(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩及びボルネオールを含む筋萎縮性側索硬化症の治療用の組成物。
【請求項２】
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとの重量比は１０：１〜１：１０であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとの重量比は４：１〜１：１であることを特徴とする請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとの重量比は４：１であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
筋萎縮性側索硬化症の発症時間及び生存時間を改善するための組成物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
筋萎縮性側索硬化症の記憶機能障害を改善するための組成物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとのモル比は３．５：１〜２：１であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとのモル比は３．５：１であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記のボルネオールは天然ボルネオールであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
さらに、薬学的に許容される賦形剤を含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
天然ボルネオールと併用される、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩を含む筋萎縮性側索硬化症治療用薬物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１５年６月１０日に中国特許庁に提出した、出願番号が２０１５１０３１４５８４．４であり、発明名称が「筋萎縮性側索硬化症治療薬物の調製における組成物の応用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全部の内容を引用により本出願に援用する。
【０００２】
本発明は製薬分野に属し、具体的には、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとの組成物の、筋萎縮性側索硬化症及び関連障害の治療における応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
運動ニューロン疾患は、病因がまだ不明であり、主に大脳皮質、脳幹及び脊髄運動ニューロンに影響する神経系変性疾患であり、筋萎縮性側索硬化（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、進行性筋萎縮、進行性球麻痺及び原発性側索硬化を含む。中で、ＡＬＳは、運動ニューロン疾患における最も一般的なタイプである。ＡＬＳ発症年齢は、５０〜６０歳の間であり、発症率は２／１０００００であり、選択的な上、下運動ニューロンの死亡ということを特徴とし、進行性筋肉萎縮、無力及び硬直に繋がる。ＡＬＳの発症から死亡までの生存期間中央値が３９ヶ月であり、一般に、ほとんどの患者は呼吸不全のために３〜５年で死亡する。約５〜１０％は家族性ＡＬＳであり、一般的に常染色体優性遺伝であり、９０〜９５％のＡＬＳ症例は散発性ＡＬＳである（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００１；２：８０６−８１９；Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００４；２７：７２３−７４９）。
【０００４】
家族性ＡＬＳの約２０％は、Ｃｕ  ／  Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子突然変異によって引き起こされる。散発性および家族性ＡＬＳの臨床症状は類似しているので、家族性ＡＬＳの潜在的機序を解明することは、２つの形態のＡＬＳの研究に有益である。したがって、ヒト突然変異ＳＯＤ１を有するトランスジェニックマウスによって、家族性ＡＬＳ病理研究の分野が展開された（Ｎｅｕｒｏｎ  ２００６；５２：３９−５９）。最近の研究では、散発性ＡＬＳおよび家族性ＡＬＳ患者の脊髄組織はいずれも異常なＳＯＤ１タンパク質が存在していることが判明され、ＳＯＤ１が２つの形態のＡＬＳ疾患のいずれにも有用である可能性が示唆された（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００４；２７：７２３−７４９）。また、家族性ＡＬＳ常染色体にＲＮＡ代謝タンパク質ＴＤＰ−４３遺伝子突然変異が存在していることが最新発見され、同時に、散発性ＡＬＳ患者の大部分にも、ＴＤＰ−４３タンパク質の病理学的変化が存在し、これは、ＴＤＰ−４３が散発性および家族性ＡＬＳを理解する上で非常に重要な意義がある可能性が示唆されている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００７；１０４：１２５２４−１２５２９）。ＡＬＳの発症機序は複雑であり、現在の生物学的仮説には、酸化的損傷、細胞内凝集体の蓄積、ミトコンドリア機能障害、軸索輸送の欠如、成長因子の欠乏、グリア細胞病理、およびグルタミン酸興奮毒性が含まれる（Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００９Ｊａｎ；６５Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３−９）。
【０００５】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（エダラボン，ｅｄａｒａｖｏｎｅ）は、新しい強力なラジカル消去剤であり，ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、一酸化窒素ラジカル（ＮＯ・）、ペルオキシ亜硝酸イオン（ＯＮＯＯ−）（Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２００４，５２（２）：１８６−９１；Ｒｅｄｏｘ  Ｒｅｐ．２００２，７（４）：２１９−２２；Ｊ  ＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ．２００７，３２２（１）：２７４−８１）を消去でき、細胞の過酸化損傷を阻害し，効果的なニューロン保護剤（ラジカル消去剤）として、分布が広く、半減期が短く、安全で、毒性が低いというメリットがあり、臨床虚血性脳卒中の効果的な第一選択治療薬物である（中国急性虚血性脳卒中の診断と治療のガイドライン（２０１０版））。エダラボンは、例えばアミロイドβタンパク質（Ａβ）を側脳室注射する動物モデルおよびストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を側脳室注射する動物モデルなどの神経変性疾患の動物モデルに対してより優れた神経保護作用を有する（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１４；２０１４：３７０３６８；Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．２０１３，３８：１３６−４５）。また、エダラボンは、突然変異ＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＡＬＳ症状進行およびニューロン退化を遅らせることができる（Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００８，２１３（２）：４４８−５５）。特許ＷＯ２００５／０７５４３４には、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンの筋萎縮性側索硬化症の治療に関する応用が開示されている。しかし、ある臨床第ＩＩＩ相試験では、プラセボ群と比較して、エダラボン群の改訂版筋萎縮性側索硬化症の機能評価スケール（ＡＬＳＦＲＳ−Ｒ）のスコアの低下が小さく、有意差がないことが示され、臨床試験の研究結果が主要エンドポイントに達していない（ＮＣＴ００３３０６８１；Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ  Ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｄｅｇｅｎｅｒ．２０１４Ｄｅｃ；１５（７−８）：６１０−７）。別の臨床第ＩＩＩ相実験（ＮＣＴ０１４９２６８６）は進行中が、まだ募集していない。
【０００６】
ボルネオールは合成ボルネオールと天然ボルネオールに分けられる。合成ボルネオールにはイソボルネオールが含まれているが，天然ボルネオールにはイソボルネオールが含まれていない。天然ボルネオールは２−ボルネオールとも呼ばれる。研究により、ボルネオールは、腸管吸収の改善（ＡＡＰＳ  ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．２０１１Ｄｅｃ；１２（４）：１０４４−９）、血脳関門（Ｊ  Ａｓｉａｎ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ．２０１４，１６（６）：６４８−５７；Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１５，１６２：２７０−７）及び角膜透過性（Ｐｈａｒｍａｚｉｅ．２００６，６１（９）：７８３−８）、神経保護作用（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０１１，１７６：４０８−１９；Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４，７４０：５２２−３１）、抗炎症（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．２０１４，３７（４）：１１４８−５７）、抗酸化及びＤＮＡ損傷の保護（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２０１４，６２（２８）：６６３２−９）；ＧＡＢＡ受容体機能の増強（ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒｍａｃｏｌ．２００５，６９（７）：１１０１−１１）に有用である以外、ラットの凝血機能、抗血栓活性を改善できる（Ａｍ  Ｊ  Ｃｈｉｎ  Ｍｅｄ．２００８；３６（４）：７１９−２７）ことが示されている。
【０００７】
３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンと天然ボルネオールとの質量比が４：１である組成物は、既に虚血性脳卒中の治療のために中国で臨床第ＩＩＩ相試験が実施されている。臨床前動物実験では、両者の質量比が４：１〜１：１の組成物が相乗的に脳梗塞面積を減少させることができ（特許ＣＮ  １０１８４８７１１Ｂ）、両者の質量比が４：１〜２：１の組成物が相乗的に敗血症動物の死亡率を減少させることができる（特許２０１３１０４７４２５３．８  ）ことが示されている。
【０００８】
従来技術によれば、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンとボルネオールとの組成物が筋萎縮性側索硬化症および関連障害に対して治療作用を有するかどうかは予期できず、  既存の質量比が４：１の３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンとボルネオールとの組成物が相乗作用を発生するかどうかも判断できない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩及びボルネオールを含む組成物の萎縮性側索硬化症及び関連障害の治療用薬物の調製における応用を提供する。
【００１０】
本発明の別の目的は、必要とする患者に３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩及びボルネオールを含む薬物組成物を投与する、萎縮性側索硬化症及び関連障害の治療方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩及びボルネオールを含む、萎縮性側索硬化症及び関連障害の治療用薬物組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩の、天然ボルネオールとの併用による筋萎縮性側索硬化症の治療用薬物の調製における応用を提供する。
【００１３】
さらに、前記薬物組成物において、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとの配合使用は萎縮性側索硬化症を治療する薬効を相乗的に増加できる。
【００１４】
本発明の一実施態様において，前記薬物組成物はＡＬＳの発症時間及び生存時間を改善することができる。
【００１５】
本発明の別の実施態様において，前記薬物組成物はＡＬＳの運動機能を改善することができる。
【００１６】
本発明のさらに別の実施態様において、前記薬物組成物はＡＬＳの記憶機能障害を改善することができる。
【００１７】
本発明に記載の組成物において、３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとの重量比は１０：１〜１：１０であり、好ましくは４：１〜１：１であり、さらに好ましくは４：１〜２：１であり、より好ましくは４：１である。
【００１８】
本発明に記載の組成物において，３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン又はその薬学的に許容される塩とボルネオールとのモル比は９：１〜１：９であり、好ましくは４：１〜１：１であり、さらに好ましくは３．５：１〜２：１であり、より好ましくは３．５：１である。
【００１９】
本発明に記載のボルネオールは天然ボルネオールであることが好ましく、前記天然ボルネオールは２−ボルネオールとも呼ばれる。
【００２０】
本発明に記載の薬物組成物は、さらに薬学的に許容される賦形剤が含まれても良い。
【００２１】
賦形剤は、一般的に薬物治療のための活性薬物成分（「ＡＰＩ」）と共に配合される薬理学的に不活性な物質である。剤形を製造する際に、常に、賦形剤を用いて、有効活性成分を含有する製剤を増量して（従って、「増量剤」、「充填剤」または「希釈剤」とも呼ばれる）、原薬を簡便で正確に分配できるようにする。さらに、例えば薬物吸収または溶解の促進又は他の薬力学的考慮のような異なる治療増強目的に用いられてもよい。
【００２２】
より具体的には、本発明の組成物は、単独で、または薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて医薬組成物に製剤化することができ、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射液、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェアおよびエアロゾル剤などの固体、半固体、液体または気体形態の製剤に製剤化することができる。したがって、化合物の投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、関節内などの様々な方法で達成することができる。活性剤は、投与後に全身性であってもよく、或いは局部投与、壁内投与であってもよく、又は移植部位に活性剤量を保持できる移植物を用いて局在化させても良い。具体的実施態様において、製剤は経口製剤である。
【００２３】
本発明で使用される併用療法は、いずれかの単剤療法の従来の投薬の効能を超える効能を含む顕著な効能を達成しつつ、それぞれの単剤療法の用量を、標準的な実施において現在用いられているものよりもより低くすることができる。当業者にとって、用量は、特定の化合物、症状の重篤度、及び被験者の副作用に対する感受性に伴って変化し得ることは容易に理解できる。いくつかの特定の化合物は他の化合物よりもより効能が高い。指定の化合物の好ましい用量は、当業者により、様々な手段によって容易に決定できる。好ましい手段としては、指定の化合物の生理学的効能を測定することである。併用療法を用いることによって、いずれかの単剤療法の従来の投薬によって達成される効能よりもより大きな効能を含む顕著な効能を達成しつつ、それぞれの単剤療法の用量を、標準的な実施において現在用いられているものよりもより低くすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は実施例１の各群のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス運動機能に対する影響を示す。
【図２】図２は実施例２の各群のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスが暗室に入る潜伏期間に対する影響を示す。
【図３】図３は実施例２の各群のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの暗所回避回数に対する影響を示す。
【図４】図４は実施例３の各群のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス体重に対する影響を示す。
【図５】図５は実施例３の各群のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス運動機能スコアに対する影響を示す。
【図６】図６は実施例３の各群のＳＯＤ１−Ｇ９３Ａロータロッド実験におけるロッドからの落下するまでの時間に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下の実施例は例を挙げて本発明を説明しただけのものであり、本発明を限定するものではない。実施例で述べたエダラボンは３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンであり、ボルネオールは天然ボルネオール、即ち２−ボルネオールであり、組成物は３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オンと天然ボルネオールとの組成物である。  
【実施例】
【００２６】
実施例１：エダラボンとボルネオールとの組成物の、筋萎縮性側索硬化症遺伝子改変マウスに対する治療作用の研究
１材料と方法
１．１  試験動物
ヒト銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）（Ｇ９３Ａ突然変異体）を持つ遺伝子改変マウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）及び野生型Ｂ６ＳＪＬ  Ｆ１マウスは南京大学から購入された。マウスの保存及び繁殖方法は、一匹の野生型雌マウスを一匹の遺伝子改変雄マウスと交配させ、その子世代の若いマウスの尻尾から抽出されたＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により同定した。
【００２７】
１．２  薬品と試薬
エダラボンとボルネオールとの組成物であり、質量比が４：１である（前記ボルネオールは２−ボルネオールである）；
エダラボン（化学名：３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）；
ボルネオール（化学名：２−ボルネオール）。
【００２８】
１．３  試験方法
１．３．１  Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒマウスの繁殖、スクリーニング：
Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ雄マウス５匹について、日齢６０日の時からＢ６ＳＪＬＦ１健常雌マウスと、１匹の雄対３匹の雌で交配し始めた。子世代のマウスについて、尻尾をカットしてＤＮＡを抽出し（キットの要求に従い）、ＳＯＤ１プライマーである５′−ＣＡＴＣＡＧＣＣＣＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡ−３′及び５′−ＣＧＣＧＡＣＴＡＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＡ−３′を加えて３０サイクルのＰＣＲにより増幅させ、２００〜３００ｂｐの間のＳＯＤ１遺伝子バンドを確定した。ＳＯＤ１突然変異遺伝子のないマウスを淘汰した。
【００２９】
１．３．２  行動学的測定：
文献に記載の方法により、マウスをロータロッドデバイス（６０Ｈｚ／ｍｉｎ，Φ９０ｍｍ）に置き、マウスをロータロッドに置いてから落下するまでの時間を記録した。各マウスを各時点で３回測定し、マウスがロータロッドに滞留する時間が最も長い１回を取ってマウスの運動機能を示し、時間が１８０ｓよりも長いと測定を停止し、１８０ｓで計算した。ＳＯＤ１遺伝子突然変異マウスを日齢６０日からロータロッドデバイスで運動機能を測定した。以後、死亡まで、１０日間ごとに１回観察測定した。
【００３０】
１．３．３  治療過程
１．３．３．１  実験用量設定及びグループ分け：
文献に記載のエダラボン（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス１５ｍｇ／ｋｇ，ＳＯＤ１−Ｈ４６Ｒラット３−６ｍｇ／ｋｇ）及びその脳虚血動物モデルにおける有効用量（ＳＤラット６ｍｇ／ｋｇ）の換算によれば、エダラボンの用量は１２ｍｇ／ｋｇに設定され、エダラボンとボルネオールとの組成物が１５ｍｇ／ｋｇ（エダラボンの用量が１２ｍｇ／ｋｇ、ボルネオールが３ｍｇ／ｋｇ）に設定され、ボルネオールが３ｍｇ／ｋｇに設定された。
【００３１】
ＳＯＤ１遺伝子突然変異マウスは日齢７０日の時に運動機能の様子によって、マウスをランダムに４群に分けた。それぞれ、ＳＯＤ１遺伝子突然変異対照群、エダラボンとボルネオールとの組成物１５ｍｇ／ｋｇ治療群、エダラボン１２ｍｇ／ｋｇ治療群、ボルネオール３ｍｇ／ｋｇ治療群とし、また、ＳＯＤ１突然変異遺伝子を有さないＢ６ＳＪＬ健常マウス対照群を設定した。各群は１群当たり１４匹であり、雌雄は半分ずつである。
【００３２】
１．３．３．２  投与実験：
グループ分けた日から、各群の動物に、１日１回で、死亡まで腹腔内注射投与した。健常対照及びＳＯＤ１遺伝子突然変異対照群動物に同体積の生理食塩水を与えた。
【００３３】
１．３．４  発症時間及び生存時間：
マウスはロータロッド上に滞留する時間がその前回の測定時間より３０％以上低下した場合、筋力低下と確定した。該運動機能の変化及びマウスの前肢振戦の有無によってマウスの発症時間を確定した。マウスが滑らかな平面に３０ｓ仰臥して立ち直り反射をすることができない場合、又は単眼、両眼に重大な感染が発生した場合、マウスが死亡すると確定して殺した。マウスの誕生から死亡までの時間は、マウスの生存時間とする。
【００３４】
１．４  統計処理：ＳＰＳＳ統計ソフトウェアを利用して分散分析を行った（多群比較）。
【００３５】
２  試験結果
２．１  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス生存時間に対する影響
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ対照群マウスは日齢約１１３ｄの時に発症し始め、平均生存時間は（１３８．４±４．６）日である。組成物群、エダラボン群はマウス７０日の時に投与し始め、マウス発症時間に影響がないが、マウスの生存時間を著しく延長することができ、組成物群の平均生存時間は（１５１．１±７．０）日であり、エダラボンは（１４４．６±３．７）日であり、ボルネオールの生存時間に対する影響はモデル群と比べて有意差がなく、（１４１．３±３．６）日である。組成物の生存時間はエダラボン及びボルネオール単剤より著しく長く、組成物の薬効か２つの単剤より著しく良好であることを示し、表１に示される。Ｂ６ＳＪＬ健常マウスは臨床症状がなく、生存時間が１年以上である。
【００３６】
金氏公式ｑ＝Ｅ（ａ＋ｂ）／（Ｅａ＋Ｅｂ−Ｅａ×Ｅｂ）によって組成物においてエダラボンとボルネオールとが相乗作用があるかどうかを評価した。式において、Ｅ（ａ＋ｂ）は併用薬物の有効率であり、Ｅａ、ＥｂはそれぞれＡ薬、Ｂ薬単独投与の有効率である。ｑ値は０．８５〜１．１５の範囲内であると、両薬併用の簡単な加算であり、ｑ値＞１．１５の時、増強を示し、ｑ値＜０．８５の時、両薬併用が拮抗作用を有することを示す。上記の式で計算したところ、ｑ＝１．３７であり、組成物の成分同士が相乗作用を有し、併用投与が単独投与より良好であることを示している。
【００３７】
【表１】
0006450887.tif 000002
【００３８】
２．２  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス運動機能に対する影響
図１から分かるように、組成物、エダラボンは全てＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの筋力低下を著しく軽減し、動物運動機能を改善することができ、１１０、１２０、１３０日齢の時にロータロッド時間に対する影響はモデル対照群と比べて、有意差がある（ｐ＜０．０５）；ボルネオールも病気の進行をある程度遅らせる傾向があるが、１３０日齢の時だけ、ロータロッド時間に対する影響はモデル群と比べて、有意差がある（ｐ＜０．０５）。そして、１１０、１２０、１３０日齢の時、組成物の作用は、エダラボン及びボルネオールより有意に良好である（ｐ＜０．０５）。
【００３９】
実施例２：エダラボンとボルネオールとの組成物の、筋萎縮性側索硬化遺伝子改変マウスの学習・記憶に対する影響
１  材料と方法
【００４０】
１．１  試験動物
ヒト銅／亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）（Ｇ９３Ａ突然変異体）を持つ遺伝子改変マウス（Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ［ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ］１Ｇｕｒ）及び野生型Ｂ６ＳＪＬ  Ｆ１マウスは南京大学から購入された。マウスの保存及び繁殖方法は、一匹の野生型雌マウスを一匹の遺伝子改変雄マウスと交配させ、その子世代の若いマウスの尻尾から抽出されたＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により同定した。
【００４１】
１．２  薬品と試薬
エダラボンとボルネオールとの組成物（前記ボルネオールは２−ボルネオールである）；
エダラボン（化学名：３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）；
ボルネオール（化学名：２−ボルネオール）。
【００４２】
１．３  試験方法
１．３．１  Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒマウスの繁殖、スクリーニング：
Ｂ６ＳＪＬ−ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ雄マウス５匹について、日齢６０日の時からＢ６ＳＪＬＦ１健常雌マウスと、１匹の雄対３匹の雌で交配し始めた。子世代のマウスについて、尻尾をカットしてＤＮＡを抽出し（キットの要求に従い）、ＳＯＤ１プライマーである５′−ＣＡＴＣＡＧＣＣＣＴＡＡＴＣＣＡＴＣＴＧＡ−３′及び５′−ＣＧＣＧＡＣＴＡＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＡ−３′を加えて３０サイクルのＰＣＲにより増幅させ、２００〜３００ｂｐの間のＳＯＤ１遺伝子バンドを確定した。ＳＯＤ１突然変異遺伝子のないマウスを淘汰した。
【００４３】
１．３．２  実験過程
１．３．２．１実験用量設定及グループ分け：
文献に記載のエダラボン（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス１５ｍｇ／ｋｇ，ＳＯＤ１−Ｈ４６Ｒラット３−６ｍｇ／ｋｇ）及びその脳虚血動物モデルにおける有効用量（ＳＤラット６ｍｇ／ｋｇ）の換算によれば、エダラボンの用量は１２ｍｇ／ｋｇに設定され、エダラボンとボルネオールとの組成物が１５ｍｇ／ｋｇ（エダラボンの用量が１２ｍｇ／ｋｇ、ボルネオールが３ｍｇ／ｋｇ）に設定され、ボルネオールが３ｍｇ／ｋｇに設定された。
【００４４】
ＳＯＤ１遺伝子突然変異マウスは日齢７０日の時に運動機能の様子によって、マウスをランダムに４群に分けた。それぞれ、ＳＯＤ１遺伝子突然変異対照群、エダラボンとボルネオールとの組成物１５ｍｇ／ｋｇ治療群、エダラボン１２ｍｇ／ｋｇ治療群、ボルネオール３ｍｇ／ｋｇ治療群とし、また、ＳＯＤ１突然変異遺伝子を有さないＢ６ＳＪＬ健常マウス対照群を設定した。各群は１群当たり１４匹であり、雌雄は半分ずつである。
【００４５】
１．３．２．２  実験投与：
グループ分けの日から、各群の動物に、１日１回で、行動学的検出が完成するまで腹腔内注射投与した。健常対照及びＳＯＤ１遺伝子突然変異対照群動物に同体積の生理食塩水を与えた。
【００４６】
１．３．２．３  行動学的検出
動物は約９０日齢の時に受動的回避実験を行って、学習・記憶能力を測定した。実験装置は明室と暗室に分けられ、明室は５Ｗ  ＬＥＤランプで照明し、両室の間に小さなドアがある。実験は３日間に分けて行った。１日目に、動物に適応的な訓練を与え、マウスの顔を入り口に背向して明室に入れ、明室、暗室で自由活動させ、両室ではいずれも電気刺激を与えなく、持続時間は５ｍｉｎである。２日目に学習実験を行い、検出する時にマウスの顔を入り口に背向して明室に入れ、同時にタイマーを起動し、動物は入り口を通って暗室に入って電撃（０．１９ｍＡ）を受けた時点で、記録した時間は潜伏期間であり、同時に５ｍｉｎ以内での、マウスが暗室に入る暗所回避（エラー）回数を記録した。３日目に記憶実験を行い、各マウスを明室に入れてから暗室に入るまでの時間を記録し、５ｍｉｎでまだ暗室に入っていない場合、潜伏期間を３００ｓとして記録し、同時に５ｍｉｎ以内での、マウスが暗室に入る暗所回避（エラー）回数を記録した。
【００４７】
１．４  統計処理：ＳＰＳＳ統計ソフトウェアを利用して分散分析を行った（多群比較）。
【００４８】
２  試験結果
２．１  受動的回避実験における暗室に入る潜伏期間に対する影響
受動的回避実験における暗室に入る潜伏期間に対する影響を図２（ヒストグラムデータは平均±標準誤差を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、生理対照群との比較であり；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１、モデル群との比較である。）に示す。学習実験において、単一因子分散分析を経て、各群の間に有意差はなかった。記憶実験において、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａモデル群は生理対照群と比較し、暗室に入る潜伏期間が著しく短縮された（ｐ＜０．０５）。組成物及びエダラボン群はモデル群と比較し、暗室に入る潜伏期間は著しく延長され（ｐ＜０．０５）、ボルネオールの作用は明らかではなかった。実験の結果から、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ動物は病気の進行過程において学習記憶能力が著しく低下し、エダラボンとボルネオールとの組成物及びエダラボンは記憶機能障害を顕著に改善することができ、且つ組成物の薬効は単剤より良好であることが示された。
【００４９】
金氏公式ｑ＝Ｅ（ａ＋ｂ）／（Ｅａ＋Ｅｂ−Ｅａ×Ｅｂ）によって組成物においてエダラボンとボルネオールとが相乗作用があるかどうかを評価した。式において、Ｅ（ａ＋ｂ）は併用薬物の有効率であり、Ｅａ、ＥｂはそれぞれＡ薬、Ｂ薬単独投与の有効率である。ｑ値は０．８５〜１．１５の範囲内であると、両薬併用の簡単な加算であり、ｑ値＞１．１５の時、増強を示し、ｑ値＜０．８５の時、両薬併用が拮抗作用を有することを示す。上記の式で計算したところ、ｑ＝１．２９であり、組成物の成分同士が相乗作用を有し、併用投与が単独投与より良好であることを示している。
【００５０】
２．２  受動的回避実験における暗所回避（エラー）回数に対する影響
受動的回避実験におけるエラー回数に対する影響を図３（ヒストグラムは平均±標準誤差を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、生理対照群との比較であり；＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、モデル群との比較である。）に示す。学習実験において、単一因子分散分析に経て、各群の間に有意差はなかった。記憶実験において、モデル群は生理対照群と比較し、暗所回避（エラー）回数が著しく増加している（ｐ＜０．０５）。組成物及びエダラボン群はモデル群と比較し、暗所回避（エラー）回数が著しく減少し（ｐ＜０．０５）、ボルネオールの作用は明らかではなかった。実験の結果から、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ動物は病気の進行過程において学習記憶能力が著しく低下し、エダラボンとボルネオールとの組成物及びエダラボンは記憶機能障害を顕著に改善することができ、且つ組成物の薬効は単剤より良好であることを示している。
【００５１】
上記の金氏公式で計算したところ、ｑ＝１．２５であり、組成物の成分同士が相乗作用を有し、併用投与が単独投与より良好であることを示している。
【００５２】
実施例３  エダラボンとボルネオールとの組成物の、筋萎縮性側索硬化遺伝子改変マウスに対する治療作用の研究
１  材料と方法
１．１  試験動物
筋萎縮性側索硬化遺伝子改変マウス（Ｂ６ＳＪＬ−Ｔｇ（ＳＯＤ１＊Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／ＪＮｊｕ、以下、単にＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスと称する）及び野生型対照マウスは南京大学−南京生物医薬研究所から購入された。
【００５３】
１．２  薬品と試薬
エダラボンと天然ボルネオールとの組成物（エダラボンと天然ボルネオールとの質量比は４：１である）；
エダラボン；
リルゾール。
【００５４】
１．３  試験方案
１．３．１  実験グループ分け
実験動物は６群に分けられ、それぞれ野生対照（Ｗｔ）群、モデル（Ｔｇ）群、陽性薬であるリルゾール（Ｔｇ−Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）群、陽性薬であるエダラボン１５ｍｇ／ｋｇ（Ｔｇ−Ｅ１５）群、組成物５ｍｇ／ｋｇ（Ｔｇ−Ｃ５群、１５ｍｇ／ｋｇ（Ｔｇ−Ｃ１５）群とした。組成物において、エダラボンと天然ボルネオールとの質量比は４：１である。
【００５５】
１．３．２  投与実験
動物１０週齢から投与し始めて生存期間全体に渡って投与した。１日１回、各用量の組成物及び陽性薬であるエダラボン群を腹腔内注射した。陽性薬であるリルゾール群薬物を１００μｇ／ｍｌで飲用水に溶解させて投与した。野生対照群及びモデル群動物に対応する体積の溶媒を腹腔内注射した。
【００５６】
１．３．３  実験過程
動物１０週齢から、１週１回、運動機能（運動能力スコア、ロータロッド実験）をモニタリングした。動物ロータロッド実験においてロッドから連続して２回落下することを動物発症のサインとする。動物が片側に配置されている場合、３０秒以内で立ち直りすることができないことを病気の終点と定義し、安楽死させた。
【００５７】
１．３．４  検出指標
体重、運動能力スコア、ロータロッド実験におけるロッドから落下するまでの潜伏期間の経時的変化，発症時間，生存時間を病気の進行を観察する指標とする。
【００５８】
１．３．５  試験方法
１．３．５．１  運動機能スコア
後肢：３、衰弱なし；２、一肢の麻痺（尻尾を持ち上げる時に、一肢が振戦する）；１、下肢の不全麻痺（両足が衰弱するが、動くことができる）；０、下半身麻痺（足が動かない）
前肢：３、衰弱なし；２、不全麻痺（ロッドをわずかに握ることができる）；１、半身不随（ロッドを握ることができないが、胸部を支えて地面から離れることができる）；０、胸部を支えて地面から離れることができない
胴体：１、ロータロッドから落下する時、胴体を捻ることができる；０、上記の動作をすることができない
全身活動性：３，走ることができる；２、歩く又は這うことができる；１、立ち直ることができる；０、３０秒以内で立ち直ることができない
各部分のスコアを加算して運動機能スコアの合計スコアにする。
【００５９】
１．３．５．２  ロータロッド実験
１０週目に３日間連続的に訓練し、１１週目に検出し始め、ロータロッドの回転数が１４ｒｐｍであり、動物がロッドからの落下するまでの潜伏期間を記録し、最も長い持続時間が１８０ｓで、合計３回行い、持続時間が最も長い１回を記録した。
【００６０】
１  試験結果
２．１  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの生存時間に対する影響
ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ対照群マウスは日齢約１１０日で発症し始め、平均生存時間は（１４１．４．±１１．１）日である。各投与群について、マウスの７０日の時に投与し始め、マウスの発症時間に影響しないが、マウスの生存時間を著しく延長することができ、表２に示されている。組成物の生存時間に対する延長作用はある用量−効果関係があり、高用量の作用は陽性薬であるエダラボン及びリルゾールより良好である。野生対照マウスは臨床症状がなかった。
【００６１】
【表２】
0006450887.tif 000003
【００６２】
２．２  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの体重に対する影響
図４から分かるように、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ対照群マウスの体重は１６週から徐々に低下し、モデル群と比較し、各投与群は全てＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス体重低下の進行を異なる程度遅くすることができ、中で、リルゾール（Ｔｇ−Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）群及び組成物の高用量（Ｔｇ−Ｃ１５）群動物は、体重が２１週齢の時にモデル対照群より著しく高かった（ｐ＜０．０５）。
【００６３】
２．３  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス運動機能に対する影響
２．３．１  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウス運動機能スコアに対する影響
図５から分かるように、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ対照群マウスの運動機能スコアは１６週から徐々に低下した。モデル群と比較し、各投与群は、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスの運動機能劣化の進行を異なる程度遅らせることができる。リルゾール及び組成物の高用量群マウスでは、１６−２１週齢時のスコアがモデル群より著しく高く（ｐ＜０．０５）、エダラボン群では、動物１７、２０、２１週齢のスコアがモデル群より著しく高く（ｐ＜０．０５）、組成物の低用量群では、動物２１週齢のスコアがモデル群より著しく高かった（ｐ＜０．０５）。組成物の薬効はある用量−効果関係があり、高用量の作用は陽性薬であるエダラボン及びリルゾールより良好である。
【００６４】
２．３．２  ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスのロータロッド実験におけるロッドからの落下するまでの時間に対する影響
図６から分かるように、ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ対照群は、ロータロッド実験におけるロッドからの落下するまでの時間が１６週から徐々に減少した。モデル群と比較し、各投与群では全てＳＯＤ１−Ｇ９３Ａマウスのロッドから落下するまでの時間を著しく遅らせることができ、動物運動機能を改善するリルゾール及び組成物の高用量群では、マウス１６−２１週齢時のロッドからの落下するまでの時間が全てモデル群より著しく高く（ｐ＜０．０５）、エダラボン群では動物１６、１９、２０、２１週齢のロッドからの落下するまでの時間が全てモデル群より著しく長く（ｐ＜０．０５）、組成物の低用量群では動物１９、２０、２１週齢のロッドからの落下するまでの時間が全てモデル群より著しく長かった（ｐ＜０．０５）。組成物の薬効はある用量−効果関係があり、高用量の作用は陽性薬であるエダラボン及びリルゾールより良好である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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