(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなる下記（ａ）〜（ｄ）及び（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡ：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）前記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡにおいて１個又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加されたＤＮＡ、
（ｆ）前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡと相同性が９０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター（ただし、ＯｓＭａｃ２遺伝子又はＯｓＭａｃ３遺伝子を含むものを除く）。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡがプロモーターと構造遺伝子との間に挿入されている請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
植物細胞、植物組織、植物器官、植物体、及び種子からなる群より選択されるいずれか１つである請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡとタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡ（ただし、ＯｓＭａｃ２遺伝子又はＯｓＭａｃ３遺伝子から合成されるＲＮＡを除く）を用いて、前記タンパク質を合成するタンパク質合成方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む組換えベクター（ただし、ＯｓＭａｃ２遺伝子又はＯｓＭａｃ３遺伝子を含むものを除く）を用いて形質転換体を得ることと、前記形質転換体を培養することと、を含む請求項６に記載のタンパク質合成方法。
【請求項８】
前記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させることを含む請求項６に記載のタンパク質合成方法。
【請求項９】
更に、請求項１に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡから前記翻訳用ＲＮＡを合成することを含む請求項８に記載のタンパク質合成方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のＤＮＡの翻訳エンハンサーとしての使用（ただし、ＯｓＭａｃ２遺伝子又はＯｓＭａｃ３遺伝子を使用する態様を除く）。
【請求項１１】
前記（ｆ）のＤＮＡが、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡと相同性が９５％以上の塩基配列からなるＤＮＡである請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡがプロモーターと構造遺伝子との間の制限酵素部位に挿入されている組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、翻訳エンハンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現の制御は、転写、転写後、翻訳、及び翻訳後の４つの段階において行われている。近年、翻訳の段階での制御（翻訳制御）についての研究が進み、構造遺伝子の翻訳効率を高める翻訳エンハンサーとして、５’非翻訳領域に由来する塩基配列が植物から単離されている（例えば、特開平８−２５６７７７号公報、特開２００３−７９３７２号公報、及び特開２０１１−１０３８３３号公報を参照）。【０００３】
近年、遺伝子組換え技術を用いて細菌、培養細胞、植物等に有用物質を生産させる技術が注目を浴びており、有用物質の発現効率を向上させる技術の開発が待たれている。その中で、翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなるＤＮＡを搭載したベクターが植物形質転換用ベクターとして上市されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、翻訳エンハンサーの単離例はまだわずかである。翻訳エンハンサーは、生物種、細胞種、及び遺伝子の種類によって翻訳効率が異なることが予想されるため、翻訳エンハンサーに対する需要に充分に応じきれていないのが現状である。したがって、翻訳エンハンサーとして使用可能な候補塩基配列、及び当該塩基配列からなるＤＮＡを数多く開発することは重要である。よって、本開示は、翻訳効率に優れる新規な翻訳エンハンサーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を達成するための具体的手段には、以下の実施態様が含まれる。
［１］翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなる下記（ａ）から（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡである：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡにおいて１個又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加されたＤＮＡ、
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ。
［２］［１］に記載のＤＮＡを含む組換えベクターである。
［３］［１］に記載のＤＮＡがプロモーターと構造遺伝子との間に挿入されている［２］に記載の組換えベクターである。
［４］［２］又は［３］に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
［５］植物細胞、植物組織、植物器官、植物体、及び種子からなる群より選択されるいずれか１つである［４］に記載の形質転換体である。
［６］［１］に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡとタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡを用いて、上記タンパク質を合成するタンパク質合成方法である。
［７］［１］に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む組換えベクターを用いて形質転換体を得ることと、上記形質転換体を培養することと、を含む［６］に記載のタンパク質合成方法である。
［８］上記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させることを含む［６］に記載のタンパク質合成方法である。
［９］更に、［１］に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡから上記翻訳用ＲＮＡを合成することを含む［８］に記載のタンパク質合成方法である。
［１０］［１］に記載のＤＮＡの翻訳エンハンサーとしての使用である。
【発明の効果】
【０００６】
本開示によれば、翻訳効率に優れる新規な翻訳エンハンサーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＯｓＭａｃ１遺伝子、ＯｓＭａｃ２遺伝子、及びＯｓＭａｃ３遺伝子の構造を示す図である。
【図２】実施例１及び実施例２で使用した形質転換用プラスミドの構造を示す図である。
【図３】イネ培養細胞における翻訳効率の評価結果を示す図である。
【図４】シロイヌナズナ培養細胞における翻訳効率の評価結果を示す図である。
【図５】小麦胚芽無細胞タンパク質合成系における翻訳効率の評価結果を示す図である。
【図６】イネ培養細胞における翻訳効率の評価結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
≪ＤＮＡ及びその使用≫
本開示のＤＮＡは、翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなる下記（ａ）〜（ｆ）のいずれか１つのＤＮＡである。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡにおいて１個又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加されたＤＮＡ、
（ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、
（ｆ）上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ。
また、本開示の使用は、本開示のＤＮＡの翻訳エンハンサーとしての使用である。
【０００９】
配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の塩基配列を下記表１に示す。配列番号１の塩基配列は、イネ（Oryza sativa）のＯｓＭａｃ２遺伝子（accession no. AK073148）の５’ＵＴＲ（untranslated region、非翻訳領域）から見出されたものであり、配列番号２の塩基配列は、イネのＯｓＭａｃ３遺伝子（accession no. AK069607）の５’ＵＴＲから見出されたものである。また、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ（ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０））は、配列番号２の塩基配列において、５’末端側から１番目〜１６０番目の塩基を欠失させた塩基配列を有するものである。
【００１０】
【表１】
0006521532.tif 000002
【００１１】
図１にＯｓＭａｃ１遺伝子、ＯｓＭａｃ２遺伝子、及びＯｓＭａｃ３遺伝子の構造を示す。図中の５’末端側の線で表される部分が各遺伝子の５’ＵＴＲを表す。白いボックスはｕＯＲＦ（upstream open reading frame）を、黒いボックスは下流ＯＲＦをそれぞれ表す。ＤＵＦ３００ドメイン中の淡色部はＴＭＲ（transmembrane region）を表す。ＯｓＭａｃ２遺伝子及びＯｓＭａｃ３遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列は、それぞれ配列番号１の塩基配列及び配列番号２の塩基配列に対応する。参考として掲載するＯｓＭａｃ１遺伝子（accession no. AK111844）は、その５’ＵＴＲ（配列番号４）が翻訳エンハンサー活性を有することが特開２０１１−１０３８３３号公報に報告されている。なお、配列番号４の塩基配列は選択的スプライシングが生じたことにより複数種存在する５’ＵＴＲのうちの１つ（ＵＴＲｃ）である。
【００１２】
【表２】
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【００１３】
図１に示されるように、ＯｓＭａｃ２遺伝子及びＯｓＭａｃ３遺伝子は、ＯｓＭａｃ１遺伝子と同様に５’ＵＴＲが比較的長い構造を有している。本発明者らは、この長い５’ＵＴＲが何らかの理由（例えば、特殊な立体構造を形成する）により翻訳エンハンサー活性を有し、下流にある遺伝子情報の翻訳効率を高めると推測している。
【００１４】
本開示において、ある塩基配列が有する「翻訳エンハンサー活性」とは、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが構造遺伝子の発現系に存在した場合、この構造遺伝子の転写産物からタンパク質が翻訳される際に、翻訳により形成されるタンパク質の量を増大させる活性をいう。翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列は、構造遺伝子の発現系において、転写産物の塩基配列の中に存在し、タンパク質には翻訳されない塩基配列であり、例えば翻訳開始コドンより上流に存在する。
【００１５】
本開示のＤＮＡは、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれでもよい。本開示のＤＮＡの塩基配列の全長は、その塩基配列が翻訳エンハンサー活性を有する範囲であれば特に制限されない。
【００１６】
本開示のＤＮＡが（ｄ）：（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡにおいて１個又は数個の塩基が欠失、置換、又は付加されたＤＮＡである場合の欠失、置換、又は付加される塩基の個数は、その塩基配列が翻訳エンハンサー活性を有する範囲であればよく、例えば、１個〜３０個程度である。転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点からは少ない方がよく、好ましくは１個〜２０個程度、より好ましくは１個〜１０個程度である。
【００１７】
上記（ｄ）のＤＮＡの一例としては、下記表３に示す配列番号５又は配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ（ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１５２−１５６））は、配列番号２の塩基配列において、５’末端側から１５２番目〜１５６番目の５個の塩基（ＧＣＡＣＴ）を他の塩基（ＣＧＴＧＡ）に置換した塩基配列を有するものである。また、配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ（ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１３７−１３９））は、配列番号２の塩基配列において、５’末端側から１３７番目〜１３９番目の３個の塩基（ＡＴＧ）を他の塩基（ＴＡＧ）に置換した塩基配列を有するものである。
【００１８】
【表３】
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【００１９】
本開示のＤＮＡが（ｅ）：（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである場合の「ストリンジェントな条件下」とは、ナトリウム濃度が１５０ｍＭ〜９００ｍＭ、好ましくは６００ｍＭ〜９００ｍＭであり、温度が６０℃〜６５℃、好ましくは６５℃の条件をいう。
【００２０】
本開示のＤＮＡが（ｆ）：（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡと相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡである場合の「相同性」は、その塩基配列が翻訳エンハンサー活性を有する範囲であれば特に制限されない。転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点からは相同性の数値は大きい方がよく、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上である。「相同性」を具体的な数値として示す場合、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（ＮＣＢＩ、又はAltschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）を用いた配列比較で決定することができる。
【００２１】
本開示のＤＮＡは、通常のＤＮＡ合成の方法に従ってＤＮＡ鎖を化学合成することで得ることができる。また、本開示のＤＮＡは、本開示のＤＮＡを有する生物のｃＤＮＡライブラリーから単離することで得ることができる。上記生物としては、特に制限されないが、例えば、イネ科植物が挙げられ、その中でもイネが好ましく挙げられる。
【００２２】
塩基配列が翻訳エンハンサー活性を有するか否かを確認する方法は、特に制限されず、当該塩基配列が構造遺伝子の発現系に共存する場合と共存しない場合とについて、当該構造遺伝子にコードされるタンパク質の合成量を比較できる方法であればよい。例えば、任意のプロモーターとレポーター遺伝子との間に当該塩基配列からなるＤＮＡを挿入したトランジェントアッセイにより確認することができる。プロモーター及びレポーター遺伝子の具体例としては、後述する組換えベクターの構築に用いられるものと同様のものが挙げられる。
【００２３】
≪組換えベクター≫
本開示の組換えベクターは、本開示のＤＮＡを含むものである。本開示の組換えベクターは、任意のベクターに本開示のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。
【００２４】
本開示のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしては、λファージＤＮＡ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。更に、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、バキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを用いることもできる。植物形質転換用ベクターとしては、例えば、pCAMBIA1301等のpCAMBIAベクター（オーストラリアＣＡＭＢＩＡ）、pGWB2等のpGWBベクター（島根大学総合科学研究支援センター中川研究室）、MATベクター（日本製紙株式会社）、pBI121等が挙げられる。
【００２５】
ベクターに本開示のＤＮＡを挿入する方法は特に制限されない。例えば、精製された上記ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。本開示において上記ＤＮＡは、その塩基配列が有する翻訳エンハンサー活性が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本開示の組換えベクターは、上記ＤＮＡが、任意のプロモーターと発現の目的となる構造遺伝子の翻訳開始コドンとの間に挿入されていることが好ましい。
【００２６】
プロモーター及び発現の目的となる構造遺伝子は、特に制限されない。例えば、各種生物に由来する遺伝子、あるいは一部又は全部を化学合成した遺伝子など、任意の構造遺伝子が挙げられる。なお、構造遺伝子は、通常のクローニング手法（例えば、J. Sambrook, et al., Molecular cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて調製することができる。
【００２７】
発現の目的となる構造遺伝子の例としては、遺伝子機能などの解析を目的として用いられるレポーター遺伝子が挙げられる。ベクターに、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子等のレポーター遺伝子と共に本開示のＤＮＡを搭載することで、遺伝子機能等の解析用の組換えベクターを構築することができる。当該組換えベクターは、従来の解析用組換えベクターに比し、レポーター遺伝子の発現量が増強される。
【００２８】
プロモーターとしては、本開示の組換えベクターを植物に適用する場合には、恒常的な発現をするものとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、緑葉特異的な発現をするものとして、例えばRuBisCOのSmall Subunit遺伝子のプロモーター、ＬＨＣＰ（集光タンパク質）等の光合成関連遺伝子のプロモーター等が挙げられ、貯蔵器官特異的な発現をするものとして、例えば貯蔵デンプンや貯蔵タンパク質の生合成に関わる遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
【００２９】
本開示の組換えベクターを大腸菌に適用する場合には、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーター、又はｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いることができる。本開示の組換えベクターを酵母に適用する場合には、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。
【００３０】
また、本開示の組換えベクターは、必要に応じて、転写のエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＮＯＳ等のターミネーターなどを連結することができる。選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン等の各耐性遺伝子）、除草剤耐性遺伝子（例えば、ビアラホス耐性遺伝子）、突然変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子などが挙げられる。
【００３１】
本開示の組換えベクターは、植物の形質転換に用いられる場合、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、本開示のＤＮＡ、発現の目的となる構造遺伝子、及びＮＯＳターミネーターを適切な配向で搭載しているものが好ましい。
【００３２】
≪形質転換体≫
本開示の形質転換体は、本開示の組換えベクターで形質転換されたものである。本開示の形質転換体は、本開示の組換えベクターを、目的の構造遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００３３】
宿主としては、本開示の組換えベクターに搭載された構造遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。また、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母も挙げられる。また、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞や、Ｓｆ９等の昆虫細胞、タバコのＢＹ２細胞、イネのＯＣ細胞などの植物の株化細胞も挙げられる。更に、宿主として、ラン藻類、クラミドモナス、ユーグレナ等の藻類、キノコ類も挙げられる。
【００３４】
宿主が植物である場合、宿主とは、植物体全体、果実、種子、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根、根茎等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、培養細胞を含む植物細胞のいずれをも意味するものである。本開示の組換えベクターは、植物を宿主として好適に用いられる。
【００３５】
宿主として用いられる植物としては、特に制限されず、例えば、被子植物及び裸子植物のいずれでもよく、被子植物の場合、単子葉植物及び双子葉植物のいずれでもよい。
裸子植物としては、具体的には、ソテツ科のソテツ等、イチョウ科のイチョウ、マツ科のアカマツ、クロマツ、モミ、トウヒ等、スギ科のスギ等、イチイ科のイチイ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
単子葉植物としては、具体的には、イネ科のイネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、ヨシ、ススキ、アマランサス、ミスカンサス、スイッチグラス、ソルガム等、サトイモ科のサトイモ等、ヤシ科のヤシ、ナツメヤシ等、バショウ科のバナナ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
双子葉植物としては、具体的には、アブラナ科のシロイヌナズナ、ナタネ等、ナス科のタバコ、トマト、ジャガイモ等、ウリ科のメロン、カボチャ等、マメ科のダイズ等、アオイ科のワタ等、キク科のキク等、ツバキ科のチャ等、ブドウ科のブドウ等、トウダイグサ科のナンヨウアブラギリ、タイワンアブラギリ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主としては、単子葉植物及び双子葉植物がより好適であり、イネ又はシロイヌナズナがより好適である。
【００３６】
宿主への組換えベクターの導入方法は、特に限定されるものではない。細菌を宿主として用いる場合の組換えベクターの導入方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母を宿主として用いる場合の組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. Methods. Enzymol., 194：182(1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75：1929(1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. J.Bacteriol., 153：163(1983)）等が挙げられる。
【００３７】
植物細胞を宿主として用いる場合の組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルガン法等が挙げられる。植物体、植物器官、又は植物組織を宿主とする場合は、採取した植物切片にアグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法で、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で、組換えベクターを導入することができる。
【００３８】
植物細胞、植物体、植物器官、又はカルスを宿主として用いる場合、組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られたカルス、シュート、毛状根等を分離することにより、形質転換を実施する。得られたカルス、シュート、毛状根等は、そのまま細胞培養、組織培養、又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与等により植物体に再生させることができる。例えば、イネではHieiらの方法（Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)）、Fujimuraらの方法（Fujimura, T. et al., Plant Tissue Culture Letter, 2, 74-75 (1985)）、及びShimamotoらの方法（Shimamoto, K. et al., Nature 338:274-276(1989)）、トウモロコシではShillitoらの方法（Shillito, R. D. et al. Bio/Technology, 7:581(1989)）、ジャガイモではVisserらの方法（Visser, et al. Theor. Appl. Genet., 78:589(1989)）、シロイヌナズナではAkamaらの方法（Akama, K. et al. Plant Cell Rep., 12:7(1992)）等が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換体又はその繁殖媒体（例えば、種子、塊茎、切穂等）から得た形質転換体は、いずれも本開示の形質転換体に包含される。
【００３９】
目的ＤＮＡが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常用いられる条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光、酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００４０】
≪タンパク質合成方法≫
本開示のタンパク質合成方法は、本開示のＤＮＡに対応するＲＮＡと目的とするタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡを用いて、当該タンパク質を合成するタンパク質合成方法である。
本開示のタンパク質合成方法によれば、上記翻訳用ＲＮＡから目的とするタンパク質への翻訳が促進されるので、本開示のＤＮＡに対応するＲＮＡを目的とするタンパク質をコードするＲＮＡと共存させない場合に比し、目的とするタンパク質の合成量を増加させることができる。
【００４１】
本開示において、「本開示のＤＮＡに対応するＲＮＡ」とは、本開示のＤＮＡの塩基配列においてＴ（チミン）をＵ（ウラシル）に置き換えた塩基配列からなるＲＮＡをいう。本開示のＤＮＡに対応するＲＮＡの具体例としては、例えば、本開示のＤＮＡに基づくｍＲＮＡが挙げられる。
【００４２】
目的とするタンパク質は、特に限定されず、例えば、各種生物に由来する構造遺伝子にコードされるタンパク質、あるいは一部又は全部を化学合成した遺伝子にコードされるタンパク質など、任意のタンパク質が挙げられる。具体例は、後述する通りである。
【００４３】
本開示のタンパク質合成方法は、上記翻訳用ＲＮＡからタンパク質の翻訳反応が行われる系を用いるものであれば特に制限されず、従来公知のタンパク質の合成方法を採用することができる。具体的には例えば、形質転換体におけるタンパク質合成方法、及びインビトロ無細胞系におけるタンパク質合成方法が挙げられる。
【００４４】
＜形質転換体におけるタンパク質合成方法＞
本開示のタンパク質合成方法は、本開示のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを含む組換えベクターを用いて形質転換体を得ることと、上記形質転換体を培養することと、を含むタンパク質合成方法とすることができる。
【００４５】
上記「形質転換体を得ること」の具体的な手法は特に制限されず、上記組換えベクターを、発現の目的となる構造遺伝子が発現し得るように宿主に導入することからなる。上記形質転換体は、具体的には例えば、既述の本開示の形質転換体を得る方法と同様の方法により得ることができ、宿主、組換えベクターの導入方法等の好ましい態様も同様である。
【００４６】
上記組換えベクターは、本開示のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを連結することで得ることができる。この連結は、本開示のＤＮＡの塩基配列が有する翻訳エンハンサー活性が発揮されるように連結されればよく、例えば、構造遺伝子の５’上流側に本開示のＤＮＡが位置するように連結する。
上記の連結は、具体的には例えば、適当なベクターを選択し、そこに本開示のＤＮＡ及び発現の目的となる構造遺伝子を、適切な配向で挿入して組換えベクターを作製することにより容易に行うことができる。この組換えベクターは、本開示のＤＮＡの５’上流側に転写を促進させるためのプロモーター配列を有することが好ましく、構造遺伝子の３’下流側に転写を終結させるためのターミネーターを有することが好ましい。上記の連結に用いることができるベクター、プロモーター、及びターミネーター、並びにベクターへのＤＮＡの挿入の方法は、既述の本開示の組換えベクターと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００４７】
上記「形質転換体を培養すること」の具体的な手法は特に制限されず、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本開示において「培養」とは、上記形質転換体を育てることをいい、上記形質転換体が少なくとも維持されればよく、上記形質転換体が植物体全体、種子、植物器官、植物組織の場合、栽培をも含む概念である。上記形質転換体を培養すれば、その培養物（上記形質転換体が植物体全体、種子、植物器官、植物組織の場合、「栽培物」ともいう。）から、発現の目的となる構造遺伝子の発現産物であるタンパク質を得ることができる。本開示において「培養物」又は「栽培物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、植物体全体、種子、植物器官、植物組織、及びこれらの破砕物のいずれをも意味するものである。
【００４８】
更に、上記タンパク質が酵素の場合には、当該酵素によって触媒される反応の産物、又は当該反応に続く一連の生合成反応経路上の中間体及び／又は最終生産物についても、上記形質転換体の培養物又は栽培物から得ることができる。これらの産物を、以下単に「代謝産物」という。
【００４９】
上記形質転換体が例えば大腸菌や動物培養細胞の場合、発現の目的となる構造遺伝子としては、具体的には、バイオ医薬品として用いられるインスリン、成長ホルモン、造血因子、抗体の各遺伝子等が挙げられる。
上記形質転換体が植物の場合、発現の目的となる構造遺伝子としては、除草剤耐性遺伝子、ビタミン合成に関わる遺伝子、ポリフェノール（カテキン等）の合成に関わる遺伝子、花の色素の遺伝子、抗菌ペプチドの合成に関わる遺伝子、抗原ペプチド（アレルゲン、毒素）の低減に関わる遺伝子等が挙げられる。
上記形質転換体が例えばイネ科植物（イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等）や果実をつける植物等の食用植物の場合、上記形質転換体を栽培することで、種子（穀物）や果実、その他の可食部における、発現の目的となる構造遺伝子でコードされるタンパク質の含有量を増加させることができる。上記タンパク質が酵素の場合には、その酵素に関する代謝産物についても、種子（穀物）や果実、その他の可食部における含有量を増加させることができる。
【００５０】
上記形質転換体を培養する方法は、特に制限されず、宿主の培養に用いられる通常の方法を採用することができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた前記形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、上記形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
上記微生物の培養は、通常、振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下、３７℃で行う。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５１】
上記形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えば、ＭＳ基本培地（Murashige, T. & Skoog, F. Physiol. Plant. 15:473(1962)）、ＬＳ基本培地（Linsmaier, E. M. & Skoog, F. Physiol. Plant. 18:100(1965)）、プロトプラスト培養培地（ＬＳ培地を改変したもの）等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。より具体的には、例えば、上記培地に細胞、組織、又は器官を１０ｇ〜１００ｇ新鮮重／Ｌ接種し、必要によりＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡ、カイネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地のｐＨは５〜７に調節し、培養は通常２０℃〜３０℃、好ましくは２５℃前後で、また、０．２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ通気、５０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍ撹拌で１週間〜６週間培養することができる。
上記形質転換体が植物体である場合は、圃場、ガラスハウス等で栽培又は水耕培養することができる。
【００５２】
上記形質転換体の培養の終了後、培養物又は栽培物から目的とするタンパク質及び／又は代謝産物を採取するには、各物質の通常の精製手段を適用することができる。なお、培養物又は栽培物から目的とするタンパク質及び／又は代謝産物を採取することは、培地、圃場等から培養物又は栽培物自体を採取することであってもよい。
【００５３】
大腸菌、酵母菌等の微生物又は培養細胞を宿主として得られた形質転換体の場合、タンパク質が微生物内又は培養細胞内に生産される場合には、微生物又は培養細胞を破砕することにより、タンパク質を抽出することができる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養物中からタンパク質を単離精製することができる。
【００５４】
上記形質転換体が植物細胞又は植物組織の場合、培養の終了後、例えば、以下のようにして目的のタンパク質及び／又は代謝産物を単離精製することができる。
まず、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、液体窒素で凍結させた後、液体窒素中で乳鉢等を用いて磨り潰す処理などにより細胞を破壊する。その後、適宜、抽出用溶液を加えて目的のタンパク質及び／又は代謝産物を含む溶液を抽出し、次いで、濾過、遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液又は代謝産物を含む溶液を得る。上記粗タンパク質溶液からタンパク質をさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。また、代謝産物を含む溶液から代謝産物をさらに精製するには、従来から知られている精製手法を使用することができる。例えば、溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。
【００５５】
植物器官又は植物体からタンパク質及び／又は代謝産物を採取するには、超音波破砕処理、磨砕処理等を行って上記粗タンパク質溶液又は代謝産物を含む溶液の抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同様にして行うことができる。
【００５６】
＜インビトロ無細胞系におけるタンパク質合成方法＞
本開示のタンパク質合成方法は、上記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させること、を含むタンパク質合成方法（以下、「インビトロ無細胞系タンパク質合成方法」ともいう。）とすることができる。
インビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、インビトロで、上記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液（以下、単に「反応液」ともいう。）とを接触させることで、上記翻訳用ＲＮＡからタンパク質の翻訳反応を行い、目的とするタンパク質を合成することができる。
【００５７】
インビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、特に制限されず、例えば、特開２００９−１６５４２６号公報、特開２００７−１４３４３５号公報、特開２００４−３４４０１４号公報、特開２００３−２４５０９４号公報等に記載の方法を適用することができる。具体的には、例えば、下記の構成とすることができる。
【００５８】
上記反応液としては、例えば、Wheat Germ Extract Plus（プロメガ株式会社）、Premium PLUS Kit（株式会社セルフリーサイエンス）、ＲＴＳシステム（フナコシ株式会社）等の試薬キットを利用することができる。
上記翻訳用ＲＮＡと上記反応液とを接触させる方法としては、任意の方法で行えばよく、例えば、上記反応液に上記翻訳用ＲＮＡを添加してもよく、上記翻訳用ＲＮＡを含む溶液に上記反応液を投入してもよい。また、上記反応液に上記翻訳用ＲＮＡを連続的に添加してもよく、定期的に添加してもよい。
翻訳反応の終了後は、目的とするタンパク質を、常法により精製すればよい。具体的には、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、タンパク質を単離精製することができる。
【００５９】
上記翻訳用ＲＮＡを得る方法は特に制限されないが、本開示のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡを用いて、インビトロで転写反応を行うことで転写産物として合成することができる。この転写反応は、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを利用する市販の試薬キット（ロシュ、ニッポンジーン等）等を利用して容易に行うことができる。転写反応により合成された上記翻訳用ＲＮＡは、常法により精製して上記の翻訳反応に用いてもよく、また、転写反応の処理に用いた溶液ごと上記の翻訳反応に用いてもよい。
【００６０】
上記鋳型ＤＮＡは、本開示のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを連結することで得ることができる。この連結は、本開示のＤＮＡの塩基配列が有する翻訳エンハンサー活性が発揮されるように連結されればよく、例えば、構造遺伝子の５’上流側に本開示のＤＮＡが位置するように連結する。
上記の連結は、具体的には例えば、適当なベクターを選択し、そこに本開示のＤＮＡ及び発現の目的となる構造遺伝子を、適切な配向で挿入して組換えベクターを作製することにより容易に行うことができる。この組換えベクターは、本開示のＤＮＡの５’上流側に転写を促進させるためのプロモーター配列を有することが好ましく、構造遺伝子の３’下流側に転写を終結させるためのターミネーターを有することが好ましい。上記の連結に用いることができるベクター、プロモーター、及びターミネーター、並びにベクターへのＤＮＡの挿入の方法は、既述の本開示の組換えベクターと同様であり、好ましい態様も同様である。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００６２】
＜実施例１  イネ培養細胞における翻訳効率の評価＞
カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子との間に本開示のＤＮＡが挿入された形質転換用プラスミドと、参考として本開示のＤＮＡの代わりにＯｓＭａｃ１遺伝子の５’ＵＴＲ（ＵＴＲｃ）が挿入された形質転換用プラスミドとを後述する方法により作製した。【００６３】
図２は作製した形質転換用プラスミドの構造を示し、３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、５’ＵＴＲはＯｓＭａｃ１遺伝子、ＯｓＭａｃ２遺伝子、又はＯｓＭａｃ３遺伝子の５’ＵＴＲ、ＧＵＳはＧＵＳ遺伝子、ＴｅｒはＮＯＳ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒをそれぞれ表す。図中の「ＯｓＭａｃ１−ＵＴＲｃ：：ＧＵＳ」はＯｓＭａｃ１の５’ＵＴＲを含む形質転換用プラスミド、「ＯｓＭａｃ２−ＵＴＲ：：ＧＵＳ」はＯｓＭａｃ２の５’ＵＴＲを含む形質転換用プラスミド、「ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳ」はＯｓＭａｃ３の５’ＵＴＲを含む形質転換用プラスミド、「３５Ｓ：：ＧＵＳ」は５’ＵＴＲを含まない対照の形質転換用プラスミドである。ＯｓＭａｃ１−ＵＴＲｃ：：ＧＵＳにおける「ＵＴＲｃ」は、選択的スプライシングが生じたことにより複数種存在するＯｓＭａｃ１遺伝子の５’ＵＴＲのうちの１つを意味する。【００６４】
温室栽培した野生型イネから既報（Fujimura et al., Plant Tissue Cult. Lett. 2: 74−75 (1985))に従い培養細胞を得た。懸濁培養細胞からプロトプラスト細胞を作製し、上記で作製した形質転換用プラスミドを既報（Yoo et al., Nature Protocols 2: 1565-1575 (2007)）のＰＥＧ法により導入して形質転換した。形質転換したプロトプラスト細胞を２６℃で１６時間、ＷＩ緩衝液（４ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、０．５Ｍ  マンニトール、２０ｍＭ  ＫＣｌ）中で培養し、遠心分離により回収した。【００６５】
回収したプロトプラスト細胞を用いて、既報（Pooggin et al. Journal of Biological Chemistry 275: 17288-17296 (2000)）に従いフルオロメトリックアッセイ法によりＧＵＳ活性を測定した。すなわち、ＧＵＳ抽出バッファー（０．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び１％  ＮｏｎｉＤｅｔ  Ｐ−４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）で抽出し、蛍光基質溶液（０．１％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド）を加え、３７℃で反応させた。その後、０．４Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３を用いて反応を停止させ、ＧＵＳ遺伝子に由来する蛍光シグナル量を励起光３５５ｎｍ、フィルター波長４６０ｎｍの条件で測定し、これをＧＵＳ活性とした。【００６６】
形質転換プラスミドのプロトプラスト細胞への導入の際に、既報（Teramura et al., Plant Biotechnology 29:43-49 (2012)）に従い作製した３５Ｓ−ＧＦＰもあわせて導入し、ＧＦＰ遺伝子に由来する蛍光シグナル量を励起光４８５ｎｍ、フィルター波長５２０ｎｍの条件で測定し、これをＧＦＰ活性とした。【００６７】
上記で得られたＧＵＳ活性の値のＧＦＰ活性に対する値（ＧＵＳ活性／ＧＦＰ活性）を算出し、更に対照の形質転換用プラスミドにより形質転換した細胞の数値を１とした場合の相対値を翻訳効率の指標とした。結果を図３に示す。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。あわせて、半定量ＲＴ−ＰＣＲにより得られたプロトプラスト細胞中のｍＲＮＡの発現量を図３の下部に示す。【００６８】
図３に示すように、ＯｓＭａｃ１−ＵＴＲｃ：：ＧＵＳ（ＯｓＭａｃ１の５’ＵＴＲを含む）、ＯｓＭａｃ２−ＵＴＲ：：ＧＵＳ（ＯｓＭａｃ２の５’ＵＴＲを含む）、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳ（ＯｓＭａｃ３の５’ＵＴＲを含む）を導入して作製した形質転換体は、対照の３５Ｓ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体に比べて翻訳効率が著しく高かった。特に、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体は他の形質転換体に比べて翻訳効率が著しく高かった。【００６９】
＜実施例２  シロイヌナズナ培養細胞における翻訳効率の評価＞
実施例１で用いたものと同じ形質転換用プラスミドのうちＯｓＭａｃ１−ＵＴＲｃ：：ＧＵＳ及びＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳと、対照の３５Ｓ：：ＧＵＳとを、実施例１と同様の方法で作製したシロイヌナズナのプロトプラスト細胞に実施例１と同様の方法で導入し、形質転換体を作製した。次いで、実施例１と同様の方法で翻訳効率を評価した。結果を図４に示す。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。【００７０】
図４に示すように、ＯｓＭａｃ１−ＵＴＲｃ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体の翻訳効率は対照の３５Ｓ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体に比べて２倍程度であったのに対し、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体は対照の１０倍を超える翻訳効率を示した。この結果は、ＯｓＭａｃ３遺伝子の５’ＵＴＲが翻訳効率及び汎用性に優れる翻訳エンハンサーとして特に有用であることを示している。【００７１】
［実施例１、２で使用する形質転換用プラスミドの作製］
ｐＢＩ２２１（Jefferson, R. A., EMBO J., 6, 3901-3907(1987)）の35Ｓ promoter-GUS-Nos terminatorに相当するコーディング領域をＰＣＲプライマー（配列番号７、８）を用いて増幅した。増幅した断片をpENTR/D-TOPO（Invitrogen社）に挿入してpENTR-35S-GUS-Terを得た。
次いで、ＯｓＭａｃ１、ＯｓＭａｃ２、及びＯｓＭａｃ３の各遺伝子の完全長ｃＤＮＡ（イネゲノムリソースセンター（茨城県つくば市）より入手）の５’ＵＴＲを、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩ（ＯｓＭａｃ２及びＯｓＭａｃ３）又はＸｂａＩ（ＯｓＭａｃ１）による切断部位を付加したＰＣＲプライマー（配列番号９、１０（ＯｓＭａｃ１用）、配列番号１１、１２（ＯｓＭａｃ２用）、配列番号１３、１４（ＯｓＭａｃ３用））を用いてそれぞれ増幅した。増幅した断片をＢａｍＨＩ又はＸｂａＩで切断し、pENTR-35S-GUSのＧＵＳ遺伝子の上流に位置するＢａｍＨＩ又はＸｂａＩサイトに挿入してpENTR-35S-5'UTR-GUSを得た。
次いで、pENTR-35S-5'UTR-GUSとｐＧＷＢ１（Nakagawa et al., 2007）とをＬＲクロナーゼ（Invitrogen社）を用いて反応させ、pGWB1-35S-5'UTR-GUSを作製した。得られたプラスミドの35S-5'UTR-GUSをＢＰクロナーゼ（Invitrogen社）を用いてpDONR 221（Invitrogen社）に置換して、実施例１、２で使用する形質転換用プラスミドを作製した。
以上の工程は、いずれも製品に付属の説明書に従って行った。【００７２】
［実施例１における半定量ＲＴ−ＰＣＲ］
全ＲＮＡは既報（Imamura et al., Plant Cell Physiol. 48: 1108−1120 (2007))に従い培養細胞から作製した。一本鎖ｃＤＮＡは１μｇの全ＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ−Ａｃｅ  ｃＤＮＡ合成キットのｏｌｉｇｏ−ｄＴ（２０）プライマー（東洋紡株式会社）を用いて合成した。得られたｃＤＮＡは、既報（She et al., Plant Cell 22: 3280−3294 (2010))に従い、半定量ＲＴ−ＰＣＲにおける各遺伝子の転写産物の検出に用いた。半定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＧＵＳ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したプライマー（配列番号１５、１６）を用いて行った。【００７３】
［実施例１、２で使用したプライマー］
【表４】
0006521532.tif 000005
【００７４】
＜実施例３  小麦胚芽無細胞タンパク質合成系における翻訳効率の評価＞
ＯｓＭａｃ１若しくはＯｓＭａｃ３の５’ＵＴＲ、又はＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）と、ＤｓＲｅｄ２−３ＦＬＡＧとを導入したプラスミドを用いて、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系における翻訳効率を評価した。【００７５】
［小麦胚芽無細胞タンパク質合成用プラスミドの作製］
pEU-E01-MCS（株式会社セルフリーサイエンス）のΩ配列（Ｅ０１）以外の領域を、５’末端に制限酵素ＳｐｅＩによる切断部位を付加したＰＣＲプライマー（配列番号１７、１８）を用いて増幅した。増幅した断片をＳｐｅＩで切断し、Ligation high（東洋紡株式会社）を用いてライゲーションさせ、pEU-MCSを作製した。
次いで、pDsRed2ベクター（タカラバイオ株式会社）のＤｓＲｅｄ２遺伝子領域を、５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩによる切断部位を付加したＰＣＲプライマー（配列番号１９）と、制限酵素ＳａｌＩによる切断部位及び３×ＦＬＡＧ遺伝子配列を付加したＰＣＲプライマー（配列番号２０）とを用いて増幅した。増幅した断片をＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、pEU-MCSのＭＣＳ領域内のＢａｍＨＩ及びＳａｌＩサイトに挿入してpEU-MCS-DsRed2-3FLAGを得た。
次いで、ＯｓＭａｃ１及びＯｓＭａｃ３の５’ＵＴＲ、並びにＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）を、５’末端に制限酵素ＮｏｔＩ（フォワードプライマー）又はＢａｍＨＩ（リバースプライマー）による切断部位を付加したＰＣＲプライマー（配列番号２１、２２（ＯｓＭａｃ１用）、配列番号２３、２４（ＯｓＭａｃ３用）、配列番号２４、２５（ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）用））を用いてそれぞれ増幅した。増幅した断片をＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩで切断し、pEU-MCS-DsRed2-3FLAGのＤｓＲｅｄ２−３ＦＬＡＧ遺伝子の上流に位置するＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩサイトに挿入して、pEU-OsMac1-DsRed2-3FLAG、pEU-OsMac3-DsRed2-3FLAG、及びpEU-OsMac3-UTR(d1-160)-DsRed2-3FLAGをそれぞれ得た。
以上の工程は、いずれも製品に付属の説明書に従って行った。【００７６】
［小麦胚芽無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質の合成］
pEU-OsMac1-DsRed2-3FLAG、pEU-OsMac3-DsRed2-3FLAG、及びpEU-OsMac3-UTR(d1-160)-DsRed2-3FLAGのそれぞれについて、JETSTAR2.0（株式会社ベリタス）を用いてプラスミドＤＮＡを大量に精製し、濃度を１μｇ／μＬに調整した。以降の小麦胚芽無細胞タンパク質合成は、Premium PLUS Kit（株式会社セルフリーサイエンス）を用いて、製品に付属の説明書に従って行った。【００７７】
ＤｓＲｅｄ２−３ＦＬＡＧのタンパク質量の測定結果を図５に示す。図５は、pEU-OsMac1-DsRed2-3FLAGを用いた場合のタンパク質量を１とした場合の相対値で示したものである。
図５に示すように、pEU-OsMac3-DsRed2-3FLAGを用いた場合のタンパク質量は、pEU-OsMac1-DsRed2-3FLAGを用いた場合のタンパク質量に比べて２．４倍であった。また、pEU-OsMac3-UTR(d1-160)-DsRed2-3FLAGを用いた場合のタンパク質量は、pEU-OsMac1-DsRed2-3FLAGを用いた場合のタンパク質量に比べて７．０倍であった。この結果は、配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡが翻訳効率及び汎用性に優れる翻訳エンハンサーとして特に有用であることを示している。【００７８】
［実施例３で使用したプライマー］
【表５】
0006521532.tif 000006
【００７９】
＜実施例４  イネ培養細胞における翻訳効率の評価＞
カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子との間に、ＯｓＭａｃ３の５’ＵＴＲ、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１５２−１５６）、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）、又はＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１３７−１３９）を挿入し、形質転換用プラスミドとして、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳ、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１５２−１５６）：：ＧＵＳ、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）：：ＧＵＳ、及びＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１３７−１３９）：：ＧＵＳを作製した。そして、この形質転換用プラスミドを用いて、イネ培養細胞における翻訳効率を評価した。【００８０】
［形質転換用プラスミドの作製］
配列番号５の塩基配列からなるＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１５２−１５６）、配列番号３の塩基配列からなるＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）、及び配列番号６の塩基配列からなるＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１３７−１３９）の３’末端及び５’末端に制限酵素ＢａｍＨＩによる切断部位を付加したＤＮＡを全合成で作製した。
次いで、得られた３種類のＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、実施例１と同様にして作製したpENTR-35S-GUSのＧＵＳ遺伝子の上流に位置するＢａｍＨＩサイトに挿入してpENTR-35S-OsMac3_5'UTR-GUSを得た。次いで、pENTR-35S-OsMac3_5'UTR-GUSとｐＧＷＢ１（Nakagawa et al, 2007）とをＬＲクロナーゼ（Invitrogen社）を用いて反応させ、pGWB1-35S-OsMac3_5'UTR-GUSを作製した。得られたプラスミドの35S-OsMac3_5'UTR-GUSをＢＰクロナーゼ（Invitrogen社）を用いてpDONR 221（Invitrogen社）に置換して、実施例４で使用する形質転換用プラスミドを作製した。
以上の工程は、いずれも製品に付属の説明書に従って行った。【００８１】
また、実施例１と同様にしてＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳを作製した。対照としては、実施例１と同様の３５Ｓ：：ＧＵＳを準備した。【００８２】
作製した形質転換用プラスミドであるＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳ、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１５２−１５６）：：ＧＵＳ、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）：：ＧＵＳ、及びＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１３７−１３９）：：ＧＵＳと、対照の３５Ｓ：：ＧＵＳとを、実施例１と同様の方法で作製したシロイヌナズナのプロトプラスト細胞に実施例１と同様の方法で導入し、形質転換体を作製した。次いで、実施例１と同様の方法で翻訳効率を評価した。結果を図６に示す。図中のエラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。【００８３】
図６に示すように、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１５２−１５６）：：ＧＵＳ又はＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｓ１３７−１３９）：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体の翻訳効率は、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体と同程度であった。このことから、ＯｓＭａｃ３の５’ＵＴＲの塩基配列の一部を改変しても、翻訳エンハンサーとしての活性が維持されることが分かる。また、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ（ｄ１−１６０）：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体は、ＯｓＭａｃ３−ＵＴＲ：：ＧＵＳを導入して作製した形質転換体に比べて３倍以上の翻訳効率を示した。【００８４】
２０１４年５月１６日に出願された日本出願２０１４−１０２５２８の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
0006521532.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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