(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させ、発酵食品組成物を製造する方法であって、以下に示す（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌、および２価の金属化合物を添加し、該食品のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する工程、
（ｂ）発酵して得られた発酵食品組成物を回収する工程、
を含み、かつ
前記クラス２食物アレルゲンを有する食品が大豆および／または大豆加工食品である製造方法。
【請求項２】
前記２価の金属化合物がマグネシウム化合物、カルシウム化合物および亜鉛化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記２価の金属化合物の添加量が２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｏｌ／Ｌ未満である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記２価の金属化合物の添加量が２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記クラス２食物アレルゲンが、ＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記乳酸菌がラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコ
ッカス属およびエンテロコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選ばれる少なくとも１
つ以上である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
発酵時間が８時間以上３６時間以下である請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラス２食物アレルゲンが低減した発酵食品組成物の製造方法、および安全で風味良好な発酵食品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品の安全性に対する関心が高まる中、食物アレルギー患者の増加あるいは多様化は大きな社会問題となっている。従来、食物アレルギーは、経口摂取した食品に含まれる特定のタンパク質によって感作が成立し、その後、食物を再度摂取した際に蕁麻疹、下痢等の症状を認めるものとされている。【０００３】
しかし、近年、花粉症やラテックスアレルギーに罹患している人において、果実や野菜、豆類を摂取した際、唇や喉等に痒みや腫れ等のアレルギー（クラス２食物アレルギー）を発症する人が増加している。例えば、医療現場において、ハンノキ花粉症に罹患している人が、大豆やモモ、リンゴ、トマト、キウイといった食品を摂取した後、クラス２食物アレルギーを発症し、受診する患者が増加しており、さらに、クラス２食物アレルギーで受診する患者の多くは、自身がクラス２食物アレルギーであるという認識が無い場合が多く、重篤なアレルギー症状に至るという問題が起きている。クラス２食物アレルギーの原因としては、植物や果実等に含まれるクラス２食物アレルゲンが挙げられ、当該アレルゲンは花粉やラテックスのアレルゲンと高い相同性を有することから、花粉症に罹患している人の体内で花粉のアレルゲンと認識されてしまい、アレルギー症状を引き起こすことが判明している。【０００４】
一方、これまでに食物アレルギーに対する解決手段として、プロテアーゼまたは塩水を用いてアレルゲン低減化小麦粉を製造する方法（特許文献１）、乳酸菌由来のプロテアーゼを用いてアレルゲン低減米を製造する方法（特許文献２）、腸内細菌を用いて大豆胚軸を発酵し、大豆に含まれるアレルゲンを低減する方法（特許文献３）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−１０８６３６公報
【特許文献２】特開平１１−００９２０２公報
【特許文献３】特開２０１２−２２８２５２公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、例えば特許文献１または２に記載の方法は、プロテアーゼを使用するため、コストが膨大になるとともに、塩水等を食品に添加するため、得られた発酵物において苦味が生じてしまう問題が懸念される。【０００７】
本発明者らは、上記の先行文献における問題を解決するために、例えば、先行文献３に記載されている、クラス２食物アレルゲンを有する食品を乳酸菌発酵した際のクラス２食物アレルゲン低減について検討を行なった。しかしながら、クラス２食物アレルゲンを有する食品を乳酸菌発酵しただけでは、クラス２食物アレルゲンは十分に分解されておらず、また、発酵物の発酵臭が強くなり、味が劣化するという問題を見出した。【０００８】
以上の問題等を鑑みて、本発明の目的は、クラス２食物アレルギーの原因タンパク質であるクラス２食物アレルゲンを低減し、さらに風味良好な発酵食品組成物を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、クラス２食物アレルゲンを有する食品に特定の範囲のロイシンアミノペプチダーゼ活性を有する乳酸菌を添加し、２価の金属化合物を用いて特定のｐＨ条件下で発酵させることで、食品中のクラス２食物アレルゲンが低減され、さらに風味良好な発酵食品組成物を得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明が提供するのは以下の通りである。
（１）クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させ、発酵食品組成物を製造する方法であって、以下に示す（ａ）〜（ｂ）：
（ａ）クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌、および２価の金属化合物を添加し、該食品のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵させる工程、
（ｂ）発酵させて得られた発酵食品組成物を回収する工程、
を含む製造方法。
（２）前記２価の金属化合物がマグネシウム化合物、カルシウム化合物および亜鉛化合物からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である（１）に記載の製造方法。
（３）前記２価の金属化合物の添加量が２ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１ｍｏｌ／Ｌ未満である（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）前記２価の金属化合物の添加量が２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である（３）に記載の製造方法。
（５）前記クラス２食物アレルゲンが、ＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質である（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）前記クラス２食物アレルゲンを有する食品が大豆および／または大豆加工食品である（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）前記乳酸菌がラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属およびエンテロコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）発酵時間が８時間以上３６時間以下である（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法により得られる発酵食品組成物。
（１０）（９）に記載の発酵食品組成物を含有する食品。
（１１）（９）に記載の発酵食品組成物を含有する飼料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の製造方法は、プロテアーゼを用いずともクラス２食物アレルゲンを分解できるため製造コストが安価となり、さらに味に影響を与える塩水を用いずにクラス２食物アレルゲンが低減した食品組成物を提供することができる。
さらに、本発明の製造方法により得られる発酵食品組成物は、クラス２食物アレルゲンが十分に低減されていることから、花粉症やラテックスアレルギーに罹患している人にとって、安全に摂取することができ、また、良好な風味を有しているため、クラス２食物アレルゲンを有する食品の代替として使用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させて発酵食品組成物を製造する方法に関する。
【００１３】
本発明でいうクラス２食物アレルゲンとは、花粉やラテックスに含まれるアレルゲンとアミノ酸配列の配列同一性が高いタンパク質を指し、主に植物や果実等に含まれる。特定のアレルゲンに対し配列同一性が２０％であれば、アレルギー症状を誘発する場合もあることから、本発明のクラス２食物アレルゲンとは、花粉やラテックスに含まれるアレルゲンとアミノ酸配列の配列同一性が２０％以上であるタンパク質を指す。
【００１４】
具体的には、以下のタンパク質が例示できる。シラカバ花粉の主要抗原である配列番号１に記載のＢｅｔＶ１のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、シラカバ花粉の主要抗原である配列番号２に記載のＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７４％以上の配列同一性を有するアミノ酸からなるタンパク質である。より具体的なクラス２食物アレルゲンとしては、ＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するＰＲ−１０ファミリータンパク質やプロフィリンファミリータンパク質が挙げられ、なかでもＰＲ−１０ファミリータンパク質であり、ＢｅｔＶ１のアミノ酸配列と４７％の配列同一性を有する、ダイズ由来のタンパク質である配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＧｌｙｍ４や、プロフィリンファミリータンパク質であり、ＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と７４％の配列同一性を有する、ダイズ由来のタンパク質である配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＧｌｙｍ３が挙げられる。
【００１５】
尚、Ｇｌｙｍ４、またはＧｌｙｍ３のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するタンパク質、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をからなるタンパク質も本発明でいうクラス２食物アレルゲンに含まれる。
【００１６】
本発明でいうクラス２食物アレルゲンを有する食品とは、クラス２食物アレルギーを引き起こす食品である。例えば、クラス２食物アレルギーを引き起こす食品として、リンゴ、モモ、イチゴ、ナシ、ビワ、サクランボ等のバラ科の食品、メロン、スイカ、キュウリ等のウリ科の食品、大豆、キウイ、オレンジ、ヤマイモ、マンゴー、アボカド、ヘーゼルナッツ（ハシバミ）、ニンジン、セロリ、ジャガイモ、トマト、ゴボウ、クルミ、アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、ライチ、タマネギ、米、小麦、マスタード、パプリカ、コリアンダー、トウガラシ、クミン等が挙げられる。なかでも、シラカバ花粉症に罹患している人の約半数が、クラス２食物アレルギーを発症することから、シラカバ花粉の主要抗原であるＢｅｔ  Ｖ１および／またはＢｅｔ  Ｖ２のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも２０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質を多く含む食品であるリンゴ、モモ、イチゴ、ナシ、ビワ、サクランボ、メロン、スイカ、キュウリ、大豆、キウイ、オレンジ、ヤマイモ、マンゴー、アボカド、ヘーゼルナッツ（ハシバミ）、ニンジン、セロリ、ジャガイモ、トマト、ゴボウ、クルミ、アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、ライチ、マスタード、パプリカ、コリアンダー、トウガラシ等の食品が好ましい。特に、本発明のクラス２食物アレルゲンを有する食品としては、年間の消費量が多く、シラカバ花粉症に罹患している人が摂取した際、アナフィラキシーショック等、重篤なアレルギー症状を示すことが報告されている大豆が好ましい。また、前記クラス２食物アレルゲンを有する食品は、単独または２種類以上の食品を組み合わせて使用してもよい。
【００１７】
さらに、本発明で使用するクラス２食物アレルゲンを有する食品は、上述で挙げられた野菜や果実等を水、熱水または食品に使用可能な有機溶媒等で抽出した抽出物、もしくは搾汁、磨砕、破砕または酵素等の処理した非濃縮物、濃縮物、希釈物または乾燥物等に加工して用いても良い。
【００１８】
また、本発明において、クラス２食物アレルゲンを有する食品に任意成分を適宜添加してもよい。前記任意成分としては、糖質、酵母エキス、肉エキス、ビタミン類、無機塩やペプチド類、アミノ酸類等が挙げられる。
【００１９】
以下に本発明の製造方法を詳述する。
本発明の製造方法は、クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌、および２価の金属化合物を添加し、該食品のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する（ａ）の工程を含む。
【００２０】
本発明におけるロイシンアミノペプチダーゼ活性は、乳酸菌の湿菌体１ｇあたりの反応液とブランクとの５４０ｎｍにおける吸光度の差（５４０ｎｍにおける吸光度の差／湿菌体（ｇ））が１である場合を１ｕｎｉｔとして定義し、Ｍａｔｓｕｔａｎｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，３００，１９６７）の方法に準じて測定することができる。
【００２１】
本発明の製造方法に用いる乳酸菌は、特定のロイシンアミノペプチダーゼ活性を有する乳酸菌であり、ロイシンアミノペプチダーゼ活性としては７５ｕｎｉｔ以上であり、好ましくは７７ｕｎｉｔ以上、より好ましくは１６６ｕｎｉｔ以上、さらに好ましくは３６８ｕｎｉｔ以上である。またロイシンアミノペプチダーゼ活性の上限としては７２０ｕｎｉｔ未満であり、好ましくは７１９ｕｎｉｔ以下であり、より好ましくは５８９ｕｎｉｔ以下である。ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ未満であると、クラス２食物アレルゲンを分解しない、もしくはクラス２食物アレルゲンを分解するための発酵時間が長くなり好ましくない。また、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７２０ｕｎｉｔ以上であると、得られた発酵食品に苦味が発生する場合があり好ましくない。
【００２２】
また、本発明の製造方法に用いる乳酸菌は、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が上記の範囲内にある乳酸菌であれば特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、バチルス属およびビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌等が挙げられる。
より具体的な一例としては、
（１）ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）Ｋ−４株（平成３年５月１５日付で工業技術院微生物工業技術研究所  特許寄託センターに微工研菌寄１２２４９号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２２４９）として寄託されている）、
（２）ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）  Ｒ０３７株（２０１０年２月１０日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９００として寄託されている。）、
（３）ペディオコッカス・エスピー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）３７９株（２０１３年１２月４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７７３として寄託され、２０１４年１１月１７日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７３として国際寄託に移管されている）、
（４）ペディオコッカス・エスピー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）３８０株（２０１３年１２月４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７７２として寄託され、２０１４年１１月１７日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７２として国際寄託に移管されている）、
（５）ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）４６２株（２０１３年１２月４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７７１として寄託され、２０１４年１１月１７日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７１として国際寄託に移管されている）、
などが挙げられる。
【００２３】
本発明の製造方法に用いる２価の金属化合物としては、アルカリ土類金属、周期表１１族金属、周期表１２属金属のいずれかを含む化合物が挙げられるが、なかでも、通常食品として摂取できる観点から酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム等のマグネシウム化合物、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム等のカルシウム化合物、グルコン酸亜鉛、硫酸亜鉛等の亜鉛化合物が好ましい。また、前記２価の金属化合物の代わりに、カルシウム、マグネシウムおよび亜鉛からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の金属化合物含有量の多い食品を添加しても良い。
【００２４】
本発明において、２価の金属化合物の添加量としては、原料であるクラス２食物アレルゲンを有する食品に対して２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、特に好ましくは８０ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。また、２価の金属化合物の添加量の上限としては１ｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。２価の金属イオンを含む化合物の添加量が２ｍｍｏｌ／Ｌ未満であると、クラス２食物アレルゲンを十分に分解できないため好ましくない。また、２価の金属化合物の添加量が１ｍｏｌ／Ｌより大きいと、２価の金属イオン特有の苦味、食感がざらつく等、風味が悪くなるため、好ましくない。
なお、前記２価の金属化合物の添加量を測定するための前記クラス２食物アレルゲンを有する食品の状態としては、前記食品を乳酸菌によって発酵させるために液状組成物としている状態をいう。
【００２５】
また、本発明の（ａ）の工程において、乳酸菌や２価の金属化合物を添加する前に、予め、クラス２食物アレルゲンを有する食品を殺菌することができる。殺菌方法は、使用する食品の種類に応じて適当なものを選択すればよく、例えば、ＵＨＴ（超高温殺菌法）のような高温殺菌、レトルト殺菌、電磁波殺菌、高温真空殺菌、オゾン殺菌、電解水殺菌、間接過熱殺菌などが挙げられるが、特に限定はない。
【００２６】
また、本発明の（ａ）の工程における発酵の温度は、乳酸菌の生育に適した温度であれば、特に限定されないが、例えば、発酵の温度は１５〜４５℃であり、好ましくは２５〜４０℃、さらに好ましくは３０〜３７℃である。
【００２７】
また、本発明の（ａ）の工程におけるクラス２食物アレルゲンを有する食品に乳酸菌を添加し発酵させる際のｐＨは４．０以上であり、好ましくは４．４以上であり、より好ましくは５．５以上である。また、本発明の（ａ）の工程におけるクラス２食物アレルゲンを有する食品のｐＨの上限としては８．５未満であり、より好ましくは７．５以下であり、さらに好ましくは６．５以下である。発酵液のｐＨが４．０未満であるとロイシンアミノペプチダーゼ活性が弱まり所望の発酵食品組成物が得られない場合があり好ましくない。また、発酵液のｐＨが８．５以上であると、乳酸菌の増殖性が悪化し所望の発酵食品組成物が得られない場合があり好ましくない。
【００２８】
本発明の（ａ）の工程におけるｐＨの調整は、発酵中における食品のｐＨが４．０以上、８．５未満になるように必要に応じて行えばよい。ｐＨを調節するにあたっては、食品に使用可能な化合物であれば、特に限定されないが、食品として摂取できる観点から、２価の金属化合物、水酸化ナトリウム、硫酸、アンモニア、クエン酸、乳酸等を用いることができ、これらの化合物を併用しても良い。食品に使用可能な２価の金属化合物としては、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム等のマグネシウム化合物、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム等のカルシウム化合物、グルコン酸亜鉛、硫酸亜鉛、等の亜鉛化合物が挙げられる。ｐＨの調整方法は特に限定されないが、ｐＨ電極で該食品中のｐＨを測定し、自動で供給する方法であっても良いし、発酵前に炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等の中性領域において不溶性の２価の金属化合物を予め添加しても良い。
【００２９】
本発明の（ａ）の工程における発酵時間としては、乳酸菌の種類および生育状況に応じて時間を設定すれば特に限定されないが、具体的には、８時間以上３６時間以下が好ましく、より好ましくは８時間以上２４時間以下、さらに好ましくは１２時間以上２４時間以下である。発酵時間が８時間以上３６時間以下であると、クラス２食物アレルゲンを十分に分解でき、且つ風味が良くなる。
【００３０】
前記（ａ）の工程において、前記発酵時間で行うことで発酵を終了すればよいが、クラス２食物アレルゲンが発酵前よりも４０％以上低減するのに必要な発酵時間を設定すればよい。なお、発酵前の食品または発酵食品組成物中のクラス２食物アレルゲンの量は、後述の実施例に記載の方法により測定すればよい。
【００３１】
さらに、本発明の製造方法は、前記（ａ）の工程で発酵して得られた発酵食品組成物を回収する（ｂ）の工程を含む。
【００３２】
本発明の製造方法における回収としては、発酵食品組成物をそのまま、もしくは、殺菌、均質化等、通常食品の用いられる処理を行った後、容器等に充填すればよいが、必要に応じて、遠心分離、圧搾、ろ過等による濃縮、凍結乾燥、スプレードライ等による乾燥等の処理を行なうことができる。また、特定の物質を低減、濃縮する目的でイオン交換膜等を用いた分離処理、溶剤を用いた抽出処理等を行っても良い。また、本発明の発酵食品組成物の製造方法は、同一の工場内で実施しても良いし、工程毎に異なる工場で実施しても良い。
【００３３】
また、本発明の製造方法より得られた発酵組成物は、原料食品と比べてクラス２食物アレルゲンの含有量が顕著に低減されており、しかも、乳酸菌による発酵で風味が良好なものとなっており、そのまま摂取することが可能であるが、必要に応じて、通常食品に用いられるその他原料を加えても良い。通常食品に用いられるその他原料としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、香料等を当業者の使用形態に応じて適宜混合することができ、前記その他原料の添加量は、当業者の製品形態に応じて設計することができる。
【００３４】
本発明の製造方法により得られる発酵食品組成物は、食品、機能性食品、医薬品、飼料等に用いることができる。
【００３５】
例えば、食品として日常的に摂取する場合、発酵食品組成物を含有する食品の形態には特に限定されず、パン類、ケーキ類、パイ類、クッキー類、和菓子類、スナック菓子類、油菓子類、チョコレートおよびチョコレート菓子類、米菓類、ルウ類、ソール類、たれ類、トッピング類、氷菓類、麺類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなどその他加工品、水産練り製品類、冷凍アントレ類、畜産冷凍食品、農産冷凍食品などの冷凍食品類、米飯類、ジャム類、チーズ、チーズフード、チーズ様食品、ガム類、キャンディー類、発酵乳類、缶詰類、飲料類などの一般食品形態が挙げられる。また、機能性食品および医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。また、飼料として用いる場合は、通常の配合飼料に使用される原料を動物の種類、発育ステージ、地域などの飼育環境に応じて適宜配合してもよい。かかる原料としては、例えば穀物類または加工穀物類（とうもろこし、マイロ、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、キビ、小麦粉、小麦胚芽粉等）、糟糠類（ふすま、米糠、コーングルテンフィード等）、植物性油粕類（大豆油粕、ごま油粕、綿実油粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕等）、動物性原料（脱脂粉乳、魚粉、肉骨粉等）、ミネラル類（炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、食塩、無水ケイ酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸等）、アミノ酸（グリシン、メチオニン等）、ビール酵母などの酵母類、無機物質の微粉末（結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライト等）などが挙げられる。さらに、本発明の飼料に賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等の飼料用添加剤、所望によりその他の成分（例えば抗生物質や殺菌剤、駆虫剤、防腐剤等）を配合してもよい。飼料の形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、ペースト状、ペレット状、カプセル剤（ハードカプセル，ソフトカプセル）、錠剤等が挙げられる。飼料の給与対象となる動物は、特に限定されるものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜類、ニワトリ（ブロイラー、採卵鶏の両方を含む）、七面鳥、合鴨等の家禽類、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、イヌ、ネコなどのペット等が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
以下に、本発明を具体的に説明するために詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００３７】
＜発酵豆乳の調製方法＞
市販の乾燥大豆を水洗し、９倍量の水に３時間浸漬した後、ミキサーでペースト状に粉砕、ガーゼでろ過し、豆乳を調製する。該豆乳にグルコース１％および炭酸カルシウム１．５％（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加し、９０℃、１５分の条件により滅菌した後、乳酸菌を接種し、３７℃で２４時間、攪拌しながら発酵させた。【００３８】
＜Ｇｌｙｍ４の低減率の算出方法＞
ＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸バッファー  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４）で１００倍希釈した発酵前後の豆乳を「９６ウェルＥＬＩＳＡプレート」（イワキ社製）に１００μＬ添加し、３７℃で３０分間静置し、プレートに固定した。発酵前後の豆乳を除去後、蒸留水で５倍希釈したブロッキング剤「ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ」（商品名、ナカライテスク社製）を各ウェルに２００μＬ添加し、室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄用バッファー「ＰＢＳＴ」（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄後、抗体希釈液「Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １」（商品名、東洋紡社製）で１０００倍希釈したＧｌｙｍ４に特異的なウサギ抗血清を各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。
各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄後、抗体希釈液「Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２」（商品名、東洋紡社製）で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。各ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄後、「ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質  ＴＭＢキット」（商品名、ナカライテスク社製）を各ウェル１００μＬ添加し、室温で１５分静置後（発色反応）、１Ｍ硫酸を各ウェル１００μＬ添加（発色停止）し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた発酵前の豆乳と発酵後の豆乳の吸光度を用いて、Ｇｌｙｍ４の低減率を式（１）にて計算した。【００３９】
【数１】
0006581968.tif 000002
【００４０】
＜乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性の算出方法＞
乳酸菌を１０ｍＬの滅菌済みＭＫ−１培地（０．５％酵母エキス、１％  ペプトン、１％  グルコースｐＨ６．８）で３７℃、２４時間培養し、遠心分離により菌体を集菌した。菌体を３０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸バッファー（０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ−３ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ６．２）で洗浄後、再度遠心分離し、湿菌体を得た。該湿菌体重量を電子天秤（ザルトリウス社製）にて測定し、湿菌体の重量を測定した後、３０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸バッファーに懸濁した菌体懸濁液をロイシンアミノペプチダーゼ活性測定に供した。菌体懸濁液０．１ｍＬに０．２ｍＭ  Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド溶液（Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎ−β−ｎａｐｈｔｙｌａｍｉｄｅ／５０ｍＭ  リン酸バッファー）を２ｍＬ加え、３７℃で１時間酵素反応を行った。酵素反応液に、１ｍＬの０．２３Ｎ  ＨＣｌ／エタノール溶液を加え、酵素反応を停止させ、０．０６％ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド／エタノール溶液を加え、３７℃、３０分間インキュベーション後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、反応液の吸光度を測定した。また、ブランクは２ｍＬの０．２ｍＭ  Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド溶液の代わりに、２ｍＬの５０ｍＭ  リン酸バッファーを用いて、前記操作を行い、吸光度を測定した。得られたブランクと反応液の５４０ｎｍにおける吸光度および湿菌体の重量を用いて、乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性を式（２）にて計算した。【００４１】
【数２】
0006581968.tif 000003
【００４２】
＜乳酸菌の選抜方法＞
食品から分離した乳酸菌のうち、上記活性測定法を用いてロイシンアミノペプチダーゼ活性が５０ｕｎｉｔ以上の乳酸菌を選別した。【００４３】
＜発酵豆乳の官能評価＞
１０℃に調製した発酵大豆を５名のパネラーに試飲してもらい、大豆臭と風味を官能にて評価した。大豆臭の評価は、大豆臭を感じないものは「○」、大豆臭をやや感じる場合は「△」、大豆臭を感じる場合は「×」として評価した。風味の評価については、風味が良いものを「○」、風味があまり良くないものを「△」、風味が良くないものを「×」として評価した。【００４４】
（実施例１）＜乳酸菌のＧｌｙｍ４低減率＞
上記発酵豆乳の調製方法に記載の方法に準じて、乳酸菌、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブエスピー・ラクティスＫＬＡＢ−４株（以下、ＬＡＢ４株と記載）、ラクトバチルス・ヘルベティクスＫ−４株（以下、Ｋ４株と記載）およびペディオコッカス・アシディラクティシＲ０３７株（以下、Ｒ０３７株と記載）を用いて発酵豆乳を調製し、上記Ｇｌｙｍ４の測定法に記載の方法に準じて、発酵豆乳中のＧｌｙｍ４を測定した。Ｇｌｙｍ４の低減率を以下の式で求め、表１に示す。
なお、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブエスピー・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）ＫＬＡＢ−４株は、２００７年８月９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３９４として寄託され、２００８年９月２２日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４として国際寄託に移管されている。【００４５】
【表１】
0006581968.tif 000004
【００４６】
表１より、発酵に用いた乳酸菌によりＧｌｙｍ４低減率が異なること見出した。【００４７】
（実施例２）＜実施例１で用いた乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性＞
上記乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定方法に記載の方法に準じて、ＬＡＢ４株、Ｋ４株、Ｒ０３７株のロイシンアミノペプチダーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。【００４８】
【表２】
0006581968.tif 000005
【００４９】
表２より、Ｇｌｙｍ４低減率が０％であったＬＡＢ４株のロイシンアミノペプチダーゼ活性は４８．２ｕｎｉｔであり、Ｇｌｙｍ４低減率が４０％のＫ４株のロイシンアミノペプチダーゼ活性は、７１８．６ｕｎｉｔ、Ｇｌｙｍ４低減率が８０％のＲ０３７株のロイシンアミノペプチダーゼ活性は３６８．３ｕｎｉｔであった。【００５０】
（実施例３）＜ロイシンアミノペプチダーゼ活性が５０ｎｕｉｔ以上を有する乳酸菌のスクリーニング＞
食品素材等から分離した乳酸菌１５株を対象に、上記乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定方法に記載の方法に準じて、各乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼを測定し、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が５０ｕｎｉｔ以上の菌株、ペディオコッカス・エスピー３８０株（以下、３８０株と記載）、ペディオコッカス・エスピー３７９株（以下、３７９株と記載）、ストレプトコッカス・エスピー４６２株（以下、４６２株と記載）を得た。これらの乳酸菌３株のロイシンアミノペプチダーゼ活性を表３に示す。【００５１】
【表３】
0006581968.tif 000006
【００５２】
（実施例４）＜実施例３にてスクリーニングした乳酸菌のＧｌｙｍ４低減率＞
上記発酵豆乳の調製方法に記載した方法に準じて、３８０株、３７９株、４６２株を用いて発酵豆乳を調製し、Ｇｌｙｍ４低減率を求めた。その結果を表４に示す。【００５３】
【表４】
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【００５４】
表４より、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７７．４ｕｎｉｔである３８０株のＧｌｙｍ４低減率は５０％であり、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が１６６．１、５８８．６ｕｎｉｔである３７９株、４６２株のＧｌｙｍ４低減率はいずれも７０％であった。
したがって、実施例１から実施例４の結果より、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ未満の乳酸菌であれば、４０％以上のＧｌｙｍ４低減率を有することを見出した。【００５５】
（実施例５）＜金属化合物の検討＞
市販の乾燥大豆より調製した豆乳に、グルコース１％、金属化合物として、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウムを各々１．５％（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、１．７％（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、１．７％（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）添加し、９０℃、１５分滅菌後、Ｒ０３７株を接種し、３７℃で２４時間、攪拌発酵し、発酵豆乳を調製した。各発酵豆乳中のＧｌｙｍ４を測定し、金属化合物を添加しなかった以外は同様に調整した発酵豆乳と比較した。その結果を表５に示す。【００５６】
【表５】
0006581968.tif 000008
【００５７】
表５より、金属化合物として炭酸カルシウムまたは炭酸マグネシウムを用いた場合は、Ｇｌｙｍ４の低減率が８０％となり、炭酸水素ナトリウムまたは金属化合物を添加していない場合は、Ｇｌｙｍ４は低減しなかった。このことから、Ｇｌｙｍ４低減には、２価の金属化合物が必要であることを見出した。【００５８】
（実施例６）＜２価の金属化合物の添加量（炭酸カルシウム）＞
市販の乾燥大豆より調製した豆乳に、グルコース１％および、炭酸カルシウムを０．０２％（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．２％（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．４％（４０ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．６％（６０ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．８％（８０ｍｍｏｌ／Ｌ）、１．５％（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）、３，０％（３００ｍｍｏｌ／Ｌ）、１０％（１０００ｍｍｏｌ／Ｌ）となるように各々添加し、９０℃、１５分滅菌後、Ｒ０３７株を接種し、２価の金属化合物の濃度が０．０２〜０．４％である豆乳は２５％水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ５．５に維持しながら３７℃で２４時間、攪拌発酵し、２価の金属化合物の濃度が０．６〜１０％の豆乳はｐＨ制御をせずに３７℃で２４時間、攪拌発酵し、各々の発酵豆乳を調製した。前記発酵豆乳中のＧｌｙｍ４を測定し、Ｇｌｙｍ４低減率を算出した。Ｇｌｙｍ４低減率ならびに発酵後のｐＨを表６に示す。【００５９】
【表６】
0006581968.tif 000009
【００６０】
表６より、炭酸カルシウムの添加量が２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、ｐＨ５．５以上に維持し発酵することで、Ｇｌｙｍ４低減率は８０％となり、Ｇｌｙｍ４が十分に分解されていることが分かった。また、炭酸カルシウム添加量が６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上であると、発酵時にｐＨ制御をしなくとも、ｐＨ５．５以上を維持できることを見出した。【００６１】
（実施例７）＜発酵時における食品のｐＨについての検討＞
市販の乾燥大豆より調製した豆乳に、グルコース１％、炭酸カルシウム０．２％（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）になるよう添加し９０℃、１５分滅菌後、Ｒ０３７株を接種し、２５％水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ５．５、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５、ｐＨ８．５に維持しながら３７℃で２４時間、攪拌発酵し、発酵豆乳を調製した。各制御ｐＨで調製した発酵豆乳中のＧｌｙｍ４を測定し、ｐＨ制御を行わない以外は同様に調整した発酵豆乳と比較した。その結果を表７に示す。【００６２】
【表７】
0006581968.tif 000010
【００６３】
表７より、ｐＨをｐＨ５．５からｐＨ７．５に維持した場合、Ｇｌｙｍ４低減率が８０％となり、発酵中のｐＨを５．５からｐＨ７．５の間で調節するのが好ましいことを見出した。【００６４】
（実施例８）＜発酵時間の検討および官能評価＞
市販無調整豆乳に、グルコース１％および炭酸カルシウム０．６％（６０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、９０℃、１５分間滅菌し、Ｒ０３７株を接種後、３７℃で８時間、１２時間、２４時間、３６時間、７２時間の各時間で攪拌発酵し、各々の発酵豆乳を調製した。
各発酵豆乳について、Ｇｌｙｍ４を測定し、未発酵の豆乳と比較した。また、各発酵豆乳および未発酵の豆乳について、上記、官能評価に記載の方法に準じて、臭いおよび味を３点法（×不良、△；普通、○；良好）で行った。Ｇｌｙｍ４の減少率および官能評価の結果を表８に示す。なお、Ｇｌｙｍ４の低減率が４０％以上であり、「臭い」および「味」の少なくとも１つが「○」であるものを合格品とした。【００６５】
【表８】
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【００６６】
表８より、市販無調製豆乳を８時間発酵することにより、Ｇｌｙｍ４の低減率は８０％となった。また、官能評価の結果、発酵時間が８時間から２４時間であると、発酵豆乳の臭いおよび味が良好であることを見出した。
【受託番号】
【００６７】
ＦＥＲＭ  Ｐ−１２２４９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４、ＮＩＴＥ  ＢＰ−９００、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７１
【配列表】
0006581968000001.app