(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オンの製造のための方法であって、前記４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素が、（ａ）３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）、または（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）である、方法。
【請求項２】
前記４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水酵素が、
（ａ）Ｍ．クプリナ（M. cuprina）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号１）、
（ｂ）Ｓ．トコダイイ（S. tokodaii）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号３）、
（ｃ）Ｍ．セヅラ（M. sedula）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号２）、
（ｄ）Ｓ．アシドカルダリウス（S. acidocaldarius）の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（配列番号５）、
（ｅ）Ａ．ホスピタリス（A. hospitalis）の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（配列番号６）、または
（ｆ）Ｂ．ラテロスポルス（B. laterosporus）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号４）
である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を利用することによるアセトアセチルＣｏＡから前記４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アセトアセチルＣｏＡ還元酵素が、
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．１．１．３４）、または
（ｉｉ）短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の方法に従った３−ブテン−２−オンの製造、および（ｂ）３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによる、このように製造された３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オールの製造のための方法。
【請求項７】
前記３−ブテン−２−オン還元酵素が、
（ｉ）カルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）、
（ｉｉ）アルコール脱水素酵素、または
（ｉｉｉ）短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素
である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）請求項６または７に記載の方法に従った３−ブテン−２−オールの製造、および（ｂ）アルケノール脱水酵素の使用により、このように製造された３−ブテン−２−オールを１，３−ブタジエンに酵素的に変換することを含む、１，３−ブタジエンの製造のための方法。
【請求項９】
４−ヒドロキシ−２−ブタノンからの３−ブテン−２−オンの製造のための、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素の使用であって、前記酵素が（ａ）３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）または（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）である、使用。
【請求項１０】
４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換、および３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによる、このように製造された３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オールの製造のための方法であって、前記酵素が（ａ）３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）または（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オンの製造のための方法であって、前記４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素が、（ａ）３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）、（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）、（ｃ）エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１７）、（ｄ）３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５９）、（ｅ）クロトニル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素（ＥＣ４．２．１．５８）、（ｆ）３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６０）、（ｇ）３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６１）、（ｈ）長鎖エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．７４）、または（ｉ）３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１８）である、３−ブテン−２−オンの製造のための方法に関する。製造された３−ブテン−２−オンは、例えば、３−ブテン−２−オールに、最終的に１，３−ブタジエンにさらに変換することができる。
【背景技術】
【０００２】
ブタジエン（１，３−ブタジエン）は、式Ｃ４Ｈ６を有する共役ジエンである。それは、合成ゴムの製造におけるモノマーとして使用される重要な工業用化学物質である。ブタジエンを製造するための種々の可能性がある。ブタジエンは、例えば、エチレンおよび他のオレフィンを製造するために使用される水蒸気分解プロセスの副産物として生成される。このプロセスでは、ブタジエンは、Ｃ４流中に生成し、通常、アセトニトリルなどの極性非プロトン溶媒中への抽出によって他の副産物から単離され、次いでアセトニトリルからストリッピングされる。ブタジエンは、ノルマルブタンの接触脱水素によっても製造することができ、またはエタノールから製造することができる。後者の場合、２つの異なるプロセスが使用されている。単一ステッププロセスでは、エタノールを、金属酸化物触媒上で４００〜４５０℃でブタジエン、水素および水に変換する（Kirshenbaum, I. (1978), Butadiene. In M. Grayson (Ed.), Encyclopedia of Chemical Technology, 3rd ed., Vol. 4, pp. 313-337. New York: John Wiley & Sons）。２ステッププロセスでは、エタノールは、アセトアルデヒドに酸化され、タンタル増強型多孔質シリカ触媒上で３２５〜３５０℃でさらなるエタノールと反応してブタジエンをもたらす（Kirshenbaum, I. (1978)、上記引用文中）。ブタジエンは、ノルマルブテンの接触脱水素によっても製造することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
この２０年間に、遺伝子工学技術は微生物の代謝の改変を可能にし、したがって、さもなければ低収率で製造される鍵物質を製造するためにそれらを使用することが可能になった。天然発生の代謝経路を強化することによって、これらの技術は、工業的関連の多数の化合物を生物学的に製造するための新しい道を開く。現在、動物用飼料のためのアミノ酸、生分解性プラスチックまたは紡織繊維などのいくつかの工業的化合物が、遺伝的に改変された生物を使用して日常的に製造されている。たとえ少量であってもブタジエンを天然に製造するものとして知られている微生物はないので、現在、主要な石油化学系誘導分子、特にブタジエンの大規模な製造のために、遺伝的に改変された微生物を使用したバイオプロセスを提供するための試みがある。世界中で製造される大量のゴムおよび増加する環境的懸念および化学的プロセスを使用して１，３−ブタジエンを製造するための限定された資源を考慮すると、１，３−ブタジエンならびにその前駆体分子であるアセトアセチルＣｏＡ、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−ブテン−２−オールおよび、特に、３−ブテン−２−オンの製造のための、代替の、環境に優しく、かつ持続可能なプロセスを提供することが必要とされている。ＷＯ２０１２／１７４４３９には、ブタノールからブタジエンへの変換を触媒することができる酵素によって、ブタノールからブタジエンを製造するための方法を報告している。さらに、ＷＯ２０１０／１４４７４６には、１，３−オキソブタノールを脱水してブタノンを形成することが可能である３−オキソブタノール脱水酵素をコードする外来性の核酸を有する非天然発生の微生物を報告している。しかしながら、微生物によって１，３−ブタジエンなどの化合物を製造することができるという重要性を考慮すると、再生可能資源からかかる化合物を製造するための代替の経路または機構を同定することが今なお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、この必要性に取り組み、３−ブテン−２−オン（メチルビニルケトンとも称される）を、いくつかの酵素を用いることによって、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから出発して酵素的に製造することができるプロセスを提供する。次いで、３−ブテン−２−オンは、３−ブテン−２−オールに酵素的にさらに変換することができ、次いでこれは１，３−ブタジエンに酵素的にさらに変換することができる。４−ヒドロキシ−２−ブタノンは、アセトアセチルＣｏＡから酵素的に製造することができ、一方アセトアセチルＣｏＡは、本明細書に記載の代謝中間体アセチルコエンザイムＡ（以下でアセチルＣｏＡとも称される）から出発して提供することができる。対応する反応を、図１に模式的に示す。
【０００５】
したがって、本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オンの製造のための方法に関する。この反応において用いることができる４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素は、全てＥ．Ｃ．４．２．１．＿（すなわち、ヒドロリアーゼ）に分類される以下の酵素である。４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素は、以下の反応を触媒する酵素である：
【０００６】
【化１】
0006469665.tif 000002
【０００７】
「脱水」という用語は、一般にＨ２Ｏの除去に関与する反応を指す。
【０００８】
本発明によれば、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素は、以下の酵素（ａ）から（ｉ）からなる群から選択される：
（ａ）３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）、
（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）、
（ｃ）エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１７）、
（ｄ）３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５９）、
（ｅ）クロトニル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素（ＥＣ４．２．１．５８）、
（ｆ）３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６０）、
（ｇ）３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６１）、
（ｈ）長鎖エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．７４）、および
（ｉ）３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１８）。
【０００９】
４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒することが可能であるこれらの全ての酵素は、それらが以下の最小の構造モチーフを有する天然基質を使用するという共通点を有する：
【００１０】
【化２】
0006469665.tif 000003
式中、
Ｒ１は、水素原子またはアルキル基またはＣＨ２ＣＯＯ−であり；
Ｒ２は、水素原子またはメチル基であり；
Ｒ３は、コエンザイムＡまたはアシルキャリアータンパク質である。
【００１１】
したがって、４−ヒドロキシ−２−ブタノンの脱水を触媒することができる上記の酵素は、以下のように２つの群に分類することができる：
Ｉ．上で示した式におけるＲ３が、アシルキャリアータンパク質である
この群は、ＥＣ４．２．１．５８、ＥＣ４．２．１．５９、ＥＣ４．２．１．６０およびＥＣ４．２．１．６１を含む。この群の酵素は、それらが以下の型の反応を触媒するという共通点を有する：
【００１２】
【化３】
0006469665.tif 000004
この群の酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏにおいてＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ０１３１１４（http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR013114）として参照される共通の構造モチーフを共有する。Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素に関する受託番号は、ＰＦ  ０７９７７（http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF07977）である。
ＩＩ．上で示した式におけるＲ３が、コエンザイムＡである
この群は、ＥＣ４．２．１．１１６、ＥＣ４．２．１．５５、ＥＣ４．２．１．１７、ＥＣ４．２．１．７４およびＥＣ４．２．１．１８を含む
この群の酵素は、ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースにおいてＩｎｔｅｒＰｒｏ  ＩＰＲ００１７５３（http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR001753）およびＩＰＲ００１８３７６（http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR018376）として参照される共通の構造モチーフを共有する。Ｐｆａｍデータベースにおけるこれらの酵素に関する受託番号は、ＰＦ００３７８（http://pfam.sanger.ac.uk/family/PF00378）である。
【００１３】
本発明による方法の一実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）の使用によって達成される。３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）は、以下の反応を触媒する：
【００１４】
【化４】
0006469665.tif 000005
【００１５】
この酵素は、様々な細菌および古細菌から既知である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、細菌の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）、好ましくはメタロスファエラ属（Metallosphaera）、スルホロブス属（Sulfolobus）およびブレビバチルス属（Brevibacillus）からなる群から選択される属の細菌または古細菌由来の、最も好ましくはメタロスファエラ・クプリナ（Metallosphaera cuprina）、メタロスファエラ・セヅラ（Metallosphaera sedula）、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）およびブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）からなる群から選択される種由来の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素を使用する。かかる細菌の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素に関する例は、メタロスファエラ・クプリナ（Metallosphaera cuprina）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｆ４ＦＺ８５）、メタロスファエラ・セヅラ（Metallosphaera sedula）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ４ＹＩ８９、Teufel et al., J. Bacteriol. 191 (2009), 4572-4581）、スルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｆ９ＶＮＧ３）およびブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｆ７ＴＴＺ１）由来の酵素である。これらの酵素に関するアミノ酸およびヌクレオチド配列は、入手可能である。対応するアミノ酸配列に関する例を、配列番号１から４において提供し、ここで、配列番号１がＭ．クプリナ（M. cuprina）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素のアミノ酸配列であり、配列番号２がＭ．セヅラ（M. sedula）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素のアミノ酸配列であり、配列番号３がＳ．トコダイイ（S. tokodaii）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素のアミノ酸配列であり、配列番号４がブレビバチルス・ラテロスポルス（Brevibacillus laterosporus）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素のアミノ酸配列である。
【００１６】
好ましい実施形態では、本発明の方法において用いる３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素は、配列番号１から４の任意の１つに示されるアミノ酸配列を有するかまたは配列番号１から４のいずれかと少なくともｘ％相同であるアミノ酸配列を示し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒する活性を有し、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００１７】
添付の実施例に示すように、種々の生物由来の種々の試験した３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素は、基質として４−ヒドロキシ−２−ブタノンを使用し、それを３−ブテン−２−オンに変換することが可能であることが見出された。したがって、原則として任意の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素を本発明による方法において用いることができる。しかしながら、本発明の方法において４−ヒドロキシ−２−ブタノンを３−ブテン−２−オンに変換するために３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素だけでなく、上記の構造的および機能的類似性を示す酵素、すなわち上記の項目（ｂ）から（ｆ）で列挙した酵素も用いることが可能である。
【００１８】
したがって、本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）の使用によって達成される。３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）は、以下の反応を触媒する：
【００１９】
【化５】
0006469665.tif 000006
【００２０】
この反応は、マイケル脱離に相当する。３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素は、リアーゼ、特にヒドロリアーゼのファミリーに属し、これは、炭素−酸素結合を切断する。この酵素クラスの系統名は、（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイルＣｏＡヒドロリアーゼ（クロトノイルＣｏＡ形成）である。他の慣用名は、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルコエンザイムＡ脱水酵素、Ｄ−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素、エノイルコエンザイムＡ加水酵素、および（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイルＣｏＡヒドロリアーゼを含む。この酵素は、ブタン酸代謝に関与する。このクラスに属し、３−ヒドロキシブチリルコエンザイムＡからクロトニル−コエンザイムＡへの上記で示した変換を触媒する酵素は、例えばラット（ドブネズミ（Rattus norvegicus））、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）およびアシディアヌス・ホスピタリス（Acidianus hospitalis）に存在することが報告されている。かかる酵素に関するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、例えばアエロパイラム・ペルニクス（Aeropyrum pernix）に関して決定された。原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）を本発明の文脈で使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、古細菌由来の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素、好ましくはスルホロブス属（Sulfolobus）およびアシディアヌス属（Acidianus）からなる群から選択される属の古細菌由来の、最も好ましくはＳ．アシドカルダリウス（S. acidocaldarius）およびアシディアヌス・ホスピタリス（Acidianus hospitalis）からなる群から選択される種由来の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素を使用する。かかる細菌の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素に関する例は、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ４Ｊ８Ｄ５）由来のおよびアシディアヌス・ホスピタリス（Acidianus hospitalis）（（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｆ４Ｂ９Ｒ３）由来の酵素である。対応するアミノ酸配列に関する例を、配列番号５および６において提供し、ここで、配列番号５がスルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素のアミノ酸配列であり、配列番号６がアシディアヌス・ホスピタリス（Acidianus hospitalis）の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素のアミノ酸配列である。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明の方法において用いる３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素は、配列番号５または６に示されるアミノ酸配列を有するかまたは配列番号５または６と少なくともｘ％相同であるアミノ酸配列を示し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒する活性を有し、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００２２】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１７）の使用によって達成される。エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１７）は、以下の反応を触媒する：
【００２３】
【化６】
0006469665.tif 000007
【００２４】
エノイルＣｏＡ加水酵素は、通常、アシルＣｏＡ上の第２と第３炭素間の二重結合を水和する酵素である。しかしながら、それを使用して、逆方向の反応を触媒することもできる。クロトナーゼとしても既知であるこの酵素は、天然に、脂肪酸を代謝して、アセチルＣｏＡとエネルギーの両方を産生することに関与する。このクラスに属する酵素は、例えば、ラット（ドブネズミ（Rattus norvegicus））、ヒト（ホモ・サピエンス（Homo sapiens））、マウス（ハツカネズミ（Mus musculus））、イノシシ（wild boar）（イノシシ（Sus scrofa））、ウシ（Bos taurus）、大腸菌（E. coli）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）およびクロストリジウム・アミノブチリクム（Clostridium aminobutyricum）に存在することが報告されている。かかる酵素に関するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、例えばラット、ヒトおよび枯草菌（Bacillus subtilis）に関して決定された。原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意のエノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１７）を本発明の文脈で使用することができる。
【００２５】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５９）の使用によって達成される。３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５９）は、以下の反応を触媒する：
【００２６】
【化７】
0006469665.tif 000008
【００２７】
この酵素は、リアーゼ、特にヒドロリアーゼのファミリーに属し、これは、炭素−酸素結合を切断する。この酵素クラスの系統名は、（３Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］ヒドロリアーゼ（オクタ−２−エノイル−［アシルキャリアータンパク質］形成）である。他の慣用名は、Ｄ−３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素、Ｄ−３−ヒドロキシオクタノイル−アシルキャリアータンパク質脱水酵素、βヒドロキシオクタノイル−アシルキャリアータンパク質デヒドラーゼ、βヒドロキシオクタノイルチオエステル脱水酵素、βヒドロキシオクタノイル−ＡＣＰ−デヒドラーゼ、および（３Ｒ）−３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］ヒドロリアーゼを含む。３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素は、例えば、大腸菌（E. coli）（Mizugaki et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 33 (1968), 520-527）に存在することが報告されている。原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意の３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素を本発明の文脈で使用することができる。好ましい実施形態では、大腸菌（E. coli）由来の酵素を、本発明による方法において使用する。
【００２８】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、クロトノイル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素（ＥＣ４．２．１．５８）の使用によって達成される。クロトノイル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素（ＥＣ４．２．１．５８）は、以下の反応を触媒する：
【００２９】
【化８】
0006469665.tif 000009
【００３０】
この酵素は、リアーゼ、特にヒドロリアーゼのファミリーに属し、これは、炭素−酸素結合を切断する。
【００３１】
他の慣用名は、（３Ｒ）−３−ヒドロキシブタノイル−［アシルキャリアータンパク質］ヒドロリアーゼ、βヒドロキシブチリルアシルキャリアータンパク質脱水酵素、βヒドロキシブチリルアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）脱水酵素、βヒドロキシブチリルアシルキャリアータンパク質脱水酵素、エノイルアシルキャリアータンパク質加水酵素、クロトニルアシルキャリアータンパク質加水酵素、３−ヒドロキシブチリルアシルキャリアータンパク質脱水酵素、βヒドロキシブチリルアシルキャリアー、およびタンパク質脱水酵素を含む。この酵素は、脂肪酸生合成に関与する。クロトノイル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素は、例えば、大腸菌（E. coli）およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）に存在することが報告されている。原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意のクロトノイル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素を、本発明の文脈で使用することができる。好ましい実施形態では、大腸菌（E. coli）由来の酵素を、本発明による方法において使用する。
【００３２】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６０）の使用によって達成される。３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６０）は、以下の反応を触媒する：
【００３３】
【化９】
0006469665.tif 000010
【００３４】
この酵素は、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）、トキソプラズマ・ゴンディ（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ピロリ菌（Helicobacter pylori）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、大腸菌（E. coli）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）およびサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）に存在することが報告されている。原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意の３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素を、本発明の文脈で使用することができる。好ましい実施形態では、大腸菌（E. coli）由来の酵素を、本発明による方法において使用する。
【００３５】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６１）の使用によって達成される。３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６１）は、以下の反応を触媒する：
【００３６】
【化１０】
0006469665.tif 000011
【００３７】
この酵素は、リアーゼ、特にヒドロリアーゼのファミリーに属し、これは、炭素−酸素結合を切断する。
【００３８】
他の慣用名は、Ｄ−３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素、βヒドロキシパルミトイル−アシルキャリアータンパク質脱水酵素、βヒドロキシパルミトイルチオエステル脱水酵素、βヒドロキシパルミチル−ＡＣＰ脱水酵素、および（３Ｒ）−３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］ヒドロリアーゼを含む。３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素は、例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、出芽酵母（S. cerevisiae）、分裂酵母（s.pombe）、コクリオボルス・カルボヌム（Cochliobolus carbonum）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、ウシ（Bos taurus）、ニワトリ（Gallus gallus）およびホモ・サピエンス（Homo sapiens）に存在することが報告されている。原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意の３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素を、本発明の文脈で使用することができる。
【００３９】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、長鎖エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．７４）の使用によって達成される。長鎖エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．７４）は、以下の反応を触媒する：
【００４０】
【化１１】
0006469665.tif 000012
【００４１】
この酵素は、リアーゼ、特にヒドロリアーゼのファミリーに属し、これは、炭素−酸素結合を切断する。この酵素クラスの系統名は、長鎖（３Ｓ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡヒドロリアーゼである。この酵素は、長鎖エノイルコエンザイムＡ加水酵素とも称され、それは、ミトコンドリアにおける脂肪酸伸長および脂肪酸代謝に関与する。この酵素は、いくつかの生物、例えば、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（Wu et al., Org. Lett. 10 (2008), 2235-2238）、イノシシ（Sus scrofa）およびモルモット（Cavia porcellus）（Fong and Schulz, J. Biol. Chem. 252 (1977), 542-547; Schulz, Biol. Chem. 249 (1974), 2704-2709）に存在し、原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意の長鎖エノイルＣｏＡ加水酵素を、本発明の方法において用いることができる。
【００４２】
本発明による方法の別の実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換は、３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１８）の使用によって達成される。３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１８）は、以下の反応を触媒する：
【００４３】
【化１２】
0006469665.tif 000013
【００４４】
この酵素は、いくつかの生物、特に細菌、植物および動物に存在する。酵素は、例えば、プチダ菌（Pseudomonas putida）、アシネトバクター属種（Acinetobacter sp.）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ３ＨＷ１２）、ニチニチソウ（Catharanthus roseus）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｑ１３８２５）、ウシ（Bos taurus）およびヒツジ（Ovis aries）に関して報告されており、原則として、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換を触媒することができる任意の３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素を、本発明の方法において用いることができる。「３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素」という用語は、ミキソコッカス・ザンサス（Myxococcus xanthus）由来の、好ましくはＤＫ１６２２株由来の遺伝子ＬｉｕＣ（Li et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52 (2013), p. 1304-1308; Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１Ｄ５Ｙ４）によってコードされる酵素も包含する。この酵素のアミノ酸配列を、配列番号２５に示す。この遺伝子は、３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素として注釈を付けられたが、Li et al.（上記引用文中）は、その天然の基質が３−ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡであることを示した。特に好ましい実施形態では、配列番号２５に示されるアミノ酸または配列番号２５と少なくともｘ％相同であるアミノ酸配列を含み、３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素／３−ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ脱水酵素の活性を有し、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを３−ブテン−２−オンに変換する活性を示す任意のタンパク質を本発明による方法において用いることができ、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００４５】
上記のように、３−ブテン−２−オンに変換される４−ヒドロキシ−２−ブタノンは、アセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換によって提供することができる。したがって、本発明は、上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オンの製造のための方法であって、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を利用することによるアセトアセチルＣｏＡから前記４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換をさらに含む、３−ブテン−２−オンの製造のための方法にも関する。
【００４６】
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を利用することによるアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換は、（１）アセトアセチルＣｏＡからアセトアセトアルデヒドへの酵素的変換および（２）アセトアセトアルデヒドから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへのその後の酵素的変換を含む、２つのステップの変換によって達成することができる。
【００４７】
第１のステップは、以下のスキームに従って起こり得る：
【００４８】
【化１３】
0006469665.tif 000014
【００４９】
第２のステップは、以下のスキームに従って起こり得る：
【００５０】
【化１４】
0006469665.tif 000015
【００５１】
原則として、かかる変換を触媒することができる任意の酵素を用いることができる。対応する酵素に関する例は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．１．１．３４）または短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素である。
【００５２】
したがって、本発明による方法の一実施形態では、アセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの変換は、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．１．１．３４）を用いることによって達成される。この酵素は、通常、以下の反応を触媒する
【００５３】
【化１５】
0006469665.tif 000016
【００５４】
このクラスに属し、上記で示した変換を触媒する酵素は、全ての界の生物、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献において広範に報告されている。かかる酵素に関するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、多数の生物、特に細菌性生物に関して決定された。原則として、アセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの変換を触媒することができる任意のヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．１．１．３４）を、本発明の文脈で使用することができる。
【００５５】
代わりにまたは加えて、アセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの上記の変換は、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素と称される酵素を使用することによっても達成することができる。本発明の文脈における「短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素」または「短鎖脱水素酵素／還元酵素（ＳＤＲ）」という用語は、以下の特色によって特徴付けられる酵素を指す：
１．それらは、脂肪酸アシルＣｏＡが脂肪アルコールに還元される２つのステップの反応を触媒する。
２．それらは、８から２０個の炭素原子の脂肪族鎖を含有するアシルＣｏＡに関する基質特異性を示す。
【００５６】
好ましくはかかる酵素は、それらの一次構造、すなわちアミノ酸配列における特異的なモチーフを示す、すなわち、ＮＡＤＰ（Ｈ）結合に関する２つの特異的なグリシンモチーフを示すという特色によってさらに特徴付けられる。
【００５７】
短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素または短鎖脱水素酵素／還元酵素（ＳＤＲ）は、酵素のファミリーを構成し、その大部分は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ依存性酸化還元酵素であることが既知である（Jornvall H. et al., Biochemistry 34 (1995), 6003-6013）。最近、マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８由来の新規な細菌のＮＡＤＰ依存性還元酵素が特徴付けられた（Willis et al., Biochemistry 50 (2011), 10550-10558）。この酵素は、脂肪酸アシルＣｏＡ基質から対応する脂肪アルコールへの４電子還元を触媒する。
【００５８】
脂肪酸アシルＣｏＡから脂肪アルコールへの酵素的変換は、以下のスキームに従って、アルデヒド中間体を通して起こる：
【００５９】
【化１６】
0006469665.tif 000017
【００６０】
この酵素は、長さが８から２０の炭素にわたる脂肪酸アシルＣｏＡ基質（飽和と不飽和の両方）および脂肪アルデヒド基質に及ぼす活性を示す。特徴的に、このファミリーのタンパク質は、２つのＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）結合モチーフを有し、これらは、保存配列ＧＸＧＸ（１〜２Ｘ）Ｇ（Willis et al., Biochemistry 50 (2011), 10550-10558；Jornvall H. et al., Biochemistry 34 (1995), 6003-6013）を有する。ＧＴＧＦＩＧである第１のパターンは、Ｎ末端付近で同定され、ＧＸＸＸＧＸＧである第２のサイン配列は、残基３８４〜３９０の間に位置する。
【００６１】
原則として、任意の「短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素」または「短鎖脱水素酵素／還元酵素（ＳＤＲ）」を、本発明による方法において適用することができる。
【００６２】
好ましくは、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素は、海洋細菌由来の、好ましくはマリノバクター属（Marinobacter）またはハヘラ属（Hahella）由来の、さらにより好ましくはマリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）種、より好ましくはマリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８、マリノバクター・マンガノキシダンス（Marinobacter manganoxydans）、マリノバクター・アルギコラ（Marinobacter algicola）、マリノバクター属種（Marinobacter sp.）ＥＬＢ１７またはハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素である。かかる酵素の例は、マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ１Ｕ３Ｌ３；Willis et al., Biochemistry 50 (2011), 10550-10558）由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、マリノバクター・マンガノキシダンス（Marinobacter manganoxydans）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｇ６ＹＱＳ９）由来の短鎖脱水素酵素、マリノバクター・アルギコラ（Marinobacter algicola）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ６ＥＵＨ６）由来の短鎖脱水素酵素、マリノバクター属種（Marinobacter sp.）ＥＬＢ１７（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ａ３ＪＣＣ５）由来の短鎖脱水素酵素およびハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ２ＳＣＥ０）由来の短鎖脱水素酵素である。
【００６３】
マリノバクター・アクアエオレイ（Marinobacter aquaeolei）ＶＴ８由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号７に示す。マリノバクター・マンガノキシダンス（Marinobacter manganoxydans）由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号８に示す。マリノバクター属種（Marinobacter sp.）ＥＬＢ１７由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号９に示す。マリノバクター・アルギコラ（Marinobacter algicola）由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号１０に示す。ハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号１１に示す。マリノバクター属種（Marinobacter sp.）Ｂｓｓ２０１４８由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号２０に示す。マリノバクター・アドハエレンス（Marinobacter adhaerens）（ＨＰ１５株）由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号２１に示す。マリノバクター・サントリニエンシス（Marinobacter santoriniensis）ＮＫＳＧ１由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号２２に示す。マリノバクター・リポリティカス（Marinobacter lipolyticus）ＳＭ１９由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号２３に示す。マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）ＡＴＣＣ４９８４０由来の短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の配列を、配列番号２４に示す。特に好ましい実施形態では、配列番号７から１１および配列番号２０から２４の任意の１つに示されるアミノ酸配列または配列番号７から１１および配列番号２０から２４のいずれかに少なくともｘ％相同であるアミノ酸配列を示し、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の活性、すなわち、アセトアセチルＣｏＡを４−ヒドロキシ−２−ブタノンに変換する活性を有する任意のタンパク質を本発明による方法において用いることができ、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００６４】
添付の実施例から明白であるように、種々の生物由来の種々の試験した短鎖脱水素酵素／還元酵素タンパク質が、基質としてアセトアセチルＣｏＡを使用し、それを４−ヒドロキシ−２−ブタノンに変換することが可能であることが見出された。
【００６５】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡが４−ヒドロキシ−２−ブタノンに変換され、次いでこれが３−ブテン−２−オンにさらに変換され、アセトアセチルＣｏＡを酵素的に提供するステップをさらに含む、本明細書で上に記載の方法にも関する。これは、２分子のアセチルＣｏＡから１分子のアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換によって達成することができる。かかる方法は、例えば、ＷＯ２０１３／０５７１９４に既に報告されている。したがって、本発明によれば、アセチルＣｏＡは、例えば、以下の反応によって、アセトアセチルＣｏＡに変換することができる：
【００６６】
【化１７】
0006469665.tif 000018
【００６７】
この反応は、ＥＣ２．３．１．９に分類されるアセチルＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼと称される酵素によって触媒される。このクラスに属し、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡおよびＣｏＡへの上記で示した変換を触媒する酵素は、全ての界の生物、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献において広範に報告されている。かかる酵素に関するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、ほんの数例を挙げれば、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）およびカンジダ属（Candida）などの、いろいろな生物に関して決定された。原則として、任意のアセチルＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を、本発明の文脈で使用することができる。
【００６８】
代わりに、アセトアセチルＣｏＡの提供を、以下の反応によって、アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換によっても達成することができる。
アセチルＣｏＡ＋マロニルＣｏＡ→アセトアセチルＣｏＡ＋ＣｏＡ＋ＣＯ２
【００６９】
この反応は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）と称される酵素によって触媒される。この酵素をコードする遺伝子は、土壌単離されたグラム陽性ストレプトマイセス属種（Streptomyces sp.）ＣＬ１９０株におけるテルペノイド製造に関するメバロン酸経路遺伝子クラスターにおいて同定された（Okamura et al., PNAS USA 107 (2010), 11265-11270, 2010）。さらに、アセトアセチルＣｏＡ製造のためにこの酵素を使用する生合成経路が、大腸菌（E. coli）において最近開発された（Matsumoto K et al., Biosci. Biotechnol. Biochem, 75 (2011), 364-366）。
【００７０】
したがって、好ましい実施形態では、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換をさらに含む本発明の方法では、アセチルＣｏＡから前記アセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換は、アセチルＣｏＡがアセトアセチルＣｏＡに直接的に変換される単一の酵素反応からなる。好ましくは、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換は、上記のアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を利用することによって達成される。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換をさらに含む本発明の方法では、アセチルＣｏＡから前記アセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換は、
（ｉ）アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡに酵素的に変換するステップ；および
（ｉｉ）マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに酵素的に変換するステップ
の２つの酵素的ステップを含む。
【００７２】
好ましくは、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへの酵素的変換は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）の使用によって達成される。この酵素は、以下の反応を触媒する：
アセチルＣｏＡ＋ＡＴＰ＋ＣＯ２→マロニルＣｏＡ＋ＡＤＰ
【００７３】
好ましくは、マロニルＣｏＡおよびアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）の使用によって達成される。
【００７４】
原則として、任意のアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）および／またはアセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）を、本発明による方法において適用することができる。
【００７５】
本明細書に記載の任意の方法に従って製造された３−ブテン−２−オンを、３−ブテン−２−オールにさらに変換することができ、これはそれ自体、以下にさらに記載する１，３−ブタジエンの製造に関する基質として役立ち得る。したがって、上記の本発明による方法は、３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによる、製造された３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換のステップをさらに含むことができる。３−ブテン−２−オン還元酵素として働くことができる酵素は、例えば、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、特に海洋細菌由来のものなどの、ＥＣ１．１．１に分類される酵素またはそれらの特徴によりＥＣ．１．１．１に分類することができる酵素である。
【００７６】
原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる、ＥＣ１．１．１に分類される任意の可能な酵素を、本発明による方法において用いることができる。好ましい酵素の例は、ＥＣ１．１．１．１に分類されるアルコール脱水素酵素、ＥＣ１．１．１．２に分類されるアルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋）およびＥＣ１．１．１．５４に分類されるアリルアルコール脱水素酵素、ならびにカルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）などのアルコール脱水素酵素である。
【００７７】
アルコール脱水素酵素は、多くの生物に存在し、アルコールとアルデヒドまたはケトン間の相互変換を促進する脱水素酵素の一群である酵素である。好ましい一実施形態では、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する３−ブテン−２−オン還元酵素は、アルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１）である。原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる、ＥＣ１．１．１．１に分類される任意のアルコール脱水素酵素を本発明による方法において用いることができる。アルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１）は、多くの生物に存在し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元（ＮＡＤ＋からＮＡＤＨ）でアルコールとアルデヒドまたはケトン間の相互変換を促進する脱水素酵素の一群である。ヒトおよび多くの他の動物では、それらは、さもなければ有毒であるアルコールを分解するのに役立ち、それらはまた様々な代謝物の生合成中の有用なアルデヒド、ケトン、またはアルコール基の生成に関与する。酵母、植物、および多くの細菌では、いくつかのアルコール脱水素酵素は、発酵の一部として逆の反応を触媒して、ＮＡＤ＋の一定の供給を保証する。このクラスに属し、上記で示した変換を触媒する酵素は、全ての界の生物、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献において広範に報告されている。例えば、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、ハツカネズミ（Mus musculus）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、ロドバクター・ルバー（Rhodobacter ruber）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、およびセイヨウアブラナ（Brassica napus）由来の酵素が、同定され、特徴付けられた。かかる酵素に関するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、多数の生物、特に細菌性生物に関して決定された。原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる任意のアルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１）を、本発明の文脈で使用することができる。実に、実施例において例証するように、種々の生物由来の種々の試験したアルコール脱水素酵素が、基質として３−ブテン−２−オンを使用し、それを３−ブテン−２−オールに変換することが可能であることが見出された。
【００７８】
別の実施形態では、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する３−ブテン−２−オン還元酵素は、アルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ１．１．１．２）である。原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる、ＥＣ１．１．１．２に分類される任意のアルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋）を、本発明による方法において用いることができる。
【００７９】
アルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ１．１．１．２）は、多くの生物に存在し、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元（ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）でアルコールとアルデヒドまたはケトン間の相互変換を促進する脱水素酵素の一群である。このクラスに属し、上記で示した変換を触媒する酵素は、全ての界の生物、すなわち植物、動物、真菌、細菌などに存在し、文献において広範に報告されている。例えば、ウシ（Bos taurus）、ハツカネズミ（Mus musculus）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、およびキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来の酵素が、同定され、特徴付けられた。かかる酵素に関するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、多数の生物に関して決定された。原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる任意のアルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋）（ＥＣ１．１．１．２）を、本発明の文脈で使用することができる。実施例に示すように、アルコール脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋）が、基質として３−ブテン−２−オンを使用し、それを３−ブテン−２−オールに変換することが可能であることが見出された。
【００８０】
好ましい実施形態では、本発明による方法において用いるアルコール脱水素酵素は、細菌起源のものである。より好ましくは、それは、ロドコッカス属（Rhodococcus）、サーモアナエロビウム属（Thermoanaerobium）またはラクトバチルス属（Lactobacillus）の細菌由来の、さらにより好ましくは、ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）種、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii）種、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）種またはラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）種由来のアルコール脱水素酵素である。
【００８１】
特に好ましい実施形態では、アルコール脱水素酵素は、ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８ＫＬＴ９；Karabec et al., Chem. Commun. 46 (2010), 6314-6316）由来の第２級アルコール脱水素酵素、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）（サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii））（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１４９４１；Keinan et al., J. Am. Chem. Soc. 108 (1986), 162-169）由来のアルコール脱水素酵素、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８４ＥＸ５；Schlieben et al., J. Mol. Biol. 349 (2005), 801-813）由来のＲ特異的アルコール脱水素酵素、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ５ＡＸＮ９；Chen et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 160 (2010), 19-29）由来のＮＡＤＨ依存性（Ｓ）特異的アルコール脱水素酵素またはラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ２Ｄ０Ｈ５）由来のＮＡＤＨ依存性（Ｓ）特異的アルコール脱水素酵素である。
【００８２】
ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＷＶＰ７；Bradshaw et al., J. Org. Chem. 57 (1992), 1532-1536）由来のＮＡＤＰＨ依存性Ｒ特異的アルコール脱水素酵素も好ましい。
【００８３】
上記の酵素に関するアミノ酸およびヌクレオチド配列は、入手可能である。対応するアミノ酸配列に関する例を、配列番号１２から１７において提供し、ここで、配列番号１２がロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）由来の第２級アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１３がサーモアナエロバクター・ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）（サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii））（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ１４９４１）由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１４がラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ８４ＥＸ５）由来のＲ特異的アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１５がラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ５ＡＸＮ９）由来のＮＡＤＨ依存性（Ｓ）特異的アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列であり、配列番号１６がラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ２Ｄ０Ｈ５）由来のＮＡＤＨ依存性（Ｓ）特異的アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号１７は、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ６ＷＶＰ７）由来のＮＡＤＰＨ依存性Ｒ特異的アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列である。
【００８５】
特に好ましい実施形態では、配列番号１２から１７の任意の１つに示されるアミノ酸配列または配列番号１２から１７のいずれかに少なくともｘ％相同であるアミノ酸配列を示し、３−ブテン−２−オンを３−ブテン−２−オールに変換する活性を有する任意のタンパク質を本発明による方法において用いることができ、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換は、アリルアルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．５４）を用いることによって達成される。アリルアルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．５４）は、以下の反応を触媒する：
【００８７】
【化１８】
0006469665.tif 000019
【００８８】
原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる、ＥＣ１．１．１．５４に分類される任意のアリルアルコール脱水素酵素を、本発明による方法において用いることができる。この酵素は、酸化還元酵素のファミリー、特にアクセプターとしてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を有するドナーのＣＨ−ＯＨ基に作用するものに属する。この酵素クラスの系統名は、アリルアルコール：ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素としばしば称される。このクラスに属し、上記で示した変換を触媒する酵素は、様々な生物に存在することが報告され、文献において報告されている。例えば、プチダ菌（Pseudomonas putida）および大腸菌（Escherichia coli）由来の酵素が、同定され、特徴付けられた。原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒することができる任意のアリルアルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．５４）を、本発明の文脈で使用することができる。
【００８９】
別の好ましい実施形態では、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する３−ブテン−２−オン還元酵素は、カルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）である。
【００９０】
カルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）は、以下の反応を触媒する：
【００９１】
【化１９】
0006469665.tif 000020
【００９２】
この酵素は、酸化還元酵素のファミリー、特にアクセプターとしてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を有するドナーのＣＨ−ＯＨ基に作用するものに属する。この酵素クラスの系統名は、第２級アルコール：ＮＡＤＰ＋酸化還元酵素である。他の慣用名は、アルデヒド還元酵素１、プロスタグランジン９−ケト還元酵素、生体異物ケトン還元酵素、ＮＡＤＰＨ依存性カルボニル還元酵素、ＡＬＲ３、カルボニル還元酵素、非特異的ＮＡＤＰＨ依存性カルボニル還元酵素、アルデヒド還元酵素１、およびカルボニル還元酵素（ＮＡＤＰＨ）を含む。この酵素は、アラキドン酸代謝に関与し、ＮＡＤＰＨ依存性様式でＮＯを分解する手段としてＳ−ニトロソグルタチオンを異化することが示された。このクラスに属し、上記で示した変換を触媒する酵素は、多くの生物に存在することが報告され、文献において広範に報告されている。例えば、ドブネズミ（Rattus norvegicus）、ホモ・サピエンス（Homo sapiens）、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）およびカンジダ・マグノリアエ（Candida magnoliae）由来の酵素が、同定され、特徴付けられた。原則として、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒することができる任意のカルボニル還元酵素を、本発明の文脈で使用することができる。添付の実施例から明白であるように、カルボニル還元酵素が、補助因子としてのＮＡＤＰＨの存在下で３−ブテン−２−オンへの還元活性を示すことが見出された。
【００９３】
好ましい実施形態では、本発明による方法において用いるカルボニル還元酵素は、哺乳類由来、好ましくはげっ歯類由来、さらにより好ましくはクマネズミ（Rattus）属のげっ歯類由来、最も好ましくはドブネズミ（Rattus norvegicus）由来である。かかる酵素に関する例は、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ２ＧＶ７２；Okamoto et al., IUBMB Life 48 (1999), 543-547）由来のカルボニル還元酵素である。カルボニル還元酵素に関するアミノ酸およびヌクレオチド配列は、入手可能である。配列番号１８は、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ２ＧＶ７２）由来のカルボニル還元酵素のアミノ酸配列である。
【００９４】
特に好ましい実施形態では、配列番号１８に示されるアミノ酸配列または配列番号１８のいずれかに少なくともｘ％相同であるアミノ酸配列を示し、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換を触媒する活性を有する任意のタンパク質を本発明による方法において用いることができ、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【００９５】
代わりに、別の態様では、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する３−ブテン−２−オン還元酵素は、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素とすることができる。これらの酵素、すなわち、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素、特に海洋細菌由来の脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素は、上に既に記載し、特に好ましい実施形態に関して、上に説明したものと同じものがここにもあてはまる。
【００９６】
実施例では、短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素を３−ブテン−２−オンを３−ブテン−２−オールに変換するために用いることができることが示される。本発明による方法の好ましい実施形態では、細菌から、好ましくは海洋細菌から、好ましくはマリノバクター属（Marinobacter）またはハヘラ属（Hahella）から、最も好ましくはハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）種から生じる酵素を用いる。特に好ましい実施形態では、用いる酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ２ＳＣＥＯに示されるアミノ酸配列を示すものである。
【００９７】
本明細書で上に記載の方法によって製造された３−ブテン−２−オールは、特に酵素的変換を経由して、すなわちアルケノール脱水酵素を利用することによって、１，３−ブタジエンにさらに変換することができる。したがって、本発明は、１，３−ブタジエンの製造のための方法であって、
（ａ）本明細書で上に記載の本発明の方法に従って３−ブテン−２−オールを製造するステップ、および
（ｂ）このように製造された３−ブテン−２−オールを１，３−ブタジエンに酵素的に変換するステップ
を含む、１，３−ブタジエンの製造のための方法にも関する。
【００９８】
３−ブテン−２−オールを１，３−ブタジエンに変換することが可能である酵素は、本文脈においてアルケノール脱水酵素と称される。
【００９９】
本発明による方法において用いるアルケノール脱水酵素の例は、「リナロール脱水酵素−異性化酵素」と命名され、カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）（以前はアルカリゲネス・デフラグランス（Alcaligenes defragrans））６５Ｐｈｅｎ株において同定された酵素である（Brodkorb et al., J. Biol. Chem. 285 (2010), 30436-30442）。リナロール脱水酵素−異性化酵素は、モノテルペンの嫌気性分解に関与する二元機能酵素である。天然酵素は、１６０ｋＤａの分子量を有することが見出され、４０ｋＤａのサブユニットのホモ四量体であると想定されている。この酵素は、熱力学的推進力に依存してｉｎ  ｖｉｔｒｏで２つの反応を両方向に触媒する。一方では、酵素は、第１級アリルアルコールであるゲラニオールから、第３級アリルアルコールモチーフを有するその立体異性体リナロールへの異性化を触媒する。他方では、酵素は、第３級アルコールであるリナロールから、共役ジエンモチーフを有する分子である対応する非環式モノテルペンβミルセンへの水の脱離（脱水）を触媒する。カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）では、タンパク質は、膜を通しての輸送の後に切断される周辺細胞質位置に関するシグナルペプチドを有する前駆体タンパク質として発現される。酵素は、ＥＣ４．２．１．１２７に分類される。リナロール脱水酵素−異性化酵素は、嫌気性条件下で以下の反応を触媒する能力を有する：
リナロール  ＜＝＞  ミルセン＋Ｈ２Ｏ
【０１００】
この活性は、例えば、Brodkorb et al.（上記引用文中）に報告されているアッセイで測定することができる。かかるアッセイでは、バイアルを３５℃で予熱し、無酸素性タンパク質溶液をバイアル中に移し、ＤＴＴを２ｍＭまで加える。反応混合物をブチルセプタムで密封し、ヘッドスペースをＣＯ２／Ｎ２（１０／９０（ｖ／ｖ））でフラッシュする。反応を、異なる濃度のリナロールを加えることによって開始し、３５℃でインキュベートする。リナロールからミルセンへの変換は、例えばガスクロマトグラフィーにより、ミルセンの生成を調査することによって評価する。
【０１０１】
好ましい実施形態では、リナロール脱水酵素−異性化酵素は、嫌気性条件下でゲラニオールからリナロールへの異性化を触媒する可能性も有する：
ゲラニオール＜＝＞リナロール
【０１０２】
この活性は、例えば、Brodkorb et al.（上記引用文中）に報告されているアッセイで測定することができる。かかるアッセイでは、バイアルを３５℃で予熱し、無酸素性タンパク質溶液をバイアル中に移し、ＤＴＴを２ｍＭまで加える。反応混合物をブチルセプタムで密封し、ヘッドスペースをＣＯ２／Ｎ２（１０／９０（ｖ／ｖ））でフラッシュする。反応を、異なる濃度のゲラニオールを加えることによって開始し、３５℃でインキュベートする。ゲラニオールからリナロールへの変換は、例えばガスクロマトグラフィーにより、ミルセンの生成、すなわち酵素によって触媒される第２の反応の生成物を調査することによって評価する。
【０１０３】
ゲラニオール、リナロールおよびミルセンは、それぞれ、アリルアルコールおよび炭化水素のクラスに属する、植物によって産生される非環式Ｃ１０−テルペノイドである。Luddecke and Harder (Z. Naturforsch. 66c (2011), 409-412)は、リナロール脱水酵素−異性化酵素の高い基質特異性に関して報告した。リナロール脱水酵素−異性化酵素がブタ−３−エン−２−オールに作用し、それをブタジエンに変換することができることが示された。
【０１０４】
本発明による方法において用いることができる一連のアルケノール脱水酵素の例を、配列番号１９において提供する。アルケノール脱水酵素に関する配列は、受託番号Ｅ１ＸＵＪ２の下でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬデータベースにおいても入手することができる。これらの配列は、リナロール脱水酵素−異性化酵素に分類されるアルケノール脱水酵素を表す。好ましい実施形態では、本発明による方法は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列または配列番号１９と少なくともｘ％同一である配列を含み、３−ブテン−２−オールから１，３−ブタジエンへの変換を触媒することができるアルケノール脱水酵素を利用し、ここで、ｘは、３０と１００の間の整数、好ましくは３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９である。
【０１０５】
したがって、本発明において使用する「アルケノール脱水酵素」という用語は、特に、配列番号１９との上記の程度の配列同一性を示し、３−ブテン−２−オールから１，３−ブタジエンへの変換を触媒することができる酵素を指す。配列番号１９の配列または対応するコードヌクレオチド配列を使用することによって、当業者は、上記の変換を触媒することができるさらなるアルケノール脱水酵素を同定することが可能である。
【０１０６】
最後に、本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換および３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによる３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オールの製造のための方法にも関する。４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素は、本明細書で上に記載の特異的な酵素に特に限定されず、この変換を触媒することができる任意の可能な酵素とすることができる。好ましい実施形態では、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素は、上記の酵素である。さらに、３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによって３−ブテン−２−オンを３−ブテン−２−オールに変換する酵素は、特異的な酵素に特に限定されず、好ましい実施形態では、本発明の第４の態様の文脈における上記の酵素とすることができる。
【０１０７】
アミノ酸またはヌクレオチド配列に関して「相同性」を参照する場合、配列同一性が好ましくは参照される。配列同一性の程度は、好ましくはＣＬＵＳＴＡＬなどの適したコンピューターアルゴリズムを使用して、当技術分野でよく知られている方法に従って決定することができる。
【０１０８】
Ｃｌｕｓｔａｌ分析方法を使用して、特定の配列が参照配列と、例えば、少なくとも６０％同一であるかどうかを決定する場合、デフォルト設定を使用することができるまたは設定は、好ましくは以下の通りである：アミノ酸配列の比較に関して、マトリックス：ｂｌｏｓｕｍ３０；オープンギャップペナルティ：１０．０；延長ギャップペナルティ：０．０５；遅延発散：４０；ギャップ分離距離：８。ヌクレオチド配列比較に関して、延長ギャップペナルティは、好ましくは５．０に設定する。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＣｌｕｓｔａｌＷ２をアミノ酸配列の比較に使用する。対比較／アラインメントの場合、以下の設定を好ましくは選択する：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．１。多重比較／アラインメントの場合、以下の設定を好ましくは選択する：タンパク質重量マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ伸長：０．２；ギャップ距離：５；エンドギャップなし。
【０１１０】
好ましくは、同一性の程度は、配列の完全な長さにわたって計算する。比較される配列が同じ長さを有さない場合、同一性の程度は、より長い配列における残基と同一であるより短い配列における残基の百分率を指すかまたはより短い配列における残基と同一であるより長い配列における残基の百分率を指す。好ましくは、それは、より長い配列における残基と同一であるより短い配列における残基の百分率を指す。
【０１１１】
本発明による方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで行うことができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応は、細胞を用いない反応、すなわち無細胞反応であることが理解される。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏは、好ましくは無細胞系においてを意味する。「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、一実施形態では、単離された酵素（または要求される可能性がある補助因子を任意選択で含む酵素系）の存在下を意味する。一実施形態では、方法において用いる酵素は、精製された形で使用する。
【０１１２】
方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うために、反応に関する基質および酵素を、酵素が活性であり、酵素的変換が起こるのを可能にする条件（緩衝液、温度、補助基質、補助因子など）下でインキュベートする。反応を、それぞれの生成物を生成するのに十分な時間、進行させる。それぞれの生成物の生成は、おそらく質量分析検出に連結したガスクロマトグラフィーなどの、当技術分野で既知の方法によって決定することができる。
【０１１３】
酵素は、酵素反応が起こることを可能にする任意の適した形態とすることができる。それらは、精製または部分精製することができるか、または粗細胞抽出物もしくは部分精製された抽出物の形態とすることができる。酵素を適したキャリアーに固定化することも可能である。好ましい実施形態では、本発明によるかかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応において用いる酵素の少なくとも１つは、非天然発生の酵素、例えば、それ自体天然に起こらない酵素の変異体である。かかる変異体は、例えば、特に、分子生物学的方法によって調製された突然変異体を含み、これらは、より高い酵素活性、より高い基質特異性、より高い温度耐性などの改善された特性を示す。
【０１１４】
本発明による方法の一実施形態では、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法において使用する基質は、上記の酵素の使用によって３−ブテン−２−オンに変換される４−ヒドロキシ−２−ブタノンである。別の実施形態では、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法において使用する基質は、上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンに最初に変換され、次いで上記の３−ブテン−２−オンにさらに変換されるアセトアセチルＣｏＡである。別の実施形態では、かかるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法において使用する基質は、上記のアセトアセチルＣｏＡに最初に変換され、次いで上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンに変換され、次いで上記の３−ブテン−２−オンにさらに変換されるアセチルＣｏＡである。
【０１１５】
本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ワンポット反応で行うことができる、すなわち基質を、それぞれ、３−ブテン−２−オン、３−ブテン−２−オールまたは１，３−ブタジエンへの変換に必要な上記の酵素と１つの反応混合物中で組み合わせ、反応をそれぞれの生成物を生成するのに十分な時間、進行させておく。代わりに、方法は、１つまたは複数の酵素的ステップを連続的に実施することによって、すなわち、最初に基質を１つまたは複数の酵素と混合し、中間体まで反応を進行させ、次いで１つまたは複数のさらなる酵素を加えて、この中間体をさらに中間体またはブタジエンに変換することによって行うこともできる。
【０１１６】
本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、生成物、好ましくは反応から脱気する気体の生成物、特に１，３−ブタジエンを回収するステップ、すなわち培養物から生成物を、または気体の生成物の場合、例えば、培養物から脱気する生成物を回収するステップをさらに含むことができる。したがって、一実施形態では、方法は、ブタジエンなどの気体の生成物を気体の形態で反応中に回収するためのシステムの存在下で行う。
【０１１７】
実際に、１，３−ブタジエンは、室温および大気圧で気体状態をとる。したがって、本発明による方法は、工業規模で行う場合、常に非常に高価であるステップである、反応混合物からの生成物の抽出を必ずしも必要としない。ブタジエンの排出および保管ならびに他の気体物質からのその可能性のあるその後の物理的分離およびその化学的変換は、当業者に既知の任意の方法に従って行うことができる。例えば、ブタジエンは、低温でのＣＯ２の濃縮によりＣＯ２から分離することができる。ＣＯ２は、極性溶媒、例えばエタノールアミンによって除去することもできる。さらに、それを疎水性膜上での吸着によって単離することができる。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明による方法は、本発明の方法の１つに従って３−ブテン−２−オンを製造するために必要である上記の酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物の存在下での培養で行う。さらに、別の実施形態では、本発明による方法は、本発明の方法の１つに従って３−ブテン−２−オールを製造するために必要である上記の酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物の存在下での培養で行う。さらに、別の実施形態では、本発明による方法は、本発明の方法の１つに従って１，３−ブタジエンを製造するために必要である上記の酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物の存在下での培養で行う。
【０１１９】
したがって、本発明のかかる実施形態では、上記の説明で特定した酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物を使用する。１つまたは複数の必要な酵素を天然に産生する（微）生物を使用すること、およびかかる（微）生物をそれが天然に発現しない酵素も発現するように遺伝的に改変することが可能である。
【０１２０】
必要な酵素活性の１つを天然に発現する（微）生物を使用する場合、この活性が（微）生物において過剰発現するようにかかる（微）生物を改変することが可能である。これは、例えば、対応する遺伝子のプロモーター領域に、その遺伝子のより高い発現を保証するプロモーターをもたらすように突然変異を引き起こすことによって達成することができる。代わりに、より高い活性を示す酵素をもたらすように、そのような遺伝子を突然変異させることも可能である。
【０１２１】
上記の酵素的変換を達成するために必要である酵素を発現する（微）生物を使用することによって、酵素を分離または精製する必要なしに、本発明による方法を培地において直接的に行うことが可能である。
【０１２２】
一実施形態では、本発明による方法において用いる生物は、１つまたは複数の上記の酵素をコードする１つまたは複数の外来性の核酸分子を含有するように遺伝的に改変された生物、好ましくは微生物である。この文脈における「外来性の」という用語は、その核酸分子が前記生物／微生物に天然に存在しないことを意味する。これは、それが生物／微生物に同じ構造でまたは同じ位置に存在しないことを意味する。好ましい一実施形態では、外来性の核酸分子は、プロモーターおよびそれぞれの酵素をコードするコード配列を含む組換え分子であり、ここで、コード配列のプロモーターが駆動する発現は、コード配列に関して異種性である。この文脈における異種性は、プロモーターが、前記コード配列の発現を天然に駆動するプロモーターではなく、異なるコード配列の発現を天然に駆動するプロモーターである、すなわち、それは、別の遺伝子由来である、または合成プロモーターもしくはキメラプロモーターであることを意味する。好ましくは、プロモーターは、生物／微生物に異種性であるプロモーター、すなわちそれぞれの生物／微生物に天然に存在しないプロモーターである。さらにより好ましくは、プロモーターは、誘導性プロモーターである。生物、特に微生物の種々の型における発現を駆動するためのプロモーターは、当業者によく知られている。
【０１２３】
さらなる実施形態では、核酸分子は、コードされる酵素が生物／微生物に内在性ではない、すなわちそれが遺伝的に改変されていない場合、生物／微生物によって天然に発現されないという点で、生物／微生物に外来性である。言い換えると、コードされる酵素は、生物／微生物に関して異種性である。外来性の核酸分子は、染色体外の形態で、例えばプラスミドとして、または染色体に安定に組み込まれて生物／微生物に存在することができる。安定な組込みが好ましい。したがって、遺伝的改変は、例えば、酵素をコードする対応する遺伝子を染色体中に組み込むこと、またはプロモーターおよびコード配列が好ましくは種々の生物から生じる、酵素コード配列の上流にあるプロモーターを含有するプラスミドから酵素を発現させること、または当業者に既知である任意の他の方法にあり得る。
【０１２４】
遺伝的に改変された生物は、天然に存在しない、すなわち、天然に見出すことができない、外来性の核酸分子の導入により天然発生の生物とは実質的に異なる生物である。かかる非天然発生の生物を、ｉｎ  ｖｉｖｏで行う本発明による方法において好ましくは用いる。
【０１２５】
本発明において使用する生物は、原核生物または真核生物とすることができ、好ましくは、それらは、細菌、酵母、真菌またはカビなどの微生物、または植物細胞もしくは動物細胞である。特定の実施形態では、微生物は、細菌であり、好ましくは大腸菌（Escherichia）属またはバチルス（Bacillus）属の、さらにより好ましくは大腸菌（Escherichia coli）種または枯草菌（Bacillus subtilis）種の細菌である。
【０１２６】
サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）などの好極限性細菌、またはクロストリジウム（Clostridiae）科の嫌気性細菌を用いることも可能である。
【０１２７】
一実施形態では、微生物は、真菌、より好ましくは酵母菌（Saccharomyces）属、分裂酵母（Schizosaccharomyces）属、コウジカビ（Aspergillus）属、トリコデルマ（Trichoderma）属、ピキア（Pichia）属またはクルイベロミセス（Kluyveromyces）属の、さらにより好ましくは出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）種、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）種、クロコウジカビ（Aspergillus niger）種、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）種、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）種の、またはクルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）種の真菌である。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明による方法は、上記の酵素的変換を達成するために必要である酵素を少なくとも発現する光合成微生物を利用する。好ましくは、微生物は、光合成細菌、または微細藻類である。さらなる実施形態では、微生物は、藻類、より好ましくはけい藻類に属する藻類である。
【０１２９】
別の実施形態では、いわゆるウッド−リュングデール経路を経由してＣＯ（またはＣＯ２＋Ｈ２）を変換してアセチルＣｏＡを製造することが可能である、酢酸を産生する細菌の群に属する微生物を使用することが可能である（Kopke et al.; PNAS 10 (2010), 13087-13092）。かかる微生物を使用する発酵プロセスは、合成ガス発酵として既知である。Ｃ．リュングデール（C. ljungdahlii）、Ｃ．アセチクム（C. aceticum）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Acetobacterium woodii）、Ｃ．オートエタノゲナム（C. autoethanogenum）、およびＣ．カルボキシデビロン（C. carboxydeviron）などの絶対的好中温嫌気性菌が、合成ガス発酵においてしばしば使用されている（Munasingheet et al.; Bioresource Technology 101 (2010), 5013-5022）。
【０１３０】
本発明による方法では、種々の（微）生物が上記の種々の酵素を発現する、（微）生物の組合せを使用することも考えられる。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明による方法は、上記の酵素的変換を達成するために必要である酵素の少なくとも１つを発現する多細胞生物を利用する。かかる生物に関する例は、植物または動物である。
【０１３２】
特定の実施形態では、本発明による方法は、標準的な培養条件（細菌の好気性増殖を可能にする発酵槽において、１ａｔｍで３０〜３７℃）または非標準的な条件（例えば、好熱性生物の培養条件に相当するより高い温度）で微生物を培養することに関与する。
【０１３３】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、微好気性条件下で行う。これは、注入する空気の量を、ブタジエンを含有する気体状排出物中の残留酸素濃度を最小化するように制限していることを意味する。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明による方法は、培養物から、または反応から脱気する１，３−ブタジエンのような気体の生成物の場合、培養物排ガスから生成物を回収するステップをさらに含む。したがって、好ましい実施形態では、方法は、生成物、例えば、１，３−ブタジエンなどの気体の生成物を、気体の形態で反応中に回収するためのシステムの存在下で行う。
【０１３５】
実際に、１，３−ブタジエンは、室温および大気圧で気体状態をとる。したがって、本発明による方法は、工業規模で行う場合、常に非常に高価であるステップである、液体培地からのブタジエンの抽出を必ずしも必要としない。ブタジエンの排出および保管ならびにその可能性のあるその後の物理的分離および化学的変換は、当業者に既知であり、上で記載した任意の方法に従って行うことができる。
【０１３６】
特定の実施形態では、方法は、気相中に存在している、ブタジエンなどの気体の生成物を検出することも含む。空気または別の気体の環境における、例えば、ブタジエンの存在は、たとえ少量であっても、様々な技法を使用することによって、特に赤外または水素炎イオン化検出を有するガスクロマトグラフィーシステムを使用することによって、または質量分析法と連結することによって、検出することができる。
【０１３７】
本発明による方法を、それぞれの酵素活性を提供する生物／微生物を使用することによってｉｎ  ｖｉｖｏで行う場合、生物、好ましくは微生物を、酵素反応の発生を可能にする適した培養条件下で培養する。特定の培養条件は、用いる特定の生物／微生物に依存するが、当業者によく知られている。培養条件は、それらがそれぞれの反応に関する酵素をコードする遺伝子の発現を可能にするように、一般的に選択される。化学誘導物質または温度シフトによる遺伝子発現の誘導などの、培養の特定の段階での特定の遺伝子の発現を改善および微調整するための多様な方法が当業者に既知である。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明の方法は、（細胞）培養物の形態で、好ましくは液体細胞培養物の形態でそれぞれの酵素活性または活性を有する生物、好ましくは微生物を提供するステップ、それぞれの酵素の発現を可能にする適した条件下で発酵槽（バイオリアクターともしばしば称される）において生物、好ましくは微生物を培養するその後のステップを含み、本明細書で上に記載の本発明の方法の酵素的変換を達成するステップをさらに含む。適した発酵槽またはバイオリアクターデバイスおよび発酵条件は、当業者に既知である。バイオリアクターまたは発酵槽は、生物学的に活性な環境を支持する当技術分野で既知の任意の製作されたまたは設計されたデバイスまたはシステムを指す。したがって、バイオリアクターまたは発酵槽は、生物、好ましくは微生物および／または生化学的に活性な物質、すなわち、かかる生物または上記の酵素を保有する生物由来の上記の酵素に関与する、本発明の方法のような化学的／生化学的プロセスが行われる容器とすることができる。バイオリアクターまたは発酵槽において、このプロセスは、好気性または嫌気性のいずれかであってよい。これらのバイオリアクターは、通例円柱状であり、サイズがリットルから立方メートルにわたることができ、しばしばステンレススチールでできている。この点で、理論に縛られることなく、発酵槽またはバイオリアクターは、全て当技術分野で一般的に既知である、例えば、バッチ培養、フィードバッチ培養、灌流培養またはケモスタット培養で生物、好ましくは微生物を培養するのに適した様式で設計されていてよい。
【０１３９】
培地は、それぞれの生物または微生物を培養するのに適した任意の培地とすることができる。
【０１４０】
上記のように、本発明によるかかる方法は、培地および／または発酵排ガスから生成された生成物を回収するステップも含むことができる。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明による方法において用いる生物は、植物である。原則として、任意の可能な植物、すなわち単子葉植物または双子葉植物を使用することができる。農業的に有意義な規模で栽培でき、大量のバイオマスを製造することを可能にする植物を使用することが好ましい。例は、ドクムギ属（Lolium）のような草類、ライムギ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、キビ、トウモロコシのような穀類、ジャガイモのような他のデンプン貯蔵植物またはサトウキビもしくはサトウダイコンのような糖貯蔵植物である。タバコの、またはトマト、コショウ、キュウリ、ナスなどの野菜植物の使用も考えられる。別の可能性は、ナタネ、オリーブなどの油貯蔵植物の使用である。樹木、特に、ユーカリ、ポプラまたはゴムの木（パラゴムノキ（Hevea brasiliensis））などの成長の早い樹木の使用も考えられる。
【０１４２】
上記のように、上記の酵素的変換を達成するために必要である少なくとも１つの酵素をコードする核酸分子を含有するように遺伝的に改変された（微）生物を、本発明による方法において使用することが可能である。上記の酵素をコードするかかる核酸分子を、単独でまたはベクターの一部として使用することができる。核酸分子は、核酸分子中に含まれるポリヌクレオチドに作動可能に連結している発現制御配列をさらに含むことができる。本明細書全体を通して使用する「機能的に連結している」または「作動可能に連結している」という用語は、発現が発現制御配列と適合する条件下で達成されるような、１つまたは複数の発現制御配列と発現されるポリヌクレオチドにおけるコード領域間の連結を表す。
【０１４３】
発現は、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの異種性ＤＮＡ配列の転写を含む。真菌および細菌における発現を保証する調節エレメントは、当業者によく知られている。それらは、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル、ターゲティングシグナルなどを包含する。例を、ベクターに関する説明と関連して以下でさらに提供する。
【０１４４】
核酸分子に関連した使用のためのプロモーターは、その起源および／または発現される遺伝子に関して相同または異種性であってよい。適したプロモーターは、例えばそれ自体を構成的発現するプロモーターである。しかしながら、外的影響によって決定される時点でのみ活性化されるプロモーターも使用することができる。人工的および／または化学的誘導性プロモーターを、この文脈において使用することができる。
【０１４５】
ベクターは、ベクターに含有される前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結している発現制御配列をさらに含むことができる。これらの発現制御配列は、細菌または真菌における翻訳可能なＲＮＡの転写および合成を保証するように適合させることができる。
【０１４６】
さらに、分子生物学において通常である方法によって、ポリヌクレオチドに種々の変異を挿入して（例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照されたい）、改変された生物学的特性をおそらく有するポリペプチドの合成をもたらすことが可能である。点変異の導入は、例えば、アミノ酸配列の改変が、生物活性またはポリペプチドの調節に影響を及ぼす位置で考えられる。
【０１４７】
さらに、改変された基質または生成物特異性を有する突然変異体を調製することができる。好ましくは、かかる突然変異体は、増加した活性を示す。さらに、上で定義した酵素をコードするポリヌクレオチド中への変異の導入は、遺伝子発現速度および／または前記ポリヌクレオチドによってコードされる酵素の活性を最適化することを可能にする。
【０１４８】
細菌または真菌を遺伝的に改変するために、上記で定義した酵素またはこれらの分子の一部をコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡ配列の組換えによる変異誘発または配列改変を可能にするプラスミドに導入することができる。標準的な方法（Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USAを参照されたい）により、塩基交換を行うか、または天然もしくは合成配列を付加することができる。ＤＮＡ断片を、アダプターおよびリンカーを断片に適用することによって、互いに接続することができる。さらに、適した制限部位を提供するまたは過剰なＤＮＡまたは制限部位を除去する工業的手段を使用することができる。挿入、欠失または置換が可能である場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発、「プライマー修復」、制限またはライゲーションを使用することができる。一般に、配列分析、制限分析ならびに生化学および分子生物学の他の方法を、分析方法として行う。
【０１４９】
上記の活性のいずれかを有するポリペプチドの生成をもたらすために、（微）生物中に導入されたポリヌクレオチドを発現させる。種々の発現系の概要は、例えば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516、Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)およびSawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9)、Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4)、Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463)、Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)に含まれている。酵母発現系の概要は、例えば、Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279)、Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19)、Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93、Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496)、Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745)およびBuckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072)によって提供されている。
【０１５０】
発現ベクターは、文献において広く報告されている。概して、それらは、選択マーカー遺伝子および選択された宿主における複製を保証する複製起点だけでなく、細菌またはウイルスプロモーター、および大部分の場合、転写に関する終止シグナルも含有する。一般的に、プロモーターと終止シグナルの間に、コードＤＮＡ配列の挿入を可能にする少なくとも１つの制限部位またはポリリンカーがある。それが選択された宿主生物において活性である場合、対応する遺伝子の転写を天然に制御するＤＮＡ配列を、プロモーター配列として使用することができる。しかしながら、この配列は、他のプロモーター配列と交換することもできる。遺伝子の構成的発現を保証するプロモーターおよび遺伝子の発現の計画的な制御を可能にする誘導性プロモーターを使用することが可能である。これらの特性を有する細菌およびウイルスプロモーター配列が、文献において詳細に報告されている。微生物（例えば大腸菌（E. coli）、出芽酵母（S. cerevisiae））における発現に関する調節配列は、文献において十分に報告されている。下流配列の特に高い発現を可能にするプロモーターは、例えば、Ｔ７プロモーター（Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89）、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐ、ｔｒｐ−ｌａｃＵＶ５（DeBoer et al., in Rodriguez and Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982)、462-481；DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25）、ｌｐ１、ｒａｃ（Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100）である。誘導性プロモーターは、好ましくはポリペプチドの合成に使用する。これらのプロモーターは、構成的プロモーターがもたらすよりも高いポリペプチド収率をしばしばもたらす。最適量のポリペプチドを得るために、２段階のプロセスがしばしば使用される。最初に、宿主細胞を、比較的高い細胞密度まで最適条件下で培養する。第２のステップでは、転写を、使用するプロモーターの型に依存して誘導する。この点で、ラクトースまたはＩＰＴＧ（＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）によって誘導することができるｔａｃプロモーターが特に適している（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25）。転写に関する終止シグナルも、文献において報告されている。
【０１５１】
本発明によるポリヌクレオチドまたはベクターでの宿主細胞の形質転換は、例えばSambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA；Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990に報告されている、標準的な方法によって行うことができる。宿主細胞を、特にｐＨ値、温度、塩濃度、通気、抗生物質、ビタミン、微量元素などに関して、使用する特定の宿主細胞の必要条件を満たす栄養培地において培養する。
【０１５２】
本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの変換および３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの変換に必要な上記の酵素を発現することができる生物、好ましくは微生物にも関する。したがって、本発明は、
（ｉ）上記で定義した４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素、および
（ｉｉ）上記で定義した３−ブテン−２−オン還元酵素
を発現する生物または微生物に関する。
【０１５３】
好ましい実施形態では、上記の生物は、３−ブテン−２−オン還元酵素が
（ａ）カルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）、
（ｂ）アルコール脱水素酵素、または
（ｃ）上記で定義した短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素
である生物である。
【０１５４】
さらなる態様では、生物は、上記で定義したアルケノール脱水酵素をさらに発現する生物である。
【０１５５】
さらなる態様では、生物は、
（ｉ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素；または
（ｉｉ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素および上記で定義したアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換することが可能である酵素
をさらに発現する生物である。
【０１５６】
生物が発現する酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【０１５７】
一実施形態では、本発明による生物は、それが上記の酵素の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸分子の導入により、遺伝的に改変されているという意味で、組換え生物である。好ましくはかかる核酸分子は、生物に関して異種性であり、これは、その核酸分子が前記生物に天然に存在しないことを意味する。したがって、本発明による生物は、好ましくは、外来性の核酸分子の導入により天然発生の生物とは異なる非天然発生の生物である。
【０１５８】
微生物は、好ましくは細菌、酵母または真菌である。別の好ましい実施形態では、生物は、植物または非ヒト動物である。他の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【０１５９】
本発明は、本発明による生物、ならびに任意選択で、アセトアセチルＣｏＡ、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−ブテン−２−オンおよび／または３−ブテン−２−オールを含む組成物にも関する。
【０１６０】
したがって、本発明は、好ましい実施形態では、本発明の方法に従って３−ブテン−２−オンを製造するために必要である上記の酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物を含む組成物に関する。任意選択で、かかる組成物は、アセトアセチルＣｏＡおよび／または４−ヒドロキシ−２−ブタノンをさらに含む。さらに、別の実施形態では、本発明は、本発明の方法に従って３−ブテン−２−オールを製造するために必要である上記の酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物を含む組成物に関する。任意選択で、かかる組成物は、アセトアセチルＣｏＡ、４−ヒドロキシ−２−ブタノンおよび／または３−ブテン−２−オンをさらに含む。さらに、別の実施形態では、本発明は、本発明の方法に従って１，３−ブタジエンを製造するために必要である上記の酵素の少なくとも１つを産生する生物、好ましくは微生物を含む組成物に関する。任意選択で、かかる組成物は、アセトアセチルＣｏＡ、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−ブテン−２−オンおよび／または３−ブテン−２−オールをさらに含む。
【０１６１】
上記の組成物の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【０１６２】
本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンからの３−ブテン−２−オンの製造のための本明細書で上に記載の４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素の使用にも関する。
【０１６３】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡからの３−ブテン−２−オンの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１６４】
本発明は、アセチルＣｏＡからの３−ブテン−２−オンの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１６５】
３−ブテン−２−オンの製造のための使用に適用される酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【０１６６】
本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンからの３−ブテン−２−オールの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素と組み合わせた、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１６７】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡからの３−ブテン−２−オールの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの脱水を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素と組み合わせた、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１６８】
本発明は、アセチルＣｏＡからの３−ブテン−２−オールの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの脱水を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換を触媒する酵素と組み合わせた、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１６９】
３−ブテン−２−オンの製造のための使用に適用される酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【０１７０】
本発明は、３−ブテン−２−オンからの１，３−ブタジエンの製造のための、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オールから１，３−ブタジエンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１７１】
本発明は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンからの１，３−ブタジエンの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの脱水を触媒する酵素と組み合わせた、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オールから１，３−ブタジエンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１７２】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡからの１，３−ブタジエンの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの脱水を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素と組み合わせた、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オールから１，３−ブタジエンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１７３】
本発明は、アセチルＣｏＡからの１，３−ブタジエンの製造のための、少なくとも１つの上記の４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの脱水を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換を触媒する酵素と組み合わせた、少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オールから１，３−ブタジエンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記の３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を触媒する酵素の組合せの使用にも関する。
【０１７４】
１，３−ブタジエンの製造のための使用に適用される酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【０１７５】
本発明は、アセトアセチルＣｏＡからの４−ヒドロキシ−２−ブタノンの製造のための、少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素の使用にも関する。
【０１７６】
本発明は、アセチルＣｏＡからの４−ヒドロキシ−２−ブタノンの製造のための、少なくとも１つの上記のアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換を触媒する酵素および少なくとも１つの上記のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換のための酵素の組合せの使用にも関する。
【０１７７】
４−ヒドロキシ−２−ブタノンの製造のための使用に適用される酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法に関連して上で説明したものと同じことがあてはまる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】３−ブテン−２−オールを経由したアセチルＣｏＡからの１，３−ブタジエン製造に関する人工的代謝経路を示す。
【図２】実施例３において概要を述べた、Ｈ．チェジュエンシス（H. chejuensis）由来の短鎖アルコール脱水素酵素様タンパク質でのアセトアセチルＣｏＡの酵素触媒還元に関して得られたクロマトグラムを示す。アッセイを、３２ｍＭアセトアセチルＣｏＡで行い、２時間インキュベートした。
【図３】実施例５において概要を述べた、Ｓ．トコダイイ（S. tokodaii）由来の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素での４−ヒドロキシ−２−ブタノンの酵素的脱水に関して得られたクロマトグラムを示す。アッセイを、１００ｍＭ  ４−ヒドロキシ−２−ブタノンで行い、２４時間インキュベートした。
【図４】４−ヒドロキシ−２−ブタノンの酵素的脱水による３−ブテン−２−オン製造を示す。３−ブテン−２−オンの著しい製造が、いくつかの３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水酵素に関して観察された。
【図５】実施例８において概要を述べた、サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii）由来のアルコール脱水素酵素によって触媒された、３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的還元に関して得られたクロマトグラムを示す。アッセイを、２０ｍＭ  ３−ブテン−２−オンで行い、４時間インキュベートした。
【図６】８０ｍＭ  ３−ブテン−２−オールおよびリナロール脱水酵素−異性化酵素での、酵素的および酵素を含まないアッセイに関して２２時間のインキュベーション後に得られたＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７９】
本発明の他の態様および利点を、以下の実施例において記載することになるが、これらは、限定のためではなく、例示の目的で提供する。
【実施例】
【０１８０】
［実施例１］
クローニング、酵素の発現および精製
遺伝子合成、クローニングおよび組換えタンパク質の発現
原核および真核生物のゲノムから推測される試験する酵素の配列を、オリゴヌクレオチド連結によって作製して、大腸菌（E. coli）のコドン使用頻度に適合させた（遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧが商業的に合成した）。一続きの６ヒスチジンコドンを、メチオニン開始コドンの後ろに挿入して、精製のためのアフィニティータグを提供した。このように合成された遺伝子を、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）発現ベクターにおいてクローニングした（ベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧが構築した）。
【０１８１】
コンピテント大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、標準的なヒートショック手順に従って、これらのベクターで形質転換した。形質転換細胞を３７℃で６時間、ＺＹＭ−５０５２自己誘導培地（Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41, (2005), 207-234）を使用して振とうしながら（１６０ｒｐｍ）増殖させ、タンパク質発現を２８℃または２０℃で終夜（約１６時間）継続した。細胞を、４℃、１０．０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収し、ペレットを−８０℃で保管した。
【０１８２】
タンパク質精製および濃縮
２００ｍｌの培養細胞からのペレットを氷上で解凍し、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＤＴＴを含有する、５ｍｌのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８に再懸濁した。２０マイクロリットルのリゾナーゼ（lysonase）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を加えた。細胞を、室温で１０分インキュベートし、次いで氷へ２０分間戻した。細胞溶解を３×１５秒間の超音波処理によって完了した。次いで細菌の抽出物を、４℃、１０．０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって清澄化した。清澄化した細菌溶解物をＰＲＯＴＩＮＯ−１０００  Ｎｉ−ＴＥＤカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）に装填し、６−Ｈｉｓタグを付けたタンパク質の吸着を可能にした。カラムを洗浄し、目的の酵素を、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５０ｍＭイミダゾールを含有する、４ｍｌの５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８で溶出した。次いで溶出液を濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  １０ｋＤａろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で脱塩し、酵素を下流酵素活性アッセイに適合する緩衝液に再懸濁した。タンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上での直接的なＵＶ２８０ｎｍ測定によって定量化した。このように精製されたタンパク質の純度は、６０％から９０％まで異なっていた。
【０１８３】
［実施例２］
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素活性の連続的分光光度アッセイ
短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素の遺伝子を合成し、対応する酵素を、実施例１に記載した手順に従って、さらに生成した。精製された酵素を、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５に再懸濁した。
【０１８４】
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素活性のアッセイに関する標準的な反応混合物は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５中に５ｍＭアセトアセチルＣｏＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１〜０．４ｍＭ  ＮＡＤＰＨを含有した。各アッセイを、１ｍｇ／ｍｌの酵素を加えることによって開始した。酵素を加えない、または基質を加えない対照アッセイを行った。反応を、３７℃で行った。各試料を、ＮＡＤＰＨの減少に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４  ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）上で３４０ｎｍで継続的にモニターした。いくつかの酵素が、補助因子としてのＮＡＤＰＨでアセトアセチルＣｏＡ還元酵素活性を実証した（表１）。
【０１８５】
【表１】
0006469665.tif 000021
【０１８６】
次に、アセトアセチルＣｏＡの酵素的還元の生成物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。
【０１８７】
［実施例３］
アセトアセチルＣｏＡの酵素的還元の生成物のＨＰＬＣに基づく分析
酵素アッセイを、以下の条件下で行った：
５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．５
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
６０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
０〜３２ｍＭアセトアセチルＣｏＡ
【０１８８】
アッセイを、１５０μｌの反応混合物への１５０μｇの精製された脱水素酵素／還元酵素の添加で開始した。インキュベーションを、３７℃で振とうしながら０、０．５、１、２および４時間行った。反応を、６５℃で５分間加熱することによって停止し、遠心分離し、１２０μｌの清澄化した上清をきれいなバイアル中に移した。市販の４−ヒドロキシ−２−ブタノン（Ｓｉｇｍａ）を、参照として使用した。ＨＰＬＣ分析を、屈折計検出器およびカラム加熱モジュールを備えた１２６０  Ｉｎｉｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。１０μｌの試料を、１．５ｍｌ／ｍｉｎの移動相流速でＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度７５℃）上で分離した。移動相は、硫酸水溶液（８．４ｍＭ）からなった。これらの条件下での４−ヒドロキシ−２−ブタノンの保持時間は、３．２分であった。
【０１８９】
ＨＰＬＣ分析は、４−ヒドロキシ−２−ブタノンがアセトアセチルＣｏＡの酵素触媒還元によって形成されたことを示した。Ｈ．チェジュエンシス（H. chejuensis）由来の短鎖アルコール脱水素酵素様タンパク質で得られた典型的なクロマトグラムを図２に示す。
【０１９０】
これらのデータは、短鎖脱水素酵素／還元酵素がアセトアセチルＣｏＡから４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの４電子還元を触媒することを示している。
【０１９１】
［実施例４］
アセトアセチルＣｏＡ還元の動態学的パラメーター
酵素アッセイを、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび純粋な酵素（１５０μｇ）を含有する１５０μｌリン酸カリウム（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）の総体積において行った。動態学的パラメーターを、可変の基質（０〜３２ｍＭ）としてのアセトアセチルＣｏＡで決定し、ＮＡＤＰＨ濃度を一定に保持した（６０ｍＭ）。各アッセイに関して形成する４−ヒドロキシ−２−ブタノンの量を、実施例３に記載したＨＰＬＣに基づく手順を使用して測定した。
【０１９２】
精製された短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素に関して得られた動態学的パラメーターを、表２に示す。
【０１９３】
【表２】
0006469665.tif 000022
【０１９４】
［実施例５］
４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素触媒脱水
古細菌および細菌のゲノムから推測される３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡおよび３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素の配列を、実施例１に記載した手順に従って作製した。このように合成された遺伝子を、ｐＥＴ２５ｂ（＋）発現ベクター（ベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧが構築した）においてクローニングし、タンパク質を実施例１に記載した手順に従って生成した。
【０１９５】
精製された脱水酵素を、４−ヒドロキシ−２−ブタノンを脱水するそれらの能力に関して評価した。
【０１９６】
試験する酵素反応を、３７℃で以下の条件下で行った：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ４−ヒドロキシ−２−ブタノン
反応体積は、０．４ｍｌであった。
【０１９７】
各アッセイを、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度での特異的な酵素の添加で開始した。酵素を加えない、または基質を加えない対照アッセイを行った。試験管を３７℃で振とうしながら２３時間インキュベートした。反応生成物を等体積の酢酸エチルで抽出し、次いでＨＰＬＣによって分析した。市販の３−ブテン−２−オン（Ｓｉｇｍａ）を参照として使用した。ＨＰＬＣ分析を、カラム加熱モジュールおよび屈折計およびＵＶ検出器を備えた１２６０  Ｉｎｉｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。１０μｌの試料を、１．５ｍｌ／ｍｉｎの移動相流速でＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）上で分離した。移動相は、８．４ｍＭ硫酸を含有する９８：２（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／アセトニトリルからなった。これらの条件下での３−ブテン−２−オンの保持時間は、５．４分であった。
【０１９８】
Ｓ．トコダイイ（S. tokodaii）由来の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素に関して得られた典型的なクロマトグラムの例を、図３に示す。３−ブテン−２−オンの著しい製造が、いくつかの３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水酵素での酵素アッセイにおいて観察された（図４）。
【０１９９】
［実施例６］
４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの脱水の動態学的パラメーター
反応の動態学的パラメーターを、以下の条件下でスルホロブス・トコダイイ（Sulfolobus tokodaii）由来の精製された組換え３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素に関して決定した：
１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０〜３００ｍＭ  ４−ヒドロキシ−２−ブタノン
４ｍｇ／ｍｌ  ３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素Ｓ．トコダイイ（S. tokodaii）
【０２００】
試験管を、３７℃で振とうしながら０、２０、６０、１２０および１８０分間インキュベートした。３−ブテン−２−オンの形成を、実施例４に記載した手順に従って、市販の３−ブテン−２−オンを使用して定量化した。
【０２０１】
Ｓ．トコダイイ（S. tokodaii）由来のヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素は、０．４Ｍよりも高いＫＭおよび７．５×１０−３ｓ−１のｋｃａｔを有することが見出された。
【０２０２】
［実施例７］
基質として３−ブテン−２−オンおよび補助因子としてＮＡＤＰＨを使用した、還元酵素の回収物のスクリーニング
真核および原核生物にわたる還元酵素／アルコール脱水素酵素の代表をコードする１０の遺伝子のセットを構築し、試験して、３−ブテン−２−オンからの３−ブテン−２−オール製造に関する潜在的な候補を同定した。遺伝子を合成し、次いで対応する酵素を実施例１に記載した手順に従って生成した。
【０２０３】
還元酵素アッセイに関して、１２０μｌの総体積で５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．４ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ３−ブテン−２−オンおよび０．００１〜１ｍｇ／ｍｌ酵素を含有する反応混合物を使用し、反応を３７℃で２０分間行った。サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii）由来のアルコール脱水素酵素およびハヘラ・チェジュエンシス（Hahella chejuensis）由来の短鎖アルコール脱水素酵素様タンパク質でのアッセイを、トリス−ＨＣｌ緩衝液の代わりに５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５において行った。酵素、基質および補助因子の陰性対照反応を同時に行った。各試料を、ＮＡＤＰＨの減少に関して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４  ＵＶ／Ｖｉｓマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）上で３４０ｎｍで継続的にモニターした。いくつかの酵素が、基質としての３−ブテン−２−オンおよび補助因子としてのＮＡＤＰＨで還元酵素活性を実証した（表３）。
【０２０４】
【表３】
0006469665.tif 000023
【０２０５】
［実施例８］
サーモアナエロビウム・ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii）由来のアルコール脱水素酵素による３−ブテン−２−オンの酵素触媒還元のＨＰＬＣに基づく分析
試験する酵素反応を、３７℃で以下の条件下で行った：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
４０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２
０〜４０ｍＭ  ３−ブテン−２−オン
Ｔｈ．ブロッキイ（Th. brockii）由来の１ｍｇ／ｍｌアルコール脱水素酵素
反応体積は、２００μｌであった。
【０２０６】
分析物を、３７℃で振とうしながら様々な期間（０、２０、４０、６０、１２０および２４０分）インキュベートした。反応を、６５℃で５分間加熱することによって停止し、反応混合物を遠心分離し、１５０μｌの清澄化した上清をきれいなバイアル中に移した。次いで反応生成物を等体積の酢酸エチルで抽出した。１５０μｌの上部酢酸エチル相をＨＰＬＣ分析のためにきれいなバイアル中に移した。市販の３−ブテン−２−オール（Ｓｉｇｍａ）を参照として使用した。ＨＰＬＣ分析を、カラム加熱モジュールおよび屈折計およびＵＶ検出器を備えた１２６０  Ｉｎｉｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して行った。１０μｌの試料を１．５ｍｌ／ｍｉｎの移動相流速でＺｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ａｑカラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ粒径、カラム温度３０℃）上で分離した。移動相は、８．４ｍＭ硫酸を含有する９８：２（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／アセトニトリルからなった。これらの条件下での３−ブテン−２−オールおよび３−ブテン−２−オンの保持時間は、それぞれ、３．９および５．４分であった。
【０２０７】
３−ブテン−２−オールの著しく、再現可能な製造が、酵素アッセイにおいて観察された。典型的なクロマトグラムの例を、図５に示す。これらのデータは、３−ブテン−２−オンの還元を、補助因子としてのＮＡＤＰＨの存在下でアルコール脱水素酵素を使用して達成し、３−ブテン−２−オールの製造をもたらすことができることを示している。
【０２０８】
Ｔｈ．ブロッキイ（Th. brockii）由来の第２級アルコール脱水素酵素は、１００ｍＭのＫＭおよび少なくとも０．５ｓ−１のｋｃａｔを有することが見出された。
【０２０９】
［実施例９］
ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）由来のＲ特異的アルコール脱水素酵素による３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの還元の動態学的パラメーター
試験する酵素反応を、３７℃で以下の条件下で行った：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
４０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
０〜４０ｍＭ  ３−ブテン−２−オン
Ｌ．ケフィリ（L. kefiri）由来の１ｍｇ／ｍｌアルコール脱水素酵素。
反応体積は、２００μｌであった。
【０２１０】
分析物を、３７℃で振とうしながら０、１０、２０、４０、６０および１２０分間インキュベートした。３−ブテン−２−オールの形成を、実施例８に記載したプロトコールに従って定量化した。ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）由来のＲ特異的アルコール脱水素酵素は、１９ｍＭのＫＭおよび４ｓ−１のｋｃａｔを有することが見出された。
【０２１１】
［実施例１０］
ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）由来の第２級アルコール脱水素酵素による３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの還元の動態学的パラメーター
試験する酵素反応を、３７℃で以下の条件下で行った：
５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ
４０ｍＭ  ＮＡＤＰＨ
０〜４０ｍＭ  ３−ブテン−２−オン
Ｒ．ルーバー（R. ruber）由来の１ｍｇ／ｍｌアルコール脱水素酵素。
反応体積は、２００μｌであった。
【０２１２】
分析物を、３７℃で振とうしながら０、１０、２０、４０、６０および１２０分間インキュベートした。３−ブテン−２−オールの形成を、実施例８に記載したプロトコールに従って定量化した。ロドコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）由来の第２級アルコール脱水素酵素は、１８０ｍＭのＫＭおよび少なくとも０．０３ｓ−１のｋｃａｔを有することが見出された。
【０２１３】
［実施例１１］
リナロール脱水酵素−異性化酵素に関する遺伝子の大腸菌（E. coli）におけるクローニングおよび発現
クローニングおよび細菌培養
カステラニエラ・デフラグランス（Castellaniella defragrans）（以前はアルカリゲネス・デフラグランス（Alcaligenes defragrans））のゲノムから推測されるリナロール脱水酵素−異性化酵素の配列を、オリゴヌクレオチド連結によって作製して、大腸菌（E. coli）のコドン使用頻度に適合した。一続きの６ヒスチジンコドンを、メチオニン開始コドンの後ろに挿入して、精製のためのアフィニティータグを提供した。このように合成された遺伝子を、ｐＥＴ２５ｂ（＋）発現ベクターにおいてクローニングした（ベクターは、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧが構築した）。コンピテント大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ヒートショック手順に従ってこのベクターで形質転換した。陰性対照として、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を空のベクターで形質転換した。形質転換細胞を、３７℃で６時間、ＺＹＭ−５０５２自己誘導培地（Studier FW, Prot. Exp. Pur. 41 (2005), 207-234）上で振とうしながら（１６０ｒｐｍ）増殖させ、タンパク質発現を１８℃で終夜（約１２時間）継続した。細胞を、４℃、１０．０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収し、ペレットを−８０℃で凍結させた。
【０２１４】
細胞溶解物の調製
１００ｍｌの培養細胞からのペレットを氷上で解凍し、４ｍｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に再懸濁した。次いで１０μｌのリゾナーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を加えた。細胞を室温で１０分間インキュベートし、次いで氷へ２０分間戻した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して決定した。
【０２１５】
［実施例１２］
３−ブテン−２−オールからの１，３−ブタジエン製造
酵素アッセイを以下の条件下で行った：
５０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ７．５
２ｍＭ  Ｄ，Ｌ−ジチオスレイトール
０〜８０ｍＭ  ３−ブテン−２−オール
ｐＨを７．５に調整した。
【０２１６】
組換えリナロール脱水酵素−異性化酵素を含有する０．２５ｍｌの細胞溶解物を、０．５ｍｌの反応混合物に加えた。空のベクターで形質転換した大腸菌（E. coli）細胞の溶解物を含有する酵素を含まない対照反応を同時に行った。分析物を、振とうしながら２ｍｌの密封されたガラスバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）において３７℃で１〜２２時間インキュベートした。１，３−ブタジエン製造を、ＧＣ／ＦＩＤ手順によって分析した。次いでこの目的のために、１ｍｌのヘッドスペース相を回収し、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフＶａｒｉａｎ  ４５０−ＧＣ中に注入した。窒素を１．５ｍｌ／ｍｉｎの流速でキャリアーガスとして使用した。揮発性化合物を、１３０℃での等温モードを使用してＲｔ−Ａｌｕｍｉｎａ  Ｂｏｎｄ／Ｎａ２ＳＯ４カラム（Ｒｅｓｔｅｋ）上でクロマトグラフ的に分離した。酵素反応生成物を、１，３−ブタジエン標準（Ｓｉｇｍａ）との比較によって同定した。これらのＧＣ条件下で、ブタジエンに関する保持時間は、７．６分であった。１，３−ブタジエンの著しい製造がリナロール脱水酵素−異性化酵素での酵素アッセイにおいて観察された。ブタジエンシグナルは、酵素を含まない対照アッセイにおいて観察されなかった（図６）。この変換に関する代謝回転数は、酵素活性部位当たり約１０−４ｓ−１基質分子に達した。
本発明は次の実施態様を含む。
（１）４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オンの製造のための方法であって、前記４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素が、
（ａ）３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．１１６）、
（ｂ）３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５５）、
（ｃ）エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１７）、
（ｄ）３−ヒドロキシオクタノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．５９）、
（ｅ）クロトニル−［アシルキャリアータンパク質］加水酵素（ＥＣ４．２．１．５８）、
（ｆ）３−ヒドロキシデカノイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６０）、
（ｇ）３−ヒドロキシパルミトイル−［アシルキャリアータンパク質］脱水酵素（ＥＣ４．２．１．６１）、
（ｈ）長鎖エノイルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．７４）、または
（ｉ）３−メチルグルタコニルＣｏＡ加水酵素（ＥＣ４．２．１．１８）
である、方法。
（２）前記４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水酵素が、
（ａ）Ｍ．クプリナ（M. cuprina）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号１）、
（ｂ）Ｓ．トコダイイ（S. tokodaii）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号３）、
（ｃ）Ｍ．セヅラ（M. sedula）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号２）、
（ｄ）Ｓ．アシドカルダリウス（S. acidocaldarius）の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（配列番号５）、
（ｅ）Ａ．ホスピタリス（A. hospitalis）の３−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水酵素（配列番号６）、または
（ｆ）Ｂ．ラテロスポルス（B. laterosporus）の３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素（配列番号４）
である、上記（１）に記載の方法。
（３）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素を利用することによるアセトアセチルＣｏＡから前記４−ヒドロキシ−２−ブタノンへの酵素的変換をさらに含む、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記アセトアセチルＣｏＡ還元酵素が、
（ｉ）ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＥＣ１．１．１．３４）、または（ｉｉ）短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素
である、上記（３）に記載の方法。
（５）アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡへの酵素的変換をさらに含む、上記（１）から（４）のいずれか一項に記載の方法。
（６）（ａ）上記（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法に従った３−ブテン−２−オンの製造、および
（ｂ）３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによる、このように製造された３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オールの製造のための方法。
（７）
前記３−ブテン−２−オン還元酵素が、
（ｉ）カルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）、
（ｉｉ）アルコール脱水素酵素、または
（ｉｉｉ）短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素
である、上記（６）に記載の方法。
（８）（ａ）上記（６）または（７）に記載の方法に従った３−ブテン−２−オールの製造、および（ｂ）アルケノール脱水酵素の使用により、このように製造された３−ブテン−２−オールを１，３−ブタジエンに酵素的に変換すること
を含む、１，３−ブタジエンの製造のための方法。
（９）（ｉ）４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する、上記（１）または（２）に記載の酵素、および
（ｉｉ）３−ブテン−２−オン還元酵素
を発現する、生物または微生物。
（１０）前記３−ブテン−２−オン還元酵素が、
（ａ）カルボニル還元酵素（ＥＣ１．１．１．１８４）、
（ｂ）アルコール脱水素酵素、または
（ｃ）短鎖脱水素酵素／脂肪酸アシルＣｏＡ還元酵素
である、上記（９）に記載の生物または微生物。
（１１）（ｉ）アルケノール脱水酵素
をさらに発現する、上記（９）または（１０）に記載の生物または微生物。
（１２）（ｉ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素、または
（ｉｉ）アセトアセチルＣｏＡ還元酵素およびアセチルＣｏＡをアセトアセチルＣｏＡに変換することが可能である酵素
をさらに発現する、上記（９）から（１１）のいずれか一項に記載の生物または微生物。
（１３）上記（９）から（１２）のいずれか一項に記載の生物または微生物、ならびに任意選択で、アセトアセチルＣｏＡ、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−ブテン−２−オンおよび／または３−ブテン−２−オールを含む組成物。
（１４）４−ヒドロキシ−２−ブタノンからの３−ブテン−２−オンの製造のための、４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する、上記（１）または（２）に記載の酵素の使用。
（１５）４−ヒドロキシ−２−ブタノン脱水を触媒する酵素を利用することによる４−ヒドロキシ−２−ブタノンから３−ブテン−２−オンへの酵素的変換、および３−ブテン−２−オン還元酵素を利用することによる、このように製造された３−ブテン−２−オンから３−ブテン−２−オールへの酵素的変換を含む、３−ブテン−２−オールの製造のための方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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