(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる医薬組成物又は食品の製造方法であって、
ノビレチンを含むポンカンからブタノールによって抽出されたブタノール抽出物を得る工程と、
前記ブタノール抽出物に、ノビレチンを含有させる工程と、を含む、
ことを特徴とする医薬組成物又は食品の製造方法。
【請求項２】
前記ポンカンの濃度が２０μｇ／ｍＬから２５００μｇ／ｍＬであり、
前記ノビレチンの濃度が１．２μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬである、
ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物又は食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物および食品に関し、特に中枢神経疾患の予防及び治療に用いられるカミツレを含有する医薬組成物及び食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
超高齢化社会に伴う認知症患者数の増加は、深刻な社会問題となっている。今後さらに高年齢者の数が増加することが予測されており、認知症を予防または治療する医薬品（医薬組成物）、食品に対する要求は増加すると考えられる。
記憶障害改善作用と作用機構を明らかにした植物由来成分として、例えば、柑橘類果皮由来のノビレチンが知られている（特許文献１）。
【０００３】
ノビレチンは、アルツハイマー病モデルを含む様々な記憶障害モデル動物において、その記憶障害を改善する。その作用機序として、ｐｒoｔｅｉｎ ｋｉｎａｓe Ａ（ＰＫＡ）／（ＥＲＫ）／ｃＡＭＰ（ＣＲＥ）-ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｔｅｉｎ（ＣＲＥＢ）細胞内シグナル経路を活性化し、ＣＲＥ依存性転写を亢進して記憶学習関連遺伝子の発現を亢進することが知られている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１１１６６４号公報
【特許文献２】特開２００７−６１０２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在までに、認知症、特にその半数を占めるアルツハイマー病に対する予防や進行抑制効果を持つ決定的な臨床薬は存在していない。そのため、アルツハイマー病に対する予防や進行抑制効果を持つ医薬組成物や食品が求められている。
【０００６】
そこで、本発明は、中枢神経疾患の予防及び進行を抑制する効果をもつ医薬組成物及び食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の医薬組成物は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる医薬組成物であって、柑橘系植物のブタノール抽出物を含有することを特徴とする。
【０００８】
本発明の医薬組成物は、柑橘系植物のブタノール抽出物に加え、さらにノビレチンを含有することを特徴とする。
【０００９】
本発明の医薬組成物は、柑橘系植物のブタノール抽出物の濃度が２０μｇ／ｍＬから２５００μｇ／ｍＬであり、ノビレチンの濃度が１．２μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬであることを特徴とする。
【００１０】
本発明の食品は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品であって、柑橘系植物のブタノール抽出物を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の医薬組成物は、柑橘系植物のブタノール抽出物を含有することで、ＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させる。そのため、この医薬組成物は、中枢神経疾患の予防及び進行を抑制することができ、中枢神経疾患の予防及び治療に用いることができる。
【００１２】
また、本発明の医薬組成物は、柑橘系のブタノール抽出物に加え、さらにノビレチンが含有することで、ブタノール抽出物の成分がノビレチンの効果を増強させる。そのため、相加効果・相乗効果により、ＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させることができる。
【００１３】
また、本発明の医薬組成物は、柑橘系植物のブタノール抽出物の濃度を２０μｇ／ｍＬから２５００μｇ／ｍＬとし、ノビレチンの濃度を１．２μｇ／ｍＬから２μｇ／ｍＬとすることで、ノビレチンのみが含有している医薬組成物に比べ、ルシフェラーゼ活性を向上させることができる。なお、柑橘系植物の抽出物の濃度に依存して、ルシフェラーゼ活性が向上するため、上記の柑橘系植物のブタノール抽出物の濃度より高い場合でも、ルシフェラーゼ活性を向上する効果が生じる。
【００１４】
さらに、本発明では、柑橘系植物の乾燥物または抽出液を含有し、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品をも提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮の純水抽出液（試料１群）、アルカリ還元水抽出液（試料２群）、９９％エタノール抽出液（試料３群）、５０％エタノール抽出液（試料４群）を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図２】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮のメタノール抽出液、ヘキサン抽出液、酢酸エチル抽出液、ブタノール抽出液、熱水抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図３】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮のヘキサン抽出液、エタノール抽出液、ブタノール抽出液、熱水抽出液にノビレチン溶液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図４】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮のブタノール抽出液におけるフラクション１Ａ〜１Ｅを添加した場合および、フラクション１Ａ〜１Ｅにノビレチン溶液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図５】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮のブタノール抽出液におけるフラクション２Ａ〜２Ｅを添加した場合および、フラクション２Ａ〜２Ｅにノビレチン溶液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図６】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮のブタノール抽出液における、成分濃度の異なるフラクション２Ａ及び２Ｅを添加した場合および、成分濃度の異なるフラクション２Ａ及び２Ｅにノビレチン溶液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【図７】本実施形態に係る柑橘系植物であるポンカンの皮の亜臨界抽出したメタノール抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本実施形態に係る医薬組成物は、柑橘系植物であるポンカンの皮の乾燥物または抽出物を含有し、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられるものである。また、本実施形態に係る医薬組成物は、柑橘系植物であるポンカンの皮の乾燥物または抽出物にノビレチンをさらに含有するものである。これらの医薬組成物は、特に、アルツハイマー病やパーキンソン病の予防及び治療に用いることができる。
【００１７】
柑橘系植物は、静岡県清水市産の太田ポンカン（ミカン科植物）を使用した。このポンカンの皮を純水（熱水）、アルカリ還元水（熱水）、９９％エタノール及び５０％エタノールによって、それぞれ抽出を行った。ポンカン皮の抽出物の濃度は、１５０〜５０００μｇ／ｍＬに調整した。
ノビレチン（ｎоｂｉｌｅｔｉｎ）は、柑橘系植物から抽出したものを使用した（純度９９％）。ノビレチンは、所定の濃度（５μＭ〜５０μＭ）となるように、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（以下、ＤＭＳＯと記す。）に溶解させた。
なお、ノビレチン濃度５μＭは２μｇ／ｍＬ、ノビレチン濃度３０μＭは１２μｇ／ｍＬ、ノビレチン濃度５０μＭは２０μｇ／ｍＬにそれぞれ相当する。
【００１８】
試料の遺伝子転写活性を評価するためにルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。
ルシフェラーゼアッセイは、被検物質の有する転写活性を定量的に解析するために使用されるものである。転写が活性化するためには、遺伝子の上流プロモーターに存在する様々な制御配列が必要である。
本実施例では、ＰＫＡ／ＥＲＫ／ＣＲＥＢ細胞内シグナルによって活性化される制御配列であり、かつ記憶学習関連遺伝子の上流プロモーターに存在するＣＲＥ配列と、発光酵素であるルシフェラーゼの遺伝子を連結したプラスミドを使用した。
被験物質がＣＲＥ依存性の転写を活性化した場合、その下流にあるルシフェラーゼ遺伝子が発現し、上昇してルシフェラーゼタンパク質が細胞内で増加する。そうすると、基質を添加することで蛍光を発するため、その吸光度を測定し、転写活性を定量できる。
ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫由来細胞株）を９６穴培養ディッシュに播種濃度４．０×１０４個／穴で播種した。その後、プラスミドをＰＣ１２細胞内に導入し、各試料を滴下した培地で培養した。培地には、１％血清を添加したα改変ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した。
ＰＣ１２細胞を所定時間培養した後、試料をそれぞれ１００μＬ加えた培地に交換し、培養ディッシュを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で、５時間インキュベートし、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。
【００１９】
添加した試料は、以下の通りである。
試料１群：純水（熱水）抽出液
（ポンカン皮抽出物の濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対するポンカン皮抽出物の濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
試料２群：アルカリ還元水（熱水）抽出液
（ポンカン皮抽出物の濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対するポンカン皮抽出物の濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
試料３群：９９％エタノール抽出液
（ポンカン皮抽出物の濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対するポンカン皮抽出物の濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
試料４群：５０％エタノール抽出液
（ポンカン皮抽出物の濃度：１５０〜５０００μｇ／ｍＬ）
（培地に対するポンカン皮抽出物の濃度：１５〜５００μｇ／ｍＬ）
【００２０】
図１は、１５０μｇ／ｍＬ〜５０００μｇ／ｍＬのポンカン皮の抽出液を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
純水抽出液とアルカリ還元水抽出液を添加した場合を比較すると、ポンカン皮の抽出物の濃度が１５０μｇ／ｍＬにおいて、純水抽出液を添加した場合の方が、ルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。その他の濃度の抽出液を添加した場合では、ほぼ同等のルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。また、どちらの抽出液を添加した場合でも、ポンカン皮の抽出物の濃度が高くなるにしたがい、ルシフェラーゼ活性が高くなることが分かった。
さらに、純水抽出液（ポンカン皮抽出物の濃度：２０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ）とアルカリ還元水抽出液（ポンカン皮抽出物の濃度：２０００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ）を添加した場合、ノビレチン溶液（１２μｇ／ｍＬ）を添加した場合よりも、ルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。このことから、ポンカン皮の純水およびアルカリ還元水抽出液は、ルシフェラーゼ活性を向上させる効果を有することが分かった。
【００２１】
９９％エタノール抽出液を添加した場合、２０００μｇ／ｍＬの濃度の抽出液を添加した場合を除き、どの濃度の抽出液を添加した場合でも、ほぼ同等のルシフェラーゼ活性を示した。
一方、５０％エタノール抽出液を添加した場合では、ポンカン皮の抽出物の濃度が高くなるにしたがい、ルシフェラーゼ活性が高くなることが分かった。
【００２２】
次に、ポンカンの皮からメタノール、ヘキサン、酢酸エチル、ブタノールおよび熱水によって、それぞれ抽出した抽出液（ポンカン皮抽出物の濃度：２５００μｇ／ｍＬ、５０００μｇ／ｍＬ）を添加した場合のルシフェラーゼ活性を調べた。
なお、培地に対するポンカン皮抽出物の濃度は、２５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬである。
【００２３】
図２は、各試料を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
２５００μｇ／ｍＬの各抽出液を添加した場合を比較すると、メタノール抽出液を添加した場合が最も高いルシフェラーゼ活性を示した。次いで、酢酸エチル抽出液、ヘキサン抽出液、熱水抽出液、ブタノール抽出液の順でルシフェラーゼ活性が高かった。
次に５０００μｇ／ｍＬの各抽出液を添加した場合を比較すると、メタノール抽出液を添加した場合が最も高く、酢酸エチル抽出液、熱水抽出液、ヘキサン抽出液、ブタノール抽出液の順でルシフェラーゼ活性が高かった。
メタノール抽出液を添加した場合、抽出物の濃度が低い方が、高いルシフェラーゼ活性を示した。また、ヘキサン抽出液、酢酸エチル抽出液を添加した場合、抽出物の濃度に関わらず、ほぼ同等のルシフェラーゼ活性を示した。一方、ブタノール抽出液、熱水抽出液を添加した場合、抽出物の濃度が高い方が、高いルシフェラーゼ活性を示した。
以上のことから、ルシフェラーゼ活性を向上させる成分の含有量は、抽出する溶媒に依存し、抽出溶媒ごとに、ルシフェラーゼ活性を向上させる適切な濃度があることが分かった。
【００２４】
次に、ポンカンの皮からヘキサン、エタノール、ブタノールおよび熱水によって、それぞれ抽出した抽出液（ポンカン皮抽出物の濃度：２５００μｇ／ｍＬ）および各抽出液とノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合のＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を調べた。
なお、培地に対するポンカン皮の抽出物の濃度は２５０μｇ／ｍＬであり、培地に対するノビレチンの濃度は０．２μｇ／ｍＬである。
【００２５】
図３は、各試料を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
メタノール抽出液、ヘキサン抽出液を添加した場合、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合と比べ、高いルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。一方、ブタノール抽出液、熱水抽出液を添加した場合、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合と同等なルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。
各抽出液とノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合では、ブタノール抽出液＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものが最も高いルシフェラーゼ活性を示した。次に、熱水抽出液＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものが高いルシフェラーゼ活性を示した。
上述のとおり、ブタノール抽出液や熱水抽出液を添加したものは、メタノール抽出液、ヘキサン抽出液を添加したものよりもルシフェラーゼ活性が低いことから、ブタノール抽出液および熱水抽出液には、ノビレチンの作用を増強する物質が含まれていると考えられる。ポンカンに含まれているノビレチンは、ヘキサン抽出液等の脂溶性フラクションに含まれており、ノビレチンの作用を増強する物質はブタノール抽出液や熱水抽出液に含まれていると考えられる。
以上のことから、培地に対するポンカン皮の抽出物の濃度を２５０μｇ／ｍＬ、培地に対するノビレチンの濃度を０．２μｇ／ｍＬとすることで、ポンカン皮抽出物に含まれている成分がノビレチンの作用を増強させ、ＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させることが明らかとなった。
【００２６】
次に、ノビレチンの作用を増強する物質が多く含まれていると考えられるブタノール抽出液の分画を行った。
ブタノール抽出液をフラクション１Ａ〜フラクション１Ｅフラクションに分画し、６０μｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解した。各フラクションとノビレチン（２μｇ／ｍＬ）を添加した培地におけるＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を調べた。
なお、培地に対するポンカン皮のブタノール抽出物の濃度は、６μｇ／ｍＬであり、培地に対するノビレチンの濃度は０．２μｇ／ｍＬである。
【００２７】
図４は、各試料を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
どのフラクション（１Ａ〜１Ｅ）を添加した場合でも、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものよりもルシフェラーゼ活性は低いことが分かった。
一方、各フラクションとノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合では、フラクション１Ｅ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合を除き、ノビレチン（２μｇ／ｍＬ）を添加したものよりもルシフェラーゼ活性が高くなる。
中でも、フラクション１Ｂ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）、およびフラクション１Ｃ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものでは、ノビレチン溶液（１２μｇ／ｍＬ）添加したものや、ブタノール抽出液（分画前の抽出液）＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものよりも顕著にルシフェラーゼ活性が向上する。このルシフェラーゼ活性は、ノビレチン溶液（２０μｇ／ｍＬ）を添加した場合と同等のものであり、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）のみを添加とした場合と比較すると約１０倍の増強が見られた。
これらの増強は、ノビレチンと各フラクションに含まれている物質の相乗効果によるものであり、フラクション１Ｂ及びフラクション１Ｃには、ノビレチンのルシフェラーゼ活性を増強する物質が含まれていることが分かった。
また、フラクション１Ａ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）、フラクション１Ｃ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合では、ノビレチンと各フラクションに含まれている物質の相加効果により、ルシフェラーゼ活性が向上していることが分かった。
【００２８】
次に、ノビレチンのルシフェラーゼ活性を増強する物質が含まれているフラクション１Ｂの分画をさらに行った。
フラクション１Ｂをフラクション２Ａ〜フラクション２Ｅに分画し、６０μｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解した。各フラクションとノビレチン（２μｇ／ｍＬ）を添加した培地におけるＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を調べた。
なお、培地に対するブラノール抽出物のフラクション成分の濃度は６μｇ／ｍＬであり、培地に対するノビレチンの濃度は０．２μｇ／ｍＬである。
【００２９】
図５は、各試料を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
フラクション２Ｅを添加したものは、フラクション１Ｂを添加したものよりも、顕著にルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。このルシフェラーゼ活性は、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものと同等である。
フラクション２Ａ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものでは、フラクション２Ａ、ノビレチン（２μｇ／ｍＬ）を単独で添加した場合のルシフェラーゼ活性を積算した値よりも若干大きな値を示した。このことから、フラクション２Ａ中には、顕著ではないがノビレチンの作用を増強する物質が含まれていると考えられる。
一方、フラクション２Ｅ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものでは、相加効果が見られた。
また、フラクション２Ｂ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）、フラクション２Ｃ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）およびフラクション２Ｄ＋ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものでは、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加したものよりも、ルシフェラーゼ活性が低くなった。このことから、フラクション２Ｂ〜フラクション２Ｄには、ノビレチンの作用を抑制する物質が含まれていると考えられる。
【００３０】
次に、フラクション２Ａ中の成分の濃度を変え、それらのフラクションに低濃度のノビレチン溶液（１．２μｇ／ｍＬ）を添加して、ルシフェラーゼ活性を調べた。フラクション２Ａの成分の濃度は、２０μｇ／ｍＬから１８０μｇ／ｍＬとした。
また、フラクション２Ｅ中の成分の濃度を低くした場合の効果を調べた。
なお、培地に対するブラノール抽出物のフラクションの成分濃度は２μｇ／ｍＬ〜１８μｇ／ｍＬであり、培地に対するノビレチンの濃度は０．１２μｇ／ｍＬである。
【００３１】
図６は、各試料を添加した場合のルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示している。
フラクション２Ａ（２０〜１８０μｇ／ｍＬ）＋ノビレチン溶液（１．２μｇ／ｍＬ）を添加することで、ルシフェラーゼ活性が顕著に向上し、相乗効果を生じることが分かった。
フラクション２Ａ（６０〜１８０μｇ／ｍＬ）＋ノビレチン溶液（１．２μｇ／ｍＬ）を添加した場合と、フラクション２Ａ（６０〜１８０μｇ／ｍＬ）＋ノビレチン溶液（２．０μｇ／ｍＬ）を添加した場合を比較すると、同程度のルシフェラーゼ活性が見られた。このことから、低濃度のノビレチン溶液（１．２μｇ／ｍＬ）で相乗効果を生じることが分かった。
また、フラクション２Ａの成分の濃度が２０μｇ／ｍＬ〜１８０μｇ／ｍＬの範囲において、用量依存性があることが分かった。用量依存性は、特に１２０μｇ／ｍＬ、１８０μｇ／ｍＬで顕著に見られた。
フラクション２Ｅ中の成分の濃度が２０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬのものを添加した場合、同程度のルシフェラーゼ活性を示した。また、フラクション２Ｅとノビレチン溶液（２．０μｇ／ｍＬ）を添加することで、ルシフェラーゼ活性が向上し、相加効果を生じることが分かった。
【００３２】
次に、亜臨界抽出によって、ポンカン皮の成分を抽出した。抽出した後のポンカン皮の残渣物をメタノールで抽出した。亜臨界抽出は、１２０℃〜１８０℃の温度範囲で行った。各抽出条件は以下の通りである。
抽出条件１：１２０℃、（飽和水蒸気圧：１９８６．６  ｈＰａ）
抽出条件２：１４０℃、（飽和水蒸気圧：３６１６．６  ｈＰａ）
抽出条件３：１５０℃、（飽和水蒸気圧：４７６４．０  ｈＰａ）
抽出条件４：１６０℃、（飽和水蒸気圧：６１８６．６  ｈＰａ）
抽出条件５：１８０℃、（飽和水蒸気圧：１００３７．０  ｈＰａ）
【００３３】
各抽出液から得られた抽出物をメタノールで抽出し、５００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬの試料を調整した。そして、これらの抽出液を添加した場合における、ルシフェラーゼ活性を測定した。
なお、培地に対するポンカン皮の抽出物の濃度は、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬである。
【００３４】
図７は、各亜臨界抽出した抽出液を添加した場合のルシフェラーゼ測定結果を示している。
抽出条件１〜抽出条件３で抽出した抽出液を添加した場合、ルシフェラーゼ活性を向上させることが分かった。中でも、抽出条件１および抽出条件２によって抽出した抽出液を添加すると、高いルシフェラーゼ活性を示すことが分かった。このことから、抽出条件１〜抽出条件３によって、ポンカン皮を亜臨界抽出した抽出液（抽出物）には、ＰＣ１２細胞のルシフェラーゼ活性を向上させる成分（物質）が含有されていることが明らかとなった。
一方、抽出条件４および抽出条件５で抽出した抽出液を添加した場合、ノビレチン溶液（２μｇ／ｍＬ）を添加した場合よりもルシフェラーゼ活性が低いことが分かった。
以上のことから、ルシフェラーゼ活性を向上させる有効成分は、短時間で亜臨界抽出した抽出液に多く含まれていることが明らかとなった。
なお、いずれの抽出条件においても、ポンカン皮の成分の濃度が高いものを添加した場合の方が、ルシフェラーゼ活性が高いことが分かった。
【００３５】
抽出条件１〜抽出条件３における残渣物の抽出液を添加した場合、ルシフェラーゼ活性を示すものの、抽出条件１〜抽出条件３で亜臨界抽出した抽出液を添加したものと比較すると、ルシフェラーゼ活性は低い。このことから、抽出条件１〜抽出条件３で抽出した場合、ルシフェラーゼ活性を向上させる有効成分は、亜臨界抽出した抽出液に多く含まれていることが分かった。
一方、抽出条件４および抽出条件５における残渣物の抽出液を添加した場合、抽出条件４および抽出条件５で亜臨界抽出した抽出液を添加したものと比較すると、それぞれルシフェラーゼ活性は高い。このことから、抽出条件４および抽出条件５で抽出した場合、ルシフェラーゼ活性を向上させる有効成分は、残渣物の抽出液に多く含まれていることが分かった。
以上より、抽出時間が長い場合、亜臨界抽出液ではなく、ポンカン皮の残渣物にルシフェラーゼ活性を向上させる有効成分が含まれていることが分かった。
【００３６】
本実施形態で用いた柑橘系植物であるポンカンの皮は、健康食品の食品素材として使用されている。そのため、柑橘系植物であるポンカンの皮の抽出物は、中枢神経疾患の予防及び治療に用いられる食品に適用することもできる。また、このポンカンの皮の抽出物にノビレチンを含有させ、中枢神経疾患の予防及び治療用の食品とすることもできる。
【００３７】
以上、本実施形態について説明したが、これ以外にも、本発明の主旨を逸脱しない限り、上記実施の形態で挙げた構成を取捨選択したり、他の構成に適宜変更することが可能である。例えば、本実施形態では、柑橘系植物として、ポンカンを使用したが、その他、シキキツ、キジツ、ダイダイ、地中海マンダリン、ダンシータンジェリン、オオベニミカン、コベニミカン、無核キシュウ、フクレミカン、カプチー、ヒラキシュウ、サンキツ、クレオパトラ、コウジ、ギリミカン、イーチャンレモン、ウンシュウミカン、シークワーサー、ユズ、ブンタン、ヒュウガナツ、ポンカン、ナツミカン、ネーブルオレンジ、ハッサク、イヨおよびカボス等を使用することもできる。
また、本実施形態では、ノビレチンを使用したが、タンゲリチン、テトラメトキシフラボン、ペンタメトキシフラボン、ヘプタメトキシフラボン等のポリメトキシフラボノイドを使用することもできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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