(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列から成るプロモーター。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターを含む遺伝子発現調節配列であるポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載の遺伝子発現調節配列であるポリヌクレオチド、及びそれに作動自在に連結された目的遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属するバクテリア細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項４または５に記載の宿主細胞を培養する段階と、
前記宿主細胞、またはそれを培養した培地で目的物質を分離する段階と、
を含む、目的物質を生産する方法。
【請求項７】
前記目的物質は、アミノ酸であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規プロモーター、及びそれを使用して目的物質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を利用して、Ｌ−アミノ酸、有機酸、核酸物質などの目的物質を高力価で生産するためには、微生物内のさまざまな代謝過程に係わる遺伝子の発現を選択的に調節しなければならない。そのうち、目的物質の生合成経路に関与する目的遺伝子の発現を強化させる必要があるが、代表的な手段としては、発現調節配列の変形を挙げることができる。前記発現調節配列の変形は、例えば、内在的プロモーターの代わりに、強いプロモーターで置換したり、内在的プロモーターに変異を与えたり、ＳＤ（Shine-Dalgarno）配列を変異させたりすることなどがある。そのうち、強いプロモーターで置換する方法が汎用されるので、有用なプロモーター開発が必須であるといえる。
【０００３】
しかし、公知された強いプロモーターは、制限されており、限定された微生物でのみ発現されたり、所望レベルほど多様な強度の力強い発現効果を示すことができない場合もある。
【０００４】
大腸菌由来ｔａｃプロモーターは、強いプロモーターとしてに広く知られており、コリネ型微生物の場合、自体遺伝子のプロモーターを形質転換させてプロモーターを開発してきた（Gene, 102, 93-98, 1991; Microbiology, 142, 1297-1309, 1996）。例えば、コリネバクテリウム・アンモニアジェネシス（Corynebacterium ammoniagenesis）由来プロモーターの場合、従来大腸菌で報告されたｔａｃプロモーターと比較し、約１０％向上しているということが公知されている（Biotechnol. Lett. 25, 1311-1316, 2003）。また、コリネバクテリウム・アンモニアジェネシス由来の強いプロモーターとして、多様な強度のＰｃｊ１〜７プロモーターが開発され、ｔａｃプロモーターより１０倍以上の力強いプロモーター活性を有する（大韓民国特許番号第１０−０６２００９２号）。また、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）由来のプロモーターの場合、ｔａｃプロモーターより強い活性を有すると報告されたが、ブレビバクテリウム属微生物以外では、発現が困難である（アメリカ特許第５，５９３，７８１号）。
【０００５】
そのために、本発明者らは、多様な微生物で多様な強度を有するプロモーター配列を有する領域を探索しているうち、発明の合成された新規プロモーターが多様な微生物で発現可能であり、公知された既存プロモーターに比べ、力強い発現効果を示すということを確認し、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新規プロモーター、並びにそれを含む遺伝子発現調節配列及びベクター、前記ベクターを含む宿主細胞、及びそれを利用して目的物質を生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の具体的な一様態は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーターを提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の新規プロモーターは、目的遺伝子の発現を誘導する微生物によって多様な活性を有することができる。それにより、目的物質の生産時、必要によって、目的遺伝子の活性を調節しなければならない場合、本発明の新規プロモーターを使用することができ、効率的に目的物質を生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の具体的な一様態は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーターを提供する。本発明においては、前記配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーターを「ｏ２プロモーター（以下「Ｐｏ２」ともいう）」で命名した。
【００１０】
本発明において用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、それと作動自在に連結されている遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域を意味し、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置することができる。
【００１１】
本発明のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、最近のさまざまな研究技法、例えば、方向性進化法（directed evolution）または部位特異突然変異技術（site-directed mutagenesis）などの方法を介して、一定程度変形が可能である。例えば、前記配列番号１のヌクレオチド配列と、７０％以上、８０％以上、９０％以上または９５％以上の配列相同性を有するプロモーターも、本発明の範囲内に含まれる。
【００１２】
本発明において用語「相同性」は、与えられたポリヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、百分率で表示される。本明細書において、与えられたポリヌクレオチド配列と同一であるか、あるいは類似した活性を有するその相同性配列が、「％相同性」で表示される。例えば、点数（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などの媒介変数（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ ２．０を利用したり、定義された厳格な条件下で、サザン混成化実験によって配列を比較することによって確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当業者に周知されている方法で決定される（例：Sambrook etal., 1989, infra 参照）。
【００１３】
本発明の具体的な他の一様態は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む遺伝子発現調節配列を提供する。
【００１４】
用語「発現調節配列（expression control sequence）」は、特定の宿主生物において、作動自在に連結されたコーディング配列の発現に使用されるＤＮＡ配列を意味する。かような調節配列は、転写を実施するためのプロモーター以外に、かような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適するｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列、並びに転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。例えば、原核生物に適する調節配列は、プロモーター、任意のオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。本発明のｏ２プロモーターを含む遺伝子発現調節配列は、通常の当業者によって、必要によって、前述のところのような遺伝子発現調節配列を構成することができる。
【００１５】
本発明の具体的な他の一様態は、前記遺伝子発現調節配列、及びそれに作動自在に連結された目的遺伝子を含むベクターを提供する。
【００１６】
用語「作動自在に連結された（operatively linked）」は、遺伝子発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と異なるヌクレオチド配列間の結合を意味し、それによって、前記調節配列は、前記他のヌクレオチド配列の転写及び／または解読を調節することができる。
【００１７】
用語「ベクター」は、適する宿主内において、目的タンパク質を発現させることができるように、適する発現調節配列に作動自在に連結された前記目的タンパク質をコーディングするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物でもある。また、そこに多数のヌクレオチド配列が結合されたり組み換えされたりして、適切な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物のＤＮＡ配列及びプロモーター断片を、細胞内に導入することもできる。該ベクターは、適する宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと係わりなく複製されたり機能したりするか、あるいはゲノムそれ自体に統合されもする。また、前記ベクターは、前記プロモーターまたはその変異体、及び目的遺伝子以外に、複製基点、プロモーター調節部位、リボゾーム結合部位、転写終結部位、選別マーカー、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
【００１８】
本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであるならば、特別に限定されるものではなく、当業界に公知の任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態であったり組み換えされたりする状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを有することができる。例えば、バクテリオベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ及びCharon２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐBluescriptＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができるが、それらに限定されるものではない。
【００１９】
前記目的遺伝子は、過量で発現させようとする産物をコーディングする遺伝子であり、例えば、アミノ酸（例えば、Ｌ−アミノ酸）、有機酸、及びそれらの組み合わせによって構成された群から選択された産物の生産に関与する遺伝子でもある。具体的には、目的遺伝子は、アミノ酸生合成に係わる酵素をコーディングする遺伝子、還元力に係わる酵素をコーディングする遺伝子、有機酸生合成に係わる酵素をコーディングする遺伝子、目的産物の排出に係わるタンパク質をコーディングする遺伝子などでもあるが、それらに制限されるのではない。
【００２０】
本発明の具体的な他の一様態は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む遺伝子発現調節配列、及びそれに目的遺伝子が作動自在に連結されたベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２１】
前記宿主細胞は、配列番号１のヌクレオチド配列を有するプロモーターを含む遺伝子発現調節配列、及びそれに目的遺伝子が作動自在に連結されたベクターを導入することができる微生物であるならば、特別にその種類が制限されるものではない。原核細胞または真核細胞いずれも可能であるが、具体的には、原核細胞でもある。例えば、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物菌株が含まれてもよい。さらに具体的には、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属する微生物菌株でもある。一層具体的には、大腸菌（Escherichia coli）、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）またはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）でもある。
【００２２】
前記ベクターの導入は、当該分野に公知されているように、宿主細胞によって、適する技術を選択して行われる。前記導入は、例えば、電気穿孔法（electroporation）、熱衝撃（heat-shock）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、陽イオンリポソーム法、酢酸リチウム−ＤＭＳＯ法、またはそれらの組み合わせによっても行われるが、それらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明の具体的な他の一様態は、前記プロモーターを含む遺伝子発現調節配列、及びそれに作動自在に連結された目的遺伝子を含むベクターを含む宿主細胞を培地で培養する段階と、前記宿主細胞またはそれを培養した培地で目的物質を分離する段階と、を含む目的物質を生産する方法を提供する。
【００２４】
前記目的物質は、アミノ酸（例えば、Ｌ−アミノ酸）、有機酸、及びそれらの組み合わせによって構成された群からも選択される。用語「アミノ酸」または「Ｌ−アミノ酸」は、一般的に、アミノ基とカルボン酸基とが同一炭素原子に結合されている生物体を構成するタンパク質の基本構成単位を意味する。前記アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、ジヨードチロシン（diiodotyrosine）、リシン、アルジニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、オキシプロリン、及びそれらの組み合わせによって構成された群からも選択されるが、それらに限定されるものではない。用語「有機酸」は、酸性を帯びる有機化合物であり、具体的には、カルボン酸基とスルホン基とが入っている有機化合物でもある。有機酸の例としては、乳酸、酢酸、コハク酸、ブチル酸、パルミチン酸、シュウ酸、酒石酸、プロピオン酸、ヘキセン酸、カプリン酸、カプリル酸、吉草酸またはクエン酸を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。
【００２５】
前記宿主細胞の培養は、当該分野に公知された一般的な方法によって行われる。前記培養に使用される培地は、糖源として、例えば、グルコース、サッカロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、セルロースのような糖、及び炭水化物；大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸；グリセロール、エタノールのようなアルコール；酢酸のような有機酸を個別的または混合物として含んでもよいが、それらに限定されるものではない。前記培地は、窒素源として、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆ミール及び尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムを個別的にまたは混合物として含んでもよいが、それらに限定されるものではない。前記培地は、リン源として、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。前記培地は、例えば、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。また、前記培養において、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質、または適切な前駆体が培養物に添加される。前記物質は、培養過程において、培養物に適切な方式、例えば、回分式または連続式で添加される。
【００２６】
また、培養内に、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加し、培養液のｐＨを調整することができる。また、培養内に、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して、気泡生成を抑制することができる。培養液の好気状態を維持するために、培養液内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入することができる。該培養液の温度は、一般的に、２０℃ないし４５℃、例えば、２５℃ないし４０℃でもある。培養期間は、所望する目的物質の生成量が得られるまで持続され、例えば、１０ないし１６０時間でもある。
【００２７】
前記宿主細胞、またはそれを培養した培地から目的物質を分離する方法は、当該分野に公知された適する反応を利用して目、的物質を分離または回収することができる。例えば、タンパク質沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子体クロマトグラフィー（ゲル濾過）・吸着クロマトグラフィー・イオン交換クロマトグラフィー・親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、及びそれらの方法の組み合わせでもあるが、それらに限定されるものではない。前記方法を使用して、宿主細胞または培地から生産された目的物質を収集、回収または分離することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明について、実施例によって、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
【００２９】
実施例１：新規プロモーターを含む組み換えベクター及び形質転換菌株の作製
（１）Ｐｏ２を含む組み換えベクター及び形質転換菌株の作製
目的遺伝子の発現を誘導するプロモーターを合成するために、コリネバクテリウム属微生物とエシェリキア属微生物とに由来の多様なプロモーター配列を分析し、配列番号１のヌクレオシドを有するプロモーターを合成し、それをｏ２プロモーター（以下、「Ｐｏ２」と称する）と命名した。Ｐｏ２の発現誘導活性を測定するために、Ｐｏ２を、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦと作動自在に連結して組み換えベクターを製造し、それをコリネ型細菌及び大腸菌に形質転換し、形質転換菌株をそれぞれ作製した。
【００３０】
また、目的物質の生産に活用することができる例として、Ｌ−アミノ酸のうちＬ−アルジニン、または分枝鎖アミノ酸の一種であるＬ−バリン生産能が向上した菌株を作製するために、Ｐｏ２を利用して、アルジニン生合成主要遺伝子またはバリン生合成主要遺伝子を強化させた形質転換菌株をそれぞれ作製した。
【００３１】
（１．１）ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐベクター及び形質転換菌株の作製
（１．１．１）ベクターの作製
合成作製したプロモーターＰｏ２をテンプレートに、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位を含む配列番号２及び配列番号３をプライマーとして利用してＰＣＲを行った。該ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、７２℃で３０秒間重合を３０回反復した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、約１００ｂｐのＰｏ２を得た。
【００３２】
ｐＧＦＰｕｖベクター（clontech社、米国）をテンプレートに、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位を含む配列番号４及び配列番号５をプライマーとして利用して、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間重合を３０回反復した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦ（open reading frame）を含む配列番号６を得た。
【００３３】
大腸菌及びコリネ型細菌において発現可能なシャトルベクターであるｐＥＣＣＧ１１７（Biotechnology letters vol 13, No. 10, p. 721-726 (1991)）のＰｓｔＩとＫｐｎＩとの位置で、制限酵素ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＶでそれぞれ処理された、Ｐｏ２とＧＦＰとの遺伝子のＯＲＦをＤＮＡ接合酵素を利用して、作動自在に連結することにより、最終的に、Ｐｏ２がＧＦＰと連結されている組み換えベクターを作製し、それをｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐと命名した。
【００３４】
（１．１．２）形質転換菌株の作製
ベクターｐＥＣＣＧ１１７、及び前述のところで作製された組み換えベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐを、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に、電気パルス法（Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52: 541-545）でそれぞれ形質転換した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含んだ選別培地において形質転換菌株を獲得し、それをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐとそれぞれ命名した。
【００３５】
また、前述のところで作製された組み換えベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐを、大腸菌ＤＨ５αに熱衝撃法で形質転換した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含んだルリアベルターニ（ＬＢ）寒天培地で形質転換菌株を獲得し、それをＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐとし、ＣＡ０１−２２９０と命名した後、ブダペスト条約下に国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に、２０１４年１０月２３日付けで寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１５９１Ｐを受けた。
【００３６】
（１．２）ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ａｒｇＪベクター及び形質転換菌株の作製
（１．２．１）ベクターの作製
アルジニン生合成主要遺伝子である、二機能性性オルニチンアセチルトレンスフェラーゼ（bifunctional ornithine acetyltransferase）／Ｎ−アセチルグルタメート合成酵素（acetylglutamate synthase）をコーディングするａｒｇＪ（Ｎｃｇｌ１３４１、配列番号７）がｏ２プロモーターによって発現されるベクターを作製するために、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐを利用して、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ａｒｇＪベクターを作製した。
【００３７】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３８６９染色体をテンプレートに、配列番号８と９とのプリマーを利用してＰＣＲを行い、ａｒｇＪが含まれたＤＮＡ断片を確保した。９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で２分間重合する条件を、Ｐｆｕポリメラーゼで３０回反復するＰＣＲ方法を介して、５’領域に、ＥｃｏＲＶ制限酵素と３’ＰｓｔＩ制限酵素とのサイトを有した約１２０１ｂｐの断片を増幅した。前記得られたＰＣＲ断片を精製し、ＥｃｏＲＶ制限酵素とＰｓｔＩ制限酵素とが処理されたｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐと混合し、インフュージョンクローニングキット（in-fusion cloning kit）を利用して連結してベクターを作製し、それをｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ａｒｇＪと命名した。
【００３８】
（１．２．２）形質転換菌株の作製
前記作製された組み換えベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ａｒｇＪを、アルジニン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（大韓民国登録特許第１０−０７９１６５９号）に電気パルス法で形質転換した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含んだ選別培地で形質転換菌株を獲得し、それをＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ａｒｇＪと命名した。
【００３９】
（１．３）ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥベクター及び形質転換菌株の作製
（１．３．１）ベクターの作製
バリン生合成主要遺伝子である、分枝鎖アミノ酸アミノトレンスフェラーゼ（branched-chain amino acid aminotransferase)をコーディングするｉｌｖＥ（Ｎｃｇｌ２１２３、配列番号１０）が、Ｐｏ２によって発現されるベクターを作製するために、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐを利用して、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥベクターを作製した。
【００４０】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１４０６７染色体をテンプレートに、配列番号１１と１２とのプリマーを利用してＰＣＲを行い、ｉｌｖＥが含まれたＤＮＡ断片を確保した。９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間アニーリング、７２℃で２分間重合する条件を、Ｐｆｕポリメラーゼで３０回反復するＰＣＲ方法を介して、５’領域に、ＥｃｏＲＶ制限酵素と３’ＰｓｔＩ制限酵素とのサイトを有した約１１０４ｂｐの断片を増幅した。前記得られたＰＣＲ断片を精製し、ＥｃｏＲＶ制限酵素とＰｓｔＩ制限酵素とが処理されたｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐと混合し、インフュージョンクローニングキット（in-fusion cloning kit）を利用して連結してベクターを作製し、それをｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥと命名した。
【００４１】
（１．３．２）形質転換菌株の作製
前記作製された組み換えベクターｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥを、バリン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミクムＫＣＣＭ１１１２０１Ｐ（大韓民国登録特許第１０−１１１７０２２号）に電気パルス法で形質転換した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／Ｌを含んだ選別培地で形質転換菌株を獲得し、それをＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥと命名した。
【００４２】
比較例１：対照群プロモーターを含む組み換えベクター及び形質転換菌株の作製
本比較例では、Ｐｏ２の発現油も活性程度を確認するために、ＧＦＰを利用して、従来公知された強いプロモーター（Ｐｔｒｃ、Ｐｃｊ１、Ｐｃｊ４、Ｐｃｊ７（大韓民国登録特許第１０−０６２００９２号））または野生型プロモーター（ａｃｅＥＰ（ＷＴ））を、ＧＦＰ遺伝子のＯＲＦと作動自在に連結して組み換えベクターを製造し、それをコリネ型細菌及び大腸菌に形質転換し、形質転換菌株をそれぞれ作製した。
【００４３】
また、Ｐｏ２を利用した生合成主要遺伝子を強化させた形質転換菌株を評価するために、アルジニン生合成主要遺伝子またはバリン生合成主要遺伝子を強化させた形質転換菌株をそれぞれ作製した。
【００４４】
（１）Ｐｏ２の活性比較のための他のプロモーターを有するｇｆｐ発現ベクター及びコリネバクテリウム・グルタミクム形質転換菌株の作製
米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Genbank）を基にして、ａｃｅＥＰ（ＷＴ）の塩基配列を確保し、野生型コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の染色体をテンプレートにし、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位を含む配列番号１３及び配列番号１４をプライマーとして利用し、前記実施例１の（１．１）と同一方法で組み換えベクターを作製し、ｐＥＣＣＧ１１７−ａｃｅＥＰ（ＷＴ）−ｇｆｐと命名した。
【００４５】
前述のところで作製したベクターを、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐベクター、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐベクター、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐベクター（大韓民国登録特許第１０−０６２００９２号）と共に、前記実施例１の（１．１）と同一方法で形質転換したコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を作製し、それぞれＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−ａｃｅＥＰ（ＷＴ）−ｇｆｐ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐ及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐと命名した。
【００４６】
（２）Ｐｏ２の活性比較のための他のプロモーターを有するｇｆｐ発現ベクター及び大腸菌形質転換菌株の作製
米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ Genbank）を基にして、Ｐｔｒｃの塩基配列を確保し、ｐＴｒｃ９９Ａ（ＮＣＢＩGenBank、Ｍ２２７４４）をテンプレートにし、ＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶ切断部位を含む配列番号１５及び配列番号１６をプライマーとして利用し、前記実施例１の（１．１）と同一方法で組み換えベクターを作製し、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｔｒｃ−ｇｆｐと命名した。
【００４７】
前述のところで作製したベクターを、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐベクター、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐベクターと共に、前記実施例１の（１．１）と同一方法で形質転換した大腸菌菌株を作製し、ＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｔｒｃ−ｇｆｐ、ＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐ及びＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐと命名した。
【００４８】
（３）Ｐｏ２の物質生産能比較のための他のプロモーターを有する形質転換菌株の作製
（３．１）アルジニン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクム形質転換菌株の作製
プライマーとして、配列番号９及び配列番号１７を利用したことだけを除いては、前記実施例１の（１．２．１）と同一方法で、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐベクターを利用してベクターを作製し、それをｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＪと命名した。
前述のところで作製したベクターでもって、前記実施例１の（１．２．２）と同一方法で形質転換した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＪと命名した。
【００４９】
（３．２）バリン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミクム形質転換菌株の作製
プライマーとして、配列番号１２及び配列番号１８を利用したことだけを除いては、前記実施例１の（１．３．１）と同一方法で、ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐベクターを利用してベクターを作製し、それをｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｉｌｖＥと命名した。
【００５０】
前述のところで作製したベクターでもって、前記実施例１の（１．３．２）と同一方法で形質転換した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｉｌｖＥと命名した。
【００５１】
実施例２：Ｐｏ２の発現誘導活性確認
（１）コリネバクテリウム・グルタミクムでのＰｏ２の発現誘導活性確認
コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、Ｐｏ２の発現誘導活性を確認するために、前記実施例１の（１．１．２）で作製した形質転換菌株ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐのＧＦＰ活性を、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７、及び比較例１の（１）で作製したＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−ａｃｅＥＰ（ＷＴ）−ｇｆｐ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐ及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐのＧＦＰ活性と比較した。
【００５２】
種培地２５ｍｌが込められた２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに、前記形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミクム菌株を２０分の１の比率でそれぞれ接種し、３０℃で培養中期（ＯＤ６００＝１０．０）まで振盪培養（２００ｒｐｍ）した。培養液から、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１５分）を介して菌体を収去し、０．１％ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝溶液に、６１０ｎｍの濁度が１６０ほどになるように懸濁した。懸濁液１．５ｍｌ当たり１．２５ｇのガラスビード（glass bead）を添加した後、ビードビータ（bead beater）を利用して、６分間菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）を介して、上澄み液を収去し、ブラッドフォード方法（Bradford, M. M 1976. Anal. Biochem. 72: 248-254）によるタンパク質濃度を定量した。同一量の菌体抽出物に対して、Laure Gory法などを利用して、４８８ｎｍで励起光を照射し、５１１ｎｍ発出光を、ＬＳ−５０Ｂ分光光度計（spectrophotometer）（Perkin-Elmer）機器を利用して測定することにより、ＧＦＰ遺伝子の発現程度を測定し、下記表１に示した。
【００５３】
［種培地］
ブドウ糖２０ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１５０μｇ、チアミン塩酸塩１．５ｍｇ、カルシウムパントテン酸３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ（蒸溜水１リットル基準）、ｐＨ７．２
【００５４】
【表１】
0006469874.tif 000002
【００５５】
前記表１の結果から分かるように、Ｐｏ２は、コリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、プロモーター活性を有しているということを確認することができ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐは、野生型ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−ａｃｅＥＰ（ＷＴ）−ｇｆｐ菌株に比べ、約１３倍以上蛍光感度が高いということを確認することができた。また、強いプロモーターとして公知されているＰｃｊ１、Ｐｃｊ４及びＰｃｊ７を利用したＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐ、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐ及びＡＴＣＣ１３０３２／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｇｆｐよりも蛍光感度がはるかに高いということを確認することができた。前記結果により、Ｐｏ２は、目的遺伝子を力強く発現させることができる強いプロモーターであるということが分かる。
【００５６】
（２）大腸菌でＰｏ２の発現誘導活性確認
大腸菌において、Ｐｏ２の発現誘導活性を確認するために、前記実施例１の（１．１．２）で作製した形質転換菌株ＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐのＧＦＰ活性を、比較例１の（２）で作製したＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｔｒｃ−ｇｆｐ、ＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ１−ｇｆｐ及びＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐのＧＦＰ活性と比較した。
【００５７】
カナマイシンが含まれたＬＢ培地２５ｍｌが込められた２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに、前記形質転換された大腸菌菌株を２０分の１の比率でそれぞれ接種し、３７℃で培養中期（ＯＤ６００＝３．０）まで振盪培養（２００ｒｐｍ）した。培養液から、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１５分）を介して、菌体を収去し、０．１％ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝溶液で２回洗浄した後、同緩衝溶液に懸濁した後、超音波破砕法で細胞を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分）を介して上澄み液を収去し、ブラッドフォード方法によるタンパク質濃度を定量した。同一量の菌体抽出物に対して、Laure Gory法などを利用して、４８８ｎｍで励起光を照射し、５１１ｎｍ発出光を、ＬＳ−５０Ｂ分光光度計（Perkin-Elmer）機器を利用して測定することにより、ＧＦＰ遺伝子の発現程度を測定し、下記表２に示した。
【００５８】
【表２】
0006469874.tif 000003
【００５９】
前記表２の結果から分かるように、Ｐｏ２は、大腸菌において、プロモーター活性を有しているということを確認することができた。また、ＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｇｆｐは、公知された強いプロモーターであるＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｔｒｃ−ｇｆｐと類似レベルの蛍光感度を示すということを確認することができた。また、ＤＨ５α／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ４−ｇｆｐより高い蛍光感度を示した。前記結果により、Ｐｏ２は、大腸菌においても、目的遺伝子を発現させることができる力強いプロモーターであるということが分かる。
【００６０】
実施例３：物質生産能強化菌株の評価
（１）アルジニン生産能強化菌株の評価
アルジニン生合成主要遺伝子であるａｒｇＪを、Ｐｏ２によって発現を強化させる場合、アルジニン生産能に及ぼす影響を評価するために、前記実施例１の（１．２．２）で製造したａｒｇＪ強化菌株であるＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ａｒｇＪのアルジニン生産能を、形質転換されていないＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株、及び比較例１の（３．１）で製造したＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＪのアルジニン生産能と比較した。
【００６１】
生産培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに、１白金耳の前記菌株を接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍで培養した。培養終了後、ＨＰＬＣでＬ−アルジニンの生産量を測定し、その結果を下記表３に示した。
【００６２】
［生産培地］
ブドウ糖６％、硫酸アンモニウム３％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム七水和物０．２％、ＣＳＬ（とうもろこし浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ１％、Yeast Ｅxtract ０．５％、ビオチン１００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
【００６３】
【表３】
0006469874.tif 000004
【００６４】
前記表３の結果から分かるように、Ｐｏ２によってａｒｇＪ発現が強化されたコリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、アルジニン生産能が向上するという結果を示した。特に、対照群対比アルジニン生産能が８４％大きく向上し、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ａｒｇＪ対比アルジニン生産能が２３％向上したということを確認することができた。前記結果により、Ｐｏ２がａｒｇＪ発現強化に効果があることが分かる。
【００６５】
（２）Ｌ−バリン生産能強化菌株の評価
バリン生合成主要遺伝子であるｉｌＥを、Ｐｏ２によって発現を強化させる場合、Ｌ−バリン生産能に及ぼす影響を評価するために、前記実施例１の（１．３．２）で製造したｉｌｖＥ強化菌株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥのＬ−バリン生産能を、形質転換されていないＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株、及び前記比較例１の（３．２）で製造したＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｉｌｖＥのＬ−バリン生産能と比較した。
【００６６】
生産培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌコーナーワッフルフラスコに、１白金耳の前記菌株を接種し、３０℃で７２時間２００ｒｐｍで生産した。培養終了後、ＨＰＬＣでＬ−バリンの生産量を測定し、その結果は、下記表４の通りであった。
【００６７】
［生産培地］
ブドウ糖５％、硫酸アンモニウム２％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％、ＣＳＬ（とうもろこし浸漬液）２．０％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２
【００６８】
【表４】
0006469874.tif 000005
【００６９】
前記表４の結果から分かるように、Ｐｏ２によってｉｌｖＥ発現が強化されたコリネバクテリウム・グルタミクムにおいて、バリン生産能が向上するということを確認することができた。特に、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｏ２−ｉｌｖＥの場合対照群対比バリン生産能が３２％で大きく向上し、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｐＥＣＣＧ１１７−Ｐｃｊ７−ｉｌｖＥ対比バリン生産能が１７％向上したということを確認することができた。前記結果から、Ｐｏ２がｉｌｖＥ発現強化に効果があると確認された。
【受託番号】
【００７０】
寄託機関名：韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１５９１Ｐ
受託日付：２０１４１０２３
0006469874.tif 000006
【００７１】
本発明の１以上の具体例によれば、新規プロモーターは、標的遺伝子の発現を誘導する微生物によって、多様な活性を有することができる。それと係わり、新規プロモーターは、目的生成物の生産過程において、目的遺伝子の活性を調節する必要がある場合に使用され、効率的に目的生成物を生産することができる。
【００７２】
本明細書で説明された具体例は、説明的な意味にのみ考慮されなければならず、制限の目的に考慮されるものではないということを理解しなければならない。それぞれの具体例内の特徴または様態の説明は、一般的に他の具体例において、他の類似した特徴または様相に対して利用可能なものであると考慮されなければならない。
【００７３】
１以上の具体例について説明したが、本発明が属する技術分野で当業者であるならば、特許請求の範囲によって定義された本発明概念の思想及び範囲を外れずに、形態及び細部事項での多様な変形が可能であるということを理解することができるであろう。
【配列表】
0006469874000001.app