(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質断片が異種の非ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチド足場に融合されたものを含む単離された融合タンパク質であって、単離されたＲＳＶ  Ｆタンパク質断片が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸１９５〜２２８からなり、前記融合タンパク質がモノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片によって特異的に結合される、融合タンパク質。
【請求項２】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヒトＲＳＶ亜型Ａ  Ｆタンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ヒトＲＳＶ亜型Ａが、ＲＳＶ  Ａ２を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、ヒトＲＳＶ亜型Ｂ  Ｆタンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ヒトＲＳＶ亜型Ｂが、ＲＳＶ  １８５３７を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
アミノ酸残基２１２のシステインが置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
アミノ酸残基２１２のシステインがセリンに置換されている、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号５の配列を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１に記載の単離された融合タンパク質であって、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質断片が、配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列からなる、融合タンパク質。
【請求項１０】
前記の異種の非ＲＳＶ  Ｆタンパク質ポリペプチド足場が、表面露出外被タンパク質を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記表面露出外被タンパク質がプロテアーゼインヒビターである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記プロテアーゼインヒビターが、カボチャ属プロテアーゼインヒビターである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記プロテアーゼインヒビターが、テッポウウリ（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）トリプシンインヒビターＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＥＥＴＩ−ＩＩのインヒビターループが、配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４によって置換されている、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号５の配列を含む、融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載のポリヌクレオチド又は請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質及び担体を含む免疫原性組成物。
【請求項２０】
抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体を同定するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質に結合するが、足場のみには結合しない抗体について抗体ライブラリーをスクリーニングするステップを含む、方法。
【請求項２１】
呼吸器合胞体ウイルス融合（ＲＳＶ  Ｆ）タンパク質の表面における高次構造エピトープであって、前記高次構造エピトープが配列番号７又は配列番号９のアミノ酸配列からなり、前記エピトープを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質はモノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片によって特異的に結合されることができ、ただし前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は融合前高次構造であることを条件とする、高次構造エピトープ。
【請求項２２】
前記エピトープを含む融合前高次構造のＲＳＶ  Ｆタンパク質が、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質よりも少なくとも１００倍高い親和性でモノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片によって結合され得る、請求項２１に記載の高次構造エピトープ。
【請求項２３】
前記エピトープが、ヒトＲＳＶ亜型Ａ  Ｆタンパク質の表面に存在する、請求項２１又は２２に記載の高次構造エピトープ。
【請求項２４】
前記エピトープが、ヒトＲＳＶ亜型Ｂ  Ｆタンパク質の表面に存在する、請求項２１又は２２に記載の高次構造エピトープ。
【請求項２５】
モノクローナル抗体Ｄ２５による前記エピトープへの結合が、加熱、長期保存、固定、又は変性によって変更又は破壊される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の高次構造エピトープ。
【請求項２６】
前記Ｆタンパク質の７残基反復配列のＣ末端である、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の高次構造エピトープ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
本出願と共に提出されたＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列表の内容（名称：ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ＿ａｓｃｉｉ．ｔｘｔ；サイズ：３１．３キロバイト；及び作成日：２０１３年３月１４日）は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるものとする。
本発明は呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質エピトープに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科に属する風邪ウイルスである。ＲＳＶは、伝染しやすい毒性ウイルスであり、２歳未満の小児における下気道疾患の最も一般的な原因である。１回のＲＳＶの季節に、託児所に通っている小児の最大９８％が感染することになる。ＲＳＶに感染した小児の０．５％〜３．２％が入院する必要がある。米国では、１年に約９０，０００人の入院及び４５００人の死亡が報告された。ＲＳＶによる入院の主な危険因子は、早産、慢性肺疾患、先天性心疾患、免疫不全、及びその他は健康な６週齢未満の乳児である。十分な栄養及び酸素療法の形態の支持療法の他には、ＲＳＶ陽性細気管支炎に有効な治療がない。抗ウイルス療法、例えば、リバビリンは、ＲＳＶ感染に有効であることは証明されていない。現在利用可能なＲＳＶの予防ワクチンは存在しない。
【０００３】
現在利用可能なＲＳＶに特異的な治療は、米国食品医薬品局によって承認された、高リスクの乳児におけるＲＳＶ下気道疾患の予防用のヒト化モノクローナル抗体、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）とも呼ばれる）のみである。しかしながら、パリビズマブは常に有効というわけではない。別のモノクローナル抗体、本明細書では「ｍｏｔａ」とも呼ばれるモタビズマブが、抗ウイルス活性が増強されたパリビズマブから得られた。パリビズマブ及びモタビズマブの両方は、抗原結合部位Ａ、即ち、アミノ酸２５８〜２７５の間のＲＳＶ−Ｆタンパク質における高度に保存された領域に結合する。パリビズマブ及びモタビズマブを含む殆どの抗Ｆ抗体は、ＲＳＶ−Ｆを折り畳むことができる２つの高次構造、準安定の融合前形態及び高度に安定の融合後高次構造によって共有されているエピトープを認識することが知られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、国際公開第２００８／１４７１９６号パンフレットに開示されている、近年同定された抗ＲＳＶモノクローナル抗体Ｄ２５によって認識されるＲＳＶ−Ｆタンパク質の融合前高次構造における高次構造エピトープ（立体構造エピトープ）を提供する。ＲＳＶ−Ｆ媒介融合の阻害のための有効な標的である融合前ＲＳＶ−Ｆ構造を標的とすることにより、本開示は、非生産的な結合事象を受けにくいより有効な抗ＲＳＶ抗体をスクリーニングする方法も提供し、従って、ＲＳＶ感染のより優れた予防又は治療を提供することができる。
【０００５】
本明細書では、呼吸器合胞体ウイルス融合（ＲＳＶ  Ｆ）タンパク質の表面における高次構造エピトープが提供され、このエピトープは、配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４のうちの少なくとも６つのアミノ酸を含み、このエピトープを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質はモノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって特異的に結合され得る、ただしこのＲＳＶ  Ｆタンパク質は融合前高次構造（状態）であることを条件とする。
【０００６】
一態様では、このエピトープを含む融合前高次構造のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、モノクローナル抗体耐性変異体（ＭＡＲＭ）に由来するＦタンパク質のアミノ酸配列を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質よりも少なくとも１００倍高い親和性で、モノクローナル抗体Ｄ２５又はその断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって結合され得、ＭＡＲＭ由来のＦタンパク質は、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含む。このエピトープは、ヒトＲＳＶ亜型Ａ  Ｆタンパク質の表面に出現し、かつヒトＲＳＶ亜型Ｂ  Ｆタンパク質の表面にも出現し得る。
【０００７】
特定の態様では、本明細書で提供される高次構造エピトープへのｍＡｂ  Ｄ２５の結合は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前高次構造を破壊することが知られている様々な処置、例えば、加熱、長期保存、固定、又は変性によって変更又は破壊される。
【０００８】
本明細書で提供される高次構造エピトープは、Ｆタンパク質の７残基反復配列（ｈｅｐｔａｄ  ｒｅｐｅａｔ）のＣ末端に存在する。
【０００９】
ｍＡｂ  Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体に特異的に結合された、上述の高次構造エピトープを含む単離された抗原−抗体構造がさらに提供される。特定の態様では、この構造は結晶構造である。
【００１０】
配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４から実質的になるＲＳＶ  Ｆタンパク質断片；及びポリペプチド足場（スキャフォールド）を含む、単離された融合タンパク質がさらに提供され、この足場は、モノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって特異的に結合され得る高次構造にＦタンパク質断片を拘束する。特定の態様では、足場は、表面露出外被タンパク質、例えば、プロテアーゼインヒビター、例えば、カボチャ属プロテアーゼインヒビターに由来する。ある特定の実施形態では、足場は、テッポウウリ（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）トリプシンインヒビターＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）に由来する。特定の態様では、ＥＥＴＩ−ＩＩのインヒビターループは、配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４によって置換されている。特定の態様では、融合タンパク質は、配列番号５の配列を含む。
【００１１】
本明細書で提供される融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／又はこのポリヌクレオチド又はこのベクターを含む宿主細胞がさらに提供される。
【００１２】
特定の態様では、本明細書で提供される融合タンパク質は、この融合タンパク質並びに担体、賦形剤、及び／又はアジュバントを含む免疫原性組成物の一部であり得る。
【００１３】
さらなる態様では、本明細書で提供される融合タンパク質は、本明細書で提供される高次構造エピトープに結合する抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体を同定するための方法に使用することができ、この方法は、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質に結合するが、足場のみには結合しない抗体について抗体ライブラリーをスクリーニングするステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、パリビズマブ、モタビズマブ、及びＲ３４７（負の対照として）の結合と比較した、ＲＳＶ  Ａ２ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４０）に感染した未固定及びアセトン固定ＨＥｐ−２細胞へのＤ２５モノクローナル抗体の結合を示している。
【図２】図２は、Ｅｕ3+標識モタビズマブ（「ｍｏｔａ」）及びＤ２５のデノボ又は加熱処理ＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合を示している。ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質で安定にトランスフェクトされた２９３細胞を氷上に維持するか、又は水槽で１５分間、５５℃で処理した。
【図３】図３は、モタビズマブ（「ｍｏｔａ」）及びＤ２５のデノボ又は熱処理ＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合（図３Ｂ）を試験するためのバイオレイヤー干渉分析（図３Ａ）を示している。Ｒ３４７は負の対照として使用した。
【図４】図４は、バイオレイヤー干渉法によって分析した、同じ条件下でのモタビズマブ（「ｍｏｔａ」）のＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合と比較して、４℃で保存後のＤ２５のＲＳＶ−Ｆタンパク質への結合のゆっくりとした減少を示している。
【図５】図５は、モタビズマブ及びＤ２５のデノボ又は熱処理ＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合、これに続くウサギ抗６へリックスバンドルモノクローナル抗体（図５Ｂ）又は抗ＲＳＶ−Ｆ  Ｃ部位モノクローナル抗体１３１１Ｈ（図５Ｂのインサート）のいずれかへの結合を試験するためのバイオレイヤー干渉分析を示している。モタビズマブ及びＤ２５は、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉センサに固定した（図５Ａ）。
【図６】図６は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質における既知の抗原部位を示している。ＲＳＶ−Ｆは、部位Ａ／ＩＩ、Ｂ／Ｉ、及びＣを含む、一般に述べられている少なくとも６つの異なる中和抗原部位を有する。
【図７−１】図７は、Ｄ２５エピトープを同定するために既知の抗原部位を備えた様々な抗ＲＳＶ−Ｆ抗体を用いた競合結合アッセイを示している。１００ｎｇ／ｍｌのビオチン標識Ｄ２５抗体を、全ての結合アッセイに使用した。図７Ａ〜図７Ｄはそれぞれ、Ａ／ＩＩ、Ｂ／Ｉ、及びＣ、又は未知の部位に結合する既知の抗ＲＳＶ−Ｆ抗体による競合を示している。
【図７−２】図７−１の続きである。
【図８】図８は、アミノ酸２０９が抗体ＡＭ２３の中和活性に重要であることを示している。
【図９】図９は、ＲＳＶ−Ｆ野生型配列と、提案されるＤ２５抗原部位におけるＤ２５モノクローナル抗体耐性変異体（ＭＡＲＭ）とのアライメントを示している。四角で囲まれたアミノ酸は、変異を示している。
【図１０】図１０は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質におけるＤ２５エピトープのマッピングを示している。図１０Ａは、同定されたＤ２５モノクローナル抗体耐性変異体（ＭＡＲＭ）における３つのアミノ酸変異の位置を示す図である。図１０Ｂは、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の表面における同定されたＤ２５エピトープの位置を示す空間充填モデルである。白い太字の矢印は、Ｄ２５の結合に重要な同定されたエピトープ領域を示している。
【図１１】図１１は、Ｄ２５  ＭＡＲＭに対するＤ２５の活性とモタビズマブ（「ｍｏｔａ」）モノクローナル抗体の活性とを比較する中和アッセイを示している。
【図１２】図１２は、パリビズマブ及びＤ２５モノクローナル抗体によってＤ２５  ＭＡＲＭに感染した細胞を用いた細胞ベースの中和アッセイを示している。
【図１３】図１３は、ＳＫエピトープの作製を例示する図である。下線が付された配列は、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質のアミノ酸１９５〜２１１に一致し、二重下線が付された配列は、Ｃ２１２Ｓ置換を含む、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質のアミノ酸２１２〜２２８に一致している。
【図１４】図１４は、バイオレイヤー干渉法によって分析された、ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質のＨＲ１領域に結合するＤ２５又はＳＫエピトープに結合するＤ２５の比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本開示において、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」実体という語は、１つ以上のその実体；例えば、「１つのポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、１つ以上のポリヌクレオチドを意味することを理解されたい。従って、「１つの（ａ）」（又は「１つの（ａｎ）」）、「１つ以上の」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用することができる。
【００１６】
さらに、「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの他方を含む又は含まない特定の開示と見なされるものとする。従って、例えば、本明細書で「Ａ及び／又はＢ」などの句に使用される「及び／又は」という語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（のみ）、及び「Ｂ」（のみ）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの句に使用される「及び／又は」という語は、以下の形式のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；及びＣ（のみ）。
【００１７】
態様は、常に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語を用いて本明細書で説明されるが、そうでない場合は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び／又は「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語で説明される類似の態様も提供されることを理解されたい。
【００１８】
特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が関連する技術分野の当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示に使用される多数の用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【００１９】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）の許容される形式で示される。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。特段の記載がない限り、アミノ酸配列は、アミノ酸が左から右にカルボキシ方向に書かれている。本明細書に記載される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、本明細書全体の参照用に記載することができる。従って、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってより詳細に定義される。
【００２０】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という語は、単数の「ポリペプチド」及び複数の「ポリペプチド」を包含し、かつ２つ以上のアミノ酸の任意の１本鎖又は複数鎖を含むものとする。従って、本明細書で使用される「ペプチド」、「ペプチド断片」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、又は２つ以上のアミノ酸の任意の１本鎖又は複数鎖を指すために使用されるその他の語は、一般的には、たとえこれらの語がそれぞれ、より明確な意味を有し得るとしても、「ポリペプチド」の定義に含まれる。「ポリペプチド」という語は、任意のこれらの語の代わりに、又はこれらの語と互換的に使用することができる。用語は、翻訳後修飾を受けた、又は合成後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク分解切断、又は非自然発生のアミノ酸による修飾を受けた「ポリペプチド」をさらに含む。
【００２１】
より具体的には、本明細書で使用される「ペプチド」断片という語は、完全長未満のペプチド、又はその変異体、誘導体、もしくは類似体を包含する。本明細書で開示される「ペプチド断片」、例えば、ＲＳＶ−Ｆペプチド断片は、追加の非ＲＳＶ−Ｆタンパク質成分、例えば、構造的足場として使用される表面露出外被タンパク質を含む融合ポリペプチドの一部であり得る。本明細書に記載されるペプチドはまた、様々な異なる方法で誘導体化され得る。
【００２２】
ＲＳＶ−Ｆペプチド断片を指す場合の「類似体（アナログ）」、「誘導体」又は「変異体（バリアント）」という語は、少なくとも一部の所望の活性、例えば、抗ＲＳＶ抗体への結合を維持している任意のペプチド断片を含む。
【００２３】
本明細書で使用される「変異体」という語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は修飾により、列挙されるペプチドとは異なるペプチドを指す。変異体は、当技術分野で公知の変異誘発技術を用いて作製することができる。変異体はまた、又は別法では、他の修飾を含み得る。例えば、ペプチドは、例えば、半減期を延長する、溶解性を高める、又は安定性を高めるために、異種アミノ酸配列又は他の部分にコンジュゲート又は結合する、例えば、融合することができる。本明細書で提供されるペプチドにコンジュゲート又は結合する部分の例として、限定されるものではないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。ペプチドは、ペプチド（例えば、６−Ｈｉｓ）の合成、精製、もしくは同定を容易にするため、又はポリペプチドの固体支持体への結合を促進するために、リンカー又は他の配列にコンジュゲート又は結合することもできる。
【００２４】
本明細書で使用される「配列同一性」という語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係、又は２つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。１つの配列におけるある位置に、比較配列の対応する位置の同じ核酸塩基又はアミノ酸が存在する場合は、これらの配列は、その位置で「同一」であると言える。パーセント「配列同一性」は、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸が存在する位置の数を決定して、「同一」の位置の数を得ることによって計算する。次いで、「同一」の位置の数を、比較ウィンドウにおける位置の合計数で除し、この値に１００を乗じて「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウに亘って最適に整列した２つの配列を比較することによって決定される。比較用に配列を最適に整列させるために、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部は、基準配列が一定に維持されたまま、ギャップと呼ばれる付加又は欠失を含み得る。最適な整列は、たとえギャップがあっても、基準配列と比較配列との間の「同一」の位置の数を最大限にする整列である。２つの配列間のパーセンテージ「配列同一性」は、プログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」のバージョンを用いて決定することができ、このプログラムは、２００４年９月１日時点でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから入手可能であり、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列の比較用）及びＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列の比較用）を含み、これらのプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）に基づいている。「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を利用すると、語長（３）、オープンギャップペナルティー（１１）、延長ギャップペナルティー（１）、ギャップドロップオフ（５０）、予想値（１０）、及び、限定されるものではないが、マトリックスオプションを含むその他の必要なパラメータに対して、２００４年９月１日時点でデフォルトパラメータであったパラメータを使用することができる。
【００２５】
「抗体」という語は、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はこれらの組み合わせを認識して、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介してこれらに特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用される「抗体」という語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗原結合抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、多重特異性抗体、例えば、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、及び抗体が所望の生物活性を示す場合の、抗原認識部位を含むその他の改変免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はこれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のいずれかとすることができる。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造及び３次元構造を有する。
【００２６】
「特異的に結合する」とは、一般に、抗体が、この抗原結合部位を介してエピトープに結合し、この結合が、抗原結合部位とエピトープとの間にある程度の相補性を伴うことを意味する。この定義によると、抗体は、無作為の無関係のエピトープに結合し得るよりも容易にその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合にエピトープに「特異的に結合」すると言える。
【００２７】
「抗ＲＳＶ抗体」又は「ＲＳＶ抗体」という語は、ＲＳＶウイルスに特異的に結合することができる抗体を指す。
【００２８】
「抗体断片」という語は、無傷の抗体の部分を指す。特に、無傷の抗体の「抗原結合断片」は、抗原に特異的に結合し得る抗体の部分である。抗体断片の例として、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、一本鎖抗体、並びに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００２９】
「エピトープ」という語は、特定の抗体によって認識されて特異的に結合され得る抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続アミノ酸、又はタンパク質の３次折り畳みによって並置された不連続アミノ酸から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に維持されるが、３次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、タンパク質変性時に放出される。エピトープは、典型的には、少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５つ又は８〜１０のユニークな空間的高次構造のアミノ酸を含む。特定の一実施形態では、エピトープは、少なくとも６つのアミノ酸を含む。
【００３０】
「線状エピトープ」又は「連続エピトープ」は、アミノ酸のその線状配列又は一次構造により抗体によって認識されるエピトープである。「高次構造エピトープ」又は「不連続エピトープ」は、その３次構造により抗体によって認識されるエピトープである。これらのエピトープを構成する残基は、一次アミノ酸配列で連続的でなくても良いが、この分子の３次構造で互いに近接する。線状エピトープ及び高次構造エピトープは、一般に、タンパク質が変性される、断片化される、又は還元されるときに異なって挙動する。特定の実施形態では、高次構造エピトープは、タンパク質の一形態、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前高次構造で見られることがあるが、別の高次構造、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合後高次構造では見られない。タンパク質の断片化又はそのジスルフィド結合の還元は、多くの場合、高次構造エピトープを破壊する。
【００３１】
「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、抗体）の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性の相互作用全体の強度を指す。特段の記載がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫD）によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合して容易に解離する傾向にあるが、高親和性の抗体は、一般に、抗原により迅速に結合し、結合を長く維持する傾向にある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で公知であり、いずれも本開示のために使用することができる。特定の例示的な実施形態を以下に説明する。
【００３２】
本明細書で使用される「免疫原性組成物」という語は、ＲＳＶ抗体を含むあらゆる医薬組成物を指し、この組成物は、対象のＲＳＶ感染に関連した疾患及び状態を予防又は治療するために使用することができる。好ましい免疫原性組成物は、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する、刺激する、又は促進することができる。
【００３３】
「組成物」又は「医薬組成物」という語は、例えば、治療を必要とする対象、例えば、ＲＳＶウイルスに感染したヒト対象に投与される薬学的に許容され得る担体、賦形剤、又は希釈剤と共に、本明細書で提供される単離されたポリペプチドを含む組成物を指す。
【００３４】
「薬学的に許容され得る（製薬上許容可能）」という語は、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の毒性又は他の合併症のない、ヒト及び動物の組織との接触に適した、健全な医療診断の範囲内にある組成物を指す。
【００３５】
「対象（被験体）」という語は、本明細書で提供される単離されたポリペプチドを含む組成物を用いた治療を必要とするあらゆる対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、クマ、乳牛、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーなどが挙げられる。一実施形態では、対象はヒト対象である。
【００３６】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科のニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属に属する。ウイルスゲノムは、１１のタンパク質をコードする負の極性の一本鎖ＲＮＡ分子からなる。これらのタンパク質のうちの２つは、ビリオンの主要表面糖タンパク質、即ち（ｉ）ウイルスの細胞表面への結合を媒介する付着タンパク質（Ｇ）、及び（ｉｉ）ウイルスの侵入の際にウイルスと細胞膜との融合を促進するとともに、感染細胞の膜と周囲細胞との融合も促進して合胞体を形成する融合タンパク質（Ｆ）である。２つの主要な抗原グループ、ＡとＢは、最も優勢なグループＡと、主にＧタンパク質における差異によって区別される。
【００３７】
ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、ホモ三量体として構築されるＩ型糖タンパク質である。各単量体は、２つの多塩基部位（Ｉ及びＩＩ）で切断されて融合能を獲得する必要がある不活性前駆体（Ｆ０）として合成される。Ｆタンパク質は、ウイルスが標的膜に結合するまで、ウイルス粒子中で準安定の融合前高次構造をとる。次いで、Ｆタンパク質は、活性化されて一連の高次構造の変化が開始され、これにより、適切なタイミング及び適切な場所で融合が起こる。融合後、Ｆタンパク質は、各単量体からの２つの７残基反復配列（ＨＲ１及びＨＲ２）の配列から構成される、６へリックスバンドル（６ＨＢ）の形成によって主に決定される非常に安定した融合後高次構造を獲得する。融合前構造から融合後構造へのＦタンパク質の変化の際に放出される自由エネルギーが、膜融合のプロセスを促進する。
【００３８】
「ＲＳＶ−Ｆタンパク質」という語は、ＲＳＶウイルス、及びその断片、変異体、類似体、又は誘導体から自然発生的に又は組換え的に形成される完全長Ｆタンパク質を指す。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前高次構造又は融合後高次構造であり得る。特定の実施形態では、ＲＳＶウイルスは、ヒトＲＳＶウイルスである。特定の実施形態では、ＲＳＶウイルスは、亜型Ａである。特定の一実施形態では、ＲＳＶ亜型ＡはＲＳＶ  Ａ２である。他の実施形態では、ＲＳＶウイルスは、亜型Ｂである。特定の一実施形態では、ＲＳＶ亜型ＢはＲＳＶ１８５３７である。別の特定の実施形態では、ＲＳＶ亜型ＢはＲＳＶＢ９３２０である。
【００３９】
「デノボＦタンパク質」又は「融合前Ｆタンパク質」という語は、その融合前構造のＲＳＶ−Ｆタンパク質を指す。未変性のトリガされていないＲＳＶ−Ｆタンパク質が準安定状態で存在し、この状態が、熱エネルギーの増加、例えば、５５℃〜６０℃での１０〜１５分間の加熱などによってより安定した融合６へリックスバンドル高次構造にインビトロで変換され得ることが分かっている。
【００４０】
代表的なＲＳＶ−Ａ（株Ａ２）及びＲＳＶ−Ｂ（株１８５３７）Ｆタンパク質配列を以下に示す。予想されるシグナルペプチドは、二重下線が付され、ｍＡｂ  Ｄ２５のエピトープを含むことが確認された領域は、一重下線が付されている。
株Ａ２由来のＲＳＶ−Ａ  Ｆタンパク質配列（配列番号１）
＞ｇｉ｜２６２７３０５｜ｇｂ｜ＡＡＢ８６６６４．１｜融合Ｆ糖タンパク質前駆体［ヒト呼吸器合胞体ウイルス］
【化１】
0006450688.tif 000002
株１８５３７由来のＲＳＶ−Ｂ  Ｆタンパク質配列（配列番号２）
＞ｇｉ｜２２２５６５｜ｄｂｊ｜ＢＡＡ００２４０．１｜融合タンパク質前駆体［ヒト呼吸器合胞体ウイルス］
【化２】
0006450688.tif 000003
【００４１】
抗ＲＳＶ抗体Ｄ２５
「モノクローナル抗体Ｄ２５」又は「ｍＡｂ  Ｄ２５」という語は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２００８／１４７１９６号パンフレットに既に記載されている、「Ｄ２５」と称される抗ＲＳＶモノクローナル抗体並びにその抗原結合断片、変異体、誘導体、及び／又は類似体を指す。
【００４２】
また、Ｄ２５  ｍＡｂの断片、誘導体、類似体、又は変異体、及びこれらの任意の組み合わせも含まれる。Ｄ２５  ｍＡｂに関する場合の「断片（フラグメント）」、「変異体」、「誘導体」、及び「類似体」という語は、本発明の対応する抗体又は抗体ポリペプチドの少なくとも一部の抗原結合特性を維持しているあらゆるポリペプチドを指す。断片は、本明細書の他で論じられる特定の抗体断片に加えて、タンパク分解断片及び欠失断片を含む。Ｄ２５  ｍＡｂの変異体は、上述の断片、及びアミノ酸の置換、欠失、又は挿入によってアミノ酸配列が変更されたポリペプチドも含む。変異体は、自然発生的又は非自然発生的に起こり得る。変異体抗体は、連続的又は不連続的なアミノ酸の置換、欠失、又は付加を含み得る。本明細書で使用される、Ｄ２５  ｍＡｂの「誘導体」は、官能性側基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する抗体又はその断片を指す。Ｄ２５  ｍＡｂの類似体は、類似性を有する。これは、例えば、本明細書で提供される高次構造エピトープに結合するＤ２５類似体のペプチドライブラリー又はファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって行われる。
【００４３】
ＲＳＶ−Ｆタンパク質のエピトープ
実施例で実証されるように、ｍＡｂ  Ｄ２５は、融合前形態のＲＳＶ  Ｆタンパク質の高次構造エピトープに結合する。Ｄ２５は、可溶性Ｆタンパク質にはあまり結合しない。Ｄ２５は、未固定ＲＳＶ感染細胞の表面に結合するが、固定感染細胞には結合しない。加えて、Ｄ２５は、加熱された、即ち、ＲＳＶ  Ｆタンパク質が融合後高次構造をとるようになるインビトロ処置を受けた感染細胞の表面には結合しない。
【００４４】
この開示は、配列番号７のアミノ酸１〜３４（即ち、配列番号１のアミノ酸１９５〜２２８）又は配列番号９のアミノ酸１〜３４（即ち、配列番号２のアミノ酸１９５〜２２８）のうちの少なくとも６つのアミノ酸を含む、呼吸器合胞体ウイルス融合（ＲＳＶ  Ｆ）タンパク質の表面の高次構造エピトープを提供する。本明細書で提供されるように、このエピトープを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前高次構造である場合は、モノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、類似体、変異体、もしくは誘導体によって特異的に結合され得る。
【００４５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される高次構造エピトープを含む融合前高次構造のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４（ＭＡＲＭ変異体）のアミノ酸配列を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質よりも少なくとも１００倍高い親和性で、モノクローナル抗体Ｄ２５、又はその断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって結合され得る。
【００４６】
本明細書で提供される高次構造エピトープは、例えば、ＲＳＶ株Ａ２に由来するヒトＲＳＶ亜型Ａ  Ｆタンパク質、又は、例えば、ＲＳＶ株１８５３７に由来するヒトＲＳＶ亜型Ｂ  Ｆタンパク質の表面に存在し得る。
【００４７】
また、本明細書で提供される上記の高次構造エピトープを含む単離構造も提供され、このエピトープは、モノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体に特異的に結合する。特定の実施形態では、この構造は結晶構造である。
【００４８】
また、本明細書で提供される高次構造エピトープを含む単離された融合タンパク質も提供される。特定の実施形態では、この融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４及びポリペプチド足場を含む、これらからなる、又は実質的にこれらからなるＲＳＶ  Ｆタンパク質断片を含む。特定の実施形態では、この融合タンパク質は、モノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって特異的に結合され得る高次構造に拘束される。特定の実施形態では、この足場は、表面露出外被タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、この表面露出外被タンパク質は、プロテアーゼインヒビター、例えば、Ｋｕｎｉｔｚ属又はカボチャ属のプロテアーゼインヒビターの１つである。特定の実施形態では、足場タンパク質は、テッポウウリ（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）トリプシンインヒビターＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）である。Ｃｈｒｉｓｔｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２：７９７−８０６（１９９９）。特定の実施形態では、ＥＥＴＩ−ＩＩのインヒビターループは、配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４によって置換される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本明細書で提供されるどのポリペプチドも、融合ペプチドの一部であり得、ＲＳＶ−Ｆエピトープは、構造的足場に高次構造的に拘束される。融合ペプチドは、リンカー配列を含んでも良いし、又は含まなくても良い。一部の実施形態では、エピトープは、表面露出外被タンパク質に融合する。
【００５０】
一実施形態では、ＥＥＴＩ−ＩＩのインヒビターループ（残基３〜８に対応する）は、配列番号１又は配列番号２の残基１９５〜２２８によって置換される。より具体的な実施形態では、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の位置２１２のシステインが置換される。
【００５１】
また、上述の任意の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドも提供される。さらに、ポリヌクレオチドを含むベクター、例えば、発現ベクター、及びポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞も提供される。
【００５２】
本明細書に記載される融合ペプチドを含む組換えＲＳＶ抗原も提供される。特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、免疫原性組成物として製剤することができ、この免疫原性組成物は、これを必要とする対象に投与されると、ＲＳＶに対する免疫応答を誘発することができる。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、１つ以上の担体、賦形剤、又はアジュバントを含む。
【００５３】
本開示の組成物は、既知の方法に従って製剤することができる。適切な製剤方法は、例えば、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に記載されている。組成物は、限定されるものではないが、水溶液、エマルション、ゲル、懸濁液、凍結乾燥形態、又は当技術分野で公知の任意の他の形態を含む様々な形態にすることができる。加えて、この組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、及び防腐剤を含む薬学的に許容され得る添加剤を含み得る。製剤されると、本明細書で提供される組成物は、対象に直接投与することができる。
【００５４】
本明細書で提供される組成物と共に使用することができる担体は、当技術分野で周知であり、限定されるものではないが、例えば、サイログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、及びポリアミノ酸、例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸、インフルエンザ、及びＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質などを含む。様々な水性担体、例えば、水、緩衝用水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、及びヒアルロン酸などを使用することができる。組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌しても良いし、又は滅菌濾過しても良い。得られる組成物は、そのまま使用するためにパッケージングしても良いし、又は凍結乾燥しても良く、この凍結乾燥製剤は、投与の前に滅菌溶液と混合される。組成物は、生理的状態に近づけるために必要な薬学的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調整及び緩衝剤、等張調整剤、及び湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンラウリン酸モノエステル、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含み得る。
【００５５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、本明細書に記載される同じ高次構造エピトープに結合する、従って、Ｄ２５  ｍＡｂに類似した抗ＲＳＶ−Ｆタンパク質抗体を同定する方法に使用することができる。例えば、融合タンパク質は、この融合タンパク質には結合するが、足場タンパク質のみには結合しない抗体について、抗体ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。特定の抗原に特異的に結合する抗体の抗体ライブラリー及びこのような抗体をパニング及び／又はスクリーニングする方法は、当業者には周知である。
【００５６】
実施形態に使用される一部のＲＳＶ−Ｆエピトープ配列を以下の表１に列記する。
【００５７】
表１．ＲＳＶ−Ｆタンパク質構築物の７残基反復配列
１Ａ．ＨＲ１ｘＨＲ２（配列番号３）−  ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質のアミノ酸１５３−２２１（太線）及びアミノ酸４７６−５２０（イタリック体）を含む。
【化３】
0006450688.tif 000004
１Ｂ．ＨＲ１（配列番号４）−  ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質のアミノ酸１５３−２２１（太線）を含む。
【化４】
0006450688.tif 000005
１Ｃ．ＳＫ−エピトープ  −  ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質ＨＲ１領域のアミノ酸１９５−２１１（太線で示され、下線が付されている）、及びＥＥＴＩ−ＩＩのインヒビターループ（図８）を置換する、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の続くアミノ酸２１２−２２８（二重線、Ｃ２１２Ｓ変異を含む）を含む。
【化５】
0006450688.tif 000006
【００５８】
本発明の実施は、特段の記載がない限り、当業者の技術の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を利用することになる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
【００５９】
抗体工学の一般的な原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に説明されている。タンパク質工学の一般的な原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に説明されている。抗体及び抗体とハプテンの結合の一般的な原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に説明されている。加えて、当技術分野で公知であるが、具体的に記載されていない免疫学における標準的な方法は、一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）及びＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ＮＹ）に説明されている。
【００６０】
免疫学の一般的な原理を説明する標準的な参考文献として、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ  ｅｄ．；Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ＆Ｃｏ．）；Ｒｏｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ  ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ２００３）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）が挙げられる。
【００６１】
上記の全ての参考文献及び本明細書で言及される全ての参考文献は、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。
【００６２】
以下の実施例は、限定のためではなく例示のために記載される。
【実施例】
【００６３】
実施例１
Ｄ２５は融合前形態のＲＳＶ−Ｆタンパク質を発現する細胞に結合する
抗体Ｄ２５によって認識される中和エピトープに結合するための要件を理解するため、多数の戦略を利用した。
【００６４】
まず、Ｄ２５が融合前又は融合後高次構造のＲＳＶ−Ｆタンパク質に結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、ＲＳＶ−Ａ２ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４０）に感染したアセトン固定又は未固定ＨＥｐ−２細胞へのＤ２５の結合を試験した。他の２つの抗ＲＳＶ−Ｆタンパク質モノクローナル抗体、即ち、パリビズマブ及びモタビズマブの結合も試験した。Ｒ３４７を、結合の負の対照として使用した。
【００６５】
ＨＥｐ２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２３）を、９６ウェルプレートにおいて、５％ＦＢＳが添加されたＥＭＥＭ培地で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた。細胞を、ＲＳＶ  Ａ２ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１５４０）の０．５〜１．０（約５×１０4の総細胞数／ウェルと仮定）の複数の感染によって感染させた。感染の２４時間後、培地を除去し、細胞を、乾燥させることによって（未固定）、又は８０％アセトンで２０分間処置してから乾燥させることによってプレートに固定した。感染細胞の層を、１％カゼインブロック（Ｔｈｅｒｍｏ）で１時間ブロックしてから、１０００ｎｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌの範囲のカゼインで希釈した抗体と共にインキュベートした。抗体を、室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、抗ヒトＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：１００００の希釈物と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ試薬（ＫＰＬ）を用いて発色させた。４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００６６】
図１Ａに示されているように、Ｄ２５は、未固定ＲＳＶ−Ａ２感染ＨＥｐ−２細胞に濃度依存的に結合したが、アセトン固定ＲＳＶ−Ａ２感染ＨＥｐ−２細胞（図１Ｂ）への結合は殆ど示されず、その一方、パリビズマブ及びモタビズマブは、固定細胞及び未固定細胞の両方に同様に結合した。
【００６７】
実施例２
Ｄ２５は熱処理ＲＳＶ−Ｆタンパク質に結合しない
Ｄ２５が、融合前ＲＳＶ−Ｆタンパク質の高次構造エピトープのみを認識することを確認するために、Ｅｕ3+標識Ｄ２５の結合を、融合前形態を示す非加熱デノボＲＳＶ−Ｆタンパク質、又は融合後形態をとる加熱（反転）ＲＳＶ−Ｆタンパク質について試験した。
【００６８】
テトラサイクリン誘導プロモーターの下でＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質配列を発現する安定にトランスフェクトされた２９３株（ＴＲＥX−Ｆ細胞）は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨｕａｎｇ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ４０：２１２−２２１（２０１０）に既に記載されている。モタビズマブ、Ｄ２５、及びＲ３４７（負の対照として）を、Ｄｅｌｆｉａ  Ｅｕ−Ｎ１−ＩＴＣ標識キレートを用いてＥｕ3+標識し、製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の指示に従って特徴付けた。ＴＲＥｘ−Ｆ細胞をコンフルエンスになるまで増殖させ、Ｆタンパク質の発現を、誘導後２０時間、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで誘導した。次いで、細胞を収集し、５０％培地／５０％ＬＲ結合バッファー（Ｔｒｉｓベースの緩衝液系、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中、約１×１０7の生細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。細胞を、氷上で維持するか、又は水槽で１５分間、５５℃で処置した。約１×１０5の細胞を、１００μｌの反応量のＬＲ結合バッファー中、２５  ｎＭ  Ｅｕ3+標識モタビズマブ、Ｄ２５、又はＲ３４７と混合した。細胞とモノクローナル抗体を、４℃で１時間インキュベートし、次いで、Ｐａｌｌ  ＧＨＰ真空濾過プレートに添加した。非結合モノクローナル抗体を、Ｄｅｌｆｉａ  Ａｓｓａｙ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を含む２００μｌの洗浄液で５回洗い流し、Ｅｕ3+蛍光を、２００μｌのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の添加で放出させた。軽く振盪させながら３７℃で１時間インキュベートした後に、時間分解蛍光をＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。Ｅｕ3+カウントを、結合ｎｇ  ＩｇＧに変換し、特定の結合モタビズマブ又はＤ２５を、全ての結合からＲ３４７非特異的結合を減じることによって計算した。
【００６９】
図２に示されているように、ＲＳＶ−Ｆ発現２９３細胞の５５℃で１５分間の加熱により、Ｄ２５の細胞への結合がほぼ完全に消失したが（図２Ｂ）、モタビズマブの結合の減少はほんの僅かであった（図２Ａ）。従って、この細胞結合アッセイの結果は、融合前形態のＲＳＶ−Ｆタンパク質のみに存在する高次構造エピトープにＤ２５が結合することを裏付けている。
【００７０】
実施例３
バイオレイヤー干渉分析によるＤ２５結合試験
バイオレイヤー干渉分析を使用して、Ｄ２５のＲＳＶ−Ｆタンパク質への結合に対する、加熱又は４℃での長期保存によるＲＳＶ−Ｆタンパク質の高次構造の変化の影響を決定した。
【００７１】
図３Ａに例示されているように、加熱の影響を試験するために、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の規定Ｃ部位に反応するモノクローナル抗体１３３１Ｈ（Ｙｕｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９６（２）：２２６−２３７（２０１０）；Ｂｅｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３（７）：２９４１−２９５０（１９８９））を、抗マウスＦｃ捕捉センサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に結合させた。このセンサをまず、６０℃で１０分間加熱されたＲＳＶ−Ｆタンパク質又は非加熱（デノボ）のＲＳＶ−Ｆタンパク質と共にインキュベートし、次いで、モタビズマブ、Ｒ３４７（負の対照）を含むウェルに移した。抗体のセンサ＋１３３１Ｈ＋ｓＦの複合体への結合は、ｎｍの光の変化（Δｎｍ）である信号測定値の振れとして検出した。
【００７２】
図３Ｂに示されているように、実施例２の細胞結合の結果に一致して、ＲＳＶ−Ｆタンパク質に結合するＤ２５は、Ｆタンパク質が加熱されるとほぼ完全に消失したが、モタビズマブは、デノボ及び加熱ＲＳＶ−Ｆタンパク質の両方に結合した。
【００７３】
同様に、４℃での長期保存の影響を試験するために、センサ＋１３３１Ｈの複合体をまず、ＣＤ  ＣＨＯ培地中、４℃で６〜７週間保存したＲＳＶ−Ｆタンパク質又は保存しなかったＲＳＶ−Ｆタンパク質と共にインキュベートし、次いで、Ｄ２５又はモタビズマブを含むウェルに移し、Δｎｍを測定した。
【００７４】
図４は、ＣＤ  ＣＨＯ培地中、４℃で保存したときに、恐らくＦタンパク質の高次構造の変化により、Ｄ２５のＲＳＶ−Ｆタンパク質への結合がゆっくりと減少したことを示している。対照的に、モタビズマブは、４℃で７週間の保存後も結合の減少を示さず、モタビズマブが非高次構造エピトープを認識するという知見に一致していた。
【００７５】
総合すると、これらのバイオレイヤー干渉分析実験は、Ｄ２５が、融合前形態のＲＳＶ−Ｆタンパク質で存在する高次構造エピトープに反応することをさらに裏付けている。
【００７６】
実施例４
Ｄ２５は抗６へリックスバンドル抗体と競合しない
特に、Ｄ２５が、十分に特徴付けられたエピトープ領域を有する他のＲＳＶ抗体と競合するか否かを試験するために、バイオレイヤー干渉分析を使用して、Ｄ２５エピトープの位置をさらに決定した。
【００７７】
図５Ａに例示されているように、Ｄ２５、モタビズマブ、又は負の対照抗体Ｒ３４７が、１．５μｇ／ｍｌの濃度で抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉センサ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に結合した。センサを、キネティックバッファー（ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を含むウェルに移して基準値を定めてから、６０℃に１０分間加熱されたｓＦ含有ＣＨＯ培地又は未処理のｓＦ含有ＣＨＯ培地のいずれかを含むウェルに移した。センサを、融合後形態のＲＳＶ−Ｆタンパク質の６へリックスバンドルに反応する３０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製ウサギポリクローナルＩｇＧ、又は１５μｇ／ｍｌのｍＡｂ  １３３１Ｈ、即ち、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の規定Ｃ部位に反応する抗体を含む次のウェルに移した（Ｙｕｎｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３９６（２）：２２６−２３７（２０１０）；Ｂｅｅｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６３（７）：２９４１−２９５０（１９８９））。全ての結合曲線は、負の対照抗体に対して減じられた基線とした。タンパク質のセンサへの結合は、ｎｍの光の変化（Δｎｍ）である信号測定値の振れとして検出した。
【００７８】
図５Ｂに示されている結果は、Ｄ２５が非加熱（融合前）ＲＳＶ−Ｆタンパク質には結合するが、ウサギ抗６へリックスバンドル（６ｘＨＢ）抗体に対して強い結合性を有する加熱処理（融合後）Ｆタンパク質には結合しないことを裏付けている。図５Ｂのインサートは、Ｄ２５と１３３１Ｈとが、融合前形態のＲＳＶ−Ｆタンパク質における異なるエピトープを認識することを示している。
【００７９】
実施例５
Ｄ２５は抗原部位Ａ、Ｂ、又はＣに結合する抗体と競合しない
ＲＳＶ−Ｆタンパク質は、一般に述べられている少なくとも６つの異なる中和抗原部位を有する。既に同定された抗ＲＳＶモノクローナル抗体、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、モタビズマブ、１１５３、１１２１、１３／１９、９２−１１Ｃ、１３１−２Ａ、１３３１Ｈ、及び１３０８Ｆは、図６に例示されているように十分に特徴付けられた抗原部位Ａ／ＩＩ、Ｂ／Ｉ、又はＣに結合する。
【００８０】
Ｄ２５が、これらの十分に特徴付けられた抗原領域のうちのいずれか１つに結合するか否かを決定するために、競合結合アッセイを行って、前述の抗ＲＳＶ抗体のいずれかが、その抗原部位についてＤ２５と競合するか否かを試験した。１００ｎｇ／ｍｌのビオチン標識Ｄ２５抗体を、全ての結合アッセイに使用した。非標識Ｄ２５を正の対照として使用し、Ｒ３４７を負の対照として使用した。吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００８１】
図７Ａ〜図７Ｃに示されているように、抗原部位Ａ、Ｂ、又はＣに結合することが知られている抗体のいずれも、ＲＳＶ−Ｆタンパク質へのその結合についてＤ２５と競合することができず、Ｄ２５が部位ＡＢ、又はＣに結合しないことを示唆した。他方、図７Ｄに示されているように、未知の抗原部位、即ち、ＡＭ２２及びＡＭ２３を含む少数の抗ＲＳＶ−Ｆ抗体は、結合アッセイでＤ２５と効果的に競合し、ＡＭ２２及びＡＭ２３のエピトープとのＤ２５のエピトープの重複を示唆した。ＡＭ２３は、ＡＭ２２よりもＤ２５とより効果的に競合し、ＡＭ２３のエピトープがＤ２５のエピトープにより類似している可能性を示唆した。
【００８２】
ＡＭ２２及びＡＭ２３はそれぞれ、米国特許出願公開第２０１２／００７０４４６  Ａ１号明細書及び同第２０１０／０２３９５９３  Ａ１号明細書に既に開示されていた。ＡＭ２３は、１つの臨床分離株（ＣＰ０９６−Ｂ１５）を除き、どのＲＳＶ−Ｂ株も中和しないことが既に分かっていた。また、アミノ酸２０９は、ＡＭ２３の中和活性に重要であることも分かっていた（図８）。総合すると、これらの結果は、Ｄ２５が、アミノ酸２０９を含む抗原性領域に結合し得ることを示唆している。
【００８３】
実施例６
Ｄ２５エピトープのマッピング
この実施例は、ＲＳＦ−Ｆタンパク質のどのアミノ酸がＤ２５の結合にとって重要であるかをさらに決定するために、Ｄ２５によって中和され得ない一連のモノクローナル抗体耐性変異体（ＭＡＲＭ）の作製を報告する。
【００８４】
この分析は、ＲＳＶウイルスのＡ分離株及びＢ分離株に対して行った。簡単に述べると、１〜５×１０6ｐｆｕ／ｍｌのＲＳＶ  Ａ２ウイルス又はＲＳＶ  Ｂ  １８５３７ウイルスを、４５０ｎｇ／ｍｌ（２００×ＩＣ50）のＤ２５  ｍＡｂで１時間インキュベートしてから、２４ウェルプレートのコンフルエントＨＥｐ２細胞に感染させた。感染から最大６日後、プレートを凍結させ、そして解凍してウイルスを放出させ、このプロセスの上清を、新しいＨｅｐ２細胞のコンフルエント層で継代し、４５０ｎｇ／ｍｌのＤ２５と共に２時間インキュベートした。上記のように第２の継代に対して第３の継代を行った。３回の選択後のウイルス収量は、Ａ２ウイルスで８×１０5〜３×１０6であり、Ｂウイルスで１．３×１０4〜５×１０4であった。第３の継代後、細胞を保持し、溶解し、全ＲＮＡを細胞から単離した。Ｆタンパク質遺伝子をＰＣＲによって増幅し、配列決定した。
【００８５】
８つのＤ２５  ＭＡＲＭＳ（ＲＳＶ  ＭＡＲＭ  Ａ１〜Ａ５及びＢ１〜Ｂ３）を単離した。ＭＡＲＭ  Ａ１〜Ａ５は、同じ変異を有することが分かった（図９）。ＭＡＲＭ  Ｂ２及びＢ３は、同じ変異を有することが分かった（図９）。
【００８６】
ＲＳＶ  ＭＡＲＭ  Ａ１、Ｂ１、及びＢ２の変異Ｆタンパク質は、以下及び図１０Ａに示される。シグナルペプチドには、二重下線が付され、野生型ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２タンパク質の高次構造エピトープを含む領域には下線が付されている。各変異についての変異アミノ酸は、太字で示されている。
ＭＡＲＭ  Ａ１  Ｆタンパク質配列（配列番号１２）
【化６】
0006450688.tif 000007
ＭＡＲＭ  Ｂ１  Ｆタンパク質配列（配列番号１３）
【化７】
0006450688.tif 000008
ＭＡＲＭ  Ｂ２  Ｆタンパク質配列（配列番号１４）
【化８】
0006450688.tif 000009
【００８７】
変異は、ＭＡＲＭ  Ａ１変異ウイルスのアミノ酸Ｎ２０８Ｙ、ＭＡＲＭ  Ｂ１変異ウイルスのアミノ酸Ｎ２０１Ｄ、及びＭＡＲＭ  Ｂ２ウイルスのアミノ酸Ｌ２０４Ｖに位置していた。この領域（上記の配列の下線が付された部分）は、Ｃ末端から、タンパク質の融合プロセスに重要なＦタンパク質の規定７残基反復配列までである。この同定されたＤ２５エピトープ領域（図１０Ｂに太い白の矢印で示されている部分）は、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の表面上にある。
【００８８】
配列を以下の表２で比較する。
【００８９】
0006450688.tif 000010
【００９０】
実施例７
Ｄ２５  ＭＡＲＭの中和アッセイ
単離されたＤ２５  ＭＡＲＭを試験するためにＲＳＶマイクロ中和アッセイを行った。この試験は、細胞ベースのＥＬＩＳＡアッセイであり、このアッセイでは、感染ＨＥｐ−２細胞を野生型又は変異Ｆタンパク質の発現に対して染色し、抗体の結合について試験した。
【００９１】
まず、モノクローナル抗体モタビズマブを、全ての同定されたＤ２５  ＭＡＲＭに対する中和活性についてＤ２５と比較した。Ｄ２５又はモタビズマブの希釈物（１〜１０００ｎｇ／ｍｌ）を中和アッセイに使用し、野生型ＲＳＶウイルスを正の対照として使用した。図１１に示されているように、モタビズマブは、１００ｎｇ／ｍｌ以下のモタビズマブを用いると、野生型ＲＳＶウイルス及び全てのＤ２５  ＭＡＲＭの両方を中和することができたが（図１１Ｃ及び図１１Ｄ）、Ｄ２５は、１〜１０００ｇ／ｍｌの量を使用すると、野生型ウイルスのみを中和することができたが、いずれのＭＡＲＭも中和することができなかった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
【００９２】
Ｄ２５とパリビズマブとの中和活性を比較する同様の実験を行った。Ｄ２５又はパリビズマブの希釈物（０．０１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ）をマイクロ中和アッセイに使用し、野生型ＲＳＶウイルスを正の対照として使用した。図１２に示されているように、約１μｇ／ｍｌのＤ２５は、野生型ＲＳＶウイルスを中和することができ、約１００μｇ／ｍｌのパリビズマブは、３つ全てのＤ２５  ＭＡＲＭを中和することができた。Ｄ２５  ＭＡＲＭ  Ｂ１及びＭＡＲＭ  Ｂ２の両方は、Ｄ２５の中和に対して完全に感受性がなく（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）、位置２０１及び２０４のアミノ酸がＤ２５の結合に重要であることを示唆した。他方、Ｄ２５は、Ａ２  ＭＡＲＭを中和できたが、野生型Ａ２を中和するために必要な濃度よりも、最小でも１００倍高い濃度であった。
【００９３】
実施例８
ＨＲ１及びＳＫエピトープの作製
実施例５で言及したように、Ｄ２５の結合に重要な同定された領域は、Ｃ末端から、タンパク質の融合プロセスに重要なＦタンパク質の規定ＨＲ１までである。従って、ＨＲ１領域（図１Ｂ）を含む構築物を、Ｄ２５の結合を試験するために作製した。
【００９４】
さらに、拘束された構造における７残基反復配列のＣ末端の延長及びＮ末端の切断は、Ｄ２５エピトープの融合前構造をより反映し得ると思われる。ＳＫエピトープと呼ばれるこの構築物は、図１３に例示されているように、テッポウウリ（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）トリプシンインヒビターＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）のスカッシュノット（ｓｑｕａｓｈ  ｋｎｏｔ）（ＳＫ）構築物の第１のループにおけるＡ２由来のＲＳＶ−Ｆタンパク質のアミノ酸１９５〜２２８を含む。ＲＳＶ−Ｆタンパク質の位置２１２のシステインは、セリンによって置換されていた。
【００９５】
これらの構築物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させ、タンパク質を結合アッセイのために精製した。
【００９６】
実施例９
Ｄ２５はＨＲ１領域よりもＳＫエピトープにより強く結合する
Ｄ２５のＳＫエピトープに対する結合親和性とＨＲ１領域に対する結合親和性とを比較するために、バイオレイヤー干渉分析を行った。Ｄ２５を、１．５６２５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の濃度で抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ捕捉センサに適用した。センサをキネティックバッファーに移して基準値を設定し、次いで、ＨＲ１断片又はＳＫエピトープ構築物のいずれかを含むウェルに移した。
【００９７】
図１４に示されているように、Ｄ２５は、濃度依存的にＨＲ１及びＳＫエピトープの両方に結合した。しかしながら、Ｄ２５は、計算したＫD値によって示されているように、ＨＲ１よりもＳＫエピトープに対して高い親和性を示した（ＳＫエピトープの５８．５ｐＭに対してＨＲ１の１．９ｎＭ）。
【００９８】
本開示は、その個々の態様の１つの例示であることを意図した、記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に均等である全ての組成物又は方法は、本開示の範囲内である。実際、本明細書に図示及び記載されているものだけではなく、本開示の様々な変更形態が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。  本発明の実施形態として、例えば以下を挙げることができる。
(1)  配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４のうちの少なくとも６つのアミノ酸を含む、呼吸器合胞体ウイルス融合（ＲＳＶ  Ｆ）タンパク質の表面における高次構造エピトープであって、前記エピトープを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質はモノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって特異的に結合されることができ、ただし前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は融合前高次構造であることを条件とする、高次構造エピトープ。
(2)  前記エピトープを含む融合前高次構造のＲＳＶ  Ｆタンパク質が、配列番号１２、配列番号１３、又は配列番号１４のアミノ酸配列を含むＲＳＶ  Ｆタンパク質よりも少なくとも１００倍高い親和性でモノクローナル抗体Ｄ２５又はその断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって結合され得る、(1)に記載の高次構造エピトープ。
(3)  前記エピトープが、ヒトＲＳＶ亜型Ａ  Ｆタンパク質の表面に存在する、(1)又は(2)に記載の高次構造エピトープ。
(4)  前記エピトープが、ヒトＲＳＶ亜型Ｂ  Ｆタンパク質の表面に存在する、(1)又は(2)に記載の高次構造エピトープ。
(5)  ｍＡｂ  Ｄ２５による前記エピトープへの結合が、加熱、長期保存、固定、又は変性によって変更又は破壊される、(1)〜(4)のいずれかに記載の高次構造エピトープ。
(6)  前記Ｆタンパク質の７残基反復配列のＣ末端である、(1)〜(5)のいずれかに記載の高次構造エピトープ。
(7)  単離された構造であって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４のうちの少なくとも６つのアミノ酸；及び
（ｂ）モノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体
を含み、前記（ａ）が前記（ｂ）に特異的に結合する、構造。
(8)  結晶構造である、(7)に記載の構造。
(9)  単離された融合タンパク質であって、
（ａ）配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４から実質的になるＲＳＶ  Ｆタンパク質断片；及び
（ｂ）ポリペプチド足場
を含み、前記融合タンパク質が、モノクローナル抗体Ｄ２５又はその抗原結合断片、変異体、類似体、もしくは誘導体によって特異的に結合され得る高次構造に拘束されている、融合タンパク質。
(10)  前記足場が、表面露出外被タンパク質を含む、(9)に記載の融合タンパク質。
(11)  前記表面露出外被タンパク質がプロテアーゼインヒビターである、(10)に記載の融合タンパク質。
(12)  前記プロテアーゼインヒビターが、カボチャ属プロテアーゼインヒビターである、(11)に記載の融合タンパク質。
(13)  前記プロテアーゼインヒビターが、テッポウウリ（Ｅｃｂａｌｌｉｕｍ  ｅｌａｔｅｒｉｕｍ）トリプシンインヒビターＩＩ（ＥＥＴＩ−ＩＩ）である、(12)に記載の融合タンパク質。
(14)  前記ＥＥＴＩ−ＩＩのインヒビターループが、配列番号７のアミノ酸１〜３４又は配列番号９のアミノ酸１〜３４によって置換されている、(13)に記載の融合タンパク質。
(15)  配列番号５の配列を含む、(14)に記載の融合タンパク質。
(16)  (9)〜(15)のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
(17)  (16)に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(18)  (16)に記載のポリヌクレオチド又は(17)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(19)  (9)〜(15)のいずれかに記載の融合タンパク質及び担体を含む免疫原性組成物。
(20)  抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体を同定するための方法であって、(9)〜(15)のいずれかに記載の融合タンパク質に結合するが、足場のみには結合しない抗体について抗体ライブラリーをスクリーニングするステップを含む、方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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