(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子を備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、無細胞合成系と、核酸が固定された固相担体と、を配置する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程と、
を含み、
前記リアクターアレイは、前記リアクターを１０，０００〜５００，０００，０００個有し、
前記工程（ａ）において、前記固相担体はリアクター１個当たり１個ずつ配置される、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項２】
前記固相担体に固定された核酸は、前記固相担体１個当たり１種類の核酸である請求項１に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項３】
前記固相担体は磁気ビーズである請求項１又は２に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子は、前記タンパク質又はペプチド中に存在するアミノ酸配列に親和性を有する分子である請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項５】
前記タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子はタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーであり、
前記工程（ｃ）は、前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記ＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項６】
更に、（ｂ）前記工程（ａ）と（ｃ）の間に、前記リアクターを密閉する工程を有する請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）における核酸が固定された固相担体の配置は、前記リアクターアレイに、前記核酸を固定した前記固相担体を分散させた分散液を添加することにより行う請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の製造方法で製造されたタンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて機能性スクリーニングを行い、所定の機能を有するタンパク質又はペプチドが固定されたリアクターを特定する工程を含む、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項９】
さらに前記特定されたリアクターに配置された固相担体に固定された核酸の塩基配列を決定する工程を含む、請求項８に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１０】
前記機能性スクリーニングの前又は後に、前記リアクター内の核酸を回収する工程を含む、請求項８又は９に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１１】
前記リアクター内の核酸を回収する工程は、前記固相担体を回収することにより行う、請求項１０に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１２】
前記固相担体の回収は、前記タンパク質アレイ又はペプチドアレイ内の前記核酸が固定された固相担体を、前記リアクターアレイと同様の配列を有する第２リアクターアレイに配置することを含む請求項１１に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１３】
前記固相担体の回収は、前記固相担体との親和性を有する基板を前記リアクターアレイと重ね合わせることにより、前記固相担体を前記基板上に捕捉することにより行う請求項１１に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１４】
前記タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子はタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーであって、
前記工程（ｃ）は、前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記ＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程を有し、
前記リアクター内の核酸を回収する工程は、前記核酸リンカーを切断することにより行う、請求項１０に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１５】
前記核酸リンカーは可逆的光連結性塩基を有する核酸であり、
前記核酸リンカーの切断は、光照射により行う請求項１４に記載の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１６】
（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分と可逆的光連結性塩基とを有する核酸リンカーを備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、無細胞合成系と、ＤＮＡが固定された固相担体と、を配置する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記ＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記核酸リンカーに固定してタンパク質アレイ又はペプチドアレイを製造する工程と、
（ｄ）前記タンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、所定の機能を有するタンパク質を有するリアクターを特定する工程と、
（ｅ）光照射により前記核酸リンカーの可逆的光連結性塩基を光開裂させ、前記リアクターから核酸を解離し回収し、前記核酸の塩基配列を決定する工程と、
を含み、
前記リアクターアレイは、前記リアクターを１０，０００〜５００，０００，０００個有し、
前記工程（ａ）において、前記固相担体はリアクター１個当たり１個ずつ配置される、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法。
【請求項１７】
特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、
前記リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定された、タンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子と、
前記タンパク質捕捉分子又はぺプチド捕捉分子に捕捉されたタンパク質又はペプチドと、を備えるタンパク質アレイ又はペプチドアレイであって、
前記リアクターアレイは、前記リアクターを１０，０００〜５００，０００，０００個有すること特徴とするタンパク質アレイ又はペプチドアレイ。
【請求項１８】
前記タンパク質又はペプチドは、前記リアクター内に配置された、ＤＮＡが固定された固相担体を用いて、無細胞合成系によって合成されたものであり、
前記リアクターは、前記固相担体が前記リアクター１個当たり１個ずつ配置される大きさである、請求項１７に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイ。
【請求項１９】
タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子は、特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、前記ＤＮＡから合成されるｍＲＮＡ及びタンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを含むこと特徴とする、請求項１８に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイ。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイと、前記固相担体との親和性を有する基板と、を備えたことを特徴とする機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
新規機能性タンパク質は、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。【０００３】
新規機能性タンパク質の取得に際しては、タンパク質の構造情報から人知によりデザインするタンパク質工学的手法が主流であったが、より有用な機能性タンパク質を取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、タンパク質のランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。【０００４】
例えば、バイオエタノールの製造では、原料のセルロースをセロビオースに分解し、更にグルコースに分解した後、アルコール発酵によりエタノールを得る。これらの分解工程において、セロビオースからグルコースへの分解反応が遅く、全工程を律速している。この分解反応における反応速度は、オリゴ糖分解酵素β−グルコシダーゼ（以下、ＢＧＬともいう。）に依存するため、より優れた活性を有する変異体の創出が求められている。【０００５】
酵素や抗体といったタンパク質の機能向上には、変異体ライブラリーを用いた高効率スクリーニングが必要である。効率的に有用タンパク質のスクリーニングを行うためには、膨大な数の変異体を同時並列的に評価する方法が望まれている。【０００６】
このような要望に対して、ウェル中に配置されたＤＮＡから合成されたタンパク質をウェル壁面に固定するタンパク質アレイの製造方法が提案されている（特許文献１〜２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／０１４８６０号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６３１２６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献１で提案されているタンパク質アレイは、高々１５３６ウェルフォーマットのアレイであり、膨大な数の変異体を同時並列的に評価するためのアレイとしては改良の余地がある。【０００９】
また、特許文献２で提案されているタンパク質アレイは、機能性タンパク質のスクリーニングの後、ＤＮＡの回収が困難であり、機能性タンパク質の効率的なスクリーニングに用いるのは改良の余地がある。【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの効率的なスクリーニングに適したタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、アレイを構成するリアクター中に固相担体に固定した核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、合成されたタンパク質又はペプチドをリアクターの壁面及び底面の少なくとも一部に固定することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（７）を提供するものである。【００１２】
（１）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法は、
（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子を備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、固相担体に固定された核酸と無細胞合成系を用意する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程と、
を有することを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法は、
（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、固相担体に固定されたＤＮＡと無細胞合成系を用意する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記ＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程と、
を有することを特徴とする。
（３）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、
先に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法を用いて製造されたことを特徴とする。
（４）本発明の一実施態様における機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、（ｄ）先に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、リアクターを特定する工程を有することを特徴とする。
（５）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、
前記リアクター内に配置された、固相担体に固定された核酸及び該核酸にコードされるタンパク質又はペプチドと、を有し、
前記リアクターは、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定された、前記タンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子を有すること特徴とする。
（６）本発明の一実施態様におけるタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、
前記リアクター内に配置された、固相担体に固定されたＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるタンパク質又はペプチドと、を有し、
前記リアクターは、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定された、前記ＤＮＡから合成されるｍＲＮＡ及びタンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを有すること特徴とする。
（７）本発明の一実施態様における機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キットは、先に記載のタンパク質アレイ又はペプチドアレイと、前記固相担体との親和性を有する基板と、を備えたことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、機能性タンパク質又は機能性ペプチドのスクリーニングを効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態における、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法の模式図である。
【図２】本実施形態における、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法の模式図である。
【図３】本実施形態における、タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法の模式図である。
【図４】実施例における、石英ガラスリアクターの作製方法の模式図である。
【図５】実施例における、Ｎｉ−ＮＴＡ修飾石英ガラスリアクターの作製方法の模式図である。
【図６】実施例における、ＢＧＬタンパク質アレイの共焦点顕微鏡観察像である。
【図７】実施例における、ＢＧＬタンパク質アレイの酵素反応の結果である。
【図８】実施例における、ＢＧＬタンパク質アレイの各リアクターにおける酵素反応の結果である。
【図９】実施例における、ガラスリアクター内の磁気ビーズのＰＤＭＳシートを用いた回収方法の模式図である。
【図１０】実施例における、ＰＤＭＳシートを用いた回収方法により回収されたＰＤＭＳシート上の磁気ビーズの顕微鏡観察像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法≫
［第１実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法は、（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子を備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、固相担体に固定された核酸と無細胞合成系を用意する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程と、を有する。
以下、図１を参照しながら、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法について具体的に説明する。
【００１６】
本実施形態において、工程（ａ）は、特定の開口形状を有したリアクター２からなり、該リアクター２内の壁面２ａ及び底面２ｂの少なくとも一部に、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子６を備えたリアクターアレイ１において、前記リアクター２内に、固相担体に固定された核酸と無細胞合成系９を添加する工程である。
【００１７】
リアクターアレイ１に用いられる材料は、石英、ガラス、ポリマー材が好ましい。ポリマー材としては、リークを抑える目的からは、ポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳともいう）などのエラストマー材料がより好ましい。
【００１８】
リアクターアレイ１は、複数のリアクター２からなることが好ましい。リアクター数としては、１００００〜５００００００００が好ましく、１０００００００〜５０００００００がより好ましい。
本実施形態においては、個々に壁を有するリアクター２からなるリアクターアレイ１を用いるため、ＤＮＡアレイからタンパク質アレイを製造する際、又は、タンパク質アレイを用いて機能性スクリーニングを行う際に必要とされていた、基板をリアクターに重ね合わせる際のアライメントを取る必要がない。
【００１９】
リアクター２の形状は一例としてウェル形状、微小凹部、溝部であり、リアクター２の底面は、例えば円又は正方形である。係る底面の直径又は一辺は、１〜２００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましく、１〜５μｍが特に好ましい。複数のリアクター２の中心間の距離としては、１．５〜５００μｍが好ましく、１．５〜１５０μｍがより好ましく、１．５〜１５μｍが特に好ましい。
また、リアクター２の深さとしては、１〜２００μｍが好ましく、１〜５０μｍがより好ましく、１〜５μｍが特に好ましい。
また、リアクター２は親水化処理が施されていてもよい。
【００２０】
工程（ａ）において、リアクター２内に添加される核酸は、タンパク質又はペプチドをコードするものであれば特に限定されない。一例としてＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられ、取り扱いやすさの観点から例えばＤＮＡである。
該ＤＮＡは、≪機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法≫における後記工程（ｄ）で特定されたリアクター２に対応する核酸の塩基配列を解析する観点から、リアクターアレイ１において、核酸の位置情報が特定されており、本実施形態においては、ＤＮＡ１３が固相担体に固定化されている。また、一例として、固相担体に固定された核酸は、固相担体１個当たり１種類の核酸である。
固定化には、アビジン−ビオチン結合を利用する方法の他、ＤＮＡをアミノ基、アルデヒド基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相担体をアミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法などを用いることができ、特に、アビジン−ビオチン結合を利用した方法が好ましい。
【００２１】
前記固相担体は、後にＤＮＡを回収する観点から、ビーズであることが好ましく、短時間でリアクターアレイ１中の各リアクター２に配列させることが可能であるという観点から磁気ビーズ１４であることがより好ましい。
【００２２】
本実施形態において、固相担体として磁気ビーズを用いる場合には、リアクターアレイ１に用いられる基板材料下に、磁性体板が配設されていることが好ましい。
かかる構造のリアクターアレイ１を用いることにより、リアクター２内に磁気ビーズ１４を容易にかつ確実に配置することができる。一例として、該基板材料の下部に磁石を配置し、該基板材料上にＤＮＡ１３を固定した磁気ビーズ１４を分散させた分散液を滴下する。磁石及び磁性体板による磁力の作用により、リアクター１２内へ磁気ビーズが誘引されることにより配置されやすくなる。さらに磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで磁気ビーズ１４が分散し、リアクター２内への充填率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００〜１００００ガウスである。
また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズ１４は安定した配置を保持し続けることが可能となる。
【００２３】
かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができ、本実施形態においては残留磁化の大きな磁性材料を用いることが好ましい。
【００２４】
磁気ビーズ１４のリアクター２への充填率はリアクター２の直径又は一辺に依存する。
充填率の観点から、リアクター２の直径又は一辺が磁気ビーズ１４の直径又は一辺よりも若干広い方が好ましく、リアクター２の直径又は一辺は磁気ビーズの直径の１〜２倍であることがより好ましい。
また、１個のリアクター２に１個の磁気ビーズ１４を充填する上で、リアクター２の深さは、磁気ビーズ１４の直径の１〜２倍であることが好ましい。
また、一例として、固相担体１個当たり１種類の核酸であり、１個の固相担体に複数種類の核酸は固定されていない。その場合、１個のリアクターには１種類の核酸が用意され、合成されるタンパク質も１種類である。
【００２５】
ＤＮＡライブラリー等の複数種類のＤＮＡの混合物としては、変異ＤＮＡライブラリーが好ましい。
変異ＤＮＡライブラリーとしては、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ（エラープローンＰＣＲ）を利用したライブラリー、Ｇｅｎｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、Ｒａｎｄｏｍ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー、ＩＴＣＨＹ Ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＳＣＲＡＴＣＨＹ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー等が挙げられる。
【００２６】
本実施形態において、リアクターアレイ１は、リアクター２内の壁面２ａ及び底面２ｂの少なくとも一部に、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子６を備えている。
タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子６としては、タンパク質又はペプチド７中に存在するアミノ酸配列に親和性を有する分子が挙げられる。一例として、マルトース；グアニンヌクレオチド；ニッケル、コバルト等の金属イオン；グルタチオン；抗原等が挙げられる。
【００２７】
また、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子６として、核酸リンカーを用いてもよい。核酸リンカーはタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を含み、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分としてはピューロマイシンが代表的である。（特開２００８−１１６２１８号公報参照。）核酸リンカーの一例としてピューロマイシンリンカーが挙げられる。ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するタンパク質合成阻害剤である。タンパク質の連結部分としては、伸張中のタンパク質又はペプチドのＣ末端に特異的に結合する機能を有する限り、任意の物質を用いることができ、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（ＰＡＮＳ−アミノ酸）、または３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（ＡＡＮＳ−アミノ酸）などのピューロマイシン誘導体を用いることができる。図２に示すように、ピューロマイシンリンカー２０は、ＤＮＡ１３を転写してなるＲＮＡとハイブリダイズし得る配列と、タンパク質又はペプチド７を捕捉するピューロマイシン誘導体２０ａを有する。
【００２８】
タンパク質又はペプチド７が、ニッケル、コバルト等の金属イオンに親和性を有するポリヒスチジンを有する場合、該ポリヒスチジンとしては、ヘキサマー以上のものが好ましく用いられる。タンパク質又はペプチド中にポリヒスチジンを含ませるためには、ＰＣＲ等で予めＤＮＡの末端に該ポリヒスチジンをコードする塩基配列を付加しておくことが好ましい。
【００２９】
リアクター２が有する前記開口形状は任意であるが、少なくとも１つのビーズを充填可能な形状であることが好ましい。例えば、リアクター２が有する前記開口形状は、円形状、四角状、六角状、ライン状、などであってもよい。
【００３０】
本実施形態においては、前記工程（ａ）と後記工程（ｃ）の間に、リアクター２を密閉する工程（ｂ）を有することが好ましい。
図１に示すように、工程（ｂ）として一例として、基板１５をリアクターアレイ１と重ね合わせる工程が挙げられる。また、基板１５に替えて、オイル等を用いて密閉してもよい。
【００３１】
前記工程（ｂ）において用いられる基板１５としては、ガラス基板、シリコン基板、ポリマー基板、金属基板等が挙げられる。ガラス基板としてはＰＤＭＳでコートされたガラス基板が好ましい。リアクター２を密閉する際には、例えばプレス機を用いて密閉する。
また、架橋が途中段階のＰＤＭＳでコートされたガラス基板を用いてもよい。架橋が途中段階のＰＤＭＳは、粘着性を有するため、リアクターアレイ１と重ね合わせることにより、リアクター２内の固相担体に固定されたＤＮＡがＰＤＭＳ上に凹版印刷される。これにより、後記工程（ｃ）で合成・固定されるタンパク質又はペプチド７に対応する核酸を、位置情報を変更することなく、ＰＤＭＳ上にプリントすることができる。
【００３２】
工程（ｃ）は、前記リアクター２内において、前記無細胞合成系９を用いて前記核酸からタンパク質又はペプチド７を合成し、前記タンパク質又はペプチド７を前記リアクター２内に固定する工程である。
【００３３】
無細胞合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。再構成型無細胞タンパク質合成系は、従来の細胞抽出液を使用する場合よりもヌクレアーゼやプロテアーゼの混入を容易に防ぐことができるため、翻訳効率を高めることができる。
このような系を用いることにより、前記リアクター２内においてタンパク質又はペプチドが製造される。
【００３４】
前記工程（ｃ）において、無細胞合成系９に用いられる核酸がＤＮＡ１３である場合には、無細胞転写系を用いて前記ＤＮＡ１３からＲＮＡを合成する工程が含まれる。前記ＲＮＡは、スクリーニングすべきタンパク質又はペプチドをコードする固定されたＤＮＡ１３から、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
また、簡便であることから、転写翻訳がカップルした系を用いてもよい。
【００３５】
また、図２に示されるように、タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子として、ピューロマイシンリンカー２０を用いる場合、ＤＮＡ１３から合成されたＲＮＡ２１がピューロマイシンリンカー２０中の配列とハイブリダイズする。
ピューロマイシンリンカー２０が、可逆的光連結性塩基を有する場合には、光照射によりリアクター２内に固定される。
【００３６】
工程（ｃ）において、前記タンパク質又はペプチド７の合成に続いて、前記タンパク質又はペプチド７のリアクター２内への固定化が行われる。
一例として、工程（ａ）において、リアクターアレイ１のリアクター２に、必要な試薬や材料（核酸）を添加した後に、工程（ｂ）において、リアクターアレイ１に封をし、密閉状態にする。工程（ｃ）において、試薬を混ぜた先から、ＤＮＡ→ＲＮＡ→タンパク質又はペプチドの一連の転写／翻訳反応が進行し、さらに翻訳されたタンパク質又はペプチド７が、リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定されたタンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子６と結合する。
タンパク質又はペプチド７のリアクター２内への固定化の後、基材１５又はオイルを除去して、リアクター２の密閉状態を解除することが好ましい。
【００３７】
工程（ａ）〜（ｃ）を経て、タンパク質又はペプチド７が固定されたリアクターアレイ１をＰＢＳ等で洗浄することが好ましい。
【００３８】
本実施形態のタンパク質又はペプチドの製造方法によれば、固相担体に固定された核酸を用いることにより、製造されたタンパク質アレイ又はペプチドアレイのリアクターに固定されたタンパク質又はペプチド７を同定することができ、リアクターに配置した核酸の情報を予め得ておく必要がない。
【００３９】
［第２実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法は、
（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、固相担体に固定されたＤＮＡと無細胞合成系を用意する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記ＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程と、、を有する。
以下、図２を参照しながら、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法について具体的に説明する。図２において、図１の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００４０】
第１実施形態で述べた前記タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子に替えて、本実施形態に係る工程（ａ）では、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカー（特開２００８−１１６２１８号公報参照。）を用いる。核酸リンカーの一例としてピューロマイシンリンカーが挙げられる。
図２に示すように、ピューロマイシンリンカー２０は、固相担体に固定されたＤＮＡ１３を転写してなるＲＮＡ２１とハイブリダイズし得る配列と、タンパク質又はペプチド７を捕捉するピューロマイシン誘導体２０ａを有する。
また、本実施形態に係る工程（ａ）では、固相担体に固定されたＤＮＡを用いる。
【００４１】
本実施形態においても、前記工程（ａ）と後記工程（ｃ）の間に、リアクター２を密閉する工程（ｂ）を有することが好ましい。
図２に示すように、工程（ｂ）として一例として、基板１５をリアクターアレイ１と重ね合わせる工程が挙げられる。また、基板１５に替えて、オイル等を用いて密閉してもよい。
【００４２】
工程（ｃ）は、前記リアクター２内において、無細胞合成系９を用いて前記核酸からｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチド７を合成し、前記タンパク質又はペプチド７を前記リアクター２内に固定する工程である。
前記工程（ｃ）において、無細胞合成系９に用いられる核酸がＤＮＡ１３であり、無細胞転写系もしくは無細胞転写翻訳系中のＲＮＡポリメラーゼを用いて前記ＤＮＡ１３からＲＮＡ２１を転写する工程が含まれる。ＲＮＡ２１は、ＤＮＡ１３から、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させることにより得られる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００４３】
次いで、ＤＮＡ１３から合成されたＲＮＡ２１がピューロマイシンリンカー２０中の配列とハイブリダイズする。
ピューロマイシンリンカー２０が、可逆的光連結性塩基を有する場合には、光照射を行い、リアクター２内にピューロマイシンリンカー２０−ＲＮＡ２１複合体を固定することが好ましい。
次いで、第１実施形態における工程（ｃ）と同様に無細胞翻訳系により、ピューロマイシンリンカー２０−ＲＮＡ２１複合体からタンパク質又はペプチド７の合成が行われ、合成されたタンパク質又はペプチド７が、リアクター内の壁面２ａ及び底面２ｂの少なくとも一部に固定されたピューロマイシンリンカー２０と結合し、ピューロマイシンリンカー２０−ＲＮＡ２１−タンパク質又はペプチド７複合体がリアクター２内に固定される。
タンパク質又はペプチド７のリアクター２内への固定化の後、基板１５又はオイルを除去して、リアクター２の密閉状態を解除することが好ましい。
【００４４】
工程（ａ）〜（ｃ）を経て、タンパク質又はペプチド７が固定されたリアクターアレイ１をＰＢＳ等で洗浄することが好ましい。本実施形態によれば、第１実施形態と同様に、リアクターに配置した核酸の情報を予め得ておく必要がない。
【００４５】
［第３実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法は、
（ａ）特定の開口形状を有したリアクターからなり、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを備えたリアクターアレイにおいて、前記リアクター内に、ＤＮＡと無細胞合成系を用意する工程と、
（ｃ）前記リアクター内において、前記無細胞合成系を用いて前記ＤＮＡからｍＲＮＡを転写し、前記核酸リンカーにハイブリダイズした前記ｍＲＮＡからタンパク質又はペプチドを合成し、前記タンパク質又はペプチドを前記リアクター内に固定する工程と、を有する。
以下、図３を参照しながら、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法について具体的に説明する。図３において、図１及び図２の模式図に示されたものと同じ構成要素には、同一の符号を付して説明を省略する。
【００４６】
第２実施形態で述べた固相担体に固定されたＤＮＡに替えて、本実施形態に係る工程（ａ）では、固相担体に固定されていないＤＮＡを用いる。
リアクターにＤＮＡを分配する方法は固相担体を用いる方法に限られず、１ウェル１分子になるようにＤＮＡを限界希釈してリアクターに展開する方法等が挙げられる。
【００４７】
本実施形態のタンパク質又はペプチドの製造方法によれば、タンパク質又はペプチド捕捉分子６及び磁気ビーズ１４を用いずともピューロマイシンリンカー２０のみを用いることにより、核酸及びタンパク質又はペプチドをリアクター内に固定化することができる。
また、第１〜２実施形態と同様に、リアクターに配置した核酸の情報を予め得ておく必要がない。
【００４８】
≪機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法≫
本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法は、（ｄ）上述した製造方法を用いて製造されたタンパクアレイ又はペプチドアレイを用いて、機能性スクリーニングを行い、リアクターを特定する工程を有する。
【００４９】
［第１実施形態］
以下、図１を参照しながら、本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法について具体的に説明する。
【００５０】
本実施形態において、工程（ｄ）は、上述した第１実施形態の製造方法により得られたタンパクアレイ又はペプチドアレイを用いて、リアクター２内に固定された前記タンパク質又はペプチド７に対して、機能性スクリーニングを行い、リアクターを特定する工程である。
機能性スクリーニング方法としては、リアクターアレイ上のリアクターから所望の特性を有するタンパク質を有するリアクターを特定するためのものであれば特に限定されない。
一例として、リアクター２内にタンパク質又はペプチド７及び核酸を保持したままリアクター２内の無細胞質合成系９を除去し、洗浄し、リアクター２内をタンパク質機能評価溶液で満たすことが好ましい。
次いで、基板１５又はオイル等でリアクターを封止し、各リアクターを独立させ、タンパク質機能評価反応を行い、目的とする機能を有するタンパク質又はペプチドが固定化されているリアクターを特定することが好ましい。
【００５１】
例えば、スクリーニング対象のタンパク質が酵素である場合、機能性スクリーニングとしては、酵素活性測定系が挙げられる。具体的な手法としては、リアクター２内にタンパク質の活性を測定するために必要な溶液（酵素活性測定系）を添加し、酵素反応を生じさせることで、リアクターアレイ上のタンパク質の活性を測定する手法が挙げられる。
【００５２】
例えば、スクリーニング対象のタンパク質が抗体である場合、機能性スクリーニングとしては、抗原との結合活性測定系が挙げられる。
【００５３】
また、酵素活性又は結合活性の測定法としては、従来公知の方法が用いられ、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ法）、エバネッセント場分子イメージング法、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、蛍光偏光解消法、蛍光相関分光法、表面プラズモン共鳴法等が挙げられる。
【００５４】
本実施形態において、更に、前記工程（ｄ）の前に、リアクター１２内の核酸を回収する工程（ｅ）を有することが好ましい。回収方法としては、リアクターアレイ１と同じ配列のリアクターアレイを用意し、該リアクターアレイに位置情報を変更することなく、磁気ビーズに固定されたＤＮＡを再配置する方法が挙げられる。
工程（ｅ）を有することにより、工程（ｄ）において機能性スクリーニングの後に、特定したリアクター２に固定されたタンパク質又はペプチド７を同定することができ、リアクター２に配置した核酸の情報を予め得ておく必要がない。
また、リアクター２内に固定されたタンパク質又はペプチド７以外の夾雑物を取り除き、工程（ｄ）に係る機能性スクリーニングの精度を高める観点からも、本実施形態において、工程（ｄ）の前に核酸を回収する工程（ｅ）を有することが好ましい。
【００５５】
また、前記工程（ｅ）は、前記工程（ｂ）で磁気ビーズとの親和性を有する基板を前記リアクターアレイと重ね合わせることにより、核酸を前記基板上にプリントする工程であってもよい。一例として、工程（ｂ）で架橋が途中段階のＰＤＭＳでコートされたガラス基板を用い、リアクターアレイ１と重ね合わせることにより、核酸をＰＤＭＳ上にプリントする工程が挙げられる。
【００５６】
また、工程（ｅ）を有することにより、回収した核酸を再利用することができる。
【００５７】
次いで、本実施形態において、更に、前記工程（ｄ）で特定されたリアクターに対応する核酸の塩基配列を解析する工程（ｆ）を有することが好ましい。塩基配列の解析方法としては、回収した核酸をＰＣＲ等により増幅し、ＤＮＡシーケンサーを用いた従来公知の方法が挙げられる。
また、工程（ｆ）に替えて、特定されたリアクターに固定されたタンパク質又はペプチドを、プロテアーゼを用いてペプチド分解し、分解されたペプチドをマススペクトルにより分析して、タンパク質又はペプチドの同定をしてもよい。
【００５８】
［第２実施形態］
以下、図２を参照しながら、本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法について具体的に説明する。
本実施形態において、工程ｄ）は、上述した第２実施形態の製造方法により得られたタンパクアレイ又はペプチドアレイを用いて、リアクター２内に固定された前記タンパク質又はペプチド７に対して、機能性スクリーニングを行い、リアクターを特定する工程である。
【００５９】
本実施形態においても、更に、前記工程（ｄ）の前に、リアクター２内の核酸を回収する工程（ｅ）を有することが好ましい。回収方法としては、上述した磁気ビーズに固定されたＤＮＡを再配置する方法以外に、ピューロマイシンリンカー２０が可逆的光連結性塩基を有する場合には、光照射により、可逆的光連結性塩基を光開裂させ、リアクター２から核酸を解離し、回収する方法が挙げられる。
他の工程については、第１実施形態と同様であるため説明を省略する。
【００６０】
［第３実施形態］
以下、図３を参照しながら、本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法について具体的に説明する。
本実施形態において、工程（ｄ）は、上述した第３実施形態の製造方法により得られたタンパクアレイ又はペプチドアレイを用いて、リアクター２内に固定された前記タンパク質又はペプチド７に対して、機能性スクリーニングを行い、リアクターを特定する工程である。
【００６１】
本実施形態においても、更に、前記工程（ｄ）の前に、リアクター２内の核酸を回収する工程（ｅ）を有することが好ましい。回収方法としては、ピューロマイシンリンカー２０が可逆的光連結性塩基を有する場合には、光照射により、可逆的光連結性塩基を光開裂させ、リアクター２から核酸を解離し、回収する方法が挙げられる。
他の工程については、第１〜２実施形態と同様であるため説明を省略する。
【００６２】
従来の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法においては、個々に壁を有さないアレイを用いるため、合成したタンパク質又はペプチドの機能性スクリーニングの際に、別途リアクターアレイを必要とする。一方、本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法によれば、個々に壁を有するリアクターからなるリアクターアレイを用いるため、一枚のリアクターアレイでタンパク質又はペプチドの機能と配列を特定できる。また、ＤＮＡアレイからタンパク質アレイを製造する際、又は、タンパク質アレイを用いて機能性スクリーニングを行う際に必要とされていた、基板をリアクターに重ね合わせる際のアライメントを取る必要がない。
【００６３】
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイ≫
［第１実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、前記リアクター内に配置された、固相担体に固定された核酸及び該核酸にコードされるタンパク質又はペプチドと、を有するものである。
前記リアクターは、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定された、前記タンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子を有する。
【００６４】
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法≫の第１実施形態で述べたように、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、核酸が固相担体に固定されたものである。該核酸は、磁気ビーズに固定されたものであることが好ましい（図１参照）。
【００６５】
［第２実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、前記リアクター内に配置された、固相担体に固定されたＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるタンパク質又はペプチドと、を有するものである。
前記リアクターは、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定された、前記ＤＮＡから合成されるｍＲＮＡ及びタンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを有する。
【００６６】
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法≫の第２実施形態で述べたように、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、第１実施形態で述べたタンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子に替えて、タンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを用いたものである（図２参照）。
【００６７】
［第３実施形態］
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、特定の開口形状を有したリアクターからなるリアクターアレイと、前記リアクター内に配置された、ＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされるタンパク質又はペプチドと、を有するものである。
前記リアクターは、該リアクター内の壁面及び底面の少なくとも一部に固定された、前記ＤＮＡから合成されるｍＲＮＡ及びタンパク質又はペプチドを捕捉するタンパク質連結部分又はペプチド連結部分を有する核酸リンカーを有する。
【００６８】
≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法≫の第３実施形態で述べたように、本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイは、第２実施形態で述べた固相担体に固定されたＤＮＡに替えて、固相担体に固定されていないＤＮＡを用いたものである（図３参照）。
【００６９】
≪機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キット≫
本実施形態の機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キットは、上述した第１実施形態の≪タンパク質アレイ又はペプチドアレイ≫と、前記固相担体との親和性を有する基板と、を備える。
≪機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法≫の第１実施形態で述べたように、固相担体との親和性を有する基板をリアクターアレイと重ね合わせることにより、核酸を前記基板上にプリントすることができる。
【００７０】
本実施形態のタンパク質アレイ又はペプチドアレイ、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キットによれば、所望の機能を有するタンパク質又はペプチドを迅速に同定することができるため、進化分子工学的用途に好適に用いられる。
【００７１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
［石英ガラスリアクターの作製］
石英ガラスを濃硫酸(１５．５％)・ 過酸化水素水(１５．５％)混合液に浸漬し、２００℃で１５分間置き、石英ガラスをＳＰＭ洗浄した。超純水でリンス後、窒素ブローで石英ガラスを乾燥させた（図４（ａ）参照）。
スパッタリング装置(Ｃａｎｎｏｎ ＡＮＥＬＶＡ  ＳＰＦ−４３０Ｈ)を用いて、Ａｒ気流下で石英ガラスへＣｒをスパッタし、石英ガラス上へ厚さ約４μｍの薄膜を形成した（図４（ｂ）参照）。
次いで、ポジ型フォトレジスト ＡＺＰ１３５０をＣｒ薄膜上にスピンコートして、１００℃９０秒プリべイクし、フォトレジスト膜を形成した（図４（ｃ）参照）。
次いで、紫外線露光装置マスクアライナー(Ｄｏｕｂｌｅ−Ｖｉｅｗ  Ｍａｓｋ  Ａｌｉｇｎｅｒ  ＰＥＭ−８００, ｕｎｉｏｎ)を用いて、マスクパターンを介してＵＶ露光した（図４（ｄ）参照）。
次いで、ＡＺ  Ｄｄｅｖｅｌｏｐｅｒを用いて ６０秒間現像し、超純水で洗浄後Ｎ２ドライし、１２０℃２ｍｉｎポストベイクし、パターンの現像をした（図４（ｅ）参照）。
次いで、Ｃｒエッチング溶液（硝酸二アンモニウムセリウム ６５．８ｇ, 過塩素酸１７．２ｍｌ, 超純水 ４００ｍｌ)を用いてＣｒ薄膜のパターンエッチングを行った（図４（ｆ）参照）。超純水に浸漬後、窒素ブローで乾燥させた。
次いで、アセトンに浸漬後、５分間超音波洗浄後してフォトレジストを除去し、窒素ブローで乾燥させた（図４（ｇ）参照）。
次いで、Ｃ４Ｆ８／ＳＦ６プラズマを用いて、深さ６０μｍまで石英をドライエッチングした（図４（ｈ）参照）。
次いで、Ｃｒエッチング溶液に２４０ｍｉｎ浸漬し、石英ガラスを濃硫酸（４６．５％） 過酸化水素水（１５．５％）混合液に浸漬し、２００℃で１５分間置いてＣｒ薄膜を除去した後、超純水でリンスし、深さ６０μｍ、直径１４０μｍのリアクターを有する石英ガラスリアクターを作製した（図４（ｉ）参照）。【００７３】
［石英ガラスリアクターのＮｉ−ＮＴＡ修飾］
ＳＰＭ洗浄した石英ガラスリアクターを１％３−アミノプルトリエトキシシラン（以下、ＡＰＴＥＳともいう。）水溶液に浸し、９０℃６０分反応させた。エタノールと超純水で洗浄した後、１１０℃で１分間キュアリングし、石英ガラスリアクターをアミノ基で修飾した（図５工程（Ｂ１）参照）。
次いで、石英ガラスリアクターを１２．５％グルタルアルデヒド水溶液に６０℃６０分間浸し、アルデヒド修飾を行った（図５工程（Ｂ２）参照）。
次いで、石英ガラスリアクターをＮ−（５−Ａｍｉｎｏ−１−ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｔｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＢ−ＮＴＡ）２ｍｇ／ｍｌに６０℃６０分間浸し、ＮＴＡ修飾を行った（図５工程（Ｂ３）参照）。
次いで、石英ガラスリアクターを１４ｍｇ／ｍｌ Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ に室温で６０分間浸して、未反応アルデヒド基をブロッキングした。
次いで、１０ｍｇ／ｍｌ  ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏに６０分間浸して、Ｎｉイオンを付加し、超純水で洗浄後、窒素ブローで乾燥させた（図５工程（Ｂ４）参照）。【００７４】
［無細胞転写翻訳溶液の製造］
配列番号１に記載のＢＧＬおよびＨｉｓＴａｇをコードしたＤＮＡ（１６８７ｂｐ）２０ｎｇ、Ｆｌｕｏｒｏｔｅｃｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ社）５μｌ、及び無細胞転写・翻訳システム（ＴＮＴ（登録商標）Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｗｈｅａｔｇｅｒｍ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）５０μｌを混合し、無細胞転写翻訳溶液を得た。【００７５】
［ＢＧＬの合成及び固定化］
Ｎｉ−ＮＴＡ修飾石英ガラスリアクター上に、上記無細胞転写翻訳溶液５０μｌを滴下し、この滴下表面に、プレス機を用いて、ＰＤＭＳ（東レ・ダウコーニング社）コートガラスを、３０℃２時間圧着させた。
次いで、ＰＤＭＳコートガラスを除去し、このリアクターを有する石英ガラスリアクターを０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｍ２０を含むリン酸緩衝液で５分間洗浄した。洗浄後のガラスリアクター上に１ｘＰＢＳを滴下し、カバーガラスを載せて共焦点レーザースキャン顕微鏡観察（Ｅｘ：４８８ｎｍ, Ｅｍ：５１５ＢＰ３０ｎｍ）を行った。共焦点レーザースキャン顕微鏡観察（Ｅｘ：４８８ｎｍ, Ｅｍ：５１５ＢＰ３０ｎｍ）を図６に示す。図６に示すように、石英ガラスリアクター上へのＢＧＬの固定化を確認した。【００７６】
次いで、窒素ブローで石英ガラスリアクター上のＰＢＳを除去し、基質として、レゾルフィン標識したグルコース（２．５μＭ ｒｅｓｏｌｆｉｎ−βグルコース）水溶液をリアクター上に滴下し、ＰＤＭＳコートガラス基板を上面から押つけることで、リアクターのリアクター内に溶液を封入した。
これを３０℃で保持し、共焦点レーザースキャン顕微鏡で経時観察した（Ｅｘ：５６１ｎｍ, Ｅｍ：５９０ＢＰ４０ｎｍ）。
酵素反応後の共焦点顕微鏡観察像を図７に示す。図６で示したＢＧＬの固定が確認されているリアクター中に酵素反応の結果生じる蛍光が時間依存的に観察された。【００７７】
また、同様に、ＢＧＬを固定化した石英ガラスリアクターの各リアクターにおける、酵素反応時間と、基質が分解することにより生じる蛍光強度との関係を示した結果を図８に示す。
図８に示すように、ＢＧＬを固定化したガラスマイクロウェルモールドでは、蛍光強度の上昇が時間依存的に上昇していることが観察された。
この結果から固定されたＢＧＬが評価可能な酵素活性を有していることが確認された。【００７８】
［ガラスリアクター内の磁気ビーズのＰＤＭＳシートを用いた回収］
ガラスリアクターに磁気ビーズを配置した。次いで、ガラスリアクターに、架橋が途中段階のＰＤＭＳ（東レ・ダウコーニング社）コートガラスをＰＤＭＳ面がガラスリアクターと接する様に重ね合わせた。次いで、ＰＤＭＳ（東レ・ダウコーニング社）コートガラスをガラスリアクターから剥がした（図９参照）。
結果を図１０に示す。（ａ）はガラスリアクターの顕微鏡像であり、（ｂ）はＰＤＭＳの顕微鏡像である。（ａ）に示すように、ガラスリアクター内の磁気ビーズは消失した一方、（ｂ）に示すようにＰＤＭＳ上に磁気ビーズがガラスリアクターに応じて回収されていることが確認された。また、図１０に示すように、複数のリアクターを有するリアクターアレイを用いた場合には、磁気ビーズはリアクターアレイの配列と対応してＰＤＭＳ上に配置される。このことから、ＰＤＭＳ上の磁気ビーズに固定された核酸とリアクター内に固定されたタンパク質との位置関係が確認できる（番地付け）。また、ＰＤＭＳ上の磁気ビーズは再利用することができる。
【符号の説明】
【００７９】
１…リアクターアレイ、２…リアクター、２ａ…壁面、２ｂ…底面、６…タンパク質捕捉分子又はペプチド捕捉分子、７…タンパク質又はペプチド、９…無細胞タンパク質合成系、１３…ＤＮＡ、１４…磁気ビーズ、１５…基板、２０…ピューロマイシンリンカー、２０ａ…ピューロマイシン誘導体、２１…ＲＮＡ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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