(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性剤として、トケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物および、必要に応じて適切な賦形剤を含んでなり、該ペプチドおよび糖抽出物がプロテアーゼおよびカルボヒドラーゼによる酵素加水分解物であり、かつペプチド類が３５００Ｄａ未満のサイズである、組成物。
【請求項２】
トケイソウ種子がPassiflora incarnata種子およびPassiflora edulis種子から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ペプチドおよび糖抽出物において、ペプチド類／糖類の重量比が、０．７５より大きい、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ペプチドおよび糖抽出物が、２０重量％〜７０重量％のペプチド類を含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ペプチドおよび糖抽出物が、２０重量％〜６０重量％の糖類を含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
組成物の全重量に対して、乾燥抽出物で表される抽出物重量で、０．００１重量％〜１０重量％のトケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
トケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物に加えて、他の活性剤を更に含んでなり、他の活性剤が、
皮膚軟化剤、保湿活性剤、ケラチン合成活性化剤、角質調節剤、角質溶解剤、皮膚バリア再構築剤（皮膚脂質合成活性化剤）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動剤、ＲＸＲまたはＬＸＲ作動剤、皮脂調節剤、抗刺激剤、緩和剤、抗炎症剤、抗酸化剤および抗老化剤、脱色素剤または色素脱失剤、着色剤、脂肪分解剤または脂質生成阻害剤または抗セルライト剤もしくはセルライト低減剤、無機または有機のサンフィルターおよびサンスクリーン、抗真菌化合物、防腐剤、抗菌剤、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス、抗生物質、免疫調節剤、
植物抽出物ならびに
オキサゾリン類
から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも一つのプロテアーゼおよび少なくとも一つのカルボヒドラーゼの存在中で少なくとも一つの酵素加水分解工程を含んでなり、ペプチド類が３５００Ｄａ未満のサイズである、トケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物の製造方法。
【請求項９】
トケイソウ種子がPassiflora incarnata種子およびPassiflora edulis種子から選択される、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
以下の連続的工程：
ａ）粉砕された種子の水相への懸濁工程、次いで、
ｂ）酵素処理、少なくとも一つのプロテアーゼおよび少なくとも一つのカルボヒドラーゼを工程ａ）で得られた水性懸濁液に添加する工程、次いで、
ｃ）必要に応じて、酵素を変性させるための熱処理する工程、ならびに、
ｄ）工程ｂ）またはｃ）の最後にペプチドおよび糖抽出物を回収する工程、
を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
酵素処理が、
ｂ１）ペクチナーゼ、セルラーゼ、アラバナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼから選択されるカルボヒドラーゼを添加する工程、次いでｂ２）プロテアーゼを添加する工程
を連続的に含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）の前に種子が脱脂される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ｂ）または必要に応じて工程ｃ）および工程ｄ）の間に、追加のろ過または遠心分離工程を含み、続いて限外ろ過、透析ろ過またはナノろ過を含んでもよい、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
１５ｋＤａの限外ろ過工程を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドおよび糖抽出物がプロテアーゼおよびカルボヒドラーゼによる酵素加水分解物であり、かつペプチド類が３５００Ｄａ未満のサイズであり、かつ該ペプチドおよび該糖抽出物が１０重量％〜９０重量％のペプチド類および１０重量％〜９０重量％の糖類を含有する、トケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物。
【請求項１６】
トケイソウ種子がPassiflora incarnata種子およびPassiflora edulis種子から選択される、請求項１５に記載の抽出物。
【請求項１７】
２０重量％〜７０重量％のペプチド類、および２０重量％〜６０重量％の糖類を含有する、請求項１５に記載の抽出物。
【請求項１８】
皮膚および／または粘膜、膜組織および／または皮膚付属器官の疾患または病的状態、
血管疾患、
脂肪組織の変異、
酸化的ストレス
の予防および／または処置用の、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の抽出物または請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
皮膚および／または皮膚付属器官および／または粘膜のケアのための化粧組成物であって、それらの状態および／または外観を改善する観点から、請求項１〜７のいずれか一項に記載された組成物または請求項１５〜１７のいずれか一項に記載された抽出物を含む、化粧組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明はPassiflora incarnata（チャボトケイソウ）またはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）のトケイソウ種子、好ましくはP. edulis（クダモノトケイソウ）種子の抽出物を含んでなる組成物に関する。該組成物は、有利には化粧組成物、医薬組成物、皮膚組成物または栄養補助組成物である。本発明の他の主題は、トケイソウ種子の抽出物を抽出する方法および当該方法によって得ることができる抽出物である。本発明は、皮膚、粘膜または皮膚付属器官の疾患または病的状態の予防または処置（治療）用、血管疾患の予防または処置（治療用）、酸化的ストレスへの対抗用あるいは脂肪組織の変異の予防または処置（治療）用の、そのような組成物またはそのような抽出物にも関する。最後に、本発明は、皮膚、皮膚付属器官または粘膜の美容ケア方法であって、それらの状態または外観を改善する観点から、そのような組成物またはそのような抽出物を投与することを含む方法に関する。
【０００２】
トケイソウ
約５００種のPassiflora（トケイソウ）が存在する。この種は、暖かくて穏やかな熱帯地域、特にアメリカにしばしば分布するが、アジア、オーストラリアおよび熱帯アフリカではむしろ稀である。
【０００３】
植生態
実生(seedings)は低木またはつる性植物の形態を有する。葉は互生でしばしば単純な浅裂状または掌状である。直径９ｃｍに達することがある花は、両性または単性で整正である。それらは白および紫で、キリストの茨の冠に似た糸状の付属器官で覆われた細かい花弁状の付属器官を有する。長さが４〜５ｃｍの果実は卵型で、しばしば黄色からオレンジ色である。最も広く分布している種は特にP. incarnata（チャボトケイソウ）およびP. edulis（クダモノトケイソウ）である。
【０００４】
植物化学物質の成分
最も研究されている種はP. incarnata（チャボトケイソウ）およびP. edulis（クダモノトケイソウ）である。
P. incarnata（チャボトケイソウ）：フラボノイドファミリーとして表される主要成分は葉に大量に存在する。高濃度のイソビテキシンを含有する。少量の単純なインドールアルカロイド（ハルメン、ハルミンなど）、糖類（ラフィノース、スクロース、フルクトースおよびグルコースなど）および精油、ならびにこの植物に起因する鎮静および抗けいれん効果を引き起こす分子といわれるマルトールも含有する。
P. edulis（クダモノトケイソウ）：特異的な化合物であるパッシフロリン（シクロプロパントリテルペングリコシド）が乾燥葉のメタノール抽出物から同定されている（E.Bombardelliら,1975）。
P. incarnata（チャボトケイソウ）中では見いだされないフラボノイドであるイソオリエンチン、ならびに微量の精油およびP. incarnata（チャボトケイソウ）と同一のアルカロイドを含有する。
果実の果肉はフラボノイド（スカフトシド、イソスカフトシド、イソオリエンチン、オリエンチン、イソビテキシンおよびルテオリンの誘導体など）（M.L.Zeraik、J.H.Yariwake-2010）およびアスコルビン酸（約６０ｍｇ／１００ｇ）を含有する。
果肉はグリコシル化されたシアノゲン誘導体（プルナシン、サンブニグリンおよびアミグダリン、ならびに最近同定された２つのマンデロニトリル−β−ルチノシド）も含有する（D.ChassagneおよびJ.Crouzet, 1998 ；D.S.Seigler, 2002）。
【０００５】
毒性
シアノゲン成分が各種のトケイソウの品種の地上部に主に存在する。
【０００６】
種子の特性
種子はP. edulis（クダモノトケイソウ）果実の６〜１２％を構成し、
・ポリフェノール（血管弛緩および抗酸化効果を持つ物質である、ピセアタンノール（レスベラトロールと類似構造）およびその二量体であるスキルプシンＢを含む）（S.Sano；K.Sugiyama；T.Ito,2011）、
・油（植物ステロール（カンペステロール、スチグマステロール、シトステロール、アベナステロールを０．２％含有）を含有する１８％の溶質；６０％〜７３％のリノール酸（オメガ６）、１４％〜２０％のオレイン酸および４６５ｐｐｍのトコフェノール類）（G.Piobom,N.Barouら、2006；R.of V.V.Lopesら）、
・糖類およびタンパク質類
を含有する。
【０００７】
背景技術
食品用途
果実は先史時代から摂取されていたと考えられている。１６世紀のペルーでは優れたPassiflora（トケイソウ）がすでに治療用として見なされており、トケイソウの多くの品種が一般的な治療方法として多くの国で使用され続けている。
【０００８】
医学的用途
トケイソウ（しばしば地上部、時々果実）は、世界中で、精神安定剤、鎮静剤、利尿剤および鎮痛剤としてしばしば使用されている（全て「Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ：ｒｅｖｉｅｗ  ｕｐｄａｔｅ．Ｋ．Ｄｈａｗａｎ，Ｓ．Ｄｈａｗａｎ，Ａ．Ｓｈａｒｍａ，２００４」に記載）。マルトールおよびそのある種の誘導体はこの鎮静効果の源である。
この活性はP. incarnata（チャボトケイソウ）においてより持続的でより著しい。
P. incarnata（チャボトケイソウ）抽出物はモルヒネ依存を食い止めることができる。
抗炎症効果もP. edulis（クダモノトケイソウ）の葉の抽出物において知られている。
各種のポリフェノールファミリーは、P. edulis（クダモノトケイソウ）の地上部タンパク質類の抗酸化および抗糖化効果（Ｍ．Ｒｕｄｎｉｃｋｉら，２００７）に大きく寄与している可能性が高い。
P. edulis（クダモノトケイソウ）果皮のメタノール抽出物の抗低血圧効果および繊維が豊富な脱脂種子の抽出物の低コレステロール血症に対する効果も知られている。
果実の煎じ汁は、腫瘍の浸潤、転移および血管新生に関わるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２およびＭＭＰ９）の阻害を介する抗腫瘍効果を有する（Ｓ．Ｓ．Ｐａｔｅｌ，２００９）。
【０００９】
スキンケア化粧品用途
ブラジルではP.foetida（クサトケイソウ）の葉が炎症性皮膚疾患の処置のために皮膚に使用されている。モーリシャスおよびロドリゲスではP.suberosa（クロミノトケイソウ）の葉の煎じ汁が皮膚疾患の処置のために入浴に使用されている。
【発明の概要】
【００１０】
出願人は、トケイソウ種子、特にPassiflora incarnata（チャボトケイソウ）またはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）の種子、さらに有利にはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子の抽出物が、これまでに開示されていない美容的および皮膚科的性質を有することを見出した。特に、そのようなトケイソウ種子の抽出物がその特異的な性質のためにそのように使用されるのは初めてである。
【００１１】
本発明の主題は、トケイソウ種子、特にPassiflora incarnata（チャボトケイソウ）またはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子、有利にはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子のペプチドおよび糖抽出物を有効成分として含んでなり、必要に応じて適切な賦形剤を含んでなる組成物である。該組成物は有利には化粧組成物、医薬組成物または皮膚組成物である。該組成物は栄養補助組成物であってもよい。前記組成物は好ましくは製剤化されて外部局所経路または経口によって投与される。
【発明の具体的説明】
【００１２】
「ペプチドおよび糖抽出物」とはペプチド類および糖類を主にまたは実質的に含んでなる抽出物を意味する。種子中に天然に存在するタンパク質類はペプチド類に加水分解され、有利には加水分解は酵素加水分解である。
【００１３】
本発明の文脈において、ペプチドおよび糖抽出物は、有利には酵素加水分解によって、より有利には少なくとも一つのプロテアーゼおよび少なくとも一つのカルボヒドラーゼの存在中で得られる。より有利には、本明細書にさらに記載される方法によって得ることができる。
【００１４】
ペプチドおよび糖抽出物において、ペプチド類は有利には３５００Ｄａ未満の分子量を有する。これらペプチド類は抽出物中に存在する全てのアミノ酸由来化合物を包含する。
【００１５】
本発明の有利な変形によれば、ペプチドおよび糖抽出物において、少なくとも９０％のペプチド類が１２００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００１６】
ペプチドおよび糖抽出物において、有利には少なくとも３０％のペプチド類、より有利には少なくとも４０％のペプチド類が３００Ｄａ未満の分子量を有する。本発明の有利な変形によれば、３０％〜５０％のペプチド類が３００Ｄａ未満の分子量を有する。
【００１７】
有利には、本発明によれば、３０％〜７０％、より有利には４０％〜６０％の抽出物のペプチド類が３００〜１２００ダルトンの分子量を有する。
【００１８】
ペプチド類の分子量分布はペプチド類全量の濃度に対する百分率として表される。
【００１９】
典型的には、本発明のペプチドおよび糖抽出物は、アレルギーを誘発する可能性のあるタンパク質類の残渣を実質的に含有しない。
【００２０】
本発明の抽出物は、有利には１０重量％〜９０重量％のペプチド類および１０重量％〜９０重量％の全糖類を含んでなり、その百分率は前記抽出物（乾燥担体を任意に添加する前）の全重量に対して表される。
【００２１】
ペプチドおよび糖抽出物において、ペプチド類／糖類の重量比は有利には０．７５より大きく、好ましくは１〜２である。
【００２２】
ペプチドおよび糖抽出物は、有利には２０重量％〜７０重量％、有利には３０重量％〜６５重量％、典型的には５５重量％のペプチド類を含んでなり、その百分率は前記抽出物の全重量に対して表される。
【００２３】
ペプチドおよび糖抽出物は、有利には２０重量％〜６０重量％、有利には３０重量％〜５５重量％、典型的には４０重量％の糖類を含んでなり、その百分率は前記抽出物の全重量に対して表される。
【００２４】
具体的には、ペプチドおよび糖抽出物は、有利には２０重量％〜７０重量％、有利には３０重量％〜６５重量％のペプチド類、および２０重量％〜６０重量％、有利には３０重量％〜５５重量％の糖類を含んでなり、その百分率は前記抽出物の全重量に対して表される。
【００２５】
本発明の好ましい側面によれば、ペプチドおよび糖抽出物は５５重量％のペプチド類および４０重量％の糖類を含んでなり、その百分率は、たとえば任意の乾燥担体の添加前の前記抽出物の活性物質の全重量に対して表される。残りの５％は無機物（灰分）および他の様々な分子である。
【００２６】
本発明の有利な変形によれば、該組成物は、０．００１重量％〜１０重量％、典型的には０．０１重量％〜５重量％の抽出物を含んでなり、これは乾燥抽出物の百分率として表される。
【００２７】
本発明の他の主題は、当業者に公知の最適ｐＨおよび温度条件下での酵素加水分解工程を少なくとも一つ含んでなる、トケイソウ種子、特にPassiflora incarnata（チャボトケイソウ）種子またはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子、有利にはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子のペプチドおよび糖抽出物の製造方法である。懸濁液の酵素処理に続いて、必要に応じて酵素を変性させるために熱処理してよい。
【００２８】
有利には、本発明によれば、トケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物の製造方法は、以下の連続的工程を含んでなる：
ａ）粉砕された種子の水相への懸濁工程、次いで、
ｂ）工程ａ）で得られた水性懸濁液の酵素処理工程、次いで、
ｃ）必要に応じて、酵素を変性させるための熱処理工程、ならびに、
ｄ）工程ｂ）またはｃ）の最後にペプチドおよび糖抽出物を回収する工程。
【００２９】
工程ａ）において水相は有利には水である。
【００３０】
酵素処理（工程ｂ））は、有利には、当業者に公知の最適ｐＨおよび温度条件下で少なくとも一つのプロテアーゼおよび少なくとも一つのカルボヒドラーゼを添加することによって行われる。たとえば、ｐＨは３．０〜９．０である。温度は典型的には２０℃〜９０℃である。具体的には、酵素処理は、カルボヒドラーゼ（有利には、ペクチナーゼ、セルラーゼ、アラバナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼから選択される）を添加する工程ｂ１）、次いで、アルカリ型または酸型のプロテアーゼを添加する工程ｂ２）を連続的に含んでなる。
【００３１】
本発明の方法の加水分解工程は、トケイソウ種子中に存在する天然タンパク質類をペプチド類に変換または「切断」することを可能にするので、非常に重要である。この工程は有利にはトケイソウ種子中に存在する多糖類をオリゴ糖類または単糖類に変換または「切断」することも可能にする。
【００３２】
該方法の有利な変形において、トケイソウ種子は工程ａ）の前に脱脂される。懸濁（工程ａ））の前に、粉砕された種子を脱脂、特にエタノール中で脱脂してよい。脂質の除去は続くろ過、限外ろ過またはナノろ過工程を改善する。これらの種子の油かす、即ち、予備的な油の抽出残渣を粉砕された種子として使用することも好ましくは可能である。この油の抽出は溶剤を使用して行っても、超臨界ＣＯ２技術を使用して行っても、好ましくは機械的圧搾によって行ってもよい。
【００３３】
工程ｄ）の間、ペプチドおよび糖抽出物は、有利には工程ｂ）の最後に得られた懸濁液を、撹拌しながら、有利には３．０〜９．０のｐＨで、有利には２０℃〜９０℃の温度で、抽出することによって回収される。
【００３４】
有利な変形において、該方法は工程ｂ）または必要に応じて工程ｃ）および工程ｄ）の間に、追加のろ過または遠心分離工程を含み、続いて限外ろ過、透析ろ過またはナノろ過工程を含んでよい。
【００３５】
ろ過または遠心分離工程は、特に、続く膜による限外ろ過または透析ろ過によってタンパク質類の残渣を除去する。ナノろ過工程は、たとえば、無機塩類または遊離アミノ酸類を除去する。
【００３６】
本発明の方法は、有利には１５ｋＤａ、有利には１０ｋＤａ〜１５ｋＤａの限外ろ過工程を含み、これはアレルギーを誘発する可能性のあるタンパク質類の残渣を除去する。
【００３７】
本発明の特定の実施態様において、該方法は、無機塩類、遊離アミノ酸類または単糖類の一部を除去するために、限外ろ過工程に続いて、たとえば、１００ダルトン〜３００ダルトン、有利には１３０ダルトン〜３００ダルトン、典型的には２００ダルトン〜３００ダルトンを分画するナノろ過工程も含む。
【００３８】
有利には、ペプチドおよび糖抽出物は、たとえば、マルトデキストリン型担体またはアカシア繊維（Fibregum（商標）、ＣＮＩ）の存在中または不存在中で、当業者に公知の手法によって乾燥することにより安定化してよい。担体の割合は、典型的には、液状抽出物として得られる乾燥物質の重量百分率に対して、担体を０重量％〜８０重量％の比率で変化させる。該抽出物は好ましくは最後の粉末を得るために凍結乾燥によって乾燥される。最後の粉末は有利には３０重量％〜７０重量の抽出物の乾燥物質を含み、凍結乾燥された担体がそれを１００％にする。より有利には、最後の粉末は、抽出物からの乾燥物質５０重量％および凍結乾燥担体５０重量％を含有する。
【００３９】
好ましくは、たとえば、ペプチドおよび糖抽出物は以下の方法によって得てよい：
ａ）乾燥物質の水中における濃度が１０％の、圧搾によって脱脂されたトケイソウ種子の油かす溶液の調製；
ｂ）セルラーゼ（たとえば、Cellulyve、Lyven製）の作用による炭水化物の酵素加水分解；
ｃ）続いて、酸プロテアーゼ（たとえば、Prolyve PAC、Lyven製）による加水分解；
ｄ）酵素を変性させるための熱処理；
ｅ）遠心分離、１５ｋＤａの膜での限外ろ過および透析ろ過。この工程は特にアレルギーを誘発する可能性のあるタンパク質類の残渣の除去を可能にする；
ｆ）２００Ｄａの膜でのナノろ過。この工程は特に、たとえば無機塩類または遊離アミノ酸類の除去を可能にする。
【００４０】
本発明の他の主題は、上記した方法によって得ることができる、トケイソウ種子、特にPassiflora incarnata（チャボトケイソウ）種子またはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子、有利にはPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子の抽出物である。このような抽出物は上記で定義した要件を満たす。具体的には、このような抽出物は有利には１０％重量〜９０重量％のペプチド類および１０重量％〜９０重量の糖類を含有する。より具体的には、該抽出物は２０重量％〜７０重量％、有利には３０重量％〜６５重量％のペプチド類、および２０重量％〜６０重量％、有利には３０重量％〜５５重量％の糖類を含有する。
【００４１】
該抽出物は有利には化粧組成物、皮膚組成物または医薬組成物のような組成物における活性剤として使用され、１以上の適切な賦形剤を含んでいてよい。該組成物はトケイソウ加水分解物に加えて少なくとも一つの他の活性化合物を更に含んでいてよい。当該他の化合物は、下記に示した全ての化合物およびその機能的な等価物から選択してよい。
【００４２】
当該他の化合物は、特に、皮膚用品または化粧品で通常使用される活性剤、たとえば、皮膚軟化剤、保湿活性剤、ケラチン合成活性化剤、角質調節剤(keratoregulators)、角質溶解剤、皮膚バリア再構築剤（皮膚脂質合成活性化剤）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）作動剤(agonists)、ＲＸＲまたはＬＸＲ作動剤、皮脂調節剤、抗刺激剤、緩和剤、抗炎症剤、抗酸化剤および抗老化剤、脱色素剤または色素脱失（hypodepigmenting）剤、着色剤、脂肪分解剤もしくは脂質生成阻害剤または抗セルライト剤もしくはセルライト低減剤、無機または有機のサンフィルターおよびサンスクリーン、抗真菌化合物、防腐剤、抗菌剤、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス、抗生物質、免疫調節剤など、から選択してよい。
【００４３】
より具体的には、組み合わせて使用できる皮膚バリアの回復および／または再構築剤は、有利にはパンテノール（ビタミンＢ５）、アラビノガラクタン、酸化亜鉛、セラミド、コレステロール、スクアランおよびリン脂質である。
【００４４】
組み合わせて使用できる皮脂調節剤は、有利には５−α還元酵素阻害剤からなる群から選択される。亜鉛（ならびに、グルコン酸塩、サリチル酸塩およびピログルタミン酸塩のような亜鉛誘導体）およびスピロノラクトンも皮脂抑制活性を有する。リノール酸のような、皮脂に影響を与える脂質を起源とする他の皮脂調節剤も興味深い。
【００４５】
抗炎症および／または抗刺激および／または緩和剤は、アラビノガラクタンであってよい。
【００４６】
組み合わせて使用できるサンスクリーン活性剤は、有利には、必要な保護の程度に応じて種類および濃度を変化させるであろう当業者に公知の無機および／または有機のスクリーンまたはフィルターのような、ＵＶＢおよび／またはＵＶＡのサンフィルターおよびサンスクリーンである。
【００４７】
組み合わせて使用できる防腐剤は、たとえば、通常化粧品で使用されるもの、カプリル誘導体、たとえば、カプリロイルグリシンおよびグリセリルカプリレートなど、ヘキサンジオール、レブリン酸ナトリウム、ならびに銅および亜鉛誘導体（グルコン酸およびＰＣＡ）のような抗菌活性を有する分子（疑似防腐剤）である。
【００４８】
当該他の化合物は、特に植物抽出物、具体的には、
・ダイズ油および／またはナタネ油、アボカド油（ＷＯ２００４／０１２４９６、ＷＯ２００４／０１２７５２、ＷＯ２００４／０１６１０６、ＷＯ２００７／０５７４３９）、ルピナス油、有利にはスイート白色ルピナス油（sweet white lupin oil）（ＷＯ９８／４７４７９）、またはこれら油の混合物のような植物油；
・保湿および／またはエモリエント、回復および／または皮膚バリア再構築、抗炎症および／または抗刺激および／または緩和活性で特に有用な、動植物油の油脂蒸留物または濃縮物、具体的には、ヒマワリ（より有利には、Laboratoires Expanscienceから市販されている不けん化物濃縮ヒマワリ油（Soline（商標）、ＷＯ２００１／２１１５０）のようなヒマワリのリノール酸濃縮物）、アボカド油、ナタネ油、コーン油型の不けん化物濃縮油；
・回復および／または皮膚バリア再構築、抗老化、抗炎症活性で特に有用な、植物または植物油の不けん化物、有利には、国際出願ＷＯ０１／２１６０５に記載された方法によって得ることができるアボカドフラン（Avocadofurane（商標））、アボカドおよび／またはダイズ不けん化物、より具体的にはアボカドフラン不けん化物およびダイズ不けん化物の混合物、有利にはそれぞれの割合が約１／３〜２／３の混合物（Ｐｉａｓｃｌｅｄｉｎｅ（商標）など）、ダイズ不けん化物（国際出願ＷＯ０１／５１５９６に記載された方法によって得られる）、ステロール不けん化物（典型的にはステロール、メチルステロールおよびトリテルペンアルコールの含量が不けん化物の全重量に対して２０重量％〜９５重量、好ましくは４５〜６５重量％である不けん化物）、植物ステロール、ステロールのエステルおよびビタミン誘導体；
・保湿および／またはエモリエント（アボカド）、角質調節（ルピナス、キノア）、回復および／またはバリア再構築（マカ、キノア、ダイズ）、抗炎症および／または抗刺激および／または緩和（ルピナス、キノア）、抗酸化（アボカド）、抗老化（ルピナス、マカ）または着色（コメ）活性で特に有用な、植物アミノ酸類のペプチド類または複合体、特にアボカド（国際出願ＷＯ２００５／１０５１２３に記載されたものなど）、ルピナスペプチド（国際出願ＷＯ２００５／１０２２５９に記載されたものなど）、キノアペプチド（国際出願ＷＯ２００８／０８０９７４に記載されたものなど）、マカペプチド（国際出願ＷＯ２００４／１１２７４２に記載されたものなど）、発酵または未発酵のダイズペプチド、コメペプチド（国際出願ＷＯ２００８／００９７０９に記載されたものなど）；Schisandra（マツブサ属）のペプチド（特許出願ＦＲ０９５５３４４に記載されたものなど）、Acasia macrostachya（アカシアマクロスタチア）種子の抽出物（特許出願ＦＲ０９５８５２５に記載されたものなど）、Vigna unguiculata（ササゲ）種子の抽出物（特許出願ＦＲ０９５８５２９に記載されたものなど）；
・角質調節、回復および／または皮膚バリア再構築、抗炎症および／または抗刺激および／または緩和能で特に有用な、植物糖類、特にアボカドの糖類（出願ＷＯ２００５／１１５４２１に記載されたものなど）；
・ブチルアボカデート（5α Avocuta（商標））、５−α還元酵素阻害剤（ＷＯ０１／５２８３７およびＷＯ０２／０６２０５）、典型的にはニキビおよびふけで認められる増加した脂漏分泌の調節剤；
・ポリフェノールが豊富な抽出物、より具体的には、アボカド果実の抽出物（出願ＦＲ１０６１０５５に記載されたものなど）、マカの葉の抽出物（出願ＦＲ１０６１０４７に記載されたものなど）およびGynandropsis gynandra（フウチョウソウ）の地上部の抽出物（出願ＦＲ１０６１０５１に記載されたものなど）；
・回復促進に特に有用なルペオール（ＦＲ２８２２８２１、ＦＲ２８５７５９６）；
・保湿性で特に高く評価されるクプアスバター；
から選択してよい。
【００４９】
当該他の化合物は、特にオキサゾリン類から選択してもよく、具体的には、２−ウンデシル−４−ヒドロキシメチル−４−メチル−１，３−オキサゾリン、２−ウンデシル−４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリン、（Ｅ）−４，４−ジメチル−２−ヘプタデカ−８−エニル−１，３−オキサゾリン、４−ヒドロキシメチル−４−メチル−２−ヘプタデシル−１，３−オキサゾリン、（Ｅ）−４−ヒドロキシメチル−４−メチル−２−ヘプタデカ−８−エニル−１，３−オキサゾリン、２−ウンデシル−４−エチル−４−ヒドロキシメチル−１，３−オキサゾリン（好ましくは、ＯＸ−１００またはＣｙｃｌｏｃｅｒａｍｉｄｅ（商標）と呼ばれる２−ウンデシル−４，４−ジメチル−１，３−オキサゾリン；ＷＯ２００４０５００５２、ＷＯ２００４０５００７９およびＷＯ２００４１１２７４１）からなる群から選択されてもよい。これらは特に抗炎症および／または抗刺激および／または緩和、抗酸化、脱色素、免疫調節活性で特に有用である。
【００５０】
これら全ての組み合わせは、トケイソウ種子の抽出物に加えて少なくとも一つの他の活性化合物を含有し、２、３、４またはそれ以上の上記した活性化合物を含有してよい。
【００５１】
本発明の組成物は、局所適用、経口、直腸、膣、鼻、耳または気管支投与、および非経口投与に適した各種の製剤に製剤化してよい。
【００５２】
第一の変形によれば、各種の製剤は局所適用に適し、特にクリーム、エマルジョン、ミルク、軟膏、ローション、オイル、水性もしくは水−アルコールもしくはグリコール溶液、粉末、パッチ、スプレー、シャンプー、ワニスまたは任意の他の外用製品が挙げられる。
【００５３】
本明細書に示されたトケイソウ種子の抽出物を含有する組成物は化粧用、医薬用、皮膚用または栄養補助用を特に目的とする。
【００５４】
化粧用、医薬用または皮膚用という文脈において、該組成物は有利には局所適用に適した製剤に製剤化されるだろう。ペプチドおよび糖抽出物を含有する組成物は化粧用、医薬用または皮膚用を特に目的とする。
【００５５】
食品用という文脈において、栄養食品または美容目的（美容食品）のために、該組成物は有利には経口投与に適した製剤に製剤化されるだろう。
【００５６】
本発明の他の主題は、化粧、医薬または皮膚組成物、栄養補助組成物または機能性食品の製造のための、本明細書で上記したトケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物の使用である。
【００５７】
機能性食品は従来の食品またはそう見える食品であって、通常の食品の一部であり、かつ通常の栄養機能を超えるまたは慢性疾患のリスクを下げる有用な生理的効果を提供する特徴を有する。
【００５８】
したがって、本発明の主題は本発明の抽出物を含有する機能性食品である。
【００５９】
本発明の他の主題は、
・皮膚および／または粘膜および／または皮膚付属器官の疾患または病的状態、
・血管疾患、
・脂肪組織の変異、
・酸化的ストレス
の予防および／または処置（治療）用の本発明の抽出物または本発明の組成物である。
【００６０】
具体的には、本発明の組成物または抽出物は、アレルギー、炎症または刺激反応、あるいは皮膚、皮膚付属器官（毛髪および爪）および／または未成熟、正常もしくは成熟／老化した粘膜（歯茎、歯周組織、生殖器粘膜）のバリアまたは恒常性の病的状態または疾患の予防および／または処置を目的とする。
【００６１】
有利には、本発明の組成物または抽出物は、
・皮膚、たとえば、ニキビ、酒さまたはエリトロ・コウペロース（erythrocouperosis）、乾癬、血管疾患、おむつかぶれ、アトピー性皮膚炎、湿疹、接触皮膚炎、刺激性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎（新生児頭部皮膚炎）、乾癬、敏感肌、反応肌、乾皮症（乾燥症）、乾燥肌、皮膚の赤み、皮膚紅斑、老化または光老化した皮膚、光過敏肌、色素沈着肌（肝斑、炎症後色素沈着など）、脱色した皮膚（白斑）、蜂巣炎に罹った皮膚、皮膚弛緩症、妊娠線のある皮膚、ふけ、あかぎれ、虫刺され、特に胸の亀裂、日焼け、すべての種類の光線による炎症、化学薬品、物理的作用を及ぼすもの（たとえば妊婦の引張応力）、細菌剤、真菌またはウイルス剤、寄生虫剤（シラミ、ダニ、白癬、コナダニ、皮膚糸状菌）、放射線剤による刺激あるいは先天性免疫欠乏症（抗菌ペプチド）または後天性免疫欠乏症（細胞性、体液性、サイトカイン）による刺激など、および／または
・粘膜、たとえば、歯肉炎に罹った歯茎および歯周組織（新生児の敏感な歯茎、喫煙による衛生上の問題など）、歯周病、または男性もしくは女性の内性器もしくは外性器領域の炎症を伴う生殖器粘膜など、および／または
・皮膚付属器官、たとえば、未熟、正常または成熟した爪（割れやすい、脆い爪など）および毛髪（脱毛症、ふけ、多毛症、脂漏性皮膚、毛嚢炎）、特に頭皮疾患（アンドロゲン性、急性、局所性、瘢痕性もしくは先天性脱毛症、新生児脱毛症、化学療法／放射線療法が原因の円形（aerata）脱毛症あるいは休止期脱毛、成長期脱毛、毛髪ジストロフィー、抜毛癖、白癬または油性もしくは乾燥性ふけ）など
の反応、疾患または病的状態の予防および／または処置に用いてよい。
【００６２】
本発明は、本発明の組成物または抽出物を投与することを含む、皮膚および／または皮膚付属器官および／または粘膜の状態および／または外観を改善する観点からのそれらの美容ケア方法にも関する。
【００６３】
具体的には、美容ケア方法は、有利には皮膚および／または皮膚付属器官および／または粘膜の局所適用によって、皮膚を安定させ、「オレンジピール」効果を減少させることを可能にする。
【００６４】
本発明は、本発明の組成物または抽出物を皮膚に適用することを含む、皮膚の老化を防ぐ観点からの皮膚の美容ケア方法に関する。
【００６５】
本発明の組成物または抽出物は、有利には血管疾患、特に赤みおよびしみの予防および／または処置に用いてもよい。
【００６６】
本発明の組成物または抽出物は、有利には脂肪組織の変異の予防および／または処置にも用いてもよい。脂肪組織の変異は、具体的には、セルライトまたは「オレンジピール」効果である。本発明の組成物は皮膚を安定させることを可能にする。
【００６７】
本発明の化合物および組成物の投与方法、投与スケジュールおよび最適な医薬形状は、医薬的処置（治療）、特に、患者または動物に適した皮膚的、化粧的または獣医的処置の確立にあたって考慮された一般的な基準、たとえば、患者または動物の年齢または体重、患者または動物の全身状態の重症度、処置に対する耐性、注意すべき副作用および皮膚タイプなどにしたがって決定してよい。所望の投与タイプに応じて、本発明の組成物および／または活性化合物は、少なくとも一つの医薬的に許容される担体、特に、皮膚科的に許容される担体または化粧的に許容される担体を更に含んでいてよい。第一の変形によれば、外用の局所適用に適した担体が使用される。本発明の組成物は、増粘剤、防腐剤、香料、着色剤、化学または無機フィルター、保湿剤、温泉水などから選択される、当業者に公知の医薬または化粧用の少なくとも一つの補助剤を更に含んでいてよい。
【００６８】
以下の実施例により本発明を説明する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：本発明の抽出物
ペプチドおよび糖抽出物は以下の方法により得られる：
ａ）乾燥物質の水中における濃度が１０％の、圧搾によって脱脂されたPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）種子の油かす溶液の調製；
ｂ）セルラーゼ（Cellulyve、Lyven製）の作用による炭水化物の酵素加水分解；
ｃ）続いて、酸プロテアーゼ（Prolyve PAC、Lyven製）による加水分解；
ｄ）酵素を変性させるための熱処理；
ｅ）アレルギーを誘発する可能性のあるタンパク質類の残渣を除去するための、遠心分離、１５ｋＤａの膜での限外ろ過および透析ろ過；
ｆ）無機塩類、遊離アミノ酸類または単糖類を除去するための２００Ｄａの膜でのナノろ過；
ｇ）ペプチドおよび糖抽出物を回収。
【００７０】
このようにして得られた液状のペプチドおよび糖抽出物は以下の特徴を有する。
１−物理化学的分析（％／全乾燥物質）
乾燥抽出物（２時間、１０５℃、通風オーブン）：９．７％
ｐＨ                                        ：４．０
α−アミノ窒素（ＯＰＡ、ロイシン相当量）    ：２４％
ペプチド類（ケルダール、Ｎ×６．２５）      ：５６％
可溶性糖類（ＨＰＬＣ）                      ：４０％
（グルコース、フルクトースを含む）
全灰量                                      ：６％
【００７１】
２−ペプチド類の分子量分布プロファイル
１３０Ｄａ未満            ：２６％
１３０〜３００Ｄａ        ：１７％
３００〜１２００Ｄａ      ：４９％
１２００〜３５００Ｄａ    ：７％
３５００Ｄａ超            ：≦１％
【００７２】
実施例２：局所適用組成物
いくつかの局所適用組成物を以下に示す。実施例１のトケイソウ種子のペプチドおよび糖抽出物は、洗顔料、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、オイル、ミルク、ローション、シャンプー、フォーム状製品およびスプレーのような各種の化粧品に含有されてよく、そのような組成物を以下の実施例に示す。
【００７３】
【表１】
0006469582.tif 000002
【００７４】
【表２】
0006469582.tif 000003
【００７５】
【表３】
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【００７６】
【表４】
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【００７７】
【表５】
0006469582.tif 000006
【００７８】
【表６】
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【００７９】
【表７】
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【００８０】
【表８】
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【００８１】
【表９】
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【００８２】
【表１０】
0006469582.tif 000011
【００８３】
【表１１】
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【００８４】
【表１２】
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【００８５】
【表１３】
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【００８６】
【表１４】
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【００８７】
【表１５】
0006469582.tif 000016
【００８８】
【表１６】
0006469582.tif 000017
【００８９】
【表１７】
0006469582.tif 000018
【００９０】
【表１８】
0006469582.tif 000019
【００９１】
【表１９】
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【００９２】
【表２０】
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【００９３】
【表２１】
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【００９４】
【表２２】
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【００９５】
【表２３】
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【００９６】
実施例３：経口投与用組成物
Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物は、有利には経口組成物に、典型的には一日当たり５０ｍｇ〜２００ｍｇのPassiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物が投与されるように組成物に含有されてよい。
【００９７】
１／ソフトカプセル形状の抗妊娠線組成物
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物          ３０ｍｇ
・アワラ（Ａｗａｒａ）油                                ６０ｍｇ
・不けん化物が豊富なナタネ油                            ３００ｍｇ
・ビタミンＢ群（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ９、Ｂ１２）
ＱＳ〜１００％ＲＤＡ
・トコトリエノール類                                    ＱＳ〜５０％ＲＤＡ
・ビタミンＥ
・ミツロウ
・大豆レシチン
・食用ゼラチン
・グリセリン                                            ＱＳ〜１ソフトカプセル
当該組成物は一日あたり４〜６錠の５００ｍｇカプセルとして投与される。
【００９８】
２／抗脱毛錠剤
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物          ２５ｍｇ
・含硫アミノ酸が豊富な穀物類抽出物（コーン、ソバ、キビ、スペルト小麦）
２００ｍｇ
・ビタミンＣ                                            ＱＳ〜５０％ＲＤＡ
・魚類軟骨グリコサミノグリカン                          ２００ｍｇ
・グルシデックスＩＴ  １９（圧縮剤）                    ＱＳ〜８００ｍｇ錠 １錠
当該組成物は一日あたり５〜８錠の錠剤として投与される。
【００９９】
３／スリミングパウダースティックの実施例
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物          １００ｍｇ
・ポリフェノールが豊富な茶抽出物                        １００ｍｇ
・ＯＰＣが豊富なブドウ抽出物                            ５０ｍｇ
・植物−β−グルカン                                    １００ｍｇ
・キサンタンガム                                        １ｍｇ
・アスコルビン酸ナトリウム                              ０．３ｍｇ
・マルトデキストリン                                    ＱＳ〜５ｇ
当該組成物は一日あたり２回投与される。
【０１００】
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物          １００ｍｇ
・Centella asiatica（ツボクサ）抽出物                    １００ｍｇ
・マグネシウム、セレン、マンガン                        ＱＳ〜１００％ＲＤＡ
・キサンタンガム                                        １ｍｇ
・アスコルビン酸ナトリウム                              ０．３ｍｇ
・マルトデキストリン                                    ＱＳ〜５ｇ
当該組成物は一日あたり２回投与される。
【０１０１】
４／チョコレート風味のシリアルバーの実施例
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物    ２００ｍｇ
・リコピン                                      ６ｍｇ
・アスタキサンチン                              ４ｍｇ
・フコキサンチン                                ４ｍｇ
・マイクロカプセル形状のルテイン                ４ｍｇ
・マイクロカプセル化トコトリエノール            ＱＳ〜１００％ＲＤＡ  ビタミンＥ
・ダークチョコレート、オリゴフルクトース、砂糖、果糖シロップ、低脂肪ココアパウダー、クランチシリアル、脱脂粉乳、アーモンド、グリセロール、ソルビトール、植物油、グルコースシロップ、香料、加糖練乳、大豆レシチン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、カラメルシロップ、マルトデキストリン、食塩、ソルビン酸カリウム、α−トコフェノール                                      ＱＳ〜５０ｇ  バー
当該組成物は一日あたり１回投与される。
【０１０２】
５／バニラ風味のシリアルバーの実施例
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物  ２００ｍｇ
・含硫アミノ酸が豊富な穀物類抽出物（コーン、ソバ、キビ、スペルト小麦）
２００ｍｇ
・魚類軟骨グリコサミノグリカン                  ２００ｍｇ
・ポリフェノールが豊富な緑茶抽出物              ２００ｍｇ
・オリゴフルクトース、砂糖、果糖シロップ、クランチシリアル、脱脂粉乳、アーモンド、グリセロール、ソルビトール、植物油、グルコースシロップ、香料、加糖練乳、大豆レシチン、脂肪酸モノグリセリドおよび脂肪酸ジグリセリド、カラメルシロップ、マルトデキストリン、食塩、ソルビン酸カリウム、α−トコフェノール
ＱＳ〜５０ｇ  バー
当該組成物は一日あたり１回投与される。
【０１０３】
６／プラリネ風味の乳飲料の実施例
・Passiflora edulis（クダモノトケイソウ）抽出物    ２００ｍｇ
・ポリフェノールが豊富な緑茶抽出物                １００ｍｇ
・ビタミンＢ群（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ９、Ｂ１２）
ＱＳ〜１００％ＲＤＡ
・亜鉛、マグネシウム、セレン                      ＱＳ〜１００％ＲＤＡ
・脱脂粉乳、香料、フルクトース、卵白、ヘーゼルナッツ、砂糖、カラメル、β−カロテン、キサンタンガム、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、大豆レシチン、マルトデキストリン                                      ＱＳ〜３０  ｇ  １パック
当該組成物は一日あたり１回投与される。
【０１０４】
実施例４：本発明の抽出物の生物学的活性試験
以下の実施例において、実施例１のトケイソウのペプチドおよび糖抽出物をトケイソウ加水分解物として表す。
【０１０５】
Ａ−正常ヒト角化細胞（ＮＨＫ）における活性スクリーニング
培養ＮＨＫにおける遺伝子発現調節の試験（４３，３７６の遺伝子配列を含むアジレント全ゲノムマイクロアレイチップにおける発現プロファイルの検討）によってトケイソウ加水分解物の生物学的活性を評価した。
【０１０６】
ａ−材料および方法
ＮＨＫを２４時間培養し、次いで、乾燥物質の濃度０．０５％のトケイソウ加水分解物で処理した。各分析ポイントが同一期間（７２＋２４時間）培養されるように、角化細胞を交互に処理した（７２ｈ、２４ｈ、６ｈ）。
選択した遺伝子の発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。
対照に対する処理サンプルの強度比（Ｒｉ）を各遺伝子および各処理条件で計算した。
【０１０７】
ｂ−結果
重要であるとみなす結果は、各動態時間だけでなく、３〜６時間または６〜２４時間のいずれかの２つの連続的な時間においてＲｉが＞２である結果である。
【０１０８】
以下に示した：
【０１０９】
転写因子ＡＴＦ３、ＧＡＤＤファミリーのプロアポトーシス遺伝子の転写因子自身ならびに他のストレス誘導プロアポトーシス遺伝子（ＤＤＩＴ４、ＦＡＮＣＥ、ＩＲＳ２およびその標的であるＦＯＸＯ３など）のトケイソウ加水分解物による阻害によって発現する抗アポトーシス効果。
【０１１０】
サイクリン類であるＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１およびサイクリン依存性キナーゼであるＣＤＫ１の遺伝子誘導を介する細胞増殖の活性化効果。この観察結果は、各種の細胞活性化の関連メカニズム、ＤＮＡ複製（ＲＦＣ４、ＴＩＰＩＮ）、有糸分裂（ＣＤＣＡ７、ＣＤＣＡ８）、スプライシング（ＳＦ３Ａ３、ＳＲＳＦ７）、ＲＮＡ転写（ＰＯＰ１）およびタンパク質翻訳（ＷＤＲ３、ＮＯＰ５６、ＭＲＴＯ４）などに関わる遺伝子誘導によって支持される。
【０１１１】
角質層、したがって表皮バリアにおける保護活性を示唆するステロール生合成における活性化効果。すなわち、以下の遺伝子、ＡＣＡＴ１、ＡＣＡＴ２、ＨＭＧＣＳ１、ＨＭＧＣＲ、ＭＶＤ、ＦＤＰＳ、ＦＤＦＴ１、ＳＱＬＥ、ＬＳＳ、ＭＳＭＯ１／ＳＣ４ＭＯＬ、ＤＨＣＲ、ＥＢＰ、ＤＨＣＲ７、ＬＩＰＡおよびＳＯＡＴ１の活性化によって生じる。
【０１１２】
抗酸化メカニズムにおける活性化効果、これは、メタロチオネインであるＭＴ１Ａ、ＭＴ１Ｂ、ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｆ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｈ、ＭＴ１Ｌ、ＭＴ１Ｍ、ＭＴ１Ｘ、ＭＴ２Ａの誘導、グルタチオンであるＧＳＴＡ４、ＧＳＴＭ３、ＭＧＳＴ２、ＧＰＸ１、ＧＰＸ２、ＧＰＸ８、ＧＳＳ、ＰＲＤＸ１またはスーパーオキシドジムスターゼであるＳＯＤ１の生合成に関わる複数の酵素の遺伝子の刺激、ならびにＭＡＦＢ、ＡＴＦ３およびＪＵＮによってコードされる複数の転写因子の遺伝子、および抗酸化応答配列（ＡＲＥ）および低酸素応答配列（ＨＲＥ）モチーフへの結合による酸化ストレス応答のための重要な因子の刺激によって生じる。
【０１１３】
Ｂ−正常ヒト繊維芽細胞（ＮＨＦ）における活性スクリーニング
培養ＮＨＦにおける遺伝子発現調節の試験によってトケイソウ加水分解物の生物学的活性を評価した。即ち、培地中のトケイソウ加水分解物の存在中で、真皮の生態、結合組織の再構築および老化に関わる４６遺伝子の発現、ならびに表皮の主要機能である皮膚の水和、抗酸化応答またはメラニン細胞による色素沈着に直接関連するバリア機能などに関わる４６遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検討した。
【０１１４】
ａ−材料および方法
トケイソウ加水分解物を培地で希釈した。培養ＮＨＦを０．０１％および０．０５％トケイソウ加水分解物で（対照分子であるＴＧＦβ１と共に）２４時間処理する。処理の終了時点で、遺伝子発現における相違点をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。トケイソウ加水分解物によって誘導された遺伝子発現の変化は、未処理の培養物の対応する条件に対する相対量（ＲＱ）として表される（ＲＱ＞１ならば遺伝子発現の刺激、およびＲＱ＜１ならば遺伝子発現の阻害）。
【０１１５】
ｂ−結果
抗酸化メカニズムにおける活性化効果
０．０１％トケイソウ加水分解物は、抗酸化力として知られるミトコンドリア内酵素であるＭＳＲＡ（ミトコンドリアペプチドメチオニンスルホキシドレダクターゼＡ）の遺伝子発現を誘導する。
同様に、０．０５％トケイソウ加水分解物は、スーパーオキシドジムスターゼと同じ活性を有する抗酸化酵素であるＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｈ）デヒドロゲナーゼ  キノン１）の遺伝子発現を誘導する。
ＭＳＱＲＡおよびＮＱＯ１の増加によって、トケイソウ加水分解物は、細胞の老化、したがって皮膚の老化の原因となる酸化的損傷に対するヒト真皮の繊維芽細胞の抵抗性をより高める能力を有する。
【０１１６】
細胞外マトリックス化合物に対する効果
０．０１％および０．０５％トケイソウ加水分解物は、組織の接着に重要な役割を果たす膜貫通型プロテオグリカンであるシンデカン１をコードするＳＤＣ１遺伝子の発現を誘導する。
【０１１７】
【表２４】
0006469582.tif 000025
【０１１８】
Ｃ−メラニン化再構成皮膚における活性スクリーニング
メラニン化再構成皮膚における遺伝子発現調節の試験によってトケイソウ加水分解物の生物学的活性を評価した。即ち、培地中のトケイソウ加水分解物の存在中で、真皮の生態、結合組織の再構築および老化に関わる４６遺伝子の発現、ならびに表皮の主要機能である皮膚の水和、抗酸化応答またはメラニン細胞による色素沈着に直接関連するバリア機能など）に関わる４６遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって検討した。
【０１１９】
ａ−材料および方法
トケイソウ加水分解物を培地で希釈した。皮膚サンプルを０．０１％および０．０５％トケイソウ加水分解物で（対照分子であるＴＧＦβ１と共に）２４時間処理する。処理の終了時点で、遺伝子発現における相違点をｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。トケイソウ加水分解物によって誘導された遺伝子発現の変化は、未処理の培養物の対応する条件に対する相対量（ＲＱ）として表される（ＲＱ＞１ならば遺伝子発現の刺激、およびＲＱ＜１ならば遺伝子発現の阻害）。
【０１２０】
ｂ−結果
真皮／表皮の接合に関わる遺伝子における効果
０．０５％トケイソウ加水分解物は、ラミニンＣ２をコードする遺伝子であるＬＡＭＣ２の発現を誘導し、したがって、トケイソウ加水分解物は真皮−表皮接合の強化を助け、それにより皮膚の弾力を増進することができる。
【０１２１】
皮膚のバリア機能に関わる遺伝子における効果
０．０５％トケイソウ加水分解物は、皮膚のバリア機能において必須の役割を果たす角質細胞のイニシエーションおよび成熟に関わる角膜（ｃｏｒｎｅａｌ）肥厚膜の構造タンパク質であるインボルクリン（ＩＶＬ）をコードする遺伝子の発現を誘導する。それは、水和およびバリア機能にも関わるフィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子の発現も刺激する。
【０１２２】
他の遺伝子における効果
トケイソウ加水分解物は、メラニン形成過程に関わるＭＣ１Ｒ、炎症応答に関わるＰＴＧＳ２、ならびに抗アポトーシス因子および幹細胞マーカーであるＢＩＲＣ５の発現を減少させる。
【０１２３】
【表２５】
0006469582.tif 000026
【０１２４】
Ｄ−ヒト脂肪組織の脂肪分解における効果
ヒト白色脂肪組織は、脂肪細胞の脂肪分解過程で放出される脂肪酸形状のエネルギー分子を生物の他の組織に提供することによって、基礎的な代謝機能に影響を及ぼす。脂肪細胞は、脂肪酸およびグリセロールが蓄えられているトリグリセリドの加水分解によって貯蔵されたエネルギーを動態化する。そのようにして血液中に放出された脂肪酸は他の組織によるエネルギー源として使用することができる。
三次元系中で培養された成熟ヒト脂肪細胞に蓄えられたトリグリセリドの加水分解中に放出されたグリセロールのアッセイによって脂肪細胞の脂肪分解におけるトケイソウ加水分解物の効果を評価した。
【０１２５】
ａ）材料および方法
４人の正常体重または過体重の女性ドナーの皮下脂肪組織の組織診で単離された成熟脂肪細胞をトケイソウ加水分解物の存在中で３７℃で４時間培養した。比色法を用いて放出されたグリセロールをアッセイし、得られた値をＤＮＡ量で標準化した。結果を一元配置分散分析手段、次いでダネット検定によって統計的に比較した。
【０１２６】
ｂ）結果
結果を以下の表に示す。
【０１２７】
【表２６】
0006469582.tif 000027
【０１２８】
０．００５％トケイソウ加水分解物はグリセロール放出を著しく刺激し、脂肪細胞の脂肪分解における活性化効果を示した。
【０１２９】
Ｅ−抗チロシナーゼ活性
チロシナーゼはメラニン合成の重要な酵素である。この酵素の特異的阻害剤はメラニン合成の阻害をもたらし、脱色素効果を引き起こすことができる。
トケイソウ加水分解物の効果をヒトメラニン細胞から抽出したチロシナーゼの活性によって評価した（細胞不使用試験）。
【０１３０】
ａ）材料および方法
トケイソウ加水分解物および試験標準（コウジ酸）を酵素抽出物（チロシナーゼ）と一緒にし、１０分間氷上で培養した。培養の最後に基質であるＬ−ＤＯＰＡ（２ｍＭ）を添加し、サンプルを３７℃で１時間培養した。酵素活性を比色法により評価した（５４０ｎｍで吸光度を読み取り）。結果をチロシナーゼ活性の割合で表し、スチューデントのｔ検定を用いて統計的に比較した。
【０１３１】
ｂ）結果
結果を以下の表に示す。
【０１３２】
【表２７】
0006469582.tif 000028
【０１３３】
トケイソウ加水分解物はチロシナーゼの酵素活性を明確に濃度依存的に阻害した（ＩＣ５０＝０．１６％）。
【０１３４】
Ｆ−酸化的ストレスに対する保護
内因的または外因的（喫煙、大気汚染、紫外線）に引き起こされる酸化的ストレスは多くの皮膚疾患の原因である。実際に、フリーラジカルの生成を介して、酸化的ストレスは皮膚細胞の各種成分（タンパク質、脂質、核、ミトコンドリアＤＮＡ）を変異させ得る。トケイソウ加水分解物の抗酸化効果を、第一にフリーラジカル生成を調節する能力の評価、および第二に酸化的ストレスが付された細胞内の脂質の過酸化に対する保護効果の評価によって確認した。
【０１３５】
１．角化細胞における活性酸素種の生成における効果
角化細胞における過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）によってもたらさる酸化的ストレスに対するトケイソウ加水分解物の抗酸化作用を活性酸素種の生成量を測定することによって評価した。この試験は活性酸素種（ＲＯＳ）と接触して破壊されて蛍光を発するプローブ（ＤＣＦＨ−ＤＡ）の使用に基づく。発せられる蛍光は、酸化的ストレスに応答する細胞によって生成されるＲＯＳの量に比例するだろう。
【０１３６】
ａ）材料および方法
正常ヒト角化細胞をトケイソウ加水分解物または参照分子、１０μＭケルセチンまたは５００μＭビタミンＣの存在中で２４時間前培養した。次いで、当該細胞をプローブＤＣＦＨ−ＤＡの存在中で１時間培養し、引き続きトケイソウ加水分解物または参照分子の存在中で、１００μＭＨ２Ｏ２で２０分間処理した。ＲＯＳアッセイは発せられる蛍光を測定することによって行った。並行して行われたニュートラルレッド取り込みアッセイを用いて決定した生存細胞数で結果を標準化した。放出されたＲＯＳの量を蛍光密度（ＤＦＵ）／ニュートラルレッドアッセイによる吸光度（ＯＤ５４０）で表す。結果を一元配置分散分析、次いでチューキー検定(Tukey’s test)によって統計的に分析した。
【０１３７】
ｂ）結果
結果を以下の表に示す。
【０１３８】
【表２８】
0006469582.tif 000029
【０１３９】
トケイソウ加水分解物は、Ｈ２Ｏ２ストレスによって誘導されたＲＯＳの生成を強力かつ非常に重要な方法で阻害した。
【０１４０】
２．脂質過酸化における保護効果
脂質過酸化におけるトケイソウ加水分解物の保護効果をＵＶ照射されたジャーカット細胞(Jurkat cell)で評価した。
【０１４１】
ａ）材料および方法
脂質過酸化物の測定に特異的な蛍光プローブ（Ｃ１１−フッ素）の存在中、ジャーカット細胞をトケイソウ加水分解物または参照（５０μＭＢＨＴ）の存在中または非存在中で４５分間培養した。この蛍光プローブは膜組織に組み込まれた脂質アナログであり、過酸化されたときに蛍光強度が減少する。次いでトケイソウ加水分解物または参照の存在中で細胞をＵＶ（ＵＶＢ２４０ｍＪ／ｃｍ2＋ＵＶＡ３．５Ｊ／ｃｍ2）照射した。照射終了後、フローサイトメトリーで分析する前に細胞を３７℃３０分間培養した。得られた蛍光強度の結果を照射した対照に対する％として表した。
【０１４２】
ｂ）結果
結果を以下の表に示す。
【０１４３】
【表２９】
0006469582.tif 000030
【０１４４】
０．０５％トケイソウ加水分解物はＵＶ照射によって誘導された脂質過酸化から細胞を保護した（２４％保護）。