抗IL6抗体の使用に関する説明書は、一般に、意図される処置のための、投与量、用量スケジュール、および投与の経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば複数用量）または部分単位用量であってよい。本発明のキットにおいて供給される説明書は、典型的には、ラベルまたは包装挿入物上に記載された説明（例えばキット中に含まれる紙のシート）であるが、機械で読み取り可能な説明（例えば磁気または光学的記憶ディスク）もまた、受容可能である。
【００９９】
ラベルまたは包装挿入物は、当該組成物が、肝線維症または肝硬変を処置するか、その発症を遅延させるか、および／またはそれを緩和するために用いられることを示す。説明書は、本明細書において記載される方法のいずれかを実施するために提供することができる。
【０１００】
本発明のキットは、好適な包装中にある。好適な包装として、限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、可橈性の包装（例えば密封されたマイラー（Mylar）またはプラスチックのバッグ）などが挙げられる。また企図されるのは、吸入器、鼻投与デバイス（例えばアトマイザー）、またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスとの組み合わせにおける使用のための包装である。キットは、無菌のアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針により貫通することができるストッパーを有する静脈内溶液のバッグまたはバイアルであってもよい）。容器もまた、無菌のアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針により貫通することができるストッパーを有する静脈内溶液のバッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、抗IL6抗体である。
【０１０１】
本明細書において記載されるキットのいずれかは、さらに、抗癌薬（例えば、オキサリプラチン、ゲムシタビンまたはドセタキセル）、またはDMARD（例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリンＡもしくはスルファサラジン）などのさらなる治療剤を含んでもよい。
キットは、任意に、バッファーおよび解釈用情報などのさらなる構成要素を提供してもよい。通常、キットは、容器、および当該容器上の、またはそれに付属した標識または包装挿入物を含む。いくつかの態様において、本発明は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。
【０１０２】
さらなる詳述なしで、当業者は、上記に基づいて、本発明をその最大の範囲まで利用することができると考えられる。以下の特定の態様は、したがって、単に説明的なものとして解釈されるべきであり、決して本開示の残りを限定するものではない。本明細書において引用される全ての刊行物は、本明細書において参照される目的または主題のために参照により援用される。
【０１０３】
例１：ヒトIL6に結合する高アフィニティー抗体の同定
ヒトIL6に結合することができる高アフィニティーヒト抗体を同定するために、ファージディスプレイされたヒトのナイーブｓｃＦｖライブラリーを、以下のように構築した。
１５１人の健康なドナーから末梢血リンパ球からmRNAを単離し、これらからオリゴｄＴプライマーを用いてM-MuLV逆転写酵素（Fermentas）によりcDNAを合成した。標準的なプロトコルに幾らかの改変を加えて、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅し、アセンブルし、ファージミドベクター中にライゲーションした。ライゲーションされた産物を、エレクトロポレーションを介してTG1 E-coli細胞中に導入した。その後、E. coli細胞を回収して、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％のブドウ糖を含む2YT培地中でインキュベートした。M13KO7ヘルパーファージ粒子を培養物に添加して、ｓｃＦｖ−ファージ粒子を生成し、それによりｓｃＦｖライブラリーを作製した。ライブラリーの多様性を、１，０００を超えるクローンをシークエンシングすることにより決定した。
【０１０４】
ｓｃＦｖライブラリーを、以下のとおり、４ラウンドのバイオパニングに供した。ウェルを、０．１ＭのＮａＨＣＯ３バッファー中の組換えIL6で、４℃で一晩コートし、次いで、３００μｌのリン酸緩衝化食塩水（PBS）で２回リンスした。ウェルを、PBS中の１％ウシ血清アルブミン（BSA）で、１時間、３７℃ブロッキングし；１％のBSAを含むPBS中の１００μｌのファージ粒子（２×１０１１ｐｆｕ）を添加し、１時間室温（ＲＴ）で振盪した。ウェルを、次いで、３００μｌの０．５％（ｗ／ｖ）のTween 20／PBSで６回洗浄した。結合したファージを溶離させ、E coli TG1を用いる感染により増幅した。感染細胞を、M13KO7によりレスキューした。生じたファージ粒子を、PEG沈降を介して濃縮し、バイオパニングの次のラウンドのために用いた。
【０１０５】
バイオパニングの第４および第５のラウンドにおいて、ファージのクローンを、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）スクリーニングにより試験し、それらの抗原結合特異性についてスクリーニングした。ELISAプレートを、組換えヒトIL6またはBSAで、２μｇ／ｍｌにおいて、０．１ＭのＮａＨＣＯ３バッファー中で、４℃で一晩、コートした。PBSにより洗浄した後、ウェルを、PBS中１％（ｗ／ｖ）のBSAで１時間ＲＴでブロッキングした。ファージクローンおよびｓｃＦｖフラグメントをプレートに添加し、これを、１時間ＲＴでインキュベートした。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）のTween 20を含有するPBSで洗浄し、次いで、１％BSA-PBS中で１：１０，０００に希釈されたHRP標識ヤギ抗ヒトIgG（KPL）で、４０分間、ＲＴでプローブした。プレートを再度洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（TMB）基質溶液を添加して発色させた。停止溶液（１ＭのＨ２ＳＯ４）を次いで添加し、自動プレートフォトメーター（Bio-Rad）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を定量化した。
【０１０６】
４ラウンドのバイオパニングの後で、上記のELISAアッセイにより、８００を超えるファージクローンを、rhIL6に結合することができるものとして同定した。２９のファージクローンを、抗IL6抗体をコードするＶＨおよびＶＬ配列を決定するための配列分析のために選択した。多数のユニークなクローンを同定し；比較ELISAアッセイにより、それらの結合活性および特異性を決定した。
【０１０７】
上記のバイオパニングの手順から同定された親ファージクローンであるクローン1-4-62を、各々が０．９×１０９を超えるバリアント抗体を含む無作為化したＶＬ／ＶＨＣＤＲファージ抗体ライブラリーの部位特異的変異誘発を介した構築を介した、高アフィニティー抗IL6抗体を生成するためのアフィニティー成熟のために選択した。以下の標準的なプロトコルに従って、クローン1-4-62のＶＬおよびＶＨ配列に基づいて、ＣＤＲ領域において無作為化した配列を含む、ＶＬおよびＶＨフォワードプライマーを用いて、ライブラリーを構築した。CDR無作為化ライブラリーを、本明細書において記載されるような高ストリンジェンシー条件下において、バイオパニングの手順に供し、少なくとも２つの高アフィニティークローン、Ag1-4-6（FB704）およびHag1T-3-10を、親クローンと比較してより高い結合活性を有するものとして同定した。
【０１０８】
３つの抗IL6抗体、1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10についての、ＶＨおよびＶＬドメインの両方についての相補性決定領域１〜３（ＣＤＲ１〜３）およびフレームワーク領域１〜４（ＦＷ１〜４）を、以下の表１において提供する。
【表１】
0006469012.tif 000002
【０１０９】
例２：高アフィニティー抗体のヒトIL6への結合の特徴づけ
材料および方法
（ｉ）細胞株および抗体
ヒト骨髄腫細胞であるU266細胞株（BCRC 60437）を、台湾のBioresource Collection and Research Center（BCRC）から入手し、１０％ウシ胎仔血清を添加したRPMI 1640（Biowet）中で培養した。
IL6依存性B細胞ハイブリドーマであるB9を、５％ウシ胎仔血清および５０ｐｇ／ｍｌの組換えヒトIL6を添加したRPMI 1640中で培養した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）は、Lonzaから購入し、ゼラチンコートしたペトリ皿上でEGMTM-2 singleQuots（登録商標）培地（Lonza）中で増殖させた。
【０１１０】
IgG産生細胞であるFreeStyleTM CHO細胞株（Invitrogen）を、FreeStyleTM CHO 発現培地（Invitrogen）中で８ｍＭのＬ−グルタミンと共に培養した。
Flp-in CHO細胞株（Invitrogen）を、Ham’s F12（Invitrogen）中で１０％ウシ胎仔血清と共に培養した。
対照の抗IL6抗体であるBE8は、Diacloneから購入した。米国食品医薬品局（FDA）により承認された関節リウマチの処置のための抗体薬（抗IL6抗体）であるアクテムラは、ハイデルベルク大学病院（Universitatsklinikum Heidelberg, Germany）から購入した。ヒトIgG1ヌクレオチドは、Sigmaから購入した。
【０１１１】
（ｉｉ）完全ヒト抗IL6 IgG1抗体の製造
４つの発現されたベクター（pA01-Kappa、pA02-Gamma、p2CMV中間体および改変されたpcDNAFRT）を、哺乳動物細胞中でヒトIgGを産生させるために構築した。抗IL6候補抗体をコードする全軽鎖遺伝子（カッパ定常領域を含む）および全重鎖遺伝子（ガンマ定常領域を含む）を、pcANTAB5EからpA01-KappaおよびpA02-Gamma中に、別々に、一過性の抗体発現のためにクローニングした。これらの発現ベクターを、GenJet（商標）Plus試薬（SignalGen）によりFreeStyle（商標）CHO-S細胞中に導入した。
【０１１２】
全軽鎖および重鎖遺伝子を、第１に、p2CMV中間体ベクター中にクローニングし、次いで、安定な抗体発現のために、改変pcDNAFRT単一発現ベクター中にクローニングした。pcDNAFRTベクターを、GenJet（商標）Plus試薬によりCHO細胞中にトランスフェクトし、より長期の発現のために、ハイグロマイシンＢ（Invitrogen）を用いて陽性クローンを選択した。培養上清を収集して、MabSelect SuReおよびタンパク質Ａカラム（GE Healthcare）により精製した。
【０１１３】
（ｉｉｉ） 結合および競合分析
抗IL6ヒトIgG抗体の結合活性を試験するために、ELISAおよびウェスタンブロットを行った。簡単に述べると、プレートを２μｇ／ｍｌの組換えヒトIL6（R&D Systems）でコートした。PBSで洗浄した後で、ウェルをPBS中１％（ｗ／ｖ）のBSAで、ＲＴで１時間ブロッキングした。連続希釈（２μｇ／ｍｌの濃度から開始する）における精製した抗IL6抗体を、ウェル中に配置し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを、０．１％（ｗ／ｖ）のTween 20を含むPBSにより洗浄し、次いで
１％BSA-PBS中で１：１０，０００に希釈されたHRP標識ヤギ抗ヒトIgG（KPL）で、４０分間、ＲＴでプローブした。プレートを再度洗浄し、TMB基質溶液を添加して発色させた。停止溶液（１ＭのＨ２ＳＯ４）を次いで添加し、自動プレートフォトメーター（Bio-Rad）を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を定量化した。
【０１１４】
組換えIL6タンパク質を、５×還元性試料バッファー（０．１５ＭのTris-HCl、ｐＨ６．８、５０％グリセロール、１０％のSDS、０．７１Ｍの２−メルカプトエタノール、０．０９５％ブロモフェノールブルー）中で１０分間煮沸し、SDS-PAGE（Bio-Rad）に供した。タンパク質を、次いでニトロセルロース膜（Bio-Rad）にトランスファーし、本明細書において記載される完全ヒト抗IL6抗体でイムノブロットした。HRP標識ヤギ抗ウサギ（Thermo）またはHRP標識ヤギ抗マウス（KPL）抗体と共にインキュベートした後で、増強化学発光（GE Healthcare）により膜を現像した。
【０１１５】
プレートを、組換えヒトIL6受容体−α（R&D Systems）で、０．１ＭのＮａＨＣＯ３バッファー中２μｇ／ｍｌにおいて、４℃で一晩コートした。PBSで洗浄した後で、ウェルをPBS中１％（ｗ／ｖ）のBSAで、ＲＴで１時間ブロッキングした。２μｇ／ｍｌの出発濃度での２倍連続希釈における精製した抗IL6抗体を、rhIL6（０．５μｇ／ｍｌ）と共にＲＴで１時間プレインキュベートした。混合物をプレート中に配置し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを０．１％（ｖ／ｖ）Tween 20を含有するPBSで洗浄し、次いで、１％BSA-PBS中で１：２，０００希釈されたマウス抗ヒトIL-6 IgG2a（Abcam）で、１時間ＲＴで、プローブした。プレートを洗浄し、次いで、１％BSA-PBS中で１：１０，０００に希釈されたHRP標識ヤギ抗マウスIgG（Thermo）で、４０分間ＲＴでプローブした。プレートを再度洗浄し、TMB基質溶液を添加して発色させた。停止溶液（１ＭのＨ２ＳＯ４）を次いで添加し、自動プレートフォトメーターを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を定量化した。
【０１１６】
（ｉｖ）細胞シグナル伝達アッセイ
U266細胞（１×１０６／ｍｌ）を、無血清RPMI 1640で２回洗浄し、ウシ胎仔血清および増殖因子の不在下において２時間培養した。細胞を、rhIL6（５ｎｇ／ｍｌ）で３０分間、３７℃で刺激し、次いで、抗IL6抗体と共に処置するか、またはこれを用いなかった。細胞を、氷冷PBSで洗浄し、次いで、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（Roche）を添加したRIPAバッファー（Thermo）でリンスした。抗pSTAT3および抗STAT3（Cell Signaling Technology）抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。HRP標識ヤギ抗ウサギ（Thermo）またはHRP標識ヤギ抗マウス抗体（Thermo）と共にインキュベートした後で、増強化学発光（GE Healthcare）により膜を現像した。
【０１１７】
（ｖ）細胞増殖アッセイ
マウスB9細胞（５×１０４／ｍｌ）を９６ウェルプレートにおいて播種し、rhIL6（１０ｐｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。マウスB9細胞のIL6受容体は、ヒトIL6により刺激することができた。多様な濃度における抗IL6抗体または対照のIgG抗体を、ウェル中に配置した。細胞を、次いで、３７℃で７２時間培養した。細胞の生存率は、水溶性テトラゾリウム（WST-1）アッセイ（Roche）により、製造者の説明書に従って検出した。全ての実験を、３回の複製において行った。
【０１１８】
（ｖｉ）Biacore分析
IgG結合アフィニティーは、BIAcore T200システム（GE healthcare）において、ヒト抗体キャプチャーキット（GE healthcare）を用いることにより測定した。マウス抗ヒトIgGを、アミンカップリングを介してCM5センサーチップ上に固定した。HBS-EP＋バッファー中の約７００ＲＵの精製した抗IL6 IgGを、固定された表面上にキャプチャーさせた。HBS-EP＋バッファー中２５．６ｎＭ〜０．４ｎＭの範囲の濃度における組換えヒトIL6（R&D Systems）を、２分間、３０μｌ／分の流速を用いてインジェクトした。HBS-EP＋バッファーフロー中の結合した抗体の解離を、７分間追跡した。表面のIgGを、各サイクルの後で、再生溶液（３ＭのＭｇＣｌ２）を用いて再生した。解離定数（ＫＤ）を、ｋｄ／ｋａとして計算した。
【０１１９】
（ｖｉｉ）特異性分析
プレートを、組換えヒトIL3、IL4、IL5、IL6、IL11、IL17A、CNTF、OSM、IGF-1（R&D Systems）、IL2、FGF（Prospec）、VEGF、TNF-α、EGF（Peprotech）で、０．１ＭのＮａＨＣＯ３バッファー中２μｇ／ｍｌにおいて、４℃で一晩コートした。PBSで洗浄した後で、ウェルを、PBS中１％（ｗ／ｖ）のBSAで、ＲＴで１時間ブロッキングした。２μｇ／ｍｌの出発濃度での４倍連続希釈における精製した抗IL6抗体を、ウェル中に配置し、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートを０．１％（ｗ／ｖ）のTween 20を含むPBS中で洗浄し、次いで１％BSA-PBS中で１：１０，０００に希釈されたHRP標識ヤギ抗ヒトIgG（KPL）で、４０分間、ＲＴでプローブした。プレートを再度洗浄し、TMB基質溶液を添加して発色させた。停止溶液（１ＭのＨ２ＳＯ４）を次いで添加し、VERSA max（Molecular Devices）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を定量化した。
【０１２０】
結果
（ａ）抗IL6 IgG抗体の結合活性
抗IL6抗体の結合特異性を研究するために、選択したｓｃＦｖクローンをコードするVHおよびVL遺伝子を、カッパおよびガンマ定常領域の遺伝子と融合させて、本明細書において記載されるような全ヒトIgG1抗体を作製した。ELISAおよびウェスタンブロットアッセイは、それらの抗IL6抗体がヒト組換えIL6タンパク質に結合することができ、用量依存的な様式において中和活性を示したことを示した。
【０１２１】
BIAcore分析は、クローンAg1-4-6およびHag1T-3-10の会合速度定数（ｋａ）の平均が、親1-4-62 クローンと比較して４．３８×１０−５から２．２４×１０−６Ｍ−１ｓ−１へと増強されたことを示した。解離速度定数（ｋｄ）は、１．６６×１０−３から６×１０−４ｓ−１へと増強された。平衡解離定数（ＫＤ）は、３．８５から０．２７ｎＭへと改善された。以下の表２を参照。
【０１２２】
【表２】
0006469012.tif 000003
【０１２３】
（ｂ）抗IL6抗体の結合特異性
本明細書において記載される高アフィニティー抗IL6抗体の結合特異性を確認するために、本明細書において記載されるようなELISAアッセイを行った。簡単に述べると、プレートを、図３Ａ（IL6ファミリーサイトカイン）および図３Ｂ（非IL6ファミリーサイトカイン）において示すような様々なサイトカインでコートし、それらのサイトカインに対するFB704抗体クローン（すなわちAg1-4-6）の結合活性を試験した。FB704は、ヒトIL6 タンパク質に対して高い結合活性を示したが、他のサイトカイン（図３Ａおよび３Ｂ）に対してはこれを示さず、このことは、ヒトIL6に対するその結合特異性を示す。
【０１２４】
（ｃ）抗IL6抗体によるIL6依存性シグナル伝達経路および細胞増殖の阻害
ヒト多発性骨髄腫U266細胞を、IL6により誘導されるシグナル伝達カスケードに対する抗IL6抗体の効果を試験するために用いた。U266細胞を、抗体の存在下または不在下において、rhIL6と一緒に培養した。３０分後、全細胞ライセートを収集し、IL6シグナル伝達経路に関与する主要な転写因子であるリン酸化STAT3タンパク質（P-STAT3）を試験するために、ウェスタンブロット分析を行った。P-STAT3タンパク質発現は、高アフィニティー抗IL6抗体、Ag1-4-6およびHAgT1-3-10により、対照として用いた抗IL6受容体ヒト化抗体であるアクテムラよりも高いレベルにおいて抑制された（図１Ａおよび１Ｂ）。抗体によるSTAT3のリン酸化の阻害のレベルは、以下の表３において示す：
【０１２５】
【表３】
0006469012.tif 000004
【０１２６】
さらに、細胞増殖に対する抗体活性を試験するために、IL6依存性B9マウスハイブリドーマ細胞を、多様な濃度における抗IL6または抗IL6R抗体ならびにアイソタイプの対照の抗体の存在下において培養した。細胞増殖に対する影響は、７２時間後に、WST-1アッセイ（Roche）により評価した。図１Ｃにおいて示すとおり、完全なヒト抗IL6抗体1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10は、B9細胞増殖を用量依存的な様式において阻害した。1-4-62、Ag1-4-6およびHAg1T-3-10のＩＣ５０値は、それぞれ、０．６１８、０．０４６８および０．００４５６μｇ／ｍｌである。
【０１２７】
例３：癌の処置における高アフィニティー抗IL6抗体の有効性
材料および方法
（ｉ）動物
全ての実験について、オスNOD/SCIDマウス（７〜８週齢）を、BioLASCO Taiwan Co., Ltd（Taipei, Taiwan）から購入した。マウスを、無菌の個別換気ケージ（IVC）において２０℃で維持し、実験を開始する前に少なくとも７日間、収容施設に順化させた。
【０１２８】
（ｉｉ）マトリゲル血管新生アッセイ
液体マトリゲル（BD Biosciences）を４℃に維持した。hIL6組換えタンパク質（R&D Systems）をマトリゲルに１００ｎｇ／０．５ｍｌの最終濃度まで添加した。マウスをAvertin（０．２ｍｌ／１０ｇ、腹腔内注射）により麻酔し、背側の２か所において０．５ｍｌのマトリゲルを注射した。次いで、マウスを、抗IL6 IgG抗体または対照のIgG抗体で静脈内注射を通して処置した。第６日において、マウスをＣＯ２窒息により安楽死させた。マトリゲルの栓を取り除き、秤量し、写真撮影した。ヘモグロビンレベルを測定するために、マトリゲルの栓を、溶解バッファー（PBS中１％のSDS、０．５％のTriton）で一晩４℃で溶解した。Drabkin試薬（Sigma）を用いて、栓のヘモグロビン含有量を定量化した。ウシヘモグロビン（Sigma）の標準曲線を用いて、栓中のヘモグロビンを決定した。ヘモグロビン含有量は、マトリゲル１グラムあたりのヘモグロビンのマイクログラム数として示した。Studentの独立ｔ検定を用いて平均＋ＳＤを計算した；ｐ＜０．０５を統計学的有意であるものとみなした。
【０１２９】
（ｉｉｉ）脾臓内移植モデルを用いた前立腺PC3腫瘍転移アッセイ
マウスを、Avertin（０．２ｍｌ／１０ｇ）で麻酔し、左側腹部において剪毛した。それらを次いで、右側臥位において配置し、左側腹部を７５％アルコールでごしごし洗った。腹壁における皮膚を縦に（脊椎に対して平衡に）１ｃｍにわたり切開した。脾臓を露出させ、そっと安置する。インスリンシリンジ上の３０ゲージの針を、脾臓の実質中に３〜４ｍｍにわたり挿入した。５０μｌのPC-3細胞懸濁液を、ゆっくりと注入した。可視の淡い膨疹は、首尾よい注射を示す。次いで針を引き抜き、注射部位を覆うように小さい綿球を３０秒間置いて、出血および細胞懸濁液の溢流を防止する。脾臓を腹膜中に戻す。６−０のナイロン縫合糸で腹壁を閉じ、４−０のナイロン縫合糸で皮膚を閉じる。
【０１３０】
移植の後で、マウスを無作為に様々な処置群（ドセタキセル群、ドセタキセル＋抗IL6抗体群、およびPBS対照群）に割り当て、i.p注射により尾静脈を通して複数用量の抗IL6抗体（毎回２０ｍｇ／ｋｇ、週２回）、ドセタキセル（毎回３ｍｇ／ｋｇ、週１回）で処置した。それらのマウスの体重を、週２回測定した。
【０１３１】
全てのマウスを、次いで、ＣＯ２窒息により安楽死させ、体重を決定した。脾臓および肝臓における原発腫瘍を切除し、秤量した。臓器指標を、マウス１グラムあたりの臓器のミリグラム数として表わした。平均＋ＳＤを、Studentのｔ検定を用いて計算した。生存率アッセイは、カプラン・マイヤー分析を用いた。腫瘍塊のパラフィン包埋切片または凍結切片を調製し、抗CD31およびKi-67＋ヘマトキシリン染色により、分析のために染色した。
【０１３２】
（ｉｖ）異種移植ヒト膵臓腫瘍モデル
ヒト膵臓腫瘍細胞BxPC-3およびMiaPaCa細胞を、PBS中に再懸濁し、皮下（s.c.）で、マウスの右側腹部中に注射した（５×１０６細胞、総容積０．１５ｍＬ）。１０日後、マウスを無作為に様々な処置群（抗体FB704、オキサリプラチン、FB704＋オキサリプラチン、ゲムシタビンおよびPBS対照群）に割り当て、i.p注射により尾静脈を通して複数用量のFB704（毎回２０ｍｇ／ｋｇ、週２回）またはオキサリプラチン（毎回３ｍｇ／ｋｇ、週１回）、またはゲムシタビン（毎回８０ｍｇ／ｋｇ、週２回）で処置した。マウスの体重および腫瘍のサイズを、週２回測定した。腫瘍のサイズは、ノギスを用いて測定し、腫瘍の容積は、長さ×幅２×０．５２により計算した。実験の後で、全てのマウスを安楽死させ、マウスの血液試料を収集し、腫瘍塊を取り除いて秤量した。平均腫瘍容積および腫瘍重量の差異を、Studentのｔ検定により評価した。腫瘍塊のパラフィン包埋切片および凍結乾燥切片を調製し、抗CD31、Ki67またはTUNEL＋Ｈ＆Ｅ染色により、分析のために染色した。
【０１３３】
結果
（ｉ）FB704はマトリゲルアッセイにおいてin vivoでの血管新生を阻害する
FB704の抗血管新生能力を、本明細書において記載されるようなin vivoマトリゲルモデルにおいて試験した。処置の６日後に、マウスを安楽死させ、ヘモグロビン濃度を測定した。FB704処置群（図４Ａ）の切除したマトリゲル栓における色および血管密度には観察し得る差異は存在しなかった。このことは、抗体の抗血管新生活性を示す。FB704処置はまた、hIL6と比較して、ヘモグロビン濃度を著しく減少させた（図４Ｂ）。
【０１３４】
（ｉｉ）FB704はヒト前立腺癌細胞PC-3により誘導される悪液質および転移を阻害する
癌により誘導される悪液質および転移に対するFB704の効力を検証するために、マウスに、ヒト前立腺癌PC-3細胞（マウス１個体あたり１．０×１０６）を、脾臓内注射により移植した。第１日において、マウスを４群に無作為化した（ｎ＝１２〜１５）。高（２０ｍｇ／ｋｇ）および低（５ｍｇ／ｋｇ）用量のFB704、陽性対照であるアクテムラ（２０ｍｇ／ｋｇ）およびPBSを、i.v.（静脈内）注射で、週２回投与した。PC-3細胞移植の３１日後に、PBS処置マウスの総体重は、約１９％減少していた。対照的に、高用量FB704およびアクテムラ処置群の総体重は、安定なままであった。これは、対照群と比較して有意な差異である（図５Ａ；Ｐ＜０．０１）。
【０１３５】
さらに、数日間の潜伏期間の後で、PC3担癌マウスは、後肢の麻痺または播種性腫瘍の伝播のさらなる症状を発症した。FB704（Ｐ＝０．０００１）およびアクテムラ（Ｐ＝０．０２４）の反復性の血管内注射は、PC3担癌マウスの無症状生存を有意に延長し、ここで、FB704は、アクテムラより有意に優れた効力を示した（Ｐ＝０．０３）（図５Ｂ）。PBS処置群の肉眼的剖検は、肝臓における重篤な拡大および腫瘍細胞浸潤を示した。対照的に、FB704処置群は、肝臓の左葉および中葉において中程度の腫瘍細胞浸潤および５０％を超える正常な肝細胞を示した（図５Ｃ）。
【０１３６】
血管新生はまた、腫瘍転移において重要な役割を果たす。腫瘍切片上の血管密度を検証するために、免疫組織化学を行った。CD31（血管新生についてのマーカー）についての染色は、FB704処置群における血管新生は、PBS対照群と比較して著しく減少したことを示した（図５Ｄおよび５Ｅ）。
さらに、FB704と化学薬物であるドセタキセルとの組合せ処置は、より良好な総生存率を提供した（図５Ｆ）。
【０１３７】
（ｉｉｉ）FB704は膵臓癌異種移植モデルにおいてオキサリプラチンまたはゲムシタビンの抗腫瘍活性を増強する
FB704は、ヒト膵臓癌モデルにおいてオキサリプラチンまたはゲムシタビンの抗腫瘍活性を増強する。
enhanced the in a.  Treatment of BxPC-3担癌マウスの、週２回の２０ｍｇ／ｋｇのFB704による処置、プラス週１回のオキサリプラチン（３ｍｇ／ｋｇ）および週２回のゲムシタビン（８０ｍｇ／ｋｇ）は、それぞれ４９％および６０％の統計学的に有意な腫瘍増殖阻害をもたらした（Ｐ＜０．０１）（図６Ａおよび６Ｇ）。マウスの体重は、正常に増加した（図６Ｂ）。腫瘍塊の質量は、処置の後で著しく減少した（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【０１３８】
細胞増殖マーカーであるKi-67に対して特異的な抗体を用いて、各々の群の腫瘍細胞の増殖率および腫瘍組織を試験した。PBS、オキサリプラチン、FB704、およびFB704＋オキサリプラチン処置群におけるKi-67陽性細胞のパーセンテージは、それぞれ、２６％、１４％、１６％および７．５％であった（図６Ｅおよび６Ｆ）。このことは、FB704とオキサリプラチンまたはゲムシタビンとの組合せ処置が、in vivoでの膵臓の腫瘍細胞の増殖のより良好な阻害を提供したことを示す。
【０１３９】
FB704はまた、膵臓癌モデルにおいてゲムシタビンとの相乗的利益を示した。BxPC-3担癌マウスの、２０ｍｇ／ｋｇのFB704および８０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンによる週２回の処置は、統計学的に有意な腫瘍増殖阻害をもたらした（Ｐ＜０．０１）（図６Ｇ）。
【０１４０】
例４：関節リウマチ処置における高アフィニティー抗IL6抗体の有効性
RA患者においては、MCP-1のケモカインの産生の増大が関節において観察されており、このことは、RAの病因におけるケモカインの関与を示唆している。接着分子であるsICAM-1もまた、損傷組織中への炎症性細胞の浸潤において重要な役割を果たす。HUVECは、天然でsICAM-1を細胞表面上に発現した。IL6プラスsIL6Rの処置は、sICAM-1の発現を誘導した。
【０１４１】
（ｉ）抗IL6抗体は、HUVEC細胞におけるMCP-1およびsICAM-1の産生を阻害した
関節リウマチ（RA）を処置することにおける本明細書において記載される抗IL6抗体の有効性を試験するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）による単球走化性タンパク質−１（MCP-1）およびsICAM-1の分泌を、以下のとおりの抗体処置の後で測定した。HUVEC細胞を、４８ウェルプレート中に、２×１０５細胞／ｍｌの密度において播種した。細胞を、組換えヒトIL6、IL6受容体−α（R&D Systems）の組み合わせにより、多様な濃度における抗IL6抗体または対照のIgG抗体と共にまたはこれらを伴わずに、３７℃で２４時間、処置した。無細胞の培養上清を収集し、MCP-1およびsICAM-1についてELISA（RayBiotech）により分析した。
【０１４２】
このin vitroアッセイは、IL6プラスsIL6RαがHUVECによるMCP-1およびsICAM-1の発現を誘導したことを示した。抗体Ag1-4-6およびHAgT1-3-10は、IL6プラスsIL6Rαにより誘導されるMCP-1（図２Ａ）およびsICAM-1（図２Ｂ）を用量依存的な様式において抑制した。抑制の効力は、アクテムラよりも高かった。
【０１４３】
（ｉｉ）抗IL6抗体はU937細胞およびヒト末梢血短角細胞（PBMC）の両方においてMCP-1産生を阻害した
MCP-1は、単球、メモリーＴ細胞および樹状細胞を炎症の部位に動員するＣＣケモカインファミリーに属する低分子サイトカインである。免疫細胞の間で、単球系の細胞は、MCP-1の主要な生産者であることが知られている。MCP-1は、炎症および関節炎において主要な役割を果たす。さらに、IL6は、ヒト単球においてMCP-1を誘導することが示された。したがって、本明細書において記載される抗IL6抗体を、IL6により刺激された前単球細胞株U937細胞におけるMCP-1発現を抑制することにおけるそれらの有効性について試験した。
【０１４４】
U937（２×１０６細胞／ウェル）をIL6（１００ｎｇ／ｍｌ）で、２４時間、RPMI1640を含む４８平底培養プレート（Corning, Corning, NY）中で、様々な濃度における抗IL6抗体の存在下において培養した。上清中のMCP-1のレベルを、MCP-1 ELISAキット（e Bioscience）により測定した。in vitroでの実験の全ては、３回の複製において行った。
U937細胞からのMCP-1の産生は、IL6刺激の後で用量依存的な様式において観察され、抗IL6抗体は、IL6により誘導されたU937細胞におけるMCP-1産生を阻害した（図７Ａ）。
【０１４５】
さらに、５人の健康なドナーからPBMCを単離した。細胞（５×１０５細胞／２５０μｌ／ウェル）を、IL6（１００ｎｇ／ｍｌ）と共に２４時間、RPMI1640を含む９６ウェルのＵ底培養プレート（Corning, Corning, NY）中で、様々な濃度における抗IL6抗体の存在下において培養した。上清中のMCP-1のレベルを、MCP-1 ELISAキット（e Bioscience）により測定した。
PBMC細胞によるMCP-1の産生は、IL6刺激の後で観察された。抗体Ag1-4-6およびHAgT1-3-10の存在は、MCP-1産生を用量依存的な様式において阻害し、一方、対照アイソタイプIgG1は、この阻害的効果を示さなかった（図７Ｂ）。
【０１４６】
（ｉｉｉ）抗IL6抗体は関節リウマチ患者からの滑膜線維芽細胞においてMCP-1およびVEGF産生を阻害した
フレッシュな滑膜組織を、刻んで、コラゲナーゼおよびDNaseの溶液中で消化した。単離された線維芽細胞を、７０ｍｍナイロンフィルターを通して濾過した。細胞を、プラスチック細胞培養ディッシュにおいて、９５％の空気／５％のＣＯ２中で、２０ｍＭのHEPESおよび１０％の熱不活化FBS、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｐＨを７．６に調整したもの）を添加したRPMI 1640（Life Technologies）中で増殖させた。細胞の９５％より多くが線維芽細胞であったことが、線維芽細胞のタンパク質マーカーであるビメンチンに対して特異的な抗体を用いる免疫蛍光染色により特徴づけられた。４〜９代の継代からの線維芽細胞を、実験のために用いた。
【０１４７】
上記のとおりヒトRA患者から誘導された線維芽細胞様滑膜細胞（RA-FLS細胞）を、６ウェルの平底培養プレート（Corning, Corning, NY；２×１０５細胞／２ｍｌ／ウェル）中で２日間培養し、IL6およびsIL6Rの両方で刺激した。多様な濃度における抗体をウェルに添加し、細胞と共に２４時間インキュベートした。次いでMCP-1 ELISAキット（e Bioscience）により、MCP-1のレベルを測定した。
RA-FLS細胞は、天然でMCP-1を低レベルにおいて発現し、IL6およびsIL6Rによる前処置は、高レベルのMCP-1産生を刺激することができた。本明細書において記載される抗IL6抗体は、市販のRA-FLS細胞（図８Ａ）および上記のとおりRA患者から得られたRA-FLS細胞（図８Ｂ）の両方において、MCP-1産生の著しい阻害を示した。
【０１４８】
血管内皮増殖因子（VEGF）は、ＲＡの病因において重要な役割を果たす。VEGFのレベルは、RA患者からの滑液中で著しく高い。それはまた、血管の透過性を誘導し、炎症を媒介する。RA-FLS細胞におけるVEGF産生に対する抗IL6抗体の効果を試験するために、それらの細胞を、以下のとおり、IL6（１００ｎｇ／ｍｌ）、sIL6R（１００ｎｇ／ｍｌ）、およびIL1β（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下において、本明細書において記載される抗IL6抗体で処置した。
RA-FLS細胞（２×１０４細胞／５００μｌ／ウェル）を、４８ウェルの平底培養プレート（Corning, Corning, NY）中で２４時間培養し、次いで、IL6およびsIL6RおよびIL-1βの両方で刺激した。多様な濃度における抗体をウェルに添加して、細胞と共に４８時間インキュベートした。上清を収集して、ヒトVEGF ELISAキット（PreproTech）によりVEGFのレベルを測定した。
【０１４９】
IL6、IL6RおよびIL1βの組み合わせで刺激したRA-FLS細胞の培養上清中のVEGFは、サイトカインにより刺激されなかった細胞からの上清中のものよりも３〜５倍高かった。本発明者らの抗IL6抗体は、市販のRA-FLS細胞（図９Ａ）および上記のようにRA患者から調製したRA-FLS細胞（図９Ｂ）の両方において、VEGF産生を著しく減少させた。
【０１５０】
他の態様
本明細書において開示される特徴の全ては、任意の組み合わせにおいて組み合わせることができる。本明細書において開示される各々の特徴は、同じ、同等または類似の目的に役立つ代替的な特徴により置き換えることができる。したがって、他に明示的に記述されない限り、開示される各々の特徴は、一般的な一連の等価物または類似の特徴の例に過ぎない。
上記から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から解離することなく、本発明の多様な変更および改変を、それを多様な用途および状態に適応させるために、行うことができる。したがって、他の態様もまた、請求の範囲の内である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【配列表】
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