(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞の分化によって生着可能なヒトケラチノサイト幹細胞を提供する方法であって、
（ａ）規定された基本培地の存在下において浮遊培養で多能性幹細胞の凝集体を形成させること；
（ｂ）開始凝集体の形成を促すために、レチノイン酸および骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含有する開始培地の存在下において浮遊培養で凝集体を培養すること；
（ｃ）ケラチノサイト前駆細胞を含む細胞集団の形成を促すために、コレラ毒素および（トランスフォーミング増殖因子ベータレセプター１（ＴＧＦβＲ１）キナーゼ阻害剤を含有するケラチノサイト前駆体培地中で開始凝集体を培養すること；および
（ｄ）生着可能なケラチノサイト幹細胞を含む細胞集団の形成を促すために、コレラ毒素および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含むケラチノサイト幹細胞成熟培地中でケラチノサイト前駆細胞を培養すること、
を含み、ケラチノサイト幹細胞がサイトケラチン１５及びＣＤ４９ｆを発現する、方法。
【請求項２】
ケラチノサイト幹細胞を、コレラ毒素およびＴＧＦβＲ１キナーゼ阻害剤を含有するケラチノサイト幹細胞維持培地中における培養中で維持することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ケラチノサイト幹細胞を、集団が少なくとも５倍に倍加するまで維持する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ケラチノサイト幹細胞の純度が少なくとも９０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞を、（ｉ）工程（ａ）の前に、血清を含まない培地中で、及び／又は（ｉｉ）工程（ａ）の前に、非細胞性マトリックス成分上で、培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）で使用される培地が、化学的に規定された培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における培養が約１日間実施される、工程（ｂ）における培養が約１日〜約５日間実施される、工程（ｃ）における培養が約８日間〜約１４日間実施される、及び／又は工程（ｄ）における培養が約４日間〜約８日間実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）における培養がミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ケラチノサイト前駆細胞培地が、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）、サイクリックＡＭＰ類似体、ナイアシンアミド、アスコルビン酸、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）における培養が接着培養として実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）及び／又は工程（ｄ）における培養が細胞外マトリックス成分又は非細胞性マトリックス成分上で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ケラチノサイト前駆細胞がサイトケラチン１４および／またはｐ６３を発現している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ケラチノサイト前駆細胞培地に含まれるカルシウムのレベルが約０．２ｍＭを超えるものではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ケラチノサイト幹細胞成熟培地が、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、サイクリックＡＭＰ類似体、ナイアシンアミド、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２０１４年１０月１４日出願の米国特許出願番号第６２／０６３，７２０号の優先権を主張し、その開示全体は、免責条項以外の全体が参照により本明細書中に具体的に組み入れられる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は基本的に、幹細胞および分化細胞の分野に関する。本発明は、より具体的には、未分化細胞からの人工ケラチノサイト幹細胞（ｉＫＣ）の生成および初代ケラチノサイトの培養方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．関連技術の説明
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ケラチノサイトを含む体の全種類の細胞に分化する能力を維持しながら、インビトロで長期間増殖させることができる。そのためこれらの多能性細胞は、移植治療および化粧品／創薬のいずれにとっても患者特異的な機能性ケラチノサイトの制約のない供給源となる可能性がある。
【０００４】
これまで複数のグループによって、マウスおよびヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を上皮ケラチノサイト（サイトケラチン１４陽性）に分化させる手法が報告されている。メタロら（２０１０）は、胚様体にレチノイン酸とＢＭＰ４を処理し、フィーダー細胞を使用せず、コラーゲンＩＶでコーティングした表面上で単層培養を行うことによりヒトＥＳ細胞からケラチノサイトを誘導した。カワサキら（２０００）は、マウスＥＳ細胞からの神経分化を促進するフィーダー細胞を使い、そこにＢＭＰ４を加えて神経外胚葉の上皮細胞への決定づけを開始させる方法を報告した。リアンら（２０１３）は、Ｓｒｃファミリーキナーゼに属する低分子阻害剤を使ってシンプル（simple）上皮前駆細胞を誘導し、これをさらに、血清を含まない条件で上皮ケラチノサイトに分化させる方法を説明している。しかしながら、これらのいずれの方法によっても、細胞数が２倍を超えて倍加するまたは長期間生着する能力を有する上皮ケラチノサイト幹細胞（サイトケラチン１４およびサイトケラチン１５の両方が陽性）を生じることはできない。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、多能性幹細胞の分化によって生着可能なケラチノサイト幹細胞を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）規定された基本培地の存在下において浮遊培養で多能性幹細胞の凝集体を形成させること；（ｂ）開始凝集体の形成を促すために、レチノイン酸およびＢＭＰ４を含有する開始培地の存在下において浮遊培養でこの凝集体を培養すること；（ｃ）ケラチノサイト前駆細胞を含む細胞集団の形成を促すために、コレラ毒素およびＴＧＦsＲ１キナーゼ阻害剤を含有するケラチノサイト前駆体培地中で開始凝集体を培養すること；および（ｄ）生着可能なケラチノサイト幹細胞を含む細胞集団の形成を促すために、ケラチノサイト幹細胞成熟培地中でこのケラチノサイト前駆細胞を培養すること、を含む。
【０００６】
種々の側面においてこの方法は、ケラチノサイト幹細胞維持培地中での培養でケラチノサイト幹細胞を維持することをさらに含む場合がある。特定の側面において、ケラチノサイト幹細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそこから導き出される任意の範囲の期間、維持され得る。細胞は、好ましくは、その集団が少なくとも５倍にまたは少なくとも１０倍に倍加するまで維持され得る。特定の側面において、ケラチノサイト幹細胞は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％の純度であってよい。好ましくは、ケラチノサイト幹細胞は、少なくとも９０％または９５％の純度でもよい。
【０００７】
特定の側面において、多能性幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞または胚性幹細胞の場合がある。幹細胞にはまた、多分化能性幹細胞、少能性幹細胞、または単能性幹細胞も含まれ得る。幹細胞にはまた、胎生幹細胞または成体幹細胞、例えば上皮幹細胞、および皮膚幹細胞も含まれ得る。特定の側面において、幹細胞は、臍帯、胎盤、羊水、絨毛膜絨毛、胚盤胞、骨髄、脂肪組織、脳、末梢血、臍帯血、経血、血管、骨格筋、皮膚、および肝臓から単離される場合がある。
【０００８】
いくつかの側面では、工程（ａ）の前に、多能性幹細胞を、血清を含まない培地中で培養してもよい。いくつかの側面では工程（ａ）の前に、多能性幹細胞を非細胞性マトリックス成分上で培養してもよい。
【０００９】
種々の側面において凝集体を形成することは、多能性幹細胞を、本質的に単一の細胞の培養へと分離させることを含む場合がある。特定の側面において、本方法の本質的に単一の培養は、少なくともまたは約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３個の細胞またはそこから導き出される任意の範囲の数の細胞を含み得る。本質的に単一の細胞の培養の初期播種密度は、少なくともまたは約１０、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８個細胞／ｍＬ、またはそこから導き出される任意の範囲の密度であってよい。特定の側面において、工程（ａ）における培地は組成が化学的に規定された培地、例えばＴｅＳＲ培地などであってよい。いくつかの側面において、工程（ａ）における培養は、約１、２、または３日間という期間の間、実施してもよい。前記培養することが約１日間実施されることが好ましい。種々の側面において、工程（ａ）における培養は、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤の存在下で実施してもよい。
【００１０】
いくつかの側面において、工程（ｂ）における培養は、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間、またはそこから導き出される任意の範囲の期間、実施してもよい。前記培養することが約１日〜約５日の間、例えば約３日間、実施されることが好ましい。特定の側面において、工程（ａ）および／または（ｂ）の浮遊培養は、静的な浮遊培養として維持することができる。特定の側面において、工程（ａ）および／または（ｂ）の浮遊培養は、動的な浮遊培養として維持することもできる。
【００１１】
特定の側面において、工程（ｃ）における培養は、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間、またはそこから導き出される任意の範囲の期間にわたって実施してもよい。前記培養することは、約８日間〜約１４日間実施すること、例えば、約１０日間実施することなどが好ましい。いくつかの側面では、工程（ｃ）における培養を接着培養として実施してもよい。いくつかの側面では、工程（ｃ）における培養を、細胞外マトリックス成分上において実施してもよい。いくつかの側面では、工程（ｃ）における培養を、非細胞性マトリックス成分上において実施してもよい。
【００１２】
種々の側面では、ケラチノサイト前駆細胞培地は、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、サイクリックＡＭＰ類似体、ナイアシンアミド、アスコルビン酸、またはこれらの組み合わせをさらに含む場合がある。いくつかの側面では、ケラチノサイト前駆細胞培地はＥＧＦおよびナイアシンアミドをさらに含む場合がある。特定の側面では、ケラチノサイト前駆細胞培地に含まれるカルシウムのレベルは、約０．２ｍＭを超えない場合があり、好ましくは約０．１２ｍＭを超えない場合がある。
【００１３】
特定の側面においてケラチノサイト前駆細胞は、サイトケラチン１４および／またはｐ６３を発現している場合がある。前記発現は、タンパク質の発現解析、例えばＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ解析、またはＲＮＡの発現解析、例えばｑＲＴ−ＰＣＲで検出することができる。
【００１４】
特定の側面では、工程（ｄ）における培養を少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間、またはそこから導き出される任意の範囲の期間、実施することができる。前記培養することは、約４日間〜約８日間実施すること、例えば、約６日間実施することなどが好ましい。いくつかの側面では、工程（ｄ）における培養を接着培養として実施してもよい。いくつかの側面では、工程（ｄ）における培養を細胞外マトリックス成分上において実施してもよい。いくつかの側面では、工程（ｄ）における培養を非細胞性マトリックス成分上において実施してもよい。
【００１５】
種々の側面では、ケラチノサイト幹細胞成熟培地が、コレラ毒素、ＴＧＦsＲ１キナーゼ阻害剤、ＥＧＦ、ＦＧＦ１、サイクリックＡＭＰ類似体、ナイアシンアミド、またはこれらの組み合わせのうちのいずれかを含む場合がある。
【００１６】
特定の側面では、ケラチノサイト幹細胞がサイトケラチン１５および／またはＣＤ４９ｆを発現している場合がある。前記発現を、タンパク質の発現解析、例えばＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ解析、またはＲＮＡの発現解析、例えばｑＲＴ−ＰＣＲで検出することができる。
【００１７】
一態様では、ケラチノサイトに及ぼす薬理学的な効果または毒性学的な効果について化合物を評価する方法が提供され、この方法は、（ａ）本態様の方法によって提供されたケラチノサイトを化合物と接触させること；および（ｂ）この化合物がケラチノサイトに及ぼす薬理学的な効果または毒性学的な効果を評価すること、を含む。
【００１８】
一態様では、本態様の方法によって生成されたケラチノサイト幹細胞を含む、移植可能な上皮細胞のシートを提供する。いくつかの側面においてこのシートはさらに、移植可能な皮膚上皮細胞のシートとして規定される場合がある。いくつかの側面においてこのシートはさらに、移植可能な角膜上皮細胞のシートとして規定される場合がある。
【００１９】
一態様では、治療を必要としている患者の治療方法が提供され、この方法は、本態様の移植可能な上皮細胞のシートを患者に移植することを含む。特定の側面においてこのケラチノサイト幹細胞は、患者にとって自家移植であってもよい。
【００２０】
一態様では、ナイアシンアミドおよびＢＭＰ４を含有する、規定されたケラチノサイト培地が提供される。特定の側面においてこの培地はさらに、約３ｍＭナイアシンアミドを含むものとして規定されていてもよい。特定の側面においてこの培地はさらに、約０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を含むものとして規定されていてもよい。いくつかの側面においてこの培地は、ＶＥＧＦおよび／またはインスリンをさらに含んでいてもよい。いくつかの側面においてこの培地は、カルシウム、エタノールアミンおよびホスホリルエタノールアミン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、ＦＧＦ１、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、Ｌ−カルニチン、サイクリックＡＭＰ類似体、および／またはコレラ毒素をさらに含んでいてもよい。いくつかの側面においてこの方法は、８０μＭのカルシウム、０．１ｍＭのエタノールアミン、０．１ｍＭのホスホリルエタノールアミン、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、０．２μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、１ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１、０．５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、１０ｎＭのＴ３、５μＭのＬ−カルニチン、０．２ｍＭの８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、１００ｐＭのコレラ毒素、３ｍＭのナイアシンアミド、０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、２５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および１０μｇ／ｍＬのインスリンを含むものとして規定されていてもよい。
【００２１】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明によって明らかとなるだろう。しかしながら、その詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい態様を示すものではあるものの、例示のためだけに提供されるものであり、当業者にはこの詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修正が明らかであると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
以下の図面は本明細書の一部をなしており、かつ、本発明の特定の側面をさらに示すために含まれている。これらの図面の１つ以上を、本明細書に記載の特定の態様に関する詳細な説明と共に参照することで、本発明をより深く理解することができるだろう。
【００２３】
【図１】図１：ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣから誘導した人工ケラチノサイト幹細胞（ｉＫＣ）の正常な分化。ケラチノサイト幹細胞は、開始、分化、成熟、および維持の４工程でＥＳＣ／ｉＰＳＣから生成することができる。各工程で使用する組成が化学的に規定された培地の全組成（ＦＢＳを含まない、およびＢＳＡを含まない）を表１〜４に示している。
【００２４】
【図２Ａ】図２Ａ−Ｂ：ｉＫＣの顕微鏡レベルの特徴。（Ａ）３回継代したヒト包皮ケラチノサイトと１回継代したｉＫＣの位相差顕微鏡像。矢印は、明るく見える細胞間の境界を示している。これは、皮膚にバリア機能をもたらしている密着結合を共有しているケラチノサイトに典型的な特徴である。（Ｂ）免疫蛍光染色した、ヒト包皮ケラチノサイトおよびｉＫＣの顕微鏡像である。細胞を、培養プレート上において２％のホルムアルデヒドで固定し、抗サイトケラチン１４（Ｋ１４）および抗サイトケラチン１５（Ｋ１５）抗体で染色した。オリンパスＩＸ７１倒立顕微鏡で別々の蛍光チャネルを使い、画像を得た。スケールバーは１００μＭを示している。
【図２Ｂ】図２Ａ−Ｂ：ｉＫＣの顕微鏡レベルの特徴。（Ａ）３回継代したヒト包皮ラチノサイトと１回継代したｉＫＣの位相差顕微鏡像。矢印は、明るく見える細胞間の境界を示している。これは、皮膚にバリア機能をもたらしている密着結合を共有しているケラチノサイトに典型的な特徴である。（Ｂ）免疫蛍光染色した、ヒト包皮ケラチノサイトおよびｉＫＣの顕微鏡像である。細胞を、培養プレート上において２％のホルムアルデヒドで固定し、抗サイトケラチン１４（Ｋ１４）および抗サイトケラチン１５（Ｋ１５）抗体で染色した。オリンパスＩＸ７１倒立顕微鏡で別々の蛍光チャネルを使い、画像を得た。スケールバーは１００μＭを示している。
【００２５】
【図３Ａ】図３Ａ−Ｂ：ｉＫＣの誘導に必須の成分。（Ａ）最適な条件（図１および表１、２を参照のこと）、および１度に培地成分を１つ変更した他の非最適条件において、継代０の、１４日間分化させた培養の位相差顕微鏡像。（Ｂ）異なる線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を使い、継代０の１４日間分化させた培養の位相差顕微鏡像と免疫蛍光顕微鏡像。細胞を、培養プレート上において２％のホルムアルデヒドで固定し、抗Ｋ１４抗体で染色し、さらにＤＡＰＩでＤＮＡを対比染色した。オリンパスＩＸ７１倒立顕微鏡で別々の蛍光チャネルを使い、画像を得た。スケールバーは１００μＭを示している。
【図３Ｂ】図３Ａ−Ｂ：ｉＫＣの誘導に必須の成分。（Ａ）最適な条件（図１および表１、２を参照のこと）、および１度に培地成分を１つ変更した他の非最適条件において、継代０の、１４日間分化させた培養の位相差顕微鏡像。（Ｂ）異なる線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を使い、継代０の１４日間分化させた培養の位相差顕微鏡像と免疫蛍光顕微鏡像。細胞を、培養プレート上において２％のホルムアルデヒドで固定し、抗Ｋ１４抗体で染色し、さらにＤＡＰＩでＤＮＡを対比染色した。オリンパスＩＸ７１倒立顕微鏡で別々の蛍光チャネルを使い、画像を得た。スケールバーは１００μＭを示している。
【００２６】
【図４】図４：ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣから分化させたｉＫＣの純度。図１で説明した方法によってｉＫＣを生成し、その後、継代していない時点（Ｐ０）と１回継代した時点（Ｐ１）で回収した。細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、抗Ｋ１４−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ４９ｆ−ＰＥ抗体で染色した。アキュリ（Ａｃｃｕｒｉ）フローサイトメーターを使い、染色したｉＫＣ、ならびにイソ型対照および３回継代した初代ヒト包皮ケラチノサイトを分析した。
【００２７】
【図５】図５Ａ−Ｂ：ｉＫＣの成長能および幹細胞性。（Ａ）維持条件におけるｉＫＣの増殖能。バーゼン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）中の０．１％トリプシンを使い、ｉＫＣを、ゼラチンでコーティングしたヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞５０，０００個の密度で継代した。細胞に隔日で維持培地を与え、プレーティングしてから５日目に、再度継代した。継代ごとに総細胞数を記録し、集団の倍加率を計算した。（Ｂ）ｉＫＣおよび初代ケラチノサイトのコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）画像。細胞を、６ウェルプレーに１ウェル当たり細胞２５０個の密度でプレーティングし、２週間生育させた。初代ケラチノサイトの最適な成長には、ブランクの、非細胞性培養で処理したプレートを用いた。一方ｉＫＣには、基底膜として天然のラミニン残留物が生じるように予め初代ケラチノサイトを培養しておいたプレートを使用した。培養の終了時に細胞を２％のホルムアルデヒドで固定し、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）で染色した。モレキュラー・デバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）社のイメージエクスプレス（ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ）高解像度イメージャを使い、プレート全体の画像を取得した。スケールバーは１ｃｍを示している。
【００２８】
【図６】図６Ａ−Ｂ：ｉＫＣの分化能。（Ａ）マウス脱表皮化真皮（ＤＥＤ）における、ｉＫＣの分化および層化。トランズウェル中で２週間培養した後、凍結切片を作成するために、ＤＥＤ移植片を取り除き、ＯＣＴコンパウンドに包埋した。切片（１６μＭ）を切り出し、ヘマトキシリンで染色した。移植された細胞の核はピンク色に染まった。括弧は、白色に見える下部のＤＥＤ組織の上にある、生きた細胞の複数の層を示している。（Ｂ）ＦｏｘＮ１免疫不全ヌードマウスの背中におけるｉＫＣの生着性。これらの写真は手術の３週間後に撮られたもので、ｉＫＣ（２複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅまたはｒｅｐ））をヒト新生仔包皮線維芽細胞（ｈＦＢ）と一緒に移植すると、初代マウスおよびヒトケラチノサイト（ｍＫＣおよびｈＫＣ）と同程度に、最初にあった皮膚の創傷を覆い、治すことができることが分かった。ｈＦＢだけを移植したマウスは、術後１〜２週間の間に死んだ。ｉＫＣ移植の方では残存毛がないことに注目されたい。スケールバーは５００μＭ。
【００２９】
【図７Ａ】図７Ａ―Ｄ：インスリンおよびＩＧＦは両方とも、ヒト新生仔包皮初代ケラチノサイトの成長を支持する。（Ａ）ＫＣＭ１中で、ＩＧＦまたは様々な濃度のインスリン（０〜１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に培養した初代ケラチノサイトの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）ＫＣＭ１を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ及びＤ）ＫＣＭ１改変物中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。６回継代したもののデータを示している。
【図７Ｂ−Ｃ】図７Ａ―Ｄ：インスリンおよびＩＧＦは両方とも、ヒト新生仔包皮初代ケラチノサイトの成長を支持する。（Ａ）ＫＣＭ１中で、ＩＧＦまたは様々な濃度のインスリン（０〜１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に培養した初代ケラチノサイトの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）ＫＣＭ１を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ及びＤ）ＫＣＭ１改変物中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。６回継代したもののデータを示している。
【図７Ｄ】図７Ａ―Ｄ：インスリンおよびＩＧＦは両方とも、ヒト新生仔包皮初代ケラチノサイトの成長を支持する。（Ａ）ＫＣＭ１中で、ＩＧＦまたは様々な濃度のインスリン（０〜１０μｇ／ｍＬ）のいずれかと共に培養した初代ケラチノサイトの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）ＫＣＭ１を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ及びＤ）ＫＣＭ１改変物中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。６回継代したもののデータを示している。
【００３０】
【図８Ａ】図８Ａ−Ｅ：ナイアシンアミドおよびＢＭＰ−４は、培養中の初代ケラチノサイトの寿命を長くする。（Ａ）様々な培地調製物中で培養した初代ケラチノサイトの明視野像（ｐ３）。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）様々な培地調製物を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ）様々な培地組成中で培養したケラチノサイト（ｐ４）を使ったＣＦＡ。（ＤおよびＥ）ＫＣＭ１、ＫＣＭ２、ＫＣＭ３およびＫＣＭ４を使って培養したケラチノサイトを使ったＣＦＡの定量。
【図８Ｂ】図８Ａ−Ｅ：ナイアシンアミドおよびＢＭＰ−４は、培養中の初代ケラチノサイトの寿命を長くする。（Ａ）様々な培地調製物中で培養した初代ケラチノサイトの明視野像（ｐ３）。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）様々な培地調製物を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ）様々な培地組成中で培養したケラチノサイト（ｐ４）を使ったＣＦＡ。（ＤおよびＥ）ＫＣＭ１、ＫＣＭ２、ＫＣＭ３およびＫＣＭ４を使って培養したケラチノサイトを使ったＣＦＡの定量。
【図８Ｃ】図８Ａ−Ｅ：ナイアシンアミドおよびＢＭＰ−４は、培養中の初代ケラチノサイトの寿命を長くする。（Ａ）様々な培地調製物中で培養した初代ケラチノサイトの明視野像（ｐ３）。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）様々な培地調製物を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ）様々な培地組成中で培養したケラチノサイト（ｐ４）を使ったＣＦＡ。（ＤおよびＥ）ＫＣＭ１、ＫＣＭ２、ＫＣＭ３およびＫＣＭ４を使って培養したケラチノサイトを使ったＣＦＡの定量。
【図８Ｄ】図８Ａ−Ｅ：ナイアシンアミドおよびＢＭＰ−４は、培養中の初代ケラチノサイトの寿命を長くする。（Ａ）様々な培地調製物中で培養した初代ケラチノサイトの明視野像（ｐ３）。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）様々な培地調製物を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ）様々な培地組成中で培養したケラチノサイト（ｐ４）を使ったＣＦＡ。（ＤおよびＥ）ＫＣＭ１、ＫＣＭ２、ＫＣＭ３およびＫＣＭ４を使って培養したケラチノサイトを使ったＣＦＡの定量。
【図８Ｅ】図８Ａ−Ｅ：ナイアシンアミドおよびＢＭＰ−４は、培養中の初代ケラチノサイトの寿命を長くする。（Ａ）様々な培地調製物中で培養した初代ケラチノサイトの明視野像（ｐ３）。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）様々な培地調製物を使った初代ケラチノサイトの長期培養。（Ｃ）様々な培地組成中で培養したケラチノサイト（ｐ４）を使ったＣＦＡ。（ＤおよびＥ）ＫＣＭ１、ＫＣＭ２、ＫＣＭ３およびＫＣＭ４を使って培養したケラチノサイトを使ったＣＦＡの定量。
【００３１】
【図９Ａ】図９Ａ−Ｃ：ＶＥＧＦは初代ケラチノサイトの増殖能を高めた。（Ａ）ＫＣＭ４およびＫＣＭ４＋ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を使って育てた細胞の長期培養。（ＢおよびＣ）継代後期におけるＣＦＡにおけるＶＥＧＦの正の効果。
【図９Ｂ】図９Ａ−Ｃ：ＶＥＧＦは初代ケラチノサイトの増殖能を高めた。（Ａ）ＫＣＭ４およびＫＣＭ４＋ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を使って育てた細胞の長期培養。（ＢおよびＣ）継代後期におけるＣＦＡにおけるＶＥＧＦの正の効果。
【図９Ｃ】図９Ａ−Ｃ：ＶＥＧＦは初代ケラチノサイトの増殖能を高めた。（Ａ）ＫＣＭ４およびＫＣＭ４＋ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）を使って育てた細胞の長期培養。（ＢおよびＣ）継代後期におけるＣＦＡにおけるＶＥＧＦの正の効果。
【００３２】
【図１０Ａ】図１０Ａ−Ｃ：ケラチノサイトは、コラーゲン１をコーティングしたプラスチック製のプレートまたはコーティングしていないプラスチック製のプレートのいずれかを使って培養することができる。（Ａ）ＫＣＭ４中で、コラーゲン１をコーティングしたプレートまたはコーティングしていないプレートのいずれかで生育させた、長期細胞培養。（ＢおよびＣ）コーティングしていないプレート上で生育させた細胞は、コラーゲン上で生育させた細胞より、ＣＦＡにおいて多少よく成長した。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−Ｃ：ケラチノサイトは、コラーゲン１をコーティングしたプラスチック製のプレートまたはコーティングしていないプラスチック製のプレートのいずれかを使って培養することができる。（Ａ）ＫＣＭ４中で、コラーゲン１をコーティングしたプレートまたはコーティングしていないプレートのいずれかで生育させた、長期細胞培養。（ＢおよびＣ）コーティングしていないプレート上で生育させた細胞は、コラーゲン上で生育させた細胞より、ＣＦＡにおいて多少よく成長した。
【図１０Ｃ】図１０Ａ−Ｃ：ケラチノサイトは、コラーゲン１をコーティングしたプラスチック製のプレートまたはコーティングしていないプラスチック製のプレートのいずれかを使って培養することができる。（Ａ）ＫＣＭ４中で、コラーゲン１をコーティングしたプレートまたはコーティングしていないプレートのいずれかで生育させた、長期細胞培養。（ＢおよびＣ）コーティングしていないプレート上で生育させた細胞は、コラーゲン上で生育させた細胞より、ＣＦＡにおいて多少よく成長した。
【００３３】
【図１１】図１１：ＫＣＭ４中で培養したケラチノサイトは、高レベルのカルシウムに応答した分化マーカーを発現する。３回継代したケラチノサイトを１．５ｍＭのＣａ２＋で３日間処理し、分化マーカーであるケラチン１、ロリクリンおよびフィラグリンの発現を免疫細胞化学によって評価した。スケールバーは２００μｍ。
【００３４】
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｄ：ＫＣＭ４は、市販されている組成が化学的に規定された培地と同様に機能する。ＫＣＭ４を、３種類の組成が化学的に規定された培地、つまり、インビトロジェンのケラチノサイト血清を含まない既知組成培地（ＤＫＳＦＭ）、エピライフの既知組成の成長補助培地（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＤＧＳ）、およびロンザのケラチノサイト既知組成成長培地（ＫＧＭ−ＣＤ）、と比較した。市販の培地中で培養した細胞は、製造業者が推奨しているように、コラーゲンＩ（Ｃ１）をコーティングしてあるプレート上で生育させた。ＫＣＭ４培養には非コーティング（ＮＣ）プレートを使用した。（Ａ）それぞれの培地（Ｐ３  ＤＳＫＦＭ、ＥＤＧＳおよびＫＧＭ−ＣＤおよびＰ５  ＫＣＭ４）中で培養した初代ＫＣの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）それぞれの培地中で培養した初代ケラチノサイトの長期培養。（ＣおよびＤ）それぞれの培地中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。コロニーの数と大きさに関しては、ＫＣＭ４がその他の培地よりも良かった。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−Ｄ：ＫＣＭ４は、市販されている組成が化学的に規定された培地と同様に機能する。ＫＣＭ４を、３種類の組成が化学的に規定された培地、つまり、インビトロジェンのケラチノサイト血清を含まない既知組成培地（ＤＫＳＦＭ）、エピライフの既知組成の成長補助培地（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＤＧＳ）、およびロンザのケラチノサイト既知組成成長培地（ＫＧＭ−ＣＤ）、と比較した。市販の培地中で培養した細胞は、製造業者が推奨しているように、コラーゲンＩ（Ｃ１）をコーティングしてあるプレート上で生育させた。ＫＣＭ４培養には非コーティング（ＮＣ）プレートを使用した。（Ａ）それぞれの培地（Ｐ３  ＤＳＫＦＭ、ＥＤＧＳおよびＫＧＭ−ＣＤおよびＰ５  ＫＣＭ４）中で培養した初代ＫＣの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）それぞれの培地中で培養した初代ケラチノサイトの長期培養。（ＣおよびＤ）それぞれの培地中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。コロニーの数と大きさに関しては、ＫＣＭ４がその他の培地よりも良かった。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−Ｄ：ＫＣＭ４は、市販されている組成が化学的に規定された培地と同様に機能する。ＫＣＭ４を、３種類の組成が化学的に規定された培地、つまり、インビトロジェンのケラチノサイト血清を含まない既知組成培地（ＤＫＳＦＭ）、エピライフの既知組成の成長補助培地（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＤＧＳ）、およびロンザのケラチノサイト既知組成成長培地（ＫＧＭ−ＣＤ）、と比較した。市販の培地中で培養した細胞は、製造業者が推奨しているように、コラーゲンＩ（Ｃ１）をコーティングしてあるプレート上で生育させた。ＫＣＭ４培養には非コーティング（ＮＣ）プレートを使用した。（Ａ）それぞれの培地（Ｐ３  ＤＳＫＦＭ、ＥＤＧＳおよびＫＧＭ−ＣＤおよびＰ５  ＫＣＭ４）中で培養した初代ＫＣの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）それぞれの培地中で培養した初代ケラチノサイトの長期培養。（ＣおよびＤ）それぞれの培地中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。コロニーの数と大きさに関しては、ＫＣＭ４がその他の培地よりも良かった。
【図１２Ｄ】図１２Ａ−Ｄ：ＫＣＭ４は、市販されている組成が化学的に規定された培地と同様に機能する。ＫＣＭ４を、３種類の組成が化学的に規定された培地、つまり、インビトロジェンのケラチノサイト血清を含まない既知組成培地（ＤＫＳＦＭ）、エピライフの既知組成の成長補助培地（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＤＧＳ）、およびロンザのケラチノサイト既知組成成長培地（ＫＧＭ−ＣＤ）、と比較した。市販の培地中で培養した細胞は、製造業者が推奨しているように、コラーゲンＩ（Ｃ１）をコーティングしてあるプレート上で生育させた。ＫＣＭ４培養には非コーティング（ＮＣ）プレートを使用した。（Ａ）それぞれの培地（Ｐ３  ＤＳＫＦＭ、ＥＤＧＳおよびＫＧＭ−ＣＤおよびＰ５  ＫＣＭ４）中で培養した初代ＫＣの明視野画像。スケールバーは２００μｍ。（Ｂ）それぞれの培地中で培養した初代ケラチノサイトの長期培養。（ＣおよびＤ）それぞれの培地中で培養したケラチノサイトのＣＦＡ。コロニーの数と大きさに関しては、ＫＣＭ４がその他の培地よりも良かった。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
初代ヒトケラチノサイトは、傷を受けた皮膚上皮および角膜上皮に使用するための上皮シートの生成に使用される。これら上皮シートの生産には、これまで、新生児包皮ケラチノサイトと自己ケラチノサイトの両方を収集し、インビトロで増やすということが行われてきた。しかしながら、拒絶的な免疫反応が起こることに加え、提供者細胞の質と量により、初代ケラチノサイトの移植が制限されることが多かった。また、ヒトケラチノサイト由来上皮シートは、化粧品の試験および薬剤開発においても必要とされている。提供者由来ケラチノサイトの個々の化合物に対する反応は、提供者が、生理学的条件と病理学的条件の両方においてどのように反応するかに関する貴重な知見をもたらすため、各人に合わせたオーダーメイドの化粧品および皮膚治療への突破口となり得る。
【００３６】
本明細書では、血清を含まない化学的に規定された細胞培養系において、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣから直接分化させた機能性ケラチノサイト幹細胞を提供する方法、ならびにその機能性ケラチノサイト幹細胞に由来する細胞を提供する。分化と成長の刺激を、開始、分化、成熟、および維持の４段階に沿って、細胞に与える（図１）。この方法を用いることで、細胞が１０倍を超えて倍加する、高い増殖能を有する人工ケラチノサイト幹細胞（ｉＫＣ）を効率的に生成することが可能である。これらのｉＫＣは、上皮ケラチノサイト幹細胞のマーカーである、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、およびＣＤ４９ｆを発現する。加えて、ヒト皮膚線維芽細胞と混合すると、ｉＫＣは免疫不全ヌードマウスの背中に生着可能となり、切除による上皮損傷を厚みの点で完全に治癒した。
【００３７】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、「１」または「ひとつ」は、１つ以上であることを意味する場合がある。本明細書に添付の特許請求の範囲で「含んでいる／含む」という語と共に使用される場合、「１」または「ひとつ」という語は、１つまたは１より大きいことを意味し得る。
【００３８】
本開示で使われる「または」という用語は、選択肢のうちのどれか１つおよび「および／または」の定義を支持するものであるが、請求項の中で使われる「または」という用語は、選択肢のうちのどれか１つを指すことが明記されているか、または両方を指すことには矛盾が生じるのではない限り、「および／または」の意味で使用される。本明細書で使用する場合「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも第二の、または第三以上のものを意味し得る。
【００３９】
「約／およそ」という用語は、本出願全体を通じて、その値が、その値を決定するのに用いられた装置および方法に固有の誤差、または研究対象間に存在する差異を含むことを示すのに使用される。
【００４０】
本明細書で使用する場合、細胞に関する「培養した（ｃｕｌｔｕｒｅｄ）」という用語は、インビトロ環境で細胞分裂をしているまたは細胞分裂をしていない１つ以上の細胞を指す場合がある。インビトロ環境とは、細胞をインビトロで維持するのに好適な当該分野で知られている任意の培地、例えば、例としては好適な液体培地または寒天などであってよい。細胞培養に好適なインビトロ環境の特定の例としては、『動物細胞の培養：基礎技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）』（１９９４）；『細胞：ラボラトリーマニュアル（Ｃｅｌｌｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ）』（１９９８）；および『動物細胞：培養と培地（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａ）』（１９９４）に記載のものが挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「細胞株」という用語は、培養を終了させることなく、少なくとも１回継代することが可能な培養細胞を指す場合がある。本発明は、不定期に継代可能な細胞株に関する。細胞の継代については以下で定義する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「浮遊（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）」という用語は、細胞が固相支持体に接していない、細胞培養の条件を指す場合がある。懸濁液中で増殖している細胞は、その増殖中に、当該分野でよく知られている装置を使って撹拌することができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「単層」という用語は、好適な培養条件で増殖している間に、固相支持体に接している細胞を指す場合がある。好適な生育条件下にある単層中で増殖している細胞の一部が、単層中の別の細胞には接しているが、固相支持体には接していないという場合もある。
【００４４】
本明細書で使用する場合、細胞に関する「プレーティングされた（ｐｌａｔｅｄ）」または「プレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）」という用語は、インビトロで細胞培養を樹立することを指す場合がある。例えば、細胞を細胞用培地で希釈し、その後、細胞培養用のプレート、シャーレ、またはフラスコに入れることができる。細胞培養用のプレートは、当業者に広く知られている。細胞は、様々な濃度でおよび／または細胞密度でプレーティングすることができる。
【００４５】
「細胞のプレーティング（ｃｅｌｌ  ｐｌａｔｉｎｇ）」という用語はまた、「細胞の継代（ｃｅｌｌ  ｐａｓｓａｇｉｎｇ）」という用語にまで及ぶ場合がある。本発明の細胞は、当業者によく知られた細胞培養技術によって、継代することができる。「細胞の継代」という用語は、（１）固相支持体または基質から細胞をはがし、これらの細胞を分離させる工程、および（２）これらの細胞を、さらなる細胞増殖に好適な培地で希釈する工程、を含む技術を指す場合がある。細胞の継代はさらに、培養細胞を含む液体培地を一部除去し、元々の培養容器に液体培地を加えて細胞を希釈し、細胞をさらに増殖させることを含む場合もある。加えて、細胞のさらなる増殖に好適な培地を入れておいた新しい培養容器に、細胞が加えられる場合もある。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「低酸素」および「低酸素条件」という用語は、周囲大気の酸素濃度（酸素濃度はおよそ１５％〜２０％）と比べて、酸素濃度が低いことによって特徴付けられる条件を指す場合がある。一側面において低酸素条件は、酸素濃度が約１０％未満であることを特徴とする。別の側面において低酸素条件とは、酸素濃度が約１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７％、１％〜６％、１％〜５％、１％〜４％、１％〜３％、もしくは１％〜２％、またはそこから導き出される任意の範囲のパーセンテージであることを特徴とする。
【００４７】
本明細書で使用する場合、細胞に関する「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」という用語は、時間経過とともに、その数を増やすことができる細胞群を指す場合がある。
【００４８】
本明細書で使用する場合、細胞に関する「永久（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）」または「不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）」という用語は、インビトロ環境で培養している間は、細胞が老化するまで、何度も細胞分裂をして細胞数を倍加させる細胞を指す場合がある。永久細胞株は、相当数の細胞が培養中で老化する前に、１０を超えて倍加する場合がある。好ましくは、永久細胞株は、相当数の細胞が培養中で老化する前に、２０を超えて、または３０を超えて倍加し得る。より好ましくは、永久細胞株は、相当数の細胞が培養中で老化する前に、４０を超えて、または５０を超えて倍加し得る。より好ましくは、永久細胞株は、相当数の細胞が培養中で老化する前に、６０を超えて倍加し得る。
【００４９】
「分化」とは、培養中またはインビボのいずれかにおいて、分化しない同じ条件にいるよりも、特殊化の程度が低い細胞がより特殊化した細胞になって、少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成する過程である。「脱分化」とは、部分的にまたは完全に分化した細胞が、より以前の発達段階に、例えば多能性または多分化能性に戻る細胞過程である。「分化転換」とは、ある１つの分化した細胞型が、別の細胞型に変換する過程である。特定の条件下では、新しい細胞型の特徴を有する後代の割合は、増殖の傾向に応じて、少なくとも約１％、５％、２５％またはそれ以上であってよい。
【００５０】
「多分化能性（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」とは、ある細胞がその後代を介して、成体に見られる複数の異なる細胞型を生じることが可能であることを意味する。
【００５１】
「多能性（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」とは、ある細胞がその後代を介して、成体に見られる全ての細胞型（生殖細胞を含む）を生じることが可能であることを意味する。胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および胚性生殖細胞は、この定義の下では多能性細胞である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「自家細胞」という用語は、受容者と遺伝的に同一の提供者細胞を指す。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「全能性」という用語は、生産動物（ｌｉｖｅ  ｂｏｒｎ  ａｎｉｍａｌ）を生じる細胞を指す場合がある。「全能性」という用語はまた、特定の動物の全ての細胞を生じる細胞を指す場合もある。全能性細胞は、１回以上の核移植の工程から胚を発生させるための過程で用いられた時に、ある動物の全ての細胞を生じ得る。
【００５４】
全能性細胞はさらに、不完全な動物、例えば、臓器を得るのに有用な動物、例としては、ホメオティック遺伝子の操作によって器官または付属肢が成長しないように遺伝的に改変された動物を生じるのに使われる場合もある。加えて、例えばＥＳ細胞に由来する子宮内で発生不可能な卵母細を生じる遺伝的改変によって、ヒト由来ＥＳ細胞を生殖のためのヒト卵母細胞の誘導には使うことができず、例えば治療用のクローニングへの適用のためだけに使用できることが保証されるだろう。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「胚性幹細胞」という用語は、胚から単離され、インビトロでの細胞培養において維持される多能性細胞を指す場合がある。このような細胞は、インビボで動物の成体に含まれる全ての細胞（生殖細胞を含む）を生じる能力を培養中でも保持している、培養胚から単離された、早い速度で分裂する培養細胞である。胚性幹細胞は、フィーダー細胞を使ってまたは使わずに培養することができる。胚性幹細胞は、胚盤胞期の胚や胚盤胞期前の胚など、発生の任意の段階にある胚から単離された胚性細胞から樹立することができる。胚性幹細胞は丸い形態であり、フィーダー層上で生育させると丸い細胞集塊を形成し得る。胚性幹細胞は当業者によく知られている。例えば、国際公開第９７／３７００９号；ヤングおよびアンダーソン（１９９２）；ピエドラヒタら（１９９８）；ワイニーら（１９９７）；ムーアおよびピエドラヒタ（１９９７）；ムーアおよびピエドラヒタ（１９９６）；ウィーラー（１９９４）；オシェロー−デレヴィエおよびペロー（１９９３）；ストロジェックら（１９９０）；ピエドラヒタら（１９９０）；ならびにエバンズら（１９９０）を参照のこと。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」または「リプログラミングされた（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）」という用語は、より特殊化した細胞を多能性細胞に変換することができる材料と方法を指す場合がある。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、別の細胞群から機械的に分離された細胞のことを指す場合がある。細胞群の例としては、発達中の細胞塊、細胞培養、細胞株および動物が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「分化型細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」という用語は、未分化の表現型から特殊化した表現型へと発達した前駆細胞のことを指す場合がある。例えば、胚性細胞は、腸管上皮細胞の裏打ち層（ライニング、ｌｉｎｉｎｇ）へと分化する場合がある。分化型細胞は、例えば、胎児または生産動物から単離することができる。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「未分化細胞（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」という用語は、特殊化していない表現型を有し、分化可能な前駆細胞のことを指す場合がある。未分化細胞の例としては幹細胞が挙げられる。
【００６０】
ＩＩ．ケラチノサイト幹細胞形成に関わる細胞
本発明の特定の態様では、多能性細胞からケラチノサイト幹細胞を提供するための方法および組成物を開示する。いくつかの態様において多能性細胞は、胚性幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞、または人工多能性幹細胞を含むがこれらには限定されない幹細胞であってよい。
【００６１】
Ａ．幹細胞
幹細胞は、全てではないが多くの多細胞生物に見られる細胞である。幹細胞は、細胞の有糸分裂を通して自己再生できること、および様々な種類の特殊化した細胞型に分化できることを特徴とする。哺乳類の幹細胞は、胚盤胞に見られる胚性幹細胞と、成体組織に見られる成体幹細胞、例えば表皮のケラチノサイト幹細胞の２つに大別される。発生途中の胚においては、幹細胞は特殊化した胚性組織の全てに分化することができる。成体生物では、幹細胞および前駆細胞は体の修復系として機能し、特殊細胞を補充し、また、血液、皮膚または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転を維持する。
【００６２】
ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ケラチノサイト幹細胞を含む身体の全ての細胞型に分化する能力を保持しながら、インビトロで長期間、増殖することができる。ケラチノサイト幹細胞は、薬剤開発および治療用用途の両方に使用できる患者特異的な機能性ケラチノサイト幹細胞の無制限な供給を実現するという可能性を秘めている。インビトロにおける、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣからケラチノサイト幹細胞への分化は正常なインビボ発生を再現する、すなわち、正常で連続した発達段階をたどる。その連続した発達過程では、様々な成長段階で、種々の成長因子や刺激が加わることが必要とされる。本発明の特定の側面では、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣを分化させることによって、完全な機能性ケラチノサイト幹細胞を提供する。このアプローチからは、ヒト初代成体ケラチノサイトと、全く同一ではないが、非常によく似た機能を有するケラチノサイト幹細胞は生成される。加えて本発明のケラチノサイト幹細胞は、その増殖能が高いことから、表皮の基底層で見られるケラチノサイト最終分化の開始細胞集団として固有の利点を有する。
【００６３】
本明細書中で使用する場合、「発現」とは、材料または物質の産生、ならびに材料または物質の産生のレベルまたは量を指す。したがって、特異的マーカーの発現を決定することは、発現しているマーカーの相対量もしくは絶対量のいずれかを検出すること、または単にマーカーが存在することもしくは存在しないことを検出することを指す。
【００６４】
本明細書中で使用する場合、「マーカー」とは、観察または検出することができるすべての分子を指す。例えば、マーカーとしては、これらに限定されるものではないが、核酸（特定の遺伝子の転写物など）、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物のポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質、または低分子が挙げられる。
【００６５】
１．胚性幹細胞
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚盤胞の内部細胞塊または早期桑実胚の胚盤葉組織に由来する多能性幹細胞である。ＥＳ細胞は、その多能性と無限に自己複製できる能力という２つの特徴的な性質によって、他の細胞から区別される。ＥＳ細胞は多能性を有し、最初の三胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉および中胚葉のすべての誘導体に分化することができる。加えて、規定された条件下では、胚性幹細胞は無限に自己を増殖させることができる。これにより、胚性幹細胞は研究および再生医療に有用なツールとして利用されている。それは、胚性幹細胞が継続研究または臨床用途において、自己を無限に生産できるためである。ＥＳ細胞は、特定の細胞型に関する十分かつ必要な刺激が与えられた場合、成体の２００種類を超える細胞型のいずれにも発生することができる。しかしながら胚性幹細胞は、胚体外膜（extra-embryonic membrane）または胎盤には寄与しない。
【００６６】
今日までのほとんどすべての研究は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を用いて行われてきた。いずれも必須の幹細胞特性を有するが、未分化状態を維持するためには非常に異なる環境が必要である。マウスＥＳ細胞は、ゼラチン層上で増殖することができ、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の存在を必要とする。ヒトＥＳ細胞は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で生育させることができ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）の存在を必要とするが多い。最適な培養条件または遺伝子操作がなければ（チャンバーズら、２００３）、胚性幹細胞は急速に分化する。
【００６７】
また、ヒト胚性幹細胞は、いくつかの転写因子および細胞表面タンパク質の存在によっても定義することができる。転写因子のＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ−２は、分化および多能性の維持につながる遺伝子を確実に抑制する中心的な調節ネットワークを形成する（ボイヤーら、２００５）。ｈＥＳ細胞を同定するのに最も一般的に使用される細胞表面抗原としては、糖脂質ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４ならびにケラタン硫酸抗原Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１が挙げられる。
【００６８】
マウスＥＳ細胞を得るための方法はよく知られている。一方法では、マウス１２９系統の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、この内部細胞塊を、胎仔ウシ血清を含有する培地中、化学的に不活性化したマウス胚線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、マウス胚線維芽細胞フィーダー層上、ウシ胎仔血清の存在下で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を生産する。いくつかの方法では、血清を含む培地にサイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を添加することによって、マウスＥＳ細胞は支持細胞層を使わなくても生育させることができる（スミス、２０００）。他の方法では、無血清培地中、骨形成タンパク質およびＬＩＦの存在下で、マウスＥＳ細胞を増殖させることができる（インら、２００３）。
【００６９】
ヒトＥＳ細胞は、既に記載のある方法によって（トムソンら、１９９５；トムソンら、１９９８；トムソンおよびマーシャル、１９９８；ルビノフら、２０００）、胚盤胞から得ることができる。一方法では、５日目のヒト胚盤胞をウサギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に曝露し、次いで栄養外胚葉細胞を溶解するために、１：５に希釈したモルモット補体に曝露する。溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊から除去した後、内部細胞塊をγ−不活性化マウス胚線維芽細胞のフィーダー層上、ウシ胎仔血清の存在下で培養する。９〜１５日後、内部細胞塊に由来する細胞集塊を化学的に（すなわちトリプシンに曝露させて）、または機械的に解離させ、ウシ胎仔血清とマウス胚線維芽細胞のフィーダー層を含む新しい培地に、再プレーティングすることができる。さらに増殖させたら、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットで選択し、機械的に解離させて集塊にし、再プレーティングする（米国特許第６，８３３，２６９号を参照のこと）。ＥＳ様の形態は、細胞質に対する核の比率が明らかに高く、顕著な核小体を有する小さいコロニーを特徴とする。得られたＥＳ細胞は、短時間のトリプシン処理によって、またはマイクロピペットで個々のコロニーを選択することによって、慣習的に継代することができる。いくつかの方法では、ＥＳ細胞を、線維芽細胞のフィーダー層上、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で培養することにより、血清を用いずに増殖させることができる（アミットら、２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「馴化」培地の存在下で、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）またはラミニンなどのタンパク質マトリックス上で細胞を培養することにより、フィーダー細胞層なしで増殖させることができる（シュウら、２００１）。培地は、線維芽細胞と共培養することによって予め馴化しておく。
【００７０】
アカゲザルおよび一般的なマーモセットからのＥＳ細胞の単離方法も知られている方法（トムソンおよびマーシャル、１９９８；トムソンら、１９９５；トムソンおよびオドリコ、２０００）。
【００７１】
ＥＳ細胞の別の供給源としては、樹立ＥＳ細胞株がある。様々なマウス細胞株およびヒトＥＳ細胞株が知られており、それらの生育および増殖のための条件も規定されている。例えば、マウスＣＧＲ８細胞系はマウス系統１２９胚の内部細胞塊から樹立された細胞系であり、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層を使わずに、ＬＩＦ存在下で生育させることができる。さらに別の例として、ヒトＥＳ細胞株Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３およびＨ１４がトムソンら（１９９５）によって樹立されている。加えて、Ｈ９系統のサブクローンＨ９．１およびＨ９．２が開発されている。当該分野で知られている、実質的に全てのＥＳ細胞株または幹細胞株、例えば、参照することにより本明細書に組み入れられるユウおよびトンプソン（２００８）に記載されているようなＥＳ細胞株または幹細胞株を本発明と共に使用してもよいことが想定される。
【００７２】
本発明に関連して使用するＥＳ細胞の供給源は、胚盤胞、胚盤胞の内部細胞塊を培養することに由来する細胞、または樹立細胞株の培養物から得られた細胞であってよい。したがって、本明細書中で使用する場合、「ＥＳ細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊細胞、内部細胞塊の培養物から得られたＥＳ細胞、およびＥＳ細胞株の培養物から得られたＥＳ細胞を指す場合がある。
【００７３】
２．人工多能性幹細胞
通常、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略される人工多能性幹細胞は、多能性をもたない細胞、一般的には成体の体細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の一種である。人工多能性幹細胞は、天然の多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞と多くの点において、例えば、特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンのメチル化パターン、倍加時間、胚様体の形成、奇形種の形成、生存可能なキメラの形成、および能力（potency）および分化可能性などの点で、同一ではないとしても類似していると考えられている。しかしながら、天然の多能性幹細胞との関係全体については、現在も評価中である。
【００７４】
ｉＰＳ細胞は、分化した体細胞をリプログラミングすることによって得られる。胚以外のヒト組織に由来する誘導された人工多能性細胞の生成は、胚および胚組織を実験に用いることに関する倫理的懸念を軽減するために望まれている。人工多能性細胞は治療への用途に関して高く期待されている。医療用途の数例を挙げると、アルツハイマー病、糖尿病および脊髄損傷の治療がある。他の用途には、疾患モデルおよび医薬品のスクリーニングがある。
【００７５】
人工多能性幹細胞は、様々な方法によって得られてきた。ヒト胎児または新生児の線維芽細胞に、レンチウイルス形質導入を用いてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の４つの遺伝子を導入する（ユウら、２００７）。感染１２〜２０日後に、ヒトＥＳ細胞形態のコロニーが見えるようになる。コロニーを採取して増殖させる。コロニーを形成する人工多能性幹細胞は、ヒトＥＳ細胞と形態学的に類似し、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現し、マウスに注入すると、神経組織、軟骨および腸上皮を有する奇形腫を形成する。
【００７６】
別の方法では、成人ヒト真皮線維芽細胞に、レトロウイルス形質導入を用いて、転写因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を導入する（タカハシら、２００７）。遺伝子導入した細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加した培地に入ったＳＮＬフィーダー細胞（ＬＩＦを産生するマウス細胞線維芽細胞株）にプレーティングする。約２５日後、ヒトＥＳ細胞コロニーに似たコロニーが培養中に現れる。このＥＳ細胞様コロニーを採取し、フィーダー細胞上、ｂＦＧＦの存在下で増殖させる。
【００７７】
ｉＰＳ細胞は最初、マウス細胞から２００６年に（タカハシら、２００６）、次いでヒト細胞からは２００７年に産生された（タカハシら、２００７；ユウら、２００７）。このことによって研究者らが、研究に重要で治療用途への可能性をもつ多能性幹細胞を、論争の的になる胚の使用を伴わずに得ることができるようになったため、これらの業績は幹細胞研究において重要な進歩であったと引用されている。最初に成功したマウスまたはヒトの組織からの人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）の生成では、特定のセットの転写因子を発現するレトロウイルスベクターが使用されていた。ジェームズ・トムソン（Ｊａｍｅｓ  Ｔｈｏｍｓｏｎ）の研究室およびシンヤ・ヤマナカ（山中伸弥）の研究室の研究から、マウスまたはヒトの線維芽細胞にレトロウイルスベクターを介して特定の転写因子を導入することが、これらの細胞を未分化の多能性幹細胞にリプログラムするのに十分であることが示されている。転写因子として、トムソンはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８を使用し、ヤマナカは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを使用した。いずれの遺伝子セットを介したリプログラミングも、これら遺伝子セットの宿主細胞ゲノムへの組み込みとこれら転写因子の発現、またはリプログラミングされた細胞からは消失させ、無傷のｉＰＳ細胞を生じることが可能なエピソームプラスミドからの発現によって達成される。
【００７８】
細胞の特徴から、ＥＳ細胞様コロニーの細胞は人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞と形態学的に類似しており、様々なヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。また、ヒトＥＳ細胞の分化を引き起こすことが分かっている条件で増殖させると、人工多能性幹細胞はそれに従って分化する。例えば、人工多能性幹細胞を、ケラチノサイト幹細胞の構造とマーカーを有する細胞に分化させることができる。本発明には事実上、ユウおよびトンプソン（２００８）に記載されているものを含む、あらゆるｉＰＳ細胞または細胞株を使用してもよいと予想される。
【００７９】
マウスから人工多能性幹細胞を調製する方法も知られている（タカハシおよびヤマナカ、２００６）。ｉＰＳ細胞の誘導には通常、Ｓｏｘファミリーの少なくとも１つのメンバーとＯｃｔファミリーの少なくとも１つのメンバーを発現させることまたはそれらに曝露することが必要とされる。ＳｏｘおよびＯｃｔは、ＥＳ細胞の独自性を規定する転写調節階層の中心であると考えられている。例えば、Ｓｏｘは、Ｓｏｘ−１、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−３、Ｓｏｘ−１５、またはＳｏｘ−１８であってよく、Ｏｃｔは、Ｏｃｔ−４であってよい。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、またはｃ−Ｍｙｃなどのそれ以外の因子によって、リプログラミング効率が高まる可能性がある。リプログラミング因子の特定のセットとしては、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、および場合によりＬｉｎ−２８を含むセット、またはＳｏｘ−２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ、および必要に応じてｃ−Ｍｙｃを含むセットがあり得る。
【００８０】
ｉＰＳ細胞はＥＳ細胞と同様に、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に対する抗体（発生学研究用ハイブリドーマバンク（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）、米国国立保健発達研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、ベセスダ、メリーランド）およびＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１（アンドリューズら、１９８７）に対する抗体を用いて、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって同定または確認され得る特徴的な抗原を有する。ｉＰＳ細胞の多能性は、８〜１２週齢の雄のＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に約０．５〜１０×１０６個の細胞を注入することによって確認することができる。各三胚葉の少なくとも１つの細胞型を示す奇形腫が発生する。
【００８１】
本発明の特定の側面では、ｉＰＳ細胞は、前述したようにまたは国際公開第２００９／１４９２３３号に記載されているように、ＯｃｔファミリーメンバーとＳｏｘファミリーメンバー、例えばＯｃｔ４とＳｏｘ２を、Ｋｌｆおよび／またはＮａｎｏｇと組み合わせて含むリプログラミング因子を用いて体細胞をリプログラミングすることから作製される。リプログラミングする体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、胃細胞、またはβ細胞などの、多能性に誘導することができるいずれの体細胞であってもよい。特定の側面では、Ｔ細胞は、リプログラミングする体細胞の供給源としても使用され得る（参照することで本明細書に組み入れられる国際公開第２０１０／１４１８０１号を参照のこと）。
【００８２】
リプログラミング因子は、組込みベクターまたはエピソームベクター、例えばＥＢＶエレメントを使った系（参照することで本明細書に組み入れられる国際公開第２００９／１４９２３３号；ユウら、２００９年を参照のこと）などの１つ以上のベクターに含まれる発現カセットから発現させることができる。さらなる側面では、タンパク質形質導入によって、リプログラミングタンパク質を体細胞に直接導入することもできる。
【００８３】
ＩＩＩ．ケラチノサイト幹細胞の特徴
細胞は、多くの表現型基準に従って特徴づけることができる。基準には、発現している細胞マーカーの検出または定量、酵素活性、ならびに形態学的特徴および細胞間シグナル伝達の特徴付けが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の特定の側面で例示したケラチノサイト幹細胞は、天然のケラチノサイト幹細胞に特徴的な形態学的特徴を有する。単一の細胞にそのような特徴が１つ以上存在することが、その細胞がケラチノサイト幹細胞系列のメンバーであることと一致する。細胞がケラチノサイト幹細胞に特徴的な形態学的特徴を有するか否かは、分化させた後代細胞、成人または胎児のケラチノサイト幹細胞、および１つ以上の陰性対照細胞（例えば線維芽細胞）、またはメラニン細胞の顕微鏡写真を符号化し、その後、それらの顕微鏡写真を盲検様式で評価し、符号をぶブレークして分化由来のケラチノサイト幹細胞であると正確に同定されたかどうかを決定することにより、偏りなく判断することができる
【００８５】
本発明の細胞は、それらがケラチノサイト細胞系列に特徴的な表現型マーカーを発現しているか否かによっても特徴付けることができる。一般的な表皮ケラチノサイトは、サイトケラチン１４とｐ６３を発現することを特徴とする。そのような集団内では、最終分化への経路上にコロニー形成ケラチノサイト幹細胞およびケラチノサイト前駆細胞が存在する。ケラチノサイト幹細胞、ケラチノサイト前駆細胞およびより分化したケラチノサイト誘導体を区別するのに有用な細胞マーカーの非限定的な例としては、サイトケラチン１５、ＣＤ４９ｆ、ケラチン１、ロリクリンおよびフィラグリンが挙げられる。
【００８６】
本開示に列挙する一般的な上皮ケラチノサイトおよびケラチノサイト幹細胞タンパク質の決定要因は、任意の好適な免疫学的手法によって検出することができる。好適な免疫学的手法の例としては、細胞表面マーカーに関するフロー免疫細胞化学（ｆｌｏｗ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーに関する免疫組織化学（例えば、固定細胞または組織切片の）、細胞抽出物のウエスタンブロット分析、および細胞抽出物もしくは培地に分泌された産物の酵素結合免疫測定法が挙げられる。細胞による抗原の発現は、標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリー検定において、その抗原に有意に検出可能な量の抗体が結合する場合、「抗体で検出可能」だと言える。標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリーアッセイは、必要に応じて細胞を固定した後に行われ、必要に応じて、二次抗体または他の複合体（例えばビオチン−アビジン結合体）を使って標識を増幅させる。
【００８７】
特定のマーカーの発現はまた、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析、または標準的な増幅法における配列特異的プライマーを用いたリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで検出することができる（米国特許第５、８４３、７８０号）。本開示に列挙する特定のマーカーの配列データは、ジンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）などの公開データベースから得ることができる。標準的な手法における典型的な比較対照のある実験において細胞試料に対するアッセイの性能が、標準的な時間内で識別可能なハイブリダイゼーションまたは増幅産物を明確に結果として生じるものである場合、ｍＲＮＡレベルでの発現は、本開示に記載するアッセイのうちの１つによって「検出可能」であると言える。特に必要のある場合を除き、特定のマーカーに対応するｍＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって検出可能であれば、特定のマーカーの発現を示す。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出されたケラチノサイト幹細胞特異的マーカーの発現は、そのレベルが対照細胞、例えば未分化の多能性幹細胞、線維芽細胞、または他の無関係な細胞型のレベルの少なくとも２倍、好ましくは１０倍または５０倍を超える場合に、陽性であると考えられる。
【００８８】
別の側面では、分化させることで生じたケラチノサイト幹細胞の生物学的機能は、例えば、コロニー形成アッセイによって、ケラチノサイト幹細胞がマウスの脱表皮した真皮上で分化および層化する能力を決定することによって、またはケラチノサイト幹細胞のヌードマウスへの生着能力によって、評価してもよい。さらに別の側面では、サイトケラチン１５および／またはＣＤ４９ｆの発現によって、ケラチノサイト幹細胞を同定してもよい。ケラチノサイト幹細胞を機能検定によって試験してもよい。例えば、生着する能力を試験するために、細胞をマウス胚の創傷上皮に移植することができる。
【００８９】
ケラチノサイト幹細胞を培養することの利点の１つは、細胞を均質な未分化細胞集団として増殖させることができることである。そのため、それらを成熟した系統を生成するために使用すると、より特殊化した細胞型の分化の効率が高まる可能性がある。これはまた、他の胚葉からのものなど、他の細胞型の混入に望ましくない影響が生じる可能性を低減する。本発明のケラチノサイト幹細胞は、関連マーカーまたは免疫染色や蛍光活性型の定量もしくは他の適切な技術によって決定される望ましくない細胞型のマーカー又は他の特徴が０．１％未満（好ましくは１００ｐｐｍ未満または１０ｐｐｍ未満）である場合、本質的に、いくつかのまたは全ての細胞型による汚染がないと特徴付けることができる。
【００９０】
本発明の特定の側面に従って提供される細胞は、一次供給源から得られた細胞の特徴の多くを有する場合がある。特定の細胞にこれらの特徴が多く含まれるほど、その細胞をケラチノサイト幹細胞系列の細胞として特徴づけることができる。これらの特徴の少なくとも２、３、５、７または９個を有する細胞が、有する特徴が多いほど、好ましい。培養容器または投与のための調製物中に存在し得る特定の細胞集団に関しては、細胞間でこのような特徴が均一に発現していることが有利に働くことが多い。この状況では、細胞の少なくとも約４０％、６０％、８０％、９０％、９５％または９８％が所望の特徴を有する集団が、その割合が多いほど、好ましい。
【００９１】
ＩＶ．ケラチノサイト幹細胞分化因子
本発明の特定の側面では、ケラチノサイト幹細胞分化因子を提供する。本発明者らはまた、本節に列挙した成長因子および化合物のすべてのアイソフォームおよび変異体が本発明に含まれることを意図している。
【００９２】
本開示で例示うるケラチノサイト幹細胞促進成長因子は、ケラチノサイト幹細胞の増殖を促進することができる可溶性成長因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド−受容体複合体、および他の化合物）を含み得る。そのような薬剤の非限定的な例としては、酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ１）、ＢＭＰ−４、ＥＧＦ、またはそのアイソフォームまたは変異体などの増殖因子が挙げられるが、これらには限定されない。
【００９３】
ケラチノサイト幹細胞を提供するための分化は、ＢＭＰ４、線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ１）、上皮細胞成長因子（例えば、ＥＧＦ）、アスコルビン酸、コレラ毒素、ニコチンアミド、サイクリックＡＭＰ類似体（例えば８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＩＩ（ＴＧＦＲＫｉ）およびレチノイン酸（例えばオールトランスＲＡ）を含むがこれらに限定されない、本節に記載する任意の１つまたは複数の因子の有効量と細胞を接触させることによって達成できる。「有効量」とは、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は１回以上の投与で投与することができる。因子の有効量とは、ケラチノサイト幹細胞の増殖または分化を促進するのに十分な量であってよい。因子の濃度は、約０．０１ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは約１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲であってよい。
【００９４】
Ｖ．細胞培養
出発細胞および分化型細胞は、一般に、培地および条件に関して異なる要件を有する。通常、少なくとも培養の初期段階、分化因子の導入後は、出発細胞の成長に適していることが知られている培地の存在下、出発細胞の成長に適していることが知られている培養条件下で培養する。これに続く培養期間は、分化培地の存在下で、分化型細胞に適していることが知られている条件下で培養する。分化するのに十分な時間が経過した後、分化型細胞を、増殖培地中で、この分化細胞を増殖させるためにさらに培養してもよい。そのような増殖培地は、前述したような１つ以上のシグナル伝達阻害剤を含むか、またはこれらの阻害剤を本質的に含まない培地を含むものでもよい。
【００９５】
培養の初期段階は、好ましくは、最長６日間、より好ましくは最長４日間、そして特定の態様では以下に記載するように、３日間以下、より具体的には最長約１日の期間である。１つ以上のシグナル伝達阻害剤を含む分化培地を使って行われる培養のその後の段階は、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３日間、またはそこから誘導可能な任意の期間であってよく、また、最長１２０日間、好ましくは最長１０日の期間であってよい。ケラチノサイト幹細胞を生成するために使用される以下に記載の具体的な態様では、培養の初期段階は約５日間であり、その後の段階は約２６〜４４日間で、様々な分化培地を使用した。分化条件は、本質的にフィーダー細胞を含まなくてもよい。さらなる側面では、分化培地は組成が化学的に規定された培地であってよい。分化を改善するために、分化培地にさらに高濃度のＦＧＦを含め、本質的にＴＧＦ−βを含まないものにしてもよい。場合によっては、培地はＴＧＦ−βを含み得る。
【００９６】
Ａ．基本条件
本発明の培養条件は、使用する培地や幹細胞に応じて適宜決定される。本発明の特定の側面に従う培地は、基礎培地として動物細胞の培養に使用される培地を用いて調製することができる。そのような培地としては、例えば、ＴｅＳＲ、必須（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）８培地、ＢＭＥ、ＢＧＪｂ、ＣＭＲＬ  １０６６、グラスゴーＭＥＭ、改良ＭＥＭ亜鉛オプション（Zinc Option）、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９、イーグルＭＥＭ、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ、ＲＰＭＩ  １６４０、フィッシャー培地のいずれか、ならびにその任意の組み合わせが挙げられるが、培地は動物細胞の培養に用いることが可能であればこれらには限定されない。
【００９７】
本発明による培地は、血清を含有する培地であっても、血清を含まない培地であってもよい。血清を含まない培地とは、未処理または未精製の血清を含まない培地を意味し、したがって、精製した血液由来成分または動物組織由来成分（例えば、成長因子）を含む培地を含み得る。異種動物由来成分の混入を防止する観点から、幹細胞と同じ動物から血清を得ることができる。
【００９８】
本発明による培地は、血清の代替物を含有していてもよいし、含有していなくてもよい。血清の代替物としては、アルブミン（例えば、脂質に富むアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン代替物、植物性デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール、またはそれらの均等物を含む。血清の代替物は、例えば、国際公開第９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。あるいは、市販されている任意の材料をより便利に使用することができる。市販されている材料には、ノックアウト血清置換（knockout Serum Replacemnent）（ＫＳＲ）、既知組成の脂質濃縮物（Lipid concentrated）（ギブコ）、およびグルタマックス(Ｇｌｕｔａｍａｘ)（ギブコ）がある。
【００９９】
本発明の培地はさらに、脂肪酸または脂質、アミノ酸（非必須アミノ酸など）、ビタミン、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩を含む場合がある。２−メルカプトエタノールの濃度は、例えば、約０．０５〜１．０ｍＭ、特に約０．１〜０．５ｍＭとすることができるが、幹細胞を培養するのに適した濃度であればこれに限定されない。
【０１００】
本発明の細胞の培養に用いる培養容器としては、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、シャーレ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、セルスタック（ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ）(R)チャンバー、培養用バッグ、ローラーボトルなどが挙げられるが、その中で細胞を培養することができれば、特にこれらには限定されるものではない。幹細胞は、培養の必要性に応じて、少なくともまたは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはそこから導き出される任意の範囲の量で培養することができる。特定の態様において培養容器はバイオリアクターであってもよく、バイオリアクターとは、生物学的に活性な環境を支援する任意の装置またはシステムを意味し得る。バイオリアクターの容量は、少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、またはそこから導き出される任意の範囲の容量であってよい。
【０１０１】
培養容器は、細胞接着性でも非接着性でもよく、目的に応じて選択することができる。細胞接着性培養容器は、細胞の容器表面への接着性を改善するために細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のような細胞を接着するための任意の基質でコーティングすることができる。細胞接着のための基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）を接着させることを目的とした、いかなる物質であってもよい。細胞接着の基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびレトロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）、ならびにそれらの混合物が挙げられ、例えばマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（登録商標）、および溶解した細胞膜調製物（クリマンスカヤら、２００５）がある。
【０１０２】
他の培養条件も適宜設定することができる。例えば、培養温度は約３０〜４０℃、例えば少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃とすることができるが、特にそれらに限定されない。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、例えば約２〜５％、またはそこから導き出される任意の範囲の温度とすることができる。酸素圧は、少なくともまたは約１、５、８、１０、２０％またはそこから導き出される任意の範囲のパーセンテージであってよい。酸素圧は、酸素正常状態での培養の場合、好ましくは２０％である。
【０１０３】
特定の側面における本発明の方法は、例えば、細胞の接着培養に使用することができる。この場合、細胞をフィーダー細胞の存在下で培養することができる。本発明の方法でフィーダー細胞を使用する場合、胎児線維芽細胞などの間質細胞をフィーダー細胞として使用することができる（例えば、ホーガンら、『マウス胚の操作、実験マニュアル（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）』（１９９４）；『遺伝子標的、実践的な手法（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）』（１９９３）；マーティン（１９８１）；エバンズおよびカウフマン（１９８１）；ジェインチルら（１９６９）；ナカノら（１９９６）；コダマら（１９８２）；ならびに国際公開第０１／０８８１００号および同第２００５／０８０５５４号を参照のこと）。
【０１０４】
特定の側面において本発明の方法は、担体を使った浮遊培養（フェルナンデスら、２００４）またはゲル／バイオポリマーカプセル化（米国特許公開第２００７／０１１６６８０号）による浮遊培養などの、細胞の浮遊培養にも使用することができる。細胞の浮遊培養という用語は、細胞を、培養容器または培地中のフィーダー細胞（使用される場合）に接着しない条件で培養することを意味する。細胞の浮遊培養には、細胞の解離培養および細胞の凝集浮遊培養が含まれる。細胞の解離培養という用語は、懸濁した細胞を培養することを意味し、細胞の解離培養には、単細胞または複数の細胞（例えば、約２〜４００細胞）からなる小細胞凝集物の解離培養が含まれる。前述の解離培養を継続すると、培養された解離細胞がより大きな細胞集合体を形成し、その後、凝集浮遊培養を行うことができる。凝集浮遊培養には、胚様体培養法（ケラーら、１９９５を参照のこと）およびＳＦＥＢ法（ワタナベら、２００５；国際公開第２００５／１２３９０２号）が含まれる。
【０１０５】
本発明のいくつかの態様の方法に従って浮遊状態で細胞を培養するために使用される培養容器は、適した等級の純度を有し、その中で培養された細胞がこのような表面に付着または接着できないように設計された内部表面を有する（例えば、表面への付着または接着を防止するための非組織培養処理細胞）任意の組織培養容器である。好ましくは、拡張可能（ｓｃａｌａｂｌｅ）な培養物を得るために、本発明のいくつかの態様による培養は制御培養システム（好ましくはコンピューター制御培養システム）によって実施され、その制御培養システム内では、温度、攪拌、ｐＨ、およびｐＯ２などの培養パラメーターが適切な装置を用いて自動的に制御される。一旦培養パラメーターが記録されると、細胞増殖を促進するため、必要に応じて培養パラメーターが自動で調節されるようにシステムが設定される。細胞は、その増殖能力を維持しながら、動的条件（すなわち、細胞が浮遊培養中で動き続ける条件で）または非動的条件（すなわち、静的培養）で培養され得る。細胞の非動的培養では、細胞をコーティングされていない５８ｍｍのペトリ皿（グレイナー、フリッケンハウゼン、ドイツ）で培養することができる。細胞の動的培養では、細胞を、制御部に接続することができ、従って制御培養システムを構成するスピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ〜１０００ｍｌ、例えば２５０ｍｌ；１００ｍｌ；または１２５ｍｌ、エルレンマイヤー）中で培養することができる。培養容器（例えばスピナーフラスコ、エルレンマイヤー）を断続的に振とうさせる。本発明のいくつかの態様によれば、培養容器は、シェーカーを用いて毎分１５回転（ｒｐｍ）で振とうされる。本発明のいくつかの態様によれば、培地は毎日交換される。
【０１０６】
Ｂ．多能性幹細胞の培養
多能性幹細胞の培養物は、集団に含まれる実質的な割合の幹細胞とその誘導体が未分化細胞の形態学的特徴を示し、それらを胚または成人由来の分化細胞とはっきりと区別できる場合、「未分化」であると言える。当業者は、未分化のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を認識でき、通常、細胞のコロニーの顕微鏡像は、細胞質に対する核の割合が高いことと顕著な核小体を有するという２つの特徴を示す。未分化細胞のコロニーが、分化している隣接している細胞を有する場合があることも理解される。
【０１０７】
ＥＳ細胞は、血清およびフィーダー層、典型的にはマウス胚線維芽細胞の存在下で細胞を培養することによって、未分化状態で維持することができる。幹細胞を未分化状態に維持するための他の方法も知られている。例えば、フィーダー層を使わなくてもＬＩＦ存在下で培養することにより、マウスＥＳ細胞を未分化状態に維持することができる。しかしながら、マウスＥＳ細胞とは異なり、既存のヒトＥＳ細胞はＬＩＦに応答しない。ヒトＥＳ細胞は、ＥＳ細胞を、線維芽細胞のフィーダー層上、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下で培養することによって（アミットら、２０００）、または、フィーダー層を使わない場合には、タンパク質マトリックス（例えばマトリゲル（登録商標）またはラミニン）上、塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した線維芽細胞馴化培地中で培養することによって、未分化状態に維持することができる（シュウら、２００１；米国特許第６，８３３，２６９号）。
【０１０８】
ＥＳ細胞を調製および培養する方法は、その全てが参照することにより本明細書に組み入れられる、『奇形腫および胚性幹細胞：実践的な取り組み（ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）』（１９８７）；『マウスの発生における技術ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）』（１９９３）；『インビトロ胚性幹細胞分化（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）』（１９９３）；『胚性幹細胞の特徴と用途：ヒト生物学および遺伝子治療への応用に関する意見（Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）』（１９９８年）などの、細胞生物学、組織培養および発生学の標準的な教科書および総説に見出すことができる。組織培養に使用される標準的な方法は、基本的に、『動物細胞の培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）』（１９８７）；『哺乳類細胞への遺伝子導入ベクター（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）』（１９８７）および『分子生物学の最新手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）』『分子生物学の手短なプロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）』（１９８７年と１９９５年）に記載されている。
【０１０９】
体細胞にリプログラミング因子を導入するかまたはリプログラミング因子と接触させた後、これらの細胞を多分化能および未分化状態を維持するのに十分な培地で培養することができる。本発明で生成される人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の培養には、参照することにより本明細書に組み入れられる、米国特許公開第２００７／０２３８１７０号、同第２００３／０２１１６０３号、および同第２００８／０１７１３８５号に記載されているような、霊長類の多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞、を培養するために開発された様々な培地および技術を使用することができる。当然のことながら、当業者に知られているような多能性幹細胞を培養および維持するためのこれ以外の方法も、本発明と共に使用することができる。
【０１１０】
特定の態様では、未定義の条件を使用することができる。例えば、幹細胞を未分化状態に維持するために、多能性細胞を、線維芽細胞フィーダー細胞上でまたは線維芽細胞フィーダー細胞に曝露した培地上で培養することができる。
【０１１１】
あるいは、多能性細胞は、ＴｅＳＲ培地（ラドウィグら、２００６ａ；ラドウィグら、２００６ｂ）または必須（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ）８培地（チェンら、２０１１）のような、定義したフィーダー細胞非依存性の培養系を用いて、本質的に未分化の状態で培養および維持することができる。フィーダー細胞非依存性の培養系および培地を使用して、多能性細胞を培養および維持してもよい。これらのアプローチにより、誘導したヒトｉＰＳ細胞ならびにヒト胚性幹細胞を、マウス線維芽細胞の「フィーダー層」を必要とせずに、本質的に未分化の状態にとどめることができる。本明細書で記載するように、必要に応じて、費用を削減するために、これらの方法に様々な変更を施してもよい。
【０１１２】
ヒト多能性幹細胞の培養および維持には、様々なマトリックス成分を使用することができる。例えば、マトリゲル（登録商標）、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ＰＬＯラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブリンクロット、およびビトロネクチンを組み合わせて、参照によりその全体が組み入れられるラドウィグら（２００６ａ；２００６ｂ）に記載されているように、多能性細胞を成長させるための固体支持体を提供する手段として、培養表面をコーティングすることができる。具体的には、細胞の培養およびヒト多能性幹細胞の維持のための基質を提供するために、マトリゲル（登録商標）を使用してもよい。マトリゲル（登録商標）は、マウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状タンパク質の混合物であり、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ニュージャージー、米国）から市販されている。この混合物は、多くの組織で見出される複雑な細胞外環境に似ており、細胞培養用の基質として細胞生物学者によって使用されている。
【０１１３】
Ｃ．細胞の継代
本発明の特定の側面には、さらに、細胞を解離する工程を含めることができる。細胞の解離は、知られている手法のいずれかを用いて行うことができる。そのような手法には、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、酵素（例えばトリプシン、コラゲナーゼ）などによる処理、および機械的な解離（例えばピペット操作）などの操作による処理が含まれる。解離の前および／または解離後に、細胞をＲＯＣＫ阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤で処理してもよい。例えば、細胞を、解離後にのみ処理してもよい。
【０１１４】
細胞培養のいくつかのさらなる態様では、培養容器がいっぱいになると、解離に適した任意の方法によって、コロニーを凝集した細胞または未だ単一の細胞に分割し、継代のために新しい培養容器に入れる。細胞継代は、細胞を生存状態に保ち、培養条件下で長時間増殖させることを可能にする技術である。細胞は通常、それらが約７０％〜１００％コンフルエントに達したときに継代される。
【０１１５】
本発明において、細胞を単細胞に解離し、次いでこの単細胞の継代を行うことは、細胞増殖の促進、細胞ソーティング、ならびに分化のための規定された播種、および培養手順およびクローン拡大の自動化を可能にするような、複数の利点に繋がる可能性がある。例えば、単一の細胞からクローンとして誘導される後代細胞は、遺伝子構造が均一で、および／または細胞周期が同調しており、これによって標的とした分化が高まる可能性がある。単一細胞を継代するための例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公報第２００８／０１７１３８５号に記載されている。
【０１１６】
特定の態様では、細胞を個々の細胞に、または個々の細胞と、２、３、４、５、６、７、８、９、１０細胞またはそれ以上の数の細胞から構成される小さい細胞クラスターとの組み合わせに解離させてもよい。解離は、機械的な力、または細胞を解離させる薬剤、例えばクエン酸ナトリウム、または酵素、例えば、トリプシン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥセレクトなどによって行うことができる。
【０１１７】
細胞の供給源および増殖の必要性に基づいて、解離させた細胞を個々にまたは小さいクラスターごとに新しい培養容器に移してもよく、このときの分配比は、例えば、少なくともまたは約１：２、１：４、１：５、１：６、１：８、１：１０、１：２０、１：４０、１：５０、１：１００、１：１５０、１：２００、またはもしくはこの範囲から導き出される任意の範囲であってよい。浮遊培養の細胞株の分配比は、培養細胞懸濁液の量によって決めることができる。継代の間隔は、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日ごと、もしくはこの範囲から導き出される任意の日数ごとであってよい。例えば、酵素を使用した異なるプロトコールにおいて達成可能な分配比は、１：２の比で３〜７日ごと、１：３の比で４〜７日ごと、および１：５〜１：１０の比でおよそ７日ごと、１：５０〜１：１００の比で７日ごとであってよい。分配比が高い場合には、継代間隔を少なくとも１２〜１４日、または過度の自発的な分化もしくは細胞死に起因する細胞消失が起きない任意の期間に延長してもよい。
【０１１８】
特定の側面では、単一細胞継代は、クローニング効率や細胞の生存率を高めるのに有効な低分子、例えば上述のＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行ってもよい。このようなＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｙ−２７６３２、ＨＡ−１０７７、Ｈ−１１５２、ＨＡ−１００またはブレビスタチンを、有効な濃度で、例えば、少なくともまたは約０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０〜約１００μＭ、もしくはこの範囲から導き出される任意の濃度で使用することができる。
【０１１９】
ＶＩ．マーカーの発現
細胞培養または細胞集団における特定の細胞型の量を決定するためには、培養または集団に含まれている他の細胞から特定の細胞型を区別する方法が望まれる。したがって、その存在、非存在および／または相対発現レベルが本発明に従って作製された特定の細胞型に特異的なマーカーが、そのようなマーカーの発現を検出および決定するための方法として提供される。
【０１２０】
マーカーの発現の有無および／またはその発現レベルは、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって決定することができる。例えば、サイトケラチン１４、サイトケラチン１５、Ｐ６３、またはＣＤ４９ｆなどの特定の遺伝子マーカーによって産生される転写産物の量を、定量的ｑＰＣＲによって決定する。さらに、免疫組織化学またはフローサイトメトリーを用いて、前述の遺伝子によって発現するタンパク質を検出することができる。ｑＰＣＲ、フローサイトメトリー、および免疫組織化学を用いて、そのようなマーカーの量または相対的な割合を同定および決定することができる。
【０１２１】
ＶＩＩ．ケラチノサイト幹細胞の使用
本発明の特定の側面の方法および組成物によって提供されるケラチノサイト幹細胞は、様々な応用に用いることができる。そのような例としては、これらには限定されないが、ケラチノサイト幹細胞をインビボで移植または留置すること；細胞傷害性化合物、発がん物質、変異生成／制御因子、医薬化合物などをインビトロでスクリーニングすること；薬剤および／または成長因子が機能するメカニズムについて研究すること；遺伝子治療；ならびに生物学的に活性な製品の生産が挙げられる。
【０１２２】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本発明のケラチノサイト幹細胞およびそれから誘導したケラチノサイトを使用して、本明細書で提供するケラチノサイトの特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、低分子薬、ペプチド、およびポリヌクレオチドなど）または環境条件（培養条件もしくは操作など）をスクリーニングすることができる。
【０１２３】
いくつかの応用例では、幹細胞（分化したものまたは未分化のもの）を使用して、細胞がケラチノサイト細胞系列に沿って成熟するのを促進する因子、または長期間培養においてそのような細胞を増殖させるまたは維持するのを促進する因子をスクリーニングする。例えば、候補となったケラチノサイト成熟因子または成長因子を別々のウェルに入れ、そこにケラチノサイト幹細胞を加え、その後、結果として表れた表現型の変化の全てを、さらなる培養のためのおよび細胞の使用に関する望ましい基準に従って決定することによって試験する。
【０１２４】
本発明の特定のスクリーニング例は、薬剤研究において医薬化合物を試験することおよび化粧品を試験することに関する。読者は通常、一般的な教科書である、医薬研究におけるインビトロ法、アカデミックプレス、１９９７、および米国特許第５，０３０，０１５号を参照する。本発明の特定の側面では、ケラチノサイト系統に分化した細胞は、これらが既に短期間培養においてケラチノサイト細胞系統または初代ケラチノサイト細胞について実施されているため、標準的な薬物スクリーニングおよび毒性アッセイに試験細胞として使用することができる。候補医薬化合物の活性評価には通常、本発明の特定の側面で提供されたケラチノサイトを候補化合物と混合すること、その化合物に起因する全ての形態的な変化、マーカーの表現型の変化、または細胞の代謝活性の変化を決定すること（未処理の細胞または不活性化合物で処理した細胞と比較する）、次いで、化合物の影響と観察された変化とを関連づけること、が含まれる。スクリーニングは、その化合物がケラチノサイトに対して薬理学的効果をもつように設計されているため、あるいは他の場所に影響を及ぼすように設計された化合物は、ケラチノサイトに意図しない副作用をもたらすかもしれないので、実施してもよい。生じる得る薬剤間相互作用を検出するために、２種類以上の薬剤を組み合わせて試験する場合もある（細胞と同時に、または順次混合することによって）。いくつかの例では、化合物をケラチノサイトに対する毒性の点からスクリーニングする（例えば、クズヤら、２００１を参照のこと）。
【０１２５】
Ｂ．上皮シートの生成と移植
本発明はまた、おそらく創傷に起因して、そのような治療を必要とする対象の上皮機能をある程度の回復させるための、本明細書で提供されるケラチノサイトの使用を提供する。例えば、本明細書で開示した方法によって誘導されたケラチノサイトおよびケラチノサイト幹細胞は、熱傷を治療するために（例えば、移植片の操作などのために）使用することができる。
【０１２６】
本明細書で提供されるケラチノサイトの治療目的での適性を決定するために、細胞を最初に適切な動物モデルで試験することができる。あるレベルでは、細胞は、例えばマウス（実施例１のように）またはヒトの死体に由来する脱表皮化真皮を接種することによって、皮膚細胞に分化および層化する能力について評価することができる。別のレベルでは、細胞を、インビボでそれらが表現型を残存および維持する能力について評価してもよい。本明細書で提供されるケラチノサイトは、免疫不全動物（ヌードマウスや、または化学的にまたは放射線の照射によって免疫不全化した動物）の、それ以降も観察できる部位に投与することができる。例えば、全層皮膚の一部分をヌードマウスの背面から手術によって除去し、続いて周囲の皮膚の下にシリコンドームチャンバーを挿入する。線維芽細胞およびケラチノサイトを、ドームの上部の穴を通して創傷に塗布する。手術の数週間後、移植部位を最初に作った創傷の治癒について分析する。数週間またはそれ以上の期間が経過した後、組織を回収し、多能性幹細胞などの出発細胞型が依然として存在するかどうか否かを評価することができる。このことは、投与する細胞を検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼ）で標識することによって、または投与する細胞に特異的な構成的マーカーを測定することによって実施することができる。本明細書で提供するケラチノサイトをげっ歯類モデルを使って試験する場合、投与した細胞の有無および表現型は、ヒト特異的抗体を用いる免疫組織化学もしくはＥＬＩＳＡ、または、特定のヒトポリヌクレオチド配列を増幅するプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を用いるＲＴ−ＰＣＲ解析によって、評価することができる。ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで遺伝子発現を評価するために好適なマーカーは、本開示の別の場所で提供する。
【０１２７】
本発明の方法により提供されるケラチノサイトは、種々の動物モデルを使い、上皮創傷を治癒するその能力に関して試験してもよい。ケラチノサイトを皮膚線維芽細胞と混合し、皮膚創傷上に移植した場合、細胞が機能性であれば創傷は少なくとも部分的に治癒する。このアッセイは一般的に、初代ケラチノサイトの機能を試験するために用いられる。
【０１２８】
それらの酵素プロファイルまたは動物モデルにおける有効性に従って所望の機能的特徴を示す、本発明の特定の側面で提供されるケラチノサイトはまた、それを必要とするヒト対象に直接投与するのにも適している。ケラチノサイトを、角膜に投与してもよい。
【０１２９】
本発明の角膜上皮シートは、角膜が損傷した患者への移植材料（角膜上皮の代替物）として使用することができる。移植においては、移植片を外科用縫合糸で周囲の組織に固定することにより移植片を固定し、生存させることが好ましい。さらに、移植後は、一時的に治療用コンタクトレンズで覆うことにより、移植部分の表面を保護することが好ましい。角膜上皮シートは、コラーゲン層上に形成された細胞層を含んでいてもよく、これは、細胞層に加えて提供される。コラーゲン層は、羊膜由来であってもよい。コラーゲン層を有する角膜上皮シートは、所定の細胞を基質としてのコラーゲン層に播種し、その後培養することにより得ることができる。
【０１３０】
本発明の特定の側面において提供されるケラチノサイト幹細胞は、それを必要とするいかなる対象もの治療に使用することができる。そのような治療に適切であり得る好ましいヒトの状態は熱傷である。治療様式および適切な用量を決定するための最終的な責任は管理医師にある。
【０１３１】
本発明の特定の側面は、生体工学によって作られた組織移植片の一部を形成する、本明細書で提供されるケラチノサイトまたはケラチノサイト幹細胞を含む。このような組織移植片は、上皮シート移植片であってもよい。
【０１３２】
グリーンおよび共同研究者らは、ヒト上皮ケラチノサイトを培養する方法を記載しており（レインワルドおよびグリーン、１９７５）、この方法は、他の培養上皮細胞にまで拡張されている。このような培養条件からは、広い熱傷面、潰瘍および他の皮膚創傷への移植に適した層化した上皮シートが得られる（ガリコら、１９８４；ハイテンら、１９８６）。この手順で得られる培養上皮は、一時的な創傷被覆材のための同種移植片としても使用されている（フィリップスら、１９８９；ボリバー・フローレスら、１９９０）。上皮細胞培養は、体表面再建のための強力なツールとなっている。
【０１３３】
上皮シートの有効期間が限られているため、それらの使用は、製造施設からあまり離れていない医療施設に限定されている。病院へ輸送するために上皮シートをディスパーゼで分離した後の有効期間は短い。そのため、培養シートの保存方法が確立できれば、それをバンク化することができ、また、世界中に輸送することができるようになる。この点に関しては、いくつかの戦略が試みられている。何人かの著者らは、凍結保護剤としてのグリセロールまたはジメチルスルホキシドの使用と、それに続く特定の凍結プロトコールに基づく凍結保存法を開発した（米国特許第５，２９８，４１７号を参照のこと）。その他のものは、細胞浸透性ガラス形成剤（特にグリセロール）と非浸透性保護剤（好ましくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストランまたはヒドロキシエチルデンプン）の両方を含む培地を有する凍結保存された培養上皮シートを開発した（米国特許第５，１４５，７７０号を参照のこと）。さらに他のものは、凍結保存成分を洗い流す必要がなく、乾燥保存の選択肢を有する凍結保存された培養上皮シートを開発した（米国特許第６，５４８，２９７号を参照のこと）。
【０１３４】
次いで、ケラチノサイトのシートを、ｉＰＳ細胞の作製元の哺乳動物に移植する。
【０１３５】
Ｃ．商用、治療用および研究目的での流通
製造、流通および使用の目的では、ケラチノサイト幹細胞を含む本発明のケラチノサイト系統の細胞は、通常、等張性の賦形剤または培地に入った細胞培養または懸濁液という形態で、必要に応じて、輸送または保管を容易にするために凍結されて、供給される。
【０１３６】
本発明はまた、製造、流通または使用のどんな時にも存在する一組または組み合わせの細胞を含んでいる種々の試薬系も含む。一組の細胞は、本開示で記載の２種以上の細胞集団の任意の組み合わせ、例えば、これらには限定されないが、分化させた細胞（ケラチノサイト細胞系列の細胞、それらの前駆細胞およびサブタイプ）と未分化幹細胞または他の分化した細胞型の組み合わせが挙げられる。ある組に含まれている細胞集団は、同じゲノムまたはそれらの遺伝的改変型を共有していることがある。ある組に含まれているそれぞれの細胞型は、一緒に梱包してもまたは同じ設備に含まれる別々の容器に入れても、あるいは別々の場所にあっても、同時にもしくは時間的に別々にあっても、同じ実体の管理下にあってもまたは取引関係のあるいは別の実体の管理下にあってもよい。
【実施例】
【０１３７】
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含まれるものである。当業者であれば理解できるように、以下の実施例で開示される技術は、本発明の実践において最もうまく機能することが発明者らによって発見された技術であり、そのため、その実践に関する好ましい形態であると見なすことができる。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、開示されている特定の態様に多くの変更を施すことができ、それでもなお、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られることを理解する。
【０１３８】
実施例１−多能性幹細胞からの機能性ケラチノサイトの分化
ケラチノサイト幹細胞は、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣから、開始、分化、成熟、および維持の４つの工程から生成することができる（図１）。開始工程（０〜３日目）では、全トランスレチノイン酸（ＲＡ）と神経分化を抑制する因子であるＢＭＰ４の相乗作用により、ＥＳＣ／ｉＰＳＣの凝集体を外胚葉に運命づけられるように誘導した。０日目に、ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣを回収し、およそ５０％コンフルエントの表面培養物を、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）で３７℃で５分間消化することで、単一細胞になるよう個別化した。単一細胞をｍＴｅＳＲ培地で１回洗浄し、０．７×１０６細胞／ｍＬの密度で、ミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤ＨＡ−１００（１０μＭ）を添加した５ｍＬのＴｅＳＲ培地を入れた超低付着Ｔ２５フラスコに播種した。Ｔ２５フラスコを、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中、１５ｒｐｍで振とうしているベリーダンサー（Ｂｅｌｌｙ  Ｄａｎｃｅｒ）攪拌機上に置いた。１日目に、ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ凝集物を開始培地（表１）で１回洗浄し、その後１日目から３日目までは、５ｍＬの開始培地中、毎日培地を交換しながらインキュベートした。分化工程（４〜１４日目）では、継続的にＥＧＦ、ＦＧＦ１、アスコルビン酸、コレラ毒素、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＩＩ（ＴＧＦＲＫｉ）、および高濃度のナイアシンアミドに曝露することによって、単層の（commited simple）上皮前駆細胞を、サイトケラチン１４（Ｋ１４）陽性でかつｐ６３陽性のケラチノサイト前駆体へと変化させた。４日目に、Ｔ２５フラスコから上皮凝集物を回収して分化培地（表２）に入れ、アキュターゼと共に３７℃で２０分間インキュベートした。部分的に消化された凝集物を分化培地で１回洗浄し、凝集物を１ウェルあたり約２０個の密度で、ビトロネクチンまたはラミニンでコーティングしたヌンクロン（Ｎｕｎｃｌｏｎ）６ウェルプレートにプレーティングした。細胞には２日毎に分化培地を与えた。１５日目にケラチノサイト前駆体（Ｋ１４＋）をバーゼン（Ｖｅｒｓｅｎｅ）に溶解したトリプシン（０．１％）で２分間消化して継代し、ゼラチンまたはラミニンでコーティングしたヌンクロン６ウェルプレート上において成熟培地（表３）中に、１ウェル当たり５０、０００個の細胞密度でプレーティングした。その後、ケラチノサイト前駆細胞を成熟条件下（１５〜２０日目、継代１）で、ケラチノサイト幹細胞マーカーであるサイトケラチン１５（Ｋ１５）とＣＤ４９ｆが高レベルで発現するまで、継続して培養した。ケラチノサイト幹細胞が生成された後の維持工程（２０日目以降）では、中程度の生育条件（表４）を適用して、細胞を成長・増殖させた。各工程における組成が化学的に規定された培地（ＦＢＳおよびＢＳＡを含まない）の全組成を表１〜４に示す。
【０１３９】
顕微鏡を使ってｉＫＣの特徴付けを行った結果、よりコンパクトで、個々のｉＫＣは初代ケラチノサイトよりもサイズが小さいことが分かった（図２Ａ）。ｉＫＣのフロー分析からも、ｉＫＣが初代ケラチノサイトよりも小さいことが示唆された。継代３のヒト包皮ケラチノサイトと継代１のｉＫＣの位相差画像から、皮膚にバリア機能をもたらしている密着結合を共有しているケラチノサイトに典型的な特徴の、明るく見える細胞間の境界が明らかになった（図２Ａ）。ヒト包皮ケラチノサイトおよびｉＫＣの免疫蛍光画像から、培養した初代ケラチノサイト（Ｐ３）が、細胞質でＫ１４を発現しているが、Ｋ１５の発現を消失していることが示された（図２Ｂ）。Ｐ０（継代０）では、ｉＫＣは多様なレベルでＫ１４を発現していたが、Ｋ１５は発現していなかった。Ｐ１（継代１）では、ｉＫＣはＫ１４をより均一に発現し、細胞の一部は、ケラチノサイト幹細胞マーカーであるＫ１５を高レベルで発現していた。
【０１４０】
ｉＫＣを誘導するのに重要な成分を同定するための実験を行った。最初に、最適条件（図１および表１〜２に記載）と、１回につき１つの成分だけを変更した様々な非最適条件で、継代０の、１４日目の分化培養物を得た。得られた培養物の画像を位相差を用いて取得した（図３Ａ）。培地にコレラ毒素とＴＧＦＲＫｉが含まれていないと、ｉＫＣを効率的に誘導することができないことが判明した。さらに、ＥＧＦとナイアシンアミドの濃度が十分でない場合、分化過程が不完全であった。同様に、培地中のカルシウムレベルが高すぎると（１ｍＭ）、シンプル（simple）の上皮前駆細胞のさらなる分化が起こらず、ケラチノサイトにならなかった。次に、異なる線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を用いて、継代０、１４日目の分化培養物を得た。得られた培養物を、抗Ｋ１４抗体による免疫蛍光染色により画像化した。ＦＧＦ１は細胞を効率的に誘導して、成熟ケラチノサイトマーカーであるＫ１４を発現させていたが、ＦＧＦ２とＦＧＦ７は均一なＫ１４の発現を促進しなかった（図３Ｂ）。
【０１４１】
ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣから分化させたケラチノサイトの純度を評価するために、ケラチノサイトを図１に記載の方法によって作製し、継代０（Ｐ０）および継代１（Ｐ１）の終了時に回収した。得られた培養物ならびに継代３の初代ヒト包皮ケラチノサイトを、抗Ｋ１４−ＦＩＴＣと抗ＣＤ４９ｆ−ＰＥ抗体で染色し、フローサイトメトリーで測定した。陽性対照の初代ケラチノサイトは、９８．１％の細胞がＫ１４＋／ＣＤ４９ｆ＋であるという結果を示し、これは、基底層ケラチノサイトの発現プロファイルと一致した（図４）。Ｐ０とＰ１の終了時にｉＫＣｓフロー分析を行った結果、Ｋ１４＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞の割合は、それぞれ、９０．２％および９１．８％であった。これらの結果は、図１に記載の分化プロトコールから、Ｋ１４とＣＤ４９ｆを発現している高純度のケラチノサイトが生成されたことを示している。
【０１４２】
維持条件におけるｉＫＣの増殖能を測定するために、ｉＫＣを、バーゼン中の０．１％トリプシンで処理し、ゼラチンでコーティングしたヌンクロン６ウェルプレートに、１ウェル当たり５０，０００個の細胞を継代した。細胞に一日おきに維持培地を与え、各プレーティングの５日後に再び継代した。集団倍加率を計算するために、各継代で合計細胞数を記録した。ｉＫＣは、老化に達する前に５回継代することができた（図５Ａ）。ｉＫＣの集団倍加率は累計で１１．６に達した。
【０１４３】
ｉＫＣの幹細胞性を決定するために、コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）を行った。細胞を６ウェルプレートに２５０細胞／ウェルでプレーティングし、２週間生育させた。初代ケラチノサイトについては、ブランクの細胞の入っていない培養で処理したプレートを最適な成長のために使用した。一方、ｉＫＣについては、前もって初代ケラチノサイトの培養に使用し、基底膜として天然のラミニン沈着物を有しているプレートを用いた。培養終了時に、細胞を２％ホルムアルデヒドで固定し、ヘキストで染色した。プレート全体を、モレキュラー・デバイス社の（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）イメージエクスプレス（ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ）高解像度イメージャで画像化した。結果から、初代ケラチノサイトが、通常のケラチノサイト集団には不十分なケラチノサイト幹細胞に由来する、約１５個の個別の大きなコロニーを形成したことが示された（図５Ｂ）。ｉＫＣは培養期間中に大きく増殖したが、細胞間の増殖能力はより均一であった（図５Ｂ）。継代１（Ｐ１）でｉＫＣは、コロニー形成アッセイにおいて２週間以内にほぼ完全なコンフルエントまで増殖した。
【０１４４】
ｉＫＣがマウス脱表皮化真皮（ＤＥＤ）上で分化および層化する能力を調べた。ＤＥＤを作製するために、マウス新生仔の背中の皮膚を外科的に切除し、約１ｃｍ２の丸い断片に切り取った。次いで皮膚組織をバーゼン中、４℃で一晩インキュベートして、表皮と真皮との結合を緩めた。１２時間インキュベーションした後、表皮をピンセットで除去した。残った真皮を７０％エタノールおよびＰＢＳで、それぞれ３回繰り返してすすいだ。次いで、清潔な真皮の液体窒素による凍結と室温での解凍を１０サイクル繰り返し、組織を失活させた。得られた組織を１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｓｔｒｅｐ）を含むＰＢＳに移し、４℃で２４時間おいた。この時点で、ＤＥＤは直ちに使用しても、または−２０℃で保存してもよい。ＤＥＤ上に細胞を播種するために、ＤＥＤをＰＢＳから取り出し、ケラチノサイト維持培地に浸漬した。目的の細胞を、トリプシンを使って表面培養から引きはがし、維持培地に集めた。約１００万個の細胞を約１００μｌの維持培地に再懸濁した。最初に、ＤＥＤをトランズウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）（コーニング）の上部チャンバーに置き、次いで、細胞懸濁液をＤＥＤの上にそっと加えた。細胞が沈降するように５分間おいた。２週間、１．５ｍＬの維持培地をＤＥＤ移植片にトランズウェルの底から供給した。１日おきに維持培地を交換した。トランズウェル中で２週間培養した後、ＤＥＤ移植片を引き上げ、凍結切片を作製するためにＯＣＴコンパウンドに包埋した。切片（１６μＭ）を切り出し、移植した細胞の核がピンク色に染まるよう、ヘマトキシリンで染色した。ＤＥＤ移植の結果から、継代１のｉＫＣが、初代ヒトケラチノサイトと同様に、マウスＤＥＤ上で分化し、層を形成することができることが示された（図６Ａ）。
【０１４５】
次に、ｉＫＣの、ＦｏｘＮ１ヌードマウスの背部に生着する能力を試験した。ＦｏｘＮ１免疫不全ヌードマウスをイソフルラン吸入により麻酔した。このヌードマウスの背部からおよそ１ｃｍ２の全層皮膚（表皮および真皮）を丸く、外科的に切除した。その創傷の収縮によって固くなった周囲の皮膚の下に、シリコンドームチャンバーをしっかりと挿入した。シリコンドームチャンバーは、移植細胞が生存および成長するための湿潤環境を提供するだけでなく、周囲の自己皮膚が広がって創傷を治癒するのを防止する。１５０μｌのＤＭＥＭに、１００万個の真皮線維芽細胞（ＦＢ）と１００万個のケラチノサイト（ＫＣ）を懸濁し、ドーム上部の穴を通して傷口の中心にそっと乗せた。細胞を移植した１０分後にイソフルオランを除去した。マウスは個別に飼育し、術後最初の４日間は鎮痛剤を与えた。手術の１週間後、シリコンチャンバーを創傷から除去した。手術の３週間後、マウスを安楽死させて移植部位を分析した。外科手術の３週間後に撮影した写真から、ｉＫＣ（２複製）が初代マウスおよびヒトケラチノサイトと同程度に皮膚の初期創傷を覆い、治癒することができることが示された（図６Ｂ）。注目すべきことに、ｉＫＣ移植片には、初代ケラチノサイトではしばしば見られる毛嚢幹細胞がないため、残存毛を欠いていた。
【表１】
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【表２】
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【表３】
0006581655.tif 000004
【表４】
0006581655.tif 000005
【表５】
0006581655.tif 000006
【０１４６】
実施例２−初代ケラチノサイトの増殖および維持
本明細書では、初代ヒトケラチノサイトの増殖および維持に用いる、組成が化学的に規定された培地を提供する。この培地を用いれば、初代ケラチノサイトを、それらのコロニー形成能力を維持しながら、集団を４０倍以上に倍加させ、増殖させることができる。この培地はまた、インビトロおよびインビボいずれの用途においても、ヒトＥＳＣ／ｉＰＳＣをケラチノサイト様細胞に分化させるのに使うことができる。
【０１４７】
初代ヒトケラチノサイトを培養するための組成が化学的に規定された培地（ＫＣＭ、ケラチノサイト培養培地）は、基礎培地としてＭＣＤＢ  １５３を使用しており、さらにアミノ酸が添加されたものであった（表６）。完全培地には、カルシウム（８０μＭ）、ＥＯＰ（エタノールアミンおよびホスホリエタノールアミン共に０．１ｍＭ）、トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（０．２μｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ１（１ｎｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（０．５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＧＦ１（１０ｎｇ／ｍＬ）が添加されていた。初代ケラチノサイトの培養を最適化するために、Ｔ３（１０ｎＭ）、Ｌ−カルニチンＨＣｌ（５μＭ）、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（０．２ｍＭ）、コレラ毒素（１００ｐＭ）、ナイアシンアミド（３ｍＭ）、ＢＭＰ４（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）およびインスリン（表で示すように、ＩＧＦに加えて、またはその代わりに０〜１０μｇ／ｍＬ）を種々の培地組成で試験した(表７)。
【表６】
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【表７】
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【０１４８】
様々な培地で生育させた細胞の機能を評価するために、形態学、集団倍加、およびコロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）の３つの測定基準を使用した。
【０１４９】
ケラチノサイトの成長に対するインスリンおよびＩＧＦの効果を決定するために、研究を行った。細胞は、０μｇ／ｍＬを含むすべての濃度のインスリンで良好に成長した。しかし、高濃度のインスリン（１μｇ／ｍＬ以上）で培養したケラチノサイトは、継代後期（ｐ６）では、分化した大きな細胞を多く含み、ＩＧＦと低濃度のインスリン（０．０５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ）を加えて生育させた細胞はそれよりも小さく、互いがより密着しているように見えた（図７Ａ）。さらに、ＫＣＭ１中で初代ケラチノサイトを長期間培養すると、ＩＧＦを加えて培養した細胞の成長速度は、インスリンと共に生育した細胞と同程度であった（図７Ｂ）。様々な変更を加えたＫＣＭ１で培養したケラチノサイトのＣＦＡを、ＣＦＡの開始時に、示した培地からＫＣＭ１（１０μｇ／ｍＬインスリン）に切り替えて試験した。ケラチノサイトをＫＣＭ１（１０μｇ／ｍＬインスリン）で１２日間培養し、コロニーサイズを測定した。ＩＧＦまたはインスリンのいずれかを添加したＫＣＭ１中で増殖させた細胞は、ＣＦＡの点では同様に機能した（図７Ｃ）。コロニー数またはサイズのいずれの条件についても統計学的に有意な差はなかった。
【０１５０】
培養初代ケラチノサイトの寿命に対する、ナイアシンアミドおよびＢＭＰ−４の効果を決定した。コーティングしていないプラスチックプレート上において、ＫＣＭ１、ＫＣＭ２、ＫＣＭ３、およびＫＣＭ４中で生育させたケラチノサイトはすべて、ケラチノサイトに典型的なコロニー増殖パターンを示した（図８Ａ）。ナイアシンアミドを添加すると（ＫＣＭ３およびＫＣＭ４）細胞が小さくなった。これは、ケラチノサイト幹細胞に不随する表現型である。さらに、様々な培地組成中で長期培養した初代ケラチノサイトについても調べた（図８Ｂ）。最も単純な組成のＫＣＭ１では、集団がおよそ１２倍になるまで、ケラチノサイトの成長が支えられた。培地にＴ３、Ｌ−カルニチン、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、およびコレラ毒素を添加すると（ＫＣＭ２）、細胞は約１９倍に増加した。ナイアシンアミド（ＫＣＭ３）を加えると、増殖能がさらに増強され、集団もおよそ２６倍に倍加した。ＢＭＰ４を加えると（ＫＣＭ４）、集団は有意に倍加した（およそ４０倍）。種々の培地組成中で培養したケラチノサイト（Ｐ４）を使い、ＣＦＡを行った。集団倍加率を高めた成分はさらに、ＣＦＡではコロニー数およびサイズを増加させた（図８Ｃ〜Ｅ）。ＫＣＭ４で生育させたケラチノサイトは、継代９（集団倍加率はおよそ３５倍）まで、ＣＦＡでコロニーを形成する能力を維持した。ＢＭＰ４およびナイアシンアミドが、寿命の延長およびコロニー形成能力の維持に関与するＫＣＭ４の重要な成分であることが見出された。すなわち、ＢＭＰ４およびナイアシンアミドによって、培養中の初代ケラチノサイト幹細胞の幹細胞性が維持された。
【０１５１】
初代ケラチノサイトの増殖能に対するＶＥＧＦの効果を測定した。ＫＣＭ４およびＫＣＭ４＋ＶＥＧＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）で成長させた初代ケラチノサイトの長期培養においては、ＫＣＭ４培地へのＶＥＧＦの添加は形態学的差異を示さなかったが、ケラチノサイトの増殖能を向上させた（図９Ａ）。さらに、ＶＥＧＦは、継代後期においてＣＦＡに正の効果を発揮することが見出された。例えば、集団倍加率が約３５倍（ＫＣＭ４についてはＰ１０、ＫＣＭ４＋ＶＥＧＦについてはＰ８）の細胞では、ＫＣＭ４での平均コロニーサイズは５８５単位であったが、ＫＣＭ４＋ＶＥＧＦでの平均コロニーサイズは１３７０単位であった（図９Ｂ）。コロニーの成長を支えるためには、ＫＣＭ４に５μｇ／ｍＬのインスリンを添加する必要があったことに注目されたい。
【０１５２】
ケラチノサイトは、コラーゲン１をコーティングしたプラスチックプレート上でも、コーティングをしていないプラスチックプレート上でも培養可能であることが判明した。コラーゲン１コーティングまたは非コーティングプレートのいずれかを用い、ＫＣＭ４中で細胞を長期培養した場合、どちらの表面でも、ケラチノサイトの成長速度に差はなかった（図１０Ａ）。しかしながら、非コーティングプレート上で増殖した初代ケラチノサイトは、コラーゲン上で増殖したものよりもＣＦＡの点で、わずかに良好に機能した（図１０Ｂ〜Ｃ）。例えば、２１．５倍に倍加した細胞（ＮＣについてはＰ６、Ｃ１についてはＰ７）をＣ１上で培養すると、１ウェル当たり平均して４０．３個のコロニーが生じ、その平均コロニーサイズは１０３３単位であったが、ＮＣ上で培養した細胞は１ウェル当たり平均８０．７個のコロニーを生じ、その平均コロニーサイズは１５６４単位であった。
【０１５３】
ＫＣＭ４で培養したケラチノサイトは、高カルシウムに応答して分化マーカーを発現することが分かった。継代３のケラチノサイトを１．５ｍＭのＣａ２＋で３日間処理し、分化マーカーのケラチン１、ロリクリンおよびフィラグリンの発現を免疫細胞化学によって評価した。３つの分化マーカーの発現は全て、高Ｃａ２＋処理ウェルで検出され、未処理ウェルでは検出されなかった（図１１）。
【０１５４】
ＫＣＭ４は、市販の組成が化学的に規定された培地と同様に機能することが分かった。ＫＣＭ４を、３種類の組成が化学的に規定された培地、つまり、インビトロジェンの組成が化学的に規定されたケラチノサイト血清を含まない培地（ＤＫＳＦＭ）、エピライフの組成が化学的に規定された成長補助培地（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（ＥＤＧＳ）、およびロンザのケラチノサイト組成が化学的に規定された成長培地（ＫＧＭ−ＣＤ）、と比較した。市販の培地中で培養した細胞は、製造業者が推奨しているように、コラーゲンをコーティングしてあるプレート上で生育させた。異なる培地中で生育させた細胞は、異なる形態を示した。ＫＣＭ４およびＤＫＳＦＭで培養した細胞は両方ともコロニーで増殖したが、ＥＤＧＳおよびＫＧＭ−ＣＤで培養した細胞はより運動性があり、成長するにつれて、プレートをより均一に覆った（図１２Ａ）。ＫＣＭ４およびＫＧＭ−ＣＤ培養細胞は、基本的に、ＤＫＳＦＭまたはＥＤＧＳ培養細胞よりも小さかった。異なる培地中で初代ケラチノサイトを長期培養すると（図１２Ｂ）、ＫＧＭ−ＣＤで培養した細胞は最も速く成長したが、集団がわずか２６倍に倍加した後に老化した。ＥＤＧＳで培養された細胞は、わずかに遅い速度で成長し、５０倍を超える集団倍加率を達成した。初期の継代では、ＫＣＭ４およびＤＫＳＦＭ培養細胞は同程度に遅い速度で成長した。ＤＫＳＦＭ細胞は２１倍に倍加した後に老化したが、ＫＣＭ４細胞は４０倍を超えて倍加し、成長した。種々の培地中で培養したケラチノサイトについて、ＣＦＡを行った（図１２Ｃ〜Ｄ）。ＫＣＭ４で培養した細胞は、市販の培地で培養した細胞よりもわずかにＣＦＡが良好であった。ＤＫＳＦＭおよびＫＧＭ−ＣＤで培養されたケラチノサイトは、ＫＣＭ４およびＥＤＧＳで培養されたケラチノサイトと比較して、形成したコロニーが少なく、より早い時点でコロニー形成能を失った。ＫＣＭ４で培養したケラチノサイトは、継代後期でより多くのコロニーを形成し、また、ＥＤＧＳで培養したケラチノサイトと比較して、より大きなコロニーを形成することができた。
【０１５５】
方法
【０１５６】
新生仔包皮からの初代ケラチノサイトの単離。包皮は、バンダービルト大学病院のヒト組織協働ネットワーク（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ）から購入した。皮下脂肪を各組織から除去した。包皮を、３ｍＬのＴｅＳＲ基本培地に溶解したディスパーゼ（５ｍｇ／ｍＬ）中で、表皮側を下にして４℃で約１６時間インキュベートした。表皮を真皮から剥がし、２ｍＬの０．０５％トリプシンと共に３７℃で５分間インキュベートした。細胞懸濁液をしっかりとピペッティングし、細胞を無傷の表皮片から外し、次いで、８０μｍの細胞フィルターに通した。０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤でトリプシンを中和した。細胞を１２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。細胞を以下のようにケラチノサイト培養培地にプレーティングした。図７および８では、新たに単離したケラチノサイトをプレーティングし、Ｐ１を通して、１０μｇ／ｍＬのインスリンを含むＫＣＭ１で培養した。細胞はＰ１の終わりに凍結した。解凍したら、細胞をＫＣＭ１（１０μｇ／ｍＬインスリン）中で１継代分増殖させ、示した組成の培地に変更した。図９、１０および１２では、ＫＣＭ４にＶＥＧＦを添加した以外はケラチノサイトの培養に使用したのと同じ培地に播種した。この条件では、Ｐ３の開示時にＶＥＧＦを加えた。図１１では、新たに単離されたケラチノサイをプレーティングし、Ｐ１を通して、１０μｇ／ｍＬのインスリンとＢＭＰ４を含むＫＣＭ１で培養した。細胞をＰ１の終わりに凍結した。解凍時に、培地をＫＣＭ４に変更した。
【０１５７】
初代ケラチノサイトの培養。ケラチノサイトを示した培地中で維持し、４〜５日ごとに継代した（約８０％コンフルエンスの時点で）。継代には、ケラチノサイトを、バーゼンに溶解した０．１％トリプシンと共に、３７℃で５分間インキュベートした。トリプシンを０．５ｍｇ／ｍＬのトリプシン阻害剤で中和した。細胞を１２００ｒｐｍで４分間遠心分離した。セロメーター（Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）（ネクセロム（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ））を用いて細胞を計数した。細胞を、示したケラチノサイト培地を入れた６ウェルプレートに、１ウェル当たり２５，０００〜５０，０００個の密度でプレーティングした。培地を１日おきに交換した。
【０１５８】
初代ケラチノサイトの分化。ケラチノサイトをＫＣＭ４中で培養し、８０％〜９０％コンフルエンスに達した時点で、細胞を１．５ｍＭのＣａ２＋で３日間処理するか、または固定した（カルシウム無処理対照）。分化マーカーであるＫ１、ロリクリン、およびフィラグリンの発現をポリクローナルウサギ抗体（コバンス（Ｃｏｖａｎｃｅ））を用いた免疫細胞化学法によって調べ、細胞を評価した。
【０１５９】
形態分析。細胞は、培養物の全体的な健康状態、および典型的なケラチノサイトの形態および成長パターンについて視覚的に評価した。
【０１６０】
集団倍加。細胞をおよそ８０％のコンフルエンスに達した時点で連続的に継代することにより、老化するまで維持した。各継代の細胞倍加の総数は、以下の式を用いて計算した：３．３２ｌｏｇ（Ｎ／Ｎｏ）。Ｎｏは、各継代の開始時にプレートされた細胞の数を示し、Ｎは、各継代の終了時に回収された細胞の数である。
【０１６１】
コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）。細胞を低密度（６ウェルプレートに１ウェル当たり２５０細胞の密度）でプレーティングし、８〜１２日間生育させた。図７および８では、ＣＦＡの開始時に、細胞を示した培地からＫＣＭ１（１０μｇ／ｍＬインスリン）に切り替えた。ケラチノサイトをＫＣＭ１（１０μｇ／ｍＬインスリン）中で１２日間培養し、コロニーサイズを測定した。図９、１０および１２では、ケラチノサイトを維持するために使用した培地を用いてＣＦＡを実施した。コロニーの成長を支えるには、ＫＣＭ４に５μｇ／ｍＬのインスリンを添加する必要があった。コロニーを８日間生育させ、コロニーサイズを測定した。
【０１６２】
培養後、プレートを固定し、ヘキストで染色した。イメージエクスプレス高解像度イメージャ（モレキュラー・デバイス）を使い、プレート全体を４０倍の倍率で画像化した。イメージ（Ｉｍａｇｅ）Ｊソフトウェアを使用し、１ウェルあたりの総コロニー数を数え、各コロニーのサイズを測定した。コロニー数を棒グラフで示す。ここで、棒の高さは各継代の１ウェル当たりの平均コロニー数を表し、エラーバーは標準偏差を表している。コロニーサイズは箱ひげ図で示しており、ここで、中心線は中央値を表し、箱が四分位範囲を表し、ひげが５〜９５パーセンタイルを表している。この範囲外のデータは個別にプロットされる。
【０１６３】
本明細書で開示し、特許請求した方法の全ては、本開示を踏まえれば過度の実験を行うことなく作成および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様の観点から説明してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法に、およびその工程に、またはその工程の順序に、変更を施すことができることは当業者には明らかである。より具体的には、同じまたは同様の結果が達成されるのであれば、本明細書に記載の薬剤を、化学的におよび生理学的に関連する特定の薬剤と置き換えてもよいと理解される。そのような当業者に明らかな類似した置き換えおよび修正は、添付の特許請求項によって定義されるように、本発明の精神、範囲および概念に含まれると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に示す手法その他の補足となる詳細な例を提供する範囲において、具体的に参照することによって本明細書に組み入れられる。
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米国特許第５，１４５，７７０号
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米国特許公報第２００７／０１１６６８０号
米国特許公報第２００７／０２３８１７０号
米国特許公報第２００８／０１７１３８５号
国際公開第９７／３７００９号
国際公開第９８／３０６７９号
国際公開第０１／８８１００号
国際公開第２００５／０８０５５４号
国際公開第２００５／１２３９０２号
国際公開第２００９／１４９２３３号
国際公開第２０１０／１４１８０１号
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ−Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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