(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原、M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原およびM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含み、前記抗原が完全体不活化バクテリンである免疫原性組成物。
【請求項２】
完全体不活化バクテリンがホルマリン不活化バクテリンである、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
免疫原性組成物が、対象動物において、M.ヒオリーニスによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
免疫原性組成物が、対象動物において、M.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である、請求項1または2に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
非ヒト対象動物を免疫する方法であって、請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を非ヒト対象動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
非ヒト対象動物がブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
免疫原性組成物が1回投与される、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項８】
3週齢以上の非ヒト対象動物に適切である、請求項5から7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を非ヒト対象動物に投与することを含む、非ヒト対象動物においてマイコプラズマ感染を治療及び／又は予防する方法。
【請求項１０】
対象動物におけるマイコプラズマ感染の治療及び／又は予防のための、請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、菌血症持続期間の短縮及び細菌負荷の低下又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで改善をもたらす、請求項5から9のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はM.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原を含む免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ（Mycoplasma）属の細菌はモリクテス（Mollicutes）綱に属し、フィルミクテス（Firmicutes）系統から派生した一群の生物である。モリクテスは自律的に複製する最小の生物であり、細胞壁を欠くという点で他の真正細菌とは構造的に異なる。それらの一重膜の表面は、複雑な免疫応答能を有する宿主という環境において適応及び生存を左右する重要な境界面と考えられる。さらにまた、モリクテスは小さなゲノムと限られた数の代謝経路を有する。したがって、マイコプラズマ属のメンバーはまた“自己複製最小生物”と言い表されている。しかしながら、この外見的単純性にもかかわらず、多数のマイコプラズマ菌はヒト及び広範囲の動物の病原体である。ビルレンスがトキシン、インバシン及びサイトリシンによってほぼ決定される他の病原性細菌とは対照的に、病原性マイコプラズマ菌はそのような典型的で直接的なビルレンス因子をもたないように思われる（Chambaud, I. et al, 2001, Nucleic Acids Res. 29: 2145-2153, Fraser et al, 1995, Science 270: 397-403）。病原性マイコプラズマが宿主に細胞損傷、炎症及び疾患をもたらすことを可能にする分子メカニズム及びエフェクターに関する利用可能な情報はこれまでのところほとんど存在しない。
【０００３】
病原性マイコプラズマは、ヒト及び動物で主として非定型的肺炎、泌尿生殖器感染及び関節炎を引き起こす（Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.；Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605）。該症状の再発及び悪化は繰り返され、徐々に慢性症に移行することが知られており、したがって早期診断及び早期治療とともに、悪化若しくは再発の予防又は治療が重要である。M.ヒオニューモニアエ（M. hyopneumoniae）は動物の風土病性肺炎の病因因子である。ブタでは、前記はもっとも一般的で、体重増加の減少及び低い飼料効率のために経済的に重要な疾患の1つである。当該疾患は、肺病巣、慢性の咳、艶のない被毛皮膚（dull hair coat）、数週間持続する発育不全的外観をもたらす。肺病巣（特に腹側先端肺葉及び心臓側肺葉）は、上皮細胞の過形成並びに血管周囲及び細気管支周囲の単核細胞の蓄積増加を特徴とする。M.ヒオリーニス（M. hyorhinis）（また別のブタ気道における一般的なマイコプラズマ）は、仔豚で多発性漿膜炎及び関節炎を引き起こし得る。M.ヒオシノビアエ（M. hyosynoviae）は一般に扁桃に定着し、関節炎症状を引き起こして経済的損失をもたらし得る。M.ヒオシノビアエは、関節及び咽頭/扁桃サンプルから単離され、血液及び関節液に抗体を誘導し得る。M.ボビス（M. bovis）はより病原性の強いマイコプラズマ種の1つと考えられ、広く世界的に顕著な経済的損失を引き起こす。マイコプラズマは、全ての齢のウシで重篤な臨床徴候を引き起こす。M.ボビスはウシで肺炎、乳房炎及び関節炎を引き起こすことが判明したもっとも頻出するマイコプラズマ病源体であり、その病因学的役割はまた耳炎、角結膜炎、滑膜炎並びに雌牛及び雄牛の生殖器異常とも密接に関係している。
【０００４】
マイコプラズマは細胞壁を欠くので、一般的な多くの抗生物質（例えばペニシリン又は細胞壁合成を標的とする他のベータ-ラクタム抗生物質）の影響を受けない。特に有用なマイコプラズマ感染のための治療薬剤はいくつかの抗生物質、例えばマクロライド系、又は新規なキノリン系又はテトラサイクリン系抗生物質であるが、そのような抗生物質は重大な副作用を有し（例えば薬剤耐性株の出現）、前記副作用はマイコプラズマ感染の重篤化をもたらし、一方、十分な治療効果は期待できず、さらに慢性症への移行の原因となる。
さらにまた、ワクチン免疫は有効なマイコプラズマ感染の制御方法である。いくつかのマイコプラズマ菌に対して有効なワクチンが先行技術として記載されている。WO2009058833（A2）はワクチン免疫用の弱毒化した非病毒性マイコプラズマ・ボビス菌株を例示的に記載している。さらにまた、WO2009126356（A2）はマイコプラズマ・ヒオニューモニアエに対する免疫原性組成物を記載している。しかしながら必要とされるものは、多数の病原体に対して防御を提供する効果的な組み合わせワクチンである。そのような組み合わせワクチンは、多数の病原体に対する防御を付与するために必要な免疫回数を最小限にするために、投与コストを削減するために、さらに許容及び対応率を高めるために希求される。しかしながら抗原干渉の問題がマルチ成分ワクチンの開発を複雑にしている。特に抗原干渉は、多数の抗原の投与は、ある種の抗原を個々に投与するときに認められる免疫応答と対比してそのような抗原に対する応答を低下させる結果をしばしばもたらすという観察に当てはまる。
したがって、多数の病原体に対する防御を提供する効果的な組み合わせワクチンが希求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は多数の病原体に対する防御を提供する効果的な組み合わせワクチンを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、a）M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原並びにM.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオリーニスから成る群から選択される1つ以上の抗原並びに前記の組み合わせ；並びにb）医薬的に許容できる担体を含む。
さらにまた、本発明は免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；並びにb）医薬的に許容できる担体を含む。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の特徴を述べる前に、以下の事柄を特記せねばならない。本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうではないことを指示しないかぎり複数形の対応語を含む。したがって、例えば“a antigen（抗原）”と言えば複数形のantigensを含み、“cell（細胞）”と言えば1つ以上の細胞及び当業者に公知のその同等物を指す、云々。特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載する方法及び材料と類似するか又は同等であるいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法、装置及び材料をこれから述べる。本明細書に記載する全ての刊行物は、当該刊行物に報告されている、本発明に関連して用いられる可能性がある細胞株、ベクター及び方法論を記載及び開示するという目的のために参照によって本明細書に取り込まれる。本明細書のいずれの記述も、先発明を理由としてそのような開示に先行する権利を付与されないことを容認するものと解されるべきではない。
【０００８】
本発明は先行技術に固有の問題を解決し、当該技術の現況に明確な進歩を提供する。一般的に、本発明は免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、a）M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原並びにM.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオリーニスから成る群から選択される1つ以上の抗原並びに前記の組み合わせ；並びにb）医薬的に許容できる担体を含む。
さらにまた、本発明は免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；並びにb）医薬的に許容できる担体を含む。
有益なことには、本発明が提供する実験データは、本明細書で提供する免疫原性組成物の有効性及び抗原干渉が存在しないことを示す。具体的には、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの抗原を含む免疫原性組成物の投与後に、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの有効性に関して干渉が存在しないことが示された。
したがってある特徴にしたがえば、本出願は免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原、M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；b）M.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原；及びc）医薬的に許容できる担体を含む。
【０００９】
“免疫原性組成物”という用語は少なくとも1つの抗原を含む組成物を指す。前記抗原は、該免疫原性組成物が投与される宿主で免疫学的応答を誘引する。そのような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物への細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答であり得る。該宿主はまた“対象動物”と記載される。好ましくは、本明細書に記載又は言及する宿主又は対象動物はいずれも動物である。
通常は、“免疫学的応答”は以下の作用の1つ以上を含む（ただしこれらに限定されない）：本発明の免疫原性組成物に含まれる1つの抗原又は複数の抗原を特異的に指向する、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び／又は細胞傷害性T細胞、及び／又はガンマ-デルタT細胞の産生又は活性化。好ましくは、該宿主は防御性免疫学的応答又は治療性応答を示すであろう。
“防御性免疫学的応答”は、感染宿主が通常示す臨床徴候の軽減又は欠如、迅速な回復時間、及び／又は感染性を示す期間の減少、又は感染宿主の組織若しくは体液若しくは分泌物中の病源体力価の低下によって明示されるであろう。
新規感染に対する抵抗性が増強され、及び／又は、当該疾患の臨床重篤度が軽減されるように宿主が防御性免疫学的応答を示す場合には、該免疫原性組成物は“ワクチン”と記載される。
【００１０】
“感染”又は“感染した”という用語は、病原体（すなわちM.ヒオリーニス又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエ）による対象動物の感染を指す。
“治療性応答”は、ある宿主が、通常1つの臨床徴候又は複数の臨床徴候を引き起こす病原体（例えばマイコプラズマ）に既に感染しているときに、そのような宿主は通常示すそのような臨床徴候の軽減及び／又は治癒を示すであろう。
“マイコプラズマ”という用語は当業者には公知である。“マイコプラズマ”は例えば以下に記載された細菌の属を指す：Blanchard, A., and G. F. Browning (eds.). 2005. Mycoplasmas: Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, Wymondham U.K.；Kobisch M. and Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci.Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605。細菌は、それらの生化学的及び生物学的特性の他にそれらの形態学に基づいて分類され得る。これらの分類基準は当業界で周知である。概して、当該マイコプラズマ感染は本記述の他の個所に記載した臨床徴候を伴う。
本明細書で用いられる“マイコプラズマ”という用語は、M.ヒオリーニス又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエを指す。M.ヒオリーニスの完全なゲノム配列は、例えば以下に例示的に提供される：Liu, W. et al., J. Bacteriol. 2010, vol. 192 (21), 5844-45 doi: 10.1128/JB.00946-10. Epub 2010 Aug 27；又はCalcutt MJ. et al., 2012, J. Bacteriol. Vol. 194 (7), 1848 doi: 10.1128/JB.00033-12。M.ヒオシノビアエの単離株は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションにアクセッション番号ATCC 25591又はATCC 27095で寄託されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニアエの単離株は、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションにアクセッション番号ATCC 25095、ATCC 25617及びATCC 25934で寄託されている。マイコプラズマ・ヒオニューモニアエJ-株のゲノムDNAは、アメリカンタイプカルチャーコレクションにアクセッション番号ATCC 25934Dで寄託されている。
【００１１】
本明細書で用いられる“抗原”は、そのような抗原又は免疫学的に活性なその成分を含む問題の免疫原性組成物又はワクチンに対する免疫学的応答を宿主で誘引する成分を指す（ただし前記に限定されない）。該抗原又は免疫学的に活性な成分は、宿主に投与されると当該宿主で免疫学的応答を誘引することができる、微生物まるごと全体（不活化又は改変された生きている形態）又はその任意のフラグメント若しくは断片であり得る。該抗原は、その本来のままの形態であるか又はいわゆる改変生ワクチン（MLV）の状態で弱毒生物として完全な生きた生物であるか又は前記を含むことができる。該抗原はさらに前記生物のエレメントを含むことができ（サブユニットワクチン）、前記サブユニットワクチンでは、これらエレメントは、生物体まるごと全体又はそのような生物の増殖培養物を破壊しその後の精製工程で所望の構造物として採集することによって、又は適切な系（例えば細菌、昆虫、哺乳動物又は他の種であるが、ただしこれらに限定されない）の適切な操作により誘導される合成プロセス（及び場合によりその後の単離及び精製手順）によって、又は適切な医薬組成物を用いて遺伝物質を直接取り入れることによりワクチンを必要とする動物で前記合成プロセスを誘導することによって（ポリヌクレオチドワクチン免疫）生成される。該抗原は、いわゆる死菌ワクチン（KV）として、適切な方法によって不活化された生物体全体（完全生物体）を含み得る。該生物が細菌である場合は、死菌ワクチンはバクテリンと称される。
【００１２】
“医薬的に許容できる担体”という用語には、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせが含まれる。
本発明のある特徴では、該抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。前記1つ以上の全不活化抗原は、M.ヒオリーニス；M.ヒオシノビアエ；M.ヒオニューモニアエ；M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ；並びにM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエから成る群から選択される全不活化バクテリンであり得る。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；並びにb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、M.ヒオリーニス；M.ヒオシノビアエ；又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエ抗原は全不活化バクテリンである。
別の特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原及びM,ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原、及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該M.ヒオリーニス；M.ヒオシノビアエ；及び／又はM.ヒオニューモニアエの抗原は全不活化バクテリンである。本発明のこの特徴は、M.ヒオリーニスの抗原は全不活化バクテリンであるか、又はM.ヒオニューモニアエの抗原は全不活化バクテリンであるか、又はM.ヒオシノビアエの抗原は全不活化バクテリンであるということを包含する。しかしながら、本発明のこの特徴はまた、本発明の免疫原性組成物の全ての抗原が全不活化バクテリンであるということを包含する。すなわち、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの抗原、又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの抗原は全不活化バクテリンである。
【００１３】
任意の通常的な不活化方法を本発明の目的のために用いることができる。したがって、不活化は、当業者に公知の化学的及び／又は物理的処理によって実施できる。好ましい不活化方法には、2-ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（BEA）（前記は環化されて二元性エチレンイミン（BEI）を形成している）の溶液の添加を含む環化二元性エチレンイミン（BEI）の添加が含まれる。さらに別の好ましい化学的不活化剤は、トリトンX-100、デオキシコール酸ナトリウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、β-プロピオラクトン、チメロサール、フェノール及びホルムアルデヒド（ホルマリン）を含むが、ただし前記に限定されない。しかしながら、不活化はまた中和工程を含むことができる。好ましい中和剤にはチオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましいホルマリン不活化条件は、約0.02％（v/v）−2.0％（v/v）、より好ましくは約0.1％（v/v）−1.0％％（v/v）、さらに好ましくは約0.15％（v/v）−0.8％（v/v）、さらに好ましくは約0.16％（v/v）−0.6％（v/v）、もっとも好ましくは約0.2％（v/v）−0.4％（v/v）のホルマリン濃度を含む。インキュベーション時間はマイコプラズマ種の耐性に左右される。一般に不活化プロセスは、適切な培養系でマイコプラズマの増殖が検出できなくなるまで実施される。
【００１４】
本発明のある特徴では、全不活化バクテリンは、好ましくは上記に記載の濃度を用いた、ホルマリン不活化バクテリンである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、1つ以上の抗原は全不活化バクテリンであり、全不活化バクテリンの1つ以上はホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物はさらにM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む。本発明のこの特徴は、M.ヒオリーニスの抗原はホルマリン不活化バクテリンであるか、又はM.ヒオニューモニアエの抗原はホルマリン不活化バクテリンであるか、又はM.ヒオシノビアエの抗原はホルマリン不活化バクテリンであるということを包含する。しかしながら、本発明のこの特徴はまた、本発明の免疫原性組成物の全てのマイコプラズマ抗原はホルマリン不活化バクテリンであること包含する。すなわち、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの抗原、又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの抗原はホルマリン不活化バクテリンである。
本発明の不活化バクテリン成分は、公知の技術（例えば以下に記載されたもの：Nature, 1974, 252, 252-254；又はJournal of Immunology, 1978, 120, 1109-13）を用いてリポソームに取り込むことができる。本発明の別の実施態様では、本発明の不活化バクテリン成分は、適切な生物学的化合物（例えば多糖類、ペプチド、タンパク質など又は前記の組み合わせ）と複合物を形成させることができる。
【００１５】
さらに別の特徴では、本明細書で提供する免疫原性組成物は、必要がある対象動物において、M.ヒオリーニスによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物において、M.ヒオリーニスによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物はさらにM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該1つ以上のマイコプラズマ抗原は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンである。
さらに別の特徴では、本明細書で提供する、さらにまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む免疫原性組成物は、必要がある対象動物において、M.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；b）M.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原；及びc）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物において、M.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物において、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、該1つ以上のマイコプラズマ抗原は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンである。
【００１６】
“治療及び／又は予防”という用語は、ある群れにおける特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下、又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随する臨床徴候の重篤度の軽減を指す。したがって、“治療及び／又は予防”という用語はまた、本明細書で提供する免疫原性組成物の有効量を投与されていない一群の動物と比較して、そのような免疫原性組成物を投与されてある、ある群れにおける特定のマイコプラズマ菌感染動物の数の減少（＝特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下）、又は一群の動物におけるマイコプラズマ感染に通常付随するか若しくは前記感染によって引き起こされる臨床徴候の重篤度の軽減を指す。
“治療及び／又は予防”は一般に、必要があるか又はそのような治療/予防により利益を受け得る対象動物又は対象動物の群れに有効量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む。“治療”という用語は、ひとたび対象動物又は群れの少なくとも数匹の動物がそのようなマイコプラズマに感染したら、さらにそのような動物がそのようなマイコプラズマ感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随するいくつかの臨床徴候を示す場合に該免疫原性組成物の有効量を投与することを指す。“予防”という用語は、対象動物のマイコプラズマによるいずれの感染よりも前に、又は少なくともそのような動物若しくは一群の動物のいずれもがそのようなマイコプラズマによる感染によって引き起こされるか若しくは前記感染に付随するいずれの臨床徴候も示さない場合に、対象動物に投与することを指す。
【００１７】
本明細書で用いられる“有効量”という用語は、限定するものではないが、対象動物で免疫応答を誘引するか又は誘引することができる抗原の量を意味する。そのような有効量は、群れにおいて特定のマイコプラズマ感染の発生率を低下させるか、又は特定のマイコプラズマ感染の臨床徴候の重篤度を軽減させることができる。
好ましくは、臨床徴候の発生率又は重篤度は、治療されていないか又は本発明より前に利用可能であった免疫原性組成物で治療されたが続いて特定のマイコプラズマ菌に感染した対象動物と比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも95％軽減される。
【００１８】
本明細書で用いられる“臨床徴候”という用語は、マイコプラズマ菌に起因する対象動物の感染の徴候を指す。該感染の臨床徴候は選択される病原体に左右される。そのような臨床徴候の例には呼吸困難、多発性漿膜炎（例えば腹膜炎、胸膜炎、心膜炎）、関節炎（跛行及び関節腫脹）、耳炎、粗雑化被毛、微熱、抑うつ状態、食欲減退及び菌血症が含まれる（ただしこれらに限定されない）。しかしながら当該臨床徴候はまた生きている動物から直接観察し得る臨床徴候を含む（ただしこのような臨床徴候に限定されない）。生きている動物から直接観察され得る臨床徴候の例には、鼻及び眼の分泌物、嗜眠、咳、喘鳴、不整痙攣性呼吸（thumping）、体温上昇、体重増加又は減少、脱水、下痢、関節腫脹、跛行、るい痩、皮膚蒼白、発育不全、下痢などが含まれる。
対象動物における特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされるか又は前記感染に付随する臨床徴候の発生率の低下又は重篤度の軽減は、本発明の免疫原性組成物の1用量以上を必要がある対象動物に投与することによって達成できる。実施例2及び3で示されるように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、必要がある対象動物への1用量の投与後に有効であることが証明された。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物において単一用量の投与後に、M.ヒオリーニスによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物はさらにM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該1つ以上のマイコプラズマ抗原は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンである。
【００１９】
さらにまた、M.ヒオニューモニアエを含む免疫原性組成物の単一用量はまた当該免疫原性組成物の当該単一用量の投与後に有効であることが示された。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；b）M.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原；及びc）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物において単一用量の投与後に、M.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。当該単一用量はただ1回だけ投与される。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物において、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、該1つ以上のマイコプラズマ抗原は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンである。
【００２０】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、当該免疫原性組成物の単一用量投与用に処方される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該免疫原性組成物は、当該免疫原性組成物の1用量としての投与用に調製される。そのような免疫原性組成物はまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むことができ、ここで、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；b）M.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原；及びc）医薬的に許容できる担体を含むそのような免疫原性組成物は、1用量投与用に調製又は提供され得る。さらに別の特徴にしたがえば、1つ以上のマイコプラズマ抗原は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンであり得る。さらにまた、そのような免疫原性組成物は、必要がある対象動物においてそのようなマイコプラズマ抗原の1用量投与後に、M.ヒオリーニス又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である（該組成物がそれぞれM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むか否かに左右される）。有益なことには、本発明が提供する実験データは、本発明の免疫原性組成物の単一用量投与が防御性免疫応答を確実にかつ効果的に刺激したことを示す。具体的には、測定可能な抗体応答がM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエについて示された。
【００２１】
上記で述べたように、本明細書で用いられる対象動物又は宿主という用語は動物、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、又はウシ、さらに好ましくはまたヒトを指す。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該免疫原性組成物は、ブタでM.ヒオリーニスによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、ブタでM.ヒオリーニスによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。そのような免疫原性組成物がさらにM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むとき、さらに別の特徴にしたがえば、前記はブタでM.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物（M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む）は、ブタでM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエによって引き起こされる臨床徴候の治療及び／又は予防に有効である。繰り返せば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンであり得る。
本発明のさらに別の特徴では、免疫原性組成物はワクチンである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該免疫原性組成物はワクチンである。そのようなワクチンはまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むことができる。本発明のワクチンは、必要がある対象動物に投与されるとき、該免疫原性組成物について記載した特性と同じ有益な特性を有する。
【００２２】
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体は、溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該医薬的に許容できる担体は、溶媒、分散媒体、被覆剤、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、並びに前記の組み合わせから成る群から選択される。上記で述べたように、そのようなワクチンはまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むことができる。さらにまた、そのようなマイコプラズマ種の1つ以上のマイコプラズマ抗原は、上記記載の全不活化バクテリンとして提供され得る。
【００２３】
本明細書で用いられる“アジュバント”には、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン（例えばQuilA、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA））、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンが含まれ得る。エマルジョンは特に以下を基剤にすることができる：軽質流動パラフィン油（欧州局方タイプ）；イソプレノイド油（例えばスクワラン又はスクワレン）；アルケン（特にイソブタン又はデセン）のオリゴマー化から生じる油；酸又は直鎖アルキル基含有アルコールのエステル、より具体的には植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ-(カプリレート/カプレート)、グリセリルトリ(カプリレート/カプレート)又は二オレイン酸プロピレングリコール；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。油を乳化剤と一緒に用いてエマルジョンを生成する。好ましくは、乳化剤は、非イオン性界面活性剤（特にソルビタン、マンニド（例えばアンヒドロマンニトールオレエート）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びオレイン酸、イソステアリン酸、レシノール酸のエステルで、前記は場合によってエトキシル化される）、及びポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニックの製品（特にL121）である。以下を参照されたい：Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.).  JohnWiley and Sons, NY, pp51-94, 1995；及びTodd et al., Vaccine 15:564-570, 1997。例えば、SPTエマルジョン（以下の文献の147ページに記載されている：Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach (M. Powell and M. Newman eds.), Plenum Press, 1995）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載されている）を用いることが可能である。さらにまた別の適切なアジュバントには、多くのものの中でとりわけRIBIアジュバント系（RIBI Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、大腸菌の易熱性エンテロトキシン（組換え体又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS 1314又はムラミルジペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーの中ではとりわけEMA（Monsanto）（無水マレイン酸とエチレンとのコポリマー）が含まれる。これらのポリマーの水への溶解は酸性溶液を生じ、好ましくは生理学的pHに中和されてアジュバント溶液が得られ、前記に免疫原性組成物、免疫学的組成物又はワクチン組成物そのものが取り込まれるであろう。
【００２４】
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌の易熱性エンテロトキシン（組換え体又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択されるアジュバントである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該医薬的に許容できる担体は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー、RIBIアジュバント系、ブロックコポリマー、SAF-M、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミン、大腸菌の易熱性エンテロトキシン（組換え体又はそうでないもの）、コレラトキシン、IMS1314、ムラミルジペプチド、並びに前記の組み合わせから成る群から選択されるアジュバントである。そのようなワクチンはまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むことができる。さらにまた、そのようなマイコプラズマ種のマイコプラズマ抗原の1つ以上は、上記記載の全不活化バクテリンとして提供され得る。
【００２５】
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、並びに無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有益なアジュバント化合物はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーで、前記は特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物はカルボマーという用語で知られている（Phameuropa Vol.  8, No.  2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照できる。前記特許は、少なくとも3つの（好ましくは8つを超えない）ヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物（少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって置換されている）で架橋されたアクリル酸ポリマーを記載している。好ましいラジカルは、2つから4つの炭素原子を含むもの（例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基）である。該不飽和ラジカルはそれら自体他の置換基（例えばメチル）を含むことができる。CARBOPOL(商標)の名称で販売されている製品（BF Goodrich, Ohio, USA）が特に適切である。それらは、ポリアルケニルエーテル又はジビニルグリコールで架橋されているか、又はアリルシュクロース若しくはアリルペンタエリトリトールで架橋されているアクリル酸のポリマーである。それらの中ではとりわけ、CARBOPOL(商標)974P、934P及び971Pを挙げることができる。もっとも好ましいものはCARBOPOL(商標)971Pの使用である。
【００２６】
好ましくは、アジュバントは1用量につき約100μgから約10mgの量で添加される。より好ましくは、アジュバントは1用量につき約100μgから約10mgの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは1用量につき約500μgから約5mgの量で添加される。さらに好ましくは、アジュバントは1用量につき約750μgから約2．5mgの量で添加される。もっとも好ましくは、アジュバントは1用量につき約1mgの量で添加される。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体は水中油中水エマルジョン又はカルボマーである。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該医薬的に許容できる担体は水中油中水エマルジョン又はカルボマーである。そのようなワクチンはまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むことができる。さらにまた、そのようなマイコプラズマ種の抗原は上記記載の全不活化バクテリンとして提供され得る。
本発明のある特徴では、水中油中水エマルジョンはモンタニド（Montanido）ISA207VG又はカルボポール（CARBOPOL(商標)）である。モンタニドISA207 VGは、非鉱物油中に溶液の無水マンニトールのオレイン酸エステルを含むアジュバントであり、水中油中水ワクチンエマルジョンを生成するように考案されている。モンタニドISA207 VGは当業者に周知である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原；及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該医薬的に許容できる担体はモンタニドISA207VG又はCARBOPOL(商標)である。上記で述べたように、そのようなワクチンはまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含むことができる。さらにまた、そのようなマイコプラズマ種の抗原は上記記載の全不活化バクテリンとして提供され得る。
【００２７】
本発明はまた免疫原性組成物を提供し、前記組成物は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエから成る群から選択されるマイコプラズマの血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の１つ以上の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって得られる。
“培養”という用語は当業者には公知である。前記用語は、当該生物の外部において培養状態で細胞を増殖させることに関する。特に“培養”という用語は、当該生物の外部において細胞系で細胞を増殖させることに関する。
“細胞系”という用語は当業者には公知である。特に、“細胞系”という用語は、微生物（例えばマイコプラズマ菌）の培養のためのin vitro細胞培養系である。そのような細胞系は、宿主細胞及び当該生物の外部でそのような細胞を増殖させるために適切な細胞培養培地を含む。特に、宿主細胞はマイコプラズマ菌の感染に感受性であることもないこともある。そのような宿主細胞は、生きている細胞として、不活化形で又は細胞フラグメントとして存在し得る。好ましくは、そのような宿主細胞はマイコプラズマ菌による感染に感受性である。本明細書に記載の方法の実施に用いることができる宿主細胞には、メイジン-ダービー（Madin-Darby）イヌ腎上皮（MDCK）細胞（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションにアクセッション番号ATCC CCL-34又はATCC CRL-2285で寄託されたメイジン-ダービーイヌ腎上皮細胞）又はマッコイ（McCoy）細胞（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションにアクセッション番号ATCC CRL-1696で寄託されたもの）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。適切な細胞培養培地は当業者には公知であり、市場で入手できる。それらは、栄養物、塩、増殖因子、抗生物質、血清(例えばウシ胎児血清)及びpHインジケーター(例えばフェノールレッド)を含むことができる。
【００２８】
“真核細胞系”という用語は、初代真核細胞及び多細胞生物（例えば植物又は動物）から得られる真核細胞を含む。さらにまた、真核細胞系は、真核単細胞生物（微生物とも称される）、例えば細菌又はカビ（酵母を含む）を包含する。しかしながら、真核細胞はマイコプラズマ菌とは異なることは理解されよう。
“血清が低減された”という用語は、無細胞培養系でマイコプラズマ菌の培養に用いられる血清の量と比較して、真核細胞系で同じ種のマイコプラズマ菌の培養に添加される血清の量が低下していることを指す。無細胞培養系でのマイコプラズマ菌培養のための血清の量と比較して、真核細胞系でのマイコプラズマ菌培養のための血清の量は、少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、さらに好ましくは少なくとも96％、さらに好ましくは少なくとも97％、さらに好ましくは少なくとも98％、さらに好ましくは少なくとも99％、もっとも好ましくは100％低減される。したがって、本発明にしたがえば、マイコプラズマ菌は、もっとも好ましくは血清を全く欠く真核細胞系で培養されると理解されねばならない。
本明細書で用いられる“無細胞培養系”という用語は、マイコプラズマ菌を除いて細胞を全く含まない培養系を指す。
【００２９】
真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−10％（v/v）、より好ましくは約1−9％（v/v）、さらに好ましくは約1−8％（v/v）、さらに好ましくは約1−7％（v/v）、さらに好ましくは約1−6％（v/v）、もっとも好ましくは約2−5％（v/v）の間の血清濃度を含む。
MDCK細胞を含む真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−6％（v/v）、より好ましくは約1−5％（v/v）、さらに好ましくは約2−4％（v/v）、さらに好ましくは約2−3％（v/v）の間の血清濃度、もっとも好ましくは約2％（v/v）の血清濃度を含む。
マッコイ細胞を含む真核細胞系でのマイコプラズマ菌の培養のための好ましい血清量は、約0−10％（v/v）、より好ましくは約1−9％（v/v）、さらに好ましくは約2−8％（v/v）、さらに好ましくは約3−7％（v/v）、さらに好ましくは約4−6％（v/v）の間の血清濃度、もっとも好ましくは約5％（v/v）の血清濃度を含む。
【００３０】
本発明にしたがえば、該真核細胞系の真核細胞はマイコプラズマ菌に感染させ得ることは理解されよう。そのような感染は真核細胞系内でのマイコプラズマ菌の増殖をもたらす。真核細胞のマイコプラズマ菌による感染及びマイコプラズマ菌の増殖を可能にするインキュベーション期間後の条件は当業者には周知である。しかしながら好ましくは、細胞は、トランスフェクション後21日間、より好ましくは約2日から約14日、より好ましくは約2日から約8日、さらに好ましくは約3から5日の期間にわたってインキュベートされる。好ましいインキュベーション条件は、約32−42℃、より好ましくは約34−40℃、さらに好ましくは約35−39℃、さらに好ましくは約36−38℃、もっとも好ましくは約37℃の温度を含む。好ましいインキュベーション条件はまた、約2％から8％、より好ましくは約3％から7％、さらに好ましくは約4％から6％の間のCO2濃度、もっとも好ましくは約5％のCO2濃度を含む。好ましくは、トランスフェクションに続いて、当該真核細胞は、特徴的な変化、例えば細胞密度の傾向、生命活性の低下（感染期間後の細胞変性効果を含む）及びpH変化による培養液の色の変化について観察される。
【００３１】
“入手する”という用語は、抗原の採集、単離、精製及び／又は処方（例えば仕上及び／又はブレンド）を含む。
“採集”という用語はマイコプラズマ菌の抗原をトランスフェクトした真核細胞系から収集又は回収することを指す。当業界で公知の任意の通常的方法（例えば任意の分離方法）を前記マイコプラズマ抗原の回収に用いることができる。当業界で周知の方法は遠心分離又はろ過（例えば一定の孔サイズを有する半透膜を用いる）を含む。
“単離”という用語はマイコプラズマ抗原の単離工程を含む。マイコプラズマ菌の抗原を感染真核細胞系から単離する方法は当業者には公知である。そのような方法は物理的及び／又は化学的方法を含み、前記には凍結融解の繰り返し、超音波処理などが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
単離株から抗原を“精製”する方法は当業者には公知であり、例えば以下に記載の方法による：Protein purification methods - a practical approach, E.L.V. Harris and S. Angel, eds., IRL Press at Oxford University Press。そのような方法には、遠心分離及び／又はろ過による分離、沈殿、サイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、共有結合クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。抗原は、精製された純粋な形態で入手し得るか、或いは他の細胞性物質若しくは培養液などを含まないか又は実質的に前記を含まない状態であり得る。前記単離及び／又は精製後、抗原は、少なくとも80％、好ましくは80％−90％、より好ましくは90％−97％、もっとも好ましくは97％の純度から夾雑物を全く含まない完全に純粋な形態までの純度を示す。
更なる特徴にしたがえば、本明細書で用いられる“入手”はまた、更なる仕上工程（例えば緩衝剤の添加、不活化、中和工程など）を含むことができる。
【００３２】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせの群から選択される1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清を低減した真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニスの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
【００３３】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。
【００３４】
該1つ以上のマイコプラズマ抗原は、好ましくは上記記載の方法のいずれかによって不活化される。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが、好ましくは上記記載の方法のいずれかによって不活化される。したがって、さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の抗原の入手（前記入手工程は該マイコプラズマ抗原の1つ以上の不活化を含む）；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって調製される免疫原性組成物を提供する。該不活化工程は、上記記載の方法のいずれかによって実施できる。ある特徴にしたがえば、そのような不活化は該マイコプラズマ菌の全不活化バクテリンをもたらす。好ましくは、そのようなマイコプラズマ菌の不活化は、該マイコプラズマ抗原が全ホルマリン不活化バクテリンであるようにホルマリンによって実施される。ある特徴では、不活化マイコプラズマ抗原は、M.ヒオリーニスの全不活化バクテリン、M.ヒオニューモニアエの全不活化バクテリン、M.ヒオシノビアエの全不活化バクテリン、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの全不活化バクテリン、又はM.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの全不活化バクテリン、又はM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの全不活化バクテリン、又はM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの全不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該免疫原性組成物中のマイコプラズマ抗原の全てが全不活化バクテリン、好ましくは全ホルマリン不活化バクテリンである。
【００３５】
ある特徴では、マイコプラズマ抗原は血清が低減された真核細胞系で製造され、ここで該血清はブタ血清を含まない。マイコプラズマ菌のM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、及びM.ヒオシノビアエはブタの病原体であるので、ブタ血清は本発明の組成物のマイコプラズマ抗原と干渉し得る成分を含み得る。したがって非ブタ血清を使用するか又は血清を使用しないことは本発明の好ましい特徴である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって得られる免疫原性組成物を提供し、ここで、該真核細胞系はブタ血清を含まない。
上記で述べたように、真核細胞系はMDCK細胞株又はマッコイ細胞株の細胞を含むことができる。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は免疫原性組成物を調製する方法を提供し、ここで、該方法は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含み、該真核細胞系はMDCK細胞株又はマッコイ細胞株を含む。
【００３６】
さらに別の特徴では、該免疫原性組成物のマイコプラズマ抗原は血清が低減された真核細胞系で製造され、ここで、前記マイコプラズマ抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原と比較して免疫原性の増大を示す。
本明細書で用いられる“増大した免疫原性”という用語は、問題の抗原を含む免疫原性組成物によって引き起こされる免疫学的応答が、同じ抗原を含む参照免疫原性組成物と比較して増進することを意味し、ここで参照免疫原性組成物の抗原は無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される。
“増大”という用語は、細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答が、同じ抗原を含む参照免疫原性組成物（参照免疫原性組成物の抗原は無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から調製される）によって誘引される細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答と比較して少なくとも10％、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも75％、もっとも好ましくは少なくとも100％増進することを意味する。細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答の測定の仕方は当業者の一般的な知識である。特に、問題の免疫原性組成物の細胞媒介免疫応答と参照物の細胞媒介免疫応答との比較、又は問題の免疫原性組成物の抗体媒介免疫応答と参照物のそれとの比較はそのような当業者には明白であるが、問題の免疫原性組成物の細胞媒介免疫応答と参照物の抗体媒介免疫応答との比較又はその逆は自明ではない。さらにまた、細胞媒介免疫応答は、例えば問題の免疫原性組成物/抗原による細胞傷害性T細胞の活性化の測定によって測定できる。抗体媒介免疫応答は、例えば、当該抗原を含む免疫原性組成物を動物に投与することによって生成される抗原特異的抗体の量の測定によって測定できる。細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答は、例えばマウスモデル、ネコモデル、ウシモデル又はブタモデルを用いることによって測定できる。しかしながら、実施例4及び5に記載するアッセイは、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエに対する免疫学的応答を検出する参照アッセイとして用いられるであろう。
【００３７】
“同じ抗原”という用語は当該抗原の性質が同一であることを意味する。したがって、血清を低減した真核細胞系で製造された免疫原性組成物のマイコプラズマ抗原がM.ヒオリーニスの全不活化バクテリンである場合、“同じ抗原”とは、無細胞系のマイコプラズマ抗原もまたM.ヒオリーニスの全不活化バクテリンであることを意味する。さらにまた、血清が低減された真核細胞系で製造された免疫原性組成物のマイコプラズマ抗原が特別な方法にしたがって調製又は精製されるならば、同じ抗原は、無細胞系のマイコプラズマ抗原が同じ方法にしたがって調製又は精製されることを意味する。
有益なことには、本発明が提供する実験データは、上記記載の方法によって提供されるマイコプラズマ抗原は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマ菌から入手される抗原と比較して増大した免疫原性を示すことを開示する。具体的には、MDCKに依るM.ヒオリーニスワクチンはより早期の血清転換の開始、より大多数の血清陽性豚、及びより高い血清学的力価を示した。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって得られる免疫原性組成物を提供し、ここで、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００３８】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニスの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００３９】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４０】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４１】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記免疫原性組成物は、無細胞培養系で培養されたマイコプラズマから入手される同じ抗原を含む免疫原性組成物と比較して増大した免疫原性を示す。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
さらに別の特徴では、該マイコプラズマ抗原は血清が低減された真核細胞系で製造され、ここで、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。
【００４２】
“真核細胞の成分”という用語は前記真核細胞の全細胞（細胞全体）及びフラグメントを含む。“フラグメント”という用語は、真核細胞の任意の部分（例えば細胞膜の部分）又は細胞内小器官をその全体若しくは部分として含む。しかしながら、フラグメントという用語はまた、脂質、タンパク質、糖、DNA、RNA及びその類似物並びに前記の組み合わせを含む前記真核細胞の任意の部分を包含する。さらにまた、真核細胞成分及びマイコプラズマ抗原は、別々に若しくは互いに接着して又は前記の組み合わせで免疫原性組成物中に存在し得る。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって得られる免疫原性組成物を提供し、ここで、前記免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４３】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニスの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４４】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４５】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４６】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、該免疫原性組成物は前記真核細胞系の真核細胞の成分を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
さらに別の特徴では、該マイコプラズマ抗原は血清が低減された真核細胞系で製造され、ここで、前記真核細胞の成分は該マイコプラズマ抗原に接着している。
【００４７】
“接着する”という用語は、前記真核細胞成分とマイコプラズマ抗原との任意の相互作用、会合、結合、付着又は連結を指す。したがって、“接着する”という用語は、間接的若しくは直接的、不可逆的若しくは可逆的、物理的及び化学的、静電気的、及び／又は共有結合的な結合を含む任意の相互作用を包含する。したがって、真核細胞の成分はマイコプラズマ抗原と例えば結合できると理解されねばならない。しかしながら、真核細胞の成分はまたマイコプラズマ抗原と連結できると理解されねばならない。そのような連結は、当業者に周知のいくつかの方法（例えばホルムアルデヒド処理など）によって生じ得る。
したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は、a）M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ、及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の血清が低減された真核細胞系での培養；b）そのようなマイコプラズマ菌の抗原の入手；及びc）医薬的に許容できる担体の添加を含む方法によって得られる免疫原性組成物を提供し、ここで、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４８】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニスの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００４９】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
【００５０】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明はM.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
【００５１】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系で製造され、前記真核細胞成分はマイコプラズマ抗原に接着している。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが血清が低減された真核細胞系で製造される。さらにまた、更なる特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上が全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の全てが不活化バクテリン、好ましくはホルマリン不活化バクテリンである。
繰り返せば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される1つ以上のマイコプラズマ抗原を含む免疫原性組成物を提供し、ここで該マイコプラズマ抗原の1つ以上は血清が低減された真核細胞系から得られる。したがって、さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエから成る群から選択される1つ以上の抗原、並びに真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００５２】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニスの1つ以上のマイコプラズマ抗原及び真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原及び真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原及び真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００５３】
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原及び真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原、並びに真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原、並びに真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
したがって、ある特徴にしたがえば、本発明は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオシノビアエの1つ以上のマイコプラズマ抗原、並びに真核細胞系の1つ以上の成分を含む免疫原性組成物を提供する。さらに別の特徴にしたがえば、該マイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００５４】
本発明はまた対象動物を免疫する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象動物に投与する工程を含む。
“免疫する”という用語は、免疫されるべき対象動物へ免疫原性組成物を投与し、それによってそのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫学的応答を引き起こす能動免疫に関する。
好ましくは、免疫は、群れにおける特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減をもたらす。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明は、本明細書で提供する免疫原性組成物のいずれか1つで対象動物を免疫する方法を提供し、前記方法は本発明の免疫原性組成物をそのような対象動物に投与する工程を含む。
そのような免疫原性組成物は、a）M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原並びにM.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオリーニス並びに前記の組合せから成る群から選択される1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む。
【００５５】
さらに別の特徴にしたがえば、本発明の免疫原性組成物は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該免疫原性組成物はまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む。
免疫原性組成物が本明細書記載の血清が低減された真核細胞系で製造される場合、該免疫原性組成物は、本明細書にさらに規定するように、一般にM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の1つ以上の抗原を含むことができる。上記規定の更なる特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の1つ以上の抗原に加えて、真核細胞系の1つ以上の成分を含むことができる。
さらに別の特徴にしたがえば、必要がある対象動物の免疫に用いられるマイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。本発明のこの特徴は、マイコプラズマ抗原のどれか1つが全不活化バクテリンであるということを包含する。しかしながら、本発明のこの特徴はまた、本発明の免疫原性組成物の全ての抗原が全不活化バクテリンであるということも包含する。すなわち、M.ヒオリーニス抗原、M.ヒオシノビアエ抗原及び／又はM.ヒオニューモニアエ抗原は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
【００５６】
好ましくは、そのような投与は、群れにおける特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減をもたらす。
さらに別の特徴にしたがえば、必要がある対象動物の本明細書で提供される免疫原性組成物による免疫は、マイコプラズマ感染による対象動物の感染症を予防する。さらに好ましくは、免疫は、マイコプラズマ感染に対する有効で長期間持続する免疫学的応答をもたらす。前記期間は2カ月を超えて、好ましくは3カ月を超えて、より好ましくは4ヶ月を超えて、より好ましくは5ヶ月を超えて、より好ましくは6ヶ月を超えて持続するであろうということは理解されよう。免疫された対象動物の全で免疫が有効であるとは限らないこともあることは理解されるべきである。しかしながら、前記用語は、群れの対象動物の有意な部分が効果的に免疫されることを要求する。
好ましくは、本文脈では、通常の場合に（すなわち免疫されていない場合に）マイコプラズマ感染によって通常引き起こされるか又は前記に付随する臨床徴候を発する一群の対象動物が意図される。群れを構成する対象動物が効果的に免疫されているか否かは、当業者による大変な作業を行うことなく決定できる。好ましくは、免疫されていない対象動物又は本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫されたがその後で特定のマイコプラズマ菌に感染した対象動物と比較して、ある群れの対象動物の少なくとも33％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は少なくとも90％で、臨床徴候が発生又は重篤度において少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも95％軽減されるならば、該免疫は有効であろう。
【００５７】
本発明のある特徴では、対象動物はブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される。したがって、ある特徴にしたがえば、対象動物を免疫する方法が提供され、前記方法は本発明の免疫原性組成物を対象動物に投与する工程を含み、ここで、対象動物はブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は1回投与される。したがって、さらに別の特徴にしたがえば、対象動物を免疫する方法が提供され、前記方法は本発明の免疫原性組成物を対象動物に投与する工程を含み、ここで、該免疫原性組成物は、当該対象動物への当該免疫原性組成物の1用量投与後に、群れの特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減に有効である。1用量はただ1回投与されることは理解されよう。実施例2及び3に示すように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、必要がある対象動物への単一用量投与後に有効であることが証明された。
【００５８】
したがって、そのような方法がM.ヒオリーニスの1つ以上の抗原の投与を含むとき、当該免疫原性組成物は、群れのM.ヒオリーニス感染の発生率の低下又はM.ヒオリーニス感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減に有効である。さらに別の特徴にしたがえば、そのような方法がM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原の投与を含むとき、該組成物は、群れのM.ヒオニューモニアエ感染の発生率の低下又はM.ヒオニューモニアエ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減に有効である。繰り返せば、本発明の方法によって投与されるマイコプラズマ抗原の1つ以上は、上記に記載のマイコプラズマ種の全不活化バクテリンであり得る。
好ましくは、該1用量は、約0.5mLから2.5mLの間、より好ましくは約0.6mLから2.0mL、さらに好ましくは約0.7mLから1.75mL、さらに好ましくは約0.8mLから1．5mL、さらに好ましくは約0.9mLから1.25mLの総体積を有し、1用量1.0mLがもっとも好ましい。
【００５９】
しかしながら、該免疫原性組成物は2回又は数回投与することができ、第一の用量は第二の用量（ブースター）の投与前に投与される。好ましくは、第二の用量（ブースター）は第一の用量の少なくとも15日後に投与される。より好ましくは、第二の用量は第一の用量の15から40日後に投与される。さらに好ましくは、第二の用量は第一の用量の少なくとも17日後に投与される。さらに好ましくは、第二の用量は第一の用量の17から30日後に投与される。さらに好ましくは、第二の用量は第一の用量の少なくとも19日後に投与される。さらに好ましくは、第二の用量は第一の用量の19から25日後に投与される。もっとも好ましくは、第二の用量は第一の用量の少なくとも21日後に投与される。2回投与レジメンの好ましい特徴では、該免疫原性組成物の第一及び第二の両用量は同じ量で投与される。好ましくは、各用量は上記に指定した好ましい量であり、第一及び第二の用量について1mLの用量がもっとも好ましい。該第一及び第二用量レジメンの他に、また別の実施態様は更なる後続用量を含む。例えば、これらの特徴では第三、第四、又は第五用量を投与することができよう。好ましくは、後続の第三、第四、及び第五用量レジメンは第一の用量と同じ量で投与され、当該用量間の時間枠は上述の第一用量と第二用量との間のタイミングと一致する。
【００６０】
免疫原性組成物は、好ましくは局所的又は全身的に投与される。通常的に用いられる適切な投与経路は、経口又は非経口投与（例えば鼻内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下或いは吸入）である。しかしながら、化合物の性質及び作用態様に応じて、免疫原性組成物は他のルートでも同様に投与され得る。
典型的には、細菌抗原、例えばマイコプラズマバクテリンが用いられるときは、免疫原性組成物は、1用量につき約103から約1010コロニー形成単位（CFU）の細菌抗原、好ましくは1用量につき約104から約109CFUの細菌抗原、より好ましくは1用量につき約105から約106CFUの細菌抗原の量を含む。不活化バクテリンが免疫原性組成物に用いられる場合は、CFU値は不活化前のマイコプラズマ菌の量を指す。
例えば、M.ヒオニューモニアエの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。M.ヒオリーニスの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。M.ヒオシノビアエの抗原を含む本発明の免疫原性組成物は、好ましくは1用量につき約102から約1010CFU、好ましくは1用量につき約103から約109CFUの量で、さらに好ましくは1用量につき約104から約108CFUの量で、もっとも好ましくは1用量につき約105から約107CFUの量で用いられる。
【００６１】
したがってさらに別の特徴にしたがえば、対象動物を免疫する方法が提供され、前記方法は本発明の免疫原性組成物を対象動物に投与する工程を含み、ここで、該免疫原性組成物は、そのような対象動物へのそのような免疫原性組成物の1用量投与後に、群れの特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減に有効であり、そのような1用量は102から約1010CFU/マイコプラズマ菌/用量を含む。
本発明のある特徴では、必要がある対象動物を免疫する方法は、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、菌血症持続期間の短縮、細菌負荷の低下又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターの改善をもたらす。
“菌血症持続期間の短縮”という用語は、免疫原性組成物で免疫された対象動物の菌血症の持続時間が、免疫されていないか又は本発明前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫されたが続いて特定のマイコプラズマ菌に感染した対象動物と比較して、少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも100％短縮されることを意味する。菌血症の持続期間は、比較する前に各群（非免疫及び免疫群）の対象動物の代表的な数で決定されることは理解されよう。
【００６２】
“細菌負荷の低下”という用語は、野生型のマイコプラズマ菌に感染した対象動物の当該野生型マイコプラズマ菌による細菌負荷が、免疫されていないか又は本発明前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫されたが続いて特定のマイコプラズマ菌に感染した対象動物と比較して、本発明の免疫原性組成物による免疫後に対象動物で少なくとも10％、より好ましくは少なくとも20％、さらに好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくとも50％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに好ましくは少なくとも70％、さらに好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも100％低下することを意味する。“細菌負荷”は、比較する前の各群（非免疫及び免疫群）の対象動物の代表的な数で決定されることは理解されよう。
したがってさらに別の特徴にしたがえば、対象動物を免疫する方法が提供され、前記方法は本発明の免疫原性組成物を対象動物に投与する工程を含み、必要がある対象動物の免疫は、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、菌血症持続期間の短縮、細菌負荷の低下又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターの改善をもたらす。
【００６３】
本発明のある特徴では、該方法は約3週齢の対象動物に適切である。したがって、ある特徴にしたがえば、本出願は対象動物を免疫する方法を提供し、前記方法は、本発明の免疫原性組成物を対象動物に投与する工程を含み、ここで、該方法は約3週齢の対象動物に適切である。
有益なことには、本発明が提供する実験データは、該免疫原性組成の約3週齢の仔豚での有効性を開示する。
好ましくは、免疫される前記対象動物は1日齢から21日齢である。より好ましくは、免疫される前記対象動物は、1日齢から10日齢、さらに好ましくは1日齢から9日齢、さらに好ましくは1日齢から8日齢、さらに好ましくは1日齢から7日齢、さらに好ましくは1日齢から6日齢、さらに好ましくは1日齢から5日齢、さらに好ましくは1日齢から4日齢、さらに好ましくは1日齢から3日齢、さらに好ましくは1日齢又は2日齢、もっとも好ましくは1日齢である。
したがって、ある特徴にしたがえば、対象動物を免疫する方法が提供され、前記方法は、本発明の免疫原性組成物を対象動物に投与して必要がある対象動物を免疫する工程を含み、ここで、免疫される前記対象動物は1日齢から21日齢である。
【００６４】
本発明はまた、本明細書に記載の方法のいずれかの使用における、例えば対象動物のマイコプラズマ感染の治療及び／又は予防の使用における、又はそのようなマイコプラズマ感染に対する対象動物の免疫での使用における、本明細書で提供する免疫原性組成物のいずれかに関する。
そのような免疫原性組成物は、a）M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原並びにM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明の免疫原性組成物は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該免疫原性組成物はまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む。
該免疫原性組成物が本明細書に記載する血清が低減された真核細胞系で製造される場合、該免疫原性組成物は一般に本明細書でさらに規定されるようにM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の1つ以上の抗原を含む。上記で規定されるさらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の1つ以上の抗原に加えて、真核細胞系の1つ以上の成分を含むことができる。
【００６５】
さらに別の特徴にしたがえば、必要がある対象動物を免疫するために用いられるマイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。本発明のこの特徴は、マイコプラズマ抗原のどれか1つは全不活化バクテリンであるということを包含する。しかしながら、本発明のこの特徴はまた、本発明の該免疫原性組成物の全ての抗原が全不活化バクテリンであるということを包含する。すなわち、M.ヒオリーニス抗原、M.ヒオシノビアエ抗原、及び／又はM.ヒオニューモニアエ抗原は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
好ましくは、そのような使用は、群れにおける特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減をもたらす。
本発明はまた、対象動物のマイコプラズマ感染の治療及び／又は予防のため、又はマイコプラズマ感染に対する対象動物の免疫のための、本明細書に記載する免疫原性組成物の使用に関する。
そのような免疫原性組成物は、a）M.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原並びにM.ヒオニューモニアエ、M.ヒオリーニス及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択される1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む。
さらに別の特徴にしたがえば、本発明の免疫原性組成物は、a）M.ヒオリーニスの1つ以上の抗原及びM.ヒオシノビアエの1つ以上の抗原；及びb）医薬的に許容できる担体を含む。さらに別の特徴にしたがえば、該免疫原性組成物はまたM.ヒオニューモニアエの1つ以上の抗原を含む。
【００６６】
該免疫原性組成物が本明細書に記載の血清が低減された真核細胞系で製造されるならば、該免疫原性組成物は一般に本明細書でさらに規定されるようにM.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の1つ以上の抗原を含む。上記で規定されるさらに別の特徴にしたがえば、そのような免疫原性組成物は、M.ヒオリーニス、M.ヒオニューモニアエ、M.ヒオシノビアエ及び前記の任意の組み合わせから成る群から選択されるマイコプラズマ菌の1つ以上の抗原に加えて、真核細胞系の1つ以上の成分を含むことができる。
さらに別の特徴にしたがえば、必要がある対象動物を免疫するために用いられるマイコプラズマ抗原の1つ以上は全不活化バクテリンである。本発明のこの特徴は、マイコプラズマ抗原のどれか1つは全不活化バクテリンであるということを包含する。しかしながら、本発明のこの特徴はまた、本発明の該免疫原性組成物の全ての抗原が全不活化バクテリンであるということを包含する。すなわち、M.ヒオリーニス抗原、M.ヒオシノビアエ抗原、及び／又はM.ヒオニューモニアエ抗原は全不活化バクテリンである。そのような全不活化バクテリンは本明細書記載の不活化方法によって得ることができる。好ましくは、そのような全不活化バクテリンはホルマリン不活化バクテリンである。
好ましくは、そのような使用は、群れにおける特定のマイコプラズマ感染の発生率の低下又は特定のマイコプラズマ感染によって引き起こされる若しくは前記に付随する臨床徴候の重篤度の軽減をもたらす。
実施例
以下の実施例は本発明を例示することのみを意図する。それらは特許請求の範囲を如何なる態様でも制限するものではない。
【実施例１】
【００６７】
それぞれMDCK細胞又はマッコイ細胞でのマイコプラズマ菌の培養
A．M.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ヒオニューモニアエのMDCK細胞での培養
M.ヒオリーニス：
MDCK細胞のコンフルエントなT75フラスコをトリプシン処理し、MEM＋5％FBSを用いて5枚のT150フラスコに継代培養する（1：10分割）。ほぼ95−100％コンフルエントな単層が認められるまで、37℃＋5％CO2でフラスコをインキュベートする。培養液をデカントし、フラスコを1ｘPBSで2回洗浄する。4−5mLのM.ヒオリーニスを各フラスコに添加する（MOI＝10−100）。上記と同じインキュベーション条件下で2時間を下まわらない時間でフラスコのコンフルエントな細胞を感染させる。感染期間後に、ほぼ37℃に予め温めた十分な感染培養液（MEM＋2％FBS）を合計体積60mL/フラスコで各フラスコに添加する。90％を超えるCPE が観察されるまで（ほぼ3−7日）フラスコをインキュベートする。細胞懸濁物を各フラスコから収集し、一緒にプールする（継代＝n）。前記プールした材料を用いて、ほぼ95−100％コンフルエントなMDCK細胞の新しいフラスコを先の感染と同じ態様で感染させ（継代＝n＋1）、用いるフラスコの数を増加させながら必要と考える十分な最終体積を達成する（継代＝n＋2、継代＝n＋3など）。
M.ヒオシノビアエ：
以下のようにいくらか改変しつつM.ヒオリーニスと同じ態様でM.ヒオシノビアエを培養する：感染培養液はDMEM＋2％FBS＋1％アルギニン溶液を含む；M.ヒオシノビアエは典型的にはCPEを示さないので、培養液の色の変化及び濁度が次の継代培養への重要な指標である。
M.ヒオニューモニアエ：
M.ヒオニューモニアエをM.ヒオリーニスと同じ態様で培養する。感染に用いる株に応じて、CPEは示すことも示さないこともある。したがって、培養液の色の変化及び濁度を次の継代培養への指標として用いることができる。
【００６８】
B．マッコイ細胞でのM.ヒオリーニス、M.ヒオシノビアエ及びM.ヒオニューモニアエの培養条件
M.ヒオリーニス：
攪拌フラスコ中の10％FBS補充改変EMEMでマッコイ細胞を懸濁培養として増殖させる。105−106細胞/mLの最終濃度を有するように細胞を新しいフラスコに播種することによって継代する。M.ヒオリーニスの場合、3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物（105−106細胞/mLの濃度）を1mLの107−108CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上で3−7日間、5％CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。マイコプラズマの増殖は眼に見える酸性pH変化及び濁度の増加によって確認される。マイコプラズマ増殖はまたPFUアッセイで評価して総数を決定する。
M.ヒオシノビアエ：
M.ヒオシノビアエはM.ヒオリーニスと類似の態様で培養される。 3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物（105−106細胞/mLの濃度）を1mLの105−107CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上でほぼ2週間、5％CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。pH変化及び濁度の増加の両方を用いて増殖を決定し、さらにPFUアッセイで総数を決定する。
M.ヒオニューモニアエ：
M.ヒオニューモニアエは、M.ヒオリーニス及びM.ヒオシノビアエと類似の態様で培養される。 3Lのフラスコに500mLの細胞懸濁物（105−106細胞/mLの濃度）を1mLの105−107CFUとともに播種する。磁気攪拌プレート上でほぼ2週間、5％CO2の存在下に37℃でフラスコをインキュベートする。pH変化及び濁度の増加の両方を用いて増殖を決定し、さらにPFUアッセイで総数を決定することができる。
【００６９】
C．種々の血清タイプによるマイコプラズマ種の培養
あるマイコプラズマ種が種々の種に由来する血清中で培養できるか否かを評価するために、MDCK細胞をM.ヒオリーニスに感染させ、ウシ胎児血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清又はウマ血清中で培養する。各血清タイプについて、MDCK細胞でのM.ヒオリーニスの培養を上記のように実施する（すなわち細胞増殖に5％血清及び感染に2％血清）。M.ヒオリーニスを標準的方法により感染後4日で採集する。CCU（色変化単位（color changing unit））アッセイを実施してM.ヒオリーニスの生力価を決定する。さらにまた、qPCR（定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）を実施して、M.ヒオリーニスの総ゲノム含有量を決定する。例示的実験を表1に示す。
【００７０】
表1：種々の血清タイプによるM.ヒオリーニスの培養
0006456437.tif 000002
表1は、CCUアッセイ又はqPCRのどちらかによって測定された力価は種々の血清タイプについて類似することを示す。さらにまた、ウェスタンブロットのデータ（表示されていない）は前記のデータを支持する。したがって、M.ヒオリーニスはどの血清タイプを培養に用いるかに関係なくMDCK細胞で培養できた。
【実施例２】
【００７１】
ワクチンの調製
最後の継代で採集できるようになったときに（90％を超えるCPEが存在する）凍結融解を1回だけ全フラスコで実施する。凍結融解は以下の工程によって実施する：全フラスコをフリーザー（＜-60℃）に2時間より長く静置する、37℃で急速融解する、溶解物を収集及びプールする、さらに数回ピペットで上下させて均質化する。通常10−20％のグリセロールを懸濁物に添加し均質化する。懸濁物を作業用体積に小分けする。必要とされるまでストックを-60℃より低温で維持する。
上記ストックの適切な体積を0.2％のホルマリンで不活化する。ワクチンをブレンドするときに、過剰なホルマリンを重亜硫酸ナトリウムで中和する。ワクチンをモンタニドTMISA207 VGアジュバント又はCARBOPOL(商標)アジュバントとブレンドする。ワクチンは2−7℃で保存する。
【実施例３】
【００７２】
ワクチンの有効性の判定
ワクチンの有効性は、ブタに投与した後で抗体応答を誘発する能力（及びELISAによる力価）を基準に評価する。
動物のケア：
動物は試験開始前に良好な健康及び栄養状態にある。任意抽出手順の前に、健康審査を実施する。試験期間を通して医薬が添加されていない飼料を用いる。飼料比率は、施設の標準作業手順にしたがい試験動物の齢、状態及び種について適切である。試験の間水は常時供給される。
【００７３】
ブタに投与後のM.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエワクチンの有効性の判定
M.ヒオリーニス：
D0及びD21に再度、通常の仔豚（6週齢+/-5日）の筋肉内にM.ヒオリーニスワクチンの2mL用量（7.1−7.3log10CCU/用量）を投与する。M.ヒオリーニスは上記のように調製する（すなわち上記のようにMDCK細胞で培養する）。ワクチンにモンタニドISA207VG又はCARBOPOL(商標)をアジュバントとして添加する。PBSをプラセボとして用いる。全身の健康状態についてブタを毎日観察する。D0（ワクチン接種前）、7、14、21、28、35及び42に血液を収集する。BIVI R&DインダイレクトELISAにより、M.ヒオリーニス特異抗体について血清を検査する。BIVI R&D ELISAの場合、0.200を超えるS/P比を陽性とみなす。
表2に示す例では、M.ヒオリーニスELISAは強い抗体応答を示す。M.ヒオリーニス-MDCK＋モンタニドISA207VG でワクチン接種した6/6（100％）の動物が、第1の用量の2週間後（D14）に陽性であった。全動物がD42までずっと陽性を維持し、第二の用量の1週間後（D28）に力価は上昇する。
【００７４】
表2：M.ヒオリーニスのELISAの結果
0006456437.tif 000003
ワクチン接種後に同様な抗体応答の結果が、マッコイ細胞で培養されたM.ヒオリーニスを用いて得られた(データは示されていない)。さらにまた、ワクチン接種後の抗体応答について同様な結果が3週齢+/-5日の仔豚で得られた（データは示されていない）。同様な結果が1用量投与後に得られた（データは示されていない)。
M.ヒオニューモニアエ：
D0及びD21に再度、通常の仔豚（6週齢+/-5日）の筋肉内にM.ヒオニューモニアエワクチンの2mL用量（8.0−8.5log10CCU/用量）を投与した。ワクチンにモンタニドISA207VGをアジュバントとして添加する。PBSをプラセボとして用いる。全身の健康状態についてブタを毎日観察する。D0（ワクチン接種前）、7、14、21、28、35及び42に血液を収集し、M.ヒオニューモニアエ抗体の存在について検査する。表3に示す例では、市販のIDEXX ELISAを用いた。IDEXX ELISA の場合、0.400を超えるS/P比を陽性とみなす。
表3に示す例では、M.ヒオニューモニアエELISAは強い抗体応答を示した。M.ヒオニューモニアエMDCK＋ISA207ワクチン接種動物の場合、D14で3/6（50％）の動物が、D21で5/6（83.3％）が陽性で、6/6（100％）はD28，35及び42で陽性であった。
【００７５】
表3：M.ヒオニューモニアエのIDEXX ELISAの結果
0006456437.tif 000004
同様な結果が単一用量投与後に得られた（データは示されていない）。
【実施例４】
【００７６】
真核細胞株培養マイコプラズマ菌から入手したワクチンと無細胞系培養マイコプラズマ菌から入手したワクチンの対比有効性
54匹のCD/CD動物（8週齢+/-5日）を6グループに分ける。グループV1及びV2は各々、それぞれMDCK細胞及びCM（複合培養液：例えばブタ血清及び酵母抽出液を含むプロテオースペプトン系培養液又はフリース（Friis）系培養液）で培養された、不活化M.ヒオリーニス単離株を投与され、グループV3及びV4は、それぞれMDCK細胞及びCMで培養された不活化M.ヒオリーニス単離株を投与される。全てのワクチンはモンタニドISA207VGアジュバントを添加され、投与量及び経路は2ｘ2mL用量でD0に1用量及びD21に第二の用量が筋肉内注射される。グループCC（コントロールグループ）には抗原を含まないプラセボ（PBS）が同じ態様で投与される。グループSC（厳密コントロール）は試験を通して全く処置を受けず、厳密なコントロール動物として供される。D42、43及び44に、グループV1−V4及びCCのブタをビルレントなM.ヒオリーニスでチャレンジする。投与の量及び経路は、それぞれ40mL腹腔内、15mL静脈内及び15mL鼻内である。M.ヒオリーニス特異的ELISA検査のためにD0から試験の終了（D58）まで毎週血液を収集する。R&D M.ヒオリーニスELISAの場合、0.200を超えるS/P比を陽性とみなした。表4に示す例示的な試験では、グループSCの全てのブタがこの試験を通して陰性を維持し、M.ヒオリーニスに曝露されていないことを示した。グループV1−V4及びCCはD0及び7では陰性であった。しかしながら血清学の結果はCM系及びMDCK系ワクチン間で変化を示した。CM系ワクチンと比較したとき、MDCK系ワクチンは、血清転換のより早期の開始、はるかに多数の血清陽性豚、及びより高い血清学的力価を示した。
【００７７】
表4：M.ヒオリーニスのELISAの結果
0006456437.tif 000005
【００７８】
力価測定実験を実施して、細胞培養系ワクチンと無細胞系で培養したマイコプラズマ菌由来ワクチンとを比較する。
M.ヒオリーニスを上記に記載したようにマッコイ細胞で培養するか、又はCM（複合培養液）でそれぞれ培養する。
未希釈抗原（“マッコイ+ISA未希釈”）、1：10抗原（“マッコイ+ISA1:10”)及び1：100抗原（“マッコイ+ISA1:100”)を用いマッコイ抗原からワクチンを作製し、全てをアジュバントとしてモンタニドISA207VGとブレンドする。CM由来抗原を用いるワクチンを同じ態様で作製する。
ブタ（ワクチン接種時に3週齢）を2mLの1用量でD0のIM投与によりワクチン免疫する。
表5に示すように、例示的試験のグループ平均はいずれもチャレンジ前（D0−D21）には“陰性”であったが、“マッコイ＋ISA未希釈”及び“マッコイ＋ISA1:10”は、陽性傾向の応答を示した。チャレンジ後1週間（D28）で、“CM＋ISA1:100”を除いて全ワクチングループが応答した。
表5から、各抗原タイプ（マッコイ、CM）が標準的な滴定効果（未希釈＞1：10＞1：100）を示すことは明らかである。さらにまた表5から、“マッコイ＋ISA未希釈”及び“マッコイ＋ISA1:10”ワクチンは、“CM＋ISA未希釈”抗原よりも高い平均スコアを有すること、及びD42の終了まで前記を維持することは明白である。チャレンジ後に陽性（S/Pが0.200以上）平均を有するグループは、“マッコイ＋ISA未希釈”及び“マッコイ＋ISA1:10”グループである。マッコイ未希釈ワクチン及び1:10稀釈は、チャレンジ前及びチャレンジ後の両方でCM未希釈ワクチンよりも高い血清応答を示した。さらにまた、マッコイ1:100でワクチン免疫した動物もまた、プラセボグループ（非ワクチン接種動物）及びCM1:100グループとは区別し得る応答を示した（CM1:100応答又はその欠如は非ワクチン接種動物と同等であった）。力価測定実験は、細胞培養系ワクチンは、無細胞系で培養したマイコプラズマ菌に由来するワクチンと比較してより良好な血清学的結果を有することを示した。
【００７９】
表5：M.ヒオリーニスのELISAの結果
0006456437.tif 000006
【実施例５】
【００８０】
M.ヒオシノビアエ、M.ヒオニューモニアエ及びM.ヒオリーニスの抗原を含む多価ワクチンの有効性
本実験では、15匹のCD/CD動物（11週齢+/-5日）に1用量2mLの三価プロトタイプマイコプラズマ組み合わせワクチンをIM投与した。前記ワクチンは不活化M.ヒオリーニス、不活化M.ヒオニューモニアエ及び不活化M.ヒオシノビアエから成る。全てのマイコプラズマ種をMDCK細胞で調製した。ワクチンにモンタニドISA207VGをアジュバントとして添加した。血液サンプルを0日目から28日目まで収集した。血清の抗体レベルをM.ヒオリーニスBIVI R&D ELISA及びM.ヒオニューモニアエIDEXX ELISAでモニターした。この実験のときには、M.ヒオシノビアエについての血清学的アッセイは入手できなかった。
M.ヒオリーニスELISAはワクチン接種後2週間（D14）で強い抗体応答を示して11/15（73.3％）のブタが陽性であり、D21までに15/15（100％）が陽性であった。
M.ヒオニューモニアエIDEXX ELISAの結果は、4匹のブタがD0でM.ヒオニューモニアエ抗体について陽性（S/P＞0.400）であることを示した。これら4匹のブタを排除すると、5匹の別個のブタがD28までにM.ヒオニューモニアエに血清転換した。これら5匹のうち3匹はD21に陽性であった。
【００８１】
表4：M.ヒオリーニスELISAの結果
0006456437.tif 000007
【００８２】
表5：M.ヒオニューモニアエIDEXX ELISAの結果
0006456437.tif 000008
M.ヒオリーニスの結果は、ワクチン中の存続分画による干渉は存在しないことを示した。さらにまた、本実験に用いた組み合わせワクチン中にブレンドされたM.ヒオリーニス抗原レベルは、1用量2mLの接種後に測定可能な抗体応答を誘発するために十分である。M.ヒオニューモニアエの結果はいくらかの血清転換を明示した。この分画のより高いブレンドレベルが血清転換の増進には有益であり得る。M.ヒオリーニス及びM.ヒオニューモニアエ分画から得られた結果は、これらの種による干渉が存在しないことを示した。