(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のオートタキシンの活性測定方法であって：
（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程；
（２）グリセロールキナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、それぞれ異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するグリセロールキナーゼと、第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
工程（１）で得られた処理物と、接触せしめ、下記式（Ｉ）：
【化１】
0006522466.tif 000006
のサイクリング反応を実施せしめる工程；
（３）工程（２）における、第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物のいずれか１以上の変化量を検出する工程；及び
（４）工程（３）で検出された変化量に基づき、試料のオートタキシン活性を算出する工程；
を含む測定方法。
【請求項２】
工程（２）と同時に又は工程（２）に先立って、さらに以下の工程：
（１ａ）リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる処理をする工程；
を行う方法であって、工程（２）が、グリセロールキナーゼと工程（１）及び（１ａ）で得られた処理物とを接触せしめる工程である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
工程（３）が、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、又は第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の増加量を検出する工程である、請求項１及び２のいずれかに記載の測定方法。
【請求項４】
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかである、請求項１〜３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の測定方法。
【請求項６】
第一のヌクレオチド補酵素がアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）であり、第二のヌクレオチド補酵素がイノシン２リン酸（ＩＤＰ）である、請求項１〜５のいずれかに記載の測定方法。
【請求項７】
工程（３）が：第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素を基質としない検出用酵素；又は第一のヌクレオシド補酵素を基質としないが、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素；を用いて、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物の増加量又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の増加量を検出する工程である、請求項１〜６のいずれかに記載の測定方法。
【請求項８】
第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物又は第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物が、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）であり、
工程（３）がＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、グルコースの存在下、ＡＤＰの増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項１〜７のいずれかに記載の測定方法。
【請求項９】
工程（３）が、さらに、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかの補酵素と、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼの存在下、ＡＤＰの増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する工程である、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１０】
試料中のオートタキシンの測定方法であって：
（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程、（１a）リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる処理をする工程；
（２）グリセロールキナーゼであって、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、グリセロールからグリセロール−３−リン酸を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応においてＡＴＰを利用し、逆反応においてイノシン２リン酸（ＩＤＰ）を利用する、グリセロールキナーゼと、ＡＴＰと、ＩＤＰと、を、工程（１）及び（１ａ）で得られた処理物と接触せしめ、下記式（ＩＩ）
【化２】
0006522466.tif 000007
のサイクリング反応を実施せしめる工程；
（３）アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼの存在下、工程（２）におけるＡＤＰの増加量を検出する工程；及び
（４）工程（３）で検出されたＡＤＰの増加量に基づき、試料のオートタキシン活性を算出する工程；
を含む測定方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の測定方法を含む、臨床検体検査方法。
【請求項１２】
試料中のオートタキシン活性測定用組成物であって、
（ａ）リゾホスファチジルグリセロールと、
（ｂ）グリセロールキナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、それぞれ異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するグリセロールキナーゼと、
（ｃ）第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｄ）第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、第二のヌクレオチド補酵素と、
を含む、組成物。
【請求項１３】
（ａ１）リゾホスホリパーゼをさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかである、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかである、請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
第一のヌクレオチド補酵素がアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）であり、第二のヌクレオチド補酵素がイノシン２リン酸（ＩＤＰ）である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素を基質としない検出用酵素、又は
第一のヌクレオシド補酵素を基質としないが、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素、
をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
検出用酵素がアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）であり、グルコースをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかと、
グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
をさらに含む、請求項１２〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
試料中のオートタキシン活性測定用組成物であって、
（ａ）リゾホスファチジルグリセロールと、
（ａ１）リゾホスホリパーゼと、
（ｂ）グリセロールキナーゼであって、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、グリセロールからグリセロール−３−リン酸を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応においてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を利用し、逆反応においてイノシン２リン酸（ＩＤＰ）を利用する、グリセロールキナーゼと、
（ｃ）ＡＴＰと、
（ｄ）ＩＤＰと、
（ｅ）アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）と、
（ｆ）グルコースと、
（ｇ）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかと、
（ｈ）グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
を含む、組成物。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれかに記載の組成物を含む、オートタキシン活性測定用試薬キット。
【請求項２２】
請求項１２〜２０のいずれかに記載の組成物を含む、オートタキシン活性測定用の臨床検体測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートタキシンの活性測定方法に関する。より詳細には、本発明は、リゾホスファチジルグリセロールを基質とするオートタキシンの反応を利用した、試料中のオートタキシンの活性の測定方法及び測定用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートタキシンは、ヒト悪性黒色腫細胞株であるＡ２０５８の培養上清より、同細胞の運動促進因子として１９９２年に単離、同定された糖タンパク質であり、ウシ血清やヒト血漿から精製取得された酵素の研究により、リゾホスファチジン酸産生酵素であるリゾホスホリパーゼＤと同一であることが見出され、リゾホスファチジン酸（以下ＬＰＡと訳す場合がある。）生成酵素として生体内で重要な役割を果たす（非特許文献１及び２）。
【０００３】
血清中のオートタキシンの活性測定法として、リゾホスファチジルコリン（以下ＬＰＣと略す場合がある。）を基質として遊離されたコリンを、コリンオキシダーゼを用いて測定する酵素法が知られている（非特許文献３）。この方法は、ＬＰＣと試料を、塩化マグネシウム、塩化カルシウム及び塩化ナトリウムの存在下に３７℃にて一定時間、例えば３時間加温したのち、コリンオキシダーゼ、パーオキシダーゼ及び発色色素を含んだ発色液を添加し、オートタキシン反応により生成したコリンを定量するものである。
【０００４】
また合成基質を用いた測定法も提案されている（特許文献１及び２）。この方法は、天然基質ＬＰＣの代わりにリゾホスファチジル−ｐ−ニトロフェノールを合成し、これを基質に用い、リゾホスホリパーゼＤの反応により遊離したｐ−ニトロフェノールをアルカリ条件下で発色させる方法や、リゾリン脂質のリン酸ジエステルのグリセロール骨格とは反対側の酸素原子を硫黄原子に置換した化合物を合成し、この化合物からリゾホスホリパーゼＤの反応により遊離したチオール化合物を、ジスルフィド化合物の存在下、チオール−ジスルフィド交換反応により生成したチオール化合物に由来する吸光度から測定する方法である。
【０００５】
一方、抗体を用いた測定方法も報告されている（特許文献３）。この方法は酵素活性の代わりに、オートタキシンに対する２種類の抗体を用い、一方の抗体を不溶性担体に固定化し、オートタキシンを作用させた後、酵素等で標識されたもう一つの抗体を用いてさらにオートタキシンを認識させ、質量として測定する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００２/０５３５６９
【特許文献２】特開２００９−１４９５８２
【特許文献３】特開２０１３−１７８２８６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J  Cell Biol. 158:227-233,2002
【非特許文献２】ＪBiol Chem. 277:39436-39442,2002
【非特許文献３】Clin Biochem 40:274-277, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
オートタキシンの活性測定方法は前述のように数種類知られている。
しかしながら、ＬＰＣから遊離されたコリンを酵素的に検出する方法は、内在性のＬＰＣや遊離コリンの影響を受ける可能性がある。また、血中のオートタキシンは安定であるが、一方で、採血後の血清中では、内在性ＬＰＣがその加温時間に応じて増加することが報告されている（非特許文献３）。このため生体試料を用いた場合、オートタキシンの活性の測定値が採血後の保存状態により影響を受ける問題もある。
【０００９】
さらに、合成基質を用いたオートタキシンの活性測定法も報告されているが、低コスト化が困難である。さらに抗体法も報告されているが操作が煩雑であり、特別な装置が必要であるという問題がある。
【００１０】
これらの課題を解決するべく、本発明は、ＬＰＣや遊離コリン等の内在性オートタキシン基質又はその生成物の影響を受けず、採血後に増加するＬＰＣ等のオートタキシン基質の影響も受けず、安価且つ簡便に、オートタキシンの活性を測定する方法及び測定用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前述の課題を解決すべく、鋭意検討したところ、驚くべきことにオートタキシンの基質としては、これまで知られていなかったリゾホスファチジルグリセロールを用いて、酵素反応が進むことを初めて確認した。そして、この酵素反応の生成物であるグリセロール、及び/又はそのリン酸化物を、グリセロールキナーゼを用いた新規な酵素サイクリング法で反応させることにより、従来法に比べてＬＰＣや遊離コリン等の内在性オートタキシン基質又はその生成物の影響を受けず、採血後に増加するＬＰＣ等のオートタキシン基質の影響も受けず、安価且つ簡便にオートタキシンの活性を測定する方法及び測定用組成物を見出した。即ち本発明は以下に関する。
【００１２】
［０］
試料中のオートタキシンの活性測定方法であって、（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程、
を含む測定方法。
［１］
試料中のオートタキシンの活性測定方法であって：、
（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程；、
（２）グリセロールキナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するグリセロールキナーゼと、第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
上記工程（１）で得られた処理物をした試料と、接触せしめさせ、下記式（Ｉ）：のサイクリング反応をせしめる工程と、
【化１】
0006522466.tif 000002
のサイクリング反応を実施せしめる工程；
（３）工程（２）における、第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物のいずれか１以上の変化量を検出する工程；及び
（４）工程（３）で検出された変化量に基づき、試料のオートタキシン活性を算出する工程；
を含む測定方法。
[１−１]
工程（２）と同時に又は工程（２）に先立って、さらに以下の工程：
（１ａ）リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる処理をする工程；
を行う方法であって、工程（２）が、グリセロールキナーゼと工程（１）及び（１ａ）で得られた処理物とを接触せしめる工程である、［１］に記載の測定方法。
［１−１−２］
上記工程（２）が、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、又は第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、［１］又は［１−１］に記載の測定方法。
［１−２］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシンのいずれかである、［１］〜［１−１−２］のいずれかに記載の測定方法。
［１−３］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシンのいずれかである、［１］〜［１−２］のいずれかに記載の測定方法。
［１−４］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシンのいずれかである、［１］〜［１−３］のいずれかに記載の測定方法。
［１−５］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシンのいずれかである、［１］〜［１−４］のいずれかに記載の測定方法。
［１−６］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシンのいずれかであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシグアノシンのいずれかである、［１］〜［１−５］のいずれかに記載の測定方法。
［１−７］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオチド部分と前記第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド補部分の組み合わせが、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、及びイノシンとアデノシンのいずれかである、［１］〜［１−６］のいずれかに記載の測定方法。
［１−８］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、イノシンである、［１］〜［１−７］のいずれかに記載の測定方法。
［１−９］
第一のヌクレオチド補酵素がアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）であり、第二のヌクレオチド補酵素がイノシン２リン酸（ＩＤＰ）である、［１］〜［１−８］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１０］
工程（３）が：第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素を基質としない検出用酵素；又は第一のヌクレオシド補酵素を基質としないが、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素；を用いて、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の増加量を検出する工程である、［１］〜［１−９］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１１］
第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物又は第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物が、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）であり、
工程（３）がＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、グルコースの存在下、ＡＤＰの増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する工程である、［１］〜［１−１０］のいずれかに記載の測定方法。
［１−１２］
工程（３）が、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかの補酵素と、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼの存在下、ＡＤＰの増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する工程である、［１−１１］に記載の測定方法。
［１−１３］
試料中のオートタキシンの測定方法であって：
（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程、（１a）リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる処理をする工程；
（２）グリセロールキナーゼであって、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、グリセロールからグリセロール−３−リン酸を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応においてＡＴＰを利用し、逆反応においてイノシン２リン酸（ＩＤＰ）を利用する、グリセロールキナーゼと、ＡＴＰと、ＩＤＰと、を、工程（１）及び（１ａ）で得られた処理物と接触せしめ、下記式（ＩＩ）
【化２】
0006522466.tif 000003
のサイクリング反応を実施せしめる工程；
（３）アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼの存在下、工程（２）におけるＡＤＰの増加量を検出する工程；及び
（４）工程（３）で検出されたＡＤＰの増加量に基づき、試料のオートタキシン活性を算出する工程；
を含む測定方法。
［１−１４］
［１］〜［１−１３］のいずれかに記載の測定方法を含む、臨床検体検査方法。
【００１３】
［２］
試料中のオートタキシン活性測定用組成物であって、
（ａ）リゾホスファチジルグリセロールと、
（ｂ）グリセロールキナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、それぞれ異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するグリセロールキナーゼと、
（ｃ）第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｄ）第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、第二のヌクレオチド補酵素と、
を含む、組成物。
［２−１］
（ａ１）リゾホスホリパーゼをさらに含む、［２］に記載の組成物。
［２−２］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかである、［２］及び［２−１］のいずれかに記載の組成物。
［２−３］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシンのいずれかである、［２］〜［２−２］のいずれかに記載の組成物。
［２−４］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかである、［２］〜［２−３］のいずれかに記載の組成物。
［２−５］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシグアノシンのいずれかである［２］〜［２−４］のいずれかに記載の組成物。
［２−６］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシンのいずれかであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシグアノシンのいずれかである、［２］〜［２−５］のいずれかに記載の組成物。
［２−７］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分と前記第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド補部分の組み合わせが、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、及びイノシンとアデノシンのいずれかである、［２］〜［２−６］のいずれかに記載の組成物。
［２−８］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がイノシンである、［２］〜［２−７］のいずれかに記載の組成物。
［２−９］
第一のヌクレオチド補酵素がアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）であり、第二のヌクレオチド補酵素がイノシン酸２リン酸（ＩＤＰ）である、［２］〜［２−８］のいずれかに記載の組成物。
［２−１０］
第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素を基質としない検出用酵素、又は
第一のヌクレオシド補酵素を基質としないが、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素、
をさらに含む、［２］〜［２−９］のいずれかに記載の組成物。
［２−１１］
検出用酵素がアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  １．７．１．１４７）であり、グルコースをさらに含む、［２−１０］に記載の組成物。
［２−１２］
グルコースをさらに含む［２］から［２−１０］のいずれかに記載の組成物。
［２−１３］
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかと、
グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
をさらに含む、［２］〜［２−１２］のいずれかに記載の組成物。
［２−１４］
試料中のオートタキシン活性測定用組成物であって、
（ａ）リゾホスファチジルグリセロールと、
（ａ１）リゾホスホリパーゼと、
（ｂ）グリセロールキナーゼであって、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、グリセロールからグリセロール−３−リン酸を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応においてアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を利用し、逆反応においてイノシン２リン酸（ＩＤＰ）を利用するグリセロールキナーゼと、
（ｃ）ＡＴＰと、
（ｄ）ＩＤＰと、
（ｅ）アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  １．７．１．１４７）と、
（ｆ）グルコースと、
（ｇ）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかと、
（ｈ）グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
を含む、組成物。
［３］
上記［２］〜［２−１４］のいずれかに記載の組成物を含む、オートタキシン活性測定用試薬キット。
［４］
上記［２］〜［２−１４］のいずれかに記載の組成物を含む、オートタキシン活性測定用の臨床検体測定装置。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、リゾホスファチジルグリセロールをオートタキシンの基質として用いて、グリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理を、グリセロールキナーゼによる酵素サイクリング反応と組み合わせることにより、ＬＰＣや遊離コリン等の内在性オートタキシン基質又はその生成物の影響を受けず、採血後に増加するＬＰＣ等のオートタキシン基質の影響も受けず、安価且つ簡便に、オートタキシンの活性を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】遺伝子組換えオートタキシンを用いた反応における、基質リゾホスファチジルグリセロール濃度と生成されたグリセロール量に相当する吸光度との関係を示すグラフである（実施例２）。
【図２】リゾホスファチジルグリセロールを基質とした反応における、遺伝子組換えオートタキシン量と生成されたグリセロール量に相当する吸光度との関係を示すグラフである（実施例３）。
【図３】本発明のオートタキシン活性測定法における、リゾホスホリパーゼ添加効果を示したグラフである（実施例４）。
【図４】ＬＰＣを基質に用いる従来法と本発明法とのオートタキシン活性測定の相関図である（実施例５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施の形態」ともいう。）について具体的に説明する。ただし、以下の実施の形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施の形態が明らかになるはずであり、本発明はここでは具体的に記載していない様々な実施の形態等を包含するということが理解されるべきである。なお、本明細書中のEC番号（Enzyme Commission numbers）は、２０１５年８月１８日現在において確認した番号である。
【００１７】
本実施の形態は、試料中のオートタキシンの活性測定方法であって：（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程；
（２）グリセロールキナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、それぞれ異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するグリセロールキナーゼと、第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
工程（１）で得られた処理物と、接触せしめ、下記式（Ｉ）：
【化３】
0006522466.tif 000004
のサイクリング反応を実施せしめる工程；
（３）工程（２）における、第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物のいずれか１以上の変化量を検出する工程；及び
（４）工程（３）で検出された変化量に基づき、試料のオートタキシン活性を算出する工程；
を含む測定方法である。
【００１８】
本実施の形態に係る方法における測定対象はオートタキシン活性である。オートタキシンは生体内でＬＰＡの生成酵素として重要な役割を果たしているが、本実施の形態に係る方法における測定対象としては、生体内に存在するものに限定されない。例えば、遺伝子操作によって産生されるもの、化学合成により合成されるもの等が例示される。また前述のように、オートタキシンはリゾホスホリパーゼＤと呼ばれる場合があり（非特許文献３）、この活性も本実施の形態に係る方法における測定対象に含まれる。
【００１９】
本実施の形態に係る方法におけるオートタキシンの基質はリゾホスファチジルグリセロールであり、例えば生体由来であっても、化学合成されたものであっても、酵素的に合成されたものでもよく、その由来は問わない。
【００２０】
本実施の形態に係る方法において用いることのできる試料としては、特に限定されないが、ヒト又は動物の生体試料が用いられる場合があり、好ましくはヒト血液、さらに好ましくは、ヒト血清である。試料中にはオートタキシンが含まれる場合もあるが結果として含まれない場合もある。また実験室で調整した試料であってもよい。
【００２１】
本実施の形態に係る方法における「接触せしめ」とは、２以上の対象を接触させようとする行為を言い、接触したかどうかの事実を示すものではない。例えば混合、添加、注入、適下等の操作が挙げられるがこれに限定されない。
【００２２】
本実施の形態に係る方法の工程（１）において、試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、試料中のオートタキシンの作用により基質であるリゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめるには、これに限定されないが例えば以下の条件で行えばよい。
【００２３】
リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）はトリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて溶解させることができるがこれに限定されない。反応時のＬＰＧ濃度は、好ましくは２〜４０ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは４〜２０ｍｍｏｌ／Ｌである。これに反応中のｐＨを維持するため、ｐＨ緩衝剤を例えば２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下加えて反応液とする。ｐＨ緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液並びにＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液等を用いることができる。
反応時のｐＨは適宜反応が効率的に進行する条件を選べばよいが、通常はｐＨ７．０以上ｐＨ１０．０以下の中性から弱アルカリ性付近に調整し、既報の活性測定法と同様塩化マグネシウムや塩化カルシウム等の金属塩を０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下適宜添加する。同様に、塩化ナトリウム等の塩も１ｍｏｌ／Ｌ以下添加することもできる。
反応液は予め２５℃以上４２℃以下、より好ましくは３７℃付近に加温し、オートタキシン反応を実施する。尚、後述するようにオートタキシン反応と工程（２）の酵素サイクリング反応を同時に実施することもできる。
【００２４】
本実施の形態に係る方法において、「生成せしめる」とは、生成させようとする行為を言い、生成するかどうかの事実は問わない。
【００２５】
本実施の形態に係る方法は、は、一態様において、さらに、以下の工程：
（１ａ）リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる処理をする工程；
を含む場合があり、この場合、工程（２）は、グリセロールキナーゼと工程（１）及び（１ａ）で得られた処理物とを接触せしめる工程である。この工程（１ａ）は、工程（２）と同時に又は工程（２）に先立って、行うことができる。
【００２６】
本実施の形態の工程（１ａ）における、リゾホスホリパーゼは、リゾホスファチジン酸を基質としてグリセロール−３−リン酸を生成するものであれば特に限定されず、例えば、市販品（ＬＹＰＬ；Ｔ−３２、旭化成ファーマ（株）等）を使用することができる。
【００２７】
本実施の形態の工程（１ａ）において、リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる方法は公知の方法を参考にして行うことができる（Clin Chim Acta 333,59-67,2003等）。例えば具体的には、下記に示した工程（２）のグリセロールキナーゼによる酵素サイクリング反応をせしめる条件下、さらにリゾホスホリパーゼを２．５ｕ／ｍＬ〜１００ｕ／ｍＬ、より好ましくは５ｕ／ｍＬ〜５０ｕ／ｍＬ添加すればよい。
【００２８】
工程（１ａ）におけるリゾホスホリパーゼは、リゾリン脂質を基質とするため、工程（１）の実施時に同時に添加すると、工程（１）のオートタキシンの基質であるリゾホスファチジルグリセロールにも作用してしまい、正確なオートタキシン活性測定の妨げになる場合がある。この場合は、工程（１）のオートタキシンの反応を停止させたのちにリゾホスホリパーゼを添加する等多段階に反応を分けて実施すればよい。反応を停止させる方法としては、ＥＤＴＡ等のキレート剤の添加、ｐＨの酸性側への変更、あるいは活性部位に結合する抗体の添加等が挙げられる。また、医薬用途としてオートタキシン阻害剤の探索が現在活発に進められていることから、これらの阻害剤を用いることもできる。このようにしてリゾホスホリパーゼを添加することによって、工程（１）で生成するグリセロール及び工程（１ａ）で生成するグリセロール−３−リン酸の両物質が工程（２）の酵素サイクリング反応に関与することが出来るため、実質的に２倍のオートタキシン活性測定感度が得られることになる。リゾホスホリパーゼを添加するかしないかは、試料中のオートタキシン活性量に応じて適宜選択すればよい。
工程（１ａ）は、工程（２）に先立って行うこともでき、工程（２）と同時に行うこともできる。例えば、工程（１）のオートタキシン反応を停止させたのちに、グリセロールキナーゼとリゾホスホリパーゼを工程（１）で得られた処理物に添加し、工程（２）の実施と並行して工程（１ａ）を行うこともできる。
【００２９】
次に、本実施の形態に係る方法の工程（２）について説明する。工程（２）おいて用いることのできるグリセロールキナーゼは、少なくとも脱リン酸化反応とリン酸化反応を行う可逆反応性を示し、ヌクレオシド部分が異なる２種類以上のヌクレオチド補酵素に作用する酵素であれば、その由来を問わずに使用することができる。該酵素はトリグリセリド測定用として汎用されているため、数多くの微生物由来酵素が市販されており入手は容易である。例えば、Cellulomonas属由来の酵素が東洋紡(株)から、 Flabobacterium meningosepticum由来の酵素が旭化成ファーマ(株)から市販されている。これらの由来細胞や組織を培養し、該酵素を単離精製して常法により取得してもよい。例えば微生物を培養後、カラムクロマトグラフィ法等の公知の精製法を組み合わせて、実用レベルまで純度を高めた酵素を取得することができる。また、遺伝子を組み込んだ大腸菌等の形質転換細胞を培養して酵素を取得することもできる。さらに、本実施の形態に係るグリセロールキナーゼは、酵素特性を向上する目的等で遺伝的に改変されたものであってもよい。例えば当該改変酵素タンパク質をコードする遺伝子を常法により単離し、遺伝子組み換え技術を用いて適当な宿主中で発現させる方法によって改変酵素を取得することができる。
【００３０】
グリセロールキナーゼの正反応及び逆反応におけるヌクレオチド補酵素（ヌクレオシドリン酸）に対する特異性を確認する方法としては、例えばヌクレオシドリン酸について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法による公知の検出法を使用して反応生成物を確認することで可能である。
【００３１】
また、正反応のヌクレオチド補酵素に対する特異性は、正反応の生成物であるグリセロール−３−リン酸を、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ及びパーオキシダーゼと組合せ、４−アミノアンチピリン等のカップラーとフェノール等の水素供与体の存在下、発色反応として容易に確認することができる。
【００３２】
グリセロールキナーゼの逆反応についての報告例は正反応ほど多くはないものの、逆反応が進行するかについては、生成物の検出により、実験により容易に確認することができる。例えば、Eur J Biochem 267, 2323-2333,2000には、逆反応により生成するＡＴＰをルシフェリンの存在下にルシフェラーゼを用いて化学発光量として検出する方法が例示されている。このようにして逆反応が確認された場合、さらに反応時のｐＨを変化させ、逆反応の至適ｐＨを調べておくことで、本実施の形態における工程（２）の条件を設定するときの参考とすることができる。逆反応の程度は、特に限定されないが、好ましくは相対活性として正反応の１．５%以上あればよい。
【００３３】
工程（２）における、異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を正反応または逆反応における反応物として利用するグリセロールキナーゼは、正反応及び逆反応のそれぞれについて最もよく作用する異なるヌクレオシド部分を持つヌクレオチド補酵素に対して、例えば４％以上、好ましくは８％以上の特異性を有することが望ましいがこれに限定されない。
【００３４】
本実施の形態に係る方法において、「ヌクレオチド補酵素」とは、ヌクレオシドのリン酸化物をいう。本実施の形態に係る方法で用いられる第一のヌクレオチド補酵素及び第二のヌクレオチド補酵素は、互いにヌクレオシド部分が異なるヌクレオチド補酵素である。
【００３５】
本実施の形態に係る方法において、「正反応による第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物脱リン酸化物」とは、キナーゼ正反応において、第一のヌクレオチド補酵素からリン酸がキナーゼの正反応基質へと転移した後の、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物のことをいう。また、「逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物脱リン酸化物」とは、キナーゼ逆反応において、キナーゼの逆反応基質から第二のヌクレオチド補酵素へとリン酸が転移した後の、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物のことをいう。ここで、転移するリン酸の個数は、１個でもよいし、２個でもよいし、３個でもよい。好ましくは１個である。
【００３６】
本実施の形態に係る方法におけるヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分は、天然に存在する物質にとどまらず、化学的あるいは酵素的に合成されたその誘導物質、及び類似物質を含むことを意味する。
【００３７】
尚、本実施の形態に係る方法の工程（２）は、１種類のグリセロールキナーゼにより実施が可能であるが、例えば、同一のサイクリング反応を触媒する２種類以上の起源の異なるグリセロールキナーゼを用いて実施することもできる。
【００３８】
本実施の形態に係る方法で用いられるヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の種類は特に限定されないが、例えば、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシン等が挙げられる。また、それらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよい。
【００３９】
ヌクレオチド補酵素としては、例えばリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
【００４０】
ヌクレオチド補酵素としてのリボヌクレオチドの具体例としては、ＡＴＰ、ＡＤＰ、アデニル酸（ＡＭＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン２リン酸（ＧＤＰ）、グアニル酸（ＧＭＰ）、５−メチルウリジン３リン酸（ＴＴＰ）、５−メチルウリジン２リン酸（ＴＤＰ）、５−メチルウリジン１リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン３リン酸（ＵＴＰ）、ウリジン２リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン１リン酸（ＵＭＰ）、シチジン３リン酸（ＣＴＰ）、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）、シチジン１リン酸（ＣＭＰ）、キサントシン３リン酸（ＸＴＰ）、キサントシン２リン酸（ＸＤＰ）、キサントシン１リン酸（ＸＭＰ）、イノシン３リン酸（ＩＴＰ）、イノシン２リン酸（ＩＤＰ）、及びイノシン１リン酸（ＩＭＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
また、ヌクレオチド補酵素としてのデオキシリボヌクレオチドの具体例としては、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシアデノシン２リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン１リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン３リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシグアノシン２リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン１リン酸（ｄＧＭＰ）、チミジン３リン酸（ｄＴＴＰ）、チミジン２リン酸（ｄＴＤＰ）、チミジン１リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン３リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシウリジン２リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン１リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン３リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシシチジン２リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン１リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシキサントシン３リン酸（ｄＸＴＰ）、デオキシキサントシン２リン酸（ｄＸＤＰ）、デオキシキサントシン１リン酸（ｄＸＭＰ）、デオキシイノシン３リン酸（ｄＩＴＰ）、デオキシイノシン２リン酸（ｄＩＤＰ）、及びデオキシイノシン１リン酸（ｄＩＭＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
好ましいヌクレオチド補酵素は、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＸＴＰ、ＸＤＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＸＴＰ、ｄＸＤＰ、ｄＩＴＰ、及びｄＩＤＰ等であるが、これらに限定されない。
【００４３】
これらのヌクレオチド酵素には、場合によって、後述の工程（３）における変化量の検出が容易になるよう、例えば発色能力を有する置換基等が結合していてもよい。
【００４４】
本実施の形態に係る方法の工程（２）の正反応における第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分としては、ヌクレオチド補酵素について上述したものが挙げられ、好ましくは、アデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシン等が挙げられ、さらに好ましくは、アデノシンが挙げられる。
また、それらのリン酸化物である第一のヌクレオチド補酵素は、１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよいが、一態様において、グリセロールキナーゼにより脱リン酸化されるという観点から３リン酸化物が好ましい。第一のヌクレオチド補酵素の具体例としては、前述の具体例に加え、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＸＴＰ、ＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＸＴＰ及びｄＩＴＰ等が挙げられる。
【００４５】
本実施の形態に係る方法の工程（２）の逆反応における第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分としては、ヌクレオチド補酵素について上述したものが挙げられ、好ましくは、イノシン、グアノシン、アデノシン、及びデオキシグアノシン等が挙げられ、さらに好ましくは、イノシンが挙げられる。
また、それらのリン酸化物である第二のヌクレオチド補酵素は、１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよい、一態様において、グリセロールキナーゼによりリン酸化されるという観点から２リン酸化物が好ましい。第二のヌクレオチド補酵素の具体例としては、前述の具体例に加え、さらに好ましくはＡＤＰ、ＧＤＰ、ＴＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＸＤＰ、ＩＤＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＸＤＰ及びｄＩＤＰが挙げられる。
【００４６】
本実施の形態に係る方法で用いられる、第一のヌクレオシチ補酵素及び第二のヌクレオチド補酵素の好ましいヌクレオシド部分は、互いに異なる限り、特に限定されず、例えば、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシアデノシン等が挙げられる。例えば、第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の組み合わせとしては、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、又はイノシンとアデノシンが挙げられる。さらに好ましくは、第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がイノシンである。
本実施の一形態において、好ましくは、第一のヌクレオシチ補酵素がＡＴＰであり、第二のヌクレオチド補酵素がＩＤＰである。
【００４７】
本実施の形態に係る方法の工程（２）おけるサイクリング反応は、例えば、以下の要領で行う。
【００４８】
例えば、グリセロールキナーゼの存在下に、第一のヌクレオチド補酵素としてヌクレオシド３リン酸及び第二のヌクレオチド補酵素としてヌクレオシド２リン酸を過剰量、具体的には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１２ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上６ｍｍｏｌ／Ｌ以下用意し、これに反応中のｐＨを維持するためｐＨ緩衝剤を２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下加えて反応液とする。ｐＨ緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、並びにＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液等が挙げられる。
反応時のｐＨは、適宜反応が効率的に進行する条件を選べばよいが、通常はｐＨ５．０以上ｐＨ９．０以下の中性付近に調整し、グリセロールキナーゼの活性化剤である塩化マグネシウム等の金属塩を例えば０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上２０ｍｍｏｌ／Ｌ以下添加する。そして、上記反応液を予め２５℃以上４２℃以下、より好ましくは３７℃付近に加温し、工程（１）及び場合により工程（１ａ）により生成した、ヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド２リン酸に比べて微量（例えば、ヌクレオシド３リン酸及びヌクレオシド２リン酸のどちらか少ない方のヌクレオチド補酵素の１／１０以下のモル量）のグリセロール（工程（１）の生成物）及び場合によりグリセロール−３−リン酸（工程（１ａ）の生成物）の存在下で反応を開始すればよい。
【００４９】
一般的な酵素サイクリング反応において、そのサイクリング率は酵素量に依存し、基質に対するミカエリス定数（Ｋｍ値）が小さいほど、少ない酵素量でより高い感度が得られることが知られている。そこで、加えるグリセロールキナーゼ量の目安としては、反応液１ｍＬ当たりグリセロール及びグリセロール−３−リン酸のうち大きいほうのＫｍ値（ｍｍｏｌ／Ｌ）の１倍以上、好ましくは２倍以上の酵素単位（ユニット：ｕ）、添加すればよい。上限は、実質的に添加可能な量であれば特に制限されない。グリセロール及びグリセロール−３−リン酸に対するグリセロールキナーゼのＫｍ値は公知の方法により求めることができる。なお、上記の添加量は、一例であってこれらに限定されるものではない。
例えば、Candida mycoderma由来グリセロールキナーゼの、グリセロールに対するＫｍ値は０．０１５ｍｍｏｌ／Ｌ、グリセロール−３−リン酸に対するＫｍ値は０．０８ｍｍｏｌ／Ｌと報告されている（J Biol Chem 249, 2562-2566, 1974）ので、上記の酵素添加量の目安に従えば、この酵素を好ましくは０．０８Ｕ／ｍＬ以上添加することが好ましいが、これに限定されない。
工程（２）は、１種類のグリセロールキナーゼにより実施が可能であるが、起源の異なる２種以上のグリセロールキナーゼを用いて実施することもできる。
【００５０】
本実施の形態に係る方法の工程（３）について、以下に説明する。
工程（３）においては、第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物のいずれか１以上の変化量の検出は、各検出対象を測定可能な方法を用いて適宜行うことができ、例えば、各検出対象の変化量に対応するシグナルの変化量を測定することによって検出することができる。
検出する変化量は、第一のヌクレオチド補酵素又は第二のヌクレオチド補酵素の減少量でも、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物又は第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の増加量でもよく、検出の簡便性の観点から、好ましくは第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物又は第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の増加量である。
各検出対象の変化量またはこれに対応するシグナルの変化量を検出する方法としては、公知のＨＰＬＣ法等を用いることができる。ＨＰＬＣ法を用いる場合はキレート剤等を添加して酵素反応を終了させてから、逆相カラム等適宜選択し、反応前後の検出対象を定量すればよい。ＨＰＬＣ分析法についての情報は、樹脂メーカーから容易に入手できる。
【００５１】
また、本実施の形態に係る方法の工程（３）は：正反応による第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素を基質としない検出用酵素を用いて、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物の増加量に対して変化するシグナル変化量を検出してもよい。あるいは、第一のヌクレオチド補酵素を基質としないが、逆反応による第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素を用いて、逆反応による第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の増加量に対して変化するシグナル変化量を検出してもよい。
【００５２】
例えば、第一のヌクレオチド補酵素にＩＴＰ、ＧＴＰ又はＣＴＰを、第二のヌクレオチド補酵素にＡＤＰを用いる場合、ＡＴＰのみを特異的に検出できる酵素により第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物であるＡＴＰのみを検出することができる。ヌクレオチド補酵素の特異性については文献情報を参考にして適宜選択すればよい。例えば、酵素番号ＥＣ６に属する合成酵素の中には、ＡＴＰのみを特異的に検出する酵素が多々報告されており、例えば、大腸菌由来のＮＡＤ合成酵素（ＥＣ  ６．３．１.５）はＡＴＰ以外のヌクレオチド補酵素に作用しないことがと報告されているので、これらの酵素を検出用酵素として用いることができる。
【００５３】
このように、本実施の形態に係る方法の工程（３）においては、用いるグリセロールキナーゼの特異性を考慮した第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素の組合せに留意して、適宜検出用酵素を選択すればよい。なお、補酵素に対する特異性は、酵素の起源のみならず、補酵素や酵素の添加量等の条件によっても左右される可能性があり、文献に報告された結果とは同一の特異性が得られない場合もあり得るため、検出用酵素の選択に当たってはその特異性を実際に確認することが望ましい。
【００５４】
本実施の一態様において、変化量の検出対象がＡＤＰである場合、検出用酵素として好ましくはアデノシン２リン酸依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いることができ、さらに好ましくはPyrococcus furiosus由来アデノシン２リン酸依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いることができる。ＡＤＰ依存性グルコキナーゼを用いた場合、生成物であるＡＭＰ又はグルコース−６−リン酸は既知の方法により定量することができる。
【００５５】
グルコース−６−リン酸の変化量は、一態様において、チオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤのいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）の存在下、ＡＤＰの増加量に対応して変化するシグナルの変化量により検出することができ、例えば還元型ＮＡＤ（Ｐ）に基づく３４０ｎｍの吸光度変化量として測定することができる。また、ＮＡＤ（Ｐ）の代わりにチオＮＡＤ（Ｐ）等の補酵素アナログを用いることもできる。
一例として、還元型ＮＡＤ（Ｐ）に基づく吸光度変化量の測定は、例えばニトロテトラゾリウムブルー（Ｎｉｔｒｏ−ＮＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等の水素受容体の存在下：電子キャリヤーである１−メトキシＰＭＳを用いて；或いは、酵素ジアホラーゼを用いてホルマザン色素を形成して；可視部吸光度の測定によっても定量することができる。これらの化合物は市販されており、容易に入手することができる。また、蛍光試薬や発光試薬と組み合わせて検出することもできる。
【００５６】
あるいは、グルコース−６−リン酸の変化量を、Ｇ６ＰＤＨを用いる酵素サイクリング法により高感度に定量することもできる（特許第３０３６７０８号）。これらの変化するシグナルの変化量を検出する工程は、本実施の形態に係る方法におけるサイクリング反応と同時に実施しても、あるいは別個に実施してもよい。
【００５７】
本実施の形態に係る方法の工程（４）について、以下に説明する。
工程（４）において、工程（３）で検出された変化量に基づき試料中のオートタキシンの活性を算出する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、工程（２）における酵素サイクリング反応において、正反応により生成する第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物及び逆反応により生成する第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物は、時間に比例して増加する。よって、試料中の被検物質の量を算出するには、工程（２）における酵素サイクリング反応の反応時間を規定し（例えば反応開始から５分後〜７分後等）、濃度や活性が既知の基準となる物質（キャリブレーター）を対照において、キャリブレーターの変化に対応するシグナルの変化量を測定することによって、試料中の被検物質の量を計算することができる。
【００５８】
本実施の形態に係る方法の工程（４）において試料中のオートタキシンの活性量を算出するには、具体的には、例えば以下の要領で行う。
【００５９】
工程（２）の酵素サイクリング反応に先だって、工程（１）のオートタキシン反応を一定時間実施し、熱処理等の操作によりオートタキシン活性を止め、その一部または全量を酵素サイクリング反応に供する。キャリブレーターには、グリセロールキナーゼの基質又はそのリン酸化物であるグリセロール又はグリセロール−３−リン酸を用いることができる。酵素活性は、単位時間当たりの触媒能力、すなわち物質変化量を表す量であり、当該例の場合、オートタキシン反応により生成するグリセロール及び／又はグリセロール−３−リン酸は時間に比例して増加する。従って、生成したグリセロール及び／又はグリセロール−３−リン酸の量をオートタキシンの反応時間で割れば、オートタキシン活性を算出することができる。
【００６０】
また、オートタキシン反応の生成物であるグリセロールのみを検出する場合は、工程（２）の酵素サイクリング反応と工程（１）のオートタキシン反応を同時に実施することもできる。このような場合、工程（１）のグリセロールの生成量は時間に比例して増加することから、このグリセロールを用いた工程（２）の酵素サイクリング反応において生成するヌクレオチド補酵素のリン酸化物及び脱リン酸化物の量は時間に比例せずに、二次関数的に増加することが知られている。従って、酵素活性が既知のオートタキシンをキャリブレーターに用いれば、容易に試料中のオートタキシン活性を算出することができる。キャリブレーター用途に用いるオートタキシンは、血清を精製するか、あるいは既知の遺伝子組換え法によって取得すればよい。また、オートタキシンをキャリブレーターとして用いることができない場合でも、グリセロールやグリセロール−３−リン酸等の濃度が既知の物質を用い、予め酵素サイクリング反応単独でのサイクリング率ｋcを実測しておけば、次式のように計算によって酵素活性を求めることもできる：
酵素活性（単位時間当たりのグリセロール生成量）＝  2ｐ/（ｋc・ｔ2）
（式中、ｔ＝反応時間、ｐ＝反応開始から時間ｔまでの生成物濃度（吸光度変化量より計算））
【００６１】
一態様において、本実施の形態の測定方法は：
（１）試料とリゾホスファチジルグリセロールを接触せしめ、リゾホスファチジルグリセロールからグリセロールとリゾホスファチジン酸を生成せしめる処理をする工程、（１a）リゾホスホリパーゼと工程（１）で得られた処理物とを接触せしめ、リゾホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸を生成せしめる処理をする工程；
（２）グリセロールキナーゼであって、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の存在下、グリセロールからグリセロール−３−リン酸を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応においてＡＴＰを利用し、逆反応においてイノシン２リン酸（ＩＤＰ）を利用する、グリセロールキナーゼと、ＡＴＰと、ＩＤＰと、を、工程（１）及び（１ａ）で得られた処理物と接触せしめ、下記式（ＩＩ）
【化４】
0006522466.tif 000005
のサイクリング反応を実施せしめる工程；
（３）ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ、及びＮＡＤのいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼの存在下、工程（２）におけるＡＤＰの増加量を検出する工程；及び
（４）工程（３）で検出されたＡＤＰの増加量に基づき、試料のオートタキシン活性を算出する工程；
を含む。各工程については、上述したとおりに行うことができる。
【００６２】
本実施の形態は、また、上記のオートタキシン活性の測定方法を含む、臨床検体検査方法にも関する。このような方法としては、例えば、血液や脳脊髄液、胸水、腹水、尿等の体液を臨床検体に用いた検査方法が挙げられ、自己血糖測定装置に代表される装置のように、上記のオートタキシン活性の測定方法によりオートタキシン活性を検出するシステムを具備し、場合により検体採取システム及び／又は検体処理システムを具備したポイントオブケア検査（ＰＯＣＴ）装置で実施される検査方法であってもよい。
【００６３】
さらなる本実施の形態は、試料中のオートタキシン活性測定用組成物であって、
（ａ）リゾホスファチジルグリセロールと、
（ｂ）グリセロールキナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、それぞれ異なるヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するグリセロールキナーゼと、
（ｃ）第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｄ）第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、第二のヌクレオチド補酵素と、
を含む、組成物である。
【００６４】
本実施の形態の係る組成物はさらに：
リゾホスホリパーゼ；
第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素を基質としない検出用酵素、又は第一のヌクレオシド補酵素を基質としないが、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素；並びに
チオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ及びＮＡＤのいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ；
のいずれか一以上を含むものであってもよい。
【００６５】
上記の組成物中の各成分については、本実施の形態に係る方法で説明したとおりである。
【００６６】
本実施の形態に係る組成物を用いれば、例えば上記の本実施の形態に係るオートタキシン活性の測定方法を実施可能である。
【００６７】
本実施の形態に係る組成物は、オートタキシン活性測定用の試薬キットであってもよい。本実施の形態における「試薬キット」は、複数の試薬に分けられていてもよく、一つにまとまっていてもよい。例えば、本実施の形態に係る組成物を、適宜二つ又は三つ以上の試薬に振り分けて試薬キットとしてもよい。例えば、上記の各工程（１）〜（４）に関与する成分のそれぞれを、適宜一つ又は二つ以上の試薬に分けた試薬キットとすることができる。
具体的には、例えば：ＡＴＰ、グルコース、ＮＡＤＰ、及びＡＤＰ依存性グルコキナーゼを一方の試薬に、リゾホスファチジルグリセロール、ＩＤＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びグリセロールキナーゼを他方の試薬に振り分けた試薬キットとすることもできるし；リゾホスファチジルグリセロール、ＡＴＰ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びＡＤＰ依存性グルコキナーゼを一方の試薬に、ＩＤＰ、ＮＡＤＰ、グルコース及びグリセロールキナーゼを他方の試薬に振り分けた試薬キットとすることもできる。
さらに、例えばチオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤと、グルコースと、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物を基質とするが、第二のヌクレオチド補酵素は基質としない検出用酵素、あるいは第一のヌクレオチド補酵素は基質としないが、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物を基質とする検出用酵素を含む組成物を、適宜上記二つ又は三つ以上の試薬キットに振り分けることができる。
一態様において、好ましくは、ＡＴＰ、グリセロールキナーゼ及びＩＤＰを含む組成物を適宜二つの試薬キットに分けることができる。さらにＮＡＤＰ、ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを適宜二つの試薬キットに振り分けてもよい。
それぞれの成分は、それぞれ分けられた複数の試薬中に重複して含まれてもよい。
【００６８】
本実施の形態は、また、上記のオートタキシン活性測定用組成物を含む、オートタキシン活性測定用の臨床検体測定装置にも関する。このような装置としては、例えば、血液や脳脊髄液、胸水、腹水、尿等の体液を臨床検体として、自己血糖測定装置に代表される装置のように、上記のオートタキシン活性測定用組成物によりオートタキシン活性を検出するシステムを具備し、場合により検体採取システム及び／又は検体処理システムを備えたポイントオブケア検査（ＰＯＣＴ）装置が挙げられる。
【実施例】
【００６９】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【００７０】
実施例１  血清中のオートタキシン活性の測定１
【００７１】
（１）グリセロールキナーゼサイクリングによる既知濃度グリセロールの測定
［反応液１］
５０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
１０ｍＭ  グルコース
１ｍＭ  ＮＡＤ
１０ｍＭ  塩化マグネシウム
１ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ）
１ｕ／ｍＬ  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  デオキシＡＴＰ
２０ｕ／ｍＬ  グリセロールキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＧＫＺ）
上記反応液１を１ｍＬ、３７℃にて予備加温した。０．２ｍｍｏｌ／Ｌのグリセロール溶液を０．０２５ｍＬ加え、さらに２０ｍｍｏｌ／Ｌに調製したＩＤＰ溶液を０．０２ｍＬ添加して、酵素サイクリング反応を開始した。グリセロール溶液の代わりに生理食塩水を添加し、同様の操作を行ったものを試薬ブランクとした。グリセロール溶液と生理食塩水のそれぞれについて、反応開始から３分後及び５分後の還元型ＮＡＤ生成に伴う３４０ｎｍにおける吸光度を読み取り、２分間当たりの吸光度変化量を求めたところ、それぞれ、０．０７１３、０．０１５１であった。
【００７２】
（２）オートタキシン反応
１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようリゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ（シグマ社製）を秤量し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に溶解させた。正常人血清（ビジコムジャパンより購入）１容に対して、０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ塩酸緩衝液０．２溶、５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム０．０７２溶、前記ＬＰＧ溶液０．４溶を加え、３７℃にて反応を開始した（合計１．６７２溶）。反応直後、３０分後及び６０分後に、それぞれ０．０２５ｍＬずつサンプリングし、（１）で用いた反応液１に添加し、（１）と同様の操作を行い、反応開始から３分後及び５分後の吸光度を読み取り、２分間当たりの吸光度変化量を求めた。吸光度変化量は、それぞれ０．０４００、０．０４４２及び０．０４７５と、血清の加温時間に従い増加した。
【００７３】
（３）オートタキシン活性の計算
以下に血清の加温時間３０分の場合を例に、計算方法を示す。３０分の吸光度変化量は（０．０４４２−０．０４００）で求まるので、血清とＬＰＧを含んだ液中のグリセロール濃度は、０．２（ｍｍｏｌ／Ｌ）ｘ（０．０４４２−０．４００）／（０．０７１３−０．０１５１）＝０．０１４９４７（ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。これが３０分当たりのグリセロール濃度の変化量に相当するので、血清中の酵素活性に換算するためには、この変化量を時間で割り、さらに液量補正のための係数をかければよく、以下の式で算出される。血清中の酵素活性
＝（１４．９４７（μｍｏｌ／Ｌ）／３０（ｍｉｎ．））ｘ１．６７２
＝  ０．８３３Ｕ／Ｌ
同様に、血清を６０分間加温した場合の血清中の酵素活性は、０．７４４Ｕ／Ｌと算出された。尚、１分間当たり、１μｍｏｌの基質が変化する量を１Ｕ（ユニット）とした。
【００７４】
実施例２  遺伝子組換えオートタキシンンの活性測定
【００７５】
（１）遺伝子組換えオートタキシンの取得
ｃＤＮＡをＯＲＩＧＥＮ社より購入し、常法に従いヒトオートタキシン遺伝子を取得（例えば、J.Biol.Chem.283,7776-7789,2008参照）、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣ（American type culture collection）より入手）にて発現させた。
【００７６】
（２）活性測定（非サイクリング）
［反応液２−１］
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム
［反応液２−２］
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ
０．０３％  ４−アミノアンチピリン
０．０２％  Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、２ナトリウム塩（ＴＯＤＢ）
５Ｕ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ（西洋わさび由来、シグマ社製）
２Ｕ／ｍＬ  グリセロールキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＧＫＺ）
１０Ｕ／ｍＬ  グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ製：ＧＰＯＳＰ）
遺伝子組換えオートタキシンがリゾホファチジルグリセロール（ＬＰＧ）を基質として用いることができるか調べた。活性測定の原理は以下のとおりである。
オートタキシンの作用で生成するグリセロールを、ＧＫＺ及びＧＰＯＳＰの作用で過酸化水素に変換し、これに色原体の存在下でペルオキシダーゼを添加し、５５０ｎｍでの吸光度として定量する。
まず、２０ｍｍｏｌ／ＬのＬＰＧを０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて調製した。
反応液２−１中のＬＰＧ濃度が、それぞれ０．５、１、２、５及び１０ｍｍｏｌ／Ｌになるように調整した。これを０．２５ｍＬ試験管に分注し、３７℃予備加温した後、０．１ｍｇ／ｍＬの遺伝子組換えオートタキシンを０．０２５ｍＬ添加し、３７℃２０分間反応させた。
次いで、予め３７℃に加温した反応液２−２を０．７５ｍＬ加え、添加５分後の、５５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
基質濃度と吸光度の関係を図１に示した。遺伝子組換えオートタキシンは、ＬＰＧにも作用していること、またその酵素活性は基質濃度依存的であることが示された。また、ＴＯＤＢの分子吸光係数を３，８０００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍとして、ＬＰＧ濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌの時の０．１ｍｇ／ｍＬの遺伝子組換えオートタキシンの活性は０．０１９５Ｕ/ｍＬと計算された。従って、重量当たりの活性に換算すると、０．１９５Ｕ／ｍｇとなった。
【００７７】
実施例３  遺伝子組換えオートタキシンの定量性
［反応液３−１］
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム
１５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＬＰＧ（０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）
［反応液３−２］
実施例２における反応液２−２に同じ
遺伝子組換えオートタキシンがリゾホファチジルグリセロール（ＬＰＧ）に作用することが実施例２により確認された。そこで、ＬＰＧを１５ｍｍｏｌ／Ｌになるように反応液３−１を調製し、遺伝子組換えオートタキシンの定量性を調べた。すなわち反応液１を０．２５ｍＬ試験管に分注し３７℃予備加温し、０．０１、０．０２、０．０５、０．１及び０．２ｍｇ／ｍＬの濃度の遺伝子組換えオートタキシンを、それぞれ０．０２５ｍＬ添加し、３７℃２０分間反応させた。次いで、予め３７℃に加温した反応液３−２を０．７５ｍＬ加え、添加５分後の５５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。基質濃度と吸光度の関係を図２に示した。吸光度は酵素濃度にほぼ比例して増大した。
【００７８】
実施例４  リゾホスホリパーゼの併用
［反応液４−１］
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム
０．２５ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＬＰＧ（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）
２ｍｍｏｌ／Ｌ  デオキシＡＴＰ
［反応液４−２］
１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）
１０ｍＭ  グルコース
１．３ｍＭ  チオＮＡＤ（オリエンタル酵母工業製）
１２ｍＭ  塩化マグネシウム
１．５ｕ／ｍＬＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ）
１．５ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
５．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ
２７ｕ／ｍＬ  グリセロールキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＧＫＺ）
１ｕ／ｍＬ  リゾホスホリパーゼ（旭化成ファーマ製：ＬＹＰＬ）
上記各反応液を調製した。０．２５ｍＬの反応液４−１に対して、血清を０．００５、０．０１、０．０１５及び０．０２５ｍＬ（試料添加量が０．０２５ｍＬになるように生理食塩水を用いて液量を補正した）添加し、３７℃にて１０分間反応させた。この時、それぞれの血清量に対して、ＬＰＧを添加しないものを検体ブランクとした。次いで、反応液４−２を０．７５ｍＬ添加し、４００ｎｍにおける吸光度をモニターした。反応液添加から２分後〜７分後の吸光度変化量を計算し、それぞれの検体ブランクにおける同変化量を差し引いた。
これとは別に、反応液４−２からリゾホスホリパーゼ（ＬＹＰＬ）を除いた試薬を調製し、同様の操作を実施した。
結果を図３に示した。ＬＹＰＬを添加することにより、オートタキシン反応の生成物であるホスファチジン酸からグリセロール−３−リン酸が生成され、これがグリセロールキナーゼサイクリング反応の基質となるため、ＬＹＰＬを添加しない場合に比べて、ほぼ２倍の感度が得られた。
【００７９】
実施例５  血清中のオートタキシン活性の測定２
従来法としてＬＰＣを基質に用い、遊離されたコリンを測定する方法と本発明法を、５種類のヒト血清（ビジコムジャパンより購入）を用いて比較した。
【００８０】
（従来法）
［比較例反応液１］
１００ｍＭ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）
５００ｍＭ    ＮａＣｌ
５ｍＭ    塩化マグネシウム
５ｍＭ    塩化カルシウム
２ｍＭ    リゾホスファチジルコリン（卵黄レシチン由来：シグマ社製）
０．０５％    Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
［比較例反応液２］
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
０．０３％  ４−アミノアンチピリン
０．０２％  Ｎ−エチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）
５Ｕ／ｍＬ  ペルオキシダーゼ（西洋わさび由来、シグマ社製）
１０Ｕ／ｍＬ  コリン酸オキシダーゼ（旭化成ファーマ製：ＣＯＤ）
０．１ｍＬの上記比較例反応液１に各々の血清を０．０２ｍＬ分注し、３７℃３時間酵素反応を行った。その後、比較例反応液２を２ｍＬ加え、３７℃で５分間加温後、５５５ｎｍの吸光度を測定した。各々の検体について、３７℃３時間の酵素反応を行なわないものを検体ブランクとし、この吸光度を差し引いた。
【００８１】
（本発明法）
［反応液５−１］
１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム
０．２５ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウム
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＬＰＧ（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）
［反応液５−２］
１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）
１０ｍＭ  グルコース
１ｍＭ  ＮＡＤＰ（オリエンタル酵母工業製）
１２ｍＭ  塩化マグネシウム
１．５ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ）
１．５ｕ／ｍＬ  グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ
１００ｕ／ｍＬ  グリセロールキナーゼ（旭化成ファーマ製：ＧＫＺ）
［反応液５−３］
１０ｍＭ  デオキシＡＴＰ
反応液５−１を０．１ｍＬに対し血清０．０２ｍＬ加え、３７℃１５分加温した。また、加温しないものを検体ブランクとした。その後反応液５−２を１ｍＬ加え、さらに反応液５−３を０．０５ｍＬ加えて酵素サイクリング反応を開始した。反応液５−３添加後、３分後〜５分後の３４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定し、各々の検体ブランクの測定値を差し引いた。両方法の測定結果を図４に示した。従来法との相関は良好であり、また従来法の３時間に比べて本法のオートタキシン反応は１５分と、より短時間でオートタキシンを測定できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によれば、ＬＰＣや遊離コリン等の内在性オートタキシン基質又はその生成物の影響を受けず、採血後に増加するＬＰＣ等のオートタキシン基質の影響も受けず、安価且つ簡便に、オートタキシンの活性を測定する方法及び測定用組成物を提供することができるという産業上の利用可能性を有する。本発明は、特に、医薬、医療、疾病診断、検体検査、試薬等の分野において有用である。
【図１】
0006522466.tif 000008
【図２】
0006522466.tif 000009
【図３】
0006522466.tif 000010
【図４】
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