(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する、α−グルコシダーゼであって、
α−グルコシダーゼが、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を有しており、
アミノ酸配列中にＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＹＮＲからなる配列を含有する、上記α−グルコシダーゼ。
【請求項２】
マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用するという基質特異性を有し、
以下の酵素化学的性質： 
（ａ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５０００ダルトンおよび７６０００ダルトン；
（ｂ）等電点：ｐＩ４．９〜５．５（中心値５．２）；
（ｃ）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（ｄ）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（ｅ）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０〜１０．０では初期活性の９０％以上の残存；
を有する、請求項１に記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項３】
マルトペンタオースに作用して６糖以上の連続するα−１，６結合を含有する糖質を生成する、請求項１または２に記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
を含有するアスペルギルス属菌を培養して得られる培養物から採取したα−グルコシダーゼであって、
ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＹＮＲからなる配列を含有する、上記α−グルコシダーゼ。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
を含有する組換えベクターであって、
前記核酸がコードするタンパク質のアミノ酸配列中に、ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＹＮＲからなる配列を含有する、上記組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取したα−グルコシダーゼ。
【請求項８】
連続するα−１，６結合を有する糖質が、３つ以上の連続するα−１，６結合を有しており、かつ、ｐＨ６．０で１時間、５０℃に保持した場合、初期活性の９０％以上が残存する、請求項１〜４および７のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
【請求項９】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつα型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
を含有するアスペルギルス属菌を培養して培養物を得る工程と、該培養物からα−グルコシダーゼを採取する工程と、を含む、α−グルコシダーゼの製造方法であって、
前記核酸がコードするタンパク質のアミノ酸配列中に、ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＹＮＲからなる配列を含有する、上記方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
を含有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体を培養して培養物を得る工程と、該培養物からα−グルコシダーゼを採取する工程と、を含む、α−グルコシダーゼの製造方法であって、
前記核酸がコードするタンパク質のアミノ酸配列中に、ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＹＮＲからなる配列を含有する、上記方法。
【請求項１１】
α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質にα−グルコシダーゼを作用させて、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成させることを含む、糖質の製造方法であって、
α−グルコシダーゼが、（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または、（２）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、を有しており、
α−グルコシダーゼが、アミノ酸配列中にＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ３［式中、Ｘ１およびＸ２は任意のアミノ酸、Ｘ３はヒスチジン以外のアミノ酸である］からなる配列を含有し、
α−グルコシダーゼが、α型のオリゴ糖類およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成するものである、上記方法。
【請求項１２】
α−グルコシダーゼが、マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用するという基質特異性を有し、
α−グルコシダーゼが、以下の酵素化学的性質：
（ａ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５０００ダルトンおよび７６０００ダルトン；
（ｂ）等電点：ｐＩ４．９〜５．５（中心値５．２）；
（ｃ）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（ｄ）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（ｅ）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０〜１０．０では初期活性の９０％以上の残存；
を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｘ１はチロシンであり、Ｘ２はアスパラギンである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
α−グルコシダーゼがアスペルギルス属菌由来である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
α−グルコシダーゼがアスペルギルス・ソヤ由来またはアスペルギルス・オリゼー由来である、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
α−グルコシダーゼが、マルトペンタオースに作用して６糖以上の連続するα−１，６結合を有する糖質を生成するものである、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
連続するα−１，６結合を有する糖質が、３つ以上の連続するα−１，６結合を有しており、かつ、α−グルコシダーゼをｐＨ６．０で１時間、５０℃に保持した場合、初期活性の９０％以上が残存する、請求項１１〜１６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なα−グルコシダーゼに関する。さらに詳しくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来の新規なα−グルコシダーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
α−グルコシダーゼは、糖のα−１，４結合に作用して加水分解反応を触媒する酵素であり、細菌、糸状菌等の微生物から、動植物まで広く天然に存在する。また、α−グルコシダーゼは糖転移反応をも触媒し、グルコシド結合を有するオリゴ糖類、多糖類の生成に関与する。【０００３】
糖転移活性を有するα−グルコシダーゼとしては、たとえば、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のα−グルコシダーゼであってイソマルトースおよびパノースを生成させるもの（非特許文献１）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属する真菌由来のα−グルコシダーゼであってα−１，３結合を有する糖質を生成するもの（特許文献１）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属由来のα−グルコシダーゼであってα−１，２結合を有する糖質とα−１，３結合を有する糖質を生成するもの（特許文献２）、およびラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）由来のα−グルコシダーゼであってα−１，６結合を有するイソマルトースを生成させるもの（特許文献３）、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のα−グルコシダーゼであって、α−１，６転移活性を有し、基質よりも重合度が１つ大きい糖質を生成するもの（非特許文献２）等がある。【０００４】
連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する酵素としては、主に細菌由来の酵素が知られており、デキストリンデキストラナーゼ（特許文献４、５、６、７）、α−グルカノトランスフェラーゼ（特許文献８）、デキストラングルカナーゼ（特許文献９）等がある。しかしながら、いずれも耐熱性が低く、工業的な糖質の製造に使用するためには不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−５９５５９
【特許文献２】特許第４８３００３１号公報
【特許文献３】特開２０１１−２２３９１０
【特許文献４】特開平４−２９３４９３
【特許文献５】特開平５−２３６９８２
【特許文献６】特開２００１−２５８５８９
【特許文献７】ＷＯ２００６／０５４４７４
【特許文献８】特表２０１２−５２５８４０
【特許文献９】特開２０１２−９５６０６
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology, March 2002, 68:1250-1256
【非特許文献２】Carbohydrate Research, 1989, 185:147-162
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性が高く、かつ、高い耐熱性を有する新規なα−グルコシダーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌の一種であるアスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）からα−グルコシダーゼを見出した。そして、このα−グルコシダーゼが種々のα型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類に作用して、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する高い活性を有することを見出した。さらに、このα−グルコシダーゼを５０℃において１時間保持しても、活性の９０％以上が残存するという高い耐熱性を示すことを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、限定されるものではないが、以下に関する。
［１］
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα−グルコシダーゼであって、以下の酵素化学的性質：
（１）作用：α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する；
を有し、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する、α−グルコシダーゼ。
［２］
以下の酵素化学的性質をさらに有する、［１］に記載のα−グルコシダーゼ：
（３）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９〜５．５（中心値５．２）；
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０〜１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
［３］
以下の（ａ）または（ｂ）である、［１］または［２］に記載のα−グルコシダーゼ：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる、α−グルコシダーゼ；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、α−グルコシダーゼ。
［４］
以下の（ａ）または（ｂ）である、α−グルコシダーゼ：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する、α−グルコシダーゼ；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する、α−グルコシダーゼ。
［５］
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸を含有するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌を培養して得られる培養物から採取したα−グルコシダーゼ：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｅ）配列番号２からなる塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
［６］
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸を含有する組換えベクター：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｅ）配列番号２からなる塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
［７］
［６］に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
［８］
［７］に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から採取したα−グルコシダーゼ。
［９］
α−グルコシダーゼをコードするアミノ酸配列中にＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ３からなる配列を含有し、ここでＸ１Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はヒスチジン以外のアミノ酸である、［１］〜［５］および［８］のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
［１０］
Ｘ１はチロシンであり、Ｘ２はアスパラギンである、［９］に記載のα−グルコシダーゼ。
［１１］
連続するα−１，６結合を有する糖質が、３つ以上の連続するα−１，６結合を有する、［１］〜［５］および［８］〜［１０］のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
［１２］
α型のオリゴ糖類がマルトース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、およびγ−サイクロデキストリンからなる群より選択され、α型の多糖類がアミロース、可溶性澱粉、グリコーゲン、およびデキストランからなる群より選択される、［１］〜［５］および［８］〜［１１］のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
［１３］
アスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌａｖｉ）に属するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌から生産される、［１］〜［５］および［８］〜［１２］のいずれかに記載のα−グルコシダーゼ。
［１４］
アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）から生産される、［１３］に記載のα−グルコシダーゼ。
［１５］
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸を含有するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌を培養して培養物を得る工程と、該培養物からα−グルコシダーゼを採取する工程とを含む、α−グルコシダーゼの製造方法：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｅ）配列番号２からなる塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
［１６］
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体を培養して培養物を得る工程と、該培養物からα−グルコシダーゼを採取する工程とを含む、α−グルコシダーゼの製造方法：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｅ）配列番号２からなる塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
［１７］
α−グルコシダーゼをコードするアミノ酸配列中にＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ３からなる配列を含有し、ここでＸ１Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はヒスチジン以外のアミノ酸である、［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
Ｘ１はチロシンであり、Ｘ２はアスパラギンである、［１７］に記載の方法。
［１９］
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌または形質転換体が、アスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌａｖｉ）に属するアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌である、［１５］〜［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌または形質転換体が、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）若しくはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）である、［１９］に記載の方法。
［２１］
［１］〜［５］および［８］〜［１４］のいずれかに記載のα−グルコシダーゼを、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用させることを含む、糖質の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のα−グルコシダーゼは、種々の糖質に作用して、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する高い活性を有する。α−１，６結合を有する糖質は消化が緩やかであることが知られており、α−１，６結合の長さが長い糖質は消化されにくいと考えられる（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ第４巻２７９ページ１９５６年）。そのため、本発明の酵素を用いると、摂取後の消化が緩やかで、急激な血糖値の上昇を招かない糖質を得ることができると考えられる。また、α−１，６結合を有する糖質は、一部が小腸では消化吸収されずに、大腸まで到達し、ビフィズス菌などの腸内細菌に資化されることが知られているため、本発明の酵素を用いると、腸内菌叢の改善効果を有する糖質を得ることができると考えられる。【００１１】
さらに、α−１，６転移をするα−グルコシダーゼを摂取することで、糖の吸収を抑制する、腸内ビフィズス菌の増殖を促進する、Bacteroides/Firmicutes比が増加し肥満状態が軽減することが報告されている（BMC Gastroenterology第13巻8１ページ2013年）。従って本発明のα−グルコシダーをサプリメント等として、直接摂取することも可能である。【００１２】
また、本発明のα−グルコシダーゼは、５０℃という高温においても高い残存活性を維持することができるため、高温での工業的な糖質の製造を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株由来推定α−グルコシダーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドベクターの構造を示す。
【図２】図２は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの精製画分をＮａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果（左のパネル）およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果（右のパネル）を示す。
【図３】図３は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの酵素活性に対する温度の影響を示す。
【図４】図４は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの酵素活性に対するｐＨの影響を示す。
【図５】図５は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの酵素活性の温度安定性を示す。
【図６】図６は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの酵素活性のｐＨ安定性を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の重合度分布の経時変化を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の２、３、４糖成分の異性体組成の経時変化を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株から特許第４８３００３１号に記載の方法で取得した粗酵素液をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の重合度分布の経時変化を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株から特許第４８３００３１号に記載の方法で取得した粗酵素液をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の２、３、４糖成分の異性体組成の経時変化を示す。
【図９】図９は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応後７２時間における反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを示す。
【図１０】図１０は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応後７２時間における反応生成物の異性体組成のクロマトグラムを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の重合度分布の経時変化を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの反応生成物の２、３、４糖成分の異性体組成の経時変化を示す。
【図１２】図１２は、各酵素をマルトースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量の経時変化を示す。
【図１３】図１３は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトースに７２時間反応させ、得られた反応生成物から５糖成分を分画し、Ｈ−ＮＭＲで解析した結果を示す。
【図１４】図１４は、ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼをマルトペンタオースに反応させた場合の、反応後７２時間における反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを示す。
【図１５】図１５は、各酵素をマルトペンタオースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの６糖以上成分含有量の経時変化を示す。
【図１６】図１６は、各酵素をマルトペンタオースに反応させた場合の、反応開始後の７２時間までの６糖以上の連続α−１，６結合含有量の経時変化を示す。
【図１７】図１７は、ＧＨ３１ファミリーに属する種々の酵素の、活性中心付近の保存配列から３残基下流までの配列を比較したものを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜本発明のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌由来のα−グルコシダーゼ＞
本発明は、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成することのできる耐熱性のα−グルコシダーゼ、およびその製造方法に関する。
【００１５】
本発明において、α型のオリゴ糖類とは、分子内にα−グルコシド結合を有する２糖〜９糖の糖質をいう。α型のオリゴ糖類の例としては、マルトース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、トレハロース、マルトトリオース、パノース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、α−サイクロデキストリン、β−サイクロデキストリン、γ−サイクロデキストリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明において、α型の多糖類とは、分子内にα−グルコシド結合を有する１０糖以上の糖質をいう。α型の多糖類の例としてはグリコーゲン、デキストラン、アミロース、可溶性澱粉等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明のα−グルコシダーゼは、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成することができる。連続するα−１，６結合を有する糖質とは、分子内にα−１，６結合を連続して２個所以上含む糖質をいい、α−１，６結合のみからなる糖質のほか、α−１，６結合とそれ以外の結合とからなる糖質も含む。糖質が連続するα−１，６結合を有するかどうかは、たとえば、デキストラナーゼ分解による評価法、ＮＭＲ分析法、メチル化分析法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第５５巻  第２０５項  １９６４年）等によって判断することができる。具体的には、実施例に示す方法により、糖質が連続するα−１，６結合を有するかどうかを判断することができる。本発明のα−グルコシダーゼは、４糖以上の糖質であって３つ以上の連続するα−１，６結合を有する糖質を生成することもできる。また、本発明のα−グルコシダーゼは、マルトペンタオースに作用させると、６糖以上の連続するα−１，６結合の含有量が５％以上、より好ましくは８％以上、さらに好ましくは１０%以上である糖質を生成することができる。
【００１８】
本発明のα−グルコシダーゼは、５０℃で１時間保持しても９０％以上の残存活性を有する耐熱酵素である。
【００１９】
本発明のα−グルコシダーゼは、たとえばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する糸状菌（以下、単にアスペルギルス属菌と表記する）から、以下の酵素化学的性質を有する酵素として得ることができる：
（１）作用：α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用し、連続するα１，６結合を有する糖質を生成する；
（２）基質特異性：マルトース、イソマルトース、マルトトリオース、イソマルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、アミロース、可溶性澱粉、デキストランに作用する。
【００２０】
本発明のα−グルコシダーゼは、以下の酵素化学的性質をさらに有する酵素であってもよい：
（３）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、６５，０００ダルトンおよび７６，０００ダルトン；
（４）等電点：ｐＩ４．９〜５．５（中心値５．２）；
（５）至適温度：ｐＨ６．０、３０分間反応で、５５℃；
（６）至適ｐＨ：４０℃、３０分間反応で、ｐＨ５．５；
（７）温度安定性：ｐＨ６．０、１時間保持で、５０℃では初期活性の９０％以上の残存；
（８）ｐＨ安定性：４℃、２４時間保持で、ｐＨ６．０〜１０．０では初期活性の９０％以上の残存。
【００２１】
本発明のα−グルコシダーゼを得るためのアスペルギルス属菌としては、アスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌａｖｉ）に属するアスペルギルス属菌を好適に用いることができる。アスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌａｖｉ）に属するアスペルギルス属菌としては、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）等を好適に用いることができる。また、本発明のα−グルコシダーゼを得るためのアスペルギルス属菌として、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）も好適に用いることができる。
【００２２】
上記のアスペルギルス属菌を、液体培養および固体培養等の公知の培養方法を用いて培養し、その培養物から公知の方法によってα−グルコシダーゼ活性を有する酵素を採取することで、本発明のα−グルコシダーゼを得ることができる。
【００２３】
アスペルギルス属菌の培養に際して用いられる培地の炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、ショ糖、乳糖、澱粉、グリセリン、デキストリン、レシチン等が、単独で又は組み合わせて用いられ、また、窒素源としては、有機および無機の窒素源の何れもが利用可能であり、そのうち、有機窒素源としては、例えば、ペプトン、酵母エキス、大豆、きなこ、米ぬか、コーンスティープリカー、肉エキス、カゼイン、アミノ酸等が用いられ、一方、無機窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸二アンモニウム、塩化アンモニウム等が用いられることとなる。更に、そのような培地に添加される無機塩や微量栄養素としては、例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、カルシウム、マンガンの塩類の他、ビタミン等を挙げることができる。また、上記の各種成分を含有する培地成分として小麦ふすま等の天然物を用いることも可能である。
【００２４】
アスペルギルス属菌の培養は、一般に１０〜４０℃の温度で行なわれるが、好ましくは２５〜３０℃の培養温度が有利に採用され、更に、培地ｐＨは２．５〜８．０であれば良い。そして、必要な培養期間は、菌体濃度、培地ｐＨ、培地温度、培地の構成等によって異なるが、通常、３日〜９日程度であり、目的物であるα−グルコシダーゼが最大に達した頃に、その培養が停止される。
【００２５】
このようにして、アスペルギルス属菌を培養した後、本発明のα−グルコシダーゼを回収する。本発明のα−グルコシダーゼの活性は、培養物の菌体と培地の両方に認められ、公知の方法によって精製して利用することができる。一例として、培養液の処理物を濃縮した粗酵素液を、カラムクロマトグラフィー等に供してグルコシダーゼ活性の高い画分を回収することによって精製し、続いて、精製画分をＮａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（たとえばＧＥヘルスケア社製「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供して単一バンドを回収して精製することにより、単一の精製されたα−グルコシダーゼを得ることができる。
【００２６】
＜本発明のα−グルコシダーゼのアミノ酸配列＞
本発明はまた、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、上記の酵素化学的性質を有するα−グルコシダーゼを提供する。また、本発明は、α−グルコシダーゼであって、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する、α−グルコシダーゼも提供する。
【００２７】
具体的には、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％、９０％、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは、９７％（例えば、９８％、さらには、９９％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
【００２８】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）等があげられ、デフォルトのパラメーターを用いることができる。また、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、「Altschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）」に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894）。また、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ （ゼネティックス社製）、ＤＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト社製）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ社製）等のプログラムを用いて決定することもできる。
【００２９】
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（WoottonおよびFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ClaverieおよびStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（KarlinおよびAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
【００３０】
配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、公知の手法によって適宜調製することができるが、たとえば配列番号３で示されるアミノ酸配列に１若しくは複数個（例えば１〜１９０個、１〜９０個、１〜５０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個）のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加して調製することができる。
【００３１】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
【００３２】
保存的置換は、一般的には、生物学的合成や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
【００３３】
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニンおよびシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸および２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギンおよびグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸および２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリンおよび４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニンおよびホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニンおよびチロシン
【００３４】
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
【００３５】
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
【００３６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸およびその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. GolubおよびD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
【００３７】
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、およびその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
【００３８】
上述したように、配列番号３で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.」(Cold Spring Harbor Press (2001))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997)、「Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6」等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００３９】
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発法の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、および遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
【００４０】
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法および当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
【００４１】
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したα−グルコシダーゼの適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のα−グルコシダーゼの生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができる。タンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている残基および領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
【００４２】
また、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、α−グルコシダーゼ活性を有するアスペルギルス属菌等の微生物から単離してもよいし、公開されている配列データベース（たとえばNCBIデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いて配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する微生物を検索し、その微生物から単離してもよい。また、後述するように、α−グルコシダーゼをコードする核酸をアスペルギルス属菌からクローニングし、その核酸をもとに、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を得てもよい。さらに、後述するように、公開されている配列データベース（たとえばNCBIデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を用いて、α−グルコシダーゼをコードする核酸を検索し、その核酸をもとに、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質を得てもよい。
【００４３】
本発明者らは、本発明のα−グルコシダーゼをコードするアミノ酸配列中に「ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ3」で示される配列を有し、ここでＸ１Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ3はヒスチジン以外のアミノ酸、好ましくはアルギニンであることが、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を示すために重要であることを見出した。ここで、Ｘ１はチロシンであり、Ｘ２はアスパラギンであることが好ましい。したがって、本発明の変異体は、上記の配列が保存され、かつ、本発明の上記活性が損なわれない限り、いかなる変異体でもよい。
【００４４】
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造およびアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
【００４５】
＜本発明のα−グルコシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸＞
本発明はまた、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸を含有するアスペルギルス属菌を培養して得られる培養物から採取したα−グルコシダーゼを提供する：
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｄ）配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸；
（ｅ）配列番号２からなる塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸。
【００４６】
以下、詳細に説明する。
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は上記のとおりである。当業者は、このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列を適宜決定することができる。
（ｂ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列において１〜１９０個、１〜９０個、１〜５０個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアミノ酸配列であってよい。当業者は、このようなアミノ酸配列をコードする塩基配列を適宜決定することができる。
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【００４７】
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリー等から得ることができる。
【００４８】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.」(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、「DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.」(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
【００４９】
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件によって決定される。
【００５０】
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーションおよび／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
【００５１】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社製）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
【００５２】
（ｄ）配列番号２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
ハイブリダイズの条件は上記のとおりである。
【００５３】
（ｅ）配列番号２からなる塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用して連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【００５４】
上記塩基配列としては、配列番号２からなる塩基配列と７５％（例えば、８０％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
【００５５】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html）から利用できるＢＬＡＳＴＮプログラム(Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン２．２．７又はＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム等があげられる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト（http://blast.wustl.edu）に記載されているものを用いることができる。
【００５６】
上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
【００５７】
例えば、ｐＢｌｕｅ−ＳｃｒｉｐｔＴＭＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ社製）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（クロンテック社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号２等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができる。そして、アスペルギルス属菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.」(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃
サイクル数：１０回以上
【００５８】
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ社製)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN社製)、ExoSAP-IT（GEヘルスケア社製）等のキットを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ社製）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN社製)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
【００５９】
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
【００６０】
＜本発明のα−グルコシダーゼ発現用ベクター構築および形質転換体の作製＞
本発明はまた、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかである核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明はさらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体を提供する。本発明はさらに、上記形質転換体を培養して得られる培養物から採取したα−グルコシダーゼを提供する。
【００６１】
このような組換えベクターおよび形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のα−グルコシダーゼをコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後の塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。この塩基配列断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、α−グルコシダーゼ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。また、市販のキット、たとえばＩｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、組換えベクターを構築することもできる。その場合、たとえば、高発現プロモーターとしてアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、ターミネーターとして本酵素の遺伝子配列の終始コドンより下流３００ｂｐの領域とともに、制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIで消化したｐＰＴＲII（タカラバイオ社製）に導入して、組換えベクターを構築することができる。
【００６２】
このとき、発現ベクターおよび宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌としては、アスペルギルス属菌を初めとする糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌やバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｒｉｓ）等があげられる。さらに植物としては、シロイヌナズナ、イネ等が挙げられる。
【００６３】
糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、プロトプラスト−ＰＥＧ法（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第５１巻  ２５４９ページ  １９８７年）、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法、核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【００６４】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
【００６５】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【００６６】
＜本発明のα−グルコシダーゼの製造方法＞
本発明は、上記α−グルコシダーゼをコードする塩基配列を含む核酸を含有するアスペルギルス属菌を培養して得られる培養物から、α−グルコシダーゼを製造する方法を提供する。また、本発明は、上記α−グルコシダーゼをコードする塩基配列を含む核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体を培養して得られる培養物から、α−グルコシダーゼを製造する方法を提供する。
【００６７】
具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
【００６８】
培養に用いる培地は、適当なｐＨおよび浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、天然のアスペルギルス属菌、形質転換したアスペルギルス属菌、または酵母を培養する場合は、ＹＰＤ培地、ＹＰＤ５培地、ＳＣ−Ｔｒｐ培地、ツァペック  ドックス培地、または小麦ふすま等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成として、ＹＰＤ培地を例示する：１リットル当たり、酵母エキス１０グラム、ペプトン２０グラム、グルコース２０グラム。液体培地に微生物を植菌して培養してもよく、必要に応じて寒天等を添加した固形培地または半固形培地に微生物を植菌して培養してもよい。
【００６９】
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよい。
【００７０】
以下に、本発明のα−グルコシダーゼの製造方法として、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）を用いる場合を例示して説明する。すなわち、滅菌した小麦ふすまにアスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）の前培養液を添加し、３０℃で４日間、固体培養を行う。その後、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で小麦ふすまを洗浄し、ミラクロス（メルク・ミリポア社製）による濾過、３，５００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離後、上清を回収し、粗酵素液を得る。この粗酵素液をそのまま本発明のα−グルコシダーゼとして用いてもよいし、適宜精製したものを本発明のα−グルコシダーゼとして用いてもよい。
【００７１】
＜本発明のα−グルコシダーゼを用いた糖質の製造方法＞
本発明は、上記α−グルコシダーゼを、α型のオリゴ糖類、およびα型の多糖類からなる群より選択される糖質に作用させることを含む、糖質の製造方法にも関する。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。なお、本発明は、下記実施例に記載の範囲に限定されるものではない。【００７３】
１）酵素活性の分析方法
＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞
酵素のα―グルコシダーゼ活性は、マルトースを基質とした加水分解活性にて評価した。【００７４】
マルトースを基質とした加水分解活性は、以下のように分析した。２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した２０ｍＭ  マルトース  ５０μLと、同緩衝液で希釈した酵素溶液５０μLとを混合し、４０℃で３０分間反応させた後、１０％シュウ酸溶液を１μL添加し１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。反応液に生成したグルコース量をグルコースCIIテストワコー（和光純薬工業社製）にて分析した。１分間に１μｍｏｌのマルトースを分解する酵素量を１Ｕと定義した。【００７５】
２）酵素を各種基質に作用させた際の反応生成物の分析方法
＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞
反応生成物の重合度（ＤＰ）は、反応液を以下の条件でゲルろ過カラムにより分析した。
ＨＰＬＣ分析条件  ：
カラム：  ＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＫ０４Ｓ（三菱化学社製）
カラム温度  ：  ６５℃
移動層組成  ：  超純水
検出器  ：  ＲＩ（示差屈折検出器）
流速  ：  ０．３５ｍＬ／分【００７６】
＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞
反応生成物の２、３、４糖成分中の、α−１，２、α−１，３、α−１，４、α−１，６結合を有するオリゴ糖の組成は、反応液を以下の条件でアミノカラムにより分析した。【００７７】
各ピークは、あらかじめ同条件で分析した標準糖の溶出時間と比較して同定し、ピーク面積より生成量を算出した。
標準糖：  
２糖類のマルトース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトースは市販試薬を用いた。【００７８】
３糖類のマルトトリオース、イソマルトトリオース、パノースは市販試薬を用い、３２−Ｏ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ｎｉｇｅｒｏｓｅ、３２−Ｏ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−ｍａｌｔｏｓｅは（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  第１７００巻  １８９ページ  ２００４年）を参考に同定した。【００７９】
４糖類のマルトテトラオース、イソマルトテトラオースは市販試薬を用い、イソマルトトリオシルグルコースは（Ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  第５３巻  ２１５ページ  ２００６年）を参考に、３２−Ｏ−α−ｎｉｇｅｒｏｓｙｌ−ｍａｌｔｏｓｅ、３２−Ｏ−α−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｙｌ−ｍａｌｔｏｓｅ、４２−Ｏ−α−Ｄ−ｎｉｇｅｒｏｓｙｌ−ｍａｌｔｏｓｅは（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  第１７００巻  １８９ページ  ２００４年）を参考に同定した。
ＨＰＬＣ分析条件  ：
カラム：  Ｕｎｉｓｏｎ  ＵＫ−Ａｍｉｎｏ  ２５０×３ｍｍ  （インタクト社製）
カラム温度  ：  ５０℃
溶媒グラディエント：【００８０】
【表１】
0006469127.tif 000002
検出器  ：  ＮＱＡＤ検出器（ＱＵＡＮＴ社製）
流速  ：  ０．４ｍＬ／分【００８１】
＜反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析方法＞
反応生成物の連続α−１，６結合含有量は、デキストラナーゼ分解による簡易評価法により分析した。【００８２】
デキストラナーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム社製）は連続α−１，６結合糖質であるデキストランを分解する酵素として知られている。デキストラナーゼＬ「アマノ」の生産菌である糸状菌由来のデキストラナーゼは、デキストランを分解しイソマルトース、イソマルトトリオースと少量のグルコースを主に生成することが知られている（ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＲＥＶＩＥＷＳ  第６９巻  ３０６ページ  ２００５年）。本発明者は、デキストラナーゼＬ「アマノ」が、４糖以上の連続α−１，６結合糖質（イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、デキストラン）に作用し、３糖以下の成分が生成することを確認した。そこで当該酵素を、本発明のα−グルコシダーゼを作用させて得られた反応生成物に作用させることにより、４糖以上の連続α１，６結合を含有する糖質が生成しているかどうかを調べた。【００８３】
具体的には、反応液３０μL（ＤＳ：固形分濃度３０％）、１，０００倍希釈のデキストラナーゼＬ「アマノ」３０μL、２０ｍＭ（ｐＨ６．０）リン酸緩衝液３９０μLを混合し、５０℃１６時間反応させた後に、１００℃で１０分加熱処理をすることで反応を停止した。そしてデキストラナーゼ未処理の反応液およびデキストラナーゼ処理後の反応液の重合度分布を前述＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞にてそれぞれ分析した。デキストラナーゼ未処理の反応液中の４糖以上成分の割合に対する、デキストラナーゼ処理後の反応液中の４糖以上成分の割合の減少量（Δ％）を４糖以上の連続α−１，６結合含有量とした。【００８４】
＜反応生成物の構造解析＞
反応生成物の分画物に含まれるα−１，６結合の割合は、Ｈ-ＮＭＲの積分値によって確認した。【００８５】
反応生成物の分画物中の結合様式の組成は、メチル化分析法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第５５巻  第２０５項  １９６４年）によって評価した。【００８６】
３）本発明のα―グルコシダーゼの取得
＜α―グルコシダーゼの遺伝子配列の定義＞
公開されているアスペルギルス属菌のゲノム配列から、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＨ３１ファミリーに属するα―グルコシダーゼと推定されているａｇｄＣの配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＸＰ＿００１８２５３９０）と同一性が９０％以上となる配列を探索し、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株のゲノム配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＢＡＣＡ００００００００）より抽出した（配列番号：１）。【００８７】
４）ＮＢＲＣ４２３９株由来推定α―グルコシダーゼの遺伝子組換え株の取得
＜染色体ＤＮＡの抽出＞
５０ｍＬ容のチューブに、滅菌したＹＰＤ培地５ｍLを入れ、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株を植菌し、３０℃２４時間培養した。そして培養菌体を回収し、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）で染色体ＤＮＡを抽出した。なお菌体は前述のキットのＡＰ１緩衝液を添加し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）で破砕した。【００８８】
＜遺伝子組換え株の作成＞
定義した遺伝子配列の、終始コドンの前に１０残基のヒスチジンタグを挿入したＰＣＲ産物を得るためのプライマーセットを設計した。抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとして、上記プライマーセットを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物はＩｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、高発現プロモーターとしてアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、ターミネーターとして本酵素の遺伝子配列の終始コドンより下流３００ｂｐの領域とともに、制限酵素ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIIIで消化したｐＰＴＲII（タカラバイオ社製）に導入しベクターを構築した。ベクターの設計を図1に示す。そしてアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）  ＡＴＣＣ３８１６３株を宿主にプロトプラスト−ＰＥＧ法（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第５１巻  ２５４９ページ  １９８７年）を行い、遺伝子組換え株を作成した。【００８９】
上記アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ４０由来の翻訳伸長因子ＴＥＦ１のプロモーター領域、α−グルコシダーゼ遺伝子、およびターミネーター領域を増幅するために用いたプライマーは以下のとおりである。
プロモーターＦ
５‘−ＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＴＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＡＣＡ−３’
プロモーターＲ
５‘−ＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＧＡＡＣＴ−３’
α−グルコシダーゼＦ
５‘−ＣＧＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＡＣＴＴＣ−３’
α−グルコシダーゼＲ
５‘−ＣＡＧＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＣＧＣ−３’
ターミネーターＦ（ヒスチジンタグを含む）
５‘−ＧＡＧＡＴＴＡＣＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＡＴＧＡＴＴＴＧＧＴＴＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧ−３’
ターミネーターＲ
５‘−ＧＴＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＧＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡ−３’【００９０】
＜ｃＤＮＡの配列解析＞
得られた酵素の遺伝子のｃＤＮＡ配列を確認するために、上記遺伝子組換え株から、前述した染色体ＤＮＡ抽出時と同様の操作で菌体を取得し、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でＲＮＡの抽出を行った。得られたＲＮＡから、Ｒｅｖｅｒ  Ｔｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いて逆転写反応でｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ反応で酵素遺伝子のｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡをＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ＫｉｔでＰＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（いずれもインビトロジェン社製）に導入した後にシークエンス解析を行い、ｃＤＮＡの全長配列を決定した（配列番号：２、ヒスチジンタグ部分は除いた）。得られたｃＤＮＡから本酵素のアミノ酸配列を決定した（配列番号：３、ヒスチジンタグ部分は除いた）。【００９１】
得られた酵素のアミノ酸配列は、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のＧＨ３１ファミリーに属するα―グルコシダーゼと推定されているａｇｄＣの配列（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＸＰ＿００１８２５３９０）と同一性が９９％であり、かつＧＨ３１ファミリーが共通に持つ２つの保存領域（ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９，ＰＳ００７０７）における配列がａｇｄＣと完全に一致するため、本酵素はＧＨ３１ファミリーに属する酵素と考えられる。【００９２】
５）ＮＢＲＣ４２３９株由来転移酵素の生産・精製
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来推定α―グルコシダーゼの生産＞
２Ｌ容の三角フラスコに、ツァペック  ドックス培地１Ｌを入れて、蒸気滅菌した後、ピリチアミンを添加し、上記の遺伝子組換え株を植菌し、３７℃の温度で４日間、振とう培養を行なった。そして、ミラクロス（メルク・ミリポア社製）で集菌、蒸留水で洗浄し、水分をよく搾った。【００９３】
得られた菌体のうち１００ｇに、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールを含んだ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）を２００ｍL加え、ヒスコトロン（日音医理科器械製作所社製）で２０，０００ｒｐｍ、３０秒の破砕を５回繰り返した。そして１０，０００ｒｐｍ、２０分遠心分離を行って上清をとり、粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵素活性を上記＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に記載した方法で評価した結果、９７Ｕの活性を得た。その結果、この酵素がα―グルコシダーゼ活性を有することがわかった。【００９４】
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α―グルコシダーゼの精製＞
得られた粗酵素液を、以下の２段階のクロマト分離に供した。【００９５】
（１）Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー：粗酵素液を０．２μｍのフィルターを通過させたサンプルをＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に通し、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールを含んだ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。これにより、ヒスチジンタグが付加されたタンパク質を選択的に回収することができる。【００９６】
（２）ゲルろ過クロマトグラフィー：  （１）で得られた溶出液を、限外ろ過により２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に置換し、Ｈｉｌｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｒｅｐｇｒａｄｅ（ＧＥヘルスケア社製）による分離を行い、α―グルコシダーゼ活性の高い画分を回収した。得られた画分から、１７Ｕのα―グルコシダーゼ活性を得た。【００９７】
（２）で得られた画分をＮａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＧＥヘルスケア社製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果を図２（左方）に示す。１１０，０００ダルトンの単一バンドであった。この結果より、単一の精製された酵素を含む画分が得られたと考えられる。【００９８】
６）ＮＢＲＣ４２３９株由来α―グルコシダーゼの性質
酵素の性質は、５）で得られた精製酵素を用いて評価した。【００９９】
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来α―グルコシダーゼの分子量＞
得られた精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＧＥヘルスケア社製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果を図２（右方）に示す。分子量６５，０００、７６，０００ダルトンの２本のバンドが検出された。Ｎａｔｉｖｅ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による結果と比較すると、本酵素はヘテロダイマーの構造を持つと考えられた。【０１００】
また、等電点電気泳動（ＧＥヘルスケア社製、「ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ」）に供した結果、本酵素の等電点は４．９〜５．５（中心値は５．２）であった。【０１０１】
＜至適温度、至適ｐＨ＞
本酵素のα―グルコシダーゼ活性に対する温度、ｐＨの影響を調べた。酵素の活性は、＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に準じて分析した。その結果を図３（温度の影響）、図４（ｐＨの影響）に示す。本酵素の至適温度はｐＨ６．０、３０分間反応で５５℃、至適ｐＨは４０℃、３０分間反応で５．５であった。【０１０２】
なお、ｐＨの影響の評価では、ｐＨ３，０〜５．０はフタル酸緩衝液、ｐＨ５．５〜７．０はＭＥＳ緩衝液、ｐＨ７．５〜８．０はＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ９．０〜１１．０はＣＡＰＳ緩衝液を使用した。【０１０３】
＜温度安定性、ｐＨ安定性＞
本酵素のα―グルコシダーゼ活性について温度、ｐＨ安定性を調べた。酵素の活性は、＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に準じて分析した。その結果を図５（温度安定性）、図６（ｐＨ安定性）に示す。本酵素の温度安定性は、５０℃で活性が９０％以上残存していた。また、ｐＨ安定性は、ｐＨ６．０〜１０．０の範囲で活性が９０％以上残存していた。【０１０４】
温度安定性は酵素溶液（２０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０、１ｍＭ  ＣａＣｌ２含有）を各温度に１時間保持し、氷水にて冷却後、残存する酵素活性を評価した。ｐＨ安定性は酵素溶液（各ｐＨの４０ｍＭ緩衝液）を４℃、２４時間保持し、ｐＨを６．０に調整した後、残存する酵素活性を評価した。【０１０５】
なお、ｐＨの安定性の評価では、ｐＨ２．０〜５．０はフタル酸緩衝液、ｐＨ６．０〜７．０はＭＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０はＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０はＣＡＰＳ緩衝液を使用した。【０１０６】
＜基質特異性＞
本酵素の基質特異性を４０℃、ｐＨ６．０の条件にて評価した。結果を下記表２に示す。【０１０７】
【表２】
0006469127.tif 000003
【０１０８】
マルトースや、コージビオース、ニゲロース、イソマルトースなどの２糖類、および、マルトテトラオースを除く重合度２〜７のマルトオリゴ糖、重合度２〜４のイソマルトオリゴ糖、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、アミロース、可溶性澱粉などには良好に作用してグルコースを生成した。特にα−１，６結合を有する重合度２〜４のイソマルトオリゴ糖が最も良好な基質であった。【０１０９】
マルトテトラオース、γ−シクロデキストリンについては作用性がやや低かった。トレハロース、グリコーゲン、デキストランについてはわずかに反応がみられた。【０１１０】
＜金属イオンの影響＞
本酵素の各金属イオンの影響を調べた。酵素活性は、＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に準じて分析した。各種イオンを反応系に添加して分析した結果を下記表３に示す。【０１１１】
本酵素はカルシウムによって活性がやや増加した。亜鉛イオン、銅イオン、鉄イオンによりその活性を阻害された。ナトリウムイオン、ＥＤＴＡによっても活性がやや阻害された。【０１１２】
【表３】
0006469127.tif 000004
【０１１３】
７）ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼと既存の酵素との比較
ＮＢＲＣ４２３９株由来α−グルコシダーゼの活性と、既存のα−グルコシダーゼを主活性とする酵素の活性とを、マルトース（グルコース重合度（Ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ＤＰ）２）およびマルトペンタオース（ＤＰ５）を基質とした際の反応生成物について比較した。【０１１４】
＜トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」によるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞
α−グルコシダーゼを主活性とし、同じアスペルギルス属（アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ））由来の市販の酵素製剤であるトランスグルコシダーゼＬ「アマノ」（天野エンザイム社製）０．２ｍＬ（１．８Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。【０１１５】
得られた反応生成物の重合度分布および、２、３、４糖成分の異性体の組成を、上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞および、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法にて分析した。また、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析した。【０１１６】
反応開始後の７２時間までの反応生成物の経時変化について、重合度分布を図７Ａ、２、３、４糖成分の異性体組成を図７Ｂに示す。重合度分布では、基質であるマルトース（ＤＰ２）の減少と共に３糖成分が生成し、続いてさらに重合度の高い成分が増加した。２、３、４糖成分の異性体組成では、α−１，４結合とα−１，６結合をともに有する低分子糖質（パノース、イソマルトトリオシルグルコース、以降はα−１，４・１，６結合オリゴ糖と記載）、α−１，６結合のみを有する低分子糖質（イソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、以後はα−１，６結合オリゴ糖と記載）が増加した。【０１１７】
反応開始後７２時間での分子量分布は、単糖２９．０％、２糖３０．９％、３糖２５．９％、４糖以上１４．２％であった。また、α−１，４・１，６結合オリゴ糖またはα−１，６結合オリゴ糖のうち２糖類であるイソマルトースが２０．８％、３糖類であるパノースが１０．０％、イソマルトトリオースが１１．１％、４糖類であるイソマルトトリオシルグルコースが５．０％、イソマルトテトラオースが２．８％であった。【０１１８】
反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量の経時変化を図１２に示す。反応開始後７２時間までに、４糖以上の連続α−１，６結合含有量は、０％から３％まで増加した。【０１１９】
＜アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株由来粗酵素液によるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞
α−グルコシダーゼを粗酵素液中に分泌することが知られているアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株から特許第４８３００３１号に記載の方法で粗酵素液を取得し、０．２ｍＬ（１．８Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。【０１２０】
得られた反応生成物の重合度分布および、２、３、４糖成分の異性体の組成を、上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞および、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法にて分析した。また、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析した。【０１２１】
反応開始後の７２時間までの反応生成物の経時変化について、重合度分布を図８Ａ、２、３、４糖成分の異性体組成を図８Ｂに示す。重合度分布では、基質であるマルトース（ＤＰ２）の減少と共に３糖成分が生成し、続いてさらに重合度の高い成分が増加した。２、３、４糖成分の異性体組成では、反応初期にα−１，３結合を有する低分子糖質（以降はα１，３結合オリゴ糖と記載）が増加し、平衡に達したまま維持された。【０１２２】
反応開始後７２時間での分子量分布は、単糖２９．２％、２糖３１．０％、３糖１９．５％、４糖以上２０．２％であった。また、α−１，４・１，６結合オリゴ糖またはα−１，６結合オリゴ糖のうち２糖類であるイソマルトースが３．２％、３糖類であるパノースが１．３％得られた。イソマルトトリオース、イソマルトトリオシルグルコース、イソマルトテトラオースは得られなかった。【０１２３】
反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量の経時変化を図１２に示す。反応開始後７２時間までに、４糖以上の連続α−１，６結合含有量の増加は全く認められなかった。【０１２４】
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来のα−グルコシダーゼによるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞
５）に記載の方法で得られた精製酵素０．２ｍＬ（１．８Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。【０１２５】
得られた反応生成物の重合度分布および、２、３、４糖成分の異性体の組成を、上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞および、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法にて分析した。また、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析した。さらに、５糖成分に含まれるα−１，６結合の割合を＜反応生成物の構造解析＞の手法に従い、Ｈ−ＮＭＲで分析を行った。【０１２６】
反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを図９、異性体組成のクロマトグラムを図１０に示す。【０１２７】
反応開始後の７２時間までの反応生成物の経時変化について、重合度分布を図１１Ａ、２、３、４糖成分の異性体組成を図１１Ｂに示す。重合度分布では、基質であるマルトース（ＤＰ２）の減少と共に３糖成分が生成し、続いてさらに重合度の高い成分が増加した。２、３、４糖成分の異性体組成では、反応初期はα−１，４・１，６結合オリゴ糖、α−１，３結合オリゴ糖が増加したが、その後減少に転じた。一方、α−１，６結合オリゴ糖は、反応初期から中期にかけて増加し平衡に達したまま維持された。【０１２８】
反応開始後７２時間での分子量分布は、単糖２７．９％、２糖２５．６％、３糖１８．４％、４糖以上２８．１％であった。また、α−１，４・１，６結合オリゴ糖またはα−１，６結合オリゴ糖のうち２糖類であるイソマルトースが１７．８％、３糖類であるパノースが２．７％、イソマルトトリオースが１０．８％、４糖類であるイソマルトトリオシルグルコースが１．０％、イソマルトテトラオースが７．８％得られた。【０１２９】
反応開始後の７２時間までの、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量の経時変化を図１２に示す。反応開始後７２時間までに、４糖以上の連続α−１，６結合含有量は、１４％までに増加した。本発明の酵素をマルトースに作用させた場合、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」やアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液を作用させた場合と比較して、反応生成物の４糖以上の連続α−１，６結合含有量が顕著に多かった。【０１３０】
上記と同じ反応条件でマルトースに、本発明の精製酵素を７２時間作用させ、得られた反応生成物から５糖成分を分画し、Ｈ−ＮＭＲで解析したところ、α−１，６結合は８１％含まれていた（図１３）。また、２、３、４糖成分は、上記に記載した通りα−１，６結合の成分（α−１，６結合オリゴ糖）が多くを占めており、６糖以上の成分も同様にα−１，６結合の割合が高いと推測される。以上より、本発明の酵素をマルトースに作用させると、生成する糖質の大部分はα−１，６結合で連結していることが分かった。【０１３１】
＜マルトペンタオース（ＤＰ５）の転移物＞
５）に記載の方法で得られた精製酵素、０．２ｍＬ（７．２Ｕ／ｍＬ）を、４５％マルトペンタオース溶液０．４ｍＬに加え（最終濃度３０％）、４０℃で反応を行った。所定時間反応後に沸騰浴槽で１０分間加熱し、酵素を失活させた。【０１３２】
得られた反応生成物の重合度分布を上記＜反応生成物の重合度分布の分析方法＞に記載した方法で分析した。また、反応生成物の連続α−１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法に準じて分析した。ここでは、デキストラナーゼ処理による６糖以上成分の割合の減少量を６糖以上の連続α−１，６結合含有量とし、経時的に評価した。【０１３３】
反応開始後７２時間における、反応生成物の重合度分布のクロマトグラムを図１４に示す。【０１３４】
また、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」、アスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液についても同様に反応し、分析を行った。【０１３５】
反応開後の７２時間までの６糖以上成分含有量の経時変化を図１５に示す。本発明の酵素をマルトペンタオースに作用させた場合、トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」やアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液を作用させた場合と比較して、反応生成物中の６糖以上の成分量が、反応時間を通して常に多かった。【０１３６】
６糖以上の連続α−１，６結合含有量の経時変化を図１６に示す。本発明の酵素は、反応開始後７２時間までに、６糖以上の連続α−１，６結合含有量が１３％まで増加した。トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」やアスペルギルス・ニジェール（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）  ＡＴＣＣ１０２５４株由来の粗酵素液を作用させた場合と比較して、６糖以上の連続α−１，６結合含有量が顕著に多かった。【０１３７】
上記と同じ反応条件でマルトペンタオースに、本発明の精製酵素を７２時間作用させ、得られた反応生成物から６糖以上の成分を分画し、メチル化分析で分析した結果を下記表４に示す。非還元末端のグルコース以外の、反応生成物を構成するグルコースのうち、６２％がα−１，６結合を含有しており、α−１，４結合のみを含有しているグルコースは３０％であった。上述した、マルトースに作用させて得られた反応生成物の解析結果から、本発明の酵素はほとんどα−１，４転移をしないことが明らかであるので、上記マルトペンタオースの反応生成物に含まれるα−１，４結合は基質のマルトペンタオース由来であり、転移反応で新たに生成する結合様式は大部分がα−１，６結合であると考えられた。【０１３８】
【表４】
0006469127.tif 000005
【０１３９】
８）その他のアスペルギルス属由来のα−グルコシダーゼの調製と評価
上記アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素の他に、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）  ＡＴＣＣ３８１６３株由来のａｇｄＢ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＥＡＡ６３７４８）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣに関して、４）と同様の手法で、遺伝子組換え株を作成し、粗酵素液を得た。また、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ストラタジーン社製）を用い、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株由来酵素のアミノ酸配列の４５０番目のアルギニンをヒスチジンに変換した遺伝子、および、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣの４５０番目のヒスチジンをアルギニンに変換した遺伝子の遺伝子組換え株を作成し、粗酵素液を得た。【０１４０】
これらの粗酵素液を、７）＜マルトペンタオース（ＤＰ５）の転移物＞と同様の方法でマルトペンタオースに作用させ、その反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析を行った。その結果、反応２４時間における、６糖以上の連続α−１，６結合含有量は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）  ＡＴＣＣ３８１６３株由来のａｇｄＢは８％、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣの点変異導入酵素は１０％となり、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素（１１％）と同程度の連続α１，６結合を生成した。一方、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣ、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株の点変異導入酵素は、α−グルコシダーゼ活性はあるものの連続α−１，６結合が全く生成しなかった。後者２種の酵素をマルトースに作用させ、＜反応生成物の異性体組成の分析方法＞に記載した方法で２、３、４糖成分の異性体の組成を分析したところ、α１，６結合を有するオリゴ糖の含有量は少なく、α−１，３またはα−１，４結合を有するオリゴ糖が多く生成した。【０１４１】
９）アスペルギルス属由来のα−グルコシダーゼ配列の比較
ＧＨ３１ファミリーに属する酵素は活性中心に保存性の高い配列を持つことが知られている（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第37巻1ページ  １９９８年、ＰＲＯＳＩＴＥ：ＰＳ００１２９）。アスペルギルス属由来のさまざまなα−グルコシダーゼ配列における活性中心付近の保存配列から３残基下流までの配列、および各α−グルコシダーゼの連続α−１，６転移活性の有無を図１７に示す。連続α−１，６転移活性を有する酵素の遺伝子配列は保存配列の全てのアミノ酸が一致していた。また、保存配列は共通するものの、活性中心の１０残基下流がアルギニンではなくヒスチジンであるアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株由来のａｇｄＣは連続α−１，６転移活性を持っていなかった。また、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株由来の酵素に点変異導入をして、活性中心の１０残基下流がアルギニンではなくヒスチジンとした酵素も、連続α−１，６転移活性を持っていなかった。さらに、同じα―グルコシダーゼであるが連続α−１，６転移酵素ではないことが知られている他の既知の酵素は、保存配列のアミノ酸が一致していなかった。したがって活性中心付近に「ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦ」の配列を持っており、かつ活性中心の１０残基下流がヒスチジンではないことが連続α−１，６転移活性を持つために重要であることが分かった。【０１４２】
つまり、上記の条件にあうアミノ酸配列、すなわちＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦＸ１Ｘ２Ｘ３からなる配列を含有し、ここでＸ１Ｘ２は任意のアミノ酸であり、Ｘ３はヒスチジン以外のアミノ酸であり、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有するα−グルコシダーゼが、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株由来の変異酵素から見出された。またアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ３．０４２株、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）  ＮＲＲＬ３３５７株は、ゲノム配列上、ＧＨ３１ファミリーに属する酵素と予測される配列を有している（それぞれ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＥＩＴ７７３８８、およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＸＰ＿００２３８０５７６）。そして、これらの酵素のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と９８％の同一性を有しており、連続するα−１，６結合を有する糖質を生成する活性を有する酵素を生産すると推測される。アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、およびアスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）は、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）と同様にアスペルギルス属フラビ節（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌａｖｉ）に属する菌種である。さらに、データベース上ではペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）   、ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃａ）、スタキボトリス・クロロハロナタ（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈｌｏｒｏｈａｌｏｎａｔａ）、スタキボトリス・カルタルム（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ  ｃｈａｒｔａｒｕｍ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、フザリウム・ベルチシリオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ）も活性中心付近に「ＤＡＬＷＩＤＭＮＥＰＡＮＦ」の配列を持っており、かつ活性中心の１０残基下流がヒスチジンではない、ＧＨ３１ファミリーに属する酵素を有しており、これらの糸状菌は、本発明のα−グルコシダーゼ同様、連続α−１，６転移活性を有する酵素を生産する可能性が高い。【０１４３】
アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株由来のα−グルコシダーゼのアミノ酸配列（配列番号３）、ゲノム遺伝子配列（配列番号１）、およびｃＤＮＡ配列（配列番号２）と比較した場合の、各種アスペルギルス属由来のα−グルコシダーゼ配列の同一性は以下の表５に示すとおりである。なお、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）  ＲＩＢ６０１株についてはゲノム配列が解読されていなかったものであるため、本株由来のａｇｄＣの配列は、発明者等が独自に解析した（配列番号４）。また、配列同一性は、clustalW（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）プログラムを用いて評価した。【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
１０）酵素の製造方法
＜ＮＢＲＣ４２３９株由来のα−グルコシダーゼ酵素液の製造＞
５００ｍｌ容の三角フラスコに、小麦ふすま１０ｇを入れて、蒸気滅菌した後、アスペルギルス・ソヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）  ＮＢＲＣ４２３９株をＹＰＤ培地で培養した前培養液を１０ｍＬ添加し、水分が均一になるようによく撹拌した後、３０℃で４日間、固体培養を行なった。培養終了後、１００ｍＬのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）で小麦ふすまを洗浄し、ミラクロス（メルク・ミリポア製）による濾過、３，５００ｒｐｍ、２０分間で２回遠心分離後、上清を回収し、粗酵素液とした。得られた粗酵素液の酵素活性を上記＜α―グルコシダーゼ活性の分析方法＞に記載した方法で評価した結果、２４Ｕの活性を得た。【０１４６】
得られた粗酵素液を７）＜ＮＢＲＣ４２３９株由来の精製酵素によるマルトース（ＤＰ２）の転移物＞、＜マルトペンタオース（ＤＰ５）の転移物＞、それぞれに記載された方法と同様にマルトース、マルトペンタオースに作用し、反応生成物の連続α−１，６結合含有量を＜反応生成物の連続α−１，６結合含有量の分析方法＞に記載した方法にて分析したところ、連続α−１，６結合の糖質が得られたことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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