(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォルスコリンを分化前の前脂肪細胞におよび分化中の脂肪細胞にも別個に添加し、脂肪生成阻害のプロセスにおいてフォルスコリンを使用して、脂肪生成阻害潜在力を比較して評価する方法であって、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに非ヒト哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｃ）２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を前記ウェルに添加するステップと、
ｄ）ステップｃにおける脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーションの後に２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）、脂肪生成誘導培地（ステップｃ）および脂肪生成進行培地（ステップｄ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｅの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｇ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｆの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｈ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｆおよびｇの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｉ）ステップａのウェルに２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を添加するステップと、
ｊ）脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーション後、ステップｉのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｋ）フォルスコリン（ステップｊ）、脂肪生成誘導培地（ステップｉ）および脂肪生成進行培地（ステップｊ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｌ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｋの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｍ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｌの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｎ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｌおよびｍの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｏ）ステップｈおよびｎの細胞において脂肪生成の阻害パーセントを比較するステップとを含む、方法。
【請求項２】
骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）からなる群から選択される、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の発現を定量的に決定し、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の前記発現が、フォルスコリンを分化中の脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合に測定すると増強されるか否か確認する方法であって、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに非ヒト哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｃ）２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を前記ウェルに添加するステップと、
ｄ）ステップｃにおける脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーションの後に２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）、脂肪生成誘導培地（ステップｃ）および脂肪生成進行培地（ステップｄ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと、
ｇ）ステップａのウェルに２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を添加するステップと、
ｈ）脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーション後、ステップｇのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｉ）フォルスコリン（ステップｈ）、脂肪生成誘導培地（ステップｇ）および脂肪生成進行培地（ステップｈ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｊ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと
を組み込む、方法。
【請求項３】
フォルスコリンを分化前の前脂肪細胞におよび分化中の脂肪細胞にも別個に添加し、脂肪生成阻害のプロセスにおいてフォルスコリンを使用して、脂肪生成阻害潜在力を比較して評価する方法であって、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに非ヒト哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｅの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｇ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｆの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｈ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｆおよびｇの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｊ）ステップａのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を添加するステップと、
ｋ）フォルスコリン（ステップｊ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｌ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｋの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｍ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｌの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｎ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｌおよびｍの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｏ）ステップｈおよびｎの細胞において脂肪生成の阻害パーセントを比較するステップとを含む、方法。
【請求項４】
骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）からなる群から選択される、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の発現を定量的に決定し、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の前記発現が、フォルスコリンを分化中の脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合に測定すると増強されるか否か確認する方法であって、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに非ヒト哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと、
ｈ）ステップａのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を添加するステップと、
ｉ）フォルスコリン（ステップｈ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｊ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと
を組み込む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月１０日提出の米国非仮特許出願１４９３６８３０の優先権を引き出すＰＣＴ出願である。
発明の分野。本発明は、一般的には栄養補助食品に関する。さらに具体的には、本発明は、哺乳動物細胞系の特定の生理的および発生的段階でフォルスコリンを使用して至適な哺乳動物エネルギーバランスを達成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明。哺乳動物エネルギーバランスの崩壊は、生活様式および食習慣の変更ならびに治療介入も必要とする代謝疾患の世界的な流行の原因として意味づけられてきた。しかし、現在の食餌療法、運動、健康管理意識または薬物戦略では、エネルギー蓄積とエネルギー消費の間の完璧な平衡が至適であることが求められる哺乳動物身体においてエネルギーの恒常性に取り組むことはできないことが多い（Elattar.S and Satyanarayana, “Can Brown Fat Win the Battle against White Fat?”, J Cell Physiol. 2015 Mar 11, Zafrir B, “Brown adipose tissue: research milestones of a potential player in human energy balance and obesity”, Horm Metab Res. 2013 Oct;45(11):774-85）。過度のエネルギー量が至適なエネルギー消費により効果的に無効にされるエネルギー恒常性のための褐色脂肪組織（ＢＡＴ）に焦点を合わせた療法（Giralt M, “White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions? Endocrinology. 2013 Sep; 154(9):2992-3000）を開発するとの観点で、褐色脂肪細胞活性および分化を制御している極めて重要な生物学的プロセスを理解することが奨励されてきた。本発明は、哺乳動物エネルギーバランスを媒介するフォルスコリンの潜在力を考察する。したがって、
Ａ．脂肪生成（脂肪沈着）阻害が、フォルスコリンを成熟脂肪細胞よりはむしろ前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合のほうが著しく増強される、前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の成人脂肪細胞内での脂質の形成を妨げるフォルスコリンの能力、
Ｂ．褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の増強された発現が、フォルスコリンを成熟脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合のほうが著しく増強される、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）のような、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する前記分泌因子の発現を増強するフォルスコリンの能力。言い換えると、フォルスコリン処理前脂肪細胞は選択的にＢＡＴに分化することができること、
を開示するのが本発明の主目的である。
本発明は前述の目的を果たし、さらに関連のある利点を提供する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、
（Ａ）脂肪生成（脂肪沈着）阻害が、フォルスコリンを成熟脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合のほうが著しく増強される、前脂肪細胞から脂肪細胞への分化中の成人脂肪細胞内での脂質の形成を妨げるフォルスコリンの能力、
（Ｂ）褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の増強された発現が、フォルスコリンを成熟脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合のほうが著しく増強される、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）のような、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する前記分泌因子の発現を増強するフォルスコリンの能力。言い換えると、フォルスコリン処理前脂肪細胞は選択的にＢＡＴに分化することができること、
を開示する。
【０００４】
本発明の利点には、フォルスコリンが、（ｉ）脂肪生成を阻害する、および（ｉｉ）成熟脂肪細胞よりはむしろ前脂肪細胞に接触させるまたは投与される場合のほうが、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）のような、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の発現を増強する、潜在力が増大することを表す、哺乳動物細胞系の特定の生理的および発生的段階でフォルスコリンを使用して哺乳動物エネルギーバランスを達成する方法の実証が含まれる。
【０００５】
本発明の他の特長および利点は、例として本発明の原理を示す添付の図と併せて考慮すれば、以下のさらに詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ前脂肪細胞から脂肪細胞への分化前におよび前脂肪細胞から脂肪細胞への分化後に添加した場合の、培養３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の細胞培養上澄み中のＢＭＰ−７のグラフ表示を示す図である。
【図２】フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ前脂肪細胞から脂肪細胞への分化前におよび前脂肪細胞から脂肪細胞への分化後に添加した場合の、培養３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の細胞培養上澄み中のＢＭＰ−４のグラフ表示を示す図である。
【図３】フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ前脂肪細胞から脂肪細胞への分化前におよび前脂肪細胞から脂肪細胞への分化後に添加した場合の、培養３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の細胞培養上澄み中のＶＥＧＦ−Ａのグラフ表示を示す図である。
【図４】フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ前脂肪細胞から脂肪細胞への分化前におよび前脂肪細胞から脂肪細胞への分化後に添加した場合の、培養３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の細胞培養上澄み中のＵＣＰ１のグラフ表示を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
もっとも好ましい実施形態では、本発明は、脂肪生成阻害潜在力を比較して評価するためにフォルスコリンを分化前の前脂肪細胞におよび成熟脂肪細胞にも別個に添加する、脂肪生成阻害のプロセスにおいてフォルスコリンを使用して哺乳動物エネルギーバランスを達成する方法であって、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｃ）２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地(Adipogenesis induction medium)をウェルに添加するステップと、
ｄ）ステップｃにおける脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーションの後に２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地(Adipogenesis progression medium)を添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）、脂肪生成誘導培地（ステップｃ）および脂肪生成進行培地（ステップｄ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｅの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｇ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｆの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｈ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｆおよびｇの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｉ）ステップａのウェルに２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を添加するステップと、
ｊ）脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーション後、ステップｉのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｋ）フォルスコリン（ステップｊ）、脂肪生成誘導培地（ステップｉ）および脂肪生成進行培地（ステップｊ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｌ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｌの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｍ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｍの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｎ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｍおよびｎの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｏ）ステップｈおよびｏの細胞において脂肪生成の阻害パーセントを比較するステップとを含む、方法に関する。
【０００８】
別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）のような、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の発現を促進するプロセスでフォルスコリンを使用する哺乳動物エネルギーバランスの方法であって、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の前記発現が、フォルスコリンを成熟脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合に測定すると著しく増強され、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｃ）２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地をウェルに添加するステップと、
ｄ）ステップｃにおける脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーションの後に２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）、脂肪生成誘導培地（ステップｃ）および脂肪生成進行培地（ステップｄ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと、
ｇ）ステップａのウェルに２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を添加するステップと、
ｈ）脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーション後、ステップｇのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｉ）フォルスコリン（ステップｈ）、脂肪生成誘導培地（ステップｇ）および脂肪生成進行培地（ステップｈ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｊ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと
を組み込む前記方法にも関する。
【０００９】
さらに別の非常に好ましい実施形態では、本発明は哺乳動物脂肪細胞系におけるエネルギーバランスを達成する方法であって、哺乳動物前脂肪細胞を標的にして有効量でフォルスコリンを投与して、（ａ）脂肪生成の阻害の増加および（ｂ）個別にまたは組み合わせて機能して褐色脂肪細胞または褐色様（ベージュまたはブライト(brite)）脂肪細胞を特異的に動員する分泌因子の発現の増加の効果を達成するステップを含む前記方法に関する。特定の実施形態では、分泌因子は骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）からなる群から選択される。
【００１０】
さらに別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物前脂肪細胞を標的にして有効量でフォルスコリンを投与して（ａ）脂肪生成の阻害の増加および（ｂ）個別にまたは組み合わせて機能して褐色脂肪細胞または褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞を特異的に動員する分泌因子の発現の増加の効果をもたらすことにより、哺乳動物脂肪細胞におけるエネルギーバランスを達成することを含む、肥満の療法において使用するためのフォルスコリンに関する。特定の実施形態では、分泌因子は骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）からなる群から選択される。
【００１１】
さらに別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物の白色脂肪細胞貯蔵場所において褐色様表現型（ベージュまたはブライト脂肪細胞）を誘導するための方法であって、完全に分化した白色脂肪細胞の貯蔵場所を有する肥満哺乳動物に有効量のフォルスコリンを投与して白色脂肪細胞貯蔵場所内で褐色様表現型（ベージュまたは褐色脂肪細胞）の発生をもたらす分泌因子の増加の効果を達成するステップを含む前記方法に関する。特定の実施形態では、分泌因子は血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）である。さらに別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、フォルスコリンを哺乳動物白色脂肪細胞貯蔵場所を標的にして有効量で投与して、哺乳動物の白色脂肪細胞貯蔵場所において褐色様表現型（ベージュまたはブライト脂肪細胞）の発生を引き起こす分泌因子である、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）の発現が増加する効果を達成することを特徴とする肥満の療法において使用するためのフォルスコリンに関する。
【００１２】
さらに別の非常に好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物脂肪細胞系においてエネルギーバランスを達成する方法であって、哺乳動物前脂肪細胞を標的にしてフォルスコリンを有効量で投与し、ミトコンドリア脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）の発現が増強される効果をもたらして、分化した褐色脂肪細胞および褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞においてミトコンドリア熱産生を増加させるステップを含む前記方法に関する。
代わりの実施形態では、本発明は、哺乳動物前脂肪細胞を標的にしてフォルスコリンを有効量で投与し、分泌因子ミトコンドリア脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）の発現が増強される効果をもたらして、分化した褐色脂肪細胞および褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞においてミトコンドリア熱産生を増加させることにより、哺乳動物脂肪細胞においてエネルギーバランスを達成することを含む、肥満の療法において使用するためのフォルスコリンにも関する。
【実施例】
【００１３】
本明細書の上の段落［０００７］〜［００１２］において概説したもっとも好ましい実施形態の例証となる例として、フォルスコリンは濃度を増加させて投与した場合、前脂肪細胞から脂肪細胞への転換が起こった後よりも前脂肪細胞の段階で投与したときのほうが、（ａ）脂肪生成を妨げるのに、ならびに（ｂ）褐色脂肪細胞を動員するＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１のような分泌因子の発現を促進し、それによって哺乳動物細胞系においてエネルギーバランスを生み出すのに効果的であることを示す以下の結果を提示する。
【００１４】
結果１−脂肪生成の防止
【表１】
0006472453.tif 000002
表Ａは、フォルスコリンのそれぞれの試験した濃度で、哺乳動物前脂肪細胞段階でのフォルスコリンの投与は前脂肪細胞から脂肪細胞への分化後に投与した場合よりも脂肪生成を妨げるのに著明な効果を及ぼすことを示している。脂肪細胞段階での投与と比べて前脂肪細胞段階でフォルスコリンを投与した場合は、２倍または２倍を超える脂肪生成の阻害パーセントが観察された。
【００１５】
結果２−褐色脂肪細胞を動員する分泌タンパク質の発現
Ａ．ＢＭＰ−７
褐色脂肪細胞分化系列のリクルーター（ｒｅｃｒｕｉｔｅｒ）としてのＢＭＰ−７の生物学的役割は、以下の科学文献において考察されてきた。
１．Mathew Harms and Patrick Seale, “Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential”, Nature Medicine, Volume 19, Number 10, October 2013, pages 1252-1263;
２．BMP7 Activates Brown Adipose Tissue and Reduces Diet-Induced Obesity at Sub thermoneutrality . Mariette R. Boon Published: September 16, 2013; PLOS One.
３．New role of bone morphogenetic protein 7 in brown adipogenesis and energy expenditure. Tseng et al. Nature. 2008 Aug 21; 454(7207):1000-4. doi: 10.1038/nature07221.
４．Transcriptional Control of Brown Fat Development; Kajimure et al. Cell Metabolism; Volume 11, Issue 4, 7 April 2010, Pages 257-262.
【００１６】
フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を前脂肪細胞段階でおよび脂肪細胞への分化が起きた後で投与した場合の、細胞培養上澄み中のＢＭＰ−７の定量化のための免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により、フォルスコリンは脂肪細胞段階でよりも前脂肪細胞段階でのほうがＢＭＰ−７発現を著明に増加させることが示された。
したがって、上に引用した文献との関連において、フォルスコリンは完全に分化した白色脂肪細胞よりはむしろ前脂肪細胞の褐色脂肪転換のほうに大きな潜在力を表す（図１）と推定することができる。図１により例証される実施例は、フォルスコリンが分泌因子ＢＭＰ−７を発現させることにより、哺乳動物前脂肪細胞の褐色脂肪細胞への選択的分化を指示するという開示されたもっとも好ましい実施形態を実証している。
【００１７】
Ｂ．ＢＭＰ−４
ＢＭＰ−７と共に作用して、ＢＭＰ−４は新しいアディポカインであり脂肪生成および白色から褐色移行に作用する（Qian S W et al Proc Natl Acad Sci USA 110: E798-807, 2013）。フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を前脂肪細胞段階でおよび脂肪細胞への分化が起きた後で投与した場合の、細胞培養上澄み中のＢＭＰ−４の定量化のための免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により、フォルスコリンは脂肪細胞段階でよりも前脂肪細胞段階でのほうがＢＭＰ−４発現を著明に増加させることが示された。
【００１８】
したがって、上に引用した文献との関連において、フォルスコリンは、分泌因子ＢＭＰ−４とＢＭＰ−７の組み合わされた発現の増加と生物学的作用により、白色前脂肪細胞からブライト／ベージュ脂肪細胞（褐色脂肪細胞様の）への転換に、より大きな潜在力を表す（図２）と推定することができる。図２より例証される実施例は、フォルスコリンが白色前脂肪細胞からブライトまたはベージュ脂肪細胞への転換をもたらすというもっとも好ましい実施形態を実証している。
【００１９】
Ｃ．ＶＥＧＦ−Ａ
ＶＥＧＦ−Ａの過剰発現は褐色脂肪組織（ＢＡＴ）熱産生を増加させ、白色脂肪組織貯蔵場所において「ＢＡＴ様」表現型も促進する。食餌誘発性肥満マウスにおいて、ＢＡＴに局所的にＶＥＧＦ−Ａを導入すれば、毛細血管希薄化が救済され、褐色脂肪細胞機能障害が寛解され、高脂肪食餌負荷により引き起こされるグルコースおよび脂質代謝に対する有害作用が改善される。これらの結果は、ＢＡＴの活性化および増殖におけるＶＥＧＦ−Ａの直接的積極的役割を実証している。ＶＥＧＦ−Ａの過剰発現は、Ｍ２抗炎症マクロファージの脂肪貯蔵場所への動員を増加することによりマクロファージへの作用も発揮する。脂肪組織においてＶＥＧＦ−Ａにより誘発される肥満の減少および抗炎症環境がトランスジェニックマウスにおけるインスリン抵抗性の低下の原因である（Bagchi et al, “Vascular endothelial growth factor is important for brown adipose tissue development and maintenance”, FASEB J. 27, 3257-3271 (2013)）。フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を前脂肪細胞段階でおよび脂肪細胞への分化が起きた後で投与した場合の、細胞培養上澄み中のＶＥＧＦ−Ａの定量化のための免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により、フォルスコリンは脂肪細胞段階でよりも前脂肪細胞段階でのほうがＶＥＧＦ−Ａ発現を著明に増加させることが示された。したがって、上に引用した文献との関連において、フォルスコリンは、哺乳動物身体中の白色脂肪細胞貯蔵場所内における白色前脂肪細胞から褐色脂肪細胞様（ブライトまたはベージュ）細胞への転換に、より大きな潜在能力を表す（図３）と推定することができる。
【００２０】
Ｄ．脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）
低体温から身体を保護するように進化してきた熱産生のシステムは、ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ−１）による褐色脂肪細胞における酸化的リン酸化の脱共役に基づいている。遺伝子操作または薬剤によりＵＣＰ１を上方調節すると肥満を抑えインスリン感受性を改善することができることが明らかにされている（International Journal of Obesity (2008) 32, S32-S38; doi:10.1038/ijo.2008.236 UCP1: its involvement and utility in obesity. L P Kozak and R Anunciado-Koza）。フォルスコリン（５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を前脂肪細胞段階でおよび脂肪細胞への分化が起きた後で投与した場合の、細胞培養上澄み中のＵＣＰ−１の定量化のための免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により、フォルスコリンは脂肪細胞段階でよりも前脂肪細胞段階でのほうがＵＣＰ−１発現を著明に増加させることが示された。したがって、上に引用した文献との関連において、フォルスコリンは、前脂肪細胞からＢＡＴ様または褐色脂肪細胞への転換に、より大きな潜在力を表すと推定することができ、これらの細胞においてＵＣＰ−１発現が増強されると、適切なエネルギー消費を通じてエネルギーバランスの惹起を増強すると予想することが可能である（図４）。
【００２１】
ヒトにおいてフォルスコリンを投与しても明らかに臨床的に重要な副作用を引き起こさないことは既に報告されている（Shonteh Henderson et al, Effect of Coleus forskolii supplementation on body composition and haematological profiles in mildly overweight women, J Int Soc Sports Nutr. 2005; 2(2): 54-62）。この研究により、フォルスコリン栄養補助食品Ｆｏｒｓｌｅａｎ（登録商標）［２５０ｍｇの１０％コレウス・フォルスコリ（Coleus forskolii）抽出物、２５ｍｇのフォルスコリン］を１日２回１２週間補給しても明らかに臨床的副作用はなかったことが明らかにされている。したがって、哺乳動物脂肪細胞系におけるエネルギーバランスを達成するための本明細書の上に含まれる例証となるインビトロ実施例は、ヒトを含む動物（哺乳動物）におけるインビボ研究にも適用可能であると推測できる。
【００２２】
前述の発明は、明確な理解を目的とする例証および例としてある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内である種の変更および修正を実行しうることは明白であろう。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕脂肪生成阻害潜在力を比較して評価するためにフォルスコリンを分化前の前脂肪細胞におよび成熟脂肪細胞にも別個に添加する、脂肪生成阻害のプロセスにおいてフォルスコリンを使用して哺乳動物エネルギーバランスを達成する方法であって、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｃ）２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を前記ウェルに添加するステップと、ｄ）ステップｃにおける脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーションの後に２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）、脂肪生成誘導培地（ステップｃ）および脂肪生成進行培地（ステップｄ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｅの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｇ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｆの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｈ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｆおよびｇの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｉ）ステップａのウェルに２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を添加するステップと、
ｊ）脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーション後、ステップｉのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｋ）フォルスコリン（ステップｊ）、脂肪生成誘導培地（ステップｉ）および脂肪生成進行培地（ステップｊ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｌ）１００μｌの１０％ホルマリンを添加することによりステップｌの細胞を固定化し、オイルレッドＯ技法を使用して染色するステップと、
ｍ）マイクロプレートリーダーにおいて４９２ｎｍでステップｍの細胞の光学密度を読み取り、その結果をグラフパッドプリズムソフトウェアを使用して阻害濃度（ＩＣ５０）値として表すステップと、
ｎ）式Ｃ−Ｔ／Ｔ×１００（式中のＣは分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度であり、Ｔは試料処理された分化中の／未分化の細胞におけるオイルレッドＯの吸光度である）を使用してステップｍおよびｎの細胞における脂肪生成の阻害パーセントを計算するステップと、
ｏ）ステップｈおよびｏの細胞において脂肪生成の阻害パーセントを比較するステップとを含む、方法。
〔２〕骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）のような、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の発現を促進するプロセスでフォルスコリンを使用する哺乳動物エネルギーバランスの方法であって、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）を選択的に動員する分泌因子の前記発現が、フォルスコリンを成熟脂肪細胞よりは前脂肪細胞に投与する（接触させる）場合に測定すると著しく増強され、
ａ）おおよそ６０×１０4細胞が４８〜７２時間播種されて７０〜８０％コンフルエンスを得るマイクロプレートのウェルに哺乳動物脂肪細胞前駆細胞（前脂肪細胞）を播種するステップと、
ｂ）未分化前脂肪細胞からなるステップａの前播種されたマイクロプレートに５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌの濃度でフォルスコリンを添加するステップと、
ｃ）２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を前記ウェルに添加するステップと、ｄ）ステップｃにおける脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーションの後に２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｅ）フォルスコリン（ステップｂ）、脂肪生成誘導培地（ステップｃ）および脂肪生成進行培地（ステップｄ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｆ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと、
ｇ）ステップａのウェルに２００μｌの新たに調製した脂肪生成誘導培地を添加するステップと、
ｈ）脂肪生成誘導培地と一緒の７２時間のインキュベーション後、ステップｇのウェルに段階的濃度のフォルスコリン（それぞれ５０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）を含む２００μｌの新たに調製した脂肪生成進行培地を添加するステップと、
ｉ）フォルスコリン（ステップｈ）、脂肪生成誘導培地（ステップｇ）および脂肪生成進行培地（ステップｈ）で処理した細胞を５％ＣＯ2および９５％空気の加湿雰囲気（３７℃）で４８時間インキュベートするステップと、
ｊ）適切な免疫アッセイ技法により、細胞上澄み中のＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ−ＡおよびＵＣＰ−１の発現を定量的に決定するステップと
を組み込む、方法。
〔３〕哺乳動物脂肪細胞系におけるエネルギーバランスを達成する方法であって、哺乳動物前脂肪細胞を標的にして有効量でフォルスコリンを投与して（ａ）脂肪生成の阻害の増加および（ｂ）個別にまたは組み合わせて機能して褐色脂肪細胞または褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞を特異的に動員する分泌因子の発現の増加の効果を達成するステップを含む、方法。
〔４〕分泌因子が骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）からなる群から選択される、前記〔３〕に記載の方法。
〔５〕哺乳動物前脂肪細胞を標的にして有効量でフォルスコリンを投与して（ａ）脂肪生成の阻害の増加および（ｂ）個別にまたは組み合わせて機能して褐色脂肪細胞または褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞を特異的に動員する分泌因子の発現の増加の効果をもたらすことにより、哺乳動物脂肪細胞におけるエネルギーバランスを達成することを含む、肥満の療法において使用するためのフォルスコリン。
〔６〕分泌因子が骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４）、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）からなる群から選択される、前記〔３〕に記載の方法。
〔７〕哺乳動物の白色脂肪細胞貯蔵場所において褐色様表現型（ベージュまたはブライト脂肪細胞）を誘導するための方法であって、完全に分化した白色脂肪細胞の貯蔵場所を有する肥満哺乳動物に有効量のフォルスコリンを投与して白色脂肪細胞貯蔵場所内で褐色様表現型（ベージュまたは褐色脂肪細胞）の発生をもたらす分泌因子の増加の効果を達成するステップを含む、方法。
〔８〕分泌因子が血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）である、前記〔７〕に記載の使用。
〔９〕フォルスコリンを哺乳動物白色脂肪細胞貯蔵場所を標的にして有効量で投与して、哺乳動物の白色脂肪細胞貯蔵場所において褐色様表現型（ベージュまたはブライト脂肪細胞）の発生を引き起こす分泌因子の、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）およびミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）の発現が増加する効果を達成することを特徴とする、肥満の療法において使用するためのフォルスコリン。
〔１０〕哺乳動物脂肪細胞系においてエネルギーバランスを達成する方法であって、哺乳動物前脂肪細胞を標的にしてフォルスコリンを有効量で投与し、ミトコンドリア脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）の発現が増強される効果をもたらして、分化した褐色脂肪細胞および褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞においてミトコンドリア熱産生を増加させるステップを含む、方法。
〔１１〕哺乳動物前脂肪細胞を標的にしてフォルスコリンを有効量で投与し、分泌因子ミトコンドリア脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）の発現が増強される効果をもたらして、分化した褐色脂肪細胞および褐色様（ベージュまたはブライト）脂肪細胞においてミトコンドリア熱産生を増加させることにより、哺乳動物脂肪細胞においてエネルギーバランスを達成することを含む、肥満の療法において使用するためのフォルスコリン。
【図１】
0006472453.tif 000003
【図２】
0006472453.tif 000004
【図３】
0006472453.tif 000005
【図４】
0006472453.tif 000006