(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）シトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化するステップ；および／または
（２）シトクロムＰ４５０を、該シトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質の共存下でα−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化するステップ
を含む、α−グアイエンから（−）−ロタンドンを製造する方法であって、前記（１）のシトクロムＰ４５０が下記（ａ）〜（ｂ）から選択される少なくとも１種であり、前記（２）のシトクロムＰ４５０が下記（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１種である、上記方法。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（１）のシトクロムＰ４５０が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣＹＰ１５２Ａ１であり、前記（２）のシトクロムＰ４５０が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣＹＰ１５２Ａ１およびＣＹＰ１０７Ｋ１ならびにセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来のＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電子伝達タンパク質がフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼとの組み合わせである、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記電子伝達タンパク質が、下記（Ａ）〜（Ｂ）から選択される少なくとも１種と下記（Ｃ）〜（Ｄ）から選択される少なくとも１種との組み合わせである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（Ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記電子伝達活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記電子伝達活性を有するタンパク質
【請求項５】
前記（１）のシトクロムＰ４５０を下記（ｇ）〜（ｊ）から選択される少なくとも１種のＤＮＡの発現によって生成すること、および／または前記（２）のシトクロムＰ４５０を下記（ｇ）〜（ｎ）から選択される少なくとも１種のＤＮＡの発現によって生成することを更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｈ）配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｉ）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｊ）配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｋ）配列番号６〜８のいずれかに示す塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｌ）配列番号６〜８のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有しＤＮＡ；
（ｍ）配列番号６〜８のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズＤＮＡ；
（ｎ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項６】
前記電子伝達タンパク質を下記（Ｇ）〜（Ｉ）から選択される少なくとも１種のＤＮＡの発現によって生成することを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（Ｇ）配列番号９に示す塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｈ）配列番号９に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｉ）配列番号９に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項７】
α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換する能力を有することが疑われるタンパク質から前記能力を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
前記能力を有することが疑われるタンパク質を、必要により、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの共存下で、α−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化するステップ、
かようなステップにより（−）−ロタンドンが生成したか否かを検出するステップ、および
かようなステップにより（−）−ロタンドンの生成が確認できた前記能力を有することが疑われるタンパク質を目的のタンパク質として選抜するステップ、
を含んでなり、かつ、
前記能力を有することが疑われるタンパク質が、
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＣＹＰ１５２Ａ１、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＣＹＰ１０７Ｋ１、配列番号３に示すアミノ酸配列を有するＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、もしくは配列番号４に示すアミノ酸配列を有するＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）のアミノ酸配列と４０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である、スクリーニング方法。
【請求項８】
α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するシトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有することが疑われるタンパク質から前記電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質のスクリーニング方法であって、
請求項１〜２のいずれか１項に記載される方法においてシトクロムＰ４５０または該シトクロムＰ４５０について定義されるタンパク質の共存下で前記電子伝達活性を有することが疑われるタンパク質をα−グアイエンに作用させるステップ、かようなステップにより（−）−ロタンドンが生成したか否かを検出するステップ、および
かようなステップにより（−）−ロタンドンの生成が確認できた前記能力を有することが疑われるタンパク質を目的のタンパク質として選抜するステップ、
を含んでなり、かつ、
前記能力を有することが疑われるタンパク質が、請求項４に記載の方法において電子伝達タンパク質について定義されるタンパク質のアミノ酸配列と４０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、スクリーニング方法。
【請求項９】
（１）シトクロムＰ４５０およびα−グアイエン；および／または
（２）シトクロムＰ４５０、該シトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質、およびα−グアイエン
を含む、α−グアイエンの（−）−ロタンドンへの変換システムであって、前記（１）のシトクロムＰ４５０が下記（ａ）〜（ｂ）から選択される少なくとも１種であり、前記（２）のシトクロムＰ４５０が下記（ａ）〜（ｄ）から選択される少なくとも１種である、上記方法。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質
【請求項１０】
請求項５に記載のＤＮＡ；または
請求項５に記載のＤＮＡおよび請求項６に記載のＤＮＡ
を含む、α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換するための組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターを担持する、α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換するための形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、香料用途として有用な（−）−ロタンドンの製造方法に関する。更に詳しくは、シトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させ、選択的に（−）−ロタンドンに変換する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然型の（−）−ロタンドン（Ｒｏｔｕｎｄｏｎｅ、（−）−（３Ｓ，５Ｒ，８Ｓ）−３，８−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−（ｐｒｏｐ−１−ｅｎ−２−ｙｌ）−３，４，５，６，７，８−ｈｅｘａｈｙｄｒｏａｚｕｌｅｎ−１（２Ｈ）−ｏｎｅ、以下単に「ロタンドン」とも称する）は生薬として香附子（こうぶし）と呼ばれるカヤツリグサ科のハマスゲの塊茎より単離・構造決定された（非特許文献１）化合物である。中国では漢方薬、日本では香道で用いられる沈香（Ａｇａｒｗｏｏｄ）中の成分としても知られている（非特許文献２）。また、ロタンドンは虫に対して忌避効果を持つことから、害虫防除剤（特許文献１）としての利用も報告されている。近年では、ロタンドンはスパイシー、コショウ様香気が特徴であるシラーズワインおよびそのワイン用のブドウの、スパイシー、コショウ様香気の原因成分であることが報告されている。また、黒コショウや白コショウにはわずかに数ｐｐｍ含有され、それらの重要香気成分であることや、マジョラム、オレガノ、ローズマリー、バジル、タイムなどのスパイス中にも微量含まれていることが報告されている（非特許文献３）。
【０００３】
また、ロタンドンは、後述のロタンドールと組合せてフレーバーやフレグランス用途に、香料として使用できることが開示されている（特許文献２）。
【０００４】
ロタンドンは植物からの抽出により得ることが可能であるが、植物の含有量が限られていることや抽出操作が煩雑なことから、抽出法によりロタンドンの工業生産を達成することは困難である。
【０００５】
前記特許文献２には、酸素源の存在下で、ラッカーゼと、α−グアイエンおよび／またはα−ブルネセンを含む材料とを反応させることにより、ロタンドール（ロタンドンの１位のカルボニル基がアルコールとなった化合物）を製造する方法が開示されており、その際の副生成物としてロタンドンも生成することが記載されている（例３、例４、例５参照）。しかしながら、この方法は本来ロタンドンの製造を目的としたものではなく、加えて様々な副生成物を生じる欠点がある。
【０００６】
また、非特許文献４には、α−グアイエンの空気酸化によってロタンドンが生成することが報告されているが、変換収率は１５％程度であり低く、また、エポキシ化合物やジケトン化合物を多量に副生する欠点がある。
【０００７】
従って、ロタンドンを高効率かつ高純度で製造する方法は、いまだ見出されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平６−１６５１６号公報
【特許文献２】特許第５７５８０００号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９６７年、８巻４７号、ｐ４６６１−４６６７
【非特許文献２】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１年、３０巻１０号、ｐ３３４３−３３４７
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、５６巻１０号、ｐ３７３８−３７４４
【非特許文献４】Ｊ．  Ａｇｒｉｃ.  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ.  ２０１４,  ６２,  ｐ１０８０９−１０８１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、香料化合物としての有用性は知られているが、いまだに効率の良い製造方法が知られていない化合物であるロタンドンを、高効率かつ高純度で製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ロタンドンはα−グアイエンの３位のメチレンが酸化されてカルボニル基となった化合物である。α−グアイエンはハマビシ科の本木であるグアヤックウッドなどの植物に比較的多く含まれており、出発物質として供給可能である。また、市販品として入手することもできる。従って、α−グアイエンの選択的酸化によりロタンドンが製造できれば、効率的な工業生産プロセスを提供できる可能性がある。
【００１２】
そこで、本発明者らはα−グアイエンの選択的酸化を酵素に行わせることを検討し、当該酸化が可能な酵素を鋭意探索したところ、特定のシトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させると、高効率かつ高純度でロタンドンが得られることを見出した。
【００１３】
かくして、本発明は以下のものを提供する。
［１］  （１）シトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化するステップ；および／または
（２）シトクロムＰ４５０を、該シトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質の共存下でα−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化するステップ
を含む、α−グアイエンから（−）−ロタンドンを製造する方法。
［２］  ［１］に記載の方法であって、前記（１）のシトクロムＰ４５０がＣＹＰ１５２に属し、前記（２）のシトクロムＰ４５０がＣＹＰ１５２、ＣＹＰ１０６またはＣＹＰ１０７に属する、方法。
［３］  前記（１）のシトクロムＰ４５０が下記（ａ）〜（ｃ）から選択される少なくとも１種であり、前記（２）のシトクロムＰ４５０が下記（ａ）〜（ｆ）から選択される少なくとも１種である、［１］または［２］に記載の方法。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置換され該アミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（ｅ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置
換され該アミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質
［４］  前記（１）のシトクロムＰ４５０が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣＹＰ１５２Ａ１であり、前記（２）のシトクロムＰ４５０が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣＹＰ１５２Ａ１およびＣＹＰ１０７Ｋ１ならびにセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来のＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  前記電子伝達タンパク質がフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼとの組み合わせである、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  前記電子伝達タンパク質が、下記（Ａ）〜（Ｃ）から選択される少なくとも１種と下記（Ｄ）〜（Ｆ）から選択される少なくとも１種との組み合わせである、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
（Ａ）配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列番号１０に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記電子伝達活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号１０に示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置換され該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記電子伝達活性を有するタンパク質；
（Ｄ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｅ）配列番号１１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記電子伝達活性を有するタンパク質；
（Ｆ）配列番号１１に示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置換され該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ前記電子伝達活性を有するタンパク質
［７］  前記（１）のシトクロムＰ４５０を下記（ｇ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１種のＤＮＡの発現によって生成すること、および／または前記（２）のシトクロムＰ４５０を下記（ｇ）〜（ｐ）から選択される少なくとも１種のＤＮＡの発現によって生成することを更に含む、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
（ｇ）配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｈ）配列番号５に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｉ）配列番号５に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｊ）配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｋ）配列番号１に示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置換され該アミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｌ）配列番号６〜８のいずれかに示す塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｍ）配列番号６〜８のいずれかに示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有しＤＮＡ；
（ｍ）配列番号６〜８のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｏ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつα−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｐ）配列番号２〜４のいずれかに示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置換され該アミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、かつα−
グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
［８］  前記電子伝達タンパク質を下記（Ｇ）〜（Ｉ）から選択される少なくとも１種のＤＮＡの発現によって生成することを更に含む、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
（Ｇ）配列番号９に示す塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｈ）配列番号９に示す塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｉ）配列番号９に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
［９］  α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換する能力を有することが疑われるタンパク質から前記能力を有するタンパク質のスクリーニング方法であって、
前記能力を有することが疑われるタンパク質を、必要により、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの共存下で、α−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化するステップ、
かようなステップにより（−）−ロタンドンが生成したか否かを検出するステップ、および
かようなステップにより（−）−ロタンドンの生成が確認できた前記能力を有することが疑われるタンパク質を目的のタンパク質として選抜するステップ、
を含んでなり、かつ、
前記能力を有することが疑われるタンパク質が、
ＣＹＰ１５２Ａ１の類縁体、もしくはＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）からなる群より選択される少なくとも１種の類縁体であるか、または
ＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、もしくはＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）のアミノ酸配列と４０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、またはシトクロムＰ４５０に属するタンパク質である、スクリーニング方法。
［１０］  α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するシトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有することが疑われるタンパク質から前記電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質のスクリーニング方法であって、
［１］〜［４］のいずれかに記載される方法においてシトクロムＰ４５０または該シトクロムＰ４５０について定義されるタンパク質の共存下で前記電子伝達活性を有することが疑われるタンパク質をα−グアイエンに作用させるステップ、かようなステップにより（−）−ロタンドンが生成したか否かを検出するステップ、および
かようなステップにより（−）−ロタンドンの生成が確認できた前記能力を有することが疑われるタンパク質を目的のタンパク質として選抜するステップ、
を含んでなり、かつ、
前記能力を有することが疑われるタンパク質が、請求項６に記載の方法において電子伝達タンパク質について定義されるタンパク質のアミノ酸配列と４０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、スクリーニング方法。
［１１］  α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換する活性の測定方法であって、
ＣＹＰ１５２Ａ１の類縁体をα−グアイエンに作用させること、または
ＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）から選択される少なくとも１種の類縁体を、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの共存下でα−グアイエンに作用させること
および
（−）−ロタンドンを検出すること
をこの順で含み、
前記類縁体が、ＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）のいずれかのアミノ酸配列と４０％以上
の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、またはシトクロムＰ４５０に属するタンパク質である、
測定方法。
［１２］  （１）シトクロムＰ４５０およびα−グアイエン；および／または
（２）シトクロムＰ４５０、該シトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質、およびα−グアイエン
を含む、α−グアイエンの（−）−ロタンドンへの変換システム。
［１３］  ［７］に記載のＤＮＡ；または
［７］に記載のＤＮＡおよび［８］に記載のＤＮＡ
を含む、α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換するための組換えベクター。
［１４］  ［１３］に記載の組換えベクターを担持する、α−グアイエンを（−）−ロタンドンに変換するための形質転換体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、香料用途として有用な天然型のロタンドン（式Ｉ）を、酵素を用いた選択的酸化によって高効率かつ高純度で製造することができる。酸化に酵素を利用するため、本発明では、副生成物が少なく高い収率または変換率で出発原料α−グアイエンまたはそれを含む混合物からロタンドンを製造することが可能である。また本発明は、生物学的酸化反応であることから金属触媒を使用しないため製造中または製造後に有毒・有害な廃棄物を生じず、高濃度の酸素も使用しないため製造時に安全に各製造ステップまたは操作を実施することが可能である、という利点がある。更にまた、原料として入手しやすいα−グアイエンを出発物質として使用するため、工業生産に向いており経済的にも有利である。加えて、本発明により得られる天然型のロタンドンは、不純物が少ないため香気が良好で、調合香料素材や風味付与剤として有用である。
【００１５】
【化１】
0006522551.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】α−グアイエンとＣＹＰ１５２Ａ１担持大腸菌の菌体の反応液の抽出液のＧＳ−ＭＳ分析の結果を表す。
【図２】α−グアイエンとＣＹＰ１５２Ａ１非担持大腸菌の菌体の反応液の抽出液のＧＳ−ＭＳ分析の結果を表す。
【図３】α−グアイエンの変換産物のＭＳスペクトル測定結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜＜用語の説明＞＞
本発明に関連して、また、本発明に文脈上、使用する技術用語について以下に説明するが、特記しない限り当業者によって理解される通常の意味を持つものと解釈される。このような技術用語を「本発明の」と表現する場合があるが、このような表現は、本発明において、本発明に用いる、などを意味することがある。
【００１８】
＜α−グアイエン＞
α−グアイエン［（−）−（１Ｓ，４Ｓ，７Ｒ）−１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−７−（ｐｒｏｐ−１−ｅｎ−２−ｙｌ）−１，２，３，４，５，６，７，８−ｏｃｔａｈｙｄｒｏａｚｕｌｅｎｅ］（式ＩＩ）は、本発明で出発物質として使用する化合物であり、グアヤックウッドなどの植物から抽出、蒸留などにより得て適宜精製したものを使用しても、市販品として入手したものを使用してもよい。
【００１９】
【化２】
0006522551.tif 000003
【００２０】
＜シトクロムＰ４５０＞
シトクロムＰ４５０とは、モノオキシゲナーゼ活性を有する一群の還元型プロトヘム含有タンパク質であり、このタンパク質に還元状態で一酸化炭素を通気すると吸収スペクトルが変化し４５０ｎｍに極大をもつ差スペクトル（ＣＯ差スペクトル）が現れることを特徴とする。シトクロムＰ４５０の遺伝子は、大腸菌などの一部の細菌を除く大部分の生物に存在することが知られている。シトクロムＰ４５０は水酸化反応、エポキシ化反応、脱メチル化反応など様々な反応に関与することが知られており、生体内での役割も、二次代謝、ステロイドホルモンの生合成、異物代謝、炭化水素の資化など多様である。
【００２１】
各シトクロムＰ４５０は、アミノ酸配列の同一性に基づいて分類される。原則として、アミノ酸配列が４０％以上一致する場合は同一のファミリー、５５％以上一致する場合には同一のサブファミリーに分類され、固有の分類記号が付与される。分類記号は、シトクロムＰ４５０を表すＣＹＰ、ファミリー番号、サブファミリー番号、および遺伝子番号をこの順で含み、遺伝子番号は発見順に付与される。新たに発見されたシトクロムＰ４５０は順次Ｎｅｌｓｏｎ博士のウェブサイトに登録され（ｈｔｔｐ：／／ｄｒｎｅｌｓｏｎ．ｕｔｈｓｃ．ｅｄｕ／ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０．ｈｔｍｌ）、現在２万を優に超える数のシトクロムＰ４５０が知られている。
【００２２】
シトクロムＰ４５０の基質や関与する反応に関するこれまでの研究から、同一サブファミリーに属するシトクロムＰ４５０であっても、関与する反応および基質は多岐に亘ることが知られている。このことは、同一サブファミリーであってもアミノ酸配列同一性が５５％と低いことからも容易に予想される。また、広い基質特異性を示すシトクロムＰ４５０がある一方で、厳格なまたは狭い基質特異性を有するシトクロムＰ４５０も存在する。
【００２３】
シトクロムＰ４５０とはこのように多様性の非常に高いタンパク質群であり、個々のシトクロムＰ４５０の関与する反応、その基質、その変換産物などをアミノ酸配列に基づいた分類から予想することは困難である。
【００２４】
また、シトクロムＰ４５０にはモノオキシゲナーゼ活性発現に際しＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の電子を必要とするものとしないものが知られている。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の電子がなくてもモノオキシゲナーゼ活性を呈するシトクロムＰ４５０の例として、ＣＹＰ７４Ａ（Ｌ
ｉら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０５  （３７），
ｐｐ．１３８８３−１３８８８  （２００８））や、過酸化水素を利用するＣＹＰ１５２Ａ１（Ｍａｔｓｕｎａｇａら，  Ｌｉｐｉｄｓ，  ３４，（８），  ｐｐ．８４１−８４６  （１９９９））、ＣＹＰ１５２Ｂ１（Ｍａｔｓｕｎａｇａら，  Ｌｉｐｉｄｓ．，
３５（４），  ｐｐ．３６５−３７１  （２０００））、ＣＹＰ１５２Ｌ１（Ｂｅｌｃｈｅｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ２８９（１０），  ｐｐ．６５３５−６５５０）などのＣＹＰ１５２ファミリーが挙げられる。
【００２５】
更に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の電子をシトクロムＰ４５０に伝達する電子伝達タンパク質（後述）と融合体を形成しているシトクロムＰ４５０も知られている。そのようなシトクロムＰ４５０の例として、野生型であればＣＹＰ１０２ファミリーに属するシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ１０２Ａ１、ＣＹＰ１０２Ａ２、ＣＹＰ１０２Ａ３、ＣＹＰ１０２Ｄ１など。ＦＭＮおよびＦＡＤの還元性ドメインと融合している。）が挙げられる（このようなシトクロムＰ４５０はｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔシトクロムＰ４５０とも呼ばれる）。また、各種シトクロムＰ４５０と電子伝達タンパク質（既知の電子伝達タンパク質の断片を含む）との人工融合体も多数作製されている（例えば、Ｈｅｌｖｉｇ，  Ｃ．  ａｎｄ  Ｃａｐｄｅｖｉｌａ，  Ｊ．  Ｈ．，  （２０００）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３９，  ５１９６−５２０５；  Ｓｉｂｂｅｓｅｎら、  （１９９６）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  （３７），  ｐｐ．２２４６２−２２４６９；  Ｎｏｄａｔｅら  （２００６）  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７１（４），  ｐｐ．４５５−４６２；  Ｌｉら  （２００７）
Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２９（４３），  ｐｐ．１２９４０−１２９４１などを参照）。
【００２６】
本発明のシトクロムＰ４５０は、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するものであることを特徴とする。以下、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する反応を単に「当該酸化反応」、当該酸化反応の活性を単に「当該酸化活性」とも称する。
【００２７】
当該酸化反応には、１種以上のシトクロムＰ４５０を用いることができる。
【００２８】
本発明のシトクロムＰ４５０は、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する際にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の電子を用いるものでも、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の電子を用いないものでもよい。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ由来の電子を用いるものである場合は、本発明のシトクロムＰ４５０と後述の電子伝達タンパク質とが、それぞれ独立した分子でも、融合体を形成していてもよい。
【００２９】
本発明のシトクロムＰ４５０が属するＣＹＰファミリーまたはサブファミリーは、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有する限りは任意である。ファミリーの例として１５２、１０６および１０７、サブファミリーの例として１５２Ａおよび１０７Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明のシトクロムＰ４５０として野生型のシトクロムＰ４５０を用いる場合は、その由来生物は当該酸化活性を有する限り任意であり、ヒトを含む動物、植物、および細菌のいずれであってもよい。細菌の例として、バシラス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属が挙げられ、バシラス属の細菌の例としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明のシトクロムＰ４５０として人工的に作製したシトクロムＰ４５０を用いる場合は、そのシトクロムＰ４５０は生合成されたものでも、化学的ペプチド合成法によって合
成されたものでもよい。生合成法は、後に例示するような材料および方法を用いることができる。化学的ペプチド合成の例としては公知の液相合成法や固相合成法が挙げられ、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋ら、丸善、１９８５年）などを参照して行うことができる。
【００３２】
本発明のシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有する限り任意である。
【００３３】
例えば、本発明のシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は、野生型のシトクロムＰ４５０が有するアミノ酸配列と同一でも、当該野生型アミノ酸配列を含むものであってよい。しかし、本発明の目的を達成する上で用いることのできる野生型のシトクロムＰ４５０の具体例として、枯草菌由来のＣＹＰ１５２Ａ１（配列番号１、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＣＡＢ１２００４．１）およびＣＹＰ１０７Ｋ１（配列番号２、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＢＱ２２９６２．１）、ならびにセレウス菌由来のＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）（配列番号３、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＳ４１５７３．１）およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＳ４１６０９．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
または、本発明のシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は、当該酸化活性を失わない限り、上記野生型アミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が変異（すなわち、欠失、置換、および／または付加）したアミノ酸配列を含んでいてもよい。変異による効果は任意であるが、例えば、当該酸化活性を調節する、すなわち向上させるまたは低下させるものであってもよい。
【００３５】
アミノ酸変異の数は、１個以上の任意の数でよいが、例えば３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、または数個以下である。ここで数個とは、大辞林（第三版、松村明編）に記載されるように「２、３個から５、６個程度の数」を意味し、本明細書においては、２、３、４、５、６、７、８、または９個を意味する。
【００３６】
好ましいアミノ酸変異の例として、保存的置換が挙げられる。保存的置換とは、あるアミノ酸残基を類似の物理化学的性質および／または構造を有する残基で置き換えることである。どのような置換が保存的置換になるかは、アミノ酸毎に当該技術分野において公知であるが、例を挙げると、同じ極性（塩基性、酸性、または中性）、荷電、親水性、および／または疎水性を有するアミノ酸同士や、芳香族アミノ酸同士または脂肪族アミノ酸同士の置換などが該当する。より具体的には、例えば、ＡｌａからＳｅｒまたはＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、ＧｌｕまたはＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＡｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＨｉｓまたはＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒまたはＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒまたはＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅまたはＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、ＰｈｅまたはＴｒｐへの置換、および、ＶａｌからＭｅｔ、ＩｌｅまたはＬｅｕへの置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
アミノ酸変異の位置は、当該酸化活性を失わない限り任意であり、例えば変異対象のシトクロムＰ４５０の三次元構造に基づいて検討することができる。
【００３８】
本発明のシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は、上記野生型アミノ酸配列、例えば配列番号１、２、３または４に示すアミノ酸配列に対して、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有することが好ましい。アミノ酸配列の同一性が一定以上であれば、変異前と同様の活性および基質特異性を有する蓋然性が高くなるのは当該技術分野でよく知られている通りである。または、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有する野生型シトクロムＰ４５０の属するファミリーまたはサブファミリーに属するほかのシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列と、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有していてもよい。
【００３９】
アミノ酸変異が保存的変異である場合は、アミノ酸配列の同一性が比較的低くても変異前と同様の活性を保持しやすいため、保存的変異の場合は、上記野生型アミノ酸配列、例えば配列番号１、２、３または４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上でよい。
【００４０】
アミノ酸配列同一性の確認は、当該技術分野で公知の方法で行うことができ、具体例として、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＸ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ〔Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．，  １６４，  ７６５（１９８８）〕などの同一性検索ソフトウェアを用いて、デフォルト（初期設定）のパラメーターを用いて計算する方法が挙げられる。
【００４１】
本発明のシトクロムＰ４５０の、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性の強さは任意である。例えば、実施例に記載のシトクロムＰ４５０のいずれかの活性に対し、５％以上、１０％以上、３０％以上、５０％以上、７０％以上、９０％以上、１００％以上、１２０％以上、または１５０％以上の活性を有してよい。活性の強さの決定方法は任意であるが、例えば生物学的変換産物であるロタンドンの収量を実施例に記載の特定のシトクロムＰ４５０を用いた場合の収量と比較することで決定することができる。
【００４２】
＜シトクロムＰ４５０をコードするＤＮＡ＞
本発明のシトクロムＰ４５０をコードするＤＮＡ（以下、本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子とも称する）は、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するタンパク質をコードするものである。塩基配列は、当該タンパク質をコードするものであれば任意である。
【００４３】
例えば、本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子の塩基配列は、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有する野生型のシトクロムＰ４５０をコードする塩基配列と同一であっても、当該塩基配列を含むものであってもよい。野生型のシトクロムＰ４５０をコードする遺伝子の具体例として、ＣＹＰ１５２Ａ１をコードする遺伝子（遺伝子名ｃｙｐＣまたはｙｂｄＴ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ００９１２６．３）（配列番号５）、ＣＹＰ１０７Ｋ１をコードする遺伝子（遺伝子名ｐｋｓＳ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ５４６６９８．１）（配列番号６）、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）をコードする遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７１９４．１のｌｏｃｕｓ  ｔａｇ“ＢＣＥ＿２６５９”）（配列番号７）、およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６２９）をコードする遺伝子（遺伝子名ｃｙｐＡ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１７１９４．１のｌｏｃｕｓ  ｔａｇ“ＢＣＥ＿２６９６”）（配列番号８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
または、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を失わない限り、当該野生型の塩基配列に対し任意の改変（置換、欠失、付加、挿入またはその他の遺伝子編集）を有する配列を含んでいてもよい。当該酸化活性を失わない改変の効果は任意であるが、例え
ば当該酸化活性を調節する、すなわち向上または低下させる改変が挙げられる。
【００４５】
塩基の変異の数は、１個以上の任意の数であることができるが、例えば、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、または数個以下である。
【００４６】
塩基の変異の例として、保存的変異が挙げられるが、これらに限定されない。ここでいう「保存的変異」とは、コドンが対応するアミノ酸が変化しない変異、または物理的、化学的、および／または構造的に類似したアミノ酸に対応するコドンに変化するような変異（すなわち上述のアミノ酸の保存的置換）を意味する。
【００４７】
または、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有し、かつ野生型のシトクロムＰ４５０のアミノ酸配列に対し１個以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列から、１個以上、または１個から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１〜４のいずれかに示すアミノ酸配列から１個以上のアミノ酸が保存的置換し当該アミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、などが挙げられる。
【００４８】
１個以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列や、配列番号５〜８に示す塩基配列と異なる塩基配列を有するＤＮＡの作製には、従来公知の手法を使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばＴ．クンケルの部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔ．  Ａ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２，  ｐｐ．４８８−４９２  （１９８５））、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法などが挙げられる。また、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（宝酒造社製））などを用いて、または宝酒造社製のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて、変異を導入することもできる。
【００４９】
更に、上記野生型の塩基配列、例えば配列番号５〜８のいずれかに示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも、本発明に含まれる。
【００５０】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、あるＤＮＡに対し、一定以上の配列同一性を有するＤＮＡがハイブリダイズし、配列同一性が低いＤＮＡはハイブリダイズしない条件を意味する。より具体的には、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄を高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味する。
【００５１】
ハイブリダイゼーション方法および「ストリンジェントな条件」の詳細については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，
１９８７−１９９７；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  （１９９５）などの記載を参照できる。
【００５２】
「ストリンジェントな条件」を本明細書において具体的数値で特定することは、塩基配列依存性があるために必ずしも限定されるものでないが、例えば６×ＳＳＣ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ、１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウムからなる）、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中において４２℃で一夜加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中において６８℃で３０分間洗浄する、または６×ＳＳＣ、４０％ホルムアミド、２５℃でのハイブリダイゼーションと、１×ＳＳＣ、５５℃での洗浄といった条件で、そのＤＮＡから脱離しない条件が挙げられる。更に詳細には、例えば、ハイブリダイゼーション時、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは１５〜５００ｍＭ、より好ましくは１５〜３００ｍＭまたは１５〜２００ｍＭであり、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６８℃であり、および／またはホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％であり、ストリンジェントな条件におけるハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件は、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは１５〜５００ｍＭ、より好ましくは１５〜３００ｍＭまたは１５〜２００ｍＭであり、および／または温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、温度などの条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定できることは自明である。
【００５３】
このようなストリンジェンシーでハイブリダイズするＤＮＡは、鋳型のＤＮＡの塩基配列に対し高い同一性、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有すると考えられ、このような配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるタンパク質は、鋳型ＤＮＡがコードするタンパク質と同様の活性を有すると考えられる。
【００５４】
また、本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子は、ｃＤＮＡでも、スプライシングされる前の塩基配列、すなわちイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体に対応する塩基配列を有するものでもよい。なぜなら、このようなｍＲＮＡ前駆体の塩基配列に相当するゲノム上の塩基配列は、転写後にスプライシング反応によって実質的に本発明のＤＮＡと同じ配列になり、またそれにコードされるタンパク質は配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列を有するシトクロムＰ４５０と実質的に同一の活性（実施例を参照）を有し得るからである。例として、スプライシング後の成熟ｍＲＮＡの塩基配列が配列番号５〜８で示す塩基配列のいずれかを有するＤＮＡが挙げられる。
【００５５】
＜電子伝達タンパク質＞
本発明において電子伝達タンパク質とは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け取り本発明のシトクロムＰ４５０に渡す活性（以下、単に「電子伝達活性」とも称する）を有するタンパク質を意味する。具体例として、フェレドキシン（Ｆｄｘ）およびフェレドキシンレダクターゼ（ＦｄＲ）、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）、オキソ酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＯＦＯＲ）、および本発明のシトクロムＰ４５０に電子を伝達する活性を有するこれらの断片が挙げられる。または、上述のｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔシトクロムＰ４５０の電子伝達活性を有する断片を用いてもよい（例えば前掲の、ＣＹＰ１０２ファミリーの還元性断片やＮｏｄａｔｅらに記載のシトクロムＰ４５０ＲｈＦの還元性ドメインなど）。
【００５６】
特に、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼは、細菌由来のシトクロムＰ４５０に電子を伝達するタンパク質の組み合わせ（以下、この組み合わせをレドックスパートナータンパク質とも称する）として知られており、様々なシトクロムＰ４５０に電子
を伝達することが報告されている（Ｈａｎｎｅｍａｎｎ  ら  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １７７０，  ｐｐ．３３０−３４４）。これらの報告されたレドックスパートナータンパク質も本発明で使用できる。
【００５７】
フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの種類は特に限定されない。フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの由来生物は、本発明のシトクロムＰ４５０に電子を伝達する活性を有する限り任意である。例えば、ＰＩＲ、ＵｎｉＰｒｏｔなどのデータベースを参照することで、様々な生物種由来のフェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列を探索、特定することができる。
【００５８】
フェレドキシンの例として、ホウレンソウ由来のフェレドキシン、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のプチダレドキシン、動物由来のアドレノドキシン、スフィンゴモナス・サブテラニア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）由来のフェレドキシン、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボランス（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）由来のフェレドキシン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のフラボドキシンやフェレドキシン、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のフェレドキシン、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の細菌由来のフェレドキシン、またはその他のフェレドキシン様タンパク質が挙げられるが、本発明で使用できるものは、必ずしも、これらに限定されない。
【００５９】
フェレドキシンレダクターゼの例として、ホウレンソウ由来のフェレドキシンレダクターゼ、シュードモナス・プチダ由来のプチダレドキシンレダクターゼ、動物由来のアドレノドキシンレダクターゼ、スフィンゴモナス・サブテラニア由来のフェレドキシンレダクターゼ、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボランス由来のフェレドキシンレダクターゼ、大腸菌由来のフラボドキシンレダクターゼやフェレドキシンレダクターゼ、サッカロミセス・セレビシエ由来フェレドキシンレダクターゼ、アシネトバクター属の細菌由来のフェレドキシンレダクターゼが挙げられるが、本発明で使用できるものは、必ずしも、これらに限定されない。
【００６０】
野生型の電子伝達タンパク質の好ましい具体例として、フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの一種である、アシネトバクター属のａｃｉＢＣ遺伝子にコードされるタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ０１２９５２．１）や、プチダレドキシン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２５７５９．１）（配列番号１０）およびプチダレドキシンレダクターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ２５７５８．１）（配列番号１１）の組み合わせが挙げられるが、本発明で使用できるものは、必ずしも、これに限定されない。
【００６１】
フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼは、互いに同じ生物由来であっても、互いに異なる生物由来であってもよい。また、それぞれシトクロムＰ４５０に対し異種でも同種でもよい。現在、シトクロムＰ４５０に電子を伝達する活性を有する異種レドックスパートナータンパク質が複数知られている（例えば、有澤、ＸＢ１１９、ＳＣＥＪ  ７５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ（Ｋａｇｏｓｈｉｍａ、２０１０）；  Ａｇｅｍａｔｕら  （２００６），  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０，  ｐｐ．３０７−３１１などを参照）。
【００６２】
フェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼは市販品を用いてもよく、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手可能である（カタログ番号Ｆ３０１３およびＦ０６２８）。
【００６３】
また、上述の通り、シトクロムＰ４５０と電子伝達タンパク質との融合体を作製し、その融合体をα−グアイエンに作用させてロタンドンに変換してもよい。当該融合体を作製するにあたっては、上述の融合体に関する文献を参照することができる。
【００６４】
本発明の電子伝達タンパク質のアミノ酸配列は、上述の野生型電子伝達タンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号１０および１１に示すアミノ酸配列と同一またはそれを含むものであっても、野生型電子伝達タンパク質のアミノ酸配列を一部改変した配列と同一またはそれを含むものでもよい。変異による効果は任意であるが、例えば、電子伝達活性を調節する、すなわち向上させるまたは低下させるものであってよい。
【００６５】
アミノ酸変異の数は、１個以上の任意の数でよいが、例えば、３０個以下、２０個以下、１５個以下、１０個以下、または数個以下である。アミノ酸変異の例としては、上述の保存的置換が挙げられる。
【００６６】
また、本発明の電子伝達タンパク質は、本発明のシトクロムＰ４５０と同様に、人工的に生合成されたものでも、化学的タンパク質合成法によって合成されたものでもよい。
【００６７】
なお、「数個」、「配列同一性」、および「保存的置換」については、上述の通りである。
【００６８】
また、上述の通り、シトクロムＰ４５０にはモノオキシゲナーゼ活性発現の際にＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび電子伝達タンパク質を必要としないものがあるため、本発明において電子伝達タンパク質は必須ではない。そのようなシトクロムＰ４５０の具体例として、上述のＣＹＰ７４Ａや、過酸化水素を利用するＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１５２Ｂ１、ＣＹＰ１５２Ｌ１などのＣＹＰ１５２ファミリーに属するシトクロムＰ４５０が挙げられる。
【００６９】
＜電子伝達タンパク質をコードするＤＮＡ＞
本発明において、電子伝達タンパク質をコードするＤＮＡとは、上述の電子伝達活性を有する電子伝達タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明の電子伝達タンパク質遺伝子とも称する）である。塩基配列は、当該電子伝達タンパク質をコードするものであれば任意である。
【００７０】
好ましい例として、ＦｄｘおよびＦｄＲ、または本発明のシトクロムＰ４５０に電子を伝達する活性を有するこれらの断片をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ国際塩基配列データベースなどの遺伝子情報を格納したデータベースを参照することで、様々な生物種由来のフェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼの塩基配列を特定し、その特定した塩基配列を採用してもよい。
【００７１】
野生型の電子伝達タンパク質遺伝子の例として、上述のプチダレドキシンおよびプチダレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子（遺伝子名ｃａｍＡおよびｃａｍＢ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０５４０６．１）（配列番号９）が挙げられるが、これに限定されない。
【００７２】
または、電子伝達活性を失わない限り、野生型の電子伝達タンパク質遺伝子の塩基配列、例えば配列番号９に示す塩基配列に対して１個以上、または１個から数個の変異を有する塩基配列や、野生型の電子伝達タンパク質遺伝子の塩基配列に対し７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列同一性を有する塩基配列であってもよい。
【００７３】
塩基の変異の例として、保存的変異が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
または、本発明のシトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有し、かつ野生型の電子伝達タンパク質のアミノ酸配列に対し１個以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明に含まれる。例えば、配列番号１０および１１に示すアミノ酸配列から、それぞれ１個以上、または１個から数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１０および１１に示すアミノ酸配列とそれぞれ６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列番号１０および１１に示すアミノ酸配列からそれぞれ１個以上のアミノ酸が保存的置換し当該アミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、または９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、などが挙げられる。
【００７５】
１個以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列や、配列番号９に示す塩基配列と異なる塩基配列を有するＤＮＡの作製には、上述の通り従来公知の手法を使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。
【００７６】
更に、上記野生型の塩基配列、例えば配列番号９に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも、本発明に含まれる。
【００７７】
また、本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子と同様に、電子伝達タンパク質遺伝子はｃＤＮＡでも、スプライシングされる前の塩基配列、すなわちイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体に対応する塩基配列を有するものでもよい。例として、スプライシング後の成熟ｍＲＮＡの塩基配列が配列番号９で示す塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。
【００７８】
なお、「数個」、「配列同一性」、「保存的変異」、および「ストリンジェントな条件」については、上述の通りである。
【００７９】
＜＜α−グアイエンのロタンドンへの変換方法＞＞
本発明のシトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させてロタンドンを製造する方法では、精製した本発明のシトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させても、本発明のシトクロムＰ４５０を産生する生物もしくは細胞またはこれらの破砕物もしくはホモジネートをα−グアイエンと混合することで本発明のシトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させ、α−グアイエンの３位のメチレンをカルボニルに酸化してもよい。このような作用させる条件は、目的の酵素活性を有する生物もしくは細胞それ自体、またはこれらの単離細胞もしくは調製物（破砕物、ホモジネート）などを用いて一定の基質を生物学的変換体へ変換する方法で常用されている条件に準ずることができる。本発明によれば、例えば、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するシトクロムＰ４５０を発現し、必要により、更に当該タンパク質に電子を伝達できるタンパク質を発現する生細胞（または生菌体）、またはこれらのタンパク質を担持する生細胞（または生菌体）を用いる場合には、これらの細胞などを培養できる培地中に、基質α−グアイエンを共存させ、これらの細胞などに悪影響を及ぼさない環境、例えば、生理学的な温度で一定時間インキュベーションすることを条件とすることができる。一方、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するシトクロムＰ４５０、必要により、更に当該タンパク質に電子を伝達できるタンパク質を含む調製タンパク質（精製タンパク質であることもできる）を含む反応系、またはかようなタンパク質を有する単離細胞もしくは調製物（破砕物、ホモジネート）などを用いる場合には、必要により生理学的に許与される緩衝剤により緩衝化さ
れた水性液中で、かようなタンパク質と基質α−グアイエンを混合または共存させ、室温などの下、一定時間インキュベーションすることを条件とすることができる。インキュベーション時間は、必要により、反応混合液のアリコートを継時的にサンプリングし、後述する方法により求めることのできるα−グアイエンから変換されたロタンドンの量などを参照に、決定することができる。こうして生成されるロタンドンは、前記反応混合物から、それ自体公知の方法、例えば抽出、蒸留、クロマトグラフィー、結晶化、分配抽出などにより、精製、単離できる。
【００８０】
以下、その具体例を述べる。
【００８１】
＜生物または細胞を用いる場合＞
本発明のシトクロムＰ４５０を産生する生物または細胞は、生来シトクロムＰ４５０を産生するものであっても、生来産生はしないが、遺伝子改変技術などによって産生するように改変されたもの（以下、本発明の組換え体とも称する）であってもよく、本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子を発現できる生物または細胞であれば任意である。例として、細菌類（大腸菌、乳酸菌、放線菌、枯草菌）、酵母、真菌、植物、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明の組換え体の作出方法は任意であるが、例えば、あるベクターに本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子および／または本発明の電子伝達タンパク質遺伝子を発現可能に挿入してベクターを作製（以下、本発明の組換えベクターとも称する）し、そのベクターを生物または細胞に導入して作出することができる。ベクターに挿入する遺伝子のコピー数は、１以上の任意の数でよい。なお、本発明のシトクロムＰ４５０遺伝子および本発明の電子伝達タンパク質遺伝子は、同じベクターに挿入してそのベクターを生物または細胞に導入もよいし、別々のベクターに挿入して個別に生物または細胞に導入してもよい。
【００８３】
ベクターの種類は特に限定されない。目的（例えば、クローニング用、または遺伝子発現用）や導入する宿主（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞もしくは植物体、特にマメ科植物）によって、適宜選択できる。使用可能なベクターの具体例としては、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＴｒｉＥＸＴＭ系（ＴａＫａＲａ社）などのプラスミドベクターや、カリフラワーモザイク（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイク（ＢＧＭＶ）、タバコモザイク（ＴＭＶ）などのベクター、またはｐＢＩ系などのバイナリーベクターが挙げられるが、これらに限定されず、自律複製型でも染色体組み込み型でもよい。
【００８４】
ベクターに目的のＤＮＡを発現可能に挿入する方法は、当該分野で公知の方法を用いることができる。通常は、精製されたＤＮＡまたはその断片を適当な制限酵素で切断し、上述した適当なベクターの対応する制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して連結する方法などが採用される。具体的方法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ．，（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００８５】
ベクターの導入には、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法が挙げられる。ベクターと共に宿主に導入されたＤＮＡは、宿主のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよいし、導入されたＤＮＡの状態（例えば、ベクターに含有されたまま）で存在していてもよい。更に、導入されたＤＮＡは、例えば、宿主のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた場合のように宿主細胞内で維持され続けるものでもよいし、一過的に保持され
るものでもよい。
【００８６】
本発明の遺伝子の導入は、当該分野で公知の方法、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノザンハイブリダイゼーション法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどによって確認することができる。
【００８７】
本発明の組換えベクターは、本発明の遺伝子に加え、他の要素も適宜含んでよい。例えば、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーターなどの調節領域、または選抜マーカー遺伝子および／またはβ−アミリン合成酵素遺伝子などの他の遺伝子を連結することができる。プロモーター、エンハンサー、ターミネーターまたは選抜マーカーの種類は、目的（例えば、クローニング、遺伝子発現、またはスクリーニング）によって、または導入する宿主（例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、または植物細胞もしくは植物体）によって適宜選択すればよい。
【００８８】
選抜マーカー遺伝子としては、ベクターが導入された細胞と導入されなかった細胞とを区別可能にするものであれば特に限定されず、主な例として、薬剤耐性遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子など）、蛍光または発光レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニターゼ（ＧＵＳ）、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）など）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）、ジヒドロ葉酸還元酵素などの酵素遺伝子が挙げられる。また、必須栄養素生産を可能にする遺伝子を導入し、当該必須栄養素を含まない培地において細胞を培養し、生育した細胞を本発明の組換え体として得てもよい。
【００８９】
以上のようにして作製された本発明の組換えベクターは、適当な宿主に導入してα−グアイエンの（−）−ロタンドンへの高効率かつ高純度の変換のために使用することができる。
【００９０】
本発明のシトクロムＰ４５０を発現する組換え体をα−グアイエンに作用させて（−）−ロタンドンに変換する場合、組換え体の培地は、各宿主の培養に適した培地を用いればよい。そのような培地は、当該分野で公知のものを使用することができる。例えば、通常、大腸菌などの細菌を宿主として培養する場合であればＬＢ培地、Ｍ９培地などを、酵母を宿主として培養する場合であればＹＰＤ培地、ＹＰＧ培地、ＹＰＭ培地、ＹＰＤＭ培地、ＳＭＭ培地などが挙げられる。培地は、炭素源（例えば、グルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトースなど）、窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素、カゼイン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、ビーフ抽出物などの有機窒素源）、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなど）、ビタミン（ビタミンＢ１など）、薬剤（アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンなどの抗生物質）などを適宜含む。更に、本発明のシトクロムＰ４５０の基質となるα−グアイエンを含んでいてもよい。任意の酸化剤（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ））や、発現誘導物質（例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ））を更に含んでいてもよい。
【００９１】
培養条件は、培養中に本発明で使用する各遺伝子の発現および／または本発明のシトクロムＰ４５０の活性発現が可能である限り任意である。通常、１０〜４５℃で、必要に応じて通気や攪拌をしながら、適宜所望のＯＤとなるまで数時間〜数百時間培養する。より具体的な条件は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ．  ａｌ．，（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅ
ｃｏｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  を参照して決定することができる。
【００９２】
培養物（培養上清および／または培養された組換え体を含む）から本発明のシトクロムＰ４５０を採取するには、培養物中に存在する本発明のシトクロムＰ４５０を公知の方法で抽出し、必要に応じて精製すればよい。例えば、溶媒抽出法、塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で、あるいは適宜組み合わせて、目的のシトクロムＰ４５０を得ることができる。
【００９３】
以上のような培養系に本発明の組換え体およびα−グアイエンを添加して当該組換え体を培養することで、ロタンドンを高効率かつ高純度で製造できる。このような培養系は、α−グアイエンを高効率かつ高純度でロタンドンに変換する新規なシステムである。
【００９４】
一方、精製した本発明のシトクロムＰ４５０をα−グアイエンに作用させる場合、その反応系は、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性が発現可能であれば任意である。例えば、シトクロムＰ４５０再構成系を（例えば、精製した本発明のシトクロムＰ４５０、酸化剤、および基質を含む系、またはこれらに加えて電子伝達タンパク質を含む系）反応系として採用できる。再構成系の構築にあたっては、Ｆｕｒｕｙａら  （２００８）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  １５，  ｐｐ．５６３−５７２などを参照できる。このような再構成系も、α−グアイエンを高効率かつ高純度でロタンドンに変換する新規なシステムである。
【００９５】
α−グアイエンの変換産物としてロタンドンが製造されたかどうかの確認は、任意の公知の方法で行うことができ、例えば、クロマトグラフ法を採用することができる。具体的には、例えばＧＣ／ＭＳで得られた標品のロタンドンのリテンションタイムおよびＭＳスペクトルとα−グアイエン変換産物のそれらとを比較し、標品のロタンドンと一致する場合には、当該変換産物がロタンドンであると確認することができる。
【００９６】
＜＜スクリーニング方法＞＞
本発明によって、α−グアイエンをロタンドンに変換する能力を有することが疑われるタンパック質から前記能力を有するタンパク質をスクリーニングする方法も提供される。この本発明の方法は、あるタンパク質をα−グアイエンに作用させる、または、あるタンパク質を当該タンパク質に電子を伝達する活性を有する電子伝達タンパク質の共存下でα−グアイエンに作用させるステップ、およびロタンドンを検出するステップをこの順で含む。スクリーニング対象のα−グアイエンをロタンドンに変換する能力を有することが疑われるタンパク質はいかなるものであってもよいが、例として、実施例に記載のＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）のいずれかのアミノ酸配列と４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびにシトクロムＰ４５０に属するタンパク質が挙げられる。また、電子伝達タンパク質も特に限定されないが、例としてフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼとの組み合わせが挙げられる。この方法によって、α−グアイエンをロタンドンに変換することのできる新たなタンパク質をスクリーニングすることが可能になった。
【００９７】
更に、本発明によって、α−グアイエンをロタンドンに変換するシトクロムＰ４５０への電子伝達活性を有することが疑われるタンパク質から前記電子伝達活性を有するタンパク質をスクリーニングする方法も提供される。この本発明の方法は、α−グアイエンをロ
タンドンに変換するシトクロムＰ４５０、特に、ＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、およびＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）から選択される少なくとも１種のシトクロムＰ４５０、または、α−グアイエンの３位のメチレンを酸化する活性を有するそれらの類縁体の共存下で、あるタンパク質をα−グアイエンに作用させるステップ、およびロタンドンを検出するステップをこの順で含む。スクリーニング対象の前記電子伝達活性を有することが疑われるタンパク質はいかなるものであってもよいが、例としてフェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼや、プチダレドキシンおよびプチダレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列（配列番号１０および１１）と４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。また、上記シトクロムＰ４５０の類縁体の例として、上記［１］〜［４］から選択される少なくとも１種が挙げられるが、これらに限定されない。この方法によって、本発明のシトクロムＰ４５０に電子を伝達する活性を有する新たな電子伝達タンパク質をスクリーニングすることが可能になった。
【００９８】
＜＜酵素活性の測定方法＞＞
本発明によって、あるタンパク質の有する、α−グアイエンをロタンドンに変換する活性を測定する方法も提供される。この本発明の方法は、あるタンパク質をα−グアイエンに作用させる、または、あるタンパク質を当該タンパク質に電子を伝達する活性を有する電子伝達タンパク質の共存下でα−グアイエンに作用させる工程、およびロタンドンを検出する工程をこの順で含む。測定対象のタンパク質は任意であるが、例として、ＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）、またはＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）のアミノ酸配列と４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上の配列同一性を有するタンパク質や、シトクロムＰ４５０に属するタンパク質が挙げられる。また、電子伝達タンパク質も特に限定されないが、例としてフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼとの組み合わせが挙げられる。この方法によって、所望の強さの当該酸化活性を有するシトクロムＰ４５０を探索することが可能となった。
【００９９】
＜＜ロタンドンの用途＞＞
本発明の製造方法によって製造されたロタンドンは、そのまま飲食品に任意の量配合し、例えば果実の香味、特に、フレッシュ感や果汁感を増強することができるが、他の成分と混合して香料組成物を調製し、該香料組成物を用いて飲食品に例えば果実の香味、特に、フレッシュ感や果汁感を増強することもできる。該香料組成物のロタンドンと共に含有し得る他の香料成分としては、各種の合成香料、野生型香料、野生型精油、動植物エキスなどを挙げることができる。
【０１００】
他の香料成分としては「特許庁、周知慣用技術集（香料）第ＩＩ部食品香料、頁８−８７、平成１２年１月１４日発行」に記載されている合成香料、野生型精油、野生型香料、動植物エキスなどを挙げることができる。
【０１０１】
本発明のロタンドンを有効成分とする香料組成物は、必要に応じて、香料組成物において通常使用されている、水、エタノールなどの溶剤、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、グリセリン、ベンジルベンゾエート、トリエチルシトレート、ハーコリン、脂肪酸トリグリセライド、脂肪酸ジグリセリドなどの香料保留剤を含有することができる。
【０１０２】
また、ロタンドンを有効成分とする香料組成物にグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、レシチン、キラヤサポニン、カゼインナトリウムなどの乳化剤を用いた乳化香料として、また
、アラビアガムやデキストリンを添加し乾燥させた粉末香料とすることができる。
【０１０３】
本発明の製造方法によって製造されたロタンドンを含む香料組成物は、上記のようにそれ自体単独で、またはロタンドンを含む香料素材を調製して、各種の飲食品に任意の量添加することができる。
【０１０４】
それらのうちで、本発明の製造方法によって製造されたロタンドンを含む飲食品の具体例としては、炭酸飲料類；果汁飲料、ソフト飲料類；嗜好飲料類；アルコール飲料類；乳製品；デザート類およびそれらを製造するためのミックス類；菓子類およびそれらを製造するためのミックス類；パン、スープ、各種インスタント食品などの一般食品類、歯磨きなどの口腔用組成物を挙げることができるが、何ら限定されるものではない。
【０１０５】
本発明の製造方法によって製造されたロタンドンの含有量は、混合される他の香料成分により異なり一概にはいえないが、通常、該香料組成物の重量を基準として０．５ｐｐｔ〜０．５ｐｐｍ、好ましくは１ｐｐｔ〜０．２ｐｐｍの濃度範囲とすることができる。
【０１０６】
果実の香味、特に、フレッシュ感や果汁感を増強する際の上記した各種の製品へのロタンドンの含有量は、製品の種類や形態に応じて異なり一概にはいえないが、通常、製品の重量を基準として０．００５ｐｐｔ〜５ｐｐｔ、好ましくは０．０１ｐｐｔ〜２ｐｐｔの濃度範囲とすることができる。
【実施例】
【０１０７】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０８】
（１）シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子を導入した組換え大腸菌の作製
シトクロムＰ４５０をコードする遺伝子として、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣＹＰ１５２Ａ１（配列番号１）をコードする遺伝子（ｃｙｐＣ（ｙｂｄＴとも称する）、配列番号５）もしくはＣＹＰ１０７Ｋ１（配列番号２）をコードする遺伝子（ｐｋｓＳ、配列番号６）、またはセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来のＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）（配列番号３）をコードする遺伝子（配列番号７）もしくはＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）（配列番号４）をコードする遺伝子（ｃｙｐＡ、配列番号８）を選択した。
【０１０９】
各遺伝子をベクターｐＥＴ２１ａまたはｐＥＴ２１ｄ（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入して作製したプラスミドベクター、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のレドックスパートナータンパク質遺伝子（ｃａｍＡおよびｃａｍＢ、配列番号９）をベクターｐＭＷ２１８に挿入して作製したプラスミドベクターを、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入した。
【０１１０】
具体的には以下の通りである。
【０１１１】
ｃｙｐＣおよびｐｋｓＳについては、まず、制限酵素ＮｄｅＩおよび後述の制限酵素を用いて各遺伝子をｐＥＴ２１ａプラスミドに挿入した。なお、ＣＹＰ１０７Ｋ１の挿入の際は、ライゲーション前にベクターのＮｄｅｌ切断箇所をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。
【０１１２】
ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）をコードする遺伝子およびｃｙｐＡについては、制限酵素ＮｄｅＩおよび後述の制限酵素を用いてｐＥＴ２１ａベクターに挿入した。
【０１１３】
ｐｄｘおよびｐｄｒについては、ｐＭＷ２１８プラスミド（ニッポン・ジーン社）をＮｄｅＩおよび後述の制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩまたはＳａｃＩ）で切断し、各遺伝子を挿入した。
【０１１４】
各遺伝子の増幅に用いたプライマーの配列および導入に用いた制限酵素は以下の通りである。プライマーの配列は５末端から３末端へと記載している。
ＣＹＰ１５２Ａ１（ｃｙｐＣ）
フォワードプライマー：GAATTCCATATGAATGAGCAGATTCCACAT（配列番号１２）
制限酵素：ＮｄｅＩ
リバースプライマー：CGCGGATCCTTAACTTTTTCGTCTGATTCC（配列番号１３）
制限酵素：ＢａｍＨＩ
ＣＹＰ１０７Ｋ１（ｐｋｓＳ）
フォワードプライマー：TGCAAATGGAAAAATTGATGTTTC（配列番号１４）
（Ｂｌｕｎｔ）
リバースプライマー：CGCGGATCCTTATTTTGAAAGTGAAACAGG（配列番号１５）
制限酵素：ＢａｍＨＩ
Ｐｄｘ（ｃａｍＡ）
フォワードプライマー：TTCCATATGTCTAAAGTAGTGTATGTGTCA（配列番号１６）
制限酵素：ＮｄｅＩ
リバースプライマー：CACAAGCTTTTACCATTGCCTATCGGGAAC（配列番号１７）
制限酵素：ＨｉｎｄＩＩＩ
ＰｄＲ（ｃａｍＢ）
フォワードプライマー：TTCCATATGAACGCAAACGACAACGTGGTC（配列番号１８）
制限酵素：ＮｄｅＩ
リバースプライマー：CACGAGCTCTCAGGCACTACTCAGTTCAGC（配列番号１９）
制限酵素：ＳａｃＩ
ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）ＯＲＦ
フォワードプライマー：GAATTCCATATGGCTTCGCCTGAAAATGTG（配列番号２０）
制限酵素：Ｎｄｅｌ
リバースプライマー：CGCGGATCCTTATTGAGTTTTTAAGCAGAT（配列番号２１）
制限酵素ＢａｍＨＩ
ＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）ＯＲＦ（ｃｙｐＡ）
フォワードプライマー：GAATTCCATATGAAAAAACTAACTTTTAAC（配列番号２２）
制限酵素：Ｎｄｅｌ
リバースプライマー：CCGGAATTCTTAGAAAATAACTGGTAGACT（配列番号２３）
制限酵素：ＥｃｏＲＩ
【０１１５】
得られた各組換えプラスミドベクターを大腸菌ＤＨ５α株（タカラバイオ社）に導入して増幅し、増幅した組換えプラスミドベクターをシーケンシングして、目的のコンストラクトが得られていることを確認した。
【０１１６】
（２）α−グアイエン変換産物の同定
作製した組換え大腸菌を、アンピシリンおよびカナマイシンをそれぞれ１００μｇ／ｍｌの濃度で含むＬＢ培地（１％（ｗ／ｖ）のトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）のイーストエクストラクト、および１％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌを含む）（ｐＨ７．０）に植菌し、ＯＤ600が０．８〜１．０になるまで、３０℃で６時間培養した。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、硫酸鉄（ＩＩ）および５−アミノレブリン酸をそれぞれ最終濃度１ｍＭ、０．５ｍＭおよび０．５ｍＭとなるように培地に添加し、更に２５℃で１５時間培養して、シトクロムＰ４５０遺伝子の発現を誘導した。１５時
間の培養後、組換え大腸菌を集菌し、集菌した大腸菌を１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含むリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、洗浄した大腸菌を同じ組成のリン酸カリウム緩衝液に懸濁した。この懸濁液をα−グアイエンと組換え大腸菌培養菌体との反応に用いた。
【０１１７】
具体的には、組換え大腸菌の菌体（菌体量は培養液２ｍｌから回収された菌体量に相当）、５ｍＭのα−グアイエン、５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、基質を反応液に溶解させるための溶剤として）、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を含む反応液２５０μｌを調製し、この反応液を３０℃で１７時間振とうした。
【０１１８】
１７時間の振とうを行った反応液に２．５μｌの５Ｎ  ＨＣｌおよび１ｍｌの酢酸エチルを添加して抽出を行い、この抽出液をＧＣ−ＭＳ分析に供した。ＧＣ−ＭＳ分析には、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＧＣ  Ｓｙｓｔｅｍ、５９７３  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（以上Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製）およびＩｎｅｒｔＣａｐ  ５ＭＳ／ＧＬカラム（ジーエルサイエンス株式会社製）を用い、サンプル注入量を１μｌ、スプリット比を４：１、キャリアガスをＨｅ（１．２ｍｌ／ｍｉｎ）、注入口温度を２７０℃、オーブン初期温度を８０℃、初期時間を２分、昇温速度を１０℃／ｍｉｎ、最終温度を３００℃として、分析を行った。
【０１１９】
その結果、上記４種の組換え大腸菌全てにおいて、α−グアイエンのピークおよびα−グアイエンの変換産物と予想される新規なピークが検出された。代表例として、ＣＹＰ１５２Ａ１の結果を図１に示す。なお、ＣＹＰ１５２Ａ１はレドックスパートナータンパク質を必要としないことが知られているものであったが、プチダレドキシンおよびプチダレドキシンレダクターゼ存在下でも酸化活性を示したことが確認された。図１においては、α−グアイエンのピークはピーク１、新規ピークはピーク２（リテンションタイム（保持時間）１３．４分）である。この新規ピークのリテンションタイムは、標品のロタンドンのリテンションタイムと一致していた。一方、コントロールとして、空ベクター、すなわち上記遺伝子を挿入していないｐＥＴ２１ａプラスミドおよびｐＭＷ２１８プラスミドを導入した組換え大腸菌を作製して上記条件で培養し、培養菌体をα−グアイエンと反応させて上記抽出および分析を行ったが、当該新規ピークは検出されなかった（図２）。
【０１２０】
また、α−グアイエン変換産物のＭＳスペクトルを測定したところ、親イオンピークのｍ／ｚ値は２１８．２であり、ロタンドンの分子量と一致した（図３）。
【０１２１】
以上の実験から、上記４種の遺伝子によって、α−グアイエンを選択的に、また高効率かつ高純度でロタンドンに変換することができることが確認された。
【０１２２】
（３）α−グアイエンの変換により生成したロタンドンの定量
標品のロタンドンを用いて検量線を作成し、検量線をもとにα−グアイエンの変換産物であるロタンドンの濃度を計算した。
【０１２３】
上記遺伝子、すなわちＣＹＰ１５２Ａ１、ＣＹＰ１０７Ｋ１、ＣＹＰ１０６（ＢＣＥ＿２６５９）またはＣＹＰ１０７（ＢＣＥ＿２６９６）を導入した組換え大腸菌培養菌体によって、１７時間の反応後、５ｍＭのα−グアイエンを含む反応液から、それぞれ０．４１ｍＭ、０．３３ｍＭ、０．３６ｍＭ、０．３６ｍＭのロタンドンが得られたことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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