(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
汗腺の形態を確認する方法であって、単離された全汗腺と細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって前記汗腺の形態を視覚化させる汗腺の形態の確認方法。
【請求項２】
単離された全汗腺と細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質との接触を、固定液によって単離された全汗腺を固定した試料と当該結合物質とを接触させることによって行なう請求項１に記載の汗腺の形態の確認方法。
【請求項３】
細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質がアクチンに特異的に結合する結合物質、ミオシンに特異的に結合する結合物質、ケラチンに特異的に結合する結合物質またはチューブリンに特異的に結合する結合物質である請求項１または２に記載の汗腺の形態の確認方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、汗腺の形態の確認方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な汗腺の形態の確認方法および被験物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過度の発汗は、肌のベタつきおよび不快感を招くことがある。そこで、汗腺を閉塞させることによって発汗を抑制する成分を含む制汗剤などが開発されている。しかしながら、近年の清潔志向の高まりに伴い、過度の発汗などをより効果的に抑制することが求められている。そこで、過度の発汗などをより効果的に抑制する成分を開発するために、汗腺の状態を確認するための技術が求められている。
【０００３】
一方、前記汗腺に含まれる汗腺細胞には、ケラチン５が発現していることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、本発明者らは、現時点では、汗腺の形態、例えば、収縮状態などを確認する方法を具体的に記載した文献を発見していない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ローランド・モール（Ｒｏｌａｎｄ  Ｍｏｌｌ）ら、「上皮の２相性中皮腫の顕著な特徴としてのケラチン５の発現；モノクローナル抗体ＡＥ１４を用いた免疫組織学的研究（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎ  ５  ａｓ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｂｉｐｈａｓｉｃ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａｓ  Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＡＥ１４）」、ウィルヒョー・アーカイブ・ビー・セル・ペイソロジー・インクルーディング・モレキュラー・ペイソロジー（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖ  Ｂ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、１９８９年発行、第５８巻、ｐｐ．１２９−１４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、汗腺の形態を的確に視覚化させることができ、しかも当該汗腺の形態を容易に確認することができる汗腺の形態の確認方法および被験物質が有する発汗誘導作用または制汗作用を容易に評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、
（１）汗腺の形態を確認する方法であって、単離された全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって前記汗腺の形態を視覚化させる汗腺の形態の確認方法、
（２）単離された全汗腺と細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質との接触を、固定液によって単離された全汗腺を固定した試料と当該結合物質とを接触させることによって行なう前記（１）に記載の汗腺の形態の確認方法、および
（３）細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質がアクチンに特異的に結合する結合物質、ミオシンに特異的に結合する結合物質、ケラチンに特異的に結合する結合物質またはチューブリンに特異的に結合する結合物質である前記（１）または（２）に記載の汗腺の形態の確認方法
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の汗腺の形態の確認方法は、汗腺の形態を的確に視覚化させることができ、しかも当該汗腺の形態を容易に確認することができるという優れた効果を奏する。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が有する発汗誘導作用または制汗作用を容易に評価することができるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ヒトの汗腺の構造を示す概略説明図である。
【図２】（Ａ）は試験例１において、実施例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は前記（Ａ）の一部を拡大した図面代用写真である。
【図３】（Ａ）は試験例１において、実施例２で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は前記（Ａ）の一部を拡大した図面代用写真である。
【図４】（Ａ）は試験例１において、実施例３で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は実施例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図５】（Ａ）は試験例１において、比較例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は前記（Ａ）の一部を拡大した図面代用写真である。
【図６】（Ａ）は試験例１において、実施例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は前記（Ａ）の一部を拡大した図面代用写真、（Ｃ）はヒトの汗腺の分泌腺の構造を示す概略説明図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．汗腺の形態の確認方法
本発明の汗腺の形態の確認方法は、汗腺の形態を確認する方法であって、単離された全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって前記汗腺の形態を視覚化させることを特徴とする。
【００１０】
前記汗腺は、図１のヒトの汗腺の構造を示す概略説明図に示されるように、分泌腺と当該分泌腺につながった汗管とからなる。前記分泌腺は、皮膚の真皮内に存在し、コイル状にねじれまがったコイル構造を有する不分枝単一管状腺である。また、前記分泌腺の表面には、筋上皮細胞が存在している。前記全汗腺の起源は、特に限定されるものではない。本発明の汗腺の形態の確認方法をヒトにおける汗の分泌の評価などに用いる場合、前記汗腺のなかでは、ヒトの汗腺が好ましい。本明細書において、「全汗腺」とは、汗腺全体を意味する。また、本明細書において、「単離された全汗腺」とは、生検などの皮膚組織から取得された全汗腺を意味する。
【００１１】
本発明者らは、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質を汗腺に接触させた場合、ラミニン−３３２、ｐ６３などの汗腺筋上皮細胞の細胞骨格の可視化に適していないマーカーを使用する場合と比べ、前記分泌腺の表面に存在する筋上皮細胞の細胞形状および配向性をより明確に視覚化させることができることを見出した。また、本発明者らは、前記筋上皮細胞が、分泌腺のねじれ方向に沿った同じ向きに配向して並んでおり、筋上皮細胞の収縮と、汗腺の収縮と、汗の分泌とが関連することを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
【００１２】
前記汗腺の形態としては、例えば、汗腺の収縮状態などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の汗腺の形態の確認方法は、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質と、単離された全汗腺とを接触させるという操作が行なわれている点に１つの大きな特徴を有する。このように、本発明の汗腺の形態の確認方法によれば、前記操作が行なわれているので、前記結合物質を介して筋上皮細胞の形状および配向性ならびに汗腺の三次元的な全体像を視覚化させることができる。したがって、本発明の汗腺の形態の確認方法によれば、汗腺の形態を的確に視覚化し、しかも容易に確認することができる。
【００１４】
まず、前記結合物質と前記単離された全汗腺とを接触させることにより、前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させる。これにより、前記結合物質と前記単離された全汗腺とを含む複合体が形成される。
【００１５】
前記細胞骨格構成物質としては、例えば、収縮タンパク質、中間径フィラメント、微小管構成タンパク質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００１６】
前記収縮タンパク質としては、アクチン、ミオシンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記アクチンとしては、例えば、α−平滑筋アクチン（以下、「α−ＳＭＡ」ともいう）、β−平滑筋アクチン（以下、「β−ＳＭＡ」ともいう）、アクチンフィラメント（以下、「Ｆ−アクチン」ともいう）、球形アクチン（以下、「Ｇ−アクチン」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの収縮タンパク質のなかでは、汗腺の形態をより明確に視覚化させて汗腺の形態の確認の容易性を向上させる観点から、アクチンおよびミオシンが好ましく、α−ＳＭＡ、Ｆ−アクチンおよびミオシンがより好ましい。
【００１７】
前記中間径フィラメントとしては、例えば、ケラチン−５、ケラチン−１４などのケラチン；デスミン；ビメンチンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの中間径フィラメントのなかでは、汗腺の形態をより明確に視覚化させて汗腺の形態の確認の容易性を向上させる観点から、ケラチンが好ましく、ケラチン−５およびケラチン−１４がより好ましい。
【００１８】
本明細書において、「微小管構成タンパク質」とは、微小管を構成するタンパク質をいう。前記微小管構成タンパク質としては、例えば、α−チューブリン、β−チューブリンなどのチューブリンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの微小管構成タンパク質のなかでは、汗腺の形態をより明確に視覚化させて汗腺の形態の確認の容易性を向上させる観点から、チューブリンが好ましい。
【００１９】
前記細胞骨格構成物質のなかでは、汗腺の形態をより明確に視覚化させて汗腺の形態の確認の容易性を向上させる観点から、前記収縮タンパク質、前記中間径フィラメントおよび前記微小管構成タンパク質が好ましく、前記アクチン、ミオシン、ケラチンおよびチューブリンがより好ましく、α−ＳＭＡ、Ｆ−アクチン、ミオシン、ケラチン−５、ケラチン−１４、α−チューブリンおよびβ−チューブリンがさらに好ましい。
【００２０】
前記結合物質は、細胞骨格構成物質に特異的に結合する物質である。前記結合物質としては、例えば、前記収縮タンパク質に特異的に結合する物質（以下、「収縮タンパク質結合物質」ともいう）、前記中間径フィラメントに特異的に結合する物質（以下、「中間径フィラメント結合物質」ともいう）、前記微小管構成タンパク質に特異的に結合する物質（以下、「微小管構成タンパク質結合物質」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２１】
前記収縮タンパク質結合物質としては、例えば、アクチンに特異的に結合する結合物質（以下、「アクチン結合物質」という）、ミオシンに特異的に結合する結合物質（以下、「ミオシン結合物質」という）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記アクチン結合物質としては、例えば、α−ＳＭＡに特異的に結合する物質、β−ＳＭＡに特異的に結合する物質、Ｆ−アクチンに特異的に結合する物質などが挙げられるが、特に限定されるものではない。前記アクチン結合物質としては、具体的には、例えば、抗α−ＳＭＡ抗体、抗β−ＳＭＡ抗体などの抗アクチン抗体またはその抗体断片；ファロイジンなどのＦ−アクチンに特異的に結合する化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ミオシン結合物質としては、例えば、抗ミオシンＨ鎖抗体、抗ミオシンＬ鎖抗体などの抗ミオシン抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記結合物質のなかでは、汗腺の形態をより明確に視覚化させて汗腺の形態の確認の容易性を向上させる観点から、好ましくはアクチン結合物質、より好ましくはα−ＳＭＡに特異的に結合する物質およびＦ−アクチンに特異的に結合する物質、さらに好ましくは抗α−ＳＭＡ抗体、抗α−ＳＭＡ抗体の断片、ファロイジン、ファロイジン蛍光誘導体、より一層好ましくは抗α−ＳＭＡ抗体、抗α−ＳＭＡ抗体の断片およびファロイジン、ファロイジン蛍光誘導体、特に好ましくはファロイジン、ファロイジン蛍光誘導体である。前記ファロイジン蛍光誘導体としては、例えば、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製の商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ファロイジン  コンジュゲートシリーズ（例えば、ライフテクノロジーズ社製の商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８ファロイジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４ファロイジン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７ファロイジンなど）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記結合物質は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２２】
前記微小管構成タンパク質結合物質としては、例えば、ケラチンに特異的に結合する結合物質（以下、「ケラチン結合物質」という）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ケラチン結合物質としては、具体的には、例えば、抗ケラチン−５抗体またはその抗体断片；抗ケラチン−１４抗体またはその抗体断片などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２３】
前記中間径フィラメント結合物質としては、例えば、チューブリンに特異的に結合する結合物質（以下、「チューブリン結合物質」という）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記チューブリン結合物質としては、例えば、α−チューブリンに特異的に結合する物質、β−チューブリンに特異的に結合する物質などが挙げられるが、特に限定されるものではない。前記チューブリン結合物質としては、具体的には、例えば、抗α−チューブリン抗体、抗β−チューブリン抗体などの抗チューブリン抗体またはその抗体断片などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２４】
なお、前記結合物質が抗体である場合、前記抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。前記抗体のなかでは、前記アクチンまたはミオシンに対する特異性が高いことから、モノクローナル抗体が好ましい。前記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、前記抗体の軽鎖の可変領域と前記抗体の重鎖の可変領域とがリンカーを介して連結された単鎖抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および前記抗体断片は、前記細胞骨格構成物質を抗原として用い、「実験医学増刊  第６巻、第１０号、モノクローナル抗体  バイオテクノロジー実験法シリーズ」などに記載の方法にしたがって作製することができる。
【００２５】
前記結合物質は、検出可能なシグナルを生じる物質であってもよく、検出可能なシグナルを生じない物質でなくてもよい。前記結合物質が検出可能なシグナルを生じない物質である場合、前記結合物質の代わりに、検出可能なシグナルを生じる標識物質によって当該結合物質が標識された標識結合物質を用いることができる。前記標識物質としては、例えば、蛍光物質、酵素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光物質としては、例えば、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製の商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズの蛍光物質（例えば、ライフテクノロジーズ社製の商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ６４７など）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフォターゼなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記シグナルとしては、蛍光シグナルなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２６】
前記結合物質と前記単離された全汗腺との接触は、例えば、固定液によって前記単離された全汗腺を固定した試料（以下、「固定試料」という）と、前記結合物質とを接触させることなどによって行なうことができる。
【００２７】
前記単離された全汗腺の固定は、例えば、前記単離された全汗腺に固定液を接触させることなどによって行なわれる。前記固定液としては、例えば、アセトン、メタノール、アセトンとメタノールとの混合溶液、ホルムアルデヒド水溶液、ホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液、パラホルムアルデヒド水溶液、パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝生理食塩水溶液、パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの固定液のなかでは、全汗腺と結合物質との結合を十分に行なう観点から、好ましくはパラホルムアルデヒドのリン酸緩衝生理食塩水溶液である。前記固定試料は、必要に応じて、適切な洗浄液で洗浄してもよく、洗浄しなくてもよい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００２８】
前記結合物質と前記単離された全汗腺との接触に際し、前記結合物質と、前記単離された全汗腺との混合比および接触時間は、前記結合物質の種類などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記結合物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００２９】
前記結合物質と前記単離された全汗腺との接触後、汗腺の形態をより良好に視覚化させる観点から、前記結合物質と前記単離された全汗腺とを含む複合体を適切な洗浄液で洗浄することが好ましい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水（以下、「ＰＢＳ」ともいう）、リン酸緩衝液、界面活性剤含有リン酸緩衝生理食塩水〔例えば、０．１体積％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート〔Ｔｗｅｅｎ−２０（アイシーアイ・アメリカス・インク．（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．）の登録商標）〕と０．１体積％ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル〔Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（ダウ・ケミカル・カンパニー（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の登録商標）〕とを含有するＰＢＳ（以下、「ＰＢＴＴ」ともいう）など〕などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記結合物質が抗体である場合、汗腺の形態をより明確に視覚化させて汗腺の形態の確認の容易性を向上させる観点から、前記結合物質と前記単離された全汗腺とを含む複合体に対し、ブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施すことが好ましい。前記ブロッキング剤としては、例えば、アルブミンを含有するリン酸緩衝生理的食塩水、アルブミンを含有するリン酸緩衝液、アルブミン含有ＰＢＴＴ〔例えば、２質量％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＴＴなど〕などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３０】
なお、前記単離された全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させるのに先立ち、前記単離された全汗腺を発汗誘導物質と接触させてもよい。この場合、発汗誘導物質による汗腺の形態への作用を視覚化させることができる。前記発汗誘導物質としては、例えば、コリン作動薬、アドレナリン作動薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記コリン作動薬としては、例えば、アセチルコリン、ピロカルピン、ベタネコール、カルバコールなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記アドレナリン作動薬としては、例えば、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンなどのカテコールアミンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３１】
つぎに、前記全汗腺内の前記結合物質を視覚化させることによって前記汗腺の形態を視覚化させる。
【００３２】
前記結合物質が検出可能なシグナルを生じる物質である場合または前記結合物質と前記単離された全汗腺との接触の際に、前記結合物質の代わりに前記標識結合物質を用いた場合、当該結合物質または標識結合物質から生じるシグナルを検出することにより、前記汗腺の形態を視覚化させることができる。
【００３３】
一方、前記結合物質が検出可能なシグナルを生じない物質であって、前記結合物質と前記単離された全汗腺との接触の際に、前記結合物質の代わりに前記標識結合物質を用いていない場合、前記結合物質に特異的に結合し、かつ検出可能なシグナルを生じる物質（以下、「第２の標識結合物質」ともいう）を前記結合物質に結合させた後、当該第２の標識結合物質から生じるシグナルを検出することにより、前記汗腺の形態を視覚化させることができる。前記第２の標識結合物質としては、例えば、前記結合物質に特異的に結合する標識抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００３４】
また、前記結合物質が検出可能なシグナルを生じない物質であって、前記結合物質と前記単離された全汗腺との接触の際に、前記結合物質の代わりに前記標識結合物質を用いていない場合、前記結合物質にビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどを結合させて用いることもできる。ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどを用いた場合、ビオチン−アビジン間の特異的親和性またはビオチン−ストレプトアビジン間の特異的親和性を利用して前記全汗腺内の前記結合物質を検出することが可能になる。前記結合物質にビオチンを結合させた場合、アビジンまたはストレプトアビジンと前記標識物質との複合体を第２の標識結合物質として用いることができる。また、前記結合物質にアビジンまたはストレプトアビジンを結合させた場合、ビオチンと前記標識物質との複合体を第２の標識結合物質として用いることができる。
【００３５】
前記シグナルの検出方法は、前記シグナルの種類に応じて異なるので、一概には決定することができないことから、前記シグナルの種類などに応じて適宜決定することが望ましい。
【００３６】
以上説明したように、本発明の汗腺の形態の確認方法によれば、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質と、単離された全汗腺とを接触させるという操作が行なわれているので、汗腺、特に、分泌腺の形態を確認することができる。汗腺、特に、分泌腺の形態は、発汗と関連すると考えられる。したがって、本発明の汗腺の形態の確認方法によれば、汗腺、特に、汗腺の分泌腺の形態に基づき、制汗剤の有効性を評価することが期待される。
【００３７】
２．被験物質の評価方法
本発明の被験物質の評価方法は、１つの側面では、被験物質が有する発汗誘導作用を評価する方法であって、
（Ａ）単離された全汗腺と被験物質とを接触させ、当該被験物質に接触させた全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察するステップ、
（Ｂ）単離された全汗腺と細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で観察された汗腺の形態と、前記ステップ（Ｂ）で観察された汗腺の形態との違いに基づき、被験物質が有する発汗誘導作用を評価するステップ
を含むことを特徴とする（以下、「評価方法１」という）。また、本発明の被験物質の評価方法は、他の側面では、被験物質が有する制汗作用を評価する方法であって、
（ａ）単離された全汗腺と発汗誘導物質と被験物質とを接触させ、当該発汗誘導物質および被験物質に接触させた全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察するステップ、
（ｂ）単離された全汗腺と前記発汗誘導物質とを接触させ、当該発汗誘導物質と接触させた全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察するステップ、および
（ｃ）前記ステップ（ａ）で観察された汗腺の形態と、前記ステップ（ｂ）で観察された汗腺の形態との違いに基づき、被験物質が有する制汗作用を評価するステップ
を含むことを特徴とする（以下、「評価方法２」という）。
【００３８】
（１）評価方法１
本発明の評価方法１では、被験物質に接触させた全汗腺および単離された全汗腺それぞれと、前記結合物質とを接触させ、被験物質に接触させた全汗腺および単離された全汗腺それぞれの細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させ、被験物質に接触させた全汗腺および単離された全汗腺それぞれの形態を比較することにより、汗腺の形態との違いに基づき、被験物質が有する発汗誘導作用を評価するという操作が行なわれている点に１つの大きな特徴を有する。このように、本発明の評価方法１によれば、前記操作が行なわれているので、汗腺の形態の違いを容易に確認することができる。したがって、本発明の評価方法１によれば、被験物質が有する発汗誘導作用を容易に評価することができる。
【００３９】
まず、ステップ（Ａ）では、単離された全汗腺と被験物質とを接触させ、当該被験物質に接触させた全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察する。
【００４０】
被験物質としては、例えば、発汗誘導作用を有することが期待される物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験物質としては、具体的には、無機化合物、有機化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４１】
前記被験物質と前記単離された全汗腺との接触は、例えば、前記被験物質を含有する溶液中に、前記単離された全汗腺を浸漬させてインキュベーションすることなどによって行なうことができる。
【００４２】
前記被検物質と前記単離された全汗腺との接触に際し、前記被検物質と、前記単離された全汗腺との混合比および接触時間は、前記被験物質の種類などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記被験物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００４３】
前記被験物質に接触させた全汗腺と前記結合物質との接触および前記汗腺の形態の視覚化は、前記汗腺の形態の確認方法における全汗腺と結合物質との接触および汗腺の形態の視覚化と同様の手法によって行なうことができる。
【００４４】
前記視覚化された汗腺の形態の観察は、例えば、蛍光顕微鏡下での観察などによって行なうことができる。
【００４５】
ステップ（Ｂ）では、単離された全汗腺と細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察する。かかるステップ（Ｂ）は、ステップ（Ａ）において、単離された全汗腺と被験物質とを接触させる代わりに、単離された全汗腺と被験物質とを接触させずに、全汗腺と結合物質との接触、汗腺の形態の視覚化および視覚化された汗腺の形態の観察を行なう点を除き、ステップ（Ａ）と同様の手法により行うことができる。
【００４６】
その後、ステップ（Ｃ）では、前記ステップ（Ａ）で観察された汗腺の形態と、前記ステップ（Ｂ）で観察された汗腺の形態との違いに基づき、被験物質が有する発汗誘導作用を評価する。
【００４７】
前記汗腺の形態との違いとしては、例えば、汗腺の収縮状態の違い
などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４８】
前記被験物質が発汗誘導作用を有することの判断基準としては、例えば、前記ステップ（Ａ）で観察された汗腺の分泌腺が、前記ステップ（Ｂ）で観察された汗腺の分泌腺と比べて収縮していることなどが挙げられる。
【００４９】
本発明の評価方法１に供することによって、発汗誘導作用を有することが判明した被験物質は、汗腺の形態を変化させることによって汗腺からの汗の分泌を促進させる物質であると考えられる。したがって、発汗誘導作用を有する被験物質は、例えば、制汗剤のスクリーニングの際の汗腺における発汗誘導などに有用であると考えられる。
【００５０】
（２）評価方法２
本発明の評価方法２では、被験物質と発汗誘導物質とに接触させた全汗腺および単離された全汗腺それぞれと、前記結合物質とを接触させ、被験物質と発汗誘導物質とに接触させた全汗腺および単離された全汗腺それぞれの細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させ、被験物質と発汗誘導物質とに接触させた全汗腺および単離された全汗腺それぞれの形態を比較することにより、汗腺の形態との違いに基づき、被験物質が有する制汗作用を評価するという操作が行なわれている点に１つの大きな特徴を有する。このように、本発明の評価方法２によれば、前記操作が行なわれているので、汗腺の形態の違いを容易に確認することができる。したがって、本発明の評価方法２によれば、被験物質が有する制汗作用を容易に評価することができる。
【００５１】
まず、ステップ（ａ）では、単離された全汗腺と発汗誘導物質と被験物質とを接触させ、当該発汗誘導物質および被験物質に接触させた全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察する。
【００５２】
前記被験物質としては、例えば、制汗作用を有することが期待される物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。被験物質としては、具体的には、無機化合物、有機化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記被験物質は、そのまま用いてもよく、必要に応じて、溶媒に溶解させて用いてもよい。前記溶媒としては、例えば、生理的食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５３】
本発明の評価方法２で用いられる発汗誘導物質は、前記汗腺の形態の確認方法における発汗誘導物質と同様である。
【００５４】
前記単離された全汗腺と前記被験物質と前記発汗誘導物質との接触は、例えば、前記被験物質と前記発汗誘導物質とを含有する溶液中に、前記単離された全汗腺を浸漬させてインキュベーションすることなどによって行なうことができる。
【００５５】
前記単離された全汗腺と前記被検物質と前記発汗誘導物質との接触に際し、前記単離された全汗腺と前記被検物質と前記発汗誘導物質との混合比および接触時間は、前記被験物質の種類、前記発汗誘導物質の種類などによって異なるため、一概に決定されるものではないことから、前記被験物質の種類、前記発汗誘導物質の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
【００５６】
前記被験物質と前記発汗誘導物質とに接触させた全汗腺と前記結合物質との接触、前記汗腺の形態の視覚化および前記視覚化された汗腺の形態の観察は、前記評価方法１における全汗腺と結合物質との接触、前記汗腺の形態の視覚化および前記視覚化された汗腺の形態の観察と同様の手法によって行なうことができる。
【００５７】
ステップ（ｂ）では、単離された全汗腺と前記発汗誘導物質とを接触させ、当該発汗誘導物質と接触させた全汗腺と、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質とを接触させて前記全汗腺の分泌腺の筋上皮細胞に含まれる細胞骨格構成物質と前記結合物質とを結合させた後、前記全汗腺内の筋上皮細胞の細胞骨格を視覚化させることによって汗腺の形態を視覚化させて観察する。かかるステップ（ｂ）は、ステップ（ａ）において、単離された全汗腺と被験物質と発汗誘導物質とを接触させる代わりに、被験物質と発汗誘導物質とに単離された全汗腺を接触させずに、全汗腺と結合物質との接触、汗腺の形態の視覚化および視覚化された汗腺の形態の観察を行なう点を除き、ステップ（ａ）と同様の手法により行うことができる。
【００５８】
その後、ステップ（ｃ）では、前記ステップ（ａ）で観察された汗腺の形態と、前記ステップ（ｂ）で観察された汗腺の形態との違いに基づき、被験物質が有する制汗作用を評価する。
【００５９】
前記被験物質が制汗作用を有することの判断基準としては、例えば、前記ステップ（Ａ）で観察された汗腺の分泌腺が、前記ステップ（Ｂ）で観察された汗腺の分泌腺と比べて収縮していないことなどが挙げられる。
【００６０】
本発明の評価方法２に供することによって、制汗作用を有することが判明した被験物質は、汗腺の分泌腺の収縮などによる汗腺の分泌腺からの汗の分泌を抑制させる物質であると考えられる。したがって、制汗作用を有する被験物質は、例えば、化粧料などの外用剤の制汗剤などに有用であると考えられる。したがって、本発明の評価方法２は、化粧料などの外用剤などの開発に用いられることが期待されるものである。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを示す。
【００６２】
製造例１
蛍光ファロイジン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）をその濃度が２質量％となるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ａを得た。なお、前記蛍光ファロイジンは、Ｆ−アクチンに特異的に結合する標識結合物質である。
【００６３】
製造例２
抗α−ＳＭＡ抗体含有ＰＢＳ溶液〔アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、商品名：Ａｎｔｉ−ａｌｐｈａ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  Ａｃｔｉｎ抗体、抗体濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ〕を、その濃度が０．００２ｍｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｂを得た。なお、前記抗α−ＳＭＡ抗体は、α−ＳＭＡに特異的に結合する結合物質である。
【００６４】
製造例３
標識結合２次抗体含有ＰＢＳ溶液〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａ１１００８）、抗体濃度：２ｍｇ／ｍＬ〕、蛍光ファロイジンおよびヘキスト３３３４２（ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を標識結合２次抗体の濃度が０．００２ｍｇ／ｍＬ、蛍光ファロイジンの濃度が１Ｕ／ｍＬおよびヘキスト３３３４２の濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｃを得た。なお、前記標識結合２次抗体は、製造例２で用いられた抗α−ＳＭＡ抗体に対する二次抗体である。
【００６５】
製造例４
抗ラミニン−３３２抗体含有ＰＢＳ溶液〔アブカム（Ａｂｃａｍ）社製、商品名：Ａｎｔｉ−Ｌａｍｉｎｉｎ  ５抗体、抗体濃度：１ｍｇ／ｍＬ〕および抗ｐ６３抗体〔サンタクルズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）社製、商品名：ｐ６３  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｈ−１３７）、抗体濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ〕を抗ラミニン−３３２抗体の濃度が０．００５ｍｇ／ｍＬおよび抗ｐ６３抗体の濃度が０．００２ｍｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｄを得た。
【００６６】
製造例５
標識結合２次抗体含有ＰＢＳ溶液〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｔｎｉｂｏｄｙ（Ａ１１００８）、抗体濃度：２ｍｇ／ｍＬ）を標識結合２次抗体の濃度が０．００２ｍｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｅを得た。なお、前記標識結合２次抗体は、製造例４で用いられた抗ラミニン−３３２抗体に対する二次抗体である。
【００６７】
製造例６
抗ケラチン−１４抗体含有ＰＢＳ溶液〔プロゲン（Ｐｒｏｇｅｎ）社製、商品名：Ｋｅｒａｔｉｎ  Ｋ１４抗体、抗体濃度：０．２ｍｇ／ｍＬ〕を、抗ケラチン−１４抗体の濃度が０．００２ｍｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｆを得た。なお、前記抗ケラチン−１４抗体は、ケラチン−１４に特異的に結合する結合物質である。
【００６８】
製造例７
標識結合２次抗体含有ＰＢＳ溶液〔ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製、商品名：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａ１１００８）、抗体濃度：２ｍｇ／ｍＬ〕、蛍光ファロイジンおよびヘキスト３３３４２（ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を標識結合２次抗体の濃度が０．００２ｍｇ／ｍＬ、蛍光ファロイジンの濃度が１Ｕ／ｍＬおよびヘキスト３３３４２の濃度が０．０１ｍｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｇを得た。なお、前記標識結合２次抗体は、製造例１で用いられた抗ケラチン−１４抗体に対する二次抗体である。
【００６９】
実施例１
（１）固定試料の作製
皮膚組織の真皮を細かく裁断し、真皮細片を得た。光学顕微鏡下にピンセットを用い、前記真皮細片から汗腺全体を採取した。
【００７０】
得られた汗腺を、４質量％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させることにより、汗腺を固定した。つぎに、固定された汗腺を、ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で５分間振盪させることによって洗浄して固定試料を得た。なお、前記固定された汗腺の洗浄を３回行なった。
【００７１】
（２）染色
実施例１（１）で得られた洗浄された固定試料に、染色試薬Ａ１００μＬを添加した。得られた混合液を振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させた。その後、前記固定試料を、ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で５分間振盪させて洗浄して染色固定試料を得た。なお、洗浄は、３回行なった。
【００７２】
（３）透明化処理
実施例１（２）で得られた染色固定試料に透明化処理を施し、汗腺標本を得た。前記透明化処理は、下記ステップ（ａ）〜（ｃ）によって行なった。
（ａ）洗浄後の固定試料を、２０体積％グリセロール含有ＰＢＴＴ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で１時間振盪させるステップ、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で得られた固定試料を、５０体積％グリセロール含有ＰＢＴＴ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で１時間振盪させるステップ、および
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で得られた固定試料を、８０体積％グリセロール含有ＰＢＴＴ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させるステップ。
【００７３】
実施例２
（１）固定試料の調製
実施例１（１）と同様の操作を行なうことにより、洗浄済みの固定試料を得た。
【００７４】
（２）染色
実施例２（１）で得られた洗浄済みの固定試料に、染色試薬Ｂ１００μＬを添加した。得られた混合液を振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させた。その後、前記固定試料を、ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で５分間振盪させて洗浄した。なお、洗浄は、３回行なった。
【００７５】
つぎに、洗浄後の前記固定試料に、染色試薬Ｃ１００μＬを添加した。得られた混合液を振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させた。つぎに、前記固定試料を、ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で５分間振盪させて洗浄して染色固定試料を得た。なお、洗浄は、３回行なった。
【００７６】
（３）透明化処理
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた染色固定試料を用いる代わりに実施例２（２）で得られた染色固定試料を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、汗腺標本を得た。
【００７７】
実施例３
（１）固定試料の調製
実施例１（１）と同様の操作を行なうことにより、洗浄済みの固定試料を得た。
【００７８】
（２）染色
実施例２（１）で得られた洗浄済みの固定試料に、染色試薬Ｆ１００μＬを添加した。得られた混合液を振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させた。その後、前記固定試料を、ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で５分間振盪させて洗浄した。なお、洗浄は、３回行なった。
【００７９】
つぎに、洗浄後の前記固定試料に、染色試薬Ｇ１００μＬを添加した。得られた混合液を振盪速度：５０ｍｉｎ-1、４℃で１６時間振盪させた。つぎに、前記固定試料を、ＰＢＳ中において、振盪速度：５０ｍｉｎ-1、室温（２５℃）で５分間振盪させて洗浄して染色固定試料を得た。なお、洗浄は、３回行なった。
【００８０】
（３）透明化処理
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた染色固定試料を用いる代わりに実施例３（２）で得られた染色固定試料を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、汗腺標本を得た。
【００８１】
比較例１
（１）固定試料の調製
実施例１（１）と同様の操作を行なうことにより、固定試料を得た。
【００８２】
（２）染色
実施例２（２）において、実施例２（１）で得られた固定試料を用いる代わりに比較例１（１）で得られた固定試料を用いたこと、染色試薬Ｂを用いる代わりに染色試薬Ｄを用いたこと、および染色試薬Ｃを用いる代わりに染色試薬Ｅを用いたことを除き、実施例２（２）と同様の操作を行ない、染色固定試料を得た。
【００８３】
（３）透明化処理
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた染色固定試料を用いる代わりに比較例１（２）で得られた染色固定試料を用いたことを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、汗腺標本を得た。
【００８４】
試験例１
実施例１で得られた汗腺標本をスペーサー付のカバーガラスの上に載置し、カバーガラスでさらにはさむことにより、試料を得た。得られた試料に含まれる汗腺を共焦点顕微鏡下で観察した。試験例１において、実施例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を図２（Ａ）、図２（Ａ）の一部を拡大した図を図２（Ｂ）に示す。図２中、黒三角は分泌腺の筋上皮細胞、黒丸は汗管を示す。図２（Ａ）および（Ｂ）中のスケールバーの長さは、いずれも５０μｍである。
【００８５】
また、前記において、実施例１で得られた汗腺標本を用いる代わりに、実施例２、実施例３または比較例１で得られた汗腺標本を用いたことを除き、前記と同様の操作を行ない、汗腺を観察した。試験例１において、実施例２で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を図３（Ａ）、図３（Ａ）の一部を拡大した図を図３（Ｂ）に示す。また、試験例１において、実施例３で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を図４（Ａ）、実施例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を図４（Ｂ）に示す。さらに、試験例１において、比較例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を図５（Ａ）、図５（Ａ）の一部を拡大した図を図５（Ｂ）に示す。また、試験例１において、実施例１で得られた試料に含まれる汗腺を観察した結果を図６（Ａ）、図６（Ａ）の一部を拡大した図を図６（Ｂ）、ヒトの汗腺の分泌腺の構造を示す概略説明図を図６（Ｃ）に示す。なお、図３、図４および図６中のスケールバーの長さは、いずれも５０μｍである。また、図５中のスケールバーの長さは、３０μｍである。
【００８６】
図２に示された結果から、汗腺において、分泌腺は、図１に示されるヒトの汗腺の構造を示す概略説明図と同様に、コイル状にねじれまがったコイル構造を有していることがわかる。また、分泌腺の表面には、紡錘型の多数の筋上皮細胞〔図２（Ｂ）中、黒三角参照〕が分泌腺のねじれ方向に沿った同じ向きに配向して並んでいることがわかる。これらの結果から、アクチンに結合するファロイジンを用いて汗腺を染色することにより、汗腺の分泌腺における筋上皮細胞の細胞形状および配向性が視覚化できることがわかる。
【００８７】
また、図３に示された結果から、図２に示された結果と同様に、汗腺において、分泌腺がコイル状にねじれまがったコイル構造を有しており、かつ分泌腺の表面に紡錘型の多数の筋上皮細胞が当該分泌腺のねじれ方向に沿った同じ向きに配向して並んでいることがわかる。したがって、これらの結果から、Ｆ−アクチンに特異的に結合するファロイジンと、α−ＳＭＡに特異的に結合する抗α−ＳＭＡ抗体とを用いて汗腺を染色することにより、汗腺の分泌腺における筋上皮細胞の細胞形状および配向性が視覚化できることがわかる。
【００８８】
さらに、図４（Ａ）および図４（Ｂ）に示された結果から、汗腺において、分泌腺がコイル状にねじれまがったコイル構造を有しており、かつ分泌腺の表面に紡錘型の多数の筋上皮細胞が当該分泌腺のねじれ方向に沿った同じ向きに配向して並んでいることがわかる。これらの結果から、ケラチン−１４に特異的に結合する抗ケラチン−１４抗体を用いて汗腺を染色することにより〔図４（Ａ）参照〕、アクチンに結合するファロイジンを用いて汗腺を染色した場合〔図４（Ｂ）参照〕と同様に、汗腺の分泌腺における筋上皮細胞の細胞形状および配向性が視覚化できることがわかる。
【００８９】
一方、図５に示された結果から、細胞外マトリックスに存在するラミニン−３３２に特異的に結合する抗ラミニン−３３２抗体と、細胞外マトリックスに存在するｐ６３に特異的に結合する抗ｐ６３抗体とを用いた場合、分泌腺の表面における紡錘型の筋上皮細胞の形状や配向性を視覚化させることができないことがわかる。
【００９０】
アクチン、ミオシンおよびケラチン−１４は、いずれも細胞骨格構成物質である。したがって、これらの結果から、筋上皮細胞中の細胞骨格構成物質（例えば、アクチン、ミオシンなどの収縮タンパク質；ケラチン、デスミン、ビメンチンなどの中間径フィラメント；チューブリンなどの微小管構成タンパク質など）に結合する物質を用いて汗腺全体を染色することにより、汗腺の分泌腺の表面における筋上皮細胞の細胞形状および配向性ならびに汗腺の形状を視覚化させることができることがわかる。
【００９１】
汗腺は、分泌腺を有している〔図６（Ａ）および（Ｂ）参照〕。また、分泌腺は、管腔を形成する分泌腺管腔細胞と、管腔の周囲に存在する筋上皮細胞とから構成されている。また、筋上皮細胞は、収縮すると考えられる。そのため、図２〜４に示された結果から、汗腺の分泌腺の表面において、筋上皮細胞が収縮した場合、分泌腺の管腔が収縮すると考えられる〔図６（Ｃ）のヒトの汗腺の分泌腺の構造を示す概略説明図における収縮状態〕。この場合、分泌腺の管腔の収縮に伴って汗が分泌腺の管腔内に分泌され、発汗が生じると考えられる、一方、汗腺の分泌腺の表面において、筋上皮細胞が非収縮状態である場合、分泌腺の管腔が非収縮状態〔図６（Ｃ）のヒトの汗腺の分泌腺の構造を示す概略説明図における非収縮状態〕となると考えられる。この状態では、汗が分泌腺の管腔内に分泌されず、発汗が生じないと考えられる。このように、汗腺の分泌腺の収縮状態は、発汗と関連すると考えられる。したがって、これらの結果から、細胞骨格構成物質に特異的に結合する結合物質を用いて汗腺全体を染色することにより、汗腺、特に、汗腺の分泌腺の形態、例えば、収縮状態などを確認することができることが示唆される。
【００９２】
実施例４
（１）汗腺と発汗誘導物質との接触
皮膚組織の真皮を細かく裁断し、真皮細片を得る。光学顕微鏡下にピンセットを用い、前記真皮細片から汗腺全体を採取する。
【００９３】
得られた汗腺を、コリン作動薬、アドレナリン作動薬などの発汗誘導物質のＰＢＳ溶液に浸漬させることにより、汗腺における発汗誘導を行なう。浸漬開始時から所定時間（１時間以内）経過後に、汗腺を回収する。
【００９４】
（２）固定試料の調製
真皮細片から採取された汗腺を用いる代わりに、実施例４（１）で得られた汗腺を用いることを除き、実施例１（１）と同様の操作を行なうことにより、洗浄済みの固定試料を得る。
【００９５】
（３）染色
実施例１（２）において、実施例１（１）で得られた洗浄済みの固定試料を用いる代わりに、実施例４（２）で得られた洗浄済みの固定試料を用いることを除き、実施例１（２）と同様の操作を行なうことにより、染色固定試料を得る。
【００９６】
（４）透明化処理
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた染色固定試料を用いる代わりに実施例４（３）で得られた染色固定試料を用いることを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、発汗誘導汗腺標本を得る。
【００９７】
（５）対照標本の作製
実施例４（２）において、実施例４（１）で得られた汗腺を用いる代わりに、真皮細片から採取された汗腺を用いることを除き、実施例４（２）〜（４）と同様の操作を行ない、対照標本を得る。
【００９８】
（６）発汗誘導の有無による汗腺の細胞骨格の構造変化の観察
実施例４（４）で得られた発汗誘導汗腺標本における筋上皮細胞の細胞骨格の構造と実施例４（５）で得られた対照標本における筋上皮細胞の細胞骨格の構造とを比較する。その結果、対照標本における筋上皮細胞と比べ、実施例４（４）で得られた発汗誘導汗腺標本における筋上皮細胞が収縮していることから、対照標本における汗腺の分泌腺と比べ、実施例４（４）で得られた発汗誘導汗腺標本における汗腺の分泌腺が収縮していることがわかる。これらの結果から、筋上皮細胞中の細胞骨格構成物質に結合する結合物質を用いて汗腺を染色することにより、コリン作動薬、アドレナリン作動薬などによって発汗誘導された汗腺の細胞骨格の構造変化を観察することができることがわかる。
【００９９】
実施例５
（１）汗腺と被験物質との接触
皮膚組織の真皮を細かく裁断し、真皮細片を得る。光学顕微鏡下にピンセットを用い、前記真皮細片から汗腺全体を採取する。
【０１００】
得られた汗腺を、被験物質のＰＢＳ溶液に浸漬させることにより、汗腺における発汗誘導を行なう。浸漬開始時から所定時間（１時間以内）経過後に、汗腺を回収する。
【０１０１】
（２）固定試料の調製
真皮細片から採取された汗腺を用いる代わりに、実施例５（１）で得られた汗腺を用いることを除き、実施例１（１）と同様の操作を行なうことにより、洗浄済みの固定試料を得る。
【０１０２】
（３）染色
実施例１（２）において、実施例１（１）で得られた洗浄済みの固定試料を用いる代わりに、実施例５（２）で得られた洗浄済みの固定試料を用いることを除き、実施例１（２）と同様の操作を行なうことにより、染色固定試料を得る。
【０１０３】
（４）透明化処理
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた染色固定試料を用いる代わりに実施例５（３）で得られた染色固定試料を用いることを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、被験物質処理汗腺標本を得る。
【０１０４】
（５）対照標本の作製
実施例５（２）において、実施例５（１）で得られた汗腺を用いる代わりに、真皮細片から採取された汗腺を用いることを除き、実施例５（２）〜（４）と同様の操作を行ない、対照標本を得る。
【０１０５】
（６）発汗誘導の有無による汗腺の細胞骨格の構造変化の観察
実施例５（４）で得られた被験物質処理汗腺標本における筋上皮細胞の細胞骨格の構造と実施例５（５）で得られた対照標本における筋上皮細胞の細胞骨格の構造とを比較する。その結果、対照標本における筋上皮細胞と比べ、実施例５（４）で得られた被験物質処理汗腺標本における筋上皮細胞が収縮することにより、対照標本における汗腺の分泌腺と比べ、実施例５（４）で得られた被験物質処理汗腺標本における分泌腺が収縮している場合、被験物質が発汗誘導作用を有する物質であると判断することができる。
【０１０６】
実施例６
（１）汗腺と被験物質と発汗誘導物質との接触
皮膚組織の真皮を細かく裁断し、真皮細片を得る。光学顕微鏡下にピンセットを用い、前記真皮細片から汗腺全体を採取する。
【０１０７】
得られた汗腺を、発汗誘導物質と被験物質とを含むＰＢＳ溶液に浸漬させることにより、汗腺における発汗誘導を行なう。浸漬開始時から所定時間（１時間以内）経過後に、汗腺を回収する。
【０１０８】
（２）汗腺と発汗誘導物質との接触
皮膚組織の真皮を細かく裁断し、真皮細片を得る。光学顕微鏡下にピンセットを用い、前記真皮細片から汗腺全体を採取する。
【０１０９】
得られた汗腺を、発汗誘導物質のＰＢＳ溶液に浸漬させることにより、汗腺における発汗誘導を行なう。浸漬開始時から所定時間（１時間以内）経過後に、汗腺を回収する。
【０１１０】
（３）固定試料の調製
真皮細片から採取された汗腺を用いる代わりに、実施例６（１）で得られた汗腺を用いることを除き、実施例１（１）と同様の操作を行なうことにより、洗浄済みの固定試料を得る。
【０１１１】
（４）染色
実施例１（２）において、実施例１（１）で得られた洗浄済みの固定試料を用いる代わりに、実施例６（２）で得られた洗浄済みの固定試料を用いることを除き、実施例１（２）と同様の操作を行なうことにより、染色固定試料を得る。
【０１１２】
（５）透明化処理
実施例１（３）において、実施例１（２）で得られた染色固定試料を用いる代わりに実施例６（３）で得られた染色固定試料を用いることを除き、実施例１（３）と同様の操作を行ない、被験物質処理汗腺標本を得る。
【０１１３】
（５）対照標本の作製
実施例６（２）において、実施例６（１）で得られた汗腺を用いる代わりに、実施例６（２）で得られた汗腺を用いることを除き、実施例６（３）〜（５）と同様の操作を行ない、対照標本を得る。
【０１１４】
（６）発汗誘導の有無による汗腺の細胞骨格の構造変化の観察
実施例６（４）で得られた被験物質処理汗腺標本における筋上皮細胞の細胞骨格の構造と実施例６（５）で得られた対照標本における筋上皮細胞の細胞骨格の構造とを比較する。その結果、対照標本における筋上皮細胞と比べ、実施例６（４）で得られた被験物質処理汗腺標本における筋上皮細胞が収縮しておらず、対照標本における汗腺の分泌腺と比べ、実施例６（４）で得られた被験物質処理汗腺標本における分泌腺が収縮していない場合、被験物質が制汗作用を有する物質であると判断することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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