(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんの処置において使用するための、オピオイドレセプターアゴニストと少なくとも１つの抗がん因子との組み合わせ物であって、ここで、
（ａ）前記オピオイドレセプターアゴニストは、少なくとも４週間にわたって治療的に有効な血漿レベルを確立するために１またはそれより多くの用量で患者に投与され、
（ｂ）少なくとも１つの抗がん因子は、ある期間を治療的に有効な血漿レベルで確立するために投与され、
（ｃ）前記ａ）およびｂ）の期間は、重複し、
前記少なくとも１つの抗がん因子および前記オピオイドレセプターアゴニストは逐次投与されることを特徴とし、ここで、前記オピオイドレセプターアゴニストが最初に投与され、
前記組み合わせ物は、（ｘｉ）オピオイドレセプターアゴニストであるＤ，Ｌメタドンと、（ｘｉｉ）ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、シクロホスファミド、テモゾロミド、シスプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、メトトレキサート、フルダラビン、チオグアニンおよびシタラビンの群から選択される少なくとも１つの抗がん因子を含む、
組み合わせ物。
【請求項２】
前記オピオイドレセプターアゴニストが、細胞増殖を阻害することができ、かつ／または細胞死を誘導することができる、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
前記患者が、抗がん因子を含む前処置を受けたことがある、請求項１または２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
治療的に妥当な用量を提供する前記オピオイドレセプターアゴニストに対する投与期間が、長期間処置を表す、請求項１〜３のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項５】
前記オピオイドレセプターアゴニストが、Ｄ／Ｌメタドンである、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
患者が、疾病および関連保健問題の国際統計分類の第１０回目の修正版（ＩＣＤ−１０）に従って分類される新生物に罹患しており、前記新生物は、クラスＣ００〜Ｃ９７の悪性新生物、クラスＤ００〜Ｄ０９の上皮内新生物、クラスＤ１０〜Ｄ３６の良性新生物およびクラスＤ３７〜Ｄ４８の性状不詳または不明の新生物からなる群からの新生物である、請求項１〜５のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項７】
患者が、膵臓癌腫、肝芽腫、結腸癌腫、小細胞肺がん、メラノーマ、乳癌腫、卵巣癌腫、前立腺癌腫、神経膠芽腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、白血病の原型、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫起源幹細胞、腫瘍幹細胞および多発性骨髄腫からなる群からの新生物に罹患している、請求項６に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
前記患者が、内因性抵抗性または獲得抵抗性のいずれかを示す、請求項１〜７のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項９】
前記患者が、次の抵抗性：
ｉ．アポトーシス抵抗性
ｉｉ．多剤抵抗性
ｉｉｉ．抗がん薬抵抗性
ｉｖ．細胞傷害薬抵抗性
ｖ．活性酸素種に対する抵抗性
ｖｉ．ＤＮＡ傷害剤に対する抵抗性
ｖｉｉ．毒性のある抗体に対する抵抗性
ｖｉｉｉ．ドキソルビシンまたはリツキシマブ抵抗性
ｉｘ．シスプラチン抵抗性
ｘ．テモゾロミド抵抗性
ｘｉ．ＨＥＲ２標的化治療、
ｘｉｉ．以下の原薬：メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、テモゾロミド、チオグアニン、テニポシド、デキサメタゾン、プレドニゾロン、シクロホスファミド、ジホスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、メルカプトプリンおよびフルダラビンのうちの１つまたはそれより多くに対する単一抵抗性または交差抵抗性
ｘｉｉｉ．照射抵抗性
のうちの１つまたはそれより多くを示す、請求項８に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
前記抗がん因子が、前記抗がん因子だけを使用してがんを処置する場合の推奨用量に等しいかまたはそれ未満の用量で与えられる、請求項１〜９のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項１１】
前記抗がん因子が、前記抗がん因子だけを使用してがんを処置する場合の推奨用量の３分の１の用量で与えられる、請求項１０に記載の組み合わせ物。
【請求項１２】
少なくとも１つのさらなるオピオイドレセプターアゴニストが、前記患者に投与される、請求項１〜１１のいずれかに記載の組み合わせ物。
【請求項１３】
がんの処置において使用するための、オピオイドレセプターアゴニストを含む組成物であって、
（ａ）前記組成物は、少なくとも４週間にわたって治療的に有効な血漿レベルを確立する１またはそれより多くの前記オピオイドレセプターアゴニストの用量で患者に投与されることを特徴とし、
（ｂ）前記組成物は、少なくとも１つの抗がん因子と組み合わせて前記患者に投与されることを特徴とし、ここで、前記抗がん因子はある期間を治療的に有効な血漿レベルで確立するように投与され、
（ｃ）前記ａ）およびｂ）の期間は、重複し、
前記少なくとも１つの抗がん因子および前記組成物は逐次投与されることを特徴とし、ここで、前記組成物が最初に投与され、
ここで、前記組成物は、（ｘｉ）オピオイドレセプターアゴニストであるＤ，Ｌメタドンを含み、（ｘｉｉ）ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、シクロホスファミド、テモゾロミド、シスプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、メトトレキサート、フルダラビン、チオグアニンおよびシタラビンの群から選択される少なくとも１つの抗がん因子と組み合わせて投与される、
組成物。
【請求項１４】
がんの処置において使用するための、少なくとも１つの抗がん因子を含む組成物であって、
（ａ）前記組成物は、ある期間を治療的に有効な血漿レベルで確立するように投与されることを特徴とし、
（ｂ）前記組成物はオピオイドレセプターアゴニストと組み合わせて投与されることを特徴とし、ここで、前記オピオイドレセプターアゴニストは、少なくとも４週間にわたって治療的に有効な血漿レベルを確立するように１またはそれより多くの用量で患者に投与され、
（ｃ）前記ａ）およびｂ）の期間は、重複し、
前記組成物および前記オピオイドレセプターアゴニストは逐次投与されることを特徴とし、ここで、前記オピオイドレセプターアゴニストが最初に投与され、
ここで、前記組成物は、（ｘｉ）オピオイドレセプターアゴニストであるＤ，Ｌメタドンと組み合わせて投与され、（ｘｉｉ）ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、シクロホスファミド、テモゾロミド、シスプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、メトトレキサート、フルダラビン、チオグアニンおよびシタラビンの群から選択される少なくとも１つの抗がん因子を含む、
組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オピオイドレセプターアゴニストと抗がん化合物との組み合わせに基づいてがん患者を処置するための新規ストラテジーに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
がんは、細胞分化の喪失によって特徴付けられる組織の異常な成長として定義され得る。この用語は、原発部位から他の身体部分に未分化細胞が侵襲的に広がり、そこでさらに未分化細胞の複製が起こり、最終的には、組織および器官の正常な機能が妨害される、大きな疾患群を包含する。
【０００３】
がんは、本来、環境病であり、症例の９０〜９５％は環境要因のせいであり、５〜１０％が遺伝に起因する。がん研究者が使用するとき、環境とは、単に汚染ではなく、遺伝的に受け継がれない任意の原因を意味する。がん死亡に関与する一般的な環境要因としては、喫煙（２５〜３０％）、食事および肥満（３０〜３５％）、感染症（１５〜２０％）、放射線（電離と非電離の両方、最大１０％）、ストレス、身体活動の不足、ならびに環境汚染物質が挙げられる。
【０００４】
がんは、毎年、３００万を超える新規症例および１７０万の死亡数であるにもかかわらず、欧州において、２番目に重要な死因および罹患率である。世界規模では、がんは、２００４年に７４０万の死亡数（全体のおよそ１３％）を占めた。
【０００５】
がん死亡の４０％超は、予防できるにもかかわらず、がんは、欧州地域において死因の第１位であり、全体の２０％の原因である。著しいことに、欧州は、全世界の人口のたった８分の１しか構成していないが、世界のがんの全症例のおよそ４分の１：１年あたり約３２０万人の新規患者を有する。
【０００６】
がんの最も一般的な形態は、前立腺がん、直腸結腸がん、乳がん、白血病および肺がんだった。７５歳未満でがんになるリスクは、２６．５％、すなわち、およそ４人に１人である。しかしながら、上記の欧州の人口は、高齢化しているので、がんの新規症例の割合も、上昇すると予想される。
【０００７】
各がんは、未分化細胞の増殖の部位、性質および臨床上の原因によって特徴付けられるが、がんのイニシエーションに関する根底にある機序は、完全に理解されていない。
【０００８】
がんは、通常、化学療法、放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）および手術によって処置される。手術に加えて化学療法は、乳がん、直腸結腸がん、膵がん、骨原性肉腫、精巣がん、卵巣がんおよびある特定の肺がんを含むいくつかの異なるがんタイプにおいて有用であることが立証されている。放射線療法は、がんの症状を治癒させるためまたは改善するために電離放射線の使用を伴う。放射線療法は、全症例の約半数において使用され、その放射線は、近接照射療法の形態では内部線源から、または外部線源からであり得る。放射線は、代表的には、手術およびまたは化学療法に加えて使用されるが、初期の頭頸部がんなどのある特定のタイプのがんの場合は、単独で使用されることがある。有痛性の骨転移の場合、約７０％の人において有効であることが見出されている。
【０００９】
数多くの治療ストラテジーがあるにもかかわらず、現在の処置の選択肢で効果的に処置できない腫瘍がなおも存在する。さらに、放射線療法および化学療法の有効性は、身体の他の組織に対する毒性によって限定されることが多い。さらに、抗がん治療は、放射線療法および／または化学療法に対する腫瘍細胞の抵抗性が原因で効果的でないことが多い。
【００１０】
したがって、腫瘍学では、がん処置をより効果的にする新規ストラテジーが大いに必要とされている。特に、がん患者を処置するための新規手段を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
この目的は、がんを処置するためにオピオイドレセプターアゴニストと抗がん薬との組み合わせを使用することによって解決され、ここで、この組み合わせは、本発明の請求項１に記載の特定の投与スキームで与えられる。
【００１２】
第１の態様において、本発明は、がんの処置において使用するための、オピオイドレセプターアゴニストと少なくとも１つの抗がん因子との組み合わせに関し、ここで、
（ａ）前記オピオイドレセプターアゴニストは、少なくとも１週間にわたって治療的に有効な血漿レベルを確立するために１またはそれより多くの用量で患者に投与され、
（ｂ）化学療法剤、細胞傷害剤、細胞分裂抑制剤、免疫毒性剤および／または照射療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）からなる群より選択される少なくとも１つの抗がん因子は、ある期間を治療的に有効な血漿レベルで確立するために投与され、
（ｃ）前記ａ）およびｂ）の期間は、重複する。
【００１３】
この併用療法は、オピオイドレセプターアゴニストが抗がん因子とともに、がん細胞をより効果的に殺滅するという予想外の知見に基づく。さらに、本発明者らは、オピオイドレセプターアゴニストと抗がん因子との相互作用が、図２６に図示されるような自己強化（ｓｅｌｆ−ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ）フィードバックループであることを示すことができた。このループの第１の経路では、オピオイドレセプターアゴニストが、抗がん薬の細胞取り込みを増強し、抗がん薬の流出を阻害する。前記ループの第２の経路では、蓄積した抗がん薬が、がん細胞の表面上におけるオピオイドレセプターの発現を増加させる。ゆえに、オピオイドレセプターアゴニストと抗がん因子の両方が、それらの細胞傷害性の潜在能力をより高い程度に発揮し得る。
【００１４】
さらに、本発明は、がん細胞の細胞表面上に発現されるオピオイドレセプターの量が、異なるがんタイプの間で様々であり、また、個体間の差異も示し、この表面会合型のオピオイドレセプターの発現が、抗がん因子によって増加され得るという予想外の知見に基づく。例えば、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、エトポシド、メトトレキサート、シタラビン、テニポシド、リツキシマブ、フルダラビンは、がん細胞の細胞表面上に発現されるオピオイドレセプターの数の増加を誘導することができる。
【００１５】
大規模なインビトロ実験およびインビボ実験によって、種々のがんタイプが本発明の併用療法の対象となり得ることを示すことができた。さらにまた、種々の抗がん薬および種々のオピオイド類が、上に記載されたフィードバックループにおいて有効であることが立証された。
【００１６】
ゆえに、本発明に係るオピオイドレセプターアゴニストと抗がん薬との併用療法は、以下の方法のうちの１つまたはそれより多くによってがん治療を改善し得る：
・オピオイドレセプターのアップレギュレーションに起因して、以前のオピオイド非感受性がんタイプが、オピオイドレセプターアゴニスト治療の対象になり得る。
・オピオイドレセプターアゴニストによって誘導される、抗がん薬の細胞内蓄積（抗がん薬の取り込みの増加もしくは流出の減少または両方の組み合わせによって）に起因して、その処置の有効性が増強される。
・これにより、従来の治療的な抗がんアプローチによって処置可能でないかまたは効果的に処置可能でないがんタイプの治療をもたらすことができた。
・さらに、これにより、抗がん薬の用量を減少させることが可能になり、化学療法の安全性および患者の服薬率が高まるだろう。
・最終的には、抵抗性のがん細胞が、抗がん処置に対して再度高感度化され得る。
・さらに、販売中の数多くのオピオイド類および数多くの抗がん薬が、高められた有効性および／または安全性のおかげで、改善された処置になり得る新しい薬の組み合わせに対して道を開く。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
がんの処置において使用するための、オピオイドレセプターアゴニストと少なくとも１つの抗がん因子との組み合わせであって、ここで、
（ａ）前記オピオイドレセプターアゴニストは、少なくとも１週間にわたって治療的に有効な血漿レベルを確立するために１またはそれより多くの用量で患者に投与され、
（ｂ）化学療法剤、細胞傷害剤、細胞分裂抑制剤、免疫毒性剤および／または照射療法からなる群より選択される少なくとも１つの抗がん因子は、ある期間を治療的に有効な血漿レベルで確立するために投与され、
（ｃ）前記ａ）およびｂ）の期間は、重複する、
組み合わせ。
（項目２）
前記抗がん因子および前記オピオイドレセプターアゴニストが、同時にまたは逐次投与される、項目１に記載の組み合わせ。
（項目３）
前記オピオイドレセプターアゴニストが、細胞増殖を阻害することができ、かつ／または細胞死を誘導することができる、項目１または２に記載の組み合わせ。
（項目４）
前記患者が、抗がん因子を含む前処置を受けたことがある、項目１〜３のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目５）
治療的に妥当な用量を提供する前記オピオイドレセプターアゴニストに対する投与期間が、少なくとも２週間、より好ましくは４週間であり、なおもより好ましくは、長期間処置を表す、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目６）
前記オピオイドレセプターアゴニストが、
ｉ．メタドン群の化合物、例えば、Ｄ／Ｌ−メタドン、Ｄ−メタドン、Ｌ−メタドン、ノルメタドン、
ｉｉ．フェンタニル誘導体、例えば、フェンタニル、スフェンタニルおよびカルフェンタニル；
ｉｉｉ．モルフィナン化合物、例えば、モルヒネ、コデイン、ヘロイン、デキストラロルファン、デキストロメトルファン、デキストロファノール、ジメモルファン、レバロルファン、レボフレチルノルモルファノール、レボメトルファン、レボフェナシルモルファン、レボルファノール、メトルファン、モルファノール、オキシロルファン、フェノモルファンおよびキソルファノール、
ｉｖ．ベンゾモルファン誘導体、例えば、５，９−ＤＥＨＢ、アラゾシン、アナゾシン、ブレマゾシン、ブチナゾシン、カルバゾシン、コガゾシン、シクラゾシン、デゾシン、エプタゾシン、エタゾシン、エチルケトシクラゾシン、フルオロフェン、ゲマゾシン、イバゾシン、ケタゾシン、メタゾシン、モキサゾシン、ペンタゾシン、フェナゾシン、クアダゾシン、チアゾシン、トナゾシン、ボラゾシンおよび８−ＣＡＣ；
ｖ．４−フェニルピペリジン誘導体、例えば、ペチジン、ケトベミドン、アニレリジン、ピミノジン、フェノペリジン、フレチジン、アルファ−プロジン、トリメペリジン、ならびに４−フェニルピロリジン誘導体、例えば、プロファドール（ｐｒｏｆａｄｏｌ）および４−フェニルアゼパン誘導体、例えば、メプタジノール、
ｖｉ．シクロヘキサン誘導体、例えば、チリジン、Ｕ−５０４８８、トラマドールおよびタペンタドール
ｖｉｉ．内因性オピオイド類、例えば、エンドルフィン類、エンケファリン類、ダイノルフィン類、ノシセプチン、デルモルフィン類、モルフィセプチン、エンドモルフィン類、およびタンパク質プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）に由来するフラグメント
からなるリストより選択される、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目７）
前記オピオイドレセプターアゴニストが、前記メタドン群に属する、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目８）
前記オピオイドレセプターアゴニストが、Ｄ／Ｌメタドンであり、好ましくは、その塩酸塩の形態である、項目７に記載の組み合わせ。
（項目９）
前記抗がん因子が、
ｉ．インターカレート物質、例えば、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシンおよびダウノルビシン；
ｉｉ．トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ラメラリンＤ、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン類およびアウリントリカルボン酸；
ｉｉｉ．ニトロソ尿素化合物、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン；
ｉｖ．ナイトロジェンマスタード類、例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、ベンダムスチン、メルファラン、クロラムブシル、マホスファミド、トロホスファミドおよびイホスファミド；
ｖ．スルホン酸アルキル類、例えば、ブスルファンおよびトレオスルファン；
ｖｉ．アルキル化剤、例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミドおよびチオテパ；
ｖｉｉ．白金アナログ、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンおよびトリプラチンテトラニトレート；
ｖｉｉｉ．微小管破壊薬、例えば、ビンブラスチン、コルセミドおよびノコダゾール；
ｉｘ．メトトレキサート、アミノプテリン、ジクロロメトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセドおよびプララトレキサートのような葉酸代謝拮抗薬：
ｘ．アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびクラドリビンのようなプリンアナログ；
ｘｉ．５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−アザウラシル、ゲムシタビンのようなピリミジンアナログ；
ｘｉｉ．ゲスターゲン、アンドロゲン、糖質コルチコイド類、デキサメタゾン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンのようなステロイドホルモン；
ｘｉｉｉ．抗がん抗体、例えば、モノクローナル抗体、放射活性的に標識された抗体および抗体−薬物結合体；
ｘｉｖ．抗がんペプチド、例えば、放射活性的に標識されたペプチドおよびペプチド−薬物結合体；
ｘｖ．アルファ、ベータもしくはガンマ線照射、電子粒子、または放射活性的に標識された化合物；
ｘｖｉ．タキサン、ならびにパクリタキセルおよびドセタキセルのようなタキサンアナログ
からなるリストより選択される、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目１０）
前記抗がん因子が、メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、テモゾロミド、エトポシド、ビンクリスチン、チオグアニン、ゲムシタビン、ベータ線照射またはガンマ線照射、特に、ドキソルビシン、シスプラチン、オキサリプラチン、リツキシマブまたはトラスツズマブである、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目１１）
患者が、疾病および関連保健問題の国際統計分類の第１０回目の修正版（ＩＣＤ−１０）に従って分類される新生物に罹患しており、前記新生物は、クラスＣ００〜Ｃ９７の悪性新生物、クラスＤ００〜Ｄ０９の上皮内新生物、クラスＤ１０〜Ｄ３６の良性新生物およびクラスＤ３７〜Ｄ４８の性状不詳または不明の新生物からなる群からの新生物である、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目１２）
患者が、膵臓癌腫、肝芽腫、結腸癌腫、（小細胞肺がん、メラノーマ、乳癌腫、卵巣癌腫、前立腺癌腫、神経膠芽腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、白血病の原型、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、神経膠芽腫起源幹細胞、腫瘍幹細胞および多発性骨髄腫からなる群からの新生物に罹患している、項目１１に記載の組み合わせ。
（項目１３）
前記患者が、内因性抵抗性または獲得抵抗性のいずれかを示す、前述の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目１４）
前記患者が、次の抵抗性：
ｉ．アポトーシス抵抗性
ｉｉ．多剤抵抗性
ｉｉｉ．抗がん薬抵抗性
ｉｖ．細胞傷害薬抵抗性
ｖ．活性酸素種に対する抵抗性
ｖｉ．ＤＮＡ傷害剤に対する抵抗性
ｖｉｉ．毒性のある抗体に対する抵抗性
ｖｉｉｉ．ドキソルビシンまたはリツキシマブ抵抗性
ｉｘ．シスプラチン抵抗性
ｘ．テモゾロミド抵抗性
ｘｉ．ＨＥＲ２標的化治療、例えば、トラスツズマブ処置に対する抵抗性
ｘｉｉ．特に、以下の原薬：メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、テモゾロミド、チオグアニン、テニポシド、デキサメタゾン、プレドニゾロン、シクロホスファミド、ジホスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、メルカプトプリンおよびフルダラビンのうちの１つまたはそれより多くに対する単一抵抗性または交差抵抗性
ｘｉｉｉ．照射抵抗性（例えば、アルファ、ベータ、ガンマまたはオージェ電子）
のうちの１つまたはそれより多くを示す、項目１３に記載の組み合わせ。
（項目１５）
前記抗がん因子が、前記抗がん因子だけを使用してがんを処置する場合の推奨用量に等しいかまたはそれ未満の用量で与えられる、上記の項目のいずれかに記載の組み合わせ。
（項目１６）
前記抗がん因子が、前記抗がん因子だけを使用してがんを処置する場合の推奨用量の３分の１、好ましくは、３０分の１、より好ましくは、１００分の１の用量で与えられる、項目１５に記載の組み合わせ。
（項目１７）
少なくとも１つのさらなるオピオイドレセプターアゴニストが、前記患者に投与される、上記の項目のいずれか１項に記載の組み合わせ。
（項目１８）
前記オピオイドモルヒネが、さらなるオピオイドフェンタニルとともに前記患者に投与される、項目１７に記載の組み合わせ。
（項目１９）
上記の項目のいずれかに記載の組み合わせを選択するためおよび／または前記組み合わせの中で使用される前記薬物の用量を選択するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）好ましくはがん生検材料または液体サンプル（例えば、血液、羊水、胸膜液、脳脊髄液または腹水）から単離された、がん細胞、細胞株または初代細胞のインビトロ培養物を提供する工程；
（ｂ）必要に応じて、工程（ａ）からの細胞をオピオイドレセプターの発現について試験する工程；
（ｃ）工程（ａ）からの細胞をオピオイドアゴニストもしくは少なくとも１つの抗がん薬またはそれらの組み合わせで処置する工程；
（ｄ）前記細胞を細胞死／生存率および／またはオピオイドレセプターの発現について解析する工程、
（ｅ）前記オピオイドレセプター／抗がん薬の組み合わせを、および好ましくは、前記組み合わせに対する用量を細胞死／生存率または増殖阻害の所望の程度に基づいて選択する工程；ならびに／または
（ｆ）前記抗がん因子を、および好ましくは、オピオイドレセプター誘導の所望の程度を示す前記抗がん因子に対する用量を選択する工程
を含む、方法。
（項目２０）
がんを処置するためのオピオイドレセプターアゴニストを選択するため、および好ましくは、前記オピオイドレセプターアゴニストに対する処置用量を選択するための方法であって、前記方法は、以下の工程：
（ａ）好ましくはがん生検材料または液体サンプル（例えば、血液、羊水、胸膜液、脳脊髄液または腹水）から単離された、がん細胞、細胞株または初代細胞のインビトロ培養物を提供する工程；
（ｂ）必要に応じて、工程（ａ）からの細胞をオピオイドレセプターの発現について試験する工程；
（ｃ）工程（ａ）からの細胞を処置する工程；
（ｄ）前記細胞を細胞死／生存率について解析する工程；
（ｅ）前記オピオイドレセプター／抗がん薬の組み合わせを、および好ましくは、前記組み合わせに対する用量を細胞死／生存率または増殖阻害の所望の程度に基づいて選択する工程；ならびに／または
（ｆ）前記オピオイドレセプターアゴニストを、および好ましくは、細胞死誘導の所望の程度を示す前記オピオイドレセプターアゴニストに対する用量を選択する工程
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ｄ，Ｌ−メタドンは、オピオイドレセプターのクリティカルな発現レベルに応じて、エキソビボにおいてＡＬＬ細胞を殺滅する。（Ａ）ヒトＡＬＬ−ＳＣＩＤ６およびＡＬＬ−ＳＣＩＤ３、異種移植されたマウスに由来するＡＬＬ−ＳＣＩＤ７およびプレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤは、異なるレベルのオピオイドレセプターをそれらの細胞表面上に示す。ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ３およびＡＬＬ−ＳＣＩＤ７を、ナロキソン−フルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプターの発現を測定し（ＯＲ，太い黒色曲線）、解析した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。（Ｂ）ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ３、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ７およびプレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤを、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンで処置した（示されているとおり）。２４時間後および４８時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、以下のとおり計算した：１００×［実験で死んだ細胞（％）−培地中の自発的に死んだ細胞（％）］／［１００％−培地中の自発的に死んだ細胞（％）］。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図２】Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、中程度の量のオピオイドレセプターを発現しているＡＬＬ細胞においてアポトーシスを誘導する。（Ａ）種々のＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株（Ｔａｎｏｕｅ、Ｎａｌｍ６およびＲｅｈ）は、中程度の数のオピオイドレセプターをそれらの細胞表面上に発現している。Ｔａｎｏｕｅ、Ｎａｌｍ６およびＲｅｈを、ナロキソン−フルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプター発現を測定し（ＯＲ，太い黒色曲線）、解析した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。（Ｂ）ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株（Ｔａｎｏｕｅ、Ｎａｌｍ６およびＲｅｈ）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ，白色の棒）、ドキソルビシンの単独、またはドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で処置した。細胞株Ｔａｎｏｕｅに対して、本発明者らは、ドキソルビシンを０．０６μｇ／ｍＬの濃度で使用し、Ｎａｌｍ６およびＲｅｈに対して、０．０１μｇ／ｍＬの濃度で使用した。刺激の１２０時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。（Ｃ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、エキソビボにおいて、異種移植片由来のＢＣＰ−ＡＬＬ患者細胞のドキソルビシン感度を強く増強する。異種移植片由来のＢＣＰ−ＡＬＬ細胞（プレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤ）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ，白色の棒）、０．０１μｇ／ｍＬドキソルビシンの単独、またはドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（＋Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で処置した。刺激の４８時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図３】ドキソルビシンと組み合わせたＤ，Ｌ−メタドンは、インビトロにおいて、中程度の量のオピオイドレセプターを発現しているＢＣＰ−ＡＬＬ細胞におけるアポトーシス経路の不十分な活性化を回復させる。（Ａ）Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置は、カスパーゼ活性化を誘発する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、Ｄ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ）、０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシン（＋Ｄｏｘｏ）の単独またはドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ）で処置した。１２０時間後、カスパーゼ−２、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を行った。約４８ｋＤａにおいて、プロカスパーゼ−２のダウンレギュレーションが検出された。カスパーゼ−９の活性型フラグメントが、約３７ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−３の活性型フラグメントが、約１９ｋＤａおよび約１７ｋＤａにおいて検出され、ＰＡＲＰ切断が、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｂ）Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンによって誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ活性化に依存する。細胞株Ｔａｎｏｕｅを５０μＭのカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ．ｆｍｋとともに１時間プレインキュベーション（白色の棒）した後、または前処置なしで（黒色の棒）、Ｄ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）を０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシンと組み合わせて加えた。刺激の１２０時間後に、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって、アポトーシス誘導を検出した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。（Ｃ）Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置によるＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーション。細胞株Ｔａｎｏｕｅを、Ｄ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ）、０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシン（＋Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ）で処置した。１２０時間後、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬに対するウエスタンブロット解析を行った。ＸＩＡＰは、５８ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ｘＬは、約３０ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図４】ドキソルビシンは、オピオイドレセプターの発現を増強するのに対し、Ｄ，Ｌ−メタドンは、ドキソルビシンの取り込みを増強し、その流出を阻害する。（Ａ）ドキソルビシンは、細胞表面上のオピオイドレセプター発現を増強する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシンで９６時間処置した。ドキソルビシンで処置された細胞（＋Ｄｏｘｏ）および未処置の細胞（−Ｄｏｘｏ）をナロキソン−フルオレセインで染色した後、相対的な蛍光強度をフローサイトメトリーで計測した。細胞の自己蛍光（−Ｄｏｘｏ）およびドキソルビシン蛍光（＋Ｄｏｘｏ）を減算した後の、オピオイドレセプター発現のＸ倍増加が示されている。（Ｂ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、ドキソルビシンの取り込みを増強し、その流出を阻害する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独またはドキソルビシンと１０μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせ（Ｄｏｘｏ＋メタドン）で２４時間前処理した。フローサイトメトリーを使用して、２４時間後に、最大のドキソルビシン細胞取り込みを、細胞内のドキソルビシン蛍光によって解析した（０ｈ，最大取り込み）。ドキソルビシンで処置された細胞を洗浄した後、細胞を未処置のまま放置するか（Ｄｏｘｏ）、または１０μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンで処置し（Ｄｏｘｏ＋メタドン）、種々の時間にわたってインキュベートした（８ｈ、２４ｈ）。フローサイトメトリーを使用して、８時間後および２４時間後に、ドキソルビシンの流出を、細胞内のドキソルビシン蛍光によって解析した。値は、平均蛍光強度＋／−ＳＥである。
【図５】Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって誘導されるアポトーシスは、ｃＡＭＰのダウンレギュレーションを介したオピオイドレセプターの引き金作用に依存する。（Ａ）オピオイドレセプターの引き金作用の阻害は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって媒介されるアポトーシス誘導を阻害する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、６０μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。９６時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定した。（Ｂ）オピオイドレセプターの引き金作用の阻害は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって媒介されるカスパーゼ活性化を阻害する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、６０μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。カスパーゼ−２、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を、インキュベーションの９６時間後に行った。プロカスパーゼ−２のダウンレギュレーションが、約４８ｋＤａにおいて検出された。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９ｋＤａおよび約１７ｋＤａにおいて検出され、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｃ）ホスホジエステラーゼ活性の抑制を介したｃＡＭＰレベルの上昇は、アポトーシスを阻害する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、２００μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独または示されるとおりの種々の組み合わせとともに９６時間インキュベートした。（Ｄ）オピオイドレセプターからの阻害性Ｇタンパク質の脱共役は、アデニリルシクラーゼの阻害を妨げることによって、アポトーシスを阻害する。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、２０ｎｇ／ｍＬの百日咳毒素（ＰＴＸ）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．０６μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。９６時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定した。アポトーシス細胞の割合をＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって計測した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図６】Ｄ，Ｌ−メタドンは、白血病異種移植片の成長を阻害し、ドキソルビシン感度を高める。患者由来のＴ−ＡＬＬのインビボ継代のフラグメント（ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６，図１も参照のこと）を、雄のＮＳＧマウスに移植した。マウスを、Ｄ，Ｌ−メタドン単独（ｎ＝８，経口的、１〜７６日目、Ｄ，Ｌ−メタドン）、ドキソルビシン単独（ｎ＝８，ｉ．ｖ．４６、５３、６０、７６日目、ドキソルビシン）またはＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置（ｎ＝８，Ｄ，Ｌ−メタドン＋Ｄｏｘｏ）で処置した。Ｄ，Ｌ−メタドンは、２０から１２０ｍｇ／ｋｇ／日まで毎週増加させて使用し、ドキソルビシンは、３ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。コントロール群として、異種移植されたマウスを、食塩水中の１０％Ｔｗｅｅｎ８０でｉ．ｖ．処置した（ｎ＝８，ビヒクル）。移植後７６日間にわたって、腫瘍の成長、体重および健康状態についてすべてのマウスをモニターした。＊ビヒクルに対して有意（ｐ＜０．０５，マン・ホイットニーＵ検定）。
【図７】オピオイドレセプターのシグナル伝達。Ｄ，Ｌ−メタドンのようなアゴニストによるオピオイドレセプター（ＯＲ）の刺激は、阻害性Ｇｉタンパク質の活性化をもたらす。そのαｉサブユニットは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を不活性化し、細胞内のｃＡＭＰレベルを低下させ、それにより、いくつかの異なる調節因子によって媒介され得るアポトーシスに至る。また、そのＧｉタンパク質のβγ−サブユニットは、Ｃａ２＋チャネルの阻害およびＫ＋チャネルの活性化のような、異なるエフェクターの活性を調節する。
【図８】神経膠芽腫細胞上でのオピオイドレセプターの発現。神経膠芽腫細胞株Ｕ１１８ＭＧおよびＡ１７２を、ナロキソンフルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプターの発現（ＯＲ，太い黒色曲線）を測定し、解析した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。
【図９】Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンの単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独または０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンと組み合わせた３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄｏｘｏ＋Ｄ，Ｌ−メタドン）とともにインキュベートした。コントロールは、未処置の神経膠芽腫細胞である。１４４時間後、光学顕微鏡写真を撮影した。Ａ１７２と３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンおよび０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンとの同時処置により、底（ｇｒｏｕｎｄ）からの細胞の剥離、膜ブレブ形成および細胞収縮がもたらされた。
【図１０】Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、神経膠芽腫細胞においてアポトーシスを誘導する。Ａ１７２およびＵ１１８ＭＧ神経膠芽腫細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独（培地，白色の棒）、ドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ，黒色の棒）の単独、またはドキソルビシンに加えて種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で処置した。１２０時間後および１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、以下のとおり計算した：１００×［実験で死んだ細胞（％）−培地中の自発的に死んだ細胞（％）］／［１００％−培地中の自発的に死んだ細胞（％）］。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図１１】Ｄ，Ｌ−メタドンは、初代ヒト神経膠芽腫細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する。（Ａ）初代ヒト神経膠芽腫細胞を、ナロキソンフルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプター発現（ＯＲ，太い黒色曲線）を測定し、解析した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。（Ｂ）初代ヒト神経膠芽腫細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独（培地，白色の棒）、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ，黒色の棒）の単独、または０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で処置した。１２０時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１ｃに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値，バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図１２】Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫起源幹細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する。（Ａ）神経膠芽腫起源幹細胞を、ナロキソンフルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプター発現（ＯＲ，太い黒色曲線）を測定し、解析した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。（Ｂ）神経膠芽腫起源幹細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独（培地，白色の棒）、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ，黒色の棒）の単独、または０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で処置した。１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１ｃに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図１３−１】図１３。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いる神経膠芽腫細胞の細胞死誘導は、カスパーゼ活性化に依存する。（Ａ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫細胞における不十分なカスパーゼ活性化をドキソルビシンによって回復させた。Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えて種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。１４４時間後、カスパーゼ−１０、−２、−９、−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を行った。プロカスパーゼ−１０のダウンレギュレーションが、約５８ｋＤａにおいて、プロカスパーゼ−２のダウンレギュレーションが、約４８ｋＤａにおいて、検出された。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１７ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて、検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｂ）カスパーゼの広域性阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋによるカスパーゼ活性化の阻害は、Ａ１７２細胞においてＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置によって誘導されるアポトーシスを阻止する。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、５０μｍｏｌ／ＬのｚＶＡＤ．ｆｍｋの非存在下（培地，黒色の棒）または存在下（白色棒，５０μｍｏｌ／ｍＬ  ｚＶＡＤ．ｆｍｋ）において、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（＋０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）と組み合わせた種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。１２０時間後および１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１ｃに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。（Ｃ）ドキソルビシンと組み合わせてＤ，Ｌ−メタドンを使用することによる、神経膠芽腫細胞におけるＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーション。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）で１４４時間処置した。ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬに対するウエスタンブロット解析を行った。ＸＩＡＰは、５８ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ｘＬは、３０ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図１３−２】図１３。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いる神経膠芽腫細胞の細胞死誘導は、カスパーゼ活性化に依存する。（Ａ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫細胞における不十分なカスパーゼ活性化をドキソルビシンによって回復させた。Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えて種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。１４４時間後、カスパーゼ−１０、−２、−９、−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を行った。プロカスパーゼ−１０のダウンレギュレーションが、約５８ｋＤａにおいて、プロカスパーゼ−２のダウンレギュレーションが、約４８ｋＤａにおいて、検出された。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１７ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて、検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｂ）カスパーゼの広域性阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋによるカスパーゼ活性化の阻害は、Ａ１７２細胞においてＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置によって誘導されるアポトーシスを阻止する。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、５０μｍｏｌ／ＬのｚＶＡＤ．ｆｍｋの非存在下（培地，黒色の棒）または存在下（白色棒，５０μｍｏｌ／ｍＬ  ｚＶＡＤ．ｆｍｋ）において、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（＋０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）と組み合わせた種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。１２０時間後および１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１ｃに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。（Ｃ）ドキソルビシンと組み合わせてＤ，Ｌ−メタドンを使用することによる、神経膠芽腫細胞におけるＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーション。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）で１４４時間処置した。ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬに対するウエスタンブロット解析を行った。ＸＩＡＰは、５８ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ｘＬは、３０ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図１４】Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫起源幹細胞におけるアポトーシス経路の不十分な活性化をドキソルビシンによって逆転させた。（Ａ）神経膠芽腫起源幹細胞を、Ｄ，Ｌ−メタドン（３μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（３μｇ／ｍＬ）で処置した。１４４時間後、カスパーゼ−１０、−２、−９、−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を行った。プロカスパーゼ−１０のダウンレギュレーションは、約５８ｋＤａにおいて、プロカスパーゼ−２のダウンレギュレーションは、約４８ｋＤａにおいて検出された。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９ｋＤａおよび約１７ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｂ）神経膠芽腫起源幹細胞を、Ｄ，Ｌ−メタドン（３μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）の単独、またはドキソルビシン（０．１μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（３μｇ／ｍＬ）で１４４時間処置した。ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳに対するウエスタンブロット解析を行った。ＸＩＡＰは、５８ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ＸＬは、３０ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ｘＳは、２７ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図１５】Ｄ，Ｌ−メタドンは、ドキソルビシンの取り込みを増強し、その流出を阻害する。（Ａ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫細胞株Ａ１７２においてドキソルビシン蓄積を増強する。Ａ１７２を、０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシンの単独とともに、または１０μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンと組み合わせてインキュベートした。４、８および２４時間のインキュベーションの後、ドキソルビシンの蛍光強度（Ｄｏｘｏ）を、フローサイトメトリー解析を使用して計測した。グラフでは、相対的なドキソルビシンの取り込みが示されている。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。（Ｂ）Ａ１７２を、０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシンとともに４時間インキュベートした。ドキソルビシン含有培地を洗浄した後（０時間）の異なる時点において（４、８および２４ｈ）、ドキソルビシンの蛍光強度を、フローサイトメトリー解析を用いて計測した。グラフでは、相対的なドキソルビシン含有量が示されている。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図１６】１ドキソルビシンは、細胞表面上のオピオイドレセプターの発現を増強する。（Ａ）神経膠芽腫細胞株Ａ１７２を、０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンで１０６時間処置した。ドキソルビシンで処置された細胞（ドキソルビシン）および未処置の細胞をナロキソン−フルオレセイン（ナロキソン）で染色した後、相対的な蛍光強度をフローサイトメトリーで測定した。（Ｂ）未処置コントロール細胞およびドキソルビシンコントロール細胞、ナロキソンで処置された細胞の表形式の要約であって、Ｄ（ナロキソン−コントロール）は、細胞の自己蛍光（コントロール）を減算した後の蛍光強度の中央値を表している。
【図１７】Ｄ，Ｌ−メタドンは、白血病がん細胞（Ｎａｌｍ−６）、膵がん細胞（Ｃｏｌｏ３５７）および卵巣がん細胞（Ａ２７８０）をエトポシド処置またはシスプラチン処置に対して高感度化する。Ｎａｌｍ６、Ｃｏｌｏ３５７およびＡ２７８０細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独（培地，白色の棒）、０．０３μｇ／ｍＬのエトポシドもしくは０．３μｇ／ｍＬのシスプラチンの単独、または０．０３μｇ／ｍＬのエトポシド（０．０３μｇ／ｍＬ  Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ，黒色の棒）もしくは０．３μｇ／ｍＬのシスプラチン（０．３μｇ／ｍＬ  シスプラチン，黒色の棒）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。１２０〜１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１ｃに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図１８】Ｄ，Ｌ−メタドンは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）細胞をフルダラビン処置に対して高感度化する。ＣＬＬ細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独（培地，白色の棒）、０．１μＭフルダラビン（０．１μＭ  Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ，黒色の棒）の単独、または０．１μＭフルダラビン（０．１μＭ  Ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ，黒色の棒）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（３０、１０、５、３、１、０．５、０．３、０．１μｇ／ｍＬ）で処置した。７２時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。類似の結果が、３つの独立した実験において得られた。
【図１９】シスプラチンは、ＨＬ６０細胞においてオピオイドレセプターの発現を増強する。シスプラチンは、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０の表面上のオピオイドレセプターの発現を増強する。ＨＬ６０細胞株を、０．３μｇ／ｍＬのシスプラチンで２４時間処置した。シスプラチンで処置された細胞（＋シスプラチン）および未処置の細胞（−シスプラチン）をナロキソン−フルオレセインで染色した後、相対的な蛍光強度をフローサイトメトリーで測定した。細胞の自己蛍光を減算した後、オピオイドレセプター発現の２．１倍の増加が示されている。
【図２０】Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抵抗性乳癌腫細胞株ＪＩＭＴ−１は、高レベルのμ−オピオイドレセプターを発現している。臨床的にハーセプチンに抵抗性である乳がんを有する６２歳患者の胸膜転移に由来するヒトＪＩＭＴ−１細胞株は、オピオイドレセプターをその細胞表面上に示す。ＪＩＭＴ−１細胞を、ナロキソン−フルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプターの発現（ＯＲ，太い黒色曲線）を測定し、解析した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。
【図２１Ａ】図２１。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの組み合わせで処置されたＨｅｒ２／ｎｅｕ抵抗性乳癌腫細胞株ＪＩＭＴ−１の細胞周期解析およびアポトーシス。ヒトＪＩＭＴ−１細胞株を、１、３または１０μｇ／ｍＬのメタドンの単独（１、３、１０Ｍｅｔ−Ｄｏｘｏ）、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）または０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンと１、３もしくは１０μｇ／ｍＬのメタドンとの組み合わせ（１、３、１０Ｍｅｔ＋Ｄｏｘｏ）で処置した。（Ａ）それらの細胞のＦＡＣＳ解析から、両方の物質の組み合わせが、処置の９６時間後にＪＩＭＴ−１細胞のアポトーシスを用量依存的に増加させたことが明らかになった。（Ｂ）処置の９６時間後（図の左側）および１２０時間後（図の右側）に行われたＦＡＣＳ解析は、併用処置に起因した、さらに増加したアポトーシスレベルを示した。０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色バー）、１μｇ／ｍＬのメタドン＋０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（白色バー）、３μｇ／ｍＬのメタドン＋０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（斜線バー）、１０μｇ／ｍＬのメタドン＋０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（ドット柄バー）。
【図２１Ｂ】図２１。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの組み合わせで処置されたＨｅｒ２／ｎｅｕ抵抗性乳癌腫細胞株ＪＩＭＴ−１の細胞周期解析およびアポトーシス。ヒトＪＩＭＴ−１細胞株を、１、３または１０μｇ／ｍＬのメタドンの単独（１、３、１０Ｍｅｔ−Ｄｏｘｏ）、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）または０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンと１、３もしくは１０μｇ／ｍＬのメタドンとの組み合わせ（１、３、１０Ｍｅｔ＋Ｄｏｘｏ）で処置した。（Ａ）それらの細胞のＦＡＣＳ解析から、両方の物質の組み合わせが、処置の９６時間後にＪＩＭＴ−１細胞のアポトーシスを用量依存的に増加させたことが明らかになった。（Ｂ）処置の９６時間後（図の左側）および１２０時間後（図の右側）に行われたＦＡＣＳ解析は、併用処置に起因した、さらに増加したアポトーシスレベルを示した。０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色バー）、１μｇ／ｍＬのメタドン＋０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（白色バー）、３μｇ／ｍＬのメタドン＋０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（斜線バー）、１０μｇ／ｍＬのメタドン＋０または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシン（ドット柄バー）。
【図２２Ａ】図２２。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いるＪＩＭＴ−１細胞の細胞死誘導は、カスパーゼ活性化に依存する。広域性カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ．ｆｍｋによるカスパーゼ活性化の阻害は、ＪＩＭＴ−１細胞においてＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置によって誘導されるアポトーシスを阻止する。ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を、５０μｍｏｌ／ＬのｚＶＡＤ．ｆｍｋの非存在下（左側の線図）または存在下（右側の線図）において、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシン（＋０．０１５μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）と組み合わせた種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。薬の組み合わせを加えた９６時間後（Ａ）または１２０時間後（Ｂ）に、細胞を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【図２２Ｂ】図２２。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いるＪＩＭＴ−１細胞の細胞死誘導は、カスパーゼ活性化に依存する。広域性カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ．ｆｍｋによるカスパーゼ活性化の阻害は、ＪＩＭＴ−１細胞においてＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置によって誘導されるアポトーシスを阻止する。ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を、５０μｍｏｌ／ＬのｚＶＡＤ．ｆｍｋの非存在下（左側の線図）または存在下（右側の線図）において、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシン（＋０．０１５μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）と組み合わせた種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。薬の組み合わせを加えた９６時間後（Ａ）または１２０時間後（Ｂ）に、細胞を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【図２３Ａ】図２３。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いるＪＩＭＴ−１細胞の細胞死誘導は、カスパーゼ活性化に依存する。（Ａ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、ＪＩＭＴ−１における不十分なカスパーゼ活性化をドキソルビシンによって回復させた。Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンの単独、または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシンに加えて種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。９６時間後、カスパーゼ−８、−９、−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を行った。カスパーゼ−８の活性型フラグメントは、約４３ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１７ｋＤａにおいて検出され、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｂ）Ｄ，Ｌ−メタドンをドキソルビシンと組み合わせて使用することによる、ＪＩＭＴ−１細胞におけるＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーション。乳癌腫細胞ＪＩＭＴ−１を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンの単独、またはドキソルビシン（０．０１５μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で９６時間処置した。ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬに対するウエスタンブロット解析を行った。ＸＩＡＰは、５７ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ｘＬは、２１ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図２３Ｂ】図２３。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いるＪＩＭＴ−１細胞の細胞死誘導は、カスパーゼ活性化に依存する。（Ａ）Ｄ，Ｌ−メタドンは、ＪＩＭＴ−１における不十分なカスパーゼ活性化をドキソルビシンによって回復させた。Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンの単独、または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシンに加えて種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。９６時間後、カスパーゼ−８、−９、−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を行った。カスパーゼ−８の活性型フラグメントは、約４３ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１７ｋＤａにおいて検出され、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｂ）Ｄ，Ｌ−メタドンをドキソルビシンと組み合わせて使用することによる、ＪＩＭＴ−１細胞におけるＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーション。乳癌腫細胞ＪＩＭＴ−１を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独、０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンの単独、またはドキソルビシン（０．０１５μｇ／ｍＬ  Ｄｏｘｏ）に加えてＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）で９６時間処置した。ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬに対するウエスタンブロット解析を行った。ＸＩＡＰは、５７ｋＤａにおいて検出され、Ｂｃｌ−ｘＬは、２１ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図２４】ドキソルビシンとフェンタニルとの組み合わせによる、Ｔ細胞白血病ＣＥＭ細胞におけるアポトーシスの誘導。ヒトＴ細胞白血病ＣＥＭ細胞株（１００００細胞／１００μｌ）を、３０、１０、５、３、１、０．５、０．３、０．１μｇ／ｍＬのフェンタニルの単独（白色バー）で、または０．０２μｇ／ｍＬのドキソルビシンに加えて（黒色バー）処置した。４８時間後および７２時間後、アポトーシスの定量をフローサイトメトリーによって測定した。
【図２５】ドキソルビシンとブプレノルフィンとの組み合わせによるヒト急性骨髄性白血病ＨＬ−６０細胞におけるアポトーシスの誘導。ヒト急性骨髄性白血病ＨＬ−６０細胞株（５０００細胞／１００μｌ）を、２０、１０、５、３、１、０．５、０．３、０．１μｇ／ｍＬのブプレノルフィンの単独（白色バー）で、または０．００３μｇ／ｍＬのドキソルビシンに加えて（黒色バー）、処置した。１４４時間後または１６８時間後、アポトーシスの定量をフローサイトメトリーによって測定した。
【図２６】オピオイド類と抗がん薬との相互の正の相互作用を示している模式図。片側において、オピオイド類は、抗がん薬の細胞取り込みを増強し、抗がん薬の流出を阻害する。反対側において、抗がん薬は、オピオイドレセプターの高発現をもたらす。ゆえに、両方の薬剤が、細胞傷害性の潜在能力をより高い程度に発揮し得る。
【図２７】異なる白血病におけるオピオイドレセプターの発現。種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病およびヒトＢ細胞白血病）は、異なる中程度の数のオピオイドレセプターをそれらの細胞表面上に発現している。白血病細胞を、ナロキソン−フルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプターの発現（ＯＲ，太い黒色曲線）を測定し、解析した。ナロキソンなしのコントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。
【図２８】オピオイドレセプターアゴニストと抗がん因子Ｄ，Ｌ−メタドンとの併用療法の効果は、種々の白血病細胞のシスプラチン感度を強く増強する。種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病およびヒトＢ細胞白血病）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−ＣＤＤＰ，白色の棒）、シスプラチンの単独、またはシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（＋ＣＤＤＰ，黒色の棒）で処置した。インキュベーションの時間の後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図２９】シスプラチンと組み合わせたＤ，Ｌ−メタドンは、白血病細胞におけるアポトーシス経路の不十分な活性化を回復させる。Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの同時処置は、カスパーゼ活性化を誘発し、ＸＩＡＰのダウンレギュレーションおよび切断ならびにＢａｘのアップレギュレーションを誘導する。種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病）を、Ｄ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−ＣＤＤＰ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）の単独、またはシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）（＋ＣＤＤＰ）で処置した。インキュベーションの時間の後、カスパーゼ−２、カスパーゼ−９、カスパーゼ−３、ＰＡＲＰ、ＸＩＡＰおよびＢａｘに対するウエスタンブロット解析を行った。プロカスパーゼ−２のダウンレギュレーションは、約４８ｋＤａにおいて検出された。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９ｋＤａおよびまたは約１７ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰは、約１１６ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出され、ＸＩＡＰは、約５８ｋＤａにおいて、ＸＩＡＰ切断は、約３０ｋＤａにおいて、Ｂａｘは、約２１ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図３０】Ｄ，Ｌ−メタドンおよびシスプラチンによって誘導されるアポトーシスは、カスパーゼ活性化に依存する。種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病）を５０μＭのカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ．ｆｍｋとともに１時間プレインキュベーション（＋ｚＶＡＤ．ｆｍｋ，白色の棒）した後、または前処置なしで（−ｚＶＡＤ．ｆｍｋ，黒色の棒）、シスプラチン（示されているとおり）と組み合わせたＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）を加えた。アポトーシスの誘導を、インキュベーションの時間の後、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって検出した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図３１】シスプラチンは、オピオイドレセプターの発現を増強する。（Ａ）シスプラチンは、シスプラチン（示されているとおり）で処置された種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病およびヒトＢ細胞前駆体白血病）の細胞表面上のオピオイドレセプターの発現を増強する。シスプラチンで処置された細胞（ＣＤＤＰ）および未処置の細胞（Ｃｏ）をナロキソン−フルオレセインで染色した後、相対的な蛍光強度をフローサイトメトリーで測定した。未処置のコントロール群と比べてオピオイドレセプター発現のＸ倍の増加が、細胞の自己蛍光およびシスプラチンの蛍光を減算した後に示される。
【図３２】Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって誘導されるアポトーシスは、オピオイドレセプターの引き金作用に依存する。オピオイドレセプターの引き金作用の阻害は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの併用処置によって媒介されるアポトーシス誘導を阻害する。神経膠芽腫細胞を、６０μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独または記号＋および−によって示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。１２０時間後および１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、ＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定した。単一のバーの下に所与の物質に関して示されている種々の処置の１２０時間後（図の左側）および１４４時間後（図の右側）の結果が、図３２に示されている。
【図３３】種々のオピオイド類の種々の効果持続時間は、神経膠芽腫細胞において種々の細胞死率を誘導する。Ａ）神経膠芽腫細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ，非常に低く、黒色バーの左側である白色の棒）、ドキソルビシンの単独、またはドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で、すべての処置に対して０．１μｇ／ｍＬという同じ濃度のドキソルビシンおよび示されているとおりの種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンを使用して、処置した。刺激の１４４時間後、細胞死およびアポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。Ｂ）神経膠芽腫細胞を、種々の濃度のモルヒネ（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ，非常に低く、黒色バーの左側である白色の棒）、ドキソルビシンの単独、またはドキソルビシンに加えてモルヒネ（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で、すべての処置に対して０．１μｇ／ｍＬという同じ濃度のドキソルビシンおよび示されているとおりの種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンを使用して、処置した。刺激の１４４時間後、細胞死およびアポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定の細胞死のパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図３４】異なるオピオイドの異なる効果持続時間は、白血病細胞において異なる細胞死率を誘導する。Ａ）白血病細胞（ヒトＢ細胞白血病）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ，黒色バーの左側の白色の棒）、ドキソルビシンの単独、またはドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ，黒色の棒））で、すべての処置に対して０．１μｇ／ｍＬという同じ濃度のドキソルビシンおよび示されているとおりの種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンを使用して、処置した。刺激の９６時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。Ｂ）白血病細胞（ヒトＢ細胞白血病）を、種々の濃度のモルヒネ（示されているとおり）の単独（−Ｄｏｘｏ，黒色バーの左側の白色の棒）、ドキソルビシンの単独、またはドキソルビシンに加えてモルヒネ（示されているとおり）（＋Ｄｏｘｏ，黒色の棒）で、すべての処置に対して０．１μｇ／ｍＬという同じ濃度のドキソルビシンおよび示されているとおりの種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンを使用して、処置した。刺激の９６時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、図１Ｂに記載されたように計算した。棒，３つ組の平均値；バー，ＳＤ＜１０％。
【図３５】Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、神経膠芽腫細胞において、増殖を阻害し、Ｓ／Ｇ２−Ｍの細胞周期静止を誘導する。メタドンおよびドキソルビシンで処置された神経膠芽腫細胞のフローサイトメトリー解析が示された。未処置の細胞（未処置細胞）（Ｇ１ピークが、Ｇ２ピークより高い）、１μｇ／ｍｌのメタドンで処置された細胞（メタドン）（Ｇ１ピークが、Ｇ２ピークより高い）および０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシンに加えてメタドンで処置された細胞（メタドン＋Ｄｏｘｏ）のフローサイトメトリー解析。Ｇ２／Ｍ期における細胞周期進行の静止（Ｇ１ピークは、未処置細胞より低く、Ｇ２ピークは、未処置細胞より高い）が、９６時間後に、ドキソルビシンに加えてメタドンで処理された神経膠芽腫細胞において示された（Ａ）。Ｇ１の前のｓｕｂＧ１ピークは、断片化されたＤＮＡである（細胞死のパーセンテージ）。結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図３６−１】図３６。アポトーシスの誘導およびカスパーゼの活性化は、神経膠芽腫においてｃＡＭＰのダウンレギュレーションを誘導するオピオイドレセプター活性化に依存する。ｃＡＭＰのダウンレギュレーションの引き金を引くオピオイドレセプターの活性化は、神経膠芽腫細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する際に重要な役割を果たす。（Ａ、Ｂ）オピオイドレセプターの活性化を阻止することにより、アポトーシスの誘導が阻害される。神経膠芽腫細胞株Ａ１７２を、１００μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独、または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。（Ａ）１２０時間後および（Ｂ）１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。（Ｃ）オピオイドレセプター活性化の阻害は、カスパーゼの活性化を阻害する。Ａ１７２細胞を、１００μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独、または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。カスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を、１２０時間のインキュベーションの後に行った。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９ｋＤａおよび約１７ｋＤａにおいて検出され、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｄ）ホスホジエステラーゼ活性の抑制を介したｃＡＭＰレベルの増加は、アポトーシスを阻害する。Ａ１７２細胞を、２５μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独、または示されるとおりの種々の組み合わせとともに１２０時間インキュベートした。１２０時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。
【図３６−２】図３６。アポトーシスの誘導およびカスパーゼの活性化は、神経膠芽腫においてｃＡＭＰのダウンレギュレーションを誘導するオピオイドレセプター活性化に依存する。ｃＡＭＰのダウンレギュレーションの引き金を引くオピオイドレセプターの活性化は、神経膠芽腫細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する際に重要な役割を果たす。（Ａ、Ｂ）オピオイドレセプターの活性化を阻止することにより、アポトーシスの誘導が阻害される。神経膠芽腫細胞株Ａ１７２を、１００μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独、または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。（Ａ）１２０時間後および（Ｂ）１４４時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。（Ｃ）オピオイドレセプター活性化の阻害は、カスパーゼの活性化を阻害する。Ａ１７２細胞を、１００μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独、または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。カスパーゼ−９、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰに対するウエスタンブロット解析を、１２０時間のインキュベーションの後に行った。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて検出され、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９ｋＤａおよび約１７ｋＤａにおいて検出され、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。（Ｄ）ホスホジエステラーゼ活性の抑制を介したｃＡＭＰレベルの増加は、アポトーシスを阻害する。Ａ１７２細胞を、２５μＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独、または示されるとおりの種々の組み合わせとともに１２０時間インキュベートした。１２０時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。
【図３７】Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫の腫瘍の成長を阻害する。神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧ（Ｕ８７）を、ヌードマウスに移植した。マウスを、Ｄ，Ｌ−メタドン（ｎ＝８，黒色正方形）またはビヒクルである食塩水中の１０％Ｔｗｅｅｎ８０（ｎ＝８，黒色菱形）で毎日した。移植後、マウスを３３日間観察した。種々の時点において（示されているとおり）、腫瘍の成長および腫瘍の体積を測定した。＊コントロールに対して有意（ｐ＜０．０５，マン・ホイットニーＵ検定）。
【図３８】Ｄ，Ｌ−メタドンは、卵巣がん細胞を短期間のシスプラチン処置に対して高感度化する。Ａ２７８０卵巣がん細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、５もしくは３μｇ／ｍＬのシスプラチンの単独、またはＤ，Ｌ−メタドンと５μｇ／ｍＬのシスプラチン（＋５μｇ／ｍＬのＣＤＤＰ，黒色の棒）もしくは３μｇ／ｍＬのシスプラチン（＋３μｇ／ｍＬ、白色の棒）との組み合わせで処置した。２４時間後、４８時間後および７２時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図３９】Ｄ，Ｌ−メタドンは、卵巣がん細胞を長期間のシスプラチン処置に対して高感度化する。Ａ２７８０卵巣がん細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、シスプラチン（２、１、０．５、０．３μｇ／ｍＬ）の単独、またはＤ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの組み合わせで処置した。７２時間後、９６時間後、１２０時間後および１４４時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図４０】Ｄ，Ｌ−メタドンは、シスプラチン抵抗性卵巣がん細胞をシスプラチン処置に対して高感度化する。Ａ２７８０ｃｉｓ卵巣がん細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、シスプラチン（３、２、１μｇ／ｍＬ）の単独、またはＤ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの組み合わせで処置した。７２時間後、９６時間後、１２０時間後および１４４時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図４１】Ｄ，Ｌ−メタドンは、卵巣がん細胞をシスプラチン処置に対して強く高感度化する。Ａ２７８０卵巣がん細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、２μｇ／ｍＬのシスプラチンの単独（黒色の棒）、および示されているとおりのＤ，Ｌ−メタドンと組み合わせた、０．５または０．２μｇ／ｍＬのシスプラチン（それぞれ斜線および灰色の棒）で処置した。１４４時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図４２】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイドレセプターの活性化は、卵巣がん細胞を、シスプラチンによって誘導されるカスパーゼの活性化に対して高感度化する。Ｄ，Ｌ−メタドンは、卵巣がん細胞おけるシスプラチンによる不十分なカスパーゼ活性化を回復させた。Ａ２７８０卵巣がん細胞を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ、−ＣＤＤＰ）の単独、５もしくは３μｇ／ｍＬのシスプラチンの単独、または５もしくは３μｇ／ｍＬのシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）（＋ＣＤＤＰ）で処置した。２４時間後、ウエスタンブロット解析を行った。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約３７ｋＤａにおいて、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９および１７ｋＤａにおいて、カスパーゼ−８の活性型フラグメントは、約４３および４１ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図４３】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイドレセプターの活性化は、乳がん細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する際に重要な役割を果たす。オピオイドアンタゴニストであるナロキソンを用いてオピオイドレセプターの活性化を阻止することにより、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって誘導されるアポトーシスの誘導が強く阻害される。乳がん細胞ＪＩＭＴ−１を、１００μｇ／ｍＬのナロキソン（ナロキソン）、１０μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドン（Ｄ，Ｌ−メタドン）および０．０１μｇ／ｍＬのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）の単独または示されるとおりの種々の組み合わせとともにインキュベートした。９６時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図４４】Ｄ，Ｌ−メタドンは、前立腺がん細胞をシスプラチン処置に対して高感度化する。前立腺がん細胞ＰＣ−３を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独、５もしくは３μｇ／ｍＬのシスプラチンの単独、またはＤ，Ｌ−メタドンと５μｇ／ｍＬのシスプラチン（＋５μｇ／ｍＬのＣＤＤＰ，黒色の棒）もしくは３μｇ／ｍＬのシスプラチン（＋３μｇ／ｍＬ，白色の棒）との組み合わせで処置した。９６時間後および１２０時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、低二倍体ＤＮＡ解析によって測定した。
【図４５】Ｄ，Ｌ−メタドンは、白血病細胞を、種々の抗がん薬による処置に対して高感度化する。白血病細胞Ｎａｌｍ６を、Ｄ，Ｌ−メタドン（３μｇ／ｍＬ）の単独、示されているとおりの種々の抗がん薬の単独（白色の棒）またはＤ，Ｌ−メタドンと種々の抗がん薬との組み合わせ（黒色の棒）で処置した。９６時間後、細胞死／アポトーシスのパーセンテージを測定した。
【図４６】Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫細胞を、同じ抗がん薬クラスの異なる抗がん薬による処置に対して高感度化する。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、Ｄ，Ｌ−メタドン（３μｇ／ｍＬ）の単独、示されているとおりの種々の抗がん薬の単独（白色の棒）、またはＤ，Ｌ−メタドンと種々の抗がん薬との組み合わせ（黒色の棒）で処置した。１２０時間後、細胞死／アポトーシスのパーセンテージを測定した。
【図４７】膵がん細胞上のオピオイドレセプター発現。膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、ナロキソンフルオレセインで染色して、フローサイトメトリーによってオピオイドレセプターの発現（ＯＲ，太い黒色曲線）を測定した。コントロール（Ｃｏ）は、細い黒色曲線として示されている。膵がんの表面上にオピオイドレセプターの強い発現が見られた。
【図４８】Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、膵がん細胞において、抗がん薬によって誘導される細胞死を増加させる。膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、示されているとおりのオキサリプラチンもしくはシスプラチンの単独、またはＤ，Ｌ−メタドンと（Ａ）オキサリプラチンもしくは（Ｂ）シスプラチンとの組み合わせで処置した。１２０時間後（Ａ）および１４４時間後（Ｂ）、細胞死／アポトーシスのパーセンテージを測定した。
【図４９】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイドレセプターの活性化は、膵がん細胞を、シスプラチンおよびオキサリプラチンによって誘導されるカスパーゼの活性化に対して高感度化する。Ｄ，Ｌ−メタドンは、膵がん細胞における不十分なカスパーゼ活性化を（Ａ）オキサリプラチンまたは（Ｂ）シスプラチンによって回復させた。膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独、（Ａ）オキサリプラチン（２、３μｇ／ｍＬ）の単独、または（Ｂ）シスプラチン（０．５または０．７μｇ／ｍＬ）の単独、または（Ａ）２もしくは３μｇ／ｍＬのオキサリプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）、または（Ｂ）０．５もしくは０．７μｇ／ｍＬのシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）で処置した。１２０時間後、ウエスタンブロット解析を行った。カスパーゼ−９の活性型フラグメントは、約４６ｋＤａにおいて、カスパーゼ−３の活性型フラグメントは、約１９および１７ｋＤａにおいて、ＰＡＲＰ切断は、約８５ｋＤａにおいて検出された。カスパーゼＸＩＡＰの阻害性タンパク質は、約５７ｋＤａにおいて検出された。等しいタンパク質充填の正確さを、抗β−アクチン抗体によって確認した。
【図５０】カスパーゼ活性化の阻害は、オキサリプラチンまたはシスプラチンによって誘導されるアポトーシスに対する、オピオイドによる膵がん細胞の高感度化を阻止する。膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、５０μｍｏｌ／ＬのｚＶＡＤ．ｆｍｋを加えずに（−ｚＶＡＤ．ｆｍｋ，黒色の棒）または加えて（＋ｚＶＡＤ，白色の棒）、（Ａ）３μｇ／ｍＬのオキサリプラチン、（Ｂ）２μｇ／ｍＬのオキサリプラチン、（Ｃ）０．７μｇ／ｍＬのシスプラチンまたは（Ｄ）０．５μｇ／ｍＬのシスプラチンと組み合わせた種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）で処置した。１２０時間後および１４４時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図５１】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイド類は、神経膠芽腫細胞をテモゾロミド処置に対して高感度化する。神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、テモゾロミドの単独、またはＤ，Ｌ−メタドンとテモゾロミドとの組み合わせ（黒色の棒）で処置した。１２０時間後、アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図５２】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイド類は、膵がん細胞をオキサリプラチン処置およびシスプラチン処置に対して強く高感度化する。（Ａ）膵がん細胞（Ｃｏｌｏ３５７）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、１０μｇ／ｍＬのオキサリプラチン（黒色の棒）、３、２μｇ／ｍｌのオキサリプラチンの単独、および示されているとおりの、Ｄ，Ｌ−メタドンと組み合わせた３μｇ／ｍＬのオキサリプラチン（斜線の棒）またはＤ，Ｌ−メタドンと組み合わせた２μｇ／ｍＬのオキサリプラチン（白色の棒）で処置した。１２０時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。（Ｂ）膵がん細胞（Ｃｏｌｏ３５７）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、１０μｇ／ｍＬのシスプラチン（黒色の棒）、０．７または０．５μｇ／ｍｌのシスプラチンの単独、および示されているとおりの、Ｄ，Ｌ−メタドンと組み合わせた０．７μｇ／ｍＬのシスプラチン（斜線の棒）またはＤ，Ｌ−メタドンと組み合わせた０．５μｇ／ｍＬのシスプラチン（白色の棒）で処置した。１４４時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図５３】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイド類は、白血病細胞をドキソルビシン処置に対して強く高感度化する。（Ａ）白血病細胞（Ｎａｌｍ６）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色の棒）の単独、０．０１μｇ／ｍｌのドキソルビシンの単独、または示されているとおりの０．０１μｇ／ｍＬのドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせ（斜線の棒）で処置した。１２０時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。（Ｂ）白血病細胞（Ｒｅｈ）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色の棒）の単独、０．０１μｇ／ｍｌのドキソルビシンの単独、または示されているとおりの０．０１μｇ／ｍＬのドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせ（斜線の棒）で処置した。１２０時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。（Ｃ）白血病細胞（Ｔａｎｏｕｅ）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色の棒）の単独、０．０１μｇ／ｍｌのドキソルビシンの単独、または示されているとおりの０．０１μｇ／ｍＬのドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせ（斜線の棒）で処置した。１２０時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図５４】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイド類は、乳がん細胞をドキソルビシン処置に対して強く高感度化する。（Ａ）ＨＥＲ２標的化治療に対して抵抗性の乳がん細胞（ＪＩＭＴ−１）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色の棒）の単独、または０．０１５μｇ／ｍｌのドキソルビシンの単独、および示されているとおりのＤ，Ｌ−メタドンと組み合わせた０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシン（斜線の棒）で処置した。１２０時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図５５】Ｄ，Ｌ−メタドンを用いるオピオイド類は、神経膠芽腫細胞をドキソルビシン処置に対して強く高感度化する。神経膠芽腫細胞（Ａ１７２）を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０μｇ／ｍＬ）の単独、１μｇ／ｍｌのドキソルビシン（黒色の棒）の単独、０．１μｇ／ｍｌのドキソルビシンの単独、または示されているとおりの０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせ（斜線の棒）で処置した。１４４時間後、細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【図５６】モルヒネとフェンタニルとの併用処置は、白血病細胞における細胞死の誘導に対して強い相乗効果を示す。ＨＬ６０白血病細胞を、フェンタニル（３、１μｇ／ｍＬ）の単独（Ａ）またはモルヒネ（３、１μｇ／ｍＬ）の単独（Ａ）、または示されておりとおりの濃度のフェンタニルとモルヒネとの組み合わせ（Ｂ）で処置した。９６時間後、１２０時間後、および１４４時間後、特定の細胞死／アポトーシス細胞のパーセンテージを測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の文脈において、用語「オピオイドレセプターアゴニスト」は、同じタイプのレセプター、いわゆるオピオイドレセプターにおいてアゴニスト的に働く、天然、合成または半合成の物質の化学的に不均一な群として定義される。痛覚消失および副作用のプロファイルによると、５つのタイプのオピオイドレセプター、すなわち、μ−レセプター（リガンド＝モルヒネ）、κ［カッパー］−レセプター（リガンド＝ケタゾシン（ｋｅｔａｚｏｃｉｎｅ））、デルタ−レセプター（リガンド＝デルトルフィン（ｄｅｌｔｏｒｐｈｉｎｅ）ＩＩ）、σ［シグマ］−レセプター（リガンド＝ＳＫＦ１００８１）、ならびに後に同定されたＯＲＬ１−レセプター（リガンド＝ノシセプチン）が知られている。他のレセプターシステムに対応させると、結合の研究ならびに機能性の調査から、オピオイドレセプターのサブタイプが存在することが示唆された。μ−およびδｉ−レセプタータイプでは、２つのサブタイプ、μ−１およびμ−２ならびにδ−１およびδ−２が、報告されている。κ−レセプターは、さらなるκ−３サブタイプを含む。特に、μ−オピオイドレセプターに関しては、その２つのサブタイプは、本発明に含められる。
【００１９】
用語「オピオイドレセプターアゴニスト」は、本明細書中で使用されるとき、完全アゴニスト、ならびに混合アゴニスト／アンタゴニストまたは部分的アゴニスト、例えば、ブプレノルフィンを含む。
【００２０】
オピオイド類の群は、天然のオピエート類（例えば、モルヒネまたはジヒドロコデインのようなアルカロイド類）、ならびに天然のオピエート類に由来する半合成のオピエート類（例えば、ヒドロモルホンまたはオキシコドン）または完全に合成のオピオイド類（例えば、フェンタニルまたはブプレノルフィン）を含む。オピオイド類の群はまた、エンドルフィン類、ダイノルフィン類またはエンケファリン類のような体内において天然に産生され得るが、合成もされ得る、内因性オピオイドペプチドも含む。
【００２１】
本明細書中で使用されるとき、用語「抗がん薬」は、がんを処置するために使用されるすべての化学的または物理的な介入を包含する。ゆえに、この用語は、化学療法剤（例えば、細胞傷害剤または免疫毒性剤）だけでなく、アルファ、ベータおよびガンマ線ならびに電子を放射し得る、放射活性的に標識された抗体、ペプチドおよび化学的物質も含む。照射療法はさらに、十分に高いエネルギーの光子、荷電粒子（例えば、加速器からの電子、陽電子、ミューオン、プロトン、アルファ粒子および重い原子核）だけでなく、中性子およびガンマ線も含む。
【００２２】
用語「治療的に有効な血漿レベル」は、致死効果を引き起こす薬物の血漿レベルと治療効果を引き起こす最低の血漿レベルとの間の血漿レベルとして定義される。本発明の文脈において、オピオイドレセプターアゴニストの治療効果は、同時に投与された抗がん薬の細胞取り込みの増加および／もしくは細胞からの流出の阻害、ならびに／または例えば、アポトーシス、ネクローシス、分裂期細胞死（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈｅ）およびオートファジーによる細胞死の誘導によってもたらされる。本発明の文脈において、抗がん薬の治療効果は、がん細胞を殺滅する能力および／またはがん細胞上においてオピオイドレセプターの発現を誘導する能力によってもたらされる。
【００２３】
がん処置の結果を考察する方法が２つある。一方の一般的な方法は、細胞死の測定である（増加のデータは、より多くの細胞が死んでいることを意味する）。他方の方法は、細胞の生存率を測定することである（減少のデータは、より少ない生細胞が存在するかまたは増殖能を失ったことを意味する）。
【００２４】
本発明の文脈において使用されるとき、単語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置」とは、本発明の組み合わせまたはそれらを含む任意の組成物を使用して、がんを予防的に妨げるか、またはがんを緩和するか、回復させるかもしくは停止させることを指す。それらは、別段明示的に述べられない限り、治療または治癒、ならびに緩和、緩解または予防を包含する。また、本明細書中で使用されるとき、単語「患者」とは、ヒトを含む哺乳動物のことを指す。
【００２５】
本発明によると、処置は、具体的には、がん細胞の増殖および／または成長の阻害のことを指す。この活性は、例えば、細胞分裂抑制活性または細胞傷害活性、さらに、細胞および／または腫瘍の成長の静止を含み得る。がん細胞の増殖は、細胞分裂の阻害の結果である。特に、オピオイドレセプターアゴニストは、腫瘍において細胞死を誘導する。本発明の文脈における細胞死は、すべてのタイプの細胞死を含む。これは、ネクローシス細胞死ならびにアポトーシス細胞死またはオートファジーを含み得る。本発明の１つの実施形態において、細胞死は、カスパーゼ依存性経路またはカスパーゼ非依存性経路の活性化によって誘導される。しかしながら、オピオイドレセプターアゴニストは、様々な経路を介して細胞死を誘導し得る。本発明の好ましい実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストは、がん細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００２６】
本明細書中で使用されるとき、用語「新生物」に対して同意語として使用される用語「がん」は、異常な細胞が、制御なしに分裂し、他の組織を浸潤することができる疾患のことを指す。がん細胞は、血液およびリンパ系を通じて、身体の他の部分に広がり得る。
・本発明の文脈における用語「従来の治療」および「従来の治療レジメン」は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｋｒｅｂｓｈｉｌｆｅ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｋｒｅｂｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｎａｔｉｏｎａｃｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）のような連合、連盟、および民間の、非政府のまたは連邦の組織であり得るそれぞれの保健機関またはがん機関の治療ガイドラインとして推奨される処置プログラム（用量、反復時間および期間に関する）として定義される。これはまた、抗がん因子のそれぞれの使用説明書に開示されている、抗がん因子の製造者または販売者によって定められる（好ましくは、単一の）抗がん因子に対する処置プログラムも含む。
【００２７】
本発明の文脈における用語「従来の治療時間」は、抗がん因子が、本発明に係るオピオイドレセプターアゴニストなしで患者に適用される従来の治療における時間と定義される。この治療時間は、抗がん因子の最初の適用から始まり、抗がん因子が患者の治療的な血漿レベル未満になる時点までの、がんおよび抗がん因子に特異的な反復時間（例えば、１週間にわたる１日に２回の用量の適用、次いで、３週間の休止、次いで、再度、１週間にわたる１日に２回の用量の適用に続いて、３週間の休止）を含み得る。
【００２８】
本発明の文脈におけるがんおよびその種々のタイプは、ＩＣＤ−１０基準のクラスＣ００〜Ｃ９７およびＤ００〜Ｄ３６の専門分類であるＩＣＤ−Ｏ基準によって分類され得る。あるいは、Ｂｏｅｃｋｅｒら、２００８のｃｈａｐｔｅｒ６の分類（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｕｒｂａｎ  ＆  Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｐ１６７−２１８）が使用され得る。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態において、前記オピオイドレセプターアゴニストは、細胞増殖を阻害することができる。
【００３０】
本発明の１つの実施形態において、前記抗がん因子および前記オピオイドレセプターアゴニストは、同時にまたは逐次投与される。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストおよび抗がん因子の治療的に有効な血漿レベルの期間はそれぞれ、主に重複する。
【００３２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、抗がん因子の治療的に有効な血漿レベルの期間は、オピオイドレセプターアゴニストのそれぞれの期間内に完全に入っている。
【００３３】
２つまたはそれより多くの抗がん因子を投与するとき、部分的な重複、主な重複または完全な重複が要求されるそれぞれの期間は、それらの２つまたはそれより多くの抗がん因子の組み合された期間によってもたらされる。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストは、患者が前記オピオイドレセプターアゴニストに対して慣れを示す方法で与えられる。したがって、慣れの期間が始まるかまたはプラトーに達するまで、抗がん処置を待つことが好ましい。その慣れは、薬効の低下および／または呼吸抑制などの副作用の減少の結果であり得る。オピオイドレセプターアゴニストの副作用は、血圧低下、呼吸抑制、嘔吐、便秘、眩暈、鎮静、多幸感および心臓作用である。この副作用は、オピオイドレセプターアゴニストおよびがんの薬剤（ｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）を用いた治療スキームを決定する場合に考慮しなければならない。これは、オピオイドレセプターアゴニストが、非常に低レベル、すなわち治療用量の１％という開始用量で与えられ、次いで、当業者に公知でありかつオピオイドレセプターアゴニストの製造者または販売者が公表しているオピオイドレセプターアゴニストのガイドラインに従って、抗がん因子とオピオイドレセプターアゴニストとの組み合わせに対して要求される治療レベルに至るまで適切な時間でその用量を増加させて与えられることを意味する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において、投与レジメン、ひいては抗がん因子の治療的に有効な血漿レベル以内である期間は、従来の治療レジメンによって定義される。
【００３６】
本発明のさらなる態様において、本発明に係る組み合わせで処置される患者は、抗がん因子を含む前処置を受けたことがある。
【００３７】
より好ましい実施形態において、抗がん因子による前処置は、中断されているか、または終了されている。
【００３８】
さらに好ましい実施形態において、前処置は、抗がん処置に対する抵抗性に起因して、終了されている。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態において、抗がん因子の治療的に有効な血漿レベル以内である期間は、少なくとも１日、好ましくは、３日、より好ましくは、少なくとも５日続く。
【００４０】
本発明の１つの実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストに対して治療的に有効な血漿レベル以内である期間は、少なくとも２週間、より好ましくは、４週間、なおもより好ましくは、長期間処置である。
【００４１】
本発明の文脈内において、用語「長期間処置」は、４週間超、好ましくは、数ヶ月超続く投与期間を有するオピオイドレセプターアゴニスト処置として定義される。さらなる実施形態において、この長期間処置は、定められたまたは当業者に公知の従来の治療レジメンとは異なるか、あるいはＤｅｕｔｓｃｈｅ  ＫｒｅｂｓｈｉｌｆｅもしくはＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｋｒｅｂｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔのような連合または連盟；ＮＣＣＮ、ＮＣＩまたは類似の保健機関もしくはがん機関の治療ガイドライン、あるいはがんを処置するために使用される薬物の製造者または販売者のガイドラインに公表されている。
【００４２】
本発明の文脈内において、少なくとも１つの抗がん因子の使用とは、本発明に係るオピオイドレセプターアゴニストと組み合わせて与えられる１つまたはそれより多くの抗がん因子の使用のことを指す。したがって、その組み合わせは、１、２、３、４、５個またはさらにより多くの抗がん因子の使用を含む。
【００４３】
一般に、アポトーシスは、２つの主要な生化学的経路を介して誘導され得ることが知られている。「デスレセプター経路」（または外因性経路）は、ＴＮＦレセプターによって誘導される（腫瘍壊死因子）モデルおよびＦａｓレセプターによって誘導されるモデル（Ｆａｓレセプターは、Ａｐｏ−１またはＣＤ９５としても知られる）を含む。これらのレセプターに結合すると、カスパーゼ−８の活性化を含む、死を誘導するシグナル伝達経路がその細胞において形成される。「ミトコンドリア経路」（または内因性経路）は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出、Ａｐａｆ−１の結合およびプロカスパーゼ−９の活性化を含む。いくつかの制御因子（例えば、アポトーシス促進性タンパク質であるＢａｘおよびＢａｋまたは抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬまたはＸＩＡＰ）が、それらのアポトーシス経路を活性化させるかまたは不活性化すると知られている。
【００４４】
本発明の１つの実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストは、腫瘍細胞におけるカスパーゼ−３およびポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断、ならびに／またはカスパーゼ−９の切断およびアポトーシスタンパク質のＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）のダウンレギュレーション、ならびに／またはＢ細胞リンパ腫特大タンパク質（Ｂｃｌ−ＸＬ）のダウンレギュレーションによって、アポトーシスを誘導する。
【００４５】
本発明の好ましい実施形態によると、オピオイドレセプターアゴニストは、Ｄ−／Ｌ−メタドン、レボメタドン、レバセチルメタドールおよびピリトラミドを含むメタドン群のメンバーである。
【００４６】
本発明の文脈において、用語「メタドン群」は、３，３−ジフェニルプロピルアミンの誘導体であるオピオイド類に関する。これらの化合物は、以下の式（Ｉ）：
【化１】
0006472750.tif 000002
によって示されるような３，３−ジフェニルアミンコア構造を有し、式中、Ｒ１は、脂肪族ケトン、３−アセトキシプロピル残基、シアノ基または１−ピロリジノ−メチルケトン、−（Ｃ＝Ｏ）Ｃ２Ｈ５であり、Ｒ２およびＲ３は、ＣＨ３であるか、または一体となって、複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｌｅ）、好ましくは、モルホリノ基を形成し、Ｒ４は、Ｈまたはアルキル残基であり、好ましくは、ＣＨ３である。
【００４７】
メタドン群の化合物に対する例の非限定的なリストとしては、メタドン、ノルメタドン、デキストロモルアミド、イソメタドン、アセチルメタドール、アルファアセチルメタドール、レボアセチルメタドール（ｌｅｖｏａｃｅｔｙｌｍｅｔｈａｄｏｌ）、プレメタドン（ｐｒｅｍｅｔｈａｄｏｎｅ）、ラセモルアミド（ｒａｃｅｍｏｒａｍｉｄ）、フェナドキソン（ｐｈｅｎａｄｏｘｏｎｅ）、デキストロプロポキシフェン、ジピパノン（ｄｉｐｉｐａｎｏｎｅ）、ベンジトルアミド（ｂｅｎｚｉｔｒａｍｉｄｅ）、ピリトラミド、ロペラミド、テマロン（ｔｈｅｍａｌｏｎ）（３，３−ジチオフェニルプロピルアミンに相当する）およびレボモルアミド（ｌｅｖｏｍｏｒａｍｉｄ）が挙げられる。
【００４８】
これらのオピオイド類のすべてが、塩として使用され得る。Ｄ−／Ｌ−メタドンのラセミ型は、好ましくは、塩酸塩の形態で提供される。本発明の好ましい実施形態において、オピオイドメタドンは、がん細胞においてミトコンドリア経路を介してアポトーシスを誘導する。
【００４９】
本発明の１つの実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストは、メタドン群の化合物（例えば、Ｄ／Ｌ−メタドン、Ｄ−メタドン、Ｌ−メタドン、ノルメタドン）、フェンタニル誘導体（例えば、フェンタニル、スフェンタニル、ロフェンタニル（ｌｏｆｅｎａｎｔｉｌ）、アルフェンタニル、レミフェンタニル、オーメフェンタニル（ｏｈｍｅｆｅｎｔａｎｙｌ）およびカルフェンタニル）；モルフィナン（ｍｏｒｐｈｉｎａｎｅ）化合物（例えば、モルヒネ、コデイン、ヘロイン（ｈｅｒｏｉｎｅ）、デキストラロルファン（ｄｅｘｔｒａｌｌｏｒｐｈａｎｅ）、デキストロメトルファン、デキストロファノール（ｄｅｘｔｒｏｐｈａｎｏｌ）、ジメモルファン、レボルファノール（ｌｅｖａｌｏｒｐｈａｎｏｌ）、ブトルファノール、レボフレチルノルモルファノール（ｌｅｖｏｆｕｒｅｔｈｙｌｎｏｒｍｏｒｐｈａｎｏｌ）、レボメトルファン（ｌｅｖｏｍｅｔｈｏｒｐｈａｎｅ）、レボフェナシルモルファン（ｌｅｖｏｐｈｅｎａｃｙｌｍｏｒｐｈａｎｅ）、レボルファノール、メトルファン（ｍｅｔｈｏｒｐｈａｎｅ）、モルファノール（ｍｏｒｐｈａｎｏｌ）、オキシロルファン（ｏｘｉｌｏｒｐｈａｎ）、フェノモルファン（ｐｈｅｎｏｍｏｒｐｈａｎ）およびキソルファノール（ｘｏｒｐｈａｎｏｌ））、ベンゾモルファン（ｂｅｎｚｏｍｏｒｐｈａｎｅ）誘導体（例えば、５，９−ＤＥＨＢ、アラゾシン（ａｌａｚｏｃｉｎｅ）、アナゾシン（ａｎａｚｏｃｉｎｅ）、ブレマゾシン、ブチナゾシン（ｂｕｔｉｎａｚｏｃｉｎｅ）、カルバゾシン（ｃａｒｂａｚｏｃｉｎｅ）、コガゾシン（ｃｏｇａｚｏｃｉｎｅ）、シクラゾシン、デゾシン、エプタゾシン、エタゾシン（ｅｔａｚｏｃｉｎｅ）、エチルケトシクラゾシン、フルオロフェン、ゲマゾシン（ｇｅｍａｚｏｃｉｎｅ）、イバゾシン（ｉｂａｚｏｃｉｎｅ）、ケタゾシン（ｋｅｔａｚｏｃｉｎｅ）、ケトシクラゾシン（ｋｅｔｏｃｙｃｌａｚｏｚｉｎｅ）、メタゾシン（ｍｅｔａｚｏｃｉｎｅ）、モキサゾシン（ｍｏｘａｚｏｃｉｎｅ）、ペンタゾシン、フェナゾシン、クアダゾシン（ｑｕａｄａｚｏｃｉｎｅ）、チアゾシン（ｔｈｉａｚｏｃｉｎｅ）、トナゾシン（ｔｏｎａｚｏｃｉｎｅ）、ボラゾシン（ｖｏｌａｚｏｃｉｎｅ）および８−ＣＡＣ）；内因性オピオイド類（例えば、エンドルフィン類（アルファ−、ベータ−、ガンマ−またはデルタ−エンドルフィン類であり得る）、エンケファリン類（例えば、Ｍｅｔ−エンケファリン、Ｌｅｕ−エンケファリンおよびメトルファミド（ｍｅｔｈｏｒｐｈａｍｉｄ））、ダイノルフィン類（例えば、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＢまたはアルファ−ネオエンドルフィン）、ノシセプチン、デルモルフィン類、モルフィセプチン（ｍｏｒｐｈｉｃｅｐｔｉｎ）、ベータ−カソモルフィン（ｃａｏｍｏｒｐｈｉｎｅ）−５、ＤＡＬＡＭＩＤ、ＤＡＤＬＥ、ＤＡＤＬ  ＤＳＬＴ、ＤＳＬＥＴ、ＤＴＬＥＴ、ＤＡＧＯ、ＤＡＭＧＯ、ＤＡＬＣＥ、ＤＡＭＭＥ、ＤＡＬＤＡ、ＤＰＤＰＥ、ＦＫ３３−８２４、［Ｄ−Ｍｅｔ２，Ｐｒｏ５］エンケファリン−アミド、ビファリン（ｂｉｐｈａｌｉｎ）およびエンドモルフィン類（ｅｎｄｏｍｏｒｐｈｉｎｅｓ）（例えば、エンドモルフィン（ｅｎｄ���ｍｏｐｒｈｉｎ）−１およびエンドモルフィン−２））；さらに、タンパク質プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）に由来するすべてのフラグメント（例えば、ベータ−リポトロピン、ベータ−ＬＰＨ−［６１−６４］、ベータ−ＬＰＨ−［６１−６５］−ＮＨ２、（Ｍｅｔ（Ｏ）６５）−ベータ−ＬＰＨ−［６１−６５］、ベータ−ＬＰＨ−［６１−６９］およびベータ−ＬＰＨ−［６１−６９］）；４−フェニルピペリジン誘導体（例えば、ペチジン、ケトベミドン、アニレリジン、ピミノジン（ｐｉｍｉｎｏｄｉｎｅ）、フェノペリジン、フレチジン（ｆｕｒｅｔｈｉｄｉｎｅ）、アルファ−プロジン（ｐｒｏｄｉｎ）、トリメペリジン（ｔｒｉｍｅｐｅｒｉｄｉｎｅ）、ならびに４−フェニルピロリジン誘導体（例えば、プロファドール（ｐｒｏｆａｄｏｌ））および４−フェニルアゼパン誘導体（例えば、メプタジノール）；シクロヘキサン誘導体（例えば、チリジン、Ｕ−５０４８８、トラマドールおよびタペンタドール（ｔａｐｅｎｔａｄｏｌ））からなるリストより選択される。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のオピオイドレセプターアゴニストは、細胞増殖を阻害することができる。
【００５１】
本発明のさらなる実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストは、少なくとも１つのさらなるオピオイドレセプターアゴニストと組み合わされる。結果として、本発明の組み合わせは、２、３、４つまたはそれより多くのオピオイドレセプターアゴニストからなる。好ましくは、２つの異なるオピオイドレセプターアゴニストの組み合わせが、使用される。異なるオピオイドを組み合わせて使用することにより、がん細胞に対して相乗的なアポトーシス促進効果がもたらされることを証明することができた（実施例３８および図５６を参照のこと）。
【００５２】
好ましい実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストの前記組み合わせは、モルヒネおよびフェンタニルを含む。好ましくは、前記組み合わせは、モルヒネおよびフェンタニルからなる。モルヒネとフェンタニルとの相乗効果は、例えば、白血病細胞株ＨＬ６０に対して示された（実施例３８および図５６を参照のこと）。
【００５３】
好ましい実施形態において、メタドン、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドン、最も好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンの塩酸塩の形態は、特に、０．０５μｇ／ｍＬ〜３μｇ／ｍＬの血漿レベルが得られるように患者に与えられる。
【００５４】
さらに好ましい実施形態において、メタドン、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドン、最も好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンの塩酸塩の形態は、特に、０．０１μｇ／ｍＬ〜３μｇ／ｍＬの血漿レベルが得られるように患者に与えられる。
【００５５】
本発明の１つの実施形態において、抗がん因子は、インターカレート物質（例えば、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシンおよびダウノルビシン）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ラメラリン（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ）Ｄ、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン類およびアウリントリカルボン酸）；ニトロソ尿素化合物（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン）；ナイトロジェンマスタード類（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、ウラムスチン、ベンダムスチン、メルファラン、クロラムブシル、マホスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、トロホスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄ）およびイホスファミド）；スルホン酸アルキル類（例えば、ブスルファンおよびトレオスルファン）；アルキル化剤（例えば、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミドおよびチオテパ）；白金アナログ（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン（ｓａｔｒａｐｌａｔｉｎ）およびトリプラチンテトラニトレート（ｔｒｉｐｌａｔｉｎ  ｔｅｔｒａｎｉｔｒａｔｅ））；微小管破壊薬（例えば、ビンブラスチン、コルセミドおよびノコダゾール）；葉酸代謝拮抗薬（メトトレキサート、アミノプテリン、ジクロロメトトレキサート（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔ）、ペメトレキセド、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）およびプララトレキサートのような）；プリンアナログ（アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびクラドリビンのような）；ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−アザウラシル、ゲムシタビン、カペシタビンのような）；タキサンおよびタキサンアナログ（パクリタキセルおよびドセタキセルのような）；ステロイドホルモン（ゲスターゲン（ｇｅｓｔａｇｅｎｅ）、アンドロゲン（ａｎｄｒｏｇｅｎｅ）、糖質コルチコイド類、デキサメタゾン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンのような）；抗がんペプチド（放射活性的に標識されたペプチド（ｐａｐｔｉｄｅｓ）およびペプチド−薬物結合体を含む）；抗がん抗体（放射活性的に標識された抗体および抗体−薬物結合体（例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、アレムツズマブ、オファツムマブ（ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、ゲムツズマブ−オゾガミシン、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）、９０Ｙ−イブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ−トシツモマブまたはトラスツズマブ）を含む）、粒子放射線を含むアルファ、ベータまたはガンマ線照射からなるリストより選択される。
【００５６】
上で列挙された抗がん因子は、ＰＥＧ化などの修飾およびリポソームの使用などの製剤化（すなわち、ＰＥＧ化されたリポソーマルドキソルビシン）も含む。
【００５７】
さらなる実施形態において、抗がん因子は、放射活性的に標識された化合物、ペプチド、タンパク質またはモノクローナル抗体であり得、ここで、その放射性標識は、アルファ、ベータまたはガンマ線および電離粒子さえも放射し得る。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、抗がん因子は、メトトレキサート、シタラビン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、フルダラビン、特に、シスプラチン、ドキソルビシン、アントラサイクリン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシンまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である。
【００５９】
オピオイドレセプターの誘導が望まれるがんの実体を処置するとき、患者は、好ましくは、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、エトポシド、メトトレキサート、シタラビン、テニポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、リツキシマブおよびトラスツズマブからなる群より選択される抗がん因子で処置される。
【００６０】
本発明の１つの実施形態において、本発明の組み合わせで処置される患者は、疾病および関連保健問題の国際統計分類の第１０回目の修正版（ＩＣＤ−１０）に従って分類される新生物に罹患しており、その新生物は、クラスＣ００〜Ｃ９７の悪性新生物、クラスＤ００〜Ｄ０９の上皮内新生物、クラスＤ１０〜Ｄ３６の良性新生物およびクラスＤ３７〜Ｄ４８の性状不詳または不明の新生物からなる群のものである。
【００６１】
上記クラスは、以下のとおり定義される：（Ｃ００）口唇の悪性新生物、（Ｃ０１）舌の基底部の悪性新生物、（Ｃ０２）その他のおよび部位不明の舌の悪性新生物、（Ｃ０３）歯肉の悪性新生物、（Ｃ０４）口腔底の悪性新生物、（Ｃ０５）口蓋の悪性新生物、（Ｃ０６）その他のおよび部位不明の口腔の悪性新生物、（Ｃ０７）耳下腺の悪性新生物、（Ｃ０８）その他のおよび部位不明の大唾液腺の悪性新生物、（Ｃ０９）扁桃の悪性新生物、（Ｃ１０）中咽頭の悪性新生物、（Ｃ１１）鼻咽頭の悪性新生物、（Ｃ１２）梨状陥凹の悪性新生物、（Ｃ１３）下咽頭の悪性新生物、（Ｃ１４）その他のおよび部位不明確の口唇、口腔および咽頭の悪性新生物、（Ｃ１５）食道の悪性新生物、（Ｃ１６）胃の悪性新生物、（Ｃ１７）小腸の悪性新生物、（Ｃ１８）結腸の悪性新生物、（Ｃ１９）直腸Ｓ状結腸移行部の悪性新生物、（Ｃ２０）直腸の悪性新生物、（Ｃ２１）肛門および肛門管の悪性新生物、（Ｃ２２）肝臓および肝内胆管の悪性新生物、（Ｃ２３）胆嚢の悪性新生物、（Ｃ２４）その他のおよび部位不明の胆管の悪性新生物、（Ｃ２５）膵臓の悪性新生物、（Ｃ２６）その他のおよび部位不明確の消化器の悪性新生物、（Ｃ３０）鼻腔および中耳の悪性新生物、（Ｃ３１）副鼻腔の悪性新生物、（Ｃ３２）喉頭の悪性新生物、（Ｃ３３）気管の悪性新生物、（Ｃ３４）気管支および肺の悪性新生物、（Ｃ３７）胸腺の悪性新生物、（Ｃ３８）心臓、縦隔および胸膜の悪性新生物、（Ｃ３９）その他のおよび部位不明確の呼吸器系および胸腔内臓器の悪性新生物、（Ｃ４０〜Ｃ４１）悪性新生物、骨および関節軟骨、（Ｃ４３）皮膚の悪性黒色腫、（Ｃ４４）その他の皮膚の悪性新生物、（Ｃ４５）中皮腫、（Ｃ４６）カポジ肉腫、（Ｃ４７）末梢神経および自律神経系の悪性新生物、（Ｃ４８）後腹膜および腹膜の悪性新生物、（Ｃ４９）その他の結合組織および軟部組織の悪性新生物、（Ｃ５０）乳房の悪性新生物、（Ｃ５１）外陰部の悪性新生物、（Ｃ５２）膣の悪性新生物、（Ｃ５３）子宮頚部の悪性新生物、（Ｃ５４）子宮体部の悪性新生物、（Ｃ５５）部位不明の子宮の悪性新生物、（Ｃ５６）卵巣の悪性新生物、（Ｃ５７）その他のおよび部位不明の女性生殖器の悪性新生物、（Ｃ５８）胎盤の悪性新生物、（Ｃ６０）陰茎の悪性新生物、（Ｃ６１）前立腺の悪性新生物、（Ｃ６２）精巣の悪性新生物、（Ｃ６３）その他のおよび部位不明の男性生殖器の悪性新生物、（Ｃ６４）腎盂を除く腎の悪性新生物、（Ｃ６５）腎盂の悪性新生物、（Ｃ６６）尿管の悪性新生物、（Ｃ６７）膀胱の悪性新生物、（Ｃ６８）その他のおよび部位不明の泌尿器の悪性新生物、（Ｃ６９）眼および付属器の悪性新生物、（Ｃ７０）髄膜の悪性新生物、（Ｃ７１）脳の悪性新生物、（Ｃ７２）脊髄、脳神経およびその他の中枢神経系の部位の悪性新生物、（Ｃ７３）甲状腺の悪性新生物、（Ｃ７４）副腎の悪性新生物、（Ｃ７５）その他の内分泌腺および関連組織の悪性新生物、（Ｃ７６）その他のおよび部位不明確の悪性新生物、（Ｃ７７）リンパ節の続発性および部位不明の悪性新生物、（Ｃ７８）呼吸器および消化器の続発性悪性新生物、（Ｃ７９）その他の部位の続発性悪性新生物、（Ｃ８０）部位の明示されない悪性新生物、（Ｃ８１）ホジキン病、（Ｃ８２）濾胞性非ホジキンリンパ腫（結節性）、（Ｃ８３）びまん性非ホジキンリンパ腫、（Ｃ８４）末梢性および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、（Ｃ８５）非ホジキンリンパ腫のその他のおよび部位不明の型、（Ｃ８８）悪性免疫増殖性疾患、（Ｃ９０）多発性骨髄腫および悪性形質細胞性新生物、（Ｃ９１）リンパ性白血病、（Ｃ９２）骨髄性白血病、（Ｃ９３）単球性白血病、（Ｃ９４）細胞型の明示されたその他の白血病、（Ｃ９５）細胞型不明の白血病、（Ｃ９６）その他のおよび部位不明のリンパ組織、造血組織および関連組織の悪性新生物、（Ｃ９７）独立した（原発性）多部位の悪性新生物、（Ｄ００）口腔、食道および胃の上皮内癌、（Ｄ０１）その他のおよび部位不明の消化器の上皮内癌、（Ｄ０２）中耳および呼吸器系の上皮内癌、（Ｄ０３）上皮内黒色腫、（Ｄ０４）皮膚の上皮内癌、（Ｄ０５）乳房の上皮内癌、（Ｄ０６）子宮頚部の上皮内癌、（Ｄ０７）その他のおよび部位不明の生殖器の上皮内癌、（Ｄ０９）その他のおよび部位不明の上皮内癌、（Ｄ１０）口腔および咽頭の良性新生物、（Ｄ１１）大唾液腺の良性新生物、（Ｄ１２）結腸、直腸、肛門および肛門管の良性新生物、（Ｄ１３）その他のおよび部位不明確の消化系の良性新生物、（Ｄ１４）中耳および呼吸器系の良性新生物、（Ｄ１５）その他のおよび部位不明の胸腔内臓器の良性新生物、（Ｄ１６）骨および関節軟骨の良性新生物、（Ｄ１７）良性脂肪腫性新生物、（Ｄ１８）任意の部位の血管腫およびリンパ管腫、（Ｄ１９）中皮組織の良性新生物、（Ｄ２０）後腹膜および腹膜の軟部組織の良性新生物、（Ｄ２１）結合組織およびその他の軟部組織のその他の良性新生物、（Ｄ２２）メラニン細胞性母斑、（Ｄ２３）皮膚のその他の良性新生物、（Ｄ２４）乳房の良性新生物、（Ｄ２５）子宮の平滑筋腫、（Ｄ２６）子宮のその他の良性新生物、（Ｄ２７）卵巣の良性新生物、（Ｄ２８）その他のおよび部位不明の女性生殖器の良性新生物、（Ｄ２９）男性生殖器の良性新生物、（Ｄ３０）泌尿器の良性新生物、（Ｄ３１）眼および付属器の良性新生物、（Ｄ３２）髄膜の良性新生物、（Ｄ３３）脳および中枢神経系のその他の部位の良性新生物、（Ｄ３４）甲状腺の良性新生物、（Ｄ３５）その他のおよび部位不明の内分泌腺の良性新生物、（Ｄ３６）その他のおよび部位不明の良性新生物、（Ｄ３７）口腔および消化器の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ３８）中耳および呼吸器および胸腔内臓器の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ３９）女性生殖器の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ４０）男性生殖器の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ４１）泌尿器の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ４２）髄膜の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ４３）脳および中枢神経系の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ４４）内分泌腺の性状不詳または不明の新生物、（Ｄ４５）真性赤血球増多症（Ｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａ  ｖｅｒａ）、（Ｄ４６）骨髄異形成症候群、（Ｄ４７）リンパ系、造血組織および関連組織の性状不詳または不明のその他の新生物、（Ｄ４８）その他のおよび部位不明の性状不詳または不明の新生物。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において、本発明の組み合わせで処置される患者は、転移に苦しんでいる。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態において、本発明の組み合わせで処置される患者は、Ｃ２５、Ｃ５０、Ｃ５６、Ｃ７１、Ｃ９１およびＣ９２からなるクラスのリストより選択される新生物に罹患している。
【００６４】
より好ましい実施形態において、患者は、急性リンパ芽球性白血病（Ｃ９１．０）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｃ９１．２）、急性前骨髄球性白血病（Ｃ９２．４）、急性骨髄性白血病（Ｃ９２．０）、慢性骨髄性白血病（Ｃ９２．１）、すべての形態の神経膠芽腫（Ｃ７１）、すべての形態の膵がん（Ｃ２５）、すべての形態の卵巣がん（Ｃ５６）、乳がんのクラス（Ｃ５０）および神経膠芽腫起源幹細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）などの腫瘍幹細胞を含むリストより選択される新生物に罹患している。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態において、患者は、例えば、トラスツズマブ抵抗性乳がんのような、ＨＥＲ２標的化治療に抵抗性の乳がんに罹患している。
【００６６】
好ましい実施形態において、急性リンパ芽球性白血病（Ｃ９１．０）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００６７】
さらに好ましい実施形態において、急性リンパ芽球性白血病（Ｃ９１．０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００６８】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、急性リンパ芽球性白血病（Ｃ９１．０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびエトポシド、またはＤ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンを含む組み合わせで処置される。
【００６９】
好ましい実施形態において、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｃ９１．２）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７０】
さらに好ましい実施形態において、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｃ９１．２）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７１】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｃ９１．２）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびフルダラビン、またはブプレノルフィンおよびフルダラビン、またはフェンタニルおよびフルダラビン、またはモルヒネおよびフルダラビンを含む組み合わせで処置される。
【００７２】
好ましい実施形態において、急性前骨髄球性白血病（Ｃ９２．４）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７３】
さらに好ましい実施形態において、急性前骨髄球性白血病（Ｃ９２．４）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７４】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、急性前骨髄球性白血病（Ｃ９２．４）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシン、またはブプレノルフィンおよびドキソルビシン、またはフェンタニルおよびドキソルビシン、またはモルヒネおよびドキソルビシンを含む組み合わせで処置される。
【００７５】
好ましい実施形態において、急性骨髄性白血病（Ｃ９２．０）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７６】
さらに好ましい実施形態において、急性骨髄性白血病（Ｃ９２．０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７７】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、急性骨髄性白血病（Ｃ９２．０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシン、またはブプレノルフィンおよびドキソルビシン、またはフェンタニルおよびドキソルビシン、またはモルヒネおよびドキソルビシンを含む組み合わせで処置される。
【００７８】
好ましい実施形態において、慢性骨髄性白血病（Ｃ９２．１）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００７９】
さらに好ましい実施形態において、慢性骨髄性白血病（Ｃ９２．１）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００８０】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、慢性骨髄性白血病（Ｃ９２．１）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびイマチニブ、またはブプレノルフィンおよびイマチニブ、またはフェンタニルおよびイマチニブ、またはモルヒネおよびイマチニブを含む組み合わせで処置される。
【００８１】
本発明の別の好ましい実施形態において、慢性骨髄性白血病（Ｃ９２．１）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびフルダラビン、またはブプレノルフィンおよびフルダラビン、またはフェンタニルおよびフルダラビン、またはモルヒネおよびフルダラビンを含む組み合わせで処置される。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、白血病に罹患している患者は、本発明の組み合わせに加えて、少なくとも１つのさらなるオピオイドレセプターアゴニストで処置される。ゆえに、その患者は、少なくとも２つのオピオイドレセプターアゴニストで処置される。このストラテジーは、異なるオピオイド類の組み合わせが、がん細胞株に対して相乗的なアポトーシス促進効果を示すという知見に基づく（図５６を参照のこと）。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明の組み合わせは、モルヒネ、フェンタニルおよび少なくとも１つの抗がん因子を含み、さらなる実施形態において、その組み合わせは、モルヒネ、フェンタニルおよびさらなる抗がん因子からなる。モルヒネとフェンタニルとの相乗効果は、例えば、白血病細胞株ＨＬ６０に対して示された（実施例３８を参照のこと）。
【００８４】
好ましい実施形態において、神経膠芽腫（Ｃ７１）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、テモゾロミド、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００８５】
さらに好ましい実施形態において、神経膠芽腫（Ｃ７１）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００８６】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、神経膠芽腫（Ｃ７１）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンを含む組み合わせで処置される。
【００８７】
好ましい実施形態において、前記ドキソルビシンは、血液脳関門を横断するドキソルビシンの移行を増強する製剤として与えられる。当業者には、ＢＢＢ移行を可能にするかまたは増強するために利用可能な製剤化ストラテジーがいくつかある。例として、ドキソルビシンは、リポソーム内に詰め込まれ得るか、またはトランスフェリンに結合され得る。
【００８８】
本発明の別の好ましい実施形態において、神経膠芽腫（Ｃ７１）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびダウノルビシンを含む組み合わせ、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびイダルビシンを含む組み合わせ、またはＤ，Ｌ−メタドンおよびテモゾロミドを含む組み合わせで処置される。
【００８９】
好ましい実施形態において、神経膠芽腫起源幹細胞に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００９０】
さらに好ましい実施形態において、神経膠芽腫起源幹細胞に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００９１】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、神経膠芽腫起源幹細胞に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンを含む組み合わせで処置される。
【００９２】
好ましい実施形態において、膵がん（Ｃ２５）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、オキサリプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００９３】
さらに好ましい実施形態において、膵がん（Ｃ２５）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００９４】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、膵がん（Ｃ２５）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびシスプラチンを含む組み合わせで処置される。
【００９５】
本発明のさらに好ましい実施形態において、膵がん（Ｃ２５）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびオキサリプラチンを含む組み合わせで処置される。
【００９６】
本発明の１つの実施形態において、がんに罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびテモゾロミドを含む組み合わせで処置される。
【００９７】
好ましい実施形態において、卵巣がん（Ｃ５６）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、カルボプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００９８】
さらに好ましい実施形態において、卵巣がん（Ｃ５６）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【００９９】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、卵巣がん（Ｃ５６）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびシスプラチンを含む組み合わせで処置される。
【０１００】
別の実施形態において、Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの組み合わせで処置される患者は、シスプラチン抵抗性卵巣がんに罹患している。
【０１０１】
好ましい実施形態において、乳がん（Ｃ５０）に罹患している患者は、メトトレキサート、シタラビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ビンクリスチン、フルダラビンからなるリストより選択され、好ましくは、シスプラチン、アントラサイクリン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはアルファ、ベータもしくはガンマ線照射である、抗がん因子を含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【０１０２】
さらに好ましい実施形態において、乳がん（Ｃ５０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィン、フェンタニルおよびモルヒネからなるリストより選択され、好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドンである、オピオイドレセプターアゴニストを含む本発明に係る組み合わせで処置される。
【０１０３】
本発明のなおもより好ましい実施形態において、乳がん（Ｃ５０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびシスプラチンを含む組み合わせで処置される。
【０１０４】
本発明のさらに好ましい実施形態において、好ましくはトラスツズマブ抵抗性乳がんなどのＨＥＲ２標的化治療に抵抗性の乳がんである、乳がん（Ｃ５０）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンを含む組み合わせで処置される。
【０１０５】
本発明の別の実施形態において、前立腺がん（Ｃ６２）に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびシスプラチンを含む組み合わせで処置される。
【０１０６】
本発明の１つの実施形態において、白血病に罹患している患者は、Ｄ，Ｌ−メタドンと以下の抗がん因子：エトポシド、シタラビン、メトトレキサート、シクロホスファミド、チオグアニン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセルまたはビンクリスチンのうちの１つとの組み合わせで処置される。
【０１０７】
別の実施形態において、処置されるがんは、２０００年からの現行のバージョンＩＣＤ−Ｏ−３における国際疾病分類腫瘍学ＩＣＤ−Ｏに係る新生物である。あるいは、処置されるがんは、患者の体内のがんの程度を説明するがんの病期分類システムである、悪性腫瘍のＴＮＭ分類（ＴＮＭ）に含められるようながんである。さらなる代替物において、処置されるがんは、Ｂｏｅｃｋｅｒら、２００８のｃｈａｐｔｅｒ６（Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｕｒｂａｎ  ＆  Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｐ．１６７−２１８）（その全体が参照により援用される）によって開示されている。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態において、前記組み合わせで処置される患者は、白血病、乳がん、皮膚がん、骨がん、前立腺がん、肝臓がん、肺がん、脳腫瘍、喉頭がん、胆嚢がん、膵臓がん、直腸がん、副甲状腺がん、甲状腺がん、副腎がん、神経組織がん、頭頸部がん、結腸がん、胃がん、気管支がん、腎臓がん、基底細胞癌腫、潰瘍型と乳頭型の両方の扁平上皮癌腫、転移性皮膚癌腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｅｌｌ  ｓａｒｃｏｍａ）、ミエローマ、巨細胞腫瘍、小細胞肺腫瘍、膵島細胞腫瘍、原発性脳腫瘍、急性および慢性のリンパ球性および顆粒球性腫瘍、ヘアリーセル腫瘍、アデノーマ、過形成、髄様癌腫、褐色細胞腫、粘膜神経腫、腸管神経節性神経腫、過形成性角膜神経腫瘍（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ）、マルファン体型腫瘍（ｍａｒｆａｎｏｉｄ  ｈａｂｉｔｕｓ  ｔｕｍｏｕｒ）、ウィルムス腫瘍、セミノーマ、卵巣腫瘍、平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａｔａ）、子宮頸部異形成および上皮内癌腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部組織肉腫、悪性カルチノイド、局所的皮膚病変、菌状息肉腫（ｍｙｃｏｓｉｓ  ｆｕｎｇｏｉｄｅ）、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、骨原性肉腫および他の肉腫、悪性の高カルシウム血症、腎細胞腫瘍、真性赤血球増多症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｒｍｉａ  ｖｅｒａ）、腺癌、多形神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、悪性黒色腫ならびに類表皮癌からなる群からの非固形腫瘍に罹患している。
【０１０９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、処置される患者は、膵臓癌腫、肝芽腫、結腸癌腫（小細胞肺がん、メラノーマ、乳癌腫、卵巣癌腫、前立腺癌腫、神経膠芽腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、前駆型の（ｐｒｏ−ｆｏｒｍｓ  ｏｆ）白血病、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、腫瘍幹細胞、神経膠芽腫起源幹細胞および多発性骨髄腫からなる群より選択される新生物に罹患している。
【０１１０】
本発明の別の実施形態において、患者は、内因性抵抗性または獲得抵抗性を示す。
【０１１１】
したがって、本発明の文脈において、「抵抗性」は、全体的または部分的であり得；換言すれば、本発明に従って処置可能であると考えられる患者は、従来の抗がん処置に対して感度の低下または感度の完全な欠如さえも示し得る。これらの患者は、「非反応者」または「反応不良者（ｐｏｏｒ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」としても判断され得る。
【０１１２】
「抵抗性の」がんまたは腫瘍に対するさらなる同義語は、「難治性」タイプのがんであり、これは、完全にまたは部分的に難治性であり得る。したがって、内因性の抵抗性は、「原発性の難治性がん」としても判断され得る。特定の形態の難治性または抵抗性のがん細胞は、例えば、最初は殺滅されるが急速に複製すると有効な処置はほぼ不可能であるという白血病細胞で公知の現象である、いわゆる「動態学的に難治性の細胞」である。
【０１１３】
本発明の文脈において使用されるとき、用語「従来の」処置または治療とは、過去の研究の結果および／または規制当局の許可に基づいて、ある特定のタイプのがんの現在認められているおよび広く使用されている治療的な処置のことを指す。
【０１１４】
従来の抗がん薬には、細胞傷害剤および細胞分裂抑制剤が含まれ、これらは、がん細胞を殺滅するか、またはそれらの成長もしくは増殖を減少させるおよび／もしくは停止する。これらの抗がん薬の作用様式は、様々であり得；例は、代謝拮抗物質（例えば、シタラビン、メトトレキサート、メルカプトプリンまたはクロファラビン（ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ））、ＤＮＡ架橋剤（例えば、シスプラチンおよびその誘導体）、ＤＮＡインターカレート物質（例えば、ドキソルビシン）、トポイソメラーゼ毒（例えば、エトポシド）、キナーゼ阻害剤（例えば、セツキシマブ）、ステロイド類（例えば、デキサメタゾン）または有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン）である。白血病の従来の抗がん処置に対する１つの例は、ドキソルビシンまたはリツキシマブの投与である。
【０１１５】
従来の照射療法は、放射線療法も含み得、それは、Ｘ線、アルファ、ベータおよびガンマ線、オージェ電子、紫外線、中性子、プロトン、ならびにがん細胞を殺滅し、腫瘍を縮小させる他の線源からの高エネルギー放射線の使用を意味する。放射線は、身体の外側のデバイスを起源とし得るか（外部ビーム放射線療法）、またはがん細胞の近傍の体内に配置された放射性源を起源とし得る（内部放射線療法）。全身放射線療法では、血流に乗って標的組織まで移動する放射性標識されたモノクローナル抗体などの放射性物質が使用される。放射線抵抗性の（ｒａｄｉｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）がん細胞は、これらの処置に反応しないか、または部分的にしか反応しない。
【０１１６】
上で詳細に概要を述べたように、本発明の１つの実施形態によると、オピオイドレセプターアゴニストは、従来の抗がん処置および／もしくは放射線処置に対するがん細胞の内因性抵抗性または獲得抵抗性、あるいはアポトーシス抵抗性を克服するためまたは「打破する」ために適用される。本発明の１つの実施形態において、本発明に従って処置可能であると考えられるがん細胞は、オピオイドレセプター、特に、μオピオイドレセプターを発現している。
【０１１７】
本発明によると、用語「抵抗性」、「放射線抵抗性」または「化学療法剤抵抗性」は、少なくとも１つの従来のがん治療、すなわち、抗がん薬または照射療法に対するがん細胞の低感度として定義される。そのようながんに罹患している患者は、「抵抗性」がん患者と判断される。その抵抗性は、内因性または獲得性であり得るので、観察される感度の低下は、適用された抗がん薬および／もしくは放射線の治療的に有効な投与量に対して反応性である完全に感受性の「通常の」がん細胞と比較されるか、治療を開始した際の元の感度と比較される。後者の場合、抵抗性は、同じ用量の場合に、少ない量の腫瘍退縮として（放射線または抗がん薬のいずれか）または等しい量の腫瘍退縮のために必要な用量の増加として現れる。
【０１１８】
本発明の別の実施形態において、患者は、次の抵抗性：アポトーシス抵抗性、多剤抵抗性、抗がん薬抵抗性、細胞傷害薬抵抗性、活性酸素種に対する抵抗性、ＤＮＡ傷害剤に対する抵抗性、毒性のある抗体に対する抵抗性、ドキソルビシン抵抗性、単一抵抗性または交差抵抗性、照射抵抗性（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）（例えば、アルファ、ベータ、ガンマまたはオージェ電子）のうちの１つまたはそれより多くを示す。
【０１１９】
特定の実施形態において、患者は、以下の原薬：メトトレキサート、シタラビン、チオグアニン、シスプラチン、オキサリプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、パクリタキセル、カルボプラチン、テニポシド、デキサメタゾン、プレドニゾロン、シクロホスファミド、ジホスファミド、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、メルカプトプリン、フルダラビン、ゲムシタビン、テモゾロミド、抗ＨＥＲ２および抗ＣＤ２０のうちの１つまたはそれより多くに対して抵抗性である。
【０１２０】
本発明の１つの実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストとともに投与される抗がん因子は、それぞれのがんに対する推奨用量に等しいかまたはそれ未満の用量で与えられる。推奨用量は、オピオイドレセプターアゴニストの投与なしでの従来のがん治療によって与えられるものである。好ましくは、当業者の観点からの抗がん因子のそれぞれの用量は、最適以下の用量または治療用量以下の用量であり、それらは、患者の副作用がより少ないという利点を有する。主要な効果は、その用量の抗がん薬の取り込みががん細胞において増加するが、血漿濃度は、従来の治療のレベルであるという点である。これは、従来の治療に対する非反応者が処置され得るという効果を有する。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストとともに投与される抗がん因子は、その抗がん因子だけを使用してがんを処置する場合の推奨用量の２分の１、好ましくは、３分の１、５分の１、１０分の１または３０分の１、なおもより好ましくは、１００分の１の用量で与えられる。
【０１２２】
本発明のさらに好ましい実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストとともに投与される抗がん因子は、それぞれのがんに対する推奨用量に等しいかまたはそれ未満の用量で与えられ、ここで、その抗がん因子の有効な血漿レベルの期間は、完全に、オピオイドレセプターアゴニストの有効な血漿レベルの期間内である。その推奨用量は、オピオイドレセプターアゴニストの投与なしでの従来のがん治療によって与えられるものである。
【０１２３】
本発明のさらに好ましい実施形態において、オピオイドレセプターアゴニストは、Ｄ／Ｌ−メタドンであり、抗がん因子は、メトトレキサートおよびデキサメタゾンである。
【０１２４】
本発明のさらなる実施形態において、オピオイド類またはオピオイドレセプターアゴニストは、少なくとも１つの抗がん薬を含む複合物として使用され得る。
【０１２５】
本発明の文脈において、用語「抗Ｈｅｒ２」は、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ遺伝子の遺伝子産物に結合して、それと相互作用する任意のリガンドのことを表す。これは、トラスツズマブ（ハーセプチン）などの抗体または任意の有機化合物を包含する。
【０１２６】
本発明の文脈内の「複合物」は、治療有効量の本発明に従って定義されるような任意のオピオイドレセプターアゴニスト（成分Ａ）および少なくとも１つのさらなる抗がん物質（成分Ｂ）を含む医薬品に関する。この「複合物」は、単一の組成物、または同時にもしくは続いて患者に投与され得る少なくとも２つの組成物を構成し得る。上述の物質は、好ましくは、メタドン、より好ましくは、Ｄ／Ｌ−メタドンの塩酸塩の形態と組み合わされる。
【０１２７】
本発明の複合物は、単一の組成物と比べて相乗効果を示し得るので、がん細胞の効果的な処置にとって有益であり得る。特に、成分Ａとしてメタドンおよび成分Ｂとして以下のような薬剤のうちの１つを含む複合物が、好ましい：メトトレキサート、シタラビン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、エトポシド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、フルダラビン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドセタキセル、テモゾロミド、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２。さらに、照射処置も含む併用処置が、可能である。
【０１２８】
さらに好ましい複合物は、成分Ａとしてのメタドンおよび成分Ｂとしてのテモゾロミドからなる。
【０１２９】
本発明の好ましい実施形態において、抵抗性または感受性の非固形がん、すなわち、血液、骨髄およびリンパ節が冒されるすべての血液学的悪性疾患（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病およびすべての白血病の原型、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫ならびに多発性骨髄腫を含む）を処置するために、オピオイド類が使用される。
【０１３０】
さらなる態様において、本発明は、オピオイドレセプターアゴニストと１つまたはそれより多くの抗がん薬との組み合わせを選択するための方法を提供する。この方法は、以下の工程：
（ａ）好ましくはがん生検材料または液体サンプル（例えば、血液、羊水、胸膜液、腹水または脳脊髄液）から単離された、がん細胞、細胞株または初代細胞のインビトロ（ａｎ  ｖｉｔｒｏ）培養物を提供する工程；
（ｂ）必要に応じて、工程（ａ）からの細胞をオピオイドレセプターの発現について試験する工程；
（ｃ）工程（ａ）からの細胞をオピオイドアゴニストもしくは少なくとも１つの抗がん薬またはそれらの組み合わせで処置する工程；
（ｄ）それらの細胞を細胞死および／またはオピオイドレセプターの発現について解析する工程
（ｅ）オピオイドレセプター／抗がん薬の組み合わせを選択する工程、および好ましくは、前記組み合わせに対する用量を所望の細胞死／生存率または増殖阻害の程度に基づいて選択する工程；および／または
（ｆ）抗がん因子を選択する工程、および好ましくは、所望のオピオイドレセプター誘導の程度を示す前記抗がん因子に対する用量を選択する工程
を含む。
【０１３１】
インビトロで培養されるがん細胞は、不死化細胞株、異種移植された細胞、続発性もしくは原発性のがん細胞株または初代細胞であり得る。好ましい実施形態において、その細胞株および／または細胞は、がん生検材料に由来し、より好ましい実施形態において、その生検材料もしくは血液のサンプリングまたは脳脊髄液のサンプリングまたは胸膜液のサンプリングまたは羊水のサンプリングまたは腹水のサンプリングは、本発明に係る組み合わせで処置される患者から採取される。がん細胞株は、１つのがん細胞型にしか基づかない均一な細胞株または異なる細胞型を含む不均一ながん細胞株であり得る。
【０１３２】
工程（ｂ）におけるオピオイドレセプターの発現の解析は、当業者に公知の手法によって行われ得る。例の非限定的なリストとしては、前記オピオイドレセプターに対して産生された抗体または抗体フラグメントを使用する免疫蛍光法、オピオイドレセプターの免疫沈降、またはナロキソン−フルオレセインなどの標識されたオピオイドレセプターリガンドの使用が挙げられる。
【０１３３】
工程（ｃ）における細胞生存率およびアポトーシスの解析については、当業者に公知の手法がいくつかある。例の非限定的なリストとしては、（ａ）細胞溶解アッセイまたは膜漏出アッセイ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイ、ヨウ化プロピジウムアッセイ、トリパンブルーアッセイ、７−アミノアクチノマイシンＤアッセイ）、（ｂ）ミトコンドリア活性アッセイまたはカスパーゼアッセイ（例えば、リザズリンおよびホルマザン（ＭＴＴ／ＸＴＴ）が、細胞死の前兆となるアポトーシスプロセスにおける様々なステージについてアッセイし得る）、（ｃ）赤血球の場合、細胞変形能、浸透圧脆弱性、溶血、ＡＴＰレベルおよびヘモグロビン含有量を測定する、機能性アッセイ；（ｄ）ＤＮＡマイクロアレイおよびタンパク質チップを使用する、ストレス経路の活性化の解析を含む、ゲノムアッセイおよびプロテオームアッセイが挙げられる。
【０１３４】
さらに好ましい実施形態において、細胞生存率は、ヨウ化プロピジウムアッセイによって測定され、アポトーシスは、低二倍体ＤＮＡ（ｓｕｂＧ１）の計測およびフローサイトメトリーによるＦＳＣ／ＳＳＣ解析によって測定される。
【０１３５】
工程（ｄ）において、培養された細胞は、好ましくは、オピオイドのみ、抗がん因子のみ、およびそれらの２つの物質の組み合わせの使用を含む平行した実験において処置される。さらなる実施形態において、効果の効力は、それぞれの効果の用量依存性を調べることによって、解析される。代替の実験では、抗アポトーシス効果またはオピオイドレセプター発現を増加させるため、または副作用プロファイルを減少させるために、いくつかの抗がん因子が組み合わされ得る。さらなる実施形態において、試験化合物の最初の選択は、腫瘍の特徴に依存し得る。さらに、年齢、性別、体重、共存症、個体の代謝能力、アレルギーおよび不適合性、遺伝的素因、疾患の経過ならびに家族歴を含む患者の特徴もまた、考慮され得る。
【０１３６】
インビトロでの解析の場合、上に記載されたようなオピオイドレセプターアゴニストは、試験のために使用され得る。好ましくは、Ｄ，Ｌ−メタドン、Ｌ−メタドン、フェンタニル、ブプレノルフィン、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、トラマドールおよびタペンタドールが、使用される。
【０１３７】
好ましい実施形態において、それぞれのがん細胞型、細胞株または細胞に対して効果を有すると周知である抗がん因子が、選択される。
【０１３８】
抗がん因子だけを試験するとき、培養された細胞を、オピオイドレセプターの発現レベルの比較が可能である条件下において、抗がん処置前および抗がん処置後のオピオイドレセプターの発現について解析する。前記比較により、それぞれのがん細胞上でのオピオイドレセプターの発現を増加させる抗がん因子を特定することが可能になる。
【０１３９】
工程（ｅ）における選択により、患者にとって許容され得る副作用プロファイルを保ったまま有効性を最大にするための、薬の組み合わせおよび／またはそれぞれの用量の優先順位がつけられる。
【０１４０】
工程（ｆ）における選択により、がん細胞上でのオピオイドレセプターの発現を増加させる能力に関して抗がん因子の優先順位がつけられる。結果として、オピオイドアゴニストの抗アポトーシス効果ならびに抗がん因子の抗アポトーシス効果（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｆｆｅｃｔ）が、最大にされる。
【０１４１】
工程（ｃ）において、細胞培養物が、オピオイドレセプターアゴニストと抗がん因子との組み合わせで処置された場合、使用される組み合わせの優先順位付けは、組み合わせの用量が、培養中の細胞に対してより良い致死効果を有する態様において行われる。最も高い致死効果を有する組み合わせ、または観察可能である場合、培養中の細胞に対して最も高い致死効果を有する組み合わせよりも最大１０％低い細胞致死効果を有する用量であるが、オピオイドレセプターアゴニストのより少ない用量が、使用されるべきである。例えば、図２ｃは、Ｄ，Ｌ−メタドンの使用説明書に記載されているような従来の治療用量においてドキソルビシンを用いるとき、０．１μｇ／ｍＬの用量が好ましいだろうということを示している。
【０１４２】
さらなる態様において、本発明は、がんを処置するためのオピオイドレセプターアゴニストを選択するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：
（ａ）好ましくはがん生検材料または液体サンプル（例えば、血液、羊水、胸膜液または腹水または脳脊髄液）から単離された、がん細胞、細胞株または初代細胞のインビトロ培養物（ａｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｕｌｔｕｒｅ）を提供する工程；
（ｂ）必要に応じて、工程（ａ）からの細胞をオピオイドレセプターの発現について試験する工程；
（ｃ）工程（ａ）からの細胞を処置する工程；
（ｄ）それらの細胞を細胞死／生存率または増殖阻害について解析する工程；
（ｅ）オピオイドレセプター／抗がん薬の組み合わせを選択する工程、および好ましくは、前記組み合わせに対する用量を所望の細胞死の程度に基づいて選択する工程；および／または
（ｆ）オピオイドレセプターアゴニストを選択する工程、および好ましくは、所望の細胞死誘導の程度を示す前記オピオイドレセプターアゴニストに対する用量を選択する工程
を含む。
【０１４３】
この方法の場合、工程（ａ）〜（ｄ）は、上に記載されたような方法およびストラテジーによって行われ得る。
【０１４４】
オピオイドレセプターの発現の解析により、オピオイドレセプターアゴニストで処置され得るがんタイプの選択が可能になる。オピオイドレセプターアゴニストによるインビトロでの処置のおかげで、インビボでのがん処置に対する個別の用量が決定され得る。
【０１４５】
Ｉ．実験手順
薬物および試薬
インビトロ実験に向けて、Ｄ，Ｌ−メタドン塩酸塩（Ｄ，Ｌ−メタドン）およびドキソルビシンをＳｉｇｍａ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ナロキソンをＦａｇｒｏｎ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ（Ｂａｒｓｂｕｔｔｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から、および百日咳毒素（ＰＴＸ）をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。各実験の前に、調製物の一定品質を確実にするために、これらの物質を新たに滅菌蒸留水に溶解した。３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ，Ｓｉｇｍａ）を新たに０．０１Ｎ  ＮａＯＨに溶解した。
【０１４６】
インビボでの適用に向けて、本発明者らは、Ｄ，Ｌ−メタドン（Ｍｅｔｈａｄｄｉｃｔ，Ｈｅｘａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、地元の薬局から購入した５ｍｇの錠剤として使用した。その錠剤を微粉状にし、使用前に新たに食塩水中の１０％Ｔｗｅｅｎ８０に可溶化した。ドキソルビシン（Ｈｅｘａｌ）を、注射液（５ｍｇ／ｍｌ）として購入し、新たに食塩水で適切な濃度に希釈した。
【０１４７】
細胞株
ヒトＢ細胞白血病（ＢＣＰ−ＡＬＬ）細胞株Ｔａｎｏｕｅ、ＲｅｈおよびＮａｌｍ６を、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、３７℃、９５％大気／５％ＣＯ２において、１０％熱不活性化ＦＣＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、１ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。実験の設定において、それらの白血病細胞を、１０，０００細胞／ｍＬの密度で播種した。
【０１４８】
オピオイドレセプターシグナル伝達の試験
Ｄ，Ｌ−メタドンのようなアゴニストによってオピオイドレセプター（ＯＲ）を刺激すると、阻害性Ｇｉタンパク質が活性化する。そのαｉサブユニットは、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を不活性化し、細胞内のｃＡＭＰレベルを低下させ、それにより、いくつかの異なる調節因子（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）によって媒介され得るアポトーシスに至る。また、そのＧｉタンパク質のβγサブユニットは、Ｃａ２＋チャネルの阻害およびＫ＋チャネルの活性化のような、異なるエフェクターの活性を調節する。オピオイドレセプターアンタゴニストとしてのナロキソンは、オピオイドレセプターを競合的に阻害する。ＰＴｘ（百日咳毒素）は、Ｇｉタンパク質を不活性化し、ｃＡＭＰのダウンレギュレーションを阻止する。ＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン）は、ホスホジエステラーゼを阻害し、ｃＡＭＰレベルを上昇させる。
【０１４９】
メタドンの血清濃度
血清サンプル中のメタドンの計測を、液体／液体抽出後に、ガスクロマトグラフを備えた質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を使用して行った。内標準として、ｄ９−メタドンを加えた。質量選択検出器を、電子衝撃モードで操作した。選択されたイオンをモニタリングするモードで、データを取得した。０．８ｎｇ／ｍｌという検出限界および１．２ｎｇ／ｍｌという定量限界とともに、以下の質量、メタドンに対しては、ｍ／ｚ２９４、２２３、７２（標的イオン）ならびにｄ９−メタドンに対しては、ｍ／ｚ３０３、２２６および７８を用いて、被検体を同定した。
【０１５０】
ドキソルビシンの血清濃度
血清中のドキソルビシンおよびその主要な代謝産物の計測を、以前に報告されているように（Ｈｉｌｇｅｒら、２００５；Ｒｉｃｈｌｙら、２００６）行った。この検証された方法を用いると、ドキソルビシン、ドキソルビシノールおよび７−デオキシ−ドキソルビシノロンの定量が、０．２ｎｇ／ｍｌのＬＬＱで可能だった。
【０１５１】
患者由来のＡＬＬ異種移植片
インビボで使用するために、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６モデルを選択した。インビボで継代された腫瘍のフラグメントを０日目に、３２匹の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｙヌル（ＮＳＧ）マウスの皮下に移植した。ランダム化の後、Ｄ，Ｌ−メタドンによる経口処置（胃管栄養法によって）を、１日後に開始し、実験の終了まで用量を増加させながら毎日行った：第１週目２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、第２週目３０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、第３週目４０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、第４週目６０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、第５〜第１０週目２×６０ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊ．。Ｄ，Ｌ−メタドンの過量投与による中毒死を回避するために、用量の適合が必要だった。使用したマウスの系統におけるＤ，Ｌ−メタドンの最大耐用量は、２×６０ｍｇ／ｋｇ／ｉｎｊ．だった。４６、５３、６０および７６日目に、ドキソルビシン３ｍｇ／ｋｇをｉ．ｖ．投与した。腫瘍サイズを、１週間に２回、二次元で測定し、腫瘍体積を式（長さ×幅２）／２に従って計算した。平均腫瘍体積および標準偏差を１群ごとに計算した。パーセントを単位とする、コントロールに対して処理された値（Ｔｒｅａｔｅｄ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｖａｌｕｅｓ）（Ｔ／Ｃ）を、各測定日における各群の平均腫瘍体積をコントロールと関連付けることによって、計算した。個体の体重を、耐容性に対するパラメータとして１週間に２回計測し、パーセントを単位とする体重変化を、各群の平均値を最初の測定日と関連づけることによって、計算した。
【０１５２】
Ｄ，Ｌ−メタドンで処置されたマウス由来の血清を、７６日目における最後のＤ，Ｌ−メタドン処置の０．５、１、４および２４時間後にそれぞれ採取し、メタドンの濃度を計測するまで−２０℃で保存した。倫理的な理由のために７７日目にマウスを屠殺した。
【０１５３】
インビトロでの調査のために、Ｔ細胞（ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ３）、Ｂ細胞（ＡＬＬ−ＳＣＩＤ７）およびＢ細胞前駆体（ＢＣＰ、プレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤ）急性白血病を有する患者由来のヒト異種移植片に由来するＡＬＬ細胞の細胞懸濁液を得て、インビトロで培養し、記載されているように（Ｂｏｒｇｍａｎｎら、２０００）表現型および遺伝子型の特徴付けを行った。すべての動物実験が、現地の監督当局（ＬａＧｅＳｏ  Ｂｅｒｌｉｎ）によって承認されたものであり、腫瘍学的実験における動物福祉に対するガイドライン（Ｗｏｒｋｍａｎら、２０００）に従って行われた。
【０１５４】
細胞表面のオピオイドレセプターを計測するためのフローサイトメトリーアッセイ
細胞を、１％ＦＣＳが補充されたＰＢＳ中で洗浄し、遠心し、ナロキソン−フルオレセイン（０．０５ｍＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｈｅｄｉｎら、１９９７）を含むＰＢＳ／１％ＦＣＳに再懸濁した。ＲＴでの３０分間のインキュベーションの後、それらの細胞を、ＰＢＳ／１％ＦＣＳで２回洗浄し、遠心し、氷冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳに再懸濁した。フローサイトメトリー解析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。
【０１５５】
アポトーシスの誘導
ＡＬＬ細胞を、１７５ｃｍ２フラスコまたは９６ウェルプレートにおいて、Ｄ，Ｌ−メタドン（≦３μｇ／ｍＬの治療的血漿濃度）で、単独でまたはドキソルビシンに加えて処置した。６０μｇ／ｍＬのナロキソン、２００μＭ  ＩＢＭＸまたは２００ｎｇ／ｍＬのＰＴＸを加えた後、さらなる実験を同時に行った。種々の時点の後、フローサイトメトリーによってアポトーシス率を測定した（Ｃａｒｂｏｎａｒｉら、１９９４；Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９１）。アポトーシスを判定するために、Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉが記載しているように（Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉら、１９９１）、クエン酸ナトリウム（０．１％）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１％）およびヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ）を含むＮｉｃｏｌｅｔｔｉ緩衝液で細胞を溶解した。低二倍体ＤＮＡ（ｓｕｂＧ１）または前方散乱／側方散乱解析（Ｃａｒｂｏｎａｒｉら、１９９４）によって、アポトーシス細胞を判定した。特定のアポトーシスのパーセンテージを、以下のとおり計算した：１００×［実験で死んだ細胞（％）−培地中の自発的に死んだ細胞（％）］／［１００％−培地中の自発的に死んだ細胞（％）］。自発的に死んだ細胞は、細胞株を使用したとき、５〜１０％の範囲（ｒａｇｅ）内だった。未処置の患者細胞（自発的に死んだ細胞）の生存率は、２４時間後および４８時間後において３５％未満だった。
【０１５６】
ｚＶＡＤ．ｆｍｋによる一般的なカスパーゼ阻害
アポトーシスを阻害するために、記載されているように（Ｆｒｉｅｓｅｎら、２００７）、白血病細胞をカスパーゼの汎カスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋ（ベンゾイルカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−フルオロメチルケトン；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｄｕｂｌｉ，ＵＳＡ）で処置した。その細胞に５０μＭ  ｚＶＡＤ．ｆｍｋを１時間加えた後、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンで刺激した。種々の時点の後、アポトーシス細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを介するＦＳＣ／ＳＳＣ解析（Ｃａｒｂｏｎａｒｉら、１９９４）によって計測した。
【０１５７】
ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析を、記載されているように（Ｃｌａｓｓｅｎら、２００３；Ｆｒｉｅｓｅｎら、２００４）行った。全細胞溶解産物を、ＰＡＲＰ、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、カスパーゼ−２、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−ｘＬおよびβ−アクチンについて、ウサギ抗ＰＡＲＰポリクローナル抗体（１：５０００，Ｒｏｃｈｅ）、マウス抗カスパーゼ−２モノクローナル抗体（１：１０００，ＢＤ−Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、抗ＸＩＡＰモノクローナル抗体（１：１０００，ＢＤ−Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウス抗カスパーゼ−３モノクローナル抗体（１：１０００，Ｃｅｌｌ−Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ／ＵＳＡ）、ウサギ抗カスパーゼ−９ポリクローナル抗体（１：１０００，Ｃｅｌｌ−Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギ抗Ｂｃｌ−ｘＬポリクローナル抗体（１：１０００，Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびマウス抗−β−アクチンモノクローナル抗体（１：５０００，Ｓｉｇｍａ）を使用して、免疫検出した。二次抗体として、ペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧまたはペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５０００，Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ）を、高感度化学発光システム（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に対して使用した。等しいタンパク質充填の正確さを、β−アクチン検出によって確認した。
【０１５８】
ドキソルビシンの取り込みおよび流出の解析
ドキソルビシンの取り込みを解析するために、ＢＣＰ−白血病細胞株Ｔａｎｏｕｅを、１７５ｃｍ２フラスコに１００，０００細胞／ｍＬの密度で播種し、３７℃／５％ＣＯ２で、未処置のまま放置するか、または０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシンもしくは０．３μｇ／ｍＬのドキソルビシンと３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせとともにインキュベートした。２４時間後、細胞を氷冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳで２回洗浄した。細胞における相対的なドキソルビシンの取り込みを、フローサイトメトリーを用いて解析した。
【０１５９】
ドキソルビシンの流出を解析するために、２４時間にわたるインキュベーションの後、細胞を洗浄して、培地からドキソルビシンを除去した。次に、細胞を、ドキソルビシンを含まない新鮮培地またはドキソルビシンを含まず３μｇ／ｍＬのＤ，Ｌ−メタドンを含む新鮮培地とともに３７℃／５％ＣＯ２においてインキュベートして、ドキソルビシンの流出を測定した。種々の時点の後、細胞を回収し、洗浄し、白血病細胞における相対的なドキソルビシン含有量を、フローサイトメトリーを使用して解析した。
【実施例】
【０１６０】
ＩＩ．実施例
実施例１：Ｄ，Ｌ−メタドンは、オピオイドレセプターの発現に応じて異種移植片由来ＡＬＬ細胞において細胞死を誘導する
白血病の処置におけるＤ，Ｌ−メタドンの臨床的関連および細胞死誘導におけるオピオイドレセプターの引き金作用の役割を示すために、Ｄ，Ｌ−メタドンの抗がん効果を、種々の異種移植片由来ＡＬＬ細胞において解析した。それらの異種移植片は、そもそも、Ｔ細胞（ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ３）、Ｂ細胞（ＡＬＬ−ＳＣＩＤ７）（Ｂｏｒｇｍａｎｎら、２０００）およびＢ細胞前駆体（ＢＣＰ、プレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤ）急性白血病を有する患者から確立された。まず、異種移植片由来ＡＬＬ細胞上のオピオイドレセプターの発現を測定した。ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ３およびＡＬＬ−ＳＣＩＤ７白血病細胞は、オピオイドレセプターを大量に示したのに対し（図１Ａ）、プレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤは、中程度レベルのオピオイドレセプターしか発現しなかった（図１Ａ）ことが観察された。
【０１６１】
Ｄ，Ｌ−メタドンを用いた細胞死の誘導が、オピオイドレセプターの発現レベルに依存するかを解析するために、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ３、ＡＬＬ−ＳＣＩＤ７およびプレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤを、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンで処置した（図１Ｂ）。
【０１６２】
リンパ組織および骨髄におけるＤ，Ｌ−メタドンのレベルは、より高い可能性があるが、測定されたことがないので（Ｓｉｎｇｈら、２０１１）、治療的血漿濃度のＤ，Ｌ−メタドン（≦３μｇ／ｍＬ）を使用するだけでなく、１０μｇ／ｍＬというより高い濃度のＤ，Ｌ−メタドンも使用した。治療的血漿濃度のＤ，Ｌ−メタドン（≦３μｇ／ｍＬ）は、細胞表面上に大量のオピオイドレセプターを発現している異種移植片由来ＡＬＬ細胞において強い細胞死を誘導したことが見出された（図１Ａ，Ｂ）。これらの観察結果と比較して、中程度のオピオイドレセプターレベルを有するプレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤ（図１Ａ）は、治療濃度のＤ，Ｌ−メタドンではわずかにしか殺滅されることができなかった（図１Ｂ）。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンによるアポトーシスの誘導が、オピオイドレセプターの発現レベルに依存することをはっきりと明らかにしている。
【０１６３】
実施例２：Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの併用処置は、中程度のオピオイドレセプター発現を有するＡＬＬ細胞を殺滅し、その細胞においてカスパーゼを活性化する
類似の研究において、細胞表面上に中程度のレベルでオピオイドレセプターを発現しているＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株（Ｔａｎｏｕｅ、Ｒｅｈ、Ｎａｌｍ６）に対するＤ，Ｌ−メタドンの細胞傷害性の潜在能力（図２Ａ）を試験した。
【０１６４】
これらのＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株は、プレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤに対して観察されたように（図１Ｂ）、Ｄ，Ｌ−メタドンによってわずかにしか殺滅されることができなかった（図２ｂ）。異なる物質が相乗的に作用するかを示すために、細胞株Ｔａｎｏｕｅ、Ｒｅｈ、Ｎａｌｍ６およびプレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤを、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンの単独で、または互いと組み合わせて、処置した（図２Ｂ、２Ｃ）。その併用処置は、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株、ならびに異種移植片由来ＢＣＰ−ＡＬＬ患者細胞（プレ−Ｂ−ＡＬＬ−ＳＣＩＤ）において細胞殺滅を強く誘導することが観察された（図２Ｂ，Ｃ）。
【０１６５】
細胞殺滅の分子経路をより詳細に解析するため、およびＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの併用処置が、どのようにしてアポトーシスを誘導したかを解明するために、まず、アポトーシスシグナル伝達のどのエフェクター分子が、Ｄ，Ｌ−メタドンまたはドキソルビシン単独で処置された細胞と比べて、この併用処置のＢＣＰ−ＡＬＬ細胞において活性化されているかを解析した。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、ドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドンで処置した１２０時間後に、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞におけるカスパーゼカスケードの活性化を観察した。この解析から、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−２の強い活性化、ならびにカスパーゼ−３の原型基質であるポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断が明らかになった（図３Ａ）。
【０１６６】
アポトーシス誘導におけるカスパーゼカスケードの役割をさらに、カスパーゼの広域性阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋを用いて調査した。ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞を、５０μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋありまたはなしでプレインキュベートし、ドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドンで処置した。ｚＶＡＤ．ｆｍｋは、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞において、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置後の細胞死を大きく減少させた（図３Ｂ）ことから、カスパーゼ活性化への依存が明白になった。
【０１６７】
アポトーシスの機構は、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのような抗アポトーシス因子によって厳重に制御されており（Ｆｕｌｄａ，２００９ａ；Ｆｕｌｄａ，２００９ｂ）、本発明者らは、これが、ドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドンで処置されたＢＣＰ−ＡＬＬ細胞において強くダウンレギュレートされることを見出した（図３Ｃ）。これらの結果から、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの組み合わせが、カスパーゼの活性化ならびにＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーションを介したアポトーシスに対してＢＣＰ−ＡＬＬ細胞を高感度化することが示唆される。
【０１６８】
実施例３：ドキソルビシンは、白血病細胞においてオピオイドレセプターの発現を強く誘導する
白血病細胞をＤ，Ｌ−メタドンで処置した後の細胞死誘導の効率およびアポトーシス経路内のエフェクター分子の活性化は、細胞表面上に示されるオピオイドレセプターの量に依存するとみられる。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、中程度のオピオイドレセプター発現を有する白血病細胞を大いに殺滅するが、これは、Ｄ，Ｌ−メタドンまたはドキソルビシン単独では、わずかにしか殺滅されることができなかった。化学療法薬は、白血病細胞においてＣＤ９５のようなレセプターの発現を増強する（Ｐｏｓｏｖｓｚｋｙら、１９９９）。ドキソルビシンが、オピオイドレセプターの発現に影響し得るかを解析するために、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、ドキソルビシンで９６時間処置した。その後、未処置細胞と比べたオピオイドレセプターの相対量を、フローサイトメトリーによって測定した。ドキソルビシンは、オピオイドレセプターの発現を大きく増加させたことが見出されたことから（図４Ａ）、Ｄ，Ｌ−メタドンが、ドキソルビシンで同時に処置された細胞に大量に結合し得ることが示唆された。この効果は、おそらく、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置のより高い細胞傷害性の潜在能力をもたらし得る。
【０１６９】
実施例４：Ｄ，Ｌ−メタドンのようなオピオイド類は、ドキソルビシンの取り込みを増強し、その流出を阻害する
オピオイド類は、多剤抵抗性に関わる流出ポンプＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の基質である。Ｄ，Ｌ−メタドンが、白血病細胞におけるドキソルビシンの取り込みおよび／または流出に影響し得るかを解析するために、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、ドキソルビシン単独またはドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせとともに、異なる間隔にわたってインキュベートした。２４時間後（０時間）、ドキソルビシンおよびＤ，Ｌ−メタドンとともに同時にインキュベートされた細胞においてドキソルビシン濃度の上昇（図４Ｂ）が、観察された。上清からドキソルビシンを除去した後、新鮮培地をドキソルビシンなしで加え、Ｄ，Ｌ−メタドンを適用した。８時間後および２４時間後、Ｄ，Ｌ−メタドンは、ドキソルビシンの流出を大きく減少させたことから（図４Ｂ）、Ｄ，Ｌ−メタドンが、ドキソルビシンの取り込みを増加させ、白血病細胞からのドキソルビシンの流出を阻害することが示唆される。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンならびにドキソルビシンが、どのようにしてそれらの細胞傷害性の潜在能力を相互に増加させるかを説明するものである。
【０１７０】
実施例５：Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンによるアポトーシス誘導は、オピオイドレセプターの活性化およびｃＡＭＰの濃度に決定的に依存する
アポトーシス誘導、およびその結果としてのアポトーシス経路の活性化におけるオピオイドレセプターの引き金作用の役割をさらに解析するために、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、Ｄ，Ｌ−メタドン、ドキソルビシンもしくはオピオイドレセプターアンタゴニストであるナロキソンの単独または互いとの種々の組み合わせで処置した（図５Ａ，Ｂ）。
【０１７１】
９６時間後、ナロキソンによるオピオイドレセプターの阻止が、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置のアポトーシス率を大きく低下させたことが見出された（図５Ａ）。さらに、ナロキソンによるオピオイドレセプターの阻止は、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞をドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドンで処置した後、カスパーゼ−９、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−３の活性化ならびにＰＡＲＰの切断を大幅に減少させた（図５Ｂ）。これは、オピオイドレセプターの引き金作用が、アポトーシスの誘導およびカスパーゼの活性化に決定的に関わっていることを示唆する（図７）。
【０１７２】
オピオイドレセプターの刺激は、阻害性Ｇｉタンパク質を活性化し、そしてそれは、アデニリルシクラーゼ活性を阻止して、ｃＡＭＰを減少させる（図７）。ｃＡＭＰは、白血病細胞においてＤＮＡ傷害ならびにドキソルビシンによって誘導されるアポトーシスの阻害剤である（Ｎａｄｅｒｉら、２００９；Ｓａｆａら、２０１０ａ）。百日咳毒素（ＰＴＸ）は、Ｇｉタンパク質を不活性化し、ｃＡＭＰのダウンレギュレーションを阻止する（Ｌａｗら、１９８５）（図７）。しかしながら、ＩＢＭＸは、ホスホジエステラーゼ阻害の結果として、ｃＡＭＰレベルを上昇させる（図７）。オピオイドレセプターの活性化によって誘導されるアポトーシスにおけるｃＡＭＰの重要な役割を解析するために、ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株Ｔａｎｏｕｅを、Ｄ，Ｌ−メタドン、ドキソルビシンおよびＩＢＭＸまたはＰＴＸで、単独または互いとの種々の組み合わせで、処置した（図５Ｃ、Ｄ）。９６時間後、ＩＢＭＸによるｃＡＭＰのアップレギュレーション（図５Ｃ）およびＰＴＸによるｃＡＭＰのダウンレギュレーションの阻止（図５Ｄ）は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置のアポトーシス率を大きく低下させたことが見出された。さらに、ＩＢＭＸによるｃＡＭＰのアップレギュレーションは、ドキソルビシンによって誘導されるアポトーシスも減少させた（図５Ｃ）。これらの結果から、オピオイドレセプター共役Ｇｉタンパク質の活性化が、細胞内のｃＡＭＰレベルを介して制御され得るアポトーシスの誘導にとって不可欠であることが示唆される。
【０１７３】
実施例６：Ｄ，Ｌ−メタドンは、単独でまたはドキソルビシンに加えて、ＡＬＬ異種移植モデルのインビボにおいて腫瘍の成長を阻害する
インビトロの結果は、Ｄ，Ｌ−メタドンが、いくつかの白血病細胞株においてアポトーシスを誘導できることおよびドキソルビシンの細胞傷害性を増加させることを証明した。Ｄ，Ｌ−メタドンの単独でのまたはドキソルビシンと組み合わせたときの抗がんの潜在能力の臨床的関連を確かめるためおよびこれまでに得られた結果を検証するために、ＡＬＬ異種移植研究を行った。
【０１７４】
インビボ研究のために、患者由来のＡＬＬ異種移植モデル（ＡＬＬ−ＳＣＩＤ６）を使用した。元の患者サンプルとそれの表現型および遺伝子型の同一性を立証した（Ｂｏｒｇｍａｎｎら、２０００）。実験は、０日目に、インビボでの継代からのＡＬＬ−ＳＣＩＤ６フラグメントを雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｙヌル（ＮＳＧ）マウスに皮下接種することによって開始した。ランダム化の後、ＡＬＬ接種の後の１日目から開始して用量を増加させながら、Ｄ，Ｌ−メタドンを経口的に投与した。腫瘍が明らかになったら、ドキソルビシン処置を開始した。Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンでの処置によって、腫瘍の成長が同程度で有意に阻害された（図６）。
【０１７５】
Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、７０日目までＤ，Ｌ−メタドンまたはドキソルビシン単独と類似の抗腫瘍有効性を有した。後の時点において、この腫瘍阻害は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとを組み合わせた処置において、より長く継続した。この治療は、耐容性がよく、体重変化は、組み合わせの場合、−１０％であり、Ｄ，Ｌ−メタドン処置またはドキソルビシン処置の場合、それぞれ−８％または−４％だった。マウスにおけるＤ，Ｌ−メタドンの血清濃度を解析するために、最後にＤ，Ｌ−メタドンを適用した０．５、１、４および２４時間後に、血清を採取し、質量分析によってＤ，Ｌ−メタドンを定量した。メタドンの血清濃度は、Ｄ，Ｌ−メタドン適用の０．５〜４時間後までの時間経過において、２８ｎｇ／ｍＬ〜１３８ｎｇ／ｍＬに見られたことから、インビトロ濃度に匹敵するレベルが達成され得ることが示唆される。ドキソルビシンの血清濃度は、１５６ｎｇ／ｍＬ〜１９８ｎｇ／ｍＬに見られた。これらの結果は、Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとを使用した同時処置が、インビボにおいて腫瘍の成長を有意に阻害したことを証明している。
【０１７６】
実施例７：Ｄ，Ｌ−メタドンは、神経膠芽腫細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する
フローサイトメトリーによって示されるように、神経膠芽腫細胞株Ａ１７２およびＵ１１８ＭＧ（図８を参照のこと）ならびに初代神経膠芽腫細胞（図１１Ａを参照のこと）および神経膠芽腫起源幹細胞（図１２Ａを参照のこと）は、オピオイドレセプターを発現している。これらの細胞および細胞株のすべてにおいて、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの併用処置は、アポトーシスを用量依存的に誘導する（図９、１０、１１Ｂおよび１２Ｂを参照のこと）。神経膠芽腫細胞株Ａ１７２に対して例証されたように、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いた神経膠腫細胞の細胞死誘導が、カスパーゼ活性化に依存することを示すことができた（図１３を参照のこと）。さらに、Ｄ，Ｌ−メタドンが、神経膠芽腫起源幹細胞においてドキソルビシンによってアポトーシス経路の不十分な活性化を逆転させることを示すことができた（図１４を参照のこと）。
【０１７７】
実施例８：ドキソルビシンの取り込みおよび流出に対するＤ，Ｌ−メタドンの効果
神経膠芽腫細胞株Ａ１７２を使用したインビトロの結果は、Ｄ，Ｌ−メタドンが、ドキソルビシンの取り込みを増強できること、およびまたドキソルビシンの流出を阻害できることを証明した（図１５を参照のこと）。これは、抗がん薬による処置に対するがん細胞の高感度化を説明するものである。
【０１７８】
実施例９：がん細胞上のオピオイドレセプターの発現に対するドキソルビシンまたはシスプラチンの効果
神経膠芽腫細胞株Ａ１７２に対して示されるように、ドキソルビシンによって、オピオイドレセプターの発現が６倍増加する（図１６を参照のこと）。前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ６０では、シスプラチン処置によって、オピオイドレセプターの発現が２．１倍増加するので、この機序は、他のがんタイプおよび抗がん薬に対しても当てはまることを示すことができた（図１９を参照のこと）。
【０１７９】
実施例１０：種々の抗がん因子による処置に対する白血病、膵がんおよび卵巣がん細胞の高感度化。さらなるインビトロ解析において、Ｄ，Ｌ−メタドンが、白血病がん細胞（Ｎａｌｍ−６）、膵がん細胞（Ｎａｌｍ６）および卵巣がん細胞（Ａ２７８０）をエトポシドまたはシスプラチン処置に対して高感度化することを証明することができた（図１７を参照のこと）。さらに、慢性リンパ性白血病細胞（ＣＬＬ）もまた、Ｄ，Ｌ−メタドンによって、フルダラビンを使用したアポトーシス処置に対して高感度化されることができた（図１８を参照のこと）。
【０１８０】
実施例１１：種々の抗がん因子による処置に対する乳癌腫細胞の高感度化。フローサイトメトリーによって示されるように、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ抵抗性乳癌腫細胞株ＪＩＭＴ−１は、μ−オピオイドレセプターを発現している（図２０を参照のこと）。ＦＡＣＳ解析によって示されるように、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの併用処置は、ＪＩＭＴ−１細胞においてアポトーシスを用量依存的に誘導する（図２１を参照のこと）。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置を用いたＪＩＭＴ−１細胞の細胞死誘導が、カスパーゼ活性化に依存することを示すことができた（図２２および２３を参照のこと）。
【０１８１】
実施例１２：オピオイドであるフェンタニルによるドキソルビシン処置に対するがん細胞の高感度化。Ｔ細胞由来白血病細胞株ＣＥＭに対して例証されるように、オピオイドであるフェンタニルもまた、ドキソルビシンを使用する処置に対してＣＥＭ細胞を高感度化できることを示すことができた（図２４を参照のこと）。さらなるインビトロ実験において、オピオイドであるブプレノルフィンは、ドキソルビシンのおかげで、白血病細胞（ＨＬ−６０）をアポトーシスに対して高感度化した（図２５を参照のこと）。
【０１８２】
実施例１３：Ｄ，Ｌ−メタドンおよびシスプラチン（ＣＤＤＰ）による併用処置は、種々の白血病細胞を殺滅し、それらの細胞においてカスパーゼを活性化する。種々の白血病細胞株に対するＤ，Ｌ−メタドンの細胞死の潜在能力が、ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病、ヒトＢ細胞白血病において示された。試験されたすべての細胞株が、中程度のレベルで細胞表面上にオピオイドレセプターを発現している（図２７）。
【０１８３】
これらの白血病細胞は、Ｄ，Ｌ−メタドンによってわずかにしか殺滅されることができなかった（図２８，白色バー）。種々の抗がん因子（物質）が相乗的に作用することを示すために、ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病およびヒトＢ細胞白血病を、種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドン（−ＣＤＤＰ）もしくはシスプラチンの単独またはシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（＋ＣＤＤＰ）で処置した（図２８）。その併用処置は、種々の濃度のシスプラチンまたは／およびＤ，Ｌ−メタドンに応じて種々の白血病において細胞死を強く誘導した。
【０１８４】
細胞殺滅の分子経路を、詳細に示し、オピオイドレセプターアゴニスト、すなわちＤ，Ｌ−メタドンと抗がん因子、すなわちシスプラチンとによる併用処置が、どのようにしてアポトーシスを誘導するかを示した。まず、種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病）において活性化される、アポトーシスシグナル伝達のエフェクター分子を示した。シスプラチンと組み合わせたＤ，Ｌメタドン（＋ＣＤＤＰ）の併用処置を、Ｄ，Ｌ−メタドン単独（−ＣＤＤＰ）またはシスプラチン単独で処置された細胞と比較した。種々の白血病細胞をシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（＋ＣＤＤＰ）で処置したとき、白血病細胞におけるカスパーゼカスケードの活性化が誘導されたことが示された。カスパーゼ−３（活性型カスパーゼ−３  ｐ１９、ｐ１７）、カスパーゼ−９（活性型カスパーゼ−９  ｐ３７）およびカスパーゼ−２の強い活性化、ならびにカスパーゼ−３の原型基質であるポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断（ｐ８５の切断およびまたはＰＡＲＰ  ｐ１１６のダウンレギュレーション）が、併用処置に応じて誘導された（図２９）。
【０１８５】
アポトーシス誘導におけるカスパーゼカスケードの役割をさらに、カスパーゼの広域性阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋを用いて調査した。種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病）を、５０μＭのｚＶＡＤ．ｆｍｋあり（＋ｚＶＡＤ．ｆｍｋ，白色バー）またはｚＶＡＤ．ｆｍｋなし（−ｚＶＡＤ．ｆｍｋ，黒色バー）でプレインキュベートし、シスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドンで処置した。ｚＶＡＤ．ｆｍｋは、Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとによる併用処置後に細胞死を大きく減少させたことから（図３０）、カスパーゼ活性化への依存性が明白になった。
【０１８６】
アポトーシスの機構は、ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのような抗アポトーシス因子ならびにＢａｘのようなアポトーシス促進因子によって厳重に制御されている（Ｆｕｌｄａ，２００９ａ；Ｆｕｌｄａ，２００９ｂ）。ＸＩＡＰは、種々の濃度のシスプラチンまたは／および種々の濃度のＤ，Ｌ−メタドンに応じて、シスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（＋ＣＤＤＰ）で処置された種々の白血病細胞において強くダウンレギュレートされ（ｐ５７）、かつまたは切断された（ｐ３０）（図２９）。Ｂａｘ（ｐ２１）の強いアップレギュレーションは、シスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（＋ＣＤＤＰ）による処置後に誘導されたヒトＴ細胞白血病において誘導される。Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの組み合わせは、カスパーゼの活性化を介する、ならびにＸＩＡＰなどの抗アポトーシス因子のダウンレギュレーションおよび阻害、ならびにＢａｘなどのアポトーシス促進因子のアップレギュレーションによるアポトーシスに対して種々の白血病細胞を高感度化する。ゆえに、オピオイドレセプターは、細胞死を誘導し、かつカスパーゼの活性化、ＰＡＲＰのダウンレギュレーションおよびもしくは切断ならびにまたは抗アポトーシス因子のダウンレギュレーションならびにまたはアポトーシス促進因子のアップレギュレーションならびにまたは阻害性アポトーシスタンパク質（ＩＡＰ）のダウンレギュレーションおよび阻害に関わるアポトーシス経路を活性化するレセプターであることが示される。ゆえに、オピオイドレセプターは、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌの系のような通常の公知の細胞死レセプター／死誘導リガンドの系および機序以外の、細胞死を誘導する新しい機序を有する新しいまだ知られていない経路である。
【０１８７】
実施例１４：シスプラチンは、白血病細胞においてオピオイドレセプターの発現を強く誘導する
オピオイドレセプターアゴニスト、すなわち、Ｄ，Ｌ−メタドンで白血病細胞を処置した後のアポトーシス経路における細胞死誘導の効率およびエフェクター分子の活性化は、細胞表面上に示されるオピオイドレセプターの量に依存する。Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとによる併用処置は、中程度のオピオイドレセプター発現を有する白血病細胞を大いに殺滅するが、これは、Ｄ，Ｌ−メタドンまたはシスプラチン単独では、わずかにしか殺滅されることができなかった。化学療法薬は、白血病細胞において、特別な公知のデスレセプターであるレセプターＣＤ９５（ＦＡＳ、ＡＰＯ−１）の発現を増強する（Ｐｏｓｏｖｓｚｋｙら、１９９９）。シスプラチンが、オピオイドレセプターの発現に影響することを示すために、種々の白血病細胞（ヒトＴ細胞白血病、ヒト急性骨髄性白血病、ヒトＢ細胞前駆体白血病）をシスプラチンで処置した。その後、未処置細胞と比べたオピオイドレセプターの相対量を、フローサイトメトリーによって測定した。シスプラチンは、オピオイドレセプターの発現を大きく増加させることが示された（図３１）。ゆえに、Ｄ，Ｌ−メタドンのようなオピオイドレセプターアゴニストは、シスプラチン、またはより高いレベルのオピオイドレセプターの発現を誘導することができる他の抗がん因子で同時に処置された細胞に大量に結合し得る。この効果は、オピオイドレセプターアゴニスト、すなわちＤ，Ｌ−メタドンと、抗がん因子、すなわちシスプラチンとの併用処置のより高い細胞死の潜在能力をもたらす。
【０１８８】
本発明では、Ｄ，Ｌメタドンのような、最小効果持続時間がより長いオピオイドレセプターアゴニストは、モルヒネのような、Ｄ，Ｌメタドンと比べて最小効果持続時間がより短いものよりも良い結果を有することが示される（図３３および図３４）。
【０１８９】
実施例１５：Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンによるアポトーシスの誘導は、神経膠芽腫においてオピオイドレセプターの活性化に決定的に依存する
固体腫瘍である神経膠芽腫のアポトーシス誘導におけるオピオイドレセプターの引き金作用の役割を示すために、神経膠芽腫細胞を、Ｄ，Ｌ−メタドン、ドキソルビシンまたはオピオイドレセプターアンタゴニストであるナロキソンの単独または互いとの種々の組み合わせで処置した（図３２）。
【０１９０】
１２０時間後および１４４時間後に、ナロキソンによるオピオイドレセプターの阻止が、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置のアポトーシス率を大きく減少させることが示された（図３２）。
【０１９１】
実施例１６：異なるオピオイドの異なる効果持続時間は、神経膠芽腫または白血病においてＤ，Ｌ−メタドンまたはモルヒネをドキソルビシンなどの抗がん薬と組み合わせて使用するとき、種々のアポトーシス率を誘導する
神経膠芽腫細胞または白血病細胞をオピオイド類で処置した後の細胞死誘導の効率は、そのオピオイド類の効果持続時間に依存する。メタドンの最小効果持続時間は、５〜７時間であり、モルヒネの最小効果持続時間は、２〜４時間である。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、神経膠芽腫細胞（図３３Ａ）および白血病細胞（図３４Ａ）において高い細胞死率を強く誘導した。対照的に、モルヒネとドキソルビシンとの併用処置は、神経膠芽腫細胞（図３３Ｂ）および白血病細胞（図３４Ｂ）においてより低い細胞死率を誘導した。これは、オピオイド類と抗がん薬との併用処置後の細胞死誘導の割合が、オピオイド類の効果持続時間にも依存することを示唆する。その効果は、他の抗がん因子においても見られる。
【０１９２】
実施例１７：ドキソルビシンに加えてＤ，Ｌ−メタドンを使用する併用処置は、神経膠芽腫細胞において細胞増殖の阻害およびＧ２／Ｍ細胞周期の静止を媒介した
細胞増殖は、成長因子だけではなく細胞周期の進行を阻害するように作用する様々なシグナルによっても制御される、真核細胞サイクルによって支配されている（Ｓｈｅｒｒ  ＣＪ．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６；２７４：１６７２−７）。がん細胞のほとんどが、４つの細胞分裂周期の段階：ギャップ１（Ｇ１）、合成（Ｓ）、Ｇ２および有糸分裂（Ｍ）を有する。染色体ＤＮＡは、Ｓ期の間に複製する。神経膠芽腫細胞が分裂するとき、細胞周期は、Ｓ期からＧ２／Ｍ期に移っているはずである。この厳重に制御された時間的順序は、様々なサイクリンとの複合体の形成による、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）として公知であるいくつかのタンパク質キナーゼの連続的な活性化によって、与えられるものである。オピオイドレセプターアゴニスト、例えば、メタドンは、ドキソルビシンと組み合わせて、神経膠芽腫細胞などのがん細胞の増殖を阻害し、神経膠芽腫細胞においてＳ／Ｇ２−Ｍ細胞周期の静止を誘導する。
【０１９３】
実施例１８：アポトーシス誘導およびカスパーゼ活性化は、神経膠芽腫においてｃＡＭＰのダウンレギュレーションを誘導するオピオイドレセプターの活性化に依存する
ｃＡＭＰに関連するシグナル伝達は、アポトーシスの誘導および細胞の成長を制御し得る。神経膠芽腫細胞のアポトーシス誘導およびカスパーゼ活性化におけるオピオイドレセプター活性化の役割を解析するために、神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、オピオイドレセプターアゴニストであるＤ，Ｌ−メタドン、抗がん因子であるドキソルビシンまたはオピオイドレセプターアンタゴニストであるナロキソンの単独または種々の組み合わせで処置した（図３６Ａ、３６Ｂおよび３６Ｃ）。ナロキソンによるオピオイドレセプターの阻止は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって誘導される、アポトーシス（図３６Ａおよび３６Ｂ）ならびにカスパーゼ−９、カスパーゼ−３の活性化およびＰＡＲＰの切断（図３６Ｃ）を大きく減少させた。これは、オピオイドレセプターの活性化が、アポトーシス誘導およびカスパーゼ活性化において重要な役割を果たすことを示唆する。オピオイドレセプターの刺激は、阻害性Ｇｉタンパク質を活性化し、それにより、アデニリルシクラーゼ活性が阻止され、ｃＡＭＰが減少する。しかしながら、ＩＢＭＸは、ホスホジエステラーゼ阻害に起因して、ｃＡＭＰレベルを上昇させる。オピオイドレセプターの活性化によって誘導されるアポトーシスにおけるｃＡＭＰの重要な役割を解析するために、Ａ１７２細胞を、Ｄ，Ｌ−メタドン、ドキソルビシンおよびＩＢＭＸの単独または種々の組み合わせで、処置した（図３６Ｄ）。ＩＢＭＸによるｃＡＭＰのアップレギュレーションは、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によるアポトーシス誘導を大きく減少させたことから、ｃＡＭＰダウンレギュレーションを介したオピオイドレセプターの活性化が、ドキソルビシンによって誘導されるアポトーシスおよびカスパーゼ活性化に対して神経膠芽腫細胞を高感度化することが示唆される。
【０１９４】
実施例１９：Ｄ，Ｌ−メタドンを使用したオピオイドレセプターの活性化は、インビボにおいて腫瘍の成長を阻害する
Ｕ８７ＭＧ神経膠芽腫細胞をヌードマウスの皮下に接種した。１６匹のマウスをランダム化した後、Ｄ，Ｌ−メタドンを８匹のマウスに、１日目から開始して実験の終了まで毎日、経口的に投与した。Ｄ，Ｌ−メタドンの投与量を、１日２回の６０から１２０〜２４０ｍｇ／ｋｇ／ｄまで毎週増加させた。３３日目に、Ｄ，Ｌ−メタドンによる最後の処置の２４時間後に、マウスを屠殺した。マウスにおけるＤ，Ｌ−メタドンの血清濃度を解析するために、最後にＤ，Ｌ−メタドンを適用した０．５、１および４時間後に、血清を採取し、質量分析によってＤ，Ｌ−メタドンを定量した。コントロール群のビヒクルで処置されたマウスと比較して、Ｄ，Ｌ−メタドンで処置されたマウスは、１９〜３３日目において、４９％という最適なＴ／Ｃ値で有意に減少した腫瘍サイズを有した（図３７を参照のこと）。Ｄ，Ｌ−メタドン処置は、使用された用量において耐容性がよく、９％というわずかな体重減少しか誘導しなかった。血清濃度は、Ｄ，Ｌ−メタドンを適用した０．５〜４時間後の時間経過において、１３６ｎｇ／ｍｌ〜１６０８ｎｇ／ｍｌのメタドンで見られた。これらの知見から、Ｄ，Ｌ−メタドンを使用したオピオイドレセプターの活性化が、インビボにおいて神経膠芽腫の成長を阻害することが証明される。
【０１９５】
実施例２０：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、短期間の処置後の卵巣がん細胞においてシスプラチンによって誘導される細胞死を増加させる
Ａ２７８０卵巣がん細胞を、シスプラチン（５、３μｇ／ｍＬ）またはＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独または組み合わせで処置した。図３８に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、卵巣がん細胞においてシスプラチンによって誘導されるアポトーシスを強く強化することを示唆する。
【０１９６】
実施例２１：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、長期間の処置後の卵巣がん細胞においてシスプラチンによって誘導される細胞死を増加させる
Ａ２７８０卵巣がん細胞を、シスプラチン（２、１、０．５、０．３μｇ／ｍＬ）またはＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独または組み合わせで処置した。図３９に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、卵巣がん細胞においてシスプラチンによって誘導されるアポトーシスを強く強化することおよび化学療法剤抵抗性を打破することを示唆する。
【０１９７】
実施例２２：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、シスプラチン抵抗性卵巣がん細胞においてシスプラチンによって誘導される細胞死を増加させる
Ａ２７８０ｃｉｓ卵巣がん細胞を、シスプラチン（３、２、１μｇ／ｍＬ）またはＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独または組み合わせで処置した。図４０に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、シスプラチン抵抗性卵巣がん細胞においてシスプラチンによって誘導されるアポトーシスを強く強化することを示唆する。
【０１９８】
実施例２３：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、卵巣がん細胞の処置におけるシスプラチンの有効性を高める
Ａ２７８０卵巣がん細胞をシスプラチン（２μｇ／ｍｌ）単独で処置した。図４１に示されているように、２μｇ／ｍＬの濃度のシスプラチンは、１４４時間後に９０％の細胞死を誘導した。しかしながら、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて０．５μｇ／ｍＬのシスプラチンによる処置は、９５％の細胞死を誘導した。さらに、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて０．２μｇ／ｍＬのシスプラチンによる処置は、Ｄ，Ｌ−メタドンの濃度に応じて７０〜８５％の細胞死を誘導した。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、卵巣がん細胞において、シスプラチンによって誘導されるアポトーシス／細胞死を強く強化することを示唆する。Ｄ，Ｌ−メタドンは、卵巣がんの処置においてシスプラチンの有効性を高めることから、匹敵する細胞死率を得るために、Ｄ，Ｌ−メタドンとの同時処置によって抗がん薬の濃度を大きく減少させることができること、およびゆえに、その抗がん薬のより少ない副作用が観察されることが示唆される。本データに基づくと、この抗がん因子は、それぞれのがんの処置に対する推奨用量の少なくとも２分の１または少なくとも３分の１で、および最少１００分の１の用量で与えることができる。
【０１９９】
実施例２４：オピオイドレセプターの活性化は、卵巣がん細胞における不十分なカスパーゼ活性化をシスプラチンによって逆転させる
不十分なカスパーゼの活性化が、抗がん薬または放射線で処置された化学療法抵抗性および放射線抵抗性の卵巣がん細胞において観察された。卵巣がん細胞におけるＤ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの併用療法によって誘導されるアポトーシスにおけるカスパーゼ活性化の関与を明らかにするために、Ａ２７８０卵巣がん細胞を、Ｄ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）またはシスプラチン（５、３μｇ／ｍＬ）の単独または組み合わせで処置した。図４２に示されているように、シスプラチンおよびＤ，Ｌ−メタドンを使用した併用処置は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９およびカスパーゼ−８の活性化ならびにポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断によって、卵巣がん細胞において強いカスパーゼ活性化をもたらす。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンを使用したオピオイドレセプターの活性化が、卵巣癌腫細胞における不十分なカスパーゼの活性化をシスプラチンによって逆転させることを証明する。
【０２００】
実施例２５：Ｄ，Ｌ−メタドンを使用したオピオイドレセプターの活性化は、乳がん細胞をドキソルビシン処置に対して高感度化する際に重要な役割を果たす
乳がんのアポトーシス誘導におけるオピオイドレセプターの活性化の役割を解析するために、トラスツズマブ抵抗性乳がん細胞ＪＩＭＴ−１を、オピオイドレセプターアゴニストであるＤ，Ｌ−メタドン、ドキソルビシンまたはオピオイドレセプターアンタゴニストであるナロキソンの単独または種々の組み合わせで処置した（図４３）。ナロキソンによるオピオイドレセプターの阻止は、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって誘導されるアポトーシスを大きく減少させた。これは、オピオイドレセプターの活性化が、アポトーシス誘導において重要な役割を果たすことを示唆する。
【０２０１】
実施例２６：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、前立腺がん細胞において、シスプラチンによって誘導される細胞死を増加させる
前立腺がん細胞ＰＣ−３を、シスプラチン（５、３μｇ／ｍＬ）またはＤ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）の単独または種々の組み合わせで処置した。図４４に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、前立腺がん細胞において、シスプラチンによって誘導されるアポトーシスを強く強化することを示唆する。
【０２０２】
実施例２７：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、白血病細胞において異なる抗がん薬クラスの種々の抗がん薬の細胞死誘導を増加させる
白血病細胞Ｎａｌｍ６を、種々の抗がん薬単独で（白色の棒）またはＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせで（黒色の棒）処置した。図４５に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンと抗がん薬との同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された（黒色の棒）。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、白血病細胞において、異なる抗がんクラスの種々の抗がん薬のアポトーシス誘導を強く強化することを示唆する。
【０２０３】
実施例２８：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、神経膠芽腫細胞において、抗がん薬によって誘導される細胞を増加させる
神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、アントラサイクリン類（ドキソルビシン、イダルビシンおよびダウノルビシン）などの同じ抗がん薬クラスの種々の抗がん薬で処置した。神経膠芽腫細胞を、アントラサイクリン類単独で（白色の棒）またはＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせで（黒色の棒）処置した。図４６に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンと種々のアントラサイクリンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、神経膠芽腫細胞において同じクラスの異なる抗がん薬のアポトーシス誘導を強く強化することを示唆する。
【０２０４】
実施例２９：膵がん細胞上でのオピオイドレセプターの発現
膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７をナロキソンフルオレセインで染色して、フローサイトメトリーでオピオイドレセプターの発現を測定した。結果として、膵がんの表面上においてオピオイドレセプターの強い発現が見られた（図４７を参照のこと）。
【０２０５】
実施例３０：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、膵がん細胞において、抗がん薬によって誘導される細胞を増加させる
膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、シスプラチン金属錯体（オキサリプラチン、シスプラチン）などの同じ抗がん薬クラスの種々の抗がん薬で処置した。膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、種々の濃度のシスプラチン金属錯体であるオキサリプラチンもしくはシスプラチンの単独またはＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせで処置した。図４８に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンと白金金属錯体である（Ａ）オキサリプラチンまたは（Ｂ）シスプラチンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、膵がん細胞において同じ抗がん薬クラスの異なる抗がん薬のアポトーシス誘導を強く強化することを示唆する。
【０２０６】
実施例３１：オピオイドレセプターの活性化は、膵がん細胞における不十分なカスパーゼ活性化をシスプラチンおよびオキサリプラチンによって逆転させる
不十分なカスパーゼ活性化が、抗がん薬または放射線で処置された化学療法抵抗性および放射線抵抗性の膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７において観察された。膵がんにおけるＤ，Ｌ−メタドンとシスプラチンとの併用療法によって誘導されるアポトーシスまたはＤ，Ｌ−メタドンとオキサリプラチンとの併用療法によって誘導されるアポトーシスにおけるカスパーゼ活性化の関与を明らかにするために、膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、Ｄ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）またはオキサリプラチン（３、２μｇ／ｍＬ；図４９Ａを参照のこと）またはシスプラチン（０．５、０．７μｇ／ｍＬ；図４９Ｂを参照のこと）の単独、またはメタドンとオキサリプラチン（図４９Ａを参照のこと）またはシスプラチン（図４９Ｂを参照のこと）との組み合わせで処置した。図４９に示されているように、併用処置は、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９の活性化およびポリ−（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断によって、膵がん細胞において強いカスパーゼ活性化をもたらす。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンを使用したオピオイドレセプターの活性化が、膵がん細胞における不十分なカスパーゼの活性化をシスプラチンによって逆転させることを証明する。
【０２０７】
実施例３２：カスパーゼ活性化の阻害は、オキサリプラチンまたはシスプラチンによって誘導されるアポトーシスに対する、オピオイドによる膵がん細胞の高感度化を阻止する
オピオイドレセプターの活性化によって誘導されるアポトーシスにおけるカスパーゼの重要な役割を調査するために、膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、カスパーゼの広域性阻害剤であるｚＶＡＤ．ｆｍｋとともにインキュベートした。ｚＶＡＤ．ｆｍｋとのインキュベーションは、オキサリプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（図５０Ａ，Ｂを参照のこと）またはシスプラチンに加えてＤ，Ｌ−メタドン（図５０Ｃ，Ｄを参照のこと）によって誘導される、膵がん細胞におけるアポトーシスをほぼ完全に阻害したことから、カスパーゼが、オキサリプラチン処置およびシスプラチン処置に対して、オピオイドレセプターの活性化によって媒介される膵がん細胞の高感度化にとって中心的であることが示唆される。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイドレセプターの活性化が、膵がん細胞における不十分なカスパーゼの活性化をオキサリプラチンまたはシスプラチンによって逆転させることを証明する。
【０２０８】
実施例３３：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、神経膠芽腫細胞において、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｌ）によって誘導される細胞死を増加させる
神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、テモゾロミドまたはＤ，Ｌ−メタドン（３、１μｇ／ｍＬ）の単独または組み合わせで処置した。図５１に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとテモゾロミドとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、神経膠芽腫細胞において、テモゾロミドによって誘導されるアポトーシスを強く強化することを示唆する。
【０２０９】
実施例３４：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、膵がん処置において、オキサリプラチンおよびシスプラチンの有効性を高める
膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、種々の濃度のオキサリプラチン（Ａ）もしくはシスプラチン（Ｂ）の単独またはＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせで処置した（斜線の棒、白色の棒）。図５２に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンと種々のシスプラチン金属錯体であるオキサリプラチン（Ａ）またはシスプラチン（Ｂ）との同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。
【０２１０】
膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、（Ａ）オキサリプラチン（１０μｇ／ｍｌ）単独で処置した。１０μｇ／ｍＬのシスプラチンは、１２０時間後に６０％の細胞死を誘導した。しかしながら、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて３μｇ／ｍＬのオキサリプラチンによる処置は、６５％の細胞死を誘導した。さらに、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて  ２μｇ／ｍＬのオキサリプラチンによる処置は、４５％の細胞死を誘導した。
【０２１１】
膵がん細胞Ｃｏｌｏ３５７を、（Ｂ）シスプラチン（１０μｇ／ｍｌ）単独で処置した。１０μｇ／ｍＬのシスプラチンは、１４４時間後に７０％の細胞死を誘導した。しかしながら、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて０．７μｇ／ｍＬのシスプラチンによる処置は、８５％の細胞死を誘導した。さらに、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて０．５μｇ／ｍＬのシスプラチンによる処置は、６０％の細胞死を誘導した。
【０２１２】
これは、Ｄ，Ｌ−メタドンが、膵がんの処置においてシスプラチンまたはオキサリプラチンの有効性を高めることを示唆することから、匹敵する細胞死率を得るために、Ｄ，Ｌ−メタドンとの同時処置によって抗がん薬の濃度を大きく減少させることができること、およびゆえに、その抗がん薬のより少ない副作用が観察されることが示唆される。さらに、抗がん薬を使用した従来の治療は、患者を処置するために使用される抗がん薬濃度の毒性によって限定されるので、これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、化学療法剤抵抗性を打破することを証明する。
【０２１３】
実施例３５：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、白血病処置においてドキソルビシンの有効性を高める
ＢＣＰ−ＡＬＬ細胞株（Ｎａｌｍ６、ＲｅｈおよびＴａｎｏｕｅ）を、ドキソルビシンの単独またはＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの組み合わせ（斜線の棒）で処置した。図５３に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンを使用した同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンが、白血病細胞の処置においてドキソルビシンの有効性を高めることを示唆することから、匹敵する細胞死率を得るために、Ｄ，Ｌ−メタドンとの同時処置によって抗がん薬の濃度を大きく減少させることができること、およびゆえに、その抗がん薬のより少ない副作用が観察されることが示唆される。
【０２１４】
実施例３６：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、乳がん処置においてドキソルビシンの有効性を高める
トラスツズマブ抵抗性乳がん細胞（ＪＩＭＴ−１）を、ドキソルビシンの単独またはＤ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの組み合わせ（斜線の棒）で処置した。図５４に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンは、１２０時間後に７０％の細胞死を誘導した。しかしながら、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１、０．１μｇ／ｍＬ）に加えて０．０１５μｇ／ｍＬのドキソルビシンによる処置は、Ｄ，Ｌ−メタドンの濃度に応じて７０〜５５％の細胞死を誘導した。
【０２１５】
これは、Ｄ，Ｌ−メタドンが、乳がん細胞の処置においてドキソルビシンの有効性を高めることを示唆することから、匹敵する細胞死率を得るために、Ｄ，Ｌ−メタドンとの同時処置によって抗がん薬の濃度を大きく減少させることができること、およびゆえに、その抗がん薬のより少ない副作用が観察されることが示唆される。
【０２１６】
実施例３７：Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類は、神経膠芽腫処置においてドキソルビシンの有効性を高める
神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、種々の濃度のドキソルビシンの単独またはＤ，Ｌ−メタドンとの組み合わせで処置した（斜線の棒、白色の棒）。図５５に示されているように、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの同時処置によって、細胞死の強い誘導が観察された。
【０２１７】
神経膠芽腫細胞Ａ１７２を、ドキソルビシン（１μｇ／ｍｌ）単独で処置した。１μｇ／ｍＬのドキソルビシンは、１４４時間後に８０％の細胞死を誘導した。しかしながら、Ｄ，Ｌ−メタドン（１０、３、１μｇ／ｍＬ）に加えて０．１μｇ／ｍＬのドキソルビシンによる処置は、Ｄ，Ｌ−メタドンの濃度に応じて８５％〜５０％の細胞死を誘導した。
【０２１８】
これは、Ｄ，Ｌ−メタドンが、神経膠芽腫の処置においてドキソルビシンの有効性を高めることを示唆することから、匹敵する細胞死率を得るために、Ｄ，Ｌ−メタドンとの同時処置によって抗がん薬の濃度を大きく減少させることができること、およびゆえに、その抗がん薬のより少ない副作用が観察されることが示唆される。さらに、抗がん薬を使用した従来の治療は、患者を処置するために使用される抗がん薬濃度の毒性によって限定されるので、これは、Ｄ，Ｌ−メタドンなどのオピオイド類が、化学療法剤抵抗性を打破することを証明する。
【０２１９】
実施例３８：異なるオピオイドの併用処置は、白血病細胞における細胞死の誘導について相乗効果を示す
白血病細胞ＨＬ６０を、フェンタニル（３、１μｇ／ｍＬ）の単独（Ａ）またはモルヒネ（３、１μｇ／ｍＬ）の単独（Ａ）または示されるような濃度のフェンタニルとモルヒネとの組み合わせ（Ｂ）で処置した。図５６に示されているように、モルヒネとフェンタニルとの同時処置（Ｂ）によって、相乗的に増加された強い細胞死の誘導が観察された。これは、異なるオピオイドの組み合わせが、アポトーシス促進効果を増強し、さらなる抗がん因子との組み合わせにおいても、オピオイド類を組み合わせて使用することに賛成することを示唆する。
【０２２０】
考察
上記の実施例は、Ｄ，Ｌ−メタドンが、ｃＡＭＰのダウンレギュレーションを誘導するオピオイドレセプターの活性化に応じて、白血病細胞において、アポトーシスを誘導し、カスパーゼを活性化し、ドキソルビシンによって誘導される細胞死を増加させるという証拠を提供する。さらに、Ｄ，Ｌ−メタドンが、異種移植モデルのインビボにおいてＡＬＬの腫瘍成長を大きく減少させることができることを初めて証明することができた。著しいことに、この腫瘍殺滅効果は、Ｄ，Ｌ−メタドンと抗がん薬ドキソルビシンとの組み合わせによって増強することができた。
【０２２１】
メタドンは、μ−オピオイドレセプターが細胞上に提示されている場合、それに結合するμ−オピオイドレセプターアゴニストである。Ｄ，Ｌ−メタドンが、高レベルのオピオイドレセプターを発現している異種移植片由来ＡＬＬ細胞を強く殺滅することが見出された。対照的に、Ｄ，Ｌ−メタドンは、中程度のオピオイドレセプターの量を発現している異種移植片由来ＡＬＬ細胞および細胞株においてはわずかにしか細胞死を誘導しないことから、Ｄ，Ｌ−メタドンによって誘導されるアポトーシスは、白血病細胞において、オピオイドレセプターのクリティカルな発現レベルに依存するとみられることが示唆される。
【０２２２】
種々の治療薬が、互いと相互作用して、より弱いデスシグナルを増幅すると知られているとき、併用処置は、いずれかの処置単独に対してなおも部分的に反応する悪性疾患において有益であることが判明する可能性がある。Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置は、中程度のレベルのオピオイドレセプターを発現しているＢＣＰ−ＡＬＬ細胞において、両方の薬剤の抗腫瘍有効性を相乗的に増強し、感受性および抵抗性のがん細胞におけるアポトーシス誘導において重要な役割を果たすカスパーゼの活性化を大きく増加させる（Ｆｕｌｄａ，２００９ｃ）。さらに、ＡＬＬまたはＮＨＬのような多くの悪性疾患において抵抗性の発生に関与する抗アポトーシスタンパク質ＸＩＡＰおよびＢｃｌ−ｘＬのダウンレギュレーション（Ａｄｄｅｏら、２００５）も、著しく増強される。これは、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとの併用処置が、アポトーシス誘導を大きく増加させ、それらの抗腫瘍有効性を相乗的に改善し得ることを示唆する。
【０２２３】
従来の化学療法薬に対する抵抗性は、治療の有効性における制限因子であり、Ｐ−ｇｐなどの薬物トランスポーターの過剰発現の結果としての多剤耐性もまた、十分特徴付けられている。健常な細胞では、Ｐ−ｇｐの発現は、正常な細胞防御システムに属するが、ヒトがん細胞では、Ｐ−ｇｐの過剰発現は、生存率の低下および不良な結果と相関する（Ｄｉｅｓｔｒａら、２００３）。Ｄ，Ｌ−メタドンは、その作用を阻害するＰ−ｇｐの基質であると示すことができた（Ｃｒｅｔｔｏｌら、２００７）。本明細書とともに示されるように、ドキソルビシンとＤ，Ｌ−メタドンとの同時処置は、ドキソルビシンの細胞取り込みを増強し、さらに、白血病細胞からのドキソルビシンの流出を阻害することから、Ｄ，Ｌ−メタドンが、細胞内のドキソルビシンの濃度を上げることによって、ドキソルビシンによって誘導されるアポトーシスに対して白血病細胞を高感度化することが示唆される。
【０２２４】
Ｄ，Ｌ−メタドンおよびドキソルビシンを使用する併用処置は、中程度の量のオピオイドレセプターを表面上に発現しているＢＣＰ−ＡＬＬ細胞においてアポトーシスおよびカスパーゼ活性化を誘導した。この併用処置の毒性の増強は、ドキソルビシン処置後のオピオイドレセプター発現の増加とさらに関連すると見出された。ゆえに、Ｄ，Ｌ−メタドンは、ドキソルビシンで同時処置された細胞により多くの量で結合し得る。これらの結果から、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置における毒性の増強が、ドキソルビシンによって媒介されるオピオイドレセプター発現のアップレギュレーション、ならびにさらに、Ｄ，Ｌ−メタドンによって媒介されるドキソルビシンの取り込みの増加および流出の減少と関連することが示唆される。ゆえに、両方の薬剤が、それらの細胞傷害性の潜在能力をより高い程度にまで発揮し得る。
【０２２５】
オピオイドレセプターは、Ｇｉ上でのリガンド依存性のヌクレオチド交換を触媒し、それにより、アデニリルシクラーゼを阻害し、Ｎ型カルシウムチャネルならびにＧタンパク質ゲート型（ｇａｔｅｄ）内向き整流性カリウム（ＧＩＲＫ）型カリウムチャネルを調節することによって、シグナル伝達して、細胞シグナル伝達の変化をもたらす（図７）。オピオイドレセプターの引き金作用に対するアポトーシス誘導の依存は、それらの阻害によって強調される。オピオイドレセプターのシグナル伝達をオピオイドレセプターアンタゴニストであるナロキソンで阻止することにより、Ｄ，Ｌ−メタドンとドキソルビシンとによる併用処置によって誘導されるアポトーシスおよびカスパーゼ活性化が、高い割合で阻害されたことから、Ｄ，Ｌ−メタドンによるオピオイドレセプターの引き金作用は、アポトーシスの誘導およびカスパーゼの活性化に関与することが示唆される（図７）。この作用機序に基づくと、すべてのオピオイドレセプターが、Ｇｉ経路を介してアデニリルシクラーゼに連結されるので、個々のオピオイドレセプターと無関係であるすべてのオピオイドレセプターアゴニストが、アポトーシスによって腫瘍細胞を殺滅するはずである。
【０２２６】
さらなる実験により、上に記載された併用療法の一般適用性が判明する：
広範囲のがん。いくつかの多様ながんタイプ（例えば、乳がん、膵がん、前立腺がん、卵巣がん、神経膠芽腫または白血病）が、オピオイドレセプターアゴニストの組み合わせによって処置され得る。
【０２２７】
広範囲のオピオイド類。Ｇｉが関連する作用機序によると、Ｄ，Ｌ−メタドン、ブプレノルフィンおよびフェンタニルのような、いくつかの構造的および薬理学的に異なるオピオイド類が、がん細胞を抗がん薬に対して高感度化し得る。
【０２２８】
広範囲の抗がん薬。いくつかの構造的および薬理学的に異なる抗がん薬について、それらが、オピオイドレセプターの発現を増加させ、同時に適用されるオピオイドアゴニストに起因して流入の増加／流出の減少を示すことが示され得る。
【０２２９】
要旨
オピオイド類と抗がん因子との相互作用が、図２６に図示されるような自己強化フィードバックループであることは、強調されなければならない。このループの第１の経路では、オピオイド類が、抗がん薬の細胞取り込みを増強し、抗がん薬の流出を阻害する。前記ループの第２の経路では、蓄積した抗がん薬が、オピオイドレセプターの発現を高める。ゆえに、両方の薬剤が、それらの細胞傷害性の潜在能力をより高い程度に発揮し得る。
【０２３０】
本実施例は、患者由来のＡＬＬ細胞、患者由来の神経膠芽腫細胞および神経膠芽腫起源幹細胞との臨床的関連をエキソビボにおいて検証することができ、単独療法としてのまたはドキソルビシンとの組み合わせのＤ，Ｌ−メタドンが、患者由来の白血病モデルおよび神経膠芽腫異種移植モデルにおいて、強い腫瘍成長阻害をもたらすことを初めて示すことができた。この抗白血病有効性、神経膠芽腫の腫瘍成長阻害、およびＤ，Ｌ−メタドンの単独またはドキソルビシンとの組み合わせの副作用は、ドキソルビシン単独のそれらと匹敵した。しかしながら、併用処置だけで、より長く続く成長阻害を達成することができた。マウスにおけるメタドンの血清濃度は、インビトロで細胞傷害性を示す濃度と相関した。
【０２３１】
要するに、オピオイド類と抗がん薬との併用療法は、いくつか方法でがん治療を改善し得る：
・オピオイドレセプターのアップレギュレーションに起因して、以前のオピオイド非感受性がんタイプが、オピオイド治療の対象になり得る。
・オピオイドによって誘導される、抗がん薬の細胞内蓄積に起因して、その処置の有効性が増強される。
・Ｂｃｌ−ＸＬなどの抗アポトーシスタンパク質の阻害およびＸＩＡＰなどの阻害性アポトーシスタンパク質の阻害に起因して。
・これにより、処置が困難ながんタイプの治療をもたらすことができた。
・さらに、これにより、抗がん薬の用量を減少させることが可能になり、化学療法の安全性および患者の服薬率が高まるだろう。
・最終的には、抵抗性のがん細胞が、抗がん処置に対して再度高感度化され得る。
・さらに、販売中の数多くのオピオイド類および数多くの抗がん薬が、高められた有効性および／または安全性のおかげで、改善された処置になり得る新しい薬の組み合わせに対して道を開く。
【０２３２】
【表１−１】
0006472750.tif 000003
【０２３３】
【表１−２】
0006472750.tif 000004
【図１】
0006472750.tif 000005
【図２】
0006472750.tif 000006
【図３】
0006472750.tif 000007
【図４】
0006472750.tif 000008
【図５】
0006472750.tif 000009
【図６】
0006472750.tif 000010
【図７】
0006472750.tif 000011
【図８】
0006472750.tif 000012
【図９】
0006472750.tif 000013
【図１０】
0006472750.tif 000014
【図１１】
0006472750.tif 000015
【図１２】
0006472750.tif 000016
【図１３−１】
0006472750.tif 000017
【図１３−２】
0006472750.tif 000018
【図１４】
0006472750.tif 000019
【図１５】
0006472750.tif 000020
【図１６】
0006472750.tif 000021
【図１７】
0006472750.tif 000022
【図１８】
0006472750.tif 000023
【図１９】
0006472750.tif 000024
【図２０】
0006472750.tif 000025
【図２１Ａ】
0006472750.tif 000026
【図２１Ｂ】
0006472750.tif 000027
【図２２Ａ】
0006472750.tif 000028
【図２２Ｂ】
0006472750.tif 000029
【図２３Ａ】
0006472750.tif 000030
【図２３Ｂ】
0006472750.tif 000031
【図２４】
0006472750.tif 000032
【図２５】
0006472750.tif 000033
【図２６】
0006472750.tif 000034
【図２７】
0006472750.tif 000035
【図２８】
0006472750.tif 000036
【図２９】
0006472750.tif 000037
【図３０】
0006472750.tif 000038
【図３１】
0006472750.tif 000039
【図３２】
0006472750.tif 000040
【図３３】
0006472750.tif 000041
【図３４】
0006472750.tif 000042
【図３５】
0006472750.tif 000043
【図３６−１】
0006472750.tif 000044
【図３６−２】
0006472750.tif 000045
【図３７】
0006472750.tif 000046
【図３８】
0006472750.tif 000047
【図３９】
0006472750.tif 000048
【図４０】
0006472750.tif 000049
【図４１】
0006472750.tif 000050
【図４２】
0006472750.tif 000051
【図４３】
0006472750.tif 000052
【図４４】
0006472750.tif 000053
【図４５】
0006472750.tif 000054
【図４６】
0006472750.tif 000055
【図４７】
0006472750.tif 000056
【図４８】
0006472750.tif 000057
【図４９】
0006472750.tif 000058
【図５０】
0006472750.tif 000059
【図５１】
0006472750.tif 000060
【図５２】
0006472750.tif 000061
【図５３】
0006472750.tif 000062
【図５４】
0006472750.tif 000063
【図５５】
0006472750.tif 000064
【図５６】
0006472750.tif 000065