(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
半減期延長部分と複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含む単離された融合タンパク質であり、
該Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストが、
配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２７）を含み、
ａ）Ｘａａ１は、Ｉ又はＴであり、
ｂ）Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
ｃ）Ｘａａ３は、Ｋ又はＲであり、
ｄ）Ｘａａ４は、Ｉ又はＥであり、
ｅ）Ｘａａ５は、Ｅ又はＫであり、
Ｋｖ１．３を形質移入したＣＨＯ細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Ｋｖ１．３に対して、約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０を有するものであり、
選択度が、Ｋｖ１．３又はＫｖ１．１を形質移入したＣＨＯ細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Ｋｖ１．１のＩＣ５０値のＫｖ１．３のＩＣ５０値に対する比として算出される場合に、半減期延長部分に複合させた配列番号１の天然のＯｄＫ２ペプチドを含む融合タンパク質と比較して、Ｋｖ１．３に対して少なくとも１００倍選択的なものである、
前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストが、配列番号３、２２、３４、又は４２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＤＢ）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記半減期延長部分が、リンカーによりＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストと複合されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーが、配列番号１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２又は４２８のアミノ配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ａ）前記Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストが、配列番号３、２２、３４、又は４２のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記リンカーが、配列番号１１６又は配列番号１１９のアミノ酸配列を含み、及び
ｃ）前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、
請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ａ）前記Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストが配列番号４２のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記リンカーが、配列番号１１６のアミノ酸配列を含み、及び
ｃ）前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、
請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ａ）前記Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストが配列番号４２のアミノ酸配列を含み、
ｂ）Ｃ末端延長部分が、配列番号２０９のアミノ酸配列を含み、
ｃ）前記リンカーが、配列番号１１６のアミノ酸配列を含み、及び
ｄ）前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンである、
請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｋｖ１．３の単離されたペプチドアンタゴニストであって、
配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２７）を含み、
ａ）Ｘａａ１は、Ｉ又はＴであり、
ｂ）Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
ｃ）Ｘａａ３は、Ｋ又はＲであり、
ｄ）Ｘａａ４は、Ｉ又はＥであり、
ｅ）Ｘａａ５は、Ｅ又はＫであり、
Ｋｖ１．３を形質移入したＣＨＯ細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Ｋｖ１．３に対して、約１×１０−８Ｍ以下のＩＣ５０を有するものであり、
選択度が、Ｋｖ１．３又はＫｖ１．１を形質移入したＣＨＯ細胞における全細胞パッチクランプアッセイにおいて、Ｋｖ１．１のＩＣ５０値のＫｖ１．３のＩＣ５０値に対する比として算出される場合に、半減期延長部分に複合させた配列番号１の天然のＯｄＫ２ペプチドを含む融合タンパク質と比較して、Ｋｖ１．３に対して少なくとも１００倍選択的なものである、
前記ペプチドアンタゴニスト。
【請求項１１】
前記アンタゴニストが、半減期延長部分と複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含む単離された融合タンパク質である、請求項１０に記載のペプチドアンタゴニスト。
【請求項１２】
請求項１〜９に記載の融合タンパク質、又は請求項１０若しくは１１に記載のペプチドアンタゴニストをコードしている単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１４に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞により発現された融合タンパク質又はペプチドを回収することとを含む、請求項１〜９に記載の融合タンパク質又は請求項１０若しくは１１に記載のペプチドアンタゴニストの製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜９に記載の融合タンパク質又は請求項１０若しくは１１に記載のペプチドアンタゴニストと、製薬上許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１７】
望ましくないＴ細胞活性化に関連する状態を治療するためのものである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記望ましくないＴ細胞活性化に関連する状態が、炎症状態、免疫及び増殖障害、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、骨粗鬆症、ぶどう膜炎、炎症性線維症、強皮症、肺線維症、硬変、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、接触性皮膚炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びその他の形態のループス、糖尿病、１型糖尿病、肥満、癌、ループス、再狭窄、全身性硬化症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植片拒絶、又は移植片対宿主病である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により全ての内容が本願に援用される、２０１３年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５７，３８９号、並びに２０１３年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／７５６，７７７号の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｋｖ１．３アンタゴニスト、これをコードしているポリヌクレオチド、並びにその製造及び使用方法に関する。アンタゴニストは、ＯｄＫ２ペプチドの変異体に基づくものである。
【背景技術】
【０００３】
イオンチャネルは、イオン電流の生成を介し、心臓、ＣＮＳ、及び免疫生理機能などの様々な細胞機能を調節する。市販薬の５〜３０％はイオンチャネルの活性を調節するものであると推定されている（Ｏｖｅｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５：９９３〜６，２００６）。既存の非選択的な薬剤の有効性及び安全性を改良するために新規療法に望まれる特徴には、サブファミリー選択性があり、これには小分子及び公知の天然に生じるペプチド毒素に関連する難しい課題が伴う（Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：６６１〜７９，２０１２）。このような課題は、電位依存性Ｋ＋、Ｃａ＋及びＮａ＋チャネルなどの相同性の高いファミリーに特に当てはまる。
【０００４】
Ｋｖ１．３、カリウム電圧依存性チャネルサブファミリーＡメンバー３はＴ細胞で発現し、Ｔ細胞活性化を調節するよう機能する。細胞表面活性化マーカーを上方調節するためのＴ細胞活性化には、持続的なカルシウムシグナリングが必要とされ、この持続的なカルシウムシグナリングが、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）のカルシニューリン依存性の脱リン酸化及び核内移行によるサイトカイン産生及び増殖を増大させる。小胞体に貯蔵されたカルシウムがイノシトール三リン酸（ＩＰ３）依存的に放出されることで、細胞表面のカルシウム放出依存性カルシウムチャネル（ＣＲＡＣ）が活性化されて細胞外カルシウムの流入がもたらされ、カルシウムシグナリングが維持される（Ｃａｈａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２３１：５９〜８７，２００９に掲載）。細胞を過分極状態に維持し、かつＴ細胞を十分に活性化させるためにカルシウムの流入を維持するには、カリウムを排出させる必要がある。このカリウム排出が電圧依存性カリウムチャネルＫｖ１．３及びカルシウム活性化カリウムチャネルＫＣａ３．１により調節されることは明らかである。Ｋｖ１．３がカルシウムシグナリングの調節に関与し、かつ更にはＫＣａ３．１には何ら阻害を示さないカリウムチャネルであることは、Ｋｖ１．３選択的遮断剤により実証されている。（Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６７：１３６９〜８１，２００５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｋｖ１．３の遮断によりＴ細胞が脱分極され、かつカルシウムの流入、サイトカイン産生、及び活性化Ｔ細胞の増殖が阻害される（Ｃａｈａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２３１：５９〜８７，２００９に掲載）。
【０００５】
Ｋｖ１．３遮断剤は、自己免疫モデルにおいて、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、実験的関節炎、遅発性過敏症（ＤＴＨ）、アレルギー性接触皮膚炎及び糸球体腎炎などのＴ細胞依存性の疾患の進行を低減させることが示されている（Ｒａｎｇａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １３：９０９〜２４，２００９；Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０３：１７４１４〜９，２００６；Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：５１２０〜８，１９９７；Ｈｙｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２９９：Ｆ１２５８−６９，２０１０）。カルシウムカルシニューリンＮＦＡＴ経路阻害剤シクロスポリンＡ（ネオーラル、サンディミュン、ジェングラフ（Gengraf））並びにタクロリムス（ＦＫ−５０６又はフジマイシン（fujimycin））は、移植片拒絶及び重度の関節リウマチなどの、重度の免疫疾患について承認されている治療薬である。カルシニューリンは腎臓などの組織に広範に分布することから、結果としてこれらの化合物は、機序による毒性が高く、安全域が狭く、かつ治療応用が制限される。選択的Ｋｖ１．３遮断剤を使用するＴ細胞阻害により、安全性プロファイルを増大させ、かつＴ細胞介在性の炎症及び自己免疫疾患の治療における有効性を増大させることができる。
【０００６】
Ｋｖ１．３は、体重増加の調節及びインスリン感受性の改善に機能し得る。Ｋｖ１．３欠損マウスは、体重増加の低減、高インスリン感受性、及び低血糖値を示す（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５５１〜９，２００３）。Ｋｖ１．３遮断剤は、骨格筋及び脂肪組織において細胞表面でのグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の発現を増加させ、並びに正常マウス及びｏｂ／ｏｂ肥満マウスにおいてインスリン感受性を増大させ、かつｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて初代脂肪細胞におけるグルコースの取り込みを増加させることが示されている（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：３１１２〜７，２００４）。ヒトでは、Ｋｖ１．３遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）はインスリン感受性の低下並びに耐糖能障害に関連付けられている（Ｔｓｃｈｒｉｔｔｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ９１：６５４〜８，２００６）。
【０００７】
Ｋｖ１．３は、血管形成などの血管手術後の患者における再狭窄などといった、平滑筋増殖性についての障害に強く関与する場合がある。Ｋｖ１．３の発現は、ヒト及びマウス平滑筋細胞の増殖時に増加している。Ｋｖ１．３遮断剤は、生体外ヒト静脈サンプルにおいて、カルシウムの流入を阻害し、平滑筋細胞の遊走を低下させ、新生内膜過形成を阻害する（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ８９：２８２〜９，２０１１）。
【０００８】
Ｋｖ１．３チャネルが、腫瘍細胞（Ｂｉｅｌａｎｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ９：９０４〜１４，２００９）、小膠細胞（Ｋｈａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８０：Ｃ７９６〜８０６，２００１）などの数多くの細胞種の活性化及び／又は増殖、並びに神経前駆細胞の分化（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０：５０２０〜７，２０１０）に関与することを示すエビデンスが増加しており、Ｋｖ１．３遮断剤は、神経炎症及び神経変性疾患、並びに癌の治療に有効である可能性があることが示唆されている。
【０００９】
様々な生物により産生される毒素ペプチドは、イオンチャネルを標的とするよう進化している。強力にかつ選択的にイオンチャネル及び受容体を標的とする低分子量の生理活性毒素ペプチド又は「毒素」に富んだ資源として提供され得る毒液を産生する生物のいくつかの例としてはヘビ、サソリ、クモ、ハチ、カタツムリ、イソギンチャク、昆虫類、クモ綱、刺胞動物、爬虫類、及び軟体動物が挙げられる。ほとんどの場合、これらの毒性ペプチドは、チャネルポアに結合してイオン透過経路を物理的に塞ぐことによる、又はポアの外部領域（例えば、電位センサードメイン）に結合してチャネル機能に拮抗することによる、イオンチャネルの強力なアンタゴニスト又は阻害剤として進化している。毒性ペプチドは、典型的にはアミノ酸約２０〜８０個程度の大きさであり、特徴的なジスルフィド結合対を備えており、ジスルフィド結合及びペプチドフォールディングをもとに数多くのスーパーファミリーに分類することができる。選択性などの特性が改良されるよう数多くの毒液毒素が設計されている（Ｋｉｎｇ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １１：１４６９〜８４，２０１１；Ｅｓｃｏｕｂａｓ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ６：２２１〜４，２００９）。
【００１０】
Ｋｖ１．３遮断を実証する毒液ペプチドとしては、ＳｈＫ、ＯｄＫ２、ＯｓＫ１、マルガトキシン、カリオトキシンなどが挙げられる（Ｃｈａｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２５：２８０〜９，２００４を参照されたい）。Ｋｖ１．３遮断剤ＯｄＫ２及びＯｓＫ１（α−ＫＴｘ３．７）は、それぞれ、オドントブタス・ドリエ（Odontobuthus doriae）及びオルトキルス・スクロビキュロサス（Orthochirus scrobiculosus）の毒液に由来し、α−ＫＴｘ３サソリ毒ファミリーのメンバーと相同である（Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔｔａｌｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ５１：１４２４〜３０，２００８；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８５（Ｐｔ  １）：９５〜１０４，２００５；国際特許公報出願公開第ＷＯ２００６／００２８５０号）。ＯｓＫ１（α−ＫＴｘ３．７）は、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．１及びＫｖ１．２チャネルを強力に遮断し、かつＫＣａ３．１チャネルを中程度に遮断することが報告されている（Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８５（Ｐｔ  １）：９５〜１０４，２００５）。ＯｄＫ２（α−ＫＴｘ３．１１）は、Ｋｖ１．３を遮断するものの、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、及びＫｖ１．６に対しては活性を示さない（Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔｔａｌｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ５１：１４２４〜３０，２００８；Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｍａｒ  ２９）。
【００１１】
これまでに、ＯｓＫ１及びＳｈＫなどの、効力、選択性、及び／又は半減期が改良されるよう設計された毒性ペプチドが報告されている（国際特許出願公開第ＷＯ２００６／００２８５０号；国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０４２１５１号；国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／１１６１５６号）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
Ｔ細胞介在性炎症などのＫｖ１．３−介在性疾患、並びに狼瘡及び多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療処置のため、より強力であり、選択的なＫｖ１．３遮断剤が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、
（ｉ）位置１０（Ｇ１０Ｉ）のグリシンがイソロイシンに置換されており、所望により１、２、３、４、５、６又は７つの追加の置換を有する、配列番号１に示す配列、又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも８０％同一であり、配列番号１と少なくとも８０％同一であり、Ｇ１０Ｉ置換を更に含むアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する、Ｋｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストを提供する。
【００１４】
本発明は、配列番号５５又は８６の配列を含むＫｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストも提供する。
【００１５】
本発明は、本発明のペプチドアンタゴニストを含む融合タンパク質も提供する。
【００１６】
本発明は、本発明のペプチドアンタゴニスト又は融合タンパク質をコードしている単離ポリヌクレオチドも提供する。
【００１７】
本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
【００１８】
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００１９】
本発明は、本発明の宿主細胞を培養すること、宿主細胞により発現されたアンタゴニスト又は融合タンパク質を回収すること、を含む、本発明のアンタゴニスト又は融合タンパク質を製造する方法も提供する。
【００２０】
本発明は、本発明のアンタゴニスト又は融合タンパク質と、製薬上許容され得る担体と、を含む、医薬組成物も提供する。
【００２１】
本発明は、望ましくないＴ細胞活性化に関連する状態を有する対象において、Ｔ細胞の活性化を抑制する方法も提供し、方法は、Ｔ細胞の活性化を抑制するのに有効な量の本発明のアンタゴニスト又は融合タンパク質を対象に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】天然のＯｄＫ２（配列番号１）及びＯｓＫ１（配列番号２）（図中ＯｓＫ−１として示す）のアミノ酸配列のアラインメントである。システイン残基を灰色でハイライトしている。ジスルフィド結合及びシステイン対を示す。ＯｄＫ２及びＯｓＫ１間で異なっている９つの残基を黒色でハイライトしている。
【図２Ａ】ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）の、Ｋｖ１．３  Ｅ３Ｃ細胞に対する結合（実線）、１０倍過剰量のＳｈＫの存在下でのＫｖ１．３  Ｅ３Ｃ細胞に対する結合（灰色破線）、及びＫｖ１．５に対する結合（陰性対照細胞；灰色点線）。結合は、フローサイトメトリーを用い抗ヒトＦｃ−Ｃｙ５により検出した。幾何的平均蛍光強度（Geometric mean fluorescence intensity）（ＧＭＦＩ）のヒストグラムを重ねたものとしてデータを示す（Ｇｅｏｍ．Ｍｅａｎ，Ｒｅｄ  Ａ：Ｃｙ５）。
【図２Ｂ】ＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）の、Ｋｖ１．３  Ｅ３Ｃ細胞に対する結合（実線）、１０倍過剰量のＳｈＫの存在下でのＫｖ１．３  Ｅ３Ｃ細胞に対する結合（灰色破線）、及びＫｖ１．５に対する結合（陰性対照細胞；灰色点線）。結合は、フローサイトメトリーを用い抗ヒトＦｃ−Ｃｙ５により検出した。幾何的平均蛍光強度（Geometric mean fluorescence intensity）（ＧＭＦＩ）のヒストグラムを重ねたものとしてデータを示す（Ｇｅｏｍ．Ｍｅａｎ，Ｒｅｄ  Ａ：Ｃｙ５）。
【図３】ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）（▼）によるメモリーＴ細胞増殖の阻害。各データ点は、３連の反応の平均±ＳＤである。陰性対照ＩｇＧ４  Ｆｃ（○）はＴ細胞の増殖を阻害しなかった。
【図４Ａ−１】アミノ酸配列及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図４Ａ−２】アミノ酸配列及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図４Ａ−３】アミノ酸配列及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図４Ａ−４】アミノ酸配列及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図４Ｂ−１】Ｋｖ１．３及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図４Ｂ−２】Ｋｖ１．３及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図４Ｂ−３】Ｋｖ１．３及びＫｖ１．１を発現している細胞を用いる結合及びタリウム流入アッセイにおいて求められた、ペプチド変異体融合タンパク質の活性及び選択性。
【図５Ａ】単一の１００ｎＭ濃度の精製ＯｄＫ２キメラＦｃ融合タンパク質によるＴ細胞活性化阻害。ＫＶ１Ｂ０３（■）は、ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２  Ｆｃ融合体）（□）と同一である。
【図５Ｂ】ＫＶ１Ｄ２６１による濃度依存的なＴ細胞活性化阻害陰性対照ＩｇＧ４  Ｆｃは、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生を阻害しなかった。
【図５Ｃ】変異体を選択する際のＫｖ１．３  Ｅ３Ｃ細胞に対する結合とＴ細胞阻害との相関。
【図６−１】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質ライブラリの活性。Ｃ末端延長部のアミノ酸配列、及び得られる延長されたｐ２６１アミノ酸配列を、結合及びタリウム流入アッセイにおける活性とともに示す。
【図６−２】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質ライブラリの活性。Ｃ末端延長部のアミノ酸配列、及び得られる延長されたｐ２６１アミノ酸配列を、結合及びタリウム流入アッセイにおける活性とともに示す。
【図６−３】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質ライブラリの活性。Ｃ末端延長部のアミノ酸配列、及び得られる延長されたｐ２６１アミノ酸配列を、結合及びタリウム流入アッセイにおける活性とともに示す。
【図６−４】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質ライブラリの活性。Ｃ末端延長部のアミノ酸配列、及び得られる延長されたｐ２６１アミノ酸配列を、結合及びタリウム流入アッセイにおける活性とともに示す。
【図６−５】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質ライブラリの活性。Ｃ末端延長部のアミノ酸配列、及び得られる延長されたｐ２６１アミノ酸配列を、結合及びタリウム流入アッセイにおける活性とともに示す。
【図６−６】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質ライブラリの活性。Ｃ末端延長部のアミノ酸配列、及び得られる延長されたｐ２６１アミノ酸配列を、結合及びタリウム流入アッセイにおける活性とともに示す。
【図７Ａ−１】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質の特性評価。
【図７Ａ−２】ｐ２６１  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質の特性評価。
【図７Ｂ】ｐ５７９  Ｃ末端延長ＨＳＡ融合タンパク質の特性評価。
【図８−１】選択されたＯｄＫ２変異体融合タンパク質の特性。
【図８−２】選択されたＯｄＫ２変異体融合タンパク質の特性。
【図９】ミニブタにおけるＫｖ１Ｄ２６１＿３４の薬物動態。
【図１０】ミニブタへのＫＶ１Ｄ２６１＿３４の生体内投与後のリンパ細胞のＩＬ１７−Ａ分泌の生体外阻害。
【図１１】抗原暴露後１０日目の遅発性過敏症（ＤＴＨ）モデルミニブタの流入領域リンパ節から得られる細胞数。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）全ての刊行物は、参照によりあたかもそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書に援用するものである。
【００２４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
【００２５】
別途記載のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法が本明細書に記載される。
【００２６】
用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。約８０個未満のアミノ酸からなるポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク質」と呼ばれる場合もある。
【００２７】
用語「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
【００２８】
用語「相補配列」は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第２の単離ポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２９】
用語「ベクター」は、生物系内で複製され得る、又はこうした系間を移動し得るポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
【００３０】
用語「発現ベクター」は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの翻訳を誘導するために使用することができるベクターを意味する。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「野生型ＯｄＫ２」又は「ＯｄＫ２」又は「天然のＯｄＫ２」は、配列番号１（ＧＶＰＴＤＶＫＣＲＧＳＰＱＣＩＱＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ）に示す配列を有する、サソリオドントブタス・ドリエ（Odontobuthus doriae）ＯｄＫ２ポリペプチドを指す。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「野生型ＯｓＫ１」又は「ＯｓＫ１」又は「天然のＯｓＫ１」は、配列番号２（ＧＶＩＩＮＶＫＣＫＩＳＲＱＣＬＥＰＣＫＫＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ）に示す配列を有する、サソリ・オルトキルス・スクロビキュロサス（Orthochirus scrobiculosus）ＯｓＫ１ポリペプチドを指す。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「変異体」又は「ＯｄＫ２変異体」は、１つ以上の改変、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失により配列番号１の野生型ＯｄＫ２ポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。
【００３４】
本明細書を通して、ＯｄＫ２変異体の残基に対する付番は、配列番号１によるものである。例えば、本明細書において、「Ｇ１０」は、配列番号１の残基位置１０のグリシン残基を指す。したがって、ＯｄＫ２  Ｇ１０Ｉは、位置１０のグリシンがイソロイシンで置換されているＯｄＫ２変異体を指し、ＯｄＫ２  Ｇ１０Ｉ、Ｐ１２Ｒは、位置１０のグリシンがイソロイシンで置換されており、かつ位置１２のプロリンがアルギニンで置換されているＯｄＫ２変異体を指す。
【００３５】
任意の所与のアミノ酸残基又はヌクレオチド残基の位置が、配列中の成分の実際の付番位置ではなく、選択されたアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の同じ又は等価の部位を参照することにより表記されるとき、所与のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の付番は、選択されたアミノ酸又はポリヌクレオチド配列に「対応」、又は「関連」する。したがって、例えば、所与のポリペプチド配列中の所与のアミノ酸位置の付番は、参照配列として使用された選択されたポリペプチド配列中の同じ又は等価なアミノ酸位置に対応する。
【００３６】
本明細書において、「等価の位置」（例えば、「等価のアミノ酸位置」又は「等価の核酸位置」又は「等価の残基位置」）は、本明細書に記載のものなどのアラインメントアルゴリズムを用い最適に整列させたときに、試験ポリペプチド（又は試験ポリヌクレオチド）配列が、参照ポリペプチド（又は参照ポリヌクレオチド）配列の対応する位置と整列する位置（アミノ酸位置又は核酸位置又は残基位置など）として定義される。試験ポリペプチドの等価なアミノ酸位置が参照ポリペプチドの対応する位置と同じ位置付番をなされる必要はなく、同様にして、試験ポリヌクレオチドの等価な核酸位置が参照ポリヌクレオチドの対応する位置と同じ位置付番をなされる必要はない。
【００３７】
配列対について想定され得る類似性スコアが最も高くなるよう、所定のパラメーター、すなわち、所定のアミノ酸置換マトリックス、ギャップ開始ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）、並びにギャップ伸長ペナルティを利用して整列させたときに、２つのポリペプチド配列は「最適に整列」されている。多くの場合、ポリペプチド配列のアラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴＰなど）にはＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（２２）：１０９１５〜１０９１９）がデフォルトのスコア行列置換マトリックスとして使用される。整列させた配列のうち１つに単一のアミノ酸ギャップが導入される場合にはギャップ開始ペナルティが課され、ギャップ伸長ペナルティは、ギャップ中の各残基に課される。別途記載のない限り、本明細書において使用されるアラインメントパラメーターは、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列、ギャップ開始ペナルティ＝１１、及びギャップ伸長ペナルティ＝１、である。アラインメントスコアは、各配列の、アラインメントが開始及び終了するアミノ酸位置（例えば、アラインメントウインドウ）をもとに定義され、所望により、想定され得る類似性スコアが最も高くなるよう１つのギャップ又は複数のギャップが１つ又は両方の配列に挿入される。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「Ｋｖ１．３」（ＫＣＮＡ３、ＨＰＣＮ３、ＨＧＫ５、ＨｕＫＩＩＩ、又はＨＬＫ３としても公知）は、ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２２００１及び配列番号４１８に示す配列を有する、公知のヒトカリウム電圧依存性チャネルサブファミリーＡメンバー３を指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、「Ｋｖ１．３のアンタゴニスト」又は「アンタゴニスト」は、Ｋｖ１．３の機能を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％阻害する又は遮断する本発明のＯｄＫ２変異体又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質を指す。野生型ＯｄＫ２のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
【００４０】
本明細書で使用するとき、「融合タンパク質」は、１つ以上の親ポリペプチド又はペプチドに由来するポリペプチド又はペプチド成分を含有するタンパク質を指す。
【００４１】
本明細書で使用するとき、「半減期延長部分」は、ＯｄＫ２変異体と複合させたときに、得られるＯｄＫ２変異体融合タンパク質の生体内半減期を、そのような操作を行っていないペプチドと比較して延長させる、分子又はタンパク質又はドメインを指す。
【００４２】
本明細書で使用するとき、「結合率」又は「結合率（％）」は、Ｋｖ１．３又はＫｖ１．１チャネルを発現している細胞を使用するＦＡＣＳアッセイから得られる対照と比較したときの、ＯｄＫ２変異体融合タンパク質の幾何的平均蛍光強度（Ｇｅｏ．ＭＦＩ又はＧＭＦＩ）の比を指す。
【００４３】
本明細書で使用するとき、「結合選択性」は、Ｋｖ１．１について得られる結合率％に対する、Ｋｖ１．３について得られる結合率％の比を指す。
【００４４】
本明細書で使用するとき、「選択」又は「選択性」は、ＯｄＫ２変異体融合タンパク質又はＯｄＫ２変異体に関するＫｖ１．３のＩＣ５０値に対する、Ｋｖ１．１のＩＣ５０値の比を指す。選択性は様々な手法、例えば、本明細書に記載される通りの電気生理学的なパッチクランプアッセイ又はタリウム流入アッセイを用い評価することができる。選択性は、測定に選択されるアッセイに応じ、わずかに変化させることができる。
【００４５】
Ｋｖ１．３遮断ペプチドＯｄＫ２（配列番号１）及びＯｓＫ１（配列番号２）は、α−ＫＴｘ３サソリ毒ファミリーのメンバーであり、アミノ酸配列中の第９番目の位置が異なっている。ＯｄＫ２及びＯｓＫ１は、いずれもアミノ酸３８個分の大きさであり、３つのジスルフィド結合によりＣｙｓ８〜Ｃｙｓ２８、Ｃｙｓ１４〜Ｃｙｓ３３、及びＣｙｓ１８〜Ｃｙｓ３５対がそれぞれ安定化されている（Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔｔａｌｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ５１：１４２４〜３０，２００８；Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３８５（Ｐｔ  １）：９５〜１０４，２００５；国際特許公報第ＷＯ２００６／００２８５０号）。折りたたまれたペプチドは、３本のストランドからなる抗パラレルβ−シートにジスルフィド結合により近接して保持されたα−ヘリックスを形成する。ＯｄＫ２及びＯｓＫ１は、ポア領域の外部結合部位に結合し、リシン２７を水充填ポアに挿入し、イオン流を閉鎖させることによりチャネル機能を阻害するポア遮断剤である。ＯｓＫ１（α−ＫＴｘ３．７）は、それぞれＩＣ５０で０．０１４ｎＭ、０．６ｎＭ、５．４ｎＭ、及び２２５ｎＭで、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．１及びＫｖ１．２チャネルを強力に遮断し、ＫＣａ３．１チャネルをある程度遮断することが報告されている（Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８５（Ｐｔ  １）：９５〜１０４，２００５）。ＯｄＫ２（α−ＫＴｘ３．１１）は、アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞においてＫｖ１．３を遮断すると、ＩＣ５０が７．２ｎとなることが報告されており、及び試験したその他のＫｖ１．ｘサブタイプ（Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５、及びＫｖ１．６）に対しては活性を有しないことが報告されている（Ａｂｄｅｌ−Ｍｏｔｔａｌｅｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｎ  ５１：１４２４〜３０，２００８）。これらのデータは、ＯｓＫ１は非常に強力であるものの、十分なサブタイプ選択性を欠如しているのに対し、ＯｄＫ２は明らかに選択性であるものの効力は高くないことを示す。
【００４６】
本発明は、Ｋｖ１．３を阻害する単離ＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質、それらをコードしているポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本発明のＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、選択性を保持している及び／又は増強されている親分子と比較したときに、Ｋｖ１．３に対してより強力である。本発明のポリペプチドは、Ｋｖ１．３活性によりカリウム電流、タリウム流及び／又はＴ細胞活性化を阻害することから、Ｔ細胞の活性化に関連する、炎症及び自己免疫疾患などの様々な状態の治療に有用であり得る。
【００４７】
アンタゴニストペプチド
本発明は、
（ｉ）位置１０（Ｇ１０Ｉ）のグリシンがイソロイシンに置換されており、所望により１、２、３、４、５、６又は７つの追加の置換を有する、配列番号１に示す配列、又は
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも８０％同一であり、Ｇ１０Ｉ置換を更に含むアミノ酸配列、を含むアミノ酸配列を有する、Ｋｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストを提供する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、単離ペプチドアンタゴニストは、配列番号１の配列に対して７未満、６未満、５未満、４未満、３未満、又は２未満の置換を有する配列を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、単離ペプチドアンタゴニストは、配列番号１に対して、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一性の配列を含む。
【００５０】
そのため、いくつかの実施形態では、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、又は１１０のいずれかの配列を含み得る。置換Ｇ１０Ｉは、Ｋｖ１．３についての選択性の改良及び／又は親和性の改良に関連する。
【００５１】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｋｖ１．３のアンタゴニストは、配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２６）を含み、
ａ）Ｘａａ１は、Ｉ又はＴ、Ｑ又はＥであり、
ｂ）Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
ｃ）Ｘａａ３は、Ｋ又はＲ、Ｅ、Ａ又はＱであり、
ｄ）Ｘａａ４は、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｋ又はＡであり、
ｅ）Ｘａａ５は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ又はＨであり、
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有する。例えば、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号３、１３、２１、２２、２４、２６、２９、３０、３２、３４、３８、３９、４２〜４６、４９、５１、５９、６３、６５、６９、７１、７３、７６、７８、８１〜８３、８５、８７、８９、９２、９６、１０１、１０３、１０４、及び１０８のアミノ酸配列を含み得る。
【００５２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｋｖ１．３アンタゴニストは、配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２７）を含み、
Ｘａａ１は、Ｉ又はＴであり、
Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
Ｘａａ３は、Ｋ又はＲであり、
Ｘａａ４は、Ｉ又はＥであり、並びに
Ｘａａ５は、Ｅ又はＫであり、並びに
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有する。例えば、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号３、２２、３４又は４２のアミノ酸配列を含み得る。
【００５３】
図４Ａを参照することにより理解される通り、本発明のペプチドアンタゴニストは、Ｃ８〜Ｃ２８、Ｃ１４〜Ｃ３３、及びＣ１８〜Ｃ３５間の天然のジスルフィド結合を保持する。本節及び本願に記載の本発明の例示的なアンタゴニストは、Ｋｖ１．１よりもＫｖ１．３について選択性を大幅に増強でき、例えば、配列番号１と比較して、選択性が１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は少なくとも７０００倍改良されている。
【００５４】
融合タンパク質
本発明のアンタゴニストは、本発明のアンタゴニストペプチドを含む単離融合タンパク質とすることができる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１に対し少なくとも８０％同一性を有し、かつ配列番号１に対するＧ１０Ｉ置換を含む配列を含む。
【００５５】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、半減期延長部分と複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含み、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号１に示す配列を含み、置換Ｇ１０Ｉを更に含み、所望により、追加の置換を１、２、３、４、５、６又は７有する。
【００５６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、半減期延長部分と複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含み、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含み、残基位置１０において、グリシンのイソロイシンへの置換を更に含む（Ｇ１０Ｉ）。
【００５７】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、半減期延長部分と複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含み、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２６）を含み、
Ｘａａ１は、Ｉ又はＴ、Ｑ又はＥであり、
Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
Ｘａａ３は、Ｋ又はＲ、Ｅ、Ａ又はＱであり、
Ｘａａ４は、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｋ又はＡであり、
Ｘａａ５は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ又はＨであり、
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有する。
【００５８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号３、１３、２１、２２、２４、２６、２９、３０、３２、３４、３８、３９、４２〜４６、４９、５１、５９、６３、６５、６９、７１、７３、７６、７８、８１〜８３、８５、８７、８９、９２、９６、１０１、１０３、１０４、及び１０８のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、アンタゴニストは、半減期延長部分と複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含む単離融合タンパク質であり、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２７）を含み、
Ｘａａ１は、Ｉ又はＴであり、
Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
Ｘａａ３は、Ｋ又はＲであり、
Ｘａａ４は、Ｉ又はＥであり、並びに
Ｘａａ５は、Ｅ又はＫであり、並びに
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有する。
【００６０】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号３、２２、３４、又は４２のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｃ末端延長部は、配列番号１２３〜２６８のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、Ｃ末端延長部は、配列番号１２８、１４３、１５５、１８８、２０６〜２１０、２１２、２１４、２１６、２１９、２２３、２２４、２２７、２３０、２３２〜２３５、２３７、２３９、２４０、２４３、２５２、２６１〜２６３、又は２６８のアミノ酸配列を含む。
【００６３】
本発明のＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、配列番号４２５のＫＶ１Ｃ２（親ＫＶ１Ｃ２融合タンパク質）などの天然のＯｄＫ２配列の融合タンパク質と比較してより強力でありかつ選択的である。本発明の例示的な融合タンパク質は、リンカーＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳ（配列番号１１６）を介しヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と複合させた配列番号３、２２、３４又は４２のＯｄＫ２変異体ペプチドを含むものである。
【００６４】
ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によると、全細胞パッチクランプ試験において、ヒトＫｖ１．３を形質移入したＣＨＯ細胞では、親ＫＶ１Ｃ２融合タンパク質は、カリウム電流の阻害についてＩＣ５０が約１３ｎＭ（１．３×１０−８Ｍ）であり、かつＫｖ１．３を発現している細胞は、タリウム流の阻害についてＩＣ５０値が約２１．４ｎＭ（２．１４×１０−８Ｍ）である。『材料及び方法』に記載のパッチクランプアッセイにおけるＩＣ５０値が約１３ｎＭ（１．３×１０−８Ｍ）以下、例えば１．０×１０−８Ｍ、５．０×１０−９Ｍ、１．０×１０−９Ｍ、５．０×１０−１０Ｍ、１．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−１１Ｍ、１．０×１０−１１Ｍ、５．０×１０−１２Ｍ、１．０×１０−１２Ｍ以下であるとき、又は『材料及び方法』に記載のタリウム流アッセイにおけるＩＣ５０値が約２１．４ｎＭ（２．１４×１０−８Ｍ）以下、例えば、１．０×１０−８Ｍ、５．０×１０−９Ｍ、１．０×１０−９Ｍ、５．０×１０−１０Ｍ、１．０×１０−１０Ｍ、５．０×１０−１１Ｍ、１．０×１０−１１Ｍ、５．０×１０−１２Ｍ、１．０×１０−１２Ｍ以下であるとき、本明細書に記載の本発明のＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、「同程度に強力又はより強力な」Ｋｖ１．３阻害剤である。例示的な融合タンパク質の、パッチクランプ及びタリウム流についてのＩＣ５０値を図８に示す。
【００６５】
本明細書で記載される通りの本発明のＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質はＫｖ１．３について選択性である。選択性は、ＯｄＫ２変異体融合タンパク質又はＯｄＫ２変異体について、Ｋｖ１．３についてのＩＣ５０値に対するＫｖ１．１についてのＩＣ５０値の比を用い、Ｋｖ１．１に対し評価することができる。更に、標準法を用い、Ｋｖ１．２、Ｋｖ１．４、Ｋｖ１．５などのその他のＫｖチャネルに対して、並びにｈＥＲＧ、ＫＣａ３．１、又はＮａｖ１．５に対して選択性を試験できる。本明細書に記載の本発明の例示的なＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、Ｋｖ１．１よりもＫｖ１．３に対し顕著な選択性を有し、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は少なくとも７０００倍の選択性を有し得る。親Ｋｖ１．２融合タンパク質は、ヒトＫｖ１．１と比較したときに、ヒトＫｖ１．３に対して６８倍選択性であり、したがって、本明細書に記載の通りの本発明の例示的なＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、選択性が大幅に増強されており、例えば、選択性は、Ｋｖ１．２融合タンパク質と比較して約約１．５、３、４．５、６、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又は少なくとも１０５倍改良されている。配列番号４２６におけるＸａａ５に相当する位置にグルタミン酸が存在すると選択性が改良されることが観察されている。
【００６６】
天然のＯｄＫ２における残基位置４、５、９、１５、及び１６（配列番号１の天然のＯｄＫ２ペプチドによる残基付番）を置換することで、得られる変異体及びそれらの融合タンパク質の効力及び選択性の両方を改良することができる。上記の全細胞パッチクランプ試験又はタリウム流アッセイにおいて、得られるＯｄＫ２変異体又はその融合タンパク質が、それぞれ約１３ｎＭ（１．３×１０−８Ｍ）又は約２１．４ｎＭ（２．１４×１０−８）のＩＣ５０を保持し、かつＫｖ１．３について、Ｋｖ１．１よりも少なくとも１００倍の選択性を有する（上記の通りのパッチクランプ法を用い得られるＩＣ５０値の比として表される）ならば、残基部分は任意のアミノ酸残基により置換することができる。選択された各位置を多様化させるのに使用することのできるアミノ酸セットとしては、位置４ではアミノ酸残基ＴＩＱＥ、位置５ではＮＤ、位置９ではＲＥＡＫＱ、位置１５ではＥＬＤＩＱＨＶＫＡ、及び位置１６ではＫＥＬＱＤＶＨが挙げられる。位置１５のグルタミン酸（Ｅ）は、Ｋｖ１．３についての選択性の増大に関連する。置換Ｇ１０Ｉは、Ｋｖ１．３に対する選択性の改良及び／又は親和性の改良に関連する（配列番号１に従う残基付番）。上記のアミノ酸セットを用いるＯｄＫ２及びその融合タンパク質の多様化の結果、天然のペプチド又はその融合タンパク質と比較して、Ｋｖ１．３について改良された結合親和性及び改良された結合選択性を示す変異体が得られる。別の多様化スキームでは、それぞれの選択された位置の多様化に使用することのできるアミノ酸セットとしては、位置４ではアミノ酸残基ＩＴ、位置５ではＮＤ、位置９ではＫＲ、位置１５ではＩＥ、及び位置１６ではＥＫが挙げられる。得られる変異体及び／又はそれらの融合タンパク質は、公知のアッセイ及び本願に記載の試験を使用し、選択性、効力、結合親和性、及び結合選択性について評価できる。効力及び選択性の改良された例示的なＯｄＫ２変異体及びそれらの融合タンパク質は、配列番号３、２２、３４、及び４２の変異体、並びにそれらのヒト血清アルブミン又はＦｃ融合タンパク質である。改良された結合親和性及び結合選択性（％）を備える例示的なＯｄＫ２変異体は、配列番号３、１３、２１、２２、２４、２６、２９、３０、３２、３４、３８、３９、４２〜４６、４９、５１、５９、６３、６５、６９、７１、７３、７６、７８、８１〜８３、８５、８７、８９、９２、９６、１０１、１０３、１０４、及び１０８の変異体である。
【００６７】
追加のＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質は本発明の範囲内である。例えば、得られるＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質が、Ｋｖ１．３に対し、親分子と比較して同様の選択性及び効力を保持するのであれば、天然のＯｄＫ２ペプチドに対し位置４、５、９、１５及び１６以外の位置に置換を行うことができる。例示的な改変は、例えば、結果として親分子と同様の特性を備えるＯｄＫ２変異体融合タンパク質を生じる保存的な置換である。保存的置換とは、側鎖において関連したアミノ酸ファミリー間で起こる置換である。遺伝的にコードされるアミノ酸は、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）、（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び（４）電荷を持たない極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、の４群に分類され得る。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは、時に、芳香族アミノ酸として一緒に分類される。あるいは、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（２）塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）脂肪族性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）（セリン及びスレオニンは、所望により脂肪族ヒドロキシル基として別にグループ化される）、（４）芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（５）アミド性アミノ酸（アスパラギン、グルタミン）、並びに（６）硫黄含有性アミノ酸（システイン及びメチオニン）にグループ化することができる（Ｓｔｒｙｅｒ（ｅｄ．），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８１）。異なる分類のアミノ酸間のアミノ酸残基の置換により、ＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質の特性を改良するなどといった非保存的な置換を天然のＯｄＫ２ペプチドに対し行うことができる。ポリペプチド又はその断片のアミノ酸配列の変化が機能相同体をもたらすかは、本明細書に記載のアッセイを用いて、修飾されていないポリペプチド又は断片と同様の手法で、この修飾ポリペプチド又は断片が応答を生じる能力を評価することによって、容易に判定され得る。１つ以上の置換が生じるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、同様に容易に試験することができる。結合又は結合特異性の増強をもたらす置換を有する、例示的な追加のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、配列番号４〜１２、１４〜２０、２３、２５、２７、２８、３１、３３、３５〜３７、４０、４１、４７、４８、５０、５２〜５８、６０〜６２、６４、６６〜６８、７０、７２、７４、７５、７７、７９、８０、８４、８６、８８、９０、９１、９３〜９５、９７〜１００、１０２、１０５〜１０７、１０９及び１１０のアミノ酸配列を有する。
【００６８】
本明細書に記載の通りのＯｄＫ２変異体（すなわち、本発明によるアンタゴニスト）を、半減期延長部分と融合させて、本発明の融合タンパク質を形成させることができる。使用できる例示的な半減期延長部分としては、公知のヒト血清アルブミン、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、チロキシン結合グロブリン（ＴＧＢ）、アルブミン結合ドメイン、又はＦｃ若しくはこれらの断片が挙げられる。生物学的に好適なポリマー又はコポリマー、例えば、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子など（ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００など）、デキストラン、ポリリジン、異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、例えば、ラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、及びドコサン二酸など、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）を使用することもできる。
【００６９】
別の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質の半減期延長部分は、ヒト血清アルブミン、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００７０】
別の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質の半減期延長部分はヒト血清アルブミンである。
【００７１】
別の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質の半減期延長部分は、リンカーによりＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストに複合されている。
【００７２】
別の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質のリンカーは、配列番号１１２〜１２２のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
半減期延長部分は、本発明のＯｄＫ２変異体ペプチドアンタゴニストに直接複合させることができ、又はリンカーにより間接的に複合させることができる。本明細書に記載の通り、本発明の融合タンパク質に使用できる例示的なペプチドリンカーは、配列番号１１２〜１２２のアミノ酸配列を有するリンカーである。非ペプチド性半減期延長部分は、公知の化学的カップリング法を用い直接ＯｄＫ２変異体に複合させることもできる。例えば、ＯｄＫ２変異体は、公知の方法及び米国特許第ＵＳ８０４３８２９号に記載の方法を用いペグ化できる。ペプチド又はタンパク質半減期延長部分は、以下に詳細に説明する通り、融合タンパク質をコードしている核酸の翻訳中にペプチドに結合させることができる。
【００７４】
半減期延長部分を組み込んだＯｄＫ２変異体は、幾種類かの公知のアッセイ法により機能について比較することもできる。例えば、ＰＥＧ又はヒト血清アルブミンを結合させたＯｄＫ２変異体の薬物動態学的特性は、公知の生体内モデルで評価することもできる。
【００７５】
本明細書に記載の通りの本発明のＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分をＯｄＫ２変異体のＣ末端に組み込んだ後、この延長したペプチドを半減期延長部分と複合させるよう設計することもできる。何らかの理論に束縛されることを望むものではないが、融合タンパク質中のＯｄＫ２変異体ペプチドのＣ末端を延長させることで、ペプチドと、Ｋｖ１．３チャネルの細胞外ループとの結合相互作用が増大し、かつ効力が増強されるものと考えられている。Ｃ末端延長ペプチド部分を備える例示的なＯｄＫ２融合タンパク質を図６、図７Ａ、及び図８に示す。Ｃ末端延長ペプチド部分を備える融合タンパク質は、典型的には、延長部分を備えない相当する融合タンパク質と比べてより強力なＫｖ１．３阻害剤となる。本明細書に記載の、Ｃ末端を延長させた例示的な変異体のＩＣ５０値は、以下に記載のタリウム流アッセイで測定したときに、約１×１０−８  Ｍ以下、例えば約１×１０−９  Ｍ以下、約１×１０−１０  Ｍ以下、約１×１０−１１  Ｍ以下、又は１×１０−１２  Ｍ以下である。例示的なＣ末端延長部分を、配列番号１２３〜２６８に示す。
【００７６】
別の実施形態では、本発明の単離融合タンパク質は、
配列番号３、２２、３４、又は４２のＫｖ１．３のペプチドアンタゴニスト、
所望により配列番号１２８、１４３、１５５、１８８、２０６〜２１０、２１２、２１４、２１６、２１９、２２３、２２４、２２７、２３０、２３２、２３５、２３７、２３９、２４０、２４３、２５２、２６１〜２６３、又は２６８のＣ末端延長部分、
配列番号１１６又は配列番号１１９のリンカー、
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
【００７７】
別の実施形態では、本発明の単離融合タンパク質は、
配列番号４２のＫｖ１．３のペプチドアンタゴニスト、
配列番号１１６のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
【００７８】
別の実施形態では、本発明の単離融合タンパク質は、
配列番号４２のＫｖ１．３のペプチドアンタゴニスト、
配列番号２０９のＣ末端延長部分、
配列番号１１６のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
【００７９】
別の実施形態では、本発明の単離融合タンパク質は、
配列番号３のＫｖ１．３のペプチドアンタゴニスト、
配列番号２３５のＣ末端延長部分、
配列番号１１６のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
【００８０】
別の実施形態では、本発明の単離融合タンパク質は、
配列番号４２のＫｖ１．３のペプチドアンタゴニスト、
配列番号２３５のＣ末端延長部分、
配列番号１１６のリンカー、及び
半減期延長部分としてヒト血清アルブミン、を含む。
【００８１】
別の実施形態では、本明細書に記載の通りの本発明の単離融合タンパク質は、それぞれＫｖ１．１及びＫｖ１．３を形質移入した細胞におけるパッチクランプアッセイにて、選択性が、単離融合タンパク質によるＫｖ１．３のＩＣ５０に対する、単離融合タンパク質によるＫｖ１．１のＩＣ５０の比として測定されるときに、ヒトＫｖ１．１よりもヒトＫｖ１．３に対して少なくとも１００倍選択的である。
【００８２】
別の実施形態では、本明細書に記載の通りの本発明の単離融合タンパク質は、ヒトＫｖ１．３により形質移入した細胞におけるパッチクランプアッセイで、配列番号４２５の親ＫＶ１Ｃ２融合タンパク質に対するＩＣ５０と比較して、少なくとも約１０倍未満のＩＣ５０値でカリウム電流を阻害する。
【００８３】
別の実施形態では、本明細書に記載の通りの本発明の単離融合タンパク質は、ヒトＫｖ１．３により形質移入した細胞におけるパッチクランプアッセイで、約１．５×１０−８  Ｍ以下のＩＣ５０でカリウム電流を阻害する。
【００８４】
別の実施形態では、本明細書に記載の通りの本発明の単離融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒトＫｖ１．３により形質移入した細胞においてＩＣ５０値約２．２×１０−８  Ｍ以下でタリウム流を阻害する。
【００８５】
本発明の別の実施形態は、リンカーにより半減期延長部分に複合させたＫｖ１．３のペプチドアンタゴニストを含む単離融合タンパク質であり、Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有し、
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、配列番号３〜１１０のアミノ酸配列を含み、
Ｃ末端延長部分は、配列番号１２３〜２６８のアミノ酸配列を含み、
リンカーは、配列番号１１６又は１１９のアミノ酸配列を含み、
半減期延長部分はヒト血清アルブミンである。
【００８６】
本発明の別の実施形態は、配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２６）を含むＫｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストであり、
Ｘａａ１は、Ｉ又はＴ、Ｑ又はＥであり、
Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
Ｘａａ３は、Ｋ又はＲ、Ｅ、Ａ又はＱであり、
Ｘａａ４は、Ｉ、Ｅ、Ｌ、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｖ、Ｋ又はＡであり、
Ｘａａ５は、Ｅ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｄ、Ｖ又はＨであり、
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有する。
【００８７】
別の実施形態では、Ｋｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストは、配列番号３、１３、２１、２２、２４、２６、２９、３０、３２、３４、３８、３９、４２〜４６、４９、５１、５９、６３、６５、６９、７１、７３、７６、７８、８１〜８３、８５、８７、８９、９２、９６、１０１、１０３、１０４、及び１０８のアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、配列ＧＶＰＸａａ１Ｘａａ２ＶＫＣＸａａ３ＩＳＲＱＣＸａａ４Ｘａａ５ＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ（配列番号４２７）を含むＫｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストであり、
Ｘａａ１は、Ｉ又はＴであり、
Ｘａａ２は、Ｎ又はＤであり、
Ｘａａ３は、Ｋ又はＲであり、
Ｘａａ４は、Ｉ又はＥであり、並びに
Ｘａａ５は、Ｅ又はＫであり、並びに
Ｋｖ１．３のペプチドアンタゴニストは、所望により４つのアミノ酸からなるＣ末端延長部分を有する。
【００８９】
別の実施形態では、Ｋｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストは、配列番号３、２２、３４、又は４２のアミノ酸配列を含む。
【００９０】
本発明の別の実施形態は、配列番号３〜１１０の配列を含むＫｖ１．３の単離ペプチドアンタゴニストである。
【００９１】
本発明のＯｄＫ２変異体ポリペプチド及びそれらの融合タンパク質は、自動化ペプチド合成装置での固相ペプチド合成法などといった化学合成法により製造できる。あるいは、本発明のポリペプチドは、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得ることもできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識されるであろう。
【００９２】
ＯｄＫ２変異体の生成は、典型的には核酸レベルで行われる。ポリヌクレオチドは、所望の変異体を生成するためのオリゴヌクレオチドの生成を利用する、米国特許第ＵＳ６５２１４２７号及び米国特許第ＵＳ６６７０１２７号に記載の方法に従う化学的遺伝子合成を用い、又は標準的なＰＣＲクローニング及び変異導入法により合成できる。ＯｄＫ２変異体をコードしているポリヌクレオチドを発現用ベクターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリを生成することができる。
【００９３】
ＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、典型的には、標準的な分子生物学的アプローチにより作製される。
【００９４】
ＯｄＫ２変異体及びそれらの融合タンパク質は、本明細書に記載の方法を用い、Ｋｖ１．３を阻害する性能について試験される。例示的なアッセイは、Ｋｖ１．３を過剰発現する細胞へのタリウム流入の阻害を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して測定するアッセイである。別の例示的なアッセイは、細胞膜を透過するイオン流入の測定に、公知のパッチクランプ法及び本明細書に記載の方法を利用する電気生理学的な記録法を使用するものである。
【００９５】
本発明の別の実施形態は、本発明のＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドである。
【００９６】
本発明のポリヌクレオチドは、転写されているが翻訳されていない配列、終止シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグナルなどの少なくとも１つの非コーディング配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含み得る。これらの更なるポリヌクレオチド配列には、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチジン若しくはＨＡタグなどの公知のタグ配列をコードしてもよい。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明のアンタゴニストをコードしている他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。例示的なポリヌクレオチドは、配列番号４２９〜４３０に示す配列を含むポリヌクレオチドである。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、本発明のＯｄＫ２変異体及びそれらの融合タンパク質をコードしている単離ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において本発明のベクターによりコードされているポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウイルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどのこれらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来のものであってよい。
【００９８】
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に、このようなベクターによってコードされているポリペプチドの発現を制御、調節、誘導することができる又は可能とすることができる核酸配列要素を有する。このような要素には、転写エンハンサー結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含ませることができる。このような発現系は、当該技術分野において公知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コードしているポリペプチドを発現させる際に使用するのに適した核酸配列要素及び親ベクター配列も公知である。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発現ベクターとしては、大腸菌（E. coli）の複製起点、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子、ＣＭＶプロモーター、シグナル配列、及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が挙げられる。
【００９９】
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌（Streptococci）、ブドウ球菌（Staphylococci）、腸球菌（Enterococci）、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、シアノバクテリア（cyanobacteria）、枯草菌（B. subtilis）、及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）などの細菌細胞、例えばクリベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、担子菌類（Basidomycete）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、又はアスペルギルス（Aspergillus）などの真菌細胞、例えばドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９などの昆虫細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ＣＶ−１、ボーズ（Bowes）メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として準備することができる。細胞集団は、単離又は培養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含み得る。
【０１００】
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には公知の方法によって行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウム法による形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介による形質移入、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介による形質移入、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
【０１０１】
本発明の別の実施形態は、少なくとも１種のＯｄＫ２変異体融合タンパク質を発現させるのに十分な条件下で宿主細胞を培養する工程、並びに宿主細胞により発現された融合タンパク質を回収する工程を含む、本発明の単離融合タンパク質の製造方法である。
【０１０２】
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペプチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチドの発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては公知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を、適切に緩衝化したＤＭＥＭ培地を使用して３７℃で好気的に培養することができる一方、細菌、酵母及び他の細胞型は、ＬＢ培地中、適切な雰囲気下で３７℃で培養することができる。
【０１０３】
本発明の方法では、ＯｄＫ２変異体の発現は様々な公知の方法を用いて確認することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばＦＡＣＳ若しくは免疫蛍光技術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ若しくはＨＰＬＣの使用により確認することができる。
【０１０４】
治療方法
本発明の別の態様は、生体組織においてＫｖ１．３の活性を調節する方法であり、本方法は、Ｋｖ１．３を発現している生体組織を、Ｋｖ１．３を調節する量の本発明のＯｄＫ２変異体若しくはその融合タンパク質、又はそれらの製薬学的に許容され得る塩と接触させることを含む。
【０１０５】
本発明のＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、炎症及び自己免疫疾患、糖尿病、肥満又は癌などといった、Ｋｖ１．３介在性疾患の治療、軽減又は寛解が所望される任意の治療に利用できる。
【０１０６】
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このような動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、動物園の動物、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる。
【０１０７】
本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、炎症状態、アレルギー、及びアレルギー状態、過敏症反応、自己免疫疾患、重症感染症、及び臓器又は組織移植拒絶症などといった、Ｋｖ１．３介在性の状態の予防及び治療に有用であり得る。本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、このような治療のための薬剤の調製においても有用であり、この薬剤は、本明細書に定められる投与量で投与するために調製される。
【０１０８】
本発明の一実施形態は、望ましくないＴ細胞活性化に関連する状態を有する対象においてＴ細胞の活性化を抑制する方法であり、本発明の単離融合タンパク質を、Ｔ細胞の活性化を抑制するのに有効な量で対象に投与することを含む。
【０１０９】
Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の低減を測定するなどといった公知の方法により測定できる。本明細書で使用するとき、「Ｔ細胞の活性化を抑制する」は、本発明のＯｄＫ２変異体及びＯｄＫ２融合タンパク質がＴ細胞の活性化を少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％阻害及び低減させる能力を指す。
【０１１０】
別の実施形態では、望ましくないＴ細胞活性化に関連する状態は、炎症状態、免疫及び増殖障害、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、骨粗鬆症、ぶどう膜炎、炎症性線維症、強皮症、肺線維症、硬変、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、アレルギー、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、多発性硬化症、乾癬、接触性皮膚炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びその他の形態の狼瘡、糖尿病、１型糖尿病、肥満、癌、狼瘡、再狭窄、全身性硬化症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植片拒絶、又は移植片対宿主病である。
【０１１１】
Ｋｖ１．３チャネルは、Ｔ細胞及びＢ細胞の全てのサブセットで発現するものの、エフェクターメモリーＴ細胞及びクラススイッチしたメモリーＢ細胞は、特にＫｖ１．３に依存している（Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：７７６，２００４）。Ｋｖ１．３は、新しく１型糖尿病を発症した患者由来のＧａｄ５／インスリン特異性Ｔ細胞、ＭＳ患者由来のミエリン特異的Ｔ細胞、及び関節リウマチ患者の滑膜由来のＴ細胞（Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１７４１４−９，２００６）、肺癌標本（Ａｂｄｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２３：３３４７，２００３）及び前立腺癌細胞下部（Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  ４４６：５５９，２００３）において過剰発現している。Ｋｖ１．３遮断剤により動物モデルにおいて得られる陽性の結果は、卵白アルブミン及び破傷風トキソイドに対する過敏症モデル（Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６７：１３６９，２００５；Ｋｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７：９９，１９９９）、ラットの養子移植による実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）モデルなどの多発性硬化症モデル（Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１７４１４−９，２００６）、炎症性骨吸収モデル（Ｖａｌｖｅｒｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ  １９：１５５，２００４）、関節炎モデル（Ｂｅｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０３：１７４１４，２００６；Ｔａｒｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐｅｒ  Ｔｈｅｒａｐ  ３４２：６４２，２０１２）並びに肥満症、糖尿病及び代謝疾患（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １２：５５１，２００３；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０１：３１１２，２００４）で報告されている。
【０１１２】
本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質により治療され得る例示的なＫｖ１．３介在性の状態は、炎症状態、免疫及び増殖障害、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、骨粗鬆症、ぶどう膜炎、炎症性線維症（例えば、強皮症、肺線維症、及び硬変）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎及び炎症性腸疾患）、喘息（アレルギー性喘息を含む）、アレルギー、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、乾癬、接触性皮膚炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びその他の形態の狼瘡、糖尿病、１型糖尿病、肥満及び癌、狼瘡、再狭窄、全身性硬化症、強皮症、糸球体腎炎、シェーグレン症候群、炎症性骨吸収、移植片拒絶、及び移植片対宿主病である。
【０１１３】
特定の疾患の動物モデルに対し、本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質を投与して、本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質の使用による症状の寛解及び疾患の経過の変化の評価に利用することができる。使用することができる動物モデルは公知であり、上記のモデル、並びにコラーゲン関節炎（ＣＩＡ）モデル、食事性肥満モデル、大腸において慢性炎症及び潰瘍を誘発する２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（trinitrobenesulfonic acid）／エタノール（ＴＮＢＳ）誘発大腸炎モデル又はオキサゾロン（oxazalone）モデル（Ｎｅｕｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：５１〜６２，２０００）、ドナーナイーブＴ細胞によるレシピエントの腸への攻撃によりヒト炎症性腸疾患と同様の慢性腸炎及び症状を引き起こすナイーブＣＤ４５ＲＢｈｉｇｈ  ＣＤ４  Ｔ細胞のＲＡＧ又はＳＣＩＤマウスへの養子細胞移植モデル（Ｒｅａｄ  ａｎｄ  Ｐｏｗｒｉｅ，Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｕｎｉｔ  １５．１３，２００１）、卵白アルブミン感作モデル及びメタコリン感作モデル（Ｈｅｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２９３：４０１〜１２，１９９５）などのモデルを挙げることができる。
【０１１４】
医薬組成物
Ｋｖ１．３活性を抑制することが望まれる状態の治療に有効な、ＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質の「治療上の有効量」は、標準的な試験法により決定することができる。例えば、狼瘡、多発性硬化症又は乾癬などの炎症状態又は自己免疫疾患の治療に有効である可能性のある薬剤の投与量は、本明細書に記載のモデルなどの関連する動物モデルに薬剤を投与することにより決定できる。
【０１１５】
更に、所望によりｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて最適な用量範囲を特定することができる。特定の有効用量の選択は、当業者であれば幾つかの因子を考慮して決定することができる（例えば臨床試験により）。このような因子には、治療又は予防しようとする疾患、疾患症状、患者の体重、患者の免疫状態、及び当業者には公知のその他の因子が含まれる。製剤に用いられる正確な用量は、投与経路、及び疾患の重篤度によって決まり、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。有効量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定することができる。
【０１１６】
本発明のＯｄＫ２ペプチド変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質の治療使用のための投与モデルは、変異体をホストに送達する任意の好適な経路によるものであってよい。これらの変異体の製薬学的組成物は、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、又は鼻腔内などの非経口投与に特に有用である。
【０１１７】
本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、有効量の変異体を製薬上許容される担体中の有効成分として含有する製薬学的組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物とともに投与される希釈剤、助剤、賦形剤、又は溶媒のことを指す。このような医薬用溶媒は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物又は合成物由来の水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌液であり、概して粒子状物質を含まない。これらの溶液は、従来の公知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物には、生理学的条件に近づけるために必要とされるｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤及び着色剤などの製薬学的に許容され得る補助物質を含有させることができる。こうした製薬学的組成物に含まれる本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質の濃度は、重量にして約０．５％未満、通常は約１％又は少なくとも約１％から、最大で１５又は２０％までと大きく異なってよく、選択される投与方法に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度などに基づいて選択される。
【０１１８】
したがって、筋肉内注射用の本発明の製薬学的組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のＯｄＫ２変異体及び／又は融合タンパク質を含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発明の医薬組成物は、２５０ｍＬの滅菌リンゲル溶液、及び約１ｍｇ〜約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明のアンタゴニストを含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は公知であり、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に詳細に記載されている。
【０１１９】
本発明のＯｄＫ２変異体及び／又はＯｄＫ２変異体融合タンパク質は、保存のために凍結乾燥し、かつ使用前に好適な担体に溶解させることができる。これまでに、この手法は一般的なタンパク製剤に有効であることが示されており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解法を用いることができる。
【０１２０】
次に、本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
【０１２１】
材料及び方法
Ｋｖチャネル発現構築物及び細胞株。常法を用い、様々なＫｖチャネル及びキメラ構築物をコードしているｃＤＮＡを哺乳類発現ベクターにクローニングした。ヒトＫｖ１．３（ｈＫｖ１．３）（配列番号４１８）、ヒトＫｖ１．１（ｈＫｖ１．１）（配列番号４２０）、ヒトＫｖ１．２（ｈＫｖ１．２）（配列番号４１９）、ヒトＫｖ１．５（ｈＫｖ１．５）（配列番号４２１）、ｈＫｖ１．３  Ｅ３ループ／ｈＫｖ１．５キメラ（ヒトＫｖ１．５アミノ酸１〜４５５及び４９６〜６１３、及びＫｖ１．３  Ｅ３ループアミノ酸４５６〜４９５）（Ｋｖ１．３  ＥＣ３ループキメラ）、Ｎ末端Ｈｉｓタグを有するｈＫｖ１．１  Ｅ３ループ／ｈＫｖ１．５キメラ（Ｈｉｓタグアミノ酸１〜９、ｈＫｖ１．５アミノ酸１０〜４７２、及び５１３〜６３、及びｈＫｖ１．１  Ｅ３ループアミノ酸４７３〜５１２を有する）（Ｋｖ１．１  ＥＣ３ループキメラ）、ラットＫｖ１．３（ｒＫｖ１．３）（配列番号４２２）、ラットＫｖ１．１（ｒＫｖ１．１）（配列番号４２３）、カニクイザル（Macaca fascicularis）チャネルｃｙｎｏＫｖ１．３（配列番号４２４）、ｈＫｖ１．３／ｈＫｖ１．５テールキメラ（ヒトＫｖ１．５アミノ酸１〜２５０及び４９７〜５９３、並びにＫｖ１．３アミノ酸配列２５１〜４９６を有する）（Ｋｖ１．３テールキメラ）、並びにｈＫｖ１．１／ｈＫｖ１．５テールキメラ（ヒトＫｖ１．５アミノ酸１〜２５０及び４９２〜５８８、並びにＫｖ１．１アミノ酸配列２５１〜４９１（Ｋｖ１．１テールキメラを有する）をコードしているｃＤＮＡをクローニングし、発現させた。ＨＥＫ細胞でチャネルを発現させるため、ネオマイシン耐性マーカーをコードしておりＣＭＶプロモーターにより駆動される発現ベクターにＫｖ遺伝子をクローニングした。標準法を用い、ＨＥＫ  ２９３−Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）細胞を安定に形質移入し、ＤＭＥＭ  １０％  ＦＢＳ及び６００ｇ／ｍＬジェネティシン選択培地で培養して、Ｋｖチャネルを発現するクローン細胞株を作出した。ＣＨＯの安定発現のため、標準法を用いｐｃＤＮＡ４／ＴＯ−Ｋｖ１．ｘによりＣＨＯ−ＴＲＥｘ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を安定に形質移入し、テトラサイクリン誘導性の方法で各カリウムチャネルを発現するクローン細胞株を作出した。１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５μｇ／ｍＬブラストサイジン及び２００μｇ／ｍＬゼオシンンを添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２を培養培地とした。いくつかの実験では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いＣＨＯ細胞に一過性形質移入を行った。電気生理学的試験の際の発現対照については、切断型ＣＤ４を発現する発現ベクター（ｐＭＡＣｓ４．１，Ｍｉｌｔｅｎｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を細胞に同時形質移入した。形質移入から２４〜４８時間後にアッセイを実施した。
【０１２２】
タンパク質発現及び精製。
ペプチド−Ｆｃ融合体、又はペプチド−ＨＳＡ融合体としてキメラライブラリを発現させた。このライブラリを最初にＨＥＫ  ２９３−Ｅ細胞に形質移入し、４８ウェル又は９６ウェルフォーマットで発現させた。１０％  ＦＢＳ、及び選別のための２５０μｇ／ｍＬジェネティシンを含有させたＤＭＥＭでこの細胞を培養した。４８ウェルでの発現については、３．０×１０５個／ｍＬを０．５ｍＬ／ｗｅｌｌで４８ウェルプレートに播種した。３００ｎｇプラスミドＤＮＡ、２５μＬ  ＯｐｔｉＰＲＯ（商標）ＳＦＭ培地、及び２．４μＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、常法によりＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用い、ライブラリを形質移入した。翌日、形質移入培地を吸い出し、０．５ｍＬの２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を各ウェルに添加した。次に、細胞を更に９６時間インキュベートした後、上清を回収し、０．２μｍフィルタ（Ｖａｒｉａｎ）により濾過した。
【０１２３】
９６ウェルでの形質移入のため、細胞を５００×ｇで５分間スピンダウンし、上清を除去した後、この細胞を２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地に再懸濁し、０．６×１０６個／ｍＬで９６ウェルプレートの各ウェルに０．２ｍＬずつ播種した。４８ウェルでの形質移入と同じ方法で、ライブラリを形質移入した。
【０１２４】
全ての小規模及び予備試験規模での形質移入には、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を使用した。
【０１２５】
常法によりＰｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロース４ＦＦ樹脂を使用して、ペプチド−Ｆｃ融合体の小規模発現をバッチ精製した。簡潔に述べると、清澄化した発現上清２０ｍＬを、ＤＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）で平衡化した約０．５ｍＬの樹脂と混ぜ、室温で１時間未満混合した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂を１ｍＬ  ＤＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）で洗浄し、結合したタンパク質を４５０μＬの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ３．０）で溶出し、５０μＬの２Ｍ  ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．０）で中和し、１ｘＤＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）に対し４℃で一晩透析した。
【０１２６】
予備試験規模での発現物をＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓ（商標）クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。一過性に形質移入したＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の発現上清を、形質移入の４日後に回収し、６０００ｒｐｍで遠心分離して清澄化し、濾過（０．２μｍ  ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）した。馴化培地に分泌された対照毒素−Ｆｃ融合タンパク質を利用して標準曲線を作成し、Ｏｃｔｅｔ装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）でペプチド−Ｆｃ融合体の相対量を求めた。次に、サンプルを１０倍のＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）で最終濃度１ｘＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）になるよう希釈し、再度濾過した（０．２μｍ  ＰＥＳ膜）。希釈した上清を、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｗａｕｋｅｓｈａ、ＷＩ）に約１０ｍｇタンパク質／ｍＬ樹脂の相対濃度にて負荷した。負荷後、カラムをＰＢＳ（ｐＨ  ７）にて洗浄し、カラム体積の１０倍量の０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ  ３）で溶出した。タンパク質画分は、画分体積の２０％の２．０Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７）を入れたチューブに溶出し、直ちに中和した。ピーク画分をプールし、１０ｋ  ＭＷＣＯ膜を取り付けた遠心限外濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  （１６／６０）カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に濃縮サンプルを透過させ、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣでＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）でクロマトグラフィーを行った。ピーク画分を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、単量体タンパク質を含有している画分をプールした。ＢｉｏＴｅｋ  ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ（商標）分光光度計により、吸光度２８０ｎｍ及び３１０ｎｍでタンパク質濃度を求めた。精製したタンパク質を、必要に応じて、１０Ｋ  ＭＷＣＯ遠心濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。精製したタンパク質の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析用のサイズ排除ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ）、及び測定されたエンドトキシンレベル（ＬＡＬ  ａｓｓａｙ）により評価した。精製したタンパク質を４℃で保存した。
【０１２７】
ペプチド−ＨＳＡ融合体については、上清を回収し、清澄化し、０．２μｍフィルターで濾過した。予め平衡化した１ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐカラムへの負荷前に、最終濃度が１倍となるよう１０倍のＤＰＢＳを添加した。段階勾配させてイミダゾールを用い、タンパク質を溶出した。融合体を含有している画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。対象とするタンパク質を含有している画分をプールし、濃縮して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラムでクロマトグラフィーを行った。再度画分を回収しＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ペプチド−ＨＳＡの単量体及び二量体を含有している画分を、最終生成物について別個にプールした。精製したタンパク質を上記の通りに分析し、４℃で保存した。
【０１２８】
ペプチド融合タンパク質の直接結合アッセイ（「結合アッセイ」）。
ペプチド−Ｆｃ融合タンパク質。細胞培養試薬は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。様々なＫｖチャネルを発現するプラスミドにより安定的に形質移入した接着性ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞を、１０％  ＦＢＳ及び６００μｇ／ｍＬジェネティシンを添加したＤＭＥＭで培養した。ＫｖチャネルＨＥＫ細胞の単個細胞懸濁液を調製し、接着性培養物を１倍のＰＢＳですすぎ洗いし、次に培養物を０．２５％トリプシンＥＤＴＡですすぎ洗いし、最終密度が２×１０６個／ｍＬになるよう、２％  ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加した１ｘ冷ＰＢＳに細胞を再懸濁し、Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。これらの手順は、氷上又は４℃にて実施した。細胞を４５０ｘｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３馴化培地又はＦＡＣＳ緩衝液で１６ｎＭに規格化したペプチド−Ｆｃサンプル１００μＬを、記載のウェル中の細胞ペレットに添加し、混合した。特異的な結合と非特異的なバックグラウンドを区別するため、陰性対照に１０倍モル過剰のＳｈＫペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）を添加して反応させ、ペプチド−Ｆｃ融合タンパク質の結合と競合させた。反応物を４℃で６０〜９０分間インキュベートした。細胞を２００μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次にＦＡＣＳ緩衝液に１：２００希釈したヤギＦａｂ’２抗ヒトＦｃ  Ｃｙ５複合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）１００μＬにより４℃で１時間インキュベートした。細胞を２００μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次に１００μＬのＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、４℃で一晩保存した。反応をＦＡＣＳＡｒｒａｙ  ９６  ｗｅｌｌ  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）でデータを分析して、各反応について幾何的平均蛍光強度（Ｇｅｏ．ＭＦＩ）を得た。結合アッセイの初回スクリーニングのため、各変異体のＧｅｏ．ＭＦＩを、一過性形質移入した野生型ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体（Ｋｖ１．２）対照と直接比較し、親型に対する割合（％）として記録した。
【０１２９】
ペプチドＨＳＡ融合タンパク質。細胞を最終密度１×１０６個／ｍＬで懸濁した後、１００μＬ／ｗｅｌｌでＶ底ポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に分注した後、５０μＬのペプチド−ＨＳＡ融合体サンプルを細胞に添加したことを除き、ペプチド−Ｆｃ融合体に対する直接結合アッセイと同一のアッセイを実施した。２ｇ／ｍＬに希釈し、ＦＡＣＳ緩衝液によりストレプトアビジン−ＰＥ複合体（）と１：２００で予混合したヤギ抗ヒトＨＳＡビオチン複合体（ＡｂＣａｍカタログ番号ａｂ４０３７８）を５０μＬ使用し、ＨＳＡ融合体を検出した。細胞を１５０μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、５０μＬのＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。反応を読み取り、上記の通りデータを分析した。結合アッセイの初回スクリーニングのため、各変異体のＧｅｏ．ＭＦＩを、対照Ｋｖ１．２６１＿２６融合タンパク質（ＧＳ（Ｇ４Ｓ）８リンカーによりＨＳＡと複合させたペプチド２６１（配列番号１２０）と直接比較して、結合率（％）を記録した。
【０１３０】
競合的結合アッセイ（「競合的結合」）。細胞培養試薬は全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た。Ｋｖチャネル発現構築物により安定的に形質移入した接着性ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞を、１０％  ＦＢＳ及び６００μｇ／ｍＬジェネティシンを添加したＤＭＥＭで培養した。ＫｖチャネルＨＥＫ細胞の単個細胞懸濁液を調製し、接着性培養物を１ｘＰＢＳですすぎ洗いし、次に培養物を０．２５％トリプシンＥＤＴＡですすぎ洗いし、最終密度が１×１０６個／ｍＬになるよう、２％  ＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を添加した１ｘ冷ＰＢＳに細胞を再懸濁し、Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。これらの手順は、氷上又は４℃にて実施した。細胞を４５０ｘｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。４５μＬのペプチド又はペプチド融合タンパク質サンプルの馴化Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地又はＦＡＣＳ緩衝液溶液を、記載のウェル中の細胞ペレットに添加し、混合した。反応物を４℃で３０分間インキュベートした。１００ｎＭのＡｇｉｔｏｘｉｎ−２−Ｃｙｓ−ＴＡＭＲＡ（Ａｌｏｍｏｎｅ  ｌａｂｓ）を含有させた細胞培養培地又はＦＡＣＳ緩衝液５μＬを各ウェルに添加し、混合し、反応物を４℃で６０分間インキュベートした。洗浄工程で２００μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに添加し、細胞を４５０ｘｇで２分間遠心分離し、上清をデカントした。細胞を５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、反応をＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  ９６  ｗｅｌｌ  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で読み取った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）でデータを分析して、各反応について幾何的平均蛍光強度（Ｇｅｏ．ＭＦＩ又はＧＭＦＩ）を得た。濃度応答曲線に関し、各化合物の濃度範囲にわたるＧｅｏ．ＭＦＩ値をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍでプロットした。ＩＣ５０及びＫｉ値は、用量応答性（可変性スロープ）シグモイド曲線による非線形回帰を用い求めた。Ｋｉを算出するため、０．２０ｎＭのＡｇｉｔｏｘｉｎ−２−Ｃｙｓ−ＴＡＭＲＡ  Ｋｖ１．３のＫＤ値を割り当てた（Ｄａｖｉｄ  Ｔｒｉｇｇｌｅ（ｅｄｓ）。Ｖｏｌｔａｇｅ−Ｇａｔｅｄ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２９，Ｐａｇｅ  ２１６，Ｔａｂ．．７．２．２）。
【０１３１】
タリウム流入アッセイ。Ｇ４１８選別下で、ＨＥＫ２９３ＦでＫｖ構築物を安定発現させた。１０％  ＦＢＳ及び６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を添加したＨｙＱ  ＤＭＥ／高グルコースを培養培地とした。細胞をウェル当たり１０Ｋ個でポリリジンコート３８４ウェルマイクロタイタープレートに播種した後、３７℃で１２〜３６時間インキュベートした。細胞プレートは、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬ４０５を使用しアッセイ緩衝液により洗浄した（４サイクル、２５μＬ／ｗｅｌｌまで吸引した後、１００μＬ／ｗｅｌｌを添加）。アッセイ緩衝液には、ｍＭ換算で、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭグルコースを含有させた。ＦｌｕｘＯＲ  ｄｙｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造元の使用説明書に従いアッセイ緩衝液（２ｍＭプロベネシドを添加）に溶解させた後、細胞に添加した。細胞を暗所にて室温で３０分間染色した。次に、染料をアッセイ緩衝液により洗い流した。０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び２ｍＭプロベネシドを添加したアッセイ緩衝液により、試験濃度の２倍濃度で試験化合物を調製した。試験化合物溶液２５μＬ／ｗｅｌｌを添加した後、細胞を暗所にて室温で３０分間インキュベートした。刺激緩衝液２０μＬ／ｗｅｌｌを添加して細胞に刺激を与え、タリウム染料の蛍光強度をＴｅｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）でモニターした。刺激緩衝液には、１８０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、９０ｍＭ  ＫＯＨ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、１ｍＭ  Ｔｌ２ＳＯ４を含有させた。アゴニストの添加後、２０秒間蛍光変化を測定した。データを、対照ウェルの平均応答に対し正規化した（完全阻害対照用の１０ｎＭ  ＳｈＫ群、及び無阻害対照用の緩衝液のみの群の各群についてＮ＝１６）。
【０１３２】
Ｔ細胞阻害アッセイ（「Ｔ細胞阻害アッセイ」）。ＩＬ−２分泌の阻害を、Ｔ細胞阻害の指標として用いた。凍結保存された精製初代正常ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ  ＬＬＣ）を解凍し、１％正常ヒトＡ／Ｂ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄ  ＆  Ｓｒｖ  Ｉｎｃ．）を添加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に最終密度２×１０６個／ｍＬで懸濁し、１００μＬの細胞を９６ウェル平底組織培養プレート（ＮＵＮＣ）に分散させた。ペプチド−ＨＳＡ融合タンパク質に関し、濃度応答性試験中にＨＳＡ濃度を一定に維持する目的で、最終濃度３％で精製正常ヒト血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）を細胞培養培地に加えた。ペプチド融合タンパク質及び対照を細胞培養培地に希釈し、５０μＬ／ｗｅｌｌをＴ細胞培養物に添加し、３７℃／５％  ＣＯ２で３０分間インキュベートした。細胞に対するビーズ比１：１でａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を細胞培養培地に希釈して用い、Ｔ細胞を活性化した。培養物を、３７℃／５％  ＣＯ２で約１６時間インキュベートし、上清を９６ウェルＶ底ポリプロピレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、遠心分離により清澄化した。ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｋｉｔ（ＲｎＤ  Ｓｙｔｅｍｓ）による化学蛍光免疫アッセイにより、清澄化した上清のＩＬ−２レベルについて分析した。最終的なＩＬ−２濃度をＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍでプロットした。ＩＣ５０値は、用量応答性（可変性スロープ）シグモイド曲線を適合させて非線形回帰を用い求めた。ペプチド融合タンパク質濃度５ｎＭ、１００ｎＭ又は２５０ｎＭでいくつかの試験を実施した。
【０１３３】
テタヌス（Tetanus）毒素（ＴＴＸ）Ｔ細胞アッセイ。Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｇｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、テタヌス（tetanus）毒素をワクチン接種した常供血から段階勾配濃度によりヒトＰＢＭＣを精製した。９６ウェル平底培養プレートに、２％ヒト血清、２ｍＭグルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、並びにペニシリンＧ及びストレプトマイシン各１００Ｕ／ｍＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩと、３ｕｇ／ｍＬテタヌス（tetanus）毒素（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）を入れ、１０６個／ｗｅｌｌのＰＢＭＣを３日間刺激した。培養２日目に培養上清を回収し、１ｕＣｉ／ｗｅｌｌの３Ｈ−チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で一晩刺激して細胞増殖を測定した。放射性チミジンを取り込んで増殖している細胞をグラスファイバーフィルタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に播種し、ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に浸漬して、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ  （Ｐａｃｋａｒｄ）により放射活性を計数した。ＭＳＤ検出法（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により、上清中のサイトカインを測定した。
【０１３４】
電気生理試験。電気生理試験には、形質移入したＣＨＯ又はＨＥＫ細胞、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞を使用した。カバーグラス上に細胞を低密度で播種した。試験日に、カバーグラスを倒立顕微鏡のステージ上に配置し、次の組成：１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ｐＨ  ７．４）、の細胞外溶液により灌流（約１ｍＬ／ｍｉｎ）した。ピペットに、次の組成：４０ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＫＦ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．３〜７．４）の細胞内溶液を充填し、抵抗２〜４ＭΩとした。Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ａ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ及びｐＣｌａｍｐ  ９ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、全ての記録は室温で記録した（２２〜２４℃）。抗ＣＤ４被覆ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、一過性形質移入したＣＨＯ細胞を同定した。保持電圧−８０ｍＶからの試験電圧２０〜４０ｍＶでホールセル式のパッチクランプ法を使用して、外向きカリウム電流を測定した。液間電位差は、２０℃にて７．１ｍＶであるものと算出した。コマンド電圧の補正はしなかった。２〜５ＫＨｚで電流記録を得て、１〜２ＫＨｚでフィルターした。２０秒毎に１回電流を流し、記録前に５〜１０分間安定化させた。ＳＦ−７７Ｂ  Ｆａｓｔ−Ｓｔｅｐ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して化合物を添加した。細胞毎に、１〜４種の濃度で化合物を試験した。
【０１３５】
データ解析：
以下の、４パラメーターによる一般的なロジスティック式を使用し、非線形回帰（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０）により濃度又は用量応答データを代入した。
応答＝最小応答＋（最大応答−最小応答）／［１＋１０（ｌｏｇＥＣ５０−Ｌｏｇアゴニスト）曲線勾配］
強度は、最大作用の５０％を生じる濃度の−ｌｏｇ  １０として表した（ｐＩＣ５０又はｐＥＣ５０）。
【０１３６】
ペプチド合成。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ樹脂０．４７ｍｍｏｌ／ｇ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得て、シュードプロリンジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ΨＭｅＭｅ  ｐｒｏ）−ＯＨはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから得た。その他の全てのアミノ酸はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）又はＡｎａｓｐｅｃから得た。自動化固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）用の試薬はＡＢＩにより得た。化学合成に必要なその他の試薬はＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ４３３Ａ自動化ペプチドシンセサイザーを使用し、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｗａｎｇ  ｒｅｓｉｎ（２２２ｍｇ，０．１０４ｍｍｏｌ）に対しＳＰＰＳによりペプチド合成を実施した。製造元のプロトコールに従って、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化には標準の０．１ｍｍｏｌｅスケールのＦａｓｔＭｏｃ  ＭｏｎＰｒｅｖＰｅａｋプロトコールを使用した。配列ＧＶＰＩＮＶＫＣＫＩＳＲＱＣＩＥＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ−樹脂（配列番号４２）中の、ボールド体でかつ下線を付した位置に、シュードプロリンジペプチド、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ（ΨＭｅＭｅ  ｐｒｏ）−ＯＨを組み込んだ。アミノ酸側鎖官能基は次の通りに保護した：Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）及びＴｈｒ（ｔＢｕ）。
【０１３７】
周囲温度にて、（ＴＦＡ（２０ｍＬ）、フェノール（１．５ｇ）、１，２エタンジチオール（４．０ｍＬ）チオアニソール（１．０ｍＬ）、水（１．０ｍＬ）及びトリイソプロピルシラン（１．０ｍＬ））により６時間かけて樹脂からペプチドを切断した。濾過し、ＴＦＡ（２ｍＬ）を追加してすすぎ洗いし、樹脂を除去した。ろ液を合わせ、予冷したエチルエーテル（４００ｍＬ）によりペプチドを沈殿させた。濾過により単離されたペプチドをジエチルエーテルにより洗浄し、減圧下で乾燥させて３７０．０ｍｇの未精製の線状生成物を得た（ＧＶＰＩＮＶＫＣＫＩＳＲＱＣＩＥＰＣＫＤＡＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫＣＨＣＴＰＫ；配列番号４２）。ペプチド濃度１００μｇ／ｍＬで、室温下、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１．０Ｍグアニジン−ＨＣＬ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、３．０ｍ；Ｍ還元グルタチオン及び０．３ｍＭ酸化グルタチオンにて未精製の直鎖ペプチドを酸化した。２５時間後に氷酢酸を滴加して反応を停止し、ｐＨを３．９に低下させ、ペプチドを凍結及び凍結乾燥した。粗ペプチドをＶｙｄａｃ  Ｃ−１８  ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動及びＬＣ／ＭＣによる分析により、純度と分子質量を確認した。
【実施例】
【０１３８】
（実施例１）
野生型ＯｄＫ２及びＯｓＫ１ペプチド並びにそれらの融合タンパク質の特性評価
常法及び上記の通りの手法を使用して、野生型ＯｄＫ２（配列番号１）及びＯｓＫ１（配列番号２）ペプチドをクローン化し、リンカーＧＳ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１９）を使用し、ＩｇＧ４融合タンパク質として発現させた。得られた融合タンパク質をそれぞれＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）及びＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）と命名した。イランサソリ・オドントブタス（Odonthobuthus）の毒液から単離及び生成した未改変のＯｄＫ２ペプチドをＬｅｕｖｅｎ大学のＪａｎ  Ｔｙｔｇａｔ教授から得て、組み換えＯｓＫ１ペプチドはＡｌｏｍｏｎｅ研究所から得た。未改変のペプチド及びそれらの融合タンパク質を、電気生理試験によりＫｖ１．３に対する結合強度及び選択性について、Ｔ細胞活性化阻害能について、並びに薬物動態試験において特性評価した。
【０１３９】
Ｋｖ１．３を発現している細胞への結合
ｈＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラを発現している安定な細胞において、上記の通り、結合アッセイを実施した。ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）は、ＦＡＣＳアッセイにおいてバックグラウンドの１２．８倍のシグナルを生成し、ＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）は、バックグラウンドの１３３．０倍のシグナルを生成し（図２）、発現させたＫｖ１．３チャネルに対する結合強度が高いことを示した。１０倍過剰のＳｈＫの存在下で、ヒトＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラを発現している細胞に対し結合しなかったことから、結合が特異的なものであることは明らかである。ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）及びＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）はヒトＫｖ１．５を発現している細胞に対し結合しなかったことから、結合も選択的であった。
【０１４０】
電気生理試験。
ヒトＫｖ１．３、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２及びＫｖ１．５イオンチャネルにより形質移入したＣＨＯ細胞に対し、ホールセルパッチクランプ試験を実施した。Ｏｓｋ１及びＯｄＫ２のいずれもがＫｖ１．３電流を強力に阻害した。ＯｓＫ１ペプチドは、Ｋｖ１．３に対しＯｄＫ２よりも顕著に強力に作用したものの、Ｋｖ１．１に対するこれらの２つのペプチドの選択性は同様であった。ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）及びＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）のＫｖ１．３に対する作用強度は、未改変のペプチドと比較して約１／３０〜１／１００であった。しかしながら、ＫＶ１Ｃ２選択性（Ｋｖ１．１  ＩＣ５０をＫｖ１．３  ＩＣ５０により除算したものとして算出）は、未改変のペプチドと比較して約３〜４倍向上した。電気生理試験により求められたＩＣ５０値と選択性の比を表１に掲載する。
【０１４１】
【表１】
0006469590.tif 000002
＊Ｌｉｎｋｅｒ＝ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４、配列番号１１９
＊＊ＩＣ５０（Ｋｖ１．１）／１Ｃ５０（Ｋｖ１．３）
ＮＡ＝実施せず
【０１４２】
Ｔ細胞活性化阻害
ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株、初代ＣＤ４＋ヒトＴ細胞（健常なヒト提供者から単離）、及びＫｖ１．３形質移入ＨＥＫ及びＣＨＯ細胞において、Ｋｖ１．３細胞電流を遮断した。Ｋｖ１．２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）も、抗ＣＤ３／ＣＤ２８により活性化した初代ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞によるサイトカイン生成を遮断した。ＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株において、Ｋｖ１．３の細胞電流を遮断し、ｈＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラを発現している細胞に対するａｇｉｔｏｘｉｎ２−ｃｙｓ−ＴＡＭＲＡ結合が同程度であり、ｈＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラを発現している細胞からのタリウム流を阻害した。この融合体の、ＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化阻害能を試験した。表１には、マニュアルでのパッチクランプ電気生理試験から得られたＩＣ５０値を掲載する。ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）も、マイトマイシンＣ処理した、自己抗原を提示している細胞の活性化によりＴ細胞の増殖を阻害し、上記アッセイにおいて、テタヌス（tetanus）毒抗原を示す（図３）。
【０１４３】
ＯｄＫ２−Ｆｃ融合タンパク質の半減期
２ｍｇ／ｍＬのＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）の１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．０）ストックを５ｍＬ／ｋｇでスプラーグドーリーラットに静脈内ボーラス投与し、最終的な投与量を１０ｍｇ／ｋｇとした。血漿濃度は、上記の通り抗Ｆｃ  ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳにより求めた。ラットにおけるＫＶ１Ｃ２の半減期（Ｔ１／２）は６０時間であった。
【０１４４】
（実施例２）
ＯｄＫ２キメラペプチドＦＣ融合体の生成（「ＯｄＫ２／ＯｓＫ１キメラライブラリ」又は「ＫＶ１Ｃ２Ｌ１」）
未改変のＯｄＫ２及びＯｓＫ１毒素ペプチド配列は、９つのアミノ酸残基が異なる、高度に類似した配列を有する（図１）。Ｋｖ１．３の効力及びＫｖ１．ｘサブタイプの選択性が増強されたペプチド変異体を作出する目的で、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１１９）を使用し、ペプチド−リンカー−Ｆｃ変異体のコンビナトリアルライブラリを作成した。このライブラリにおいて、ＯｄＫ２ペプチドアミノ酸配列は、ＯｓＫ１に由来するＯｄＫ２配列と９つ中８つの位置が異なっている（配列番号１のＯｈＫ２における位置、３、４、５、９、１０、１２、１６及び２０）。この位置ではイソロイシン及びロイシンは類似することから、位置１５は、ライブラリの多様性に包含されない。これらの位置は、各位置に存在するＯｄＫ２及びＯｓＫ１アミノ酸残基を用い多様化させた。したがって、位置３は、ＰＩにより多様化させ、位置４、５、９、１０、１２、１６及び２０は、それぞれＴＩ、ＤＮ、ＲＫ、ＧＩ、ＲＰ、ＥＱ、及びＫＤにより多様化させた。同様に、ライブラリの設計には、ＯｓＫ１ペプチドの効力を増大させる（Ｍｏｕｈａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３８５：９５〜１０４，２００５）と報告されている位置１６でのリシン置換による６種の変異と、正確なＯｄＫ２アミノ酸配列における初期相違の結果としての位置３８でのグルタミン置換とを組み込んだ。したがって、ＯｄＫ２／ＯｓＫ１キメラライブラリは、リシン置換変異体、ＯｄＫ２  Ｋ３８Ｑ変異体、及びＫｖ１．２（ＯｄＫ２融合体）及び（ＯｓＫ１融合体）の両方の親分子の全部で２６４種のメンバーから構成された。位置付番は、配列番号１の未改変のＯｄＫ２ペプチド配列による。
【０１４５】
ライブラリを作製し、常法の分子生物学的手法を用い、上記の通りに発現させた。
【０１４６】
未精製の上清を用い、ｈＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラを形質移入したＨＥＫ細胞株を使用して、ｈＫｖ１．３に対する結合について、並びに上記の通りのｈＫｖ１．１  ＥＣ３ループキメラチャネルを形質移入したＨＥＫ細胞株に対し結合させることにより選択性について、ライブラリをスクリーニングした。初回スクリーニングでは、結合は対照Ｋｖ１．２の結合率（％）として、並びに選択性はＫｖ１．１への結合率（％）に対するＫｖ１．３への結合率（％）の比として測定した。図４は、ＯｄＫ２／ＯｓＫ１キメラライブラリ（ＫＶ１Ｃ２Ｌ１ライブラリ）並びに実施例４に記載のアミノ酸スキャンライブラリー（ＫＶ１２６Ｌ１ライブラリ）から得られる変異体を選択するための、アミノ酸配列、結合率（％）、選択性、及びタリウム流入アッセイによるＩＣ５０値を示す。
【０１４７】
親ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）と比較したときに、選択した融合タンパク質は、Ｋｖ１．３に対し８０％以上の結合率と、Ｋｖ１．１の１．３倍以上の選択性とを示すことが更に特性評価された。
【０１４８】
（実施例３）
ＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合体の特性評価。
実施例２で同定され選択されたＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合タンパク質を上記の通り精製し、２回目の結合アッセイ、電気生理試験、及びＴ細胞阻害アッセイにより特性評価した。
【０１４９】
電気生理試験
選択された変異体を、上記の通り安定的に形質移入したＣＨＯを用いてホールセルパッチクランプ試験において効力及び選択性について評価した。単一濃度（Ｋｖ１．３については１ｎＭ又はＫｖ１．１については１００ｎＭ）の精製変異体によりヒトＫｖ１．３又はヒトＫｖ１．１の阻害を評価した（表２）。選択した変異体は、親ＫＶ１Ｃ２と比較してＫｖ１．３に対する活性が大幅に増大していたものの、Ｋｖ１．１に対する活性は同程度であった。
【０１５０】
ＩＣ５０値は、「材料及び方法」に記載される通りヒトＫｖ１．３又はＫｖ１．１のいずれかにより安定的に形質移入したＣＨＯ細胞を用いる、ＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合体を選択するための哺乳類パッチクランプ電気生理試験から得た。選択性は、ＩＣ５０（Ｋｖ１．３）に対するＩＣ５０（Ｋｖ１．１）の比として算出した。表３には、選択された変異体並びに親ＯｄＫ２及びＯｓＫ１融合体ＫＶ１Ｃ２及びＫＶ１Ｎ２のそれぞれについてのＩＣ５０値を掲載する。
【０１５１】
【表２】
0006469590.tif 000003
＊親（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）
＊＊融合タンパク質（１０ｎＭ）
【０１５２】
【表３】
0006469590.tif 000004
＊パッチクランプ電気生理試験によるＩＣ５０値
＊＊選択性＝ＩＣ５０（Ｋｖ１．１）／ＩＣ５０（Ｋｖｉ３）
【０１５３】
パッチクランプ試験により、ＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合タンパク質は、親ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）と比較した場合に、Ｋｖ１．３に対する効力が約２８〜約８７倍に向上しており、選択性については約３〜９倍向上しており、親ＫＶ１Ｎ２（ＯｓＫ１−Ｆｃ融合体）と比較した場合に選択性が約８５倍も向上していた。
【０１５４】
Ｔ細胞活性化阻害
「材料及び方法」に記載の通り、抗ＣＤ３／Ｃ２８誘導Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌の阻害としてＴ細胞活性化阻害能を測定し、選択されたＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合体を特性評価した。単一濃度（１００ｎＭ）でＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合体の阻害率を測定した。結果を、最大ＩＬ−２産生の阻害率（％）として図５Ａに示す。ＫＶ１Ｂ０３は親ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２融合体）と同一であり、ライブラリの構築中に偶然再生成された。図５Ｂは、活性化Ｔ細胞によるＩＬ−２生産に対するＫＶ１Ｄ２６１による濃度依存性の阻害を示す。ＫＶ１Ｄ２６１融合タンパク質によるＣＤ４＋  Ｔ細胞阻害についてのＩＣ５０値は１．６６ｎＭであった。
【０１５５】
機能するＫｖ１．３遮断剤を結合アッセイが同定する性能を評価するため、未精製の上清を用いライブラリの初回スクリーニング中に実施した、Ｔ細胞活性化の阻害と、Ｋｖ１．３に対する結合の相関を評価した（図５Ｃ）。２つのアッセイ間で有意な相関が認められた（ピアソン相関ｒ  ０．９３３９，ｐ＜０．０００１）。
【０１５６】
融合タンパク質の拮抗作用はペプチド部分に由来する。
ＯｄＫ２キメラペプチドＦｃ融合体の阻害特性、並びに選択性がペプチド部分により保有されているかを決定するため、選択されたＯｄＫ２キメラ融合体を、対応する合成ペプチドとそれらの特性につい比較した。
【０１５７】
ＫＶ１Ｄ２６１及び対応する合成ペプチドｐ２６１（配列番号４２）を、Ｋｖ１．３に対する効力及び選択性、ラットＫｖ１．３チャネルに対する交差反応性、並びにＴ細胞活性化阻害について特性評価した。Ｄｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．１０：１６８〜８１，２００５に記載のものなどの常法を使用し、ｈＥＲＧをアッセイした。全ての細胞株は、ラットＫｖ１．３及びｈＫＣａ３．１以外の対象とするチャネルを安定的に発現していた。ＫＶ１Ｄ２６１及び合成ペプチドｐ２６１についての実験結果を表４に掲載する。合成ペプチドは、対応する融合タンパク質と比較した場合に、電気生理及びＴ細胞阻害の両方でＦｃ融合体よりも約１０倍超強力であり、選択性を保持していたことから、設計したペプチド領域が効力及び選択性についての特性を担保し得ることが実証された。Ｆｃと融合させた場合の効力の低下は、分子量の増大に伴いエントロピーが増大することに起因するものと予測される。
【０１５８】
【表４】
0006469590.tif 000005
ｅｐｈｙｓ：電気生理式のマニュアルパッチクランプ
＊ＣＨＯ細胞におけるＩＣ５０（ｈＫｖｉ．ｘ）／ＩＣ５０（ｈｘｖ１．３）比
【０１５９】
ＫＶ１Ｄ２６１の薬物動態特性
８．３ｍｇ／ｍＬのＫＶ１Ｄ２６１（２６１−Ｆｃ融合体）の１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．０）ストックを１．２ｍＬ／ｋｇでスプラーグドーリーラットに静脈内ボーラス投与し、最終的な投与量を１０ｍｇ／ｋｇとした。ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳアッセイの両方を用いタンパク質を測定した。半減期は約７２時間であるものと評価された。
【０１６０】
（実施例４）
アミノ酸スキャニングライブラリ（ＫＶ１Ｄ２６Ｌ１ライブラリ）の作製
Ｋｖ１．３遮断ペプチドの選択性を更に向上させるため、実施例２において記載のＯｄＫ２／ＯｓＫ１で、強力であるものの非選択的な変異体であると同定されたＫＶ１Ｄ２６（対応するペプチドｐ２６、配列番号１１１）のペプチド領域の各非システイン残基における９つのアミノ酸（Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｖ、Ｄ）の単一置換により、スキャニングライブラリを設計した。このアミノ酸スキャニングライブラリは、２７０の変異体から構成された。
【０１６１】
ライブラリを作製し、常法の分子生物学的手法を用い、上記の通りに発現させた。簡潔に述べると、変異体ペプチドをコードしている遺伝子を、合成遺伝子アセンブリ法（米国特許第ＵＳ６５２１４２７号及び米国特許第ＵＳ６６７０１２７号）を用い合成し、哺乳類発現ベクターにおいて、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１９）リンカーＩｇＧ４  Ｆｃ融合パートナーにインフレームでクローニングした。
【０１６２】
上記の通りにライブラリを発現させて、未精製の上清を、ヒトＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラチャネルを形質移入したＨＥＫ細胞株に対する結合性について、並びに上記の通りヒトＫｖ１．１  ＥＣ３ループキメラチャネルを形質移入したＨＥＫ細胞株に対する結合性をもとに選択性についてスクリーニングした。各変異体を定量し、これをもとに活性を正規化した。Ｋｖ１．３及びＫｖ１．１の結合率（％）を、「材料及び方法」において記載の通り、親ＫＶ１Ｃ２（ＯｄＫ２−Ｆｃ融合体）の割合（％）として表す。「材料及び方法」に記載の通りの２種類の細胞株を使用して、タリウム流入アッセイでもライブラリをスクリーニングした。
【０１６３】
図４Ａは、選択された変異体の配列を示す。結合率及びタリウム流入データを図４Ｂに要約する。
【０１６４】
アミノ酸スキャニングライブラリ由来の複数の変異体が、Ｋｖ１．３に対し、Ｋｖ１．１に対するものを上回る結合率及び選択性の増大を示した。結合アッセイスクリーニングによると、リシンのグルタミンへの置換により、Ｋｖ１．３に対し、Ｋｖ１．１に対するものを上回る選択性の向上が得られた。Ｋｖ１．３に対し８０％以上の結合率、及びＫｖ１．１に対するものを１．３倍上回る選択性を示すものとして選択された変異体を、精製し、更に特性評価した。
【０１６５】
（実施例５）
アミノ酸スキャニングライブラリ（Ｋｖ１Ｄ２６Ｌ１ライブラリ）から得られた変異体の特性評価
Ｋｖ毒素阻害剤との競合
選択された変異体を精製し、公知のＫｖ１．３阻害剤であるａｇｉｔｏｘｉｎ−２−ＣｙｓＴＡＭＲＡとの競合性について、上記の通り一点及び濃度応答性アッセイにおいて評価した。１０ｎＭのＡｇｉｔｏｘｉｎ−２−ＣｙｓＴＡＭＲＡ、及び単一読み取りについては４０ｎＭ、又は濃度応答性試験については０．０１５ｎＭ〜４μＭのいずれかの各変異体を使用して、ヒトＫｖ１．３  ＥＣ３ループキメラを発現している安定的なＨＥＫ２９３細胞において阻害率を評価した。
【０１６６】
選択された変異体のａｇｉｔｏｘｉｎ−２−ＣｙｓＴＡＭＲＡの結合阻害率（％）及びＩＣ５０値を表５に掲載する。選択された変異体は、ａｇｉｔｏｘｉｎ−２−ＣｙｓＴＡＭＲＡのＫｖ１．３に対する結合をＫＶ１Ｄ２６１と同程度で阻害し、いくつかの変異体では、ＩＣ５０値は、低ナノモル濃度のＫＶ１Ｄ２６１の場合と同様５ｎＭ〜１．３μＭの範囲であった。
【０１６７】
【表５】
0006469590.tif 000006
ＮＡ：実施せず
０：阻害は測定不能
【０１６８】
Ｔ細胞活性化阻害
活性化マーカーとしてＩＬ−２分泌を使用して、選択された変異体のＴ細胞活性化阻害能を上記の通り評価した。
【０１６９】
５ｎＭ又は２５０ｎＭのいずれかの単一の変異体濃度で、又は濃度応答については０．０１５ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲を用い、アッセイを実施した。最大シグナルをもとにした、選択された変異体による阻害率（％）を表５に掲載する。
【０１７０】
ＫＶ１Ｄ５７９は強力であり、かつ選択的なＫｖ１．３阻害剤である
上記の通り、ヒトＫｖ１．３、Ｋｖ１．１、又はＫｖ１．６で形質移入したＨＥＫ細胞を使用し、ホールセルパッチクランプ試験及びタリウム流入において、ＫＶ１Ｄ５７９を試験した。ＫＶ１Ｄ５７９についてのＩＣ５０値を、親ＫＶ１Ｄ２６、実施例２に置いて単離したＯｄｋキメラ−Ｆｃ融合体変異体とともに、表６に掲載する。丸括弧中の値はタリウム流入アッセイに由来するものであり、丸括弧外の値はパッチクランプ試験に由来するものである。
【０１７１】
【表６】
0006469590.tif 000007
【０１７２】
丸括弧中の値は、タリウム流入阻害アッセイに由来するものである。
＊ＩＣ５０（Ｋｖ１．×）／ＩＣ５０（Ｋｖ１．３）比
【０１７３】
（実施例６）
Ｃ末端延長ライブラリの作製（ＫＶ１Ｄ８１９Ｌ１ライブラリ）
試験管内での静止期ヒト末梢血単核球の培養により、リンカーＧＳ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１９）を使用して複合させた複数のペプチド−Ｆｃ融合タンパク質では望ましくない炎症性サイトカインの放出が誘導されるのに対し、対応する合成ペプチドではそのような誘導はなされないことが判明した。したがって、望ましくないサイトカイン放出は、二価のペプチド−Ｆｃ融合体又はそのＦｃの構造に由来する。
【０１７４】
望ましくないサイトカイン放出を予防するため、リンカーＧＳ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１１９）を使用して、ペプチド２６１（ｐ２６１）（配列番号４２）をヒト血清アルブミン融合体タンパク質として合成した。
【０１７５】
ＫＶ１Ｄ２６１＿２３に基づき融合体タンパク質ライブラリを作製して、得られる融合体タンパク質（ＫＶ１Ｄ２６１＿２３）の効力を更に最適化した。このライブラリでは、ペプチドｐ２６１のＣ末端を４つのアミノ酸で延長させた。ＫＶ１Ｄ２６１＿２３融合タンパク質のペプチド領域のＣ末端を延長させることで、ペプチドと、Ｋｖ１．３チャネルの細胞外ループとの結合相互作用が増大し、これにより効力が増強されるものと仮定された。
【０１７６】
ＫＶ１Ｄ２６１＿２３融合タンパク質は、ペプチドのＣ末端と介在するＧＳ（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１１９）との間に更に４つのアミノ酸を挿入し、かつ２６１ペプチドの新しい位置３９、４０、４１及び４２に、位置毎に全ての組み合わせで次の１２の残基（Ｑ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｅ、Ｇ、Ａ、及びＤ）を挿入することにより改質した。Ｒは１．５、及びＳは０．５としたことを除き、各残基の比は１とした。この結果、このライブラリで想定され得る変異体数の理論値は１２４（２０，７３６）となった。変異Ｃ末端延長部を有するペプチドをコードしている遺伝子を前述の通りに合成し、分子生物学的に常法の手法を使用して、ＧＳ（Ｇ４Ｓ）４リンカー（配列番号１１９）及びヒト血清アルブミン融合パートナーとともに、哺乳類発現ベクターにインフレームでクローニングした。
【０１７７】
ライブラリは、一過性に形質移入したＨＥＫ２９３細胞において組み換え法により発現させた。直接結合アッセイ、並びにＫｖ１．３効力についてはヒトＫｖ１．３テールキメラチャネルを形質移入したＨＥＫ細胞株、及びヒトＫｖ１．１テールキメラチャネルを形質移入したＨＥＫ細胞株を用いる機能的タリウム流入アッセイを使用して、未精製の上清をスクリーニングした。このライブラリによるヒットは、塩基性（Ｒ、Ｈ及びＫ）、酸性（Ｔ、Ｎ、及びＧ）、並びに非極性（Ａ及びＰ）残基において高かった。図６には、融合タンパク質のスクリーニングのための結合アッセイ及びタリウム流入アッセイの結果を掲載する。
【０１７８】
（実施例７）
Ｃ末端延長ライブラリ（ＫＶ１Ｄ８１９Ｌ１ライブラリ）の特性評価
Ｃ末端延長ライブラリから同定され、選択された候補を精製し、Ｋｖ１．３に対する結合を確認した。タリウム流入アッセイについて濃度応答曲線を作成した。表７には、タリウム流入アッセイにおいて求められたＩＣ５０値、及び各変異体のＣ末端延長部分のアミノ酸配列を掲載する。ＫＶ１Ｄ２６１＿２６（ＧＳ（Ｇ４Ｓ）８リンカー（配列番号１２０）を用いるｐ２６１−ＨＳＡ融合体）をアッセイにおいて対照として使用した。ほとんどのｐ２６１  Ｃ末端延長ペプチド融合体は、ペプチド部分の延長されていない対照と比較して、タリウム流入において同等の効力を示し又は効力が増強されていた。ＫＶ１Ｄ２６１＿２３よりも長いリンカーを有するＫＶ１Ｄ２６１＿２６融合体の試験結果は、一貫して、ＫＶ２Ｄ３６１＿２３（Ｇｓ（Ｇ４Ｓ）４リンカーを使用するｐ２６１−ＨＳＡ融合タンパク質（配列番号１１９）のおよそ５倍超強力であった。
【０１７９】
【表７】
0006469590.tif 000008
＊ヒト血清アルブミン
＊＊配列番号１１９
【０１８０】
（実施例８）
ペプチドＨＳＡ融合タンパク質の設計
様々なリンカーを使用して、ペプチド２６１を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との融合タンパク質として設計し、得られた融合タンパク質を、Ｋｖ１．３に対する効力及び選択性、並びにＴ細胞活性化阻害について試験した。各種リンカーによりＨＳＡと複合させたペプチド２６１によるＩＬ−２分泌の阻害率として測定されたＴ細胞阻害、並びにタリウム流入阻害の結果を表８に掲載する。
【０１８１】
【表８】
0006469590.tif 000009
【０１８２】
リンカーの設計により、より可撓性のグリシンセリン（ＧＳ）リンカーの代わりに、より構造化されたアラニンプロリンリピート（ＡＰ）リンカーを融合タンパク質に挿入すると効力が著しく改良されること、並びにリンカー長を延長させると効力が更に増強されることが示された。ＩＤＣ１（１３ＡＡ）２（配列番号１１３）及びＩＤＣ１（１３ＡＡ）３（配列番号１１４）及び（ＥＡＡＡＫ）８（配列番号１１８）リンカーも効力を改良したものの、精製後に存在する融合タンパク質断片を備えるタンパク質産生中の安定性が明らかに劣っていた。ＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳリンカー（配列番号１１６）によりＨＳＡに複合させたペプチド２６１を備える融合タンパク質ＫＶ１Ｄ２６１＿３４は、Ｋｖ１．３に関し、Ｔ細胞阻害アッセイにおいては約４ｎＭのＩＣ５０を有し、タリウム流入アッセイにおいては約０．４ｎＭのＩＣ５０を有した。
【０１８３】
ｐ２６１及びｐ５７９  ＨＳＡ融合体の特性評価
融合タンパク質ＫＶ１Ｄ２６１＿３４、並びに融合タンパク質ＫＶ１Ｇ４９．ＫＶ１Ｗ７２０を生成するためＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳリンカー（配列番号１１６）によりヒトＨＳＡに複合させた対応する合成ペプチドｐ２６１及びペプチドｐ５７９を、様々な機能アッセイにおいて更に試験した。ヒトＫｖチャネルに対するそれらの選択性は表９に掲載する通りである。
【０１８４】
【表９】
0006469590.tif 000010
ｅｐｈｙｓ：パッチクランプ電気生理試験
＊ＩＣ５０  ２０ｐＭ／１％  ＢＳＡ及び１３ｐＭ／５％  ＦＣＳ
＊＊効力が低いことに起因し濃度応答が不完全。ＩＣ５０は、試験した最も高濃度のものを超過するものとして報告される。
＃  ＣＨＯ細胞におけるＩＣ５０（Ｋｖ１．１）／ＩＣ５０（Ｋｖ．１．３）の比
【０１８５】
ＫＶ１Ｄ２６１＿３４も、ヒト及びブタ（Ｙｕｃａｔａｎミニブタ）全血をもとにタプシガルジン誘導性ＩＬ−１７Ａ生産阻害能について試験した。ヒト及びミニブタのいずれにおいても阻害率のＩＣ５０値は０．５ｎＭであった。ＫＶ１Ｄ２６１＿３４も、１．６ｎＭのＩＣ５０値でミニブタＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化（ＩＬ−２分泌）を阻害した。
【０１８６】
（実施例９）
更なるＣ末端延長ペプチド融合体の作製及び特性評価
数種類のＣ末端延長部分を使用してペプチドｐ２６１（配列番号４２）及びｐ５７９（配列番号３）を延長させて、ＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳ（配列番号１１６）又はＧＳ（ＡＰ）２０ＡＳリンカー（配列番号４２８）によりＨＳＡと複合させた。選択された融合タンパク質を発現させ、精製し、競合結合アッセイ、タリウム流入アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞活性化、並びに電気生理アッセイなどのアッセイにより特性評価した。
【０１８７】
図７Ａには、ペプチドｐ２６１上に様々なＣ末端延長部を有する融合タンパク質の特性を掲載する。Ｔ細胞の阻害率を評価するため、選択された変異体を、１ｎＭの単一濃度での、抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激したヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の阻害率％（１ｎＭでのＴ細胞阻害率）、又は同じアッセイを用いる濃度応答曲線に由来するＩＣ５０値（Ｔ細胞阻害率ＩＣ５０  ｎＭ）のいずれかについて試験した。タリウム流入アッセイにより得た値を用いてＩＣ５０（Ｋｖ１．１）／ＩＣ５０（Ｋｖ１．３）比として選択性を評価した。
【０１８８】
親ＫＶ１Ｄ２６１＿３４非延長ペプチド融合体のＫｉが約１ｎＭであるのに対し、Ｃ末端延長ペプチド融合体タンパク質の競合的結合のＫｉ値は約０．１５ｎＭ〜約１８．０ｎＭの範囲であった。複数の変異体で、効力及び選択性が親ＫＶ１Ｄ２６１＿３４と比較して向上しており、タリウム流入ＩＣ５０値は約１０ｐＭ〜約１ｎＭの範囲であり、かつＫｖ１．１に対する選択性は約３０〜約８００倍であった。
【０１８９】
ペプチド融合タンパク質を選択するため、上記の通りＫｖ１．３を形質移入したＣＨＯ細胞株においてマニュアルパッチクランプ試験を実施した。ＫＶ１Ｇ１５．ＫＶ１Ｗ６８６（ＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳリンカー（配列番号１１６）によりＨＳＡに融合させたＡＨＲＨ（配列番号２０９）を用いるペプチドｐ２６１のＣ末端延長）のＩＣ５０値は１９９ｐＭであった。Ｃ末端挿入の一部では、効力が親ＫＶ１Ｄ２６１＿３４よりも約５〜１０倍に増大するという結果が得られた。
【０１９０】
ＧＳ（ＡＰ）２０ＡＳ（配列番号１１６）により介在されＨＳＡに複合された、選択されたＣ末端延長を備える及び備えない融合タンパク質ｐ５７９を、競合的結合（ＨＥＫ細胞に対する結合に１０ｎＭａｇｉｔｏｘｉｎ−ｃｙｓ−ＴＡＭＲＡが競合）及びＴ細胞阻害（ＩＬ−２分泌）において特性評価し得られた結果を図７Ｂに示す。一部のＣ末端挿入では、結果として、効力が親ＫＶ１Ｇ４９．ＫＶ１Ｗ７２０の約３〜５倍に増大していた。
【０１９１】
ＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳリンカー（配列番号１１６）を使用してペプチド変異体に複合させた数種類のＨＳＡ融合タンパク質を、ＰＢＭＣからのサイトカイン及びケモカイン（ＩＦＮ、ＩＬ−１、ＴＮＦ−、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ１２ｐ７０、及びＩＬ−１３）の分泌誘導能について試験した。これらのＨＳＡ誘導体に何ら誘導は観察されなかった。
【０１９２】
（実施例１０）
ＫＶ１Ｄ２６１薬物動態及びミニブタにおける薬物動態
ＫＶ１Ｄ２６１＿３４（ＡＳ（ＡＰ）２０ＧＳリンカー（配列番号１１６）により介在される２６１ペプチドＨＳＡ融合タンパク質）を、静脈内注射としてミニブタに単回投与した（３０ｎｍｏｌｅｓ／Ｋｇ）。投与後の各時点でヘパリン添加血漿サンプルを採取し、抗２６１  ｃａｐｔｕｒｅ／抗ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ−ＨＲＰ  ＥＬＩＳＡを使用し血漿濃度を求めた。図９には、４頭の実験動物の第３６日目までの、並びに２頭の実験動物の第５４日目（最終日）の時点での平均±ＳＤとして結果を掲載する。融合体タンパク質の半減期（Ｔ１／２）は５〜７日間であり、クリアランス（ＣＬ）は０．００８〜０．０１ｍＬ／分／Ｋｇであり、分布容積（Ｖｓｓ）＝９０〜１２０ｍＬ／Ｋｇであった。
【０１９３】
生体外全血中のリンパ細胞からのＩＬ−１７Ａ分泌を測定することにより、対象との結合度を評価した。投与の４８、２４、１時間前と、ＫＶ１Ｄ２６１＿３４の投与（３０ｎｍｏｌｅｓ／Ｋｇ）後０．０１７〜１２９６時間（５４日間）の時点で、各実験動物から全血を採取した。１μＭの外因性の２６１ペプチドの非存在下又は存在下で、全血サンプルをタプシガルジンにより処理した。各条件について、各サンプルは３連とした抗ブタＩＬ−１７Ａ  ＥＬＩＳＡにおいて、ＩＬ−１７サイトカインレベルを測定し、外因性ペプチド２６１による阻害率（％）を次の通りに算出した。
【０１９４】
１００−（タプシガルジン＋１μＭ外因性２６１反応物における平均ＩＬ−１７ｐｇ／ｍＬ濃度／タプシガルジン添加反応物中平均ＩＬ−１７ｐｇ／ｍＬ濃度）×１００。
【０１９５】
外因性２６１ペプチドによるタプシガルジン誘発性ＩＬ−１７分泌の阻害率（％）（２頭の実験動物を分析した５４日目以外は、４頭の実験動物の平均±ＳＤ）として表される実験結果を図１０に示す。予め投与したサンプル及び投与しなかった対照動物（全ての時点で）の全てについて、外因性２６１によるタプシガルジン誘発性ＩＬ−１７分泌の平均阻害率（％）は７５．３±１４．１％であった。ＫＶ１Ｄ２６１−３４の静脈内注射後約１４日間については、生体外全血における、外因性の２６１による、タプシガルジン誘導性ＩＬ−１７分泌の平均阻害率（％）が２５％以下であったことから、ＫＶ１Ｄ２６１＿３４は循環により高レベルで対象と結合することが示唆される。これらの時点での血漿濃度は１０ｎＭ超であった。後の時点での、外因性２６１によるタプシガルジン誘発性ＩＬ−１７分泌の阻害率（％）は、第３６日目に６５％超に増大し、第５４日目にはベースラインレベルの８０％以上に増大したことから、血漿レベルの低下に伴い、対象との結合は漸減することが示唆される。本試験による所見により、ＫＶ１Ｄ２６１＿３４は、ミニブタの生体において血漿中で安定であり、かつ血漿半減期が長いことが示される。循環しているＫＶ１Ｄ２６１＿３４は生体利用可能であり、静脈内注射後にリンパ細胞によるタプシガルジン誘導性ＩＬ−１７分泌を阻害する。タプシガルジン誘導性ＩＬ−１７分泌の阻害は血漿濃度と良好に相関することが明らかとなり、かつ有効血漿濃度はＫＶ１Ｄ２６１＿３４に提唱されている作用機序（Ｋｖ１．３遮断）と一致した。
【０１９６】
（実施例１１）
ミニブタキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）誘発性遅発性過敏症（ＤＴＨ）モデル
ミニブタ遅発性過敏症（ＤＴＨ）モデルを、ＫＶ１Ｄ２６１＿３４のＴ細胞機能阻害能を評価するための生体内モデルとして使用した。ミニブタに、溶媒（ＰＢＳ，ｎ＝６）又はＫＶ１Ｄ２６１＿３４（３０ｎｍｏｌｅｓ／ｋｇ，ｎ＝６）のいずれかを投与した。陽性対照として、１日目から、剖検するまでの間、１０ｍｇ／ｍＬ（ｎ＝６）濃度で、シクロスポリンＡを１日２回１ｍＬ／ｋｇ皮下投与した。ＫＬＨ抗原による免疫の１日前に投与を開始した。第０日目に、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡＡ）に混合した５ｍｇ／ｍＬ  ＫＬＨ、又は対照群として、ＩＦＡに混合したＰＢＳ、を１ｍＬ皮下注射することにより、ミニブタを免疫した。後肢の尾側の約５箇所に注射した。実験動物には、次に、第７日目に０．１ｍＬ／ｓｐｏｔのＫＬＨ（１０、５、２．５、１．２５ｍｇ／ｍＬ）又はＰＢＳを、左脇腹に対して投与毎に１箇所に、右脇腹には二箇所に投与した。投与後１日目及び２日目となる第９日及び第１０日目に硬化レベルを測定した。第１０日目では、流入領域リンパ節細胞質、抗原に対する抗体力価、投与部位の組織学検査を追加して測定するため、組織及び血液サンプルを採取した。
【０１９７】
投与から２日後の第１０日目に、リンパ節細胞質を定量するため、流入領域リンパ節を採取した。結果を図１１に示す。Ｋｖ１Ｄ２６１＿３４処理した実験動物では、溶媒で処理した実験動物と比較して細胞質が著しく減少していた。細胞質は、免疫していない対照実験動物において観察されたものと匹敵するレベルにまで現用していた。
【０１９８】
第９日目及び第１０日目（免疫から１日及び２日後）では、Ｋｖ１Ｄ２６１＿３４を投与した実験動物において、抗ＫＬＨ抗体の力価における著しい減少又は硬化は検出されなかった。
【図１】
0006469590.tif 000011
【図２Ａ】
0006469590.tif 000012
【図２Ｂ】
0006469590.tif 000013
【図３】
0006469590.tif 000014
【図４Ａ−１】
0006469590.tif 000015
【図４Ａ−２】
0006469590.tif 000016
【図４Ａ−３】
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【図４Ａ−４】
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【図４Ｂ−１】
0006469590.tif 000019
【図４Ｂ−２】
0006469590.tif 000020
【図４Ｂ−３】
0006469590.tif 000021
【図５Ａ】
0006469590.tif 000022
【図５Ｂ】
0006469590.tif 000023
【図５Ｃ】
0006469590.tif 000024
【図６−１】
0006469590.tif 000025
【図６−２】
0006469590.tif 000026
【図６−３】
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【図６−４】
0006469590.tif 000028
【図６−５】
0006469590.tif 000029
【図６−６】
0006469590.tif 000030
【図７Ａ−１】
0006469590.tif 000031
【図７Ａ−２】
0006469590.tif 000032
【図７Ｂ】
0006469590.tif 000033
【図８−１】
0006469590.tif 000034
【図８−２】
0006469590.tif 000035
【図９】
0006469590.tif 000036
【図１０】
0006469590.tif 000037
【図１１】
0006469590.tif 000038
【配列表】
0006469590000001.app