(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毒性H3N2インフルエンザまたはH3N2ブタインフルエンザによって引き起こされる疾患に対して、ブタ類において、安全で効果的な免疫応答を提供することができる弱毒ブタインフルエンザ株であって、前記毒性の親株に対して少なくとも4つの追加のグリコシル化部位を有するHAタンパク質をコードし、前記グリコシル化部位が、S71N、K90N、L173TおよびP287Tであるか、または、S71N、K90N、L173T、P287TおよびK294Tであり、前記アミノ酸変化位置が、前記毒性の親株によってコードされる配列番号18に記載の配列を有するHAタンパク質に基づく、前記弱毒ブタインフルエンザ株。
【請求項２】
HAタンパク質が配列番号22の配列を有する、請求項１に記載の弱毒株。
【請求項３】
HAタンパク質が配列番号24の配列を有する、請求項１に記載の弱毒株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の弱毒株を含む免疫組成物。
【請求項５】
薬学的もしくは獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤をさらに含み、毒性のブタインフルエンザチャレンジに対してブタ類において防御免疫応答を提供する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ブタインフルエンザ以外のブタ類病原体に関連するかまたはそれに由来する少なくとも1つの追加の抗原をさらに含み、前記少なくとも1以上の追加の抗原が、ブタ類を感染させ、ブタ類に病気を引き起こすかまたはそれに対する感受性を引き起こすことができるM. hyo、ブタサーコウイルス２（PCV2）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）、ブタインフルエンザウイルス（SIV）または他の病原体に対して、ブタ類において免疫応答を誘発することができる、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ブタ類動物にワクチン接種するための請求項４〜６のいずれか1項記載の組成物。
【請求項８】
ブタ類動物が、分娩前3週間〜6週間の雌豚である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
毒性H3N2インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含む弱毒ブタインフルエンザの製造のための複数のベクターを含む組成物であって、前記HA cDNAが前記毒性の親ブタインフルエンザ株によってコードされるHAに対して追加のグリコシル化部位をコードし、前記追加のグリコシル化部位が、 S71N、K90N、L173TおよびP287Tであるか、または、S71N、K90N、L173T、P287TおよびK294Tであり、前記アミノ酸変化位置が、前記毒性の親株によってコードされる配列番号18に記載の配列を有するHAタンパク質に基づく、前記組成物。
【請求項１０】
HA cDNAが配列番号２２または２４のタンパク質をコードする、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
非ヒト動物にワクチン接種する方法であって、請求項４記載の組成物の少なくとも1度の投与を含む前記方法。
【請求項１２】
非ヒト動物が、分娩前3週間〜6週間の雌豚である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ワクチン未接種雌豚から生まれた子豚と比較して、得られた子豚が罹患率および／または死亡率の低下を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
インフルエンザウイルスの製造方法であって、感染性インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で請求項９又は１０に記載の組成物と細胞をin vitroで接触させることを含む前記方法。
【請求項１５】
毒性H3N2インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含む細胞であって、前記HA cDNAが前記毒性の親ブタインフルエンザ株によってコードされるHAに対して追加のグリコシル化部位をコードし、前記追加のグリコシル化部位が、S71N、K90N、L173TおよびP287Tであるか、または、S71N、K90N、L173T、P287TおよびK294Tであり、前記アミノ酸変化位置が、前記毒性の親株によってコードされる配列番号18に記載の配列を有するHAタンパク質に基づく、前記細胞。
【請求項１６】
HA cDNAが配列番号２２のタンパク質をコードする、請求項１５記載の細胞。
【請求項１７】
HA cDNAが配列番号２４のタンパク質をコードする、請求項１５記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による組み込み
本願は、2012年7月17日出願の米国仮出願USSN61/672，398に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本願に組み込まれる。
技術分野
本発明は、一般に弱毒ウイルスワクチンに関し、特にブタインフルエンザに対して幅広く安全で効果的な防御をブタ類に提供する弱毒ウイルスワクチンに関する。本発明はさらに、弱毒ウイルスの製造方法および弱毒ウイルスのビルレンスの低下に関連する核酸変異の同定にも関する。
【０００２】
従って、本発明は、本発明のウイルス、例えば弱毒生ウイルスを含む免疫原性組成物またはワクチン組成物に関する。本ウイルスはまた、組成物中で不活化されることもできるが、本ウイルスが弱毒生ブタインフルエンザであることは有利であることができる。従って、本発明はさらに、このような組成物の製造方法および／または製剤化方法、例えば、適切な培地上もしくは培地中でのウイルスの培養、増殖もしくは増加、ウイルスの採取、場合によるウイルスの不活化、ならびに場合による適切な獣医学的もしくは薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくはビヒクルおよび／またはアジュバントおよび／または安定剤との混合にも関する。従って、本発明はまた、このような組成物の製剤化における本ウイルスの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
インフルエンザウイルスは、ウイルス侵入を媒介する赤血球凝集素(HA)に対する宿主の体液性免疫を逃れるいくつかの機構を有する。ゲノムセグメントの遺伝子再集合は、抗原シフトをもたらすことができるし、変異の緩慢な蓄積は遺伝的浮動をもたらす(Desselberger U， et al. 1978， Schild G， et al. 1974)。変異HAを認識する既存の抗体の能力に影響を及ぼしうるHAの抗原エピトープにおける変異に加えて、HAのN−結合型グリコシル化における変異は、HAを取り巻くオリゴ糖層を変えることによって抗体認識のウイルス回避を促進することができる(Schulze IT， 1997)。グリカン残基は、抗体によっては、そのエピトープへの結合を妨げて、グリカン遮蔽として知られる現象によって抗体認識および免疫原性の消失をもたらすことができる(Wanzeck K， et al. 2011， Wei C-J， et al. 2010)。さらに、変異および遺伝的浮動は、グリカンによって保護されていないHAの球状頭部部位に選択的に存在する(Das SR， et al. 2010)。グリカン残基はまた、受容体結合にも影響し、その結果として、ウイルス複製キネティクスに影響を及ぼすことができる。
【０００４】
インフルエンザウイルスの進化は、しばしば、グリコシル化部位の数および位置の改変を含む(Long J， et al. 2011)。H3N2ウイルスについては、グリコシル化部位の数は、過去40年の間に2から10に増加した(4)。しかしながら、グリコシル化が増加したHAは、マウスにおけるビルレンスの低下およびウイルス適合性の低下と関連づけられている（Das SR， et al. 2011， Vigerust DJ， et al. 2007)。グリコシル化の増加によって中和抗体からHAを遮蔽することはできるが、細胞受容体に対するウイルス親和性は決まって低下する(Abe Y， et al. 2004， Das SR， et al. 2011)。また、HAまたはノイラミニダーゼ(NA)のいずれかにおける代償性変異は、受容体結合と放出活性を釣り合わせるために必要である(Wagner R， et al. 2000)。NAにおけるこれらの代償性変異は、NA阻害薬に対する自然耐性の獲得と関連づけられている(Hensley SE， et al. 2011)。
【０００５】
β、γおよびδ-クラスターのH1N1およびH1N2ウイルスならびにH3N2亜型を含むブタインフルエンザウイルスの多数の遺伝系統および抗原性の異なる系統がブタにおいて同時に循環している(Lorusso A， et al. 2012)。δ-クラスターは、元は2つのサブクラスター(δ-Iおよびδ-II)に細分されていた。しかしながら、より最近の研究によって、5つの異なる遺伝的サブクラスター(δ-A、δ-B、δ-C、δ-D、δ-E)が明らかにされ、少なくとも3つの抗原性の異なる群が示された(Hause BM， et al. 2011， Vincent AL， et al. 2009)。
死滅ウイルスワクチンは、そのワクチン株が野外のチャレンジウイルスに適合する場合は効果的であるが、インフルエンザの高い突然変異率によって、ワクチン株と循環ウイルスとの間の遺伝的および抗原的適合性を確実にするためには、煩瑣な株の変更が必要となる。さらに、ブタ類に共循環している複数の亜型および系統によって、各タイプの代表を包含するためには、しばしば5つ以上のワクチン株を必要とする。広域スペクトル免疫を誘発する単一の生ワクチンは、ブタ類の衛生プログラムに著しい進歩を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、弱毒ワクチンならびにブタインフルエンザによる感染症の治療および予防方法を提供することである。
一実施形態において、本ワクチンは、その親株に対して追加のグリコシル化部位を有するHA遺伝子を発現するように改変された弱毒インフルエンザウイルスを含む。
特定の実施形態において、HA遺伝子および／または遺伝子産物は、配列番号17と21の間、配列番号17と23の間、配列番号18と22の間または配列番号18と24の間に存在する改変と同じ改変を有する。さらに他の実施形態において、HA遺伝子および／または遺伝子産物は、5つの改変のうち少なくとも1つの改変を有する。さらに特定の実施形態において、HA遺伝子および／または遺伝子産物は、親HA遺伝子産物に対して、該改変のうちの4つまたは5つを有し、これらは+4および+5のグリコシル化部位を生じる。
【０００７】
本発明の他の目的は、本開示の弱毒インフルエンザを製造するための、逆遺伝学系に使用するcDNAおよび／またはプラスミドを提供することである。一実施形態において、該cDNAおよび／またはプラスミドの少なくとも1つは、配列番号18の配列に対してグリコシル化部位の数が増加したHA配列を含む。
特定の実施形態において、HA配列は配列番号21または23の配列である。
本発明はさらに、安全で効果的で幅広い感染防御免疫を提供する、インフルエンザの新規弱毒株に関する。該弱毒株は、親インフルエンザ株に対して、それらのHA遺伝子によってコードされる追加のグリコシル化部位および／または推定上のグリコシル化部位を有することができ、それらの存在はビルレンスの低下に関連する、
従って、本発明は、1以上の核酸配列における、野生型/親ウイルスに対する変異（単数または複数)であって、親ウイルス（野生型HAタンパク質をコードする核酸を含む）に対して変異ウイルスを弱毒化する変異（単数または複数)を含む変異ウイルスを提供する。本明細書においては、”野生型”HAタンパク質は、配列番号18の配列と比較して同じ数のグリコシル化部位および／または推定上のグリコシル化部位を有するタンパク質である。
特定の実施形態において、変異ウイルスは、配列番号21または23に示すDNA配列であって、それぞれ配列番号22または24のペプチドをコードし、毒性の野生型/親ウイルスに対して該変異ウイルスを弱毒化/無毒化するDNA配列に相当する（すなわち逆相補的であり、チミジンの代わりにウラシルを有する）vRNA核酸配列を含む。
【０００８】
本明細書において、用語”遺伝子”は広い意味で用いられ、コード配列および非コード配列（すなわち上流および下流調節配列、プロモーター、5’/3’UTR、イントロンならびにエクソン)の両方を含むものとする。遺伝子のコード配列のみについていう場合は、用語”遺伝子のコード配列”または”CDS”は、本開示を通じて同義で使用される。特定の核酸、例えば配列番号17の配列（親ウイルスcRNA”センス”鎖のDNA配列等価物）を論じる場合、当業者は、その配列から導き出せるすべての形態(mRNA、vRNA、cRNA、DNA、タンパク質など)を直ちに知るであろう。例えば、インフルエンザウイルスはマイナス一本鎖RNAウイルス(ssRNA)である。そのマイナスssRNA(本明細書において”vRNA”と定義される)は、複製するためにプラスまたはセンスRNA(本明細書において”cRNA”と定義される)に転写されなければならない。宿主細胞機構は、cRNAを用いてウイルスタンパク質およびvRNAを産生するように命じられる。当業者は、公知の遺伝コードを用いて、DNA配列からルーチンにそのvRNA、cRNAおよびペプチド配列を誘導することができる。
【０００９】
特定の実施形態において、弱毒ワクチンはアジュバントを含む。アジュバントは、弱毒ワクチン単独と比較して、誘発される免疫応答を増強および／または増加させる任意の物質であることができる。キトサンおよびその誘導体を含む粘膜アジュバントは、本開示の経口弱毒ワクチンに特に有用である。
本発明はさらに、インフルエンザに対する免疫(もしくは免疫原性)応答または感染防御応答を誘導する方法ならびにインフルエンザまたはインフルエンザによって引き起こされる病状（単数または複数)を予防または治療する方法であって、弱毒ウイルスまたは弱毒ウイルスを含む組成物をそれを必要とする動物に投与することを含む前記方法を提供する。
少なくとも弱毒インフルエンザ株および使用説明書を含むキットもまた提供される。
これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明によって開示され、またはそれらから明らかになり、かつそれらに含まれる。
最良の形態を含む、当業者への本発明の十分で実施可能な開示は、添付の図面を含む本明細書の残りの部分においてより具体的に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】逆遺伝学を用いて作成されたウイルスの遺伝子型を示す図である。
【図２】配列番号18(親インフルエンザウイルスのHAタンパク質）と配列番号22(n+5グリコシル化変異体のHAタンパク質）とのアミノ酸アラインメントを示す図である。
【図３】親および、親に対してそのHA遺伝子に1〜5の追加のグリコシル化部位を有するグリコシル化変異体インフルエンザウイルスの培養細胞の増殖を示すグラフである。
【図４】本開示の配列番号のリストを示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、微生物、例えばウイルス、例えば、インフルエンザの弱毒化に関与するヌクレオチド配列および遺伝子、そのヌクレオチド配列によってコードされる産物(例えば、タンパク質、抗原、免疫原、エピトープ)、このようなヌクレオチド配列、産物、微生物の製造方法ならびに、ワクチンもしくは免疫原性組成物の製造のための、または免疫もしくは免疫応答を誘発するための、またはベクター、例えば発現ベクター(例えばin vitroもしくはin vivo発現ベクター)としてのその使用を提供する。
微生物のヌクレオチド配列および遺伝子に変異を導入することによって、新規で自明でない弱毒変異体が作成される。これらの変異体は、高度の免疫原性を有する弱毒生免疫原性組成物または弱毒生ワクチンの製造に有用である。
変異の同定によって、新規で自明でないヌクレオチド配列および遺伝子ならびにそのヌクレオチド配列および遺伝子によってコードされる新規で自明でない遺伝子産物が提供される。
一実施形態において、本発明は、インフルエンザまたはインフルエンザによって引き起こされる疾患に対して、ブタ類において、安全で効果的な免疫応答を提供することができる弱毒高グリコシル化ブタインフルエンザ株を提供する。一実施形態において、該株は、毒性の親株に対して少なくとも1つの追加のグリコシル化部位を有するHA遺伝子をコードすることができる。
【００１２】
他の実施形態において、該弱毒株は、毒性の親株に対して4つまたは5つの追加のグリコシル化部位を有するHA遺伝子をコードすることができる。特定の実施形態において、該株のグリコシル化部位は、配列番号18の配列を有するHA遺伝子に基づくアミノ酸変化位置でS71N、K90N、L173T、P287TおよびK294Tから選択される。
一実施形態において、弱毒インフルエンザ株によって産生されるHAタンパク質は、配列番号22の配列または、以下の位置が以下のアミノ酸を有する（71N、90N、173T、287Tおよび294T）という条件で配列番号22に少なくとも90%の相同性を有する配列を有する。
他の実施形態において、該弱毒インフルエンザは、配列番号24の配列または、以下の位置が以下のアミノ酸を有する（71N、90N、173T、287T）という条件で配列番号24に少なくとも90%の相同性を有する配列を有するHAタンパク質を産生する。
他の側面において、本発明は、高グリコシル化HAタンパク質をコードする弱毒インフルエンザ株を含む免疫組成物を提供する。一実施形態において、本組成物は、さらに、薬学的もしくは獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤を含むことができる。
【００１３】
一実施形態において、本組成物は、毒性のブタインフルエンザチャレンジに対して、ブタ類において、防御免疫応答を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物はさらに、病原体以外のブタインフルエンザに関連する少なくとも1つの追加の抗原を含む。
他の実施形態において、少なくとも1つの追加の抗原は、ブタ類を感染させ、ブタ類に病気を引き起こすかまたはそれに対する感受性を引き起こすことができるM. hyo、PCV2、PRRSV、SIVまたは他の病原体あるいはそれらの組み合わせから選択される。
一実施形態において、本発明は、動物にワクチン接種する方法であって、高グリコシル化インフルエンザHAタンパク質をコードする配列を含む組成物の少なくとも1つの投与を含む前記方法を提供する。他の実施形態において、ブタ類は、分娩前約3週間〜約6週間の雌豚である。さらに他の実施形態において、ワクチン未接種雌豚から生まれた子豚と比較して、得られた子豚は罹患率および／または死亡率の低下を示すことができる。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含む弱毒ブタインフルエンザの製造のための複数のベクターを含む組成物であって、HA cDNAが、毒性の親ブタインフルエンザ株によってコードされるHAに対して追加のグリコシル化部位をコードする前記組成物を提供する。特定の一実施形態において、追加のグリコシル化部位はS71N、K90N、L173T、P287TおよびK294Tから選択され、アミノ酸変化位置は、配列番号18の配列を有するHA遺伝子に基づく。
一実施形態において、弱毒インフルエンザを製造するためのHA cDNAは配列番号22のタンパク質をコードする。他の実施形態において、HA cDNAは、配列番号24のタンパク質をコードする。
一実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスの製造方法であって、感染性インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で本発明の組成物の1つと細胞を接触させることを含む前記方法を提供する。一実施形態において、本方法はさらに、該ウイルスを単離することを含む。
他の実施形態において、本発明は、遺伝子送達ビヒクルの製造方法であって、インフルエンザウイルスを産生するのに有効な量で本発明の組成物と細胞を接触させ、該ウイルスを単離することを含む前記方法を提供する。本発明はさらに、本発明の組成物と接触される細胞を提供する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、インフルエンザウイルスHA cDNAに作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを含む弱毒ブタインフルエンザの製造のための複数のベクターを含む脊椎動物細胞であって、HA cDNAが、毒性の親ブタインフルエンザ株によってコードされるHAに対して追加のグリコシル化部位をコードする前記細胞を提供する。
本発明はさらに、抗原、免疫原およびエピトープを提供し、単離された遺伝子産物として有用な遺伝子産物を含む。
このような単離された遺伝子産物およびそのエピトープは、診断用途に有用な抗体を製造するためにも有用である。
エピトープ、抗原または免疫原を提供または製造することができるこのような遺伝子産物は、免疫原性または免疫組成物ばかりでなくワクチンにも有用である。
【００１６】
一側面において、本発明は、ヌクレオチド配列または遺伝子における弱毒変異を含むウイルスであって、前記変異が、遺伝子によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質の生物活性を改変し、前記ウイルスの弱毒化ビルレンスをもたらす前記ウイルスを提供する。
特に、本発明は、動物において免疫原性応答を誘発する弱毒ブタインフルエンザ株、特にブタ類において応答を誘発、誘導または刺激する弱毒ブタインフルエンザ株およびそれを含むワクチンを含む。
対象とする特定のブタインフルエンザ弱毒株は、毒性の親野生型株に対して、ビルレンスに関連する遺伝子の変異を有する。開示された変異を有する株に加えて、開示されたビルレンス遺伝子における任意の数の変異を有する弱毒株を本発明の実施に用いることができることは明らかであろう。
他の側面において、新規弱毒ブタインフルエンザ株は、ブタインフルエンザおよびブタインフルエンザによって引き起こされる感染症/疾患に対して安全で効果的なワクチンに製剤化される。
【００１７】
一実施形態において、ブタインフルエンザワクチンはさらにアジュバントを含む。特定の実施形態において、アジュバントは、粘膜アジュバント、例えばキトサン、メチル化キトサン、トリメチル化キトサンまたはそれらの誘導体もしくは組み合わせである。
一実施形態において、アジュバントは、H.パラスイス（H. parasuis）、クロストリジウム(clostridium)、ブタインフルエンザウイルス(SIV)、ブタサーコウイルス(PCV)、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)、マンヘミア(Mannheimia)、パスツレラ(Pasteurella)、フィストフィオウス(Histophious)、サルモネラ(Salmonella)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)またはそれらの組み合わせおよび／もしくは変異体を含む全細菌および／またはウイルスを含む。いくつかの実施形態において、アジュバントは、IgM、IgG、IgA、および／またはそれらの組み合わせの動物による産生を増加させる。
”抗原”または”免疫原”は、宿主動物における特定の免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、全生物体（死滅、弱毒化もしくは生）;生物体のサブユニットもしくは部分；免疫原性を有するインサートを含む組換えベクター；宿主動物への提示によって免疫応答を誘導することができるDNAの断片もしくはフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテンまたはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。あるいはまた、免疫原または抗原は毒素または抗毒素を含むことができる。
【００１８】
本明細書において、用語”タンパク質”、”ペプチド”、”ポリペプチド”および”ポリペプチドフラグメント”は同義で使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。該ポリマーは、直鎖または分枝鎖であることができ、修飾アミノ酸またはアミノ酸アナログを含むことができ、アミノ酸以外の化学的部分によって中断されることができる。本用語はまた、天然にまたは介入（例えばジスルフィド結合生成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変、例えば標識もしくは生体活性成分との結合）によって改変されたアミノ酸ポリマーを含む。
本明細書において、用語”免疫原性または抗原ポリペプチド”は、一度でも宿主に投与されれば、そのタンパク質に指向性を有する体液性および／または細胞性免疫応答を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性なポリペプチドを含む。好ましくは、タンパク質フラグメントは、全タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するタンパク質フラグメントである。従って、本発明に記載のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープまたは抗原決定基を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
【００１９】
本明細書において、”免疫原性”タンパク質またはポリペプチドは、該タンパク質の完全長配列、それらのアナログまたはそれらの免疫原性フラグメントを含む。”免疫原性フラグメント”とは、1以上のエピトープを含み、ゆえに前述の免疫学的応答を誘発するタンパク質のフラグメントを意味する。このようなフラグメントは、当該分野で公知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology， Vol. 66 (Glenn E. Morris， Ed.， 1996)を参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、固体担体上に多数のペプチド（タンパク質分子の部分に対応するペプチド）を同時に合成し、該ペプチドが担体に接着している間に抗体と該ペプチドを反応させることによって決定することができる。このような技術は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4，708，871号; Geysen et al.， 1984; Geysen et al.， 1986 に記載されている。同様に、配座エピトープは、例えばX線結晶学および2次元核磁気共鳴などでアミノ酸の空間的コンホメーションを決定することによって容易に同定される。例えば、前出のEpitope Mapping Protocolsを参照のこと。特に、T.パルバ（T. parva）のタンパク質に適用可能な方法が、PCT/US2004/022605に十分に記載されている（参照によりその全体が本願に組み込まれる）。
【００２０】
本明細書で述べたように、本発明は抗原ポリペプチドの活性フラグメントおよびバリアントを含む。従って、用語”免疫原性または抗原ポリペプチド”はまた、そのポリペプチドが本明細書に記載の免疫応答を生じさせる限りは、その配列に対する欠失、付加および置換を考える。用語”保存的変異”は、生物学的に類似する他の残基によるアミノ酸残基の置換あるいは、コードされるアミノ酸残基が変化しないかまたは生物学的に類似する他の残基であるような、核酸配列におけるヌクレオチドの置換を意味する。この点において、特に好ましい置換は、一般に性質が保存的である置換、すなわち、アミノ酸ファミリー内で行われる置換である。例えば、アミノ酸は一般に4つのファミリーに分類される：(1)酸性--アスパラギン酸およびグルタミン酸;(2)塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;ならびに(4)非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは芳香族アミノ酸に分類される場合がある。保存的変異の例は、疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンの1つからもう1つの疎水性残基への置換または、極性残基の1つからもう1つの極性残基への置換、例えばアルギニンからリジンへの置換、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換もしくはグルタミンからアスパラギンへの置換など；あるいは、アミノ酸の1つから構造的に関連するアミノ酸の1つへの、生物活性に大きな影響を与えない同様な保存的置換を含む。従って、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない少数のアミノ酸置換を有するが、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義の範囲内である。これらの修飾によって生じるポリペプチドのすべては本明細書に含まれる。用語”保存的変異”はまた、置換ポリペプチドに対して産生された抗体が、非置換ポリペプチドに対しても免疫応答する限り、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含む。
【００２１】
用語”エピトープ”とは、特定のB細胞および／またはT細胞が応答する抗原またはハプテンの部位のことをいう。この用語はまた、”抗原決定基”または”抗原決定部位”と同義で使用される。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が標的抗原への他の抗体の結合を遮断する能力を示す簡単なイムノアッセイにおいて同定することができる。
組成物またはワクチンに対する”免疫応答”とは、対象とする組成物またはワクチンに対する細胞性および／または抗体性免疫応答の宿主における発生である。通例、”免疫応答”は、限定するものではないが、以下の効果：対象とする組成物またはワクチンに含まれる抗原（単数または複数）に特異的な抗体、B細胞、ヘルパーT細胞および／または細胞傷害性T細胞の産生、の1以上を含む。好ましくは、宿主は、新規感染に対する抵抗性が増強され、かつ／または疾患の臨床的重症度が軽減されるような治療応答または防御免疫学的応答のいずれかを示す。このような防御は、通常、感染宿主によって示される症状および／または臨床疾患の徴候の軽減または欠如、回復期間の短縮化ならびに／または感染宿主におけるウイルス力価の低下のいずれかによって示される。
【００２２】
”動物”とは、哺乳動物、鳥などを意味する。本明細書において、動物または宿主は哺乳動物およびヒトを含む。動物は、ウマ類(例えばウマ)、イヌ科動物(例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル)、ネコ科動物(例えばライオン、トラ、イエネコ、ヤマネコ、他の大猫ならびにチーターおよびヤマネコを含む他のネコ科動物）、ヒツジ類(例えばヒツジ)、ウシ亜科動物(例えばウシ)、ブタ類(例えばブタ)、鳥類(例えばニワトリ、カモ、ガチョウ、七面鳥、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ)、霊長類(例えば原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿)、フェレット、アザラシならびに魚類からなる群から選択されることができる。用語”動物”は、新生児期、胎生期および胎児期を含むすべての発育段階の個々の動物もまた含む。
【００２３】
別途記載のない限り、本明細書において用いられるすべての学術用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。単数用語”ある(a)”、”ある（an）”および”その（the）”は、文脈から明白でない限り複数指示対象を含む。同様に、語”または（or）”は、文脈から明白でない限り”および（and）”を含むものとする。
本開示、特にそのクレームおよび／またはパラグラフにおいて、用語、例えば”含む（comprises）”、”含んだ（comprised）”、”含んでいる（comprising)”などは、米国特許法においてそれらに付与された意味を有することができ、例えばそれらは”含む（includes）”、”含んだ（included）”、”含んでいる（including）”などを意味することができる。さらに、用語、例えば”本質的に〜からなっている(consisting essentially of)”または”本質的に〜からなる(consists essentially)”は、米国特許法において与えられた意味を有する。例えばそれらは明記されていない要素を許容するが、先行技術に示されているかまたは本発明の基礎的または新規な特徴に影響を及ぼす要素を排除することに注意されたい。
【００２４】
組成物
本発明は、動物において応答を誘発、誘導または刺激する弱毒ブタインフルエンザ株および薬学的もしくは獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルを含むことができるブタインフルエンザワクチンまたは組成物に関する。
【００２５】
用語”核酸”および”ポリヌクレオチド”は、直鎖もしくは分枝鎖、一本鎖もしくは二本鎖またはそれらのハイブリッドであるRNAまたはDNAのことをいう。本用語はRNA/DNAハイブリッドもまた含む。以下は限定するものではないポリヌクレオチドの例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ、ウラシル(uracyl)、他の糖および連結基、例えばフルオロリボースおよびチオラートならびにヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列は、重合後、例えば標識成分との結合によってさらに修飾されることができる。本定義に含まれる他の種類の修飾は、キャップ、天然に存在するヌクレオチドの1以上のアナログによる置換および、タンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチドまたは固体担体にポリヌクレオチドを結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成で得ることもできるし、微生物に由来することもできる。
【００２６】
用語”遺伝子”は、生物学的機能に関連するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く用いられる。従って、遺伝子は、ゲノム配列におけるイントロンおよびエクソンまたはcDNAにおけるコード配列そのものならびに／またはそれらの発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNAもしくは機能性RNAを発現する核酸フラグメントまたは、特定のタンパク質をコードしかつ調節配列を含む核酸フラグメントのことをいう。
”単離された”生物学的成分(例えば核酸またはタンパク質または細胞小器官)は、成分が天然に存在する、生物体の細胞内の他の生物学的成分、例えば、他の染色体および染色体外のDNAおよびRNA、タンパク質ならびに細胞小器官から実質的に分離または精製された成分のことをいう。”単離された”核酸およびタンパク質は、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、組換え技術ばかりでなく、化学合成によって製造された核酸およびタンパク質もまた含む。
用語”保存的変異”は、生物学的に類似する他の残基によるアミノ酸残基の置換か、あるいはコードされるアミノ酸残基が変化しないかまたは他の生物学的に類似する残基であるような、核酸配列におけるヌクレオチドの置換を意味する。この点において、特に好ましい置換は、一般に、前述のように性質が保存的である。
【００２７】
用語”組換え”は、自然には存在しないか、または自然界には見られない配置で他のポリヌクレオチドに結合した半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
”異種”とは、比較されている実体の残りの部分とは遺伝的に異なった実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって、異なる起源に由来するプラスミドまたはベクターにポリヌクレオチドを挿入することができるが、これは異種ポリヌクレオチドである。天然コード配列から除去され、その天然配列以外のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターは異種プロモーターである。
本発明のポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば同じ転写ユニット内の追加のコード配列、調節因子、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同じまたは異なるプロモーターの制御下にある追加の転写ユニット、クローニング、発現、相同組換えおよび宿主細胞の形質転換を可能にする配列ならびに本発明の実施形態を提供するのに望ましい任意の構築物を含むことができる。
【００２８】
使用方法および製造物
本発明は、以下の方法の実施形態を含む。一実施形態において、動物にワクチン接種する方法であって、弱毒ブタインフルエンザ株および薬学的もしくは獣医学的に許容される担体、賦形剤またはビヒクルを含む組成物を動物に投与することを含む前記方法が開示される。本実施形態の一側面において、動物はイノシシ科動物である。
【００２９】
本発明の一実施形態において、少なくとも1つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を用いる、少なくとも1つの第1投与および少なくとも1つのブースター投与を含むプライム・ブーストレジメンを用いることができる。一般的には、第1投与に用いられる免疫組成物またはワクチンは、ブースターとして用いられるものとは性質が異なる。しかしながら、第1投与およびブースター投与として同じ組成物を用いることができることに注意されたい。この投与プロトコルは”プライム・ブースト”と呼ばれる。
プライム・ブーストレジメンは、少なくとも1つの共通のポリペプチドおよび／またはそれらのバリアントもしくはフラグメントを用いる、少なくとも1つのプライム投与および少なくとも1つのブースト投与を含む。プライム投与に用いられるワクチンは、後のブースターワクチンで用いられるワクチンとは性質が異なることができる。プライム投与は、1以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は、1以上の投与を含むことができる。
哺乳動物標的種のための組成物の投与容量、例えばウイルス抗原に基づくブタ類組成物の投与容量は、一般に、約0.1〜約2.0ml、約0.1〜約1.0mlおよび約0.5ml〜約1.0mlである。
【００３０】
ワクチンの有効性は、動物、例えばブタ類動物をブタインフルエンザの毒性株によってチャレンジすることによって、最終免疫化の約2〜4週間後に試験することができる。ワクチンの有効性を試験するために、相同株および異種株の両方がチャレンジに用いられる。動物は、IMもしくはSC注射、スプレー、鼻腔内、眼内、気管内および／または経口でチャレンジすることができる。チャレンジ前およびチャレンジ後に関節、肺、脳、および／または口から試料を採取することができ、ブタインフルエンザ特異的抗体の存在について分析することができる。
プライム・ブーストプロトコルに用いられる本発明の弱毒ウイルス株を含む組成物は、薬学的もしくは獣医学的に許容されるビヒクル、希釈剤または賦形剤に含まれる。本発明のプロトコルは、ブタインフルエンザから動物を保護し、かつ／または感染動物において疾患進行を予防する。
種々の投与は、好ましくは1〜6週間離して行われる。好ましい時間間隔は3〜5週間であり、一実施形態によれば最適には4週間であり、年1回のブースターもまた考えられる。動物、例えばブタは、初回投与時に少なくとも3〜4週齢であることができる。
【００３１】
本開示は例として提供されるものであって、本発明がそれに限定されないことは当業者には明らかであろう。本開示および当該技術分野における知識から、当業者は、過度の実験を要することなく、各注射プロトコルに使用される投与回数、投与経路および用量を決定することができる。
本発明の他の実施形態は、動物において、ブタインフルエンザに対して免疫応答または感染防御応答を誘発または誘導する方法を実施するためのキットであって、弱毒ブタインフルエンザ免疫組成物またはワクチンならびに動物において免疫応答を誘発するための有効量で送達する方法を実施するための使用説明書を含む前記キットである。
本発明の他の実施形態は、動物においてブタインフルエンザに対する免疫応答または感染防御応答を誘導する方法を実施するためのキットであって、本発明の弱毒ブタインフルエンザ株を含む組成物またはワクチンならびに動物において免疫応答を誘発するための有効量で送達する方法を実施するための使用説明書を含む前記キットである。
本発明のさらに他の側面は、前述の本発明によるプライム・ブーストワクチン接種のためのキットに関する。本キットは、少なくとも2つのバイアル:本発明のプライムワクチン接種のためのワクチンまたは組成物を含む第1バイアルおよび、本発明のブーストワクチン接種のためのワクチンまたは組成物を含む第2バイアル、を含むことができる。本キットは、有利には、追加のプライムワクチン接種または追加のブーストワクチン接種のための追加の第1または第2バイアルを含むことができる。
【００３２】
薬学的もしくは獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は当業者に公知である。例えば、薬学的もしくは獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は0.9%NaCl(例えば生理食塩水)溶液またはリン酸緩衝液であることができる。本発明の方法に使用することができる他の薬学的もしくは獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、限定するものではないが、ポリ-(L-グルタミン酸)またはポリビニルピロリドンを含む。薬学的もしくは獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、ベクター(または本発明のベクターからin vitroで発現されるタンパク質）の投与を容易にする任意の化合物または化合物の組み合わせであることができる。有利には、担体、ビヒクルまたは賦形剤は、トランスフェクションを容易にし、かつ／またはベクター(またはタンパク質)の保存を改善することができる。本明細書において、用量および投与容量は一般的な記述で説明されているが、当業者は、過度の実験を要することなく、本開示を読み、当該技術分野での知識と組み合わせることによって決定することもできる。
【００３３】
本発明の免疫組成物およびワクチンは、1以上のアジュバントを含むかまたは本質的にそれらからなることができる。本発明の実施に使用するための適切なアジュバントは、(1)アクリル酸もしくはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のポリマー、(2)免疫刺激配列(ISS)、例えば1以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列(Klinmanら、1996;WO98/16247)、(3)水中油型エマルション、例えばM. Powell、M. Newman(プレナムプレス1995)によって出版された“Vaccine Design， The Subunint and Adjubant Approach”の147ページに記載されているSPTエマルションおよび同書の183ページに記載されているMF59エマルション、(4)第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質、例えばDDA、(5)サイトカイン、(6)水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、(7)サポニンもしくは(8)引用され、本願に参照により組み込まれた前述の任意の文書に記載の他のアジュバント、または(9)それらの任意の組み合わせもしくは混合物である。
【００３４】
一実施形態において、アジュバントは、粘膜内層を介する吸収の改善を促進するアジュバントを含む。例には、MPL、LTK63、毒素、PLGミクロ粒子などを含む(Vajdy， M. Immunology and Cell Biology (2004) 82， 617-627)。一実施形態において、アジュバントはキトサンであることができる(Van der Lubben et al. 2001; Patel et al. 2005; Majithiya et al. 2008; 米国特許第5，980.912号)。
【００３５】
参考文献
Abe Y， Takashita E， Sugawara K， Matsuzaki Y， Muraki Y， Hongo S. 2004. Effect of the addition of oligosaccharides on the biological activities and antigenicity of influenza A/H3N2 virus hemagglutinin. J. Virology 78:9605-9611.
A  ltschul SF， Madden TL. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
Bohne-Lang A， von der Lieth CW. 2005. GlyProt: in silico glycosylation of proteins. Nucleic Acids Res. 33:W214-219.
Bragstad K， Nielsen LP， Fomsgaard A. 2008. The evolution of human influenza A viruses from 1999 to 2006: A complete genome study. Virology J. 5:40.
Cai Z， Zhang T， Wan X-F. 2010. A computational framework for influenza antigenic cartography. PLoS Computational Biology， 6(10):e1000949.
Caton AJ， Brownlee GG， Yewdell JW， Gerhard W. 1982. The antigenic structure of the influenza virus A/PR/8/34 hemagglutinin (H1 subtype). Cell 31:417-427.
Cottey R， Rowe CA， Bender BS. 2001. Influenza virus. Curr. Protoc. Immunol. 19.11:1-32.
Das SR， Hensley SE， David A， Schmidt L， Gibbs JS， Puigbo P， Ince WL， Bennick JR， Yewdell JW. 2011. Fitness costs limit influenza A virus hemagglutinin glycosylation as an immune evasion strategy. Proc. Natl. Acad. Sci. 108:E1417-E1422.
Das SR， Puigbo P， Hensley SE， Hurt DE， Bennick JR， Yewdell JW. 2010. Glycosylation focuses sequence variation in the influenza A virus H1 hemagglutinin globular domain. PLoS Pathog 6:e1001211.
Desselberger U， Nakajima K， Alfino P， Pedersen F， Haseltine W， Hannoun C， Palese P. 1978. Biochemical evidence that “new” influenza virus strains in nature may arise by recombination (reassortment). Proc. Natl. Acad. Sci. 75:3341-3345.
Hause BM， Oleson TA， Stine DL， Bey RF， Simonson RR. 2011. Genetic and antigenic characterization of recent human-like H1 (δ-cluster) swine influenza virus isolates. J. Swine Health Prod. 19:268-276.
Hause BM， Oleson TA， Bey RF， Stine DL， Simonson RR. 2010. Antigenic categorization of contemporary H3N2 swine influenza virus isolates using a high-throughput serum neutralization assay. J. Vet. Diagn. Invest. 22:352-359.
Hay AJ， Gregory V， Douglas AR， Lin YP. 2001. The evolution of human influenza viruses. Philos. T. R. Soc. B. 356:1861-1870.
Hensley SE， Das SR， Gibbs JS， Bailey AL， Schmidt LM， Bennick JR， Yewdell JW. 2011. Influenza A virus hemagglutinin antibody escape promotes neuraminidase antigenic variation and drug resistance. PLoS ONE 6:e15190.
Hoffmann E， Stech J， Guan Y， Webster RG， Perez DR. 2001. Universal primer set for the full length amplification of al influenza viruses. Arch. Virol. 146:2275-2289.
Hoffmann E， Neumann G， Kawaoka Y， Hobom G， Webster RG. 2000. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6108-6113.
Karasin AI， Carman S， Olsen CW. 2006. Identification of human H1N2 and human-swine reassortant H1N2 and H1N1 influenza A viruses among pigs in Ontario， Canada (2003-2005). J. Clin. Microbiol. 44:1123-1126.
Long J， Bushnell RV， Tobin JK， Pan K， Deem MW， Nara PL， Tobin GJ. 2011. Evolution of H3N2 influenza virus in a guinea pig model. PLoS ONE 6:e20130.
Lorusso A， Vincent AL， Gramer MR， Lager KM， Ciacci-Zanella JR. 2012. Contemporary epidemiology of North American lineage triple reassortant influenza A viruses in pigs. Curr. Top. Microbiol. Immunol. Jan. 22 [epub ahead of print].
Sali A， Potterton L. 1995. Evaluation of comparative protein modeling by MODELLER." Proteins 23: 318-326.
Schild G， Oxford J， Dowdle W， Coleman M， Pereira M， Chakraverty P. 1974. Antigenic variation in current influenza A viruses: evidence for a high frequency of antigenic ‘drift’ for the Hong Kong virus. Bull. World Health Organ. 51:1-11.
Schulze IT. 1997. Effects of glycosylation on the properties and functions of influenza virus hemagglutinin. J. Infect. Dis. 176:S24-S28
Strengell M， Ikonen N， Ziegler T， Julkunen I. 2011. Minor changes in the hemagglutinin of influenza A(H1N1)2009 virus alter its antigenic properties. PLoS ONE 6:e25848.
Sun S， Wang Q， Zhao F， Chen W， Li Z. 2011. Glycosylation site alteration in the evolution of influenza A (H1N1) viruses. PLoS ONE 6:e22844.
Sun S， Wang Q， Zhao F， Chen W， Li Z. 2012. Prediction of biological functions on glycosylation site migrations in human influenza H1N1 viruses. PLoS ONE 7:e32119.
WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance， 2002 (http://whqlibdoc.who.int/hq/2002/WHO_CDS_CSR_NCS_2002.5.pdf).
Tamura K， Peterson D， Peterson N， Stecher G， Nei M， and Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood， evolutionary distance， and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28: 2731-2739.
Vigerust DJ， Ulett KB， Boyd KL， Madsen J， Hawgood S， McCullers JA. 2007. N-linked glycosylation attenuates H3N2 influenza viruses. J. Virology 81:8593-8600.
Vincent AL， Ma W， Lager KM， Gramer MR， Richt JA， Janke BH. 2009. Characterization of a newly emerged genetic cluster of H1N1 and H1N2 swine influenza virus in the United States. Virus Genes 39:176-185.
Wagner R， Wolff T， Herwig A， Pleschka S， Klenk H-D. 2000. Interdependence of hemagglutinin glycosylation and neuraminidase as regulators of influenza virus growth: a study by reverse genetics. J. Virology 74:6316-6323.
Wanzeck K， Boyd KL， McCullers JA. 2011. Glycan shielding of the influenza virus hemagglutinin contributes to immunopathology in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183:767-773.
Wei C-J， Boyington JC， Dai K， Houser KV， Pearce MB， Kong W-P， Yang Z， Tumpey TM， Nabel GJ. 2010. Cross-neutralization of 1918 and 2009 influenza viruses: role of glycans in viral evolution and vaccine design. Sci. Trans. Med. 2:24fa21. doi:10.1126/scitranslmed.3000799.
Zhou B， Donnelly ME， Scholes DT， George KS， Hatta M， Kawaoka Y， Wentworth DE. 2009. Single-reaction genomic amplification accelerates sequencing and vaccine production for classical and swine origin human influenza A viruses. J. Virology 83:10309-10313.
【００３６】
ここで、限定するものではない以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
＜実施例＞
【実施例１】
【００３７】
高グリコシル化ブタインフルエンザウイルスの構築
材料／方法
インフルエンザ様疾患を示すブタから臨床試料(鼻腔拭取り検体または肺組織)を採取し、ウイルス単離および特性解析(ルーチン診断検査)を行った。ウイルス単離は、5%ウシ胎児血清を含有するDMEM中、37℃、5%CO2で培養したブタ精巣(ST)細胞で行った。ウイルス増殖のために、DMEMからウシ胎児血清を省いた。10%ウシ胎児血清を含有するDMEM中で293TおよびMDCK細胞を増殖させた。5x MagMax-96 Viral Isolation Kit (Life Technologies社)を用いて、感染細胞培養採取液からRNAを採取した。
【００３８】
前述のマルチセグメント逆転写PCR法を用いて完全ウイルスゲノムを増幅した(Zhou B， et al. 2009)。キットアダプターをバーコードアダプター(Ion Xpress Barcode Adaptor 1-16 Kit、Life Technologies社)に置き換えた以外は、製造業者の使用説明書(New England Biolabs社)に従って、NEBNext Fast DNA Fragmentation and Library Prep Set 4キットを用いてウイルスcDNAライブラリーを調製した。Ion Xpress Template Kit version 2.0(Life Technologies社)を用いてDNA配列決定鋳型を調製し、Ion Torrent Personal Genome Machine (Life Technologies社)を用いて配列決定した。SeqMan NGenソフトウェア(DNAStar社)を用いてコンティグをアセンブルした。BLAST解析によって、完全長HAをコードするコンティグを同定した。ClustalW法を用いて完全長HA DNA配列をアラインメントした。隣接結合法(neighbor-joining method)を用いるMEGA 5.0によって系統発生解析を行い、1000回のブートストラップ反復試験によって3つのトポロジーを立証した(Tamura K， et al. 2011)。HA遺伝子配列をアクセッション番号JQ638655-JQ638665としてGenbankに寄託した。
【００３９】
逆遺伝学
分子生物学においては、”逆遺伝学”は、クローン化したcDNA由来のゲノムを有するウイルスの作成と定義される(概説に関しては、Neumann et al.1， J. Gen. Viral.， 83:2635; 2002 を参照の事)。本研究においては、トリプルリアソータント内部遺伝子カセット（triple reassortant internal gene cassette）(TRIG)ブタインフルエンザウイルスの逆遺伝学系を作成するために、鋳型としてTRIGブタインフルエンザウイルス(A/swine/North Carolina/3793/08(H1N1))を用いた。全8セグメントをPCR増幅し、BsmBIで消化し、既述のように同様に消化したpHW2000に連結した(Hoffmann E， et al. 2001)。制限酵素消化物によってインサートを含むプラスミドを同定し、配列決定して、A/swine/North Carolina/3793/08との同一性を検証した。10-0036-2からのHAおよびNA遺伝子(配列番号7および11)もまたpHW2000にクローニングし（Hoffmann et al 2000， PNAS 97(11):6108-6113)、塩基性ポリメラーゼ2（polymerase basic 2)(PB2)、塩基性ポリメラーゼ1(polymerase basic1)(PB1)、酸性ポリメラーゼ(polymerase acid)(PA)、核タンパク質(NP)、マトリックス(M)およびA/swine/North Carolina/3793/08由来の非構造遺伝子(NS)を含むプラスミドに加えてトランスフェクトした。逆遺伝学由来の10-0036-2(RG 10-0036-2、図1)を作成した。Quik Change II部位特異的変異誘発キット(Agilent Technologies社)(表1、図2)を用いて、10-0036-2からのHA遺伝子を含むプラスミドに部位特異的変異誘発を行い、追加の1-5N−結合型グリコシル化部位を有する変異体を作成した。N-X-S/T（式中、Nはアミノ酸のアスパラギンであり、Xは任意のアミノ酸でありS/Tはセリンまたはトレオニンである）のN−結合型グリコシル化モチーフ上に位置するアスパラギン(N)残基においてグリカンがタンパク質に付加される。
【表１】
0006467672.tif 000002
【００４０】
組換えウイルスのレスキューは既述のように行った(Hoffmann E，et al.2000)。手短かに言えば、トランスフェクションのおおよそ18時間前に、6-ウェルプレートにおいて、5%FBSを含むOpti-MEM I中で293TおよびMDCK細胞（293TおよびMDCKをそれぞれおおよそ1x106細胞）を共培養した。8つのプラスミドのそれぞれ100ナノグラムをOpti-MEM I 100μL中にプールし、リポフェクタミン(Invitrogen社)3μLを含むOpti-MEM 100μLと混合し、室温で15分間インキュベートし、次いでOpti-MEM Iで1mLに希釈し、6-ウェルプレートのウェルの1つに移した。37℃、5%CO2で6時間プレートをインキュベートし、次いでトランスフェクション混合物をOpti-MEM Iで置換した。トランスフェクションの24時間後に、6-ウェルプレートの集密的MDCK細胞に1.5mLを移し、TPCK処理トリプシン1μg/mLを含むDMEM1.5mLを加えた。感染5日後にウイルスを採取し、HAアッセイによってそれらの力価を測定した。レスキューされたウイルスのHA遺伝子を配列決定し、正確な配列を確かめた。
【００４１】
結果
予測されるN−結合型グリコシル化部位(N-X-S/T)の遺伝子解析によって、ウイルス10-0036-2に関して、N28、N40、N104、N142、N176、N303、N497およびN556の部位が見出された。HAの球状頭部部位に追加の1-5N−結合型グリコシル化部位を加えるために部位特異的変異誘発を用いた(表1)。細胞培養物からのウイルスレスキューに続いて、ST細胞での増殖研究で変異ウイルスを特性解析した。弱毒ウイルスは、多くの場合、in vitroで増殖速度および力価の低下を示すため、増殖研究を行った。4または5個の追加のN−結合型グリコシル化部位を有する変異ウイルスは、このような増殖欠損を示すため、追加のグリコシル化によってウイルスが弱毒化されたことが示唆された。次いで、in vivoでこれらのビルレンスを評価し、これらの変異ウイルスに対する免疫応答を解析するために、ブタにおいてこれらの弱毒ウイルスを評価した。
【実施例２】
【００４２】
ブタにおける弱毒ブタインフルエンザワクチンの有効性
材料および方法
63週齢のハイヘルス(high health)ブタ(IDEXX FlockChek ELISAによって、SIV血清反応陰性であることが確定された）を15匹の4群に分割して別々の部屋に入れた。0日目(d0)に、6.0 TCID50/mLウイルス2mLをブタの鼻腔内に接種した。第1群は、細胞培養培地(DMEM)を感染させたモックであった。第2群には、10-0036-2 n+5を投与した。第3群には、10-0036-2 n+4(4つの追加のグリコシル化部位を有する変異体；n+5に類似するが、変異A881C[K294T]を欠く）を投与した。第4群には、逆遺伝学を作成した10-0036-2親(変異なし)を投与した。0日目に、ブタから拭取り検体(鼻腔)を採取し、SIV検出のために試料をQPCRにかけて、活動性感染のないことを確かめた。結果を表2にまとめる。表2および3については、異なる文字を有する群は、統計的有意差のある平均値を有する(P<0.05)。例えば”A”は、”B”との間に統計的有意差があり、”BC”は、”A”との間に統計的有意差があるが、”B”または”C”との間には統計的有意差がない。
【表２】
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【００４３】
1日目、3日目および5日目に鼻腔拭取り検体を採取した。5日目に、各群からのブタを安楽死させ、肺試料を採取した。1日目の拭取り検体をQPCRで分析した。3日目および5日目の拭取り検体ならびに肺試料をSIVに関して滴定した。組織病理学的検討およびIHCのために、肺をUniversity Diagnostic labに送った。上記のように、21日目にブタにワクチン再接種をした。4または5のさらなるN−結合型グリコシル化部位を含む変異体は、弱毒化されており、ブタに対して非病原性であり、in vitro増殖研究と一致することをこれらの結果は示している。鼻腔拭取り検体の滴定はこれらのウイルスがin vivoで複製できることを示唆した。しかしながら、肺におけるウイルスの非存在および肺損傷の欠如は、複製が上気道に限定されていることを示唆している。温度感受性を付与する他のインフルエンザ遺伝子における変異は、上気道への感染症を限定することが示されており、これはヒト弱毒生インフルエンザワクチンFluMist（登録商標）の基礎となっている。
【００４４】
31日目に、野外分離株12-1110-1(H3N2)でブタをチャレンジした。チャレンジ試験の結果を表3にまとめた。チャレンジ（Richt et al 2006， J.Virology 80(22):11009-11018 と同様に行った）のために、鼻腔内に4.6 TCID50/mLを2mL送達した。31目のチャレンジ前に、血液および鼻腔拭取り検体を採取した。0日目および1日目に鼻腔拭取り検体を採取し、QPCRによって分析した。3日目および5日目に鼻腔拭取り検体を採取し、滴定によってSIV力価を測定した。5日目にすべてのブタを安楽死させ、滴定によって肺試料を分析した。肺試料は上記の様に分析した。
【表３】
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【００４５】
n+4またはn+5変異体をワクチン接種されたブタは、滴定およびIHCにおいて肺でのウイルスが欠如していることならびに肺病変の根拠のないことから明らかなように、疾患から防御されていたことをこれらの結果は示している。ナイーブ(陰性対照)ブタは、H3N2チャレンジウイルスに容易に感染し、古典的インフルエンザ疾患を示した。あらかじめ親ウイルス10-0036-2に感染させたブタもまた、H3N2チャレンジから防御された。
【００４６】
これまで、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、それらの多くの見かけの変形が可能であるため、上記パラグラフによって定義される本発明が、上記の説明で述べた特定の詳細に限定されるべきではないことが理解されなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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