(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が体液試料内に含まれ、前記方法が、
前記粒子分析システムのフローセルの流路に沿ってシース液を注入することと、
試料流体注入管に隣接する第１の厚さを有する試料流れストリームを提供するように、前記体液試料を前記試料流体注入管からある流量で前記フローセル内を流れる前記シース液に注入することであって、前記試料流れストリームの厚さが前記第１の厚さから、画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに縮小するように、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、前記体液試料を注入することと、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標を撮像することによって、画像捕捉デバイスを焦点化することであって、前記撮像目標及び試料流れストリームが撮像軸に沿う既定の変位距離を画定する、画像捕捉デバイスを焦点化することと、
前記画像捕捉デバイスを用いて、前記試料流れストリーム内で、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記フローセルの前記画像捕捉部位における、前記撮像軸に沿った、前記体液試料からの第１の複数の粒子の焦点画像を取得することであって、前記画像捕捉デバイスが、前記焦点化工程及び前記既定の変位距離を使用して、前記試料流れストリーム上に焦点化される、前記体液試料からの第１の複数の粒子の焦点画像を取得することと、を含み、
前記流路サイズの縮小部が、近位厚さを有する近位流路部分、及び前記近位厚さよりも小さい遠位厚さを有する遠位流路部分によって画定され、
前記試料流体注入管の下流端が、前記近位流路部分の遠位に位置付けられ、
前記シース液と体液試料との間の速度差異が、前記流路サイズの縮小部及び前記体液試料の流量との組み合わせで、前記試料流体注入管から前記画像捕捉部位に前記体液試料内の細胞を４秒以内で送達することに効果的である、方法。
【請求項２】
前記体液試料が、尿流体試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液試料が、前記試料流体注入管の出口ポートから前記画像捕捉部位の前記撮像軸まで約１．５秒で移動する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記流路サイズの縮小部が、前記試料流れストリームの第１及び第２の厚さを二等分する横断面について、略対称的な、前記流路に沿って放射状に内向きに角度が付いた、前記流路の対向壁によって画定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フローセルが、シース液供給源から、前記画像捕捉部位の前記流路に沿う前記シース液の第２の流れ方向に垂直な第１の流れ方向において、前記流路へと前記シース液を受容するように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記撮像目標が、前記フローセル上に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記体液試料が試料粘性を有し、前記シース液が前記試料粘性とは異なるシース液粘性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
体液試料内の粒子を撮像するための、幾何学的流体集束を行う、粒子分析システムであって、
シース液の流れを送るために構成される流路を有するフローセルと、
前記流路と流体連通する試料流体注入システムであって、前記試料流体注入システムは、前記試料流体注入システムに隣接する第１の厚さを有する試料流体ストリームを提供するように、前記体液試料を前記フローセル内を流れる前記シース液に注入するために構成され、前記試料流体ストリームの厚さが前記第１の厚さから画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに縮小するように、前記フローセルの前記流路が、流路サイズの縮小部を有する、試料流体注入システムと、
前記フローセルの前記画像捕捉部位において、前記体液試料からの複数の前記粒子を撮像するように、前記画像捕捉部位と整列する、画像捕捉デバイスと、
前記フローセルに対する、前記画像捕捉デバイスの焦点を設定するように構成される、焦点化機構と、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び試料流体ストリームが、撮像軸に沿う変位距離を画定する、撮像目標と、
プロセッサと、
前記変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記画像捕捉デバイスの前記焦点を設定するように、前記焦点化機構を操作するために、前記プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を備える焦点化モジュールと、を備え、
前記体液試料が、約２〜４秒の範囲内の前記フローセルを通る移行時間を有するように、前記試料流体注入システムが、前記体液試料を送達するように構成される、システム。
【請求項９】
前記体液試料が、尿流体試料である、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記流路サイズの縮小部が、前記試料流体ストリームの第１及び第２の厚さを二等分する横断面について、略対称的な、前記流路に沿って放射状に内向きに角度が付いた、前記流路の対向壁によって画定される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１１】
前記フローセルが、シース液供給源から、前記画像捕捉部位の前記流路に沿う前記シース液の第２の流れ方向に垂直な第１の流れ方向において、前記流路へと前記シース液を受容するように構成される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１２】
前記撮像目標が、前記フローセル上に固定される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１３】
前記体液試料が試料粘性を有し、前記シース液が前記試料粘性とは異なるシース液粘性を有する、請求項８に記載のシステム。
【請求項１４】
幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して体液試料内の粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が、試料流体粘性を有する前記体液試料に含まれ、前記方法が、
前記体液試料が、流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅を有する試料流れストリーム内で流れるように、前記体液試料をフローセルに注入することであって、前記試料流れストリームが、流路サイズの縮小部を通って流れ、撮像軸を横断する、前記体液試料を注入することと、
視野を有する画像捕捉デバイスを焦点化することであって、前記焦点化することは、撮像目標を撮像することによって行われ、前記撮像目標は、前記画像捕捉デバイスの前記視野内に前記フローセルに対して固定された位置を有する、ことと、
前記画像捕捉デバイスを用いて、前記試料流れストリーム内で、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記粒子の焦点画像を取得することと、を含み、前記画像捕捉デバイスが、変位距離を使用して前記試料流れストリーム上に焦点化される、方法。
【請求項１５】
前記体液試料が、尿試料である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
体液試料内の粒子を撮像するための、幾何学的流体集束を行う、粒子分析システムであって、
注入管を伴う流路及びそこを通る撮像軸を伴う撮像窓を有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記注入管と流体連通する流体インプットであって、前記体液試料が、流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅を有する試料流れストリーム内を流れるように、前記体液試料をフローセルに注入するように構成される、流体インプットと、
画像捕捉デバイスと、
前記フローセルに対する、前記画像捕捉デバイスの焦点を設定するように構成される、焦点化機構と、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び試料流れストリームが、前記撮像軸に沿う変位距離を画定する、撮像目標と、
プロセッサと、
前記変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記画像捕捉デバイスの前記焦点を設定するように、前記焦点化機構を操作するために、前記プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を備える焦点化モジュールと、を備える、システム。
【請求項１７】
前記体液試料が、尿試料である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
複合した粘性及び幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して複数の粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が、試料流体粘性を有する体液試料に含まれ、前記方法が、
フローセルの流路に沿ってシース液を流すことであって、前記シース液が、既定の粘性差異範囲内の粘性差異で前記試料流体粘性とは異なるシース液粘性を有する、シース液を流すことと、
前記シース液に包まれた試料流体ストリームを提供するように、前記体液試料を前記フローセル内の前記流れるシース液に注入することと、
前記粘性差異に関連する、前記シース液と前記試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路サイズの縮小部に関連する、前記シース液と前記試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、前記シース液内の粘性剤が、前記試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、前記細胞が前記試料流体ストリームから前記流れるシース液に伸びる際に、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像部位での前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的となるように、前記試料流体ストリーム及び前記シース液を前記流路サイズの縮小部を通して前記撮像部位に向かって流すことと、
視野を有する画像捕捉デバイスを焦点化することであって、前記焦点化することは、撮像目標を撮像することによって行われ、前記撮像目標は、前記画像捕捉デバイスの前記視野内に前記フローセルに対して固定された位置を有し、前記画像捕捉デバイスは、変位距離を使用して、前記試料流体ストリーム上に焦点化される、ことと、
前記撮像部位にて前記複数の粒子を撮像することと、を含む、方法。
【請求項１９】
前記体液試料が、尿試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試料流体粘性を有する体液試料内の複数の粒子を撮像するためのシステムであって、前記システムが、既定の粘性差異範囲内の粘性差異で前記試料流体粘性とは異なるシース液粘性を有するシース液との使用のためのものであり、前記システムが、
流路及び試料流体注入管を有する、フローセルであって、前記流路が、流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記シース液の流れを前記フローセルの前記流路に沿って送るように、前記フローセルの前記流路と流体連通する、シース液インプットと、
前記シース液及び前記体液試料が、前記流路サイズの縮小部を通って撮像部位に向かって流れる際に、前記粘性差異に関連する、前記シース液と前記体液試料との間の相互作用によって誘発される、粘性流体集束効果が、前記流路サイズの縮小部に関連する、前記シース液と前記体液試料との間の相互作用によって誘発される、幾何学的流体集束効果との組み合わせで、前記シース液内の粘性剤が、試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、前記細胞が前記試料流体ストリームから前記流れるシース液に伸びる際に、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、前記撮像部位にて前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて目標撮像状態を提供するように、前記体液試料の流れを、前記フローセル内を流れる前記シース液に注入するように、前記フローセルの前記試料流体注入管と流体連通する、体液試料インプットと、
前記撮像部位にて前記複数の粒子を撮像する撮像デバイスであって、前記撮像デバイスは、視野を有する、撮像デバイスと、
前記撮像デバイスの前記視野内に前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標であって、前記撮像デバイスは、変位距離を使用して、前記試料流体ストリーム上に焦点化される、撮像目標と
を備える、システム。
【請求項２１】
前記体液試料が、尿試料である、請求項２０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１３年３月１５日出願の、米国特許仮出願第６１／７９９，０１４号の非仮出願であり、その利益を主張し、該特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。本出願はまた、両者とも２０１４年３月１７日出願の、米国特許出願第１４／２１６，５６２号及び国際特許出願第（造影剤）にも関連する。これらの出願のそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、試料中の粒子を弁別及び定量化するように、全体的又は部分的自動化デバイスを使用する、尿試料等の流体試料内の粒子の撮像を含む、粒子の分析のための、システム、分析器、組成物、及び方法の分野に関する。本開示はまた、被験者からの尿試料中の粒子を分析するために有用な粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）、該液体を産生するための方法、並びに、尿中の粒子を検出及び分析するために該液体を使用するための方法にも関する。画像ベースの尿試料分析を実行するために有用な組成物及び方法もまた開示する。本開示の組成物及び方法はまた、尿内の粒子の検出、計数、及び特徴付けにも有用であり、かかる粒子は、例えば、画像及び形態ベースの粒子計数、分類、副分類、特徴付け、及び／又は分析のための、細胞、円柱、結晶、又は脂肪体を含み得る。
【０００３】
尿沈渣分析は、患者の健康状態の概観を提供するために最も一般的に行われる診断試験のうちの１つである。尿試料は、患者の体から得られ得、後の処理及び分析のために試験管内で保存され得る。尿試料内の形成成分とも呼ばれる特定の特色的沈渣の外見は、臨床的に有意であり得る、及び／又は被験者の病理状態を示し得る。
【０００４】
概して、異常な尿は、血球、上皮細胞、結晶、円柱、又は微生物等の、様々な形成成分を含有し得る。例えば、尿試料は、血液由来の細胞を含有し得る。糸球体から尿道までの泌尿生殖器系の任意の点での出血（血尿）の結果として、赤血球（erythrocyte）又は赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ＲＢＣ）が尿中に存在することがある。白血球（leukocyte）又は白血球（ＷＢＣ）、好中球、好酸球の存在は、臨床的有意性を有することがある。格子細胞は、１．０１０以下の比重の低張尿において見られる好中球の一種である。リンパ球の存在は、移植の後の腎拒絶の早期指標として使用されている。好酸球は、薬物誘発性の間質性腎炎に関連付けられ、腎臓又は下部尿路に由来する粘性糸が存在し得る。
【０００５】
尿試料はまた、上皮由来の細胞も含有し得る。腎尿細管細胞とも呼ばれるいくつかの腎上皮細胞は、正常な剥離のため、健常者の尿内に見られることがある。しかしながら、過剰な腎尿細管細胞の存在は、活性腎疾患又は細管損傷を示す。尿内に見られる様々な種類の上皮細胞（腎性、移行又は尿路上皮、及び扁平上皮）の中で、腎上皮細胞は、最も臨床的に有意である。これらは、急性細管壊死、ウイルス感染（サイトメガロウイルス等）、及び腎移植拒絶に関連付けられる。これらの存在はまた、熱、化学的毒素、薬物（特にアスピリン）、重金属、炎症、感染、及び腫瘍と共に増加する。更に、封入体の存在が、風疹及び疱疹等のウイルス感染において、特にサイトメガロウイルスと共に見られることがある。
【０００６】
尿はまた、移行上皮細胞又は尿路上皮細胞も含有し得る。移行上皮細胞は、腎盤から、男性の尿道の遠位部まで、及び女性の膀胱の基部（三角部）までの尿路の内部を覆う、上皮細胞の多層である。これらは、腎上皮細胞と区別することが困難なことがあるが、これらは、概してより大きく、より球形である。いくつかの移行細胞は、健常者の尿内に存在する。数の増加は、感染に関連付けられる。これらの細胞の大きい凝集塊又はシートは、移行上皮癌と共に見られることがある。
【０００７】
尿はまた、扁平上皮細胞も含有し得る。扁平上皮細胞は、女性の尿道、及び男性の尿道の遠位部の、内部を覆う。女性における多数の扁平上皮細胞の存在は、概して、膣汚染を示す。
【０００８】
尿はまた、クルー細胞も含有し得る。クルー細胞は、別の種類の膣由来の扁平上皮細胞であり、尿沈渣の汚染が見られ得る。この扁平上皮細胞は、細菌、ガードネレラ菌で覆われる又はちりばめられ、その存在は細菌性膣炎を示す。
【０００９】
尿はまた、楕円脂肪体、尿細管脂肪、又は尿細管脂肪体も含有し得る。これらの脂肪体は、脂肪又は脂肪滴で満たされた、腎上皮細胞（又はマクロファージ）である。脂肪は、中性脂肪（トリグリセリド）又はコレステロールのいずれかであり得、これらは同じ臨床的有意性を有する。尿内の楕円脂肪体の存在は、疾患異常性を示すものであり、軽視されるべきではない。これらは、多くの場合、尿沈渣内の脂肪円柱及び脂肪滴と共に見られ、ネフローゼ症候群に見られるような重度のタンパク尿と関連付けられる。
【００１０】
尿はまた、細菌及び酵母等の微生物も含有し得る。通常は、尿は無菌であるか、又は細菌が無い。しかしながら、特定の細菌は、アルカリ性ｐＨの尿内に典型的に見られる。関連する沈渣の所見は、ＷＢＣ（好中球）及び円柱（ＷＢＣ、細胞、顆粒、又は細菌）の存在を含み得る。感染症は、最も多くの場合、腸由来のグラム陰性桿菌によるものであるが、感染性微生物もまた、グラム陽性球菌であり得る。
【００１１】
更に、特に酵母感染を有する女性患者からの汚染等の膣汚染の結果として、酵母が尿内に見られることがある。これはまた、尿グルコースの存在により、糖尿病とも関連付けられる。酵母は、皮膚及び環境からの一般的な汚染物質であり、感染症は、衰弱し、及び免疫抑制の、又は免疫不全状態の患者において問題である。
【００１２】
従来、尿内の沈渣の分析は、一般実験室において顕微鏡を使用する、視覚検査によって行われている。これらのアプローチでは、尿試料は、まず遠心分離及び濃縮に供される。このようにして得られる沈渣は、いくつかの場合では、着色され、次いで、顕微鏡スライドガラスに載せられ、顕微鏡下で手動判定及び計数に供される。
【００１３】
試料調製工程は、遠心分離による尿沈渣の濃縮、並びに、ときには、例えば、ＲＢＣ、ＷＢＣ、及び上皮細胞等の、沈渣種類間の造影を促進するための顕微鏡着色の適用を含み得る。手動計数では、技術者は、湿式台スライドを見て、可視細胞の種類間を、又は専門的な判断でそれらの外見によって、区別し、既定の区域内の異なる種類の観察された尿沈渣の数を手動で計数する。
【００１４】
尿分析システムの使用は、米国特許第４，４７３，５３０号、Ｖｉｌｌａ−Ｒｅａｌの、表題「Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｓａｎｉｔａｒｙ  Ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ」、米国特許第３，８９４，８４５号、表題「Ｕｒｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ」、及び米国特許第３，９８８，２０９号、表題「Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ」（両方ともＭｃＤｏｎａｌｄ）、米国特許第４，９７３，４５０号、Ｓｃｈｌｕｔｅｒの表題「Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｕｒｉｎａｌｙｓｉｓ」、米国特許第４，６２２，２９８号、Ｍａｎｓｏｕｒらの、表題「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ」、並びに米国特許第５，１３２，２３２号、Ｐａｒｋｅｒの表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｑｕｉｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ」において概して記載される。米国特許第４，６１２，６１４号Ｄｅｉｎｄｏｅｒｆｅｒら、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｆｌｕｉｄ  Ｓａｍｐｌｅ」は、顕微鏡スライドガラス又はフローセル等の、拡張区域に及んで、試料を分布することによる、尿沈渣の分析方法を報告する。Ｄｅｉｎｄｏｅｒｆｅｒらは、視覚的に認識可能な特性のクラス別に順序付けられるアレイで表示される電子画像に変換される、試料の複数の光静止画像の使用を報告する。しかしながら、これらの早期に開発された尿分析システムのうちの多くは、概して、全ての意図される目的のための全ての目標／被験者にわたる適応に必要とされる、処理能力、正確さ、及び／又は全体的な適用範囲に欠いていた。
尿沈渣判定の自動化のためには、自動化フロー顕微鏡が使用され得る（例えば、フロー型自動顕微鏡、ｉＱ（登録商標）２００、Ｉｒｉｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。これらの種類のデバイスで、尿試料は、事前濃縮を伴わずに平坦型のフローセルに導入され、試料がフローセルを通って流れる間に画像が撮影及び保存される。しかしながら、尿沈渣は、形態において多様化し得、多くの沈渣が損傷しており、したがって、良好な正確性で撮影される画像の判定は、到達することが困難である。赤血球（特に異形赤血球）、細菌、及び結晶等の、大きさの小さい沈渣を、良好な正確性で外部のユーザの検定を伴わずに判定することは、特に困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第４，４７３，５３０号明細書
【特許文献２】米国特許第３，８９４，８４５号明細書
【特許文献３】米国特許第３，９８８，２０９号明細書
【特許文献４】米国特許第４，９７３，４５０号明細書
【特許文献５】米国特許第４，６２２，２９８号明細書
【特許文献６】米国特許第５，１３２，２３２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，６１２，６１４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
現在既知の粒子分析システム及び方法は、関連医療診断技術と共に、医師、臨床医、及び患者に、真の利益を提供することができるが、尚も更なる改善が望ましい。本発明の実施形態は、これらの目立つ必要性のうちの少なくともいくつかに対する解決策を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本開示は、尿試料等の、粒子を含有する調製試料を分析するための分析器、システム、組成物、及び方法に関する。いくつかの態様では、該システムは、視覚分析器であり得る分析器を含む。いくつかの態様では、該分析器は、視覚（例えば、撮像）分析器及びプロセッサを含有する。一態様では、本開示は、対象の粒子を含有する尿試料が、そこを通して高光学解像度撮像デバイスが画像を捕捉する表示ポートを有するフローセルを通って流される、自動化粒子撮像システムに関する。いくつかの態様では、高光学解像度撮像デバイスは、デジタルカメラ等のカメラを備える。一態様では、高光学解像度撮像デバイスは、対物レンズを備える。
【００１８】
フローセルは、調製試料等の試料流体の供給源に、並びに、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）の供給源に結合する。該システムは、流れ内の試料内の粒子の焦点画像の捕捉を可能にする。いくつかの実施形態では、画像は、粒子の分類及び副分類のための自動化高処理能力プロセスにおいて使用され得る。
【００１９】
一実施形態では、分析器は、１つ以上の視覚特異性を有する試料内の粒子を検出し、正確な粒子計数又は試料内の粒子の異なる分類又は副分類の濃度を判定するように構成される。
【００２０】
試料は、任意の従来の方法、例えば、尿試料採取によって得られ得る。試料は、健康であると考えられる被験者からのもの、例えば、日常的な身体検査の一部又は対照群として採取された試料であり得る。試料はまた、障害を有する、その危険性がある、又はそれを有することが疑われる被験者からのものでもあり得る。該障害は、疾患、遺伝的異常、感染症、外傷、又は不明な原因の結果であり得る。代替的に、又は更に、該方法は、障害のための治療の過程の間の被験者の監視に有用であり得る。治療に非反応性である徴候がある場合は、臨床医は、代替の又は補助的治療を選択することができる。被験者の状態、及び、もしあれば、特定の障害に依存して、試料は、毎日、毎週、毎月、又は毎年１回（又は２回、３回等）採取することができる。試料は、本明細書に記載される粒子造影剤組成物との接触により調製され得る。
【００２１】
粒子は、試料に依存し変化し得る。粒子は、生体細胞、例えば、上皮細胞又は血球であり得る。いくつかの実施形態では、粒子は、感染因子、例えば、細菌、原生生物、原生動物、真菌、又は寄生虫であり得る。
【００２２】
一態様では、本発明の実施形態は、粒子分析システムを使用して粒子を撮像するための方法を包含する。いくつかの場合では、該システムは、幾何学的流体集束のために構成される。粒子は、体液試料内に含まれ得る。例示的な方法は、粒子分析器のフローセルの流路に沿ってシース液を注入することと、注入管に隣接する第１の厚さを有する試料流れストリームを提供するように、体液試料を試料流体注入管からある流量でフローセル内の流れるシース液に注入することであって、試料流れストリームの厚さが初期厚さから画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに縮小するように、フローセルの流路が流路サイズの縮小部を有する、体液試料を注入することと、前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標を撮像することによって、画像捕捉デバイスを焦点化することであって、撮像目標及び試料流れストリームが撮像軸に沿う既定の変位距離を画定する、画像捕捉デバイスを焦点化することと、画像捕捉デバイスを用いて、流れストリーム内で、粒子特徴付け及び計数に好適な、フローセルの画像捕捉部位における、撮像軸に沿った、第１の試料からの第１の複数の粒子の焦点画像を取得することと、を含み、画像捕捉デバイスは、焦点化工程及び既定の変位距離を使用して、試料流れストリーム上に焦点化される。流路サイズの縮小部は、近位厚さを有する近位流路部分及び近位厚さよりも小さい遠位厚さを有する遠位流路部分によって画定され得る。試料流体注入管の下流端は、近位流路部分の遠位に位置付けられ得る。シースと血液流体試料との間の速度差異は、流路サイズの縮小部及び試料の流量との組み合わせで、試料内の細胞を、試料流体注入管から画像捕捉部位まで、４秒以下で送達することに効果的であり得る。いくつかの場合では、体液試料は、尿流体試料である。いくつかの場合では、画像捕捉部位は、約８００μｍ×８００μｍの視野を有する。いくつかの場合では、試料流体は、約９００μＬの容積を有する。いくつかの場合では、試料流体は、試料流体注入管の出口ポートから画像捕捉部位の撮像軸まで約１．５秒で移動する。いくつかの場合では、流路サイズの縮小部は、試料流体ストリームを第１及び第２の厚さに二等分する横断面について、略対称的な、流路に沿って放射状に内向きに角度が付いた流路の対向壁によって画定される。いくつかの場合では、フローセルは、シース液供給源から、撮像部位の流路に沿うシース液の第２の流れ方向に垂直な第１の流れ方向において、流路へとシース液を受容するように構成される。いくつかの場合では、フローセルは、画像捕捉デバイスの自動焦点目標を含む。いくつかの場合では、自動焦点目標は、フローセルに対して固定された位置にあり得る。いくつかの場合では、体液試料は、試料粘性を有し、シース液は、試料粘性とは異なるシース液粘性を有する。
【００２３】
別の態様では、本発明の実施形態は、体液試料内の粒子を撮像するための、幾何学的流体集束を行う粒子分析システムを包含する。例示的なシステムは、シース液の流れを送るように構成される流路を有するフローセルを含み得、試料流体注入システムは、該流路と流体連通し、注入管に隣接する第１の厚さを有する試料流体ストリームを提供するように、該試料をフローセル内の流れるシース液に注入するように構成され、フローセルの該流路は、試料流体ストリームの厚さが初期厚さから画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに縮小するように、流路サイズの縮小部を有する。システムはまた、フローセルの画像捕捉部位において、試料流体からの複数の粒子を撮像するように、画像捕捉部位と整列する画像捕捉デバイスも含み得、焦点化機構は、フローセルに対する画像捕捉デバイスの焦点状態を設定するように構成され、撮像目標は、フローセルに対して固定された位置を有する。撮像目標及び試料流れストリームは、撮像軸に沿う変位距離を画定し得る。システムはまた、プロセッサと、変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、画像捕捉デバイスの焦点状態を設定するように、焦点化機構を操作するために、プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を有する焦点化モジュールと、も含み得る。いくつかの場合では、試料流体注入システムは、試料流体が約２〜４秒の範囲内のフローセルを通る移行時間を有するように、試料流体を送達するように構成される。いくつかの場合では、体液試料は、尿流体試料である。いくつかの場合では、画像捕捉部位は、約８００μｍ×８００μｍの視野を有する。いくつかの場合では、試料流体は、約９００μＬの容積を有する。いくつかの場合では、流路サイズの縮小部は、試料流体ストリームを第１及び第２の厚さに二等分する横断面について、略対称的な、流路に沿って放射状に内向きに角度が付いた流路の対向壁によって画定される。いくつかの場合では、フローセルは、シース液供給源から、撮像部位の流路に沿うシース液の第２の流れ方向に垂直な第１の流れ方向において、流路へとシース液を受容するように構成される。いくつかの場合では、フローセルは、画像捕捉デバイスの自動焦点目標を含む。いくつかの場合では、自動焦点目標は、フローセルに対して固定された位置を有する。いくつかの場合では、体液試料は、試料粘性を有し、シース液は、試料粘性とは異なるシース液粘性を有する。
【００２４】
別の態様では、本発明の実施形態は、幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して、体液試料内の粒子を撮像するための方法を包含する。粒子は、流体試料内に含まれ得、流体試料は、試料流体粘性を有する。例示的な方法は、流体試料流体が試料流れストリーム内を流れストリーム厚さよりも大きい流れ厚さ幅で流れるように、流体試料をフローセルに注入することであって、試料流れストリームは、流路サイズの縮小部を通って流れ、撮像軸を横断する、注入することと、フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標を撮像することにより画像捕捉デバイスを焦点化することと、画像捕捉デバイスを用いて流れストリーム内で粒子特徴付け及び計数に好適な粒子の焦点画像を取得することとを含み、画像捕捉デバイスは、変位距離を使用して試料流れストリーム上に焦点化される。いくつかの場合では、体液試料は、尿試料である。
【００２５】
別の態様では、本発明の実施形態は、体液試料内の粒子を撮像するように、幾何学的流体集束を行う粒子分析システムを包含する。例示的なシステムは、注入管を伴う流路及びそこを通る撮像軸を伴う撮像窓を有する、フローセルであって、フォローセルの流路が、流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、感染管と流体連通する流体インプットであって、流体試料が、流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅を有する試料流れストリーム内を流れるように、流体試料をフローセルに注入するように構成される、流体インプットと、画像捕捉デバイスと、フローセルに対して画像捕捉デバイスの焦点状態を設定するように構成される焦点化機構と、フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標であって、撮像目標及び試料流れストリームが、撮像軸に沿う変位距離を画定する、撮像目標と、プロセッサと、変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、画像捕捉デバイスの焦点状態を設定するように、焦点化機構を操作するために、プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を有する焦点化モジュールと、を含み得る。いくつかの実施形態では、体液試料は、尿試料である。
【００２６】
別の態様では、本発明の実施形態は、複合した粘性及び幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して、複数の粒子を撮像するための方法を包含する。粒子は、試料流体粘性を有する体液試料内に含まれ得る。例示的な方法は、試料流体粘性とは既定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有するシース液を、フローセルの流路に沿って流すことと、シース液に包まれた試料流体ストリームを提供するように、体液試料をフローセル内の流れるシース液に注入することとを、含む。方法はまた、粘性差異に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路サイズの縮小部に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、シース液内の粘性剤が、試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液に伸びる際に、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的となるように、試料流体ストリーム及びシース液を流路サイズの縮小部を通して撮像部位に向かって流すことも含み得る。更に、方法は、撮像部位にて複数の粒子を撮像することを含み得る。いくつかの実施形態では、体液試料は、尿試料である。
【００２７】
更に別の態様では、本発明の実施形態は、試料流体粘性を有する体液試料内の複数の粒子の撮像システムを包含する。システムは、試料流体粘性とは既定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有するシース液との使用のために構成され得る。例示的なシステムは、流路サイズの縮小部を有する流路及び試料流体注入管を有するフローセルと、シース液の流れをフローセルの流路に沿って送るためにフローセルの流路と流体連通するシース液インプットと、体液試料の流れをフローセル内の流れるシース液に注入するようにフローセルの注入管と流体連通する体液流体試料インプットと、を含み得、よって、シース液及び試料流体が流路サイズの縮小部を通って撮像部位に向かって流れる際に、粘性差異に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路サイズの縮小部に関連する、シース液と試料流体との間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、シース液内の粘性剤が試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液に伸びる際に、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供する。システムは、撮像部位にて複数の粒子を撮像する撮像デバイスを更に含み得る。いくつかの実施形態では、体液試料は、尿試料である。
【００２８】
上記したもの及び本発明の実施形態の多くの他の特徴及び付随する利点は、下記の実施形態への参照により、付随の図と共に考慮されると、明らかとなりより理解されるだろう。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が体液試料内に含まれ、前記方法が、
前記粒子分析器のフローセルの流路に沿ってシース液を注入することと、
注入管に隣接する第１の厚さを有する試料流れストリームを提供するように、前記体液試料を前記試料流体注入管からある流量で前記フローセル内の前記流れるシース液に注入することであって、前記試料流れストリームの厚さが初期厚さから、画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに縮小するように、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、前記体液試料を注入することと、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標を撮像することによって、画像捕捉デバイスを焦点化することであって、前記撮像目標及び試料流れストリームが撮像軸に沿う既定の変位距離を画定する、画像捕捉デバイスを焦点化することと、
前記画像捕捉デバイスを用いて、前記流れストリーム内で、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記フローセルの前記画像捕捉部位における、前記撮像軸に沿った、第１の試料からの第１の複数の粒子の焦点画像を取得することであって、前記画像捕捉デバイスが、前記焦点化工程及び前記既定の変位距離を使用して、前記試料流れストリーム上に焦点化される、第１の試料からの第１の複数の粒子の焦点画像を取得することと、を含み、
前記流路サイズの縮小部が、近位厚さを有する近位流路部分、及び前記近位厚さよりも小さい遠位厚さを有する遠位流路部分によって画定され、
前記試料流体注入管の下流端が、前記近位流路部分の遠位に位置付けられ、
前記シースと体液試料との間の速度差異が、前記流路サイズの縮小部及び前記試料の流量との組み合わせで、前記試料流体注入管から前記画像捕捉部位に前記試料内の細胞を４秒以内で送達することに効果的である、方法。
（項目２）
前記体液試料が、尿流体試料である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料流体が、前記試料流体注入管の出口ポートから前記画像捕捉部位の前記撮像軸まで約１．５秒で移動する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記流路サイズの縮小部が、前記試料流体ストリームの第１及び第２の厚さを二等分する横断面について、略対称的な、前記流路に沿って放射状に内向きに角度が付いた、前記流路の対向壁によって画定される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記フローセルが、シース液供給源から、前記撮像部位の前記流路に沿う前記シース液の第２の流れ方向に垂直な第１の流れ方向において、前記流路へと前記シース液を受容するように構成される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記撮像目標が、前記フローセル上に固定される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記体液試料が試料粘性を有し、前記シース液が前記試料粘性とは異なるシース液粘性を有する、項目１に記載の方法。
（項目８）
体液試料内の粒子を撮像するための、幾何学的流体集束を行う、粒子分析システムであって、
シース液の流れを送るために構成される流路を有するフローセルと、
前記流路と流体連通し、前記注入管に隣接する第１の厚さを有する試料流体ストリームを提供するように、前記試料を前記フローセル内の前記流れるシース液に注入するために構成される、試料流体注入システムであって、前記試料流体の厚さが初期厚さから画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに縮小するように、前記フローセルの前記流路が、流路サイズの縮小部を有する、試料流体注入システムと、
前記フローセルの前記画像捕捉部位において、前記試料流体からの複数の前記粒子を撮像するように、前記画像捕捉部位と整列する、画像捕捉デバイスと、
前記フローセルに対する、前記画像捕捉デバイスの焦点面を設定するように構成される、焦点化機構と、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び試料流れストリームが、前記撮像軸に沿う変位距離を画定する、撮像目標と、
プロセッサと、
前記変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記画像捕捉デバイスの前記焦点状態を設定するように、前記焦点化機構を操作するために、前記プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を備える焦点化モジュールと、を備え、
前記試料流体が、約２〜４秒の範囲内の前記フローセルを通る移行時間を有するように、前記試料流体注入システムが、前記試料流体を送達するように構成される、システム。（項目９）
前記体液試料が、尿流体試料である、項目８に記載のシステム。
（項目１０）
前記流路サイズの縮小部が、前記試料流体ストリームの第１及び第２の厚さを二等分する横断面について、略対称的な、前記流路に沿って放射状に内向きに角度が付いた、前記流路の対向壁によって画定される、項目８に記載のシステム。
（項目１１）
前記フローセルが、シース液供給源から、前記撮像部位の前記流路に沿う前記シース液の第２の流れ方向に垂直な第１の流れ方向において、前記流路へと前記シース液を受容するように構成される、項目８に記載のシステム。
（項目１２）
前記撮像目標が、前記フローセル上に固定される、項目８に記載のシステム。
（項目１３）
前記体液試料が試料粘性を有し、前記シース液が前記試料粘性とは異なるシース液粘性を有する、項目８に記載のシステム。
（項目１４）
幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して体液試料内の粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が、試料流体粘性を有する前記流体試料に含まれ、前記方法が、
前記流体試料が、流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅を有する試料流れストリーム内で流れるように、前記試料流体をフローセルに注入することであって、前記試料流れストリームが、流路サイズの縮小部を通って流れ、撮像軸を横断する、前記試料流体を注入することと、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標を撮像することによって、画像捕捉デバイスを焦点化することと、
画像捕捉デバイスを用いて、前記流れストリーム内で、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記粒子の焦点画像を取得することと、を含み、前記画像捕捉デバイスが、変位距離を使用して前記試料流れストリーム上に焦点化される、方法。
（項目１５）
前記体液試料が、尿試料である、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
体液試料内の粒子を撮像するための、幾何学的流体集束を行う、粒子分析システムであって、
注入管を伴う流路及びそこを通る撮像軸を伴う撮像窓を有するフローセルであって、前記フローセルの前記流路が流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記注入管と流体連通する流体インプットであって、前記流体試料が、流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅を有する試料流れストリーム内を流れるように、前記流体試料をフローセルに注入するように構成される、流体インプットと、
画像捕捉デバイスと、
前記フローセルに対する、前記画像捕捉デバイスの焦点状態を設定するように構成される、焦点化機構と、
前記フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標であって、前記撮像目標及び試料流れストリームが、前記撮像軸に沿う変位距離を画定する、撮像目標と、
プロセッサと、
前記変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、前記画像捕捉デバイスの前記焦点状態を設定するように、前記焦点化機構を操作するために、前記プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を備える焦点化モジュールと、を備える、システム。
（項目１７）
前記体液試料が、尿試料である、項目１６に記載のシステム。
（項目１８）
複合した粘性及び幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して複数の粒子を撮像するための方法であって、前記粒子が、試料流体粘性を有する体液試料に含まれ、前記方法が、
フローセルの流路に沿ってシース液を流すことであって、前記シース液が、既定の粘性差異範囲内の粘性差異で前記試料流体粘性とは異なるシース液粘性を有する、シース液を流すことと、
前記シース液に包まれた試料流体ストリームを提供するように、前記体液試料を前記フローセル内の前記流れるシース液に注入することと、
前記粘性差異に関連する、前記シース液と前記試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路サイズの縮小部に関連する、前記シース液と前記試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、前記シース液内の粘性剤が、前記試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、前記細胞が前記試料流体ストリームから前記流れるシース液に伸びる際に、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、前記撮像部位での前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的となるように、前記試料流体ストリーム及び前記シース液を前記流路サイズの縮小部を通して撮像部位に向かって流すことと、
前記撮像部位にて前記複数の粒子を撮像することと、を含む、方法。
（項目１９）
前記体液試料が、尿試料である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
試料流体粘性を有する体液試料内の複数の粒子を撮像するためのシステムであって、前記システムが、既定の粘性差異範囲内の粘性差異で前記試料流体粘性とは異なるシース液粘性を有するシース液との使用のためのものであり、前記システムが、
流路及び試料流体注入管を有する、フローセルであって、前記流路が、流路サイズの縮小部を有する、フローセルと、
前記シース液の流れを前記フローセルの前記流路に沿って送るように、前記フローセルの前記流路と流体連通する、シース液インプットと、
前記シース液及び前記試料流体が、前記流路サイズの縮小部を通って撮像部位に向かって流れる際に、前記粘性差異に関連する、前記シース液と前記試料流体との間の相互作用によって誘発される、粘性流体集束効果が、前記流路サイズの縮小部に関連する、前記シース液と前記試料流体との間の相互作用によって誘発される、幾何学的流体集束効果との組み合わせで、前記シース液内の粘性剤が、前記試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持し、前記細胞が前記試料流体ストリームから前記流れるシース液に伸びる際に、前記細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、前記撮像部位にて前記複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて目標撮像状態を提供するように、前記体液試料の流れを、前記フローセル内の前記流れるシース液に注入するように、前記フローセルの前記注入管と流体連通する、体液試料インプットと、
前記撮像部位にて前記複数の粒子を撮像する撮像デバイスと、を備える、システム。
（項目２１）
前記体液試料が、尿試料である、項目２０に記載のシステム。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】例示的なフローセル、並びに、デジタル画像処理を使用する試料画像分析のための自動焦点化システム及び高光学解像度撮像デバイスの動作態様を示す、部分的に断面であり、正確な縮尺ではない、模式図である。
【図１Ａ】本発明の実施形態に従う、光学台配置を示す。
【図１Ｂ】本発明の実施形態に従う、光学台配置を示す。
【図１Ｃ】本発明の実施形態に従う、検尿分析器のブロック図である。
【図１Ｄ】本発明の実施形態に従う、プロセスの流れ図を示す。
【図１Ｅ】本発明の実施形態に従う、モジュールシステムの態様を描写する。
【図２】例示的な実施形態に従うフローセルの斜視図である。
【図３】図２に示されるフローセルの線３〜３に沿う、長手方向正中断面図である。
【図３Ａ】本発明の実施形態に従う、フローセルの追加の断面図を提供する。
【図３Ｂ】本発明の実施形態に従う、フローセルの追加の断面図を提供する。
【図４】本発明の実施形態に従う、撮像システムの態様を示す。
【図４Ａ】本発明の実施形態に従うフローセルの態様を描写する。
【図４Ｂ−１】本発明の実施形態に従うフローセルの態様を描写する。
【図４Ｂ−２】本発明の実施形態に従うフローセルの態様を描写する。
【図４Ａ−１】本発明の実施形態に従う、フローセル内の、それぞれ、カニューレ出口ポートでの、及び画像捕捉部位での、シース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）エンベロープ及び試料流体ストリームの寸法の断面図を描写する。
【図４Ａ−２】本発明の実施形態に従う、フローセル内の、それぞれ、カニューレ出口ポートでの、及び画像捕捉部位での、シース液（例えば、ＰＩＯＡＬ）エンベロープ及び試料流体ストリームの寸法の断面図を描写する。
【図４Ｃ】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｄ】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｅ】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｆ】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｇ】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｃ−１】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｄ−１】本発明の実施形態に従う、カニューレ構成の態様を描写する。
【図４Ｈ】本発明の実施形態に従う、カニューレの一部分を示す。
【図４Ｉ】本発明の実施形態に従う、フローセルを描写する。
【図４Ｊ】本発明の実施形態に従う、フローセルを描写する。
【図４Ｋ】本発明の実施形態に従う、フローセルの画像捕捉部位を通って流れる試料ストリームを示す。
【図４Ｌ】本発明の実施形態に従う、フローセルの画像捕捉部位を通って流れる試料ストリームを示す。
【図４Ｋ−１】本発明の実施形態に従う目標撮像部位を示す。
【図４Ｋ−２】本発明の実施形態に従う目標撮像部位を示す。
【図４Ｋ−３】本発明の実施形態に従う、試料流体ストリーム内の粒子整列の態様を描写する。
【図４Ｌ−１】本発明の実施形態に従う、フローセルの流路内の流体流れストリーム速度プロファイルの態様を描写する。
【図４Ｍ】本発明の実施形態に従う、例示的な細胞内粒子整列特徴を示す。
【図４Ｎ】本発明の実施形態に従う、例示的な細胞内粒子整列特徴を示す。
【図４Ｏ】本発明の実施形態に従う、ＰＩＯＡＬ対従来のシース液を使用して得た画像間の比較を実証する画像を示す。
【図４Ｐ】本発明の実施形態に従う、ＰＩＯＡＬ対従来のシース液を使用して得た画像間の比較を実証する画像を示す。
【図４Ｑ】本発明の実施形態に従うシステム及び方法を使用して得た結果画像を示す。
【図５】本発明の実施形態に従う、フローセル内の１つ以上の試料流体の注入に対応するタイムラインを描写する。
【図６】本発明の実施形態に従う、尿流体試料内の粒子の撮像の例示的な方法の態様を描写する。
【図６Ａ】本発明の実施形態に従う、尿流体試料内の粒子の撮像の例示的な方法の態様を描写する。
【図６Ｂ】本発明の実施形態に従う、尿流体試料内の粒子の撮像の例示的な方法の態様を描写する。
【図７】本発明の実施形態に従う、フローセルの流路内に存在する流れストリームひずみ速度の態様を描写する。
【図８】本発明の実施形態に従う、フローセルの流路内に存在する流れストリームひずみ速度の態様を描写する。
【図９Ａ】本発明の実施形態に従う、例示的な自動焦点目標を描写する。
【図９Ｂ】本発明の実施形態に従う、捕捉画像を示す。
【図１０】本発明の実施形態に従う、例示的な自動焦点目標を描写する。
【図１１】本発明の実施形態に従う、例示的な自動焦点目標を描写する。
【図１２Ａ】本発明の実施形態に従う、例示的な自動焦点目標を描写する。
【図１２Ｂ】本発明の実施形態に従う、自動焦点目標の中央部分の拡大図を示す。
【図１３Ａ】本発明の実施形態に従う、フローセル温度センサの図を描写する。
【図１３Ｂ】本発明の実施形態に従う、フローセル温度センサの図を描写する。
【図１３Ｃ】本発明の実施形態に従う、フローセル温度センサの図を描写する。
【図１３Ｄ】本発明の実施形態に従う、フローセル気泡除去技術の態様を描写する。
【図１４Ａ】本発明の実施形態に従う、焦点化システム及び方法の態様を示す、断面側面図を提供する。
【図１４Ｂ】本発明の実施形態に従う、焦点化システム及び方法の態様を示す、断面側面図を提供する。
【図１４Ｃ】本発明の実施形態に従う、焦点化システム及び方法の態様を示す、フローセルの断面側面図を描写する。
【図１４Ｄ】本発明の実施形態に従う、焦点化システム及び方法の態様を示す、断面側面図を提供する。
【図１５】本発明の実施形態に従う、自動焦点パターン及び焦点化技術の態様を描写する。
【図１６Ａ】本発明の実施形態に従う、焦点システム及び方法の態様を示す。
【図１６Ｂ】本発明の実施形態に従う、焦点システム及び方法の態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本開示は、粒子を含有する尿試料の分析のための、分析器、システム、組成物、及び方法に関する。一実施形態では、本発明は、視覚分析器を備え得る、自動化粒子撮像システムに関する。いくつかの実施形態では、視覚分析器は、画像の自動化分析を容易にするためにプロセッサを更に備え得る。例示的な尿粒子は、尿沈渣粒子を含み得る。例示的な尿沈渣粒子は、赤血球（erythrocyte）（赤血球（ＲＢＣ））、異形赤血球、白血球（leukocyte）（白血球（ＷＢＣ））、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片を含み得る。例示的な細胞は、赤血球、白血球、及び上皮を含み得る。例示的な円柱は、無細胞顔料円柱、未分類円柱（例えば、顆粒円柱）を含み得る。例示的な無細胞円柱は、例えば、ろう様円柱、幅広円柱、脂肪円柱、及び結晶円柱を含み得る。例示的な細胞円柱は、例えば、ＲＢＣ円柱、ＷＢＣ円柱、及び細胞円柱を含み得る。例示的な結晶は、例えば、シュウ酸カルシウム、三重リン酸塩、リン酸カルシウム、尿酸、炭酸カルシウム、ロイシン、シスチン、チロシン、及び非晶質結晶を含み得る。例示的な非扁平上皮細胞は、例えば、腎上皮及び移行上皮を含み得る。例示的な酵母は、例えば、出芽酵母、及び仮性菌糸を伴う酵母を含み得る。例示的な尿沈渣粒子は、ＲＢＣ凝集塊、脂肪、楕円脂肪体、及びトリコモナスもまた含み得る。
【００３１】
本開示に従い、液体内で懸濁される粒子を含有する試料の画像を取得するための分析器を備えるシステムが提供される。該システムは、例えば、赤血球（erythrocyte）（赤血球（ＲＢＣ））、異形赤血球、白血球（leukocyte）（白血球（ＷＢＣ））、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片の検出及び定量化等の、生体液内の粒子の特徴付け、分類及び副分類、計数及び分析に有用であり得る。他の流体からの細胞及び粒子の特徴付け等の、他の類似する使用もまた企図される。
【００３２】
尿試料内の尿沈渣粒子の弁別は、本内容が特によく適している例示的な用途である。試料は、自動化技術によって調製され、薄いリボン形状の試料ストリームとして高光学解像度撮像デバイスに提示され、リボン形状の試料ストリームが視野を横切って流れる間に周期的に撮像される。粒子（尿内等の）の画像は、細胞及び／又は粒子を特定及び計数するために、完全に自動的に又はわずかなヒトによる補助を伴い、ピクセル画像データをプログラム化した処理技術を使用して、互いから区別、分類、副分類、及び計数することができる。粒子の異常又は臨界特徴の場合に備えて保存され得、利用可能にされ得る、細胞画像に加え、出力データは、記録された試料画像において区別された細胞又は粒子の、それぞれの特定の分類及び／又は副分類の発生の数を含む。
【００３３】
それぞれの画像において見られる、異なる粒子の数は、更に処理され得、例えば、全体としての試料内のそれぞれの区別された分類及び／又は副分類の細胞数の正確かつ統計的に有意な比率を蓄積するために使用される。画像ベースの（例えば、視覚的）弁別に使用された試料は希釈され得るが、それぞれの分類及び／又は副分類における細胞の割合は、希釈した試料において、具体的には多数の画像が処理された後で比例的に表される。
【００３４】
検尿−粒子分析システム
ここで図面を参照すると、図１は、試料流体を、デジタル画像処理を使用して、試料流れストリーム３２内の顕微鏡粒子を撮像するための構成にある高光学解像度撮像デバイス２４の、表示帯域２３を通って運ぶための、例示的なフローセル２２を模式的に示す。フローセル２２は、粒子造影剤組成物との接触及び加熱等の処理に供された可能性があり得る、試料流体の供給源２５に結合される。フローセル２２はまた、試料流体の粘性よりも高い粘性を有する透明なグリセロール溶液等の、シース液、又は粒子及び／若しくは細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）の、１つ以上の供給源２７にも結合する。
【００３５】
試料流体は、試料供給管２９の遠位端２８の平坦な開口部を通って、ＰＩＯＡＬの流れが実質的に確立された点にてフローセル２２の内部へと注入され、リボン形状の試料ストリームの上及び下の（又は対向側の）ＰＩＯＡＬの、安定かつ対称的な層流をもたらす。試料及びＰＩＯＡＬストリームは、実質的に狭細化する流路に沿って、注入された試料流体と共にＰＩＯＡＬを移動させる、精密計量ポンプによって供給され得る。ＰＩＯＡＬは、流路が狭細化する帯域２１において、試料流体を包み圧縮する。したがって、帯域２１での流路厚さの縮小部は、試料ストリーム３２の幾何学的集束に寄与し得る。試料流体リボン３２は、狭細帯域２１の下流で、ＰＩＯＡＬと共に包まれ、かつ運ばれ、例えば、ＣＣＤ  ４８を使用して、画像が収集される高光学解像度撮像デバイス２４の前を通るか、又は別の方法では、その表示帯域２３を通過する。プロセッサ１８は、ＣＣＤ  ４８からピクセルデータを入力として受信することができる。試料流体リボンは、ＰＩＯＡＬと共に排出部３３へと流れる。
【００３６】
ここに示すように、狭細帯域２１は、遠位厚さＤＴが近位厚さＰＴよりも小さくなるように、近位厚さＰＴを有する近位流路部分２１ａ、及び遠位厚さＤＴを有する遠位流路部分２１ｂを有し得る。したがって、試料流体は、近位部分２１ａに遠位でかつ遠位部分２１ｂに近位な位置にて、試料管２９の遠位端２８を通して注入され得る。したがって、ＰＩＯＡＬストリームが帯域２１によって圧縮される際に、試料流体は、ＰＩＯＡＬエンベロープに入ることができる。
【００３７】
対物レンズ４６を伴うデジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン形状の試料ストリーム３２と交差する光学軸に沿って方向付けられる。対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離は、フォトセンサアレイ上の、焦点化デジタル画像の解像及び収集のために、モータ駆動５４の操作によって可変である。
【００３８】
本開示は、リボン形状の試料ストリーム３２上に焦点化するために、高光学解像度撮像デバイス２４の正確な作動位置を自動的に達成するための技術を提供する。フローセル構造２２は、リボン形状の試料ストリーム３２が、フローセル２２内の表示帯域２３を通過するＰＩＯＡＬの層間の薄いリボンにおいて、試料流体の流路を画定するフローセル内に、固定された、かつ信頼性のある位置を有するように構成され得る。特定のフローセル実施形態では、ＰＩＯＡＬの流路の断面は、試料が、オリフィスに長方形のルーメンを伴う管２９又はカニューレ等の平坦なオリフィスを通して挿入される点にて、対称的に狭細化する。狭細流路（例えば、２０：１の比率による、又は２０：１〜７０：１の比率による、断面積における幾何学的狭細化）は、ＰＩＯＡＬと試料流体との間の差異粘性と共に、及び任意で、試料の流れと比較したＰＩＯＡＬの線速度における差異と共に、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で圧縮するために協働する。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は、４０：１であり得る。
【００３９】
一態様では、フローセル２２の対称性性質、並びに試料流体及びＰＩＯＡＬの注入の様式は、ＰＩＯＡＬの２つの層間のリボン形状の試料ストリーム３２のための、フローセル２２内の再現可能な位置を提供する。結果として、試料及びＰＩＯＡＬの具体的な線速度等のプロセスの変形は、リボン形状の試料ストリームを流れ内のその位置から変位させる傾向に無い。フローセル２２の構造に対して、リボン形状の試料ストリーム３２の位置は、安定かつ再現可能である。
【００４０】
しかしながら、フローセル２２及び光学システムの高光学解像度撮像デバイス２４の相対位置は、変更の対象であり得、高光学解像度撮像デバイス２４とリボン形状の試料ストリーム３２との間の最適又は所望の距離を維持するための、折に触れた位置調節から、利益を受けることがあり得、このようにしてリボン形状の試料ストリーム３２内の包まれた粒子の質の高い焦点画像を提供する。いくつかの実施形態に従い、高光学解像度撮像デバイス２４とリボン形状の試料ストリーム３２との間には、包まれた粒子の焦点画像を取得するための、最適又は所望の距離があり得る。光学素子は、まず、高光学解像度撮像デバイス２４を、フローセル２２に対する固定された位置を伴って、自動焦点目標４４からの最適又は所望の距離に位置付けるように、自動焦点化又は他の技術によってフローセル２２に対して正確に位置付けられ得る。自動焦点目標４４とリボン形状の試料ストリーム３２との間の変位距離は、例えば、初期較正工程の結果として、精密に既知である。自動焦点目標４４上に自動焦点化した後に、フローセル２２及び／又は高光学解像度撮像デバイス２４は、その後自動焦点目標４４とリボン形状の試料ストリーム３２との間の既知の変位距離にわたって変位する。結果として、高光学解像度撮像デバイス４４の対物レンズは、包まれた粒子を含有するリボン形状の試料ストリーム３２上に精密に焦点化する。
【００４１】
本発明の例示的な実施形態は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイス２４の光学軸に沿う、既知の位置を画定する、高造影フィギュアである、焦点又は撮像目標４４上の、自動焦点化を含む。目標４４は、リボン形状の試料ストリーム３２の位置に対する、既知の変位距離を有し得る。具体的に、目標特徴上に、造影測定アルゴリズムが用いられ得る。一実施例では、造影フィギュアの縁をわたることが既知の、画像におけるピクセルのラインに沿い生じる、ピクセル輝度値間に１つ以上の最大差異振幅が見られる、深度又は距離を見つけるために、高光学解像度撮像デバイス２４の位置は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの光学軸に平行な線に沿い変化し得る。いくつかの場合では、自動焦点パターンは、光学軸に平行な線に沿う変形を有さず、該線は、記録された変位距離を提供するように、モータ付きコントロールが高光学解像度撮像デバイス２４の位置を調節するためにそれに沿って動作する線でもある。
【００４２】
このように、異なる画像間で可変であり、造影に関しては高度な画定に欠き、又は位置の範囲内のどこかに位置付けられ得る、画像内容態様に、参照のための距離位置の判定の基準として、自動焦点化又は依存することは必須でないことがある。自動焦点目標４４上の最適又は所望の焦点の位置を見つけると、高光学解像度撮像デバイス対物レンズ２４及びフローセル２２の相対位置は、リボン形状の試料ストリーム３２内の粒子の最適又は所望の焦点位置を提供するように、記録した変位距離で変位され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態に従い、高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン形状の試料ストリーム３２の画像を、照射開口部（窓）４３を通して適用される光源４２によって背面光を当てることで、解像することができる。図１に示される実施形態では、照射開口部４３の視野計は、自動焦点目標４４を形成する。しかしながら、目的は、リボン形状の試料ストリーム３２の精密に焦点化した画像を、一体型電荷結合デバイス等の光電性素子のアレイ上の、高光学解像度撮像デバイス光学素子４６を通して収集することである。
【００４４】
高光学解像度撮像デバイス２４及びその光学素子４６は、距離５０にて焦点化している、リボン形状の試料ストリーム３２内の粒子の画像を解像するように構成され、該距離は、光学システムの寸法、レンズの形状、及びそれらの材料の屈折率の結果であり得る。いくつかの場合では、高光学解像度撮像デバイス２４とリボン形状の試料ストリーム３２との間の、最適又は所望の距離は変化しないが、フローセル２２と高光学解像度撮像デバイス及びその光学素子４６との間の距離は変化し得る。高光学解像度撮像デバイス２４及び／又はフローセル２２を互いに対してより近く又はより遠くに離して移動させることは（例えば、撮像デバイス２４とフローセル２２との間の距離５１を調節することによって）、フローセルに対する、距離５０の端の焦点化点の位置を移動させる。
【００４５】
本発明の実施形態に従い、焦点目標４４は、リボン形状の試料ストリーム３２からある距離を置いて位置付けられ得、この場合は、照射源４２からの光のための開口部４３の縁にてフローセル２２に直接固定され得る。焦点目標４４は、リボン形状の試料ストリーム３２からの一定の変位距離５２にある。フローセル内のリボン形状の試料ストリーム３２の位置は一定に保持することができるため、多くの場合、変位距離５２は一定である。
【００４６】
例示的な自動焦点化手順は、高光学解像度撮像デバイス２４を自動焦点目標４４上に焦点化するために、モータ５４を使用して高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の相対位置を調節することを含む。この実施例では、自動焦点目標４４は、フローセル内のリボン形状の試料ストリーム３２の後ろにある。高光学解像度撮像デバイス２４及び／又はフローセル２２は、その後、自動焦点化手順が、フォトセンサ上で解像された画像が自動焦点目標４４の正確に焦点化した画像であると確証するまで、互いに向かって移動する。その後、モータ５４が、高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム３２上に焦点化させるために、すなわち、高光学解像度撮像デバイス２４及び／又はフローセル２２を、精密に変位距離５２の範囲で、互いに離して移動させることによって、高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の相対位置を変位させるために動作する。
【００４７】
当然のことながら、焦点目標４４が後部の照射窓４３の反対側の正面表示ポート窓上に位置付けられる場合、これらの移動の方向は逆であり得る。その場合は、変位距離は、リボン形状の試料ストリーム３２と正面表示ポートの目標４４との間の範囲となり得る（図示せず）。
【００４８】
リボン形状の試料ストリーム３２と自動焦点目標４４との間の高光学解像度撮像デバイス２４の光軸に沿う距離と同等である、変位距離５２は、工場較正工程において確立され得る。典型的には、一度確立されると、変位距離５２は変化しない。熱膨張変動及び振動は、高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の精密な位置を互いに対して変化させ得、よって自動焦点化プロセスの再開を必要とする。しかし、目標４４上の自動焦点化は、フローセル２２に対して固定された、及びよってリボン形状の試料ストリーム３２に対して固定された、位置参照を提供する。同様に、変位距離は、一定である。したがって、目標４４上に自動焦点化すること、及び高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２を変位距離の範囲で変位させることによって、高光学解像度撮像デバイスがリボン形状の試料ストリーム３２上に焦点化する、という結果になる。
【００４９】
いくつかの実施形態に従い、焦点目標は、照射開口部４３の周囲に印刷及び塗布される、高造影円として提供される。代替の焦点目標構成は、本明細書の他の箇所に記載される。目標４４上の焦点化において正方形又は長方形の画像が収集されるとき、高造影のボーダーが照射の中心の周囲に表れる。開口部の内縁にて、画像内で最も高い造影が得られる位置を探すことは、自動的に、高光学解像度撮像デバイスを目標４４の作動位置にて焦点化させる。いくつかの実施形態に従い、「作動距離」という用語は、対物レンズと祖の焦点面との間の距離を指し得、「作動位置」という用語は、撮像デバイスの焦点面を指し得る。画像の最高造影尺度は、最も明るい白及び最も暗い黒と測定されたピクセルが、内縁を通る線に沿って互いに隣接する場合である。最高造影尺度は、撮像デバイスの焦点面が目標４４に対して所望の位置にあるかどうかを評価するために使用され得る。隣接ピクセル間の振幅における差異を統合すること及び差異の最高合計を探すこと等の、他の自動焦点化技術も同様に使用され得る。一技術では、差異の合計は、目標４４の一方の端の作動位置を含む３つの距離にて計算され、結果の値を特色的曲線に整合させ、ここにおいて最適距離は、曲線上の最高値にある。関連して、例示的な自動焦点化技術は、異なる位置でのフローセル目標の画像の収集を含み得、最良焦点位置を見つけるために、目標の画像が最も鮮明なときに最大になるメトリックを使用して、該画像を分析する。第１の工程（粗）の間、自動焦点化技術は、２．５μｍの間隔で収集された画像の組から、予備的最良位置を見つけるために動作し得る。その位置から、自動焦点化技術は、その後、０．５μｍ間隔での、画像の第２の組（精）の収集、及び目標上の最終最良焦点位置の計算を含み得る。
【００５０】
いくつかの場合では、焦点目標（自動焦点パターン）は、試料が現れるはずである表示区域の周辺部上にあり得る。焦点目標を、図１５に描写するもの等の、視野内にある造影形状によって画定することができる、ということもまた可能である。典型的には、自動焦点目標は、フローセル上に載せられる、又はフローセルに対して固定された位置に強固に取り付けられる。自動焦点目標の画像の造影の最大化に反応する検出器によって制御される、位置付けモータの電力下で、装置は、リボン形状の試料ストリームの反対側で目標上に自動焦点化する。その後、フローセル及び／又は高光学解像度撮像デバイスを、互いに対して、自動焦点目標とリボン形状の試料ストリームとの間の距離であると既知の変位距離で、変位させることによって、高光学解像度撮像デバイスの作動位置は、自動焦点目標からリボン形状の試料ストリームへと変位する。結果として、リボン形状の試料ストリームは、収集されたデジタル画像において焦点化して見える。
【００５１】
データ処理技術によって、赤及び白血球の分類及び／又は副分類等の、粒子の種類を区別するために、ある分類又は副分類を他から区別する態様を露呈するために十分な解像度及び明確性を有する顕微鏡ピクセル画像を記録することが好都合である。記載される自動焦点化技術を容易にすることは、本発明の１つの目的である。
【００５２】
実践的な実施形態では、装置は、図１Ａに示し、図１Ｂに拡大するような、光学台配置に基づき得、ジンバル式キャリア５５内に搭載されたフローセル２２上に方向付けられる照射の供給源４２を有し、高光学解像度撮像デバイス２４によって得られる画像におけるフローセル２２の内容物に背面光を当てる。フローセルキャリア５５は、高光学解像度撮像デバイス２４に向かって及びそれから離れて、精密に移動可能となるように、モータ駆動上に搭載される。ジンバル式キャリア５５は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの光表示軸に対する、フローセルの精密な整列を可能にもまたし、そのため、リボン形状の試料ストリームが撮像される帯域内、すなわち図１に描写する照射開口部４３と表示ポート５７との間の、表示軸に垂直な面において流れる。焦点目標４４は、ジンバル式キャリア５５の調節において、例えば、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの光学軸に垂直なリボン形状の試料ストリームの面を確立することを、補助し得る。
【００５３】
したがって、キャリア又はフローセルホルダ５５は、フローセル２２の位置及び配向の、例えば、画像捕捉デバイス２４又は画像捕捉デバイス対物レンズに対する、非常に精密な線及び角度調節を提供する。ここに示すように、キャリア５５は、画像捕捉デバイスに対する、キャリア及びフローセルの角度調節を容易にするために、２つの枢着部５５ａ、５５ｂを含む。角度調節枢着部５５ａ、５５ｂは、同一面に位置付けられ、フローセルチャネル（例えば、画像捕捉部位の）を中心とする。これは、フローセル位置の線状の平行移動をもたらすことなく、角度の調節を可能にする。キャリア５５は、枢着点５５ａの軸の周囲若しくは枢着点５５ｂの軸の周囲、又は両方の軸の周囲を回転し得る。かかる回転は、図４に描写するプロセッサ４４０及びフローセル制御機構４４２等の、プロセッサ及びフローセル動作制御機構により制御され得る。
【００５４】
図１Ｂに戻って参照すると、画像捕捉デバイス２４及びキャリア５５（フローセル２２と共に）の一方又は両方が、三次元における様々な軸（例えば、Ｘ、Ｙ、Ｚ）に沿って回転又は平行移動し得る。したがって、画像捕捉デバイスの焦点の調節のための例示的な技術は、例えば、デバイス２４を軸Ｘの周囲で回転させることにより、撮像軸の周囲の画像捕捉デバイス２４の軸回転を実行することを含み得る。焦点調節は、撮像軸に沿って延びる軸の周囲の、撮像デバイスの視野内での、フローセル２２及び／又はキャリアキャリア５５の軸回転によってもまた達成され得る。いくつかの場合では、焦点調節は、画像捕捉デバイスの先端回転（例えば、Ｙ軸の周囲の回転）を含み得る。いくつかの場合では、焦点調節は、フローセルの先端回転（例えば、Ｙ軸の周囲又は枢着部５５ａの周囲の回転）を含み得る。ここに描写するように、枢着部５５ａは、フローセルの流路に沿ってその内部に延びるＹ軸に対応する。いくつかの場合では、焦点調節は、画像捕捉デバイスの傾斜回転（例えば、Ｚ軸の周囲の回転）を含み得る。いくつかの場合では、焦点調節は、フローセルの傾斜回転（例えば、Ｚ軸の周囲又は枢着部５５ｂの周囲の回転）を含み得る。ここに描写するように、枢着部５５ｂは、流路及び撮像軸を横断するＺ軸に対応する。いくつかの場合では、画像捕捉デバイスは、回転が画像捕捉デバイスの視野内を中心とするように、フローセルの回転（例えば、Ｘ軸の周囲）を実行することにより、試料流れストリーム上に焦点化され得る。分析器システムの１つ以上の構成要素における位置のドリフトの原因となるように、本明細書に記載される三次元の回転調節が実行され得る。いくつかの場合では、分析器システムの１つ以上の構成要素における温度揺らぎの原因となるように、三次元の回転調節が実行され得る。いくつかの場合では、分析器システムの調節は、撮像デバイス２４をＸ軸に沿って平行移動させることを含み得る。いくつかの場合では、分析器システムの調節は、キャリア５５又はフローセル２２をＸ軸に沿って平行移動させることを含み得る。
【００５５】
いくつかの実施形態に従い、液体内で懸濁された粒子を含有する試料の画像を取得するための視覚分析器は、図１に描写するように、試料の供給源２５に及びシース液又はＰＩＯＡＬ物質の供給源２７に結合する、フローセル２２を含む。図３の断面図に見られるように、フローセル２２は、流れ方向（図３では右から左、又は図１では下から上）で対称的に狭細化する、内部流路を画定する。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬによって包まれる試料の流れ３２を、フローセル内の表示帯域を通して、すなわち表示ポート５７の後ろに方向付けるように構成される。
【００５６】
図１を再び参照すると、対物レンズ４６を伴うデジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン形状の試料ストリーム３２と交差する光学軸に沿って方向付けられる。対物レンズ４６とフローセル３３との間の相対距離は、フォトセンサアレイ上の、焦点化デジタル画像の解像及び収集のために、モータ駆動５４の操作によって可変である。
【００５７】
フローセル２２に対して固定された位置を有する自動焦点パターン４４は、リボン形状の試料ストリーム３２の面からの変位距離５２に位置付けられる。示される実施形態では、自動焦点パターン（目標４４）は、高光学解像度撮像デバイス２４によって収集された画像において可視的な位置にて、フローセル２２に直接適用される。別の実施形態では、目標は、一体型様式でフローセルの本体に直接適用されない場合は、フローセル２２及びその中のリボン形状の試料ストリーム３２に対する位置に強固に固定された部分上に運ばれ得る。
【００５８】
定常供給源であり得、又は高光学解像度撮像デバイスフォトセンサの操作と合わせて閃光するストローブであり得る、光源４２は、リボン形状の試料ストリーム３２を照射するように、及び、目標４４の造影に寄与するようにもまた構成される。描写する実施形態では、照射は、背面光からのものである。
【００５９】
図１Ｃは、例示的な検尿分析器の追加の態様を示す、ブロック図を提供する。ここに示すように、分析器１００ｃは、モータ駆動５４を操作するため、及び目標自動焦点パターン４４に対する異なる焦点位置にて収集したフォトセンサアレイからのデジタル画像を分析するために結合された、少なくとも１つのデジタルプロセッサ１８を含む。プロセッサ１８は、自動焦点パターン４４の焦点位置を判定するように、すなわち目標自動焦点パターン４４上に自動焦点化するように構成され、よって高光学解像度撮像デバイス２４と自動焦点パターン４４との間の最適距離を確立する。これは、第１の距離にて画像内の造影のレベルを評価するためにアルゴリズムを適用すること等の、画像処理工程によって達成され得、これは、画像全体又は少なくとも自動焦点パターン４４の一縁に適用することができる。プロセッサは、モータ５４を別の位置に移動させ、その位置又は縁にて造影を評価し、２回以上の反復の後に、自動焦点パターン４４上の焦点の正確性を最大化する最適距離を決定する（又はその位置に移動した場合は、焦点の正確性を最適化し得る）。プロセッサは、自動焦点目標自動焦点パターン４４とリボン形状の試料ストリームとの間の固定された間隔に依存し、その後プロセッサ１８は、モータ５４を制御し、高光学解像度撮像デバイス２４を、リボン形状の試料ストリーム３２上に焦点化するための正確な距離に移動させる。より具体的には、プロセッサは、モータを操作して、高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリーム３２との間の距離を、それによりリボン形状の試料ストリームが目標自動焦点パターン４４から変位する、変位距離５２で（例えば、図１に描写するように）変位させる。このように、高光学解像度撮像デバイスは、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化する。
【００６０】
モータ５４は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスによって撮像された区別特徴、特に血球の態様よりもいくぶん低い精度を伴う、ギア付きステッピングモータを備え得る。高光学解像度撮像デバイス２４の位置が、リボン形状の試料ストリームの幅の内部で光対物レンズの位置を位置付けるために調節されるならば、リボン形状の試料ストリーム内の細胞／粒子の表示は、焦点化する。自動焦点パターン４４は、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの視野の縁に位置付けられ得、この理由から表示を妨害することはない。
【００６１】
更に、高光学解像度撮像デバイスが変位距離にわたって移動し、自動焦点パターンが焦点から外れる場合、自動焦点パターンとは対照的に、焦点化して見える特徴は、血球である。図１５の実施形態では、例えば、自動焦点パターンは、視野における形状によって画定される。形状は、限られた大きさの相対的に薄く離散的な形態であり、したがって、変位距離で移動した後に、該形態は、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化したとき、デジタル画像において実質的に非可視的となる。典型的な変位距離は、例えば、検尿撮像適用のために寸法したフローセル内で５０〜１００μｍであり得る。いくつかの実施形態では、自動焦点特徴は、高光学解像度撮像デバイスを、最適焦点距離の１μｍ内に維持する。
【００６２】
フローセル内部輪郭、並びにＰＩＯＡＬ及び試料の流量は、試料がリボン形状のストリームを形成するように調節され得る。ストリームは、リボン形状の試料ストリーム内に包まれた粒子とおおよそ同じ薄さであり得るか、又は更にはそれよりも薄くあり得る。白血球は、例えば、約１０μｍの直径を有し得る。リボン形状の試料ストリームに１０μｍ未満の厚さを提供することにより、リボン形状の試料ストリームがシース液又はＰＩＯＡＬによって伸張されるとき、細胞が配向され得る。驚くべきことに、狭細流路に沿う、リボン形状の試料ストリームとは異なる粘性の、例えば、より高い粘性のＰＩＯＡＬ層内の、リボン形状の試料ストリームの伸張は、好都合なことに、流れ方向に実質的に平行な面における非球形粒子を整列させ、細胞に力を適用する傾向があり、細胞の細胞内構造の焦点内容物を改善する。高光学解像度撮像デバイス２４の光学軸は、リボン形状の試料ストリームの面に対して実質的に垂直（直角）である撮像の点でのリボン形状の試料ストリームの線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であり得る。いくつかの実施形態では、リボン形状の試料ストリームの線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒であり得る。シース液の別の実施形態は、ＬＡＭＩＮＡ（商標）（ＩＲＩＳ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）溶液であり得る。ＬＡＭＩＮＡ（商標）は、２０℃で、ｐＨ約７．０及び比重１．００７を有し得る。関連する実施形態では、シース液は、生理食塩水溶液として提供され得る。いくつかの実施形態では、シース液は、水性塩組成物である。いくつかの実施形態では、シース液の粘性は、試料流体の粘性と同じ又はそれに類似する。
【００６３】
リボン形状の試料ストリームの厚さは、試料流体及びＰＩＯＡＬの相対粘性及び流量によって影響され得る。図１に戻って参照すると、例えば、高精度容積型ポンプを備える、試料の供給源２５及び／又はシース液若しくはＰＩＯＡＬの供給源２７は、リボン形状の試料ストリーム３２の寸法を最適化する、すなわち、高光学解像度撮像デバイス２４の視野と少なくとも同じ幅の薄いリボンとするために、試料及び／又はＰＩＯＡＬを、制御可能な流量で提供するように構成され得る。
【００６４】
一実施形態では、シース液又はＰＩＯＡＬの供給源２７は、ＰＩＯＡＬを既定の粘性で提供するように構成される。その粘性は、試料の粘性とは異なり得、試料の粘性よりも高くあり得る。ＰＩＯＡＬの粘性及び密度、試料物質の粘性、ＰＩＯＡＬの流量、及び試料物質の流量は、リボン形状の試料ストリームを、自動焦点パターンから変位距離に、及び好都合なリボン形状の試料ストリーム厚さ等の既定の寸法特色を伴って、維持するために調和する。
【００６５】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、試料よりも速い線速度及び試料よりも高い粘性を有し、それによって試料を平坦なリボンに伸張する。いくつかの場合では、ＰＩＯＡＬ粘性は、最大１０センチポアズであり得る。
【００６６】
図１Ｃに示す実施形態では、フォトセンサアレイから得られたピクセルデジタル画像を分析するために使用される同じデジタルプロセッサ１８が、自動焦点化モータ５４を制御するためにもまた使用される。しかしながら、典型的には、高光学解像度撮像デバイス２４は、捕捉した全ての画像に自動焦点化するわけではない。自動焦点化プロセスは、周期的に（その日の開始時若しくはシフトの開始時）、又は、例えば、温度若しくは他のプロセス変化が適切なセンサによって検出されたとき、又は画像分析が再焦点化の潜在的必要性を検出したときに、達成され得る。いくつかの場合では、自動化した自動焦点化プロセスは、約１０秒間の持続時間内に行われ得る。いくつかの場合では、自動焦点化手順は、１つの試料のラック（例えば、１つのラック当たり１０個の試料）を処理する前に行われ得る。他の実施形態では、尿試料画像分析を１つのプロセッサによって達成すること、及び、任意で、固定目標４４への自動焦点化工程を操作するために配置される、それ自体のフォトセンサアレイと関連する、別個のプロセッサを有すること、もまた可能である。
【００６７】
デジタルプロセッサ１８は、プログラム化された時間で若しくはプログラム化された状態で、又はユーザの必要に応じて、自動焦点化するように構成され得、粒子の画像ベースの分類及び副分類を行うようにもまた構成される。例示的な粒子は、細胞、白血球、赤血球等を含む。
【００６８】
一実施形態では、図１又は図１Ｃのデジタルプロセッサ１８は、自動焦点化再開信号を検出するように構成される。自動焦点化再開信号は、検出された温度変化、ピクセル画像日付、時間の経過、又はユーザ入力のパラメータによって認識される焦点化の質における低減によって、引き起こされ得る。好都合なことに、再較正するための、図１に描写する変位距離５２の測定という意味で、再構成することは、必須ではない。任意で、自動焦点化は、質の管理のため及び又は焦点を維持するために、測定間の特定の頻度／間隔で、再較正するようにプログラム化され得る。
【００６９】
変位距離５２は、あるフローセルと別のものではわずかに変化するが、１つの所与のフローセルについては一定のままである。画像分析器をフローセルに備えるときの設定プロセスとして、まず変位距離が推測され、その後較正工程の間、自動焦点化及び撮像態様が訓練され、フローセルの正確な変位距離が決定され、プロセッサ１８のプログラミングに定数として入力される。
【００７０】
結果的に、図１Ｄにおいて流れ図形態で示すように、並びに、図１及び／又は図１Ｃの検尿分析器を参照すると、開示される方法に従って行われるプロセスは、１回あるかないかの較正を含み得る。較正は、工程１１０ｄに示すように、造影目標４４上に焦点化することと、リボン形状の試料ストリーム３２上に焦点化することと、これらの２つの位置の間の光学軸に沿う変位を認知することと、を含み得る。この変位は、定数として認知され得る。その後、工程１２０ｄに示すように、モータ５４の制御及びフォトセンサアレイからの画像データの分析により、プロセッサ１８は、目標４４上に自動焦点化し、高光学解像度撮像デバイス２４及び／又はフローセル２２を互いに対して、認知された変位距離で、変位させる。その後リボン形状の試料ストリーム３２は焦点化され、その画像は、規則的な間隔、特に、表示ポート５７にて、表示帯域を通過するリボン形状の試料ストリームの部分の、実質的に非重複の隣接表示を収集するために、十分な間隔で、収集（工程１３０ｄに示す通り）及び処理（工程１４０ｄに示す通り）され得る。自動観察（工程１５０ｄに示す通り）が、熱膨張における差異により、高光学解像度撮像デバイス２４及びフローセル２２の相対位置を変更した可能性のある、データ異常又は温度変化を露呈すると、自動焦点化（工程１６０ｄに示す通り）が再開し、その後通常操作が再開する。したがって、自動焦点化プロセスは、自動焦点化再開信号を検出すること、並びに、自動焦点化再開信号に反応して自動焦点及び画像収集工程を反復すること、を含み得る。いくつかの実施形態では、自動焦点化再開信号は、温度変化、焦点化の質の低減、経過時間間隔、又はユーザ入力を含み得るか、又はこれらに基づき得る。
【００７１】
リボン形状の試料ストリームの線速度は、フォトセンサアレイの画像露出時間にて、デジタル画像の被写体ぶれを防止するために十分に制限され得る。光源は、任意で、短時間高い入射振幅を適用するために閃光する、ストローブ光であり得る。自動焦点パターン４４及び画像が同一視野内にあるため、光源は、リボン形状の試料ストリーム及び自動焦点パターンを同時に照射するように構成される。しかしながら、他の実施形態では、撮像のための及び自動焦点化のための視野は異なり得、例えば、別個に照射される及び／又は撮像される。
【００７２】
課題の開発は、装置の態様と同様に方法を有する。視覚分析器を焦点化する方法は、デジタル高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスであり得る、高光学解像度撮像デバイス２４を、フローセル２２に対して固定された自動焦点パターン４４上に焦点化することを含み、ここにおいて自動焦点パターン４４は、リボン形状の試料ストリーム３２からの変位距離５２に位置する。デジタル高光学解像度撮像デバイス２４は、リボン形状の試料ストリーム３２と交差する光学軸を伴う、対物レンズを有する。対物レンズとフローセル２２との間の相対距離は、モータ駆動５４の操作によって変化するが、高光学解像度撮像デバイスと最適焦点の点との間の光学軸に沿う距離は既知である。デジタル高光学解像度撮像デバイスは、フォトセンサアレイ上でデジタル画像を解像及び収集するように構成される。モータ駆動は、自動焦点化プロセスにおいて、自動焦点パターン上に焦点化するように操作される。その後モータ駆動は、変位距離にわたって操作され、それによって高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム上に焦点化する。
【００７３】
リボン形状の試料ストリーム上の焦点化に適切な距離を得るために、目標上の自動焦点化及び変位距離での変位を使用することが可能である。しかしながら、好都合なことに、自動焦点化は、それぞれの画像捕捉について必要とされる又は反復されることはない。しかしながら、自動焦点化は、特定の条件において始められる。自動焦点化再開信号が検出又は生成され得、自動焦点パターン上の再焦点化の工程をもたらし、モータ駆動を変位距離にわたって操作し、高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム上に再焦点化させる。自動焦点化再開信号は、例えば、温度における変化、焦点化の質の低減、時間の経過、他のプロセスパラメータ又はユーザ入力の、検出によってもたらされ得る。
【００７４】
図１Ｅは、モジュールシステム１００ｅの個々のシステム要素が、別々に又はより一体化した様式で、どのように実行され得るかを大まかに示す、例示的なモジュールシステムの簡略ブロック図である。本発明の実施形態に従い、モジュールシステム１００ｅは、尿試料等の体液試料内の粒子を撮像するための粒子分析システムの、一部であるか又はそれと接続し得る。モジュールシステム１００ｅは、焦点化及び撮像技術に関連するデータ又は命令の生成によく適しており、本明細書の他の箇所に記載されるように、焦点化及び撮像技術に関連する入力を受信し、並びに／又は、焦点化及び撮像技術に関連する情報若しくはデータを処理する。いくつかの場合では、モジュールシステム１００ｅは、１つ以上のプロセッサ１０４ｅ、ユーザインターフェース入力デバイス等の１つ以上の入力デバイス１０６ｅ、及び／又はユーザインターフェース出力デバイス等の１つ以上の出力デバイス１０８ｅを含む、バスサブシステム１０２ｅを介して、電気的に結合する、ハードウェア要素を含む。いくつかの場合では、システム１００ｅは、ネットワークインターフェース１１０ｅ、並びに／又は、撮像システム１４２ｅからの信号を受信することができる及び／若しくはそこに信号を送ることができる撮像システムインターフェース１４０ｅ、を含む。いくつかの場合では、システム１００ｅは、例えば、ここでは現在メモリ１１４ｅのワーキングメモリ１１２ｅ内に位置付けられている、ソフトウェア要素、オペレーティングシステム１１６ｅ、及び／又は本明細書に開示する技術の１つ以上の態様を実行するように構成されるプログラム等の他のコード１１８ｅを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、モジュールシステム１００ｅは、本明細書に開示する様々な技術の機能性を提供する、基本ブログラム及びデータ構造を記憶することができる、記憶サブシステム１２０ｅを含み得る。例えば、本明細書に記載される方法の態様の機能性を実行する、ソフトウェアモジュールは、記憶サブシステム１２０ｅに記憶されてよい。これらのソフトウェアモジュールは、１つ以上のプロセッサ１０４ｅによって実行されてよい。分散型環境では、ソフトウェアモジュールは、複数のコンピュータシステムに記憶され、複数のコンピュータシステムのプロセッサによって実行されてよい。記憶サブシステム１２０ｅは、メモリサブシステム１２２ｅ及びファイル記憶サブシステム１２８ｅを備え得る。メモリサブシステム１２２ｅは、プログラム実行の間命令及びデータを記憶するメインランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）１２６ｅ、並びに固定された命令を記憶する読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）１２４ｅを含む、多数のメモリを含み得る。ファイル記憶サブシステム１２８ｅは、プログラム及びデータファイルのための、持続性（非揮発性）記憶を提供し得、任意で、試料、患者、治療、評価、又は他のデータを組み入れ得る、有形記憶媒体を含んでもよい。ファイル記憶サブシステム１２８ｅは、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ並びに関連リムーバブルメディア、コンパクトデジタル読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）ドライブ、光学式ドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ  ＲＷ、固体リムーバブルメモリ、他のリムーバブルメディアカートリッジ又はディスク等を備えてよい。該ドライブのうちの１つ以上は、モジュールシステム１００ｅに結合される別の場所の、別の接続されたコンピュータ上の遠隔位置に位置づけられてよい。いくつかの例において、システムは、１つ以上のプロセッサによって実行されると、１つ以上のプロセッサに、本明細書に開示する技術又は方法の任意の態様を実施させることができる、１つ以上の一連の命令を記憶する、コンピュータ可読記憶媒体又は他の有形記憶媒体を含んでもよい。本明細書に開示される技術の機能性を実行する１つ以上のモジュールは、ファイル記憶サブシステム１２８ｅによって記憶されてよい。いくつかの実施形態では、ソフトウェア又はコードは、プロトコルを提供し、モジュールシステム１００ｅが通信ネットワーク１３０ｅと通信することができるようにする。任意に、このような通信には、ダイヤルアップ又はインターネット接続通信を含んでよい。
【００７６】
システム１００ｅは、本発明の方法の様々な態様を実施するように構成することができるということが理解される。例えば、プロセッサ構成要素若しくはモジュール１０４ｅは、センサ入力デバイス若しくはモジュール１３２ｅから、ユーザインターフェース入力デバイス若しくはモジュール１０６ｅから、並びに／又は撮像システム１４２ｅから、任意で、画像システムインターフェース１４０ｅ及び／若しくはネットワークインターフェース１１０ｅ並びに通信ネットワーク１３０ｅを介して、温度パラメータ信号及び／若しくはフローセル操作パラメータを受信するように構成される、マイクロプロセッサ制御モジュールであり得る。いくつかの場合では、センサ入力デバイス（複数を含む）は、尿試料等の体液試料の画像を取得するために装備される粒子分析システムを含み得るか又はその一部であり得る。いくつかの場合では、ユーザインターフェース入力デバイス（複数を含む）１０６ｅ及び／又はネットワークインターフェース１１０ｅは、画像パラメータを得るために装備される粒子分析システムによって生成された画像パラメータ信号を受信するように構成されてよい。いくつかの場合では、撮像システム１４２ｅは、尿試料等の体液試料に関連する画像パラメータを得るために装備される粒子分析システムを、含み得るか又はその一部であり得る。
【００７７】
プロセッサ構成要素又はモジュール１０４ｅは、任意で、本明細書に開示する技術のいずれかに従い処理された、粒子分析パラメータ信号又は画像パラメータ信号を、センサ出力デバイス又はモジュール１３６ｅに、ユーザインターフェース出力デバイス又はモジュール１０８ｅに、ネットワークインターフェースデバイス又はモジュール１１０ｅに、撮像システムインターフェース１４０ｅに、又はそれらの任意の組み合わせに、送るようにもまた構成され得る。本発明の実施形態による装置又はモジュールのそれぞれは、プロセッサ若しくはハードウェアモジュール、又はこれらの任意の組み合わせによって処理される、コンピュータ可読媒体上の１つ以上のソフトウェアモジュールを備えてよい。任意の様々な一般的プラットフォーム、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＭａｃＩｎｔｏｓｈ、及びＵｎｉｘ（登録商標）を、任意の様々な一般的なプログラミング言語と共に用いて、本発明の実施形態を実行してよい。
【００７８】
ユーザインターフェース入力デバイス１０６ｅは、例えば、タッチパッド、キーボード、マウス等のポインティングデバイス、トラックボール、グラフィックスタブレット、スキャナ、ジョイスティック、ディスプレイに組み込まれたタッチスクリーン、音声認識システムなどの音声入力装置、マイクロホン、及び他の種類の入力デバイスを含んでよい。ユーザ入力装置１０６ｅは、有形記憶媒体から、又は通信ネットワーク１３０ｅから、コンピュータ実行可能コードをダウンロードしてもよく、このコードは、本明細書に開示される任意の方法又は態様を組み入れるものである。端末ソフトウェアは時々アップデートされ、必要に応じて端末にダウンロードすることができることが理解されるであろう。概して、「入力デバイス」という用語の使用は、様々な従来の特許デバイス及びモジュールシステム１００ｅへの情報入力方法を含むことが意図される。
【００７９】
ユーザインターフェース出力デバイス１０６ｅは、例えば、ディスプレイサブシステム、プリンタ、ファクス、又は音声出力デバイス等の非視覚的ディスプレイを含んでよい。ディスプレイサブシステムは、陰極線管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などのフラットパネル装置、投射装置などであってよい。ディスプレイサブシステムは、音声出力装置を介するものなど非視覚的表示を提供してもよい。概して、「出力デバイス」という用語の使用は、様々な従来の特許デバイス及びモジュールシステム１００ｅからユーザへの情報出力方法を含むことが意図される。
【００８０】
バスサブシステム１０２ｅは、モジュールシステム１００ｅの様々な構成要素及びサブシステムを意図又は所望の通りに互いと通信させる機構を提供する。モジュールシステム１００ｅの様々なサブシステム及び構成要素は、同じ物理的位置にある必要はないが、分散型ネットワーク内の様々な位置に分散されてよい。バスサブシステム１０２ｅは、模式的に単一バスとして示されるが、バスサブシステムの別の実施形態では、多重バスを利用してもよい。
【００８１】
ネットワークインターフェース１１０ｅは、外部ネットワーク１３０ｅ又は他のデバイスへのインターフェースを提供することができる。外部通信ネットワーク１３０ｅは、必要又は所望の通りに、他と通信することができるように構成されてよい。したがって、モジュールシステム１００ｅから電子パケットを受信し、必要又は所望の通りに、モジュールシステム１００ｅに任意の情報を送り返すことができる。ここに描写するように、通信ネットワーク１３０ｅ及び／又は撮像システムインターフェース１４２ｅは、尿試料等の体液試料に対応する画像又は画像パラメータを得るために装備された撮像システム１４２ｅに、情報を送る又はそこから情報を受信してよい。
【００８２】
システム内にかかるインフラストラクチャ通信リンクを提供することに加え、通信ネットワークシステム１３０ｅは、インターネット等の他のネットワークへの接続を提供もまたし得、有線、無線、モデム、及び／又は他の種類のインターフェース接続を備えてよい。
【００８３】
特定の要件に従って大幅に変更され得ることが、当業者には明らかであろう。例えば、カスタマイズされたハードウェアも使用され、及び／又は、特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（アプレット等の高移植性ソフトウェアを含む）、若しくは両方で実装され得る。更に、ネットワーク入力／出力装置などの他のコンピュータデバイスへの接続が利用することができる。モジュール端末システム１００ｅ自体は、コンピュータ端末、パーソナルコンピュータ、ポータブルコンピュータ、ワークステーション、ネットワークコンピュータ、又は任意の他のデータ処理システムを含む、様々な種類のものであってよい。コンピュータ及びネットワークの変化し続ける性質により、図１Ｅに描写するモジュールシステム１００ｅの説明は、本発明の１つ以上の実施形態を例示する目的の具体例としてのみ意図される。図１Ｅに描写するモジュールシステムよりも、多い又は少ない構成要素を有する、モジュールシステム１００ｅの多くの他の構成が可能である。モジュールシステム１００ｅの任意のモジュール若しくは構成要素、又はかかるモジュール又は構成要素の任意の組み合わせは、本明細書に開示する任意の粒子分析及び／又は撮像システムと、結合し得る、又は一体化し得る、又は他の方法で接続するよう構成され得る。関連して、上記任意のハードウェア及びソフトウェア構成要素は、別の場所で使用される別の医学的評価、又は治療システムと一体化され、又はインターフェースで接続されるように構成されてよい。
【００８４】
いくつかの実施形態では、モジュールシステム１００ｅは、入力モジュールにて、尿試料等の体液試料の１つ以上の画像パラメータを受信するように構成され得る。画像パラメータは、診断又は他の結果を、画像データの分析に基づいて予測又は判定することができる、評価モジュールに送られ得る。画像又は診断データは、出力モジュールを介してシステムユーザに出力することができる。いくつかの場合では、モジュールシステム１００ｅは、尿試料等の体液試料についての診断結果を、例えば、診断モジュールを使用することによって、決定することができる。診断情報は、出力モジュールを介してシステムユーザに出力することができる。任意で、診断の特定の態様は、出力デバイスによって決定することができ、診断システム又は診断システムのサブデバイスに送ることができる。尿試料等の体液試料又は試料が得られた患者に関する、年齢、体重、性別、治療歴、病歴等を含む、任意の様々なデータは、モジュールシステムに入力することができる。治療レジメン又は診断的評価のパラメータは、かかるデータに基づいて決定してよい。
【００８５】
関連して、いくつかの場合では、システムは、画像データを入力として受信するように構成されるプロセッサを含む。任意で、プロセッサ、記憶媒体、又は両方が、検尿又は粒子分析機械内に組み込まれてよい。いくつかの場合では、検尿機械は、プロセッサへの入力のために、画像データ又は他の情報を生成し得る。いくつかの場合では、プロセッサ、記憶媒体、又は両方は、コンピュータ内に組み込まれ得、該コンピュータは検尿機械と通信し得る。いくつかの場合では、プロセッサ、記憶媒体、又は両方は、コンピュータ内に組み込まれ得、該コンピュータはネットワークを介して検尿機械と遠隔通信し得る。
【００８６】
フローセル
フローセル２２の実施形態は、図２及び３に更に描写される。ここに示すように、フローセル２２は、試料供給源２５と、及びシース液又はＰＩＯＡＬ物質の供給源２７にもまた結合し得る。試料流体は、カニューレ２９を介して、例えば、カニューレ２９の遠位出口ポート３１を通って、フローセル２２内に注入される。典型的には、ＰＩＯＡＬシース液は、供給源２７から表示帯域２３に向かって、フローセル内の曲線チャネルセクション４１を通って移動する際、層流状態にない。しかしながら、フローセル２２は、ＰＩＯＡＬシース液が、試料流体が流れるシース液に導入される、遠位出口ポート３１を過ぎて曲がれる際に、層流である若しくはそうなる、又は平坦な速度プロファイルを呈するように、構成され得る。試料流体及びＰＩＯＡＬは、全体的に矢印Ａによって示される方向において、フローセル２２に沿って、その後排出部３３を介してフローセル２２の外に流れ得る。フローセル２２は、流れ方向Ａで対称的に狭細化する（例えば、遷移帯域２１にて）、内部流路２０を画定する。流路の対称性は、頑強で集中した試料ストリームの流れに寄与する。フローセル２２は、ＰＩＯＡＬによって包まれる試料の流れ３２を、フローセル内の表示帯域２３を通って、すなわち表示ポート５７の後ろに方向付けるように構成される。自動焦点パターン４４が表示ポート５７に関連付けられる。フローセル２２は、顕微鏡対物レンズ（図示せず）を受け入れる又は収容するように構成される、丸い又はくぼんだシート５８を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態に従い、自動焦点パターン４４は、フローセル２２に対して固定された位置を有し得、これは、リボン形状の試料ストリーム３２の面から、変位距離に位置する。ここに示す実施形態では、自動焦点パターン（目標４４）は、フローセル２２に、高光学解像度撮像デバイス（図示せず）によって表示ポート５７を通して収集される画像において可視的である位置にて、直接適用される。フローセル２２は、第１の又は上部セクション又は層２２ａ及び第２の又は下部セクション又は層２２ｂから構成され得る。ここに示すように、ガラス又は透明窓６０が、第１のセクション２２ａに取り付けられるか、又はそれと一体である。窓ガラス６０は、フローセル内の試料流路の少なくとも一部を画定し得る。光源４２からの光は、流れストリーム３２内を流れる試料粒子を照射するために、自動焦点パターン４４のアパーチュア又は通路を通って移動し得る。
【００８８】
いくつかの場合では、窓ガラス６０の厚さは、約１５０μｍ〜約１７０μｍの範囲内の値を有し得る。上述のように、窓ガラス６０は、流路又はシース（例えば、ＰＩＯＡＬ）チャネルを画定し得る又はその一部を形成し得る。薄い窓ガラス６０を使用することにより、顕微鏡対物レンズを、試料流体リボンに非常に近く配置し、よって高度に拡大した流路に沿って流れる粒子の画像を取得することが可能である。
【００８９】
図３Ａは、フローセルの実施形態の態様を描写し、ここにおいて撮像軸３５５と遠位遷移帯域部分３１６との間の距離は、約８．２４ｍｍである。遠位遷移帯域部分３１６とカニューレ出口ポート３３１との間の距離は、約１２．５４ｍｍである。カニューレ出口ポート３３１とシース液入口３０１との間の距離は、約１２．７ｍｍである。カニューレ出口ポート３３１と近位遷移帯域部分３１８との間の距離は、約０．７３ｍｍである。図３Ｂは、フローセル実施形態の態様を描写し、ここにおいてカニューレ出口ポートは、図３Ａの実施形態と比較して、遷移帯域に対してより遠位位置に移動している。ここに示すように、カニューレ遠位端は、フローセルの狭細遷移帯域へ前進し、撮像軸３５５と遠位遷移帯域部分３１６との間の距離は、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内である。いくつかの場合では、撮像軸３５５と遠位遷移帯域部分３１６との間の距離は、約２１ｍｍである。
【００９０】
図１に戻って参照すると、フローセル内部輪郭（例えば、遷移帯域２１の）並びにＰＩＯＡＬ及び試料の流量は、試料がリボン形状のストリーム３２に形成されるように、調節され得る。ストリームは、リボン形状の試料ストリーム内に包まれた粒子とおおよそ同じ薄さであり得るか、又は更にはそれよりも薄くあり得る。白血球は、例えば、約１０μｍの直径を有し得る。リボン形状の試料ストリームに１０μｍ未満の厚さを提供することにより、リボン形状の試料ストリームがシース液又はＰＩＯＡＬによって伸張されるとき、細胞が配向され得る。驚くべきことに、狭細流路に沿う、リボン形状の試料ストリームとは異なる粘性の、例えば、より高い粘性のＰＩＯＡＬ層内の、リボン形状の試料ストリームの伸張は、好都合なことに、流れ方向に実質的に平行な面における非球形粒子を整列させ、細胞に力を適用する傾向があり、細胞の細胞内構造の焦点内容物を改善する。高光学解像度撮像デバイス２４の光学軸は、リボン形状の試料ストリームの面に対して実質的に垂直（直角）である。撮像の点でのリボン形状の試料ストリームの線速度は、例えば、２０〜２００ｍｍ／秒であり得る。いくつかの実施形態では、リボン形状の試料ストリームの線速度は、例えば、５０〜１５０ｍｍ／秒であり得る。
【００９１】
図２及び３もまた参照すると、フローセルの内部流路は、リボン形状の試料ストリームのＰＩＯＡＬへの注入の点の下流で、リボン形状の試料ストリームの例えば、最大７μｍの厚さを生成するために、狭細化する、及び／又は、内部流路は、５００〜３，０００μｍのリボン形状の試料ストリーム幅を生成する。例示的な実施形態では、図１に描写するように、フローセルの内部流路は、試料ストリームのＰＩＯＡＬへの注入の点の上流で、狭細遷移帯域を開始する。
【００９２】
別の実施形態では、内部流路は、厚さで２〜４μｍのリボン形状の試料ストリームの厚さを生成するために狭細化する、及び／又は内部流路は幅２０００μｍのリボン形状の試料ストリームをもたらす。いくつかの場合では、試料ストリームは、約２１９０μｍの幅を有する。この場合のストリームの厚さは、緩和状態の赤血球等のいくつかの粒子の直径よりも小さい。結果的に、これらの粒子は、そのより幅の広い寸法が撮像軸に面するように再配向され得、これは際立った特色を露呈することにおいて有用である。
【００９３】
該方法は、更に、リボン形状の試料ストリームをリボン形状に形成することを更に含み得る。リボン形状は、高光学解像度撮像デバイスの光学軸が、リボン形状の試料ストリームに実質的に直角である、すなわちリボン形状のストリームの面に垂直であるように、提供される。
【００９４】
図４は、尿試料内の粒子の撮像のためのシステム４００の態様を描写する。ここに示すように、システム４００は、試料流体注入システム４１０、フローセル４２０、及び画像捕捉デバイス４３０、及びプロセッサ４４０を含む。フローセル４２０は、シース液の流れを、任意で試料流体との組み合わせで、送る、流路４２２を提供する。いくつかの実施形態に従い、試料流体注入システム４１０は、カニューレ又は管４１２を含み得るか又はそれと結合し得る。試料流体注入システム４１０は、流路４２２と流体連通し得、試料流体ストリーム４２８を提供するように、試料流体４２４を、カニューレ４１２の遠位出口ポート４１３を通してフローセル４２０内の流れるシース液４２６に注入するように動作し得る。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、試料流体注入システム４１０に、試料流体４２４を流れるシース液４２６に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得るか又はそれと動作可能に関連し得る。ここに示すように、シース液４２６は、シース液注入システム４５０によってフローセル４２０に導入され得る。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、シース液注入システム４５０に、シース液４２６をフローセル４２０に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得るか又はそれと動作可能に関連し得る。
【００９５】
試料流体ストリーム４２８は、注入管４１２に隣接する第１の厚さＴ１（例えば、図４Ａを参照）を有する。フローセルの流路４２２は、流路サイズの縮小部を有するため、試料流体ストリーム４２８の厚さは、初期厚さＴ１から画像捕捉部位４３２に隣接する第２の厚さＴ２に縮小する。画像捕捉デバイス４３０は、フローセル４２０の画像捕捉部位４３２にて、第１の試料流体からの第１の複数の粒子を撮像するように、画像捕捉部位４３２と整列する。
【００９６】
プロセッサ４４０は、試料流体注入器システム４１０、画像捕捉デバイス４３０、及び任意でシース液注入システム４５０と結合する。プロセッサ４４０は、第１の試料流体の流れるシース液４２６への注入を終結させ、第２の試料流体の流れるシース液４２６への注入を開始させるように構成され、よって試料流体の過渡が開始される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、試料流体注入システム４１０に、第２の試料流体を流れるシース液４２６に注入させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得るか又はそれと動作可能に関連し得、よって試料流体の過渡が開始される。
【００９７】
更に、プロセッサ４４０は、試料流体過渡の後でかつ第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、フローセル４２０の画像捕捉部位４３２にて、第２の試料流体からの第２の複数の粒子の画像の捕捉を開始させるように構成される。例えば、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、画像捕捉デバイス４３０に、試料流体過渡の後でかつ第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に、フローセル４２０の画像捕捉部位４３２にて、第２の試料流体からの第２の複数の粒子の画像の捕捉を開始させるように、構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得る又はそれと動作可能に関連し得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、フローセル動作制御機構４４２に、フローセル４２０の位置を、例えば、画像捕捉デバイス４３０に対して調節させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得る又はそれと動作可能に関連し得る。いくつかの実施形態では、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、画像捕捉デバイス動作制御機構４４４に、画像捕捉デバイス４３０の位置を、例えば、フローセル４２０に対して調節させるように構成される、コンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含み得る又はそれと動作可能に関連し得る。動作制御機構４４２、４４４は、モータ、ジンバル、並びにそれぞれフローセル及び画像捕捉デバイス内の動作を容易にする及び生成する他の機械特徴を含んでよい。いくつかの場合では、フローセル制御機構４４２及び／又は画像捕捉デバイス制御機構４４４は、画像捕捉デバイスのフローセルに対するモータ化及び自動化焦点化を提供する高精度ステッパモータコントロールを含んでよい。図１に描写するように、プロセッサは画像捕捉デバイス２４の動作を制御することができる。同様に、図１Ｂに描写するように、プロセッサはフローセルキャリア５５の動作を制御することができる。
【００９９】
したがって、本発明の実施形態は、尿試料内の粒子の撮像のために、複合した粘性及び幾何学的流体集束を行う、粒子分析システムを包含する。例示的なシステムは、注入管及びそこを通る撮像軸を伴う撮像窓を伴う、流路を有するフローセルを含み得る。フローセルの流路は、流路サイズの縮小部を有し得る。更に、分析器システムは、流路と流体連通するシース液インプットと、注入管と流体連通する尿インプットとを含み得る。尿インプットは、試料流れストリーム内の尿試料が、流れストリームの厚さよりも大きい流れストリームの幅で流れるように、尿試料をフローセル内の流れるシース液に注入するために構成され得る。シース液は、尿試料の粘性よりも高い粘性を有し得る。更に、分析器システムは、画像捕捉デバイスと、フローセルに対する画像捕捉デバイスの焦点面を設定する焦点化機構とを含み得る。更に、システムは、フローセルに対して固定された位置を有する撮像目標を含み得、ここにおいて撮像目標及び試料流れストリームは、撮像軸に沿う変位距離を画定する。システムは、プロセッサと、変位距離を使用して、粒子特徴付け及び計数に好適な、画像捕捉デバイスの焦点状態を設定するために、焦点化機構を操作するために、プロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる有形媒体を有する焦点化モジュールと、もまた含み得る。シース液と尿試料との間の粘性差異は、流路サイズの縮小部との組み合わせで、尿試料内の細胞の生存能を保持する一方で、撮像軸にて第１及び第２の試料流体を流体集束させることに効果的であり得る。いくつかの場合では、焦点化機構は、画像捕捉デバイスとフローセルとの間の距離を調節するように構成される駆動モータを含み得る。
【０１００】
いくつかの場合では、分析器システム４００は、図４に描写するように、フローセル４２０と熱結合する、温度又は熱センサ４４８を含んでよい。任意でプロセッサと動作可能に関連付けられ得る焦点化モジュールは、温度センサによって感知される温度変化及び温度と所望の焦点との間の既知の関係に反応して、粒子特徴付け及び計数に好適な、画像捕捉デバイスの焦点状態又は焦点面を設定するために、焦点化機構（例えば、フローセル制御機構４４２又は画像捕捉デバイス制御機構４４４）を操作するためにプロセッサ上で実行される機械可読コードを組み入れる、有形媒体を含み得る。
【０１０１】
結果的に、本発明の実施形態は、試料流体粘性を有する尿試料４２４内の複数の粒子の撮像のためのシステム４００を包含する。システム４００は、試料流体粘性とは既定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有する、シース液４２６と共に使用され得る。システム４００は、流路４２２及び試料流体注入管４１２を有する、フローセル４２０を含み得る。流路４２２は、流路サイズの縮小部又は狭細遷移帯域を有し得る。更に、システム４００は、シース液の流れをフローセル４２０の流路４２２に沿って送るために、フローセル４２０の流路４２２と流体連通するシース液インプット４０１を含み得る。システム４００は、尿試料の流れ又はストリーム４２８を、フローセル４２０内の流れるシース液４２８に注入するために、フローセル４２０の注入管４１２と流体連通する、尿試料インプット４０２もまた含み得る。例えば、試料流体４２４は、カニューレ４１２の遠位出口ポート４２３から、流れるシース液４２６のエンベロープ内に出ることができ、そこで試料リボン４２８を形成する。
【０１０２】
シース液４２６が、試料流体４２４から形成された試料流体リボン４２８と共に、流路サイズの縮小部４１９を通って撮像部位４３２に向かって流れる際に、粘性差異に関連する、シース液４２６と試料流体４２４との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路サイズの縮小部に関連する、シース液４２６と試料流体４２４との間の相互作用によって誘発される幾何学的集束効果との組み合わせで、撮像部位４３２にて複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供する。ここに示すように、システム４００は、撮像部位４３２にて複数の粒子を撮像する、撮像デバイス４３０もまた含む。
【０１０３】
図４Ａに描写するフローセルの実施形態に示すように、流路サイズの縮小部（例えば、遷移帯域４１９ａの）は、流路４２２ａの対向壁４２１ａ、４２３ａによって画定され得る。対向壁４２１ａ、４２３ａは、流路４２２ａに沿って半径方向内側に角度があり得、概して試料流体ストリーム４２８ａを二等分する横断面４５１ａについて対称である。面４５１ａは、試料ストリームが第１の厚さＴ１を有する試料ストリーム４２８ａを、試料ストリーム４２８ａがカニューレ又は試料注入管４１２ａの遠位部分４２７ａを出る位置にて、二等分し得る。同様に、面４５１ａは、試料ストリームが第２の厚さＴ２を有する試料ストリーム４２８ａを、試料ストリーム４２８ａが画像捕捉部位４３２ａを過ぎる位置にて二等分する。いくつかの実施形態に従い、第１の厚さＴ１は約１５０μｍの値を有し、第２の厚さＴ２は約２μｍの値を有する。かかる場合は、試料リボンストリームの圧縮比率は、７５：１である。いくつかの実施形態に従い、第１の厚さＴ１は、約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内の値を有し、第２の厚さＴ２は、約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の値を有する。試料ストリーム流体が、フローセルを通って流れる際に、加速するに伴ってリボンは薄くなり、伸張する。フローセルの２つの特徴が試料流体リボンを薄くすることに寄与し得る。１つ目に、シース液エンベロープと試料流体リボンとの間の速度差異がリボンの厚さを低減させるために動作し得る。２つ目に、遷移帯域の先細り形状がリボンの厚さを低減させるために動作し得る。図４Ａに描写するように、カニューレ４１２ａの遠位出口ポート４１３ａは、狭細遷移帯域４１９ａの長さに沿う中央位置に位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポートは、遷移帯域４１９ａの開始部（近位部分４１５ａ）のより近くに位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポートは、遷移帯域４１９ａの終結部（遠位部分４１６ａ）のより近くに位置付けられ得る。いくつかの場合では、遠位出口ポート４１３ａは、例えば、図３Ａ（遠位出口ポート３３１が狭細遷移帯域の近位に配設される）に描写するように、遷移帯域４１９ａの完全に外部に位置付けられ得る。
【０１０４】
図４Ａ（並びに図４及び４Ｂ−１）に描写するように、遷移帯域４１９ａは、近位（４１５ａ）及び遠位（４１６ａ）部分の角度遷移によって画定され得る。遷移帯域４１９ａは、近位（４１５ａ）及び遠位（４１６ａ）部分にて、図１、３、３Ａ、３Ｂ、及び４Ｂ−２に描写される滑らかな又は曲線の遷移に類似する、滑らかな又は曲線の遷移を代わりに呈し得る、ということもまた理解される。
【０１０５】
典型的に、第１の厚さＴ１は、試料粒子のサイズよりもはるかに大きく、よって該粒子は試料リボンストリーム内に完全に含有される。しかしながら、第２の厚さＴ２は、特定の試料粒子のサイズよりも小さくあり得、よってそれらの粒子は試料流体から周りのシース液へ及び得る。図４Ａに示すように、試料リボンストリームは、カニューレを出て画像捕捉部位に向かって移動する際に、概して試料面に沿って流れ得る。
【０１０６】
フローセルは、遠位カニューレ部分４２７ａと画像捕捉部位４３２ａとの間の、分離距離４３０ａもまた提供し得る。いくつかの実施形態に従い、試料流体注入管４１２ａの遠位部分４２７ａは、画像捕捉部位４３２ａからの軸分離距離４３０ａに位置付けられ得、軸分離距離４３２ａは約２１ｍｍの値を有する。いくつかの実施形態に従い、軸分離距離４３０ａは、約１６ｍｍ〜約２６ｍｍの範囲内の値を有する。
【０１０７】
カニューレ出口ポートと画像捕捉部位との間の軸分離距離４３０ａは、流体が出口ポートから画像捕捉部位に移動する際の試料流体の遷移時間に影響を与え得る。例えば、相対的により短い軸分離距離４３０ａは、より短い遷移時間に寄与し得、相対的により長い軸分離距離４３０ａは、より長い遷移時間に寄与し得る。
【０１０８】
流路遷移帯域４１９ａに対する、又は流路遷移帯域４１９ａの近位部分４１５ａに対する、カニューレ遠位部分４２７ａの出口ポートの位置もまた、流体が出口ポートから画像捕捉部位に移動する際の試料流体の遷移時間に推定し得る。例えば、シース液は近位部分４１５ａにて相対的により遅い速度を、及び近位部分４１５ａと遠位部分４１６ａとの間の位置にて相対的により速い速度を有し得る。したがって、遠位部分４２７ａのカニューレ出口ポートが、近位部分４１５ａに位置付けられると、試料流体が画像捕捉部位に到達することにより多くの時間がかかり得、これは移動距離がより長いためだけではなく、カニューレ遠位ポートを出た後の試料流体の初期速度もより遅い（より遅いシース液速度のため）ためである。言い換えると、フローセルのより厚い部分（近位部分４１５ａ付近）内に存在する試料流体がより長いほど、試料が画像捕捉部位に到達することにより長い時間がかかる。逆に、遠位部分４２７ａのカニューレ出口ポートが、近位部分４１５ａの遠位に（例えば、図４Ａに描写するように、近位部分４１５ａと遠位部分４１６ａとの間の中央位置にて）位置付けられる場合、試料流体が画像捕捉部位に到達することにより短い時間がかかり得、これは、移動距離が短いためだけではなく、カニューレ遠位ポートを出た後の試料流体の初期速度もより速い（より速いシース液速度のため）ためである。本明細書の他の箇所で記載されるように、帯域４１９ａの狭細断面積のため、シース液は遷移帯域４１９ａを通って流れる際に加速する。
【０１０９】
いくつかの実施形態に従い、より短い遷移時間を伴い、画像捕捉部位での画像収集により多い時間が使用可能になる。例えば、カニューレ遠位端から撮像区域への遷移時間の持続時間が低減するに伴い、特定の長さの時間内でより多くの試料を処理することが可能になり、関連して、特定の長さの時間内でより多くの画像（例えば、１分当たりの画像）を得ることが可能になる。
【０１１０】
カニューレ遠位部分４２７ａの出口ポートを画像捕捉部位４３２ａのより近くに位置付けることに関連する利点があるものの、ポートと捕捉部位との間に特定の距離を維持することもまた望ましい。例えば、図３に描写するように、撮像デバイスの光学対物レンズ又は前方レンズは、フローセル２２のシート５８内に位置付けられ得る。カニューレの出口ポート３１がシート５８に近すぎる場合、画像捕捉部位にて所望の撮像特性を提供するように、シース液に注入された後、試料流体が十分に安定化されないことがある。同様に、先細りの領域が画像捕捉デバイスの対物レンズを収容するシート５８の位置付けに干渉しないように、先細りの遷移領域２１を表示帯域２３からある距離を置いて維持することもまた望ましいことがある。
【０１１１】
続けて図４Ａを参照し、試料流体注入管４１２ａの下流端４２７ａは、流路遷移帯域４１９ａの近位部分４１５ａの遠位に位置付けられ得る。関連して、試料流体注入管４１２ａの下流端４２７ａは、流路遷移帯域４１９ａの遠位部分４１６ａの近位に位置付けられ得る。したがって、いくつかの実施形態に従い、試料流体は、遷移帯域４１９ａ内の位置にて注入カニューレ４１２ａからフローセルに注入され得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態に従い、流路サイズの（例えば、流路遷移帯域４１９ａでの）縮小部における対称性は、尿試料内の粒子の不整列を制限するために動作する。例えば、かかる対称性は、尿試料内の赤血球撮像配向不整列を、約２０％未満に制限することに効果的であり得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態に従い、本明細書に開示する方法は、血液計数分析の間の、試料の、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％未満の減退率に対して操作可能である。
【０１１４】
いくつかの実施形態に従い、画像捕捉部位４３２ａは、８００μｍ×８００μｍの間の視野４３３ａを有する。いくつかの場合では、画像捕捉部位４３２ａは、約２７５μｍ×２７５μｍの視野４３３ａを有する。いくつかの場合では、視野は長さかける幅という観点で画定され得る。表面積として表現される場合、２７５μｍ×２７５μｍの視野は、７５，６２５μｍ２の面積を有する。いくつかの実施形態に従い、視野は撮像デバイス対物レンズ及びその倍率によって決定され得る。いくつかの場合では、視野は、収集光学素子（例えば、対物レンズ、管レンズ、及びカメラ）によって撮像される、領域（面積）の範囲に対応し得る。いくつかの場合では、視野は画像捕捉部位での透明区域の表示ポートよりもはるかに小さい。
【０１１５】
図４Ａ−１及び４Ａ−２は、カニューレ出口ポートから画像捕捉部位へ移動する際の、試料ストリーム上の流体集束の効果を図示する。図４Ａ−１に示されるように、試料ストリームは、約１５０μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有し得る。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｓ）は約１６００μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｓ）は幅が約２０００μｍである。いくつかの場合では、試料ストリームは、約２１９０μｍの幅を有する。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｓ）は、約１３５０μｍ〜約２２００μｍの範囲内の値を有する。ここに描写する試料ストリームの寸法は、例えば、図４Ｅに描写するカニューレ出口ポートの寸法に対応し得る。更に、ＰＩＯＡＬシース液は、約６０００μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有し得る。図４Ａ−２に示すように、流体集束の後に、試料ストリームは約２μｍの高さＨ（Ｓ）及び約１３５０μｍの幅Ｗ（Ｓ）を有し得る。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｓ）は約１６００μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｓ）は幅が約２０００μｍである。いくつかの場合では、試料ストリームは、約２１９０μｍの幅を有する。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｓ）は、約１３５０μｍ〜約２２００μｍの範囲内の値を有する。更に、ＰＩＯＡＬシースストリームは、約１５０μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）を有し得る。一実施形態では、カニューレ出口でのＰＩＯＡＬシースストリームの断面積は、画像捕捉部位の付近の断面積よりも４０倍大きい。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、画像捕捉部位にてフローセルチャネルの断面を判定することが有用であり得る。これは、図４Ａ−２に描写するように、ＰＩＯＡＬシースストリームの、約１５０μｍの高さＨ（Ｐ）及び約４０００μｍの幅Ｗ（Ｐ）に対応し得る。フローセルを通って流れる、画像捕捉部位にて、複合した試料及びシース液の容積流量を決定することもまた有用であり得る。断面積及び流量が分かっている場合、画像捕捉部位にて、複合した試料及びシース液の速度を決定することが可能である。
【０１１７】
いくつかの実施形態に従い、フローセルを通る試料流体及びシース液の流れは、平行板プロファイルモデルで概算することができる。関連して、試料流体ストリームの中央における流量（例えば、図４Ａ−２に描写される）は、複合した試料及びシース液ストリームの平均流量の約１．５倍であり得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態に従い、カニューレ出口での試料の流れの断面積（例えば、図４Ａ−１におけるＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））は、撮像部位での試料の流れの断面積（例えば、図４Ａ−２におけるＷ（Ｓ）×Ｈ（Ｓ））よりも４０倍大きい。撮像区域でのシース液の容積流量は、約４５μＬ／秒であり得る。撮像区域での試料流体の容積流量は、約０．２３２μＬ／秒である。いくつかの場合では、撮像部位での複合したシース及び試料ストリームの断面積は、６００，０００μｍ２である。いくつかの場合では、撮像部位での平均流れストリーム速度は、７５ｍｍ／秒である。
【０１１９】
該流量又は速度は、明確で焦点の合った細胞内画像をもたらす量に決定され得る。例示的な流量及び速度は、撮像部位にて特定の試料流れストリームリボン形状又は特色に到達することが観察された、２つの試料の流量に基づいて発見された。例えば、約７５ｍｍ／秒（又は２０〜２００ｍｍ／秒の範囲内）の流量にて、連続画像において細胞の重複があるほど細胞の流れが遅すぎることはなく、ゴースト効果（ぼけた画像）が生まれるほど細胞の流れが速すぎることはない。関連して、過剰に高い流量を避けることによって、より多くの試薬及び試料を保存することが可能になる。いくつかの実施形態に従い、容積流量（ポンプ速度）又はカニューレの形状のいずれかを変更することによって、最適又は所望の線速度が達成され得る。
【０１２０】
試料ストリームの画像捕捉帯域を通る流速は、フローセル機能に対する画像捕捉デバイスの性能にもまた関連し得る。例えば、試料ストリームの流れが速すぎる場合、試料内に含有される粒子の明確な画像を取得することが困難であることがある（例えば、画像捕捉デバイスのシャッター速度が遅すぎ、よってぼけた画像を生成することがあり得る）。同様に、試料ストリームの流れが遅すぎる場合、画像捕捉デバイスは同じ粒子の連続画像を取得することがある（例えば、同じ粒子が２つの画像捕捉の間補足フレームに残る）。いくつかの実施形態では、フレーム捕捉の間の流れが最小になり、高い割合の試料が撮像されるように、試料リボンの速度は、画像捕捉率に対して調節され得る（例えば、様々なフローセル操作パラメータのうちの任意のものを調節することによって）。
【０１２１】
いくつかの実施形態に従い、粒子分析システム及び関連する構成要素は、シース液及び流体試料がフローセルを通って流れる際に、シース液が４５μＬ／秒のシース液容積流量で流れることができ、流体試料が０．２３２μＬ／秒（又は０．２〜０．３５μＬ／秒の範囲内）の流体試料容積流量で流れることができるように、構成され得る。いくつかの場合では、試料流体の流量は、０．２μＬ／秒〜１μＬ／秒の範囲内の値を有し得る。いくつかの場合では、シース液は約４０μＬ／秒の流量を有し得る。いくつかの場合では、試料流体は約０．５６μＬ／秒の流量を有し得る。いくつかの場合では、約１９秒間の撮像持続時間に、フローセルを通って流される試料流体の容積は、約８μＬ〜約１２μＬの範囲内の値を有し得る。いくつかの場合では、シース液の流量の、試料流体の流量に対する比率は、約２００である。いくつかの場合では、シース液の流量の、試料流体の流量に対する比率は、約７０〜２００の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、シース液の流量の、試料流体の流量に対する比率は、約１９３である。いくつかの場合では、シース液の流量の、試料流体の流量に対する比率は、約７０である。場合によっては、フローセル内を流れる、シース液の容積の、流体試料の容積に対する比率は、２５：１〜２５０：１の範囲内であり得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態に従い、システム及び関連する構成要素は、シース液及び流体試料がフローセル４２０を通って流れる際に、撮像区域の前でシース液が７５ｍｍ／秒のシース液速度で流れることができ、撮像区域の前で流体試料が１３０ｍｍ／秒の流体試料速度で流れることができるように、構成され得る。場合によっては、フローセル内を流れる、シース液の容積の、流体試料の容積に対する比率は、１００：１〜２００：１の範囲内であり得る。
【０１２３】
場合によっては、フローセルは、約５０：１の最小圧縮比率及び約１２５：１の最大圧縮比率を有し得る。いくつかの場合では、最小圧縮比率は、約３０：１又は２０：１であり得る。この圧縮比率は、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較したときの、流れストリームの厚さの比率Ｈ（Ｓ）：Ｈ（Ｓ）を指す。この圧縮比率は、幾何学的圧縮（例えば、図４Ａ−１を図４Ａ−２と比較したときの、シース液厚さの比率Ｈ（Ｐ）：Ｈ（Ｐ）であり、図４Ａに示すフローセル狭細先細り遷移帯域４１９ａの寸法にもまた概して対応し得る）及び流体力学圧縮（例えば、速度差異にもまた対応する）の組み合わせによって影響され得る。いくつかの実施形態に従い、幾何学的圧縮比率は約４０：１である。
【０１２４】
遷移帯域に対応する流路サイズの縮小部は、近位厚さ又は高さを有する近位流路部分と、近位厚さ又は高さよりも小さい遠位厚さ又は高さを有する遠位流路部分とによって画定され得る。例えば、図４Ｂ−１及び４Ｂ−２の部分図に示すように、流路の遷移帯域４１９ｂは、近位部分４１５ｂと遠位部分４１６ｂとの間に長さＬを有し得、近位部分４１５ｂは近位高さ４１７ｂを有し、遠位部分４１６ｂは遠位高さ４１８ｂを有する。図４Ｂ−２に描写するように、及び本明細書の他の箇所で記載されるように、遷移帯域の形状又は輪郭は曲線又は滑らかであり得、例えば、Ｓ曲線、Ｓ字状曲線、又は正接曲線の形状で提供され得る。いくつかの実施形態に従い、近位高さ４１７ｂは約６０００μｍの値を有する。いくつかの場合では、近位高さ４１７ｂは、約３０００μｍ〜約８０００μｍの範囲内の値を有する。いくつかの実施形態に従い、遠位高さ４１８ｂは、約１５０μｍの値を有する。いくつかの場合では、遠位高さ４１８ｂは、約５０μｍ〜約４００μｍの範囲内の値を有する。
【０１２５】
遷移帯域４１９ａの形状は、第１の流路境界４０３ｂと二等分横断面４５１ｂとの間に第１の角度α１及び第２の流路境界４０４ｂと二等分横断面４５１ｂとの間に第２の角度α２を提供し得る。いくつかの場合では、角度α１は約４５度であり、角度α２は約４５度である。いくつかの場合では、角度α１は約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの場合では、角度α２は約１０度〜約６０度の範囲内の値を有する。いくつかの実施形態に従い、角度α１及びα２は同じ値を有する。角度α１及びα２は、近位部分４１５ｂから遠位部分４１６ｂに移動する際に、試料流体の層流を維持する又は乱流を最小化するために選択され得、これは同じく横断面４５１ｂに沿う試料内の粒子の整列を促進し得る。図４Ａを参照して上述したように、遠位及び近位境界又は遷移帯域の部分は、角度が付く代わりに、曲線又は滑らかであり得る。
【０１２６】
図４Ｃは、本発明の実施形態に従う例示的なカニューレ又は試料供給管４００ｃの特徴を描写し、ここにおいてカニューレは長さＬを有する。図４Ｄは、カニューレ４００ｄの長手方向断面図を描写する。ここに示すように、カニューレ４００ｄは、遠位平坦セクション４１０ｄ、中央先細りセクション４２０ｄ、及び近位管状部分４３０ｄを含む。図４Ｃ−１に描写するように、例示的なカニューレ又は試料供給管４００ｃ−１は、遠位部分４１０ｃ−１及び近位部分４３０ｃ−１を有し得る。いくつかの場合では、遠位部分４１０ｃ−１は、約１．３５９ｍｍの長さ及び約１．４３ｍｍの幅を有する。いくつかの場合では、遠位端の出口ポートは約１．３５９ｍｍの出口幅Ｗ（Ｅ）を有する。いくつかの実施形態に従い、カニューレは図４Ｃ及び４Ｄに描写されるものとは異なる内部流路形状を有し得る。例えば、図４Ｄ−１に図示されるように、カニューレ４００ｄ−１は、先細り中央セクションを含まず、拡張した流面積断面を有する。図４Ｄ−１に描写されるように、カニューレ４００ｄ−１は、遠位セクション４１０ｄ−１、先細り内径を有する中央先細りセクション４２０ｄ−１、及び近位セクション４３０ｄ−１を有する。中央セクション４２０ｄ−１の先細り内径に対応し、４１０ｄ−１の内部断面積は、４３０ｄ−１の内部断面積よりも小さい。
【０１２７】
本発明の実施形態に従う検尿システムは、約９００μＬの容積を有する尿試料を処理することができる。図４Ｄに示すカニューレ又は注入管４００ｄは、約１３μＬの内部容積を有する。いくつかの実施形態に従い、カニューレ又は注入管は、約３０μＬ未満の内部容積を有する。
【０１２８】
図４Ｅは、遠位平坦セクション４１０ｅの横断面を図示する。ここに示すように、遠位セクション４１０ｅは内部幅Ｗ（Ｉ）及び内部高さＨ（Ｉ）を有し、これを通って試料ストリームが流れる。更に、遠位セクション４１０ｅは、外部幅Ｗ（Ｏ）及び外部高さＨ（Ｏ）を有する。組み合わされる図４Ｄ及び４Ｅに描写されるように、試料流体注入管の遠位部分４１０ｅは、高さＨ（Ｉ）及び幅Ｗ（Ｉ）を有する排出ポートＰを有し、ここにおいて高さＨ（Ｉ）は幅Ｗ（Ｉ）よりも小さい。いくつかの実施形態に従い、遠位部分４１０ｅの排出ポートＰの高さＨ（Ｉ）（又は遠位部分４１０ｄの内部高さ）は、約１５０μｍの値を有し得る。いくつかの場合では、高さＨ（Ｉ）は、約５０μｍ〜約２５０μｍの範囲内であり得る。いくつかの実施形態に従い、遠位部分４１０ｅの排出ポートＰの幅Ｗ（Ｉ）（又は遠位部分４１０ｄの内部幅）は、約１３５０μｍの値を有し得る。いくつかの場合では、幅は約１１９４μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は約５００μｍ〜約３０００μｍの範囲内の値を有し得る。いくつかの場合では、高さＨ（Ｉ）は約１５０μｍであり得、幅Ｗ（Ｉ）は約１３５０μｍであり得る。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は約１６００μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は幅が約２０００μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は約２１９０μｍである。いくつかの場合では、幅Ｗ（Ｉ）は、約１３５０μｍ〜約２２００μｍの範囲内の値を有する。本明細書の他の箇所で記載されるように、幅Ｗ（Ｉ）の値は撮像部位での試料の幅を決定することができる。いくつかの場合では、遠位平坦セクション４１０ｄは、管又は導管に型締力をかけることによって製造され得る。いくつかの場合では、カニューレは、約３．１２ｃｍ（約１．２３インチ）の長さ及び約０．１４０ｃｍ（約０．０５５インチ）の内径を有し得る。いくつかの場合では、カニューレは約４８μＬの内部容積を有し得る。
【０１２９】
図４Ｆは、中央先細りセクション４２０ｆの横断面を図示する。ここに示すように、中央先細りセクション４２０ｆは内径Ｄ（Ｉ）を有し、ここを通って試料ストリームが流れる。更に、中央先細りセクション４２０ｆは外径Ｄ（Ｏ）を有する。図４Ｇは、近位セクション４３０ｇの横断面を図示する。ここに示すように近位セクション４３０ｇは内径Ｄ（Ｉ）を有し、ここを通って試料ストリームが流れる。更に、遠位セクション４３０ｇは外径Ｄ（Ｏ）を有する。
【０１３０】
図４Ｄに描写されるように、注入管又はカニューレ４００ｄは、第１の流れ断面積（例えば、図４Ｇに示すπ×（Ｄ／２）２）を有する近位部分４３０ｄと、第１の流れ断面積よりも小さい第２の流れ断面積（例えば、図４Ｅに示されるＷ（Ｉ）×Ｈ（Ｉ））を有する遠位部分４１０ｄと、近位部分４３０ｄと遠位部分４１０ｄとの間に配設された第３の部分４２０ｄとを有し得る。第３の部分４２０ｄは、第１及び第２の流れ断面よりも大きい第３の流れ断面（例えば、図４Ｆに示されるπ×（Ｄ／２）２）を有し得る。場合によっては、近位部分４３０ｇの外径Ｄ（Ｏ）は、約１０６７μｍであり、近位部分４３０ｇの内径Ｄ（Ｉ）は約８１３μｍである。
【０１３１】
いくつかの実施形態に従い、注入管の近位部分は、試料流入口取り付け部の試料ポートと結合し得る。例えば、図４Ｈに示すように、カニューレ４００ｈの近位部分４０５ｈは、試料流入口取り付け部４２０ｈの出口にて、試料ポート４１０ｈに直接結合し得る。
【０１３２】
尿試料内の粒子の撮像のためのシステムのフローセルは、重力の方向に対する任意の所望の角度又は方向で配向され得る。例えば、フローセルは、フローセル内を流れる流体（例えば、シース液、任意で試料流体との組み合わせ）が重力に反して上向きの方向に移動することができるように、上向きの方向に配向され得る。同様に、フローセルは、フローセル内を流れる流体（例えば、シース液、任意で試料流体との組み合わせ）が重力で下向きの方向に移動することができるように、下向きの方向に配向され得る。図４Ｉは、上向きの方向に配向したフローセル４２０ｉを描写し、よってフローセル４２０ｉ内を流れる、試料流体４２４ｉ及びシース液４２６ｉは、重力Ｇに反して流れる。図４Ｊは、下向きの方向に配向したフローセル４２０ｊを描写し、よってフローセル４２０ｊ内を流れる、試料流体４２４ｊ及びシース液４２６ｊは、重力Ｇに反して流れるのではなく、むしろ重力Ｇで流れる。
【０１３３】
図４Ｋに示すように、フローセル４２０ｋの画像捕捉部位４３２ｋを通って流れる試料ストリームリボンＲは、約２μｍの厚さＴを有し得る。いくつかの場合では、試料ストリームリボンの厚さＴは、最大３μｍであり得る。典型的には、試料ストリーム厚さよりも小さい細胞又は粒子は、リボン内に有含され得る。例示的な赤血球（ＲＢＣ）は、両凹面ディスクとして提供され得、約６．２μｍ〜約８．２μｍの直径Ｄを有し得る。更に、例示的な赤血球は、約２μｍ〜約２．５μｍの最大厚さＴ１及び約０．８μｍ〜約１μｍの最小厚さＴ２を有し得る。いくつかの場合では、赤血球は最大約３μｍの厚さを有し得る。例示的なヒト血小板は、大きさが多様であり得、約２μｍの厚さ又は直径もまた有し得る。ここでは一定の縮尺で示されていないものの、フローセルは画像捕捉部位にて約１５０μｍの値を有する流路厚さＨを画定し得る。いくつかの場合では、流路厚さＦは、５０μｍ〜４００μｍの値を有する。この流路厚さＦは、図４Ｂ−１及び４Ｂ−２に描写する遠位部分４６１ｂの遠位高さ４１８ｂにもまた対応する。
【０１３４】
図４Ｋに示すように、試料流体ストリームの厚さＴの粒子（赤血球）の厚さに対する比率は、約１：１である。いくつかの実施形態に従い、画像捕捉部位での試料流体ストリームの厚さＴの、粒子のうちの１つのサイズに対する比率は、０．２５〜２５の範囲内である。いくつかの場合では、厚さＴは、０．５μｍ〜５μｍの範囲内の値を有し得る。
【０１３５】
本明細書の他の箇所並びに同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号で記載されるように、試料リボンＲの流体とシース液との間の粘性差異は、試料ストリーム内の粒子、例えば、赤血球を、流れの方向に沿って整列又は配向するように動作し得る。そのように整列すると、図４Ｋに示すように、撮像デバイス又はカメラは、血球の主要面がカメラに向かって面するため丸く見える赤血球の画像を取得することができる。このように、赤血球は流れに対して低い抵抗性を呈する整列をとる。したがって、シース液及び試料流体の相対的粘性特色は、カメラに向かって面する赤血球の数の高い割合に寄与し得、よって粒子分析システムの評価能力を増強する。
【０１３６】
いくつかの実施形態に従い、シース液の粘性特色は、尿試料内の粒子不整列を制限するために動作する。例えば、粘性差異は尿試料内の赤血球撮像配向不整列を約１０％未満に制限することに効果的であり得る。つまり、試料内の１００個の赤血球のうちの９０個以上の赤血球が、主要面が撮像デバイスに面するように、整列し得る。対称狭細遷移帯域は２０％の値を提供し得る。粘性シース液を用いずにフローセルを使用して処理した尿試料の画像は図４Ｏに描写し、比較して、粘性シース液を用いてフローセルを使用して処理した尿試料の画像は図４Ｐに描写する。ここに示すように、粘性シース液の使用は、試料流体ストリーム内の粒子の不整列を制限することができる。いくつかの実施形態に従い、シース液は水のもの（すなわちｎ＝１．３３３０）に類似する屈折率を有する。いくつかの場合では、シース液は、約８９％の含水量を有する。粘性差異の結果として観察される整列効果に加え、整列効果は両側性先細り遷移帯域の結果としてもまた観察される。いくつかの場合では、両側性（すなわち対称）先細り遷移帯域は、粒子の整列において、非対称先細り遷移帯域設計と比較して２倍効果的であるということが観察される。
【０１３７】
赤血球の効果的な整列は、診断の改善に寄与し得る。いくつかの場合では、撮像した赤血球の形状は、試料が得られた患者が特定の病態又は疾患を有するかどうかを決定することに使用され得る。例えば、鎌状赤血球病を有する患者は、異常形状を有する（すなわち鎌の形状）血球を呈する。したがって、整列した赤血球の高い質の画像を取得することによって、正確な診断を保証することが可能である。赤血球における他の形状変化、例えば、赤血球が自転車のタイヤのプロファイルを有するように見える、薄い辺縁面積及び広い平坦中央面積を有する赤血球は、簡易整列技術を使用して効果的に撮像され得る。同様に、赤血球がトラックのタイヤのプロファイルを有するように見える、小さい中央部分及び厚い辺縁面積を有する赤血球は、診断目的のために撮像され得る。本明細書に開示される、改善した撮像技術は、ヘモグロビン含量、鉄含量等の、他の赤血球特徴の評価にもまた有用である。
【０１３８】
いかなる特定の理論にも拘束されることなく、シース液の粘性と試料流体の粘性との間の粘性差異は、修正された放物線プロファイルを生成すると考えられており、ここにおいてプロファイルは概して放物線であり、加速が増加する流れの中央区域に対応する中央隆起を有し、中央隆起は試料粒子又は粒子内小器官の整列に寄与する。いくつかの実施形態に従い、シースと試料リボンとの間の速度差異及び粘性差異は、小器官又は細胞内粒子の整列を増加させるせん断力を生成する。シース液放物線プロファイルの例示的な態様は、同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号に記載し、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３９】
白血球は典型的に赤血球及び血小板よりも大きい。例えば、例示的な好中球及び好酸球は、約１０μｍ〜約１２μｍの直径を有し得る。例示的な好塩基球は、約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有し得る。例示的なリンパ球（小型）は、約７μｍ〜約８μｍの直径を有し得、例示的なリンパ球（大型）は、約１２μｍ〜約１５μｍの直径を有し得る。例示的な単球は、約１２μ〜約２０μｍの直径を有し得る。フローセルを通過する際の、シース液と流体試料リボンとの間の相互作用を含む、粒子分析システムの構成は、図４Ｌに示すように、画像捕捉部位４３２ｌを通って移動する白血球を圧縮するように動作することができる。したがって、例えば、白血球（ＷＢＣ）の中央部分は試料流体リボンＲ内に位置付けられ得、白血球の辺縁部分はシース液内に位置付けられ得る。したがって、白血球がリボンによってフローセルを通して輸送される際に、白血球の側部がシース液に及び得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の粘性差異は、白血球等の細胞内に存在する小器官又は他の細胞内特徴を整列させるために動作することができる。いかなる特定の理論にも拘束されることなく、シース液と試料流体との間の粘性差異に関連するせん断力は、細胞内特徴を整列させるために白血球上で作用し得ると考えられる。いくつかの場合では、シース液と試料流体との間の粘性差異に関連するせん断力は、かかる整列に寄与し得る。これらの整列効果は、粒子と試料流体リボンとの間のサイズの差異によっても同様に影響され得る。例えば、粒子の一部が試料流体リボンを出て周りのシース液に伸びる場合、粘性差異に関連するせん断力は、細胞内特徴整列上に顕著な効果を有し得る。
【０１４１】
図４Ｌに描写するように、白血球等の細胞の一部は、シース液に及び得る。本発明の実施形態は、細胞がシース液に露出したときに、細胞を溶解しない若しくは細断しない、又はその反対に外部細胞膜の一体化を損なう、シース液組成物を包含する。シース液内の粘性剤は、細胞膜又は壁が試料流体リボンとシース液エンベロープとの間の界面を横断する、又は別様では試料流体ストリームから流れるシース液に伸びる際に、細胞の構造（例えば、形状）及び内容物（例えば、核）を無傷のままにするために、試料流体ストリーム内の細胞の生存能を保持するように動作し得る。
【０１４２】
多くの場合、試料流体リボン内をフローセルに沿って流れる際に、細胞又は粒子上に作用する圧縮力がある。したがって、細胞が圧縮状態にある、又は別様で狭細遷移帯域の結果として圧縮力を受ける間、細胞はシース液と接触し得る。シース液の粘性剤は、薄い試料流体リボンから現れ、粘性シース液に露出したときに、少なくとも細胞が画像捕捉部位に到達するまで、圧縮細胞を細断又は破壊されることから保護するように動作し得る。したがって、シース液の粘性剤組成物は、粒子又は粒子内内容物の整列を促進もまたする一方で、細胞内保護剤として動作し得る。
【０１４３】
図４Ｋ及び４Ｌを参照すると、場合によっては、細胞又は粒子の一部が、薄い試料流体リボンＲを出て周りのシース液に及び得る。同時係属である米国特許出願第＿＿＿＿号に記載されるように、シース液は、シース液が細胞又は粒子を崩壊又は溶解することを抑制する又は防止する、細胞内保護剤を含有し得る。例えば、シース液は、細胞がシース液の化学環境に露出する際に細胞壁の構造的一体性を保護する、細胞内保護剤を含有し得る。同様に、細胞内保護剤もまた、細胞が、フローセルの形状、並びに試料流体とシース液との間の速度及び／又は粘性の差異によって誘発される、任意のせん断力を受ける際に、細胞壁の構造的一体性を保護するように動作し得る。関連して、保護剤は、試料流体とシース液との間の速度の差異から生じる力から、細胞又は粒子を保護し得る。このように、細胞は画像捕捉部位に到達する際に生存能を保持する。
【０１４４】
せん断力は、試料流体リボンとシース液エンベロープとの間の界面にて著しくあり得る。いくつかの実施形態に従い、フローセル流路内の流れは、放物線流れプロファイルによって特徴付けられ得る。図４Ｌ−１は放物線流れプロファイル４００ｌ−１ａ及び４００ｌ−１ｂの例示的な態様を描写する。上部板における放物線プロファイル４００ｌ−１ａは、本発明の特定のフローセル実施形態内の流れ（例えば、シース液流れストリーム内に包まれる試料流体流れストリームの間に粘性差異がほとんど無い又は無い場合）において見られる、典型的速度プロファイルである。分かり得るように、最高線速度は流体ストリームの中間において観察され、より遅い線速度はフローセル壁付近で観察される。プロファイル４００ｌ−１ａは、シース液と試料流体との間のわずかな粘性差異を伴って、流体ストリームにおいてもまた観察され得る。シースストリームと流体ストリームとの間に高い粘性差異がある場合では、中央隆起はプロファイル４００ｌ−１ｂに示すように観察され、ここにおいて増幅した線速度を伴う局部的中央区域がある。いくつかの実施形態に従い、大きさが十分に大きい粒子は、かかる粒子が完全に単一流体相内に（すなわちシース液エンベロープ内又は代替的に試料流体リボン内のいずれか）含有される場合でさえ、いくらかのせん断力を受け得る。
【０１４５】
場合によっては、シース液の速度は試料流体の速度とは異なり得る。例えば、シース液は８０ｍｍ／秒で移動し得、試料流体は６０ｍｍ／秒で移動し得る。したがって、場合によっては、試料流体は、周りのエンベロープのシース液速度よりも遅い試料流体速度で遠位カニューレポートを出る。したがって、シース液は試料流体をカニューレの流路に沿って引きずるように動作し得、よって試料流体を加速させ試料流体リボンの厚さを低減する。試料流体リボンは、全体的容積及び質量を維持するため、より速く移動するほどより薄くなる。いくつかの実施形態に従い、シース液及び試料流体の両方が、画像捕捉部位にて約２０〜２００ｍｍ／秒の速度を有する。
【０１４６】
典型的に、試料流体の速度は、試料流体がカニューレ出口ポートから画像捕捉部位に移動するに伴って増加する。場合によっては、画像捕捉部位での試料流体の速度は、カニューレ遠位部分にてカニューレポートを出る際の試料流体の速度の４０倍である。いくつかの実施形態に従い、試料リボンの断面積の縮小は、速度における増加に比例する。いくつかの実施形態に従い、カニューレ出口でのシース速度が試料リボン速度よりも速い場合、これは撮像区域での最終試料リボン速度もまた増加させる。
【０１４７】
シース液は、有意なせん断力を試料流体リボンに及び試料流体リボン内の粒子にかけるよう動作し得る。いくつかの力は流れの方向に平行であり、粒子は流れの方向に垂直である力にもまた遭遇し得る。多くの場合、シース液及び試料流体が画像捕捉部位又は帯域に近づくにつれ、シース液及び試料流体は同じ又はほぼ同じ速度で移動する。したがって、画像捕捉部位を通る際のシース液と試料流体との間の境界又は界面は、遠位カニューレ出口ポートでの又は先細り遷移帯域での境界又は界面と比較して、より低いせん断力を呈し得る。例えば、先細り遷移帯域にて、シース液エンベロープと試料流体リボンとの間の境界又は界面は、最初はより遅くかつより厚い試料リボンがより速くかつより薄くなり、試料流体内の粒子がより整列するように、遷移中にあり得る。別の言い方をすると、せん断力は、先細り遷移帯域にて顕著であり得、画像捕捉部位に向かって消散し得る。画像捕捉部位でのせん断力は、放物線プロファイルによって表され得、先細り遷移帯域でのせん断力よりもはるかに低くあり得る。したがって、細胞又は粒子は、遷移帯域を通過する際により高いせん断力を、及び画像捕捉部位を通過する際により低いせん断力を経験し得る。いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の粘性差異は、赤血球を整列させ得及びそれによって焦点化させ得る。いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の粘性差異は、白血球小器官を整列させ得及びそれによって焦点化させ得る。関連して、改善した撮像結果は、ストリームの幾何学的狭細化及びシース液と試料流体との間の速度差異の結果として生じた、整列し焦点化した細胞及び小器官構成要素について、得られ得る。
【０１４８】
本明細書の他の箇所で述べたように、並びに図４Ｋ及び４Ｌを参照すると、シース液及び試料流体Ｒが流路サイズの縮小部又はフローセルの遷移帯域を通って、撮像部位４３２ｋ又は４３２ｌに向かって流れる際に、シース液粘性と試料流体粘性との間の粘性差異に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果が、流路サイズの縮小部又は遷移帯域に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、撮像部位４３２ｋ又は４３２ｌでの複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて、目標撮像状態を提供する。
【０１４９】
いくつかの場合では、目標撮像状態は、撮像部位での焦点面Ｆに対する目標配向である。例えば、図４Ｋ−１に描写するように、粒子（ＲＢＣ）は、焦点面Ｆからある距離を置いて配設され得る。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位４３２ｋ−１での焦点面Ｆに対する目標粒子配向を含む。粒子は、赤血球、白血球、又は血小板等の血球であり得る。ここに示すように、撮像部位４３２ｋ−１での流路は、焦点面Ｆに実質的に平行又は同一平面上のＰ面を画定し得る。いくつかの場合では、粒子の中央位置は焦点面Ｆから別の方法でずれ得るものの、粒子の一部は焦点面Ｆに沿って位置付けられ得る。いくつかの場合では、目標配向は、撮像部位４３２ｋ−１での焦点面Ｆに対する目標位置を含む。例えば、目標位置は、粒子の少なくとも一部が焦点面Ｆに沿って配設されるように粒子を位置付けることを含み得る。いくつかの場合では、目標位置は、粒子と焦点面Ｆとの間の距離が特定の閾値を超えないように粒子を位置付けることを含み得る。いくつかの場合では、目標位置は撮像部位４３２ｋ−１での焦点面Ｆに対する目標粒子位置を含む。いくつかの場合では、目標位置は焦点面Ｆからの距離Ｄ又はそれよりも近くにあり得、ここにおいて距離Ｄは位置公差に対応する。シース液と試料流体との間の粘性差異は、フローセル内のリボン試料ストリームの（例えば、流路面Ｐ及び／又は焦点面Ｆに対する）所望の位置付けを達成するように選択され得る。いくつかの場合では、粘性差異は、位置公差Ｄ又はそれよりも近い目標粒子位置を達成するように選択され得る。
【０１５０】
いくつかの場合では、焦点面Ｆは図４Ｋ−２に示されるように被写界の厚さ又は深さを有し、粒子（ＲＢＣ）は焦点面の厚さに対する目標撮像状態を有する。例えば、粒子の目標位置は、焦点面Ｆ内、又は少なくとも部分的に焦点面Ｆ内にあり得る。いくつかの場合では、高光学解像度撮像デバイス又はカメラは、約７μｍの視界の深さ又は焦点面の厚さを有し得る。いくつかの場合では、被写界深度又は焦点面の厚さは、約２μｍ〜約１０μｍの範囲を伴う値を有する。いくつかの場合では、カメラの被写界深度は、画像捕捉部位での試料リボンの厚さに類似するか又は同等である。
【０１５１】
いくつかの場合では、目標配向は撮像部位での焦点面Ｆに対する目標整列を含み得る。例えば、目標整列は、図４Ｋ−３に示すように画像捕捉部位４３２ｋ−３での焦点面Ｆに対する特定の角度αを超えないように、粒子によって画定される面が焦点面Ｆと整列するということを示し得る。いくつかの場合では、目標撮像状態は試料内の不整列粒子の数又は割合の制限を含み得る。例えば、シース液と試料流体Ｒとの間の粘性の差異は、尿試料内の赤血球撮像配向不整列を約１０％未満に制限することに効果的であり得る。つまり、試料内の１００個の赤血球のうちの９０個以上の赤血球が整列し得、よって主要面が撮像デバイスに向かって面する（図４Ｋ−１及び４Ｋ−２に描写するように）、又はこれらの９０個以上のＲＢＣの整列が流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内になる（例えば、ＲＢＣ整列角度αは２０度以下である）。本明細書の他の箇所で記載されるように、いくつかの場合では、ＲＢＣ等の非球形粒子の少なくとも９２％が流れの方向に実質的に平行な面において整列し得る。いくつかの場合では、ＲＢＣ等の非球形粒子の少なくとも７５％〜９５％が、実質的に、すなわち流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内（例えば、整列角度αが２０度以下である）に整列し得る。いくつかの実施形態に従い、特定の粒子（例えば、赤血球及び／又は血小板）の９０％以上が撮像デバイスの撮像軸を横断して配向され得る。
【０１５２】
いくつかの場合では、本発明の実施形態は、本明細書に記載される検尿システムとの使用のための、シース液又は粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）等の組成物を含む。かかるシース液又はＰＩＯＡＬは、複合した粘性及び幾何学的流体集束視覚分析器における使用に好適である。ＰＩＯＡＬは、視覚分析器の狭細フローセル遷移帯域を通る、所与の粘性の尿試料流体の流れを、方向付ける又は促進するために動作することができる。ＰＩＯＡＬは、試料の粘性よりも高い粘性を有する流体を含み得る。粘性差異に関連する、ＰＩＯＡＬ液と試料流体との間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果は、狭細フローセル遷移帯域に関連する、ＰＩＯＡＬ液と試料流体との間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、尿試料流体内の細胞の生存能を保持する一方で、視覚分析器の撮像部位にて複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的であり得る。
【０１５３】
図４Ｍは、ローブ４１０ｍ等の内部小器官を有する例示的な好中球４００ｍ（白血球の一種）を描写する。試料流体とシース液との間の粘性差異の結果として、図４Ｎに示されるように、内部小器官は細胞内で整列することができる。したがって、細胞内小器官は、小器官が互いに重複することなく、画像捕捉デバイス４３０ｍで効果的に撮像され得る。つまり、図４Ｍに描写されるような互いに積み重なるローブの代わりに、画像捕捉デバイスの撮像又は光学軸から見たときに、ローブは図４Ｎに描写されるように整列し横に並ぶ。したがって、ローブは捕捉した画像においてより効果的に視覚化され得る。内部小器官整列は、試料流体とシース液との間の粘性差異の驚くべきかつ予想外の結果である。
【０１５４】
本明細書の他の箇所で述べたように、及び図４Ｍ及び４Ｎを参照すると、シース液及び試料流体Ｒがフローセルの流路サイズの縮小部又は遷移帯域を通って、画像捕捉デバイス４３０ｍ又は４３０ｎの撮像部位に向かって流れる際に、シース液粘性と試料流体粘性との間の粘性差異に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果は、流路サイズの縮小部又は遷移帯域に関連する、シース液と試料流体Ｒとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、撮像部位での複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおいて目標撮像状態を提供する。いくつかの実施形態に従い、目標撮像状態は撮像状態の分布に対応し得る。
【０１５５】
いくつかの場合では、目標撮像状態は、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造配向（例えば、整列及び／又は位置）を含み得る。例えば、図４Ｎに描写されるように、内部構造４１０ｍ（例えば、細胞内構造、小器官、ローブ等）は、焦点面Ｆに対して配向され得る。いくつかの場合では、目標整列は、図４Ｋ−３に描写する粒子整列関係に類似する、撮像部位での焦点面Ｆに対する目標粒子内構造整列を含む。いくつかの場合では、目標位置は、図４Ｋ−１に描写する粒子位置関係に類似する、撮像部位での焦点面に対する目標粒子内構造位置を含む。いくつかの場合では、粒子内構造の目標配向は、焦点面に対する目標整列及び更に焦点面に対する目標位置の両方を含み得る。いくつかの場合では、目標撮像状態は撮像部位での目標変形を含み得る。例えば、図４Ｎに描写するように、粒子４００ｍは、図４Ｍに描写する粒子形状と比較して、圧縮された形状を有する。したがって、フローセルの動作は、粒子形状における側方圧縮効果を生成し得る、ということが分かり得る。関連して、粒子内特徴は、粒子自体が形状において圧縮される際に、位置的に又は方向的に配向され得る（例えば、焦点面Ｆ及び／又はリボン流れ面に関して整列する）。いくつかの実施形態に従い、シース液と試料流体との間の速度差異は、流れストリーム内に摩擦を生成し得、シース液と試料流体との間の粘性差異は流体力学的摩擦を増幅させ得る。
【実施例】
【０１５６】
フローセルを通って流れる試料流体の画像を使用して、様々な検尿又は尿粒子分析技術のうちの任意のものが行われ得る。多くの場合、画像分析は、特定の細胞若しくは粒子パラメータの決定、又は特定の細胞若しくは粒子特徴の、測定、検出、若しくは評価を含み得る。例えば、画像分析は、細胞又は粒子サイズ、細胞核特徴、細胞質特徴、細胞内小器官特徴等の評価を含み得る。関連して、分析技術は、特定の計数若しくは分類方法、又は診断試験を包含し得る。関連して、図４を参照すると、プロセッサ４４０は、プロセッサによって実行されると、システム４００に、画像捕捉デバイスから得られた画像に基づき、異なる種類の細胞又は粒子を鑑別させるように構成されるコンピュータアプリケーションを有する記憶媒体を、含むか又はそれと動作可能に関連し得る。例えば、診断又は試験技術は、尿内に存在する様々な粒子（例えば、赤血球、白血球、扁平上皮細胞、円柱、結晶、又は酵母）を鑑別するために使用され得る。
【０１５７】
本明細書に提供する実施例は、例示のみを目的とし、本発明はこれらの実施例に限定されず、むしろ本明細書で提供する教示の結果として明白である、全ての変形を包含する。
【０１５８】
本明細書に記載される実験以前は、本明細書に開示するような、尿内の粒子の整列及び細胞内容物の再位置付けのためのＰＩＯＡＬを含む用途の、開発及び方法を可能にする公開されたプロトコルは無かった。これは、体液（例えば、尿）試料内の粒子の、画像ベースの分析並びに差異分類及び副分類に有用である。本明細書に開示する方法及び組成物は、顕微鏡スライドガラス上の差異視覚化を促進する、白血球着色、上皮細胞、細菌着色を達成するために、任意で、好適な様式で粒子を着色及び／又は溶解することができる。関連して、本明細書に記載される実験以前は、画像ベースの分析のため、並びに、尿試料内の粒子／細胞差異分類及び副分類のためのＰＩＯＡＬと、顕微鏡スライドガラス状で差異的視覚化を増強する、白血球、上皮細胞、細菌着色に到達するための、流れ内にある間に生じる任意の着色及び透過化工程を伴い、生存可能又は実質的に無傷な細胞を維持する一方で、かかる組成物を使用する方法と、を含む、開発及び使用方法を可能にする、公開されたプロトコルはなかった。
【０１５９】
本明細書に記載される例示的な組成物は、相対的に低い血液対試薬希釈にて着色が生じることを可能にし、着色は急速に（例えば、３０秒以内で）生じ得る。所望であれば、例示的な方法は、赤血球溶解を達成するために、熱との組み合わせで界面活性剤の使用を用いることができる。例示的な調合物は、ＲＢＣの一体性を保持しながら尚ＷＢＣ、網状赤血球、及び血小板着色有効性を達成するために、修正され得る。
【０１６０】
本開示の態様及び実施形態は、特定のＰＩＯＡＬ組成物が、画像ベースの粒子／細胞分析を行うために使用されると、細胞を整列させ、細胞内構造を位置付け直すという、予想外の特性を有するという、驚くべくかつ予想外の発見に基づく。
【０１６１】
例えば、いくつかの例示的なＰＩＯＡＬ調合物及びその使用方法が開発された。下記は、所望の特性を伴うＰＩＯＡＬ調合物のいくつかの例である。
【０１６２】
本明細書に記載される例示的な組成物は、相対的に高い尿対希釈比率にて着色が生じることを可能にし、着色は急速に（例えば、３０秒以内で）生じ得る。所望であれば、例示的な方法は、ＲＢＣ一体性を保持しながら、尚ＷＢＣ、上皮細胞、及び細菌着色有効性を所望の解像度で達成するために、膜透過処理を達成するために、熱との組み合わせで界面活性剤の使用を用いることができる。
【０１６３】
図４Ｏ及び４Ｐは、ＰＩＯＡＬ（図４Ｐ）対従来のシース液（図４Ｏ）を使用して得られた画像間の比較を実証する画像を示す。ｉＱ２００陽性尿対照の濃縮版を含有する試料が、焦点化プロトコルを（例示的な自動焦点パターン上で）使用して器具が焦点化された後に、分析された。試料はカニューレを通してフローセルに注入され、ＰＩＯＡＬ又は従来のシース（対照）の２つの層の間に、約２．５ミクロンの厚さのリボン形状の試料ストリームを生成した。視覚分析器はその後、分析に使用するための、リボン形状の試料ストリーム内の粒子の焦点画像を生成する（例えば、１秒当たり約６０フレーム）。図４Ｏ及び４Ｐから見られ得るように、ＰＩＯＡＬは濃縮した尿試料内の整列した粒子の割合を有意に増加させる。
【０１６４】
例えば、図４Ｑは、本開示の例示的な組成物及び方法を使用して得られた結果画像を示し、赤血球、白血球、扁平上皮細胞、円柱、結晶、及び酵母といった、流れる粒子の、分類及び／又は副分類における有効性を実証した。画像は、様々な細胞成分並びに、核ローブ及び顆粒構造はそれぞれの細胞種類について明確に区別可能であるということを、露呈した。尿試料は、次のプロトコルを使用して採取された。試料は下記で説明される粒子造影剤組成物と接触させた。次の液体が撹拌され、例示的な粒子造影剤組成物を得た。０．１５０ｍＬの、溶解性溶液（ＣＤＳ  ５ＰＤ−Ｌｙｔｉｃ）内に溶解した１ｍｇ／ｍｌクリスタル紫、及び０．１５０ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ  ７．２。例示的な試料は、最初に３００μＬの例示的な粒子造影剤組成物を試験管内にピペット操作し、それを１．７ｍＬの尿試料と撹拌することによって、調製した。混合物は、３０秒間、６０℃の水浴内で温められた。試料は、次の条件を使用して、例示的な分析器（例えば、図１に描写する通り）上で分析された。試料流量０．５６μＬ／秒、及びシース液流量４６μＬ／秒。結果は図４Ｑに示される。したがって、本明細書に開示する試料処理技術は、粒子構造及び内容物が保存されるような、好ましい撮像結果を提供することができ、撮像軸に関して改善した整列が達成される。
【０１６５】
対称及び非対称フローセルにおける、増加するレベルのグリセロール（ｇｌｙ）の使用に基づき、ＰＩＯＡＬの実装は改善した整列をもたらす、ということもまた観察された。
【０１６６】
これらの結果は、特定のＰＩＯＡＬ組成物が、画像ベースの粒子／細胞分析を行うために使用されると、細胞を整列させ、細胞内構造を位置付け直すという、予想外の特性を有するという、驚くべくかつ予想外の発見の根拠を提供する。
【０１６７】
例えば、いくつかの例示的なＰＩＯＡＬ調合物及びその使用方法が開発された。下記は、所望の特性を伴うＰＩＯＡＬ調合物のいくつかの例である。ＰＩＯＡＬは、希釈剤及び少なくとも１つの粘性変性剤を含む。
【０１６８】
例示的なＰＩＯＡＬ調製物Ａは、３００ｍＬのグリセロール及び１ＬまでのＱＳ（適量化、又は最終容積をそうするまでに必要な量）を有する、３０％（ｖ／ｖ）のグリセロール溶液を含み、希釈剤は、９．８４ｇの硫酸ナトリウム、４．０７ｇの塩化ナトリウム、０．１１ｇのプロカインＨＣｌ、０．６８ｇの第一リン酸カリウム、０．７１ｇの第二リン酸ナトリウム、及び１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する。初期の混合物には、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調節する一方で、脱イオン水での１ＬまでのＱＳ化が続いた。
【０１６９】
例示的なＰＩＯＡＬ調製物Ｂは、６５ｍＬのグリセロール及び１ＬまでのＱＳを有する６．５％（ｖ／ｖ）のグリセロール溶液を含み、好適な例示的な希釈剤は、９．８４ｇの硫酸ナトリウム、４．０７ｇの塩化ナトリウム、０．１１ｇのプロカインＨＣｌ、０．６８ｇの第一リン酸カリウム、０．７１ｇの第二リン酸ナトリウム、及び１．８６ｇのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する。初期の混合物には、水酸化ナトリウムでｐＨを７．２に調節する一方で、脱イオン水での１ＬまでのＱＳ化が続いた。
【０１７０】
例示的なＰＩＯＡＬ調製物Ｃは、５０ｍＬのグリセロール、１０ｇのＰＶＰ（ＭＷ：３６０，０００）、１包のシグマＰＢＳ粉末を有する、ｐＨ  ７．４の（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水、０．１３８Ｍの塩化ナトリウム、０．００２７Ｍの塩化カリウム）緩衝剤内に、１％のＰＶＰ（ｗ／ｖ）を伴う、５％のグリセロール（ｖ／ｖ）溶液、及び脱イオン水での１ＬまでのＱＳ化を含む。
【０１７１】
例示的なＰＩＯＡＬ調製物Ｄは、１６ｇのＰＶＰ（ＭＷ：３６０，０００）及び１包のシグマＰＢＳ粉末を有する、ｐＨ  ７．４の（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水、０．１３８Ｍの塩化ナトリウム、０．００２７Ｍの塩化カリウム）１．６％  ＰＶＰ（ｗ／ｖ）溶液及び脱イオン水での１ＬまでのＱＳ化を含む。
【０１７２】
処理能力
図５は、フローセル内の１つ以上の試料流体の注入に対応するタイムライン５００を描写する。ここに示すように、工程５１０によって示されるように、第１の試料流体のフローセルへの注入が開始され得る。その後、工程５１５によって示されるように、第１の試料流体からの粒子がフローセル内で撮像され得る。第１の試料流体は、約９００μｌの容積を有し得る。いくつかの場合では、撮像区域にて、流れは０．２３２μＬ／秒（又は０．２μＬ／秒〜０．３５μＬ／秒の範囲内）である。第１の試料流体の注入は、工程５２０によって示されるように終了し得、第２の試料流体のフローセルへの注入が、工程５３０によって示されるように、開始し得る。工程５３５によって示されるように、第１の試料流体注入の終了及び第２の試料流体注入の開始の結果として、試料流体過渡が開始され得る。その後、工程４４５によって示されるように、フローセル内の試料流体過渡は消散し得る。第２の試料流体からの粒子は、工程５５０によって示されるように、フローセル内で撮像され得る。工程５６０によって示されるように、第２の試料流体の注入が終了し得る。場合によっては、注入及び流れ手順は、約１８℃〜約４０℃の範囲内の温度で行われる。
【０１７３】
典型的には、シース液の流れは、試料が注入される際及び該注入が終了する際に、フローセル内を流れ続ける。したがって、いくつかの実施形態に従い、シース液の連続的流れは、試料流体の注入が流れるシースに規則的に送り込まれる間、維持される。シース液の連続的流れは、試料流体がフローセルに沿って流れる際に、試料流体におけるリボン形状の保存に寄与し得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態に従い、工程５５０に関連する画像捕捉は、工程５１５に関連する画像捕捉の４秒以内に行われ得る。いくつかの実施形態に従い、第１と第２の試料流体注入との間（例えば、工程５１０と５３０との間）の時間は、約３０秒である。関連して、いくつかの実施形態に従い、第１及び第２の試料流体の撮像の開始の間（例えば、工程５１５の開始と工程５５０の開始との間）の時間は、約３０秒である。このように、１時間当たり１２０個の試料流体を処理することが可能である。いくつかの場合では、画像捕捉デバイスは、１秒当たり１８０フレーム（ＦＰＳ）のフレーム速度で動作し、よって複数の固有の連続的画像又はフレームを、高頻度又は高速で生成する、ここに示すように、撮像工程（例えば、５１５又は５５０）の持続時間は１５秒であり得、よって１つの試料流体当たり２，７００個の画像を生成する。
【０１７５】
場合によっては、第１の試料流体は、試料流体注入管から流れるシース液への第１の試料流体の注入（例えば、工程５１０）後、約１〜３秒以内で、安定状態に到達する。場合によっては、第１の試料流体は、試料流体注入管から流れるシース液への第１の試料流体の注入（例えば、工程５１０）後、約１秒未満内に、安定状態に到達する。試料のフローセルへの注入は、２工程のプロセスであり得る。本実施形態に従い、第１の工程は、カニューレから全ての希釈剤を取り除く、高速圧迫であり、最初の圧迫の後に、試料の流量は有意に低減する。遷移時間は、試料（例えば、細胞）が撮像流れ条件（より遅い試料流量）下でカニューレ出口から撮像区域に移動するためにかかる時間として画定され得る。場合によっては、第１の試料流体は、試料流体注入管から流れるシース液への第１の試料流体の注入（例えば、工程５１０）から約１．８秒以内で、安定状態に到達する。場合によっては、試料流体は、約２〜４秒の範囲内の、フローセル（例えば、カニューレ出口ポートから画像捕捉部位まで）を通る遷移時間を有する。
【０１７６】
いくつかの実施形態に従い、流れが安定化すること又はカニューレの遠位出口ポートから撮像区域に移動することに、約５秒かかる。いくつかの場合では、画像捕捉の持続時間は約２０秒間であり得る。
【０１７７】
本発明の実施形態に従う検尿システムは、約９００μＬの容積を有する尿試料を処理することができる。いくつかの実施形態に従い、カニューレ又は注入管は、約３０μＬ未満の内部容積を有する。いくつかの実施形態に従い、カニューレ又は注入管は、約３０μＬよりも大きい内部容積を有する。尿試料の容積は、画像収集を開始する前にカニューレを洗浄することに効果的であり、よって試料の流れが安定でない時間の延長を回避することができる。例えば、約１３μＬの内部容積を有するカニューレの使用は、約２〜３秒間の試料流れ不安定時間に対応し得る。いくつかの実施形態に従い、カニューレ内部容積は、試料流れ安定性に影響を与えることはない。いくつかの実施形態に従い、初期高速試料圧迫がカニューレ内の全ての希釈剤を取り換えることに不十分である場合、カニューレ内部容積は、試料リボン自体における細胞濃度安定性に影響を与え得る。関連して、カニューレは、試料間に、少量の希釈剤を使用して、短時間で洗浄され得る。このように、質の高い画像の捕捉を容易にする、安定した試料の流れに到達し、同時に、低いキャリオーバで高い処理能力に到達することが可能である。いくつかの実施形態に従い、高内部容積を伴うカニューレは、ライン及びカニューレにおける全ての希釈剤を取り除くために、試料の高容積初期高速圧迫を要求し得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態に従い、検尿システムは、尿試料からの画像捕捉を速くするために、過渡及び連続的試料公差汚染を制限する。
【０１７９】
方法
図６は、本発明の実施形態に従う、複合した粘性及び幾何学的流体集束のために構成される粒子分析システムを使用して、複数の粒子を撮像するための、例示的な方法６００の態様を描写する。粒子は、試料流体粘性を有する尿流体試料６１０内に含まれ得る。ここに示すように、尿試料６１０は粒子を含み、粒子を含有する第１の試料流体６１２及び粒子を含有する第２の試料流体６１４等の、１つ以上の試料流体に分けることができる。
【０１８０】
方法は、工程６３０によって示されるように、フローセルの流路に沿ってシース液６２０を流すことを含み得る。シース液６２０は、試料流体粘性とは既定の粘性差異範囲内の粘性差異で異なるシース液粘性を有し得る。該方法はまた、工程６３０によって示されるように、シース液に包まれた試料流体ストリームを提供するように、尿流体試料６１０（第１の試料流体６１２）を、試料流体注入管からフローセル内の流れるシース液に注入することも含み得る。
【０１８１】
フローセルの流路は、流路サイズの縮小部を有し、よって、流路サイズの縮小部を通り撮像部位に向かう、試料流体ストリーム及びシース液の厚さは、初期厚さから画像捕捉部位に隣接する第２の厚さに低減する。方法６００は、工程６４０によって示されるように、第１の試料流体からの第１の複数の粒子をフローセルの画像捕捉部位において、撮像することを更に含み得る。試料ストリーム及びシース液が流路サイズの縮小部又は遷移帯域を通過する際に、粘性差異に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果（工程６５０に示す通り）が、流路サイズの縮小部に関連する、シース液と試料流体ストリームとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果（工程６６０に示す通り）との組み合わせで、撮像部位にて複数の粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的となり、一方で、工程６７０によって示されるように、シース液内の粘性剤が、細胞が試料流体ストリームから流れるシース液に伸びる際に、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする。方法はまた、工程６８０によって示されるように、撮像部位にて複数の粒子を撮像することも含み得る。
【０１８２】
方法６００はまた、試料流体過渡を開始することも含み得る。例えば、試料流体過渡は、工程６５０によって示されるように、第１の試料流体の流れるシース液への注入を終了させ、第２の試料流体を流れるシース液に注入することによって開始され得る。更に、方法６００は、工程６６０によって示されるように、第２の試料流体からの第２の複数の粒子を、フローセルの画像捕捉部位において、撮像することを含み得る。いくつかの実施形態に従い、第２の複数の粒子の撮像は、試料流体過渡後でかつ第１の複数の粒子の撮像の４秒以内に実質的に行われ得る。
【０１８３】
図６Ａ及び６Ｂは、せん断力、側方向圧縮、配向、差異粘性、シース液と試料中体との間の相対動作等に関連する、例示的な流れストリーム特色を描写する。
【０１８４】
せん断ひずみ速度
図７及び８は、本発明の実施形態に従う、フローセル内の特定の流れ条件の、せん断ひずみ速度値の態様を描写する。これらの図のそれぞれにおいて、３０％グリセロールのシース液が使用される。いくつかの場合では、粘性は２．４５×１０−３の値を有し得る。せん断応力値は、粘性値をひずみ速度値で乗じることによって得られる積と同等である。図７に関して、試料は０．３μＬ／秒の流量を有し得、シース液は２１μＬ／秒の流量を有し得る。図８に関して、試料は１μＬ／秒の流量を有し得、シース液は７０μＬ／秒の流量を有し得る。これらの数値のそれぞれにおいて、流れは中央（Ｃ）に向かってより低いひずみ値及び周辺部（Ｐ）に向かってより高いひずみ値を呈するということが分かり得る。かかるひずみ値は、いくつかの実施形態では、非対称フローセル構成に対応し得る。
【０１８５】
図７に描写するように、いくつかの実施形態に従い、中央（Ｃ）部分に向かうより低いひずみ速度は、約５００（１／ｓ）以下の値を有し得、流れストリームの周辺部（Ｐ）に向かうより高いひずみ速度は、約３０００（１／ｓ）以上の値を有し得る。図８に描写するように、いくつかの実施形態に従い、中央（Ｃ）部分に向かうより低いひずみ速度は、約１０００（１／ｓ）以下の値を有し得、流れストリームの周辺部（Ｐ）に向かうより高いひずみ速度は、約９０００（１／ｓ）以上の値を有し得る。
【０１８６】
したがって、より低い試料流体及びシース液速度（例えば、図７）はより低いひずみ速度に対応し、より高い試料流体及びシース液速度（例えば、図８）はより高いひずみ速度に対応するということが分かり得る。本発明の実施形態は、様々な粘性値、様々なひずみ速度値、及び／又は様々なせん断応力値に対応する、試料流体及び／又はシース液の使用を包含するということが理解される。
【０１８７】
ＰＩＯＡＬは、好適な粘性及び密度を有し、フローセルへの導入点での試料の流量は、試料流体が薄いリボンに平坦化するようなものである。リボン形状の試料ストリームは、ＰＩＯＡＬと共に運ばれ、対物レンズ及び光源がリボン形状の試料ストリームの表示を可能にするように配置される、表示ポートの前を通る。試料流体は、例えば、ＰＩＯＡＬの流路が対称的に狭細化する点にて注入されることにより、導入される。結果として、試料流体ストリームは、薄いリボンに平坦化し伸長する。本開示のＰＩＯＡＬは、本開示の任意の視覚分析器と共にシース液として使用されてよい。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、フローセルの端に導入され、試料流体を排出部に向かって運ぶ。
【０１８８】
表示帯域におけるリボン形状の試料ストリームの寸法は、ＰＩＯＡＬ流路の幾何学的厚さ減少、並びに試料流体及びＰＩＯＡＬの差異線速度によって影響され、リボン形状の試料ストリームの厚さ減少及び伸張をもたらす。使用のＰＩＯＡＬに対する初期差異線速度は、０．５：１〜５：１の範囲であり得る。ＰＩＯＡＬ流路断面は、約１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、又は２００：１の係数で、深さを低減することにより、薄くなり得る。一実施形態では、幾何学的厚さ減少は、４０：１である。一実施形態では、幾何学的厚さ減少は、３０：１である。考慮される因子は、フローセルを通る遷移時間、試料処理能力の所望の比率、粒子のサイズに同等なリボン形状の試料ストリーム厚さの達成、粒子及び小器官の整列を得ること、焦点化した粒子の内容物の達成、動作制限内での圧力、流れ、及び粘性の均衡、リボン形状の試料ストリームの厚さを最適化すること、所望の線速度を得ること、製造能力の考慮、必要とされる試料及びＰＩＯＡＬの容積である。
【０１８９】
カニューレ及び断面平坦化の長さ及び容積は、試料流れ不安定の時間を低減し、それによって処理能力を増加させるために選択され得る。いくつかの実施形態では、流れ不安定の時間は、約３、２．７５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５  １．２５、又は約１秒未満であり得る。より小さいカニューレ容積は、試料測定間にカニューレを洗浄するために必要な時間及び希釈剤の容積もまた低減し得る。いくつかの実施形態では、フローセルを通る遷移時間は、１、２、３、若しくは４秒、又はこれらの時間のうちの任意の２つの間内の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、遷移時間は４、３、又は２秒未満であり得る。
【０１９０】
試料流体及びＰＩＯＡＬの粘性及び流量、並びにフローセルの輪郭は、ＰＩＯＡＬの流れが、試料の流れを、画像捕捉部位に対応する信頼できる位置での表示帯域を通して、一定して平坦なリボンに、平坦化及び伸張させるように、準備される。試料流体ストリームは、流体流れ厚さ内で約２〜３μｍに圧縮され得る。いくつかの血球の種類は、ストリーム厚さよりも大きい直径を有する。流れの方向に平行な方向のせん断力は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面における撮像条件下での粒子の画像投影の増加をもたらし、並びに／又は、粒子内構造、例えば、細胞内構造、小器官、若しくはローブの、流れの方向に実質的に平行になるような、位置付け、再位置付け、及び／若しくはより良好な位置付けをもたらす。高光学解像度撮像デバイス被写界深度は、最大７μｍ、例えば、１〜４μｍである。
【０１９１】
ＰＩＯＡＬの流れ断面は、運ばれるリボン形状の試料ストリームを伴い、そこを通して対物レンズが方向付けられる、表示ポートの正面の表示帯域を通して一定である。対物レンズは、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの、対物構成要素であり得る。リボン形状の試料ストリームは、フローセル内の既知でかつ再現可能な、例えば、フローセルの２つの壁から既知でかつ再現可能な距離にある位置にて、表示帯域をまたがる経路を追随し、下流で排出される。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び／又は方法のうちの任意のものにおいて得られる画像は、デジタル画像であってよい。いくつかの実施形態では、得られる画像は顕微鏡画像である。特定の実施形態では、画像は手動で得られてよい。他の実施形態では、画像を取得するための手順の少なくとも一部が自動化される。いくつかの実施形態では、画像は、フローセルと、任意で自動焦点特徴を伴う、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスとを備える、視覚分析器を使用して得られてよい。
【０１９３】
試料内の粒子からの光学情報は、リボン形状の試料ストリームが表示ポートの前の表示帯域を通って運ばれるときに、分析器内の検出セクションによって検出され、それによって試料内に含有される粒子／細胞からデータを生成する。本分析器の使用は、試料内に含有される細胞及び／又は粒子の捕捉、処理、分類及び副分類、並びに計数を可能にする。ＰＩＯＡＬ液体は、粘性変性剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、抗菌剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤の追加によって調製され得る。本開示における分析器の、例示的な機能性構成要素及び／又は特徴は、例えば、画像分析、試料着色処理、画像処理、及び／又は粒子画像識別からのデータを取得する及び／又は処理する能力、計数、及び／又は分類及び副分類を含み得る。
【０１９４】
一実施形態では、本開示は、ＰＩＯＡＬ内の好適な量の粘性剤の追加が、フローセル内の粒子／細胞整列を有意に改善し、焦点化した細胞又は細胞成分のより高い割合並びに流れ内の細胞及び／又は粒子のより高い質の画像をもたらすという、驚くべきかつ予想外の発見に基づく。粘性差異は、狭細遷移帯域の幾何学的流体集束効果との組み合わせで、増強した整列及び焦点結果を達成することができる。粘性剤の追加は、ＲＢＣ等の細胞上のせん断力を増加させ、流れの方向に実質的に平行な面における細胞の整列を改善し、画像最適化をもたらす。これは、細胞内構造、小器官、又はローブ等の粒子内構造の、流れの方向に実質的に平行な位置付け、再位置付け、及び／又はより良好な位置付けもまたもたらし、画像最適化をもたらす。粘性剤は、全体的に細胞の不整列もまた低減するが、流れストリームよりも直径が小さい細胞に限定されない。
【０１９５】
流れストリームよりも直径が小さい細胞の整列、例えば、赤血球は、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって、又は流れ速度比を増加させることによって、得られ得る。これは、流れの方向に平行なＲＢＣの整列をもたらす。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ不整列の低減及び／又はＲＢＣ整列の増加は、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって達成される。
【０１９６】
ＰＩＯＡＬの流れ断面は、運ばれるリボン形状の試料ストリームを伴い、そこを通して高光学解像度撮像デバイスが方向付けられる、表示ポートの正面の表示帯域を通して一定である。リボン形状の試料ストリームは、フローセルの前及び後ろの壁のいずれかから、既知でかつ再現可能な距離にて、表示帯域をまたがる経路を追随し、その下流で排出される。
【０１９７】
本開示は、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化するための、高光学解像度撮像デバイスの正確な作動位置を、自動的に達成するための技術を提供する。フローセルは、リボン形状の試料ストリームが、フローセル内の表示帯域を通過する、ＰＩＯＡＬの層の間の薄いリボン内の、試料流体の流路を画定するフローセルの壁の間に、固定されたかつ再現可能な位置を有するように構成される。開示するフローセル実施形態では、例えば、図１〜４Ｇでは、ＰＩＯＡＬの流路の断面は、遷移帯域にて対称的に狭細化し得、試料はオリフィスに長方形のルーメンを伴う管等の平坦なオリフィスを通して挿入され得る。狭細流路（例えば、２０：１〜４０：１の比率での、断面における幾何学的狭細化）及び更に試料の流れと比較したＰＩＯＡＬの任意でより大きい線速度は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で平坦化するために協働する。いくつかの実施形態に従い、該比率は、１０：１〜１００：１の範囲内、５０：１〜１００：１の範囲内、７０：１〜８０：１の範囲内であり得る。いくつかの実施形態に従い、該比率は、７５：１である。効果的なことに、流量、粘性、及び形状の組み合わせにより、試料は、薄いリボンの形状になる。狭細流路（例えば、４０：１の比率又は２０：１〜７０：１の比率での断面積における幾何学的狭細化）及び試料の流れと比較したＰＩＯＡＬの線速度における差異は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で圧縮するために協働する。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は、４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は、３０：１であり得る。
【０１９８】
結果として、試料及びＰＩＯＡＬの具体的な線速度等のプロセスの変形は、リボン形状の試料ストリームを流れ内のその位置から変位させる傾向に無い。フローセルの構造に対して、リボン形状の試料ストリームの位置は、安定しており、かつ再現可能である。
【０１９９】
別の態様では、本発明は、本発明の粒子造影剤組成物を備えるキットに関する。該キットはまた、本明細書に記載される任意の方法に従う、粒子造影剤組成物の使用についての説明書も含有し得る。該キットは、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）もまた含み得る。該キットはまた、プログラム可能な記憶媒体及び、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、血小板、網状赤血球、有核ＲＢＣ、芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、細菌、真菌、原生生物、原生動物、又は寄生虫等の、粒子の画像ベースの識別のための関連ソフトウェアも含有してよい。該キットは、等張性緩衝剤を含み得る、１つ以上の緩衝剤及び／又は希釈剤を備えてよい。該キット及び又は緩衝剤は、界面活性剤、ｐＨ調節剤、及び／又は抗菌剤を更に含んでよい。他の実施形態では、該キットはまた、洗浄又は水洗溶液を備えてもよい。該キットは、陽性及び陰性対照のための標準物もまた備えてよい。いくつかの実施形態では、標準物は標準着色細胞試薬を含み得る。該キットは、キットの構成要素を移すための、使い捨てマイクロピペット、チップ、又は管等の、使い捨てのものもまた含み得る。キットは、これらのキット構成要素のうちのいずれか１つ又はその２つ以上の任意の組み合わせを含有してよい。
【０２００】
尿試料内の血球又は他の粒子の弁別は、本発明の実施形態が特によく適している例示的な用途である。該試料は、自動化技術によって調製され、高光学解像度撮像デバイスに薄いリボン形状の試料ストリームとして提供され、リボン形状の試料ストリームが視野にわたって流れる間に周期的に撮像される。粒子（血球等）の画像は、細胞又は粒子を識別及び計数するために、完全に自動的に又はわずかなヒトによる補助を伴い、ピクセル画像データをプログラム化した処理技術で、互いから区別、分類、副分類、及び計数され得る。粒子の異常又は臨界特徴の場合に備えて保存され得利用可能にされ得る細胞画像に加え、出力データは、記録された試料画像において区別された細胞又は粒子の、それぞれの特定の分類及び／又は副分類の発生の計数を含む。
【０２０１】
それぞれの画像において見られる、異なる粒子の計数は、更に処理され得、例えば、全体の試料内のそれぞれの区別された分類及び／又は副分類の細胞の、正確で統計的に有意な比率を蓄積するために使用される。視覚的弁別に使用される試料は、希釈され得るが、それぞれの分類及び／又は副分類における細胞の割合は、希釈した試料内で、特に多数の画像が処理された後で表され得る。
【０２０２】
本明細書に開示する装置、組成物、及び方法は、視覚的特質に基づいて、試料内の細胞を弁別及び定量化することに有用である。試料は、生体試料、例えば、白血球を含む体液試料であり得、血液、結晶、骨髄、洗浄液、浸出液、滲出液、脳脊髄液、胸膜液、腹膜液、及び羊水を制限なく含む。いくつかの実施形態では、試料は固体組織試料、例えば、細胞懸濁液を生成するために処理された生検試料であり得る。試料はまた、糞便試料を処理することから得られる懸濁液でもあり得る。試料はまた、細胞培養試料等の、粒子を含む実験室又は製造ライン試料でもあり得る。試料という用語は、患者若しくは実験室から得られる試料又はその任意の断片、一部、若しくは部分標本を指すために使用されてよい。試料はいくつかのプロセスにおいて、希釈され得、部分に分割され得、又は着色され得る。
【０２０３】
一態様では、本開示の組成物及び方法は、流れ内の細胞の驚くべく高い質の画像を提供する。一態様では、視覚分析器は、本開示の方法において使用され得、自動化した画像ベースのＷＢＣ差異計数を提供する。特定の実施形態では、本開示の方法は、被験者が健康であるか又は疾患、病態、異常、及び／若しくは感染症を有するか、並びに／又は、治療に反応性であるか若しくは非反応性であるかの、判定、診断、予後診断、予測、及び／又は診断の支持のための、形態特徴及び／又は異常を含む視覚特質の自動化識別に関する。該システムは、いくつかの実施形態では粒子計数器を更に備え得る。用途は、尿試料等の流体試料内の細胞の、分類及び／又は副分類、並びに計数を含む。粒子の追加の種類及び／又は他の流体試料内の粒子の計数のための他の類似する使用もまた企図される。本発明のシステム、組成物、及び方法は、リアルタイムの分類及び副分類、並びに任意の好適な自動化粒子認識アルゴリズムを使用する画像の表示に使用され得る。それぞれの試料について捕捉された画像は、後日に表示するために保存され得る。
【０２０４】
別の態様では、本発明の装置、組成物、及び方法は、驚くべくことに、より正確な画像ベースの細胞分類及び副分類、並びに、現在の自動化分析器を使用するときの手動レビュー率と比較して手動のレビュー率を低減する減退を提供する。該システム、組成物、及び方法は、手動レビュー率を低減し、手動レビューを器具上で行うことを可能にする。更に、本開示のシステム、組成物、及び方法は、手動のレビューを要求することで、自動化分析の間に減退した試料の割合を低減する。
【０２０５】
結果的に、いくつかの実施形態では、本発明の開示は、粒子、例えば、血球を含有する、試料の分析のための、装置及び方法を提供する。本開示に従い、視覚分析器が液体内で懸濁された粒子を含む試料の画像を取得するために、提供される。いくつかの実施形態では、視覚分析器はフローセル及び自動焦点構成要素を備え、ここにおいて対称の粒子を含有する液体試料は、そこを通して対物レンズに結合するカメラが粒子のデジタル画像を捕捉する表示ポートを有する、フローセルを通して流される。本発明の実施形態を使用して実行され得る例示的な自動焦点技術は、同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号に開示され、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。フローセルは、希釈された及び／又は処理された、尿試料又は本明細書に記載される他の体液試料等の、試料流体の供給源に、並びに透明なシース液又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）の供給源に結合される。
【０２０６】
一実施形態では、該装置は、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器、並びに分析器、及びプロセッサもまた備える。分析器及びプロセッサは、粒子計数機に関連する、計数、分類、及び副分類誤差を補正するために、追加の情報を提供し、試料内の粒子の異なる分類及び／又は副分類の正確な粒子計数又は濃度を決定するように構成される。
【０２０７】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される粒子の画像ベースの分析において使用され得るＰＩＯＡＬに関する。尿試料内の細胞分類及び／又は副分類計数は、本開示において、分析され得る試料の種類の非制限的な例として使用される。いくつかの実施形態では、試料内に存在する細胞は、細菌又は真菌細胞、並びに白血球及び／又は赤血球を含み得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態に従い、試料調製装置、並びに試料希釈、透過化、及び組織着色の方法の詳細は、１つ以上のプログラム可能なコントローラによって操作される精密ポンプ及び弁を使用して達成され、本開示の中心ではない。例は、プログラム可能なコントロールに関する、米国特許第７，３１９，９０７号等の、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．に与えられた特許において見ることができる。同様に、相対的大きさ及び色等の、その属性によって特定の細胞分類及び／又は副分類間を区別するための技術は、白血球との関連で、米国特許５，４３６，９７８号において見ることができる。これらの特許の開示は、参照によりここに組み込まれる。いくつかの実施形態に従い、試料調製技術は、着色、溶解、透過化、及び同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号にきさいされるもの等の他の処理様式を含んでよく、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０９】
高光学解像度撮像デバイスという用語は、形態特徴及び／又は変化を鑑別するために十分な視覚特質を伴う、粒子の画像を取得することができるデバイスを含み得る。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４６μｍ等の、例えば、０．４〜０．５μｍを含む、１μｍ以下の光学解像度を伴うデバイスを含み得る。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び／又は方法のうちの任意のものにおいて得られる画像は、デジタル画像であってよい。いくつかの実施形態では、得られる画像は顕微鏡画像である。特定の実施形態では、画像は手動で得られてよい。他の実施形態では、画像を取得するための手順の少なくとも一部が自動化される。いくつかの実施形態では、画像は、フローセルと、任意で自動焦点特徴を伴う、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスとを備える、視覚分析器を使用して得られてよい。
【０２１１】
一実施形態では、画像は、細胞基質、細胞核、及び／又は細胞の核成分に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は顆粒成分及び／又は他の細胞の形態特徴に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞基質、核及び／又は細胞の顆粒成分に関連する情報を提供する。顆粒及び／又は核画像及び／又は特徴は、独立的に又は互いとの組み合わせで、細胞分類及び副分類に決定的である。
【０２１２】
自動焦点目標
戻って図１を参照すると、粒子撮像システムは、フローセル２２に対して固定された自動焦点パターン又は目標４４を含み得る。自動焦点目標４４は、フローセルを通って流れる尿流体粒子の焦点画像に到達するために使用され得る。
【０２１３】
図９Ａは、本発明の実施形態に従う、例示的な自動焦点目標９００を描写する。ここに示すように、目標９００は、不透明環状バンド９１０及び透明な中心部又は開口部９２０を含む。動作において、撮像デバイスはバンド９１０上に焦点化し、開口部を通して画像を捕捉する。本明細書の他の箇所で及び同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号に記載されるように、画像捕捉プロセスは、バンド９１０上の第１の焦点化（又は自動焦点化）、及びその後、開口部９２０を通して画像を取得する前の、画像捕捉デバイスと試料流体ストリームとの間の距離の調節を含み得る。結果的に、バンド９１０は、画像捕捉デバイスの自動焦点化システムが検出及び焦点化することができる目標を提供し、目標の特定の部分（例えば、縁又はセグメント）が画像内に含まれ得る。いくつかの場合では、目標は中央開口部を有するクロムディスクとして提供され得る。例示的な目標には、約０．５ｍｍの直径を有し、フローセルに接着剤で付けられた又は固定された、中央ピンホールが提供され得る。中央ピンホール又は開口部９２０のサイズは、図９Ｂに示すように、不透明環状バンド９１０の４つの縁部分９３０のみが、捕捉画像９４０において可視的となるように、選択され得る。したがって、環状バンド９１０は、細胞画像の捕捉を妨害することがない（例えば、試料粒子を照射するために、光は開口部９２０を通過することができ、視野は環状バンドによって実質的に妨害されない）。このように、バンド９１０は画像の角においてのみ現れる。
【０２１４】
図１０は、本発明の実施形態に従う例示的な自動焦点目標１０００を描写する。目標１０００は、バンド又はボーダー１０１０及び中央開口部１０２０を含む。図１１は、本発明の実施形態に従う、別の例示的な自動焦点目標１１００を示す。目標１１００は、バンド又はボーダー１１１０及び中央開口部１１２０を含む。いくつかの実施形態に従い、自動焦点目標１１００は、上部及び下部に、黒い５０ピクセルを有する画像を提供する。いくつかの場合では、自動焦点目標１１００は、約６５．３μｍのフローセル焦点オフセット（ＦＣＦＯ）を提供する。
【０２１５】
図１２Ａは、本発明の実施形態に従う、例示的な自動焦点目標１２００を描写する。目標１２００は、郵便箱設計として提供され、第１の又は上部ボーダー１２１０及び第２の又は下部ボーダー１２２０を含む。目標１２００は、第１と第２のボーダーとの間に開口部又は透明通路１２３０もまた含む。いくつかの実施形態に従い、目標は約４ｍｍの直径を有し、郵便箱の高さは２６５μｍである。いくつかの場合では、上部及下部ボーダーは、半円として提供され得、酸化クロム又は何らかの他の不透明材料等の溶着金属で生成され得る。
【０２１６】
本発明の方法の別の態様では、粒子造影剤組成物に接触する及び／又は撮像される細胞は、マラリア感染細胞、非定型リンパ球等の、異常細胞である。本発明のいくつかの態様では、該細胞は、病態、疾患、感染症、及び／又は症候群を、識別、予測、診断、予後診断、又はそれらの診断の支持のために使用され得る、異常細胞である。
【０２１７】
図１２Ｂは、自動焦点目標１２００の中央部分の拡大図を示す。ここに示されるように、第１のボーダー１２１０は、中央のゼロ値を伴う正／負数字目盛を含む。第２のボーダー１２２０は、類似する目盛を含む。いくつかの場合では、目盛増分は１００μｍである。いくつかの実施形態では、該目盛は、撮像デバイス又はカメラの視野を試料ストリーム上の中心とすることができるようなフローセルの位置付けを容易にするために使用され得る。ここに示されるように、試料ストリーム１２４０は、第１及び第２のボーダーの目盛に垂直な方向において流れる。焦点化プロトコルの一部として、画像捕捉デバイスは、ボーダー１２１０、１２２０上に存在する数字又は他の特徴若しくは撮像可能物体上に焦点化するために動作することができる。
【０２１８】
本発明の実施形態は、粒子分析システムの使用に関連する熱ドリフトに対処する技術を包含し、そうでなければかかる熱効果が撮像デバイスで得られる画像の質を劣らせることになる。図１３Ａは、熱センサ１３７０、反射器１３８０、及び自動焦点目標１３４４を有するフローセル１３２０の、部分側面図を描写する。粒子分析システムの動作の間、熱効果が、試料ストリームを撮像デバイスの焦点外にゆっくりと流出させることがある。例えば、熱効果は、ランプから出る放射熱によるフローセルの熱膨張によってもたらされ得る。更に、熱効果は、伝導性及び放射性加熱による、フローセル及び光学台アセンブリ（ＯＢＡ）アセンブリの熱膨張によってもたらされ得る。いくつかの実施形態では、ＯＢＡの特定の構成要素は膨張し得、焦点化誤差に寄与し得る。例えば、かかる構成要素は、共にカメラ２４を保持する金属板、フローセルを保持する若しくはそれに接続される金属板、又はフローセル及びカメラ２４の両方を合わせて保持する金属板を含んでよい。図１３Ｂは、熱センサ１３７０及び自動焦点目標１３４４を有するフローセル１３２０の、部分斜視図を描写する。更に、図１３Ｃは、熱センサ１３７０、反射器１３８０、及び自動焦点目標１３４４を有するフローセル１３２０の、別の透視図を描写する。
【０２１９】
図１３Ｃは、熱センサ１３７０、反射器１３８０、及び自動焦点又は撮像目標１３４４を有するフローセル１３２０の、別の透視図を描写する。反射器１３８０は、フローセル１３２０によって吸収される熱の量を低減又は制限するために動作し得る。例えば、反射器１３８０は、図１３Ａに示されるように、閃光ランプ１３４２によって放射された熱を遮ることができる。したがって、反射器１３８０は、ランプの熱影響を最小化することができる。反射器１３４２はまた、ランプによって生成されるまぶしい光及び光散乱を低減することもでき、よって画像の質の改善をもたらす。熱センサ１３７０は、正確な温度読取りが得られるように、流体流れチャネルの付近でかつ画像捕捉部位に隣接して位置付けられる。温度センサからの情報は、画像捕捉デバイスを試料流体リボンストリーム上に焦点化させるために使用され得る。本明細書に開示する例示的な自動焦点化技術は、分析器の特定の要素内で生じる温度揺らぎに基づき得る。
【０２２０】
図１３Ｄに描写するように、フローセル１３００ｄは、そこを通して気泡１３０２ｄが放出又は除去され得る、ポート又はベント１３０１ｄを有する、流路１３２２ｄを含み得る。ここに描写するように、そこを通して真空が適用され得る管１３０３ｄは、流れストリームから気泡１３０２ｄを引出すために、ポート１３０１ｄと接触し得る。かかる気泡除去機構は、フローセル内の流れる流体から気泡を除去することに好適であり、気泡又は微細気泡がフローセルの内部で留まる又は詰まることを防止するように動作することができる。流れストリームは、図１３Ｄにおいて上向きの方向において描写される。いくつかの実施形態では、流れストリームは、下向きの方向においてフローセルを通って移動し得る、ということが理解される。ここに示される気泡は、フローセル内で流体の上部に向かって浮遊する。
【０２２１】
いくつかの実施形態に従い、尿試料内の粒子を撮像するための方法は、シース液をフローセルの流路に沿って流すこと、及び尿試料が試料流れストリーム内を流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅で流れ、よってフローセルが関連する温度を有するように、尿試料をフローセル内の流れるシース液に注入することを含み得る。更に、該方法は、画像捕捉デバイスを、撮像軸に沿って、フローセルに関連する温度が第１の温度である間に、流れストリーム上で第１の焦点状態に焦点化させること、及び、流れストリーム内の粒子の第１のサブセットの第１の焦点画像を、画像捕捉デバイスを用いて第１の焦点状態で取得することを含み得る。更に、該方法は、フローセルに関連する温度が第１の温度から第２の温度へ変化したということを判定すること、並びに、温度における変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係に反応して、画像捕捉デバイスの焦点を、第１の焦点状態から第２の焦点状態に自動的に調節することを含み得る。尚も更には、該方法は、流れストリーム内の粒子の第２のサブセットの第２の焦点画像を、画像捕捉デバイスを用いて第２の焦点状態で取得することを含み得る。
【０２２２】
いくつかの場合では、画像捕捉デバイスの焦点の調節のプロセスは、温度の変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係を使用して、画像捕捉デバイスとフローセルとの間の距離を調節することを含む。いくつかの場合では、画像捕捉デバイスの焦点の調節のプロセスは、温度の変化及びフローセル温度と所望の焦点との間の既知の関係を使用して、画像捕捉デバイスの焦点距離を調節することを含む。
【０２２３】
焦点画像
図１４Ａ及び１４Ｂは、本発明の実施形態に従う、撮像システム及び方法の態様を示す断面側面図を提供する。図１４Ａを参照すると、尿試料分析器等の粒子分析システム１４００ａは、例えば、本明細書に記載されるもの等のフローセル及び粘性シース液技術を使用する、粘性及び／又は幾何学的流体集束のために構成され得る。粒子分析システムを使用する、尿試料内の粒子の撮像の例示的な方法は、シース液１４１０ａを、粒子分析システムのフローセル１４３０ａの流路１４２０ａに沿って流すことを含み得る。流路１４２０ａは、フローセルの対向フローセル壁１４２２ａ、１４２４ａによって少なくとも部分的に画定され得る。シース液１４１０ａは、尿試料の粘性とは異なる粘性を有し得る。撮像方法は、尿試料流体が試料流れストリーム１４４０ａ内で流れるように、尿試料をフローセル１４３０ａ内の流れるシース液１４１０ａに注入することを更に含み得る。試料流れストリーム１４４０ａは、流れストリーム厚さよりも大きい流れストリーム幅を有し得る。試料流れストリーム１４４０ａは、更に流路サイズの縮小部を通って流れ得、撮像軸１４５０ａを横断し得る。図１４Ａの実例では、流れの方向は左から右である。
【０２２４】
更に、撮像方法は、フローセル１４３０ａに対して固定された位置を有する撮像目標１４７０ａを撮像することにより、画像捕捉デバイス１４６０ａを焦点化することを含み得る。例えば、ここに描写するように、撮像目標１４７０ａは、フローセルの照射窓１４８０ａに対して固定された位置を有し得る。いくつかの場合では、撮像目標１４７０ａは、窓１４８０ａの内部又はその表面上に埋め込まれ得る。方法はまた、試料流体の粒子（例えば、流れストリーム１４４０ａ内に少なくとも部分的に配設される、粒子１４９０ａ）の焦点画像を画像捕捉デバイス１４６０ａで取得することも含み得る。焦点画像は、粒子特徴付け及び計数に好適である。
【０２２５】
画像捕捉デバイス１４６０ａは、変位距離を使用して試料流れストリーム１４４０ａ上に焦点化され得る。例えば、変位距離は試料流れストリーム１４４０ａと撮像目標１４７０ａとの間の距離Ｄに対応し得る。シース液１４１０ａと尿試料との間の粘性差異は、流路サイズの縮小部との組み合わせで、尿試料内の細胞の生存能を保持する一方で、試料流れストリーム１４４０ａ内の試料流体を、撮像軸１４５０ａにて流体集束させることに効果的である。例えば、粘性差異に関連する、シース液１４１０ａと試料流体ストリーム１４４０ａとの間の相互作用によって誘発される粘性流体集束効果は、流路サイズの縮小部に関連する、シース液１４１０ａと試料流体ストリーム１４４０ａとの間の相互作用によって誘発される幾何学的流体集束効果との組み合わせで、シース液１４１０ａ内の粘性剤が試料流体ストリーム１４４０ａ内の細胞の生存能を保持し、細胞が試料流体ストリーム１４４０ａから流れるシース液１４１０ａに伸びる際に、細胞の構造及び内容物を無傷のままにする一方で、撮像軸１４５０ａにて流体試料粒子のうちの少なくともいくつかにおける目標撮像状態を提供することに効果的となり得る。
【０２２６】
変位距離を使用して、画像捕捉デバイス１４６０ａが試料流れストリーム１４４０ａ上に焦点化される際に、画像捕捉デバイス１４６０ａは、撮像軸１４５０ａにて又は撮像軸１４５０ａに関連する画像捕捉部位にて、試料流れストリーム１４４０ａ内の粒子又は細胞の画像を取得することができる。いくつかの場合では、粒子は照射源又はランプ１４２６ａで照射され得る。試料流れストリーム１４４０ａの画像は、粒子が撮像軸１４５０ａに接近する際、粒子が撮像軸１４５０ａを横断する際、及び／又は粒子が流れて撮像軸１４５０ａから離れる際に得られ得る。
【０２２７】
図１４Ｂは、代替のフローセル構成の態様を描写し、ここにおいて撮像目標１４７０ｂは、フローセル１４３０ｂの表示ポート窓１４８２ｂに対して固定された位置を有する。例えば、撮像目標１４７０ｂは、窓１４８２ｂの内部又はその表面上に埋め込まれ得る。ここに示すように、撮像方法は、フローセル１４３０ｂに対して固定された位置を有する撮像目標１４７０ｂを撮像することによって、画像捕捉デバイス１４６０ｂを焦点化することを含み得る。更に、画像捕捉デバイス１４６０ｂは、変位距離を使用して、試料流れストリーム１４４０ｂ上に焦点化し得る。例えば、変位距離は、試料流れストリーム１４４０ｂと撮像目標１４７０ｂとの間の距離Ｄに対応し得る。
【０２２８】
図１４Ｃは、フローセル１４３０ｃの断面端面図を描写し、自動焦点又は撮像目標の、様々な代替配置位置を示す。例えば、撮像目標１４７２ｃはフローセル１４３０ｃの表示ポート窓１４８２ｃに位置付けられ得る。任意で、撮像目標１４７４ｃは、フローセル１４３０ｃの照射窓１４８０ｃに位置付けられ得る。更に任意で、撮像目標１４７６ｃは、側方フローセル壁（例えば、１４３２ｃ及び／又は１４３４ｃ）内に位置付けられ得る。画像捕捉デバイス１４６０ｃは、変位距離を使用して、シース液１４１０ｃ内に包まれる試料流れストリーム１４４０ｃ上に焦点化し得る。いくつかの実施形態では、変位距離は、試料流れストリーム１４４０ｃ（又は流れストリーム１４４０ｃによって画定される中央面１４４１ｃ）と表示ポート窓撮像目標１４７２ｃとの間の、撮像軸１４５０ｃに沿う距離Ｄ１に、対応し得る又はそれによって画定され得る。いくつかの実施形態では、変位距離は、試料流れストリーム１４４０ａ（又は中央面１４４１ｃ）と照射窓撮像目標１４７６ｃとの間の、撮像軸に沿う距離Ｄ２に、対応し得る又はそれによって画定され得る。いくつかの実施形態では、変位距離は、試料流れストリーム１４４０ａ（又は中央面１４４１ｃ）とフローセル側方壁撮像目標１４７４ｃとの間の、撮像軸に沿う距離Ｄ３に、対応し得る又はそれによって画定され得る。いくつかの場合では、距離Ｄ３は、ゼロより大きい値を有する。いくつかの場合では、距離Ｄ３はゼロの値を有する。つまり、試料流れストリーム１４４０ａ（又は中央面１４４１ｃ）が撮像目標１４７４ｃと同一平面上にある。いくつかの場合では、距離Ｄ１、距離Ｄ２、又は距離Ｄ３に基づいて計算されない変位距離を画定することが可能である。例えば、変位距離は、フローセル又は形態分析器製造者によって提供される、既定の数又は値であり得る。
【０２２９】
いくつかの実施形態に従い、試料流れストリーム１４４０ｃは、撮像軸にて約２μｍ〜約１０μｍの範囲内の厚さＴ１を有し得る。いくつかの場合では、流路又はシース液１４１０ｃは、撮像軸にて約１５０μｍの厚さＴ２を有し得る。ここに示すように、撮像目標１４７２ｃは、試料流れストリーム１４４０ｃと画像捕捉デバイス１４６０ｃとの間に配設される、表示ポート窓１４８２ｃ上に位置付けられ得る。いくつかの場合では、撮像目標（例えば、１４７４ｃ）は、照射窓１４８０ｃと表示ポート窓１４８２ｃとの間に位置付けられ得る。本明細書の他の箇所に記載されるように、焦点画像を取得するプロセスは、変位距離を使用して、画像捕捉デバイス１４６０ｃとフローセル１４３０ｃとの間の距離を調節することを含み得る。いくつかの場合では、本明細書の他の箇所で記載されるように、焦点画像を取得するプロセスは、変位距離を使用して、画像捕捉デバイス１４６０ｃの焦点距離を調節することを含み得る。いくつかの場合では、焦点画像を取得するプロセスは、画像捕捉デバイス１４６０ｃとフローセル１４３０ｃとの間の距離を調節することを含み得、距離を調節するプロセスは、フローセル１４３０ｃを、例えば、画像捕捉デバイス１４６０ｃにより近い位置に、又は画像捕捉デバイス１４６０ｃからより遠い位置に、移動させることを含む。
【０２３０】
図１４Ｄに描写するように、画像捕捉デバイス１４６０ｄの第１の焦点距離は、画像捕捉デバイス１４６０ｄと撮像目標１４７０ｄとの間の距離Ｄ１（例えば、撮像軸１４５０ｄに沿う）に対応し得、画像捕捉デバイス１４６０ｄの第２の焦点距離は、画像捕捉デバイス１４６０ｄと試料流れストリーム１４４０ｄ（又は試料流れストリームによって画定される中央面）との間の距離Ｄ２（例えば、撮像軸１４５０ｄに沿う）に対応し得る。いくつかの場合では、撮像目標は、例えば、図１４Ｃに描写するように、フローセル内の別の位置に位置付けられ得る。いくつかの実施形態に従い、変位距離は、第１の焦点距離（又は距離Ｄ１）と第２の焦点距離（又は距離Ｄ２）との間の距離差異に対応し得る。画像捕捉デバイス１４６０ｄは、この変位距離（例えば、Ｄ１とＤ２との間の差異）を使用して、試料流れストリーム１４４０ｄ上に焦点化し得る。
【０２３１】
図１５は、自動焦点パターン（又は撮像目標）の実施形態を示す上面図を描写し、これは、例えば、照射オリフィス若しくは窓上、表示ポータル若しくは窓上、又は別のフローセル位置にて位置付けられ得る。目標は、高光学解像度撮像デバイスの距離又は位置が、リボン形状の試料ストリームに対して移動するにつれて、薄くなる。図９〜１２Ｂに描写するように、撮像又は焦点目標（自動焦点パターン）は、試料が現れるはずである表示区域の周辺部上にあり得る。戻って図１５を参照すると、焦点目標は、視野内にある造影形状によって画定され得るということもまた可能である、ということが分かり得る。
【０２３２】
撮像デバイスが、自動焦点パターン（目標）上に焦点化しているとき（図１５の板Ｂ）、デバイスによって撮像される形状は、良好に画定されており、本明細書に記載されるように、すなわち、形状が、矢印の頭として示されるライン等の、形状をまたぐラインに沿って位置付けられる、隣接するピクセル間の振幅において最高の造影を生成する、目標と撮像デバイスとの間の距離を探すために、自動焦点化に使用され得る。板Ｂにおいて描写される焦点構成は、図１６Ａに描写される類似焦点構成に対応する。図１６Ａに示されるように、画像捕捉デバイスの焦点面は、自動焦点目標と整列し、よって画像捕捉デバイスは、自動焦点目標の鮮明な画像を取得するための位置にある。
【０２３３】
戻って図１５を参照すると、例えば、対物レンズの動作距離及び対物レンズとその焦点面との間の距離を調節することによって、作動位置（例えば、撮像デバイスの焦点面）が自動焦点パターンから離れて移動するとき（板Ａ及びＣに図示、図１５の自動焦点パターンの左及び右に図示）、焦点目標形状は、ここで焦点から外れ、高光学解像度撮像デバイスがリボン形状の試料ストリーム上に焦点化した位置にて、焦点目標形状はもはや認識可能ではなくなる（図１５の板Ｄを参照）。板Ｄに描写される焦点構成は、図１６Ｂに描写する類似焦点構成に対応し得る。図１６Ｂに示すように、画像捕捉デバイスの焦点面は、試料流体ストリームと整列し、よって画像捕捉デバイスは試料流れストリーム内の粒子の鮮明な画像を取得するための位置にある。図１６Ａの焦点面は、図１６Ｂの焦点面から距離Ｄで分離する。図１６Ｂに示すように、画像捕捉デバイスを距離Ｄで移動させることによって、焦点面を距離Ｄで移動させ、よって焦点面を自動焦点目標から試料流れストリームに移動させることもまた可能になる。いくつかの場合では、画像捕捉デバイスの焦点距離を内部で調節することにより、画像捕捉デバイスをフローセルに対して固定された位置に維持する一方で、焦点面を自動焦点目標から試料流れストリームに移動させることができる。いくつかの場合では、フローセルに対する画像捕捉デバイスの位置を調節することとの組み合わせで、画像捕捉デバイスの焦点距離を内部で調節することにより、焦点面を自動焦点目標から試料流れストリームに移動させることができる。自動焦点形状は、照射オープニング又は窓上、又はそこを通して高光学解像度撮像デバイスが方向付けられる表示ポート若しくは窓の前面又は背面上、又は光電池に取り付けられた備品にて等の、表示内でかつフローセルに対して固定された任意の位置にて提供され得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態に従い、高光学解像度撮像デバイスが変位距離にわたって移動し、自動焦点パターンが焦点から外れるときに、自動焦点パターンとは対照的に焦点化して見える特徴は、血球である。図１５の実施形態では、例えば、自動焦点パターンは、視野における形状によって画定される。形状は、限られた大きさの相対的に薄く離散的な形態であり、したがって、変位距離で移動した後に、該形態は、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化したとき、デジタル画像において実質的に非可視的となる。典型的な変位距離は、例えば、検尿撮像適用のために寸法したフローセル内で５０〜１００μｍであり得る。いくつかの実施形態では、自動焦点特徴は、高光学解像度撮像デバイスを、最適焦点距離の１μｍ内に維持する。
【０２３５】
結果的に、図１５において記載される特徴は、変位距離を決定する例示的な技術を提供する。例えば、変位距離の決定方法は、フローセル内で試験試料流れストリームを形成するために、試験流体試料をシース液に注入すること、及び画像捕捉デバイスを使用して撮像目標の第１の焦点画像を取得することを含む、自動焦点化プロセスを含んでよい。第１の焦点画像は、図１５の板Ｂに対応し得、ここにおいて焦点化した撮像目標及び画像捕捉デバイスは第１の焦点距離を画定する。ここに描写するように、画像捕捉デバイスの焦点面又は動作距離／位置は、撮像目標に位置付けられる。自動焦点化プロセスはまた、画像捕捉デバイスを使用して、試験試料流れストリームの第２の焦点化画像を取得することも含み得る。第２の焦点画像は、図１５の板Ｄに対応し得、ここにおいて焦点化した試験試料流れストリーム及び画像捕捉デバイスは、第２の焦点距離を画定する。ここに描写するように、画像捕捉デバイスの焦点面又は動作距離／位置は、撮像目標に位置付けられる。自動焦点化プロセスは、第１の焦点距離と第２の焦点距離との間の差異を計算することによって、変位距離を得ることを更に含んでよい。いくつかの場合では試験流体試料は、尿試料と同一であり、試験試料流れストリームは、試料流れストリームと同一である。いくつかの場合では、自動焦点化プロセスは、画像捕捉デバイスに関連する焦点面を確立し、焦点面は画像捕捉デバイスに対して定常に残る。いくつかの場合では、画像捕捉デバイスの自動焦点化のプロセスは、複数の焦点位置の中から最適焦点位置を決定することを含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態に従い、画像捕捉デバイスは、温度データを使用せずに、試料流れストリーム上に焦点化し得る。例えば、画像捕捉デバイスを試料流れストリーム上に焦点化するプロセスは、画像捕捉デバイスの温度から独立して行われ得る。いくつかの場合では、撮像目標は、画像捕捉デバイスの撮像軸を、試料流れストリームに対して位置付けることにおける使用のための目盛（例えば、図１２Ｂに描写する通り）を含み得る。いくつかの場合では、撮像目標は撮像軸に対して整列する絞りを含み、よって撮像した粒子は、絞りによって画定される開口部内に配設され、絞りの１つ以上の縁部分は自動焦点化の間に撮像される。
【０２３７】
例示的な実施形態では、自動焦点化技術は、フローセルを試料ストリームの最適焦点位置から±１μｍ以内に位置付けることができる。いくつかの場合では、実施形態は、別個の焦点化液体若しくは溶液、又は任意の使用者操作を必要とすることなく、撮像システムを自動的に焦点化する自動焦点技術を包含する。例示的な自動焦点化技術は、撮像デバイス対物レンズとフローセルとの間の距離における揺らぎをもたらす、ドリフト又は熱膨張等の、最適以下の焦点化性能の機械的原因もまた説明することができる。いくつかの場合では、フローセル内の試料流れの位置は非常に安定でかつ温度非依存性であり得るということが観察された。したがって、例示的な撮像技術は、フローセル内で撮像目標上に焦点化すること、及び試料ストリーム上の最適焦点に到達するために固定されたオフセットを使用することを含み得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態に従い、撮像システム上で使用される顕微鏡対物レンズは、０．７５の開口数を有し、理論上±０．５μｍの被写界深度（ＤＯＦ）をもたらす。特定の実験試験では、良好な画像の質は、最適焦点面から１．２５μｍにて得ることができるということが観察された。実践的又は実験的被写界深度は、理論上の被写界深度とは異なり得るということもまた観察された。例えば、特定の実験では、被写界深度は約２．５〜３μｍであるということが観察された。特定の実験的研究に基づき、フローセルを±１．２５μｍ以内に位置付けるための自動焦点性能は、良好な画像の質を保証することができるということが判定された。いくつかの実施形態では、自動焦点化システムは、フローセルを試料ストリームの最適焦点位置から±１μｍ以内に位置付けるように動作することができる。特定の実験では、本明細書に開示する自動焦点化技術が、フローセル内で、目標を０．３μｍ未満の標準偏差で、繰り返し位置付け得るということが観察された。いくつかの場合では、実験自動焦点化システムは、実証された優れた再現可能性（標準偏差≦０．２３μｍ）を実行させ、試料ストリームの焦点位置を、±１μｍ以内の位置公差である、最適計量位置から＜０．６μｍ以内に決定することができた。様々な温度条件での、追加の自動焦点化実験の実行は、優れた位置付け性能（例えば、最適焦点位置に対して、必要とされる±１μｍ公差以内のフローセルの位置付け）もまた示した。自動化分析器システムにおけるこの程度の正確性は、本明細書の他の箇所に開示する薄いリボン流れストリーム内を流れる尿試料からの粒子の、質の高い画像を一定してかつ確実に得ることに、標準実験室条件に対応する動作温度範囲にわたって、よく適している。
【０２３９】
別途明記しない限り、本開示内での「粒子」（１つ又は複数）への言及は、流体内に分散した任意の離散的又は有形物体を包含するということが理解され得る。本明細書で使用される場合、「粒子」は、生体液内の、全ての（例えば、画像及び／又は他の測定可能なパラメータによって）測定可能でかつ検出可能な成分を含み得る。該粒子は任意の物質、任意の形状、及び任意のサイズである。特定の実施形態では、粒子は細胞を含み得る。粒子の例は、血球、胎児細胞、上皮、幹細胞、腫瘍細胞、若しくは細菌、寄生虫、又は前述のいずれかの断片若しくは生体液内の他の断片を含む細胞を含むが、これらに限定されない。血球は、任意の血球であってよく、生体液内に潜在的に存在する、任意の正常又は異常、成熟又は未熟細胞、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、血小板（ＰＬＴ）、及び他の細胞を含む。該メンバは、未熟又は異常細胞もまた含む。未熟ＷＢＣは、後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球を含み得る。成熟ＲＢＣに加え、ＲＢＣのメンバは、有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）、正常又は異常ＲＢＣ、及び網状赤血球を含み得る。ＰＬＴは、「巨大」ＰＬＴ及びＰＬＴ凝集塊を含み得る。血球及び形成成分は、本開示の他の箇所に更に記載される。
【０２４０】
例示的な粒子は、生体液試料内の形成成分を含み得、例えば、球形及び非球形粒子を含む。特定の実施形態では、粒子は非球形成分を含み得る。非球形成分の画像投影は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において最大化され得る。特定の実施形態では、非球形粒子は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において整列する（流れの方向に実質的に平行な面に整列する）。いくつかの実施形態では、血小板、網状赤血球、有核ＲＢＣ、及びＷＢＣは、粒子として計数及び分析される。本明細書で使用される場合、例示的な白血球（ＷＢＣ）は、例えば、好中球；リンパ球；単球；好酸球；好塩基球；後骨髄球、骨髄球、前骨髄球、及び芽球を含む、未熟顆粒球；並びに異常白血球を含み得る。
【０２４１】
本明細書で使用される場合、検出可能でかつ測定可能な粒子パラメータは、例えば、大きさ、形状、対称性、輪郭、及び／又は他の特色の、視覚及び／又は非画像ベースの指数を含み得る。
【０２４２】
別の実施形態では、本開示は、例えば、本発明のキットを使用し、方法が例えば、１）視覚分析器において光で粒子を照射すること、２）ＰＩＯＡＬによって包まれる試料粒子のデジタル画像を取得すること、及び３）画像情報に基づいて試料を含有する粒子を分析することを含む、粒子を撮像するための方法に関する。他の実施形態では、該方法は、粒子を含有する試料を、処理した試料を照射する前に、粒子造影剤組成物に接触させることを更に含んでよい。
【０２４３】
一実施形態では、分析される粒子は、球形粒子、非球形粒子のうちの少なくとも１つ、又は両方を含む。別の実施形態では、粒子は少なくとも１つの球形粒子を含む。更に別の実施形態では、粒子は少なくとも１つの非球形粒子を含む。別の実施形態では、非球形粒子、又は非球形成分を有する粒子の画像投影は、流れの方向に実質的に平行な面において最大化する。粒子は、例えば、ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び／又は血小板であってよい。一実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも５０％は、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。別の態様では、フローセル内での本発明のＰＩＯＡＬの使用は、非球形粒子のうちの少なくとも９０％が流れの方向に実質的に平行な面において整列することを可能にする。
【０２４４】
一実施形態では、非球形粒子は赤血球を含む。本発明の別の態様では、球形粒子は白血球又は有核赤血球を含む。
【０２４５】
ＰＩＯＡＬによって包まれるリボン形状の試料ストリームの厚さよりも小さい細胞の流れは、流れの方向に平行なこれらの細胞の整列をもたらす。本開示の一実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも９２％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。更に別の実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも９０％は、流れの方向に実質的に平行な面において整列する。別の実施形態では、粒子のうちの少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は少なくとも９５％が実質的に、すなわち流れの方向に実質的に平行な面から２０度以内に、整列する。別の実施形態では、流れの方向に実質的に平行な面において整列する非球形及び／又は球形粒子の割合は、列挙した割合のうちの任意の２つの間の任意の範囲、例えば、少なくとも７５〜８５％、７５〜８０％、及び７５〜９２％等の他の範囲であってよい。
【０２４６】
ＷＢＣ等の、ＰＩＯＡＬによって包まれる試料内の、より大きい細胞の流れの結果である、流れの方向に平行な方向のせん断力は、核構造、細胞質構造、若しくは顆粒、又は他の細胞内成分若しくは構造の、流れの方向に平行な面のより近くへの、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好な位置付けをもたらす。
【０２４７】
本開示の一実施形態では、画像断面は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球を含むＷＢＣ、又は、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む未熟ＷＢＣ内の、差異的に着色した核構造、差異的に着色した細胞質構造、又は差異的に着色した顆粒のうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態では、球形及び／又は非球形粒子のうちの、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は少なくとも９５％が、高光学解像度撮像デバイスの焦点面又は被写界深度において、核構造、細胞質構造、又は顆粒を有する。
【０２４８】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、画像情報は粒子の画像断面である。いくつかの態様では、画像断面は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球を含むＷＢＣ、又は、芽球、前骨髄球、骨髄球、若しくは後骨髄球を含む未熟ＷＢＣ内の、差異的に着色した核構造、差異的に着色した細胞質構造、又は差異的に着色した顆粒のうちの少なくとも１つを含む。
【０２４９】
一実施形態では、本発明の方法は、自動化、画像ベースのＷＢＣ差異を得る際に有用である、フロー内の焦点化した粒子及び粒子内容物の高い割合を伴う、驚くべく高い質の細胞の画像、並びに被験者が、健康であるか又は疾患、病態、異常、若しくは感染症を有するか、あるいは、治療に対して反応性であるか又は非反応性であるかを、判定、診断、予後診断、予測、又はその診断を支持する際に有用な形態異常の自動化識別を提供する。
【０２５０】
別の態様では、本発明の組成物及び方法は、より正確な画像ベースの細胞分類及び副分類、並びに現在の分析器と比較して手動レビュー率を大幅に低減する減退を提供する。
【０２５１】
本明細書で使用される場合、粘性剤は、粘性剤又は粘性変性剤を含み得る。ＰＩＯＡＬ及び粘性剤が混合すると、ＰＩＯＡＬの粘性は粒子の整列を最大化するために変更され、又は、及び／若しくは増加するように、例示的な粘性剤／変性剤は、試料の粘性とは異なる特色的な粘性を有する。特定の実施形態では、リボン形状の試料ストリームとＰＩＯＡＬとの間の粘性差異及び／又は速度差異は、流れ内にある間に粒子上で作用するせん断力を導入し得、それによって不整列を低減し、及び／又は粒子を整列させる。
【０２５２】
本明細書で使用される場合、粒子造影剤組成物は、被験者からの試料内の粒子の分析のための視覚分析器における、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）との組み合わせでの使用に用いられ得る。例示的なＰＩＯＡＬは、例えば、被験者からの試料内の異なる種類の粒子の自動化認識の方法において有用である。
【０２５３】
別の態様では、画像が得られるとき、細胞は、ＰＩＯＡＬ内に包まれ得る。好適な例示的な細胞内小器官整列液体が、本明細書に記載される。
【０２５４】
一実施形態では、本開示は、視覚分析器における使用のためのＰＩＯＡＬに関する。特定の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、緩衝剤；ｐＨ調節剤；緩衝剤；粘性剤／変性剤；イオン強度変性剤；界面活性剤；キレート剤；及び／又は抗菌剤のうちの少なくとも１つを含み得る。
【０２５５】
一態様では、ＰＩＯＡＬは、２つ以上の粘性剤／変性剤を含んでよい。
【０２５６】
一態様では、本発明のＰＩＯＡＬは、約１〜約１０センチポアズの粘性を有し得る。一実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬは、粘性剤／変性剤を含み得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、最大１００％の粘性剤を含む。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、粘性剤及び／又は粘性変性剤は、約１〜約１０センチポアズの粘性に到達するために好適な、撮像システムにおける使用に適切な、光学的透明性を含む光学特色を伴う、任意の物質を含み得る。概して、粘性剤又は変性剤は、無毒性かつ生体適合性であり、細胞構造及び内容物を実質的に無傷のままにする。粘性剤及び／又は粘性変性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、水溶性ポリマー及び／又はデキストランのうちの少なくとも１つを含み得る。一態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、グリセロールであり得る。例えば、一態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、グリセロール誘導体であり得る。例えば、一態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）であり得る。例えば、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、エチレングリコールであり得る。例えば、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）であり得る。別の例としては、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ポリエチレングリコールであり得る。別の例としては、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、水溶性ポリマー又はデキストランであり得る。他の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、グリセロール、グリセロール誘導体；エチレングリコール；プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）；ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；ポリエチレングリコール；水溶性ポリマー又はデキストランのうちの２つ以上を含み得る。粘性剤／変性剤は、撮像システムにおける使用に適切な、光学的透明性を含む光学特色を伴う、約１〜約１０センチポアズの粘性を提供するために好適な、任意の薬剤を含み得る。
【０２５８】
本明細書で使用される場合、他の例示的な粘性剤／変性剤は、例えば、アカシア、トラガカント、アルギン酸、カラゲナン、ローカストビーンガム、グアーガム、キサンタンガム、アラビアガム、グアーガム、ゼラチン、セルロース、アルギン酸、デンプン、糖、デキストラン等の天然親水コロイド（及び誘導体）と、ゼラチンと、ブドウ糖、果糖等の糖（及び誘導体）と、ポリデキストロースと、デキストランと、ポリデキストランと、サッカリドと、ポリサッカリドと、グリセロール、メチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチ（ヘタスターチ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の半合成親水コロイド（及び誘導体）と、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び／又はＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）等の合成親水コロイド（及び誘導体）と、を含み得る。他の細胞適合性粘性剤／変性剤もまた、この目的に好適であると考えられる。
【０２５９】
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ＰＩＯＡＬの約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロールであり得る。例えば、一実施形態では、粘性剤／変性剤は、約５．０％〜約８．０％（ｖ／ｖ）の濃度でＰＩＯＡＬ内に存在し得る。別の態様では、粘性剤／変性剤は、約６．５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。一実施形態では、粘性剤／変性剤は、約６．５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロールである。
【０２６０】
更に別の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、約３０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロール粘性剤／変性剤を含み得る。
【０２６１】
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、約０．５〜約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在するＰＶＰであり得る。例えば、一実施形態では、粘性剤／変性剤ＰＶＰは、ＰＩＯＡＬ内で約１．０〜約１．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。一実施形態では、ＰＶＰは、約１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【０２６２】
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ＰＶＰ及びグリセロールであり得る。例えば、一実施形態では、グリセロールは、ＰＩＯＡＬ内に、約５％（ｖ／ｖ）の濃度で、約１％（ｗ／ｖ）のＰＶＰとの組み合わせで存在する。
【０２６３】
一実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬは、粒子を撮像するために視覚分析器において使用され得る。一態様では、視覚分析器は、対称性流路を伴うフローセル及び自動焦点構成要素を備える。
【０２６４】
グリセロール等の、粘性剤及び／又は粘性変性／調節剤が、ＰＩＯＡＬ内に含まれ得る。粘性剤又は粘性変性剤は、導入されると、ＰＩＯＡＬの粘性を所望の範囲に適切に調節し得る。ＰＩＯＡＬの粘性を十分に増加させ、流れ内の細胞の質の高い撮像を可能にするための好適な光学特色を有する、任意の好適な粘性剤が使用され得る。ＰＩＯＡＬは、細胞及び／又は細胞構造を、流れの方向に実質的に平行な単一面に整列させるために好適な粘性を有し得、それによって焦点化した粒子の内容物を部分的に増加させる。
【０２６５】
ＰＩＯＡＬは、本開示の任意の分析器と共に使用されてよい。
【０２６６】
本明細書で使用される場合、「グリセロール」という用語は、グリセロール及びグリセロールの誘導体（以降、グリセロール誘導体と称する）を包含する。グリセロール誘導体の例は、チオグリセロール、ポリグリセロール等を含む。ポリグリセロールの使用可能な例には、ジグリセロール、ポリグリセリン＃３１０（阪本薬品工業株式会社）、ポリグリセリン＃７５０（阪本薬品工業株式会社）、ポリグリセリン＃５００（阪本薬品工業株式会社）等が挙げられる。
【０２６７】
別の実施形態では、本開示のＰＩＯＡＬは、ｐＨ調節剤を更に含む。一態様では、ＰＩＯＡＬ及び／又は試料の最終ｐＨは、約６．０〜約８．０である。別の態様では、ＰＩＯＡＬ及び／又は試料の最終ｐＨは、約６．６〜約７．４である。一態様では、ＰＩＯＡＬの最終ｐＨは、調製した試料１２Ａ（図１Ｃを参照）と同じｐＨであり得る。
【０２６８】
例示的なｐＨ調節剤は、例えば、酸（例は有機酸及び無機酸を含む）、塩基（例はアルカリ金属及びアルカリ土類金属の有機塩基及び水酸化物を含む）を含み得る。例示的な有機酸は、酢酸、乳酸、ギ酸、クエン酸、シュウ酸、及び尿酸を含み得る。例示的な無機酸は、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、及び過塩素酸を含み得る。例示的な有機塩基は、例えば、ピリジン、メチルアミン、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ヒスチジン、ホスファゼン、及びカチオンの水酸化物を含み得る。アルカリ金属及びアルカリ土類金属の例示的な水酸化物は、例えば、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）、水酸化セシウム（ＣｓＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化ストロンチウム（Ｓｒ（ＯＨ）２）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、及び水酸化ルビジウム（ＲｂＯＨ）を含み得る。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、緩衝剤を使用して、ＰＩＯＡＬのｐＨは、好ましくは約６．０〜約８．５に、より好ましくは約７．０〜約８．０に維持される。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬのｐＨを調節するために、緩衝剤をＰＩＯＡＬに追加することが好ましい。薬剤（１つ又は複数）がＰＩＯＡＬのｐＨを適切な範囲に調節する限り、任意の好適な緩衝剤（１つ又は複数）が使用され得る。かかる緩衝剤の例には、ＰＢＳ、Ｇｏｏｄの緩衝剤（特に、トリス緩衝剤、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、トリシン、ビシン、ＴＡＰＳ等）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ベロナールのナトリウム−ＨＣｌ、コリジン−ＨＣｌ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−マレイン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌが挙げられ、これらは単独で又は組み合わせで使用され得る。
【０２７０】
別の実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬは、結果として生じる製剤のイオン強度を調節するためにイオン強度変性剤を含む。例示的なイオン強度変性剤は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＨＣＯ−３、硫酸、ピロ硫酸、リン酸、ピロリン酸（例えば、ピロリン酸カリウム）、クエン酸、カコジル酸、又は他の好適な塩を含み得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは等張性であり得る。
【０２７１】
界面活性剤がＰＩＯＡＬに追加されてよい。界面活性剤の種類は、それらがＰＩＯＡＬの他の構成要素と適合性であり、リボン形状の試料ストリーム及び試料内の粒子と適合性である限り、特に制限されない。界面活性剤は、例えば、カチオン性、アニオン性、非イオン性、及び両性の界面活性剤を含み得る。例示的な界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル型界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型界面活性剤（例えば、ＮＩＳＳＡＮ  ＮＯＮＩＯＮ  ＮＳ−２４０（ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル型界面活性剤（例えば、ＲＨＥＯＤＯＬ  ＴＷ−０１２０（花王株式会社、登録商標））、ポリオールコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１２７、Ｆ−１２３、Ｆ−１０９、Ｆ−８７、Ｆ−８６、Ｆ−６８、Ｔ−１１０７、Ｔ−１１０２（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、登録商標））、ＭＥＧＡ−８、スクロースモノカプレート、デオキシＢＩＧＣＨＡＰ、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯを含み得、同様のものが使用され得る。他の界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００及びＴｗｅｅｎ  ２０を試料及びリボン形状の試料ストリームに適合性の濃度で含み得る。
【０２７２】
ＰＩＯＡＬ内の界面活性剤の濃度は、好適には、試料内の細胞等の粒子が影響されない及び／又は実質的に無傷のまま残る、濃度レベルである。具体的には、濃度は、好適には５〜５０００ｍｇ／Ｌ、より好適には１００〜３０００ｍｇ／Ｌである。
【０２７３】
試料内に含有される粒子が分析器で分析されるとき、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、炭酸カルシウム等の非晶質塩が試料内で沈降し得る。これらの非晶質塩を溶解するために、キレート剤がＰＩＯＡＬに追加され得る。キレート剤の追加は、非晶質塩の溶解だけでなく、ＰＩＯＡＬの酸化の抑止もまた可能にする。キレート剤の使用可能な例には、ＥＤＴＡ塩、ＣｙＤＴＡ、ＤＨＥＧ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＥＤＤＡ、ＥＤＤＰ、ＧＥＤＴＡ、ＨＤＴＡ、ＨＩＤＡ、メチル−ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＮＴＰ、ＮＴＰＯ、ＥＤＤＰＯ等が挙げられる。ＰＩＯＡＬ内のキレート剤の濃度は、好適には０．０５〜５ｇ／Ｌの範囲内である。
【０２７４】
別の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、１つ以上の抗菌剤を更に含み得る。いくつかの態様では、抗菌剤は、例えば、殺真菌力を有する物質（抗真菌剤）及び／又は殺菌力を有する物質（殺菌剤）であり得る。特定の実施形態では、好適な抗菌剤は、例えば、パラべン、イソチアゾリノン、フェノール樹脂、酸性防腐剤、ハロゲン化化合物、クウォーターニア（quarternia）、及びアルコールを含み得る。例示的なパラベンは、パラベン及びパラベン塩を含み得る。例示的なイソチアゾリノンは、メチルクロロイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、ベンゾイソチアゾリノンＰｒｏＣｌｉｎ  １５０、ＰｒｏＣｌｉｎ  ２００、ＰｒｏＣｌｉｎ  ３００、及びＰｒｏＣｌｉｎ  ９５０を含み得る。例示的なフェノール樹脂の種類は、フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、及びフェネチルアルコールを含み得る。例示的な酸性防腐剤は、デヒドロ酢酸、安息香酸、ソルビン酸、サリチル酸、ギ酸、プロピオン酸を含み得る。例示的なハロゲン化化合物は、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１、３−ジオール、クロロアセトアミド、クロロブタノール、クロロキシレノール、クロルフェネシン、ジクロロベンジルアルコール、ヨードプロピニルブチルカルバメート、メチルジブロモグルタロニトリルを含み得る。例示的なクウェターニア（quarternia）は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、ヘキサミジンジイセチオネート、及びポリアミノプロピルビグアニドを含み得る。例示的なアルコールは、エチルアルコール及びイソプロピルアルコールを含み得る。その例としては、トリアジン抗菌剤、チアゾール殺菌剤（例えば、ベンゾイソチアゾロン等）、ピリチオン、ピリジン殺菌剤（例えば、１−ヒドロキシピリジン−２−チオナトリウム等）、２−フェノキシエタノール等が挙げられる。具体的には、Ｐｒｏｘｅｌ  ＧＸＬ（Ａｖｅｃｉａ）、ＴＯＭＩＣＩＤＥ  Ｓ（ＡＰＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等が使用され得る。殺菌及び／又は殺真菌剤は、ＰＩＯＡＬの安定性の改善に役立つ。
【０２７５】
一実施形態では、抗菌剤の濃度は、０．０１％〜０．５％（ｗ／ｖ）であり得る。該濃度は、０．０３〜０．０５％（ｗ／ｖ）であり得る。
【０２７６】
実施形態におけるＰＩＯＡＬを伴う、分析器を使用した分析を受ける試料は、特に制限されない。生体から得られる試料（生体試料）が通常使用される。代替的に、これらの試料は、使用のために、希釈、精製、造影剤との接触等がなされ得る。具体的に、かかる試料の例としては、血液、精液、脳脊髄液等が挙げられ得る。試料は、組織試料に由来する粒子懸濁剤もまた含み得る実施形態におけるＰＩＯＡＬは、粒子（赤血球、白血球、細菌等）が分析されるときに好適に使用される。
【０２７７】
本発明のＰＩＯＡＬは、粒子を撮像する視覚分析器において使用され得る。一態様では、視覚分析器は、好都合なリボン形状の試料ストリームの厚さ等の、既定の寸法特色を伴う、リボン形状の試料ストリームの流れを維持することができるフローセルを備える。いくつかの実施形態では、フローセルは対称性流路を有し得、自動焦点構成要素との組み合わせで使用され得る。
【０２７８】
本開示は、１）試料を粒子造影剤組成物と接触させること、２）調製した粒子を照射すること、３）ＰＩＯＡＬ内に包まれたリボン形状の試料ストリーム内の粒子のデジタル画像を取得すること、及び４）粒子を分類又は副分類するために画像情報を分析することを含む、粒子を撮像する方法に関する。いくつかの実施形態では、該粒子は本明細書に開示する任意の粒子のうちの少なくとも１つであり得、粒子画像情報に基づいて計数及び分析され得る。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、視覚分析器は対称性又は非対称性の流路及び自動焦点構成要素を伴うフローセルを備える。
【０２８０】
全体的な態様では、例示的なＰＩＯＡＬ及びその使用方法は、研究及び／又は医療実験室で見られる、自動化分析器との組み合わせで用いられると有用である。例示的な自動化分析器は、例えば、ヒト体液試料を含む、多数の生体試料内の、異なる形成成分及び／又は他の特色を、最小限のヒトの補助を伴って迅速に測定するように設計された器具である。例示的な自動化分析器は、例えば、検尿分析器を含み得る。例示的な分析器は、試料を一回で、数回に分けて、又は連続的に処理することができる。
【０２８１】
一態様では、例示的な分析器／システムは、１つ以上の選択基準を満たす複数の粒子を検出するように、及びその粒子計数を提供するように構成される自動化粒子計数器を備え、ここにおいて選択基準は該粒子内の少なくとも２つの分類のメンバを包含する。計数器の構成要素を含み得るプロセッサを備え得る分析器は、該少なくとも２つの分類の粒子を区別するようにプログラム化される。それぞれの粒子の分布は、該分析器を使用して判定される。該プロセッサは、該少なくとも２つの分類及び／又は副分類のうちの少なくとも１つのメンバの粒子計数を補正するために、該分布を使用する。いくつかの実施形態では、粒子計数器は、容積、大きさ、形状、及び／又は他の基準に基づく、既定の範囲に基づいて、粒子の該少なくとも１つの分類及び／又は副分類の粒子計数を提供するように構成される、少なくとも１つのチャネルを備える。例えば、該少なくとも１つの分類及び／又は副分類のメンバは、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、巨大血小板（ＰＬＴ）、及び有核赤血球（ＮＲＢＣ）の副分類からなる群から選択される少なくとも１種類の粒子を含む。粒子計数器上で、類似する大きさ又は他の測定される特色により、巨大ＰＬＴ及びＮＲＢＣ等の細胞は、ＷＢＣとして計数されることがある。本明細書に記載されるように装置を操作することにより、巨大ＰＬＴ及びＮＲＢＣの粒子計数又は濃度は、正確に測定され得る。
【０２８２】
一態様では、本開示の組成物及び方法は、流れ内の細胞の驚くべく高い質の画像を提供する。一態様では、視覚分析器が、自動化した画像ベースの尿沈渣粒子計数を提供するために、本開示の方法において使用され得る。特定の実施形態では、本開示の方法は、被験者が健康であるか又は疾患、病態、異常、若しくは感染症を有するかの、判定、判定、診断、予後診断、予測、及び／又は診断の支持のための、並びに／あるいは、治療に反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察ための、形態異常を含む視覚特質の自動化識別に関する。用途は、尿試料等の流体試料内の細胞の、特に分類又は副分類に従う、分類、副分類、及び計数を含む。粒子の追加の種類及び／又は他の流体試料内の粒子の計数のための他の類似する使用もまた企図される。本発明のシステム、組成物、及び方法は、リアルタイムの分類及び副分類、並びに任意の好適な自動化粒子認識アルゴリズムを使用する画像の表示に使用され得る。それぞれの試料について捕捉された画像は、後日に表示するために保存され得る。
【０２８３】
別の態様では、本発明の分析器、組成物、及び方法は、驚くべくことに、より正確な画像ベースの細胞分類及び副分類、並びに、現在の自動化した画像ベースの分析器を使用するときの手動レビュー率と比較して、手動のレビュー率を低減する減退を提供する。該システム、組成物、及び方法は、初期手動レビュー率を低減し、手動レビューを器具上で行うことを可能にする。更に、本開示のシステム、組成物、及び方法は、手動のレビューを要求することで、自動化分析の間に減退した試料の割合を低減する。
【０２８４】
結果的に、いくつかの実施形態では、本開示は、粒子、例えば、尿内の粒子を含有する、試料の分析のための、分析器及び方法を提供する。本開示に従い、視覚分析器が液体内で懸濁された粒子を含む試料の画像を取得するために、提供される。いくつかの実施形態では、視覚分析器はフローセル及び自動焦点構成要素を備え、ここにおいて対称の粒子を含有する液体試料は、そこを通して対物レンズに結合するカメラが粒子のデジタル画像を捕捉する表示ポートを有する、フローセルを通して流される。フローセルは、希釈された及び／又は希釈されていない尿試料等の試料流体の供給源に、並びに透明なシース液又は粒子及び／若しくは細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）の供給源に結合される。
【０２８５】
一実施形態では、分析器は、少なくとも１つの検出範囲を有する粒子計数器並びに分析器及びプロセッサもまた備える。分析器及びプロセッサは、試料内の正確な粒子計数及び／又は濃度を分類、副分類、及び判定するために情報を提供するように構成される。
【０２８６】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される、粒子の画像ベースの分析において使用され得る、ＰＩＯＡＬに関する。尿試料内の粒子分類及び／又は副分類係数は、本開示において、分析され得る試料の種類の非制限的例として使用される。いくつかの実施形態では、試料内に存在する細胞は、細菌又は真菌細胞、並びに白血球又は赤血球を含み得る。いくつかの実施形態では、組織又は吸引液から得られる粒子懸濁剤が分析され得る。
【０２８７】
尿試料内の尿沈渣粒子の弁別は、本内容が特によく適している例示的な用途である。試料は、自動化技術によって調製され、リボン形状の試料ストリームとして高光学解像度撮像デバイスに提供され、試料が視野を横切って流れる間に周期的に撮像される。粒子（尿沈渣粒子等）の画像は、細胞又は粒子を特定するために、完全に自動的に又はわずかなヒトによる補助を伴い、ピクセル画像データをプログラム化した処理技術を使用して、互いから区別、分類、副分類、及び計数することができる。異常又は臨界特徴の場合に備えて保存され得利用可能にされ得る粒子画像に加え、出力データは、記録された試料画像において区別された細胞又は粒子の、それぞれの特定の分類及び／又は副分類の発生の計数を含む。それぞれの画像において見られる、異なる粒子の計数は、更に処理され得、例えば、全体の試料内のそれぞれの区別された分類及び／又は副分類の細胞の、正確で統計的に有意な相応比率を蓄積するために使用される。視覚的弁別に使用される試料は、高度に希釈され得るが、それぞれの分類及び／又は副分類における細胞の割合は、希釈した試料の分布において、特に多数の画像が処理された後で表され得る。本明細書で使用される場合、粒子／細胞の識別のための画像ベース（例えば、視覚）の情報の使用は、２００ｎｍ〜１０ｍｍまでの紫外線、可視赤外のスペクトル範囲を覆う。
【０２８８】
いくつかの態様では、試料は、自動化様式で提供され、撮像され、及び分析される。尿試料の場合では、試料は水又は生理食塩水溶液で実質的に希釈され得、未希釈又は希釈が少ない試料内の、ある細胞及び／又は粒子の表示が他の細胞及び／又は粒子によって隠され得る程度を低減する。該細胞は、例えば、細胞膜を透過性にするために透過化剤を、並びに、細胞内の細胞質等の特徴内に接着及びそれを露呈するために組織着色剤を、使用することで、いくつかの細胞態様の造影を増強する薬剤で処理され得る。いくつかの実施形態では、粒子の計数及び特徴付け並びに副集合計数、白血球、上皮細胞、及び／又は細菌を含む粒子の特徴付け及び分析のために試料の部分標本を着色することが望ましいことがある。
【０２８９】
試料調製分析器及び試料希釈の方法の詳細は、１つ以上のプログラム可能なコントローラによって操作される精密ポンプ及び弁を使用して達成され、本開示の中心ではない。例は、プログラム可能なコントローラに関する、米国特許第７，３１９，９０７号等の、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．に与えられた特許において見ることができる。同様に、Ｂ０２１によって着色されたときの色等の、それらの属性によって特定の細胞間を区別するための技術は、米国特許第５，４３６，９７８号に見られる。これらの特許の開示は、参照によりここに組み込まれる。
【０２９０】
細胞等の粒子が分類及び副分類される、容量、速度、及び効率性を促進することには、データ処理システムによる自動化分析に、尿粒子の鮮明で質の高い画像を提供することが好都合である。本開示に従い、調製試料ストリームは、フローセルの対向壁間に安定した位置を有する薄いリボン内に配置される。試料ストリームの位置付け及びリボン形状の試料ストリームへのその平坦化は、試料流体とは粘性が異なり対称性流れチャネルを通って流される、フローセルに導入されるＰＩＯＡＬの、層の間の流れによって達成され得る。
【０２９１】
ＰＩＯＡＬ及び試料は、試料流体が薄いリボン形状に平坦化するように、試料のフローセルへの導入の点にて、協調する粘性及び流量を有する。リボン形状の試料ストリームは、ＰＩＯＡＬと共に運ばれ、対物レンズ及び光源がリボン形状の試料ストリームの表示を可能にするように配置される、表示ポートの前を通る。試料流体は、例えば、ＰＩＯＡＬの流路が対称的に狭細化する点にて注入されることにより、導入される。結果として、試料流体ストリームは、薄いリボンに平坦化し伸長する。本開示のＰＩＯＡＬは、本開示の任意の視覚分析器と共にシース液として使用されてよい。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、フローセルの端に導入され、試料流体を排出部に向かって運ぶ。
【０２９２】
表示帯域におけるリボン形状の試料ストリームの寸法は、ＰＩＯＡＬ流路の幾何学的厚さ減少、並びに試料流体及びＰＩＯＡＬの差異線速度によって影響され、リボン形状の試料ストリームの厚さ減少及び伸張をもたらす。試料のＰＩＯＡＬに対する初期線速度比率は、０．５〜５．０の範囲であり得る。ＰＩＯＡＬ流路断面は、約５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、１００：１、１０５：１、１１０：１、１１５：１、１２５：１、１３０：１、１４０：１、１５０：１、１６０：１、１７０：１、１８０：１、１９０：１、又は２００：１の係数での流路の断面積の低減に到達するために、深さを低減することにより薄くなり得る。一実施形態では、この幾何学的厚さ減少は、４０：１である。考慮される因子は、フローセルを通る遷移時間、試料処理能力の所望の比率、粒子のサイズに同等なリボン形状の試料ストリーム厚さの達成、粒子及び小器官の整列を得ること、焦点化した粒子の内容物の達成、動作制限内での圧力、流れ、及び粘性の均衡、リボン形状の試料ストリームの厚さを最適化すること、所望の線速度を得ること、製造能力の考慮、必要とされる試料及びＰＩＯＡＬの容積である。
【０２９３】
カニューレ及び断面平坦化の長さ及び容積は、試料流れ不安定の時間を低減し、それによって処理能力を増加させるために選択され得る。いくつかの実施形態では、流れ不安定の時間は、約３、２．７５、２．５、２．２５、２、１．７５、１．５  １．２５、又は約１秒未満であり得る。より小さいカニューレ容積は、試料測定間にカニューレを洗浄するために必要な時間及び希釈剤の容積もまた低減し得る。いくつかの実施形態では、フローセルを通る遷移時間は、１、２、３、若しくは４秒、又はこれらの時間のうちの任意の２つの間内の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、遷移時間は、４、３、又は２秒未満であり得る。
【０２９４】
試料流体及びＰＩＯＡＬの粘性及び流量、並びにフローセルの輪郭は、ＰＩＯＡＬの流れが試料の流れを、信頼可能な位置での表示帯域を通して、一定して平坦なリボンに、平坦化及び伸張させるように準備される。試料流体ストリームは、流体流れ厚さ内で約２〜３μｍに圧縮され得る。いくつかの尿細胞の種類は、ストリームの厚さよりも大きい直径を有する。流れの方向に平行な方向のせん断力は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面における撮像条件下での粒子の画像投影の増加をもたらし、並びに／又は、細胞内構造、小器官、若しくはローブを、流れの方向に実質的に平行になるように、位置付け、再位置付け、及び／若しくはより良好に位置付けさせる。高光学解像度撮像デバイス被写界深度は、最大７μｍ、例えば、１〜４μｍである。
【０２９５】
共に運ばれるリボン形状の試料ストリームを伴う、ＰＩＯＡＬの流れの厚さは、そこを通して対物レンズが方向付けられる、表示ポートの正面の表示帯域を通して一定である。対物レンズは、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの対物構成要素であり得る。リボン形状の試料ストリームは、フローセル内の既知でかつ再現可能な、例えば、フローセルの２つの壁から、既知でかつ再現可能な距離にある位置にて、表示帯域をまたがる経路を追随し、下流で排出される。
【０２９６】
試料内の粒子からの光学情報は、リボン形状の試料ストリームが表示ポートの前の表示帯域を通って運ばれるときに、分析器内の検出セクションによって検出され、それによって試料内に含有される粒子／細胞からデータを生成する。本分析器の使用は、試料内に含有される細胞及び／又は粒子の捕捉、処理、分類及び副分類、並びに計数を可能にする。ＰＩＯＡＬ液体は、粘性変性剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、抗菌剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、及び／又はキレート剤の追加により調製され得る。本開示における分析器の例示的な機能性構成要素及び／又は特徴は、例えば、画像分析、試料着色処理、画像処理、並びに／又は粒子画像識別、計数、並びに／又は分類及び副分類からのデータを、取得する及び／若しくは処理する能力を含み得る。
【０２９７】
一実施形態では、本開示は、ＰＩＯＡＬ内の好適な量の粘性剤の追加が、フローセル内の粒子／細胞整列を有意に改善し、焦点化した細胞又は細胞成分のより高い割合、並びに流れ内の細胞及び／又は粒子のより高い質の画像をもたらすという、驚くべきかつ予想外の発見に基づいた。粘性剤の追加は、ＲＢＣ等の細胞上のせん断力を増加させ、流れの方向に実質的に平行な面における細胞の整列を改善し、画像最適化をもたらす。これは、細胞内構造、小器官、又はローブ等の粒子内構造の、流れの方向に実質的に平行な位置付け、再位置付け、及び／又はより良好な位置付けもまたもたらし、画像最適化をもたらす。粘性剤は、全体的に細胞の不整列もまた低減するが、流れストリームよりも直径が小さい細胞に限定されない。
【０２９８】
例えば、赤血球及び／又は細菌桿のように、流れストリームよりも直径が小さい細胞の整列は、例えば、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって、及び／又は流れの線速度率を増加させることによって得られ得る。これは、流れの方向に平行なＲＢＣ又は細菌桿の整列をもたらす。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ又は細菌桿の不整列の低減及び／又はＲＢＣ又は細菌桿の整列における増加は、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって達成される。
【０２９９】
一態様では、本開示は、画像ベースの粒子分類、副分類、及び計数を使用して、粒子を差異的に類別する及び／又は粒子を計数する方法に関する。例示的な方法は、粒子又は細胞を含有する試料を、粒子の分類及び／又は副分類のための視覚的特質を生成することに効果的な量の粒子造影剤組成物と接触させることと、該試料を少なくとも１つのフローセルに適用することと、接触させた試料の第１の分量と共に、少なくとも１つのフローセルに、処理した試料の粘性とは異なる粘性を有し、試料の流れの支持、粒子の整列、並びに流路内を流れる焦点化した粒子の内容物及び細胞の小器官の増加に効果的な、粒子及び細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）を導入することと、視覚分析器、プロセッサを備える装置を使用して細胞を分析することと、１つ以上の視覚特質を判定することにより粒子分類及び副分類を行うことと、視覚特質に基づく分類及び副分類において粒子を計数することと、を含み得る。
【０３００】
本方法及び本開示の他の方法のいずれかにおいて、該粒子は試料内に存在する細胞の任意の分類及び／又は副分類であり得、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片からなる群から選択される粒子を含んでよい。
【０３０１】
本開示は、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化するための、高光学解像度撮像デバイスの正確な作動位置を、自動的に達成するための技術を提供する。フローセルは、リボン形状の試料ストリームが、フローセル内の表示帯域を通過する、ＰＩＯＡＬの層の間の薄いリボン内の、試料流体の流路を画定するフローセルの壁の間に、固定されたかつ再現可能な位置を有するように構成される。模式的に図１で並びに図６及び７の実践的実施形態で、開示するフローセルの実施形態では、ＰＩＯＡＬの流路の断面は、オリフィスに長方形のルーメンを伴う管等の、試料が平坦なオリフィスを通って挿入される点にて、対称的に狭細化する。狭細流路（例えば、２０：１〜４０：１の比率での、断面における幾何学的狭細化）及び更に試料の流れと比較したＰＩＯＡＬのより大きい線速度は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で平坦化及び延展させるために協働する。効果的なことに、流量、粘性、及びストリームの厚さの組み合わせにより、試料は薄いリボンの形状になる。狭細流路（例えば、４０：１の比率又は２０：１〜７０：１の比率での断面積における幾何学的狭細化）及び試料の流れと比較したＰＩＯＡＬの線速度における差異は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で薄くするために協働する。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は４０：１であり得る。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は３０：１であり得る。
【０３０２】
結果として、試料及びＰＩＯＡＬの具体的な線速度等のプロセスの変形は、リボン形状の試料ストリームを流れ内の中央位置から変位させる傾向に無い。フローセルの構造に対して、リボン形状の試料ストリームの位置は安定で再現可能である。
【０３０３】
高光学解像度及び撮像デバイス光学素子は、所与の焦点距離を有し、該光学素子はまずフローセルに対して正確に、すなわち高光学解像度撮像デバイスを自動焦点パターン上に焦点化することによって、位置付けられる。自動焦点パターンと試料ストリームとの間の変位距離は、好適には初期較正工程の結果として、精密に既知である。自動焦点パターン上に自動焦点化した後、フローセル及び高光学解像度画像捕捉デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスは、変位距離にわたって互いに対して変位する。結果として、高光学解像度画像捕捉デバイスは、試料ストリーム上に精密に焦点化する。
【０３０４】
このように、異なる画像間で可変であり、又は造影に関しては高度な画定に欠き、又は位置の範囲内のどこかに位置付けられ得る、画像内容態様に、参照のための距離位置の判定の基準として、自動焦点化又は依存することは必須でない。自動焦点パターンの最適焦点の位置を見つけると、高光学解像度撮像デバイス及びフローセルの相対位置は、最適焦点位置を、自動焦点パターンの位置からリボン形状の試料ストリームの位置に移動させるために、変位する。
【０３０５】
一実施形態では、本開示は、細胞を着色するために使用され得る粒子造影剤組成物に関する。本発明の粒子造影剤組成物及び方法は、一実施形態では、例えば、本明細書に開示する任意の粒子の、分類、計数、及び特徴付け、並びに、副分類、計数、特徴付け、及び分析のために使用され得る。一実施形態では、粒子造影剤組成物は、画像ベースの、自動化又は部分的に自動化した分析器との使用に好適である。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、粒子造影剤組成物は、１つ以上の細胞の種類が、活気若しくは生存能力を維持し、並びに／又は、細胞及び／又は細胞及び／若しくは細胞下特徴が実質的に無傷のまま残る条件下で、細胞及び／又は細胞下特徴を増強するために使用される。粒子造影剤組成物は、粒子分類及び副分類のための視覚特質を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、粒子造影剤組成物は、白血球を着色するために使用され得る。いくつかの実施形態では、粒子造影剤組成物は、例えば、白血球に加え、上皮細胞、細菌、及び／又は病理円柱内の含有物の視覚化可能特徴を増強もまたし得る。他の実施形態では、粒子造影剤組成物は、白血球並びに上皮細胞、細菌、及び／又は病理円柱内の含有物を着色し得る。
【０３０７】
本開示の態様及び実施形態は、これらの構成要素を含む特定の染色製剤が、分類、副分類、及び計数等の、画像ベースの分析の増強のために、造影剤として使用されるときに、驚くべくかつ予想外の特性及び有効性を有するという発見から起因する。一実施形態では、本開示は、細胞を処理及び／又は着色するために使用され得る粒子造影剤組成物に関する。本発明の粒子造影剤組成物及び方法は、一実施形態では、例えば、白血球の計数及び特徴付け、並びに白血球差異特徴付け及び分析に、並びに、生体液内の粒子の、粒子計数、特徴付け、及び分析に使用され得る。一実施形態では、粒子造影剤組成物は、自動化又は部分的に自動化した分析器との使用に好適である。本発明のいくつかの態様では、画像ベースの尿沈渣分析を実行するための方法及び組成物が提供される。一実施形態では、組成物及び関連する方法は、ユーザが、造影及び／又は形態に基づく異常細胞の識別を容易にし得る、細胞及びその細胞内容物を見ることを可能にする。
【０３０８】
他の実施形態では、粒子造影剤組成物は、ＷＢＣの細胞下構造、並びに上皮細胞、細菌、病理円柱内の含有物、又は細胞断片を、増強及び／又は着色し得る。
【０３０９】
本開示の態様及び実施形態は、特定の染色組成物、及び／又はその組み合わせが、尿沈渣試料分析を行うために使用されるときに、予想外の特性及び有効性を有するという、驚くべくかつ予想外の発見に基づく。例示的な染色組成物及び／又はその組み合わせは、同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿号に記載され、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３１０】
別の態様では、本発明は、本発明の粒子造影剤組成物を備えるキットに関する。該キットはまた、本明細書に記載される任意の方法に従う、粒子造影剤組成物の使用についての説明書も含有し得る。該キットは、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）もまた含み得る。該キットはまた、プログラム可能な記憶媒体と、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片等の粒子の、画像ベースの識別のための、関連するソフトウェアとを含有してもよい。該キットは、等張性緩衝剤を含み得る、１つ以上の緩衝剤及び／又は希釈剤を備えてよい。該キット及び又は緩衝剤は、界面活性剤、ｐＨ調節剤、及び／又は抗菌剤を更に含んでよい。他の実施形態では、該キットはまた、洗浄又は水洗溶液を備えてもよい。該キットは、陽性及び陰性対照のための標準物もまた備えてよい。いくつかの実施形態では、標準物は標準着色細胞試薬を含み得る。該キットは、キットの構成要素を移すための、使い捨てマイクロピペット、チップ、又は管等の、使い捨てのものもまた含み得る。キットは、これらのキット構成要素のうちのいずれか１つ又はその２つ以上の任意の組み合わせを含有してもよい。
【０３１１】
別の実施形態では、本開示は、ａ）本明細書に記載される任意の方法に従い、粒子を含有する試料を粒子造影剤組成物と接触させること、ｂ）粒子内構造を含む粒子の画像を取得すること、ｃ）細胞の１つ以上の特色を判定すること、及びｄ）粒子の画像ベースの分類及び副分類、並びに／又は分析を行うこと、を含む、画像ベースの細胞分類及び副分類を行う方法に関する。
【０３１２】
本明細書で使用される場合、本開示における分析器の例示的な機能性構成要素及び／又は特徴は、例えば、画像を取得する及び／若しくは処理すること、並びに／又は、粒子画像識別、計数、分類、及び副分類することができる、視覚分析器を含み得る。該分析器は、尿試料又は他の試料を分析し、試料内に存在する細胞を分類及び／若しくは副分類、並びに／又は計数するため、あるいは粒子特徴の分析に基づいて試料内に存在する細胞を識別するために、本発明の方法において使用され得る。
【０３１３】
特定の実施形態では、画像は例示的な分析器によって得られる。分析器は、試料の供給源に、並びに小器官及び整列液体、例えば、ＰＩＯＡＬの供給源に、結合したフローセルを含み得、ここにおいてフローセルは内部流路を画定し、フローセルはＰＩＯＡＬによって包まれる試料の流れを、フローセル内の表示帯域を通って方向付けるように構成される。分析器は、リボン形状の試料ストリームと交差する光学軸上に対物レンズを伴うデジタル高光学解像度撮像デバイスもまた含み得、対物レンズとフローセルとの間の相対距離は、フォトセンサアレイ上の、焦点デジタル画像の解像及び収集のために、モータ駆動の操作によって可変である。更に、分析器は、フローセルに対して固定された位置を有する、自動焦点パターン（１つ及び／又は複数）を含み得、自動焦点パターンは、リボン形状の試料ストリームの面から既定の距離に位置する。更に、分析器は、リボン形状の試料ストリーム及び自動焦点パターンを照射するように構成される光源と、モータ駆動を操作しデジタル画像を分析するために結合された少なくとも１つのデジタルプロセッサと、を含み得る。プロセッサは、高光学解像度及び撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム上に焦点化させるために、自動焦点パターンの焦点位置を決定するように、並びに、対物レンズ及びフローセルを焦点位置から、既定の距離にわたって相対的に変位させるように構成され得る。
【０３１４】
高光学解像度撮像デバイスという用語は、形態特徴及び／又は変化を鑑別するために十分な視覚特質を伴う、粒子の画像を取得することができるデバイスを含み得る。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．７μｍ等の、例えば、０．６〜０．８μｍを含む、１μｍ以下の解像度を伴うデバイスを含み得る。別の実施例では、高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．３５μｍ等の、０．３〜０．４μｍの解像度を有し得る。別の実施例では、高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４３μｍ等の、０．４〜０．５μｍの解像度を有し得る。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び／又は方法のうちの任意のものにおいて得られる画像は、デジタル画像であってよい。いくつかの実施形態では、得られる画像は顕微鏡画像である。特定の実施形態では、画像は手動で得られてよい。他の実施形態では、画像を取得するための手順の少なくとも一部が自動化される。いくつかの実施形態では、画像は、フローセルと、任意で自動焦点特徴を伴う、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスとを備える、分析器を使用して得られてよい。
【０３１６】
一実施形態では、画像は、細胞基質、細胞核、及び／又は細胞の核成分に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は顆粒成分及び／又は他の細胞の形態特徴に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は、細胞基質、核及び／又は細胞の顆粒成分に関連する情報を提供する。顆粒及び／又は核画像及び／又は特徴は、独立的に又は互いとの組み合わせで、細胞分類及び副分類に決定的である。
【０３１７】
本発明の方法の一態様では、粒子造影剤組成物と接触させる細胞は、白血球、上皮細胞、及び／又は細菌を含み得る。別の態様では、本発明の方法は、白血球分類及び副分類を更に含み得る。
【０３１８】
本発明の方法の一態様では、粒子造影剤組成物と接触させる又は撮像する細胞は、赤血球である。更に別の態様では、本発明の方法は、画像ベースの尿粒子分類及び副分類を行うための、ａ）粒子細胞の一部を撮像すること、及びｂ）撮像した粒子の形態を判定することを含む、方法に関する。一実施形態では、尿内の粒子は、赤血球であり得る。本明細書で使用される場合、赤血球（ＲＢＣ）は、例えば、通常赤血球及び／又は異形赤血球を含み得る。いくつかの実施形態では、撮像は、視覚分析器及びプロセッサを備える分析器等の、本開示の分析器を使用して行われる。
【０３１９】
本明細書で使用される場合、例示的な完全尿沈渣分析は、典型的に医師又は他の医療専門家によって必要とされる、患者の尿試料内に存在する形成成分（例えば、細胞及び／又は他の粒子）についての情報を提供する試験板を含み得る。尿内に見られる例示的な形成成分は、概して本明細書に開示する任意の粒子を含み得るがこれらに限定されない。
【０３２０】
本明細書で使用される場合、異常に高い計数は、疾患、障害、及び／又は病態の存在を示し得る。したがって、完全尿沈渣分析は、患者の全体的な健康状態の概観を提供することができるため、医学において一般的に行われる尿試験の１つである。結果的に、尿沈渣分析は、年に１回の健康診断の間に決まって行われる。
【０３２１】
本明細書で使用される場合、典型的に被験者は尿試料を概してカップ内に採取する。試料は、その後、実験室に輸送される。従来の方法では、尿試料はまず遠心分離及び濃縮され、このようにして得られた沈渣は、いくつかの場合では着色され、顕微鏡スライドガラス（例えば、湿式台又は専用の計数スライドガラス）に載せられ、顕微鏡下で手動の判定及び計数を受ける。別の実施形態では、試料は、自動化分析器で処理され、ここにおいて、粒子がシース液内に包まれる間に、粒子が分類、副分類、及び計数される。
【０３２２】
本明細書で使用される場合、概して、尿分析器は、細い管を通して非常に少量の検体を吸引し得る。センサは、管を通過する細胞の計数及び／又は数を検出することができ、細胞の種類を識別することができる。例示的なセンサは、光（例えば、可視、ＵＶ、若しくはＩＲ）の検出器、及び／又は電気インピーダンスを含み得る。例示的な検出パラメータは、大きさ、容積、及び／又は細胞特徴を含み得る。特定の実施形態では、センサは約２００ｎｍ〜約１．０ｍｍの範囲の波長スペクトル内の、可視及び非可視光を検出することができる。特定の実施形態では、センサは約３８０ｎｍ〜７６０ｎｍの波長を検出することができる。
【０３２３】
本発明の方法の別の態様では、血球、扁平及び非扁平細胞、円柱、トリコモナス、又は細菌等の、粒子造影剤組成物と接触させる粒子、及び／又は撮像される粒子。本発明のいくつかの態様では、これらの粒子の異常な存在は、病態、疾患、感染症、及び／若しくは症候群の、識別、予測、診断、予後診断、若しくはその診断の支持に、並びに／又は、被験者が治療に対して反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察に、使用され得る。
【０３２４】
本明細書で使用される場合、検出可能でかつ測定可能な粒子パラメータは、例えば、視覚画像、及び／又は、大きさ、形状、対称性、輪郭、及び／若しくは他の特色の、非画像ベースの指数を含み得る。
【０３２５】
本明細書で使用される場合、尿試料は、いくつかのプロセスで、希釈、分量に分割、又は粒子造影剤で処理され得る。
【０３２６】
本明細書に開示する方法は、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウマ、ウシ、又は他の家畜、イヌ、ネコ、又はペットとして飼われる他の哺乳類、ラット、ネズミ、又は他の実験室動物、鳥類、例えば、ニワトリ、爬虫類、例えば、ワニ、魚類、例えば、サケ、及び他の養殖種、並びに両生類を含む、幅広い範囲の生物からの試料に適用可能である。
【０３２７】
試料は、任意の従来の方法、例えば、排泄、摘出、収集、吸引、又は生検によって得られ得る。試料は、健康であると考えられる被験者からのもの、例えば、決まった身体検査の一部として採取された試料であり得る。試料はまた、障害を有する、その危険性がある、それを有すると疑われる被験者からのものでもあり得る。該障害は、疾患、遺伝的異常、感染症、外傷、又は未知の原因の結果であり得る。代替的に、又は更に、方法は障害の治療の過程の間の被験者の観察に有用であり得る。治療及び／又は両方に非反応性である兆候がある場合は、臨床医は代替の又は補助的な薬剤を選択することができる。被験者の状態及びもしあれば具体的障害に依存し、試料は毎日、毎週、毎月、又は毎年１回（又は２回、３回等）採取することができる。
【０３２８】
粒子は、尿試料に依存して変化し得る。該粒子は、尿内に見られる細胞、例えば、血球、胎児細胞、幹細胞、腫瘍細胞、又はそれらの断片であり得る。いくつかの実施形態では、粒子は感染因子、例えば、ウイルス、細菌、原生生物、原生動物、真菌、又は寄生虫であり得る。
【０３２９】
「形成成分」への言及は、生体液試料内に存在する非流体要素を包含することが理解され得る。形成成分は、例えば、赤血球（ＲＢＣ）；白血球（ＷＢＣ）；ＷＢＣ凝集塊；単球、好中球、好酸球、好塩基球等の成熟白血球を含む白血球のサブクラス；を含む、科学的分類又は生理的機能に基づく血球のクラスを含む。本明細書の使用のための「形成成分」は、円柱、上皮細胞、酵母、結晶、細菌、粘液、微生物、細菌、真菌、原生生物、原生動物、寄生虫、寄生虫性嚢胞を含む嚢胞、又はそれらの断片、又は他の細胞断片等の粒子もまた含み得る。
【０３３０】
別途明記しない限り、本開示における粒子の「分類」への言及は、大きさ、形状、質感、又は色等の、測定、検出、又は誘導された、少なくとも１つの検出基準を使用して検出された粒子の群を包含するということが理解され得る。いくつかの実施形態では、本開示の分析器によって計数される粒子の、少なくとも１つの分類及び／又は副分類のメンバは、同じ種類の形成成分であり得る。本開示における粒子の「分類」への言及は、大きさ、形状、質感、又は色等の、測定、検出、又は誘導された基準に対応する、粒子のグループを包含するということが理解され得る。いくつかの実施形態では、本開示の分析器によって計数される粒子の、少なくとも１つの分類及び／又は副分類のメンバは、同じ種類の形成成分であり得る。
【０３３１】
本開示における、粒子の分類及び／又は副分類の「メンバ」（１つ又は複数）への言及は、粒子の分類又は副分類内の、個々の粒子を包含するということが理解され得る。
【０３３２】
本明細書で使用される場合、高光学解像度撮像デバイスという用語は、形態特徴及び／又は変化を鑑別するために、十分な視覚特質を伴う粒子画像を取得することができるデバイスを含み得る。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．８μｍ等の、例えば、０．７〜０．９μｍを含む、１μｍ以下の解像度を伴うデバイスを含み得る。別の例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４３μｍ等の、０．４〜０．５μｍの解像度を有する。例示的な高光学解像度撮像デバイスは、例えば、０．４６μｍを含む、１μｍ以下の光学解像度を伴うデバイスを含み得る。
【０３３３】
本明細書で使用される場合、粒子造影剤組成物は、被験者からの試料内の粒子の分析のための視覚分析器における、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）との組み合わせでの使用に用いられ得る。例示的なＰＩＯＡＬは、例えば、被験者からの試料内の異なる種類の粒子の自動化認識の方法において有用である。
【０３３４】
別の態様では、画像が得られるとき、細胞はＰＩＯＡＬ内に包まれ得る。好適で例示的なＰＩＯＡＬは、本明細書に記載される。
【０３３５】
本明細書で使用される場合、「整列」は、球形及び／又は非球形粒子の整列によって部分的に特徴付けられ得る。例えば、非球形粒子等の粒子は、流れの方向に実質的に平行な面において整列し得る。特定の実施形態では、非球形粒子の整列は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、撮像条件下で、非球形粒子の画像投影を増加させる、粒子の配向によって特徴付けられる。球形粒子等の粒子は、粒子及び細胞の、焦点化した粒子内内容物の量における増加を有し得る。球形粒子等の粒子の粒子内構造は、流れの方向に実質的に平行に、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好に位置付けされ得る。例えば、細胞内構造、小器官、又はローブはまた、流れの方向に実質的に平行に、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好に位置付けられ得る。
【０３３６】
本開示における粒子の「クラス」への言及は、科学的分類に基づく粒子の群を包含するということが理解され得る。例えば、尿試料内の形成成分の主要なクラスは、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片を含むが、これらに限定されない。
【０３３７】
本開示における、粒子の「メンバ」（１つ又は複数）への言及は、粒子のある分類における粒子の副分類を包含するということが理解され得る。例えば、尿沈渣のそれぞれのクラスは、副分類又は副分類に、更に分割され得る。ＷＢＣの主要な副分類は、好中球、リンパ球、単球、好酸球、及び好塩基球を含むがこれらに限定されない。成熟ＲＢＣに加え、ＲＢＣのメンバは、異常な形状のＲＢＣを含み得る。
【０３３８】
「異常」細胞又は粒子への言及は、特定の疾患若しくは病態に関連付けられるもの、又は、場合によっては特定の疾患又は病態に関連付けられ得る不規則性を、包含するということが理解され得る。粒子のサイズ、形状、色、質における変化、及び／又は細胞内構造は、特定の疾患若しくは病態、又はそれらの欠如に関連付けられ得る。
【０３３９】
本開示における粒子の「計数」又は「粒子計数」への言及は、視覚分析器によって検出及び分類又は副分類された全ての粒子の数を蓄積して得られる粒子の数を包含するということが理解され得る。本開示における、粒子の、クラス、分類、又は、サブクラス若しくは副分類の「濃度」への言及は、単位容積当たり（例えば、１リットル当たり）又は既知の容積の１つの試料当たりの、粒子の数を意味するということが理解され得る。例えば、視覚分析器は、粒子のそれぞれの分類又は副分類についての、計数、濃度、比率、又は他の濃度ベースのパラメータを提供し得る。
【０３４０】
本開示は、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化するための、高光学解像度撮像デバイスの正確な作動位置を、自動的に達成するための技術を提供する。フローセル構造は、リボン形状の試料ストリームが、フローセル内の表示帯域を通過するＰＩＯＡＬの層間の薄いリボンにおいて、試料流体の流路を画定するフローセル内に、固定された信頼性のある位置を有するように構成される。模式的に図１で並びに図６及び７の実践的実施形態で、開示するフローセルの実施形態では、ＰＩＯＡＬの流路の断面は、オリフィスに長方形のルーメンを伴う管等の、試料が平坦なオリフィス、又はカニューレを通って挿入される点にて、対称的に狭細化する。狭細流路（例えば、２０：１の比率又は２０：１〜７０：１の比率での断面積における幾何学的狭細化）及び試料の流れと比較したＰＩＯＡＬの線速度における差異は、試料断面を約２０：１〜７０：１の比率で圧縮するために協働する。いくつかの実施形態では、断面厚さ比率は４０：１であり得る。
【０３４１】
一態様では、フローセルの対照的性質、並びに試料流体及びＰＩＯＡＬの注入の様式は、ＰＩＯＡＬの２つの層間のリボン形状の試料ストリームのための、フローセル内の再現可能な位置を提供する。結果として、試料及びＰＩＯＡＬの具体的な線速度等のプロセスの変形は、リボン形状の試料ストリームを流れ内の中央位置から変位させる傾向に無い。フローセルの構造に対して、リボン形状の試料ストリームの位置は安定で再現可能である。
【０３４２】
しかしながら、フローセル及び光学システムの高光学解像度撮像デバイスの相対位置は、変更の対象であり、高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリームとの間の最適距離を維持するための、折に触れた位置調節を必要とし、このようにしてリボン形状の試料ストリーム内の包まれた粒子の質の高い焦点画像を提供する。高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリームとの間には、包まれた粒子の焦点画像を取得するための、最適距離がある。光学素子は、まず、図１において模式的に示すように、高光学解像度撮像デバイスを、フローセルに対して固定された位置を伴う自動焦点パターンから最適距離に位置付けるために、フローセルに対して正確に、すなわち、自動焦点化技術によって位置付けられる。自動焦点パターンとリボン形状の試料ストリームとの間の変位距離は、好適には初期較正工程の結果として、精密に既知である。自動焦点パターンの自動焦点化の後、フローセル及び／又は高光学解像度撮像デバイスは、その後、フローセルと高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスとリボン形状の試料ストリームとの間に、既知の変位距離を提供するように変位する。結果として、高光学解像度撮像デバイスの対物レンズは、包まれた粒子を含有するリボン形状の試料ストリーム上に精密に焦点化する。
【０３４３】
自動焦点態様を伴う写真システムでは、多くの場合、自動焦点化プロセスは、画像に表れる被写体の造影を増加させようとする。しかしながら、本技術に従い、自動焦点化は、場合によっては、高光学解像度撮像デバイス又はデジタル画像捕捉デバイスの光学軸に平行な線に沿って既知の位置を画定する高造影フィギュアである、高造影自動焦点パターン上に、自動焦点化することによって簡略化される。自動焦点パターンは、リボン形状の試料ストリームの位置に対する、既知の変位又は距離を有する。造影測定アルゴリズムは、自動焦点パターンの特徴に、特異的に用いられ得る。一実施例では、造影フィギュアの縁をまたぐことが既知である、画像内のピクセルの線に沿って生じるピクセル輝度値間で、１つ以上の最大差異振幅が見られる、深度又は距離を見つけるために、高光学解像度撮像デバイスの位置は、高光学解像度撮像デバイスの光学軸に平行な線に沿って変化する。自動焦点パターンは、好都合なことに、高光学解像度撮像デバイスの光学軸に平行な線に沿う変形を有さず、該線は、記録された変位距離を提供するように、モータ付きコントロールが高光学解像度撮像デバイスの位置を調節するためにそれに沿って動作する線でもある。
【０３４４】
該方法は、リボン形状の試料ストリームをリボン形状に形成することを更に含む。リボン形状は、高光学解像度撮像デバイスの光学軸が、リボン形状の試料ストリームに実質的に直角である、すなわちリボン形状のストリームの面に垂直であるように、提供される。
【０３４５】
視覚分析器１７は、粒子分類及び副分類のための視覚特質を生成することに効果的な、希釈剤、透過化剤、造影剤のうちの少なくとも１つを含む、少なくとも１つの化学物質を提供するように構成される、少なくとも１つの接触チャンバ２６もまた含み得る。例えば、図１及び他の箇所に示すように、接触させた試料は、試料注入器２９を通してフローセルに導入され、シース又は細胞内小器官整列試薬が注入器２７から導入される。
【０３４６】
希釈剤は、試料を好適な濃度に希釈するために使用され得る。造影剤及び／又は透過化剤は、粒子の分類及び／又は副分類のための視覚特質を生成するために使用される。ＰＩＯＡＬは、特定の種類の細胞又は細胞構造を、より良好な撮像のために、一方向に整列させるために使用される。いくつかの実施形態では、該少なくとも１つの化学物質は、まず試料と接触するために適用され得、その後処理した試料は視覚分析器１７上に提供される。
【０３４７】
少なくとも１つの化学物質の少なくとも追加での試料の処理は、室温で行われ得る。いくつかの実施形態では、かかる処理は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、３６、３７、３８、３８、３９、４０、４５、４６、４７、４８、４９、５０  ５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０℃等の温度で、行われ得る。選択された温度での該処理は、視覚分析器１７とは別個の、又は温度が制御された視覚分析器１７上の、インキュベータ内で実行され得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、視覚分析器は、試料を、造影剤及び／若しくは透過化剤、又は界面活性剤と、接触させるための、接触チャンバを有し得る。他の実施形態では、試料は、視覚分析器への注入の前に、造影剤及び／又は透過化剤と接触し得る。他の実施形態では、視覚分析器は、制御された時間に制御された温度で、造影剤及び／又は透過化剤と接触する間に試料を加熱するための、加熱素子を含有する。視覚分析器は、加熱工程の後に試料混合物を冷却するための冷却素子もまた有し得る。
【０３４９】
正確な結果を提供することに加え、視覚分析器１７は、分析の速度を改善することにおいて重要な利点を提供する。図１Ｃでは、異なる尿沈渣の計数の正確な結果は、ディスプレイ６３を通して出力され得る。分析プロセスの間、操作者は、端末６５を通してプロセッサ１８と相互作用し得る。操作者は、試料内の細胞又は他の粒子の、クラス又はクラスのメンバを、識別又は実証するために、スライドガラスを作り、その情報をプロセッサ１８に入力しなければならないことがある。以前は、それを伴い操作者によって顕微鏡下で検査される、顕微鏡スライドガラス（例えば、湿式台又は専用計数スライドガラス）を作ることにより、結果の最大約２５％〜３０％が、手動でレビューされた。本開示に記載されるように分析器を操作することにより、画像は視覚分析器上でレビューされ得、試料は頻度のより低い手動レビューを必要とすることになる。
【０３５０】
以下の適用の分類は、本開示における分析器の例示の目的で記載される。適用は、下記のものに限定されない。
【０３５１】
本開示は、粒子分析を実行するための、新奇組成物及びその使用方法を提供する。特に、本開示は、試料内の粒子を分析するための分析器内で使用される、粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）に関する。シース液及びＰＩＯＡＬという用語は、本開示を通して交換可能に使用され得る。本開示は、ＰＩＯＡＬを生成するための方法、及び粒子を分析するためにＰＩＯＡＬを使用するための方法を更に提供する。本発明のＰＩＯＡＬは、例えば、試料内の粒子の自動化分類及び副分類の方法において、有用である。
【０３５２】
ＰＩＯＡＬは、１つ以上の粘性剤又は粘性変性剤を含み得る。本明細書で使用される場合、ＰＩＯＡＬは、試料の粘性とは異なる特色的粘性を有する、化合物又は組成物である。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬの粘性は、流れ内にある間に、粒子の整列を最大化するために増加又は低減され、驚くべきことに、撮像のために提供されるときに、焦点化した粒子の内容物及び／又は粒子の細胞内小器官も増加させる。例えば、粒子及び／又は細胞は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、撮像条件下で、粒子の画像投影を増加させるために配向され得る。細胞内構造、小器官、又はローブ等の粒子内構造は、流れの方向に実質的に平行になるように、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好に位置付けられもまたし得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の粘性剤は、追加の塩又は他の構成要素を含有し得る、ＰＩＯＡＬの全体の液体分量を含む。他の実施形態では、流れ内にある間に粒子の整列を最大化し、撮像に提供されたときに、焦点化した粒子の内容物及び／又は粒子の細胞内小器官を増加させるために、試料の粘性は、試料の粘性及びＰＩＯＡＬの粘性における相対差異を最大化するために、増加又は低減される。
【０３５３】
特定の実施形態では、リボン形状の試料ストリームとＰＩＯＡＬとの間の粘性差異及び／若しくは速度差異、並びに／又は、リボン形状の試料ストリームの厚さは、流れ内にある間に粒子状で作用するせん断力を導入し得、それによって、視覚分析器内の撮像処理を通して、粒子を整列させる又は整列を維持させる。いくつかの実施形態では、試料は造影が増強され得る。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬは最大１００％の粘性剤を含み得る。
【０３５４】
他の実施形態では、本開示は、尿試料、又は、脳脊髄液及び／若しくは粒子状態に関連付けられる浸出液等の、他の生体液試料内の、粒子の画像ベースの分析において使用され得る、ＰＩＯＡＬに関する。本開示において尿試料における使用のために記載される、粒子分類及び／又は副分類計数は、分析され得る試料の種類の、非制限的な例である。いくつかの実施形態では、試料内に存在する細胞は、細菌又は真菌細胞、並びに白血球又は赤血球を含み得る。いくつかの実施形態では、組織又は吸引液から得られる粒子懸濁剤が分析され得る。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、試料流体のストリームは、相当な幅を伴う流路を確立するために、平坦なオープニングを伴うカニューレを通して注入され得る。ＰＩＯＡＬは、フローセルに導入され得、試料流体を、撮像区域を通り、その後排出部に向かって共に運ぶ。ＰＩＯＡＬは、異なる、例えば、相対的に試料流体よりも高い、粘性、及び任意で、リボン形状の試料ストリームへの注入の点にて異なる流量を有し、試料流体が薄いリボン形状に薄くなることをもたらす。試料流体の薄いリボンは、ＰＩＯＡＬと共に運ばれ、高光学解像度撮像デバイス及び光源が、リボン形状の試料ストリームを表示するために配置される、表示ポートの正面を通る。
【０３５６】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬの粘性は、試料の粘性よりも高くあり得る。ＰＩＯＡＬの粘性、試料物質の粘性、ＰＩＯＡＬの流量、及び試料物質の流量は、好都合なリボン形状の試料ストリーム厚さ等の、既定の寸法特色を伴うリボン形状の試料ストリーム内の流れを維持するために、調和する。好都合なリボン形状の試料ストリーム厚さを維持することは、例えば、焦点化した細胞等の粒子、及び／又は、焦点化した細胞成分の、高い割合を提供する。
【０３５７】
本開示は、ＰＩＯＡＬ内の好適な量の粘性剤の追加は、フローセル内の粒子／細胞整列を有意に改善し、細胞の、焦点化した細胞内内容物を増加させ、非粘性変性の従来のシース液の使用と比較して、流れ内の細胞のより高い質の画像をもたらす。粘性剤の追加は、流れの方向に実質的に平行な面において細胞を整列させる、ＲＢＣ等の細胞上のせん断力を増加させ、画像最適化をもたらす。ＷＢＣ等の細胞については、これは、細胞内構造、小器官、又はローブの、流れの方向に実質的に平行な、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好な位置付けもまたもたらす。
【０３５８】
流れストリームよりも直径が小さい粒子の整列は、ＰＩＯＡＬの粘性を増加させることによって得られ得る。これは、流れの方向に実質的に平行な面における、これらの粒子の整列の改善をもたらす。
【０３５９】
例示的なＰＩＯＡＬの実施形態は、粒子分析のために、フローセル内で使用される。試料は、ＰＩＯＡＬのストリーム内で包まれ、分析器デバイスのフローセルを通過する。試料からの情報は、検出区域を通過するときに収集され、試料内に含有される粒子／細胞を分析することができるようにする。かかる分析器でのＰＩＯＡＬの使用は、正確な分類及び副分類、並びに細胞及び試料内に含有される他の粒子等の粒子の計数を、可能にする。
【０３６０】
本明細書で使用される場合、ＰＩＯＡＬは、本明細書に開示する、以下の細胞及び／又は粒子に関連する情報を得ることに有用である。
【０３６１】
本明細書で使用される場合、粘性剤及び／又は粘性変性剤は、ＰＩＯＡＬの粘性と試料の粘性との間の差異の、０．１〜１０センチポアズの、絶対値に到達するために好適な、撮像システムにおける使用に適切な光学的透明性を含む光学特色を伴う、任意の物質を含み得る。粘性剤／変性剤は、ＰＩＯＡＬの粘性と試料の粘性との間の差異の、０．１〜１０センチポアズ（ｃＰ）の、絶対値に到達することに好適な、撮像システムにおける使用に適切な光学的透明性を含む光学特色を伴う、任意の薬剤を含んでよい。
【０３６２】
追加の好適な緩衝剤は、例えば、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールＢｉｏＸｔｒａ、ｐＨ  １０．０〜１２．０（２０℃、Ｈ２Ｏ内に０．５Ｍ）；ＡＣＥＳ；ＡＤＡ；ＢＥＳ；ビシン；ビス−トリス；ＤＩＰＳＯ；ＥＰＰＳ；Ｇｌｙ−Ｇｌｙ；ＨＥＰＢＳ；ＨＥＰＥＳ；ＭＥＳ；ＭＯＢＳ；ＭＯＰＳ；ＭＯＰＳＯ；リン酸；ＰＩＰＥＳ；ＰＯＰＳＯ；炭酸ナトリウム；重炭酸ナトリウム；ＴＡＰＳ；ＴＡＰＳＯ；ＴＥＳ；トリシン；塩酸トリエタノールアミン；及びトリス；トリズマを含む、生理的範囲ｐＨ  ６〜８において作用するｐＨ緩衝剤を含んでよい。
【０３６３】
一態様では、例示的な分析器／システムは、その内部で対称の粒子を含有する液体試料が、高光学解像度撮像デバイスがそこを通してデジタル画像を捕捉する、表示ポートを有する、フローセルを通って流される、自動化視覚分析器構成要素を含む。該フローセルは、試料流体の供給源に、及びＰＩＯＡＬの供給源に結合する。試料は、撮像分析の前に、本明細書に記載される１つ以上の例示的な粒子造影剤組成物で処理され得る。尿試料は、いくつかのプロセスにおいて、希釈、分量に分割、着色され得、デジタルカメラを備える高光学解像度撮像デバイスを使用して、そこを通してピクセルデータ画像が補足される、透明なポート又は窓を有する、フローセルを通して流される。ピクセルデータ画像は、モニタ上に表示され得、対象の粒子の可視的特徴を認識するために、自動的に及び／又は相互作用的に分析され得る。該特徴は、尿試料内の形成成分等の粒子の、区別、分類、副分類、及び計数を可能にする。
【０３６４】
試料は、任意の従来の方法、例えば、尿試料採取によって得られ得る。試料は、健康であると考えられる被験者からのもの、例えば、決まった身体検査の一部として採取された試料であり得る。試料はまた、障害を有する、その危険性がある、それを有すると疑われる被験者からのものでもあり得る。該障害は、疾患、遺伝的異常、感染症、外傷、又は未知の原因の結果であり得る。代替的に、又は更に、方法は治療の過程の間の被験者の観察に有用であり得る。反応性の兆候がある場合は、臨床医は、それに応じて投与量又は治療を調節することができる。治療に対する非反応性の兆候がある場合は、臨床医は、投与量を調節するか又は代替の若しくは補助的な薬剤を選択することができる。被験者の状態及びもしあれば具体的障害に依存し、試料は毎日、毎週、毎月、又は毎年１回（又は２回、３回等）採取することができる。
【０３６５】
高光学解像度撮像デバイス及び光源は、粒子の背面光画像を取得するために、フローセルの対向壁上に位置付けられ得る。高光学解像度撮像デバイスは、フローセル内の表示ポートを通して、試料のピクセルデータ画像を捕捉する。例えば、高光学解像度撮像デバイスは、流量と一致した反復率で画像を捕捉し、よってリボン形状の試料ストリームのセクションは、実質的な途切れ又は重複なく撮像される。
【０３６６】
フローセルを通って進むリボン形状の試料ストリームの、高解像度の画像を収集するシステムの、設計及び操作において、多数の構造的及び機能的困難がある。ある必要性は、粒子を互いから区別することを可能にする、様々な粒子の種類の異なる特徴を露呈することに、十分に明確な、鮮明に焦点化した粒子の画像を取得することである。
【０３６７】
焦点を維持するために、高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリームとの間の距離は、リボン形状の試料ストリームが、光学軸に沿う、高光学解像度撮像デバイスから正しい距離にあるように、固定する必要がある。高光学解像度撮像デバイスの対物レンズは、そこからピクセルデータがデジタル化される、二次元電荷結合デバイスアレイ等の、フォトセンサアレイ上で焦点画像を解像する。撮像される試料の面積の寸法、及び試料内で焦点化している被写界深度は、光学構成によって決定される。アパーチャ調節及びズーム調節は可能であり得るが、簡略化の目的のために、本開示内の実施例は、高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム内の粒子状に焦点化することは、単純に、高光学解像度撮像度撮像デバイスを、フローセル内で、リボン形状の試料ストリームから既定の正確な距離、すなわち、フォトセンサアレイ上の焦点化した粒子画像をもたらす距離に、位置付けることを必要とする。
【０３６８】
一態様では、本発明の組成物との使用のための、視覚分析器、又は画像分析器は、リボン形状の試料ストリームと光学システムの高光学解像度撮像デバイスとの間の距離を、非常に正確に設定することによって、試料の、信頼性のある焦点画像を捕捉することができる。いくつかの実施形態では、視覚分析器は、該距離を確立するために、本発明の組成物及びアルゴリズムとの組み合わせで使用され得る。
【０３６９】
調製試料の薄い層を撮像することが望ましい。試料は、フローセル内に配置され、表示ポートを通して表示することができるように照射される。個々の粒子は、例えば、粒子の分類及び副分類を互いから区別することが既知であるパラメータと、比較及び対比される属性を、露呈するために、十分な特徴造影を伴い、捕捉されたピクセルデータ画像において明確に見える。
【０３７０】
フローセルを、好適な粒子造影剤組成物との組み合わせで用いること、及び、例示的なＰＩＯＡＬが、分析器の粒子認識のための最適画像の収集を可能にすることが、１つの目的である。更に、ＰＩＯＡＬ及びフローセルは、高光学解像度撮像デバイスのリボン形状の試料ストリームまでの最適距離を維持する、自動焦点機構との組み合わせで、ＰＩＯＡＬの流れに注入されるリボン形状の試料ストリームのための、安定でかつ高度に再現可能な位置を提供し、よって質の高い焦点画像を提供する。
【０３７１】
不特定の深度位置にて被写体上に焦点化するために、自動化焦点プロセスを、概してデジタル写真において、及び特にデジタル画像顕微鏡検査において、使用することが既知である。しかしながら、プログラム化したプロセッサは、画像内容物の知覚を有しない。典型的には、焦点の質は、被験者の画像が、画像内のピクセルデータに適用される数値的アルゴリズムによって決定される最高全体造影を有する距離を見つけることによって評価される。例えば、画像内のそれぞれのピクセルについての輝度振幅対その隣接するピクセルにおける差異の合計は、尺度合計造影として計算され得る。他のものが同等である場合、わずかに異なる距離で画像において見られる最高合計は、最高造影に対応する。しかしながら、画像内容物は、かかる数値的尺度の結果に影響を与え、画像内容物は異なる距離にて異なり得る。したがって、手動の手順におけるように、スライドガラスに取り付けられた試料の代わりにフローセルを使用するときに、例えば、細胞又は粒子の厚さに匹敵する厚さの、希釈着色試料の薄い層を撮像することが望ましい。試料は、表示ポートを通した表示を可能にするようにフローセル内に配置されること、及び照射されることを必要とする。
【０３７２】
したがって、それによって個々の粒子が、粒子の分類及び副分類を互いから区別することが既知である、パラメータと比較及び対比される可視属性を、露呈するために十分な特徴造影を伴い、捕捉したピクセルデータ画像において明確に見えることになる、自動化焦点プロセスを有することが好都合である。
【０３７３】
フローセルを、ＰＩＯＡＬの流れに注入される試料ストリームのために、安定でかつ高度に再現可能な位置を提供する、本明細書に開示する例示的なＰＩＯＡＬとの組み合わせで、高光学解像度撮像デバイスの焦点面を、流れの方向に実質的に平行な、リボン形状の試料ストリーム上に維持する、高光学解像度撮像自動焦点装置との組み合わせで用い、よって、試料内の粒子の質の高い焦点画像を提供するが、自動焦点化プロセスの一定又は頻繁な反復を必要としないことが、１つの目的である。該画像は、視覚分析器の流れの方向に実質的に平行な面において焦点化される。
【０３７４】
例えば、第１の工程は、例示的なＰＩＯＡＬ及びリボン形状の試料ストリームを運ぶフローセルに対する、高光学解像度撮像デバイスの、精密な相対位置を決定することである。好都合なことに、フローセル及び／又は高光学解像度撮像デバイスは、自動焦点化プロセスにおいて、基準点として鮮明な造影縁を伴う、自動焦点パターンを被写体として使用し、互いに対して移動する。リボン形状の試料ストリームは、その基準点に対する位置において固定される。
【０３７５】
ＰＩＯＡＬ流路は、同等なＰＩＯＡＬの流れが、薄いリボンとしての試料ストリームを、高光学解像度撮像デバイスの光学軸に平行なラインに沿って、自動焦点パターンから固定された距離にて、延展及び位置付けるように、対称的に配置され得る。一実施形態では、自動焦点パターンは、後部照射の供給源から光を入れる開口部の周囲に、不透明なボーダーを含み、自動焦点パターンの距離には、自動焦点コントロールによって、容易にかつ明確に絞り込める。その後、リボン形状の試料ストリームは、高光学解像度撮像デバイスを、固定された変位距離である、自動焦点パターン位置からリボン形状の試料ストリームの位置に、変位することによって焦点化され、更なる自動焦点化が考えられるものの、画像内容物上に自動焦点化する必要性は伴わない。
【０３７６】
モータ駆動は、焦点の質の尺度、例えば、造影の尺度を評価するプロセッサによって、提供及び制御され、自動焦点化のためにモータ駆動を操作する。通常の動作では、プロセッサは、自動焦点パターン上に自動焦点化するようにモータ駆動を操作し、高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の距離を、自動焦点パターンからリボン形状の試料ストリームまでの、記録された変位距離で調節する。デバイスがリボン形状の試料ストリームを同じように移動させ続け、熱膨張又は類似する交絡因子が発生しない限り、リボン形状の試料ストリームの画像は、焦点化したままとなる。
【０３７７】
予備的設定又は較正プロセスは、フローセル内の、自動焦点パターンとリボン形状の試料ストリームの位置との間の変位距離を、決定及び記録するために使用され得る。異なるフローセルについては異なり得る、正確な変位距離は、例えば、二者択一的に、自動焦点パターン上及び試験リボン形状の試料ストリーム上に数回自動焦点化すること、並びに平均結果をフローセルに関連付けられる定数として記録することにより、予備的試験によって確立される。
【０３７８】
尿試料内の粒子は、少なくとも部分的に自動化した画像分析プロセスによって分析される、デジタル画像を収集する、高光学解像度撮像デバイスによって撮像される。自動焦点化プロセスは、自動焦点パターン又は類似する焦点目標上で、好適には、被験者のリボン形状の試料ストリーム上ではなく、光学軸の方向においてわずかな又は無の距離変形を伴う平面目標上で、達成される。自動焦点パターンは、リボン形状の試料ストリームの距離への、既知の距離変位を有する。自動化した焦点化構成は、光学軸に沿い、フローセル及び高光学解像度撮像デバイスの相対距離を調節する、モータ駆動を含み、これは、距離の範囲にわたる焦点の質の１つ以上の尺度を収集するプロセッサからの、制御信号に反応性であり、最適距離を探す。自動焦点化は、高光学解像度撮像デバイスの焦点を、流れストリームに平行な、平坦なリボン形状の試料ストリームから変位距離に位置付けられる、目標パターンの深度に固定するために適用される。
【０３７９】
自動焦点パターン上に焦点化されると、プロセッサは固定された変位距離にわたってモータ駆動を操作し、それによってリボン形状の試料ストリームをデジタル画像において焦点化させる。自動焦点パターンは、高度な視覚造影を有し得、いくつかの実施形態では、平面整列を補助することができる、すなわち、高光学解像度撮像デバイスの光学軸に垂直な面にフローセルを配置する。
【０３８０】
一態様では、本発明の方法は、被験者が、疾患、病態、異常、若しくは感染症を有するかどうかの、判定、診断、予後診断、予測、及び／若しくはその診断の支持、並びに／又は、被験者が治療に対して反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察に有用な、自動化した画像ベースの尿沈渣計数を可能にする、流れ内の粒子の驚くべく高い質の画像、並びに、形態異常の自動化識別を提供する。別の態様では、本発明の組成物及び方法は、より正確な細胞分類、副分類、及び現在の自動化分析器と比較して手動のレビュー率を低減する、より正確な減退を提供する。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＰＩＯＡＬを備えるキットに更に関する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＰＩＯＡＬ及び少なくとも１つの粒子造影剤を備えるキットに関する。いくつかの態様では、キットは、ＰＩＯＡＬに加え、２つの粒子造影剤を含有し得る。いくつかの実施形態では、粒子造影剤は、新メチレン青、クリスタル紫、サフラニンＯ、エオシンＹ、及び／又は、メチル緑を含む組成物である。
【０３８２】
一実施形態では、非球形粒子は、赤血球、上皮細胞、円柱、白血球凝集塊、及び／又は、出芽若しくは菌糸酵母を含む。本発明の別の態様では、球形粒子は、白血球、脂肪体、トリコモナスを含む。
【０３８３】
分析される尿試料内の粒子は、特色的沈渣又は形成成分を含む。該形成成分は、本明細書に開示する例示的な粒子を含み得る。
【０３８４】
例示的な円柱は、無細胞顔料円柱、未分類円柱（例えば、顆粒円柱）を含み得る。例示的な無細胞円柱は、例えば、ろう様円柱、幅広円柱、脂肪円柱、及び結晶円柱を含み得る。例示的な細胞円柱は、例えば、ＲＢＣ円柱、ＷＢＣ円柱、及び細胞円柱を含み得る。
【０３８５】
例示的な結晶は、例えば、シュウ酸カルシウム、三重リン酸塩、リン酸カルシウム、尿酸、炭酸カルシウム、ロイシン、シスチン、チロシン、及び非晶質結晶を含み得る。
【０３８６】
例示的な非扁平上皮細胞は、例えば、腎上皮及び移行上皮を含み得る。
【０３８７】
例示的な酵母は、例えば、出芽酵母、及び仮性菌糸を伴う酵母を含み得る。
【０３８８】
例示的な細菌性病原体は、例えば、炭疽菌、ペスト菌、エンテロコリチカ菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、野兎病菌、ブルセラ種、サルモネラ菌種、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を含む大腸菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、鼻疽菌、類鼻疽菌、クラミジア菌種、コクシエラ菌、発疹チフスリケッチア、ビブリオ菌種、赤痢菌菌種、リステリア菌、ミコバクテリア結核、らい菌、ライム病ボレリア、アクチノバチルスプルロニューモニア、ヘリコバクターピロリ菌、髄膜炎菌、百日咳菌、ジンジバリス菌、及びカンピロバクタージェジュニ、を含み得る。真菌性病原体は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、スタキボトリス属、トリコデルマ属、マイコプラズマ属、ヒストプラズマカプスラーツム属、クリプトコッカスネオフォルマンス属、クラミジアトラコマチス属、及び、カンジダアルビカンス属のメンバを、制限なく含み得る。病原性原生動物は、例えば、クリプトスポリジウム属のメンバ、例えば、クリプトスポリジウムパルバム、ランブル鞭毛虫、微胞子虫及びトキソプラズマ属のメンバ、例えば、トキソプラズマブルセイ、トキソプラズマゴンヂ、赤痢アメーバ、熱帯熱マラリア原虫、大型リーシュマニア、及びシクロスポラカイエタネンシスを含み得る。
【０３８９】
例示的な尿沈渣粒子は、ＲＢＣ凝集塊、脂肪、楕円脂肪体、及びトリコモナスもまた含み得る。
【０３９０】
尿内のヘモグロビンに関連付けられる条件は、例えば、重度の高ビリルビン血症において見られるビリルビン結晶又は非晶質沈殿物、シスチン症において見られるシスチン結晶、鉄過剰において見られる血沈素、及び発作性寒冷ヘモグロビン尿症において見られる赤血球を含む。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、得られる結果は、基準物と比較され得る。
【０３９２】
標準の基準レベルは、典型的に、大きい基準集団に由来する細胞数を表す。基準集団は、類似する年齢、体型、問題となっている個人の民族的背景又は健康状態、の個人を含み得る。
【０３９３】
一態様では、本明細書に開示する例示的な着色組成物は、本明細書に開示する粒子の分類、副分類、及び計数に有用である。
【０３９４】
本明細書で使用される場合、粒子造影剤組成物は、ＰＩＯＡＬとの組み合わせで、より多い数の焦点化した細胞内容物（例えば、ローブ、核、核内容物、細胞質、及び顆粒）を含有する画像を生成するために、視覚分析器内で使用され得る。
【０３９５】
ＰＩＯＡＬの使用は、試料ストリームを薄くし、流れを薄い平坦なリボンに方向付けることの役に立つ。いくつかの実施形態では、例示的なＰＩＯＡＬの使用は、細胞の、ローブ、細胞質、及び顆粒成分を含み得る、より焦点化した細胞内容物をもたらす。更に、いくつかの実施形態では、フローセル設計は、非対称性流路を伴うフローセルよりも少ない細胞不整列を産出する、対称性流路を有する。
【０３９６】
本明細書で使用される場合、造影剤は、例えば、白血球、上皮細胞、及び／又は細菌を含む、様々な細胞種類を着色するために使用される。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、本開示の粒子造影剤組成物によって着色された、撮像細胞の特徴は、表１に記載される。
【０３９８】
【表１】
0006521940.tif 000002
【０３９９】
特定の実施形態では、粒子造影剤組成物は、安定性、保存の容易性、廃棄、及び／又は限られた毒性のために、製剤化される。
【０４００】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法及び分析器は、細胞形態を観察するために使用され得る。細胞形態における変質は、多くの種類の障害に関連付けられる。かかる変質は、具体的障害及び細胞種類に依存して変化し得るが、概して大きさ、形状、色、及び細胞内構造の不規則性、又は、大きさ、形状、色、及び細胞内構造の不規則性の任意の組み合わせを含む。例えば、ＲＢＣ形状の変質は、肝／腎疾患を示し得る。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、得られた値は、基準レベルと比較され得る。標準な基準レベルは、典型的に、個人の大集団に由来する粒子数を表す。基準集団は、類似する年齢、体型、問題となっている個人の民族的背景又は健康状態、の個人を含み得る。
【０４０２】
該細胞は、おとり細胞又は腫瘍細胞であり得る。
【０４０３】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に開示する方法における使用のための、１つ以上の試薬を含有するキットを含む。一実施形態では、キットは、１つ以上のＰＩＯＡＬのユニットを備えてよい。他の実施形態では、キットは、１つ以上の粒子造影剤組成物を更に備えてよい。キットは、１つ以上の、等張性であり得る緩衝剤、及び／又は希釈剤もまた含んでよい。キット及び又は緩衝剤は、界面活性剤、ｐＨ調節剤、イオン強度変性剤、キレート剤、糖、糖アルコール、タンパク質安定化剤、抗菌剤、及び／又はヘモグロビン試薬を、更に含んでよい。他の実施形態では、該キットはまた、洗浄又は水洗溶液を備えてもよい。該キットは、陽性及び陰性対照のための標準物もまた備えてよい。いくつかの実施形態では、標準物は、標準着色粒子試薬（較正器又はコントロール）を含み得る。キットは、前述のいずれかの、濃縮物もまた含んでよい。キットは、キットの構成要素を移すための、使い捨てマイクロピペット、チップ、又は管等の、使い捨てのもの、コネクタ、洗浄剤（溶液）、又は取扱説明書、操作説明書、分析の証明書、ＭＳＤＳ等、及びかかる要素をユニットとしてまとめるパッケージもまた備えてよい。
【０４０４】
白血球、上皮細胞、病理円柱、及び／又は細菌を含む、粒子、細胞、又は細胞特徴内の特徴を増強させるための粒子造影剤は、２０１４年３月１７日出願の、同時係属の米国特許出願第１４／２１６，５６２号に更に記載され、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４０５】
本明細書に開示する分析器及び方法は、尿内の粒子を含む任意の試料を評価するために使用され得る。該方法は、哺乳類、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、ウマ、ウシ、又は他の家畜、イヌ、ネコ、又はペットとして飼われる他の哺乳類、ラット、ネズミ、又は他の実験室動物、鳥類、例えば、ニワトリ、爬虫類、例えば、ワニ、魚類、例えば、サケ、及び他の養殖種、並びに両生類を含む、幅広い範囲の被験体からの試料に適用可能である。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法及び組成物は、細胞計数、細胞特徴／形態、及び／又は細胞特徴／形態における変質を観察するために使用され得る。かかる変質は、障害に関連付けられ得、具体的障害及び細胞の種類に依存して変化し得るが、概して、大きさ、形状、色、及び細胞内特徴／構造における不規則、又は、大きさ、形状、色、及び細胞内特徴／構造における不規則の任意の組み合わせを含む。例えば、ＲＢＣ形状における変質は、肝／腎疾患を示し得る。
【０４０７】
本開示は、例示的な粒子造影剤組成物及び粒子分析における使用方法もまた提供する。粒子造影剤組成物は、粒子を含有する試料の検出及び／又は分析に好適な、本明細書に記載される分析器を含む、任意の分析器において使用され得る。全体的な態様では、例示的な粒子造影組成物及び使用方法は、研究及び／又は医療実験室で見られる自動化分析器との組み合わせで用いられるときに、有用である。例示的な自動化分析器は、例えば、ヒト体液試料を含む、多数の生体試料における、異なる特徴及び／又は他の特色を、最小限のヒトの補助を伴って検出するように設計される器具である。例示的な自動化分析器は、例えば、尿沈渣自動分析器を含み得る。例示的な分析器は、試料を、個々に、数回に分けて、又は連続的に処理することができる。一実施形態では、本明細書に記載される例示的な粒子造影組成物は、自動粒子計数器及び／又は視覚分析器の使用を必要とすることなく、従来の顕微鏡用途においてもまた使用され得る。
【０４０８】
試料は、希釈、分量に分割、又は濃縮され得る。いくつかの態様では、画像分析の前に、試料は分析器上又は外で、例示的な粒子造影剤組成物に接触させ得る。例示的な粒子造影剤組成物での処理はまた、分析器内で、オンラインで行われてもよい。特定の実施形態では、粒子を含有する試料は、粒子造影剤組成物と接触し、調製された試料は、例示的なＰＩＯＡＬによって包まれ、フローセルを通って輸送される。いくつかの態様では、調製された試料は、高光学解像度撮像デバイスを使用し、そこを通してピクセルデータ画像が周期的に又は連続的に補足される、透明なポート又は窓を有する、フローセルを通して指向され得る。ピクセルデータ画像は、モニタ上に表示され得、並びに／又は、対象の可視特徴を認識するために、自動的に及び／若しくは少なくとも部分的に相互作用的に、分析され得る。典型的な物体の視覚的に区別可能な特徴は、尿試料内の形成成分等の粒子の、分類、副分類、及び／又は類別若しくは副類別、並びに計数に使用される。
【０４０９】
一態様では、本開示は、液体内で懸濁された粒子を含有する試料の撮像のための、視覚分析器に関し、ここにおいて、視覚分析器は、試料の供給源及びＰＩＯＡＬの供給源に結合したフローセルを含み、ＰＩＯＡＬによって包まれるリボン形状の試料ストリームの流れを、フローセル内の表示帯域を通して指向するように構成されるフローセルが、内部流路を画定する。高光学解像度撮像デバイスに関連付けられる対物レンズは、対物レンズ光学軸が、フローセル内で、リボン形状の試料ストリームと交差するように、位置付けられる。対物レンズとフローセルとの間の相対距離は、フォトセンサアレイ上でデジタル画像を解像及び収集するために、コントローラに結合するモータ駆動の操作によって可変である。自動焦点パターン（例えば、デジタル画像において可視的な）は、フローセルに対して固定された位置にあり、自動焦点パターンは、リボン形状の試料ストリームの平面から既定の距離に位置付けられる。光源は、リボン形状の試料ストリーム及び自動焦点パターンを照射する。少なくとも１つのデジタルプロセッサが、モータ駆動を操作するために、コントローラに関連付けられる。プロセッサは、デジタル画像を分析するために配置される。プロセッサは、高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム上に焦点化させるために、自動焦点パターンの焦点位置を決定し、対物レンズ及びフローセルを、焦点位置から既定の距離（例えば、「変位距離」）にわたって相対的に変位させる。
【０４１０】
別の態様では、視覚分析器は、画像の自動化分析を容易にするために、プロセッサを備えてよい。一態様では、視覚分析器は、自動化した画像ベースの尿形成成分計数を提供するために、本開示の方法において使用され得る。特定の態様では、本開示の方法は、被験者が健康であるか又は疾患、病態、異常、及び／若しくは感染症を有するかの、判定、診断、予後診断、予測、及び／又は診断の支持、並びに／あるいは、被験者が治療に反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察のための、形態異常の自動化識別に関する。
【０４１１】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、フローセル内に誘導され、撮像区域を通りその後排出部に向かって、試料流体を運ぶ。試料流体の流れは、相当な幅を伴う流路を確立するために、平坦なオープニングを伴うカニューレを通して注入され得る。いくつかの実施形態では、注入される試料流体は、注入の前に粒子造影剤組成物で処理され、調製される。本発明の別の態様では、試料は、一連の弁及びポンプを操作することにより、フローセルに注入され得る。一態様では、試料流体及びＰＩＯＡＬの流れは、精密流体ポンプにより、選択された流量で、フローセルに導入される。
【０４１２】
試料流体及びＰＩＯＡＬの粘性及び流量、並びにフローセルの輪郭及び寸法は、ＰＩＯＡＬの流れが試料の流れを、信頼可能な位置での表示帯域を通して、一定して平坦なリボンに、平坦化及び伸張させるように準備され得る。例えば、ＰＩＯＡＬは、注入された試料を流れ内で一定のレベルで定位置に維持する傾向がある、対称的に平坦化する断面を伴う流路に沿って流れ得る。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬは、試料流体よりも相対的により高い粘性を有し、試料の注入点での、相対的なＰＩＯＡＬ及び試料の線流量は、試料流体が薄いリボン形状の試料ストリームに平坦化するようなものである。
【０４１３】
リボン形状の試料ストリームは、ＰＩＯＡＬと共に運ばれ、リボン形状の試料ストリーム内の粒子を表示するために高光学解像度撮像デバイス及び光源（例えば、ＵＶ、可視、ＩＲ）が配置される、表示ポートの正面を通る。高光学解像度撮像デバイス及び光源は、粒子の背面光画像を取得するために、フローセルの対向壁上に位置付けられ得る。高光学解像度撮像デバイスは、フローセル内の表示ポートを通して、試料流体のピクセル画像を捕捉する。例えば、高光学解像度撮像デバイスは、試料流れ粘性と一致した反復率で画像を捕捉し、よって、リボン形状の試料ストリームの断面は、実質的な途切れ又は重複なく撮像される。
【０４１４】
本発明の実施形態は、フローセルを通って流れる、リボン形状の試料ストリームの画像の収集のために、システムの設計及び動作において実装される、多数の独特な構造的及び機能的特徴を提供する。例示的な実施形態は、粒子及び／又は細胞の種類を互いから区別することができるようにする、血球等の様々な粒子の異なる特徴を露呈するために十分な明確性及び解像度を伴う、十分に焦点化した粒子の画像を取得するように構成される。
【０４１５】
一態様では、フローセルの対照的性質、並びに試料流体及びＰＩＯＡＬの注入の様式は、ＰＩＯＡＬ内のリボン形状の試料ストリームのための、フローセル内の再現可能な位置を提供する。しかしながら、フローセル及び高光学解像度撮像デバイスの相対位置は、変更の対象であり、高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリームとの間の最適距離を維持するための、折に触れた位置調節を必要とし、このようにして粒子の質の高い焦点画像を提供する。
【０４１６】
本発明の実施形態は、リボン形状の試料ストリームと高光学解像度撮像デバイスとの間の距離を、非常に正確に設定することによって、信頼可能に焦点化した試料の画像を提供するように、自動焦点化デバイス／装置を組み込む、尿及び／又は他の生体液のための、自動化視覚分析器システム及び方法を包含する。一態様では、本明細書に開示する自動焦点化システムの実施形態は、リボン形状の試料ストリームと高光学解像度撮像デバイスとの間の距離を非常に正確に設定することができ、信頼可能に焦点化した試料の画像を捕捉することができる。いくつかの実施形態では、良好な焦点結果に到達する距離を確立するために、アルゴリズムが使用される。
【０４１７】
ＰＩＯＡＬの流れ内に包まれるリボン形状の試料ストリームのための、安定かつ高度に再現可能な位置を提供するフローセルを、高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリームとの間の最適焦点距離を維持する、高光学解像度撮像デバイス及び自動焦点化デバイス／分析器との組み合わせで、用い、よって質の高い焦点画像を提供することが１つの目的である。
【０４１８】
かかる装置及び方法は、本明細書に開示及び請求される。フローセル内の再現可能なリボン形状の試料ストリーム距離を生成することが分かっている、対称性フローセルが提供される。焦点化は、リボン形状の試料ストリーム上の焦点を維持するために、高光学解像度撮像デバイスのリボン形状の試料ストリームに対する、精密に正確な相対位置を設定することを含む。
【０４１９】
好都合なことに、フローセル及び／又は高光学解像度撮像デバイスは、自動焦点化プロセスにおいて、高造影パターン又は類似する焦点目標等の自動焦点パターン、好適には縁等の鮮明な造影特徴を伴う平面パターン、を使用して、互いに対して移動させることができ、自動焦点パターンは、フローセルに対して位置が固定され、試料自体の代わりに焦点対象として使用される。リボン形状の試料ストリームは、高光学解像度撮像デバイスの光学軸に平行な線に沿い、自動焦点パターンから固定された距離にある。自動焦点パターンとリボン形状の試料ストリーム位置との間の変位距離は、一定の距離であり、これは、初期に決定され、自動焦点デバイス／分析器にプログラム化される。その後の例示的な技術は、自動焦点パターン上に自動焦点化すること、その後高光学解像度撮像デバイス及び／又はフローセルを互いに対して既定の距離で変異させることであり、ここにおいて、高光学解像度撮像デバイスとリボン形状の試料ストリームの位置との間の距離は、質の高いリボン形状の試料ストリームの画像を提供するための最適距離である。例えば、まず、自動焦点化アルゴリズムは、高光学解像度撮像デバイスの位置を、リボン形状の試料ストリームから固定距離に位置付けられる自動焦点パターン上に焦点化する。自動焦点パターン上に焦点化すると、プロセッサは既定の変位にわたってモータ駆動を操作し、それによって、リボン形状の試料ストリームを高光学解像度撮像デバイスで焦点化させる。
【０４２０】
例示的な高光学解像度撮像デバイスは、粒子の画像（例えば、視覚）特徴を解像するために、十分な詳細を提供するように、十分な拡大及び解像度で、粒子を露呈する画像を捕捉することが可能な、対物レンズ及び関連付けられるピクセル画像センサを備える。
【０４２１】
ＰＩＯＡＬ流路は、同等な量のＰＩＯＡＬが、試料ストリームの上及び下を流れるように、対称的に準備され、これは、薄いリボンの試料ストリームを、伸張させ、自動焦点パターンから高光学解像度撮像デバイスの光学軸に平行なラインに沿う、固定距離に位置付ける一実施形態では、自動焦点パターンは、後部照射の供給源から光を入れる開口部の周囲に、不透明なボーダーを含み、自動焦点パターンの距離には、自動焦点コントロールによって、容易にかつ明確に絞り込める。更なる自動焦点化は考えられるものの、試料の画像内容物上に直接自動焦点化する必要はない。
【０４２２】
自動化した焦点化構成は、光学軸に沿い、フローセル及び高光学解像度撮像デバイスの相対距離を調節する、モータ駆動を含み、これは、距離の範囲にわたる焦点の質の１つ以上の尺度を評価するプロセッサからの、制御信号に反応性であり、最適距離を探す。例えば、プロセッサは、造影の尺度を評価し得、自動焦点化のために、モータ駆動を操作し得る。通常の動作では、プロセッサは、パターン上に自動焦点化するようにモータ駆動を操作し、高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の距離を、自動焦点パターンから、記録した変位で調節し、リボン形状の試料ストリームに焦点化する。デバイスがリボン形状の試料ストリームを同じように移動させ続け、熱膨張又は類似する交絡因子が発生しない限り、リボン形状の試料ストリームの画像は、焦点化したままとなる。
【０４２３】
予備的設定又は較正プロセスは、フローセル内の、自動焦点パターンとリボン形状の試料ストリームの位置との間の変位距離を、決定及び記録するために使用され得る。異なるフローセルについてはわずかに異なり得る、正確な変位距離は、例えば、二者択一的に、自動焦点パターン上及び試験リボン形状の試料ストリーム上に数回自動焦点化すること、並びに、平均結果をフローセルに関連付けられる定数として記録することにより、予備的試験によって確立される。
【０４２４】
結果的に、調製された尿試料等の、撮像される試料は、フローセル内で、画定された流路に沿って表示帯域を通して方向付けられる。好適には、ＰＩＯＡＬ流路は対称性であり、試料はＰＩＯＡＬの流れの中心に注入され、これによって試料は包まれる。試料及びＰＩＯＡＬの流量及び粘性及び密度特色は、フローセルの輪郭と共に、試料を、再現可能な位置にて表示帯域を通って一定に流れる平坦なリボンに形成するために協働する。
【０４２５】
試料は、高光学解像度撮像デバイスのカメラ構成要素によって撮像されてよく、収集されたデジタル画像は、本明細書に記載される自動焦点プロセスを含む、少なくとも部分的に自動化した画像分析プロセスで分析される。
【０４２６】
１つの目的は、本明細書に記載される血球等の尿試料内の粒子を、区別、分類、副分類、及び／又は計数することであり、これは特定の条件に関連付けられ得る。一態様では、本開示の粒子造影剤組成物は、驚くべく高い質の流れ内の粒子の画像を提供するように、本明細書に記載される分析器等の分析器と組み合わされ得る。高い質の粒子の画像は、自動的に捕捉及び処理されてよい。
【０４２７】
該画像は、被験者が健康であるか、又は疾患、病態、異常、及び／若しくは感染症を有するかの、判定、診断、予後診断、予測、及び／若しくは診断の支持、並びに／又は、被験者が治療に対して反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察に有用な、自動化した画像ベースの尿形成成分計数、並びに、形態異常の自動化した識別を可能にする。尿試料内の細胞分類及び／又は副分類計数は、本開示において、分析され得る流体の種類の非制限的な例として使用される。
【０４２８】
フローセルを、本明細書に記載される例示的な造影剤組成物と、粒子認識のための最適な質の画像及び詳細を提供する例示的なＰＩＯＡＬとの、組み合わせで用いることが１つの目的である。更に、ＰＩＯＡＬ及び装置は、ＰＩＯＡＬの流れ内に包まれるリボン形状の試料ストリームのための、安定かつ高度に再現可能な位置を提供する。これは、高光学解像度撮像デバイスと、高光学解像度撮像デバイスのリボン形状の試料ストリームまでの光学距離を維持する、自動焦点化デバイス／装置との組み合わせで、質の高い焦点画像を提供する。
【０４２９】
対照的に、他の分析器、例えば、視覚分析器等の画像ベースの弁別器は、細胞若しくは凝集細胞、及び／又は粒子若しくは凝集粒子の、外見に基づき、異なる分類及び副分類の例示的な細胞及び／又は粒子の間を弁別することが可能である。一実施形態では、画像は、細胞核又は細胞の核成分に関連する情報を提供する。一実施形態では、本開示の粒子造影剤組成物で処理された粒子の画像は、顆粒組成物及び／又は細胞の特徴に関連する情報を提供する。一実施形態では、画像は核細胞質及び細胞の顆粒成分に関連する情報を提供する。顆粒、細胞質、及び／又は核特徴は、独立的に又は互いとの組み合わせでの細胞分類及び副分類に、少なくとも部分的に決定的であり得る、画像ベースの（例えば、視覚）特質である。
【０４３０】
自動化デバイス上のソフトウェアによる粒子認識のための、最適造影を提供するために、本開示の粒子造影剤組成物を選択することによって、本開示の組成物は、尿沈渣粒子分類及び副分類等の、粒子分類及び副分類の方法において有用である。
【０４３１】
本発明の方法の一態様では、粒子造影剤組成物に接触させ、撮像される細胞は、白血球であってよい。別の態様では、本発明の方法は、白血球分類及び副分類を含んでよい。
【０４３２】
本発明の方法の別の態様では、粒子造影剤組成物に接触させ、撮像される細胞は、マラリア感染細胞、癌細胞、細菌、又は寄生虫等の、異常粒子である。
【０４３３】
粒子撮像システムにおいて使用される従来のシース液は、実質的に粒子を整列させる又は焦点粒子内容物を増加させることはない。粒子及び／又は細胞内小器官整列液体（ＰＩＯＡＬ）が、正確な自動化粒子分類及び副分類を行うために、有用な、方法及び組成物の必要性がある。本開示のいくつかの態様においてもまた提供されるが、ＰＩＯＡＬは、本開示のシステムのフローセル内で使用される。
【０４３４】
本開示は、粒子分析を実行するための、新奇組成物及びその使用方法を提供する。特に、本開示は、試料内の粒子の分析のために分析器内で使用される、ＰＩＯＡＬに関連する。本開示は、ＰＩＯＡＬを生成するための方法、及び粒子を分析するためにＰＩＯＡＬを使用するための方法を更に提供する。本発明のＰＩＯＡＬは、例えば、試料内の粒子の自動化分類及び副分類の方法において、有用である。
【０４３５】
本開示の発明の一態様は、ＰＩＯＡＬ内の少なくとも１つの粘性剤及び／又は粘性変性剤は、粒子、細胞の整列、及び、フローセルを通って流れる細胞の細胞内構造等の粒子内構造の焦点内容物を、有意に改善するという、予想外の観察に基づく。ＰＩＯＡＬは、流れの方向に実質的に平行な平面における細胞の整列を改善し、高光学解像度撮像デバイスの焦点面における、非球形粒子の画像投影を最大化し、画像最適化及び焦点粒子の数の増加をもたらす。これは、細胞内構造、小器官、又はローブ等の、粒子内構造の、流れの方向に実質的に平行な、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好な位置付けもまたもたらす。結果的に、いくつかの態様では、本発明の組成物及び方法は、焦点ローブ、細胞質、及び／又は顆粒等の、増加した焦点細胞内容物をもたらす。本発明の組成物及び方法は、粒子のより精密な分類及び／又は副分類、並びに計数を更に提供し、差異粒子計数を可能にする。
【０４３６】
本発明は、分析器内での使用に好適なＰＩＯＡＬに関する。一態様では、本開示は、流路内の所与の粘性の尿試料の流れを方向付けるように構成される、分析器内での使用のためのＰＩＯＡＬを提供し、ＰＩＯＡＬは試料の粘性とは異なる粘性を有する流体を含み、ＰＩＯＡＬは、試料の流れを支持すること、及び粒子を整列させること、及び／又は、流れの方向に実質的に平行な面における整列を改善すること、並びに流路内を流れる細胞の、粒子及び焦点内容物を増加させることに効果的であり、それによって、整列した粒子及び細胞の細胞内小器官が撮像され得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、緩衝剤、ｐＨ調節剤、抗菌剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、及びキレート剤のうちの少なくとも１つを更に含む。いくつかの実施形態では、ＰＩＯＡＬは、追加の適合性構成要素を含有し得る。
【０４３７】
一態様では、粘性剤／変性剤は、ＰＩＯＡＬ内で、ＰＩＯＡＬの粘性と試料の粘性との間の差異の、動作条件下での、約０．１〜約１０センチポアズ（ｃＰ）、約１．０〜約９．０センチポアズ、３．０〜７．０センチポアズ、又は約５．０センチポアズの、絶対値に、効果的に到達することに十分な濃度で、存在する。一態様では、ＰＩＯＡＬは、より低い粘性を伴う試料と共に使用され得る。別の態様では、ＰＩＯＡＬは、より高い粘性を有する試料と共に使用され得る。一態様では、ＰＩＯＡＬは、最大１００％の粘性剤を含む。
【０４３８】
別の態様では、本発明のＰＩＯＡＬは、ｐＨ調節剤を更に含む。一実施形態では、ＰＩＯＡＬのｐＨは、試料への導入の前に、動作条件下で、約６．０〜約８．０である。一実施形態では、ＰＩＯＡＬのｐＨは、動作条件下で、約６．５〜約７．５である。一実施形態では、該ｐＨは、動作条件下で、約６．８〜約７．２である。
【０４３９】
一態様では、本発明のＰＩＯＡＬは、１つ以上の抗菌剤を更に含んでよい。いくつかの態様では、抗菌剤は、例えば、殺真菌力を有する物質（殺真菌剤）及び／又は殺菌力を有する物質（殺菌剤）であり得る。
【０４４０】
特定の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、プロカインＨＣｌ等の、追加の適合性構成要素を含有し得る。
【０４４１】
特定の実施形態では、ＰＩＯＡＬは、バッチ又はロット識別に好適な、検出可能不活性マーカを更に含み得る。一態様では、本開示は、流路内の所与の粘性の試料の流れを方向付けるように構成される、視覚分析器／分析器内での使用のための、ＰＩＯＡＬを提供し、ここにおいて該液体は、試料の粘性とは異なる粘性を有する流体を含み、例えば、ＰＩＯＡＬは試料よりも高い粘性であり、ＰＩＯＡＬは、流路内を流れる細胞の、粒子及び細胞内小器官の焦点化内容物を、整列及び増加させること、並びに、流れ内の粒子及び細胞の高い質の撮像を可能にすることに、効果的である。
【０４４２】
別の実施形態では、本開示のＰＩＯＡＬは、イオン強度を調節するための、イオン強度変性剤を含む。例示的なイオン強度変性剤は、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＨＣＯ３−、硫酸、ピロ硫酸、リン酸、ピロリン酸、クエン酸、カコジル酸、又は他の好適な塩を含み得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは等張性であり得る。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、等張性であり、及び／又は、等張性の水溶液を含む。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、塩化ナトリウムを含む。一実施形態では、該塩化ナトリウムは、約０．９％の濃度で存在する。一態様では、ＰＩＯＡＬは、尿と同じ浸透圧を有する。一実施形態では、本発明のＰＩＯＡＬ内の塩化ナトリウムは、約０．１〜約１０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。ＰＩＯＡＬ内の塩化ナトリウムの濃度は、例えば、１００ミリリットルにおいて約０．９グラムの塩化ナトリウムであり得る。
【０４４３】
一態様では、ＰＩＯＡＬは、動作温度及び条件下で、約１〜１０センチポアズの目標粘性を有する。一実施形態では、濃縮ＰＩＯＡＬの原液が提供され、ここにおいて該濃縮原液は、ＰＩＯＡＬ粘性に到達するように希釈され得る。一実施形態では、原液の濃縮は、動作条件下で、ＰＩＯＡＬの少なくとも１．１倍〜少なくとも約１００倍濃縮である。本明細書で使用される場合、動作温度は、約１０〜４０℃の範囲であり得、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０℃を含む。典型的には、粘性測定は、室温で又は約２５℃で報告される。
【０４４４】
一態様では、本開示は、濃縮した粒子及び細胞内小器官整列液体の原液を提供し、ここにおいて、濃縮した原液は、動作条件下で、約１〜１０センチポアズの粘性に到達するように希釈され得る。
【０４４５】
粘性剤は、流れの方向に実質的に平行な面において細胞を整列させること、並びに／又は、細胞内構造、小器官、若しくはローブ等の粒子内構造を、流れの方向に実質的に平行に、位置付け、再位置付け、及び／若しくはより良好に位置付けることが可能な、任意の化合物である。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、グリセロール、グリセロール誘導体、エチレングリコール、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、水溶性ポリマー、及びデキストランのうちの少なくとも１つから選択される、少なくとも１つの粘性剤を含む。一実施形態では、粘性剤はグリセロールである。一実施形態では、粘性剤は、グリセロール及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。一実施形態では、粘性剤は、ＰＶＰを含む。一実施形態では、粘性剤は、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）を含む。一実施形態では、粘性剤は、ポリエチレングリコールを含む。一実施形態では、粘性剤は、水溶性デキストランを含む。一実施形態では、粘性剤は、グリセロール及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。一実施形態では、粘性剤は、グリセロール及びデキストラン、例えば、硫酸デキストランを含む。一実施形態では、粘性剤はグリセロール誘導体を含む。一実施形態では、粘性剤は、エチレングリコールを含む。一実施形態では、粘性剤は、プロピレングリコール（ジヒドロキシプロパン）を含む。粘性剤は、ラクトース、スクロース、マルトデキストリン、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、セルロース、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＮａＣＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、及びそれらの組み合わせもまた含み得る。更に、粘性を修正するための追加の薬剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９０年６月、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．に記載される。これらの薬剤は、所望の最終の張度及び粘性に応じて選択され得る。粘性変性剤は、ＰＩＯＡＬ内で、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５〜約１０センチポアズの粘性を提供するために好適な、光学的透明性を含む光学特色を伴う、視覚分析器内での使用に適切な、任意の薬剤を含み得る。
【０４４６】
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、動作条件下で、ＰＩＯＡＬの約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。例えば、粘性剤／変性剤はまた、動作条件下で、約３〜約３０％（ｖ／ｖ）の濃度でも、ＰＩＯＡＬ内に存在し得る。例えば、一実施形態では、グリセロール粘性剤／変性剤は、動作条件下で、約５．０％〜約８．０％（ｖ／ｖ）の最終濃度でＰＩＯＡＬ内に存在し得る。別の態様では、グリセロール粘性剤／変性剤は、動作条件下で、約６．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度で存在し得る。更に別の実施形態では、グリセロール粘性剤／変性剤は、動作条件下で約５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、グリセロールである。更に別の実施形態では、グリセロール粘性剤／変性剤は、動作条件下で約３０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、グリセロールである。
【０４４７】
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、動作条件下で、ＰＩＯＡＬの約１〜約５０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するＰＶＰであり得る。例えば、粘性剤／変性剤ＰＶＰは、ＰＩＯＡＬ内で約１．０〜約１．６％（ｗ／ｖ）の濃度で存在し得る。一実施形態では、ＰＶＰは、ＰＩＯＡＬ内で約１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【０４４８】
別の態様では、ＰＩＯＡＬ内の粘性剤／変性剤は、ＰＩＯＡＬの約１〜約１０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するグリセロールと、約０．５〜約２．５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在するＰＶＰとを伴い、グリセロール及びＰＶＰの組み合わせであり得る。例えば、一実施形態では、グリセロールは、ＰＩＯＡＬ内に、約５％（ｖ／ｖ）の濃度で、約１％（ｗ／ｖ）のＰＶＰとの組み合わせで存在する。
【０４４９】
一実施形態では、本開示のＰＩＯＡＬは、本開示の任意の分析器、例えば、視覚分析器を備える分析器、及びプロセッサと共に使用され得る。一実施形態では、視覚分析器は、対称性流路を伴うフローセル、及び自動焦点構成要素を備える。一実施形態では、分析器は粒子計数器を備え得る。
【０４５０】
一態様では、本開示は、液体内に粒子を含有する試料のための、視覚分析器／分析器を提供することにより、例示的なＰＩＯＡＬを使用する、粒子の撮像方法を提供する。視覚分析器は、試料の供給源及びＰＩＯＡＬの供給源に結合するフローセルを有し、ここにおいてフローセルは内部流路を画定し、フローセルはＰＩＯＡＬによって包まれるリボン形状の試料ストリームの流れを、フローセル内の表示帯域を通して方向付ける。分析器は、本開示の高光学解像度撮像デバイスを備えてよい。
【０４５１】
層流は、少なくとも２つのＰＩＯＡＬ層に包まれた又はその間の、リボン形状の試料ストリームを含み、確立される。リボン形状の試料ストリーム及びＰＩＯＡＬは、異なる粘性を有し得る。一実施形態では、試料の粘性は、ＰＩＯＡＬのものよりも低い。別の実施形態では、ＰＩＯＡＬの粘性は、試料のものよりも低い。
【０４５２】
一実施形態では、分析される粒子は、少なくとも１つの球形粒子を含み、球形粒子、非球形粒子、又は両方を含み得る。それぞれの実施形態では、粒子は、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片を含み得る。一実施形態では、粒子は少なくとも１つの球形粒子を含む。一実施形態では、球形粒子は白血球又は微生物である。一実施形態では、粒子は少なくとも１つの非球形粒子を含む。一実施形態では、撮像条件下での非球形粒子の画像投影は、分析器の焦点面において増加する。一実施形態では、非球形粒子は、赤血球、上皮細胞、円柱、白血球凝集塊、及び／又は出芽若しくは菌糸酵母である。
【０４５３】
一態様では、本開示は、ａ）試料内の粒子を粒子造影剤組成物に接触させること、ｂ）調製した試料内の粒子を視覚分析器内に光で照射すること、ｃ）ＰＩＯＡＬ内に包まれた粒子のデジタル画像を取得すること、ｄ）画像（例えば、視覚）特徴に基づいて試料内の粒子を分析すること、並びにｅ）粒子のそれぞれの分類及び／又は副分類の特色的視覚特徴に従って粒子を分類及び／又は副分類すること、を含む、粒子を差異的に分類及び／又は副分類するための方法を提供する。
【０４５４】
一実施形態では、画像情報は、球形粒子を含む粒子／細胞の、焦点内容物を含む。一実施形態では、該粒子、細胞、又はそれらの一部は、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液のうちの、少なくとも１つから選択され得る。粒子状物質、細胞凝集塊、又は細胞断片若しくは成分。一実施形態では、該粒子の焦点化内容物は、差異的に着色した核構造、差異的に着色した細胞基質構造、又は差異的に着色した成分のうちの、少なくとも１つを含む。
【０４５５】
一実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも５０％は、流れの方向に実質的に平行な、例えば、平行な、面において整列するか、又は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、撮像条件下で、画像投影を最大化させる。別の態様では、フローセル内での本発明のＰＩＯＡＬの使用は、非球形粒子のうちの少なくとも９０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列すること、又は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において撮像条件下で画像投影を最大化することを可能にする。本発明の一態様では、非球形粒子のうちの少なくとも９２％は、流れの方向に実質的に平行な面において整列するか、又は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、撮像条件下で、画像投影を最大化させる。別の実施形態では、非球形粒子のうちの少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、若しくは９５％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列する、及び／又は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において撮像条件下で画像投影を最大化する。別の実施形態では、流れの方向に実質的に平行な面において整列する、又は高光学解像度撮像デバイスの焦点面において撮像条件下で画像投影を最大化する、非球形粒子の割合は、上述の割合のうちの任意の２つの間の任意の範囲であり得、例えば、少なくとも７５〜８５％、７５〜８０％、７５〜９２％、９２％〜９５％、又は他の範囲である。
【０４５６】
一実施形態では、球形粒子は、小器官、核構造、細胞基質構造、又は顆粒を、流れの方向に実質的に平行に、より良好に位置付け、再位置付け、及び／又はより良好に位置付け、核構造、細胞基質構造、又は顆粒のうちの少なくとも５０％が、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、流れの方向に実質的に平行になる。一実施形態では、球形粒子は、核構造、細胞基質構造、又は顆粒のうちの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、又は少なくとも９２％を、高光学解像度撮像デバイスの焦点面における流れの方向に実質的に平行であるか、又は、流れの方向に実質的に平行、例えば、平行、な面において整列する状態で有する。別の実施形態では、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において流れの方向に実質的に平行な、球形粒子構造の割合は、上述の割合のうちの任意の２つの間の範囲であり得る。一実施形態では、非球形粒子の内容物の少なくとも７５％は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、流れの方向に実質的に平行である。別の態様では、フローセル内での本発明のＰＩＯＡＬの使用は、非球形粒子の内容物の少なくとも９０％又は９２％が、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において、流れの方向に実質的に平行になることを可能にする。
【０４５７】
本発明の方法のいくつかの実施形態では、画像情報は、粒子内容物の画像である。いくつかの態様では、粒子内容物は、差異的に着色した核構造、差異的に着色した細胞基質構造、又は差異的に着色した粒子内の成分のうちの、少なくとも１つを含む。着色に感受性のある粒子の例は、ＷＢＣ及び上皮細胞である。
【０４５８】
一態様では、本発明の方法は、被験者が、疾患、病態、異常、若しくは感染症を有するかの判定、診断、予後診断、予測、及び／若しくは診断の支持、並びに／又は、被験者が治療に対して反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察に、有用な、画像ベースの尿形成成分分析、並びに形態異常の自動化識別を得ることにおいて、有用な、流れ内の細胞の驚くべき高い質の画像を提供する。
【０４５９】
一態様では、本開示は、尿等の生体液内の粒子を着色するために使用され得る粒子造影剤組成物に関する。本発明の組成物及び方法は、一態様では、例えば、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片等の、粒子の計数及び特徴付けのために、粒子特徴を増強するために、並びに、白血球差異計数、及び白血球分類、副分類、特徴付け、及び分析のために、使用され得る。本開示の方法におけるいくつかの態様では、試料は、分析器上にインラインで、粒子造影剤組成物で処理され得る。別の態様では、試料は、視覚分析器への導入の前に、粒子造影剤組成物で処理され得る。
【０４６０】
一態様では、粒子造影剤組成物は、１つ以上の細胞の種類が実質的に無傷のまま残る条件下で、粒子及び／又は細胞の特徴を増強するために使用される。他の態様では、粒子造影剤組成物は、細胞断片又は他の粒子を処理するために使用される。いくつかの態様では、粒子造影剤組成物は、白血球及び／又は上皮細胞及び／又は細菌の、細胞特徴を、着色及び／又は増強するために、使用され得る。
【０４６１】
本発明の態様及び実施形態は、例えば、着色／染色組成物を含む、特定の粒子造影剤組成物、及び／又はそれらの組み合わせが、画像ベースの、自動化尿試料分析を行うために使用されるときに、予想外の特性及び有効性を有するという、驚くべくかつ予想外の発見に基づく。一態様では、本発明は、クリスタル紫、サフラニンＯ、エオシンＹ、新メチレン青、及び／又はメチル緑のうちの少なくとも１つを含む、粒子造影剤組成物に関する。着色料／染色量は、生存可能及び／又は実質的に無傷な細胞を着色し、画像ベースの分類及び副分類のための視覚特質を生成することに効果的な量で、存在し得る。特定の実施形態では、対象の粒子は、細胞膜を更に含む細胞粒子を含み得る。特定の実施形態では、細胞膜の透過性は、これらの細胞粒子において、造影剤の細胞内内容物への接近可能性を増加させ、それによって、表示又は撮像されるときに、細胞内容物の特徴を増強するために、透過剤及び固定剤の使用によって、変更又は調節され得る。一実施形態では、透過化剤は第四アンモニウム塩を含む。
【０４６２】
特定の態様では、粒子造影剤組成物の様々な構成要素が、迅速な一工程の粒子着色手順を、効果的に可能にするための量で存在する。
【０４６３】
いくつかの態様では、粒子造影剤の精製方法が開示される。本開示の組成物及び方法において使用される、１つ以上の着色料／染色量を精製することは、試料との接触の際に形成される沈殿物のレベルを低減し、それによりバックグラウンドを低減し、画像の更なるレビュー又は手動で調製する顕微鏡検査に対する必要性の低減で、画像ベースの尿試料分析の結果を改善する。
【０４６４】
一態様では、粒子造影剤組成物は、例えば、細胞が実質的に無傷のまま残る条件下で、細胞特徴を増強することによって、粒子の分類及び副分類のための視覚特質を生成するために、細胞若しくは他の粒子であり得る粒子に接触させるために使用される。例示的な粒子造影剤組成物は、非アルコール系の溶媒系において、造影剤を使用し、生体及び／又は実質的に無傷な細胞の着色画像を取得するために、本開示の方法において使用され得る。別の態様では、粒子造影剤組成物は、細胞膜及び／又は壁を透過化するために、粒子透過化剤もまた含み得る。いくつかの態様では、驚くべきことに、透過化剤を含む本発明の粒子造影剤組成物は、細胞膜を透過化することができ、細胞が実質的に無傷のまま残る一方で、造影剤を細胞の内側に浸透させるということが分かっている。
【０４６５】
いくつかの態様では、粒子造影剤組成物は、白血球、上皮細胞、及び／又は細菌を処理するために使用され得る。例えば、いくつかの態様では、粒子造影剤組成物は、白血球、上皮細胞、細菌のうちの少なくとも１つを処理するため、及び／又は細胞の形態を分析するために、使用され得る。別の態様では、本発明の方法は、白血球分類及び副分類を更に含み得る。
【０４６６】
本発明の方法の一態様では、粒子造影剤組成物に接触させる又は撮像される細胞は、例えば、細菌、寄生虫、又はトリコモナスである。本発明のいくつかの態様では、該細胞は、病態、疾患、感染症、及び／若しくは症候群の、識別、予測、診断、予後診断、及び／若しくはその診断の支持に、並びに／又は、被験者が治療に対して反応性であるか若しくは非反応性であるかの観察に使用され得る、異常細胞である。例示的な造影剤組成物及びそれらの使用及び製造方法は、同時係属の米国特許出願第＿＿＿＿＿号に開示され、該特許の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４６７】
別の態様では、本開示はキットを提供する。一態様では、キットは本明細書に記載されるＰＩＯＡＬの、１つ以上のユニットを備える。別の態様では、本発明は、本発明の粒子造影剤組成物、又は、本発明の粒子造影剤組成物を形成するために組み合わせられ得る、その構成要素及び／若しくは濃縮物、を備えるキットに関し、本明細書に記載される組成物のうちの任意のものが、キット内に含まれ得る。キットはまた、本明細書に記載される方法のうちのいずれかに従う、粒子造影剤組成物の使用の説明書、及び／又はキットの任意の他の構成要素の使用の説明書も含有し得る。該キットはまた、１つ以上の緩衝剤及び／又は希釈剤を備えてもよい。該キット及び又は緩衝剤は、ｐＨ調節剤、イオン強度変性剤、界面活性剤、キレート剤、糖、糖アルコール、タンパク質安定化剤、及び／又は抗菌剤のうちの少なくとも１つを更に含んでよい。他の実施形態では、該キットはまた、洗浄又は水洗溶液を備えてもよい。キットは、陽性及び陰性対照物のための標準物、較正器、又はコントロールもまた備えてよい。いくつかの実施形態では、標準物は、較正器及び／又はコントロールを含有する標準物を含んでもよい。キットは、キットの構成要素を移すための、使い捨てマイクロピペット、チップ、又は管もまた備えてよい。
【０４６８】
別の態様では、本発明は本発明のＰＩＯＡＬ及び少なくとも１つの造影剤を備えるキットに関する。いくつかの態様では、キットは、ＰＩＯＡＬに加え、２つの造影剤を含有し得る。一実施形態では、該キットは、少なくとも１つの透過化剤と、クリスタル紫、新メチレン青、エオシンＹ、サフラニンＯ、及びメチル緑のうちの少なくとも１つとを、分類及び副分類のために、生存可能及び／又は実質的に無傷の細胞を着色することに効果的な量で、備える。
【０４６９】
該キットは、本明細書に開示する方法において使用され得、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、細胞トリコモナス、凝集塊、及び／又は細胞断片等の、尿形成成分の識別に有用であり得る。該キットはまた、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び／又は細胞断片等の尿形成成分の、画像ベースの識別のためのソフトウェアも含有し得る。
【０４７０】
別の態様では、本開示は例示的な試薬キットを使用して、差異粒子／細胞分類及び副分類を行う方法を提供する。
【０４７１】
一態様では、本方法は、例えば、本発明の試薬キットを使用して、粒子を分類、副分類、及び／又は計数する方法に関し、該方法は、１）粒子を含有する試料を粒子造影剤組成物に接触させること、２）生じる処理された試料を視覚分析器に導入すること、３）処理された試料粒子を視覚分析器内で光で照射すること、４）ＰＩＯＡＬ内に包まれた処理された試料粒子のデジタル画像を取得すること、及び５）画像情報に基づいて粒子を分類、副分類、及び計数すること、を含む。一実施形態では、該方法は、自動インライン着色を含む。別の実施形態では、試料は、粒子造影剤組成物との接触の前に、視覚分析器に導入され得る。
【０４７２】
別の態様では、本開示は本明細書に記載されるＰＩＯＡＬ液体組成物の製造方法を提供する。
【０４７３】
別の態様では、本開示は、ａ）粒子の試料を、撮像のために提示されるときに、例えば、試料内の粒子の細胞内内容物特徴を増強することによって、粒子の分類及び副分類のための視覚特質を生成するために、効果的な量で、本明細書に記載される粒子造影剤組成物に接触させること、ｂ）粒子及びその内部詳細の画像を取得すること、ｃ）視覚特質に基づいて、粒子の画像ベースの分類及び副分類を行うこと、を含む、画像ベースの粒子分類及び副分類を使用して、粒子／細胞を差異的に分類及び／又は副分類する方法を提供する。いくつかの態様では、粒子造影剤は、少なくとも１つの透過化剤、少なくとも１つの固定剤、並びに、クリスタル紫、新メチレン青、サフラニンＯ、エオシンＹ、及びメチル緑のうちの少なくとも１つを、粒子分類及び副分類のための視覚特質を生成するために効果的な量で含む。一実施形態では、粒子を含有する試料の、粒子造影剤組成物との接触は、高温で実施される。
【０４７４】
いくつかの態様では、分類、副分類、及び計数は、ａ）粒子を含有する試料を粒子造影剤組成物と接触させること、ｂ）処理した粒子を含有するリボン形状の試料ストリームを、ＰＩＯＡＬ内に包むこと、ｃ）処理した試料粒子を視覚分析器内で、光で照射すること、ｄ）ＰＩＯＡＬ内に包まれた、処理した試料粒子の、デジタル画像を取得する、又は、視覚分析器を使用して粒子を撮像すること、並びにｅ）画像特徴に基づいて粒子を分類及び／又は副分類及び計数すること、を含み得、ここにおいて、粒子は本明細書に開示する任意の粒子であり得る。いくつかの態様では、ＰＩＯＡＬは、本明細書に開示する任意の粘性剤を含み得る。分析器は、本明細書に開示する任意の分析器であり得る。
【０４７５】
別の態様では、本開示は、粒子及び／又は細胞のうちの少なくとも１つを運ぶ試料の流れを支持するように構成される、分析器内のＰＩＯＡＬのための流体組成物を提供する。流体組成物は、粒子を含有する試料流体を含み得、試料流体は所与の粘性を有し得る。更に、流体組成物は、界面表面に沿って試料流体に接するＰＩＯＡＬを含み得、ＰＩＯＡＬは、実質的に透明であり、粒子及び細胞が整列するように、試料流体の粘性よりも高い又は低い粘性を有する。粒子は、本明細書に開示するように整列させられ得るか、又は位置付けられ得る。
【０４７６】
一実施形態では、ＰＩＯＡＬ及び試料流体は、試料流体とＰＩＯＡＬとの間の接触の初期点にて、異なる平均線速度を有する。一実施形態では、試料流体は、ＰＩＯＡＬの２つの層の間に配置され、それによって、ＰＩＯＡＬが試料流体に接する、２つの該界面表面を画定し、該界面表面はある距離分離間される。一実施形態では、界面層を離間させる距離は、粒子及び細胞のうちの該少なくとも１つの、より幅の広い寸法以下である。一実施形態では、界面層を離間させる距離は、ＰＩＯＡＬ及び試料流体のうちの少なくとも１つの流れの方向に沿って、狭細化する。一実施形態では、界面層を離間させる距離は、遷移帯域内で、流れの方向において、粒子のうちの少なくとも１つのより幅の広い寸法以下である距離に狭細化する。一実施形態では、粒子のうちの少なくとも１つのより幅の広い寸法の整列、及び、細胞内小器官又は細胞の小器官の一部の、流れの方向に平行な方向における相対位置は、遷移帯域において増加する。一実施形態では、ＰＩＯＡＬの粘性の試料流体の粘性に対する差異は、約０．１センチポアズ〜約１０センチポアズである。粘性の差異は、リボン形状の試料ストリーム上で作用する、好ましい／好適なせん断力の生成を可能にする。
【０４７７】
本開示は、粒子を含有する試料の分析のための、例示的な粒子造影剤組成物、及び好適な分析器内でのその使用方法を提供する。全体的な態様では、例示的な組成物及びその使用方法は、研究及び／又は医療実験室で見られる、自動化分析器との組み合わせで用いられると有用である。例示的な自動化分析器は、例えば、尿を含む、多数の生体試料内の、粒子の異なるパラメータ及び生化学的構成要素を、最小限のヒトの補助及び高い処理能力を伴って、測定するように設計された器具である。例示的な自動化分析器は、例えば、完全尿形成成分計数を行うことができる、例えば、自動化尿顕微鏡分析器及び／又は細胞計数器を含み得る。いくつかの態様では、分析器は、試料を１回で、数回に分けて、又は連続的に処理することができる。
【０４７８】
いくつかの態様では、試料は、撮像分析の前に、本明細書に記載される例示的な粒子造影剤組成物で処理され得る。いくつかの態様では、例示的な粒子造影剤組成物での処理はまた、分析器内でオンラインで、又は試料を分析器に提供する前に、行われてもよい。いくつかの実施形態では、試料は粒子着色プロセスの一部又は全ての間、加熱され得る。試料はまた、加熱の後、冷却され得る。
【０４７９】
一態様では、本開示は尿試料の分析方法を提供し、該方法は、ａ）試料を、試料の流れを流路に沿って方向付けるように構成される、少なくとも１つのフローセルに導入すること、ｂ）フローセルに、試料と共に、試料の粘性とは異なる粘性を有するＰＩＯＡＬを導入することであって、ＰＩＯＡＬが平坦なリボン内の試料の流れを支持することに効果的である、導入すること、ｃ）視覚分析器を備える分析器上で粒子を撮像すること、ｄ）１つ以上の視覚特質を有する粒子を検出及び計数することを含み、ここにおいて、該粒子は、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片のうちの少なくとも１つを含む。
【０４８０】
別の態様では、本開示は、ａ）フローセルに対して固定された自動焦点パターン上の高光学解像度撮像デバイス、ｂ）既定される尿のリボン形状の試料ストリームからの変位距離に位置付けられる自動焦点パターン、ｃ）リボン形状の試料ストリームに交差する光学軸上の対物レンズを伴う、高光学解像度撮像デバイス、ｄ）モータ駆動の操作によって可変である高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の相対距離、ｅ）フォトセンサアレイ上でデジタル画像を解像及び収集するように構成される、高光学解像度撮像デバイスを備える、尿分析のための視覚分析器を焦点化する、並びに、高光学解像度撮像デバイスをリボン形状の試料ストリーム上に焦点化させるために、モータ駆動を変位距離にわたって操作する方法もまた提供する。一実施形態では、該方法は、リボン形状の試料ストリームをリボン形状に形成することを更に含む。別の実施形態では、光学軸は、リボン形状の試料ストリームに対して実質的に垂直である。別の実施形態では、自動焦点パターンは、限られた大きさの形を含み、変位距離は、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化したときに、該形がデジタル画像において実質的に不可視になるために十分である。更に別の実施形態では、該方法は、ａ）自動焦点化再開信号を検出すること、ｂ）自動焦点パターン上に再焦点化すること、ｃ）変位距離（自動焦点パターンとリボン形状の試料ストリームとの間の既定の距離）にわたってモータ駆動を操作すること、を含み、それによって、高光学解像度撮像デバイスは、リボン形状の試料ストリーム上に焦点化する。一実施形態では、自動焦点化再開信号は、温度の変化、焦点化の質、時間、又はユーザ入力の低減、のうちの少なくとも１つを含む。
【０４８１】
一実施形態では、内部流路は、リボン形状の試料ストリームを形成する。一実施形態では、試料の供給源は、制御可能な試料流量で、試料を提供するように構成される。一実施形態では、ＰＩＯＡＬの供給源は、制御可能なＰＩＯＡＬ流量でＰＩＯＡＬを提供するように構成される。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、既定の粘性を有する。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、試料とは異なる粘性を有する。一実施形態では、ＰＩＯＡＬの粘性、試料物質の粘性、ＰＩＯＡＬの線速度、及び試料物質の線速度は、リボン形状の試料ストリームを、自動焦点パターンから変位距離に維持するために、協調する。一実施形態では、ＰＩＯＡＬは、リボン形状の試料ストリームとの初期接触の際に、リボン形状の試料ストリームよりも速い線速度を有する。一実施形態では、自動焦点パターンは、高光学解像度撮像デバイスの視野の縁に位置付けられる。
【０４８２】
一実施形態では、少なくとも１つの該デジタルプロセッサは、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片の、画像ベースの分類及び副分類を行うように、更に構成される。一実施形態では、少なくとも１つの該デジタルプロセッサは、自動焦点化再開信号を検出するように更に構成され、ここにおいて自動焦点再開信号は、温度の変化、焦点化の質、時間、又はユーザ入力の低減、のうちの、少なくとも１つによって誘発される。一実施形態では、分析器は、厚さで２〜４μｍのリボン形状の試料ストリーム厚さを生成するために狭細化する、内部流路を有する。一実施形態では、該内部流路は、幅が５００〜３，０００μｍのリボン形状の試料ストリームをもたらす。一実施形態では、該内部流路は、幅が１５００〜２５００μｍのリボン形状の試料ストリームをもたらす。一実施形態では、分析器が構成され、ここにおいて試料内の粒子の線速度は、粒子が画像内で実質的にぼけないようなものである。一実施形態では、分析器が構成され、ここにおいて光源は、リボン形状の試料ストリーム及び自動焦点パターンを照射するように、更に構成される。
【０４８３】
一態様では、本開示は、液体内で懸濁された粒子を含む試料のための視覚分析器を提供することと、分析器内でより高い及びより低い粘性である層セクションを有する流れを確立することと、を含む、本明細書に記載されるＰＩＯＡＬを使用する尿内の粒子の撮像方法を提供し、ここにおいて、該分析器は、試料の供給源及びＰＩＯＡＬの供給源に結合したフローセルであって、ここにおいてフローセルが内部流路を画定し、フローセルが、ＰＩＯＡＬによって包まれる試料の流れを、フローセル内の表示帯域を通して方向付ける、フローセルと、リボン形状の試料ストリームと交差する光学軸上の対物レンズを伴う高光学解像度撮像デバイスであって、高光学解像度撮像デバイスとフローセルとの間の相対距離が、フォトセンサアレイ上でデジタル画像を解像及び収集するために、モータ駆動の操作によって可変である、高光学解像度撮像デバイスと、フローセルに対して固定された位置を有する自動焦点パターンであって、自動焦点パターンがリボン形状の試料ストリームの面から変位距離に位置付けられる、自動焦点パターンと、リボン形状の試料ストリーム及び自動焦点パターンを照射するように構成される光源と、モータ駆動を操作しデジタル画像を分析するために結合した少なくとも１つのデジタルプロセッサであって、プロセッサが、自動焦点パターンの焦点位置を決定するように、並びに、高光学解像度撮像デバイス及びフローセルを、焦点位置から変位距離にわたって相対的に変異させるように、構成され、それによって高光学解像度撮像デバイスがリボン形状の試料ストリーム上に焦点化する、プロセッサとを、更に備える。一実施形態では、粒子は少なくとも１つの球形粒子を含む。一実施形態では、粒子は少なくとも１つの非球形粒子を含む。一実施形態では、方法は、特徴を含み、ここにおいて、撮像条件下での非球形粒子の画像投影は、高光学解像度撮像デバイスの焦点面において増加する。一実施形態では、該粒子は、赤血球（ＲＢＣ）、異形赤血球、白血球（ＷＢＣ）、好中球、リンパ球、食細胞、好酸球、好塩基球、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、おとり細胞、尿細管上皮細胞、円柱、結晶、細菌、酵母、寄生虫、楕円脂肪体、脂肪滴、精子、粘液、トリコモナス、細胞凝集塊、及び細胞断片のうちの少なくとも１つを含む。
【０４８４】
一実施形態では、非球形粒子の少なくとも５０％は、流れの方向に実質的に平行な面において整列し、それにより、撮像条件下での、高光学解像度撮像デバイス（ＨＯＲＩＤ）の焦点面における、非球形粒子の画像投影が、増加又は最大化する。一実施形態では、非球形粒子の少なくとも９０％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列し、それによって、撮像条件下での、ＨＯＲＩＤの焦点面における、非球形粒子の画像投影が、増加又は最大化する。一実施形態では、非球形粒子の少なくとも９２％が、流れの方向に実質的に平行な面において整列し、それによって、撮像条件下での、ＨＯＲＩＤの焦点面における、非球形粒子の画像投影が、増加又は最大化する。
【０４８５】
一実施形態では、球形粒子の少なくとも５０％が、整列する、すなわち、球形粒子の粒子内構造が、流れの方向に実質的に平行に、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好に位置付けられる。例えば、球形細胞は、小器官、核構造、細胞基質構造、又は顆粒の少なくとも５０％を、分析器の焦点面内に有する。一実施形態では、細胞等の球形粒子の粒子内構造の少なくとも９０％が、流れの方向に実質的に平行に、位置付け、再位置付け、及び／又は、より良好に位置付けられる。一実施形態では、細胞等の球形粒子の粒子内構造の少なくとも９２％が、流れの方向に実質的に平行に、位置付け、再位置付け、及び／又はより良好に位置付けられる。
【０４８６】
一実施形態では、粒子分類、副分類、及び計数は、大きさ、形状、対称性、及び輪郭のうちの少なくとも１つから選択される、視覚特質に基づく。一実施形態では、撮像は、デジタル撮像である。一実施形態では、撮像は、顕微鏡法によって行われる。一実施形態では、撮像は、従来の顕微鏡法を使用して手動で行われる。一実施形態では、撮像は、自動化される。一実施形態では、粒子は、本明細書に開示する任意の粒子を含み得る。一実施形態では、撮像は、本明細書に開示する任意の実施形態において、分析器を使用して、行われる。
【０４８７】
本明細書に記載される計算又は演算はそれぞれ、ハードウェア、ソフトウェア、及び／若しくはファームウェアを有するコンピュータ又は他のプロセッサを用いて実行されてよい。様々な方法工程はモジュールによって実行されてよく、モジュールは、本明細書に記載される方法工程を実行するために配置される、任意の広範なデジタル及び／又はアナログデータ処理ハードウェア及び／又はソフトウェアを備えてよい。データ処理ハードウェアを任意に備えるモジュールは、これらに伴って適当な機械プログラミングコードを有することによって、これらの工程のうち１つ以上を実行するのに適しており、２つ以上の工程（又は２つ以上の工程の部分）に対するモジュールは、任意の広範な統合処理及び／又は分散処理アーキテクチャにおいて、単一のプロセッサボードに組み込まれている、又は、異なるプロセッサボードに分かれている。これらの方法及びシステムは、多くの場合、上記方法工程を実行するための命令を伴う、コンピュータ可読コードを組み込む有形媒体を利用するだろう。好適な有形媒体は、メモリ（揮発性メモリ及び／又は不揮発性メモリを含む）、記憶媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、テープなどへの磁気記録、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ／Ｗ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤなどといった光学式メモリ、又は任意の他のデジタル若しくはアナログ記憶媒体）などを含んでよい。
【０４８８】
本明細書で参照又は言及する、全ての特許、出版物、科学論文、ウェブサイト、並びに、他の書物及び資料は、本発明が関係する当業者の技術のレベルを示すものであり、それぞれのかかる参考文献及び資料は、その全体が参照により個々に組み込まれる又はその全体が本明細書で説明されるかのように、ここに、参照により組み込まれる。出願者は、任意のかかる特許、出版物、科学論文、ウェブサイト、電気的に入手可能な情報、及び他の参照試料又は書物からの、全ての試料及び情報を、本明細書に物理的に組み込む権利を留保する。
【０４８９】
本明細書に記載される具体的方法及び組成物は、好ましい実施形態の代表であり、例示的であって、本発明の範囲の制限を意図するものではない。他の目的、態様、及び実施形態は、本明細書の考慮の際に、当業者に生じ得、請求項の範囲によって定義される、本発明の精神の範囲内に包含される。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示する発明に、多様な置換及び修正がなされ得るということが、当業者には容易に明らかになるだろう。例示的に本明細書に記載される発明は、本明細書に必須であると特異的に開示されない、任意の要素（１つ若しくは複数）、又は制限（１つ若しくは複数）の欠如において、好適に実施され得る。したがって、例えば、本明細書のそれぞれの例において、本発明の実施形態又は実施例において、「含む」、「本質的に〜からなる」、及び「〜からなる」という用語のうちの任意のものは、本明細書において、他の２つの用語のうちのいずれかと置換されてよい。また、「備える」、「含む」、「含有する」等の用語は、制限なく、拡張的に理解されるべきである。本明細書に例示的に記載される方法及びプロセスは、工程の異なる順序で、好適に実践され得、これらは、本明細書又は請求項に示される工程の順序に必ずしも制限されない。また、本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別様を明確に示さない限り、複数への言及を含む。いかなる状況においても、本特許は、本明細書に具体的に開示する具体的な実施例、又は実施形態、又は方法に、制限されるものと理解されることはない。いかなる状況においても、本特許は、かかる叙述が具体的に、かつ、認定又は留保を伴わず明示的に、出願者によって応答文書において承認されない限り、任意の審査官又は、特許及び商標事務所の任意の他の職員若しくは従業員によってなされる、任意の叙述によって、制限されるものと理解されることはない。
【０４９０】
用いられてきた用語及び表現は、制限ではなく説明の観点で使用され、かかる用語及び表現の使用において、示され記載される特徴又はその一部の、任意の同等物を排除する意図はないが、しかし、請求される発明の範囲内で、様々な修正が可能であるということが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特徴によって、具体的に開示されてきたものの、本明細書に開示される概念の修正及び変形は、当業者によって訴えられ得、かかる修正及び変形は、添付の請求項によって定義される本発明の範囲内であると考えられるということが理解されるだろう。
【０４９１】
本発明は、本明細書に、広範にかつ汎用的に記載されてきた。汎用的開示内に収まる、より狭い種及び亜属群のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これは、削除されたものが本明細書に具体的に記載されているかいないかに関わらず、その部類から任意の主題を取り除く、条件又は消極的な限定を伴う、本発明の汎用的説明を含む。
【０４９２】
他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。更に、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュグループの観点で記載される場合、当業者は、それによって、本発明が、マーカッシュグループの、任意の個々のメンバ又はメンバの下位グループの観点でもまた記載される、ということを認識するだろう。
【０４９３】
図面中に示し、上記で説明したものと異なる構成要素の配置、並びに、示されていない、すなわち説明されていない構成要素及び工程は可能である。同様に、一部の特徴及び部分的組み合わせは有用なものであり、他の特徴及び部分的組み合わせに関係なく使用することができる。本発明の実施形態は、限定目的ではなく例示目的で説明しており、本発明の読者には、別の実施形態が明らかになるであろう。特定の場合では、方法工程又は操作が異なる順序で実施又は実行されてよく、あるいは、操作を追加、削除、又は変更してもよい。本発明の特定の態様では、ある要素若しくは構造を提供するため、又は、ある機能を実行するために、単一の構成要素を複数の構成要素と置き換えてよく、複数の構成要素を単一の構成要素と置き換えてよいことが理解され得る。かかる置換が本発明の特定の実施形態の実行に有効でない場合を除き、かかる置換は本発明の範囲内であると見なされる。したがって、本発明は、上記の、又は図に示した実施形態に限定されず、以下の特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態及び変更がなされてよい。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｃ−１】
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【図４Ｄ−１】
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【図４Ｄ−４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｋ−１】
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【図４Ｋ−２】
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【図４Ｋ−３】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｌ−１】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図４Ｏ】
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【図４Ｐ】
0006521940.tif 000035
【図４Ｑ】
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【図５】
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【図６】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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