(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のすべての特性を有するグルコースデヒドロゲナーゼを含んでなるグルコースセンサを用いて、グルコースを測定する方法。
（Ａ）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする
（Ｂ）Ｄ−グルコースをＤ−グルコノラクトンに変換する反応を触媒する
（Ｃ）マルトースに対する反応性が対Ｄ−グルコース比５％以下である
（Ｄ）Ｄ−グルコースに対するミカエリス定数が１５ｍＭ以下である
（Ｅ）２５℃における同一濃度のグルコース溶液から得られる電流値を１００％とした際の、５℃における電流値の比率が７５％以上であって、
グルコース測定用試薬溶液のｐＨが７．５であり、かつ、以下の（ａ）〜（ｄ）の組成からなるものである
（ａ）クエン酸
（ｂ）フェリシアン化カリウム
（ｃ）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ
（ｄ）カルボキシメチルセルロース
【請求項２】
前記グルコース測定用試薬溶液が、以下の（ａ）〜（ｄ）の組成からなる、請求項１に記載のグルコースを測定する方法。
（ａ）１ｍＭ  クエン酸
（ｂ）５０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
（ｃ）５００Ｕ／ｍｌ  フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ
（ｄ）０．５％  カルボキシメチルセルロース
【請求項３】
電極上の組成物が、以下の（ａ）〜（ｄ）を含んでなる、請求項１に記載のグルコースを測定する方法。
（ａ）５ｎｍｏｌ  クエン酸
（ｂ）２５０ｎｍｏｌ  フェリシアン化カリウム
（ｃ）２．５Ｕ  フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ
（ｄ）２．５μｇ  カルボキシメチルセルロース
【請求項４】
Ｄ−グルコースに対するミカエリス定数が２ｍＭ以下であって、かつ、２５℃における同一濃度のグルコース溶液から得られる電流値を１００％とした際の、５℃における電流値の比率が８０％以上である請求項１〜３のいずれかに記載のグルコースを測定する方法。
【請求項５】
少なくとも作用極・対極からなる電極を有するグルコースセンサを用いて、請求項１〜４のいずれかに記載のグルコースを測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースセンサによるグルコース測定方法であって温度依存的シグナル強度変動の低減されたグルコース測定方法、および、その利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中グルコース濃度の測定は、糖尿病患者が適当な血糖コントロールを行うにあたって必要不可欠である。日常的に血糖値をチェックするために使われるのは簡易型自己血糖測定キットであり、グルコースオキシダーゼ（以下ＧＯＤとも記載）もしくはグルコースデヒドロゲナーゼ（以下ＧＤＨとも記載）を利用したものが知られている。ＧＯＤは血糖測定用酵素として古くから用いられているが、溶存酸素が測定値に影響を与えることから、近年ではＧＤＨを用いたものが主流となってきている。ＧＤＨを原料としたグルコースセンサは、ＧＤＨの以下の反応を利用して血液中のグルコース濃度を測定するものである。
Ｄ−グルコース  ＋  電子受容体（酸化型）  →
Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  電子受容体（還元型）
すなわち、グルコースを酸化することによって生じる電子の流れを測定することにより、グルコースの定量を可能にしている。これまでに血糖測定に用いられているＧＤＨとしては、反応に要する補酵素の違いから、ニコチンアミド依存型、ピロロキノリンキノン（以下ＰＱＱとも記載）依存型、フラビンアデニンジヌクレオチド（以下ＦＡＤとも記載）依存型の３種類が知られている。ニコチンアミド依存型としてはバチルス属由来のものが市販されているが、補酵素を含んだホロ酵素の状態で精製することができないため、センサを作製するにあたって補酵素となるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下ＮＡＤとも記載）などを加えなければならない。この煩雑さ及び補酵素となるＮＡＤ等が高価であることが問題点として挙げられる。一方、ＰＱＱ依存型ＧＤＨはホロ酵素での提供が可能であり、また比活性が高くグルコースに対する十分な応答シグナルを得られるという利点がある一方で、基質特異性の厳密さに欠け、マルトース等のグルコース以外の糖類にも反応してしまう点が問題視されている。これらの問題点をクリアしうるものとして、ＦＡＤ依存型ＧＤＨが浸透しつつある。
【０００３】
またさらに、アスペルギルス属由来ＧＤＨ（特許文献１、２）やペニシリウム属由来ＧＤＨ（特許文献３）などに見られる、キシロース作用性を解消したケカビ科糸状菌由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨも近年見出され、特許出願がなされている（特許文献４〜６）。こうしたＧＤＨを使用した血糖センサも鋭意検討・開発されているものと推察される。
【０００４】
ところで、グルコースセンサにおいてグルコースの定量を行うにあたっては、１０℃〜４０℃の温度範囲での使用が想定される。一般に酵素による触媒を介した化学反応は、温度の上昇に伴って反応速度も上昇し、そして一定の温度を超えた条件では酵素の失活に伴って反応速度も急激に低下するという挙動を示す。このような温度依存的な酵素活性の変動は、測定を行う際の外気温度に依存してグルコースの定量値が変動する要因となりうる。これを避けるために、例えばグルコースセンサに温度計を具備し、測定時の温度から計測値を補正する工夫がなされている。しかしながらこのような温度補正機能も、環境温度が定量値に与える影響を十分に解消しえないことが非特許文献１において指摘されている。よって環境温度がグルコースの定量値に与える影響を低減するためには、酵素自体の特性として特に１０℃〜４０℃の温度範囲において酵素活性の変動が小さいことがより望ましい。
【０００５】
このような観点から、これまで様々な工夫がなされてきた。特許文献７〜９には、酵素の反応温度依存性を改良し、低温領域での活性を、２５℃ないし４０℃における活性と比較してその差が縮められた改変酵素が開示される。こうした改変により温度依存的な感度の乖離は一定の解消はみられているものの完全とはいえず、酵素活性の反応温度依存性とは異なる、別の観点からの問題解決が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許４４９４９７８号
【特許文献２】特許４２９２４８６号
【特許文献３】米国特許７４９４４９４号
【特許文献４】特許４６４８８９３号
【特許文献５】特開２０１３−９０６２１
【特許文献６】特開２０１３−１１６１０２
【特許文献７】特開２０１１−１５２１２９
【特許文献８】特開２０１２−０１９７５６
【特許文献９】ＷＯ２０１０／１３７４８９
【特許文献１０】米国特許７８７１８０５号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】宇野志保ら  （２００９）  医学検査  Ｖｏｌ．５８  ｐ７６−７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、グルコースセンサによるグルコース測定方法であって温度依存的シグナル強度変動の低減されたグルコース測定方法を提供すること、および、前記方法に用いる低温領域での測定感度が高められたグルコースセンサや、前記グルコースセンサ上における低温領域での測定感度を向上させるためのグルコースデヒドロゲナーゼを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行った結果、酵素活性の温度依存性とは異なる観点、より具体的にはグルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の低い酵素を適用することにより、低温領域における感度が高められることを見出し、本発明を完成するに至った。このような観点から低温領域におけるシグナル感度低下を抑制しうることは、これまで報告例がなく、その可能性についても示唆すらされていなかった。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項１．
以下の（Ａ）〜（Ｄ）のすべての特性を有するグルコースデヒドロゲナーゼを含んでなるグルコースセンサを用いて、グルコースを測定する方法。
（Ａ）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
（Ｂ）Ｄ−グルコースをＤ−グルコノラクトンに変換する反応を触媒する。
（Ｃ）マルトースに対する反応性が対Ｄ−グルコース比５％以下である。
（Ｄ）Ｄ−グルコースに対するミカエリス定数が４０ｍＭ以下である。
項２．
少なくとも作用極・対極からなる電極上に、電子伝達物質および以下の（Ａ）〜（Ｄ）のすべての特性を有するグルコースデヒドロゲナーゼを含んでなるグルコースセンサを用いて、グルコースを測定する方法。
（Ａ）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
（Ｂ）Ｄ−グルコースをＤ−グルコノラクトンに変換する反応を触媒する。
（Ｃ）マルトースに対する反応性が対Ｄ−グルコース比５％以下である。
（Ｄ）Ｄ−グルコースに対するミカエリス定数が４０ｍＭ以下である。
項３．
５℃の環境下で得られるシグナル強度が、２５℃の環境下で得られるシグナル強度と比して５０％以上である、項１または２に記載のグルコース測定方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、２５℃以下の温度領域における温度依存的な応答シグナルの変動を低減したグルコースセンサを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施形態は、以下のすべての特性を有するグルコースデヒドロゲナーゼを含んでなるグルコースセンサを用いて、グルコースを測定する方法である。
（Ａ）フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とする。
（Ｂ）Ｄ−グルコースをＤ−グルコノラクトンに変換する反応を触媒する。
（Ｃ）マルトースに対する反応性が対Ｄ−グルコース比５％以下である。
（Ｄ）Ｄ−グルコースに対するミカエリス定数が４０ｍＭ以下である。
【００１３】
前記（Ｄ）におけるミカエリス定数は、好ましくは３５ｍＭ以下であり、より好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは２ｍＭ以下である。
【００１４】
上記のグルコース測定方法で用いられるグルコースデヒドロゲナーゼの由来は特に限定されないが、たとえばペニシリウム属やムコール属の微生物が挙げられる。中でもペニシリウム・イタリカム、ペニシリウム・リラシノエキヌラタム、ムコール・プライニー、ムコール・ヒエマリスなどが好ましい。これらの微生物からグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを抽出するか、あるいは、文献などで公知のグルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列または前記グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡなどの情報を基に合成ＤＮＡを作成し、これらＤＮＡを適当な宿主ベクター系に導入し、得られた形質転換体を栄養培地で培養した培養液を精製して所望のグルコースデヒドロゲナーゼを得ることができる。
【００１５】
上記のグルコース測定方法で用いられるグルコースセンサの形態は特に限定されないが、一例は、以下の構成からなる。すなわち、少なくとも作用極・対極からなる電極を有し、さらに参照極を含んでもよく、それら電極上に、少なくとも上記グルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達物質を含んでなるグルコースセンサである。
電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上にＧＤＨを固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどを用いる方法があり、あるいは電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。使用する電子メディエーターとしては、ＧＤＨから電子を受け取り、発色物質や電極に電子を供与しうるものが挙げられ、たとえばフェリシアン化物塩、フェナジンエトサルフェート、フェナジンメトサルフェート、フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルフェニレンジアミン、１−メトキシ−フェナジンメトサルフェート、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、２，５−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，６−ジメチル−１，４−ベンゾキノン、２，５−ジクロロ−１，４−ベンゾキノン、ニトロソアニリン、フェロセン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、シトクロム等が例示されるが、これらに限定されない。また、電極上のＧＤＨ組成物中には、安定化剤及び／又は活性化剤としてウシ血清アルブミン、セリシン等のタンパク質、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、コール酸塩、デオキシコール酸塩などの界面活性剤、グリシン、セリン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシルグリシン等のアミノ酸、トレハロース、イノシトール、ソルビトール、キシリトール、グリセロール、スクロース等の糖及び／又は糖アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類を適宜添加してもよく、またあるいはプルラン、デキストラン、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどに代表される親水性ポリマーを賦形剤として含んでもよい。
【００１６】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。電極上のグルコースデヒドロゲナーゼおよび電子伝達物質を少なくとも含んでなる組成上にサンプルを添加し、電極に一定の電圧を印加し、電流値を測定する。計測された電流値から、標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。この際、得られる電流値は温度の影響を受け、低温度では電流値は低く、高温では電流値は高くなる。よって、計測時の温度により補正をかけた上でグルコース濃度を計算する必要がある。本発明における、低温での測定感度向上の指標としては、上記方法によって５℃、２５℃の環境下で同一濃度のグルコース溶液から得られる電流値を計測し、２５℃における電流値を１００％とした際の、５℃における電流値の比率として評価する。好ましい比率としては、好ましくは５０％以上であり、より好ましくは５５％以上であり、よりさらに好ましくは７５％以上であり、最も好ましくは８０％以上である。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、前記のグルコースセンサによるグルコース測定方法であって温度依存的シグナル強度変動の低減されたグルコース測定方法である。
本発明において、シグナル強度とは、すなわちグルコースセンサにおいて電圧を印加した際に発生する、ＧＤＨによるグルコースの酸化に起因する電流値の高さのことを言う。
本発明において、シグナル強度の比較は、５℃の環境下で得られるシグナル強度と、２５℃の環境下で得られるシグナル強度とを比較して行うものとする。
本発明においては、５℃の環境下で得られるシグナル強度が、２５℃の環境下で得られるシグナル強度と比して５０％以上であれば、シグナル強度変動が低減されていると判断する。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、前記のグルコースセンサによるグルコース測定方法、または、前記のグルコースセンサによるグルコース測定方法であって温度依存的シグナル強度変動の低減されたグルコース測定方法に用いる、グルコースセンサである。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、前記のグルコースセンサに用いる、前記グルコースセンサ上における低温領域での測定感度を向上させるためのグルコースデヒドロゲナーゼである。
【００２０】
活性測定例
本明細書において、ＦＡＤ依存型ＧＤＨ活性測定は特に断りのない限り、以下の方法に従って行われる。
反応液（０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｄ−グルコース、０．５５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＣＰＩＰ、ｐＨ６．５）２．９ｍＬを石英セルにいれ、３７℃で５分間予備加温する。そしてＧＤＨ溶液０．１ｍＬを加えて混和し、３７℃で５分反応させ、この間７００ｎｍ吸光度を測定する。吸光度変化の直線部分から１分間あたりの吸光度の上昇度（ΔＯＤＴＥＳＴ）を算出する。盲検は、ＧＤＨ溶液の代わりに緩衝液を加えて混和し、同様に３７℃５分インキュベートして７００ｎｍ吸光度を記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を算出する。これらの値を以下の式に当てはめて活性値（Ｕ／ｍＬ）を算出する。なおここでは、基質存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
ＧＤＨ活性（Ｕ／ｍＬ）＝［（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．０×希釈倍率  ］／（４．５×１．０×０．１）
なお、ここで
３．０    ：ＧＤＨ溶液混和後の容量（ｍＬ）
４．５    ：ＤＣＰＩＰのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）
１．０    ：光路長（ｃｍ）
０．１    ：添加するＧＤＨ溶液の液量（ｍＬ）
である。
【００２１】
グルコースに対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出例
本発明に述べる基質に対するミカエリス定数（Ｋｍ）の算出方法は、以下の測定方法により行う。すなわち、測定溶液として上述の活性測定例に記載の反応液組成におけるＤ−グルコースの濃度を２００ｍｍｏｌ／Ｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌとした５種類の反応液を作製し、それぞれの測定溶液を用いて上述の活性測定例の方法に従いＧＤＨ溶液（上述の活性測定例における活性値が０．８Ｕ／ｍｌとなるよう調整した溶液）のΔＯＤ（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。それら測定値をもとにＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロット法（両逆数プロット法）に従ってミカエリス定数（Ｋｍ）を算出する。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１  グルコースに対するＫｍ値の低いＦＡＤ依存型ＧＤＨの調製
ペニシリウム・イタリカム由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨ（以下ＰｉＧＤＨと称する）、ペニシリウム・リラシノエキヌラタム由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨ（以下ＰｌＧＤＨと称する）は、特許文献１０に記載のとおり、それぞれの精製酵素を調製した。
ムコール・プライニー由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨ（以下ＭｐＧＤＨと称する）は、特許文献４に記載のアミノ酸配列を参考に配列番号２に記載の配列からなる合成ＤＮＡを作製した。また、ムコール・ヒエマリス由来ＦＡＤ依存型ＧＤＨ（以下ＭｈＧＤＨと称する）は、特許文献６に記載のアミノ酸配列を参考に配列番号４に記載の配列からなる合成ＤＮＡを作製した。これら合成ＤＮＡは、既に公開となっている特許文献（ＷＯ２０１３／０８０８８１）に記載される宿主（クリプトコッカス・エスピー・Ｓ−２．Ｕ−５株）に、概特許に記載のとおりのフローで形質転換を行った。なお、形質転換の際にベクターとしてｐＣｓＵＸを使用し、配列番号２および４の遺伝子はそれぞれ５‘末端側をクリプトコッカス・エスピー・Ｓ−２株由来キシラナーゼの分泌シグナルと融合し、かつ３’末端側に終止コドン（ＴＡＡ）を付加した状態で概ベクターのＭｌｕＩ／ＳｐｅＩサイトに挿入した。ベクターｐＣｓＵＸの概要及びキシラナーゼ分泌シグナルの配列も、上記特許文献に記載されている。このようにして作製した形質転換体は、２００ｍＬ容のバッフル付きフラスコ中のＹＭ培地６０ｍＬに植菌し、温度２５℃、回転速度１８０ｒｐｍで２日間培養し、培養液全量を６Ｌの生産培地（５％酵母エキス、２％キシロース、０．０２％アデカノール）に加え、３０℃で通気攪拌培養した。培養液を高速冷却遠心機（日立ハイテク製ＣＲ２２型）にセットした連続遠心用ローター（型番：Ｒ１０Ｃ）に通液し、５０００ｒｐｍで回転させることにより菌体を沈降させ、培養液上清を得た。この溶液を分子量５００００カット限外ろ過膜を用いて加水濃縮することにより１０００倍以上になるよう加水し、最終的に液量２Ｌまで濃縮した。この溶液に０．４飽和となるよう硫酸アンモニウムを溶解し、０．４飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．０）で緩衝化したＰｈｅｎｙｌ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６ＦＦ  ＨＳ（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、硫酸アンモニウム濃度が０となるまでグラジエント溶出を行い、ＧＤＨ活性を有する画分を集めた。この溶液を分子量５００００カット限外ろ過膜を用いて１０ｍＬまで濃縮し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファーで緩衝化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００に通液し、ゲルろ過を行って精製酵素を得た。上記計４種類のＧＤＨについて、上述のミカエリス定数の算出例に従ってミカエリス定数（Ｋｍ値）を算出し、これを市販品であるＦＡＤ依存型ＧＤＨ（ＡｏＧＤＨ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来）のＫｍ値と比較した結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
0006569203.tif 000002
【００２５】
グルコースセンサの調製およびシグナル強度の温度依存性比較
グルコース測定用試薬として、以下の組成からなる溶液（ｐＨ＝７．５）を作製した。
１ｍＭ  クエン酸
５０ｍＭ  フェリシアン化カリウム
５００Ｕ／ｍｌ  ＦＡＤ依存型ＧＤＨ
０．５％  カルボキシメチルセルロース
上記溶液５μＬを、３電極を具備するディスポーサブルチップ（ＤＥＰ−ＣＨＩＰ、バイオデバイステクノロジーズ社製）の作用極・対極・参照極上に滴下し、５０℃１０分の加温処理を行うことでセンサチップとした。このセンサチップを専用ソケットを介してポテンショ／ガルバノスタット（ＨＳＶ−１００、北斗電工製）に接続して２５℃の環境下に置き、電極上の組成物に２５℃でプレインキュベーションを行った１０ｍＭの標準グルコース溶液５μＬを添加して＋０．３Ｖの電圧を印加して電流値をモニタリングした。また、これらセンサチップを５℃の環境下において同様に５℃にプレインキュベートしたグルコース溶液と反応させて電流値をモニタリングして、５℃における電流値の、２５℃での電流値に対する比率を求めた。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】
0006569203.tif 000003
【００２７】
表に示すように、５℃におけるシグナルの２５℃での電流値に対する比率は、ＧＤＨのグルコースに対するＫｍ値の影響を受けており、４０ｍＭを下回るＫｍ値を有するＧＤＨにおいて、それを上回るＫｍ値を有するＧＤＨよりも高い比率を示すこと、すなわち低温環境においても比較的高い電流値を示すことが見出された。これはすなわち、グルコースセンサが低温による影響をより受けにくくなったことを意味する。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明により製造したグルコースセンサは、血糖値測定用試薬、血糖センサ並びにグルコース定量キットとしての供給が可能である。
【配列表】
0006569203000001.app