(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメイン、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびにマウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記キメラポリペプチドを発現する、
マウス。
【請求項２】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座からマウスＨ−２Ｄポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項１に記載のマウス。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウスＨ−２Ｄリーダーヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１エクソン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１−α２イントロン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α２エクソン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α２−α３イントロン、およびヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α３エクソンを含む、請求項１に記載のマウス。
【請求項７】
内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、請求項１から６のいずれか一項に記載のマウス。
【請求項８】
前記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から機能的な内在性β２ミクログロブリンを発現しない、請求項７に記載のマウス。
【請求項９】
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、請求項８に記載のマウス。
【請求項１０】
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のマウス。
【請求項１１】
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、エクソン３、およびエクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のマウス。
【請求項１２】
内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、２つまたはそれ超のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする２つまたはそれ超のヌクレオチド配列を含むげっ歯動物であって、
前記キメラポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメイン、げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびにげっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記げっ歯動物は、前記２つまたはそれ超のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、
げっ歯動物。
【請求項１３】
前記げっ歯動物は、マウスまたはラットである、請求項１２に記載のげっ歯動物。
【請求項１４】
前記げっ歯動物はマウスであり、前記げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、マウスＨ−２Ｄポリペプチド、マウスＨ−２Ｋポリペプチド、またはマウスＨ−２Ｌポリペプチドである、請求項１３に記載のげっ歯動物。
【請求項１５】
前記げっ歯動物は、細胞の表面上に、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現しない、請求項１２に記載のげっ歯動物。
【請求項１６】
内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメイン、マウスＨ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびにマウスＨ−２Ｋポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメイン、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびにマウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する、マウス。
【請求項１７】
前記マウスは、細胞の表面上に、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現しない、請求項１６に記載のマウス。
【請求項１８】
前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座に位置する、請求項１６に記載のマウス。
【請求項１９】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする核酸であって、
げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結したヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列
を含み、
前記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７であり、前記げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、マウスＨ−２ＫポリペプチドまたはマウスＨ−２Ｄポリペプチドである、核酸。
【請求項２０】
マウスの内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現させる方法であって、前記内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
【請求項２１】
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの前記細胞外ドメインを発現しない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マウスは、前記ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記マウスは、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメインおよび前記マウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、前記単一のＥＳ細胞は、マウス胚に導入されて、マウスを作製する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
第１のマウスのＨ−２Ｄ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；
第２のマウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに
前記第１のマウスおよび前記第２のマウスを交配して、そのゲノムに、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生成する工程であって、前記遺伝子改変されたマウスは、前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドおよび前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する工程
を含む、方法。
【請求項２６】
前記第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列およびマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドであって、前記キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉ  ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含み、前記キメラポリペプチドのげっ歯動物部分は、げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチド。
【請求項２８】
前記ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンに非共有結合している、請求項２７に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチド。
【請求項２９】
前記げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、マウスＨ−２Ｄ  ＭＨＣ  Ｉポリペプチドである、請求項２７に記載のキメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチド。
【請求項３０】
ヒトＣＴＬエピトープを同定するための方法であって、
請求項１〜１１および１６〜１８のいずれか一項に記載のマウス、または請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のげっ歯動物を、推定ＣＴＬエピトープを含む抗原に曝露する工程、
前記マウスまたは前記げっ歯動物に免疫応答を開始させる工程、
前記エピトープに結合したＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬを前記マウスまたは前記げっ歯動物から単離する工程、および
前記ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬによって結合された前記エピトープを同定する工程
を含む方法。
【請求項３１】
ヒト細胞による提示およびヒトリンパ球による結合がペプチド保有細胞の細胞傷害性をもたらすＨＬＡクラスＩ−拘束ペプチドを同定するための方法であって、
請求項１〜１１および１６〜１８のいずれか一項に記載のマウス、または請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のげっ歯動物を、目的のペプチドを含む分子に曝露する工程、
前記目的のペプチドに結合するキメラヒト／げっ歯動物クラスＩ分子を発現する前記マウスまたは前記げっ歯動物の細胞を単離する工程、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＬＡクラスＩ拘束細胞傷害性を導き得るヒトリンパ球に対して前記細胞を曝露する工程、および
ペプチド誘導型細胞傷害性を測定する工程
を含む方法。
【請求項３２】
キメラヒト／げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された細胞であって、前記キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉ  ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含み、前記キメラポリペプチドのげっ歯動物部分は、マウスＭＨＣ  Ｉ  Ｈ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、単離された細胞。
【請求項３３】
請求項１〜１１および１６〜１８のいずれか一項に記載のマウス、または請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のげっ歯動物に由来する組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１１日に出願した米国出願第１３／７９３，８１２号の利益を主張する。この出願の内容は、これにより、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ヒトまたはヒト化主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現する、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）に関する。本発明はまた、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉタンパク質（例えば、ＭＨＣ  Ｉα鎖）および／またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスまたはラット、ならびに、これを発現する胚、組織および細胞にも関する。本発明はさらに、ヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩタンパク質（例えば、ＭＨＣ  Ｉα鎖）および／またはβ２ミクログロブリンを発現する、遺伝子改変された非ヒト動物を作製するための方法を提供する。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト化細胞性免疫系に関連して、または遺伝子改変された非ヒト動物において、ペプチドを同定および評価するための方法、ならびに、非ヒト動物、例えばマウスまたはラットのＭＨＣ  Ｉ遺伝子座および／またはβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変して、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉおよび／またはβ２ミクログロブリンを発現する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
獲得免疫応答では、外来性抗原が、Ｂリンパ球（例えば、免疫グロブリン）およびＴリンパ球（例えば、Ｔ細胞受容体すなわちＴＣＲ）上の受容体分子によって認識される。これらの外来性抗原は、特殊分化したタンパク質、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれるタンパク質によって細胞の表面にペプチド断片として提示される。ＭＨＣ分子は、約４Ｍｂに及ぶ遺伝子の連結したクラスターとして見出される複数の遺伝子座によってコードされる。マウスでは、ＭＨＣ遺伝子は第１７番染色体上に見出され、歴史的な理由から組織適合性２（Ｈ−２）遺伝子と呼ばれる。ヒトでは、上記遺伝子は第６染色体上に見出され、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。マウスおよびヒトにおける遺伝子座は多遺伝子性である；これらは、ヒトゲノムとマウスゲノムとにおいて類似の構成を示すＭＨＣ遺伝子の３つの高度多形性クラス（クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を含む（それぞれ、図２および図３を参照されたい）。
【０００４】
ＭＨＣ遺伝子座は、ゲノムにおいて最も高度の多形性を示す；いくつかの遺伝子は、３００を超える対立遺伝子によって表される（例えば、ヒトＨＬＡ−ＤＲβおよびヒトＨＬＡ−Ｂ）。全てのクラスＩおよびＩＩ  ＭＨＣ遺伝子は、ペプチド断片を提示し得るが、各々の遺伝子は、多形および対立遺伝子バリアントを反映して、異なる結合特性を有するタンパク質を発現する。任意の所定の個体は、免疫応答の過程においてＢ細胞およびＴ細胞に対する、細胞表面に提示され得る独特な範囲のペプチド断片を有する。
【０００５】
ヒトおよびマウスの両方とも、クラスＩ  ＭＨＣ遺伝子を有する（図２および図３を参照されたい）。ヒトにおいて、古典的クラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃと呼ばれ、他方で、マウスにおいて、これらは、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌである。クラスＩ分子は、２本の鎖からなる：多形性α鎖（時々、重鎖と呼ばれる）および、一般に多形性ではないβ２−ミクログロブリンと呼ばれるより短い鎖（軽鎖としても知られる）（図１）。これらの２本の鎖は、細胞表面で非共有結合ヘテロダイマーを形成する。α鎖は、３つのドメイン（α１、α２およびα３）を含有する。α鎖遺伝子のエクソン１はリーダー配列をコードし、エクソン２および３はα１およびα２ドメインをコードし、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６および７は細胞質尾部をコードする。α鎖は、α１ドメインおよびα２ドメイン（Ｉｇ様ドメインに似ている）を含むペプチド結合溝を形成し、その後に、β２−ミクログロブリンに類似するα３ドメインが続く。
【０００６】
β２ミクログロブリンは、非グリコシル化１２ｋＤａタンパク質である；その機能の１つは、ＭＨＣクラスＩ  α鎖を安定化させることである。α鎖とは異なり、β２ミクログロブリンは膜まで及ばない。ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座は、第１５番染色体上にあり、他方で、マウス遺伝子座は、第２番染色体上にある。β２ミクログロブリン遺伝子は、４つのエクソンおよび３つのイントロンからなる。β２ミクログロブリンの循環形態は、血清、尿および他の体液中に存在する；したがって、非共有結合ＭＨＣ  Ｉ関連β２ミクログロブリンは、生理学的条件下で、循環β２ミクログロブリンと交換され得る。
【０００７】
クラスＩ  ＭＨＣ分子は、腫瘍細胞を含む全ての有核細胞上に発現される。これらは、とりわけ、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞ならびに好中球において特異的に発現され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対し、その表面にペプチド断片（典型的には、８〜１０アミノ酸長）を表すように機能する。ＣＴＬは、その自らの膜結合ＴＣＲによって認識されるＭＨＣ  Ｉ結合ペプチドを保有する任意の細胞を死滅させるように特殊分化される。細胞が細胞性タンパク質に由来するが通常は存在しない（例えば、ウイルス起源、腫瘍起源または他の非自己起源の）ペプチドを表面に表す場合、このようなペプチドは、ＣＴＬによって認識され、該ＣＴＬは、活性化されて、該ペプチドを表面に表す細胞を死滅させる。
【０００８】
典型的には、ＭＨＣ  Ｉ分子との関連で、正常の（すなわち、自己の）タンパク質の提示は、寛容機構ゆえに、ＣＴＬ活性化を惹起しない。しかし、いくつかの疾患（例えば、がん、自己免疫疾患）において、自己タンパク質に由来するペプチドが、免疫系の細胞構成要素の標的になり、このようなペプチドを提示する細胞の破壊をもたらす。ＭＨＣクラスＩ分子を介してヒトＣＴＬによって認識されるペプチドの同定を改善するために、細胞性免疫応答を惹起するいくつかの自己由来抗原（例えば、種々のがんに関連する抗原）を認識することにおいて進歩はあるが、ヒト細胞性免疫系の諸態様を模倣するｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方の系についての必要性が依然としてある。ヒト細胞性免疫系を模倣する系は、ヒト治療剤、例えばワクチンおよび他の生物製剤を開発するための、疾患関連抗原を同定することにおいて使用され得る。ヒト免疫系との関連で、抗原認識を評価するための系は、治療的に有用な（例えば、ヒト疾患を研究し、これと闘うのに有用な）ＣＴＬ集団を同定することを補助し得る。このような系はまた、ヒトＣＴＬ集団の活性を、感染症および外来性抗原保有実体とより有効に闘うように、増強することも補助し得る。したがって、ヒト免疫系の機能を模倣する構成要素を表面に表す免疫系を生成し得る生物システム（例えば、遺伝子操作動物）についての必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質およびそのキメラに関連し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合するペプチドを生成するかまたは同定するための生物系が提供される。細胞性免疫応答において機能するヒト分子またはヒト化分子を発現する非ヒト細胞を含む非ヒト動物が提供される。ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉタンパク質およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヒト化げっ歯動物遺伝子座もまた提供される。ヒトまたはヒト化ＭＨＣ分子およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞もまた提供される。１種または複数種のヒトまたはヒト化免疫系分子を発現するヒト化げっ歯動物細胞を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ系およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が提供される。
【００１０】
キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えば、ヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）であって、ここで、該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含む非ヒト動物が本明細書中で提供される。具体的には、非ヒト動物であって、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座においてキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含むヌクレオチド配列を含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する非ヒト動物が本明細書中で提供される。１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現しない。本発明の１つの態様では、上記非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）は、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えばヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２コピーのＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含む。本発明の別の態様では、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１コピーのＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含む。したがって、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＭＨＣ  Ｉ遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。種々の実施形態において、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）の生殖細胞系に含まれる。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、非ヒト動物の生殖細胞系に含まれる。
【００１１】
１つの態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒト調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなどに作動可能に連結している。１つの実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分はヒトリーダー配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチドは、非ヒトリーダー配列、例えば、内在性非ヒトリーダー配列を含む。さらなる実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１、α２およびα３ドメインを含む。ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−ａポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドである。別の実施形態では、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドである。
【００１２】
１つの態様では、遺伝子操作された非ヒト動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、上記げっ歯動物はマウスである。したがって、１つの実施形態では、内在性非ヒト遺伝子座は、マウス遺伝子座、例えば、マウスＨ−２Ｋ、Ｈ−２ＤまたはＨ−２Ｌ遺伝子座である。１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの非ヒト部分は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。したがって、上記非ヒト動物がマウスである実施形態では、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座）であってもよく、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｋポリペプチドであってもよい；したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。非ヒト動物がマウスである別の実施形態では、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、Ｈ−２Ｄ遺伝子座であってもよく、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｄポリペプチドであってもよい；したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。同様に、別の実施形態では、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｌ遺伝子座であってもよく、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｌポリペプチドであってもよい；したがって、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｌポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み得る。
【００１３】
また、マウスであって、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座においてキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分がヒトＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、そのマウス部分がマウスＨ−２Ｋポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含むヌクレオチド配列を含み、該キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するマウスも本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、上記マウスは、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座からマウスＨ−２Ｋポリペプチドの細胞外ドメインを発現しない（例えば、機能的な細胞外ドメインを発現しない）。１つの態様では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している。上記キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトリーダー配列を含み得る。これはまた、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１、α２およびα３ドメインも含み得る。上記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチドであってもよい。１つの態様では、上記マウスＨ−２Ｋ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座である。
【００１４】
内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ｂ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｄ（例えば、Ｈ−２Ｄ１）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、該マウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、マウスもまた提供される。いくつかの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現しない。１つの態様では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している。キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトリーダー配列を含み得る。キメラポリペプチドは、マウスリーダー配列を含み得る。キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１、α２、およびα３ドメインを含み得る。ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドであり得る。１つの態様では、マウスＨ−２Ｄ遺伝子座はＨ−２Ｄ１遺伝子座である。
【００１５】
さらなる実施形態では、内在性マウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ２７、およびＨＬＡ−Ｂ７からなる群より選択されるヒトＭＨＣ  Ｉの細胞外ドメインを含む、マウスが提供される。別の実施形態では、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含むマウスであって、キメラポリペプチド（複数可）のヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含み、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）のマウス部分は、マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するマウスが提供される。したがって、マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｋ、およびＨ−２Ｌから選択され得る。１つの実施形態では、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ、ＨＬＡ−Ａ３／Ｈ−２Ｋ、ＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｈ−２Ｄ、およびこれらの組合せから選択され得る。１つの実施形態では、１つ、２つ、または３つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、各第１７番姉妹染色体上にコードされ得る；したがって、マウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含み得る。１つの実施形態では、マウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、該２つのヌクレオチド配列は、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードし、該マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する。１つの実施形態では、本明細書中で提供されるマウスは、内在性マウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から、いかなる機能的な内在性マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドも発現しない。したがって、１つの態様では、マウスは、ヒト化ポリペプチド、例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドのみを発現し、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉ配列を含まないＭＨＣ  Ｉ遺伝子座（例えば、内在性マウスＭＨＣ  Ｉヌクレオチド配列の、キメラヒト／マウスポリペプチドをコードするヌクレオチド配列による置き換えを含まない残りのＭＨＣ  Ｉ遺伝子座）は、欠失によって除去される。別の実施形態では、マウスは、機能的な内在性マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、Ｈ−２Ｌポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を保持する。
【００１６】
本発明の別の態様は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む、非ヒト動物、例えばげっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）に関する。したがって、非ヒト動物であって、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座においてヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する非ヒト動物が本明細書中で提供される。１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から機能的な内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。１つの態様では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする２コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む；別の実施形態では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする１コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む。したがって、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするβ２ミクログロブリン遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。種々の実施形態において、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）の生殖細胞系に含まれる。１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、上記ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉタンパク質に結合可能である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している。１つの態様では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。別の態様では、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４に示されるヌクレオチド配列を含む。さらなる態様において、上記ヌクレオチド配列はまた、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列も含む。いくつかの実施形態では、上記非ヒト動物は、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）である；したがって、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座は、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）β２ミクログロブリン遺伝子座である。
【００１８】
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を内在性β２ミクログロブリン遺伝子座において含むマウスであって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するマウスも提供される。いくつかの実施形態では、上記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な内在性マウスβ２ミクログロブリンを発現しない。上記ヌクレオチド配列は内在性マウス調節エレメントに連結し得る。１つの態様では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。あるいは、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１のヌクレオチド配列をさらに含み得る。１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、上記ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉタンパク質に結合可能である。
【００１９】
本発明は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）をさらに提供する。１つの実施形態では、本発明は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分がヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含む該キメラポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列をそのゲノムに含む非ヒト動物であって、該第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に位置し、該第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、該キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する非ヒト動物が提供される。１つの態様では、上記動物はマウスである。したがって、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌ遺伝子座からなる群より選択され得る。１つの実施形態では、内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ｋｂ遺伝子座）である。別の実施形態では、内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２Ｄ遺伝子座である。１つの実施形態では、上記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃポリペプチドからなる群より選択される。１つの態様では、上記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）である。別の実施形態では、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７である。種々の実施形態では、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列は、上記非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）の生殖細胞系に含まれる。
【００２０】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分がヒトＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）の細胞外ドメインを含み、マウス部分がマウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む該キメラポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、ならびにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列をそのゲノムに含むマウスであって、該第１のヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、該第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、該キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよび該ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するマウスを提供する。別の実施形態では、本発明は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分がヒトＨＬＡ−Ｂ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７）の細胞外ドメインを含み、マウス部分が、マウスＨ−２Ｄの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む該キメラポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列；ならびにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列をそのゲノムに含むマウスであって、該第１のヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座に位置し、該第２のヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置し、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、マウスを提供する。１つの実施形態では、上記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの両方を含む非ヒト動物（例えば、マウス）は、それらのそれぞれの内在性遺伝子座から、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、マウスＨ−２Ｋ、またはＨ−２Ｄポリペプチド）の細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）および／または機能的な内在性非ヒト（例えば、マウス）β２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。１つの態様では、上記動物（例えば、マウス）は、それぞれ２コピーの上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列を含む。別の態様では、上記動物（例えば、マウス）は、１コピーの上記第１のヌクレオチド配列および１コピーの上記第２のヌクレオチド配列を含む。したがって、上記動物は、上記第１のヌクレオチド配列および上記第２のヌクレオチド配列の両方について、ホモ接合型であっても、またはヘテロ接合型であってもよい。
【００２１】
１つの態様では、上記第１のヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（例えば、マウス）ＭＨＣ  Ｉ調節エレメントに作動可能に連結しており、上記第２のヌクレオチド配列は、内在性非ヒト（例えば、マウス）β２ミクログロブリンエレメントに作動可能に連結している。上記キメラポリペプチドのヒト部分は、上記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１、α２およびα３ドメインを含み得る。上記第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、上記第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３および４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、上記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの両方を含むマウスは、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの発現の非存在下における上記キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドの発現と比較して、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンの発現がキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドの発現を増大させるものであってもよい。
【００２２】
さらに、そのゲノム、例えば、その内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含み、その内在性β２ミクログロブリン遺伝子座に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むマウスが提供される。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）のヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。したがって、マウスは、１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現し得る。
【００２３】
本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えばマウスまたはラット）を作製する方法もまた、提供される。したがって、１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／げっ歯動物（例えば、ヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するように非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）のＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を改変する方法であって、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座において、非ヒト、例えば、げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法が提供される。別の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように非ヒト、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）のβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変する方法であって、内在性非ヒト、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）β２ミクログロブリン遺伝子座において、非ヒト、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法が提供される。このような方法では、上記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ得、該単一のＥＳ細胞は、胚を作製するために、非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）に導入され得る。得られた非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）を交配して、二重ヒト化動物を生み出すことができる。
【００２４】
したがって、本発明はまた、二重ヒト化動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）を作製する方法も提供する。１つの実施形態では、遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、（ａ）第１のマウスのＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するように改変する工程であって、内在性マウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座においてマウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程、（ｂ）第２のマウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座においてマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに（ｃ）該第１のマウスと該第２のマウスとを交配させて、そのゲノムに、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生成する工程を含み、該遺伝子改変されたマウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する方法が提供される。いくつかの実施形態では、上記ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌから選択され；いくつかの実施形態では、上記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃから選択される。１つの実施形態では、上記ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、Ｈ−２Ｋ遺伝子座であり、上記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）であり、上記マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチド）を発現する。１つの態様では、上記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチドの細胞外ドメインならびにＨ−２Ｋポリペプチドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。別の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座はＨ−２Ｄ遺伝子座であり、ヒトＭＨＣ  ＩポリペプチドはＨＬＡ−Ｂ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７）であり、マウスは、キメラＨＬＡ−Ｂ２／Ｈ−２Ｄポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチド）を発現する。１つの態様では、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドの細胞外ドメインならびにＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。１つの態様では、上記第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４（例えば、エクソン２〜エクソン４）に示されるヌクレオチド配列、ならびにマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする非ヒトキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座であって、非ヒトＭＨＣ  Ｉ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列と作動可能に連結したヒトＭＨＣ  Ｉ細胞外ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列を含む、非ヒトキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座も本明細書中で提供される。１つの態様では、キメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の内在性ＭＨＣ  Ｉ位にある。１つの態様では、キメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えば、ヒト／マウスまたはヒト／ラット）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  Ｉは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７またはＨＬＡ−Ａ２）から選択される。１つの実施形態では、非ヒトＭＨＣ  Ｉは、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｋ、およびＨ−２Ｌから選択されるマウスＭＨＣ  Ｉ（例えば、Ｈ−２ＤまたはＨ−２Ｋ）である。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、１つまたは複数のキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する。
【００２６】
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変されたβ２ミクログロブリン遺伝子座も本明細書中で提供される。１つの態様では、遺伝子座は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４（例えば、エクソン２〜４）に示される配列を含む第１のヌクレオチド配列、および非ヒト（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示される配列を含む第２のヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結している。１つの態様では、遺伝子改変されたβ２ミクログロブリン遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の内在性β２ミクログロブリン位置にある。１つの態様では、遺伝子改変されたβ２ミクログロブリン遺伝子座は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する。
【００２７】
１つの態様では、非ヒトキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を生成するための、本明細書中で記載される任意の方法によって入手可能である。１つの態様では、遺伝子改変されたβ２ミクログロブリン遺伝子座は、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を生成するための、本明細書中で記載される任意の方法によって入手可能である。
【００２８】
本明細書中で記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来する細胞（例えば、単離された抗原提示細胞）もまた、本明細書中で提供される。本明細書中で記載される非ヒト動物に由来する組織および胚もまた提供される。
【００２９】
なお別の実施形態では、本発明は、免疫応答を惹起する抗原または抗原エピトープの同定のための方法、ワクチン候補を評価するための方法、ヒト病原体またはがん抗原に対する高親和性Ｔ細胞の同定のための方法を提供する。
【００３０】
本明細書中で記載される実施形態および態様のいずれもが、他に指示がない限り、文脈から別段明らかでない限り、互いに共同して使用され得る。他の実施形態は、続く詳細な記載を精査して当業者に明らかになる。以下の詳細な記載は、特許請求される本発明を制限しない、本発明の種々の実施形態の代表例を含む。添付の図面は、本明細書の一部を構成し、記載と一緒に、実施形態を例証するためのみに働き、本発明を制限しない。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメイン、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびにマウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記キメラポリペプチドを発現する、
マウス。
（項目２）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座からマウスＨ−２Ｄポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、請求項１に記載のマウス。
（項目３）
前記内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、請求項１に記載のマウス。
（項目４）
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウスＨ−２Ｄリーダーヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のマウス。
（項目５）
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１に記載のマウス。
（項目６）
前記ヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１エクソン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１−α２イントロン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α２エクソン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α２−α３イントロン、およびヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α３エクソンを含む、請求項１に記載のマウス。
（項目７）
内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、請求項１から６のいずれか一項に記載のマウス。
（項目８）
前記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から機能的な内在性β２ミクログロブリンを発現しない、請求項７に記載のマウス。
（項目９）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、請求項８に記載のマウス。
（項目１０）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のマウス。
（項目１１）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、エクソン３、およびエクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載のマウス。
（項目１２）
内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、２つまたはそれ超のキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする２つまたはそれ超のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
前記キメラポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメイン、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン、ならびに非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記動物は、前記２つまたはそれ超のキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、
非ヒト動物。
（項目１３）
前記動物は、げっ歯動物である、請求項１２に記載の動物。
（項目１４）
前記げっ歯動物は、マウスまたはラットである、請求項１３に記載の動物。
（項目１５）
前記げっ歯動物はマウスであり、前記非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、マウスＨ−２Ｄポリペプチド、マウスＨ−２Ｋポリペプチド、またはマウスＨ−２Ｌポリペプチドである、請求項１４に記載の動物。
（項目１６）
前記動物は、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現しない、請求項１２に記載の非ヒト動物。
（項目１７）
内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記マウスは、前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する、マウス。
（項目１８）
前記マウスは、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現しない、請求項１７に記載のマウス。
（項目１９）
前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座に位置する、請求項１７に記載のマウス。
（項目２０）
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩポリペプチドをコードするキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座であって、
非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結したヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列
を含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、遺伝子座。
（項目２１）
前記ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の内在性ＭＨＣ  Ｉ位に位置する、請求項２０に記載の遺伝子座。
（項目２２）
前記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７である、請求項２１に記載の遺伝子座。
（項目２３）
前記非ヒトＭＨＣ  ＩポリペプチドはマウスＨ−２ＫポリペプチドまたはマウスＨ−２Ｄポリペプチドである、請求項２０に記載の遺伝子座。
（項目２４）
マウスの内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現させる方法であって、前記内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
（項目２５）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの前記細胞外ドメインを発現しない、請求項２４に記載の方法。
（項目２６）
前記マウスは、前記ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを発現する、請求項２４に記載の方法。
（項目２７）
前記マウスは、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメインおよび前記マウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを発現する、請求項２４に記載の方法。
（項目２８）
前記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、前記単一のＥＳ細胞は、マウス胚に導入されて、マウスを作製する、請求項２４に記載の方法。
（項目２９）
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
第１のマウスのＨ−２Ｄ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；
第２のマウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに
前記第１のマウスおよび前記第２のマウスを交配して、そのゲノムに、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生成する工程であって、前記遺伝子改変されたマウスは、前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドおよび前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する工程
を含む、方法。
（項目３０）
前記第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列およびマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、クラスＩ  ＭＨＣ分子の４つのドメイン：α１、α２およびα３ドメインを含有するα鎖および非共有結合した第４のドメインであるβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）の概略図である。灰色の円は、ペプチド結合溝に結合したペプチドを表す。
【００３２】
【図２】図２は、ヒトＨＬＡの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。
【００３３】
【図３】図３は、マウスＭＨＣの関連のゲノム構造の概略描写（原寸に比例しない）であり、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ遺伝子を示す。
【００３４】
【図４】図４は、キメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２ＫポリペプチドおよびＩＲＥＳ−ＧＦＰレポーターをコードするｃＤＮＡを含有するウイルスベクター構築物（Ａ）；ならびに単独で（左）またはヒト化β２ミクログロブリンと共形質導入された（右）、ＨＬＡ−Ａ２によって形質導入された（破線）、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋによって形質導入された（点線）、または形質導入されていない（実線）ＭＧ８７細胞におけるヒトＨＬＡ−Ａ２の発現を比較するヒストグラム（Ｂ）を示す。（Ｂ）においてグラフで示される水平ゲートからのデータは、構築物を発現する細胞の百分率として（Ｃ）の表に示される。
【００３５】
【図５】図５は、ヒトＨＬＡ−Ａ２タンパク質の細胞外領域を発現するキメラＨ−２Ｋ遺伝子座を作製するために使用される標的化戦略の概略図（原寸に比例しない）である。マウス配列は、黒で表され、ヒト配列は、白で表される。Ｌ＝リーダー、ＵＴＲ＝非翻訳領域、ＴＭ＝膜貫通ドメイン、ＣＹＴ＝細胞質ドメイン、ＨＹＧ＝ハイグロマイシン。
【００３６】
【図６Ａ】図６Ａは、野生型（ＷＴ）マウスまたはキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋ  ＨＥＴ）を有するヘテロ接合型マウスのいずれかから単離された細胞におけるＨＬＡ−Ａ２（左）およびＨ−２Ｋ（右）の発現（％全細胞）を明示する。
【００３７】
【図６Ｂ】図６Ｂは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子座を有するヘテロ接合型マウスにおけるキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現のドットプロットである。
【００３８】
【図７】図７は、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座におけるβ２ミクログロブリン遺伝子のヒト化についての標的化戦略（原寸に比例しない）を示す。マウス配列は黒であり、ヒト配列は、白である。ＮＥＯ＝ネオマイシン。
【００３９】
【図８】図８は、野生型（ＷＴ）マウス、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋに対してヘテロ接合型マウス、およびキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋに対してヘテロ接合型かつヒト化β２ミクログロブリンに対してヘテロ接合型マウス（二重ヘテロ接合型；クラスＩ／β２ｍ  ＨＥＴ）の血液から単離された細胞におけるＨＬＡクラスＩおよびヒトβ２ミクログロブリンの発現の代表的なドットプロットを示す。
【００４０】
【図９】図９は、野生型（ＷＴ）、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋヘテロ接合型（クラスＩ  ＨＥＴ）、およびキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋ／ヒト化β２ミクログロブリン二重ヘテロ接合型（クラスＩ／β２ｍ  ＨＥＴ）マウスの血液から単離された細胞におけるヒトＨＬＡクラスＩ発現（Ｘ軸）の代表的なヒストグラムを示す。
【００４１】
【図１０】図１０は、ｆｌｕ（左）またはＥＢＶ（右）ペプチドの存在下で野生型マウス（ＷＴ  ＡＰＣ）由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋおよびヒト化β２ミクログロブリンの両方に対してヘテロ接合型マウス由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）（二重ＨＥＴ  ＡＰＣ）に曝露したヒトＴ細胞についてのＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果を示す。統計学的分析を、Ｔｕｋｅｙの事後多重比較検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して実施した。
【００４２】
【図１１】図１１は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子の細胞外ドメイン（特定の実施形態では、ヒトα１、α２、およびα３ドメインと示される）、ならびに内在性マウスＨ−２Ｄリーダー、膜貫通、および細胞質ドメインを発現するキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ１遺伝子座を作製するための標的化戦略の概略図（原寸に比例しない）である。ゲノタイピングに使用されるプローブの位置（表２を参照されたい）も含まれている。ｈＥＸ１＝ヒトエクソン１；ｍＥＸ１＝マウスエクソン１；ｈ２、ｈ３、ｈ４＝ヒトエクソン２、３、および４；ｍ５、ｍ６、ｍ７、ｍ８＝マウスエクソン５、６、７、および８；ｍＴＭ＝ｍ５内のマウス膜貫通ドメイン。他に指示がない場合、マウス配列は黒で表され、ヒト配列は白で表される。
【００４３】
【図１２】図１２の上の２つのグラフは、野生型マウス（ＷＴ；右上の図）またはキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄヘテロ接合型／ヒト化β２ミクログロブリンヘテロ接合型マウス（Ｂ２７／ｈＢ２Ｍ  Ｈｅｔ／Ｈｅｔ；左上の図）の血液から単離された細胞におけるヒトＨＬＡクラスＩ発現の代表的なヒストグラムを示す；下の２つのグラフは、ＷＴマウスまたはＢ２７／ｈＢ２Ｍ  Ｈｅｔ／Ｈｅｔマウスの血液から単離された細胞におけるヒトβ２ミクログロブリン発現の代表的なヒストグラムを示す。ＭＦＩ＝平均蛍光強度；ｓｅｃのみ＝二次抗体染色のみ。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
定義
本発明は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉおよび／またはβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現する遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）；これを含む胚、細胞、および組織；これを作製する方法；ならびにこれを使用する方法を提供する。他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されない限り、またはこの用語もしくは語句が使用される文脈から別段明らかにされない限り、この用語および語句が当該分野で果たしている意味を含む。
【００４５】
用語「保存的」は、保存的アミノ酸置換を記載するために使用される場合、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するようにヌクレオチド配列を改変することによって達成され得る。一般に、保存的アミノ酸置換は、目的のタンパク質の機能的特性、例えば、ＭＨＣ  Ｉが目的のペプチドを提示する能力を、実質的に変えない。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；脂肪族−ヒドロキシル側鎖、例えばセリンおよびトレオニン；アミド含有側鎖、例えばアスパラギンおよびグルタミン；芳香族側鎖、例えばフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；塩基性側鎖、例えばリジン、アルギニン、およびヒスチジン；酸性側鎖、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに、硫黄含有側鎖、例えばシステインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換基としては、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発において使用されるように、タンパク質における任意の天然の残基のアラニンによる置換であってもよい。いくつかの実施形態では、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれる、Gonnetら（（１９９２年）Exhaustive  Matching  of  the  Entire  Protein  Sequence  Database、Science  ２５６巻：１４４３〜４５頁）において開示されるＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を有するように行われる。いくつかの実施形態において、上記置換は、中程度に保存的な置換であり、ここで、該置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負でない値を有する。
【００４６】
したがって、そのゲノムがヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよび／またはβ２ミクログロブリンポリペプチド（このポリペプチドは、本明細書中で記載されるアミノ酸配列の保存的アミノ酸置換を含む）をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変された非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。
【００４７】
当業者は、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよび／またはβ２ミクログロブリンをコードする核酸残基に加えて、遺伝コードの縮重に起因して、他の核酸が本発明のポリペプチドをコードし得ることを理解する。したがって、保存的アミノ酸置換を有するＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよび／またはβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む遺伝子改変された非ヒト動物に加えて、そのゲノムが遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載されるものとは異なるヌクレオチド配列を含む非ヒト動物もまた提供される。
【００４８】
用語「同一性」は、配列に関して使用される場合、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の配列同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知の多くの異なるアルゴリズムによって決定される同一性を含む。本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティー、０．１の伸長ギャップペナルティーを用いたＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アラインメントを使用し、かつＧｏｎｎｅｔ類似性行列（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８年）を使用して決定される。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、特定の配列に依存する。種々の実施形態では、同一性は、成熟タンパク質の配列を、そのＮ−末端からそのＣ−末端まで比較することによって決定される。種々の実施形態では、キメラヒト／非ヒト配列をヒト配列と比較する場合、ヒト配列とキメラヒト／非ヒト配列のヒト部分との間のレベルの同一性の確認を目的とした比較を行う（例えば、キメラヒト／マウスタンパク質のヒトエクトドメインとヒトタンパク質のヒトエクトドメインを比較する）ことにおいて、該キメラヒト／非ヒト配列のヒト部分を使用する（しかし、非ヒト部分を使用しない）。
【００４９】
配列、例えば、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して、用語「相同性」または「相同な」は、最適アラインメントおよび比較における２つの配列が、例えば、少なくとも約７５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、少なくとも約８０％のヌクレオチドまたはアミノ酸、少なくとも約９０〜９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸、例えば、９７％を超えるヌクレオチドまたはアミノ酸において、同一であることを意味する。最適な遺伝子標的化のために、標的化構築物は、内在性ＤＮＡ配列に対して相同なアーム（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含有すべきであることを、当業者は理解する；したがって、相同組換えは、標的化構築物と標的にされた内在性配列との間に起こり得る。
【００５０】
用語「作動可能に連結している」は、記載された構成要素が、該要素の意図する様式で機能することを可能にする関係にある近位をいう。このように、タンパク質をコードする核酸配列は、正しい転写調節を保持するように調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に作動可能に連結し得る。さらに、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々の部分は、細胞内で、タンパク質の正しい折り畳み、プロセシング、標的化、発現および他の機能的特性を保持するように作動可能に連結し得る。他に言及されない限り、本発明のキメラタンパク質またはヒト化タンパク質の種々のドメインは、互いに作動可能に連結している。
【００５１】
用語「ＭＨＣ  Ｉ複合体」などは、本明細書中で使用される場合、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖ポリペプチドとβ２−ミクログロブリンポリペプチドとの間の複合体を含む。用語「ＭＨＣ  Ｉポリペプチド」などは、本明細書中で使用される場合、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖ポリペプチドのみを含む。典型的には、用語「ヒトＭＨＣ」および「ＨＬＡ」は、相互交換可能に使用され得る。
【００５２】
遺伝子置き換えに関して用語「置き換え」は、内在性遺伝子の遺伝子座に外来性遺伝物質を置き、それによって、オルソロガスなまたは相同な核酸配列で内在性遺伝子の全てまたは一部を置き換えることをいう。以下の実施例において実証されるように、マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドの部分をコードする内在性遺伝子座の核酸配列を、それぞれ、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドの部分をコードするヌクレオチド配列によって置き換えた。
【００５３】
「機能的」は、例えば、機能的なポリペプチドについて本明細書中で使用される場合、通常天然のタンパク質に関連する少なくとも１つの生物学的活性を保持するポリペプチドをいう。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、内在性遺伝子座における置き換え（例えば、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉおよび／またはβ２ミクログロブリン遺伝子座における置き換え）は、機能的な内在性ポリペプチドを発現しない遺伝子座を生じる。同様に、用語「機能的」は、タンパク質の機能的な細胞外ドメインについて本明細書中で使用される場合、その機能性、例えば、ＭＨＣ  Ｉの場合では、抗原に結合する能力、Ｔ細胞共受容体に結合する能力などを保持する細胞外ドメインをいう。本発明のいくつかの実施形態では、内在性ＭＨＣ遺伝子座における置き換えは、内在性ＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現しないが、ヒトＭＨＣの細胞外ドメイン（例えば、機能的な細胞外ドメイン）を発現する遺伝子座を生じる。
【００５４】
遺伝子改変されたＭＨＣ  Ｉ非ヒト動物について本明細書中以下で記載されるいくつかの態様、例えば、動物の種類；動物系統；細胞の種類；スクリーニング、検出および他の方法；使用の方法；などは、遺伝子操作されたβ２ミクログロブリン動物およびＭＨＣ  Ｉ／β２ミクログロブリン動物に対して適用可能である。
【００５５】
遺伝子改変されたＭＨＣ  Ｉ動物
種々の実施形態では、本発明は、一般に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含み、したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。
【００５６】
ＭＨＣ遺伝子は、３つのクラス：クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩに分類され、これらの全ては、ヒト第６番染色体上またはマウス第１７番染色体上のいずれかにコードされる。ヒトおよびマウスのＭＨＣクラスの相対的構成の概略は、それぞれ図２および３に示される。ＭＨＣ遺伝子はとりわけ、マウスおよびヒトのゲノムのうちで最も多形な遺伝子である。ＭＨＣ多形性は、進化的利点を提供する上で重要であると推定される；配列における変化はペプチド結合における差異をもたらし得、細胞傷害性Ｔ細胞のよりよい病原体提示を可能にする。
【００５７】
ＭＨＣクラスＩタンパク質は、細胞外ドメイン（３つのドメイン：α１、α２およびα３を含む）、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含む。α１およびα２ドメインは、ペプチド結合溝を形成し、他方で、α３は、β２−ミクログロブリンと相互作用する。
【００５８】
β２−ミクログロブリンとのその相互作用に加えて、α３ドメインは、ＴＣＲ共受容体ＣＤ８と相互作用し、抗原特異的活性化を促進する。ＭＨＣクラスＩのＣＤ８に対する結合は、ＴＣＲのＭＨＣクラスＩに対する結合よりも約１００倍弱いが、ＣＤ８結合は、ＴＣＲ結合の親和性を増大する。Wooldridgeら（２０１０年）MHC  Class  I  Molecules  with  Superenhanced  CD8  Binding  Properties  Bypass  the  Requirement  for  Cognate  TCR  Recognition  and  Nonspecifically  Activate  CTLs、J.  Immunol.１８４巻：３３５７〜３３６６頁。興味深いことに、ＭＨＣクラスＩのＣＤ８に対する結合の増大は、ＣＴＬ活性化における抗原特異性を抑制した。同上。
【００５９】
ＭＨＣクラスＩ分子に対するＣＤ８の結合は、種特異的である；ＣＤ８のマウスホモログであるＬｙｔ−２は、α３ドメインにおいてＨ−２Ｄｄ分子に結合するが、ＨＬＡ−Ａ分子には結合しないことが示された。Connollyら（１９８８年）The  Lyt-2  Molecule  Recognizes  Residues  in  the  Class  I  α3  Domain  in  Allogeneic  Cytotoxic  T  Cell  Responses、J.  Exp.  Med.１６８巻：３２５〜３４１頁。差次的結合は、おそらく、ヒトとマウスとの間で保存されていないＣＤ８におけるＣＤＲ様抗原決定基（ＣＤＲ１様およびＣＤＲ２様）に起因した。Sandersら（１９９１年）Mutations  in  CD8  that  Affect  Interactions  with  HLA  Class  I  and  Monoclonal  Anti-CD8  Antibodies、J.  Exp.  Med.１７４巻：３７１〜３７９頁；Vitielloら（１９９１年）Analysis  of  the  HLA-restricted  Influenza-specific  Cytotoxic  T  Lymphocyte  Response  in  Transgenic  Mice  Carrying  a  Chimeric  Human-Mouse  Class  I  Major  Histocompatibility  Complex、J.  Exp.  Med.１７３巻：１００７〜１０１５頁；ならびにGaoら（１９９７年）Crystal  structure  of  the  complex  between  human  CD8αα  and  HLA-A2、Nature  ３８７巻：６３０〜６３４頁。ＣＤ８は、α３ドメインの保存的領域において（２２３〜２２９位において）ＨＬＡ−Ａ２に結合することが報告されている。ＨＬＡ−Ａにおける単一の置換（Ｖ２４５Ａ）が、ＣＤ８のＨＬＡ−Ａに対する結合を減少させ、同時に、Ｔ細胞媒介型溶解を大きく減少させた。Salterら（１９８９年）、Polymorphism  in  the  α3  domain  of  HLA-A  molecules  affects  binding  to  CD8、Nature  ３３８巻：３４５〜３４８頁。一般に、ＨＬＡ−Ａ分子のα３ドメインにおける多形性はまた、ＣＤ８に対する結合に影響を及ぼした。同上。マウスにおいて、Ｈ−２Ｄｄにおける残基２２７でのアミノ酸置換は、マウスＬｙｔ−２のＨ−２Ｄｄに対する結合に影響を及ぼし、変異体Ｈ−２Ｄｄによってトランスフェクトされた細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって溶解されなかった。Potterら（１９８９年）Substitution  at  residue  227  of  H-2  class  I  molecules  abrogates  recognition  by  CD8-dependent,  but  not  CD8-independent,  cytotoxic  T  lymphocytes、Nature  ３３７巻：７３〜７５頁。
【００６０】
したがって、ＭＨＣクラスＩ  α３ドメインとＣＤ８との間の相互作用の種特異性に起因して、Ｈ−２Ｋ  α３ドメインのヒトＨＬＡ−Ａ２  α３ドメインによる置き換えを含むＭＨＣ  Ｉ複合体は、マウスにおいて（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで）ヒトＣＤ８の非存在下で非機能的であった。ＨＬＡ−Ａ２についてトランスジェニックである動物において、マウスα３ドメインに代えてのヒトα３ドメインによる置換は、Ｔ細胞応答の回復をもたらした。Irwinら（１９８９年）Species-restricted  interactions  between  CD8  and  the  α3  domain  of  class  I  influence  the  magnitude  of  the  xenogeneic  response、J.  Exp.  Med.１７０巻：１０９１〜１１０１頁；Vitielloら（１９９１年）、上掲。
【００６１】
マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質尾部もまた、重要な機能を有する。ＭＨＣ  Ｉ膜貫通ドメインの機能の１つは、おそらくはＭＨＣ分子の表面の架橋（またはライゲーション）の結果として、ホモタイプな細胞接着のＨＬＡ−Ａ２による（接着を増強するかまたは阻害するための）モジュレーションを促進することである。Wagnerら（１９９４年）Ligation  of  MHC  Class  I  and  Class  II  Molecules  Can  Lead  to  Heterologous  Desensitization  of  Signal  Transduction  Pathways  That  Regulate  Homotypic  Adhesion  in  Human  Lymphocytes,  J.  Immunol.１５２巻：５２７５〜５２８７頁。細胞接着は、ＨＬＡ−Ａ２分子の多様なエピトープにおいて結合するｍＡｂｓによって影響を受け得、このことは、ホモタイプな細胞接着のモジュレーションに関係する複数の部位がＨＬＡ−Ａ２上に存在すること；結合したエピトープに依存して、その影響は、ＨＬＡ−Ａ２依存型接着を増強し得るか、または阻害し得ることを示唆する。同上。
【００６２】
ＭＨＣ  Ｉ遺伝子のエクソン６および７によってコードされる細胞質尾部は、細胞表面上の正しい発現のため、およびＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＬＩＲ１媒介型阻害のために必要であると報告される。Grudaら（２００７年）Intracellular  Cysteine  Residues  in  the  Tail  of  MHC  Class  I  Proteins  Are  Crucial  for  Extracellular  Recognition  by  Leukocyte  Ig-Like  Receptor  1,  J.  Immunol.１７９巻：３６５５〜３６６１頁。細胞質尾部は、少なくともいくつかのＭＨＣ  Ｉ分子の、そのシステイン残基におけるジスルフィド結合の形成を介した多量体化のために必要であり、したがって、クラスター形成において、およびＮＫ細胞による認識において役割を果たし得る。Lynchら（２００９年）Novel  MHC  Class  I  Structures  on  Exosomes,  J.  Immunol.１８３巻：１８８４〜１８９１頁。
【００６３】
ＨＬＡ−Ａ２の細胞質ドメインは、構成的にリン酸化されたセリン残基およびリン酸化可能なチロシンを含有するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞においては、細胞質ドメインを欠く変異体ＨＬＡ−Ａ２分子が、発現、細胞骨格会合、凝集およびエンドサイトーシス内部移行に関して正常であるようである。Gurら（１９９７年）Structural  Analysis  of  Class  I  MHC  Molecules:  The  Cytoplasmic  Domain  Is  Not  Required  for  Cytoskeletal  Association,  Aggregation,  and  Internalization、Mol.  Immunol.３４巻（２号）：１２５〜１３２頁。細胞質ドメインを欠く短縮型ＨＬＡ−Ａ２分子は、明らかに正常に発現し、β２ミクログロブリンと正常に会合する。同上。
【００６４】
しかし、いくつかの研究は、細胞内輸送、樹状細胞（ＤＣ）媒介型抗原提示およびＣＴＬプライミングにおいて、細胞質尾部が重要であることを実証している。エクソン６によってコードされるチロシン残基は、エンドソームの区画を介したＭＨＣ  Ｉ輸送、外来性抗原の提示、およびＣＴＬプライミングに必要であることが示された；他方で、エクソン７の欠失は、抗ウイルス性ＣＴＬ応答の増強を引き起こした。Lizeeら（２００３年）Control  of  Dendritic  Cross-Presentation  by  the  Major  Histocompatibility  Complex  Class  I  Cytoplasmic  Domain、Nature  Immunol.４巻：１０６５〜７３頁；Bashaら（２００８年）MHC  Class  I  Endosomal  and  Lysosomal  Trafficking  Coincides  with  Exogenous  Antigen  Loading  in  Dendritic  Cells、PLoS  ONE  ３巻：e3247；およびRodriguez-Cruzら（２０１１年）Natural  Splice  Variant  of  MHC  Class  I  Cytoplasmic  Tail  Enhances  Dendritic  Cell-Induced  CD8+  T-Cell  Responses  and  Boosts  Anti-Tumor  Immunity、PLoS  ONE  ６巻：e22939。
【００６５】
種々の実施形態では、本発明は、そのゲノムにヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）を提供する。非ヒト動物、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する非ヒト動物は、そのゲノムに部分的にヒトであり部分的に非ヒトであるＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、非ヒト動物は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチド、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのみを発現し、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉタンパク質（例えば、機能的な内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉタンパク質）を発現しない。
【００６６】
１つの実施形態では、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノム、例えば、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に含む、非ヒト動物、例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウスが本明細書中で提供される。別の実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノム、例えば、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に含む、非ヒト動物、例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウスが本明細書中で提供される。
【００６７】
１つの実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、そのヒト部分において、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのペプチド結合ドメインを含む。１つの態様では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉの細胞外ドメインを含む。この実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉのα鎖の細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉのα１およびα２ドメインを含む。別の実施形態において、キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉのα１、α２、およびα３ドメインを含む。１つの実施形態では、キメラポリペプチドのヒト部分（例えば、キメラポリペプチドの細胞外ドメイン）は、ヒトリーダー配列を含む。別の実施形態では、キメラポリペプチド（例えば、キメラポリペプチドの細胞外ドメイン）は、非ヒトリーダー配列（例えば、内在性非ヒトリーダー配列）を含む。
【００６８】
ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｅ遺伝子座、ＨＬＡ−Ｆ遺伝子座、またはＨＬＡ−Ｇ遺伝子座のいずれかによってコードされる機能的なヒトＨＬＡ分子に由来し得る。一般に使用されるＨＬＡ抗原のリストは、参照により本明細書に組み込まれるShankarkumarら（（２００４年）The  Human  Leukocyte  Antigen  (HLA)  System、Int.  J.  Hum.  Genet.  ４巻（２号）：９１〜１０３頁）に記載されている。Shankarkumarらはまた、当該分野で使用されるＨＬＡ命名法の簡潔な説明も提示する。ＨＬＡ命名法および種々のＨＬＡ対立遺伝子に関するさらなる情報は、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、Holdsworthら（２００９年）The  HLA  dictionary  ２００８年：a  summary  of  HLA-A,  -B,  -C,  -DRB1/3/4/5,  and  DQB1  alleles  and  their  association  with  serologically  defined  HLA-A,  -B,  -C,  -DR,  and  -DQ  antigens、Tissue  Antigens  ７３巻：９５〜１７０頁、およびMarshらによる最新の更新（２０１０年）Nomenclature  for  factors  of  the  HLA  system、２０１０年、Tissue  Antigens  ７５巻：２９１〜４５５頁において見出され得る。したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、そこに記載されている任意の機能的なヒトＨＬＡクラスＩ分子に由来し得る。
【００６９】
１つの特定の態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ａに由来する。特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド（例えば、およびＨＬＡ−Ａ２．１ポリペプチド）である。１つの実施形態では、ＨＬＡ−Ａポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１：０１：０１対立遺伝子によってコードされるポリペプチドである。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１対立遺伝子は、北米の集団の間で一般に使われている。本実施例は、この特定のＨＬＡ配列を記載するが、任意の好適なＨＬＡ−Ａ配列、例えば、ヒト集団において示されるＨＬＡ−Ａ２の多形バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的なアミノ酸改変を有する配列、遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載される配列とは異なる核酸配列などが、本明細書中に包含される。
【００７０】
１つの態様では、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列を発現する非ヒト動物であって、該ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、１つまたは複数の保存的または非保存的な改変を含む非ヒト動物が提供される。
【００７１】
１つの態様では、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列を発現する非ヒト動物であって、該ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、上記ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、実施例において記載されるヒトＨＬＡ−Ａ２配列に対し、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。１つの実施形態では、上記ヒトＨＬＡ−Ａ２配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。
【００７２】
別の特定の態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃから選択されるヒトＭＨＣ  Ｉに由来する。１つの態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉは、ＨＬＡ−Ｂ、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７に由来する。他の実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉは、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｃｗ６などに由来する。
【００７３】
したがって、１つの態様では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉは、ＨＬＡ−Ｂに由来する。特定の実施形態では、ＨＬＡ−ＢポリペプチドはＨＬＡ−Ｂ２７である。１つの実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子サブタイプＢ＊２７０１−２７５９によってコードされるポリペプチドである。ＨＬＡ−Ｂ２７使用は、一般に、ヒト集団における強直性脊椎炎と相関する。本例では、この特定のＨＬＡ配列が記載されているが、任意の適切なＨＬＡ−Ｂ２７配列、例えば、ヒト集団において示されるＨＬＡ−Ｂ２７の多形バリアント、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸改変を有する配列、遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載される配列とは異なる核酸配列などが、本明細書中に包含される。
【００７４】
１つの態様では、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列を発現する非ヒト動物であって、該ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列は、１つまたは複数の保存的または非保存的な改変を含む非ヒト動物が提供される。
【００７５】
１つの態様では、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列を発現する非ヒト動物であって、該ヒトＨＬＡ−２７配列は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である非ヒト動物が提供される。特定の実施形態では、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列は、実施例において記載されるヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列に対し、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。
【００７６】
１つの態様では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの非ヒト部分は、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインを含む。１つの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、およびＨ−２Ｌから選択される。１つの実施形態では、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｋ、例えば、Ｈ−２Ｋｂである。別の実施形態では、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、Ｈ−２Ｄ、例えば、Ｈ−２Ｄ１である。特定のＨ−２ＫおよびＨ−２Ｄ配列は実施例において記載されるが、任意の好適なＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄ配列、例えば、多形バリアント、保存的／非保存的アミノ酸置換などが、本明細書中に包含される。
【００７７】
本明細書中で記載される非ヒト動物は、そのゲノムに、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチド、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、ここで、このようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座（例えば、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子座）に位置する。１つの態様では、これは、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子またはその部分の、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、その結果、本明細書中で記載されるキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするキメラ遺伝子による置き換えをもたらす。１つの実施形態では、上記置き換えは、非ヒトＭＨＣ  Ｉペプチド結合ドメインまたは非ヒトＭＨＣ  Ｉ細胞外ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列の、非ヒトＭＨＣ  Ｉペプチド結合ドメインまたは非ヒトＭＨＣ  Ｉ細胞外ドメインをコードするヒトヌクレオチド配列（例えば、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７ヌクレオチド配列）による置き換えを含む。この実施形態では、上記置き換えは、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄポリペプチド）の膜貫通ドメインおよび／または細胞質ドメインをコードするＭＨＣ  Ｉ配列の置き換えを含まない。したがって、非ヒト動物は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座においてキメラヒト／非ヒトヌクレオチド配列を含有し、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から、キメラヒト／非ヒトＭＨＣポリペプチドを発現する。
【００７８】
キメラヒト／非ヒトポリペプチドは、ヒトまたは非ヒトリーダー（シグナル）配列を含むようなものであってもよい。１つの実施形態では、キメラポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２タンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１リーダー配列）のリーダー配列を含む。したがって、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣ  Ｉリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。
【００７９】
別の実施形態では、キメラポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉタンパク質の非ヒトリーダー配列、例えば、内在性ＭＨＣ  Ｉタンパク質の非ヒトリーダー配列を含む。１つの実施形態では、キメラポリペプチドは、非ヒトＭＨＣ  Ｉタンパク質、例えば、マウスＨ−２Ｄタンパク質のリーダー配列（例えば、マウスＨ−２Ｄ１リーダー配列）を含む。したがって、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、非ヒトＭＨＣ  Ｉリーダー配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結し得る。
【００８０】
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、そのヒト部分において、完全なまたは実質的に完全な、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含み得る。したがって、上記ヒト部分は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、例えば、９５％またはそれ超の、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインをコードするアミノ酸（例えば、ＨＬＡ−Ａ２ポリペプチド、ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチド）を含み得る。１つの例では、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの実質的に完全な細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ  Ｉリーダー配列を欠く。別の例では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉリーダー配列を含む。
【００８１】
さらに、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、内在性非ヒト調節エレメントの制御下で発現され得る（例えば、げっ歯動物のＭＨＣ  Ｉ調節動物）。このような配置は、非ヒト動物において、例えば、非ヒト動物における免疫応答の間に、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドの正しい発現を促進する。
【００８２】
遺伝子改変される非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群から選択され得る。非ヒト動物について、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に入手できない場合、他の方法が、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために使用される。このような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変する工程、および核移入を使用して好適な細胞、例えば、卵母細胞へ改変したゲノムを移植する工程、および胚を形成するために好適な条件下で、非ヒト動物において該改変細胞（例えば、改変卵母細胞）を懐胎させる工程を含む。
【００８３】
１つの態様では、非ヒト動物は、哺乳動物である。１つの態様では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミ上科（Dipodoidea）またはネズミ上科（Muroidea）の小哺乳動物である。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、げっ歯動物である。１つの実施形態では、げっ歯動物は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。１つの実施形態では、げっ歯動物は、上科ネズミ上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｍｕｒｏｉｄｅａ）から選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変された動物は、カンガルーハムスター科（Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ）（例えば、マウス様ハムスター）、キヌゲネズミ科（Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ）（例えば、ハムスター、新世界ラットおよび新世界マウス、ハタネズミ）、ネズミ科（Ｍｕｒｉｄａｅ）（真のマウスおよびラット（ｔｒｕｅ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｔｓ）、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ（ｃｒｅｓｔｅｄ  ｒａｔｓ））、アシナガマウス科（Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ）（キノボリマウス（ｃｌｉｍｂｉｎｇ  ｍｉｃｅ）、イワマウス（ｒｏｃｋ  ｍｉｃｅ）、尾のあるラット（ｗｉｔｈ−ｔａｉｌｅｄ  ｒａｔｓ）、マダガスカルラットおよびマウス（Ｍａｌａｇａｓｙ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ））、トゲヤマネ科（Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ）（例えば、トゲヤマネ（ｓｐｉｎｙ  ｄｏｒｍｉｃｅ））、ならびにメクラネズミ科（Ｓｐａｌａｃｉｄａｅ）（例えば、デバネズミ（ｍｏｌｅ  ｒａｔｅｓ）、タケネズミ（ｂａｍｂｏｏ  ｒａｔｓ）、およびモグラネズミ（ｚｏｋｏｒｓ））から選択される科に由来する。特定の実施形態では、上記遺伝子改変されたげっ歯動物は、真のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。１つの実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、ネズミ科のメンバー由来である。１つの実施形態では、上記動物は、げっ歯動物である。特定の実施形態では、上記げっ歯動物は、マウスおよびラットから選択される。１つの実施形態では、上記非ヒト動物は、マウスである。
【００８４】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである、げっ歯動物である。別の実施形態では、マウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Festingら（１９９９年）Revised  nomenclature  for  strain  129  mice、Mammalian  Genome  １０巻：８３６頁を参照されたい、また、Auerbachら（２０００年）Establishment  and  Chimera  Analysis  of  129/SvEv-  and  C57BL/6-Derived  Mouse  Embryonic  Stem  Cell  Linesも参照されたい）。特定の実施形態では、遺伝子改変されたマウスは、上記の１２９系統と上記のＣ５７ＢＬ／６系統との混血である。別の特定の実施形態では、マウスは、上記の１２９系統の混血であるか、または上記のＢＬ／６系統の混血である。特定の実施形態では、混血の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。なお別の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統と別の上記の系統との混血である。
【００８５】
１つの実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。１つの実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。１つの実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２またはそれ超の系統の混血である。
【００８６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、そのゲノムにキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉ（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ、またはＨＬＡ−Ｂ、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２、またはＨＬＡ−Ｂ２７（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１））のペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメイン（例えば、機能的ペプチド結合または細胞外ドメイン）を含むマウスに関する。いくつかの実施形態では、マウスは、その内在性マウス遺伝子座から、内在性マウスポリペプチドのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを発現しない。ヒトＭＨＣ  Ｉのペプチド結合ドメインは、α１ドメインおよびα２ドメインを含み得る。あるいは、ヒトＭＨＣ  Ｉのペプチド結合ドメインは、α１、α２、およびα３ドメインを含み得る。１つの態様では、ヒトＭＨＣ  Ｉの細胞外ドメインは、ヒトＭＨＣ  Ｉ  α鎖の細胞外ドメインを含む。１つの実施形態では、内在性マウス遺伝子座は、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子座（例えば、Ｈ−２ＫｂまたはＨ−２Ｄ１）であり、キメラポリペプチドのマウス部分は、マウスＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄポリペプチド（例えば、Ｈ−２ＫｂまたはＨ−２Ｄ１）それぞれの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。
【００８７】
したがって、１つの実施形態では、内在性Ｈ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分はヒトＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分はマウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、マウスが提供される。１つの態様では、マウスは、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドの細胞外ドメイン、例えば、機能的細胞外ドメイン、を発現しない。１つの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）遺伝子座からキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ（例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２．１／Ｈ−２Ｋｂ）ポリペプチドを発現する。種々の実施形態では、キメラ遺伝子の発現は、内在性マウスＭＨＣクラスＩ調節エレメントの制御下にある。いくつかの態様では、マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２コピーのキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含み；他方、他の態様では、マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する１コピーのキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含む。したがって、マウスは、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。
【００８８】
本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座に位置するキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含むマウスが提供される。上記キメラ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−Ａ２タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子のα１、α２、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。上記キメラ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋタンパク質の細胞外ドメイン（例えば、マウスＨ−２Ｋのα１、α２、およびα３ドメイン）をコードするヌクレオチド配列を欠く。１つの態様では、上記キメラ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋのリーダーペプチド、α１、α２、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を欠き；ヒトＨＬＡ−Ａ２のリーダーペプチド、α１、α２、およびα３ドメインならびにマウスＨ−２Ｋの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。上記キメラ遺伝子座の種々のドメインは、キメラ遺伝子座が機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉタンパク質を発現するように、互いに作動可能に連結している。
【００８９】
別の実施形態では、内在性Ｈ−２Ｄ（例えば、Ｈ−２Ｄ１）遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変マウスであって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ｂ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７）ポリペプチドの細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２Ｄ（例えば、Ｈ−２Ｄ１）ポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、マウスが提供される。１つの態様では、マウスは、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から、細胞外ドメイン、例えば、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない。１つの実施形態では、マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座から、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する。種々の実施形態では、キメラ遺伝子の発現は、内在性マウスＭＨＣクラスＩ調節エレメントの制御下にある。いくつかの態様では、マウスは、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する２コピーのキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含み；他方、他の態様では、マウスは、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する１コピーのキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含む。したがって、マウスは、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。
【００９０】
本明細書中で記載されるいくつかの実施形態では、内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子座に位置するキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含むマウスが提供される。キメラ遺伝子座は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子のα１、α２、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。キメラ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｄタンパク質の細胞外ドメイン（例えば、マウスＨ−２Ｄのα１、α２、およびα３ドメイン）をコードするヌクレオチド配列を欠く。１つの態様では、キメラ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｄのα１、α２、およびα３ドメインをコードするヌクレオチド配列を欠き；ヒトＨＬＡ−Ｂ２７のα１、α２、およびα３ドメイン、ならびにマウスＨ−２Ｄのリーダー配列および膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。キメラ遺伝子座の種々のドメインは、キメラ遺伝子座が機能的なキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉタンパク質を発現するように、互いに作動可能に連結している。
【００９１】
種々の実施形態では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から機能的なキメラＭＨＣ  Ｉタンパク質を発現する非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）は、細胞表面にキメラタンパク質を表す。１つの実施形態では、非ヒト動物は、ヒトにおいて観察されるのと同様に、細胞分布において、細胞表面にキメラＭＨＣ  Ｉタンパク質を発現する。１つの態様では、上記細胞は、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質の細胞外部分（例えば、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７細胞外部分）に結合したペプチド断片（抗原断片）を表面に表す。１つの実施形態では、このようなキメラタンパク質の細胞外部分は、前記細胞の表面上の他のタンパク質、例えば、β２−ミクログロブリンと相互作用する。
【００９２】
種々の実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋタンパク質またはＨＬ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄタンパク質を表面に表す細胞は、有核細胞である。種々の態様では、上記細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。体内のほとんどの細胞は、ＭＨＣ  Ｉに関して抗原を提示し得るが、抗原提示細胞のいくつかの非限定の例としては、マクロファージ、樹状細胞、およびＢ細胞が挙げられる。他の抗原提示細胞としては、プロフェッショナルＡＰＣおよび非プロフェッショナルＡＰＣが挙げられ、当該分野で公知であり、本明細書中に包含される。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質を表面に表す細胞は、腫瘍細胞であり、該キメラタンパク質によって提示されるペプチド断片は、腫瘍に由来する。他の実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質によって提示されるペプチド断片は、病原体、例えば、細菌またはウイルスに由来する。
【００９３】
本明細書中で記載されるキメラＭＨＣ  Ｉタンパク質は、同じ細胞または第２の細胞の表面上の他のタンパク質と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質は、前記細胞の表面上の内在性非ヒトタンパク質と相互作用する。キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質もまた、同じ細胞または第２の細胞の表面上のヒトまたはヒト化タンパク質と相互作用し得る。
【００９４】
同じ細胞上で、ＨＬＡクラスＩ分子は、非ヒト（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）およびヒトβ２−ミクログロブリンの両方と機能的に相互作用し得る。したがって、１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄタンパク質は、マウスβ２−ミクログロブリンと相互作用する。いくつかのヒトＨＬＡクラスＩ分子とマウスβ２−ミクログロブリンとの間の相互作用は起こり得るが、ヒトＨＬＡクラスＩとヒトβ２−ミクログロブリンとの間の相互作用と比較して、大いに低下する可能性がある。したがって、ヒトβ２−ミクログロブリンの非存在下で、細胞表面上のヒトＭＨＣ  Ｉの発現は低下し得る。Perarnauら（１９８８年）Human  β2-microglobulin  Specifically  Enhances  Cell-Surface  Expression  of  HLA  Class  I  Molecules  in  Transfected  Murine  Cells、J.  Immunol.１４１巻：１３８３〜８９頁。他のＨＬＡ分子、例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７は、マウスβ２−ミクログロブリンと相互作用しない；例えば、Tishonら（２０００年）Transgenic  Mice  Expressing  Human  HLA  and  CD8  Molecules  Generate  HLA-Restricted  Measles  Virus  Cytotoxic  T  Lymphocytes  of  the  Same  Specificity  as  Humans  with  Natural  Measles  Virus  Infection,  Virology  ２７５巻：２８６〜２９３頁を参照されたい、これは、トランスジェニックマウスにおけるＨＬＡ−Ｂ２７機能は、ヒトβ２−ミクログロブリンとヒトＣＤ８との両方を必要とすることを報告する。したがって、別の実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質は、ヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリンと相互作用する。本明細書中で以下に記載されるいくつかのこのような実施形態では、非ヒト動物、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）は、そのゲノムにヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリン遺伝子を含み、該動物は、機能的なヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリンポリペプチドを発現し；したがって、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質は、ヒトまたはヒト化β２−ミクログロブリンポリペプチドと相互作用する。
【００９５】
種々の態様では、キメラタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄタンパク質）はまた、第２の細胞の表面におけるタンパク質とも、（その細胞外部分を介して）相互作用する。上記第２の細胞は、非ヒトの細胞、例えば、マウスの細胞であってもよく、またはヒト起源の細胞であってもよい。上記第２の細胞は、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する細胞と同じ非ヒト動物に由来しても、または同じ非ヒト動物種に由来してもよい。キメラタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ）の細胞外部分が相互作用し得るタンパク質の非限定の例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその共受容体ＣＤ８が挙げられる。したがって、第２の細胞は、Ｔ細胞であってもよい。さらに、キメラＭＨＣ  Ｉタンパク質の細胞外部分は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面上のタンパク質、例えば、ＮＫ細胞の表面上のキラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）に結合し得る。
【００９６】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドと表面に表れたそのペプチド断片との間で形成された複合体に結合し得る。このような結合は、Ｔ細胞活性化またはＮＫ媒介型細胞死滅化の阻害をそれぞれもたらし得る。１つの仮説は、ＮＫ細胞は、そのＭＨＣ  Ｉ複合体を下方制御することによってＴ細胞媒介型細胞傷害性を回避した感染細胞または腫瘍細胞のいずれかを死滅させるように進化しているというものである。しかし、ＭＨＣ  Ｉ複合体が細胞表面に発現される場合、ＮＫ細胞受容体はこれを認識し、ＮＫ媒介型細胞死滅化が阻害される。したがって、いくつかの態様では、ＮＫ細胞がキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチド）と感染細胞または腫瘍細胞の表面上に表れたペプチド断片との間に形成された複合体に結合する場合、ＮＫ媒介型細胞死滅化は、阻害される。
【００９７】
１例では、本明細書中で記載されるキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド、例えば、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、第２の細胞の表面上のＣＤ８タンパク質と相互作用する。１つの実施形態では、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、第２の細胞の表面上の内在性げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）ＣＤ８タンパク質と相互作用する。１つの実施形態では、第２の細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、第２の細胞は、ＣＤ８を発現するように工学的に作製される。ある特定の態様では、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド、例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、第２の細胞（例えば、ヒト細胞またはげっ歯動物細胞）の表面上のヒトＣＤ８と相互作用する。いくつかのこのような実施形態では、非ヒト動物、例えば、マウスまたはラットは、ヒトＣＤ８導入遺伝子を含み、該マウスまたはラットは、機能的ヒトＣＤ８タンパク質を発現する。
【００９８】
本明細書中で記載されるキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドはまた、第２の細胞上の非ヒト（例えば、マウスまたはラット）ＴＣＲ、ヒトＴＣＲ、またはヒト化ＴＣＲと相互作用し得る。キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、第２の細胞の表面上の内在性ＴＣＲ（例えば、マウスまたはラットのＴＣＲ）と相互作用し得る。キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドはまた、第２の細胞の表面に発現されるヒトまたはヒト化ＴＣＲとも相互作用し得、ここで、該細胞は、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する細胞と同じ動物または動物種（例えば、マウスまたはラット）に由来する。上記キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ヒト細胞の表面に発現されるヒトＴＣＲと相互作用し得る。
【００９９】
遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、げっ歯動物胚、例えば、マウスまたはラットの胚）であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に由来するドナーＥＳ細胞を含む胚もまた提供される。１つの態様では、胚は、キメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子を含むＥＳドナー細胞、および宿主胚細胞を含む。
【０１００】
本明細書中で記載されるように非ヒト動物（例えば、マウスまたはラット）に由来し、キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫポリペプチドまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチド）を発現する組織もまた提供される。
【０１０１】
さらに、本明細書中で記載されるように非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。１つの実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。１つの実施形態では、細胞は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞である。１つの実施形態では、細胞は免疫細胞である。１つの実施形態では、免疫細胞はリンパ球である。
【０１０２】
本明細書中で記載されるように非ヒト動物の染色体またはその断片を含む非ヒト細胞もまた提供される。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の核を含む。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移入の結果として、染色体またはその断片を含む。
【０１０３】
１つの態様では、本明細書中で記載されるようにキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチド）をコードする遺伝子を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。１つの実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来する。
【０１０４】
１つの態様では、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマが提供される。１つの実施形態では、非ヒト動物は、マウスまたはラットである。
【０１０５】
本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法もまた提供される。遺伝子操作された非ヒト動物を作製するための方法は、そのゲノムがキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物を生じる。１つの実施形態では、上記方法は、そのゲノムが、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座、例えば、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子座において、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作されたマウスを生じ、ここで、該キメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドのヒト部分は、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはヒトＨＬＡ−Ｂ２７の細胞外ドメインを含み、マウス部分は、マウスＨ−２ＫまたはマウスＨ−２Ｄの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、実施例において記載される通り、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製された構築物の標的化を利用して該構築物をＥＳ細胞へと導入する工程、および、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用して標的化したＥＳ細胞クローンをマウス胚へと導入する工程を含む。１つの実施形態では、ＥＳ細胞は、１２９マウス系統とＣ５７ＢＬ／６マウス系統との混血である；別の実施形態では、ＥＳ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統と１２９マウス系統との混血である。
【０１０６】
したがって、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物を生成するために使用されるヌクレオチド構築物も提供される。１つの態様では、上記ヌクレオチド構築物は以下を含む：５’および３’の非ヒトホモロジーアーム、ヒトＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ遺伝子配列を含むヒトＤＮＡ断片、および組換え部位が隣接する選択カセット。１つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、ヒトＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を含むゲノム断片である。１つの実施形態では、非ヒトホモロジーアームは、非ヒトＭＨＣクラスＩ遺伝子座（例えば、マウスＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子座）に対して相同である。
【０１０７】
１つの実施形態では、ゲノム断片は、ヒトＨＬＡ−Ａ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２）リーダー、α１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードする配列を含む。１つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、５’から３’へ：ＨＬＡ−Ａリーダー配列、ＨＬＡ−Ａリーダー／α１イントロン、ＨＬＡ−Ａ  α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ  α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ  α２エクソン、ＨＬＡ−Ａ  α２−α３イントロン、およびＨＬＡ−Ａ  α３エクソンを含む。
【０１０８】
別の実施形態では、ゲノム断片は、ヒトＨＬＡ−Ｂ（例えば、ＨＬＡ−Ｂ２７）α１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインをコードする配列を含む。したがって、遺伝子操作された動物を生成するためのヌクレオチド配列は、非ヒト、例えば、マウス、例えば、マウスＨ−２Ｄ、リーダー配列を含み得る。１つの実施形態では、ヒトＤＮＡ断片は、５’から３’へ：ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１エクソン、ＨＬＡ−Ｂ２７  α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ｂ２７  α２エクソン、ＨＬＡ−Ｂ２７  α２−α３イントロン、およびＨＬＡ−Ｂ２７  α３エクソンを含む。
【０１０９】
選択カセットは、目的の構築物を組み込んだ細胞（例えば、ＥＳ細胞）の選択を容易にするため、標的化構築物に挿入されたヌクレオチド配列である。いくつかの好適な選択カセットが、当該分野で公知である。通常、選択カセットは、特定の抗生物質（例えば、Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、Ｓｐｅｃ、など）の存在下でのポジティブ選択を可能にする。さらに、選択カセットは、組換え部位が隣接していてもよく、それにより、リコンビナーゼ酵素による処理の際に選択カセットの切除を可能にする。一般に使用される組換え部位はＣｒｅ酵素およびＦｌｐ酵素によってそれぞれ認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他のものが当該分野で公知である。
【０１１０】
１つの実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の５’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片の３’末端に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片内に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、ヒトＤＮＡ断片のイントロン内に位置する。別の実施形態では、選択カセットは、α２−α３イントロン内に位置する。なお別の実施形態では、選択カセットは、非ヒト動物のゲノムに挿入される配列の一部である非ヒト配列内に位置し得る。
【０１１１】
１つの実施形態では、５’および３’非ヒトホモロジーアームは、それぞれ、内在性非ヒト（例えば、マウス）ＭＨＣクラスＩ遺伝子座の５’および３’位置にゲノム配列を含む（例えば、非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子の５’の第１リーダー配列および３’のα３エクソン）。別の実施形態では、５’非ヒトホモロジーアームは、非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子のα１エクソンの上流のゲノム配列、例えば、非ヒトリーダー配列エクソンを含むゲノム配列を含み得る；この実施形態では、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉタンパク質は、非ヒトリーダー配列を保持する。１つの実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋ、Ｈ−２ＤおよびＨ−２Ｌから選択される。
【０１１２】
特定の実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｋである。したがって、１つの態様では、５’から３’へ以下を含むヌクレオチド構築物が提供される：内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の第１ゲノム配列を含む第１のヒトＤＮＡ断片、５’組換え配列部位（例えば、ｌｏｘＰ）、選択カセット、３’組換え配列部位（例えば、ｌｏｘＰ）、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の第２ゲノム配列を含む第２ヒトＤＮＡ断片、および内在性Ｈ−２Ｋ  α３エクソンの３’のマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド構築物は、５’から３’へ、以下を含む：内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、ＨＬＡ−Ａリーダー、ＨＬＡ−Ａリーダー／α１イントロン配列、ＨＬＡ−Ａ  α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ  α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ  α２エクソン、α２−α３イントロンの第１の５’部分、組換え部位が隣接する選択カセット、α２−α３イントロンの第２の３’部分、ＨＬＡ−Ａ  α３エクソンを含むヒトゲノム配列、および内在性マウスＨ−２Ｋ  α３エクソンの３’の非マウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。１つの実施形態では、５’ホモロジーアーム配列は、配列番号１に示され、３’ホモロジーアーム配列は、配列番号２に示される。
【０１１３】
別の特定の実施形態では、内在性ＭＨＣクラスＩ遺伝子座はマウスＨ−２Ｄ遺伝子座である。したがって、１つの態様では、５’から３’へ以下を含むヌクレオチド構築物が提供される：内在性マウスＨ−２Ｄ１遺伝子の５’のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、ＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子のゲノム配列を含むヒトＤＮＡ断片、および内在性Ｈ−Ｄ遺伝子の３’のマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。１つの実施形態では、ヌクレオチド構築物は、５’から３’へ、以下を含む：リーダー配列エクソンおよびＨ−２Ｄ１リーダー−α１イントロンを含む内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子の５’のマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム、ＨＬＡ−Ｂ２７  α１エクソン、ＨＬＡ−Ｂ２７  α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ｂ２７  α２エクソン、５’ｌｏｘＰ部位の挿入を伴うＨＬＡ−Ｂ２７  α２−α３イントロン、ＨＬＡ−Ｂ２７  α３エクソン、マウスＨ−２Ｄ  α−３膜貫通ドメインイントロン、マウス膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインゲノム配列およびポリＡ尾部、５’ＦＲＴ部位、ハイグロマイシンカセット、３’ＦＲＴ部位、３’ｌｏｘＰ部位およびマウスＨ−２Ｄ遺伝子の下流のゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム。１つの実施形態では、５’ホモロジーアーム配列は、内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子の４９．８ｋｂ上流のマウスゲノム配列に及び、Ｈ−２Ｄリーダー配列を含み、３’ホモロジーアームは、内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子の１５５．６ｋｂ下流のマウスゲノム配列に及ぶ。
【０１１４】
遺伝子標的化の完了の際、ＥＳ細胞または遺伝子改変された非ヒト動物をスクリーニングして、目的の外来性ヌクレオチド配列の成功裏の組み込みまたは外来性ポリペプチドの発現を確認する。多くの技術が当業者に公知であり、それらとしては、サザンブロッティング、長ＰＣＲ、定量的ＰＣＴ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用したリアルタイムＰＣＲ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる（しかし、これらに限定されない）。１つの例では、目的の遺伝子改変を有する非ヒト動物（例えば、マウス）が、マウス対立遺伝子の欠失および／またはヒト対立遺伝子の獲得についての、対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら（２００３年）High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis、Nature  Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁に記載される）の変形を使用するスクリーニングによって、同定され得る。遺伝子改変された動物において特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を同定する他のアッセイは、当業者に公知である。
【０１１５】
本開示はまた、非ヒト動物のＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を改変して、本明細書中で記載されるキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現させる方法も提供する。１つの実施形態では、本発明は、マウスのＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現させる方法であって、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座において、マウスＭＨＣポリペプチドのペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドのペプチド結合ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む方法を提供する。いくつかの態様では、マウスＭＨＣ  Ｉの細胞外ドメインのヌクレオチド配列は、ヒトＭＨＣ  Ｉの細胞外ドメインのヌクレオチド配列で置き換えられる。上記マウスは、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座からマウスＭＨＣ  Ｉのペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを発現できない場合がある。１つの実施形態では、マウスＨ−２Ｋの細胞外ドメインのヌクレオチド配列がヒトＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメインのヌクレオチド配列で置き換えられ、その結果、改変マウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座がキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドを発現する。１つの実施形態では、マウスＨ−２Ｄの細胞外ドメインのヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７の細胞外ドメインのヌクレオチド配列で置き換えられ、その結果、改変ウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座がキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する。
【０１１６】
１つの態様では、キメラヒトＨＬＡクラスＩ／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子を作製する方法であって、単一の細胞において、ヌクレオチド構築物からキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ／Ｈ−２Ｄタンパク質を発現させる工程を含み、該ヌクレオチド構築物は、ＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂタンパク質それぞれのα１、α２、およびα３ドメイン、ならびに非ヒトＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄタンパク質、例えば、マウスＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄタンパク質それぞれの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を含む方法が提供される。１つの実施形態では、上記ヌクレオチド構築物はウイルスベクターであり；特定の実施形態では、該ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０１１７】
１つの態様では、キメラヒトＨＬＡクラスＩ／非ヒトＭＨＣ  Ｉタンパク質（例えば、ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ／Ｈ−２Ｄタンパク質）を発現する細胞が提供される。１つの実施形態では、細胞は、キメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を含む発現ベクターを含み、ここで、該キメラＭＨＣクラスＩ遺伝子は、非ヒトＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子、例えば、マウスＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子それぞれの配列と作動可能な連結で融合した、ヒトＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ遺伝子の配列を含む。１つの実施形態では、ヒトＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ遺伝子の配列は、ＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂタンパク質のα１、α２およびα３ドメインをコードするエクソンを含む。１つの実施形態では、非ヒトＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子の配列は、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄタンパク質それぞれの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするエクソンを含む。１つの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６（商標）細胞）から選択される。
【０１１８】
本明細書中で記載されるように非ヒト動物によって作製されたキメラＭＨＣクラスＩ分子もまた提供され、ここで、該キメラＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂタンパク質からのα１、α２、およびα３ドメイン、ならびに非ヒト、例えば、マウス、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄタンパク質からの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。本明細書中で記載されるキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、抗ＨＬＡ−Ａ抗体によって検出され得る。したがって、キメラヒト／非ヒトＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋポリペプチドを表面に表す細胞は、抗ＨＬＡ−Ａ抗体を使用して検出および／または選択され得る。いくつかの場合では、本明細書中で記載されるキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドは、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体によって検出され得る。別の実施形態では、本明細書中で記載されるキメラＨＬＡ−Ｂ／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、抗ＨＬＡ−Ｂ抗体によって検出され得る；例えば、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドは、抗ＨＬＡ−Ｂ２７抗体によって検出され得る。
【０１１９】
以下の実施例は、そのゲノムが、それぞれ、マウスＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列の、内在性マウスＨ−２Ｋ遺伝子座においてはヒトＨＬＡ−Ａ２の細胞外ドメイン、または内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子座においてはヒトＨＬＡ−Ｂ２７の細胞外ドメインをコードする配列による置き換えを含む、遺伝子操作された動物を記載するが、類似の戦略を使用して、他のマウスＭＨＣ  Ｉ遺伝子座（例えば、Ｈ−２Ｌ）を、その対応するヒトＨＬＡ遺伝子座（例えば、ＨＬＡ−Ｃ）で置き換え得ることを、当業者は理解する。したがって、そのゲノムにキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、該ポリペプチドのヒト部分が、別のＨＬＡクラスＩタンパク質に由来する非ヒト動物もまた提供される。
【０１２０】
複数のＭＨＣ  Ｉ遺伝子座の置き換えも提供される。したがって、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）、例えば、キメラヒト／非ヒト（例えば、ヒト／げっ歯動物、例えば、ヒト／マウス）ＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含む非ヒト動物、例えば、げっ歯動物、例えば、マウスもまた本明細書中で提供される。１つの場合では、２つのマウス第１７番姉妹染色体のそれぞれが、Ｈ−２Ｋ遺伝子、Ｈ−２Ｌ遺伝子、およびＨ−２Ｄ遺伝子を含むＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含有する；したがって、１つの態様では、各姉妹染色体は、それらの内在性遺伝子位置において、３つまでのキメラヒト／マウスポリペプチドをコードし得る。したがって、１つの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスは、それらの内在性ＭＨＣ遺伝子座において、６つまでのヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）、例えば、６つまでのキメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／マウス、ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする６つまでの異なるヌクレオチド配列を含み得る。別の場合には、２つのマウス第１７番姉妹染色体のそれぞれが、Ｈ−２Ｋ遺伝子およびＨ−２Ｄ遺伝子を含むＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含有する；したがって、１つの態様では、各姉妹染色体は、それらの内在性遺伝子位置において２つまでのキメラヒト／マウスポリペプチドをコードし得；遺伝子改変された非ヒト動物、例えば、マウスは、４つまでのヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする４つまでの異なるヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２１】
１つの実施形態では、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）；例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含むマウスであって、該キメラポリペプチド（複数可）のヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインを含み、該キメラポリペプチドのマウス部分は、マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含み、１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、マウスＭＨＣ  Ｉは、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｋ、およびＨ−２Ｌから選択される。１つの実施形態では、ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃから選択される。
【０１２２】
したがって、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含むマウスであって、該２つのヌクレオチド配列は、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードし、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する、マウスが提供される。１つの実施形態では、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子およびＨ−２Ｄ遺伝子座に位置する。１つの態様では、マウスは、いかなる機能的な内在性マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドも発現しない。別の態様では、マウスは、内在性マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を保持し、例えば、機能的なマウスＭＨＣポリペプチド（例えば、Ｈ−２Ｌポリペプチド）を発現する。
【０１２３】
さらに、非ヒト動物、例えば、マウスを生成するための方法であって、キメラヒト／非ヒト、例えば、ヒト／マウス、ＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）をコードする１つまたは複数、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチド配列を含む複数の内在性ＭＨＣ遺伝子座、例えば、非ヒト、例えば、マウスにおける置き換えを含む方法が本明細書中で提供される。マウス第１７番染色体上の種々のＭＨＣ  Ｉ遺伝子座の密接な連関に起因して、いくつかの実施形態では、上記方法は、遺伝子座における連続的な置き換えを含む。１つの実施形態では、上記方法は、ＥＳ細胞において、第１のマウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、第１のキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するマウスを生成する工程、前記マウスからＥＳ細胞を生成する工程、前記ＥＳ細胞において、第２のマウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、および２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するマウスを生成する工程を含む。第３のキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスが、同様に、２つのキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子を含むＥＳ細胞において実施される、第３のマウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を第３のキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程によって生成され得る。あるいは、上記方法は、ＥＳ細胞において、第１のマウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、第１のキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、その後の、同じＥＳ細胞において第２のマウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、第２のキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程、および２つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するマウスを生成する工程を含み得る；３つのキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを含むマウスが同じＥＳ細胞で生成され得る。連続的な置き換えによって生成された、１つ、２つ、または３つのキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを含むマウスは、キメラＭＨＣ  Ｉ配列についてヘテロ接合型であってもホモ接合型であってもよい。４つ、５つ、および６つのキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを含むマウスが、それぞれがキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２つの動物を交配し、その結果、１つの実施形態ではキメラＭＨＣ  Ｉ配列のそれぞれについてヘテロ接合型である動物をもたらすことによって生成され得る。当業者は、２つ、３つ、または４つのキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを含むマウスもまた、連続的な置き換えではなく交配によって生成され得ることを理解する；この動物は、キメラＭＨＣ  Ｉ配列の全てに対してヘテロ接合型であり得る（例えば、その姉妹染色体のそれぞれに異なるキメラ遺伝子を含むマウスは、２つのＭＨＣ遺伝���に対してヘテロ接合型であるなど）。
【０１２４】
遺伝子改変されたβ２ミクログロブリン動物
本発明は、一般に、遺伝子改変された非ヒト動物であって、そのゲノムにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；したがって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、非ヒト動物を提供する。
【０１２５】
β２ミクログロブリンすなわちＭＨＣクラスＩ複合体の軽鎖（「β２Ｍ」とも略される）は、低分子の（１２ｋＤａ）非グリコシル化タンパク質であり、主に、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖を安定化するために機能する。ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子は、リーダー配列をコードする２０のＮ末端アミノ酸を有する、１１９アミノ酸のタンパク質をコードする。成熟タンパク質は９９アミノ酸を含む。上記遺伝子は、４つのエクソンを含有し、第１のエクソンは、５’非翻訳領域、完全なリーダー配列および成熟ポリペプチドの最初の２つのアミノ酸を含有し；第２のエクソンは、成熟タンパク質の大半をコードし；第３のエクソンは、成熟タンパク質の最後の４つのアミノ酸および停止コドンをコードし；第４のエクソンは、３’非翻訳領域を含有する。Gussowら（１９８７年）The  β2-Microglobulin  Gene.  Primary  Structure  and  Definition  of  the  Transcriptional  Unit、J.  Immunol.１３９巻：３１３１〜３８頁。β２ミクログロブリンは、ＭＨＣ  Ｉと非共有結合する。未結合のβ２ミクログロブリンは、体液、例えば血漿中に見出され、排泄のために腎臓に運ばれる。腎不全は、β２ミクログロブリンの蓄積を引き起こし、これは病原性であり得る（例えば、透析関連アミロイド症）；蓄積したタンパク質は、関節および結合組織において、アミロイド斑に似た糸状の細線維を形成する。
【０１２６】
透析関連アミロイド症に加えて、β２ミクログロブリンは、多くの他の障害に関与している。β２ミクログロブリンの上昇したレベルを、リンパ性悪性腫瘍、例えば、非ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫において検出した。例えば、Shiら（２００９年）β2  Microglobulin:  Emerging  as  a  Promising  Cancer  Therapeutic  Target,  Drug  Discovery  Today  １４巻：２５〜３０頁を参照されたい。β２ミクログロブリンのレベルの上昇を伴ういくつかの他の悪性腫瘍としては、乳がん、前立腺がん、肺がん、腎がん、消化器がんおよび鼻咽頭がんが挙げられる。β２ミクログロブリンの過剰発現は、腫瘍増殖促進作用を有することが示唆されている。同上。β２ミクログロブリンは、上皮を間葉に移行させ、乳がん、前立腺がん、肺がんおよび腎がんにおいて骨および軟組織へのがんの転移を促進することが、近年示されている。Jossonら（２０１１年）β2  microglobulin  Induces  Epitelial  to  Mesenchymal  Transition  and  Confers  Cancer  Lethality  and  Bone  Metastasis  in  Human  Cancer  Cells.  Cancer  Res.７１巻（７号）：１〜１１頁。β２ミクログロブリンは、非古典的ＭＨＣ  Ｉメンバーであるヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質と相互作用し、トランスフェリン受容体と相互作用し、鉄ホメオスタシスを調節する。同上。悪性腫瘍の他の特徴（自己再生、新脈管形成の強化、処置に対する抵抗性）におけるβ２ミクログロブリンの関与は、当該分野で広範に記載される。
【０１２７】
β２ミクログロブリン欠損のマウスが報告されている。Kollerら（１９９０年）Normal  development  of  mice  deficient  in  β2m,  MHC  class  I  proteins,  and  CD8+  T  cells,  Science  ２４８巻:１２２７〜１２３０頁を参照されたい。Kollerらにおいて報告されるように、これらのマウスは、健康であるように見えるが、ＭＨＣ  クラスＩ発現は検出されなかった。さらに、いくつかの組織では、Ｔ細胞集団がほとんど正常であるように見えたが、他においては、ＣＤ８＋Ｔ細胞の顕著な低下が観察された。これは、ＭＨＣ  Ｉ発現の欠損は、Allenら（（１９８６年）β2  microglobulin  Is  Not  Required  for  Cell  Surface  Expression  of  the  Murine  Class  I  Histocompatibility  Antigen  H-2Db  or  of  a  Truncated  H-2Db、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８３巻：７４４７〜７４５１頁）によって得られた以前の結果と一致しないことを意味した。Allenらは、β２ミクログロブリンが、全てのＭＨＣ  Ｉ複合体の細胞表面発現に絶対的に必要ではないと報告した。何故なら、β２ミクログロブリンを欠く細胞が、Ｈ−２Ｄｂを発現可能であったからである。しかし、これらの細胞におけるＨ−２Ｄｂの機能は、おそらく損なわれており、Ｈ−２Ｄｂのコンフォメーションは、天然のタンパク質と異なっていた。このことは、Kollerおよび共同研究者らが、天然のＨ−２Ｄｂに対する抗体を使用して上記タンパク質を検出できなかったことを説明する。しかし、β２ミクログロブリンを欠く細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（正常マウス由来の外来性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）に対して内在性抗原提示できると報告され、β２ミクログロブリンは、マウスにおける抗原チャレンジに対する応答において、高レベルのＨ−２ｄＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬの発達のために必要ではないが、有効な免疫応答を維持するために必要とされると報告される。Quinnら（１９９７年）Virus-Specific,  CD8+  Major  Histocompatibility  Complex  Class  I-Restricted  Cytotoxic  T  Lymphocytes  in  Lymphocytic  Choriomeningitis  Virus-Infected  β2-Microglobulin-Deficient  Mice、J.  Virol.７１巻：８３９２〜８３９６頁。β２ミクログロブリンの非存在下で高レベルのそのようなＴ細胞を生成する能力は、Ｈ−２ｄＭＨＣクラスＩ拘束応答に限定されることが報告されていることに留意されたい。β２ミクログロブリン欠損マウスは、多くの劇的な特徴、例えば、いくつかの寄生虫症に対する感受性の増大、肝炎感染症に対する感受性の増大、鉄代謝の欠損、および繁殖不全表現型を有することが報告されている。Cooperら（２００７年）An  impaired  breeding  phenotype  in  mice  with  a  genetic  deletion  of  Beta-2  microglobulin  and  diminished  MHC  class  I  expression:  Role  in  reproductive  fitness、Biol.  Reprod.７７巻：２７４〜２７９頁。
【０１２８】
無作為に挿入された導入遺伝子においてヒトβ２ミクログロブリンおよびヒトＨＬＡクラスＩ分子（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７）を発現するマウスが報告されている。Chamberlainら（１９８８年）Tissue-specific  and  cell  surface  expression  of  human  major  histocompatibility  complex  class  I  heavy  (HLA-B7)  and  light  (β2-microglobulin)  chain  genes  in  transgenic  mice、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：７６９０〜７６９４頁。ヒトＨＬＡクラスＩの発現は内在性クラスＩの発現と一致し、肝臓において顕著に減少していた。同上。ヒトβ２ミクログロブリンの発現はまた、内在性β２ミクログロブリンと一致し、他方で、ヒトＨＬＡクラスＩ分子の発現は、二重トランスジェニックマウスにおいて、１０倍〜１７倍増大した。同上。しかし、著者らは、マウス内在性β２ミクログロブリン遺伝子座のヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座による置き換えを企図しなかった。
【０１２９】
したがって、そのゲノムが、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）が、本明細書中で開示される。１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から内在性非ヒトβ２ミクログロブリンを発現しない。いくつかの実施形態では、β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、部分的にヒトであり、部分的に非ヒトである。例えば該ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンに対応するいくつかのアミノ酸と、非ヒトβ２ミクログロブリンに対応するいくつかのアミノ酸とを含有する。１つの態様では、非ヒト動物は、内在性非ヒト遺伝子座から内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現せず、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドのみを発現する。１つの例では、非ヒト動物は、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、完全な内在性非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しないが、非ヒト内在性β２ミクログロブリンポリペプチドの部分のみを発現する。したがって、種々の実施形態では、上記動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的な非ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。特定の態様では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置する。１つの態様では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む２コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む。別の態様では、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１コピーのβ２ミクログロブリン遺伝子座を含む。したがって、上記動物は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むβ２ミクログロブリン遺伝子座について、ホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンのヌクレオチド配列は、ヒト集団において天然に見出されるβ２ミクログロブリン配列の集合に由来し得る。種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された非ヒト動物は、その生殖細胞系に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。１つの実施形態では、上記ポリペプチドは、ＭＨＣ  Ｉタンパク質に結合可能である。
【０１３０】
ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、完全なヒトβ２ミクログロブリン遺伝子に対応する核酸残基を含み得る。あるいは、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２１〜１１９に示されるアミノ酸配列（すなわち、成熟ヒトβ２ミクログロブリンに対応するアミノ酸残基）をコードする核酸残基を含み得る。代替の実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３〜１１５に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンタンパク質のアミノ酸２３〜１１９に示されるアミノ酸配列をコードする核酸残基を含み得る。ヒトβ２ミクログロブリンの核酸配列およびアミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるGussowら（上掲）に記載される。
【０１３１】
したがって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３〜１１５に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２３〜１１９に示されるアミノ酸配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸２１〜１１９に示されるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、ヒトβ２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンポリペプチドのアミノ酸１〜１１９を含み得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む。あるいは、上記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む。この実施形態では、エクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列は、遺伝子の正常な転写および翻訳を可能にするように、作動可能に連結している。したがって、１つの実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４の約２６７ｂｐ後ろに対応するヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ヒト配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の約２．８ｋｂを含む。
【０１３３】
したがって、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列、例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に対応するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。あるいは、上記ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４の約２６７ｂｐ後ろに対応するヌクレオチド配列によってコードされる。別の特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化ポリペプチドは、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の約２．８ｋｂを含むヌクレオチド配列によってコードされる。β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン４は、５’非翻訳領域を含有するので、ヒトまたはヒト化ポリペプチドは、β２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２および３を含むヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０１３４】
遺伝子操作された動物を生成するための特定の核酸配列およびアミノ酸配列が、本実施例に記載されるが、１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸置換の配列、または遺伝コードの縮重に起因して本明細書中で記載されるものとは異なっている配列もまた、提供されることが、当業者には理解される。
【０１３５】
したがって、ヒトβ２ミクログロブリン配列を発現する非ヒト動物が提供され、ここで、該β２ミクログロブリン配列は、ヒトβ２ミクログロブリン配列に対し、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。特定の実施形態では、β２ミクログロブリン配列は、本実施例において記載されるヒトβ２ミクログロブリン配列に対し、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。１つの実施形態では、ヒトβ２ミクログロブリン配列は、１つまたは複数の保存的置換を含む。１つの実施形態では、ヒトβ２ミクログロブリン配列は、１つまたは複数の非保存的置換を含む。
【０１３６】
さらに、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列も含む非ヒト動物が提供される。したがって、特定の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノムにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列であって、非ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン１およびヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含むヌクレオチド配列を含む。したがって、上記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１およびヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４（例えば、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２および３）によってコードされる。
【０１３７】
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物と同様に、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌ウシ、雄ウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）からなる群より選択され得る。本発明のいくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、非ヒト動物は、ネズミ、例えば、げっ歯動物（例えば、マウスまたはラット）である。１つの実施形態では、上記動物は、マウスである。
【０１３８】
したがって、いくつかの態様では、遺伝子操作されたマウスであって、本明細書中で記載されるようにヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスが提供される。遺伝子操作されたマウスであって、その内在性β２ミクログロブリン遺伝子座において、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチド（例えば、ヒトまたは実質的にヒトβ２ミクログロブリンポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含むマウスが提供される。いくつかの実施形態では、上記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から、内在性β２ミクログロブリンポリペプチド（例えば、機能的な内在性β２ミクログロブリンポリペプチド）を発現しない。いくつかの実施形態では、上記遺伝子操作されたマウスは、マウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１およびヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、上記マウスは、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する。
【０１３９】
１つの態様では、異種β２ミクログロブリン配列を含む改変非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座が提供される。１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化配列である。
【０１４０】
１つの実施形態では、改変遺伝子座は、げっ歯動物遺伝子座である。特定の実施形態では、げっ歯動物遺伝子座は、マウス遺伝子座またはラット遺伝子座から選択される。１つの実施形態では、非ヒト遺伝子座は、少なくとも１つのヒトβ２ミクログロブリンをコードする配列によって改変される。
【０１４１】
１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン配列は、内在性調節エレメント、例えば、内在性プロモーターおよび／または発現制御配列に作動可能に連結している。特定の実施形態では、異種β２ミクログロブリン配列はヒト配列であり、該ヒト配列は、内在性プロモーターおよび／または発現制御配列に作動可能に連結している。
【０１４２】
１つの態様では、内在性プロモーターおよび／または発現制御配列に作動可能に連結しているヒト配列を含む改変非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座が提供される。
【０１４３】
種々の態様では、遺伝子改変された非ヒト動物または非ヒト動物に由来する細胞、胚、または組織によって発現されたヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンは、内在性β２ミクログロブリンおよび／または内在性ヒトβ２ミクログロブリンの全ての機能的態様を保存している。例えば、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンが、ＭＨＣ  Ｉポリペプチド（例えば、内在性非ヒトまたはヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチド）のα鎖に結合することが好ましい。ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、任意の他の分子、例えば、内在性非ヒトβ２ミクログロブリンおよび／または内在性ヒトβ２ミクログロブリンと会合する受容体、アンカーまたはシグナル伝達分子（例えば、ＨＦＥなど）に結合し得、これらを動員し得、または別の方法でこれらと会合し得る。
【０１４４】
遺伝子改変された動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）に加えて、組織または細胞であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来し、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列、すなわち、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を含む組織または細胞もまた提供される。１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列である。好ましくは、上記細胞は有核細胞である。上記細胞は、ＭＨＣ  Ｉ複合体を発現することが公知である任意の細胞、例えば、抗原提示細胞であってもよい。前記細胞によって発現されるヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ（例えば、げっ歯動物ＭＨＣ  Ｉ）と相互作用して、機能的なＭＨＣ  Ｉ複合体を形成し得る。得られたＭＨＣ  Ｉ複合体は、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用可能であり得る。したがって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物由来の細胞とＴ細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体もまた提供される。
【０１４５】
また、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列、およびさらなるヒトまたはヒト化配列、例えば、ここで開示されるキメラＭＨＣ  Ｉポリペプチドを含む非ヒト細胞も提供される。このような場合、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドは、例えば、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドと相互作用し得、機能的ＭＨＣ  Ｉ複合体が形成され得る。いくつかの態様では、このような複合体は、Ｔ細胞、例えば、ヒトまたは非ヒトＴ細胞上のＴＣＲと相互作用可能である。したがって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物由来の細胞とヒトまたは非ヒトＴ細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏ複合体もまた提供される。
【０１４６】
本開示の別の態様は、本明細書中で記載されるように、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列を含むげっ歯動物胚（例えば、マウスまたはラットの胚）である。１つの実施形態では、上記胚は、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列を含むＥＳドナー細胞および宿主胚細胞を含む。異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン遺伝子またはヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列である。
【０１４７】
本発明はまた、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の染色体またはその断片を含む（例えば、染色体またはその断片が、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）非ヒト細胞を包含する。非ヒト細胞は、本明細書中で記載されるように、非ヒト動物の核を含み得る。１つの実施形態では、非ヒト細胞は、核移入の結果として、染色体またはその断片を含む。
【０１４８】
１つの態様では、異種β２ミクログロブリン遺伝子または異種β２ミクログロブリン配列を含む非ヒト人工多能性細胞が提供される。１つの実施形態では、人工多能性細胞は、本明細書中で記載されるように非ヒト動物に由来する。１つの実施形態では、異種β２ミクログロブリン遺伝子また異種β２ミクログロブリン配列は、ヒトまたはヒト化遺伝子またはヒトまたはヒト化配列である。
【０１４９】
また、本明細書中で記載されるように非ヒト動物の細胞に由来するハイブリドーマまたはクアドローマも提供される。１つの実施形態では、非ヒト動物はマウスまたはラットである。
【０１５０】
本開示はまた、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、遺伝子操作されたげっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を作製するための方法も提供する。上記方法は、そのゲノムがヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む動物を生じる。１つの態様では、上記方法は、そのゲノムが、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座において、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子操作されたマウスを生じる。いくつかの場合では、上記マウスは、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なマウスβ２ミクログロブリンを発現しない。いくつかの態様では、上記方法は、実施例において記載されるように、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製した標的化構築物を利用し、該構築物をＥＳ細胞へと導入し、標的とされたＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を使用してマウス胚へと導入する。１つの実施形態では、上記ＥＳ細胞は、１２９マウス系統およびＣ５７ＢＬ／６マウス系統の混血であり；別の実施形態では、上記ＥＳ細胞は、ＢＡＬＢ／ｃマウス系統および１２９マウス系統の混血である。
【０１５１】
また、遺伝子操作された非ヒト動物を生成するために使用されるヌクレオチド構築物も提供される。上記ヌクレオチド構築物は、以下を含み得る：５’および３’の非ヒトホモロジーアーム、ヒトβ２ミクログロブリン配列を含むヒトＤＮＡ断片、および組換え部位が隣接する選択カセット。１つの実施形態では、上記ヒトＤＮＡ断片は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のイントロンおよびエクソンの両方を含むゲノム断片である。１つの実施形態では、上記非ヒトホモロジーアームは、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に対して相同である。上記ゲノム断片は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４を含み得る。１つの場合では、上記ゲノム断片は、５’から３’へ、エクソン２、イントロン、エクソン３、イントロン、およびエクソン４、ヒトβ２ミクログロブリン配列の全てを含む。上記選択カセットは、上記構築物内で、β２ミクログロブリンコード領域の外側のどこに位置してもよく、例えば、ヒトβ２ミクログロブリンのエクソン４の３’に位置してもよい。上記５’および３’の非ヒトホモロジーアームは、それぞれ、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子の５’および３’のゲノム配列を含み得る。別の実施形態では、５’および３’の非ヒトホモロジーアームは、それぞれ、内在性非ヒト遺伝子のエクソン２の５’およびエクソン４の３’のゲノム配列を含む。
【０１５２】
本発明の別の態様は、非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）のβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変し、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現させる方法に関する。マウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を改変してヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現させる１つの方法は、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にて、マウスβ２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む。このような方法の１つの実施形態では、上記マウスは、内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。いくつかの特定の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜４に示されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む。
【０１５３】
遺伝子改変されたＭＨＣ  Ｉ／β２ミクログロブリン動物
種々の実施形態では、本発明は、一般に、そのゲノムにヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉおよびβ２ミクログロブリンポリペプチドの両方をコードするヌクレオチド配列を含む、遺伝子改変された非ヒト動物であって；したがって、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびβ２ミクログロブリンポリペプチドの両方を発現する、非ヒト動物を提供する。
【０１５４】
ヒト／非ヒト系の構成要素を混合して使用する場合、機能的差異が生じる。ＨＬＡクラスＩは、β２ミクログロブリンにマウスクラスＩよりも強固に結合する。Bernabeu（１９８４年）β2-microgobulin  from  serum  associates  with  MHC  class  I  antigens  on  the  surface  of  cultured  cells、Nature  ３０８巻：６４２〜６４５頁。機能的差異をなくす試みは、特定のヒト化ＭＨＣマウスの構築において反映される。そのＮ末端がヒトβ２−ミクログロブリンのＣ末端にリンカーを介して結合した、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１のα１およびα２ならびにマウスＨ−２Ｄｂのα３を有する、無作為に組み込まれたヒトＨＬＡ−Ａ２．１／ＨＬＡ−ＤＲ１キメラ導入遺伝子を発現する、Ｈ−２クラスＩおよびクラス２ノックアウトマウス（β２ミクログロブリンＫＯバックグラウンドのマウスにおいて）が、開発されている。例えば、Pajotら（２００４年）A  mouse  model  of  human  adaptive  immune  functions:HLA-A2.1-/HLA-DR1-transgenic  H-2  class  I-/class  II-knockout  mice、Eur.  J.  Immunol.３４巻：３０６０〜３０６９頁を参照されたい。これらのマウスは、Ｂ型肝炎ウイルスに対する抗原特異的抗体を生成し、ＣＴＬ応答を起こすが、ＨＬＡ−Ａ２．１についてのみトランスジェニックであるマウスまたはＨ−２クラスＩ／クラスＩＩノックアウトマウスは生成しないことが報告されている。上記遺伝子についてのみトランスジェニックであるマウスの欠損は、おそらく、このようなマウスが内在性クラスＩおよび／またはクラスＩＩ遺伝子を用いて任意の導入遺伝子を回避する能力から生じるものであり、ＭＨＣノックアウトマウスに利用不能である選択肢である。しかし、上記マウスは、少なくともＨ−２Ｄｂを発現し得、マウスβ２ミクログロブリンノックアウトマウスバックグラウンドへの交配に起因すると推定される（Pajotら上掲を参照されたい；これは、インタクトな内在性クラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子座を明らかに含む）。
【０１５５】
ヒトβ２ミクログロブリンとのキメラ融合物の細胞表面発現は、内在性ＭＨＣ発現よりも低いと報告されているが、ＮＫ死滅化の生存性／生存率は報告されておらず、ＮＫ自己死滅化の割合も報告されていない。Pajotら、上掲。ＣＤ８＋Ｔ細胞数におけるいくらかの改善が、ＭＨＣクラスＩ欠損β２−ミクログロブリンノックアウトマウスに対して観察されている（全脾細胞の２〜３％対β２  ＫＯマウスにおける０．６〜１％）。しかし、Ｔ細胞可変領域利用は、ＢＶ  ５．１、ＢＶ  ５．２、およびＢＶ  １１の遺伝子セグメントについて変更されたプロフィールを示した。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答の両方が、マウスを免疫するために使用した適切なＢ型肝炎抗原に対して拘束されたが、少なくとも２匹のマウスが、いずれかの抗原を有する細胞を死滅させたことが報告されている（該マウスは、１つの抗原のみで免疫されていて、このことは、ＮＫ細胞阻害の欠如またはＮＫ細胞選択性の欠如に起因し得る）。
【０１５６】
上で述べられた通り、ヒトＭＨＣ  Ｉおよびヒトβ２ミクログロブリンの両方についてトランスジェニックであるマウスは、キメラＭＨＣ  Ｉ／β２ミクログロブリンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、該ＭＨＣ  Ｉ部分およびβ２ミクログロブリン部分は、１本のポリペプチド鎖内に含有され、その結果、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖とβ２ミクログロブリンとは互いに共有結合で連結することにより、細胞表面において繋ぎ止められている。そのゲノムに２つの独立したヌクレオチド配列（ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするものおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするもの）を含むマウスが提供される。本明細書中で提供されるマウスは、天然に存在するＭＨＣ  Ｉ複合体に非常に似ているＭＨＣ  Ｉ複合体を発現し、ここで、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖およびβ２ミクログロブリンは、ＭＨＣ  Ｉ  α鎖に非共有結合しているβ２ミクログロブリンを有する２つの別個のポリペプチド鎖上に提供される。
【０１５７】
したがって、本開示は、そのゲノムに以下を含む非ヒト動物を提供する：ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列。１つの態様では、そのゲノムに以下を含む非ヒト動物が提供される：（ａ）キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列であって、該キメラポリペプチドのヒト部分は、ヒトＭＨＣ  Ｉ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ；例えば、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７）のペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインを含む、ヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列。
【０１５８】
第１のヌクレオチド配列は、上記動物が、そのゲノムにおいて、ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座での、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子の全てまたは部分（例えば、ペプチド結合ドメインまたは細胞外ドメインをコードする部分）の、対応するヒトＭＨＣ  Ｉ配列による置き換えを含むように、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に位置してもよい。したがって、上記動物は、内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座において、ヒトＭＨＣ  Ｉ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ；例えば、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７）の細胞外ドメインならびに内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ（例えば、Ｈ−２Ｋ、Ｈ−２Ｄ、Ｈ−２Ｌ、例えば、Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含み得る。１つの態様では、上記動物はマウスであり、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ２（例えば、ＨＬＡ−Ａ２．１）の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｋ（例えば、Ｈ−２Ｋｂ）の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様では、動物はマウスであり、第１のヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７の細胞外ドメインおよびマウスＨ−２Ｄの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（例えば、Ｈ−２Ｄ１）をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１５９】
第２のヌクレオチド配列は、上記動物が、そのゲノムにおいて、β２ミクログロブリン遺伝子座での、内在性β２ミクログロブリン遺伝子の全てまたは部分の、対応するヒトβ２ミクログロブリン配列による置き換えを含むように、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座に位置してもよい。第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含み得る。この実施形態では、ヌクレオチド配列は、互いに作動可能に連結している。第２のヌクレオチド配列は、非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１の配列を、さらに含み得る。
【０１６０】
１つの態様では、上記動物は、内在性非ヒトＭＨＣ  Ｉ遺伝子座から、機能的なＭＨＣ  Ｉを発現せず（例えば、内在性ＭＨＣ  Ｉの機能的なペプチド結合ドメインまたは機能的な細胞外ドメインのどちらも発現しない）、１つの態様では、該動物は、内在性非ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子座から、機能的なβ２ミクログロブリンポリペプチドを発現しない。いくつかの態様では、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＭＨＣ  Ｉ遺伝子座およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含むβ２ミクログロブリン遺伝子座の両方について、ホモ接合型である。他の態様では、上記動物は、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＭＨＣ  Ｉ遺伝子座およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列を含むβ２ミクログロブリン遺伝子座の両方について、ヘテロ接合型である。
【０１６１】
好ましくは、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、内在性発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーなど）に作動可能に連結している。
【０１６２】
本明細書中に包含される第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列（およびこれらがコードするポリペプチド）の種々の他の実施形態は、明細書を通して記載された実施形態（例えば、遺伝子操作されたＭＨＣ  Ｉ動物および遺伝子操作されたβ２ミクログロブリン動物に関連する節において記載されたもの）から、容易に理解され得る。
【０１６３】
１つの態様では、本開示は、そのゲノムに、（ａ）キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチド（具体的には、ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫまたはＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドのどちらか）をコードし、該キメラポリペプチドのヒト部分が、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７の細胞外ドメインを含み、そのマウス部分が、マウスＨ−２ＫまたはマウスＨ−２Ｄそれぞれの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む、第１のヌクレオチド配列、および（ｂ）ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列（例えば、該ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列、またはヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列を含む）を含むマウスであって、ここで、該第１のヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２ＫまたはＨ−２Ｄ遺伝子座に位置し、該第２の配列は、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座に位置するマウスを提供する。１つの実施形態では、上記マウスは、機能的なＨ−２ＫまたはＨ−２Ｄおよびマウスβ２ミクログロブリンポリペプチドを、そのそれぞれの内在性遺伝子座から発現しない。１つの実施形態では、上記マウスは、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドの両方を発現する。
【０１６４】
以下の実施例で示されるように、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉとβ２ミクログロブリンとの両方を共発現するように遺伝子操作された動物は、ＭＨＣ  Ｉのみについてヒト化した動物と比較して、細胞表面にキメラＭＨＣクラスＩの増大した発現を示した。いくつかの実施形態では、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉとβ２ミクログロブリンとの共発現は、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉの細胞表面発現を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンの非存在下でのヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉの発現よりも、約１０％超、例えば、約２０％超、例えば、約５０％またはそれ超、例えば、約７０％増大する。
【０１６５】
本開示はまた、そのゲノムが本明細書中で記載されるように第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法も提供する。上記方法は、一般に、そのゲノムが本明細書中で記載される第１のヌクレオチド配列（すなわち、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉ配列）を含む、第１の遺伝子操作された非ヒト動物を生成する工程、そのゲノムが本明細書中で記載される第２のヌクレオチド配列（すなわち、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリン配列）を含む、第２の遺伝子操作された非ヒト動物を生成する工程、ならびに、第１の動物および第２の動物を交配させて、そのゲノムが両ヌクレオチド配列を含有する子孫を得る工程を、含む。１つの実施形態では、第１の動物および第２の動物は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列それぞれについて、ヘテロ接合型である。１つの実施形態では、第１の動物および第２の動物は、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列それぞれについて、ホモ接合型である。１つの実施形態では、第１の動物および第２の動物は、内在性非ヒト遺伝子座を、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列それぞれで置き換えることを介して生成される。１つの態様では、第１の動物および第２の動物は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を介して生成した構築物を利用し、このような構築物を有する標的とされたＥＳ細胞クローンを、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を介して、胚（例えば、げっ歯動物胚、例えば、マウスまたはラット胚）へと導入することによって生成される。
【０１６６】
なお別の態様では、本発明は、１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）のキメラヒト／非ヒト（例えば、キメラヒト／マウス）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含む、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）を提供する。キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチド（複数可）およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンの種々の態様は、本明細書を通して開示されており、本開示から当業者に明らかになる。１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）のキメラヒト／非ヒト（例えば、キメラヒト／マウス）ＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物を生成するための方法もまた本明細書中で提供される。
【０１６７】
遺伝子改変された動物の使用
種々の実施形態では、本明細書中で記載される遺伝子改変された非ヒト動物は、細胞表面にヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉおよび／またはβ２ミクログロブリンを有するＡＰＣを作製し、結果として、サイトゾルタンパク質に由来するペプチドを、ＣＴＬに対するエピトープとしてヒト様の様式で提示する（何故なら、その複合体の構成要素の実質的に全てが、ヒトまたはヒト化であるからである）。本発明の遺伝子改変された非ヒト動物は、ヒト化動物においてヒト免疫系の機能を研究するため；免疫応答を惹起する抗原および抗原エピトープ（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば、独特なヒトがんエピトープ）を同定するため、例えば、ワクチン開発に使用するため；ヒト病原体またはがん抗原に対する高親和性Ｔ細胞（すなわち、高いアビディティを有して、ヒトＭＨＣ  Ｉ複合体との関連で抗原に結合するＴ細胞）の同定のため、例えば、適応Ｔ細胞治療において使用するため；ワクチン候補の評価および他のワクチン戦略のため；ヒト自己免疫を研究するため；ヒト感染症を研究するため；および別の方法で、ヒトＭＨＣ発現に基づくより良い治療戦略を案出するために、使用され得る。
【０１６８】
ＭＨＣ  Ｉ複合体は、ペプチドに結合し、それらを細胞表面に提示する。そのような複合体との関連で、一旦、表面に提示されると、上記ペプチドは、Ｔ細胞によって認識可能である。例えば、上記ペプチドが病原体または他の目的の抗原（例えば、腫瘍抗原）に由来する場合、Ｔ細胞認識は、Ｔ細胞活性化、提示されたペプチド配列を有する細胞のマクロファージによる死滅化、および提示された配列に結合する抗体のＢ細胞活性化をもたらし得る。
【０１６９】
Ｔ細胞は、ペプチド結合ＭＨＣクラスＩエクトドメインおよびＴ細胞のＣＤ８エクトドメインを介して、ＭＨＣ  Ｉ複合体を発現する細胞と相互作用する。ＭＨＣクラスＩ分子に結合した好適な抗原を有するＡＰＣに遭遇した、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞になる。したがって、ＭＨＣクラスＩとの関連で、Ｔ細胞受容体に対し高いアビディティで結合する抗原は、ヒト病変に対する処置の開発において、潜在的に重要である。しかし、ヒトおよびマウスのＭＨＣ複合体は、抗原を異なって認識する（例えば、マウスＭＨＣ  Ｉは、ヒトＭＨＣ  Ｉと同じ抗原を認識しない場合があるか、または、ヒトＭＨＣ  Ｉとは異なるエピトープを提示し得る）ので、マウスＭＨＣ  Ｉとの関連で、抗原の提示は、ヒト疾患にいくぶん関係があるだけである。したがって、ヒト病変について最も関係するデータは、ヒトＭＨＣ  Ｉによる抗原エピトープの提示の研究を通して得られる。
【０１７０】
したがって、種々の実施形態では、本発明の遺伝子操作された動物は、ヒトにおいて免疫応答を開始する抗原の能力を評価するため、および、多様な抗原を生成し、ヒトワクチン開発において使用され得る特定の抗原を同定するために、とりわけ有用である。
【０１７１】
１つの態様では、ペプチド配列のヒトにおける抗原性を決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を、該ペプチド配列を含む分子に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉ複合体またはヒト化ＭＨＣ  Ｉ複合体（キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉおよびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンを含む）によって提示されるペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。
【０１７２】
１つの態様では、ペプチドが、ヒトにおいて細胞性免疫応答を引き起こすかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された非ヒト動物を該ペプチドに曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程、および、該非ヒト動物において、本明細書中で記載されるようにキメラヒト／非ヒトＭＨＣクラスＩ分子によって該ペプチドの配列に結合する細胞を検出する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、曝露後の非ヒト動物は、上記ペプチドに結合する、ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。１つの態様では、上記ＣＴＬは、上記ペプチドを保有する細胞を殺す。
【０１７３】
１つの態様では、ヒトＣＴＬエピトープを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物を、推定ＣＴＬエピトープを含む抗原に曝露する工程、該非ヒト動物に免疫応答を開始させる工程、該非ヒト動物から、該エピトープに結合したＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬを単離する工程、および、該ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＤ８＋ＣＴＬによって結合された該エピトープを同定する工程を含む方法が提供される。
【０１７４】
１つの態様では、ヒト細胞によるその提示およびヒトリンパ球（例えば、ヒトＴ細胞）による結合がペプチド保有細胞の細胞傷害性をもたらす、ＨＬＡクラスＩ−拘束ペプチドを同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように非ヒト動物（またはそのＭＨＣクラスＩ発現細胞）を目的のペプチドを含む分子に曝露する工程、該目的のペプチドに結合するキメラヒト／非ヒトクラスＩ分子を発現する該非ヒト動物の細胞を単離する工程、ＨＬＡクラスＩ拘束細胞傷害性を導き得るヒトリンパ球に対して該細胞を曝露する工程、および、ペプチド誘導型細胞傷害性を測定する工程を含む方法が提供される。
【０１７５】
１つの態様では、細胞傷害性Ｔ細胞応答をヒトにおいて起こす抗原を同定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスに対して推定抗原を曝露する工程、該マウスに免疫応答を起こさせる工程、および、ＨＬＡクラスＩ拘束分子により結合した抗原を同定する工程を含む方法が提供される。
【０１７６】
１つの実施形態では、抗原は、細菌表面抗原またはウイルス表面抗原またはエンベロープタンパク質を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒト腫瘍細胞の表面の抗原を含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおける使用のための推定ワクチンを含む。１つの実施形態では、抗原は、ヒトにおいて抗体を生成するヒトエピトープを含む。別の実施形態では、抗原は、エピトープ／ＭＨＣ  Ｉ複合体を標的とする高親和性ＣＴＬを生成するヒトエピトープを含む。
【０１７７】
１つの態様では、推定抗原が、ヒト免疫系に対する曝露の際に、ＨＬＡクラスＩ拘束免疫応答、例えばＨＬＡ−Ａ拘束免疫応答（例えば、ＨＬＡ−Ａ２拘束応答）またはＨＬＡ−Ｂ拘束免疫応答（ＨＬＡ−Ｂ２７拘束免疫応答）を起こすエピトープを含有するかどうかを決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスを推定抗原に曝露する工程、および、該マウスにおける抗原特異的ＨＬＡクラスＩ拘束、例えばＨＬＡ−ＡまたはＨＬＡ−Ｂ拘束（例えば、ＨＬＡ−Ａ２拘束またはＨＬＡ−Ｂ２７拘束）免疫応答を測定する工程を含む方法が提供される。
【０１７８】
１つの実施形態では、推定抗原は、生物製剤またはその断片、非自己タンパク質、非自己細胞の表面抗原、腫瘍細胞の表面抗原、細菌細胞または酵母細胞または真菌細胞の表面抗原、ウイルスの表面抗原またはエンベロープタンパク質から選択される。
【０１７９】
さらに、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物は、目的の抗原（例えば、腫瘍抗原または別の疾患抗原）を認識するＴ細胞受容体、例えば、高アビディティＴ細胞受容体の同定のために有用であり得る。上記方法は以下を含み得る：本明細書中で記載される非ヒト動物を抗原に曝露する工程、該非ヒト動物に該抗原に対する免疫応答を開始させる工程、該非ヒト動物から、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉによって提示された抗原に結合するＴ細胞受容体を含むＴ細胞を単離する工程、および、該Ｔ細胞受容体の配列を決定する工程。
【０１８０】
１つの態様では、ヒト腫瘍抗原に対して高い親和性を有するＴ細胞受容体可変ドメインを同定するための方法であって、ヒト化ＭＨＣ  Ｉ  α１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメイン（例えば、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７  α１、α２、およびα３ドメイン）を含むマウスをヒト腫瘍抗原に曝露する工程；該マウスに免疫応答を起こさせる工程；および、該マウスから、Ｔ細胞受容体可変ドメインをコードする核酸配列を単離する工程を含み、ここで、該Ｔ細胞受容体可変ドメインは、約１ナノモル濃度以下のＫＤでヒト腫瘍抗原に結合する方法が提供される。
【０１８１】
１つの実施形態では、上記マウスは、内在性マウスＴ細胞受容体可変領域遺伝子座において、複数の再配列されていないヒトＴ細胞受容体可変領域遺伝子セグメントによる置き換えであって、ここで、該再配列されていないヒトＴ細胞受容体可変領域遺伝子セグメントは、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含むキメラヒト−マウスＴ細胞受容体遺伝子をコードするように組み換える置き換えをさらに含む。１つの実施形態では、上記マウスは、ヒトＣＤ８導入遺伝子を含み、該マウスは、機能的なヒトＣＤ８タンパク質を発現する。
【０１８２】
腫瘍抗原に対して高いアビディティを有するＴ細胞受容体は、細胞ベースの治療において有用である。ヒト腫瘍抗原に対し高いアビディティを有するＴ細胞集団は、腫瘍抗原に対し非常に高いアビディティを有するＴ細胞（すなわち、ＣＤ８のα３に対する結合不能性にもかかわらず該抗原を認識するＴ細胞クローン）のみを選択するために、α３サブユニットに対するＣＤ８の結合性を最小化するように変異しているＨＬＡ−Ａ２にヒトＴ細胞を曝露することによって、調製されている。Pittetら（２００３年）α3  Domain  Mutants  of  Peptide/MHC  Class  I  Multimers  Allow  the  Selective  Isolation  of  High  Avidity  Tumor-Reactive  CD8  T  Cells、J.  Immunol.１７１巻：１８４４〜１８４９頁を参照されたい。非ヒト動物、および該非ヒト動物の細胞は、ヒトＨＬＡクラスＩと、Ｔ細胞受容体に対する高いアビディティで結合するか、またはＴ細胞受容体を有するリンパ球を活性化する複合体を形成するペプチドを同定するために有用である。
【０１８３】
Ｔ細胞に対する抗原／ＨＬＡクラスＩ結合、またはＴ細胞の活性化は、当該分野で公知の任意の好適な方法によって測定され得る。ペプチド特異的ＡＰＣ−Ｔ細胞結合および活性化は、測定可能である。例えば、ＨＬＡ−Ａ２を発現する抗原提示細胞のＴ細胞会合は、ＰＩＰ２を生じて、免疫シナプスにおいて蓄積するが、他方で、架橋ＭＨＣクラスＩ分子はそれを起こさないことが、報告されている。Fooksmanら（２００９年）Cutting  Edge:  Phosphatidylinositol  4,5-Bisphosphate  Concentration  at  the  APC  Side  of  the  Immunological  Synapse  Is  Required  for  Effector  T  Cell  Function、J.  Immunol.１８２巻：５１７９〜５１８２頁を参照されたい。
【０１８４】
ＴＣＲを有するリンパ球およびクラスＩ発現ＡＰＣの相互作用の機能的帰結もまた、測定可能であり、リンパ球による細胞死滅化を含む。例えば、ＣＤ８＋ＣＴＬによるＨＬＡ−Ａ２のα２サブユニットにおける接触点は、Ｆａｓ非依存型死滅化についてのシグナルを生成することが報告されている。ＨＬＡ−Ａ２発現Ｊｕｒｋａｔ細胞は、細胞質ドメイン上に何ら明らかな確実性なしにＣＤ８と接触することが（結晶学的研究から）公知であるＨＬＡ−Ａ２分子上のエピトープに（抗体によって）接触した場合、アポトーシスがおこる。Pettersenら（１９９８年）The  TCR-Binding  Region  of  the  HLA  Class  I  α2  Domain  Signals  Rapid  Fas-Independent  Cell  Death:  A  Direct  Pathway  for  T  Cell-Mediated  Killing  of  Target  Cells?  J.  Immunol.１６０巻：４３４３〜４３５２頁を参照されたい。ＣＤ８＋ＣＴＬの  ＣＤ８と接触したＨＬＡ−Ａ２  α２  によって誘導された迅速な死滅化は、主に、このＦａｓ非依存型ＨＬＡ−Ａ２媒介型経路に起因し得ると仮定され（同上）、それ自身がアポトーシスを誘導し得るＴＣＲ非依存型α３ドメイン媒介型死滅化とは区別される（Woodleら（１９９７年）Anti-human  class  I  MHC  antibodies  induce  apoptosis  by  a  pathway  that  is  distinct  from  the  Fas  antigen-mediated  pathway、J.  Immunol.１５８巻：２１５６〜２１６４頁を参照されたい）。
【０１８５】
Ｔ細胞とＭＨＣ  Ｉとの関連でペプチドを表面に表すＡＰＣとの間の相互作用の結果はまた、Ｔ細胞増殖アッセイによって測定され得る。あるいは、これは、一般に免疫応答の活性化と関連するサイトカイン放出の測定によって、決定され得る。１つの実施形態では、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴが、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化をモニタリングして定量化するために使用され得る。
【０１８６】
本明細書中で記載されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、本明細書中で記載される遺伝子改変された非ヒト動物において、ＭＨＣ  Ｉに対するＣＤ８の種特異的結合性に起因して、妨害され得る。種特異的ＣＤ８相互作用が所望される実施形態について、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された動物（例えば、げっ歯動物、例えば、マウスまたはラット）の細胞は、（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで）ヒト細胞、例えば、ヒトＣＤ８保有細胞、例えば、ヒトＴ細胞に曝露される。１つの実施形態では、本明細書中で記載されるようにマウスのＭＨＣクラスＩ発現細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトＣＤ８およびＴ細胞受容体を含むＴ細胞に曝露される。特定の実施形態では、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。１つの実施形態では、マウスのＭＨＣクラスＩ発現細胞は、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉ複合体（ヒトβ２ミクログロブリンを含む）に結合するペプチドを含み、上記Ｔ細胞はヒトＴ細胞であり、ペプチドを表面に表すマウス細胞に結合するＴ細胞の能力が決定される。１つの実施形態では、ペプチドを表面に表すマウス細胞によるヒトＴ細胞の活性化が決定される。１つの実施形態では、ペプチドを表面に表す細胞によるヒトＴ細胞の活性化を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、本明細書中で記載されるように、マウスまたはマウス細胞を目的の抗原に曝露する工程、前記マウス由来の細胞または前記マウス細胞（ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉとの複合体における該抗原に由来するペプチドを有すると推定される）を、ヒトＴ細胞に曝露する工程、および、該ヒトＴ細胞の活性化を測定する工程を含む方法が提供される。１つの実施形態では、上記方法は、ヒト病原体またはヒト新生物のＴ細胞エピトープを同定するために使用される。１つの実施形態では、上記方法は、ワクチンのためのエピトープを同定するために使用される。
【０１８７】
１つの実施形態では、推定ヒト治療薬によるＴ細胞活性化を決定するための方法であって、本明細書中で記載されるように遺伝子改変された動物を推定ヒト治療薬に曝露する工程（または、例えば、そのような動物のヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉ発現細胞を推定治療薬のペプチド配列に曝露する工程）、ヒトまたはヒト化ＭＨＣ  Ｉ／ペプチド複合体を表面に表す遺伝子改変された動物の細胞を、該遺伝子改変された動物の細胞に結合可能なヒトＴ細胞受容体およびＣＤ８を含むＴ細胞に曝露する工程、および、該遺伝子改変された動物の、該ペプチドを表面に表す細胞によって誘導されるヒトＴ細胞の活性化を測定する工程を含む方法が提供される。
【０１８８】
種々の実施形態では、本明細書中で記載されるように動物由来のヒトまたはヒト化ＭＨＣクラスＩ発現細胞間に形成される複合体は、ヒトＣＤ８配列を含むＴ細胞、例えば、ヒトＴ細胞、またはヒトＣＤ８をコードする導入遺伝子を含む非ヒト動物のＴ細胞によって作製される。ヒトＣＤ８についてトランスジェニックであるマウスは、当該分野で公知である。Tishonら（２０００年）Trangenic  Mice  Expressing  Human  HLA  and  CD8  Molecules  Generate  HLA-Restricted  Measles  Virus  Cytotoxic  T  Lymphocytes  of  the  Same  Specificity  as  Humans  with  Natural  Measles  Virus  Infection、Virology  ２７５巻（２号）：２８６〜２９３頁；また、LaFaceら（１９９５年）Human  CD8  Transgene  Regulation  of  HLA  Recognition  by  Murine  T  Cells、J.  Exp.  Med.１８２巻：１３１５〜１３２５頁。
【０１８９】
ヒト病原体または新生物からの抗原および抗原エピトープを同定する能力に加え、本発明の遺伝子改変された動物が、ヒト自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症などに関連する自己抗原を同定するために使用され得る。例えば、Takakiら（（２００６年）HLA-A*0201-Restricted  T  Cells  from  Humanized  NOD  Mice  Recognize  Autoantigens  of  Potential  Clinical  Relevance  to  Type  1  Diabetes、J.  Immunol.１７６巻：３２５７〜６５頁）は、ＨＬＡ／β２ミクログロブリン単鎖を有するＮＯＤマウスの、１型糖尿病自己抗原を同定する上での利用を記載する。また、本発明の遺伝子改変された動物は、ヒト自己免疫疾患の種々の態様を研究するために使用され得る。ヒトＭＨＣ  Ｉのいくつかの多形対立遺伝子は、ある特定の疾患、例えば、自己免疫疾患（例えば、グレーヴス病、重症筋無力症、乾癬など）の発症に関連することが公知である;Bakkerら（２００６年）A  high-resolution  HLA  and  SNP  haplotype  map  for  disease  association  studies  in  the  extended  human  MHC、Nature  Genetics  ３８巻：１１６６〜７２頁およびSupplementary  Information  and  International  MHC  and  Autoimmunity  Genetics  Network（２００９年）Mapping  of  multiple  susceptibility  variants  within  the  MHC  region  for  7  immune-mediated  diseases,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １０６巻：１８６８０〜８５頁、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ヒト化ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座を含む本発明の遺伝子改変された動物は、自己免疫疾患モデルとして有用であり得るような対立遺伝子を含む。１つの実施形態では、疾患対立遺伝子は、ＨＬＡ−Ｂ２７であり、上記疾患は、硬直性脊椎炎または反応性関節炎であり；したがって、１つの実施形態では、これらの疾患の研究のために使用される動物は、ヒトまたはヒト化ＨＬＡ−Ｂ２７を含む。他のヒト疾患対立遺伝子、例えば、ＨＩＶ、エボラ感染症などに関連するＨＬＡクラスＩ対立遺伝子が公知であり、これらの対立遺伝子または対立遺伝子の組合せは、本明細書中で記載される遺伝子改変された動物における疾患モデルの作製に有用であり得る。
【０１９０】
さらに、本発明の遺伝子改変された動物および該動物によって発現されるヒトまたはヒト化ＨＬＡ分子は、ヒト疾患の進行に関連する、ヒトＨＬＡ分子による抗原提示を遮断する抗体を試験するために使用され得る。したがって、抗体が、ヒト疾患、例えば、上記のヒト疾患に関連づけられるＨＬＡ分子による抗原の提示を遮断することができるかどうかを決定する方法であって、本明細書中で記載されるヒトまたはヒト化ＨＬＡを発現する細胞を試験抗体に曝露する工程、および該試験抗体が、ヒトまたはヒト化ＨＬＡによる免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への抗原の提示を遮断することができるかどうかを、例えば、ヒトまたはヒト化ＨＬＡ拘束免疫応答を遮断するその能力を測定することによって決定する工程を含む方法が本明細書中で提供される。１つの実施形態では、上記方法は、ヒトまたはヒト化ＨＬＡを発現する動物、例えば、疾患に対する疾患モデルとして役立つ疾患関連ヒトまたはヒト化ＨＬＡを発現する動物において行われる。
【０１９１】
ＭＨＣ  Ｉ複合体を包含する細胞性免疫の他の態様は、当該分野で公知である；したがって、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物は、免疫生物学のこれらの態様を研究するために使用され得る。例えば、ＴＣＲのＭＨＣクラスＩに対する結合性は、さらなる因子によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで調節される。白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー（ＬＩＬＲＢ１、またはＬＩＲ−１）は、ＭＨＣクラスＩ拘束ＣＴＬにおいて発現され、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩ分子のα３サブユニットにおける特定の抗原決定基の結合によって、Ｔ細胞刺激を下方制御する。構造研究は、ＬＩＲ−１およびＣＤ８についての結合部位が重複することを示し、このことは、ＭＨＣクラスＩ分子との結合について、阻害性ＬＩＲ−１が刺激性ＣＤ８と競合することを示唆する。Willcoxら（２００３年）Crystal  structure  of  HLA-A2  bound  to  LIR-1,  a  host  and  viral  major  histocompatibility  complex  receptor、Nature  Immunology  ４巻（９号）：９１３〜９１９頁；また、Shirioshiら（２００３年）Human  inhibitory  receptors  Ig-like  transcript  2  (ILT2)  and  ILT4  compete  with  CD8  for  MHC  class  I  binding  and  bind  preferentially  to  HLA-G、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １００巻（１５号）：８８５６〜８８６１頁。ＬＩＲ−１は、阻害シグナルを、その（細胞内）免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を介して伝達する。ＮＫ細胞では、研究は、ＩＴＩＭを欠く（通常、阻害不可能である）ＫＩＲ（阻害性キラー細胞Ｉｇ様受容体）が、ＬＩＲ−１の存在下で（おそらく、ＬＩＲ−１  ＩＴＩＭを介して）ＭＨＣクラスＩ分子のα３ドメインへの結合を阻害し得ることを示している（Kirwinら（２００５年）Killer  Cell  Ig-Like  Receptor-Dependent  Signaling  by  Ig-Like  Transcript  2  (ILT2/CD85j/LILRB1/LIR-1)  J.  Immunol.１７５巻：５００６〜５０１５頁を参照されたい）。このことは、ＭＨＣクラスＩに結合したＬＩＲ−１とＫＩＲとの間の協調を示唆し、したがって、ＮＫ細胞阻害の調節におけるＨＬＡ  α３ドメイン結合の役割を示唆している。
【０１９２】
上で記載されるように、ＭＨＣ分子は、ＴＣＲを発現しない細胞と相互作用する。これらの細胞の間ではＮＫ細胞である。ＮＫ細胞は、細胞性免疫応答において、特に先天免疫において、中心的役割を果たす細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ、すなわち細胞傷害性Ｔリンパ球とは区別される）である。ＮＫ細胞は、侵入性の微生物、ウイルス、および他の非自己（例えば、腫瘍）実体に対する防御の第１線である。ＮＫ細胞は、表面受容体を介して活性化されるかまたは阻害され、これらは、ＣＤ８を発現するが、ＴＣＲは発現しない。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩを発現する細胞と相互作用し得るが、相互作用は、ＴＣＲ結合、ペプチド保有α１およびα２ドメインではなくＣＤ８結合α３ドメインを介する。ＮＫ細胞の主な機能は、充分なＭＨＣクラスＩ表面タンパク質を欠く細胞を破壊することである。
【０１９３】
ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の表面の架橋ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞内チロシンリン酸化、ＭＨＣクラスＩ分子の免疫シナプスからの移動、および腫瘍細胞死滅化の下方制御をもたらす。Rubioら（２００４年）Cross-linking  of  MHC  class  I  molecules  on  human  NK  cells  inhibits  NK  cell  function,  segregates  MHC  I  from  the  NK  cell  synapse,  and  induces  intracellular  phosphotyrosines、J.  Leukocyte  Biol.７６巻：１１６〜１２４頁。
【０１９４】
ＮＫ細胞におけるＭＨＣクラスＩの別の機能は、明らかに自己死滅化を防ぐ。ＮＫ細胞は、活性化受容体２Ｂ４および２Ｂ４リガンドＣＤ４８の両方を有し；ＭＨＣクラスＩは、２Ｂ４に結合し、ＣＤ４８によるその活性化を妨げるようである。Betser-Cohen（２０１０年）The  Association  of  MHC  Class  I  Proteins  with  the  2B4  Receptor  Inhibits  Self-Killing  of  Human  NK  Cells,  J.  Immunol.１８４巻：２７６１〜２７６８頁。
【０１９５】
したがって、本明細書中で記載される遺伝子操作された非ヒト動物は、これらの非ＴＣＲまたは非ＣＴＬ媒介型プロセスを研究するため、およびその調節のためのアプローチを設計するために、使用され得る。
【実施例】
【０１９６】
本発明は、以下の非限定の実施例によって、さらに例証される。これらの実施例は、本発明の理解を助けるために示されるが、本発明の範囲を制限することを何ら企図せず、また何らそのように解釈されるべきではない。本実施例は、当業者に周知の慣用的方法（分子クローニング技術など）の詳細な記載を含まない。そうでないと示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏（Ｃｅｌｓｉｕｓ）で示され、圧力は大気圧付近である。
【０１９７】
（実施例１）
遺伝子改変されたＨＬＡ−Ａ２マウスの構築および性質決定
実施例１．１：ＭＧ８７細胞におけるＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋの発現
キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子配列を含有するウイルス構築物（図４Ａ）を、トランスフェクトした細胞におけるキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉ発現を分析するために、当業者に公知の標準的分子クローニング技術を使用して作製した。
【０１９８】
簡潔には、キメラヒトＨＬＡ−Ａ／マウスＨ−２Ｋウイルス構築物を、α鎖のα１、α２およびα３ドメインをコードするエクソン配列を使用して作製し、これらを、Ｈ−２Ｋ遺伝子由来の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインについて、マウスコード配列にインフレームでクローニングした（図４Ａ、ｐＭＩＧ−ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋ）。図４に示される通り、上記構築物は、ＩＲＥＳ−ＧＦＰレポーター配列を含有し、これは、該構築物が、トランスフェクションによって細胞内で発現できるかどうかを決定することを可能にした。
【０１９９】
上記のキメラ構築物を含有するウイルスを作製し、ヒト胚性腎２９３（２９３Ｔ）細胞内で増やした。２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍディッシュにまいて、９５％コンフルエンシーまで増殖させた。ＤＮＡトランスフェクション混合物を、２５μｇのｐＭＩＧ−ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋ、ｐＭＩＧ−ヒトＨＬＡ−Ａ２またはｐＭＩＧ−ヒト化β２ミクログロブリン、および５μｇのｐＭＤＧ（エンベローププラスミド）、１５μｇのｐＣＬ−Ｅｃｏ（パッケージングシグナルΨなしのパッケージング構築物）、１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製した。この１ｍＬのＤＮＡ混合物に、１ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の８０μＬのリポフェクタミン−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、これを先に一緒に混合し、室温で５分間インキュベートした。リポフェクタミン／ＤＮＡ混合物を、さらに２０分間室温でインキュベートし、次いで、１０ｃｍディッシュに加え、この平板培養物（ｐｌａｔｅ）を、３７℃でインキュベートした。この細胞からの培地を、２４時間後に回収し、新鮮な１０ｍＬのＲ１０（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％  ＦＢＳ）培地を、この細胞に添加した。この培地交換を、２回繰り返した。計４日間の後、回収した培地をプールし、遠心分離し、滅菌フィルターを通して、細胞屑を除去した。
【０２００】
上記のように増やしたウイルスを、ＭＧ８７（マウス線維芽細胞）細胞を変換するために使用した。単一のＴ−７５フラスコからのＭＧ８７細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。３ｍＬの０．２５％トリプシン＋ＥＤＴＡを細胞に加え、室温で３分間インキュベートした。７ｍＬのＤ１０（高グルコースＤＭＥＭ；１０％ウシ胎仔血清）をこの細胞／トリプシン混合物に加え、１５ｍＬチューブに移して、１３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を遠心分離した後、培地を吸引し、細胞を、５ｍＬ  Ｄ１０中に再度懸濁させた。細胞を計数し、６ウェルプレート中の１ウェルあたり約３．０×１０５細胞を入れた。ｐＭＩＧ−ヒトＨＬＡ−Ａ２またはｐＭＩＧ−ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋは、単独で、またはｐＭＩＧ−ヒト化β２ミクログロブリンウイルスとともにウェルに加え、対照として非変換細胞を用いた。細胞を、３７℃にて５％  ＣＯ２と共に２日間インキュベートした。β２ミクログロブリンを有するかまたは有さないＨＬＡ−Ａ２発現について、ＦＡＣＳ分析（抗ＨＬＡ−Ａ２抗体、クローンＢＢ７．２を使用した）のために、細胞を調製した。
【０２０１】
グラフ（図４Ｂ）および該グラフから得られたデータをまとめた表（図４Ｃ）は、ヒト化β２ミクログロブリンとの共変換は、右方へシフトする曲線によって実証されるように、ヒトＨＬＡ−Ａ２またはキメラヒト／非ヒトＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋの発現を増大することを実証する。
【０２０２】
実施例１．２．  キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋ遺伝子座の操作
マウスＨ−２Ｋ遺伝子を、独自の標的化ベクターを、ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を用いて構築することにより、一工程でヒト化した（例えば、米国特許第６、５８６、２５１号およびValenzuelaら（２００３年）High-throughput  engineering  of  the  mouse  genome  coupled  with  high-resolution  expression  analysis、Nat.  Biotech.２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照されたい）。マウスＢＡＣクローンＲＰ２３−１７３ｋ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＤＮＡを、相同組換えによって改変し、マウスＨ−２Ｋ遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＨＬＡ−Ａ遺伝子のα１、α２およびα３サブユニットをコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換えた（図５）。
【０２０３】
簡潔には、ｌｏｘＰ部位が隣接するハイグロマイシンカセットおよび５’非翻訳領域を含むマウスＨ−２Ｋ遺伝子座の５’の配列を含有する５’マウスホモロジーアーム（ＵＴＲ；５’ホモロジーアームは、配列番号１に示される）およびマウスＨ−２Ｋ  α３をコードする配列の３’のゲノム配列を含有する３’マウスホモロジーアーム（３’ホモロジーアームは、配列番号２に示される）を含む標的化ベクターを使用する、単一の標的化事象で、Ｈ−２Ｋ遺伝子のマウスα１、α２およびα３サブユニットをコードするゲノム配列を、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換える。
【０２０４】
内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座を標的とするための最終構築物は、５’から３’へ、以下を含む：（１）内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子の５’の約２００ｂｐのマウスゲノム配列（５’ＵＴＲを含む）を含有する５’ホモロジーアーム、（２）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１リーダー配列、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１リーダー／α１イントロン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α１エクソン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α２エクソン、α２−α３イントロンの約３１６ｂｐの５’末端を含む約１３３９ｂｐのヒトゲノム配列、（３）５’ｌｏｘＰ部位、（４）ハイグロマイシンカセット、（５）３’ｌｏｘＰ部位、（６）α２−α３イントロンの約３０４ｂｐの３’末端、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  α３エクソンを含む約５８０ｂｐのヒトゲノム配列、ならびに（７）マウスＨ−２Ｋ  α３と膜貫通をコードする配列との間のイントロンを含む約２００ｂｐのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム（Ｈ−２Ｋ標的化ベクターの概略的表示については、図５を参照されたい）。標的化ベクターの５’におけるマウス／ヒト配列の接合部における１４９ヌクレオチドの配列は、配列番号３に示され、標的化ベクターの３’におけるヒト／マウス配列の接合部における１５９ヌクレオチドの配列は、配列番号４に示される。この標的化ベクターによる相同組換えは、内在性マウスＨ−２Ｋ膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列に作動可能に連結している、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する改変マウスＨ−２Ｋ遺伝子座を作製した。この遺伝子座は、翻訳されるとキメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の形成を導く。
【０２０５】
標的化されたＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＦ１Ｈ４  ＥＳ細胞をエレクトロポレーションし、有核細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、好中球）の表面にキメラＭＨＣクラスＩタンパク質を発現するマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を作製した。ヒトＨＬＡ配列の挿入物を含有するＥＳ細胞を、定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイによって同定した。特異的プライマーセットおよびプローブを、ヒトＨＬＡ配列および付随する選択カセットの挿入（対立遺伝子の獲得、ＧＯＡ）ならびに内在性マウス配列の欠失（対立遺伝子の欠失、ＬＯＡ）を検出するために設計した。表１は、定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用されるプローブそれぞれについて検出される名称および位置を同定する。
【表１】
0006456351.tif 000002
【０２０６】
選択カセットは、当業者に公知の方法によって除去され得る。例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩ遺伝子座を有するＥＳ細胞は、ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子配列を含有する標的化構築物の挿入によって導入された「ｌｏｘｅｄ」ハイグロマイシンカセットを除去するために、Ｃｒｅを発現する構築物によってトランスフェクトされ得る（図５を参照されたい）。ハイグロマイシンカセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに交配させることによって、任意選択で除去され得る。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットは、そのマウスに保持される。
【０２０７】
標的とした上記のＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって、８細胞期のマウス胚へと導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）F0  generation  mice  that  are  essentially  fully  derived  from  the  donor  gene-targeted  ES  cells  allowing  immediate  phenotypic  analyses  Nature  Biotech.２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照されたい）。独立してキメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、独自のヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）を改変して使用するゲノタイピングによって同定した。
【０２０８】
実施例１．３．  遺伝子改変されたマウスにおけるキメラ  ＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋ  のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
実施例１．２に記載されるように遺伝子改変されたＨ−２Ｋ遺伝子座を有するヘテロ接合型マウスを、この動物の細胞におけるキメラＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋタンパク質の発現について分析した。
【０２０９】
血液を、野生型マウスおよびＨＬＡ−Ａ／Ｈ−２Ｋキメラヘテロ接合型（Ａ２／Ｈ２Ｋ）マウスから別個に得た。細胞を、フィコエリトリンコンジュゲート（ＰＥ）抗ＨＬＡ−Ａ抗体によってヒトＨＬＡ−Ａ２について染色し、アロフィコシアニンコンジュゲート抗Ｈ−２Ｋｂ抗体に１時間４℃にて曝露した。細胞を、ＨＬＡ−ＡおよびＨ−２Ｋｂについて特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーによって、発現について分析した。図６Ａは、野生型およびキメラヘテロ接合型において、Ｈ−２ＫｂおよびＨＬＡ−Ａ２の発現を示す（キメラヘテロ接合体は、両方のタンパク質を発現する）。図６Ｂは、ヘテロ接合体マウスにおいて、Ｈ−２ＫｂおよびキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋの両方の発現を示す。
【０２１０】
（実施例２）
遺伝子改変されたβ２ミクログロブリンマウスの構築および性質決定
実施例２．１：ヒト化β２ミクログロブリン遺伝子座を操作する
マウスβ２ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝子を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用し、ヒトおよびマウスの細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの独自の標的化ベクターを構築することによって、１工程でヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら、上掲を参照されたい）。
【０２１１】
簡潔には、標的化ベクターを、ＲＰＣＩ−２３ライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＢＡＣクローン８９Ｃ２４からのマウスβ２ｍの上流ホモロジーアームおよび下流ホモロジーアームを含有する細菌相同組換えによって生成した。このマウスホモロジーアームを、エクソン２から非コードエクソン４の約２６７ヌクレオチド下流へ延びる２．８ｋｂのヒトβ２ｍ  ＤＮＡ断片が隣接するように工学的に作製した（図７）。リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰ部位）が隣接する薬物選択カセット（ネオマイシン）を、標的化ベクター内に工学的に作製し、その後の選択を可能にした。最終標的化ベクターを、直鎖状にし、Ｆ１Ｈ４マウスＥＳ細胞系内にエレクトロポレーションした（Valenzuela、上掲）。
【０２１２】
薬物カセットを（Ｃｒｅリコンビナーゼの導入によって）除去した標的とされたＥＳ細胞クローンを、８細胞期のマウス胚へと、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、上掲を参照されたい）。ヒト化β２ｍ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、マウス対立遺伝子の欠失およびヒト対立遺伝子の獲得について、対立遺伝子アッセイを改変して使用してスクリーニングすることによって、同定した（Valenzuelaら、上掲）。
【０２１３】
実施例２．２：ヒト化β２ミクログロブリンマウスの性質決定
ヒト化β２ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝子についてのヘテロ接合型のマウスを、フローサイトメトリーを使用して、発現について評価した（図８および図９）。
【０２１４】
簡潔には、当該分野で公知の技術を使用して、血液を、野生型、ヒト化β２ｍ、ヒト化ＭＨＣ（すなわち、ヒトＨＬＡ）クラスＩ、およびβ２ｍとＭＨＣクラスＩとの二重ヒト化マウスの群（１群あたりｎ＝４）から単離した。各群におけるマウスそれぞれに由来する血液を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）で処理し、赤血球を除去した。残った細胞を、蛍光色素をコンジュゲートした抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗ヒトＨＬＡクラスＩ、および抗ヒトβ２ミクログロブリン（２Ｍ２）抗体を使用して染色した。フローサイトメトリーを、ＢＤ−ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。
【０２１５】
ヒトＨＬＡクラスＩの発現を、一重ヒト化動物および二重ヒト化動物由来の細胞において検出し、他方で、β２ミクログロブリンの発現を、二重ヒト化マウス由来の細胞のみにおいて検出した（図８）。ヒトβ２ｍおよびヒトＨＬＡクラスＩの共発現は、ヒトβ２ｍの非存在下でのヒトＨＬＡクラスＩ発現と比較して、細胞表面のヒトＨＬＡクラスＩの検出可能な量の増大をもたらした（図９；平均蛍光強度２３７０対１３８７）。
【０２１６】
（実施例３）
ＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋおよびヒト化β２ミクログロブリンを発現する遺伝子改変されたマウス由来のＡＰＣによって提示されたＦｌｕペプチドおよびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ペプチドに対する免疫応答
数人のヒトドナー由来のＰＢＭＣを、ＨＬＡ−Ａ２発現ならびにｆｌｕペプチドおよびＥＢＶペプチドに対する応答を開始させるその能力の両方について、スクリーニングした。単一のドナーを、その後の実験のために選択した。
【０２１７】
選択されたドナーのＰＢＭＣから、ネガティブセレクションを使用してヒトＴ細胞を単離する。脾性非Ｔ細胞を、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋについてヘテロ接合型でありヒト化β２−ミクログロブリン遺伝子についてヘテロ接合型であるマウスおよび野生型マウスから単離した。マウス由来の約５０，０００の脾性非Ｔ細胞を、抗ヒトＩＦＮγ抗体でコーティングしたＥｌｉｓｐｏｔプレートに添加した。Ｆｌｕペプチド（１０マイクロモル濃度）またはＥＢＶペプチドのプール（各５マイクロモル濃度）を、添加した。Ｐｏｌｙ  ＩＣを、２５マイクログラム／ウェルで添加し、ウェルを、３７℃にて５％  ＣＯ２において３時間インキュベートした。ヒトＴ細胞（５０，０００）および抗ヒトＣＤ２８を、脾性非Ｔ細胞および上記ペプチドに添加し、ウェルを、４０時間３７℃にて５％  ＣＯ２においてインキュベートし、その後、ＩＦＮγ  Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを実施した。
【０２１８】
図１０に示されるように、ヒトＴ細胞は、その表面にキメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋおよびヒト化β２ミクログロブリンを発現したマウスＡＰＣによって提示された場合、ｆｌｕペプチドおよびＥＢＶペプチドに対する応答を開始し得た。
【０２１９】
（実施例４）
遺伝子改変されたＨＬＡ−Ｂ２７マウスの構築および性質決定
実施例４．１：キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ１遺伝子座の操作
マウスＨ−２Ｄ１（組織適合２、Ｄ領域遺伝子座１）遺伝子を、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用し、ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの独自の標的化ベクター  を構築することによって、１工程でヒト化した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびValenzuelaら（２００３年）、上掲を参照されたい）。マウスＢＡＣクローンｂＭＱ３００ｃ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のＤＮＡを、相同組換えによって改変し、マウスＨ−２Ｄ１遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子のα１、α２およびα３サブユニットをコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換えた（図１１）。
【０２２０】
簡潔には、リーダー配列エクソンを含むマウスＨ−２Ｄ１遺伝子座の５’の配列を含有する５’マウスホモロジーアームおよびマウスＨ−２Ｄ１ポリＡ配列の３’のゲノム配列を含有する３’マウスホモロジーアームを含む標的化ベクターを使用する、単一の標的化事象で、マウスＨ−２Ｄ１遺伝子のα１、α２およびα３サブユニットをコードするゲノム配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７（サブタイプＢ＊２７０１−２７５９）遺伝子のα１、α２およびα３をコードするヒトゲノムＤＮＡで置き換える。
【０２２１】
内在性Ｈ−２Ｄ１遺伝子座を標的とするための最終的な構築物は、５’から３’へ、以下を含むものであった。（１）リーダー配列エクソンおよびイントロンを含む内在性Ｈ−２Ｄ１遺伝子の５’の４９．８ｋｂのマウスゲノム配列を含有する５’ホモロジーアーム（２）ＨＬＡ−Ｂ２７  α１エクソン、ＨＬＡ−Ｂ  α１−α２イントロン、ＨＬＡ−Ｂ  α２エクソン、５’ｌｏｘＰ部位の挿入を伴うＨＬＡ−Ｂ  α２−α３イントロン、ＨＬＡ−Ｂ  α３エクソンを含む１．６７ｋｂのヒトゲノム配列、（３）１．８ｋｂのマウスＨ−２Ｄ１  α３イントロン、Ｈ−２Ｄ１膜貫通および細胞質をコードするエクソンおよびポリＡ配列、（４）５’ＦＲＴ部位、（５）ハイグロマイシンカセット、（６）３’ＦＲＴ部位、（７）３’ｌｏｘＰ部位および（８）マウスＨ−２Ｄ１遺伝子の下流の１５５．６ｋｂのマウスゲノム配列を含有する３’ホモロジーアーム（Ｈ−２Ｄ１標的化ベクターの概略描写については図１１を参照されたい）。標的化ベクターの５’におけるマウス／ヒト配列の接合部の１９９ヌクレオチドの配列は配列番号９に示され、標的化ベクター内でヒト配列に囲まれたｌｏｘＰ挿入を含む１３４ヌクレオチドの配列は配列番号１０に示され、標的化ベクターの３’におけるヒト／マウス配列の接合部の２００ヌクレオチドの配列は配列番号１１に示され、マウス配列とＦＲＴ−ＨＹＧ−ＦＲＴ選択カセットの５’接合部の配列は配列番号１２に示され、ＦＲＴ−ＨＹＧ−ＦＲＴカセットとマウス配列の３’接合部の配列は配列番号１３に示される。この標的化ベクターを用いた相同組換えにより、内在性マウスＨ−２Ｄ１膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする配列に作動可能に連結した、ＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子のα１、α２およびα３ドメインをコードするヒトゲノムＤＮＡを含有する改変マウスＨ−２Ｄ１遺伝子座が作製された。この遺伝子座は、翻訳されるとキメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩタンパク質の形成を導く。
【０２２２】
標的化されたＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、マウスＦ１Ｈ４  ＥＳ細胞をエレクトロポレーションし、有核細胞（例えば、Ｔリンパ球およびＢリンパ球、マクロファージ、好中球）表面にキメラＭＨＣクラスＩタンパク質を発現するマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を作製した。ヒトＨＬＡ配列の挿入物を含有するＥＳ細胞を、定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイによって同定した。特異的プライマーセットおよびプローブを、ヒトＨＬＡ配列および付随する選択カセットの挿入（対立遺伝子の獲得、ＧＯＡ）ならびに内在性マウス配列の欠失（対立遺伝子の欠失、ＬＯＡ）を検出するために設計した。表２は、定量的ＰＣＲアッセイにおいて使用されるプローブそれぞれについて検出される名称および位置を同定する；これらのプローブは図１１に概略的に示されている。
【表２】
0006456351.tif 000003
【０２２３】
ＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ２−Ｄ１対立遺伝子は、Ｃｒｅ  ｄｅｌｅｔｏｒマウス系統と交雑することによって、条件的に除去されるように誘導され得る。例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩ遺伝子座を有するマウスは、標的化構築物において５’および３’ｌｏｘＰ部位が隣接する「Ｌｏｘｅｄ」ヒトＨＬＡ−Ｂ２７α３およびマウスＨ２−Ｄ１膜貫通および細胞質領域を除去するために、特定の細胞系列においてＣｒｅリコンビナーゼを発現するトランスジェニックマウスと交雑され得る（図１１を参照されたい）。
【０２２４】
選択カセットは、当業者に公知の方法によって除去され得る。例えば、キメラヒト／マウスＭＨＣクラスＩ遺伝子座を有するＥＳ細胞は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子配列を含有する標的化構築物の挿入によって導入された「ＦＲＴｅｄ」ハイグロマイシンカセットを除去するために、ＦｌｐＯを発現する構築物によってトランスフェクトされ得る（図１１を参照されたい）。ハイグロマイシンカセットは、ＦｌｐＯリコンビナーゼを発現するマウスと交配することによって、必要に応じて除去され得る。必要に応じて、ハイグロマイシンカセットは、そのマウスに保持される。
【０２２５】
標的とした上記のＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法によって８細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびPoueymirouら（２００７年）、上掲）。独立してキメラＭＨＣクラスＩ遺伝子を有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞に完全に由来するＦ０マウス）を、独自のヒトＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Valenzuelaら、上掲）を改変して使用したゲノタイピングによって同定した。
【０２２６】
実施例４．２：遺伝子改変マウスにおけるキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ１の発現
ヒト化Ｂ２ＭおよびキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ１の両方についてヘテロ接合型のマウスおよびそれらの野生型から血液を、ＥＤＴＡを伴うマイクロテイナチューブ（ＢＤ）中に採取した。血液を、１ｍｇ／ｍｌの一次抗体（Ｗ６／３２−ＰＥ、汎用ＨＬＡ−クラスＩ抗体、Ａｂｃａｍ；または抗ヒトｂ２ｍ抗体）を用い、４℃で２５分染色し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて洗浄し、ＡＰＣ標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：３００希釈物と一緒に４℃で２０分インキュベートした。赤血球を、１−ｓｔｅｐ  Ｆｉｘ／ｌｙｓｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて溶解させ、細胞を固定し、１×ＢＤ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｆｉｘａｔｉｖｅ中に再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ｍａｃｈｉｎｅで取得し、ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを解析した。
【０２２７】
図１２に示されているように、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄ１タンパク質およびヒト化Ｂ２Ｍが遺伝子操作された動物の血液細胞上に発現され（ヒトＨＬＡ−Ｂ２７およびヒトＢ−２Ｍに対して生じた抗体の検出によって証明された通り）、他方で、これらの発現は野生型動物においては検出されなかった。
【０２２８】
均等物
当業者は、慣用的実験以上のものを用いることなく、本明細書中で記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが企図される。
【０２２９】
本出願を通して挙げられた全ての非特許文献、特許出願および特許の全内容は、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
（項目１）
内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座にキメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記キメラポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドの細胞外ドメイン、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメイン、およびマウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記マウスは、前記キメラポリペプチドを発現する、
マウス。
（項目２）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座からマウスＨ−２Ｄポリペプチドの機能的な細胞外ドメインを発現しない、項目１に記載のマウス。
（項目３）
前記内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座は、マウスＨ−２Ｄポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインをコードする内在性ヌクレオチド配列を欠く、項目１に記載のマウス。
（項目４）
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウスＨ−２Ｄリーダーヌクレオチド配列を含む、項目１に記載のマウス。
（項目５）
前記ヌクレオチド配列は、内在性マウス調節エレメントに作動可能に連結している、項目１に記載のマウス。
（項目６）
前記キメラポリペプチドは、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを含む、項目１に記載のマウス。
（項目７）
前記ヌクレオチド配列は、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１エクソン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α１−α２イントロン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α２エクソン、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α２−α３イントロン、およびヒトＨＬＡ−Ｂ２７  α３エクソンを含む、項目１に記載のマウス。
（項目８）
内在性β２ミクログロブリン遺伝子座にヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する、項目１から７のいずれか一項に記載のマウス。
（項目９）
前記マウスは、内在性β２ミクログロブリン遺伝子座から機能的な内在性β２ミクログロブリンを発現しない、項目８に記載のマウス。
（項目１０）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性マウスβ２ミクログロブリン調節エレメントに作動可能に連結している、項目９に記載のマウス。
（項目１１）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２〜エクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目８に記載のマウス。
（項目１２）
前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、エクソン３、およびエクソン４に示されるヌクレオチド配列を含む、項目８に記載のマウス。
（項目１３）
内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、２つまたはそれ超のキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドをコードする２つまたはそれ超のヌクレオチド配列を含む非ヒト動物であって、
前記キメラポリペプチドは、ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメイン、非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメイン、および非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞質ドメインを含み、
前記動物は、前記２つまたはそれ超のキメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、
非ヒト動物。
（項目１４）
前記動物は、げっ歯動物である、項目１３に記載の動物。
（項目１５）
前記げっ歯動物は、マウスまたはラットである、項目１４に記載の動物。
（項目１６）
前記げっ歯動物はマウスであり、前記非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、マウスＨ−２Ｄポリペプチド、マウスＨ−２Ｋポリペプチド、またはマウスＨ−２Ｌポリペプチドである、項目１５に記載の動物。
（項目１７）
前記動物は、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現しない、項目１３に記載の非ヒト動物。
（項目１８）
内在性ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座に、キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２Ｋポリペプチドをコードするヌクレオチド配列およびキメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むマウスであって、
前記マウスは、前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ−２ＫおよびＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドを発現する、マウス。
（項目１９）
前記マウスは、機能的な内在性ＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現しない、項目１８に記載のマウス。
（項目２０）
前記キメラＨＬＡ−Ａ２／Ｈ２Ｋポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｋ遺伝子座に位置し、前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座に位置する、項目１８に記載のマウス。
（項目２１）
キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  ＩポリペプチドをコードするキメラＭＨＣ  Ｉ遺伝子座であって、
非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列に作動可能に連結したヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドの細胞外ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列
を含み、キメラヒト／非ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現する、遺伝子座。
（項目２２）
前記ＭＨＣ  Ｉ遺伝子座は、非ヒト動物のゲノム内の内在性ＭＨＣ  Ｉ位に位置する、項目２１に記載の遺伝子座。
（項目２３）
前記ヒトＭＨＣ  Ｉポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ｂ２７である、項目２２に記載の遺伝子座。
（項目２４）
前記非ヒトＭＨＣ  ＩポリペプチドはマウスＨ−２ＫポリペプチドまたはマウスＨ−２Ｄポリペプチドである、項目２１に記載の遺伝子座。
（項目２５）
マウスの内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座を改変して、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現させる方法であって、前記内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む、方法。
（項目２６）
前記マウスは、内在性Ｈ−２Ｄ遺伝子座から、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの前記細胞外ドメインを発現しない、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記マウスは、前記ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドのα１ドメイン、α２ドメイン、およびα３ドメインを発現する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記マウスは、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの膜貫通ドメインおよび前記マウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞質ドメインを発現する、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記置き換えは、単一のＥＳ細胞において行われ、前記単一のＥＳ細胞は、マウス胚に導入されて、マウスを作製する、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
遺伝子改変されたマウスを作製する方法であって、
第１のマウスのＨ−２Ｄ遺伝子座を、キメラヒト／マウスＭＨＣ  Ｉポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性マウスＨ−２Ｄ遺伝子座において、マウスＨ−２Ｄポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒトＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；
第２のマウスのβ２ミクログロブリン遺伝子座を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現するように改変する工程であって、前記内在性マウスβ２ミクログロブリン遺伝子座において、マウスβ２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で置き換える工程を含む工程；ならびに
前記第１のマウスおよび前記第２のマウスを交配して、そのゲノムに、キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、およびヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含む遺伝子改変されたマウスを生成する工程であって、前記遺伝子改変されたマウスは、前記キメラＨＬＡ−Ｂ２７／Ｈ−２Ｄポリペプチドおよび前記ヒトまたはヒト化β２ミクログロブリンポリペプチドを発現する工程
を含む、方法。
（項目３１）
前記第２のヌクレオチド配列は、ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン２、３、および４に示されるヌクレオチド配列およびマウスβ２ミクログロブリン遺伝子のエクソン１に示されるヌクレオチド配列を含む、項目３０に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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