(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薄膜式培養装置であって、
防水性の第１の基材と、
防水性の第２の基材と、
前記第１の基材と前記第２の基材との間に配置された生長領域と、
前記生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
前記生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
前記生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、前記有効量のカルシウムキレート化合物が、前記培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
前記コロニー形成単位の前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、薄膜式培養装置。
【請求項２】
微生物を計数するための方法であって、
薄膜式培養装置の生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物を含む前記生長領域において、接種された培養培地を形成することと、
顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーを形成させるのに十分な所定の期間にわたって、前記接種された培養培地をインキュベートすることと、
前記生長領域における顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーの数を計数することとを含み、
前記接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により前記生長領域を水和することを含み、
前記生長領域が前記所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、前記カルシウムキレート化合物は、前記培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された前記有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させ、
前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、微生物を計数するための方法。
【請求項３】
キットであって、
カビ微生物を生長させ計数するための薄膜式培養装置と、
所定量のカルシウムキレート化合物を収容する容器とを含み、
前記培養装置の接種後に前記培養装置の生長領域に配置されたとき、所定量の一部分は、前記培養装置において生長するカビ種のコロニー形成単位の横方向拡大率を、前記生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに十分であり、
前記コロニー形成単位の前記横方向拡大率を低減させても、前記コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年５月６日に出願された米国仮特許出願第６１／８１９，６９０号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
カビ類は真核微生物であり、自然環境、すなわち土壌、大気、水、及び植物表面のいたるところに偏在する。従属栄養性であり、かつ広範な環境条件に適応する能力を有することに起因し、それらの微生物は、食品原料などの様々な農作物、加工食品、飲料、洗浄が不十分な食品加工装置、及び食品保存設備などの内部及び外部において、高額な経費を生じさせる厄介な存在として頻繁に出現する。更に、一部の酵母及びカビは、人及び動物の健康を脅かす恐れがある。例えば、多くのカビはマイコトキシンを生成し、一部のカビ微生物は、人及び動物感染の原因となる。
【０００３】
食品及びその他の農産物におけるカビ汚染は、生産業者、製造加工業者、及び消費者にかなりの経済的損失をもたらし得る。食品産業において高品質の食品を製造するには、日用品（食品原料、加工食品、及び飲料）のカビ汚染を迅速かつ正確に判定することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
食品に含まれるカビを日常試験する際の現在の実務では、主として、半固体の寒天培地上で真菌の生細胞を培養する、従来の培養法が利用されている。これらの方法は広く受け入れられているものの、概して労働集約型であり、再現性が低いなどの数多くの欠点がある。更に従来法では、多くの場合、菌糸を広げて生長するタイプのカビが近隣のコロニーを横切って菌糸を生長させてしまい、サンプル中の生細胞の正確な計数の妨げとなるという問題が共通して見られる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、概してサンプル中のカビ微生物の検出及び計数に関する。特に、本開示は、薄膜式培養装置におけるカビコロニーの計数に関する。本発明者らは、ヘッドスペースが存在せず、かつ比較的薄型の栄養層（従来的な寒天ペトリ皿培養装置と比較）を有する薄膜式培養装置は、この装置において少なくとも数種のカビコロニーを生長させる際に、コロニーの横方向の拡大（例えば、コロニーの放射状の広がり）を高率で示すことを発見した。本発明者らは、驚くべきことに、カビコロニーの検出を大幅に遅延させることなく、コロニー生長の横方向拡大率を低減させるために、カルシウムキレート化合物を使用できることも発見した。有利に、カルシウムキレート化合物により平均コロニー直径を低減させると、低減させなかった場合に生長領域の大部分の領域に広がって他のカビコロニーを覆ってしまい、各コロニーの計数を難しくするカビ種を含むサンプル中のカビ微生物を、より正確に計数可能になる。
【０００６】
本開示は、薄膜式培養装置を提供する。培養装置は、防水性の第１の基材と、防水性の第２の基材と、第１の基材と第２の基材との間に配置された生長領域と、生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物と、を含み得る。生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、有効量のカルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができる。コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることがない。任意の実施形態では、薄膜式培養装置には、所定量の水性液体を更に含ませることができ、生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物は、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して、生長領域に配置された有効量を含有する培養装置において生長するカビ種のコロニーの横方向拡大率を大幅に低減させるのに有効な濃度で、水性液体に溶解される。
【０００７】
別の態様では、本開示は、微生物を計数するための方法を提供する。本方法は、薄膜式培養装置の生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物を含む生長領域において、接種された培養培地を形成することと、顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーを形成させるのに十分な所定の期間にわたって、接種された培養培地をインキュベートすることと、生長領域において顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーの数を計数することと、を含み得る。接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により生長領域を水和することを含む。生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、カルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させる。コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることがない。任意の実施形態では、方法は更に、生長領域において顕微鏡検出可能な酵母コロニーの数を計数することを含む。任意の実施形態では、接種された培養培地を形成することは、薄膜式培養装置に水性サンプルを載せることを含んでよく、水性サンプルを載せる前の薄膜式培養装置は、栄養培地、指示薬、及び／又は有効量のカルシウムキレート化合物を含む。
【０００８】
更に別の態様において、本開示はキットを提供する。キットは、カビ微生物を生長させ計数するための薄膜式培養装置と、所定量のカルシウムキレート化合物を収容する容器とを含み得る。培養装置の接種後に培養装置の生長領域に配置されたとき、所定量のカルシウムキレート化合物の一部分は、培養装置において生長するカビ種のコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに十分である。コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出が大幅に遅延させることがない。
【０００９】
「好ましい」及び「好ましくは」なる語は、特定の状況下で、特定の効果をもたらし得る本発明の実施形態のことを指す。しかしながら、同じ又は他の状況下においては他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、かつ本発明の範囲内から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
【００１０】
用語「含む」及びこの変形は、説明及び請求項においてこれらの用語が現れる箇所で制限する意味を持たない。
【００１１】
本明細書で使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えばカビ微生物と言う場合には、「１種以上の」カビ微生物を意味すると解釈することができる。
【００１２】
用語「及び／又は」は、列挙した要素の１つ又は全て、あるいは列挙した要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１３】
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含される全ての数（例えば１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、など）が含まれる。
【００１４】
本発明の上記の「課題を解決するための手段」は、本発明が開示する各実施形態又はあらゆる実施を説明することを意図したものではない。以下の説明は、例示的実施形態をより詳細に示す。本出願の全体を通じて幾つかの箇所で、実施例のリストによって指針が与えられるが、これらの実施例は異なる組み合わせで使用することができる。いずれの場合も、記載されるリストは、あくまで代表的な群としてのみの役割を果たすものであって、排他的なリストとして解釈するべきではない。
【００１５】
これらの実施形態及び他の実施形態の更なる詳細を、添付の図面及び以下の説明文に記載する。他の特徴、目的、及び利点は、その説明と図面、及び「特許請求の範囲」から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本開示による薄膜式培養装置の一実施形態の上面図。
【図２】線２−２に沿った図３の薄膜式培養装置の断面図。
【図３】本開示による薄膜式培養装置の代替的な実施形態の、部分的に切り欠いた上面図。
【図４】図３の薄膜式培養装置の部分断面図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示は、概して、酵母及びカビ微生物を検出するための物品及び方法に関する。特に、本開示は、薄膜式培養装置におけるカビコロニーの検出及び計数に関する。
【００１８】
薄膜式培養装置は、栄養培地表面及び装置用カバー表面の間にヘッドスペースを有していないという点が、薄膜式培養装置の構造を酵母及びカビ用の典型的な培養装置（例えば、ペトリ皿）と異なるものにしている。したがって、細胞集団がペトリ皿のヘッドスペースに垂直に拡大することのできる（これにより、装置においてコロニーの視認性が高くなる）、カビコロニーを生長させるペトリディッシュとは対照的に、薄膜式培養装置において生長するカビコロニーの細胞集団は、栄養培地中に水平（横方向）に拡大することになる。
【００１９】
更に、当該技術分野では、遊離のカルシウムの利用能がカビの菌糸先端の生長に影響し得ることが知られている（例えば、Ｓ．Ｌ．Ｊａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｉ．Ｂ．Ｈｅａｔｈ；ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅ．；１９９３；５７：３６７〜３８２を参照のこと；参照によりその全体が本明細書に援用される）。特に、カビ菌糸先端領域において、遊離カルシウム量を制限すると、菌糸先端の生長速度を大幅に低減させることができる。本発明の物品及び方法は、コロニーの検出を大幅に遅延させることなく生長させるのに有効な量のキレート剤を使用することにより、カビの生長を予防するための保存料として一般に使用されているカルシウムキレート化合物の効果（例えば、カビ菌糸の伸長阻害）を利用するものである。驚くべきことに、使用されるキレート剤の量は、特定の食品で保存料として使用されるときにカビの生長を抑えるために典型的に利用されるものよりも、大幅に多かった。
【００２０】
理論に束縛されるものではないが、本発明は、半固体の栄養培地では、遊離のカルシウムイオン濃度が、栄養培地を含む培養装置（例えば、薄膜式培養装置）において生長するカビコロニーの横方向拡大率に影響する、少なくとも１つの重要な要素であることを発見した。更に、本発明者らは、栄養培地に、有効量のカルシウムキレート化合物を含有させることで、カビコロニーの横方向拡大率及び／又は度合いが低減されることを発見している。本発明は生長を遅延させる化合物を使用するものの、驚くべきことに、カビコロニーの検出は、有効量のカルシウムキレート化合物を含まない類似の培養装置と比較して大幅に遅延しない。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「通気性」は、端部（複数可）が空気に実質的に露出されたときに、下層の培地において好気性微生物の生長を支持する目的で、この培地に十分に空気を供給するために、水平方向（すなわち、表面に対し平行）において空気に対し十分に透過性である膜を指す。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「冷水に溶解性」は、水に懸濁可能であり、例えば、室温の水で分散液、溶液、又はゲルを形成する物質を指す。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「冷水可溶性」は、室温の水で溶液又はゲルを形成する、冷水に溶解性の物質を指す。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「生長領域」は、微生物を成長させることが意図される、装置の各構成要素の領域を指す。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「粉末」は、例えば、栄養剤及び／又はゲル化剤の、粒子状物質を指し、この粒子は、本開示の装置に使用するのに好適な平均直径を有し、例えば、約４００μｍ未満の平均直径を有する。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「再水和させた媒質」は、水又は水性試験サンプルにより再水和されている、冷水に溶解性の培地を指す。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「微生物及び水蒸気に対し実質的に不透過性」は、（ｉ）装置の運搬、保管、及び使用中に、下層の培地の望ましくない汚染を予防し、（ｉｉ）培地の乾燥を回避する、すなわち、インキュベート期間中の微生物の生長を支持するのに好適な、再水和させた媒質の水和度を維持する、第２の基材を指す。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「実質的に水を含まない」は、水分含量が、周囲環境の大体の水分含量を超過しないことを指す。
【００２９】
図１及び２を参照すると、防水性の第１の基材１２及び防水性の第２の基材１８を有する本体部材１０として、本開示の薄膜式培養装置１００の一実施形態が提示される。任意の実施形態では、好ましくは、培養装置１００は、任意の通気膜１４を更に含む。これらは任意の好適な関係を持たせて配置可能であるものの、図１に、構成要素の好ましい配置を例示する。図中、通気膜１４は、第１の基材１２の外側表面の少なくとも生長領域４０に固定されており、かつこれと同じ広がりを持っている。培養装置１００は、第１の乾燥コーティング１６を含む。第１の乾燥コーティング１６の少なくとも一部分は生長領域４０に配置される。
【００３０】
本開示の薄膜式培養装置の任意の実施形態では、生長領域４０は、第１の基材１２及び第２の基材１８の間に配置され、かつ第１の基材１２又は第２の基材１８上の生長領域４０内に配置された任意のコーティング（複数可）又はその部分を含む。生長領域４０は培養装置内の位置であり、薄膜式培養装置の使用中に、サンプル及び／又は水性懸濁媒質（例えば、栄養培地、滅菌水、又は緩衝液）により水和される。任意の実施形態では、生長領域４０は、第１及び第２の基材の間のどこかに配置される。好ましくは、生長領域４０は、汚染及び／又はインキュベート中の水分の望ましくない消失を回避するため、第１の基材１２及び第２の基材１８の端部から離れている。任意の実施形態では、生長領域４０は、所定量のサンプル及び／又は水性懸濁媒質を保持することが意図される構造により画定される［例えば、本明細書において検討されるスペーサー２４（図１及び２を参照されたい）］。
【００３１】
任意の実施形態では、第１の乾燥コーティング１６は、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤を含む。第１の乾燥コーティング１６は、典型的には、本体基材１０において、通気膜１４が存在する場合には通気膜１４上に配置され、通気膜１４が存在しない場合には（図示せず）第１の基材１２上に配置され、又は第２の基材１８上に配置される。任意の実施形態では、第１の乾燥コーティング１６は、カビ微生物の生長を促進する２種以上の栄養分を含み得る。任意の実施形態では、栄養分はカルシウムイオン（例えば、カルシウム塩）を含む。第１の乾燥コーティング１６は、下記の通りの有効量のカルシウムキレート化合物を更に含み得る。任意の実施形態では、第１の乾燥コーティング１６の少なくとも一部分（又は全量）が、薄膜式培養装置の生長領域４０に配置される。
【００３２】
任意の実施形態では、本開示の薄膜式培養装置は、所望により、第２の乾燥コーティング（乾燥コーティング１６’）を含み得る。第２の乾燥コーティング１６’は、通気膜１４が存在する場合には通気膜１４（図示せず）上に配置され；通気膜１４が存在しない場合には第１の基材１２上に配置され；又は第２の基材１８上に配置される。任意の実施形態では、第２の乾燥コーティング１６’は、乾燥した冷水可溶性ゲル化剤；栄養分又は栄養分混合物（所望によりカルシウム塩を含む）、カルシウムキレート化合物、カルシウム塩、又は前述の成分のうち任意の２つ以上の組み合わせを含み得る。任意の実施形態では、第２の乾燥コーティング１６’は、第１の乾燥コーティング１６と同一であってもよい。任意の実施形態では、第２の乾燥コーティング１６が存在する場合、この第２の乾燥コーティング１６の少なくとも一部分（又は全量）が、薄膜式培養装置の生長領域４０に配置される。
【００３３】
米国特許第４，５６５，７８３号の培地コーティング法；同第５，０８９，４１３号に記載の粉末コーティング法、又はこれらを組み合わせた方法を使用して、第１の乾燥コーティング１６及び／又は第２の乾燥コーティング１６’を、第１の基材１２及び／又は第２の基材１８上にコーティングすることもできる。
【００３４】
薄膜式培養装置の生長領域４０には、有効量のカルシウムキレート化合物も含まれる。カルシウムキレート化合物は、第１の乾燥コーティング１６（例えば、第１の乾燥コーティング１６を構成するコーティング混合物の一成分として）及び／又は第２の乾燥コーティング１６’（例えば、第２の乾燥コーティング１６’を構成するコーティング混合物の一成分として）における生長領域４０の、少なくとも一部分に配置され得る（例えば、粉末コーティングとして）。
【００３５】
好適なカルシウムキレート化合物は、水性液体に可溶性のものである。溶解度は、培養装置においてコロニーの検出を大幅に遅延させることなく、薄膜式培養装置において生長するカビ微生物のコロニーの横方向拡大率を低減させる（カルシウムキレート化合物を含まないことを除き同一の薄膜式培養装置において生長する同じカビ微生物のコロニーの横方向拡大率と比較）濃度を達成するのに十分高いものである。好適なカルシウムキレート化合物の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸塩、及び塩類（例えば、ナトリウム塩）、水和物、及びこれらの溶媒和物が挙げられるがこれらに限定されない。任意の実施形態では、塩形態の方が水溶性が高いことから、カルシウムキレート化合物の塩は遊離酸形態であることが望ましい。
【００３６】
カビ微生物の生長を実質的に阻害しない色素であるならば、カルシウム感受性色素も、本開示によるカルシウムキレート化合物として使用できる。カルシウム感受性色素の例としては、クロロホスホナゾＩＩＩ（ビス（４−クロロ−２−ホスホノフェニルアゾ）クロモトロピック酸）、アルセナゾＩＩＩ（２，２’−（１，８−ジヒドロキシ−３，６−ジスルホナフチレン−２，７−ビスアゾ）ビスフェニルアルソン酸、２，７−ビス（２−アルソノフェニルアゾ）クロモトロピック酸）、アンチピリルアゾＩＩＩ（３，６−ビス（４−アンチピリルアゾ）−４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸）、カルボキシアルセナゾＩＩＩ（２−（２−アルソノフェニルアゾ）−７−（２−カルボキシフェニルアゾ）クロモトロピック酸）、トロポロン（２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オン）、アリザリンレッド（１，２−ジヒドロキシアントラキノン）、カルボキシアゾＩＩＩ（２，２’−［（１，８−ジヒドロキシ−３，６−ジスルホ−２，７−ナフタレンジイル）ビス（アゾ）］ビス−（９ＣＩ）安息香酸）、オメガクロームブラックブルー、エリオクロームグレイ３ＢＬ（Eriochrome grey 3BL）、オキシアセトアゾＩ、ムレキシドプルプル酸アンモニウム、エリオクロムブラックＴ、アルセナゾＩ（２−（１，８−ジヒドロキシ−３，６−ジスルホ−２−ナフチルアゾ）ベンゼンアルソン酸三ナトリウム塩、３−（２−アルソノフェニル）アゾ−４，５−ジヒドロキシ−２，７−ナフタレンジスルホン酸三ナトリウム塩）、ブロモピロガロールレッド（５’，５”−ジブロモピロガロールスルホンフタレイン）、ブロモピロガロールパープル、メチルチモールブルー、カルセイン、オルトクレゾールフタレインコンプレキソン、及びウンベリフェロンコンプレキソンカルセインブルー（４−メチルウンベリフェロン−８−メチルアミノニ酢酸）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３７】
有効量のカルシウムキレート化合物は、内因的及び外因的に変動し得る複数の可変要素に応じ様々に異なり得る。カルシウムキレート化合物に関係する内因的な可変要素の１つは、カルシウムキレート化合物とカルシウムとの間の結合相互作用についての解離定数である。カルシウムキレート化合物に関係する別の内因的な可変要素は、カルシウムキレート化合物と、栄養培地及び／又はサンプル中に存在し得るものであり、かつカルシウムキレート化合物と相互作用し得るその他の二価カチオン（例えば、Ｍｇ）との間の結合相互作用についての解離定数である。有効量のカルシウムキレート化合物に影響し得る外因的可変要素のうち２つは、ｉ）本開示により使用される栄養培地及び／又はサンプル材料中に存在する二価カチオンの量（特に、カルシウムイオン）並びにｉｉ）栄養培地及び／又はサンプル材料のｐＨである。当業者であれば、カルシウムキレート化合物の解離定数は、周囲環境のｐＨに影響を受ける場合があることを認識されるであろう。更に、当業者であれば、ｐＨの影響は、緩衝剤の使用により軽減され得ることも認識されるであろう。
【００３８】
本明細書に開示されるカルシウムキレート化合物の有効量（又は濃度）の範囲は、多くの状況（食品、飲料、又は環境試験）に適したものであるものの、特定のサンプルのためのカルシウムキレート化合物の有効濃度は、水性液（例えば、水又はバターフィールド緩衝液）中化合物溶液を作製し、この溶液を滅菌水又は緩衝液により数倍希釈し（例えば、２倍又は５倍希釈）、実施例１２に記載の手順を行うことにより容易に決定することができる。有効量の、本開示の任意のカルシウムキレート化合物は、検出されるカビ微生物の、顕微鏡検出可能なコロニーの検出を、カルシウムキレート化合物を含まないことを除き同一の薄膜式培養装置におけるカビ微生物の検出と比較して大幅に遅延させない。
【００３９】
本開示の薄膜式培養装置の任意の実施形態では、有効量のカルシウムキレート化合物が、本明細書に開示される１つ以上の乾燥コーティング（例えば、第１の乾燥コーティング１６及び第２の乾燥コーティング１６’）中に配置される。任意の実施形態では、有効量が、培養装置（例えば、生長領域４０）の生長領域に配置される。したがって、カルシウムキレート化合物、カルシウム塩、及び生長領域に塗布する乾燥コーティング質量の割合は、水和されたときに、生長領域が、培養装置において生長するカビ微生物のコロニーの横方向拡大率をコロニーの検出を大幅に遅延させることなく低減させるのに有効な濃度のカルシウムキレート化合物を有するヒドロゲルを含むように調節される。
【００４０】
任意の実施形態では、１００ｃｍ２当たり約０．５ｍｇ〜約１２ｍｇのカルシウムキレート化合物を有する乾燥コーティングとして、有効量のカルシウムキレート化合物（例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物）が薄膜式培養装置に配置される。任意の実施形態では、１００ｃｍ２当たり約０．５ｍｇ〜約６ｍｇのカルシウムキレート化合物を有する乾燥コーティングとして、有効量のカルシウムキレート化合物が薄膜式培養装置に配置される。任意の実施形態では、１００ｃｍ２当たり約１．０ｍｇ〜約１２ｍｇのカルシウムキレート化合物を有する乾燥コーティングとして、有効量のカルシウムキレート化合物が薄膜式培養装置に配置される。任意の実施形態では、１００ｃｍ２当たり約１．０ｍｇ〜約６ｍｇのカルシウムキレート化合物を有する乾燥コーティングとして、有効量のカルシウムキレート化合物が薄膜式培養装置に配置される。任意の実施形態では、１００ｃｍ２当たり約３．０ｍｇ〜約１２ｍｇのカルシウムキレート化合物を有する乾燥コーティングとして、有効量のカルシウムキレート化合物が薄膜式培養装置に配置される。
【００４１】
以下に詳細に検討される本開示の任意の方法では、有効量のカルシウムキレート剤の一部分又は全部を乾燥コーティングとして薄膜式培養装置に供給することができる。更に、あるいは培養装置にサンプルを接種する前、接種している間、又は接種の直後に、有効量のカルシウムキレート化合物の一部分又は全部を液体形態で培養装置に導入することができる。任意の実施形態では、接種培養装置におけるカルシウムキレート化合物の濃度は、約１ｍＭ〜約９．０ｍＭとすることができる。任意の実施形態では、接種培養装置におけるカルシウムキレート化合物の濃度は、約１ｍＭ〜約５ｍＭとすることができる。任意の実施形態では、接種培養装置におけるカルシウムキレート化合物の濃度は、約１ｍＭ〜約２ｍＭとすることができる。
【００４２】
当業者であれば、比較的高濃度のカルシウムを含有するある種のサンプル（例えば、酪農製品、ゴマ種子、亜麻種子）を本開示の方法に使用可能であることを認識されるであろう。所望により、カルシウムキレート化合物（培養装置に供給されるもの及び／又は装置に添加されるもののいずれか）の量は、サンプル中に存在する多量のカルシウムを相殺するよう接種時に調節され得る。このアプローチを実施例５に示す。
【００４３】
有効量のカルシウムキレート化合物により、カビ微生物の横方向の生長率が低減される。したがって、任意の実施形態では、所定の増殖期間（すなわち、３０℃で４８時間のインキュベート後）後、有効量のカルシウムキレート化合物を含む薄膜式培養装置における特定のカビ種のコロニーの平均直径は、有効量のカルシウムキレート化合物を含まない、類似の薄膜式培養装置における同一のカビ種のコロニーの平均直径よりも少なくとも約３０％小さい。任意の実施形態では、所定の増殖期間後、有効量のカルシウムキレート化合物を含む薄膜式培養装置における特定のカビ種のコロニーの平均直径は、有効量のカルシウムキレート化合物を含まない、類似の薄膜式培養装置における同一のカビ種のコロニーの平均直径よりも少なくとも約５０％小さい。任意の実施形態では、所定の増殖期間後、有効量のカルシウムキレート化合物を含む薄膜式培養装置における特定のカビ種のコロニーの平均直径は、有効量のカルシウムキレート化合物を含まない、類似の薄膜式培養装置における同一のカビ種のコロニーの平均直径よりも少なくとも約９０％小さい。
【００４４】
図面に戻り、第１の乾燥コーティング１６は、存在する場合、膜１４の上面の生長領域４０、又は耐水基材（例えば、図１〜４に示す通り、第１の基材１２）に固定されており、かつ同じ広がりを持っている。図１には、本体部材１０の一端部に沿ってヒンジ式の方法で連結されているものとして、第２の基材１８（運搬、保管、及びインキュベート中に生長領域４０を覆うよう機能する）も示す。好適な第１の基材及び第２の基材としては、米国特許第４，５６５，７８３号に記載のものが挙げられ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００４５】
第１の基材１２は、好ましくは、水を吸着しない又は水による影響を受けないポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン等の材料製の比較的剛性の耐水フィルムである。厚さ約１００μｍ〜約１８０μｍのポリマーフィルム、厚さ約１００μｍ〜約２００μｍのポリプロピレンフィルム、及び厚さ約３００μｍ〜約３８０μｍのポリスチレンフィルムが好適である。他の好適な基材には、ポリエチレン又は他の耐水性コーティングを有する紙が挙げられる。好適なポリエチレンコーティング紙基材の例は、「Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ  Ｔｙｐｅ  ＭＩＬ」写真印画紙（Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ  Ｐｕｌａｓｋｉ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから入手可能）である。任意の実施形態では、第１の基材１２は、第１の基材１２を通してコロニーを観察することが望ましい場合には透明又は半透明とすることができる。
【００４６】
使用中に、生長領域４０を覆って第２の基材１８を配置するとき、通気膜１４により生長領域４０に空気を十分に供給することができる。そのため、膜１４は、培養装置において好気性微生物（例えば、好気性糸状菌類）の生長を支持するのに有用である。これは、生長に加え又は生長以外の理由のため、例えば、以下に詳述する通り微生物コロニーの視認性を上げる色素を酸化するために、微生物に空気が必要とされる場合にも有用である。通気膜１４に好適な特性及び材料は、米国特許第５，０８９，４１３号に開示され、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００４７】
任意の実施形態では、第１の基材１２、第２の基材１８又は通気膜１４のいずれかは、好ましくは、米国特許第５，０８９，４１３に示される通り、それらの上に印刷されており微生物コロニーの計数を容易にする、視認可能な格子模様を有する。
【００４８】
任意の実施形態では、第１の乾燥コーティング１６及び／又は第２の乾燥コーティング１６’は、冷水に溶解性であり、かつカビ微生物、及び所望により酵母微生物の生長を支持し得る任意の好適な形態の乾燥した培養培地を含み得る。このような培地は公知である。本開示の装置の任意の実施形態では、第１の乾燥コーティング１６は、１種以上のゲル化剤及び１種以上の微生物を生長させるための栄養分（例えば、カビ微生物）からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含有する。
【００４９】
第１の乾燥コーティング１６及び／又は第２の乾燥コーティング１６’に使用するのに好適なゲル化剤には、冷水溶解性の天然及び合成ゲル化剤が挙げられる。天然ゲル化剤、例えば、アルギン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、グアーガム、ローカストビーンガム、キサンタンガムなど、並びに合成ゲル化剤、例えば、ポリアクリルアミドなどは概して好適である。本発明の装置がカビアッセイに使用することを意図するものである場合に、ゲル化剤の選択は特に重要である。ある種のカビでは、一部のゲル化剤、例えば、グアーガムなどは、かかるカビがこのようなゲル化剤を代謝し得ることから使用に好適でない。適切なゲル化剤は、本発明の教示により、装置に意図される用途に合わせて選択することができる。好ましいゲル化剤にはローカストビーンガム及びキサンタンガムが挙げられ、これらのゲル化剤は、それぞれが、又は好ましくは一緒に組み合わせたものが有用である。
【００５０】
上記の通り、第１の乾燥コーティング１６にはゲル化剤のみを含有させ、栄養剤は含有させなくてもよい。微生物を含有することが見込まれる水性サンプルの添加前に、使用者は、生長させる微生物の種類に合わせた栄養分を添加できる。例えば、乾燥粉末化した栄養分をエタノール又は揮発性クロロフルオロカーボンなどの高蒸発性の液体に懸濁でき、及びこの懸濁液を装置の生長領域に載せることができる。他の例では、乾燥粉末化した栄養分を、水溶液に懸濁、例えば、分散又は溶解させて、培養装置の生長領域上にコーティングでき（例えば、米国特許第４，５６５，７８３号に記載の通り）あるいは生長領域に載せることができる。いずれにせよ栄養分の懸濁液又は溶液のアリコートを培地表面に加えるとき、この液体を蒸発させて、ゲル化剤と一緒に十分な栄養分を残存させることができる。更に他の例では、サンプルを使用して培地装置に接種する前、サンプルを培養装置に接種している間、及び／又はサンプルを培養装置に接種した後に、栄養分又は栄養分混合物を水性サンプルに添加することができる。
【００５１】
薄膜式培養装置に使用するのに好適な具体的な栄養分は、装置における微生物の生長によって異なり、かつ当業者により容易に選択され得る。概して、このような栄養分は冷水溶解性である。
【００５２】
任意の実施形態では、第１の乾燥コーティング１６及び／又は接着層２０には、色素、架橋剤、又は抗生物質などの試薬といった、その他の成分を含有させることもできる。例えば、いくつかの使用については、コーティング又は接着させる粉末培地の接着剤中に染料を組み込むことが望ましい。好適な色素には、微生物の生長により代謝され又は微生物の生長により反応して、コロニーを着色し又は蛍光させて可視化を容易にするものが挙げられる。このような色素には、例えば、５−ブロモ−４−クロロインドイルホスフェート二ナトリウム塩などの発色性酵素基質が挙げられる。その他の好適な色素には、例えば、ニュートラルレッド又はクロロフェノールレッドなどのｐＨ指示色素が挙げられる。
【００５３】
いくつかの用途に関し、媒質に溶解させたときに画線による接種を可能にするのに十分剛性である乾燥培地を含む薄膜式培養装置を有することが望ましい。画線可能な培地を形成させるため、ゲル化剤を含有する乾燥培地に有効量の好適な架橋剤を組み込むことができる。好適な架橋剤は、意図される微生物の生長に実質的な影響を与えないものである。架橋剤の好適な種類及び量は、当業者により容易に選択される。例えば、グアーガムについては、四ホウ酸カリウム又はアルミニウム塩などの架橋剤が好適であり、有効量、例えば、乾燥培地の約１．０重量％未満を添加することができる。
【００５４】
任意の実施形態では、薄膜式培養装置には、所望により、特定の微生物試験を実施するのに必要な試薬を含有させることができる。例えば、抗生物質感受性試験を実施するため、抗生物質を含有させることができる。微生物を同定するため、特定種の微生物が存在すると色が変化する試薬を含有させることができる。細菌と干渉させずに酵母又はカビサンプルを生長させるため、クロラムフェニコール、クロルテトラサイクリン、酒石酸、又は好適なペニシリンなどの静菌剤、又は殺菌剤を乾燥培地に含ませることができる。
【００５５】
本開示の薄膜式培養装置は、図１に例示する通りの第２の基材などの、例えば、培養装置の少なくとも生長領域４０を覆うのに適した第２の基材を含む。任意の実施形態では、第２の基材１８は、好ましくはコロニーの観察及び計数を容易にするため透明である。更に第２の基材１８は、微生物及び水蒸気に対し実質的に不透過性である。概して、第２の基材は、第１の基材１２の作製に使用される材料から作製することができる。通気膜１４を介して生長領域に空気が供給されることから、第２の基材に、培地に空気を輸送するものを選択する必要はない。第２の基材に好ましい材料はポリプロピレンであり、例えば、厚さ４０μｍの２軸配向ポリプロピレンフィルムである。
【００５６】
第２の基材１８には、なんらコーティングが存在しなくてもよく、あるいは第２の基材１８に、接種した薄膜式培養装置の生長領域４０を覆わせて密閉するのを容易にさせる目的で、コーティングしてもよく、例えば、第１の基材１２に面する表面上をコーティングしてもよい。更に、図３及び４に例示する第２の基材１８などの、第２の基材は、接着層２０’及び第２の乾燥コーティング１６’の複数の層により（例えば、第１の基材１２に面する表面を）所望によりコーティングすることができる。接着層２０’は、接着層２０と同じであっても異なっていてもよい。第２の乾燥コーティング１６’は、冷水溶解性のゲル化剤、栄養分、指示薬、選択薬、又は前述の任意の２つ以上の組み合わせを含む。第２の基材１８に対するコーティングは、乾燥コーティングに面する表面全体を覆うものとすることができるものの、好ましくは、少なくとも培地の生長領域と同じ広がりを持っている。このようにコーティングされた第２の基材は、第１の乾燥コーティング１６だけに組み込むことが可能な量よりも多量のゲル化剤を装置に供給することが望まれるときに特に好ましい。
【００５７】
本発明の装置は、第１の乾燥コーティング１６及び第２の基材１８の間に、第１の乾燥コーティング１６の生長領域４０を画定しかつ培養装置の生長領域４０に水性サンプルをとどめるウェルを形成させる目的で、スペーサー手段を含ませることもできる。スペーサー手段の一実施形態を、円形孔２６を画定するスペーサー２４として図２に例示する。孔２６の壁が、培養装置の生長領域４０上に、所定の寸法及び形状を有するウェルをもたらす。スペーサー２４は、生長領域の寸法及び培地に配置するサンプルの寸法に応じ、所望の容積、例えば、１、２、又は３ｍｌのウェルを形成するのに十分な厚みのものとすべきである。任意の実施形態では、スペーサー２４は、独立気泡ポリエチレンフォームで作製される。しかしながら、疎水性（非湿潤性）であり、微生物に対し不活性であり、及び任意の実施形態では、滅菌可能である任意の材料を使用できる。任意の実施形態では、スペーサー２４は、第１の乾燥コーティング１６、通気膜１４（存在する場合）及び／又は第１の基材１２に結合させることができる（例えば、感圧接着剤により）。
【００５８】
本発明の装置は、様々な技術を使用して作製することができる。概して、装置は、手作業により作製することができ、又は例えば、米国特許第４，５６５，７８３号；同第５，０８９，４１３号；及び同第５，６０１，９９８号（それらは参照によりその全体が本明細書に援用される）に詳述されるものなどの一般的な研究室設備を利用して作製することができる。
【００５９】
図３及び４は、本開示による装置の代替的実施形態を例示する。薄膜式培養装置２００は、上面及び底面を備える防水性の第１の基材１２を有する、本体部材１０’を含む。膜１４の底面は、少なくとも基材１２の上面の生長領域４０に固定される（例えば、接着剤により固定され、又はその他の方法により取り付けられる）。任意の実施形態では、第１の基材１２の上面には、膜１４を固定するのに使用される接着層３０がコーティングされている。接着層３０は好ましくは感圧性で、水に不溶性で、かつ目的とする微生物の生長を実質的に阻害しないものである。好ましい接着剤には、本明細書において接着層２０及び２０’と関連して記載のものが挙げられる。多くの場合、好適な接着剤により予めコーティングされている好適な基材が利用可能である。しかしながら、望むならば、好適な基材を選択して、好適な接着剤によりコーティング（例えば、ナイフコーターを使用して）することができる。
【００６０】
膜１４を第１の基材１２に対し固定する方法は、接着層３０の性質によって異なるであろう。例えば、接着層３０が感圧性接着剤である場合、接着層３０上に膜１４が配置され、押し付けられ、その場に接着される。第１の乾燥コーティング１６は、任意の好適な方法で固定され、少なくとも膜１４の生長領域４０を覆う。
【００６１】
任意の実施形態では、図３及び４に例示する、１種以上の粉末を含み得る第１の乾燥コーティング１６は、最初に少なくとも膜１４上面の生長領域上に接着層を形成することにより、作製及び固定される。接着剤は好ましくは感圧性で、水に不溶性で、かつ目的とする微生物（例えば、カビ微生物）の生長を実質的に阻害しないものである。好ましくは、接着層２０も、湿潤させたときに微生物のコロニーを視認するのに十分透明である。
【００６２】
好適な感圧接着剤の非限定例は、モル比９０／１０の２−メチルブチルアクリレート／アクリル酸（３Ｍ社，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）の共重合体である。使用することができる他の好ましい感圧性接着剤としては、モル比９５／５又は９４／６のイソオクチルアクリレート／アクリル酸（３Ｍ社）、及びシリコーンゴムが挙げられる。コロニーの可視化を容易にする目的で上記の通り色素を組み込むとき、概して、粉末よりも接着剤に色素を組み込むことが好ましい。
【００６３】
接着剤を（例えば、ナイフコーターを使用して）膜１４の上面にコーティングして、好ましくは第１の乾燥コーティング１６又は第２の乾燥コーティング１６’の粒子の平均直径未満の厚みを有する層を形成させる。概して、粒子を膜１４に接着させるのに十分であるものの、粒子を接着剤に完全に埋没させない程度の接着剤をコーティングする。概して、厚さ約５μｍ〜約１２μｍの接着層が好適である。
【００６４】
次に、粉末培地を接着させるために、冷水溶解性の粉末層（第１の乾燥コーティング１６）を、少なくとも接着層２０の生長領域に実質的に均一に接着させる。
【００６５】
第１の乾燥コーティング１６は、上記の１種以上の成分（例えば、カルシウムキレート化合物、栄養分、指示薬、選択薬、ゲル化剤又は前述の成分のうち任意の２つ以上の組み合わせ）を含む。好ましくは、第１の乾燥コーティング１６にゲル化剤を含有させるとき、ゲル化剤は、培地への所定量（例えば、１〜３ｍｌ）の水又は水性サンプルの配置により、好適な粘度を有する、例えば、ブルックフィールドモデルのＬ  ＶＦ粘度計を使用して２５℃にて６０ｒｐｍで測定したときに約１５００ｃｐｓ以上の粘度を有する、再水和した媒質が形成されるような量で含まれる。この粘度の培地は、取り扱いが簡単であり、インキュベート中に装置を積み重ねることができ、及びこの培地における明瞭なコロニー形成をもたらす。例えば、０．０２５ｇ〜０．０５０ｇの粉末グアーガムを、２０．３ｃｍ２の表面領域上に実質的に均一に広げることで、１〜３ｍＬの水性サンプルにより溶解させたときに十分な粘性の培地がもたらされる。単位面積当たりのコーティング重量を制御するために、粉末粒径が使用され得る。例えば、１００メッシュのグアーガムが使用される条件下では、重量が約０．０５ｇ／２０．３ｃｍ２になるようコーティングされ、４００メッシュのグアーガムが使用される条件下では、重量が約０．０２５ｇ／２０．３ｃｍ２になるようコーティングされる。
【００６６】
接着させる粉末培地に好ましい、栄養分に対するゲル化剤比は、装置で生長させる具体的な微生物により決定される。しかしながら、汎用の任意の実施形態では、約４：１〜約５：１（重量に基づき合計の栄養分に対する合計ゲル化剤）の比率が好ましいであろう。実質的に均一な層を塗布するのに好適な、任意の手法により、粉末又は粉末の凝集塊から構成され得る第１の乾燥コーティング１６を接着層２０に塗布することができる。好ましい方法には、シェーカー型の装置の使用、又は粉末コーターの使用が挙げられる。その他の好ましい形態の乾燥コーティング、すなわち培地コーティングは、実質的に水を含まないコーティングとして、少なくとも膜、第１の基材及び／又は第２の基材の上面の生長領域に直接コーティングすることによって作製される。培地コーティングは、概して自己接着して膜になり、膜及び培地の間には接着剤層は必要とされない。
【００６７】
培地コーティングは、ゲル化剤及び／又は栄養分を含有する溶液を作成し、この溶液を膜上にコーティングして（例えば、ナイフコーターを使用して）、溶液のコーティングを乾燥させることにより作製される。上記の好適なゲル化剤に加え、寒天は、培地コーティングに使用するのに好適な冷水に溶解性のゲル化剤である。ゲル化剤は、膜上へのコーティングを容易にする目的で、培地溶液にとろみを付けるために機能させることもできる。実用目的で、ゲル化剤の量は、好ましくは、実際に培地を膜上にコーティングするときを除き、溶液にとろみをもたらす量よりも少ない。
【００６８】
本発明の装置には、スペーサー手段を含有させることもできる。任意選択的なスペーサー手段を、任意の好適な手法により第１の乾燥コーティング及び第２の基材１８の間に固定させることができる。例えば、接着層２０を介し膜１４又は第１の基材１２に接着させることができる。感圧接着層２０に対し押圧することによりスペーサーを固定できる。
【００６９】
第２の基材１８は、好ましくはスペーサー２４の一端部に沿ってヒンジ式の方法で接着され、所望により、接着層２０’及び第２の乾燥コーティング１６’でコーティングされる。あるいは、第２の基材１８は、基材１２に直接接着させることができる（図示せず）。
【００７０】
本開示の薄膜式培養装置は、好気性微生物、及び特に好気性のカビを生長させるのに特に有用である。概して、本発明の装置の使用は、接種、インキュベート、及び単離及び／又は分析に標準的な工程を含む。
【００７１】
別の態様では、本開示は、サンプル中のカビ微生物を計数するための方法を提供する。この方法は、本明細書に開示される薄膜式培養装置の任意の実施形態に使用できる。方法は、薄膜式培養装置において、接種された培養培地を形成することと、顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーを形成させるのに十分な所定の期間にわたって、接種された培養培地をインキュベートすることと、薄膜式培養装置において、顕微鏡検出可能なカビ微生物のコロニー数を計数することと、を含む。
【００７２】
方法の任意の更なる実施形態では、接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により水和された生長領域を形成することを含む。任意の実施形態では、サンプル材料（例えば、液体サンプル、固体サンプル、又は液体に懸濁された固体サンプルのいずれか）は、所定量の水性液体で溶解又は懸濁され、したがって、サンプル及び所定量の水性液体は同時に（例えば、ピペット操作により）薄膜式培養装置の生長領域に載せられる。
【００７３】
あるいは、任意の実施形態では、サンプル材料は、所定量の水性液体よりも前に生長領域に載せられる。
【００７４】
あるいは、任意の実施形態では、所定量の液体を生長領域に載せて、ゲル化剤を膨潤／水和させる。続いて、培養装置を開き、水和させたゲルにサンプル材料を載せる。任意の実施形態では、サンプルは、例えば、膜フィルターなどのサンプル捕捉装置上に配置することができる。
【００７５】
培養装置における乾燥コーティング及び／又は粉末が、微生物の生長に必要とされる栄養分を含む場合、培養装置の接種に使用されるサンプル材料又は水性液体には、いずれにもカビ微生物の生長を促進する栄養分を含有させる必要はない。しかしながら、任意の実施形態では、装置の接種に使用されるサンプル材料及び／又は水性液体には、カビ微生物の生長を促進する１種以上の栄養分を含ませることができる。更に、任意の実施形態では、装置への接種に使用されるサンプル材料及び／又は水性液体には、存在し得るその他の微生物（例えば、細菌、酵母）ではなく全てのカビ微生物を生長させるのに望ましい選択薬、又は存在し得るその他のカビ微生物ではなく特定のカビ微生物に望ましい選択薬（例えば、抗生物質、特定のカビ微生物では代謝可能であり、その他のカビ微生物では代謝不能である必須栄養分）を含ませることができる。
【００７６】
図１及び２の装置を使用するため、ユーザーが透明な第２の基材１８を引き剥がし、生長領域を露出させた後、所定量の水性液体（所望により、サンプル材料を含有する）を、培養装置の生長領域４０内の第１の乾燥コーティング１６上に、例えば、ピペット操作により配置する。例示の実施形態における生長領域４０は、スペーサー２４において孔２６により画定される。これにより、第１の乾燥コーティング１６が再水和される。次に、再水和させた媒質の上に、第２の基材１８を配置し、例えば、カバーした装置の上部におもりプレートを配置することにより、生長領域上にサンプルを均一に広げる。次に、微生物のコロニーを生長させる目的で、この装置を好適な温度かつ好適な時間にわたってインキュベートする。培地におけるコロニーの生長は、第２の基材１８を通してそれらを観察することにより計数できる。望ましくは、コロニーは、更なる同定及び／又は分析のため培地から除去することもできる。
【００７７】
図３及び４に例示する装置１１の実施形態は、図３にはスペーサー２４が存在しないことを除き図１及び２と同一である。このような実施形態を使用するため、水性液体を生長領域に載せた後、型板（例えば、生長領域を画定する採寸された円環）を一時的に第２の基材１８上面に貼り付け、装置を閉じることで、型板により取り囲まれた生長領域に、再水和された培地を閉じ込めることができる。生長領域においてゲル化剤の少なくとも一部分が水和される期間の後、この型板を培養装置から取り除いてもよい。典型的には、ゲル化剤の少なくとも一部分は、２〜３秒以内に水和される。
【００７８】
本開示による薄膜式培養装置において、接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により水和された生長領域を形成することを含む。水和された生長領域が形成されたとき、生長領域に存在するカルシウムキレート化合物が、接種された培養培地に、培養装置において生長するカビ微生物のコロニーの横方向拡大率を低減させるのに有効な濃度で溶解される。驚くべきことに、カルシウムキレート化合物の溶解濃度は、培養装置において生長するカビ微生物のコロニーの横方向拡大率を、コロニーの検出を大幅に遅延させることなく低減させる。すなわち、コロニーは、典型的には、有効量のカルシウムキレート化合物の存在しない装置において、同じ培養培地に慣習的に使用されるものとおよそ同じ期間にわたって装置をインキュベートした後に、検出され得る。任意の実施形態では、有効量（すなわち、水性液体に溶解させたときの有効濃度）のカルシウムキレート化合物は、存在していれば、この化合物を含有させなかった場合に所定の時間内に検出され得る酵母微生物の検出を、大幅に遅延させるものではない。
【００７９】
当業者であれば、特定の栄養培地において生長するカビ微生物の、顕微鏡検出可能なコロニーを形成させるのに十分なインキュベート条件（例えば、温度、時間長）に十分に思い当たるであろう。典型的には、培養装置は、周囲温度（約２５℃）〜約３２℃でインキュベートされる。検出されるカビ微生物に合わせ、培養装置は包括的に約４０時間〜約１２０時間インキュベートされ得る。任意の実施形態では、培養装置は、約４０時間〜約９６時間インキュベートされる。
【００８０】
薄膜式培養装置において、顕微鏡検出可能なカビ微生物のコロニー数を計数することは、培養装置の生長領域に存在するコロニーを観察することを含む。任意の実施形態では、コロニーを観察することは、コロニーを視覚的に観察することを含む。コロニーが直接的に視覚的に観察され得ること（すなわち、技師が培養装置を観察する）、あるいはコロニーが間接的に視覚的に観察され得ること（すなわち、技師が培養装置の画像を観察する）が期待される。任意の実施形態では、顕微鏡検出可能なコロニー数を計数することは、第２の、顕微鏡検出可能な酵母微生物のコロニー数を計数することを更に含み得る。
【００８１】
任意の実施形態では、培養装置は、例えば、３Ｍ社（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）から入手可能なＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダー又はＳｙｎｂｉｏｓｉｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から入手可能なＰＲＯＴＯＣＯＬコロニーカウンターなどのコロニー計数装置を使用して画像化することができる。任意の実施形態では、画像中のカビコロニー及び／又は酵母コロニーは、市販の画像解析ソフトウェアを使用して検出及び計数することができる。
【００８２】
更に別の態様において、本開示はあるキットを提供するものである。キットは、本明細書に開示されるカビ微生物を計数する方法の任意の実施形態に使用することができる。キットは、カビ微生物を生長及び計数するための薄膜式培養装置と、所定量のカルシウムキレート化合物を収容する容器とを含む。培養装置の接種後に装置の生長領域に配置されたとき、所定量の一部分は、培養装置において生長するカビ種のコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに十分なものであり、コロニー形成単位の横方向拡大率の低減は、コロニーの検出を大幅に遅延させるものではない。
【００８３】
キットの任意の実施形態では、薄膜式培養装置は、防水性の第１の基材と、防水性の第２の基材と、第１及び第２の基材の間に配置された生長領域と、生長領域に配置された、乾燥しており冷水溶解性のゲル化剤と、生長領域に配置された、有効量のカルシウムキレート化合物と、を含み得る。生長領域が所定量の水性液体により水和され、カビ種のコロニー形成単位が接種されたとき、有効量のカルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減し得る。コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出が大幅に遅延することはない。
【００８４】
任意の実施形態では、キットは、栄養分、検出試薬、選択薬、緩衝剤、染料、及び前述の試薬のうちの任意の２種以上を含む混合物からなる群から選択される試薬を更に含む。
【００８５】
本開示の方法及び装置は、カビ微生物の生長に好適な温度で４８時間インキュベートした後のカビコロニーの平均直径を、カルシウムキレート化合物の存在しない実質的に同一の薄膜式培養装置において生長させたカビ微生物の平均コロニー直径と比較して、約３０％、約５０％又は少なくとも約９０％低減するために使用することができる。驚くべきことに、コロニーの横方向の拡大は最大９０％も低減されたにも関わらず、コロニーは、カビコロニーの検出及び計数に使用される典型的なインキュベート時間内で尚も観察可能であった。有利に、平均コロニー直径が低減することにより、低減させなかった場合には生長領域の大部分の領域に広がって他のカビコロニーを覆ってしまい、各コロニーの計数を難しくするカビ種を含むサンプル中のカビ微生物を、より正確に計数可能になる。
【００８６】
実施形態
実施形態Ａは、薄膜式培養装置であって、
防水性の第１の基材と、
防水性の第２の基材と、
第１の基材と第２の基材との間に配置された生長領域と、
生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、有効量のカルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることがない、薄膜式培養装置である。
【００８７】
実施形態Ｂは、実施形態Ａの薄膜式培養装置であり、生長領域に配置されたカルシウム塩を更に含むものである。
【００８８】
実施形態Ｃは、実施形態Ａ又は実施形態Ｂの薄膜式培養装置であり、カルシウムキレート化合物及び／又は存在していればカルシウム塩が第１の乾燥コーティングに配置されるものである。
【００８９】
実施形態Ｄは、実施形態Ａ〜Ｃのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、ゲル化剤が、第１の乾燥コーティング及び／又は第２の乾燥コーティングに配置されるものである。
【００９０】
実施形態Ｅは、実施形態Ａ〜Ｄのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、有効量のカルシウムキレート化合物が、カビ微生物の生長に好適な温度で４８時間インキュベートした後のカビ微生物の平均コロニー直径を、カルシウムキレート化合物の存在しない実質的に同一の薄膜式培養装置において生長させたカビ微生物の平均コロニー直径と比較して少なくとも３０％低減させるために使用するのに十分であるものである。
【００９１】
実施形態Ｆは、実施形態Ｅの薄膜式培養装置であり、有効量のカルシウムキレート化合物が、カビ微生物の生長に好適な温度で４８時間インキュベートした後のカビ微生物の平均コロニー直径を、カルシウムキレート化合物の存在しない実質的に同一の薄膜式培養装置において生長させたカビ微生物の平均コロニー直径と比較して少なくとも５０％低減させるために使用するのに十分であるものである。
【００９２】
実施形態Ｇは、実施形態Ｆの薄膜式培養装置であり、有効量のカルシウムキレート化合物が、カビ微生物の生長に好適な温度で４８時間インキュベートした後のカビ微生物の平均コロニー直径を、カルシウムキレート化合物の存在しない実質的に同一の薄膜式培養装置において生長させたカビ微生物の平均コロニー直径と比較して少なくとも９０％低減させるために使用するのに十分であるものである。
【００９３】
実施形態Ｈは、実施形態Ａ〜Ｇのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、カルシウムキレート化合物が、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、又はクエン酸塩を含むものである。
【００９４】
実施形態Ｉは、実施形態Ｈの薄膜式培養装置であり、カルシウムキレート化合物が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物を含み、前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物が、コーティング密度約０．５ｍｇ〜約１２ｍｇ／１００ｃｍ２で生長領域において乾燥コーティング内に配置されるものである。
【００９５】
実施形態Ｊは、実施形態Ａ〜Ｈのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、カビ微生物の生長を支持する栄養培地を更に含むものである。
【００９６】
実施形態Ｋは、実施形態Ａ〜Ｊのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、指示薬を更に含むものである。
【００９７】
実施形態Ｌは、実施形態Ａ〜Ｋのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、所定量の水性液体を更に含み、生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物が、生長領域に配置された有効量を含有する培養装置において生長するカビ種のコロニーの横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに有効な濃度で水性液体に溶解されるものである。
【００９８】
実施形態Ｍは、実施形態Ａ〜Ｋのいずれか１つの薄膜式培養装置であり、第１の基材に接着させた通気膜を更に含み、通気膜が培養装置の生長領域と実質的に同じ広がりを持っているものである。
【００９９】
実施形態Ｎは、微生物を計数するための方法であり、
生長領域に配置された、有効量のカルシウムキレート化合物を含む薄膜式培養装置の生長領域において、接種された培養培地を形成させることと、
顕微鏡検出可能なカビ微生物コロニーを形成させるのに十分な所定の期間にわたって、接種された培養培地をインキュベートすることと、
薄膜式培養装置において、顕微鏡検出可能なカビ微生物のコロニー数を計数することとを含み、
接種された培養培地を形成することは、所定量の水性液体により水和された生長領域を形成することを含み、
生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、カルシウムキレート化合物は、培養装置において生長する前記コロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させ、
横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることがないものである。
【０１００】
実施形態Ｏは、実施形態Ｎの方法であり、有効量のカルシウムキレート化合物が、存在していれば、この化合物を含有させなかった場合に所定の時間内に検出され得る、酵母微生物の検出を大幅に遅延させないものである。
【０１０１】
実施形態Ｐは、実施形態Ｏの方法であり、生長領域において顕微鏡検出可能な酵母コロニーの数を計数することを更に含むものである。
【０１０２】
実施形態Ｑは、実施形態Ｎ〜Ｐのいずれか１つの方法であり、
接種された培養培地を形成することは水性サンプルを薄膜式培養装置に載せることを含み、
水性サンプルを載せる前に、薄膜式培養装置は、栄養培地、指示薬、及び／又は有効量のカルシウムキレート化合物を含むものである。
【０１０３】
実施形態Ｒは、実施形態Ｎ〜Ｑのいずれか１つの方法であり、接種された培養培地を所定の期間インキュベートすることが、接種された培養培地を約４０時間〜約９６時間インキュベートすることを含むものである。
【０１０４】
実施形態Ｓは、実施形態Ｎ〜Ｒのいずれか１つの方法であり、顕微鏡検出可能なコロニーの数を計数することが、薄膜式培養装置の生長領域の画像を得ることを含むものである。
【０１０５】
実施形態Ｔはキットであり、
カビ微生物を生長及び計数するための薄膜式培養装置と、
所定量のカルシウムキレート化合物を収容する容器とを含み、
培養装置の接種後に培養装置の生長領域に配置されたとき、所定量の一部分は、培養装置において生長するカビ種のコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させるのに十分なものであり；
コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることはないものである。
【０１０６】
実施形態Ｕは実施形態Ｔのキットであり、薄膜式培養装置が、
防水性の第１の基材と、
防水性の第２の基材と、
第１の基材と第２の基材との間に配置された生長領域と、
生長領域に配置された乾燥した冷水溶解性のゲル化剤と、
生長領域に配置された有効量のカルシウムキレート化合物とを含み、
生長領域が所定量の水性液体により水和されカビ種のコロニー形成単位を接種されたとき、有効量のカルシウムキレート化合物は、培養装置において生長するコロニー形成単位の横方向拡大率を、生長領域に配置された有効量を含有していないことを除き同一の培養装置において生長する同一のカビ種のコロニーの横方向拡大率と比較して低減させることができ、
コロニー形成単位の横方向拡大率を低減させても、コロニーの検出を大幅に遅延させることはないものである。
【０１０７】
実施形態Ｖは、実施形態Ｔ又は実施形態Ｕのキットであり、栄養分、検出化合物、選択薬、緩衝剤、染料、及び前述の試薬のうちの任意の２種以上を含む混合物からなる群から選択される試薬を更に含むものである。
【０１０８】
本発明を例示するため、以下の実施例を提供する。実施例は本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０９】
材料
別途記載のない限り、全ての試薬はシグマ・アルドリッチ社から得た。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
実施例１〜４カビ微生物を検出するための薄膜式培養装置
栄養培地粉末混合物の調製
非タンパク質性成分４〜１１（表２）の５バッチを、表に記載の量で２５０ｍＬプラスチック容器に計量した。表３に示す量で各バッチにＥＤＴＡを添加した。ＥＤＴＡの添加後、各粉末混合物をコーヒーグラインダーで３０秒間均質化した（ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄ  ｍｏｄｅｌ  ＢＣＧ１１１０Ｂ；ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄ；Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＩ）。均質化後、表１のタンパク質性成分１〜３を添加した後、手作業で３０秒間振って、粉末を混合した。比較例１は、ＥＤＴＡを除く全ての成分を用いて調製した。実施例において使用するとき、「ＥＤＴＡ」は、シグマ・アルドリッチ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得たエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物（ＣＡＳ  Ｎｏ．６３８１−９２−６）を指す。
【０１１２】
【表２】
0006469088.tif 000003
【０１１３】
【表３】
0006469088.tif 000004
【０１１４】
薄膜式培養装置の作製
表２に示す量でブレンドした粉末に、キサンタン／ローカストビーンガム（ＸＬＢＧ）の１：１（ｗ／ｗ）混合物を含む乾燥している粉末ゲル化剤（３００ｇ）を添加した後、手作業により３０秒間振って混合した。米国特許第４，４７６，２２６号及び同第５，０８９，４１３号に概説される手順により培養プレートを作製した。簡単に、マスターロールから、３×４インチ（７．６×１０．２ｃｍ）のボトムフィルム部分（すなわち、本明細書において上記した通りの「第１の基材」）を切り出した。マスターロールは、疎水性コーティングした紙と、この紙面上にコーティングされた接着剤の薄層［米国特許第５，６３５，３６７号の実施例１に記載の非阻害的な接着剤コポリマー（酢酸エチル及びヘプタン溶液中固形分約２４％）、参照によりその全体が本明細書に援用される］とから構成された。接着剤は、クロラムフェニコール及びクロルテトラサイクリンにより処方され、本質的に、米国特許第５，０８９，４１３号の実施例１に記載の通りにマスターロール上にコーティングされた。厚さ約０．５７ｍｍであり直径２．４インチ（６．１ｃｍ）の円を切り取ったフォーム層を各ボトムフィルムに積層した。開口部に約２ｇの粉末を塗布した後、前後左右に動かし、粉末を接着剤上に均一に分布させる。過剰な粉末はフィルムをひっくり返して除去し、接着剤層に栄養分／ゲル混合粉末を結合させた薄層を得た。接着層を含む透明なトップフィルムをキサンタン／ローカストビーンガム混合物により粉末コーティングし、同様に７．６×１０．２ｃｍ片に切り出し、両面接着テープ（３Ｍ社，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を使用してボトムフィルムの上面端部に接着した。接着層は、表４に示す酵素基質と混合した上記接着剤を含んだ。
【０１１５】
【表４】
0006469088.tif 000005
【０１１６】
アスペルギルス・ニガー（Aspergillusniger）の接種及び薄膜式培養装置のインキュベート
凍結保存したアスペルギルス・ニガー（Aspergillusniger）（ＡＴＣＣ  １６４８４）をバターフィード緩衝液で段階希釈して、１ｍＬ当たり約１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）とした。上記の粉末処方でコーティングしたこの薄膜式培養装置のカバーシートを持ち上げ、コーティングしたボトムフィルムの中央で１ｍＬの希釈サンプルをピペッティングし、カバーシートを再設置し、３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ酵母＆カビカウントプレート（以降「ＰＹＭプレート」；３Ｍ社，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）に付属のスプレッド装置を使用して下向きに圧力を加えて、接種菌液をフォーム積層体に開いている円形の孔の端部に放射状に分散させることにより、装置に接種した。各粉末コーティング組成は、３つ組で複製し調製した。接種後、このプレートを３０℃に設定したインキュベータに設置した。
【０１１７】
薄膜式培養装置の分析
３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅを計数するよう設定した３Ｍ  ＰＥＴＲＩＦＩＬＭプレートリーダー（３Ｍ社，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を使用し、４２、４８、及び６６時間の時点でプレート画像を得た。ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）で、「ｃｏｕｎｔ／ｓｉｚｅ」機能によりコロニー面積を測定した。ヒストグラムベースの閾値を用い、次の強度値を使用し、青色コロニーの縁部を判別した。赤＝１２４〜２０５、緑＝１８２〜２５５及び青＝１１２〜２５５。各画像に関し、接種した領域端部の、重なり合っている（接触している）コロニー及び不規則に切り欠きのあるコロニー（すなわち、円形ではない）を分析から除外した。インキュベート開始から４２時間後に、各バッチのプレートについて、平均コロニー寸法を求めた（３枚の複製プレートから得られたコロニーの直径を利用して算出）。結果を表５に掲載する。
【０１１８】
【表５】
0006469088.tif 000006
【０１１９】
所定のインキュベート期間後（各４２時間及び６６時間）、青く着色したコロニーを手作業で計数して、定量的なカビ数を求めた。複製した培養装置の各セットの合計コロニーの数を表６に示す。
【０１２０】
【表６】
0006469088.tif 000007
【０１２１】
様々なカビ種の検出
アスペルギルス・ニガー（A. niger）の培養について記載の通り、表７に示すカビ種を段階希釈し、接種し、インキュベートし、画像化し、分析した。各カビ種について、実施例１〜４の薄膜式培養装置を使用して観察された平均コロニー寸法を、比較例１の薄膜式培養装置を使用して観察された平均コロニー寸法と比較した。各サンプルの平均コロニー寸法の低減率（％）を表７に掲載する。乾燥粉末コーティングの１重量％超の濃度のＥＤＴＡを含む培養装置では、いくつかの種で、視認可能なコロニーの出現の遅延が観察された。
【０１２２】
【表７】
0006469088.tif 000008
１−アスペルギルス・オリゼ（Aspergillusoryzae）の平均コロニー寸法は、このＥＤＴＡ濃度で５％増加した。
２−ジオトリカム・カンディダム（Geotrichumcandidum）の平均コロニー寸法は、このＥＤＴＡ濃度で１％増加した。
３−この濃度ではコロニーは検出されなかった。
【０１２３】
実施例５カルシウムキレート化合物を含有する薄膜式培養装置を使用する、高カルシウム食品サンプルにおけるカビ検出
近所の食料品店から脱脂粉乳を購入した。１０ｍＬの脱脂粉乳に３．７ｍｇのＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物を加え、最終濃度１ｍＭ  ＥＤＴＡを得た。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）（ＡＴＣＣ  ＃１６４８４）をバターフィールド緩衝液に希釈して、濃度約５００コロニー形成単位／ｍＬとした。ミルクサンプルに希釈懸濁液１００μＬを加えた。簡単にボルテックスにかけた後、カビを含有しているミルクサンプル１ｍＬを使用して、製造元の指示に従いＰＹＭプレートに接種した。このＰＹＭプレートを３０℃で４８時間インキュベートした後、上記の通り画像化し、コロニー寸法を分析した。バターフィード緩衝液で、対照サンプル（ミルク不含有）も調製した。コロニー寸法の低減率を表８に示す。
【０１２４】
【表８】
0006469088.tif 000009
【０１２５】
実施例６カルシウムキレート化合物を含有する薄膜式培養装置を使用する酵母微生物の検出
上記の通り薄膜式培養装置を作製した。凍結保存したものから３つの酵母株を段階希釈して、１ｍＬ当たり約１００ＣＦＵの最終濃度とした。上記の通り、薄膜式培養装置に接種し、９１時間インキュベートし、画像化し、分析した。データは、濃度１％未満のＥＤＴＡを存在させても、これらの非糸状菌のコロニー寸法には影響が出なかったことを示す。実施例１〜４に記載の通りにコロニー面積を算出し、ピクセルで記録した。ＥＤＴＡ濃度１％超の培養装置では、Ｃ．グラブラタ（C. glabrata）及びＲ．ムシラギノサ（R. mucilaginosa）のコロニーは検出されなかった。データを表９に示す。
【０１２６】
【表９】
0006469088.tif 000010
【０１２７】
実施例７〜１１カビ微生物を検出するための薄膜式培養装置
表１０に示す栄養分処方（これまでの実施例で加えた硫酸マグネシウム７Ｈ２Ｏ、塩化マンガン、及び硫酸亜鉛７Ｈ２Ｏを含まない）を使用して、実施例１〜４に記載の通りに薄膜式培養装置を作製、接種、及び分析した。実施例１〜４に記載の通りにＥＤＴＡを加えて、表１１に示す通りの最終濃度を得た。実施例１〜４に記載の通り、各処方の３つ組プレートにアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を接種し、４８時間及び７２時間の時点で画像化した。４８時間インキュベート時の数平均コロニー寸法、及び、４８時間及び７２時間インキュベート時に観察されたコロニーの数をそれぞれ表１２及び１３に記録する。
【０１２８】
【表１０】
0006469088.tif 000011
【０１２９】
【表１１】
0006469088.tif 000012
【０１３０】
【表１２】
0006469088.tif 000013
ＮＤ−画像加工に使用したパラメーターではコロニーが検出されなかった。
【０１３１】
【表１３】
0006469088.tif 000014
【０１３２】
実施例１２カビ微生物の検出方法
この実施例では、上記の通りコーティングされた栄養分処方中の成分として配置するのではなく、１ｍＬ接種菌液にＥＤＴＡを溶解させてプレートに加えた。実施例１に記載の通り、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の希釈懸濁液を調製した。１０ｍＬのバターフィード緩衝液に３．７ｍｇのＥＤＴＡを溶解させて、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を調製した。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）希釈懸濁液をＥＤＴＡ／バターフィード緩衝液に加えて、細胞濃度約５ｃｆｕ／ｍＬを得た。製造元の指示に従い、接種菌液１ｍＬをＰＹＭプレートに添加し、装置を５つ組で複製した。ＥＤＴＡを含有させてない、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の５ｃｆｕ／ｍＬ溶液から、一連の対照プレートを作製した。表１４は、インキュベート開始から４８時間及び７２時間後のプレート当たりの平均コロニー数を示す。表１５は、１ｍＭ  ＥＤＴＡ下で生長するカビコロニーが有した平均コロニー直径を示す。インキュベート開始から４８時間後、直径は対照プレートの１／２０であった。
【０１３３】
【表１４】
0006469088.tif 000015
【０１３４】
【表１５】
0006469088.tif 000016
【０１３５】
実施例１３薄膜式培養装置においてカビ微生物を検出する方法におけるＥＧＴＡの使用
１０ｍＬのバターフィード緩衝液に１５．２ｍｇのＥＧＴＡを溶解させて、４ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）溶液を調製した。段階２倍希釈を調製し、それぞれ２ｍＭ及び１ｍＭ  ＥＧＴＡを含有する溶液を調製した。実施例において使用するとき、「ＥＤＴＡ」は、シグマ・アルドリッチ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得たエチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（６７−４２−５）を指す。アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）を希釈し、実施例１２に記載の通りに溶液に添加し、最終細胞濃度約５ｃｆｕ／ｍＬを得た。製造元の指示に従い、１ｍＬカビ懸濁液をＰＹＭプレートに接種して、装置を３つ組で複製した。それぞれインキュベート開始から４８時間後及び７２時間後にプレート画像を得た。所定のインキュベート期間後（各４２時間及び６６時間）、青く着色したコロニーを手作業で計数して、定量的にカビ数を求めた。複製した培養装置の各セットの合計コロニー数を表１６に示す。各プレートの画像から、プレートカウント数（３枚のプレートの合計）を求めた。結果を表１６に示す。上記の通りのプレート画像化及び画像解析により、インキュベート開始から４８時間後の平均コロニー寸法を求めた。結果を表１７に示す。
【０１３６】
【表１６】
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【０１３７】
【表１７】
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【０１３８】
本明細書に引用する全ての特許、特許出願、及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を、参照により援用する。本出願の開示内容と本明細書に援用されたいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上術の詳細な説明及び実施例はあくまで理解を助けるために示したものである。したがってこれらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、図示及び説明された厳密な詳細に限定されるものではなく、当業者には明らかな変形例は特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれるものとする。
【０１３９】
全ての見出しは読者の便宜のためのものであって、特に断らない限り、見出しの後に続く文面の意味を限定するために使用されるものではない。
【０１４０】
本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な改変を行うことが可能である。これらの実施例及び他の実施形態は以下の特許請求の範囲に含まれるものである。
【０１４１】
本開示の利点及び実施形態を、以下の実施例によって更に例示するが、これらの実施例において記載される特定の材料及びその量並びに他の条件及び詳細は、本開示を不要に限定するものとして解釈すべきではない。特に断らない限り、全ての材料は市販されているか、又は当業者に既知である。
【図１】
0006469088.tif 000019
【図２】
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【図３】
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【図４】
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