(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（１）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化１】
0006450394.tif 000009
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼがクレアチンキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）とグアノシン２リン酸（ＧＤＰ）の組み合わせ、及びデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）とデオキシグアノシン２リン酸（ｄＧＤＰ）の組み合わせからなる群から選択され、
前記正反応基質がクレアチンであり、
前記正反応基質のリン酸化物がクレアチンリン酸であり、
前記誘導前物質がクレアチニンである、
測定方法。
【請求項２】
前記誘導前物質を、前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理において、クレアチニンに、水の存在下、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）を接触させることを含む、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（２）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化２】
0006450394.tif 000010
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼが３−ホスホグリセリン酸キナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、又はグアノシン３リン酸（ＧＴＰ）とアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質が３−ホスホグリセリン酸である、
測定方法。
【請求項４】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（３）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化３】
0006450394.tif 000011
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼがホスホフルクト−１−キナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がフルクトース−６−リン酸である、
測定方法。
【請求項５】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（４）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化４】
0006450394.tif 000012
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼがグリセロールキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、又はデオキシアデノシン３リン酸とイノシン２リン酸の組み合わせであり、
前記正反応基質がグリセロールである、
測定方法。
【請求項６】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（５）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化５】
0006450394.tif 000013
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼがピルビン酸キナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がピルビン酸であり、
前記正反応基質のリン酸化物がホスフォエノールピルビン酸である、
測定方法。
【請求項７】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（６）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化６】
0006450394.tif 000014
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼがヘキソキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）とアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がグルコースであり、
前記正反応基質のリン酸化物がグルコース−６−リン酸である、
測定方法。
【請求項８】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、前記キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には前記誘導前物質を前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（７）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化７】
0006450394.tif 000015
（２）前記第一のヌクレオチド補酵素、前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物、前記第二のヌクレオチド補酵素、及び前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法であって、
前記キナーゼがアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）とアデニル酸（ＡＭＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がグルコースであり、
前記正反応基質のリン酸化物がグルコース−６−リン酸である、
測定方法。
【請求項９】
測定対象が前記誘導前物質であり、前記試料が、前記誘導前物質を、前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料であり、  前記検出されたシグナルの変化量に基づき、前記誘導前物質の量が算出される、
請求項１から８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記シグナルの変化量を検出する工程において、正反応による前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、前記第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は前記第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが、逆反応による前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できる検出用酵素を用いて、前記正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物又は前記逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量に対応する前記シグナルの変化量を検出する、請求項１から９のいずれかに記載の測定方法。
【請求項１１】
前記シグナルの変化量を検出する工程において、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、グルコースの存在下、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する、請求項１から６及び８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１２】
前記シグナルの変化量を検出する工程において、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、の存在下、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する、請求項１から６及び８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１３】
前記シグナルの変化量を検出する工程において、グリセロールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）を用いて、グリセロールの存在下、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する、請求項３又は７に記載の測定方法。
【請求項１４】
前記シグナルの変化量を検出する工程において、グリセロールキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）を用いて、４−アミノアンチピリン、トリンダー試薬、Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ及びパーオキシダーゼの存在下、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）の増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する、請求項３又は７に記載の測定方法。
【請求項１５】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼがクレアチンキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、デオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）とグアノシン２リン酸（ＧＤＰ）の組み合わせ、及びデオキシアデノシン３リン酸（ｄＡＴＰ）とデオキシグアノシン２リン酸（ｄＧＤＰ）の組み合わせからなる群から選択され、
前記正反応基質がクレアチンであり、
前記正反応基質のリン酸化物がクレアチンリン酸であり、
前記誘導前物質がクレアチニンである、
組成物。
【請求項１６】
前記誘導前物質を、前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理において、クレアチニンに、水の存在下、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）を接触させ、クレアチンを誘導せしめる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼが３−ホスホグリセリン酸キナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、又はグアノシン３リン酸（ＧＴＰ）とアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質が３−ホスホグリセリン酸である、
組成物。
【請求項１８】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼがホスホフルクト−１−キナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がフルクトース−６−リン酸である、
組成物。
【請求項１９】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼがグリセロールキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせ、又はデオキシアデノシン３リン酸とイノシン２リン酸の組み合わせであり、
前記正反応基質がグリセロールである、
組成物。
【請求項２０】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼがピルビン酸キナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）とイノシン２リン酸（ＩＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がピルビン酸であり、
前記正反応基質のリン酸化物がホスフォエノールピルビン酸である、
組成物。
【請求項２１】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼがヘキソキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）とアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がグルコースであり、
前記正反応基質のリン酸化物がグルコース−６−リン酸である、
組成物。
【請求項２２】
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、前記誘導前物質を前記キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、前記正反応と前記逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）前記正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）前記第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、前記逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物であって、
前記キナーゼがアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼであり、
前記第一のヌクレオチド補酵素と前記第二のヌクレオチド補酵素の組み合わせが、シチジン２リン酸（ＣＤＰ）とアデニル酸（ＡＭＰ）の組み合わせであり、
前記正反応基質がグルコースであり、
前記正反応基質のリン酸化物がグルコース−６−リン酸である、
組成物。
【請求項２３】
測定対象が誘導前物質であり、当該誘導前物質を、前記キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられる、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
正反応による前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、前記第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は前記第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが、逆反応による前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物は利用できる検出用酵素を更に含む、請求項１５から２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
正反応による前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、前記第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は前記第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが、逆反応による前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物は利用できる検出用酵素を更に含み、
前記検出用酵素がアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）であり、グルコースを更に含む、請求項１５から２０及び２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
正反応による前記第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、前記第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は前記第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが、逆反応による前記第二のヌクレオチド補酵素の変化物は利用できる検出用酵素を更に含み、
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）と、
グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
を更に含む、請求項１５から２０及び２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
クレアチニンを測定するための測定用組成物であって、
当該クレアチニンに、水の存在下、クレアチニン  アミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）を接触させ、クレアチニンをクレアチンへと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、
（ａ）クレアチンキナーゼと、
（ｂ）アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）と、
（ｃ）イノシン２リン酸（ＩＤＰ）と、
（ｄ）アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）と、
（ｅ）グルコースと、
（ｆ）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）と、
（ｇ）グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
を備える、組成物。
【請求項２８】
請求項１５から２７のいずれか１項に記載の組成物を含む、試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナーゼを用いた酵素サイクリング法による新規な高感度測定方法、及びその組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素サイクリング法は、酵素の働きを利用して、ごく微量の物質の濃度を増幅して測定する手法である。従来、補酵素を測定する方法として、２種類の脱水素酵素を用いたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）サイクリング等、補酵素の高感度測定法が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。また、同じく２種類のキナーゼを用いて、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を測定するサイクリング法も報告されている（例えば、特許文献１参照。）。一方、補酵素ではなく基質を測定する酵素サイクリング法としては、２種類の転移酵素を用いて測定する方法と、１種類の酵素で測定する方法などが挙げられる。【０００３】
２種類の酵素を用いる方法としては、トランスアミナーゼと、ポリアミンオキシダーゼとを用いる方法が挙げられる（例えば、特許文献２参照。）。この方法は、プトレッシントランスアミナーゼとポリアミンオキシダーゼを用い、プトレッシンから４−アミノブタナール方向の反応はポリアミンオキシダーゼを、逆方向の反応はプトレッシントランスアミナーゼを用いた酵素サイクリング反応によりプトレッシンを定量する方法であり、具体的にはポリアミンオキシダーゼ反応で生成する過酸化水素を既知の発色法で測定する。同様に、ベンジルアミントランスアミナーゼとベンジルアミン酸化酵素を用いたベンジルアミン類、更にベンジルアミントランスアミナーゼとチラミン酸化酵素を用いたチラミンの測定法が報告されている（例えば、特許文献３、４参照。）。
【０００４】
また、１種類の酵素を用いたサイクリング法による測定方法としては、デヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている（例えば、特許文献５、６参照。）。この方法は酸化型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）又はそのアナログと、還元型補酵素ＮＡＤ（Ｐ）又はそのアナログの存在下、デヒドロゲナーゼの可逆反応性を利用した酵素サイクリング反応を進行せしめ、デヒドロゲナーゼの基質を高感度に定量する方法で、チオＮＡＤと還元型ＮＡＤの存在下３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼを用いた胆汁酸の定量や、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを用いたグルコース−６−リン酸の定量などに応用されている。【０００５】
従来、基質を測定対象とするキナーゼを用いた測定方法としては、例えばトリグリセリドを測定する方法等が知られている（例えば、非特許文献２参照。）。また、クレアチニンを測定する方法が知られている（例えば、特許文献７参照。）。この測定法は、クレアチニンをクレアチニンアミドヒドロラーゼの作用でクレアチンに変換し、更にＡＴＰの存在下、クレアチンキナーゼで、クレアチンリン酸とアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）に変換した後、このＡＤＰを測定することによりクレアチニンを測定する方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２２３１６３号公報
【特許文献２】特開平３−１８０２００号公報
【特許文献３】特開平７−１５５１９９号公報
【特許文献４】特開平７−１７７８９８号公報
【特許文献５】特開平３−２２４４９８号公報
【特許文献６】特開平４−３３５８９８号公報
【特許文献７】特開平９−２８５２９７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】生化学実験講座５  酵素研究法（上）、社団法人日本生化学会編集、東京化学同人、１９７５年、Ｐ１２１−１３５
【非特許文献２】酵素−バイオテクノロジーへの指針−  日本農芸化学会編集、朝倉出版、１９８５年、Ｐ９７−１０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、キナーゼ正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを、高い精度で測定可能な方法、及び組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
酵素サイクリング法による測定法は、添加する酵素量に応じて酵素反応によるシグナルが増加するため、酵素量を制御することにより高感度定量に適応できる技術である。特に、基質を定量する酵素サイクリング法においてキナーゼを用いたものはこれまで知られておらず、基質を定量する酵素サイクリング法における測定対象が限定されていた。また、キナーゼ反応は一般に正反応が逆反応に優先して進行するのが通常であり、逆反応を利用する酵素サイクリング法にキナーゼを応用するには技術的に困難とみられていた。【００１０】
一方、前述のように、キナーゼを用いた基質の測定方法としては、クレアチンキナーゼを用いて、クレアチニンを測定する方法などがあるが（例えば、特許文献７参照。）、キナーゼは一方向への化学両論的な変換反応のために用いられていたにすぎず、そのため、測定対象物の濃度が低い場合には必ずしも十分な感度が得られず、検体量を増やすなどで対処する必要があった。しかし検体量を増やすと共存物質の影響を受けやすくなるなど、実用性の面から問題があった。【００１１】
本発明者らは、これらの状況の中で、キナーゼの中に、キナーゼ反応の正反応と逆反応を両方とも触媒し、且つ正反応と逆反応で別異のヌクレオシド部分を持つ補酵素を利用するキナーゼが複数あり、これらを酵素サイクリング反応に応用したところ、驚くべきことに、キナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物、又はそれらへ誘導される誘導前物質を高感度で測定できることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
本発明は、例えば以下の構成を有する。
［１］キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応と逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を
試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（１）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化１】
0006450394.tif 000002
（２）第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の変化物、第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）検出されたシグナルの変化量に基づき、試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法。【００１３】
［１−１］
測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物である、上記［１］に記載の測定方法。【００１４】
［１−１−１］
測定対象がキナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物であり、測定対象とキナーゼの組み合わせが、表１に記載のいずれかである、上記［１］又は［１−１］に記載の測定方法。
【表１】
0006450394.tif 000003
【００１５】
［１−１−２］
測定対象がキナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物であって、測定対象とキナーゼの組み合わせが以下のいずれかである、上記［１］から［１−１−１］のいずれかに記載の測定方法。なお以下においては、測定対象：キナーゼの順に記載されている。また、そのリン酸化物とは、記載されたキナーゼ正反応基質に対応するリン酸化物である。
クレアチン／そのリン酸化物：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）
３−ホスホグリセリン酸／そのリン酸化物：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）
ピルビン酸／そのリン酸化物：ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４０）
フルクトース−６−リン酸／そのリン酸化物：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）
グリセロール／そのリン酸化物：グリセロールナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）
ヘキソース／そのリン酸化物：ヘキソキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１）
グルコース／そのリン酸化物：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  １．７．１．１４７）【００１６】
［１−２］
測定対象が誘導前物質であり、試料が、誘導前物質を、キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料であり、検出されたシグナルの変化量に基づき、誘導前物質の量が算出される、上記［１］に記載の測定方法。【００１７】
［１−２−１］
測定対象が誘導前物質であり、測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物の組み合わせが、表２に記載のいずれかである、上記［１］又は［１−２］に記載の測定方法。
【表２】
0006450394.tif 000004
【００１８】
［１−２−２］
測定対象が、誘導前物質であって、測定対象、キナーゼ、及びキナーゼ正反応基質／そのリン酸化物の組み合わせが以下の組み合わせのいずれかである、上記［１］、［１−２］及び［１−２−１］のいずれかに記載の測定方法。なお以下においては、測定対象：キナーゼ：キナーゼ正反応基質の順に記載されている。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）：クレアチン／そのリン酸化物
グリセロアルデヒド−３−リン酸、ヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、又は２，３−ビスホスホグリセリン酸：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）：３−ホスホグリセリン酸／そのリン酸化物
グルコース−６−リン酸：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）：ホスホフルクトース−６−リン酸／そのリン酸化物
ヒドロキシアセトンリン酸、トリグリセリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジルグリセロール、又はホスファチジルグリセロール：  グリセロキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）：  グリセロール／そのリン酸化物
グルコース−１−リン酸：  ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）：グルコース／そのリン酸化物
【００１９】
［１−２−３］  
測定対象が誘導前物質であるクレアチニン、キナーゼがクレアチンキナーゼ、キナーゼの正反応基質がクレアチンである、上記［１］、［１−２］及び［１−２−２］のいずれかに記載の測定方法。【００２０】
［１−２−４］
誘導前物質を、キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理において、クレアチニンに、水の存在下、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．５．２．１０）を接触させることを含む、上記［１］、及び［１−２］ないし［１−２−３］のいずれかに記載の測定方法。【００２１】
［２］
上記工程（２）が、第一のヌクレオチド補酵素の正反応変化物、又は第二のヌクレオチド補酵素の逆反応変化物の増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程である、上記［１］から［１−２−４］のいずれかに記載の測定方法。【００２２】
［３］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシンのいずれかであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１］〜［２］のいずれかに記載の測定方法。【００２３】
［４］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシアデノシンであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１］〜［３］に記載の測定方法。【００２４】
［５］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１］から［４］のいずれかに記載の測定方法。【００２５】
［６］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシグアノシンであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１］から［５］のいずれかに記載の測定方法。【００２６】
［７］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシアデノシンであって、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシグアノシンであり、かつ、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１］から［６］のいずれかに記載の測定方法。【００２７】
［７−１］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の組み合わせが、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、又はイノシンとアデノシンである、上記［１］から［７］のいずれかに記載の測定方法。【００２８】
［７−２］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであって、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、イノシンである、上記［１］から［７−１］のいずれかに記載の測定方法。【００２９】
［７−３］
第一のヌクレオチド補酵素がアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）であり、第二のヌクレオチド補酵素がイノシン２リン酸（ＩＤＰ）である、上記［１］ないし［７−３］のいずれかに記載の測定方法。【００３０】
［８］
シグナルの変化量を検出する工程において、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが、逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できる検出用酵素を用いて、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量に対応するシグナルの変化量を検出する、上記［１］ないし［７−３］のいずれかに記載の測定方法。【００３１】
［９］
シグナルの変化量を検出する工程において、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、グルコースの存在下、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する、上記［１］から［８］のいずれかに記載の測定方法。【００３２】
［１０］
シグナルの変化量を検出する工程において、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）のいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、の存在下、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する、上記［１］ないし［９］のいずれかに記載の測定方法。【００３３】
［１１］
測定対象が誘導前物質であるクレアチニンの測定方法であって、以下の工程を含む、上記［１］及び［１−２］から［１０］のいずれかに記載の測定方法。
（１）クレアチニンに、水の存在下、クレアチニン  アミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）を接触させ、クレアチンを定量的に誘導せしめる処理を行った試料、と、少なくとも以下の成分（ａ）〜（ｃ）とを接触せしめ、下記式（２）のサイクリング反応を反応せしめる工程と、
（ａ）クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）
（ｂ）ＡＴＰ
（ｃ）ＩＤＰ
【化２】
0006450394.tif 000005
（２）アデノシン２リン酸依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、チオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ、又はＮＡＤのいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、の存在下、アデノシン２リン酸の増加量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）上記（２）の工程の検出結果から、試料中のクレアチニンの量を算出する工程。【００３４】
［１２］  
キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを測定するための測定用組成物であって、測定対象が誘導前物質である場合には、誘導前物質をキナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、且つ
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応と逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える、組成物。【００３５】
［１２−１］
測定対象がキナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物である、上記［１２］に記載の組成物。【００３６】
［１２−１−１］
測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物であり、測定対象とキナーゼの組み合わせが、表３に記載のいずれかである、上記［１２］又は［１２−１］に記載の組成物。
【表３】
0006450394.tif 000006
【００３７】
［１２−１−２］
測定対象がキナーゼ正反応基質及び／又はそのリン酸化物であって、測定対象とキナーゼの組み合わせが以下の組み合わせのいずれかである、上記［１２］から［１２−１−１］のいずれかに記載の組成物。なお以下においては、測定対象：キナーゼの順に記載されている。また、そのリン酸化物とは、記載されたキナーゼ正反応基質に対応するリン酸化物である。
クレアチン／そのリン酸化物：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）
３−ホスホグリセリン酸／そのリン酸化物：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）
ピルビン酸／そのリン酸化物：ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４０）
フルクトース−６−リン酸／そのリン酸化物：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）
グリセロール：グリセロールナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）
ヘキソース／そのリン酸化物：ヘキソキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１）
グルコース／そのリン酸化物：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）【００３８】
［１２−２］
測定対象が誘導前物質であり、当該誘導前物質を、キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられる、上記［１２］に記載の組成物。【００３９】
［１２−２−１］
測定対象が誘導前物質であり、測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物の組み合わせが、表４に記載のいずれかである、上記［１２］又は［１２−２］に記載の組成物。
【表４】
0006450394.tif 000007
【００４０】
［１２−２−２］
測定対象が誘導前物質であって、測定対象、キナーゼ、及びキナーゼ正反応基質／そのリン酸化物の組み合わせが、以下の組み合わせのいずれかである、上記［１２］、［１２−２］及び［１２−２−１］のいずれかに記載の組成物。なお以下においては、測定対象：キナーゼ：キナーゼ正反応基質／そのリン酸化物の順に記載されている。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）：クレアチン／そのリン酸化物
グリセロアルデヒド−３−リン酸、ヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、又は２，３−ビスホスホグリセリン酸：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）：３−ホスホグリセリン酸／そのリン酸化物
グルコース−６−リン酸：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）：ホスホフルクトース−６−リン酸／そのリン酸化物）、（ジヒドロキシアセトンリン酸、トリグリセリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジルグリセロール、又はホスファチジルグリセロール：グリセロキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）：グリセロール／そのリン酸化物
グルコース−１−リン酸：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）：グルコース／そのリン酸化物【００４１】
［１２−２−３］
測定対象が誘導前物質であるクレアチニン、キナーゼがクレアチンキナーゼ、前記キナーゼの正反応基質がクレアチンである、上記［１２］及び［１２−２］から［１２−２−２］のいずれかに記載の組成物。【００４２】
［１２−２−４］
誘導前物質を、キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理において、クレアチニンに、水の存在下、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）を接触させ、クレアチンを誘導せしめる、上記［１２］、［１２−２］から［１２−２−３］のいずれかに記載の組成物。【００４３】
［１３］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１２］から［１２−２−４］のいずれかに記載の組成物。【００４４】
［１４］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシアデノシンであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１２］から［１３］のいずれかに記載の組成物。【００４５】
［１５］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン及びデオキシイノシンのいずれかであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１２］から［１４］のいずれかに記載の組成物。【００４６】
［１６］
第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシグアノシンであり、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１２］から［１５］のいずれかに記載の組成物。【００４７】
［１７］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシアデノシンであって、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がイノシン、グアノシン、アデノシン、又はデオキシグアノシンであり、かつ、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分が別異である、上記［１２］から［１６］のいずれかに記載の組成物。【００４８】
［１７−１］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の組み合わせが、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、又はグアノシンとアデノシンである、上記［１２］から［１７］のいずれかに記載の組成物。【００４９】
［１７−２］
第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がイノシンである、上記［１２］から［１７−１］のいずれかに記載の組成物。【００５０】
［１７−３］
第一のヌクレオチド補酵素がアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）であり、第二のヌクレオチド補酵素がイノシン２リン酸（ＩＤＰ）である、上記［１２］から［１７−２］のいずれかに記載の組成物。【００５１】
［１８］
正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが、逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物は利用できる検出用酵素を更に含む、上記［１２］から［１７−３］のいずれかに記載の組成物。【００５２】
［１９］
検出用酵素がアデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  １．７．１．１４７）であり、グルコースを更に含む、上記［１８］に記載の組成物。【００５３】
［２０］
チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）と、
グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
を更に含む、上記［１８］に記載の組成物。【００５４】
［２１］
測定対象が誘導前物質であるクレアチニンであり、
当該クレアチニンに、水の存在下、クレアチニン  アミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）を接触させ、クレアチニンをクレアチンへと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いられ、
（ａ）クレアチンキナーゼと、
（ｂ）アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）と、
（ｃ）イノシン２リン酸（ＩＤＰ）と、
（ｄ）アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）と、
（ｅ）グルコースと、
（ｆ）チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（チオＮＡＤＰ）、チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）と、
（ｇ）グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、
を備える、上記［１２−２］ないし［２０］のいずれかに記載の組成物。【００５５】
［２２］
上記［１２］から［２１］のいずれかに記載の組成物を含む、試薬キット。
【発明の効果】
【００５６】
本発明により、キナーゼの基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つを高感度で測定することが可能となる。【００５７】
本発明によれば、従来のサイクリング法では高感度に測定することが困難であった測定対象物質、例えば、フルクトース−６−リン酸、及びクレアチニン等を高感度に測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】クレアチンキナーゼを用いた試料中のクレアチン濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図２】クレアチンキナーゼを用い、反応液中にデオキシイノシン２リン酸（ＩＤＰ）を含めた実施例と、反応液中にＩＤＰを含めなかった比較例と、における試料中のクレアチン濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図３】クレアチンキナーゼを用いた試料中のクレアチニン濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図４】３−ホスホグリセリン酸キナーゼを用いた試料中の３−ホスホグリセリン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図５】ホスホフルクト−１−キナーゼを用いた試料中のフルクトース−６−リン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図６】グリセロキナーゼを用いた試料中のグリセロール濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図７】ピルビン酸キナーゼを用いた試料中のピルビン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図８】３−ホスホグリセリン酸キナーゼを用いた試料中の３−ホスホグリセリン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図９】ヘキソキナーゼを用いた試料中のグルコース−６−リン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図１０】アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼを用いた試料中のグルコース−６−リン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図１１】ピルビン酸キナーゼを用いた試料中のホスホエノールピルビン酸濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【図１２】クレアチンキナーゼを用いた試料中のクレアチニン濃度と吸光度変化量との相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施の形態」ともいう。）について具体的に説明する。ただし、以下の実施の形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。なお、本明細書中のＥＣ番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）は、２０１４年９月１２現在において確認した番号である。
【００６０】
本実施の形態に係る方法は、キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定方法であって、
（１）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応と逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を有するヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、キナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と、第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる第二のヌクレオチド補酵素と、を、試料、又は測定対象が誘導前物質である場合には誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料と接触せしめ、下記式（３）の酵素サイクリング反応を反応せしめる工程と、
【化３】
0006450394.tif 000008
（２）第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の変化物、第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量を検出する工程と、
（３）検出されたシグナルの変化量に基づき、試料が含有するキナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの量を算出する工程と、
を含む測定方法である。
【００６１】
本実施形態に係る方法において使用されるキナーゼは、上記式（３）に示すように、第一のヌクレオチド補酵素の存在下、正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応を触媒し、かつ、第二のヌクレオチド補酵素の存在下、正反応基質のリン酸化物から正反応基質を生成する逆反応を触媒することが可能であるキナーゼである。
【００６２】
測定対象が誘導前物質である場合、試料としては、誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理を行った試料が用いられる。
【００６３】
本実施の形態に係る方法の測定対象となるキナーゼの正反応基質及びそのリン酸化物は、本実施の形態に係る方法で測定可能であれば特に限定されないが、例えば、クレアチン、３−ホスホグリセリン酸、ピルビン酸、フルクトース−６−リン酸、グルセロール、及びそれらのリン酸化物が挙げられる。またそれらへ誘導される誘導前物質としては、クレアチニン、グリセロアルデヒド−３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、２，３−ビスホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、トリグリセリド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルグリセロール、及びグルコース−１−リン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、好ましい誘導前物質としては、クレアチニンが挙げられる。
【００６４】
本実施の形態に係る方法で、含有するキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、あるいはそれらへ誘導される誘導前物質の量が検査される試料としては、特に限定されないが、例えばヒト又は動物の生体試料であり、好ましくはヒト血液、さらに好ましくは、ヒト血清である。なお、試料中に、測定対象であるキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、あるいはそれらへ誘導される誘導前物質が入っているか否かは、上記方法を実施する前に未知であってもよく、本実施の形態に係る方法を実施して、試料がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、あるいはそれらへ誘導される誘導前物質を含有していないことが明らかになることもあり得る。
【００６５】
本実施の形態に係る方法において、「誘導前物質」とは、キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと誘導される物質である。キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと至る反応ステップが複数ある場合は、誘導前物質とは、その出発物質、及び中間物質の全てを含み、そのいずれであってもよい。
【００６６】
本実施の形態に係る方法において、「定量的に誘導せしめる処理」とは、誘導前物質の減少量と、誘導後物質であるキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物の増加量とが、対応するように、誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物に誘導せしめる処理をいう。具体的には、本実施の形態に係る方法によって第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の変化物、第二のヌクレオチド補酵素、及び第二のヌクレオチド補酵素の変化物の少なくともいずれかの変化量に対応するシグナルの変化量に基づき、誘導前物質の量が算出可能であるような処理であればよい。定量的に誘導せしめる処理の例としては、公知の化学的処理を用いればよいがこれに限定されない。化学的処理の例としては、加水分解、酸化、及び還元等の化学反応を利用した処理が挙げられるが、これに限定されない。具体的な例としては、酸やアルカリによる加水分解が挙げられる。
【００６７】
化学的処理以外の例としては、例えば酵素的処理等が挙げられる。例えば、クレアチニンは、水の存在下、クレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼ）（ＥＣ  ３．５．２．１０）に接触させることによって、クレアチンに誘導できる。したがって、本実施の形態に係る方法において、キナーゼとしてクレアチンキナーゼを用いることによりクレアチンを測定すれば、クレアチンの誘導前物質であるクレアチニンの測定も可能となる。
【００６８】
また、トリグリセリドはリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．３）によりグリセロールに誘導できるので、グリセロキナーゼの酵素サイクリング反応と組み合わせれば、トリグリセリドの測定が可能である。
【００６９】
更にリゾレシチンはリゾホスフォリパーゼ（ＥＣ  ３．１．１．５）とグリセロホスホコリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ  ３．１．４．２）によってコリンとグリセロール−３−リン酸に誘導される。したがって、誘導されたグリセロール−３−リン酸を基質としてグリセロキナーゼの酵素サイクリング反応を生じさせることによりグリセロール−３−リン酸を測定すれば、リゾレシチンの測定も可能となる。ただし、酵素的処理は、これらに限定されない。
【００７０】
本実施の形態に係る方法に用いることができるキナーゼは、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒することが可能であり、当該正反応と逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を持つヌクレオチド補酵素を利用できる性質を有していれば特に限定されない。ここで、本実施の形態に係る方法における「キナーゼ正反応」とは、キナーゼが触媒する高エネルギーのリン酸転移のうち、リン酸がヌクレオチド補酵素から正反応基質へ移行する方向の反応をいい、転移するリン酸の個数は問わない。好ましくは、転移するリン酸は一個である。また、「キナーゼ逆反応」とは、上記「キナーゼ正反応」とは逆方向の反応をいう。
【００７１】
本実施の形態において、測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物である場合、測定対象と、キナーゼと、の組み合わせとしては、例えば以下が挙げられるが、これらに限定されない。なお以下の例示においては、測定対象：キナーゼ、の順に記載されている。また、そのリン酸化物とは、記載されたキナーゼの正反応基質に対応するリン酸化物である。
クレアチン及び／又はそのリン酸化物：クレアチンキナーゼ
３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
ピルビン酸及び／又はそのリン酸化物：ピルビン酸キナーゼ
フルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物：ホスホフルクト−１−キナーゼ
グリセロール及び／又はそのリン酸化物：グリセロールキナーゼ
ヘキソース及び／又はそのリン酸化物：ヘキソキナーゼ
グルコース及び／又はそのリン酸化物：アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）依存性グルコキナーゼ
【００７２】
好ましくは、ＥＣ番号（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ）で特定されたキナーゼを含む以下の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
クレアチン及び／又はそのリン酸化物：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）
３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）
ピルビン酸及び／又はそのリン酸化物：ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４０）
フルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）
グリセロール及び／又はそのリン酸化物：グリセロールナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）
ヘキソース及び／又はそのリン酸化物：ヘキソキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１）
グルコース及び／又はそのリン酸化物：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）
【００７３】
測定対象が、誘導前物質である場合、測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、それぞれについての組み合わせとしては、以下が例示されるがこれらに限定されない。なお、以下の例示においては、測定対象：キナーゼ：キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物の順に記載されている。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ：クレアチン及び／又はそのリン酸化物
グリセロアルデヒド−３−リン酸、ヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、又は２，３−ビスホスホグリセリン酸：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ：３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物
グルコース−６−リン酸：ホスホフルクト−１−キナーゼ：ホスホフルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物
ジヒドロキシアセトンリン酸、トリグリセリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジルグリセロール、又はホスファチジルグリセロール：グリセロキナーゼ：グリセロール及び／又はそのリン酸化物
グルコース−１−リン酸：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ：グルコース及び／又はそのリン酸化物
【００７４】
好ましくは、ＥＣ番号で特定されたキナーゼを含む以下の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）：クレアチン及び／又はそのリン酸化物
グリセロアルデヒド−３−リン酸、ヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、又は２，３−ビスホスホグリセリン酸：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）：３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物
グルコース−６−リン酸：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）：ホスホフルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物
ヒドロキシアセトンリン酸、トリグリセリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジルグリセロール、又はホスファチジルグリセロール：グリセロキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）：グリセロール及び／又はそのリン酸化物
グルコース−１−リン酸：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）：グルコース及び／又はそのリン酸化物
【００７５】
測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物の好ましい組み合わせとしては、下記が挙げられる。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ：クレアチン及び／又はそのリン酸化物
【００７６】
測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物である場合、本実施の形態に係る方法の測定対象、及びキナーゼのそれぞれについての組み合わせは、上記以外にも、以下の方法で決定することができる。また、測定対象が誘導前物質である場合も、測定対象、キナーゼ、及びキナーゼの正反応基質／そのリン酸化物、それぞれについての組み合わせは、上記以外にも、以下の方法で決定することができる。
【００７７】
測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物である場合、最初に、例えば酵素ハンドブック（朝倉書店、１９８２年）などを参考に特定のキナーゼの選択を行う。逆反応が進行するか否かということ、あるいはヌクレオチド補酵素に対する特異性についての文献情報が得られる場合はこれを参考に選択する。また、文献情報が得られない場合は、公知の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などの方法と組み合わせれば、実際にこれらの情報を確認することができる。例えば、逆反応についての文献情報がない場合、逆反応が進行するかどうかについては、特定のキナーゼについて、常法にしたがい、逆反応の基質及びヌクレオチド補酵素を過剰量存在させた条件でキナーゼを添加して反応させ、生成物（正反応基質）又はヌクレオチド補酵素の変化物を既存の方法で検出すればよい。
【００７８】
例えば、これに限定されないが、グリセロールキナーゼの逆反応を調べる場合、逆反応基質であるグリセロール−３−リン酸とＡＤＰを過剰量加えてキナーゼ反応を進行させ、生成されたグリセロール又はアデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を既法で検出すればよい。具体的にはグリセロールを検出する場合には、グリセロール酸化酵素を用いて過酸化水素として検出することができる。また、ＡＴＰを検出する場合は、ＨＰＬＣ法又はＡＴＰ検出用の既知の酵素法と組み合わせればよい。逆反応が確認された場合、更に反応時のｐＨを変化させ、逆反応の至適ｐＨを調べておけば、本実施の形態に係る方法の実施条件を設定するときの参考とすることができる。同様に、正反応及び／又は逆反応のヌクレオチド補酵素の特異性についてもＨＰＬＣ法と組み合わせれば確認することができる。本実施形態に係る方法で用いられるキナーゼは、正反応、逆反応それぞれについて最もよく作用する別異のヌクレオシド部分を持つヌクレオチド補酵素に対して４％以上、好ましくは８％以上の特異性を有することが望ましいが、これに限定されない。
【００７９】
次に、これらキナーゼに組み合わせる、正反応基質又はそのリン酸化物の選択を行う。正反応基質又はそのリン酸化物の選択は、正反応基質又はそのリン酸化物に対するキナーゼのミカエリス定数Ｋｍによって選択できる場合もある。例えばミカエリス定数Ｋｍはできるだけ小さいことが好ましい。具体的にはＫｍ値は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
【００８０】
これらのキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物がある物質の加水分解物や酸化物質である場合、これらの誘導前物質を測定対象とすることができる。すなわち、これらの誘導前物質は公知の化学処理によってキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物に変換できる。さらには、代謝マップ等でキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物に変換される代謝経路を確認し、反応に係る酵素類が容易に入手可能であれば、これら誘導前物質を測定対象とすることもできる。
【００８１】
本実施形態に係る方法における「ヌクレオチド補酵素」とは、キナーゼの補酵素として働く、ヌクレオシドのリン酸化物をいう。本実施の形態に係る方法で用いられる第一のヌクレオチド補酵素及び第二のヌクレオチド補酵素は、互いにヌクレオシド部分が別異のヌクレオチド補酵素である。本実施の形態に係る方法で用いられるヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の種類は特に限定されないが、例としてはアデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシン等が挙げられる。また、それらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよい。
【００８２】
ヌクレオチド補酵素としては、例えばリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。
【００８３】
ヌクレオチド補酵素としてのリボヌクレオチドの具体例としてはＡＴＰ、ＡＤＰ、アデニル酸（ＡＭＰ）、グアノシン３リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン２リン酸（ＧＤＰ）、グアニル酸（ＧＭＰ）、５−メチルウリジン３リン酸（ＴＴＰ）、５−メチルウリジン２リン酸（ＴＤＰ）、５−メチルウリジン1リン酸（ＴＭＰ）、ウリジン3リン酸（ＵＴＰ）、ウリジン2リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン1リン酸（ＵＭＰ）、シチジン3リン酸（ＣＴＰ）、シチジン2リン酸（ＣＤＰ）、シチジン1リン酸（ＣＭＰ）、キサントシン3リン酸（ＸＴＰ）、キサントシン2リン酸（ＸＤＰ）、キサントシン1リン酸（ＸＭＰ）、イノシン3リン酸（ＩＴＰ）、イノシン2リン酸（ＩＤＰ）、及びイノシン1リン酸（ＩＭＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
また、ヌクレオチド補酵素としてのデオキシリボヌクレオチドの具体例としては、デオキシアデノシン3リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシアデノシン2リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン1リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシグアノシン3リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシグアノシン2リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン1リン酸（ｄＧＭＰ）、チミジン3リン酸（ｄＴＴＰ）、チミジン2リン酸（ｄＴＤＰ）、チミジン1リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン3リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシウリジン2リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン1リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシシチジン3リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシシチジン2リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン1リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシキサントシン3リン酸（ｄＸＴＰ）、デオキシキサントシン2リン酸（ｄＸＤＰ）、デオキシキサントシン1リン酸（ｄＸＭＰ）、デオキシイノシン3リン酸（ｄＩＴＰ）、デオキシイノシン2リン酸（ｄＩＤＰ）、及びデオキシイノシン1リン酸（ｄＩＭＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
好ましいヌクレオチド補酵素は、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＸＴＰ、ＸＤＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＸＴＰ、ｄＸＤＰ、ｄＩＴＰ、及びｄＩＤＰ等であるが、これらに限定されない。
【００８６】
これらのヌクレオチド酵素には、場合によって例えば発色能力を有する置換基等が結合していてもよい。
【００８７】
本実施の形態に係る方法で用いられる正反応における第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分は、特に限定されないが、例としてはアデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシン等が挙げられる。好ましくはアデノシン、イノシン、グアノシン、及びデオキシアデノシン等が挙げられる。さらに好ましくは、アデノシンが挙げられる。またそれらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよいが、３リン酸化物が好ましい。第一のヌクレオチド補酵素の具体例としては、前述の具体例に加え、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＸＴＰ、ＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＸＴＰ、及びｄＩＴＰ等が挙げられる。
【００８８】
本実施の形態に係る方法で用いられる逆反応における第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分は、特に限定されないが、例としてはアデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシン等が挙げられる。好ましくはイノシン、グアノシン、アデノシン、及びデオキシグアノシン等が挙げられる。さらに好ましくはイノシンである。またそれらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよいが、２リン酸化物が好ましい。第二のヌクレオチド補酵素の具体例としては、前述の具体例に加え、さらに好ましくはＡＤＰ、ＧＤＰ、ＴＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＸＤＰ、ＩＤＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＸＤＰ、及びｄＩＤＰが挙げられる。
【００８９】
本実施の形態に係る方法で用いられる、第一のヌクレオシチ補酵素及び第二のヌクレオチド補酵素の好ましいヌクレオシド部分は、特に限定されないが、例えば、アデノシン、イノシン、グアノシン、又はデオキシアデノシン等であり、かつ、互いに別異するものである。例えば、第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の組み合わせは、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、又はイノシンとアデノシンである。さらに好ましくは、第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がイノシンである。
【００９０】
本実施の形態に係る方法において、「正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物」とは、キナーゼ正反応において、第一のヌクレオチド補酵素からリン酸がキナーゼの正反応基質へと転移した後の、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物のことをいう。また、「逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物」とは、キナーゼ逆反応において、キナーゼの逆反応基質から第二のヌクレオチド補酵素へとリン酸が転移した後の、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物のことをいう。ここで、転移するリン酸の個数は、１個でもよいし、２個でもよいし、３個でもよい。好ましくは１個である。
【００９１】
本実施の形態に係る方法の工程（１）において、上記式（３）のサイクリング反応をせしめるには、例えば以下の要領で行う。
【００９２】
例えば第一及び第二のヌクレオチド補酵素を過剰量、具体的には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１２ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌないし６ｍｍｏｌ／Ｌ用意し、これに反応中のｐＨを維持するためｐＨ緩衝剤を２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下加えて反応液とする。反応時のｐＨは適宜反応が効率的に進行する条件を選べばよいが、通常はｐＨ５．５以上ｐＨ８．５以下の中性付近に調整し、キナーゼの活性化剤である塩化マグネシウム等の金属塩を０．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下添加する。これに前述のキナーゼを加え、上記反応液を予め２５℃以上４２℃以下、より好ましくは３７℃付近に加温し、第一及び第二のヌクレオチド補酵素濃度に比べて微量の正反応基質及び／又はそのリン酸化物を添加し、反応を開始すればよい。
【００９３】
酵素の添加量について以下説明する。一般的な酵素サイクリング反応において、そのサイクリング率は酵素量に依存し、基質に対するミカエリス定数（Ｋｍ値）が小さいほど、少ない酵素量でより高い感度が得られることが知られている。そこで、加える酵素量の目安としては、反応液１ｍＬ当たり正反応基質及びそのリン酸化物のうち大きいほうのＫｍ値（ｍｍｏｌ／Ｌ）の１倍以上、好ましくは２倍以上の酵素単位（ユニット：ｕ）、またその上限としては、実質的に添加可能な量を添加すればよい。Ｋｍ値は公知の方法により求めることもできる。なお、これらの分量は、一例であってこれらに限定されるものではない。
【００９４】
以下、キナーゼの具体例としてクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を挙げて説明するが、キナーゼはこれに限定されない。ＣＫは動物界に広く存在する酵素で、骨格筋、心筋、及び脳等に豊富に含まれている。ウサギ、牛、ブタ、及びニワトリなどを起源とするＣＫが市販されており、ヌクレオチド補酵素の特異性についての情報は文献により得ることができる。例えば、ウサギ筋肉ＣＫの場合、ＡＤＰを１００％としたとき、ＩＤＰは２９％の相対活性を示すことが報告されている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２４１，  ３１１６−３１２５，１９６６）。また、例えばＡＤＰ以外のヌクレオシド２リン酸を用い、クレアチンリン酸を基質とした逆反応を利用して生成したクレアチンから、クレアチンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．５．３．３．）、及びサルコシンオキシダーゼ（ＥＣ  １．５．３．１）を用いて過酸化水素を発生させ、当該過酸化水素を定量することによって、容易にＡＤＰ以外のヌクレオシド２リン酸に対するＣＫの特異性を確認できる。例えばウサギ筋肉由来のＣＫはＩＤＰに特異性が高いので、正反応における第一のヌクレオチド補酵素としてＡＴＰを、逆反応における第二のヌクレオチドとしてＩＤＰを選択することができる。
【００９５】
本実施の形態に係る方法のサイクリング反応を実施するためには、２種類のヌクレオチド補酵素存在下、ｐＨ依存性を調べ、効率的にサイクリング反応が進行するｐＨを適宜選択すればよい。例えばウサギ筋肉やヒト筋肉由来ＣＫの場合は、いずれもｐＨ６以上ｐＨ８以下の中性付近の緩衝液が最適である場合がある。そして、ＡＤＰ及びＩＤＰを過剰量、より具体的には０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上１２ｍｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは０．２ｍｍｏｌ／Ｌ以上６ｍｍｏｌ／Ｌ以下存在せしめ、ＡＤＰ及びＩＤＰに比べて微量のクレアチン又はクレアチンリン酸と酵素ＣＫを添加すればよい。酵素の添加量について、例えば、ウサギ筋肉由来ＣＫの場合、クレアチン、クレアチンリン酸に対するＫｍ値はそれぞれ１６ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌと報告されている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２１０、ｐ６５、１９５４）。先に述べた酵素添加量目安に従えば、これらは１６ｕ／ｍＬ、３２ｕ／ｍＬに相当する。したがって、好ましくは３２ｕ／ｍＬ以上、上限としては８００ｕ／ｍＬ程度酵素を添加すればよいが、これらに限定されない。
【００９６】
本実施の形態に係る方法の工程（２）においては、第一のヌクレオチド補酵素、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物、第二のヌクレオチド補酵素、及び逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の変化量のいずれかに対応するシグナルの変化量を検出すればよい。またシグナルの変化量は第一のヌクレオチド補酵素又は第二のヌクレオチド補酵素の減少量でも、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量でもよい。好ましくは正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量である。変化量を検出する方法は、公知のＨＰＬＣ法等を用いることができる。ＨＰＬＣ法を用いる場合はキレート剤などを添加して酵素反応を終了させてから、正反応による第一のヌクレオチドの変化物又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物を逆相カラムなど適宜選択して定量すればよい。これらＨＰＬＣ分析法についての情報は、樹脂メーカーから簡単に入手できる。
【００９７】
また、本実施の形態に係る方法の工程（２）においては、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素を用いて、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量に対して変化するシグナル変化量を検出してもよい。あるいは、第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できる検出用酵素を用いて、逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量に対して変化するシグナル変化量を検出してもよい。
【００９８】
例えば、アデノシン２リン酸依存性グルコキナーゼ（ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ、ＥＣ  ２．７．１．１４７）を用いて、グルコースの存在下、ＡＤＰの増加量に対応するシグナルの変化量を検出する方法が挙げられる。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＡＤＰ依存性グルコキナーゼは、ヌクレオチド補酵素としてＡＤＰの他にＣＤＰを利用することができるが、ＧＤＰ、ＩＤＰに対してはごく僅かしか作用しないことが知られている。したがって、第一のヌクレオチド補酵素にＡＴＰを、第二のヌクレオチド補酵素にＩＤＰ又はＧＤＰを利用するキナーゼサイクリング反応時に、検出用酵素としてＡＤＰ依存性グルコキナーゼを共存させれば、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物であるＡＤＰのみを特異的に検出できる。このことは、後述するように実際に確認されている。
【００９９】
また、大腸菌由来のグリセロールキナーゼは、リン酸供与体としてＡＴＰのみを利用するとの報告がある。したがって、例えば第一のヌクレオチド補酵素にＩＴＰ、ＧＴＰ又はＣＴＰを、第二のヌクレオチド補酵素にＡＤＰを利用するキナーゼを本実施形態に係る方法に用いる場合、検出用酵素として大腸菌由来のグリセロールキナーゼを用いれば、ＡＴＰのみを特異的に検出できる。ＡＴＰのみを特異的に検出する検出用酵素としては、上記大腸菌由来のグリセロールキナーゼの他に、ＡＴＰのみに特異的な他のキナーゼも用いることができ、ヌクレオチド補酵素の特異性については文献情報を参考にして適宜選択すればよい。また、酵素番号Ｅ  ６に属する合成酵素の中には、ＡＴＰのみを特異的に検出する酵素が多々報告されているのでこれらの酵素も検出用酵素として検出反応に用いることができる。例えば、大腸菌由来のＮＡＤ合成酵素（ＥＣ  ６．３．１.５）はＡＴＰ以外のヌクレオチド補酵素に作用しないと報告されている。このように本実施の形態に係る方法の工程（２）においては、本実施の形態に係る方法で用いられるキナーゼの第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素の組合せに留意して、適宜利用できる検出用酵素を選択すればよい。しかしながら補酵素に対する特異性は、酵素起源のみならず、補酵素や酵素の添加量などの条件によっても左右される可能性がある。そのため、文献に報告された結果とは異なるケースもあり、選択に当たっては特異性を実際に確認するとよい。
【０１００】
好ましくはアデノシン２リン酸依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）を検出用酵素として用いる。ＡＤＰ依存性グルコキナーゼを用いた場合、生成物であるＡＭＰ又はグルコース６リン酸は既知の方法により定量することができる。グルコース−６−リン酸は、場合によって、チオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ、及びＮＡＤのいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、の存在下、ＡＤＰの増加量に対応して変化するシグナルの変化量を検出する場合がある。例えば、グルコース６リン酸は、ＮＡＤ（Ｐ）の存在下にグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）を用い、還元型ＮＡＤ（Ｐ）に基づく３４０ｎｍの吸光度変化量として測定することができる。また、ＮＡＤ（Ｐ）の代わりにチオＮＡＤ（Ｐ）などの補酵素アナログを用いることもできる。
【０１０１】
還元型ＮＡＤ（Ｐ）の測定に当たっては、例えばニトロテトラゾリウムブルー（Ｎｉｔｒｏ−ＮＢ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、及び２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，ナトリウム塩（ＷＳＴ−３）などの水素受容体の存在下、電子キャリヤーである１−メトキシＰＭＳを用い、あるいは酵素ジアホラーゼによりホルマザン色素として可視部吸光度の測定によっても定量できる。これらの化合物は容易に購入できる。また、蛍光試薬や発光試薬と組み合わせて検出することもできる。あるいは、グルコース６リン酸を、Ｇ６ＰＤＨを用いる酵素サイクリング法により高感度に定量することもできる（例えば、特許文献７参照。）。これらの変化するシグナルの変化量を検出する工程は、本実施形態に係る方法におけるサイクリング反応と同時に実施しても、あるいは別個に実施してもよい。同様に大腸菌由来のグリセロールキナーゼを用いたときも、生成物であるグリセロール−３−リン酸を既知の方法で定量することができる。
【０１０２】
尚、本実施の形態に係る方法は、１種類のキナーゼにより実施が可能であるが、サイクリング反応は、起源の異なる同一反応を触媒する２種類以上の酵素を用いても実施することもできる。
【０１０３】
本実施の形態に係る方法において、キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、又はそれらへ誘導される誘導前物質の、試料中の量を算出する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、酵素サイクリング反応においては、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物及び逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物は、時間に比例して増加する傾向にある。試料中の被検物質の量を算出するには、酵素サイクリング反応の反応時間を規定し（例えば反応開始後５分目から７分目など）、濃度が既知の基準となる物質（キャリブレーター）を対照において、キャリブレーターの変化物に対応するシグナルの変化量を測定することによって、試料中の被検物質の量を計算することができる。キャリブレーターには、キナーゼの正反応基質又はそのリン酸化物を用いることができる。
【０１０４】
誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又は正反応基質のリン酸化物に導く一つ又は複数の工程がある場合、誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又は正反応基質のリン酸化物に導く工程を実施せしめた後、酵素サイクリング反応を実施すればよい。また、誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又は正反応基質のリン酸化物に導く工程が酵素反応である場合、誘導反応を触媒する酵素を過剰量加えれば短時間にキナーゼの正反応基質及び／又は正反応基質のリン酸化物に導くことができるので、キナーゼを予め含有させて本実施形態に係る方法のサイクリング反応を実施することもできる。この場合、誘導反応が終了した後の一定時間を反応時間に規定すればよい。
【０１０５】
試料中に正反応基質とそのリン酸化物が混在している場合に、正反応基質又はリン酸化物のどちらか一方だけを定量したい時は、酵素サイクリング反応に先立ち、公知の方法を用いて、非測定対象物を別の物質に変換しておくなどの処理をすればよい。
【０１０６】
また、本実施の形態は、キナーゼの正反応基質、そのリン酸化物、及びそれらへ誘導される誘導前物質の少なくとも一つの測定用組成物であって、
（ａ）キナーゼであって、ヌクレオチド補酵素の存在下、当該キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒し、正反応と逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を持つヌクレオチド補酵素を利用するキナーゼと、
（ｂ）正反応における第一のヌクレオチド補酵素と、
（ｃ）第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、逆反応における第二のヌクレオチド補酵素と、
を備える組成物であって、
測定対象が誘導前物質である場合には、誘導前物質をキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物へと定量的に誘導せしめる処理をした後に用いる組成物である。
【０１０７】
本実施の形態に係る組成物のキナーゼは、前述のように、ヌクレオチド補酵素の存在下、キナーゼの正反応基質からそのリン酸化物を生成する正反応、及びその逆反応を触媒することが可能であり、当該正反応と逆反応において、少なくともそれぞれ別異のヌクレオシド部分を持つヌクレオチド補酵素を利用できる性質を有していれば特に限定されない。
【０１０８】
本実施の形態に係る組成物の測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物である場合、測定対象、及びキナーゼのそれぞれについての組み合わせとしては、以下が例示されるが、これらに限定されない。なお、以下の例示においては、測定対象：キナーゼの順に記載されている。また、そのリン酸化物とは、記載されたキナーゼの正反応基質に対応するリン酸化物である。
クレアチン及び／又はそのリン酸化物：クレアチンキナーゼ
３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ
ピルビン酸及び／又はそのリン酸化物：ピルビン酸キナーゼ
フルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物：ホスホフルクト−１−キナーゼ
グリセロール及び／又はそのリン酸化物：グリセロールキナーゼ
ヘキソース及び／又はそのリン酸化物：ヘキソキナーゼ
グルコース及び／又はそのリン酸化物：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ
【０１０９】
好ましくは、ＥＣ番号で特定された以下のキナーゼを含む以下の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
クレアチン及び／又はそのリン酸化物：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）
３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）
ピルビン酸及び／又はそのリン酸化物：ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４０）
フルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）
グリセロール及び／又はそのリン酸化物：グリセロールナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）
ヘキソース及び／又はそのリン酸化物：ヘキソキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１）
グルコース及び／又はそのリン酸化物：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）
【０１１０】
測定対象が、誘導前物質である場合、測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、それぞれについての組み合わせとしては、以下が例示されるが、これらに限定されない。なお、以下の例示においては、測定対象：キナーゼ：キナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物の順に記載されている。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ：クレアチン及び／又はそのリン酸化物
グリセロアルデヒド−３−リン酸、ヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、又は２，３−ビスホスホグリセリン酸：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ：３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物
グルコース−６−リン酸：ホスホフルクト−１−キナーゼ：ホスホフルクトース−６−リン酸及び／又はそのリン酸化物
ジヒドロキシアセトンリン酸、トリグリセリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジルグリセロール、又はホスファチジルグリセロール：グリセロキナーゼ：グリセロール及び／又はそのリン酸化物
グルコース−１−リン酸：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ：グルコース及び／又はそのリン酸化物
【０１１１】
好ましくは、ＥＣ番号で特定されたキナーゼを含む以下の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．３．２）：クレアチン及び／又はそのリン酸化物
グリセロアルデヒド−３−リン酸、ヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、フルクトース−１，６−ビスリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、又は２，３−ビスホスホグリセリン酸：３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ  ２．７．２．３）：３−ホスホグリセリン酸及び／又はそのリン酸化物
グルコース−６−リン酸：ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１１）：ホスホフルクトース−６−リン酸／そのリン酸化物）、（ヒドロキシアセトンリン酸、トリグリセリド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジン酸、グリセロール−３−リン酸、リゾホスファチジルグリセロール、又はホスファチジルグリセロール：グリセロキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．３０）：グリセロール及び／又はそのリン酸化物
グルコース−１−リン酸：ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）：グルコース及び／又はそのリン酸化物
【０１１２】
測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物のさらに好ましい組み合わせとしては、下記の例が挙げられる。
クレアチニン：クレアチンキナーゼ：クレアチン及び／又はそのリン酸化物
【０１１３】
本実施の形態に係る組成物において、測定対象がキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物である場合、測定対象、及びキナーゼのそれぞれについての組み合わせは、本実施の形態に係る方法についての上記説明と同様の方法で決定することができる。また、測定対象が誘導前物質である場合も、測定対象、キナーゼ、並びにキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、それぞれについての組み合わせは、本実施の形態に係る方法についての上記説明と同様の方法で決定することができる。
【０１１４】
第一のヌクレオチド補酵素及び第二のヌクレオチド補酵素は、ヌクレオシド部分が別異のヌクレオチド補酵素である。ヌクレオシド部分の種類は特に限定されないが、例としてはアデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシン等が挙げられる。またそれらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよい。
【０１１５】
ヌクレオチド補酵素の具体例としてはＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＧＭＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、ＴＭＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＵＭＰ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＣＭＰ、ＸＴＰ、ＸＤＰ、ＸＭＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰ、ＩＭＰ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＴＭＰ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＵＭＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＣＭＰ、ｄＸＴＰ、ｄＸＤＰ、ｄＸＭＰ、ｄＩＴＰ、ｄＩＤＰ、及びｄＩＭＰ等が挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＧＴＰ、ＧＤＰ、ＴＴＰ、ＴＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、ＣＴＰ、ＣＤＰ、ＸＴＰ、ＸＤＰ、ＩＴＰ、ＩＤＰ、ｄＡＴＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＴＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＴＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＤＰ、ｄＸＴＰ、ｄＸＤＰ、ｄＩＴＰ、及びｄＩＤＰ等である。これらのヌクレオチド酵素には、場合によって例えば発色能力を有する置換基等が結合されていてもよい。
【０１１６】
本実施の形態に係る組成物に用いられる、正反応における第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分としては、特に限定されないが、例としてはアデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシン等が挙げられる。好ましくはアデノシン、イノシン、グアノシン、デオキシアデノシン、及びデオキシアデノシン等が挙げられる。より好ましくは、アデノシンが挙げられる。また、それらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよいが、３リン酸化物が好ましい。第一のヌクレオチド補酵素の具体例としては、前述の具体例に加え、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＸＴＰ、ＩＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＸＴＰ、及びｄＩＴＰ等が挙げられる。
【０１１７】
本実施の形態に係る組成物に用いられる、逆反応における第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分は、特に限定されないが、例としてはアデノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン、シチジン、キサントシン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、デオキシキサントシン、及びデオキシイノシン等が挙げられる。好ましくはイノシン、グアノシン、アデノシン、及びデオキシグアノシン等が挙げられる。さらに好ましくはイノシンである。また、それらのリン酸化物は１リン酸化物でもよいし、２リン酸化物でもよいし、３リン酸化物でもよいが、２リン酸化物が好ましい。第二のヌクレオチド補酵素の具体例としては、前述の具体例に加え、さらに好ましくはＡＤＰ、ＧＤＰ、ＴＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ＸＤＰ、ＩＤＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＤＰ、ｄＸＤＰ、及びｄＩＤＰが挙げられる。
【０１１８】
本実施の形態の上記組成物における、第一のヌクレオチド補酵素と第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分の組み合わせとしては、互いに異なっていれば特に限定されないが、例えば、アデノシンとイノシン、グアノシンとアデノシン、デオキシアデノシンとグアノシン、デオキシアデノシンとデオキシグアノシン、デオキシアデノシンとイノシン、又はイノシンとアデノシンである。好ましくは第一のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がアデノシンであり、第二のヌクレオチド補酵素のヌクレオシド部分がイノシンである。
【０１１９】
本実施の形態に係る組成物を用いれば、例えば本実施形態に係る方法を実施可能であり、上記式（３）の反応をサイクリング法で反応せしめることが可能である。
【０１２０】
本実施の形態に係る組成物を用いれば、第一のヌクレオチド補酵素、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物、第二のヌクレオチド補酵素、及び逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物のいずれか一つの変化量に対応するシグナルの変化量を検出することが可能である。また、シグナルの変化量は、第一のヌクレオチド補酵素又は第二のヌクレオチド補酵素の減少量でも、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量でもよい。好ましくは、シグナルの変化量は、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物又は逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量である。変化量を検出する方法は、公知のＨＰＬＣ法等を用いることができる。ＨＰＬＣ法を用いる場合については、本実施形態に係る方法の説明と同様である。
【０１２１】
本実施の形態に係る組成物を用いれば、試料中に含有されるキナーゼの正反応基質及び／又はそのリン酸化物、又はそれらへ誘導される誘導前物質の量を算出することが可能である。算出する方法は、本実施形態に係る方法の説明と同様であり、公知の方法を用いることができる。
【０１２２】
本実施の形態に係る組成物は、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できるが、第二のヌクレオチド補酵素を利用できない検出用酵素、又は第一のヌクレオチド補酵素を利用できないが逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物を利用できる検出用酵素を任意に含んでいてもよい。検出用酵素の例としては、アデノシン２リン酸依存性グルコキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１４７）等が挙げられるがこれに限定されない。さらにこれらに加えて、本実施の形態に係る組成物においては、チオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤのいずれかの補酵素と、グルコースと、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼと、を加える場合がある。これらを用いれば、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物、逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物の増加量に対応するいずれかのシグナルの変化量を検出測定できる。具体的には、本実施形態に係る方法の上記説明と同様である。
【０１２３】
本実施の形態に係る組成物は、複数に分けられた試薬キットとしてもよい。例えば、第二のヌクレオチド補酵素を含む組成物を、適宜二つ又は三つ以上に分けた試薬キットに振り分けることができる。この場合、さらに、例えばチオＮＡＤＰ、チオＮＡＤ、ＮＡＤＰ又はＮＡＤと、グルコースと、正反応による第一のヌクレオチド補酵素の変化物と、を利用できるが、第二のヌクレオチド補酵素は利用できない検出用酵素、あるいは第一のヌクレオチド補酵素は利用できないが逆反応による第二のヌクレオチド補酵素の変化物は利用できる検出用酵素を含む組成物を適宜上記二つ又は三つ以上の試薬キットに振り分けることができる。これらの成分はいずれも、それぞれ分けられた試薬キットに重複して含むことができる。
【０１２４】
好ましくはＣＫを用いる場合、ＡＴＰ、ＣＫ、及びＩＤＰを含む組成物を適宜二つの試薬キットに分けることができる。更にＮＡＤＰ、ＡＤＰ依存性グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを適宜二つの試薬キットに振り分けてもよい。これらの成分はいずれも、それぞれ分けられた試薬キットに重複して含むことができる。
【０１２５】
以下に本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。
【０１２６】
（ＡＤＰ−ＨＫのヌクレオチド特異性の確認）
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ（Ｔ−９２）  旭化成ファーマ株式会社）が、ヌクレオシド−２−リン酸としてＡＤＰの他にＩＤＰ、ＧＤＰをリン酸供与体とすることができないことを確認した。すなわち、ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ反応により生成するグルコースを、ＮＡＤＰの存在下、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ：東洋紡）を共存させ、３７℃にて還元型ＮＡＤＰに基づく３４０ｎｍの吸光度変化として測定した。
【０１２７】
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコース
２ｍｍｏｌ／Ｌ  塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰ
１ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ヌクレオシド−２−リン酸（ＡＤＰ、ＩＤＰ、又はＧＤＰ）
【０１２８】
試薬ブランクは、ヌクレオシド−２−リン酸の代わりに生理食塩水を加えたものとした。
【０１２９】
まず、ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩを反応液の中で１．２５ｕ／ｍＬとなるように添加したところ、１分間当たりの吸光度変化は、ＡＤＰ、ＩＤＰ、ＧＤＰそれぞれにおいて、１１０．４、−０．２、−０．１（いずれも吸光度  ｘ  １０００）であり、ＩＤＰ及びＧＤＰについては、吸光度の変化量は殆ど認められなかった。次に、酵素を８０倍量、すなわち反応液の中で１００ｕ／ｍＬになるように添加した。ＡＤＰの場合、吸光度は瞬時に３０００（吸光度  ｘ  １０００）を超えたのに対して、ＩＤＰ、ＧＤＰの９分間での吸光度の変化量はそれぞれ４．８、０．７（吸光度  ｘ  １０００）であり、ＡＤＰ−ＨＫＩＩはＩＤＰ及びＧＴＰを実質的にリン酸供与体としないことが確認された。
【０１３０】
（実施例１  ＡＴＰ、ＩＤＰ共存下に可逆反応が進むかの確認）
上記のように、ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩが実質的にＩＤＰを水素供与体としないことが確認されたため、第一のヌクレオチド補酵素としてのヌクレオシド−３−リン酸にＡＴＰを、第二のヌクレオチド補酵素としてのヌクレオシド−２−リン酸にＩＤＰを選択し、両者の存在下にＣＫ反応が進行するかどうかを調べた。
【０１３１】
下記の組成の反応液を調製した。  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ  緩衝剤ＰＩＰＥＳ  （ｐＨ７．０）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰ
８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）
１ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨ
１ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ−ＨＫＩＩ
【０１３２】
上記反応液１ｍＬを３７℃に加温した。反応液中の濃度が０．０５ｍｍｏｌ／Ｌになるようにクレアチンリン酸を加えたのち、ＣＫ（ウサギ筋肉由来、オリエンタル酵母社製）を１０ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃での３４０ｎｍにおける吸光度変化が起きるかどうかを観察した。その結果、還元型ＮＡＤの生成に基づく吸光度が、時間と共に増加していることが確認された。このことは、ＣＫによって、下記両反応が連続的に進行していることを示している。
クレアチンリン酸＋ＩＤＰ→クレアチン＋ＩＴＰ
クレアチン＋ＡＴＰ→クレアチン＋ＡＤＰ
【０１３３】
（実施例２  クレアチンの定量）
下記の組成の反応液を調製した。  ５０ｍｍｏｌ／Ｌ  緩衝剤ＰＩＰＥＳ  （ｐＨ７．０）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコース
２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰ
８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）
１ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨ
１ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ−ＨＫＩＩ
【０１３４】
上記反応液１ｍＬに対して、ＣＫ（旭化成ファーマ株式会社製、ＨＣ−ＣＫＩＩ、カタログＮｏ．Ｔ−７４）を１００ｕ／ｍＬになるように添加した。３７℃で予備加温し、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、１、２ｍｍｏｌ／Ｌのクレアチン溶液を０．０５ｍＬ添加したところ、３４０ｎｍの吸光度が時間に比例して増加した。そこで、３４０ｎｍにおける３分目から５分目までの吸光度変化量を記録した。結果を図１に示した。図１から明らかなように、吸光度変化量は、試料中のクレアチン濃度に比例した。
【０１３５】
（実施例３  ウサギ  補酵素組合せ）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  緩衝剤ＰＩＰＥＳ  （ｐＨ７．０）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ヌクレオシド−３−リン酸
４ｍｍｏｌ／Ｌ  ヌクレオシド−２−リン酸
８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）
１ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨ
１ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ−ＨＫＩＩ
１００ｕ／ｍＬ  ＣＫ  （ウサギ筋肉由来）
【０１３６】
上記反応液において、ヌクレオシド−３−リン酸（１ｍｍｏｌ／Ｌ）とヌクレオシド−２−リン酸（４ｍｍｏｌ／Ｌ）の組合せとしてｄＡＴＰ／ＩＤＰ、ｄＡＴＰ／ＧＤＰ、ｄＡＴＰ／ｄＧＤＰを選択し、それぞれの組合せに対して、０．１ｍｍｏｌ／Ｌクレアチンを０．０５ｍＬ添加した場合の吸光度増加量と、クレアチンの代わりに精製水を加えた場合の吸光度増加量と、の差を求めた。５分間の吸光度変化量（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｘ  １０３）はそれぞれ、３４．６（ｄＡＴＰ／ＩＤＰ）、１１．２（ｄＡＴＰ／ＧＤＰ）、８．７（ｄＡＴＰ／ｄＧＤＰ）と程度に差は認められたものの、いずれの組合せにおいても反応が進行することが確認された。
【０１３７】
（実施例４  クレアチンの測定）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  緩衝剤ＰＩＰＥＳ  （ｐＨ７．０）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＤ
１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ
４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ
８ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）
１ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨ
１ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ−ＨＫＩＩ
２５０ｕ／ｍＬ  ＣＫ  （ウサギ筋肉由来）
【０１３８】
上記反応液１ｍＬに対して、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌのクレアチン水溶液を０．０５ｍＬ加えて、３７℃にて３４０ｎｍの吸光度変化をモニターした。比較例として、上記反応液からＩＤＰを除いたものを用い、同様の測定を実施した。本実施例については５分間の吸光度変化量を、比較例については、反応開始１０分後の吸光度を測定し、それぞれ試薬ブランクから差し引いた。両者の結果を図２に示した。本実施例では、比較例に比べて約１０倍、吸光度変化量が上昇していた。
【０１３９】
（実施例５  クレアチニンの定量）
下記の組成の反応液１を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  緩衝液（ｐＨ７．０）
１２ｍｍｏｌ／Ｌ    ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
５．３ｍｍｏｌ／Ｌ    ＩＤＰ
２０ｕ／ｍＬ    クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡製）
【０１４０】
また、下記の組成の反応液２を調製した。
２００ｍｍｏｌ／Ｌ  緩衝剤ＰＩＰＥＳ  （ｐＨ７．０）
２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２
４ｍｍｏｌ／Ｌ    チオＮＡＤ
４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）
４ｕ／ｍＬ  Ｇ６ＰＤＨ
４ｕ／ｍＬ  ＡＤＰ−ＨＫＩＩ
１０００ｕ／ｍＬ  ＣＫ  （ウサギ筋肉由来）
【０１４１】
０．７５ｍＬの反応液１に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０３ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌクレアチニン溶液をそれぞれ０．０５ｍＬ添加して３７℃５分間加温した。その後、反応液２を０．２５ｍＬ加え４００ｎｍの吸光度をモニターした。反応液２添加後の２分目から７分目までの吸光度変化量を測定した。結果は、図３に示したように、クレアチニン濃度に応じて吸光度変化量は定量的に増加した。
【０１４２】
（実施例６  ３−ホスホグリセリン酸の定量）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ
１ｕ／ｍＬ    Ｇ６ＰＤＨ
２ｍｍｏｌ／Ｌ      ＮＡＤ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＡＴＰ
４ｍｍｏｌ／Ｌ      ＩＤＰ
２０ｕ／ｍＬ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（シグマ社製：酵母由来）
【０１４３】
上記反応液１ｍＬに対し、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌの３−ホスホグリセリン酸水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７℃にて３−ホスホグリセリン酸添加後、１分目から６分目までの３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。結果を図４に示した。比較対象として、反応液からＩＤＰを除いた通常の測定系の場合、５０μｍｏｌ／Ｌの３−ホスホグリセリン酸水溶液で吸光度は０．００６であった。還元型ＮＡＤの分子吸光係数を考慮すると、本実施例による吸光度変化量は、通常の測定系に比べて約５０倍の０．３であった。
【０１４４】
（実施例７  ホスホフルクト−１−キナーゼ（ＰＦＫ）によるフルクトース−６−リン酸の定量）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
５ｍｍｏｌ／Ｌ    ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ
１ｕ／ｍＬ    Ｇ６ＰＤＨ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＮＡＤ
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ      ＡＴＰ
５ｍｍｏｌ／Ｌ      ＩＤＰ
【０１４５】
上記反応液１ｍＬに対し、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのフルクトース−６−リン酸溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７℃にて予備加温した。各々につき、ホスホフルクト−１−キナーゼ（旭化成ファーマ株式会社、Ｔ−１４２：  Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）を３０ｕ／ｍＬになるように加え３７℃にて反応を開始した。ホスホフルクト−１−キナーゼ添加後、１分目から６分目までの３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。結果を図５に示した。図５に示すように、フルクトース−６−リン酸の濃度に応じて、吸光度変化量は定量的に増加した。
【０１４６】
（実施例８    ＧＫ  によるグリセロールの定量）
下記の組成の反応液を調製した。グリセロールキナーゼとしては、下記のように微生物由来の酵素を用いた。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
５ｍｍｏｌ／Ｌ    ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ
１ｕ／ｍＬ    Ｇ６ＰＤＨ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＮＡＤ
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ      ＡＴＰ
４ｍｍｏｌ／Ｌ      ＩＤＰ
２０ｕ／ｍＬ  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｋｉｎａｓｅ（旭化成ファーマ株式会社、Ｔ−６４：  Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ由来）  
【０１４７】
上記反応液１ｍＬを予備加温後、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのグリセロール溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７℃にて反応を開始した。グリセロール溶液添加後、１分目から６分目までの３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。次に、ＡＴＰをデオキシＡＴＰに置換え、同様の測定を実施した。これらの結果を図６に示した。ＡＴＰとＩＤＰの組合せよりも、ｄＡＴＰとＩＤＰの組合せのほうが約３倍の感度が得られた。
【０１４８】
（実施例９  ＰＫ  ＩＤＰ添加の効果）
ウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼを用い、下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）
５ｍｍｏｌ／Ｌ    塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
１ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ
１ｕ／ｍＬ    Ｇ６ＰＤＨ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＮＡＤ
３ｍｍｏｌ／Ｌ      ＡＴＰ
１０ｕ／ｍＬ  ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、シグマ社、ウサギ筋肉由来）
【０１４９】
上記反応液１ｍＬにピルビン酸を０．５ｍｍｏｌ／Ｌになるように加え、３７℃で３４０ｎｍの吸光度をモニターした。同様の操作を１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸についても実施した。３４０ｎｍの吸光度は反応平衡に達し、一定値を示した。次に、この反応液の中に更に１ｍｍｏｌ／ＬのＩＤＰを加えたところ、吸光度は直線的に増加した。ＩＤＰ添加後、１分目から１１分目までの吸光度変化量を測定した結果を、図７に示した。図７に示すように、定量性は認められた。このことからピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）のＡＴＰとＩＤＰを介した可逆反応が起こっていることが確認された。
【０１５０】
（実施例１０  ３−ホスホグリセリン酸の定量（大腸菌ＧＫによる検出反応））
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ    ＭｇＣｌ２
１０ｍｍｏｌ／Ｌ      グリセロール
５ｕ／ｍＬ      パーオキシダーゼ  （西洋わさび、Ｓｉｇｍａ）
０．０３％    ４−アミノアンチピリン
０．０２％  Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン，ナトリウム塩，２水和物（ＴＯＯＳ、同仁化学）
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＧＴＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＡＤＰ
２０ｕ／ｍＬ  Ｌ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼ  （旭化成ファーマ株式会社、ＧＰＯＳＰ、カタログＮｏ．Ｔ−６０）
５ｕ／ｍＬ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（シグマ社製：酵母由来）
１ｕ／ｍＬ  グリセロキナーゼ（ＧＫ）  （大腸菌由来、Ｓｉｇｍａ）
【０１５１】
上記反応液１ｍＬに対し、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌの３−ホスホグリセリン酸水溶液を０．００５ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．０１５ｍＬ加えて、３７℃にて反応をさせた。３−ホスホグリセリン酸添加後、３分目から５分目までのＴＯＯＳと４−アミノアンチピリンの酸化縮合色素に基づく５５５ｎｍの吸光度変化量を測定した。実施例６において、ヌクレオチド補酵素はＡＴＰとＩＤＰを用いたが、ここではＧＴＰとＡＤＰの組合せを選択した。そして、生成したＡＴＰを大腸菌由来のＧＫを用いて定量した。３−ホスホグリセリン酸水溶液を添加しなかったものを試薬ブランクとしてそれぞれの吸光度変化量に対して差し引いた結果を図８に示した。図８に示すように、３−ホスホグリセリン酸の濃度に応じて、吸光度変化量は定量的に増加した。
【０１５２】
（実施例１１  ヘキソキナーゼによるグルコース６リン酸定量）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ    ＭｇＣｌ２
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＤＰ
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  グリセロール
０．３％    ４−アミノアンチピリン
２０ｕ／ｍＬ  ＧＰＯＳＰ（旭化成ファーマ株式会社、カタログＮｏ．Ｔ−６０）
０．２％      ＴＯＯＳ  （同仁化学）
４．５ｕ／ｍＬ  パーオキシダーゼ（シグマ）
１ｕ／ｍＬ    グリセロキナーゼ（大腸菌由来：シグマ）
５０ｕ／ｍＬ  ＨＫＩＩＩ（旭化成ファーマ株式会社；カタログＮｏ．Ｔ−１４１）
【０１５３】
測定の原理は、ＡＤＰ、ＧＴＰの共存下、大腸菌由来のグリセロキナーゼを用い、ＨＫＩＩＩ反応により生成されるＡＴＰを特異的に定量するというものである。上記反応液１ｍＬに対し、反応液中の濃度が１μｍｏｌ／Ｌ、２μｍｏｌ／Ｌ、３μｍｏｌ／Ｌ、４μｍｏｌ／Ｌ、５μｍｏｌ／Ｌになるようにグルコース−６−リン酸溶液を加え予備加温した。次いで、反応液中の濃度が１ｍｍｏｌ／ＬになるようにＧＴＰ水溶液を加えて、３７度にて反応を開始させた。ＧＴＰ溶液添加後、３分目から８分目までの５５５ｎｍの吸光度変化量を測定した。試薬ブランクを差し引いたそれぞれの吸光度変化量の結果を図９に示した。図９に示すように、グルコース−６−リン酸の濃度に応じて、吸光度変化量は定量的に増加した。
【０１５４】
（実施例１２    ＡＤＰ依存性グルコキナーゼの逆反応）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ      ＭｇＣｌ２
５ｍｍｏｌ／Ｌ    クレアチンリン酸
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＭＰ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      ＣＤＰ
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ｄｅａｍｉｄｏ−ＮＡＤ
２０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＮＨ４Ｃｌ
１ｍｍｏｌ／Ｌ      コール酸ナトリウム
０．５ｕ／ｍＬ    ＮＡＤ合成酵素（ＮＡＤＳＩＩ：旭化成ファーマ株式会社、Ｔ−６７）
２ｕ／ｍＬ    １２α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（１２α−ＨＳＤＩＩ：旭化成ファーマ株式会社、Ｔ−１９０）
１０ｕ／ｍＬ    ＣＫ（ＨＣ−ＣＫＩＩ：  旭化成ファーマ株式会社、Ｔ−７４）
【０１５５】
ＡＤＰ依存性グルコキナーゼとしてＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ（旭化成ファーマ株式会社：Ｔ−９２）を用い、２種のヌクレオチド補酵素としてＣＤＰ及びＡＭＰを選択した。本実施例により生成したＡＤＰの検出には、まずＣＫでＡＤＰをＡＴＰに変換した後、これをＮＡＤ合成酵素でＮＡＤに変換、最終的に１２α−ＨＳＤＩＩによる還元型ＮＡＤの生成速度を３４０ｎｍにて検出した。反応液１ｍＬを石英セルに分注し３７℃にて加温後、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース−６−リン酸溶液をそれぞれ０．０１ｍＬ添加した。各濃度のグルコース−６−リン酸が添加された石英セルにＡＤＰ−ＨＫＰＩＩをそれぞれ２０ｕ添加し、３４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。酵素添加後５分目から７分目までの吸光度変化量を読み取り、グルコース−６−リン酸溶液がゼロのものをブランクとして差し引き、グルコース−６−リン酸溶液の濃度に対してプロットした。結果を図１０に示した。図１０に示すように、グルコース−６−リン酸の濃度に応じて、吸光度変化量は定量的に増加した。
【０１５６】
（実施例１３  ＰＫによるホスホエノールピルビン酸の定量）
下記の組成の反応液を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）
５ｍｍｏｌ／Ｌ    塩化マグネシウム 
１０ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    塩化カリウム
１ｕ／ｍＬ    ＡＤＰ−ＨＫ（旭化成ファーマ株式会社製：Ｔ−９２）
１ｕ／ｍＬ    Ｇ６ＰＤＨ（東洋紡製）
１ｍｍｏｌ／Ｌ    ＮＡＤ
２ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＴＰ
５０ｕ／ｍＬ    ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、シグマ社、ウサギ筋肉由来） 
【０１５７】
上記反応液１ｍＬに対し、０ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌのホスホエノールピルビン酸カリウム水溶液を０．０２ｍＬ加えて、３７℃にて予備加温した。その後、それぞれに１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ溶液を０．０５ｍＬ加え、反応を開始させた。ＩＤＰ添加後、３分目から８分目までの３４０ｎｍの吸光度変化量を測定した。結果は、図１１に示したように、ホスホエノールピルビン酸濃度に比例して吸光度変化量は定量的に増加した。
【０１５８】
（実施例１４  クレアチニンの定量）
マウスＢ型アイソザイムをコードするＤＮＡを常法により取得した。ＣＫ（旭化成ファーマ株式会社製、カタログＮｏ．Ｔ−７４）生産に用いられている宿主、ベクター系にこの遺伝子を挿入してクローニングし、常法に従いＣＫ−Ｂ（ヒト由来Ｂ型アイソザイム）を取得した。
【０１５９】
また、下記の組成の反応液１を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ    ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
１２ｍｍｏｌ／Ｌ    塩化マグネシウム
１２ｍｍｏｌ／Ｌ    グルコース
１．５ｕ／ｍＬ    ＡＤＰ−ＨＫ（旭化成ファーマ株式会社製：Ｔ−９２）
１．５ｕ／ｍＬ    Ｇ６ＰＤＨ（東洋紡製）
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ    チオＮＡＤ（オリエンタル酵母工業製）
０．７ｍｍｏｌ／Ｌ    ＡＴＰ
【０１６０】
さらに、下記の組成の反応液２を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＩＤＰ
０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン
０．０２％  ＢＳＡ
１６ｕ／ｍＬ  クレアチニンアミドハイドロラーゼ（東洋紡製）
２００ｕ／ｍＬ  ＣＫ−Ｂ（ヒト由来Ｂ型アイソザイム）
【０１６１】
クレアチニンアミドハイドロラーゼによるクレアチニンからクレアチンへの転換反応と、ＣＫサイクリング反応と、を同時に実施した。０．７５ｍＬの反応液１に対して０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、０．３ｍｍｏｌ／Ｌのクレアチニン水溶液を０．０５ｍＬ加え、３７℃３分間予備加温した。次いで反応液２を０．２５ｍＬ加え反応を開始させた。反応液２添加後３分目から４分目までの４００ｎｍにおける吸光度変化量を測定した。結果は、図１２に示したように、クレアチニン濃度に応じて吸光度変化量は定量的に増加した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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