(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを有効成分とし、
ウイルス感染による免疫反応時において、インターフェロンλの産生を促進する、インターフェロンλ産生促進剤（インターフェロンα及び／又はβ産生促進作用による、多発性硬化症、乾癬、メラノーマ、及び髄鞘脱落性多発性神経根炎（Guillan-Barre症候群）の予防・治療用途、並びに、インターフェロンα及び／又はβ産生促進作用による、癌細胞の増殖・転移の抑制、及びウイルスの増殖抑制用途、並びに、抗ノロウイルス、抗ロタウイルス、抗エンテロウイルス、抗アデノウイルス、抗単純ヘルペスウイルス、抗ヒト免疫不全ウイルス、及び抗Ｃ型肝炎ウイルス用途を除く）。
【請求項２】
前記インターフェロンλ産生促進剤は、非免疫反応時においては、インターフェロンλの産生を促進しない、請求項１記載のインターフェロンλ産生促進剤。
【請求項３】
ラクトフェリンが、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は２種以上の混合物である、請求項１又は２に記載のインターフェロンλ産生促進剤。
【請求項４】
ラクトフェリンを有効成分とし、
ウイルス感染による免疫反応時において、インターフェロンλの産生を促進する、インターフェロンλ産生促進用飲食品組成物（インターフェロンα及び／又はβ産生促進作用による、多発性硬化症、乾癬、メラノーマ、及び髄鞘脱落性多発性神経根炎（Guillan-Barre症候群）の予防・治療用途、並びに、インターフェロンα及び／又はβ産生促進作用による、癌細胞の増殖・転移の抑制、及びウイルスの増殖抑制用途、並びに、抗ノロウイルス、抗ロタウイルス抗エンテロウイルス、抗アデノウイルス、抗単純ヘルペスウイルス、抗ヒト免疫不全ウイルス、及び抗Ｃ型肝炎ウイルス用途を除く）。
【請求項５】
前記インターフェロンλ産生促進用飲食品組成物は、非免疫反応時においては、インターフェロンλの産生を促進しない、請求項４記載のインターフェロンλ産生促進用飲食品組成物。
【請求項６】
インターフェロンλ発現能を有する細胞を、ラクトフェリンで処理する処理工程と、
前記細胞に、ポリＩ：Ｃ、不活化ウイルス、及びウイルスＲＮＡから選択される１以上の自然免疫誘導物質を導入する導入工程と、
前記細胞を培養した後に、発現されたインターフェロンλを回収する回収工程と、
を含む、インターフェロンλの製造方法。
【請求項７】
前記細胞は、腸管上皮細胞である、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記自然免疫誘導物質は、ポリＩ：Ｃである、請求項６又は７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記処理工程を行った後に、前記導入工程を行う、請求項６から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロンλ産生促進剤に関する。より詳しくは、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進するインターフェロンλ産生促進剤、該インターフェロンλ産生促進剤を用いた飲食品、インターフェロンλの製造方法、及びインターフェロンλ産生促進作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは、大きく分けて、インターフェロンαやインターフェロンβなどが属するＩ型インターフェロン、インターフェロンγが属するＩＩ型インターフェロン、及び、インターフェロンλが属するＩＩＩ型インターフェロンの３つのタイプがある（非特許文献１及び特許文献１参照）。
【０００３】
この中でもＩＩＩ型インターフェロンに属するインターフェロンλ（ＩＦＮ−λ）は、２００３年に初めてその存在が報告され（非特許文献２及び３参照）、抗ウイルス作用、抗ガン作用、及び免疫調節作用などの多様な生理活性を持つことが報告されている（非特許文献１参照）。インターフェロンλは、哺乳類の上皮細胞で産生され、上皮細胞自身に対して作用を発揮する。インターフェロンλの作用は、その特異受容体を介して発現されるが、その受容体はＩ型インターフェロンやＩＩ型インターフェロンの受容体とは異なることが知られている（非特許文献１参照）。また、インターフェロンλは、Ｉ型インターフェロンやＩＩ型インターフェロンとは構造や機能も異なる（非特許文献１及び特許文献１参照）。
【０００４】
ところで、これまで、インターフェロンλ産生促進作用を有する物質としては、プロバイオティクスが報告されている（非特許文献４）。その他、Ｉ型インターフェロンの産生促進作用を有する物質として、ラクトフェリンが知られている（特許文献２参照）。このラクトフェリンは、哺乳類の乳汁、唾液、血液などの体液や好中球の二次顆粒に含有され、鉄吸収調節作用、抗菌作用、抗ウイルス作用、抗ガン作用、および免疫調節作用などの多様な生理活性を持つことが知られている（非特許文献５参照）。
【０００５】
一方、ラクトフェリンのＩＩＩ型インターフェロン産生促進への利用については、現在に至るまで何らの技術も報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５１４７９４号公報
【特許文献２】特開２００６−８３０８９号公報
【０００７】
【非特許文献１】Journal of Leukocyte Biology, Volume 86, July 2009, p.23-32
【非特許文献２】Nature immunology, Volume 4, No.1, January 2003, p.63-68
【非特許文献３】Nature immunology, Volume 4, No.1, January 2003, p.69-77
【非特許文献４】Applied and Environmental Microbiology, Volume 80, Number5, March 2014, p.1692-1700
【非特許文献５】Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, Volume 53, Number 6, December 2011, p.606-614
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本技術は、インターフェロンλ産生促進への利用が可能な、安全性の高い技術を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、乳由来の成分であるラクトフェリンは、非免疫反応時においてはインターフェロンλ産生促進作用を有さないにも関わらず、免疫反応時においては、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλ産生を促進させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本技術は、まず、ラクトフェリンを有効成分とし、
免疫反応時において、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進する、
インターフェロンλ産生促進剤を提供する。
本技術に用いるラクトフェリンとしては、金属飽和型、金属部分飽和型、アポ型からなる群より選択される１種又は２種以上の混合物を用いることができる。
本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤は、飲食品に含有させることも可能である。
【００１１】
本技術では、次に、インターフェロンλ発現能を有する細胞を、ラクトフェリンで処理する処理工程と、
前記細胞に、自然免疫誘導物質を導入する導入工程と、
を含む、インターフェロンλの製造方法を提供する。
本技術に用いる前記細胞としては、腸管上皮細胞を用いることができる。
本技術に用いる前記自然免疫誘導物質としては、ポリＩ：Ｃ又はその誘導体を用いることができる。
本技術に係る製造方法において、前記導入工程と前記処理工程の順番は特に限定されないが、前記処理工程を行った後に、前記導入工程を行うことが可能である。
【００１２】
本技術では、更に、インターフェロンλの産生を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、
インターフェロンλ発現能を有する細胞を、被検物質で処理する処理工程と、
前記細胞に、自然免疫誘導物質を導入する導入工程と、
前記細胞において産生されたインターフェロンλの産生量を測定する測定工程と、
を含む、スクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本技術によれば、非免疫反応時においてはインターフェロンλ産生を不要に促進させず、免疫反応時においてのみ、インターフェロンλ産生を促進させることができる。また、本技術では、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、生体への安全性が高い。なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本技術に係るインターフェロンλの製造方法のフローチャートである。
【図２】本技術に係るスクリーニング方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１６】
＜１．インターフェロン−λ産生促進剤＞
（１）ラクトフェリン
有効成分であるラクトフェリンは、乳、涙、唾液、血液等に存在する鉄結合性の糖蛋白質である。ラクトフェリンは、特に哺乳動物、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトの乳に含まれる。含有量、入手容易の点から、例えば、ウシ、ヒト等の乳が好ましい。乳は、初乳、移行乳、常乳、末期乳のいずれでもよい。
【００１７】
本技術においては、ラクトフェリンは哺乳動物の乳由来のものに限定されず、他に、前記乳の処理物である脱脂乳、ホエー等から常法（例えば、イオンクロマトグラフィー等）によって分離されたラクトフェリン、遺伝子操作によって微生物、動物細胞、トランスジェニック動物等から産生された組換えラクトフェリン、合成ラクトフェリン、又はそれらの混合物でもよい。また、ラクトフェリンは、非グリコシル化又はグリコシル化されたものでもよい。
【００１８】
本技術の有効成分であるラクトフェリンは、生体材料であって安全な乳由来の物質であるため、比較的安価に簡便に製造することができる。
【００１９】
本技術において、ラクトフェリン中の金属含有量は特に限定されず、本技術では、ラクトフェリンを塩酸やクエン酸等により脱鉄したアポ型ラクトフェリン；該アポ型ラクトフェリンを、鉄、銅、亜鉛、マンガン等の金属でキレートさせて得られる飽和度１００％の状態の金属飽和型ラクトフェリン；及び１００％未満の各種飽和度で金属が結合している状態の金属部分飽和型ラクトフェリンからなる群から選ばれる、いずれか１種又は２種以上の混合物を用いることができる。
【００２０】
（２）インターフェロンλ産生促進剤の特徴及び効果
本技術の有効成分であるラクトフェリンは、後述する実施例で示す通り、非免疫反応時においてはインターフェロンλ産生促進作用を有さない。しかし、免疫反応時においては、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλ産生を促進させることが可能である。そのため、非免疫反応時において、不必要にインターフェロンλを産生させることなく、免疫反応時においてのみ、インターフェロンλ産生を促進させることができるため、インターフェロンλによる副作用の発現等の悪影響を低減させることができる。
【００２１】
本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件等に応じて適宜設定することができる。
【００２２】
以上説明したインターフェロンλ産生促進剤は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、生体への安全性が高い。そのため、副作用や依存性が生じる等の危険性がなく、長期間、連続的に摂取することが可能である。
【００２３】
また、本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤の有効成分であるラクトフェリンは、生体材料として比較的安価な乳由来の原料から安定して簡便に製造することができるので、インターフェロンλ産生促進剤を安価に提供することが可能である。そのため、費用負担の面からも、長期間に渡って継続して摂取することが容易なインターフェロンλ産生促進剤を提供することができる。
【００２４】
本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤は、インターフェロンλが関与する疾患、例えば多発性硬化症、乾癬、メラノーマ、髄鞘脱落性多発性神経根炎（Guillan-Barre症候群）等の予防・治療剤、若しくは癌細胞（骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、悪性リンパ腫、乳癌、肝細胞癌、骨肉腫、黒色腫、口頭乳頭腫、急性白血病等）の増殖や転移の抑制剤やウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳ（Severe Acute Respiratory Syndrome：重症急性呼吸器症候群）ウイルス等）の増殖抑制剤として有用である。さらに、本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤は、癌細胞（骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、悪性リンパ腫、乳癌、肝細胞癌、骨肉腫、黒色腫、口頭乳頭腫、急性白血病等）やウイルス（単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス等）の増殖に起因する種々の疾病・合併症等の治療又は予防、並びにこれら疾病・合併症等のリスクを低減することも可能である。
【００２５】
＜２．インターフェロンλ産生促進用の医薬品＞
本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤の有効成分であるラクトフェリンは、腸管からの吸収性に優れ、かつ、前述の通り免疫反応時において、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλ産生を促進させる効果を有する。そのため、インターフェロンλ産生促進用の医薬品として用いることができる。
【００２６】
また、本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤は、食品として長年使用されてきた乳由来の成分を有効成分とするため、種々の疾患を罹患した患者に対しても安心して投与できる可能性が高い。また、長期間、連続的に投与しても副作用を心配する必要性も少ない。更に、他の薬剤との併用においても安全性が高い。
【００２７】
本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤を医薬品に用いる場合、経口投与及び非経口投与のいずれでもよい。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、顆粒剤、散剤等が挙げられる。非経口投与としては、静注、直腸投与、吸入、経皮投与等が挙げられる。
【００２８】
また、製剤化に際しては、有効成分であるラクトフェリンの他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤を含有しているものであれば、公知の又は将来的に見出されるインターフェロンλ産生促進効果を有する成分を、本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤と併用することもできる。
【００２９】
さらに、適用方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。非経口投与の場合、座剤、噴霧剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤等に製剤化することができる。
【００３０】
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、有効成分であるラクトフェリンのみを製剤化してもよく、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
【００３１】
なお、製剤担体を配合する場合、本技術の有効成分であるラクトフェリンの含有量は特に限定されず、剤形に合わせて適宜選択することができるが、０．０００１〜５質量％の範囲であることが好ましく、０．０００２〜２質量％の範囲であることがより好ましく、０．００６〜２質量％の範囲であることが更に好ましい。
【００３２】
また、前記製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体や基剤を用いることができる。経口投与製剤、座剤、噴霧剤及び注射剤等の非経口製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。軟膏剤及び貼付剤等の非経口製剤の場合の基剤としては、例えば、水溶性基剤、油脂性基剤、乳剤性基剤等が挙げられる。
【００３３】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
【００３４】
結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
【００３５】
崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
【００３６】
滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
【００３７】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
【００３８】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
【００３９】
水溶性基剤としては、例えば、水、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、エタノール、イソプロパノール等が挙げられる。
【００４０】
油脂性基剤としては、例えば、ワセリン、パラフィン、ミリスチン酸イソプロピル、ミツロウ、ラノリン、ステアリン酸、ステアリルアルコール、セタノール等が挙げられる。
【００４１】
乳剤性基剤としては、例えば、前記水溶性基剤と前記油脂性基剤とを界面活性剤で乳化したもの等が挙げられる。
【００４２】
＜３．飲食品＞
上述した通り、本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤の有効成分であるラクトフェリンは、腸管からの吸収性に優れ、かつ、前述の通り免疫反応時において、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλ産生促進を促進させる効果を有する。そのため、インターフェロン−λ産生促進用の飲食品等の有効成分としてこれらに配合して使用することができる。
【００４３】
本技術に係るインターフェロンλ産生促進剤を飲食品に利用する場合、公知の飲食品に添加してインターフェロンλ産生促進効果を有する飲食品を調製することもできるし、飲食品の原料中に混合してインターフェロンλ産生促進効果を有する新たな飲食品を製造することもできる。
【００４４】
前記飲食品は、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等のほか、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料、これら以外の市販品等が挙げられる。
【００４５】
小麦粉製品としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
乳・乳製品としては、例えば、加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、調製粉乳類、クリーム、その他の乳製品等が挙げられる。
油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
上記以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶潰けのり等が挙げられる。
【００４６】
また、本技術で定義される飲食品は、インターフェロンλ産生促進用との保健用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
【００４７】
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
【００４８】
一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ（Point of purchase advertising）等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
【００４９】
また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、これに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
【００５０】
なお、飲食品を製造する際に添加するインターフェロンλ産生促進剤の有効成分であるラクトフェリンの含有量は特に限定されず、適宜選択することができるが、０．０００１〜５質量％の範囲であることが好ましく、０．０００２〜２質量％の範囲であることがより好ましく、０．００６〜２質量％の範囲であることが更に好ましい。
【００５１】
＜４．インターフェロンλの製造方法＞
本技術で有効成分として用いるラクトフェリンは、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進させる効果があるため、自然免疫誘導物質を用いたインターフェロンλの製造方法に、好適に用いることができる。
【００５２】
図１は、本技術に係るインターフェロンλの製造方法のフローチャートである。本技術に係るインターフェロンλの製造方法は、少なくとも、処理工程Ｉと、導入工程ＩＩと、を行う方法である。また、必要に応じて、細胞培養工程ＩＩＩや、回収工程ＩＶなどを適宜行うことができる。以下、各工程について、詳細に説明する。
【００５３】
（１）処理工程Ｉ
処理工程Ｉは、インターフェロンλ発現能を有する細胞を、ラクトフェリンで処理する工程である。処理工程Ｉにおいて、インターフェロンλ発現能を有する細胞のラクトフェリンを用いた処理方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して用いることができる。例えば、インターフェロンλ発現能を有する細胞を含む培地中に、ラクトフェリンを添加し、所定時間、処理を行う方法等が挙げられる。
【００５４】
（２）導入工程ＩＩ
導入工程ＩＩは、インターフェロンλ発現能を有する細胞に、自然免疫誘導物質を導入する工程である。導入工程ＩＩにおいて、インターフェロンλ発現能を有する細胞への自然免疫誘導物質の導入方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して用いることができる。例えば、インターフェロンλ発現能を有する細胞を含む培地中に、自然免疫誘導物質を添加し、所定時間、処理を行う方法等が挙げられる。
【００５５】
導入工程ＩＩにおいて、インターフェロンλ発現能を有する細胞へ導入する自然免疫誘導物質は特に限定されず、自然免疫を誘導し得る物質であれば、公知の物質を自由に選択して用いることができる。例えば、ポリＩ：Ｃ（poly I‐poly C；polyinosinic acid‐polycytidylic acid）又はその誘導体、不活性化ウイルス、ウイルスＲＮＡ等を挙げることができる。
【００５６】
導入工程ＩＩでは、前記細胞への自然免疫誘導物質の導入を補助するために、導入補助剤を使用することも可能である。本技術で用いることができる導入補助剤は、本技術の効果を損なわない限り特に限定されず、自然免疫誘導物質の種類や、導入する細胞の種類等に応じて、自由に選択して用いることができる。例えば、導入する自然免疫誘導物質が核酸である場合、遺伝子導入試薬等を用いることができる。
【００５７】
前記処理工程Ｉと導入工程ＩＩとの順番は特に限定されないが、インターフェロンλの発現量をより増加させるためには、後述する実施例で示す通り、導入工程ＩＩ及び処理工程Ｉを同時に行うことが好ましく、導入工程ＩＩの前に処理工程Ｉを行うことがより好ましい。
【００５８】
（３）細胞培養工程ＩＩＩ
細胞培養工程ＩＩＩは、インターフェロンλ発現能を有する細胞を培養する工程である。本技術に係る製造方法では、前記導入工程Ｉ及び前記処理工程ＩＩの前に、必要に応じて、細胞培養工程ＩＩＩを行うことも可能である。
【００５９】
細胞培養工程ＩＩＩを行う場合、その培養方法も特に限定されず、前記細胞の種類等に応じて、公知の培養方法を自由に選択して用いることができる。
【００６０】
（４）回収工程ＩＶ
回収工程ＩＶは、発現されたインターフェロンλを回収する工程である。本技術に係る製造方法では、前記導入工程Ｉ及び前記処理工程ＩＩの後に、必要に応じて、回収工程ＩＶを行うことも可能である。
【００６１】
回収工程ＩＶを行う場合、その回収方法も特に限定されず、公知の回収方法を自由に選択して用いることができる。
【００６２】
＜５．スクリーニング方法＞
本技術では、前述した通り、ラクトフェリンに、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進させる効果があることを初めて見出しているが、ラクトフェリンの部分を被検物質とすることで、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進させる効果のある物質をスクリーニングする技術に応用することができる。即ち、本技術を応用することにより、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進させる効果のある物質をスクリーニングすることができる。
【００６３】
図２は、本技術に係るスクリーニング方法のフローチャートである。本技術に係るスクリーニング方法は、少なくとも、処理工程Ｉと、導入工程ＩＩと、測定工程Ｖを行う方法である。また、必要に応じて、細胞培養工程ＩＩＩ、回収工程ＩＶ、判定工程ＶＩなどを適宜行うことができる。以下、各工程について、詳細に説明する。なお、導入工程ＩＩ、細胞培養工程ＩＩＩ及び回収工程ＩＶについては、前述した製造方法の各工程と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００６４】
（１）処理工程Ｉ
処理工程Ｉは、インターフェロンλ発現能を有する細胞を、被検物質で処理する工程である。なお、処理工程Ｉの詳細は、前述した製造方法の処理工程Ｉで行う前記細胞のラクトフェリンでの処理方法と同一であるため、ここでは説明を割愛する。
【００６５】
前記処理工程Ｉと前記導入工程ＩＩとの順番は特に限定されないが、被検物質に、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進する作用があった場合には、前述の通り、導入工程ＩＩ及び処理工程Ｉを同時に行うか、更には、導入工程ＩＩの前に処理工程Ｉを行うことで、インターフェロンλの発現量をより増加させることができる。そのため、スクリーニングの精度を向上させるためには、導入工程ＩＩ及び処理工程Ｉを同時に行うことが好ましく、導入工程ＩＩの前に処理工程Ｉを行うことがより好ましい。
【００６６】
（２）測定工程Ｖ
測定工程Ｖは、インターフェロンλ発現能を有する細胞において産生されたインターフェロンλの産生量を測定する工程である。測定工程Ｖにおけるインターフェロンλの産生量の測定方法は、特に限定されず、公知の測定方法を自由に選択して用いることができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）等を採用することができる。
【００６７】
（３）判定工程ＶＩ
判定工程ＶＩは、前記測定工程Ｖで測定されたインターフェロンλの産生量に基づいて、前記被検物質が、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進する作用を有するか否かを判定する工程である。より具体的には、例えば、前記測定工程Ｖにおいて測定されたインターフェロンλの産生量が、しきい値以上又はしきい値を超える場合には、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進する作用ありと判定し、しきい値未満又はしきい値以下の場合には、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進する作用なしと判定することができる。
【００６８】
しきい値を用いて判定する場合、用いるしきい値は、目的に応じて設定することが出来るが、例えば、被検物質による処理のみを行った場合のインターフェロンλの産生量をしきい値として用いることができる。
【００６９】
また、しきい値を用いずに、被検物質による処理のみを行った場合のインターフェロンλの産生量をその都度測定し、被検物質による処理のみを行った場合のインターフェロンλの産生量と、被検物質による処理及び自然免疫誘導物質の導入によって産生されたインターフェロンλの産生量と、を比較することで、前記被検物質が、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλの産生を促進する作用を有するか否かを判定することも可能である。
【実施例１】
【００７０】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００７１】
＜実験例１＞
本実施例では、ラクトフェリンのインターフェロンλ産生促進作用について検討を行った。
【００７２】
［試験方法］
（１）培養
ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から購入）を、７５ｃｍ２フラスコで、１０％ＦＣＳ、１００ｕｎｉｔ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）を用いて継代培養した。８０％コンフルエントの細胞にトリプシン：ＥＤＴＡを加え、細胞を回収し、培地で１：３となるように希釈し、４８ウェルプレートに播種して２日間培養した（９５％コンフルエント）。
【００７３】
（２）細胞処理
ａ．試験例１
前記培養を行った後、４８ウェルプレートから培地を除去し、１０％ＦＣＳ及び抗生物質無添加培地で１回洗浄した後、１０％ＦＣＳ及び抗生物質無添加培地１７６μＬを添加した。さらに、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ・ラクトフェリン（森永乳業株式会社製）を添加し、培地合計３００μＬで細胞を処理し、２４時間後に培地上清を回収した。
【００７４】
ｂ．試験例２
ラクトフェリンを添加する代わりに、終濃度０．１μｇ／ｍＬのポリＩ：Ｃ（Invivogen社製、ＨＭＷ、アニーリンング済み）、及び、１μＬ／ウェルのリポフェクタミン溶液（登録商標、LifeTechnologies社製）を、常法により、混合インキュベートした後に添加した以外は、試験例１と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００７５】
ｃ．試験例３
ラクトフェリンを添加し、１時間処理後に試験例２と同様の方法でポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンを添加した以外は、試験例１と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００７６】
ｄ．試験例４
ラクトフェリン、試験例２と同様の方法でポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンを全て同時に添加した以外は、試験例１と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００７７】
ｅ．試験例５
試験例２と同様の方法でポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンを添加し、１時間処理後にラクトフェリンを添加した以外は、試験例１と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００７８】
ｆ．コントロール
ラクトフェリンを添加せずに、試験例１と同様の方法で細胞処理を行った例を、コントロールとした。
【００７９】
（３）インターフェロンλ産生量の測定
前記試験例１〜５及びコントロールについて、培地上清サンプル中のインターフェロンλ１（ＩＬ−２９）の濃度を、ＥＬＩＳＡキット（Affymetrix社製）を用いて測定した。
【００８０】
［結果］
結果を下記表１に示す。表１に示す通り、ラクトフェリンのみを用いた試験例１では、コントロールと同等のインターフェロンλしか産生しないことが分かった。一方、自然免疫誘導物質であるポリＩ：Ｃ及び遺伝子導入試薬であるリポフェクタミンを用いた試験例２では、コントロールに比べて、多くのインターフェロンλを産生することが分かった。
【００８１】
【表１】
0006472229.tif 000002
【００８２】
自然免疫誘導物質であるポリＩ：Ｃ及び遺伝子導入試薬であるリポフェクタミンに加えて、ラクトフェリンを用いた試験例３〜５では、ポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンを用いた試験例２に比べ、より多くのインターフェロンλを産生することが分かった。
【００８３】
これらの結果から、本技術の有効成分であるラクトフェリンは、非免疫反応時においてはインターフェロンλ産生促進作用を有さないが、免疫反応時においては、自然免疫誘導物質によるインターフェロンλ産生を促進させることが分かった。
【００８４】
また、試験例３〜５の結果を比較すると、ポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンの処理後にラクトフェリンで処理を行った試験例５に比べ、ラクトフェリン、ポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンを同時に添加した試験例４の方が、多くのインターフェロンλを産生し、更に、ラクトフェリンの処理後にポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンで処理を行った試験例３の方が、より多くのインターフェロンλを産生することが分かった。即ち、インターフェロンλの発現量をより増加させるためには、ポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンの処理後にラクトフェリンで処理を行うよりも、ラクトフェリン、ポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンを同時に添加することが好ましく、更に、ラクトフェリンの処理後にポリＩ：Ｃ及びリポフェクタミンで処理を行うことがより好ましいことが分かった。
【００８５】
＜実験例２＞
本実施例では、ラクトフェリンの濃度の違いによるインターフェロンλ産生促進作用について検討を行った。
【００８６】
［試験方法］
（１）培養
実験例１と同様の方法で培養を行った。
【００８７】
（２）細胞処理
ａ．試験例６
ラクトフェリンの添加量を０．００２ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００８８】
ｂ．試験例７
ラクトフェリンの添加量を０．００６ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００８９】
ｃ．試験例８
ラクトフェリンの添加量を０．０２ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００９０】
ｄ．試験例９
ラクトフェリンの添加量を０．０６ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００９１】
ｅ．試験例１０
ラクトフェリンの添加量を０．２ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００９２】
ｆ．試験例１１
ラクトフェリンの添加量を０．６ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００９３】
ｇ．試験例１２
ラクトフェリンの添加量を２ｍｇ／ｍＬとした以外は、試験例３と同様の方法で細胞処理を行い、２４時間後に培地上清を回収した。
【００９４】
ｈ．コントロール
ラクトフェリンを添加せずに、試験例２と同様の方法で細胞処理を行った例を、コントロールとした。
【００９５】
（３）インターフェロンλ産生量の測定
前記試験例６〜１２及びコントロールについて、培地上清サンプル中のインターフェロンλ１（ＩＬ−２９）の濃度を、ＥＬＩＳＡキット（Affymetrix社製）を用いて測定した。
【００９６】
［結果］
結果を下記表２に示す。表２に示す通り、インターフェロンλ産生量は、ラクトフェリンの濃度に依存することが分かった。また、ラクトフェリンの添加量が０．００２ｍｇ／ｍＬの場合でも、コントロールに比べると、インターフェロンλ産生量が増加することが分かった。
【００９７】
【表２】
0006472229.tif 000003
【００９８】
以上の結果から、ラクトフェリンの使用量は０．００２ｍｇ／ｍＬ以上が好ましく、０．００６ｍｇ／ｍＬ以上がより好ましいことが分かった。
【図１】
0006472229.tif 000004
【図２】
0006472229.tif 000005