(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むげっ歯動物であって、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のα鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、前記げっ歯動物の細胞の表面上にＭＨＣ  ＩＩ複合体を形成する、げっ歯動物。
【請求項２】
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１に記載のげっ歯動物。
【請求項３】
前記げっ歯動物は、ラットまたはマウスである、請求項１に記載のげっ歯動物。
【請求項４】
前記げっ歯動物はマウスであり、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、請求項３に記載のげっ歯動物。
【請求項５】
前記げっ歯動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、抗原提示細胞の表面上に、機能的な内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを発現しない、請求項１に記載のげっ歯動物。
【請求項６】
内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むげっ歯動物であって、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＱ８のα鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＱ８のβ鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドのβ２およびβ２ドメインを含み、前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、前記げっ歯動物の細胞の表面上にＭＨＣ  ＩＩ複合体を形成する、げっ歯動物。
【請求項７】
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、請求項６に記載のげっ歯動物。
【請求項８】
前記げっ歯動物は、ラットまたはマウスである、請求項６に記載のげっ歯動物。
【請求項９】
前記げっ歯動物はマウスであり、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、請求項８に記載のげっ歯動物。
【請求項１０】
前記げっ歯動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、抗原提示細胞の表面上に、機能的な内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを発現しない、請求項６に記載のげっ歯動物。
【請求項１１】
内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のα鎖の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ-ＤＲ２  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ-ＤＲ２  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウス。
【請求項１２】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１３】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１４】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項１２に記載のマウス。
【請求項１５】
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１６】
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１７】
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項１５に記載のマウス。
【請求項１８】
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ａ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ａ  βポリペプチドも発現しない、請求項１１に記載のマウス。
【請求項１９】
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１１に記載のマウス。
【請求項２０】
内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＱ８のα鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＱ８のβ鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウス。
【請求項２１】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座から、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項２０に記載のマウス。
【請求項２２】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座から、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項２０に記載のマウス。
【請求項２３】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座から、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項２１に記載のマウス。
【請求項２４】
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座は、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項２０に記載のマウス。
【請求項２５】
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座は、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項２０に記載のマウス。
【請求項２６】
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座は、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項２４に記載のマウス。
【請求項２７】
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドを発現しない、請求項２０に記載のマウス。
【請求項２８】
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、請求項２０に記載のマウス。
【請求項２９】
第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含む第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、ならびに
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、
第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含む第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列、ならびに
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第４のヌクレオチド配列
を含むマウスであって、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面に２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現し、
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２またはＨＬＡ−ＤＱ８のα鎖から選択され、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２またはＨＬＡ−ＤＱ８のβ鎖から選択される、マウス。
【請求項３０】
前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２ＡまたはＨ−２Ｅのα鎖から選択され、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、Ｈ−２ＡまたはＨ−２Ｅのβ鎖から選択される、請求項２９に記載のマウス。
【請求項３１】
前記マウスは、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの機能的な細胞外ドメインもマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインも発現しない、請求項２９または３０に記載のマウス。
【請求項３２】
前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｅ遺伝子座であり、
前記第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のα鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、
前記第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ｅ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、
前記第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ｅ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む、
請求項２９から３１のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項３３】
前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ａ遺伝子座であり、
前記第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＱ８のα鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、
前記第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、Ｈ−２Ａ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ａ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＱ８のβ鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、
前記第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、Ｈ−２Ａ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ａ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む、
請求項２９から３２のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項３４】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする核酸であって、
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列
を含み、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８のα鎖遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８のα１ドメインおよびα２ドメインを含み、前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの前記ヒト部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結しており、
前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８のβ遺伝子の少なくとも一部によってコードされ、かつＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８のβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、前記キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの前記ヒト部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結している、核酸。
【請求項３５】
前記げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、マウスＨ−２ＡポリペプチドまたはマウスＨ−２Ｅポリペプチドである、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
マウスのＥＳ細胞の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、
ＥＳ細胞の第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、第１の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程、および
前記ＥＳ細胞の第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、第２の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程
を含み、
前記第１の遺伝子座および前記第２の遺伝子座は、同じＥＳ細胞において逐次改変される、方法。
【請求項３７】
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、およびＨＬＡ−ＤＱ８．１のα鎖からなる群から選択され、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、およびＨＬＡ−ＤＱ８．１のβ鎖からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅのα鎖からなる群から選択され、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅのβ鎖からなる群から選択される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ａ遺伝子座である、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｅ遺伝子座である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
マウスの第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を、第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、
前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、第１の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程を含む工程、ならびに
前記マウスの第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ
ＩＩ  αポリペプチドおよび第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、
前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、第２の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程
を含み、
前記第１の内在性遺伝子座および前記第２の内在性遺伝子座は、前記マウスにおいて逐次改変され、
前記マウスは、前記第１の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座および前記第２の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
【請求項４２】
内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、
前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結する工程を含み、
前記遺伝子座は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
【請求項４３】
前記内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ｅ遺伝子座である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、
前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結する工程を含み、
前記遺伝子座は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
【請求項４５】
前記内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ａ遺伝子座である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
マウスの内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座において前記マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座において前記マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程を含む工程
を含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
【請求項４７】
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
マウスの内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座において、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換え、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドの前記α１ドメインおよびα２ドメインが、前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座において前記マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、かつ
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座において、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列で置き換えて、それによって、前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドの前記β１ドメインおよびβ２ドメインが、前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座において前記マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結し、改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程を含む工程
を含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
【請求項４８】
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ａ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ａ  βポリペプチドも発現しない、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドも発現しない、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドであって、前記キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、またはＨＬＡ−ＤＱ８のヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、前記キメラポリペプチドのげっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド。
【請求項５１】
前記げっ歯動物はラットである、請求項５０に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド。
【請求項５２】
前記げっ歯動物はマウスである、請求項５０に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド。
【請求項５３】
前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドまたはマウスＨ−２Ａ  αポリペプチドである、請求項５２に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド。
【請求項５４】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドであって、前記キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、またはＨＬＡ−ＤＱ８のヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、前記キメラポリペプチドのげっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド。
【請求項５５】
前記げっ歯動物はラットである、請求項５４に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド。
【請求項５６】
前記げっ歯動物はマウスである、請求項５４に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド。
【請求項５７】
前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドまたはＨ−２Ａ  βポリペプチドである、請求項５６に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド。
【請求項５８】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩタンパク質複合体であって、
（ｉ）キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドであって、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、またはＨＬＡ−ＤＱ８のヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのげっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド；および
（ｉｉ）キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドであって、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、またはＨＬＡ−ＤＱ８のヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのげっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド
を含む、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩタンパク質複合体。
【請求項５９】
前記げっ歯動物はラットである、請求項５８に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩタンパク質複合体。
【請求項６０】
前記げっ歯動物はマウスである、請求項５８に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩタンパク質複合体。
【請求項６１】
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、それぞれＨＬＡ−ＤＲ２のαポリペプチドおよびβポリペプチドであり、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、それぞれマウスＨ−２Ｅタンパク質のαポリペプチドおよびβポリペプチドである、請求項６０に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩタンパク質複合体。
【請求項６２】
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、それぞれＨＬＡ−ＤＱ８のαポリペプチドおよびβポリペプチドであり、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、それぞれマウスＨ−２Ａタンパク質のαポリペプチドおよびβポリペプチドである、請求項６０に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩタンパク質複合体。
【請求項６３】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定するための方法であって、
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のげっ歯動物、または請求項１１〜３３のいずれか一項に記載のマウスを、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む抗原に曝露する工程、
前記げっ歯動物または前記マウスに免疫応答を開始させる工程、
前記エピトープに結合するＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞を前記げっ歯動物または前記マウスから単離する工程、および
前記ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞が結合した前記エピトープを同定する工程
を含む方法。
【請求項６４】
（ａ）キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のα鎖、ＨＬＡ−ＤＱ２のα鎖、およびＨＬＡ−ＤＱ８のα鎖からなる群から選択されるヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含む、ヌクレオチド配列、および／または（ｂ）キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ２のβ鎖、ＨＬＡ−ＤＱ２のβ鎖、およびＨＬＡ−ＤＱ８のβ鎖からなる群から選択されるヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む、ヌクレオチド配列を含む単離された細胞であって、
前記単離された細胞は、抗原提示細胞または胚性幹細胞であり、
前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの前記げっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、および／または前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの前記げっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、単離された細胞。
【請求項６５】
前記げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＭＨＣ  αポリペプチドであり、および／または前記げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドである、請求項６４に記載の単離された細胞。
【請求項６６】
（ａ）前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドであり、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドであり、および／または（ｂ）前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドであり、前記マウスＭＨＣ  βポリペプチドは、Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドである、請求項６５に記載の単離された細胞。
【請求項６７】
（ａ）前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ８  αポリペプチドであり、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、Ｈ−２Ａ  αポリペプチドであり、および／または（ｂ）前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ８  βポリペプチドであり、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、Ｈ−２Ａ  βポリペプチドである、請求項６５に記載の単離された細胞。
【請求項６８】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のげっ歯動物、または請求項１１〜３３のいずれか一項に記載のマウスに由来する組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１１日に出願した米国出願第１３／７９３，９３５号の利益を主張する。この出願の内容は、これにより、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質を発現するように遺伝子操作された非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）、ならびにこれを発現する胚、組織、および細胞に関する。本発明は、さらに、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩタンパク質を発現する遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法に関する。リンパ球を活性化し、Ｔ細胞を会合させるペプチドを同定するため、ならびにヒトワクチンおよび他の治療薬を開発するために、ヒト化ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物、細胞、および組織を使用する方法も提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
獲得免疫応答では、外来性抗原が、Ｂリンパ球（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体すなわちＴＣＲ）上の受容体分子によって認識される。これらの外来性抗原は、特殊分化したタンパク質、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれるタンパク質によって細胞の表面にペプチド断片として提示される。ＭＨＣ分子は、約４Ｍｂに及ぶ遺伝子の連結したクラスターとして見出される複数の遺伝子座によってコードされる。マウスでは、ＭＨＣ遺伝子は第１７番染色体上に見出され、歴史的な理由から組織適合性２（Ｈ−２）遺伝子と呼ばれる。ヒトでは、上記遺伝子は第６染色体上に見出され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。マウスおよびヒトにおける遺伝子座は多遺伝子性である；これらは、ヒトゲノムとマウスゲノムとにおいて類似の構成を示すＭＨＣ遺伝子の３つの高度多形性クラス（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を含む（それぞれ、図２および図３を参照されたい）。
【０００４】
ＭＨＣ遺伝子座は、ゲノムにおいて最も高度の多形性を示す；いくつかの遺伝子は、３００を超える対立遺伝子によって表される（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲβおよびヒトＨＬＡ−Ｂ）。全てのクラスＩおよびＩＩ  ＭＨＣ遺伝子は、ペプチド断片を提示し得るが、各々の遺伝子は、多形および対立遺伝子バリアントを反映して、異なる結合特性を有するタンパク質を発現する。任意の所定の個体は、免疫応答の過程においてＢ細胞およびＴ細胞に対する、細胞表面に提示され得る独特な範囲のペプチド断片を有する。
【０００５】
ヒトおよびマウスの両方とも、クラスＩＩ  ＭＨＣ遺伝子を有する（図２および図３を参照されたい）。ヒトでは、古典的なＭＨＣ  ＩＩ遺伝子はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲと呼ばれ、他方で、マウスでは、これらはＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅである（それぞれ、Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅと略されることも多い）。ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座の遺伝子、ヒトではＨＬＡ−ＤＭおよびＨＬＡ−ＤＯ、ならびにマウスではＨ−２ＭおよびＨ−２Ｏによってコードされるさらなるタンパク質は、細胞表面上には見出されないが、エンドサイトーシスの区画内に存在し、ＭＨＣ  ＩＩ分子へのペプチドの正しい負荷を確実にする。クラスＩＩ分子は、２本のポリペプチド鎖からなる：α鎖およびβ鎖。α鎖の細胞外部分は２つの細胞外ドメインα１およびα２を含有し、β鎖の細胞外部分もまた、２つの細胞外ドメインβ１およびβ２を含有する（図１を参照されたい）。α鎖およびβ鎖は互いに非共有結合により会合している。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、炎症の過程中などに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、内皮細胞上に発現される。ＭＨＣ  ＩＩ分子は、典型的には細胞内小胞において生じる抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞に提示するＡＰＣの表面上に発現される。ＣＤ４＋Ｔ細胞会合に関与するために、目的の抗原とのＭＨＣクラスＩＩ複合体は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と会合するのに十分に長く存在するために十分に安定でなければならない。ＡＰＣの表面でＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞と外来性ペプチド／ＭＨＣ  ＩＩ複合体が会合すると、Ｔ細胞は活性化されて、侵入物に対する免疫応答を補助するサイトカインを放出する。
【０００７】
寛容機構に起因して、全ての抗原がＴ細胞活性化引き起こすとは限らない。しかし、いくつかの疾患（例えば、がん、自己免疫疾患）では、自己タンパク質に由来するペプチが免疫系の細胞構成要素の標的になり、このようなペプチドを提示する細胞の破壊をもたらす。臨床的に重要な抗原（例えば、種々のがんに関連する抗原）の認識に関しては著しく進歩してきた。しかし、ヒトＴ細胞において適切な応答を引き起こすペプチド、特に、臨床的に重要な抗原のペプチドの同定および選択を改善するために、ヒト免疫系の諸態様を模倣するｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方の系についての必要性が依然としてある。したがって、ヒト免疫系の構成要素を提示し得る生物システム（例えば、遺伝子改変された非ヒト動物および細胞）についての必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ヒトＭＨＣクラスＩＩタンパク質およびそのキメラに関連し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するペプチドを生成するまたは同定するための生物システムが提供される。細胞性免疫応答において機能するヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物が提供される。ヒト化ＭＨＣ  ＩＩタンパク質をコードするヒト化げっ歯動物遺伝子座もまた提供される。ヒト化ＭＨＣ分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞もまた提供される。１種または複数種のヒト化免疫系分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞を含むｉｎ  ｖｉｖｏ系およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が提供される。
【０００９】
ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）であって、ここで、該ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体のヒト部分がヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体の細胞外ドメイン、例えば、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインおよびヒト化ＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインを含む非ヒト動物が本明細書中で提供される。
【００１０】
１つの態様では、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  α遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物が本明細書中で提供される。１つの実施形態では、このようなキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、非ヒト動物は、動物の細胞の表面上に機能的なＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する。１つの実施形態では、動物におけるヒトＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α１ドメインおよびα２ドメインを含む；１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している（例えば、その調節制御下で発現される）。１つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、例えば、ヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質、ＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質、ＨＬＡ−ＤＱ２タンパク質、およびＨＬＡ−ＤＱ８タンパク質から選択されるＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する。非ヒト動物は、げっ歯動物、例えば、マウスであり得る。１つの態様では、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  α遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、さらに、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  β遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。内在性ＭＨＣ  ＩＩ  α遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法も本明細書中で提供される。このような方法は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  α遺伝子座における、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列による置き換えを含み得る。
【００１１】
内在性ＭＨＣ  ＩＩ  β遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物も本明細書中で提供される。１つの実施形態では、このようなキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、非ヒト動物は、動物の細胞の表面上に機能的なＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する。１つの実施形態では、動物におけるヒトＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β１ドメインおよびβ２ドメインを含む；１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している（例えば、その調節制御下で発現される）。１つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する、例えば、ヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質、ＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質、ＨＬＡ−ＤＱ２タンパク質、およびＨＬＡ−ＤＱ８タンパク質から選択されるＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来する。１つの態様では、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  β遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、さらに、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  α遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。内在性ＭＨＣ  ＩＩ  β遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法も本明細書中で提供される。このような方法は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  β遺伝子座における、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列による置き換えを含み得る。
【００１２】
１つの態様では、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインを含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインを含む、非ヒト動物が提供される。１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドは、細胞の表面で機能的なキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体（例えば、ヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体）を形成する。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ  ＩＩのヒトα１ドメインおよびα２ドメインを含む。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ  ＩＩのヒトβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。種々の態様では、第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される（例えば、それに作動可能に連結している）。種々の態様では、第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される（例えば、それに作動可能に連結している）。いくつかの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。
【００１３】
種々の実施形態では、非ヒト動物は、げっ歯動物であり、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰからなる群から選択されるＨＬＡクラスＩＩタンパク質に由来するヒト配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αおよびβ配列のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４配列に由来する；したがって、ＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲα＊０１遺伝子の配列に由来し、ＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４遺伝子の配列に由来する。本発明のいくつかの実施形態では、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αおよびβ配列のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２配列に由来する；したがって、ＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲα１＊０１遺伝子の配列に由来し、ＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２（１５０１）遺伝子）の配列に由来する。本発明のいくつかの実施形態では、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αおよびβ配列のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ２配列に由来する；したがって、ＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＱα１＊０５遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊１５０１遺伝子）の配列に由来し、ＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＱβ１＊０２遺伝子の配列に由来する。本発明のいくつかの実施形態では、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  αおよびβ配列のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８配列に由来する；したがって、ＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＱα１＊０３０１遺伝子の配列に由来し、ＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−ＤＱβ１＊０３０２遺伝子の配列に由来する。
【００１４】
本発明の種々の実施形態では、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列は同じ染色体上に位置する。いくつかの態様では、動物は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有する２コピーのＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含み、他方、他の態様では、動物は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有する１コピーのＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含む。したがって、動物は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有するＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。１つの実施形態では、本明細書中で記載されるキメラＭＨＣ  ＩＩは、非ヒト動物の生殖細胞系に存在する。
【００１５】
いくつかの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび／またはキメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、非ヒトリーダー配列に作動可能に連結している。
【００１６】
１つの態様では、遺伝子操作された非ヒト動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、げっ歯動物は、マウスおよびラットからなる群から選択される。したがって、いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αおよびβ遺伝子の非ヒト配列は、マウスＭＨＣ  ＩＩタンパク質、例えば、マウスＨ−２ＡまたはＨ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列に由来する。１つの実施形態では、本発明のげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）は、機能的な内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをそれらの内在性遺伝子座から発現しない。げっ歯動物がマウスである１つの実施形態では、マウスは、機能的な内在性Ｈ−２ＥおよびＨ−２Ａポリペプチドをそれらの内在性遺伝子座から発現しない。
【００１７】
したがって、いくつかの実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスであって、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、およびＨＬＡ−ＤＱ８から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、およびＨＬＡ−ＤＱ８から選択されるヒトＨＬＡクラスＩＩタンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２ＡまたはＨ−２Ｅ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２ＡまたはＨ−２Ｅ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該マウスは、機能的なキメラＨＬＡクラスＩＩ複合体を発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、機能的なキメラＨＬＡクラスＩＩ複合体はＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅである。別の実施形態では、機能的なキメラＨＬＡクラスＩＩ複合体はＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅである。別の実施形態では、機能的なキメラＨＬＡクラスＩＩ複合体はＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａである。なお別の実施形態では、機能的なキメラＨＬＡクラスＩＩ複合体はＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａである。いくつかの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインは、ヒトα１ドメインおよびα２ドメインを含む；いくつかの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインは、ヒトβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現され（例えば、それに作動可能に連結している）、第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントの調節制御下で発現される（例えば、それに作動可能に連結している）。種々の実施形態では、マウスは、機能的な内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチド、例えば、Ｈ−２ＥおよびＨ−２Ａポリペプチドを、それらの内在性遺伝子座から発現しない。いくつかの態様では、マウスは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有する２コピーのＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含み、他方、他の態様では、マウスは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有する１コピーのＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含む。
【００１８】
さらに、そのゲノム、例えば、その内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つのヌクレオチド配列を含むマウスが提供される。１つの実施形態では、各複合体は、ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを含み、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびキメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、それぞれヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインおよびヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインを含み、他方で、マウス部分は、それぞれマウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインならびにマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。したがって、マウスは、１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現し得る。
【００１９】
本明細書中で記載されるように遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製する方法もまた提供される。種々の実施形態では、本発明の非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ配列をキメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣ  ＩＩ  αおよびβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換えることによって作製される。１つの実施形態では、本発明は、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）のＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、内在性げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法を提供する。該方法の１つの態様では、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α鎖の細胞外ドメインおよびげっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列、ならびにヒトＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の細胞外ドメインおよびげっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のげっ歯動物部分はマウスＨ−２Ｅタンパク質に由来し、ヒト部分はヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質に由来する。いくつかの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のげっ歯動物部分はマウスＨ−２Ｅタンパク質に由来し、ヒト部分はヒトＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質に由来する。いくつかの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のげっ歯動物部分はマウスＨ−２Ａタンパク質に由来し、ヒト部分はヒトＨＬＡ−ＤＱ２タンパク質に由来する。なお他の態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のげっ歯動物部分はマウスＨ−２Ａタンパク質に由来し、ヒト部分はヒトＨＬＡ−ＤＱ８タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書中で記載される内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座の置き換えは単一のＥＳ細胞において行われ、該単一のＥＳ細胞をげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）胚に導入して、遺伝子改変されたげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）を作製する。
【００２０】
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α鎖の細胞外ドメインおよび非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列ならびにヒトＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の細胞外ドメインおよび非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする非ヒトキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座も本明細書中で提供される。１つの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の内在性ＭＨＣ  ＩＩ位に存在する。１つの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えば、ヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩは、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＤＰ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、およびＨＬＡ−ＤＱ８）から選択される。１つの実施形態では、非ヒトＭＨＣ  ＩＩは、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅから選択されるマウスＭＨＣ  ＩＩである。１つの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を生み出すための、本明細書中で記載される任意の方法によって入手可能である。
【００２１】
本明細書中で記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来する細胞、例えば、単離された抗原提示細胞も本明細書中で提供される。本明細書中で記載される非ヒト動物に由来する組織および胚もまた提供される。
【００２２】
本明細書中で記載される実施形態および態様のいずれもが、他に指示がない限り、文脈から別段明らかでない限り、互いに共同して使用され得る。他の実施形態は、続く詳細な記載を精査して当業者に明らかになる。以下の詳細な記載は、特許請求される本発明を制限しない、本発明の種々の実施形態の代表例を含む。添付の図面は、本明細書の一部を構成し、記載と一緒に、実施形態を例証するためのみに働き、本発明を制限しない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、４つのドメイン：α１、α２、β１、およびβ２を含有する、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されたＭＨＣ  ＩＩクラス分子の概略図である。灰色の円は、ペプチド結合溝に結合したペプチドを表す。
【００２４】
【図２】図２は、ヒトＨＬＡの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。
【００２５】
【図３】図３は、マウスＭＨＣの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。
【００２６】
【図４Ａ】図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ  βおよびＩ−Ｅ  α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα＊０１キメラ）を含む標的化ベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃでは、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ配列を、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間にライゲーションして、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角形はエクソンを表し、黒塗りの三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。
【図４Ｂ】図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ  βおよびＩ−Ｅ  α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα＊０１キメラ）を含む標的化ベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃでは、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ配列を、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間にライゲーションして、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角形はエクソンを表し、黒塗りの三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。
【図４Ｃ】図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ  βおよびＩ−Ｅ  α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα＊０１キメラ）を含む標的化ベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃでは、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ配列を、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間にライゲーションして、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角形はエクソンを表し、黒塗りの三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。
【図４Ｄ】図４（Ａ〜Ｄ）は、ヒト化Ｉ−Ｅ  βおよびＩ−Ｅ  α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα＊０１キメラ）を含む標的化ベクターを生成するための戦略の概略図（原寸に比例しない）である。図４Ｃでは、図４Ｂからの最終ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ配列を、図４Ａからの最終構築物のＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位とＩ−ＣｅｕＩ制限部位の間にライゲーションして、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩおよびＢＡＬＢ／ｃ由来のＩ−Ｅαのエクソン１を含む構築物を生成する。Ｐｇ＝偽遺伝子；ＢＨＲ＝細菌相同組換え；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン；ｈｙｇ＝ハイグロマイシン；ｎｅｏ＝ネオマイシン；ＥＰ＝エレクトロポレーション。三角形はエクソンを表し、黒塗りの三角形はＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウスエクソンを表し（例外として斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１を表す）、白抜きの三角形はヒトエクソンを表す。
【００２７】
【図５】図５は、ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉ−ＥおよびＩ−Ａ遺伝子の原寸に比例しない概略図を示し、ハイグロマイシンカセットを使用したマウス遺伝子座のノックアウト、その後のヒト化Ｉ−Ｅ  βおよびＩ−Ｅ  α（すなわち、それぞれＨ−２Ｅβ／ＨＬＡ−ＤＲβ１*０４キメラおよびＨ−２Ｅα／ＨＬＡ−ＤＲα＊０１キメラ）を含むベクターの導入を示す。白抜きの三角形はヒトエクソンを表す；黒塗りの三角形はマウスエクソンを表す。ゲノタイピングに使用したプローブが囲まれている。
【００２８】
【図６】図６は、図５のネオマイシンカセットのＣｒｅ媒介型除去の原寸に比例しない概略図を示す。白抜きの三角形はヒトエクソンを表す；黒塗りの三角形はマウスエクソンを表す。上の２つの鎖は、ネオマイシン選択カセットを有する、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩヘテロ接合型マウスにおけるＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を表し、下の２つの鎖は、ネオマイシンカセットが除去された、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩヘテロ接合型マウスにおけるＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を表す。
【００２９】
【図７】図７は、マウスおよびヒトクラスＩＩ遺伝子座の原寸に比例しない比較概略図を示す。クラスＩＩ遺伝子が四角形で示されている。種々の核酸断片の相対的なサイズ（ｋｂ）が含まれている。
【００３０】
【図８】図８の左側のパネルは、ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖についてのヒト化戦略の概略図（原寸に比例しない）である；具体的には、この図は、マウス膜貫通配列および細胞質尾部配列を保持する一方での、ＭＨＣ  ＩＩ  α遺伝子のエクソン２およびエクソン３によってコードされるα１ドメインおよびα２ドメインの置き換えを示す。ヒト化遺伝子座では、ＭＨＣ  ＩＩ  αリーダー配列は、マウスＢＡＬＢ／ｃ系統に由来する。右側のパネルは、マウスリーダー配列およびマウス膜貫通配列および細胞質尾部配列を保持する一方での、ＭＨＣ  ＩＩ  β鎖のヒト化を例証する；具体的には、この図は、ＭＨＣ  ＩＩ  β遺伝子のエクソン２およびエクソン３によってコードされるβ１ドメインおよびβ２ドメインの置き換えを示す。上の行は全てヒト配列である；中央の行は全てマウス配列である；下の行は全て、ヒトＨＬＡ−ＤＲ遺伝子に由来するエクソン２およびエクソン３を有するヒト化配列である。
【００３１】
【図９】図９は、ポリ（Ｉ：Ｃ）の存在下（１６８１ＨＥＴ＋ポリ（Ｉ：Ｃ）または非存在下（１６８１ＨＥＴ）での、キメラＨＬＡ−ＤＲ４（ｎｅｏカセットが除去された）に対してヘテロ接合型マウス由来のＢ細胞の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体および野生型マウス（ＷＴマウス）由来のＢ細胞の抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体を用いたＦＡＣＳ分析を示す。
【００３２】
【図１０】図１０は、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を生成するために使用される標的化ベクター、具体的には、ＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ２−Ａマウスを生成するための標的化ベクター（図１０Ａ）、ＨＬＡ−ＤＱ８．１／Ｈ−２Ａマウスを生成するための標的化ベクター（図１０Ｂ）、およびＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅマウスを生成するための標的化ベクター（図１０Ｃ）の概略図（原寸に比例しない）である。この図では、別段の指示がない限り（例えば、ｌｏｘＰ部位など）、白抜きの四角形または三角形はヒトエクソンの配列であり、二重線はヒトイントロンの配列であり、黒塗りの四角形または三角形はマウスエクソンの配列であり、単線はマウスイントロンの配列であり、斜線の入った三角形はＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＩ−Ｅαのエクソン１である。接合部の配列の位置が各標的化ベクター図の下に示されており、また、表１および配列表に示されている。
【００３３】
【図１１】図１１は、ＷＴマウスまたはヘテロ接合型ＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ−２Ａ（「６０４０Ｈｅｔ」）マウスから得たＣＤ１９＋Ｂ細胞でのマウスＨ−２Ａ／Ｈ−２Ｅ（ＩＡ／ＩＥ）およびヒトＨＬＡ−ＤＱ２．５発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
発明の詳細な説明
定義
本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを発現する遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）；これを含む胚、細胞、および組織；これを作製する方法；ならびにこれを使用する方法を提供する。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されない限り、またはこの用語もしくは語句が使用される文脈から別段明らかにされない限り、この用語および語句が当該分野で果たしている意味を含む。
【００３５】
用語「保存的」は、保存的アミノ酸置換を記載するために使用される場合、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって達成され得る。一般に、保存的アミノ酸置換は、目的のタンパク質の機能的特性、例えば、ＭＨＣ  ＩＩが目的のペプチドを提示する能力を、実質的に変えない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖、例えばセリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖、例えばアスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖、例えばフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；塩基性側鎖、例えばリジン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性側鎖、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに、硫黄含有側鎖、例えばシステインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発において使用されるように、タンパク質における任意の天然の残基のアラニンによる置換であってもよい。いくつかの実施形態では、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれる、Gonnetら（（１９９２年）Exhaustive  Matching  of  the  Entire  Protein  Sequence  Database、Science  ２５６巻：１４４３〜４５頁）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように行われる。いくつかの実施形態において、上記置換は、中程度に保存的な置換であり、ここで、該置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する。
【００３６】
したがって、そのゲノムがヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩポリペプチド（このポリペプチドは、本明細書中で記載されるアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。
【００３７】
当業者は、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードする核酸残基に加えて、遺伝コードの縮重に起因して、他の核酸が本発明のポリペプチドをコードし得ることを理解する。したがって、保存的アミノ酸置換を有するＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、そのゲノムが遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載されるものとは異なるヌクレオチド配列を含む非ヒト動物もまた提供される。
【００３８】
用語「同一性」は、配列に関して使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知の多くの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を含む。本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１の伸長ギャップペナルティーを用いたＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用し、かつＧｏｎｎｅｔ類似性行列（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８年）を使用して決定される。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、特定の配列に依存する。種々の実施形態では、同一性は、成熟タンパク質の配列を、そのＮ−末端からそのＣ−末端まで比較することによって決定される。種々の実施形態では、キメラヒト／非ヒト配列をヒト配列と比較する場合、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との間のレベルの同一性の確認を目的とした比較を行う（例えば、キメラヒト／マウスタンパク質のヒトエクトドメインとヒトタンパク質のヒトエクトドメインを比較する）ことにおいて、該キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分を使用する（しかし、非ヒト部分を使用しない）。
【００３９】
配列、例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して、用語「相同性」または「相同な」は、最適アラインメントおよび比較における２つの配列が、少なくとも約７５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、少なくとも約８０％のヌクレオチドまたはアミノ酸、少なくとも約９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、９７％を超えるヌクレオチドまたはアミノ酸において、同一であることを意味する。最適な遺伝子標的化のために、標的化構築物は、内在性ＤＮＡ配列に対して相同なアーム（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含有すべきであることを、当業者は理解する；したがって、相同組換えは、標的化構築物と標的にされた内在性配列との間に起こり得る。
【００４０】
用語「作動可能に連結している」は、記載された構成要素が、該要素の意図する様式で機能することを可能にする関係にある近位をいう。このように、タンパク質をコードする核酸配列は、正しい転写調節を保持するように調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結し得る。さらに、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々の部分は、細胞内で、タンパク質の正しい折り畳み、プロセシング、標的化、発現および他の機能的特性を保持するように作動可能に連結し得る。他に言及されない限り、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結している。
【００４１】
用語「ＭＨＣ  ＩＩ複合体」、「ＭＨＣ  ＩＩタンパク質」などは、本明細書中で使用される場合、ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドとＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドとの間の複合体を含む。用語「ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド」または「ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド」（など）は、本明細書中で使用される場合、それぞれＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのみまたはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのみを含む。同様に、用語「ＨＬＡ−ＤＲ４複合体」、「ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質」、「Ｈ−２Ｅ複合体」、「Ｈ−２Ｅタンパク質」など（例えば、他のＭＨＣ  ＩＩ対立遺伝子を指す同様の用語）は、αポリペプチドとβポリペプチドとの間の複合体をいう。典型的には、用語「ヒトＭＨＣ」および「ＨＬＡ」は、相互交換可能に使用される。
【００４２】
遺伝子置き換えに関して用語「置き換え」は、内在性遺伝子の遺伝子座に外来性遺伝物質を置き、それによって、オルソロガスなまたは相同な核酸配列で内在性遺伝子の全てまたは一部を置き換えることをいう。以下の実施例において実証されるように、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座の核酸配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドの部分をコードする；具体的には、ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドの細胞外部分をコードする配列を含むヌクレオチド配列によって置き換えた。
【００４３】
「機能的」は、例えば、機能的なポリペプチドについて本明細書中で使用される場合、通常天然のタンパク質に関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドをいう。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座における置き換え）は、機能的な内在性ポリペプチドを発現しない遺伝子座を生じる。同様に、用語「機能的」は、タンパク質の機能的な細胞外ドメインについて本明細書中で使用される場合、その機能性、例えば、ＭＨＣ  ＩＩの場合では、抗原に結合する能力、Ｔ細胞共受容体に結合する能力などを保持する細胞外ドメインをいう。本発明のいくつかの実施形態では、内在性ＭＨＣ遺伝子座における置き換えは、内在性ＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現しないが、ヒトＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現する遺伝子座を生じる。
【００４４】
遺伝子改変されたＭＨＣ  ＩＩ動物
種々の態様では、本発明は、一般に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含み、したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体（例えば、ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチド）を発現する遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。
【００４５】
ＭＨＣ遺伝子は、３つのクラス：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類され、これらの全ては、ヒト第６番染色体上またはマウス第１７番染色体上のいずれかにコードされる。ヒトおよびマウスのＭＨＣクラスの相対的構成の概略は、それぞれ図２および３に示される。ＭＨＣ遺伝子の大多数は多形性であり、実際、ＭＨＣ遺伝子は、マウスおよびヒトのゲノムの最も多形な遺伝子の１つである。ＭＨＣ多形性は、進化的利点を提供する上で重要であると推定される；配列における変化はペプチド結合における差異をもたらし得、よりよい抗原提示を可能にする。１つの例外として、ヒトＨＬＡ−ＤＲα鎖およびそのマウスホモログであるＥα（すなわち、Ｈ−２Ｅａ）は単形性である。
【００４６】
ＭＨＣクラスＩＩ複合体は、非共有結合により会合している２つのドメイン：本明細書中ではαポリペプチドおよびβポリペプチドとも呼ばれるα鎖およびβ鎖を含む（図１）。該タンパク質は、原形質膜に及ぶ；したがって、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含有する。α鎖の細胞外部分はα１ドメインおよびα２ドメインを含み、β鎖の細胞外部分はβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。α１ドメインおよびβ１ドメインは細胞表面でペプチド結合溝を形成する。ＭＨＣ  ＩＩ複合体のペプチド結合溝の３次元コンフォメーションに起因して、理論的には、結合する抗原の長さに上限はないが、典型的には、ＭＨＣ  ＩＩによって提示されるペプチドは、１３アミノ酸長から１７アミノ酸長の間である。
【００４７】
抗原性ペプチドとのその相互作用に加えて、ＭＨＣ  ＩＩ分子のペプチド結合溝は、ＭＨＣ  ＩＩ複合体形成およびペプチド獲得のプロセスの間に不変鎖（Ｉｉ）と相互作用する。α／β  ＭＨＣ  ＩＩ二量体は小胞体内に集合し、Ｉｉ鎖と会合し、これがペプチド結合の制御およびＭＨＣ  ＩＩのエンドサイトーシス経路への標的化の原因になる。エンドソームにおいて、Ｉｉはタンパク質分解を受け、Ｉｉの小さな断片であるクラスＩＩ関連不変鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）がペプチド結合溝に残る。エンドソームにおいて、ＨＬＡ−ＤＭ（ヒトでは）の制御下で、ＣＬＩＰは抗原性ペプチドと交換される。
【００４８】
ＭＨＣ  ＩＩは、α２ドメインとβ２ドメインとの間の接合部の疎水性間隙においてＴ細胞共受容体ＣＤ４と相互作用する。WangおよびReinherz（２００２年）Structural  Basis  of  T  Cell  Recognition  of  Peptides  Bound  to  MHC  Molecules、Molecular  Immunology、３８巻：１０３９〜４９頁。ＣＤ４およびＴ細胞受容体がペプチドと複合体を形成した同じＭＨＣ  ＩＩ分子に結合すると、Ｔ細胞の抗原に対する感受性が増大し、活性化のために必要な抗原が１００分の１になる。参照により本明細書に組み込まれるJaneway's  Immunobiology、第７版、Murphyら編、Garland  Science、２００８年を参照されたい。
【００４９】
ＭＨＣ  ＩＩの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに関して多くの機能が提唱されてきた。細胞質ドメインの場合では、細胞内シグナル伝達、原形質膜への輸送、および最終的に、抗原提示に重要であることが示されている。例えば、Ｔ細胞ハイブリドーマは、細胞質ドメインにおいて切断されたＭＨＣ  ＩＩ  β鎖によってトランスフェクトされた抗原提示細胞（ＡＰＣ）への応答が乏しく、Ｂ細胞分化の誘導が妨害されることが示された。例えば、Smileyら（１９９６年）Truncation  of  the  class  II  β-chain  cytoplasmic  domain  influences  the  level  of  class  II/invariant  chain-derived  peptide  complexes,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９３巻：２４１〜４４頁を参照されたい。クラスＩＩ分子の切断はｃＡＭＰ産生を損なうと思われる。ＭＨＣ  ＩＩの細胞質尾部の欠失は細胞内輸送に影響を及ぼし、したがって、複合体がエンドサイトーシス経路において関係する抗原と遭遇することが妨げられると仮定されている。Smileyら（上掲）は、細胞質ドメインにおけるクラスＩＩ分子の切断によりＣＬＩＰ／クラスＩＩ複合体の数が減少することを実証しており、これが、抗原提示を有効に調節するＣＬＩＰの能力に影響を及ぼすと仮定される。
【００５０】
ＭＨＣ  ＩＩクラスタリングはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）誘発に重要であるので、細胞質ドメインにおいて切断されたＭＨＣ  ＩＩ分子の細胞骨格との結合、したがって凝集が妨げられると、Ｔ細胞への抗原提示が影響を受けるという仮説が立てられている。Ostrand-Rosenbergら（１９９１年）、Abrogation  of  Tumorigenicity  by  MHC  Class  II  Antigen  Expression  Requires  the  Cytoplasmic  Domain  of  the  Class  II  Molecule、J.  Immunol.  １４７巻：２４１９〜２２頁。実際には、細胞質ドメインにおいて切断されたＨＬＡ−ＤＲはオリゴマー化後に細胞骨格と会合できないことが最近示された。El  Fakhyら（２００４年）Delineation  of  the  HLA-DR  Region  and  the  Residues  Involved  in  the  Association  with  the  Cytoskeleton、J.  Biol.  Chem.  ２７９巻：１８４７２〜８０頁。重要なことに、アクチン細胞骨格は局在型シグナルトランスダクション活性の部位であり、抗原提示に影響を及ぼし得る。細胞骨格との会合に加えて、最近の研究により、全ＨＬＡ−ＤＲ分子の２０％に至るまでが、コレステロールおよびスフィンゴ糖脂質が豊富な微小ドメインであるＡＰＣの脂質ラフト中に構成的に存在すること、および、このような局在化が抗原提示、免疫シナプス形成、およびＭＨＣ  ＩＩ媒介型シグナル伝達に重要であることが示されている。例えば、Dolanら（２００４年）Invariant  Chain  and  the  MHC  II  Cytoplasmic  Domains  Regulate  Localization  of  MHC  Class  II  Molecules  to  Lipid  Rafts  in  Tumor  Cell-Based  Vaccines、J.  Immunol.  １７２巻：９０７〜１４頁を参照されたい。Dolanらは、ＭＨＣ  ＩＩの細胞質ドメインの切断によりＭＨＣ  ＩＩの脂質ラフトへの構成的局在化が減少することを示唆した。
【００５１】
さらに、ＭＨＣ  ＩＩの細胞質ドメイン、具体的にはβ鎖は、ＭＨＣ  ＩＩのエンドサイトーシス輸送、内部移行、および分解を制御する膜関連ＲＩＮＧ−ＣＨ  Ｉ（ＭＡＲＣＨ  Ｉ）であるユビキチンリガーゼによるユビキチン化を受けるロイシン残基を含有し；ＭＡＲＣＨ媒介型ユビキチン化は樹状細胞が成熟すると終わり、これにより原形質膜におけるＭＨＣ  ＩＩのレベルが上昇することが示されている。Shinら（２００６年）Surface  expression  of  MHC  class  II  in  dendritic  cells  is  controlled  by  regulated  ubiquitination、Nature  ４４４巻：１１５〜１８頁；De  Gassartら（２００８年）MHC  class  II  stabilization  at  the  surface  of  human  dendritic  cells  is  the  result  of  maturation-dependent  MARCH  I  down-regulation、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０５巻：３４９１〜９６頁。
【００５２】
ＭＨＣ  ＩＩのα鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインは、互いと相互作用し、この相互作用がクラスＩＩ  ＭＨＣ複合体の正しい集合に重要である。CossonおよびBonifacino（１９９２年）Role  of  Transmembrane  Domain  Interactions  in  the  Assembly  of  Class  II  MHC  Molecules、Nature  ２５８巻：６５９〜６２頁。実際には、α鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインがＩＬ−２受容体のα鎖で置き換えられているＭＨＣ  ＩＩ分子はＥＲ内に保持され、細胞表面ではほとんど検出できなかった。同上。変異誘発研究を通じて、α膜貫通ドメインおよびβ膜貫通ドメインにおける保存されたＧｌｙ残基が細胞表面におけるＭＨＣ  ＩＩ集合の原因であることが見出された。同上。したがって、膜貫通ドメインと細胞質ドメインはどちらも、ＭＨＣ  ＩＩ複合体の正しい機能のために極めて重要である。
【００５３】
種々の実施形態では、本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体、例えば、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはβポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）を提供する。非ヒト動物は、部分的にヒトであり部分的に非ヒト、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する非ヒト動物（例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドを発現する非ヒト動物）であるＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含み得る。１つの態様では、非ヒト動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体のみを発現し、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現しない。いくつかの実施形態では、動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座からいかなる内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体も発現することができないが、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体のみを発現する。他の実施形態では、動物は、機能的な内在性マウスＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を保持する。種々の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）は、その生殖細胞系に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体、例えば、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはβポリペプチド（複数可）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００５４】
１つの実施形態では、そのゲノム、例えば、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウスが本明細書中で提供される。別の実施形態では、そのゲノム、例えば、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウスが本明細書中で提供される。したがって、そのゲノム、例えば、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、ヒトまたはキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む非ヒト動物もまた本明細書中で提供される。
【００５５】
１つの態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体が提供される。１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを含む。１つの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分および／またはキメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、それぞれ、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび／またはヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのペプチド結合ドメインを含む。１つの態様では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはβポリペプチドのヒト部分は、それぞれ、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはβポリペプチドの細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインを含む；別の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインを含む。さらなる実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインを含む；別の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインを含む。
【００５６】
本明細書中で記載されるＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−ＤＰ遺伝子座、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座、およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座のいずれによってもコードされ得る。一般に使用されるＨＬＡ抗原および対立遺伝子のリストは、参照により本明細書に組み込まれるShankarkumarら（（２００４年）The  Human  Leukocyte  Antigen  (HLA)  System、Int.  J.  Hum.  Genet.  ４巻（２号）：９１〜１０３頁）に記載されている。Shankarkumarらはまた、当該分野で使用されるＨＬＡ命名法の簡潔な説明も提示する。ＨＬＡ命名法および種々のＨＬＡ対立遺伝子に関するさらなる情報は、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Holdsworthら（２００９年）The  HLA  dictionary  ２００８年：a  summary  of  HLA-A,  -B,  -C,  -DRB1/3/4/5,  and  DQB1  alleles  and  their  association  with  serologically  defined  HLA-A,  -B,  -C,  -DR,  and  -DQ  antigens、Tissue  Antigens  ７３巻：９５〜１７０頁、およびMarshらによる最新の更新（２０１０年）Nomenclature  for  factors  of  the  HLA  system、２０１０年、Tissue  Antigens  ７５巻：２９１〜４５５頁において見出され得る。したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、そこに記載されている任意の機能的なヒトＨＬＡ分子に由来し得る。
【００５７】
１つの特定の態様では、本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４またはＨＬＡ−ＤＲ２に由来する。典型的には、ＨＬＡ−ＤＲ  α鎖は単形性であり、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ複合体のα鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲα１＊０１遺伝子）によってコードされる。他方では、ＨＬＡ−ＤＲ  β鎖は多形性である。したがって、ＨＬＡ−ＤＲ４は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子によってコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４遺伝子）によってコードされるβ鎖を含む。本明細書中で下に記載されるように、ＨＬＡ−ＤＲ４は、多くの自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症などの発生率に関連することが公知である。ＨＬＡ−ＤＲ２は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子によってコードされるα鎖およびＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２遺伝子）によってコードされるβ鎖を含む。ＨＬＡ−ＤＲ２は、多くの疾患、例えば、グッドパスチャー症候群、多発性硬化症などに関連することが公知である。本発明の１つの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＡ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲα＊０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−ＤＲα＊０１：０１：０１：０１である。別の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子は、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４、例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４：０１：０１である。別の実施形態では、ＨＬＡ−ＤＲＢ対立遺伝子はＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２、例えば、ＨＬＡ−ＤＲβ１＊１５０１である。
【００５８】
別の特定の実施形態では、本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ、例えば、ＨＬＡ−ＤＱ２およびＨＬＡ−ＤＱ８に由来する。ＨＬＡ−ＤＱ２は、ＨＬＡ−ＤＱＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱα１＊０５遺伝子）によってコードされるα鎖を含む。１つの実施形態では、ＨＬＡ−ＤＱα１＊０５遺伝子はＨＬＡ−ＤＱα１＊０５０１である。ＨＬＡ−ＤＱ２は、ＨＬＡ−ＤＱＢ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱβ１＊０２遺伝子）によってコードされるβ鎖も含む。ＨＬＡ−ＤＱ８は、ＨＬＡ−ＤＱＡ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱα１＊０３０１遺伝子）によってコードされるα鎖を含む。ＨＬＡ−ＤＱ８は、ＨＬＡ−ＤＱＢ遺伝子（例えば、ＨＬＡ−ＤＱβ１＊０３０２遺伝子）によってコードされるβ鎖も含む。ＨＬＡ−ＤＱ２．５およびＨＬＡ−ＤＱ８対立遺伝子は、セリアック病およびＩ型糖尿病などの疾患に関連することが公知である。
【００５９】
本発明の実施例では、これらの特定のＨＬＡ配列が記載されているが、任意の適切なＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ配列、例えば、ヒト集団において示される多形バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸改変を有する配列、遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載される配列とは異なる核酸配列などが、本明細書中に包含される。
【００６０】
ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体のヒト部分は、一般的なヒト疾患に関連することが公知のＨＬＡ対立遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされ得る。このようなＨＬＡ対立遺伝子としては、これらに限定されないが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０１０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０２０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０２０２、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０５０１、およびこれらの組合せが挙げられる。ＨＬＡ対立遺伝子／疾患関連性の概要については、参照により本明細書に組み込まれる、Bakkerら（２００６年）A  high-resolution  HLA  and  SNP  haplotype  map  for  disease  association  studies  in  the  extended  human  MHC、Nature  Genetics  ３８巻：１１６６〜７２頁および補遺情報を参照されたい
【００６１】
１つの態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体の非ヒト部分は、内在性非ヒト（例えば、げっ歯動物、例えば、マウス、ラットなど）ＭＨＣ  ＩＩ複合体の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含む。したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含み得る。１つの態様では、動物はマウスであり、キメラαポリペプチドおよびβポリペプチドの非ヒト部分はマウスＨ−２Ｅタンパク質に由来する。したがって、キメラαポリペプチドおよびβポリペプチドの非ヒト部分はマウスＨ−２Ｅタンパク質由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。他の態様では、動物はマウスであり、キメラαポリペプチドおよびβポリペプチドの非ヒト部分はマウスＨ−２Ａタンパク質に由来する。したがって、キメラαポリペプチドおよびβポリペプチドの非ヒト部分は、マウスＨ−２Ａタンパク質由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。本発明の実施例では特定のＨ−２ＥおよびＨ−２Ａ配列が企図されているが、任意の適切な配列、例えば、多形バリアント、保存的／非保存的アミノ酸置換なども本明細書中で企図されている。
【００６２】
本発明の種々の態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする配列（複数可）は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座（例えば、マウスＨ−２Ａおよび／またはＨ−２Ｅ遺伝子座）に位置する。１つの実施形態では、これは、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子（複数可）またはその部分の、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列（複数可）、例えば、本明細書中で記載されるキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質をコードするキメラ遺伝子による置き換えをもたらす。ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドコードするヌクレオチド配列とＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は染色体上で互いの近くに位置するので、置き換えは、この２つの遺伝子がそれぞれ独立して、または一緒に標的化されるように設計され得る；これらの可能性はどちらも本明細書中に包含される。１つの実施形態では、置き換えは、ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドをコードする内在性ヌクレオチド配列の、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  αポリペプチドおよびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列による置き換えを含む。１つの態様では、置き換えは、１つまたは複数（例えば、２つ）の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を表すヌクレオチド配列を置き換えることを含む。したがって、非ヒト動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／非ヒトヌクレオチド配列を含有し、内在性非ヒト遺伝子座からキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質を発現する。
【００６３】
したがって、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインを含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインを含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、細胞の表面で機能的なＭＨＣ  ＩＩ複合体を形成する、非ヒト動物が本明細書中で提供される。
【００６４】
キメラヒト／非ヒトポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトリーダー（シグナル）配列を含むようなものであってもよい。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、内在性ＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。代替の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、それぞれ、別の非ヒト動物、例えば、別のげっ歯動物または別のマウス系統由来のＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの非ヒトリーダー配列を含む。したがって、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。なお別の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、それぞれ、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒトリーダー配列を含む。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＲＡのリーダー配列であり、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４のリーダー配列である。別の実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＲＡのリーダー配列であり、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２のリーダー配列である。別の実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＱα１＊０５のリーダー配列であり、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＱβ１＊０２のリーダー配列である。なお別の実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＱα１＊０３０１のリーダー配列であり、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒトリーダー配列はヒトＨＬＡ−ＤＱβ１＊０３０２のリーダー配列である。
【００６５】
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、そのヒト部分において、それぞれ、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの完全なまたは実質的に完全な細胞外ドメインを含み得る。したがって、ヒト部分は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、９５％またはそれ超の、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするアミノ酸を含み得る。１つの例では、実質的に完全なヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインは、ヒトリーダー配列を欠く。別の例では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ヒトリーダー配列を含む。
【００６６】
さらに、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、内在性非ヒトプロモーターおよび調節エレメント、例えば、それぞれ、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αおよび／またはＭＨＣ  ＩＩ  β調節エレメントに作動可能に連結し得る（例えば、その制御下で発現され得る）。このような配置は、非ヒト動物において、例えば、非ヒト動物における免疫応答の間に、キメラＭＨＣ  ＩＩポリペプチドの正しい発現を促進する。
【００６７】
遺伝子改変される非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択され得る。非ヒト動物について、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手できない場合、他の方法が、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために使用される。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変する工程、および核移入を使用して好適な細胞、例えば、卵母細胞へ改変したゲノムを移植する工程、および胚を形成するために好適な条件下で、非ヒト動物において該改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を懐胎させる工程を含む。
【００６８】
１つの態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。１つの態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミ上科（Dipodoidea）またはネズミ上科（Muroidea）の小哺乳動物である。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、げっ歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。１つの実施形態では、げっ歯動物は、上科ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｍｕｒｏｉｄｅａ）から選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（真のマウスおよびラット（ｔｒｕｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔｓ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｒａｔｓ））、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、イワマウス（ｒｏｃｋ  ｍｉｃｅ）、尾のあるラット（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔｓ）、マダガスカルラットおよびマウス（Ｍａｌａｇａｓｙ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ））、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ（ｓｐｉｎｙ  ｄｏｒｍｉｃｅ））、ならびにメクラネズミ科（Ｓｐａｌａｃｉｄａｅ）（例えば、デバネズミ（ｍｏｌｅ  ｒａｔｅｓ）、タケネズミ（ｂａｍｂｏｏ  ｒａｔｓ）、およびモグラネズミ（ｚｏｋｏｒｓ））から選択される科に由来する。特定の実施形態では、上記遺伝子改変されたげっ歯動物は、真のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、ネズミ科のメンバー由来である。１つの実施形態では、上記動物は、げっ歯動物である。特定の実施形態では、上記げっ歯動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態では、上記非ヒト動物は、マウスである。
【００６９】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである、げっ歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）Revised  nomenclature  for  strain  129  mice、Mammalian  Genome  １０巻：８３６頁を参照されたい、また、Auerbachら（２０００年）Establishment  and  Chimera  Analysis  of  129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Embryonic  Stem  Cell  Linesも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、上記の１２９系統と上記のＣ５７ＢＬ／６系統との混血である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混血であるか、または上記のＢＬ／６系統の混血である。特定の実施形態では、混血の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。なお別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記の系統との混血である。
【００７０】
１つの実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。１つの実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。１つの実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２またはそれ超の系統の混血である。
【００７１】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、そのゲノムに、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体、例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスに関する。１つの実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含み、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性マウス遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ａおよび／またはＨ−２Ｅ遺伝子座）から内在性マウスαおよび／またはβポリペプチドのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを発現しない。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から内在性マウスＭＨＣ  ＩＩポリペプチドの機能的なペプチド結合ドメインも機能的な細胞外ドメインも発現しない。いくつかの実施形態では、マウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、Ｈ−２Ｅａ、およびこれらの組合せを含む機能的なＭＨＣクラスＩＩ分子をコードする遺伝子を欠くゲノムを含む。ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのペプチド結合ドメインは、α１ドメインを含み得、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのペプチド結合ドメインは、β１ドメインを含み得る；したがって、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のペプチド結合ドメインは、ヒトα１ドメインおよびβ１ドメインを含み得る。ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインは、α１ドメインおよびα２ドメインを含み得、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインは、β１ドメインおよびβ２ドメインを含み得る；したがって、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体の細胞外ドメインは、ヒトα１、α２、β１およびβ２ドメインを含み得る。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のマウス部分は、マウスＭＨＣ  ＩＩ、例えば、マウスＨ−２ＥまたはＨ−２Ａの膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメイン（例えば、マウスＨ−２Ｅ  α鎖およびβ鎖またはマウスＨ−２Ａ  α鎖およびβ鎖の膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメイン）を含む。
【００７２】
したがって、１つの実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、機能的なキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体は、ＨＬＡ−ＤＲ４タンパク質（ＨＬＡ−ＤＲＡ  α１ドメインおよびα２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、α１ドメインおよびα２ドメイン）およびマウスＨ−２Ｅ  α鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  α鎖、ならびにＨＬＡ−ＤＲ４（ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４  β１ドメインおよびβ２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、β１ドメインおよびβ２ドメイン）およびマウスＨ−２Ｅ  β鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  β鎖を含む。
【００７３】
別の実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ｅ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、機能的なキメラＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、キメラＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体は、ＨＬＡ−ＤＲ２タンパク質（ＨＬＡ−ＤＲＡ  α１ドメインおよびα２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、α１ドメインおよびα２ドメイン）およびマウスＨ−２Ｅ  α鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  α鎖、ならびにＨＬＡ−ＤＲ２（ＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２  β１ドメインおよびβ２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、β１ドメインおよびβ２ドメイン）およびマウスＨ−２Ｅ  β鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  β鎖を含む。
【００７４】
別の実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ２タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ２タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ａ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ａ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、機能的なキメラＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、キメラＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱ２タンパク質（ＨＬＡ−ＤＱα１＊０５  α１ドメインおよびα２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、α１ドメインおよびα２ドメイン）およびマウスＨ−２Ａ  α鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  α鎖、ならびにＨＬＡ−ＤＱ２（ＨＬＡ−ＤＱβ１＊０２  β１ドメインおよびβ２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、β１ドメインおよびβ２ドメイン）およびマウスＨ−２Ａ  β鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  β鎖を含む。
【００７５】
なお別の実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８タンパク質のαポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８タンパク質のβポリペプチドに由来する細胞外ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ａ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２Ａ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、機能的なキメラＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、キメラＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａ  ＭＨＣ  ＩＩ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱ８タンパク質（ＨＬＡ−ＤＱα１＊０３０１  α１ドメインおよびα２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、α１ドメインおよびα２ドメイン）およびマウスＨ−２Ａ  α鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  α鎖、ならびに、ＨＬＡ−ＤＱ８（ＨＬＡ−ＤＱβ１＊０３０１  β１ドメインおよびβ２ドメイン）に由来する細胞外ドメイン（例えば、β１ドメインおよびβ２ドメイン）およびマウスＨ−２Ａ  β鎖由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むＭＨＣ  ＩＩ  β鎖を含む。
【００７６】
１つの態様では、マウスは、その内在性マウス遺伝子座から機能的な内在性Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅポリペプチドを発現しない（例えば、マウスは、Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａポリペプチドを発現しない）。種々の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列の発現は、それぞれの内在性マウスプロモーターおよび調節エレメントの制御下にある（例えば、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、内在性プロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している）。本発明の種々の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は同じ染色体上に位置する。いくつかの態様では、マウスは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有する２コピーのキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含み、他方、他の態様では、マウスは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有する１コピーのＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含む。したがって、マウスは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含有するキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。種々の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列はマウスの生殖細胞系に含まれる。
【００７７】
本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、例えば、内在性マウスＨ−２Ａ遺伝子およびＨ−２Ｅ遺伝子の置き換えによってキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含むマウスが提供される。いくつかの態様では、キメラ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−ＤＲＡの細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｅ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびにヒトＨＬＡ−ＤＲβ１＊０４またはＨＬＡ−ＤＲβ１＊０２の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｅ  β鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。他の態様では、キメラ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−ＤＱα１＊０５またはＨＬＡ−ＤＱα１＊０３０１の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ａ  α鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびにヒトＨＬＡ−ＤＱβ１＊０２またはＨＬＡ−ＤＱβ１＊０３０２の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ａβ鎖の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。キメラ遺伝子座の種々のドメインは、該遺伝子座が機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現するように連結している。
【００７８】
種々の実施形態では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から機能的なキメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質を発現する非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、細胞表面にキメラタンパク質を提示する。１つの実施形態では、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるものと同じ細胞分布で、細胞表面にキメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質を発現する。１つの態様では、細胞は、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質の細胞外部分（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、またはＨＬＡ−ＤＱ８の細胞外部分）に結合したペプチド断片（抗原断片）を提示する。
【００７９】
種々の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質）を提示する細胞は、抗原提示細胞、（ＡＰＣ）例えば、マクロファージ、樹状細胞、またはＢ細胞である。いくつかの実施形態では、該キメラタンパク質によって提示されるペプチド断片は、腫瘍に由来する。他の実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質によって提示されるペプチド断片は、病原体、例えば、細菌、ウイルス、または寄生生物に由来する。
【００８０】
本明細書中で記載されるキメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質は、同じ細胞または第２の細胞の表面上の他のタンパク質と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質は、前記細胞の表面上の内在性非ヒトタンパク質と相互作用する。キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質は、同じ細胞または第２の細胞の表面上のヒトまたはヒト化タンパク質とも相互作用し得る。いくつかの実施形態では、第２の細胞はＴ細胞であり、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその共受容体ＣＤ４と相互作用する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は内在性マウスＴ細胞である。他の実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはヒトまたはヒト化ＴＣＲである。さらなる実施形態では、ＣＤ４はヒトまたはヒト化ＣＤ４である。他の実施形態では、ＴＣＲおよびＣＤ４の一方または両方が非ヒト、例えば、マウスまたはラットである。
【００８１】
１つの実施形態では、腫瘍をキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を欠く野生型動物よりも高率では発生しない、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物が提供される。いくつかの実施形態では、動物は、血液系腫瘍、例えば、種々のＴ細胞およびＢ細胞リンパ腫、白血病、複合リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫）を野生型動物よりも高率では発生しない。
【００８２】
遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット胚）であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む胚もまた提供される。１つの態様では、胚は、キメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。
【００８３】
本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来し、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質）を発現する組織もまた提供される。
【００８４】
さらに、本明細書中で記載されるように非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。１つの実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。１つの実施形態では、細胞は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞である。１つの実施形態では、細胞は免疫細胞である。１つの実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。
【００８５】
本明細書中で記載されるように非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞もまた提供される。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移入の結果として、染色体またはその断片を含む。
【００８６】
１つの態様では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質）をコードする遺伝子を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。１つの実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来する。
【００８７】
１つの態様では、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。１つの実施形態では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。
【００８８】
１つの態様では、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ／ペプチド複合体が形成されるように結合したペプチドを含むキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ表面タンパク質を有する第１の細胞、およびキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  ＩＩ／ペプチド複合体に結合する第２の細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製物が提供される。１つの実施形態では、第２の細胞は、ヒトまたはヒト化Ｔ細胞受容体を含み、１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化ＣＤ４をさらに含む。１つの実施形態では、第２の細胞は、ヒトまたはヒト化Ｔ細胞受容体およびヒトまたはヒト化ＣＤ４タンパク質を含むげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）細胞である。１つの実施形態では、第２の細胞はヒト細胞である。
【００８９】
本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法もまた提供される。遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための方法は、そのゲノムがキメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質（例えば、キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む動物を生じる。１つの実施形態では、上記方法は、そのゲノムが、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子操作されたマウスを生じ、ここで、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４またはＨＬＡ−ＤＲ２の細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｅの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。他の実施形態では、上記方法は、そのゲノムが、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子操作されたマウスを生じ、ここで、キメラＭＨＣ  ＩＩタンパク質のヒト部分は、ヒトＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８の細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ａの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態では、上記方法では、実施例において記載される通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された標的化構築物、該構築物のＥＳ細胞への導入、およびＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用したマウス胚への標的化したＥＳ細胞クローンの導入を利用する。１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、１２９マウス系統とＣ５７ＢＬ／６マウス系統の混血である；１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統と１２９マウス系統の混血である。
【００９０】
本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物を生成するために使用されるヌクレオチド構築物もまた提供される。１つの態様では、ヌクレオチド構築物は以下を含む：５’および３’の非ヒトホモロジーアーム、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  α鎖およびβ鎖配列を含むＤＮＡ断片、および組換え部位が隣接する選択カセット。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  α鎖配列およびβ鎖配列は、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  α鎖遺伝子およびβ鎖遺伝子のイントロンおよびエクソンを含むゲノム配列である。１つの実施形態では、非ヒトホモロジーアームは、非ヒトＭＨＣ  ＩＩゲノム配列に対して相同である。
【００９１】
１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  α鎖配列は、α１ドメインおよびα２ドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  α鎖配列は、５’から３’へ：α１エクソン（エクソン２）、α１／α２イントロン（イントロン２）、およびα２エクソン（エクソン３）を含む。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  β鎖配列は、β１ドメインおよびβ２ドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＤＲ  β鎖配列は、５’から３’へ：β１エクソン（エクソン２）、β１／β２イントロン（イントロン２）、およびβ２エクソン（エクソン３）を含む。
【００９２】
同様に、ヒトＨＬＡ−ＤＱ  α鎖配列およびβ鎖配列（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＱ  α１ドメインおよびα２ドメインをコードする配列およびヒトＨＬＡ−ＤＱ  β１ドメインおよびβ２ドメインをコードする配列）を含む遺伝子操作された非ヒト動物を生成するためのヌクレオチド構築物も本明細書中で提供される。このような構築物の特定の実施形態は図１０に示されている。
【００９３】
選択カセットは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするため、標的化構築物に挿入されたヌクレオチド配列である。いくつかの好適な選択カセットが、当該分野で公知である。通常、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣ、など）の存在下でのポジティブ選択を可能にする。さらに、選択カセットは、組換え部位が隣接していてもよく、それにより、リコンビナーゼ酵素による処理の際に選択カセットの切除を可能にする。一般に使用される組換え部位はＣｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によってそれぞれ認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものが当該分野で公知である。選択カセットは構築物内のコード領域の外側のどこに位置してもよい。１つの実施形態では、選択カセットは、β鎖イントロン、例えば、β２／膜貫通ドメインイントロン（イントロン３）に位置する。
【００９４】
１つの実施形態では、５’および３’のホモロジーアームは、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座の５’および３’位置にゲノム配列を含む。１つの実施形態では、５’ホモロジーアームは、マウスＨ−２Ａｂ１遺伝子の上流のゲノム配列を含み、３’ホモロジーアームは、マウスＨ−２Ｅａ遺伝子の下流のゲノム配列を含む。この実施形態では、構築物により、マウスＨ−２Ｅ遺伝子とマウスＨ−２Ａ遺伝子の両方の置き換えが可能になる。
【００９５】
したがって、１つの態様では、５’から３’へ以下を含むヌクレオチド構築物が提供される：マウスＨ−２Ａｂ１遺伝子の上流のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  β鎖をコードする配列を含む第１のヌクレオチド配列、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  α鎖をコードする配列を含む第２のヌクレオチド配列、およびマウスＨ−２Ｅａ遺伝子の下流のマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。特定の実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  β鎖をコードする配列を含む第１のヌクレオチド配列は、ヒトβ１エクソン、β１／β２イントロン、β２エクソン、およびヒトβ２エクソン配列とマウス膜貫通ドメインエクソンの配列との間のイントロン領域に挿入された組換え部位が隣接する選択カセットを含む。特定の実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  α鎖をコードする配列を含む第２のヌクレオチド配列は、ヒトα１エクソン、α１／α２イントロン、およびヒトα２エクソンを含む。本発明の例示的な構築物は、図５および図１０に示されている。
【００９６】
遺伝子標的化の完了の際、ＥＳ細胞または遺伝子改変された非ヒト動物をスクリーニングして、目的の外来性ヌクレオチド配列の成功裏の組み込みまたは外来性ポリペプチドの発現を確認する。多くの技術が当業者に公知であり、それらとしては、サザンブロッティング、長ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用したリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。１つの例では、目的の遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）が、マウス対立遺伝子の欠失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についての、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら（２００３年）High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載される）の変形を使用するスクリーニングによって、同定され得る。遺伝子改変された動物において特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を同定する他のアッセイは、当業者に公知である。
【００９７】
本開示はまた、非ヒト動物のＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、本明細書中で記載されるキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法をも提供する。１つの実施形態では、本発明は、マウスのＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列をキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法を提供する。特定の態様では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α鎖（例えば、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ  α鎖）の細胞外ドメインおよびマウスＭＨＣ  ＩＩ  α鎖（例えば、Ｈ−２ＥまたはＨ−２Ａ  α鎖）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列、ならびにヒトＭＨＣ  ＩＩ  β鎖の細胞外ドメイン（例えば、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ  β鎖）およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  β鎖（例えば、それぞれ、Ｈ−２ＥまたはＨ−２Ａ  β鎖、例えば、Ｈ−２Ｅｂ１またはＨ−２Ａｂ１鎖）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変されたマウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅタンパク質を発現する。他の実施形態では、改変されたマウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、キメラＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅタンパク質、キメラＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａタンパク質、またはキメラＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質を発現する。
【００９８】
１つの態様では、キメラヒトＨＬＡクラスＩＩ／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子を作製するための方法であって、単一の細胞において、本明細書中で記載されるようにヌクレオチド構築物からキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質（例えば、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質）を発現させる工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、該ヌクレオチド構築物はウイルスベクターである；特定の実施形態では、該ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【００９９】
１つの態様では、キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質を発現する細胞が提供される。１つの実施形態では、細胞は、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣクラスＩＩ配列を含む発現ベクターを含む。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０１００】
本明細書中で記載されるように非ヒト動物によって作製されたキメラＭＨＣクラスＩＩ分子もまた提供され、ここで、該キメラＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＱ２、またはＨＬＡ−ＤＱ８からのα１、α２、β１、およびβ２ドメイン、および非ヒトＭＨＣ  ＩＩタンパク質、例えば、マウスＨ−２ＥまたはＨ−２Ａタンパク質からの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。本明細書中で記載されるＨＬＡ−ＤＲ４またはＨＬＡ−ＤＲ２の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって検出され得る。本明細書中で記載されるＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８の細胞外ドメインを含むキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体は、抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体によって検出され得る。したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを提示する細胞は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体または抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体を使用して検出および／または選択され得る。
【０１０１】
以下の実施例には、そのゲノムが、マウスＨ−２ＡおよびＨ−２Ｅタンパク質をコードするヌクレオチド配列の、キメラヒト／マウスＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ、ＨＬＡ−ＤＱ２／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａタンパク質をコードするヌクレオチド配列での置き換えを含む、遺伝子操作された動物が記載されているが、他のヒトＭＨＣ  ＩＩ遺伝子（他のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ遺伝子）を含むキメラを導入するために類似の戦略が使用され得ることが当業者には理解される。さらに、複数のヒト化ＭＨＣ  ＩＩ分子（例えば、キメラＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２ＥおよびＨＬＡ−ＤＱ／Ｈ−２Ａ）の導入もまた提供される。
【０１０２】
複数のＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座における置き換えが提供される。したがって、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣ  ＩＩ複合体（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物、例えば、げっ歯動物、例えば、マウスもまた本明細書中で提供される。１つの場合では、２つのマウス第１７番姉妹染色体のそれぞれが、Ｈ−２Ａ遺伝子およびＨ−２Ｅ遺伝子を含むＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を含有する；したがって、１つの態様では、各姉妹染色体は、それらの内在性遺伝子位置において、２つまでのキメラヒト／マウス複合体をコードし得る。したがって、１つの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスは、それらの内在性ＭＨＣ遺伝子座に、４つまでのキメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／マウス、ＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする４つまでの異なるヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０３】
１つの実施形態では、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチド配列を含むマウスであって、該ＭＨＣ  ＩＩ複合体のヒト部分は、ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体の細胞外ドメイン（すなわち、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドの細胞外ドメイン）を含み、該キメラＭＨＣ  ＩＩ複合体のマウス部分は、マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（すなわち、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびβポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、例えば、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅ膜貫通および細胞外ドメイン）を含み、１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つの、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体（複数可）を発現するマウスが提供される。１つの実施形態では、マウスＭＨＣ  ＩＩは、Ｈ−２ＥおよびＨ−２Ａから選択される。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  ＩＩは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＱ２、およびＨＬＡ−ＤＱ８）から選択される。
【０１０４】
さらに、複数の内在性ＭＨＣ遺伝子座における置き換えを含む非ヒト動物、例えば、マウス、例えば、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／マウス、ＭＨＣ  ＩＩ複合体（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、または４つのヌクレオチド配列を含む非ヒト、例えば、マウスを生成するための方法が本明細書中で提供される。マウス第１７番染色体上の種々のＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座の密接な連関に起因して、いくつかの実施形態では、上記方法は、遺伝子座における逐次の置き換えを含む。１つの実施形態では、上記方法は、ＥＳ細胞において、第１のマウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、第１のキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現するマウスを生成する工程、前記マウスからＥＳ細胞を生成する工程、前記ＥＳ細胞において、第２のマウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、および２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現するマウスを生成する工程を含む。あるいは、上記方法は、ＥＳ細胞において、第１のマウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、その後に、同じＥＳ細胞において、第２のマウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、および２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現するマウスを生成する工程を含み得る。第３のまたは第４のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を含むマウスが、例えば交配によって生成され得る。当業者は、２つまたはそれ超のキメラＭＨＣ  ＩＩ複合体を含むマウスもまた、逐次の置き換えではなく交配によって生成され得；この動物は、キメラＭＨＣ  ＩＩ配列の全てに対してヘテロ接合型であり得る（例えば、その姉妹染色体に異なるキメラ遺伝子を含むマウスは、２つのＭＨＣ遺伝子に対してヘテロ接合型であるなど）ことを理解する。遺伝子座における逐次の置き換えの代わりに、１つ超、例えば、２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を含むマウスは、１つ超、例えば、２つのＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードするヌクレオチド配列を、１つ超、例えば、２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする外来性ヌクレオチド配列で置き換えることによって生成され得る（例えば、マウスＨ−２Ａ遺伝子およびＨ−２Ｅ遺伝子の両方をコードするヌクレオチド配列は、キメラＨＬＡ−ＤＲ／Ｈ−２ＥおよびＨＬＡ−ＤＱ／Ｈ−２Ａ複合体をコードするヌクレオチド配列で置き換えられ得る）。
【０１０５】
遺伝子改変された動物の使用
種々の実施形態では、本明細書中で記載される遺伝子改変された非ヒト動物は、細胞表面にヒトまたはヒト化ＭＨＣ  ＩＩを有するＡＰＣを作製し、結果として、サイトゾルタンパク質に由来するペプチドを、Ｔ細胞に対するエピトープとしてヒト様の様式で提示する（何故なら、その複合体の構成要素の実質的に全てが、ヒトまたはヒト化であるからである）。本発明の遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト化動物においてヒト免疫系の機能を研究するため；免疫応答を惹起する抗原および抗原エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば、独特なヒトがんエピトープ）を同定するため、例えば、ワクチン開発に使用するため；ワクチン候補および他のワクチン戦略の評価のため；ヒト自己免疫を研究するため；ヒト感染症を研究するため；および別の方法で、ヒトＭＨＣ発現に基づくより良い治療戦略を案出するために、使用され得る。
【０１０６】
ＭＨＣ  ＩＩ複合体は、細胞外タンパク質、例えば、Ｂ細胞受容体が結合し、Ｂ細胞に内部移行した細胞外細菌、近隣細胞またはポリペプチドに由来するペプチドに結合する。細胞外タンパク質がエンドサイトーシス経路に進入すると、それらはペプチドに分解され、該ペプチドは、ＭＨＣ  ＩＩと結合し、それによって提示される。ＭＨＣ  ＩＩによって提示されるペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されると、Ｔ細胞は活性化され、増殖し、種々のヘルパーＴサブタイプ（例えば、ＴＨ１、ＴＨ２）に分化し、マクロファージ媒介型病原体死滅化の活性化、Ｂ細胞増殖、および抗体産生を含めた多くの事象を導く。免疫応答におけるＭＨＣ  ＩＩの役割が理由で、ＭＨＣ  ＩＩペプチド提示を理解することがヒト病変に対する治療の開発において重要である。しかし、ヒトおよびマウスのＭＨＣ複合体は、抗原を異なって認識する（例えば、マウスＭＨＣ  ＩＩは、ヒトＭＨＣ  ＩＩと同じ抗原を認識しない場合があるか、または、ヒトＭＨＣ  ＩＩとは異なるエピトープを提示し得る）ので、マウスＭＨＣ  ＩＩとの関連で、抗原の提示は、ヒト疾患に幾分関係があるだけである。したがって、ヒト病変について最も関係するデータは、ヒトＭＨＣ  ＩＩによる抗原エピトープの提示の研究を通して得られる。
【０１０７】
したがって、種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された動物は、ヒトにおいて免疫応答を開始する抗原の能力を評価するため、および、多様な抗原を生成し、ヒトワクチン開発において使用され得る特定の抗原を同定するために、とりわけ有用である。
【０１０８】
１つの態様では、ペプチド配列のヒトにおける抗原性を決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を、該ペプチド配列を含む分子に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体によって提示されるペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。
【０１０９】
１つの態様では、ペプチドが、ヒトにおいて免疫応答を引き起こすかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を該ペプチドに曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子によって該ペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、曝露後の非ヒト動物は、上記ペプチドに結合する、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【０１１０】
１つの態様では、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物を、推定Ｔ細胞エピトープを含む抗原に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程、およびＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔ細胞が結合したエピトープを同定する工程を含む方法が提供される。
【０１１１】
１つの態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をヒトにおいて起こす抗原を同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスに対して推定抗原を曝露する工程、該マウスに免疫応答を起こさせる工程、ヒトＭＨＣ  ＩＩ分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ分子  ）との関連で、抗原に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出する工程、およびヒトＭＨＣ  ＩＩ拘束分子（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ拘束分子）が結合した抗原を同定する工程を含む方法が提供される。
【０１１２】
１つの実施形態では、抗原は、細菌タンパク質を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒト腫瘍細胞抗原を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおける使用のための推定ワクチン、または別の生物製剤を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおいて抗体を生成するヒトエピトープを含む。なお別の実施形態では、抗原は、酵母または真菌の細胞抗原を含む。なお別の実施形態では、抗原は、ヒト寄生生物に由来する。
【０１１３】
１つの態様では、推定抗原が、ヒト免疫系に対する曝露の際に、ＨＬＡ−ＤＲ拘束免疫応答（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ２拘束応答またはＨＬＡ−ＤＲ４拘束応答）を起こすエピトープを含有するかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスを推定抗原に曝露する工程、および、該マウスにおける抗原特異的ＨＬＡ−ＤＲ拘束（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ２−またはＨＬＡ−ＤＲ４拘束）免疫応答を測定する工程を含む方法が提供される。別の態様では、推定抗原が、ヒト免疫系に対する曝露の際に、ＨＬＡ−ＤＱ拘束（例えば、ＨＬＡ−ＤＱ２拘束またはＨＬＡ−ＤＱ８拘束）免疫応答を起こすエピトープを含有するかどうかを決定するための方法が提供される。
【０１１４】
ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体との関連で提示される抗原、例えば、細菌、寄生生物などに由来する抗原に対する抗体を生成する方法であって、本明細書中で記載されるマウスを抗原に曝露する工程、マウスに免疫応答を開始させる工程であって、該免疫応答は抗体産生を含む工程、およびヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体との関連で提示される抗原を認識する抗体を単離する工程を含む方法もまた提供される。１つの実施形態では、ペプチド−ＭＨＣ  ＩＩに対する抗体を生成するために、ＭＨＣ  ＩＩヒト化マウスをペプチド−ＭＨＣ  ＩＩ免疫原で免疫する。
【０１１５】
１つの態様では、ＭＨＣ  ＩＩとの関連で提示される抗原（例えば、ヒト腫瘍抗原、ワクチンなど）を認識するＴ細胞受容体可変ドメインを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体を含むマウスを抗原に曝露する工程、該マウスに免疫応答を起こさせる工程、および該マウスから、ＭＨＣ  ＩＩ拘束抗原に結合するＴ細胞受容体の可変ドメインをコードする核酸配列を単離する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、抗原は、ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ（例えば、ヒトＨＬＡ  ＩＩエクトドメイン／マウスＭＨＣ  ＩＩ膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン）との関連で提示される。
【０１１６】
Ｔ細胞とＭＨＣ  ＩＩ（例えば、ヒトＨＬＡ  ＩＩエクトドメイン／マウスＭＨＣ  ＩＩ膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメイン）との関連でペプチドを提示するＡＰＣとの間の相互作用の結果は、当該分野で公知の多くの技術、例えば、Ｔ細胞増殖アッセイ、サイトカイン放出アッセイなどによって測定され得る。
【０１１７】
病原体または新生物からの抗原およびそれらのＴ細胞エピトープを同定する能力に加え、本発明の遺伝子改変された動物は、ヒト自己免疫疾患に関連する自己抗原を同定するため、および他のやり方でヒト自己免疫疾患の進行を研究するために使用され得る。ＨＬＡ遺伝子座内の多形性がヒト自己免疫疾患に対する素因において役割を果たすことが公知である。実際には、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子座およびＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座における特定の多形性が、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、グレーヴス病、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、潰瘍性大腸炎、および他の自己免疫障害の発症と相関することが同定された。例えば、WongおよびWen（２００４年）What  can  the  HLA  transgenic  mouse  tell  us  about  autoimmune  diabetes?、Diabetologia  ４７巻：１４７６〜８７頁；TanejaおよびDavid（１９９８年）HLA  Transgenic  Mice  as  Humanized  Mouse  Models  of  Disease  and  Immunity、J.  Clin.  Invest.  １０１巻：９２１〜２６頁；Bakkerら（２００６年）、上掲；およびInternational  MHC  and  Autoimmunity  Genetics  Network（２００９年）Mapping  of  multiple  susceptibility  variants  within  the  MHC  region  for  7  immune-mediated  diseases、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０６巻：１８６８０〜８５頁を参照されたい。
【０１１８】
したがって、本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣ  ＩＩ複合体動物を作製する方法は、特定のヒト自己免疫疾患に関連すると考えられるＭＨＣ  ＩＩ分子を導入するために使用され得、また、ヒト自己免疫疾患の進行が研究され得る。さらに、本明細書中で記載される非ヒト動物は、ヒト自己免疫疾患の動物モデルを開発するために使用され得る。本明細書中で記載されるヒト化ＭＨＣ  ＩＩタンパク質を有する、本発明によるマウスは、潜在的な自己抗原を同定するため、疾患の進行に関与するエピトープをマッピングするため、および自己免疫疾患の調整のための戦略を設計するために使用され得る。
【０１１９】
さらに、本明細書中で記載される遺伝子改変された動物は、ヒトのアレルギー応答の研究において使用され得る。アレルギー応答は、ＭＨＣ  ＩＩ対立遺伝子に関連すると思われるので、本明細書中で記載される遺伝子改変された動物は、アレルゲン特異的Ｔ細胞応答のＨＬＡ拘束を決定するため、およびアレルギー応答と闘うための戦略を開発するために使用され得る。
【０１２０】
さらに、本発明の遺伝子改変された動物および該動物によって発現されるヒトまたはヒト化ＨＬＡ分子は、ヒト疾患の進行に関連する、ヒトＨＬＡ分子による抗原提示を遮断する抗体を試験するために使用され得る。したがって、抗体が、ヒト疾患、例えば、上記のヒト疾患に関連づけられるＨＬＡ分子による抗原の提示を遮断することができるかどうかを決定する方法であって、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化ＨＬＡを発現する細胞を試験抗体に曝露する工程、および該試験抗体が、ヒトまたはヒト化ＨＬＡによる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への抗原の提示を遮断することができるかどうかを、例えば、ヒトまたはヒト化ＨＬＡ拘束免疫応答を遮断するその能力を測定することによって決定する工程を含む方法が本明細書中で提供される。１つの実施形態では、上記方法は、ヒトまたはヒト化ＨＬＡを発現する動物、例えば、疾患に対する疾患モデルとして役立つ疾患関連ヒトまたはヒト化ＨＬＡを発現する動物において行われる。
【実施例】
【０１２１】
本発明は、以下の非限定の実施例によって、さらに例証される。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために示されるが、本発明の範囲を制限することを何ら企図せず、また何らそのように解釈されるべきではない。本実施例は、当業者に周知の慣用的方法（分子クローニング技術など）の詳細な記載を含まない。そうでないと示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏（Ｃｅｌｓｉｕｓ）で示され、圧力は大気圧付近である。
【０１２２】
（実施例１）
内在性ＭＨＣクラスＩＩ  Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅ遺伝子座の欠失
内在性ＭＨＣクラスＩＩ  Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を導入するための標的化ベクターは、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら、上掲を参照されたい）を使用して作製した。細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＤＮＡを改変して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａを欠失させた。
【０１２３】
簡潔には、上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを、それぞれＨ−２Ａｂ１遺伝子の５’位およびＨ−２Ｅａ遺伝子の３’からのマウスＢＡＣ  ＤＮＡのＰＣＲによって引き出した。図５に示されているように、これらのホモロジーアームを使用して、細菌相同組換え（ＢＨＲ）により、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の遺伝子Ｈ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａを含むＲＰ２３−４５８ｉ２２の約７９ｋｂが欠失したカセットを作製した。この領域をｌｏｘ６６部位およびｌｏｘ７１部位が隣接するハイグロマイシンカセットで置き換えた。最終的な標的化ベクターは、５’から３’へ、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ａｂ１遺伝子に対して５’側のマウスゲノム配列を含む３４ｋｂのホモロジーアーム、５’ｌｏｘ６６部位、ハイグロマイシンカセット、３’ｌｏｘ７１部位および内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ｅａ遺伝子に対して３’側のマウスゲノム配列を含む６３ｋｂのホモロジーアームを含むものであった（ＭＡＩＤ５１１１、図５を参照されたい）。
【０１２４】
ＢＡＣ  ＤＮＡ標的化ベクター（上記）を使用して、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションし、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含む改変ＥＳ細胞を作製した。内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイによって同定した（LieおよびPetropoulos（１９９８年）Curr.  Opin.  Biotechnology  ９巻：４３〜４８頁）。欠失した遺伝子座の上流領域を、プライマー５１１１Ｕ  Ｆ（ＣＡＧＡＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＡＣ；配列番号１）および５１１１Ｕ  Ｒ（ＧＧＡＧＡＧＣＡＧＧＧＴＣＡＧＴＣＡＡＣ；配列番号２）ならびにプローブ５１１１Ｕ  Ｐ（ＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＴＴＡＣＡ；配列番号３）を使用したＰＣＲによって確認し、他方、欠失した遺伝子座の下流領域を、プライマー５１１１Ｄ  Ｆ（ＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣ；配列番号４）および５１１１Ｄ  Ｒ（ＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＴＧＡＣＴＣ；配列番号５）ならびにプローブ５１１１Ｄ  Ｐ（ＡＧＧＣＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴ；配列番号６）を使用して確認した。標的化ベクター由来のハイグロマイシンカセットの存在を、プライマーＨＹＧＦ（ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣ；配列番号７）およびＨＹＧＲ（ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧ；配列番号８）ならびにプローブＨＹＧＰ（ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣ；配列番号９）を使用して確認した。上流欠失点にわたるヌクレオチド配列（配列番号１０）は以下を含み、これは、欠失点に存在するカセット配列と隣接して連結している欠失点の上流の内在性マウス配列（下の括弧内に含まれる）を示す：（ＴＴＴＧＴＡＡＡＣＡ  ＡＡＧＴＣＴＡＣＣＣ  ＡＧＡＧＡＣＡＧＡＴ  ＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣ  ＡＧＣＴＣＣＡＡＴＧ  ＣＴＧＡＴＴＧＧＴＴ  ＣＣＴＣＡＣＴＴＧＧ  ＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴ）  ＣＴＣＧＡＧＴＡＣＣ  ＧＴＴＣＧＴＡＴＡＡ  ＴＧＴＡＴＧＣＴＡＴ  ＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ  ＡＴＧＣＡＴＣＣＧＧ  ＧＴＡＧＧＧＧＡＧＧ。下流欠失点にわたるヌクレオチド配列（配列番号１１）は以下を含み、これは、欠失点の下流の内在性マウス配列（下の括弧内に含まれる）と隣接するカセット配列を示す：ＣＣＴＣＧＡＣＣＴＧ  ＣＡＧＣＣＣＴＡＧＧ  ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴ  ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧ  ＣＴＡＴＡＣＧＡＡＣ  ＧＧＴＡＧＡＧＣＴＣ  （ＣＡＣＡＧＧＣＡＴＴ  ＴＧＧＧＴＧＧＧＣＡ  ＧＧＧＡＴＧＧＡＣＧ  ＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡ  ＣＡＡＴＣＧＧＧＡＴ  ＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴ  ＡＧＡＡＴＧＧＧＡＧ  ＴＴＡＧＧＧＡＡＧＡ）。次いで、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（下記）を使用して陽性ＥＳ細胞クローンを雌マウスに移植して、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座の欠失を含有する同腹仔を生成した。
【０１２５】
標的とした上記のＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって８細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）F0  generation  mice  that  are  essentially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  immediate  phenotypic  analyses、Nature  Biotech.  ２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座においてＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を有するマウスを、ハイグロマイシンカセットの存在を検出し、内在性ＭＨＣクラスＩＩ配列の非存在を確認する対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）を改変して使用したゲノタイピングによって同定した。
【０１２６】
例えば、ＥＳ細胞期または胚においては除去されていない、標的化ベクターによって導入されたいかなるｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットを除去するために、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座においてＨ−２Ａｂ１、Ｈ−２Ａａ、Ｈ−２Ｅｂ１、Ｈ−２Ｅｂ２、およびＨ−２Ｅａ遺伝子の欠失を有するマウスをＣｒｅ  ｄｅｌｅｔｏｒマウス系統と交配することができる（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）。任意選択で、ハイグロマイシンカセットは、そのマウスに保持される。
【０１２７】
（実施例２）
キメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ遺伝子を含む大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成
ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ配列を導入するための標的化ベクターを、図４に示されているように設計した。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術を使用して、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ２３−４５８ｉ２２  ＤＮＡを種々の工程で改変して、（１）ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２Ｅａ遺伝子由来の機能的なＩ−Ｅ  αエクソン１を含むベクターを作製し（図４Ａ）；（２）マウスＩ−Ｅ  β遺伝子のエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲβ１＊０４のエクソン２およびエクソン３による置き換え、ならびにマウスＩ−Ｅ  αのエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲα１＊０１のエクソン２およびエクソン３による置き換えを含むベクターを作製し（図４Ｂ）；（３）残りのマウスＩ−Ｅ  βエクソンの間にヒトＤＲβ１＊０４のエクソン２およびエクソン３を有し、かつ、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の機能的なＩ−Ｅ  αエクソン１を含む残りのマウスＩ−Ｅ  αエクソンの間にヒトＤＲα１＊０１のエクソン２およびエクソン３を有するベクターを作製し（工程（１）（図４Ｃ）；（４）（３）において生成されたベクター内の潜在的なスプライス部位を除去した（図４Ｄ）。
【０１２８】
具体的には、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでは、Ｉ−Ｅ  α遺伝子は、非機能的なエクソン１の存在に起因して偽遺伝子であるので、まず、ＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２Ｅａ遺伝子由来の機能的なＩ−Ｅ  αエクソン１を含むベクターを作製した（図４Ａ）。ＲＰ２３−４５８ｉ２２  ＢＡＣを細菌相同組換え（１．ＢＨＲ）によって改変して、クロラムフェニコール耐性遺伝子をスペクトロマイシン耐性遺伝子で置き換えた。得られたベクターをさらにＢＨＲによって改変して、Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅコード領域全体を組換え部位が隣接するネオマイシンカセットで置き換えた（２．ＢＨＲ）。ＢＡＬＢ／ｃ  Ｉ−Ｅαリーダーをコードするエクソン（エクソン１）ならびにＰＩ−ＳｃｅＩ制限部位およびＩ−ＣｅｕＩ制限部位が隣接するクロラムフェニコール遺伝子を含む構築物を用いたＢＨＲのさらなるラウンド（３．ＢＨＲ）により、機能的なＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２Ｅａエクソン１を含むベクターがもたらされた。
【０１２９】
独立して、マウスＩ−Ｅ  β遺伝子のエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲβ１＊０４のエクソン２およびエクソン３による置き換え、およびマウスＩ−Ｅ  αのエクソン２およびエクソン３の、ヒトＤＲα１＊０１のエクソン２およびエクソン３による置き換えを含むベクターを生成するために、ＲＰ２３−４５８ｉ２２  ＢＡＣ  をいくつかの相同組換え工程、４．ＢＨＲ〜８．ＢＨＲによって改変した（図４Ｂ）。得られた核酸配列は、上記のＢＡＬＢ／ｃ  Ｉ−Ｅαエクソン１を有する構築物へのライゲーションを可能にするためのＰＩ−ＳｃｅＩ／Ｉ−ＣｅｕＩ制限部位が隣接するものであった（図４Ｃ）。
【０１３０】
図４Ｃに示されている最終構築物の配列は、ＢＡＬＢ／ｃイントロンの３’末端に潜在的なスプライス部位を含有するものであった。いくつかのＢＨＲ工程（１１．ＢＨＲ〜１２．ＢＨＲ）、その後に欠失工程を実施して、最終標的化ベクター（ＭＡＩＤ１６８０）を得、それを使用してＥＳ細胞にエレクトロポレーションした（図４Ｄ）。
【０１３１】
詳細には、最終標的化ベクター（ＭＡＩＤ１６８０）は、５’から３’へ、内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ａｂ１遺伝子のすぐ上流で終わる約２６ｋｂのマウスゲノム配列からなる５’マウスホモロジーアーム；ヒト化ＭＨＣ  ＩＩ  β鎖遺伝子（ヒト化Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子）およびヒト化ＭＨＣ  ＩＩ  α鎖遺伝子（ヒト化Ｈ−２Ｅａ遺伝子）およびｆｌｏｘｅｄネオマイシンカセットを含有する約５９ｋｂの挿入断片；ならびに内在性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座のＨ−２Ｅａ遺伝子のすぐ下流から始まる約５７ｋｂのマウスゲノム配列からなる３’マウスホモロジーアームを含むものであった。５’アームと挿入断片との間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１２）は以下を含んだ：
【化１】
0006456350.tif 000002
ここで、イタリック体で示されている配列は独特なＰＩ−ＳｃｅＩ部位であり、５’ホモロジーアーム内のマウスゲノム配列は括弧内に示されている。挿入断片と３’アームとの間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１３）は以下を含んだ：
【化２】
0006456350.tif 000003
ここで、３’ホモロジーアーム内のマウスゲノム配列は括弧内に示されている。
【０１３２】
約５９ｋｂの挿入断片内で、Ｈ−２Ｅｂ１遺伝子を以下の通り改変した：イントロン１の最後の１５３ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の１２２ｂｐを含むＨ−２Ｅｂ１の５１３６ｂｐの領域を、イントロン１の最後の１４８ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の１３２ｂｐを含むヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４の３１１１ｂｐの相同領域で置き換えた。イントロン３のヒト配列とマウス配列との間の接合部に、５’ｌｏｘ２３７２部位、ＵｂＣプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、および３’ｌｏｘ２３７２部位を含有するカセットを挿入した。得られた遺伝子は、ＤＲＢ１＊０４由来のマウスＨ−２Ｅｂ１リーダー、ヒトβ１ドメインおよびβ２ドメイン、ならびにマウス膜貫通ドメインおよび細胞質尾部で構成されるキメラＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４／Ｈ−２Ｅｂ１タンパク質をコードするものであった。イントロン１内のマウス／ヒト接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１４）は以下を含み、
【化３】
0006456350.tif 000004
ここで、イタリック体で示されている配列はクローニング工程の間に導入された多重クローニング部位であり、マウスイントロン１配列は括弧内に示されている。ヒトイントロン３とネオマイシンカセットとの間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１５）は以下を含んだ：
【化４】
0006456350.tif 000005
ここで、５’ｌｏｘ２３７２部位はイタリック体で示されており、ヒトイントロン３配列は括弧内に示されている。ネオマイシンカセットとマウスイントロン３との間の接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１６）は以下を含んだ：
【化５】
0006456350.tif 000006
ここで、３’ｌｏｘ２３７２部位はイタリック体で示されており、マウスイントロン３配列は括弧内に示されている。
【０１３３】
同様に、約５９ｋｂの挿入断片内で、Ｈ−２Ｅａ遺伝子を以下の通り改変した：イントロン１の最後の１０１ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の６６ｂｐを含むＨ−２Ｅａの１１８５ｂｐの領域を、イントロン１の最後の１０４ｂｐ、エクソン２、イントロン２、エクソン３、およびイントロン３の最初の６６ｂｐを含むヒトＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１の１１８９ｂｐの相同領域で置き換えた。上記の通り、Ｈ−２ＥａのＣ５７ＢＬ／６対立遺伝子のエクソン１は、遺伝子を非機能的にする欠失を含有するので、Ｈ−２Ｅａエクソン１およびイントロン１の残りを、機能的であるＨ−２ＥａのＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子由来の同等の２６１６ｂｐの領域で置き換えた。得られた遺伝子は、ＢＡＬＢ／ｃ由来のマウスＨ−２Ｅａリーダー、ＤＲＡ１＊０１由来のヒトα１ドメインおよびα２ドメイン、およびマウス膜貫通ドメインおよび細胞質尾部で構成されるキメラＨ−２Ｅａ／ＨＬＡ−ＤＲＡ１＊０１タンパク質をコードするものであった。イントロン１内のマウス／ヒト接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１７）は以下を含んだ：
【化６】
0006456350.tif 000007
ここで、イタリック体で示されている配列はクローニング工程の間に導入された制限酵素部位であり、ＢＡＬＢ／ｃイントロン１配列は括弧内に示されている。イントロン３内のヒト／マウス接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１８）は以下を含んだ：
【化７】
0006456350.tif 000008
ここで、イタリック体で示されている配列はクローニング工程の間に導入された制限酵素部位であり、マウスイントロン３配列は括弧内に示されている。エクソン１の５’のＣ５７ＢＬ／６−ＢＡＬＢ／ｃ接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号１９）は以下を含んだ：
【化８】
0006456350.tif 000009
ここで、Ｃ５７ＢＬ／６特異的配列は括弧内に示されている。エクソン１の３’のＢＡＬＢ／ｃ−Ｃ５７ＢＬ／６接合部にわたるヌクレオチド配列（配列番号２０）は以下を含んだ：
【化９】
0006456350.tif 000010
ここで、ＳａｃＩＩ制限部位はイタリック体で示されており、Ｃ５７ＢＬ／６配列は括弧内に示されている。
【０１３４】
（実施例３）
遺伝子改変されたＨＬＡ−ＤＲ４マウスの生成
実施例２のベクターを使用してヒト化ＭＨＣ  ＩＩマウスを生成するための戦略の簡略図が図５および図８に示されている。
【０１３５】
具体的には、ＭＡＩＤ１６８０  ＢＡＣ  ＤＮＡ（上記）を使用して、ＭＡＩＤ５１１１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションして、内在性マウスＩ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を含むゲノム断片での置き換えを含む改変ＥＳ細胞を作製した。キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を含むゲノム断片によって置き換えられた、内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の欠失を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイによって同定した（LieおよびPetropoulos、上掲）。ヒトＤＲα配列の挿入を、プライマーｈＤＲＡ１Ｆ（ＣＴＧＧＣＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧ；配列番号２１）、ｈＤＲＡ１Ｒ（ＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣ；配列番号２２）、ならびにプローブｈＤＲＡ１Ｐ（ＣＧＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＧＧ；配列番号２３）を使用したＰＣＲによって確認した。ヒトＤＲβ配列の挿入を、プライマーｈＤＲＢ１Ｆ（ＡＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＧ；配列番号２４）、ｈＤＲＢ１Ｒ（ＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＣ；配列番号２５）、ならびにプローブｈＤＲＢ１Ｐ（ＣＡＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＡ；配列番号２６）を使用したＰＣＲによって確認した。標的化ベクター由来のハイグロマイシンカセットの欠失を、プライマーＨＹＧＦ（ＴＧＣＧＧＣＣＧＡＴＣＴＴＡＧＣＣ；配列番号７）およびＨＹＧＲ（ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＧ；配列番号８）ならびにプローブＨＹＧＰ（ＡＣＧＡＧＣＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣ；配列番号９）を用いて確認した。
【０１３６】
次いで、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上掲）を使用して陽性ＥＳ細胞クローンを雌マウスに移植して、内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座のキメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座による置き換えを含有する同腹仔を生成した。標的とした上記のＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって８細胞期のマウス胚に導入した。キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を有するマウスを、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）を改変して使用したゲノタイピングによって同定した。
【０１３７】
例えば、ＥＳ細胞期または胚においては除去されていない、標的化ベクターによっていかなるｌｏｘｅｄネオマイシンカセットを除去するために、キメラヒトＤＲ４／マウスＩ−Ｅ遺伝子座を有するマウスをＣｒｅ  ｄｅｌｅｔｏｒマウス系統と交配することができる（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）（図６を参照されたい）。
【０１３８】
（実施例４）
遺伝子改変されたマウスにおけるキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅの発現
ＷＴマウスまたはヘテロ接合型ヒト化ＨＬＡ−ＤＲ４マウス（「１６８１ＨＥＴ」）由来の脾臓を、コラゲナーゼＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて灌流し、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解させた。脾細胞を２５マイクログラム／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）と一緒に２日間培養して、ＭＨＣ−ＩＩ遺伝子の発現を刺激した。ヒトＨＬＡ−ＤＲ４の細胞表面での発現を、蛍光色素とコンジュゲートした抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、抗Ｆ４８０（ＢＭ８）、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（Ｍ１５）および抗ＨＬＡＤＲ（Ｌ２４３）を使用したＦＡＣＳによって分析した。フローサイトメトリーはＢＤ−ＬＳＲＩＩを使用して実施した。ヒトＨＬＡ−ＤＲ４の発現は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の表面で明白に検出可能であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）に対するｔｏｌｌ様受容体による刺激で上方制御された（図９を参照されたい）。
【０１３９】
（実施例５）
遺伝子改変されたＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、およびＨＬＡ−ＤＲ２マウス
キメラヒトＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ−２Ａ、ＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２ＡおよびＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅを有するマウスを、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子操作技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら、上掲を参照されたい）を使用して作製した。ヒト化遺伝子を有するＬＴＶＥＣを遺伝子合成、ならびに細菌相同組換えおよび消化／ライゲーション技術によるＢＡＣの改変によって生成した。
【０１４０】
ヒトＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８．１、およびＤＲ２α鎖およびβ鎖配列を、公的に入手可能な遺伝子配列に基づくＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ＷＡ、ＵＳＡ）によって合成した。具体的には、合成されたヒトＨＬＡ−ＤＱ２．５α（ＤＱＡ１＊０５）およびβ（ＤＱＢ１＊０２）鎖ならびにマウスＢＡＣ  ＲＰ２３−４４４Ｊ２０を改変し、それを使用して、図１０Ａに記載の、キメラＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ−２Ａを有するＬＴＶＥＣを生成した。同様に、合成されたヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１α（ＤＱＡ１＊０３０１）およびβ（ＤＱＢ１＊０３０２）鎖ならびにマウスＢＡＣ  ＲＰ２３−４４４Ｊ２０を改変し、それを使用して、図１０Ｂに記載の、キメラＨＬＡ−ＤＱ８．１／Ｈ−２Ａを有するＬＴＶＥＣを生成した。ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅについては、合成されたヒトＨＬＡ−ＤＲ２  β鎖（ＤＲＢ１＊１５０１）を使用して、ＤＲβ１＊０２（１５０１）エクソンおよびイントロンを含むベクターを生成し、細菌相同組換えを使用してキメラＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅ遺伝子を含有するＬＴＶＥＣに取り換えた（上記の実施例２のＭＡＩＤ１６８０）。得られたＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ  ＬＴＶＥＣは図１０Ｃに示されている。得られたＬＴＶＥＣの種々のヌクレオチド配列接合部（例えば、マウス／ヒト配列接合部、ヒト／マウス配列接合部、または選択カセットを有するマウスまたはヒト配列の接合部）が以下の表１に要約されており、配列表に列挙されている；それらの位置は図１０の略図に示されている。以下の表１では、マウス配列は通常のフォントで示されており；ヒト配列は括弧内に示されており；Ｌｏｘ配列はイタリック体で示されており；クローニング工程の間に導入された制限部位および他のベクターに基づく配列（例えば、多重クローニング部位など）は太字で示されている。ＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅ内のヒト化Ｈ−２Ｅａについてのヌクレオチド配列接合部は、上の実施例２でＨＬＡ−ＤＲ４／Ｈ−２Ｅについて前述のものと同じである（配列番号１７〜２０）。
【表１−１】
0006456350.tif 000011
【表１−２】
0006456350.tif 000012
【表１−３】
0006456350.tif 000013
【０１４１】
大型標的化ベクターを使用してＭＡＩＤ５１１１  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションして、内在性マウスＩ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の、キメラＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ−２Ａ、ＨＬＡ−ＤＱ８／Ｈ−２Ａ、またはＨＬＡ−ＤＲ２／Ｈ−２Ｅを含むゲノム断片による置き換えを含む改変ＥＳ細胞を作製する。キメラ遺伝子座を含むゲノム断片によって置き換えられた、内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座の欠失を含有する陽性ＥＳ細胞を、ＴＡＱＭＡＮ（商標）プローブを使用した定量的ＰＣＲアッセイ（LieおよびPetropoulos、上掲）によって同定する。
【０１４２】
次いで、陽性ＥＳ細胞クローンを使用して、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（上掲）を使用して雌マウスに移植して内在性Ｉ−ＡおよびＩ−Ｅ遺伝子座のキメラヒト／マウス遺伝子座での置き換えを含有する同腹仔を生成する。標的化したＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって８細胞期のマウス胚に導入する。キメラヒト／マウス遺伝子座を有するマウスを、キメラヒト／マウス遺伝子座の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）を改変して使用したゲノタイピングによって同定する。
【０１４３】
例えば、ＥＳ細胞期または胚においては除去されていない、標的化ベクターによって導入されたいかなるｌｏｘｅｄネオマイシンまたはハイグロマイシンカセットも除去するために、キメラヒト／マウス遺伝子座を有するマウスをＣｒｅ  ｄｅｌｅｔｏｒマウス系統と交配する（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／１１４４００号を参照されたい）。
【０１４４】
キメラヒト／マウスタンパク質の発現を試験する。具体的には、ＨＬＡ−ＤＱ２．５／Ｈ−２Ａ遺伝子改変された動物について、ＷＴマウスまたはヘテロ接合型ヒト化ＨＬＡ−ＤＱ２．５マウス（「６０４０  ＨＥＴ」；カセットが除去されたもの）由来の血液をヘパリンでコーティングした毛細管中に採取し、ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解させた。ヒトＨＬＡ−ＤＱ２．５の細胞表面での発現を、蛍光色素とコンジュゲートした抗ＣＤ３抗体（１７Ａ２）、抗ＣＤ１９抗体（１Ｄ３）、抗Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ抗体（Ｍ１５）および抗ＨＬＡ−ＤＱ抗体（Ｔｕ１６９）を使用したＦＡＣＳによって分析した。フローサイトメトリーはＢＤ−Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用して行った。マウスＭＨＣ−ＩＩ（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）およびヒトＨＬＡ−ＤＱ２．５の両方の発現が抗原提示ＣＤ１９＋マウスＢ細胞の表面で明白に検出可能であった（図１１）。
【０１４５】
均等物
当業者は、慣用的実験以上のものを用いることなく、本明細書中で記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが企図される。
【０１４６】
本出願を通して挙げられた全ての非特許文献、特許出願および特許の全内容は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
（項目１）
内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  α細胞外ドメインを含み、前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  β細胞外ドメインを含み、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、前記動物の細胞の表面上にＭＨＣ  ＩＩ複合体を形成する、非ヒト動物。
（項目２）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  α細胞外ドメインは、ヒトα１ドメインおよびヒトα２ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目３）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  β細胞外ドメインは、ヒトβ１ドメインおよびヒトβ２ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目４）
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、項目１に記載の動物。
（項目５）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目６）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１に記載の動物。
（項目７）
前記動物は、げっ歯動物である、項目１に記載の動物。
（項目８）
前記げっ歯動物は、ラットまたはマウスである、項目７に記載の動物。
（項目９）
前記げっ歯動物はマウスであり、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目８に記載の動物。
（項目１０）
前記動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、機能的な内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを発現しない、項目１に記載の動物。
（項目１１）
内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座にキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  α細胞外ドメインを含み、前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  β細胞外ドメインを含み、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、前記動物の細胞の表面上にＭＨＣ  ＩＩ複合体を形成する、非ヒト動物。
（項目１２）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  α細胞外ドメインは、ヒトα１ドメインおよびヒトα２ドメインを含む、項目１１に記載の動物。
（項目１３）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  β細胞外ドメインは、ヒトβ１ドメインおよびヒトβ２ドメインを含む、項目１１に記載の動物。
（項目１４）
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、項目１１に記載の動物。
（項目１５）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１１に記載の動物。
（項目１６）
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１１に記載の動物。
（項目１７）
前記動物は、げっ歯動物である、項目１１に記載の動物。
（項目１８）
前記げっ歯動物は、ラットまたはマウスである、項目１７に記載の動物。
（項目１９）
前記げっ歯動物はマウスであり、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、前記キメラＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチド由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、項目１８に記載の動物。
（項目２０）
前記動物は、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、機能的な内在性ＭＨＣ  ＩＩポリペプチドを発現しない、項目１１に記載の動物。
（項目２１）
内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウス。
（項目２２）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目２１に記載のマウス。
（項目２３）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目２１に記載のマウス。
（項目２４）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目２２に記載のマウス。
（項目２５）
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目２１に記載のマウス。
（項目２６）
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目２１に記載のマウス。
（項目２７）
前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目２５に記載のマウス。
（項目２８）
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ａ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ａ  βポリペプチドも発現しない、項目２１に記載のマウス。
（項目２９）
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、項目２１に記載のマウス。
（項目３０）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  α細胞外ドメインは、ヒトα１ドメインおよびヒトα２ドメインを含む、項目２１に記載のマウス。
（項目３１）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  β細胞外ドメインは、ヒトβ１ドメインおよびヒトβ２ドメインを含む、項目２１に記載の動物。
（項目３２）
内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／マウスＭＨＣＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  αポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  βポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、マウス。
（項目３３）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座から、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目３２に記載のマウス。
（項目３４）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座から、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目３２に記載のマウス。
（項目３５）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座から、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目３３に記載のマウス。
（項目３６）
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座は、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドのα１ドメインおよびα２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目３２に記載のマウス。
（項目３７）
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座は、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目３２に記載のマウス。
（項目３８）
前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座は、マウスＨ−２Ａ  βポリペプチドのβ１ドメインおよびβ２ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目３６に記載のマウス。
（項目３９）
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドを発現しない、項目３２に記載のマウス。
（項目４０）
前記第１のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  αプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結しており、前記第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ  βプロモーターおよび調節エレメントに作動可能に連結している、項目３２に記載のマウス。
（項目４１）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  α細胞外ドメインは、ヒトα１ドメインおよびヒトα２ドメインを含む、項目３２に記載のマウス。
（項目４２）
前記ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  β細胞外ドメインは、ヒトβ１ドメインおよびヒトβ２ドメインを含む、項目３２に記載のマウス。
（項目４３）
第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含む第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、ならびに
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、
第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座に、
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含む第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列、ならびに
ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第４のヌクレオチド配列
を含むマウスであって、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面に２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現し、
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２またはＨＬＡ−ＤＱ８．１のα鎖から選択され、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２またはＨＬＡ−ＤＱ８．１のβ鎖から選択される、マウス。
（項目４４）
前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、マウスＨ−２ＡまたはＨ−２Ｅのα鎖から選択され、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、Ｈ−２ＡまたはＨ−２Ｅのβ鎖から選択される、項目４３に記載のマウス。
（項目４５）
前記マウスは、内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの機能的な細胞外ドメインもマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの機能的な細胞外ドメインも発現しない、項目４３または４４に記載のマウス。
（項目４６）
前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｅ遺伝子座であり、
前記第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドの細胞外ドメイン、Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ｅ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドの細胞外ドメイン、Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ｅ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む、
項目４３から４５のいずれか一項に記載のマウス。
（項目４７）
前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ａ遺伝子座であり、
前記第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ８．１  αポリペプチドの細胞外ドメイン、Ｈ−２Ａ  αポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ａ  αポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ８．１  βポリペプチドの細胞外ドメイン、Ｈ−２Ａ  βポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびＨ−２Ａ  βポリペプチドの細胞質ドメインを含む、
項目４３から４６のいずれか一項に記載のマウス。
（項目４８）
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体をコードする非ヒトキメラＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座であって、
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列
を含み、
前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  α細胞外ドメインを含み、前記キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  β細胞外ドメインを含み、
前記遺伝子座は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、遺伝子座。
（項目４９）
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチド細胞外ドメインは、非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結しており、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチド細胞外ドメインは、非ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインに作動可能に連結している、項目４８に記載の遺伝子座。
（項目５０）
前記ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、非ヒト動物のゲノムの内在性ＭＨＣ  ＩＩ位に位置する、項目４８に記載の遺伝子座。
（項目５１）
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２ポリペプチド、ＨＬＡ−ＤＲ４ポリペプチド、ＨＬＡ−ＤＱ２ポリペプチド、またはＨＬＡ−ＤＱ８ポリペプチドである、項目４８に記載の遺伝子座。
（項目５２）
前記非ヒトＭＨＣ  ＩＩポリペプチドは、マウスＨ−２ＡポリペプチドまたはマウスＨ−２Ｅポリペプチドである、項目４８に記載の遺伝子座。
（項目５３）
マウスのＥＳ細胞の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、
ＥＳ細胞の第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換え、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えて、第１の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程、および
前記ＥＳ細胞の第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換え、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えて、第２の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程
を含み、
前記第１の遺伝子座および前記第２の遺伝子座は、同じＥＳ細胞において逐次改変される、方法。
（項目５４）
前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、およびＨＬＡ−ＤＱ８．１のα鎖からなる群から選択され、前記ヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＱ２、ＨＬＡ−ＤＱ２．５、ＨＬＡ−ＤＱ８、およびＨＬＡ−ＤＱ８．１のβ鎖からなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドは、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅのα鎖からなる群から選択され、前記マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドは、Ｈ−２ＡおよびＨ−２Ｅのβ鎖からなる群から選択される、項目５３または５４に記載の方法。
（項目５６）
前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ａ遺伝子座である、項目５３から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座は、Ｈ−２Ｅ遺伝子座である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
マウスの第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を、第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記第１の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えて、第１の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程を含む工程、ならびに
前記マウスの第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよび第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記第２の内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびマウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびヒトＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えて、第２の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程
を含み、
前記第１の内在性遺伝子座および前記第２の内在性遺伝子座は、前記マウスにおいて逐次改変され、
前記マウスは、前記第１の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座および前記第２の改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座から２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
（項目５９）
内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、
前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換え、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含み、
前記遺伝子座は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
（項目６０）
前記内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ｅ遺伝子座である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
内在性マウスＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現させる方法であって、
前記内在性ＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座において、
マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換え、かつ
マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含み、
前記遺伝子座は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
（項目６２）
前記内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ａ遺伝子座である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
マウスの内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性Ｈ−２Ｅ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｅ  αポリペプチドおよびマウスＨ−２Ｅ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ２  αポリペプチドおよびヒトＨＬＡ−ＤＲ２  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えて改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程を含む工程
を含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
（項目６４）
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
マウスの内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  αポリペプチドおよびキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ  βポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性Ｈ−２Ａ遺伝子座において、マウスＨ−２Ａ  αポリペプチドおよびマウスＨ−２Ａ  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  αポリペプチドおよびヒトＨＬＡ−ＤＱ８．１  βポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換えて改変されたＭＨＣ  ＩＩ遺伝子座を生成する工程を含む工程
を含み、
前記マウスは、前記マウスの細胞の表面にキメラヒト／マウスＭＨＣ  ＩＩ複合体を発現する、方法。
（項目６５）
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ａ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ａ  βポリペプチドも発現しない、項目６３または６４に記載の方法。
（項目６６）
前記マウスは、機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  αポリペプチドも機能的な内在性Ｈ−２Ｅ  βポリペプチドも発現しない、項目６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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