(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）化合物（Ｉ−Ｄ）：
【化１】
0006569908.tif 000021
式（Ｉ−Ｄ）：エチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−４−オキソ−２−｛［４−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジニル］アミノ｝−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
および化合物（Ｉ−Ｅ）：
【化２】
0006569908.tif 000022
式（Ｉ−Ｅ）：シクロプロピルメチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（モルホリノアミノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
から選択されるＣｄｃ７阻害剤、および
２）Ｍ期促進剤として、Ｗｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５：
【化３】
0006569908.tif 000023
とを組み合わせた、がんを治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗がん剤組成物に関する。より詳細には、本発明はＣｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤との組み合わせを含む抗がん剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは細胞が細胞周期の制御を失い、無制限に増殖することにより引き起こされる疾患である。通常、がん細胞は正常細胞よりも増殖が速いため、細胞分裂、ＤＮＡの複製を制御することにより、がんの治療が可能であると考えられている。実際、ＤＮＡ複製阻害作用を有するゲムシタビンは、非小細胞肺がん、膵臓がん、胆道がん、膀胱がん、乳がん、又は卵巣がんなどの治療に広く用いられている。【０００３】
細胞周期の過程には様々なタンパク質が関与する。一般に、タンパク質の生物学的機能は、翻訳後修飾の様々な機構によって調節されている。具体的には、メチル化、アセチル化、グリコシル化、リン酸化などが、タンパク質の機能や構造の修飾に関与する。これらの翻訳後修飾の中でもリン酸化は、細胞内シグナル伝達、細胞周期、細胞死などの多くの機能の調節に関連した重要な機構である。例えば、哺乳類細胞の細胞内タンパク質の３分の１以上は、リン酸化されていると考えられる。【０００４】
タンパク質キナーゼは基質タンパク質の特定のアミノ酸残基にリン酸基を結合する反応を触媒する酵素である。このタンパク質キナーゼの作用によって、タンパク質が特定のリン酸化部位でリン酸化される。タンパク質キナーゼは、リン酸化される部位のアミノ酸の種類に基づいて下記のとおりに分類される。
セリン−トレオニンキナーゼ（Ｓｅｒ／Ｓ又はＴｈｒ／Ｔ残基がリン酸化される）
チロシンキナーゼ（Ｔｙｒ／Ｙがリン酸化される）【０００５】
Ｃｄｃ７はセリン−トレオニンキナーゼの一種であり、細胞周期におけるＤＮＡ複製の開始に関与する必須のタンパク質キナーゼである。Ｃｄｃ７はそのリン酸化作用を活性化させるＤｂｆ４（ＡＳＫ）等のコファクターと複合体を形成し、基質であるＭＣＭ（ミニクロモソームメンテナンス）タンパク質をリン酸化する。このリン酸化によりＣｄｃ４５とＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ上に集合してＭＣＭ複合体が形成され、ＤＮＡ複製が開始すると考えられている（非特許文献１参照）。【０００６】
近年、Ｃｄｃ７は抗がん剤のターゲットとして注目され、活発に研究が行われている。例えば、Ｃｄｃ７は、一般的なヒト腫瘍由来株化細胞だけでなく、生体から採取した乳がん、大腸がん、肺がんなどのがん細胞においても過剰発現していることが明らかになった（非特許文献２参照）。特に、最近、ｐ５３変異トリプルネガティブ（ＥＲ−／ＰＲ−／Ｈｅｒ２−）の乳がん細胞でＣｄｃ７が過剰発現していることが示され（非特許文献３参照）、これまで治療困難とされてきたトリプルネガティブタイプの乳がんに対して、Ｃｄｃ７が有望な標的となることが期待されている。実際に、ＲＮＡ干渉技術を用いたＣｄｃ７発現抑制実験において、Ｃｄｃ７発現を阻害すると正常細胞の細胞周期の停止が誘発されることが確認された。さらに重要な点として、ＲＮＡ干渉技術によるＣｄｃ７阻害は、ＨｅＬａ及びＨＣＴ１１６などのヒト腫瘍細胞の増殖は抑制するが、正常細胞（正常なヒト皮膚線維芽細胞）に対する抑制効果は少なかった（非特許文献４参照）。【０００７】
ＤＮＡの複製因子の欠失はしばしばがん細胞に細胞死をもたらす。Ｃｄｃ７も細胞周期におけるＤＮＡ複製の開始に関与する必須のタンパク質キナーゼであるため、その欠失は、細胞内でのＤＮＡ修復、細胞増殖停止、アポトーシスなどの細胞増殖サイクルの抑制を制御するｐ５３遺伝子の状態如何にかかわらず、がん細胞の死を誘発する。Ｍａｓａｉらは、最近開発された、Ｆｕｃｃｉ（蛍光ユビキチン系細胞周期インジケータ）の蛍光プローブを利用して細胞周期の進行をリアルタイムに観察しながらＣｄｃ７の欠失によって誘発される細胞死を研究した（非特許文献５参照）。彼らは、ｐ５３ポジティブ及びネガティブの両細胞においてＣｄｃ７阻害により明瞭な細胞周期応答が誘発されることを示した。特にｐ−５３ネガティブ細胞では、Ｍ期に先立つＧ２期において細胞周期の進行が一時的に停止し、サイクリンＢ１及び他の有糸分裂調節遺伝子産物が蓄積される。それに引き続いて異常なＭ期へと移行することになり、有糸分裂後に細胞死が起こる。一方ｐ５３ポジティブがん細胞では、サイクリンＢ１の蓄積は生じないものの、Ｃｄｃ７欠失後の異常なＳ期への移行によりほとんどが死滅するようである（非特許文献５参照）。【０００８】
従って、Ｃｄｃ７を選択的に阻害する阻害剤は、種々のがんに対し有効な治療効果を示すことが期待される。これまでにも、Ｃｄｃ７阻害作用を有する種々の化合物が報告されている（特許文献１参照）。特に、Ｃｄｃ７阻害作用を有するフラノン誘導体が報告されている（特許文献２参照）。【０００９】
Ｗｅｅ１はセリン／トレオニンファミリーのタンパク質キナーゼに属する核内タンパク質キナーゼであり、脱リン酸化酵素であるＣｄｃ２５と共に細胞周期の進行に重要な調節剤の役割を果たしている。【００１０】
Ｗｅｅ１キナーゼは、Ｃｄｋ１キナーゼのＴｙｒ１４、Ｔｙｒ１５をリン酸化することによりその活性を抑制するが、逆にＣｄｃ２５はそれらのチロシン残基を脱リン酸化し、活性化する。なお、Ｗｅｅ１やＣｄｃ２５はＧ２／Ｍチェックポイント機構によって、活性化又は抑制を受ける。すなわち、Ｇ２期からＭ期への移行はチェックポイントの下流にあるこれらＷｅｅ１及びＣｄｃ２５の機能のバランスにより制御を受けている。【００１１】
Ｗｅｅ１の上記機能から、Ｗｅｅ１を阻害することにより、異常や不具合のある細胞をＭ期へと移行させ、未成熟な有糸分裂や細胞死を引き起こすことができると考えられる。そのため、Ｗｅｅ１阻害剤の抗がん治療への応用が考えられている。実際、Ｗｅｅ１阻害剤ＭＫ−１７７５について抗がん効果が報告されているが（非特許文献６参照）、抗がん効果やがん細胞に対する選択性は必ずしも満足のいくものではない。【００１２】
一方、メルク社が開発したＷｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５が、ヒト肉腫に対してゲムシタビンのようなＤＮＡ損傷剤の細胞毒性効果を増大させるという報告がある（非特許文献７）。しかしＣｄｃ７阻害剤はゲムシタビンのようなＤＮＡ損傷剤とは異なり、直接ＤＮＡ損傷を引き起こしているわけではないので、Ｃｄｃ７阻害剤とＷｅｅ１阻害剤の組み合わせについては従来技術には一切開示がなく、がん細胞に対する抗がん作用やがん細胞選択性についても全く報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００８／０４６９８２号
【特許文献２】国際公開第２０１２／１３３８０２号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈ．Ｍａｓａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９０、２００２、２８７−２９６
【非特許文献２】ＤＢｏｎｔｅら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、１０、２００８、９２０−９３１
【非特許文献３】Ｓ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ａｃｅｂｅｓら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１７７、２０１０、２０３４−２０４５
【非特許文献４】Ａ．Ｍｏｎｔａｇｎｏｌｉら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、６４、２００４、７１１０−７１１６
【非特許文献５】Ｍａｓａｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）、７（５）、ｅ３６３７２
【非特許文献６】Ａ．Ｄ．Ｇｕｅｒｔｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （２０１３），１２（８），１４４２−１４５２
【非特許文献７】Ｊ．Ｍ．Ｋｒｅａｈｌｉｎｇら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１３）、８（３）、ｅ５７５２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明はＤＮＡ複製及び細胞周期チェックポイント機構に対する制御を通じてがん細胞にのみ選択的・特異的に細胞死を誘導する抗がん剤組成物（組み合わせ薬剤）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明はＣｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤との組み合わせによる抗がん剤組成物に関する。より具体的には本発明は以下に関する。
（１）Ｃｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤とを含む薬剤組成物。
（２）前記Ｃｄｃ７阻害剤が、下式（Ｉ）で示されるフラノン誘導体又はその薬学的に許容される塩である、（１）記載の薬剤組成物。
【化１】
0006569908.tif 000002
（式中、Ａは、−ＣＯＯＲ１又は水素原子を表し、Ｒ１は、水素原子、置換基を有してもよい炭化水素基、又は置換基を有してもよい複素環を表し、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なってもよく、水素原子、置換基を有してもよい炭化水素基、置換基を有してもよいフェニル基、置換基を有してもよい複素環、置換基を有してもよい複素環式縮合環、又は置換基を有してもよいアミノ基を表す。あるいは、Ｒ２及びＲ３は、これらが結合している窒素原子と共に、置換基を有してもよい複素環又は置換基を有してもよい複素環式縮合環を形成してもよい。Ｒ４は、水素原子又はハロゲン原子を表す。ただし、Ａが−ＣＯＯＲ１を表す場合は、Ｒ２及びＲ３は同時に置換基を有してもよいアミノ基にならず、Ａが水素原子を表す場合は、Ｒ３は水素原子を表す。）
（３）前記Ａが−ＣＯＯＲ１である、（２）に記載の薬剤組成物。
（４）前記Ａが水素原子である、（２）に記載の薬剤組成物。
（５）前記フラノン誘導体が以下の化合物（Ｉ−Ａ）、化合物（Ｉ−Ｂ）、化合物（Ｉ−Ｃ）、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）の構造を有する、（３）に記載の薬剤組成物。
式（Ｉ−Ａ）：イソプロピル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（モルホリノアミノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化２】
0006569908.tif 000003
（Ｉ−Ａ）
式（Ｉ−Ｂ）：エチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（７−メトキシ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化３】
0006569908.tif 000004
（Ｉ−Ｂ）
式（Ｉ−Ｃ）：イソプロピル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−４−オキソ−２−｛［４−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジニル］アミノ｝−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化４】
0006569908.tif 000005
（Ｉ−Ｃ）
式（Ｉ−Ｄ）：エチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−４−オキソ−２−｛［４−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジニル］アミノ｝−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化５】
0006569908.tif 000006
（Ｉ−Ｄ）
式（Ｉ−Ｅ）：シクロプロピルメチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（モルホリノアミノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化６】
0006569908.tif 000007
（Ｉ−Ｅ）
（６）前記Ｃｄｃ７阻害剤が以下の化合物である、（１）に記載の薬剤組成物。
式（Ｉ−Ｆ）：２−（ピリジン−４−イル）−１，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジノン
【化７】
0006569908.tif 000008
（Ｉ−Ｆ）
式（Ｉ−Ｇ）：５−（２−アミノ−ピリミジン−４−イル）−２−（２，４−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸アミド
【化８】
0006569908.tif 000009
（Ｉ−Ｇ）
（７）前記Ｍ期促進剤がＷｅｅ１阻害剤である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
（８）前記Ｗｅｅ１阻害剤がＭＫ−１７７５
【化９】
0006569908.tif 000010
、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−３８１、
６−ブチル−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３−（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
９−メトキシ−４−（２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−４，５，６，１０ｃ−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，３ａＨ）−ジオン、
Ｎ−［３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノイル］ベンゼンスルホンアミド、
４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（３−ヒドロキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−（１Ｈ）−イル）−Ｎ−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イルスルフィニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（３−ブロモプロピル）−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパン酸、
Ｎ−［３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノイル］−２−（ジメチルアミノ）エタンスルホンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
Ｎ−［３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノイル］メタンスルホンアミド、
４’−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）ブタン酸、
Ｎ−［４−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）ブタノイル］メタンスルホンアミド、
６−アセチル−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンアミド、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパンニトリル、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル））−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルファニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
Ｎ−［４−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）ブタノイル］ベンゼンスルホンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イルスルホニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルフィニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）イル）プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルホニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）イル）プロパン酸、
４−（２−クロロフェニル）−６−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
２−（４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）エチルメタンスルホネート、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−４−フェニルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（３−ブロモプロピル）−４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（３−メトキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［（２Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）エチル］プロパンアミド、
９−ヒドロキシ−６−（３−ヒドロキシプロピル）−４−（２−メトキシフェニル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
メチル ３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノエート、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（４−モルホリニル）エチル］プロパンアミド、
４−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル］ブタンニトリル、
４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−６−（３，４−ジヒドロキシブチル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［（２Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
２−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）エチルメタンスルホネート、
４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（３−ヒドロキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−４−（２−メトキシフェニル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−６−（２−ヒドロキシエチル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（メチルスルファニル）プロピルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−６−エチル−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−イソプロピルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（２−クロロエチル）−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（３−ブロモプロピル）−４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−ヒドロキシ−３−（メチルアミノ）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−メチルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−ヒドロキシ−３−（４−モルホリニル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン
である、（７）に記載の薬剤組成物。
（９）前記Ｍ期促進剤がＣｈｋ１阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤又はＭｙｔ１阻害剤である、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
（１０）前記Ｃｈｋ１阻害剤がＳＣＨ９００７７６、ＵＣＮ−０１、ＧＤＣ−０４２５、ＸＬ８４４、ＣＥＰ−３８９１、ＣＨＩＲ−１２４、ＣＨＩＲ−６００、ＰＦ−００３９４６９１、ＰＦ−００４７７７３６、Ｎ−アリール−Ｎ’−ピラジニルウレア、Ｇｏ６９７６、ＳＢ−２１８０７８、ＩＣＰ−１、ＰＤ−０１６６２８５、ＣＢＰ−５０１、スタウロスポリン、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン（ＤＢＨ）、シトネミン、ピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、フラノピリミジン、ピラゾロキノリン、イミダゾピラジン、ピリミジニルインダゾリルアミン、２−ウレイドチオフェン、３−ウレイドチオフェン、トリアゾロン、ジアリール尿素、ベンゾイミダゾールキノロン、ジベンゾジアゼピノン、インドリノン、アミノピラゾール、インデノピラゾール又はジアゾピノインドロンである、（９）記載の薬剤組成物。
（１１）前記Ｈｓｐ９０阻害剤がゲルダナマイシン、タネスピマイシン（１７−ＡＡＧ）、１７−アミノデメトキシゲルダナマイシン（ＩＰＩ−４９３）、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）、ＸＬ８８８、ＳＮＸ−２１１２、ＳＮＸ−５４２２、ＳＮＸ−７０８１、ガネテスピブ（ＳＴＡ−９０９０）、ＡＴ１３３８７、ＡＵＹ９２２、Ｄｅｂｉｏ０９３２、ＢＩＩＢ０２８、ＢＩＩＢ０２１、ＭＰＣ−３１００、ＭＰＣ−０７６７、レタスピマイシン（ＩＰＩ−５０４）、ＰＵ３、ＰＵ２４ＦＣＩ、ＰＵ−Ｈ５８、ＰＵ−Ｈ７１、ＤＳ−２２４８、ＫＷ−２４７８、ＣＣＴ０１８１５９、ＣＣＴ０１２９３９７、ＢＪ−Ｂ１１、エレスクロモール（ＳＴＡ−４７８３）、Ｇ３１３０、ゲダニン、ハービマイシン、ラデスター、ＫＮＫ４３７、ＨＳＰ９９０又はＮＶＰ−ＢＥＰ８００である、（９）記載の薬剤組成物。
（１２）前記Ｍｙｔ１阻害剤が、
２-(４-フルオロフェニルアミノ)-４-(４-ピリジル)チアゾール、
２-(４-フルオロフェニルアミノ)-４-(４-フルオロフェニル)チアゾール、
３-(３,４-ジクロロフェニル)-５-[４-[２-[(２-ピリジル)アミノ]チアゾリル]]-イソキサゾール、
３-(３,４-ジクロロフェニル)-５-[４-[２-(３-ピリジル)アミノ]チアゾリル]-イソキサゾール、
１,４-ビス(２-フェニルアミノ-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,４-ビス(２-フェニルアミノ-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１-[２-フェニル-４-(５-ブロモ)チアゾリル]-４-[２-フェニル-４-チアゾリル]ベンゼン、
１-[２-フェニル-４-(５-ブロモ)チアゾリル]-４-[２-フェニル-４-チアゾリル]ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,４-ビス(２-フェニル)-(４-(５-ブロモ)チアゾリルベンゼン、
１,４-ビス(２-フェニル)-(４-(５-ブロモ)チアゾリルベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,４-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,４-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンビストリフルオロ酢酸塩、
１-[(２-(３-ピリジルアミノ)-４-(５-ブロモ)チアゾリル)]-４-[２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル] ベンゼン、
１-[(２-(３-ピリジルアミノ)-４-(５-ブロモ)チアゾリル)]-４-[２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル] ベンゼンビストリフルオロ酢酸塩、
１,３-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,３-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,４-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,４-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,３-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,３-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
４,４'-ジ(２,２-フェニルアミノチアゾリル)、
４,４'-ジ(２,２-フェニルアミノチアゾリル)ジ臭化水素酸塩、
４,４'-ジ(２-(２-メトキシピリド-５-イルアミノ)チアゾリル)、
４,４'-ジ(２-(２-メトキシピリド-５-イルアミノ)チアゾリル)ビストリフルオロ酢酸塩、
４,４'-ジ(２-(２-ピリジル)アミノチアゾリル)、
４,４'-ジ(２-(２-ピリジル)アミノチアゾリル)ビストリフルオロ酢酸塩、
ビス[２-(４-フェニル-５-メチル)チアゾリル]アミン、
ビス[２-(４-フェニル-５-メチル)チアゾリル]アミン臭化水素酸塩、
ビス[２-(４-(２-ピリジル)チアゾリル]アミン、
ビス[２-(４-(２-ピリジル)チアゾリル]アミンジ臭化水素酸塩、
ビス[２-[４-(３-ピリジル)チアゾリル)アミン、
ビス[２-[４-(３-ピリジル)チアゾリル)アミンビストリフルオロ酢酸塩、
Ｎ,Ｎ-ビス(５(３,４-ジクロロフェニル)-２-チアゾリル)アミン、
Ｎ,Ｎ-ビス(５(３,４-ジクロロフェニル)-２-チアゾリル)アミンジ臭化水素酸塩、
１,３-ビス[４-(３-ピリジル)-２-チアゾリルアミノ]ベンゼン、
１,３-ビス[４-(３-ピリジル)-２-チアゾリルアミノ]ベンゼンジ臭化水素酸塩
又はダサチニブである、（９）記載の薬剤組成物。
（１３）（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の薬剤組成物からなる抗がん剤組成物。
（１４）Ｃｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤とを組み合わせたことを特徴とするがん治療薬。
（１５）がん治療薬が配合剤であることを特徴とする、（１４）に記載のがん治療薬。
（１６）がん治療薬がＣｄｃ７阻害剤を含有してなる薬剤とＭ期促進剤を含有してなる薬剤とからなるキットであることを特徴とする、（１４）に記載のがん治療薬。
【発明の効果】
【００１７】
Ｃｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤との組み合わせにより、Ｃｄｃ７阻害剤又はＭ期促進剤のそれぞれを単独に使用した場合に比べて、幅広いがん細胞に対してより高い選択性・特異性をもって、より高い効率で細胞死をもたらすことができる。特にＣｄｃ７阻害剤はがん細胞は細胞死に至らしめ、正常細胞に対しては細胞周期を安全に停止するため細胞の生存を維持することができ、一方Ｍ期促進剤はがん細胞の細胞周期チェックポイントを無効化することによりＭ期への異常な進行を進めることにより、ＤＮＡ損傷の蓄積、分裂期細胞死の誘導を引き起こす。このような抗がん剤は新しい作用機序を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、大腸がん細胞に対する、Ｃｄｃ７阻害剤としての化合物（Ｉ−Ｄ）及び化合物（Ｉ−Ｅ）とＭ期促進剤としてのＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図２】図２は、正常細胞に対する化合物（Ｉ−Ｄ）及び化合物（Ｉ−Ｅ）とＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）との相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図３】図３は、Ｐａｎｃ−１細胞（膵がん細胞株）における、化合物（Ｉ−Ｄ）及び化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５の相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図４】図４は、化合物（Ｉ−Ｄ）及び化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５の配合薬剤内の組成を変更しても効果がみられることを示すＦＡＣＳ図である。
【図５】図５は、Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ａ）とＭＫ−１７７５の組み合わせによる相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図６】図６は、Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｂ）とＭＫ−１７７５の組み合わせによる相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図７】図７は、Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｃ）とＭＫ−１７７５の組み合わせによる相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図８】図８は、Ｃｄｃ７阻害剤（化合物（Ｉ−Ｆ）又は化合物（Ｉ−Ｇ））とＭＫ−１７７５の組み合わせによる相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図９】図９は、Ｍ期促進剤として、Ｃｈｋ１阻害剤であるＳＣＨ９００７７６（ＳＣＨ）を、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と組み合わせたときの相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図１０】図１０は、Ｍ期促進剤として、Ｃｈｋ１等のキナーゼ阻害剤であるＵＣＮ−０１を、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と組み合わせたときの相互作用を示すＦＡＣＳ図である
【図１１】図１１は、Ｍ期促進剤として、Ｈｓｐ９０阻害剤であるゲルダナマイシンを、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と組み合わせたときの相互作用を示すＦＡＣＳ図である。
【図１２】図１２は、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する化合物（Ｉ−Ｄ）とＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の組み合わせによる相互作用を示す細胞増殖阻害率の図である。
【図１３】図１３は、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する化合物（Ｉ−Ｅ）とＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の組み合わせによる相互作用を示す細胞増殖阻害率の図である。
【図１４】図１４は、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する化合物（Ｉ−Ｄ）とＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の組み合わせによる相互作用を示すＢＬＩＳＳスコアの図である。
【図１５】図１５は、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する化合物（Ｉ−Ｅ）とＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の組み合わせによる相互作用を示すＢＬＩＳＳスコアの図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１）Ｃｄｃ７阻害剤
本発明においてＣｄｃ７阻害剤とは、Ｃｄｃ７キナーゼ活性を阻害する薬剤をいい、低分子化合物、ポリペプチド、タンパク質、核酸（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー等）、その他の高分子化合物等のＣｄｃ７キナーゼを阻害する薬剤を包含する。
【００２０】
Ｃｄｃ７を阻害すると、がん細胞特異的に異常なＤＮＡ複製が進行し、細胞死が誘導される。  正常細胞では、正常なＤＮＡ複製チェックポイント機構が働き、細胞周期の停止が起こるため、生存を維持することができる。より詳細には、Ｃｄｃ７はＤＮＡ複製前複合体のＭＣＭタンパク質のリン酸化を起こし複製開始点の発火を促進する。
【００２１】
Ｃｄｃ７の抑制は、複製開始点の発火を阻害するので、複製開始点が減少することにより、複製フォークの停止が起き、中途半端な複製状態となる。ＤＮＡ複製チェックポイントに影響を与えるようながん性遺伝子変異の存在により、細胞周期が異常な進行を起こし、Ｍ期においてＤＮＡ損傷を誘導、ＤＮＡ損傷の蓄積を起こし、最終的にがん細胞特異的な細胞死を誘導する。
【００２２】
Ｃｄｃ７阻害剤としては、例えば、特表２０１３−５２５３５４、特表２０１３−５２５３０４、特表２０１３−５２５３０３、特表２０１３−５２２２１２、特表２０１３−５１１４８７、特表２０１２−５３３５５３、特表２０１２−５３３５５１、特表２０１２−５１９６５３、特表２０１１−５０７９０８、特表２０１０−５２７３２４、特表２０１０−５１９３２４、特表２０１０−５０５９２２、特表２００９−５３４４００、特表２００９−５３１３７３（国際公開第２００７／１１０３４４号）、特表２００９−５１９９１９、特表２００９−５１５８４９、特表２００７−５０１８２７、特表２００７−５０１８２５、再表２０１１／１０２３９９、再表２０１０／１２２９７９、国際公開２０１１／１０２３９９号、国際公開第２０１２／００２５６８号、国際公開第２０１２／１３３８０２号（特許文献２）に挙げられた化合物が挙げられる。
Ｃｄｃ７阻害剤の一つの態様は、国際公開第２０１２／１３３８０２号（特許文献２）に記載される下式（Ｉ）で示されるフラノン誘導体又はその薬学的に許容される塩である。
【００２３】
【化１０】
0006569908.tif 000011
【００２４】
（式中、Ａは、−ＣＯＯＲ１又は水素原子を表し、Ｒ１は、水素原子、置換基を有してもよい炭化水素基、又は置換基を有してもよい複素環を表し、Ｒ２及びＲ３は同一又は異なってもよく、水素原子、置換基を有してもよい炭化水素基、置換基を有してもよいフェニル基、置換基を有してもよい複素環、置換基を有してもよい複素環式縮合環、又は置換基を有してもよいアミノ基を表す。あるいは、Ｒ２及びＲ３は、これらが結合している窒素原子と共に、置換基を有してもよい複素環又は置換基を有してもよい複素環式縮合環を形成してもよい。Ｒ４は、水素原子又はハロゲン原子を表す。ただし、Ａが−ＣＯＯＲ１を表す場合は、Ｒ２及びＲ３は同時に置換基を有してもよいアミノ基にならず、Ａが水素原子を表す場合は、Ｒ３は水素原子を表す。）
【００２５】
前記式（Ｉ）において、置換基を有してもよい炭化水素基としては、例えば、
a)炭素数１から６の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルキル基（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシルなど）、b) 炭素数１から６の直鎖状、あるいは分岐鎖状のアルケニル基(例えば、ビニル、アリル、イソプロペニル、２−ブテニルなど)、c) 炭素数２から６のアルキニル基(例えば、エチニル、プロパルギル、２−ブチニルなど)、d) 炭素数３から８のシクロアルキル基(例えば、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなど)、e) 炭素数３から８のシクロアルケニル基(例えば、シクロヘキセニル、シクロヘプテニルなど)、
f)アラルキル基、アラルキル基のアリール部分としては、炭素数６から１４のアリールが挙げられ(例えば、フェニル、ナフチル、インデニルなど)、アラルキル基のアルキレン部分としては、前記アルキル基から水素原子を１つ除いたものと同義である、
などが挙げられる。
【００２６】
置換基を有してもよい複素環の複素環部分としては、脂環式複素環基及び芳香族複素環基が挙げられ、脂環式複素環基としては、例えば、窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む３から８員の複素環基などが挙げられる。具体的には、ピロリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニルなどが挙げられる。また、芳香族複素環基としては、例えば、窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む５又は６員の単環性芳香族複素環基などが挙げられる。具体的には、イミダゾリル、ピラゾリル、チエニル、チアゾリル、ピリジルなどが挙げられる。
【００２７】
置換基を有してもよい複素環式縮合環の複素環式縮合環部分としては、例えば、３から８員の環が縮合した二環性で、窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む縮合複素環基などが挙げられる。具体的には、ベンゾチオフェニル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソキノリル、フタルイミドなどが挙げられる。
【００２８】
置換基を有してもよいアミノ基としては、置換若しくは非置換の炭素数１から６の直鎖状、分枝状若しくは環状のアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基などを有するアミノ基などが挙げられ、例えば、１若しくは２以上の置換基を有するか又は非置換の、アルキル基、アルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、複素環基、複素環式縮合環基などが結合していてもよいアミノ基が挙げられ、アミノ基に結合するこれらの基の「１若しくは２以上の置換基」としては、特に記載のない限り、１若しくは２以上の同一若しくは異なる任意の置換基であってもよく、例えば、ハロゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルケニル基、置換若しくは非置換アルキニル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換アルキルアミノ基、カルバモイル基、カルボキシル基、ホルミル基、アセチル基、ベンゾイル基などが挙げられる。
【００２９】
置換基を有してもよい炭化水素基、置換基を有してもよい複素環、置換基を有してもよいフェニル基又は置換基を有してもよい複素環式縮合環の「置換基」としては、特に記載のない限り、１又は２個以上の任意の種類の置換基を、化学的に可能な任意の位置に有してもよく、置換基が２個以上の場合、それぞれの置換基は同一であっても異なっていてもよく、例えば、ハロゲン原子、置換若しくは非置換アルキル基、置換若しくは非置換アルコキシ基、置換若しくは非置換アミノ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、置換若しくは非置換アルキルアミノ基、カルバモイル基、カルボキシル基、ホルミル基、アセチル基、ベンゾイル基などが挙げられる。
【００３０】
Ｒ２及びＲ３が結合している窒素原子と共に、置換基を有してもよい複素環あるいは置換基を有してもよい複素環式縮合環を形成する場合における複素環基としては、例えば、窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む３から８員の複素環基、３から８員の環が縮合した二環性で、窒素原子、硫黄原子及び酸素原子から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含む縮環式脂環式複素環基などが挙げられ、具体的には、ピロリジニル、ピペリジル、モルホリニル、チオモルホリニル、アゼピニル、ジアゼピニル、ジヒドロイソキノリル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル、イソインドリニル、インドリニル、テトラヒドロベンゾアゼピニル、ベンゾアゼピニル、ベンゾジアゼピニル、ベンゾキシアゼピニル、ベンゾチアゼピニルなどが挙げられる。  ハロゲン原子としては、例えばフッ素、塩素、臭素などが挙げられる。
【００３１】
本発明に係る化合物（Ｉ）は、例えば、置換基の種類によって、異性体が存在する場合がある。本明細書において、それらの異性体の一形態のみの化学構造で記載することがあるが、本発明には、構造上生じ得るすべての異性体（幾何異性体、光学異性体、互変異性体など）も含有し、異性体単体、又はそれらの混合物も含有する。また、本発明に係る化合物である式（Ｚ）−（Ｉ）及び（Ｅ）−（Ｉ）で具体的に示されるこれら立体異性体、並びにこれらの混合物も本発明に包含される。
【００３２】
【化１１】
0006569908.tif 000012
（Ｚ）−（Ｉ）                          （Ｅ）−（Ｉ）
【００３３】
また、本発明に係る化合物（Ｉ）の薬学的に許容される塩としては、塩酸、硫酸、炭酸、リン酸などとの無機酸塩、ギ酸、酢酸、フマル酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの有機酸塩などが挙げられる。また、ナトリウム、カリウムなどとのアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウムなどとのアルカリ土類金属塩、低級アルキルアミン、低級アルコールアミンなどとの有機アミン塩、リジン、アルギニン、オルニチンなどとの塩基性アミノ酸塩の他、アンモニウム塩なども本発明に包含される。
【００３４】
本発明に係る化合物（Ｉ）及びその薬学的に許容される塩は、例えば国際公開第２０１２／１３３８０２号に記載の方法によって製造することができる。なお、国際公開第２０１２／１３３８０２号に記載の製造方法において、定義した基が実施方法の条件下で変化するか、又は方法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で通常用いられる方法、例えば、官能基の保護、脱保護［Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９］などの手段を付すことにより容易に製造することができる。また、必要に応じて置換基導入などの反応工程の順序を変えることもできる。
【００３５】
上記式（Ｉ）の化合物は、好ましくはＡが−ＣＯＯＲ１又は水素原子であり、より好ましくは以下の化合物（Ｉ−Ａ）、化合物（Ｉ−Ｂ）、化合物（Ｉ−Ｃ）、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）の構造を有する。
【００３６】
式（Ｉ−Ａ）：イソプロピル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（モルホリノアミノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化１２】
0006569908.tif 000013
（Ｉ−Ａ）
【００３７】
化合物（Ｉ−Ｂ）：エチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（７−メトキシ−３，４−ジヒドロイソキノリン−２（１Ｈ）−イル）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化１３】
0006569908.tif 000014
（Ｉ−Ｂ）
【００３８】
化合物（Ｉ−Ｃ）：イソプロピル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−４−オキソ−２−｛［４−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジニル］アミノ｝−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化１４】
0006569908.tif 000015
（Ｉ−Ｃ）
【００３９】
化合物（Ｉ−Ｄ）：エチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−４−オキソ−２−｛［４−（２，２，２−トリフルオロエチル）ピペラジニル］アミノ｝−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化１５】
0006569908.tif 000016
（Ｉ−Ｄ）
【００４０】
化合物（Ｉ−Ｅ）：シクロプロピルメチル  ５−［（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル）メチレン］−２−（モルホリノアミノ）−４−オキソ−４，５−ジヒドロフラン−３−カルボキシレート
【化１６】
0006569908.tif 000017
（Ｉ−Ｅ）
ここで、化合物（Ｉ−Ａ）は、特許文献２：国際公開第２０１２／１３３８０２号明細書の実施例２４５の化合物であり、化合物（Ｉ−Ｂ）は、特許文献２：国際公開第２０１２／１３３８０２号明細書の実施例２４４の化合物であり、化合物（Ｉ−Ｃ）は、特許文献２：国際公開第２０１２／１３３８０２号明細書の実施例３５１の化合物であり、化合物（Ｉ−Ｄ）は、特許文献２：国際公開第２０１２／１３３８０２号の実施例２４６の化合物であり、化合物（Ｉ−Ｅ）は、特許文献２：国際公開第２０１２／１３３８０２号の実施例３４７の化合物である。
【００４１】
Ｃｄｃ７阻害剤の他の態様として
化合物（Ｉ−Ｆ）：２−（ピリジン−４−イル）−１，５，６，７−テトラヒドロ−４Ｈ−ピローロ［３，２−ｃ］ピリジノン（メルク社、カタログ番号：２１７７０７−５ＭＧＣＮ、２１７７０７）
【化１７】
0006569908.tif 000018
（Ｉ−Ｆ）
【００４２】
化合物（Ｉ−Ｇ）：５−（２−アミノ−ピリミジン−４−イル）−２−（２，４−ジクロロ−フェニル）−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸アミド（特表２００９−５３１３７３、国際公開第２００７／１１０３４４号明細書の化合物Ｆ２６）
【化１８】
0006569908.tif 000019
（Ｉ−Ｇ）
【００４３】
（２）Ｍ期促進剤
本発明においてＭ期促進剤とは、細胞が細胞周期のＧ２/Ｍチェックポイントを通過して分裂期であるＭ期に移行するまでの過程を促進する機能を有する薬剤を言う。
Ｇ２／ＭチェックポイントはＧ２期からＭ期に移行する際の制御を行うチェックポイントであり、この制御がＤＮＡ損傷などで活性化されるとＭ期開始が阻害され、細胞はＧ２期に留まる。ＤＮＡ損傷応答においては、リン酸化を受け活性化されたＡＴＲ（ａｔａｘｉａ−ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｒｅｌａｔｅｄ）がＣｈｋ１をリン酸化して活性化し、次いで活性型Ｃｈｋ１がＣｄｃ２５のリン酸化をダウンレギュレートし、リン酸化Ｃｄｃ２５によるＣｄｋ１の脱リン酸化を阻害するため、Ｃｄｋ１は高リン酸化された不活性な状態に保たれ、細胞はＭ期に進行せずに細胞周期が停止する。
【００４４】
従って、Ｃｄｋ１がリン酸化されない状態であれば、細胞はＭ期に移行し細胞周期が進んでいくことになる。上記細胞周期のＧ２/ＭチェックポイントからＭ期に移行するまでの過程のメカニズムに関与し細胞のＭ期への移行を促進する物質は、低分子、核酸やタンパク質のような高分子のいずれであっても、本発明においてはＭ期促進剤であると言える。
【００４５】
Ｍ期促進剤の例としては、Ｗｅｅ１阻害剤、Ｃｈｋ１阻害剤、Ｍｙｔ１阻害剤、Ｃｄｃ２５活性化剤が挙げられる。また、このＧ２／Ｍチェックポイントに直接関与することは報告されていないが、Ｇ２期からＭ期への移行を促進すると報告がある、Ｈｓｐ９０阻害剤（ゲルダナマイシン、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００８；２７：５５６７）、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グリコヒドロラーゼ（ＰＡＲＧ）阻害剤（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１３；４４１：７９３、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１１；１６：１８５４）などが挙げられる。
【００４６】
ここでＷｅｅ１は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒファミリーのタンパク質キナーゼに属する核内キナーゼの１種である。Ｗｅｅ１はアミノ酸配列のＴｙｒ１５及びＴｈｒ１４の部位でのリン酸化によりＣｄｋ１を阻害する。このＣｄｋ１は、様々な細胞周期チェックポイントのサイクリン依存性の経路で重要な役割を果たす。
【００４７】
Ｇ２/Ｍチェックポイントでは、Ｗｅｅ１はＣｄｋ１のＴｙｒ１５及びＴｈｒ１４をリン酸化し、Ｃｄｋ１のキナーゼ活性を低く保ち、Ｍ期（有糸分裂）への移行を妨げる。一方、Ｍ期への移行の間、Ｗｅｅ１の活性は幾つかの制御因子により減少し、これによりＣｄｋ１活性が増大する。
【００４８】
ＤＮＡ損傷チェックポイントでは、ＤＮＡ損傷を有する細胞のＭ期（有糸分裂）への移行を遅延させることによりＧ２／Ｍ遷移を制御する。
【００４９】
従って、Ｗｅｅ１キナーゼの機能を阻害する薬剤（本発明ではこの薬剤をＷｅｅ１阻害剤と言う。）は、細胞のＧ２／Ｍ遷移を経由してＭ期への移行を促進することになり、Ｗｅｅ１阻害剤はＭ期促進剤の代表的な例であるといえる。
【００５０】
下記の構造式で示されるＭＫ−１７７５
【化１９】
0006569908.tif 000020
は、５．２ｎＭのＩＣ５０を有する有力で選択的なＷｅｅ１阻害剤であり、ＤＮＡ損傷チェックポイントを遮蔽する機能を有しており、ＤＮＡ損傷剤のような標準化学療法との併用による卵巣がんへの適用が試みられている。
また、Ｗｅｅ１阻害剤の例として、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−３８１、及び特表２００６−５０４６３２号明細書に記載された
６−ブチル−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３−（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
９−メトキシ−４−（２−メトキシ−５−ニトロフェニル）−４，５，６，１０ｃ−テトラヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，３ａＨ）−ジオン、
Ｎ−［３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノイル］ベンゼンスルホンアミド、
４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（３−ヒドロキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−（１Ｈ）−イル）−Ｎ−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イルスルフィニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（３−ブロモプロピル）−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパン酸、
Ｎ−［３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノイル］−２−（ジメチルアミノ）エタンスルホンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
Ｎ−［３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノイル］メタンスルホンアミド、
４’−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）ブタン酸、
Ｎ−［４−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）ブタノイル］メタンスルホンアミド、
６−アセチル−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンアミド、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパンニトリル、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル））−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルファニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
Ｎ−［４−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）ブタノイル］ベンゼンスルホンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イルスルホニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルフィニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）イル）プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（１Ｈ−イミダゾール−２−イルスルホニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−４−フェニル−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）イル）プロパン酸、
４−（２−クロロフェニル）−６−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
２−（４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）エチルメタンスルホネート、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−（４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イルスルファニル）エチル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−４−フェニルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（３−ブロモプロピル）−４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（３−メトキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［（２Ｓ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（１Ｈ−イミダゾール−５−イル）エチル］プロパンアミド、
９−ヒドロキシ−６−（３−ヒドロキシプロピル）−４−（２−メトキシフェニル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
メチル ３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）プロパノエート、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（４−モルホリニル）エチル］プロパンアミド、
４−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル］ブタンニトリル、
４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−６−（３，４−ジヒドロキシブチル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
３−（４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）−Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンアミド、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［（２Ｒ）−３−ヒドロキシ−２−メチルプロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
２−（４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−６（１Ｈ）−イル）エチルメタンスルホネート、
４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−６−（３−ヒドロキシプロピル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
９−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−４−（２−メトキシフェニル）ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−６−（２−ヒドロキシエチル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（メチルスルファニル）プロピルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−６−エチル−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−イソプロピルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（４−モルホリニル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（２−クロロエチル）−４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
６−（３−ブロモプロピル）−４−（２−クロロ−６−メトキシフェニル）−９−ヒドロキシピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−ヒドロキシ−３−（メチルアミノ）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−メチルピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２−クロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［２−ヒドロキシ−３−（４−モルホリニル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン、
４−（２，６−ジクロロフェニル）−９−ヒドロキシ−６−［３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル］ピロロ［３，４−ｃ］カルバゾール−１，３（２Ｈ，６Ｈ）−ジオン
が挙げられる。
【００５１】
Ｃｈｋ１阻害剤の例としては、Ｃｈｋ１等のキナーゼ阻害剤であるＵＣＮ−０１、Ｃｈｋ１阻害剤であるＳＣＨ９００７７６、ＧＤＣ−０４２５、ＸＬ８４４、ＣＥＰ−３８９１、ＣＨＩＲ−１２４、ＣＨＩＲ−６００、ＰＦ−００３９４６９１、ＰＦ−００４７７７３６、Ｎ−アリール−Ｎ’−ピラジニルウレア、Ｇｏ６９７６、ＳＢ−２１８０７８、ＩＣＰ−１、ＰＤ−０１６６２８５、ＣＢＰ−５０１、スタウロスポリン、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン（ＤＢＨ）、シトネミン、ピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、フラノピリミジン、ピラゾロキノリン、イミダゾピラジン、ピリミジニルインダゾリルアミン、２−ウレイドチオフェン、３−ウレイドチオフェン、トリアゾロン、ジアリール尿素、ベンゾイミダゾールキノロン、ジベンゾジアゼピノン、インドリノン、アミノピラゾール、インデノピラゾール、ジアゾピノインドロン等が挙げられる。
また、Ｈｓｐ９０阻害剤の例としては、ゲルダナマイシン、タネスピマイシン（１７−ＡＡＧ）、１７−アミノデメトキシゲルダナマイシン（ＩＰＩ−４９３）、１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＤＭＡＧ）、ＸＬ８８８、ＳＮＸ−２１１２、ＳＮＸ−５４２２、ＳＮＸ−７０８１、ガネテスピブ（ＳＴＡ−９０９０）、ＡＴ１３３８７、ＡＵＹ９２２、Ｄｅｂｉｏ０９３２、ＢＩＩＢ０２８、ＢＩＩＢ０２１、ＭＰＣ−３１００、ＭＰＣ−０７６７、レタスピマイシン（ＩＰＩ−５０４）、ＰＵ３、ＰＵ２４ＦＣＩ、ＰＵ−Ｈ５８、ＰＵ−Ｈ７１、ＤＳ−２２４８、ＫＷ−２４７８、ＣＣＴ０１８１５９、ＣＣＴ０１２９３９７、ＢＪ−Ｂ１１、エレスクロモール（ＳＴＡ−４７８３）、Ｇ３１３０、ゲダニン、ハービマイシン、ラデスター、ＫＮＫ４３７、ＨＳＰ９９０、ＮＶＰ−ＢＥＰ８００等が挙げられる。
さらに、Ｍｙｔ１阻害剤の例としては、
特表２００２−５３１５００に記載された化合物である、
２-(４-フルオロフェニルアミノ)-４-(４-ピリジル)チアゾール、
２-(４-フルオロフェニルアミノ)-４-(４-フルオロフェニル)チアゾール、
３-(３,４-ジクロロフェニル)-５-[４-[２-[(２-ピリジル)アミノ]チアゾリル]]-イソキサゾール、
３-(３,４-ジクロロフェニル)-５-[４-[２-(３-ピリジル)アミノ]チアゾリル]-イソキサゾール、
特表２００２−５３１５０３に記載された化合物である、
１,４-ビス(２-フェニルアミノ-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,４-ビス(２-フェニルアミノ-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１-[２-フェニル-４-(５-ブロモ)チアゾリル]-４-[２-フェニル-４-チアゾリル]ベンゼン、
１-[２-フェニル-４-(５-ブロモ)チアゾリル]-４-[２-フェニル-４-チアゾリル]ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,４-ビス(２-フェニル)-(４-(５-ブロモ)チアゾリルベンゼン、
１,４-ビス(２-フェニル)-(４-(５-ブロモ)チアゾリルベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,４-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,４-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンビストリフルオロ酢酸塩、
１-[(２-(３-ピリジルアミノ)-４-(５-ブロモ)チアゾリル)]-４-[２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル] ベンゼン、
１-[(２-(３-ピリジルアミノ)-４-(５-ブロモ)チアゾリル)]-４-[２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル] ベンゼンビストリフルオロ酢酸塩、
１,３-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,３-ビス(２-(３-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,４-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,４-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
１,３-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼン、
１,３-ビス(２-(２-ピリジルアミノ)-４-チアゾリル)ベンゼンジ臭化水素酸塩、
４,４'-ジ(２,２-フェニルアミノチアゾリル)、
４,４'-ジ(２,２-フェニルアミノチアゾリル)ジ臭化水素酸塩、
４,４'-ジ(２-(２-メトキシピリド-５-イルアミノ)チアゾリル)、
４,４'-ジ(２-(２-メトキシピリド-５-イルアミノ)チアゾリル)ビストリフルオロ酢酸塩、
４,４'-ジ(２-(２-ピリジル)アミノチアゾリル)、
４,４'-ジ(２-(２-ピリジル)アミノチアゾリル)ビストリフルオロ酢酸塩、
特表２００２−５３１５０４に記載された化合物である、
ビス[２-(４-フェニル-５-メチル)チアゾリル]アミン、
ビス[２-(４-フェニル-５-メチル)チアゾリル]アミン臭化水素酸塩、
ビス[２-(４-(２-ピリジル)チアゾリル]アミン、
ビス[２-(４-(２-ピリジル)チアゾリル]アミンジ臭化水素酸塩、
ビス[２-[４-(３-ピリジル)チアゾリル)アミン、
ビス[２-[４-(３-ピリジル)チアゾリル)アミンビストリフルオロ酢酸塩、
Ｎ,Ｎ-ビス(５(３,４-ジクロロフェニル)-２-チアゾリル)アミン、
Ｎ,Ｎ-ビス(５(３,４-ジクロロフェニル)-２-チアゾリル)アミンジ臭化水素酸塩、
１,３-ビス[４-(３-ピリジル)-２-チアゾリルアミノ]ベンゼン、
１,３-ビス[４-(３-ピリジル)-２-チアゾリルアミノ]ベンゼンジ臭化水素酸塩、
及びダサチニブが挙げられる。
【００５２】
本発明に係る化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容される塩は、経口投与又は点滴注入などの非経口投与のための従来の薬学製剤の形態で、医薬、特に抗腫瘍剤として用いることができる。
【００５３】
経口投与のための製剤は、錠剤、顆粒、粉末、カプセルなどの固形剤、及びシロップなどの液体製剤を含む。これらの製剤は従来の方法によって調製することができる。固形剤は、ラクトース、コーンスターチなどのデンプン、微結晶性セルロースなどの結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムなどのような従来の薬学的担体を用いることによって調製することができる。カプセルは、このように調製した顆粒又は粉末をカプセルに包むことによって調製することができる。シロップは、ショ糖、カルボキシメチルセルロースなどを含む水溶液中で、本発明に係る化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容される塩を溶解又は懸濁することによって調製することができる。
【００５４】
非経口投与のための製剤は、点滴注入などの注入物を含む。注入製剤もまた従来の方法によって調製することができ、等張化剤（例えば、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビトール、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース）、安定化剤（例えば、亜硫酸ナトリウム、アルブミン）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、ｐ−オキシ安息香酸メチル）中に適宜組み入れることができる。
【００５５】
本発明に係る化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容される塩は、医薬、特に腫瘍の治療のために効果的である。腫瘍としては、乳がん、大腸がん、肺がんなどの固形腫瘍や、白血病、リンパ腫、骨髄腫などの血液がんなど、幅広いがん種への抑制効果が挙げられる。
【００５６】
本発明に係る化合物（Ｉ）又はその薬学的に許容される塩の用量は、疾患の重症度、患者の年齢及び体重、投薬形態などに従って変化させることができるが、通常は成人において１日あたり１ｍｇ〜１，０００ｍｇの範囲であり、それは経口経路又は非経口経路によって、１回、又は２回もしくは３回に分割して投与することができる。
【００５７】
本発明の薬剤組成物中、Ｃｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤の割合は、１：３００〜１０：１、好ましくは１：１００〜３：１、より好ましくは１：３０〜１．２：１である。
【実施例】
【００５８】
Ｃｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤（Ｗｅｅ１阻害剤）との相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤とＭ期促進剤の相乗的効果を調べるためＷｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５をＣｄｃ７阻害剤（化合物Ｉ−Ｄ又は化合物Ｉ−Ｅ）と共投与した。【００５９】
本発明者は先にパクリタキセルの共投与によりＣｏｌｏ２０５に対する特定のＣｄｃ７阻害剤の細胞毒性が減少したことを実証しており、パクリタキセルのようなＧ２／Ｍ期の阻害を引き起こす化合物ではＣｄｃ７阻害剤である特定のＣｄｃ７阻害剤との良好な併合薬はできないことを確認した。そこでＷｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５とＣｄｃ７阻害剤の組み合わせによってＣｏｌｏ２０５の生存性に影響があるかどうかを研究した。【００６０】
培養細胞
ＣＯＬＯ２０５（ＲＣＢ２１２７、ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ）は１０ｃｍディッシュで１０％ＦＣＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−ｂｉｏ）５％ペニシリンストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  １５１４０）添加ＲＰＭＩ−１６４０メディウム（ＳＩＧＭＡ  Ｒ８７５８）を用いて培養した。良く増殖している状態（７０−９０％コンフルエント）の細胞からメディウムを除き、トリプシン（ＴｒｙｐＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，  ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで処理して細胞をディッシュからはがし、同じメディウムで回収した。【００６１】
Ｐａｎｃ−１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４６９）は１０ｃｍディッシュで１０％ＦＣＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−ｂｉｏ）５％ペニシリンストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  １５１４０）添加  Ｄ−ＭＥＭメディウム（Ｓｉｇｍａ  Ｄ５７９６）を用いて培養した。良く増殖している状態（７０−９０％コンフルエント）の細胞からメディウムを除き、トリプシン（ＴｒｙｐＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，  ＧＩＢＣＯ社製）２ｍＬで処理して細胞をディッシュからはがし、同じメディウムで回収した。【００６２】
また、ＮＨＤＦ細胞（Ｃｒｙｏ  ＮＨＤＦ−ＮｅｏＣＣ−２５０９、三光純薬社製）を１０ｃｍ  ディッシュ中でメディウム（ブレットキットＦＧＭ２、ＣＬＣＣ−３１３２）で培養した。良く増殖している状態（７０−９０％コンフルエント）のＮＨＤＦ細胞からメディウムを除き、継代試薬セット（ＣＬＣＣ−５０３４、三光純薬社製）中のＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液５ｍＬで細胞を洗浄した。【００６３】
ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩液を除いた後セットの中に含まれているトリプシン／ＥＤＴＡ液３ｍＬでディッシュ全体を覆った。手でディッシュの側面を軽くたたき少し衝撃を加え細胞を剥離させたあと、セットの中のトリプシン中和液３ｍＬを加えて細胞を回収した。【００６４】
培養細胞への化合物の添加
回収した各細胞を６ウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号  ３５３０４６）に１ウェル  １ｍｌあたり２．５ｘ１０５細胞となるように蒔いた。５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。翌日、メディウム５００μｌに添加したい化合物の１，０００倍濃度のストック溶液を１．５μｌ添加したものを各ウェルに加え、最終濃度が１μＭの条件下でさらに４８〜７２時間培養を行った。【００６５】
細胞周期への影響の検討
細胞を４８〜７２時間化合物と反応後、細胞をトリプシン（ＴｒｙｐＬ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＧＩＢＣＯ社製）で処理しウェルからはがし、ＤＰＢＳで洗った後、１ｍｌの冷エタノールを添加、染色まで−３０度で保存した。細胞は染色前に一度ＤＰＢＳで洗い、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で遮光し室温で３０分以上静置した。ＰＩ染色を行った細胞はＦＡＣＳを用いて細胞周期及びＳｕｂＧ１で表される細胞死の割合の検討を行った。
まず、リン酸化されたヒストンＨ３のアップレギュレーションに対するＭＫ−１７７５の濃度を調べ、次いでＭ期促進を引き起こす濃度範囲でＣｄｃ７阻害剤の添加に加えてＭＫ−１７７５を大腸がん細胞であるＣｏｌｏ２０５細胞の培養物に添加した。【００６６】
ＢＬＩＳＳスコアを用いた薬剤併用における相乗効果の評価
ＢＬＩＳＳスコアは、薬剤併用における相乗効果の評価によく用いられる基準の一つである(Ｂｏｒｉｓｙら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１００(１３)：７９７７−７９８２（２００３）、Ｂｕｃｋら  Ｍｏｌ.Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．５(１１)（２００６）)。このＢＬＩＳＳスコアを用いて、Ｃｄｃ７阻害剤とＷｅｅ１阻害剤のがん細胞に対する増殖阻害に対する併用効果を解析した。
【００６７】
実施例１ Ｃｄｃ７阻害剤としての化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）とＭ期促進剤としてのＷｅｅ１阻害剤との組み合わせによる相互作用
具体的には、Ｃｏｌｏ２０５細胞について、化合物（Ｉ−Ｄ）の０．１μＭに対して、ＤＭＳＯ（対照）、Ｗｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５の０．２５μＭ、０．５μＭ、及び０．７５μＭをそれぞれ共投与して細胞死を起こした細胞数を調べた。化合物（Ｉ−Ｅ）の０．１μＭに対しても、ＤＭＳＯ（対照）、ＭＫ−１７７５の各濃度をそれぞれ共投与して細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図１に示す。【００６８】
化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）により誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤の共投与により相乗的に増加することがわかった。【００６９】
ＭＫ−１７７５は０．１〜１μＭの濃度範囲でＭ期にある細胞の割合を効率的に増大させた。実際、ＭＫ−１７７５と化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）の組み合わせで処理された細胞中、死滅した細胞の割合が相乗的に増大したことが観察された。【００７０】
実施例２ 化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５（Ｗｅｅ１阻害剤）の相互作用のがん細胞選択性
化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５（Ｗｅｅ１阻害剤）の相乗効果が正常な細胞でも観察されるかどうかを調べるために、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）細胞を当該組み合わせ剤で処理して調べた。【００７１】
ＮＨＤＦ細胞を化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と様々な濃度のＭＫ−１７７５の組み合わせで処理した。【００７２】
具体的には、ＮＨＤＦ細胞について、化合物（Ｉ−Ｄ）の０．１μＭに対して、ＤＭＳＯ（対照）、ＭＫ−１７７５の０．２５μＭ、０．５μＭ、及び０．７５μＭをそれぞれ共投与して細胞死を起こした細胞数を調べた。化合物（Ｉ−Ｅ）の０．１μＭに対しても、ＤＭＳＯ（対照）、ＭＫ−１７７５の各濃度をそれぞれ共投与して細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図２に示す。【００７３】
化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）を０．１μＭの濃度で調べたところ、Ｗｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５を添加しても正常細胞であるＮＨＤＦ細胞に対する細胞毒性の増加は見られなかったことから、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５の組み合わせの効果はがん細胞に対して選択的であることがわかる。【００７４】
実施例３ Ｐａｎｃ−１細胞（膵がん細胞株）における、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５の相互作用
具体的には、膵がん細胞株であるＰａｎｃ−１細胞について、化合物（Ｉ−Ｄ）の０．１μＭに対して、ＤＭＳＯ（対照）、ＭＫ−１７７５の０．５μＭ、及び０．７５μＭをそれぞれ共投与して細胞死を起こした細胞数を調べた。化合物（Ｉ−Ｅ）の０．１μＭに対しても、ＤＭＳＯ（対照）、ＭＫ−１７７５の各濃度をそれぞれ共投与して細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図３に示す。Ｐａｎｃ−１細胞（膵がん細胞株）についても、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）により誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤の共投与により相乗的に増加することがわかった。【００７５】
実施例４ 化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５の配合薬剤内の組成による効果の変動
化合物（Ｉ−Ｅ）とＭＫ−１７７５の配合薬剤内の組成（μＭでの比）を、０．０１：１．０、０．０３：０．１、及び０．３：０．１のように、１：１００〜３：１の範囲で変えて共投与し、Ｃｏｌｏ２０５細胞の細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図４に示す。化合物（Ｉ−Ｅ）：ＭＫ−１７７５＝１：１００〜３：１の範囲で、化合物（Ｉ−Ｅ）により誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤の共投与により十分相乗的に増加することがわかった。【００７６】
実施例５ 化合物（Ｉ−Ａ）とＭＫ−１７７５との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ａ）を用いた以外は、実施例１と同様に、ＭＫ−１７７５と共投与してＣｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図５に示す。他のＣｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ａ）を用いても、誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤としてのＭＫ−１７７５の共投与により相乗的に増加することがわかった。【００７７】
実施例６ 化合物（Ｉ−Ｂ）とＭＫ−１７７５との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｂ）を用い、化合物（Ｉ−Ｂ）の濃度を０．３μＭとした以外は、実施例１と同様に、ＭＫ−１７７５と共投与してＣｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図６に示す。他のＣｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｂ）を用いても、誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤としてのＭＫ−１７７５の共投与により相乗的に増加することがわかった。【００７８】
実施例７ 化合物（Ｉ−Ｃ）とＭＫ−１７７５との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｃ）を用い、化合物（Ｉ−Ｃ）の濃度を０．１μＭ又は０．３μＭとした以外は、実施例１と同様に、ＭＫ−１７７５と共投与してＣｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図７に示す。化合物（Ｉ−Ｃ）を用いても、誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤としてのＭＫ−１７７５の共投与により相乗的に増加することがわかった。【００７９】
実施例８ 化合物（Ｉ−Ｆ）又は化合物（Ｉ−Ｇ）とＭＫ−１７７５との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｆ）又は化合物（Ｉ−Ｇ）を用い、その濃度を０．１μＭ又は０．３μＭとし、ＭＫ−１７７５の濃度を０．５μＭとした以外は、実施例１と同様に、ＭＫ−１７７５と共投与してＣｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図８に示す。化合物（Ｉ−Ｆ）又は化合物（Ｉ−Ｇ）を用いても、誘導される細胞死は、Ｗｅｅ１阻害剤としてのＭＫ−１７７５の共投与により相乗的に増加することがわかった。ここで、上述のように、化合物（Ｉ−Ｇ）は特表２００９−５３１３７３、国際公開第２００７／１１０３４４号明細書に記載の化合物Ｆ２６であり、化合物（Ｉ−Ｆ）はメルク社、カタログ番号：２１７７０７−５ＭＧＣＮのＣｄｃ７／Ｃｄｋ９阻害剤である。【００８０】
実施例９ 化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と他のＭ期促進剤との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）を用い、その濃度を０．３μＭ又は０．１μＭとし、Ｍ期促進剤としてＷｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５の代わりに、Ｃｈｋ１阻害剤であるＳＣＨ９００７７６を用い、その濃度を３．３μＭとした以外は、実施例１と同様に、両者を組み合わせて共投与して、Ｃｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図９に示す。他のＭ期促進剤としてＳＣＨ９００７７６（ＳＣＨ）を用いても、誘導される細胞死は、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）との共投与により相乗的に増加することがわかった。【００８１】
実施例１０ 化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と他のＭ期促進剤との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）を用い、その濃度を０．１μＭ、０．０３μＭ又は０．３μＭとし、Ｍ期促進剤としてＷｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５の代わりに、Ｃｈｋ１阻害剤であるＵＣＮ−０１を用い、その濃度を３３３ｎＭとした以外は、実施例１と同様に、両者を組み合わせて共投与して、Ｃｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図１０に示す。他のＭ期促進剤としてＵＣＮ−０１を用いても、誘導される細胞死は、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）との共投与により相乗的に増加することがわかった。【００８２】
実施例１１ 化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と他のＭ期促進剤との組み合わせによる相互作用
Ｃｄｃ７阻害剤として化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）を用い、その濃度を０．１μＭ、０．０３μＭ又は０．３μＭとし、Ｍ期促進剤としてＷｅｅ１阻害剤であるＭＫ−１７７５の代わりに、Ｈｓｐ９０阻害剤であるゲルダナマイシンを用い、その濃度を１０ｎＭ又は３３ｎＭとした以外は、実施例１と同様に、両者を組み合わせて共投与して、Ｃｏｌｏ２０５細胞について細胞死を起こした細胞数を調べた。結果を図１１に示す。他のＭ期促進剤としてゲルダナマイシンを用いても、誘導される細胞死は、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）との共投与により相乗的に増加することがわかった。【００８３】
実施例１２ ＢＬＩＳＳスコアを用いた、化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と、Ｍ期促進剤としてのＷｅｅ１阻害剤との組合せによる相互作用の評価
ＢＬＩＳＳスコアを用いて、Ｃｄｃ７阻害剤とＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）のがん細胞に対する増殖阻害に対する併用効果を解析した。【００８４】
（使用する細胞の培養）
ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ社Ｎｏ．ＨＴＢ−２６）は、Ｔ７５フラスコ中、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ社）および５％ペニシリンストレプトマイシン（ナカライ社）を添加したＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃１１４１５−０６４）（以下、増殖培地）を用いて３７℃インキュベーター内で培養した（ＣＯ２なし）。【００８５】
（細胞懸濁液のプレートへの播種）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を細胞密度０．０３５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように、新鮮な増殖培地に再懸濁したのち、細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、＃３５３０７５）の各ウェルに１００μＬずつ添加し、３７℃のインキュベーター内において１晩培養した（１ウェル当たり３，５００個の細胞）。播種の約２４時間後、培地を除去し、新しい増殖培地を８０μＬ添加した。【００８６】
（被験化合物の添加）
第1試験化合物であるＣｄｃ７阻害剤（化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）の１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液を、１０濃度（１０ｍＭ、５ｍＭ、２．５ｍＭ、１．２５ｍＭ、０．６２５ｍＭ、０．３１３ｍＭ、０．１５６ｍＭ、０．０７８１ｍＭ、０．０３９１ｍＭ、０．０１９５ｍＭ）にＤＭＳＯで希釈し、それぞれの溶液を増殖培地で更に１００倍希釈して、上記プレートの各ウェルに１０μＬ添加した（１０００倍希釈となり、最終投与濃度の範囲は１９．５〜１００００ｎＭ）。第２試験化合物のＷｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液を、８濃度（１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１２５ｍＭ、０．０６２５ｍＭ、０．０３１３ｍＭ、０．０１５６ｍＭ、０．００７８１ｍＭ）にＤＭＳＯで希釈し、それぞれの溶液を更に増殖培地で１００倍希釈して、上記プレートの各ウェルに１０μＬ添加した（１０００倍希釈となり、最終投与濃度の範囲は７．８１〜１０００ｎＭ）。またＤＭＳＯを増殖培地で１００倍希釈し、上記プレートに２０μＬ添加したものをコントロールウェルとした。【００８７】
（細胞増殖抑制効果の測定）
化合物の添加後、７２時間インキュベートしたのち、マイルドホルム（Ｒ）１０Ｎ（和光純薬、＃１３３−１０３１１）を１００μＬずつ各ウェルに添加して室温で４５分インキュベートし、細胞を固定した。各ウェルを１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、２μＭになるようにＰＢＳで希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、＃Ｈ３５７０）を１００μＬずつ各ウェルに添加して室温で３０分インキュベートし、核を染色した。１００μＬのＰＢＳで３回洗浄後、細胞イメージアナライザー（ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ  ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて核の数（細胞数）を測定した（Ｅｘ／Ｅｍ＝３５０／４６１ｎｍ）。【００８８】
（細胞増殖阻害効果の算出）
７２時間後のコントロールウェルの平均値を非処理対照細胞数（Ｇｕｎｔ７２）とし、化合物処理したウェルの平均値を化合物処理細胞数（Ｇ７２）とした。また、細胞播種の２４時間後に培地交換しただけのウェルを初期値としてカウントし、初期細胞数（Ｇ０）とした。【００８９】
各ウェルの細胞増殖率は次の計算式で算出した。
細胞増殖率Ｇ＝（（Ｇ７２−Ｇ０）／（Ｇｕｎｔ７２−Ｇ０）
また各ウェルの細胞増殖のパーセント阻害率は、以下の式で計算し、結果を図１２および図１３に示した。
細胞増殖阻害率ＧＩ（％）＝１００×（１−Ｇ）【００９０】
（ＢＬＩＳＳスコアによる評価）
各ウェルの理論的なＢＬＩＳＳｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ（ＢＬＩＳＳｉｎ）は、第1試験化合物および第２試験化合物が各々単剤として作用したと考えたとき（つまり、どちらか一方の化合物濃度が０のときの細胞増殖率）、以下の式から算出できる。
ＢＬＩＳＳｉｎ＝Ｇ（第1試験化合物）×Ｇ（第２試験化合物）【００９１】
各ウェルにおけるＢＬＩＳＳスコアは、理論値のＢＬＩＳＳｉｎと細胞増殖率実測値の差から求めることができる。ＢＬＩＳＳスコアが正の数であれば、相乗効果があると考えられる。
ＢＬＩＳＳスコア＝１００×（ＢＬＩＳＳｉｎ−Ｇ）
本試験の結果を図１４および１５に示す。【００９２】
以上の結果から、Ｃｄｃ７阻害剤である化合物（Ｉ−Ｄ）又は化合物（Ｉ−Ｅ）と、Ｗｅｅ１阻害剤（ＭＫ−１７７５）の併用により、がん細胞の増殖を相乗的に抑制することを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、Ｃｄｃ７阻害剤又はＭ期促進剤のそれぞれを単独に使用した場合に比べて、幅広いがん細胞に対してより高い選択性・特異性をもって、より高い効率で細胞死をもたらす抗がん剤組成物を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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