(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥血斑から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法であって：
緩衝溶液を、乾燥血液試料へ適用することにより乾燥血液試料を再水和して、再水和された乾燥血液試料を作製し、細胞に付随するＲＮＡ及び／又はＤＮＡを細胞と共に含ませ；
細胞に付随するＲＮＡ及び／又はＤＮＡを破壊することなく、細胞遊離性ウイルス粒子を優先的に溶出する、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む溶出試薬により、再水和された乾燥血液試料から細胞遊離性ウイルス粒子を溶出し；
再水和された乾燥血液試料中に存在し得るあらゆる細胞デブリから、溶出された細胞遊離性ウイルスを分離するためのフィルターを使用し；並びに
ウイルス粒子定量技術により、細胞遊離性ウイルス粒子を測定する
を含む、方法。
【請求項２】
再水和された乾燥血液試料中に存在する細胞を固定試薬により固定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス粒子定量技術が、配列−特異的核酸定量、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、等温核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、及び電子顕微鏡からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞遊離性ウイルス粒子が、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、及びＥＢＶからなる群から選択されるウイルスのウイルス粒子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記固定試薬が、メタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、クロロホルム、及びアセトンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記フィルターが、遠心又は吸引によるスピンカラム濾過に用いられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フィルターが、約０．１μｍ〜約１００μｍの細孔サイズ範囲を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記緩衝溶液が、固定試薬及び溶出試薬を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記固定試薬が、メタノールを含み、及び溶出試薬が、ＰＢＳを含む、請求項２又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記緩衝溶液が、溶出試薬を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、外界温度で実行される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、振盪又はボルテックスを伴わずに実行される、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液中のウイルス負荷を測定する分野、より特定すると乾燥血斑から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
２０１３年に、世界保健機関（ＷＨＯ）は、最新ＨＩＶ治療及び予防ガイドラインを改訂し、ＨＩＶ陽性患者の管理におけるＨＩＶウイルス負荷（ＶＬ）試験の重要性を強調した。ＷＨＯは、ＨＩＶ抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）をモニタリングするために、臨床所見及びＣＤ４細胞カウントの代わりに、ＨＩＶウイルス負荷試験を使用することを強く推奨し、かつ治療的有効性に関するＨＩＶ血漿ＶＬレベルのカットオフ値を５０００コピー／ｍＬから１０００コピー／ｍＬへ低下した。別の言い方をすると、ＡＲＴを受けているＨＩＶ患者が、１０００コピー／ｍＬよりも大きい血漿中ウイルス力価を有する場合、薬物治療は失敗したと考えられるであろう。密着したカウンセリング、薬物耐性試験及び第二の治療計画などの治療失敗に対する反応は、時間がかかりかつ高価であり、必要な場合にのみ使用されるべきである。
【０００３】
感染後ＨＩＶウイルスは、感染細胞内でそれ自身複製し始めるのみではなく、また潜在性ＨＩＶプロウイルスＤＮＡとしてそのｃＤＮＡを宿主染色体へも組み込む(Greene, W.C.及びPeterlin, B.M.、2002、「細胞を通じたHIVの驚くべき旅の図(Charting HIV's remarkable voyage through the cell)」、Nat Med. 8(7): 673-80；Blankson, J.N.、D. Persaud、R.F. Siliciano、2002、「HIV-1感染におけるウイルスリザーバの課題(The Challenge of Viral Reservoirs in HIV-1 Infection)」、Annu. Rev. Med. 53:557-593)。ＨＩＶウイルス負荷は通常、標本型として血漿を用いて測定される。しかし、アフリカなどの資源が限定された状況においては、血漿試料を容易に入手し、貯蔵し、運搬し、かつ試験することができない(世界保健機関、2013年、HIV感染症治療及び予防のための抗レトロウイルス薬使用に関する統一指針：公衆衛生的方法のための推奨(Consolidated guidelines on the use of antiretroviral drugs for treating and preventing HIV infection: recommendations for a public health approach))、世界保健機関、ジュネーブ)。乾燥血斑（ＤＢＳ）は、資源が限定された状況において、ＨＩＶウイルス負荷試験のための解決法として評価されており、限られた成功を伴っている(Smit PWら、2014、「HIVウイルス負荷モニタリング及び未熟児診断に関する乾燥血斑使用の概説(Systematic review of the use of dried blood spots for monitoring HIV viral load and for early infant diagnosis)」、PLoS ONE. 9(3): e86461；Bertagnolio, S.、N.T. Parkin、M. Jordan、J. Brooks、J.G. Garcia-Lerma、2010、「HIV-1薬物耐性及びウイルス負荷試験のための乾燥血斑；世界規模HIV薬物耐性調査に関する最新知識及びWHO研究の総説(Dried blood spot s for HIV-1 Drug Resistance and Viral Load Testing: A Review of Current Knowledge and WHO Efforts for Global HIV Drug Resistance Surveillance)」、AIDS Rev. 12:195-208；Johannessen, A、2010、「HIVモニタリングにおける乾燥血斑；資源が限定された状況における適用(Dried blood spots in HIV monitoring: applications in resource-limited settings)」、Bioanalysis. 2(11):1893-1908)。Roche Molecular Diagnostics(RMD)社は、２００９年に開発された研究専用（ＲＵＯ）の製品を有しており、これはＤＢＳ中のＨＩＶウイルス負荷を測定するために、リアル−タイムＰＣＲであるCOBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)(CAP/CTM)HIV-1試験v2.0及び乾燥液体斑手順(Dried Fluids Spot Procedure)（ＤＦＳＰ）を使用する。残念なことに、血漿試料とＤＢＳ試料の対が試験される場合、ＤＦＳＰ試験は、血漿の優れた標準に比べ、より高いウイルス負荷力価を生じた。この過大評価は、血漿ウイルス負荷が５，０００コピー／ｍＬ未満の試料において特に顕著であり、おそらく細胞−結合性ＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡを検出したためであろう。
【０００４】
CAP/CTM HIV-1 DFSP手順によると、ＨＩＶ  ＤＢＳは、最初に、カオトロピック試薬−標本プレ抽出（ＳＰＥＸ）緩衝液、及び液体血液中のＨＩＶウイルスＲＮＡを含む総核酸、それに加えて他の細胞−結合性ＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えばＨＩＶプロウイルスＤＮＡなどと共にインキュベーションされ、ＤＢＳからＳＰＥＸ緩衝液へと抽出されかつ溶出される。次に、抽出された緩衝液を、核酸精製、その後のＨＩＶ標的の増幅及び検出のために、CAP/CTM装置に配置した。HIV DBS VL測定に関する現存する核酸抽出法は、全ての細胞を完全に溶解し、かつ全てのタンパク質複合体を変性させ、液体血液中の遊離ＨＩＶウイルス粒子並びに細胞−結合性ＨＩＶ  ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、ＤＢＳ由来の総核酸の完全な抽出を可能にする。
【０００５】
ＤＢＳ中のＨＩＶ  ＶＬの過剰定量は、Roche社のＤＢＳアッセイによるのみではなく、他の商業的に利用可能なアッセイ、例えばAbbott社のＨＩＶ  ＤＢＳアッセイによっても認められる問題点である。ＨＩＶの科学界及び医学界において、ＤＢＳにおけるＨＩＶ感染細胞中に存在するＨＩＶ  ＤＮＡは、ウイルス負荷の過剰定量を引き起こすという仮説が立てられているが、この過剰定量現象の正確な機序は不明で明らかにされていない(Medecins Sans Frontieres Access Campaign, 2013)。ＤＮＡよりもＲＮＡに特異性を有する増幅手順(例えば、BioMerieux NucliSENS(登録商標)により使用されるNASBA手順)により、ＤＢＳ中の過大評価は改善され得るが、排除されない。試料中のＨＩＶ  ＶＬ過剰定量の課題に対処する別の手順が依然必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
ＤＢＳの過大評価の一つの解決法は、試料から細胞−結合性ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を除去することであり、これにより血漿試料と同様に、検出されるべき細胞遊離性ウイルスのみを残すことができる。これは、患者を治療失敗として、犠牲の大きい誤分類を行うことを防ぐことができる。かかる方法及び関連した恩恵が、本開示において説明されている。
【０００７】
一実施態様において、乾燥血斑から細胞遊離性核酸及び／又はウイルス粒子を測定する方法が提供される。この方法は、緩衝溶液を、乾燥血液試料へ塗布し、再水和された乾燥血液試料を作製することにより、乾燥血液試料を再水和する工程；任意に、再水和された乾燥血液試料中に存在する細胞を、固定試薬により固定し、細胞−結合性ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを細胞と共に含むようにする工程；細胞−結合性ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを破壊することなく、細胞遊離性ウイルス粒子を優先的に溶出する溶出試薬により、細胞遊離性核酸及び／又はウイルス粒子を、再水和された乾燥血液試料から溶出する工程；フィルターにより、再水和された乾燥血液試料中に存在し得るあらゆる細胞デブリから、細胞遊離性核酸及び／又はウイルス粒子を分離する工程；並びに、配列−特異的核酸定量、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、及び電子顕微鏡からなる群から選択されるウイルス粒子定量技術により、細胞遊離性核酸及び／又はウイルス粒子を測定する工程：を含むことができる。
【０００８】
一部の実施態様において、ＤＢＳ中の測定されるべきウイルス粒子は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス−１又は−２（ＨＴＬＶ−１、又は−２）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ヒトＣＭＶ）、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の１種又は複数であることができる。緩衝溶液の実施態様は、固定試薬及び溶出試薬を含むことができる。固定試薬の一実施態様は、メタノールであることができ、かつ溶出試薬の一実施態様は、リン酸緩衝食塩水又は他の好適な緩衝液であることができる。本方法の一部の実施態様において、分離工程は、スピンカラム濾過、真空濾過、又は遠心を含むことができる。実施態様は、約０．１μｍ〜約１００μｍ、例えば約２０μｍ〜約８０μｍ、例えば約３０μｍ〜約７０μｍ、例えば約４０μｍ〜約６０μｍの範囲の細孔サイズを有するフィルターを含むことができる。
【０００９】
別の実施態様において、緩衝溶液は、ＰＢＳを含む。追加の実施態様において、緩衝溶液は、溶出溶液を含む。一つの他の実施態様において、溶出溶液は、ＰＢＳを含む。
【００１０】
本発明の１又は複数の実施態様の詳細は、添付図面及び以下の説明において詳述される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、これらの図面及び詳細な説明から、並びに請求項から、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、ＨＩＶウイルスの生活環の概略図を示す。宿主細胞が、ＨＩＶウイルスに感染した後、ウイルスＲＮＡゲノムは、ウイルスにコードされた逆転写酵素によりｃＤＮＡへ逆転写される。次にｃＤＮＡは、宿主染色体ＤＮＡへ組み込まれ、これは、プロウイルスＤＮＡを形成する。さらなるＨＩＶウイルスＲＮＡゲノムが、プロウイルスＤＮＡから転写され、かつウイルス粒子構築のために細胞質へ輸送される。成熟したＨＩＶウイルスは、感染細胞から出芽し、遊離ウイルス粒子となり始める。
【００１２】
【図２】図２は、乾燥血斑から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する設定の例証的実施態様の概略図を示す。Whatman濾紙上のＤＢＳによりＨＩＶ患者の試料を最初に、スピンカラムに配置し、固定／溶出緩衝液又は抽出緩衝液と共にインキュベーションする。ウイルス粒子をＤＢＳから抽出した後、ウイルスを含有する緩衝液を、例えば遠心又は真空のいずれかによりスピンカラム内のフィルターを通過させる。次に収集された通過した緩衝液を、さらなる試料調製並びに標的の増幅及び検出のために、CAP/CTM上に配置する。
【００１３】
【図３】図３は、Whatman 903濾紙上に固定されたＤＢＳ由来の細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法の例証的実施態様の詳細な概略図を示す。再水和及び固定時に、ほとんどの血液細胞は、濾紙の表面上に残留され、かつ細胞−結合性ＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡは、感染細胞内に含まれる一方で、細胞遊離性ウイルス粒子は、溶出緩衝液へと取り除かれる。ＨＩＶ感染細胞及び細胞デブリを含む一部の血液細胞はまた、９０３濾紙により分離され得る。遠心が実行される場合、スピンカラムフィルターは、細胞又は細胞デブリが通過することは防ぐが、溶出した細胞遊離性ウイルスは防がず、細胞遊離性ＨＩＶウイルスは通過溶液から収集される。
【００１４】
【図４】図４は、血漿ウイルス負荷に対する、乾燥血斑のＳＰＥＸ及びＰＢＳ溶出の分析成績を示している。
【００１５】
【図５】図５は、ＰＢＳ溶出を使用する、ＤＢＳと血漿のウイルス負荷の間の臨床相関を示している。補正因子０．６ｌｏｇが、適用される。
【００１６】
【図６】図６は、ＤＢＳウイルス負荷法を、参照方法としての血漿ウイルス負荷と比較するバイアスプロットを示す。
【００１７】
【図７】図７は、ＤＢＳからのウイルス負荷の測定の血漿との相関及び一致を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
ＤＢＳウイルス負荷測定への細胞−結合性ＤＮＡの寄与を低下する製品が利用可能であるが、本明細書に記載された方法は、細胞−結合性ＲＮＡ及び細胞−結合性ＤＮＡの両方を低下することができる。説明された手順は、操作が容易であり、かつ複雑な器具及び生化学処理を必要としない。重要なことに、これらの方法は、ＤＢＳに関する現存する試料収集方法を改変せず、又、存在する下流のプロトコール、例えばRMD CAP/CTM HIV-1 DFSP製品を変更しない。
【００１９】
ＤＢＳ上の細胞又は細胞デブリを破壊することなく、再水和されたＤＢＳから細胞遊離性ウイルス粒子（例えば、細胞遊離性ＨＩＶウイルス粒子）のみを溶出することができる溶液又は抽出緩衝液によるＤＢＳ（例えば、ＨＩＶ  ＤＢＳ）の再水和は、比較的大きい細胞−結合性デブリから比較的小さい細胞遊離性粒子の分離を可能にすることができる。次に遊離性ウイルス粒子からのウイルス負荷（ＶＬ）（例えば、ＨＩＶ  ＶＬ）の測定は、細胞−結合性ＲＮＡ及びＤＮＡ（例えば、ＨＩＶ  ＲＮＡ及びＤＮＡ）からの干渉を伴わずに行うことができる。
【００２０】
本発明の一態様において、ＤＢＳ（例えば、ＨＩＶ  ＤＢＳ）は、緩衝溶液中に再水和される。一実施態様において、緩衝溶液は、生物学的緩衝液及び固定試薬を含有する。例えば、メタノール（固定試薬）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（生物学的緩衝液）を使用することができ、これは細胞遊離性ウイルス粒子（例えば、細胞遊離性ＨＩＶ粒子）を優先的に溶出することができるが、再水和されたＤＢＳ（例えば、ＨＩＶ  ＤＢＳ）中の感染細胞（例えば、細胞−結合性ＨＩＶ  ＲＮＡ及びプロウイルスＤＮＡを伴うＨＩＶ感染細胞）を破壊しない。メタノール、エタノール、ホルムアルデヒド、クロロホルム、及び／又はアセトンなどの固定試薬（又は、固定剤及び脱水試薬）の例証的実施態様を、使用することができる。溶出緩衝液の例証的実施態様は、ＰＢＳなどのリン酸緩衝溶液を含むことができる。ＰＢＳは、ヒトの生理的条件に近い通常の緩衝液であり、かつメタノールは、タンパク質を沈殿することにより、細胞を固定することができる。メタノールは、免疫学的検定において穏やかな固定剤として広く使用されている。ＤＢＳ（例えば、ＨＩＶ  ＤＢＳ）が、ＰＢＳ＋メタノールにより処理される場合、細胞−結合性ウイルスＲＮＡ及びＤＮＡ（例えば、ＨＩＶ  ＲＮＡ及びＤＮＡ）は、固定された細胞内に含まれることができるが、細胞遊離性ウイルス粒子（例えば、ＨＩＶ粒子）は、ＰＢＳで再水和されたＤＢＳから溶出することができる。このＰＢＳ／メタノール溶液による細胞遊離性ウイルスの回収率は、ＳＰＥＸ緩衝液による回収率よりも低いことがあるが、この溶液は、ＤＢＳからの、細胞−結合性ウイルスＤＮＡ及びＲＮＡ（例えば、ＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡ）の放出を著しく減少することができる（実施例参照）。実験プロトコール及び手順の最適化は、ＤＢＳからのウイルス回収率を増加することができる。加えて他の緩衝液及びＰＢＳ／メタノールに類似した特性を有する溶媒とのそれらの組合せは、記載された方法の一部の実施態様において使用することができる。
【００２１】
本発明の別の態様において、ＤＢＳ（例えば、ＨＩＶ  ＤＢＳ）は、固定試薬が存在しない緩衝溶液中に再水和される。一つの追加の実施態様において、ＤＢＳは、生物学的緩衝液を含む緩衝溶液中に再水和される。別の実施態様において、生物学的緩衝液はＰＢＳである。一つの他の実施態様において、緩衝溶液は、固定試薬を含まない。このＰＢＳ−含有緩衝溶液は、再水和されたＤＢＳ中に存在する感染細胞（例えば、細胞−結合性ＨＩＶ  ＲＮＡ及びプロウイルスＤＮＡを含むＨＩＶ感染細胞）を破壊することなく、細胞遊離性ウイルス粒子（例えば、細胞遊離性ＨＩＶウイルス粒子）を優先的に溶出させるために使用することができる。ＤＢＳがＰＢＳで処理される場合、細胞−結合性ＲＮＡ及びＤＮＡは、固定された細胞内に含まれることができるのに対し、細胞遊離性ウイルス粒子は、ＰＢＳ再水和されたＤＢＳから溶出されることができる。一実施態様において、ＤＢＳは、ＨＩＶ  ＤＢＳである。
【００２２】
追加の態様において、本発明は、乾燥血斑（ＤＢＳ）から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、緩衝溶液を、乾燥血液試料へ塗布し、再水和された乾燥血液試料を作製することによる、乾燥血液試料を再水和する工程を含む。別の実施態様において、本方法は、溶出試薬により、再水和された乾燥血液試料から、細胞遊離性ウイルス粒子を溶出する工程を含む。一つの他の実施態様において、この溶出試薬は、細胞−結合性ＲＮＡ及び／又はＤＮＡを破壊することなく、細胞遊離性ウイルス粒子を優先的に溶出する。一つの追加の実施態様において、本方法は、再水和された乾燥血液試料中に存在し得るあらゆる細胞デブリから細胞遊離性ウイルスを分離する工程を含む。一実施態様において、この分離は、フィルターによる。一つの他の実施態様において、この分離工程は、任意である。別の実施態様において、本方法は、ウイルス粒子定量技術により、細胞遊離性ウイルス粒子を測定する工程を含む。一つの他の実施態様において、ウイルス粒子は、ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス粒子である。追加の実施態様において、ＲＮＡ又はＤＮＡウイルス粒子は、再水和工程時（水性緩衝溶液）及び溶出工程時（水性溶出溶液）に、水溶液中に存在し、結果的にこれらは、本方法の分離工程及び／又は測定工程における使用に適している。
【００２３】
再水和されたＤＢＳからの細胞−結合性ウイルス（例えば、ＨＩＶ）のＲＮＡ及びＤＮＡの夾雑をさらに減少するために、ＰＢＳ／メタノール（又はＰＢＳ単独）で抽出された溶出液をフィルター通過させることができ、これは抽出時にＤＢＳから抜け出す可能性がある任意の比較的大きい細胞デブリからの、溶出されたウイルス粒子の分離を可能にする。規定された細孔サイズのスピンカラムフィルターを、利用することができる。真空濾過又は遠心などの他の分離方法は、この方法の処理量を増大することができる。当業者は、他の分離方法が適し得ることを理解するであろう。一実施態様において、ＤＢＳは、ＨＩＶ  ＤＢＳである。
【００２４】
本出願の説明された方法はまた、ＤＢＳ又は全血からの、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶなどの他の血液媒介型ウイルスの単離に適用され得る。さらに本方法は、小型の核酸又はポリペプチドなどの小型の生化学分子を、大型の細胞又は細胞デブリから、単離することに広げることができる。例えば本方法は、大量の染色体ＤＮＡと細胞デブリと干渉することなく、全血から、細胞遊離性腫瘍特異的核酸又は抗原を収集するために使用することができる。本方法はまた、母体のＤＢＳ試料から循環している胎児ＤＮＡを濃縮するために使用することもできる。
【００２５】
ウイルス負荷の定期的測定は、感染した個体の、特に抗ウイルス療法（例えば、抗−レトロウイルス療法）を受けている個体の、治療計画の指針に関して重要なツールである(Arredondoら、J. Clin. Microbiol, 2012, 50(3):569)。本明細書に考察するように、血漿中のウイルス負荷の測定は、資源が限定された状況のある種の課題に直面し、乾燥血液試料中のウイルス負荷の測定は、成功が限定される。本発明の方法は、血漿試料からのウイルス負荷（ＶＬ）測定値に一致する、乾燥血液試料からのウイルス負荷測定値を得るために、使用することができる。本明細書において使用する用語「一致(concordance)」又は「と一致する」とは、少なくとも2種のウイルス負荷の測定値が、統計学的に合致(agreement)の状況にあることを指す。一部の実施態様において、乾燥血液試料のＶＬ測定値の、血漿ＶＬ測定値との一致は、約８５％〜約９９％の間である。他の実施態様において、この一致は、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％である。この一致の型は、抗−ウイルス療法の前、療法時、又は療法後での、患者に関する医学的決定時点の状況に該当する。医学的決定時点で、１ｍＬ当たりのウイルスコピー数（ｃｐ）のｌｏｇ10（又は、ｌｏｇ10ｃｐ／ｍＬ）により、患者試料中のＨＩＶウイルス負荷を測定することは一般的である。概して、ＨＩＶウイルス負荷（ＶＬ）のカットオフ値は、１０００ｃｐ／ｍＬであり、ここで＞１０００ｃｐ／ｍＬ又は＜１０００ｃｐ／ｍＬの測定値は、医学的決定を導く。例えば、測定されたｃｐ／ｍＬに応じて、医学的決断は、ＨＩＶ治療計画を開始することができ、並びに目下のＨＩＶ治療計画を継続、改変又は中止することができる。例えば、抗−レトロウイルス療法を受けているＨＩＶ患者に関して、その後のＨＩＶの＞１０００ｃｐ／ｍＬの測定値は、目下の療法はうまくいっていないことを指摘する一方で、ＨＩＶの＜１０００ｃｐ／ｍＬの測定値は、目下の療法がうまくいっていることを指摘するであろう。従って、乾燥血液試料からと血漿試料からのウイルス負荷測定値の間の一致は、このｃｐ／ｍＬは、医学的決定時点の状況において統計学的に有意な相関を明らかにしていることを意味する。実施例３表３．２に示したように、１９６名の患者試料からの対のある試料を使用し、血漿試料からの、及び本発明の方法に従う乾燥血液試料プロセス（遊離ウイルス溶出又はＦＶＥプロセスとも称す）からのウイルス負荷測定値を得た。１９６の対をなす試料のうち、（ｉ）９３は、血漿及び乾燥血液試料の両方について、ＶＬ＜１０００ｃｐ／ｍＬを有することがわかり；（ｉｉ）９３は、血漿及び乾燥血液試料の両方について、ＶＬ＞１０００ｃｐ／ｍＬを有することがわかり；並びに、（ｉｉｉ）わずかに１０が、血漿試料中＞１０００ｃｐ／ｍＬを、及び乾燥血液試料中＜１０００ｃｐ／ｍＬを有することがわかった。従って、全体的乾燥血液試料の血漿との一致は、９５％と高かった。対照的に表３．１に示したように、全体的乾燥血液試料の乾燥液体斑プロトコール（ＤＦＳＰ）を使用する血漿との一致は、はるかに低く、これは１９６の対をなす試料のうちの、６４は、血漿中で＞１０００ｃｐ／ｍＬを、しかし乾燥血液試料中では＜１０００ｃｐ／ｍＬを有するという事実のためであった。従って、全体的乾燥血液試料の血漿との一致は、わずかに６７％であった。
【００２６】
別の態様において、本発明は、医学的決断を導く目的のＨＩＶウイルス負荷（ＶＬ）測定値のカットオフ値が、約１０００ｃｐ／ｍＬ〜約５０００ｃｐ／ｍＬの間である方法を提供し、ここでこのカットオフ値を上回るＶＬ測定値は、目下の療法がうまくいっていないことを示すのに対し、このカットオフ値を下回るＶＬ測定値は、目下の療法がうまくいっていることを示す。他の実施態様において、ＶＬ測定値のカットオフ値は、約１１００ｃｐ／ｍＬ、約１２００ｃｐ／ｍＬ、約１３００ｃｐ／ｍＬ、約１４００ｃｐ／ｍＬ、約１５００ｃｐ／ｍＬ、約１６００ｃｐ／ｍＬ、約１７００ｃｐ／ｍＬ、約１８００ｃｐ／ｍＬ、約１９００ｃｐ／ｍＬ、約２０００ｃｐ／ｍＬ、約２１００ｃｐ／ｍＬ、約２２００ｃｐ／ｍＬ、約２３００ｃｐ／ｍＬ、約２４００ｃｐ／ｍＬ、約２５００ｃｐ／ｍＬ、約２６００ｃｐ／ｍＬ、約２７００ｃｐ／ｍＬ、約２８００ｃｐ／ｍＬ、約２９００ｃｐ／ｍＬ、約３０００ｃｐ／ｍＬ、約３１００ｃｐ／ｍＬ、約３２００ｃｐ／ｍＬ、約３３００ｃｐ／ｍＬ、約３４００ｃｐ／ｍＬ、約３５００ｃｐ／ｍＬ、約３６００ｃｐ／ｍＬ、約３７００ｃｐ／ｍＬ、約３８００ｃｐ／ｍＬ、約３９００ｃｐ／ｍＬ、約４０００ｃｐ／ｍＬ、約４１００ｃｐ／ｍＬ、約４２００ｃｐ／ｍＬ、約４３００ｃｐ／ｍＬ、約４４００ｃｐ／ｍＬ、約４５００ｃｐ／ｍＬ、約４６００ｃｐ／ｍＬ、約４７００ｃｐ／ｍＬ、約４８００ｃｐ／ｍＬ、約４９００ｃｐ／ｍＬ、又は約５０００ｃｐ／ｍＬである。
【００２７】
一態様において、本発明は、血漿試料からのウイルス負荷測定値と一致する乾燥血液試料からのウイルス負荷測定値を得る方法を提供する。別の態様において、本発明は、乾燥血液試料（例えば、乾燥血斑）から細胞遊離性ウイルス粒子を測定する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、乾燥血液試料を、緩衝溶液により再水和する工程を含む。別の実施態様において、乾燥血液試料は、ウイルス粒子を含むことが疑われる。他の実施態様において、緩衝溶液は、ＰＢＳを含む。追加の実施態様において、再水和工程には、溶出工程が続く。
【００２８】
別の実施態様において、本方法は、細胞−結合性核酸を破壊することなく細胞遊離性ウイルス粒子を優先的に溶出する（又は、細胞−結合性核酸の破壊が存在することなく細胞遊離性ウイルス粒子を溶出する）溶出試薬により、再水和された乾燥血液試料から、細胞遊離性ウイルス粒子を溶出する工程を含む。一実施態様において、細胞−結合性核酸は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡである。追加の実施態様において、溶出試薬は、再水和工程からの緩衝溶液と同じである。追加の実施態様において、溶出工程には、分離工程が続く。
【００２９】
別の実施態様において、本方法は、乾燥血液試料を再水和しかつ細胞−結合性核酸を破壊することなく細胞遊離性ウイルス粒子を溶出する（又は、細胞−結合性核酸の破壊が存在することなく細胞遊離性ウイルス粒子を溶出する）ために、乾燥血液試料を、緩衝溶液中でインキュベーションする工程を含む。追加の実施態様において、このインキュベーション工程には、分離工程が続く。
【００３０】
一つの他の実施態様において、本方法は、細胞遊離性ウイルスを、再水和された乾燥血液試料から分離する工程を含む。一実施態様において、この分離工程は、再水和された乾燥血液試料中に存在し得るあらゆる細胞デブリから、細胞遊離性ウイルスを分離することを含む。別の実施態様において、この分離工程は、遠心又は真空によるスピンカラム濾過を含むが、これらに限定されるものではない、濾過を含む。一部の実施態様において、濾過は、約０．１μｍ〜約１００μｍの間の細孔サイズを有するフィルターの使用を含む。追加の実施態様において、分離工程は、再水和工程及び／若しくは溶出工程により先行されるか、又はインキュベーション工程により先行される。
【００３１】
一態様において、本方法は、分離工程から得られた試料を基に、測定する工程を含む。一実施態様において、この測定工程は、分離工程後に得られた試料中の細胞遊離性ウイルス粒子の量を測定することを含む。別の実施態様において、この測定工程は、血漿試料からのウイルス負荷測定値と一致する、試料からのウイルス負荷測定値を得ることを含む。一つの別の実施態様において、測定工程は、ウイルス粒子の定量を含む。一部の実施態様において、ウイルス粒子の定量技術は、配列−特異的核酸定量、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、等温核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、及び電子顕微鏡からなる群から選択される。当業者は、他のウイルス粒子定量技術が、本明細書記載の方法での使用に適し得ることを理解するであろう。
【００３２】
一実施態様において、本明細書に記載された方法は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＣＭＶ、及びＥＢＶを含むが、これらに限定されるものではない様々なウイルスの測定に適している。
【００３３】
本明細書に記載されたように、CAP/CTM HIV-1試験乾燥液体斑手順は、核酸を抽出するための、乾燥血液試料のカオトロピック試薬（ＳＰＥＸ緩衝剤）とのインキュベーションに関係している。この手順はまた、５６℃、１０００ｒｐｍで、１０分間連続振盪しながらの、緩衝液中の試料のインキュベーションを必要としている。一態様において、本発明は、加熱又は上昇した温度及びボルテックス又は振盪の使用が任意であるか又は不要である、細胞遊離性ウイルスを乾燥血液試料から抽出する方法を提供する。一実施態様において、本明細書に記載された方法は、加熱若しくは上昇した温度の非存在下並びに／又はボルテックス若しくは振盪の非存在下で実行される。別の実施態様において、再水和、溶出、インキュベーション、及び分離の工程の少なくとも一つ又は全ては、（ｉ）加熱又は上昇した温度を伴わないか又は非存在下で；（ｉｉ）ボルテックス又は振盪の非存在下又は伴わないで；並びに／あるいは、（ｉｉｉ）外界温度で：実行される。用語「外界温度」とは、乾燥血液試料が、本発明の方法に従い緩衝液と接触される温度を示す。一般に外界温度は、温度−制御された周囲の温度である。外界温度は、約１８℃〜約３０℃の範囲である。一実施態様において、外界温度は、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８°℃、約２９℃、又は約３０℃である。
【００３４】
一つの他の実施態様において、再水和されるべきＤＢＳは、ＥＤＴＡ−全血を含む。ＥＤＴＡは、非限定的に、保存剤、抗凝固薬、及び／又は抗菌薬を含む血液試料において使用される場合に、有益な特性を有する。当業者は、他の保存剤／抗凝固薬／抗菌薬も、血液試料及び本明細書記載の方法の目的であるそれに対応するＤＢＳにおける使用に適し得ることを理解するであろう。
【００３５】
本開示の実施態様はさらに、以下の実施例において説明されるが、これらは請求項により説明される本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例
下記の実施例及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付された請求項において示される。本発明の精神から逸脱しない限りは、示された手順において変更を行うことができることは理解されるべきである。
【００３７】
実施例１
プロトコール：
１．  血液をWhatman 903フィルターカード上にスポットし、かつこれを乾燥させるという、標準法を用い、試験されるＤＢＳ試料を収集する。
２．  乾燥血斑を、Whatmanフィルターカードから切り出し、適切にラベルされたＳ字チューブ及びスピンフィルターカラムに配置する。
３．  ＤＢＳを含むチューブに、ＰＢＳ緩衝液中の１０％メタノール１０００μｌを添加する。スピンカラムへ添加する場合は、緩衝液５００μｌのみを添加する。
４．  Ｓ字チューブ又はスピンフィルターカラムを、５６℃、１０００ｒｐｍのインキュベーター内に１０分間配置する。
ａ．ＤＢＳが、Ｓ字チューブ内に直接配置される場合は、工程４を飛ばす。
５．  カラムを、微量遠心機内で、短く遠心する(VWR 0.2μm遠心フィルターを使用する場合、最大速度５０００×ｇで５〜１０分間回転させる）。その後、スピンカラムを取り外し、ディスポーズし、かつ緩衝液５００μｌを収集チューブに添加する。
６．  試料を、COBAS(登録商標)AmpliPrep上に装加し、HI2DFSP96プロトコールを開始する。
【００３８】
材料：COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)96；COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)HIV-1試験乾燥液体斑手順RUOキット；Whatman 903フィルターカード(Whatman社カタログ番号95026-896)；ＰＢＳ中の１０％メタノール溶液；並びに、VWR遠心フィルター、カタログ番号82031-356、細孔サイズ０．２μｍ。
【００３９】
結果：異なる塩及び界面活性剤、例えばＮａＣｌ（３Ｍ）、Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１％）、ＳＤＳ（１％）、及びメタノール（１０％）を含むＰＢＳ緩衝液を、評価した。ＳＰＥＸは、比較するための陽性対照である。本実験において、ＳＰＥＸ緩衝液は、様々な個別の緩衝液により単純に置き換えた。ＤＢＳを含有するＳ字チューブは、５６℃で１０分間振盪しながらインキュベーションした。抽出後、通常のCAP/CTM HIV-1 DFSPプロトコールに従った(「COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)HIV-1試験乾燥液体斑手順」の添付文書を参照されたい)。全血（ＷＢ）にスパイクされたＨＩＶウイルス及びＨＩＶ細胞の濃度は、かなり低いので（約５００ｃｐ／ＤＢＳ又は７Ｅ３ｃｐ／ｍＬ、１２細胞／ＤＢＳ又は１．２Ｅ３細胞／ｍＬ）、ウイルス力価はわずかに＜４００ｃｐ／ｍＬを示した。そのため、ウイルス力価の代わりに、標的のＣｔ値を、様々な緩衝液を比較するために使用した。これらの試料中のほぼ全てのＱＳが、正常に挙動した。
【００４０】
表１に示したように、１０％メタノールを含むＰＢＳは、ＳＰＥＸ緩衝液と比べ、ＨＩＶウイルス粒子を、ウイルススポットされたＷＢ  ＤＢＳから比較的効果的に溶出することができた。ＰＢＳ／ＭｅＯＨによるＣｔ遅延は、最適を下回る抽出及び溶出条件によるものである。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表２に示したように、ＰＢＳ／ＭｅＯＨのみが、ＳＰＥＸと比べ、遅延したＣｔを伴い、ＨＩＶ細胞でスパイクされたＷＢから細胞−結合性ＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡの検出可能な微量を溶出することができる。別の言い方をすると、ＰＢＳ／ＭｅＯＨは、ＨＩＶ細胞でスパイクされたＤＢＳからの、細胞−結合性ＨＩＶ  ＤＮＡ及びＲＮＡの溶出を有意に低下した。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
ＨＩＶウイルスとＨＩＶ陽性細胞が一緒に混合され、かつＷＢへスパイクされる場合、表３に示したように、ＳＰＥＸは、両方を効果的に溶出することができるのに対し、ＰＢＳ／ＭｅＯＨは、ＨＩＶウイルス単独のＣｔ（表１）に類似したＣｔで、ＨＩＶウイルスのみを溶出することができる。
【００４５】
【表３】
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【００４６】
表４は、ウイルスでスパイクされたＤＢＳと、ウイルスと細胞の両方でスパイクされたＤＢＳの間のＣｔの差異をまとめている。ＳＰＥＸ緩衝液が使用される場合には、ＨＩＶ細胞からの寄与のために、明確に、大きいＣｔ差が存在するのに対し、ＰＢＳ／ＭｅＯＨ緩衝液が使用される場合は、はるかに小さいＣｔ差が存在し、このことは、ＰＢＳ／ＭｅＯＨは、ＤＢＳ中のＨＩＶ細胞の存在とは関わりなく、細胞遊離性ウイルスのみを溶出することを示唆している。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
参考文献：
Johanson, H.C.、V. Hyland、C. Wicking、R.A. Sturm、2009, 「変性メタノール固定法を使用するWhatman FTAクラシックカード上に保存された口腔細胞からのDNA溶出（DNA elution from buccal cells stored on Whatman FTA Classic Cards using a modified methanol fixation method）」、BioTechniques、第46巻4号； Medecins Sans Frontieres Access Campaign, 2013, 「試験のためのHIV治療の配置：ウイルス負荷及び治療時点でのCD4診断ツールのための製品ガイド；感染性ウイルス粒子を生じることなくAIDSウイルス抗原を産生する8E5細胞株 (Putting HIV treatment to the test: A product guide for viral load and point-of-care CD4 diagnostic tools; 8E5 cell line Producing Aids Viral Antigens without producing infectious virus particles)」：米国特許第4,752,565号；「SeraCareから培養されたウイルス粒子、分析の検定(Cultured virus particles from SeraCare, Certificate of Analysis )」(Part No: PN-227; Lot #: 51884)。
【００４９】
実施例２
プロトコール：
１．  ＨＩＶ陽性ＥＤＴＡ全血をWhatman 903フィルターカード上にスポットし、かつこれを少なくとも３時間乾燥させるという標準法を用い、試験されるＤＢＳ試料を収集する。[Munktellカードも作業する]。
２．  乾燥血斑を、Whatmanフィルターカードから切り出し、適切にラベルされたＳ字チューブに配置する。
３．  ＤＢＳを含むチューブに、ＰＢＳ緩衝液１０００μｌを添加する。
４．  外界温度で少なくとも３０分間インキュベーションする。
ａ．  加熱及び振盪（任意に）、
ｂ．  望ましいならば、インキュベーション時間を一晩まで延長することができる。
５．  試料を、COBAS(登録商標)AmpliPrep上に装加し、HI2DFSP96プロトコールを開始する。
【００５０】
材料：COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)96；COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)HIV-1試験乾燥液体斑手順RUOキット；Whatman 903フィルターカード；ＰＢＳ(Mediatech社、Corning Cellgro社により製造、カタログ番号21-040-CV)。
【００５１】
結果：本方法の成績の研究には、ウイルス負荷が未検出から＞１０5コピー／ｍＬまでの範囲である１５７名のＨＩＶ−感染対象からの、乾燥血斑及び血漿試料の対を使用した。この新規方法（ＰＢＳ抽出）の成績を、古い方法（ＳＰＥＸグアニジン緩衝液による抽出）の成績と比較した。この血漿ウイルス負荷を、優れた標準として使用した。
【００５２】
ＤＢＳは、ＥＤＴＡ−全血から作製した。血漿ウイルス負荷は、通常の血漿CAP/CTM HIV-1 v2.0プロトコールにより測定した。ＳＰＥＸ抽出は、通常のＤＦＳＰプロトコールに従い、これは５６℃で１０分間振盪しながらのインキュベーションを含んだ。ＤＢＳのＰＢＳ溶出は、１ｍＬ  ＰＢＳを含むＳ字チューブにおいて、室温で、振盪せずに行った。溶出時間は、３０分間から一晩まで変動した。抽出後、CAP/CTM HIV-1 DFSPプロトコールに従う通常の標的の増幅及び検出を、続けた(「COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)HIV-1試験乾燥液体斑手順」の添付文書を参照されたい)。
【００５３】
図４に示したように、ＤＦＳＰ法は、低い血漿ウイルス負荷の試料の過剰定量を生じた。対照的に、遊離ウイルス溶出法は、この範囲で、はるかに少ない過剰定量を示した。この遊離ウイルス溶出法は、およそ０．６ｌｏｇ10の試験範囲にわたり、系統だった過小定量を生じなかった。この過小定量の一部である０．３ｌｏｇ10は、全血はわずかに５０％が血漿であるという事実により説明することができ、かつ使用される試験定義ファイルは、この要因を考慮していない。
【００５４】
図５に示したように、ＰＢＳ溶出と血漿ウイルス負荷の改善された相関は、改善された臨床的一致も生じた。これは、補正因子０．６ｌｏｇが適用される場合に、特に注目される。
【００５５】
実施例３
乾燥血斑（ＤＢＳ）は、ＨＩＶウイルス負荷試験へのアクセスを改善するが、細胞−結合性ウイルス核酸のために、血漿からとは異なる結果を生じる。以下の実験を、リン酸−緩衝食塩水によるＤＢＳ試料からの血漿−結合したウイルスの優先的溶出に関する遊離ウイルス溶出（ＦＶＥ）法を評価するために行った。
【００５６】
方法：標準COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)(CAP/CTM)乾燥液体斑手順(DFSP)に関して、添付文書説明に従い、ＤＢＳを、グアニジン−ベースの試料プレ−抽出（ＳＰＥＸ）緩衝液により抽出した(Roche Molecular Systems社、COBAS(登録商標)AmpliPrep/COBAS(登録商標)TaqMan(登録商標)HIV-1試験乾燥液体斑手順RUO添付文書、Roche Molecular Systems社、プレザントン、CA、USA)。遊離ウイルス溶出（ＦＶＥ）プロトコールに関して、各ＤＢＳを、COBAS(登録商標)Ｓ字試料チューブ内で、カルシウム及びマグネシウム−非含有リン酸緩衝食塩水１ｍＬ（ＰＢＳ、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、５．６ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１．１ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．４；Corning社)の中で、室温で３０分間以上、振盪せずにインキュベーションした。次にこのＰＢＳ溶出液を、乾燥液体斑（ＤＦＳＰ）試験定義ファイルソフトウェア（同上）を使用し、通常のTaqMan HIV-1試験v2.0ワークフローにより、Ｓ字チューブへ直接進めた（ＤＢＳ紙を取り除くことなく）。
【００５７】
（ｉ）精製されたウイルス８Ｅ５；（ｉｉ）８Ｅ５ウイルスから精製されたＲＮＡ；又は、（ｉｉｉ）８Ｅ５細胞株からの洗浄されたＨＩＶ−含有細胞：によりスパイクされたＨＩＶ−陰性血液を試験するために、ＤＢＳのモデルシステムを用いて、ＦＶＥ作用様式を調査した(Folks TMら、1986、「後天性免疫不全症候群レトロウイルスに感染した生存しているクローニングされたLeu-3-細胞の生物学的及び生化学的特徴化(Biological and biochemical characterization of a cloned Leu-3-cell surviving infection with the acquired immune deficiency syndrome retrovirus)、J Exp Med. 164:280-290)。最後に、臨床成績試験は、１９６名のＨＩＶ−感染患者由来の対にしたＤＢＳ試料及び血漿試料を使用した（オン及びオフ抗レトロウイルス療法）。ＦＶＥ法により処理した臨床試料由来のＶＬ結果を、参照方法としてCAP/CTM HIV-1試験v2.0により測定した血漿ＶＬによるＤＦＳＰプロトコール由来の結果と比較した。ＦＶＥ及びＤＦＳＰの両方に関して、本アッセイは、ＤＢＳと血漿標本の間の容積差について補正する。＋０．３ｌｏｇ追加は、下記の理由のために全てのＦＶＥ結果に追加した。ＦＶＥは、全血試料のおよそ５０％を占める血液の血漿画分のみ溶出すると考えられる。
【００５８】
結果：スパイクされた試料による実験は、ＳＰＥＸ（全ての細胞遊離性及び細胞−結合性ウイルス核酸を本質的に溶出する）と比較して、ＤＢＳからのＰＢＳ溶出は、細胞遊離性ウイルスの方が、細胞−結合性ＨＩＶ核酸よりもおよそ５倍より選択的であることを認めた。ＰＢＳ溶出の使用は、幅のあるインキュベーション時間及び温度にわたり、反復試料で、測定値間で０．３ｌｏｇ未満の差異と規定された一貫しかつ定量的な溶出を認めた。２３℃で、０．５、２及び１２時間のインキュベーション時間により測定されたウイルス負荷は、各々、３．１０、３．１４及び３．１１  ｌｏｇ  ｃｐ／ｍＬ  ＶＬであった。温度２３、５６及び７０℃での０．５時間のインキュベーションを比較し、測定されたウイルス負荷は、各々、３．３８、３．３４及び３．２０  ｌｏｇ  ｃｐ／ｍＬ  ＶＬであった。
【００５９】
ＰＢＳは、グアニジンカオトロピック緩衝液が提供するＲＮａｓｅ失活をもたらさないので、高レベルの外因性ＲＮａｓｅの存在下で試料安定性を評価した。臨床的ＨＩＶ−陽性ＤＢＳ試料の溶出液は、分解に抵抗性であり、ＲＮａｓｅを含まずに定量サイクル（Ｃｑ値）３１．２を、及びＲＮａｓｅを含みＣｑ値３２．９であった。全ウイルスによりスパイクされたＨＩＶ−陰性ＤＢＳ試料の溶出液も、分解に対し抵抗性であり、ＲＮａｓｅを含まずに定量サイクル（Ｃｑ値）２７．４を、及びＲＮａｓｅを含みＣｑ値２７．１であった。対照的に、裸のウイルスＲＮＡによりスパイクされたＨＩＶ−陰性ＤＢＳ試料の溶出液は、ＲＮａｓｅを含まずにＣｑ値２２．４を、及びＲＮａｓｅを含みＣｑ値３４．２を示した。
【００６０】
本方法の臨床評価は、オン及びオフの両方の抗レトロウイルス治療の１９６名のＨＩＶ患者由来の対にしたＤＢＳ試料及び血漿試料を使用し、血漿ＶＬは、未検出から１０6コピー／ｍＬまでの範囲であった。参照方法として血漿ウイルス負荷を使用し、ＰＢＳ溶出法は、ＤＦＳＰプロトコールと比べ、ＤＢＳ由来のＶＬの過剰定量を減少した（図６）。
【００６１】
図６は、ＤＢＳウイルス負荷方法を、参照方法としての血漿ウイルス負荷と比較するバイアスプロットを示している。これらの記号は、ＰＢＳ溶出（●）及びＳＰＥＸ（グアニジン）溶出（Δ）を示している。ＰＢＳ値は、容積補正係数＋０．３ｌｏｇで調節した。血漿と比べ、ＰＢＳは、平均差−０．３１  ｌｏｇ10コピー／ｍＬ及び標準偏差０．７２  ｌｏｇ10コピー／ｍＬを示すのに対し、ＳＰＥＸは、平均差＋０．９４  ｌｏｇ10コピー／ｍＬ及び標準偏差１．０７  ｌｏｇ10コピー／ｍＬを示した。
【００６２】
ＤＢＳの標準グアニジンＳＰＥＸ抽出により、１０００ｃｐ／ｍＬの医学的決定時点でのＤＢＳと血漿の間の一致は、過剰定量されたウイルス負荷のために、わずかに６７％であり、このことは、血漿ウイルス負荷１０００ｃｐ／ｍＬ未満を有する患者の６９％を治療失敗として誤って分類した（表３．１及び図７参照）。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
ＳＰＥＸ抽出は、感度１００％及び特異度３１％で行い、血漿ウイルス負荷により規定されるウイルス学的失敗は、ＰＰＶの６２％及びＮＰＶの１００％であった。
【００６５】
図７は、ＤＢＳ由来のウイルス負荷測定値の血漿との相関及び一致を示している。記号は、ＰＢＳ溶出（●）及びＳＰＥＸ（グアニジン）溶出（Δ）を示している。ＰＢＳ値は、容積補正係数＋０．３ｌｏｇで調節した。治療失敗を示すためにウイルス負荷のカットオフ値１０００ｃｐ／ｍＬを使用し、ＤＢＳにより誤分類される可能性のある患者は、影付き領域により示している。
【００６６】
ＰＢＳ溶出により、抑制された患者は全員、正確に分類されたが、ウイルス負荷１０００ｃｐ／ｍＬを上回る患者の１０％は、ここでは治療成功として分類された（表３．２参照）。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
血漿との全体的ＤＢＳの一致は、９５％まで有意に改善された（ｐ＜０．０５、両側ｚ検定）。ＰＢＳ溶出は、感度９０％及び特異度１００％で行い、血漿ウイルス負荷により規定されるウイルス学的失敗は、ＰＰＶの１００％及びＮＰＶの９０％であった。
【００６９】
ＤＢＳのＰＢＳ  ＨＩＶ溶出は、標準グアニジン抽出プロトコールと比較した場合に、血漿に対するＤＢＳにおけるＨＩＶ  ＶＬの過剰定量を有意に減少した。この溶出は、追加の液体移動工程又は装置を伴わずに達成することができる。いずれかの理論に結びつけられるものではないが、モデルシステム実験は、本方法は、試料から遊離ウイルス成分を選択的に溶出するように作動するのに対し、細胞−結合性ＨＩＶ核酸は、紙に保持されることを示唆している。ＰＢＳへのＲＮａｓｅ  Ａの追加は、ウイルス定量を変化せず、このことは、ＰＢＳにより溶出されたＲＮＡ鋳型は、保護的ウイルス構造内に被包され得ることを示唆している。このＦＶＥプロトコールは、６７％から９５％まで、血漿ＶＬ＞１０００ｃｐ／ｍＬとして規定されたウイルス学的失敗に関する全体的合致の割合を改善し、かつウイルス学的失敗に関する感度９０％及び特異度１００％を明らかにした。遊離ウイルスを細胞物質から分離するためのＰＢＳ溶出工程の使用は、ＤＢＳ中のＨＩＶ  ＶＬの過剰定量を有意に減少する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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