(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチを有する被験体の確率を求める方法であって、
被験体から回収したサンプルから抽出したＤＮＡの配列を得ることと、
前記ＤＮＡの配列に基づいて、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含むバイオマーカーの相対存在量を計算することと、
前記バイオマーカーの相対存在量が所定の閾値より高い場合に前記被験体が関節リウマチのリスクを有するという結論を出すために、前記相対存在量と前記所定の閾値とを比較して、前記相対存在量に基づいて、前記関節リウマチを有する被験体の確率を求めることと
を含み、
前記サンプルが、糞便サンプル、歯科サンプル、及び唾液サンプルのうちの少なくとも１つを含み、
前記ＤＮＡの配列に基づいて前記バイオマーカーの相対存在量を計算することが、
前記ＤＮＡの配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列のコピー数を計算することと、
前記ＤＮＡの配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列について、前記ＤＮＡ配列のコピー数と前記サンプル中の全てのＤＮＡ配列のコピー数の合計との比に基づいて前記ＤＮＡ配列の相対存在量を計算することと、
前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列の前記相対存在量の少なくとも一部に基づいて前記バイオマーカーの相対存在量を計算することを含み、
前記バイオマーカーが、以下のメタゲノム連鎖群（ＭＬＧ）：
前記糞便サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号２１６９からなるＭＬＧ；
前記歯科サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号１６６００からなるＭＬＧ；及び
前記唾液サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号４６４３からなるＭＬＧ
のうちの少なくとも１つを含み、
前記ＭＬＧ番号２１６９の遺伝子が、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号１〜５９３によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている；
前記ＭＬＧ番号１６６００の遺伝子が、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号５９４〜１５３６によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている；及び
前記ＭＬＧ番号４６４３の遺伝子が、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号１５３７〜２５９４によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項２】
ＭＬＧ番号２１６９が、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子からなる；
ＭＬＧ番号１６６００が、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子からなる；及び
ＭＬＧ番号４６４３が、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子からなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関節リウマチに関する処置を評価する方法であって、
関節リウマチを有する複数の被験体の各被験体について、
前記被験体が前記処置を受ける前に前記被験体から回収した第１のサンプルから抽出した第１のＤＮＡ配列を得ること、
前記第１のＤＮＡ配列に基づいて、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含むバイオマーカーの第１の相対存在量を計算すること、
前記被験体が前記処置を受けた後に前記被験体から回収した第２のサンプルから抽出した第２のＤＮＡ配列を得ること、及び
前記第２のＤＮＡ配列に基づいて前記バイオマーカーの第２の相対存在量を計算することと、
前記第１の相対存在量と前記第２の相対存在量とを比較して、前記複数の被験体について計算された前記第１の相対存在量及び前記第２の相対存在量に基づいて前記処置を評価する；所与の割合よりも多い関節リウマチを有する前記被験体について、前記バイオマーカーの第２の相対存在量が、前記第１の相対存在量より減少した場合、前記処置が有効であると決定すること；又は、関節リウマチを有する前記被験体の中の前記バイオマーカーの第２の相対存在量の平均が、前記処置後に所与の数だけ前記第１の相対存在量の平均より減少した場合、前記処置が有効であると決定すること；
とを含み、
前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルが同じ種類のものであり、前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルが、それぞれ、糞便サンプル、歯科サンプル、及び唾液サンプルのうちの少なくとも１つを含み、
前記第１のＤＮＡ配列に基づいて前記バイオマーカーの第１の相対存在量を計算することが、
前記第１のＤＮＡ配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列のコピー数を計算することと、
前記第１のＤＮＡ配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列について、前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列のコピー数と前記第１のサンプル中の前記第１のＤＮＡ配列のコピー数の合計との比に基づいて、前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列の前記第１の相対存在量を計算することと、
前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列の前記第１の相対存在量の少なくとも一部に基づいて前記バイオマーカーの第１の相対存在量を計算することを含み、
前記第２のＤＮＡ配列に基づいて前記バイオマーカーの第２の相対存在量を計算することが、
前記第２のＤＮＡ配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列のコピー数を計算することと、
前記第２のＤＮＡ配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列について、前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列のコピー数と前記第２のサンプル中の前記第２のＤＮＡ配列のコピー数の合計との比に基づいて、前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列の前記第２の相対存在量を計算することと、
前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列の前記第２の相対存在量の少なくとも一部に基づいて前記バイオマーカーの第２の相対存在量を計算することを含み、
前記バイオマーカーが、以下のメタゲノム連鎖群（ＭＬＧ）：
前記糞便サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号２１６９からなるＭＬＧ；
前記歯科サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号１６６００からなるＭＬＧ；及び
前記唾液サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号４６４３からなるＭＬＧ
のうちの少なくとも１つを含み、
前記ＭＬＧ番号２１６９の遺伝子が、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号１〜５９３によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている；
前記ＭＬＧ番号１６６００の遺伝子が、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号５９４〜１５３６によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている；及び
前記ＭＬＧ番号４６４３の遺伝子が、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号１５３７〜２５９４によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項４】
関節リウマチに関する処置を評価する方法であって、
関節リウマチを有する複数の被験体の各被験体について、
前記被験体が前記処置を受けた後に前記被験体から回収したサンプルから抽出したＤＮＡの配列を得ること、及び
前記ＤＮＡの配列に基づいて、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含むバイオマーカーの相対存在量を計算することと、
前記相対存在量と所定の閾値とを比較して、前記複数の被験体について計算された前記相対存在量に基づいて前記処置を評価する；前記バイオマーカーの相対存在量が前記閾値より低い場合に、前記処置が有効であると評価すること
とを含み、
前記サンプルが、糞便サンプル、歯科サンプル、及び唾液サンプルのうちの少なくとも１つを含み、
前記ＤＮＡの配列に基づいて前記バイオマーカーの相対存在量を計算することが、
前記ＤＮＡの配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列のコピー数を計算することと、
前記ＤＮＡの配列の中の前記バイオマーカーの各ＤＮＡ配列について、前記ＤＮＡ配列のコピー数と前記サンプル中の全てのＤＮＡ配列のコピー数の合計との比に基づいて前記ＤＮＡ配列の相対存在量を計算することと、
前記バイオマーカーの前記ＤＮＡ配列の前記相対存在量の少なくとも一部に基づいて前記バイオマーカーの相対存在量を計算することを含み、
前記バイオマーカーが、以下のメタゲノム連鎖群（ＭＬＧ）：
前記糞便サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号２１６９からなるＭＬＧ；
前記歯科サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号１６６００からなるＭＬＧ；及び
前記唾液サンプルに対応し、且つＭＬＧ番号４６４３からなるＭＬＧ
のうちの少なくとも１つを含み、
前記ＭＬＧ番号２１６９の遺伝子が、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号１〜５９３によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている；
前記ＭＬＧ番号１６６００の遺伝子が、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号５９４〜１５３６によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている；及び
前記ＭＬＧ番号４６４３の遺伝子が、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列における対応するポリヌクレオチド酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つ配列番号１５３７〜２５９４によってコードされているアミノ酸配列における対応するアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードしていることを特徴とする方法。
【請求項５】
ＭＬＧ番号２１６９が、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子からなる；
ＭＬＧ番号１６６００が、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子からなる；及び
ＭＬＧ番号４６４３が、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子からなる請求項３又は４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１４年９月３０日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８８０６８号、国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８８０６９号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８８０６０号の利益及び優先権を主張し、これらは参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、生体医学分野、具体的には、疾患、特に関節リウマチ（ＲＡ）のリスクを予測するためのバイオマーカー及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、世界中で何千万人もが罹患している消耗性自己免疫疾患であり、心血管及び他の全身合併症を伴う患者の死亡率を増大させる。疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）を用いて多くのＲＡ患者の病態を緩和することに成功しているにもかかわらず、特異的且つより有効な療法の開発は、前記疾患を誘発又は促進する因子の理解が十分でないことによって妨げられている。マイクロバイオームに関する研究によって、ＲＡを予防又は軽減するプロバイオティクスを明らかにすることができる。腸内微生物叢は、ヒトの健康にとって重要な環境因子であり、肥満、糖尿病、結腸癌等における役割は確立されている。口腔微生物叢は、腸内微生物叢に比べて相対的に研究が進んでいない。疾患における口腔マイクロバイオームの役割のメタゲノム解析は未だ行われていない。また、口腔微生物疾患マーカー及び腸内微生物疾患マーカーの同一性又は機能がどの程度重複しているかについても知られていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示は、生体医学分野、具体的には、疾患、特に関節リウマチ（ＲＡ）のリスクを予測するためのバイオマーカー及び方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
疾患を有する被験体の確率を得るか又は前記疾患に関する処置を評価するためのシステムを本教示に開示する。
【０００６】
一例では、疾患を有する被験体の確率を得るためのシステムを開示する。前記システムは、プロセッサと、前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含む記憶媒体とを含む。前記プログラム命令は、前記プロセッサに以下の工程を実行させる。前記被験体からサンプルを回収する。前記サンプルからＤＮＡを抽出する。前記ＤＮＡの配列を得る。次いで、前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）のゲノム中のＤＮＡ配列を含む。前記相対存在量に基づいて、前記疾患を有する被験体の確率を得る。
【０００７】
別の例では、疾患に関する処置を評価するか又は治療剤を同定するためのシステムを開示する。前記システムは、プロセッサと、前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含む記憶媒体とを含む。前記プログラム命令は、前記プロセッサに以下の工程を実行させる。前記疾患を有する複数の被験体の各被験体について、第１のサンプルから抽出した第１のＤＮＡ配列及び第２のサンプルから抽出した第２のＤＮＡ配列を得る。前記第１のサンプルは、前記被験体が前記処置を受ける前に前記被験体から回収したものである。前記第２のサンプルは、前記被験体が前記処置を受けた後に前記被験体から回収したものである。各被験体について、前記第１のＤＮＡ配列に基づいてバイオマーカーの第１の相対存在量を計算し、前記第２のＤＮＡ配列に基づいてバイオマーカーの第２の相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。次いで、前記複数の被験体について計算された前記第１の相対存在量及び前記第２の相対存在量に基づいて前記処置を評価する。
【０００８】
異なる例では、疾患に関する処置を評価するか又は治療剤を同定するためのシステムを開示する。前記システムは、プロセッサと、前記プロセッサによる実行のためのプログラム命令を含む記憶媒体とを含む。前記プログラム命令は、前記プロセッサに以下の工程を実行させる。前記疾患を有する複数の被験体の各被験体について、ＤＮＡの配列を得るが、前記ＤＮＡは、前記被験体が前記処置を受けた後に前記被験体から回収したサンプルから抽出したものであってよい。前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。次いで、前記複数の被験体について計算された相対存在量に基づいて前記処置を評価する。
【０００９】
また、疾患を有する被験体の確率を得るか、前記疾患に関する処置を評価するか、又は治療剤を同定する方法を本教示に開示する。
【００１０】
一例では、方法を開示する。被験体からサンプルを回収する。前記サンプルからＤＮＡを抽出する。前記ＤＮＡの配列を得る。次いで、前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。前記相対存在量に基づいて、疾患を有する被験体の確率を得る。
【００１１】
別の例では、疾患に関する処置を評価するか又は治療剤を同定する方法を開示する。前記疾患を有する複数の被験体の各被験体について、第１のサンプルから抽出した第１のＤＮＡ配列及び第２のサンプルから抽出した第２のＤＮＡ配列を得る。前記第１のサンプルは、前記被験体が前記処置を受ける前に前記被験体から回収したものである。前記第２のサンプルは、前記被験体が前記処置を受けた後に前記被験体から回収したものである。各被験体について、前記第１のＤＮＡ配列に基づいてバイオマーカーの第１の相対存在量を計算し、前記第２のＤＮＡ配列に基づいてバイオマーカーの第２の相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。次いで、前記複数の被験体について計算された第１の相対存在量及び第２の相対存在量に基づいて前記処置を評価する。
【００１２】
異なる例では、疾患に関する処置を評価するか又は治療剤を同定する方法を開示する。前記疾患を有する複数の被験体の各被験体について、ＤＮＡの配列を得るが、前記ＤＮＡは、前記被験体が前記処置を受けた後に前記被験体から回収したサンプルから抽出してよい。前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。次いで、前記複数の被験体について計算された相対存在量に基づいて前記処置を評価する。
【００１３】
また、疾患を有する被験体の確率を得るためのコンピュータプログラム製品を本教示に開示する。前記コンピュータプログラム製品は、プログラムコードが保存されているコンピュータ可読記憶媒体を含む。前記プログラムコードは、プロセッサによって実行可能であり、前記プロセッサに以下の工程を実行させる命令を含む。前記被験体からサンプルを回収する。前記サンプルからＤＮＡを抽出する。前記ＤＮＡの配列を得る。次いで、前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。前記相対存在量に基づいて、前記疾患を有する被験体の確率を得る。
【００１４】
また、疾患を有する被験体の確率を得るか、又は前記疾患に関する処置を評価するか、又は治療剤を同定するためのバイオマーカーを本教示に開示する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノムにおける少なくとも１つのＤＮＡ配列、又は以下のメタゲノム連鎖群（ＭＬＧ）のうちの少なくとも１つを含む：ＭＬＧ番号２１６９からなるＭＬＧ；ＭＬＧ番号１６６００からなるＭＬＧ；及びＭＬＧ番号４６４３からなるＭＬＧ。
【００１５】
更なる新規特徴は、一部は以下の説明に記載され、一部は、以下の記載及び添付図面を考察することにより当業者に明らかになるか又は実施例の作製又は作業から習得することができる。本教示の新規特徴は、以下で論じる詳細な実施例に記載の方法論、手段、及び組合せの様々な態様の実施又は使用によって実現し、獲得することができる。
【００１６】
本教示に記載する方法及びシステムは、例示的な実施形態の観点で更に説明される。これら例示的な実施形態は、図面を参照して詳細に記載される。これら例示的な実施形態は、非限定的な例示的な実施形態であり、類似の参照番号は、図面の幾つかの図に亘って類似の構造を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本教示の実施形態に係る、バイオマーカーを同定し、ＲＡリスクの評価について検証する例示的なプロセスのフローチャートを示す。
【００１８】
【図２】図２は、本教示の実施形態に係る、腸、歯科、及び唾液のメタゲノム連鎖群（ＭＬＧ）に対する表現型の影響の解析結果を示す。
【００１９】
【図３】図３は、本教示の実施形態に係る、アドバンストアセンブリした後のラクトバチルス  ｓｐ．のＧＣ深度のグラフを示す。
【００２０】
【図４】図４は、本教示の実施形態に係る、アセンブリとラクトバチルス・サリバリウスとの間の共線性を示す。
【００２１】
【図５】図５は、本教示の実施形態に係る、ＲＡ関連細菌に基づく患者の層別化を示す。
【００２２】
【図６】図６は、本教示の実施形態に係る、腸ＭＬＧの相対存在量と歯科ＭＬＧの相対存在量との間の相関を示す。
【００２３】
【図７】図７は、本教示の実施形態に係る、腸ＭＬＧの相対存在量と唾液ＭＬＧの相対存在量との間の相関を示す。
【００２４】
【図８】図８は、本教示の実施形態に係る、歯科ＭＬＧの相対存在量と唾液ＭＬＧの相対存在量との間の相関を示す。
【００２５】
【図９】図９は、本教示の実施形態に係る、ＲＡリスクを評価するためにバイオマーカーを利用する例示的なプロセスのフローチャートを示す。
【００２６】
【図１０】図１０は、本教示の実施形態に係る、ＲＡに関する処置を評価するためにバイオマーカーを利用する例示的なプロセスのフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書で使用する用語は、本教示に関連する分野の当業者に一般的に理解されている意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の用語は、単数の実体のみを指すことを意図するのではなく、その具体例を例証のために用い得る一般的な分類を含む。本明細書における専門用語は、本教示の１以上の例示的な実施形態を説明するために用いられるが、その使用は、特許請求の範囲に概説されるものを除いて本教示の範囲を定めるものではない。
【００２８】
本開示は、疾患のリスクを予測し、前記疾患、特にＲＡの疾患に関する処置の効果を判定するためのバイオマーカー及び前記バイオマーカーを利用する方法について記載する。長い間、感染病原体がＲＡに関係があるとされてきた。しかし、ＲＡ関連病原体のアイデンティティ及び病原性は殆ど不明であり、人体が何兆個もの有益な微生物及び有害な微生物の宿主である超個体であるという説が最近復活してきたことによって問題が更に複雑化している。
【００２９】
ＲＡは、関節の炎症が発症する何年間も前に幾つかの他の身体部位において発生し、潜伏していると考えられる。マイクロバイオームに関する研究によって、ＲＡを予防又は軽減するプロバイオティクスを明らかにすることができる。腸内微生物叢は、ヒトの健康にとって重要な環境因子であり、肥満、糖尿病、結腸癌等における役割は確立されている。栄養素及び生体異物の代謝における機能に加えて、遠位腸における微生物は、神経免疫内分泌系及び血流とクロストークして、人体全体に影響を与える。腸内微生物叢は、所与の個体と安定的に連携しているので、疾患に関連する研究においてその価値が高まっている。ヒト集団における腸内マイクロバイオームが不均質であることは、腸内マイクロバイオームに応じて疾患の処置をカスタマイズすべきであることを示唆しているが、薬物の活性化又は不活化、免疫調節等におけるその役割は、未だ殆ど不明のままである。口腔微生物叢は、腸内微生物叢比べて相対的に研究が進んでおらず、ヒトマイクロバイオームプロジェクト（ＨＭＰ）ではＷＧＳ（全ゲノムシークエンシング）用に〜１００人の健常個体しかサンプリングされていない。疾患における口腔マイクロバイオームの役割のメタゲノム解析は未だ行われていないが、歯科及び唾液のサンプルは、糞便サンプルよりも通院時に容易に入手可能である。また、口腔微生物疾患マーカー及び腸内微生物疾患マーカーの同一性又は機能がどの程度重複しているかについても知られていない。
【００３０】
バイオマーカーは、一般的に、何らかの生物学的状態又は病態の測定可能な指標を指す。用語「バイオマーカー」とは、本教示で使用するとき、その存在が疾患、感染、又は環境曝露等の何らかの現象の指標となる、生物内の測定可能な物質を指す。特に、ＲＡ患者又は正常ヒトに由来するサンプル中のバイオマーカーは、ヒトのＲＡリスクを評価するために利用することができる。
【００３１】
図１は、本教示の実施形態に係る、バイオマーカーを同定し、ＲＡリスクの評価について検証する例示的なプロセスのフローチャートを示す。先ず、１０２において、ＲＡ患者及び健常対照ヒトの両方から腸及び／又は口腔のサンプルを回収する。腸サンプルは、糞便サンプルを含んでいてよく、一方、口腔サンプルは、歯科及び唾液のサンプルを含んでいてよい。１０４において、各サンプルについてＤＮＡの抽出を実施する。１０６において、例えば、メタゲノムシークエンシングによって、抽出されたＤＮＡの配列を決定する。次いで、１０８において、腸及び口腔のサンプルについて遺伝子カタログを構築する。腸サンプルの遺伝子カタログは、既存の遺伝子カタログと置き換えてもよく又は統合してもよいが、口腔サンプルについては、既存の遺伝子カタログが殆ど存在しない。
【００３２】
１１０において、前記遺伝子カタログに基づいて、サンプル中の遺伝子の相対存在量を求める。サンプル中の所与の遺伝子の相対存在量は、以下の通り計算することができる。先ず、サンプルから得られた配列データにおける各遺伝子のコピー数を、サンプルにおいて遺伝子を検出することができる回数と前記遺伝子の長さとの比として計算する。次に、所与の遺伝子の相対存在量を、前記所与の遺伝子のコピー数とサンプル中の全遺伝子のコピー数の合計との比として計算することができる。
【００３３】
１１２において、同一性及び機能に基づいて遺伝子をアノテーションする。例えば、マーカー遺伝子が対照群とＲＡ群との間で相対存在量の差を示す場合、１１４において、それぞれの相対存在量に基づいてマーカー遺伝子を決定することができる。１１６において、これらマーカー遺伝子を選択し、クラスタリングして、ＭＬＧを構築する。用語「ＭＬＧ」とは、本教示で使用するとき、恐らく、独立して分布しているのではなくユニットとして物理的に結合しているメタゲノム中の遺伝物質の群を指し得る。１１８において、対照群及びＲＡ群の両方のＮＬＧを分析する。１２０において各ＭＬＧと臨床指数との間の相関を決定する。例えば、バイオマーカーが粘膜免疫系の優占抗体又は主な血清免疫グロブリンと正の相関を示す場合、１２２において、前記相関に基づいてＭＬＧから１以上のバイオマーカーを同定する。１２４において、全サンプルにおけるバイオマーカーを検証する。例えば、ＲＡ患者由来の腸及び／又は口腔のサンプルにおけるバイオマーカーのエンリッチが一貫して見られるかどうかについて検証してよい。
【００３４】
本開示の実施形態によれば、検証されたバイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。本開示の様々な実施形態によれば、検証されたバイオマーカーは、表２−２に示す通り、配列番号１〜５９３、配列番号５９４〜１５３６、又は配列番号１５３７〜２５９４の部分配列を少なくとも含んでいてよい。本明細書と共に提出する配列表は、上記配列番号に対応するヌクレオチド及び／又はアミノ酸の配列を含む。
【００３５】
例えば、表２−２を参照すると、ＭＬＧ番号２１６９は、糞便サンプルから同定された少なくとも５９３個のＲＡ関連遺伝子を含む。これら５９３個の遺伝子は、それぞれ、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列を有する。当業者であれば理解する通り、ＭＬＧ番号２１６９は、配列番号１〜５９３に加えて他の遺伝子を含んでいてもよい。本教示の実施形態では、ＭＬＧ番号２１６９の遺伝子の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％）は、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％）の配列同一性を有し、且つ配列番号１〜５９３によってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％）の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている。本教示の別の実施形態では、ＭＬＧ番号２１６９は、配列番号１〜５９３のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる。
【００３６】
同様に、表２−２を参照すると、ＭＬＧ番号１６６００は、糞便サンプルから同定された少なくとも９４３個のＲＡ関連遺伝子を含む。これら９４３個の遺伝子は、それぞれ、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列を有する。当業者であれば理解する通り、ＭＬＧ番号１６６００は、配列番号５９４〜１５３６に加えて他の遺伝子を含んでいてもよい。本教示の実施形態では、ＭＬＧ番号１６６００の遺伝子の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％）は、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％）の配列同一性を有し、且つ配列番号５９４〜１５３６によってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％）の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている。本教示の別の実施形態では、ＭＬＧ番号１６６００は、配列番号５９４〜１５３６のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる。
【００３７】
同様に、表２−２を参照すると、ＭＬＧ番号４６４３は、糞便サンプルから同定された少なくとも１，０５８個のＲＡ関連遺伝子を含む。これら１，０５８個の遺伝子は、それぞれ、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列を有する。当業者であれば理解する通り、ＭＬＧ番号４６４３は、配列番号１５３７〜２５９４に加えて他の遺伝子を含んでいてもよい。本教示の実施形態では、ＭＬＧ番号４６４３の遺伝子の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％）は、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％）の配列同一性を有し、且つ配列番号１５３７〜２５９４によってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、又は１００％）の配列同一性を有するポリペプチドをコードしている。本教示の別の実施形態では、ＭＬＧ番号４６４３は、配列番号１５３７〜２５９４のポリヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる。
【実施例】
【００３８】
以下の非限定的な実施例において本教示を更に例証する。特に指定しない限り、部及びパーセントは重量により、度は摂氏である。当業者には明らかである通り、本教示の好ましい実施形態を示すこれら実施例は、例示のためだけに与えられるものであり、試薬は全て市販されている。
【００３９】
この実施例は、ＲＡリスクを評価するためのバイオマーカーを同定及び検証する方法に関する。一例では、２１２個の糞便サンプル（７７人の未処置ＲＡ症例、８０人の無関係な健常対照；１７人の未処置ＲＡ症例及び１７人の関連する健常対照；２１人のＤＭＡＲＤ処置症例）についてメタゲノムショットガンシークエンシングを実施した（表１−１、１−２、１−３）。これを用いて、ＲＡ患者における腸内マイクロバイオームを調べることができる。次いで、データを既存の腸内微生物叢参照遺伝子カタログに統合して、５９０万個の遺伝子（４８１個のサンプル由来）のセットを得、これによって、シークエンシングリードのマッピングを飽和させることが可能になった（８０．３±２．３％、平均±ｓ．ｄ．）（Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）、参照により本明細書に援用される）。
【００４０】
未処置ＲＡ患者及び健常対照から歯垢及び唾液のサンプルも回収し、１０５個の歯科サンプル及び９８個の唾液サンプル（５４／５１人の未処置ＲＡ症例及び５１／４７人の健常対照由来の歯科／唾液サンプル；糞便、歯科、及び唾液のサンプルの完全セットを有する被験体６９人）に対してメタゲノムシークエンシングを実施した（表１−１、１−２、１−３）。これによって、ＲＡ腸内マイクロバイオームにおいてディスバイオシスを証明した後、口腔マイクロバイオームにおいてもディスバイオシスが明白であることを示すことができる。これら配列のデノボアセンブリによって、３２０万個の遺伝子の遺伝子カタログが得られ、それぞれ、歯科及び唾液のシークエンシングリードの７６．６±１．８％及び７０．７±７．３％（平均±ｓ．ｄ．）をマッピングした。
【００４１】
研究コホートについて以下に記載する。ＲＡは、２０１０  ＡＣＲ／ＥＵＬＡＲ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）分類基準に従って北京協和医院で診断した。標準的な手順に従って、被験体が始めて病院を訪れた際に全ての表現型情報を回収した。腸内微生物の遺伝子カタログの構築に用いた２１２個のサンプルに、ＤＭＡＲＤ処置患者由来の糞便サンプルは２１個しか含まれておらず、この例では分析しなかった。少なくとも６週間の罹病期間があり、少なくとも１箇所の関節腫脹及び３箇所の圧痛関節を有する１８歳〜６５歳のＲＡ患者を参加させた。慢性の重篤な感染症の病歴があるか、現在何らかの感染症に罹患しているか、又は任意の種類の癌の病歴がある場合、その患者を除外した。妊婦又は授乳婦は除外した。全ての患者に、不妊のリスクがあることを伝え、子供をもつことを望んでいる患者は除外した。患者の一部は何年間もＲＡに罹患していたが、ＤＭＡＲＤ処置は受けていなかった。その理由は、北京協和医院を訪れる前に地域の病院でＲＡであると診断されたことがなく、ＲＡの症状を和らげるために鎮痛剤を服用していただけであったためである。
【００４２】
健常対照群は、以下の組み入れ基準を満たしていた：１８歳〜６５歳である；肝臓及び腎臓の機能についての最近のスクリーニング、定期血液検査、赤血球沈降速度、空腹時血糖、血液脂質、及び血圧が正常レベルであった。慢性の重篤な感染症の病歴があるか、現在何らかの感染症に罹患しているか、又は任意の種類の癌若しくは自己免疫疾患の病歴がある場合、被験体を除外した。妊婦又は授乳婦は除外した。この試験に参加する前１ヶ月間以内に抗生物質処置を受けた被験体も除外した。
【００４３】
処置は、メトトレキサート（ＭＴＸ）系ＤＭＡＲＤを用いて実施した。患者の９７％にＭＴＸのみ（最初に７．５ｍｇ  ＱＷ、４週間目以降１５ｍｇ（最高０．３ｍｇ／ｋｇ）ＱＷ；葉酸１０ｍｇ  ＱＷを補充）、Ｔ２のみ（２０ｍｇ  ＴＩＤ）、又はＭＴＸ＋Ｔ２を投与した。残りの患者において用いた他の薬剤は、レフルノミド（ＬＥＦ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄ）、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、及びエタネルセプトを含んでいたが、これらはサンプルサイズが小さいので比較しなかった。本教示で使用するとき、「ＱＷ」は１週間に１回を意味し；「ＴＩＤ」は、１日間に３回を意味し；「Ｔ２」は、Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ（ライコウトウ）配糖体を意味する。処置後のＤＡＳ２８−ＥＳＲの低下に基づき、ＥＵＬＡＲ応答基準に従って患者のサンプルを良好、中等度、及び改善無しに分類した。患者は中国全土から北京協和医院を訪れていたので、処置後に全ての患者のサンプルを入手できた訳ではなかった。
【００４４】
この研究は、北京協和医院及び（北京基因組研究所）ＢＧＩ−深センにおける治験審査委員会によって承認された。
【００４５】
サンプルの回収について以下に記載する。糞便サンプルは、北京協和医院で回収し、凍結輸送し、既に記載されている通り（Ｑｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４９０，５５−６０（２０１２）、参照により本明細書に援用される）ＢＧＩ−深センで抽出した。体積が３μＬになるまで眼科用鉗子を用いて歯表面から歯垢を掻き取った。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び２００μｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含有する１×溶解バッファ２００μＬにサンプルを移し、５５℃で２時間インキュベートした。９５℃で１０分間インキュベートすることによって溶解を終結させ、サンプルを輸送まで−８０℃で凍結させた。糞便サンプル用のプロトコールに従ってＤＮＡ抽出を実施した。唾液については、唾液１００μＬを２×溶解バッファ１００μＬに添加した。咽頭後壁を綿棒で拭き取り、サンプル管に添加した。次いで、サンプルを溶解させ、歯科サンプルとして抽出した。
【００４６】
全ての利用可能なサンプルを分析した（表１−１、１−２、１−３）。便秘又はサンプル保存が不適切であったため、糞便サンプルの一部を除外した。微生物のＤＮＡ濃度が低かったため、口腔サンプルの一部を除外した。
【００４７】
メタゲノムシークエンシング及びアセンブリについて以下に記載する。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（インサートサイズ３５０ｂｐ、リード長１００ｂｐ）においてペアードエンドメタゲノムシークエンシングを実施し、既に記載されている通り（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、前掲）、ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ  ｖ２．０４（Ｌｕｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．ＳＯＡＰｄｅｎｏｖｏ２：ａｎ  ｅｍｐｉｒｉｃａｌｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｈｏｒｔ−ｒｅａｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ａｓｓｅｍｂｌｅｒ．Ｇｉｇａｓｃｉｅｎｃｅ  １，１８（２０１２）、参照により本明細書に援用される）を用いてシークエンシングリードの品質を制御し、コンティグにデノボアセンブリした。平均宿主夾雑率は、糞便サンプルが０．３７％、歯科サンプルが５．５５％、唾液サンプルが４０．８５％であった。
【００４８】
遺伝子カタログの構築について以下に記載する。ＧｅｎｅＭａｒｋ  ｖ２．７ｄを用いて、アセンブリされたコンティグから遺伝子予測を実施した。カットオフ値をオーバーラップ９０％及び同一性９５％（ギャップは許容しない）としてＢＬＡＴを用いて冗長遺伝子を除去したところ、２１２個の糞便サンプル（２１個のＤＭＡＲＤ処置サンプルを含む）について３，８００，０１１個の遺伝子の非冗長遺伝子カタログ、及び２０３個の未処置口腔サンプル（１０５個の歯垢サンプル及び９８個の唾液サンプル）について３，２３４，９９７個の遺伝子のカタログが得られた。ＢＬＡＴ（同一性９５％、オーバーラップ９０％）（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、前掲）を用いて４３０万個の遺伝子の既存の腸内微生物の参照カタログに糞便サンプルの遺伝子カタログを更に統合したところ、５９０万個の遺伝子の最終カタログが得られた。高品質シークエンシングリードを腸又は口腔の参照遺伝子カタログに対してアラインメントすることによって遺伝子の相対存在量を求めた。アラインメントの詳細な手順は、前掲のＱｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２に見出すことができる。
【００４９】
分類学的アノテーション及び存在量の計算について以下に記載する。予測遺伝子の分類学的割り当ては、既に詳述されている社内ルート（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、前掲）に基づいてＩＭＧデータベース（ｖ４００）に従って実施し、門への割り当てについてはオーバーラップ７０％及び同一性６５％、属については同一性８５％、種については同一性９５％を用いた。分類群の相対存在量は、その遺伝子の相対存在量から計算した。
【００５０】
一例では、サンプル中の所与の遺伝子の相対存在量は、以下の通り計算することができる。先ず、前記サンプルから得られた配列データにおける各遺伝子のコピー数を、前記サンプルにおいて遺伝子を検出することができる回数（即ち、マッピングされたリードの数）及び前記遺伝子の長さとの間の比として計算する。次に、前記所与の遺伝子の相対存在量を、前記所与の遺伝子のコピー数と前記サンプル中の全遺伝子のコピー数の合計との間の比として計算することができる。
【００５１】
ウイルコクスン順位和検定（ｐ＜０．０５）によって、患者と健常対照との間で分類群の相対存在量の有意な差が確認された。
【００５２】
メタゲノムワイドな関連研究（ＭＧＷＡＳ）について以下に記載する。糞便マイクロバイオームの症例対照比較のために、サンプルの１０％未満でしか検出されなかった遺伝子を除去した結果、２，００７，６４３個の遺伝子のセットが得られた。１１７，２１９個の遺伝子が、対照と症例との間で相対存在量の差を示した（ウイルコクスン順位和検定、ＦＤＲ＜０．３）。次いで、これらマーカー遺伝子を、全てのサンプルに亘ってその存在量のばらつきに従ってＭＬＧにクラスタリングした（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、前掲）。ＭＬＧは、メタゲノムのための種の概念に代わる汎用概念である。用語「ＭＬＧ」は、本教示で使用するとき、恐らく、独立して分布しているのではなくユニットとして物理的に結合しているメタゲノム中の遺伝物質の群を指し得る。これは、メタゲノム中に存在する具体的な微生物種を完全に決定する必要をなくすのに役立ち得、このことは、多数の未知の生物が存在し且つ細菌間で水平遺伝子伝達（ＬＧＴ）が頻繁に生じていると考えると重要である。ＭＬＧを用いて、大量のメタゲノムデータを低減し、構造的に体系化することができ、また、分類学的説明を加えるのに役立てることができる。遺伝子プロファイルに基づいて、ＭＬＧは、様々な個々のサンプル中に共存する遺伝子の群として同定することができ、一貫した存在量レベル及び分類学的割り当てを有する。
【００５３】
歯科ＭＬＧを構築するために、１，９００，７７４個の遺伝子（サンプルの少なくとも１０％に存在）から３７１，９９０個のマーカー遺伝子（ウイルコクスン順位和検定、ＦＤＲ＜０．１）を選択した。唾液のＭＬＧについては、２，０３０，６３６個の遺伝子（サンプルの少なくとも１０％に存在）から２５８，０５５個のマーカー遺伝子（ウイルコクスン順位和検定、ＦＤＲ＜０．１）を選択した。
【００５４】
既に記載されている通り（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、分類学及び構成遺伝子の相対存在量に従って、ＭＬＧの分類学的割り当て及び存在量のプロファイリングを実施した。１つのＭＬＧの全ての遺伝子を、ヌクレオチドレベルでは参照微生物ゲノムに対して、タンパク質レベルでは（米国バイオテクノロジー情報センター）ＮＣＢＩ−ｎｒデータベースに対してアラインメントを行った。参照微生物ゲノムに対するアラインメントから、各ＭＬＧについて十分にマッピングされた細菌ゲノムのリストを得、細菌ゲノムにマッピングすることができた遺伝子の比率及びアラインメントの平均同一性に従ってこれら細菌ゲノムを整理することができる。
【００５５】
種への割り当ては、ＭＬＧにおける遺伝子の９０％超を、クエリーとの同一性９５％超、オーバーラップ７０％の条件で種のゲノムに対してアラインメントすることを必要とし得る。ＭＬＧの属への割り当ては、ＤＮＡ及びタンパク質の配列の両方において、その遺伝子の８０％超を、同一性８５％の条件でゲノムに対してアラインメントすることを必要とし得る。
【００５６】
症例対照ステータスにかかわらず、全てのサンプル中の存在量間でスピアマン相関に従ってＭＬＧを更にクラスタリングした。
【００５７】
様々な身体部位に由来するＭＬＧの相関を、糞便、歯科、及び唾液のサンプルを有する６９人の被験体（３６人の対照、３３人の未処置症例）において同様に解析する。
【００５８】
対照及びＲＡサンプルのＭＬＧ存在量プロファイルに対して正準コレスポンデンス分析（ＣＣＡ）を実施して、列挙した各因子からの影響を評価した（Ｆｅｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｍａ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，６５２８（２０１５）、参照により全体が本明細書に援用される）。
【００５９】
ＲＡ患者又は対照において差次的にエンリッチされた１１７，２１９個の遺伝子マーカーが同定された（ウイルコクスン順位和検定、ＦＤＲ＜０．３）。これは、ＲＡに関連する腸内微生物叢の特徴を正確に記述するのに役立ち得る。サンプル中の遺伝子間の存在量の共変動に基づいて、メタゲノム連鎖群（ＭＬＧ）をコンピュータで計算した（Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２、前掲）。少なくとも１００個の遺伝子に含有されている８８個のＭＬＧを、正準コレスポンデンス分析（ＣＣＡ）におけるエンリッチメントの方向に従って分離し、これらがＲＡステータスに主に関連していることを確認した。
【００６０】
少なくとも１００個の遺伝子に含有されている１７１個の歯科ＭＬＧ及び１４２個の唾液ＭＬＧをＣＣＡにおけるエンリッチメントの方向に従って分離し、そのＲＡとの関連を確認した。
【００６１】
ＭＬＧと臨床指数との間の関係について以下に記載する。既に記載されている通り（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｆ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｒｍａｌ，ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４９８，９９−１０３（２０１３）、参照により全体が本明細書に援用される）、各ＭＬＧの相対存在量と臨床的に測定された連続変数との間でスピアマン相関を実施した。
【００６２】
スピアマン相関を用いて、ＭＬＧの相対存在量と臨床指数との間の数値の共変動について調べた。これは、ＲＡについての腸マイクロバイオームの診断又は予測的価値を調べるのに役立ち得る。
【００６３】
一例では、サンプル中のＭＬＧの相対存在量は、このＭＬＧ由来の遺伝子の相対存在量値に基づいて推定することができる。このＭＬＧについては、それぞれ最高及び最低の相対存在量５％に入る遺伝子を破棄してよく、次いで、残りに対してポアソン分布を当てはめる。ポアソン分布の推定平均を、このＭＬＧの相対存在量として解釈することができる。更なる分析のために、全サンプル中のＭＬＧのプロファイルを得てもよい。サンプル中のバイオマーカーの相対存在量も同様に計算することができる。
【００６４】
図２は、本教示の実施形態に係る、腸、歯科、及び唾液のＭＬＧに対する表現型の影響の解析結果を示す。この例では、図２は、腸（ａ）、歯科（ｂ）、又は唾液（ｃ）のＭＬＧに対する表現型の影響についてのＣＣＣ結果を示す。サンプルの半分において欠落している分類別又は連続表現型は分析しなかった。黒点は、対照でエンリッチされたＭＬＧを表し、一方、白点は、ＲＡでエンリッチされたＭＬＧを表す。ＲＡでエンリッチされたＭＬＧ、例えば、クロストリジウム・アルパラギホルメ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｓｐａｒａｇｉｆｏｒｍｅ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の種、及びラクトバチルス  ｓｐ．（Ｌ．サリバリウスと最も近縁、表２−１、表２−２）は、粘膜免疫系の優占抗体であるＩｇＡ又は主な血清免疫グロブリンであるＩｇＧと正の相関を示した。
【００６５】
一方、ラクトバチルス・サリバリウス、アトポビウム属（Ａｔｏｐｏｂｉｕｍ）の種、及びクリプトバクテリウム・クルツム（Ｃｒｙｐｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｒｔｕｍ）等の嫌気性菌は、ＲＡ患者の唾液及び歯のサンプルの両方でみられた。
【００６６】
よりＲＡに関連しているゲノムのアセンブリについて以下に記載する。次いで、ＳＯＡＰ  （ｓｈｏｒｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ）ファミリーのソフトウェアパッケージ、例えば、ＳＯＡＰＭｅｔａ（国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０７９４９２号、参照により本明細書に援用される）を用いてＭＬＧ及びその関連するメタゲノムシークエンシングリードから直接細菌ゲノムをアセンブリすることができる。ラクトバチルス  ｓｐ．（ラクトバチルス・サリバリウスと最も近縁）については、ＲＡ患者から得られたデータを用いてアドバンストアセンブリを１ラウンド行った後、アセンブリが十分に完了し（表３）、ラクトバチルス・サリバリウスＣＥＣＴ（Ｃｏｌｅｃｃｉｏｎ  Ｅｓｐａｎｏｌａ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｉｖｏｓ  Ｔｉｐｏ）５７１３参照ゲノムと共線性を示した。
【００６７】
図３及び図４は、ラクトバチルス  ｓｐ．のドラフトゲノムを示す。図３は、本教示の実施形態に係る、アドバンストアセンブリした後のラクトバチルス  ｓｐ．のＧＣ深度のグラフを示す。図４は、本教示の実施形態に係る、アセンブリ（サンプルＤ２０１由来）とＮＣＢＩから入手したラクトバチルス・サリバリウスＣＥＣＴ５７１３参照ドラフトゲノム（ＮＣ＿０１７４８１．１）との間の共線性を示す。ゲノムによってコードされている機能は、このＲＡでエンリッチされたラクトバチルス  ｓｐ．が宿主免疫系によって認識され得る様々な細胞壁修飾をコードしていることを除いて、ラクトバチルス・サリバリウスＣＥＣＴ５７１３又は他のラクトバチルス属の株と殆ど同様であった。
【００６８】
腸及び口腔のマイクロバイオーム間の一致について以下に記載する。ＲＡに関連している腸細菌分類群と口腔細菌分類群とに差があるにもかかわらず、ラクトバチルス・サリバリウスはＲＡ患者において一貫してエンリッチされたことが見出され、腸及び唾液のＭＬＧはＩｇＧと正の相関を示し、歯のＬ．サリバリウスは、全ての歯のＭＬＧの中で２番目に高いオッズ比を示した（表２−１）。これら結果から、これらはＲＡのバイオマーカーとして有望な候補となる。更に、Ｌ．サリバリウスは、軽度〜中等度の活動性（ＤＡＳ２８≦５．１）のＲＡ症例と比べて非常に活動性の高い（ＤＡＳ２８＞５．１）のＲＡ症例において存在量が多く（表４、それぞれ糞便、歯垢、及び唾液においてｐ＝０．０１７、０．０３６、０．０８４、ウイルコクスン順位和検定）、これは非侵襲的予後推定の可能性を強調するものである。
【００６９】
本開示の実施形態によれば、ＲＡを評価又は診断するためのバイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。本開示の様々な実施形態によれば、ＲＡを評価又は診断するためのバイオマーカーは、表２−２に記載の通り、配列番号１〜５９３；配列番号５９４〜１５３６；又は配列番号１５３７〜２５９４の部分配列を少なくとも含んでいてよい。本明細書と共に提出する配列表は、上記配列番号に対応するヌクレオチド及び／又はアミノ酸の配列を含む。
【００７０】
図５は、本教示の実施形態に係る、ＲＡ関連細菌に基づく患者の層別化を示す。糞便、歯科、及び唾液中のラクトバチルス・サリバリウスＭＬＧの相対存在量をプロットしたところ、非常に活動性の高いＲＡ症例と中等度の活動性のＲＡ症例との間の差は、糞便サンプル及び歯科サンプルにおいて有意である（それぞれ、ｐ＝０．０１７、０．０３６、０．０８４、ウイルコクスン順位和検定）。ＭＬＧ識別番号をアノテーションの後の括弧内に示す。疾患分類は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ（ＥＵＬＡＲ）基準に従った。即ち、３．２＜ＤＡＳ２８≦５．１、中等度；ＤＡＳ２８＞５．１、非常に活動性（表４）。
【００７１】
サンプル中の糞便、歯科、及び唾液のＭＬＧの相対存在量間の相関をコンピュータで計算することができる（ｎ＝６９）。これは、身体部位にまたがるＲＡ関連細菌の分布をより理解するのに役立ち得る。３つの部位から得たＬ．サリバリウス（腸内のラクトバチルス  ｓｐ．）は、互いに正の相関を示し（表５）、複数の身体部位におけるこの細菌の存在が確認された。
【００７２】
２つの部位に基づく分類を用いて他の部位に基づく幾つかの誤分類を却下した場合、１人の関連する対照を除いて誤分類された被験体はおらず、これは、複数の部位におけるマイクロバイオームを調べる力を強調するものである（表６）。更に、これら結果は、糞便、歯科、及び唾液の微生物マーカーが全て、ＲＡの診断及び管理に非常に有益であり得るが、歯科のマイクロバイオーム（ＲＡの確率０．９４）は、腸のマイクロバイオーム（ＲＡの確率０．７３）よりも感度が高い可能性があることを示す。
【００７３】
図６〜８は、腸ＭＬＧと口腔ＭＬＧとの間の相関を示す。図６は、本教示の実施形態に係る、腸ＭＬＧの相対存在量と歯科ＭＬＧの相対存在量との間の相関を示す。図７は、本教示の実施形態に係る、腸ＭＬＧの相対存在量と唾液ＭＬＧの相対存在量との間の相関を示す。図６及び図７の両方によれば、糞便、歯科、及び唾液のサンプルの完全セットを有する被験体（ｎ＝６９）について、腸ＭＬＧの相対存在量と歯又は唾液のＭＬＧの相対存在量（≧１００個の遺伝子）との間のスピアマン相関を計算した。他の手段、即ち、ＴＩＧＲＥＳＳ（Ｔｒｕｓｔｆｕｌ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｂｏｒｕｔａ、ＣＬＲ（Ｃｏｎｔｅｘｔ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  ｏｆ  Ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）、Ｂｉｃｏｒ（Ｂｉｗｅｉｇｈｔ  ｍｉｄｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）、ＭＩＮＥ（Ｍａｘｉｍａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）を用いても同様の相関が観察された。ノードのサイズは、各ＭＬＧにおける遺伝子の数を反映している。身体部位及びエンリッチメントの方向に従ってＭＬＧを着色した。１超のＭＬＧが、ある属（種）の同じ種又は未分類の種にアノテーションされた場合、ＭＬＧ識別番号を括弧内に示す。種又は属を正確に特定するための基準を満たしていなかったとしても、遺伝子の５０％超が株までアノテーションされた全てのＭＬＧについて、可能性のある株名を表２−１に示す。実線（エッジ）は、スピアマン相関係数（ｃｃ）＞０．４、ｐ＜０．０５を表し；点線（エッジ）は、ｃｃ＜−０．４、ｐ＜０．０５を表す。
【００７４】
図８は、本教示の実施形態に係る、歯科ＭＬＧの相対存在量と唾液ＭＬＧの相対存在量との間の相関を示す。図８によれば、身体部位及びエンリッチメントの方向に従ってＭＬＧを着色した。１超のＭＬＧが、ある属（種）の同じ種又は未分類の種にアノテーションされた場合、ＭＬＧ識別番号を括弧内に示す。種又は属を正確に特定するための基準を満たしていなかったとしても、遺伝子の５０％超が株までアノテーションされた全てのＭＬＧについて、可能性のある株名を表２−１に示す。実線（エッジ）は、スピアマン相関係数（ｃｃ）＞０．６、ｐ＜０．０５を表し；点線（エッジ）は、ｃｃ＜−０．６、ｐ＜０．０５を表す。
【００７５】
図９は、本教示の実施形態に係る、ＲＡリスクを評価するためにバイオマーカーを利用する例示的なプロセスのフローチャートを示す。先ず、９０２において個体から腸及び／又は口腔のサンプルを回収して、前記個体のＲＡリスクを評価する。腸サンプルは、糞便サンプルを含み得るが、口腔サンプルは、歯及び唾液のサンプルを含み得る。９０４において、各サンプルに対してＤＮＡ抽出を実施する。９０６において、例えば、メタゲノムシークエンシングによって、抽出されたＤＮＡの配列を決定して、前記ＤＮＡの配列を得る。１つの実施形態では、前記ＤＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、前記ＤＮＡの配列を得ることができる。別の実施形態では、前記ＤＮＡの少なくとも一部を特異的に認識する１以上のプローブを用いることによって、前記ＤＮＡの配列を得ることができる。
【００７６】
次いで、９０８において、遺伝子カタログに基づいて各サンプルからバイオマーカーの遺伝子を同定する。例えば、バイオマーカーは、例えば、クロストリジウム・アルパラギホルメ、バクテロイデス属の種、及びラクトバチルス  ｓｐ．（Ｌ．サリバリウスと最も近縁）等のＲＡでエンリッチされたＭＬＧ、及び／又はラクトバチルス・サリバリウス、アトポビウム属の種、及びクリプトバクテリウム・クルツム等の嫌気性菌であってよい。１つの実施形態では、ＲＡリスクを評価するための好ましいバイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスである。用語「遺伝子」は、本教示で使用するとき、任意のＤＮＡ配列を指し得る。
【００７７】
９１０において、各サンプルにおけるバイオマーカーの相対存在量を求める。例えば、サンプル中のＤＮＡの配列の中のバイオマーカーの遺伝子を、遺伝子のそれぞれの相対存在量の順に列挙することができる。最高相対存在量を有する上位５％の遺伝子及び最低相対存在量を有する下位５％の遺伝子を除去した後、バイオマーカーの残りの遺伝子の相対存在量を平均するか又はポアソン分布に当てはめて、サンプル中のバイオマーカーの相対存在量を求めることができる。
【００７８】
９１２において、相対存在量を所定の閾値と比較する。所定の閾値は、サンプルの種類、例えば、糞便、歯科、又は唾液のサンプルに関連していてよく、バイオマーカーに関する統計分析に基づいて決定してよい。９１４において、比較に基づいて個体のＲＡリスクを評価する。例えば、Ｌ．サリバリウスは、軽度〜中等度の活動性（ＤＡＳ２８≦５．１）のＲＡ症例と比べて非常に活動性の高い（ＤＡＳ２８＞５．１）ＲＡ症例における存在量が多いので、閾値を、ＤＡＳ２８＝５．１に対応するＬ．サリバリウスの相対存在量として設定してよい。次いで、Ｌ．サリバリウスの相対存在量が前記閾値よりも高い場合、個体のＲＡリスクが高い。別の実施形態では、様々な種類のサンプルの相対存在量を合わせて、ＲＡリスクを評価してよい。
【００７９】
様々な種類のサンプルについて、分類のためのＭＬＧ相対存在量の様々な例示的な閾値を表６に示す。ＭＬＧの相対存在量が閾値よりも大きい場合、そのヒトはＲＡのリスクを有する。
【００８０】
別の実施形態では、ＲＡリスクは、トレーニングセットに基づいて作成される分類子に基づいて評価することができる。バイオマーカーの所与の相対存在量について、分類子は、ＲＡを有する個体の確率を示すことができる。トレーニングセットは、ＲＡを有する複数の被験体及びＲＡを有しない複数の被験体由来のサンプル中のバイオマーカーの相対存在量を含んでいてよい。多変量統計モデル、例えば、ランダムフォレストモデルに基づいて分類子を作成してよい。例えば、バイオマーカーの特定の相対存在量について、分類子に基づいて対応するＲＡの確率を求めることができる。次いで、前記確率に基づいて個体のＲＡリスクを評価することができる。例えば、所定の閾値を超える確率は、被験体がＲＡを有するか又はＲＡのリスクを有することを示す。
【００８１】
ＤＭＡＲＤ処置によるＲＡマイクロバイオームの変化について以下に記載する。４０人の個体由来の糞便サンプルにおいて処置（６サンプルを除いて３ヶ月間）前後のＭＬＧをコンピュータで計算することができる（表１−３）。これは、ＤＭＡＲＤによる処置が健常マイクロバイオームを回復させるかどうかを調べるのに役立ち得る。患者の大部分に、アンカードラッグであるメトトレキサート（ＭＴＸ）、伝統的な漢方薬成分であるＴｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ  ｗｉｌｆｏｒｄｉｉ（ライコウトウ）配糖体（Ｔ２）、又は両方（ＭＴＸ＋Ｔ２）をＤＭＡＲＤとして投与した。ＢＤＭ−３３５５（ＢＤＭ、ＤＭＡＲＤ前）及びバクテロイデス属の種（ＸＩ型コラーゲン及びＨＬＡ−ＤＲ４／１に類似のモチーフを含む）等の処置前又はＲＡでエンリッチされたＭＬＧは、ＭＴＸ又はＭＴＸ＋Ｔ２よりもＴ２で処置した後により大きく減少し、一方、ＡＤＭ−２６３６（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）と最も近縁）及びＡＤＭ−２９４４（ＡＤＭ、ＤＭＡＲＤ後）等の処置後にエンリッチされたＭＬＧは、Ｔ２後により大きく増加した。しかし、ＭＴＸ又はＭＴＸ＋Ｔ２の使用は、他の態様、例えば、より高レベルのバクテロイデス・カッカエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ）及びヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属では優れていることもある。これらデータは、異なるＤＭＡＲＤが腸マイクロバイオームに対して異なる調節を行うことを示し得、腸マイクロバイオームの調査がＤＭＡＲＤ及び補助療法の選択を最適化するのに役立つことを示唆し得る。
【００８２】
ＤＭＡＲＤ処置は、同様に口腔マイクロバイオームの有望な変化を示し、対照でエンリッチされた歯又は唾液のＭＬＧの一部、例えば、アグリゲイティバクター属（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）の種は、改善が中等度であったか又は改善しなかった患者と比べて、良好な応答を示す患者において大きな比率を示した。Ｃｏｎ−１６１３８等の対照でエンリッチされた歯のＭＬＧであるプレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）は、Ｔ２のみ又はＭＴＸのみと比べてＭＴＸ＋Ｔ２で処置した患者において最も存在量が多かったが、一方、ＲＡ−９９３８、ＲＡ−１０６８４、及びＲＡ−９９９８は、ＭＴＸのみで処置した患者において最も大きく減少した。ＭＴＸ、ＭＴＸ＋Ｔ２、又はＴ２によるＲＡ又は対照に関連するＭＬＧの異なる変化は、唾液サンプルでも観察された。尚、上述の比較のいずれにおいてもラクトバチルス・サリバリウスの有意な差は検出されず、これは、腸及び口腔のマイクロバイオームが処置後も依然として厳密には健常でなかったことを示す。したがって、腸及び口腔のマイクロバイオームの両方が、ＤＭＡＲＤに対して部分的に応答するので、ＲＡの重篤度及びＤＭＡＲＤの選択に従って管理すべきである。
【００８３】
図１０は、本教示の実施形態に係る、ＲＡに関する処置を評価するためにバイオマーカーを利用する例示的なプロセスのフローチャートを示す。先ず、１００２において、処置前のＲＡ患者から腸及び／又は口腔のサンプルを回収する。腸サンプルは、糞便サンプルを含んでいてよいが、口腔サンプルは、歯及び唾液のサンプルを含んでいてよい。上論の通り、処置は、ＭＴＸ、Ｔ２、若しくはＭＴＸ＋Ｔ２等のＤＭＡＲＤ処置であってもよく、ＲＡに関する任意の処置であってもよい。１００４において、処置を受けた後の同じＲＡ患者から腸及び／又は口腔のサンプルを回収する。１００６において、各サンプルについてＤＮＡの抽出を実施する。１００８において、例えば、メタゲノムシークエンシングによって、抽出されたＤＮＡを配列決定して、前記ＤＮＡの配列を得る。１つの実施形態では、前記ＤＮＡの少なくとも一部にハイブリダイズするプライマーを用いるＰＣＲによって、前記ＤＮＡの配列を得ることができる。別の実施形態では、前記ＤＮＡの少なくとも一部を特異的に認識する１以上のプローブを用いることによって、前記ＤＮＡの配列を得ることができる。
【００８４】
次いで、１０１０において、遺伝子カタログに基づいて各サンプルからバイオマーカーの遺伝子を同定する。例えば、バイオマーカーは、例えば、クロストリジウム・アルパラギホルメ、バクテロイデス属の種、及びラクトバチルス  ｓｐ．（Ｌ．サリバリウスと最も近縁）等のＲＡでエンリッチされたＭＬＧ、及び／又はラクトバチルス・サリバリウス、アトポビウム属の種、及びクリプトバクテリウム・クルツム等の嫌気性菌であってよい。１つの実施形態では、ＲＡに関する処置を評価するための好ましいバイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスである。
【００８５】
１０１２において、各サンプルにおけるバイオマーカーの相対存在量を求める。例えば、サンプル中のＤＮＡの配列の中のバイオマーカーの遺伝子を、遺伝子のそれぞれの相対存在量の順に列挙することができる。最高相対存在量を有する上位５％の遺伝子及び最低相対存在量を有する下位５％の遺伝子を除去した後、バイオマーカーの残りの遺伝子の相対存在量を平均するか又はポアソン分布に当てはめて、サンプル中のバイオマーカーの相対存在量を求めることができる。これは、処置前後のサンプルについて実施してよい。
【００８６】
１０１４において、各ＲＡ患者について処置前後のバイオマーカーの相対存在量を比較することができる。例えば、同じ種類のサンプル（例えば、糞便、歯科、又は唾液のサンプル）中のＬ．サリバリウスの相対存在量を、ＲＡ患者が処置を受ける前及び前記ＲＡ患者が処置を受けた後に求めてよい。次いで、処置前後の相対存在量を比較して、Ｌ．サリバリウスの存在量が処置後に減少するか否かを調べることができる。このような場合、前記処置は、少なくともこの患者に対して何らかの効果を示す。サンプルを回収した全てのＲＡ患者に対して同様の比較を実施してよい。
【００８７】
次いで、１０１６において、比較に基づいて前記処置を評価する。例えば、評価における全てのＲＡ患者について、処置前後のＬ．サリバリウスの相対存在量を比較して、Ｌ．サリバリウスの存在量が処置後に減少するか否かを調べることができる。１つの実施形態では、所与の割合よりも多いＲＡ患者について、Ｌ．サリバリウスの相対存在量が処置後に減少した場合、前記処置は有効であると決定することができる。別の実施形態では、ＲＡ患者の中のＬ．サリバリウスの平均相対量が、処置後に所与の数だけ減少した場合、前記処置は有効であると決定することができる。
【００８８】
別の実施形態では、処置後のＲＡ患者から回収したサンプルだけに基づいてＲＡに関する処置を評価することができる。その場合、処置後の全ての患者についてバイオマーカー、例えば、Ｌ．サリバリウスの相対存在量を計算することができる。次いで、前記相対存在量を所定の閾値と比較して、前記処置がバイオマーカーの相対存在量を、ＲＡリスクを有しないか又はＲＡリスクが低いことを示す安全な範囲まで下げるか否かを判定することができる。このような場合、処置が有効であると評価することができる。また、前記処置は、分類子を用いて評価することもできる。
【００８９】
様々な実施形態に従って、バイオマーカー、例えば、Ｌ．サリバリウスは、様々な用途を有し得る。本開示は、バイオマーカーとして使用するためのＬ．サリバリウス；ＲＡの測定可能な指標として使用するためのＬ．サリバリウス；被験体におけるＲＡのリスクの評価又は予測に使用するためのＬ．サリバリウス；被験体におけるＲＡの診断に使用するためのＬ．サリバリウス；及び疾患、例えば、ＲＡに関する処置の評価に使用するためのＬ．サリバリウスを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
一例では、バイオマーカーは、試験される被験体におけるＲＡのリスクを評価又は予測するために用いてよい。前記被験体からサンプルを回収する。前記サンプルからＤＮＡを抽出する。前記ＤＮＡの配列を得る。次いで、前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含んでいてよい。前記相対存在量に基づいて、疾患を有する被験体の確率を得ることができる。前記確率に基づいて、前記被験体におけるＲＡのリスクを評価又は予測することができる。
【００９１】
別の例では、バイオマーカーは、疾患、例えば、ＲＡに関する処置を評価するために用いることができる。疾患を有する複数の被験体の各被験体について、前記被験体が処置を受けた後に前記被験体からサンプルを回収する。前記サンプルからＤＮＡを抽出する。前記ＤＮＡの配列を得る。次いで、前記ＤＮＡの配列に基づいてバイオマーカーの相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含んでいてよい。前記複数の被験体について計算された相対存在量に基づいて、前記処置を評価することができる。
【００９２】
更に別の例では、バイオマーカーは、疾患、例えば、ＲＡに関する処置を評価するために用いることができる。疾患を有する複数の被験体の各被験体について、前記被験体が処置を受ける前に前記被験体から第１のサンプルを回収し、前記被験体が処置を受けた後に前記被験体から第２のサンプルを回収する。前記第１のサンプルに基づいてバイオマーカーの第１の相対存在量を計算する。前記第２のサンプルに基づいてバイオマーカーの第２の相対存在量を計算する。前記バイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。次いで、前記複数の被験体について計算された第１の相対存在量及び第２の相対存在量に基づいて前記処置を評価することができる。
【００９３】
本開示の実施形態によれば、疾患、例えば、ＲＡに関する処置を評価するためのバイオマーカーは、ラクトバチルス・サリバリウスのゲノム中のＤＮＡ配列を含む。本開示の様々な実施形態によれば、疾患、例えば、ＲＡに関する処置を評価するためのバイオマーカーは、表２−２に示す通り、配列番号１〜５９３、配列番号５９４〜１５３６、又は配列番号１５３７〜２５９４の部分配列を少なくとも含んでいてよい。本明細書と共に提出する配列表は、上記配列番号に対応するヌクレオチド及び／又はアミノ酸の配列を含む。
【００９４】
例示的な実施形態を図示及び説明したが、当業者であれば、上記実施形態が本開示を限定すると解釈することはできず、本開示の趣旨、原理、及び範囲から逸脱することなしに前記実施形態を変更、代替、及び改変できることを理解するであろう。
【００９５】
【表１−１】
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【００９６】
【表１−２】
0006485843.tif 000003
【００９７】
【表１−３】
0006485843.tif 000004
【００９８】
【表２−１】
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【００９９】
【表２−２】
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【０１００】
【表３】
0006485843.tif 000007
【０１０１】
【表４−１】
0006485843.tif 000008
【０１０２】
【表４−２】
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【０１０３】
【表４−３】
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【０１０４】
【表５】
0006485843.tif 000011
【０１０５】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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