(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中間中胚葉細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程を含む、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を製造する方法。
【請求項２】
前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中間中胚葉細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＦβシグナル刺激剤が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＭＰ阻害剤が、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９およびＤＭＨ１からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＧＦβシグナル刺激剤がＴＧＦβ１であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ１である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記中間中胚葉細胞が、多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞である、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記中間中胚葉細胞が、以下の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含む方法で製造された中間中胚葉細胞である、請求項７に記載の方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
【請求項９】
前記工程（ｉｉ）が以下の工程（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）を含む、請求項８に記載の方法。
（ｉｉ−１）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ−２）工程（ｉｉ−１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
【請求項１０】
前記工程（ｉｉ−１）が、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地で培養する工程であり、前記工程（ｉｉ−２）が、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体を含む培地で培養する工程である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レチノイン酸誘導体が、ＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢである、請求項８から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項７から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
多能性幹細胞から腎前駆細胞を製造する方法であって、以下の工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む、方法：
（ｉ）多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養する工程。
【請求項１６】
前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｉｉ）で得られた細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＴＧＦβシグナル刺激剤が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＢＭＰ阻害剤が、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９およびＤＭＨ１からなる群から選択される１以上の物質である、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＧＦβシグナル刺激剤がＴＧＦβ１であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ１である、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ｉｉ）が以下の工程（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）を含む、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
（ｉｉ−１）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ−２）工程（ｉｉ−１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
【請求項２２】
前記工程（ｉｉ−１）が、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地で培養する工程であり、前記工程（ｉｉ−２）が、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体を含む培地で培養する工程である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記レチノイン酸誘導体が、ＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢである、請求項１５から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１５から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法に関する。本発明はまた、そのようにして得られた腎前駆細胞を含む腎疾患の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、生体内における代謝活動により生じる有害物質などの老廃物を血中から濾過することで除去し、身体の健康維持を図るべく機能する重要な臓器の一つである。腎臓の疾患として、腎不全等が挙げられ、治療方法としては人工透析を挙げることができる。しかし、この治療に要する医療費負担が大きいことから、医学的のみならず医療経済面からも依然として世界的な問題である。また、他の治療として腎移植が挙げられるが、深刻なドナー臓器不足の状態である。
一方、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）など多能性を有する細胞がこれまでに報告されている（特許文献１および２）。そこで、腎不全の治療方法として、これらの多能性幹細胞から分化誘導された腎細胞を移植する治療法が検討されている。さらに、これらの多能性幹細胞由来の均一な腎細胞を用いて治療薬の開発を行うことも視野に入れられている。
哺乳類の腎臓は前腎、中腎、後腎の３段階を経て形成されており、そのうち後腎は、中間中胚葉の後方領域に生じることが知られている。これまで、腎形成のためにマウス多能性幹細胞から中間中胚葉への分化誘導方法が検討されており（非特許文献１）、中間中胚葉の特徴的なマーカーとしてＯＳＲ１が確認されている。また、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを使用して緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を内在性のＯＳＲ１対立遺伝子との相同組換えで導入したヒトｉＰＳ細胞（ＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞）を作製し、この細胞を用いた検討により、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ｗｎｔ、ＢＭＰおよび各種低分子化合物を用いてヒト多能性幹細胞から中間中胚葉への分化誘導に成功している（非特許文献２、特許文献３）。
腎組織への移植を考慮すると、中間中胚葉よりさらに腎臓への分化が進んだ腎前駆細胞を誘導することが好ましく、腎前駆細胞を特徴付ける因子の１つとしてＳＩＸ２が知られている（非特許文献４）。しかし、これまでに中間中胚葉から腎前駆細胞へ人工的に誘導させる方法は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，８４３，７８０号
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２０１２／０１１６１０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３９３：８７７−８２
【非特許文献２】Ｍａｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１３６７
【非特許文献３】Ｏｓａｆｕｎｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３３：１５１−６１
【非特許文献４】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．３：１６９−８１
【発明の概要】
【０００５】
本発明の課題は、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法を提供することにある。より具体的には、多能性幹細胞から誘導した中間中胚葉細胞をさらに腎前駆細胞へ分化誘導する工程を含む、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法を提供することにある。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養を行うことにより、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導できることを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］中間中胚葉細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養し、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を誘導する工程を含む、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞の製造方法。
［２］前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、［１］に記載の方法。
［３］前記中間中胚葉細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記ＴＧＦβシグナル刺激剤が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２からなる群から選択される１以上の物質である、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記ＢＭＰ阻害剤が、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ＬＤＮ１９３１８９およびＤＭＨ１からなる群から選択される１以上の物質である、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記ＴＧＦβシグナル刺激剤がＴＧＦβ１であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ１である、［１］から［３］のいずれかに記載の方法。
［７］前記中間中胚葉細胞が、多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞である、［１］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記中間中胚葉細胞が、以下の工程（ｉ）および（ｉｉ）を含む方法で製造された中間中胚葉細胞である、［７］に記載の方法。
（ｊ）多能性幹細胞を、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
［９］前記工程（ｉｉ）が以下の工程（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）を含む、［８］に記載の方法。
（ｉｉ−１）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ−２）工程（ｉｉ−１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
［１０］前記工程（ｉｉ−１）が、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地で培養する工程であり、前記工程（ｉｉ−２）が、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体を含む培地で培養する工程である、［９］に記載の方法。
［１１］前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［８］から［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記レチノイン酸誘導体が、ＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢである、［８］から［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［７］から［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［１３］に記載の方法。
［１５］多能性幹細胞から腎前駆細胞を製造する方法であって、以下の工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む、方法。
（ｉ）多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養する工程。
［１６］前記腎前駆細胞がＳＩＸ２陽性細胞である、［１５］に記載の方法。
［１７］前記工程（ｉｉ）で得られた細胞がＯＳＲ１陽性細胞である、［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］前記ＴＧＦβシグナル刺激剤が、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２からなる群から選択される１以上の物質である、［１５］から［１７］のいずれかに記載の方法。
［１９］前記ＢＭＰ阻害剤が、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９およびＤＭＨ１からなる群から選択される１以上の物質である、［１５］から［１８］のいずれかに記載の方法。
［２０］前記ＴＧＦβシグナル刺激剤がＴＧＦβ１であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＤＭＨ１である、［１５］から［１７］のいずれかに記載の方法。
［２１］前記工程（ｉｉ）が以下の工程（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）を含む、［１５］から［２０］のいずれかに記載の方法。
（ｉｉ−１）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ−２）工程（ｉｉ−１）で得られた細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
［２２］前記工程（ｉｉ−１）が、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地で培養する工程であり、前記工程（ｉｉ−２）が、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体を含む培地で培養する工程である、［２１］に記載の方法。
［２３］前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、［１５］から［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記レチノイン酸誘導体が、ＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢである、［１５］から［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］前記多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、［１５］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］前記ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［２５］に記載の方法。
［２７］［１］から［２６］のいずれかに記載の方法で製造された、腎前駆細胞。
［２８］［１］から［２６］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞を含む、医薬組成物。
［２９］［１］から［２６］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞を含む、腎疾患治療剤。
［３０］［１］から［２６］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞を、治療を必要とする患者に投与する工程を包含する、腎疾患を治療する方法。
［３１］腎疾患の治療に使用するための、［１］から［２２］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞。
［３２］腎疾患の治療用の医薬組成物の製造における、［１］から［２６］のいずれかに記載の方法で製造された腎前駆細胞の使用。
本発明によって中間中胚葉から腎前駆細胞へ人工的に誘導することが初めて可能となった。さらに、本発明によって多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞）から腎前駆細胞へ人工的に誘導することが初めて可能となった。また、本発明の方法で製造された腎前駆細胞は、腎疾患モデル動物における治療効果を有することが確認された。本発明の方法で製造された腎前駆細胞は、腎不全等の腎疾患の治療または再生医療に使用され得る。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−１２３０７２号（出願日：２０１３年６月１１日）ならびに２０１４−９２１０８号（出願日：２０１４年４月２５日）の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、実施例２〜４における分化誘導後のＳＩＸ２陽性細胞の含有率を示す。図１Ａは対照としてＤＭＳＯを含む培地で培養した結果を示す。図１Ｂは、誘導方法１（実施例２）による結果を示す。図１Ｃは、誘導方法２（実施例３）による結果を示す。図１Ｄは、誘導方法３（実施例４）による結果を示す。図中、ｔｄＴｏｍａｔｏは、レポーター遺伝子を示す。
図２は、実施例５における分化誘導後のＳＩＸ２陽性細胞の含有率を示す。図２Ａは対照としてＤＭＳＯを含む培地で培養した結果を示す。図２Ｂ、ＣおよびＤは、誘導方法１のステージ３においてドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）の代わりに、それぞれノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）、ＬＤＮ１９３１８９およびＤＭＨ１を用いた場合の結果を示す。図２ＥおよびＦは、誘導方法１のステージ３においてＴＧＦβ１の代わりに、それぞれＩＤＥ１およびＩＤＥ２を用いた場合の結果を示す。図２Ｇは、誘導方法１のステージ３において、ＴＧＦβ２およびＬＤＮ１９３１８９を用いた場合の結果を示す。図２Ｈは、誘導方法１のステージ３において、ＴＧＦβ３およびＬＤＮ１９３１８９を用いた場合の結果を示す。
図３は、ヒトｉＰＳ細胞からＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋腎前駆細胞を作製する方法の一例を示す。図３Ａは、ＥＢ（胚様体）三次元培養を使用するＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋腎前駆細胞への分化方法を示す。図３Ｂは、フローサイトメトリーによるＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の経時的な分化パターン分析を示し、具体的には細胞集団の二次元分布の結果を示す（ｎ＝５）。図３Ｃは、分化細胞集団中の表示した各遺伝子に対するｍＲＮＡ発現のタイムコース分析を示す。グラフはＤａｙ１〜Ｄａｙ２８におけるβアクチン発現に対する相対発現量を示す（ｎ＝３）。図３Ｄは、実施例７におけるフローサイトメトリーによるＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の経時的な分化パターン分析を示し、具体的には該細胞集団のタイムコース分析の結果を示す（ｎ＝５）。図３Ｄ中、ｄ１はＤａｙ１でのｉＰＳ細胞、ｄ３はＣＨＩＲ９９０２１とアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）Ａを含有する培地（ステージ１）で作製したＥＢ（Ｄａｙ３）の結果を示す。図３Ｄ中、ｄ６〜ｄ２８は、Ｄａｙ６〜Ｄａｙ２８までのＤＭＳＯ群（ＤＭＳＯと記す）及びＴＧＦβ１＋ＴＴＮＰＢ処理群（Ｔｘと記す）の結果を示す。ステージ２（Ｄａｙ３〜Ｄａｙ６）でＣＨＩＲ９９０２１とＢＭＰ７を含む培地で３日間培養後、Ｄａｙ６でＤＭＳＯ群とＴｘ群に分け、ステージ３及びステージ４での培養を行った。なお、ＤＭＳＯ群では、ステージ３においてＴＧＦβ１及びＴＴＮＰＢに代えてＤＭＳＯを含む培地で培養し（Ｄａｙ８で同じ培地に交換した）、ステージ４においてＴＧＦβ１及びＤＭＨ１に代えてＤＭＳＯを含む培地で培養した（３日に１度同じ培地に交換した）。図３Ｅは、培養２８日目の４Ａ６Ｃ３−１０から分化したＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋腎前駆細胞における腎前駆細胞マーカー発現を示す。
図４は、ヒトｉＰＳ細胞からのＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞誘導に対するＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤の各組み合わせの効果を示す。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表す（ｎ＝５）。
図５は、種々のヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞での誘導方法４による分化誘導の結果（ＯＳＲ１発現量（図５Ａ）及びＳＩＸ２発現量（図５Ｂ））を示す。４Ａ６Ｃ３−１０での発現量に対する各細胞におけるＯＳＲ１及びＳＩＸ２の相対発現量を示す。
図６は、腎前駆細胞の評価試験の結果を示す。図６Ａは、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞をＲＥＧＭ培地中で７日間培養した後の免疫染色像を示す。図中、ＮＥＰＨＲＩＮは、糸球体ポドサイトのマーカー、ＡＱＰ１およびＭＥＧＡＬＩＮは、近位尿細管のマーカー、およびＵＲＯＭＵＣＯＩＤは、ヘンレのループのマーカーを示す。これらの各マーカーはピンク色で、また核は青色でそれぞれ染色されている。スケールバーは、５０μｍを示す。図６Ｂは、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の細胞塊をＷｎｔ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３と７日間共培養した後の顕微鏡像（左図）および免疫染色像（３つの右図）を示す。図６Ｃは、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の細胞塊をＥ１１．５のマウス胚脊髄と７日間共培養した後の顕微鏡像（左図）および免疫染色像（３つの右図）を示す。図６Ｄは、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の細胞塊をＥ１１．５のマウス胚後腎細胞と器官培養した後の免疫染色像を示す。図６Ｅは、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の細胞塊をＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊの副睾丸脂肪組織へ移植した後の組織を免疫染色した像を示す。図中、ＷＴ１およびＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮ（ＰＯＤＸ）は糸球体ポドサイトのマーカー（それぞれ赤色、ピンク色）を、ＬＴＬは近位尿細管のマーカー（赤色）を、ＬＡＭＩＮＩＮは極性上皮のマーカー（ピンク色）を、ＣＤＨ１は遠位尿細管のマーカー（ピンク色）を、およびＣＤＨ６は腎小胞のマーカー（ピンク色）を示し、ＨｕＮｕはヒト核（緑色）を示し、マウス核は青色で染色されており、またスケールバーは、５０μｍを示す。図６Ｆは、ｉＰＳ細胞由来の各分画（ＯＳＲ１−ＳＩＸ２−、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２−、ＯＳＲ１−ＳＩＸ２＋、およびＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋）の細胞塊をＥ１１．５のマウス尿管芽と７日間器官培養した後の顕微鏡像（左図）およびＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞塊と尿管芽の共培養の免疫染色像（右図）を示す。図中、ＤＢＡは、尿管芽のマーカー（赤色）を示し、スケールバーは、５０μｍを示す。ＨｕＮｕはヒト核（緑色）、マウス核は青色でそれぞれ染色されている。
図７は、マウス腎疾患モデルへの移植実験の結果を示す。図７ＡおよびＢは、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の細胞塊を腎実質への移植後２週間でのマウス急性腎障害（ＡＫＩ）モデル（図７Ａ）及びマウス慢性腎不全モデル（図７Ｂ）の腎臓切片の免疫染色像を示す。ＬＴＬおよびＡＱＰ１は近位尿細管のマーカーを示し、それぞれ緑色、赤色で染色されている。ＨｕＮｕは、ヒト核（ピンク色）を示し、スケールバーは、５０μｍを示す。図７Ｃは、ｈｉＰＳＣ−ＲＰ（ｎ＝１０、ｉＰＳＣ−ＲＰｓ、三角）、未分化ヒトｉＰＳ細胞（ｎ＝１０、ｉＰＳＣｓ、四角）、又は生理食塩水（ｎ＝１０、Ｓａｌｉｎｅ、丸）の腎臓被膜下移植を受けたＡＫＩモデルマウスにおける、ＢＵＮレベル及び血清Ｃｒレベルのタイムコース分析を示す［＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１  ｖｓ  Ｓａｌｉｎｅ］。図７Ｄは、ｈｉＰＳＣ−ＲＰ（ｉＰＳＣ−ＲＰｓ）又は生理食塩水（Ｓａｌｉｎｅ）を移植したマウス由来の腎組織の組織学的所見を示す。腎組織を虚血再灌流後（Ｉ／Ｒ）３日目に過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ、上）又はマッソントリクローム（ＭＴ、下）染色で染色した。図７Ｅは、Ｉ／Ｒ後３日目の宿主腎臓における円柱を伴う内腔の拡張した尿細管（Ｄｉｌａｔｅｄ  ｔｕｂｕｌｅｓ  ｗｉｔｈｃａｓｔｓ）又は線維化（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の面積の測定結果を示す［＊＊Ｐ＜０．０１  ｖｓ  Ｓａｌｉｎｅ、一群あたりｎ＝３］。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明では、中間中胚葉細胞を、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、腎前駆細胞を製造する方法を提供する。
本発明において、中間中胚葉細胞とは、本発明においてＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養することによって腎前駆細胞へ誘導される任意の細胞を意味する。中間中胚葉細胞を取得する方法としては、例えば、マウスおよびヒトの多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導方法が公知である（非特許文献１および２、特許文献３）。中間中胚葉細胞を特徴づけるマーカーとしてＯＳＲ１が知られており、本発明の方法で使用される中間中胚葉細胞の例として、ＯＳＲ１陽性の中間中胚葉細胞が挙げられる。例えば、ＯＳＲ１プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＯＳＲ１陽性の中間中胚葉細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４，１３６７，（２０１３））等の遺伝子発現を分析する方法によって、中間中胚葉細胞におけるＯＳＲ１の発現を確認することもできる。本発明において、ＯＳＲ１陽性の中間中胚葉細胞には、ＯＳＲ１タンパク質を発現している細胞、およびＯＳＲ１プロモーター制御下にある遺伝子によってコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。本発明において、ＯＳＲ１には、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿１４５２６０．２、マウスの場合、ＮＭ＿０１１８５９．３に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。好ましくは、本発明の方法で使用される中間中胚葉細胞は、ＳＩＸ２が陰性であり、ＯＳＲ１が陽性である細胞である。
本発明において、腎前駆細胞は、ネフロン前駆細胞と同等の細胞として取り扱われ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腎臓の糸球体様構造や尿細管様構造などの器官構造へ分化し得る細胞であり、器官構造への分化能は、例えば、Ｏｓａｆｕｎｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３：１５１−６１に記載の方法によって評価し得る。ネフロン前駆細胞としての状態を維持するための特徴的な因子としてＳＩＸ２が知られており（非特許文献４）、本発明の方法で誘導される腎前駆細胞の例として、ＳＩＸ２陽性の腎前駆細胞が挙げられる。例えば、ＳＩＸ２プロモーター制御下に導入されたレポーター遺伝子（例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏ）を有する多能性幹細胞（例えば、後記実施例記載のＯＳＲ１−ＧＦＰ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞）を培養し、当該レポーター遺伝子の発現を指標に当該分野で公知の方法（例えば、細胞ソーターを用いる方法）によって、ＳＩＸ２陽性の腎前駆細胞を単離することができる。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ＮａｔＣｏｍｍｕｎ  ４，１３６７，（２０１３））等の遺伝子発現を分析する方法によって、腎前駆細胞におけるＳＩＸ２の発現を確認することもできる。本発明において、ＳＩＸ２陽性の腎前駆細胞には、ＳＩＸ２タンパク質を発現している細胞、およびＳＩＸ２プロモーター制御下にある遺伝子にコードされるタンパク質を発現する細胞が包含される。本発明において、ＳＩＸ２には、ＮＣＢＩのアクセッション番号として、ヒトの場合、ＮＭ＿０１６９３２．４、マウスの場合、ＮＭ＿０１１３８０．２に記載されたヌクレオチド配列を有する遺伝子並びに当該遺伝子にコードされるタンパク質、ならびにこれらの機能を有する天然に存在する変異体が包含される。好ましくは、本発明の方法で誘導される腎前駆細胞は、ＯＳＲ１が陽性であり、かつＳＩＸ２が陽性である細胞である。
本発明において、中間中胚葉細胞または腎前駆細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、５％以上、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％、２０％、２８％または３０％以上当該細胞が含まれた細胞集団である。
本発明の方法において、中間中胚葉細胞を任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態、または、細胞同士が接着した細胞塊の状態で、浮遊培養により培養するか、あるいは、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養してもよい。ここで、分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。
本発明の方法において使用される浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
本発明の方法において使用される接着培養とは、コーティング処理された培養皿にて培養することである。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくは、マトリゲル、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘまたはゼラチンである。
本発明の中間中胚葉細胞の培養工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＴＧＦβシグナル刺激剤およびＢＭＰ阻害剤を添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、ＤＭＥＭとＦ１２の１：１の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノールおよび抗生物質を含む培地である。
本発明において使用されるＴＧＦβシグナル刺激剤とは、ＴＧＦβシグナル経路を活性化するものである限り特に限定されず、ＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３などのタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒ＆Ｄ社等から入手可能）、ＩＤＥ１（（Ｚ）−２−（（２−（６−ｃａｒｂｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ）ｈｙｄｒａｚｏｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）およびＩＤＥ２（７−（２−ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌｉｄｅｎｅｈｙｄｒａｚｉｎｙｌ）−７−ｏｘｏｈｅｐｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｂｏｒｏｗｉａｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００９，４：３４８−５８）などの化合物が例示される。ＩＤＥ１およびＩＤＥ２は、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｔｏｃｒｉｓ社等から入手可能である。好ましいＴＧＦβシグナル刺激剤は、ＴＧＦβ１である。
本発明において、ＴＧＦβシグナル刺激剤を用いる場合の濃度は、使用するＴＧＦβシグナル刺激剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＴＧＦβシグナル刺激剤としてＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３などのタンパク質を用いる場合の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌである。また、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２を用いる場合の濃度は、１μＭから１００μＭ、好ましくは、２５μＭから７５μＭ、さらに好ましくは、４０μＭから６０μＭである。
本発明において使用されるＢＭＰ阻害剤とは、ＢＭＰ（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナル経路を抑制するものである限り特に限定されず、ＢＭＰ阻害剤としては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ  （６−［４−（２−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ−ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）およびその誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）、ＤＭＨ１（４−［６−（４−Ｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ，４−［６−［４−（１−Ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）、ならびにＬＤＮ１９３１８９（４−（６−（４−（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ１９３１８９は市販されており、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、Ｍｅｒｃｋ、Ａｘｏｎ  ＭｅｄＣｈｅｍ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社等から入手可能である。好ましいＢＭＰ阻害剤としては、ＤＭＨ１、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ１９３１８９、及びＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎが挙げられ、より好ましいＢＭＰ阻害剤は、ＤＭＨ１である。
本発明において、ＢＭＰ阻害剤を用いる場合の濃度は、使用するＢＭＰ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＢＭＰ阻害剤としてＣｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤を用いる場合の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌである。また、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＤＭＨ１およびＬＤＮ１９３１８９を用いる場合の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから１μＭである。
本発明の中間中胚葉細胞の培養工程において、基礎培地へＦＧＦ９、ＦＧＦ２０、ＢＭＰ７、レチノイン酸誘導体、ＧＳＫ−３β阻害剤のいずれかまたは任意の組み合わせをさらに添加しても良い。
本発明の中間中胚葉細胞の培養工程の日数は、長期間培養することで腎前駆細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、２日以上、４日以上、６日以上、８日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上、１６日以上、１７日以上、１８日以上、１９日以上、２０日以上が挙げられる。
本発明の中間中胚葉細胞の培養工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
本発明の１つの実施形態において、中間中胚葉細胞は、多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞である。この場合、誘導された中間中胚葉細胞を一旦単離し、単離された中間中胚葉細胞を本発明の培養工程によって腎前駆細胞へ誘導しても良い。または、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞を誘導し、中間中胚葉細胞を単離せずにそのまま本発明の培養工程に供することによって腎前駆細胞へ誘導しても良い。
中間中胚葉細胞を単離する場合、内在性のＯＳＲ１プロモーターによって発現が制御されるレポーター遺伝子を有する多能性幹細胞を使用してもよい。多能性幹細胞のＯＳＲ１プロモーター制御下にレポーター遺伝子を導入する方法としては、例えば、ＢＡＣベクター等を用いた相同組換えが挙げられ、ＷＯ２０１２／０１１６１０等に記載されている。また、誘導された腎前駆細胞を単離するために、ＳＩＸ２プロモーターによって発現が制御されるレポーター遺伝子を有する多能性幹細胞を使用してもよく、前記と同様の方法を使用して作製することができる。使用されるレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｔｄＴｏｍａｔｏ、細胞表面タンパク質などの公知のレポータータンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。これらの多能性幹細胞から誘導された中間中胚葉細胞または腎前駆細胞は、当該レポータータンパク質の発現を指標として細胞ソーターを用いる方法、当該細胞表面タンパク質に対する抗体を使用して、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ）、当該抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等、当該分野で公知の方法を用いて単離され得る。
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、ｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ  Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ��（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一または実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座またはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
本発明において、多能性幹細胞から中間中胚葉細胞への分化誘導に際して、以下の工程を含む方法を用いることができる：
（ｉ）多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程、および
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程。
以下に各工程についてさらに説明する。
（ｉ）多能性幹細胞を、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程：
本工程では、多能性幹細胞を当該分野で公知の任意の方法で分離し、浮遊培養または接着培養により培養してもよい。多能性幹細胞の分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液を用いて解離し、力学的に細かく単一細胞へ分散する方法である。本工程で用いるヒト多能性幹細胞としては、使用したディッシュに対して７０％〜８０％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを用いることが好ましい。
本工程（ｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を添加して調製することができる。１つの実施形態において、本工程で使用される物質は、Ａｃｔｉｖｉｎ  ＡおよびＧＳＫ−３β阻害剤の組み合わせ、または、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体の組み合わせである。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ＦＢＳ）が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有しうる。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、ＧｌｕｔａＭＡＸ、血清および抗生物質を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２である。
本工程（ｉ）において、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａには、ヒトおよび他の動物由来のＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社等の市販されているものを使用することができる。本工程で用いるＡｃｔｉｖｉｎ  Ａの濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌである。
本工程（ｉ）において、ＧＳＫ−３β阻害剤は、ＧＳＫ−３βの機能、例えば、キナーゼ活性を阻害できるものである限り特に限定されず、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニル−α−ブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（α，４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２：配列番号１）および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５３：５１９−５２３）が挙げられる。これらの化合物は、例えば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂｉｏｍｏｌ社等から入手可能であり、また自ら作製してもよい。本工程で用いる好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。本工程で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＧＳＫ−３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから３μＭである。
本工程（ｉ）において、レチノイン酸誘導体は、天然のレチノイン酸が有する機能を保持する人工的に修飾されていてもよいレチノイン酸であり、例えば、レチノイド化合物及びビタミンＤ３化合物を包含する。レチノイド化合物の例としては、レチノイン酸、３−デヒドロレチノイン酸、４−［［（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．３２：１７−２６（１９９０））、４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）−１−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｙｌ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：５２６８−５２７２（１９８３））、およびＴａｎｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：９１４−９１９（１９８０）に記載されている化合物、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール等が挙げられる。レチノイン酸化合物とは、レチノイド化合物のうち、カルボキシル基を有する化合物であり、例えば、レチノイン酸、３−デヒドロレチノイン酸、ＡＭ５８０、ＴＴＮＰＢ等が挙げられる。ビタミンＤ３化合物の例には、Ａｂｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８：４９９０−４９９４（１９８１）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４：１８（１９８３）に記載されている化合物が挙げられる。本工程の１つの実施形態において、レチノイン酸誘導体は、レチノイド化合物又はビタミンＤ３化合物である。本工程の別の実施形態において、レチノイン酸誘導体は、レチノイド化合物であり、また別の実施形態において、レチノイン酸誘導体は、レチノイン酸化合物である。本工程で用いる好ましいレチノイン酸誘導体としては、ＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢを用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから２μＭである。
本工程（ｉ）における培地はさらに、ＲＯＣＫ阻害剤を含んでいてもよい。特に、本工程が多能性幹細胞を単一細胞へ分散させる工程を含む場合には、培地にＲＯＣＫ阻害剤が含まれていることが好ましい。
ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｒｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（例、Ｉｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例、Ｕｅｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例、Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例、Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５／０２０９２６１号、同第２００５／０１９２３０４号、同第２００４／００１４７５５号、同第２００４／０００２５０８号、同第２００４／０００２５０７号、同第２００３／０１２５３４４号、同第２００３／００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいＲＯＣＫ阻害剤としては、Ｙ−２７６３２が挙げられる。本工程で用いるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、使用するＲＯＣＫ阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＲＯＣＫ阻害剤としてＹ−２７６３２を用いる場合、０．１μＭから１００μＭ、好ましくは、１μＭから５０μＭ、さらに好ましくは、５μＭから２０μＭである。
本工程（ｉ）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。本工程の培養時間は、例えば２日以下の培養であり、好ましくは２日である。
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を含む培地で培養する工程：
本工程では、前述の工程（ｉ）で得られた浮遊培養後の細胞集団をそのままコーティング処理された培養皿にて、任意の培地中で接着培養してもよく、または、前述の工程（ｉ）で接着培養により得られた細胞を、培地の交換により培養を続けてもよい。
本工程（ｉｉ）において使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へＢＭＰ７、ＧＳＫ−３β阻害剤およびレチノイン酸誘導体からなる群から選択される１以上の物質を添加して調製することができる。１つの実施形態において、本工程で使用される物質は、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤の組合せ、または、レチノイン酸誘導体である。基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清（例えば、ＦＢＳ）が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。本工程の１つの実施形態において、基礎培地は、ＤＭＥＭとＦ１２の１：１の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ＫＳＲ、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノールおよび抗生物質を含む培地である。
本工程（ｉｉ）において、例えば、工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養し、その後に、レチノイン酸誘導体を含む培地でさらに培養しても良い。好ましくは、本工程（ｉｉ）において、工程（ｉ）で得られた細胞を、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む培地で培養し、その後に、レチノイン酸誘導体およびＴＧＦβシグナル刺激剤を含む培地でさらに培養する。
すなわち、本工程（ｉｉ）は、次の工程（ｉｉ−１）および（ｉｉ−２）：
（ｉｉ−１）ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤から選択される１以上の物質を含む基礎培地で培養する工程、および
（ｉｉ−２）ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体から選択される１以上の物質を含む基礎培地で培養する工程
の２工程に分離して行っても良い。
より好ましくは、本工程（ｉｉ）において、（ｉｉ−１）工程は、ＢＭＰ７およびＧＳＫ−３β阻害剤を含む培地で培養する工程であり、かつ（ｉｉ−２）工程は、ＴＧＦβシグナル刺激剤およびレチノイン酸誘導体を含む培地で培養する工程である。
本工程（ｉｉ）において、ＢＭＰ７には、ヒトＢＭＰ７（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿００１７１９．２）および他の動物由来のＢＭＰ７、ならびにこれらの機能的改変体が包含され、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｒ＆Ｄ社等の市販されているものを使用することができる。本工程で用いるＢＭＰ７の濃度は、１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌである。
本工程（ｉｉ）において、ＧＳＫ−３β阻害剤は、前述の工程（ｉ）について例示したＧＳＫ−３β阻害剤を使用することができ、好ましいＧＳＫ−３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。本工程で用いるＧＳＫ−３β阻害剤の濃度は、使用するＧＳＫ−３β阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＧＳＫ−３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから３μＭである。
本工程（ｉｉ）において、ＴＧＦβシグナル刺激剤は、ＴＧＦβシグナル経路を活性化するものである限り特に限定されず、ＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３あるいはＩＤＥ１およびＩＤＥ２を使用することができ、好ましいＴＧＦβシグナル刺激剤としては、ＴＧＦβ１が挙げられる。本工程（ｉｉ）において、ＴＧＦβシグナル刺激剤を用いる場合の濃度は、使用するＴＧＦβシグナル刺激剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ＴＧＦβシグナル刺激剤としてＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３などのタンパク質を用いる場合の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌである。また、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２を用いる場合の濃度は、１μＭから１００μＭ、好ましくは、２５μＭから７５μＭ、さらに好ましくは、４０μＭから６０μＭである。
本工程（ｉｉ）において、レチノイン酸誘導体は、前述の工程（ｉ）について例示したレチノイン酸誘導体を使用することができ、好ましいレチノイン酸誘導体としては、ＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてＡＭ５８０またはＴＴＮＰＢを用いる場合、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは、０．１μＭから１０μＭ、さらに好ましくは、０．５μＭから２μＭである。
本工程（ｉｉ）、（ｉｉ−１）及び（ｉｉ−２）において、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われる。ＣＯ２濃度は、約２〜５％、好ましくは約５％である。培養時間は、、長期間培養することで腎前駆細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、工程（ｉｉ）の培養時間としては、例えば３日以上の培養であり、好ましくは３日以上から１２日以下、より好ましくは３日以上９日以下が挙げられる。工程（ｉｉ）が工程（ｉｉ−１）及び（ｉｉ−２）を含む場合、工程（ｉｉ）の培養時間としては前述のとおりであるが、工程（ｉｉ−１）の培養時間としては、例えば１日以上の培養であり、好ましくは２日以上から１１日以下、より好ましくは２日以上６日以下が挙げられ、工程（ｉｉ−２）の培養時間としては、例えば１日以上の培養であり、好ましくは２日以上から１１日以下、より好ましくは３日以上６日以下が挙げられる。この時、培地は、３日ごとに交換することが望ましい。
本発明では、上述した方法により得られた腎前駆細胞、該腎前駆細胞を含む医薬組成物、該腎前駆細胞を含む腎疾患治療剤、該腎前駆細胞の治療有効量を投与する工程を包含する腎疾患を治療する方法、腎疾患の治療に使用するための該腎前駆細胞、及び腎疾患の治療用の医薬組成物の製造における該腎前駆細胞の使用をそれぞれ提供する。治療を必要とする患者への治療剤の投与方法としては、例えば、得られた腎前駆細胞をシート化して、患者の腎臓に貼付する方法、得られた腎前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させた細胞懸濁液、あるいは三次元培養（例えば、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．Ｓｅｐ  １１，２０１２；２３（３）：６３７−６５１）し、得られた細胞塊を患者の腎臓に直接移植する方法、マトリゲル等から構成されたスキャフォールド上で三次元培養し、得られた腎前駆細胞塊を移植する方法などが挙げられる。移植部位は、腎臓内であれば特に限定されないが、好ましくは、腎被膜下である。腎疾患としては、急性腎障害、慢性腎不全、慢性腎不全にまで至らない慢性腎臓病が例示される。
本発明において、腎疾患治療剤に含まれる腎前駆細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
【実施例】
【０００８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれらの実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
［ＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ＧＦＰ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎヒトｉＰＳ細胞株の樹立］
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、京都大学（日本国、京都）の山中伸弥教授より受領し、従来の方法で培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−７２）。続いて、Ｍａｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１３６７，２０１３に記載された方法で、内在性のＯＳＲ１の発現と連動してＧＦＰを発現するＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞株を作製した。次いで、Ｍａｅら（前出）と同じ方法を用いて、ＩＲＥＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏを挿入したＢＡＣクローン（ＲＰ１１−８１９Ｈ１９、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｏａｋｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、当該ＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞株のＳＩＸ２の終止コドンの下流へＩＲＥＳ−ｔｄＴｏｍａｔｏを相同組換えにより導入し、内在性のＳＩＸ２の発現と連動してｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターｉＰＳヒト細胞株を作製した。
［実施例２］
［ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法１］
＜ステージ１＞
実施例１の方法で得られたＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞株を、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を添加した霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培地（リプロセル）を含む１０ｃｍディッシュ上で、ＳＮＬ細胞（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６２；１０７３−１０８５）（１５．５μｇ／ｍｌのマイトマイシン（協和発酵キリン）で２〜３時間処理し、３×１０５細胞／１０ｃｍディッシュで播種）をフィーダー細胞として用いて、３７℃、２〜５％ＣＯ２雰囲気下でコンフルエントになるまで培養した。ここへＣＴＫ溶液（２．５％Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍｇ／ｍｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、１０ｍＬ  ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２９．５ｍＬ  Ｈ２Ｏ）を加えて解離させ、フィーダー細胞を除去した後、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ、０４−０００４）、１００ｎｇ／ｍｌＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３３８−ＡＣ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３５０５０−０６１）、２％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０５６５）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁させ、非接着プレート（ＬＯＷ  ＣＥＬＬ  ＢＩＮＤ  ６ＷＥＬＬ  ＤＩＳＨ（Ｎｕｎｃ、１４５３８３））へ１ｕｆｅｒｕあたり１０ｃｍディッシュから得られた細胞懸濁液の１／３〜１／６量を移し浮遊培養にて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
＜ステージ２＞
ステージ１で得られた細胞塊を、マトリゲル（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５６２３０）によりコートした２４ウェルまたは６ウェルディッシュ（ＤＭＥＭ中０．２ｍｇ／ｍｌのマトリゲルでコーティングし、３７℃で３０分または４℃で一晩処理）またはＳｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ  ＩＩ−ＳＣ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５３５ＸＸ１））によりコートした２４ウェルまたは６ウェルディッシュ（滅菌水で４０倍希釈したＳｙｎｔｈｅｍａｘでコーティングし、室温で２時間処理）へ移し、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３５３４−ＢＰ））、０．１％  ２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１９８５）、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０）、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加した培地へ交換し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で接着培養にて３日間から６日間培養した。３日間以上培養した場合は、３日目に同じ条件の培地へ交換した。
＜ステージ３＞
ステージ２で得られた細胞から培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，１００−２１Ｃ）、０．５μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（ＡＭＰＫ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃ（Ｍｅｒｃｋ、１７１２６０））、０．１％２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、１％  ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加した培地へ交換し、さらに浮遊培養にて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１５日間から２２日間培養した。このとき、３日に１度同じ条件の培地へ交換した。得られた細胞のＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞率をフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）を用いて評価したところ、２１．５±２．０％であった（図１Ｂ）。
［実施例３］
［ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法２］
＜ステージ１＞
実施例１の方法で得られたＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞株を、誘導方法１のステージ１に記載した方法と同じ方法で、ＳＮＬ細胞をフィーダー細胞として用いて１０ｃｍディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。ここへＣＴＫ溶液を加えて解離させ、フィーダー細胞を除去した後、１μＭ  ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ、Ｔ３７５７）、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、２％ＦＢＳ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁させ、非接着プレート（ＬＯＷ  ＣＥＬＬ  ＢＩＮＤ  ６ＷＥＬＬ  ＤＩＳＨ）へ１ウェルあたり１０ｃｍディッシュから得られた細胞懸濁液の１／３〜１／６量を移し、浮遊培養にて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
＜ステージ２＞
ステージ１で得られた細胞塊を、マトリゲルによりコートしたディッシュまたはＳｙｎｔｈｅｍａｘによりコートしたディッシュ（誘導方法１のステージ２に記載の方法で調製）へ移し、１μＭ  ＴＴＮＰＢ、０．１％２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加した培地へ交換し、接着培養にて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間から９日間培養した。このとき、３日に１度同じ条件の培地へ交換した。
＜ステージ３＞
ステージ２で得られた細胞から培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１、０．５μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．１％２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加した培地へ交換し、さらに浮遊培養にて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１２日間から２２日間培養した。このとき、３日に１度同じ条件の培地へ交換した。得られた細胞においてＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞率をフローサイトメーターを用いて評価したところ、２０．６±５．３％であった（図１Ｃ）。
［実施例４］
［ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法３］
＜ステージ１＞
実施例１の方法で得られたＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞株を、誘導方法１のステージ１に記載した方法と同じ方法で、ＳＮＬ細胞をフィーダー細胞として用いて１０ｃｍディッシュ上でコンフルエントになるまで培養した。ここへＣＴＫ溶液を加えて解離させ、フィーダー細胞を除去し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＴ−１０４）を加えてｉＰＳ細胞を単一細胞へ分散させた。次いで、１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ、２５３−００５１３）、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１μＭ  ＴＴＮＰＢ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、２％ＦＢＳ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁させ、０．１％ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｋｉｎ，Ｔｙｐｅ  Ａ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ１８９０））でコーティングしたディッシュに上記細胞懸濁液（１×１０５細胞／ウェル（９６ウェルの場合））を移し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で接着培養にて２日間培養した。
＜ステージ２＞
ステージ１で得られた細胞をＰＢＳで洗浄し、１μＭ  ＴＴＮＰＢ、０．１％２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加した培地へ交換し、接着培養にて３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間から９日間培養した。このとき、３日に１度同じ条件の培地へ交換した。
＜ステージ３＞
ステージ２で得られた細胞へＡｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）を加えて解離させ、ＯＳＲ１（ＧＦＰ）を指標としてＦＡＣＳによりＯＳＲ１陽性細胞をソーティングした。得られたＯＳＲ１陽性細胞を５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１、０．５μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．１％２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２を添加した培地中で、非接着プレート（ＬＯＷ  ＣＥＬＬ  ＢＩＮＤ  ６ＷＥＬＬ  ＤＩＳＨ）へ１×１０６細胞／ウェルを移し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で浮遊培養にて２日間培養した。得られた細胞塊をマトリゲル（ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ）によりコートしたディッシュへ移し、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１、０．５μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、０．１％２−メルカプトエタノール（１０００Ｘ）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（１００Ｘ）、１０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、および０．５％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日から１３日間、接着培養した。このとき、３日に１度同じ条件の培地へ交換した。得られた細胞においてＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞率をフローサイトメーターを用いて評価したところ、３１．１±１０．０％であった（図１Ｄ）。
［実施例５］
［Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎの代替物での検討］
ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法１のステージ３において、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを１００ｎｇ／ｍｌＮｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、０．５μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Ａｘｏｎ  ＭｅｄＣｈｅｍ、１５０９）または０．５μＭ  ＤＭＨ１（Ｔｏｃｒｉｓ、４１２６）へ変更して同様に分化誘導したところ、それぞれ、ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞率は７．５％、２０．４％または１５．４％であった（それぞれ、図２Ｂ、ＣおよびＤ）。
［ＴＧＦβ１の代替物での検討］
ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法１のステージ３において、ＴＧＦβ１を５０μＭ  ＩＤＥ１（Ｔｏｃｒｉｓ）または５０μＭ  ＩＤＥ２（Ｔｏｃｒｉｓ）へ変更して同様に分化誘導したところ、それぞれ、ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ陽性細胞率は８．４％、３９．４％であった（図２ＥおよびＦ）。
［組み合わせでの検討］
ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法１のステージ３において、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎを０．５μＭ  ＬＤＮ１９３１８９へ変更し、ＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）または１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ）へ変更して同様に分化誘導したところ、それぞれ、ＳＩＸ２陽性細胞率は８．６％、９．３％であった（図２ＧおよびＨ）。
［実施例６］
［ＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎヒトｉＰＳ細胞株の樹立］
実施例１に記載と同様の方法を用いて、Ｍａｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１３６７，２０１３に記載のＯＳＲ１−ＧＦＰレポーターヒトｉＰＳ細胞株（３Ｄ４５）から、ＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターｉＰＳヒト細胞株（４Ａ６Ｃ３−１０）を作製した。
［実施例７］
［ＳＩＸ２陽性細胞の誘導方法４］
＜ステージ１＞
実施例６の方法で得られたＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＆  ＳＩＸ２−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターヒトｉＰＳ細胞株
４Ａ６Ｃ３−１０を、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び５ｎｇ／ｍｌ組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｗａｋｏ）を添加した霊長類ＥＳ培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）を含む１０ｃｍディッシュ上で、胎生１２．５日ＩＣＲマウス胚由来マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）又はＳＮＬフィーダー細胞（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６２；１０７３−１０８５）（１５．５μｇ／ｍｌのマイトマイシン（協和発酵キリン）で２〜３時間処理し、２×１０５細胞／６ｃｍディッシュで播種）をフィーダー細胞として用いて、３７℃、２〜５％ＣＯ２雰囲気下で７０％〜８０％コンフルエントになるまで培養した。細胞を含む１０ｃｍプレートをＰＢＳでリンスし、ＣＴＫ溶液（ＰＢＳ中、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１％Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ＩＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔＳＲ（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で３７℃、４分間処理した。ＣＴＫ溶液をＰＢＳでのリンスにより除去した後、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び２０％ＫＳＲを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に置き換えた。次いで、細胞をセルスクレーパーで掻きとり、０．２％ゼラチンコートした６ｃｍプレートに播いて、フィーダー細胞を除去した。１時間後、細胞を５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン及び２％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ［ステージ１培地］で洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌ組換えヒト／マウス／ラットＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含有するステージ１培地を含む超低接着ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３４７１）に移し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２日間培養した。
＜ステージ２＞
細胞を中間中胚葉へ分化させるために、ステージ１で得られた細胞塊（胚様体（ＥＢ））を、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ  ＩＩ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）によりコートした２４ウェルプレートへ移し、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％ＫＳＲ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＢＭＰ７、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘへ交換し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。
＜ステージ３＞
ステージ２の後、培地を、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％ＫＳＲ、１μＭ  ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ  Ｔ３７５７）及び５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘへ交換し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で５日間培養した。培養開始後２日目（ステージ１開始（１日目）から８日目）に同じ条件の培地に交換した。
＜ステージ４＞
ステージ３の後、培地を、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、０．５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％ＫＳＲ、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び０．５μＭ  ＤＭＨ１（Ｔｏｃｒｉｓ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘへ交換し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１７日間培養した（ステージ１開始（１日目）から全２８日間の培養。図３Ａ）。このとき、３日に１度同じ条件の培地に交換した。得られた細胞においてＯＳＲ１陽性ＳＩＸ２陽性（ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋）細胞率を、フローサイトメーターを用いて評価したところ、培養２８日目で３２．８％であった（図３Ｂ）。また、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞率は、培養２５日目で最大に達し、その後培養２８日まで維持していることが確認された（図３Ｄ）。
［実施例８］
［種々のＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤の組み合わせでの検討］
種々のＴＧＦβシグナル刺激剤及びＢＭＰ阻害剤の組み合わせについて、前記ｉＰＳ細胞株４Ａ６Ｃ３−１０からＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞への誘導を検討した。具体的には、以下に説明する条件１）〜１０）の下で４Ａ６Ｃ３−１０からＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞への誘導を検討した。
条件１）〜１０）のステージ１〜２では、それぞれ実施例７のステージ１〜２と同じ方法を用いた。条件１）〜７）及び１０）のステージ３では、実施例７のステージ３と同じ方法を用いた。条件８）のステージ３では、実施例７のステージ３における５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び１μＭ  ＴＴＮＰＢを５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に置き換えた培地で培養した。条件９）のステージ３では、実施例７のステージ３における５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び１μＭ  ＴＴＮＰＢを５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に置き換えた培地で培養した。各条件のステージ４では、実施例７のステージ４と同じ方法、又は実施例７のステージ４における５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び０．５μＭ  ＤＭＨ１を以下のいずれかに置き換えた培地で培養した：条件１）ＤＭＳＯのみ、条件２）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１、条件３）０．５μＭ  ＤＭＨ１、条件４）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び１００ｎｇ／ｍｌ  Ｎｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、条件５）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び０．５μＭ  Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（Ｍｅｒｃｋ）、条件６）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び０．５μＭ  ＬＤＮ１９３１８９（Ａｘｏｎ  ＭｅｄＣｈｅｍ）、条件７）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．５μＭ  ＤＭＨ１（実施例７と同じ）、条件８）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．５μＭ  ＤＭＨ１、条件９）５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．５μＭ  ＤＭＨ１、条件１０）５０μＭ  ＩＤＥ２（Ｔｏｃｒｉｓ）及び０．５μＭ  ＤＭＨ１。
その結果（図４）、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞への誘導には、ＴＧＦβシグナル刺激剤としてはＴＧＦβ１を、ＢＭＰ阻害剤としてはＤＭＨ１を用いることが効果的であることが確認された。実施例７におけるステージ４において、５ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１及び０．５μＭ  ＤＭＨ１と共に、ＴＧＦβレセプター１阻害剤であるＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ）（１０μＭ）を含む培地で培養した場合（条件１１））、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞への分化が抑制された。
［実施例９］
［種々のヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞での検討］
１５種のヒトｉＰＳ細胞（末梢血由来ｉＰＳ細胞５８５Ａ１、５８５Ｂ１、６０４Ａ１、６０４Ｂ１、６４８Ａ１、６４８Ｂ１、６９２Ｄ２；臍帯血由来ｉＰＳ細胞６０６Ａ１、６０６Ｂ１、６１０Ｂ１；成人皮膚線維芽細胞（ａＨＤＦ）由来ｉＰＳ細胞２０１Ｂ６、２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４；及び４Ａ６Ｃ３−１０）及び３種のヒトＥＳ細胞（ｋｈＥＳ１、ｋｈＥＳ３、Ｈ９）（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０９，１２５３８−１２５４３（２０１２）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１，４５８−４６６（２０１３）、）を実施例７に記載の方法と同じ方法で処理し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４，１３６７，（２０１３））によりＯＳＲ１及びＳＩＸ２の遺伝子発現を分析した。実施例７に記載の方法により、４Ａ６Ｃ３−１０以外の複数の細胞株においてＯＳＲ１及びＳＩＸ２の発現が確認され（図５）、本方法が他のｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞にも適用可能であることが確認された。
［実施例１０］
［発現マーカー分析］
実施例７での誘導工程で処理した４Ａ６Ｃ３−１０における各種発現マーカーをＲＴ−ＰＣＲまたは定量ＲＴ−ＰＣＲで分析した。結果を図３ＣおよびＥに示す。ステージ１後の細胞では初期の後方中胚葉（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ）のマーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ及びＴＢＸ６の発現が確認され、ステージ２後の細胞では中間中胚葉のマーカーであるＯＳＲ１の発現が確認された（図３Ｃ）。その後、後腎間充織（間葉）マーカーであるＷＴ１、ＰＡＸ２、ＳＩＸ２、及び後方（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）ＨＯＸ遺伝子の発現が活性化された（図３Ｃ）。培養２８日目のＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞において、腎前駆細胞マーカーであるＣＩＴＥＤ１、ＥＹＡ１、ＰＡＸ２、ＷＴ１、ＳＡＬＬ１、ＩＴＧＡ８、ＣＤＨ１１、ＧＤＮＦ、ＨＯＸＡ１１及びＨＯＸＤ１１が発現されており、一方、当該細胞において間質マーカーであるＦＯＸＤ１、中腎管マーカー、尿管芽であるＨＯＸＢ７は検出されなかった（図３Ｅ）。
［腎前駆細胞の評価］
実施例７での誘導工程で処理した培養２８日目のＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞をフローサイトメトリーで単離し、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ  ＩＩをコートした９６ウェルプレート上に３．０×１０４細胞／ウェルで播種し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＲＥＧＭ培地（ＬＯＮＺＡ）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７日間培養した。得られた細胞をＮＥＰＨＲＩＮ（糸球体ポドサイトマーカー）、ＡＱＰ１およびＭＥＧＡＬＩＮ（近位尿細管マーカー）ならびにＵＲＯＭＵＣＯＩＤ（ヘンレのループマーカー）に対する免疫染色によって、各マーカーの陽性細胞を確認した（図６Ａ）。
続いて、同ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＵＢＣ培養上清（以下参照）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ  Ｃｏａｔ、ＮＯＦ）に１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７、０．５μＭ  ＢＩＯ（Ｗａｋｏ）、及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ培養上清に置き換え、２から３日間培養した後、細胞を回収し、マイトマイシン処理したＷｎｔ４を発現するＮＩＨ３Ｔ３（Ｏｓａｆｕｎｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３３：１５１−６１）上に３．０×１０４細胞／ウェル（２４ウェルプレート）で播種し、５から７日間培養した。得られた細胞をＬｏｔｕｓ  Ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ（ＬＴＬ）（近位尿細管マーカー）、ＬＡＭＩＮＩＮ（極性上皮細胞マーカー）、ＣＤＨ１（遠位尿細管マーカー）ならびにＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮおよびＷＴ１（糸球体ポドサイトマーカー）に対する免疫染色によって、各マーカーの陽性細胞を確認した（図６Ｂ）。
さらに、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞をＥ１１．５のマウス胚脊髄と器官培養した。詳細には、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＵＢＣ培養上清（以下参照）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ  Ｃｏａｔ、ＮＯＦ）に１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７、０．５μＭ  ＢＩＯ（Ｗａｋｏ）、及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ培養上清に置き換え、２から３日間培養した後、細胞を回収し、Ｅ１１．５のマウス胚脊髄と共に０．４μｍ孔を有するポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上の空気−培養液の境界において３７℃で培養した。培養液側には５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を用いた（Ｏｓａｆｕｎｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１３３：１５１−６１）。一週間後得られた細胞をＬＴＬ、ＬＡＭＩＮＩＮ、ＣＤＨ１、ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮおよびＷＴ１に対する免疫染色によって、各マーカーの陽性細胞を確認した（図６Ｃ）。
同様に、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞をＥ１１．５のマウス胚後腎と器官培養した。詳細には、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＵＢＣ培養上清（以下参照）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ  Ｃｏａｔ、ＮＯＦ）に１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７、０．５μＭ  ＢＩＯ（Ｗａｋｏ）、及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ培養上清に置き換え、２から３日間培養した後、細胞を回収し、Ａｃｃｕｍａｘを用いて分離した。ＩＣＲマウスからＥ１１．５のマウス胚後腎を抽出し、ＤＭＥＭ中で切断し、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ中で１０分間放置し、ピペティングにより分離した。分離したマウス胚後腎細胞は、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で、３７℃、１０分間静置した後、４０μｍセルストレーナー（ＢＤ）でろ過した。得られた５．０×１０５細胞のマウス胚後腎細胞を５．０×１０５細胞の前記Ａｃｃｕｍａｘで分離したＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞と混合し、紡錘底低接着９６ウェルプレート上、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で一昼夜培養し、凝集塊を形成させた。得られた凝集塊を０．４μｍ孔を有するポリカーボネート（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上の空気−培養液の境界において３７℃で培養した。培養液側には５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を用いた（Ｕｃｈｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ  ２９４，８１３−８１８（２００５））。一週間後得られた細胞をＣＤＨ６（腎小胞マーカー）、ＬＴＬ、ＬＡＭＩＮＩＮ、ＣＤＨ１、ＰＯＤＯＣＡＬＹＸＩＮおよびＷＴ１に対する免疫染色によって、各マーカーの陽性細胞を確認した（図６Ｄ）。
さらに、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＵＢＣ培養上清（以下参照）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ  Ｃｏａｔ、ＮＯＦ）に１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７、０．５μＭ  ＢＩＯ（Ｗａｋｏ）、及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ培養上清に置き換え、２から３日間培養した後、細胞を回収し、免疫不全マウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（Ｃｈａｒｌｅｓ  ｒｉｖｅｒ））の副睾丸脂肪組織へ移植し、３０日後移植部位を回収したところ、ＬＴＬおよびＬＡＭＩＮＩＮ陽性の近位尿細管様構造を確認した（図６Ｅ）。
さらに、実施例７での誘導工程で処理した培養２８日目の各分画の細胞（ＯＳＲ１−ＳＩＸ２−、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２−、ＯＳＲ１−ＳＩＸ２＋、およびＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋）をＥ１１．５のマウス胚尿管芽と器官培養した。詳細には、ｉＰＳ細胞由来の細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＵＢＣ培養上清（以下参照）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ  Ｃｏａｔ、ＮＯＦ）に１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌＢＭＰ７、０．５μＭ  ＢＩＯ（Ｗａｋｏ）、及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ培養上清に置き換え、２から３日間培養した後、細胞を回収し、Ａｃｃｕｍａｘを用いて分離した。ＩＣＲマウスからＥ１１．５のマウス胚尿管芽を抽出した。得られた５．０×１５細胞のマウス胚尿管芽を５．０×１０５細胞の前記Ａｃｃｕｍａｘで分離したＯＳＲ１−ＳＩＸ２−、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２−、ＯＳＲ１−ＳＩＸ２＋、およびＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋の各細胞群と混合し、紡錘底低接着９６ウェルプレート上、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で一昼夜培養し、凝集塊を形成させた。得られた凝集塊を０．４μｍ孔を有するｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上の空気−培養液の境界において３７℃で培養した。培養液側には５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を用いた（Ｕｃｈｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．ＪＡＭＡ  ２９４，８１３−８１８（２００５））。一週間後得られた細胞凝集塊を観察したところ、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞との凝集塊においてのみ管構造を確認した（図６Ｆ左図）。さらに、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞との凝集塊に対して、ＤＢＡ（尿管芽マーカー）に対する免疫染色を行ったところ、マウス尿管芽由来の分枝が確認された（図６Ｆ右図）。
以上より、実施例７に記載の方法で分化誘導したＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞は、腎前駆細胞であることが示された。
［ＵＢＣ培養上清］
Ｕｒｅｔｅｒｉｃ  Ｂｕｄ細胞（ＵＢＣ）馴化培地を文献（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７３，Ｆ７５７−７６７（１９９７））記載の方法を改良した方法で作製した。ＵＢＣ（Ｄｒ  Ｓａｋｕｒａｉから譲受、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，６２７９−６２８４（１９９７））を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する最小必須培地（ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。８０％コンフルエントになったところで細胞をＰＢＳでリンスし、培地を０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ、５００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、及び０．５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％ＫＳＲを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘで置き換えた。次いで、細胞を３日間培養して培養上清を生成した。培養上清は使用前に０．２２μｍフィルターでろ過した。
［実施例１１］
［ヒトｉＰＳ由来腎前駆細胞の治療効果］
実施例７に記載の方法で分化誘導した２５日〜２８日目のヒトｉＰＳ由来腎前駆細胞（ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞；ＲＰ−ＯＳとも称する）又はヒトｉＰＳ由来腎前駆細胞を含む細胞群（ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２−細胞及びＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞；ｈｉＰＳＣ−ＲＰとも称する）をフローサイトメトリーで単離し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２（Ｗａｋｏ）を添加したＵＢＣ培養上清（上記）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ  Ｃｏａｔ、ＮＯＦ）に１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間培養した。次いで、培地を５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７、０．５μＭ  ＢＩＯ（Ｗａｋｏ）、及び１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加したＵＢＣ培養上清に置き換え、さらに２４時間培養した。コントロールとして未分化ヒトｉＰＳ細胞（４Ａ６Ｃ３−１０）を、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加した霊長類ＥＳ細胞培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）を含む紡錘底低接着９６ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で４８時間培養した。培養後の各細胞を生理食塩水で洗浄し、培地を除去した。その後、以下に記載のように、１５個のｈｉＰＳＣ−ＲＰの細胞塊を急性腎障害（ＡＫＩ）モデルマウスの腎臓被膜下に移植した。また、ＯＳＲ１＋ＳＩＸ２＋細胞の組織分化を確認する実験（図７ＡおよびＢ）として、以下に記載のように、５個のＲＰ−ＯＳの細胞塊をＡＫＩモデルマウス及び慢性腎不全モデルマウスの腎臓実質にピペッティングで注入した。
［マウス急性腎障害（ＡＫＩ）モデル試験］
マウス虚血再灌流ＡＫＩモデルを公知の方法（Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  ８，１９２−２００（２００９）、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０，１５４４−１５５５（２００９）、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２５，３１６−３２８（２０１４））に従って作製した。６週齢の雌性免疫不全マウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ（Ｃｈａｒｌｅｓｒｉｖｅｒ））をイソフルラン吸入により麻酔し、３７℃で維持した。側腹切開して右腎摘出を行った後、非外傷的微小血管用クランプ（夏目製作所、日本国）を使用して、４５分間左腎動脈を閉塞した。クランプを外したのち、ＲＰ−ＯＳ、ｈｉＰＳＣ−ＲＰ、又は４Ａ６Ｃ３−１０を移植した（コントロールマウスには生理食塩水を注入した）。マウスの末梢血中の腎機能マーカーである血中尿素窒素（ＢＵＮ）及び血清クレアチニン（Ｃｒ）レベルをＤＲＩ−ＣＨＥＭ７０００ＶＺ（富士フイルム、日本国）を使用して測定した。ＡＫＩ状態の確立は、虚血再灌流後に腎梗塞を伴うことなく２日目にＢＵＮレベルが上昇（＞４１ｍｇ／ｄｌ）していることにより確認した。腎組織の解析においては虚血再灌流後（Ｉ／Ｒ）３日目に過ヨウ素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）又はマッソントリクローム（ＭＴ）染色で染色した。
［マウス慢性腎不全モデル試験］
マウス慢性腎不全モデル（５／６腎摘出モデル）を公知の方法（Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２６，８３２−８３８（２０１１））に従って作製した。６週齢の雌性免疫不全マウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ）をイソフルラン吸入により麻酔し、３７℃で維持した。右腎摘出を行った後、左腎臓の上下両極を切除した。ＲＰ−ＯＳの細胞塊を術後２週間で移植した。移植３日後又は２週間後にマウスを屠殺し、腎組織切片を免疫染色で試験した。
［結果］
ＲＰ−ＯＳの腎実質移植後２週間目のＡＫＩモデル（図７Ａ）及び慢性腎不全モデル（図７Ｂ）の両方において、移植したＲＰ−ＯＳのいくらかが宿主の腎臓に組み込まれ、近位尿細管マーカーＬＴＬ及びＡＱＰ１陽性細胞に分化していた。しかし、ＲＰ−ＯＳの腎実質移植は、両モデルにおいて腎機能に対する明確な効果を示さなかった（データは示さず）。静脈内注射と比較して腎臓被膜下へ移植を行うことにより多数の間葉系幹細胞を損傷された腎臓に直接送達することが報告されている（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ４１，９４７−９５１（２００９））ことから、本発明者らは、ｈｉＰＳＣ−ＲＰの腎臓被膜下への移植による治療効果を試験した。その結果、虚血再灌流後２、４、６日目でコントロール群及び未分化ヒトｉＰＳ細胞移植群と比較して、ｈｉＰＳＣ−ＲＰ移植群においてＢＵＮレベル及び血清Ｃｒレベルが有意に低下した（図７Ｃ）。組織学的分析により、腎実質領域の円柱を伴う拡張尿細管がコントロール群と比較してｈｉＰＳＣ−ＲＰ移植群において有意に小さく、線維化領域もｈｉＰＳＣ−ＲＰ移植群で小さいことが確認された（図７Ｄ及びＥ）。ｈｉＰＳＣ−ＲＰは宿主の腎臓に組み込まれなかったことから、本プロトコルで確認されたｈｉＰＳＣ−ＲＰの治療効果は主にパラクライン効果に基づくことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
以上詳述したように、本発明は、中間中胚葉細胞から腎前駆細胞を分化誘導する方法を提供する。これにより、本方法で製造された腎前駆細胞は、腎不全等の腎疾患の再生医療に使用され得る。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
0006450311.tif 000002
【図１】
0006450311.tif 000003
【図２】
0006450311.tif 000004
【図２ＥＦＧＨ】
0006450311.tif 000005
【図３】
0006450311.tif 000006
【図３Ｃ】
0006450311.tif 000007
【図３ＤＥ】
0006450311.tif 000008
【図４】
0006450311.tif 000009
【図５】
0006450311.tif 000010
【図６】
0006450311.tif 000011
【図６ＢＣＤ】
0006450311.tif 000012
【図６Ｆ】
0006450311.tif 000013
【図７】
0006450311.tif 000014
【図７ＣＤ】
0006450311.tif 000015